JPH0822232B2

JPH0822232B2 - Ｌ−イソロイシンの製造法

Info

Publication number: JPH0822232B2
Application number: JP10398087A
Authority: JP
Inventors: 真人寺沢; 昭一奈良; 真樹子福島; 恵子小浜; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1987-04-27
Filing date: 1987-04-27
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPS63269991A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、酵素法によるＬ−イソロイシンの製造法に
関するものである。

本発明によれば高収量で効率よくＬ−イソロイシンを
製造することができる。

Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間および
動物の栄養上重要な役割りをするアミノ酸であり、医
薬、食品、飼料添加剤等としてその需要が近年急激に増
加しつつある。

公知技術Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のアミ
ノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成
法ではＬ体のみの製造は困難であり、主に醗酵法により
生産が行われている。醗酵法としてはDL−α−アミノ酪
酸、スレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を使用
する方法（特公昭43−8709号、同40−2880号公報等）、
前駆物質を特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭38−70
91号、特開昭49−93586号公報等）がある。一方酵素法
としては、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外
のＬ−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−、Ｌ−、
またはDL−α−ケト−β−メチルバレリアン酸からＬ−
イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29789号公
報）、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外のＬ
−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−イソロイシン
あるいはＤ−アロイソロイシンの単独もしくは混合物、
又はこれらとその光学異性体との適宜混合物に作用させ
てＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29788
号公報）、セラチア（Serratia）属細菌の固定化物を用
いてグルコースとＤ−スレオニンからＬ−イソロイシン
を製造する方法（日本醗酵工学会大会講演要旨集p.47〜
48昭和52年度）等が報告されている。しかしながらこれ
らの方法は、原料費が嵩むとか収率が低い課題を抱えて
いる。

発明の要旨本発明は、ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体の存在下、α−ケ
ト酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有する
水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−イソロイシン
を生成せしめ、これからＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法を提供するも
のである。

発明の効果本発明によれば、α−ケト酪酸又はその塩から、高収
率で効率よくＬ−イソロイシンが製造できる。本発明の
方法において、酵素反応時の水溶液として好ましく用い
られるエタノールを含有する完全合成培地は、発酵法の
場合に用いられる培地の滅菌等煩雑な操作が必要でない
ので、生産管理は容易である。

本発明の方法は、従来このような酵素法によるＬ−イ
ソロイシンの生産は、報告が無く又実施されてもいな
く、本発明は新規な方法である。

発明の具体的説明本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性のブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものであ
り、好ましくはエタノール資化性のものである。このな
かにはＬ−イソロイシン生産菌が含まれる。本発明に使
用される微生物菌体としては例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM
BP−1497）、ブレビバクテリウム・フラバム（Breviba
cterium flavum）MJ−233−AB−41（FERM BP−1498）、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABT−11（FERM BP−1500）及びブレビバク
テリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233
−ABD−21（FERM BP−1499）等であり、これらの菌が本
発明に好適に用いられる。

なお、上記の（FERM BP−1498）は、（FERM BP−149
7）を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与されたエタノール資化性微生物である（特公昭59−28
398号公報３〜４欄参照）。（FERM BP−1500）は、（FE
RM BP−1497）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トラン
スアミナーゼ高活性変異株である（特願昭60−190609号
明細書３〜５頁参照）。また、（FERM BP−1499）は（F
ERM BP−1497）を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭61−177993号公報参
照）。

これらの微生物菌体の他にブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6
871、同ATCC 13745、同ATCC 13746、ブレビバクテリ
ウム・デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 14020等を用いることもできる。

本発明に用いられるビオチン要求性のブレビバクテリ
ウム属に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用
いることもできるし、又これらを公知の手法で固定化し
た固定化物を使用することもできる。この固定化手法と
しては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用
いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な
担体に不溶化させる等がある。

本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性のブ
レビバクテリウム属に属する微生物菌体の調製に使用す
る培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に
使用されるものでよい。中でも好ましいものは、エタノ
ールを主炭素源とする培地である。

本発明に使用する微生物菌体の調整に使用する培地の
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは
混合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加し用いる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中
のpHの調整には酸、アルカリを添加して行う。

培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％が適する。培養期間は
２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水
又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に
使用する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌
体（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、α
−ケト酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有
する水溶液にて酵素反応させる。ここで該水溶液に添加
されるエタノールの濃度は0.5〜40容量％、好ましくは
１〜20容量％である。

該水溶液は、上記の様にエタノールを含有する水ある
いはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液を用いることもで
きるが、好ましくはエタノールを含有する完全合成培地
が用いられる。ここで完全合成培地とは、化学構造が公
知の無機窒素源及び無機塩を含有する水溶液である。本
発明に用いられる完全合成培地の無機窒素源としては、
アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が例示でき、ま
た無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄
等が例示される。これらの無機窒素源、無機塩は、単独
でも２種以上混合しても用いることもできる。

これら無機窒素源及び／又は無機塩の水溶液としての
濃度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同
程度の範囲でよく、特に限定されない。

完全合成培地の一例を示すと、（NH₄）₂SO₄ 2g/;K
H₂PO₄ 0.5g/;K₂HPO₄ 0.5g/;MgSO₄・7H₂O 0.5g/
;FeSO₄・7H₂O 20ppm/MnSO₄・４〜6H₂O 20ppm含有す
るpH7.6の水溶液がある。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、
ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。ビ
オチンの含有されないことの明らかな化学構造公知のア
ミノ酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。

本発明の方法においては、α−ケト酪酸又はその塩の
酵素反応時の濃度には特に制限はないが、一般には0.1
〜20％（wt/vol）、好ましくは0.5〜10％（wt/vol）の
濃度範囲で使用するのが適当である。又、該菌体の使用
量も特に制限されるものではないが、一般に１〜50％
（wt/vol）の濃度で使用することが出来る。

本発明において、酵素反応は、約20〜約50℃、好まし
くは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われ
る。

上記酵素反応は、反応に用いられるエタノールを含有
する水溶液、好ましくは上述のエタノールを含有する完
全合成培地、中の溶存酸素濃度が0.05ppm以上、8ppm以
下となる様に、反応系中に空気もしくは酸素を、連続又
は間歇的に供給して行うのが好ましい。

上記のような反応方法によつて得られる反応液中に生
成したＬ−イソロイシンの分離・精製は、公知のイオン
交換樹脂処理法あるいは、沈殿法等により行うことがで
きる。

実施例以下の実験例において、Ｌ−イソロイシンの定性は、
ペーバークロマトグラフのRf値、電気泳動法の移動度、
微生物定量法による生物活性値により確認した。定量は
ロイコノストツク・メセンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides）ATCC 8042を用いるマイクロバイオアツ
セイ法と高速液体クロマトグラフイー（島津LC−5A）と
を併用して行つた。また、下記の実験例において％と表
したのは重量％を意味する。

実施例−１培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・
2H₂O 2ppm、FeSO₄・7H₂O 2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O 2pp
m、ZnSO₄・7H₂O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.1％、酵母
エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM BP−149
7）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30℃にて
２日間振盪培養を行つた。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・
7H₂O 20ppm、MnSO₄・nH₂O 20ppm、ビオチン200μg/、
チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.3％、酵母エキ
ス0.3％）の1000mlの２容通気撹拌槽に仕込み、滅菌
（120℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養
物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温
度33℃pH7.6にて48時間培養を行つた。

尚、エタノールは、培養中培地の温度が２容量％を越
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物500mlから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にて２度洗浄して得た菌体を、反
応液〔（NH₄）₂SO₄ 2g/;KH₂PO₄ 0.5g/;KH₂PO₄ 0.5g
/;MgSO₄・7H₂O 0.5g/;FeSO₄・7H₂O、20ppm;MnSO₄・
４〜6H₂O 20ppm;チアミン−塩酸100μg/、α−ケト酪
酸ソーダ10g/（pH7.6）〕の1000mlに懸濁後、該懸濁
液を２容通気撹拌槽に仕込み、エタノール20mlを添加
して、回転数300rpm、通気量を第１表に示すように変化
させ、温度33℃、pH7.6にて15時間反応を行つた。

反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＬ−イソロイシンを定量した。結
果を第１表に示した。

実施例−２実施例−１と同様の条件にて、ブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41
（FERM BP−1498）を培養し、また実施例−１と同様の
条件にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定
量した。結果を第２表に示した。

実施例−３実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11（F
ERM BP−1500）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定量し
た。結果を第３表に示した。

実施例−４実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21（F
ERM BP−1499）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定量し
た。結果を第４表に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小浜恵子茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体の存在下、α−ケ
ト酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有する
水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−イソロイシン
を生成せしめ、これからＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。
【請求項２】少なくともエタノールを含有する水溶液
が、エタノールを含有する完全合成培地である特許請求
の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】酵素反応を該水溶液中の溶存酸素濃度が0.
05ppm以上となる様に保持して行うことを特徴とする特
許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。