JPH0824574B2 - キシログルカン分解酵素の製造法、及びキシログルカン分解酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セルロースには作用せ
ずにキシログルカンのみに特異的に作用するキシログル
カン分解酵素の製造法、及びキシログルカン分解酵素に
関し、さらに詳しくは、例えば植物の伸長や分化に重要
な役割を担っている生体高分子であるキシログルカンの
構造や機能の解明に用いられる酵素試薬として使用する
ことができるものである。

【０００２】

【従来の技術】キシログルカンは、グルコース、キシロ
ース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構
成単糖とするヘテロ多糖であるが、グルコースがβ−
１，４−グルコシド結合で多数結合した主鎖に対して、
キシロースがα−１，６結合で高頻度に分岐結合した構
造を基本とすることから、キシログルカンと呼称されて
いる。このキシログルカンは、植物の一次細胞壁の構成
成分として、またある種の熱帯性マメ科植物の種子貯蔵
多糖として重要な役割を担っており、その構造や機能が
注目されている。特に、植物の一次細胞壁中におけるキ
シログルカンは、セルロースと密接に関わって存在して
いると考えられており、セルロースとの相対的な存在形
態が、植物の伸長や分化に重要な役割を担っているもの
と想像されている。こうしたキシログルカンの役割を解
析するために種々の手法が用いられているが、中でも多
糖類の特異的な分解酵素試薬は、重要で強力な分析手段
となっている。

【０００３】上述のようにキシログルカンの主鎖の構造
は、セルロースと同様なものであることから、エンド−
１，４−β−グルカナーゼ、所謂エンド型セルラーゼに
より分解されることが知られており、キシログルカンの
構造や機能の解明に各種起源のエンド型セルラーゼが用
いられてきた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このエ
ンド型セルラーゼは、キシログルカンを分解すると同時
にセルロースをも分解してしまう。そして、キシログル
カンはその存在形態から植物細胞壁中でセルロースと密
接に関わって存在しているため、エンド型セルラーゼを
用いた分析では必ずしもキシログルカンのみに特異的に
作用しているとは言えず、分析結果の解釈を複雑なもの
にしてきた。こうした困難を排し、キシログルカンの役
割を明確に把握するためには、セルロースには作用せず
にキシログルカンのみに特異的に作用するような分解酵
素の開発が嘱望されていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、キシログ
ルカンとセルロースとがその立体構造において大きな差
異を有していること、並びに酵素は一般的に高い基質特
異性を有していることに着目し、自然界よりキシログル
カンを基質として、新たにエンド−１，４−β−グルカ
ナーゼ生産微生物のスクリーニングを行い、さらに分離
微生物の生産する酵素系を、キシログルカンとカルボキ
シメチルセルロースを分解基質として精査することによ
り、キシログルカンにのみ特異的に作用し、カルボキシ
メチルセルロースには作用しないキシログルカン分解酵
素の存在の可能性について鋭意検討した。その結果、糸
状菌の一種であるペニシリウム属の一菌株（ペニシリウ
ム属菌Ｍ４５１株）が、新規のキシログルカン分解酵素
（以下、本酵素と記す）を生産することを見出し、本発
明を完成するに至った。

【０００６】本発明において使用されるペニシリウム属
菌Ｍ４５１株の菌学的性質は以下の通りである。

【０００７】生育：酵母エキス添加ツァペック寒天培地
上での生育は、２５℃，７日間で直径２８ｍｍに達す
る。集落は最初白色で胞子形成と共に青緑色になり、培
養後期には灰緑色となる。集落中央から周辺にかけて高
さ２〜３ｍｍの大きく顕著な分生子柄束を形成する。こ
の分生子柄束は単条で緻密である。また、集落裏面は培
養後期には暗色となり、分生子柄束の直下では特に顕著
である。３７℃では上記条件でも生育しない。

【０００８】形態：菌糸の直径は２．５〜３．５μｍ
で、無色であり、菌糸には隔壁が認められる。また、菌
糸表面は平滑である。

【０００９】ペニシリ：非対称性である。

【００１０】メトレ：２〜４本が群生する。

【００１１】フィアライド：３〜５本が輪生する。

【００１２】分生子：約４×３μｍの楕円形、滑面、長
い連鎖を形成。

【００１３】以上の菌学的性質について、宇田川俊一
［防菌防黴 １９巻 第１２号 ｐｐ６５７−６６５
（１９９１）］を参照した結果、本菌はペニシリウム
クラビフォルメ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｌａｖｉ
ｆｏｒｍｅ）に近縁の糸状菌と考えるのが妥当であり、
本菌をペニシリウム属菌Ｍ４５１株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ｓｐ．Ｍ４５１）と命名した。本菌はＦＥＲＭ
Ｐ−１３７９８として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。

【００１４】上記ペニシリウム属菌Ｍ４５１株より、本
酵素を生産するためには、通常、タマリンド種子キシロ
グルカンを炭素源とし、これに窒素源として、硝酸塩、
アンモニウム塩或いはペプトン、酵母エキスのような無
機または有機の窒素源と少量の金属塩を含む液体または
固体培地を用い、２０〜３０℃で、４〜１０日程度、好
気的に培養される。本酵素は、菌体外に生産される酵素
であるため、液体培地の場合は培養後、濾過或いは遠心
分離した上澄液を、そして固体培養の場合は培養後、水
または適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液とする
ことができる。粗酵素液中には、従来のエンド型セルラ
ーゼ類似の酵素活性が含まれるため、これを除去する必
要があるが、公知のクロマトグラフィーにより、容易に
共存するエンド型セルラーゼ活性を除去することができ
る。

【００１５】上記のようにして得られた本酵素（精製
物）は、以下のような性質を有している。

【００１６】（１）分子量及び等電点；精製された本酵
素は、分子量が約２８，０００で、等電点ｐＨは約５．
０である。

【００１７】（２）作用；本酵素は、各種起源のキシロ
グルカン及びキシログルカンのエンド型セルラーゼによ
る部分分解で生ずる重合度１２以上のキシログルカン由
来オリゴ糖に作用し、これを特定の場所で分解する。一
方、キシロース側鎖を持たないセルロース等について
は、結晶性セルロースである脱脂綿、微結晶性セルロー
スであるアビセル、及び精製パルプをリン酸処理により
調製した非結晶性セルロースの何れにも全く作用しな
い。また、セルロースの可溶性誘導体であるヒドロキシ
エチルセルロースにも全く作用しない。さらに、陰イオ
ン性の解離基を有する可溶性のセルロース誘導体である
カルボキシメチルセルロースには、ごく僅かに作用する
が、その分解率は１％以下である。上記以外のβ−グル
カン類にも全く作用しない。同様に、セルロースの部分
分解により調製される重合度２〜６の直鎖セロオリゴ糖
にも作用しない。以上のように、本酵素は、キシログル
カンのみを特異的に分解し、セルロースには作用しない
酵素である。

【００１８】（３）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ；キシロ
グルカンを分解基質としたときの、本酵素の作用ｐＨ範
囲は、４５℃で１０分間作用させた場合、図１（ａ）に
示すようにｐＨ３〜６であり、最適作用ｐＨは約５．０
付近に認められた。

【００１９】（４）安定ｐＨ範囲；本酵素をクエン酸−
リン酸塩緩衝液中で、４５℃，３時間放置してその残存
活性からみた安定ｐＨ範囲は図１（ｂ）に示すように約
ｐＨ５．０〜７．０であった。

【００２０】（５）作用温度範囲及び最適作用温度；キ
シログルカンを分解基質としたときの、本酵素の作用温
度範囲は、ｐＨ５．０で１０分間作用させた場合、図２
（ａ）に示すように約５５℃まで作用が認められたが、
最適作用温度は５０℃であった。

【００２１】（６）熱安定性；本酵素を５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）のもとで、各温度で１０分間加熱処
理した残存活性は図２（ｂ）に示すように５０℃までは
殆ど失活せず、５５℃で約１０％、６０℃で約８５％が
活性を失った。

【００２２】（７）阻害剤；各種金属イオンのうちで、
１ｍＭ以上の水銀イオン及び銅イオンにより、本酵素は
強く阻害された。

【００２３】（８）精製法；本酵素は、培養濾液を限外
濾過により濃縮・脱塩した後、Ｑ−セファロース及びＳ
−セファロースを用いたカラムクロマトグラフィーによ
り大部分の夾雑タンパク質を吸着除去し、これらカラム
に未吸着の活性画分をさらに陰イオン交換体ＰＢＥ９４
のカラムを用いたイオン交換及び吸着クロマトグラフィ
ーを行い、さらにトヨパールＨＷ５０Ｆカラムによるゲ
ル濾過により、ＳＤＳ電気泳動的に均一なまで分離精製
することができた。

【００２４】（９）活性測定法；本酵素は、キシログル
カンのみを特異的に分解することから、タマリンド種子
より調製したキシログルカンの０．５％水溶液５００μ
ｌ（ｐＨ５．０）に対して、適量の酵素を添加して全量
を１０００μｌとし、４５℃で１０分間反応させ、生成
する還元糖をネルソン−ソモギー法により測定し、活性
を求めた。この条件で、１分間に１μｍｏｌのグルコー
スに相当する還元力を生成する酵素量を１単位とした。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を図示実施例により詳細に説明
する。

【００２６】実施例１；まず、タマリンド種子キシログ
ルカン１％とペプトン０．８％と硫酸マグネシウム０．
０５％とリン酸一カリウム０．２％と酵母エキス０．０
５％とを含む培地（ｐＨ６．０）２０ｍｌを２００ｍｌ
容の三角フラスコに入れ、常法により殺菌した後、ペニ
シリウム属菌Ｍ４５１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７９８）
を接種し、３０℃で６日間通気培養した。その後、濾過
により除菌し、得られた上澄液について前記活性測定法
により活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当り０．０５
単位であった。

【００２７】実施例２；前記実施例１と同様な組成の培
養液４０００ｍｌを調製し、ペニシリウム属菌Ｍ４５１
株を接種して同様に培養し、培養濾液を得た。培養液中
の全酵素活性は２００単位であった。培養濾液を限外濾
過により濃縮・脱塩した後、Ｑ−セファロース及びＳ−
セファロースを用いたカラムクロマトグラフィーにより
大部分の夾雑タンパク質を吸着除去し、これらカラムに
未吸着の活性画分をさらに陰イオン交換体ＰＢＥ９４の
カラムを用いたイオン交換及び吸着クロマトグラフィー
を行い、さらにトヨパールＨＷ５０Ｆカラムによるゲル
濾過により精製した。精製酵素はＳＤＳ−電気泳動的に
均一であり、活性の収率は培養濾液に対して１２％であ
った。また、精製酵素タンパク質１ｍｇ当たりの活性
は、２４．１単位であった。

【００２８】実施例３；前記実施例２で得られた本精製
酵素０．１単位を、０．５％タマリンド種子キシログル
カン、０．５％カルボキシメチルセルロース、０．５％
ヒドロキシエチルセルロースに対してｐＨ５．０，４５
℃で作用させ、経時的に一部を採取し、分解作用により
生じた直接還元糖をネルソン−ソモギー法で、また全糖
をフェノール−硫酸法で測定して分解率を求めた。その
結果、図３に示すように本精製酵素はタマリンド種子キ
シログルカン（ＸＧ）のみを速やかに分解し、他の可溶
性セルロース誘導体であるカルボキシメチルセルロース
（ＣＭＣ）或いはヒドロキシエチルセルロース（ＨＥ
Ｃ）を殆ど或いは全く分解しなかった。

【００２９】実施例４；前記実施例２で得られた本精製
酵素０．１単位を、表１に示す各種起源のキシログルカ
ン、セルロース類、各種多糖類に実施例３と同様に作用
させ、１８時間反応させた後、同様に分解率を測定し
た。その結果、本酵素は、キシログルカンのみを特異的
に分解し、セルロースや他の多糖類に殆ど或いは全く作
用しないことが示された。

【００３０】

【表１】

【００３１】実施例５；前記実施例２で得られた本精製
酵素０．１単位を、表２に示す構造を有する各種キシロ
グルカン、セルロース関連オリゴ糖の０．８％溶液に実
施例３と同様に作用させ、１８時間反応させた後、分解
産物をリクロソルブＮＨ₂ カラムを用いた高速液体クロ
マトグラフィーで分析した。加えた基質が完全に消失し
たものを分解率１００％として分解率を測定した結果、
表２に示すように直鎖セロオリゴ糖やキシログルカンの
エンド型セルラーゼによる完全分解物である重合度７〜
９のオリゴ糖には全く作用せず、エンド型セルラーゼに
よるタマリンド種子キシログルカンの限定分解より得ら
れた重合度１４、１８の高級ヘテロオリゴ糖のみに作用
した。

【００３２】従来知られているエンド型セルラーゼは、
直鎖セロオリゴ糖を分解するのに対して、本酵素はこれ
らに作用しない点で既知エンド型セルラーゼとは明らか
に異なるものである。また、キシログルカンオリゴ１
４、１８糖は、既知エンド型セルラーゼにより、それぞ
れオリゴ７糖及び９糖に分解されることが知られている
が、本酵素によるこれらオリゴ糖の分解産物も、既知エ
ンド型セルラーゼの分解産物と同様であった。したがっ
て、本酵素のキシログルカンの切断部位は、キシロース
側鎖を持たないグルコース残基の還元末端側であった。
しかし、直鎖セロヘキサオースに作用せず、キシログル
カンオリゴ１４糖に作用することは、本酵素の基質認識
に、キシロース側鎖が重要であることを強く示唆してい
た。この結果は、本酵素が従来知られているエンド型セ
ルラーゼとは全く異なる基質特異性を持つ酵素であるこ
とを示すものであった。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例６；前記実施例２で得られた本精製
酵素０．１単位を、実施例５で用いた重合度１４の高級
ヘテロオリゴ糖に、イソプリメベロース生成酵素を限定
的に作用させて調製した。重合後８〜１４の表３に示す
構造を有する各種オリゴ糖に実施例５と同様に作用さ
せ、同様に分解率を測定した。その結果、本酵素は、基
質切断部位の非還元末端側に少なくとも二つのイソプリ
メベロース（キシロシルα−１，６−グルコース）単位
が必要であり、それより短い基質には作用しないことが
示された。一方、既知のエンド型セルラーゼは表３中に
示した構造を有するオリゴ糖の全てを分解できることが
知られており、この結果からも本酵素が従来のエンド型
セルラーゼとは全く異なる基質特異性を有するものであ
ることが示された。

【００３５】

【表３】

【００３６】以上本発明を実施例に基づいて説明した
が、本発明は前記した実施例に限定されるものではな
く、特許請求の範囲に記載した構成を変更しない限りど
のようにでも実施することができる。

【００３７】

【発明の効果】以上説明したように本発明は特殊な技術
や装置を用いることなく、セルロース類に全く、或いは
殆ど作用しない新規なキシログルカン分解酵素を提供す
るものである。

【００３８】そして、得られた本酵素は、セルロースと
キシログルカンの植物一次細胞壁における関係の解明
や、キシログルカンの構造解明のための強力な酵素試薬
として利用することができる。

【００３９】また、セルロースに全く作用せず、セルロ
ースの周囲に存在すると考えられているキシログルカン
を分解、除去できるので、より精製度の高いパルプを製
造できることも見込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のキシログルカン分解酵素の４５℃にお
ける最適作用ｐＨ（ａ）、ｐＨ安定範囲（ｂ）を示すグ
ラフである。

【図２】本発明のキシログルカン分解酵素のの酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）中での最適作用温度（ａ）、及び熱安
定性（ｂ）を示すグラフである。

【図３】本発明のキシログルカン分解酵素によるキシロ
グルカン（ＸＧ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ）及びヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）の分解
の経時変化を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペニシリウム属菌Ｍ４５１株（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１３７９８）を培養し、得られる粗酵素液からク
   ロマトグラフィー等により共存するエンド型セルラーゼ
   類似の酵素活性を除去するようにしたことを特徴とする
   キシログルカン分解酵素の製造法。
2. 【請求項２】 以下の理化学的性質を有するキシログル
   カン分解酵素。 （１）基質特異性： キシログルカンのみを特異的に加水分解し、セルロース
   は分解しない。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは、キシログルカンを基質とした場合ｐＨ５．
   ０である。 安定ｐＨ範囲はｐＨ５．０〜７．０である。 （３）作用適温の範囲： ３０℃〜５５℃の範囲である。 （４）分子量 分子量は約２８，０００である。