JPH0824599B2 - 病原糸状真菌遺伝子増幅プライマー - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、病原糸状真菌のリボソ
ームＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）の検出方法に関する。本発
明はまた、該遺伝子検出のための検出キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】高度医療の普及に伴い、易感染患者は増
加の一途をたどっている。アスペルギルス症を初めとす
る深部（全身性）真菌症は、易感染患者が高率に罹患す
る重要な感染症として医療上の問題となっている。しか
し深部真菌症、とりわけ糸状菌感染症であるアスペルギ
ルス症の診断は極めて困難であり、様々な抗真菌剤が開
発されている今日においても、有効な診断法が未だに確
立されていないために、多くの患者が治療を受けられな
いままに亡くなっているのが現状である。アスペルギル
ス症の診断は、臨床検体からの培養同定によって行われ
ているが、例え病理学的にアスペルギルス感染が明らか
な症例であったとしても、アスペルギルスの培養陽性率
は低い上に、培養が出来たとしてもアスペルギルス属の
同定の根拠となる分生子頭が形成されるまでに２週間以
上かかるのが普通であり、このことがアスペルギルス症
の生前診断を困難にしている。また、アスペルギルス症
の診断キットとして現在までに認可されているものは無
く、実験室的な診断法としてはアスペルギルス抗原また
は抗体を免疫学的に検出する方法、病原真菌の菌体成分
または代謝産物を生化学的に検出する方法があるが、い
ずれの方法も、感度が低い上に、病理学的に真菌感染が
認められない患者（健常人を含む）に対しても有意に高
値を示す欠点がある。従って、アスペルギルス症により
特異的であり、かつ迅速な診断方法の確立が求められて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ法は、特定のプ
ライマー対を用いることによって任意の遺伝子を迅速か
つ簡便に増幅する事ができる、現在のところ最も鋭敏な
遺伝子検出法である。病原糸状真菌の特徴はその遺伝子
により規定される。そこで、その病原糸状真菌に特徴的
な遺伝子領域に対応したプライマー対を用いてＰＣＲ法
を施行し、病原糸状真菌に特徴的な遺伝子を検出する事
により、病原糸状真菌の存在を確定することができる。
本発明者は、アスペルギルス属又はペニシリウム属の病
原糸状真菌に特異的な配列を、病原糸状真菌遺伝子中に
繰り返して存在するリボソームＲＮＡ遺伝子（ＤＮＡ）
中に見いだした。従って、リボソームＲＮＡ遺伝子中の
病原糸状真菌に特異的な配列をプライマー対として用い
るＰＣＲ法によって、該遺伝子を高感度かつ迅速に検出
できれば、病原糸状真菌の存在を簡便に確定することが
出来る。すなわち、本発明は、試料中の病原糸状真菌に
特徴的なリボソームＲＮＡ遺伝子の検出方法及びそれに
用いるキットを提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、第
１の発明は病原糸状真菌の検出方法に関し、配列表の配
列番号１及び２で表される合成プライマー対を用いて、
アスペルギルス属又はペニシリウム属の病原糸状真菌リ
ボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅させて検出
することを特徴とする。第２の発明は、病原糸状真菌の
検出用キットに関し、上記第１の発明の方法に用いて該
病原真菌の検出を行うための検出用キットであって、該
病原糸状真菌のリボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法によ
り増幅させるための上記合成プライマー対及び増幅され
たＤＮＡを検出するためのプローブからなることを特徴
とする。

【０００５】リボソームＲＮＡ遺伝子中の、病原糸状真
菌に特徴的なプライマー対の配列は、以下の手順で決定
することができる。 （１）遺伝子配列データバンク（GenBank ）に登録され
ている遺伝子配列のうち、アスペルギルス、そのほかの
各種病原真菌、ヒト及び大腸菌の１８ＳリボソームＲＮ
Ａ遺伝子（ＤＮＡ）を各々の塩基配列間で比較し、アス
ペルギルス・フミガタス（登録番号Ｍ５５６２６）及び
ペニシリウム・ノタツム（登録番号Ｍ５５６２８）に特
徴的であり、ヒト（登録番号Ｍ１００９８）、大腸菌
（登録番号Ｍ２４９９６）及び表１に示す各種病原真菌
には共通しない配列領域を限定する。

【０００６】表１ カンジダ・アルビカンス Ｍ６０３０２ カンジダ・ギリエルモンディイ Ｍ６０３０４ カンジダ・ケフィル Ｍ６０３０３ カンジダ・クルゼイ Ｍ６０３０５ カンジダ・ルシタニエ Ｍ６０３０６ カンジダ・パラプシローシス Ｍ６０３０７ カンジダ・ヴィスワナティイ Ｍ６０３０９ カンジダ・グラブラータ Ｍ６０３１１ ハンセヌラ・ポリモルファ Ｍ６０３１０ サッカロマイセス・セレビシエ Ｖ０１３３５ クリプトコッカス・ネオフォルマンス Ｍ５５６２５

【０００７】（２）上記の配列領域から、アスペルギル
ス・フミガタス及びペニシリウム・ノタツムに共通した
１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のみを特異的に増幅する
ことができ、ヒト、大腸菌及び表１に示したその他の病
原真菌の遺伝子は増幅しないプライマー対ＤＮＡ配列
（配列表の配列番号１及び２）を決定する。プライマー
は、オリゴヌクレオチドＤＮＡとしてＤＮＡ合成機によ
り合成でき、ＨＰＬＣにて精製できる。

【０００８】検出する病原糸状真菌ＤＮＡは、血液等、
病原糸状真菌感染試料より調製することができる。ＰＣ
Ｒ法については、タック・ポリメラーゼ（Taq polymera
se）を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が
市販されており、これと本発明のプライマー対を用い、
病原糸状真菌ＤＮＡの増幅反応を行わせることができ
る。ＰＣＲ法では、酵素として、例えば耐熱性タック・
ポリメラーゼを用い、ＤＮＡの変性（９４℃）の過程、
プライマーＤＮＡのアニーリング（５５℃）の過程及び
ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成（７２℃）の過程、より成る
温度サイクルを任意の回数繰り返すことで、目的遺伝子
のみを指数的に増幅させることができる。例えば温度サ
イクルを２５回繰り返せば、目的ＤＮＡは約１０万倍に
増幅される。微量試料より高感度にＤＮＡを検出するに
は、現在このＰＣＲ法が最も有効な方法である。増幅後
のリボソームＲＮＡ遺伝子の検出は、例えばアガロース
ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スポ
ット法、及びサザンブロット法等を用いて行うことがで
きる。スポット法、サザンブロット法の際は増幅領域内
に特異的なＤＮＡ配列をプローブとして選択すればよ
い。その一例として配列表の配列番号３のプローブ１が
ある。

【０００９】プローブＤＮＡは、前記プライマーＤＮＡ
と同様の方法で合成、精製することができる。プローブ
ＤＮＡは、標識することにより、高感度な検出が可能と
なる。 標識化の方法は放射性同位元素標識法に限ら
ず、アビジン・ビオチン系標識を含む酵素標識、ケミプ
ローブ標識を含む蛍光標識法等、公知の方法なら何でも
よい。実際選定されたプライマーを用い、病原真菌のリ
ボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ反応を行い、電気泳動
法、サザンハイブリダイゼーション法等により高感度に
検出することができる。

【００１０】このように病原糸状真菌のリボソームＲＮ
Ａ遺伝子に特有な塩基配列から設計したプライマー対を
用いたＰＣＲ法によって、病原糸状真菌を高感度に検出
することができる。また、本発明に従って、病原糸状真
菌のリボソームＲＮＡ遺伝子領域を増幅させるためのプ
ライマー対及び増幅されたＤＮＡ領域を検出するための
プローブをそろえてキットとしておくことにより、病原
糸状真菌の検出を簡便に行うことができる。なお、キッ
トに用いる試薬は溶液状、凍結乾燥物あるいはプレート
等に固定化した状態等でもよい。以上、本発明によって
病原糸状真菌症の早期診断が可能となり、その早期治療
に結びつく。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例をもって詳細に説明す
るが、本発明はこれら実施例によって制限されるもので
はない。

【００１２】実施例１ アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のリボソー
ムＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ法による検出 （１）プライマー（ＤＮＡ）及びプローブ（ＤＮＡ）の
合成及び精製 配列表の配列番号１〜３に示したプライマー（ＤＮＡ）
及びプローブ（ＤＮＡ）の合成、精製は、クラボウ（倉
敷紡績株式会社）、バイオメディカル部に依頼した。 （２）アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８のゲ
ノムＤＮＡの調製 アスペルギルス・フミガタスの培養及びゲノムＤＮＡの
調製は、Bainbridgeらの方法〔Bainbridge BW et.al.FE
MS Microbiology Letters 66:113-118,1990.〕により行
い、最終的に培養液１. ５mlから約２５μg のゲノムＤ
ＮＡを得た。 （３）病原真菌各種各株のゲノムＤＮＡの調製 表２に示した病原真菌各種各株の培養、スフェロプラス
トの調製及びゲノムＤＮＡの調製は、阿部らの方法〔昭
和６２年１１月１０日、（株）ソフトサイエンス社発
行、口野嘉幸ほか２名編「遺伝子・タンパク質・実験操
作ブロッティング法」（初版）〕により行い、最終的に
培養液１５mlから約１００μg のゲノムＤＮＡを得た。

【００１３】 表２ カンジダ・アルビカンス ＴＩＭＭ１６２３ カンジダ・アルビカンス ＴＩＭＭ２７２６ カンジダ・アルビカンス （ステラトイデア） ＴＩＭＭ０３１０ カンジダ・ギリエルモンディイ ＴＩＭＭ０２６０ カンジダ・ケフィル ＴＩＭＭ０３０２ カンジダ・クルゼイ ＴＩＭＭ０２６９ カンジダ・トロピカリス ＴＩＭＭ０３１３ カンジダ・パラプシローシス ＴＩＭＭ０２９２ カンジダ・グラブラータ ＴＩＭＭ１０６４ ハンセヌラ・アノマラ ＪＣＭ３５８５ サッカロマイセス・セレビシエ ＴＩＭＭ０９２５ クリプトコッカス・ネオフォルマンス ＴＩＭＭ０３５４ クリプトコッカス・ネオフォルマンス Ｎｏ．００６１

【００１４】（４）アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ
１７３８のリボソームＲＮＡ遺伝子に特異的な領域のＰ
ＣＲ法による増幅 実施例１−（２）、（３）で調製したアスペルギルス・
フミガタスＪＣＭ１７３８のＤＮＡ１０ng、表２に示し
た病原真菌各種各株のＤＮＡ各々１０ng、公知の方法で
調製したヒトのＤＮＡ １μg 、ウシのＤＮＡ １μg
及び大腸菌のＤＮＡ１０ngをそれぞれ０. ５ml用チュー
ブに取り、１０μl の１０×増幅用緩衝液（１００mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．３， ５００mM ＫＣｌ，１
５mM ＭｇＣｌ₂ ， ０．０１％(w/v) ゼラチン）、８
μl のｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ；各１００mM）、１μl の３０pmol／μl
プライマー１、１μl の３０pmol／μl プライマー２及
び０. ５μl の５ユニット／μl タックポリメラーゼを
加え、更に滅菌水を加えて１００μl の溶液にした。こ
の反応液に、上層に１００μl のミネラルオイルを加え
た後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーにより増
幅反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間の変性の
後、９４℃で１分間の変性→５５℃で２分間のプライマ
ーのアニーリング→７２℃で１分間の合成反応のサイク
ルを２５サイクル行った後、７２℃１０分間伸長反応を
行った。反応後、下層の反応液を５μl 取り、１. ２％
アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
でＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを確認した。その
結果、アスペルギルス・フミガタスＪＣＭ１７３８を鋳
型にした場合のみに３８５bpの単一のバンドを確認し
た。他のＤＮＡを鋳型にしたときは増幅は認められなか
った。 （５）サザンハイブリダイゼーションによる、ＰＣＲ法
により増幅されたアスペルギルス・フミガタスのリボソ
ームＲＮＡ遺伝子の検出 実施例１−（４）に記載のＰＣＲ反応液を電気泳動し
た、１．２％アガロースゲルをアルカリ変性後、ナイロ
ンメンブラン（アマーシャムハイボンド−Ｎ）に一晩サ
ザンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２
５４nm）で１０分間照射し、ＤＮＡをメンブランに固定
した。このメンブランからのＤＮＡ検出は、ＥＣＬ ３
´ーオリゴラベリング・検出システム（アマシャム・ジ
ャパン社）を用いた蛍光発光によって、次のように行っ
た。プレハイブリダイゼーション緩衝液（０．５％ブロ
ッキング液、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５％硫酸デ
キストラン及び１００μg ／mlサケ精子ＤＮＡ）５ml中
で３７℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。次にターミナルトランスフェラーゼを用いて、フル
オレセイン修飾ｄＵＴＰをテーリングさせたプローブ１
を加え、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーション後、メンブランを洗浄バッ
ファー１（１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）中で１５分
間、６０℃で振とうしながら洗浄し、続いて洗浄バッフ
ァー２（０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）中で１５分
間、６０℃で振とうしながら２回洗浄した。更にバッフ
ァー１の中でメンブランを１分間軽く洗浄後、室温で６
０分間、０．５％ブロッキング液中で振とうを行った。
次にバッファー２を用いて１０００倍希釈したＨＲＰ標
識抗フルオレセイン抗体溶液中で、室温で６０分間イン
キュベーションを行った。メンブランを乾燥させた後、
ハイパーフィルム−ＥＣＬ（アマシャム・ジャパン社）
を入れたカセット内で４０分間露光を行った。この結
果、アスペルギルス・フミガタスのＰＣＲ増幅ＤＮＡ
は、プローブ１とハイブリダイズしてバンドが現れた
が、その他のサンプルではバンドが認められなかった。
このことは、プライマー１及びプライマー２でアスペル
ギルス・フミガタスのＤＮＡのみが特異的に増幅され、
プローブ１とのハイブリダイゼーションでアスペルギル
ス・フミガタスのリボソームＲＮＡ遺伝子に特異的な配
列が検出できることを示すものである。

【００１５】実施例２ 病原糸状真菌各種各株のリボソームＲＮＡ遺伝子のＰＣ
Ｒ法による検出 （１）ゲノムＤＮＡの調製 表３に示した病原糸状真菌各種各株について、実施例１
−（２）の方法による培養及びゲノムＤＮＡの調製を行
った。

【００１６】表３ アスペルギルス・フミガタス ＪＣＭ１７３８ アスペルギルス・フミガタス ＴＩＭＭ１３３５ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２００５ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２０１４ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２０２１ アスペルギルス・フミガタス Ｎｏ．２０２２ アスペルギルス・テレウス Ｎｏ．２０３６ アスペルギルス・フラーブス ＴＩＭＭ００５７ アスペルギルス・ベルシカラー ＴＩＭＭ１２９０ アスペルギルス・ニドゥランス ＴＩＭＭ０１１１ アスペルギルス・ニゲル ＴＩＭＭ０１１３ ペニシリウム・エクスパンスム ＴＩＭＭ１２９３

【００１７】（２）プライマー１及びプライマー２を用
いたＰＣＲによるリボソームＲＮＡ遺伝子の検出 上記ＤＮＡ１０ngをそれぞれ０. ５ml用チューブに取
り、実施例１と同じ組成に調製した１０μl の１０×増
幅用緩衝液、８μl のｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ；各１００mM）、１μl の３
０pmol／μl プライマー１、１μl の３０pmol／μl プ
ライマー２及び０. ５μl の５ユニット／μl タックポ
リメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００μl の溶
液にした。この反応液に、上層に１００μl のミネラル
オイルを加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイク
ラーにより増幅反応を行った。反応条件は、９４℃で５
分間変性の後、９４℃で１分間の変性→５５℃で２分間
のプライマーのアニーリング→７２℃で１分間の合成反
応のサイクルを２５サイクル行った後、７２℃で１０分
間の伸長反応を行った。反応後、下層の反応液を５μl
取り、１. ２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジ
ウムブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅されたＤＮＡを
確認した。この結果、表３に示した７種１２菌株の病原
糸状真菌全てに３８５bpの単一のバンドを確認した。

【００１８】実施例３ 病原糸状真菌遺伝子の増幅・検出キットの作製 試料中の病原糸状真菌遺伝子を増幅・検出するためのキ
ットを作製した。ＤＮＡ増幅用プライマーとしてプライ
マー１及びプライマー２が各３０pmol／μl 溶液となる
ようにＴＥ緩衝液（１０mM Ｔｒｉｓ、 １mM ＥＤＴ
Ａ、pH８．２）４０μl に溶解し、病原糸状真菌遺伝子
増幅プライマー液（Ａ剤）とした。ＤＮＡ検出用プロー
ブとして、プローブ１の１μg をＴＥ緩衝液２０μl に
溶解し、病原真菌遺伝子検出プローブ液（Ｂ剤）とし
た。Ａ剤、Ｂ剤を１組として、病原糸状真菌遺伝子ＤＮ
Ａの増幅・検出キットとした（表４）。

【００１９】表４ Ａ剤 病原糸状真菌遺伝子増幅プライマーＡ液 ４０μ
l （２μl ×２０回分） Ｂ剤 病原糸状真菌遺伝子検出プローブＢ液 ２０μ
l （１μl ×２０回分）

【００２０】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
り、病原糸状真菌のリボソームＲＮＡ遺伝子を検出する
ことによる、試料中の病原糸状真菌の高感度検出法及び
検出キットが提供される。

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴： 1-19 E primer 配列： ACTTTCGATGGTAGGATAG 19 配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴： 1-19 E primer 配列： CAGAAGGAAAGGTCCAGCC 19 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴： 1-20 E probe 配列： CTGAGAAACGGCTACCACAT 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:67） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:80） (56)参考文献 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，36〜４！ （1992）（英）Ｐ．255−263 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡ Ｌ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，29〜11！ （1991）（米）Ｐ．2543−2549 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡ Ｌ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，30〜５！ （1992）（米）Ｐ．1210−1215

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１及び２で表される合
   成ＤＮＡプライマー対を用いて、アスペルギルス属又は
   ペニシリウム属の病原糸状真菌リボソームＲＮＡ遺伝子
   （ＤＮＡ）をＰＣＲ法により増幅させて検出することを
   特徴とするアスペルギルス属またはペニシリウム属の病
   原糸状真菌の検出方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の合成ＤＮＡプライマー
   対、及び増幅されたＤＮＡを検出するためのプローブか
   らなることを特徴とする病原糸状真菌の検出キット。