JPH0825902B2 - γ−グロブリンの加熱処理方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、γ−グロブリン含有水溶液の加熱処理方法
に関する。

更に詳しくは、γ−グロブリンに選ばれた安定化剤を
添加し、低温殺菌（60℃、10時間）した場合、重合体の
増加、抗補体価の上昇を認めない安定なγ−グロブリン
加熱処理方法に関する。

〔従来の技術〕

血漿蛋白成分である免疫グロブリンの内、特にIgGを
主成分とするγ−グロブリン製剤は、これまで広く各種
感染症の予防並びに治療に役立てられてきたが、熱安定
性に欠けること、多種ウィルス、細菌等の抗体を広く含
有している等の理由で加熱殺菌は施されていない。

しかし、γ−グロブリンを血漿蛋白の分画から得る場
合には、肝炎ウィルス等の夾雑ウィルスの混在を100％
否定することはできない。そのため、夾雑ウィルスの不
活化方法として、血液製剤化技術において広く認められ
ている60℃、10時間の加熱処理が施されていることが極
めて重要である。

しかし、通常の生理的食塩溶液等の水溶液中でこれを
行うと短時間で白濁し、大部分の活性を失い、蛋白分子
が変性してしまう。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、種々検討を重ね、γ−グロブリンを含
有する水溶液に対して、肝炎ウィルスを不活化するため
の加熱処理を行うに際して、単糖類、二糖類および糖ア
ルコールから選ばれる少なくとも一種（これらを主安定
化剤と総称する）を添加すれば加熱処理に対するγ−グ
ロブリンの熱安定性が著しく高まることを見出すと共に
上記主安定化剤に加えてさらに補助安定化剤としての界
面活性剤、所望によりさらに塩化ナトリウムを共存させ
ることによってγ−グロブリンを熱安定性がより一層高
められることを見出し、本発明を完成した。

また、本発明の方法で加熱処理することによりγ−グ
ロブリン水溶液中に含まれるγ−グロブリンの重合体を
単量体に解離させることもできる。

〔問題点を解決するための手段及び作用〕

本発明におけるγ−グロブリン含有水溶液としては、
γ−グロブリンを含む未精製な水溶液から精製された水
溶液までいかなる段階のγ−グロブリン水溶液であって
もよいが、有利には部分精製または精製段階の水溶液が
加熱処理の対象とされる。その蛋白（γ−グロブリン）
の含量は0.1〜30％（w/v）のものが好ましい。また、当
該水溶液のpHは一般にpH4.5〜10であり、好ましくは適
当な緩衝液によってpH6〜８に調整されることが好まし
い。

γ−グロブリン含有水溶液に加えられる主安定化剤に
関して、単糖類としてはグルコース、マンノース、ガラ
クトース、果糖などが、二糖類としてはショ糖、麦芽
糖、乳糖などが、糖アルコールとしてはマンニット、ソ
ルビット、キシリットなどが好適なものとして例示され
るが、これらに限定されるものではない。当該主安定化
剤の添加量は、γ−グロブリン水溶液100ml当たり10〜1
00gである。

補助安定化剤としては、塩化ナトリウムを使用する場
合には、添加量は、γ−グロブリン水溶液100ml当たり
0.1〜10gである。

界面活性剤としては、アルキルフェニルポリオキシエ
チレン（例えばトリトン登録商標〔Triton 〕及びノニ
デット登録商標〔Nonidet 〕）のような非イオン性
剤、胆汁酸塩（例えばナトリウムタウロコラート）のよ
うなアニオン性剤、又ベンズアルコニウムクロライドの
ようなカチオン性剤、プロピレンオキシドの高分子量共
重合体のような界面活性を持つ多価アルコール（プルロ
ニック登録商標〔Pluronic 〕F68）などが例示され、
その添加量は、γ−グロブリン水溶液100ml当たり0.002
〜0.05g程度が好ましい。

加熱処理は、夾雑ウィルスを不活化するに十分な温度
および時間行えばよく、たとえば50℃〜70℃、好ましく
は約60℃にて５〜20時間、好ましくは10時間行われる。

本発明の加熱効果を検討するため、γ−グロブリン製
剤に含まれる可能性が危惧される各種ウィルスの感染性
について、安定化剤の添加による加熱効果、安定化剤の
無添加による加熱効果を実験した。この実験は、γ−グ
ロブリン試料に痘瘡ウィルス、おたふくかぜウィルス、
はしかウィルス、水泡性口内炎ウィルス、チタングニア
ウィルス、ポリオウィルス、コタサツキーウィルス、エ
コーウィルスを加え、60℃で10時間の加熱処理を行い、
経時的に残存するウィルス感染性を測定したが、10時間
後には安定化剤の添加、不添加に係わらず、感染性を完
全に失っていた。この結果は用いたウィルス以外のウィ
ルスについても本発明の加熱処理が施されるならば感染
性は失活させうることを示唆するものである。

本発明は上記加熱処理を行った後、外観、性状はもと
より、重合体の定量、抗補体価の測定、麻疹抗体価の測
定および急性毒性実験を行い、γ−グロブリン製剤とし
て医療上極めて安全性の高いまた、有効性の高いものと
いえる。

かくして得られた製剤は、溶液状であり、高度精製γ
−グロブリンを出発材料とした場合はそのまま、粗製品
を用いた場合は公知の精製法に準じて処理を行った後、
必要ならば、透析、除菌濾過を行った後、包装単位に従
って500〜10,000mgのγ−グロブリンを含むように分注
される。貯蔵方法としては、高温を避ければ特に限定さ
れるものではないが、特に望ましくは、30℃以下に保存
することであるが、また、これは所望により凍結乾燥製
剤としてもよい。

当該処理を経たγ−グロブリンは、そのまま、または
自体公知の製剤化処理を行って、例えば注射用蒸留水で
希釈又は溶解して投与される。投与量は、通常、成人に
対しては１回にγ−グロブリンとして、2500〜5000mg
量、小児に対しては、１回にγ−グロブリンとして、10
0〜150mg/kg体重が使用される。

試験方法： 外観性状としては、濁りが問題となることからO.D.
₆₀₀ nmの吸光度を測定した。

重合体の定量は高速液体クロマトグラフィーで分析し
た。

抗補体価の測定は、カパットとマイヤーの方法〔エク
スペリメンタル イムノケミストリ（Experimental Imm
unochemistry）,225,（1961）〕及び西岡、岡田の方法
〔免疫の生化学,103,昭46（共立出版）〕の方法に準じ
た。すなわち、100単位の補体が試料を加えることによ
って何単位に減少するかを測定し、その減少単位を抗補
体価として表わした。

麻疹抗体価はヘマグルチネーション インヒビション
テスト（Hemagglutination Inhibition test）法によ
り測定し、国際単位（IU/150mg）で表わした。

実験例１ 本発明による安定化効果を確認するための実験を行っ
た。実験には重合体を約30％含むγ−グロブリンを５％
濃度に調整して行った。各種主安定化剤を添加後（添加
量は表中に明記）、60℃、10時間の加熱処理を行い、溶
液の濁り（O.D.₆₀₀ nm）、重合体の定量および抗補体価
を調べた。この結果、安定化剤を添加することによって
γ−グロブリンの加熱安定性は増大した（表１）。

また、重合体特に２量体の低下が確認された。

実験例２ 重合体を約20％含むγ−グロブリン溶液に各種濃度に
グルコースを添加、γ−グロブリン濃度を５％に調整し
たものにつき60℃加熱処理を行い、経時的にO.D.₆₀₀ nm
値、重合体定量、抗補体価、麻疹抗体価等の測定を行っ
た。

グルコースを含まない系は、１時間以内に白濁し、変
性していることが見られるのに対し、グルコースを加え
た系は、加えた量が増すに伴いγ−グロブリンの安定性
が高まった。100gグルコース添加の系では60℃、10時間
加熱においても全く白濁せず、麻疹抗体価の減少も見ら
れなかった。しかもダイマーもわずか10％に低下し、抗
補体価も19単位と低下した（表２）。

実験例３ 主安定化剤であるグルコースに中性アミノ酸（グリシ
ン）、中性塩（塩化ナトリウム）、有機カルボン酸塩
（クエン酸ナトリウム）、界面活性剤（プルロニック
F68）等を加え、60℃加熱処理におけるγ−グロブリン
の安定性につき調べた。実験例１と同様重合体を約15％
含むγ−グロブリン溶液で行った。

グルコース添加量をγ−グロブリン水溶液100ml当た
り75gとし、塩化ナトリウム5.8％添加、グリシン５％添
加、クエン酸ナトリウム10％添加、プルロニック F6
8、0.01％添加および塩化ナトリウム5.8％とプルロニッ
ク F68 0.01％両補助安定化剤添加の各系について60
℃加熱処理を施した。結果は表３に示す。補助安定化剤
を添加することによって重合体および抗補体価をさらに
低下させることができた。

実験例４ 安全性試験として急性毒性実験を行った。

実験例３で60℃、10時間加熱処理を施したサンプルA,
B,C,D,E,Fにつき無菌生理的食塩水で十分透析した後、
マウスの尾静脈から１匹当たり総量0.5mlおよび1.0mlを
それぞれ１群５匹に投与し、７日間観察したが、異常は
認められなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−118825（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−3721（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−139422（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｎｏｖｅｍｂｅ ｒ19，1983Ｐ．1198〜1199

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】γ−グロブリン含有水溶液に対して、単糖
   類、二糖類、糖アルコール類から選ばれた少なくとも一
   種の主安定化剤に加えて、γ−グロブリン含有水溶液10
   0ml当たり補助安定化剤として（ａ）界面活性剤を0.002
   〜0.05g、または（ｂ）界面活性剤および塩化ナトリウ
   ムをそれぞれ0.002〜0.05gおよび0.1〜10g存在下に加熱
   処理をすることを特徴とするγ−グロブリン含有水溶液
   の加熱処理方法。
2. 【請求項２】主安定化剤の添加量が、γ−グロブリン含
   有水溶液100ml当たり、10〜100gである特許請求の範囲
   第（１）項記載の加熱処理方法。
3. 【請求項３】加熱処理が、60℃、10時間処理である特許
   請求の範囲第（１）項記載の加熱処理方法。