JPH084502B2 - Compound mutation tPA - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規な複合変異tPAとその医薬組成物並びに
該変異tPAの生産に係る遺伝子組換技術に関する。さら
に詳しくはtPAを構成する領域についての欠落変異並び
にtPAのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換を複合し
ておこない，該複合変異によってtPAの医薬用途におけ
る特性を改善することを内容とする。従って本発明は医
療用医薬品の分野において利用することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (1) Field of Industrial Application The present invention relates to a novel complex mutant tPA, a pharmaceutical composition thereof, and a gene recombination technique for producing the mutant tPA. More specifically, the content of the present invention is to perform a deletion mutation in a region constituting tPA and a substitution of an amino acid in the amino acid sequence of tPA in a complex manner to improve the properties of tPA in pharmaceutical use by the combined mutation. Therefore, the present invention can be used in the field of medical drugs.
（２）従来技術 組織プラスミノーゲン活性化因子（本発明においてtP
Aと略記される）が医薬品分野において特に血栓症治療
剤として有用な物質であり，その利用をいっそう容易に
する目的で遺伝子組換技術が応用されることは一般に公
知であり，下記文献１）〜３）に示されるとおりであ
る。またtPAの生体内利用を高める目的でtPAのアミノ酸
配列に各種の構造的変異を加える試みがなされており，
この目的のために同様に遺伝子組換技術が応用されてい
ることも一般に公知であり，例えば下記文献４）〜９）
に示されるとおりである。(2) Prior art Tissue plasminogen activator (tP in the present invention
(Abbreviated as A) is a substance particularly useful as a therapeutic agent for thrombosis in the pharmaceutical field, and it is generally known that gene recombination technology is applied for the purpose of facilitating its use. ~ 3). In addition, attempts have been made to add various structural mutations to the amino acid sequence of tPA in order to enhance the bioavailability of tPA.
It is generally known that genetic recombination technology is also applied for this purpose, and for example, the following Documents 4) to 9).
As shown in.
１）欧州特許出願公開 No.0041766 A2 ２）欧州特許出願公開 No.0093619 A1 ３）ペニカ エタール.,ネイチャー301 214−221（198
3） （Pennica et al.,Nature 301 214−221（1983）） ４）エッチ．カギタニ，エタール.,フェブス レット.1
89巻,1号（1985） 145−149 （H.Kagitani, et al.,FEBS Lett. Vol.189,No.1（198
5）145−149） ５）エー．ジェー．ブイ．ゾンネベルト，エタール：プ
ロッシ．ナショル．アカド．サイ．ユーエスエー83 467
0−4674（1986） （A.J.V.Sonneveld,et.al:Proc.Natl.Acad.Sci.USA83 4
670−4674（1986）） ６）国際特許出願公開 No.8601538 ７）欧州特許出願公開 No.0155387 A2 ８）欧州特許出願公開 No.0178105 A2 ９）欧州特許出願公開 No.0199574 A こうした各種の構造的変異の中で最近特に注目されるの
はtPAのアミノ末端側にあるＨ鎖を構成する各種の領域
についての欠落変異である。すなわち下記文献10）が提
示するtPAの二次構造モデルによれば,tPAのカルボキシ
末端側にあるＬ鎖にはセリンプロテアーゼとしての活性
部位があり,tPA活性，すなわちプラスミノーゲンをプラ
スミンに転換してフィブリンを分解する活性を示し，他
方アミノ末端側にあるＨ鎖にはフィンガー領域（以下Ｆ
領域と略記する），上皮，細胞増殖因子領域（以下Ｇ領
域と略記する），クリングル１領域（以下K1領域）およ
びクリングル２領域（以下K2領域と略記する）の四つの
主要な領域がこの順序で配列しており，フィブリンへの
結合に機能していることがわかっている。Ｆ領域はフィ
ブロネクチンのフィンガー領域に似ており，フィブロネ
クチンにおけると同様にフィブリンへの結合に寄与して
いると考えられる。クリングル領域はプロトロンビン，
プラスミノーゲン，ウロキナーゼにも存在しており，フ
ィブリンへの結合に寄与しているが,tPAのK2領域はフィ
ブリンの結合に寄与するばかりでなく，フィブリンがtP
A活性を増強するのを仲介する機能をも有している。Ｇ
領域はtPAのフィブリン溶解活性にとっては必須の領域
ではなく，親水性部分が乏しいのでＧ領域自体は疎水的
である。1) European Patent Application Publication No. 0041766 A 2 2) European Patent Application Publication No. 0093619 A 1 3) Penica Ettal., Nature 301 214-221 (198)
3) (Pennica et al., Nature 301 214-221 (1983)) 4) Etch. Kagitani, Ettal., Phebs Lett. 1
Volume 89, Issue 1 (1985) 145-149 (H.Kagitani, et al., FEBS Lett. Vol.189, No.1 (198
5) 145-149) 5) A. J. buoy. Sonnebert, Ettal: Prossi. National. Acad. Rhino. USA 83 467
0-4674 (1986) (AJVSonneveld, et.al: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 4
670-4674 (1986)) 6) International Patent Publication Nanba8601538 7) European Patent Application Publication No.0155387 A 2 8) European Patent Application Publication No.0178105 A 2 9) European Patent Application Publication No.0199574 A such various Among the structural mutations of E. coli, which have recently received special attention are deletion mutations in various regions constituting the H chain on the amino terminal side of tPA. That is, according to the secondary structure model of tPA presented by Reference 10) below, the L chain on the carboxy-terminal side of tPA has an active site as a serine protease, and converts tPA activity, that is, plasminogen to plasmin. Shows the activity of degrading fibrin, while the H chain on the amino-terminal side has a finger region (hereinafter referred to as F
Area), epithelium, cell growth factor area (hereinafter abbreviated as G area), kringle 1 area (hereinafter abbreviated as K 1 area) and kringle 2 area (hereinafter abbreviated as K 2 area). They are arranged in this order and are known to function in binding to fibrin. The F region resembles the finger region of fibronectin and is considered to contribute to the binding to fibrin as in fibronectin. The kringle region is prothrombin,
It is also present in plasminogen and urokinase and contributes to the binding to fibrin. Not only does the K 2 region of tPA contribute to the binding of fibrin, but fibrin also binds to tP.
It also has a function of mediating enhancing A activity. G
The region is not essential for the fibrinolytic activity of tPA, and the G region itself is hydrophobic because the hydrophilic part is scarce.
10）ティー．ナイ，エタール.,プロン．ナショナル．ア
カド．サイ．ユーエスエー 81,5355−5359,1984（T.N
y,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,5355−5359,198
4） これら各領域を欠落あるいは増加せしめることが可能で
あれば，そうした欠落あるいは増加による変異がtPAの
生体内利用に関連する諸々の物理化学的性質に重要な影
響を及ぼすであろうことは容易に推考することができ
る。例えばＧ領域を欠落せしめて水溶性を高めるとか，
K2領域を欠落せしめてK1領域の機能を高めてみるとか，
目的に応じた各種の改良を意図することができる。前記
文献５）は各領域を単独または各種の組合せにおいて欠
落せしめるための技術並びにその結果について開示して
いる。10) Tea. Nye, Ettal., Pron. National. Acad. Rhino. USA 81, 5355-5359,1984 (TN
y, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 , 5355-5359, 198
4) If it is possible to delete or increase each of these regions, it is easy for mutations resulting from such deletions or increases to have important effects on various physicochemical properties related to bioavailability of tPA. Can be inferred. For example, to eliminate the G region to improve water solubility,
To eliminate the K 2 region and enhance the function of the K 1 region,
Various improvements can be intended depending on the purpose. The above document 5) discloses a technique for eliminating each region alone or in various combinations, and the result thereof.
他方,tPAのアミノ酸配列における構造的変異の中に糖
鎖変異を目的としたものがある。すなわちtPAは他の多
くの生理活性物質と同様に糖蛋白質であり，通常は分子
内に３本あるいは２本のアスパラギン結合型糖鎖を持っ
ている。従ってこれら糖鎖の増減変異がtPAの生体内利
用に関連する諸々の物理化学的特性に重要な影響を及ぼ
すであろうことは容易に推考することができる。例えば
アスパラギン結合型糖鎖を増加して水溶性を高めると
か，糖鎖の結合位置を変化せしめて溶解度と血中消失時
間の双方を同時に満足する最適値を求めるとか，目的に
応じた各種の改良を意図することができる。前記文献
８）は子宮由来のtPAの３本のアスパラギン結合型糖鎖
をすべて消失せしめるための技術を開示している。On the other hand, some structural mutations in the amino acid sequence of tPA are aimed at sugar chain mutations. That is, tPA is a glycoprotein like many other physiologically active substances, and usually has three or two asparagine-linked sugar chains in the molecule. Therefore, it can be easily inferred that the increase / decrease mutation of these sugar chains will have an important influence on various physicochemical properties related to the bioavailability of tPA. For example, increasing the water solubility by increasing the number of asparagine-linked sugar chains, or changing the sugar chain binding position to find the optimal value that satisfies both solubility and blood elimination time at the same time, and various improvements depending on the purpose Can be intended. The above document 8) discloses a technique for eliminating all three asparagine-linked sugar chains of uterine-derived tPA.
なお，糖蛋白質において糖鎖が蛋白質に結合する部位
についてはある種の規則性の存在することが知られてい
る。すなわち糖鎖は一般に蛋白質中のアスパラギン残基
に結合し，しかも当該アスパラギンを含むアミノ酸配列
はいわゆるAsparagine sequonと呼ばれる規則的な配列
をしており，これは例えば下記文献11）〜17）によれば
三つのアミノ酸から構成される配列，すなわちトリプレ
ットであって，具体的にはAsn−Ｘ−Thr,Asn−Ｘ−Ser
あるいはAsn−Ｘ−Cysによって示され,Xはプロリン以外
のいずれのアミノ酸でもよいことが知られている。It is known that there is a certain degree of regularity in the site where the sugar chain binds to the protein in the glycoprotein. That is, a sugar chain is generally bound to an asparagine residue in a protein, and the amino acid sequence containing the asparagine has a regular sequence called the so-called Asparagine sequon. This is, for example, according to the following references 11) to 17). A sequence composed of three amino acids, that is, a triplet, specifically, Asn-X-Thr, Asn-X-Ser
Alternatively, it is known to be represented by Asn-X-Cys, where X may be any amino acid other than proline.
11）イー．バウゼ，エ タール：フェブス レターズ,1
08巻 ２号 341〜344（1979） （E.Bause,et al.:FEBS LETTERS Vol.108,No.2 341〜34
4（1979）） 12）イー．バウゼ，エ タール：バイオケム．ジェー．
（1982）203,761〜768 （E.Bause,et al.:Biochem.J.（1982）203,761〜768） 13）イー．バウゼ：バイオケム．ジェー．（1983）209,
331〜336 （E.Bause:Biochem.J.（1983）209,331〜336） 14）アール．ディー．マーシャル：バイオケミカル ソ
サイエティー トランスアクションズ（1984）12巻 51
3〜514 （R.D.Marshall:Biochemical Society Transactions（1
984）Vol.12,513〜514） 15）イー．バウゼ：同誌（1984）12巻 514〜517 （E.Bause:ibid.（1984）Vol.12,514〜517） 16）ディー．ケー．ストラック アンド ダブル．ジェ
ー．レンナルツ イン ダブル．ジェー．レンナルツ編
ザ バイオケミストリー オブ グリコプロティン
アンド プロテオグリカンス，プレナム プレス,1980,
ニューヨーク,35〜83頁 （D.K.Struck and W.J.Lennarz in W.J.Lennarz ed.The
Biochemistry of Glycoprotein and Proteoglycans,Pl
enum Press,1980,New York,pp35〜83） 17）シー．ロニン，エタール.,フェブス レット.,96,1
79（1978） （C.Ronin,et al.,FEBS Lett.,96,179（1978）） （３）発明が解決しようとする問題点 tPAにおける糖鎖の問題については，これまでに前記
文献８）による以外には特別な開示はなされていない。
しかしながら糖鎖の問題に対してはより多くの考慮がは
らわれる必要がある。例えば前記したAsparagine sequo
nを構成するトリプレットを分子内に有しながら，ある
種のトリプレットでは当該部位に糖鎖が結合する分子と
結合しない分子が混在し，その結果生産物のロットごと
に結合糖鎖数が変動してしまうことが知られている。こ
のような結合糖鎖数の不均一性はプラスミノーゲン，セ
ルロプラスミン，プロラクチン，マウスIgM,ウシα−ラ
クトアルブミン等においてすでに観察されているが,tPA
においても同様であり，下記文献18）によれば天然tPA
のアミノ酸位置番号184〜186のトリプレットであるAsn
−Gly−Serに対する糖鎖の結合は特に不確実であり，そ
の結果結合糖鎖数の不均一を紹いている。11) E. Bauze, Ettal: Phebs Letters, 1
Volume 08 Issue 2 341-344 (1979) (E.Bause, et al .: FEBS LETTERS Vol.108, No.2 341-34)
4 (1979)) 12) E. Bauze, Etal: Biochem. J.
(1982) 203,761 to 768 (E. Bause, et al .: Biochem.J. (1982) 203,761 to 768) 13) E. Bauze: Biochem. J. (1983) 209,
331-336 (E.Bause: Biochem.J. (1983) 209,331-336) 14) Earl. Dee. Marshall: Biochemical Society Trans Actions (1984) Volume 12 51
3 to 514 (RDMarshall: Biochemical Society Transactions (1
984) Vol.12,513 ~ 514) 15) E. Bauze: The same magazine (1984), 12 volumes 514-517 (E.Bause: ibid. (1984) Vol.12,514-517) 16) D. K. Struck and double. J. Renaltz in double. J. Renarutsu Hen The Biochemistry of Glycoprotein
And Proteoglycans, Plenum Press, 1980,
New York, pp. 35-83 (DKStruck and WJLennarz in WJLennarz ed.The
Biochemistry of Glycoprotein and Proteoglycans, Pl
enum Press, 1980, New York, pp35-83) 17) See. Ronin, Ettal., Phebs Lett., 96, 1
79 (1978) (C.Ronin, et al., FEBS Lett., 96, 179 (1978)) (3) Problems to be Solved by the Invention Regarding the problem of sugar chains in tPA, the above-mentioned reference 8 ), But no special disclosure is made.
However, more consideration needs to be given to the problem of sugar chains. For example, Asparagine sequo
While having a triplet that constitutes n in the molecule, a certain type of triplet contains a mixture of molecules that bind to sugar chains and molecules that do not bind to the site, and as a result, the number of sugar chains bound varies from lot to lot of product. It is known to end up. Such heterogeneity in the number of linked sugar chains has already been observed in plasminogen, ceruloplasmin, prolactin, mouse IgM, bovine α-lactalbumin, etc.
The same is true for the case of
Is a triplet of amino acid position numbers 184 to 186 of Asn
The binding of sugar chains to -Gly-Ser is particularly uncertain, and as a result, the number of linked sugar chains is uneven.
18）グンナー ポール，エタール.,バイオケミストリ
ー，23,3701−3707（1984） （Gunnar Pohl,et al.,Biochemistry,23,3701−3707（1
984）） 特定部位に糖鎖の結合している蛋白質と結合していな
い蛋白質とを分離することはきわめて困難であるので，
実際には不均一のまま使用されることになるが，その結
果は好ましくない。例えば溶解度等の物性が糖鎖の結合
していない蛋白質の存在に応じて変化し，また非経口投
与でしばしば観察される免疫原性が変化して品質が一定
しない。すなわち天然tPAには医療用医薬品として利用
する上で重要な要件である品質についてこれが一定しな
いという欠点がある。従って特定部位への糖鎖の結合を
均一にするための特別の技術が提供される必要がある。
またtPAの糖鎖には別の角度からも考慮がはらわれなけ
ればならない。すなわちtPAの実用化にあたってはこれ
を医療用医薬品として使用する目的や程度に応じてその
血栓溶解活性を変化させ，あるいは溶解度や血中半減期
を調整することが望まれる。この目的を達成するための
手段として糖鎖の結合数を増減したり結合部位を変化せ
しめることができるならば，それが好ましい。この角度
から糖鎖変異にはいっそうの考慮がはらわれる必要があ
る。18) Gunnar Paul, Ettal., Biochemistry, 23, 3701-3707 (1984) ( Gunnar Pohl, et al., Biochemistry, 23, 3701-3707 (1
984)) It is extremely difficult to separate a protein with a sugar chain bound to a specific site from a protein with no sugar chain bound.
In practice, it will be used without uniformity, but the result is not desirable. For example, the physical properties such as solubility change depending on the presence of a protein to which a sugar chain is not bound, and the immunogenicity often observed in parenteral administration changes, resulting in inconsistent quality. In other words, natural tPA has the drawback that this is not constant regarding quality, which is an important requirement for use as a prescription drug. Therefore, it is necessary to provide a special technique for uniform binding of sugar chains to specific sites.
In addition, the sugar chain of tPA must be considered from another angle. That is, in the practical application of tPA, it is desired to change its thrombolytic activity or adjust its solubility and blood half-life depending on the purpose and degree of its use as a medical drug. As a means for achieving this purpose, it is preferable if the number of sugar chain bonds can be increased or decreased or the binding site can be changed. From this angle, further consideration needs to be given to sugar chain mutations.
他方tPAのＨ鎖を構成する各領域については多数の文
献がある。しかし領域の欠落変異の問題については，最
近特に注目されようとしているにもかかわらず，これま
でに前記文献４）,5）による以外には特別な開示がなさ
れていない。しかしながら領域の欠落変異の問題に対し
ては多くの考慮がはらわれる必要がある。領域の欠落変
異で特に期待される効果は生体内におけるtpAの半減期
の改善である。ヒトの生体内におけるtpAの半減期は３
分程度であり，注射投与された場合には肝臓で急速に代
謝され，大部分が30分以内に低分子量化することが知ら
れている。そこで冠動脈に生成した血栓を溶解するため
には多量のtPAが必要となるが，これは逆にフィブリノ
ーゲンの過剰分解を招くことになる。こうした実情にか
んがみ臨床応用の面からフィブリン溶解作用に積極的な
役割を演ずるとはみられない部分はtPAから欠落せし
め，その結果としてフィブリン結合能の増強した，かつ
体内半減期の延長した変異tPAが提供されるのが望まれ
るのである。つまりtPAの活性部位はtPAの生理条件下で
急速に代謝される部位に直接的には関連しないので，急
速に代謝される部位に相当する領域の除去が体内半減期
の延長をもたらすと考えられるのである。領域の欠落変
異でさらに期待されるのは水溶性の増加や比活性の向上
であり，それによって臨床的な必要用量を減らすことが
できると予想されている。このように領域の欠落変異に
は多数の重要な課題が含まれているのであるが，いまだ
に十分な開示がなされていない。特にここで強調されな
くてはならないことは領域の欠落変異はtPAにおける他
の構造的変異と無関係ではないという点である。例えば
文献４）,5）においては領域の欠落変異とその影響につ
いてそれらがあたかも独立した現象であるかのように考
察されているが，実際には他の変異と相互に関連してい
ることは容易に想像できる。特に糖鎖との関連は明瞭で
ある。例えばK1領域やK2領域が欠落すればこれらの領域
に結合していた糖鎖も同時に失なわれるので，これらの
糖鎖が水溶性や血中半減期に対してもともと有していた
効果は消失することになる。つまり領域の欠落変異はそ
れ独自に効果にとどまるのではなく，他のさまざまな変
異効果をも巻き込んで，全体としてまったく予期するこ
とのできなかった効果を招くものであると考えなくては
ならない。しかしながら領域の欠落変異がもたらす総合
的効果についてはいまだになんらの検討も加えられてい
ないのが実情である。On the other hand, there are many documents about each region constituting the H chain of tPA. However, regarding the problem of region deletion mutation, no particular disclosure has been made so far except by the above-mentioned documents 4) and 5), although attention has recently been paid to it. However, much consideration needs to be given to the problem of region deletion mutations. A particularly expected effect of the region deletion mutation is the improvement of the half-life of tpA in vivo. The half-life of tpA in human body is 3
It is known that when administered by injection, it is rapidly metabolized in the liver, and most of it is reduced in molecular weight within 30 minutes. Therefore, a large amount of tPA is required to dissolve the thrombus formed in the coronary arteries, which, on the contrary, leads to excessive degradation of fibrinogen. In view of these circumstances, the part that does not seem to play an active role in fibrinolytic action from the viewpoint of clinical application was deleted from tPA, and as a result, mutant tPA with enhanced fibrin-binding ability and extended half-life in the body was deleted. Is desired to be provided. In other words, since the active site of tPA is not directly related to the site of tPA that is rapidly metabolized under physiological conditions, removal of the region corresponding to the rapidly metabolized site may lead to an increase in half-life in the body. Of. Further expected in region deletion mutations are increased water solubility and improved specific activity, which are expected to reduce the clinically required dose. Thus, region deletion mutations have many important problems, but they have not been sufficiently disclosed. It should be emphasized in particular here that the deletion mutations in the region are not related to other structural mutations in tPA. For example, in References 4) and 5), deletion mutations in regions and their effects are considered as if they were independent phenomena, but in reality, they may be correlated with other mutations. You can easily imagine. Especially, the relationship with sugar chains is clear. For example, if the K 1 and K 2 regions are deleted, the sugar chains bound to these regions are also lost at the same time, so the effects that these sugar chains originally had on water solubility and half-life in blood Will disappear. In other words, it is necessary to consider that the deletion mutation of the region is not limited to the effect by itself, but also involves various other mutation effects, resulting in an unexpected effect as a whole. However, no consideration has been given to the overall effect of region deletion mutations.
前記したごとく糖鎖変異にはそれ独自においても特別
の考慮がはらわれる必要がある。従ってこれが領域の欠
落変異と同時に生起した場合にはいっそう重要な課題が
提示されることになり，十分な検討が加えられなければ
ならない。この検討のためには領域の欠落変異した各種
のtPAが用意され，さらに該変異tPAに結合する糖鎖につ
いてその結合数を増減したり結合部位を変化せしめたり
するための特別の技術が提供される必要がある。As described above, the sugar chain mutation needs to be given special consideration by itself. Therefore, if this occurs at the same time as the deletion mutation in the region, an even more important issue will be presented and thorough consideration must be given. For this study, various tPA mutants lacking the region were prepared, and a special technique for increasing or decreasing the number of sugar chains binding to the mutant tPA or changing the binding site was provided. Need to
医療用医薬品として使用する目的や程度に応じてtPA
の活性および物性を適宜に調節するための手段として本
発明者はかねてより領域の欠落変異と糖鎖変異を同時に
生起せしめる技術に注目してきた。TPA depending on the purpose and degree of use as a prescription drug
As a means for appropriately controlling the activity and physical properties of the enzyme, the present inventor has long been paying attention to a technique for simultaneously causing a deletion mutation in a region and a sugar chain mutation.
以上によって示されるとおり，本発明が解決しようと
する問題点はtPAにおける領域の欠落変異と糖鎖変異を
任意に同時に生起せしめ，医療用医薬品としての使用を
いっそう容易にするための技術改良を提供することであ
る。As shown by the above, the problem to be solved by the present invention is to provide a technical improvement for causing the deletion mutation of the region in tPA and the mutation of the sugar chain at the same time, and further facilitating the use as a medical drug. It is to be.
（４）問題点を解決するための手段 本発明者は前記問題点に対し種々の検討を行い，その
結果，下記ａ）〜ｇ）のいずれかによって解決されるこ
とを知り，本発明を完成するに至った。(4) Means for Solving the Problems The present inventor has conducted various studies on the above problems, and as a result, has found that the problems can be solved by any of the following a) to g) and completed the present invention. Came to do.
ａ）天然tPAのＦ領域およびＧ領域を欠落し，かつ天然t
PAのアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186番のSerをそ
れぞれSerおよびThrに置換する ｂ）天然tPAのＦ領域およびＧ領域を欠落し，かつ天然t
PAのアミノ酸位置番号119番のSerをMetに置換する ｃ）天然tPAのＧ領域を欠落し，かつ天然tPAのアミノ酸
位置番号183番のGlyおよび186番のSerをそれぞれSerお
よびThrに置換する ｄ）天然tPAのＧ領域を欠落し，かつ天然tPAのアミノ酸
位置番号119番のSerをMetに置換する ｅ）天然tPAのＦ領域,G領域およびK2領域を欠落し，か
つ天然tPAのアミノ酸位置番号119番のSerをMetに置換す
る ｆ）天然tPAのＦ領域,G領域およびK2領域を欠落し，か
つ天然tPAのアミノ酸位置番号96のGln,98番のIleおよび
119番のSerをそれぞれAsn,ThrおよびMetに置換する ｇ）天然tPAのＦ領域,G領域およびK1領域を欠落し，か
つ天然tPAのアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186番の
SerをそれぞれSerおよびThrに置換する すなわち本発明は上記によって示されるとおりの領域
の欠落変異およびアミノ酸の置換を分子中に併有するこ
とを特徴とする複合変異tPAを要旨とするものである。a) lacking the F and G regions of native tPA and
Substitute Gly at amino acid position 183 of Ser and Ser at position 186 of PA with Ser and Thr, respectively. B) The F region and G region of natural tPA are deleted, and the natural t
Substitution of Ser at amino acid position 119 of PA with Met c) Deletion of G region of natural tPA and substitution of Gly at amino acid position 183 and Ser of amino acid position 186 of natural tPA with Ser and Thr, respectively d ) The G region of natural tPA is deleted and Ser at amino acid position number 119 of natural tPA is replaced with Met. E) The F region, G region and K 2 region of natural tPA are deleted and the amino acid position of natural tPA. Substituting Ser for Met No. 119 with Met f) Lacking the F region, G region and K 2 region of natural tPA, and Gln at amino acid position 96 of the natural tPA, Ile at 98 and
Substituting Ser at position 119 with Asn, Thr and Met respectively g) The F region, G region and K 1 region of natural tPA are deleted, and the amino acid positions of position 183 Gly and 186 of natural tPA are deleted.
Substituting Ser for Ser and Thr, respectively, that is, the present invention provides a compound mutant tPA characterized in that a deletion mutation in a region and an amino acid substitution as described above are combined in a molecule.
以下に本発明を定義，構成，方法の項に分けて説明す
る。The present invention will be described below in terms of definitions, configurations and methods.
定義 本発明において天然tPAとはヒトメラノーマ細胞のmRN
Aから転写して得られるcDNA（原cDNAと呼ぶことにす
る）並びに該cDNAに該cDNAがコードするアミノ酸配列に
変異が起らない範囲内の人工的変異が加えられたcDNA
（類似cDNAと呼ぶことにする）がコードするアミノ酸配
列を有するtPA活性ペプチドを言う。このアミノ酸配列
および該配列における各アミノ酸のアミノ酸位置番号は
ペニカらによってすでに文献３）に詳細に開示されてお
り，本発明における天然tPAのアミノ酸配列および各ア
ミノ酸のアミノ酸位置番号は同文献のFig3に記載される
配列および位置番号によって特定される。Definition In the present invention, natural tPA is mRN of human melanoma cells.
A cDNA obtained by transcription from A (to be referred to as an original cDNA) and a cDNA obtained by adding an artificial mutation within the range in which the amino acid sequence encoded by the cDNA does not cause mutation.
It refers to a tPA active peptide having an amino acid sequence encoded by (to be referred to as similar cDNA). This amino acid sequence and the amino acid position number of each amino acid in the sequence have already been disclosed in detail in Reference 3) by Penica et al., And the amino acid sequence of natural tPA and the amino acid position number of each amino acid in the present invention are shown in Fig. 3 of the reference. It is identified by the sequence and position number listed.
変異tPAとは原cDNAまたは類似cDNAにこれらcDNAがコ
ードするアミノ酸配列に変異が起る特別の人工的変異が
加えられたcDNA（変異cDNAと呼ぶことにする）がコード
するアミノ酸配列を有するtPA活性ペプチドであると定
義される。ここで特別な人工的変異とは遺伝子組換操
作，例えばZoller and Smithの部位特異的変異誘発を利
用してcDNAの核酸塩基配列に部分的な欠落，附加，変換
が加えられることを言う。従って変異tPAのアミノ酸配
列は天然tPAのアミノ酸配列が部分的に欠落，附加，変
換したものであると言うことができる。アミノ酸配列に
おける領域の欠落によって得られる変異tPAを特に欠落
変異tPAと，またアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換
によって得られる変異tPAを特に置換変異tPAとそれぞれ
その必要があるときには呼ぶことにする。また天然tPA
の同一のアミノ酸配列に異なる二種類の変異が複合して
加えられた場合，例えば領域の欠落とアミノ酸の置換が
同時に加えられた場合には，得られる変異tPAは例えば
欠落変異tPAであると同時に変換変異tPAでもあるので，
この多面的な変異を特に強調する必要があるときに複合
変異tPAと呼ぶことにする。What is mutant tPA? TPA activity that has an amino acid sequence encoded by a cDNA in which a special artificial mutation that causes mutation in the amino acid sequence encoded by these cDNAs is added to the original cDNA or similar cDNA (referred to as mutant cDNA). Defined to be a peptide. Here, the special artificial mutation means that partial deletion, addition, or conversion is added to the nucleobase sequence of cDNA by utilizing a gene recombination operation, for example, Zoller and Smith site-directed mutagenesis. Therefore, it can be said that the amino acid sequence of mutant tPA is a partial deletion, addition, or conversion of the amino acid sequence of natural tPA. A mutant tPA obtained by deletion of a region in an amino acid sequence will be specifically referred to as a deletion mutant tPA, and a mutant tPA obtained by substitution of an amino acid in an amino acid sequence will be particularly referred to as a substitution mutation tPA, when necessary. Also natural tPA
When two different mutations are added to the same amino acid sequence in a complex manner, for example, when the deletion of the region and the substitution of the amino acid are added at the same time, the obtained mutant tPA is, for example, a deletion mutant tPA and Since it is also a conversion mutation tPA,
When this pleiotropic mutation needs to be particularly emphasized, it will be referred to as a composite mutant tPA.
本発明において変異の語が各種の局面において各種の
意味で使用されているが，混乱を避けるために議論され
る局面に応じて区別して使用される必要があり，例えば
核酸塩基配列に部分的な欠落，附加，変換があった場合
にはcDNAの核酸塩基配列変異であり，アミノ酸配列に部
分的な欠落，附加，変換があった場合にはアミノ酸配列
の配列変異であり，結合糖鎖に欠落，附加，変換があっ
た場合には糖鎖の結合変異であるとそれぞれ区別され
る。本発明に係る変異tPAは当該変異の結果として二次
的に糖鎖変異を伴なっている。従って単にアミノ酸配列
における変異のみを問題として議論する場合に該変異tP
Aを単に変異tPAと呼び，糖鎖変異にまで着目し，糖鎖変
異を伴う変異tPAを指称する場合には特に糖鎖変異tPAの
語をもって区別することにする。In the present invention, the term “mutation” is used in various aspects in various meanings, but it is necessary to distinguish them according to the aspects discussed in order to avoid confusion. If there is a deletion, addition, or conversion, it is a nucleobase sequence mutation of the cDNA, and if there is a partial deletion, addition, or conversion in the amino acid sequence, it is a sequence mutation of the amino acid sequence, and the sugar chain is missing. , Addition and conversion are distinguished as sugar chain binding mutations. The mutant tPA according to the present invention is secondarily accompanied by sugar chain mutation as a result of the mutation. Therefore, when discussing only the mutation in the amino acid sequence as a problem, the mutation tP
A is simply referred to as a mutant tPA, and attention is paid to sugar chain mutations, and when a mutant tPA accompanied by a sugar chain mutation is referred to, the term “glycan mutation tPA” will be used to make a distinction.
本発明において領域とは天然tPAのＨ鎖を構成する各
領域を言い，具体的にはＦ領域,G領域，K1領域，K2領域
の四つの領域である。Ｈ鎖における位置関係はアミノ酸
末端側からＦ領域,G領域，K1領域，K2領域の順序である
が，各領域の区分を厳密に特定することはできない。天
然tPAのアミノ酸配列におけるアミノ酸位置番号および
該番号のアミノ酸をもって各領域の標準的な範囲を示せ
ば,F領域は４番Valから50番Ser,G領域は51番Cysから86
番Ile,K1領域は87番Aspから174番Ser,K2領域は175番号G
luから262番Serである。しかしながらここに示した範囲
は各領域の位置と範囲についての単なる中心的例示にす
ぎず，本発明における各領域の範囲を限定するものでは
ない。各領域の範囲については上記例示範囲を中心にし
て，該当する領域の性質と機能がいちじるしく失なわれ
ない範囲内の変動を含めた自由な解釈がなされるべきで
ある。従って例えばＦ領域が１番Serから48番Valとかあ
るいはK1領域が90番Alaから179番Aspとかのごとくに各
領域をその本質的概念が損なわれない範囲内で適宜に指
定すればよい。In the present invention, the term “region” means each region constituting the H chain of natural tPA, and is specifically four regions of F region, G region, K 1 region and K 2 region. The positional relationship in the H chain is in the order of F region, G region, K 1 region, and K 2 region from the amino acid terminal side, but the division of each region cannot be specified exactly. If the standard range of each region is indicated by the amino acid position number in the amino acid sequence of natural tPA and the amino acid of that number, the F region is from Val 4 to 50 Ser, and the G region is 51 to Cys 86.
Ile, K 1 area is 87 Asp to 174 Ser, K 2 area is 175 number G
It is 262 Ser from lu. However, the range shown here is merely a central example of the position and range of each region, and does not limit the range of each region in the present invention. The range of each area should be freely interpreted around the above-mentioned example range, including fluctuations within the range in which the properties and functions of the corresponding area are not significantly lost. Therefore, each region may be appropriately designated as long as the essential concept is not impaired, for example, the F region is Ser to 48 Val and the K 1 region is 90 Ala to 179 Asp.
領域の欠落とは該領域の指定された範囲のアミノ酸配
列が除去され，該アミノ酸配列の直前のアミノ酸と直後
のアミノ酸とがペプチド結合によって新たに連接するこ
とを言う。例えばＧ領域として50番Serから87番Aspのア
ミノ酸配列が指定されたＧ領域の欠落とは該アミノ酸配
列が除去され,49番Lysと88番Thrとが連接されることを
言う。同様にＦ領域として４番Valから50番Ser,G領域と
して51番Cysから86番Ile,K2領域として175番号Gluから2
62番Serの各アミノ酸配列が指定された場合に,F領域,G
領域およびK2領域の欠落とは各アミノ酸配列が除去さ
れ,3番Glnと87番Aspとが連接されかつ174番Serと263番T
hrとが連接されることを言う。The lack of a region means that the amino acid sequence in the designated range of the region is removed, and the amino acid immediately before the amino acid sequence and the amino acid immediately after the amino acid sequence are newly connected by a peptide bond. For example, the lack of the G region in which the amino acid sequence from Ser 50 to Ser 87 is designated as the G region means that the amino acid sequence is removed and Lys 49th and Thr 88th are concatenated. In the same manner, F region from 4 Val to 50 Ser, G region from 51 Cys to 86 Ile, K 2 region from 175 number Glu to 2
If each amino acid sequence of Ser No. 62 is specified, F region, G
Region and K 2 region deletion means that each amino acid sequence is removed, Gln 3 and Asp 87 are concatenated, and Ser 174 and T 263
It means that hr is connected.
領域の欠落変異で特に注意しなければならない点はア
ミノ酸位置番号の変化である。すなわち領域が欠落する
と該領域の後方の領域におけるアミノ酸配列のアミノ酸
位置番号は欠落したアミノ酸配列のアミノ酸の数だけ繰
上がった数になる。しかしこの繰上がる数は欠落領域と
して指定されたアミノ酸配列の範囲および欠落領域の組
合せに応じて多様に変化するので，同一のアミノ酸であ
りながら多数のアミノ酸位置番号を持つという複雑な結
果となる。例えば天然tPAのアミノ酸配列におけるアミ
ノ酸位置番号186番のSerは,G領域として指定された51番
Cysから86番Ileのアミノ酸配列が欠落した場合およびK1
領域として指定された87番Aspから174番Serのアミノ酸
配列が欠落した場合にはそれぞれ150番および98番のア
ミノ酸となる。つまり同一のアミノ酸に複数の位置番号
が与えられ，混乱を招きやすい。そこで本発明では指定
されたアミノ酸配列が欠落により除去され，その結果該
当するアミノ酸が存在しなくても，該配列のアミノ酸位
置番号は失なわれることなくそのまま残すことにする。
従っていかなる欠落変異が生起しても，変異tPA中の同
一のアミノ酸は常に天然tPAのアミノ酸配列における唯
一のアミノ酸位置番号によって表示されることになる。Of particular note in region deletion mutations are changes in amino acid position numbers. That is, when a region is deleted, the amino acid position number of the amino acid sequence in the region behind the region becomes a number carried up by the number of amino acids in the deleted amino acid sequence. However, this carry number varies in various ways depending on the range of the amino acid sequence designated as the missing region and the combination of the missing regions, resulting in a complicated result of having many amino acid position numbers even though they are the same amino acid. For example, Ser at amino acid position number 186 in the amino acid sequence of natural tPA is the 51st amino acid designated as the G region.
When the amino acid sequence of No. 86 Ile is missing from Cys and K 1
When the amino acid sequence of Ser No. 174 to Ser No. 174 designated as a region is deleted, the amino acids are 150th and 98th amino acids, respectively. That is, multiple position numbers are assigned to the same amino acid, which is likely to cause confusion. Therefore, in the present invention, the specified amino acid sequence is removed by deletion, and even if the corresponding amino acid does not exist as a result, the amino acid position number of the sequence is not lost and is left as it is.
Therefore, no matter which deletion mutation occurs, the same amino acid in the mutant tPA is always represented by the unique amino acid position number in the amino acid sequence of natural tPA.
一個の独立した分子として表わされる核酸塩基配列上
あるいはアミノ酸配列上に相互に異なる二以上の変異が
同時に生起するとき，全体としての変異はこれら二以上
の変異が複合した複合変異であると定義する。本発明に
おいては一個の独立した分子として表わされる天然tPA
のアミノ酸配列上に領域の欠落変異およびアミノ酸の置
換変異が同時に生起し，全体としての変異はこれら二つ
の変異が複合した複合変異として示される。When two or more mutations that are different from each other occur simultaneously on the nucleobase sequence or amino acid sequence represented as one independent molecule, the overall mutation is defined as a complex mutation that combines these two or more mutations. . In the present invention, natural tPA represented as one independent molecule
Region deletion mutations and amino acid substitution mutations occur simultaneously on the amino acid sequence of, and the overall mutation is shown as a composite mutation in which these two mutations are combined.
構成 本発明の構成上の特徴は次の二点に示される。Structure The structural features of the present invention are shown in the following two points.
第１点は本発明の目的物質は領域の欠落変異およびア
ミノ酸の置換変異を併有する複合変異tPAである。とこ
ろで該複合変異tPAは複合変異の結果として結合糖鎖に
おける変異を受ける。すなわち該複合変異tPAをコード
するcDNAを含む発現プラスミドで宿主を形質転換し，こ
れを培養して得られる生産物は糖鎖変異のある複合変異
tPAである。The first point is that the target substance of the present invention is a complex mutant tPA having both a region deletion mutation and an amino acid substitution mutation. By the way, the complex mutant tPA undergoes mutation in the binding sugar chain as a result of the complex mutation. That is, a product obtained by transforming a host with an expression plasmid containing the cDNA encoding the complex mutant tPA and culturing the same is a complex mutation having a sugar chain mutation.
It is tPA.
第２点は第１点における領域の欠落変異とアミノ酸の
置換変異の特定に関するものであり，具体的には，次の
ａ）〜ｇ）である。The second point relates to the identification of the deletion mutation of the region and the substitution mutation of the amino acid at the first point, and specifically, the following a) to g).
ａ）天然tPAのＦ領域およびＧ領域を欠落し，かつ天然t
PAのアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186番のSerがそ
れぞれSerおよびThrに置換される ｂ）天然tPAのＦ領域およびＧ領域が欠落し，かつ天然t
PAのアミノ酸位置番号119番のSerがMetに置換される。a) lacking the F and G regions of native tPA and
Gly at PA amino acid position 183 and Ser at position 186 are replaced by Ser and Thr, respectively. B) Natural tPA F and G regions are deleted, and natural t
Ser at amino acid position 119 of PA is replaced with Met.
ｃ）天然tPAのＧ領域を欠落し，かつ天然tPAのアミノ酸
位置番号183番のGlyおよび186番のSerがそれぞれSerお
よびThrに置換される。c) The G region of natural tPA is deleted, and Gly at amino acid position number 183 and Ser at amino acid position number 186 of natural tPA are replaced with Ser and Thr, respectively.
ｄ）天然tPAのＧ領域を欠落し，かつ天然tPAのアミノ酸
位置番号119番のSerがMetに置換される。d) The G region of natural tPA is deleted, and Ser at amino acid position 119 of natural tPA is replaced with Met.
ｅ）天然tPAのＦ領域,G領域およびK2領域が欠落し，か
つ天然tPAのアミノ酸位置番号119番のSerがMetに置換さ
れる。e) The F region, G region, and K 2 region of natural tPA are deleted, and Ser at amino acid position 119 of natural tPA is replaced with Met.
ｆ）天然tPAのＦ領域,G領域およびK2領域が欠落し，か
つ天然tPAのアミノ酸位置番号96番のGln,98番のIleおよ
び119番のSerをそれぞれAsn,ThrおよびMetに置換され
る。f) The F region, G region and K 2 region of natural tPA are deleted, and Gln at amino acid position 96, Ile at 98 and Ser at 119 of natural tPA are replaced with Asn, Thr and Met, respectively. .
ｇ）天然tPAのＦ領域,G領域およびK1領域が欠落し，か
つ天然tPAのアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186番の
SerがそれぞれSerおよびThrに置換される。g) The F region, G region, and K 1 region of natural tPA are deleted, and amino acid positions 183 and 186 of natural tPA Gly and 186 of natural tPA are deleted.
Ser is replaced by Ser and Thr, respectively.
上記のアミノ酸の置換においてアミノ酸位置番号183
番のGlyおよび186番のSerがそれぞれSerおよびThrに置
換された場合には同185番のAsnに結合する糖鎖の結合が
均一化し，常に一定品質の生産物が得られる。またアミ
ノ酸位置番号119番のSerがMetに置換された場合には同1
17番のAsnに結合する糖鎖が消失し，またアミノ酸位置
番号96番のGln,98番のIle,119番のSerをそれぞれAsn,Th
r,Metに置換した場合には同117番のAsnに結合する糖鎖
が消失し，代わりに同96番に新たに糖鎖が結合して，そ
れぞれ血中半減期の長い生産物が得られる。In the above amino acid substitutions, amino acid position number 183
When Gly of No. 186 and Ser of No. 186 are replaced with Ser and Thr, respectively, the glycan binding to Asn of No. 185 becomes uniform and a product of constant quality is always obtained. When Ser at amino acid position 119 is replaced with Met,
The sugar chain that binds to Asn at position 17 disappeared, and Gln at amino acid position 96, Ile at position 98, and Ser at position 119 were replaced with Asn and Th
When substituted with r and Met, the sugar chain that binds to Asn at No. 117 disappears, and a new sugar chain at No. 96 instead replaces a product with a long blood half-life, respectively. .
次に本発明の最終目的物質は遺伝子組換技術によって
生産することができる。従って本発明複合変異tPAをコ
ードするcDNA,該cDNAを外来遺伝子として含み，かつ選
択した宿主内で制禦および発現が可能となるように連結
して得られた発現プラスミドは本発明最終目的物質の生
産のために必要な中間物質であり，同一の問題点を解決
する意味において発明としては供に一体となるべきもの
である。発現プラスミドの具体例としてZem99−2660,同
−2663,同−2460,同−2463,同−2760,同−2810,同−282
0によって識別表示されるプラスミドをあげることがで
き，これらはいずれもそれぞれ後記実施例において示さ
れる。また発現プラスミドによって形質転換された宿主
もcDNAおよび発現プラスミドと同様に発明としては共に
一体となるべきものであり、宿主としては大腸菌や動物
細胞，とりわけBHK細胞が使用される。形質転換した大
腸菌の例としてEscherichia coli RR1−Zem99−2660,同
−2663,同−2460,同−2463,同−2760,同−2810,同−282
0によって識別表示される大腸菌をあげることができ，
これらはいずれもそれぞれ後記実施例において示され，
かつそれぞれの表示をもって微工研に寄託されている。Next, the final substance of the present invention can be produced by a gene recombination technique. Therefore, a cDNA encoding the complex mutant tPA of the present invention, an expression plasmid containing the cDNA as a foreign gene and ligated so that it can be restrained and expressed in a selected host is the final target substance of the present invention. It is an intermediate substance necessary for production and should be united together as an invention in the sense of solving the same problems. Specific examples of expression plasmids include Zem99-2660, same-2663, same-2460, same-2462, same-2760, same-2810, same-282.
The plasmids identified by 0 can be mentioned, and each of them is shown in the Examples below. Also, the host transformed with the expression plasmid should be integrated together as an invention like the cDNA and the expression plasmid, and Escherichia coli or animal cells, especially BHK cells are used as the host. Examples of transformed E. coli include Escherichia coli RR1-Zem99-2660, -2663, -2460, -2463, -2760, -2810, -282.
E. coli identified by 0 can be mentioned,
Each of these is shown in the examples below,
In addition, it has been deposited with the Institute of Micro-Mechanics with each display.
最終目的物質である本発明複合変異tPAは天然tPAが変
異したものであるにもかかわらず，後記実験例によって
示されるごとく天然tPAの活性，すなわち血栓溶解活性
を天然tPAと同程度に有している。従って天然tPAが医薬
組成物の必須の有効成分となって，その活性を利用する
医療目的に提供されるのと同様に，本発明複合変異tPA
もその活性を利用する治療目的のための医薬組成物の必
須の有効成分となることができる。とりわけ各種の血栓
症治療剤となることができるのは後記実験例より明らか
である。同じく後記実験例によって示されるごとく，本
発明複合変異tPAの血中濃度は天然tPAのそれに比べて10
〜20倍大きい。この点を考慮すると本発明複合変異tPA
は天然tPAよりも優れた血栓症治療剤となることが知ら
れる。すなわち天然tPAの一日当りの用量はその急速な
血中消失を配慮して30mg〜150mg/人であるとみられるの
に対し，本発明複合変異tPAのそれは1.5mg〜15mgで十分
であることが知られる。もちろん本発明は当該範囲に限
定されるものではなく，一日用量は症状に応じて適宜に
増減すればよいが，本発明によってはるかに改良された
医薬組成物，とりわけ血栓症治療剤が提供されることは
明らかである。Although the complex mutant tPA of the present invention, which is the final target substance, is a mutant of natural tPA, it has the activity of natural tPA, that is, thrombolytic activity, to the same extent as that of natural tPA, as shown in the experimental examples below. There is. Therefore, in the same way that natural tPA becomes an essential active ingredient of a pharmaceutical composition and is provided for medical purposes utilizing its activity, the complex mutant tPA of the present invention is also provided.
It can also be an essential active ingredient of a pharmaceutical composition for therapeutic purposes utilizing its activity. Especially, it can be used as a therapeutic agent for various thrombosis, as will be apparent from the experimental examples described below. Similarly, as shown by the experimental examples described below, the blood concentration of the complex mutant tPA of the present invention was 10% lower than that of natural tPA.
~ 20 times bigger. Considering this point, the complex mutant tPA of the present invention
Is known to be a better thrombosis therapeutic agent than natural tPA. That is, the daily dose of natural tPA is considered to be 30 mg to 150 mg / person in consideration of its rapid elimination in blood, whereas that of the complex mutant tPA of the present invention is 1.5 mg to 15 mg. To be Of course, the present invention is not limited to this range, and the daily dose may be appropriately increased or decreased according to the symptom, but the present invention provides a much improved pharmaceutical composition, especially a therapeutic agent for thrombosis. It is clear that
この場合に該医薬組成物は主として注射剤であり，静
脈内投与される。注射剤として製造されるためには，微
量生理活性物質を注射剤とするときの常法に従っておこ
なえばよい。従って例えば本発明複合変異tPAを単独あ
るいは適当な賦形剤，溶解剤と供に水溶液とし，無菌
過して充填し，凍結乾燥し，他方溶解用水溶液を添付し
て用時溶解型注射剤とすればよい。In this case, the pharmaceutical composition is mainly an injection and is administered intravenously. In order to produce it as an injection, it may be carried out according to a conventional method for producing a trace amount of physiologically active substance as an injection. Therefore, for example, the composite mutant tPA of the present invention is used alone or as an aqueous solution together with an appropriate excipient and a solubilizing agent, and is sterilized and filled, and lyophilized. do it.
方法 本発明物質の製造方法および評価方法について説明す
る。Method The production method and evaluation method of the substance of the present invention will be described.
まず本発明物質を製造するために必要な天然tPAをコ
ードするcDNA（原cDNAまたは類似cDNA）を含むクローン
はボウズメラノーマ細胞のmRNAを出発物質としてすでに
数種のものが作製されているので，該cDNAを外来遺伝子
として含むプラスミドで形質転換した適当な株を入手
し，プラスミドを単離して使用すればよい。例えばpDR1
496（ATCC20728）,pDR1296（ATCC53347）等である。あ
るいはさらにこれらのプラスミドからtPAのコード部分
をとり出し，適当なプロモータおよびターミネータを連
結して得られる発現プラスミドを用意し，これを使用し
てもよい。例えば下記文献19）によって示されるMThGH1
11およびMThGH112からメタロチオネインプロモータ（MT
−１プロモータと略記する）およびヒト成長ホルモンタ
ーミネータ（hGHターミネータと略記する）を得て，こ
れらにtPAコード部分を連結して発現プラスミドを用意
し，使用すればよい。First, since several clones containing cDNA (original cDNA or similar cDNA) encoding natural tPA necessary for producing the substance of the present invention have already been prepared starting from the mRNA of bowel melanoma cells, A suitable strain transformed with a plasmid containing cDNA as a foreign gene may be obtained, and the plasmid may be isolated and used. For example pDR1
496 (ATCC20728), pDR1296 (ATCC53347) and the like. Alternatively, an expression plasmid obtained by further extracting the tPA coding portion from these plasmids and ligating an appropriate promoter and terminator may be used. For example, MThGH1 shown by the following reference 19)
11 and MThGH112 to metallothionein promoter (MT
-1 promoter) and a human growth hormone terminator (abbreviated as hGH terminator), and the tPA coding portion is ligated to these to prepare and use an expression plasmid.
19）パルミター，エタール.,サイエンス 222 809−81
4,1983 （Palmiter,et al.,Science 222 809−814,1983） 一例を示せば次のごとくである。まずMThGH111よりMT−
１プロモータを含むKpn I−Bam H I断片を単離し，プラ
スミドpUC18に挿入した後,MT−１プロモータを含むBamH
I−Sal I断片を用意する。他方MThGH112よりMT−１プ
ロモータおよびhGHターミネータを含むEcoR I断片を単
離し，プラスミドpUC13に挿入した後,hGHターミネータ
を含むBgl II−Sal I断片を用意する。19) Palmiter, Ettal., Science 222 809-81.
4,1983 (Palmiter, et al., Science 222 809-814, 1983) An example is as follows. First, MT− from MThGH111
The Kpn I-Bam HI fragment containing the 1 promoter was isolated and inserted into the plasmid pUC18, and then the BamH containing the MT-1 promoter was isolated.
Prepare the I-Sal I fragment. On the other hand, an EcoRI fragment containing the MT-1 promoter and hGH terminator is isolated from MThGH112, inserted into plasmid pUC13, and then a BglII-SalI fragment containing the hGH terminator is prepared.
以上の二つの断片とtPAのpre−pro部分をコードするB
amH I−Xho II断片とを結合し，その結果得られるプラ
スミドを精選しさらにBgl IIで切断し，ここにpDR1296
から得てきたtPAをコードするXho II断片を挿入すれ
ば，目的とする発現プラスミドが得られる。Zem99はこ
のようにして得られる発現プラスミドの一例であり，図
１にその制限酵素マップを示す。B encoding the two fragments above and the pre-pro part of tPA
The resulting plasmid was ligated with the amH I-Xho II fragment, and the resulting plasmid was further digested with Bgl II.
The desired expression plasmid can be obtained by inserting the XhoII fragment encoding tPA obtained from the above. Zem99 is an example of the expression plasmid thus obtained, and its restriction enzyme map is shown in FIG.
本発明変異tPAは公知の遺伝子組換操作を適宜組合わ
せることによって製造することができるが，本発明では
もっぱら特定位置のアミノ酸配列の除去および特定位置
のアミノ酸の置換が行われる関係で本発明変異tPAをコ
ードするcDNAの調製のためには特にZoller and Smithの
部位特異的変異誘発（site−directed mutagenesis）を
好便に利用することができる。すなわち天然tPAのアミ
ノ酸配列をコードするcDNA（原cDNAおよび類似cDNA）を
M13のごときファージベクターに組込み，その結果得ら
れる二本鎖M13 DNAで形質転換した大腸菌の培養液から
一本鎖M13 DNAを用意し，これに所定の合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとしてアニーリングして変異を誘
発させればよい。例えばプラスミドpDR1496からtPAをコ
ードするcDNAを含む断片をM13tg130RFベクターに組込
み，その結果得られる二本鎖M13 DNAから一本鎖M13 DNA
を用意し，目的とする領域の欠落変異およびアミノ酸の
置換変異に応じて所定の合成オリゴヌクレオチドをアニ
ーリングすればよい。領域の欠落変異に応じた合成オリ
ゴヌクレオチドを示せば次のごとくである。まずＦ領域
として天然tPAのアミノ酸位置番号４番のValから同50番
のSerまでのアミノ酸配列を指定し，またＧ領域として
同51番のCysから同86番のIleまでのアミノ酸配列を指定
した場合に,G領域のみの欠落およびＦ領域とＧ領域の欠
落のためにはそれぞれ下記の合成ヌクレオタイドPM1お
よびPM2を使用すればよい。The mutant tPA of the present invention can be produced by appropriately combining known gene recombination operations. However, in the present invention, the mutation of the present invention is due to the fact that the amino acid sequence at the specific position is removed and the amino acid at the specific position is replaced. In particular, Zoller and Smith site-directed mutagenesis can be conveniently used for the preparation of the cDNA encoding tPA. That is, the cDNA encoding the amino acid sequence of natural tPA (original cDNA and similar cDNA)
Single-stranded M13 DNA was prepared from the culture solution of Escherichia coli transformed with the double-stranded M13 DNA obtained by incorporating it into a phage vector such as M13, and annealed with a predetermined synthetic oligonucleotide as a primer for mutation. You can trigger it. For example, a fragment containing the cDNA encoding tPA from the plasmid pDR1496 was inserted into the M13tg130RF vector, and the resulting double-stranded M13 DNA was converted to single-stranded M13 DNA.
And a predetermined synthetic oligonucleotide may be annealed depending on the deletion mutation of the target region and the substitution mutation of the amino acid. The synthetic oligonucleotide corresponding to the deletion mutation of the region is as follows. First, the amino acid sequence from Val at the amino acid position number 4 to Ser at the amino acid position 50 of natural tPA was designated as the F region, and the amino acid sequence from Cys at the 51st position to Ile at the 86th position was designated as the G region. In this case, the following synthetic nucleotides PM1 and PM2 may be used for the deletion of only the G region and the deletion of the F region and the G region, respectively.
PM1:5′GCA CGT GGC CCT GGT TTT GCA AGG CAC TGA 3′ PM2:5′CGT GGC CCT GGT ATC TTG GTA AG 3′ またK1領域として同87番のAspから同174番のSerまで
のアミノ酸配列を指定し，またK2領域として同175番のG
luから同262番のSerまでのアミノ酸配列を指定した場合
に，K1領域のみの欠落およびK2領域のみの欠落のために
はそれぞれ下記の合成ヌクレオチドPM3およびPM4を使用
すればよい。PM1: 5′GCA CGT GGC CCT GGT TTT GCA AGG CAC TGA 3 ′ PM2: 5′CGT GGC CCT GGT ATC TTG GTA AG 3 ′ Also, the amino acid sequence from Asp No. 87 to Ser No. 174 as the K 1 region. Is specified, and G of 175 is set as the K 2 area.
When the amino acid sequence from lu to Ser at position 262 is specified, the following synthetic nucleotides PM3 and PM4 may be used to delete only the K 1 region and only the K 2 region, respectively.
PM3:5′GCA GTC ACT GTT TCC TTG GTA AG 3′ PM4:5′CAG GCC GCA GGT GCT ACA AGC TGG GGT GCT GCT
ACA G3′ Ｆ領域,G領域およびK1領域の欠落あるいはＦ領域,G領域
およびK2領域の欠落のためにはPM2およびPM3あるいはPM
2およびPM4によって一本鎖M13DNAにそれぞれ逐次的に変
異を導入すればよい。アミノ酸の置換変異に応じた合成
ヌクレオチドを示せば次のごとくである。アミノ酸位置
番号186番のSerをThrに置換し，さらに糖鎖結合を容易
にする目的で同183番のGlyをSerに置換するためには下
記合成ヌクレオチドPM5を使用すればよい。PM3: 5′GCA GTC ACT GTT TCC TTG GTA AG 3 ′ PM4: 5′CAG GCC GCA GGT GCT ACA AGC TGG GGT GCT GCT
ACA G3 'F space, missing or F region of the G range and K 1 region, for lack of G region, and K 2 region PM2 and PM3 or PM
Mutations may be sequentially introduced into the single-stranded M13 DNA by 2 and PM4, respectively. The synthetic nucleotides corresponding to the amino acid substitution mutations are shown below. To substitute Ser at amino acid position number 186 with Thr and further substitute Gly at position 183 with Ser for the purpose of facilitating sugar chain binding, the following synthetic nucleotide PM5 may be used.
PM5:5′ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA 3′ アミノ酸位置番号119番のSerをMetに置換するために
は下記合成ヌクレオチドPM6を使用すればよい。PM5: 5′ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA 3 ′ In order to replace Ser at the amino acid position number 119 with Met, the following synthetic nucleotide PM6 may be used.
PM6:5′GGC CAA CGC CAT GGA GTT CCA GTT 3′ アミノ酸位置番号96番のGlnおよび同98番のIleをそれ
ぞれAsnおよびThrに置換するためには下記合成ヌクレオ
チドPM7を使用すればよい。PM6: 5'GGC CAA CGC CAT GGA GTT CCA GTT 3'The following synthetic nucleotide PM7 may be used to replace Gln at amino acid position 96 and Ile at amino acid position 98 with Asn and Thr, respectively.
PM7:5′CCT GTA GCT GGT ACC GTT GTC CTCGTA 3′ 複数のアミノ酸を置換する場合，すなわち96番のGln,98
番のIle,119番のSerをそれぞれ上記の例のごとく置換す
るためにはPM6およびPM7によって逐次的に一本鎖M13DNA
に変異を導入すればよい。またPM6およびPM7によってそ
れぞれ別の一本鎖M13DNAに変異を導入し，別々に発現プ
ラスミドを調製し，それぞれにおける所定の消化断片を
連結してもよい。PM7: 5′CCT GTA GCT GGT ACC GTT GTC CTCGTA 3 ′ When multiple amino acids are substituted, that is, Gln, 98 at position 96
No. Ile and No. 119 Ser were respectively replaced by single-stranded M13 DNA by PM6 and PM7 as in the above example.
A mutation may be introduced into. Alternatively, PM6 and PM7 may be used to introduce mutations into different single-stranded M13 DNAs, separately prepare expression plasmids, and ligate predetermined digested fragments in each.
領域の欠落のための部位特異的変異誘発とアミノ酸の
置換のための部位特異的変異誘発とを複合する方法は大
別すると二通りある。There are roughly two methods for combining site-directed mutagenesis for region deletion and site-directed mutagenesis for amino acid substitution.
第一は領域の欠落を目的とした部位特異的変異誘発の
ための合成オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸の置換を
目的とした部位特異的変異誘発のための合成オリゴヌク
レオチドによって好ましくはこの順序で逐次的に一本鎖
M13DNAに変異を導入して複合する方法である。The first is a synthetic oligonucleotide for site-directed mutagenesis for the purpose of region deletion and a synthetic oligonucleotide for site-directed mutagenesis for the purpose of amino acid substitution, preferably sequentially in this order. Main chain
This is a method in which a mutation is introduced into M13 DNA for complexing.
第二は領域の欠落を目的とした部位特異的変異誘発の
ための合成オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸の置換を
目的とした部位特異的変異誘発のための合成オリゴヌク
レオチドによってそれぞれ別の一本鎖M13DNAに変異を導
入する方法であり，この段階では複合しないが，各一本
鎖M13DNAから別々に発現プラスミドを調製し，それぞれ
における所定の消化断片を連結することにより複合を完
成する。Second, mutated into different single-stranded M13 DNAs by synthetic oligonucleotides for site-directed mutagenesis aimed at region deletion and synthetic oligonucleotides for site-directed mutagenesis aimed at amino acid substitution. Although not complexed at this stage, an expression plasmid is separately prepared from each single-stranded M13 DNA, and a predetermined digested fragment in each is ligated to complete the complex.
部位特異的変異誘発を行った後は，得られた反応液で
大腸菌を形質転換し，これを培養して得られるプラーク
について放射標識した合成オリゴヌクレオチドをハイブ
リッドしてスクリーニングすれば，本発明に係る変異tP
AをコードするcDNAを外来遺伝子として含む二本鎖M13フ
ァージDNAを得ることができる。必要により該DNAから当
該cDNAを切り出し，これを宿主に応じて使用される適当
な発現ベクターに連結することは常法に従って適宜おこ
なえばよい。After site-directed mutagenesis, Escherichia coli is transformed with the obtained reaction solution, and plaques obtained by culturing the same are screened by hybridizing radiolabeled synthetic oligonucleotides. Mutant tP
Double-stranded M13 phage DNA containing the cDNA encoding A as a foreign gene can be obtained. If necessary, the cDNA may be excised from the DNA and ligated to an appropriate expression vector used depending on the host, according to a conventional method.
以上の製造プロセスの中間段階で利用される個々の遺
伝子組換操作はほとんどが公知であるので，文献あるい
は簡単な記述によって以下に説明する。Since most of the individual gene recombination operations used in the intermediate steps of the above manufacturing process are known, they will be described below in the literature or a brief description.
制限酵素によるプラスミドの切断および切断して得ら
れるDNA断片のアガロースゲル電気泳動またはポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分離と回収と結合につい
ては下記文献20）の記述が参照される。Regarding the cleavage of the plasmid with a restriction enzyme and the separation, recovery and ligation of the DNA fragment obtained by the digestion by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis, the description in the following document 20) is referred to.
20）マニアティス，ティー，エタール.,モレキュラーク
ローニング，ア ラボラトリー マニュアル，コールド
スプリング ハーバーラボラトリー 1982 （Maniatis,T,et al., Molecular Cloning,A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982） 例えば天然tPAをコードするcDNAを含むプラスミドお
よびM13ファージベクターを各々切断し，断片を結合し
てcDNAの組込まれた二本鎖M13DNAを得る場合に応用され
る。20) Maniatis, T, Ettal., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982 (Maniatis, T, et al., Molecular Cloning, A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982) For example, it is applied when a plasmid containing a cDNA encoding natural tPA and an M13 phage vector are each cleaved, and the fragments are ligated to obtain a double-stranded M13 DNA in which the cDNA is incorporated.
プラスミドの大腸菌への形質転換は下記文献21）に従
えばよい。Transformation of the plasmid into E. coli may be performed according to the following reference 21).
20）DNAクローニング第１巻第６章ディー．エム．グロ
バー編，アイアールエルプレス 1985 （DNA cloning Vol.1,Chap.6,ed.D.M.Glover IRL press
1985） 例えば天然tPAをコードするcDNAの組込まれた二本鎖M
13DNAあるいは変異tPAをコードするcDNAの組込まれた発
現プラスミドを大腸菌への形質転換に供するときに応用
される。20) DNA Cloning Volume 1 Chapter 6 D. M. Glover, RL Press 1985 (DNA cloning Vol.1, Chap.6, ed.DMGlover IRL press
1985) For example, double-stranded M with a cDNA encoding native tPA.
It is applied when an expression plasmid in which 13DNA or a cDNA encoding mutant tPA is integrated is subjected to transformation into Escherichia coli.
変異誘発用およびスクリーニング用のオリゴヌクレオ
チドのPhosphoamidite法による合成および５′末端の標
識はそれぞれ下記文献22）および23）によればよい。Synthesis of oligonucleotides for mutagenesis and screening by the Phosphoamidite method and labeling of the 5'end may be carried out by the following references 22) and 23), respectively.
22）エス．エル．ビューケージ，エタール.,:テトラヘ
ドロン レット.,22 1859,（1981） （S.L.Beaucage,et al.,Tetrahedron Lett.,22 1859（1
981）） 23）エー．マキサム アンド ダブリュ．ギルバード，
メソッズ イン エンチモロジー,65巻 499−560頁
アカデミックプレス 1980 （A.Maxam and W.Gilbert,Methods in Enzymology,Vol.
65 p499−560 Academic Press 1980） DNA塩基配列の決定は下記文献24）に従いdideoxy法に
よりおこなえばよい。22) S. El. View Cage, Ettal.,: Tetrahedron Lett., 22 1859, (1981) (SLBeaucage, et al., Tetrahedron Lett., 22 1859 (1
981)) 23) A. Maxam and W. Gilbird,
METHODS IN ENCHIMOLOGY, Vol. 65, pp. 499-560
Academic Press 1980 (A. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymology, Vol.
65 p499-560 Academic Press 1980) The DNA base sequence may be determined by the dideoxy method according to the following Reference 24).
24）エフ．サンガー．エタール.,ピー．エヌ．エー．エ
ス．74 5463,1977 （F.Sanger et al.,P.N.A.S 74 5463,1977） 例えば変異誘発し，スクリーニングした一本鎖M13DNA
について塩基配列を決定し，目的とする変異が誘発され
ているか否かを確認する場合に応用される。24) F. Sanger. Etal., Pee. N. A. S. 74 5463,1977 (F. Sanger et al., PNAS 74 5463,1977) For example, mutagenized and screened single-stranded M13 DNA
It is applied to determine the nucleotide sequence of sucrose and confirm whether or not the desired mutation has been induced.
二本鎖および一本鎖のM13ファージDNAは以下のように
調製される。Double-stranded and single-stranded M13 phage DNA is prepared as follows.
すなわち形質転換した大腸菌を下記文献25）により培
養し，さらに振盪培養し，遠心分離する。沈澱部の大腸
菌からは前記文献20）に記載の方法により二本鎖M13DNA
を得る。また上澄液からは，その1.3mlに260μｌの2.5M
NaCl-20％ PEG 6000混合溶液を加え，混合物をエッペ
ンドルフミクロチューブで遠心分離し，得られるペレッ
トを120μｌの10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.9,0.1mM EDT
A）に懸濁し，フェノール抽出し，エタノールで沈澱さ
せ,70％エタノールで洗浄し，乾燥後30μｌの10mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.9,0.1mM EDTA）に再び懸濁して一本
鎖M13DNAを得る。That is, the transformed Escherichia coli is cultivated by the following reference 25), further cultivated with shaking, and centrifuged. From the Escherichia coli in the precipitate, double-stranded M13 DNA
Get. From the supernatant, add 260 μl of 2.5M to 1.3 ml of the supernatant.
NaCl - 20% PEG 6000 mixed solution was added, the mixture was centrifuged in an Eppendorf microtube, and the resulting pellet was 120 μl of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9, 0.1 mM EDT).
Suspended in A), extracted with phenol, precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol, dried and then resuspended in 30 μl of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9, 0.1 mM EDTA) to give single-stranded M13 DNA. obtain.
25）ジェー．メッシング，メソッズ イン エンチモロ
ジー 101 ,20−78 1983 （J.Messing,Method in Enzymology 101,20−78 1983 部位特異的変異誘発反応は下記文献26）に従っておこ
なわれる。25) J. J. Messing, Method in Enzymology 101 , 20-78 1983 (Site-specific mutagenesis reaction is carried out according to Reference 26 below).
26）ゾラー アンド スミス，メソッズ イン エンチ
モロジー 100 468−500,1983 （Zoller and Smith,Methods in Enzymology,100 468−
500,1983） すなわち非放射性リン酸で末端標識した変異誘発用合
成オリゴヌクレオチド（プライマー）20pmolに一本鎖M1
3DNA １μg,アニーリング用緩衝液（50mMトリス塩酸,p
H8.0,0.25mM MgCl2）２μl,B緩衝液（0.2Mトリス塩酸,p
H7.5,0.1M MgCl2,0.1Mジチオスレイトール）８μl,dAT
P,dGTP,dCTP,dTTP各2.5mMずつの混合物４μl,5mM rATP
2μl,蒸溜水１μl,T4DNAリガーゼ５単位,DNAポリメラー
ゼ I Klenow フラグメント５単位を加え，最終全液量
を20μｌとして14℃３時間反応させる。26) Zoller and Smith, Mesozzu Inn Enchimoroji 100 468-500,1983 (Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 100 468-
500,1983) That is, single-stranded M1 was added to 20 pmol of synthetic oligonucleotide (primer) for mutagenesis end-labeled with non-radioactive phosphate.
3 DNA 1 μg, annealing buffer (50 mM Tris-HCl, p
H8.0,0.25mM MgCl 2 ) 2μl, B buffer (0.2M Tris-HCl, p
H7.5,0.1M MgCl 2 , 0.1M dithiothreitol) 8μl, dAT
P, dGTP, dCTP, dTTP 2.5 mM each mixture 4 μl, 5 mM rATP
2 μl, distilled water 1 μl, T 4 DNA ligase 5 units, DNA polymerase I Klenow fragment 5 units were added, and the final total volume was 20 μl, and the reaction was carried out at 14 ° C. for 3 hours.
次に反応混合液を用いて変異誘発を受けたDNAで大腸
菌を形質転換するためには下記文献27）に従って行な
い，さらに下記文献28）に従って形質転換した大腸菌を
大腸菌JM103とまぜて寒天培地上に拡げ,37℃で一夜培養
し，形成するプラークをニトロセルロースフィルター上
に写しとる。Next, in order to transform Escherichia coli with the mutagenized DNA using the reaction mixture, the procedure described in the following reference 27) is performed, and E. coli transformed according to the following reference 28) is mixed with Escherichia coli JM103 on an agar medium. Spread and incubate overnight at 37 ℃, and copy the formed plaques onto a nitrocellulose filter.
27）クレーマー エタール.,セル 38 879−887,1984 （Kramer et al.,Cell 38 879−887,1984） 28）グルンスタイン アンド ホグネス，ピー．エヌ．
エー．エス．ユーエスエー 72 3961,1975 （Grunstein and Hogness,P.N.A.S.USA 72 3961,1975） ニトロセルロースフィルター上に写しとったプラーク
についてのスクリーニングは以下のように行なう。27) Kramer Ettal., Cell 38 879-887,1984 (Kramer et al., Cell 38 879-887,1984) 28) Gurung Stein and Hogness, copy. N.
A. S. USA 72 3961,1975 (Grunstein and Hogness, PNASUSA 72 3961,1975) Screening for plaques transferred on nitrocellulose filters is performed as follows.
ニトロセルロースフィルターを６倍のSSC（１倍のSSC
は150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウム）,10倍のDenhar
dt's（１倍のDenhardt'sは0.02％ポリビルニピロリド
ン,0.02％フィコール,0.02％ウシ血清アルブミン）,50
μｇ超音波処理サケ精子DNAの中に加えて65℃３時間処
理し，予備ハイブリッドを形成させる。次いでフィルタ
ーを放射標識した変異誘発用合成オリゴヌクレオチドと
同一緩衝液条件下で混合し65℃で一夜放置してハイブリ
ッドを形成させる。フィルターを６倍のSSCで洗浄し，
水分をきった後，増感スクリーンを重ね,X線フィルムに
露出して目的のプラークを選出する。Nitrocellulose filter with 6 times SSC (1 time SSC
Is 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 10 times Denhar
dt's (1x Denhardt's is 0.02% Polyvirnipyrrolidone, 0.02% Ficoll, 0.02% Bovine Serum Albumin), 50
μg sonicate Add to salmon sperm DNA and treat at 65 ° C for 3 hours to form pre-hybrid. The filters are then mixed with radiolabeled synthetic mutagenesis oligonucleotides under the same buffer conditions and left at 65 ° C overnight to form hybrids. Wash the filter with 6x SSC,
After removing the water, overlay an intensifying screen and expose it to X-ray film to select the target plaque.
変異tPAをコードするcDNAを二本鎖M13DNAから切り出
し，これを発現ベクターに連結して得られる発現プラス
ミドは宿主に応じてそれぞれ形質転換に使用すればよい
が，例えばBHK細胞の形質転換のためには下記文献29）
に従ってLoyterらの方法によりおこなえばよい。すなわ
ち得られた発現プラスミドを例えばpSV2−dhfrと共にBH
K570細胞株（ts,tk-）に形質転換する。なおpSV2−dhfr
については下記文献30）が参照される。The expression plasmid obtained by excising the cDNA encoding the mutant tPA from the double-stranded M13 DNA and ligating it to an expression vector may be used for transformation depending on the host, for example, for transformation of BHK cells. Is the reference 29)
According to Loyter et al. That is, the obtained expression plasmid was combined with, for example, pSV2-dhfr and BH
K 570 cell line (ts, tk -) and transformed into. PSV2-dhfr
For details, refer to Reference 30) below.
29）ロイター エタール.,ピー．エヌ．エー．エス．ユ
ーエスエー，79 422,1982） （Loyter et al.,P.N.A.S.USA,79 422,1982） 30）サブラマニ，エタール：モル．セル．バイオロ．1
854−864,（1981） （Sabramani, et al:Mol.Cell.Biol.1 854−864,（198
1）） クローニングは限界希釈法（limiting dilution法）
を利用して以下のごとく行なうことができる。29) Reuter Ethal., P. N. A. S. USA, 79 422,1982) (Loyter et al., PNASUSA, 79 422,1982) 30) Sabramani, etal: mol. cell. Biolo. 1
854-864, (1981) (Sabramani, et al: Mol.Cell.Biol. 1 854-864, (198
1)) Cloning is the limiting dilution method
You can do the following using.
形質転換の数日後より200nM Amethopterin含有ダルベ
コ変法イーグル培地（ダルベコ変法イーグル培地，ブド
ウ糖3.5％，炭酸水素ナトリウム7.5％，牛胎児血清（FC
S）５％，トラネキサム酸3mM,グルタミン2mM,（＋）−A
methopterin 200nM）で２〜３日毎に１〜２週培地交換
しながら限界希釈して産生株を得る。次に産生株をロー
ラーボトルに用意した200nM Amethopterin含有ダルベコ
変法イーグル培地300mlに接種し,37℃で培養し，培養開
始より３〜４日後より毎日３〜４週間同量の培地で培地
交換し，培養上清を集めればよい。Several days after transformation, Dulbecco's modified Eagle medium containing 200 nM Amethopterin (Dalbeco's modified Eagle medium, glucose 3.5%, sodium bicarbonate 7.5%, fetal bovine serum (FC
S) 5%, tranexamic acid 3 mM, glutamine 2 mM, (+)-A
The production strain is obtained by limiting dilution with methopterin 200 nM) while changing the medium every 2-3 days for 1-2 weeks. Next, inoculate 300 ml of Dulbecco's modified Eagle medium containing 200 nM Amethopterin prepared in a roller bottle with the production strain, incubate at 37 ° C, and exchange the medium with the same amount of medium for 3-4 weeks every day 3-4 days after the start of culture. , Collect the culture supernatant.
変異tPAの精製のためには抗tPA抗体を担体に結合した
抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィーを
好便に利用することができる。すなわちあらかじめトリ
ス緩衝液（100mMトリス塩酸,pH7.5,0.5M NaCl）で緩衝
化した抗体カラムに前記培養上清をチャージし，同上ト
リス緩衝液で洗浄後,5M KSCN溶液（同上トリス緩衝液に
溶解）で活性成分を溶出する。溶出した活性画分は濃縮
し，例えばセファクリルＳ−200にチャージし，トリス
緩衝液（50mMトリス塩酸,pH7.5,0.5M NaCl,1.5M KSCN）
でゲル過する。再び活性画分は濃縮し，脱塩し，例え
ばマニトールを添加して凍結乾燥すれば最終物質を得る
ことができる。For purification of mutant tPA, affinity chromatography using an antibody column in which an anti-tPA antibody is bound to a carrier can be conveniently used. That is, the above-mentioned culture supernatant was charged in an antibody column buffered with Tris buffer (100 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.5M NaCl) in advance, washed with Tris buffer as above, and then 5M KSCN solution (in Tris buffer as above). The active ingredient is eluted by dissolution. The eluted active fraction was concentrated and charged with, for example, Sephacryl S-200, and Tris buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1.5 M KSCN) was added.
To pass the gel. The active fraction can be concentrated again, desalted, and added with mannitol, for example, and freeze-dried to obtain the final substance.
以上の工程操作によって得られた本発明糖鎖変異tPA
においては，糖鎖の結合位置を特定する必要があり，こ
の目的のためには以下の分析を行なえばよい。The sugar chain mutant tPA of the present invention obtained by the above process operation
In the above, it is necessary to specify the binding position of the sugar chain, and the following analysis may be performed for this purpose.
まず糖鎖変異tPAについて，下記文献31）に示すWaxda
llらの方法に従い，ジスルフィド結合を還元アルキル化
後，反応液をPD−10カラム （ファルマシアジャパン
社）により脱塩し，ついで凍結乾燥物を1mlの4M尿素含
有50mMトリス緩衝液pH9.0に溶解し，リジルエンドペプ
チダーゼを酵素対基質モル比が１対100となるよう加え,
37℃で16時間酵素消化を行う。酵素消化終了後，反応液
に70％ギ酸を加え,pH2に調整して反応を止め，反応液は
下記の条件下での高速液体クロマトグラフィーによるペ
プチドマッピングに供する。 First, regarding sugar chain mutant tPA, Waxda shown in the following reference 31)
ll et al., Reductive alkylation of disulfide bond
After that, the reaction solution was added to PD-10 column. (Pharmacia Japan
Desalination, and then the freeze-dried product was added with 1 ml of 4M urea.
Dissolved in 50 mM Tris buffer pH 9.0, and lysyl endopep
Add tidase to a molar ratio of enzyme to substrate of 1: 100,
Perform enzymatic digestion at 37 ° C for 16 hours. Reaction solution after enzymatic digestion
70% formic acid was added to the solution to adjust the pH to 2 to stop the reaction, and the reaction solution
High-performance liquid chromatography chromatography under the following conditions:
Use for petite mapping.
31）ワックスダール，エム．ジェー.,エタール.:バイオ
ケミストリー，7,1959,（1968） Waxdall,M.J.,et al.:Biochemistry,7,1959,（1968）） カラム Ultrapore RPSC（ベックマンジャパン社） 溶出液 0.1％トリフルオロ酢酸水溶液及び0.08％ト
リフルオロ酢酸含有ア セトニトリル 溶出条件 アセトニトリル含量を60分で０％から60％に
上昇させるリニアグラジ エント 流速 毎分1ml 検出 206nmの紫外吸収 ペプチドマッピングでは，あらかじめ天然tPAについ
て上記と同一の酵素消化を行い，糖含有ペプチドを含
め，すべての断片ペプチドについての溶出位置を決定し
ておく。この結果を基にして，各糖鎖変異tPAについて
の糖含有ペプチドの溶出位置を推定し，さらにレクチン
−パーオキシダーゼを用いたドットブロッティング法に
より，糖鎖の有無の確認を行う。31) Wax Dahl, M. J., et al .: Biochemistry, 7 , 1959, (1968) Waxdall, MJ, et al .: Biochemistry, 7 , 1959, (1968)) Column Ultrapore RPSC (Beckman Japan) Eluent 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution And 0.08% trifluoroacetic acid-containing acetonitrile Elution conditions Linear gradient to increase the acetonitrile content from 0% to 60% in 60 minutes Flow rate 1 ml / min Detection of UV absorption at 206 nm In peptide mapping, the same enzymatic digestion as above was performed for natural tPA. Then, the elution positions of all the fragment peptides including the sugar-containing peptide are determined. Based on these results, the elution position of the sugar-containing peptide for each sugar chain mutant tPA is estimated, and the presence or absence of sugar chains is confirmed by the dot blotting method using lectin-peroxidase.
こうして得られた各糖鎖変異tPAの糖鎖含有フラグメ
ントは0.1M重炭酸アンモニウム水溶液に溶解し，トリプ
シン（Warthington,U.S.A.）を加え,37℃,6時間の酵素
消化を行い，上記の高速液体クロマトグラフィーの条件
でさらに分離精製する。各溶出ピークについてアミノ酸
配列を分析し，糖鎖の結合したアミノ酸を決定する。The sugar chain-containing fragments of each sugar chain-mutated tPA thus obtained were dissolved in 0.1 M ammonium bicarbonate aqueous solution, trypsin (Warthington, USA) was added, and enzymatic digestion was performed at 37 ° C for 6 hours. It is further separated and purified under the conditions of chromatography. The amino acid sequence of each elution peak is analyzed to determine the amino acid to which the sugar chain is bound.
（５）実施例 以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。(5) Examples The present invention will be described more specifically by the examples described below.
実施例１ ａ）Ｆ領域とＧ領域の欠落のためのDNAプラスミドの調
整 図２に示した様にpDR1496よりM13tg130−W RFを作製
した。Example 1 a) Preparation of DNA plasmid for deletion of F region and G region As shown in FIG. 2, M13tg130-W RF was prepared from pDR1496.
すなわちpDR1496をSph I ,Xba Iにて切断し,Bgl II制
限酵素切断部位を含む約2.1KbpのDNA断片を回収する。
このDNA断片とM13tg130 RF（アマシャムジャパン
（株））のSph I,Xba I切断断片とを結合させ，二本鎖M
13DNAとし，大腸菌へ形質転換しM13tg130−W RF及び一
本鎖M13tg130−Ｗを得た。That is, pDR1496 is cleaved with Sph I and Xba I to recover a DNA fragment of about 2.1 Kbp containing the Bgl II restriction enzyme cleavage site.
This DNA fragment was ligated to the M13tg130 RF (Amersham Japan KK) Sph I, Xba I cleavage fragment to form a double-stranded M fragment.
E. coli was transformed with 13 DNA to obtain M13tg130-W RF and single-stranded M13tg130-W.
次に,tPAのＦ領域Ｇ領域を欠落させる目的で式： ５′CGTGGCCCTGGTATCTTGGTAAG 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとして一本鎖M13tg130−Ｗと
により部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニング
し，部位特異的な変異の生じたファージを得た。このフ
ァージより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩
基配列を確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13tg130−W
6 RF DNAとした。Next, for the purpose of deleting the F region and G region of tPA, an oligonucleotide of the formula: 5'CGTGGCCCTGGTATCTTGGTAAG 3'was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer for site-specific mutation with single-stranded M13tg130-W. After induction, screening was performed to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained, M13tg130-W
6 RF DNA.
次に図３に示した様にM13tg130−W6 RF DNAよりZem99
−2600を調製した。Next, as shown in Fig. 3, Zem99 was obtained from M13tg130-W6 RF DNA.
-2600 was prepared.
すなわち,M13tg130−W6 RF DNAをBgl II,Apa 1にて切
断し1.15KbpのDNA断片を回収しこの断片と,Zem99をBgl
II,Apa 1にて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転
換し，プラスミドを回収しZem99−2600を得た。That is, M13tg130-W6 RF DNA was digested with BglII and Apa1 to recover a 1.15 Kbp DNA fragment, and this fragment and Zem99 were digested with BglII.
The fragments cleaved with II and Apa1 were ligated, transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2600.
ｂ）183番GlyをSerに,186番SerをThrに置換するためのD
NA プラスミドの調製 図４に示したようにZem99よりM13mp18/BamZem99を作
製した。b) D to replace 183 Gly with Ser and 186 Ser with Thr
Preparation of NA plasmid As shown in FIG. 4, M13mp18 / BamZem99 was prepared from Zem99.
すなわち,Zem99をBamH1にて切断し,Bgl II制限酵素切
断部位を含む約2.4KbpのDNA断片を回収する。このDNA断
片とM13mp18（フアルマシア（株））のBamH1切断断片と
を結合させ，二本鎖M13DNAとし，大腸菌へ形質転換しM1
3mp18/BamZem99を得た。That is, Zem99 is cut with BamH1 to recover a DNA fragment of about 2.4 Kbp containing the Bgl II restriction enzyme cleavage site. This DNA fragment was ligated with the BamH1 cleavage fragment of M13mp18 (Falmatia Co., Ltd.) to give double-stranded M13 DNA, which was transformed into E. coli and transformed into M1.
I got 3mp18 / BamZem99.
次に,tPAの183GlyをSerに，186SerをThrに置換する目
的で式： ５′ACGGTAGGCTGTCCCATTGCTAAAGTAGCA 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとしM13mp18/BamZem99とによ
り部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニングし，
部位特異的な変異の生じたファージを得る。このファー
ジより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩基配
列を確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13−6000 RFと
した。Next, for the purpose of substituting 183 Gly of tPA with Ser and 186 Ser with Thr, an oligonucleotide of the formula: 5′ACGGTAGGCTGTCCCATTGCTAAAGTAGCA 3 ′ was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer and site-specific with M13mp18 / BamZem99. Mutagenesis, screening,
A phage having a site-specific mutation is obtained. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA nucleotide sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained and designated as M13-6000 RF.
次に図５に示したようにM13−6000 RFよりZem99−600
0を調製した。Next, as shown in Fig. 5, from M13-6000 RF to Zem99-600.
0 was prepared.
すなわち,M13−6000 RFをBgl II,Apa Iにて切断し1.4
KbpのDNA断片を回収しこの断片と,Zem99をBgl II,Apa I
にて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，プ
ラスミドを回収しZem99−6000を得た。That is, M13-6000 RF is cut with Bgl II and Apa I to
The DNA fragment of Kbp was recovered and Zem99 and Bgl II, Apa I
The fragment cleaved at was ligated, transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-6000.
ｃ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図６に示したように,Zem99−2600,Zem99−6000および
Zem99よりZem99−2660を調製した。すなわちZem99−260
0をBgl II,Nar Iにて，またZem99−6000をNar I,Apa I
にて切断し，それぞれ82bp,1068bpの断片を回収する。
これらのDNA断片とZem99のBgl II,Apa I切断断片を結合
させ，大腸菌に形質転換し，プラスミドを回収しZem99
−2660を得た。c) Preparation of DNA plasmid for complex mutation As shown in FIG. 6, Zem99-2600, Zem99-6000 and
Zem99-2660 was prepared from Zem99. That is Zem99-260
0 for Bgl II, Nar I, and Zem99−6000 for Nar I, Apa I
Digest at 82 bp and collect fragments of 82 bp and 1068 bp, respectively.
These DNA fragments were ligated with the Bgl II and Apa I cleavage fragments of Zem99, transformed into Escherichia coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99.
I got -2660.
なおZem99−2660の変異tPAコーディング領域のDNA塩
基配列およびそのアミノ酸配列を図18−1,図18−２に示
す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia coli R
R1−Zem99−2660は微工研寄託番号FERM P−9122であ
る。The DNA base sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2660 and its amino acid sequence are shown in FIGS. 18-1 and 18-2. Also, Escherichia coli R transformed with Escherichia coli R
R1-Zem99-2660 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9122.
ｄ）糖鎖変異tPA 得られたZem99−2660とpSV2−dhfrとでBHK570細胞株
（ts,tk-）をLoyterの方法により形質転換し，限界希釈
法でクローニングし，培養上清を抗体カラムにチャージ
し，最終物質No.2660を得た。No.2660について糖鎖の結
合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列にお
けるアミノ酸位置番号117番,184番,448番のAsnに糖鎖が
結合しており，特に184番の糖鎖結合が不均一になりや
すいと考えられる問題が解決されていることが判明し
た。d) a sugar chain mutant tPA obtained Zem99-2660 and pSV2-dhfr and in BHK 570 cell line (ts, tk -) was transformed by the method of Loyter, cloning by limiting dilution, the culture supernatant antibody column The final material No. 2660 was obtained. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 2660, the sugar chain was bound to Asn at amino acid positions 117, 184 and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and in particular, the 184th sugar chain was bound. It turns out that the problems that are likely to be non-uniform have been resolved.
実施例２ ａ）119番SerをMetに置換するためのDNAプラスミドの調
製 実施例１のａ）で作製した一本鎖M13tg130−Ｗを用意
した。Example 2 a) Preparation of DNA plasmid for replacing Ser 119 with Met The single-stranded M13tg130-W prepared in a) of Example 1 was prepared.
次に,tPAの119SerをMetに置換させる目的で式： ５′GGCCAACGCCATGGAGTTCCAGTT 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとし一本鎖M13tg130−Ｗとに
より部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニング
し，部位特異的な変異の生じたファージを得た。このフ
ァージより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩
基配列を確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13tg130−W
16 RF DNAとした。Next, for the purpose of substituting Met for 119 Ser of tPA, an oligonucleotide of the formula: 5'GGCCAACGCCATGGAGTTCCAGTT 3'was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer and site-directed mutagenesis with single-stranded M13tg130-W. After induction, screening was performed to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained, M13tg130-W
16 RF DNA.
次に図７に示したようにM13tg130−W16 RF DNAよりZe
m99−6300を調製した。Next, as shown in FIG. 7, Ze was obtained from M13tg130-W16 RF DNA.
m99-6300 was prepared.
すなわちM13tg130−W16 RF DNAをBgl II,Apa 1にて切
断し1.4KbpのDNA断片を回収しこの断片と,Zem99をBgl I
I,Apa 1にて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転
換し，プラスミドを回収しZem99−6300を得た。That is, M13tg130-W16 RF DNA was cleaved with Bgl II and Apa 1 to recover a 1.4 Kbp DNA fragment.
The fragment cleaved with I and Apa 1 was ligated, transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-6300.
ｂ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図８に示したように,Zem99−2600,Zem99−6300および
Zem99よりZem99−2663を調製した。すなわち実施例１の
ａ）で作製したZem99−2600をBgl II,Nar Iにて，またZ
em99−6300をNar I,Apa Iにて切断し，それぞれ82bp,10
68bpの断片を回収した。これらのDNA断片とZem99のBgl
II,Apa I切断断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，プ
ラスミドを回収しZem99−2663を得た。b) Preparation of DNA plasmid for complex mutation As shown in FIG. 8, Zem99-2600, Zem99-6300 and
Zem99-2663 was prepared from Zem99. That is, Zem99-2600 produced in Example 1 a) was treated with Bgl II, Nar I, and Z
Em99-6300 was cut with Nar I and Apa I, 82bp and 10
A 68 bp fragment was recovered. These DNA fragments and Bem of Zem99
II and Apa I digested fragments were ligated and transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2663.
なおZem99−2663の変異tPAコーディング領域のDNA塩
基配列およびそのアミノ酸配列を図19−1,図19−２に示
す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia coli R
R1−Zem99−2663は微工研寄託番号FERM P−9123であ
る。The DNA base sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2663 and its amino acid sequence are shown in FIGS. 19-1 and 19-2. Also, Escherichia coli R transformed with Escherichia coli R
R1-Zem99-2663 is the Micromachine Research Deposit No. FERM P-9123.
ｃ）糖鎖変異tPA Zem99−2663を使用し，実施例１のｄ）項の記載と同
様にして最終物質No.2663を得た。No.2663について糖鎖
の結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列
におけるアミノ酸位置番号184番と448番のAsnにのみ糖
鎖が結合しており,117番のAsnには糖鎖が結合していな
いことが判明した。c) Using sugar chain mutation tPA Zem99-2663, the final substance No. 2663 was obtained in the same manner as described in the item d) of Example 1. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 2663, the sugar chain was bound only to Asn at amino acid positions 184 and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and the sugar chain was bound to Asn at 117. Turned out not to.
実施例３ ａ）Ｇ領域の欠落のためのDNAプラスミドの調製 図９に示したように実施例１のａ）で作製した一本鎖
M13tg130−ＷよりM13tg130−24 RFを作製した。Example 3 a) Preparation of a DNA plasmid for deletion of the G region The single strand prepared in a) of Example 1 as shown in FIG.
M13tg130-24 RF was prepared from M13tg130-W.
すなわちtPAのＧ領域を欠落させる目的で式： ５′GCACGTGGCCCTGGTTTTGACAGGCACTGA 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとし一本鎖M13tg130−Ｗとに
より部位特異的な変異誘発を行い，スクリーニングし，
部位特異的な変異の生じたファージを得た。このファー
ジより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩基配
列を確認し，一本鎖M13tg130−24とし，さらに二本鎖DN
Aを得,M13tg130−24 RF DNAとした。That is, for the purpose of deleting the G region of tPA, an oligonucleotide of the formula: 5'GCACGTGGCCCTGGTTTTGACAGGCACTGA 3'was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer for site-directed mutagenesis with single-stranded M13tg130-W. Screening,
A phage with a site-specific mutation was obtained. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing, and single-stranded M13tg130-24 was obtained.
A was obtained and designated as M13tg130-24 RF DNA.
ｂ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図10に示したようにM13tg130−24 RF,Zem99−6000お
よびZem99よりZem99−2460を調製した。すなわちM13tg1
30−24RFをBgl II,Nar Iにて，また実施例１のｂ）で作
製したZem99−6000をNar I,Apa Iにて切断し，それぞれ
217bp,1068bpの断片を回収した。これらのDNA断片とZem
99のBgl II,Apa I切断断片を結合させ，大腸菌に形質転
換し，プラスミドを回収しZem99−2460を得た。b) Preparation of DNA plasmid for complex mutation As shown in FIG. 10, Zem99-2460 was prepared from M13tg130-24 RF, Zem99-6000 and Zem99. That is, M13tg1
30-24 RF was cut with Bgl II and Nar I, and Zem99-6000 produced in b) of Example 1 was cut with Nar I and Apa I, respectively.
The 217 bp and 1068 bp fragments were recovered. These DNA fragments and Zem
BglII and ApaI cleavage fragments of 99 were ligated and transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2460.
なお,Zem99−2460の変異tPAコーディング領域のDNA配
列およびそのアミノ酸配列を図23−1,図20−2,図20−３
に示す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia co
li RR1−Zem99−2460は微工研寄託番号FERM P−9270で
ある。The DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2460 and its amino acid sequence are shown in Figure 23-1, Figure 20-2, and Figure 20-3.
Shown in In addition, Escherichia co transformed with Escherichia co
li RR1-Zem99-2460 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9270.
ｃ）糖鎖変異tPA Zem99−2460を使用し，実施例１のｄ）項の記載と同
様にして最終物質No.2460を得た。No.2460について糖鎖
の結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列
におけるアミノ酸位置番号117番,184番,448番のAsnに糖
鎖が結合しており，特に184番の糖鎖結合が不均一とな
りやすいと考えられる問題が解決されていることが判明
した。c) The final substance No. 2460 was obtained using the sugar chain mutation tPA Zem99-2460 in the same manner as described in the item d) of Example 1. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 2460, the sugar chain was bound to Asn at amino acid positions 117, 184, and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and in particular, the 184th sugar chain was bound. It turns out that the problem that is likely to be non-uniform has been resolved.
実施例４ ａ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図11に示したように,M13tg130−24 RF,Zem99−6300,
およびZem99よりZem99−2463を調製した。すなわち，実
施例３のａ）で作製したM13tg130−24 RFをBgl II,Nar
Iにて，また実施例２のａ）で作製したZem99−6300をNa
r I,Apa Iにて切断し，それぞれ217bp,1068bpの断片を
回収した。これらのDNA断片とZem99のBgl II,Apa I,切
断断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，プラスミドを
回収しZem99−2463を得た。Example 4 a) Preparation of DNA plasmid for complex mutation As shown in FIG. 11, M13tg130-24 RF, Zem99-6300,
And Zem99-2463 was prepared from Zem99. That is, M13tg130-24 RF produced in a) of Example 3 was mixed with Bgl II, Nar.
Zem99-6300 prepared in I) and in Example 2 a)
After cutting with r I and Apa I, fragments of 217 bp and 1068 bp were recovered. These DNA fragments were ligated with BglII, ApaI, and a cleavage fragment of Zem99, transformed into Escherichia coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2463.
なお,Zem99−2463の変異tPAコーディング領域のDNA塩
基配列およびそのアミノ酸配列を図21−1,図21−2,図21
−３に示す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichi
a coli RR1−Zem99−2463は微工研寄託番号FERM P−927
1である。The DNA base sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2463 and its amino acid sequence are shown in Figure 21-1, Figure 21-2, and Figure 21.
-3. Escherichia coli transformed with this
a coli RR1-Zem99-2463 is Micromachine Research Deposit No.FERM P-927
Is one.
ｂ）糖鎖変異tPA Zem99−2463を使用し，実施例１のｄ）項の記載と同
様にして最終物質No.2463を得た。No.2463について糖鎖
の結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列
におけるアミノ酸位置番号184番と448番のAsnにのみ糖
鎖が結合しており,117番のAsnには糖鎖が結合していな
いことが判明した。b) The final substance No.2463 was obtained using the sugar chain mutation tPA Zem99-2463 in the same manner as described in item d) of Example 1. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No.2463, the sugar chain was bound only to Asn at amino acid positions 184 and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and the sugar chain was bound to Asn at 117. Turned out not to.
実施例５ ａ）Ｆ領域,G領域およびK2領域の欠落のためのDNAプラ
スミドの調製 図12に示したように実施例１のａ）で作製した一本鎖
M13tg130−W6よりM13tg130−612 RFを作製した。Example 5 a) Preparation of a DNA plasmid for the deletion of the F, G and K 2 regions The single strand prepared in a) of Example 1 as shown in FIG.
M13tg130-612 RF was prepared from M13tg130-W6.
すなわちtPAのK2領域を欠落させる目的で式： ５′CAGGCCGCAGGTGCTACAAGCTGGGGTGCTGCTGCAG 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとして一本鎖M13tg130−W6と
により部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニング
し，部位特異的な変異の生じたファージを得た。このフ
ァージより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩
基配列を確認し，一本鎖M13tg130−612とし，さらに二
本鎖DNAを得,M13tg130−612 RF DNAとした。That is, for the purpose of deleting the K 2 region of tPA, an oligonucleotide of the formula: 5′CAGGCCGCAGGTGCTACAAGCTGGGGTGCTGCTGCAG 3 ′ was synthesized, and site-directed mutagenesis was performed with single-stranded M13tg130-W6 as a mutagenic oligonucleotide primer. We screened and obtained phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA nucleotide sequencing, and single-stranded M13tg130-612 was obtained. Further, double-stranded DNA was obtained and M13tg130-612 RF DNA was obtained.
ｂ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図13に示したように一本鎖M13tg130−612よりZem99−
2810作製した。b) Preparation of DNA plasmid for complex mutation. As shown in Fig. 13, single-stranded M13tg130-612 was used for Zem99-.
2810 was produced.
すなわちtPAの119番SerをMetに変換させる目的で式： ５′GGCCAACGCCATGGAGTTCCAGTT 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとし一本鎖M13tg130−612と
により部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニング
し，部位特異的な変異の生じたファージを得た。このフ
ァージより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩
基配列を確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13tg130−6
12−16 RFとした。That is, for the purpose of converting 119 Ser of tPA into Met, an oligonucleotide of the formula: 5′GGCCAACGCCATGGAGTTCCAGTT 3 ′ was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer to induce site-directed mutagenesis with single-stranded M13tg130-612. Screening was performed to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA nucleotide sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained, M13tg130-6
12-16 RF.
M13tg130−612−16 RFをBgl II,Apa Iにて切断し,886
bpのDNA断片を回収した。このDNAとZem99のBgl II,Apa
I切断断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，プラスミ
ドを回収しZem99−2810を得た。M13tg130-612-16 RF was cut with Bgl II and Apa I, and 886
A bp DNA fragment was recovered. This DNA and Zgl99 Bgl II, Apa
The I-cleavage fragment was ligated and transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2810.
なお,Zem99−2810の変異tPAコーディング領域のDNA塩
基配列およびそのアミノ酸配列を図22−1,図22−２に示
す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia coli R
R1−Zem99−2810は微工研寄託番号FERM P−9124であ
る。The DNA base sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2810 and its amino acid sequence are shown in Figures 22-1 and 22-2. Also, Escherichia coli R transformed with Escherichia coli R
R1-Zem99-2810 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9124.
ｃ）糖鎖変異tPA Zem99−2810を使用し，実施例１のｄ）項の記載と同
様にして最終物質No.2810を得た。No.2810について糖鎖
の結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列
におけるアミノ酸位置番号448番のAsnにのみ糖鎖が結合
しており，同117番のAsnには糖鎖が結合していないこと
が判明した。c) Using sugar chain mutation tPA Zem99-2810, the final substance No. 2810 was obtained in the same manner as described in the item d) of Example 1. Analysis of the binding position of the sugar chain for No. 2810 revealed that the sugar chain was bound only to Asn at amino acid position 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and the sugar chain was bound to Asn at 117. Turned out not.
実施例６ ａ）Ｆ領域とＧ領域の欠落および96番GlnをAsnに,98番I
leをThrに置換するためのDNAプラスミドの調製 実施例１のａ）で作製した一本鎖M13tg130−W6を用意
した。Example 6 a) Missing of F region and G region, 96th Gln to Asn, 98th I
Preparation of DNA Plasmid for Replacing le with Thr The single-stranded M13tg130-W6 prepared in a) of Example 1 was prepared.
次に,tPAの96GlnをAsnに98IleをThrに置換させる目的
で式： ５′CCTGTAGCTGGTACCGTTGTCCTCGTA 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとしてM13tg130−W6とにより
部位特異的な変異誘発を行い，スクリーニングし，部位
特異的な変異の生じたファージを得た。このファージよ
り一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩基配列を
確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13tg130−62 RFとし
た。Next, for the purpose of substituting 96 Gln of tPA with Asn and 98 Ile with Thr, an oligonucleotide of the formula: 5'CCTGTAGCTGGTACCGTTGTCCTCGTA 3'was synthesized, and this was used as a mutagenic oligonucleotide primer in a site-specific manner with M13tg130-W6. Mutagenesis was performed and screened to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained and designated as M13tg130-62 RF.
ｂ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図14に示したように,M13tg130−62 RFをBgl II,Nar I
にて，また実施例５のｂ）で作製したM13tg130−612−1
6 RFをNar I,Apa Iにて切断し，それぞれ82bp,804bpのD
NA断片を回収した。これらのDNAとZem99のBgl II,Apa I
切断断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，プラスミド
を回収しZem99−2820を得た。b) Preparation of DNA plasmid for complex mutation As shown in Fig. 14, M13tg130-62 RF was digested with Bgl II, Nar I.
, And M13tg130-612-1 prepared in Example 5b).
6 RF is cut with Nar I and Apa I and D of 82bp and 804bp respectively
The NA fragment was recovered. Bgl II, Apa I of these DNA and Zem99
The digested fragment was ligated and transformed into E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2820.
なおZem99−2820の変異tPAコーディング領域のDNA塩
基配列およびそのアミノ酸配列を図23−1,図23−２に示
す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia coli R
R1−Zem99−2820は微工研寄託番号FERM P−9125であ
る。The DNA base sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2820 and its amino acid sequence are shown in FIGS. 23-1 and 23-2. Also, Escherichia coli R transformed with Escherichia coli R
R1-Zem99-2820 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9125.
ｂ）糖鎖変異tPA Zem99−2820を使用し，実施例１のｄ）の記載と同様
にして最終物質No.2820を得た。No.2820について糖鎖の
結合位置を分析したところ，天然tPAのアミノ酸配列に
おけるアミノ酸位置番号98番,448番に糖鎖が結合してお
り，同117番のAsnには糖鎖が結合していないことが判明
した。b) Using sugar chain mutation tPA Zem99-2820, the final substance No. 2820 was obtained in the same manner as described in d) of Example 1. When the binding position of the sugar chain was analyzed for No. 2820, the sugar chain was bound to amino acid positions 98 and 448 in the amino acid sequence of natural tPA, and the sugar chain was bound to Asn at 117. Turned out not.
実施例７ ａ）Ｆ領域,G領域およびK1領域の欠落のためのDNAプラ
スミドの調製 図15に示したように実施例１のａ）で作
製したM13tg130−W6よりZem99−2700を作製した。Example 7 a) Preparation of DNA plasmid for deletion of F region, G region and K 1 region As shown in FIG. 15, Zem99-2700 was prepared from M13tg130-W6 prepared in a) of Example 1.
すなわちtPAのK1領域を欠落させる目的で式： ５′GCAGTCATCGTTTCCTTGGTAAG 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとして一本鎖M13tg130−W6と
により部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニング
し，部位特異的な変異の生じたファージを得た。このフ
ァージより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定により塩
基配列を確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13tg130−W
7 RFとした。That formula for the purpose of dropping the K 1 region of tPA: synthesize an oligonucleotide of 5'GCAGTCATCGTTTCCTTGGTAAG 3 ', performs site-specific mutagenesis by a single strand M13tg130-W6 this as mutagenic oligonucleotide primer We screened and obtained phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained, M13tg130-W
7 RF.
次に,M13tg130−W7 RFをBgl II,Apa 1にて切断し883bp
のDNA断片を回収し，この断片とZem99をBgl II,Apa 1に
て切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，プラ
スミドを回収しZem99−2700を得た。Next, M13tg130-W7 RF was cut with Bgl II, Apa 1 and 883bp.
The DNA fragment was recovered, and this fragment was ligated to the fragment obtained by cutting Zem99 with BglII and Apa1 to transform E. coli, and the plasmid was recovered to obtain Zem99-2700.
ｂ）複合変異のためのDNAプラスミドの調製 図16に示したように,Zem99−2700をBamH Iにて切断し
約1.9KbpのDNA断片を回収し，この断片とM13 mp 18 RF
をBamH Iにて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転
換し,M13 mp 18−2700のRF DNAおよび一本鎖M13 mp 18
−2700を得た。b) Preparation of DNA plasmid for complex mutation As shown in Fig. 16, Zem99-2700 was digested with BamHI to recover a DNA fragment of about 1.9 Kbp, and this fragment and M13 mp 18 RF were isolated.
The fragment cleaved with BamHI was ligated, transformed into E. coli, and the RF DNA of M13 mp 18-2700 and single-stranded M13 mp 18
I got -2700.
次に図17に示したようにM13 mp 18−2700よりZem99−
2760を作製した。Next, as shown in Fig. 17, from M13 mp 18-2700 to Zem99-
2760 was produced.
すなわち96番GlyをSerに,98番SerをThrに置換させる
目的で式： ５′ACGGTAGGCTGTCCCATTGCTAAAGTAGCA 3′ のオリゴヌクレオチドを合成し，これを変異誘発性オリ
ゴヌクレオチドプライマーとして一本鎖M13 mp 18−270
0とにより部位特異的な変異誘発を行ない，スクリーニ
ングし，部位特異的な変異の生じたファージを得た。こ
のファージより一本鎖M13DNAを得,DNA塩基配列決定によ
り塩基配列を確認し，さらに二本鎖M13DNAを得,M13 mp
18−2760 RFとした。That is, the oligonucleotide of the formula: 5′ACGGTAGGCTGTCCCATTGCTAAAGTAGCA 3 ′ was synthesized with the purpose of substituting Ser for 96 Gly with Ser and Thr for 98 Ser, and using this as a mutagenic oligonucleotide primer, single-stranded M13 mp 18-270
By 0, site-directed mutagenesis was performed and screening was performed to obtain phages with site-specific mutations. Single-stranded M13 DNA was obtained from this phage, the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing, and double-stranded M13 DNA was obtained.
18-2760 RF.
次に,M13 mp 18−2760 RFをBgl II,Apa 1にて切断し8
83bpのDNA断片を回収し，この断片とZem99をBgl II,Apa
1にて切断した断片を結合させ，大腸菌に形質転換し，
プラスミドを回収しZem99−2760を得た。Next, cut M13 mp 18−2760 RF with Bgl II, Apa 1
The 83 bp DNA fragment was recovered, and this fragment and Zem99 were added to Bgl II, Apa.
The fragment cut in 1 is ligated and transformed into E. coli,
The plasmid was recovered to obtain Zem99-2760.
なお,Zem99−2760の変異tPAコーディング領域のDNA塩
基配列およびそのアミノ酸配列を図24−1,図24−２に示
す。またこれで形質転換した大腸菌Escherichia coli R
R1−Zem99−2760は微工研寄託番号FERM P−9273であ
る。The DNA base sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2760 and its amino acid sequence are shown in Figures 24-1 and 24-2. Also, Escherichia coli R transformed with Escherichia coli R
R1-Zem99-2760 is Micromachine Research Deposit No. FERM P-9273.
ｃ）糖鎖変異tPA Zem99−2760を使用し，実施例１のｄ）項の記載と同
様にして最終物質No.2760を得た。c) Using sugar chain mutation tPA Zem99-2760, the final substance No. 2760 was obtained in the same manner as described in item d) of Example 1.
（６）発明の効果 以下の実験例によって本発明の効果を示す。(6) Effects of the Invention The effects of the present invention will be shown by the following experimental examples.
実験例１ 試料と方法 実施例1,2,7,8で得られたNo.2660,No.2663,No.2810,N
o.2820を検体試料とし，また天然tPAを対照試料とし
た。３％マニトール,3％アスパラギン酸および３％アル
ギニンを含むpH6.0の水溶液に各試料を溶解し,Spragu−
Dawley系雄性ラット（体重230〜270g）に各々0.4mg/kg
ずつを大腿部静脈内に投与し，経時的に頸静脈から0.5m
lずつ採血し，少量の3.8％クエン酸を添加して遠心分離
し，血漿を得た。血漿中の各tPA濃度はサンドイッチ法
による酵素免疫測定法で測定した。Experimental Example 1 Sample and Method No. 2660, No. 2663, No. 2810, N obtained in Examples 1, 2, 7, and 8
o.2820 was used as a sample and natural tPA was used as a control sample. Each sample was dissolved in a pH 6.0 aqueous solution containing 3% mannitol, 3% aspartic acid and 3% arginine, and the Spragu-
0.4 mg / kg each for Dawley male rats (weight 230-270 g)
Were administered into the femoral vein, and 0.5m from the jugular vein over time
Blood was collected in 1-liter increments, a small amount of 3.8% citric acid was added, and centrifugation was performed to obtain plasma. Each tPA concentration in plasma was measured by the enzyme immunoassay method by the sandwich method.
結果 結果を図25に示す。図25は各試料についての血漿中濃
度の経時的推移を示すグラフであり，図中●印線，△印
線，×印線，▲印線，○印線はそれぞれ天然tPA,No.266
0,No.2663,No.2810,No.2820における結果を示す。図25
の各試料濃度の経時的推移はtwo−compartment modelで
解析される。α相の消失半減期T1/2（α）およびβ相の
Ｙ切片血中濃度Ｂ並びに血中濃度−時間曲線下の面積AU
Cを求めた。その結果を表１に示す。表中の数値は３例
の平均値であり,T1/2（α）,B,AUCの単位はそれぞれmi
n,μg/ml,min・μg/mlである。Results Results are shown in FIG. Figure 25 is a graph showing the time course of plasma concentration for each sample. In the figure, ●, △, ×, ▲, and ○ are the natural tPA, No.266, respectively.
The results for 0, No. 2663, No. 2810, and No. 2820 are shown. FIG.
The time course of each sample concentration is analyzed by a two-compartment model. Elimination half-life of α phase T1 / 2 (α) and Y section of β phase Blood concentration B and area under blood concentration-time curve AU
I asked for C. The results are shown in Table 1. The values in the table are the average values of 3 cases, and the units of T1 / 2 (α), B, and AUC are mi
n, μg / ml, min · μg / ml.
図25および表１より本発明糖鎖変異tPAが血中濃度に
おいて天然tPAを改善したものとなっていることが判明
する。 From FIG. 25 and Table 1, it is found that the sugar chain mutant tPA of the present invention is an improved natural tPA at a blood concentration.
実験例２ 方法 実施例1,7,8で得られたNo.2660,No.2810,No.2820を検
体試料とし，また天然tPAを対照試料とした。各試料約5
00μｇにpH7.12緩衝液（イオン強度0.05）を溶解液とし
て加え,26℃で５分間攪拌し,8時間振とうしてから遠心
分離し，上澄液についてHPLC（UV220nm）により蛋白量
を求め溶解度を定めた。結果を表２に示す。表中の数値
はmg/mlによって示される。Experimental Example 2 Method No. 2660, No. 2810, and No. 2820 obtained in Examples 1, 7, and 8 were used as sample samples, and natural tPA was used as a control sample. About 5 for each sample
PH7.12 buffer solution (ionic strength 0.05) was added to 00 μg as a solution, stirred at 26 ° C for 5 minutes, shaken for 8 hours and then centrifuged, and the amount of protein in the supernatant was determined by HPLC (UV220nm). The solubility was set. Table 2 shows the results. Numerical values in the table are given in mg / ml.
表２より本発明糖鎖変異tPAは天然tPAよりもはるかに
大きい溶解度を有することが判明する。 From Table 2, it is found that the sugar chain mutant tPA of the present invention has a much higher solubility than the natural tPA.
実験例３ 試料と方法 実施例1,2,7,8で得られたNo.2660,No.2663,No.2810,N
o.2820を検体試料とし，また天然tPAを対照試料とし
た。アトム静脈カテーテル（4Fr,3.5cm）に3cm長の絹糸
を入れ，注入用シリンジに結合させておく。別に血液と
3.8％クエン酸ナトリウムを9:1に混合してヒトクエン酸
血液を用意し，この液0.5mlに125Iでラベルしたフィブ
リノーゲン（25μCi/50μｌ生理食塩水）,0.25M塩化カ
ルシウム50μl,トロンビン5U/10μｌを加える。得られ
る溶液16μｌを前記注入用シリンジに吸いとってカテー
テル内に注ぎ，室温60分間放置する。絹糸をカテーテル
からとり出し，生理食塩水で洗浄してから放射活性を測
定し，スタート時のフィブリン血栓値とした。次にこの
絹糸をSprague−Dawley系雄ラット（200−300g）の頸動
静脈（AVシャント）内に入れ，続いて計算量の試料を1m
lの溶解液に希釈したものを同ラットの大腿静脈より投
与し,2時間経過後に絹糸をとりだし，放射活性を測定し
て残存フィブリン血栓値とした。Experimental Example 3 Sample and Method No. 2660, No. 2663, No. 2810, N obtained in Examples 1, 2, 7, and 8
o.2820 was used as a sample and natural tPA was used as a control sample. Insert a 3 cm long silk thread into the atom vein catheter (4 Fr, 3.5 cm) and connect it to the injection syringe. Separately with blood
Prepare human citrate blood by mixing 3.8% sodium citrate 9: 1, and in 0.5 ml of this solution fibrinogen labeled with 125 I (25 μCi / 50 μl physiological saline), 0.25 M calcium chloride 50 μl, thrombin 5U / 10 μl Add. 16 μl of the obtained solution is sucked into the injection syringe, poured into the catheter, and left at room temperature for 60 minutes. The silk thread was taken out from the catheter, washed with physiological saline, and then the radioactivity was measured to obtain the fibrin thrombosis value at the start. Next, this silk thread was put into the jugular arteriovenous (AV shunt) of Sprague-Dawley male rats (200-300 g), and then the calculated amount of sample was 1 m.
A diluted solution of 1 l was administered through the femoral vein of the same rat, and after 2 hours, the silk thread was taken out and the radioactivity was measured to determine the residual fibrin thrombosis value.
下式により血栓残存率（％）を求めた。 The residual rate of thrombus (%) was calculated by the following formula.
結果 結果を図26に示す。図26は試料の投与量と血栓残存率
との関係を示すグラフであり，図中，実線（−），点線
（……），三点鎖線 ，一点鎖線 ，二点鎖線 はそれぞれ天然tPA,No.2660,No.2663,No.2810,No.2820
についての三例の平均値の結果を示す。図26より本発明
複合変異tPAは天然tPAと同程度に血栓溶解活性を有する
ことが判明する。 Results Results are shown in FIG. Fig. 26 is a graph showing the relationship between the dose of the sample and the residual rate of thrombus. In the figure, the solid line (-), the dotted line (...), and the three-dot chain line. ， Dashed line , Two-dot chain line Are natural tPA, No.2660, No.2663, No.2810, No.2820
The result of the average value of three examples is shown. From FIG. 26, it is revealed that the composite mutant tPA of the present invention has thrombolytic activity to the same extent as natural tPA.
図１はZem99の制限酵素マップである。 図２はM13tg130−W RFの構築図である。 図３はZem99−2600の構築図である。 図４はM13mp18/Bam Zem99 RFの構築図である。 図５はZem99−6000の構築図である。 図６はZem99−2660の構築図である。 図７はZem99−6300の構築図である。 図８はZem99−2663の構築図である。 図９はM13tg130−24 RFの構築図である。 図10はZem99−2460の構築図である。 図11はZem99−2463の構築図である。 図12はMtg130−612 RFの構築図である。 図13はZem99−2810の構築図である。 図14はZem99−2820の構築図である。 図15はZem99−2700の構築図である。 図16はM13 mp 18−2700 RFの構築図である。 図17はZem99−2760の構築図である。 図18−1,図18−２はZem99−2660の変異tPAコーディング
領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列である。 図19−1,図19−２はZem99−2663の変異tPAコーディング
領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列である。 図20−1,図20−2,図20−３はZem99−2460の変異tPAコー
ディング領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列であ
る。 図21−1,図21−2,図21−３はZem99−2463の変異tPAコー
ディング領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列であ
る。 図22−1,図22−２はZem99−2810の変異tPAコーディング
領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列である。 図23−1,図23−２はZem99−2820の変異tPAコーディング
領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列である。 図24−1,図24−２はZem99−2760の変異tPAコーディング
領域のDNA配列およびそのアミノ酸配列である。 図25は血漿中濃度の経時的推移を示すグラフである。 図26は投与量と血栓残存率の関係を示すグラフである。Figure 1 is a restriction enzyme map of Zem99. FIG. 2 is a construction diagram of M13tg130-W RF. FIG. 3 is a construction diagram of Zem99-2600. Figure 4 is a construction diagram of M13mp18 / Bam Zem99 RF. FIG. 5 is a construction diagram of Zem99-6000. FIG. 6 is a construction diagram of Zem99-2660. FIG. 7 is a construction diagram of Zem99-6300. FIG. 8 is a construction diagram of Zem99-2663. FIG. 9 is a construction diagram of M13tg130-24 RF. FIG. 10 is a construction diagram of Zem99-2460. FIG. 11 is a construction diagram of Zem99-2463. FIG. 12 is a construction diagram of Mtg130-612 RF. FIG. 13 is a construction diagram of Zem99-2810. FIG. 14 is a construction diagram of Zem99-2820. FIG. 15 is a construction diagram of Zem99-2700. Figure 16 is a construction diagram of the M13 mp 18-2700 RF. FIG. 17 is a construction diagram of Zem99-2760. 18-1 and 18-2 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2660 and its amino acid sequence. 19-1 and 19-2 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2663 and its amino acid sequence. Figure 20-1, Figure 20-2, and Figure 20-3 show the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2460 and its amino acid sequence. 21-1, FIG. 21-2, and FIG. 21-3 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2463 and its amino acid sequence. 22-1 and 22-2 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2810 and its amino acid sequence. 23-1 and 23-2 are the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2820 and its amino acid sequence. 24-1 and 24-2 show the DNA sequence of the mutant tPA coding region of Zem99-2760 and its amino acid sequence. FIG. 25 is a graph showing the time course of plasma concentration. FIG. 26 is a graph showing the relationship between the dose and the residual rate of thrombus.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 欧州特許公開196920（ＥＰ，Ａ) 欧州特許公開178105（ＥＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．83Ｐ．4670−4674（1986) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．261（30）Ｐ. 14214−14218（1986) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ23Ｐ．3701− 3707（1984)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication (C12N 9/64 Z C12R 1:91) (56) References European Patent Publication 196920 (EP, A) European Patent Publication 178105 (EP, A) Proc. Natl. Acad. Sc i. 83P. 4670-4674 (1986) J. Biol. Chem. 261 (30) P. 14214-14218 (1986) Biochemistry 23P. 3701-3707 (1984)
Claims (1)
かつ天然tPAのアミノ酸位置番号183番のGlyおよび186番
のSerをそれぞれSerおよびThrに置換した複合変異tPA。1. The F region and G region of natural tPA are deleted,
Also, a complex mutant tPA in which Gly at the amino acid position number 183 and Ser at the position 186 of natural tPA are replaced with Ser and Thr, respectively.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62064340A JPH084502B2 (en) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Compound mutation tPA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62064340A JPH084502B2 (en) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Compound mutation tPA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63230084A JPS63230084A (en) | 1988-09-26 |
| JPH084502B2 true JPH084502B2 (en) | 1996-01-24 |
Family
ID=13255415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62064340A Expired - Lifetime JPH084502B2 (en) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Compound mutation tPA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH084502B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005075639A1 (en) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Shionogi Co., Ltd. | Method of constructing glycoprotein by using extension codon |
Family Cites Families (3)
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| DE353716C (en) * | 1922-05-26 | Buckau Akt Ges Zu Magdeburg Ma | Reversible strips for tube dryers | |
| HU200615B (en) * | 1982-05-05 | 1990-07-28 | Genentech Inc | Methods of preparing tissue plasiminogen activator derivative composition |
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-
1987
- 1987-03-20 JP JP62064340A patent/JPH084502B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３Ｐ．３７０１−３７０７（１９８４） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（３０）Ｐ．１４２１４−１４２１８（１９８６） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３Ｐ．４６７０−４６７４（１９８６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63230084A (en) | 1988-09-26 |
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