JPH084505B2 - 溶解タンパク質の固定方法 - Google Patents
溶解タンパク質の固定方法Info
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- JPH084505B2 JPH084505B2 JP61094942A JP9494286A JPH084505B2 JP H084505 B2 JPH084505 B2 JP H084505B2 JP 61094942 A JP61094942 A JP 61094942A JP 9494286 A JP9494286 A JP 9494286A JP H084505 B2 JPH084505 B2 JP H084505B2
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- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、水中に溶解したタンパク質、特に酵素を電
解質の存在で固体担体に固定する方法に関する。
解質の存在で固体担体に固定する方法に関する。
従来の技術 固定された酵素は、溶解した酵素をグルタルジアルデ
ヒドを用いて架橋することによつてすでに得られた。こ
の場合イオン濃度の増大によつて架橋が促進される現象
が観察されたが、これは電解質の沈殿作用によると説明
された〔K.オガタ（Ogata）等:Biochim.Biophys.Acta,1
59巻（1968）,405〜407頁参照〕。
ヒドを用いて架橋することによつてすでに得られた。こ
の場合イオン濃度の増大によつて架橋が促進される現象
が観察されたが、これは電解質の沈殿作用によると説明
された〔K.オガタ（Ogata）等:Biochim.Biophys.Acta,1
59巻（1968）,405〜407頁参照〕。
西独国特許出願公開第3336257号記載の方法の場合に
は、多孔質担体、例えば珪藻土に酵素溶液を含浸させ又
は担体を固体酵素の層で被覆しかつ担体と溶解又は固体
酵素とから成るこの調製物を水性塩溶液中に入れかつ架
橋剤を作用させることによつて固体酵素を耐久的に製造
する。塩溶液は、酵素が酵素調製物から溶出されず、固
定を無効にしないという効果を有する。従つてこの方法
は原則的に２つの別個の作業段階つまり担体及び溶解又
は可溶性酵素を含有する酵素調製物の製造及び酵素調製
物の架橋浴導入を必要とする。
は、多孔質担体、例えば珪藻土に酵素溶液を含浸させ又
は担体を固体酵素の層で被覆しかつ担体と溶解又は固体
酵素とから成るこの調製物を水性塩溶液中に入れかつ架
橋剤を作用させることによつて固体酵素を耐久的に製造
する。塩溶液は、酵素が酵素調製物から溶出されず、固
定を無効にしないという効果を有する。従つてこの方法
は原則的に２つの別個の作業段階つまり担体及び溶解又
は可溶性酵素を含有する酵素調製物の製造及び酵素調製
物の架橋浴導入を必要とする。
ヨーロツパ特許出願公開第37667号には巨大多孔質陽
イオン性交換樹脂から成る担体に、またヨーロツパ特許
出願公開第26672号には巨大多孔質両性イオン交換樹脂
から成る担体に、グルタルジアルデヒドを用いて菌類ラ
クターゼを結合することが記載されている。両方法の場
合、緩衝物質としての電解質は、せいぜいグルタルジア
ルデヒドとの反応前又は後に使用するけれども、反応そ
のものの間にはイオン吸着が止められないように0.05mo
l/lを決して越えない低濃度でのみ使用する。これに対
して高いイオン濃度は、場合により架橋されずに残存し
た酵素量を担体から溶出するための手段であると述べて
いる。両性又は陽イオン性担体樹脂は、基質溶液の溶解
成分との不利な交換作用を幾度も生じ、従つて使用でき
なくなることが多い。
イオン性交換樹脂から成る担体に、またヨーロツパ特許
出願公開第26672号には巨大多孔質両性イオン交換樹脂
から成る担体に、グルタルジアルデヒドを用いて菌類ラ
クターゼを結合することが記載されている。両方法の場
合、緩衝物質としての電解質は、せいぜいグルタルジア
ルデヒドとの反応前又は後に使用するけれども、反応そ
のものの間にはイオン吸着が止められないように0.05mo
l/lを決して越えない低濃度でのみ使用する。これに対
して高いイオン濃度は、場合により架橋されずに残存し
た酵素量を担体から溶出するための手段であると述べて
いる。両性又は陽イオン性担体樹脂は、基質溶液の溶解
成分との不利な交換作用を幾度も生じ、従つて使用でき
なくなることが多い。
発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、高い活性収率を有する巨大多孔質
（makroporoes）担体に対する溶解タンパク質の固定
を、一段階法で簡単に行うことである。
（makroporoes）担体に対する溶解タンパク質の固定
を、一段階法で簡単に行うことである。
問題点を解決するための手段 ところが、水に不溶で、高々弱い膨潤性の固体担体に
対する溶解タンパク質の固定は、少なくとも0.15mol/l
の電解質イオン濃度を有するタンパク質の水性溶液を、
タンパク質の担体吸着が行われるまで、前記水性溶液に
よつて接触された担体上に作用させる場合に奏効するこ
とが判明した。純粋吸着固定が十分であると、負荷担体
を容易に分離することができる。一般に固定は架橋剤に
よつて安定化される。この架橋は本発明によれば、電解
質含有溶液中で直接行い、タンパク質吸着担体を予め分
離しない。吸着の間及び少なくとも次の、架橋剤による
固定の際には、電解質含有溶液の上澄みを用いて作業す
るので、懸濁された又はカラム充填物として配置された
担体粒子は完全に接触される。
対する溶解タンパク質の固定は、少なくとも0.15mol/l
の電解質イオン濃度を有するタンパク質の水性溶液を、
タンパク質の担体吸着が行われるまで、前記水性溶液に
よつて接触された担体上に作用させる場合に奏効するこ
とが判明した。純粋吸着固定が十分であると、負荷担体
を容易に分離することができる。一般に固定は架橋剤に
よつて安定化される。この架橋は本発明によれば、電解
質含有溶液中で直接行い、タンパク質吸着担体を予め分
離しない。吸着の間及び少なくとも次の、架橋剤による
固定の際には、電解質含有溶液の上澄みを用いて作業す
るので、懸濁された又はカラム充填物として配置された
担体粒子は完全に接触される。
有利な作用 前記範囲の高いイオン濃度は従来は、共有結合されな
かつたタンパク質分子を担体から溶出し、架橋剤の存在
で担体を含まない不溶沈殿物を形成する手段として認め
られていたのに、このような高イオン濃度が巨大多孔質
担体上のタンパク質の固定を促進するという事実は意外
である。
かつたタンパク質分子を担体から溶出し、架橋剤の存在
で担体を含まない不溶沈殿物を形成する手段として認め
られていたのに、このような高イオン濃度が巨大多孔質
担体上のタンパク質の固定を促進するという事実は意外
である。
次表は、イオン濃度の増大する際グルタルジアルデヒ
ドを用いてペニシリンアミダーゼをフエニルセフアロー
ズ（phenylsepharose）に結合する際の活性収率の増大
を示す。結合方法は例５で記載した作業法と同じであ
る。
ドを用いてペニシリンアミダーゼをフエニルセフアロー
ズ（phenylsepharose）に結合する際の活性収率の増大
を示す。結合方法は例５で記載した作業法と同じであ
る。
グルタルジアルデヒドを用いないと、他の点では同じ
結合条件でも結合活性は認められない。
結合条件でも結合活性は認められない。
両性担体における固定と比べて本発明による好ましい
作業法の有利な作用は、酵母ラクターゼの結合の例によ
り説明することができる。ヨーロツパ特許出願公開第26
672号の比較実験１によれば、酵母ラクターゼはpH6.6
5、20〜22℃で、グルタルジアルデヒドによつてフエノ
ール・ホルムアルデヒド樹脂を基剤とする両性イオン交
換体に量収率64％で固定される。しかし活性は、活性収
率が実際には得られない程低い。
作業法の有利な作用は、酵母ラクターゼの結合の例によ
り説明することができる。ヨーロツパ特許出願公開第26
672号の比較実験１によれば、酵母ラクターゼはpH6.6
5、20〜22℃で、グルタルジアルデヒドによつてフエノ
ール・ホルムアルデヒド樹脂を基剤とする両性イオン交
換体に量収率64％で固定される。しかし活性は、活性収
率が実際には得られない程低い。
これに対して、酵素製剤111g/lを含有する水性溶液か
ら成る酵母ラクターゼを、23℃で結合活性基としてオキ
シラン基を有する架橋アクリルアミドを基剤とするパー
ル状の中性巨大多孔質担体樹脂に結合すると、使用した
電解質濃度に依存して次の活性収率が得られる： 就中、極めて異なる非特異性担体による本発明方法に
よつて、従来は担体の費用のかかる活性化後に初めて達
成できる絶対的な高活性及び抜群の活性収率が容易に得
られることは意外である。架橋終了後にはタンパク質は
また低イオン濃度でも担体に結合されており、例えば酵
素の場合には、注目すべき活性損失なしに幾度も再使用
することができる。
ら成る酵母ラクターゼを、23℃で結合活性基としてオキ
シラン基を有する架橋アクリルアミドを基剤とするパー
ル状の中性巨大多孔質担体樹脂に結合すると、使用した
電解質濃度に依存して次の活性収率が得られる： 就中、極めて異なる非特異性担体による本発明方法に
よつて、従来は担体の費用のかかる活性化後に初めて達
成できる絶対的な高活性及び抜群の活性収率が容易に得
られることは意外である。架橋終了後にはタンパク質は
また低イオン濃度でも担体に結合されており、例えば酵
素の場合には、注目すべき活性損失なしに幾度も再使用
することができる。
有効な応用 本発明による方法は、もともと可溶性タンパク質を固
定された形で含有する、あらゆる種類の巨大多孔質固体
物体の製造に適している。最も重要な応用分野は担体結
合酵素の製造である。また親和性クロマトグラフイー用
充填材の製造及び診断用検体の製造も重要である。
定された形で含有する、あらゆる種類の巨大多孔質固体
物体の製造に適している。最も重要な応用分野は担体結
合酵素の製造である。また親和性クロマトグラフイー用
充填材の製造及び診断用検体の製造も重要である。
タンパク質 本発明により結合されうるタンパク質は、０〜60℃の
温度で十分に水溶性であつて、溶解された形で担体に接
触することのできるタンパク質である。本発明はこの種
の特定タンパク質に限定されておらず、タンパク質を含
有する水溶性の任意の生物源物質を包含する。本発明方
法を完全に否定する事例は今まで観察されなかつたけれ
ども、個々のタンパク質が担体に結合され得ないか又は
結合されても他の方法によるよりも不良な結果しか得ら
れない場合も起こり得るだろう。タンパク質をイオン添
加によつて又は酵素の場合には基質添加によつて安定化
するのが有利である場合もある。
温度で十分に水溶性であつて、溶解された形で担体に接
触することのできるタンパク質である。本発明はこの種
の特定タンパク質に限定されておらず、タンパク質を含
有する水溶性の任意の生物源物質を包含する。本発明方
法を完全に否定する事例は今まで観察されなかつたけれ
ども、個々のタンパク質が担体に結合され得ないか又は
結合されても他の方法によるよりも不良な結果しか得ら
れない場合も起こり得るだろう。タンパク質をイオン添
加によつて又は酵素の場合には基質添加によつて安定化
するのが有利である場合もある。
好ましいのは酵素である。例としてはアミラーゼ、プ
ロテアーゼ、アミダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、
ヘミーセルラーゼ、アシラーゼ、ラクターゼ、イソメラ
ーゼ、インベルターゼ及びオキシダーゼが挙げられる。
非酵素タンパク質の種類の例は抗体、タンパク質構造を
有するホルモン及び酵素抑制因子である。
ロテアーゼ、アミダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、
ヘミーセルラーゼ、アシラーゼ、ラクターゼ、イソメラ
ーゼ、インベルターゼ及びオキシダーゼが挙げられる。
非酵素タンパク質の種類の例は抗体、タンパク質構造を
有するホルモン及び酵素抑制因子である。
担体 担体は巨大多孔構造を有する、水又は電解質溶液に不
溶の任意の固体から成つていてよい。巨大多孔構造を有
する適当な固体は、少なくとも10nmの孔径を有する細孔
を有しかつ0.1cm3/g、好ましくは0.5cm3/gを越える孔容
積を有する。好ましい担体は10〜100nmの孔径、10〜500
m2/gの比表面積及び１〜３cm3/gの孔容積を有する。
溶の任意の固体から成つていてよい。巨大多孔構造を有
する適当な固体は、少なくとも10nmの孔径を有する細孔
を有しかつ0.1cm3/g、好ましくは0.5cm3/gを越える孔容
積を有する。好ましい担体は10〜100nmの孔径、10〜500
m2/gの比表面積及び１〜３cm3/gの孔容積を有する。
担体の外形は、少なくとも１m2/gの比表面積を有する
表面積に富む系が数倍有利であるとしても、担体の作用
にとつては重要ではない、それというのも担体作用は固
定タンパク質の高い活性量を小さい空間に結合すること
を許すからである。適当な担体としては、容器又は管も
しくは容器又は導管の組込部材の内表面及び被膜、洗滌
可能な又は流通可能なフイルム、膜、紙、織布、繊維フ
リース又は繊維パツキン材料又は他のパツキン材料、又
は固体物体の積層物がある。これらの物体の間に十分に
大きい流通可能な空間が存在する場合には、担体又は少
なくとも表面に近い担体層は、流通性を損ずることなく
著しく膨潤することができる。好ましくは粒子状担体を
使用する。粒子状の担体とは10mm未満、好ましくは0.1
〜5mmの範囲の粒度を有する担体の意である。極めて好
ましくはパール、つまり球状担体である。粒子状担体
が、その中で使用される水性媒体中で全く膨潤しないか
又は僅かしか膨潤しない、好ましくは乾燥分の嵩体積の
２倍未満にしかならない場合が有利である。粒子状担体
に適合する条件は、同担体が電解質含有溶液中で攪拌に
よつて懸濁されうるか又はカラム充填物中を流通しうる
かということである。
表面積に富む系が数倍有利であるとしても、担体の作用
にとつては重要ではない、それというのも担体作用は固
定タンパク質の高い活性量を小さい空間に結合すること
を許すからである。適当な担体としては、容器又は管も
しくは容器又は導管の組込部材の内表面及び被膜、洗滌
可能な又は流通可能なフイルム、膜、紙、織布、繊維フ
リース又は繊維パツキン材料又は他のパツキン材料、又
は固体物体の積層物がある。これらの物体の間に十分に
大きい流通可能な空間が存在する場合には、担体又は少
なくとも表面に近い担体層は、流通性を損ずることなく
著しく膨潤することができる。好ましくは粒子状担体を
使用する。粒子状の担体とは10mm未満、好ましくは0.1
〜5mmの範囲の粒度を有する担体の意である。極めて好
ましくはパール、つまり球状担体である。粒子状担体
が、その中で使用される水性媒体中で全く膨潤しないか
又は僅かしか膨潤しない、好ましくは乾燥分の嵩体積の
２倍未満にしかならない場合が有利である。粒子状担体
に適合する条件は、同担体が電解質含有溶液中で攪拌に
よつて懸濁されうるか又はカラム充填物中を流通しうる
かということである。
陽イオンを有しない担体固体が好ましい。これは、基
質又は少なくとも有効表面に共有結合された陽イオン基
又はプロトン化によつて陽イオン基に変化しうる塩基性
基、つまりアンモニウム基又はアミノ基を有しないか又
はとにかく0.1m当量/g未満の前記基を有する固体を意味
する。特に、イオンを有しない（ungeladen）か又は弱
陰イオンを有する巨大多孔質固体が好ましい。「イオン
を有しない」とは、共有結合されたカルボニル基、カル
ボキシレート基、スルホネート基、アミノ基又はアンモ
ニウム基を有しないか又は0.1m当量/g（乾燥担体樹脂）
未満の前記基を有する固体を謂う。弱陰イオン性担体樹
脂は、5m当量/g以下の濃度で陰イオン基、例えば共有結
合されたカルボキシル基又はカルボキシレート基を有す
ることができる。前記の数値はともかく樹脂物質の場合
には担体粒子の活性表面についてあてはまる。
質又は少なくとも有効表面に共有結合された陽イオン基
又はプロトン化によつて陽イオン基に変化しうる塩基性
基、つまりアンモニウム基又はアミノ基を有しないか又
はとにかく0.1m当量/g未満の前記基を有する固体を意味
する。特に、イオンを有しない（ungeladen）か又は弱
陰イオンを有する巨大多孔質固体が好ましい。「イオン
を有しない」とは、共有結合されたカルボニル基、カル
ボキシレート基、スルホネート基、アミノ基又はアンモ
ニウム基を有しないか又は0.1m当量/g（乾燥担体樹脂）
未満の前記基を有する固体を謂う。弱陰イオン性担体樹
脂は、5m当量/g以下の濃度で陰イオン基、例えば共有結
合されたカルボキシル基又はカルボキシレート基を有す
ることができる。前記の数値はともかく樹脂物質の場合
には担体粒子の活性表面についてあてはまる。
しかし、タンパク質の表面塩析（oberflaeche Aussal
zung）は、高められた塩濃度の作用下に極めて親水性の
表面においても、それどころか強陰イオンを有する固体
においてさえ起りうることが判明した。したがつてまた
このような担体も使用することができる。
zung）は、高められた塩濃度の作用下に極めて親水性の
表面においても、それどころか強陰イオンを有する固体
においてさえ起りうることが判明した。したがつてまた
このような担体も使用することができる。
タンパク質の結合は、疎水基、例えばＣ原子２個以上
を有する飽和又は好ましくは不飽和の脂肪族側基又は芳
香族基によつて著しく促進されるが、これは前記基の大
きさよりも担体表面のこれらの基の面密度に依存する。
好ましい担体は、孔壁の表面で又は連続的に少なくとも
１重量％の前記種類の側基を有する重合体物質から成
る。
を有する飽和又は好ましくは不飽和の脂肪族側基又は芳
香族基によつて著しく促進されるが、これは前記基の大
きさよりも担体表面のこれらの基の面密度に依存する。
好ましい担体は、孔壁の表面で又は連続的に少なくとも
１重量％の前記種類の側基を有する重合体物質から成
る。
原則的にはまた、巨大多孔質無機担体例えばパール状
ガラス又はガラス繊維〔例えば“調整多孔ガラス（Cont
rolled Pore Glass）”〕、珪酸、酸化アルミニウム又
は活性炭も適当である。有機物質、特にプラスチツク
は、それから成る担体を限定された形で、例えばパー
ル、繊維、フイルム又は被覆の形で比較的容易に製造す
ることができるという利点を有する。有機担体の化学的
構造は、個々の場合に最も有利な効果が如何なる種類の
担体を用いて得られるかを入念に試験する必要はあるけ
れども、重要ではない。
ガラス又はガラス繊維〔例えば“調整多孔ガラス（Cont
rolled Pore Glass）”〕、珪酸、酸化アルミニウム又
は活性炭も適当である。有機物質、特にプラスチツク
は、それから成る担体を限定された形で、例えばパー
ル、繊維、フイルム又は被覆の形で比較的容易に製造す
ることができるという利点を有する。有機担体の化学的
構造は、個々の場合に最も有利な効果が如何なる種類の
担体を用いて得られるかを入念に試験する必要はあるけ
れども、重要ではない。
水に不溶の適当な巨大多孔質合成樹脂は、例えば無極
性であつて、架橋されていないか又は架橋されていても
よく、例えばポリメチルメタクリレート及び他のアクリ
ルエステルポリマー、ポリスチロール、セルロースエス
テル、フエノールホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂
又はポリオレフインである。合成樹脂はまた極性を有
し、程度の差こそあれ親水性であつてもよいが、架橋に
より水に不溶であつてもよい。これに属するものは、架
橋セルロース及びデンプン誘導体、架橋ポリアクリルア
ミド又はポリメタクリルアミド、アクリル酸又はメタク
リル酸の架橋ポリヒドロキシアルキルエステル、架橋ポ
リビニルピロリドン又は非塩基性アミノプロスト樹脂で
ある。
性であつて、架橋されていないか又は架橋されていても
よく、例えばポリメチルメタクリレート及び他のアクリ
ルエステルポリマー、ポリスチロール、セルロースエス
テル、フエノールホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂
又はポリオレフインである。合成樹脂はまた極性を有
し、程度の差こそあれ親水性であつてもよいが、架橋に
より水に不溶であつてもよい。これに属するものは、架
橋セルロース及びデンプン誘導体、架橋ポリアクリルア
ミド又はポリメタクリルアミド、アクリル酸又はメタク
リル酸の架橋ポリヒドロキシアルキルエステル、架橋ポ
リビニルピロリドン又は非塩基性アミノプロスト樹脂で
ある。
吸着性を改善するためには、担体を少なくとも表面に
関し若干疎水性にするのがしばしば有利である。例えば
二酸化珪素、ベントナイト又は多孔ガラスのような無機
担体を、フエニル官能性シランと反応させることによつ
て、表面にフエニル基を施してもよい。同様に巨大多孔
質有機担体、例えばセフアローズ（Sepharose）を、フ
エニルグリシジルエーテルでフエニル化するか又はアル
キルグリシジルエーテルでアルキル化してもよい。アル
キル基の他に、Ｃ原子１〜18個を有するすべての直鎖又
は枝分れアルキル基も一般に吸着促進作用を有する。
関し若干疎水性にするのがしばしば有利である。例えば
二酸化珪素、ベントナイト又は多孔ガラスのような無機
担体を、フエニル官能性シランと反応させることによつ
て、表面にフエニル基を施してもよい。同様に巨大多孔
質有機担体、例えばセフアローズ（Sepharose）を、フ
エニルグリシジルエーテルでフエニル化するか又はアル
キルグリシジルエーテルでアルキル化してもよい。アル
キル基の他に、Ｃ原子１〜18個を有するすべての直鎖又
は枝分れアルキル基も一般に吸着促進作用を有する。
パール又は中空パールの形の担体樹脂の好適な群は、
西独国特許出願公告第2237316号、同第2343633号及び西
独国特許出願公開第2722751号により得られる。これ
は、親水性母材を有し、好ましくは主要部分がアクリル
アミド、メタクリルアミド及び架橋性メチレン−ビス−
アクリルアミド又は−メタクリルアミドから構成された
殆ど膨潤しないか又は膨潤しない架橋重合体である。こ
れらの重合体は、タンパク質に対して結合性を有する
基、特にエポキシ基を有する。それというのも該重合体
は加水分解によつて又はタンパク質との反応の際イオン
基を形成しないからである。また該重合体は、片側のみ
が反応された架橋剤分子から由来する遊離メタクリルロ
イル基又はイソプロパニル基約２〜５重量％を有する。
これらの担体を使用する場合には、付加的架橋剤の併用
を省略することもできる。
西独国特許出願公告第2237316号、同第2343633号及び西
独国特許出願公開第2722751号により得られる。これ
は、親水性母材を有し、好ましくは主要部分がアクリル
アミド、メタクリルアミド及び架橋性メチレン−ビス−
アクリルアミド又は−メタクリルアミドから構成された
殆ど膨潤しないか又は膨潤しない架橋重合体である。こ
れらの重合体は、タンパク質に対して結合性を有する
基、特にエポキシ基を有する。それというのも該重合体
は加水分解によつて又はタンパク質との反応の際イオン
基を形成しないからである。また該重合体は、片側のみ
が反応された架橋剤分子から由来する遊離メタクリルロ
イル基又はイソプロパニル基約２〜５重量％を有する。
これらの担体を使用する場合には、付加的架橋剤の併用
を省略することもできる。
電解質 電解質は、本発明による方法の場合おそらく、水分子
の形成によつて、タンパク質の一種の過飽和、ともかく
その溶解度の減少をもたらす作用を有する。タンパク質
の溶解後に初めて電解質にタンパク質を加えるのが有利
であることが多い。それというのもそうしなければタン
パク質は、時にはなかなか溶解しないか又は全然溶解し
ないからである。
の形成によつて、タンパク質の一種の過飽和、ともかく
その溶解度の減少をもたらす作用を有する。タンパク質
の溶解後に初めて電解質にタンパク質を加えるのが有利
であることが多い。それというのもそうしなければタン
パク質は、時にはなかなか溶解しないか又は全然溶解し
ないからである。
いかなる電解質がいかなる濃度で沈殿作用を呈するか
という問題は、タンパク質の性質、その濃度及び同伴物
質に依存しており、場合に応じてテストしてみなければ
ならない。一般には塩析作用を有するすべての電解質、
例えば離液順列によれば塩化物を含むすべての塩析性陰
イオンを使用することができる。電解質の種々の効果の
例は、H.M.ラウエン（Rauen）が“ビオヒエミツシエン
・タツシエンブーフ（Biochemishen Taschenbuch）”、
Teil ２、第２版、56〜57頁で記載している。次の方程
式： もしくは logSO＝β logS＝β−KS・Ｊ 〔式中Ｓは電解質の存在におけるタンパク質の溶解度を
表わし、SOは電解質の不在でのタンパク質の溶解度を表
わす〕によるKSの正の値を有する電解質が適当である。
多価金属陽イオンは沈殿又は不活性化作用を呈すること
が多く、従つて１価陽イオン、就中アルカリイオンを選
ぶべきである。陰イオンは添加電解質の作用に明らかに
影響する。硫酸塩、燐酸塩及びポリ燐酸塩が一番好適で
ある。また炭酸塩、クロム酸塩、酢酸塩、クエン酸塩及
び酒石酸塩も強塩析作用を発揮するが、敏感なタンパク
質の場合には必ずしも使用できない。塩化物又は酢酸塩
のような１価陰イオンは、必要なイオン濃度を得るため
には比較的高い濃度で１価陰イオンとして使用しなけれ
ばならない。塩析作用を発揮することができるために
は、どれも高濃度で使用しなければならない。構造形成
中性塩、例えば硫酸アンモニウム、−ナトリウム又は−
カリウム、燐酸水素アンモニウム、−ナトリウム又はカ
リウムは効果が大きく、値段が安価で、無害であるため
に大部分のタンパク質にとつて最も適している。電解質
含有タンパク質溶液のpH値は、タンパク質の感受性に左
右され、好ましくは４〜９の範囲にある。
という問題は、タンパク質の性質、その濃度及び同伴物
質に依存しており、場合に応じてテストしてみなければ
ならない。一般には塩析作用を有するすべての電解質、
例えば離液順列によれば塩化物を含むすべての塩析性陰
イオンを使用することができる。電解質の種々の効果の
例は、H.M.ラウエン（Rauen）が“ビオヒエミツシエン
・タツシエンブーフ（Biochemishen Taschenbuch）”、
Teil ２、第２版、56〜57頁で記載している。次の方程
式： もしくは logSO＝β logS＝β−KS・Ｊ 〔式中Ｓは電解質の存在におけるタンパク質の溶解度を
表わし、SOは電解質の不在でのタンパク質の溶解度を表
わす〕によるKSの正の値を有する電解質が適当である。
多価金属陽イオンは沈殿又は不活性化作用を呈すること
が多く、従つて１価陽イオン、就中アルカリイオンを選
ぶべきである。陰イオンは添加電解質の作用に明らかに
影響する。硫酸塩、燐酸塩及びポリ燐酸塩が一番好適で
ある。また炭酸塩、クロム酸塩、酢酸塩、クエン酸塩及
び酒石酸塩も強塩析作用を発揮するが、敏感なタンパク
質の場合には必ずしも使用できない。塩化物又は酢酸塩
のような１価陰イオンは、必要なイオン濃度を得るため
には比較的高い濃度で１価陰イオンとして使用しなけれ
ばならない。塩析作用を発揮することができるために
は、どれも高濃度で使用しなければならない。構造形成
中性塩、例えば硫酸アンモニウム、−ナトリウム又は−
カリウム、燐酸水素アンモニウム、−ナトリウム又はカ
リウムは効果が大きく、値段が安価で、無害であるため
に大部分のタンパク質にとつて最も適している。電解質
含有タンパク質溶液のpH値は、タンパク質の感受性に左
右され、好ましくは４〜９の範囲にある。
添加電解質の効果にとつてそのイオン濃度Ｊは決定的
である。イオン濃度は、ｉイオン種を含む水性溶液に関
して、次式： 〔式中Ciはｉイオン種の濃度を表わし、Ziはそのイオン
価を表わす〕により計算される。例えば１mK2HPO4の溶
液の場合、CK＝２、ZK＝１、 からイオン濃度Ｊ＝３が得られる。実際には好ましい電
解質の濃度は、0.15〜2mol/lのイオン濃度の範囲にあ
る。好ましくはイオン濃度は少なくとも0.3mol/lであ
る。
である。イオン濃度は、ｉイオン種を含む水性溶液に関
して、次式： 〔式中Ciはｉイオン種の濃度を表わし、Ziはそのイオン
価を表わす〕により計算される。例えば１mK2HPO4の溶
液の場合、CK＝２、ZK＝１、 からイオン濃度Ｊ＝３が得られる。実際には好ましい電
解質の濃度は、0.15〜2mol/lのイオン濃度の範囲にあ
る。好ましくはイオン濃度は少なくとも0.3mol/lであ
る。
固定 固定は原則として吸着段階とともに始まる。また架橋
剤が使用される場合には吸着段階が架橋反応に先行す
る。２つの段階を前記順序で次次に行うことができる、
つまり先づ電解質の存在でタンパク質を担体に吸着さ
せ、次に初めて架橋性結合成分を加えることができる。
この順序が好ましい。しかしまた両段階を工程的に包括
して、結合成分をすでに吸着の間に電解質と共に同時に
作用させてもよい。最後にまた多くの場合、先づ担体を
結合成分のみと反応させ、次に初めてタンパク質及び電
解質を加えることもできる。
剤が使用される場合には吸着段階が架橋反応に先行す
る。２つの段階を前記順序で次次に行うことができる、
つまり先づ電解質の存在でタンパク質を担体に吸着さ
せ、次に初めて架橋性結合成分を加えることができる。
この順序が好ましい。しかしまた両段階を工程的に包括
して、結合成分をすでに吸着の間に電解質と共に同時に
作用させてもよい。最後にまた多くの場合、先づ担体を
結合成分のみと反応させ、次に初めてタンパク質及び電
解質を加えることもできる。
タンパク質の吸着は、タンパク質の水性溶液の上澄み
及び担体材料から成る系においては、0.1〜100時間、好
ましくは１〜10時間の間に起こる。両反応段階で電解質
溶液が担体粒子の周りで接触することが重要である。温
度の上昇とともに固定は促進される。好ましくは、タン
パク質が効果の損失なしに耐えられる最高温度で作業す
る。また０℃でもなお作業することはできるけれども、
40℃を越える温度、多くの場合50℃を越える温度が極め
て有利である。
及び担体材料から成る系においては、0.1〜100時間、好
ましくは１〜10時間の間に起こる。両反応段階で電解質
溶液が担体粒子の周りで接触することが重要である。温
度の上昇とともに固定は促進される。好ましくは、タン
パク質が効果の損失なしに耐えられる最高温度で作業す
る。また０℃でもなお作業することはできるけれども、
40℃を越える温度、多くの場合50℃を越える温度が極め
て有利である。
固定すべきタンパク質は、溶液の重量に対して例えば
0.01〜30％の広い濃度範囲及び担体材料に対する量割合
の広い範囲で使用することができる。酵素の場合には高
い結合収率及び生成物活性が得られる。負荷量は一般に
タンパク質20mg/g（乾燥担体物質）を越えており、つま
り２重量％以上である。これに対して生物巨大分子を単
離するための固定配位子の場合には小さい負荷密度が有
利である。
0.01〜30％の広い濃度範囲及び担体材料に対する量割合
の広い範囲で使用することができる。酵素の場合には高
い結合収率及び生成物活性が得られる。負荷量は一般に
タンパク質20mg/g（乾燥担体物質）を越えており、つま
り２重量％以上である。これに対して生物巨大分子を単
離するための固定配位子の場合には小さい負荷密度が有
利である。
固定は、担体をタンパク質溶液中で懸濁しかつ電解質
添加後工提の終るまで適度に攪拌するという具合に行う
ことができる。また電解質含有タンパク質溶液をカラム
反応器の担体充填物中に流し、同溶液を長時間ポンプで
供給してもよい。
添加後工提の終るまで適度に攪拌するという具合に行う
ことができる。また電解質含有タンパク質溶液をカラム
反応器の担体充填物中に流し、同溶液を長時間ポンプで
供給してもよい。
固定は差当つてタンパク質の担体吸着のみである。負
荷された担体を次に電解質の少ない媒体に導入すると、
多くの場合タンパク質の脱着を予期しなければならな
い。これは、後続のタンパク質分子の共有結合によつて
相互に又は担体に関して妨止する。この目的のために第
２反応段階で結合成分つまり架橋成分を加える。これは
工程的にはすでに吸着段階の間に行うこともできる。
荷された担体を次に電解質の少ない媒体に導入すると、
多くの場合タンパク質の脱着を予期しなければならな
い。これは、後続のタンパク質分子の共有結合によつて
相互に又は担体に関して妨止する。この目的のために第
２反応段階で結合成分つまり架橋成分を加える。これは
工程的にはすでに吸着段階の間に行うこともできる。
結合成分は、少なくともタンパク質の固定に十分な量
が水性電解質溶液中に溶けていなければならない。同成
分は電解質容液の上澄み中で使用されることが重要であ
る。つまり溶液は担体物質によつて完全に吸着されては
ならない。湿潤担体物質1ml当り少なくとも約0.2ml、好
ましくは10mlまでの電解質溶液を使用する。さらに結合
成分は電解質の存在で作用しなければならないので、電
解質の沈殿作用はタンパク質が不可逆的に固定されてし
まうまで保持されている。
が水性電解質溶液中に溶けていなければならない。同成
分は電解質容液の上澄み中で使用されることが重要であ
る。つまり溶液は担体物質によつて完全に吸着されては
ならない。湿潤担体物質1ml当り少なくとも約0.2ml、好
ましくは10mlまでの電解質溶液を使用する。さらに結合
成分は電解質の存在で作用しなければならないので、電
解質の沈殿作用はタンパク質が不可逆的に固定されてし
まうまで保持されている。
結合成分としては、２個以上の官能基を有する少なく
とも限定的に水溶性の化合物が適当であり、同成分はこ
れらの官能基によつてタンパク質及び場合によつては担
体の対応する官能基と反応することができる。不可逆的
固定はタンパク質それ自体の架橋又はタンパク質の担体
に対する架橋によつて起こる。タンパク質に対して反応
する適当な官能基は、例えばアルデヒド基、エポキシ
基、ジアゾ基、イソシアネート基及びクロル蟻酸エステ
ル基である。多くの場合カルボン酸無水物又は−エステ
ル基はあまり有利ではない、それというのもこれらの基
が陰イオンカルボキシレート基の形成によつて担体の電
気化学的性質を著しく変化させるからである。使用する
ことのできる結合成分の例は、ジアゾベンジジン、ヘキ
サメチレンジイソシアネート、クロル蟻酸エチルエステ
ルであり、極めて重要な化合物としてはグルタルジアル
デヒドである。また分子量100,000未満の低水溶性重合
体、例えばポリアクロレイン、アクリル−又はメタクリ
ルアミドとグリシジルアクリレート又は−メタクリレー
ト、アクロレイン又はＮ−アリルメタクリルアミドとの
共重合体も使用することができる。
とも限定的に水溶性の化合物が適当であり、同成分はこ
れらの官能基によつてタンパク質及び場合によつては担
体の対応する官能基と反応することができる。不可逆的
固定はタンパク質それ自体の架橋又はタンパク質の担体
に対する架橋によつて起こる。タンパク質に対して反応
する適当な官能基は、例えばアルデヒド基、エポキシ
基、ジアゾ基、イソシアネート基及びクロル蟻酸エステ
ル基である。多くの場合カルボン酸無水物又は−エステ
ル基はあまり有利ではない、それというのもこれらの基
が陰イオンカルボキシレート基の形成によつて担体の電
気化学的性質を著しく変化させるからである。使用する
ことのできる結合成分の例は、ジアゾベンジジン、ヘキ
サメチレンジイソシアネート、クロル蟻酸エチルエステ
ルであり、極めて重要な化合物としてはグルタルジアル
デヒドである。また分子量100,000未満の低水溶性重合
体、例えばポリアクロレイン、アクリル−又はメタクリ
ルアミドとグリシジルアクリレート又は−メタクリレー
ト、アクロレイン又はＮ−アリルメタクリルアミドとの
共重合体も使用することができる。
もちろん、紫外線の作用下又はラジカル形成体（レツ
ドクス開始剤）によつて初めて結合活性を生じるような
結合成分、例えばジアリルエーテル又はアクリル−又は
メタクリルアミドとｐ−トルイル−ヒドロキシエチルメ
タクリレートとの共重体は残つていなければならない。
ドクス開始剤）によつて初めて結合活性を生じるような
結合成分、例えばジアリルエーテル又はアクリル−又は
メタクリルアミドとｐ−トルイル−ヒドロキシエチルメ
タクリレートとの共重体は残つていなければならない。
不可逆的固定に必要な結合成分量は、タンパク質及び
場合によつては担体に対する同成分の反応能力に依存
し、例えばタンパク質の重量に対して１〜100重量％の
範囲にあつてよい。結合の反応条件は一般に吸着反応条
件とは異つていて、両反応は同一条件下では同時に進行
することができる。グルタルジアルデヒドを用いる結合
の場合には、一般に０〜80℃の温度で0.1〜100時間、好
ましくは２時間の反応時間で十分である。
場合によつては担体に対する同成分の反応能力に依存
し、例えばタンパク質の重量に対して１〜100重量％の
範囲にあつてよい。結合の反応条件は一般に吸着反応条
件とは異つていて、両反応は同一条件下では同時に進行
することができる。グルタルジアルデヒドを用いる結合
の場合には、一般に０〜80℃の温度で0.1〜100時間、好
ましくは２時間の反応時間で十分である。
固定反応後には一般に、場合によりタンパク質及び結
合成分の未結合残分を含有する電解質溶液を負荷された
担体から分離する。この負荷担体は適当な緩衝液を用い
て後洗浄して、工業的応用のために使用する。
合成分の未結合残分を含有する電解質溶液を負荷された
担体から分離する。この負荷担体は適当な緩衝液を用い
て後洗浄して、工業的応用のために使用する。
実施例 例１ 固定グルコースイソメラーゼ 担体：内部表面積約200m2/g及び平均孔径40nmを有す
るパール状高架橋巨大多孔質スチロール／ジビニルベン
ジル。
るパール状高架橋巨大多孔質スチロール／ジビニルベン
ジル。
酵素：クルコースイソメラーゼ、ストレプトミセス・
アルブス（Streptomyces albus）の培養物からの液状濃
縮物。
アルブス（Streptomyces albus）の培養物からの液状濃
縮物。
活性：酵素1gがpH7、温度70℃で60分間にＤ−グルコ
ース溶液0.1molからＤ−フルクトース5gを生成する。
ース溶液0.1molからＤ−フルクトース5gを生成する。
結合：先づ巨大多孔質担体に対する酵素の吸着が行わ
れる。このために担体10gを、塩溶液（硫酸ナトリウム1
2％、硫酸マグネシウム５％及び硫酸コバルト0.02％を
含有する）5ml中の酵素10gと一緒に回転台（Rollbank）
でころがす。水性溶液のイオン濃度は4.18mol/lであ
る。pH値は7.0に調整した。20時間後に0.5％グルタルジ
アルデヒドを加えて、再びころがす。これによつて吸着
された酵素は“横架橋され（quervernetzt）”、細孔中
に固定される。
れる。このために担体10gを、塩溶液（硫酸ナトリウム1
2％、硫酸マグネシウム５％及び硫酸コバルト0.02％を
含有する）5ml中の酵素10gと一緒に回転台（Rollbank）
でころがす。水性溶液のイオン濃度は4.18mol/lであ
る。pH値は7.0に調整した。20時間後に0.5％グルタルジ
アルデヒドを加えて、再びころがす。これによつて吸着
された酵素は“横架橋され（quervernetzt）”、細孔中
に固定される。
２時間後に吸引し、洗浄する。活性の比較的測定によ
つて45％の濾液の残余活性が得られる。担体では37％が
再び検出される（＝活性収率37％）。
つて45％の濾液の残余活性が得られる。担体では37％が
再び検出される（＝活性収率37％）。
応用：固定グルコースイソメラーゼを、カラム反応器
に充填する。60℃の温度でpH＝7.5の40％グルコース溶
液は１時間当り固定床容積の７倍の流量で40％が異性化
されてフルクトースになつた。
に充填する。60℃の温度でpH＝7.5の40％グルコース溶
液は１時間当り固定床容積の７倍の流量で40％が異性化
されてフルクトースになつた。
例２ 固定アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）
−ラクターゼ 担体：架橋ポリアクリル酸エステル、25nmの平均孔
径、内部表面積140m2/g、直径0.3〜1mmのパール状担
体。
−ラクターゼ 担体：架橋ポリアクリル酸エステル、25nmの平均孔
径、内部表面積140m2/g、直径0.3〜1mmのパール状担
体。
酵素：アスペルギルス・オリザエ−ラクターゼ、粉末
状濃縮物、活性＝30,000u/g。
状濃縮物、活性＝30,000u/g。
結合：担体10gを、酵素製剤1gと一緒に35℃で塩溶液4
0ml中で８時間振盪する。同塩溶液は塩化カリウム24％
を含有し、pH＝5.0に調整した。水性溶液はイオン濃度
3.21mol/lを有している。さらに酵素安定化のためにラ
クトース0.1％を加えた。次に冷却し、室温でさらに２
時間グルタルジアルデヒド0.5％を添加しながら振盪す
る。次に吸引し洗浄する。担体及び濾液のラクターゼ活
性を比較する。担体については使用した活性の34％が再
び検出され、濾液では11％である。活性収率＝34％。
0ml中で８時間振盪する。同塩溶液は塩化カリウム24％
を含有し、pH＝5.0に調整した。水性溶液はイオン濃度
3.21mol/lを有している。さらに酵素安定化のためにラ
クトース0.1％を加えた。次に冷却し、室温でさらに２
時間グルタルジアルデヒド0.5％を添加しながら振盪す
る。次に吸引し洗浄する。担体及び濾液のラクターゼ活
性を比較する。担体については使用した活性の34％が再
び検出され、濾液では11％である。活性収率＝34％。
応用：固定したアスペルギルス−ラクターゼをカラム
反応器に充填する。35℃の温度でpH＝4.5の５％ラクト
ース溶液は、１時間当り40倍の固定床容積の流量で90％
以上が加水分解される。60日後にはもう認められる程の
活性低下は検出できない。
反応器に充填する。35℃の温度でpH＝4.5の５％ラクト
ース溶液は、１時間当り40倍の固定床容積の流量で90％
以上が加水分解される。60日後にはもう認められる程の
活性低下は検出できない。
例３ 固定酵母ラクターゼ 担体：遊離エポキシ基（オキシラン酸素1.2％）及び
孔内面に集中している付着イソプロペニル基2.2％を有
するメタクリルアミド／メチレン−ビス−メタクリルア
ミドをベースとするパール状の高架橋巨大多孔質重合
体。孔容積＝3.4ml/g、平均孔径＝2nm。該担体の製造は
西独国特許出願公開第2722751号の例２に記載してあ
る。
孔内面に集中している付着イソプロペニル基2.2％を有
するメタクリルアミド／メチレン−ビス−メタクリルア
ミドをベースとするパール状の高架橋巨大多孔質重合
体。孔容積＝3.4ml/g、平均孔径＝2nm。該担体の製造は
西独国特許出願公開第2722751号の例２に記載してあ
る。
この場合には吸着酵素の結合は、高い塩濃度の作用下
に酵素の吸着と同時にエポキシ基によつて共有的に行わ
れる。
に酵素の吸着と同時にエポキシ基によつて共有的に行わ
れる。
酵素：サツカロミセス（Saccharomyces）〔クルイベ
ロミセス（Kluyveromyces）〕・ラクチス（lactis）、
液状製剤、5000中性ラクターゼ単位（NLU）。
ロミセス（Kluyveromyces）〕・ラクチス（lactis）、
液状製剤、5000中性ラクターゼ単位（NLU）。
結合：担体10gを、酵素10gと一緒に室温（23℃）で塩
溶液80g中で塩盪する。塩溶液は燐酸水素ジカリウム16
％、燐酸二水素カリウム7.9％及び酵素安定化のためにM
n（II）塩化物・４H2Oを含有する。同溶液は3.34mol/l
のイオン濃度を有する。72時間後に吸引濾過し、洗浄し
かつ濾液のラクターゼ活性を担体の同活性と比較する。
担体に関しては使用した活性の55％が再び検出され、濾
液では14％である。
溶液80g中で塩盪する。塩溶液は燐酸水素ジカリウム16
％、燐酸二水素カリウム7.9％及び酵素安定化のためにM
n（II）塩化物・４H2Oを含有する。同溶液は3.34mol/l
のイオン濃度を有する。72時間後に吸引濾過し、洗浄し
かつ濾液のラクターゼ活性を担体の同活性と比較する。
担体に関しては使用した活性の55％が再び検出され、濾
液では14％である。
従つて活性収率はこの感受性酵素の場合には55％で極
めて高い。
めて高い。
応用：結合酵母ラクターゼをカラム反応器に充填す
る。温度７℃で脱脂乳（脂肪0.3％）を20日間55×固定
床容積／時の流量で導通させる。脱脂乳中に含有してい
るラクトースは初めは65％がグルコース及びガラクトー
スに加水分解され、20日間後にはなお50％が加水分解さ
れる。
る。温度７℃で脱脂乳（脂肪0.3％）を20日間55×固定
床容積／時の流量で導通させる。脱脂乳中に含有してい
るラクトースは初めは65％がグルコース及びガラクトー
スに加水分解され、20日間後にはなお50％が加水分解さ
れる。
例４ 固定アミノ酸アシラーゼ 担体：遊離エポキシ基（オキシラン酸素1.2％）及び
孔内面に集中している付着イソプロペニル基2.2％を有
するメタクリルアミド／メチレン−ビス−メタクリルア
ミドをベースとするパール状の高架橋巨大多孔質重合
体。孔容積＝3.4ml/g、平均孔径＝20nm。この担体の製
造は西独国特許出願公開第2722751号の例２に記載され
ている。
孔内面に集中している付着イソプロペニル基2.2％を有
するメタクリルアミド／メチレン−ビス−メタクリルア
ミドをベースとするパール状の高架橋巨大多孔質重合
体。孔容積＝3.4ml/g、平均孔径＝20nm。この担体の製
造は西独国特許出願公開第2722751号の例２に記載され
ている。
酵素：アスペルギルス（Aspergillus）菌株からの粉
末状アミノ酸アシラーゼ濃縮物。活性:23,000U/g、基質
＝アセチル−D,L−メチオニン。
末状アミノ酸アシラーゼ濃縮物。活性:23,000U/g、基質
＝アセチル−D,L−メチオニン。
結合：担体10gを酵素製剤20gと一緒に35℃で塩溶液80
ml中で振盪する。塩溶液は硫酸ナトリウム14.2％及びコ
バルト（II）塩化物・６H2O 24ppmを含有しており、pH
＝70に調整してある。同溶液のイオン濃度は、酵素製剤
の塩分を考慮することなく3mol/lである。
ml中で振盪する。塩溶液は硫酸ナトリウム14.2％及びコ
バルト（II）塩化物・６H2O 24ppmを含有しており、pH
＝70に調整してある。同溶液のイオン濃度は、酵素製剤
の塩分を考慮することなく3mol/lである。
８時間後に担体を吸引し、洗浄する。担体に関しては
使用された活性の61％が検出され、濾液の場合には１％
である。従つて61％の活性収率が得られた。
使用された活性の61％が検出され、濾液の場合には１％
である。従つて61％の活性収率が得られた。
例５ 種々の担体に対するペニシリンアミダーゼの結合 表１による湿潤担体物質それぞれ3.5gを、その都度脱
塩水の５倍量で５回洗浄しかつガラスフリツトで吸引す
る。次に担体物質を、Ｋ−燐酸塩緩衝液（pH7.5、NaN
30.1％を含む）0.5M中のE.coli源ペニシリンアミダーゼ
676国際単位（Internat.Units）を含有する酵素溶液6.8
mlと一緒に約21℃で２時間振盪する。緩衝液のイオン濃
度は1.5mol/lである。イオン交換樹脂〔アンバーリツト
（Amberlite A 21）〕を介して安定化された25％グル
タルジアルデヒド水性溶液0.136mlを加えた後さらに２
時間振盪する。次に負荷された担体物質を水と一緒にガ
ラスフリツト上にもたらし、1M NaClで３回、0.05M Na
−燐酸塩緩衝液（pH7.5、NaN30.1％を含む）で４回洗浄
する。
塩水の５倍量で５回洗浄しかつガラスフリツトで吸引す
る。次に担体物質を、Ｋ−燐酸塩緩衝液（pH7.5、NaN
30.1％を含む）0.5M中のE.coli源ペニシリンアミダーゼ
676国際単位（Internat.Units）を含有する酵素溶液6.8
mlと一緒に約21℃で２時間振盪する。緩衝液のイオン濃
度は1.5mol/lである。イオン交換樹脂〔アンバーリツト
（Amberlite A 21）〕を介して安定化された25％グル
タルジアルデヒド水性溶液0.136mlを加えた後さらに２
時間振盪する。次に負荷された担体物質を水と一緒にガ
ラスフリツト上にもたらし、1M NaClで３回、0.05M Na
−燐酸塩緩衝液（pH7.5、NaN30.1％を含む）で４回洗浄
する。
酵素活性を、基質としてのペニシリン−GK（粗製）に
対してpH7.5でアルカリ滴定法によつて測定した。この
ためにその都度0.05M Na−燐酸塩溶液（pH7.5）中の２
％基質溶液20mlを使用しかつ37℃で0.5M苛性ソーダ溶液
で自動的に滴定した。結果は表１に記載してある。
対してpH7.5でアルカリ滴定法によつて測定した。この
ためにその都度0.05M Na−燐酸塩溶液（pH7.5）中の２
％基質溶液20mlを使用しかつ37℃で0.5M苛性ソーダ溶液
で自動的に滴定した。結果は表１に記載してある。
例６ フエニル−セフアローズ（Sepharose）に対するトリプ
シンの結合 例１と同様にしてフエニルセフアローズ3.5g（湿潤重
量）を前処理する。次に0.5M燐酸カリウム緩衝液（pH7.
5、NaN30.1を含む）6.8ml中に溶したトリプシン150mgを
加え、23℃で２時間振盪する。イオン濃度は1.5mol/lで
ある。吸着酵素の固定及び後処理は例１と同様に行う。
シンの結合 例１と同様にしてフエニルセフアローズ3.5g（湿潤重
量）を前処理する。次に0.5M燐酸カリウム緩衝液（pH7.
5、NaN30.1を含む）6.8ml中に溶したトリプシン150mgを
加え、23℃で２時間振盪する。イオン濃度は1.5mol/lで
ある。吸着酵素の固定及び後処理は例１と同様に行う。
酵素活性を基質としてのカゼイン及びＮ−ベンゾイル
−１−アルギニンエチルエステル−ヒドロキシド（BAE
E）に対して測定した。
−１−アルギニンエチルエステル−ヒドロキシド（BAE
E）に対して測定した。
結果：カゼインの場合 8.3U/g湿潤重量 BAEEの場合 311 U/g湿潤重量 例７ 担体結合ラクターゼ製剤の製造 30,000U/gを有するアスペルギルス・オリザエ（Asper
gillus oryzae）〔商品名“ラクターゼ−プレパラート
（Lactase−Preparat）2214 C Kong."、レームGmbH
製〕1gをその都度、イオン濃度2.1mol/lの0.7M Na2SO4
溶液（pH5.5）40ml中に溶かし、その都度この溶液に表
２に記載した担体樹脂10gを加え、室温で20時間振盪す
る。次に25％グルタルジアルデヒド水性溶液0.8mlを加
え、室温で２時間振盪する。製剤を濾取して、洗浄しか
つ固定した酵素及び濾液中に残存している酵素の活性を
測定しかつ使用した活性に対するパーセントで表わす。
結果は表２に示す。
gillus oryzae）〔商品名“ラクターゼ−プレパラート
（Lactase−Preparat）2214 C Kong."、レームGmbH
製〕1gをその都度、イオン濃度2.1mol/lの0.7M Na2SO4
溶液（pH5.5）40ml中に溶かし、その都度この溶液に表
２に記載した担体樹脂10gを加え、室温で20時間振盪す
る。次に25％グルタルジアルデヒド水性溶液0.8mlを加
え、室温で２時間振盪する。製剤を濾取して、洗浄しか
つ固定した酵素及び濾液中に残存している酵素の活性を
測定しかつ使用した活性に対するパーセントで表わす。
結果は表２に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルムート・ウーリツヒ ドイツ連邦共和国 ロスドルフ １ アウ フ・デム・ヴインゲルト ４ (72)発明者 ライナー・シユネー ドイツ連邦共和国 ダルムシユタツト・ア ルハイルガー・ヴオーグシユトラーセ 62 (56)参考文献 特開 昭59−216586（ＪＰ，Ａ) 英国特許2129809（ＧＢ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】水に不溶の巨大多孔質固体担体に電解質の
存在で溶解タンパク質を固定するに当り、少なくとも0.
15mol/lの電解質イオン濃度を有するタンパク質の水性
溶液を、同水性溶液によつて接触される担体上に、担体
に対するタンパク質の吸着が行われてしまうまで作用さ
せることを特徴とする溶解タンパク質の固定方法。 - 【請求項２】タンパク質吸着の前、間又は後に、担体に
吸着されたタンパク質を架橋させる水溶性結合成分を、
電解質含有溶液に加える特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】共有結合された陽イオン基を有しないか又
は0.1m当量/g未満の同基を有する担体を使用する特許請
求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 - 【請求項４】乾燥分1g当りせいぜい5m当量の共有結合さ
れた陰イオン基を有する担体を使用する特許請求の範囲
第３項記載の方法。 - 【請求項５】乾燥分1g当りせいぜい0.1m当量の共有結合
された陰イオン基を有する担体を使用する特許請求の範
囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】水性媒体中でせいぜい２倍の体積に膨潤す
る担体を使用する特許請求の範囲第１項から第４項まで
のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項７】担体を小粒子の形で、特にパール状で使用
する特許請求の範囲第６項記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE3515252.4 | 1985-04-27 | ||
| DE3515252A DE3515252C2 (de) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | Verfahren zur Immobilisierung gelöster Eiweißstoffe |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61249390A JPS61249390A (ja) | 1986-11-06 |
| JPH084505B2 true JPH084505B2 (ja) | 1996-01-24 |
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|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0200107B1 (ja) |
| JP (1) | JPH084505B2 (ja) |
| AT (1) | ATE68525T1 (ja) |
| DE (2) | DE3515252C2 (ja) |
| DK (1) | DK189286A (ja) |
| FI (1) | FI93124C (ja) |
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| US5449759A (en) * | 1987-05-16 | 1995-09-12 | Somatogen, Inc. | Hemoglobins with intersubunit desulfide bonds |
| DK427987A (da) * | 1987-08-17 | 1989-02-18 | Vnii Biotekhnologii | Fremgangsmaade til immobilisering af fungal beta-galactosidase |
| GB2208649A (en) * | 1987-08-17 | 1989-04-12 | Vnii Biotekhnologii | Immobilization of fungal beta -galactosidase on an inorganic carrier |
| US5545727A (en) * | 1989-05-10 | 1996-08-13 | Somatogen, Inc. | DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin |
| US5092992A (en) * | 1989-06-07 | 1992-03-03 | J. T. Baker Inc. | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography |
| US5085779A (en) * | 1989-06-07 | 1992-02-04 | J. T. Baker, Inc. | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography |
| DE3932521C1 (en) * | 1989-09-29 | 1991-04-25 | Nitra Gesellschaft Fuer Biotechnik Mbh, 2100 Hamburg, De | Removing nitric oxide from enclosed atmos. - comprises culturing nitrifying bacteria in aq. suspension on membrane |
| DE4029374A1 (de) * | 1990-09-15 | 1992-03-19 | Roehm Gmbh | Immobilisierte enzyme |
| US5200471A (en) * | 1990-11-05 | 1993-04-06 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Biomolecules covalently immobilized with a high bound specific biological activity and method of preparing same |
| EP0611306B1 (en) * | 1991-11-08 | 1998-07-08 | Somatogen, Inc. | Hemoglobins as drug delivery agents |
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1985
- 1985-04-27 DE DE3515252A patent/DE3515252C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1986
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- 1986-04-17 EP EP86105330A patent/EP0200107B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-17 DE DE8686105330T patent/DE3681953D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-21 FI FI861662A patent/FI93124C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-04-24 DK DK189286A patent/DK189286A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-04-25 JP JP61094942A patent/JPH084505B2/ja not_active Expired - Lifetime
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1988
- 1988-02-16 US US07/161,204 patent/US4839419A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| FI93124C (fi) | 1995-02-27 |
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