JPH084510B2 - ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ - Google Patents
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡInfo
- Publication number
- JPH084510B2 JPH084510B2 JP1163662A JP16366289A JPH084510B2 JP H084510 B2 JPH084510 B2 JP H084510B2 JP 1163662 A JP1163662 A JP 1163662A JP 16366289 A JP16366289 A JP 16366289A JP H084510 B2 JPH084510 B2 JP H084510B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bani
- restriction endonuclease
- dna
- methylase
- plasmid
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はBanI制限エンドヌクレアーゼをコードするDN
A、に関する。
A、に関する。
II型制限酵素はいままでのところ細菌等から約120種
類のII型制限酵素が発見され商品化されている。II型制
限酵素はデオキシリボ核酸（DNA）鎖中のある特定の塩
基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の高い酵
素であり、遺伝子工学の分野で幅広く利用されている。
また遺伝子診断による臨床検査にもその利用が期待され
ている。BanI制限エンドヌクレアーゼはII型制限酵素の
ひとつである。本酵素はDNAの塩基配列中のGGPyPuCCを
認識しこれを切断する酵素であり、バチルス アノイリ
ノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）IAM1077に
おいて生産される酵素であるが、このバチルス アノイ
リノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）IAM1077
は、BanI以外に他の制限酵素BanII,BanIIIを菌体内に同
時に生産するためこれらを除くことが非常に困難であり
製造上の問題を抱えていた。
類のII型制限酵素が発見され商品化されている。II型制
限酵素はデオキシリボ核酸（DNA）鎖中のある特定の塩
基配列を認識し、これを切断する極めて特異性の高い酵
素であり、遺伝子工学の分野で幅広く利用されている。
また遺伝子診断による臨床検査にもその利用が期待され
ている。BanI制限エンドヌクレアーゼはII型制限酵素の
ひとつである。本酵素はDNAの塩基配列中のGGPyPuCCを
認識しこれを切断する酵素であり、バチルス アノイリ
ノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）IAM1077に
おいて生産される酵素であるが、このバチルス アノイ
リノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）IAM1077
は、BanI以外に他の制限酵素BanII,BanIIIを菌体内に同
時に生産するためこれらを除くことが非常に困難であり
製造上の問題を抱えていた。
一方、制限サイトメチラーゼは制限酵素の認識塩基配
列をメチル化するものであって、遺伝子操作では制限酵
素の認識配列をメチル化することによりそれに対応する
制限酵素による切断を防ぐことに使われているものであ
るが、BanI制限エンドヌクレアーゼの認識塩基配列をメ
チル化するBanIメチラーゼ、及びそのDNAを取得した例
は現在まで見当らない。
列をメチル化するものであって、遺伝子操作では制限酵
素の認識配列をメチル化することによりそれに対応する
制限酵素による切断を防ぐことに使われているものであ
るが、BanI制限エンドヌクレアーゼの認識塩基配列をメ
チル化するBanIメチラーゼ、及びそのDNAを取得した例
は現在まで見当らない。
遺伝子操作技術を使用してバチルス アノイリノリテ
ィカス（Bacillus aneurinolyticus）以外の宿主にBanI
制限エンドヌクレアーゼを生産させることができれば、
該バチルス アノイリノリティカス（Bacillus aneurin
olyticus）に由来する夾雑酵素の問題は解決し、純粋な
BanI制限エンドヌクレアーゼを得ることが可能となる。
本発明の課題は、この遺伝子操作技術によりBanI制限エ
ンドヌクレアーゼを生産する際に、まず必要となる該酵
素をコードするDNAを提供することにある。
ィカス（Bacillus aneurinolyticus）以外の宿主にBanI
制限エンドヌクレアーゼを生産させることができれば、
該バチルス アノイリノリティカス（Bacillus aneurin
olyticus）に由来する夾雑酵素の問題は解決し、純粋な
BanI制限エンドヌクレアーゼを得ることが可能となる。
本発明の課題は、この遺伝子操作技術によりBanI制限エ
ンドヌクレアーゼを生産する際に、まず必要となる該酵
素をコードするDNAを提供することにある。
本発明者らはBanI制限エンドヌクレアーゼ生産菌から
染色体DNAを採取し得られた染色体DNAを適当な制限酵素
で消化してpBR322などのプラスミドに組み込み、このプ
ラスミドにより大腸菌等に形質転換し、形質転換菌を増
殖させてBanI制限エンドヌクレアーゼ、またはBanIメチ
ラーゼ生産菌をそれぞれ単離し、これら生産菌を培養す
ることにより、BanI制限エンドヌクレアーゼ及びBanIメ
チラーゼを採取するとともに、これら酵素をコードする
DNAを単離、同定することにも成功し、本発明を完成す
るに至ったものである。
染色体DNAを採取し得られた染色体DNAを適当な制限酵素
で消化してpBR322などのプラスミドに組み込み、このプ
ラスミドにより大腸菌等に形質転換し、形質転換菌を増
殖させてBanI制限エンドヌクレアーゼ、またはBanIメチ
ラーゼ生産菌をそれぞれ単離し、これら生産菌を培養す
ることにより、BanI制限エンドヌクレアーゼ及びBanIメ
チラーゼを採取するとともに、これら酵素をコードする
DNAを単離、同定することにも成功し、本発明を完成す
るに至ったものである。
すなわち本発明は、 （１）バチルスアノイリノリティカス（Bacillusaneuri
nolyticus）由来のBanI制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするDNA断片であって、次に式Ｉで表わされるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片。
nolyticus）由来のBanI制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするDNA断片であって、次に式Ｉで表わされるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片。
式Ｉ （２）（１）記載のDNA断片を含む発現ベクター。
に関する。
以下に本発明を詳述する。
本発明のBanI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドは例えばエシェリヒア（Esheri−chia）属に属
する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）として知ら
れるコリシンE1因子等の培養された細胞内で増殖しうる
型式をとるプラスミドにバチルス アノイリノリティカ
ス（Bacillus aneurinolyticus）IAM1077由来のBanI制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子、BanIメチラーゼ遺伝子を
含むDNA断片、およびBanIメチラーゼのみを含むDNA断片
を組み込んでなるプラスミドであり、前記ベクターDNA
としては天然に存在するものを抽出したものの他、増殖
に必須な部分以外のDNAの部分が一部欠失しているもの
でもよくColE1の系統、pBR322の系統、pSC101の系統、p
MB9の系統、ラムダファージの系統が挙げられる。
ラスミドは例えばエシェリヒア（Esheri−chia）属に属
する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）として知ら
れるコリシンE1因子等の培養された細胞内で増殖しうる
型式をとるプラスミドにバチルス アノイリノリティカ
ス（Bacillus aneurinolyticus）IAM1077由来のBanI制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子、BanIメチラーゼ遺伝子を
含むDNA断片、およびBanIメチラーゼのみを含むDNA断片
を組み込んでなるプラスミドであり、前記ベクターDNA
としては天然に存在するものを抽出したものの他、増殖
に必須な部分以外のDNAの部分が一部欠失しているもの
でもよくColE1の系統、pBR322の系統、pSC101の系統、p
MB9の系統、ラムダファージの系統が挙げられる。
また前記ベクターDNAに前記染色体DNA断片を組み込む
方法は既知のいずれの方法も適用しうる。例えば適当な
制限酵素で処理して染色体DNAを特定部位で切断し、つ
いで同様に処理したベクターDNAと混合しリガーゼによ
って再結合する方法が用いられる。
方法は既知のいずれの方法も適用しうる。例えば適当な
制限酵素で処理して染色体DNAを特定部位で切断し、つ
いで同様に処理したベクターDNAと混合しリガーゼによ
って再結合する方法が用いられる。
ベクターDNAとしてpBR322プラスミドを用いこれにバ
チルス アノイリノリティカス（Bacillusaneurinolyti
cus）IAM1077から調製された染色体DNA断片を組み込む
ことにより、新規プラスミドpBANIRM ８が得られる。p
BANIRM ８プラスミドの制限酵素地図を第１図に示す。
第１図に示す様にこのプラスミドはpBR322プラスミドの
制限サイトにバチルス アノイリノリティカス（Bacill
us aneurinolyticus）IAM1077のBanI制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子、およびBanIメチラーゼ遺伝子を含むDNA
断片が組み込まれた8kbの塩基対を有するプラスミドで
ある。
チルス アノイリノリティカス（Bacillusaneurinolyti
cus）IAM1077から調製された染色体DNA断片を組み込む
ことにより、新規プラスミドpBANIRM ８が得られる。p
BANIRM ８プラスミドの制限酵素地図を第１図に示す。
第１図に示す様にこのプラスミドはpBR322プラスミドの
制限サイトにバチルス アノイリノリティカス（Bacill
us aneurinolyticus）IAM1077のBanI制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子、およびBanIメチラーゼ遺伝子を含むDNA
断片が組み込まれた8kbの塩基対を有するプラスミドで
ある。
本発明のBanI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子、および
BanIメチラーゼ遺伝子は次の同様にして同定できる。
BanIメチラーゼ遺伝子は次の同様にして同定できる。
まず本発明者らは、BanI制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を同定するため本プラスミド菌株エッシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）HB101（pBanIRM8）（FERM P−
9424）〔エッシェリヒア コリ（Escherichia coli）H
B101（pBAN11）と同じである。〕を培養し、菌体を取得
した。
子を同定するため本プラスミド菌株エッシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）HB101（pBanIRM8）（FERM P−
9424）〔エッシェリヒア コリ（Escherichia coli）H
B101（pBAN11）と同じである。〕を培養し、菌体を取得
した。
本菌体よりBanI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメチラ
ーゼをそれぞれ電気泳動（SDS PAGE）でシングルバンド
になるまで精製純化し本標品にてアミノ酸シーケンサー
によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。
ーゼをそれぞれ電気泳動（SDS PAGE）でシングルバンド
になるまで精製純化し本標品にてアミノ酸シーケンサー
によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。
更にBanI制限エンドヌクレアーゼを生産する上記菌株
を培養しその培養菌体よりプラスミドを調製した。本プ
ラスミドは当然ながらBanI制限エンドヌクレアーゼを暗
号化しているDNAとBanIメチラーゼを暗号化しているDNA
を保有しており、これを用いて塩基配列を決定できる。
DNA塩基配列を決めるため本プラスミドより上記２つの
酵素を暗号化していると思われる領域のDNA断片を塩基
配列決定に適したベクター、例えばpUC18,M13mp18に移
し、M13−ジオキシ法（Sanger,Pro.Natl.Acad.Sci.74,5
463−5467（1977）より決定した。即ちpUC18,M13mp18に
組み換えプラスミドに変えた後、種々制限酵素による制
限酵素サイトの決定、及びサブクローニング、マグビー
ンヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIIIを用いるデレ
ーション法により、種々デレーションミュータントを作
成しBanI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子、BanIメチラー
ゼ遺伝子の領域を決定した。さらに、デレーション ミ
ュータントの挿入DNA断片の塩基配列を決定した。ま
た、制限酵素活性、メチラーゼ活性のうち前者の活性の
みが発現するデレーション ミュータントでは菌が死滅
するため、塩基配列を決めるべき領域のDNAが取れない
ため塩基配列が決められないことがある。そのような場
合、カスタムプライマー法等を活用して決定した。
を培養しその培養菌体よりプラスミドを調製した。本プ
ラスミドは当然ながらBanI制限エンドヌクレアーゼを暗
号化しているDNAとBanIメチラーゼを暗号化しているDNA
を保有しており、これを用いて塩基配列を決定できる。
DNA塩基配列を決めるため本プラスミドより上記２つの
酵素を暗号化していると思われる領域のDNA断片を塩基
配列決定に適したベクター、例えばpUC18,M13mp18に移
し、M13−ジオキシ法（Sanger,Pro.Natl.Acad.Sci.74,5
463−5467（1977）より決定した。即ちpUC18,M13mp18に
組み換えプラスミドに変えた後、種々制限酵素による制
限酵素サイトの決定、及びサブクローニング、マグビー
ンヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIIIを用いるデレ
ーション法により、種々デレーションミュータントを作
成しBanI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子、BanIメチラー
ゼ遺伝子の領域を決定した。さらに、デレーション ミ
ュータントの挿入DNA断片の塩基配列を決定した。ま
た、制限酵素活性、メチラーゼ活性のうち前者の活性の
みが発現するデレーション ミュータントでは菌が死滅
するため、塩基配列を決めるべき領域のDNAが取れない
ため塩基配列が決められないことがある。そのような場
合、カスタムプライマー法等を活用して決定した。
その結果、 式II で表されるBanI制限エンドヌクレアーゼをコードするDN
A配列及び 式IV で表されるBanIメチラーゼをコードするDNA配列を決定
した。
A配列及び 式IV で表されるBanIメチラーゼをコードするDNA配列を決定
した。
塩基配列から決定したＮ末端のアミノ酸配列は精製Ba
nI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメチラーゼ標品から得
たＮ末端のアミノ酸配列と一致した。ここで塩基配列を
決定したDNA配列を利用して各々の遺伝子を採取するこ
とが可能となると同時に遺伝子操作の手法を利用してBa
nI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメチラーゼの生産系を
構築することができる。遺伝子操作の手法を用いて物質
生産を行うには大腸菌、酵母または動物細胞を用いた系
のいずれを使用してもよい。（日本生化学会編“遺伝子
研究法II"pp126−150,pp170−204（1986））。例えば大
腸菌を宿主としてBanI制限エンドヌクレアーゼを生産す
るには前記のDNA配列に発現のため制御部位、例えばト
リプトファンオペロンのプロモーターとSD配列を付加し
たDNA配列をBanIメチラーゼ遺伝子を付加したpBR322な
どのベクターDNAに連結し、大腸菌に導入すればよい。
nI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメチラーゼ標品から得
たＮ末端のアミノ酸配列と一致した。ここで塩基配列を
決定したDNA配列を利用して各々の遺伝子を採取するこ
とが可能となると同時に遺伝子操作の手法を利用してBa
nI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメチラーゼの生産系を
構築することができる。遺伝子操作の手法を用いて物質
生産を行うには大腸菌、酵母または動物細胞を用いた系
のいずれを使用してもよい。（日本生化学会編“遺伝子
研究法II"pp126−150,pp170−204（1986））。例えば大
腸菌を宿主としてBanI制限エンドヌクレアーゼを生産す
るには前記のDNA配列に発現のため制御部位、例えばト
リプトファンオペロンのプロモーターとSD配列を付加し
たDNA配列をBanIメチラーゼ遺伝子を付加したpBR322な
どのベクターDNAに連結し、大腸菌に導入すればよい。
酵母を宿主とする場合、発現の制御部位としては、抑
制性酸性フォスファターゼ遺伝子やグリセロアルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなど
が知られており、酵母内での複製オリジンとしては２μ
ｍプラスミド由来、酵母染色体由来のものを用いるとよ
い。動物細胞を宿主とする場合、発現制御部位としたSV
40プロモーターやHBウイルス遺伝子のプロモーターなど
がしられており、複製開始としてはSV40やポリオーマウ
イルスのものを用いるとよい。また、BanI制限エンドヌ
クレアーゼをコードするDNAのみを使用する場合には宿
主が増殖できない場合があるから本発明のBanI制限エン
ドヌクレアーゼをコードするDNAと、BanIメチラーゼを
コードするDNAと併用して上記のような発現系を構築す
れば、BanI制限エンドヌクレアーゼを大量に生産するこ
とができる。BanIメチラーゼのみを生産したい時は上記
発現系にBanIメチラーゼ遺伝子のみ利用すれば本酵素の
みを大量に生産できる。
制性酸性フォスファターゼ遺伝子やグリセロアルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなど
が知られており、酵母内での複製オリジンとしては２μ
ｍプラスミド由来、酵母染色体由来のものを用いるとよ
い。動物細胞を宿主とする場合、発現制御部位としたSV
40プロモーターやHBウイルス遺伝子のプロモーターなど
がしられており、複製開始としてはSV40やポリオーマウ
イルスのものを用いるとよい。また、BanI制限エンドヌ
クレアーゼをコードするDNAのみを使用する場合には宿
主が増殖できない場合があるから本発明のBanI制限エン
ドヌクレアーゼをコードするDNAと、BanIメチラーゼを
コードするDNAと併用して上記のような発現系を構築す
れば、BanI制限エンドヌクレアーゼを大量に生産するこ
とができる。BanIメチラーゼのみを生産したい時は上記
発現系にBanIメチラーゼ遺伝子のみ利用すれば本酵素の
みを大量に生産できる。
以下実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例１ （１） BanI制限エンドヌクレアーゼの遺伝子をもつ染
色体DNAの調製 バチルス アノイリノリティカス（Bacillusaneurino
lyticus）IAM1077をＬ−broth培地（純水１当りトリ
プトン（Difco）10g,酵母エキス5g,NaCl 10gをpH7.0に
調製したもの）50mlに接種し、30℃で振とう培養をおこ
ない、14時間後菌体を集めた。次に集めた菌体を10mg/m
lのリゾチーム（太陽化学（株）製）、20％ショ糖、1mM
EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20mlに懸濁
し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイルサルコ
シン酸を含む0.1M EDTA溶液（pH9.6）44ml及び5.44mg/m
lのプロナーゼ溶液2.0mlを加え、500℃で30分間静置し
た。次に塩化セシウム66g,10mg/mlのエチジウムブロマ
イド溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm、40時間
の遠心分離をおこなった。DNAを注射器で抜取り、ｎ−
ブタノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去
し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に
透析することにより約500μｇの染色体DNAを取得した。
色体DNAの調製 バチルス アノイリノリティカス（Bacillusaneurino
lyticus）IAM1077をＬ−broth培地（純水１当りトリ
プトン（Difco）10g,酵母エキス5g,NaCl 10gをpH7.0に
調製したもの）50mlに接種し、30℃で振とう培養をおこ
ない、14時間後菌体を集めた。次に集めた菌体を10mg/m
lのリゾチーム（太陽化学（株）製）、20％ショ糖、1mM
EDTAを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）20mlに懸濁
し、37℃で10分間静置した。次に１％ラウロイルサルコ
シン酸を含む0.1M EDTA溶液（pH9.6）44ml及び5.44mg/m
lのプロナーゼ溶液2.0mlを加え、500℃で30分間静置し
た。次に塩化セシウム66g,10mg/mlのエチジウムブロマ
イド溶液3.3mlを加え、混合した後に38,000rpm、40時間
の遠心分離をおこなった。DNAを注射器で抜取り、ｎ−
ブタノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去
し、1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に
透析することにより約500μｇの染色体DNAを取得した。
（２）染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得られた染色体DNA3μｇについて0.02ユニッ
トのSAu3AI制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃、１時
間の反応を行うことにより、これを部分分解した。次に
ベクタープラスミドpBR322（東洋紡績製）１μｇについ
て４ユニットのBamHI制限酵素を加え、37℃、１時間の
反応を行うことによりこれを完全分解し、更に１ユニッ
トのアルカリフォスファターゼを加え、37℃、１時間の
反応を行うことにより、５′末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体DNA断片と１
μｇのpBR322のDNA断片を混合し、更に1mMATP及び5mMジ
チオスライトールの存在下に５ユニットのT4ファージ由
来のDNAリガーゼを用いて15℃,16時間の連結反応を行う
ことにより染色体DNAを組込んだプラスミドDNAを取得し
た。
トのSAu3AI制限エンドヌクレアーゼを加え、37℃、１時
間の反応を行うことにより、これを部分分解した。次に
ベクタープラスミドpBR322（東洋紡績製）１μｇについ
て４ユニットのBamHI制限酵素を加え、37℃、１時間の
反応を行うことによりこれを完全分解し、更に１ユニッ
トのアルカリフォスファターゼを加え、37℃、１時間の
反応を行うことにより、５′末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体DNA断片と１
μｇのpBR322のDNA断片を混合し、更に1mMATP及び5mMジ
チオスライトールの存在下に５ユニットのT4ファージ由
来のDNAリガーゼを用いて15℃,16時間の連結反応を行う
ことにより染色体DNAを組込んだプラスミドDNAを取得し
た。
（３）BanI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む 組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリｋ−12株とエシリヒア・コリＢ株
のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB101株をL
B培地（純水１当りトリプトン（Difco）10g,酵母エキ
ス5g,NaCl 10gをpH7.0に調製したもの）10mlに接種し、
37℃で振とう培養を行い、対数増殖期まで生育させた後
に集菌した。これを氷冷下、最終濃度で0.03M CaCl2の
溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。この細胞
懸濁液に（２）で得たプラスミドDNAの溶解液を加え
て、氷冷下で60分反応させ、42℃,1−２分間ヒートショ
ックをあたえて、前記プラスミドDNAを細胞内にとり込
ませた。次いでこの細胞懸濁液を別途前記LB培地に接種
し、37℃,3−５時間振とう培養して且つBanI制限エンド
ヌクレアーゼを生産する株を分離し、エシェリヒア・コ
リHB101（pBanIRM8）（FERM P−9424）を得た。この形
質転換微生物に含まれるプラスミドpBanIRM8の制限酵素
地図を第１図に示す。またpBanIRM8をサブクローニング
してBanIメチラーゼを生産する株を分離しエシェリヒア
・コリ（pBanIM4）（FERM P−10741）を得た。
のハイブリッド株であるエシェリヒア・コリHB101株をL
B培地（純水１当りトリプトン（Difco）10g,酵母エキ
ス5g,NaCl 10gをpH7.0に調製したもの）10mlに接種し、
37℃で振とう培養を行い、対数増殖期まで生育させた後
に集菌した。これを氷冷下、最終濃度で0.03M CaCl2の
溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。この細胞
懸濁液に（２）で得たプラスミドDNAの溶解液を加え
て、氷冷下で60分反応させ、42℃,1−２分間ヒートショ
ックをあたえて、前記プラスミドDNAを細胞内にとり込
ませた。次いでこの細胞懸濁液を別途前記LB培地に接種
し、37℃,3−５時間振とう培養して且つBanI制限エンド
ヌクレアーゼを生産する株を分離し、エシェリヒア・コ
リHB101（pBanIRM8）（FERM P−9424）を得た。この形
質転換微生物に含まれるプラスミドpBanIRM8の制限酵素
地図を第１図に示す。またpBanIRM8をサブクローニング
してBanIメチラーゼを生産する株を分離しエシェリヒア
・コリ（pBanIM4）（FERM P−10741）を得た。
（４）エシェリヒア・コリHB101（pBanIRM8）によるBan
I制限エンドヌクレアーゼの生産 （３）で得られた形質転換株エシェリヒア・コリHB10
1（pBanIRM8）（FERM P−9424）を前記LB培地200L発酵
タンクで37℃,16時間通気攪拌培養を行った。これを遠
心分離して集菌、培養菌体385gをえた。得られた菌体10
0gよりBanI制限エンドヌクレアーゼを精製した。菌体10
0gをBufferA（10mM MgCl2,7mM2−メルカプトエタノール
を含んだ20mMトリス塩酸緩衝液pH7.5）500mlに懸濁し
た。この懸濁液を超音波破砕器ソニファイアにて10分間
破砕後、上澄液を調製した。上澄液を0.2MNaCl存在下で
ポリエチレンイミンを0.2％になるように添加し、8000r
pm、20分間遠心分離を行い上澄液を得た。この上澄液に
硫安を70％飽和加え、硫安沈澱後沈澱物を集め、10mMMg
Cl2,7mM2−メルカプトエタノールを含む20mMのトリス塩
酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し透析を行った。透析後、フ
ォスフォセルロースカラム（体積200ml）クロマトグラ
フィを行った。BanI制限エンドヌクレアーゼはKCI濃度
0.5M付近で溶出された。溶出された酵素液を透析チュー
ブに入れ透析した。透析液を更にヒドロキシアパタイト
カラム（80ml）クロマトグラフィを行った。リン酸濃度
0.3MにてBanI画分が溶出された。更にこの画分を透析後
DEAE−セファロース（40ml）クロマトグラフィを行うと
BanIは洗浄画分に溶出することが認められた。この画分
を濃縮後セファクリルＳ−200ゲル濾過を実施した。ゲ
ル濾過BanI画分を透析チューブに入れ、2mM メルカプ
トエタノール、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液
に透析することにより2.8mlの酵素液が得られた。
I制限エンドヌクレアーゼの生産 （３）で得られた形質転換株エシェリヒア・コリHB10
1（pBanIRM8）（FERM P−9424）を前記LB培地200L発酵
タンクで37℃,16時間通気攪拌培養を行った。これを遠
心分離して集菌、培養菌体385gをえた。得られた菌体10
0gよりBanI制限エンドヌクレアーゼを精製した。菌体10
0gをBufferA（10mM MgCl2,7mM2−メルカプトエタノール
を含んだ20mMトリス塩酸緩衝液pH7.5）500mlに懸濁し
た。この懸濁液を超音波破砕器ソニファイアにて10分間
破砕後、上澄液を調製した。上澄液を0.2MNaCl存在下で
ポリエチレンイミンを0.2％になるように添加し、8000r
pm、20分間遠心分離を行い上澄液を得た。この上澄液に
硫安を70％飽和加え、硫安沈澱後沈澱物を集め、10mMMg
Cl2,7mM2−メルカプトエタノールを含む20mMのトリス塩
酸緩衝液（pH7.5）に懸濁し透析を行った。透析後、フ
ォスフォセルロースカラム（体積200ml）クロマトグラ
フィを行った。BanI制限エンドヌクレアーゼはKCI濃度
0.5M付近で溶出された。溶出された酵素液を透析チュー
ブに入れ透析した。透析液を更にヒドロキシアパタイト
カラム（80ml）クロマトグラフィを行った。リン酸濃度
0.3MにてBanI画分が溶出された。更にこの画分を透析後
DEAE−セファロース（40ml）クロマトグラフィを行うと
BanIは洗浄画分に溶出することが認められた。この画分
を濃縮後セファクリルＳ−200ゲル濾過を実施した。ゲ
ル濾過BanI画分を透析チューブに入れ、2mM メルカプ
トエタノール、50％グリセロールを含んだリン酸緩衝液
に透析することにより2.8mlの酵素液が得られた。
この精製BanI酵素をSDS−PAGE法にて蛋白純度を調べ
ると単一のBanI蛋白であることがわかった。またセファ
クリルＳ−200の溶出位置によりBanIの分子量は約72,00
0（SDS−PAGEよりサブユニット分子量36,000のダイマ
ー）と推定された（第２図）。本酵素標品についてアミ
ノ酸シーケンサーにてＮ末端アミノ酸配列を決めるとAl
a−Gln−Leu−Lys−Tyr−Asn−Lys−Asp−Ile−Asp−Gl
u−Leu−Gluであることが判明した。
ると単一のBanI蛋白であることがわかった。またセファ
クリルＳ−200の溶出位置によりBanIの分子量は約72,00
0（SDS−PAGEよりサブユニット分子量36,000のダイマ
ー）と推定された（第２図）。本酵素標品についてアミ
ノ酸シーケンサーにてＮ末端アミノ酸配列を決めるとAl
a−Gln−Leu−Lys−Tyr−Asn−Lys−Asp−Ile−Asp−Gl
u−Leu−Gluであることが判明した。
（５）BanIメチラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドに
よる形質転換 BanI制限エンドヌクレアーゼのDNAを含む組換えプラ
スミドpBanIRM8よりメチラーゼ遺伝子のみを含むBanIII
−SphI断片をpUC18のAccI−SphIサイトに挿入しpBanIM4
を調製した（第３図）。次いでpBanIM4を用いて常法に
よりE.coliHB101を形質転換した。
よる形質転換 BanI制限エンドヌクレアーゼのDNAを含む組換えプラ
スミドpBanIRM8よりメチラーゼ遺伝子のみを含むBanIII
−SphI断片をpUC18のAccI−SphIサイトに挿入しpBanIM4
を調製した（第３図）。次いでpBanIM4を用いて常法に
よりE.coliHB101を形質転換した。
（６）エシェリヒア・コリHB101（pBanIM4）によるBanI
メチラーゼの生産 BanIメチラーゼをコードするDNAをもつpBanIM4を含有
するE.coli HB101（pBanIM4）（FERM P−10741）をＬ−
broth培地で0.5lフラスコを用いて培養し、菌体を集め
た。菌体をBufferA50mlに懸濁後超音波破砕（3A、10
分）した。35,000rpm、30分遠心して上澄液に得た。こ
の上澄液をフォスフォセルロースカラム（40ml）クロマ
トグラフィを実施した。BanIメチラーゼはカラムを通過
するのでこれを集め、DEAEカラムクロマトグラフィを行
った。BanIメチラーゼはKCl0.3Mで溶出される。この画
分を再びフォスフォセルロースカラム（20ml）クロマト
を実施した。BanIメチラーゼは0.45M KClで溶出され
た。この画分を濃縮し、セファクリルＳ−200ゲル濾過
（2cm×37cm）をおこなった。BanIメチラーゼ画分を透
析し更にヘパリン（10ml）カラムクロマトグラフィを行
った。溶出画分をポリエチレングリコール濃縮後、50％
グリセロール溶液で透析した。全活性４キロユニットの
BanIメチラーゼを得た。
メチラーゼの生産 BanIメチラーゼをコードするDNAをもつpBanIM4を含有
するE.coli HB101（pBanIM4）（FERM P−10741）をＬ−
broth培地で0.5lフラスコを用いて培養し、菌体を集め
た。菌体をBufferA50mlに懸濁後超音波破砕（3A、10
分）した。35,000rpm、30分遠心して上澄液に得た。こ
の上澄液をフォスフォセルロースカラム（40ml）クロマ
トグラフィを実施した。BanIメチラーゼはカラムを通過
するのでこれを集め、DEAEカラムクロマトグラフィを行
った。BanIメチラーゼはKCl0.3Mで溶出される。この画
分を再びフォスフォセルロースカラム（20ml）クロマト
を実施した。BanIメチラーゼは0.45M KClで溶出され
た。この画分を濃縮し、セファクリルＳ−200ゲル濾過
（2cm×37cm）をおこなった。BanIメチラーゼ画分を透
析し更にヘパリン（10ml）カラムクロマトグラフィを行
った。溶出画分をポリエチレングリコール濃縮後、50％
グリセロール溶液で透析した。全活性４キロユニットの
BanIメチラーゼを得た。
本漂品をSDS−PAGE後銀染色法にて蛋白純度を調べる
と単一のバンド（第８図）を示した。またこの場合、分
子量は約44,000であった。ゲル濾過法では約45,000であ
った（第４図）。本酵素はモノマー酵素であると推定さ
れた。
と単一のバンド（第８図）を示した。またこの場合、分
子量は約44,000であった。ゲル濾過法では約45,000であ
った（第４図）。本酵素はモノマー酵素であると推定さ
れた。
（７）BanI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメチラーゼを
コードするDNAの単離及び塩基配列の決定 （３）で得られたBanI制限エンドヌクレアーゼを生産
する株エシェリヒア・コリHB101（pBanIRM8）（FERM P
−9424）を培養し常法により組み換えプラスミド（pBan
IRM8）を調製した。調製したpBanIRM8を制限酵素HindII
I,SphIで切断し、BanI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメ
チラーゼをコードするDNA断片（6.2kb）を切り出しクレ
ノーフラグメントに平滑末端化した後、これをpUC18のH
incIIサイトに挿入しpBanIRM6.2を作成した（第５
図）。このpUC18に挿入されたpBanIRM8由来のDNA断片の
制限酵素地図を示す（第６図）。
コードするDNAの単離及び塩基配列の決定 （３）で得られたBanI制限エンドヌクレアーゼを生産
する株エシェリヒア・コリHB101（pBanIRM8）（FERM P
−9424）を培養し常法により組み換えプラスミド（pBan
IRM8）を調製した。調製したpBanIRM8を制限酵素HindII
I,SphIで切断し、BanI制限エンドヌクレアーゼ、BanIメ
チラーゼをコードするDNA断片（6.2kb）を切り出しクレ
ノーフラグメントに平滑末端化した後、これをpUC18のH
incIIサイトに挿入しpBanIRM6.2を作成した（第５
図）。このpUC18に挿入されたpBanIRM8由来のDNA断片の
制限酵素地図を示す（第６図）。
また、この挿入断片におけるBanI制限エンドヌクレア
ーゼ及びBanIメチラーゼのコーディング領域を第７図に
示す。図中、BanIRはBanI制限エンドヌクレアーゼのコ
ーディング領域を表わし、BanIMはBanIメチラーゼのコ
ーディング領域を表わす。なお、Cmp1〜４は塩基配列を
決定するのに使用したカスタムメイトプライマーを示
す。
ーゼ及びBanIメチラーゼのコーディング領域を第７図に
示す。図中、BanIRはBanI制限エンドヌクレアーゼのコ
ーディング領域を表わし、BanIMはBanIメチラーゼのコ
ーディング領域を表わす。なお、Cmp1〜４は塩基配列を
決定するのに使用したカスタムメイトプライマーを示
す。
次にpBanIRM6.2を制限酵素、BamHI,KpnIで切断しBamH
I−KpnIDNA断片を調製した。このDNA断片をエキソヌク
レアーゼIII,マングビーンヌクレアーゼでBanI制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子側より漸次的欠失（Deletion）を
行い、得られた漸次的デレーション ミュタントを作成
し、ジオキシ法にてシーケンス決定を行った。これによ
りDNAの１方の鎖の塩基配列が決定された。他方の鎖に
ついては、上述のとおり決定した塩基配列に相補的なヌ
クレオチド（17mer）を合成しこれらをプライマーとし
ジオキシ方にて塩基配列の決定を行った。その結果、前
記式II及びIVに示されるBanI制限エンドヌクレアーゼを
コードするDNA及びBanIメチラーゼをコードするDNAの塩
基配列を決定した。
I−KpnIDNA断片を調製した。このDNA断片をエキソヌク
レアーゼIII,マングビーンヌクレアーゼでBanI制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子側より漸次的欠失（Deletion）を
行い、得られた漸次的デレーション ミュタントを作成
し、ジオキシ法にてシーケンス決定を行った。これによ
りDNAの１方の鎖の塩基配列が決定された。他方の鎖に
ついては、上述のとおり決定した塩基配列に相補的なヌ
クレオチド（17mer）を合成しこれらをプライマーとし
ジオキシ方にて塩基配列の決定を行った。その結果、前
記式II及びIVに示されるBanI制限エンドヌクレアーゼを
コードするDNA及びBanIメチラーゼをコードするDNAの塩
基配列を決定した。
また、このII及びIVの塩基配列に対応する前記式Ｉの
アミノ酸配列及び 式III のアミノ酸配列は、Ｎ末端において精製BanI制限エンド
ヌクレアーゼ及びBanIメチラーゼ標品から得たＮ末端の
アミノ酸配列とそれぞれ一致した。
アミノ酸配列及び 式III のアミノ酸配列は、Ｎ末端において精製BanI制限エンド
ヌクレアーゼ及びBanIメチラーゼ標品から得たＮ末端の
アミノ酸配列とそれぞれ一致した。
（発明の効果） 本発明により、BanI制限エンドヌクレアーゼをコード
するDNAを提供することができた。これにより夾雑酵素
を含有しない純粋なBanI制限エンドヌクレアーゼ標品を
遺伝子操作技術を用いることにより効率的かつ大量に生
産することが可能となる。
するDNAを提供することができた。これにより夾雑酵素
を含有しない純粋なBanI制限エンドヌクレアーゼ標品を
遺伝子操作技術を用いることにより効率的かつ大量に生
産することが可能となる。
第１図はpBanIRM8のプラスミドの制限酵素地図、第２図
はpBanI制限エンドヌクレアーゼの分子量の測定結果を
示す図、第３図はpBanIRM8よりpBanIM4への構築図、第
４図はBanIメチラーゼ分子量の測定結果を示す図、第５
図はpBanIRM6.2の構築図、第６図はpBanIRM6.2の作成に
際し、pUC18に挿入されたpBanIRM8由来のDNA断片の制限
酵素地図を、第７図はpUC18に挿入されたpBanIRM8由来
のDNA断片におけるBanI制限エンドヌクレアーゼ及びBan
Iメチラーゼのコーディング領域、並びにこれら酵素のD
NA塩基配列決定のストラキジーを示す図である。 第８図は本発明により得られたBanIメチラーゼの電気泳
動パターンを表わす写真である。
はpBanI制限エンドヌクレアーゼの分子量の測定結果を
示す図、第３図はpBanIRM8よりpBanIM4への構築図、第
４図はBanIメチラーゼ分子量の測定結果を示す図、第５
図はpBanIRM6.2の構築図、第６図はpBanIRM6.2の作成に
際し、pUC18に挿入されたpBanIRM8由来のDNA断片の制限
酵素地図を、第７図はpUC18に挿入されたpBanIRM8由来
のDNA断片におけるBanI制限エンドヌクレアーゼ及びBan
Iメチラーゼのコーディング領域、並びにこれら酵素のD
NA塩基配列決定のストラキジーを示す図である。 第８図は本発明により得られたBanIメチラーゼの電気泳
動パターンを表わす写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (2)
- 【請求項１】バチルスアノイリノリティカス（Bacillus
aneurinolyticus）由来のBanI制限エンドヌクレアーゼ
をコードするDNA断片であって、次の式Ｉで表わされる
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片。 式Ｉ - 【請求項２】請求項１記載のDNA断片を含む発現ベクタ
ー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1163662A JPH084510B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1163662A JPH084510B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0330679A JPH0330679A (ja) | 1991-02-08 |
| JPH084510B2 true JPH084510B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=15778204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1163662A Expired - Lifetime JPH084510B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH084510B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022365A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
-
1989
- 1989-06-28 JP JP1163662A patent/JPH084510B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0330679A (ja) | 1991-02-08 |
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