JPH084511B2 - 新規蛋白質遺伝子 - Google Patents
新規蛋白質遺伝子Info
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- JPH084511B2 JPH084511B2 JP22930489A JP22930489A JPH084511B2 JP H084511 B2 JPH084511 B2 JP H084511B2 JP 22930489 A JP22930489 A JP 22930489A JP 22930489 A JP22930489 A JP 22930489A JP H084511 B2 JPH084511 B2 JP H084511B2
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- protein
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子に関するものであり、更に詳細に
は、蛋白質高生産菌バチルス・ブレビス（Bacillus bre
vis）HPD31の蛋白質特に細胞壁由来の菌体外蛋白質をコ
ードする遺伝子に関する。
は、蛋白質高生産菌バチルス・ブレビス（Bacillus bre
vis）HPD31の蛋白質特に細胞壁由来の菌体外蛋白質をコ
ードする遺伝子に関する。
（従来の技術） 先に、鵜高らは、バチルス・ステアロサーモフィルス
（Bacillus stearothermophilus）DY−５の耐熱性α−
アミラーゼ遺伝子をプラスミドpUB110に組込んだpBAM10
1を保有するバチルス・ブレビス47及び枯草菌を37℃48
時間培養した時、バチルス・ブレビス47では約15,000U/
ml、枯草菌では3,000U/ml程度のα−アミラーゼをそれ
ぞれ培地中に生産蓄積するのを確認した〔J.Bacterio
l.,164,（３）,1182−1187（1985）〕。
（Bacillus stearothermophilus）DY−５の耐熱性α−
アミラーゼ遺伝子をプラスミドpUB110に組込んだpBAM10
1を保有するバチルス・ブレビス47及び枯草菌を37℃48
時間培養した時、バチルス・ブレビス47では約15,000U/
ml、枯草菌では3,000U/ml程度のα−アミラーゼをそれ
ぞれ培地中に生産蓄積するのを確認した〔J.Bacterio
l.,164,（３）,1182−1187（1985）〕。
同じく鵜高らは、バチルス・ブレビス47株が２種類の
細胞壁蛋白質（OWP,MWP）を含有しており、これらの蛋
白質の完全なヌクレオチド配列も明らかにしている〔J.
Bacteriol.,168,（１）,365−373（1986）,J.Bacterio
l.,170,（２）,935−945（1988）〕。
細胞壁蛋白質（OWP,MWP）を含有しており、これらの蛋
白質の完全なヌクレオチド配列も明らかにしている〔J.
Bacteriol.,168,（１）,365−373（1986）,J.Bacterio
l.,170,（２）,935−945（1988）〕。
たしかに鵜高らによって創製されたバチルス・ブレビ
ス47株は、菌体外に著量の蛋白質を生産する点ですぐれ
てはいるが、蛋白質分解酵素を菌体外に生産する性質も
併有しており、一旦生産された蛋白質を分解してしまう
という欠点を有している。
ス47株は、菌体外に著量の蛋白質を生産する点ですぐれ
てはいるが、蛋白質分解酵素を菌体外に生産する性質も
併有しており、一旦生産された蛋白質を分解してしまう
という欠点を有している。
そこで更に鵜高らは、菌体外に著量の蛋白質を生産す
るが蛋白質分解酵素を菌体外に生産しない新菌株をスク
リーニングして分離するのに成功した。そしてこの新菌
株をバチルス・ブレビスH102と命名し、微工研に寄託し
た（FERM BP−1087）（特開昭63−56277号）。
るが蛋白質分解酵素を菌体外に生産しない新菌株をスク
リーニングして分離するのに成功した。そしてこの新菌
株をバチルス・ブレビスH102と命名し、微工研に寄託し
た（FERM BP−1087）（特開昭63−56277号）。
（発明が解決しようとする問題点） この新菌バチルス・ブレビスH102（FERM BP−1087）
は、30g/lという非常に多量の細胞壁由来の蛋白質を菌
体外に蓄積するのみでなく、異種遺伝子産物の分泌能力
も高く、好熱菌由来のα−アミラーゼを3g/lもの量分泌
するという顕著な有用性も更に発見され、そこで本菌に
ついて整理を行って、H102をHPD31に改称した。したが
って以下、H102株はバチルス・ブレビスHPD31株という
こととする。
は、30g/lという非常に多量の細胞壁由来の蛋白質を菌
体外に蓄積するのみでなく、異種遺伝子産物の分泌能力
も高く、好熱菌由来のα−アミラーゼを3g/lもの量分泌
するという顕著な有用性も更に発見され、そこで本菌に
ついて整理を行って、H102をHPD31に改称した。したが
って以下、H102株はバチルス・ブレビスHPD31株という
こととする。
B.ブレビスHPD31の細胞壁は１層の蛋白質層とペプチ
ドグリカン層とからなり、この細胞壁構成蛋白質は135K
Daから成り、それはHWPないしメイン蛋白質と称されて
いる。
ドグリカン層とからなり、この細胞壁構成蛋白質は135K
Daから成り、それはHWPないしメイン蛋白質と称されて
いる。
そこで上記した有用性に鑑み、HPD31由来の蛋白質を
更に大量に生産するシステムの開発が当業界において強
く希求されるようになった。
更に大量に生産するシステムの開発が当業界において強
く希求されるようになった。
そこで上記業界におけるニーズに応えるために各方面か
ら検討を行った結果、遺伝子、特にHWPをコードする遺
伝子構造の解明が必要となってきた。
ら検討を行った結果、遺伝子、特にHWPをコードする遺
伝子構造の解明が必要となってきた。
（発明が解決するための手段） 本発明は、この目的を達成するためになされたもので
あって、Bacillus brevis HPD31の細胞壁構成蛋白質遺
伝子のクローン化を行うためになされたものである。
あって、Bacillus brevis HPD31の細胞壁構成蛋白質遺
伝子のクローン化を行うためになされたものである。
そこで鋭意研究した結果、B.ブレビス47のMWP蛋白質
の抗体を用いてウェスタン ブロッティングを行ったと
ころHWPが上記抗体とクロスリアクトするという知見を
得たので、HWP遺伝子とMWP遺伝子とはホモロジーが高い
ことを予想した。
の抗体を用いてウェスタン ブロッティングを行ったと
ころHWPが上記抗体とクロスリアクトするという知見を
得たので、HWP遺伝子とMWP遺伝子とはホモロジーが高い
ことを予想した。
そしてこの予想のもち、既に鵜高らによってクローン
化されているMWP遺伝子をプローブとして用いてHPD31の
染色体DNA断片を処理したところ、HWP遺伝子のクローニ
ングに成功し、本発明に完成に至ったものである。
化されているMWP遺伝子をプローブとして用いてHPD31の
染色体DNA断片を処理したところ、HWP遺伝子のクローニ
ングに成功し、本発明に完成に至ったものである。
以下、本発明について詳しく説明する。
すなわち本発明においては、染色体DNA源としてはバ
チルス・ブレビスHPD31（B.ブレビスH102）（FERM BP−
1087）を用い、制限酵素等で切断したDNA断片につい
て、これらをファージに取り込ませ、これらのDNA断片
を取り込んだ各々のファージの中から、B.ブレビス47由
来のDNA断片，プローブＡを用いてHWP遺伝子を取り込ん
だファージをつり上げる。
チルス・ブレビスHPD31（B.ブレビスH102）（FERM BP−
1087）を用い、制限酵素等で切断したDNA断片につい
て、これらをファージに取り込ませ、これらのDNA断片
を取り込んだ各々のファージの中から、B.ブレビス47由
来のDNA断片，プローブＡを用いてHWP遺伝子を取り込ん
だファージをつり上げる。
次に、このようにして得られたDNA断片の１部をプロ
ーブＢとし、これを用いてHPD31由来の染色体DNA断片の
内、HWP遺伝子ないしメイン蛋白質遺伝子部分をつり上
げる。
ーブＢとし、これを用いてHPD31由来の染色体DNA断片の
内、HWP遺伝子ないしメイン蛋白質遺伝子部分をつり上
げる。
そして、得られたメイン蛋白DNAを、DNAリガーゼ等を
用いてプラスミドベクター断片に結合させ、目的とする
遺伝子を含む組換えDNAを作成するのである。
用いてプラスミドベクター断片に結合させ、目的とする
遺伝子を含む組換えDNAを作成するのである。
HPD31株由来の染色体DNAは、本菌を、例えばT2液体培
地（１％グルコース、１％ペプトン、0.5％肉エキス、
0.2％酵母エキス、pH7.0）で約１〜３日間振とう培養な
いし通気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離によっ
て集菌し、次いで溶菌させることによって得ることがで
きる。
地（１％グルコース、１％ペプトン、0.5％肉エキス、
0.2％酵母エキス、pH7.0）で約１〜３日間振とう培養な
いし通気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離によっ
て集菌し、次いで溶菌させることによって得ることがで
きる。
それには既知の方法が適宜使用され、例えばSaito,Mi
uraの方法（Saito,H.and Miura,K.,Biochim.Biophys.Ac
ta,72,619,（1964））、Rodoriguezらの方法（Rodorigu
ez and Tait,Recombinant DNA Techniques（Addison−W
esleypub.Co）（1983））が利用できる。
uraの方法（Saito,H.and Miura,K.,Biochim.Biophys.Ac
ta,72,619,（1964））、Rodoriguezらの方法（Rodorigu
ez and Tait,Recombinant DNA Techniques（Addison−W
esleypub.Co）（1983））が利用できる。
以後の処理は既知の方法によって行い、溶菌方法は、
例えば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶
解酵素による処理や超音波処理などが用いられる。ま
た、必要によりプロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの
他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤
が併用される。また凍結融解処理を施すこともある。こ
のようにして得られる溶菌物からDNAを分離、精製する
には、常法にしたがって、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせる
ことによって行うことができる。
例えば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶
解酵素による処理や超音波処理などが用いられる。ま
た、必要によりプロテアーゼ、リボヌクレアーゼなどの
他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤
が併用される。また凍結融解処理を施すこともある。こ
のようにして得られる溶菌物からDNAを分離、精製する
には、常法にしたがって、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせる
ことによって行うことができる。
DNAを切断する方法は、例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができる。切断後、必要に応
じてホスファターゼやDNAポリメラーゼ等の修飾酵素が
用いられる。また種々のリンカーやアダプターを用いる
ことによりDNA断片末端の塩基配列を変えることができ
る。
素処理などにより行うことができる。切断後、必要に応
じてホスファターゼやDNAポリメラーゼ等の修飾酵素が
用いられる。また種々のリンカーやアダプターを用いる
ことによりDNA断片末端の塩基配列を変えることができ
る。
切断されたDNA断片から、蔗糖密度勾配遠心法や電気
泳動したゲルからの抽出等によって最適な長さの断片の
みを得られる。
泳動したゲルからの抽出等によって最適な長さの断片の
みを得られる。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得る
ファージまたはプラスミドが適している。
ファージまたはプラスミドが適している。
ファージとしては、例えば、エシェリヒア コリ（Es
cherichia coli）を宿主微生物とする場合には、λファ
ージやM13ファージなどが使用出来る。
cherichia coli）を宿主微生物とする場合には、λファ
ージやM13ファージなどが使用出来る。
また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア
コリを宿主微生物とする場合には、pUC118、pBR322、pU
C18やそれらの派生体などが使用できる。更に、例え
ば、エシェリヒア コリ、バチルス ズブチリスなどの
二種類以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例え
ば、pHY300PLK、酵母のベクターを利用することも可能
である。このようなベクターを、先に述べたDNAと同様
に制限酵素などで切断し、ベクター断片を得る。DNA断
片とベクター断片とを結合させる方法は、公知のDNAリ
ガーゼを用いる方法であればよく、例えば、DNA断片と
ベクター断片とをアニーリングの後、生体外で適当なDN
Aリガーゼの作用により組換えDNAを作成する。必要なら
ば、アニーリングの後、宿主微生物に導入して、生体内
のDNAリガーゼを利用して組換えDNAにすることもでき
る。
コリを宿主微生物とする場合には、pUC118、pBR322、pU
C18やそれらの派生体などが使用できる。更に、例え
ば、エシェリヒア コリ、バチルス ズブチリスなどの
二種類以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例え
ば、pHY300PLK、酵母のベクターを利用することも可能
である。このようなベクターを、先に述べたDNAと同様
に制限酵素などで切断し、ベクター断片を得る。DNA断
片とベクター断片とを結合させる方法は、公知のDNAリ
ガーゼを用いる方法であればよく、例えば、DNA断片と
ベクター断片とをアニーリングの後、生体外で適当なDN
Aリガーゼの作用により組換えDNAを作成する。必要なら
ば、アニーリングの後、宿主微生物に導入して、生体内
のDNAリガーゼを利用して組換えDNAにすることもでき
る。
宿主微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。
殖が可能でその形質発現のできるものであればよい。
宿主微生物に組替えDNAを導入する方法は、公知の方
法、例えば、宿主微生物がエシェリヒアコリの場合には
カルシウム法（Lederberg,E.M.and Cohen,S.N.,J.Bacte
riol.,119,1072,（1974））などを採用することができ
る。
法、例えば、宿主微生物がエシェリヒアコリの場合には
カルシウム法（Lederberg,E.M.and Cohen,S.N.,J.Bacte
riol.,119,1072,（1974））などを採用することができ
る。
λファージDNAであれば、イン ビトロ パッケイジ
ング法（Horn,B.,Methods in Enzymology,68,299,（197
9））によりλファージ粒子を形成し、このλファージ
粒子をエシェリヒア コリの培養菌懸濁液に添加して、
HWP生産能を保有する特殊形質導入ファージを得ること
ができる。
ング法（Horn,B.,Methods in Enzymology,68,299,（197
9））によりλファージ粒子を形成し、このλファージ
粒子をエシェリヒア コリの培養菌懸濁液に添加して、
HWP生産能を保有する特殊形質導入ファージを得ること
ができる。
組換えDNAが導入された形質転換微生物の選択方法
は、目的遺伝子とホモロジーの高い遺伝子をプローブに
用い、DNA−DNAハイブリダイゼーション法にて行う。液
体選択培地にはベクター上のマーカーによって、最小培
地や、抗生物質添加培地が適宜用いられる。
は、目的遺伝子とホモロジーの高い遺伝子をプローブに
用い、DNA−DNAハイブリダイゼーション法にて行う。液
体選択培地にはベクター上のマーカーによって、最小培
地や、抗生物質添加培地が適宜用いられる。
以下、本発明を、実施例により更に詳細に且つ具体的
に説明する。
に説明する。
実施例 バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）HPD31（FERM
BP−1087）37℃で振とう培養した後、遠心分離によっ
て集菌、洗滌し、得られた菌からSaito,Miuraの方法（S
aito,H.and Miura,K.,Biochim.Biophys.Acta,72,619（1
964））によって染色体DNAを分離した。分離した染色体
DNAをトリスバッハァーに溶解し、制限酵素Bam HI（宝
酒造社製）を添加して37℃で部分分解した後、分解物を
電気泳動し、ゲルからの抽出により染色体DNA断片を分
離、取得した。
BP−1087）37℃で振とう培養した後、遠心分離によっ
て集菌、洗滌し、得られた菌からSaito,Miuraの方法（S
aito,H.and Miura,K.,Biochim.Biophys.Acta,72,619（1
964））によって染色体DNAを分離した。分離した染色体
DNAをトリスバッハァーに溶解し、制限酵素Bam HI（宝
酒造社製）を添加して37℃で部分分解した後、分解物を
電気泳動し、ゲルからの抽出により染色体DNA断片を分
離、取得した。
ベクターとしては、λ−ファージ クローニング ベ
クター EMBL3を用いた。このファージベクターEMBL3を
Bam HIで切断して得られたEMBL3DNAと上記のバチルス・
ブレビスHPD31株から得られた染色体DNA断片とを混合
し、T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を添加して連結処理
した（Weiss,B.Sablon,A.J.,Live,T.R.,Fareed,G.C.and
Richardson,C.C.,J.Biol.Chem.,243,4543（1968））。
クター EMBL3を用いた。このファージベクターEMBL3を
Bam HIで切断して得られたEMBL3DNAと上記のバチルス・
ブレビスHPD31株から得られた染色体DNA断片とを混合
し、T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を添加して連結処理
した（Weiss,B.Sablon,A.J.,Live,T.R.,Fareed,G.C.and
Richardson,C.C.,J.Biol.Chem.,243,4543（1968））。
このようにして得られた処理液を、イン ビトロ パ
ッケイジング キット（STARATGENE社製）に添加して、
イン ビトロ パッケイジング法（Horn,B.,Methods in
Enzymology,68,299（1979））により当該DNAをファー
ジ粒子に導入して、B.ブレビスHPD31株のDNAライブラリ
ーを作製した。
ッケイジング キット（STARATGENE社製）に添加して、
イン ビトロ パッケイジング法（Horn,B.,Methods in
Enzymology,68,299（1979））により当該DNAをファー
ジ粒子に導入して、B.ブレビスHPD31株のDNAライブラリ
ーを作製した。
これをエシェリヒア コリ Q359に感染せしめた後、
バチルス・ブレビス47株のMWP遺伝子をプローブＡとし
てプラーク ハイブリダイゼーションを行い、陽性を示
す組換えDNAφ−SK10を得た。
バチルス・ブレビス47株のMWP遺伝子をプローブＡとし
てプラーク ハイブリダイゼーションを行い、陽性を示
す組換えDNAφ−SK10を得た。
なおバチルス・ブレビス47のMWP遺伝子は、本発明者
らによって既に解明されており、（J.Bacteriol.,170,9
35（1988）），そのうちのHpa I−Hpa I断片（プラスミ
ドpCWP300）をプローブＡとして使用した（第３図）。
らによって既に解明されており、（J.Bacteriol.,170,9
35（1988）），そのうちのHpa I−Hpa I断片（プラスミ
ドpCWP300）をプローブＡとして使用した（第３図）。
そして得られたφ−SK10nには14kbのBam HI挿入断片
が認められたが、これはHWPの構造遺伝子の５′側の半
分しか含んでいないことを確認した（第４図）。
が認められたが、これはHWPの構造遺伝子の５′側の半
分しか含んでいないことを確認した（第４図）。
そこで３′側のBg1 II2.7kb部分を、以下に示す処理
によってプラスミドpUC118で大腸菌にクローン化し、プ
ラスミドpSK31C（5.3kb）を得た（第４図）。
によってプラスミドpUC118で大腸菌にクローン化し、プ
ラスミドpSK31C（5.3kb）を得た（第４図）。
すなわち、バチルス・ブレビスHPD31の染色体DNAを常
法にしたがって分離した後、制限酵素Bgl IIを用いてDN
Aを完全消化した後、常法により染色体DNA断片を分離、
取得した。
法にしたがって分離した後、制限酵素Bgl IIを用いてDN
Aを完全消化した後、常法により染色体DNA断片を分離、
取得した。
一方、ベクターとして使用するプラスミドpUC118を制
限酵素Bam HIで処理しておき、上記によって得たDNA断
片と接触せしめて両者をリガーゼにより連結処理した。
この処理液を用い、エシェリヒア・コリ JM103株を宿
主として、Lederberg,Cohen法（Lederberg,E.M.and Coh
em,S.N.,J.Bacteriol.,119,1072（1974））によりプラ
スミドを導入し、形質転換体を作成した。
限酵素Bam HIで処理しておき、上記によって得たDNA断
片と接触せしめて両者をリガーゼにより連結処理した。
この処理液を用い、エシェリヒア・コリ JM103株を宿
主として、Lederberg,Cohen法（Lederberg,E.M.and Coh
em,S.N.,J.Bacteriol.,119,1072（1974））によりプラ
スミドを導入し、形質転換体を作成した。
得られた形質転換体について、先に得たφ−SK10のCl
aI−Bam HI 400bp断片をプローブＢとして用い、コロニ
ーハイブリダイゼーションを行った。
aI−Bam HI 400bp断片をプローブＢとして用い、コロニ
ーハイブリダイゼーションを行った。
そこで陽性を示すコロニーをスクリーニングしそれか
らプラスミドを分離した。このプラスミドは、従来未知
の新規なものであって、これをプラスミドpSK31Cと命名
した（第４図）。そしてひき続き、HWP遺伝子を含有す
るDNA断片について塩基配列の決定を行い、そしてそれ
から予想されるアミノ酸配列について第１図の結果を得
た。そして第２図にその５′側を拡大して示した。
らプラスミドを分離した。このプラスミドは、従来未知
の新規なものであって、これをプラスミドpSK31Cと命名
した（第４図）。そしてひき続き、HWP遺伝子を含有す
るDNA断片について塩基配列の決定を行い、そしてそれ
から予想されるアミノ酸配列について第１図の結果を得
た。そして第２図にその５′側を拡大して示した。
第１図に示したClaIからBglIIまでの4.3kbについての
塩基配列図において、HWP遺伝子はTTGもしくはATGを開
始コドンとし、TGAを終止コドンとしていることが判
る。
塩基配列図において、HWP遺伝子はTTGもしくはATGを開
始コドンとし、TGAを終止コドンとしていることが判
る。
そこで、HWPのＮ末端アミノ酸配列を決定したとこ
ろ、第１図の下線を付した15個のアミノ酸と一致するこ
とが確認された。よって、翻訳開始点は不明であるが、
HWPは53個もしくは23個のアミノ酸からなるシグナルペ
プチドを含む前駆体蛋白質として合成され、その成熟体
はアラニン（１の位置）をＮ末端としバリン（終止コド
ンTGAの前の位置）をＣ末端とする分子量約118,000の蛋
白質であることが充分に示唆された。つまりメイン蛋白
遺伝子であるHWP遺伝子は、アラニンに対応するGCA（１
の位置）からバリンに対応するGTGまでの塩基配列を含
むものである。
ろ、第１図の下線を付した15個のアミノ酸と一致するこ
とが確認された。よって、翻訳開始点は不明であるが、
HWPは53個もしくは23個のアミノ酸からなるシグナルペ
プチドを含む前駆体蛋白質として合成され、その成熟体
はアラニン（１の位置）をＮ末端としバリン（終止コド
ンTGAの前の位置）をＣ末端とする分子量約118,000の蛋
白質であることが充分に示唆された。つまりメイン蛋白
遺伝子であるHWP遺伝子は、アラニンに対応するGCA（１
の位置）からバリンに対応するGTGまでの塩基配列を含
むものである。
このHWPのアミノ酸配列についてみると、疎水性アミ
ノ酸が43％という多量含まれており、酸性アミノ酸も18
％と比較的多量に含まれており、各種細菌の表層蛋白質
のアミノ酸配列と一致しているが、システインが１分子
含まれている点で、従来既知のものと大きく相違してい
る。
ノ酸が43％という多量含まれており、酸性アミノ酸も18
％と比較的多量に含まれており、各種細菌の表層蛋白質
のアミノ酸配列と一致しているが、システインが１分子
含まれている点で、従来既知のものと大きく相違してい
る。
また、第２図からも明らかなように、本塩基配列には
シグナルが２ケ所（−23及び−53の位置）存在してお
り、特徴的である。そしてその上流にはSD1配列も認め
られている。
シグナルが２ケ所（−23及び−53の位置）存在してお
り、特徴的である。そしてその上流にはSD1配列も認め
られている。
そして、HWP遺伝子についてその転写開始領域をSlマ
ッピングにより調べた結果、第２図に示すようにP1、
P2、P3、P4、P5で示される５個の転写開始領域が確認さ
れた。これらのプロモーターはいずれも強力であるの
で、このプロモーター部分を活用して、他の有用遺伝子
を結合しこれを強力に発現することができる。プロモー
ターは原菌（宿主）のものであるので、発現性は良好で
あり、非常に有効である。
ッピングにより調べた結果、第２図に示すようにP1、
P2、P3、P4、P5で示される５個の転写開始領域が確認さ
れた。これらのプロモーターはいずれも強力であるの
で、このプロモーター部分を活用して、他の有用遺伝子
を結合しこれを強力に発現することができる。プロモー
ターは原菌（宿主）のものであるので、発現性は良好で
あり、非常に有効である。
また、本発明によれば自己のプロモーター、メイン蛋
白遺伝子を再導入することができ、それによって同一の
遺伝子を複数にし、蛋白生産量を大幅に向上せしめるこ
とができる。その結果、食料蛋白、飼料用の蛋白の生産
が大幅に増加し、コストダウンも可能となる。
白遺伝子を再導入することができ、それによって同一の
遺伝子を複数にし、蛋白生産量を大幅に向上せしめるこ
とができる。その結果、食料蛋白、飼料用の蛋白の生産
が大幅に増加し、コストダウンも可能となる。
そして更に、全DNA塩基配列が第１図に示したように
明らかになっているので、有用な部分、目的とする部分
のみの断片に加工し、発現させることができるので、本
発明は各種の用途に広範に対応利用することもできる。
明らかになっているので、有用な部分、目的とする部分
のみの断片に加工し、発現させることができるので、本
発明は各種の用途に広範に対応利用することもできる。
そしてこの全塩基配列の終止コドンTGAの下流にはタ
ーミネーターと思われるInverted repeatが２個認めら
れ、これらによってHWP遺伝子の転写が終結しているこ
とが示唆されている。
ーミネーターと思われるInverted repeatが２個認めら
れ、これらによってHWP遺伝子の転写が終結しているこ
とが示唆されている。
（発明の効果） 本発明によってはじめてHWP遺伝子のクローン化が行
われ、その遺伝子構造が解明された。
われ、その遺伝子構造が解明された。
したがってこのHWP遺伝子を発現させることにより、H
WPを大量に生産することができ、食料蛋白ないし飼料蛋
白として有効利用することができる。
WPを大量に生産することができ、食料蛋白ないし飼料蛋
白として有効利用することができる。
また、本遺伝子におけるP1〜P5の５つのプロモーター
はいずれも強力であるので、このプロモーター部分を活
用して、他に有用遺伝子を結合しこれを強力に発現する
ことができる。プロモーターは原菌（宿主）のものであ
るので、発現性は良好であり、非常に有効である。
はいずれも強力であるので、このプロモーター部分を活
用して、他に有用遺伝子を結合しこれを強力に発現する
ことができる。プロモーターは原菌（宿主）のものであ
るので、発現性は良好であり、非常に有効である。
また、本発明によれば自己のプロモーター、メイン蛋
白遺伝子を再導入することができ、それによって同一の
遺伝子を複数にし、蛋白生産量を大幅に向上せしめるこ
とができる。その結果、食料蛋白、飼料用の蛋白の生産
が大幅に増加し、コストダウンも可能となる。
白遺伝子を再導入することができ、それによって同一の
遺伝子を複数にし、蛋白生産量を大幅に向上せしめるこ
とができる。その結果、食料蛋白、飼料用の蛋白の生産
が大幅に増加し、コストダウンも可能となる。
そして更に、全DNA塩基配列が第１図に示したように
明らかになっているので、有用な部分、目的とする部分
のみの断片に加工し、発現させることができるので、本
発明は各種の用途に広範に対応利用することもできる。
明らかになっているので、有用な部分、目的とする部分
のみの断片に加工し、発現させることができるので、本
発明は各種の用途に広範に対応利用することもできる。
第１図は、本発明に係る遺伝子の全塩基配列を示した図
であり、第２図はその上流部分の拡大図である。 第３図は、B.ブレビス47のメイン蛋白質DNAの制限酵素
切断点地図である。 第４図は、B.ブレビスHPD31のDNA断片（φ−SK10内）の
制限酵素切断地図、HPD31株のメイン蛋白質のDNAの制限
酵素切断点地図、及びプラスミドpSK31Cを示した図面で
ある。
であり、第２図はその上流部分の拡大図である。 第３図は、B.ブレビス47のメイン蛋白質DNAの制限酵素
切断点地図である。 第４図は、B.ブレビスHPD31のDNA断片（φ−SK10内）の
制限酵素切断地図、HPD31株のメイン蛋白質のDNAの制限
酵素切断点地図、及びプラスミドpSK31Cを示した図面で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 塚越 規弘 愛知県名古屋市名東区猪高台２―510 (72)発明者 鵜高 重三 愛知県名古屋市名東区植園町１―24―３
Claims (4)
- 【請求項１】第１図の＋１の位置（アラニン）からはじ
まり最終位置（バリン）で終了するアミノ酸配列に対応
する塩基配列を有するDNA。 - 【請求項２】第１図の−23の位置（メチオニン）及び／
又は−53の位置（メチオニン）の翻訳開始点を含み、且
つ＋１の位置（アラニン）からはじまり最終位置（バリ
ン）で終了するアミノ酸配列に対応する塩基配列を有す
るDNA。 - 【請求項３】第１図のP1、P2、P3、P4、及び／又はP5の
位置の転写開始点を含み、且つ−23の位置（メチオニ
ン）及び／又は−53の位置（メチオニン）の翻訳開始点
を含み、そして更に＋１の位置（アラニン）からはじま
り最終位置（バリン）で終了するアミノ酸配列に対応す
る塩基配列を有するDNA。 - 【請求項４】最初のコドンATCから最終のコドンTCTに至
る第１図に図示した塩基配列を有するDNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22930489A JPH084511B2 (ja) | 1989-09-06 | 1989-09-06 | 新規蛋白質遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22930489A JPH084511B2 (ja) | 1989-09-06 | 1989-09-06 | 新規蛋白質遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0394683A JPH0394683A (ja) | 1991-04-19 |
| JPH084511B2 true JPH084511B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=16890042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22930489A Expired - Lifetime JPH084511B2 (ja) | 1989-09-06 | 1989-09-06 | 新規蛋白質遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH084511B2 (ja) |
-
1989
- 1989-09-06 JP JP22930489A patent/JPH084511B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0394683A (ja) | 1991-04-19 |
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