JPH088866B2 - ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法 - Google Patents
ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法Info
- Publication number
- JPH088866B2 JPH088866B2 JP62052990A JP5299087A JPH088866B2 JP H088866 B2 JPH088866 B2 JP H088866B2 JP 62052990 A JP62052990 A JP 62052990A JP 5299087 A JP5299087 A JP 5299087A JP H088866 B2 JPH088866 B2 JP H088866B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phospholipase
- activity
- enzyme
- phosphatidylcholine
- phosphatidyl group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、水中および各種有機溶媒中でホスファチジ
ル基転移活性を有し、かつすぐれた熱安定性を有するホ
スホリパーゼＤおよびその製造法に関するものである。
ル基転移活性を有し、かつすぐれた熱安定性を有するホ
スホリパーゼＤおよびその製造法に関するものである。
ホスホリパーゼＤ（特に後記ホスファチジル基転移触
媒能を有するもの）は、大豆や卵黄に含まれているホス
ファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンな
どのリン脂質と各種アルコールから乳化剤、分散剤、農
薬、医薬、工業用試薬等に有用な、リン脂質誘導体を製
造するのに使われる。
媒能を有するもの）は、大豆や卵黄に含まれているホス
ファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンな
どのリン脂質と各種アルコールから乳化剤、分散剤、農
薬、医薬、工業用試薬等に有用な、リン脂質誘導体を製
造するのに使われる。
従来の技術 ホスホリパーゼＤ（EC3.1.4.4）は、リン脂質のホス
ファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解し
てホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である
が、その起源によっては、グリセロール、エタノール等
のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセ
ロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル
結合を加水分解すると同時にホスファチジル基と上記ア
ルコール性水酸基を有する化合物とより新たなエステル
を生成する反応（ホスファチジル基転移反応）を生起さ
せる。
ファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解し
てホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である
が、その起源によっては、グリセロール、エタノール等
のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセ
ロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル
結合を加水分解すると同時にホスファチジル基と上記ア
ルコール性水酸基を有する化合物とより新たなエステル
を生成する反応（ホスファチジル基転移反応）を生起さ
せる。
この酵素は、キャベツ、ニンジン等の植物体その他の
植物界に広く存在することが早くから知られており、こ
の酵素を含有する植物体から抽出する方法により製造す
るのが普通であったが、最近では、ストレプトミセス
属、ミクロモノスポラ属、ノルカディオプシス属、アク
チノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いて
発酵法により製造する方法が提案され、一部実施されて
いる（特公昭52−39918号，特公昭58−52633号，特開昭
58−63388号，特開昭58−67183号，特開昭60−164483
号）。
植物界に広く存在することが早くから知られており、こ
の酵素を含有する植物体から抽出する方法により製造す
るのが普通であったが、最近では、ストレプトミセス
属、ミクロモノスポラ属、ノルカディオプシス属、アク
チノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いて
発酵法により製造する方法が提案され、一部実施されて
いる（特公昭52−39918号，特公昭58−52633号，特開昭
58−63388号，特開昭58−67183号，特開昭60−164483
号）。
しかしながら、これら従来の製造法により得られるホ
スホリパーゼＤは、ホスファチジル基転移活性を有する
ものに関する限り、至適条件下における熱安定性が悪
く、そのため転移反応を高温で能率よく行わせることが
できないという問題があった。
スホリパーゼＤは、ホスファチジル基転移活性を有する
ものに関する限り、至適条件下における熱安定性が悪
く、そのため転移反応を高温で能率よく行わせることが
できないという問題があった。
また、上記従来の微生物利用製造法は、上述のように
熱安定性のよい酵素を与えないだけでなく、培養液当り
の酵素生産性が悪く、したがって製品が高価なものにな
るという問題があった。さらに、一部の製法において使
われる微生物には病原性が指摘されており、食品用乳化
剤の製造に使用するには安全性の点で問題があった。
熱安定性のよい酵素を与えないだけでなく、培養液当り
の酵素生産性が悪く、したがって製品が高価なものにな
るという問題があった。さらに、一部の製法において使
われる微生物には病原性が指摘されており、食品用乳化
剤の製造に使用するには安全性の点で問題があった。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、ホスファチジル基転移活性を有する従来の
ホスホリパーゼＤが上述のような欠点を持ち、その製造
法もまた改良の余地あるものであったことに鑑み、高度
の熱安定性およびホスファチジル基転移活性を示すホス
ホリパーゼＤとその効率よい製造法を提供しようとする
ものである。
ホスホリパーゼＤが上述のような欠点を持ち、その製造
法もまた改良の余地あるものであったことに鑑み、高度
の熱安定性およびホスファチジル基転移活性を示すホス
ホリパーゼＤとその効率よい製造法を提供しようとする
ものである。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、ホスファチジル基転移活性を示すホス
ホリパーゼＤを生産する能力を多数の微生物について探
索し、さらに、選抜されたホスホリパーゼＤ高能率生産
菌について、特に熱安定性のよい酵素を生産する菌株を
探索する実験を繰返した。その結果、東京都多摩地区で
採取した土壌から分離された新菌株・ストレプトミセス
・プルニカラー（Streptomyces prunicolor）SK−02−8
1がすぐれた性能を有することを知り、本発明を完成す
るに至った。
ホリパーゼＤを生産する能力を多数の微生物について探
索し、さらに、選抜されたホスホリパーゼＤ高能率生産
菌について、特に熱安定性のよい酵素を生産する菌株を
探索する実験を繰返した。その結果、東京都多摩地区で
採取した土壌から分離された新菌株・ストレプトミセス
・プルニカラー（Streptomyces prunicolor）SK−02−8
1がすぐれた性能を有することを知り、本発明を完成す
るに至った。
すなわち、本発明は上記ストレプトミセス・プルニカ
ラーSK−02−81株を用いるホスホリパーゼＤの製造法、
およびそれにより得られる高耐熱性ホスホリパーゼＤを
提供するものである。
ラーSK−02−81株を用いるホスホリパーゼＤの製造法、
およびそれにより得られる高耐熱性ホスホリパーゼＤを
提供するものである。
本発明の製法において使われるストレプトミセス・プ
ルニカラーSK−02−81株は、次のような菌学的性質を有
する。
ルニカラーSK−02−81株は、次のような菌学的性質を有
する。
形態的特徴 気菌糸：直線状が主であり、僅かに屈曲している。時に
ネストまたはスクレロチウム様のものが認められる。幅
0.4〜６μｍ。
ネストまたはスクレロチウム様のものが認められる。幅
0.4〜６μｍ。
胞子：大きさ0.4〜0.6μｍ×1.1〜1.3μｍの短円筒形。
表面は平滑。
表面は平滑。
基生菌糸：多少波状で、短軸分岐している。菌糸の分断
および胞子の着生はない。
および胞子の着生はない。
鞭毛胞子および胞子嚢：形成しない。
諸種の培地上での生育状態：次表のとおり（但し28℃、
２週間後の結果。色の表示はJIS Z8721準拠標準色票に
よる色の分類に従っている。）。
２週間後の結果。色の表示はJIS Z8721準拠標準色票に
よる色の分類に従っている。）。
細胞壁のアミノ酸組成および糖組成 meso−ジアミノピメリン酸 − LL−ジアミノピメリン酸 ＋ グリシン ＋ グルタミン酸 ＋ アラニン ＋ アラビノース − ガラクトース − ガラクトサミン − グルコサミン ＋ 以上より、SK−02−81株の細胞壁はＩ型である。
生理的性質 a.生育温度範囲:20〜40℃ b.至適生育温度:28〜35℃ c.至適pH:6〜７ d.ゼラチンの液化：なし e.スターチの加水分解：あり f.脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：なし g.メラノイド色素の産生：なし h.炭素源の利用性（30℃,16日培養）： Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−マニトール ＋ シュークロース ＋ イノシトール ＋ Ｌ−ラムノース ＋ ラフィノース ＋ i.GC含量:70.4％ （「放線菌の同定実験法」日本放線菌研究会,151〜160
頁の方法による） この菌株がストレプトミセス・プルニカラーであるこ
とは、上述の菌学的性質を、Bergey's Manual第８版，
第807〜808頁、およびCooperative Description of Typ
e Culture of Streptomyces IV Species,Descriptions
from the Second,Third and Fourth Studies by Elwoo
d,B.Shirling and Gottlieb,第468〜469頁の各記載と照
合することにより確認された。
頁の方法による） この菌株がストレプトミセス・プルニカラーであるこ
とは、上述の菌学的性質を、Bergey's Manual第８版，
第807〜808頁、およびCooperative Description of Typ
e Culture of Streptomyces IV Species,Descriptions
from the Second,Third and Fourth Studies by Elwoo
d,B.Shirling and Gottlieb,第468〜469頁の各記載と照
合することにより確認された。
ストレプトミセス・プルニカラーSK−02−81は、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄
託番号は、微工研菌寄第9225号である。
技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄
託番号は、微工研菌寄第9225号である。
本発明のホスホリパーゼＤを製造するための、上記ス
トレプトミセス・プルニカラーSK−02−81の培養は、放
線菌一般の培養に通常採用される方法に従って行うこと
ができる。すなわち、培地には炭素源としてブドウ糖、
果糖、ショ糖、乳糖、糖蜜、デンプン、デキストリン、
グリセリン等を単独で、または組合せて、適宜用いるこ
とができ、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類など
を用いることもできる。また窒素源としては、硫酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿
素、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスチープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、
大豆蛋白、デスチラーズソリュブルなどを用いることが
できる。培地には、ほかに食塩、塩化カリウム、リン酸
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、鉄
塩、マンガン塩、各種ビタミン、その他、菌の生育やホ
スホリパーゼＤの生産促進に有効な物質を適宜添加する
ことができる。好ましい培地pHは５〜９、特に好ましく
は６〜７である。培養法としては深部培養法が好ましい
が、固体培養法を採用することもできる。培養は約20〜
40℃で行うことができるが、好ましい培養温度は25〜35
℃である。好ましい培養期間は温度、pH、培地によって
異なるが、通常１〜６日程度であり、目的物であるホス
ホリパーゼＤの生産が最大に達した頃に培養を停止す
る。
トレプトミセス・プルニカラーSK−02−81の培養は、放
線菌一般の培養に通常採用される方法に従って行うこと
ができる。すなわち、培地には炭素源としてブドウ糖、
果糖、ショ糖、乳糖、糖蜜、デンプン、デキストリン、
グリセリン等を単独で、または組合せて、適宜用いるこ
とができ、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類など
を用いることもできる。また窒素源としては、硫酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿
素、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスチープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、
大豆蛋白、デスチラーズソリュブルなどを用いることが
できる。培地には、ほかに食塩、塩化カリウム、リン酸
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、鉄
塩、マンガン塩、各種ビタミン、その他、菌の生育やホ
スホリパーゼＤの生産促進に有効な物質を適宜添加する
ことができる。好ましい培地pHは５〜９、特に好ましく
は６〜７である。培養法としては深部培養法が好ましい
が、固体培養法を採用することもできる。培養は約20〜
40℃で行うことができるが、好ましい培養温度は25〜35
℃である。好ましい培養期間は温度、pH、培地によって
異なるが、通常１〜６日程度であり、目的物であるホス
ホリパーゼＤの生産が最大に達した頃に培養を停止す
る。
培養終了後、培養液から菌体をろ別し、ろ液からホス
ホリパーゼＤを採取する。ホスホリパーゼＤの採取に特
に困難はなく、各種酵素の分離精製に通常採用される方
法を適宜組合せて行うことができる。たとえば、限外ろ
過、減圧濃縮、塩析、有機溶媒沈殿、透析、ゲルろ過、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、等電点電気泳動法、凍結乾燥等の方法を、後述する
本発明のホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条
件で採用すればよい。
ホリパーゼＤを採取する。ホスホリパーゼＤの採取に特
に困難はなく、各種酵素の分離精製に通常採用される方
法を適宜組合せて行うことができる。たとえば、限外ろ
過、減圧濃縮、塩析、有機溶媒沈殿、透析、ゲルろ過、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、等電点電気泳動法、凍結乾燥等の方法を、後述する
本発明のホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条
件で採用すればよい。
ストレプトミセス・プルニカラーSK−02−81が生産す
る本発明のホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性
質を有するものである。
る本発明のホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性
質を有するものである。
（イ）作用 リン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステ
ル結合を加水分解し、ホスファチジン酸および塩基を遊
離させる。
ル結合を加水分解し、ホスファチジン酸および塩基を遊
離させる。
グリセロール、エタノール等のアルコール性水酸基
を有する化合物の共存下、グリセロリン脂質のホスファ
チジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解すると
同時にホスファチジル基と上記アルコール性水酸基を有
する化合物とより新たなエステルを生成するホスファチ
ジル基転移反応を生じさせる。
を有する化合物の共存下、グリセロリン脂質のホスファ
チジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解すると
同時にホスファチジル基と上記アルコール性水酸基を有
する化合物とより新たなエステルを生成するホスファチ
ジル基転移反応を生じさせる。
（ロ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を100
とした場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに
対して1.5、スフィンゴミエリンに対して0.1である。
とした場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに
対して1.5、スフィンゴミエリンに対して0.1である。
ホスファチジルコリンに対するKm値は0.9mMであ
る。
る。
（ハ）至適pH:約6.0 （加水分解反応およびホスファチジル基転位反応に共
通） （ニ）至適温度:50〜55℃ （加水分解反応およびホスファチジル基転位反応に共
通） （ホ）pH安定性:pH5〜８で安定 （ヘ）熱安定性 pH5または６において50℃３カ月間の加熱または55℃1
00時間の加熱で全く失活しない。
通） （ニ）至適温度:50〜55℃ （加水分解反応およびホスファチジル基転位反応に共
通） （ホ）pH安定性:pH5〜８で安定 （ヘ）熱安定性 pH5または６において50℃３カ月間の加熱または55℃1
00時間の加熱で全く失活しない。
（ト）金属イオンによる影響 濃度10mMの金属イオンを存在させた場合、加水分解活
性は金属イオンがMn2+のとき30％阻害されるが、Ca2+、
Ni2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Co2+のときは阻害されない。
性は金属イオンがMn2+のとき30％阻害されるが、Ca2+、
Ni2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Co2+のときは阻害されない。
（チ）各種阻害剤の影響 モノヨード酢酸により46％阻害されるが、ジイソプロ
ピルフルオロホスフェート、Ｎ−エチルマレイミド、シ
アン化カリウム、ｐ−クロロマーキュリーベンゾエー
ト、ｏ−フェナンスロリン、２−メルカプトエタノー
ル、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムでは影響され
ない。
ピルフルオロホスフェート、Ｎ−エチルマレイミド、シ
アン化カリウム、ｐ−クロロマーキュリーベンゾエー
ト、ｏ−フェナンスロリン、２−メルカプトエタノー
ル、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムでは影響され
ない。
（リ）分子量 5.2万（SDS−PAGE法による）。
なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性は、基質であるリ
ン脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を
分解したときに生じる塩基を定量することにより求め
る。この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジル
コリンを基質として用いる下記の方法により測定された
ものであって、１分間に１μモルのコリンを遊離する酵
素活性を１ユニットとしている。
ン脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を
分解したときに生じる塩基を定量することにより求め
る。この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジル
コリンを基質として用いる下記の方法により測定された
ものであって、１分間に１μモルのコリンを遊離する酵
素活性を１ユニットとしている。
ホスファチジルコリン分解活性測定法:0.8％のホスフ
ァチジルコリンと0.6％のトリトンX100を含むイソプロ
パノール溶液50μｌ、および0.1％のトリトンX100を含
む0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6）900μｌを混合
し、これに酵素液50μｌを加え、50℃で10分間反応させ
る。その後、直ちに100℃で２分間煮沸し、反応を完全
に停止させる。次に、コリン測定用試薬（コリンオキシ
ダーゼ325ユニット、パーオキシダーゼ500ユニット、塩
化カルシウム123mg、トリトンX100 250mg、４−アミノ
アンチピリン50mg、フェノール78mgをpH8.0のトリス塩
酸緩衝液250mlに溶かしたもの）1mlに上記酵素反応の反
応液50μｌを添加し、37℃で10分間反応させた後、あら
かじめ熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたも
のを対照液にして、500nmの吸光度を測定する。
ァチジルコリンと0.6％のトリトンX100を含むイソプロ
パノール溶液50μｌ、および0.1％のトリトンX100を含
む0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6）900μｌを混合
し、これに酵素液50μｌを加え、50℃で10分間反応させ
る。その後、直ちに100℃で２分間煮沸し、反応を完全
に停止させる。次に、コリン測定用試薬（コリンオキシ
ダーゼ325ユニット、パーオキシダーゼ500ユニット、塩
化カルシウム123mg、トリトンX100 250mg、４−アミノ
アンチピリン50mg、フェノール78mgをpH8.0のトリス塩
酸緩衝液250mlに溶かしたもの）1mlに上記酵素反応の反
応液50μｌを添加し、37℃で10分間反応させた後、あら
かじめ熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたも
のを対照液にして、500nmの吸光度を測定する。
実 施 例 以下、実施例を示して本発明を説明する。
実施例 １ 培地として、可溶性デンプン４％、大豆粉５％、リン
酸一カリウム0.1％、リン酸二カリウム0.2％、塩化ナト
リウム0.3％、硫酸マグネシウム0.05％、およびアデカ
ノールLG294を0.2％含むpH7.0のものを用意し、その100
mlを500ml容の坂口フラスコに入れ、蒸気滅菌後、スト
レプトミセス・プルニカラーSK−02−81の前培養液5ml
を植菌し、28℃で３日間、120spmで振とう培養した。
酸一カリウム0.1％、リン酸二カリウム0.2％、塩化ナト
リウム0.3％、硫酸マグネシウム0.05％、およびアデカ
ノールLG294を0.2％含むpH7.0のものを用意し、その100
mlを500ml容の坂口フラスコに入れ、蒸気滅菌後、スト
レプトミセス・プルニカラーSK−02−81の前培養液5ml
を植菌し、28℃で３日間、120spmで振とう培養した。
培養終了後、菌体をろ別し、酵素活性が75.5ユニット
/mlの培養ろ液100mlを得た。
/mlの培養ろ液100mlを得た。
次いで上記ろ液に硫酸アンモニウム96gを攪拌しなが
ら徐々に加え、生成した沈殿を遠心分離により集め、減
圧下に乾燥して、淡褐色のホスホリパーゼＤ（880mg,53
00ユニットを得た。培養ろ液からのホスホリパーゼＤの
活性回収率は70％であった。
ら徐々に加え、生成した沈殿を遠心分離により集め、減
圧下に乾燥して、淡褐色のホスホリパーゼＤ（880mg,53
00ユニットを得た。培養ろ液からのホスホリパーゼＤの
活性回収率は70％であった。
実施例 ２ 実施例１で用いた培地と同じ培地20を30のジャー
ファーメンターに入れ、120℃で15分間蒸気滅菌した
後、ストレプトミセス・プルニカラーSK−02−81の前培
養液１を植菌し、28℃で40時間培養した。
ファーメンターに入れ、120℃で15分間蒸気滅菌した
後、ストレプトミセス・プルニカラーSK−02−81の前培
養液１を植菌し、28℃で40時間培養した。
培養終了後、菌体等の固形物を遠心分離により除去
し、酵素活性が80.0ユニット/mlの上清液18を得た。
し、酵素活性が80.0ユニット/mlの上清液18を得た。
次いで上記上清液を４℃に冷却し、限外ろ過膜・AIL
−1010（旭化成株式会社製品）を用いて限外ろ過を行
い、濃縮液1.8を得た。濃縮液に対して40〜60％飽和
の硫安塩析を行い、生成した沈殿を50mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.0）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。そ
の後、同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファロースCL−
6Bのカラムに通し、不純物である蛋白質および色素を吸
着させた。溶出したホスホリパーゼＤ画分は同じ緩衝液
に対して透析したのち、4.8mMのクエン酸緩衝液（pH5.
4）で平衡化したCM−セファロースCL−6Bのカラムに通
して活性を吸着させ、食塩濃度勾配法（０〜0.2M）によ
り活性区分を溶出分離し、凍結乾燥して、白色のホスホ
リパーゼD 130mgを得た。
−1010（旭化成株式会社製品）を用いて限外ろ過を行
い、濃縮液1.8を得た。濃縮液に対して40〜60％飽和
の硫安塩析を行い、生成した沈殿を50mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.0）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。そ
の後、同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファロースCL−
6Bのカラムに通し、不純物である蛋白質および色素を吸
着させた。溶出したホスホリパーゼＤ画分は同じ緩衝液
に対して透析したのち、4.8mMのクエン酸緩衝液（pH5.
4）で平衡化したCM−セファロースCL−6Bのカラムに通
して活性を吸着させ、食塩濃度勾配法（０〜0.2M）によ
り活性区分を溶出分離し、凍結乾燥して、白色のホスホ
リパーゼD 130mgを得た。
上記精製工程におけるホスホリパーゼＤの活性回収率
は約30％、得られた精製品の比活性は3300ユニット/mg
蛋白であった。
は約30％、得られた精製品の比活性は3300ユニット/mg
蛋白であった。
次に、精製品について下記のような理化学的性質の試
験を行なった。
験を行なった。
至適pH ホスファチジルコリン分解活性：前述の酵素活性測定
法における緩衝液を他の種々のpHの緩衝液にかえて酵素
活性を測定することにより、本酵素のホスファチジルコ
リン分解活性のpH依存性を調べた。その結果は第１図の
とおりであって、至適pHは6.0付近にある。
法における緩衝液を他の種々のpHの緩衝液にかえて酵素
活性を測定することにより、本酵素のホスファチジルコ
リン分解活性のpH依存性を調べた。その結果は第１図の
とおりであって、至適pHは6.0付近にある。
ホスファチジル基転移活性：ホスホリパーゼＤの存在
下、ホスファチジルコリンとグリセリンからホスファチ
ジルグリセロールを生成する反応の初速度を種々のpHで
測定した。その結果は第２図のとおりであって、有機溶
媒系、水系、いずれにおいても、至適pHは６〜７であ
る。［反応初速度測定法：有機溶媒（酢酸エチル）系の
場合は、10％のホスファチジルコリンを含有するイソプ
ロパノール溶液25μｌ、グリセリン50μｌ、緩衝液50μ
ｌ、酢酸エチル400μｌ、酵素液数μｌを混合し、50℃
で30分間反応させる。反応終了後、反応液のpHを希塩酸
で２以下に調整して全リン脂質を酢酸エチル層に移し、
同層中のホスファチジルグリセロールをイアトロスキャ
ンにて分析して反応初速度を求める。水系の場合は、10
％のホスファチジルコリンを含有するイソプロパノール
溶液25μｌ、グリセリン50μｌ、緩衝液400μｌ、0.1M
塩化カルシウム水溶液50μｌ、酵素液数μｌを混合し、
50℃で30分間反応させる。反応終了後、反応液pHを希塩
酸で２以下に調整し、ヘキサン／エーテル／イソプロパ
ノール（1/1/0.5）混合溶媒を加えて全リン脂質を抽出
した後、有機溶媒層中のホスファチジルグリセロールを
イアトロスキャンにて分析し、反応初速度を求める。］ 至適温度 前述のホスファチジルコリン分割活性測定法における
酵素反応の温度を種々変更して酵素活性を測定すること
により、本酵素の活性の温度依存性を調べた。その結果
は第３図のとおりであって、至適温度は50〜55℃付近に
ある。
下、ホスファチジルコリンとグリセリンからホスファチ
ジルグリセロールを生成する反応の初速度を種々のpHで
測定した。その結果は第２図のとおりであって、有機溶
媒系、水系、いずれにおいても、至適pHは６〜７であ
る。［反応初速度測定法：有機溶媒（酢酸エチル）系の
場合は、10％のホスファチジルコリンを含有するイソプ
ロパノール溶液25μｌ、グリセリン50μｌ、緩衝液50μ
ｌ、酢酸エチル400μｌ、酵素液数μｌを混合し、50℃
で30分間反応させる。反応終了後、反応液のpHを希塩酸
で２以下に調整して全リン脂質を酢酸エチル層に移し、
同層中のホスファチジルグリセロールをイアトロスキャ
ンにて分析して反応初速度を求める。水系の場合は、10
％のホスファチジルコリンを含有するイソプロパノール
溶液25μｌ、グリセリン50μｌ、緩衝液400μｌ、0.1M
塩化カルシウム水溶液50μｌ、酵素液数μｌを混合し、
50℃で30分間反応させる。反応終了後、反応液pHを希塩
酸で２以下に調整し、ヘキサン／エーテル／イソプロパ
ノール（1/1/0.5）混合溶媒を加えて全リン脂質を抽出
した後、有機溶媒層中のホスファチジルグリセロールを
イアトロスキャンにて分析し、反応初速度を求める。］ 至適温度 前述のホスファチジルコリン分割活性測定法における
酵素反応の温度を種々変更して酵素活性を測定すること
により、本酵素の活性の温度依存性を調べた。その結果
は第３図のとおりであって、至適温度は50〜55℃付近に
ある。
安定なpH トリトンX100を0.1％含有する種々のpHの緩衝液に試
料を１ユニット/mlになるように溶解し、それぞれ50℃
で１時間、または４℃で24時間、静置した。その後、酵
素活性を測定し、試験前の酵素活性と比較した。結果は
第４図（50℃保存）および第５図（４℃保存）のとおり
であって、本発明によるホスホリパーゼＤが安定なpHは
約５〜８、特に安定なpHは５〜７であることがわかる。
料を１ユニット/mlになるように溶解し、それぞれ50℃
で１時間、または４℃で24時間、静置した。その後、酵
素活性を測定し、試験前の酵素活性と比較した。結果は
第４図（50℃保存）および第５図（４℃保存）のとおり
であって、本発明によるホスホリパーゼＤが安定なpHは
約５〜８、特に安定なpHは５〜７であることがわかる。
熱安定性 0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に試料を溶
解し、20〜70℃に30分間保ったのち残存する酵素活性を
測定した。その結果は第６図のとおりであって、55℃で
は全く失活せず、60℃で約５％の活性低下が認められ
た。別に、pH5または６において、この酵素の至適温度
である50℃に長期間保った場合における活性変化を調べ
たが、３か月後も100％の残存活性を示した。
解し、20〜70℃に30分間保ったのち残存する酵素活性を
測定した。その結果は第６図のとおりであって、55℃で
は全く失活せず、60℃で約５％の活性低下が認められ
た。別に、pH5または６において、この酵素の至適温度
である50℃に長期間保った場合における活性変化を調べ
たが、３か月後も100％の残存活性を示した。
金属イオンの影響 前述の酵素活性測定法において各種金属塩の水溶液を
用い、酵素反応系中で金属イオン濃度が1mMまたは10mM
になるようにして酵素活性を測定した。金属イオン無添
加のときの活性を100とする相対活性を、第１表に示
す。
用い、酵素反応系中で金属イオン濃度が1mMまたは10mM
になるようにして酵素活性を測定した。金属イオン無添
加のときの活性を100とする相対活性を、第１表に示
す。
阻害剤の影響 前述の酵素活性測定法において各種阻害剤（種々の酵
素に対して阻害作用あることが知られている物質）の水
溶液を用い、酵素反応系中で阻害剤濃度が1mMになるよ
うにして酵素活性を測定した。阻害剤無添加のときに測
定される活性を100とする相対活性を、第２表に示す。
素に対して阻害作用あることが知られている物質）の水
溶液を用い、酵素反応系中で阻害剤濃度が1mMになるよ
うにして酵素活性を測定した。阻害剤無添加のときに測
定される活性を100とする相対活性を、第２表に示す。
第２表 阻 害 剤 相対活性 ジイソプロピルフルオロホスフェート 104 モノヨード酢酸 54 Ｎ−エチルマレイミド 111 シアン化カリウム 105 ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート 101 ｏ−フェナンスロリン 111 ２−メルカプトエタノール 96 エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム 112 分子量 SDS−PAGE法によって分子量を測定した。その結果か
ら推察される本酵素の分子量は、5.2万であった。
ら推察される本酵素の分子量は、5.2万であった。
発明の効果 本発明のホスホリパーゼＤは、上述のようにその至適
反応温度である50℃において３か月以上連続使用しても
100％の残存活性を示し、この温度では事実上活性低下
を起こさないという、きわめてすぐれた熱安定性を示
す。また、金属イオンや阻害剤の影響も受け難い。した
がって、本発明のホスホリパーゼＤはカビ等微生物増殖
のおそれのない約50℃またはそれ以上の温度での長期保
存ができるという特長を持つとともに、リン脂質誘導体
の製造を従来よりもはるかに高能率かつ低い酵素コスト
で容易に実施できるようにする優れたものである。
反応温度である50℃において３か月以上連続使用しても
100％の残存活性を示し、この温度では事実上活性低下
を起こさないという、きわめてすぐれた熱安定性を示
す。また、金属イオンや阻害剤の影響も受け難い。した
がって、本発明のホスホリパーゼＤはカビ等微生物増殖
のおそれのない約50℃またはそれ以上の温度での長期保
存ができるという特長を持つとともに、リン脂質誘導体
の製造を従来よりもはるかに高能率かつ低い酵素コスト
で容易に実施できるようにする優れたものである。
また本発明の製造法によれば、上述のようにすぐれた
特性を有するホスホリパーゼＤをきわめて高い生産性を
もって製造することができる。すなわち、従来報告され
ているホスホリパーゼＤ生産菌株の培地1ml当りの酵素
生産量は、ストレプトミセス・クロモフスカスが0.5ユ
ニット（J.Biochem.,85巻,79頁,1979年）、ミクロモノ
スポラ・チャルセアが0.13ユニット（特公昭58−52633
号）、ノカルディオプシスspが0.54ユニット（特開昭58
−63388号）、アクチノマデューラspが1.7ユニット（特
開昭58−67183号）、ノカルディアspが0.17ユニット
（特開昭60−164483号）といった低水準のものであるか
ら、80ユニット/mlもの高力価産生菌を使用する本発明
の製造法によれば、ホスホリパーゼＤの製造能率の飛躍
的な向上が可能になる。
特性を有するホスホリパーゼＤをきわめて高い生産性を
もって製造することができる。すなわち、従来報告され
ているホスホリパーゼＤ生産菌株の培地1ml当りの酵素
生産量は、ストレプトミセス・クロモフスカスが0.5ユ
ニット（J.Biochem.,85巻,79頁,1979年）、ミクロモノ
スポラ・チャルセアが0.13ユニット（特公昭58−52633
号）、ノカルディオプシスspが0.54ユニット（特開昭58
−63388号）、アクチノマデューラspが1.7ユニット（特
開昭58−67183号）、ノカルディアspが0.17ユニット
（特開昭60−164483号）といった低水準のものであるか
ら、80ユニット/mlもの高力価産生菌を使用する本発明
の製造法によれば、ホスホリパーゼＤの製造能率の飛躍
的な向上が可能になる。
第１図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
のpH依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素のホスファチジル基転位活性のpH
依存性を示すグラフ。 第３図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ（保存温度50℃）。 第５図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ（保存温度４℃）。 第６図：本発明の酵素の熱安定性を示すグラフ。
のpH依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素のホスファチジル基転位活性のpH
依存性を示すグラフ。 第３図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ（保存温度50℃）。 第５図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ（保存温度４℃）。 第６図：本発明の酵素の熱安定性を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡辺 常一 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内 (72)発明者 黒田 彰夫 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内 (72)発明者 大木 隆正 東京都大田区蒲田本町１−９−３ 株式会 社新潟鉄工所内 (56)参考文献 特開 昭58−152481（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するホスホリパー
ゼD: （イ）作用 リン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステ
ル結合を加水分解し、ホスファチジン酸および塩基を遊
離させる； グリセロール、エタノール等のアルコール性水酸基
を有する化合物の共存下、グリセロリン脂質のホスファ
チジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解すると
同時にホスファチジル基と上記アルコール性水酸基を有
する化合物とより新たなエステルを生成するホスファチ
ジル基転移反応を生じさせる； （ロ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を100
とした場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに
対して1.5、スフィンゴミエリンに対して0.1である； ホスファチジルコリンに対するKm値は0.9mMであ
る； （ハ）至適pH:約6.0 （ニ）至適温度:50〜55℃ （ホ）pH安定性:pH5〜８で安定 （ヘ）熱安定性 pH5〜６において50℃３カ月間の加熱、または55℃100時
間の加熱で全く失活しない； （ト）金属イオンによる影響 濃度10mMの金属イオンを存在させた場合、加水分解活性
は金属イオンがMn2+のとき30％阻害されるが、Ca2+、Ni
2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Co2+のときは阻害されない； （チ）各種阻害剤の影響 モノヨード酢酸により46％阻害されるが、ジイソプロピ
ルフルオロホスフェート、Ｎ−エチルマレイミド、シア
ン化カリウム、ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート、
ｏ−フェナンスロリン、２−メルカプトエタノール、エ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウムでは影響されない； （リ）分子量 5.2万（SDS−PAGE法による）。 - 【請求項２】ストレプトミセス・プルニカラーSK−02−
81株を培養し、培養液からホスホリパーゼＤを採取する
ことを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62052990A JPH088866B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62052990A JPH088866B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63219373A JPS63219373A (ja) | 1988-09-13 |
| JPH088866B2 true JPH088866B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=12930359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62052990A Expired - Fee Related JPH088866B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH088866B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101052702B (zh) * | 2004-07-16 | 2013-01-09 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 脂肪分解酶及其在食品工业中的应用 |
| JP4895507B2 (ja) * | 2005-02-04 | 2012-03-14 | 株式会社ヤクルト本社 | ストレプトマイセス属細菌の培養方法及びこれを利用する有用物質の製造方法 |
| JP4663370B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-04-06 | 株式会社ヤクルト本社 | ホスホリパーゼｄの凍結保存方法及び耐凍結性ホスホリパーゼｄ組成物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58152481A (ja) * | 1982-03-05 | 1983-09-10 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 |
-
1987
- 1987-03-10 JP JP62052990A patent/JPH088866B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63219373A (ja) | 1988-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Watanabe et al. | Isolation and identification of alkaline lipase producing microorganisms, cultural conditions and some properties of crude enzymes | |
| JPH0378115B2 (ja) | ||
| CH639695A5 (it) | Procedimento enzimatico-microbiologico per la produzione di amminoacidi otticamente attivi a partire da idantoine e/o carbamil-derivati racemi. | |
| EP0201039B1 (en) | L-aminoacylases | |
| JPH088866B2 (ja) | ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法 | |
| EP0243167B1 (en) | A novel microorganism, a novel esterase and method for preparing the same | |
| JPS6362195B2 (ja) | ||
| JP2799621B2 (ja) | ホスホリパーゼｄの製造法 | |
| US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
| Lim et al. | Production and characterization of extracellular phospholipase D from Streptomyces sp. YU100 | |
| JP4426664B2 (ja) | ホスホリパーゼｄおよびその製造法 | |
| JP2005328781A (ja) | 新規ホスホリパーゼｃ | |
| JPH05328972A (ja) | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法 | |
| JPH0787781B2 (ja) | ホスホリパーゼｄ及びホスホリパーゼｄの製造法 | |
| JPH0117675B2 (ja) | ||
| JP3729468B2 (ja) | シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌 | |
| JPS58152481A (ja) | 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 | |
| JP2799622B2 (ja) | ホスホリパーゼｄおよびその製造法 | |
| JPS58179489A (ja) | 新規アルデハイド・オキシダ−ゼ | |
| RU2077577C1 (ru) | Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы | |
| DE3020646C2 (ja) | ||
| JPS6339579A (ja) | リパ−ゼａｍｌの製造法 | |
| JP3649765B2 (ja) | 新規なグリセロールキナーゼおよびその製造法 | |
| JPS5852633B2 (ja) | 発酵法によるホスホリパ−ゼｄの製造法 | |
| KR100444948B1 (ko) | 세포외 포스포리파제 ｄ를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ｙｕ100 균주 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |