JPH09508526A

JPH09508526A - Genetic engineering of mollusks

Info

Publication number: JPH09508526A
Application number: JP7520792A
Authority: JP
Inventors: リンナマドセンヒアフォード; デニスアルファパワーズ; マルタゴメスチアリ
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1994-02-04
Filing date: 1995-02-02
Publication date: 1997-09-02
Also published as: NZ279759A; AU702639B2; WO1995020872A1; CA2182501A1; AU1699995A

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子導入軟体動物、特に遺伝子導入アワビの生産に有用なベクターおよび方法を記述するものである。本発明は、さらに、増大された成長特性を有する遺伝子導入軟体動物を記述する。そのうえに、アワビアクチンの遺伝子のプロモーター領域の単離と特性解析が開示されている。 (57) [Summary] The present invention describes vectors and methods useful for the production of transgenic molluscs, especially transgenic abalone. The present invention further describes transgenic mollusks with enhanced growth characteristics. In addition, the isolation and characterization of the promoter region of the abalone actin gene is disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】軟体動物の遺伝子工学発明の技術分野本発明は、遺伝子導入軟体動物（transgenic mollusk）、特に貝類に関し、さらにアワビを含む軟体動物の遺伝子工学の方法に関する。さらに本発明は、アワビのアクチンの遺伝子配列の単離と特性解析およびその使用に関する。参考文献発明の背景海産食物に対する米国の市場は、大きく、かつ成長しつつあり、一人当りの海産食物の消費量は、過去１０年間で２３％増加している。この期間に、海産食物の消費者物価指数は、２４４％急騰したが、赤肉の価格は、その半分上昇したに過ぎない。収量維持のレベルで野生の魚類と貝類の個体数を管理しようとする努力がなされているにもかかわらず、米国は、その漁師から産出される量より一層多量を消費し資源を涸渇させている。全世界の海洋収穫量は、西暦２０００年の推定需要量の１１４，０００，０００メートルトンに対して、僅か９０，０００，０００メートルトンしか満たさないと予想されている（Ｈａｒｖｅｙの文献、１９９０年）。この世界的な実状は、カリフォルニアのアワビ産業に反映している。１９３１年から１９６８年まで、アワビの商業的漁獲量は、１年間で平均して約９００メートルトンであった。１９６８年以後、漁獲量は、上記レベルの約１５％まで減少した。この減少は、いくつもの要因が原因であるとされているが、そのうち最も重要な要因は、恐らく、極東からの需要によってもたらされた魚獲圧力であろう（Ｔｅｇｎｅｙの文献、１９８９年）。漁場を回復させようとするｔｈｅＣａｌｉｆｏｒｎｉａＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＦｉｓｈａｎｄＧａｍｅの集中的な努力にもかかわらず、現在の漁獲量は、その１９６８年の水準のままである。カリフォルニアのアワビ漁場の衰退は、メキシコ（ＧｕｔｚｍａｎｄｅｌＰｒｏｏの文献、１９９２年）、南アフリカ（Ｔａｒｒの文献、１９９２年）およびオーストラリア（ＰｒｉｎｃｅとＳｈｅｐｈｅｒｄの文献、１９９２年）における類似の衰退と符合している。アワビの供給が減少すると、そのｐｅｒｌｉｍｉｔｖａｌｕｅは、増大し続ける。１９７３年〜１９８８年の間で、ダイバーに支払われる代価は、インフレ率の２倍を上回る８００％増大した（Ｔｅｇｎｅｒ他の文献、１９９２年）。この需要の増大によって、商業養殖の技術が開発されてきた。これらの努力は、主に日本とカリフォルニアに集中しているが、カリフォルニアは、地上で集約的な養殖を行うための海水システムの開発において独特である（Ｅｂｅｒｔの文献、１９９２年）。発明の概要一面において、本発明には、軟体動物に対して非相同（heterologous）のＤＮＡ配列を有する遺伝子導入（transgenic）軟体動物が含まれる。その非相同ＤＮＡ配列は、組み込まれてもよいし、または染色体外であってもよい。一実施態様で、上記ＤＮＡ配列には調節配列が隣接し、このことは該ＤＮＡ配列を軟体動物内で発現させるのに有効である（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現）。これらの調節配列は、アワビのような軟体動物またはドロソフィラ・メラノガスター（Drosophi la melanogaster）の遺伝子をはじめとする他の起源から誘導することができる。本発明の実施態様には、ドロソフィラ・メラノガスターまたはアワビ由来のアクチン遺伝子の調節配列の使用が含まれる。好ましい実施態様では、本明細書に記載のアクチン遺伝子のプロモーターが用いられる。本発明の一実施態様において、上記調節配列は、ドロソフィラ・メラノガスターのＡＣＴ−５プロモーターから得られ、そして上記の非相同ＤＮＡ配列は、ギンザケ成長ホルモンをコードしている。この構造体は遺伝子導入アワビを産出するのに用いると、アワビの成長が促進される。本発明を実施するのに有用な非相同ＤＮＡ配列としては、成長増大を促進する産物（例えば、成長ホルモンまたはインスリン様成長因子など）をコードしているＤＮＡ配列がある。その外に、軟体動物の組織の味またはテクスチャに影響する産物をコードしているＤＮＡ配列がある。また本発明には、遺伝子導入軟体動物を本発明の方法によって製造するのに有用な発現ベクターが含まれる。発現ベクターは、典型的に、（ｉ）軟体動物内で配列を発現させるのに有効な調節要素が隣接している第一ＤＮＡ配列（この調節要素は、軟体動物の遺伝子から得られる）、および（ｉｉ）二次宿主内でこの発現ベクターを繁殖させる第二ＤＮＡ配列を含有している。代表的な第二配列としては、複製開始点と選択可能マーカーを有するＤＮＡ配列があり、これら両者は二次宿主内で機能する。二次宿主としては、細菌、酵母および昆虫細胞がある。上記発現ベクターは、上記の調節要素およびＤＮＡコーディング配列を保有することができる。他の実施態様で、本発明には、対象のあらゆるコーディング配列を挿入し易くするのに有用なクローニング部位に隣接したアワビアクチン遺伝子プロモーター領域を含有する発現ベクターが含まれている。また本発明には、軟体動物にトランスフェクトする方法が含まれる。この方法で、対象のＤＮＡ配列を有するベクターが提供される。このベクターは、例えばエレクトロポレーションによって、選択された軟体動物中に導入される。トランスフェクトされた軟体動物、すなわち対象のＤＮＡを保有する軟体動物は、上記ＤＮＡ配列の存在に基づいて、例えばハイブリッド形成分析または該ＤＮＡ配列に伴う特性の発現によって確認される（例えば、リポーター遺伝子の存在）。上記ＤＮＡ配列は、成長増大を促進する遺伝子、例えば、成長因子またはインスリン様成長因子などをコードすることができる。導入されるＤＮＡは、組み込まれてもよいし、または染色体外であってもよい。一実施態様において、ＤＮＡの導入は、該ベクターを、軟体動物の受精卵中例えばアワビの受精卵中にエレクトロポレートすることによって行われる。典型的には、そのＤＮＡ配列には、そのＤＮＡ配列を遺伝子導入軟体動物中で発現させるのに有効な調節配列が隣接している。本発明の他の実施態様に、軟体動物内でタンパク質を組換え発現させる方法が含まれている。この方法では、そのタンパク質の発現が可能な条件下で増殖するタンパク質をコードする非相同ＤＮＡ配列を有する遺伝子導入軟体動物が用いられる。本発明には、さらに、軟体動物の成長を促進する方法が含まれ、この方法によって、成長増大を促進する遺伝子をコードする非相同ＤＮＡ配列を有する遺伝子導入軟体動物が産出される（例えば成長ホルモンまたはインスリン様成長因子など）。次いで、その遺伝子導入軟体動物は、成長促進タンパク質を許容する条件下で養殖される。また本発明には、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびこのＤＮＡ配列に隣接し該ポリペプチドの転写を促進するのに有効なプロモーターを含有する二重らせんＤＮＡフラグメントも含まれており、この場合、そのプロモーターはアワビアクチン遺伝子のプロモーターであり、かつそのＤＮＡ配列はアワビアクチン遺伝子ではない。この実施態様で、そのポリペプチドのコーディング配列は、そのプロモーター配列に対して非相同である。一つの実施態様で、そのＤＮＡ配列は、成長増大を促進する遺伝子、例えば、成長ホルモン（ギンザケ成長ホルモンなど）またはインスリン様成長因子などである。このような二重らせんＤＮＡフラグメントは、例えば、対象のベクター中に挿入する発現カセットとして有用である。別の面において、本発明には、倍数体の軟体動物例えばアワビの産生方法が含まれる。この方法では、アワビの受精卵をサイトカラシンＢで処理して倍数性を誘発させる。次に、この処理された受精卵を、それを倍数体生物に発育させる条件下で養殖する。一実施態様で、サイトカラシンＢで処理すると、極体の生成が７０％以上阻害されるようになる。このような倍数体生物は、成長が促進された特性を有しているので有用である。本発明のこれらのおよび他の目的と特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付図面とともに読めば、より一層充分に分かるであろう。図面の簡単な説明図１は、エレクトロポレーションを行ったアワビの卵中へのプラスミドＤＮＡの取込みと保持を示す。図２は、３箇月齢の幼若アワビ中にエレクトロポレートされたＤＮＡの保持を示す。図３Ａは、潜在結合フラグメント（potential junction fragments）の部分制限地図を示す。図３Ｂは、遺伝子導入アワビのＤＮＡハイブリッド形成データを示す。図４は、エレクトロポレートされた幼生におけるβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。図５Ａは、アクチン遺伝子と４００ｂｐの内部領域の概略図を示す。図５Ｂは、アクチン特異的配列のＰＣＲによる増幅を示す。図６は、ｐＬＨ３で遺伝子導入されたアワビと遺伝子導入されていない対照のアワビの重量の比較結果を示す。図７は、ドロソフィラ・メラノガスターＡＣＴ５Ｃプロモーターを含有するベクターｐＭＫ２６の概略地図を示す。図８Ａと図８Ｂは、アワビアクチンプロモーターを単離する際に実施するステップを図式で示す。図９は、アワビアクチンのプロモーターおよび隣接領域の配列（配列番号：５）を示す。図１０は、アワビアクチンのプロモーターの構造の概略を示す。図１１は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を含有するベクターｐＬＵＣの図式地図を示す。図１２は、ベクターｐＣＭＶｔｋＬＵＣ、すなわちルシフェラーゼリポーター遺伝子を含有する対照プラスミドの図式地図を示す。発明の詳細な説明Ｉ．定義相同ＤＮＡとは、組換え法によって宿主生物に導入されたのではないＤＮＡを意味する非相同ＤＮＡとは、宿主生物中にトランスフェクトされたＤＮＡを意味する。典型的には、非相同ＤＮＡとは、トランスフェクトまたは形質転換された細胞のゲノムＤＮＡ（例えば、ＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼの遺伝子配列）からは、本来得られないＤＮＡを意味する。しかし、組換え法によって生物中に導入されたＤＮＡは、非相同ＤＮＡと呼ぶ（例えば、アワビ成長ホルモン遺伝子を保有する発現ベクターのアワビ内への導入など）。染色体外ＤＮＡとは、宿主細胞内に導入されたプラスミドＤＮＡを意味し、そのプラスミドＤＮＡは、その宿主の細胞のゲノムＤＮＡ中には組み込まれていない。用語「軟体動物」は、本明細書で用いる場合、ビバルビア（Bivalvia）綱（例えば、カキ類）、ガストロポーダ（Gastropoda）綱（例えば、アワビ）、およびセファロポーダ（Cephalopoda）綱（例えば、イカ）を含めて、モルスカ（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）門の構成員を意味する。ＩＩ．遺伝子導入貝類の産出に有用なベクターの開発Ａ．外因性ＤＮＡの導入遺伝子導入軟体動物を産出する有効な方法を開発するには、これら生物体の何らかの特異性を考慮する必要がある。本発明の目的のための代表的な軟体動物は、アワビである。アワビは、「ブロードキャスト・スポーナー（broadcast spawners）」として知られている海の無脊椎動物のあいまいなグループ（loose group）に属している。このような生物の場合、受精は体外受精であり、多数の精子と卵子が可妊成体から放出されて行われる。大きな成体の雌（７インチ）は、１０，０００，０００個のオーダーの卵を産出し、ふ化の条件下で受精率は９５％以上である。発育は、迅速かつ同調して進行する。すなわち、減数分裂Ｉ（第一極体の出現）が２０分間で完了し、減数分裂ＩＩ（第二極体の出現）が３０分間で完了し、次いで第一卵割が２時間で完了する。２４時間で原腸形成が完了し、次いで面盤すなわち泳ぐための簡単な動物システムが発生した。この時点で、卵子がふ化して、ベリジャー幼生を放出する。次の２４時間中に、事実上全ての成体組織の一次分化が起こり、トロコフォア幼生と呼ばれるものになる。トロコフォアの発育は、５〜７日間続き、その期間にセツルメント（se ttlement）が起こる。セツルメントは、動物が固体の基板に結合することによって行われ、その後、動物は、その泳ぐ器官を失い、成体の貝殻を発生し、次いでグレージング（graz ing）を始める。理由は、充分理解されていないが、セツルメントは、死亡率が高く、ふ化の条件下でも僅かコンピテントベリジャー幼生の２〜５％しかセツルメントに成功しない。このことは、この生物の高い多産性のため、ふ化を大きく阻害しないが、効率的な遺伝子導入技術の開発に対する問題点になっている。外因性ＤＮＡを生殖細胞系列に組み込む機会を改善するため、外因性ＤＮＡを第一分裂分割の前に導入する。エレクトロポレーションでＤＮＡを導入すると、第一分裂分割の比較的短い時間枠（約２時間）内で多数の卵子を処理することができる。エレクトロポレーションによるＤＮＡの導入が本発明の好ましい実施態様であるが、外因性ＤＮＡを導入する別の方法、例えばマイクロインジェクション法なども同様に使用できる。アワビのトランスフェクションを行う場合にさらに考慮すべきことは、動物界におけるその分類学的位置、および発現ベクター内で使用するのに適切なプロモーターを選択する際の上記位置の影響である。「古典的な」脊椎動物の発現ベクターは、通常いくつもの組織内で高いレベルで発現されるプロモーターを使用している。これらのプロモーターのなかで最も普及しているのは、レトロウイルス類のサイトメガロウイルス類（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）由来のプロモーターである。しかし、脊椎動物と軟体動物を分ける進化上の距離があるため、脊椎動物のプロモーターは、軟体動物の組織内で発現を行わないようである。本発明を裏付けるために実施した実験では、脊椎動物より軟体動物に一層密接に関連している生物のディー・メラノガスターのプロモーター（例えば、ＡＣＴ５−Ｃ、Ｋｏｅｌｌｅの文献、１９９３年）を利用した。他のディー・メラノガスタープロモーター／発現ベクターにも、本発明を実施するのに有用なものがある（例えば、Ｒｉｏ他の文献、１９８５年。Ｄａｖｉｅｓ他の文献、１９８６年。Ｓｃｈｗｅｉｎｆｅｓｔ他の文献、１９８８年）。代表的なプラスミドｐＭＫ１８については、実施例１で述べる。プラスミドｐＭＫ１８は、ＡＣＴ５−Ｃプロモーターのβ−アクチンプロモーターを含有している。このプロモーターは、遺伝子が大部分の成体組織内ではもとより、発育の全体を通じて発現される（Ｆｒｙｂｅｒｇ他の文献、１９８３年）ので、選択した。上記プラスミドは、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子及びｕｂｘ遺伝子の５´非翻訳領域からなる「発現カセット」を含有している。本発明を裏付けるのに実施した実験では、エレクトロポレーションによってアワビの受精卵にトランスフェクトするのにプラスミドｐＭＫ１８を使用した。エレクトロポレーション条件の初期の最適化は、ドットブロットハイブリッド形成法を用いて、受精卵中への外因性ＤＮＡの導入を検出して行った（実施例２）。ＤＮＡは、単一の卵子（ｓｉｎｇｌｅｅｇｇ）または幼生から抽出し、次にニトロセルロースに固定し、次いで適当な放射能標識をつけたプラスミドＤＮＡとハイブリッドを形成させた。ドットブロットは、二つの時点で行った。すなわち、（ｉ）２〜４細胞の段階（two-to-four cell stage）…ＤＮＡの取り込みを監視するため、および（ｉｉ）ふ化後直ちに…ＤＮＡの保持を監視するため、行った。エレクトロポレーション条件の最適化を行った後の典型的なドットプロットを図１に示す（実施例３）。この図で、全エレクトロポレートされた卵子の約８０〜１００％において、ＤＮＡが取り込まれ、保持されていることが分かる。遺伝子導入アワビ内での外因性ＤＮＡの発現について検査するため、５０個づつの幼生のプールを、幼生の発育期間中の各種の時点で収集し、β−ガラクトシダーゼの活性について検定した（実施例４）。これら検定の結果を図４に示す。これらのデータは、ｐＭＫ１８（β−アクチンプロモーター）を使用するとβ− ガラクトシダーゼが発現することを示している。トロコフォア幼生（１日目）で活性が観察され、そしてこの活性は、ベリジャー幼生（２日目）で最高に到達する。ドットブロット法によってプラスミドＤＮＡが幼生期間全体を通じて保持されていることが明らかになっているので、酵素活性の衰退は、プラスミド配列の喪失が原因ではない。β−ガラクトシダーゼ活性のピークは、明らかに、トロコフォアからベリジャーへ変異する間、すなわち細胞分裂が最大の時点で起こる。β−アクチンのレベルは、細胞分裂と正の相関関係があるので、ドロソフィラのアクチンプロモーターが発育上正しい具合に作用していると考えられている。このデータは、また、脊椎動物のレトロウイルスプロモータＣＭＶが活性でなく見えることを実証している。類似の結果がＲＳＶプロモーターの場合に得られた。プラスミドＤＮＡが保持され、セツルメントの後に発現されたかどうかを検査するため、ｐＭＫ１８ＤＮＡを用いて約６０００個の卵子のエレクトロポレーションを行った結果、約２００個の幼若体を得た。これらの幼若体を３箇月齢、６箇月齢および９箇月齢でサンプリングを行った（実施例３）。３箇月齢の幼若体から得た典型的なドットブロットを図２に示す。検査した９匹の動物のうち、すべてがＤＮＡを保持し、これら動物のうち、６匹が有意なレベルのβ−ガラクトシダーゼの発現を示した（表１、本質的に実施例４に記載されているように検定した）。６箇月齢と９箇月齢の幼生アワビから類似の試験結果が得られた。プラスミドＤＮＡは、幼若体に存続しているが、安定した遺伝子導入系を樹立するには、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれていなければならない。未切断のゲノムＤＮＡをＤＮＡハイブリッド形成分析に付した結果、そのプラスミド配列は、高分子量のＤＮＡであることが明らかになった。このような高分子量は、鎖状体形成または鎖状体形成と組み込みが原因であろう。これらの可能性を識別するために、ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した。この制限酵素は、ＥｃｏＲＩで線状にしてエレクトロポレーションを行うのに用いたプラスミドを非対称的に切断する（実施例３、図３Ａ）。そのＤＮＡを、ｐＭＫ１８の２００ｂｐフラグメントとハイブリッドを形成させて分析した（図３Ａ）。上記ハイブリッド形成分析の結果は、次のとおりであった。可能性のある３種の鎖状体のうちの２種に対応する強力な８ｋｂのシグナルがすべてのゲノムＤＮＡ試料中に観察された。第三の種類の鎖状体に対応する弱い約１６ｋｂのシグナルがいくつかのブロット中に観察された。これらの試験結果は、大部分の鎖状体が、魚について観察されているような頭−尾マルチマーであることを示唆している（Ｓｔｕａｒｔ他の文献、１９８８年。ＣｈｏｎｇとＶｉｅｌｋｉｎｄの文献、１９８９年）。結合フラグメント（junction fragment）が、その時点の約７０％で観察されたが、このことは非常に高度の組み込みを示唆している。組み込まれたＤＮＡと組み込まれていないＤＮＡの両者を示すオートラジオグラムを図３Ｂに示す（実施例３）。ＡＣＴ５−Ｃプロモーターは、幼生のアワビと幼若アワビの両者で機能するが、ドロソフィラＳ２細胞内でのその発現に比べて僅かに約５〜１０％の効率で機能するにすぎない。より効率的な軟体動物発現ベクターの開発について以下に述べる。ＡＣＴ５−Ｃプロモーターの調節下でギンザケ成長ホルモン（ｃｓＧＨ）遺伝子（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖｉｌｌａｎｓｅｎｏｒｓ他）を有する遺伝子導入アワビも構築した。ｃｓＧＨ遺伝子の配列は、配列番号：１で示す。ＡＣＴ５−Ｃの制御下のｃｓＧＨ遺伝子を含有するベクターは、ｐＬＨ２と命名した。対照の（野生型）アワビに対する、ｐＬＨ２ベクターを保有する遺伝子導入アワビの重量分布を測定した。図６は、このような分析の一つの結果を示す。図６のデータは、遺伝子導入アワビの方が非遺伝子導入の対照のアワビより重量分布が広くかつ平均重量が高いことを示している。これら試験結果は、成長特性が増大した遺伝子導入軟体動物を産出する効力を実証している。ジノゲン（gynogen）と三倍体の産生は、倍数性、特に三倍体と四倍体を化学的に誘発するすることによって達成することができる。化学的誘発方法は、該生物の生活環の特定の相、例えば減数分裂Ｉまたは減数分裂ＩＩにおいてサイトカラシンＢで処理することによって実施できる。この方法では、アワビの受精卵が提供される。その受精卵は、典型的には二倍体卵であるが、四倍体のような異なる倍数性であってもよい。次に、その受精卵を、倍数性を誘発するのに有効な濃度のサイトカラシンＢで処理する。この濃度は、処理される卵子のタイプに依存している。有効な濃度は、実験で決定することができる。アワビの場合、サイトカラシンＢの好ましい濃度の範囲は、約０．１ｍｇ／１〜１ｍｇ／ｌである。処理された卵子は、次に倍数体の生物に発育させられる。受精卵が二倍体の場合、得られる倍数体生物は一般に三倍体かまたは四倍体である。サイトカラシンＢによる処理は、典型的には、減数分裂Ｉ、減数分裂ＩＩ、または減数分裂ＩとＩＩの両者を阻害するために行われる。好ましい実施態様では、このような処理を行うと極体の生成が７０％以上阻害される。また、このような処理は、倍数体生物が典型的に染色体の正常補体（normal complement）を有する同じ生物（通常二倍体）に比べて成長特性が増大しているので、アワビの成長を促進する方法を提供する。ジノゲンは、一世代内で自殖（selfing）を行うことができるので、一層古典的な繁殖法を促進するのみならず、遺伝子導入体を迅速にホモ接合（homogygose ）する機構を提供することができる。例えば、ジノゲンは、Ｆ１に使用して導入遺伝子（transgenes）をホモ接合し、次に三倍体を産生することによってＦ２が不稔となる。さらに、三倍体（ジノゲンを産生する際の１成分を含有している）は、不稔シードストックを産生することができるので、遺伝子工学で処理された生物に対する環境上の懸念を緩和できる。ＴＩＩ．貝類ベクターの開発本発明は、また「全アワビ」または「全軟体動物」の発現プラスミドの開発にも関する。誘導プロモーター類、メタロチオネインおよび熱ショックなどのプロモーター（すでに魚類に使われているように）は、外部刺激によって誘導することができる。しかし、このような誘導プロモーター類は、大規模商業生産に対して現実的に適合できない。アワビの増殖は、海水が連続的に流動するタンク内で起こる。工業生産が要求する規模で水温または化学組成を調節しようとすることは、コスト面で非効率的で環境面でも賢明なことではない。Ａ．アワビβ−アクチンのプロモーターの単離本発明を裏付けるために実施した実験は、β−アクチンプロモーターを使用してアワビの発現ベクターを構築することに関する実験である。このプロモーターは、二つのことを考慮して選択した。第一に、β−アクチンは、いくつもの成体組織内で高レベルで発現される（Ｆｒｙｂｅｒｇ他の文献、１９８３年）。第二に、発現に関与する要素の組合せを変えてベクターを構築することによって、β −アクチンプロモーターの活性を調節することができる（Ｌｉｕ他の文献、１９９０年ａ。Ｌｉｕ他の文献、１９９０年ｃ）。この特性は、生物の応答が循環ホルモンのレベルに依存している場合、成長ホルモンのようないくつかのタンパク質を発現させるのに重要である。成長ホルモン（ＧＨ）の場合、生物の成長は、ある最適濃度まではホルモンの濃度の比例しているが、最適濃度をこえると阻害作用が全くないかまたはごく僅かとなる（Ａｇｅｌｌｏｎ他の文献、１９８８年。Ｍｏｒｉｙａｍａの文献、１９９２年）。アクチン遺伝子類は、多重遺伝子族である（ＶａｎｄｅｒｋｅｒｃｋｈｏｖｅおよびＷｅｂｅｒの文献、１９７８年ａ、１９７８年ｂ）。これらの遺伝子は、高度に保存されているので、β−アクチンをα−アクチンまたはγ−アクチンから識別するプローブまたはプライマーを設計することは不可能である。これとは対照的に、３´非翻訳領域は、広い相同性（extensive homology）を示さない（Ｆｒｙｂｅｒｇ他の文献、１９８３年。Ｌｉｕ他の文献、１９９０年ｃ）ので、特定のアクチンＤＮＡ配列を同定するのに使用できる。アワビのβ−アクチン遺伝子を単離するため、まずその遺伝子のコーディング領域の一部をポリメラーゼ連鎖反応増幅法で単離した（実施例５Ａ）。非脊椎動物のアクチンに対する一組の縮重プライマーを用いて、アワビβ−アクチン遺伝子のコーディング領域内の約４００ｂｐのフラグメントを単離した（実施例５Ａ、図５Ａ、５Ｂおよび８Ａ）。約４００ｂｐの上記配列から、アワビβ−アクチン配列特異的プライマーを合成する。これらのプライマーを用い、該遺伝子の３´と５´の末端の両者を、ｃＤＮＡ末端のＰＣＲ迅速増幅（ＰＣＲ−ＲＡＣＥ）反応（Ｆｒｏｈｍａｎの文献、１９８８年、１９９０年）で単離する。５´と３´の末端を単離した後、配列を決定する。該遺伝子の５´と３´の非翻訳末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは、λ−ｇｔ１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在）中に保有されている、アワビゲノムＤＮＡクローンに対するハイブリッド形成プローブとして用いられる。積極的にハイブリッドを形成するクローンを同定し、次いで、制限エンドヌクレアーゼ開裂法によって地図を作成する。開裂フラグメントを該オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成させて、アクチン遺伝子とそのプロモーターおよび３´と５´の非翻訳領域を含有する適当な大きさの制限フラグメントを確認する。上記のアクチン遺伝子含有制限フラグメントを、標準の技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他の文献、１９８９年）を用いて、大きさを選択したライブラリーを構築することによって、クローン化する。次いで、全アクチン挿入断片のＤＮＡ配列を決定する。５´非翻訳配列を含めてアワビアクチン遺伝子の５´領域を含有する配列を決定した（実施例５Ｂ）。これらの配列を図９に示す（配列番号：５）。図１０は、配列を決定されたアクチン遺伝子の領域の概略図を示す。過渡的発現の検定結果（実施例５Ｂ、表２）は、アクチン遺伝子プロモーターが機能していることを実証している。このアワビβ−アクチン遺伝子は、発現ベクターを構築するのに使用できる（実施例５ｃ）。一実施態様において、アワビアクチンプロモーター配列は、例えば成長ホルモン遺伝子が、該プロモーターの制御下にある場合、アワビを形質転換するするのに有用なベクターを構築するのに使用できる。他の適切な軟体動物遺伝子由来のプロモーター（例えば、ヘキソキナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼなど）は、β−アクチンについて本明細書に記載した手続にほぼ従って単離することができる。Ｂ．発現ベクターの構築アクチンプロモーターに特異的なモチーフは、他のアクチンプロモーターと比較することによって同定する。類似の比較は、他の単離されたアワビ遺伝子について行うことができる。プロモーター領域および他の５´と３´の機能領域は、欠失地図作成によって同定する（実施例５Ｂ）。欠失体の配列を決定し、次いで全アクチン遺伝子クローンと比べてエンドポイントを決定した。プロモーターおよび５´と３´の非翻訳領域を各種の比率で含有するプラスミドが構築された。ポリリンカー部位が、迅速クローン化を行うため、典型的に５´と３´の非翻訳遺伝子の調節領域の間に挿入される。ポリリンカーは、通常、例えばｐＵＣ１８のポリリンカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州パロアルト所在）の場合のように、いくつかの独特の酵素エンドヌクレアーゼ部位を持っている。受精卵への発現ベクターＤＮＡの取り込みおよびＤＮＡの組み込みは、実施例２と３に記載したようにして測定する。アクチン遺伝子発現カセット（すなわち、ポリリンカーに隣接する５´／３´ アクチン配列）は、典型的には、大量のベクターＤＮＡの操作と単離を容易に行うためにシャトルベクター中にクローン化される。このようなシャトルベクターは、いくつか市販されている（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在）。シャトルベクターは、典型的に、複製開始点（選択された宿主中でプラスミドが増殖するための複製開始点、例えばその複製開始点はｃｏｌＥ１タイプでもよい）および宿主細胞内で選択できる選択可能マーカー遺伝子（例えば、細菌の場合、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^R））を持っている。Ｃ．発現のレベルの測定本発明の発現ベクターを用いたときの遺伝子発現のレベルは、遺伝子導入アワビの産出および生きている幼生と幼若体中での非相同ＤＮＡの発現の特性解析によって測定した。β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＲＡＴ）およびルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔ他の文献、１９８７年。Ｇｉｂｂｓ他の文献、１９９１年）の遺伝子をはじめとする、いくつかのリポーター遺伝子が、遺伝子発現を定量するのに有用である。典型的に、リポーター遺伝子は、発現カセット（例えば、アクチン遺伝子発現カセット）中にインフレーム融合遺伝子（in-frame fusion）として挿入される。遺伝子発現のレベルは、選択されたリポーター遺伝子を検出する標準の酵素検定法によって定量される（例えば、ＣＡＴ酵素検定システム、Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州マディソン所在）。さらに、発現レベルの定量は、ＲＮＡハイブリッド形成分析法（Ａｕｓｕｂｅｌ他の文献、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他の文献）を用い、内因性遺伝子ＲＮＡ（例えば、β−アクチンｍＲＮＡ）のレベルをリポーター遺伝子ＲＮＡ（例えば、ルシフェラーゼｍＲＮＡ）のレベルと比較して実施する。ＩＶ．成長に影響する貝類遺伝子の単離Ａ．成長ホルモンの遺伝子成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子を挿入すると、次のようないくつかの商業上重要な水産物の成長速度が増大する結果が得られている。例えば、ドジョウ（ミスグルヌス・アンギリカウダトゥス＝Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ）（Ｚｈｕ他の文献、１９８６年）、コイ（シプリヌス・カルピオ＝Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）（Ｚｈａｎｇ他の文献、１９９０年）、大西洋サケ（サルモ・サラール（Ｓａｌｍｏｓａｌａｒ）（Ｒｏｋｏｎｅｓ他の文献、１９８９年。Ｄｕ他の文献、１９９２年）、ニジマス（オノリンクス・ミディス＝Ｏｎｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍｙｄｉｓｓ）（Ｇｕｙｏｍａｒｄ他の文献、１９８９年）、カワカマス（エソックス・ルシウス＝Ｅｓｏｘｌｕｃｉｕｓ）およびウォールアイ（Ｗａｌｌｅｙｅ）（スティゾステジオン・ビトレウム＝Ｓｔｉｚｏｓｔｅｄｉｏｎｖｉｔｒｅｕｍ）（Ｍｏａｖ他の文献、１９９２年）がある。遺伝子導入魚類は、典型的に、その遺伝子を導入されていない同胞より１〜３倍の大きさである。商業的に重要な貝類のアワビとカキは、外因性ＧＨに応答する（Ｍｏｒｓｅ他の文献、１９８１年、１９８４年）。変態中のアワビの幼生をヒトＧＨとともにインキュベートすると、４日後に貝殻の長さが約１０％大きくなった。最近、Ｍｏｒｉｙａｍａ（１９９２年の文献）は、幼若アワビに組換えサケホルモンを注入するかまたは幼生アワビを該ホルモンに浸漬すると、重量が２〜３倍増大することを示した。イースターンカキ（eastern oyster）（クラソストレア・バージニカ＝Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｖｉｒｇｉｎｉｃａ）について類似の試験結果を、ＰａｙｎｔｅｒとＣｈｅｎが報告している（１９９１年の文献）。これらの貝類に対するＧＨの正作用は、おそらく、原始的軟体動物中に複合ホルモン系が存在していることを反映している（ＪｏｏｓｅとＧａｒａｅｒｔｓの文献、１９８３年）。この解釈と一致して、Ｍｏｒｉｙａｍａと彼の同僚たちは、アワビから成長ホルモン様ペプチドを単離し、部分的に精製しており、そしてこのペプチドも成長を刺激する（Ｍｏｒｉｙａｍａ他の文献、１９８９年、１９９２年）。本発明は、軟体動物の成長に影響する遺伝子を導入できる組換えベクターと方法を示す。本発明の方法によって、アワビのＧＨ遺伝子は、例えば、生成するタンパク質発現産物がアクチン／ＧＨ融合タンパク質であるように、アクチンカセット発現ベクター中にクローン化される。あるいは、アクチン調節配列を用いＧＨ調節配列を置換して、ＧＨ遺伝子を、アクチン遺伝子調節配列の転写と翻訳の制御下に置く。さらに、本発明の方法を用いて、正常なＧＨ遺伝子調節配列を欠失させ、次にこの配列を高レベルの発現を行わせる調節配列で置換することによって（すなわち遺伝子置換）、ＧＨ遺伝子の内生コピーを修飾することができる。Ｂ．他の可能性がある有用な遺伝子遺伝子導入アワビの成長速度と最終の大きさを増大するためにアワビ成長ホルモン遺伝子を使用するのに加えて、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）遺伝子もＧＨに対するその正の調節によって成長を促進するのに用いることができる（ＳａｒａとＨａｌｌの文献、１９９０年）。ＩＧＦ１は、最近カキ類から単離されている。各種の生物体から由来のＩＧＦ１様の配列は、アワビ同族体のＩＧＦ１遺伝子の単離に用いる縮重プライマーを産出するのに使用できる（アワビβ−アクチン遺伝子の単離について本明細書で述べたのと同様）。Ｖ．用途本発明は、モルスカ（ｍｏｌｌｕｓｃａ）門のメンバーの形質転換法を含んでいる。この門には、ガストロポーダ綱が含まれ、この綱にアワビ類が含まれている。Ａ．ベクターと変異品種本発明は、軟体動物を形質転換するのに適切なベクターを提供するものである。このようなベクターは、個々にまたはキットで販売されており、本発明のトランスフェクション法と形質転換法に用いることができる。また、キットには、形質転換を行うのに有用な緩衝液が入っていることもある。本発明のベクターと方法は、遺伝子導入アワビなどの遺伝子導入水産生物を産出するのに使用できる。本発明のベクターと方法は、非相同ＤＮＡを導入するか、あるいは組換え遺伝子法で内生遺伝子を修飾するのに使用できる。このような遺伝子導入生物は、操作して先に述べたように成長速度を高めることができる。成長を高めることに加えて、疾病抵抗性、貝殻および／または貝の肉の着色、肉のテクスチャおよび味などの他の特性を有する品種を作ることができる。この技術は、アワビのみならず、他の商業上重要な軟体動物にまで広げることができる。Ｂ．遺伝分析本発明のトランスフェクション法は、一層古典的な遺伝的方法を補完する。本明細書に記載の遺伝子発現の効率によって、成長と生物発生の過程にとって重要な遺伝子発現について詳細な研究を行うことが可能になる。さらに、本発明の遺伝子導入生物（transformed organism）は、かような過程を妨害するかまたは促進するのに有効な化合物を（典型的には、リポーター遺伝子、例えばＧＨプロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子の発現に対するかような化合物の作用を利用することによって）選別する手段を提供するものである。本発明の遺伝子導入軟体動物も、トランスフェクションで導入されたＤＮＡがコードする非相同タンパク質を発現する伝達体（vehicles）である。また、本発明のベクターと方法は、遺伝子置換法および遺伝子ノックアウト法を含めて、軟体動物の組換え遺伝子操作を行う手段を提供するものである。本発明を実施する好ましい実施態様、使用および方法を詳細に説明してきたが、本明細書に示したような他の各種の使用、組合せおよび実施方法は、本発明の意図内にあることが分かるであろう。材料と方法大腸菌ＤＮＡのポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ＢＭＢ）（米国インディアナ州インディアナポリス所在）から入手した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼとＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社（米国マサチューセッツ州ビバリー所在）から入手し、ニトロセルロースフィルターは、ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ（米国ニューハンプシャー州キーン所在）から入手した。合成のオリゴヌクレオチドリンカーとプライマーは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて製造した。あるいは、注文設計の合成オリゴヌクレオチドは、例えばＳｙｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃｓ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）から購入できる。ｃＤＮＡ合成キットおよびランダムプライミング標識付けキットは、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社（ＢＭＢ、米国インディアナ州インディアナポリス所在）から入手した。ペプチド類をコードするオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成の標準方法で直接合成するか、またはコーディング配列が大きい場合そのコーディング配列に対応する多重オリゴヌクレオチドフラグメントのタンデムアレーを含む一連のクローン化ステップで合成することができる（Ｃｒｅａ、Ｙｏｓｈｉｏ他、Ｅａｔｏｎ他）。オリゴヌクレオチドのコーディング配列は、標準の組換え法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ａｕｓｕｂｅｌ他）によって発現させることができる。標準の分子生物学の方法とクローン化法は、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、およびＭａｎｉａｔｉｓ他の文献に既に記載されているのと本質的に同様に実施した。ポリメラーゼ連鎖反応は、本質的にメーカーの支持どおりに行った。ポリメラーゼ連鎖反応法は、Ｋａｗａｓａｋｉの文献、Ｍｕｌｌｉｓの文献、およびＭｕｌｌｉｓ他の文献に記載されている。受精卵は、ＰａｃｉｆｉｃＭａｒｉｃｕｌｔｕｒｅＩｎｃ．社（米国カリフォルニア州９５０６０サンタクルズ、コーストロード５５１５所在）から入手した。受精卵の他の出所は、次のとおりである。ＴｈｅＡｖａｌｏｎｅＦａｒｍＩｎｃ．社（米国カリフォルニア州９３４３０、カーヨコス、私書箱１３６）、およびＡｂＬａｂ社（米国カリフォルニア州９３０４３−４３２８、ポート・ヒューニーム、センター・ドライブ５６０）である。実施例１プラスミド類の構築プラスミドｐＭＫ１８とｐＬＨ２は、ｐＭＫ２６（図７。Ｋｏｅｌｌｅ他の文献、１９９１年。ｐＭＫ２６＝ｐＡｃｔ／Ｓｖ４０／ＢＳ）から構築した。プラスミドｐＭＫ２６は、ドロソフィラメラノガスターＡＣＴ５−Ｃプロモーター、 β−アクチンプロモーターを含有している。このプロモーターは、発育中全体を通じておよび殆どの成体組織中において発現される（Ｆｒｙｂｅｒｇ他の文献、１９８３年）。両者ベクターは、下記のように修飾されたｐＭＫ２６から構築した。すなわち、ｐＭＫ２６をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、ｐＭＫ２６内のＫｐｎＩ部位の隣のＥｃｏＲＩ部位（図７）を、クレノウとｄＮＴＰを用いて満たした（Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｍａｎｉａｔｉｓ他）。獲られたプラスミドをブラント末端連結法によって再び環状にし、次いで単一のＥｃｏＲＩ部位を有する修飾ｐＭＫ２６を制限地図作成によって確認した。ｃＰｂｘｄ６．２の４．８β−ガラクトシダーゼｕｂｘカセット（Ｉｒｖｉｎｅ他の文献、１９９１年）を、そのフラグメントのブラント末端連結によって修飾ｐＭＫ２６のＳｍａＩ部位に挿入することによって、ｐＭＫ１８を構築した。エレクトロポレーションを行う場合、プラスミドは、ユニークＥｃｏＲＩ部位で線状にした。ｐＬＨ２を構築するため、ｃｓＧＨ遺伝子ならびにすべての５´−非翻訳リーダーおよび３７３ＢＰの３´−非翻訳領域を含有する１０７０ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＲＳＶＣＳＧＨから得た（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｖｉｌｌａｎｓｅｎｏｒ他）。上記ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、修飾ｐＭＫ２６ポリリンカーのユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位中に連結した。このプラスミドは、エレクトロポレーションを行う場合は、ＥｃｏＲＩによって線状にした。ｃｓＧＨのＤＮＡ配列は配列番号：１として示す。ｃｓＧＨの全翻訳配列は、配列番号：２として示す。ｐＬＵＣベクターは、以下のようにして生成させた。ルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０調節配列を含有する、ｐＸＰ２の２．０ｋｂＸｋｏＩ／ＳｔｙＩフラグメント（Ｎｏｒｄｅｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６巻、４５４〜４５７貞、１９８８年）を単離した。このフラグメントを、ｘｈｏＩ／ＳｔｙＩで消化したｐＢＬＣＡＴ６中にクローン化して（Ｂｏｓｈａｒｔ他、Ｇｅｎｅ）１１０巻、１２９〜１３０頁、１９９２年）、プロモーターなしのルシフェラーゼ含有ベクターを得た。上記のｐＣＭＶｔｋＬＵＣベクターは、ＣＭＶエンハンサーを有するＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有していた。実施例２アワビへのＤＮＡの導入ＤＮＡを導入するため、４０００から６０００卵／２００μｌの濃度のアワビ受精卵２００μｌを、Ｂａｅｋｏｎ２０００エレクトロポレーターキュベットの各々に入れた。各キュベットには、２ｍｇ／ｍｌの濃度の線状化プラスミドＤＮＡ１００μｌと人工海水４００μｌが入っていた。典型的な人工海水の構成成分は、次のとおりである。すなわち、２４．７２ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．６７ｇ／ｌのＫＣｌ，１．３６ｇ／ｌのＣａＣｌ₂・２（Ｈ₂Ｏ）、４．６６ｇ／ｌのＭｇＣｌ₂・４（Ｈ₂Ｏ）、６．２９ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄・７（Ｈ₂Ｏ）、０．１８ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ７．８である。エレクトロポレーションの条件は、次の通りであった。１０ＫＶ、６サイクル、パルス時間：１６０μｓおよびバースト時間：１．６秒である。エレクトロポレーションを行った後、これらの卵をペニシリンとストレプトマイシンを各々１００μｇ／ｌずつ含有する海水１ｌ（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国メリーランド州ガイサーズバーグ所在）中に入れた。その卵／幼生を通気しながら１４℃で培養した。海水／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐは毎日取り替えた。実施例３遺伝子導入アワビのゲノムＤＮＡハイブリッド形成分析Ａ．ＤＮＡの取り込みと保持上記ベクターでトランスフェクトしたアワビ卵を、トランスフェクトしているＤＮＡの存在について評価した。受精してから２時間後（第一卵割期（first cleavage division））と２４時間後（トロコフォア幼生）に、エレクトロポレーションされた卵からＤＮＡを抽出した（Ｈａｈｎの文献、１９８９年）。上記の最初の時点では、ＤＮＡの取り込みを観察し、第二の時点では、ＤＮＡの保持を観察した。各時点で、５個の卵または幼生のプールを、「エッペンドルフ」微量遠心単離管中のＴＥ（Ｍａｎｉａｔｉｓ他）１０μｌ内で、ホモジナイザーを用いて摩砕した。破片を除いてから、核酸を沈澱させた。再懸濁させたＤＮＡ試料を、ドットブロットキャプチャーシステム（dot blot capture system）を用いてニトロセルロースに移した（Ａｕｓｕｂｅｌ他、ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ社）。このようなドットブロット分析の代表的な結果を図１に示す。図１は、プラスミドＤＮＡがエレクトロポレートされたアワビ卵中に取込まれ保持されていることを示す。上記ニトロセルロースフィルターに結合させたＤＮＡを放射能標識をつけたプラスミドｐＭＫ１８ＤＮＡとハイブリッドを形成させた（ランダムプライマー、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、米国インディアナ州インディアナポリス所在）。図１において、２時間後の試料の最下行の左から２本のスロットは、エレクトロポレートされていない卵から抽出したＤＮＡである。標準は、図１のトップパネルに示してあり、左から右へそれぞれ６００、３００、１００、６０および３０ピコグラムのｐＭＫ１８ＤＮＡである。このようにして得たデータは、エレクトロポレートされた卵全部の約８０〜１００％にＤＮＡが取込まれ保持されていることを示唆した。Ｂ．トランスフェクトされたＤＮＡの保持ｐＭＫ１８ベクターでトランスフェクトしたアワビを成長させた。３箇月齢の幼若アワビからＤＮＡを抽出し、放射標識をつけたプラスミドｐＭＫ１８ＤＮＡを用いドットブロット法で分析した。図２は、遺伝子導入アワビと非遺伝子導入の対照アワビについてのドットブロットハイブリッド形成データを示す。濃度標準は（左から右へ）、６００、４００、１００、６０、３０、１０、６および３ピコグラムのｐＭＫ１８ＤＮＡである。図２の結果は、エレクトロポレートされたＤＮＡが３箇月齢の幼若アワビ中に保持されていることを実証している。Ｃ．３箇月齢の遺伝子導入幼若アワビのＤＮＡハイブリッド形成分析上記３箇月齢の遺伝子導入幼若アワビから単離したＤＮＡ試料を、アガロースゲルに負荷し、サイズ分画を行い、ニトロセルロースフィルターに移した（Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他）。これらのフィルターを放射能標識をつけたｐＭＫ１８とハイブリッドを形成させた。これらフィルターのオートラジオグラムは、ｐＭＫ１８相同配列が高分子量ＤＮＡ中に存在していることを実証した。これら試験結果を図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて、二つのレーンのＤＮＡ試料は、二つの異なる動物から単離された。左側パネルのＤＮＡが組み込まれている。右側のパネルのＤＮＡは組み込まれていない。ｐＭＫ１８の鎖状体と組込みを識別するため、ゲノムＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この制限エンドヌクレアーゼは、エレクトロポレーションを行うのに用いた、ＥｃｏＲＩで線状にしたプラスミドを非対称的に切断する（図３Ａ参照）。ニトロセルロースフィルター上の上記ＤＮＡを、ｐＭＫ１８の８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント由来で２００ｂｐのポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、米国コネティカット州ノーウォーク）で増幅したフラグメントとハイブリッドを形成させた（図３Ａ参照）。３種の可能性のある鎖状体のうちの２種に対応する強力な８ｋｂのシグナルが観察された（図３Ｂ）。ゲノムＤＮＡの全試料中に、各試料中に鎖状体が存在していることを示す８ｋｂのシグナルが観察された。上記ＤＮＡ試料のいくつかには、約１６ｋｂのシグナルも観察された。この１６Ｋｂのシグナルは、第三のタイプの鎖状体に対応するシグナルであった（図３Ａ）。これらの試験結果は、これら鎖状体の大部分が頭尾マルチマーであることを示唆している。遺伝子導入アワビ由来のＤＮＡ試料の約７０％に結合フラグメントが観察された（図３Ｂ）例えば、８ｋｂ未満の分子量で現れるシグナル）。この試験結果は、極めて高度に取り込まれていることを示唆している。実施例４遺伝子導入アワビにおける遺伝子発現の分析ベクターｐＭＫ１８は、β−ガラクトシダーゼの発現カセットを持っていた。このベクターを有する遺伝子導入アワビのβ−ガラクトシダーゼの発現について、時間の経過とともに検定した。５０個の幼生からなるプールを、幼生の発育期間中、各種の時間間隔をおいて抽出し、次いでβ−ガラクトシダーゼのレベルを、Ｋｏｅｌｌｅ他の１９９１年の文献にすでに記載されているのと本質的に同様にして、蛍光基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．社、米国ミズーリ州セントルイス所在）を用いて測定した。図４は、エレクトロポレートされた幼生内でのβ−ガラクトシダーゼの発現についての代表的な蛍光試験から得たデータを示す。蛍光単位をＹ軸に示し、時間（日数）（受精後）をＸ軸に示す。酵素活性は、任意の蛍光単位で示してある。図４に示すデータは、プラスミドｐＭＫ１８については、５個の別個のエレクトロポレーション試験結果の平均値であり、対照のプラスミドＣＭＶＬａｃについては、２個の別個の実験結果の平均値である。ＣＭＶｌａｃは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に隣接したサイトメガロウイルスプロモーターを保有するベクターである（例えば、「ｐＣＭＶβ」、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州パロアルト所在）。標準誤差は、計算しなかったが、試験間の変動は、５％未満であった。このデータは、ｐＭＫ１８（β−アクチンのプロモーター）を用いたときβ− ガラクトシダーゼが発現されることを示唆している。ドットブロット試験の結果が、幼生期を通じてプラミドＤＮＡが保持されていることを示しているので、酵素活性の減少は、プラスミド配列の損失が原因ではない。脊椎動物のレトロウイルスのプロモーターＣＭＶは、遺伝子導入アワビ内では活性でないようである。ＲＳＶのプロモーターの場合も類似の結果が得られた。実施例５アワビアクチンの遺伝子の同定と単離および軟体動物発現ベクターの構築Ａ．アワビアクチン遺伝子の約４００塩基対のフラグメントの分離非脊椎動物アクチンに対する一組の縮重プライマー（ディー．メラノガスター（５ＣＸ、８Ｆ、８７Ｅ）、ビー．モリイ（Ｂ．Ｍｏｒｙｉ）（Ａ１、Ａ２、Ａ３）のアクチン遺伝子に対する「ＧＥＮＢＡＮＫ」配列に基づいて）を設計した。これらプライマーの配列を配列番号：３および配列番号：４として示す。これらのプライマーは、標的コーディング領域内で約４００ｂｐのフラグメントを増幅する（図５Ａ）。この約４００ｂｐのフラグメントの単離を示す概略図を図３Ａに示す。ＲＮＡは、アワビの卵巣組織から単離した（Ｌ．ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＫ．Ｍｏｌｄａｖｅ編集「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１２巻、パートＢ、１２０−１２９貞のＲ．Ａ．ＣｏｘＩの報告（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社、米国フロリダ州オーランド所在）、１９８８年発行。Ｔｅｌ−ＴｅｓｔＩｎｃ．社（米国テキサス州フレンズウッド所在）から入手できる「ＲＮＡＺＯＬ」キット）。１０μｌの逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）を用い、最終容積２０μｌで、全卵巣ＲＮＡ５μｇからｃＤＮＡを合成した。各ｃＤＮＡ試料１μｌを用い、２０μＭのプライマーを加えて１００μｌポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ポリメラーゼ連鎖反応の条件とプロトコルは、市販のキツト（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、米国コネティカット州ノーウォーク所在）に見られるのとほぼ同じにした。増幅産物を、電気泳動を利用し大きさに基づいて分割した。増幅後、各反応産物混合物の約７％を、１％アガロースゲルの電気泳動によって単離した（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社、米国メイン州ロックポート所在）。これらのゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線照射で眼に見えるようにした。このような分析の一つの試験結果を図５Ｂに示す。図５Ｂの第１レーンは、縮重アクチンプライマーのセットと卵巣由来のＤＮＡを利用した増幅で得られた増幅産物を示す。第２レーンは、縮重アクチンプライマーのセットと全アワビ卵巣ＲＮＡを利用した増幅で得られた増幅産物を示す。約４００ｂｐの予想増幅産物が第２レーンに観察された。この４００ｂｐフラグメントの配列は、標準のＤＮＡ配列決定法で確認した。Ｂ．アワビアクチンのプロモーターの配列の単離アワビアクチン遺伝子配列特異的プライマーを上記の約４００塩基対の配列から得た。アクチンタンパク質のコーディング配列に対応するＤＮＡストランドに相補的なプライマーを選択した（図８Ｂ）。アワビゲノムＤＮＡライブラリーをλｇｔ１０（Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に作成した。このライブラリーは、第一プライマーとして先に述べたアクチン特異的プライマーを用いおよび第二プライマーとして一組のランダムプライマー（ＢＭＢ社、米国インディアナ州インディアナポリス所在）を用いるポリメラーゼ連鎖反応による増幅の場合にＤＮＡ基質（DNA substrate）として用いた（図８Ｂ）。ゲノムウォーキング試験によって、アワビアクチン遺伝子のゲノムコーディング配列が単離された。図９（配列番号：５）は、アクチン遺伝子の５´コーディング領域を示し５´非コーディング配列を伴う１５４０塩基対の部分配列を示す。アクチン遺伝子のイントロンの位置と転写開始点の地図を作成するため、配列決定とＲＮアーゼ保護の検定を実施した。図９に示した配列に対応するアワビ遺伝子の構造を図１０に図式的に示す。プロモーターモチーフ（例えばＴＡＴＡボックス）およびプロモーター領域を、アクチンタンパク質コーディング領域の２個のエキソンと１個のイントロンとして図１０に示す。２種の発現ベクター構造体をこれらアクチン配列で創製した。第一に、特に全クローンをベクターｐＬＵＣの多重クローン化部位中に導入した（図１１）。このベクターをｐＡＢＡ１６００ＬＵＣと命名した。第二のベクターは、ｐＬＵＣの多重クローン化部位中に、配列番号：５の最初の約８００ｂｐを導入して創製した（ｐＡＢＡ８００ＬＵＣと命名）。これらベクター構造体のリポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）であった。ｐＡＢＡ１６００ＬＵＣ、ｐＡＢＡ８００ＬＵＣ、ｐＬＵＣ（負の対照、実施例１）およびＰＣＭＶｔｋＬＵＣ（正の対照、実施例１）を、標準のリン酸カルシウムトランスフェクション法にしたがってヒト胚腎細胞系ＡＴＫ２９３中にトランスフェクトした。これらの遺伝子導入細胞系を用いて過渡的発現の検定を実施した。トランスフェクション検定におけるアワビアクチンプロモーターの活性は、１Ｕガラクトシダーゼ当りのｆｇルシフェラーゼとして測定した。負の対照（ｐＬＵＣだけで遺伝子導入された細胞）に対する活性の百分率を求めた。この分析試験の結果を表２に示す。これらの試験結果は、発現ベクター構造体にプロモーター機能を提供する、クローン化アクチン配列の性能を実証している。Ｃ．アワビアクチンプロモーターベースのベクターの産出操作し易くするため、β−アクチン配列をシャトルベクター中にクローン化する。例えば、「ＳＫ＋ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」ベクターは、細菌宿主中でベクター構造体を複製し選択できる配列を提供した。他の公知の細菌ベクター系（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州パロアルト所在）が同様にこの機能で使用できる。さらに、酵母のベクターが本発明を実施するのに使用できる（例えば、Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｒｕｔｔｅｒ他、Ｏｅｄａ他）。酵母の遺伝子導入宿主として典型的なものは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるが、遺伝子導入に適した他の酵素も同様に使用できる（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ））。非相同ＤＮＡ（遺伝子導入されつつある生物からは本来得られないＤＮＡ）を発現させるベクターを製造するために、転写と翻訳の調節配列（開始と終止の配列を含む）が典型的に遺伝子の５´と３´の非コーディング領域から得られる（アワビ由来のβ−アクチンについて先に述べたのと同様）。特異的な活性プロモーター配列の特性解析をさらに行うため、配列の比較で同定されたアクチン遺伝子プロモーター配列（図１０）を含有する５´非コーディング配列および隣接する５´コーディング配列を、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（Ｇｏｒｍａｎ）のようなリポータータンパク質コーディング配列にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合させる。 β−アクチンの５´末端とリポーター遺伝子を含有する一連のプラスミドを、プロモーター含有領域の５´遠位端をＥｘｏＩＩＩで消化することによって構築する（ＨｏｈｅｉｓｅｌとＰｏｈｌの文献、１９８６年。Ｈｅｎｉｋｏｆｆの文献、１９８７年）。欠失シリーズを先に述べたようにしてアワビの卵中にトランスフェクトし、次いでその卵をリポーター遺伝子の発現について検定した。リポーター遺伝子を発現するプラスミドの配列を決定して、欠失のエンドポイントを求めた。各種の比率でアクチンプロモーターと５´と３´の非翻訳領域を含有する適当な発現プラスミドを構築した。非反復制限部位（Unique restriction sites）を、迅速クローン化のために、５´と３´の非翻訳領域の間に挿入する。このベクターを用いて行うＤＮＡの取込みと組込みは、上記のようにドットブロット法とＤＮＡハイブリッド形成検定法で測定する。本発明を特定の方法と実施態様を参照して説明してきたが、本発明から逸脱することなく各種の変形を行うことができるものと理解されたい。 Detailed Description of the Invention Genetic engineering of mollusksTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to transgenic mollusks, especially shellfish. And a method for genetic engineering of molluscs including abalone. Furthermore, the present invention It relates to the isolation and characterization of the gene sequence of biactin and its use.References Background of the Invention The US market for seafood is large and growing, with per capita seafood Food consumption has increased by 23% in the last decade. During this period, seafood Consumer price index jumped 244%, but red meat price rose half that Not too much. Efforts to control wild fish and shellfish populations at the level of yield maintenance Despite its efforts, the United States is much more than the fishermen produce. It consumes large amounts and is depleting resources. The world's ocean yield is the year 2000 Only 90,000 against the estimated demand of 114,000,000 metric tons It is expected to meet only 1,000 metric tons (Harvey's article, 1990). This global reality reflects the California abalone industry. 1931 From year 1 to year 1968, abalone's commercial catch averaged about 900 me It was Tolton. Since 1968, catches have fallen to approximately 15% of the above levels A little bit This decrease goes It is said that one of the factors is the cause, but the most important factor is probably It could be the fishing pressure brought by the demand from the Far East (Tegney, 1989). The California Department wants to restore the fishing ground Despite the intensive efforts of ent of Fish and Game, The current catch remains at its 1968 level. California Abalone The decline of fishing grounds is described in Mexico (Gutzman del Proo, 1992). Year), South Africa (Tarr literature, 1992) and Australia (Pr. Consistent with similar decline in Ince and Shepherd, 1992. ing. As the abalone supply decreases, its per limit value increases. to continue. Between 1973 and 1988, the price paid to divers is Increased by 800%, more than double the rate (Tegner et al., 1992). This growing demand has led to the development of commercial aquaculture technology. These efforts are Mainly concentrated in Japan and California, but California is ground intensive Unique in the development of a seawater system for successful aquaculture (Ebert's reference) , 1992).Summary of the invention In one aspect, the present invention provides DN that is heterologous to mollusks. Included are transgenic mollusks having an A sequence. Its heterologous DN The A sequence may be integrated or extrachromosomal. One embodiment The regulatory sequence is adjacent to the above DNA sequence, which means that the DNA sequence is Expressed in Are effective (eg, RNA or protein expression). These regulatory arrangements Rows of mollusks like abalone or Drosophi melanogaster (Drosophi can be derived from other sources, including the la melanogaster gene . Embodiments of the present invention include Drosophila melanogaster or abalone-derived The use of the regulatory sequences of the Kutin gene is included. In a preferred embodiment, herein The actin gene promoter described is used. In one embodiment of the invention the regulatory sequence is Drosophila melanogast Derived from the ACT-5 promoter, and the above heterologous DNA sequences are It encodes salmon growth hormone. This structure produces transgenic abalone When used to promote abalone, it promotes abalone growth. Heterologous DNA sequences useful in practicing the invention include those that promote increased growth. Encodes a product (eg, growth hormone or insulin-like growth factor) There is a DNA sequence In addition, it affects the taste or texture of mollusk tissue DNA sequence encoding the product Further, the present invention is useful for producing transgenic molluscs by the method of the present invention. Expression vectors are included. Expression vectors are typically (i) in molluscs A first DNA sequence flanked by regulatory elements that are effective in expressing the sequence (this regulatory Elements are obtained from mollusc genes), and (ii) this gene is generated in the secondary host. It contains a second DNA sequence that propagates the current vector. As a typical second array Have a DNA sequence with an origin of replication and a selectable marker, both of which Functions in a secondary host. Secondary hosts include bacteria, yeast and insect cells. The expression vector contains the above regulatory elements and And can carry a DNA coding sequence. In another embodiment, the invention facilitates the insertion of any coding sequence of interest. Abalone actin gene promoter adjacent to a cloning site useful for An expression vector containing the region is included. The invention also includes methods of transfecting molluscs. This way Provides a vector having the DNA sequence of interest. This vector is for example Introduced into selected mollusks by electroporation. Trang Defected molluscs, ie, mollusks carrying the DNA of interest, are described above. On the basis of the presence of a DNA sequence, for example a hybridization assay or said DNA sequence Is confirmed by the expression of properties associated with (eg, the presence of a reporter gene). The DNA sequence may include genes that promote increased growth, such as growth factors or It can encode a Surin-like growth factor or the like. The introduced DNA may be integrated or extrachromosomal. . In one embodiment, the introduction of DNA is carried out by using the vector in fertilized eggs of molluscs. For example, it is performed by electroporating the fertilized egg of abalone. Typical In order to express the DNA sequence in transgenic mollusks, Flanking regulatory sequences that are effective in In another embodiment of the invention, a method of recombinantly expressing a protein in mollusks is provided. include. This method grows under conditions that allow expression of the protein For use in transgenic mollusks having a heterologous DNA sequence encoding a protein It is. The invention further includes a method of promoting mollusc growth, By this method, a heterologous DNA sequence encoding a gene that promotes increased growth is identified. A transgenic mollusk having is produced (eg, growth hormone or insulin). Like growth factors). The transgenic mollusks then in turn provide growth-promoting proteins. Cultivated under acceptable conditions. The present invention also provides a DNA sequence encoding a polypeptide and this DNA sequence. Flanked by, and containing a promoter effective to promote transcription of the polypeptide. A heavy-helix DNA fragment is also included, in which case the promoter is It is a promoter of the abalone actin gene and its DNA sequence is abalone Not a gene. In this embodiment, the coding sequence for the polypeptide is It is heterologous to the promoter sequence. In one embodiment, the DNA Columns are genes that promote increased growth, such as growth hormone (coho salmon growth hormone). Or insulin-like growth factor. Such a double helix DNA fragment is inserted, for example, into the vector of interest. It is useful as an input expression cassette. In another aspect, the invention includes a method of producing a polyploid mollusk, such as an abalone. I will. In this method, fertilized eggs of abalone were treated with cytochalasin B to increase ploidy. Trigger. The treated fertilized egg is then treated with a strain that allows it to develop into a polyploid organism. Aquaculture under conditions. In one embodiment, treatment with cytochalasin B results in polar body formation. 70% or more will be inhibited. Such polyploid organisms were growth-promoted. It is useful because it has characteristics. These and other objects and features of the present invention are illustrated in the accompanying detailed description of the invention below. It will be even more fully understood if read along with the face.Brief description of the drawings Figure 1 shows the plasmid DNA in electroporated abalone eggs. Shows the uptake and retention of. Figure 2 shows the retention of electroporated DNA in 3 month old juvenile abalone. Show. FIG. 3A shows a partial structure of potential junction fragments. Shows a limited map. Figure 3B shows DNA hybridization data of transgenic abalone. Show. FIG. 4 shows β-galactosidase expression in electroporated larvae. Is shown. FIG. 5A shows a schematic diagram of the actin gene and an internal region of 400 bp. FIG. 5B Shows amplification of actin-specific sequences by PCR. Figure 6 shows pLH3 transgenic abalone and non-transgenic controls. The comparison result of the weight of abalone is shown. FIG. 7 shows a vector containing the Drosophila melanogaster ACT5C promoter. Fig. 3 shows a schematic map of K. pMK26. Figures 8A and 8B show the steps performed when isolating the abalone actin promoter. Is shown in the diagram. FIG. 9 shows the sequence of abalone actin promoter and flanking region (SEQ ID NO: 5). ). FIG. 10 shows an outline of the structure of the abalone actin promoter. FIG. 11 is a diagram of the vector pLUC containing the luciferase reporter gene. A ceremony map is shown. Figure 12: Vector pCMVtkLUC, the luciferase reporter A schematic map of a control plasmid containing the gene is shown.Detailed description of the invention I. Definition Homologous DNA is DNA that has not been introduced into the host organism by recombinant methods. means Heterologous DNA means DNA that has been transfected into the host organism. Heterologous DNA typically refers to cells that are transfected or transformed. From genomic DNA (eg, CAT and β-galactosidase gene sequences) Means DNA that is not originally obtained. However, it was introduced into the organism by the recombinant method. The resulting DNA is referred to as heterologous DNA (eg, it carries the abalone growth hormone gene). Introduction of the expression vector having it into abalone). Extrachromosomal DNA means plasmid DNA introduced into a host cell. Plasmid DNA is not integrated into the genomic DNA of the host cell. Yes. The term “mollusc” as used herein, refers to the class Bivalvia (eg, Oysters), Gastropoda (eg, abalone), and Including the Cephalopoda class (eg, squid), llusca) means a member of the phylum. II.Development of vector useful for production of transgenic shellfish A.Introduction of exogenous DNA To develop effective methods for producing transgenic mollusks, what is needed for these organisms? It is necessary to consider some peculiarities. Representative molluscs for the purposes of the present invention are , Abalone. Abalone is a "broadcast spawners" Belongs to a known loose group of marine invertebrates You. In the case of such organisms, fertilization is in vitro fertilization, and many sperms and eggs are fertile. It is released from the body. Large adult female (7 inches) has 10,000,0 The fertilization rate is 95% or more under the conditions of hatching, which produces 00 eggs. Development progresses rapidly and in unison. That is, meiosis I (the appearance of the first polar body) ) Is completed in 20 minutes, meiosis II (emergence of the second polar body) is completed in 30 minutes, The first cleavage is then completed in 2 hours. The gastrulation is completed in 24 hours, then the disc That is, a simple animal system for swimming was created. At this point, the egg hatches, releasing Verizier larvae. In the next 24 hours , Called trochophore larvae, where virtually all adult tissue primary differentiation occurs become. Trochophore development lasts for 5-7 days, during which period ttlement) occurs. The settling is done by binding the animal to a solid substrate, then Animals lose their swimming organs, develop adult shells, and then glazing (graz ing) begins. The reason is not fully understood, but the settlement has a mortality rate. High, only 2-5% of competent verger larvae set under hatching conditions Ment does not succeed. This makes hatching large due to the high fertility of this organism. It does not inhibit, but it is a problem for the development of efficient gene transfer technology. To improve the chances of incorporating exogenous DNA into the germline, Introduced before the first division. When DNA is introduced by electroporation, A relatively short time frame for the first division (about 2 Multiple eggs can be processed in time). By electroporation Although the introduction of DNA is a preferred embodiment of the present invention, the introduction of exogenous DNA The method such as the microinjection method can be used as well. Another consideration when transfecting abalone is the animal kingdom. Its taxonomic position in the, and suitable promoter for use in the expression vector. This is the effect of the above position when selecting a motor. "Classical" vertebrate expression vector Is a promoter that normally uses high levels of expression in several tissues. ing. The most prevalent of these promoters is the retrovirus. Of cytomegaloviruses (CMV) and Rous sarcoma virus (RSV) It is a promoter derived from the long terminal repeat (LTR). However, due to the evolutionary distance that separates vertebrates and mollusks, vertebrate models The lomomotor does not appear to be expressed in mollusc tissues. Supporting the invention Experiments carried out in order to demonstrate that living organisms that are more closely related to molluscs than vertebrates are Dee Melano Gaster promoter (eg ACT5-C, Koel le reference, 1993). Other Dee Melano Gaster Promoters Some expression / expression vectors are also useful in practicing the present invention (eg, Ri o Other references, 1985. Davies et al., 1986. Schwein fast et al., 1988). A representative plasmid pMK18 is described in Example 1. Plasmid p MK18 contains the β-actin promoter of the ACT5-C promoter I have. This promoter is a developmental gene for which the gene is expressed in most adult tissues. Since it is expressed throughout (Fryberg et al., 1983), it was selected. Was. The above plastic Smid is a 5'untranslated β-galactosidase gene and ubx gene of E. coli. It contains an "expression cassette" consisting of regions. Experiments carried out in support of the present invention have shown that electroporation Plasmid pMK18 was used to transfect fertilized eggs of abalone. D Initial Optimization of Lectroporation Conditions Is Dot Blot Hybridization The method was used to detect the introduction of exogenous DNA into fertilized eggs (Example 2). DNA is extracted from a single egg or larva and then double sized. Immobilized on trocellulose and then with a suitable radiolabeled plasmid DNA Hybrids were formed. Dot blots were done in two time points. That is, (i) the stage of 2 to 4 cells (Two-to-four cell stage) ... to monitor DNA uptake, and (ii ) Immediately after hatching ... Performed to monitor DNA retention. Electroporation A typical dot plot after optimization of the scanning conditions is shown in FIG. 1 (Example 3). . In this figure, in about 80-100% of all electroporated eggs, D It can be seen that NA is captured and retained. To test the expression of exogenous DNA in transgenic abalone, 50 Pools of two larvae were collected at various time points during the larval development period and It was assayed for activity of the dase (Example 4). The results of these tests are shown in FIG. These data show that the β-actin promoter using pMK18 (β-actin promoter) It is shown that galactosidase is expressed. Activity was observed in trochophore larvae (day 1), and this activity -Achieve the highest in the larvae (2nd day). Plasmid DN by dot blotting A is retained throughout the larval period It is clear that the loss of enzyme activity is due to the loss of plasmid sequences. Not the cause. The peak of β-galactosidase activity clearly indicates the trochophore. To Verijer mutation, that is, when cell division is at its maximum. β-a Since the level of cutin is positively correlated with cell division, the activity of Drosophila It is believed that the promoter is working in the right way in terms of development. This data also indicates that the vertebrate retrovirus promoter CMV is not active. It proves to look good. Similar results were obtained with the RSV promoter Was. Checks whether plasmid DNA is retained and expressed after settling To electroporate approximately 6000 eggs using pMK18 DNA. As a result, about 200 juveniles were obtained. These juveniles were 3 months old, 6 Sampling was performed at ages of 9 months and 9 months (Example 3). Juvenile of 3 months old A typical dot blot obtained from the above is shown in FIG. Of the 9 animals tested, all carried DNA and 6 of these animals The animals showed significant levels of β-galactosidase expression (Table 1, essentially performed). Assayed as described in Example 4). Similar test results were obtained from 6 and 9 month old larval abalone. Plasmid Although the DNA remains in the juvenile body, in order to establish a stable gene transfer system, It must be incorporated into the nom DNA. Uncut genomic DNA is DN As a result of A hybridization analysis, the plasmid sequence was found to have high molecular weight DN. It became clear that it was A. Such high molecular weights may result in chain formation or chain formation. It may be due to body formation and integration. To identify these possibilities, genomic DNA was cut with HindIII . This restriction enzyme is used for linearization with EcoRI for electroporation. The plasmid used is cut asymmetrically (Example 3, FIG. 3A). The DNA Hybridized with a 200 bp fragment of pMK18 and analyzed (Fig. 3A). The results of the above hybridization analysis were as follows. 3 possibilities A strong 8 kb signal corresponding to two of the concatenations of Observed in the A sample. Weak approximately 16 kb CIGNA corresponding to the third kind of chain Were observed in some blots. These test results show that most chain Suggest that it is a head-to-tail multimer as observed for fish. (Stuart et al., 1988. Chong and Vielkind. , 1989). A junction fragment was observed at about 70% of the time However, this suggests a very high degree of integration. Autoradiography showing both integrated and unincorporated DNA The frame is shown in FIG. 3B (Example 3). Although the ACT5-C promoter functions in both juvenile and juvenile abalone, , With an efficiency of only about 5-10% compared to its expression in Drosophila S2 cells It just works. The following describes the development of more efficient mollusc expression vectors. Bell. Coho salmon growth hormone (csGH) inheritance under the control of the ACT5-C promoter Transgenic foxtail millet having offspring (Gonzalez-Villansenors et al.) Bi also built. The sequence of the csGH gene is shown in SEQ ID NO: 1. ACT5-C The vector containing the csGH gene under control was named pLH2. Contrast ( Weight of transgenic abalone carrying pLH2 vector relative to (wild type) abalone The distribution was measured. FIG. 6 shows the result of one such analysis. The data in Figure 6 , Transgenic abalone has a wider weight distribution than non-transgenic control abalone and It shows that the average weight is high. The results of these tests show that Demonstrate efficacy in producing offspring mollusks. The production of gynogen and triploid chemistries is polyploidy, especially triploid and tetraploid. It can be achieved by eliciting it. The chemical induction method is Cytokines in certain phases of the life cycle of a product, such as meiosis I or meiosis II. It can be carried out by treating with Racine B. In this method, the fertilized egg of abalone Provided. The fertilized egg is typically a diploid egg, but unlike a tetraploid egg May be polyploid. The fertilized egg is then treated with cytochalasin B at a concentration effective to induce polyploidy. To process. This concentration depends on the type of egg processed. Exist. Effective concentrations can be determined experimentally. For abalone, rhinoceros The preferred concentration range of tochalasin B is about 0.1 mg / 1 to 1 mg / l. The treated egg is then allowed to develop into a polyploid organism. When fertilized eggs are diploid When combined, the resulting polyploid organisms are generally triploid or tetraploid. Treatment with cytochalasin B typically involves meiosis I, meiosis II, or Or to inhibit both meiosis I and II. In a preferred embodiment However, such treatment inhibits the generation of polar bodies by 70% or more. Also like this Processing is that polyploid organisms typically have a normal complement of chromosomes. Growth characteristics are increased compared to the same living organisms (usually diploids) Provide a way to promote length. Zinogen is more classical because it can selfing within a generation. Not only to promote efficient breeding methods, but also to rapidly homogenize transgenic bodies (homogygose). ) Can be provided. For example, Dinogen is used in F1 and introduced By homozygous for the transgenes and then producing triploids, F2 Become sterile. In addition, triploids (which contain one component in the production of dinogen) are sterile To produce genetically engineered organisms, so Environmental concerns. TII.Development of shellfish vector The present invention also provides for the development of "whole abalone" or "whole mollusc" expression plasmids. Also concerns. Producers such as inducible promoters, metallothionein and heat shock Motor (already used for fish Sea urchin) can be induced by external stimuli. However, such guidance Romotors are not practically adaptable for large-scale commercial production. Abalone growth occurs in tanks where seawater flows continuously. Industrial production required Attempting to adjust water temperature or chemical composition on a scale that makes it cost inefficient And it's not environmentally wise either. A.Isolation of abalone β-actin promoter The experiments carried out in support of the present invention use the β-actin promoter. Experiments on constructing abalone expression vectors. This promoter Was selected considering two things. First, β-actin is a number of adult It is expressed at high levels in tissues (Fryberg et al., 1983). second By constructing a vector by changing the combination of elements involved in expression, The ability to regulate the activity of the actin promoter (Liu et al., 19 90 years a. Liu et al., 1990 c). This property makes the biological response Some proteins such as growth hormone, depending on the level of Lumon It is important for expressing quality. In the case of growth hormone (GH), the growth of an organism is Hormone concentration is proportional up to a certain optimum concentration, but it is inhibited when it exceeds the optimum concentration. No or minimal effect (Agellon et al., 1988). . Moriyama, 1992). Actin genes are a multigene family (Vanderkerckhove). And Weber, 1978a, 1978b). These genes are Since it is highly conserved, β-actin is either α-actin or γ-actin. From the probe or It is impossible to design primers. In contrast, the 3'untranslated region Does not show extensive homology (Fryberg et al., 1983. Liu et al., 1990 c), a specific actin DNA sequence. Can be used to identify To isolate the abalone β-actin gene, first encode the gene. Part of the region was isolated by the polymerase chain reaction amplification method (Example 5A). Non-vertebral motion Abalone β-actin inheritance using a set of degenerate primers for actin An approximately 400 bp fragment within the offspring coding region was isolated (Example 5A). , Figures 5A, 5B and 8A). An abalone β-actin sequence-specific primer was combined from the above sequence of about 400 bp. To achieve. Using these primers, both 3'and 5'ends of the gene were c PCR rapid amplification of DNA ends (PCR-RACE) reaction (Frohman reference) , 1988, 1990). After isolating the 5'and 3'ends, the sequence is determined. 5'and 3'non of the gene An oligonucleotide probe specific for the translation end is synthesized. These Rigonucleotides are λ-gt10 (Stratagene, Calif. Abalone genomic DNA clones held in La Jolla, N.A. It is used as a hybridization probe. Actively forming a hybrid The clones that create. Allowing the cleaved fragment to hybridize to the oligonucleotide Contains the actin gene and its promoter and the 3'and 5'untranslated regions. Check for appropriately sized restriction fragments. The actin gene-containing restriction fragment described above was prepared using standard techniques (Sambrook k, et al., 1989) to construct a size-selected library. To clone. Then, determine the DNA sequence of all actin inserts. Set. The sequence containing the 5'region of the abalone actin gene including the 5'untranslated sequence was determined. (Example 5B). These sequences are shown in Figure 9 (SEQ ID NO: 5). FIG. Shows a schematic diagram of the sequenced region of the actin gene. Test of transient expression The results (Example 5B, Table 2) show that the actin gene promoter is functional. Have demonstrated. This abalone β-actin gene can be used to construct an expression vector ( Example 5c). In one embodiment, the abalone actin promoter sequence is If the growth hormone gene is under the control of the promoter, it will transform abalone. It can be used to construct a vector that is useful to convert. Promoters from other suitable mollusc genes (eg, hexokinase, ho (Sphoglycerate kinase, pyruvate kinase, etc.) And can be isolated in much accordance with the procedure described herein. B.Construction of expression vector Motif specific to the actin promoter is comparable to other actin promoters. Identify by comparison. Similar comparisons were made for other isolated abalone genes. Can be done. The promoter region and the other 5'and 3'functional regions are: It is identified by deletion mapping (Example 5B). Sequence the deletions, then Endpoints were determined relative to all actin gene clones. Promoter Plasmids containing various ratios of 5'and 3'untranslated regions were constructed. The polylinker site is typically 5'and 3'non-translated for rapid cloning. It is inserted between the regulatory regions of the transgene. Polylinkers are usually eg pUC1 8 polylinkers (Clontech, Palo Alto, CA, USA) ) Has some unique enzyme endonuclease sites, as in . Incorporation of the expression vector DNA into the fertilized egg and integration of the DNA are described in Examples. Measure as described in 2 and 3. Actin gene expression cassette (ie 5 '/ 3' adjacent to polylinker Actin sequences) typically facilitate the manipulation and isolation of large amounts of vector DNA. Cloned into a shuttle vector to Shuttle vector like this Are commercially available (Clontech, Inc., LA, CA, USA). Hoya location). Shuttle vectors are typically the origin of replication (in the selected host The replication origin for the propagation of the plasmid in E. coli, for example its replication origin is colE1 Type) and a selectable marker gene (eg, selectable in the host cell) For example, in the case of bacteria, the β-lactamase gene (Amp^R))have. C.Measuring the level of expression The level of gene expression when the expression vector of the present invention is used is To characterize the expression of heterologous DNA in rat production and in live larvae and juveniles Therefore, it was measured. β-galactosidase, chloramphenicol acetyl tran Spherase (RAT) and luciferase (de Wet et al., 198). 7 years. Gibb s et al., 1991) and some reporter genes The offspring are useful for quantifying gene expression. Typically, the reporter gene is In-frame fusion site in the expression cassette (eg actin gene expression cassette) Inserted as an in-frame fusion. The level of gene expression is determined by standard enzymatic assay to detect selected reporter genes. Quantitation by standard methods (eg CAT enzyme assay system, Promega) , Madison, Wisconsin, USA). In addition, quantification of expression levels was determined by RNA hybridization assay (Ausube). l et al., Sambrook et al.), using an endogenous gene RNA (eg, , Β-actin mRNA) and reporter gene RNA (eg, luciferase). Erase mRNA). IV.Isolation of shellfish genes affecting growth A.Growth hormone gene The insertion of the growth hormone (GH) gene has several commercially important The result is that the growth rate of various seafood is increased. For example, loach Runnus anguillicaudas = Misgurnus anguillicau data) (Zhu et al., 1986), carp (Cyprinus carpio) Cyprinus carpio (Zhang et al., 1990), Onishi Western salmon (Salmo salar (Rokones) Dedication, 1989. Du et al., 1992), rainbow trout (Onorinx mide). Onorhynchus mydiss) (Guyomard et al., 1989), pike (Esox lucius) and Walleye (Wa lleye) (Stizostedion Vitreum = Stizostedion Vitreum) (Moav et al., 1992). Transgenic fish , Typically 1-3 times larger than siblings without the gene introduced. Abalones and oysters of commercially important shellfish respond to exogenous GH (Morse et al. , 1981, 1984). Abalone larvae during transformation with human GH Upon incubation, the shell length increased by about 10% after 4 days. Recently, M oriyama (1992 literature) injects recombinant salmon hormone into juvenile abalone. Inclusion or immersion of juvenile abalone in the hormone increases weight 2-3 times That was shown. Eastern oyster (Crasostrea virginica = Cra) Similar test results for ssostrea virginica) ter and Chen (1991). Against these shellfish The positive action of GH is probably due to the existence of multiple hormone systems in primitive mollusks (Jose and Garaerts, 1983). This Consistent with the interpretation of Moriyama and his colleagues, Hormo grows from abalone. Protein-like peptide has been isolated and partially purified, and this peptide also stimulates growth. Intense (Moriyama et al., 1989, 1992). The present invention relates to a recombinant vector and method capable of introducing a gene that affects the growth of molluscs. Show the law. According to the method of the present invention, the abalone GH gene is, for example, As the protein expression product is an actin / GH fusion protein, the actin cassette Cloning into the expression vector It is Alternatively, the actin regulatory sequence may be used to replace the GH regulatory sequence to produce G The H gene is placed under the control of transcription and translation of actin gene regulatory sequences. In addition, the method of the invention was used to delete the normal GH gene regulatory sequences and then By replacing this sequence with regulatory sequences that drive high levels of expression (ie, (Gene replacement), the endogenous copy of the GH gene can be modified. B.Other potentially useful genes In order to increase the growth rate and final size of transgenic abalone, abalone growth In addition to using the Mon gene, the insulin-like growth factor (IGF1) gene also It can be used to promote growth by its positive regulation on GH (S ara and Hall, 1990). IGF1 was recently isolated from oysters ing. IGF1-like sequences derived from various organisms are abalone homologous IGF1 It can be used to produce degenerate primers for isolation of the gene (abalone β- (As described herein for the isolation of the cutin gene). V.Use The invention includes a method of transforming a member of the phylum Mollusca. I have. This gate contains the Gastropoda class, which contains abalone You. A.Vectors and mutants The present invention provides a vector suitable for transforming molluscs. Things. Such vectors are sold individually or in kits, It can be used in the transfection method and transformation method of the present invention. Also, The kit may also contain a buffer useful in carrying out the transformation. The vectors and methods of the present invention produce transgenic aquatic products such as transgenic abalone. Can be used to get out. Does the vector and method of the present invention introduce heterologous DNA? Alternatively, it can be used to modify an endogenous gene by the recombinant gene method. like this Transgenic organisms can be engineered to increase growth rates as described above. In addition to enhancing growth, disease resistance, coloration of shell and / or shell meat, meat Varieties with other characteristics such as texture and taste can be made. This technique Surgery can extend beyond abalone to other commercially important mollusks . B.Genetic analysis The transfection method of the present invention complements the more classical genetic methods. Book Important for growth and biogenesis processes due to the efficiency of gene expression described here It is possible to perform detailed studies on various gene expressions. Further, the remains of the present invention Transformed organisms interfere with or facilitate such processes. Compounds that are effective in advancing (typically reporter genes such as the GH promoter Effect of such compounds on the expression of reporter genes under the control of It provides a means of selection (by utilization). Gene induction of the present invention The molluscs also encode heterologous tags encoded by the DNA introduced by transfection. It is a vehicle that expresses proteins. In addition, the vector and method of the present invention include a gene replacement method and a gene knockout method. The present invention provides means for performing recombinant gene manipulation of molluscs, including. Having described in detail the preferred embodiments, uses and methods of carrying out the invention. , Various other uses, combinations and methods of implementation as set forth herein may be used according to the invention. You will find it within your intent. Materials and methods The polymerase I (Klenow fragment) of E. coli DNA is Boehrin. ger Mannheim Biochemicals (BMB) (Indianapolis, Diana). T4 DNA ligase and T4 DNA polymerase is available from New England Biolabs (Massa, USA). Nitrocellulose filters available from S.A. chleicher and Schuell (Key, NH, USA) Location). Synthetic oligonucleotide linkers and primers are commercially available automated oligonucleotide It was manufactured using an Otide synthesizer. Alternatively, custom designed synthetic oligonucleotides Is, for example, Synthetic Genetics Inc. You can purchase it from N Diego. cDNA synthesis kit and random prime Labeling kit is available from Boehringer Mannheim Bioch Entered from electronic company (BMB, Indianapolis, Indiana, USA) I did it. Oligonucleotide sequences encoding peptides are synthesized by oligonucleotide synthesis Direct synthesis or coding scheme Multiple oligonucleotide flags corresponding to the coding sequence in large columns Can be synthesized in a series of cloning steps involving a tandem array of (Crea, Yoshio et al., Eaton et al.). Oligonucleotide coordinates The ligation sequence was prepared by standard recombinant methods (Maniatis et al., Ausubel et al.). Can be expressed. Standard molecular biology and cloning methods are described in Ausubel et al., Sambro. ok et al. and Maniatis et al., essentially the same as previously described. Was carried out. The polymerase chain reaction was performed essentially as per manufacturer's support. Polymer The polymerase chain reaction method is described by Kawasaki, Mullis, and Mu. Llis et al. Fertilized eggs were obtained from Pacific Mariculture Inc. Company (US Cali Obtained from Coast Road 5515, Santa Cruz, PA 95060. did. Other sources of fertilized eggs are: The Avalone Fa rm Inc. Company (Cayocos, CA 93430, USA, PO Box 13 6), and Ab Lab, Inc. (93043-4328, California, USA). It is the Huthniet Center Drive 560). Example 1 Construction of plasmids Plasmids pMK18 and pLH2 were cloned into pMK26 (Fig. 7. Koelle et al. Dedication, 1991. pMK26 = pAct / Sv40 / BS). Plastic Smid pMK26 is a Drosophila melanogaster ACT5-C promoter, β-actin promoter Contains. This promoter is found throughout development and in most adult populations. It is expressed in tissue (Fryberg et al., 1983). Both vector Was constructed from pMK26 modified as follows. That is, pMK26 Was partially digested with EcoRI and EcoRI next to the KpnI site in pMK26. The site (FIG. 7) was filled with Klenow and dNTPs (Ausubel et al., M. aniatis and others). The captured plasmid is recircularized by the blunt end ligation method. Modified pMK26 with a single EcoRI site for restriction mapping Therefore confirmed. cPbxd6.2 4.8 β-galactosidase ubx cassette (Irvin e et al., 1991) by blunt-end ligation of the fragment. PMK18 was constructed by inserting it into the SmaI site of decorated pMK26. When electroporation is performed, the plasmid will contain a unique EcoRI site. I made it linear. To construct pLH2, the csGH gene as well as all 5'-untranslated 1070 KB HindI containing the 3'-untranslated region of DNA and 373 BP The II fragment was obtained from pRSVCCSGH (Gonzalez-Villa. nsenor and others). The above HindIII fragment was added to the modified pMK26 poly Ligated into the unique HindIII site of the linker. This plasmid When performing troporation, it was linearized with EcoRI. csGH D The NA sequence is shown as SEQ ID NO: 1. The entire translated sequence of csGH is SEQ ID NO: 2. And show it. The pLUC vector was generated as follows. Luciferase gene and 2.0 kb XkoI / StyI flag of pXP2 containing SV40 regulatory sequences Mento (Nordeen, Biote chniques, vol. 6, 454-457 Sada, 1988). This The fragment was cloned into pBLCAT6 digested with xhoI / StyI. (Boshart et al., Gene) 110, 129-130, 1992) A luciferase-containing vector without a promoter was obtained. The pCMVtkLUC vector described above contains HSV clones with CMV enhancers. Contains the luciferase gene under the control of the amidine kinase promoter Was. Example 2 Introduction of DNA into abalone Abalone at a concentration of 4000 to 6000 eggs / 200 μl for introducing DNA 200 μl of the fertilized egg was placed in a Baekon 2000 electroporator cuvette. Put in each. Each cuvette contains linearized plasmid DN at a concentration of 2 mg / ml. It contained 100 μl of A and 400 μl of artificial seawater. The components of typical artificial seawater are as follows. That is, 24.72 g / L NaCl, 0.67 g / l KCl, 1.36 g / l CaCl₂・ 2 ( H₂O), 4.66 g / l MgCl 2₂・ 4 (H₂O), 6.29 g / l MgS O_Four・ 7 (H₂O), 0.18 g / l sodium carbonate, pH 7.8. The conditions for electroporation were as follows. 10KV, 6 cycles , Pulse time: 160 μs and burst time: 1.6 seconds. Electropo And the eggs were treated with penicillin and streptomycin, respectively. 1 l of seawater containing 100 μg / l each (pen / strep, Life Tech nologie s company, Gaithersburg, Maryland, USA). The egg / larva Incubated at 14 ° C with aeration. Seawater / pen / strep was changed daily. Example 3 Genomic DNA hybridization analysis of transgenic abalone A.DNA uptake and retention Abalone eggs transfected with the above vector were not transfected. Was evaluated for the presence of DNA. 2 hours after fertilization (first cleavage period (first cleavage division)) and 24 hours later (trochophore larvae), electroporation. DNA was extracted from the isolated eggs (Hahn, 1989). the above At the first time point, DNA uptake was observed, and at the second time point, DNA retention was observed. Was observed. At each time point, a pool of 5 eggs or larvae was "Eppendorf" microcentrifuged Triturate with homogenizer in 10 μl of TE (Maniatis et al.) In a tube. did. Debris was removed before nucleic acid was precipitated. Do not resuspend the DNA sample. Nitro using a dot blot capture system Transferred to cellulose (Ausubel et al., Schleicher and Sc) huell). A typical result of such a dot blot analysis is shown in FIG. Figure 1 is a plus The mid DNA is incorporated and retained in electroporated abalone eggs. And Radiolabeling the DNA bound to the nitrocellulose filter Hybridized with the attached plasmid pMK18 DNA (random Reimer, B oehringer-Mannheim, Indianapo, Indiana, USA Squirrel location). In Figure 1, the two slots from the left in the bottom row of the sample after 2 hours are , DNA extracted from non-electroporated eggs. Standard is Figure 1 From the left to the right, 600, 300, 100, 6 respectively. 0 and 30 picograms of pMK18 DNA. The data obtained in this way is approximately 80 to 1 of all electroporated eggs. It was suggested that DNA was taken up and retained at 00%. B.Retention of transfected DNA Abalones transfected with the pMK18 vector were grown. 3 months old DNA extracted from juvenile abalone and radiolabeled plasmid pMK18 DN A was analyzed by the dot blot method. Figure 2 shows transgenic abalone and non-genetically derived abalone. Shows dot blot hybridization data for input control abalone. concentration Standards (from left to right) are 600, 400, 100, 60, 30, 10, 6 and 3 picograms of pMK18 DNA. The results in Figure 2 show that electroporated DNA was found in juvenile abalone at 3 months of age. Demonstrate retention. C.DNA Hybridization Analysis of Transgenic Juvenile Abalone at 3 Months of Age The DNA sample isolated from the transgenic juvenile abalone at the age of 3 months was treated with agarose. Loaded on gel, size-fractionated and transferred to nitrocellulose filter (Au subel et al., Sambrook et al.). This These filters were hybridized with radiolabeled pMK18 . The autoradiograms of these filters show that the pMK18 homologous sequence has a high molecular weight D. Demonstrated to be present in NA. The results of these tests are shown in Figure 3B. Figure 3B In, two lanes of DNA samples were isolated from two different animals. left The side panel DNA is incorporated. The right panel DNA is integrated Absent. Restriction of genomic DNA samples to distinguish between pMK18 concatemer and integration Digested with the nuclease HindIII. This restriction endonuclease is The EcoRI linearized plasmid used to perform the Cut symmetrically (see Figure 3A). The above DNA on nitrocellulose filter 20 from the 8 kb HindIII / EcoRI fragment of pMK18. 0 bp polymerase chain reaction (Perkin-Elmer / Cetus, USA Hybridizes with amplified fragments in Norwalk, Connecticut (See FIG. 3A). A strong 8 kb signal corresponding to 2 out of 3 possible chains Observed (Figure 3B). In all samples of genomic DNA, there are chains in each sample A signal of 8 kb was observed, indicating that A signal of about 16 kb was also observed in some of the DNA samples. This one The 6 Kb signal was the signal corresponding to the third type of chain (FIG. 3). A). The results of these tests indicate that the majority of these chains are head-to-tail multimers. It suggests. Binding fragments were observed in about 70% of DNA samples from transgenic abalone (Fig. 3B) For example, a system with a molecular weight of less than 8 kb appears. Gunnar). The results of this study suggest a very high level of uptake . Example 4 Analysis of gene expression in transgenic abalone The vector pMK18 had a β-galactosidase expression cassette. Expression of β-galactosidase in transgenic abalone containing this vector , And was tested over time. Pool of 50 larvae at various time intervals during larval development Extracted, then β-galactosidase levels were determined according to Koelle et al., 1991. Essentially as described previously in the literature. Umbelliferyl-β-D-galactoside (Sigma Chemical Co . (St. Louis, Mo., USA). Figure 4 shows the expression of β-galactosidase in electroporated larvae. The data obtained from a representative fluorescence test for is shown. Fluorescence units are shown on the Y-axis and time (Days) (after fertilization) is shown on the X-axis. Enzyme activity is shown in arbitrary fluorescent units. The data shown in FIG. 4 shows that for plasmid pMK18, 5 individual elect It is the average value of the tropometry test results, and is the same as that of the control plasmid CMVLac. Furthermore, it is the average value of the results of two separate experiments. CMVlac is β-galacto Vectors carrying a cytomegalovirus promoter flanking the sidase gene (E.g., "pCMVβ", Clontech, Calif., USA). Located in Palo Alto, A). Standard error was not calculated, but variation between tests was 5% Was less than. This data shows that β- when using pMK18 (promoter of β-actin) It is suggested that galactosidase is expressed. Dot blot test results Indicates that the pramid DNA is retained throughout the larval period. The decrease in elementary activity is not due to the loss of plasmid sequences. The vertebrate retrovirus promoter CMV is found in transgenic abalone. It doesn't seem to be active. Similar results were obtained with the RSV promoter. Example 5Identification and isolation of abalone actin gene and construction of mollusc expression vector A. Isolation of an approximately 400 base pair fragment of the abalone actin gene A set of degenerate primers (D. melanogaster) for invertebrate actin (5CX, 8F, 87E), Bee. B. Morii (A1, A2, A 3) was designed based on the "GENBANK" sequence for the actin gene). . The sequences of these primers are shown as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. this These primers increased the approximately 400 bp fragment within the target coding region. Width (Fig. 5A). A schematic diagram showing the isolation of this approximately 400 bp fragment is shown in FIG. A. RNA was isolated from abalone ovarian tissue (L. Grossman and K. Edited by Moldave, "Methods in Enzymology", Volume 12 , Part B, 120-129 Sada's R.I. A. Report on Cox I (Academic Press, Flori, USA Published in 1988, Orlando, Da. Tel-Test Inc. Company (US "RNAZOL" kit available from Friendswood, Texas). 10 μl of reverse transcriptase (Invitrogen, San, CA, USA Diego), in a final volume of 20 μl, from 5 μg of total ovarian RNA to cDNA Was synthesized. Use 1 μl of each cDNA sample and add 10 μM of primer to obtain 10 A 0 μl polymerase chain reaction (PCR) was performed. Polymerase chain reaction conditions And protocol are commercially available kits (Perkin-Elmer, Connecticut, USA). (Norwalk, Tut)). Amplification products were separated based on size using electrophoresis. After amplification, each reaction product About 7% of the product mixture was isolated by electrophoresis on a 1% agarose gel (FMC Bioproducts, Rockport, Maine, USA). These gels Was stained with ethidium bromide and made visible by UV irradiation. The results of one test of such an analysis are shown in Figure 5B. The first lane in FIG. Amplification using a set of heavy actin primers and ovarian DNA Indicates a breadth product. Lane 2 is a set of degenerate actin primers and whole abalone ovary The amplification product obtained by amplification using RNA is shown. Expected amplification product of about 400 bp Was observed in the second lane. The sequence of this 400 bp fragment is standard DN Confirmed by A sequencing method. B. Isolation of abalone actin promoter sequence Is the abalone actin gene sequence-specific primer a sequence of about 400 base pairs above? I got it. To the coding sequence of the actin protein A primer complementary to the corresponding DNA strand was selected (Fig. 8B). The abalone genomic DNA library was cloned into λgt10 (Ausubel et al., Stra (Tagene, Inc.). This library is the first primer Using the actin-specific primer described above and as a second primer. Ndum Primer (BMB, Indianapolis, Indiana, USA) DNA substrate in case of amplification by polymerase chain reaction used (FIG. 8B). The genome walking test revealed that the ababiactin gene has a genomic coding Sequence was isolated. FIG. 9 (SEQ ID NO: 5) shows the 5 ′ code of the actin gene. Showing the coding region and showing a partial sequence of 1540 base pairs with 5'non-coding sequence. . To map the position of the intron of the actin gene and the transcription start site, Determination and RNase protection assay were performed. Abalone remains corresponding to the sequence shown in FIG. The structure of the gene is shown schematically in FIG. Promoter motif (eg TATA X) and the promoter region to the actin protein coding region 2 Shown in Figure 10 as one exon and one intron. Two expression vector constructs were created with these actin sequences. First, especially whole The clone was introduced into the multiple cloning site of vector pLUC (Figure 11). This The vector was named pABA1600LUC. The second vector is pLUC Created by introducing the first about 800 bp of SEQ ID NO: 5 into the multiple cloning site of (Named pABA800LUC). Reporter inheritance of these vector constructs The offspring were the luciferase gene (LUC). pABA1600LUC, pABA800LUC, pLUC (negative Control, Example 1) and PCMVtkLUC (positive control, Example 1) as standard. Human embryonic kidney cell line ATK according to the method of calcium phosphate transfection 293 were transfected. Assays for transient expression were performed using these transgenic cell lines. Troff Activity of the abalone actin promoter in the assay It was measured as fg luciferase per dase. Negative control (only pLUC left The percentage of activity against the cells (transfected cells) was determined. Show the results of this analytical test 2 shows. These test results indicate that the expression vector construct provides promoter function. Demonstrates the performance of the cloned actin sequence. C. Production of abalone actin promoter-based vectors The β-actin sequence was cloned into a shuttle vector for ease of manipulation. You. For example, the "SK + BLUESCRIPT" vector is a vector that is used in bacterial hosts. -Provided a sequence which can be duplicated and selected. Other known bacterial vector systems (eg (Clontech, Palo Alto, Calif., USA) Can be used in functions. In addition, yeast vectors can be used to practice the invention. (For example, Hitzeman et al., Rutter et al., Oeda et al.). Yeast genes A typical introduction host is Saccharomyces cerevisiae (Sacchar). omyces cerevisiae), but other enzymes suitable for gene transfer Can be used as well (for example, Schizosa pombe). ccharomyces pombe)). Heterologous DNA (DNA that is not originally obtained from organisms that are being introduced into genes) Transcriptional and translational regulatory sequences (start and stop sequences) are engineered to produce a vector for expression. Lanes) are typically obtained from the 5'and 3'noncoding regions of the gene ( As described above for abalone-derived β-actin). To further characterize the specific active promoter sequence, the sequence comparison 5'non-cody containing defined actin gene promoter sequence (Figure 10) Coding sequence and flanking 5'coding sequence to the β-galactosidase, luciferase Ferrase or chloramphenicol acetyl transferase (CAT) Inflation with reporter protein coding sequences such as (Gorman) In-frame fusion. A series of plasmids containing the 5'end of β-actin and the reporter gene were Constructed by digesting the 5'distal end of the promoter containing region with ExoIII Suru (Hoheisel and Pohl, 1986. Text by Henikoff 1987). The deletion series was transcribed into the abalone egg as described above. Sfected and then the eggs were assayed for expression of the reporter gene. Lipo Sequence of the plasmid that expresses the I asked. Suitable containing actin promoter and 5'and 3'untranslated regions in various ratios Different expression plasmids were constructed. Unique restriction sites , Insert between the 5'and 3'untranslated regions for rapid cloning. This baek Uptake and integration of DNA performed using the It is measured by a DNA hybridization assay. Although the present invention has been described with reference to particular methods and embodiments, it departs from the invention. It should be understood that various modifications can be made without modification.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／２８６，８７２ (32)優先日 1994年８月５日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パワーズデニスアルファアメリカ合衆国カリフォルニア州 93950 パシフィックグローブオーシャンビューブールバードスタンフォードユニバーシティホプキンスマリーンステーション (72)発明者ゴメスチアリマルタアメリカ合衆国カリフォルニア州 93950 パシフィックグローブクロッカーアベニュー 706────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (31) Priority claim number 08 / 286,872 (32) Priority date August 5, 1994 (33) Priority claiming countries United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE, HU , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, N Z, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK , TJ, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Powers Dennis Alpha United States California 93950 Pacific Grove Ocean Mbour Boulevard Stanford You Niversity Hopkins Marine Stay Option (72) Inventor Gomestiari Malta United States California 93950 Pacific Gloves Crocca -Avenue 706

Claims

[Claims] 1. A transgenic soft body containing a DNA sequence that is not homologous to the target molluscs animal. 2. The transgenic mollusc according to claim 1, That the DNA sequence is integrated into the mollusc genomic DNA site What is characteristic. 3. The transgenic mollusc according to claim 1, The above-mentioned DNA sequence is an extrachromosomal DNA sequence. 4. The transgenic mollusc according to claim 1, The DNA sequence is flanked by regulatory sequences, and the regulatory sequences What is characterized by being effective in expressing in the molluscs. 5. The transgenic mollusc according to claim 4, The above-mentioned regulatory sequence is derived from the mollusc. 6. The transgenic mollusc according to claim 5, That the regulatory sequence contains a promoter sequence derived from the actin gene What is characteristic. 7. The transgenic mollusk according to claim 6, Wherein the promoter sequence is derived from the abalone actin gene, What to do. 8. The transgenic mollusc according to claim 7, The above-mentioned promoter is derived from SEQ ID NO: 5. 9. The transgenic mollusc according to claim 4, Adjacent to the DNA sequence is a regulatory sequence derived from the Drosophila melanogaster gene. Characterized by being in contact. 10. The transgenic mollusc according to claim 9, Said regulatory sequence is derived from the ACT-5 promoter and said heterologous DNA Characterized by the sequence encoding coho salmon growth hormone. 11. The transgenic mollusc according to claim 1, The heterologous DNA sequence encodes a gene that promotes increased growth. What to collect. 12. The transgenic mollusc according to claim 11, It is characterized that the gene encodes a growth factor or an insulin-like growth factor. What to collect. 13. The transgenic mollusc according to claim 12, The gene is characterized in that the gene encodes coho salmon growth hormone. 14． The transgenic mollusc according to any one of claims 1 to 13, The said mollusc is an abalone. 15. Transgenic soft body containing a heterologous DNA sequence encoding a protein A method of increasing the growth of a mollusc comprising culturing an animal, comprising: (I) The encoded protein is expressed in the mollusc in the heterologous sequence. Flanked by regulatory elements effective to cause and (ii) increased growth of said heterologous sequence. That encodes a gene that promotes Done under conditions of gaining A method characterized by the following. 16. The method of claim 15, wherein The gene introduction mollusc according to any one of claims 2 to 14. A method characterized by being a mollusc. 17． Transgenic soft body containing a heterologous DNA sequence encoding a protein Recombinant expression of proteins in molluscs consisting of culturing animals The law, Expressing the encoded protein in said molluscs at said heterologous DNA sequence. Are flanked by regulatory elements effective to allow the culture to express the protein. Performed under certain conditions A method characterized by the following. 18. The method of claim 17, wherein The gene introduction mollusc according to any one of claims 2 to 14. A method characterized by being a mollusc. 19. An expression vector useful for transforming molluscs, It is effective in expressing the sequence in said molluscs and is of genetic origin in molluscs. A first DNA sequence flanked by conventional regulatory elements, A second DNA sequence for propagating the vector in a secondary host, An expression vector comprising: 20. The expression vector according to claim 19, wherein The second DNA sequence contains an origin of replication and a selectable marker Characterized by. 21. The expression vector according to claim 19, wherein The above-mentioned secondary host is a bacterial host. 22. The expression vector according to claim 19, wherein That the regulatory element is derived from the mollusc actin gene What is characteristic. 23. The expression vector according to claim 22, wherein The regulatory element contains a promoter sequence derived from the abalone actin gene Characterized by. 24. The expression vector according to claim 23, The above-mentioned promoter sequence is derived from SEQ ID NO: 5. 25. The expression vector according to claim 19, wherein The first DNA sequence encodes a growth hormone or insulin-like growth factor What is characterized by. 26. The expression vector according to claim 25, wherein The above-mentioned growth hormone is coho salmon growth hormone. 27. The expression vector according to any one of claims 19 to 26, The said mollusc is an abalone. 28. A method of transfecting a mollusk comprising: Providing a vector containing the DNA sequence, Introducing the vector into the mollusk, Identification of transfected molluscs based on the presence of said DNA sequence A method comprising: 29. 29. The method of claim 28, wherein The vector is the vector according to any one of claims 19 to 26. A method characterized by the following. 30. 29. The method of claim 28, wherein Upon transfection, the vector is placed at the genomic site. A method comprising incorporating. 31. 29. The method of claim 28, wherein Wherein said introducing is accomplished by electroporation Way. 32. The method of claim 31, wherein Said introducing electroporates said vector into a mollusc fertilized egg A method characterized by being achieved by. 23. The method according to any one of claims 28 to 32, The method wherein the mollusc is an abalone. 34. A DNA sequence encoding the polypeptide and flanking this DNA sequence A duplex containing a promoter that is effective in promoting transcription of the lever DNA sequence. DNA fragment, Said promoter is the promoter of the gene for abalone actin, and The DNA sequence is not homologous to the promoter of the abalone actin gene Characterized by. 35. The double helix DNA fragment according to claim 34, The polypeptide promotes increased growth and growth hormone or insulin Characterized by being a growth factor. 36. A double helix DNA fragment according to claim 35, wherein The above-mentioned growth hormone is coho salmon growth hormone. 37. A method for producing a polyploid abalone, a) Preparing an abalone fertilized egg, b) treating the fertilized egg with cytochalasin B to induce polyploidy; c) developing the treated fertilized egg to a polyploid organism, A method comprising. 38. 38. The method of claim 37, wherein The method, wherein the treatment inhibits the formation of polar bodies by 70% or more.