KR102891033B1 - 의료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 의료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 의료용 조성물은 생분해성, 생체적합성, 생체 조직에 대한 접착력, 상처 치유 효능 및 지혈 효능이 우수할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 의료용 조성물은 지혈용, 상처 치유용, 조직 접착용, 또는 균 감염 억제용으로 사용될 수 있다.

Description

의료용 조성물{COMPOSITION FOR MEDICAL TREATMENT}

본 발명은 사람 또는 동물의 생체 조직에 적용할 수 있는 의료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일상 생활 및 산업 현장에서 상해로 인한 출혈이 발생한 경우, 신속하고 안전한 응급 지혈과 함께 상처 부위에서의 과다 출혈을 막아주는 외과 수술이 이루어진다. 상기 외과 수술에서 상처 부위의 효과적인 지혈과 봉합은 환자의 출혈량과 수혈량을 줄이고 환자의 회복을 촉진할 수 있기 때문에 그 처치가 잘 이루어져야 한다.

상기 지혈과 봉합의 처치를 위해 종래에는 거즈, 붕대, 수술용 봉합사, 스테이플러 또는 전기/레이저 등과 같은 의료장비가 활용된 바 있다. 그러나 이들의 활용은 환자의 생체 조직(예컨대, 피부)이 연약할 경우, 상처 부위의 손상 또는 감염 등과 같은 부작용이 일어나는 문제가 있었다.

이러한 문제를 해결하기 위해 지혈제 또는 의료용 접착제가 개발되고 있다. 상기 지혈제 또는 의료용 접착제는 출혈이 일어나는 상처 부위에 적용될 경우, 물리적 성질, 화학적 성질, 또는 생리활성적 성질을 발현하여 출혈을 일차적으로 막고 상처 부위를 회복시키는데 도움을 준다. 나아가, 상처 부위에 도포하는 방식으로 적용되기 때문에 환자의 생체 조직이 연약하더라도 상처 부위가 손상되거나 감염되는 것을 최소화할 수 있다.

그러나 현재 개발된 지혈제 또는 의료용 접착제는 상처 부위를 봉합하기 위해 요구되는 접착력을 나타내지 못하거나 면역반응이 일어나 생체적합성이 떨어지는 한계가 있다.

대한민국 공개특허 제2013-0055847호

본 발명은 면역반응이 일어나는 것을 최소화하면서 생체 조직에 대해 높은 접착력을 나타내고 지혈 효능, 상처 치유 효능, 균 감염 억제 효능, 항균 효능 등이 우수한 의료용 조성물을 제공하고자 한다.

또 본 발명은 상기 의료용 조성물의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명의 일 측면에 따르면, 입경이 10,000 nm 이하이고, 총 중량을 기준으로 3-하이드록시부티레이트(3HB)로부터 유래된 반복단위를 40 중량% 이상으로 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 의료용 조성물을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 의료용 조성물은 100% 상대습도 및 상온에서 측정한 조직 접착 강도가 15 kPa 이상일 수 있다.

다른 일 실시예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위를 더 포함할 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 상기 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위의 함량은 0.1 내지 60 중량%일 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체일 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 분자량이 10,000 내지 1,200,000 g/mol일 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 의료용 조성물에 포함된 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.1 내지 75 %(w/v)일 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 의료용 조성물은 지혈용으로 사용될 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 의료용 조성물은 상처 치유용으로 사용될 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 의료용 조성물은 조직 접착용으로 사용될 수 있다.

또 다른 일 실시예에 있어서, 상기 의료용 조성물은 균 감염 억제용으로 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜 분산상 용액을 준비하는 단계; 계면활성제를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계; 상기 분산상 용액을 10,000 nm 이하의 기공 크기를 갖는 멤브레인에 통과시켜 상기 연속상 용액에 분산상 입자가 분산된 에멀전을 형성하는 단계; 및 상기 에멀전을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계를 포함하는 의료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 분산상 용액에 포함된 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 함량은 상기 분산상 용액 총 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%일 수 있다.

다른 일 실시예에 있어서, 상기 분산상 용액은 2.5 내지 320 kPa의 압력으로 상기 멤브레인을 통과할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜 분산상 용액을 준비하는 단계; 계면활성제를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계; 상기 분산상 용액과 상기 연속상 용액을 혼합하여 프리믹스 에멀전을 형성하는 단계; 상기 프리믹스 에멀전을 고압분산장치(microfluidizer)에 투입하여 입경이 10,000 nm 이하인 분산상 입자가 분산된 에멀전을 형성하는 단계; 및 상기 에멀전을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계를 포함하는 의료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 고압분산장치에 의해 상기 프리믹스 에멀전에 가해지는 압력은 1 내지 30 kpsi일 수 있다.

본 발명에 따른 의료용 조성물은 특정 범위로 제어된 입경을 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함함에 따라 생분해성 및 생체적합성(낮은 면역원성)이 우수하면서 생체 조직에 대한 강한 접착력을 나타낼 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 의료용 조성물은 사람 또는 동물의 생체 조직을 지혈, 치유 또는 봉합하는데 효율적으로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 의료용 조성물은 수분이 존재하는 생체 조직(예컨대, 표면이 젖은 조직, 또는 수중에 있는 조직)에 대해서도 강한 접착력을 나타내어 수중에서 상처 부위를 지혈하기 위해 사용될 경우, 우수한 지혈 효능을 나타낼 수 있다.

또 본 발명에 따른 의료용 조성물은 생체 조직의 적용 부위 특성에 따라 다양한 형태로의 제형이 가능할 수 있다. 특히. 본 발명에 따른 의료용 조성물은 미생물 시스템을 통해 대량생산이 가능한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함함에 따라 제형화된 지혈제 또는 의료용 접착제를 경제적으로 제공할 수 있다.

도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 합성예 1 내지 5 및 10 내지 15에서 각각 제조한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 나타낸 이미지(SEM)이다.
도 3 및 도 4는 본 발명에 따른 시험예 2에서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자의 크기 및 입도 분포 변화를 광산란분석방법으로 분석한 결과이다.
도 5 및 도 6은 본 발명에 따른 시험예 3에서 염증성 사이토카인 인자(TNF-α 및 IL-6)의 발현량을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 시험예 4에서 돼지 피부에 대한 의료용 조성물의 접착 성능을 100% 습윤 환경에서 평가한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 시험예 5에서 하이드로젤에 대한 의료용 조성물의 접착 성능을 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 시험예 6에서 시일 경과에 따라 창상 부위를 확인한 이미지이다.
도 10은 본 발명에 따른 시험예 6에서 창상 부위 변화를 Image J 프로그램을 이용하여 계산한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 시험예 6에서 창상 부위의 피부 조직과 혈관을 확인한 이미지이다.
도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 시험예 7에서 시일 경과에 따른 창상 부위를 확인한 이미지이다.
도 14 내지 도 18은 본 발명에 따른 시험예 8에 따른 유전자 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 19은 본 발명에 따른 시험예 9에서 의료용 조성물의 지혈 효능을 평가한 결과이다.
도 20는 본 발명에 따른 시험예 10에서 의료용 조성물의 지혈 효능을 평가한 결과이다.
도 21은 본 발명에 따른 시험예 11에서 의료용 조성물의 균 감염 억제 효능을 평가한 결과이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 설명한다. 여기서 본 발명은 이하에 개시된 내용에 한정되는 것이 아니며 발명의 요지가 변경되지 않는 한, 다양한 형태로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 하나의 구성 요소가 다른 구성 요소의 상/하에 형성되거나 서로 연결 또는 결합된다는 기재는, 이들 구성 요소 간에 직접 또는 또 다른 구성 요소를 개재하여 간접적으로 형성, 연결 또는 결합되는 것을 모두 포함한다. 또한 각 구성 요소의 상/하에 대한 기준은 대상을 관찰하는 방향에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

본 명세서에서 "포함"한다는 기재는 특정 특성, 영역, 단계, 공정, 요소 및/또는 성분을 구체화하기 위한 것이며, 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 그 외 다른 특성, 영역, 단계, 공정, 요소 및/또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 구성성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자 및 표현은 특별한 기재가 없는 한 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수식되는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명은 생체적합성 고분자 입자를 포함하는 생체적합성 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 생체 조직을 접합시킬 수 있으면서 생체 조직에 대한 지혈 효능, 상처 치유 효능, 균 감염 억제 효능, 항균 효능 등을 나타낼 수 있는 의료용 조성물에 관한 것으로, 이에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

의료용 조성물의 조성

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 특정 범위로 입경이 제어된 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함한다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 특정 범위의 입경을 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자가 통상적인 용매, 또는 용액에 분산된 상태의 조성물일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경(평균 입경)이 10,000 nm 이하인 입자이다. 구체적으로 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경이 9,000 nm 이하, 8,000 nm 이하, 7,000 nm 이하, 6,000 nm 이하, 5,000 nm 이하, 3,000 nm 이하, 1,000 nm 이하, 700 nm 이하, 500 nm 이하, 300 nm 이하, 또는 200 nm 이하일 수 있다. 예컨대, 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경(평균 입경)이 10 내지 10,000 nm, 10 내지 9,000 nm, 13 내지 8,500 nm, 13 내지 6,500 nm, 15 내지 5,000 nm, 15 내지 4,000 nm, 18 내지 3,500 nm, 18 내지 2,000 nm, 20 내지 1,500 nm, 23 내지 1,000 nm, 23 내지 950 nm, 25 내지 800 nm, 25 내지 700 nm, 28 내지 600 nm, 28 내지 500 nm, 30 내지 400 nm, 30 내지 300 nm, 50 내지 290 nm, 60 내지 285 nm, 70 내지 280 nm, 90 내지 275 nm, 100 내지 270 nm, 110 내지 260 nm, 120 내지 250 nm, 130 내지 240 nm, 140 내지 230 nm, 또는 150 내지 260 nm인 입자일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 입경이 상기 범위 내임에 따라 본 발명에 따른 의료용 조성물은 생체 조직에 균일하게(고밀도로) 도포되어 접착면적 및 접착력을 극대화시킬 수 있다. 특히, 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 입자 크기를 제어함에 따라 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 표면적이 넓어지고, 이는 생체 조직과의 상호 작용을 증가시킬 수 있는데, 본 발명은 이를 만족함으로써 의료용 조성물의 지혈 작용 및/또는 접착 기능을 최적화할 수 있다. 또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 입경이 상기 범위 내임에 따라 본 발명에 따른 의료용 조성물은 상처가 난 생체 조직(생체 조직 세포)에 효율적으로 침투하여 영양분 역할을 수행할 수 있고, 이로 인해 본 발명에 따른 의료용 조성물은 상처 치유 효능이 우수할 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입도 편차가 ±0.1 ㎛ 이내일 수 있다. 구체적으로 상기 입도 편차는 ±0.09 ㎛ 이내, ±0.07 ㎛ 이내, ±0.05 ㎛ 이내, 또는 ±0.03 ㎛ 이내일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 입경 및 입도 편차는 나노입도분석기로 측정된 값을 의미할 수 있다. 구체적으로, 나노입도분석기인 Zetasizer Nano ZS(제조사: Marven)를 이용하여 25 ℃의 온도 및 175°의 측정앵글각도에서 동적 광산란(DLS)의 원리를 통해 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 평균 입경 및 입도 편차를 측정할 수 있다. 이때, 0.5의 신뢰구간에서의 다분산지수(polydispersity index, PDI)를 통해 도출된 피크(peak)의 값을 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 입경으로 정의할 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 다분산지수(PDI)가 1 이하일 수 있고, 구체적으로는 0.001 내지 1, 0.003 내지 0.9, 0.005 내지 0.8, 또는 0.005 내지 0.6일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 입도 편차 및 다분산지수가 상기 범위 내임에 따라 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자의 분산성 및 의료용 조성물의 가공성을 높일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 3-하이드록시부티레이트(3HB)로부터 유도된 반복단위(3HB 반복단위)를 포함한다. 상기 3HB 반복단위의 함량은 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 40 중량% 이상일 수 있고, 구체적으로는 40 내지 99.9 중량%, 42 내지 99.5 중량%, 45 내지 99 중량%, 46 내지 98.5 중량%, 47 내지 98 중량%, 48 내지 97 중량%, 50 내지 96 중량%, 51 내지 95 중량%, 52 내지 94.5 중량%, 55 내지 94 중량%, 60 내지 93.5 중량%, 65 내지 93 중량%, 70 내지 93 중량%, 75 내지 92.5 중량%, 80 내지 92 중량%, 또는 82 내지 91.5 중량%일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 4-하이드록시부티레이트(4HB), 3-하이드록시프로피오네이트(3HP), 3-하이드록시헥사노에이트(3HH), 3-하이드록시발레레이트(3HV), 4-하이드록시발레레이트(4HV), 5-하이드록시발레레이트(5HV) 및 6-하이드록시헥사노에이트(6HH)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유도된 반복단위를 더 포함할 수 있다.

구체적으로 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상기 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위(4HB 반복단위)를 더 포함할 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)가 4HB 반복단위를 포함함에 따라 의료용 조성물의 생분해성, 생체적합성, 지혈 효능, 상처 치유 효능 및 접착 성능을 높일 수 있다.

상기 4HB 반복단위의 함량은 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로 0.1 내지 60 중량%일 수 있고, 구체적으로는 0.5 내지 58 중량%, 1 내지 55 중량%, 1.5 내지 54 중량%, 2 내지 53 중량%, 3 내지 52 중량%, 4 내지 50 중량%, 5 내지 49 중량%, 6 내지 48 중량%, 6 내지 45 중량%, 6.5 내지 40 중량%, 7 내지 35 중량%, 7 내지 30 중량%, 7.5 내지 25 중량%, 8 내지 20 중량%, 또는 8.5 내지 18 중량%일 수 있다.

구체적으로 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체일 수 있으며, 이로 인해 의료용 조성물의 생분해성, 생체적합성, 지혈 효능, 상처 치유 효능 및 접착 성능을 높일 수 있다.

한편, 상기 4HB 반복단위의 함량에 따라 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 그 결정성이 제어되어 반결정형 PHA(scPHA), 또는 비정형 PHA(aPHA)로 구분될 수 있다.

구체적으로 상기 scPHA는 4HB 반복단위의 함량이 0.1 내지 30 중량%, 1 내지 28 중량%, 3 내지 26 중량%, 5 내지 25 중량%, 6 내지 23 중량%, 8 내지 21 중량%, 또는 10 내지 20 중량%일 수 있다. 또한, 상기 aPHA는 4HB 반복단위의 함량이 15 내지 60 중량%, 20 내지 58 중량%, 25 내지 55 중량%, 35 내지 53 중량%, 40 내지 50 중량%, 43 내지 49 중량%, 또는 45 내지 48 중량%일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상기 scPHA 단독, 또는 상기 aPHA 단독으로 이루어지거나 이들이 혼합된 것일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 시차 주사 열용량 분석법(DSC, Differential Scanning Calorimeter)에 의해 측정된 결정화도가 90 % 이하, 85 % 이하, 80 % 이하, 75 % 이하, 또는 70 % 이하일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 분자량(중량평균분자량)이 10,000 내지 1,200,000 g/mol일 수 있고, 구체적으로는 20,000 내지 1,100,000 g/mol, 30,000 내지 1,000,000 g/mol, 40,000 내지 900,000 g/mol, 45,000 내지 850,000 g/mol, 50,000 내지 800,000 g/mol, 60,000 내지 750,000 g/mol, 70,000 내지 700,000 g/mol, 80,000 내지 600,000 g/mol, 90,000 내지 500,000 g/mol, 100,000 내지 400,000 g/mol, 200,000 내지 800,000 g/mol, 또는 300,000 내지 700,000 g/mol일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 분자량이 상기 범위 내임에 따라 생체 조직에 대한 의료용 조성물의 접착 성능을 높일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 유리 전이 온도(T_g)가 -45 내지 80 ℃, -35 내지 50 ℃, -20 내지 20 ℃, 또는 -15 내지 0 ℃일 수 있다. 또한 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 결정화 온도(T_c)가 측정되지 않거나, 60 내지 120 ℃, 70 내지 115 ℃, 75 내지 110 ℃, 또는 80 내지 105 ℃일 수 있다. 또 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 용융 온도(T_m)가 측정되지 않거나, 100 내지 170 ℃, 105 내지 160 ℃, 110 내지 150 ℃, 또는 115 내지 140 ℃일 수 있다.

이러한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.1 내지 75 %(w/v)(의료용 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1 내지 75 wt%)일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물에 포함된 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.2 내지 70 %(w/v), 0.2 내지 60 %(w/v), 0.2 내지 50 %(w/v), 0.3 내지 40 %(w/v), 0.3 내지 30 %(w/v), 0.3 내지 25 %(w/v), 0.3 내지 16 %(w/v), 0.35 내지 15.6 %(w/v), 0.7 내지 13 %(w/v), 3 내지 11 %(w/v), 또는 6 내지 9 %(w/v)일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도가 상기 범위 내임에 따라 의료용 조성물의 지혈 효능, 상처 치유 효능 및 접착 성능을 현저히 높일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 100% 상대습도 및 상온(예컨대, 20±5 ℃, 구체적으로 25 ℃)에서 측정한 조직 접착 강도가 15 kPa 이상일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 생체 조직에 대한 접착 강도가 15 내지 300 kPa, 18 내지 200 kPa, 20 내지 100 kPa, 또는 30 내지 50 kPa일 수 있다. 상기 생체 조직에 대한 접착 강도가 상기 범위 내임에 따라 수분이 존재하지 않는 생체 조직뿐만 아니라 수분이 존재하는 생체 조직(예컨대, 표면이 젖은 조직, 또는 수중에서의 조직)에 대해서도 의료용 조성물이 높은 접착 성능을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 이외의 생체적합성 고분자 및/또는 접착물질을 더 포함할 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 구체적으로 카테콜(catechol), 카페익산(caffeic acid), 갈산(gallic acid), 타닌(tannin); 키토산, 히알루론산, 알긴산, 덱스트란 등과 같은 다당류 계통 고분자; 또는 콜라겐, 젤라틴 등과 같은 단백질 계통 고분자일 수 있다. 상기 접착물질은 구체적으로 프로타민(protamine), 홍합접착 단백질, 또는 오징어빨판이빨 단백질(suckerin)일 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 통상적으로 공지된 약리 활성 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 약리 활성 물질은 구체적으로 진통제, 항염증제, 항균제, 또는 항진균제일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 분말형, 액상형, 겔형, 또는 시트형(필름형) 등의 제형을 가질 수 있다.

의료용 조성물의 용도

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 다양한 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 지혈용, 상처 치유용, 욕창 치유용, 조직 접착용, 또는 균 감염 억제용으로 사용될 수 있는데, 이에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

지혈용 조성물

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 지혈용 조성물일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 낮은 면역원성을 가져 생체적합성이 우수하고 혈액을 효과적으로 지혈하는 작용을 할 수 있는 것으로, 본 발명의 지혈용 조성물은 이러한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함함에 따라 상처가 난 생체 조직의 지혈을 효율적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지혈용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상기 '의료용 조성물의 조성'에서 설명한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)와 실질적으로 동일한 구성 및 특징을 갖는다.

바람직하게는, 상기 지혈용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위를 0.1 내지 30 중량%, 1 내지 28 중량%, 3 내지 26 중량%, 5 내지 25 중량%, 6 내지 23 중량%, 또는 10 내지 20 중량%로 포함하면서 분자량이 30,000 내지 1,000,000 g/mol, 40,000 내지 900,000 g/mol, 45,000 내지 850,000 g/mol, 또는 50,000 내지 800,000 g/mol일 수 있다. 또한 상기 지혈용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경(평균 입경)이 25 내지 700 nm, 25 내지 600 nm, 25 내지 500 nm, 30 내지 400 nm, 30 내지 300 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 230 nm, 70 내지 220 nm, 100 내지 210 nm, 120 내지 200 nm, 130 내지 190 nm, 140 내지 180 nm, 또는 150 내지 180 nm인 입자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지혈용 조성물에 포함되는 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.1 내지 25 %(w/v)(지혈용 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1 내지 25 wt%)일 수 있고, 구체적으로는 0.3 내지 16 %(w/v), 0.5 내지 15 %(w/v), 0.7 내지 13 %(w/v), 1 내지 10 %(w/v), 2 내지 9 %(w/v), 3 내지 9 %(w/v), 또는 6 내지 8 %(w/v)일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도가 상기 범위 내임에 따라 지혈용 조성물의 지혈 효능을 현저히 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지혈용 조성물은 생체(인체)에 무해하면서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 균일하게 분산시킬 수 있는 통상적인 용매, 또는 용액을 포함할 수 있다. 상기 용매, 또는 상기 용액은 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로 정제수, 식염수, 또는 PBS buffer 용액 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 지혈용 조성물은 상술한 생체적합성 고분자, 상술한 접착물질 및 상술한 약리 활성 물질을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

상처 치유용 조성물

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 상술한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 상처 치유용 조성물일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상처가 난 생체 조직(생체 조직 세포)이 빠르게 회복될 수 있도록 하는 영양분이 되어, 상처가 난 생체 조직의 회복 속도를 높이는 작용을 할 수 있는 것으로, 본 발명의 상처 치유용 조성물은 이러한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함함에 따라 상처가 난 생체 조직의 치유(치료)를 효율적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치유용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상기 '의료용 조성물의 조성'에서 설명한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)와 실질적으로 동일한 구성 및 특징을 갖는다.

바람직하게는, 상기 상처 치유용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위를 0.1 내지 30 중량%, 1 내지 28 중량%, 3 내지 26 중량%, 5 내지 25 중량%, 6 내지 23 중량%, 또는 10 내지 20 중량%로 포함하면서 분자량이 30,000 내지 1,000,000 g/mol, 40,000 내지 900,000 g/mol, 45,000 내지 850,000 g/mol, 또는 50,000 내지 800,000 g/mol일 수 있다. 또한 상기 상처 치유용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경(평균 입경)이 25 내지 700 nm, 25 내지 600 nm, 25 내지 500 nm, 30 내지 400 nm, 30 내지 300 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 230 nm, 70 내지 220 nm, 100 내지 210 nm, 120 내지 200 nm, 130 내지 190 nm, 140 내지 180 nm, 또는 150 내지 180 nm인 입자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치유용 조성물에 포함되는 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.1 내지 25 %(w/v)(상처 치유용 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1 내지 25 wt%)일 수 있고, 구체적으로는 0.3 내지 16 %(w/v), 0.5 내지 15 %(w/v), 0.7 내지 13 %(w/v), 1 내지 12 %(w/v), 2 내지 11 %(w/v), 3 내지 10 %(w/v), 5 내지 9 %(w/v), 또는 6 내지 8 %(w/v)일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도가 상기 범위 내임에 따라 상처 치유용 조성물의 상처 치유 효능을 현저히 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치유용 조성물은 생체(인체)에 무해하면서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 균일하게 분산시킬 수 있는 통상적인 용매, 또는 용액을 포함할 수 있다. 상기 용매, 또는 상기 용액은 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로 정제수, 식염수, 또는 PBS buffer 용액 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치유용 조성물은 상술한 생체적합성 고분자, 상술한 접착물질 및 상술한 약리 활성 물질을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

조직 접착용 조성물

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 상술한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 조직 접착용 조성물일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 다양한 작용기(예컨대, OH기)를 가져 수분이 존재하지 않는 생체 조직(예컨대, 피부 조직)뿐만 아니라, 젖어 있는 생체 조직에 적용하더라도 이를 다른 생체 조직과 강하게 결합(접착)시키는 작용을 할 수 있는 것으로, 본 발명의 조직 접착용 조성물은 이러한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함함에 따라 상처가 난 생체 조직의 봉합(접합)을 효율적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조직 접착용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상기 '의료용 조성물의 조성'에서 설명한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)와 실질적으로 동일한 구성 및 특징을 갖는다.

바람직하게는, 상기 조직 접착용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위를 0.1 내지 30 중량%, 1 내지 28 중량%, 3 내지 26 중량%, 4 내지 25 중량%, 5 내지 23 중량%, 6 내지 20 중량%, 7 내지 18 중량%, 또는 8 내지 19 중량%로 포함하면서 분자량이 100,000 내지 1,000,000 g/mol, 150,000 내지 900,000 g/mol, 200,000 내지 800,000 g/mol, 또는 300,000 내지 700,000 g/mol일 수 있다. 또한 상기 조직 접착용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경(평균 입경)이 25 내지 700 nm, 25 내지 650 nm, 25 내지 600 nm, 30 내지 550 nm, 30 내지 500 nm, 50 내지 450 nm, 50 내지 400 nm, 70 내지 350 nm, 100 내지 300 nm, 110 내지 290 nm, 120 내지 280 nm, 130 내지 270 nm, 또는 140 내지 260 nm인 입자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조직 접착용 조성물에 포함되는 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.1 내지 25 %(w/v)(조직 접착용 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1 내지 25 wt%)일 수 있고, 구체적으로는 0.3 내지 16 %(w/v), 0.5 내지 15 %(w/v), 0.7 내지 14 %(w/v), 1 내지 13 %(w/v), 2 내지 12 %(w/v), 3 내지 11 %(w/v), 4 내지 10 %(w/v), 또는 5 내지 10 %(w/v)일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도가 상기 범위 내임에 따라 조직 접착용 조성물의 생체 조직 접착 성능을 현저히 높일 수 있다.

이러한 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 접착용 조성물은 100% 상대습도 및 상온(예컨대, 20±5 ℃, 구체적으로 25 ℃)에서 측정한 조직(생체 조직) 접착 강도가 15 kPa 이상일 수 있고, 구체적으로는 15 내지 300 kPa, 16 내지 270 kPa, 17 내지 250 kPa, 18 내지 200 kPa, 19 내지 150 kPa, 20 내지 100 kPa, 25 내지 80 kPa, 28 내지 60 kPa, 또는 30 내지 50 kPa일 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 접착용 조성물은 하이드로젤을 대상으로 한 접착 강도가 1 내지 300 J/㎡일 수 있고, 구체적으로는 2 내지 280 J/㎡, 3 내지 250 J/㎡, 5 내지 230 J/㎡, 6 내지 200 J/㎡, 7 내지 180 J/㎡, 8 내지 150 J/㎡, 9 내지 100 J/㎡, 10 내지 80 J/㎡, 13 내지 70 J/㎡, 15 내지 60 J/㎡, 17 내지 50 J/㎡, 또는 20 내지 45 J/㎡일 수 있다. 상기 접착 강도가 상기 범위 내임에 따라 수분이 존재하지 않는 생체 조직뿐만 아니라 수분이 존재하는 생체 조직(예컨대, 표면이 젖은 조직, 또는 수중에서의 조직)에 대해서도 조직 접착용 조성물이 높은 접착 성능을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조직 접착용 조성물은 생체에 무해하면서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 균일하게 분산시킬 수 있는 통상적인 용매, 또는 용액을 포함할 수 있다. 상기 용매, 또는 상기 용액은 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로 정제수, 식염수, 또는 PBS buffer 용액 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 접착용 조성물은 상술한 생체적합성 고분자, 상술한 접착물질 및 상술한 약리 활성 물질을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

균 감염 억제용 조성물(항균용 또는 멸균용 조성물)

본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는 균 감염 억제용 조성물일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 균(예컨대, 세균, 박테리아 등)의 번식 및 대사 기능을 억제하는 작용을 할 수 있는 것으로, 본 발명의 균 감염 억제용 조성물은 이러한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함함에 따라 상처가 난 생체 조직, 또는 수술이 이루어진 생체 조직의 균 감염을 효율적으로 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 균 감염 억제용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 상기 '의료용 조성물의 조성'에서 설명한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)와 실질적으로 동일한 구성 및 특징을 갖는다.

바람직하게는, 상기 균 감염 억제용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위를 0.1 내지 30 중량%, 1 내지 28 중량%, 3 내지 26 중량%, 5 내지 25 중량%, 6 내지 23 중량%, 또는 10 내지 20 중량%로 포함하면서 분자량이 30,000 내지 1,000,000 g/mol, 40,000 내지 900,000 g/mol, 45,000 내지 850,000 g/mol, 또는 50,000 내지 800,000 g/mol일 수 있다. 또한 상기 균 감염 억제용 조성물에 포함되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 입경(평균 입경)이 25 내지 700 nm, 25 내지 600 nm, 25 내지 500 nm, 30 내지 400 nm, 30 내지 300 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 230 nm, 70 내지 220 nm, 100 내지 210 nm, 120 내지 200 nm, 130 내지 190 nm, 140 내지 180 nm, 또는 150 내지 180 nm인 입자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 균 감염 억제용 조성물에 포함되는 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도는 0.1 내지 75 %(w/v)(균 감염 억제용 조성물 총 중량을 기준으로, 0.1 내지 75 wt%)일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 75 %(w/v), 10 내지 75 %(w/v), 15 내지 70 %(w/v), 20 내지 70 %(w/v), 25 내지 65 %(w/v), 30 내지 65 %(w/v), 또는 35 내지 55 %(w/v)일 수 있다. 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도가 상기 범위 내임에 따라 균 감염 억제용 조성물의 균 감염 억제 효능을 현저히 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 균 감염 억제용 조성물은 생체(인체)에 무해하면서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 균일하게 분산시킬 수 있는 통상적인 용매, 또는 용액을 포함할 수 있다. 상기 용매, 또는 상기 용액은 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로 정제수, 식염수, 또는 PBS buffer 용액 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 균 감염 억제용 조성물은 상술한 생체적합성 고분자, 상술한 접착물질 및 상술한 약리 활성 물질을 선택적으로 더 포함할 수 있다.

의료용 조성물의 제조방법

본 발명은 최적 생체적합성을 나타낼 수 있는 입경을 갖도록 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 입자화하는 과정을 거쳐 의료용 조성물을 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물의 제조방법은, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜 분산상 용액을 준비하는 단계(S-1); 계면활성제를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계(S-2); 상기 분산상 용액을 10,000 nm 이하의 기공 크기를 갖는 멤브레인에 통과시켜 상기 연속상 용액에 분산상 입자가 분산된 에멀전을 형성하는 단계(S-3); 및 상기 에멀전을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계(S-4)를 포함한다.

상기 S-1 단계는 초기 원료인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜(분산시켜) 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)가 분산되어 있는 분산상 용액을 준비하는 단계이다.

상기 초기 원료로 사용되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 기계적인 방법 또는 물리적인 방법을 이용한 미생물의 세포 파쇄(cell disruption)를 통해 수득한 것이거나, 비기계적인 방법 또는 화학적인 방법을 이용한 미생물의 세포 파쇄(cell disruption)를 통해 수득한 것일 수 있다.

상기 용매는 초기 원료인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용해시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로는 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 부틸 아세테이트 및 트리클로로에탄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

한편 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)가 상기 용매에 고르게 잘 용해될 수 있도록 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 용해는 40 내지 50 ℃에서 45 내지 55 시간 동안 교반하는 것으로 이루어질 수 있다.

이러한 과정을 거쳐 준비된 분산상 용액은 초기 원료인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 0.01 내지 5 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로 분산상 용액은 분산상 용액 총 중량을 기준으로 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 0.02 내지 4.5 중량%, 0.05 내지 4 중량%, 0.08 내지 3.5 중량%, 0.1 내지 3 중량%, 0.2 내지 2.5 중량%, 0.35 내지 2 중량%, 0.4 내지 1.5 중량%, 0.5 내지 1.3 중량%, 0.6 내지 1.2 중량%, 0.7 내지 1 중량%, 또는 0.75 내지 0.9 중량%로 포함할 수 있다. 상기 분산상 용액에 포함된 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 함량이 상기 범위 내임에 따라 10,000 nm 이하의 입경을 가지면서 균일한 형태(구형)를 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득할 수 있다.

상기 S-2 단계는 계면활성제(유화제)를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계이다. 구체적으로 상기 연속상 용액은 계면활성제와 수성 용매를 포함할 수 있다.

상기 계면활성제는 구체적으로 소듐도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate), 소듐라우릴설페이트(Sodium lauryl sulfate), 소듐라우레스설페이트(Sodium laureth sulfate), 소듐스테아레이트(sodium stearate), 소듐코코일글리시네이트(Sodium Cocoyl glycinate) 및 퍼플루오로옥탄설포네이트(perfluorooctane sulfonate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 수성 용매는 물, 증류수, 탈이온수, 순수, 또는 초순수 등일 수 있다.

이러한 연속상 용액 제조 시 교반속도는 1 내지 800 rpm, 50 내지 600 rpm, 또는 200 내지 500 rpm일 수 있다. 상기 연속상 용액의 교반속도가 상기 범위 내임에 따라 균일한 나노 크기를 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득할 수 있다.

상기 연속상 용액을 준비하는 S-2 단계는 상기 S-1 단계와 동시에 이루어지거나 S-1 단계 전 또는 후에 이루어질 수 있다.

상기 S-3 단계는 상기 S-1 단계에서 준비한 분산상 용액을 10,000 nm 이하의 기공 크기를 갖는 멤브레인에 통과시켜 상기 S-2 단계에서 준비한 연속상 용액에 분산상 입자(PHA 분산상 입자)가 분산된 에멀전을 형성하는 단계이다.

상기 멤브레인은 구체적으로 무기 다공성 멤브레인(예컨대, SPG(Shirasu porous glass))일 수 있으며, 10,000 nm 이하의 기공 크기를 가져, 수득되는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자가 요구되는 입경인 10,000 nm 이하의 입경을 갖도록 할 수 있다.

상기 분산상 용액이 상기 멤브레인을 통과하는 압력은 2.5 내지 320 kPa일 수 있고, 구체적으로는 50 내지 320 kPa, 100 내지 320 kPa, 또는 200 내지 320 kPa일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 멤브레인을 통과하는 압력은 기공의 크기에 따라 조절될 수 있으며, 기공이 클수록 보다 낮은 압력으로 수행할 수 있다. 상기 압력이 상기 범위 내임에 따라 균일한 형태(구형)를 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득할 수 있다.

상기 S-4 단계는 상기 분산상 입자를 포함하는 에멀전을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계이다. 상기 에멀전의 고형화는 상기 S-1 단계에서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용해시키기 위해 사용된 용매를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 에멀전의 고형화는 자연건조, 오븐을 이용한 진공건조, 또는 회전식 증발 농축기를 이용한 건조 등을 통해 이루어질 수 있다. 상기 에멀전의 고형화를 거침에 따라 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 포함하는 생성물(예컨대, 입경이 10,000 nm 이하인 PHA 입자가 분산된 수계 분산액)을 수득할 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의료용 조성물의 제조방법은, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜 분산상 용액을 준비하는 단계(S-1'); 계면활성제를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계(S-2'); 상기 분산상 용액과 상기 연속상 용액을 혼합하여 프리믹스 에멀전을 형성하는 단계(S-3'); 상기 프리믹스 에멀전을 고압분산장치(microfluidizer)에 투입하여 입경이 10,000 nm 이하인 분산상 입자가 분산된 에멀전을 형성하는 단계(S-4'); 및 상기 에멀전을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계(S-5')를 포함한다.

상기 S-1' 단계와 상기 S-2' 단계 각각은 상기 S-1 단계와 상기 S-2 단계와 실질적으로 동일한 구성 및 특징을 가져, 이에 대한 구체적인 설명은 생략한다.

상기 S-3' 단계는 상기 S-1' 단계에서 준비한 분산상 용액과 상기 S-2' 단계에서 준비한 연속상 용액을 혼합하여 프리믹스 에멀전(A)을 형성하는 단계이다.

상기 프리믹스 에멀전(A)의 형성을 위한 혼합은 통상적인 균질기(homogenizer)를 통해 이루어질 수 있다. 상기 균질기를 통한 상기 혼합은 5,000 내지 15,000 rpm의 교반속도에서 1 내지 5 분 동안 이루어질 수 있다.

상기 S-4' 단계는 상기 프리믹스 에멀전(A)을 고압분산장치(microfluidizer)에 투입하여 입경이 10,000 nm 이하인 분산상 입자가 분산된 에멀전(B)을 형성하는 단계이다.

상기 고압분산장치(고압분산유화장치)는 상기 프리믹스 에멀전(A)에 압력을 가해 상기 프리믹스 에멀전(A)의 액적이 더 작게 쪼개지도록 하는 장치로서, 통상적인 고압분산장치를 사용할 수 있다.

상기 고압분산장치에 의해 상기 프리믹스 에멀전(A)에 가해지는 압력은 1 내지 30 kpsi일 수 있고, 구체적으로는 3 내지 25 kpsi, 5 내지 20 kpsi, 또는 9 내지 15 kpsi일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 고압분산장치의 작동 압력은 상기 분산상 용액에 포함된 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 함량에 따라 조절될 수 있으며, 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 함량이 높을수록 높은 압력으로 작동될 수 있다. 상기 압력이 상기 범위 내임에 따라 균일한 형태(구형)를 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득할 수 있다.

상기 S-5' 단계는 상기 분산상 입자를 포함하는 에멀전(B)을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계이다. 상기 에멀전의 고형화는 상기 S-1' 단계에서 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용해시키기 위해 사용된 용매를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 에멀전(B)의 고형화는 자연건조, 오븐을 이용한 진공건조, 또는 회전식 증발 농축기를 이용한 건조 등을 통해 이루어질 수 있다. 상기 에멀전(B)의 고형화를 거침에 따라 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 포함하는 생성물(예컨대, 입경이 10,000 nm 이하인 PHA 입자가 분산된 수계 분산액)을 수득할 수 있다.

이와 같이 멤브레인을 이용한 막유화법, 또는 고압분산장치를 이용한 유화법을 통해 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 제조함에 따라 본 발명은 입경이 10,000 nm 이하이면서 균일한 형상을 갖는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 용이하게 제조할 수 있다.

한편, 상기 S-4 단계 및 상기 S-5' 단계를 통해 각각 수득한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자(폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 포함하는 생성물)는 멸균 등의 과정을 추가로 거칠 수 있다. 이후, 얻어진 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자(폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 포함하는 생성물)는 그 자체가 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물로 적용될 수 있다. 또한 얻어진 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 분말화, 액상화, 겔화, 시트화(필름화) 등의 제형화를 거쳐 본 발명의 일 실시예에 따른 의료용 조성물로 적용될 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단 이들 실시예로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<PHA 입자 제조>

합성예 1

멤브레인을 이용한 막유화법(Membrane emulsification)을 통해 PHA 입자를 제조하였다. 구체적으로 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol)를 클로로포름(chloroform)에 용해시켜 10 ml의 분산상 용액(PHA 함량: 0.4 wt% 이하)을 준비하였다. 또한 계면활성제인 소듐도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 0.3 wt%로 포함하는 100 ml의 연속상 수용액을 준비하였다.

유화 장치로 SPG(Shirasu-porous glass) 멤브레인(membrane)을 사용하는 IMK-40(MCTech社) 기기를 사용하고, 준비된 분산상 용액과 연속상 용액을 적용하여 에멀전 형성을 유도하였다. 이때, 멤브레인(membrane)의 기공 크기는 300 nm로, 멤브레인(membrane) 통과 압력은 150 내지 320 kPa, 교반속도는 100 내지 300 rpm으로 제어하였다.

형성된 에멀전 200 ml를 10 mm 미만의 계면 높이가 유지될 수 있는 용기에 부어준 후 상온에서 48 시간 동안 서서히 클로로포름을 증발시켜 에멀전의 고형화를 유도하였으며, 이를 통해 입경이 300 nm 이하인 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 수득하였다.

합성예 2 내지 5

200 nm(합성예 2), 1 ㎛(합성예 3), 5 ㎛(합성예 4) 및 10 ㎛(합성예 5)의 기공 크기를 각각 갖는 멤브레인(membrane)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 1과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 각각 수득하였다.

합성예 6 내지 9

클로로포름에 용해되는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체의 조성 및 분자량을 하기 표 1과 같이 조절한 것을 제외하고는 합성예 1과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 각각 수득하였다.

합성예 10

멤브레인을 이용한 막유화법(Membrane emulsification)을 통해 PHA 입자를 제조하였다. 구체적으로 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 클로로포름(chloroform)에 용해시켜 10 ml의 분산상 용액(PHA 함량: 1.0 wt% 이하)을 준비하였다. 또한 계면활성제인 소듐도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 0.3 wt%로 포함하는 100 ml의 연속상 수용액을 준비하였다.

유화 장치로 SPG(Shirasu-porous glass) 멤브레인(membrane)을 사용하는 IMK-40(MCTech社) 기기를 사용하고, 준비된 분산상 용액과 연속상 용액을 적용하여 에멀전 형성을 유도하였다. 이때, 멤브레인(membrane)의 기공 크기는 300 nm로, 멤브레인(membrane) 통과 압력은 150 내지 320 kPa, 교반속도는 100 내지 300 rpm으로 제어하였다.

형성된 에멀전 200 ml를 1 L 용량 둥근바닥 플라스크에 부어준 후 57 ℃ 및 150 mbar에서 4 시간 동안 클로로포름을 증발시켜 에멀전의 고형화를 유도하였으며, 이를 통해 입경이 300 nm 이하인 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 수득하였다.

합성예 11 내지 14

1 ㎛(합성예 11), 2 ㎛(합성예 12), 5 ㎛(합성예 13) 및 10 ㎛(합성예 14)의 기공 크기를 각각 갖는 멤브레인(membrane)을 사용한 것을 제외하고는 합성예 10과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 각각 수득하였다.

합성예 15 내지 17

클로로포름에 용해되는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체의 함량(농도)을 하기 표 1과 같이 조절한 것을 제외하고는 합성예 10과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 각각 수득하였다.

합성예 18 내지 20

클로로포름에 용해되는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체의 함량(농도)을 하기 표 1과 같이 조절한 것을 제외하고는 합성예 11과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 각각 수득하였다.

합성예 21 내지 25

클로로포름에 용해되는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체의 조성 및 분자량을 하기 표 1과 같이 조절한 것을 제외하고는 합성예 10과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 각각 수득하였다.

합성예 26

고압분산장치를 이용한 유화법을 통해 PHA 입자를 제조하였다. 구체적으로 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 클로로포름(chloroform)에 용해시켜 25 ml의 분산상 용액(PHA 함량: 5 wt% )을 준비하였다. 또한 계면활성제인 소듐도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 0.3 wt%로 포함하는 500 ml의 연속상 수용액을 준비하였다.

상기 연속상 수용액에 상기 분산상 용액을 투입하고, 13,600 rpm으로 설정된 균질기(IKA ULTRA-TURRAX® T 25 digital, IKA社)로 2 분 동안 혼합하여 프리믹스(premix) 에멀전을 형성하였다.

이어서, 고압분산장치(LM20, Microfluidics社)에 상기 프리믹스(premix) 에멀전을 투입하고 압력을 가하여 균질화된 에멀전 형성을 유도하였다. 이때, 압력은 10 kpsi로 제어하였다.

형성된 에멀전 200 ml를 1 L 용량 둥근 바닥 플라스크에 부어준 후 57 ℃ 및 150 mbar에서 4 시간 동안 클로로포름을 증발시켜 에멀전의 고형화를 유도하였으며, 이를 통해 입경이 300 nm 이하인 PHA 입자(구체적으로, PHA 입자 함유 수계 분산액)를 수득하였다.

구분	초기 원료 PHA([P(3HB-co-4HB)]		분상상 용액 내 PHA 함량 (wt%)	멤브레인 기공 크기	수득한 PHA 입경
	4HB 반복단위(wt%)	분자량(g/mol)
합성예 1	17	687,000	0.334	300 nm	202.5 nm
합성예 2	17	687,000	0.334	200 nm	158.9 nm
합성예 3	17	687,000	0.334	1 ㎛	791 ㎚
합성예 4	17	687,000	0.334	5 ㎛	3230 ㎚
합성예 5	17	687,000	0.334	10 ㎛	6170 ㎚
합성예 6	6	50,000	0.334	300 nm	202.7 nm
합성예 7	16	257,000	0.334	300 nm	213.9 nm
합성예 8	7	576,000	0.334	300 nm	210.7 nm
합성예 9	48	800,000	0.334	300 nm	249.6 nm
합성예 10	8.7	390,000	0.8	300 nm	274.3 nm
합성예 11	8.7	390,000	0.8	1 ㎛	913 nm
합성예 12	8.7	390,000	0.8	2 ㎛	1929 nm
합성예 13	8.7	390,000	0.8	5 ㎛	4737 nm
합성예 14	8.7	390,000	0.8	10 ㎛	8480 nm
합성예 15	8.7	390,000	0.1	300 nm	197.7 nm
합성예 16	8.7	390,000	0.2	300 nm	236 nm
합성예 17	8.7	390,0009	0.4	300 nm	260.2 nm
합성예 18	8.7	390,000	0.1	1 ㎛	515.2 nm
합성예 19	8.7	390,000	0.2	1 ㎛	600 nm
합성예 20	8.7	390,000	0.4	1 ㎛	710.7 nm
합성예 21	6	50,000	0.8	300 nm	284.8 nm
합성예 22	7	576,000	0.8	300 nm	223.5 nm
합성예 23	16	257,000	0.8	300 nm	247 nm
합성예 24	17	687,000	0.8	300 nm	210.4 nm
합성예 25	48	800,000	0.8	300 nm	237 nm
합성예 26	8.7	390,000	5	-	131.1 nm

시험예 1 - PHA 입자 확인

합성예 1 내지 5 및 합성예 10 내지 15에서 각각 수득한 PHA 입자를 주사전자현미경(SEM)을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 멤브레인(membrane)을 이용한 막유화법으로 PHA 입자를 제조함에 따라 균일한 크기를 가지면서 구형의 형상을 갖는 PHA 입자의 제조가 잘 이루어짐을 확인할 수 있다.

시험예 2 - PHA 입자 분포 분석

분산상 용액 준비 시 PHA의 함량(농도)을 0.042 내지 0.334 wt%로 조절한 것을 제외하고는 합성예 1과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자를 수득하였다. 수득된 PHA 입자의 크기와 분포 변화를 광산란분석방법(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, U.K)을 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

또한 분산상 용액 준비 시 PHA의 함량(농도)을 0.1 내지 0.8 wt%로 조절한 것을 제외하고는 합성예 10 및 11과 동일한 과정을 거쳐 PHA 입자를 수득하였다. 수득된 PHA 입자의 크기와 분포 변화를 광산란분석방법(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, U.K)을 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 분산상 용액에 포함된 PHA(초기 원료)의 함량이 0.01 내지 0.5 wt% 범위 내임에 따라 300 nm 이하의 입경을 갖는 PHA 입자의 제조가 잘 이루어짐을 확인할 수 있다. 또한, 도 4를 참조하면, 분산상 용액에 포함된 PHA(초기 원료)의 함량이 0.1 내지 1 wt% 범위 내이고, 멤브레인의 기공 크기가 0.3 ㎛임에 따라 300 nm 이하의 입경을 갖는 PHA 입자의 제조가 잘 이루어짐을 확인할 수 있다.

시험예 3 - PHA 면역원성 평가

합성예 1의 반결정형 PHA(scPHA, [P(3HB-co-4HB)] 형태. 4HB 유래 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol) 및 합성예 9의 비정형 PHA(aPHA, [P(3HB-co-4HB)] 형태. 4HB 유래 반복단위: 48 wt%, 분자량: 800,000 g/mol)의 면역원성을 평가하였으며, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 구체적으로 Raw 264.7 세포를 10% FBS(Fetal bovine Serum)를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 현탁시킨 후, 48 well plate에 1Х10⁵ cells/ml 세포수가 되도록 분주하고, 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 12 시간 동안 배양하였다. 이후 0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에 용해(분산)시킨 scPHA 또는 aPHA를 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 500 ㎍/ml 및 1000 ㎍/ml의 농도로 각각 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 배양액을 취하여 염증성 사이토카인(cytokine) 인자인 TNF-α와 IL-6의 함량을 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 이때, 양성대조군으로는 LPS(Lipopolysaccharides from　Escherichia coli　O55:B5 (Cat# L2880, Sigma-Aldrich (St, louis, MO, USA))를 적용하였고, 음성대조군으로는 0.1 M PBS buffer(pH 7.4)(NT)를 적용하였다.

도 5 및 도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 PHA인 aPHA 10 ㎍/ml, aPHA 100 ㎍/ml, aPHA 500 ㎍/ml, aPHA 1000 ㎍/ml, scPHA 10 ㎍/ml, scPHA 100 ㎍/ml, scPHA 1000 ㎍/ml은 염증성 사이토카인 인자인 TNF-α와 IL-6의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있다. 특히, aPHA 1000 ㎍/ml 및 scPHA 1000 ㎍/ml와 동일 농도로 처리된 LPS(양성대조군)를 비교할 때, 본 발명에 따른 PHA가 LPS에 비해 염증성 사이토카인 인자의 발현이 현저히 낮다는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 PHA가 낮은 면역원성을 가져 생체적합성이 우수하다는 것을 뒷받침하는 것이다.

<의료용 조성물 제조>

실시예 1

멤브레인(membrane)의 기공 크기를 제어한 것을 제외하고는 합성예 1과 동일한 과정을 거쳐 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol)를 수득하였다. 수득한 PHA 입자를 0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에 0.3 내지 16 %(w/v) 범위의 농도로 용해(분산)시켜 조성물을 제조하였다.

실시예 2

멤브레인(membrane)의 기공 크기를 제어하는 것을 제외하고는 합성예 1과 동일한 과정을 거쳐 입경이 259 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol)를 수득하였다. 수득한 PHA 입자를 0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에 0.3 내지 16 %(w/v) 범위의 농도로 용해(분산)시켜 조성물을 제조하였다.

실시예 3

멤브레인(membrane)의 기공 크기를 제어하는 것을 제외하고는 합성예 11과 동일한 과정을 거쳐 입경이 180 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 수득하였다. 수득한 PHA 입자의 농도를 0.1 내지 10 %(w/v) 범위로 조절하는 과정을 거쳐 조성물을 제조하였다. 이때, PHA 입자의 농도 조절은 회전식 증발기로 농축하거나 정제수로 희석하는 과정으로 이루어졌다.

실시예 4

입경이 580 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 수득하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 과정을 거쳐 조성물을 제조하였다.

실시예 5

입경이 850 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 수득하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 과정을 거쳐 조성물을 제조하였다.

실시예 6

입경이 4740 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 수득하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 과정을 거쳐 조성물을 제조하였다.

실시예 7

입경이 8190 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol)를 수득하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 과정을 거쳐 조성물을 제조하였다.

비교예 1

피브린글루(녹십자, 한국)(FG)를 적용하였다.

시험예 4 - 접착 성능 평가 1

만능재료시험기(Instron 5544, Norwood, MA, US)를 이용한 전단응력 측정을 통해 생체 조직에 대한 조성물의 접착력을 평가하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 구체적으로, 돼지 껍데기(stellen Medical, USA)를 10 mm×10 mm 크기로 잘라 0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 방치하였다. 방치완료한 돼지 껍데기를 10 mm×100 mm 크기의 알루미늄 바에 순간접착제(3M)를 이용하여 부착한 후, 돼지 껍데기의 표면에 시료로서 실시예 1 및 2에서 제조한 조성물과 비교예 1의 피브린글루를 각각 도포하였다. 다음, 시료가 도포되지 않은 돼지 껍데기가 부착된 알루미늄 바를 겹쳐준 후, 클립을 사용하여 2개의 알루미늄 바를 고정하였다. 고정된 2개의 알루미늄 바를 100 % 상대습도 및 상온(RT)에서 2시간 동안 배양한 후, 10 kN 로드셀(load cell)을 이용하여 10 mm/min의 크로스 헤드(cross head) 속도로 2개의 알루미늄 바가 완전히 분리될 때까지의 전단응력을 측정하였다.

도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 조성물인 실시예 1 및 2는 비교예 1인 피브린글루와 비교할 때, 동등 이상의 접착력을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히. PHA 입자의 입경이 259 nm이면서 PHA 입자의 농도가 3 내지 16 %(w/v)일 때, 현저히 높은 접착력을 나타냄을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 생체 조직에 대한 접착력을 높이기 위해 PHA 입자의 입경을 제어할 필요가 있다는 것과 본 발명에 따른 의료용 조성물(조직 접착용 조성물)이 수분이 존재하는 환경에서도 강한 접착력을 나타내는 것을 뒷받침하는 것이다.

시험예 5 - 접착 성능 평가 2

만능재료시험기(QC-508E, Cometech, Taiwan)를 이용한 전단응력 측정을 통해 생체 조직에 대한 조성물의 접착력을 평가하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 구체적으로, N,N'-methylenebis(acrylamide) 27.6 mg, potassium persulfate 4,920 mg을 4 ℃의 탈이온수 30 g에 녹인 후에 N,N-dimethylacrylamide 18.528 ml 및 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine 270 ul을 첨가하고 혼합한 용액을, 1.5 mm 폭을 갖는 틀에 넣고 30 ℃에서 16 시간 동안 가교시켜 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 하이드로젤을 5 mm×30 mm 크기로 자른 후, 하이드로젤 표면에 시료로서 실시예 3 내지 7에서 제조한 조성물 10ul을 5 mm×10 mm 면적에 각각 도포하였다. 다음 시료가 도포된 2개의 하이드로젤 조각을 겹쳐준 후 4 시간 동안 상온(RT)에서 방치하였다. 4시간 후, 50 N 로드셀(load cell)을 이용하여 10 mm/min의 크로스 헤드(cross head) 속도로 2개의 하이드로젤 조각이 완전히 분리될 때까지의 전단응력을 측정하였다.

도 8을 참조하면, PHA 입자의 입경이 작을수록 높은 접착력을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히. PHA 입자의 입경이 300 nm 이하이면서 PHA 입자의 농도가 3 내지 10 %(w/v)일 때, 현저히 높은 접착력을 나타냄을 확인할 수 있다.

이러한 결과 역시 생체 조직에 대한 접착력을 높이기 위해 PHA 입자의 입경을 제어할 필요가 있다는 것과 본 발명에 따른 의료용 조성물(조직 접착용 조성물)이 수분이 존재하는 환경에서도 강한 접착력을 나타내는 것을 뒷받침하는 것이다.

시험예 6 - 창상 회복 평가 1

0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에, 실시예 1에서 수득한 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol)를 7.8 %(w/v) 농도로 용해(분산)시킨 조성물을 대상으로 창상 회복 시험을 진행하였으며, 그 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다. 구체적으로 성별과 주령이 일치하는 7주령 이내의 Sprague Dawley(SD) 래트와 멸균된 수술 도구를 준비하였다. 또한, PHA 입자가 7.8 %(w/v) 농도로 용해(분산)된 조성물은 자외선 살균하였다. 다음, 아이프란액을 넣은 호흡마취기를 사용하여 준비된 래트를 마취시켰다. 마취된 래트의 등을 면도기로 제모한 후 직경 8 mm의 바이옵시 펀치(Kai medical, Japan)를 이용하여 원형 창상 부위를 만들고 자외선 살균한 조성물을 도포한 후 긁음 방지를 위해 멸균방수필름을 부착하였다. 이후, 창상 회복 경과를 카메라를 이용하여 21일 동안 같은 시간에 촬영한 후 Image J 프로그램을 이용하여 창상 부위를 계산하였다. 또한 시험 시작 7일째와 14일째에 이산화탄소를 이용하여 안락사시킨 후 창상 부위 주변의 피부 조직을 10 mm×10 mm 크기로 잘라 포르말린 용액에 고정시킨 후 hematoxylin and eosin(H&E) 염색과 Masson's trichrome(MT) 염색을 진행하고, Leica microscope를 이용하여 염색 부위의 이미지를 확인하였다. 이때, 음성대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 경우(NT)를 적용하였고, 양성대조군으로 피브린글루(녹십자, 한국)(FG)를 적용하였다.

도 9 및 도 10을 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA)은 대조군들에 비해 창상 부위 면적이 빠른 시간 안에 줄어드는 것을 확인할 수 있다.

도 11의 (c)(hematoxylin and eosin(H&E) 염색 결과)를 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA)이 처리될 경우, 상처 복구가 빠르게 일어나 수많은 새로운 혈관이 생성된 것을 관찰할 수 있다. 이와 같이 새로 생성된 혈관은 임시 육아 조직 생성을 지원하여 새로운 조직의 성장을 높이면서 치유 과정을 지원하는 데에 필요한 확장 조직에 영양과 산소를 전달할 수 있다. 또한 혈관 신생 과정은 상처 부위에서 노폐물과 죽은 세포를 제거하는 데에 도움을 주어 치유 과정 속도를 높일 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA)이 처리될 경우, 대조군들에 비해 더 빠른 재상피화(표피 복원)가 일어났으며, 특히, 3일째부터 새로 형성된 상피 혀는 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA)이 처리된 그룹에서만 관찰할 수 있다.

도 11의 (d)(Masson's trichrome(MT) 염색 결과)를 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA)이 처리될 경우, 더 성숙한 콜라겐 함량 구조로 육아 조직이 더 빠르게 리모델링되는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 의료용 조성물(상처 치유용 조성물)이 상처 치유 효능이 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

시험예 7 - 창상 회복 평가 2

0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에, 실시예 1에서 수득한 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol) 및 실시예 3에서 수득한 입경이 180 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol) 각각을 25 %(w/v) 농도로 용해(분산)시킨 조성물(PHA1(4HB 반복단위: 17 wt%), PHA2(4HB 반복단위: 8.7 wt%))을 대상으로 창상 회복 시험(in vivo 상처 치유 능력 평가)을 진행하였으며, 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다. 구체적으로 이소플루란으로 Sprague Dawley(SD) 래트를 마취시키고 등을 면도한 후, 길이 1.5 cm 및 깊이 3.0 mm로 피부를 절개하여 좁은 피부 상처를 만들었다. 다음, 상처 부위에 10 μl의 PHA1 조성물 및 PHA2 조성물 각각 도포하고 3 분 동안 상처 부위를 고정시켰다. 그 다음 7일 후, 래트를 안락사시키고, 상처 부위를 포함하도록 피부를 1 cm×2 cm 크기로 절개하였다. 이어서 절개한 피부를 p-포름알데히드 용액(3.7 wt%)에 고정하고 파라핀에 포매한 후, 피부 단면 절편을 hematoxylin and eosin(H&E)으로 염색하였다. 이후, Leica microscope를 이용하여 염색 부위의 이미지를 확인하였다.

도 12 및 도 13을 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA1, PHA2)은 대조군들에 비해 상처 부위가 깔끔하게 회복되는 것을 확인할 수 있다.

시험예 8 - 창상 회복 평가 3(PHA 입자의 In vitro 세포주에서의 Differentially Expressed Genes(DEGs) 분석)

0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에, 실시예 1에서 수득한 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol) 및 실시예 3에서 수득한 입경이 180 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol) 각각을 25 %(w/v) 농도로 용해(분산)시킨 조성물(PHA1(4HB 반복단위: 17 wt%), PHA2(4HB 반복단위: 8.7 wt%))을 대상으로 DEGs 분석을 진행하여 PHA 입자가 인간 상처 치유에 관여하는 유전자가 무엇인지를 분석하였으며, 그 결과를 도 14 내지 도 18에 나타내었다. 구체적으로, 인간혈관세포주인 HMEC01, 인간 피부 fibroblast 세포인 HDfn을 10.0 vol% FBS 및 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PRMI 1640에서 배양(가습 배양기 37 ℃에서 5% CO₂ 조건으로 LC 나노클러스터가 있는 조건)하였다. 또한, 1.5×10⁵ 세포/mL의 밀도를 갖는 10 mL 세포 현탁액을 각 지름이 10 cm인 원형 세포 배양 디시에 첨가하고 바깥쪽 영역이 채워진 세포 배양 배지를 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, PHA1 조성물 및 PHA2 조성물 각각을 세포 배양 배지에 넣고 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후, 배지를 버리고, 1mL trizol을 넣고 -70℃에서 급속 냉동시킨 후, ㈜ROKIT Genomics에 DEGs 시험 분석을 의뢰하여 결과를 얻었다.

도 14 내지 도 18을 참조하면, 주로 혈관 생성 및 상처 치유와 관련된 유전자들이 PHA 입자 처리군에서 과다 발현된 것을 확인할 수 있다.

시험예 9 - 지혈 효능 평가 1

0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에, 실시예 1에서 수득한 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol)를 7.8 %(w/v) 농도로 용해(분산)시킨 조성물을 대상으로 지혈 성능 시험을 진행하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 구체적으로 구연산나트륨 용액(3.8%)이 포함된 토끼 전혈을 원심분리하여 적혈구(RBC) 및 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)을 각각 용혈 분석 및 혈장 응고 분석을 위해 분리하였다. 다음, 적혈구(RBC)를 식염수로 4회 세척하고, 500 μL로 희석된 적혈구(1 mL의 RBC와 9 mL의 식염수)를 100 mg의 조성물(PHA 조성물)이 담긴 마이크로튜브에 첨가하였다. 이때, 100μL의 0.1% Triton와 100μL의 PBS를 각각 양성 대조군(Postive controls, PC) 및 음성 대조군(Negative control, NC)으로, 100μL의 Fbrin glue를 비교군으로 적용하였다. 상기 마이크로튜브를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후, 얻어진 상등액을 540 nm에서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 광학밀도(Optical Density, O.D.)를 분석하였으며, 하기 식 1에 따라 지혈률(Hemolysis, %)을 산출하였다(N = 3).

[식 1]

지혈률(%) = {(O.D. 샘플 - O.D. 음성 대조군)/(O.D. 양성 대조군 - O.D. 음성 대조군)}×100

도 19를 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(지혈용 조성물)은 지혈 효능이 우수한 것을 확인할 수 있다.

시험예 10 - 지혈 효능 평가 2

0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에, 실시예 1에서 수득한 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol)를 1 %(w/v), 3 %(w/v), 7 %(w/v) 및 10 %(w/v) 농도로 용해(분산)시킨 조성물을 대상으로 지혈 성능 시험을 진행하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다. 구체적으로 구연산나트륨 용액(3.8%)이 포함된 토끼 전혈을 원심분리하여 적혈구(RBC) 및 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)을 각각 용혈 분석 및 혈장 응고 분석을 위해 분리하였다. 다음, 각 농도별로 준비된 조성물(PHA 조성물)과 20 μL의 나노입자 현탁액 실리카가 각각 투입된 마이크로튜브에 180 μL의 혈장을 첨가하였다. 이후, 마이크로튜브를 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 6,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 다음, 100 μL의 각 상청액을 96-웰 평평한 바닥 플레이트의 웰로 옮기고 65 μL의 50 mM CaCl₂ 용액으로 재석회화하였다. 이어서, plate reader로 1시간 동안 405 nm에서 50초 간격으로 흡광도를 측정하여 fibrin 중합 정도를 평가하였다.

도 20를 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(지혈용 조성물)은 fibrin 중합 정도가 높아 지혈 효능이 우수한 것을 확인할 수 있다.

시험예 11 - 균 감염 억제 평가

0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에, 실시예 1에서 수득한 입경이 178 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 17 wt%, 분자량: 687,000 g/mol) 및 실시예 3에서 수득한 입경이 180 nm인 PHA 입자([P(3HB-co-4HB)]. 4HB 반복단위: 8.7 wt%, 분자량: 390,000 g/mol) 각각을 30 %(w/v), 50 %(w/v), 70 %(w/v)로 용해(분산)시킨 조성물(PHA3(4HB 반복단위: 17 wt%), PHA4(4HB 반복단위: 8.7 wt%))을 대상으로 항균 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다. 구체적으로, OD600의 값이 0.5가 되는 시점에서 대장균(E. coli) 0.2 mL 용액에, PHA 조성물 각각을 첨가한 후, LB 고체배지에 도포하였다. 이어서, 37 ℃에서 12 시간 동안 배양한 후, 콜로니의 수 형성값을 분석하여 대장균에 대한 콜로니의 형성 정도를 분석하였다.

도 21을 참조하면, 본 발명에 따른 의료용 조성물(PHA3, PHA4)은 PHA 농도가 증가됨에 따라 콜로니의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 의료용 조성물(균 감염 억제용 조성물)이 균 감염 억제 효능이 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

Claims (16)

1. 입경이 10,000 nm 이하이고, 총 중량을 기준으로 3-하이드록시부티레이트(3HB)로부터 유래된 반복단위를 40 중량% 이상으로 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는, 의료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   100% 상대습도 및 상온에서 측정한 조직 접착 강도가 15 kPa 이상인, 의료용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위를 더 포함하는, 의료용 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 총 중량을 기준으로, 상기 4-하이드록시부티레이트(4HB)로부터 유래된 반복단위의 함량이 0.1 내지 60 중량%인, 의료용 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 공중합체인, 의료용 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)는 분자량이 10,000 내지 1,200,000 g/mol인, 의료용 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 농도가 0.1 내지 75 %(w/v)인, 의료용 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   지혈용으로 사용되는, 의료용 조성물.
9. 제 1 항에 있어서,
   상처 치유용으로 사용되는, 의료용 조성물.
10. 제 1 항에 있어서,
    조직 접착용으로 사용되는, 의료용 조성물.
11. 제 1 항에 있어서,
    균 감염 억제용으로 사용되는, 의료용 조성물.
12. 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜 분산상 용액을 준비하는 단계;
    계면활성제를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계;
    상기 분산상 용액을 10,000 nm 이하의 기공 크기를 갖는 멤브레인에 통과시켜 상기 연속상 용액에 분산상 입자가 분산된 에멀전을 형성하는 단계; 및
    상기 에멀전을 고형화하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 의료용 조성물의 제조방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 분산상 용액에 포함된 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 함량이 상기 분산상 용액 총 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%인, 의료용 조성물의 제조방법.
14. 제 12 항에 있어서,
    상기 분산상 용액은 2.5 내지 320 kPa의 압력으로 상기 멤브레인을 통과하는, 의료용 조성물의 제조방법.
15. 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 용매에 용해시켜 분산상 용액을 준비하는 단계;
    계면활성제를 포함하는 연속상 용액을 준비하는 단계;
    상기 분산상 용액과 상기 연속상 용액을 혼합하여 프리믹스 에멀전을 형성하는 단계;
    상기 프리믹스 에멀전을 고압분산장치(microfluidizer)에 투입하여 입경이 10,000 nm 이하인 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자가 분산된 에멀전을 형성하는 단계; 및
    상기 에멀전을 고형화하여 상기 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 입자를 수득하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 의료용 조성물의 제조방법.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 고압분산장치에 의해 상기 프리믹스 에멀전에 가해지는 압력이 1 내지 30 kpsi인, 의료용 조성물의 제조방법.