KR19990082128A - 식물내의 트랜스유전자의 발현을 위한 라즈베리 프로모터 - Google Patents
식물내의 트랜스유전자의 발현을 위한 라즈베리 프로모터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 라즈베리 게놈으로부터 유래된 두가지의 상이한 프로모터 영역의 동정과 분리에 관한 것이다. 그 프로모터 영역은 천연 라즈베리 게놈에서, 라즈베리 dru1 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연쇄된다. 본 발명의 프로모터는 그 지배하에 있는 이종 식물 유전자의 보통 수준, 구성적 발현을 조절할 수 있다. 본 발명은 더 나아가 키메라 유전자, 카세트 벡터, 트랜스유전자 식물, 및 그러한 프로모터들을 채용하는 방법에 관한 것이다.
Description
식물내에서 유전자 발현을 조절하는 프로모터는 식물 유전자 공학의 본질적인 요소이다. 식물 내의 선택된 유전자 발현에 유용한 프로모터의 몇가지 예들이 근래 입수가능하다(Zhu, 외, 1995; Ni, 외, 1995).
세포 내에서 발현되기 위하여, 유전자는 세포내의 특정 효소에 의해 인식되는 프로모터에 작동가능(operably)하게 연쇄되어야한다. 프로모터 또는 전사 조절 영역으로 불리어지는 유전자의 5' 비코딩 영역(즉, 코딩 영역에 5' 인접 영역)이 유전자의 전사를 개시하여 mRNA 전사물을 생성한다. mRNA는 그리고 나서 세포내 리보솜에서 번역되어 코드화된 폴리펩티드를 생산한다.
프로모터는 전형적으로 약 500-1500 염기를 함유하고 그 지배 하에서 조절된 유전자 발현을 제공할 수 있다. 식물 세포 내에서 이종 유전자를 발현하는 데에 이용되는 프로모터는 (i)구성적 프로모터, 즉, 모든 또는 다수의 식물 조직에서 유사한 수준의 유전자 발현을 일으킬 수 있는 프로모터 또는 (ii)조직 선택적 프로모터, 즉, 식물 형질전환체 내의 조직(예를 들어, 잎이나 열매)을 선택하여 유전자 발현을 조절할 수 있는 프로모터 인 것을 특징으로 한다.
식물 비루스, 아그로박테리움 유전자, 및 다양한 식물 유전자로부터 유래된 것들을 포함하여 다수의 이러한 프로모터들이 특성화(characterization) 되어 왔다. 식물계 내에서 다양한 이종 유전자 발현을 조정하는 구성적 프로모터의 특성화와 분리에 상당한 노력이 투자되어 왔다.
식물내에서 선택된 유전자를 발현하게 하기 위한 비루스성 프로모터(즉, 비루스 유전자로부터의 프로모터)는 비루스(이중-스트랜드 DNA 비루스 그룹)의 칼리모비루스과로 동정되었고, 칼리플라워 모자이크 비루스(CaMV) 35S(Balazs, 외, 1982; Guilley, 외., 1982; Odell, 외, 1985; Odell 외, 1987; Odell, 외, 1988; Tommerup, 외, 1990; Jefferson, 외, 1987a; Jefferson, 1987b)와 CaMV 19S 프로모터(Fraley, 외, 1994), 및 휘그워트 모자이크 비루스(FMV)(Rogers, 1995) 프로모터를 포함한다. 아그로박테리움(Agrobacterium)-유래 프로모터와 같이 세균 소스로부터 얻어지고 식물 내의 유전자 발현을 조절하는데 유용한 프로모터들이 동정되었고 분리되었다. 이러한 프로모터들은 아그로박테리움 T-DNA 오핀(opine) 합성 유전자로부터 유래된 것들을 포함하고, 노팔린 신타아제(nos) 프로모터(Rogers, 1991), 옥토핀 신타아제(ocs) 프로모터(Leisner and Gelvin, 1988) 및 만노핀 신타아제(mas) 프로모터를 포함한다.
구성적 발현을 제공하는데에 효과적인 식물 프로모터(식물 소스로부터 유래된 프로모터)들은 덜 주지되어 있고, hsp80, 칼리플라워로부터의 열 충격 단백질 80(Brunke and Wilson, 1993) 및 토마토 유비퀴톤 프로모터(Picton, 외, 1993)를 포함한다. 이들 프로모터들은 형질전환된 식물 조직에서 이종 핵산 서열의 구성적 발현을 지시하는 데에 이용될 수 있다. 현재, 비교적 소수의 식물 프로모터들, 특히 구성적 식물 프로모터들이 동정되고 있다. 식물 유전자 공학에서 그러한 프로모터들의 이용은 지금까지 다소 제한되어 왔는데, 이는 식물 내의 유전자 발현이 대부분에 있어서, 전형적으로 조직, 발생적으로 또는 환경적으로 조절되기 때문이다.
본 발명은 이종(heterologous)의 식물 유전자의 구성적 발현을 제공할 수 있는, 라즈베리로부터의 프로모터의 동정(identification) 및 키메라 유전자(chemeric gene), 카세트 벡터, 키트, 트랜스유전자(transgenic) 식물, 및 이러한 프로모터를 사용하는 방법에 관한 것이다.
참고문헌
도 1은 여기서 dru259pro로 지칭되는 예의 라즈베리 dru1 프로모터 및 nptⅡ 유전자를 함유하는 플라스미드 pAG-431의 생성을 예시하는 도식적인 개략도이고,
도 2는 키메라 dru110pro-nptⅡ 유전자를 함유하는 벡터 pAG-421의 형성에서 이어지는 단계들을 나타내는 플로우 챠트이고,
도 3은 플라스미드 pAG-1542 및 pAG-421로부터, nptⅡ 유전자에 융합된 dru110pro를 함유하는 아그로박테리움 이원 벡터 pAG-7242를 형성할 때 수반되는 단계들의 개략도이고,
도 4는 키메라 dru259pro-nptⅡ 유전자를 함유하는 아그로박테리움 이원 벡터 pAG-7342의 생성을 도시한 플로우 챠트이고,
도 5는 세 가지의 다른 프로모터-nptⅡ 키메라 유전자 조합에 대하여, 10개의 트랜스유전자 샘플에 걸쳐서 nptⅡ 유전자 발현의 상대적 수준을 나타낸 그래프이고,
도 6a 및 6b는 dru1 유전자의 게놈 DNA 서열을 제공하고, CAAT 박스, TATA 박스, ATG 개시 코돈, 두 개의 엑손, 인트론, 이어맞춤 부위, 정지 코돈 및 폴리-아데닐화 부위를 나타내고,
도 7a 및 7b는 완전한 길이 dru1 프로모터의 DNA 서열을 제공하고,
도 8은 dru110 프로모터의 DNA 서열을 제공하고,
도 9는 dru259 프로모터의 DNA 서열을 제공하고,
도 10은 라즈베리 소핵과 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석의 대표적인 결과를 제공하고,
도 11a 및 11b는 라즈베리 dru1 유전자의 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR; Kawasaki, 외, 1989; Wang, 외, 1990) 클로닝을 대략적으로 나타낸 것이고,
도 12는 dru1의 단백질 구조 및 유전자 조직의 개략적인 묘사를 나타낸 것이고,
도 13은 dru1 코딩 서열의 Kyte-Doolittle 친수도 플롯을 나타낸 것이고, 여기서 친수도 윈도우 크기는 7이고,
도 14는 라즈베리 잎 및 꽃턱에서의 dru1 RNA 발현의 RNA 도트 블롯 분석의 결과를 도시한 것으로서, RNA를 그린, 머츄어 그린, 브레이커 및 오랜지/숙성 라즈베리(각각 단계 I, II, III, IV에 해당)로부터 분리했고,
도 15는 라즈베리 잎과 열매에서의 dru1 RNA 발현을 평가하는 RNA 하이브리드화 연구의 결과를 도시한 것이고,
도 16은 다양한 숙성 단계에서 소핵과로부터 획득한 라즈베리 소핵과 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석의 결과를 도시한 것이고,
도 17a 및 도 17b는 플라스미드 pAG-1542의 형성을 요약한 플로우챠트를 도시한 것이다.
본 발명은 그 지배 하에 놓인 핵산 서열의 보통(moderate) 수준, 구성적 발현을 개별적으로 및 공동으로 제공하는 라즈베리 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 프로모터는 또한 이종의 비구성적 프로모터에 구성적 발현을 부여할 수 있다.
본 발명은 천연의 라즈베리 게놈에서, dru1 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연쇄되어 있는 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 키메라 유전자는 라즈베리 dru1 프로모터의 전사 조절 하에서 목적 생성물을 코드화하는 DNA 서열을 함유한다. 그 DNA 서열은 전형적으로 프로모터에 이종이며 생성물의 구성적 발현을 가능하게 하는 프로모터에 작동가능하게 연쇄되어 있다.
한 구체예에서 생성물은, 형질전환되지 않은 세포에 대해서는 유독하게 될 소량의 항생제에 대해 세포가 내성을 갖도록 함으로써, 키메라 유전자를 함유하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 가능하게 하는 폴리펩티드이다. 예의 생성물은 네오마이신 인산전이효소 및 히그로마이신 인산전이효소와 같은 아미노글리코시드 인산전이효소를 포함하는데 그것에 한정되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 본 발명의 키메라 유전자는 dru1 프로모터의 전사 조절 하에서 히그로마이신 인산전이효소 Ⅱ를 코드화하는 hpt 유전자 서열을 함유한다. 다른 실시예에서는, 본 발명의 키메라 유전자가 dru1 프로모터의 전사 조절 하에서 네오마이신 인산전이효소를 코드화하는 nptⅡ 유전자 서열을 함유한다.
또 다른 구체예에서 생성물은, 그 폴리펩티드를 발현하는 형질전환된 식물 세포에 제초제-내성을 부여하는 폴리펩티드이다. 또 한 구체예에서는, 본 발명의 키메라 유전자가 dru1 프로모터의 전사 조절 하에서 브롬옥시닐-특이성 니트릴라아제를 코드화하는 bxn 유전자를 함유한다. 이러한 키메라 유전자를 함유하는 형질전환된 식물은 브롬옥시닐-특이성 니트릴라아제를 발현하고, 브롬옥시닐-함유 제초제의 사용에 내성을 갖는다. 제초제 내성을 부여하는 유전자를 코드화하는 다른 예의 DNA 서열은 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 EPSP 신타아제 유전자(5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 효소를 코드화), 제초제 "GLEAN"에 대한 내성을 부여하는 아세토락테이트 신타아제 유전자, 포스피노트리신 아세틸전이효소(PAT)에 대해 코딩한 비알라포스 내성 유전자(bar 유전자) 및 글리포세이트-내성 유전자, CP4 및 GOX를 포함한다. 본 발명의 키메라 유전자는 dru1 프로모터에 작동적으로 연쇄된 이러한 제초제-내성 유전자를 하나 이상 함유한다.
또 다른 구체예에서, DNA 서열 또는 cDNA 서열은 알팔파(alfalfa) 모자이크 비루스 막 단백질, 오이 모자이크 비루스 막 단백질, 담배 줄무늬 비루스 막 단백질, 감자 비루스 막 단백질, 담배 래틀(rattle) 비루스 막 단백질, 및 담배 모자이크 비루스 막 단백질과 같은 비루스 막 단백질을 코드화한다. 한 구체예에 따르면, 본 발명의 키메라 유전자는 dru1 프로모터의 전사 조절 하에서 ALMV, CMV, TSV, PVX, TRV, 또는 TMV와 같은 비루스 막 단백질 유전자를 함유한다. 택일적으로, DNA 서열은 에틸렌 둔감성을 부여하는 ETR1 유전자의 돌연변이 형태와 같이 우성 불완전 단백질을 코드화하는 유전자에 해당한다. 또 다른 실시예에서, DNA 서열은 ACCD 유전자와 같이 식물 생화학적 경로를 변경할 수 있는 유전자에 해당한다. ACCD 유전자는 에틸렌 생합성 경로에서 선구물질(precursor)를 분해하는 생성물을 형성한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 라즈베리 dru1 유전자로부터의 구성적 프로모터를 포함하는 분리된 DNA 분자를 포한한다. 한 예의 라즈베리 dru1 프로모터는 dru110 프로모터인데 여기에서는 서열번호:3으로 표시된다. 또 다른 예의 구성적 라즈베리 프로모터는 dru259 프로모터인데 여기에서는 서열번호:4로 표시된다. 추가적인 단편(fragment)들이 완전한-길이(full-length)의 dru1 프로모터, 서열번호:2를 나타내는 서열로부터 유래될 수 있는데, 이 때 보다 작은 단편들이 그 지배 하에서 DNA 서열의 구성적 발현을 조절하는 데에 효과적이다.
본 발명은 또한 식물 형질전환 벡터를 발생시키는 상기 키메라 유전자, DNA 구성체, 및 분리된 DNA 서열 중 일부의 사용을 포함한다. 이러한 벡터들은 아그로박테리움-기초(Agrobacterium-based) 방법, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션(microinjection), 및 미세탄환충격(microprojectile bombardment)을 포함한 어떠한 식물 세포 형질전환 방법에도 이용될 수 있다. 이들 벡터들은 또한 식물 형질전환 키트의 일부분을 형성할 수도 있다. 키트의 다른 구성성분들은 식물 세포 형질전환에 유용한 시약을 포함하는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 라즈베리 프로모터, 키메라 유전자 또는 DNA 구성체 중 어떤 것을 함유하는 식물 세포, 식물 조직, 트랜스유전자 식물, 열매 세포, 전체 열매, 씨앗 또는 칼리(calli)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 여기에서 기술된 dru 프로모터를 트랜스유전자 식물 내에서, 선택가능한 마커(marker) 유전자와 같은 이종 유전자의 보통의 발현을 제공하기 위한 방법에 사용한다. 이 방법에서, 선택가능한 마커 생성물(예를 들어, 네오마이신 인산전이효소 또는 히그로마이신 인산전이효소)을 코드화하는 DNA 서열을 함유하는 본 발명의 키메라 유전자를 식물의 어버이 세포에 도입한다. 형질전환되지 않은 세포에 대해 독성을 갖는 소량의 선택제(예를 들어, 히그로마이신, 제네티신, 카나마이신)의 존재 하에서 성장할 수 있는 능력에 의해, 키메라 유전자를 함유하는 트랜스유전자 식물을 선택한다. 이렇게 선택된 형질전환된 식물 세포는 그 후 재생되어 변이된 식물을 제공하고, 이어서 그 생성물을 발현하는 형질전환된 식물이 선택된다.
본 발명은 트랜스유전자 열매-형성 식물을 생성하기 위한 방법을 더 포함한다. 이 방법에서는 전형적으로, 본 발명의 키메라 유전자를, 식물 세포 내에서의 선택을 가능하게 하는 발현 벡터로써 운반하여, 선택된 식물의 어버이 세포에 도입한다. 이들 어버이 세포는 그 후 성장하여 트랜스유전자 식물을 생성한다.
이 방법은,
(i) 라즈베리 dru1 유전자 DNA의 영역에 동종(homologous)인 서열을 함유하는 탐침(probe) DNA 분자를 선택하는 단계,
(ii) 탐침 분자와 탐침 분자에 동종인 타겟 분자 사이의 특이적 하이브리드화(specific hybridization)를 유리하게 하는 조건 하에서, 그 탐침을 라즈베리 게놈으로부터 유래된 복수의 타겟 DNA 분자와 접촉시키는 단계,
(iii) 라즈베리 dru1 유전자에 동종인 DNA 서열을 갖는 타겟 분자를 동정하는 단계,
(iv) 타겟 분자와 결합된 프로모터 서열을 분리하는 단계, 및
(v) 그 지배 하에서 다운스트림(dowmstream) 유전자의 구성적 발현을 조절하는 능력에 관한 하나이상의 분리된 서열 혹은 그 부분을 평가하는 단계.
키메라 유전자, 벡터, 구성체, 분리된 DNA 분자, 본 발명의 생성물 및 방법은 상기한 바와 같이 라즈베리 dru1 프로모터 서열을 필수적으로 사용하여 생산할 수 있다.
I. 용어의 정의
여기에서 사용되는 용어는 다음 제시한 바와 같은 의미를 갖는다.
여기에서 "키메라 유전자"는 상이한 유전자 부분들로 이루어진, 비천연적으로 생긴 유전자를 말한다. 키메라 유전자는 전형적으로 "이종" DNA 서열에 작동가능하게 연쇄된 프로모터 서열로 이루어진다. 식물의 형질전환에 있어서 본 발명의 전형적인 키메라 유전자는 라즈베리 dru 프로모터(예를 들어, dru110 또는 dru259 프로모터), 이종 구조 DNA 코딩 서열(예를 들어, 아미노글리코시드 인산전이효소(nptⅡ) 유전자) 및 3' 비번역 폴리아데닐화 부위를 포함할 것이다.
"구성적" 프로모터는 식물 형질전환체의 여러 또는 모든 조직에서 RNA 생산을 지시하는 프로모터를 말하는데, 이는 특별한 유형의 세포 및 조직 내에서 보다 높은 수준의 RNA 합성을 지시하는 조직-특이성 프로모터(예를 들어, 토마토 E4 또는 E8 프로모터와 같은 열매 특이성 프로모터(Cordes, 외, 1989; Bestwick, 외, 1995))와 반대이다.
"프로모터"는 다운스트림 이종 유전자의 전사를 지시하고, 작동 영역과의 연결(ligation), 무작위의 또는 조절된 돌연변이, 인헨서(enhancer) 서열의 첨가 또는 복제, 합성 링커(linker)에의 부가 및 변형 등의 방법에 의해 유래되는 프로모터들을 포함하는 DNA의 서열을 의미한다.
"식물 프로모터"는 천연의 형태로 그 식물 게놈 DNA로부터 유래된 프로모터(상기에 정의된 바와 같이)를 의미한다.
"라즈베리 프로모터"는 천연의 형태로 라즈베리 게놈으로부터 유래된 프로모터를 말한다. 예를 들어, dru110 또는 dru259와 같은 dru1 프로모터는 천연 라즈베리 게놈 내에서 dru1 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 비코딩 조절 영역이다.
상술한 유전자로부터 유래된 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110 또는 dru259와 같이 dru1 유전자로부터 유래된 라즈베리 프로모터)는 적어도 하나 이상의 프로모터 영역이 상술한 라즈베리 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 이러한 유형의 예의 프로모터는, 숙주 세포내에서 결과적인 키메라 유전자의 발현을 거의 감소시킴 없이 또는 변경되지 않은 dru259 프로모터의 기능을 변경함 없이, 프로모터(예를 들어, dru259 프로모터)의 영역을 다른 유전자로부터 유래된 하나 이상의 서열로 대체한 것이다.
"프로모터 강도"는 적당한 표준(칼리모비루스 카사바 모틀 베인 비루스 프로모터 CAS 또는 hsp80 프로모터)과 비교한, 식물 조직 또는 조직들 내의 이종 유전자의 프로모터-조절된(예를 들어, dru110, dru259) 발현의 수준을 말한다. 발현 수준은 프로모터를 GUS(β-글루쿠로니다아제), 디히드로폴레이트 환원효소, 또는 nptⅡ(네오마이신 인산전이효소)와 같은 적절한 보고 유전자(reporter gene)에 연쇄함으로써 측정할 수 있다. 보고 유전자의 발현은 형광계, 분광광도계, 또는 조직화학적 분석법에 의해 쉽게 측정될 수 있다(Jefferson, 외, 1987a; Jefferson, 1987b).
본 발명의 목적에 있어서, 보통 수준의 프로모터는 hsp80과 같은 프로모터로써 얻어지는 수준의 약 10-90% 수준에서 보고 유전자의 발현을 조정하는 것이다.
"이종" DNA 코딩 서열은 형질전환된 식물 본래의 것이 아닌 구조적(structural) 코딩 서열이거나 또는 그것의 단백질 생성물의 특징 개선을 위하여 조작된 코딩 서열이다.
프로모터에 있어서 이종이라 함은 코딩 서열이 붙어있는 프로모터와 같은 유전자 내에 본래 존재하지 않는 코딩 서열을 말한다.
dru1 유전자와 서열 동일성(identity)을 공유하는 것으로 간주되는 유전자 또는 그 특정 영역은, 여기에 개시된 라즈베리 dru1 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호s:1-4)에 해당하는 폴리뉴클레오티드 서열의 한 구간에 걸쳐서 적어도 약 60%, 바람직하게는 80% 포괄적인 서열 동일성을 갖는다.
"서열 동일성"은 본질적으로 다음과 같이 정해진다. 같은 길이의 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열(바람직하게는, 유전자의 코딩 서열에 해당)은, 만약 그들이 ALIGN 프로그램을 사용하여 정렬될 때 가장 높은 스코어링 정렬의 핵산의 60%, 또는 바람직하게는 80%에 걸쳐서 1의 ktup, 디폴트 파라미터 및 디폴트 PAM 매트릭스(Dayhoff, 1972)를 사용하여 동일하게 정렬된다면 서로 동일(즉, 동종)하다고 여겨진다.
ALIGN 프로그램은 서열 비교 프로그램(Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; William R. Pearson, Department of biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA로부터 입수가능한 프로그램)의 FASTA 버전 1.7에서 찾는다.
두 개의 핵산 단편들은 만약 그들이 코딩 서열 또는 그 변이체에 특이적으로 하이브리드화할 수 있거나 또는 중합효소 연쇄 증폭 반응(polymerase chain amplification reaction):즉, (i)예를 들어 Maniatis, 외, 1982, p 320-328, 및 382-389에 기술된 바와 같이 전형적인 하이브리드화 및 세척 조건하에서;(ii)최대한 약 25-30% 염기쌍 미스매치(mismatch)를 허용하는 덜 엄격한 세척 조건, 예를 들어, 2×SSC(pH 7.0에서 3.0M NaCl 및 0.3M 구연산나트륨을 함유), 0.1% 황산 도데실 나트륨(SDS) 용액, 실온에서, 2회, 각 30분간;그리고 나서 2×SSC, 0.1% SDS, 37℃, 1회, 30분간;그리고 나서 2×SSC, 실온에서 2회, 각 10분간의 조건을 사용하여, 또는 (iii)표준 조건 하에서 전형적인 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 사용하기 위한 시발물질(primer)을 선택하여(예를 들어, Saiki, 외, 1988) 원하는 타겟 서열 또는 그 변이체의 특이적 증폭을 일으키는 반응;을 특정하게 시발(priming)할 수 있다면, 그 두 개의 핵산 단편들은 dru1 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드에 "선택적으로 하이브리드화가능"이라고 여겨진다.
바람직하게는, 고도로 동종인 핵산 가닥들은 20-40% 이하의 염기쌍 미스매치를 가지며, 더욱 바람직하게는 5-20% 이하의 염기쌍 미스매치를 갖는다. 이러한 동종성의 정도(즉, 서열 동일성)는, 당해 기술분야에서 주지된 바와 같이, 유전자 라이브러리(또는 다른 소스의 유전 물질)로부터 클론들의 동정을 위한 적당한 엄격함의 세척 조건을 사용함으로써 선택될 수 있다.
"dru1 코드화된 폴리펩티드"는 여기에서 dru1 코드화된 폴리펩티드와 동종인(즉, 실질적으로 같은 서열 동일성을 갖는) 어떤 폴리펩티드로 정의된다. 한 구체예에서, 만약 폴리펩티드가 dru1 서열이나 그 변이체에 선택적으로 하이브리드화하는 핵산에 의해 코드화된다면, 그 폴리펩티드는 dru1 코드화된 폴리펩티드와 동종이다.
또 다른 구체예에서, 만약 폴리펩티드가 상기와 같이 dru1이나 그 변이체에 의해 코드화된다면 그 폴리펩티드는 dru1 코드화된 폴리펩티드에 동종이다. 이 그룹의 폴리펩티드는 전형적으로 15, 바람직하게는 25, 더욱 바람직하게는 35보다 큰 연속된 아미노산이다. 더 나아가, 약 60 아미노산보다 긴 폴리펩티드에 관하여, "폴리펩티드 동종성" 또는 "폴리펩티드 서열 동일성"을 결정하기 위한 목적의 서열 비교는 부분적인 정렬 프로그램 LALIGN을 사용하여 수행한다. 폴리펩티드 서열은 상기 정한 바와 같이, 1의 ktup, 디폴트 파라미터 및 디폴트 PAM으로써 LALIGN 프로그램을 사용하여, dru1 아미노산 서열 또는 그 어떤 변이체와 대비하여 비교한다.
60 아미노산보다 길고, 동일하게 정렬된 아미노산이 55% 또는 바람직하게는 80%이상인 최적의 정렬을 갖는 어떠한 폴리펩티드는 "동종 폴리펩티드"로 간주된다. LALIGN 프로그램은 서열 비교 프로그램(Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; William R. Pearson, Department of biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA로부터 입수가능한 프로그램)의 FASTA 버전 1.7에서 찾는다.
폴리뉴클레오티드는 만약 dru1 단백질 코딩 서열, dru1의 cDNA, 또는 그 보체(complement)의 영역과 같은 또는 실질적으로 같은 염기쌍 서열을 갖는다면, 또는 만약 그것이 상기 정한 바와 같이 동종성을 보인다면, dru1에서 "유래"하는 것이다.
폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "단편"은 만약 그것이 (i)dru1 유전자에 의해 코드화되거나, 또는 (ii)상기 기술한 바와 같이 dru1 코드화된 폴리펩티드에 동종성을 보인다면, dru1에서 "유래"하는 것이다.
본 발명의 문맥에서, 어구 "핵산 서열"는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 코드화하는 서열을 지칭할 때, 개시된 서열 뿐만 아니라 동종의 단백질, 폴리펩티드, 혹은 펩티드 서열을 코드화하는 축퇴성(degenerative) 핵산 서열을 포함하는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 "식물 세포"라 함은 식물 종자, 꽃가루, 프로개귤(progagules), 배 뿐만 아니라 미분화된 조직(예를 들어, 캘러스)을 포함한 식물로부터 유래된 어떤 세포를 말한다.
II. 라즈베리 dru1 프로모터의 동정 및 분리
본 발명의 한 태양은, 천연 라즈베리 게놈에서 (i) dru1 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연괘되고, (ii)보통 강도, 구성적 프로모터로서의 기능을 하는 프로모터에 대한 것이다. 본 발명의 이러한 면은 숙성중인 열매에서 매우 높은 수준으로 발현되는 라즈베리 내의 dru1 유전자의 발견에 기초한다. 완전한 길이 dru1 프로모터에 의해 지시되는 발현은 열매 특이적이고, 열매 숙성 동안 활성적이다.
dru1 프로모터의 기능적 활성과는 대조적으로, 완전한 길이 라즈베리 dru1 프로모터로부터 유래되는 두 가지의 새로운 프로모터가 (i)구성적 프로모터(즉, 열매-특이성이 아닌)로서 기능을 하고 (ii)하기에서 더 상세히 기술되듯이, 그 조절하에서 보통 수준으로 유전자의 발현을 조정한다는 것이 예상치 못하게 발견되었다.
본 발명의 두가지 예의 dru1 프로모터, dru110 및 dru259의 분리 및 라즈베리로부터의 dru1 유전자의 동정이 이제 기술될 것이다.
A. dru1 단백질 동정, 정제, 및 서열 결정
라즈베리에 의해 생산되는 것과 같은 숙성중인 과일에 의해 생성되는 단백질은 전형적으로 겔 전기영동에 의해 분석된다. 가용성 소핵과(drupelet) 단백질의 쿠마시에 블루(coomassie blue)-염색된 SDS 폴리아크릴아미드 겔은 도 10에 도시되어 있다. 도 10으로부터 알 수 있듯이, 라즈베리로부터 분리될 수 있는 두 가지의 고도로 풍부한 단백질이 대략 17과 15kd에서 관찰되었고, 여기서는 각각 drupe1 및 drupe2라고 지칭한다. 가용 단백질의 전체 양에 상대적인 drupe1 및 drupe2의 양은 예를 들어 농도계를 스캐닝함으로써 정해질 수 있다. 도 10에 예시된 겔의 농도계 분석 스캐닝은, drupe1 및 drupe2가 각각 라즈베리 소핵과 내의 총 가용 단백질의 대략 23 및 37%를 포함한다는 것을 제시한다. 이러한 측정(즉, 높은 수준의 drupe1 및 drupe2)의 결과로, drupe1 및 drupe2의 정제 및 시퀀싱이 예를 들어, 직접적인 웨스턴 블롯 접근을 이용하여 수행될 수 있다.
웨스턴 블롯 분석의 실행에서, 전체 소핵과 단백질은 PDVF 막에 웨스턴 블롯하고(실시예 1B), drupe1 및 drupe2에 해당하는 영역은 N-말단 아미노산 서열 분석을 행한다. drupe1 샘플은 30 아미노산 N-말단 서열을 산출한다(실시예 1B). 아미노 말단 drupe1 서열은 여기에서 서열번호:11로 주어진다.
B. 서열을 코드화하는 dru1 클로닝
1) dru1 cDNA 클론의 RT-PCR 및 클로닝
dru1을 클로닝하는 전체 과정, cDNA 합성에서 유전자의 게놈 복사(genomic copy)의 역 PCR까지가 도 11a 및 도 11b에 개략적으로 도시되어 있다.
클로닝 과정 수행에서는, 머츄어 그린(mature green)의 라즈베리 소핵과 mRNA를 실시예 2A 및 2B에 기술된 바와 같이 준비하여 cDNA 합성 반응에서 주형으로 사용한다. 반응은 도 11a 및 도 11b에 도시된 dTRAMDOM 시발물질(서열번호:12)을 사용하여 시발한다. 생성된 cDNA(실시예 2C)는 drupe1 아미노 말단 서열(실시예 3)에 기초한 512-폴드(fold) 축퇴 시발물질(Drupe20) 및 dTRANDOM 시발물질 부분에 해당하는 시발물질을 사용하여 표준 PCR 반응을 행한다.
그리고 나서 PCR 증폭 생성물을 분석한다. 상기 PCR반응으로부터의 생성물은, 정제하고 벡터 pCRⅡ(실시예 3)로 서브클론(subclone)된 아가로스 겔인 710bp 생성물을 포함한다. 순차적인 이러한 몇몇 클론들의 서열 분석은, drupe1의 아미노 말단 서열을 매칭(matching)하는 단백질을 코드화하는 서열을 갖는 클론들의 동정을 가능하게 한다.
2) dru1 유전자의 게놈 복사의 역 PCR 클로닝
dru1 유전자를 클로닝하는 이러한 접근에서, 게놈 라즈베리 DNA를, 상기한 바(실시예 4)와 같이 얻어지는 cDNA 서열에 내재하는 시발물질을 사용하는 PCR 반응에 사용한다. 이러한 반응은 단백질 코딩 영역의 대부분을 함유하는 dru1 유전자의 게놈 클론을 생성한다. 단일 인트론은 이러한 클론(도 6b)의 순차적인 서열 분석으로부터 동정된다. 역 PCR 전략은 dru1 프로모터(실시예 5)를 함유하는 유전자의 5' 영역을 시퀀싱하고 특성화하는데에 채용될 수 있다. 도 11a 및 도 11b는 이러한 것이 어떻게 수행될 수 있는지를 개략적으로 도시한다.
역 PCR 기술을 이용하여 dru1 게놈 DNA의 5' 측면 영역을 특성화할 때, 라즈베리 게놈 DNA를 NsiI로 증해(digest)하고, 제한(restriction) 단편들의 원형화를 가능하게 하는 묽은 조건하에서 연결(ligate)한다. 연결된 DNA는 그 후 dru1 코딩 서열에 내재하는 시발물질을 이용한 PCR 증폭을 행하고 서로 반대 방향으로 향하게 한다. 이렇게 하여 제1 엑손 부분과 1.35kb의 프로모터를 함유하는 PCR 반응 생성물을 생산한다. 이러한 클론의 순차적인 서열 분석은 앞서 기술한 클론으로부터의 서열 정보와 조합하여 완전한 dru1 서열을 생산한다.
3) 서열 결정 및 유전자 발현 패턴의 평가
dru1 유전자(도 6a, 도 6b)는 서열번호:20으로 주어지는 예견된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드화한다. 이 단백질에 대한 예견된 분자량은 17,088인데, 이는 총 소핵과 단백질의 겔 전기영동(도 10을 보라)에 의해 정해지는 17kd 분자량과 거의 일치한다. dru1 단백질은 예견된 pI 4.8을 가지며 비교적 산성이다. 중요한 매치를 찾기 위하여 현재의 서열 데이터베이스의 핵산 및 단백질 동종성 서치를 수행할 수 있다. dru1에 대하여는, 현재 서열 데이터베이스의 핵산 및 단백질 동종성 서치가 어떠한 중요한 매치도 만들어내지 못했다. 이러한 결과는 drupe1이 새로운 단백질이라는, 단백질의 아미노 말단 서열로써 관찰된 본래의 관찰을 지지한다.
dru1의 유전자 발현 패턴은 또한 RNA 및 단백질 수준에서 평가되어서, 완전한 길이 프로모터의 조직 특이성을 확인할 수 있다. 상이한 숙성 단계에서 라즈베리 잎과 꽃턱으로부터의 전체 RNA의 노던 도트 블롯(Northern dot blots), 즉, 도 14 및 도 15는 조직 및 단계 특이적 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 이것은 다른 다양한 식물 조직들로부터의 전체 RNA의 노던 블롯의 비교에 의해 확인될 수 있다. dru1의 조직 및 단계 특이적 유전자 발현 패턴은 잎, 꽃턱, 및 소핵과로부터의 전체 RNA의 노던 블롯에서 동정된다(도 14 및 도 15를 보라). 양쪽의 경우에서, 잎 RNA에서는 dru1 발현이 전혀 관찰되지 않는다. 꽃턱에서의 RNA 발현 패턴은 소핵과 내에서 그것이 분석되는 두 단계(즉, 그린(green) 및 숙성) 에서 완전하게 발현되는 동안 일시적으로 조절된다.
상이한 숙성 단계들로부터의 소핵과 용균체(lysates)의 단백질 겔은 또한 dru1의 단계 특이적 발현을 더욱 뒷받침하기 위해 수행될 수 있다. 도 16에서 예시한 바와 같이, 숙성의 다양한 단계(즉, 그린, 머츄어 그린, 브레이커(breaker), 오랜지(orange) 및 숙성)에서 소핵과로부터 얻는 라즈베리 소핵과 단백질의 전기영동 분석은 소핵과 내의 단계 특이적 발현 패턴을 더욱 뒷받침한다(도 16).
C. 완전한 길이 dru1 프로모터의 분리
dru1 게놈 클론의 특성화는 dru1 프로모터의 분리를 가능하게 한다. 예의 완전한 길이 dru1 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호:2로 주어진다.
III. 프로모터 dru110 및 dru259의 분리
본 발명의 두 가지의 대표적인 라즈베리 프로모터, dru110과 dru259를, 단계 및 열매-특이적 프로모터로서 특성화되어 온 dru1 프로모터의 완전한 길이 전사물로부터 분리했다. 놀랍게도, 이들 두 가지의 새로운 dru1-유래 프로모터는, 이종 유전자에 융합되고 형질전환된 식물 내 발현의 결과적 패턴에 대해 평가될 때, 보통 수준의 구성적 프로모터로서의 기능을 하는 것으로 밝혀졌다.
잘려진 dru 프로모터, dru110 및 dru259는 실시예 7 및 8에 기술된 바와 같이 완전한 길이 dru1 프로모터로부터 얻어질 수 있다.
이러한 접근의 이용에서, 제 1 엑손 부분과 1.35kb의 dru1 프로모터를 함유하는 PCR 반응 생성물(상기 단락 Ⅱ.B.2)에 기술된 바와 같이)을 플라스미드 pCRⅡ(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 연결(ligate)하여, 도 1 및 도 2에 도시한 바와 같이 완전한 길이 dru1 프로모터를 함유하는 서브클론, pAG-310을 형성한다. 그리고 나서, pAG-310으로부터의 1.3kb DNA 단편을 표준 조건 하에서 시발물질 DrupeUp(5' 시발물질, 서열번호:7)과 DrupeLow(3' 시발물질, SE ID NO:8)을 사용하여 PCR 증폭한다.
전형적으로 반응 혼합물에 용매를 첨가한 후 원심분리하여 수성 상을 회복하고 아세트산 나트륨으로 침전시킴으로써, 증폭된 DNA의 회복(recovery)을 수행한다. 회복된 DNA는 그리고 나서 일반적으로 원심분리와 반복된 세척, 그 후 회복된 펠릿의 건조에 의해 정제한다.
1.3kb DNA 단편을 제한 효소 NsiI 및 XbaI로 완료될 때까지 증해하고, 이어서 정제하고, XbaI 및 PstI로 증해된 식물 발현 벡터, p35S-GFP(Clontech, Palo Alto, CA)에 연결한다. 연결에 있어서 어느 제한 부위도 재건되지 않도록, 제한 효소, PstI(p35S-GFP 증해에 사용) 및 NsiI(dru1 PCR 생성물 증해에 사용)는 양자 모두 같은 3' 돌출된 부착단(cohesive end)(TGCA)을 발생시킨다. pAG-155로 지정된 생성된 중간 플라스미드는 대략적으로 도 1 및 도 2에서 나타내었다.
라즈베리 dru259 프로모터의 분리는, 플라스미드 pAG-155를 둘 다 블런트 엔드(blunt end) 절단제인 제한효소, SnaBI 및 EcoRV로 증해시킴으로써 수행하여, 여기서 dru259로 지칭되는 259bp dru1 프로모터 단편을 생산한다.
라즈베리 dru110의 분리는, 플라스미드 pAG-155로 운반되는 dru1의 166bp 단편을, 시발물질 dru1-118H3(서열번호:9) 및 GFPStartR(서열번호:10)을 사용하여 표준 PCR 반응 조건 하에서 증폭시킴으로써 수행된다. 증폭된 생성물은 그리고 나서 반응 혼합물로부터 회복하고, 상기한 바와 같이 정제하고, 166bp 생성물을 HindⅢ 및 EcoRV로 증해시켜서, 여기서 dru110으로 지칭되는 112bp 프로모터를 생산한다.
라즈베리 프로모터, dru110 및 dru259는 이종 유전자의 발현을 조절하는데에 사용될 수 있다. 예의 dru 프로모터, dru259는 여기서 서열번호:4로 주어지는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 예의 dru 프로모터, dru110은 서열번호:3으로 주어지는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
각각 dru259 및 dru110에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 예시적인 서브클론, pAG-431 및 pAG-421의 형성은 도 1 및 도 2에 나타나 있다.
IV. 식물 dru1 프로모터의 동정
본 발명은 또한 dru1 프로모터, 예를 들어 dru110 및 dru259를 다양한 식물 소스, 예를 들어 라즈베리로부터 동정하고 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 프로모터들은 선택가능 마커 유전자 또는 제초제 내성을 부여하는 유전자와 같은 이종 유전자를 함유하는 벡터 구성체의 형성에 유용하다.
서던 블롯 실험은 예를 들어 딸기, 복숭아, 자두 내의 라즈베리 dru1 유전자와 상당한 서열 동일성(즉, 표준 서열 비교 프로그램을 사용하여 전형적으로 55%보다 큰, 더 바람직하게는 80%보다 큰 동일성)을 갖는 DNA 분자 존재를 증명하는데에 이용된다. 추가적인 dru1 유전자를 동정하기 위하여 유사한 서던 블롯 분석이 다른 열매-맺음 식물에서 수행될 수 있다.
dru1 동종 유전자는 라즈베리 dru1 유전자의 코딩 서열을 함유하는 표지된 DNA 단편으로 탐침검사하여 식물 게놈 DNA의 서던 블롯(Ausubel, 외, 1992)에서 동정한다.
탐침은 전형적으로 프로모터 서열보다도 dru1 코딩 서열을 함유하도록 선택되는데, 이는 전형적으로 코딩 서열이 프로모터 서열보다 종에서 종으로 더 많이 보존되기 때문이다. 탐침 분자들은 시발물질-특이적 증폭(Mullis, 1987; Mullis, 외, 1987)을 사용하여 라즈베리 게놈 DNA로부터 생성된다. 올리고뉴클레오티드 시발물질들은, 증폭된 영역이 여기서 주어지는 라즈베리 dru1 유전자의 전체 코딩 서열을 포함하도록 선택한다. 시발물질은 또한 단지 라즈베리 dru1 유전자의 선택된 영역을 증폭하기 위해 선택될 수 있다.
택일적으로, 탐침은 목적 서열을 함유하는 제한-증해 단편들을 플라스미드 DNA로부터 분리함으로써 만들 수 있다.
그 탐침은 동종 타겟 분자들의 서열 동정을 가능하게 하는 검출가능한 모이어티(moiety)로 표지할 수 있다. 예의 표지 모이어티는32P-표지된 뉴클레오티드, 디곡시제닌(digoxigenin)-표지된 뉴클레오티드, 비오티닐화된 뉴클레오티드 등과 같이 상업적 소스로부터 입수가능한 방사능 뉴클레오티드를 포함한다.
시발물질-증폭된 탐침의 경우에, 표지된 뉴클레오티드는 증폭 과정 동안 탐침에 직접 합체될 수 있다. 플라스미드 DNA로부터의 제한-증해 단편들과 같이 이미 분리된 DNA로부터 유래된 탐침 분자는 일반적으로 말단-표지한다(Ausubel, 외, 1992).
상기-나열된 식물들의 게놈으로부터의 HindⅢ DNA 단편들과 같은 타겟 분자들은 겔 상에서 전기영동하고, 블롯하고, 나일론 또는 니트로셀룰로스 여과기 위로 고정시킨다. 표지된 탐침 분자들은 그리고나서 탐침 분자와 탐침 분자에 동종인 타겟 분자 사이의 특이적 하이브리드화에 유리한 조건에서 타겟 분자들과 접촉시킨다(Maniatis, 외, 1982; Sambrook, 외, 1989; Ausubel, 외, 1992).
dru1 유전자를 함유하는 식물들의 동정에 이어서, 프로모터 영역을 포함하여 원하는 유전자를 함유하는 DNA를, 예를 들어 라즈베리 dru1 유전자의 분리에 대하여 여기에 기술된 방법에 의해 각 종으로부터 분리될 수 있다. 잘려진 프로모터들의 생성은, 예를 들어 dru110 및 dru259 프로모터들의 분리에 대하여 여기에 기술된 것과 같이 5' 삭제에 의해 수행될 수 있다.
dru1 프로모터의 변이체들은 상기한 방법에 의해 상이한 라즈베리 재배종으로부터 그리고 다른 식물로부터 분리될 수 있다. GUS(β-글루쿠로니다아제)와 같은 보고 유전자가 그러한 프로모터에 의해 조절되는 구성적, 보통 수준 발현에 대해 조직을 테스트하는 데에 사용될 수 있다. GUS 단백질의 발현은 형광계, 분광광도계, 또는 조직화학적 분석법에 의해 쉽게 측정될 수 있다(Jefferson, 외, 1987a; Jefferson, 1987b).
더 나아가, 보고 유전자 서열에 작동가능하게 연쇄된 dru1 프로모터 서열을 함유하는 키메라 유전자를 사용하고, 예를 들어 삭제 분석(Benfey, 외, 1990)을 이용하여 조절 영역에 해당하는 DNA 서열을 동정할 수 있다. 예를 들어, 서열번호:4로 주어지는 dru259 프로모터 서열은, 기능적으로 GUS 보고 유전자에 연쇄될 수 있다. 그리고 나서 표준 방법(Ausubel, 외, 1992; Maniatis, 외, 1982; Sambrook, 외, 1989)에 의해 삭제 분석을 수행할 수 있다. 택일적으로, 완전한 길이 dru1 프로모터 서열의 영역은 도 1 및 도 2에 예시한 바와 같이 PCR에서 서열-특이적 시발물질을 사용하여 증폭될 수 있다. 이들 증폭된 단편들은 그리고 나서 GUS 코딩 서열에 5' 삽입될 수 있고, 결과적인 발현 패턴은 본 발명의 라즈베리 프로모터의 특징인 보통 수준, 구성적 발현으로 평가된다.
V. 식물 형질전환
본 발명을 근거로 하여, 이종 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 라즈베리 식물 프로모터 서열을 함유하는 예의 키메라 유전자가 형성될 수 있다. 예의 키메라 유전자 구성체는 dru110pro:nptⅡ(실시예 10) 및 dru259pro:nptⅡ(실시예 9)를 포함한다. nptⅡ 유전자에 의해 발현되는 단백질인 네오마이신 인산전이효소는 생성물을 발현하는 트랜스유전자 식물에게 카나마이신 내성을 부여하는 아미노글리코시드 인산전이효소이다. 다른 선택가능한 마커 생성물뿐만 아니라 아러한 단백질 및 제초제 내성을 부여하는 생성물은 만약 트랜스유전자 식물 내에서 (i)구성적으로, 그리고 (ii)보통 수준(과도하게 발현되는 것보다)에서 발현된다면 더욱 효율적으로 기능을 한다. 따라서, 예의 프로모터 dru110 및 dru259는 이러한 목적을 만족시키는 이상적인 프로모터를 대표한다.
A. 아그로박테리움 이원 식물 형질전환 벡터의 형성
상기한 두가지의 대표적인 키메라 유전자를 함유하는 아그로박테리움 이원 벡터, pAG-7242 및 pAG-7342의 형성은 실시예 10 및 실시예 19(각각 도 3 내지 4에 개략적으로 나타난 dru110pro:nptⅡ 및 dru 259pro:nptⅡ)에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 이들 이원 벡터는 또한 SAMase, S-아데노실메티오닌 가수분해효소(Ferro, 외, 1995; Hughes, 외, 1987)를 코드화하는 유전자를 함유하는데, 이는 본 발명에 중요하지 않다.
1) dru259::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7342의 형성
이원 식물 형질전환 벡터, pAG-7342는, HindⅢ 및 BamHI로 증해하는 방법에 의해 서브클론 pAG-1542로부터 13kb nos pro::nptⅡ 단편을 절제하고, 이어서 서브클로닝 벡터, pAG-431로부터의 1.1kb HindⅢ-BamHI 단편에 연결하여 dru259pro::nptⅡ 키메라 유전자에 삽입한다.
플라스미드 pAG-1542는 당업계에서 공지된 종래의 클로닝 기술을 사용하여 제조될 수 있다(Sambrook, 외, 1989). 이 예시적인 서브클로닝 이원 벡터는 좌측 가장자리 가까이에 위치된 nos 프로모터의 지배 하의 네오마이신 인산전이효소Ⅱ 선택가능 마커 유전자(nptⅡ)와, 우측 가장자리 가까이에 위치된 토마토 E8 프로모터(Deikman, 외, 1988: Deikman, 외, 1992)에 의해 조정되는 SAMase 유전자(Ferro, 외, 1995)를 함유한다. 앞서 기술했듯이, 토마토 E8:SAMase 구성체의 존재는 여기에 기술된 발현 결과에 크게 중요하지 않다.
dru259::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 서브클론 pAG-431의 구성은 실시예 7에 기술한다. 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7342의 형성은 도 4에 개략적으로 도시되어 있고, 실시예 9에서 상세히 설명한다.
플라스미드 pAG-1542의 구성을 요약한 플로우 챠트는 도 17에 나타나 있다.
2) dru110::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 이원 식물 형질전환 벡터의 형성
유사한 접근을 이용하여, 이원 식물 형질전환 벡터, pAG-7242는 HindⅢ 및 BamHI로 증해하는 방법으로 13kb nos pro::nptⅡ 단편을 서브클론 pAG-1542로부터 절제하고, 이어서 pAG-421로부터의 0.95kb dru259::nptⅡ 단편에 연결함으로써 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7242를 형성한다. 이원 식물 형질 전환 벡터 pAG-7242의 형성은 도 3에 개략적으로 도시되어 있고, 실시예 10에서 기술한다. dru110::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 서브클론 pAG-421의 형성은 실시예 8에서 기술한다.
B. 식물을 형질전환하는 방법
상기한 키메라 유전자는 예를 들어, 식물세포에 삽입할 수 있다. 본 발명의 라즈베리 프로모터에 의해 조절되는 이들 예의 키메라 유전자를 함유하는 트랜스유전자 식물은, 그 생성물을 발현하는 식물에 항생제, 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 인산전이효소Ⅱ를 발현한다.
본 발명을 근거로 행해지는 실험에서, 키메라 유전자를 토마토 식물 세포에 삽입했고, nptⅡ 선택가능 마커 유전자의 발현의 결과적인 수준 및 패턴을 시험하였다. nptⅡ는 본 발명의 라즈베리 식물 프로모터가 그 지배하의 유전자 발현을 조절하는 능력을 예시하는 예의 마커 유전자로서 선택되었지만, 많은 이종 유전자 중 어떤 것의 발현이 본 발명의 프로모터들에 의해 지시될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
예를 들어, nptI 및 nptⅡ은 그 아미노산 서열 및 기질 특이성 양자에서 상위점을 갖는 상이한 구분되는 효소들이다(Beck, 외, 1982). 본 발명의 라즈베리 프로모터들은 이들 네오마이신 인산전이효소 중 어느 것의 발현도 지시하기에 적합하다.
본 발명의 라즈베리 프로모터를 이용한 형질전환에 적절한 식물에는 라즈베리, 토마토, 딸기, 바나나, 키위, 아보카도, 멜론, 망고, 파파야, 애플, 복숭아, 콩, 목화, 알팔파, 오일씨드(oilseed) 평지, 아마, 사탕무우, 해바라기, 감자, 담배, 옥수수, 밀, 벼, 및 상추등이 포함되는데 이것에 한정되는 것은 아니다.
라즈베리 프로모터 예를 들어, dru110 및 dru 259를 함유하는 키메라 유전자는 수 많은 식물 형질전환 방법론 중 어떤 것에 의해 식물 세포에 전달될 수 있다. 여기에서 채용되는 그러한 한 방법은 키메라 유전자를 A. tumefaciens에 의해 운반되는 T-DNA-없는 Ti 플라스미드로 삽입하고, 이어서 A. tumefaciens를 식물 세포와 공배양하는 것을 포함한다.
실시예 11에서 주어진 바와 같이, 아그로박테리움 이원 식물 형질전환 벡터, pAG-7242 및 pAG-7342는, 디스암(disarm)된 A. tumefaciens균주로 일렉트로포레이션(Nagel, 외, 1990)에 의해 개별적으로 도입하고, 이어서 토마토 식물 세포와 공배양하여, 키메라 유전자를 토마토 식물 세포로 전달한다.
아그로박테리움-기초 방법에 부가하여, 잎 화반-기초 형질전환, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 및 미세탄환충격(입자 발사 형질전환)등과 같은 식물 숙주의 형질전환을 도출하는데에 택일적인 방법론이 채용될 수 있다. 이들 방법들은 당해 기술분야에서 주지된 것이며(Fry, 외, 1987; Comai and Coning, 1993; Klein, 외, 1988; Miki, 외, 1987; Bellini, 외, 1989), 선택된 DNA를 식물 게놈으로 도입하는 수단을 제공한다. 이러한 DNA는 이종 코딩 서열에 기능적으로 인접한 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110, dru259)로 구성된 DNA 카세트를 포함할 수 있다.
부가적으로, 반복적인 배양-선택 방법론이 식물 형질전환체를 생성하는데에 채용할 수 있고, 특히 라즈베리와 같은 목질 종들의 형질 전환에 적합하게 되어있다.
이 방법은 1995년 12월 28일에 발행된 국제 공개 No. WO 95/35388에, "식물 유전자 형질전환 방법 및 트랜스유전자 식물"이라는 제목으로 상세하게 기술되어 있다.
반복적인 배양-선택 형질전환 방법론 채용시에는, 목적 벡터를 함유하는 아그로박테리움의 존재하에서 타겟 외식편을 공배양하는 것등에 의해, 목적 키메라 유전자를 타겟 식물 조직 외식편의 세포 내로 삽입한다. 전형적으로, 공동 배양은 액체 내에서 약 1 내지 약 3일간 행해진다. 식물 조직 외식편은 잎, 떡잎, 잎꼭지, 및 분열조직을 포함하는(이것으로 한정되는 것은 아님) 다양한 식물 조직으로부터 얻을 수 있다.
그리고 나서 형질전환된 외식편 세포들을, 경계(threshold) 농도의 선택제를 갖는 선택적 배지 내에서 배양될 수 있는 그 능력에 대해 스크리닝한다. 선택적 배지상에서 생장할 수 있는 외식편은 일반적으로 새롭게 공급된 같은 배지로 전달하고 다시 배양한다. 외식편은 그 후 재생 조건에서 배양하여 재생된 식물 발아를 생성한다. 이들 재생된 발아는 외식편을 발생시키는데에 사용된다. 선택되고, 재생된 식물 발아로부터의 이들 외식편은 그 후 더 높은 농도의 선택제상에서 배양한다. 이 반복적 배양 방법은 본질적으로 순수한 트랜스유전자 외식편이 획득될 때까지 반복한다.
순수한 트랜스유전자 외식편은, 재생된 식물 발아를 외식편로 나누고 그 외식편을 배양하고, 그리고 모든 외식편의 생장은 사용되는 선택제의 높은 농도에 대해 내성을 가진다는 것을 입증함으로써 동정된다. 즉, 선택제의 존재하에서, 외식편 조직의 회저(necrosis)나 중요한 표백은 없다. 본질적으로 순수한 트랜스유전자 외식편의 생성을 동정한 후, 순수한 트랜스유전자 외식편로부터 식물을 재생시킴으로써 트랜스유전자 식물을 생산한다.
C. 식물 형질전환체의 동정 및 평가
트랜스유전자 식물을, 생성물 mRNA, DNA, 단백질을 합성하는 능력 그리고/또는 아미노글리코시드 항생물질, 예를 들어 카나마이신 등에 대한 내성에 대해 분석한다. 분석은 전형적으로 다양한 식물 조직 소스, 예를 들어 잎, 줄기 또는 열매를 사용하여 수행한다.
예의 프로모터 dru110 및 dru259에 관한 경우처럼, 만약 이종 유전자(트랜스유전자)를 조정하는 래스베리 프로모터가 잎 조직에서 적어도 다소는 활성적이라면, 잎-기초 분석법은 유용하다. 그러한 경우에, 잎-기초 분석법은 트랜스유전자의 발현 수준의 초기 스크린에 유용한데, 이는 그것이 열매-기초 분석법보다 훨씬 먼저 수행될 수 있기 때문이다. 한편 열매-기초 분석법은 열매와 같은 타겟 조직 그자체 내의 트랜스유전자 발현에 더욱 정확한 데이터를 제공한다.
RNA-기초 분석법은 예를 들어 RNAase 단백질 분석법(RPA)을 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 분석법의 수행에서, mRNA는 일반적으로 형질전환된 식물 및 야생형 식물로부터 유래되는 식물 세포로부터 추출한다. RNAase 단백질 분석법(RPA)은 Lee,외, 1987에 의해 앞서 기술된 바와 같이, Ambion, Inc.(Hialeah, FL)로부터의 "RPAⅡ" 키트를 사용하는 제조자 지침에 따라 수행될 수 있다.
라즈베리 프로모터에 의해 조절되는 키메라 유전자를 함유하는 트랜스유전자 식물의 유전자 발현 패턴은 또한 노던 도트 블롯을 수행함으로써 평가될 수 있다(예를 들어, 실시예 6). 프로모터 기능(즉, 조직 및/또는 단계 특이적 발현, 또는 구성적 발현)은, 상이한 숙성 단계에서의 잎과 열매 조직으로부터의 총 RNA의 노던 블롯을 다양한 다른 식물 조직들로부터의 총 RNA의 노던 블롯에 비교함으로써 평가될 수 있다.
본 발명에 근거하여 행한 실험은 라즈베리 프로모터, dru110 및 dru259가 단계 또는 조직-특이적 프로모터로서의 기능을 하지 않는다는 것을 보여준다. 완전한 길이 dru1 프로모터에 의해 조절되는, dru1의 조직 및 단계 특이적 유전자 발현 패턴이, 잎, 꽃턱, 및 소핵과로부터의 총 RNA의 노던 블롯 상에서 동정되었으므로 이것은 다소 놀라운 것이다.
본 발명의 라즈베리 프로모터에 의해 조절되는 다운스트림 이종 유전자의 발현의 또다른 동정으로서, 웨스턴 블롯 분석이 수행될 수 있다. 전형적인 웨스턴 블롯 실험의 수행에서는, 총 가용 단백질을 냉동 식물 조직으로부터 추출하여, 예를 들어 Coomassie Plus 단백질 분석법(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 측정한다. 가용단백질의 알려진 양 또는 정제된 단백질 생성물(예를 들어, 네오마이신-인산전이효소Ⅱ, positive 조절)의 알려진 양을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 용해시키고 나일론 막으로 전달한다. 그리고 나서 결합한 단백질을, 단백질 생성물에 특이적으로 면역반응을 일으키는 모노클로날 항체로 탐침검사했다.
본 발명의 라즈베리 프로모터에 의해 지시되는 유전자 발현을 동정하기 위한 또다른 접근으로는, 서던 하이브리드화 분석이 수행될 수 있다. 일반적으로, 추출 완충액내에서 냉동 식물조직을 갈아서, 원심분리하고, 얻어진 상등액을 분리하고, 그리고 염화세슘으로 침전시켜서 식물 DNA를 추출한다. 얻어진 CsCl 성분은 그 후 연장한 시간(예를 들어, 48시간)동안 원심분리하고, 회복된 DNA는 투석하고 에탄올로 침전시킨다. 식물 DNA의 회복 후, DNA를 적절한 제한 효소로 증해하여 DNA 단편을 얻고, 아가로스 겔상에서 전기영동 분리를 행한다. 얻어진 밴드들은 니트로셀룰로스(Southern, 1975)로 전달하고, 그리고나서 블롯들은 트랜스유전자의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 표지된 DNA 단편들로 탐침검사하여, 상기 기술한 바와 같이 라즈베리 프로모터-키메라 유전자 구성체에 해당하는 DNA의 존재를 동정한다.
D. 유전자 발현과 프로모터 강도의 비교 평가
본 발명을 기초로 행해지는 실험은, 본 발명의 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110, dru259)에 작동가능하게 연쇄된 키메라 유전자로써 토마토 식물을 형질전환하는 것을 증명한다. 이들 실험의 결과로부터 명백하듯이, 본 발명의 라즈베리 프로모터는 그 지배 하에 놓인 유전자의 발현을 조절하는 능력을 가지며, 보통 수준, 구성적 프로모터로서의 기능을 한다.
토마토 식물은 각각 nptⅡ 유전자에 작동가능하게 연쇄된 라즈베리 프로모터를 함유하는 식물 형질전환 벡터, pAG-7242 및 pAG-7342로써 형질전환한다(실시예 11). 상기 V.A.1)-2)에서 상세히 설명한 바와 같이, 식물 형질전환 벡터 pAG-7242는 dru110::nptⅡ 유전자를 함유하고, 구성체 pAG-7342는 dru259::nptⅡ 유전자를 함유한다. nptⅡ 유전자에 융합된 hsp80 프로모터나 CAS 프로모터(칼리모비루스 카사바 모틀 베인 비루스 프로모터) 중 어느 것을 함유하는 키메라 유전자도 제조하여 토마토 식물을 형질전환하는 데에 사용하여서, 본 발명의 라즈베리 프로모터의 성능을 평가하기 위한 비교 근거를 제공하였다.
상기한 구성체를 채용하는 10개의 분리된 유전자 샘플로부터의 결과는 실시예 12에 주어진다. 식물 형질전환체 내의 nptⅡ 효소 활성의 존재를 검출하기 위하여, 배양시에 이용가능한 뿌리내린 식물의 잎 조직으로부터의 단백질 추출물을 ELISA로써 분석했다. 몇몇 경우에, 단지 한개의 식물이 분석(예를 들어, 표 1, 마지막 두 줄, IV열)에 이용될 수 있는 반면에, 다른 경우(예를 들어 표 1, 둘째 줄, IV열)에서는, 10개의 분리된 트랜스유전자 샘플(event)이 분석에 이용가능하다.
이제 본 발명의 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110, dru259)를 함유하는 트랜스유전자 식물에 관해서 말하면, 표 1(특히, 3-7행)의 결과로부터 알 수 있듯이, nptⅡ 효소 활성은 사용되는 선택제의 농도 및 테스트되는 뿌리내린 식물의 수에 따라서 약 20-100%의 범위의 값을 가지면서, 분석되는 식물의 높은 백분율로 검출된다. 이러한 결과는 알려진 프로모터::nptⅡ 구성체를 함유하는 트랜스유전자 식물에 대해 얻어지는 결과에 유사하고, 본 발명의 라즈베리 프로모터가 그 지배 하에 놓인 이종 유전자의 발현을 조절하는데에 효과적이라는 것을 보여준다.
또한 형질 전환 빈도, 즉, 초기 외식편의 총 개수에 대하여 선택제의 존재 하에 뿌리를 내릴 능력이 있는 재생된 발아를 생성하는 조직 외식편의 수의 비율을 백분율로 표현한 것의 비교가 표 1에서 주어진다. III열의 결과에 기초하여, 본 발명의 라즈베리 프로모터를 함유하는 식물에 관하여 말하면, 평균하여서, 라즈베리 프로모터-함유 구성체로써 형질전환된 식물의 적어도 약 절반이 항생물질로의 선택에서 생존하였다. 즉, 그것들은 형질전환되지 않은 식물세포에 대해서는 독성을 갖게 될 소량의 선택제의 존재 하에서 뿌리를 내릴 수 있었다.
상기에서 논한 네오마이신 인산전이효소 분석의 경우에서와 같이, 이러한 결과들은 알려진 식물 프로모터(hsp80, CAS)로써 얻어진 결과들과 일치하고, 더 나아가 식물 숙주를 형질전환하여 이종 유전자를 발현하는 트랜스유전자 식물을 형성하기 위한, (i)본 발명의 라즈베리 프로모터가 그 지배하에 놓인 유전자의 발현을 조절하는 능력, 및(ii)라즈베리 프로모터(dru110, dru259)를 함유하는 키메라 유전자 구성체와 형질전환 벡터의 형성과 이용을 예시한다.
본 발명의 라즈베리 프로모터는, 예의 식물 형질전환 벡터 pAG-7242 및 pAG-7342로 형질전환된 트랜스유전자 식물로부터 얻는 모든 조직에서 nptⅡ 활성이 검출되는 것으로써 증명되듯이, 이종 유전자의 구성적 발현을 제공한다.
nptⅡ 유전자의 프로모터-조정 발현은 형질전환체내의 nptⅡ 효소 수준의 측정에 의해 평가된다. 결과는 표 2 및 도 5에서 주어진다. CAS::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 형질전환체로부터 얻어지는 잎 조직에 있어서의 단백질 수준은 표나 도면 어디에도 포함되어 있지 않는데 이는 분석된 두 개의 CAS::nptⅡ 샘플로부터의 값은 6000pg/ml을 초과하기 때문이며, 이로써 CAS 프로모터(즉, 강한 프로모터)에 의해 조절되는 유전자 발현의 높은 수준을 나타낸다. 본 발명의 dru1 프로모터가, hsp80 프로모터에 대해 관찰된 것 보다 다소 낮은 수준에서 트랜스유전자 발현을 지시하는 것으로 생각되는 반면에, dru110 및 dru259 양자는 보통-수준 프로모터로서 기능을 한다고 여겨진다.
표 2의 처음 두 개의 트랜스유전자 샘플에 대한 결과를 보면, dru110(dru259)::nptⅡ 식물에 대한 평균 nptⅡ 효소 수준은 CAS::nptⅡ 식물에 대해 측정한 것의 약 5-9%이다.
비교를 위한 기초로서 hsp80 프로모터를 사용하여 이들 같은 결과를 고찰해 볼 때, dru110(dru259)::nptⅡ 식물에 대해 측정되는 평균 nptⅡ 효소 활성은 hsp80::nptⅡ 식물에 대해 측정되는 nptⅡ 효소 활성의 약 40-60%이다.
이렇게, dru1 유전자로부터 유래되는 프로모터, 예를 들어 dru110 및 dru259는 hsp80 프로모터보다 다소 낮은 수준의 유전자 발현을 제공할 뿐만 아니라, 또한 보통 강도 프로모터로서 기능을 한다고 생각된다. 상기한 데이터에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 여기에서 기술된 각 예의 라즈베리는, 많은 이종 유전자 생성물 중 어떤 것의 발현 조절에서 그 사용을 지지하기에 충분한 수준에서 트랜스유전자의 구성적 발현을 지시할 수 있는 능력을 갖는다.
부가적으로, 본 발명의 라즈베리 프로모터를 이용한 토마토 식물의 형질전환은, 라즈베리로부터 유래된 프로모터 영역을, 완전하게 상이한 속, 과, 또는 종의 식물의 식물 세포 내에서 유전자 발현을 촉진하는데에 사용할 수 있다는 것을 예시한다.
VI. 본 발명의 벡터
본 발명은 식물의 형질 전환에 적절한 벡터들을 제공한다. 본 발명의 벡터, 키메라 유전자, 및 DNA 구성체는 또한 이종 유전자의 발현에도 유용하다. 본 발명의 키메라 유전자를 운반하는 트랜스유전자 식물은 재조합-발현된 물질의 유용한 소스일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 키메라 유전자는 두가지의 성분:(i)라즈베리 dru1 유전자로부터 유래된 구성적 프로모터, 및 (ii)바람직한 생성물을 코드화하는 이종 DNA 서열을 갖는다.
본 발명의 벡터들은 목적하는 DNA 코딩 서열에 대한 삽입 부위를 함유하는 발현 카세트를 운반하도록 형성될 수 있다. 이러한 삽입된 DNA의 전사는 그 후 본 발명의 적절한 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110pro 또는 dru259pro)의 지배하에 있게된다.
이러한 발현 카세트는 발현되고 있는 DNA 서열의 코딩-3'-말단에서 단일의 또는 여러개의 전사 종결 시그날(signal)를 가질 수 있다. 발현 카세트는 또한 예를 들어, (i)리더 서열(예를 들어, 분비 또는 액포 타게팅을 가능하게 하는) 및 (ii)번역 종결 시그날을 코드화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 벡터는 식물 세포 내에서 사용하기 위한 선택가능 마커 유전자(네오마이신 인산전이효소Ⅱ 유전자(nptⅡ) 또는 네오마이신 인산전이효소Ⅰ 유전자와 같은)를 포함할 수 있다. nptⅡ 유전자의 존재는 항생물질, 카나마이신에 대한 내성을 부여한다. 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 또다른 아미노글리코시드 내성 유전자는 히그로마이신 인산전이효소를 코드화하는 유전자, 즉 hpt 유전자를 포함한다(Gritz, 외, 1983). hpt 유전자를 함유하는 식물 세포는 아미노시클리톨 항생물질, 히그로마이신 B의 존재하에서 생장할 수 있다. 본 발명에 이용하기 위한 다른 선택가능 마커 서열은 글리포세이트-내성 CP4 및 COX 유전자를 포함한다(Zhou, 외, 1995). 이들 유전자 중 어느 것을 발현하는 트랜스유전자 식물도 글리포세이트에 대한 내성을 보이므로, 이를 식물 형질전환체에 대해 선택하기 위한 선택 배지에서 사용될 수 있다.
벡터는 또한 복제개시점과 선택가능 마커를 함유하는 서열과 같이, 2차 숙주내에서 그 선택과 전파를 가능하게 하는 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 2차 숙주에는 세균과 효모가 포함된다. 한 구체예에서는, 2차 숙주는 Escherichia coli이고, 복제 개시점은 colE1-형이고, 선택가능 마커는 앰피실린 내성을 코드화하는 유전자이다. 그러한 서열은 당해 기술분야에서 주지된 것이며 또한 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA).
본 발명의 벡터는 또한 Agrobacterium tumefaciens 벡터에 동종인 영역, Agrobacterium tumefaciens로부터의 T-DNA 가장자리 영역, 및 키메라 유전자나 발현 카세트(상기되었음)를 함유하는 중간체 식물 형질전환 플라스미드로 변형될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 벡터들은 Agrobacterium tumefaciens의 디스암(disarm)된 식물 종양 유도 플라스미드를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터들은 식물 세포 내의 핵산 코딩 서열의 보통 수준 구성적 발현에 유용하다. 예를 들어, 선택된 펩티드 혹은 폴리펩티드 코딩 서열은 본 발명의 벡터의 발현 카세트 내에 삽입할 수 있다. 벡터는 그리고 나서 숙주 세포로 전달하고, 숙주 세포는 단백질 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하고, 그리고 발현된 펩티드 혹은 폴리펩티드를 세포로부터 분리한다. 형질전환된 어버이 세포는 또한 열매를 맺는 트랜스유전자 식물을 생산하는데에 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터, 키메라 유전자, 및 DNA 구성체는, 식물 세포 형질전환 및 트랜스유전자 식물의 이어지는 발생에 사용하기 위해 키트로 혹은 개별적으로 판매될 수 있다.
A. 이종 유전자
여기에 기술된 방법과 결과는 본 발명의 라즈베리 프로모터가 트랜스유전자 식물 내에서 구성적, 보통 수준 유전자 발현을 제공하는 능력을 증명한다. 본 발명의 라즈베리 프로모터는 수많은 식물 조직 내에서 바로 인접한 (다운스트림) 유전자의 전사를 구성적으로 촉진하는 DNA의 영역을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 이종 유전자는 본 발명의 라즈베리 프로모터에 작동가능하게 연쇄된다.
식물의 형질전환을 위한 예의 이종 유전자에는, 항생물질 내성을 부여하는 데에 효과적인 생성물을 갖는 유전자들이 포함된다. nptⅡ 유전자를 포함하여 이들 유전자들 중 일부가 상기에서 기술되었다.
본 발명의 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110, dru259)와 함께 사용될 수 있는 다른 유전자들에는: Phaseolus vulgaris(Toubart, 외, 1992)로부터 유래된 폴리갈락투로나아제 억제 단백질(PGIP) 유전자 및 식물 글루카나아제, 키티나아제(Jongedijk, 외, 1995) 및 다른 병원체 관련(PR) 유전자(Melchers, 외, 1994; Ponstein, 외, 1994; Woloshuk, 외, 1991)의 변형된 형태와 같이 균 내성을 부여할 수 있는 유전자가 포함되는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 유전자 생성물(예를 들어, 치타나아제 혹은 베타-1,3-글루카나아제)은 예를 들어, 후사리움(Fusarium), Sclerotinia sclerotiorum, 및 Rhizoctonia solani와 같은 균에 대한 내성을 증대시킬 수 있다. 이들 생산물을 발현하는 형질전환된 식물은 묘목 입고병(damping off), 뿌리 부식병 등과 같은 병에 대해 증가한 내성을 나타낸다. 트랜스유전자 식물에 비루스 내성 및 균 내성 양자를 부여하기 위한 다른 대표적 유전자는 "VIRUS AND FUNGAL RESISTANCE: FROM LABORATORY TO FIELD"(Van Den Elzen, 외, 1994)에 기술되어 있다.
본 발명의 라즈베리 프로모터와 함께 사용하기 위한 추가적인 예의 이종 유전자는, 형질전환된 식물 세포에 제초제-내성을 부여하는데에 효과적인 생성물을 갖는 유전자를 포함한다. 예의 제초제 내성 유전자는 포스피노트리신 아세틸전이효소(PAT)에 대해 코딩하는 비알라포스(bialaphos) 내성 유전자(bar)를 포함한다(Akama, 외, 1995). 이들 유전자를 함유하는 트랜스유전자 식물은 제초제, "BASTA"에 대해 내성을 나타낸다. 이 유전자는 또한 선택가능 마커 유전자로 사용될 수 있는데, 이는 bar 유전자를 운반하는 외식편이 비알라포스의 활성 성분인 포스피노트리신(PPT)을 함유하는 선택적 배지에서 생장할 수 있기 때문이다.
추가적인 제초제 내성 유전자는 글리포세이트-함유 제초제에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다. 글리포세이트는 N-포스포노메틸 글리신의 산성 형태나 음이온 형태를 말한다. 이 활성 성분을 함유하는 제초제에는 "ROUNDUP" 및 "GLEAN"이 포함된다. 글리포세이트 내성을 첨가하기 위한 예의 유전자에는 EPSP 신타아제 유전자(5-에놀피루빌-3-포스포시키메이트 신타아제)(Delanney, 외, 1995; Tinius, 외, 1995), 또는 아세토락테이트 신타아제 유전자(Yao, 외, 1995)가 포함된다.
다른 예의 DNA 코딩 서열은 dru1 프로모터의 전사적 조절하에서 브롬옥시닐-특이성 니트릴라아제(Stalker, 외, 1988)를 코드화하는 bxn 유전자를 포함한다. 이 키메라 유전자를 함유하는 형질전환된 식물은 브롬옥시닐-특이성 니트릴라아제를 발현하고 브롬옥시닐-함유 제초제의 적용에 대해 내성을 갖는다.
본 발명의 프로모터를 사용하여 발현하는데에 유용할 수 있는 다른 유전자 생성물은 비루스 막 단백질을 코드화하는 유전자를 포함하여, 트랜스유전자 식물에서 막-단백질 조정된 비루스-내성을 증대시킨다. 예의 유전자는 알팔파 모자이크 비루스 막 단백질(AIMV), 오이 모자이크 비루스 막 단백질(CMV), 담배 줄무늬 비루스 막 단백질 (TSV), 감자 비루스 막 단백질(PVY), 담배 래틀(rattle) 비루스 막 단백질(TRV), 및 담배 모자이크 비루스 막 단백질(TMV)에 대해 코딩하는 유전자를 포함한다(Beachy, 외, 1990). 따라서, 본 발명의 키메라 유전자는 라즈베리 dru1 프로모터의 전사적 조절하에서, ALMV, CMV, TSV, PVX, TRV, 또는 TMV 유전자와 같은 비루스 막 단백질 유전자를 함유할 것이다.
B. 이종 식물계에서의 발현
본 발명을 기초로 수행되는 실험은 본 발명의 키메라 유전자 구성체의 다재다능함을 증명한다. 본 발명의 벡터 구성체는, 프로모터 서열에 대한 식물 기원에 독립적인 트랜스유전자 식물 내에서의 이종 서열의 발현 및 형질전환에 사용될 수 있다. 예를 들어, dru110::nptⅡ 및 dru259::nptⅡ 키메라 유전자를 토마토 식물 세포에 성공적으로 도입하였다.
이들 데이터는 본 발명의 라즈베리 프로모터(예를 들어, dru110, dru259)가 이종 식물계, 즉, 토마토와 같이 라즈베리 외의 식물 세포 내에서 유전자 발현을 촉진하는데에 유용하다는 것을 제시한다. 더 나아가, 프로모터에 의해 조정되는 발현은 이종 식물 내에서도 구성적으로 나타난다. 이러한 발견은 식물의 형질전환에 대한 본 발명의 벡터, 키메라 유전자, 및 DNA 구성체의 유용성을 뒷받침한다.
VII. 효용성
본 발명을 기초로 수행된 실험은 dru110 또는 dru259와 같은 dru1 프로모터에 의해 지시되는 nptⅡ의 유전자 발현 패턴이 다양한 식물조직(예를 들어, 잎, 줄기, 과일, 뿌리)에서 관찰된다는 것을 증명한다. 따라서, 본 발명의 라즈베리 프로모터의 이용은 그 지배하에 놓인 외래 유전자의 구성적 발현을 가능하게 한다.
본 발명의 라즈베리 dru1-유래 프로모터, dru110 및 dru259는 여기에 기술된 서열 정보를 채택하여 상기한 바와 같이 클로닝할 수 있다. 이들 라즈베리 프로모터는 보통 수준, 구성적 프로모터에 의해 그 기능이 증대되거나 가능해지는 어떤 이종 유전자를 발현하는데에 사용될 수 있다. 예의 유전자는 상기에 기술되어 있다.
이들 프로모터의 이용은 특히 본 발명의 라즈베리 프로모터를 이용한 성공적인 토마토의 형질전환의 관점에서 볼 때, 라즈베리에 국한된다고 여겨질 수 없다. 라즈베리는 본질적으로 소핵과이기 때문에, 라즈베리 프로모터는 다른 핵과(drupe)에서도 기능을 할 가능성이 있다. 본 발명의 구성체 및 방법은 베리류 열매, 예를 들어, 비티스(Vitis)(포도), 프라가리아(Fragaria)(딸기), 러버스(Rubus)(라즈베리, 블랙베리, 로간베리), 라이비스(Ribes)(커런트 및 구스베리), 백시니움(Vaccinium)(블루베리, 빌베리, 워틀베리, 크랜베리), 악티니다(키위 및 중국 구스베리) 등을 포함하되 이에 한정되는 것은 아닌 모든 그 이상의 식물에 적용될 수 있다. 더 나아가, 맬러스(사과), 피루스(배), 프러너스 속의 모든 식물, 사포타, 망고, 아보카도, 살구, 복숭아, 체리, 플럼, 및 승도복숭아 등을 포함하되 이에 한정되지 않는 다른 핵과 식물에 적용될 수 있다. 부가적인 식물 소스가 상기에서 기술되어 있다.
본 발명은 구성적 방법으로 어떤 유전자의 식물세포 발현을 조절하는 조성물과 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 프로모터는 nptⅡ와 같은 선택가능 마커 유전자의 발현을 조절하는데에 이용될 수 있다. 택일적으로, 라즈베리 프로모터는 제초제-내성 유전자의 발현을 촉진하는데에 이용될 수 있거나, 또는 비루스 막 단백질을 코드화하는 유전자의 발현을 조절하여 비루스 내성을 증대시키는데에 이용될 수 있다.
본 발명의 라즈베리 프로모터는 키메라 유전자, 식물 형질전환 벡터, 발현 카세트, 키트 등에 이용하여 식물 세포의 형질전환을 촉진시킬 수 있다.
여기에 기술된 라즈베리 프로모터는 또한 트랜스유전자 식물에서, 선택가능 마커 유전자와 같은 이종 유전자의 보통 수준 발현을 제공하기 위한 방법에 채용될 수 있다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 목적 및 특성은 다음 상세한 설명을 첨부한 도면 및 실시예와 연결하여 읽으면 더욱 완전하게 명확해질 것이다.
다음 실시예들은 발명을 예시하고 있으나, 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
생물학적 시약은 대체로 다음 공급처로부터 구입하였다: 5'에서 3' Prime, Boulder, CO; New England Biolabs, Beverly, MA; Gibco/BRL, Gaithersburg, MD; Promega, Madison, WI; Clontech, Palo Alto, CA; 및 Operon, Alameda, CA. 표준 재조합 DNA 기술이 모든 형성과정에서 사용되었다(Adams and Yang, 1977; Ausubel, 외, 1992; Hooykaas and Schilperoot 1985; Sambrook, 외, 1989; Wang, 외, 1990; Kawasaki, 외, 1989; Veluthambi, 외, 1988; Benvenuto, 외, 1988).
실시예 1
라즈베리 소핵과 단백질 특성화 및 정제
A. 단백질 용균체 조제 및 겔 전기영동
액체 질소를 함유한 막자와 막자사발을 사용하여, 한 개의 온전한 베리 냉동 핵과를 미세한 분말로 갈아서 라즈베리 단백질 샘플을 조제했다. 샘플 완충액(0.05M 트리스(Tris), pH 6.8, 1% SDS, 5% 베타-머캡토에탄올, 10% 글리세롤; Laemelli, 1970)을 소용돌이에 의해 섞인 샘플과 조직에 가했다(900μls). 샘플은 90-95℃에서 10분간 가열하고 4℃에서 10분간 14K rpm에서 원심분리했다. 상등액을 불용성 부스러기 펠릿으로부터 제거하고 -20℃에서 저장했다.
소핵과 단백질은 표준 과정을 사용하여 쿠마시에 블루 염색약과 결합한 황산 도데실 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해 분석한다. 가용 소핵과 단백질의 쿠마시에 블루-염색된 SDS 폴리아크릴아미드 겔은 도 10에 도시되어 있다. 도 10에서: 레인 1, 분자량 마커(BioRad, Richmond, CA), 레인 2, 3 및 5 각각은 개별적인 열매로부터 따로따로 조제된 9㎍의 라즈베리 소핵과 단백질 용균체를 함유한다. 레인 4는 더 많은 양의 용균체를 함유했다.
두 개의 보다 더 많은 단백질이 대략 17 및 15kd에서 관찰되었고, 각각 drupe1 및 drupe2로 명명되었다. 도 10에서, 이들 두 단백질은 화살표로 표시되어 있다. 이 겔의 밀도계 분석 스캐닝은 drupe1 및 drupe2가 각각 대략 23% 및 37%를 포함한다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 단백질의 정제 및 시퀀싱에 대한 직접적인 웨스턴 블롯 접근을 이어서 행했다.
B. 시퀀싱을 위한 단백질 블롯
단백질 블롯(Applied Biosystem, Inc. User Bulletin Number 58; Ausubel, 외, 1992)을 상기한 라즈베리 단백질 용균체를 사용하여 조제했다. 라즈베리 단백질 용균체의 다양한 양(12-36㎍/웰)을 4.5% 스태커(stacker)와 함께 10웰 18% SDS-PAGE 미니겔(1.5mm 두께) 상에 담고, 25mM 트리스, 192mM 글리신, 0.1% SDS 완충액에서 2-2.5시간 동안 100볼트에서 전기영동했다.
단백질을 25mM 트리스, 192mM 글리신, 10% 메탄올 완충액에서 2시간 동안 4℃, 90볼트에서 Applied BioSystem의 "PROBLOTT" 폴리비닐이덴디플루오리드(PVDF) 막 위에 트랜스블롯했다. 단백질 전달 후, 블롯을 쿠마시에 블루로 염색하고, 15 및 17킬로달톤(kd) 단백질 밴드를 블롯 위에 위치시키고 절단한다. 단백질의 N-말단 시퀀싱을 New Haven, CT의 W.M.Keck Foundation, Biotechnology Resource Laboratory에서 수행했다.
drupe1 샘플은 30 아미노산 N-말단 서열을 산출했다. drupe2 샘플은 아마도 차단된 아미노 종결점에 기인하여서 유용한 서열 정보를 산출하지 못했다. 아미노 말단 drupe1 서열은 서열번호:11로 주어진다. 이 30 아미노산 drupe1 서열은 BLAST 서칭을 사용하여 단백질 데이터베이스에 비교되는데, drupe1이 새로운 단백질임을 나타내는 어떠한 중요한 매치도 찾지 못했다.
실시예 2
drupe1 단백질에 해당하는 cDNA 클론의 회복
A. 소핵과 전체 RNA 조제
RNA를 머츄어 그린 라즈베리 소핵과로부터 추출했다. 제 철에 따서 -80℃에서 저장해 놓은 네 개의 머츄어 그린 라즈베리 과실을 RNA 추출에 사용했다. 소핵과의 견적량은 12그램이었다. 액체 질소를 함유한 차가운 막자 사발 내에서, 전체 베리를 막자로 쳐서 파쇄했다. 소핵과는 꽃턱으로부터 분리했다. 꽃턱은 막자사발로부터 제거하여 버렸다. 소핵과는 막자사발 안에서 분말이 되도록 갈아서, 조직을 냉동상태로 유지하는데 필요한만큼의 액체 질소를 첨가했다. 씨앗은 의도적으로 손을 대지 않고 방치했다. 균질화 완충액, 조직 2ml/그램을 RNA를 추출하는데에 사용하였다(균질화 완충액 : 200mM 트리스-HCl pH 8.5, 300mM LiCl, 10mM Na2EDTA, 1%(w/v) 데옥시콜산 나트륨, 1.5%(w/v) 황산 도데실 나트륨(SDS), 8.5%(w/v) 불용성 폴리비닐폴리피롤리딘(PVPP), 1% (v/v) NP-40, 1mM 아우린트리카르복실산(ATA), 5mM 티오우레아, 및 10mM 디티오트레이톨(DTT); 마지막 3개 성분들은 오토클레이브한 이후에 첨가했다).
냉동 분말 소핵과 조직을 3 내지 5 부분으로 완충액에 가하고, 모든 조직이 젖을 때까지 첨가물 사이를 소용돌이했다. 조직과 완충액을 합친 용액(여기에서 펄프로 지칭됨)을 멸균수로 1:1 희석하고 균질화 완충액의 0.75 부피를 희석된 펄프에 가하였다. 그 샘플을 65℃에서 10 내지 15분간 배양하고, 스윙잉 버킷 로터(swinging bucket rotor)에서 4℃, 15분간 9000g에서 원심분리했다. 상등액은 깨끗한 튜브로 옮겼다. 염화세슘(CsCl)을 상등액에 0.2g/ml으로 가하였다. 그 샘플을 CsCl이 용해될 때까지 혼합했다.
4ml 쿠션을 Beckman 1×3.5인치 폴리알로머 초원심분리 튜브안으로 넣었다(쿠션: 5.7M CsCl, 10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM Na2EDTA, pH 8). 그 샘플을 쿠션의 상부위에 서서히 층을 만든다. 그 샘플은 Beckman L8-80M 초원심분리기에서 SW 28 로터로 20℃에서 20시간동안 23,000rpm에서 원심탈수했다. 샘플을 초원심분리기로부터 제거한 후, 상등액을 흡입기에 부착된 drawn Pasteur 피펫을 사용함으로써 샘플에서 분리했다. 투명한 렌즈-라이크 펠릿은 튜브의 바닥에서도 볼 수 있었다.
펠릿을 500μl SSTE에 용해하고, 마이크로퓨지(microfuge) 튜브에 옮겼다(SSTE: 0.8M NaCl, 0.4% SDS, 10mM 트리스-HCl, pH 8.0 및 1mM Na2EDTA, pH8). 그 샘플을 클로로포름:이소아밀 알콜(24:1)의 동일한 부피로 2회 추출했다. RNA를 침전시키기 위하여, 2.5부피의 에탄올을 수성상에 가하였다. 그 샘플을 원심분리로써 수집하고, 75% 에탄올로 2회 세척하고, 100μl TE에서 재현탁시켰다. 산출물은 1.6mg이었다. RNA는 -20℃에서 저장하는 동안, 3M 초산 나트륨 1/9부피와 에탄올 3부피로 재침전하였다.
B. 소핵과 mRNA 침전
머츄어 그린 라즈베리 소핵과 전체 RNA로부터 mRNA의 분리는 제조자 지침서에 따라서 "STRAIGHT A'S" mRNA 분리 시스템(Novagen, Madison, WI)을 사용하여 수행하였다. mRNA는 상기한 머츄어 그린 라즈베리 소핵과로부터 추출된 전체 RNA 1.6mg으로부터 분리했다. 이 과정으로부터 mRNA의 산출량은 6.6㎍이었다.
C. 비숙성 라즈베리 소핵과 mRNA로부터 cDNA의 조제
머츄어 그린 라즈베리 소핵과 RNA로부터의 mRNA는 cDNA 합성의 주형으로서 이용하였다. cDNA 반응의 시발물질은 dTRANDOM(서열번호:12; Operon Technologies, Inc., Alameda, CA에 의해 합성됨)이었다. 올리고(dT) 영역이 mRNA 풀의 폴리(A) 영역으로 하이브리드화하였다. 다른 15 뉴클레오티드는, 클로닝 공정의 후반 단계의 PCR 증폭을 촉진하는데에 이용되는 5' 돌출을 만들었다.
다음 반응 혼합물을 cDNA 합성 반응을 위하여 수집하였다:H2O, 10.2μl; 250ng mRNA, 0.8μl; 5×BRL RT 완충액(BRL, Bethesda, MD), 4.0μl; 100mM DTT(dithiothreitol-BRL, Bethesda, MD), 0.2μl; "RNAguard"(23.4U/μl; Pharmacia, Piscataway, NJ로부터의 RNAse 억제물질), 0.5μl; dNPT's(각각 2.5mM), 2.0μl; 50μM 시발물질, 1.0μl; [32P]dCPT(3000Ci/mmol; DuPont/NEN, Boston, MA), 1.0μl; 그리고 AMV 역전사효소(38U/μl;Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida), 0.3μl. cDNA 반응은 반응동안 mRNA와 물을 조합함으로써 그리고 3분간 65℃로 가열함으로써 수행하였다. 그 혼합물을 얼음위에서 냉각시키고 마이크로퓨지했다(응결된 것을 수집하기 위하여). 나머지 반응 성분들을 그 후에 가하였다.
42℃에서 1시간 동안 배양한 후, cDNA 반응을 얼음으로 옮겨서 PCR 반응에 사용하기 앞서 4℃에서 저장했다.
실시예 3
cDNA dru1 단편의 PCR 증폭 및 클로닝
축퇴성 PCR 시발물질, Drupe20을 dru1 단백질 서열의 역번역에 기초한 cDNA의 5' 말단에 대하여 설계하였다. dru1의 공지된 아미노산 서열(서열번호:13)의 섹션을 아미노 종결점에 대한 그 근접도로서, 그리고 그 역번역된 서열(서열번호:14; Drupe20)내의 비교적 낮은 수준의 축퇴성으로서 선택하였다. Drupe20 시발물질은 (i)서열번호:13으로 주어지는 아미노산 서열에 해당하는 512-폴드 축퇴성 뉴클레오티드 서열이고, (ii) 3'-시발물질로서 이용하였다.
5'PCR 시발물질(DrupeRAN18, 서열번호:15, cDNA 시발물질인 dTRANDOM에 해당)은 3'말단에 대하여 설계하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR; Rerkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT; Mullis, 1987; Mullis, 외, 1987)은, "AMPLITAQ"(Perkin Elmer Cetus), PCR 완충액 II(50.0mM KCl, 10mM 트리스-HCl, pH 8.3), 2mM MgCl2, 각 dNTP 0.2mM, 머츄어 그린 소핵과 cDNA 및 Drupe20 및 DrupeRAN18 시발물질을 다음 조건하에서 사용하는 제조자 과정을 따라서 수행하였다:
95℃에서 1분간 1사이클,
95℃에서 1분간, 42℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 35사이클,
72℃에서 5분간 1사이클, 그리고 5℃로의 냉각.
증폭반응의 두가지의 주요 생성물이 있다: 대략 700bp의 지배적인 생성물과 대략 500bp의 보다 적은 생성물이 그것이다. 700bp 밴드는 공급자 지침에 따라서 β-아가라아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 1% "SEAPLAQUE" 아가로스 겔로부터 분리하였다. 이 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서 Invitrogen(San Diego, CA)로부터의 TA 클로닝 벡터, 벡터 pCRⅡ에 연결하였다.
dru1 유전자의 cDNA 클론은, 알칼리성 용균 방법(Ausubel, 외, 1992)을 사용하여 1.6ml의 배양균으로부터 조제되는 플라스미드 미니프렙(miniprep) DNA를 스크리닝함으로써 동정했다. 이중-스트랜드 DNA는 "SEQUENASE" ver.2 효소 및 키트 성분(United States Biochemical, Cleveland, Ohio) 그리고 [α-35S]-dATP(DuPont/NEN)을 사용하는 디데옥시 사슬-종결 방법에 의해 시퀀싱되었다. 반응은 M13 보편적 포워드(forward) 및 역 시발물질(New England Biolabs, Beverly, MA)로 시발하였다. 시퀀싱 반응은 아크릴아미드 겔("LONG RANGER GEL", FMC, Rockland, Maine) 상에 용해하고 밴드는 오토라디오그래피로 검출했다.
서열은 오토라디오그래피로 읽고, drupe1으로부터의 역 번역된 N-말단 단백질 서열과의 동종성에 관하여 분석했다. 단백질 서열의 역번역을 통하여 얻어지는 축퇴성 DNA 서열에 마주보는 실제 DNA 서열을 결정하였다. cDNA 및 N-말단 단백질 서열 사이의 상관성을 동정하였다. 클론(pAG-301로 지정된)을 이들 기준에 따라서 또 다른 특성화에 관해 선택하였다. pAG-301의 dru1 cDNA 삽입체의 핵산 서열은 서열번호:16으로 주어진다.
cDNA 합성으로부터 유전자의 게놈 복사의 역 PCR까지의 전체 dru1 클로닝 과정이 도 11a 및 도 11b에 개략적으로 도시되어 있다.
실시예 4
dru1 cDNA에 해당하는 게놈 DNA 단편의 회복
"CTAB"(헥사데실-트리메틸-암모늄 브로마이드) 방법(Doyle and Doyle, 1990)을 라즈베리 잎으로부터 DNA를 추출하는데에 이용하였다. PCR 시발물질(DruGen5', 서열번호:17; DruGen3', 서열번호:18)을 완전한 dru1 cDNA 서열에 기초하여 설계하였다. National Biosciences, Inc.(Plymouth, MN)의 다중-기능 프로그램, "OLIGO"를 시발물질의 설계를 용이하게 하는데에 사용하였다. PCR은 "AMPLITAQ"(Perkin-Elmer Cetus), PCR 완충액(50.0mM KCl, 10mM 트리스-HCl pH 8.3, 및 1.5mM MgCl2), 각 dNTP 0.2mM, 라즈베리 게놈 DNA 및 DruGen5' 및 DruGen3' 시발물질을 다음 ("HOT START") 조건하에서 사용하는 제조자 과정을 따라서 수행하였다:
97℃에서 5분간 1사이클, 그 후 "AMPLITAQ" 첨가,
97℃에서 1분간, 52℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 2사이클,
94℃에서 1분간, 52℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 25사이클,
72℃에서 5분간 1사이클, 그리고 5℃로의 냉각.
이 증폭 반응은 3가지의 주요생성물을 생산하는데, 710bp의 지배적인 생성물 1가지와 690bp 및 625bp의 보다 적은 생성물 2가지가 것이다. PCR 반응생성물은 제조자 지침을 따라서 Invitrogen(San Diego, CA)으로부터의 TA 클로닝 벡터, 벡터 pCRⅡ에 연결(ligate)하였다. 710bp 삽입체로 클론을 선택하여 pAG-302로 지정하였다.
pAG-302의 플라스미드 DNA는, 알칼리성 용균 방법(Ausubel, 외, 1992)을 사용하여 1.6ml의 배양균으로부터 조제하며, "SEQUENASE" ver.2 효소 및 키트 성분(USB, Cleveland, Ohio) 그리고 [α-35S]-dATP(DuPont/NEN)을 사용하는 디데옥시 사슬-종결 방법에 의해 시퀀싱되었다. 시퀀싱 반응은 M13 보편적 포워드 및 역 시발물질(New England Biolabs, Beverly, MA)로 시발하였다. 더 이상의 시퀀싱 반응은 2가지의 추가적인 내부 시발물질로써 시발하였다. 시퀀싱 반응은 아크릴아미드 겔 상에 용해하고 밴드는 오토라디오그래피로 검출했다.
pAG-302 내의 dru1 게놈 DNA 삽입체의 서열은 서열번호:19으로 주어진다.
그 클론의 서열은 dru1 cDNAdp 해당하는 게놈 DNA 단편이 분리되었음을 증명했다.
실시예 5
역 PCR을 통한 dru1 게놈 DNA의 5'측면 영역의 회복
역 PCR 시발물질(DruInvUp, 서열번호:5, 및 DruInvLow, 서열번호:6을 지정)을 게놈 DNA 서열에 기초하여 설계하고, OLIGO를 사용하여 최적화하였다. 게놈 라즈베리 DNA를 제한 효소 NsiI으로 증해하였다. NsiI는 cDNA 서열에 기초하여 NsiI가 유전자의 3'-비번역 영역에서 절단한다고 알려져 있기 때문에 선택하였다. NsiI 증해된 DNA의 작은 부분을 분석 아가로스 겔 위를 지나가게 하고, 서던 전이를 수행하였다(Ausubel, 외, 1992).
서던 블롯은 pAG-302내에 함유된 cDNA 단편으로 탐침검사하였다. 그 탐침은 약 2-2.3kb의 NsiI 단편을 동정하였는데, 이 단편은 게놈 클론과 강하게 하이브리드화하였다. 제 2의 보다 작은 단편이 또한 탐침에 하이브리드화하였지만, 게놈 클론과 약하게 하이브리드화하였다.
나머지 NsiI-증해된 라즈베리 DNA는 1% "SEAPLAQUE" 아가로스 겔(FMC, Rockland, ME) 상에서 전기영동하였다. 가이드로서 BstEⅡ 람다 표준 사이즈를 사용하여, 2-2.3kb 범위의 증해된 DNA를 겔로부터 절제하였다. DNA는 제조자 지침을 따라서 β-아가라아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 정제하였다. DNA는 원형 연결 반응 생성물(Ochman, 외, 1990)의 형성으로 치우치게 하기 위하여, 비교적 묽은 농도(1㎍/ml)에서 자가연결하였다.
역 PCR은 자가-연결된, NsiI-증해된, 사이즈-선택된 게놈 라즈베리 DNA 상에서 순차적으로 수행하였다. Perkin Elmer Corporation/Applied Biosystems Division(Foster City, CA)로부터의 "AMPLITAQ"를 DNA 증폭에 사용하였다. PCR 완충액, 각 dNPT 0.2mM, 라즈베리 게놈 DNA(여기에서 기술된 바와 같이 조제된), 및 DruInvUp(서열번호:5) 및 DruInvLow 시발물질(서열번호:6)을 사용하여 제조자 과정을 따른다. 다음 ("HOT START") 반응 조건을 채용하였다:
97℃에서 5분간 1사이클, 그 후 "AMPLITAQ" 첨가,
97℃에서 1분간, 58℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 2사이클,
94℃에서 1분간, 58℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 25사이클,
72℃에서 5분간 1사이클, 그리고 5℃로의 냉각.
이 증폭 반응은 2가지의 주요생성물을 생산하는데, 1가지는 1.8kb이고 한 가지는 900bp이다. 1.8kb 밴드는 β-아가라아제를 사용하여 1% "SEAPLAQUE" 아가로스 겔로부터 분리하였다. 이 단편은 pCRⅡ에 연결(ligate)하여서 pAG-310을 발생시켰다. 도 1 및 도 2에서 서브클론 pAG-310의 조제를 개략적으로 도시하였다.
pAG-310 삽입체는 완전히 그대로 시퀀싱하였고(서열번호:1), dru1 삽입체 시퀀스는, cDNA 클론(서열번호:16) 및 시퀀스가 공유되는 영역의 게놈 클론(서열번호:19)과 동일한 것으로 밝혀졌다. CATT 박스, TATA 박스, ATG 개시 코돈, 두 엑손, 인트론, 이어맞춤(splicing) 부위, 정지 코돈 및 폴리-아데닐화 부위를 포함하여 식물 유전자의 일반 요소와 그 조절 성분이 동정되었다(도 6a 및 6b).
dru1의 유전자 조직과 단백질 구조는 도 12에 대략적으로 도시되어 있다. 유전자는 서열번호:20으로 주어지는 예견된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드화한다. 예견된 단백질은 계산된 분자량 17,087.64을 가지며, 어림된 pI 4.80을 갖는다. dru1 단백질의 Kyte-Doolittle 친수도는 도 13과 같이 주어진다.
실시예 6
dru1 유전자 발현의 특성화
A. RNA 도트 블롯
RNA 도트 블롯은 그린, 머츄어 그린, 브레이커, 및 숙성(도 14에서 각각 단계 I, II, III, IV에 해당) 라즈베리로부터의 각각의 총 꽃턱 RNA 5㎍과 총 라즈베리 잎 RNA 5㎍을 사용하여 조제하였다. 블롯은 무작위 시발 방법(Boeringer Mannheim Biochemicals, Random Primed 반응 키트, Indianapolis, IN)에 의해 [32-P]dCTP(>3000 Ci/mmole)로 표지된 dru1 cDNA 단편으로 탐침검사하였다.
그 블롯은 45℃에서 하룻밤동안 "HYBRISOL I"(Oncor, Gaithersburg, MD)내에서 하이브리드화시켰다. 1.2×107DPM/ml의 탐침 농도를 사용하였다. 블롯은 하룻밤 하이브리드화 후에 세척하되 42℃에서 1시간 동안 0.1×SSC를 사용하여 최종 세척하였다. 하이브리드화 탐침은 표준 오토라디오그래피법을 통하여 검출하였다. 블롯은 4시간 10분 동안 -80℃에서 보력 스크린과 함께 필름에 노출시켰다.
이 분석의 결과는 도 14에 도시되어 있다. 이 도면에서 RNA 도트는 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 그린(도 14, "I"), 머츄어 그린(도 14 "II"), 브레이커(도 14, "III") 및 숙성(도 14, "IV")으로부터의 라즈베리 잎 RNA 및 꽃턱 RNA이다.
B. 또다른 RNA 하이브리드화 분석
식물 RNA 추출 법(Chang, 외, 1993)은 꽃턱과 잎에 대하여 이용하였다. 상기한 라즈베리 소핵과 RNA 추출법은 소핵과 및 딸기 열매에 대하여 이용하였다.
노던 블롯은 5㎍/레인의 각 샘플 RNA를 이용하여 조제하였다. RNA 샘플은 다음과 같다: 라즈베리 잎(도 15, 레인 1), 머츄어 그린된 라즈베리 꽃턱(도 15, 레인 2), 숙성 라즈베리 꽃턱(도 15, 레인 3), 머츄어 그린 라즈베리 소핵과(도 15, 레인 4), 및 숙성 라즈베리 소핵과(도 15, 레인 5).
블롯은 무작위 시발 방법에 의해 [32P]dCTP(>3000 Ci/mmole)로 표지된 dru1 cDNA 단편으로 탐침검사하였다. 그 블롯은 45℃에서 하룻밤동안 "HYBRISOL I"(Oncor, Gaithersburg, MD)내에서 하이브리드화를 수행하였다. 4.2×106DPM/ml의 탐침 농도를 사용하였다. 블롯은 하룻밤 하이브리드화 후에 세척하되 50℃에서 30분간 0.1×SSC를 사용하여 최종 세척하였다. 하이브리드화 탐침은 표준 오토라디오그래피법을 통하여 검출하였다. 블롯은 1시간 동안 실온에서 보력 스크린 없이 필름에 노출시켰다.
이 분석의 결과는 도 15에 주어져 있으며 소핵과 내의 단계 특이적 발현 패턴을 뒷받침한다.
C. 단백질 발현 분석
단백질 용균체를 다양한 숙성의 단계에서 라즈베리 소핵과로부터 조제했다(실시예 1에 기술된 바와 같이). 용균체는 PAGE 및 쿠마시에 블루(50% MeOH, 10mM 트리스-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2)로 염색된 겔로써 사이즈-분별하였다. 결과는 도 16에 주어져 있다. 이 도면에서 레인 내의 용균체는 다음과 같다: 레인 1, 그린 소핵과; 레인 2, 머츄어 그린 소핵과; 레인 3, 브레이커 소핵과; 레인 4, 오랜지 소핵과; 및 레인 5, 숙성 소핵과. 이 분석의 결과는 소핵과내의 단계 특이성 발현 패턴을 뒷받침한다.
실시예 7
dru259 프로모터를 함유하는 서브클론 pAG-431의 조제
완전한-길이 dru1 프로모터를 함유하는 서브클론 pAG-310의 제조는 상기 실시예 5에 기술되어 있다.
dru1 프로모터를 함유하는 DNA 단편은 표준 PCR 반응 조건 하에서, 5' 시발물질, DrupeUp(서열번호:7) 및 3' 시발물질, DrupeLow(서열번호:8)의 시발물질을 이용하여 서브클론 pAG-310으로부터 PCR 증폭하였다. PCR 반응 혼합물은 다음 성분들을 함유하였다:79.0μl 물, 10.0μl 10X 벤트(Vent) 완충액, 1.0μl DrupeUp 시발물질(50μM 용액), 1.0μl DurpeLow 시발물질(50μM 용액), 8.0μl dNPTs(2.5mM 씩), 1.0μl 주형 DNA(100ng). 채용된 PCR 반응 조건은 다음과 같다:
97℃에서 4분간 1사이클, 그 후 "AMPLITAQ" 첨가,
94℃에서 1분간, 49℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 25사이클,
72℃에서 5분간 1사이클, 그리고 5℃로의 냉각.
증폭 반응은 도 1 및 도 2의 상단부에 예시된 바와 같이 1.3kb 단편 생성물을 생산하였다.
이 단편은 하기하는 반응 혼합물로부터 정제하였다. PCR 반응 혼합물은 라이트 Phase Lock Gel 튜브(5 Prime to 3 Prime, Boulder, CO)로 옮겼다. 다음 용매 조합, 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1)을 PCR 반응 부피와 동등한 부피에서 이 튜브에 가하였다. 그 튜브를 제조자 지침을 따라서 마이크로원심분리기에서 원심탈수하였다. 상측의 수성상은 Select, g-50 스핀 칼럼(5 Prime to 3 Prime, Bouler, CO)으로 옮기고, DNA는 제조자 지침에 따라 칼럼을 통하여 원심분리하였다. DNA를 침전시키기 위하여, 용리제에 3M 아세트산 나트륨 1/10부피 및 에탄올 2.5부피를 가하였다. 그 샘플을 10분 이상 얼음위에서 배양하고, 그리고 나서 4℃에서 30분간 14,000rpm에서 마이크로원심분리하였다. 상등액을 튜브로부터 가만이 따라내고, 펠릿은 75% 에탄올로 2회 세척하였다. 펠릿은 건조시키고, 그리고 나서 25μl 1/2 강도 TE(5mM 트리스-HCl, 0.5mM EDTA, pH 8)에 현탁시켰다. DNA 단편을 제한효소 NsiI 및 XbaI로 완전히 증해하여 dru1 프로모터 단편을 생성하였다. 이 단편을 상기한 PCR 생성물의 경우와 같은 방법으로 정제하였다.
합쳐지지 않은 식물 발현 벡터 p35S-GFP(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA)를 XbaI 및 PstI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProducts, Rockland, ME) 위로 지나가게 하였다. 3.7kb 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단하였다. DNA 단편은, 제조자 지침을 따라서 New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제하였다. 0.85kb 35S 프로모터를 함유하는 겔 영역은 버렸다. p35S-GFP2로부터의 3.7kb 단편과 1.3kb dru1 프로모터 단편을, 제조자 지침을 따라서, Gibco/BRL's T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결(ligation) 반응으로 조합하여 중간체 플라스미드 pAG-155를 형성하였다. 라즈베리 dru1 프로모터를 함유하는 얻어진 플라스미드는 도 1 및 도 2에서 도시한 바와 같이 pAG-155로 지정하였다.
플라스미드 pAG-155를, 모두 블런트 절단제인 SnaBI 및 EcoRV로 완전하게 증해하여, 여기에서 dru259로 지정되었고 그 뉴클레오티드 처음이 ATG 개시 코돈의 5' 에 인접한 259bp dru1 프로모터 단편을 내 놓는다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 259bp dru1 프로모터 단편을 함유한 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서 β-아가라아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 나머지 플라스미드를 함유하는 겔 영역은 버렸다.
nos::nptⅡ 카세트를 함유하는 서브클론 pAG-411은 다음과 같이 조제하였다. 클로닝 벡터 pGEMR3Zf(+)(Promega, Madison, WI)를 XbaI 및 BamHI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 3.2kb 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제해냈다.
식물 이원 형질전환 벡터 pGPTV·kan(Max-Planck Institut, Koln, Germany)는 XbaI 및 BamHI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 1.48kb nos:nptⅡ 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, β-아가라아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 13.3kb 단편을 함유하는 겔 영역은 버렸다.
pGEMR3Zf(+)으로부터의 3.2kb 단편과 1.48kb nos::nptⅡ 단편을, 제조자 지침을 따라서 Gibco/BRL의 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결 반응으로 조합하여 중간체 플라스미드 pAG-411를 형성하였다.
플라스미드 pAG-411을 모두 블런트 절단제인 HincⅡ 및 PshAI로 완전히 증해하여, 636bp nos 프로모터 단편을 내 놓았다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 4kb 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, β-아가라아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 636bp nos 프로모터 단편을 함유하는 겔 영역은 버렸다.
pAG-411로부터의 4kb 단편과 pAG-155로부터의 259bp dru1 프로모터 단편을, 제조자 지침을 따라서 Gibco/BRL의 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결 반응으로 조합하여 중간체 플라스미드 pAG-431를 형성하였다. 잘려진 프로모터 dru259에 대한 뉴클레오티드 서열은 여기에서 서열번호:4로 주어진다.
실시예 8
dru110 프로모터를 함유하는 서브클론 pAG-421의 생성
완전한-길이 dru1 프로모터를 함유하는 플라스미드 pAG-155의 형성은 실시예 7에 기술되어 있다.
dru1 프로모터의 166bp를 함유하는 DNA 단편을, 하기 PCR 조건 하에서 시발물질 Dru1-118H3(서열번호:9) 및 GFPStartR(서열번호:10)을 사용하여 서브클론 pAG-155로부터 PCR 증폭을 하였다:
97℃에서 3분간 1사이클, 그 후 "AMPLITAQ" 첨가,
97℃에서 1분간, 47℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 2사이클,
94℃에서 1분간, 47℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간 25사이클,
72℃에서 5분간 1사이클, 그리고 5℃로의 냉각.
그리고 나서, dru1 프로모터 단편의 166bp를 하기와 같이 정제했다. PCR 반응 혼합물을 라이트 Phase Lock Gel 튜브(5 Prime to 3 Prime, Boulder, CO.)로 옮겼다. 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1)을 함유하는 혼합된 용매 시스템을 PCR 반응 부피와 동등한 부피에서 이 튜브에 가하였다. 그 튜브를 제조자 지침을 따라서 마이크로원심분리기에서 원심탈수하였다. 상측의 수성상은 Select, G-50 스핀 칼럼(5 Prime to 3 Prime, Bouler, CO)으로 옮기고, DNA는 제조자 지침에 따라 칼럼을 통하여 원심분리하였다. DNA를 침전시키기 위하여, 용리제에 3M 아세트산 나트륨 1/10부피 및 에탄올 2.5부피를 가하였다. 그 샘플을 10분 이상 얼음위에서 배양하고, 그리고 나서 4℃에서 30분간 14,000rpm에서 마이크로원심분리하였다. 상등액을 튜브로부터 가만이 따라내고, 펠릿은 75% 에탄올로 2회 세척하였다. 펠릿은 건조시키고, 그리고 나서 31.6μl H2O에 재현탁시켰다. 이 DNA 단편을 제한효소 HindⅢ 및 EcoRV로 완전히 증해하여 112bp dru1 프로모터 단편을 생성하였다. 이 단편을 상기한 PCR 생성물의 경우와 같은 방법으로 정제하였다.
nos::nptⅡ 카세트를 함유하는 서브클론 pAG-411의 조제는 상기 실시예 7에 나타나 있다.
플라스미드 pAG-411은 HindⅢ 및 PshAI로 완전히 증해하여, 620bp nos 프로모터 단편을 생성했다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 4kb 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 420bp nos 프로모터 단편을 함유하는 겔 영역은 버렸다.
pAG-411로부터의 4kb 단편과 pAG-155로부터 유래된 112bp dru1 프로모터 단편을, 제조자 지침을 따라서 Gibco/BRL의 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결 반응으로 조합하여 중간체 플라스미드 pAG-421를 형성하였다. 플라스미드 pAG-421을 형성하는데에 따르느 단계들은 도 2에 개략적으로 나타나 있다.
실시예 9
dru259::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7342의 형성
A. 플라스미드 pAG-1542의 형성
플라스미드 pAG-1542의 형성을 요약한 플로우챠트를 도 17에서 도시하였다. 플라스미드 pAG-1542는 당해 기술분야에서 공지된 종래의 클로닝 기술(Sambrook, 외, 1989)을 이용하여 형성하였다. 서브클로닝 이원 벡터 pAG-1542는, 왼쪽 가장자리 가까이에 위치된 nos 프로모터의 지배 하의 nptⅡ 마커 유전자 및 오른쪽 가장자리 가까이에 위치된 토마토 E8 프로모터(Deikman, 외, 1988; Deikman, 외, 1993)에 의해 조정되는 SAMase 유전자(Ferro, 외, 1995)를 함유했다.
B. 이원 식물 형질전환 벡터, pAG-7342의 형성
dru259::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 서브클론 pAG-431의 형성은 실시예 7에 기술되어 있다.
플라스미드 pAG-1542는 HindⅢ 및 BamHI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 13kb 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 1.46kb nos::nptⅡ 단편을 함유하는 겔 영역은 버렸다.
플라스미드 pAG-431은 HindⅢ 및 BamHI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 1.1kb dru259::nptⅡ 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 나머지 플라스미드를 함유하는 겔 영역은 버렸다.
pAG-1542로부터의 13kb 단편과 pAG-431로부터의 1.1kb dru259::nptⅡ 단편을, 제조자 지침을 따라서 Gibco/BRL의 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결 반응으로 조합하여 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7342를 형성하였다. 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7342의 형성은 도 4에 개략적으로 도시하였다.
실시예 10
dru110::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 이원 식물 형질전환 벡터의 형성
플라스미드 pAG-1542의 형성은 실시예 9A에 기술되어 있다.
dru110::nptⅡ 키메라 유전자를 함유하는 서브클론 pAG-421의 형성은 실시예 8에 기술되어 있다.
플라스미드 pAG-1542를 HindⅢ 및 BamHI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 13kb 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 1.46kb nos::nptⅡ 단편을 함유하는 겔 영역은 버렸다. 플라스미드 pAG-421을 HindⅢ 및 BamHI로 증해하였다. 증해된 플라스미드를 1% 저융점 아가로스 겔(SeaPlaque, FMC BioProduct, Rockland, ME) 위로 지나가게 했다. 0.95kb dru259::nptⅡ 단편을 함유하는 겔 영역을 겔 몸체로부터 절단했다. DNA 단편은 그리고 나서 제조자 지침을 따라서, New England Biolabs(Beverly, MA)로부터의 β-아가라아제를 사용하여 겔로부터 정제해냈다. 나머지 플라스미드를 함유하는 겔 영역은 버렸다.
pAG-1542로부터의 13kb 단편과 pAG-421로부터의 0.95kb dru110::nptⅡ 단편을, 제조자 지침을 따라서 Gibco/BRL의 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결 반응으로 조합하여 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7242를 형성하였다. 이원 식물 형질전환 벡터 pAG-7242의 형성은 도 3에 개략적으로 도시하였다.
실시예 11
이원 벡터 pAG-7242 및 pAG-7342를 이용한 식물 형질전환
키메라 dru110::nptⅡ 및 dru254::nptⅡ 유전자를 각각 함유하는 이원 벡터 pAG-7242 및 pAG-7342를 이용한 아그로박테리움-기초 식물 형질전환은, 예의 플라스미드 pAG-7242에 대해 하기한 바와 같이 토마토 떡잎을 이용하여 수행하였다.
Sunseeds Co.(Morgan Hill, CA)로부터 얻는 체리 토마토 라인(CH3)을 식물 형질 전환 실험에 있어서 타겟으로서 사용했다. 형질전환은 표준 떡잎-기초 아그로박테리움 공배양 방법(Fillatti, 외, 1987)을 사용하여 수행했다.
식물 내로 코딩 서열을 도입하는데에는 Agrobacterium tumefacience 균주 C58의 디스암된 유도체인 Agrobacterium tumefacience 균주 EHA101(Hood, 외, 1986)를 사용했다. 이 균주는 T-DNA-없는 Ti 플라스미드를 함유한다. Nagel, 외,(1990)에 의해 기술된 바와 같이 본질적으로 일렉트로포레이션을 사용하여, pAG-7242 플라스미드를 EHA101로 전달했다. 간단히, Agrobacterium tumefaciens 배양균은, 수산화 나트륨의 첨가에 의해 pH를 7.2로 조정한, 트립톤(5g/l), 효모 추출물(2.5g/l), NaCl(5g/l), 만니톨(5g/l), 글루탐산 나트륨(1.17g/l), K2HPO4(0.25g/l), MgSO4(0.1g/l) 및 비오틴(2㎍/l)을 함유하는 MG/L 아가(agar) 배지 내에서 미드-로그(mid-log) 상(OD 600 0.5에서 1.0)까지 생장시켰다.
토마토 떡잎의 약 1/3을 양 끝으로부터 절삭하고, 가운데 부분을 조직 외식편으로 사용했다. 떡잎 외식편을 담배 지지세포판(feeder plate)(Fillatti, 외, 1987) 위에서 하룻밤동안 전-조건처리했다. 전-조건처리된 외식편을, 하룻밤 배양한 EHA105/pAG-7242 20ml 내에 15분간 둠으로써 접종했다. 그리고 나서, Fillatti, 외,(1987)에 의해 기술된 바와 같이 외식편을 담배 지지세포판 상에서 2일 동안 EHA105/pAG-7242와 공배양했다.
외식편을 2Z 배지(Fillatti, 외, 1987), Murisheegee and Skoog(MS) 염, Nitsch and Nitsch 비타민, 3% 수크로스, 2mg/l 시틴, 500mg/l 카르베니실린, 60-200mg/l 카나마이신, 및 0.7% 아가를 함유하는 조직 배양 배지 안에서 생장시켰다. 외식편을 8 내지 10주 동안 조직 배양으로 생장시켰다. 카르베니실린 처리를 모든 배지에서 2 내지 3 개월동안 계속하였다. 식물에게서 생존가능한 Agrobacterium tumefaciens 세포를 없애기 위해 카운터-선택으로 토양에 심을 때까지, 외식편 및 식물을 카르베니실린 상에서 유지시켰다.
표 1은 이용되는 선택제의 농도 및 형질전환 빈도를 포함하여 식물 형질전환 실험의 요약을 제공한다. 본 발명의 신규한 라즈베리 프로모터를 사용하는 식물 형질 전환 실험에 대해 얻어지는 결과는, 두가지의 상이한 강한 구성적 프로모터인 칼리모비루스 프로모터, 카사바 모틀 베인 비루스 프로모터(CAS) 및 hsp80 프로모터를 함유하는 이원 벡터를 사용하여 얻어지는 것에 유사하다. CAS 프로모터는 Scripps Research Institute(La Jolla, CA)로부터 얻는다. hsp80 프로모터를 함유하는 트랜스 유전자의 벡터 형성 및 발현 수준 뿐만 아니라 hsp80 프로모터의 분리 및 그 핵산 서열도 기술되어 있다(Brunke and Wilson, 1993).
상기한 4가지의 프로모터-nptⅡ 키메라 유전자 조합을 이용하여 생성된 형질전환체로부터의 10개의 트랜스유전자 샘플에 걸친 nptⅡ 발현의 상대적 강도의 비교는 도 5에 주어져 있다.
실시예 12
라즈베리로부터 유래된 프로모터를 함유하는 트랜스유전자 식물 내에서 nptⅡ 마커유전자의 상대적 발현
라즈베리 프로모터 dru110 및 dru254를 각각 함유하는 벡터 pAG-7242 및 pAG-7342를 채용하는 10개의 분리된 트랜스유전자 샘플로부터의 잎 조직을, (i)단백질 추출 및 (ii)nptⅡ 발현 수준의 측정에 대한 제조자(5'-3', Inc., Boulder, CO) 추천 프로토콜을 따라서 ELISA로써 분석하여 nptⅡ 발현 수준을 측정하였다. 형질전환 실험으로부터의 결과는 하기 표 1과 표 2에 주어져 있다.
nptⅡ 분석은 테스트 시에 배양에 이용할 수 있는 뿌리내린 식물을 사용하여 몇몇 샘플들로써 수행하였다. 따라서, 모든 뿌리내린 색물들이 nptⅡ 발현에 대해 테스트되는 것은 아니다. ELISA 분석의 결과는 하기 표 1의 (IV) 열에 주어져 있다.
| 형질전환 결과 | |||
| (I) | (II) | (III) | (IV) |
| 프로모터 | 카나마이신의 선택농도(mg/l) | 형질전환 빈도 | nptⅡ 발현 |
| CAS | 200 | 50% | 100%(10/10) |
| dru259 | 90 | 60% | 67%(4/6) |
| 200 | 55% | 75%(3/4) | |
| dru110 | 60 | 63% | 17%(1/6) |
| 90 | 47% | 67%(2/3) | |
| 200 | 30% | 100%(1/1) | |
| hsp80 | 60 | 50% | 63%(5/8) |
| 90 | 27% | 100%(1/1) | |
| 200 | 60% | 100%(1/1) |
표 1에 주어진 데이터에 대해 언급하면, 형질전환 빈도는 초기 조직 외식편의 총 수에 대한, 선택제(카나마이신)의 존재 하에 뿌리를 내릴 수 있는 재생 발아를 생산하는 조직 외식편의 수의 비를 백분율로 표한 것으로 정의된다. 백분율로 표현되는 NptⅡ 발현 수준은, 실시예 12에 기술된 ELISA 분석법의 결과에 기초한, nptⅡ에 대해 테스트된 뿌리내린 식물의 총 수에 대한 nptⅡ 양성 식물의 비이다. 양성 nptⅡ 결과는 백그라운드보다 큰 ELISA 값이다. 예를 들어, 열(IV) 하의 첫 번째 기재사항은, nptⅡ에 대하여 테스트된 10개의 샘플로부터 10개가 양성 ELISA 결과를 보인다는 것을 나타낸다.
nptⅡ의 상대적 발현 수준은 표 2에 주어진다. CAS::nptⅡ 구성체를 함유하는 트랜스유전자 식물로부터의 데이터는, CAS 프로모터를 함유하는 형질전환체에서 관찰되는 높은 발현 수준 때문에 표 2에 포함되어 있지 않다. 분석된 두 개의 CAS::nptⅡ 샘플로부터의 값은 nptⅡ의 6000pg/ml을 초과했다.
도 5에서 그래프로 예시되었고 하기 표 2에 주어진 샘플들에 걸친 발현의 범위는 전형적으로 식물 내의 트랜스유전자 발현에 대한 것이다.
상기 데이터는 예의 dru259 및 dru110 프로모터가, hsp80 프로모터보다 그 지배하에 있는 유전자의 낮은 수준의 발현을 지시한다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 두 예의 라즈베리 dru 프로모터는 양쪽 다 트랜스유전자의 선택을 가능하게 하는 충분한 수준의 nptⅡ를 발현할 수 있다.
본 발명이 특정 방법과 구체예를 기술하였으나, 다양한 변형과 변화가 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있음이 고려되어야 할 것이다.
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인: 애그리토프
(ii) 발명의 명칭: 식물 내의 트랜스유전자 발현을 위한 라즈베리 프로모터
(iii) 서열의 수: 20
(iv) 대응 주소:
(A) 수신처: Dehlinger & Associates
(B) 거리: 스위트 250 캠브리지 애비뉴 350
(C) 시: Palo Alto
(D) 주: CA
(E) 국가: USA
(F) 우편번호: 94306
(v) 컴퓨터 가독 형태
(A) 매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 상용성
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현재 출원 데이타
(A) 출원 번호
(B) 출원 날짜
(C) 분류
(vii) 우선권 출원 데이타
(A) 출원 번호: US 08/592,936
(B) 출원 날짜: 29-JAN-1996
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: Evans, Susan T.
(B) 등록 번호: 38,443
(C) 참고 번호: 4257-0015
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (415) 324-0880
(B) 팩스: (415) 324-0960
(2) 서열 번호: 1에 관한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 2213 염기쌍
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(ii) 분자의 타입: DNA
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(C) 개체·분리클론명: pAG310 삽입 서열(dru 1 유전자)
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(2) 서열번호: 2에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 1356 염기쌍
(B) 타입: 핵산
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(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA
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(iv) 안티센스: No
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(C) 개체·분리클론명: 예의 완전한 길이 dru1 프로모터 서열
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(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 112 염기쌍
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(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA
(iii) 추정 서열: No
(iv) 안티센스: No
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(C) 개체·분리클론명: dru110 프로모터 서열(개시 코돈으로부터 마이너스 112 영역)
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(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 259 염기쌍
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(C) 개체·분리클론명: dru259 프로모터 서열(개시 코돈으로부터 마이너스 259 영역)
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(i) 서열의 특징:
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(i) 서열의 특징:
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(C) 개체·분리클론명: dTRANDOM 시발물질
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(vi) 기원:
(C) 개체·분리클론명: 서열번호 :1, 3' PCR 시발물질의 역번역된 서열
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CARGGNAARG TNGARCGNGA 20
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(i) 서열의 특징:
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(i) 서열의 특징:
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(2) 서열번호: 18에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
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(i) 서열의 특징:
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(vi) 기원:
(C) 개체·분리클론명: pAG302, dru1 게놈 클론
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(2) 서열번호: 20에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이: 152 아미노산
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(ii) 분자의 타입: 단백질
(iii) 추정 서열: No
(iv) 안티센스: No
(vi) 기원:
(C) 개체·분리클론명: dru1의 예견된 아미노산 코딩 서열
(xi) 서열의 기재방법: 서열 번호: 20:
Claims (29)
- 식물 세포 내에서 발현되는 키메라 유전자에 있어서,(a) 라즈베리 dru1 프로모터, 및(b) 목적 생성물을 코드화하는 DNA 서열로서, 상기 DNA 서열이 상기 프로모터에 이종이고, 상기 DNA 서열이 상기 생성물의 구성적 발현이 가능하도록 상기 프로모터에 작동가능하게 연쇄되어 있는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 서열이, 상기 세포가 형질전환되지 않은 식물 세포에 대해서는 유독하게 될 소량의 항생제에 대해 내성을 갖도록 함으로써, 상기 유전자를 함유하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 가능하게 하는 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 네오마이신 인산전이효소, 히그로마이신 인산전이효소, 및 브롬옥시닐-특이적 니트릴라아제로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 서열이 상기 폴리펩티드를 발현하는 형질전환된 식물 세포에 제초제-내성을 부여하는 폴리펩티드를 코드화하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 서열번호:1로 주어지는 서열에 함유되는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 이종 DNA 서열이 nptⅡ 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 프로모터가 dru110 또는 dru259 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 서열번호:3에 해당하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 서열번호:4에 해당하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- (a) 천연의 라즈베리 게놈에서, dru1 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연쇄된 프로모터; 및 (b) 목적 생성물을 코드화하는 DNA 서열로서, 상기 DNA 서열이 상기 프로모터에 이종이고, 상기 DNA 서열이 상기 생성물의 구성적 발현을 가능하게 하는 상기 프로모터에 작동가능하게 연쇄된 것;을 함유하는 키메라 유전자를 포함하는 식물 세포.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 키메라 유전자를 함유하는 식물 세포.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 키메라 유전자를 함유하는 식물 형질전환 벡터.
- (a) 라즈베리 dru1 프로모터; 및 (b) 목적 생성물을 코드화하는 DNA 서열로서, 상기 DNA 서열이 상기 프로모터에 이종이고, 상기 DNA 서열이 상기 생성물의 구성적 발현을 가능하게 하는 상기 프로모터에 작동가능하게 연쇄된 것;을 포함하는 키메라 유전자를 함유하는 트랜스유전자 식물.
- 제 2 항 내지 제 9 항의 키메라 유전자를 함유하는 트랜스유전자 식물.
- 라즈베리 dru1 유전자로부터의 구성적 라즈베리 프로모터를 포함하는 분리된 DNA 분자.
- 제 15 항에 있어서, 프로모터가 dru110 또는 dru259 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
- (a) 천연의 라즈베리 게놈에서, dru1 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연쇄된 라즈베리 프로모터; 및 (b)목적 생성물을 코드화하는 DNA 서열로서, 상기 DNA 서열이 상기 프로모터에 이종이고, 상기 DNA 서열이 상기 프로모터의 조절적 지배하에서, 상기 생성물의 구성적 발현을 가능하게 하는 것;을 포함하는 DNA 구성체.
- 제 17 항에 있어서, 라즈베리 프로모터가 dru110 또는 dru259 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
- 트랜스유전자를 생산하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 키메라 유전자를 식물의 어버이 세포로 도입하고, 그 형질전환된 어버이 세포를 생장시켜서 트랜스유전자 식물을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 도입 단계의 키메라 유전자가 제 7항의 키메라 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 트랜스유전자 식물 내에서 선택가능 마커 유전자의 보통의 발현을 제공하는 방법에 있어서,(a) 상기 DNA 서열이 식물 세포 내에서 기능적인 선택가능 마커 유전자를 포함하며, 상기 생성물의 발현은 상기 유전자를 함유하는 식물 세포에게 선택제의 존재하에서 생장할 수 있는 능력을 부여하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 키메라 유전자를 식물의 어버이 세포 내로 도입하는 것,(b) 형질전환되지 않은 세포에 대해 독성을 갖는 소량의 선택제의 존재 하에서 성장할 수 있는 능력에 의해, 형질전환된 식물 세포를 선택하는 것,(c) 상기 형질전환된 식물 세포를 재생시켜서 변이된 식물을 제공하는 것, 및(d) 상기 생성물을 발현하는 형질전환된 식물을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 도입이 상기 키메라 유전자를 함유하는 벡터로써 식물의 어버이 세포를 형질전환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 선택제가 히그로마이신, 제네티신, 및 카나마이신으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 선택가능한 마커 유전자가 네오마이신 인산전이효소, 히그로마이신 인산전이효소, 및 브롬옥시닐 특이적 니트릴라아제로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 프로모터가 dru110 또는 dru259인 것을 특징으로 하는 방법.
- 식물 형질전환용 키트에 있어서, 제 12 항의 식물 형질전환 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 트랜스유전자 식물 내에서 선택가능 마커 유전자의 보통의 발현을 제공하기 위한 키트에 있어서, 제 2 항의 키메라 유전자를 함유하는 식물 형질전환 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 트랜스유전자 식물 내에서 선택가능 마커 유전자의 보통의 발현을 제공하기 위한 키트에 있어서, (a) 라즈베리 dru1 프로모터, 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 것, (b)네오마이신 인산전이효소를 코드화하는 이종 DNA 서열로 이루어진 키메라 유전자를 함유하는 식물 형질전환 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 28항에 있어서, 라즈베리 프로모터가 dru110 또는 dru259 프로모터인 것을 특징으로 하는 키트.
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