KR20140088501A

KR20140088501A - Il－12 생산유도능을 갖는 유산균 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20140088501A
Application number: KR1020137034003A
Authority: KR
Inventors: 간다츠히코; 오와키마코토
Original assignee: 바이오제닉스코리아 주식회사; 도쿠테이히에이리가츠도호진 닛폰사프리멘토 린쇼겐큐카이; 유겐가이샤 바이오켄
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2014-07-10
Anticipated expiration: 2033-07-22
Also published as: DK2930235T3; EP2930235A1; ES2873951T3; CN105026549A; EP2930235B1; US20150344841A1; WO2014088183A1; CN105026549B; KR101583018B1; EP2930235A4; JP2014131504A

Abstract

본 발명은 유산균의 균체를 고수량으로 제조할 수 있고, 또한 얻어진 유산균의 활성도 높일 수 있는 새로운 기술을 제공하는 것으로, 유산균을 배지에 알칼리제를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양하고, 배양 후기에 스트레스를 주고 살균하여 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균을 제조한다. 상기 스트레스는 (a) 알칼리제를 첨가하지 않고 배양하는 것, (b) 증식이 억제되는 온도대에서 배양하는 것, (c) 염분을 1질량％ 이상 첨가하여 배양하는 것, 및 (d) pH를 5 이하로 하여 배양하는 것으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개인 것이 바람직하다.

Description

IL－12 생산유도능을 갖는 유산균 및 그 제조 방법{Lactobacillus capable of inducing production of IL-12 and method of preparing thereof}

본 발명은 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

유산균에는 장내 플로라의 개선 외에 알레르기 증상을 완화하거나, 면역 활성을 향상시키거나 하는 효과가 있는 것이 알려져 있다. 예를 들면, IL－12는 수상(樹狀) 세포나 대식 세포와 같은 항원 제시 세포로부터 분비되는 사이토카인으로, 암 세포를 직접 공격하는 내츄럴 킬러세포(NK세포)나 림포카인 활성 살생 세포(LAK세포), 킬러 T 세포(CTL세포)를 활성화하거나, 인터페론γ(IFN-γ)의 생산을 증강시키거나 하는 매우 강력한 면역 부활 물질이다. 또 Th1/Th2 밸런스를 Th1 측으로 시프트시키는 면역 조절 기능을 가진다. 유산균은 이 IL－12의 생산유도능을 갖는 것이 알려져 있다(특허 문헌 1). 유산균을 경구 섭취함으로써 장관 면역을 담당하는 면역 담당 세포에 직접 작용하여 IL－12 생산을 유도하고, 이에 따라 면역 부활이나 알레르기 증상의 완화를 도모할 수 있다.

한편, 유산균의 배양에는 여러가지 배지가 이용되고 있지만, 통상, 유산균의 생육을 양호하게 하기 위해서 효모 엑기스, 펩톤, 고기 엑기스 등을 포함한 영양분이 풍부한 배지가 이용되고 있다. 그런데 유산균의 대사 산물(예를 들면, 젖산 등)에 의해 배지의 pH가 저하하기 때문에 균의 증식이 억제되어 버리므로 배지 pH를 중성 부근으로 조정하면서 배양을 실시하는 이른바 중화 배양도 실시되고 있다.

또, 배지 조건은 얻어지는 유산균의 활성에도 영향을 주는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 특허 문헌 2에는 옥수수 침지액(corn steep liquor)과 카제인의 가수분해물을 함유하는 배지를 이용하여 유산균을 배양함으로써 면역 부활 효과가 높은 유산균을 얻는 것이 기재되어 있다. 또, 특허 문헌 3에는 유산균을 pH3.5∼pH 5.0의 배지에서 배양함으로써 면역 조절 효과가 높은 유산균을 얻는 것이 기재되어 있다.

일본국 특허 제4621218호 공보 일본국 특개 2004－41099호 공보 국제 공개 제2007/138993호

그러나, 상기 특허 문헌 2, 3과 같이 배지 조건을 변경하여 유산균의 활성을 높이는 기술은 호조건하에서의 유산균의 배양에 의해 균체를 고수량(高收量)으로 얻어 제조 비용의 경감을 도모한다는 측면에서는 반대로 불리하고, 종래 이들을 양립하는 기술은 없었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유산균의 균체를 고수량으로 제조할 수 있고, 또한 얻어지는 유산균의 활성도 높일 수 있는 새로운 기술을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 열심히 연구한 결과, 유산균의 제조에 있어서 균체의 고수량을 실현하기 위해 중화 배양을 실시하면, pH 조정을 실시하지 않고 배양한 경우에 비해 유산균의 활성은 저감하지만, 그 중화 배양 후의 배양 후기에 유산균을 생육에 바람직하지 않은 환경에 둠으로써 유산균의 활성이 회복되거나, 혹은 한층 더 높일 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

[1] 유산균을 배지에 알칼리제를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양하고, 배양 후기에 스트레스를 주고 살균하는 것을 특징으로 하는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[2] 상기 스트레스는 (a) 알칼리제를 첨가하지 않고 배양하는 것, (b) 증식이 억제되는 온도대에서 배양하는 것, (c) 염분을 1질량％ 이상 첨가하여 배양하는 것, 및 (d) pH를 5 이하로 하여 배양하는 것으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, 상기 [1]에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[3] 배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후에 집균하는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[4] 상기 유산균은 식물로부터 분리된 것인, 상기 [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[5] 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 엔테로코커스 패칼리스, 또는 락토바실러스 브레비스에 속하는 미생물인, 상기 [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[6] 상기 살균을 80℃ 이상에서 실시하는, 상기 [1]∼[5] 중 어느 한 항에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[7] 배양 후의 배양액 중에서 살균하고, 그것을 원심분리하거나, 막분리하거나, 또는 침강시킴으로써 배지를 제거하고 조제한 고형분 4∼7％의 균체 농축액 5g을 직경 35mm의 석영 유리 샬레에 넣고, 그 상태로 L*a*b* 표색계의 측색을 측정했을 때의 명도 L*값이 65 이하이고, 색도 a*값이 -4 이상이 되도록 해당 살균을 실시하는, 상기 [3]에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.

[8] 유산균을 배지에 알칼리제를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양하고, 배양 후기에 스트레스를 주고 살균하여 얻어진 것인 것을 특징으로 하는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.

[9] 배양 후의 배양액 중에서 살균하고, 그 후에 집균하여 얻어진 것인, 상기 [8]에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.

[10] 80℃ 이상에서 살균하여 얻어진 것인, 상기 [8] 또는 [9]에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.

[11] 배양 후의 배양액 중에서 살균하고, 그것을 원심분리하거나, 막분리하거나, 또는 침강시킴으로써 배지를 제거하고 조제한 고형분 4∼7％의 균체 농축액 5g을 직경 35mm의 석영 유리 샬레에 넣고, 그 상태로 L*a*b* 표색계의 측색을 측정했을 때의 명도 L*값이 65 이하이고, 색도 a*값이 -4 이상이 되도록 해당 살균을 실시하여 얻어진 것인, 상기 [9]에 기재된 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.

본 발명에 따르면, 중화 배양에 의해 유산균의 생육능을 높여 균체를 고수량으로 얻은 후에, 그 중화 배양 후의 배양 후기에 유산균을 생육에 바람직하지 않은 환경에 둠으로써 그 중화 배양에 의해 감퇴한 유산균의 활성, 특히 IL－12 생산유도능을 회복하거나, 또는 한층 더 높일 수 있다. 이에 따라, 제조 비용의 경감을 도모하면서 고활성을 나타내는 유산균을 제조할 수 있다.

도 1은 유산균의 배양 후에 미살균 균체의 착색 상태와, 소정 조건으로 살균하고 나서 집균하여 얻어진 균체의 착색 상태를 비교하는 사진이다.

본 발명에 이용하는 유산균은 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움(E.faecium) 등의 엔테로코커스속에 속하는 미생물, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(L.gasseri), 락토바실러스 말리(L.mali), 락토바실러스 플란타룸(L.plantarum), 락토바실러스 부크네리(L.buchneri), 락토바실러스 카제이(L.casei), 락토바실러스 존소니(L.johnsonii), 락토바실러스 갈리나룸(L.gallinarum), 락토바실러스 아밀로보러스(L.amylovorus), 락토바실러스 브레비스(L.brevis), 락토바실러스 람노서스(L.rhamnosus), 락토바실러스 케피르(L.kefir), 락토바실러스 파라카제이(L.paracasei), 락토바실러스 크리스파투스(L.crispatus) 등의 락토바실러스속에 속하는 미생물, 스트렙토코커스 서모필루스(Streptcoccus thermophilus) 등의 스트렙토코커스속에 속하는 미생물, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 등의 락토코커스속에 속하는 미생물, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis sp cremoris)에 속하는 미생물, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 론굼(B.longum), 비피도박테리움 아돌레센티스(B.adolescentis), 비피도박테리움 인펀티스(B.infantis), 비피도박테리움 브레베(B.breve), 비피도박테리움 카테눌라툼(B.catenulatum) 등의 비피도박테리움속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다.

상기 유산균 중 식물로부터 분리된 것인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이나 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 후술하는 실시예에서 나타나는 바와 같이, 본 발명에 의한 작용 효과를 현저히 누릴 수 있으므로 특히 바람직하게 적용된다.

본 발명에 있어서는, 유산균을, 그 배양의 전단에 있어서 충분히 증식하게 하여 균체의 고수량을 확보한다. 그러기 위해서는 유산균의 증식에 적합한 배지에서 배양하는 동시에, 유산균의 대사 산물(예를 들면, 젖산 등)에 의한 pH 저하를 억제하기 위해 배지에 알칼리제를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양하는 것이 필요하다.

알칼리제로는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘 등의 수용액이나 암모니아 등을 이용할 수 있다. pH는 바람직하게는 pH5.8∼7.5, 보다 바람직하게는 pH6.0∼6.8로 유지한다. pH 조정은 수동으로 실시해도 되지만, pH자동제어장치(pH stat) 등을 이용하면 간편하고 정확하다.

배지는 유산균의 증식에 적합한 것이면 특별히 제한은 없다. 유산균의 증식에 적합한 배지로는 효모 엑기스, 펩톤, 고기 엑기스 등을 포함하는 영양분이 풍부한 배지를 들 수 있다. 시판 중인 배지에도 「Difco Lactobacilli MRS Broth」(상품명, 일본 벡턴 디킨슨 주식회사), 「MRS부이욘 MERCK」(상품명, Chemicals사) 등이 있고, 이들을 이용해도 된다. 또, 유산균의 종류에 따라 특수한 배지 조성이 필요한 경우 등 적절히 원하는 배지 조성을 이용하는 것에 특별히 제한은 없다.

상기 중화 배양의 전형적인 예를 들면, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 「Difco Lactobacilli MRS Broth」(상품명, 일본 벡턴 디킨슨 주식회사)의 배지에서 pH6.5∼6.8로 유지하고 35∼38℃에서 16∼30시간 배양했을 때에는 초발(初發) 균체 농도 1×10^6∼1×10⁷cfu/mL로 했을 때에 최종 균체 농도 5×10^9∼5×10¹⁰cfu/mL에까지 증식시킬 수 있다.

또, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 「Difco Lactobacilli MRS Broth」(상품명, 일본 벡턴 디킨슨 주식회사)의 배지에서 pH6.0∼6.2로 유지하고 30∼35℃에서 18∼40시간 배양했을 때에는 초발 균체 농도 1×10^6∼1×10⁷cfu/mL로 했을 때에 최종 균체 농도 5×10^9∼5×10¹⁰cfu/mL에까지 증식시킬 수 있다.

본 발명에 있어서는 또 상기 중화 배양 후의 배양 후기에 스트레스를 주는 것이 필요하다. 여기서 「스트레스」란, 유산균의 생육에 바람직하지 않은 환경 모두를 넓게 의미한다. 이에 따라, 상기의 중화 배양에 의해 감퇴한 유산균의 활성, 특히 IL－12 생산유도능을 회복하거나, 혹은 한층 더 높일 수 있다.

스트레스를 주는 방법으로는 예를 들면 이하와 같은 것을 들 수 있다.

(a) 알칼리제를 첨가하지 않고 배양한다.

(b) 증식이 억제되는 온도대에서 배양한다.

(c) 배양액 중의 농도로서 1질량％ 이상의 염분을 첨가하여 배양한다.

(d) pH를 5 이하로 하여 배양한다.

상기 (a)에서는, 유산균이 생산하는 젖산에 의해서 배지의 pH가 내려가 유산균이 저pH하에 놓임으로써 생육에 바람직하지 않은 환경이 된다. 이 경우, 적어도 pH 5 이하가 될 때까지 알칼리제를 첨가하지 않는 상태로 배양하는 것이 바람직하다.

상기 (b)에서는, 유산균이 소정의 온도하에 놓임으로써 생육에 바람직하지 않은 환경이 된다. 온도 조건은 이용하는 유산균에 따라 다양하며 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 생육에 알맞은 온도대에서부터 바람직하게는 3∼12℃, 보다 바람직하게는 5∼10℃ 고온측 혹은 저온측으로 시프트한 온도대 등이다.

상기 (c)에서는, 유산균이 고침투압하에 놓임으로써 생육에 바람직하지 않은 환경이 된다. NaCl 등의 염분을 배양액 중의 농도로서 바람직하게는 0.5질량％ 이상, 보다 바람직하게는 1∼2질량％ 함유하도록 첨가한다.

상기 (d)에서는, 유산균이 저pH하에 놓임으로써 생육에 바람직하지 않은 환경이 된다. 젖산 등의 산성제에 의해 바람직하게는 pH5 이하, 보다 바람직하게는 pH5∼3이 되도록 조정한다.

스트레스를 주는 방법은 상기에 예시한 것에 한정되는 것은 아니고, 다른 방법에 의한 스트레스를 적절히 채용할 수 있다. 또, 2종 이상의 방법에 의한 스트레스를 동시에 또는 순차로 주어도 된다. 또한, 각각 같은 방법에 의한 스트레스를 시간을 두고 주어도 되고, 다른 방법에 의한 스트레스와 번갈아 주어도 된다. 그 부여 형태에 특별히 제한은 없다.

본 발명에 있어서는 또한 상기와 같은 배양을 끝낸 유산균을 살균하는 것이 필요하다. 이에 따라, 유산균의 자기소화 등을 방지하여 품질의 안정성을 확보할 수 있다.

살균 방법에 특별히 제한은 없고, 통상 실시하는 바와 같이 배양 후에 배지를 여과 분리(濾別), 원심, 침강 등에 의해 제거하고 집균하여, 물이나 완충액 등에 의해서 현탁하여 유산균의 농축액을 조정하고, 이것을 80∼100℃에서 오토클레이브 처리하는 등의 방법을 들 수 있다. 또, 유산균을 건조 분말화하는 목적으로 분무 건조 장치 등에 공급한 경우에도, 조건에 따라서는 그 과정에서 균이 살균되므로 그러한 처리라도 좋다.

다만, 후술하는 실시예에서 나타나는 바와 같이, 배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후 집균하는 편이, 집균 후 배양액을 제거한 상태로 살균하는 것보다도 IL－12 생산유도능이 높아진다. 그래서 바람직한 형태로는, 배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후에 집균한다. 이 경우, 예를 들면 배양 후의 배양액에 가열살균 처리를 실시하고, 그 후에 여과 분리, 원심, 침강 등에 의해서 배지를 제거하고 집균하는 방법 등을 들 수 있다. 혹은, 배양 후에 배지의 일부를 여과 분리, 원심, 침강 등에 의해서 제거하고 2∼10배로 농축된 농축액을 조제한 후, 이것에 가열살균 처리를 실시하고, 그 후에 여과 분리, 원심, 침강 등에 의해서 나머지 배지를 제거하고 집균하는 방법 등이어도 된다. 가열살균은 80℃ 이상에서 실시하는 것이 바람직하고, 80∼100℃에서 5∼20분간 실시하는 것이 보다 바람직하다.

그런데 후술하는 실시예에서 나타나는 바와 같이, 배양 후의 배양액 중에서 살균하면, 얻어지는 유산균의 균체는 황갈색으로 착색되고, 그 색이 어느 일정한 농도가 되면 IL－12 생산유도능이 높아진다. 따라서, 살균은 유산균의 균체의 황갈색이 소정의 농도 이상이 되도록 실시하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 이하와 같이 하여 구해지는 L*a*b* 표색계의 명도 L*값이 65 이하이고, 색도 a*값이 -4 이상이 되도록 실시하는 것이 바람직하다.

배양 후의 배양액 중에서 살균하고, 그것을 원심분리하거나, 막분리하거나, 또는 침강시킴으로써 배지를 제거하고 고형분 4∼7％의 균체 농축액을 조제한다. 그 5g을 직경 35mm의 석영 유리 샬레에 넣고, 그 상태를 L*a*b* 표색계로 측색했을 때의 명도 L*값과 색도 a*값을 구한다. 또한, 측색은 색차계 등을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 유산균은, 미립자화 및 재응집 방지 처리를 실시해도 좋다. 이것에 의하면, 유산균의 IL－12 생산유도능 등의 활성, 품질의 안정성을 더욱 잘 유지할 수 있다. 그 방법으로는 일본 특허 제4621218호 공보에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는 이하와 같이 실시할 수 있다.

우선, 유산균을 그 평균 입경이 1미크론(마이크로미터) 미만의 나노미터(nm) 사이즈, 바람직하게는 0.6미크론 정도가 될 때까지 분쇄 혹은 분산한다. 이 분쇄 처리와 분산 처리를 따로따로 실시할 수도 있고, 동시에 실시할 수도 있다. 또한 해당 입경이 1미크론 미만인지 아닌지는 입도 분포계 혹은 전자현미경 등으로 측정할 수 있다.

미립자화의 방법으로는 습식·건식을 불문하고, 교반, 믹서, 볼밀, 비즈밀, 제트밀, 호모게나이저, 제너레이터, 「나노마이저」(요시다 기계공업 주식회사제), 「알티마이저 시스템」(주식회사 스기노머신제) 등에 의한 공지의 수법을 들 수 있지만, 유산균의 경우에는 습식 분산처리에 의해 실시하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 유산균의 균체를 건조물 환산으로 2∼30질량％, 보다 바람직하게는 5∼20질량％ 함유하고, pH6.0∼7.0으로 조정한 현탁액을 고압 호모게나이저를 이용하여, 압력 80∼200kg/㎠, 보다 바람직하게는 100∼170kg/㎠의 조건으로 순환시킴으로써 실시할 수 있다.

다음으로, 분산제를 이용하여 재응집 방지 처리를 실시한다. 그 방법으로는 상기 미립자화 시에 유산균의 균체에 분산제를 첨가하고, 이것을 미립자화하여, 이어서 분말화하거나, 또는 유산균의 균체를 미립자화하고, 이것에 분산제를 첨가하여 분말화하는 것이 바람직하다. 분말화는 유산균의 균체를 미립자화한 후에, 분무 건조나 동결 건조에 의해 건조시킴으로써 실시할 수 있다. 이에 따라, 미립자화한 유산균의 균체에 분산제를 접촉시킨 상태로 분말화하고 있으므로, 물 등에 재현탁한 때에도 분산성이 좋고, 미립자화된 유산균의 균체의 재응집을 방지하여 유산균의 활성, 품질의 안정성을 잘 유지할 수 있다.

그 분산제로는 덱스트린, 가용성 식물 섬유, 난소화성 덱스트린 등의 다당류, 트레할로스, 유당, 맥아당 등의 저분자 당류, 콜라겐, 유청(whey) 분해물, 대두단백 분해물 등의 펩티드류 등을 바람직하게 예시할 수 있다. 그 첨가량은 유산균의 균체의 건조물 환산 100질량부에 대하여 분산제 20∼1,000질량부인 것이 바람직하고, 50∼1,000질량부인 것이 보다 바람직하며, 100∼600질량부인 것이 가장 바람직하다. 분산제의 첨가량이 유산균의 균체의 건조물 환산 100질량부에 대하여 20질량부 미만이면 분산제의 첨가에 의한 효과가 부족하고, 1,000질량부를 넘으면 유산균의 균체의 함유량을 확보할 수 없기 때문에 모두 바람직하지 않다.

이하, 본 발명에 의해 얻어지는 유산균의 이용 형태의 일례를 든다.

본 발명에 의해 얻어지는 유산균은 후술하는 실시예에서도 나타나는 바와 같이, IL－12 생산 유도 효과가 뛰어나므로 IL－12 생산유도제의 유효 성분으로서 매우 알맞다. 그 경우, 상기 미립자화 및 재응집 방지 처리를 실시한 것을 그대로, 혹은 그것을 분무 건조나 동결 건조에 의해 건조한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 이에 반해, 미립자화한 유산균의 균체를 물 등에 의해 세정하면, 미립자화에 의해 저분자화한 성분이나, 미립자화에 의해 균체 바깥에 노출된 내용 영양 성분이 씻겨 내려가 버릴 우려가 있으므로 바람직하지 않다.

상기 IL－12 생산 유도제에 있어서는 본 발명에 의해 얻어지는 유산균 이외에, 다른 소재를 배합하는 것에 특별히 제한은 없고, 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 기재나 담체를 첨가하고, 공지의 제제 방법에 의해서, 예를 들면 정제, 과립제, 캡슐제, 환제(丸劑), 산제(散劑), 액제(液劑), 분말제, 젤리상제, 캔디형상제 등의 형태로 하여, 이것을 경구제로서 이용할 수 있다. 또, 연고제, 크림제, 젤, 로션 등의 형태로 하여, 이것을 피부 외용제로서 이용할 수 있다.

상기 IL－12 생산 유도제에 있어서는 본 발명에 의해 얻어지는 유산균 이외에, 다른 소재로서 식품 원료를 배합할 수도 있다. 식품 원료로는 예를 들면, 각종 당질이나 유화제, 감미료, 산미료, 과즙, 플레이버 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 벌꿀 등의 당류, 소르비톨, 자일리톨, 에리트리톨, 락티톨, 파라티니트(palatinit) 등의 당알코올, 자당 지방산 에스테르, 글리세린당 지방산 에스테르, 레시틴 등의 유화제를 들 수 있다. 그 밖에도 비타민 A, 비타민 B류, 비타민 C, 비타민 E 등의 각종 비타민류나 허브 엑기스, 곡물 성분, 야채 성분, 젖 성분 등을 배합해도 된다.

상기 IL－12 생산 유도제에 있어서는, 유산균의 균체의 함유량은 각종의 형태로 했을 경우에 그것이 사용되는 양과 유효 투여량과의 관계를 감안하여 적절히 정하면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 통상, 고형상의 형태의 경우에는 유산균의 균체의 건조물 환산으로 0.1∼100질량％인 것이 바람직하고, 1∼50질량％인 것이 보다 바람직하다. 또, 액상 또는 젤리상의 형태의 경우에는 유산균의 균체의 건조물 환산으로 0.1∼50질량％인 것이 바람직하고, 1∼5질량％인 것이 보다 바람직하다.

상기 IL－12 생산 유도제의 투여 형태로는 몸속에서 작용시키기 위해 경구적으로 섭취해도 되고, 혹은 피부에 도포하여 이용해도 된다. 또, 흡인하여 호흡기계에 적용해도 되며, 그 투여 형태가 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 IL－12 생산 유도제의 투여량은 특별히 제한은 없지만, 전형적으로 경구적으로 섭취하는 경우에는 유산균의 균체의 건조물 환산으로 성인 1일당 대략 0.01∼10g이다. 이들 사료의 조성이나 형태는 경구 섭취하여 이용하는 경우의 상기 이용 형태에 관한 기재에 준하여 이룰 수 있다.

한편, 본 발명에 의해 얻어지는 유산균은 쿠키, 센베이, 젤리, 양갱, 요구르트, 만쥬 등의 과자류, 청량 음료, 영양 음료, 스프 등 음식품에 배합하여 이용할 수도 있다. 또, 통상의 음식품보다 적극적인 의미로 보건, 건강 유지·증진 등을 목적으로 하여 제공되는 건강식품에 배합해도 된다. 또한, 가축, 경주마, 관상용 동물 등의 사료；펫푸드 등 동물용의 사료에 이용해도 된다.

실시예

이하 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[사용 균주］

유산균으로 표 1에 나타내는 균주를 이용했다.

[유산균의 배양］

유산균의 배양은 특별히 나타내는 것 이외는 다음과 같이 하여 실시했다.

배지로 「Difco Lactobacilli MRS Broth」(상품명, 일본 벡턴 디킨슨 주식회사)를 사용하고, 본 배양의 개시 시의 배양액의 pH를 pH6.0∼6.5로 설정하여, pH를 조정하면서 배양하는 경우에, 초발 균체 농도를 1×10^6∼1×10⁷cfu/mL로 했을 때에, 최종 균체 농도가 대략 5×10^9∼5×10¹⁰cfu/mL가 되도록 배양 조건을 설정했다. 배양은 각각의 균주의 생육에 알맞은 온도, 즉, 유산균 락토바실러스 플란타룸 nF1과 유산균 락토바실러스 플란타룸 SNK12와 락토바실러스 플란타룸 KH3에 대해서는 32℃, 유산균 엔테로코커스 패칼리스 KH2에 대해서는 37℃, 유산균 락토바실러스 브레비스 FERP BP-4693에 대해서는 31∼32℃, 유산균 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 CF4에 대해서는 30℃에서 실시했다. 배양액의 pH를 조정하는 경우에는 pH자동제어장치(pH stat)를 이용하여 가성 소다로 설정 pH±0.1로 조정하면서 배양을 실시했다.

[배양 후의 처리］

배양 후의 처리를, 특별히 나타내는 것 이외는 다음과 같이 하여 실시했다.

90mL의 배양액을 오토클레이브에서 80℃로 10분 살균한 후, 원심으로 집균하고, 인산완충액 약 20mL에 균체 농도가 1∼4％가 되도록 현탁했다. 이것을 테프론 호모게나이저를 이용해 균체끼리 응집하는 것을 피하여 가능한 한 분산시키도록 했다. 이와 같이 하여 얻어진 균체 현탁액을 121℃로 15분 멸균한 후, 초음파 처리를 30분 실시하여, 균체의 응집을 방지하는 동시에, 별도로 균체 현탁액의 고형분 함량을 측정하고, 그 값을 기초로 소정의 농도로 조정하여 이하의 IL－12 생산 유도 시험을 실시했다.

[IL－12 생산 유도 시험］

IL－12 생산유도능의 시험에는 마우스 비장세포의 시험관내 배양계를 이용했다. 구체적으로는, 8주령의 BALB/c 마우스로부터 비장세포를 채취하고, 일반적인 방법에 따라 10％ FBS, 10μM 2-메르캅토에탄올, 10mM HEPES, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지에서 세포 부유액(1.0×10⁶ cells/mL)을 조제했다. 이것에 유산균을 건조물 환산으로 종농도(終濃度) 10μg/mL가 되도록 첨가하여 세포/유산균 혼합액을 조제하고, 96 홀 플레이트의 각 웰에 0.2mL씩 뿌렸다. 온도 37℃, 5％ CO₂의 조건하에서 24시간 배양하고, 배양 후의 배양 상청을 회수하여 배양 상청 중의 IL－12량을 ELISA법으로 측정했다. 또한, 측정에는 키트 「EMIL12」(상품명, Thermo Scientific사)를 사용하고, 결과는 이뮤노플레이트(IMMUNO PLATE)의 6웰의 평균으로 구했다.

＜시험예 1＞

유산균 락토바실러스 플란타룸 nF1을 사용하고, 배지에 알칼리제(가성 소다)를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양(이하, 「중화 배양」이라고 한다.)한 경우와, pH를 조정하지 않고 배양(이하, 「정치 배양」이라고 한다.)한 경우에 대해서, 얻어진 유산균의 IL－12 생산유도능을 비교했다. 또, 중화 배양 후에 정치 배양하여 얻어진 유산균에 대해서도 그 IL－12 생산유도능을 비교했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2에 나타내는 바와 같이, 유산균 락토바실러스 플란타룸 nF1을 32℃에서 20시간, 정치 배양하여 얻은 균체의 IL－12 생산유도능은 IL－12 생산량이 1,800pg/mL였다. 이에 반해, 같은 배지에서 중화 배양하면, 정치 배양에 비해 대략 3배 정도의 균체의 수량 증가를 얻을 수 있었지만, IL－12 생산유도능으로서는 IL－12 생산량이 50pg/mL로 저하되어 버렸다. 한편, 중화 배양을 20시간 실시한 후 pH자동제어장치(pH stat)를 끄고 정치 배양을 실시한 결과, 그 정치 배양 시간이 길어질수록 IL－12 생산유도능이 높아지는 것이 분명해졌다. 따라서, 중화 배양에 의한 IL－12 생산 유도 활성의 감소는 그 중화 배양 후 pH 제어를 실시하지 않고 정치 배양함으로써 회복되는 것이 분명해졌다.

＜시험예 2＞

유산균 락토바실러스 브레비스 FERP BP-4693을 사용하여 시험예 1과 마찬가지의 시험을 실시했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타내는 바와 같이, 유산균 락토바실러스 브레비스 FERP BP-4693을 31℃에서 29시간, 정치 배양하여 얻은 균체의 IL－12 생산유도능은 IL－12 생산량이 783pg/mL였다. 이에 반해, 같은 배지에서 중화 배양하면, 정치 배양에 비해 대략 3배 정도의 균체의 수량 증가를 얻을 수 있었지만, IL－12 생산유도능으로서는 IL－12 생산량이 152pg/mL로 저하되어 버렸다. 한편, 중화 배양을 23시간 실시한 후 pH자동제어장치(pH stat)를 끄고 정치 배양을 실시한 결과, 그 정치 배양 시간이 길어질수록 IL－12 생산유도능이 높아지는 것이 분명해졌다. 따라서, 중화 배양에 의한 IL－12 생산 유도 활성의 감소는 유산균의 종류에 관계없이 그 중화 배양 후 pH제어를 실시하지 않고 정치 배양함으로써 회복되는 것이 분명해졌다.

＜시험예 3＞

시험예 1, 2의 결과, 중화 배양 후 pH 제어를 멈추고 정치 배양하면 IL－12 유도능이 높아지는 것이 분명해졌으므로, 그 정치 배양 시에 해당 균을 가혹한 조건하에 둠으로써 더욱 유도능이 높아지는지 어떤지를 검토했다. 또한, 유산균으로는 유산균 락토바실러스 플란타룸 SNK12를 사용했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4에 나타내는 바와 같이, 유산균 락토바실러스 플란타룸 SNK12를 32℃에서 24시간 정치 배양하여 얻은 균체의 IL－12 생산유도능은 IL－12 생산량이 1,050pg/mL였다. 이에 반해, 같은 배지에서 20시간 중화 배양하면, 정치 배양에 비해 대략 3배 정도의 균체의 수량 증가를 얻을 수 있었지만, IL－12 생산유도능으로서는 IL－12 생산량이 50pg/mL로 저하되어 버렸다. 한편, 중화 배양을 20시간 실시한 후 pH자동제어장치(pH stat)를 끄고 4시간 정치 배양을 실시한 결과, IL－12 생산유도능이 IL－12 생산량 1,100pg/mL에까지 회복했다. 또한, 이 정치 배양 시, 배지 중에 식염을 첨가하거나, 유산균 락토바실러스 플란타룸 SNK12의 증식에는 가혹한 40℃까지 배양 온도를 높이거나 하면, IL－12 생산유도능이 더욱 높아지는 것이 분명해졌다. 이 IL－12 생산유도능의 활성화의 효과는 정치 배양, 식염 첨가, 고온의 3조건을 조합했을 때에 가장 높았다.

이상으로부터, 유산균을 억지로 생육에는 가혹한 스트레스 조건하에 둠으로써 해당 균의 IL－12 생산유도능이 회복하거나, 더욱 유도능이 높아지거나 하는 것이 분명해졌다. 따라서, 중화 배양 후에 스트레스를 주는 것에 의해 충분한 균체 수량을 얻으면서 IL－12 생산유도능이 높은 유산균을 제조할 수 있는 것이 분명해졌다.

＜시험예 4＞

유산균을 제제로서 시장에 공급할 때에는 자기소화 등을 방지하여 안정성을 확보하기 위해 살균하는 것이 필요하다. 배양 종료 후에 균체를 살균하거나 집균하거나 하는 공정에 대해서는 MF막이나 원심분리에 의해 배지 성분을 제거하고, 유산균만을 물이나 완충액 등의 매체에 현탁한 농축액을 살균 처리하는 방법과, 배양 후의 배양액을 남긴 상태로 미리 살균 처리를 실시하고 그 후 집균하는 방법의 2가지 방법을 고려할 수 있다. 이 중 어느 쪽 방법을 채용해야 할 것인가를 검토했다. 검토를 위해 상기 시험예 1∼3에서 실시한 바와 같이, 배양 후의 배양액을 그대로 80℃에서 10분 살균한 경우와, 원심에 의해 집균한 후 인산완충액에 현탁하여 같은 조건으로 살균한 경우를 비교했다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.

표 5에 나타내는 바와 같이, 어느 균주에 있어서도, 배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후 집균하는 편이, 집균 후 배양액을 제거한 상태로 살균하는 것보다도 IL－12 생산유도능이 현저하게 높았다. 또, 어느 균주에 있어서도, 집균 후 살균하는 것보다 살균 후 집균하는 편이 균체의 황갈색의 착색이 짙었다. 이러한 결과가 얻어지는 이유는 분명하지 않지만, 배양 후의 배양액 중에서 살균 처리함으로써 집균 후 살균하는 것과는 다른 유산균의 생리 반응이 일어나기 때문은 아닐까 생각되었다.

＜시험예 5＞

시험예 4의 결과, 배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후 집균하는 편이, 집균 후 배양액을 제거한 상태로 살균하는 것보다도 IL－12 생산유도능이 높고, 또, 집균 후 살균하는 것보다 살균 후 집균하는 편이 균체의 황갈색의 착색이 짙은 것이 밝혀졌다. 그래서, 유산균의 균체의 착색과 IL－12 생산유도능의 관계에 대해 더 검토했다. 또한, 유산균으로는 유산균 락토바실러스 플란타룸 KH3를 사용하고, 18시간 중화 배양 후, 6시간 정치 배양하고, 그 배양 후에 그대로 각 조건으로 가열 살균했다.

유산균의 균체의 착색은 색차계(일본전색공업 주식회사제 SQ-300H)를 이용하여, 이하와 같이 하여 측색했다.

살균 후의 배양액을 90mL 취하여 50mL 원심관에 45mL씩 분주하고, 8400rpm, 5분 원심분리하여 균체를 모았다. 이 균체를 인산완충액에 현탁하고, 테프론 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 재차 원심분리를 실시하여 배지 성분을 제거했다. 얻어진 침전을 인산완충액에 현탁하고, 테프론 호모게나이저로 균질화하여 최종적으로 25mL의 용량으로 조제했다. 이상과 같이 하여 조제한 고형분 4％의 균체 현탁액을 석영 유리 샬레(35mm 지름)로 옮기고, 그 상태를 색차계(일본전색공업 주식회사제 SQ-300H)에 의해 L*a*b* 표색계의 명도 L*값과 색도 a*값과 b*값을 측정했다. 또, 도 1에는 그 균체 현탁액의 사진을 나타낸다.

결과를 정리하여 표 6에 나타낸다.

표 6에 나타내는 바와 같이, 미살균보다도 배양 후에 소정 조건의 살균 처리를 실시하는 편이, 유산균의 IL－12 생산유도능이 높아졌다. 그 살균 온도는 80∼100℃가 보다 바람직하고, 균체의 명도 L*값의 저하 및 색도 a*값의 증가와 IL－12 생산유도능의 향상이 매우 좋게 상관하고 있었다.

Claims

유산균을 배지에 알칼리제를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양하고, 배양 후기에 스트레스를 주고 살균하는 것을 특징으로 하는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 스트레스는 (a) 알칼리제를 첨가하지 않고 배양하는 것, (b) 증식이 억제되는 온도대에서 배양하는 것, (c) 배양액 중의 농도로서 1질량％ 이상의 염분을 첨가하여 배양하는 것, 및 (d) pH를 5 이하로 하여 배양하는 것으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나인, IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후에 집균하는, IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유산균은 식물로부터 분리된 것인, IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 엔테로코커스 패칼리스, 또는 락토바실러스 브레비스에 속하는 미생물인, IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 살균을 80℃ 이상에서 실시하는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,
배양 후의 배양액 중에서 살균하고, 그것을 원심분리하거나, 막분리하거나, 또는 침강시킴으로써 배지를 제거하고 조제한 고형분 4∼7％의 균체 농축액 5g을 직경 35mm의 석영 유리 샬레에 넣고, 그 상태로 L*a*b* 표색계의 측색을 측정했을 때의 명도 L*값이 65 이하이며, 색도 a*값이 -4 이상이 되도록 해당 살균을 실시하는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균의 제조 방법.
유산균을 배지에 알칼리제를 첨가하여 pH를 조정하면서 배양하고, 배양 후기에 스트레스를 주고 살균하여 얻어진 것인 것을 특징으로 하는 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.
제 8 항에 있어서,
배양 후의 배양액 중에서 살균하고 그 후에 집균하여 얻어진 것인, IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
80℃ 이상에서 살균하여 얻어진 것인, IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.
제 9 항에 있어서,
배양 후의 배양액 중에서 살균하고, 그것을 원심분리하거나, 막분리하거나, 또는 침강시킴으로써 배지를 제거하고 조제한 고형분 4∼7％의 균체 농축액 5g을 직경 35mm의 석영 유리 샬레에 넣고, 그 상태로 L*a*b* 표색계의 측색을 측정했을 때의 명도 L*값이 65 이하이며, 색도 a*값이 -4 이상이 되도록 해당 살균을 실시하여 얻어진 것인 IL－12 생산유도능을 갖는 유산균.