KR20250025384A

KR20250025384A - Ceacam5 및 cd47에 대한 이중특이적 항체 및 ceacam5 및 cd3에 대한 이중특이적 항체의 조합 요법

Info

Publication number: KR20250025384A
Application number: KR1020247043424A
Authority: KR
Inventors: 바네사 부아토이스; 안자 세킨거; 디르크 호세
Original assignee: 람카프 바이오 베타 엘티디.
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2025-02-21
Also published as: IL316117A; WO2023242351A1; CN119998319A; MX2024013063A; JP2025523424A; US20250230256A1; EP4514851A1; AU2023291779A1; CA3248576A1

Abstract

본 발명은 인간 암배아 항원 CEACAM5 및 CD3ε에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 암 치료에 사용하기 위한, 인간 암배아 항원 CEACAM5 및 인간 CD47에 결합하는 이중특이적 항체, 상기 조합 및 질환 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체 및 CEACAM5 및 CD3에 대한 이중특이적 항체의 조합 요법

서열 목록에 대한 참조

본 출원과 함께 출원된 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 하기 기술되는 바와 같은 CEA 및 인간 CD3ε에 결합하는 이중특이적 항체(CEAxCD3 이중특이적 항체)와 조합된, 암 치료에서 사용하기 위한, 하기 기술되는 바와 같은 인간 암배아 항원 5(CEACAM5, CEA: carcinoembryonic antigen) 및 인간 CD47에 결합하는 이중특이적 항체(CEAxCD47 이중특이적 항체), 상기 조합, 및 질환 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 배경

CEA는 염색체 19q13 상의 CEA 관련 세포 부착 분자(CEACAM: CEA-related cell adhesion molecule)와 임신 특이적 당단백질(PSG: pregnancy-specific glycoprotein) 하위군 사이에서 나뉘어진 22개의 유전자에 의해 코딩된 인간에서 12개의 밀접하게 관련된 단백질을 포함하는 CEACAM 패밀리에 속한다(문헌 [Beauchemin N & Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev. 2013]). CEACAM은 예컨대, 세포-세포 인식과 같은 다양한 생리학적 프로세스에 관여하고, 조직 구조의 형성 및 혈관신생에서 인슐린 항상성 조절 및 T 세포 증식에 이르는 세포 프로세스를 조절하고; CEACAM은 또한 숙주 특이적 바이러스 및 박테리아에 대한 수용체로 확인되었다(문헌 [Kuespert K et al., Curr Opin Cell Biol. 2006]). CEA(CEACAM5 또는 CD66e; UniProtKB - P06731)는 배아 및 태아 발달 초기에 존재하며, 정상적인 성인 조직에서 그의 발현을 유지한다. 그의 주요 발현 부위는 결장의 원주형 상피 세포및 배상 세포, 특히, 소낭의 상부 1/3 및 빈 내강 표면에 있다.

CEA는 결장직장 암종, 위 암종, 폐 암종 및 췌장 암종을 포함하나, 이에 제한되지 않는 상피 기원의 종양에서 (과다) 발현된다(문헌 [Beauchemin N & Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev. 2013]에서 리뷰). 그의 전단 발현을 유지하지 못하게 됨에 따라 전체 세포 표면에 걸쳐 분포하게 된다(문헌 [Hammarstrom, Semin Cancer Biol 1999]). 대개는 CEA 양성 종양에서 과다발현이 관찰되고, 전체 표면에 걸쳐 종양 세포 기반 CEA가 분포한다는 점을 고려하면, CEA는 같은 조직의 정상 세포는 살리면서, 암 세포에 대한 면역요법 공격을 위한 흥미로운 표적이 된다.

인간 PD-1 축 길항제 및 T 세포 재지시 및 활성화 항CEA/항CD3 이중특이적 항체(시비사타맙(Cibisatamab))의 조합에 의해 CEA 발현 암을 치료하는 방법은 US20140242079 및 WO2017118657(이들은 각각 그 전문이 참조로 포함)에 언급되어 있고, 임상 결과는 ASCO 연례 회의 2017에서 발표되었다(문헌 [Tabernero et al., J Clin Oncol 35, 2017 (suppl;abstr 3002)]). 022년 6월 시비사타맙을 사용한 유일의 활동 모집 임상 시험은 T 세포의 공자극성 수용체 4-1BB를 자극하여 T 세포의 추가 활성화를 유도할 수 있는 FAP-4-1BBL 이중특이적 항체와 조합한 시험이다(ClinicalTrial.gov Identifier NCT04826003). 환자는 항약물 항체(ADA: anti-drug 항체) 형성과 연속적인 노출 손실을 피하기 위해 B 세포 고갈제인 오비누투주맙(Obinutuzumab)으로 사전 치료된다. 시비사타맙의 ADA 형성과 노출 손실은 상기 언급한 시비사타맙 임상 시험 중 단일요법 및 PD-L1 억제제와의 병용 요법에서 관찰되었다.

면역 체크포인트 경로의 2개 이상의 상이한 표적에 결합하는 면역 체크포인트 길항제, 및 CEA 및 T 세포 표면 항원에 결합하는 T 세포 재지시제를 투여함으로써 종양을 치료하는 방법이 WO2015112534에 언급되어 있다. CEACAM5 및 과립구에 결합하는 클래스 I 항체는 US20110064653에 언급되어 있다.

인간 CD47(UniProtKB - Q08722(CD47_HUMAN; IAP))은 리간드 트롬보스폰딘-1(TSP-1) 및 신호 조절 단백질 알파(SIRPα: signal-regulatory protein alpha; CD172a; UniProtKB P78324)에 결합하고, 특히, SIRPα를 발현하는 대식세포에 대해 면역계에 "돈트 잇 미(don't eat me)" 신호를 보내는 역할을 할 수 있는 막관통 단백질이다. 종양 세포 표면 상의 CD47에의 SIRPα의 결합을 강력하게 억제(낮은 IC50)시키는 것은 대식세포에 의한 종양 세포의 식작용을 증가시키는 조치이다. CD47은 아폽토시스, 증식, 부착 및 이동을 비롯한 다양한 세포 프로세스에 관여한다. 추가로, 면역 및 혈관신생 반응에서 중요한 역할을 한다. CD47은 혈액 종양과 고형 종양 환자의 종양 세포에서 과다발현된다. CD47에 대한 항체는 최신 기술에 기술되어 있으며, 예컨대, 림프종과 같은 혈액 악성종양 및 고형 종양, 예를 들어, 위암을 비롯한, 상이한 종양 엔티티에서 유망한 임상전 및 초기 임상 활성을 보여주었다(문헌 [Weiskopf K., European Journal of Cancer 76 (2017) 100-109]; [Huang Y et al., J Thorac Dis 2017;9(2):E168-E174]; [Kaur et al., 항체 Therapeutics, 3 (2020) 179-192]). CD47에 결합하는 IgG1 서브클래스의 항체는 Fc에 의존하는 방식으로 혈소판 고갈(혈소판감소증) 및 적혈구(RBC: red blood cell, 빈혈) 개수 감소를 초래할 수 있다(예컨대, US20140140989 참조). 이러한 역효과를 피하기 위해, WO2017196793에는 항CD47 항체의 IgG4 서브클래스의 돌연변이체 형태(IgG4PE, S228P 돌연변이 뿐만 아니라, FcγR 결합을 감소시키기 위한 L235E 돌연변이 포함)가 기술되어 있다. FcγR 결합 및 이펙터 기능이 크게 감소된 상기 항CD47 항체는 상기 혈소판 고갈을 초래하지 않는다. CD47 및 CD20에 대한 단일 도메인 이중특이적 항체는 (von Bommel PE et al.)(문헌 [Oncoimmunol. 7 (2018) e386361]) 및 (Piccione EC et al.)(문헌 [mAbs 7 (2015)946-956])에 의해 기술되었다. (Dheilly E. et al.)(문헌 [Mol. Thera. 25 (2017) 523-533]); WO2014087248 또한 참조)은 CD19 및 CD47에 대한 이중특이적 항체를 기술한다.

서열 번호 5의 공통 중쇄(VH-CH1) 및 서열 번호 10의 CD47-상호작용 가변 경쇄 영역 VL을 포함하는 CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체는 WO2019234576, EP19213002, 및 US62943726(그의 전문이 참조로 포함)에 기술되어 있다. 서열 번호 5의 공통 중쇄 및 서열 번호 10의 CD47-상호작용 가변 경쇄 영역 VL을 포함하는 CD19 및 CD47에 대한 이중특이적 항체는 WO2014087248(그의 전문이 참조로 포함)에 기술되어 있다. WO2018098384는 CD47 및 CEACAM5를 공동 표적화하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. EP3623388은 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하기 위한 낮은 친화도를 갖는 융합 단백질 및 종양 표적화 아암을 포함하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이다. WO 2018/057955는 CD47과 메조텔린, 둘 모두에 결합하고, 공통 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. WO2019016411은 CD47 및 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 항체 분자에 관한 것이다.

국소 진행성 또는 특히, 전이성 고형암 타입의 치료에서의 특정 진전에도 불구하고, 결장직장암, 췌장암, 폐암 등과 같은 진행성 암을 앓는 환자의 무진행 생존(PFS: progression-free survival) 및/또는 전체 생존(OS: overall survival)의 새로운 항암 약물에 의해 유도된 유의적인 증가는 여전히 다소 제한적이고, 일반적으로 치유법이 없다. 암 면역요법에 많은 희망이 있었고, 확실하지만, 제한적인 성공이 있다. 종양은 T 이펙터 세포 및 대식세포와 같은 다른 면역 세포에 의한 파괴로부터 세포를 보호하기 위한 대책을 개발한다. 지난 10년 (수십 년) 동안 암 면역요법 기반 전략법은 상기 종양 방어 대책에 대응하고, 암 세포에 대하여 T 세포를 재지시하는 데 어느 정도 성공을 이루었다. 상기 전략법의 가장 두드러진 예는 특정 면역 체크포인트의 억제제/활성제이다. 예를 들어, PD-1 축 길항제와 같은 체크포인트 억제제는 특정 고형암과 싸우기 위해 T 이펙터 세포를 재활성화시키는 것으로 나타났다. 그러나, 모든 고형 종양 타입이 PD-1 축 길항제에 반응하는 것은 아니며, 이러한 반응 타입에서도 종종 50%보다도 훨씬 적은 환자가 예컨대, 항PD-1 또는 PD-L1 항체를 이용한 치료로부터 관련된 이익을 가진다. 예를 들어, 진행성 결장직장암 환자 중 10% 미만의 진행성 결장직장암 환자 10% 미만이 PD-1 축 억제제를 사용한 요법에 적합하다(특히 암에서 현미부수체 불안정성 MSI(Microsatellite Instability)을 보이는 진행성 결장직장암 환자 중 대략 4%가 약간의 이익을 가진다).

키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor) T 세포를 사용한 입양 T 세포 요법 및 T 세포 이중특이적 항체를 사용한 요법은 혈액 악성종양에서 유망한 임상 결과를 전달하였다. 그러나, 입양 T 세포 요법을 사용한 임상 연구, 예를 들어 다양한 고형 종양에서 CAR T 세포는 대부분 반응률을 보이지 않거나, 또는 미미한 반응률만을 보였다(예컨대, 문헌 [Xu et al., Expert Review of Anticancer Therapy 2017, 17, 1099-1106]; [Greenbaum et al., Biol Blood Marrow Transplant 2020 Oct;26(10):1759-1769]).

US20140242079, WO2017055389, US20140242080, WO2007071426, WO2013012414, WO2015112534, WO2017118675, US20140242079, 및 (Bacac et al.)(문헌 [Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016)])에는 CEAxCD3 T 세포 이중특이적 항체가 기술되어 있다.

T 세포 이중특이 항체 TAAxCD3(TAA=종양 연관 항원(Tumor associated antigen), 예컨대, CEA 및 다수의 다른 것)은 혈액학적 악성종양, 예컨대, 다발성 골수종, B 세포 악성종양, 예컨대, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종 환자 등에서 매우 효과적이다. 시비사타맙 CEAxCD3을 이용한 임상 결과에 따르면 진행성 고형 종양에서도 TAAxCD3의 효능이 있지만(상기 텍스트 참조), 혈액학적 악성종양에서 예컨대, CD20xCD3 또는 BCMAxCD3 등을 사용한 경우에 달성된 효능보다는 훨씬 더 낮다(문헌 [Moreau P1., N Engl J Med.,. 2022 Jun 5. doi: 10.1056/NEJMoa2203478]). PD-1 축 억제제를 추가하면 효능이 증가할 수 있지만, 증가하더라도 제한적일 뿐이다. 예컨대, CD28 또는 4-1BB와 같은 공자극성 T 세포 수용체에서 효능작용을 하는 이중특이적 항체 또는 융합 단백질을 첨가하면 임상전 시험에서 효능 뿐만 아니라, 독성은 증가하고, 예컨대, 사이토카인 방출은 증가한다. T 세포의 추가 활성화를 목표로 하는 대신, 다른 면역 세포, 특히, 대식세포를 종양 세포로 재지시하는 치료제를 추가하는 것이 더 성공적일 수 있다. 본 발명은 CEAxCD3 이중특이적 항체의 종양 세포 살해 효과를 증가시키고, T 세포 공자극성 수용체에서 이중특이적 효능제와의 조합과 달리 사이토카인 방출 증후군인 CRS(Cytokine Release Syndrome) 및 잠재적인 T 세포 고갈의 위험 증가를 방지하기 위해, 특히 CEAxCD3 T 세포 이중특이적 항체와의 조합 요법에서 CEACAM5 발현 고형 종양에 대한 대식세포를 재지시하고, 활성화시키는 이중특이적 항체 CEAxCD47을 다룬다.

CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체는 WO2019234576 및 WO2021110647에 기술되어 있다. WO2019234576에 기술된 한 이중특이적 항체는 K2AC22이다(WO2019234576의 서열 번호 65는 K2AC22의 CEACAM5 결합부의 경쇄를 보여주는 것이고, WO2019234576의 서열 번호 5는 K2AC22의 공통 중쇄를 보여주는 것이고, 서열 번호 11은 K2AC22의 CD47 결합부의 경쇄를 보여주는 것이다). WO2019234576에서, K2AC22의 경우, CEA-TCB로 명명되는 CEAxCD3와의 조합시 종양 세포 살해는 증가한 것으로 나타났다. 본 발명자들이 아는 한, CEA-TCB는 시비사타맙이거나, 또는 최소한 시비사타맙과 동일한 CEA 에피토프에 결합하며, 시비사타맙과 동일한 기본 구조(2+1 포맷)를 가진 CEAxCD3이다. 본 발명의 목적은 개체에게 CEACAM5 및 CD3에 대한 이중특이적 항체와 조합하여 CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나, 또는 그의 진행을 지연시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 CEAxCD47 이중특이적 항체 및 CEAxCD3 이중특이적 항체의 유리한 조합이다. 상기 조합은 본 발명에서 추가로 기술된다.

본 발명에 따른 조합 및 방법에서 사용되는 바와 같은 CEACAM5 및 CD3에 대한 이중특이적 항체는 WO2021053587에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 조합 및 방법에서 사용되는 바와 같은 CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체는 PCT/IB2021/061983(WO2022130348)에 기술되어 있다.

본 발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은 하기 기술되는 CEACAM5 및 CD3ε에 대한 이중특이적 항체(CEAxCD3 이중특이적 항체)와 함께 조합하여, 암 치료에 사용하기 위한, 하기 기술되는 CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체(이는 추가로 CEAxCD47 이중특이적 항체로도 명명)를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에게 하기 기술되는 CEACAM5 및 CD3ε에 대한 이중특이적 항체(CEAxCD3 이중특이적 항체)와 함께 조합하여 하기 기술되는 CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체(이는 추가로 CEAxCD47 이중특이적 항체로도 명명)를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나, 또는 그의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 상기 조합을 제공한다. 본 발명에 따른 방법 또는 조합에서 사용되는 바와 같은 CEAxCD47 이중특이적 항체는 종양 세포에 대해, CEACAM5를 다량으로 발현하는 종양 세포 및 소량으로 CEACAM5를 발현하는 종양 세포, 둘 모두에 대해 높은 식작용 활성을 유도한다. 한 실시양태에서, CEAxCD47 이중특이적 항체는 면역 세포, 특히, 대식세포의 관여에 기인하여 주로 최적화된 식작용/항체 의존적 세포 식작용(ADCP: antibody-dependent cellular phagocytosis)을 통해 그의 항종양 세포 효과를 유도한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 CEAxCD47 이중특이적 항체는 감소된 비의 CEACAM3 대 CEACAM5 결합 친화도, 각각 CEACAM5xCD47 항체 K2AC22 대비 증가된 비의 KD를 나타낸다. 한 실시양태에서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 CEAxCD47 이중특이적 항체는 종양 세포 상에서 발현된 CD47에의 SIRPα의 결합을 억제하고, 종양 세포의 식작용을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 CEACAM5xCD3 이중특이적 항체는 인간 IgG 항체의 서열 및 구조를 완전히 유지하는 카파 람다 이중특이적 항체인 바, 따라서, ADA 형성 및 잠재적 노출 손실을 유발하는 면역원성의 위험이 낮다.

본 발명에 따른 조합은 또한 종양 치료, 특히, 고형 종양 치료에 사용하기에도 적합하다.

한 측면에서, 본 발명은

B) a) 제1 결합부는 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

서열 번호 18의 CDRL1, 서열 번호 19의 CDRL2, 및 서열 번호 20의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 CDRL1, 서열 번호 7의 CDRL2, 및 서열 번호 8의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD3ε(추가로 "CD3"으로도 명명)에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체와 함께 조합하여 암 치료에 사용하기 위한,

A) a) 제1 결합부는 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 35의 CDRL1, 서열 번호 36의 CDRL2, 및 서열 번호 37의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,

b) 제2 결합부는 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2, 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역,

및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 29의 CDRL1, 서열 번호 30의 CDRL2, 및 서열 번호 31의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5(추가로 "CEA"로도 명명)에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD47(추가로 "CD47"로도 명명)에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 치료 방법을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은

B) a) 제1 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 5의 경쇄 가변 영역을 포함하고,

b) 제2 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역, 및

서열 번호 21의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체와 함께 조합하여 암 치료에 사용하기 위한,

A) a) 제1 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 38의 경쇄 가변 영역을 포함하고,

b) 제2 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역,

및 서열 번호 32의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 치료 방법을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은

B) a) 제1 결합부는 서열 번호 10의 중쇄 영역 및 서열 번호 22의 경쇄를 포함하고,

b) 제2 결합부는 서열 번호 10의 중쇄 영역, 및 서열 번호 9의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체와 함께 조합하여 암 치료에 사용하기 위한,

A) a) 제1 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역 및 서열 번호 39의 경쇄를 포함하고,

b) 제2 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역,

및 서열 번호 33의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 치료 방법을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은

A) 하기 내용을 특징으로 하는 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체로서:

및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 29의 CDRL1, 서열 번호 30의 CDRL2, 및 서열 번호 31의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는,

인간 CEACAM5(추가로 "CEA"로도 명명)에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD47(추가로 "CD47"로도 명명)에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체, 및

서열 번호 18의 CDRL1, 서열 번호 19의 CDRL2, 및 서열 번호 20의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 및 서열 번호 6의 CDRL1, 서열 번호 7의 CDRL2, 및 서열 번호 8의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD3ε(추가로 "CD3"으로도 명명)에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체의 조합을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은

b) 제2 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역,

및 서열 번호 32의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체, 및

b) 제2 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역, 및

서열 번호 21의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는,

인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체의 조합을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은

b) 제2 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역,

및 서열 번호 33의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는,

인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체, 및

B) a) 제1 결합부는 서열 번호 15의 중쇄 영역 및 서열 번호 22의 경쇄를 포함하고,

b) 제2 결합부는 서열 번호 15의 중쇄 영역, 및 서열 번호 9의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체의 조합을 제공한다.

본 발명은 상기 측면의 추가 실시양태를 포함한다:

한 실시양태에서, 두 항체 모두의 불변 및 가변 프레임워크 영역 서열은 인간의 것이다.

한 실시양태에서, 두 항체 모두, 제1 및 제2 결합부가 각각 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 두 항체 모두 전장 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG1 타입의 항체인 것을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 두 항체 모두 제1 결합부에 대해 1가이고, 제2 결합부에 대해 1가인 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 제1 항체는 변형된 올리고당을 갖는 Fc 영역을 갖도록 당조작된 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 제1 이중특이적 항체는 당조작되지 않은 동일한 이중특이적 항체와 비교하여 푸코스 잔기 개수가 감소되도록 당조작된 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 제1 항체는 재조합 CEACAM3 및 재조합 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비가 100배 이상인 것을 특징으로 한다(실시예 3, 표 2).

한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 제1 항체는 재조합 CEACAM3 및 재조합 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비가 100배 내지 200배인 것을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 CEACAM5 및 CEACAM3에의 결합의 상대적 언커플링을 보인다(차별적인 결합). 이중특이적 CEAxCD47 항체 K2AC22와 비교하여 전장 재조합 인간 CEACAM5 단백질에의 결합 증가에도 불구하고, 전장 재조합 인간 CEACAM3에의 결합은 비례하여 증가하지 않는다. 전장 CEACAM3 대 CEACAM5에의 결합에 대한 KD의 몫/비는 83(K2AC22)에서 146(K2AC100)으로 증가함을 보여준다. 이는 차별적 결합이 65% - 76% 증가한 것과 같다(실시예 3, 표 2).

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 농도 의존적 식작용(인간 대식세포에 의한 CEACAM5 발현 종양 세포주의 ADCP)을 특징으로 한다. ADCP는 본 발명에 따라 이미징에 의해 식작용 지수(EC50 및/또는 최대값)로 측정되며, 일반적으로 E:T 비는 1:3이다(인간 대식세포:표적 세포(종양 세포); 예컨대, EC50 값, 및 식작용 Emax의 max. 지수에 대해 표 6 내지 9를 참조한다). 검정법에 관한 세부사항은 실시예 7에 기술되어 있고; 이미징 검정법은 셀인사이트 CX5(CellInsight CX5)에 기초한다. 달리 언급되지 않는 한, 식작용 지수 값은 상기 이미징 방법에 의해 측정된다.

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 K2AC22의 식작용 지수와 비교하여 LoVo 종양 세포의 식작용 지수의 최대값(Emax)이 적어도 8% 증가한 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, LoVo 종양 세포에 대해 증가는 8% 내지 20%이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 K2AC22의 식작용 지수와 비교하여 Ls174T 종양 세포의 식작용 지수의 최대값이 적어도 8% 증가하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, Ls174T 종양 세포에 대해 증가는 8% 내지 25%이다. (실시예 7, 표 5). LoVo 및 LS174T는 CEACAM5의 발현이 다소 낮은 종양 세포이다 (실시예 5의 표 3 참조).

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 인간 CD47과 인간 SIRPα 사이의 상호작용을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 동일한 실험 조건하에 K2AC22에 대해 측정된 IC50보다 10배 이상 더 낮은 IC50으로 MKN-45 세포 상의 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 상기 배수는 10 내지 30이다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 0.1 nM 이하의 IC50으로 MKN-45 세포 상의 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 0.1 nM 내지 0.04 nM의 IC50으로 MKN-45 세포 상의 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 억제시킨다(실시예 10 및 표 12 참조).

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 하기 특성 중 2개 이상을 갖는 것을 특징으로 한다: 재조합 CEACAM3 및 재조합 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비가 100배 이상인 것인 특성, CEACAM5 및 CEACAM3에의 결합의 상대적 언커플링을 보이는 특성, 농도 의존적 ADCP를 보이는 특성, K2AC22의 식작용 지수와 비교하여 LoVo 종양 세포의 식작용 지수의 최대값(Emax)이 적어도 8% 증가한 것인 특성, 및 K2AC22와 비교하여 10배 초과로 더 낮은 IC50으로 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 억제시킬 수 있는 능력을 보이는 것인 특성.

이중특이적 항체 K2AC22는 인간 CEACAM5 및 인간 CD47에 결합하는 이중특이적 항체이고, WO2019234576에 기술되어 있다. K2AC22는 WO2019234576의 서열 번호 5의 공통 중쇄, WO2019234576의 CEACAM5 결합부 중 서열 번호 65의 경쇄, 및 CD47 결합부 중 서열 번호 11의 경쇄를 포함하고; K2AC22의 CDR은 WO2019234576의 서열 번호 1-3, 7-9, 및 34-36에 제시되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 (생물층 간섭법에 의해 측정된) 100 nM 내지 600 nM의 결합 친화도(KD), 및 한 실시양태에서, 100 nM 내지 500 nM의 결합 친화도로 재조합 인간 CD47에 결합하는 것을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 2 nM 내지 10 nM의 KD로 재조합 인간 CEACAM5에 결합하는 것을 특징으로 한다(실시예 3, 표 2). 한 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바와 같은 제1 항체는 최신 기술의 이중특이적 항체 K2AC22와 비교하여 10배 내지 50배, 및 한 실시양태에서, 20배 내지 50배 더 높은 결합 친화도(더 낮은 KD)를 가진다(실시예 3, 표 2).

한 실시양태에서, 제1 항체는 CEACAM5에 특이적으로 결합하되, CEACAM5에의 결합에 대해 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 제2 항체와 경쟁하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 종양 세포를 이중특이적 항체 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포의 세포 용해를 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 종양 세포는 환자에서의 인간 종양 세포이다. 종양 세포의 세포 용해를 유도하는 방법의 한 실시양태에서, 종양 세포는 결장직장암 세포, NSCLC(비소세포 폐암: non-small cell lung cancer) 세포, 위암 세포, 췌장암 세포, 유방암 세포, 또는 CEACAM5를 발현하는 또 다른 종양 세포이다.

본 발명은 CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체에서 생존 기간을 연장시키는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 추가 실시양태는 암이 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 또는 유방암인 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법인 것이다.

본 발명은 CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 인간 피험체에게 화학요법 또는 방사선 요법과 함께 조합하여 투여하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법인 것이다.

본 발명은 CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체 치료용 의약 제조에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 추가로 제공한다. 본 발명의 추가 실시양태는 암이 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 상기의 본 발명에 따른 의약 제조에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합인 것이다.

본 발명은 CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체의 치료에서 동시, 개별, 또는 순차적인 투여에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 제1 이중특이적 항체가 먼저 투여된 후, 이어서, 제1 및 제2 이중특이적 항체의 조합이 투여된다. 한 실시양태에서, 제2 이중특이적 항체가 먼저 투여된 후, 이어서, 제1 및 제2 이중특이적 항체의 조합이 투여된다.

본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 제1 이중특이적 항체 및 제2 이중특이적 항체를 상기 피험체에게 2 내지 15일 간격으로 교대로 투여하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합 이다. 한 실시양태에서, 교대 요법은 제1 항체로 시작된다. 한 실시양태에서 교대 요법은 본 발명의 제2 이중특이적 항체로 시작된다.

본 발명의 추가 실시양태는 제1 이중특이적 항체 및 제2 이중특이적 항체를 상기 피험체에게 2 내지 15일 간격으로 동시에 투여하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합이다.

본 발명의 추가 실시양태는 상기 암이 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 및 유방암인 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따라 사용하기 위한, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합이다.

본 발명의 추가 실시양태는 종양(암), 특히, 고형 종양, 특히, CEACAM5를 발현하는 고형암, 특히, 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 및 유방암 진단을 받은 인간 환자에게 유효량의, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하고, 후속적으로,

상기 환자에게 제1 이중특이적 항체를 0.1 내지 10 mg/kg, 추가 실시양태에서, 0.5 내지 10 mg/kg, 추가 실시양태에서, 10 내지 30 mg/kg 및 0.1 내지 1 mg/kg으로, 추가 실시양태에서, 1 내지 10 mg/kg의 제2 이중특이적 항체를 예컨대, 4 내지 12주간에 걸쳐 매주 또는 4 내지 12주간에 걸쳐 q2w로 투여하고, 상기 4 내지 12주 후 및 제2 이중특이적 항체의 추가의 2 또는 3 또는 4 제거 반감기 대기 후에 상기 환자에게 0.1 내지 20 mg/kg의 용량의 제1 이중특이적 항체를 투여하는 단계,

환자에게 상기 제1 항체를 예컨대, 12주 초과의 기간 동안 q1, q2w, q3w 또는 임의적으로, q4w로 투여하고, 제1 이중특이적 항체의 2 또는 3 또는 4 제거 반감기를 대기한 후, 이어서, 임의적으로, 제2 이중특이적 항체 투여, 이어서, 제1 이중특이적 항체 투여로 이루어지는 상기 사이클을 반복하고, 임의적으로, 상기 사이클 등을 다시 반복하는 단계를 포함하는, 종양(암), 특히, 고형 종양, 특히, CEACAM5를 발현하는 고형암, 특히, 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 및 유방암 진단을 받은 인간 환자를 치료하는 방법이다.

CEA x CD3 이중특이적 항체(AB73) 및 CEA x CD47 이중특이적 항체(K2AC100)는 CEACAM5에의 결합에 대해 비경쟁적인 바, 두 이중특이적 항체는 또한 예컨대, 환자에게 거의 동시에 0.1 내지 10 mg/kg, 추가 실시양태에서, 0.5 내지 10 mg/kg, 추가 실시양태에서, 10 내지 20 mg/kg 용량의 제1 이중특이적 항체 및 0.1 내지 10 mg/kg 추가 실시양태에서, 1 내지 10 mg/kg 용량의의 본 발명에 따른 제2 이중특이적 항체를 투여한 후, 이어서, q1w 또는 q2w 또는 q3w 또는 임의적으로, q4w의 빈도로 상기 조합 투여를 1회 이상 수행함으로써 환자가 병용으로 두 이중특이적 항체 모두 치료 유효 혈장 및 조직 농도를 경험하는 방식("동시 방식")으로 투여될 수 있다. 용어 "q1w"는 주 1회 투여를 의미하고; q2w는 2주마다 투여하는 것 등을 의미한다.

안전상의 이유로, 한 실시양태에서, 제1 이중특이적 항체를 첨가하지 않고 상기 제2 이중특이적 항체로 요법을 시작한 후, 이어서, 두 이중특이적 항체의 동시 투여를 시작하는 것이 필요할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다. 상기 한 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양 장애 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 결장직장암, NSCLC(비소세포 폐암), 위암, 췌장암, 또는 유방암 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 포함한다.

본 발명은 CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 피험체의 치료에서 동시, 개별, 또는 순차적인 조합으로 사용하기 위한, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 고형 종양 장애 치료에서 의약 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명의 추가 실시양태는 결장직장암, NSCLC(비소세포 폐암), 위암, 췌장암, 또는 유방암 및 CEACAM5를 발현하는 다른 암의 치료에서의 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합의 용도인 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 종양 세포를 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것의 이중특이적 항체 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포의 세포 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 결장직장암 세포, NSCLC(비소세포 폐암), 위암 세포, 췌장암 세포 또는 유방암 세포이다. 한 실시양태에서, 세포 용해는 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합의 항체 의존적 세포 식작용 및/또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성에 의해 유도된다. 한 실시양태에서, 종양 세포 용해는 대식세포 유도 식작용 및 T 세포 활성화에 의해 유도된다.

본 발명의 또 다른 측면은 CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것의 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것의 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. CEAxCD3 이중특이적 항체 및 CEAxCD47 이중특이적 항체는 경쟁하지 않거나, 또는 단지 최소한으로 경쟁하는 바, 이는 순차적으로 뿐만 아니라, 병용으로(동시에) 제공될 수 있고, 이는 매우 유리할 수 있는데, 그 이유는 CEAxCD3 이중특이적 항체에 의한 T 세포의 결합을 통한 및 동시에 본 발명에 따른 CEAxCD47 이중특이적 항체에 의한 대식세포의 결합을 통한 종양 세포 살해가 상가적이거나, 또는 심지어 시너지적일 수 있으며, 이는 두 약물을 병용으로 제공하면, 효능이 증가한다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 측면은 CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것의 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에서 무진행 생존을 증가시키고/거나, 전체 생존 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암 또는 유방암 또는 CEACAM5를 발현하는 임의의 다른 암이다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합은 화학요법 또는 방사선 요법과 함께 조합하여 투여된다. 한 실시양태에서, 피험체는 결장직장암 또는 폐암 또는 위암 또는 췌장암 또는 유방암 또는 CEACAM5를 발현하는 또 다른 암을 앓는 환자이다.

본 발명의 또 다른 측면은 CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것의 이중특이적 항체를 인간 CEA 및 인간 CD3엡실론에 대한 이중특이적 항체와 함께 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에게 치료 유효량의 상기 기술된 실시양태 중 임의의 것의 이중특이적 항체 조합을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 과다발현하는 암을 앓는 피험체에서 무진행 생존 기간 및/또는 전체 생존 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 또는 유방암이다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합은 화학요법 또는 방사선 요법과 함께 조합하여 투여된다. 한 실시양태에서, 피험체는 결장직장암 또는 폐암 또는 위암 또는 췌장암 또는 유방암 또는 또 다른 CEACAM5 발현 암을 앓는 암 환자이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 기술된 치료 방법 중 임의의 것을 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체 조합의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 결장직장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 위암, 췌장암, 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택된다.

도면의 간단한 설명
도 1. 혼합 검정법에서 달성된 살해( MKN -45 세포).
도 1은 MKN-45 세포에 대하여 단일요법으로, 및 0.1, 1 및 10 ㎍/ml의 K2AC100(CEAxCD47 이중특이적 항체)과의 조합으로 이루어진 AB73(CEAxCD3 이중특이적 항체)에 대한 농도 반응 곡선을 보여주는 것이다. AB73 단일요법의 경우, 심지어 최고 농도에서도 30%를 약간 상회하는 살해를 달성할 뿐이었다. 0.1 ㎍/ml의 K2AC100 첨가시, 최대 살해는 대략 40%로 증가하였고, 1 또는 10 ㎍/kg 첨가시 살해는 대략 80%로 증가하였다. 조합에 의한 살해는 AB73 단일요법에서의 살해와 비교하여 훨씬 낮은 AB73 농도에서 시작되었다; hIgG1 = 대조군(혼합 검정법에 대한 설명은 실시예 11 참조).
도 2. 결과가 도 1에 제시되어 있는 혼합 검정법에서의 동일한 연구로부터의 데이터.
도 2a는 단일요법으로, 및 조합으로 0.6, 0.12 또는 0.024 ㎍/ml AB73과 조합된 1 ㎍/ml의 K2AC100으로 달성된 살해율(%)을 보여주는 것이고; 도 2b는 1 ㎍/ml 대신 10 ㎍/ml의 K2AC100을 사용한 경우의 결과를 보여주는 것이며; 두 단일요법과 비교했을 때 조합시 항상 더 높은 살해율(%)을 달성하였다.
도 3. 혼합 검정법에서 달성된 살해( LS -174T 세포).
도 3은 단일요법으로, 및 0.1, 1 또는 10 ㎍/ml의 K2AC100과의 조합으로 이루어진 AB73에 대한 농도 반응 곡선을 보여주는 것이다. AB73을 이용하여 단일요법을 수행하였을 때, 시험된 최고 농도에서 이미 대략 70%의 살해율을 달성하였다. K2AC100(0.1, 1, 10 ㎍/ml) 첨가시, AB73의 농도 반응 곡선은 왼쪽으로 이동하였고, 최대 대략 80%의 살해율을 달성하였다; hIgG1 = 대조군 (혼합 검정법에 대한 설명은 실시예 11 참조).
도 4. 결과가 도 3에 제시되어 있는 혼합 검정법에서의 동일한 연구로부터의 데이터.
도 4a는 단일요법으로, 또는 0.08, 0.016 또는 0.0032 ㎍/ml AB73과 조합된 1 ㎍/ml의 K2AC100으로 달성된 살해율(%)을 보여주는 것이고; 도 4b는 1 ㎍/ml 대신 10 ㎍/ml의 K2AC100을 사용하고, AB73의 농도는 도 4a하의 것과 동일한 경우의 결과를 보여주는 것이며; 두 단일요법과 비교했을 때 조합시 항상 더 높은 살해율(%)을 달성하였다.
도 5. 혼합 검정법에서 달성된 살해( LS -174T 세포).
도 5는 단일요법으로, 및 5 ㎍/ml의 AB73과의 조합으로 이루어진 K2AC100에 대한 농도 반응 곡선을 보여주는 것이다. K2AC100을 이용하여 단일요법을 수행하였을 때, 시험된 최고 농도에서 이미 90% 초과의 살해율을 달성하였다. AB73(5 ㎍/ml) 첨가시, K2AC100의 농도 반응 곡선은 왼쪽으로 이동하였다; hIgG1 = 대조군 (혼합 검정법에 대한 설명은 실시예 11 참조).
도 6. 결과가 도 5에 제시되어 있는 동일한 연구로부터의 데이터.
도 6은 단일요법의 5 ㎍/ml AB73으로, 및 0.4 또는 0.08 ㎍/ml의 K2AC100과 5 ㎍/ml AB73의 조합으로 달성된 살해율(%)을 보여주는 것이고; 두 단일요법과 비교했을 때 조합시 항상 더 높은 살해율(%)을 달성하였다.

본 발명의 상세한 설명

사이토카인 방출 증후군 CRS(TAAxCD3에 대해 보고) 등과 같은 잠재적인 부작용으로 인해, 이중특이적 항체 중 단 하나만을 사용한 더 높은 고용량 요법과 비교하였을 때, 종양 세포의 동일한 최대 살해는 더 낮은 저농도의 약물에 의해 달성할 수 있다면 유익한 것이다. 예상외로, 본 발명에 따른 조합은 그러한 이점을 보여준다:

본 발명에 따른 조합은 동일한 공여자로부터의 인간 대식세포 및 PBMC/T 세포를 사용한 혼합 검정법에서 종양 세포의 최대 살해를 상당히 증가시킨다.

· 본 발명의 조합은 동일한 공여자로부터의 인간 대식세포 및 PBMC/T 세포를 사용한 혼합 검정법에서 MKN-45 세포와 같은 종양 세포의 최대 살해를 단일요법시 대략 30%의 살해율에서 조합시 대략 80%의 살해율로 증가시킨다(도 1, 실시예 11).

· 본 발명의 조합은 동일한 공여자로부터의 인간 대식세포 및 PBMC/T 세포를 사용한 혼합 검정법에서 동일한 농도를 사용할 경우, 단일요법과 비교하여 시험된 모든 농도에서 조합시 LS-174T 및/또는 MKN-45와 같은 종양 세포의 더 높은 살해율(%)을 나타낸다(도 2, 4, 6, 실시예 11).

· 본 발명의 CEAxCD3 이중특이적 항체와 CEAxCD47 이중특이적 항체의 조합은 인간 대식세포 및 PBMC/T 세포를 사용한 혼합 검정법에서 조합시 뿐만 아니라, 이중특이적 항체 중 하나의 단일요법시에도 높은 살해율(%)(> 80%)을 나타내지만, 더 낮은 농도를 시험한 경우, 살해율(%)은 단일요법과 비교하여 조합시에 더 우수하다(도 5 및 도 6, 실시예 11).

용어는 본원에서 하기와 같이 달리 정의되지 않는 한, 일반적으로 당업계에서 사용되는 바와 같이 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "사용되는 바와 같이" 또는 "본 발명에 따라 사용되는 바와 같이"라는 용어는 "본 발명에 따른 조합 또는 방법에서 사용되는 바와 같이"라는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "AB73L3-1/N"은 이중특이적 CEAxCD3 항체로서, 서열 번호 2, 3, 및 4의 공통 중쇄 CDR, 및 CEA에 대한 제1 결합부 중 서열 번호 18, 19, 및 20의 경쇄 CDR, 및 CD3에 대한 제2 결합부 중 서열 번호 6, 7, 및 8의 경쇄 CDR을 포함하는 것을 특징으로 한다. AB73 파트는 제1 결합부(항CEACAM5 결합부)를 나타내고, L3-1은 상기 항체의 제2 결합부(항CD3 결합부)를 나타낸다. 한 실시양태에서 AB73L3-1/N은 서열 번호 15의 공통 중쇄(L234A + L235A + P329A 돌연변이를 포함하는 IgG1), 제1 결합부 중 서열 번호 22의 경쇄 및 제2 결합부 중 서열 번호 9의 경쇄를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "AB73"은 상기 AB73L3-1/N 항체를 나타내고, 카파 람다 CEAxCD3 이중특이적 항체이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "K2AC100"은 이중특이적 CEAxCD47 항체로서 서열 번호 23, 24 및 25의 공통 중쇄 CDR, 및 CEA에 대한 제1 결합부 중 서열 번호 35, 36 및 37의 경쇄 CDR, 및 CD47에 대한 제2 결합부 중 서열 번호 29, 30 및 31의 경쇄 CDR을 포함하는 것을 특징으로 한다. AC100은 제1 결합부(항CEACAM5 결합부)를 나타내고, K2는 상기 항체의 제2 결합부(항CD47 결합부)를 나타낸다.

한 실시양태에서, K2AC100은 서열 번호 28의 공통 중쇄(IgG1 WT), CEA에 대한 제1 결합부 중 서열 번호 39의 경쇄, 및 CD47에 대한 제2 결합부 중 경쇄 서열 번호 32를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "제1 항체"는 본원에서 정의된 바와 같이 CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체(CEAxCD47 이중특이적 항체; CEAxCD47 항체, K2AC100)를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "제2 항체"는 본원에서 정의된 바와 같이 CEACAM5 및 CD3에 대한 이중특이적 항체(CEAxCD3 이중특이적 항체; CEAxCD3 항체; AB73)를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "두 항체 모두" 또는 "항체들"은 "제1 및 제2 항체"를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "본 발명에 따른 항체" 및 "본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 항체"는 "본 발명에 따른 조합 또는 방법에서 사용되는 바와 같은 항체"를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "조합 치료, 조합으로 사용되는 공동 투여, 제1 및 제2 항체의 조합"은 제1 및 제2 항체가 사용되고, 제제화되고, 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 의미한다. 상기 사용, 치료 및 조합에 대한 세부 사항은 하기에 자세히 기술되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 CEAxCD47 항체는 하기 특성 중 하나 이상의 유익한 특성을 가진다:

· CEACAM3 대 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비,

· 낮은 CEA 발현 종양 세포에서의 식작용 지수의 최대값(Emax) 증가, 및/또는

· 종양 세포의 표면 상의 CD47에의 SIRPα의 결합의 낮은 IC50에서의 억제.

매우 예상치 못하게도, 제1 이중특이적 항체는 CEACAM5 및 CEACAM3에의 결합의 상대적 언커플링을 보이고(차별적인 결합), CEACAM5에의 결합 증가는 CEACAM3에의 결합을 비례적으로 증가시키지 않는다(실시예 3 및 표 2). 예를 들어, K2AC22의 결합 친화도(KD)와 비교하여 K2AC100은 CEACAM5에 대해 25배 더 높은 결합 친화도(더 낮은 KD)를 보이지만, 놀랍게도, CEACAM3에 대해서는 단지 14배 더 높은 결합 친화도(더 낮은 KD)를 보인다. 따라서, CEACAM3에의 결합에 대한 KD 값 대 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비는 K2AC22의 경우, 83이지만, K2AC100의 경우, 146이다.

CEACAM5 또는 CEACAM6과 같은 여러 패밀리 구성원이 상피 세포에 의해 발현되는 반면, 예컨대, CEACAM3(CGM1 또는 CD66d; UniProtKB - P40198)과 같은 다른 패밀리 구성원은 전적으로 인간 과립구, 예컨대, 박테리아 감염 제거에 관여하는 세포 타입에서 발현된다(문헌 [Kuespert K et al., Curr Opin Cell Biol. 2006]; [Pils S et al., Int J Med Microbiol. 2008]). CEACAM5와 CEACAM3 사이의 높은 서열 상동성에도 불구하고, CEACAM3은 CEACAM 패밀리의 다른 구성원과 달리 세포-세포 부착을 지원하지 않고, 오히려 옵소닌 비의존적 인식 및 네이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 및 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)를 비롯한, 제한된 그람 음성 박테리아 세트의 제거를 매개한다(문헌 [Kuroki et al., J. Biol. Chem. 1991]; [Pils S et al., Int J Med Microbiol. 2008]). CEACAM3은 선천성 면역계의 식세포 수용체로 논의된다(문헌 [Schmitter et al., J Exp Med. 2004]). 본 발명자들의 지식에 따르면, CEACAM5 및 CD47에 대한 이중특이적 항체는 CEACAM3에도 상당히 결합하는 경우, 호중구 과립구에 악영향을 미치고, 호중구의 개수를 감소시킬 수 있으며, 즉, 식작용 증가에 기인하여 호중구 감소증을 유발할 수 있다. 특히, 대개는 면역계 결핍인 암 환자에서는 이로 인해 즉각적인 의료 개입 없이는 생명을 위협할 수 있는 박테리아 감염이 발생할 위험이 높아질 수 있다. 높은 결합 친화도는 낮은 KD를 특징으로 한다. CEACAM 5와 CEACAM3 사이의 CEA 표적화 이중특이적 항체의 분포는 상기 두 CEACAM 패밀리 구성원에 대한 결합 친화도의 비에 의해 결정된다. CEACAM5에의 결합에 대한 KD 대비 CEACAM3에의 결합에 대한 KD의 비가 높다는 것은 CEACAM5에의 결합과 비교하여 이중특이적 항체의 CEACAM3에의 결합이 더 적다는 것을 의미하며, 이는 유익할 것이다.

매우 예상치 못하게도, CEAxCD47 이중특이적 항체는 낮은 CEACAM5 발현 세포주 LS174T 및 LoVo에서 K2AC22와 비교하여 식작용에 대해 Emax 증가를 보이는 반면, 높은 CEACAM5 발현 세포주 SNU-C1에서는 Emax가 증가하지 않는다. 따라서, 제1 항체는 놀랍게도 각 세포주에서 K2AC22로 달성한 식작용 지수의 증가와 비교하여 낮은 CEA 발현 종양 세포(예컨대, LoVo 세포주)에서 식작용 지수의 최대값(Emax)의 유익한 증가를 보인다. 표 5에 따르면, 제1 항체는 최신 기술의 K2AC22의 이중특이적 항체와 비교하여 LoVo 세포(세포 표면에서 4000 CEACAM5)의 식작용 지수 곡선의 8.5 내지 17% 더 높은 최대값 증가를 나타낸다. LS174T 세포(세포 표면에서 26000 CEACAM5)의 경우, 식작용 지수의 최대값 증가는 K2AC22와 비교하여 본 발명의 항체들의 경우, 8.7 내지 20.6% 더 높다(표 5). SNU-C1 또는 MKN-45와 같은 더 높은 CEACAM5 발현 세포에서 Emax의 증가는 K2AC22와 비교하여 더 낮거나, 또는 심지어는 증가는 전혀 없다.

따라서, 더 높은 비율(%)의 환자가 본 발명에 따른 이중특이적 항체로 성공적으로 치료될 수 있다.

실시예 5 및 11에 개시된 바와 같이, 악성 세포에서의 CEA 발현은 RNA 발현 또는 세포 표면 CEA 분자의 계수 면에서 상당히 다양할 수 있다. 이중특이적 CEAxCD47 항체의 식작용 활성을 연구하는 데 사용되는 CEA 발현 암 세포주는 세포 표면에서 평균 108,000개의 CEA 표적을 발현한다(실시예 5, 표 3). 암 환자(결장직장암 및 폐암)의 새 종양 조직으로부터 유래된 오가노이드는 실시예 10에 기술된 방법에 의해 조사되었다. 이들 1차 오가노이드의 CEACAM5의 평균 발현은 세포당 28,000개의 CEACAM5 표적, 즉, 표 3에 제시된 바와 같이 세포주에서의 평균 발현보다 대략 4배 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제1 항체는 CEACAM5 발현이 더 낮은 악성 세포에 대해 개선된 식작용을 보인다. 따라서, 이는 종양 요법에 사용하는 데 유리할 수 있다. 따라서, 예컨대, 폐 선암종에서, 결장직장암 및 다른 CEACAM5 발현 종양에서 발현이 이종성이고/거나, 다소 낮다고 가정하면, 상기 환자는 본 발명의 CEAxCD47 이중특이적 항체로 성공적으로 치료될 수 있다.

제1 항체는 놀랍게도 실시예 9 및 도 4에 제시된 바와 같이, 항체 K2AC22와 비교하여 종양 세포 표면 상의 CD47에의 SIRPα의 결합의 유익한 억제(낮은 IC50)를 나타낸다. 종양 세포 상의 CD47과 대식세포 상의 SIRPα의 상호작용이 종양 세포의 식작용을 억제시키며, 이는 상기 상호작용의 효과적인 억제가 식작용을 증가시킨다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "Emax"는 화합물의 최대 활성을 기술한다. 예를 들어, 세포 살해 검정법에서, Emax는 이미 포화 상태인 농도에서 주어진 시간 프레임 내에서 대식세포에 의한 암 세포(예컨대, 칼세인 AM으로 표지, 실시예 7 참조)의 제거율/살해율(%)을 기술한다. 이는 종양 침윤 대식세포의 총 개수가 제한되어 있기 때문에, 임상적으로 매우 중요한 것으로 추정되고: 예를 들어, 시간 간격당 종양 세포 개수의 2배로 제거된다면, 이는 시간당 동일한 개수의 종양 세포를 제거하기 위해 존재해야 하는 대식세포 개수의 절반과 같다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "EC50"은 최대 활성의 절반(Emax/2)에 도달하는 화합물 농도를 기술한다. 낮은 EC50은 더 적은 양의 화합물을 주입해야 하고, 따라서, 예컨대, 더 높은 EC50에 비해 더 낮은 생산 비용 및/또는 잠재적으로는 반드시 그러한 것은 아니지만, 더 낮은 비율의 부작용을 달성하기 때문에 유용하다. 따라서, Emax와 EC50은 화합물 활성의 다른 측면을 설명한다. 비교가능한 Emax의 두 화합물의 경우, EC50은 더 낮은 농도에서 동일한 치료 효과를 얻을 수 있으므로 투여할 약물의 양이 적고, 잠재적으로 부작용 발생률이 낮기 때문에 중요하다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "항원 결합부" 및 "결합부"는 가장 넓은 의미에서 예컨대, CEA, CD47 및 CD3과 같은 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 항체의 일부분을 지칭한다. 따라서, 결합부는 경쇄 및 중쇄 가변부의 일부, 및 경쇄 및 중쇄의 일부인, 중쇄 및 경쇄의 6개의 CDR을 포함한다.

더욱 구체적으로, 본원에서 사용되는 바, 막 결합 인간 암배아 항원(CEA, CEACAM5와 동일), CD47 또는 CD3에 결합하는 결합부는 CEA, CD47 또는 CD3에, 더욱 특히, 세포 표면 또는 막 결합 CEA, CD47 또는 CD3에 특이적으로 결합한다. 따라서, 각 결합부는 CEA, CD47 또는 CD3에 결합한다. "특이적으로 결합하는, ~에 특이적인, ~에 결합하는"이란, 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치 않거나, 또는 비특이적인 상호작용과 구별될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 비관련된, 비표적 단백질에의 항표적 항체의 결합 정도는 예컨대, 생물층 간섭법, 예컨대, 옥테트(Octet)®, 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance), 예컨대, 비아코어(Biacore)®, 효소 결합 면역흡착(ELISA: enzyme-linked immunosorbent) 또는 유세포 분석법(FACS)에 의해 측정된 바, 상기 표적에의 항체의 결합보다 약 10배, 바람직하게는 >100배 더 적다. 표적은 본원에서 논의된 단백질 - 예컨대, CEA, CD47, 및 CD3ε이다.

한 실시양태에서, CEA 및 CD47에 특이적으로 결합하는, CEA 및 CD47에 결합하는, 및 CEA 및 CD47에 특이적인이라는 어구는 항체, 예컨대, 이중특이적 항체가 CEACAM5 및 CD47을 발현하는 종양 세포를 표적화하는 데 치료제로서 유용하도록 하는 데 충분한 친화도로 표적 CEA 및 CD47에 결합할 수 있다는 것을 지칭한다. 특정 EC50 값으로 MKN-45, SNU-C1, LS174T, SK-CO-1, HPAF-II 및/또는 LoVo 세포에 결합한다고 언급하는 것은 유세포 분석법에 의해 측정된 EC50 값을 지칭한다(실시예 6 참조).

본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 본원에 사용되는 바, 용어 "항체 중쇄"는 전장 항체에 대해 정의된 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된 항체 중쇄를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "항체 경쇄"는 전장 항체에 대해 정의된 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된 항체 경쇄를 지칭한다.

"전장 항체"라는 용어는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 구성된 항체를 나타낸다. "전장 항체 중쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)으로 구성된 폴리펩티드이며, 이는 VH-CH1-HR-CH2-CH3로 약칭된다. "전장 항체 경쇄"는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된 폴리펩티드이며, 이는 VL-CL로 약칭된다. 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 2개의 전장 항체 도메인은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이에서 폴리펩티드간 디술피드 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 IgG(예컨대, IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 천연 항체이다. 본 발명에 따른 전장 항체는 한 실시양태에서, 인간 IgG1 타입의 것이고, 추가의 한 실시양태에서, 하기에서 정의된 바와 같은 Fc 부분에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고/거나, Asn297에 부착된 다당류 쇄에서 당조작된 것이다. 본 발명에 따른 전장 제1 항체는 각각 하나는 CEA에 결합하고, 다른 하나는 CD47에 결합하는 것인 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 형성된 2개의 결합부를 포함한다. 본 발명에 따른 전장 제2 항체는 각각 하나는 CEA에 결합하고, 다른 하나는 CD3에 결합하는 것인 한 쌍의 VH 및 VL에 의해 형성된 2개의 결합부를 포함한다.

본원에서 사용되고, 상기에서 언급된 바와 같이, "상보성 결정 영역(들)"(CDR(들): Complementarity determining 영역(s))은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드, 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비연속 항원 결합 부위(이는 또한 항원 결합 영역으로도 공지)를 기술한다. CDR은 또한 "초가변 영역"(HVR: hypervariable 영역)으로도 지칭되며, 상기 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분과 관련하여 본원에서 "CDR"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다. 상기 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함)에 기술되어 있다. 카바트(Kabat)에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 하기 서열 목록 표에 제시되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 어떤 잔기가 특정 CDR을 구성하는지를 통상적으로 결정할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "서열 번호 x의 CDRL1을 포함하는"이라는 용어는 언급된 가변 경쇄의 CDRL1 영역이 (CDRL1로서 서열 번호 x의 CDRL1을 포함하는) 서열 번호 x의 것이라는 것을 지칭한다. 다른 CDR도 마찬가지이다. 달리 명시되지 않는 한, HVR 잔기는 본원에서 문헌 [Kabat et al. 상기 문헌 동일]에 따라 넘버링되고, "CDR"로 명명되며, 본 발명에 따른 이중특이적 항체에서 다른 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 또한 카바트 넘버링 체계에 따른다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "Fc 영역" 및 "Fc 도메인"은 IgG 중쇄의 C 말단 영역을 지칭하고; IgG1 항체의 경우, C 말단 영역은 -CH2-CH3를 포함한다(상기 참조). IgG 중쇄의 Fc 영역 경계는 약간 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기에서 카복실 말단까지 뻗어 있는 것으로 정의된다. 불변 영역은 당업계 최신 기술에 널리 공지되어 있으며, 예컨대, (Kabat, E.A.)에 의해 기술되어 있다(예컨대, 문헌 [Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218]; [Kabat, E.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788] 참조).

IgG 분자는 각 중쇄에 하나씩 그의 Fc 영역에 2개의 N 연결 올리고당을 보유한다. 임의의 당단백질로서, 항체는 동일한 폴리펩티드 백본을 공유하지만, 글리코실화 부위에 부착된 상이한 올리고당을 갖는 당형태 집단으로 제조된다. 글리칸 모이어티에서 푸코스 함량이 감소된 항체는 일반적으로 푸코실화된 항체와 비교하여 더 높은 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC) 활성을 나타낸다(문헌 [Niwa R et al., Cancer Res, 64, 2127-33, 2004]). 푸코스 첨가를 담당하는 유전자(α1,6-푸코실트랜스퍼라제; FUT8)에 대한 두 대립형질이 넉아웃된 세포주는 US6946292, US7425446, US8067232(각각 그 전문이 참조로 포함)에 기술되어 있다. 상기 세포주를 사용하여, 푸코스 함량이 감소되고, ADCC 및 항체 의존적 세포 식작용(ADCP)이 증가된, 글리칸 모이어티를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. 푸코스 함량이 감소된 항체를 제조하는 데 사용할 수 있는 또 다른 기술은 US8642292(본원에 참조로 포함)에 기술되어 있다. 이 기술은 CHO 세포주 등과 같은 항체 생산자 세포주 내로 이종성 박테리아 효소를 안정적으로 통합시키도록 디자인된 것이다. 이러한 조치에 의해 D-만노스로부터의 푸코스의 드 노보 합성은 차단된다. 또한 생산 세포가 푸코스가 없는 배지에서 배양되는 경우, 결과적으로 안정적인 수준으로 어푸코실화된 항체가 생성된다. 본 발명의 어푸코실화된 이중특이적 항체를 제조 및 정제하는 예시적인 방법은 실시예 9(1. 및 2.)에 기술되어 있다.

Fc 도메인 내의 돌연변이는 또한 상이한 Fc 수용체에의 Fc 도메인의 결합 특성을 변경시킬 수 있다(WO2004063351, WO2004099249; WO2005018669, WO2005063815, WO2005110474, WO2005056759, WO2005092925, WO2005018572, WO2006019447, WO2006116260, WO2006023420, WO2006047350, WO2006085967, WO2006105338, WO2007021841, WO2007008943, WO2007024249, WO2007041635, WO2007048077, WO2007044616, WO2007106707, WO2008022152, WO2008140603, WO2008036688, WO2008091798, WO2008091954, WO2008092117, WO2008098115, WO2008121160, WO2008150494, WO2010033736, WO2014113510(이들은 각각 그 전문이 참조로 포함)).

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정기를 포함한다. 특정 실시양태에서, "에피토프"는 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하고, 특정 실시양태에서, 특정 3차원 구조적 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합이 이루어지는 표적의 영역이다. 한 실시양태에서, 제1 이중특이적 항체는 CEACAM5의 N 말단 도메인에 결합한다(아미노산 35-144의 Ig 유사 V 타입 도메인, UniProtKB - P06731). CEACAM5에의 이중특이적 항체의 결합 위치는 에피토프 비닝을 통해 달성된다. 에피토프 비닝에서, 항체는 쌍별 조합 방식으로 시험되며, 동일한 결합 영역에 대해 경쟁하는 항체는 빈으로 함께 그룹화된다. 최신 기술에 따라 및 본원에 기술된 바와 같이, 본원에서는 항CEA 항체를 사용하여 경쟁 시험이 수행된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제1 이중특이적 항체는 참조 항체 SM3E와 CEACAM5에의 결합에 대해 경쟁한다. 경쟁은 0.5 ㎍/ml 농도의 비오티닐화된 인간 CEACAM5를 고정화하고, 참조의 연속 희석액(67 nM 내지 0.09 nM)과 함께 인큐베이션시키는 검정법에 의해 측정된다. 본 발명의 이중특이적 항체를 실온에서 1시간 동안 0.1 ㎍/ml로 첨가한다. 플레이트를 세척하고, 결합된 CEAxCD47 또는 CEAxCD3 이중특이적 항체를 검출한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "공통 중쇄"(cHC: common heavy chain)는 N 말단에서 C 말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)으로 구성된 폴리펩티드를 지칭하며, VH-CH1-HR-CH2-CH3으로 약칭된다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 적합한 공통 중쇄는 WO2012023053, WO2013088259, WO2014087248, 및 WO2016156537(이들은 각각 그 전문이 참조로 포함)에 기술된 바와 같은 중쇄이다. 한 실시양태에서, 제1 항체의 공통 중쇄는 중쇄 CDR로서 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 cHC는 중쇄 가변 영역 VH로서 서열 번호 26의 VH 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 공통 중쇄 cHC의 Fab 부분은 서열 번호 27의 것(VH-CH1)이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 공통 중쇄 cHC는 서열 번호 28의 것(VH-CH1-CH2-CH3)이다. 서열 번호 28은 추가로 IgG1 Fc 부분을 포함하는 중쇄이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체들은 cHC를 포함하는 κλ 이중특이적 항체(κλ 바디)이다.

κλ 바디 포맷은 표준 단일클론 항체와 구별할 수 없는 특징을 갖는(예컨대, WO2013088259, WO2012023053 참조), 환자에서 잠재적인 면역원성이 없거나, 낮을 가능성이 있는 이중특이적 항체의 친화성 정제를 허용한다.

본 발명에 따라 사용되는 이중특이적 항체는 공통 중쇄를 포함하고, 예를 들어, WO2012023053(그의 전문이 참조로 포함)에 따라 제조될 수 있다. 상기 타입의 분자는 고유한 중쇄 폴리펩티드의 두 카피, 불변 카파 도메인에 융합된 제1 경쇄 가변 영역 및 불변 람다 도메인에 융합된 제2 경쇄 가변 영역으로 이루어진다. 한 결합 부위는 CEA에 대한 특이성을 나타내고, 다른 부위는 CD47에 대한 특이성을 나타내며, 여기서, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄가 그에 기여한다. 경쇄 가변 영역은 람다 또는 카파 패밀리일 수 있고, 바람직하게는 각각 람다 및 카파 불변 도메인에 융합된다. 이는 비천연 폴리펩티드 접합부의 생성을 피하기 위해 선호되는 것이다. 그러나, 제1 특이성을 위해 카파 경쇄 가변 도메인을 불변 람다 도메인에 융합시키거나, 또는 제2 특이성을 위해 람다 경쇄 가변 도메인을 불변 카파 도메인에 융합시킴으로써 본 발명의 이중특이적 항체를 수득할 수 있다. 이어서, 다른 경쇄는 항상 완전 카파(VL 및 CL) 또는 완전 람다(소위 카파 람다 이중특이적 항체의 하이브리드 포맷으로 불림)이다. WO 2012023053에 기술된 이중특이적 항체는 "κλ 바디"이다. 상기 κλ 바디 포맷은 표준 단일클론 항체와 구별할 수 없는 특성을 가진 표준 IgG 분자와 구별할 수 없는 이중특이적 항체의 친화성 정제를 허용하는 바, 따라서, 예컨대, 아미노산 브릿지 또는 다른 비생리적 요소를 포함하는 이전 포맷과 비교하여 바람직하다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "CEA" 및 "CEACAM5"는 세포 표면 당단백질 및 종양 연관 항원(문헌 [Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965]; [Berinstein NL, J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002])인, 인간 암배아 항원(CEA, CEACAM-5 또는 CD66e; UniProtKB - P06731)을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "CEACAM3"은 이 또한 암배아 항원 관련 세포 부착 분자(CEACAM) 패밀리의 구성원인 인간 CEACAM3(UniProtKB - P40198 (CEAM3_HUMAN)을 지칭한다. 추가 정보 및 CEA 패밀리의 다른 구성원에 대한 정보는 http://www.uniprot에서 살펴볼 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 맥락에서 "CD47에 특이적으로 결합하는," "CD47에 결합하는" 및 "CD47 결합부"라는 용어는 인간 CD47에 대한 특이성을 지칭한다. 인간 CD47은 다중 통과 막 단백질이며, 3개의 세포외 도메인(아미노산 19-141, 198-207 및 257-268; UniProtKB - Q08722 참조)을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "CD47에의 결합 친화도"는 생물층 간섭법(Octet Technology) 및/또는 표면 플라스몬 공명(Biacore Technology)에 의해 정량적으로(KD) 측정된다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제1 이중특이적 항체의 CD47에의 결합은 상기 세포외 도메인 중 하나 이상의 것을 통해 이루어진다.

본원에서 사용되는 바, "서열 번호 27의 중쇄를 특징으로 하는"이라는 용어는 표 1에 제시된 바와 같은, 본 발명에 따른 항체의 Fab 부분인 중쇄의 VH-CH1 부분을 지칭한다. 상기 중쇄는 추가로, 및 일반 지식에 따라, 힌지 영역, CH2, CH3으로서 추가 부분을 포함할 수 있고, 예컨대, F(ab')₂ 포맷과 같은 임의의 항체 포맷일 수 있다. 바람직한 포맷은 상기 기술된 바와 같은 공통 중쇄 포맷이다.

본원에서 사용되는 바, "CEA에 특이적으로 결합하는," "CEA에 결합하는" 및 "CEA 결합부"라는 용어는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 재조합 인간 CEACAM5에의 결합을 지칭하는 것으로, 여기서, 상기 항체는 재조합 인간 CEACAM5에의 결합의 KD 값과 비교하여 100배 이상의 KD 값으로 재조합 인간 CEACAM3에 결합하는 것이다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "KD"는 본 발명에 따른 이중특이적 항체와 그의 항원 CEACAM5 또는 CEACAM3 사이의 평형 해리 상수를 지칭하고, nM으로 명기되고, 예컨대, 표면 플라스몬 공명 및/또는 생물층 간섭법(실시예 3)에 의해 측정될 수 있다.

세포 상의 CEA(CEACAM5)에의 결합은 상이한 종양 세포주, 예컨대, LoVo, LS174T, MKN-45, SNU-C1, SK-CO-1, HPAF-II를 사용하여 측정된다. 본 발명에 따른 제1 항체의 농도는 상기 정의된 바와 같은, 세포에의 결합에 대하여 생성된 EC50 값 및 Emax 값과 관련하여 적절한 범위에서 달라진다. K2AC22 및 K2AC100의 다양한 종양 세포주에의 결합에 대한 EC50 및 Emax는 표 4에 열거되어 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "막 결합 인간 CEA"는 세포의 막 부분 또는 세포의 표면, 특히, 종양 세포의 표면에 결합된 인간 암배아 항원(CEA)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "CD3ε" 및 "CD3"은 인간 CD3ε(UniProtKB - P07766 (CD3E_HUMAN)을 지칭한다. 용어 "CD3ε(CD3)에 대한 항체" 및 "항CD3ε(CD3) 항체"는 CD3ε에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD3ε에 대한 항체는 항CD3 항체 SP34(BD Biosciences 카탈로그 번호 565983)와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "ADCP"는 항체 의존적 세포 식작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 본 발명에 따른 식작용, 식작용의 EC50 값, 식작용의 최대값, 및 식작용 지수는 종양 세포주, 예컨대, LoVo, LS174T, SNU-C1 및/또는 MKN-45를 이용하여 "이미징"에 의해 측정된 식작용을 지칭한다. 예컨대, 1:1 또는 1:3의 이펙터(대식세포):표적(종양) 세포 비로 인큐베이션시키고, 판독값으로서 "식작용 지수"(이미징으로 측정된 ADCP")를 갖는 적절한 이미징 방법이 실시예 7에 기술되어 있다. 본원에서 사용되는 바, "상기 이중특이적 항체의 식작용"이란, 상기 항체에 의해 유발/유도된 식작용을 의미한다.

용어 "인간 IgG" 및 "hIgG"는 인간 항체 이소타입을 지칭한다. 실험 설정에서 사용되는 바, 상기 용어는 CD47 및 CEACAM5에 특이적으로 결합하지 않는 인간 면역글로불린 IgG의 상업적으로 이용가능한 임상 등급의 균질 제제(예컨대, Bio-Rad로부터 이용가능)를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "항체 K2AC22"는 WO2019234576에 개시된 바와 같은 항체를 지칭한다. 항체는 공통 중쇄(WO2019234576의 서열 번호 5), CEACAM5에 결합하는 경쇄(WO2019234576의 서열 번호 65), 및 CD47에 결합하는 경쇄(WO2019234576의 서열 번호 11)를 포함한다.

항CEA 항원 결합 분자의 치료적 적용 및 사용 방법

본 발명에 따른 조합 요법은 한 실시양태에서, PD-1 축 길항제와 함께 조합하여 주로 주로 종양 세포의 대식세포 매개 식작용에 의해 뿐만 아니라, ADCC에 의해 이루어지는 고형 종양의 치료를 위해 최적화된다. 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 항체들은 하기 기술되는 바와 같이 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 질환 resp. 고형 종양은 결장직장 종양, 비소세포 폐 종양, 위 종양, 췌장 종양 및 유방 종양으로 구성된 군을 포함하나, 이에 제한되지 않는, CEACAM5를 발현하거나, 또는 심지어 과다발현하는 암이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서 종양은 위 종양 또는 위식도 연접부 종양이다. 특정 실시양태에서 종양은 CEACAM5를 발현하는 위 종양/위식도 연접부 종양이다. 특정 실시양태에서 종양은 폐 종양이다. 본원에 기술된 모든 치료 적용 사용 방법, 용도, 조합 등은 특히 상기 종양/질환의 치료를 위한 실시양태이다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 항체들이 IgG 유사 구조와 아키텍처를 고려할 때 각각 중화 항약물 항체(ADA)에 기인하는 약물 노출 상실로 각각 효능이 상실됨에 따라 ADA 형성 가능성이 낮거나, 또는 없다는 것을 인식한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암종(암, 종양, 예를 들어, 인간 암종), 특히, CEACAM5 발현 종양을 생체내에서 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명에 따른 조성물을 약학적 유효량으로 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. "피험체"는 인간 피험체, 한 실시양태에서, 암/종양/암종을 앓는 환자를 의미한다.

CEACAM5 발현은 다양한 종양 엔티티에서, 특히 다른 것들 중에서도 결장직장 암종, 췌장 선암종, 위암, 비소세포 폐암, 유방암에서 발견될 수 있다. 위장관의 건강하고, 정상적인 선 상피에서, CEACAM5는 주로 세포의 정단 표면에서 분극화된 패턴으로 발현된다. 이러한 분극화된 발현 패턴은 전신으로 단독 투여되는 항CEA 단일 또는 이중특이적 항체에 의한 접근을 제한하고, 이로써, 건강한 조직에 대한 잠재적인 독성을 제한한다. 제1 항체의 낮은 친화도의 CD47 결합과 함께 제2 항체의 투여는 본 발명에 따른 사용에 의한 상기 정상 세포의 살해/식작용을 유도하지 않거나, 또는 제한한다. 이러한 분극화된 발현 패턴은 위장 및 다른 악성 종양의 세포에는 더 이상 존재하지 않는다. CEACAM5는 암 세포의 전체 세포 표면에 걸쳐 동등하게 발현된다. 이는 암 세포가 정상적인 건강한 세포보다 제1 및 제2 항체에 훨씬 더 잘 접근할 수 있고, 본 발명에 따른 조합에 의해 선택적으로 살해될 수 있다는 것을 의미한다. 암 세포에서 CEACAM5의 발현은 대부분 비악성 세포에서의 발현보다 높다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조합은 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용된다. 한 실시양태에서, 조합은 PD-1 축 길항제와 함께 조합하여 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용된다. 상기 PD-1 축 길항제는 예컨대, WO2017118675에 기술되어 있다. 상기 조합을 통해 대식세포와 T 세포에 의해 고형 종양에서 암 세포를 공격할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 제1 항체 및 제2 항체의 "조합, 동시, 개별, 또는 순차적 조합"이라는 용어는 2개의 항체(또는 PD-1 축 길항제의 조합인 경우, 3개의 항체)를 개별적으로 또는 함께 투여하는 것을 지칭하고, 여기서, 2개 또는 3개의 항체는 조합 요법의 이점을 얻도록 디자인된 적절한 투여 요법, 예를 들어, 개별, 순차적, 동시, 공동, 시차를 둔 또는 교대 투여의 일부로 투여된다. 따라서, 2개 또는 3개의 항체는 동일한 약학 조성물의 일부로서 또는 별개의 약학 조성물로 투여될 수 있다. 제1 항체는 제2 이중특이적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 이후에, 또는 그의 일부 조합으로 투여될 수 있다. 제1 항체가 반복된 간격으로 환자에게 투여되는 경우, 제2 이중특이적 항체는 제1 항체의 각각의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에, 또는 그의 일부 조합으로, 또는 제1 항체를 사용한 치료와 관련하여 상이한 간격으로, 또는 제1 항체를 사용한 치료 과정 전에, 그 동안 어느 시점에든 또는 그 이후에 단일 용량으로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 항체 및 제2 항체는 교대 투여로, 한 실시양태에서, 제1 항체와 제2 항체의 투여 사이에 6 내지 15일의 간격을 두고 투여된다. 상기 교대 투여에서, 제1 투여는 제1 항체 또는 제2 항체일 수 있다.

용어 "PD-1 축 길항제"는 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 지칭한다. 항PD-1 항체는 예컨대, 펨브롤리주맙(Keytruda®, MK-3475), 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, MEDI-0680, PDR001 및 REGN2810이다. 항PD-1 항체는 예컨대, 5 WO200815671, WO2013173223, WO2015026634, US7521051, US8008449, US8354509, WO20091 14335, WO2015026634, WO2008156712, WO2015026634, WO2003099196, WO2009101611, WO2010/027423, WO2010/027827, WO2010/027828, WO2008/156712, 및 WO2008/156712(이들은 각각 그 전문이 참조로 포함)에 기술되어 있다.

항PD-L1 항체는 예컨대, 아테졸리주맙, MDX-1 105, 두르발루맙 및 아벨루맙이다. 항PD-L1 항체는 예컨대, WO2015026634, WO2013/019906, W02010077634, US8383796, WO2010077634, WO2007005874, 및 WO2016007235(이들은 각각 그 전문이 참조로 포함)에 기술되어 있다.

제1 및 제2 항체의 조합 투여와 관련하여, 두 화합물 모두 하나의 단일 투여 형태로 또는 별도의 투여 형태로, 예를 들어, 2개의 상이한 또는 동일한 투여 형태로 존재할 수 있다.

제1 및 제2 항체는 CEACAM5 결합과 관련하여 경쟁하지 않고, 따라서, 의사가 원하는 경우, 동시에 투여될 수 있다.

제1 및 제2 항체는 전형적으로 당업계에 공지된 바와 같이, 효능 및 안전성 관점, 둘 모두에서 암을 가장 적절하게 치료하는 투여 요법으로 환자에게 투여될 것이다. 바람직하게, 종양 세포는 상기 접근법의 완전한 치료 잠재력을 달성하기 위해 T 세포 및 대식세포에 의해 동시에 공격을 받는다. 따라서, 본 발명에 따른 CEAxCD3 및 CEAxCD47 이중특이적 항체는 세포 표면의 CEA에의 결합과 관련하여 비경쟁적이어야 한다.

상기 논의된 바와 같이, 투여되는 항체들의 양 및 항체들의 투여 시기는 치료되는 환자의 타입(예컨대, 성별, 연령, 체중) 및 상태, 치료되는 질환 또는 병태의 중증도, 및 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 항체는 1일 또는 1주일에 체중 1 kg당 0.1 내지 100 mg 범위의 용량으로 단일 또는 분할 용량으로 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체들은 각각 0.1 내지 30 mg/kg 범위의 용량으로 환자에게 투여된다. 일부 경우에는 상기에서 언급된 범위의 하한보다 낮은 투여량 수준이 적절할 수 있는 반면, 다른 경우에는 훨씬 더 많은 용량이 임의의 유해한 부작용을 유발하지 않으면서 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "항체의 반감기"는 통상적인 약동학적 검정법에서 측정된 상기 항체의 제거 반감기를 지칭한다. 제1 및 제2 이중특이적 항체는 3-14일의 제거 반감기를 가진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 질환, 특히, CEACAM5가 발현되는, 특히, CEA가 동일한 세포 타입의 정상 조직과 비교하여 과다발현되는(예컨대, 세포 표면 상에 과다발현되거나, 또는 상이한 패턴으로 발현되는) 세포 증식 장애의 치료에서의 본 발명에 따른 조합의 용도에 관한 것이다. 상기 장애로는 결장직장암, NSCLC(비소세포 폐암), 위암, 위식도암, 췌장암, 및 유방암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. CEACAM5 발현 수준은 상이한 최신 방법(예컨대, 면역조직화학 검정법, 면역형광 검정법, 면역효소 검정법, ELISA, 유세포 분석법, 방사선면역검정법 등을 통해)에 의해 측정될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명의 조합은 CEACAM5를 발현하는 세포를 생체내에서 또는 시험관내에서 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 조합은 특히 종양 세포의 ADCP 및 ADCC 유도를 통한 종양 근절 및 종양 성장 또는 전이의 억제에 특히 유용하다. 조합은 CEACAM5를 발현하는 임의의 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 조합으로 치료될 수 있는 특정 악성 종양으로는 결장직장암, 비소세포 폐암, 위암, 위식도 연접부 암, 췌장암, 및 유방암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

조합은 인간에게 볼루스로서 정맥내로 투여되거나, 일정 기간 동안 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 국소 경로에 의해 투여될 수 있는 것을 비롯하여, 하기에서 논의되는 것과 같은 약학적으로 허용되는 투여 형태로 인간에게 투여된다. 조합은 또한 국소 및 전신 치료 효과를 발휘하기 위해 종양내, 종양 주위, 병변내 또는 병변 주위 경로에 의해 적합하게 투여된다.

질환의 치료를 위해, 제1 및 제2 항체의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 타입, 질환의 중증도 및 경과, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 좌우될 것이다. 제1 및 제2 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 본 발명은 CEACAM5를 발현하는 종양 세포(본원에서는 또한 암 세포로도 명명)를 선택적으로 살해하는 방법을 제공한다.

본 방법은 제1 및 제2 이중특이적 항체와 상기 종양 세포의 상호작용을 포함한다. 이들 종양 세포는 결장직장 암종, 비소세포 폐 암종(NSCLC), 위 암종, 위식도 연접부 암, 췌장 암종 및 유방 암종을 포함하는 인간 암종으로부터 유래될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 CEACAM5 과다발현과 관련된 질환 치료용 의약의 제조를 위한 제1 및 제2 항체의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 질환은 결장직장 종양, 비소세포 폐 종양, 위 종양, 위식도 연접부 종양, 췌장 종양, 및 유방 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는, CEACAM5를 발현하거나, 또는 심지어는 과다발현하는 암이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다.

조성물, 제제, 투여량 및 투여 경로

한 측면에서, 본 발명은 제1 및 제2 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 예컨대, 암과 같은 질환의 치료 방법에서 또는 예컨대, 암과 같은 질환의 치료용 의약 제조에서의 상기 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 치료, 및 더욱 특히, 암 치료 방법에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 인간 암종, 종양을 치료하기 위한 약학 조성물, 조합물 및 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 약학적 유효량의 제1 및 제2 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인간 암종의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 이중특이적 항체 조성물은 정맥내, 복강내, 경구, 림프내 또는 직접적인 종양내 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는 통상적인 투여 모드를 사용하여 투여될 수 있다. 정맥내 투여 또는 피하 투여가 바람직하다.

본 발명의 한 측면에서, 제1 및 제2 항체를 함유하는 치료 제제는 동결건조 제제 또는 액체 제제의 형태로 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 보관용으로 제조된다(문헌 [Remington's Ph아암aceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균 상태여야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 가장 효과적인 투여 모드 및 투여량 요법은 질환의 중증도 및 경과, 환자의 상태 및 치료에 대한 반응 및 담당 의사의 판단에 따라 결정된다. 따라서, 조성물의 투여량은 균일한 용량일 수 있거나, 또는 개별 환자, 예컨대, 체중, 또는 제곱미터(체표면적)당 체중에 맞게 적합화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 조성물의 유효 용량은 일반적으로 0.1 내지 30 mg/kg의 범위가 될 것이다.

제1 및 제2 항체는 Mol당 150 kD 규모의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 이는 Fc 부분을 보유한다. 환자에서 제거 반감기는 3 내지 14일 범위이다. 이 반감기는 하루에 한 번, 일주일에 한 번 또는 2주에 한 번 투여, 또는 심지어는 4주 한 번 투여를 허용하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 액체 액제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 중합체성 마이크로캡슐 또는 마이크로소포체, 리포솜 및 주사용 액제 또는 주입용 액제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 투여 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 모드 및 치료 적용에 따라 달라진다.

조성물은 우수한 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 인자로는 치료 중인 특정 질환 또는 장애, 치료 중인 특정 인간, 개별 환자의 임상 상태, 질환 또는 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 다른 인자를 포함한다.

제조 물품

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품은 용기, 및 용기 위의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 인서트를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 예컨대, 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 수용하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 니들에 의해 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 이중특이적 항체이다. 라벨 또는 패키지 인서트는 본 조성물이 선택된 병태를 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 한 실시양태에서, 제조 물품은 (a) 제1 항체를 포함하는 제1 용기, 및 제2 항체를 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제조 물품은 한 용기에 두 항체를 모두 포함할 수 있다. 더욱이, 제조 물품은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 추가 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서, 제조 물품은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 인서트를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대, 주사용 정균수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트 완충처리된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들 및 시린지를 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1: 인간 CEACAM5의 클로닝 , 발현, 및 정제; huCEACAM3 및 huCD47의 공급원.

완전 세포외 도메인(ECD: extracellular domain) CEACAM5에 상응하는 서열을 pEAK8 포유동물 발현 벡터(Edge Biosystems: 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)로 서브클로닝하였다. 벡터를 변형시켜 C 말단에 아비태그(Avitag)™(Avidity, 미국 콜로라도주 덴버 소재) 및 헥사-히스티딘 태그, 인간 Fc 영역 또는 마우스 Fc 영역을 도입하였다. DNA 시퀀싱에 의해 구성물을 확인하였다. IMAC(고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피: Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography), FcXL 또는 캡쳐셀렉트™ IgG-Fc(ms) 친화성 매트릭스(CaptureSelect™ IgG-Fc(ms) Affinity Matrix)에 의해 재조합 가용성 단백질의 정제를 수행하였고; 인간 CEACAM3 및 비오티닐화된 CEACAM3은 ACRO바이오시스템즈(ACROBiosystems: 미국 뉴어크 소재)(Thermo Fisher Scientific)로부터 이용가능하다. 인간 CD47 및 비오티닐화된 CD47은 WO2019234576에 기술된 바와 같이 제조될 수 있거나, 또는 ACRO바이오시스템즈(미국 뉴어크 소재)로부터 이용가능하다.

실시예 2: 람다 및 카파 경쇄를 보유하는 이중특이적 항체의 발현 및 정제

동시 발현은 예컨대, 각각이 공동 발현시키고자 하는 쇄 중 하나를 발현하는 것인 다중 벡터의 형질감염과 같은 상이한 방식으로, 또는 다중 유전자의 발현을 구동하는 벡터를 사용함으로써 달성될 수 있다. 벡터 pNovi κHλ는 US 2012/0184716 및 WO 2012/023053(이는 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함)에 기술된 바와 같이 1개의 중쇄, 1개의 카파 경쇄 및 1개의 람다 경쇄의 공동 발현을 허용하도록 이전에 생성되었다. 3개 유전자의 발현은 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(hCMV)에 의해 구동되고, 벡터는 안정적인 세포주의 선별 및 확립을 가능하게 하는 글루타민 합성 효소 유전자(GS: glutamine synthetase gene) 또한 함유한다. 항hCEACAM5 IgGλ 또는 항hCD47 IgGκ를 포유동물 세포에서 일시적인 발현을 위해 벡터 pNovi κHλ에 클로닝하였다. 피크(peak) 세포 또는 CHO 세포를 적합한 세포 개수 및 배양 배지 부피(우태아 혈청 함유)가 있는 적절한 플라스크에서 배양한다. 제조사의 설명서에 따라 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)을 사용하여 플라스미드 DNA를 세포에 형질감염시킨다. 형질감염된 세포의 상청액 중 항체 농도는 옥테트RED96(OctetRED96)을 사용하여 생산하는 동안 측정한다. 항체 농도에 따라, 형질감염 5 내지 7일 후에 상청액을 수확하고, 1300 g로 10 min 동안 원심분리하여 정화시킨다. 정제 프로세스는 3개의 친화도 단계로 구성된다. 먼저, FcXL 친화성 매트릭스(Thermo Fisher Scientific)를 PBS로 세척한 후, 이어서, 정화된 상청액에 첨가한다. +4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 상청액을 2000 g로 10 min 동안 원심분리하고, 통과액을 보관하고, 수지를 PBS로 2회 세척한다. 이어서, 수지를 아미콘™ 프로(Amicon™ Pro) 칼럼으로 옮기고, pH 3.0의 50 mM 글리신을 함유하는 용액을 용출에 사용한다. 수개의 용출 분획이 생성되고, 이를 풀링시키고, 50 kDa 아미콘™ 울트라 센트리퓨갈(Amicon™ Ultra Centrifugal) 필터 장치(Merck KGaA: 독일 다름슈타트 소재)를 사용하여 PBS에 대해 탈염시킨다. 상청액으로부터의 총 인간 IgG를 함유하는 용출된 생성물을 나노드롭(Nanodrop) 분광광도계(NanoDrop Technologies: 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재)를 사용하여 정량화하고, 적절한 부피의 카파 선택 친화성 매트릭스(GE Healthcare)와 함께 20 rpm으로 RT에서 15 min 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션, 수지 회수, 용출 및 탈염 단계는 앞서 기술된 바와 같이 수행된다. 마지막 친화성 정제 단계는 람다 Fab 선택 친화성 매트릭스(GE Healthcare)를 사용하여 이전 두 정제와 동일한 프로세스를 적용하여 수행된다. 최종 생성물을 나노드롭을 사용하여 정량화한다. 정제된 이중특이적 항체를 변성 및 환원 조건하에 전기영동에 의해 분석한다. 애질런트 2100 바이오애널라이저(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 프로테인 80(Protein 80)과 함께 제조사(Agilent Technologies: 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 의해 기술된 바와 같이 사용한다. 4 ㎕의 정제된 샘플을 디티오트레이톨(DTT; Sigma Aldrich: 미국 미주리주 세인트루이스)로 보충된 샘플 완충제와 함께 혼합한다. 샘플을 95℃에서 5 min 동안 가열한 후, 이어서, 칩 상에 로딩한다. 모든 샘플을 리물루스 아메보사이트 라이세이트 시험(LAL: Limulus Amebocyte Lysate; Charles River Laboratories: 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)을 사용하여 내독소 오염에 대해 시험한다.

실시예 3: KD 측정.

a) 재조합 인간 CEACAM5에의 Ab의 KD를 측정하기 위한 실험 절차(Octet)

생물층 간섭법(BLI: Bio-Layer Interferometry) 기술을 사용하여 재조합 가용성 인간 CEACAM5에 대한 본 발명의 CD47xCEACAM5 이중특이적 항체의 항인간 CEACAM5 아암의 친화도를 측정하였다. 옥테트RED96 기기 및 프로테인 A(Protein A) 바이오센서를 사용하였다(Sartorius). 30℃에서 측정을 수행하였다. 키네틱(Kinetic) 완충제(PBS, 0.002% 트윈 20, 0.01% BSA, Kathon; Sartorius)에서의 수화, 사전 컨디셔닝, 및 기준선 단계 후, 키네틱 완충제 중 0.5 ㎍/mL의 κλ 바디를 바이오센서에 5 min 동안 로딩하였다. 이어서, 50 nM로 시작하여 2x의 희석률로 재조합 인간 CEACAM5 세포외 도메인(ECD: Extra Cellular Domain) 가용성 단백질의 일련의 희석액(사내 제조)에 바이오센서를 침지시켰다. 회합 및 해리 단계를 각각 600초 동안 모니터링하였다. 10 mM 글리신(pH 1.7)을 이용하여 바이오센서를 재생시켰다. 표준 획득률을 적용하였다(5.0 Hz, 평균 20). 곡선은 단계간 보정 없이, 참조 웰 감산, 기준선 상의 Y 정렬을 이용하여 프로세싱하였다. 전체 회합 및 해리 단계에 대해 1:1 글로벌 피팅 모델을 적용하여 친화도를 측정하였다. 동일한 실험 절차에 의해 본 발명의 이중특이적 항체의 재조합 인간 CD47에의 결합 친화도(KD)를 측정하였다. 상기 절차에 의해 측정된, CEACAM5에의 예시적인 본 발명의 이중특이적 항체의 KD는 하기 표 2에 제시되어 있다.

b) 재조합 인간 CEACAM3에의 Ab의 KD를 측정하기 위한 실험 절차(Octet)

생물층 간섭법(BLI) 기술 및 옥테트RED96 기기를 사용하여 재조합 가용성 인간 CEACAM3에 대한 본 발명의 CD47xCEACAM5 이중특이적 항체의 항인간 CEACAM5 아암의 친화도를 측정하였다. 항His 태그 항체가 로딩된 HIS1K 바이오센서(Sartorius)를 사용하여 his 태그부착된 재조합 huCEACAM3(R&D Systems, # 9868-CM)을 포획하였다. 30℃에서 측정을 수행하였다. 키네틱 완충제(PBS, 0.002% 트윈 20, 0.01% BSA, Kathon; Sartorius)에서의 수화, 사전 컨디셔닝 및 기준선 단계 후, 키네틱 완충제 중 0.5 ㎍/mL의 재조합 huCEACAM3을 바이오센서에 5 min 동안 로딩하였다. 이어서, 667 nM로 시작하여 2x의 희석률로 κλ 바디의 일련의 희석액에 바이오센서를 침지시켰다. 회합 및 해리 단계를 각각 60초 및 120초 동안 모니터링하였다. 10 mM 글리신(pH 1.7)을 이용하여 바이오센서를 재생시켰다. 표준 획득률을 적용하였다(5.0 Hz, 평균 20). 곡선은 이중 참조 감산, 기준선 상의 Y 정렬 및 단계간 보정을 이용하여 프로세싱하였다. 전체 회합 단계 및 해리 단계 처음 5초 동안 그에 대해 1:1 글로벌 피팅 모델을 적용하여 친화도를 측정하였다. 상기 절차에 의해 측정된, CEACAM3에의 예시적인 본 발명의 이중특이적 항체의 KD는 하기 표 2에 제시되어 있다.

실시예 4: 참조 항체 SM3E와의 경쟁에 의한 CEACAM5xCD47 이중특이적 항체의 에피토프 비닝

에피토프 비닝은 본 발명에 따른 항체의 결합, 또는 예컨대, 본 발명의 이중특이적 항체의 제1 결합부의 관련된 2가 항CEA(표적 단백질) 항체의 결합을 특징화하기 위해 사용되는 경쟁적 면역검정법이다. 표적 단백질에 결합하는 신규 항체의 경쟁적 차단 프로파일은 상기 표적 단백질에 또한 결합하고, 그에 대한 결합 에피토프가 이미 확립/공개된 항체에 대해 생성된다. 이러한 참조 항체에 대한 경쟁은 항체가 동일하거나, 위상학적으로 밀접하게 관련된 에피토프를 가지므로, 이에 이들은 함께 "비닝된다"는 것을 나타낸다. CEACAM5 참조 항체와 경쟁할 수 있는 본 발명의 CD47xCEACAM5 이중특이적 항체의 능력은 ELISA에 의해 마우스 Fc 영역을 보유하는 SM3E로부터 유래된 참조 항체(US20050147614)(표준 방법을 사용하여 제조된 mAb)를 이용하여 재조합 인간 CEACAM5에 대해 시험된다. SM3E는 CEA의 N 말단, 세포막 원위부에 더 많이 결합한다.

비오티닐화된 인간 CEACAM5를 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트에 0.5 ㎍/ml로 코팅하고, 참조 mAb(0.09 nM 내지 67 nM), 또는 마우스 Fc 영역을 보유하는 비관련 mAb의 일련의 희석액과 함께 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 본 발명의 CD47xCEACAM5 이중특이적 항체를 0.1 ㎍/ml로 실온에서 1시간 동안 첨가한다. 플레이트를 세척하고, 결합된 CD47xCEACAM5 이중특이적 항체를 항인간 IgG(Fc)-HRP(Jackson ImmunoResearch)를 이용하여 검출한다. 세척 후, 플레이트를 암플렉스 레드(Amplex Red) 시약으로 현시한다. 형광 신호를 시너지 HT(Synergy HT) 플레이트 판독기(Biotek) 상에서 측정한다.

본 발명의 CD47 x CEACAM5 이중특이적 항체를 이용하여 경쟁 실험을 수행하였다. K2AC100의 결합은 각 경쟁(즉, 도구) 항체에 의해 80% 이상만큼 감소되었다. 최고 농도의 참고 도구 항체하에서 이중특이적 항체의 결합이 80% 이상만큼 감소되었을 때, CD47xCEACAM5 이중특이적 항체는 본원에서 SM3E 항체와 경쟁하는 것으로 확인된다. 도구 항체의 첨가 및 비첨가하의 결과를 비교하는 경우, CEACAM5에의 결합이 20% 미만만큼 감소되는 경우, CD47xCEACAM5 이중특이적 항체는 도구 항체와 비경쟁적인 것으로 확인된다.

실시예 5: 6개의 상이한 암 세포주의 세포 표면 상의 CEACAM5 및 CD47의 표적 밀도(즉, 분자 개수)의 정량화.

6개의 상이한 암 세포주의 세포 표면에서의 CEACAM5 및 CD47의 표적 밀도(즉, 개수)를 측정하였다. 상기 세포주는 인간 위 선암종 세포(MKN-45, DSMZ ACC 409), 인간 결장직장암 세포(SK-CO-1(ATCC; HTB-39); SNU-C1(ATCC; CRL-5972); Ls174T(ATCC; CL-188) 및 LoVo(ATCC; CCL-229)), 또는 췌장 선암종 세포(HPAF-II, ATCC, CRL-1997)였다.

간접 면역형광 검정법을 이용하여 유세포 분석법에 의해 세포 표면 항원을 정량적으로 측정하기 위해 QIFIKIT®(Agilent Dako)를 사용하였다. QIFIKIT®는 상이하되, 잘 정의된 정량의 마우스 단일클론 항체(Mab)로 코팅된 일련의 6개의 비드 집단으로 구성된다. 비드는 특정 1차 마우스 단일 클론 항체로 표지된 세포를 모방한다. 상이한 세포 표본을 상이한 1차 항체로 표지한 후, 동일한 보정 비드 세트를 사용하여 정량화할 수 있다.

세포를 그의 적합화된 배지에서 배양하고, 트립신-EDTA(Sigma Aldrich)로 분리하고, 원심분리(3 min, 350 g)한 후, 냉 FACS 완충제(PBS, 2% BSA - Sigma Aldrich로부터 입수) 중에 재현탁시키고, 0.22 ㎛(Stericup, Millipore)를 통해 여과하여 3.106개의 세포/mL를 수득하였다. 각 샘플의 3.10⁵개의 세포를 V-바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 1 ㎕의 FcγR 차단 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 10 min 동안 인큐베이션시켰다. 인간 CEACAM5(#sc-23928; mIgG1(Santa Cruz)) 및 인간 CD47(내부 생산; B6H12; 마우스 백본)에 대한 1차 항체 10 ㎕를 최종 농도 20 ㎍/mL로 세포에 첨가하고, 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 200 ㎕의 PBS BSA 2%로 세포를 2회 세척하고, 3 min 동안 400 g로 원심분리하였다. (QIFIKIT®로부터 입수한 셋업 또는 보정) 비드 100 ㎕를 세포와 함께 세척하고, 동일하게 처리하였다. 키트로부터의 2차 항체 100 ㎕(PBS BSA 2% 중 1/50)를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 30 내지 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리(4℃에서 3 min, 400 g)하여 상청액을 폐기하고, 2회 세척하였다. 마지막 원심분리 후, 세포를 130 ㎕의 셀픽스(CellFix) 중에 재현탁시키고, 사이토플렉스(CytoFlex) 세포분석기(Beckman Coulter)에서 획득하였다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 및 Excel 파일로 익스포트된 기하 평균을 이용하여 분석을 수행하였다. 보정 비드로부터의 MFI 값을 이용하여 선형 회귀를 수행하였다. 상기 회귀선으로부터 세포의 항체 결합능(ABC: Antibody Binding Capacity)을 외삽하였다. 특이적 염색 중 하나에 대하여 이소타입 대조군으로부터 ABC를 감산하여 특이적 항체 결합능(sABC: Specific Antibody Binding Capacity)을 얻었다. 상기 분석으로부터의 데이터는 하기 표 3에 제시되어 있다.

실시예 6: CEAxCD47 이중특이적 항체의 CEACAM5 발현 암 세포주에의 결합 측정(EC50 및 최대 결합 ( Emax )).

CD47xCEACAM5 이중특이적 항체의 결합을 CEACAM5 발현 인간 위 선암종 세포(예컨대, MKN-45), CEACAM5 발현 인간 결장직장암 세포(SK-CO-1, SNU-C1, Ls174T, 및 LoVo), 및 CEACAM5 발현 췌장 선암종 세포(HPAF-II)에서 시험하였다.

세포를 수확하고, 계수하고, 생존능에 대해 체크하고, FACS 완충제(PBS 2% BSA, 0.1% NaN3) 중에 3x10⁶개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 V 바닥 96 웰 플레이트에 분배하였다(3x10⁵개의 세포/웰). 4℃에서 1300 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 이어서, 본 발명에 따른 항체를 농도를 증가시켜 가면서 웰에 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 냉 FACS 완충제로 2회 세척하고, PE(R-피코에리트린) 접합된 마우스 항인간 IgG Fc 2차 항체(SouthernBiotech, FACS 완충제 중에 1:100으로 미리 희석)와 함께 4℃에서 추가로 15분 동안 다시 인큐베이션시켰다. 세포를 냉 FACS 완충제로 2회 세척하고, 1:15000으로 희석된 사이톡스블루(SytoxBlue)(Life Technologies)와 함께 300 ㎕ FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 형광, 구체적으로, 평균 형광 활성(MFI)을 사이토플렉스(Cytoflex)(Millipore)를 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 그래프패드 프리즘7(GraphPad Prism7) 소프트웨어를 이용하여 결합 곡선 및 EC50 및 Emax 값을 수득하고, 계산하였다. 상기 분석으로부터의 데이터는 하기 표 4에 제시되어 있다.

K2AC100은 K2AC22와 비교하여 상당히 더 낮은 EC50 및 더 높은 Emax를 나타낸다.

K2AC100은 SK-CO1 세포에는 10 내지 30 nM의 EC50 값으로, MKN-45 세포에는 5 내지 15 nM의 EC50 값으로, HPAF-II 세포에는 5 내지 15 nM의 EC50 값으로, SNU-C1 세포에는 1 내지 10의 EC50 값으로, LS174T 세포에는 3 내지 15 nM의 EC50 값으로, 및/또는 LoVo 세포에는 15 내지 25 nM의 EC50 값으로 결합한다.

K2AC100은 SK-CO1 세포에는 0.5 내지 1.5(MFI x 10⁶)의 Emax 값으로, MKN-45 세포에는 1 내지 2(MFI x 10⁶)의 Emax 값으로, HPAF-II 세포에는 0.5 내지 1.5(MFI x 10⁶)의 Emax 값으로, SNU-C1 세포에는 0.2 내지 0.6(MFI x 10⁶)의 Emax 값으로, LS174T 세포에는 0.05 내지 0.2(MFI x 10⁶)의 Emax 값으로, 및/또는 LoVo 세포에는 0.2 내지 0.5(MFI x 10⁶)의 Emax 값으로 결합한다.

실시예 7: 항체 의존적 세포 식작용( ADCP ) 각각의 식작용(식작용 지수) 측정

6개의 CEACAM5 발현 암 세포주(MKN-45, SK-CO-1, SNU-C1, Ls174T, LoVo 및 HPAF-II)를 이용하여 K2AC100의 시험관내 식작용 활성을 평가하였다. K2AC22는 비교를 위해 동일한 세포주 및 실험 절차를 이용하여 평가하였다.

본 검정법은 셀인사이트 CX5 고함량 스크리닝 플랫폼(CellInsight CX5 High Content Screening Platform)을 이용하는 이미징 기반 방법에 의존한다. 평가되는 판독값은 100개의 대식세포에 의해 포식되는 표적 세포의 평균 개수로 정의되는 식작용 지수이다.

1. 대식세포 제조:

피콜(Ficoll) 구배 원심분리에 의해 다른 건강한 공여자(세포주에 따라 5 내지 7명의 상이한 공여자)로부터의 버피 코트로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)를 단리시켰다. 20 ng/mL의 인간 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: macrophage colony-stimulating factor), PeproTech)의 존재하에서 7 내지 9일 동안 완전 배지(RPMI 1640, 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(Invitrogen)), 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM HEPES 완충제, 25 mg/mL 겐타마이신 (모두 Sigma-Aldrich로부터 입수), 및 50 mM 2-메르캅토에탄올(Thermo Fisher Scientific)) 중에서 PBMC를 배양함으로써 대식세포를 생성한다. 이어서, 세포 배양 배지를 교환하여 분화 단계(+1일째)에서 비부착성 세포를 제거하고, 대식세포를 나타내는 부착성 세포는 세포 해리 완충제(Sigma-Aldrich)를 사용하여 분리하고, 세포분석법에 기반한 ADCP 실험을 위해 사용 당일(+7일, +8일, 또는 +9일째) 완전 배지 중에서 세척하였다. 세포 이미징에 기반한 ADCP를 위해, +6일째 세포 해리 완충제를 이용하여 대식세포를 분리하고, 96 광학 플레이트(Costar) 중에 웰당 30'000개로 시딩하였다.

2. 식작용 활성 평가( CellInsight ™ 기반 검정법)

마이크로플레이트 웰에 부착된 대식세포(칼세인 레드 오렌지로 염색된)를 칼세인(칼세인) AM 표지된 표적 종양 세포와 1:3의 이펙터:표적 세포 비로 상이한 농도의 시험되는 항체의 존재하에 37℃에서 30 min(MKN45 및 SNU-C1) 또는 2.5시간(LoVo 및 Ls174T) 동안 공동 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 종료시, 상청액을 완전 배양 배지로 교체하고, 셀인사이트™ CX5 고함량 스크리닝 플랫폼을 이용하여 마이크로플레이트를 이미징하였다. 웰당 1500개의 대식세포를 획득하고, 분석하였다. 식작용은 이중 양성 이벤트 (대식세포 + 표적 종양 세포)인 것으로 입증되었고, 셀인사이트™ 제조사의 소프트웨어에 의해 식작용 지수를 계산하였다.

도 2, 및 표 5, 6, 7, 8, 9에 제시된 결과는 모두 4개의 CEACAM5 발현 암 세포주(MKN-45, SNU-C1, Ls174T, LoVo)를 이용하여 수득된 것이고; 여기서, 이펙터 세포 대 표적/종양 세포 비는 1:3이었다.

K2AC100은 K2AC22와 비교하여 더 우수한 결합을 보였다(더 낮은 EC50 및 더 높은 Emax, 실시예 6, 표 4 참조). 놀랍게도, K2AC22 대비 K2AC100의 달성된 최대 식작용 지수 Emax ADCP의 증가율(%)은 낮은 CEACAM5 발현 세포주 LoVo 및 Ls174T에서 가장 강력하다.

본 결과는 실험에서 상이한 인간 공여자로부터 수득한 대식세포를 이용한 실험에서 수득하였다. 상기 실험으로부터 수득된 데이터는 표 6(MKN-45 세포에 대한 결과), 표 7(SNU-C1 세포에 대한 결과), 표 8(Ls174T 세포에 대한 결과) 및 표 9(LoVo 세포에 대한 결과)에 제시되어 있다.

실시예 8: 본 발명의 어푸코실화된 이중특이적 항체 제조

표 10 및 11은 본 발명의 이중특이적 항체의 어푸코실화된 버전에 의한 2개의 세포주(MKN-45 및 SNU-C1)의 식작용에 대한 결과(EC50 및 Emax)를 보여주는 것이다. 본 발명의 이중특이적 항체의 어푸코실화된 버전을 하기 방법에 의해 제조하고, 정제하였다:

1. 제조

각각 푸코실화된 항체 및 어푸코실화된 항체 제조를 위해 작업 부피가 700 mL 또는 100 mL인 토마슨 에를렌(Thomson erlen) 장치에 0.3 x 10⁶개의 세포/mL의 생존가능한 세포 농도로 각각의 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 플라스미드로 형질감염된 CHO 풀(각각 벡터 플라스미드에 대해 실시예 2 참조)을 접종하였다. 모든 풀을 CDACF 배지 CDCHO를 사용하는 15일 기간의 유가식 모드 및 적합화된 공급 방식으로 작동시켰다. 어푸코실화된 항체를 제조하기 위해, 문헌 [Rillahan et al. Nature Chem. Biol. 2012Jul;8(7):661-8]에 기술된 어푸코실화에 기초하여, 및 EP2282773에 기초하여 200 μM 푸코스 억제제(1,3,4-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스) 볼루스를 유가식 프로세스 동안 0, 5, 8 및 11일째에 첨가하였다. 유가식 배양 15일 후에 푸코실화된 또는 어푸코실화된 항체를 함유하는 본 발명의 이중특이적 항체의 풀 상청액을 수확하였다. 사토클리어 다이나믹스® 랩 V 세포 수확 사토리우스 시스템(Sartoclear Dynamics® Lab V Cell Harvesting Sartorius system)을 사용하여 CHO 풀 상청액 수확물을 정화시켰다(공급업체의 설명서 참조).

2. 정제

본 발명의 푸코실화된 및 어푸코실화된 이중특이적 항체의 정제는 3 단계 친화성 정제 프로세스에 의해 달성하였다. 정제를 시작하기 전, 적절한 부피의 친화성 매트릭스가 있는 칼럼을 사용하기 위해 옥테트RED96을 사용하여 이중특이적 항체 풀의 상청액 중 항체 농도를 측정하였다. 푸코실화된 또는 어푸코실화된 이중특이적 항체를 함유하는 각각의 정화된 CHO 풀 상청액을 사전 조정 없이 MabSelect SuRe(MSS) 칼럼(GE Healthcare)에 로딩하여 세포 배양 오염물질 대부분을 제거하였다. 이어서, MSS 용출액을 낮은 pH 유지로 처리하여 바이러스를 불활성화시키고, 트리스 1 M pH 9로 pH 6에서 중화시켰다. 이어서, MSS 용출액을 LambdaFabSelect(LFS) 칼럼(GE Healthcare)에 로딩하여 단일특이적 κ(모노 κ)를 제거하였다. 이어서, LFS 용출액의 pH를 pH 6으로 조정하였다. LFS를 Capto L(CL) 칼럼(GE Healthcare)에 로딩하여 단일특이적 λ(모노 λ)를 제거하였다. CL 용출액을 보관 전에 pH를 조정하였다. 이어서, 최종 물질을 농축시키고, 최종 제제 완충제로 정용여과하였고, 그의 농도는 나노드롭을 사용하여 조정하였다. 푸코실화된 및 어푸코실화된 이중특이적 항체를 분취하고, 사용될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 제조자(Agilent Technologies: 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)에 의해 기술된 바와 같이 단백질 80(Protein 80) 키트를 사용하여 애질런트 2100 바이오분석기(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용하여 변성 및 환원 조건하에서 전기영동으로 사이징에 대해 정제된 이중특이적 항체를 분석하였다. ACQUITY UPLC H-클래스 바이오 시스템(ACQUITY UPLC H-Class Bio System)(Waters)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC-UPLC)로 응집 수준을 평가하였다. 정제된 이중특이적 항체의 전하 변이체 분석은 멀티포르 II 전기영동 시스템(Multiphor II Electrophoresis System)(GE Healthcare)을 사용하여 등전점 포커싱 기술(IEF: isoelectric focusing)에 의해 달성하였다. 푸코실화된 및 어푸코실화된 K2AC5 및 K2AC22 항체의 N 연결 복합체 바이안테너리 당형태의 상대적 분포는 랩칩 GXII터치(LabChip GXIITouch)(Perkin Elmer)에서 처리량 마이크로칩-CE 방법을 사용하여 측정하였다. 리물루스 아메보사이트 라이세이트 시험(LAL; Charles River Laboratories: 미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)을 사용하여 내독소 오염에 대해 모든 항체를 시험하였다. 본 발명의 afuc 이중특이적 항체는 > 70%의 어푸코실화를 보였다.

상기 어푸코실화된 CEAxCD47 이중특이적 항체를 사용하여 표 10 및 11에, 및 도 3a 및 3b에 제시된 결과를 수득하였다.

3. 본 발명의 어푸코실화된 이중특이적 항체를 제조하는 다른 방법

3.1 FUT 8 음성 생산 세포주를 이용한 방법

대안적으로, 및 본 발명자들의 지식에 따르면, 본 발명에 따른 어푸코실화된 이중특이적 항체 또한 하기와 같은 방법에 따라 제조할 수 있다:

물질 및 방법은 문헌 [Naoko Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng.; 87 (2004) 614-622]에 따른다.

차이니즈 햄스터 FUT8 cDNA 단리

본 발명자들의 지식에 따르면, RN이지® 미니 키트(RNeasy® Mini Kit)(Qiagen: 독일 힐덴 소재)를 이용하여 CHO/DG44 세포로부터 전체 RNA를 단리시키고, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse transcript-polymerase chain reaction)(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)을 위해 슈퍼스크립트(Superscript) 제1 가닥 합성 시스템을 이용하여 올리고-dT로 역전사시킨다. 뮤린 FUT8 cDNA(문헌 [Hayashi, 2000; DNA Seq 11:91-96])로부터 디자인된 프라이머

5V-GTCTGAAGCATTATGTGTTGAAGC-3V(서열 번호 44) 및

5V-GTGAGTACATTCATTGTACTGTG-3V(서열 번호 45)를 이용하여 PCR에 의해 차이니즈 햄스터 FUT8 cDNA를 단일 가닥 CHO/DG44 세포 cDNA로부터 증폭시킨다.

FUT8 유전자좌의 표적화 구성물

본 발명자들의 지식에 따르면, 2개의 대체 벡터, pKOFUT8Neo 및 pKOFUT8Puro를 이용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴를 수행한다. 프로브로서 차이니즈 햄스터 FUT8 cDNA를 사용하여 CHO-K1 세포 E-게놈 라이브러리(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야 소재)를 스크리닝하여 제1 코딩 엑손을 포함하는 FUT8 유전자의 9.0 kb 단편을 단리시켜 표적화 구성물을 확립한다. 번역 개시 부위를 포함하는 234 bp 세그먼트를 loxP 부위 측면에 위치하는, 각각 플라스미드 pKOSelectNeo 또는 pKOSelectPuro(Lexicon: 미국 텍사스 소재)의 네오마이신 내성 유전자(Neor) 카세트 또는 퓨로마이신 내성 유전자(Puror) 카세트로 대체한다. 플라스미드 pKOSelectDT(Lexicon)로부터의 디프테리아 독소 유전자(DT) 카세트를 5V 상동성 영역에 삽입한다. 생성된 표적화 구성물, pKOFUT8Neo 및 pKOFUT8Puro는 1.5 kb 5V 상동성 서열 및 5.3 kb 3V 상동성 서열을 포함하였다. 형질감염 전, 표적화 구성물을 고유한 SalI 부위에서 선형화한다.

상동성 재조합체에 대한 형질감염 및 스크리닝

본 발명자들의 지식에 따르면, 서브컨플루언트 CHO/DG44 세포(1.6 106)를 바이오-래드 진펄서® II(Bio-Rad GenePulser® II)를 사용하여 350 V 및 250 AF에서 4 Ag의 선형화된 pKOFUT8Neo로 전기천공하였다. 전기천공 후, 600 Ag/mL G418(Nacalai Tesque: 일본 교토 소재)을 이용하여 형질감염체를 선별한다. 앞서 보고된 변형된 미세추출 방법(문헌 [Ramirez-Solis et al., 1992; Anal Biochem 201:331-335.])에 의해 하기 프라이머를 사용하여 96 웰 플레이트에서 게놈 PCR을 수행한다:

5V-TTGTGTGACTCTTAACTCTCAGAG-3V(서열 번호 40) 및

5V-GAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTG-3V(서열 번호 41).

게놈 PCR을 사용하여 수득된 1.7 kb 단편에 의해 상동성 재조합체를 확인하고, 하기 프라이머로 증폭된 221 bp 단편을 사용하여 서던 블롯 분석에 의해 확인한다:

5V-GTGAGTCCATGGCTGTCACTG-3V(서열 번호 42) 및

5V-CCTGACTTGGCTATTCTCAG-3V(서열 번호 43).

앞서 기술된 바와 같이 반접합성 클론에 대해 선형화된 pKOFUT8Puro를 이용하여 제2 라운드의 상동성 재조합을 수행하고, 15 Ag/mL 퓨로마이신(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트루이스 소재)으로 약물 선별을 수행한다. 확인된 형접합성 파괴체를 Cre-레콤비나제 발현 벡터 pBS185(Invitrogen)로 전기천공하여 두 FUT8 대립유전자, 둘 모두로부터 약물 내성 유전자 카세트를 제거한다.

FUT8 (-) 세포에 의한 단일클론 항체 제조

본 발명자들의 지식에 따르면, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 코딩하는 발현 벡터로 FUT8(-) 세포주를 전기천공하고, 크산틴 및 티미딘이 결여된 배지에서 선별한다. 컨플루언트 형질감염체를 Ex 세포® 301 배지(Ex-Cell® 301 Medium)(JRH Biosciences: 미국 캔자스주 르넥사 소재) 중에서 1주 동안 배양한다. MabSelect™(Amersham Biosciences: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 이용하여 배양물 상청액으로부터 항체를 정제한다. 추가 정제 단계는 음이온/양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 특히 상기 기술된 바와 같은 각각 카파 람다 선택 수지를 사용하는 정제일 수 있다.

3.2. 생산 세포 배지로부터의 세포외 푸코스 회수 및 세포내 푸코스 생합성에 대한 효소적 개입

바람직하게, 및 본 발명자들의 지식에 따르면, 본 발명의 어푸코실화된 이중특이적 항체는 또한 하기와 같은 US8642292에 기술된 방법/기술에 따라 제조할 수 있다. 이 기술은 CHO 세포주 등과 같은 항체 생산자 세포주 내로 이종성 박테리아 효소를 안정적으로 통합시키도록 디자인된 것이다. 이로써, D-만노스로부터의 푸코스의 드 노보 합성은 차단된다. 또한 생산 세포가 푸코스가 없는 배지에서 배양되는 경우, 결과적으로 안정적인 수준으로 어푸코실화된 항체가 생성된다.

진핵 세포에서, 푸코스는

a) 샐비지 경로를 통해 세포외 공간 또는 리소솜으로부터, 및

b) 푸코스의 드 노보 합성 경로에서 D-만노스로부터 푸코스의 드 노보 합성에 의해 이루어지는 2개 경로를 통해 생성된다.

샐비지 경로는 배양 배지로부터 푸코스를 생략함으로써 완전히 차단될 수 있다. 드 노보 생합성 경로는 상기 경로의 중간체 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스를 GDP-4-케토-6-데옥시-D-갈락토스 대신 GDP-D-람노스로 전환함으로써 차단될 수 있다. 이는 각각 박테리아 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 리덕타제(RMD)를 코딩하는 유전자를 생산 세포주 내로 안정적으로 통합시킴으로써 RMD를 생산 세포주로 이동시킴으로써 달성된다. 생산 세포주에서 발현되는 RMD는 심지어 소량도 생산 세포의 드 노보 합성 경로를 완전히 차단시킨다.

생산 세포주, 예컨대, 본 발명의 어푸코실화된 항체 제조를 위해 디자인된 CHO 기반 세포주 뿐만 아니라, 본 발명의 항체를 이미 생산하고 있고, 푸코스 함량이 80% 내지 100%만큼 감소된 항체를 생산하도록 조작된 기존의 생산 세포주를 구성하는 데 상기 기술이 사용될 것이다.

도 3a 및 3b, 및 표 10 및 11에 제시된 모든 결과는 2개 CEACAM5 발현 암 세포주(MKN-45 및 SNU-C1)를 사용하여 수득된 것이고; 여기서, 이펙터 세포 대 표적/종양 세포 비는 1:3이었다. 본 결과는 3명의 상이한 인간 공여자로부터 수득한 대식세포를 이용한 실험에서 수득하였다. 상기 실험으로부터 수득된 데이터는 표 10(MKN-45 세포에 대한 결과), 및 표 11(SNU-C1 세포에 대한 결과)에 제시되어 있다.

실시예 10

종양 세포 상의 CD47과 SIRPα의 상호작용 차단

본 발명의 이중특이적 항체의 SIRPα 억제 효능(IC50)의 측정을 위한 실험 설정:

차단 활성을 검출하기 위해 하기 기술되는 바와 같이 MKN-45 세포의 표면에서 발현된 인간 CD47과 가용성 SIRPα의 상호작용을 모니터링하는 세포 기반 검정법을 이용하였다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 사용한 농도-반응 실험을 통해 억제 곡선(도 4 참조) 및 IC50 값(표 12 참조)을 결정할 수 있었다.

CD47 및 CEACAM5, 둘 모두를 발현하는 MKN-45 암 세포를 이미징 시스템(CX5)에 의해 예컨대, 세포 분열을 검출하기 위해 바이올렛으로 염색한다. 간략하면, 웰당 3'000개의 염색된 MKN-45 세포를 384 광학 웰 플레이트(Costar)에 시딩하고, 본 발명의 이중특이적 항체의 농도를 증가시켜 가면서(1.9 pM 내지 333 nM, 사중으로) 50분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 항마우스 IgG-Fc AF647 커플링된 항체(Jackson Immunoresearch, 1:2000으로 희석)와 함께 미리 혼합된, 고정 농도의 SIRPα 마우스Fc를 최종 50 ng/mL로 첨가하였다. 3시간 30분의 인큐베이션 후, 플레이트에서 검출된 결합된 SIRPα에 의해 방출된 형광 신호의 이미지를 이미징 시스템(CX5, Thermo Fisher)으로 획득하였다. 형광 신호(평균 형광 강도 MFI)를 시험된 용량 범위에 따라 플롯팅하였고, 소프트웨어(Prism, GraphPad)에 의해 IC50을 계산하였다.

결과는 표 12에 제시되어 있다:

실시예 10: a. 암 환자의 신선한 샘플로부터의 암 세포에서의 CEACAM5 발현을 수득하고(Qifikit 데이터), b. 식작용 데이터를 수득하기 위한 오가노이드 절차

환자의 1차 샘플로부터 유래된 오가노이드를 표준 방법(효소 소화 및/또는 기계적 해리)에 의해 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 10 ㎕의 항인간 CEACAM5 1차 항체((#sc-23928; mIgG1(Santa Cruz); 최종 농도 20 ㎍/mL)를 세포에 첨가하고, 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고 원심분리하였다. (QIFIKIT®로부터 입수한 셋업 또는 보정) 비드 100 ㎕를 세포와 함께 세척하고, 동일하게 처리하였다. 키트로부터의 2차 항체 100 ㎕(PBS BSA 2% 중 1/50)를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 30 내지 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리하여 상청액을 폐기하고, 2회 세척하였다. 마지막 원심분리 후, 세포를 재현탁시키고, 유세포 분석기를 사용하여 평가하였다. 특정 소프트웨어 및 Excel 파일로 익스포트된 기하 평균을 이용하여 분석을 수행하였다. 보정 비드로부터의 MFI 값을 이용하여 선형 회귀를 수행하였다. 상기 회귀선으로부터 세포의 항체 결합능(ABC)을 외삽하였다. 특이적 염색 중 하나에 대하여 이소타입 대조군으로부터 ABC를 감산하여 특이적 항체 결합능(sABC)을 얻었다.

상기 1차 오가노이드의 CEACAM5의 평균 발현은 세포당 28,000개의 CEACAM5 표적인 것으로 밝혀졌는데, 이는 표 5의 세포주에서의 평균 발현보다 대략 4배 낮은 값이다.

암 환자의 1차 샘플로부터 유래된 오가노이드는 본 발명의 이중특이적 항체 및 인간 공여자로부터의 대식세포가 첨가되는 경우, 농도 의존적 식작용/식작용 지수를 연구하는 데에도 또한 사용될 수 있다(실시예 7 참조). 동일한 방법을 사용함으로써, 본 발명자들의 지식에 따르면, 또한 인간 공여자로부터의 T 세포가 첨가되는 경우, CEAxCD3 이중특이적 항체와 본 발명의 이중특이적 항체의 조합 또한 연구될 수 있다.

실시예 11: CEAxCD3 및 CEAxCD47의 조합에 의한 혼합 살해 검정법

버피 코트(건강한 공여자)로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. 상기 PBMC의 분취물을 90% FCS 및 10%의 냉동 보호제를 포함하는 배지 중에서 동결 보관하여 혼합 살해 검정법을 위해 T 세포 공급원으로 사용하였다. PBMC의 추가 분취물을 사용하여 단핵구로부터 유래된 대식세포를 제조하였다.

간략하면, 10⁷개의 PBMC를 10%의 보체가 제거된 FCS를 함유하고, 10% AB+ 인간 혈청 및 20 ng/mL의 인간 M-CSF로 보충된 배지 중에서 배양 플라스크 175 ㎠에 시딩하였다. 37℃, 5%의 CO₂에서 24 h 동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 제거하여 부유 세포를 제거하고, 20 ng/mL-1의 인간 M-CSF로만 보충된 배양 배지로 대체한다. 2일 더 인큐베이션시킨 후, 배지의 절반을 인간 M-CSF로 보충된 신선한 배양 배지로 대체한다.

분화 6일 후, 유래된 대식세포를 투명한 평평한 바닥 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이팅 2일 후, 상응하는 대식세포 공여자의 동결된 PBMC를 해동하여 대식세포 플레이트에 첨가하였다.

표적 종양 세포(예컨대, MKN45 또는 LS174T 또는 다른 CEA 양성 종양 세포)를 셀트레이스 바이올렛(Cell-Trace Violet)으로 염색하고, 본 발명의 조합으로 옵소닌화하였다. 옵소닌화된 표적 세포를 대식세포 및 상응하는 자가 PBMC를 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에 48시간(또는 72 h) 동안 인큐베이션시켰다.

인큐베이션 기간 후, 상청액 중 부유 세포를 수집하고, 트립신을 이용하여 부착성 세포를 분리하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 동일한 웰로부터 회수된 부유 세포 및 부착 세포를 풀링하고, 표지된 항CD14 항체로 염색하여 세포분석법에 의해 분석하는 동안 대식세포를 확인하였다. 염색 종료시, 생존능 마커(사이톡스 그린(sytox green))를 첨가하여 분석에서 사멸 세포를 제거하였다.

세포를 유세포 분석기(Cytoflex/Beckman)로 분석하였다. 획득된 이벤트는 각 검정 조건에 대해 동일한 수의 이벤트를 분석하기 위해 정규화하였다. 살아있는 표적 세포 개수는 살아있는 표적 세포 = 총 셀트레이스 바이올렛 양성 살아있는 세포-CD14/셀트레이스 바이올렛 이중 양성 살아있는 세포로 계산하였다. 각 조건에 대한 살해율(%)은 (1-(처리 웰 중 살아있는 표적 세포/음성 대조군 웰 중 살아있는 표적 세포)) x 100%로 계산하였다.

본 발명의 조합을 2가지 상이한 셋업에서 연구하였다:

1. K2AC100이 첨가되지 않은 경우 뿐만 아니라, 정의된 농도(들)의 K2AC100과 함께 조합된 경우의 AB73에 대한 농도 반응 곡선을 확립하였다(도 1 참조).

2. AB73이 첨가되지 않은 경우 뿐만 아니라, 정의된 농도(들)의 AB73L3-1/N과 함께 조합된 경우의 K2AC100에 대한 농도 반응 곡선을 확립하였다(도 5 참조).

결과는 도 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 제시되어 있다.

도 1은 셋업 번호 1에서 실행된 실험 결과를 보여주는 것이다. AB73은 최고 농도에서 (농도 반응 곡선의 포화) 대략 30%의 살해율을 달성하였고, 1 또는 10 ㎍/ml의 K2AC100과의 조합시 그 효과는 80%의 살해율로 증가하였다. 도 2는 동일한 연구로부터의 단일요법으로 1 뿐만 아니라, 10 ㎍/ml의 K2AC100을 사용하여 달성된 효과를 보여주며, 살해율(%)은 도 2에 제시된 조합으로 달성된 살해율(%)보다 분명히 낮았다.

도 3은 다시 셋업 번호 1에서, 단, 상이한 공여자 및 상이한 종양 세포(MKN-45 대신 LS-174T)를 사용하여 얻은 결과를 보여주는 것이다. AB73을 이용하여 단일요법을 수행하였을 때, 최대에서 (농도 반응 곡선 포화) 이미 대략 70%의 살해율을 달성하였고, K2AC100과의 조합시에는 대략 80%의 살해율로 증가하였다. 상기의 대략 80%의 살해율은 또한 K2AC100 첨가시에는 더 낮은 농도의 AB73에서도 또한 달성된다 - 도 4 참조. 단일요법의 K2AC100은 시험된 농도, 즉, 1 내지 10 ㎍/ml에서 40% 초과의 살해율은 달성하지 못했다.

도 5 및 6은 셋업 번호 2에서의 결과로부터의 결과를 보여주는 것이다. 본 실험에서 사용된 공여자의 PBMC 및 대식세포는 K2AC100 단일요법에서 이미 100%에 가까운 살해를 일으켰다(도 5). 조합은 동일한 최대 살해를 일으켰다. 그러나 다시 말하지만, 더 낮은 농도의 이중특이적 항체와의 조합시 동일한 농도에서 단일요법으로 두 이중특이적 항체를 사용하여 달성된 것보다 더 높은 살해율(%)을 달성하였다.

실시예 12: 항종양 활성: 조직 슬라이스 배양.

CEA 발현 종양 진단을 받은 환자로부터의 종양 조직 슬라이스 배양물 중 K2AC100 및 AB73L3-1/N을 이용한 조합 치료의 항종양 활성을 문헌 [Sonnichsen R. et al., Clinical Colorectal Cancer, Vol. 17, No. 2, e189-99, 2018]에 기술된 방법에 따라 수행하였다.

1. 조직 슬라이스 배양 및 처리

신선한 종양 조직 샘플을 절단하고, 문헌 [Sonnichsen R. et al.]에 기술된 바와 같이 처리한다. 간략하면, 외과적 절제 및 1차 육안상의 병리학적 평가 직후, 종양 샘플을 조직 초퍼를 사용하여 350 ㎛ 슬라이스로 절단한다. 이어서, 3 mm 코어링 도구를 사용하여 조직 슬라이스 직경을 표준화한다. 3개의 조직 슬라이스를 무작위로 풀링하고, 막 인서트에 배치하고, 6 웰 플레이트에서 배양한다. 37℃ 및 5% CO2의 표준화된 조건하에서 슬라이스를 인큐베이션시킨다. 표준 세포 배양 배지에서의 사전 배양 후, 슬라이스 삼중체를 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 단독으로 또는 (예컨대, PD-L1 억제제와 함께) 조합하여 각각 최대 120시간 동안 노출시킨다. 화합물 노출 후, 종양 슬라이스를 4% 파라포름알데히드를 사용하여 밤새도록 고정시킨다.

2. 염색

파라포름알데히드로 고정된 슬라이스를 파라핀 중에 포매시키고, 5 ㎛ 절편으로 프로세싱한다. 헤마톡실린 & 에오신(HE) 염색을 수행하여 조직병리학적 측면 및 종양 세포 비율을 평가한다. 전체 세포 계수, 종양 세포 계수 및 증식을 면역형광 염색으로 분석한다. 간략하면, 파라핀 절편을 탈파라핀화한다. 항원 회수 후, 절편을 0.3% PBS/트리톤X(TritonX)로 세척하고, 5% 정상 염소 혈청으로 30분 동안 차단한다. 사이토케라틴(AE1þ3), Ki67 및 절단된 PARP에 대한 1차 항체를 각각 0.5% 소 혈청 알부민 중에 희석하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다. 절편을 0.3% 포스페이트 완충처리된 염수/트리톤X로 세정하고, 2차 항체로 표지한다. 핵을 훽스트(Hoechst) 33342로 염색한다. (예컨대, CEA 발현에 대한) 추가 염색을 포함할 수 있다.

3. 데이터 분석

형광 현미경을 사용하여 형광 염색된 절편으로부터 조직 슬라이스당 5개의 사진(20x)을 촬영한다. 염색별 분할 알고리즘을 이용하여 훽스트 33342, 사이토케라틴, Ki67 및 절단된 PARP 염색에 대해 양성 픽셀 계수를 측정한다. 사이토케라틴 양성 픽셀로 둘러싸인 Ki67/절단된 PARP 양성 핵의 픽셀을 분석하여 증식/아폽토시스성 종양 면적을 계산한다. 모든 사진에 대해 총 세포 계수(훽스트 양성), 종양 세포 계수(훽스트 및 사이토케라틴 양성) 및 증식성 종양 세포 계수(훽스트, 사이토케라틴 및 Ki67 양성/절단 PARP)를 계산한다. 종양 세포 계수를 전체 세포 계수로 정규화하여 사진마다 상이한 종양 세포 분율을 고려한다. 이어서, 단일 이미지 값으로부터 평균 슬라이스 값을 계산한다. 평균 슬라이스 값을 이용하여 조건에 대한 평균값을 계산한다. 예비 데이터는 CEA 발현 고형 종양 환자에 대한에 대한 K2AC100 및 AB73L3-1/N 조합의 유익한 영향을 뒷받침한다.

실시예 13: 인간 PBMC 및 대식세포 공동 이식 마우스 종양 모델에서 CEAxCD3 이중특이적 항체와 조합된 CEAxCD47의 생체내 항종양 활성.

본 발명자들의 지식에 따라, 본 발명의 조합의 항종양 활성을 하기 마우스 모델에서 평가할 수 있다:

버피 코트(건강한 공여자)로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. 상기 PBMC 중 일부를 90% FCS 및 10%의 냉동 보호제를 포함하는 배지 중에서 동결 보관하였고, 이식 당일 사용할 것이다. PBMC의 주요 부분은 단핵구로부터 유래된 대식세포를 제조하는 데 사용하였다. 간략하면, 10⁷개의 PBMC를 10%의 보체가 제거된 FCS를 함유하고, 10% AB+ 인간 혈청 및 20 ng/mL의 인간 M-CSF로 보충된 배지 중에서 T175 ㎠ 배양 플라스크에 시딩한다. 37℃, 5%의 CO₂에서 24 h 동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 제거하여 부유 세포를 제거하고, 20 ng/mL-1의 인간 M-CSF로만 보충된 배양 배지로 대체한다. 2일 더 인큐베이션시킨 후, 배지의 절반을 인간 M-CSF로 보충된 신선한 배양 배지로 대체한다. 분화 6일 후, 대식세포를 분리하고, PBS 중에 현탁시켰다.

동결된 PBMC를 해동시키고, 멸균 PBS 중에 재현탁시켰다.

그 동안 지수 성장기의 CEA 발현 표적 세포(LS174T 또는 HPAF-II 또는 다른 CEA 양성 종양 세포)를 분리하고, 세포 현탁액을 PBS 중에서 조정하였다. 자동 트리판 블루 기반 세포 계수기(ViCell XR# Beckman)를 사용하여 세포 현탁액을 계수하였다.

마지막으로, 3개의 상이한 세포 현탁액을 혼합하여 이식에 사용하였다. 최종의 혼합된 세포 현탁액은 100 ㎕ 중 10⁶개의 CEA 발현 표적 세포, 10⁶개의 PBMC 및 동일한 개수의, 또는 대안적으로, 더 많거나, 또는 더 적은 개수의 인간 대식세포를 포함하였다. LS174T 또는 다른 종양 세포, 인간 PBMC 및 인간 대식세포를 포함하는 100 ㎕의 세포 현탁액을 NSG 마우스(또는 대안적으로, NOG 마우스)에 피하로 이식한다.

이식 후 +1일째 또는 그 이후에 전용 군의 마우스에 처음에는 CEAxCD3 단독 또는 CEAxCD47 분자와 함께 조합하여 주사하였다. 그 후 몇 주 동안, 마우스에 본 발명의 조합을 예컨대, 주 2회 또는 1회 i.v. 주사한다. 병행하여 대조군에는 각 단일 분자만 단독으로 주사한다. 마지막으로, 한 군에 비히클을 주사하여 종양 성장 참조 곡선을 얻는다. 마우스를 적어도 주 2회에 걸쳐 종양 성장에 대해 모니터링하고, 실험 종료 시점(종양 부피 = 1500 ㎣ 또는 GvHD 증상 발생)까지 디지털 캘리퍼로 종양을 측정한다. 종양 부피는 공식 (길이 x 너비) x 0.5를 사용하여 계산한다. 통계 분석은 연구시 일원 ANOVA 비교 분석을 사용하여 수행한다.

실시예 14: 트랜스제닉 마우스 모델에서의 생체내 항종양 활성

본 발명자들의 지식에 따르면, 본 발명에 따른 조합의 항종양 활성을 트랜스제닉 마우스에서 각각 단일 작용제로서 뿐만 아니라, 조합 치료에서 평가할 수 있다.

1. 세포주 생성 및 성장 시험

예컨대, 뮤린 결장암 세포주 CT26 또는 MC38에 기초한 hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) 세포주를 생성할 것이다. CRISPR/Cas9를 이용한 후, 이어서, 세포 분류에 의해 KO 클론을 단리시켜 내인성 마우스 CD47 유전자의 넉 아웃(KO: Knock-out)을 수행한다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 이용하여 hCD47 및 hCEACAM5, 둘 모두의 발현을 구동시키는 카세트로 KO 클론을 형질감염시킨 후, 예컨대, 전체 발현 수준 및 비에 기초하여 조작된 클론을 단리시킨다. 검증된 클론 3개를 선택하여 3개의 검증된 클론이 선택되어 최종 클론의 선택을 위해 생체내 생착/종양형성에 대해 후속적으로 시험할 것이다.

2. 생체내 항종양 활성

인간 CD3e를 발현하는 BALB/cJGpt 배경의 마우스 계통(T001550 이형접합성 BALB/c-hCD3ET/Wt 마우스) 및 인간 CD47/인간 SIRPα를 발현하는 것(T037264 동형접합성 BALB/c-hCD47/hSIRPα 마우스)은 젬파마테크(GemPharmatech)에서 이용가능하다. 대안적으로, 인간 CD3e를 발현하는 C57BL/6/Bcgen 배경의 마우스 계통(동형접합성 B-hCD3E 마우스) 및 인간 CD47/인간 SIRPα를 발현하는 것(동형접합성 B-hSIRPα/hCD47 마우스)은 바이오사이토젠(Biocytogen)에서 이용가능하다. 각 경우에서 두 마우스 계통을 교배하여 삼중 인간화 hCD3e/hSIRPa/hCD47 마우스를 수득하고, 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 단일 작용제로서 또는 조합 치료로 시험하는 후속 실험을 위해 자손을 사용할 것이다.

0일째 삼중 인간화 hCD3e/hSIRPa/hCD47 마우스에 CT26-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) 세포주(BALB/c 배경) 또는 MC38-hCEACAM5(Tg)hCD47(Tg)mCD47(ko) 세포주(C57BL/6 배경)를 접종한다. 일단 코호트에서 중간 종양 크기가 예컨대, 200 ㎣에 도달하고 나면, 마우스 1마리의 종양 부피가 예컨대, 3000 ㎣를 초과하거나, 또는 미리 지정된 동물 보호 및 관리 종점 중 어느 하나 이상의 것이 발생할 때까지, 단일 작용제로서 뿐만 아니라, 조합으로 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 이용하는 치료를 예컨대, 2회 치료/주의 간격으로 i.v. 볼루스로서 개시한다. 주 3회로 종양 부피 및 체중을 측정한다. 하기 공식: TV = 0.5 a x b2(여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이다).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

a) 제1 결합부는 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 35의 CDRL1, 서열 번호 36의 CDRL2, 및 서열 번호 37의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2, 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 29의 CDRL1, 서열 번호 30의 CDRL2, 및 서열 번호 31의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체로서,
a) 제1 결합부는 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 CDRL1, 서열 번호 19의 CDRL2, 및 서열 번호 20의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 CDRL1, 서열 번호 7의 CDRL2, 및 서열 번호 8의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부, 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체와 조합되는, 암 치료에 사용하기 위한 제1 이중특이적 항체.
a) 제1 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 38의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 32의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체로서,
a) 제1 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 21의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 5의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체와 조합되는, 암 치료에 사용하기 위한 제1 이중특이적 항체.
a) 제1 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역 및 서열 번호 39의 경쇄를 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역, 및 서열 번호 33의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체로서,
a) 제1 결합부는 서열 번호 15의 중쇄 영역 및 서열 번호 22의 경쇄를 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 15의 중쇄 영역, 및 서열 번호 9의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체와 조합되는, 암 치료에 사용하기 위한 제1 이중특이적 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형 암인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제4항에 있어서, 암이 결장직장암, NSCLC(비소세포 폐암), 위암, 췌장암, 유방암, 또는 또 다른 CEACAM5 발현 암인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 CEACAM3 및 재조합 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비가 100배 이상인 것을 특징으로 하는 제1 이중특이적 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 CEACAM3 및 재조합 CEACAM5에의 결합에 대한 KD 값의 비가 100배 내지 200배인 것을 특징으로 하는 제1 이중특이적 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 이중특이적 항체 및 제2 이중특이적 항체가 상기 피험체에게 2 내지 15일 간격으로 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
조합으로서,
a) 제1 결합부는 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 35의 CDRL1, 서열 번호 36의 CDRL2, 및 서열 번호 37의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 23의 CDRH1, 서열 번호 24의 CDRH2, 및 서열 번호 25의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 29의 CDRL1, 서열 번호 30의 CDRL2, 및 서열 번호 31의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체, 및
a) 제1 결합부는 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 CDRL1, 서열 번호 19의 CDRL2, 및 서열 번호 20의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 2의 CDRH1, 서열 번호 3의 CDRH2 및 서열 번호 4의 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 6의 CDRL1, 서열 번호 7의 CDRL2, 및 서열 번호 8의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체의 조합.
조합으로서,
a) 제1 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 38의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 32의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체, 및
a) 제1 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 21의 경쇄 가변 영역을 포함하고,
b) 제2 결합부는 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 5의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체의 조합.
조합으로서,
a) 제1 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역 및 서열 번호 39의 경쇄를 포함하고, b) 제2 결합부는 서열 번호 27의 중쇄 영역, 및 서열 번호 33의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제1 이중특이적 항체, 및
a) 제1 결합부는 서열 번호 15의 중쇄 영역 및 서열 번호 22의 경쇄를 포함하고, b) 제2 결합부는 서열 번호 15의 중쇄 영역 및 서열 번호 9의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CEACAM5에 특이적으로 결합하는 제1 결합부 및 인간 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 결합부를 포함하는 제2 이중특이적 항체의 조합.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조합 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
제12항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 약학 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서, 고형 암 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 약학 조성물.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 결장직장암, NSCLC(비소세포 폐암), 위암, 췌장암, 또는 유방암 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 약학 조성물.
CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 환자인 피험체에게 치료 유효량의, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조합, 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 환자를 치료하는 방법.
제16항에 있어서, 항체들을 동시에 투여하는 것인 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 환자가 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조합 또는 조성물을 0.01 내지 10 mg/kg의 1회 이상의 용량으로 투여받는 것인 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 환자가 제2 이중특이적 항체를 0.01 내지 10 mg/kg의 1회 이상의 용량으로 및 제1 이중특이적 항체를 1 내지 20 mg/kg의 1회 이상의 용량으로 투여받는 것인 방법.
CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 환자에게 치료 유효량의, 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조합, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 환자에서 생존 기간을 연장시키는 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CEACAM5를 발현하는 암을 앓는 환자를 치료하기 위한 의약 제조에서 사용하기 위한 조합.