RS20060055A - Vezujući konstrukti i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na nove fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, koji sadrže vezujući domen za srodne strukture, kao što su antigeni, protivreceptori i slične, divlji tip IgG, IGA ili IgE regiona šarki, t.j. polipeptid IgE CH2 regiona ili mutantni polipeptid regiona šarke IgG I koji sadrži ni jedan, jedan ili dva cisteinska ostatka, kao i CH2 i CH3 domene imunoglobulina, koji su sposobni za ADCC i/ili CDC, a koji se najčešće pojavljuju kao polipeptidi čija je spsobnost za stvaranje multimera povezanih disulfidnim vezama smanjena. Fuzioni proteini mogu da se dobiju rekombinantnim tehnikama, pri visokim nivoima ekspresije. Takođe su obezbeđeni srodni preparati i postupci, uključujući i forme rekombinantnih proteina koji se vezuju za ćelijsku površinu, kao i imunoterapeutske primene fuzionih proteina i polinukleotida koji kodiraju takve fuzione proteine.

Description

VEZUJUĆI KONSTRUKTI I POSTUPCI ZA NJIHOVU UPOTREBU

Sve prijave nad kojima predmetna prijava ima prednost su ovde inkorporirane u potpunosti po referenci.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju raznoliku primenu, obuhvatajući primenu u istraživanjima, dijagnostici i terapiji, na primer, imunoterapiji. Jedinjenja predmetnog pronalaska obuhvataju imunološki aktivne proteine i konjugate proteina. Takvi proteini obuhvataju rekombinantne ili vezujuće proteine dobijene inžinjeringom kao što su, na primer, fuzioni proteini vezujućih domena i imunoglobulina, koji mogu da obuhvataju fuzione proteine jcdnolančanih Fv-imunoglobulina i jedinjenja koja sadrže jednolančane Fv-imunoglobuline. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na preparate i postupke za lečenje stanja, bolesti i poremećaja koji bi bili poboljšani, olakšani ili smanjeni usled primene, na primer, poilpeptidnih i/ili konstrukata nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska, uključujući, na primer, maligna stanja i poremećaje B ćelija, obuhvatajući bolesti koje se odlikuju proizvodnjom antitela i/ili zapaljenj a.

Pozadina pronalaska

Imuni sistem je jedan od najkompleksni]ih među mnogim visoko ravvijenim sistemima tela. Širok i komplikovan, sastavljen od velikog broja različitih vrsta ćelija i u kome mnogi različiti molekuli igraju ulogu, humani imuni sistem omogućava organizmu da odgovori na invaziju stranih organizama kao što su bakterije, virusi i druge infektivne vrste, kao i na strani materijal kao što je polen. Uopšteno govoreći, humani imuni sistem je podeljen u dva glavna dela, imunitet posredovan antitelima (poznat još kao "humoralni" ili "cirkulišući" imunitet) i imunitet posredovan ćelijama, pri čemu limfociti upravljaju obema vrstama imuniteta. Limfociti su jedna od pet vrsta belih krvnih zrnaca (leukocita) koje cirkulišu u krvi. Postoji nekoliko vrsta limfocita, od kojih svaka obavlja drugačije funkcije. Najzastupljenije vrste limfocita su B limfociti (B ćelije), koje su odgovorne za proizvodnju antitela i T limfociti (T ćelije). Ćelije imunog sistema ne obuhvataju samo B i T ćelije, već još i ćelije prirodne ubice, granulocite (ili polimorfonuklearne (PMN) leukocite), makrofage i dendritske ćelije. Humoralnim sistemom upravljaju B ćelije uz pomoć T ćelija, on se bavi infektivnim vrstama u krvi i tkivima organizma. Sistemom posredovanim ćelijama upravljaju T ćelije, a on se bavi inficiranim ćelijama samog organizma.

Antigen je supstanca, najčešće makromolekul, koja stimuliše ili pokreće imuni odgovor. Zbog svoje kompleksne makromolekulske strukture, svaki pojedinačni mikroorganizam sastoji

se od mnoštva antigena (npr. površinskih struktura kao što su komponente ćelijskog zida, treplje, bičevi itd., ili vanćelijskih proteina, kao što su toksini ili enzimi koje mikroorganizam proizvodi). Proteini omotača i neki od proteina koverte životinjskih virusa su takođe obično imunogeni. Organizam domaćina je obično sposoban da odgovori specifično na antigene sa kojima njegov imuni sistem dođe u dodir. I imunitet posredovan antitelima i imunitet posredovan ćelijama podrazumevaju kompleksne međusobne odnose koji im omogućavaju imune reakcije na skoro svaki antigen. Drugim rečima, imuni sistem je sposoban da prepozna strane supstance (antigene)

koji stimulišu sistem da proizvede imunitet posredovan antitelima, imunitet posredovan ćelijama,

ili oba.

Kompleks imunog sistema sastoji se od mnoštva različitih ćelijskih vrsta i organa rasprostranjenih po ćelom organizmu. Ovi organi obuhvataju primarne i sekundarne limfoidne organe. Primarni limfoidni organi su koštana srž i timus. Sve ćelije imunog sistema su prvenstveno nastale u koštanoj srži, u procesu poznatom kao hematopojeza. Tokom hematopojeze, matične ćelije nastale iz koštane srži diferenciraju se ili u zrele ćelije imunog sistema ("B" ćelije) ili u prekursore ćelija koji migriraju iz koštane srži kako bi sazreli u timusu ("T" ćelije). Uz crvena krvna zrnca, krvne pločice i B ćelije, koštana srž proizvodi i ćelije prirodne ubice, granulocite i nezrele timocite. Uloga timusa je da proizvede zrele T ćelije. Nezreli timociti, poznati još i kao protimociti, napuštaju koštanu srž i migriraju u timus gde sazrevaju, nakon čega se oslobađaju u krv. Kompleks imunog sistema takođe obuhvata sekundarne limfoidne organe, npr. slezinu, limfne čvorove itd., kao i cirkulatorni sistem odvojen od krvnih sudova.

Slezina, sačinjena od B ćelija, T ćelija, makrofaga, dendritskih ćelija, ćelija prirodnih uhica i crvenih krvnih zrnaca, je imunološki filter krvi. Migrirajući makrofagi i dendritske ćelije hvataju antigene iz krvi koja prolazi kroz slezinu. Migrirajući makrofagi i dendritske ćelije takođe donose antigene u slezinu preko krvi. Imuni odgovor se pokreće u slezini, kada makrofagi ili dendritske ćelije prikažu antigen odgovarajućim B ili T ćelijama i kada se B ćelije aktiviraju i počnu da proizvode velike količine antitela.

Limfni sudovi i limfni čvorovi su delovi posebnog sistema cirkulacije koji nosi limfu. Limfa je prozirna tečnost koja sadrži bela krvna zrnca, i to pretežno limfocitc. Limfa okružuje tkiva u organizmu, te se skuplja u limfnim sudovima. Limfni čvorovi povezuju mrežu limfnih čvorova i, kada aferentni limfni sudovi donesu limfu koja sadrži antigen u čvorove, limfni čvorovi igraju ulogu imunoloških filtera limfe. Sastavljeni pretežno od T ćelija, B ćelija, dendritskih ćelija i makrofaga, limfni čvorovi dreniraju tečnost iz većine tkiva. U limfnim čvorovima se antigeni izdvajaju iz limfe filtracijom, pre nego što se limfa vrati u cirkulaciju. Makrofagi i dendritske ćelije, koji hvataju antigene, takođe prikazuju ove strane supstance T i B ćelijama u limfnim čvorovima, što stimuliše B ćelije u čvorovima i dovodi do njihove transformacije u plazma ćelije koje luče antitela. Antitela napuštaju limfne čvorove preko eferentnih sudova koji se ulivaju u krvne sudove. Limfociti mogu da napuste limfne čvorove i preko eferentnih sudova, putujući do drugih mesta u limfnom sistemu, ili da na taj način uđu u krv. Svaki pojedinačni limfocit obiđe krug kroz krv i limfni sistem jednom u 24 časa.

Krajnici, adenoidi, Pejerova tela i slepo crevo takođe su limfoidna tkiva. Pejerova tela (grupe limfocita) su slična krajnicima a nalaze se svuda u organizmu, posebno u mukozama koje oblažu digestivni i respiratorni trakt. Fagociti koji se nalaze u Pejerovim telima i drugim limfatičnim agregatima brane telo od, na primer, neadekvatno svarenih čestica hrane koje prolaze kroz zid creva i ulaze u krv i od nepoželjnih stranih napadača dok su još uvek u crevima.

Glavna uloga B ćelija je proizvodnja antitela kao odgovor na strane proteine bakterija, virusa i tumorskih ćelija. T ćelije se obično dele u dve glavne grupe, citotoksične T limfocite ("Tc" ćelije, ili CTL) i T ćelije pomagače ("Th" ćelije ili T ćelije pomoćnice). Uloga Th ćelija, koje se još nazivaju i CD4+ T ćelije, je pojačavanje ili povećavanje imunog odgovora pomoću lučenja specijalizovanih faktora koji aktiviraju druga bela krvna zrnca za borbu protiv infekcije. One pojačavaju lučenje antitela od strane B ćelija. Tc ćelije, poznate još i kao CD8+ T ćelije, mogu direktno da usmrte određene ćelije tumora, ćelije inficirane virusima, a ponekad i parazite.

Tc ćelije su takođe važne u stišavanju imunog odgovora. Obe vrste T ćelija često zavise od sekundarnih limfnih organa (limfnih čvorova i slezine) kao mesta na kojima dolazi do njihove aktivacije, ali se često nalaze i u drugim tkivima u organizmu, uključujući jetru, pluća, krv, kao i intestinalni i reproduktivni trakt.

Ćelije prirodne ubice, koje se često nazivaju NK ćelije ("natural killers"), predstavljaju još jednu vrstu limfocita i slične su Tc ćelijskoj podvrsti. Ovo su efektorske ćelije koje neposredno usmrćuju određene tumore, kao što su melanomi i limfomi, kao i ćelije inficirane virusima. Nazivaju se "prirodnim" ubicama zbog toga što, za razliku od T ćelija, ne moraju da prepoznaju specifični antigen pre nego što izvrše svoju funkciju. Dok NK ćelije, za razliku od T ćelija, usmrćuju svoje ciljne ćelije bez prethodne aktivacije u limfnim organima, NK ćelije aktivirane izlučevinama Th ćelija će efikasnije ubijati tumorske ćelije ili ćelije inficirane virusima. NK ćelijama su tumorske ćelije ciljne ćelije, a štite i od širokog spektra infektivnih mikroorganizama. U nekoliko vrsta bolesti imunodeficijencije, uključujući SIDU, javlja se abnormalna funkcija ćelija prirodnih ubica. Ćelije prirodne ubice mogu da pomognu i u imunoregulaciji, lučeći velike količine uticajnih limfokina.

Neke NK ćelije imaju površinske receptore (FcyRIII, koji se naziva još i CD16)*za Fc delove IgG antitela. One se vezuju za ciljne ćelije preko receptora za FC delove antitela koja su reagovala sa antigenima na ciljnim ćelijama. Ova vrsta imuniteta posredovanog ćelijama naziva se citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC, Antibodv Dependent Cell-mediated Cytotoxicity). NK ćelije mogu da imaju i receptore za C3 komponentu sistema komplementa, još jednog od odbrambenih imunih sistema, što im omogućava da prepoznaju ćelije obložene C3 komponentama kao ciljne ćelije. ADCC se smatra važnom odbranom protiv različitih parazitskih infekcija koje uzrokuju, na primer, protozoe i gliste.

Iako mali limfociti izgledaju identično, oni mogu da se razlikuju prema molekulima koje nose na svojoj površini. Takvi markeri ne pokazuju samo razliku između B i T limfocita, već i razliku između različitih podvrsta ćelija koje se različito ponašaju. Svaka zrela T ćelija, na primer, nosi marker poznat pod imenom T3 (ili CD3). Uz to, većina T ćelija pomoćnica nose T4 (CD4) marker, molekul koji prepoznaje antigene glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II. Molekul poznat kao T8 (CD8); koji prepoznaje antigene MHC klase I, nalazi se na mnogim supresorskim/citotoksičnim T ćelijama.

Još jednu grupu belih krvnih zrnaca, poznatu pod imenom granulociti ili polimorfonuklearni leukociti (PMN), čine tri vrste ćelija. Ove ćelije, neutrofili, eozinofili i bazofili, su važne za uklanjanje bakterija i parazita iz organizma. Neutrofili migriraju kroz zidove kapilara u inficirana tkiva gde ubijaju napadače (npr. bakterije) a potom njihove ostatke uklanjaju fagocitozom. Eozinofili su citotoksični, što postižu oslobađanjem sadržaja svojih granula na napadača. Bazofili napuštaju krv i gomilaju se na mestu infekcije ili drugog zapaljenja i prazne svoje granule, oslobađajući mnoštvo različitih medijatora kao što su histamin, serotonin, prostaglandini i leukotrieni, koji, na primer, povećavaju dotok krvi ka toj oblasti.

W0 2005/017148 PCT/US2003/041600

Medijatori koje otpuste bazofili takođe igraju važnu ulogu u nekim alergijskim odgovorima, kao

što su polenska groznica i anafilaktički odgovori na ujede insekata.

Monociti su velika fagocitična bela krvna zrnca koja se iz koštane srži oslobađaju u cirkulaciju. Kada monocit udje u tkivo, razvija se u makrofag. Makrofagi su takođe velike, fagocitične ćelije koje mogu da fagocitiraju strani materijal (antigene) koji ulazi u organizam,

kao i mrtve i umiruće ćelije samog organizma. Makrofagi su značajni za regulaciju imunih odgovora, a često se nazivaju i đubretarima, ili antigen prikazujućim ćelijama (APC, antigen presenting cells) zbog toga što sakupljaju i fagocitiraju strane materijale a zatim ove antigene prezentuju drugim ćelijama imunog sistema kao što su T ćelije i B ćelije. Ovo je jedan od važnih prvih koraka u pokretanju imunog odgovora. Stimulisani makrofagi pokazuju povišen nivo fagocitoze i luče Interleukin-1 (IL-1), proizvod koji pomaže aktivaciju B ćelija i T ćelija.

Dendritske ćelije takođe nastaju u koštanoj srži i igraju ulogu APC. Najčešće se sreću u strukturnim komponentama limfnih organa kao što su timus, limfni čvorovi i slezina, ali se takođe nalaze i u krvotoku i drugim tkivima. Veruje se da dendritske ćelije hvataju antigen ili ga donose do limfnih organa u kojima se pokreće imuni odgovor.

Važne odlike imunološkog sistema koje su bitne za odbranu i/ili imunost organizma domaćina na patogene mikroorganizme obuhvataju specifičnost, pamćenje i toleranciju. Smatra se, na prmer, da će antitelo ili reaktivna T ćelija reagovati specifično sa antigenom koji je pokrenuo njihov nastanak; a da neće reagovati sa drugim antigenima. Uopšteno govoreći, ova specifičnost je istog reda veličine kao i specifičnost interakcija enzim - supstrat ili receptor -

ligand, iako je moguća pojava ukrštene reaktivnosti. Specifičnost imunog odgovora objašnjava se klonalnom selekcijom. Tokom primarnog imunog odgovora, specifični antigen odabira već postojeći klon specifičnih limfocita i stimuliše njegovu aktivaciju, proliferaciju i diferencijaciju.

Smatra se, takođe, da jednom kad je imuni sistem odgovorio proizvodnjom specifične vrste antitela ili reaktivne T ćelije, postaje sposoban da proizvede još antitela ili reaktivnih T ćelija, u velikim količinama i brže; ova pojava se naziva sekundarni (ili memorijski) odgovor. Zna se još i da životinja obično ne razvija imuni odgovor na sopstvene (potencijalno antigene) molekule.

Kaže se da je životinja tolerantna, ili da nije sposobna da reaguje na sopstvene potencijalno antigene molekule. Na ovaj način se osigurava da se, pod normalnim uslovima, ne razvija imuni odgovor na "sopstvene" antigene (ovakav imuni odgovor naziva se autoimuni odgovor). Tolerancija se osigurava na nekoliko načina, ali je suština u tome da je imuni odgovor u stanju

da razlikuje "sopstvene" od "ne-sopstvenih" (stranih) antigena; imuni sistem će odgovoriti na "ne-sopstveno", ali ne i na "sopstveno". Ponekad kod životinje dolazi do "proboja" tolerancije,

što može da dovede do nastanka autoimune bolesti.

Biološke aktivnosti imunog odgovora posredovanog antitelima i onog posredovanog ćelijama su različite, a razlikuju se i od jedne do druge infekcije. Postoji nekoliko klasa ili vrsta antitela (kao i podklasa različitih vrsta) uključenih u imunitet posredovan antitelima. Sve klase antitela koje se proizvode u odgovor na specifični antigen reaguju stereohemijski sa tim, ali ne i sa drugim (različitim) antigenima. Organizam domaćina ima genetsku sposobnost da proizvede specifična antitela na hiljade različitih antigena, ali to ne čini sve dok ne dobije odgovarajući (specifičan) antigeni stimulus. Usled klonalne selekcije, organizam domaćina proizvodi samo homologa antitela koja će reagovati sa tim antigenom, koja se, kao što je predhodno objašnjeno, nalaze u krvi (plazmi), limfi i mnogim ekstravaskularnim tkivima. Kada se imunitet posredovan antitelima javi nakon interakcije B limfocita sa antigenom i njihove diferencijacije u plazma ćelije koje luče antitela, izlučena antitela se vezuju za antigen, što dovodi do njegove neutralizacije ili eliminacije iz organizma.

Imunitet posredovan ćelijama, sa druge strane, posredovan je specifičnim podpopulacijama T limfocita, nazvanim efektorskim T ćelijama, koje postoje u obliku prekursora (nazvanih "T ćelije u mirovanju", pT ćelije). Ove ćelije nose receptore za specifične antigene, te prepoznaju ove antigene na površini drugih ćelija. Stimulacija tim antigenom dovodi do aktivacije T ćelija. T ćelije se povećavaju, ulaze u mitotički ciklus, razmnožavaju se i razvijaju u efektorske T ćelije, čije su aktivnosti odgovorne za ovu vrstu imuniteta. One se takođe razvijaju u klonove identičnih reaktivnih T ćelija nazvanih memorijske T ćelije. Kao što je predhodno objašnjeno, većina T ćelija u organizmu pripadaju jednoj od dve podvrste i razlikuju se prema prisustvu jednog od dva glukoproteina označena kao CD4 i CD8 na površini ćelije. Od toga koji je od ova dva molekula prisutan na ćelijskoj površini zavisi za koju će vrstu ćelija moći da se vežu T ćelije. T ćelije koje nose CD8 (CD8<+>T ćelije) uvek prepoznaju antigene vezane za MHC molekule klase I i obično se ponašaju kao citotoksične T ćelije. Skoro sve ćelije u organizmu eksprimiraju MHC molekule klase I. T ćelije koje nose CD4 (CD4<+>T ćelije) uvek prepoznaju antigene vezane za MHC molekule klase II na površini drugih ćelija. Samo specijalizovane ćelije koje prikazuju antigene eksprimiraju MHC molekule klase II, uključujući dendritske ćelije, fagocitirajuće ćelije kao što su makrofagi i B ćelije. CD4<+>T limfociti obično igraju ulogu T ćelija pomagačica.

T ćelije pomagačice, koje obuhvataju Thl ćelije i Th2 ćelije, odgovaraju na prisustvo antigena proizvodnjom limfokina. Thl i Th2 ćelije mogu da se razlikuju na osnovu svojih profila limfokina. Kao i sve T ćelije, Th ćelije nastaju u timusu. Kada se sretnu sa antigenom izloženim na dendritskim ćelijama koje prezentuju antigene, one počinju da se dele i postaju aktivirane.

Postoje dve vrste dendritskih ćelija, DC1 ćelije (koje potiču od monocita) i DC2 ćelije (za koje

se smatra da potiču od limfocita).

Thl ćelije (zapaljenske T ćelije uključene u eliminaciju patogena koji se nalaze unutar ćelija u vezikularnim odeljcima) se proizvode kada dendritske ćelije tipa DC1 prikažu antigen T ćelijskom receptom za antigen (TCR) i izluče Interleukin 12 (IL-12). Ova parakrina stimulacija aktivira Thl ćelije da izlučuju sopstvene limfokine, a posebno beta faktor nekroze tumora (Tumor-Necrosis Factor-beta, TNF-(3), poznat još i kao limfotoksin, kao i interferon gama (INF-

y). Ovi limfokini stimulišu makrofage da ubijaju bakterije koje su uneli fagocitozom i utiču na druge leukocite da se sakupe na tom mestu, izazivajući zapaljenje. Thl ćelije su neophodne za imunitet posredovan ćelijama, kao i za kontrolu unutarćelijskih patogena kao što su, na primer,ListeriaiMycobacterium tuberculosis.

Th2 ćelije ("prave" Th2 ćelije pomagačice, koje su neophodne za proizvodnju antitela od strane B ćelija) nastaju kada dendritske ćelije tipa DC2 prikažu antigen T ćelijskom receptom za antigen i, kako se predpostavlja, jedom ili više parakrinih stimulanata. Glavni limfokini koje luče Th2 ćelije su Interleukin 4 (IL-4), koji stimuliše prelazak između klasa kod B ćelija i njihovu proizvodnju IgE antitela, koji takođe igra ulogu sredstva za održavanje pozitivne povratne sprege koje dovodi do povećanja broja pre-Th ćelija koje ulaze u Th2 put, a blokira ekspresiju receptora za IL-12 čime onemogućava pre-Th ćelije u timusu da uđu u Thl put. IL-4 takođe izaziva deobu B ćelija i njihovu diferencijaciju u plazma ćelije koje luče antitela i memorijske B ćelije. IL-4 aktivira samo B ćelije u svojoj okolini koje su i same vezale antigen, ali ne i druge, čime se čuva specifičnost imunog odgovora. Th2 ćelije proizvode i Interleukin 5 (IL-5, koji privlači i aktivira eozinofile), Interleukin 10 (IL-10, koji inhibira proizvodnju IL-2 od strane DC i sprečava sazrevanje pre-Th ćelija u Thl ćelije) i Interleukin 13 (IL-13 koji takođe stimuliše sintezu IgE antitela).

Aktivacija Th2 ćelija izaziva početak njihove sinteze Interleukina 2 (IL-2), kao "i ekspresije membranskog receptora za IL-2. Izlučeni IL-2 izaziva proliferaciju Th2 ćelija autostimulacijom. Na primer, IL-2 se vezuje za IL-2 receptore na drugim T ćelijama (koje su vezale antigen) i stimuliše njihovu proliferaciju. Uz IL-2, stimulisane Th2 ćelije proizvode i IFN-

y i Interleukin 6 (IL-6), koji posreduju u različitim aspektima imunog odgovora. IFN-y aktivira ćelije prirodne ubice koje dostižu svoj pun citolitički potencijal, a aktivira i makrofage čime pojačava njihove antitumorske aktivnosti. Ako su makrofagi inficirani unutarćelijskim parazitima, on aktivira makrofage koji potom uništavaju parazite. IFN-y učvršćuje i antitumorske aktivnosti citotoksičnih limfocita, pojačava nespecifične aktivnosti NK ćelija, jedan je od faktora

koji kontrolišu diferencijaciju B ćelija, a povećava i izlučivanje imunoglobulina. IL-6 stimuliše nekoliko vrsta leukocita, kao i proizvodnju proteina akutne faze u jetri. Posebno je važan za izazivanje diferencijacije B ćelija u ćelije koje luče antitela (plazma ćelije). Na ovaj način, Th2 ćelije pružaju pomoć B ćelijama te su neophodne za imunitet posredovan antitelima.

Citotoksični T limfociti su u stanju da usmrte ćelije koje na svojoj površini prikazuju nov

ili strani antigen (na primer, ćelije inficirane virusima, tumorske ćelije, ili ćelije transplantiranog tkiva). CD8<+>CTL takođe se dele na dve vrste: Tcl koje, kao i Thl, luče IFN-y i Tc2 koje, kao i Th2, luče IL-4.

Imuni odgovor posredovan ćelijama igra ulogu i u razaranju tumorskih ćelija, kao i u odbacivanju transplantiranih tkiva kod životinja. Veliki problem transplantacije tkiva je u odbacivanju, koje se često zasniva na imunom odgovoru posredovanom ćelijama na "strane" ćelije (zbog toga što nisu savršeno podudarne u pogledu antigena). Zbog toga što ćelije tumora sadrže specifične antigene koji se ne sreću na normalnim ćelijama, one takođe mogu da budu prepoznate kao strane i uništene od strane učesnika u imunom odgovoru posredovanom ćelijama. Ako se tumorske ćelije redovno stvaraju u organizmu životinja, moguće je daje imuni odgovor posredovan ćelijama taj koji ih eliminiše ili drži pod kontrolom. Povećanje učestalosti mnogih vrsta kancera (tumora) kod ljudi sa starošću može da bude u vezi sa smanjenjem efikasnosti imunog sistema koja otpočinje oko 25 godine starosti.

Sledi kratak pregled vrsta ćelija koje su uključene u ekspresiju imuniteta posredovanog ćelijama. Tc limfociti ubijaju ćelije koje nose strane antigene na svojoj površini, vezane za MHC klase I, a mogu da usmrte i ćelije u kojima se nalaze unutarćelijski paraziti (bilo bakterije ili virusi), ukoliko te ćelije na svojoj površini prikazuju antigen potekao od tog mikroba. Tc ćelije ubijaju tumorske ćelije, a zaslužne su i za odbacivanje transplantiranih ćelija. Tc ćelije prepoznaju komplekse antigen - MHC klase I na ciljnim ćelijama, vezuju se za njih i oslobađaju sadržaje svojih granula neposredno u membranu ciljnih ćelija što dovodi do lize tih ćelija. Th limfociti proizvode limfokine koji su faktori "pomoći" za razvoj B ćelija u plazma ćelije koje luče antitela. Oni proizvode i određene limfokine koji stimulišu diferencijaciju efektorskih T limfocita i aktivnost makrofaga. Thl ćelije prepoznaju antigene na makrofagima vezane za MHC klase II i aktiviraju se (pomoću IL-1) kako bi proizvodile limfokine, uključujući IFN-ykoji aktivira makrofage i NK ćelije. Ove ćelije posreduju u različitim oblicima imunog odgovora posredovanog ćelijama, uključujući odložene reakcije preosetljivosti. Th2 ćelije prepoznaju antigen vezan za MHC klase II na nekoj od APC nakon čega proizvode interleukine i druge supstance koje stimulišu proliferaciju i aktivnost specifičnih B i T ćelija. Makrofagi su važni kao antigen - prikazujuće ćelije koje izazivaju interakcije, razvoj i proliferaciju T ćelija. Makrofagi su uključeni i u ekspresiju imuniteta posredovanog ćelijama usled toga što se aktiviraju pomoću IFN-y proizvedenog u imunom odgovoru posredovanom ćelijama. Aktivirani makrofagi imaju povećan potencijal za fagocitozu i luče rastvorne supstance koje izazivaju zapaljenje i uništavaju mnoge bakterije i druge ćelije. Ćelije prirodne ubice su citotoksične ćelije koje liziraju ćelije koje nose nove antigene, bez obzira na tip MHC koji eksprimiraju, a liziraju čak i neke ćelije koje uopšte ne nose MHC proteine. NK ćelije se definišu na osnovu njihove sposobnosti za ubijanje ćelija koje nose strani antigen (npr., tumorskih ćelija) bez obzira na njihov MHC tip i bez obzira na prethodnu senzitaciju (izlaganje) antigenu. NK ćelije mogu da se aktiviraju pomoću IL-2 i IFN-y i da liziraju ćelije na isti način kao i citotoskični T limfociti. Neke NK ćelije-imaju receptore za Fc domen IgG antitela što ih čini sposobnim da vezuju Fc deo IgG na površini ciljne ćelije i da oslobode citotoksične supstance koje usmrćuju ciljnu ćeliju putem citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela.

Vanćelijski faktori koji utiču na proliferaciju i diferencijaciju ćelija definisani su kao citokini. Oni obuhvataju limfokine, koji su proteini koje proizvode T limfociti, a koji deluju na diferencijaciju, proliferaciju i aktivnost različitih ćelija uključenih u ekspresiju imuniteta posredovanog ćelijama. Uopšteno govoreći, limfokini funkcionišu tako što: (1) usmeravaju leukocite i limfocite iz cirkulacije ka mestu imunološke reakcije; (2) stimulišu razvoj i proliferaciju B i T ćelija; (3) stimulišu i pripremaju makrofage za njihove fagocitozne aktivnosti;

(4) stimulišu ćelije prirodne ubice i (5) obezbeđuju zaštitu protiv virusa i antivirusnu aktivnost. Sledi kratki opis različitih značajnih limfokina. Prvobitno nazvan faktor aktivacije limfocita, IL-1 je uglavnom proizvod makrofaga i ima različita dejstva na različite vrste ćelija. Deluje kao regulator rasta T ćelija i B ćelija i izaziva proizvodnju proteina važnih za odbranu organizma domaćina u drugim ćelijama, kao što su hepatociti. IL-1 stvara hemotaktički gradijent za neutrofile a služi i kao endogeni pirogen koji izaziva groznicu. Na taj način, IL-1 igra važnu ulogu i u imunom odgovoru i u zapaljenskom odgovoru. IL-2 stimuliše proliferaciju T ćelija i aktivira NK ćelije. IL-3 reguliše proliferaciju matičnih ćelija i diferencijaciju mastocita. IL-4 izaziva proliferaciju B ćelija i pojačava sintezu antitela. IL-6 (koji se još naziva i Interferon - beta2, faktor rasta hibridoma, faktor diferencijacije B ćelija i faktor stimulacije hepatocita) deluje na diferencijaciju B ćelija i na proizvodnju antitela, kao i na aktivaciju T ćelija, njihov rast i diferencijaciju, a verovatno igra i značajnu ulogu u posredovanju zapaljenskih i imunih odgovora na infekcije ili povrede. IL-8 je hemotaktički atraktant za neutrofile. IL-13 deli mnoge osobine IL-4 i moćan je regulator zapaljenskih i imunih odgovora. IFN-y proizvode T ćelije te se može smatrati i limfokinom. Ponekad se naziva još i "imuni interferon" (pri čemu se Interferon - alfa naziva "leukocitni interferon" a Interferon - beta "fibroblastni interferon"). IFN-y ima nekoliko antivirusnih dejstava uključujući inhibiciju sinteze viralnih proteina u inficiranim ćelijama. On takođe aktivira makrofage i NK ćelije, a stimuliše i proizvodnju IL-1, IL-2 i antitela. Limfotoksini obuhvataju faktore nekroze tumora. T ćelije proizvode TNF - beta, dok TNF - alfa proizvode i T ćelije kao i druge vrste ćelija. TNF deluju tako što ubijaju ćelije, uključujući ćelije tumora (sa razdaljine). Postoji nekoliko faktora stimulacije kolonija (Colonv Stimulating Factors, CSF), uključujući faktor stimulacije kolinija granulocita makrofaga (GMCSF), koji izaziva deobu i diferencijaciju svih vrsta fagocitičnih belih krvnih zrnaca.

Priroda membranskih receptora za antigen na B ćelijama i T ćelijama je relativno dobro proučena. Svaka B ćelija ima približno IO<5>molekula antitela vezanih za membranu (IgD ili IgM)

koji po specifičnosti odgovaraju antitelu koje je ta ćelija programirana da proizvede (ovi receptori se označavaju kao BCR). CD32 (FcyRII) na B ćelijama su receptori za Fc region IgG. CD21 i CD35 na B ćelijama su receptori za komponente komplementa. Svaka T ćelija ima oko

IO<5>molekula specifičnog antigen - vezujućeg receptora (TCR) izloženih na svojoj površini. TCR

je sličan, ali ne i identičan, antitelu. Postoje dve vrste T ćelija koje se razlikuju po svojim TCR, alfa/beta (cđ3) T ćelije i gama/delta (y5) T ćelije. TCR alfa/beta T ćelija se vezuje za bimolekularni kompleks koji izlažu MHC molekuli klase I na površini ćelije antigen prikazujuće ćelije. Kao što je predhodno opisano, većina Th ćelija eksprimira CD4, dok većina Tc ćelija eksprimira CD8.

I BCR i TCR su slični u tom smislu što su integralni proteini ćelijske membrane, prisutni

su u hiljadama identičnih kopija izloženih na površini ćelije, nastaju pre nego što ćelija dođe u dodir sa antigenom, kodiraju ih geni sastavljeni rekombinacijom segmenata DNK, imaju jedinstvena vezivna mesta koja se neko valentnim silama vezuju za deo antigena označen kao epitop (ili antigenska determinanta), što zavisi od komplementarnosti površine receptora i površine epitopa, a uspešno vezivanje receptora za antigen za epitop, ukoliko ga prate dodatni signali, dovodi do stimulacije ćelije koja napušta G0i ulazi u ćelijski ciklus i ponavljanu mitozu, koja dovodi do razvoja klonova ćelija koje nose identičan receptor za antigen, t.j. klonova ćelija sa identičnom specifičnošću. BCR i TCR se razlikuju po svojoj strukturi, genima koji ih kodiraju i vrstama epitopa koje vezuju.

Indukcija primarnog imunog odgovora počinje kada antigen prodre kroz površinu epitela.

Pre ili kasnije, on će doći u dodir sa makrofagima ili nekim drugim vrstama antigen prikazujućih ćelija (APC), uključujući B ćelije, monocite, dendritske ćelije, Langerhansove ćelije i ćelije endotelijuma. Antigeni, kao što su bakterijske ćelije, unose se endocitozom, a zatim "prerađuju" u APC, nakon čega se "prikazuju" imunokompetentnim limfocitima kako bi se pokrenuli rani koraci imunološkog odgovora. Prerađivanje u makrofagu, na primer, dovodi do vezivanja antigenih materijala za površinu ćelijske membrane, u okviru MHC molekula klase II na površini ćelije. Kompleks antigen - MHC molekul klase II se prikazuje T ćeliji pomoćnici (Th2 ćeliji), koja je u stanju da prepozna prerađeni antigen vezan za MHC molekul klase II na membrani makrofaga. Ova interakcija, uz stimulaciju pomoću IL-1 izlučenog iz makrofaga, aktivira Th2 ćeliju.

Kao što je predhodno pomenuto, i same B ćelije se ponašaju kao APC. Unakrsno povezani antigeni vezani za receptore - antitela na površini B ćelije izazivaju unošenje antigena u ćeliju i njegovu kasniju ekspresiju na membrani B ćelije u okviru kompleksa sa.MHC molekulima klase II. Th2 ćelije prepoznaju antigen vezan za MHC molekul klase II, te luče

različite limfokine koji aktiviraju B ćelije da postanu plazma ćelije koje luče antitela i memorijske B ćelije. Čak i u slučaju da antigen ne može unakrsno da veže receptore, on može da bude unesen u B ćeliju endocitozom, prerađen a potom i vraćen na površinu vezan za MHC klase II, gde specifične Th2 ćelije mogu da ga prepoznaju i aktiviraju se da podstaknu diferencijaciju i proliferaciju B ćelija. U svakom slučaju, ukupan odgovor B ćelije dovodi do imuniteta posredovanog antitelima.

Smatra se da su receptori za antigen na površini B ćelija posebna vrsta antitela za čiju su proizvodnju ove ćelije genetski programirane. Stoga postoje hiljade subpopulacija B ćelija koje se međusobno razlikuju po svojoj sposobnosti da proizvedu jedinstveni molekul antitela. B ćelije takođe mogu da reaguju sa homologim antigenom na površini makrofaga, ili sa rastvornim antigenima. Kada se B ćelija veže za antigen i kada je istovremeno stimulisana pomoću IL-4 koji proizvode obližnje Th2 ćelije, B ćelija je podstaknuta da raste i da se deli, stvarajući klonove identičnih B ćelija, od kojih je svaki sposoban da proizvede identične molekule antitela. Aktivirana B ćelija se dalje diferencira u plazma ćelije koje sintetišu i luče velike količine antitela, kao i u memorijske B ćelije. Antitela koja proizvedu i izluče plazma ćelije specifično će reagovati sa homologim antigenom koji je izazvao njihov nastanak. Mnoge od ovih reakcija dovode do odbrane domaćinskog organizma, kao i do sprečavanja ponovne infekcije patogenima. Memorijske ćelije igraju ulogu u sekundarnim imunim odgovorima. Plazma ćelije žive relativno kratko (oko nedelju dana), ali stvaraju velike količine antitela tokom ovog perioda. Memorijske ćelije, s druge strane, žive relativno dugo i pri narednom susretu sa antigenom brzo se transformišu u plazma ćelije koje luče antitela.

Nastanak imuniteta posredovanog ćelijama počinje kada, na primer, citotoksična T ćelija prepozna prerađeni antigen vezan za MHC molekule klase I na membrani ćelije (obično je to promenjena sopstvena ćelija, ali može da bude i ćelija transplantiranog tkiva ili eukariotski parazit). Usled stimulacije pomoću IL-2 koji proizvode Th2 ćelije, Tc ćelija se aktivira i postaje citotoksični T limfocit koji je sposoban da lizira ćeliju koja na svojoj površini prikazuje ovaj novi strani antigen, što je primarna manifestacija imuniteta posredovanog ćelijama. Interakcija između makrofaga koji prikazuje antigen i Th ćelije podstiče makrofag da proizvede i izluči Interleukin-1 koji deluje lokalno na Th ćelije, stimulišući Th ćelije da se diferenciraju i proizvode sopstvene citokine (koji ovde mogu da se nazovu limfokinima jer nastaju u limfocitima). Ovi limfokini imaju različite funkcije. IL-4 ima neposredno dejstvo na obližnje B ćelije. IL-2 ima neposredno dejstvo na T ćelije, kao što je predhodno opisano.

Leukociti takođe eksprimiraju receptore koji podstiču adheziju, a koji posreduju u interakcijama ćelija - ćelija i ćelija - matriks. Ove adhezivne interakcije su od velikog značaja za regulaciju hemopojeze i sazrevanja timocita, usmeravanje i kontrolu kretanja leukocita i migraciju kroz tkiva, kao i za razvoj imunih i ne-imunih zapaljenskih odgovora. Identifikovano je nekoliko porodica adhezionih receptora. Porodica leukocitnih integrina sadrži tri alfa - beta heterodimerna membranska glukoproteina koji dele zajedničku beta podjedinicu, označenu kao CD 18. Alfa podjedinica svakog od ova tri člana, antigen spregnut sa funkcijom limfocita - 1 (lymphocyte function associated antigen - 1, LFA-1), antigen makrofaga - 1 (Mac-1) i pl50, označene su kao CDlla, b i c, respektivno. Ovi adhezioni molekuli igraju kritičnu ulogu u imunim i zapaljenskim odgovorima leukocita. Porodica leukocitnih integrina je, sa svoje strane,

deo integrinske superfamilije, čiji su članovi evoluciono, strukturno i funkcionalno srodni. VLA grupa je još jedna podfamilija integrina koja se nalazi na leukocitima, nazvana je tako jer je prvobitno pronađeno da se "antigeni veoma kasne aktivacije" ("very late activation antigens") VLA-1 i VLA-2 javljaju kasno u aktivaciji T ćelija. Članovi ove porodice uglavnom igraju ulogu adhezionih receptora vanćelijskog matriksa i nalaze se i na hemopojetičnim i na nehemopojetičnim ćelijama. Oni igraju ulogu u različitim ćelijskim funkcijama, uključujući organizaciju tkiva, recirkulaciju limfocita i imune odgovore T ćelija. Još jedna podfamilija, citoadhezini, obuhvata receptore na krvnim polčicama i ćelijama endotela koje vezuju proteine vanćelijskog matriksa. Druga porodica adhezionih receptora je imunoglobulinska superfamilija,

čiji članovi uključuju CD2, LFA-3 i ICAm-1, koji učestvuju u adhezivnim interakcijama T ćelija, kao i antigen specifične receptore T i B ćelija, CD4, CD8, i MHC molekule klase 1 i II.

Još jedna poznata porodica adhezionih receptora je porodica selektina, koje odlikuje zajednički lecitinski domen. Leukocitni adhezioni lolekul - 1 (LCAM-1), koji je humani homolog mišjem homing receptom, MEL-14, eksprimira se na leukocitima, dok se endotelijalni leukocitini adhezioni molekul - 1 (ELAM-1) i membranski protein granula (GMP-140) eksprimiraju na stimulisanim ćelijama endotela i aktiviranim krvnim pločicama.

Aktivacija imunog odgovora zahteva fizički dodir ćelija - ćelija, uz prisustvo citokina. Stoga, na primer, razvoj prekursora B i T ćelija zahteva intimni dodir sa ćelijama strome. Neophodna su najmanje tri kritična dodira ćelija - ćelija za nastanak imunog odgovora. Prvi je inicijalni kontakt specifičnog antigena sa naivnom T ćelijom. S obzirom na zahtev za prikazivanje u okviru MHC, ovo je obavezan kontakt između ćelija. U normalnim okolnostima kritična antigen prikazujuća ćelija je dendritska ćelija. Uz interakciju MHC/peptid-TCR postoje i drugi ne-antigeni specifični parovi ligand - receptor vezani za membranu, koji su važni za interakciju između T ćelije i dendritske ćelije. Najvažniji je vezivanje CD28 molekula na T ćeliji za bilo koji od dva liganda, B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86), na dendritskoj ćeliji. Ovi molekuli nazivaju se dodatni molekuli i smatra se da CD28 obezbeđuje neophodni drugi signal T ćeliji bez kog ne dolazi do aktivacije T ćelije.

Drugi neophodni dodir ćelija - ćelija odvija se između aktivirane T ćelije i antigen-specifične B ćelije. Većina antigena je zavisna od T ćelija, to jest, odgovor antitela na antigen apsolutno zahteva pomoć T ćelija. Ova pomoć podrazumeva i citokine i dodir ćelija - ćelija. Ćelije vezuju specifične antigene preko površinskog Ig, zatim taj antigen unose, prerađuju i izlažu u okviru MHC molekula klase II. Ovo im omogućava da budu prepoznate od strane T ćelija specifičnih za pomoćne epitope iz specifičnog antigena. Ova interakcija ćelija - ćelija takođe zahteva vezivanje CD28 za B7 na B ćeliji. Uz to, molekul nazvan CD40 ligand ili CD154, čija ekspresija započinje nakon aktivacije T ćelija, vezuje se za CD40 na B ćelijama. Unakrsno vezivanje CD40 podstiče proliferaciju B ćelija, sprečava apoptozu B ćelija germinalnog centra i podstiče prebacivanje između izotipova imunoglobulina. CD28-B7 i CD40-CD40L interakcije receptor ligand su obe neophodne za komunikaciju između B i T ćelija koja izaziva njihovu međusobnu aktivaciju.

Treća interakcija ćelija - ćelija neophodna za imuni odgovor je vezivanje aktiviranih B ćelija (koje su migrirale u specijalizovanu strukturu u limfnim organima, nazvanu germinalni centri) za folikularne dendritske ćelije (FDC). FDC su specijalizovane ćelije strome koje čuvaju intaktne, t.j. neprerađene antigene na svojoj površini u obliku dugo živećih imunih kompleksa.

Uz druge molekule, FDC eksprimiraju CD23, koji se vezuje za B ćelije germinalnog centra preko CR2 receptora i podstiče diferencijaciju u plazma ćelije.

Potrebno je vreme pre nego što primarni imuni odgovor postane delotvoran kao odbrana domaćinskog organizma. Antigeni treba da budu prepoznati, uneseni, svareni, prerađeni i izloženi od strane APC. Nekoliko odabranih Th ćelija moraju da reaguju sa antigenom i da odgovore na ovu interakciju; predhodno postojeći B ili T limfociti moraju da sretnu antigen i da se podele i diferenciraju u efektorske ćelije (plazma ćelije ili Tc ćelije). U slučaju imuniteta posredovanog antitelima, koncentracija antitela mora da se poveća do delotvorne fiziološke koncentracije da bi organizam domaćina postao otporan. Može da prođe nekoliko dana ili nedelja dok se ne dostigne delotvoran stepen imuniteta, iako ovaj imunitet potom može da traje mnogo meseci, godina ili čak i doživotno, usled prisustva antitela. Kod prirodnih infekcija, inokulum je mali, pa iako se antigeni stimulus povećava tokom replikacije mikroorganizma, tokom prvih nekoliko dana nastaje samo mali broj antitela, pa je nemoguće detektovati antitela u krvi do oko nedelju dana nakon infekcije.

U pogledu indukcije sekundarnog imunog odgovora, smatra se da, po ponovnom izlaganju antigenima mikroorganizama (sekundarnom izlaganju antigenima), dolazi do ubrzanog imunološkog odogovora, t.j. do sekundarnog ili memorijskog odgovora. Veće količine antitela nastaju za samo 1 do 2 dana. Ovo je poslediva aktivnosti specifičnih memorijskih B ćelija ili memorijskih T ćelija koje su nastale tokom primarnog imunog odgovora. Ove memorijske ćelije se, kada su stimulisane homologim antigenom, "sete" da su predhodno već srele taj antigen, pa su u stanju da se brzo podele i diferenciraju u efektorske ćelije. Stimulacija memorijskih ćelija da brzo proizvedu veoma visoke (delotvorne) koncentracije dugotrajnih cirkulatornih antitela je osnova za davanje revakcina kod ljudi i kućnih ljubimaca. Stoga, nakon prvog izlaganja antigenu imuni odgovor (kao što je dokazano praćenjem koncentracije specifičnih antitela u serumu) se razvija postepeno kroz vremenski period od nekoliko dana, dostiže nizak plato u roku od 2 do 3 nedelje, a tada obično počinje da opada u relativno kratkom vremenskom periodu. Kada se antigen sretne drugi put, sekundarni (memorijski) odgovor izaziva brz porast koncentracije antitela, koja u serumu dostiže mnogo više koncentracije, a koja može da traje relativno dugo. Zaštitna koncentracija antitela može da se dostigne i samo primarnim izlaganjem, ali je obično neophodno da se antigena stimulacija imunog sistema ponavlja kako bi se osigurala dugotrajna visoka koncentracija zaštitnih antitela.

Molekul imunoglobulina (skraćeno Ig) je multimerni protein koji se sastoji od dva identična polipeptida lakih lanaca (L) i dva identična polipeptida teških lanaca (H) (H2L2) koji su međusobno vezani u makromolekulski kompleks interlančanim disulfidnim vezama, t.j. kovalentnim vezama između sulfahidril grupa susednih cisteinskih ostataka. Postoje različite klase humanih proteina antitela, od kojih svaku proizvodi specifični klon plazma ćelije. Na osnovu sastava teških lanaca, definisano je pet klasa humanih imunoglobulina, nazvanih IgG, IgM, IgA, IgE i IgD. IgG klasa i IgA klasa antitela su dalje podeljene na podklase, nazvane IgG], IgG2, IgG3i IgG4, i IgAii IgA2. Intralančane disulfidne veze spajaju različite delove istog polipeptidnog lanca, što dovodi do stvaranja petlji koje, zajedno sa susednim aminokiselinskim ostacima, čine domene imunoglobulina. Na amino - terminalnom kraju (takođe poznatom i kao "NH2-terminus" ili "N terminalni kraj"), svaki laki lanac i svaki teški lanac imaju po jedan varijabilni region koji pokazuje značajne varijacije u aminokiselinskom sastavu od jednog do drugog antitela. Varijabilni region lakog lanca, VL, u sprezi sa varijabilnim regionom teškog lanca, VH, čini antigen vezujuće mesto imunoglobulina, koje se označava kao Fy-

Uz varijabilni region, svaki od lanaca antitela ima jedan ili više konstantnih regiona. Laki lanci imaju samo po jedan konstantni region. Dakle, laki lanci sadrže jedan varijabilni i jedan konstantni region. Teški lanci sadrže po nekoliko konstantnih regiona. Teški lanci u IgG, IgA i IgD antitelima sadrže po tri domena konstantnih regiona, koji su označeni kao CH1, CH2 i CH3,

dok teški lanci u IgM i IgE antitelima imaju po četiri domena konstantnih regiona, CH1, CH2, CH3 i CH4. Dakle, teški lanci sadrže po jedan varijabilni region i tri ili čeriri konstantna regiona. Struktura i funkcija su objašnjeni u, na primer, Harlovvet al,urednici,Antibodies: A Laborntory Manual,Poglavlje 14, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor (1988).

Teški lanci imunoglobulina takođe mogu da se podele u tri funkcionalna domena: Fd region (deo koji sadrži Vhi CH1, t.j. dva N-terminalna domena teškog lanca), region šarke i Fc region (region "fragmenta koji kristalizuje" ("fragment crvstallizable"), koji je nastao iz konstantnih domena a dobija se nakon digestije pepsinom). Fd region, u kombinaciji sa lakim lancem formira Fab ("antigen vezujući fragment" ("fragment antigen binding")). S obzirom da antigen stereohemijski reaguje sa antigen vezujućim regionom na amino terminalnom kraju svakog Fab, IgG molekul je divalentan, t.j. može da veže dva molekula antigena. Fc sadrži domene koji interaguju sa receptorima za imunoglobuline na ćelijama, kao i sa početnim elementima kaskade komplementa. Stoga se obično smatra da je Fc region odgovoran za efektorske funkcije imunoglobulina, kao što su fiksacija komplementa i vezivanje za Fc receptore. Pepsin ponekada razlaže molekul pre trećeg konstantnog regiona (CH3) teškog lanca, čime se dobija veliki fragment (Fabc) i mali fragment pFcb. Ovi nazivi se koriste i za analogne regione drugih imunoglobulina. Region šarke, koji se nalazi kod IgG, IgA i IgD klasa antitela ponaša se kao fleksibilni razdvajač, koji omogućava Fab delu molekula da se slobodno pomera u prostoru. Nasuprot konstantnim regionima, domeni šarke su strukturno različiti, a između različitih klasa i podklasa imunoglobulina razlikuju se kako u sekvenci tako i u dužini.

Dužina i fleksibilnost regiona šarke različite su, na primer, kod članova različitih podklasa IgG. Region šarke kod IgGl, prema istraživanjima, obuhvata aminokiselinske ostatke-216 do 231, a zbog toga što može slobodno da se pomera, Fab regioni mogu da rotiraju oko svoje ose simetrije, kao i da se kreću u okviru sfere čiji je centar prva od dve interlančane disulfidne veze između teških lanaca. IgG2 ima ima kraću šarku nego IgGl, prema istraživanjima ona obuhvata 12 aminokiselinskih ostataka i četiri disulfidne veze. U regionu šarke IgG2 ne postoji glicinski ostatak, region je relativno kratak i sadrži rigidan poliprolinski dvostruki heliks, koji stabilizuju dodatni disulfidni interlančani mostovi između teških lanaca. Ovakve osobine ograničavaju fleksibilnost molekula IgG2. IgG3 se razlikuje od ostalih podklasa

po svom jedinstvenom regionu šarke (koji je oko četiri puta duži od istog regiona kod IgGl),

koji, prema istraživanjima, sadrži 62 aminokiselinska ostatka (uključujući 21 prolinski i 11 cisteinskih ostataka) koji grade nefleksibilni poliprolinski dvostruki heliks. Kod IgG3, Fab fragmenti su relativno daleko od Fc regiona, što molekulu daje veću fleksibilnost. Izdužena šarka kod IgG3 je takođe odgovorna za njegovu relativno veliku molekulsku masu, u poređenju sa drugim podklasama. Region šarke IgG4 je kraći nego kod IgGl, a fleksibilnost mu se nalazi između fleksibilnosti IgGl i IgG2. Fleksibilnost regiona šarke se, prema istraživanjima, smanjuje prema redosledu IgG3 > IgGl > IgG4 > IgG2. Četiri podklase IgG razlikuju se međusobno i po svojim efektorskim funkcijama. Ova razlika srodna je razlici u strukturi, uključujući i razlike u interakcijama između varijabilnih regiona, Fab fragmenata i konstantnog Fc fragmenta. Međutim, osim po glikozilaciji u okviru CH2 regiona, na primer, i uprkos ovim saznanjima, ne postoje čvrsta pravila ili konvencije o načinima ili postupcima za promenu osobina, uključujući sekvence, ovih podklasa molekula kako bi se promenile, kontrolisale, dodale ili uklonile različite funkcije, na primer ADCC, CDC i druge funkcije.

Prema kristalografskim istraživanjima, region šarke imunoglobulina može dalje da se podeli, prema funkciji, na tri regiona: gornji region šarke, središnji region i donji region šarke. Shinet al,1992Immunological Reviews130: 87. Gornji region šarke obuhvata aminokiselinske ostatke od karboksilnog kraja CH1 do prvog ostatka u regionu šarke koji ograničava kretanje, obično je to prvi cisteinski ostatak koji gradi disulfidnu vezu između dva teška lanca. Dužina gornjeg regiona šarke u korelaciji je sa fleksibilnošću antitela po segmentima. Središnji region šarke sadrži interlančane disulfidne veze, dok donji region šarke povezuje amino terminalni kraj CH2 domena i sadrži ostatke iz CH2.Id.Središnji region šarke humanog IgGl sadrži sekvencu Cys-Pro-Pro-Cys, koja, kada se dimerizuje stvaranjem disulfidnih veza, gradi ciklični oktapeptid za koji se veruje da se ponaša kao tačka oslonca za okretanje i na taj način obezbeduje pokretljivost. Region šarke može da sadrži još ijedno ili više mesta glikozilacije, koja uključuju više strukturno različitih vrsta mesta za vezivanje ugljenih hidrata. Na primer, IgAl sadrži pet mesta glikozilacije u okviru segmenta od 17 aminokiselinskih ostataka u regionu šarke, koji polipeptidu regiona šarke daju otpornost na crevne proteaze, što se smatra prednošću kod sekretornih imunoglobulina.

Konformacione promene koje dozvoljavaju struktura i fleksibilnost polipeptida regiona šarke imunoglobulina mogu da utiču i na efektorske funkcije Fc dela antitela. Tri opšte kategorije efektorskih funkcija Fc regiona obuhvataju (1) aktivaciju klasičnog puta komplementa, (2) interakciju sa efektorskim ćelijama i (3) kompartmentalizaciju imunoglobulina. Različite podklase humanih IgG razlikuju se po relativnoj efikasnosti kojom fiksiraju komplement ili kojom aktiviraju i amplifikuju korake kaskade komplementa. Videti,

npr. Kirschfink, 2001Immunol. Rev.180: 177; Chakrabortiet al,2000Cell Signal12: 607; Kohlet al,1999Mol. Immunol.36: 893; Marshet al,1999Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.8:

557; Spethet al,1999JVien Klin. Wochenschr.111: 378.

Citotoksičnost zavisna od komplementa (Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC) se smatra značajnim mehanizmom uklanjanja specifičnih ciljnih ćelija kao što su ćelije tumora. CDC je tok događaja koji se sastoji od serije aktivacija enzima, koji kaskadno aktiviraju jedan drugi. Komplement igra važnu ulogu u uklanjanju antigena, koju ostvaruje pomoću svoje četiri glavne funkcije: (1) lokalne vazodilatacije; (2) privlačenja imunih ćelija, posebno fagocita (hemotaksije); (3) obeležavanja stranih organizama za fagocitozu (opsonizacije); i (4) uništavanja organizama napadača pomoću kompleksa za napad membrane (Membrane Attack Complex, MAC). Centralni molekul je C3 protein. To je enzim koji se čepa na dva dela dejstvom učesnika bilo klasičnog, bilo alternativnog puta. Antitela, posebno IgG i IgM, pokreću klasični put, dok alternativni put nespecifično pokreću bakterijski proizvodi kao što su lipopolisaharidi (LPS). Ukratko, proizvodi nastali cepanjem C3 obuhvataju mali molekul, C3a, koji je hemotaktički atraktant za fagocitirajuće ćelije imunog sistema i dovodi do lokalne vazodilatacije izazivajući oslobađanje C5a fragmenta iz C5. Drugi deo C3, C3b, oblaže antigene na površini stranih organizama čime taj organizam opsonizuje kako bi bio uništen. C3b reaguje i sa drugim učesnicima sistema komplementa kako bi izgradio MAC koji se sastoji od C5b, C6, C7, C8 i C9.

Uopšteno posmatrano, IgGl i IgG3 fiksiraju komplement sa'najvećom efikasnošću, IgG2

je nešto manje efikasan dok IgG4 ne aktivira komplement. Aktivacija komplementa započinje vezivanjem Clq, podjedinice prve komponente u kaskadi. Cl, za kompleks antigen - antitelo. Iako se mesto za vezivanje Clq nalazi u CH2 domenu antitela, region šarke utiče na sposobnost antitela da aktivira kaskadu. Na primer, prema istraživanjima, rekombinantni imunoglobulini koji nemaju region šarke nisu u stanju da aktiviraju komplement. Shinet al,1992. Bez fleksibilnosti koju daje region šarke, Fab deo molekula vezan za antigen možda neće biti u stanju da zauzme konformaciju u kojoj je neophodno da se nađe da bi omogućio vezivanje Clq za CH2. Videtiid.Dužina šarke i fleksibilnost segmenata su, prema istraživanjima, u korelaciji sa aktivacijom komplementa; međutim, ova korelacija nije apsolutna. Humani IgG3 molekuli sa

izmenjenim regionima šarke koji su rigidni koliko i region šarke IgG4, na primer, i dalje mogu efikasno da aktiviraju ovu kaskadu.

Nedostatak regiona šarke, ili nedostatak funkcionalnog regiona šarke, može da utiče i na sposobnost određenih humanih IgG imunoglobulina da vežu receptore za Fc na efektorskim ćelijama imunog sistema. Vezivanje imunoglobulina za Fc receptor omogućava citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela, koja se, kako je predhodno pomenuto, smatra važnim mehanizmom za uklanjanje ćelija tumora. Porodica receptora za Fc humanog IgG (FcR) podeljena je u tri grupe, FcyRI (CD64), koji je sposoban da sa visokim afinitetom veže- IgG i FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD16), koji su, oba, receptori nižeg afiniteta. Molekulske interakcije između svakog od ova tri receptora i imunoglobulina nisu precizno definisane, ali eksperimentalni dokazi ukazuju da bi ostaci u CH2 domenu blizu šarke mogli da budu važni za specifičnost interakcije između antitela i receptora Fc. Proteini IgGl mijeloma i rekombinantna himerna IgG3 antitela kojima nedostaje region šarke nisu, prema istraživanjima, sposobni da vežu FcyRI, možda zbog toga što je smanjena mogućnost prilaza CH2 regionu. Shinet al,1993Intern. Rev. Immunol.10: 177, 178 - 79.

Neobični i naizgled evoluciono nesrodni izuzeci od H2L2strukture konvencionalnih antitela javljaju se kod nekih izotipova antitela koji se sreću kod kamelida (jednogrbih i dvogrbih kamila i lama; Hamers - Castermanet al.,1993Nature363: 446; Nguvenet al.,1998J. Mol.

Biol275: 413), kod ajkulaGinglymostoma cirratum(Rouxet al,1998Proc. Nat. Acad. Sci. USA95: 11804) i kod ribaHydrolagus colliei(Nguvenet al.,"Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation", 2002Immunogenetics54 (1): 39 - 47). Izgleda da

ova antitela mogu da grade antigen - vezujuće regione korišćenjem samo varijabilnih regiona teških lanaca (koja se nazivaju "antitela teških lanaca" ili HCAb). Kod obe vrste, ovi varijabilni regioni često sadrže produženi treći region za određivanje komplementarnosti (CDR3) koji može da pomogne u nadomeštavanju nedostatka varijabilnog regiona lakog lanca, a česte su i disulfidne veze između CDR regiona za koje se smatra da pomažu stabilizaciju vezujućeg mesta. Muyldermanset al,1994Prot. Engineer.7: 1129; Rouxet al,1998. Međutim, tačna funkcija antitela sastavljenih samo od teških lanaca nije poznata, a evolucioni pritisak koji je doveo do njihovog stvaranja još nije identifikovan. Videti, npr. Nguyenet al,2002, iznad. Kamelide, uključujući kamile, lame i alpake, eksprimiraju i konvencionalna H2L2antitela, stoga ne izgleda da su antitela sastavljena samo od teških antitela kod ovih životinja prisutna jednostavno kao alternativna struktura antitela.

Varijabilni regioni (VHH) imunoglobulina sastavljenih samo od teških lanaca kod kamelida i varijabilni regioni teških lanaca konvencionalnih antitela (H2L2) međusobno se razlikuju u aminokiselinama, a te razlike uključuju i razlike na onim pozicijama koje bi mogle da učestvuju u izgradnji granične linije između VLi HL konvencionalnih domena. Nguvenet al,1998J. Mol. Biol275: 413; Muvldermanset al,1994Prot. Engineer.7: 1129. Prema istraživanjima, VHH kamelida se rekombinuju sa konstantnim regionima IgG2 i IgG3 koji sadrže region šarke, CH2 i CH3 domene, a kojima nedostaje CH1 domen. Hamers-Castermanet al,1993Nature363: 446. Interesantno je da VHH kodiraju lokusi na hromozomima koji su sasvim različiti od VHlokusa (Nguvenet al,1998, iznad), što ukazuje na to da su B ćelije kamelida razvile kompleksne mehanizme prepoznavanja antigena i diferencijacije. Stoga, na primer, IgGl kod lama je konvencionalni (H2L2) izotop antitela kod koga se VHrekombinuje sa konstantnim regionom koji sadrži region šarke, CH1, CH2 i CH3 domene, dok su IgG2 i IgG3 lama izotipovi sastavljeni samo od teških lanaca kojima nedostaje CH1 domen i koji ne sadrže lake lance.

Klase imunoglobulina imaju različite fizičke i hemijske odlike i pokazuju jedinstvene biološke osobine. Njihova sinteza se odvija u različitim fazama i brzinama tokom imunog odgovora i/ili tokom infekcije. Njihov značaj i uloge u otpotnosti organizma (imunosti) su različite.

Imunoglobulin G (IgG), protein molekulske mase od oko 150 000 daltona (150 kD) je predominantni Ig u serumu. On čini oko 80% ukupnih antitela koja se nalaze u organizmu životinje u bilo kom trenutku, a 75% ukupnih antitela u serumu. Može da difunduje van krvnog toka u ekstravaskularne prostore i najrasprostranjeniji je Ig koji se tamo nalazi. Njegova koncentracija u tkivnim tečnostima raste tokom zapaljenja, a posebno je efikasan u neutralizaciji bakterijskih vanćelijskih toksina i virusa. Ima još i sposobnost opsonizacije i sposobnost fiksacije komplementa. Polipeptidni sastav Fc regiona molekula IgGl antitela relativno je stalan, bez obzira na specifičnost antitela; međutim, kao što je ranije pomenuto, Fab regioni su uvek različiti u svojim tačnim aminokiselinskim sekvencama u zavisnosti od svoje specifičnosti za antigen. Receptori na fagocitima i određenim drugim ćelijama prepoznaju specifične aminokiselinske regione Fc dela molekula, a Fc domen sadrži i peptidni region koji će se vezati za komplement i aktivirati ga, što je često neophodno za ispoljavanje imunog odgovora posredovanog antitelima. Obzirom da je IgG molekul divalentan, on može unakrsno da vezuje molekule antigena, što može da dovede do precipitacije i aglutinacije antigena; ako je IgG vezan za antigen na ćeliji mikroorganizma ili na njenoj površini, Fc region može da obezbedi spoljni ligand koji mogu da prepoznaju specifični receptori na fagocitima. Ćelije mikroorganizama ili virusi obloženi IgG molekulima opsonizuju se za fagocitozu, a opsonizovani patogeni se mnogo lakše unose i uništavaju u fagocitima od svojih neopsonizovanih srodnika. IgG, kao i IgM i IgA, neutrališe aktivnost toksina, uključujući egzotoksine bakterija. Štaviše, unakrsno vezani molekuli IgG na površini ćelije mogu da vežu i aktiviraju komplement iz seruma i da pokrenu kaskadu reakcija koja će dovesti do uništenja ćelije.

IgM je prvi imunoglobulin koji se pojavljuje u krvotoku tokom infekcije. Uglavnom je ograničen na krvotok i obezbeđuje zaštitu protiv patogena koji se kreću kroz krvotok. IgM čini oko 10% imunoglobulina u serumu, a sastavljen je u formu pentamera sačinjenog od pet molekula imunoglobulina (molekulske mase od oko 900 kD) koji su međusobno vezani svojim Fc domenima. Uz kovalentno vezivanje monomernih podjedinica, pentamer stabilizuje polipeptid od 15 kD koji se naziva J lanac. IgM, stoga, ima teoretsku "valentnost" od deset (t.j.

ima deset izloženih Fab domena). Verovatno je da najvažnija uloga IgM leži u njegovoj sposobnosti da deluje rano u imunom odgovoru protiv patogena koji se kreću kroz krvotok, obzirom na njegovu efikasnost u aglutinaciji čestičnih antigena. IgM takođe jako vezuje komplement a molekuli IgM vezani za površinu ćelije deluju kao opsonini, Čineći mikroorganizam podložnijim fagocitozi. Cele ćelije mikroorganizama mogu da budu ubijene i lizirane u prisustvu komplementa i IgM. Kao što je predhodno pomenuto, IgM se javlja i na površini zrelih B ćelija, u obliku transmembranskog monomera, gde deluje kao receptor za antigen, koji je u stanju da aktivira B ćeliju po vezivanju antigena.

Premeštanje gena na imunoglobulinskim lokusima tokom razvoja limfocita stvara repertoar B limfocita koji eksprimiraju moštvo različitih receptora za antigene. Premeštanje gena, katalizovano rekombinazom gena za aktivaciju premeštanja (rearrangement - activating gene, "RAG"), dovodi do integracije V, D i J segmenata imunoglobulinskih gena, kako bi se dobili produktivno uređeni geni imunoglobulina koji kodiraju teške i lake lance IgM antitela. Veliki broj različitih IgM antitela u ovom primarnom repertoaru nastaje kroz kombinatorne mehanizme (izbor V, D i J genskih segmenata upotrebljenih za dobijanje gena za konkretno antitelo), kao i kroz raznolikost spojeva. Spajanje V, D i J genskih segmenata je donekle neprecizno, te može da dođe do ubacivanja nukleotida na mestu spoja i to ne prema nekom određenom modelu. Stoga se dobija veoma visok stepen raznolikosti na V-D-J granicama. Ovo značajno doprinosi strukturnoj raznolikosti trećeg regiona za određivanje komplementarnosti u antitelu, dela koji često igra kritičnu ulogu u prepoznavanju antigena. Primarni repertoar IgM antitela sadrži nekoliko miliona različitih struktura. Širina ovog repertoara znači da će svaki antigen koji uđe u organizam verovatno sresti antitelo koje ga prepoznaje sa prihvatljivim afinitetom. Za većinu ulazećih antigena verovatno neće postojati visokoafinitetno vezivno mesto (jer repertoar nije dovoljno širok), ali će afinitet dostupnih IgM antitela u primarnom repertoaru biti različit od jednog do drugog antigena. Ako se epitop često sreće jer se u velikoj gustini nalazi na površini antigena (npr. ponavljana struktura na površini virusa ili bakterije), IgM antitelo može ipak da bude dovoljno efikasno u posredovanju izbacivanja ovog organizma, bez obzira na to što su slabe individualne interakcije između epitopa na antigenu i kombinovanog mesta na imunoglobulinu. Gustina epitopa može da omogući multivalentne interakcije sa IgM,

što dovodi do interakcije visokog aviditeta, ukoliko postoji odgovarajuće rastojanje između epitopa na antigenu. Bez obzira na to, kako bi se obezbedio efikasan i specifičan odgovor, posebno kada je koncentracija antigena niska (kao što može da bude slučaj kada se organizam sreće sa veoma malim brojem infektivnih čestica virusa), bilo bi poželjno da postoje visoko afinitetna antitela za neutralizaciju, na primer, infektivnog organizma. Širina primarnog repertoara ne ide u prilog verovatnoći da će takva, visoko afinitetna antitela, biti prisutna u ovom repertoaru. Imuni sistem, stoga, funkcioniše u dve faze. Primarni repertoar IgM antitela nastaje premeštanjem gena koje se odvija pre nego što dođe do susreta sa antigenom, tokom ranog razvoja limfocita. Međutim, kada dođe do susreta sa antigenom, B ćelije u tom primarnom repertoaru koje kodiraju odgovarajuća antitela (čak iako su ta antitela niskog afiniteta) selektivno se šire i podležu usmerenoj promeni kroz usmerenu hipermutaciju i selekciju posredovanu antigenom. Na ovaj način se omogućava značajno sazrevanje afiniteta antitela specifičnih za antigen koja se proizvode. Prisustvo antigena dovodi i do rekombinacije u kojoj se menja izotip antitela. Na ovaj način, u odsustvu spoljašnje stimulacije antigenom i bez imunoglobulina koji potiču od majke, serum će sadržati samo mnoštvo raznolikih nemutiranih molekula IgM koji su nastali premeštanjem gena. Ovaj repertoar se menja sa starošću, usled stalne izloženosti različitim antigenima, tako da je kod starijih životnija većina imunoglobulina u serumu sastavljena od mutiranih molekula IgG (i IgA) čije su se specifičnosti razvile kao posledica selekcije antigenom.

IgA postoji kao H2L2monomer molekulske mase od oko 160 kD u serumu, dok se u izlučevinama nalazi kao dimer H2L2monomera mase od oko 400 kD. Kao i kod IgM, polimerizacija (dimerizacija) se odvija preko J lanca. IgA ima dve podklase, na osnovu različitih teških lanaca, IgAl i IgA2. IgAl nastaje u koštanoj srži i čini većinu IgA u serumu. I IgAl i lgA2 se sintetišu u GALT (gut associated lvmphoid tissue, limfatička tkiva u digestivnom sistemu), kako bi se izlučila na mukozne površine. S obzirom da IgA može da se sintetiše lokalno i luči u seromukozne telesne izlučevine, ponekad se naziva još i sekretorno antitelo ili slgA. Količinski, IgA se sintetiše u većim količinama nego IgG, ali ima kraći poluživot u serumu (6 dana), a gubi se i kroz izlučevine. Koncentracija IgA u serumu je oko 15% ukupne koncentracije antitela. Izlučivanje dimernog IgA odvija se pomoću glikoproteina mase oko 100 kD koji se naziva sekretorna komponenta. Upravo vezivanje ove sekretorne komponente omogućava molekulima IgA da izađu iz organizma kroz mukozne površine putem egzokrinih žlezda. IgM može da se prenosi na sličan način, te ima mali udeo u sekretornim antitelima. Sekretorni IgA glavni je imunoglobulin prisutan u gastrointestinalnim tečnostima, nazalnim izlučevinama, pljuvačci, suzama i drugim mukoznim izlučevinama organizma. IgA antitela važna su za otpornost organizma prema infekcijama mukoznih površina, posebno u respiratornom, intestinalnom i urogenitalnom traktu. IgA igra ulogu zaštitnog omotača mukoznih površina protiv adhezije mikroorganizama ili početne kolonizacije. On, takođe, može da neutrališe aktivnost toksina na mukoznim površinama. Fc receptori za mikroorganizme obložene IgA antitelima, koji se nalaze na monocitima i neutrofilima iz respiratorne mukoze ukazuje da bi IgA u plućima mogao da igra ulogu, bar, u opsonizaciji patogena. Sekretorni IgA se prenosi i mlekom, t.j. kolostrumom, sa majke koja doji na novorođeno dete, čime se obezbeđuje pasivni imunitet za mnoge patogene, posebno za one koji ulaze putem GI trakta.

IgE je imunoglobulin od oko 190 kD koji čini oko 0,002% ukupih imunoglobulina u serumu. Proizvode ga plazma ćelije respiratornog i intestinalnog epitela. Većina IgE vezana je za ćelije tkiva, posebno za mastocite. Ako infektivni organizam uspe da prodre kroz IgA barijeru, nailazi na sledeću liniju odbrane, sistem nazvan MALT (mucosa associated lvmphoid tissues, limfna tkiva vezana za mukozu) koji je pod kontrolom IgE. IgE se veoma čvrsto vezuje za specifične receptore za IgE Fc na mastocitima. Dodir sa antigenom dovodi do oslobađanja medijatora zapaljenja iz mastocita, koji efikasno pokreću različita sredstva imunog odgovora, uključujući komplement, hemotaktičke faktore fagocita, T ćelija i si. Iako je dobro poznata manifestacija ove reakcije vrsta reakcije neposredne preosetljivosti koja se naziva atopijska alergija (npr. koprivnjača, astma, polenska groznica itd.) MALT odgovori služe kao mehanizam odbrane zbog toga što pojačavaju zapaljenski odgovor i mogu da olakšaju odbacivanje patogena.

IgD je molekul od oko 175 kD koji, u svom monomernom obliku, podseća na IgG. IgD antitela se, u najvećoj meri, nalaze na površini B limfocita. Iste ćelije mogu da nose još i IgM antitela. Kao što je ranije pomenuto, smatra se da IgD i IgM igraju ulogu receptora za antigen koji međusobno interaguju kako bi kontrolisali aktivaciju i supresiju B ćelije. Stoga se smatra da bi IgD mogao da ima imunoregulatorsku ulogu.

Uz opsonizaciju, aktivaciju komplementa i ADCC, antitela imaju i druge uloge u odbrani organizma domaćina, koje obuhvataju sterne smetnje, neutralizaciju toksina, aglutinaciju i precipitaciju. Što se tiče sternih smetnji, smatra se da se antitela kombinuju sa površinom mikroorganizama te mogu da blokiraju ili spreče njihovo vezivanje za podložne ćelije ili mukozna tkiva organizma domaćina. Antitela na virusne komponente mogu da spreče vezivanje virusa za podložne ćelije organizma domaćina i da na taj način smanje infektivnost. Sekretorni IgA može da spreči vezivanje patogena za površine mukoze. Antitela koja neutrališu toksine (antitoksini) takođe mogu da reaguju sa rastvornim bakterijskim toksinima i da spreče interakciju toksina sa njegovom specifičnom ciljnom ćelijom ili supstratom. Antitela takođe mogu da se kombinuju sa površinama mikroorganizama ili rastvornih antigena i da ih na taj, način aglutiniraju ili precipitiraju. Na ovaj način se smanjuje broj odvojenih infektivnih jedinica a one postaju podložnije fagocitozi zbog toga što su sjedinjene čestice veće. Fagociti mogu da uklone flokulate ili agregate neutralisanih toksina.

Predložena je upotreba antitela u terapiji. Životinje, uključujući ljude i miševe, sposobne

su da proizvedu antitela koja su u stanju da prepoznaju (vezivanjem) suštinski bilo koje antigene determinante, kao i da razlikuju slične epitope. Ne samo da se na ovaj način obezbeđuje osnova za zaštitu od organizama koji uzrokuju bolesti, na ovaj način antitela postaju privlačni kandidati za ciljanje drugih vrsta molekula koji se nalaze u organizmu, kao što su receptori ili drugi proteini prisutni na površini normalnih ćelija i molekuli koji se nalaze isključivo na površini ćelija kancera. Stoga je izuzetna specifičnost antitela razlog zbog koga je njihova upotreba u terapiji ljudi veoma obećavajuća.

Prvobitni preparati antitela koji su bili dostupni za primenu, kao što su gamaglobulini za intravensku primenu, obuhvatali su životinjske i humane antiserume koji su se koristiliin vivoza uništavanje bakterija (tetanus, pneumokokus) i neutralizaciju virusa (hepatitis A i B, besnilo, citomegalovirus i varičela zoster) u krvi inficiranih osoba. Upotreba endotoksina verovatno je najznačajnija od ranih primena. Međutim, postoje problemi sa upotrebom antitela u humanoj terapiji zbog toga što je odgovor imunog sistema na bilo koji antigen, čak i na najjednostavniji, uvek "poliklonski", t.j. sistem proizvodi antitela širokog spektra struktura, kako u pogledu vezivnih regiona, tako i u pogledu efektorskih regiona. Terapija poliklonskim antitelima ima i određene neželjene efekte. Uz poliklonsku prirodu ovih preparata antitela, postoji i rizik od infekcije virusima koji su zagadili preparat. Serumska bolest i anafilaksija takođe su smatrani ograničavajućim faktorima. Dalje, čak iako bi se izolovala samo jedna ćelija koja luči antitela, a potom gajila u kulturi, ona bi izumrla nakon nekoliko generacija usled ograničenog potencijala za rast svih somatskih ćelija.

Do kasnih sedamdesetih godina dvadesetog veka, poliklonska antitela dobijena iz seruma imunizovanih životinja bila su jedini izvor antitela za istraživanja i terapiju bolesti. Izolacija specifičnih antitela suštinski je bila nemoguća sve dok Kohler i Milstein nisu otkrili kako da dobiju "monoklonska antitela" koja bi imala istu specifičnost, koja bi sva bila slična jedna drugima usled toga što bi ih proizvodio klon pojedinačne plazma ćelije i koja bi mogla da se gaje beskonačno. Ova tehnika opisana je u publikaciji iz 1975{ Nature256: 795 - 97), a Kohler i Milstein su za svoj rad dobili Nobelovu nagradu za medicinu 1984.

Prvi korak u tehnici Kohlera i Milsteina za proizvodnju monoklonskih antitela podrazumeva imunizaciju eksperimentalne životinje proučavanim antigenom. U većini svojih eksperimenata, Kohler i Milstein ubrizgavali su ovčija crvena krvna zrnca miševima. Organizam miša pokreće imuni odgovor i počinje da proizvodi antitela specifična za antigen. Potom se uklanja slezina miša i iz nje izoluju B ćelije koje proizvode antitela na posmatrani antigen. Ćelije koje proizvode tumor koje su gajene u kulturi se zatim spajaju sa B limfocitima korišćenjem polietilenglikola, kako bi se dobio "hibridom". Samo hibridomi koji su rezultat fuzije će preživeti. Limfociti iz slezine imaju ograničen životni vek, tako da će B ćelije koje nisu fuzionisale sa ćelijama mijeloma izumreti u kulturi. Uz to, ćelije kojima nedostaje o'Sobina proizvodnje antitela koja potiče iz B ćelije, neće lučiti emzim HGPRT, koji je neophodan za rast u podlozi sa hipoksantin-aminopterintimidinom (HAT podloga). HAT podloga, na kojoj se gaje ćelije, inhibira put sinteze nukleotida. Ćelije koje proizvode HGPRT mogu da zaobiđu ovaj put i da nastave sa rastom. Prebacivanjem fuzionisanih ćelija u HAT podlogu moguće je izolovati prave hibridome. Izolovane ćelije hibridoma se zatim ispituju na specifičnost za posmatrani antigen. Obzirom daje svaki hibridom potomak pojedinačne B ćelije, on proizvodi kopije samo jednog antitela. Hibridom koji proizvodi antitela sa željenim osobinama se gaji u kulturi kako bi se dobile velike količine monoklonskih antitela, koja se potom izoluju za dalju upotrebu. Tehnika se naziva hibridizacija somatskih ćelija, a dobijeni hibridom (selektovan i na osnovu besmrtnosti i na osnovu proizvodnje željenog specifičnog antitela) može beskrajno da se gaji u kulturi, t.j. on predstavlja potencijalno besmrtnu ćelijsku liniju.

Monoklonska antitela se danas često koriste kao dijagnostički i istraživački reagensi. Međutim, njihovo uvođenje u humanu terapiju napredovalo je znatno sporije. Glavna poteškoća

leži u tome što humani imuni sistem "vidi" mišja antitela kao strana. Humani pacijent razvija imuni odgovor na njih, proizvodeći HAMA (humana anti - mišja antitela). Na taj način, ne samo da se terapeutska antitela brzo izbacuju iz organizma domaćina, već se javlja i mogućnost da imunokompleksi oštete bubrege.

U pokušaju da se prevaziđe problem HAMA korišćena su dva pristupa. Prvi je proizvodnja himernih antitela kod kojih antigen - vezujući deo (varijabilni regioni) mišjeg monoklonskog antitela fuzioniše sa efektorskim delom (konstantni region) humanog antitela pomoću genetskog inžinjeringa. U drugom pristupu, antitela glodara se prerađuju upotrebom tehnike poznate kao presađivanje regiona za određivanje komplementarnosti ("CDR grafting") ili "humanizacija". U ovom procesu, antigen vezujuća mesta koja nastaju od tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca isecaju se iz ćelija koje luče glodarska mAb, i presađuju u DNK koji kodira okvir humanog antitela. S obzirom na to da se presađuje samo CDR antigen - vezujućeg mesta, umesto celog varijabilnog domena glodarskog antitela, dobij eno humanizovano antitelo (antitelo druge generacije ili "hiperhimerno" antitelo) je, prema istraživanjima, manje imunogeno od himernog antitela prve generacije. Ovaj proces je dalje poboljšan, uz uključivanje promena koje se nazivaju "preoblikovanje" (Verhovenet al,"Reshaping human antibodies: grafting an anti-lvsosome activitv", 1988Science239: 1534 - 1536; Riechmannet al,"Reshaping human antibodies for therapv", 1988Nature332: 323 - 337; Tempestet al,"Reshaping human monoclonal antibodv to inhibit respiratorv svncitial virus infection in vivo",Bio/ Technol 19919: 266 - 271), "hiperhimerizacija" (Queenet al,"A humanized antibodv that binds to the human interleukin 2 receptor", 1989Proc Natl Acad Sci USA86: 10029 - 10033; Coet al,"Humanized antibodies for antiviral therapy" 1991Proc Natl Acad Sci USA88: 2869 - 2873; Coet al,"Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen", 1992J Immunol 148:1149 - 1154) i "lakiranje" (Market al,"Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies" u Metcalf BW, Dalton BJ urednici, Cellular adhesion: molecuilar definition to therapeutic potential. Nevv York: Plenum Press, 1994: 291 - 312).

U procesu preoblikovanja na osnovu homologije, varijabilni region iz glodara poredi se

sa koncenzus sekvencom proteinske sekvence podgrupe kojoj pripada. Slično tome, izabrani akceptorski okvir humanog konstantnog regiona se poredi sa koncenzusnom sekvencom svoje porodice. Gussovalet al,"Humanization of monoclonal antibodies", 1991Meth Enzymol203: 99-121. Analiza sekvence pokazuje koji su ostaci mogli da podlegnu mutaciji tokom procedure afinitetnog sazrevanja te stoga mogu da budu idiosinkratski. Smatra se da uključivanje jednog ili više humanih ostataka smanjuje probleme imunogenosti zamenjivanjem idiosinkrotskih humanih akceptorskih ostataka. Dalje, smatra se da proces preoblikovanja omogućava poređenje humanih i glodarskih koncenzus sekvenci kako bi se otkrile eventualne razlike između vrsta. RSV19 antitela su humanizovana korišćenjem ove procedure. Tayloret al,"Humanized monoclonal antibody to respiratory syncitial virus" 1991Lancet337: 1411 - 1412; Tempestei al,"Reshaping a human monoclonal antobody to inhibit human respiratory syncitial virus infection in vivo",Bio/ Technol 19919: 266 - 271.

Hiperhimerizacija je alternativni postupak identifikacije ostataka izvan CDR regiona za koje je verovatno da učestvuju u rekonstituciji vezivne aktivnosti. U ovom postupku, humane sekvence se porede sa sekvencama mišjeg varijabilnog regiona te se za akceptorski okvir bira ona sa najvećim stepenom homologije. Kao i u proceduri preoblikovanja, "idiosinkratski" ostaci se zamenjuju sa ostacima koji se češće sreću u humanim sekvencama. Identifikuju se ostaci izvan CDR koji bi mogli da interaguju sa CDR sekvencama. Konačno, određuje se koj^ će od ovih ostataka da bude uključen u okvir varijabilnog regiona. Humanizovana antitela na CD33 antigen su, kako je objavljeno, razvijena ovim postupkom. Coet al,"Chimeric and humanized antibodies vvith specificity for the CD33 antigen", 1992J Immunol 148:1149 - 1154. Videti, takođe, Čarteret al,"Humanization of an anti-pl85 HER2 antibody for human cancer therapy", 1992Proc Natl Acad Sci USA89: 4285 - 4289.

Izložena površina proteina je primarna determinanta njegove imugenosti. Humanizovano mišje antitelo može, stoga, da bude učinjeno manje imunogenim zamenom izloženih ostataka koji se razlikuju od onih koji se obično nalaze u humanim antitelima. Ovaj postupak humanizacije naziva se "lakiranje". Odgovarajuće zamene spoljašnjih mogu da imaju mali ili nikakav uticaj na unutrašnje domene ili okvir između domena. Lakiranje je proces koji se odvija u dva koraka. U prvom koraku, biraju se humani varijabilni regioni najvišeg stepena homologije i porede, ostatak po ostatak, sa odgovarajućim mišjim varijabilnim regionima. U drugom koraku, ostaci prisutni u humanim homologim sekvencama zamenjuju mišje ostatke iz okvira, koji se razlikuju od ostataka koji su im homologi u humanim sekvencama. Ova zamena podrazumeva samo one ostatke koji se nalaze na površini i koji su bar delimično izloženi.

Ipak, bilo je potrebno više od četvrtine veka istraživanja tehnologije monoklonskih antitela i postupaka genetskog inžinjeringa da bi se došlo do razvoja molekula imunoglobulina za lečenje humanih bolesti. Zapravo, tek u poslednjih pet godina monoklonska antitela postala su klasa terapeutskih sredstava u ekspanziji. Videti Glennie MJ & van de Winkel JG,Drug Discov Today2003 Jun 1; 8 (11): 503 - 10; Soriau C & Hudson PJ, "Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy", 2003Expert Opin Biol Ther.3 (2): 305 - 18. Videti još i Pendley Cet al,"Immunogenicity of therapeutic monoclonal antobodies", 2003Curr Opin Mol Ther.5 (2): 172 - 9.

U svakom slučaju, u prošeku se na tržištu pojavljivalo u prošeku manje od jednog terapeutskog antitela godišnje, počev od 1986, jedanaest godina po objavljivanju monoklonskih antitela. Pet mišjih monoklonalnih antitela uvedeno je u humanu medicinu tokom perioda od deset godina od 1986 do 1995, uključujući "muromonab-CD3" (OrthoClone OKT3®), koji se vezuje za molekul na površini T ćelija i koji je pušten u upotrebu 1986 kako bi se sprečilo akutno odbacivanje presađenih organa; "edrecolomab" (Panorex®), pušten u upotrebu 1995 za lečenje kolorektalnog kancera; "odulimomab" (Antilfa©), pušten u upotrebu 1997 protiv odbacivanja transplanta; i "ibritumomab" (Zevalin® yiuxetan), pušten u upotrebu 2002 za lečenje ne-Hodžkinovog limfoma. Uz to, jedno monoklonsko Fab "abcimab" (ReoPro©) pušteno je u upotrebu 1995. Ono inhibira zgrušnjavanje krvnih pločica vezivanjem za receptore na njihovoj površini koji su normalno vezani za fibrinogen, a može da bude od pomoći i u sprečavanju ponovnog stvaranja ugrušaka u koronarnim arterijama kod pacijenata kojima je izvršena angioplastija. U upotrebu su puštena i tri himerna monoklonska antitela: "rituksimab"

(Rituxan®), 1997, koji se vezuje za molekule CD20 koji se nalaze na većini B ćelija i koristi se za lečenje limfoma B ćelija; "baziliksimab" (Simulect®), 1998, protiv odbacivanja transplanta; i "infiksimab" (Remicade®) koji se vezuje za faktor nekroze tumora - alfa (TNF-a), 1998, za lečenje reumatoidnog artritisa i Kronove bolesti. Uz to, "abciksimab" (ReoPro®), Fab fragment mase 47,6 kD himernog humanog/mišjeg monoklonskog antitela 7E3 koje se vezuje za glikoprotein (GP) Ilb/IIIa receptor humanih krvnih pločica, pušten je u upotrebu 1995 kao dodatak perkutanoj koronarnoj intervenciji za sprečavanje srčanih ishemičnih komplikacija kod pacijenata kojima je izvršena perkutana koronarna intervencija. Konačno, u periodu od 1997 do 2003 u upotrebu je pušteno sedam "humanizovanih" antitela: "daklizumab" (Zenapax®), 1997,

koji se vezuje za IL-2 receptor koji se proizvodi na površini aktiviranih T ćelija a koristi se za sprečavanje akutnog odbacivanja presađenih bubrega; "palivizumab" (Svnagis®), 1998, protiv RSV; "trastuzumab" (Herceptin®), 1998, koji se vezuje za HER-2, receptor faktora rasta koji se nalazi na ćelijama kancera dojke; "gemtuzumab" (Mvlotarg®), 2000, koji je konjugat monoklonskog antitela koje vezuje CD33, molekula sa površine ćelije kog eksprimiraju ćelije kancera akutne mijelogenozne leukemije (AML) ali ne i normalne matične ćelije koje su neophodne da se ponovo naseli koštana srž; i "alemtuzumab" (MabCampath®), 2001, koji se vezuje za CD52, molekul koji se nalazi na belim krvnim zrncima a dovodi do privremene remisije hronične limfocitične leukemije; "adalimumab" (Humira® (D2E7)), humano anti-TNF monoklonsko antitelo koje sadrži teški lanac i varijabilne regione lakog lanca dobijene iz čoveka i humani IgG:Kkonstantni region pušten je u upotrebu 2002 za lečenje reumatoidnog artritisa; a puštanje u upotrebu preparata "omalizumab" (Xolair®), koji se vezuje za IgE i sprečava njegovo vezivanje za mastocite, odobreno je 2003 za lečenje odraslih i dece starije od 12 godina sa umerenom do jakom upornom astmom čiji je kožni test pozitivan ili koji pokazujuin vitroreaktivnost na alergene višegodišnjih biljaka a kod kojih inhalacija koritikosteroida ne obezbeđuje dovoljnu kontrolu simptoma.

Na ovaj način, proteinski inžinjering je primenjen u pokušaju da se smanje problemi koji

su u vezi sa imunogeošću primenjenih rekombinantnih polipeptida imunoglobulina i u pokušaju da se promene efektorske funkcije antitela. Međutim, i dalje postoje problemi. Na primer, kod većine pacijenata lečenih od kancera kod kojih je primenjen rituksimab kancer se pojavi ponovo nakon 6 do 12 meseci, a postoje izveštaji od fatalnim reakcijama na infuziju u roku 24 časa od infuzije rituksimaba. Ove fatalne reakcije pratile su infuzioni reakcioni kompleks koji uključuje

hipoksiju, pulmonalne infiltrate, sindrom akutnog poremećaja disanja, infarkt miokarda, ventrikularnu fibrilaciju ili kardiogeni šok. Takođe postoje izveštaji o akutnom otkazivanju bubrega koje zahteva dijalizu, sa slučajevima sa smrtnim ishodom, kod sindroma lize tumora nakon lečenja rituksimabom, kao i o snažnim mukokutanim reakcijama, od kojih su neke takođe imale smtran ishod. Uz to, neophodne su visoke doze rituksimaba za intravenske injekcije jer je molekul veliki, približno 150 kD, a difuzija u limfna tkiva u kojima žive mnoge ćelije tumora je ograničena.

Primena trastuzumaba može da dovede do razvoja ventrikularne disfunkcije i kongestivne srčane insuficijencije, a, prema izveštajima, učestalost pojave i ozbiljnost srčane disfunkcije je posebno visoka kod pacijenata koji su primili trastuzumab u kombinaciji sa antraciklinima i ciklofosfamidom. Primena trastuzumaba može da dovede i do snažnih reakcija preosetljivosti (uključujući i anafilaksu), infuzionih reakcija i pulmonalnih događaja.

Pacijenti koji primaju imunosupresivnu terapiju daklizumabom pod većim su rizikom od ? razvoja limfoproliferativnih poremećaja i oportunstičkih infekcija, a nije poznato da li će upotreba daklizumaba imati dugoročne efekte na sposobnost imunog sistema da odgovara na antigene koje je prvi put sreo tokom imunosupresije izazvane daklizumabom.

Takođe je prijavljena pojava hepatotoksičnosti, uključujući ozbiljnu bolest okluzije hepatične vene ("hepatic veno-occlusive disease", VOD) kod upotrebe gemtuzumaba kao pojedinačnog sredstva, kao dela režima kombinovane hemoterapije i kod pacijenata koji nemaju istoriju bolesti jetre ili transplant hematopojetičnih matičnih ćelija ("hematopoietic stem-cell transplant", HSCT). Pacijenti koji primaju gemtuzumab bilo pre bilo posle HSCT, pacijenti čija je osnovna bolest bolest jetre ili sa abnormalnom funkcijom jetre, kao i pacijenti koji primaju gemtuzumab u kombinaciji sa drugim heoterapijama mogu da budu pod povišenim rizikom od razvoja ozbiljne VOD. Postoje slučajevi smrti usled otkazivanja jetre i usled VOD kod pacijenata koji su primili gemtuzumab, te postoji i upozorenje da čak i pažljiv nadzor ne mora da otkrije sve pacijente kod kojih taj rizik postoji, ili da spreči komplikacije usled hepatotoksičnosti.

Prijavljeni su i slučajevi hepatotoksičnosti kod pacijenata koji su primali alemtuzumab. Ozbiljna, i, u nekim retkim slučajevima čak i fatalna, pancitopenija/hipoplazija srži, autoimuna idiopatska trombocitopenija i autoimuna hemolitička anemija javljale su se kod pacijenata koji su primali terapiju alemtuzumabom. Alemtuzumab može da dovede i do ozbiljnih infuzionih reakcija kao i do oportunističkih infekcija.

Kod pacijenata lečenim adalimumabom, prijavljeni su slučajevi ozbiljnih infekcija i sepse, nekad i sa smrtnim ishodom, a prijavljeno je i pojačavanje kliničkih simptoma i/ili radiografskih dokaza demijelinizujuće bolesti, dok je kod pacijenata kojima je, u kliničkim istraživanjima, davan adalimumab, promećena povećana učestalost limfoma nego što bi se očekivalo u opštoj populaciji.

Ozbiljne neželjne reakcije u kliničkim ispitivanjima omalizumaba obuhvatale su malignitet i anafilaksiju, pri čemu je uočena učestalost pojave maligniteta kod pacijenata lečenim omalizumabom (0,5%) bila numerički viša nego kod pacijenata u kontrolnim grupama (0,2%).

U pokušaju da se prevaziđu raznoliki problemi povezani sa terapijom celim imunoglobulinima napravljeni su manji molekuli imunoglobulina. Jednolančani polipeptidi fragmenata varijabilnih regiona ("single chain immunoglobulin variable region fragments"; scFv) sačinjeni su od varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina vezanog kratkim povezujućim peptidom za varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina. Hustonet al,1988Proc Natl Acad Sci USA,85: 5879 - 83. Predpostavljeno je da manja veličina scFv molekula može da dovede do bržeg uklanjanja iz plazme i efikasnijeg prodora u tkiva nego što je to slučaj sa celim imunoglobuhnima. Videti, npr. Jain, 1990Cancer Res.50: 814s - 819s. Objavljeno je da anti-tumorsko scFv pokazuje brži prodor u tumore i ravnomerniju raspodelu u masi tumora nego odgovarajuće himerno antitelo. Yokotaet al, Cacer Res.52: 3402 - 08 (1992).

Uprkos prednostima koje scFv molekuli mogu da imaju u pogledu seroterapije, postoje i problemi i u ovom terapeutskom pristupu. Na primer, brzo uklanjanje (klirens) scFV može da spreči dopremanje najmanje delotvorne doze do ciljnog tkiva. Uz to, proizvodnja dovoljnih količina scFv za primenu kod pacijenata pokazala se kao problematična zbog teškoća u ekspresiji i izolaciji scFv što negativno utiče na prinos. Tokom ekspresije, scFv molekuli nemaju dovoljnu stabilnost i često agregiraju usled sparivanja varijabilnih regiona različitih molekula. Dalje, nivoi proizvodnje scFv u sisarskim sistemima ekspresije su, prema istraživanjima, niski, što može da ograniči potencijal efikasne proizvodnje scFv molekula za terapiju. Davišet al,1990,J. Biol. Chem.265: 10410 - 18; Trauneckeret al,1991EMBO J.10: 3655 - 59. Istraživane su strategije

za poboljšanje proizvodnje i one, prema istraživanjima, uključuju dodavanje mesta za glikozilaciju u varijabilne regione. Videti, npr. SAD Patent br. 5,888,773; Jostet al,1994J. Biol. Chem.269: 26267 - 73. Još jedan problem u korišćenju scFv u terapiji leži u nedostatku efektorske funkcije. scFV molekul, kome nedostaju citolitičke funkcije, ADCC i citotoksičnost zavisna od komplementa može da bude manje delotvoran ili nedelotvoran u lečenju bolesti. Iako je tehnologija dobijanja scFv počela da se razvija pre više od 12 godina, još uvek nema scFv preparata čija je upotreba u terapiji odobrena.

Alternativno, predpostavljeno je da bi fuzijom scFv molekula sa nekim drugim molekulom, kao što je toksin, mogla da se iskoristi sposobnost scFv molekula da specifično veže antigen, kao i njegova mala veličina, za dopremanje toksina do ciljnog tkiva. Chaundrvet al.

1989,Nature339: 394; Batraet al,1991Mol Cell Biol.11: 2200. Konjugacija ili fuzija toksina za scFv je na taj način predložena kao alternativna strategija za dobijanje moćnih molekula, specifičnih za antigen, ali primena takvih konjugata ili himernih molekula može da. bude ograničena preteranom i/ili nespecifičnom toksičnošću koja potiče od ostataka toksina u takvim preparatima. Toksična dejstva mogu da uključuju povišenje koncentracije enzima jetre iznad fizioloških vrednosti i sindrom povećane vaskularne propustljivosti, kao i druge neželjene efekte.

Uz to, imunotoksini su, sami za sebe, veoma imunogeni kada se primenjuju na organizam domaćina, te antitela koja organizam domaćina proizvede protiv njih mogu da ograniče potencijalnu korist u ponavljanim terapeutskim tretmanima datog pojedinca.

Ispitivani su i fuzioni proteini kod kojih su prisutne sekvence polipeptida konstantnog regiona imunoglobulina, dok su neimunoglobulinske sekvence zamenjene varijavilnim regionima antitela. Na primer, DC4, površinski protein T ćelija koji prepoznaje HIV, rekombinantno je fuzionisan za efektorski Fc domen imunoglobulina, a IL-2-IgGl fuzioni protein je, prema istraživanjima, doveo do lize ćelija koje nose IL-2 receptor posredovane komplementom. Videti Senselet al, Chem. Immunol.65: 129 - 158 (1997). Detaljan uvod kao i obilje informacija o svim aspektima tehnologije rekombinantnih antitela mogu da se nađu u udžbeniku "Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, 1999, NY). Sveobuhvatna zbirka detalnjih laboratorijskih protokola za inžinjering antitela može da se nađe u R. Kontermann & S. Diibel, urednici, "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, Heidelberg/Nevv York, 2000).

Bolesti i poremećaji za koje se smatra da bi mogle da budu olakšane upotrebom neke vrste imunoglobulinske terapije obuhvataju kancere i poremećaje imunog sistema. Kanceri obuhvataju širok spektar bolesti, koje pogađaju približno svaku četvrtu osobu na svetu. Brza i neregulisana proliferacija malignih ćelija je glavno obeležje mnogih vrsta kancera, uključujući i hematološke malignitete. Iako su pacijenti koji pate od hematoloških malignih stanja imali koristi od napretka u razvoju terapije kancera u poslednje dve decenije, Multaniet al,1998J. Clin. Oncology,16: 3691 - 3710, a periodi remisije su se produžili, kod većine pacijenata bolest

se ponovo javi, sa smrtnim ishodom. Prepreke lečenju citotoksičnim lekovima uključuju, na primer, otpornost ćelija tumora i visoku toksičnost hemoterapije, što sprečava primenu optimalne doze kod mnogih pacijenata.

Bez obzira, pacijenti su lečeni imunoterapeuticima kojima su ciljne ćelije maligne ćelije,

t.j. antigeni koji su eksprimirani na ćelijama tumora. U pogledu izbora površinskih antigena ćelija tumora koji bi bili pogodni kao cilj za imunoterapeutike, poželjno je izabrati onaj antigen koji nije eksprimiran na normalnim tkivima, posebno u onim slučajevima u kojima je očuvanje

takvih tkiva neophodno za opstanak pacijenta. U slučaju hematoloških maligniteta, maligne ćelije eksprimiraju mnoge antigene koji se ne eksprimiraju na površini matičnih ćelija ili drugih neophodnih ćelija. Lečenje hematološkog malignog stanja korišćenjem režima terapije koji uništava i normalne i maligne ćelije hematološkog porekla bilo je prihvatljivo u onim slučajevima kod kojih može da dođe do regeneracije normalnih ćelija iz njihovih prekursora kada je terapija završena. Uz to, poželjno je da je ciljani antigen eksprimiran na svim ili skoro svim klonogeničnim populacijama ćelija tumora, a poželjno je i da se ekspresija nastavi uprkos negativnom pritisku usled primene terapije imunoglobulinima. Strategije koje podrazumevaju upotrebu selekcije idiotipa ćelijske površine (npr. datog idiotipa) kao ciljnog molekula za terapiju maligniteta B ćelija ograničene su prevelikim rastom varijanti ćelija tumora kod kojih je ekspresija površinskih idiotipova promenjena, čak i u slučajevima da antigen pokazuje visok stepen selektivnosti tumora. Markeret al,1985N. Engl. J. Med,312: 1658 - 65. Izabrani antigen treba, takođe, normalno da se kreće kada se za njega veže molekul imunoglobulina. Nakon što se imunoglobulin veže za ciljni antigen sa ćelijske površine, tumorska ćelija može da

se spase od uništenja odbacivanjem ili unošenjem u ćeliju tog antigena, čime može da se ograniči delotvornost seroterapije. Konačno, vezivanje imunoglobulina za antigene sa ćelijske površine u svrhu prenošenja ili transdukcije signala za ćelijsku aktivaciju može da dovede do poboljšanja funkcionalnih odgovora tumorskih ćelija na imunoterapiju, kao i do zaustavljanja rasta i/ili apoptoze. Iako su sve ove osobine važne, pokretanje apoptoze nakon vezivanja imunoglobulina za ciljni antigen takođe može da bude kritičan faktor za ostvarivanje uspešne seroterapije.

Antigeni koji su ispitani kao ciljni molekuli za seroterapiju maligniteta B i T ćelija obuhvataju Ig idiotipove (Brovvnet al,1999,Blood73: 651 - 61), CD19 (Hekmanet al,1991,Cancer Immunol. Immunother.32: 364 - 72), Vlasveldet al,1995,Cancer Immunol. Immunother.40: 37 - 47, CD20 (Presset al,1987Blood69: 584 - 91, Maloneyet al,1997J. Clin. Oncol15: 3266 - 74), CD21 (Scheinberget al,1990J. Clin. Oncol8: 729 - 803), CD5 (Dillmanet al,1986J. Biol Respn. Mod.5: 394 - 410) i CD52 (CAMPATH) (Pavvsonet al,1997J. Clin. Oncol.15: 2667 - 72). Među njima, korišćenjem molekula koji za cilj imaju molekulue CD20 dobijaju se bolji rezultati u lečenju maligniteta B ćelija. Drugi ciljni molekuli ograničeni su samim biološkim svoj štivima antigena. Na primer, idiotip na površini ćelije može da bude promenjen somatskom mutacijom, što omogućava ćeliji tumora da izbegne smrt: CD5, CD21 i CD 19 se brzo unose u ćeliju kada se za njih veže monoklonsko antitelo, što omogućava ćeliji tumora da izbegne uništenje osim u slučaju da je monoklonsko antitelo konjugovano sa toksinom. CD22 se eksprimira samo na površini podvrste limfoma B ćelija, što ograničava njegovu upotrebljivost, dok se CD52 eksprimira i na T i na B ćelijama pa može da dovede do kontraproduktivne imunosupresije smanjivanjem broja ćelija.

Lečenje pacijenata koji imaju slabo razvijen ili folikularni limfom B ćelija korišćenjem himernog monoklonskog antitela na CD20, prema istraživanjima, dovodi do delimičnog ili potpunog odgovora kod pacijenata. McLaughlinet al,1996Blood88: 90a (apstrakt, dodatak 1), Malonevet al,1997Blood90: 2188 - 95. Međutim, kao što je predhodno pomenuto, često se tumor vraća u roku od šest meseci do jedne godine. Neophodna su dalja poboljšanja seroterapije kako bi se dobili dugotrajniji odgovori, na primer, kod slabo razvijenog B ćelijskog limfoma, kao i da bi se obezbedilo delotvorno lečenje visoko razvijenog limfoma i drugih bolesti B ćelija.

Još jedan pristup bio je da se radioizotopi usmere ka limfomima B ćelija korišćenjem monoklonskih antitela specifičnih za CD20. Iako je, prema istraživanjima, delotvornost ovakve terapije povećana, povećava se i s njom spregnuta toksičnost odin vivopoluživota radioaktivnih antitela, što ponekad zahteva da pacijent dobije terapiju za spašavanje matičnih ćelija. Presset al,1993N. Eng. J. Med.329: 1219 - 1224; Kaminskiet al,1993N. Eng. J. Med.329: 459 - 65. Monklonska antitela na CD20 takođe su hidrolizovana dejstvom proteaza čime su dobijeni F(ab')2ili Fab fragmenti pre vezivanja za radioizotope. Ovaj postupak je, prema istraživanjima, doveo do poboljšanja prodiranja konjugata radioizotopa u tumor i do skraćenjain vivopoluživota. čime se smanjuje toksičnost za normalna tkiva. Ipak, ovim molekulima nedostaju efektorske funkcije, uključujući fiksaciju komplementa i/ili ADCC.

CD20 bio je prvi humani površinski molekul specifičan za B ćelijsku liniju koji je identifikovan pomoću monoklonskog antitela. To je neglikozilovani, hidrofobni transmembranski fosfoprotein B ćelija mase 35 kDa, čiji se i amino i karboksi terminalni kraj nalaze u citoplazmi. Einfeldet al,1988EMBO J.7: 711 - 17. Sve normalne zrele B ćelije eksprimiraju CD20, ali ga prekursori B ćelija ne eksprimiraju. Prirodni ligandi za CD20 još nisu identifikovani, a uloga CD20 u biologiji B ćelija još nije potpuno rasvetljena..

Anti-CD20 monoklonska antitela utiču na vijabilnost i rast B ćelija. Clarket al,1986Proc. Natl. Acad. Sci. USA83: 4494 - 98. Obilno ukršteno vezivnje CD20 može da prouzrokuje apoptozu kod ćelijskih linija B limfoma, Shanet al,1998Blood91: 1644 - 52, a unakrsno vezivanje CD20 na ćelijskoj površini, prema istraživanjima, pojačava i ubrzava transdukciju signala, kao što je, na primer, detektovano merenjem fosforilacije tirozina ćelijskih supstrata. Deanset al,1993J. Immunol.146: 846 - 53. Stoga, uz smanjenje broja ćelija pomoću mehanizama komplementa i ADCC, vezivanje Fc receptora od strane monoklonskih antitela na CD20in vivomože da pospeši apoptozu malignih B ćelija preko unakrsnog vezivanja CD20, što je u skladu sa teorijom da bi delotvornost terapije humanih limfoma pomoću CD20 u SCID mišjem modelu mogla da bude zavisna od vezivanja Fc receptora od strane monoklonskog antitela na CD20. Funakoshiet al,1996J. Immunotherapy19: 93 - 101. Prisustvo više domena koji prolaze kroz membranu kod polipeptida CD20 (Einfeldet al,1988EMBO J.7: 711 - 17; Stamenkovicet al,1988J. Exp. Med167: 1975 - 80; Tedderet al,1988J. Immunol.141:4388 - 4394), sprečava unošenje molekula CD20 nakon vezivanja antitela, što je prepoznato kao važna osobina za terapiju aligniteta B ćelija kada je mišje monoklonsko antitelo na CD20, 1F5, ubrizgano pacijentima sa limfomom B ćelija, što je dovelo do značajnog smanjenja broja malignih ćelija i delimičnih kliničkih odgovora. Presset al, Blood 69:584 - 91.

Zbog toga što i normalne zrele B ćelije eksprimiraju CD20 i broj normalnih zrelih B ćelija se smanjuje tokom terapije pomoću anti-CD20 antitela. Reff, M.E.et al,1994Blood83: 435 - 445. Nakon što je lečenje završeno, međutim, normalne B ćelije mogu da se regenerišu iz CD20 negativnih prekursora B ćelija; stoga pacijenti koji su lečeni pomoću anti-CD20 terapije

ne trpe značajnu imunosupresiju. Smanjenje broja normalnih B ćelija može da bude i korisno kod bolesti koje podrazumevaju neželjenu proizvodnju autoantitela ili kod drugih bolesti kod kojih je moguće da B ćelije igraju ulogu. Himerno monoklonsko antitelo specifično za CD20, koje se sastoji od varijabilnih regiona lakih i teških lanaca poreklom iz miša fuzionisanih sa konstantnim regonima teškog lanca humanog IgGl i humanog kapa lakog lanca su, kako je objavljeno, zadržala vezivanje za CD20 i sposobnost da posreduju u ADCC i da fiksiraju komplement. Liuet al,1987J. Immunol 139:3521 - 26. Mehanizam anti-tumorske aktivnosti rituksimaba, koji je predhodno razmatran, smatra se za kombinaciju nekoliko aktivnosti, uključujući ADCC, fiksaciju komplementa i pokretanje signala koji pospešuju apoptozu kod malignih B ćelija, iako velika veličina rituksimaba sprečava optimalnu difuziju tog molekula u limfna tkiva koja sadrže maligne B ćelije, što ograničava njegove anti-tumorske aktivnosti. Autoimune bolesti obuhvataju autoimune bolesti štitne žlezde, koje obuhvataju Grejvsovu bolest

i Hašimotov tirdiditis. Samo u Sjedinjenim Američkim Državama živi oko 20 miliona ljudi koji imaju neki oblik autoimune bolesti štitne žlezde. Autoimune bolesti štitne žlezde nastaju usled proizvodnje autoantitela koja ili stimulišu štitnu žlezdu izazivajući hipertiroidizam (Grejvsova bolest) ili uništavaju štitnu žlezdu izazivajući hipotiroidizam (Hašimotov tiroiditis). Stimulacija štitne žlezde nastaje usled vezivanja autoantitela i aktivacije receptora za hormon koji stimuliše štitnu žlezdu ("Thvroid - Stimulating Hormone", TSH). Razaranje štitne žlezde nastaje usled reakcije između autoantitela i drugih tiroidnih antigena. Terapija za Grejvsovu bolest Roja je trenutno u upotrebi podrazumeva hirurške intervencije, primenu radioaktivnog joda, ili primenu antitiroidnih lekova. Radioaktivni jod se često koristi, jer antitiroidni lekovi imaju značajne sporedne efekte a čest je i povratak bolesti. Hirurške intervencije čuvaju se za pacijente sa

velikom gušavošću ili za slučajeve u kojima postoji potreba za veoma brzom normalizacijom funkcije štitne žlezde. Ne postoje terapije koje za cilj imaju proizvodnju autoantitela odgovornih za stimulaciju receptora za TSH. Terapija za Hašimotov tiroiditis koja je trenutno u upotrebi je natrijum levotiroksin, a terapija je obično doživotna zbog malog rizika od povratka bolesti. Pokazano je da supresivna terapija dovodi do smanjenja gušavosti kod Hašimotovog tiroiditisa, ali nisu poznate terapije koje bi smanjile proizvodnju autoantitela kako bi se ciljao mehanizam bolesti.

Reumatoidni artritis (RA) je hronična bolest koja se odlikuje zapaljenjem zglobova, što dovodi do oticanja, bola i gubitka funkcije. RA pogađa oko 2,5 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama. RA nastaje kao posledica kombinacije događaja, uključujući prvobitnu infekciju ili povredu, abnormalni imuni odgovor i genetske faktore. Dok su autoreaktivne T ćelije i B ćelije prisutne kod RA, za postavljanje dijagnoze koristi se otkrivanje visoke koncentracije antitela koja se skupljaju u zglobovima, nazavanih reumatoidni faktor. Terapije za RA koje su trenutno u upotrebi obuhvataju mnoge lekove za ublažavanje bola i za usporavanje napredovanja bolesti. Za sada nije pronađena ni jedna terapija koja bi dovela do izlečenja. Lekovi obuhvataju nesteroidne antiinflamatorne lekove ("non-steroidal antiinflamatorv drugs", NSAID) i antireumatske lekove za modifikovanje bolesti ("disease modifving antirheumatic drugs", DMARD). NSAID su korisni kod benignih bolesti, ali nisu u stanju da spreče progresiju bolesti ka uništenju zglobova i hendikepu kod uznapredovalog RA. I NSAID i DMARD dovedeni su u vezu sa značajnim neželjenim efektima. U poslednjih deset godina odobrena je upotreba samo jednog novog DMARD, Leflunomida. Leflunomid zaustavlja sintezu autoantitela, smanjuje zapaljenje i usporava napredovanje RA. Međutim, ovaj lek takođe izaziva ozbiljne neželjene efekte koji uključuju mučninu, gubitak kose, osip i oštećenje jetre.

Sistematski eritematozni lupus ("Svstemic Lupus Ervthematosus", SLE) je autoimuna bolest koju izazivaju ponavljane povrede krvnih sudova u mnogim organima, uključujući bubrege, kožu i zglobove. Procenjuje se da od SLE pati preko 500 000 ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama. Kod pacijenata sa SLE, pogrešna interakcija T ćelija i B ćelija dovodi do proizvodnje autoantitela koja napadaju ćelijsko jezgro. Ona uključuju antitela na dvostruki lanac DNK i anti-Sm antitela. Autoantitela koja vezuju fosfolipide se takođe nalaze kod oko polovine pacijenata sa SLE, a odgovorna su za oštećenje krvnih sudova i nizak broj krvnih ćelija. Immuni kompleksi se gomilaju u bubrezima, krvnim sudovima i zglobovima pacijenata, gde izazivaju zapaljenje i oštećenje tkiva. Za sada nije pronađena terapija koja bi dovela do izlečenja bolesti. NSAID i DMARD se koriste kao terapija, u zavisnosti od razvijenosti bolesti. Plazmafereza sa zamenom plazme u svrhu uklanjanja autoantitela može da dovede do privremenog poboljšanja kod pacijenata sa SLE. Postoji opšta saglasnost da su autoantitela odgovorna za SLE, te bi nove terapije koje smanjuju broj B ćelija, što bi omogućilo imunom sistemu da počne od početka sa novim B ćelijama koje nastaju od prekursora mogle da pruže nadu za dugotrajno poboljšanje kod pacijenata sa SLE.

Sjorgenov sindrom je autoimuna bolest koja se odlikuje razaranjem žlezda koje obezbeđuju vlažnost. Sjorgenov sindrom je jedna od najrasprostranjenijih autoimunih bolesti,

koja pogađa 4 miliona ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama, prema procenama. Oko polovine ljudi pogođenih Sjorgenovim sindromom imaju i bolest vezujućeg tkiva, kao što je RA,

dok druga polovina ima primarni Sjorgenov sindrom bez drugih istovremenih autoimunih bolesti. Autoantitela, uključujući anti-nuklearna antitela, reumatoidni faktor, anti-fodrin i anti-muskarinski receptor često su prisutna kod pacijenata sa Sjorgenovim sindromom. Uobičajena terapija podrazumeva kortikosteroide, dok bi dodatne, efikasnije terapije bile veoma korisne.

Imunu trombocitopeničnu purpuru (ITP) izazivaju autoantitela koja se vezuju za krvne pločice i izazivaju njihovo uništenje. Neki slučajevi ITP izazvani su lekovima, dok su drugi u vezi sa infekcijom, trudnoćom ili autoimunom bolešću kao što je SLE. Oko polovine slučajeva klasifikovanoje kao "idiopatski", što znači daje uzrok nepoznat. Terapija ITP određuje se prema razvijenosti simptoma. U nekim slučajevima, nije potrebna nikakva terapija, iako se u većini slučajeva koriste imunosupresivni lekovi, uključujući kortikosteroide ili intravenske infuzije imunskih globulina kako bi se smanjio broj T ćelija. Druga vrsta terapije koja obično dovodi do povećanja broja pločica je uklanjanje slezine, organa koji uništava pločice obložene antitelima.

Jači imunosupresivni lekovi, uključujući ciklosporin, ciklofosfamid ili azatioprin se koriste za najozbiljnije slučajeve. Uklanjanje autoantitela propuštanjem plazme pacijenta kroz kolonu Proteina A se koristi kao druga linija terapije kod pacijenata čija je bolest veoma razvijena. Poželjne su dodatne delotvornije terapije.

Multipla skleroza (MS) je takođe autoimuna bolest. Odlikuje je zapaljenje centralnog nervnog sistema i razaranje mijelina, koji izoluje nervna vlakna u mozgu, kičmenoj moždini i organizmu. Iako je uzrok MS nepoznat, rasprostranjeno je verovanje da autoimune T ćelije najviše doprinose patogenezi ove bolesti. Međutim, visoke koncentracije antitela prisutne u cerebrospinalnoj tečnosti pacijenata sa MS, kao i neke teorije predviđaju daje odgovor B ćelija koji dovodi do proizvodnje antitela važan u nastanku ove bolesti. Nije proučavana ni jedna terapija uklanjanja B ćelija kod pacijenata sa MS i ne postoji lek za MS. Trenutno je u upotrebi terapija kortikosteroidima, koja može da smanji trajanje i ozbiljnost napada, ali ne utiče na razvoj MS tokom vremna. Nedavno je odobrena upotreba novih terapija za MS sa biotehnološkim interferonom (IFN) ali su poželjne dodatne delotvornije terapije.

Mijastenija gravis (MG) je hronični autoimuni neuromišićni poremećaj koji se odlikuje slabošću grupa voljno pokretljivih mišića. MG pogađa oko 40 000 ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama. MG izazivaju autoantitela koja se vezuju za acetilholinske receptore eksprimirane na neuromišićnim spojevima. Autoantitela smanjuju ili blokiraju acetilholinske receptore, sprečavajući prenos signala od nerava ka mišićima. Nije poznat lek za MG. Uobičajene terapije uključuju imunosupresiju kortikosteroidima, ciklosporinom, ciklofosfamidom ili azatioprinom. Cesto se koristi hirurško uklanjanje timusa kako bi se smanjio imuni odgovor. Plazmafereza, koja se koristi za smanjenje koncentracije autoantitela u krvi, delotvorna je u slučaju MG, ali je kratkog veka zbog toga što se proizvodnja autoantitela nastavlja. Plazmafereza se najčešće primenjuje samo kod pacijenata sa veoma izraženom slabošću mišića, pre hirurške intervencije. Nove i delotvorne terapije bi bile od koristi.

Psorijaza pogađa približno pet miliona ljudi, a odlikuje je autoimuno zapaljenje kože. Psorijaza se javlja zajedno sa artritisom kod 30% pacijenata (psorijazni artritis). Koriste se mnoge terapije, uključujući steroide, retenoide UV zraka, derivate vitamina D, ciklosporin, metotreksat, ali je jasno da bi korisno bilo pronaći nove i delotvorne terapije za psorijazu. Skleroderma je hronična autoimuna bolest koja se odlikuje preteranom sintezom kolagena, što dovodi do zadebljanja kože. Približno 300 000 ljudi u Sjedinjenim Američkim Državama pati od skleroderme, te bi bilo od koristi pronaći nove i delotvorne terapije i za nju.

Postoji jasna potreba za poboljšanim preparatima i postupcima za lečenje maligniteta, uključujući malignitete B ćelija i poremećaja, uključujući autoimune bolesti, poremećaje i stanja,

kao i drugih bolesti, poremećaja i stanja... Preparati i postupci predmetnog pronalaska koji su ovde opisani i podvedeni pod obim zaštite patentnih zahteva obezbeđuju takve poboljšane preparate i postupke, kao i druge prednosti.

Kratak opis pronalaska

Predmetni pronalazak u svom rešenju obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji sadrži polipetid vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za imunoglobulinski region šarke ili polipetid regiona koji se ponaša kao region šarke, koji je, s druge strane, fuzionisan ili na drugi način vezan za region koji sadrži jedan ili više nativnih konstantnih regiona ili konstantih regiona dobijenih inžinjeringom iz teškog lanca imunoglobulina, koji nije CH1, na primer, CH2 i CH3 regione IgG i IgA, ili CHS i CH4 regione IgE. Fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina dalje sadrži region koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, polipeptida konstatnog regiona CH2 imunoglobulinskog teškog lanca (ili CH3 u slučaju konstrukta izvedenog, potpuno ili delimično, iz IgE), nativnog ili dobijenog inžinjeringom, koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke i polipeptid CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina (ili CH4 u slučaju konstrukta izvedenog, potpuno ili delimično, iz IgE), nativnog ili dobijenog inžinjeringom. Takvi fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina sposobni su za bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela i fiksacije komplementa. Takvi polipeptidi vezujućih domena sposobni su i za vezivanje ili specifično vezivanje za ciljni molekul, na primer, za ciljni antigen.

U nekim rešenjima, polipeptid vezujućeg domena sadrži bar jedan polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina izabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom, i/ili polipeptida varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom. U nekim daljim rešenjima, fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina sadrži polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativan ili dobijen inžinjeringom, gde je polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina dobij en inžinjeringom (ili polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz neke druge vrste, dobijen inžinjeringom) koji sadrži mutaciju, supstituciju ili deleciju amino kiseline(a) na poziciji koja odgovara bilo kojoj ili bilo kojim aminokiselinskim pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od pozicija 9, 10, 11, 12, 108 i/ili 112. Mutacije, supstitucije ili delecije amino kiseline(a) na poziciji koja odgovara bilo kojoj ili bilo kojim aminokiselinskim pozicijama izabranim iz grupe koja se sastoji od pozicija 9, 10, 11, 12, 108 i/ili 112 u varijabilnom regionu teškog lanca mogu da budu obuhvaćene konstruktom kao što je konstrukt koji odgovara, na primer, sekvenci čiji je ID broj: . U nekim drugim daljim rešenjima, fuzioni protein sadrži polipeptid čija je sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od sekvence čiji je ID broj i sekvence čiji je ID broj . U nekim rešenjima, polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina dobijen je iz, na primer, humanog imunoglobulina, a u nekim drugim rešenjima polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina sadrži polipeptidnu sekvencu humanizovanog imunoglobulina. U nekim rešenjima, polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina, bez obzira da li je ili nije humanizovan, dobijen je iz mišjeg imunoglobulina, ili je dobijen iz imunoglobulina neke gruge vrste, uključujući, na primer, pacova, svinju, majmuna ili pripadnike porodice kamelida.

Prema nekim rešenjima predmetnog pronalaska, polipeptid vezujućeg regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) bar jednog polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom; (b) bar jednog polipeptida varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom; i (c) bar jednog povezujućeg (linker) polipeptida koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipetid iz (a) i polipetid iz (b). U određenim daljim rešenjima, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, dobijeni su ili konstruisani iz humanih imunoglobulina, dok u određenim drugim rešenjima povezujući polipetid sadrži bar jedan polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu ili čija je aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (sekvenca čiji je ID broj: ). U drugim rešenjima povezujući polipeptid sadrži bar dva ili tri ponovka peptida čija je aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (sekvenca čiji je ID broj: ). U drugim rešenjima, povezujući polipeptid sadrži i mesto za glikozilaciju, koje je u određenim daljim rešenjima mesto za glikozilaciju vezano za asparagin, O- vezano mesto za glikozilaciju, mesto za C-manozilaciju, mesto za glipijaciju, ili mesto za fosfoglikaciju. U još jednom rešenju bar jedan

od polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijnog inžinjeringom, i polipeptida CHS konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom dobijeni su iz IgG ili IgA teških lanaca humanih imunoglobulina. U još jednom rešenju, bar jedan od polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom, i polipeptida CH4 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativnog ili dobijenog inžinjeringom dobijeni su iz IgE teškog lanaca humanog imunoglobulina.

Peptid regiona šarke imunoglobulima može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji

od, na primer, bilo kog od (1) bilo kog peptida regiona šarke ili regiona koji se ponaša kao region šarke koji se javlja u prirodi, na primer, polipeptida regiona šarke humanog imunoglobulina koji uključuje, na primer, region šarke divljeg tipa humanog IgG ili njegov deo, region šarke divljeg

tipa humanog IgA ili njegov deo, region šarke divljeg tipa humanog IgD ili njegov deo, ili region koji se ponaša kao region šarke divljeg tipa humanog IgE t.j., IgE CH2, ili njegov deo, region šarke divljeg tipa kamelida ili njegov deo (uključujući region šarke IgGl lame ili njegov deo, region šarke IgG2 lame ili njegov deo i region šarke IgG3 lame ili njegov deo), region šarke ajkuleGinglymostoma cirratumili njegov deo i/ili region šarke ribeHydrolagus collieiili njegov deo; (2) mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen polipeptid regiona šarke koji ne sadrži ostatke cisteina a koji je dobijen ili konstruisan iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima jedan ili više cisteinskih ostataka; (3) mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen polipeptid regiona šarke koji sadrži jedan cisteinski ostatak a koji je dobijen ili konstruisan iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima jedan ili više cisteinskih ostataka; (4) polipeptid regiona šarke koji je mutiran ili na drugi način promenjen ili dobijen inžinjeringom tako da sadrži jedno ili više mesta za glikozilaciju, na primer, mesto za glikozilaciju vezano za asparagin, O- vezano mesto za glikozilaciju, mesto za C-manozilaciju, mesto za glipijaciju, ili mesto za fosfoglikaciju; (5) mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen polipeptid regiona šarke kod kojeg je broj cisteinskih ostataka smanjen aminokiselinskom supstitucijom ili delecijom, na primer, mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen region šarke IgGl ili IgG4 koji sadrži, na primer, nula, jedan ili dva cisteinska ostatka, mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen region šarke IgG2 koji sadrži, na primer, nula, jedan, dva ili tri cisteinska ostatka, mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen region šarke IgG3 koji sadrži, na primer, nula, jedan, dva, tri, ili od četiri do deset cisteinskih ostataka, ili mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen region šarke humanog IgAl ili IgA2 koji sadrži nula ili samo jedan ili dva cisteinska ostatka (npr. "SCC" region šarke), mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen region šarke IgD koji ne sadrži cisteinske ostatke, ili mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen region koji se ponaša kao region šarke humanog IgE, t.j., polipeptid CH2 regiona IgE koji sadrži nula ili samo jedan, dva, tri ili četiri cisteinska ostatka, ili (6) bilo koji region povezujućeg molekula koji je ovde opisan ili referenciran ili na drugi način poznat ili za koji je kasnije otkriveno daje koristan za povezivanje susednih imunoglobulinskih domena kao što su, na primer, CH1 domen i CH2 domen. Na primer, polipeptid regiona šarke može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od: (i) polipeptida regiona šarke divljeg tipa humanog IgGl imunoglobulina, na primer, (ii) mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen polipeptid regiona šarke humanog IgGl ili nekog drugog imunoglobulina koji je dobijen ili konstruisan iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima tri ili više ostataka cisteina, gde dotični imitirani polipeptid regiona šarke humanog IgGl ili nekog drugog imunoglobulina sadrži dva ostatka cisteina a gde prvi cistein regiona šarke divljeg tipa nije mutiran, (iii) mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen polipeptid regiona šarke IgGl ili nekog drugog imunoglobulina koji je dobijen iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima tri ili više ostataka cisteina, gde dotični mutirani polipeptid regiona šarke humanog IgGl ili nekog drugog imunoglobulina sadrži ne više od jednog cisteinskog ostatka, i (iv) mutiran ili na drugi način promenjen ili inžinjeringom dobijen polipeptid regiona šarke IgGl ili nekog drugog imunoglobulina koji je dobijen iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima tri ili više ostataka cisteina, gde dotični mutirani polipeptid regiona šarke humanog IgGl ili nekog drugog imunoglobulina ne sadrži cisteinske ostatke. U određenim rešenjima, na primer, polipeptid regiona šarke imunoglobulina je mutiran ili na drugi način promenjen ili dobijen inžinjeringom polipeptid regiona šarke koji pokazuje smanjenu sbosobnost da dimerizuje, u odnosu na polipeptid regiona šarke divljeg tipa humanog imunoglobulina G ili polipeptid drugog divljeg tipa regiona šarke ili polipeptid koji se ponaša kao region šarke.

Polipeptidi konstantnih regiona teških lanaca imunoglobulina mogu da budu, na primer, CH2 i CH3 domeni, nativni ili dobijeni inžinjeringom, izotipa koji je humani IgG ili humani IgA. Polipeptidi konstantnih regiona teških lanaca imunoglobulina takođe mogu da budu, na primer, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi CH3 i CH4 konstantnih regiona teškog lanca izotipa koji je humani IgE.

U određenim drugim rešenjima, ciljni molekul ili ciljni antigen može da bude, na primer, CD19 (antigen CD19 B limfocita, koji se još naziva i površinski antigen B4 B limfocita, ili Leu-12), CD20 (antigen 20 B limfocita, koji se još naziva i površinski antigen BI B limfocita, Leu-16 ili Bp35), CD22 (CD22 receptor B ćelija, koji se naziva još i Leu-14, molekul ćelijske adhezije B limfocita ili BL-CAM), CD37 (leukocitni antigen 37), CD40 (CD40 površinski antigen B ćelija, koji se naziva još i peti član superfamilije receptora faktora nekroze tumora, CD40L receptor ili-Bp50), CD80 (CD80 antigen aktivacije T limfocita, koji se još naziva i antigen aktivacije B7-1, B7, B7-1 ili BB1), CD86 (CD86 antigen aktivacije T limfocita, koji se još naziva i antigen aktivacije B7-2, B70, FUN-1 ili BU63), CD137 (koji se još naziva i deveti član superfamilije receptora faktora nekroze tumora), CD152 (koji se naziva još i protein 4 citotoksičnih T limfocita ili CTLA-4), CD45 (zajednički antigen leukocita, koji se naziva još i L-CS, T200 i E.C. 3.1.3.48), CD45RA (izoforma CD45, kao i antigen eksprimiran na naivnim ili nezrelim limfocitima), CD45RB (izoforma CD45), CD45RO (izoforma CD45 i zajednički antigen leukocita eksprimiran na memorijskim B i T ćelijama), L6 (LG antigen vezan za tumore, koji se naziva još i prvi član superfamilije transmembranskih 4, površinski marker komponenti membrane 1 ili M3S1), CD2 (CD2 površinski antigen T ćelija, koji se naziva još i Tll/Leu-5 površinski antigen T ćelija, LFA-2, receptor LFA-3, receptor eritrocita ili Rozet receptor), CD28 (CD20 homodimerni površinski protein specifičan za T ćelije, koji se još naziva i Tp44),.CD30

(CD30 antigen aktivacije limfocita, poznat i kao osmi član superfamilije receptora faktora nekroze tumora, receptor CD30L ili Ki-1), CD50 (koji se naziva još i molekul međućelijske adhezije 3 (ICAM3) ili ICAM-R), CD54 (koji se naziva još i molekul međućelijske adhezije 1 (ICAM1) ili receptor rinovirusa glavne grupe), B7-H1 (ligand za imunoinhibitorni receptor koji eksprimiraju aktivirane T ćelije, B ćelije i mijeloidne ćelije, koji se naziva još i PD-L1; videti Donget al,"B7-H1 a third member of the B7 familv, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion", 1999,Nat. Med.5: 1365 - 1369), CD134 (koji se naziva još i četvrti član superfamilije receptora faktora nekroze tumora, OX40, receptor OX40L, ACT35 antigen ili receptor TAX-transkripciono aktiviranog glikoproteina 1), 41BB (receptor 4-1BB Uganda, antigen 4-1BB T ćelija, ili ILA antigen T ćelija), CD153 (koji se naziva još i osmi član

? superfamilije receptora faktora nekroze tumora, CD30 ligand ili CD30-L), CD 154 (koji se naziva još i peti član superfamilije receptora faktora nekroze tumora, CD40 ligand, CD40-L, aktivacioni protein srodan TNF, TRAP ili Gp39 antigen T ćelija), ICOS (inducibilni kostimulator), CD3 (jedan ili više od delta, epsilon, gama, eta i/ili zeta lanaca, sam ili u kombinaciji), CD4 (CD4 površinski glikoprotein T ćelija, koji se naziva još i T4/Leu-3 površinski antigen T ćelija), CD25 (koji se naziva još i alfa lanac receptora Interleukina-2, alfa podjedinica IL-2 receptora, p55 ili Tac antigen), CD8a (alfa lanac CD8 površinskog glikoproteina T ćelija, koji se naziva još i antigen diferencijacije T limfocita, T8/Leu-2 i Lyt-2), CDllb (koji se naziva još i alfa-M integrin, alfa podjedinica MAC-1 glikoproteina ćelijske površine, alfa lanac CR-3, Mol receptor adhezije leukocita, ili receptor lepljenja neutrofila), CD14 (CD14 antigen diferencijacije monocita, koji se još naziva i leucinom bogati glikoprotein specifičan za mijeloidne ćelije ili LPS receptor), CD56 (koji se naziva još i adhezioni molekul 1 neuralnih ćelija), ili CD69 (koji se još naziva i rani p60 antigen aktivacije T ćelija, Gp32/28, Leu-23, MLR-3, molekul indukcije aktivacije ili AIM) i faktori TNF (na primer, TNF-ot). Navedena lista ciljnih molekula za konstrukte i/ili ciljnih antigena data je samo kao primer i nije konačna.

U još jednoj vrsti rešenja, predmetni pronalazak uključuje vezujući konstrukt (ili polinukleotid koji kodira takav konstrukt) koji obuhvata vanćelijski domen CD 154, ili njegov željeni funkcionalni deo. U jednom rešenju ovakve vrste, na primer, vezujući konstrukt obuhvata vanćelijski domen CD154 koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za drugi vezujući domen. Drugi vezujući domen, na primer, može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od bar jednog polipeptida varijabilnog regiona imunoglobulina. Taj, bar jedan polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina može da bude nativni ili inžinjeringom dobijeni scFv. Nativni ili inžinjeringom dobijeni scFv može da bude nativni ili inžinjeringom dobijeni scFv koji je ovde opisan ili imenovan. Drugi vezujući domen, uključujući nativni ili inžinjeringom dobijeni scFv, može da bude domen koji se vezuje, na primer, za bilo koji od ciljnih molekula, uključujući ciljne antigene, koji su ovde opisani ili imenovani, uključujući ali se ne ograničavajući na, na primer, bilo koji od B7-H1, ICOS, L6, CD2, CD3, CD8, CD4, CDllb, CD14, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD45, CD50, CD54, CD56, CD69, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD153 ili CD154.

U još jednom rešenju polipeptid vezujućeg domena sadrži vanćelijski domen CTLA-4, ili njegov željeni funkcionalni deo, dok je u daljim rešenjima bar jedan od polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina izabran između polipeptida CH2 konsntantnog regiona i polipeptida CH3 konstantnog regiona polipeptid humanog konstantnog regiona IgGl, nativan ili dobijen inžinjeringom.

U još jednom daljem rešenju bar jedan od polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, izabran između polipeptida CH2 konsntantnog regiona i polipeptida CH3 konstantnog regiona, je polipeptid humanog konstantnog regiona IgA, nativan ili dobijen inžinjeringom.

U još jednom daljem rešenju bar jedan od polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, izabran između polipeptida CH3 konsntantnog regiona i polipeptida CH4 konstantnog regiona, je polipeptid humanog konstantnog regiona IgE, nativan ili dobijen inžinjeringom.

Okrećući se još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina; (b) polipeptid CH2 (ili IgE CH3) konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativan ili dobijen inžinjeringom, koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke; i (c) polipeptid CH3 (ili IgE CH4) konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, nativan ili dobijen inžinjeringom, koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid CH2 (ili IgE CH3) konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, gde (1) vezujući domen sadrži vanćelijski domen CTLA-4, ili njegov deo, koji je u stanju da specifično veze bar jedan od CTLA-4 liganada izabranih iz grupe koja se sastoji od CD80 i CD86; (2) polipeptid regiona šarke imunoglobulina može da bude onakav kao što je opisano predhodno ili ovde i može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgGl i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 regiona humanog IgE, (3) polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgGl i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgE (4) polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgGl i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH4 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgE (5) je fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina u stanju da pokrene bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, CDC i fiksacije komplementa. U daljem rešenju, fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina u stanju je da pokrene dve imunološke aktivnosti izabrane iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, CDC i fiksacije komplementa.

U još jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg regiona koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde dotični polipeptid regiona šarke može da bude kao što je opisano predhodno ili ovde, a može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, nativnog ili inžinjeringom dobijenog IgE regiona koji se ponaša kao region šarke, t.j., polipeptid CH2 regiona IgE; (b) prvi nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke, gde dotični nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona humanog IgE, i (c) drugi nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za prvi nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid konstantnog regiona, gde dotični nativni ili inžinjeringom dobijeni drugi polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH4 konstantnog regiona humanog IgE i gde je (1) fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina u stanju da pokrene bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela i pokretanja mehanizma alergijskog odgovora i (2) polipeptid vezujućeg domena u stanju da veže ili specifično veže antigen. U daljem rešenju antigen je antigen tumora.

U određenim drugim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde je polipeptid vezujućeg domena u stanju da veže ili specifično veže bar jedan antigen koji je prisutan na efektorskoj ćeliji imunog sistema i gde polipeptid regiona šarke može da bude kao što je opisano predhodno ili ovde, i može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgGl i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona koji se ponaša kao region šarke humanog IgE, t.j. polipeptid CH2 regiona IgE; (b) prvog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke, gde dotični prvi nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona humanog IgG i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona humanog IgE; (c) drugog nativnog ili inžinjerjngom dobijenog polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za prvi polipeptid konstantnog regiona, gde dotični drugi polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CHS konstantnog regiona humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CHS konstantnog regiona humanog IgG i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH4 konstantnog regiona humanog IgE; i (d) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida domena sidra u plazminoj membrani. U jednom primeru ovog rešenja, polipeptid domena sidra u plazminoj membrani vezan je za membranu preko nativne ili inžinjeringom dobijene glikozil-fosfatidilinozitol- veze. U daljem rešenju, polipeptid domena sidra u plazminoj membrani sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida transmembrahskog domena. U još jednom daljem rešenju, polipeptid domena sidra u plazminoj membrani sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida transmembranskog domena i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida citoplazmatskog repa. U još daljem rešenju polipeptid citoplazmatskog repa sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativne ili inžinjeringom dobijene polipeptidne sekvence signala za apoptozu, koja je, u još daljem rešenju, dobijena ili konstruisana iz nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida receptora domena smrti, domena smrti, ili njegovog funkcionalnog dela. U daljem rešenju, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid domena smrti sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od ITIM domena ("immunoreceptor Tyr-based inhibition motif, inhibicioni motiv imunoreceptora zasnovan na tirozinu), ITAM domena ("immunoreceptor Tyr-based activation motif, aktivacioni motiv imunoreceptora zasnovan na tirozinu), TRAF, RIP, CRADD, FADD ("Fas-associated death domain", domen smrtni vezan za Fas), TRADD ("Tumor Necrosis Factor receptor type 1 associated DEATH domain protein", protein domena smrti vezan za receptor faktora nekroze tumora tipa 1), RAIDD (koji se još nazivai RAID), CD95 (šesti član superfamilije receptora faktora nekroze tumora, koji se još naziva i FASL receptor, površinski FAS antigen koji posreduje u apoptozi, FAS i Apo-1 antigen), TNFR1 i/ili DR5 (death receptor 5, receptor smrti 5). U još jednom rešenju, nativna ili inžinjeringom dobijena sekvenca polipeptida za signalizaciju apoptoze sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, polipeptidne sekvence dobijene iz nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida kapsaze koji je kaspaza-3 ili kaspaza-8 ili kaspaza-10, uključujući kapsaza 8/FLICE/MACH/Mch5 i kapsaza 10/Flice2/Mch4. U još jednom rešenju, polipeptid domena sidra u plazminoj membrani sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, nativne ili inžinjeringom dobijene polipeptidne sekvence glikozil-fosfatidilinozitol- veze. U još jednom rešenju, antigen koji je prisutan na efektorskoj ćeliji imunog sistema je, na primer, CD2, CD 16, CD28, CD30, CD32, CD40, CD50, CD54, CD64, CD80, CD86, B7-H1, CD134, CD137, CD152, CD153, CD154, ICOS, CD19, CD20, CD22, CD37, L6, CD3, CD4, CD25, CD8, CDllb, CD14, CD56 ili CD69. U još jednom rešenju, humani IgG je nativni ili inžinjeringom dobijeni humani IgGl. Ovi fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina, mogu da budu u stanju da pokrenu, na primer, bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, fiksacije komplementa i CDC i u stanju su da vežu ili specifično vežu ciljni molekul, uključujući, na primer, ciljni antigen. U drugim rešenjima, fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina mogu da budu u stanju da pokrenu, na primer, dve imunološke aktivnosti izabrane iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, fiksacije komplementa i CDC i u stanju su da vežu ili specifično vežu ciljni molekul. Efektorske ćelije imunog sistema uključuju, na primer, granulocite, mastocite, monocite, makrofage, dendritske ćelije, neutrofile, eozinofile. bazofile, NK ćelije, T ćelije (uključujući Thl ćelije, Th2 ćelije, Tc ćelije, memorijske T ćelije, nulte ćelije i velike granularne limfocite, itd.) i B ćelije. Ovo rešenje predmentog pronalaska dalje uključuje upotrebu takvih proteina u terapiji i, na primer, upotrebu takvih vektora zain vivoiex vivogenske terapije. Predhodno navedene liste sastojaka i ciljnih molekula nisu konačne i mogu da obuhvataju bilo koji željeni ciljni molekul ili sastojak koji može da se ponaša, ili da bude koristan u svrhe, kao što je ovde opisano.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje protein koji ima prvi proteinski motiv koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od. (1) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke imunoglobulina ili regiona koji se ponaša kao region šarke imunoglobulina (npr. IgE CH2) koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za (2) nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstantnog regiona (ili nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona IgE). Dati prvi proteinski motiv može da bude fuzionisan ili na drugi način vezan za jedan ili više drugih takvih prvih proteinskih motiva čineći drugi proteinski motiv, pri čemu drugi proteinski motiv može da bude fuzionisan ili na drugi način vezan za (3) nativni ili inžinjeringom dobijeni CH3 konstantni region (ili nativni ili inžinjeringom dobijeni CH4 konstantni region IgE) čineći treći proteinski motiv. Dati prvi, drugi ili treći proteinski motivi mogu da budu fuzionisani ili na drugi način vezani za jedan ili više ovde opisanih nativnih ili inžinjeringom dobijenih polipeptida domena sidra u plazminoj membrani, uključujući, na primer, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid transmembranskog domena, i nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid transmembranskog domena i nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid citoplazmatskog repa, kao što .je, na primer, nativna ili inžinjeringom dobijena polipeptidna sekvenca signala za apoptozu, koja može da bude dobijena ili konstruisana iz nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida receptora za domen smrti, domena smrti ili funkcionalnog dela bilo kog od ova dva polipeptida. Stoga, protein ili polinukleotid u okviru ove vrste rešenja predmetnog pronalaska, može da bude, na primer, konstrukt region šarke- CH2 - CH3 - transmembranski domen - domen smrti. On može da bude i, na primer, konstrukt (region šarke - CH2)X- CHS - transmembranski domen - domen smrti, gde je X od 2 do oko 5, ili broj koji je potreban da bi se postigla željena dužina za obavljanje funkcija vezivanja receptora Fc i/ili fiksacije komplementa. Ovo rešenje predmetnog pronalaska takođe obuhvata polinukleotide koji kodiraju ovakve proteine, vektore koji sadrže takve polinukleotide i ćelije domaćine koje sadrže takve polinukleotide i vektore. Ovo rešenje predmentog pronalaska dalje obuhvata upotrebu takvih proteina u terapiji, kao i, na primer, upotrebu takvih polinukleotida i/ili vektora zain vivoiex vivogenske terapije. Predmetni pronalazak obezbeđuje, u još jednom rešenju, fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde je polipeptid vezujućeg domena u stanju da veže ili specifično veže bar jedan antigen koji je prisutan na površini ćelije kancera i gde polipeptid regiona šarke može da bude kao što je opisano predhodno ili ovde i može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgG i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida koji se ponaša kao region šarke humanog IgE, t.j. polipeptida IgE CH2 regiona; (b) prvog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke, gde dotični prvi polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida koji je nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstantnog regiona humanog IgA, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstantnog regiona humanog IgG ili nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgE; i (c) drugog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za prvi polipeptid konstantnog regiona, gde dotični drugi polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida koji je nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CHS konstantnog regiona humanog IgA, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CHS konstantnog regiona humanog IgG ili nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH4 konstantnog regiona humanog IgE. U daljem rešenju, polipeptidi humanog IgG su nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi humanog IgGl.

U još jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde dati polipeptid regiona šarke može da bude, kao što je opisano predhodno ili ovde i može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, polipeptida regiona šarke humanog IgA koji je divlji tip ili je dobijen inžinjeringom; (b) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstatnog regiona teškog lanca koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke, gde dati nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstatnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona humanog IgA; i (c) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CHS konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstatnog regiona, gde nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, polipeptida koji je (i) polipeptid CH3 konstantnog regiona divljeg tipa humanog IgA ili drugi region IgA, koji je poželjno da bude human ili humanizovan, koji je u stanju da se veže za J lanac, (ii) mutirani, promenjeni ili na drugi način inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgA koji, na primer, nije u stanju da se veže za J lanac, gde je (1) fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina sposoban za bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, CDC i fiksacije komplementa, i (2) polipeptid vezujućeg domena u stanju da se veže ili specifično veže za ciljni molekul kao što je, na primer, antigen. U određenim daljim rešenjima mutirani polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgA koji nije u stanju da se veže za J lanac je (i) polipeptid koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od aminokiselinske sekvence prednstavljene u sekvenci čiji je ID broj: , ili (ii) polipeptid koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od aminokiselinske sekvence-predstavljene u sekvenci čiji je ID broj: . U drugim rešenjima, polipeptid regiona šarke IgA je nativan ili inžinjeringom dobijeni polipeptid regiona šarke IgAl ili nativan ili inžinjeringom dobijeni polipeptid regiona šarke IgA2. U nekim drugim rešenjima, polipeptid regiona šarke IgA je različit od divljeg tipa polipeptida regiona šarke IgAl ili IgA2 usled, na primer, promene, supstitucije, ili delecije jednog ili više cisteinskih ostataka iz okvira datog divljeg tipa regiona šarke.

U određenim drugim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina; (b) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konsntantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke, gde nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona lame koji je nativni ili inžinjeringom dobijeni CH2 konstantni region IgGl lame, nativni ili inžinjeringom dobijeni CH2 konstantni region IgG2 lame, ili nativni ili inžinjeringom dobijeni CH2 konstantni region IgG3 lame; i (c) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstantnog regiona, gde dati nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona lame koji je izabran iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog CH3 konstantnog regiona IgGl lame, nativnog ili inžinjeringom dobijenog CH3 konstantnog regiona IgG2 lame i nativnog ili inžinjeringom dobijenog CHS konstantnog regiona IgG3 lame gde je (1) fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina sposoban za bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, fiksacije komplementa i CDC, i (2) polipeptid vezujućeg domena u stanju da se veže ili specifično veže za ciljni molekul, na primer, za ciljni antigen. U daljem rešenju polipeptid regiona šarke imunoglobulina, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH2 konstantnog regiona lame i nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CHS konstantnog regiona lame sadrže sekvence dobijene iz nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida IgGl lame a fuzioni protein ne sadrži nativni ili inžinjeringom dobijeni CH1 konstantni region IgGl lame. U određenim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje bilo koji od predhodno opisanih fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina u kome je polipeptid regiona šarke mutiran, dobijen inžinjeringom ili na bilo koji drugi način promenjen tako da sadrži mesto za glikozilaciju, koje je u određenim daljim rešenjima mesto za glikozilaciju vezano za asparagin,

O- vezano mesto za glikozilaciju, mesto za C-manozilaciju, mesto za glipijaciju ili mesto za fosfoglikaciju.

U određenim rešenjima predmetnog pronalaska obezbeđeni su bilo koji od predhodno ili ovde opisanih vezujućih konstrukta, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, gde vezujući region ili peptid vezujućeg regiona sadrži dve ili više polipeptidne sekvence vezujućeg domena gde je svaka od polipeptidnih sekvenci vezujućeg regiona u stanju da veže ili specifično veže ciljni(e) molekul(e) kao što je(su) antigen(i), pri čemu antigen(i) mogu da budu isti ili mogu da budu različiti. Nativni, ili, poželjnije, inžinjeringom dobijeni region šarke IgD je poželjan povezujući region između vezujućih regiona bispecifičnog molekula predmetnog pronalaska, t.j. onog koji ima dva ili više vezujućih domena, a poželjno je da ima dva. Humani region šarke divljeg tipa IgD ima jedan cistein koji gradi disulfidnu vezu sa lakim lancem u nativnoj strukturi IgD. Poželjno je da ovaj cistein u regionu šarke humanog IgD bude mutiran ili deliran, kako bi se ovaj region koristio kao povezujući region između vezujućih domena, na primer, bispecifičnog molekula. Druge zamene amino kiselina ili delecije ili promene u regionu šarke IgD koje ne dovode do neželjene nefleksibilnosti regiona šarke spadaju u obim zaštite predmetnog pronalaska. Nativni ili inžinjeringom dobijeni regioni šarke IgD drugih vrsta takođe su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska, kao što je slučaj i sa humanizovanim nativnim ili inžinjeringom dobijenim regionima šarke IgD iz drugih vrsta. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje, u određenim rešenjima, fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde polipeptid regiona šarke može da bude kao što je opisano predhodno ili ovde, i može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, na primer, alternativne sekvence polipeptida regiona šarke; (b) prvi nativni ili inžinjeringom dobijeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina, kao što je polipeptid CH2 konstantnog regiona IgG ili IgA (ili polipeptid CH3 konstantnog regiona IgE) koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke; i (c) drugi nativni ili inžinjeringom dobijeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina, kao što je polipeptid CH3 konstantnog regiona IgG ili IgA (ili polipeptid CH4 konstantnog regiona IgE) koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid prvog konstantnog regiona, gde je (1) fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina sposoban za bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, CDC i fiksacije komplementa, i (2) polipeptid vezujućeg domena u stanju da se veže ili specifično veže za ciljni molekul, kao što je antigen.

U još jednom rešenju obezbeđen je fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde je polipeptid vezujućeg domena u stanju da se veže ili specifično veže za bar jedan ciljni molekul, kao što je antigen, koji je prisutan na površini ćelije kancera i gde polipeptid regiona šarke može da bude kao što je opisano predhodno ili ovde i može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od alternativne polipeptidne sekvence regiona šarke; (b) prvog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke, gde dotični polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona humanog IgA, nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona humanog IgG i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona humanog IgE; i (c) drugog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za prvi polipeptid konstantnog regiona, gde drugi polipeptid konstantnog regiona sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida koji je nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgA, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgG ili nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH4 konstantnog regiona humanog IgE. U određenim daljim rešenjima alternativna polipeptidna sekvenca regiona šarke sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptidne sekvence od bar deset kontinualnih aminokiselinskih ostataka koji su prisutni u sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi od do .

U određenim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotide ili vektore (uključujući vektore za kloniranje i ekspresione vektore) ili transformisane ili transficirane ćelije, uključujući izolovane ili prečišćene ili čiste polinukleotide, vektore i izolovane transformisane ili transficirane ćelije, koji kodiraju ili sadrže bilo koji od predhodno ili ovde opisanih polipeptida ili proteinskih konstrukta predmetnog pronalaska, na primer, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina. Na taj način, u različitim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje konstrukt za rekombinantno kloniranje ili ekspresioni konstrukt, koji sadrži bilo koji polinukleotid koji je operativno vezan za promoter.

U drugim rešenjima obezbeđena je ćelija domaćin transformisana ili transficirana, ili koja na drugi način sadži, bilo koji takav konstrukt za rekombinantno kloniranje ili ekspresioni konstrukt. Ćelije domaćini uključuju ćelije pacijenta koji je podvrgnutex vivoćelijskoj terapiji, uključujući, na primer,ex vivogensku terapiju.

U srodnom rešenju obezbeđen je postupak proizvodnje polipeptida ili proteina ili drugog konstrukta predmetnog pronalaska, na primer, uključujući fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji podrazumeva korake (a) gajenja ćelije domaćina u kulturi kao što je opisano ili predviđeno ovde pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju konstrukta, na primer, fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina; i (b) izolovanja konstrukta, na primer, fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina iz ćelije domaćina ili kulture ćelije domaćina.

U još jednom rešenju obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži bilo koji od predhodno ili ovde opisanih polipeptida ili proteina ili drugih konstrukta predmetnog pronalaska, na primer (uključujući, na primer, fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina), u kombinaciji sa fiziološki prihvatljivim nosiocima.

U još jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži, na primer, izolovani, prečišćeni ili čist polinukleotid koji kodira bilo koji od polipeptidnih ili proteinskih konstrukta predmetnog pronalaska, na primer (uključujući, na primer, fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina) u kombinaciji sa fiziološki prihvatljivim nosiocima, ili, na primer, u kombinaciji sa, ili u dostavnom vehikulimu ili vektoru genske terapije.

U još jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja pacijenta koji pati od ili za koga se sumnja da pati od malignog stanja ili poremećaja B ćelija, koji podrazumeva primenu terapeutski delotvorne količine bilo kog od farmaceutskih preparata koji su ovde opisani ili podvedeni pod obim zaštite patentnih zahteva.

U određenim daljim rešenjima maligno stanje ili poremećaj B ćelija je limfom B ćelija ili leukemija B ćelija, ili bolest koja se odlikuje proizvodnjom autoantitela, dok je u određenim drugim daljim rešenjima poremećaj B ćelija, na primer, reumatoidni artritis, mijastenija gravis, Grejvsova bolest, dijabetes melitus tipa I, multipla skleroza ili autoimuna bolest. U određenim drugim rešenjima maligno stanje je, na primer, melanom, mijelom, gliom, astrocistom, limfom, leukemija, karcinom ili sarkom, i tako dalje.

U drugom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) polipeptida vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke imunoglobulina, gde je dati polipeptid regiona šarke imunoglobulina kao što je opisano predhodno ili ovde i može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od (i) mutiranog, inžinjeringom dobijenog ili na drugi način promenjenog polipeptida regiona šarke koji ne sadrži cisteinske ostatke a koji je dobijen iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima jedan ili više cisteinskih ostataka, (ii) mutiranog, inžinjeringom dobijenog ili na drugi način promenjenog polipeptida regiona šarke koji sadrži jedan cisteinski ostatak a koji je dobijen iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima dva ili više cisteinskih ostataka, (iii) polipeptida regiona šarke divljeg tipa humanog IgA (iv) mutiranog, inžinjeringom dobijenog ili na drugi način promenjenog polipeptida regiona šarke humanog IgA koji ne sadrži cisteinske ostatke (v) mutiranog, inžinjeringom dobijenog ili na drugi način promenjenog polipeptida regiona šarke humanog IgA koji sadrži jedan cisteinski ostatak i (vi) mutiranog, inžinjeringom dobijenog ili na drugi način promenjenog polipeptida regiona šarke humanog IgA koji sadrži dva cisteinska ostatka; (b) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid regiona šarke; i (c) nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CHS konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid CH2 konstantnog regiona, gde je (1) fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina sposoban za bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela i fiksacije komplementa, i (2) polipeptid vezujućeg domena u stanju da se veže ili specifično veže za antigen. U jednom rešenju, polipeptid regiona šarke imunoglobulina je mutirani polipeptid regiona šarke, na primer, a dobijeni konstrukt pokazuje smanjenu sposobnost za dimerizaciju, u odnosu na konstrukt koji sadrži polipeptid regiona šarke imunoglobulina G divljeg tipa. U još jednom rešenju, polipeptid vezujućeg domena sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od bar jednog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida varijabilnog regiona koji je nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i/ili nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U daljem rešenju, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona dobijen je iz humanog imunoglobulina i, na primer, može da bude humanizovan.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) bar jednog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina; (b) bar jednog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina; i (c) bar jednog povezujućeg peptida koji je fuzionisan ili na drugi način vezan za polipeptid iz (a) i za polipeptid iz (b). U daljem rešenju nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina dobijeni su iz humanih imunoglobulina i mogu, na primer, da budu humanizovani.

U još jednom rešenju bar jedan od nativnih ili inžinjeringom dobijenih polipeptida CH2

(ili CHS IgE) konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i nativnih ili inžinjeringom dobij enih polipeptida CHS (ili CH4 IgE) konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina dobijen je ili konstruisan iz teškog lanca humanog imunoglobulina. U još jednom rešenju nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi CH2 i CHS konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina su iz, ili su dobijeni iz, ili su na drugi način pripremljeni ili konstruisani iz izotipa izabranog između humanog IgG i humanog IgA. U još jednom rešenju, ciljni molekul, na primer, ciljni antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD16, CD19, CD20, CD37, CD40, CD50RO, CD80, CD86, CD137, CD152 i L6. U određenim daljim rešenjima predhodno opisanog konstrukta fuzionog proteina, vezujući domen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od scFv, a scFv sadrži povezujući polipeptid koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od bar jednog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ili mu je aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (sekvenca čiji je ID broj: ), dok u određenim drugim rešenjima povezujući polipeptid sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od bar tri ponovka polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ili čija je aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (sekvenca čiji je ID broj: ). U određenim rešenjima polipeptid regiona šarke imunoglobulina sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog IgG, IgA, IgD ili nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona IgE. U određenim rešenjima, polipeptid vezujućeg domena sadrži, suštinski

se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog vanćelijskog domena CD 154. U određenim rešenjima, polipeptid vezujućeg domena sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog vanćelijskog domena CD154 i bar jednog nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida varijabilnog regiona.

U drugim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bilo koji od konstrukata predmetnog pronalaska, na primer, proteinske i polipeptidne konstrukte predmetnog pronalaska uključujući fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina, dok u srodnim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni ekspresioni konstrukt koji sadrži takav polinukleotid, dok u određenim daljim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja je transformisana ili transficirana, ili koja na drugi način sadrži, takav rekombinantni ekspresioni konstrukt. U još jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje konstrukta predmetnog pronalaska, na primer, proteinskog ili polipeptidnog konstrukta predmetnog pronalaska kao što je fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji podrazumeva korake (a) gajenja ćelija domaćina koje su transformisane ili transficirane, ili koje na drugi način sadrže polinukleotidni konstrukt predmetnog pronalaska u kulturi, pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju konstrukta, na primer, konstrukta koji kodira fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina; i (b) izolovanja konstrukta, na primer, fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina iz kulture ćelija domaćina.

Pronalasci koji su opisani ovde i podvedeni pod obim zaštite patentnih zahteva uključuju nove molekule koji su korisni, na primer, kao terapeutici i u druge svrhe koje uključuju dijagnostičke i istraživačke svrhe. Takvi molekuli imaju, na primer, funkciju vezivanja antigena ili drugu(e) funkciju(e) vezivanja i jednu ili više efektorskih funkcija. DNK konstrukti predmetnog pronalaska su korisni u, na primer, genskim terapijama, uključujućiin vivoiex vivogenske terapije.

U jednom rešenju, različiti konstrukti molekula predmetnog pronalaska uključuju molekule koji sadrže "vezujući region", region "repa" i "povezujući" region koji povezuje vezujući region i region repa.

Vezujući regioni u molekulima predmetnog pronalaska mogu da sadrže, na primer, vezujuće domene za željene ciljne molekule, uključujući antigen vezujuće ciljne molekule. Vezujući domeni za antigen vezujuće ciljne molekule mogu da sadrže, na primer, jednolančane Fv i scFv domene. U određenim rešenjima, molekuli predmetnog pronalaska mogu da sadrže vezujući region koji ima bar jedan polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina, koji može da bude polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca ili teškog lanca. U određenim rešenjima, molekuli predmetnog pronalaska mogu da sadrže bar jedan takav V-region lakog lanca i jedan takav V-region teškog lanca i bar jedan povezujući peptid koji povezuje V-regione. scFv korisna u predmetnom pronalasku takođe obuhvataju ona sa himernim vezujućim ili drugim domenima ili sekvencama. Druga scFv korisna prema predmetnom pronalasku obuhvataju i ona sa humanizovanim vezujućim ili drugim domenima. U takvim rešenjima, cela ili deo vezujuće sekvence imunoglobulina ili druge sekvence koja je dobijena iz ne-humanog izvora može da bude "humanizovan" prema priznatim procedurama za dobijanje humanizovanih antitela, t.j. imunoglobulinskih sekvenci u kojima su sekvence humanih Ig uvedene kako bi se smanjio stepen u kome će humani imuni sistem takve proteine smatrati stranim.

Primeri scFv korisnih prema predmetnom pronalasku, bilo da su uključena kao mišja ili druga scFv (uključujući humana scFv), himerna scFv ili humanizovana scFv, cela ili kao delovi, uključuju anti-humana CD20 scFv (na primer, "2H7" scFv), anti-humana CD37 scFv (na primer, "G28-l"scFv), anti-humana CD40 scFv (na primer, "G28-5"scFv i "40.2.220" scFv), anti-antigen spregnut sa kancerom scFv (na primer, "L6" scFv), anti-CTLA-4 (CD 152) scFv (na primer, "10A8" scFv), anti-humana CD28 scFv (na primer, "2E12" scFv), anti-mišja CD3 scFv (na primer, "500A2" scFv), anti-humana CD3 scFv (na primer, G19-4 scFv), anti-mišja 4-1BB scFv (na primer, "1D8" scFv), anti-humana 4-1BB scFv (na primer, "5B9" scFv), anti-humana CD45RO (na primer, "UCHL-1" scFv) i anti-humana CD16 (na primer, "Fc2" scFv).

scFv korisna prema predmetnom pronalasku takođe uključuju scFv, uključujući himerna i humanizovana scFv, koja imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Poželjna aminokiselinska supstitucija je na amino kiselini na poziciji 11 u varijabilnom teškom lancu (VH). Takva supstitucija ovde može da se označi kao "XxxVHl lZxx". Tako, na primer, tamo gde je amino kiselina koja se normalno javlja u poziciji VhII leucin, a zamenjena je serinskim ostatkom, ta supstitucija se označava kao "L VhI 1S" ili "Leu VhI ISer". Druga poželjna rešenja predmetnog pronalaska obuhvataju molekule koji sadrže scFv u kojima je aminokiselinski ostatak koji se normalno'nalazi u poziciji VhII deliran. U opet drugim poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska obuhvaćeni su molekuli koji sadrže scFv u kojima su aminokiselinski ostaci koji se normalno nalaze u pocicijama VhIO i/ili VH11 i/ili Vh12 supstituisani ili delirani.

Drugi vezujući regioni u molekulima predmetnog pronalaska mogu da obuhvataju domene koji sadrže mesta za glikozilaciju, na primer, kovalentno vezivanje ugljenohidratnih ostataka kao što su monosaharidi ili oligosaharidi.

Opet, drugi vezujući regioni u molekulima predmetnog pronalaska obuhvataju polipeptide koji mogu da sadrže proteine ili delove proteina koji zadržavaju sposobnost da specifično vežu drugi molekul, uključujući antigen. Tako, vezujući regioni mogu da sadrže ili da budu dobijeni iz hormona, citokina, hemokina i sličnih; receptora sa površina ćelija ili rastvornih receptora za takve polipeptidne ligande; lektina; interćelijskih adhezionih receptora kao što su specifični leukocitni integrini, selektini, članovi superfamilije imunoglobulinskih gena, molekuli interćelijske adhezije (ICAM-1, -2, -3) i slični; antigena histokompatibilnosti; i tako dalje. Vezujući regioni dobijeni iz ovakvih molekula će, uopšteno govoreći, obuhvatati one delove molekula koji su neophodni ili poželjni za vezivanje za ciljni molekul.

Određeni konstrukti uključuju vezujuće regione koji sadrže receptore ili receptor-vezujuće domene. Domeni receptora korisni za vezivanje ciljnog molekula uključuju, na primer, vanćelijski domen CD154, ili vanćelijski domen CTLA-4. U još jednom primeru, vezujući domen može da uključuje prvi deo koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od vanćelijskog domena CD154 i drugog dela koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od bar jednog polipeptida varijabilnog regiona imunoglobulina, gde dati drugi deo uključuje, na primer, scFv ili VH. Primeri drugih receptora sa površine ćelija koji mogu da sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od dela koji može da obezbedi vezujući region i polipeptid vezujućeg domena uključuju,

na primer, HER1, HER2, HER3, HER4, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), faktor rasta ćelija vaskularnog endotela, receptor faktora rasta ćelija vaskularnog endotela, irisulinu sličan faktor rasta I, insulinu sličan faktor rasta II, receptor transferina, receptor estrogena, receptor progesterona, receptor folikulo-stimulišućeg hormona (FSH-R), receptor retinske kiseline, MUC-1, NY-ESO-l, melan-A/MART-1, tirozinazu, Gp-100, MAGE, BAGE, GAGE, bilo koji od receptora iz klase CTA posebno uključujući HOM-MEL-40 antigen koji kodira SSX2 gen, karcinoembionični antigen (CEA) i PyLT. Dodatni receptori sa ćelijskih površina koji mogu da budu izvor vezujućih regiona ili polipeptida vezujućih domena uključuju, na primer, CD2, 4-1BB, 4-1BB ligand, CD5, CD10, CD27, CD28, CD152/CTLA-4, CD-40, interferon-y (INF-y), interleukin-4 (IL-4), interleukin-17 (IL-17) i receptor interleukina-17 (IL-17R). Drugi, opet, receptori sa ćelijskih površina koji mogu da budu izvor vezujućih regiona i/ili polipeptida vezujućih domena uključuju, na primer, CD59, CD48, CD58/LFA-3, CD72, CD70, CD80/B7.1, CD86/B7.2, B7-H1/B7-DC, IL-17, CD43, ICOS, CD3 (npr. gama podjedinica, epsilon podjedinica, delta podjedinica), CD4, CD25, CD8, CDllb, CD14, CD56, CD69 i VLA-4 (a4p7). Sledeći receptori na površini ćelija obično su vezani za B ćelije: CD 19, CD20, CD22, CD30, CD153 (CD30 ligand), CD37, CD50 (ICAM-3), CD106 (VCAM-1), CD54 (ICAM-1), interleukin-12, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD83 i DEC-205. Ove liste nisu konačne. Vezujući regioni kao što su oni predhodno pomenuti mogu da budu vezani, na primer, preko nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke, poželjno je da to bude humani ili humanizovani nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid regiona šarke. Predmetni pronalazak

stoga dalje obezbeđuje konstrukte koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od dva vezujuća regiona, na primer, scFv i receptora sa površine ćelije (ili njegovog dela), povezanih trećim molekulom, na primer, polipeptidom regiona šarke IgD, kao što je ovde opisano.

Različiti molekuli predmetnog pronalaska koji su ovde opisani i podvedeni pod obim zaštite patentnih zahteva uključuju povezujući region koji povezuje jedan kraj molekula sa drugim krajem. Takvi povezujući regioni mogu da sadrže, na primer, polipeptide regiona šarke imunoglobulina, uključujući bilo koji peptid ili polipeptid šarke koji se javlja u prirodi. Povezujući region može, takođe, da uključuje, na primer, bilo koji veštački dobijeni peptid ili drugi molekul (uključujući, na primer, nepeptidne molekule, delimično peptidne molekule i peptidomimetike, itd.) korisne za povezivanje regiona repa i vezujućeg regiona. Oni mogu da uključuju, na primer, molekule čije se izmene nalaze u polipeptidima teškog lanca između aminokiselinskih ostataka koji su odovorni za stvaranje intralančanih disulfidnih veza u okviru domena imunoglobulina u regionima CH1 i CH2. Regioni šarke koji se javljaju u prirodi uključuju one koji se nalaze između domena konstantnih regiona CH1 i CH2 molekula imunoglobulina. Korisni polipeptidi regiona šarke imunoglobulina uključuju, na primer, polipeptide regiona šarke humanih imunoglobulina i polipeptide regiona šarke imunoglobulina lame ili drugih kamelida. Drugi korisni polipeptidi regiona šarke imunoglobulina uključuju, na primer, polipeptide regiona šarkeGinglymostoma cirratumiHydrolagus colliei.Polipeptidi regiona šarke humanih imunoglobulina uključuju, na primer, regione šarke divljeg tipa IgG, uključujući regione šarki divljeg tipa humanog IgGl, polipeptide regiona šarki dobijene iz humanih IgG, delove regiona šarke humanog IgG ili imunoglobulina dobijenog iz humanog IgG, regione šarki divljeg tipa humanog IgA, polipeptide regiona šarki dobijene iz humanih IgA, delove regiona šarke humanog IgA ili imunoglobulina dobijenog iz humanog IgA, regione šarki divljeg tipa humanog IgD, polipeptide regiona šarki dobijene iz humanih IgD, delove regiona šarke humanog IgD ili imunoglobulina dobijenog iz humanog IgD, region koji se ponaša kao region šarke humano<g>IgE, t.j. polipeptidi CH2 regiona IgE (koji, uopšteno, imaju 5 cisteinskih ostataka), polipeptide regiona šarki dobijene iz humanih IgE, delove regiona koji se ponaša kao region šarke humanog IgE, t.j. polipeptida CH2 regiona IgE ili polipeptida imunoglobulina dobijenog iz humanog IgE, i tako dalje. Polipeptid koji je "dobijen iz" ili koji je "deo ili fragment od" polipeptidnog lanca regiona imunoglobulina za koji se smatra da ima ulogu šarke, ima jednu ili više aminokiselinskih ostataka vezanih peptidnim vezama, na primer 15 do 115 aminokiselinskih ostataka, poželjno je 95 do 110, 80 do 94, 60 do 80, ili od 5 do 65 aminokiselinskih ostataka, poželjno je da to bude 10 do 50, još poželjnije da to bude 15 do 35, čak još poželjnije 18 do 32, čak još poželjnije 20 do 30, čak još poželjnije 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29 aminokiselinskih ostataka. Polipeptidi regiona šarke imunoglobulina lame uključuju, na primer, region šarke IgGl lame. Povezujući region može da sadrži niz uzastopnih aminokiselinskih ostataka iz regiona šarke imunoglobulina. Na primer, povezujući region može da sadrži najmanje pet uzastopnih aminokiselinskih ostataka regiona šarke, najmanje deset uzastopnih aminokiselinskih ostataka regiona šarke, najmanje petnaest uzastopnih aminokiselinskih ostataka regiona šarke, najmanje 20 uzastopnih aminokiselinskih ostataka regiona šarke i najmanje dvadeset pet ili više uzastopnih aminokiselinskih ostataka regiona šarke iz regiona šarke humanog IgG, regiona šarke humanog IgA, regiona šarke humanog IgE, regiona šarke kamelida, regiona šarke IgGl lame, regiona šarkeGinglymostoma cirratumi regiona šarkeHydrolagus colliei,uključujući, na primer, region šarke IgGi, region šarke IgG2, region šarke IgG3i region šarke IgG4.

Takvi povezujući regioni uključuju još i, na primer, mutirane ili na drugi način promenjene ili inžinjeringom dobijene polipeptide regiona šarke imunoglobulina. Mutirani ili na drugi način promenjeni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid regiona šarke imunoglobulina može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od polipeptida regiona šarke koji potiče iz imunoglobulina jedne vrste, jednog izotipa ili klase, ili imunoglobulinske podklase koja je'ista ili različita od one kojoj pripada bilo koji od uključenih nativnih ili inžinjeringom dobijenih CH2 i CH3 domena. Mutirani ili na drugi način promenjeni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi regiona šarke imunoglobulina obuhvataju one koji su dobijeni ili konstruisani iz, na primer, divljeg tipa regiona šarke imunoglobulina koji sadrži jedan ili više cisteinskih ostataka, na primer, polipeptida regiona šarke divljeg tipa humanog ili nekog drugog IgGl ili IgG4 koji sadrži nula, jedan ili dva cisteinska ostatka, i mutiranog ili na drugi način promenjenog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke humanog ili nekog drugog IgAl ili IgA2 koji sadrži nula, jedan ili dva cisteinska ostatka. Mutirani ili na drugi način promenjeni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi regiona šarke imunoglobulina obuhvataju one koji su dobijeni ili konstruisani iz, na primer, divljeg tipa regiona šarke imunoglobulina koji sadrži tri ili više cisteinskih ostataka, na primer, polipeptida regiona šarke divljeg tipa humanog IgG2 (koji ima 4 cisteina) ili regiona šarke IgG4 (koji ima 11 cisteina). Mutirani ili na drugi način promenjeni ili inžinjeringom dobijeni polipeptidi regiona šarke imunoglobulina obuhvataju one koji su dobijeni ili konstruisani iz, na primer, divljeg tipa CH2 regiona IgE koji obično sadrži pet cisteinskih ostataka. U ovakvim polipeptidima, broj cisteinskih ostataka može da bude smanjen za jedan ili više cisteinskih ostataka aminokiselinskom supstitucijom, delecijom ili isecanjem, na primer. Takođe su obuhvaćeni promenjeni polipeptidi regiona šarke kod kojih su cisteinski ostaci u regionu šarke supstituisani serinom ili jednom ili većim brojem drugih aminokiselinskih ostataka koji su manje polarni, manje hidrofobični, hidrofilniji i/ili neutralni. Takvi mutirani polipeptidi regiona šarke imunoglobulina obuhvataju, na primer, mutirane polipeptide regiona šarke koji sadrže jedan cisteinski ostatak a koji su dobijeni iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina koji ima dva ili više cisteinskih ostataka, kao što je mutirani polipeptid regiona šarke humanog IgG ili IgA koji sadrži jedan cisteinski ostatak a koji je dobijen iz polipeptida regiona šarke divljeg tipa humanog IgG ili IgA. Polipeptidi povezujućeg regiona obuhvataju polipeptide regiona šarke imunoglobulina čija je sposobnost da grade interlančane homodimerne disulfidne veze smanjena.

Mutirani polipeptidi regiona šarke imunoglobulina takođe obuhvataju mutirane polipeptide regiona šarke koji pokazuju smanjenju sposobnost da dimerizuju, u odnosu na polipeptid regiona šarke divljeg tipa humanog imunoglobulina G, kao i mutirane polipeptide regiona šarke koji dozvoljavaju ekspresiju smeše monomernih i dimernih molekula. Mutirani polipeptidi regiona šarke imunoglobulina takođe obuhvataju polipeptide regiona šarke kojima je inžinjeringom uvedeno mesto za glikozilaciju. Mesta za glikozilaciju obuhvataju, na primer, mesto za glikozilaciju vezano za asparagin, 0- vezano mesto za glikozilaciju, mesto za C-manozilaciju, mesto za glipijaciju i mesto za fosfoglikaciju.

Specifični povezujući regioni korisni u molekulima predmetnog pronalaska koji su ovde opisani i podvedeni pod obim zaštite patentnih zahteva uključuju, na primer, sledećih 18 aminokiselinskih sekvenci, DQEPKSCDKTHTCPPCPA, DOEKSSDKTHTSPPSPA i DLEPKSCDKTHTCPPCPA. Drugi specifični povezujući regioni uključuju, na primer, mutantne regione šarke u okviru sekvenci koje će ovde biti označene kao "2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3" i "2H7 scFv (CSS)H WCH2 WCH3" i region šarke dobijen iz humanog IgA koji se ovde označava kao "2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3".

Regioni repa u okviru molekula predmetnog pronalaska mogu da obuhvataju sekvence konstantnih regiona teških lanaca imunoglobulina. Regioni repa mogu da obuhvataju, na primer, polipeptid koji ima bar jedan od polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Bar jedan od polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina može da bude dobijen iz teškog lanca humanog imunoglobulina. Stoga, na primer, peptidi CH2 i/ili CH3 mogu da budu dobijeni iz molekula humanog IgG, humanog IgA ili humanog IgD. Regioni repa mogu takođe da obuhvataju, na primer, polipeptide koji imaju bar jedan od polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptida CH4 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Bar jedan od polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptida CH4 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina može da bude dobijen iz teškog laća humanog imunoglobulina. Stoga, na primer, peptidi CH2 i/ili CH3 mogu da budu dobijeni iz molekula humanog IgE. Polipeptid CH2 regiona teškog lanca imunoglobulina koji je obuhvaćen molekulom predmetnog pronalaska može, na primer, da bude iz podklasa IgGl, IgG2, IgG3 i/ili IgG4. Polipeptid CH3 regiona teškog lanca imunoglobulina koji je obuhvaćen molekulom predmetnog pronalaska može takođe, na primer, da bude iz podklasa IgGl, IgG2, IgG3 i/ili IgG4. Uz to, i polipeptid CH2 regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptid CH3 regiona teškog lanca imunoglobulina koji su obuhvaćeni molekulom predmetnog pronalaska mogu, na primer, da budu iz podklasa IgGl, IgG2, IgG3 i/ili IgG4. U drugim molekulima predmetnog pronalaska bar jedan od polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina izabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida CH2 konstnatnog regiona i polipeptida CH3 konstantnog regiona je polipeptid konstantnog regiona humanog IgA. Polipeptid CH2 regiona teškog lanca imunoglobulina koji je obuhvaćen molekulom predmetnog pronalaska može, na primer, da bude iz podklasa IgAl i/ili IgA2. Polipeptid CH3 regiona teškog lanca imunoglobulina koji je obuhvaćen molekulom predmetnog pronalaska može takođe, na primer, da bude iz podklasa IgAl i/ili IgA2. Uz to, i polipeptid CH2 regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptid CH3 regiona teškog lanca imunoglobulina koji su obuhvaćeni molekulom predmetnog pronalaska mogu, na primer, da budu iz podklasa IgAl i/ili IgA2. U, opet, drugim molekulima predmetnog pronalaska, region repa može da sadrži ili da se suštinski sastoji od polipeptida CH2 i/ili CH3 konstantnog regiona koji sadrži polipeptid iz humanog IgA i/ili humanog IgE. U drugim rešenjima, na primer, region repa u okviru molekula predmetnog pronalaska može da obuhvata polipeptid CH2 i/ili CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je mutiran (na primer, mutirani polipeptid CH3 konstantnog regiona IgA koji nije u stanju da se veže za J lanac u kojem je, na primer, polipeptid CH3 konstantnog regiona IgA humanog porekla). Region repa može takođe da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od vanćelijskog dela proteina iz superfamilije TNF, na primer, CD154.

Za molekule predmetnog pronalaska koji su namenjeni za upotrebu kod ljudi, ovi regioni će obično biti u značajnoj meri ili potpuno humani kako bi se potencijalni humani imuni odgovor na ove molekule sveo na najmanju moguću meru i kako bi se obezbedile odgovarajuće efektorske funkcije. U određenim rešenjima predmetnog pronalaska, na primer, region repa obuhvata sekvencu CH3 regiona humanog IgGl, sekvencu polipeptida konstantnog regiona teškog lanca divljeg tipa IgA koji je u stanju, ili nije u stanju da se veže za J lanac.

U poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska, CH1 domen nije obuhvaćen regionom repa molekula, a karboksil kraj vezujućeg regiona je vezan za amino kraj CH2 dela regiona repa, bilo posredno bilo neposredno. Vezujući region može da bude posredno vezan za region repa, na primer, preko polipeptida povezujućeg regiona ili preko drugog povezujućeg molekula.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje molekule koji imaju mutirane sekvence CH2 i/ili CH3 u okviru regiona repa. Na primer, molekul predmetnog pronalaska može da obuhvata mutirani Fc domen koji ima jednu ili više mutacija uvedenih u CH2, CH3 i/ili CH4 domene. U određenim rešenjima predmetnog pronalaska molekuli mogu da obuhvataju polipeptid CH3 konstantnog regiona IgA, kao što je polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgA kod kojeg su dva ili više ostataka sa C-terminalnog kraja delirani kako bi se dobio skraćeni polipeptid CH3 konstantnog regiona. U drugim rešenjima predmetnog pronalaska, molekuli obuhvataju mutirani polipeptid CHS konstantnog regiona humanog IgA koji nije u stanju da se veže za J lanac, a koji sadrži deleciju četiri ili 18 aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju. Međutim, predmetni pronalazak ne treba da bude tako ograničen, tako da molekuli megu da obuhvataju mutirani polipeptid CH3 konstantnog regiona humanog IgA koji može da sadrži deleciju 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21 do 25,26 do 30 ili više aminokiselinskih ostataka, pod uslovom daje fuzioni protein u stanju da specifično veže antigen i da je sposoban za bar jednu imunološku aktivnost, kao što su ADCC, CDC ili fiksacija komplementa. Predmetni pronalazak takođe obuhvata molekule koji sadrže region repa koji obuhvata mutirani polipeptid CH3 konstantnog regiona IgA koji nije u stanju da se veže za J lanac usled toga što mu je predposlednji cisteinski ostatak supstituisan, ili usled hemijske modifikacije tog aminokiselinskog ostatka na način koji sprečava nastanak interlančane disulfidne veze.

Različiti molekuli predmetnog pronalaska obuhvataju, na primer, fuzioni protein vezujućeg regiona i scFv koji ima polipeptid vezujućeg domena koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (a) bar jednog polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina, (b) bar jednog polipeptida-varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina i (c) bar jednog povezujućeg peptida koji spaja polipeptid iz (a) i polipeptid iz (b). Ovakvi polipeptidi mogu, na primer, da budu dobijeni iz humanih imunoglobulina ili iz imunoglobulina drugih vrsta.

Stoga, u jednom rešenju, predmetni pronalazak uključuje jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi i/ili VHprotein i/ili VLprotein, ili poželjni deo bilo kog od predhodno pomenutih, uključujući prvi polipeptid koji sadrži polipeptid vezujućeg regiona koji je u stanju da se veže za ciljni molekul, drugi polipeptid koji sadrži fleksibilan ili drugi poželjni povezujući peptid vezan za dati prvi polipeptid, treći polipeptid koji sadrži region repa, na primer, i polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imuoglobulina koji je na svom N terminalnom kraju skraćen (ili njegov željeni deo) koji je vezan za drugi polipeptid. Fleksibilni povezujući polipeptid može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od regiona šarke imunoglobulina ili njegovog dela koji je mutiran ili na drugi način promenjen ili dobijen inžinjeringom, na primer, u kome je broj cisteinskih ostataka manji nego broj cisteinskih ostataka prisutnih u regionu šarke ili njegovom delu kod divljeg tipa imunoglobulina (na primer, nula, jedan ili dva cisteina u slučaju IgGl ili IgG4), i gde je dati jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban za bar jednu od imunoloških aktivnosti koje uključuju, na primer, ADCC, CDC i/ili fiksaciju komplementa. Jednolančani protein može da bude sposoban za dve imunološke aktivnosti koje uključuju, na primer, ADCC, CDC i/ili fiksaciju komplementa. Ovaj protein može da obuhvata polipeptid vezujućeg domena koji je jednolančani Fv, gde varijabilni region teškog lanca jednolančanog Fv ima amonokiselinsku deleciju ili supstituciju na mestu jedne od ili više aminokiselinskih pozicija 9, 10, 11, 12, 108, 110 i 112. Protein može takođe da uključuje polipeptid vezujućeg domena koji je jednolančani Fv gde varijabilni region lakog lanca jednolančanog Fv ima amonokiselinsku deleciju ili supstituciju na mestu jedne od ili više aminokiselinskih pozicija 12, 80,81,83, 105, 106 i 107.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata VHprotein koji se ne javlja u prirodi, ili njegov željeni deo, koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, sam ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim molekulom ili konstruktom, Vh regiona ili njegovog dela koji ima aminokiselinsku supstituciju ili deleciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 9, 10, 11, 12, 108, 110 i 112 datog Vh regiona. Aminokiseline mogu da budu supstituisane ili aminokiselinama koje se javljaju u prirodi ili aminokiselinama koje se ne javljaju u prirodi, ili nekim drugim željenim korisnim molekulom.

Ovde su takođe opisane i podvedene pod obim zaštite upotrebe Vhproteina, ili njihovih poželjnih delova, koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od, sami ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim molekulom ili konstruktom, Vhregiona ili njegovog dela koji ima aminokiselinsku supstituciju ili deleciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 9, 10, 11, 12, 108, 110 i 112 datog Vhregiona. Ovakve upotrebe obuhvataju upotrebe u sistemima i postupcima fagnih biblioteka, biblioteka kvasaca i biblioteka ribozoma.

U, opet, još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata Vi protein koji se ne javlja u prirodi, ili njegov željeni deo, koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, sam ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim molekulom ili konstruktom, Vlregiona ili njegovog dela koji ima aminokiselinsku supstituciju ili deleciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 12, 80, 81, 83, 105, 106 i 107 datog Vlregiona. Aminokiseline mogu da budu supstituisane ili aminokiselinama koje se javljaju u prirodi ili aminokiselinama koje se ne javljaju u prirodi, ili nekim drugim željenim korisnim molekulom.

Takođe su opisane i podvedene pod obim zaštite upotrebe Vlproteina, ili njihovih poželjnih delova, koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od, sami ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim molekulom, VLregiona ili njegovog dela koji ima aminokiselinsku supstituciju ili deleciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 12, 80, 81, 83, 105, 106 i 107 datog VLregiona. Ovakve upotrebe obuhvataju upotrebe u sistemima i postupcma fagnih biblioteka, biblioteka kvasaca i biblioteka ribozoma.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata molekul koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od (1) Vh proteina, ili njegovog poželjnog dela, gde Vh protein ili njegov deo ima aminokiselinsku deleciju ili supstituciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 9, 10, 11, 12, 108, 110 i 112, i (2) Vl proteina koji se ne javlja u prirodi, ili njegovog poželjnog dela, samog ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim molekulom, gde Vlprotein, ili njegov deo, ima aminokiselinsku supstituciju ili deleciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 12, 80, 81, 83, 105, 106 i 107. Aminokiseline mogu da budu supstituisane ili aminokiselinama koje se javljaju u prirodi ili aminokiselinama koje se ne javljaju u prirodi, ili nekim drugim željenim korisnim molekulom.

Takođe su opisane i podvedene pod obim zaštite upotrebe molekula koji sadrži, suštinski

se sastoji od ili se sastoji od (1) VHproteina, ili njegovog poželjnog dela, gde Vh protein ili njegov deo ima aminokiselinsku deleciju ili supstituciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 9, 10, 11, 12, 108, 110 i 112, i (2) VLproteina koji se ne javlja u prirodi, ili njegovog poželjnog dela, samog ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim molekulom, gde VLprotein, ili njegov deo, ima aminokiselinsku supstituciju ili deleciju na jednoj od ili više aminokiselinskih pozicija 12, 80, 81, 83, 105, 106 i 107. Ovakve upotrebe obuhvataju upotrebe u sistemima i postupcma fagnih biblioteka, biblioteka kvasaca i biblioteka ribozoma.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata molekulske konstrukte u kojima je vezujući domen jednolančani Fv a varijabilni region teškog lanca datog jednolančanog Fv ima aminokiselinsku supstituciju na aminokiselinskoj poziciji 11. Aminokiselina kojom je supstituisana aminokiselina na poziciji 11 u varijabilnom regionu teškog lanca jednolančanog Fv može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, treonina, tirozina, asparagina, glutamina, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline, lizina, arginina i histidina. Predmetni pronalazak, stoga, obuhvata, na primer, konstrukt u kome je vezujući domen jednolančani Fv a gde varijabilni region teškog lanca datog jednolančanog Fv ima serinsku aminokiselinsku supstituciju u aminokiselinskoj poziciji 11. Promene u drugim pozicijama, supstitucije i delecije su ovde pomenute.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata, na primer, konstrukt u kome je vezujući domen jednolančani Fv a gde je aminokiselinski ostatak u poziciji 10 i/ili 11 varijabilnog regiona teškog lanca datog jednolančanog Fv deliran.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata konstrukte čiji se vezujući region vezuje za tumor ili antigen vezan za tumor. Vezujući region konstrukta predmetnog pronalaska može da se vezuje, na primer, za antigen ćelije kancera. Antigeni ćelija kancera za koje se vezuju konstrukti predmetnog pronalaska obuhvataju antigene sa površine ćelija kancera i unutarćelijske antigene ćelija kancera,

U, opet, još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata konstrukt čiji se vezujući region vezuje za antigen koji se nalazi na efektorskoj ćeliji imunog sistema.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata konstrukt čiji se vezujući region vezuje za antigene B ćelija, uključujući, na primer, antigen B ćelije izabran iz grupe koja se sastoji od CD 19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86. Konstrukti predmetnog pronalaska koji se vezuju za takve antigene B ćelija obuhvataju, na primer, vezujuće regione koji sadrže jednolančani Fv. Primeri takvih vezujućih regiona jednolančanih Fv obuhvataju molekule koji sadrže ili se suštinski sastoje od jednolančanih Fv izabranih iz grupe koja se sastoji od HD37 jednolančanog Fv, 2H7 jednolančanog Fv, G28-1 jednolančanog Fv i 4.4.220 jednolančanog Fv. Drugi primeri obuhvataju vezujući region koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od vanćelijskog domena CTLA-4.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata konstrukt u kome se vezujući region vezuje za antigen diferencijacije B ćelija. Antigeni diferencijacije B ćelija obuhvataju, na primer, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD37, CD40, CD45RO, CD80, CD86 i HLA klase

II.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata konstrukt u kome se vezujući region vezuje za ciljni molekul izabran iz grupe koja se sastoji od CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD10, CDllb, CD14, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50 (ICAM3), CD54 (ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA-4), CD153 (CD30 ligand), CD154 (CD40 ligand), ICOS, L6, B7-H1 i HLA klase II.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata konstrukte koji imaju vezujući region, region repa i povezujući region, gde je proteinski konstrukt u stanju da se u rastvoru nalazi kao monomer ili u pretežno monomernom obliku.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata konstrukte koji imaju vezujući region, region repa i povezujući region, gde je proteinski konstrukt u stanju da gradi kompleks koji se sastoji od dva ili više datih konstrukta proteina uključujući, na primer, slučajeve u kojima je dati kompleks dimer.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su u stanju da učestvuju ili pokrenu ili izazovu ili da pomognu u pokretanju ili izazivanju, posredno ili neposredno, bar jedne imunološke aktivnosti izabrane iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela, citotoksičnosti zavisne od komplementa (ili lize posredovane komplementom), fiksacije komplementa, pokretanja apoptoze, pokretanja jednog ili više biološki aktivnih signala, indukcije jedne ili većeg broja efektorskih ćelija imunog sistema, aktivacije ćelijske diferencijacije, ćelijske aktivacije, otpuštanja jednog ili više biološki aktivnih molekula i neutralizacije infektivnog sredstva ili toksina.

U još jednom rešenju, vezujući konstrukti predmetnog pronalaska u stanju su da indukuju biološki aktivne singale aktivacijom ili inhibicijom jednog ili više molekula izabranih iz grupe koja se sastoji od protein kinaza, protein fosfataza, G-proteina, cikličnih nukleotida ili drugih sekundarnih glasnika, jonskih kanala i komponenti sekretnornih puteva. Ovakvi biološki aktivni molekuli su, na primer, proteaze. Drugi biološki aktivni molekuli su, na primer, citokini, uključujući kao primer monokine, limfokine, hemokine, faktore rasta, faktore stimulacije kolonija, interferone i interleukine.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za indukciju ili učestvovanje u indukciji jednog ili većeg broja efektorskih ćelija imunog sistema izabranih iz grupe koja se sastoji od NK ćelija, monocita, makrofaga, B ćelija, T ćelija, mastocita, neutrofila, eozinofila i bazofila.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za indukciju ili učestvovanje u indukciji jednog ili većeg broja efektorskih ćelija imunog sistema koje dovode do citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela ili do otpuštanja jednog ili više biološki aktivnih molekula.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za učestvovanje u pokretanju ili pokretanje apoptoze u ciljnoj ćeliji, na primer, aktivacijom jednog ili više signalnih mehanizama ili molekula.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za indukciju ili učestvovanje u indukciji ćelijske aktivacije, gde data aktivacija dovodi do promena u ćelijskog transkripcionoj aktivnosti. U jednom rešenju, ćelijska transkripciona aktivnost je povišena. U još jednom rešenju, ćelijska transkripciona aktivnost je smanjena.

U još jednom rešenju konstrukti predmetnog pronalaska koji imaju regione repa koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od konstantnih regiona iz IgA ili IgE molekula, sposobni su za pokretanje, ili učestvovanje u pokretanju degranulacije neutrofila i/ili mastocita.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za pospešivanje, ili učestvovanje u pospešivanju, neutralizacije infektivnog sredstva, gde je dato infektivno sredstvo,

na primer, bakterija, virus, parazit ili gljiva.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za pospešivanje, ili učestvovanje u pospešivanju, neutralizacije toksina, gde je dati toksin izabran iz grupe koja se sastoji od endotoksina i egzotoksina. Ovakvi toksini obuhvataju, na primer, egzotoksine izabrane iz grupe koja se sastoji od toksina antraksa, toksina kolere, toksina difterije, toksina velikog kašlja, toksina LTE. coliosetljivog na temperaturu, toksina STE. colistabilnog na toploti, šiga toksina, egzotoksina APseudomonas,toksina botulinuma, toksina tetanusa, AC toksinaBordatella pertussisi EF toksinaBacillus anthracis.Drugi toksini obuhvataju, na primer, saksitoksine, tetrodoksine, toksine pečuraka (amatoksine, giromitrin, orelanin itd.), aflatoksine, alkaloide pirolizidina, fitohemaglutinine i grajanotoksine.

U još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska su sposobni za vezivanje za unutarćelijski ciljni molekul kako bi, na primer, izvršili (ili učestvovali u izvršenju) ćelijsku funkciju. Ovakvi konstrukti obuhvataju, na primer, konstrukte koji uključuju region repa koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog regiona CH2 domena IgA i nativnog ili inžinjeringom dobijenog regiona CH3 domena, pri čemu je dati region repa u stanju da se veže za J lanac. Ovakav region repa nalazi se, na primer, u konstruktu 2H7 scFv IgAH WlgACH2 WCH3 + JChain. Stoga, predmetni pronalazak obuhvata konstrukte koji sadrže, na primer, "anti - unutarćelijski ciljni molekul" vezujući domen (na primer, "anti - unutarćelijski ciljni molekul" scFv), povezujući region, i nativni ili inžinjeringom dobijeni konstantni region IgA koji je u stanju da veže J lanac (na primer, WlgACH2 WCH3).

U, opet, još jednom rešenju, konstrukti predmetnog pronalaska obuhvataju molekul čiji N-terminalni kraj polipeptida konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina sadrži polipeptid CH2 konstantnog regiona IgG vezan za polipeptid CH3 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina IgG.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata postupak smanjenja populacije ciljnih ćelija kod pacijenta, koji podrazumeva primenu terapeutski delotvorne količine proteinskog molekula koji je manji od oko 120 kD, ili manji od oko 150 kD, mereno, na primer, pomoću HPLC i ne-redukujućih gelova a koji se suštinski sastoji od (a) prvog molekula peptida ili proteina koji je u stanju da se veže za ćelije u okviru ciljne populacije ćelija, i (b) drugog molekula peptida ili proteina koji je u stanju da (i) se veže za Fc receptor i/ili (ii) pokrene apoptozu ciljne ćelije i/ili (iii) fiksira komplement, gde je dati prvi molekul proteina ili peptida neposredno vezan za dati drugi molekul peptida ili proteina, ili su, opciono, dati prvi molekul proteina ili peptida i dati drugi molekul proteina ili peptida vezani pomoću trećeg mdlekula proteina ili peptida, gde dati molekul proteina nije antitelo, član porodice TNF ili porodice TNF receptora i nije konjugovan sa bakterijskim toksinom, citotoksičnim lekom ili radioizotopom.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde je dati jednolančani protein sposoban za bar jednu imunološku aktivnost, i pod uslovom da (a) kada polipeptid povezujućeg regiona sadrži polipeptid regiona šarke IgG koji nema cisteinskih ostataka, ciljni molekul peptida vezujućeg domena nije CD20 ili L6, ili (b) kada polipeptid povezujućeg regiona sadrži polipeptid regiona šarke IgG koji nema cisteinskih ostataka, jednolančani protein nije 1F5 scFv koji je u stanju da se veže za CD20. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde je dati jednolančani protein u stanju da se veže za ciljni molekul na ili u ciljnoj ćeliji i da dovede do smanjenja broja ciljnih ćelijain vivoi/ili da iskoreni populaciju ciljnih ćelijain vivo.Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine kojiSadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde je dati jednolančani protein u stanju da pokrene citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela i fiksaciju komplementa. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde je dati jednolančani protein u stanju (1) da pokrene citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela i fiksaciju komplementa i (2) da se veže za ciljni molekul na ili u ciljnoj ćeliji i da dovede do smanjenja broja ciljnih ćelijain vivoi/ili da iskoreni populaciju ciljnih ćelijain vivo.Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde kada dati povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih drugog i trećeg cisteinskog ostatka su supstituisani ili delirani, a gde je dati jednolančani protein sposoban za bar jednu imunološku aktivnost. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) -trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde kada dati povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih drugog i trećeg cisteinskog ostatka su supstituisani ili delirani, a gde je dati jednolančani protein sposoban da pokrene bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od (a) citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela i (b) fiksacije komplementa. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde kada povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih drugog i trećeg cisteinskog ostatka su supstituisani ili delirani, a gde je dati jednolančani protein sposoban za citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela i fiksaciju komplementa. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde kada povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih drugog i trećeg cisteinskog ostatka su supstituisani ili delirani, a gde je dati jednolančani protein u stanju da se veže za ciljni molekul na ili u ciljnoj ćeliji i da dovede do smanjenja broja ciljnih ćelijain vivoi/ili da iskoreni populaciju ciljnih ćelijain vivo.Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde kada povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski" ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih drugog i trećeg cisteinskog ostatka su supstituisani ili delirani, a gde je dati jednolančani protein u stanju da pokrene bar jednu imunološku aktivnost izabranu iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela i fiksacije komplementa, a gde je dati jednolančani protein u stanju da se veže za ciljni molekul na ili u ciljnoj ćeliji i da dovede do smanjenja broja ciljnih ćelijain vivoi/ili da iskoreni populaciju ciljnih ćelijain vivo.Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde kada povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih drugog i trećeg cisteinskog ostatka su supstituisani ili delirani, a gde je dati jednolančani protein sposoban pokrene citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela i fiksaciju komplementa i gde je dati jednolančani protein u stanju da se veže za ciljni molekul na ili u ciljnoj ćeliji i da dovede do smanjenja broja ciljnih ćelijain vivoi/ili da iskoreni populaciju ciljnih ćelijain vivo.Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul, gde dati polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca u kome je leucin na poziciji 11 u prvom regionu okvira varijabilnog regiona teškog lanca deliran ili supstituisan nekom drugom aminokiselinom; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde je dati jednolančani protein sposoban za bar jednu imunološku aktivnost,

a pod uslovom da kada je polipeptid vezujućeg domena u stanju da se veže za CD20 dati povezujući region sadrži tri cisteinska ostatka gde su jedan ili dva od data tri cisteinska ostatka supstituisani ili zamenjeni nekom drugom aminokiselinom. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul, gde dati polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca u kome je leucin na poziciji 11 u prvom regionu okvira varijabilnog regiona teškog lanca deliran ili supstituisan nekom drugom aminokiselinom; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezan za C terminalni kraj datog prvog polipeptida; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za C terminalni kraj datog drugog polipeptida, gde je dati jednolančani protein u stanju da pokrene bar jednu imunološku aktivnost, pod uslovom da kada je polipeptid vezujućeg domena 2H7 scFv koji je u stanju da se veže za CD20 i dati povezujući region sadrži region šarke IgG koji ima najmanje prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je dati prvi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati drugi cisteinski ostatak, a drugi cisteinski ostatak N terminalan u odnosu na dati treći cisteinski ostatak, jedan ili oba od datih cisteinskih ostataka su

supstituisani ili delirani. Predmetni pronalazak takođe obuhvata jednolančane proteine koji sadrže, suštinski se sastoje od ili se sastoje od (i) prvog polipeptida koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za ciljni molekul, gde dati polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca u kome je leucin na poziciji 11 u prvom regionu okvira varijabilnog regiona teškog lanca deliran ili supstituisan nekom drugom aminokiselinom; (ii) drugog polipeptida koji sadrži povezujući region vezanog za prvi polipeptid; i (iii) trećeg polipeptida koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je skraćen na N terminalnom kraju vezanog za dati drugi polipeptid, gde je dati jednolančani protein sposoban za bar jednu imunološku aktivnost, pod uslovom da dati jednolančani protein ne sadrži, suštinski se ne sastoji od ili se ne sastoji od polipeptida vezujućeg domena koji je u stanju da se veže za CD20 i povezujućeg regiona koji sadrži (a) region šarke IgG koji ima tri cisteinska ostatka i (b) region šarke IgG koji sadrži tri serinska ostatka (ili ostatka sličnih aminokiselina) kojima su supstituisani cisteinski ostaci. Postoje mnoge moguće varijacije i varijante ovakvih jednolančanih proteina. Na primer, polipeptid vezujućeg domena može da bude jednolančano antitelo ili scFv, uključujući i polipeptide Vhi Vlkoji se javljaju u prirodi i one koji se ne javljaju u prirodi, a polipeptid vezujućeg regiona može da veže bilo koji od velikog broja ciljnih molekula. Polipeptidi VHkoji se ne javljaju u prirodi obuhvataju, kao primer ali bez ograničavanja, polipeptid varijabilnog regiona humanog teškog lanca koji sadrži mutaciju, supstituciju ili deleciju aminokiseline(a) na mestu koje odgovara bilo kojoj jednoj ili većem broju aminokiselina na pozicijama 9, 10, 11, 12, 108, 110 i/ili 112. Polipeptidi VL koji se ne javljaju u prirodi obuhvataju, kao primer ali bez ograničavanja, polipeptid varijabilnog regiona humanog teškog lanca koji sadrži mutaciju, supstituciju ili deleciju aminokiseline(a) na mestu koje odgovara bilo kojoj jednoj ili većem broju aminokiselina na pozicijama 12, 80, 81, 83, 105, 106 i/ili 107. Ciljni molekuli uključuju, kao primer ali bez ograničavanja, CD19, CD20, CD28, CD30, CD37, CD40, L6, HER2, receptore faktora rasta epiderma (EGFR), faktore rasta • ćelija vaskularnog epitela (VEGF), faktore nekroze tumora (npr., TNF-alfa) kao i druge ciljne molekule koji su ovde opisani ili pomenuti ili na drugi način korisni, bilo da su poznati sada ili će biti otkriveni kasnije. Uz to, polipeptid povezujućeg regiona može da bude bilo koji od većeg broja molekula, bilo da se javljaju u prirodi ili da se ne javljaju u prirodi. Polipeptidi povezujućeg regiona obuhvataju, kao primer ali bez ograničavanja, polipeptide regiona šarke imunoglobulina koji se javljaju u prirodi i koji se ne javljaju u prirodi. Polipeptidi regiona šarke imunoglobulina koji se javljaju u prirodi obuhvataju polipeptide regiona šarke divljeg tipa imunoglobulina kao što su, kao primer ali bez ograničenja, polipeptidi regiona šarke humanog IgGl, polipeptidi regiona šarke humanog IgA, polipeptidi regiona šarke humanog IgD, regioni koji se ponašaju kao regioni šarki humanog IgE (t.j., IgE CH2), regioni šarke imunoglobulina kamelida, ili bilo koji drugi polipeptidi regiona šarke koji se javljaju u prirodi a koji su ovde opisani ili koji su na drugi način korisni, bilo da su poznati sada ili će biti otkriveni kasnije. Polipeptidi regiona šarke imunoglobulina koji se ne javljaju u prorodi obuhvataju, kao primer ali bez ograničavanja, mutirane regione šarki imunoglobulina koji se javljaju u prirodi, uključujući polipeptide regiona šarki imunoglobulina koji sadrže manji broj cisteinskih ostataka od divljeg tipa, na primer, mutirane regione šarki imunoglobulina koji se javljaju u prirodi koji sadrže nula, jedan ili dva cisteinska ostatka, kao i bilo koji drugi molekul povezujućeg regiona koji je ovde opisan ili pomenut, ili koji je na drugi način koristan, bilo da je poznat sada ili će tek biti otkriveno da je koristan za povezivanje, na primer, domena imunoglobulina kao što su CH1 domen i CH2 domen. Polipeptidi konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina skraćeni na N terminalnom kraju obuhvataju polipeptide konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina skraćene na N terminalnom kraju koji se javljaju u prirodi kao i one koji se ne javljaju u prirodi,

a koji, sa ili bez drugih delova jednolančanih proteina, obezbeđuju jednu ili više efektorskih funkcija kao što su one koje su ovde opisane. Polipeptidi konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina skraćeni na N terminalnom kraju koji se javljaju u prirodi obuhvataju, kao primer ali ne i kao ograničenje, polipeptide CH2CH3 konstantnih regiona, uključujući polipeptide konstantnih regiona CH2CH3 koji su dobijeni, zajedno ili odvojeno, iz humanih IgG, humanih IgA i humanih IgE, kao i bilo koji polipeptid konstantnog regiona teškog lanca koji je ovde opisan ili pomenut ili za koji se zna ili će tek biti otkriveno da je na neki drugi način koristan. Polipeptidi konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina skraćeni na N terminalnom kraju koji se ne javljaju u prirodi obuhvataju, kao primer a ne i kao ograničenje, bilo koji mutirani polipeptid konstantnog regiona teškog lanca koji je ovde opisan ili pomenut ili za koji se zna ili će tek biti otkriveno daje na neki drugi način koristan.

Različiti specifični konstrukti predmetnog pronalaska obuhvataju, samo kao primer, sledeće:

1. 2H7 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3

2. 2H7scFvVHLllSIgECH2CH3CH4

3. 2H7scFvVHLllSmIgECH2CH3CH4

4. 2H7 scFv VH L11S mlgAH WIgACH2 T4CH3

5. 2H7 scFv VH LI 1S (SSS-S) H K322S CH2 WCH3

6. 2H7 scFv VH LI 1S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3

7. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3

8. 2HUscFvVHLllS (CSS-S) H P331S CH2 WCH3

9. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H T256N CH2 WCH3

10. 2H7 scFv VH LI 1S (SSS-S) H RTPE/ONAK (255-258) CH2 WCH3

11. 2H7 scFv VH LI 1S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3

12. 2H7 scFv VH LI 1S (SSS-S) H A339P CH2 WCH3

13. G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

14. G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3

15. G28-1 scFv VH LI 1S (SSS-S) HWCH2WCH3

16. G28-1 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3

17. G28-1 scFv VH LI 1S (CSC-S) H WCH2 WCH3

18. G28-1 scFv VH LI 1S (SSC-P) H WCH2 WCH3

19. CTLA4 (SSS-S) H P238SCH2 WCH32

20. CTLA4 (CCC-P) WH WCH2 WCH3

21. FC2-2 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

22. FC2-2 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3

23. UCHL-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

24. UCHL-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3

25. 5B9 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

26. 5B9 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3

27. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

28. 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3

29. 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3

30. 2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3

31. 2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + J Lanac

32. 2H7 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3

33. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405YCH3

34. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405ACH3

35. 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 Y407ACH3

36. 2H4 scFv (SSS-S) HWCH2 F405A, Y407ACH3

37. 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3

38. 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCFI3

39. 2H7 scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3

40. 2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 WCH3

41. 2H7 scFv (CCS-P) H WCH2 WCH3

42. 2H7 scFv (SCC-P) H VVCH2 WCH3

43. 2H7 scFv VH LI 1S (SSS-S) H WCH2 WCH3

44. 2H7 scFv VH LI 1S (CSS-S) H WCH2 WCH3

45. G28-1 scFv VH LI 1S (SCS-S) H WCH2 WCH3

46. G28-1 scFv VH LI 1S (CCS-P) H WCH2 WCH3

47. G28-1 scFv VH L11S (SCC-P) H WCH2 WCH3

48. G28-1 scFv VH L11S mlgE CH2 CH3 CH4

49. G28-1 scFv VH LI 1S mlgAH WIgACH2 T4CH3

50. G28-1 scFv VH LI 1S hlgE CH2 CH3 CH4

51. G28-1 scFv VH LI 1S hlgAH WIgACH2 T4CH3

52. HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3

53. HD37 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

54. HD37 scFv VH LI 1S (SSS-S) H WCH2 WCH3

55. L6 scFv IgAH WCH2 WCH3

56. L6 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3

57. 2H7 scFv-llama IgGl

58. 2H7 scFv-llama IgG2

59. 2H7 scFv-llama IgG3

60. CD 16-6 low (ED)(SSS-S) H P238SCH2 WCH3

61. CD16-9 high (ED)(SSS-S) H P238SCH2 WCH3

62. 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hCD80TM/CT

63. 10A8 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hCD80TM/CT

64. 40.2.36 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hCD80TM/CT

65. 2H7 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hCD80TM/CT

66. G19-4 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hCD80TM/CT

67. 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3—hCD80TM/CT

68. 2el2 scFv IgAH IgACH2 T4CH3—hCD80TM/CT

69. 2el2 scFv IgE CH2CH3CH4—hCD80TM/CT

70. 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—mFADD-TM/CT

71. 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3—mFADD-TM/CT

72. 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3—mcasp3-TM/CT

73. 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—mcasp3-TM/CT

74. 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3—mcaspS-TM/CT

75. 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—mcasp8-TM/CT

76. 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3—hcasp3-TM/CT

77. 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hcasp3-TM/CT

78. 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3—hcasp8-TM/CT

79. 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hcasp8-TM/CT

80. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hCD80TM/CT

81. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3—I1CD8OTM/CT

82. 1D8 scFv—mIgAT4—hCD80TM/CT

83. 1D8 scFv--hIgE—hCD80TM/CT

84. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—mFADD-TM/CT

85. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3—mFADD-TM/CT

86. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3—mcasp3-TM/CT

87. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—mcasp3-TM/CT

88. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3—mcasp8-TM/CT

89. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—mcasp8-TM/CT

90. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3—hcasp3—TM/CT

91. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hcasp3-TM/CT

92. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3—hcasp8-TM/CT

93. 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3—hcasp8-TM/CT L6

scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3

94. 2H7 scFv CD 154 (L2)

95. 2H7 scFv CD 154 (S4)

96. CTLA4 IgAH IGACH2CH3

97. CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3

98. 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3

99. 2H7 scFv IgAH IgAHCH2 T18CH3

100. 2H&-40.2.220 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 (bispecifično anti-ccd20-anti-cd40)

101. 2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD89 TM/CT

102. G19-4 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT 103. 2el2 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT

Ova i druga rešenja predmetnog pronalaska biće još jasnija nakon konsultovanja detaljnog opisa koji sledi i priloženih slika. Kao što je ovde naglašeno, svi referencirani patenti, članci, dokumenti i drugi materijali koji su ovde opisani ili identifikovani su ovde inkorporirani u potpunosti po referenci, kao daje svaki od njih inkorporiran pojedinačno.

Kratak opis slika

Slika1 prikazuje DNK i izvedene aminokiselinske sekvence (sekvence čiji su ID brojevi: ) 2H7scFv-Ig, fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina koji je u stanju da specifično veže CD20.

Slika2 prikazuje nivo proizvodnje 2H7scFv-Ig u transficiranim, stabilnim CHO ćelijskim linijama i nastanak standardne krive vezivanjem prečišćenog 2H7scFv-Ig za CHO ćelije koje eksprimiraju CD20.

Slika3 prikazuje SDS-PAGE analizu više preparata izolovanog 2H7scFv-Ig proteina.

Slika4 prikazuje fiksaciju komplementa (slika 4A) i posredovanje 2H7scFv-Ig u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (slika 4B).

Slika 5 prikazuje dejstvo simultanog vezivanja CD20 i CD40 na rast normalnih B ćelija

Slika6 prikazuje dejstvo simultanog vezivanja CD20 i CD40 na ekspresiju CD95 i pokretanje apoptoze u ćelijskoj liniji B limfoblastoida.

Slika7 prikazuje DNK i izvedene aminokiselinske sekvence (sekvence čiji su ID brojevi: _) 2H7scFv-CD154 L2 (Slika 7A, sekvence čiji su ID brojevi: _) i 2H7scFv-CD154 S4 (Slika 7B, sekvence čiji su ID brojevi: ) fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina koji su u stanju da specifično vežu CD20 i CD40.

Slika8 prikazuje vezivanje 2H7scFv-CD154 fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina za CD20+CHO ćelije pomoću protočne imunocitofluorimetrije.

Slika9 prikazuje vezivanje Aneksina V za B ćelijske linije Ramos, BJAB i T51 nakon vezivanja 2H7scFv-CD154 fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina za ćelije.

Slika 10prikazuje uticaje na proliferaciju B ćelijske linije T51 nakon vezivanja 2H7scFv-CDl 54 fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina.

Slika11 predstavlja šematske prikaze struktura fuzionih proteina 2H7scFv-Ig (sekvence čiji su ID brojevi: _) koji se nazivaju CitoksB ili derivati CitoksB: CitoksB-MHWTG1C (2H7 ScFv, mutantni region šarke, Fc domen humanog IgGl divljeg tipa), CitoksB-MHMGlC (2H7 ScFv, mutantni region šarke, mutirani Fc domen humanog IgGl) i CitoksB-IgAHWTGlC (2H7 ScFv, region šarke humanog IgA (sekvenca čiji je ID broj: ), Fc domen humanog IgGl divljeg tipa). Strelicama su označeni brojevi pozicija aminokiselinskih ostataka za koje se veruje da doprinose vezivanju FcR i ADCC aktivnosti (debele strelice) i fiksaciji komplementa (tanke strelice). Primetiti odsustvo interlančanih disulfidnih veza.

Slika 12 prikazuje SDS-PAGE analizu izolovanih CitoksB i 2H7scFv-CD154 fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina.

Slika 13 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela CitoksB derivata.

Slika 14 prikazuje citotoksičnost zavisnu od komplementa CitoksB derivata.

Slika 15 prikazuje određivanja poluživota u serumu za CitoksB-MHWTGlC u uzorcima krvi majmuna rodaMacaca.

Slika 16 prikazuje delovanje CitoksB-MHV/TGlC na koncentracije CD40+ B ćelija u cirkulaciji u uzorcima krvi majmuna rodaMacaca.

Slika 17 prikazuje nivo proizvodnje HD37 (specifičnog za CD-19) ScFv-Ig u transficiranim ćelijskim linijama sisara i nastanak standardne krive vezivanjem prečišćenog HD37 ScFv-Ig za ćelije koje eksprimiraju CD19.

Slika 18 prikazuje nivo proizvodnje L6 (antigen karcinoma) ScFv-Ig u transficiranim, stabilnim CHO ćelijskim linijama i nastanak standardne krive vezivanjem prečišćenog L6 ScFv-Ig za ćelije koje eksprimiraju L6 antigen.

Slika 19 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina 2H7 ScFv-Ig, HD37 ScFv-Ig i G28-1 ScFv-Ig (specifičnog za CD37).

Slika 20 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela fuzionih proteina L6 ScFv-Ig.

Slika 21 prikazuje SDS-PAGE analizu fuzionih proteina L6 ScFv-Ig i 2H7 ScFv-Ig. Slika 22 prikazuje SDS-PAGE analizu fuzionih proteina G28-1 ScFv-Ig i HD37 ScFv-Ig.

Slika 23 prikazuje poravnavanje sekvenci regiona šarke i CH2 domena humanog imunoglobulina IgGl (sekvenca čiji je ID broj: ) sa regionima šarke i CH2 domenima imunoglobulina lame IgGl (sekvenca čiji je ID broj: ), IgG2 (sekvenca čiji je ID broj: ) i IgG3 (sekvenca čiji je ID broj: ).

Slika 24 prikazuje migraciju prečišćenih 2H7 scFv-Ig fuzionih proteina IgG lame u 10% SDS poliakrilamidnom gelu. Prečišćeni fuzioni proteini (5 p.g po uzorku) pripremljeni su u neredukujućem puferu za uzorke (trake 2 do 5) i u redukujućem puferu za uzorke (trake 6*do 9). Traka 1: markeri molekulske mase (neredukujući uslovi); trake 2 i 6: 2H7 scFv - IgGl lame (sekvenca čiji je ID broj: ); trake 3 i 7: 2H7 scFv IgG2 lame (sekvenca čiji je ID broj: ); trake 4 i 8: 2H7 scFv - IgG3 lame (sekvenca čiji je ID broj: ) i trake 5 i 9: Rituksimab (himerno anti-CD20 antitelo (konstantni region humanog IgGl)).

Slika25 prikazuje vezivanje 2H7 scFv - IgGl lame (sekvenca čiji je ID broj: ), 2H7 scFv - IgG2 lame (sekvenca čiji je ID broj: ) i 2H7 scFv - IgG3 lame (sekvenca čiji je ID broj: ), za CD20+ CHO ćelije koje se detektuju pomoću protočne imunocitofluorimetrije.

Slika 26 prikazuje CDC aktivnost fuzionih proteina 2H7 scFv i IgG lame, 2H7 scFv - IgGl lame (sekvenca čiji je ID broj: ), 2H7 scFv - IgG2 lame (sekvenca čiji je ID broj: ) i 2H7 scFv - IgG3 lame (sekvenca čiji je ID broj: ), kao i 2H7 scFv - humani IgGl (2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3) (sekvenca čiji je ID broj: _) prema BJAB ćelijama u prisustvu zečjeg komplementa. Rituksimab je uvršćen kao kontrola.

Slika 27 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela fuzionih proteina 2H7 scFv i IgG lame, 2H7 scFv - IgGl lame (sekvenca čiji je ID broj: ), 2H7 scFv - IgG2 lame (sekvenca čiji je ID broj: ) i 2H7 scFv - IgG3 lame (sekvenca čiji je ID broj: ). Efektorske ćelije (humane PBMC) kombinovane su sa ciljnim ćelijama (BJAB ćelijama) u tri različita odnosa, 1 : 25, 1 : 50 i 1 : 100. Rituksimab je uvršćen kao kontrola. Svaka tačka predstavlja tri odvojena merenja.

Slika 28 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela fuzionih proteina 2H7 scFv i IgG lame, 2H7 scFv - IgGl lame (sekvenca čiji je ID broj: ), 2H7 scFv - IgG2 lame (sekvenca čiji je ID broj: ) i 2H7 scFv - IgG3 lame (sekvenca čiji je ID broj: ). Efektorske ćelije (PBMC lame) kombinovane su sa ciljnim ćelijama (BJAB ćelijama) u tri različita odnosa, 1 : 25, 1 : 50 i 1 : 100. Rituksimab je uvršćen kao kontrola. Svaka tačka predstavlja tri odvojena merenja.

Slika 29 prikazuje aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa Reh ćelija (akutna limfocitna leukemija) koje eksprimiraju scFv-Ig fuzione proteine na površini ćelija. Reh ćelije su transficirane konstruktima koji kodiraju scFv antitela specifična za humane kostimulatorne molekule, CD152, CD28, CD40 i CD20, fuzionisana za region šarke - CFI2 - CH3 humanog IgGl divljeg tipa, koji je fuzionisan za humani transmembranski domen CD80 i za domen citoplazmatskog repa. Aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa merena je u prisustvu i odsustvu zečjeg komplementa (plus C i bez C, respektivno). Podaci predstavljaju prosečnu vrednost u uzorcima u duplikatu. Reh anti-hCD152 scFvIg: Reh ćelije transficirane polinukleotidom 10A8 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); Reh anti-hCD28scFvIg: 2E12 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); Reh anti-hCD40scFvIg: 4.2.220 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); i Reh anti-hCD20scFvIg: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MT CH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _).

Slika 30 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela Reh ćelija koje su transficirane konstruktima koji kodiraju scFv antitela specifična za humane kostimulatorne molekule, CD152, CD28, CD40 i CD20, kao što je opisano za sliku 29, kao i za mišji CD3, fuzionisane za mutantni region šarke humanog IgGl i mutantni CH2 i CH3 divljeg tipa (Reh anti-mCD3scFv označava Reh ćelije transficirane polinukleotidom 500A2 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (sekvenca čiji je ID broj: __)), koji su fuzionisani za transmembranski domen i domen citoplazmatskog repa humanog CD80. Podaci predstavljaju prosečne vrednosti iz četvorostrukih uzoraka.

Slika 31 prikazuje listu konstrukta konstantnog regiona imunoglobulina koji su korišćeni

u eksperimentima prikazanim na slikama koje slede.

Slika 32 prikazuje aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa fuzionih proteina CTLA-4 i Ig, CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) (2 pg/ml) i CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _ J (2 pg/ml) u prisustvu i odsustvu zečjeg komplementa (plus C i bez C, respektivno). Ciljne ćelije su Reh ćelije i Reh ćelije transficirane pomoću CD80 (Reh CD80.10).

Slika 33 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela fuzionih proteina CTLA-4 i Ig, CTLA-4 IgG WTH (CCC) V/TCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J (2 ug/ml) i CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) (2 pg/ml). Efektorske ćelije, humane PBMC, dodate su ciljnim ćelijama, Reh ili Reh CD80.1, u naznačenim odnosima. Slika 33A prikazuje nivo prirodnog usmrćivanja kod Reh 80.1 ćelija u odsustvu bilo kakvih fuzionih proteina Ig. Slika 33B prikazuje citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela posredovanu pomoću CTLA-4 IgG MTH MTCH2WTCH3, dok slika 33C prikazuje citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela posredovanu pomoću CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3. Svaki podatak predstavlja prosečnu vrednost procenta specifičnog usmrćivanja merenog u četiri polja sa uzorcima.

Slika 34 prikazuje vezivanje 2H7 (anti-CD20) scFv Ig fuzionih proteina za (CD20+) CHO ćelije pomoću protočne imunocitofluorimetrije.

Slika 35 prikazuje imunoblot 2H7 scFv IgG i IgA fuzionih proteina. COS ćelije su prolazno transficirane različitim konstruktima 2H7 scFv Ig fuzionih proteina. Eksprimirani polipeptidi staloženi su građenjem imunoprecipitata sa proteinom A, odvojeni u neredukujućem SDS poliakrilamidnom gelu, a onda prebačeni na polivinil fluoridnu membranu. Proteini su detektovani korišćenjem anti-humanog IgG (specifičnog za Fc) konjugovanog za peroksidazu iz rena. Traka 1: samo vektor; traka 2: 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); traka 3: 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); traka 4: 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); traka 5: 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __); i traka 6: 2H7 scFv IgG MTH (SSS) V/TCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _).

Slika36 prikazuje vezivanje polipeptida 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J i 2H7 scFv IgAH lgAT4 (sekvenca čiji je ID broj: _J za (CD20+) CHO. ćelije pomoću protočne imunocitofluorimetrije. Izvor polipeptida bili su supernatanti kultura prolazno transficiranih COS ćelija. COS ćelije transficirane plazmidom koji sadrži sekvencu koja kodira 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 kotransficirane su plazmidom koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani J lanac.

Slika37 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela anti-CD20 (2H7) scFv Ig fuzionih proteina prema BJAB ciljnim ćelijama korišćenjem potpune krvi kao izvora efektorskih ćelija. Prečišćeni 2H7 scFv Ig fuzioni proteini su titrovani i kombinovani sa BJAB ćelijama obeleženim<5I>Cr (5 x IO<4>) i potpunom krvlju (konačno razblaženje 1 : 4). Svaka tačka predstavlja prosečnu vrednost procenta specifičnog usmrćivanja merenog u četiri polja sa uzorcima.

Slika38 prikazuje aktivnost citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela 2H7 scFv Ig fuzionih proteina (5 u.g/ml) prema BJAB ćelijama obeleženim<5!>Cr pri razblaženjima potpune krvi od 0,25, 0,125 i 0,625. Svaka tačka predstavlja prosečnu vrednost procenta specifičnog usmrćivanja merenog u četiri polja sa uzorcima.

Slika39 prikazuje poređenje aktivnosti citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (5 pg/ml) i 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (5 ug/ml) kada su humane PBMC izvor efektorskih ćelija (slika 39A) i kada je potpuna krv izvor efektorskih ćelija (slika 39B).

Slika40 prikazuje imunoblot 2H7 scFv Ig fuzionih proteina. COS ćelije su prolazno transficirane različitim konstruktima 2H7 scFv Ig fuzionih proteina. Supernatanti kultura koji sadrže eksprimirane polipeptide odvojeni su u neredukujućem SDS poliakrilamidnom gelu nakon čega su prebačeni na polivinil fluoridnu membranu. Proteini su detektovani korišćenjem anti-humanog IgG (specifičnog za Fc) konjugovanog za peroksidazu iz rena. Trake 1 do 5: prečišćeni 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 pri koncentraciji od 40 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng i 2,5 ng po traci, respektivno. Supernatanti kulture razdvajani su u trakama 6 do 9. Traka 6: 2H7 scFv IgG WTH (CCC) V/TCH2CH3; traka 7: 2H7 scFv IgG MTH (CSS) V/TCH2CH3; traka 8: 2H7 scFv IgG MTH (SCS) V/TCH2CH3; i traka 9: 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) V/TCH2CH3. Molekulska masa (u kDal) proteina markera prikazana je na levoj strani imunoblota.

Slika 41 prikazuje ekspresiju 1D8 (anti-mišjeg 4-1BB) scFv IgG WTH VVTCH2CH3-CD80 fuzionog proteina na ćelijskoj površini ćelija Kl735 melanoma pomoću protočne imunocitofluorimetrije (Slika 41 A). scFv fuzioni protein detektovan je pomoću F(ab')2kozjeg anti-humanog IgG konjugovanog sa fikoeritrinom. Slika 41B prikazuje rast tumora u naivnim CH3 miševima kojima su potkožnom injekcijom usađene ćelije divljeg tipa K1735 melanoma (K1735-WT) ili ćelije K1735 koje su transficirane pomoću 1D8 scFv IgG WTH V/TCH2CH3-CD80 (K1735-1D8). Rast tumora je praćen merenjem veličine tumora. Slika 41C prikazuje kinetiku rasta tumora u naivnim CFI3 miševima kojima su intraperitonealno ubrizgana monoklonska antitela kako bi se uklonile CD4<+>, CD8<+>ili i CD4<+>i CD8<+>T ćelije pre usađivanja K1735-1D8 ćelija u životinje.

Slika 42 prikazuje terapiju razvijenih K1735-V/T tumora korišćenjem K1735-1D8 kao imunogena. Šest dana nakon što su miševima usađeni K1735-WT tumori, jednoj grupi (pet životinja) potkožno su ubrizgane ćelije K1735-1D8 (prazni krugovi) ili ozračene ćelije K1735-WT (puni kvadrati) na kontralateralnoj strani. Kontrolna grupa miševa dobijala je PBS (prazni kvadrati). Tretman je ponavljan u danima označenim strelicama.

Slika 43 prikazuje rast tumora kod životinja kojima je potkožno ubrizgano 2 x IO<6>K1735-WT ćelija (puni kvadrati) i rast tumora kod životinja kojima je potkožno ubrizgano 2 x 10<6>K1735-WT ćelija plus 2 x 10<5>K1735-1D8 ćelija (prazni trouglovi).

Slika 44 prikazuje analizu protočne citometrije tumorskih ćelija antigeni04 mišjeg sarkoma transficiranih pomoću 1D8 scFv IgG WTH V/TCH2CH3-CD80 izolovanog -nakon ponavljanih pretraga za anti-humani IgG. Transficirane ćelije koje eksprimiraju 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80 detektovane su pomoću kozjeg anti-humanog IgG konjugovanog sa fiuorizotiocijanatom (FITC) (prikazanog crnom bojom). Netransficirane ćelije prikazane su sivom bojom.

Slika 45 prikazuje migraciju različitih 2H7 scFv IgG fuzionih proteina u 10% SDS-PAGE gelu. 2H7 korišćen je kao anti-CD20 scFv, dok je 40.2.220 korišćen kao anti-CD40 scFv. Traka 1: predhodno obojeni standardi molekulskih masa, Bio-Rad; traka 2: anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2V/TCH3; traka 3: anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) VVTCH2CH3; traka 4: 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3; traka 5: anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3; traka 6: Rituksimab; traka 7: standardi molekulskih masa, Novex Multimark®.

Slika 46 prikazuje efektorsku funkciju izmerenu u testu citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela 2H7 Ig fuzionih proteina koji sadrže mutantni CH2 domen ili CH2 domen divljeg tipa. Procenat specifičnog usmrćivanja ciljnih BJAB ćelija u prisustvu humanih PBMC efektorskih ćelija, od strane 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (rombovi) poređen je sa 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (kvadrati) i 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 (trouglovi) i Rituksimabom (krugovi).

Slika 47prikazuje ekspresiju anti-humanog CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ) fuzionog proteina na ćelijskoj površini Reh ćelija (slika 47A) i T51 limfoblastoidnih ćelija (slika 47B) merenjem linearnog fluorescentnog ekvivalenta<*>(LFE) korišćenjem protočne imunocitofluorimetrije.

Slika 48 prikazuje procenat specifičnog usmrćivanja netransficiranih ćelija Reh i T51 i procenat specifičnog usmrćivanja Reh ćelija (Reh anti-hCD3) (slika 48A) i T51 ćelija (T51 anti-hCD3) (slika 48B) koje su transficirane konstruktom koji kodira scFv antitela specifična za humani CD3, fuzionisanim za humani IgGl divlji tip region šarke - CH2-CH3 koji je fuzionisan za transmembranski domen i domen citoplazmatskog repa humanog CD80 (anti-humani CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: _)). Humane PBMC (efektorske ćelije) mešane su sa ciljnim BJAB ćelijama u naznačenim odonsima.

Slika49 prikazuje vezivanje 5B9, anti-mišjeg CD137 (4-1BB) monoklonskog antitela i 5B9 scFv IgG fuzionog proteina (5B9 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: )) za stimulisane humane PBMC. Vezivanje 5B9 scFv IgG fuzionog proteina detektovano je pomoću protočne imunocitofluorimetrije, uz upotrebu kozjeg anti-humanog IgG konjugovanog za FITC. Vezivanje 5B9 monoklonskog antitela detektovano je koričćenjem kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog za FITC.

Slika 50prikazuje dejstvo LVH11S mutacije na ekspresiju 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3 ("CitoksB scFv Ig", (sekvenca čiji je ID broj: )) u ćelijskim linijama CHO.

Slika 51prikazuje polu-kvantitativnu SDS-PAGE analizu kojom se ispituje ekspresija 2H7 LVnl1S scFv WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) pri prolaznoj transfekciji u CHO ćelijama. U trakama 2 do 5 su različite količine 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3. U trakama 6

do 10 su uzorci od po 10 u.1 iz pet različitih klonova koji eksprimiraju 2H7 LVH11S scFv WCH2 WCH3.

Slika 52prikazuje razlike u kapacitetu vezivanja između konstrukta G28-1 LVhI 1S scFv

Ig (sekvenca čiji je ID broj: ) i konstrukta fuzionog proteina vezujućeg domena G28-1 scFv Ig divljeg tipa (sekvenca čiji je ID broj: ), koje su obe dobijene iz prolazno transficiranih COS ćelija. Vezivanje za Ramos ćelije utvrđeno je korišćenjem protočne citometrije. Podaci pokazuju značajno povećanje u vezivanju VhI 1S proteina za CD37+ Ramos ćelije.

Slika 53prikazuje povećane nivoe ekspresije G28-1 LVH11S scFv Ig konstrukta (sekvenca čiji je ID broj: ) u poređenju sa konstruktom G28-1 scFv Ig divljeg tipa u COS. Količine proteina poređene su korišćenjem imunoblot analize. Oba gela imunoblota imala su kvantifikovane količine prešišćenog konstrukta predmetnog pronalaska G28-1 scFv Ig (SSS-S) H WCH2 WCH3 u trakama 1 do 4. Trake 5 do 9 prvog imunoblota predstavljaju pet različitih klonova od kojih je svaki transficiran sa G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 dok trake 5 do 9 drugog imunoblota predstavljaju pet različitih klonova od kojih je svaki transficiran sa G28-1 LVH11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3. Imunoblotovi pokazuju da oblik LVH11S oblik izaziva ekspresiju G28-1 scFv Ig konstrukta u veoma velikim količinama.

Slika 54 prikazuje vezivanje 2H7 scFv Ig derivata sa promenjenim regionima šarki (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , , , ) za CHO ćelije koje eksprimiraju CD20 (CD20+ CHO) pomoću protočne citometrije i pokazuje da ovi konstrukti sa promenjenim regionima šarki (uključujući (SSS-S), (CSS-S), (SCS-S) i (CSC-S) regione šarki) zadržavaju funkciju vezivanja CD20.

Slika 55 prikazuje sposobnost za posredovanje u citotoksičnosti posredovanoj ćelijama zavisnoj od antitela različitih konstrukta prema Bjab ciljnim ćelijama: (A) 2H7 scFv Ig konstrukta predmetnog pronalaska koji sadrže povezujuće regione koji sadrže (CSS-S), (SCS-S), (CSC-S) i (SSS-S) regione šarki (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , , , ) i

(B) 2H7 scFv Ig konstrukta predmetnog pronalaska sa različitim povezujućim regionima i regionima repa (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , ). Procenat specifičnog

usmrćivanja poredi se sa ukupnim usmrćivanjem koje izaziva detergent. Kontrole su prirodno usmrćivanje ciljnih ćelija sa dodatim efektorima i 2H7 konstrukti sa IgA regionom šarke kao povezujućim regionom i regionom repa dobijenim iz IgA koji se ne vezuje za PBMC efektore.

Slika 56 prikazuje sposobnost raznih 2H7 scFv Ig konstrukata predmetnog pronalaska (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , ) koji uključuju povezujuće regione koji imaju različite regione šarki (npr., (CSC-S), (SSS-S), (SCS-S) i (CSS-S)) da posreduju u aktivnosti komplementa u Ramos ćelijama. Procenat specifičnog usmrćivanja meri se naspram samog komplementa kao kontrole, dok se 100% usmrćivanje određuje izlaganjem ćelija detergentu.

Slika 57 prikazuje vezivanje 2H7 scFv Ig konstrukata predmetnog pronalaska koji sadrže različite regione repa (sekvence čiji su ID brojevi: , , ) za CD20+ CHO korišćenjem imunocitofluorimetrije. Različiti proteini detektovani su pomoću anti-IgG, anti-IgA i anti-IgE konjugovanih za FITC.

Slika 58A prikazuje vezivanje 2H7 VHLI 1S scFv IgECH2CH3CH4, prečišćenih korišćenjem hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja ("Hvdrophobic charge induction chromatographv", HCIC) i eluirani pri različitim pH 4,0 i 3,5 (sekvenca čiji je ID broj: ) u CD20+ CHO ćelijama pomoću protočne imunocitofluorimetrije, što ukazuje da su proteini vezivali CD20 bez obzira na to da li su eluirani pri pH od 4,0 ili 3,5. Slika 58B je grafik koji ukazuje na sposobnost ovih 2H7 VH L11S scFv IE konstrukata za posredovanje u, na primer, ADCC u Bjab ciljnim ćelijama.

Slika 59 prikazuje kapacitet G28-1 VH LI 1S scFv mIgECH2CH3CH4 (sekvenca čiji je

ID broj: ) za vezivanje (A) za Bjab i Ramos ciljne ćelije i (B) za CD20+ CHO ćelije pomoću protočne citofluorimetrije.

Slika 60 prikazuje hromatografske profile tečne hromatografije visokih performansi ("High Performance Liquid Chromatographv", HPLC) različitih proteinskih konstrukata predmetnog pronalaska (A) 2H7 scFv (SSS-S) H (P283S)CH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), (B) 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3, (sekvenca čiji je ID broj: _), (C) 2H7 scFv (SCS-

S) H WCH2 WCH3, (sekvenca čiji je ID broj: _) i (D) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 (Y407A)CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __), koji ukazuju da konstrukt A ima oblike sa određenim molekulskim masama od 100 kD i 75 kD i da se, uvođenjem određenih promena u velikom višku dobija oblik molekulske mase 75 kD, kao što se vidi u konstruktima B, C i D. Videti primer 40.

Slika 61 prikazuje HPLC profile različitih proteinskih konstrukata predmetnog pronalaska (A) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), (B) 2H7 scFv

(CSC-S) H WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: __), (C) 2H7 scFv (CCC-P) H WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) i (D) 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: ), koji ukazuju da konstrukt A ima oblike sa određenim molekulskim masama od 100 kD

i 75 kD i da se, uvođenjem određenih promena u velikom višku dobija oblik molekulske mase 75 kD, kao što se vidi u konstruktima B i C, dok konstrukt D (koji ima region repa IgA) ima određenu molekulsku masu od 150 kD. Videti primer 40.

Slika 62 prikazuje HPLC profile različitih proteinskih konstrukata predmetnog pronalaska (A) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), (B) 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 "WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), (C) 2H7 scFv IgA 3TCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) i (D) 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 (F405A Y407A)CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ), koji ukazuju da konstrukt A ima oblike sa određenim molekulskim masama od 100 kD i 75 kD, da konstrukt B ima oblik koji se javlja u velikom višku određene molekulske mase od 75 kD, dok konstrukt C sa T4 mutacijom dovodi do pojave tri oblika sa određenim molekulskim masama blizu 600 kD a konstrukt D sa dvostrukom tačkastom mutacijom u CHS regionu dovodi do oblika koji se javlja u velikom višku koji ima određenu molekulsku masu od manje od 44 kD. T4 mutacija se ovde odnosi na skraćivanje za četiri aminokiselinska ostatka iz CHS regiona. Videti primer 40.

Slika 63 prikazuje poređenje dejstva 2H7 VHLI 1S scFv Ig konstrukata (sekvence"čiji su ID brojevi: , ) sa i bez F405A i Y407A promena u CH3 regionu na vezivanje CD20+ CHO ćelija pomoću protočne citofluorimetrije, koje ukazuje na gubitak kapaciteta za vezivanje sa uvođenjem ove dvostruke aminokiselinske promene. Videti primer 41.

Slika 64 prikazuje kapacitet za vezivanje 2H7 VhLI 1S scFv Ig derivata (sekvence čiji su

ID brojevi: , , , ) konjugovanih za FITC za CD20+ CHO ćelije pomoću protočne citofluorimetrije, koji ukazuje da ovi konstrukti ne gube kapacitet vezivanja kada su konjugovani za fluorescentni marker. Videti primer 41.

Slika 65 prikazuje neredukujuću SDS-PAGE analizu kojom se ispituje 10 (ig (po traci) raznih prečišćnih 2H7 VhLI 1S scFv Ig konstrukata predmetnog pronalaska (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , ), koja ukazuje na određenu molekulsku masu za svaki konstrukt u odnosi na standarde molekulske mase u traci 1. Videti primer 41.

Slika 66 prikazuje poređenje sekvenci CH2 domena četiri različita humana IgG regiona, hlgGl, MgG2, hIgG3, hIgG4 i jednog regiona pacova, rIgG2b. Tačkaste mutacije koje utiču na ADCC i CDC označene su strelicama. Videti primer 52.

Slika 67 prikazuje sposobnost raznih 2H7 VhLUS scFv Ig konstrukata (sekvence čiji su

ID brojevi: , ) da posreduju pri ADCC u CHO i Leci3 CHO prolazno transficiranim ćelijama, ukazujući da su konstrukti koji su eksprimirani u Lec 13 CHO ćelijama imali 20% povećanje specifičnog usmrćivanja u odnosu na isti konstrukt koji je eksprimiran u regularnim CHO ćelijama. Videti primer 42.

Slika 68 prikazuje SDS-PAGE analizu, i redukujuću i neredukujuću, alela rastvornog CD 16(ED) (SSS-S) H P283S CH2 WCH3 (sekvence čiji su ID brojevi: _, _) sa visokim i hiskim ' afinitetom. Videti primer 43.

Slika 69 prikazuje različite kapacitete vezivanja fuzionih proteina CD 16 visokog i niskog afiniteta (sekvence čiji su ID brojevi: _, __) za 2H7 VhLI 1S scFv (CSC-S) WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) ili 2H7 VHLI 1S scFv (SSS-S) WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) i ukazuje na gubitak vezivanja alela sa visokim i niskim afinitetom korišćenjem P238S CH2 konstrukata. Videti primer 43.

Slika 70 prikazuje dijagram (A) testa koji je korišćen za otkrivanje promena u Fc receptoru korišćenjem fuzionog proteina vanćelijskog domena CD 16 i IgG sa mutiranim repom,

što eliminiše samoasocijaciju, konjugovanim za FITC i (B) sisarski sistem za izlaganje koji koristi ekspresiju konstrukata na ćelijskoj površini. Videti primer 44.

Slika 71 prikazuje pokretanje apoptoze u Bjab i Ramos ćelijama različitim mAb (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , , ) i scFvIg konstruktima predmetnog pronalaska (sekvence čiji su ID brojevi: , , , , , ). Videti primer 45.

Slika 72 prikazuje sposobnost 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S)

H P238SCH2 WCH3 konstrukata da pokrenu apoptozu u Ramos ćelijama koja je posredovana aktivacijom kapsaze 3. Rezultati ukazuju da, pod ovim uslovima, oba konstrukta vezuju CD20 i pokreću apoptozu.

Slika 73 prikazuje sposobnost 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S)

H P238SCH2 WCH3 konstrukata da posreduju u CDC aktivnosti kod CD20 pozitivnih Bjab ciljnih ćelija. Rezultati pokazuju da su oba konstrukta bila u stanju da posreduju pri CDC.

Slika 74 prikazuje poređenje sposobnosti 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 konstrukata da posreduju u ADCC u Bjab ciljnim ćelijama. Rezultati pokazuju daje konstrukt 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 bio veoma efikasan i da

je doveo do veoma visokog specifičnog usmrćivanja, dok konstrukt 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 nije bio delotvoran u posredovanju u ADCC.

Slika 75 prikazuje poređenje sposobnosti 2FI7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 konstrukata da vezuju CD16 (visokoafinitetne i niskoafinitetne oblike) u CD20 pozitivnim CHO ćelijama. Rezultati pokazuju daje 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 bio u stanju da veže CD16 (oba oblika), dok 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 nije bio u stanju da veže CD16 (ni jedan oblik).

Slika 76 prikazuje poređenje sposobnosti 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 konstrukata da vezuju CD64 pozitivne U937 ćelije. Rezultati pokazuju da su oba konstrukta imala visok afinitet za FcyRI, a daje P238S mutacija selektivno smanjivala vezivanje za FcyRIII.

Slika 77 prikazujein vivoeksperiment u majmuna rodaMacacau kojem je mereno dejstvo 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 konstrukata na smanjenje broja B ćelija. Konstrukti su primenjivani sa razmakom od nedelju dana a broj B ćelija je određivan u danima -7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 i 43, korišćenjem potpune krvi i dvobojne protočne citometrije. Rezultati pokazuju da je 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 konstrukt doveo do brzog i potpunog iskorenjivanja B ćelija, koje je trajalo do 28 dana nakon druge injekcije. Nasuprot tome, 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 konstrukt doveo je do sporog smanjenja broja B ćelija do oko 50% u prve dve nedelje; međutim, ubrzo potom, B ćelije su brzo počele da se vraćaju na normalan nivo. Ovo ukazuje da je ADCC posredovana interakcijom CD 16 verovatno neophodna za brzo i trajno iskorenjivanje B ćelija.

Slika 78prikazuje SEC profile G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 i G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 konstrukata. Konstrukt sa SSS regionom šarke dao je mali ujednačen vrh na približno 75 do 100 kD, dok je konstrukt sa SSC regionom šarke dao manju oblik i druge heterogene oblike, uključujući jedan veći od 200 kD.

Slika 79prikazuje sposobnost vezivanja G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 i G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 konstrukata u ćelijama B ćelijskog limfoma: Bjab, Ramos, WIL-2, Namlavva i Raji. Rezultati u (a) pokazuju da se G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 vezivao za Bjab i Ramos ćelije, umereno za WIL-2 ćelije, a u manjim količinama za Namlavva i Raji ćelije. Rezultati u (b) pokazuju da se G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 vezivao za Bjab ćelije, umereno za Ramos i WIL-2 ćelije, a u manjim količinama za Namlavva i Raji ćelije.

Slika 80prikazuje vezivanje aneksina i v-propidijum jodida u Ramos ćelijama inkubiranim preko noći sa G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 i G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 konstruktima. Rezultati pokazuju da oba konstrukta pokreću apoptozu; ipak, konstrukt sa (SSC) regionom šarke pokrenuo je više apoptoze nego konstrukt sa (SSS) regionom šarke.

Slika 81prikazuje sposobnost G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 i G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 konstrukata da inhibraju proliferaciju Ramos ćelija. Rezultati pokazuju da su oba konstrukta inhibirala proliferaciju.

Slika 82prikazuje sposobnost G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 i G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 konstrukata da pokrenu apoptozu u Ramos B ćelijama, sami i u različitim kombinacijama. Rezultati do kojih se došlo u ovim rezultatima pokazuju da su oba G28-1 konstrukta bila delotvornija od 2H7 konstrukta. Rezultati rakođe pokazuju da je G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3 konstrukt delotvorniji od G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 konstrukta. Međutim, količina apoptoze bila je najveća kada su 2H7 konstrukti i G28-1 konstrukti korišćeni u kombinaciji.

Slika 83 prikazuje poređenje sposobnosti G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3, G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 konstrukata za posredovanje pri CDC u Ramos B ćelijama. Rezultati su pokazali da svi konstrukti posreduju pri CDC. 2H7 konstrukt je bio najdelotvorniji, pratio ga je G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 a potom G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3.

Slika 84 prikazuje poređenje sposobnosti G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2 WCH3, G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 konstrukata za posredovanje pri ADCC u Ramos B ćelijama. Rezultati su pokazali da su G28-1 VL11S scFv

(SSS) H WCH2 WCH3 i G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2 WCH3 konstrukti bili u stanju da posreduju pri ADCC, dok je sposobnost 2H7 scFv (CSS) H WCH2 WCH3 konstrukta za posredovanje pri ADCC bila niža, ali ipak viša od nivoa prirodnog usmrćivanja.

Detaljan opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na nove molekule koji su korisni, na primer, kao terapeutici, kao i u druge svrhe koje uključuju dijagnostiku i istraživanje. Takvi molekuli imaju,

na primer, antigen - vezujuću ili drugu(e) funkciju(e) i, na primer, jednu ili više efektorskih funkcija. Predmetni pronalazak obuhvata molekulske konstrukte, uključujući fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina i povezane preparate i postupke, koji će biti korisni u imunoterapeutskim i imunodijagnostičkim primenama, kao i u istraživačkim postupcima, a koji će doneti određene prednosti nad antigen-specifičnim jedinjenjima i polipeptidima koji su od ranije poznati struci. Poželjno je da su konstrukti predmetnog pronalaska, uključujući fuzione proteine, pojedinačni polipeptidni lanci koji sadrže, kao značajnu odliku, sledeće fuzionisane ili na drugi način povezane domene ili regione: konstrukt vezujućeg regiona, kao što je vezujući domen ili polipeptid, konstrukt povezujućeg regiona uključujući, na primer, nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid regiona šarke imunoglobulina, kao i konstrukt regiona repa, uključujući, na primer, konstrukt koji može da sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH2 konstantnog regiona teškog lanca i nativnog ili inžinjeringom dobijenog polipeptida CH3 konstantnog regiona teškog lanca. Prema određenim rešenjima koja su posebno korisna u genskoj terapiji, konstrukti predmetnog pronalaska, uključujući fuzione proteine, mogu dalje da sadrže nativni ili inžinjeringom dobijeni domen sidra u plazminoj membrani. Prema određenim drugim poželjnim rešenjima konstrukti predmetnog pronalaska, uključujući fuzione proteine, mogu dalje da sadrže region repa koji ima nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid CH4 konstantnog regiona teškog. lanca imunoglobulina. U posebno poželjnim rešenjima, vezujući regioni, kao što su polipeptidni domeni, od kojih su sastavljeni konstrukti, uključujući fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina, su, ili su dobijeni iz, polipeptida koji su proizvodi humanih genskih sekvenci,

ali nema potrebe da pronalazak bude toliko ograničen te može, zapravo, da se odnosi na konstrukte, uključujući fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina, kao što je ovde

predviđeno, koji su dobijeni iz bilo kog prirodnog i veštačkog izvora, uključujući polipeptide dobijene genetskim inžinjeringom i/ili mutirane polipeptide.

Predmetni pronalazak se u jednom delu odnosi i na iznenađujuće otkriće da su novi konstrukti, uključujući fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina, koji su ovde opisani, sposobni za imunološke aktivnosti. Preciznije, ovi proteini zadržavaju sposobnost da učestvuju u dobro poznatim imunološkim efektorskim aktivnostima uključujući, na primer, citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela (npr., nakon vezivanja antigena na ćelijskoj površini, uključivanje i pokretanje citotoksičnih efektorskih ćelija koje nose odgovarajuće Fc receptore, kao što su ćelije prirodne ubice koje nose FcRyIII, pod odgovarajućim uslovima) i/ili fiksaciju komplementa u citotoksičnosti posredovanoj komplementom (npr., nakon vezivanja antigena na ćelijskoj površini, regrutacija i aktivacija citolitičkih proteina koji su sastojci kaskade komplementa u krvi) uprkos tome što imaju strukturu od koje se ne očekuje da bude u stanju da pospešuje takve efektorske aktivnosti ili da pokreće aktivnosti koje su ovde opisane. Za opise ADCC i CDC videti, npr., Čarter, 2001,Nat. Rev. Canc.1: 118; Sulicaet al,2001Int. Rev. Immunol20: 371; Malonevet al,2002,Semin. Oncol29: 2; Sondelet al,2001Hematol Oncol Clin North Am15 (4): 703 - 21; Maloney 2001Anticanc. Drugs12 Dodatak 2: 1 - 4. IgA aktivacija komplementa alternativnim putem opisana

je, na primer, u Schneidermanet al,1990J. Immunol.145: 233. Kao što je detaljnije opisano kasnije, ADCC, fiksacija komplementa i CDC su neočekivane funkcije za konstrukte, uključujući fuzione proteine, koji sadrže, na primer, regione teških lanaca imunoglobulina i koji imaju strukture koje su ovde opisane, a posebno za fuzione proteine imunoglobulina koji sadrže,

na primer, polipeptide regiona šarki imunoglobulina čija je sposobnost da grade interlančane homodimerne disulfidne veze narušena.

Još jedna prednost koju donosi predmetni pronalazak su konstrukti, uključujući fuzione polipeptide vezujućih domena i imunoglobulina, predmetnog pronalaska koji mogu da budu proizvedeni u značajnim količinama koje su obično veće od onih koje se rutinski dobijaju kod konstrukata jednolančanih antitela koji su od ranije poznati struci, na primer. U poželjnim rešenjima, konstrukti, uključujući fuzione polipeptide vezujućih domena i imunoglobulina, predmetnog pronalaska rekombinaciono su eksprimirani u sisarskim i drugim poželjnim i korisnim ekspresionim sistemima, koji nude prednost dobijanja polipeptida koji su stabilniin vivo(npr., pod fiziološkim uslovima). Prema neograničavajućoj teoriji, takva stabilnost može delimično da potiče od posttranslacionih modifikacija, posebno glikozilacije. Proizvodnja konstrukata, uključujući konstrukte fuzionih proteina vezujućih domena i imunoglobulina, predmetnog pronalaska, rekombinantnom ekspresijom u sisarima, dobijena je u statičkim kulturama ćelija u količinama većim od 50 mg proteina po litru supernatanta kulture i rutinski je primećena u količinama od 10 do 50 mg/litru, tako daje poželjno da može da se proizvede najmanje 10 do 50 mg/litru pod uslovima statičke kulture; takođe je razmatrana poboljšana proizvodnja, u potpunosti ili delimično, proteinskih konstrukata predmetnog pronalaska korišćenjem metodologija skaliranja koje su priznate u struci, kao što je proizvodnja "u punjenom baču" (t.j. nestatička), gde se dobijaju prinosi od najmanje 5 do 500 mg/l, a u nekim slučajevima najmanje 0,5 do 1 gm/1, u zavisnosti od konkretnog proteinskog proizvoda.

Konstrukt, uključujući polipeptid vezujućeg regiona, prema predmetnom pronalasku može da bude, na primer, bilo koji polipeptid koji ima sposobnost da specifično prepozna i da se veže za srodni biološki molekul ili kompleks više od jednog molekula ili skup ili agregat, bilo da je stabilan ili prolazan, takvog molekula. Takvi molekuli uključuju proteine, polipeptide, peptide, aminokiseline, ili njihove derivate; lipide, masne kiseline ili slične, ili njihove derivate; nukleinske kiseline, nukleotide, nukleoz'de, purine, pirimidine ili srodne molekule, ili njihove derivate; ili bilo koju kombinaciju ovih molekula, kao što su, na primer, glikoproteini, glikopeptidi, glikolipidi, lipoproteini, proteolipidi; ili bilo koje druge biološke molekule koji mogu da budu prisutni u biološkom uzorku. Biološki uzorci mogu da budu dobijeni, na primer, uzimanjem uzorka krvi, uzorka biopsije, eksplantacijom tkiva, kulturom organa, iz biološke tečnosti ili bilo kog drugog tkiva ili ćelije ili drugog preparata iz pacijenta ili biološkog izvora. Pacijent ili biološki izvor mogu, na primer, da budu ljudi, ili druge životinje, primarna ćelijska kultura ili ćelijska linija prilagođena kulturi uključujući ali se ne ograničavajući na ćelijske linije dobijene genetskim inžinjeringom koje mogu da sadrže hromozomalno integrisane ili epizomalne rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina, imortalizovane ćelijske linije ili ćelijske linije koje mogu da budu imortalizovane, ćelijske linije hibridnih somatskih ćelija, diferencirane ćelijske linije ili ćelijske linije koje mogu da budu diferencirane, transformisane ćelijske linije i slične, itd. U određenim poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska, može da postoji sumnja da pacijent ili biološki izvor imaju, ili su pod rizikom da razviju, bolest, poremećaj ili stanje, uključujući malignu bolest, poremećaj ili stanje ili poremećaj B ćelija, koji u određenim daljim rešenjima može da bude autoimuna bolest, a u određenim drugim rešenjima predmetnog pronalaska može da se zna da pacijent ili biološki izvor nisu pod rizikom da razviju ili da nemaju takvu bolest, poremećaj ili stanje.

Vezujući region, uključujući i polipeptid vezujućeg domena, na primer, može da bude bilo koji partner u vezivanju biološkog ili drugog molekula koji se ili javlja u prirodi, ili je sintetički, polusintetički ili dobijen rekombinantnim tehnikama, koji je posmatrana ciljna struktura, a koji se ovde ponekad označava kao "antigen" ali koji, prema predmetnom pronalasku, treba da obuhvata bilo koji ciljni biološki ili drugi molekul za koji je poželjno da se predmetni pronalazak, na primer, fuzioni protein, veže ili specifično veže. Konstrukti predmetnog pronalaska, uključujući fuzione proteine vezujućih domena i imunoglobulina, definisani su kao "imunospecifični" ili sposobni za vezivanje u željenom stepenu, uključujući specifično vezivanje, ako vezuju željeni ciljni molekul kao što je antigen, kao što je ovde opisano, željenom jačinom, na primer, sa Kavećom ili jednakom približno IO<4>M"', poželjno je većom od ili jednakom približno IO<5>M"1, još poželjnije je većom od ili jednakom približno IO6 M"', ajoš poželjnije je većom od ili jednakom približno IO7 M"<1>. Afiniteti veći od oko IO7 M"<1>su još poželjniji, kao što su i afiniteti jednaki ih veći od oko 10 M" , oko 10 M" i oko 10 M" i oko 10<10>M"<1.>Afiniteti fuzionih proteina vezujućih domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku mogu jednostavno da se odrede korišćenjem uobičajenih tehnika, na primer onih opisanih u Scatchardet al,1949Ann. N. Y. Acad. Sci51: 660. Takvo određivanje vezivanja fuzionih proteina za posmatrane ciljne antigene može da se izvrši i korišćenjem bilo kog od većeg broja poznatih postupaka za identifikaciju i dobijanje proteina koji specifično interaguju sa drugim proteinima ili polipeptidima, na primer, dvo-hibridni sistem za testiranje u kvascu kao što je opisan u S.A.D. patentu br. 5,283,173 i S.A.D. patentu br. 5,468,614, ili neki ekvivalentan njemu.

Poželjna rešenja konstrukata predmetnog pronalaska, na primer, fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, sadrže vezujuće regione ili vezujuće domene koji mogu da obuhvataju, na primer, bar jedan nativni ili inžinjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina, kao što je ceo ili deo ili fragment V regiona nativnog ili inžinjeringom dobijenog teškog lanca i/ili nativnog ili inžinjeringom dobijenog lakog lanca, pod uslovom daje u stanju da veže ili specifično veže antigen ili neku drugu poželjnu posmatranu ciljnu strukturu sa poželjnom jačinom vezivanja i selektivnošću. U drugim poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska vezujući region ili vezujući domen sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od jednolančanog Fv proizvoda dobijenog iz imunoglobulina, na primer, i scFv, koji može da obuhvata ceo ili deo najmanje jednog nativnog ili inžinjeringom dobijenog V regiona lakog lanca imunoglobiulina i ceo ili deo bar jednog nativnog ili inžinjeringom dobijenog V regiona teškog lanca imunoglobulina, kao i povezujući deo fuzionisan ili na drugi način vezan za V regione; pripremanje i ispitivanje takvih konstrukata detaljnije su opisani ovde. Drugi postupci pripremanja i ispitivanja su dobro poznati u struci.

Kao što je ovde opisano i struci poznato, imunoglobulini sadrže proizvode porodice gena čiji članovi pokazuju visok stepen očuvanja sekvence. Aminokiselinske sekvence dva ili više imunoglobulina ili domena imunoglobulina ili njihovih regiona ili delova (npr. VHdomena, VL. domena, regiona šarki, CH2 konstantnih regiona, CH3 konstantnih regiona) mogu da budu poravnate i analizirane. Delovi sekvenci koji odgovaraju jedni drugima mogu da se identifikuju, na primer, pomoću homologije sekvence. Određivanje homologije sekvence može da se izvrši pomoću bilo kog od većeg broja pomagala za poravnavanje i analizu sekvence, uključujući računarske algoritme koji su dobro poznati svima sa uobičajenim stepenom stručnosti u ovoj oblasti, kao što su Align ili BLAST algoritam (Altschul, 1991,J. Mol. Biol.219: 555 - 565; Henikoff & Henikoff, 1992Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 10915 - 10919), koji su dostupni preko internet strane NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Mogu da se koriste standardni parametri.

Delovi, na primer, određene referentne sekvence imunoglobulina i bilo koji ili veći broj dodatnih posmatranih sekvenci imunoglobulina mogu da se uporede sa referentnom sekvencom. "Odgovarajuće" sekvence, regioni, fragmenti ili slično, mogu da se identifikuju na osnovu konvencije za označavanje aminokiselinskih pozicija u imunoglobulinima prema Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5. izdanje, Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)). Na primer, prema ovoj konvenciji, porodica imunoglobulina kojoj pripada posmatrana imunoglobulinska sekvenca određuje se na osnovu očuvanja invarijantnih aminokiselinskih ostataka u polipeptidu varijabilnog regiona, kako bi se identifikovao konkretan sistem označavanja za datu porodicu imunoglobulina, a posmatrana(e) sekvenca(e) potom može da se poravna kako bi se dodelili brojevi pozicijama u sekvenci koje zauzimaju pojedinačni aminokiselinski ostaci koji čine datu sekvencu(e). Poželjno je da najmanje oko 70%, još poželjnije najmanje oko 80% do oko 85% ili oko 86%) do oko 89%, a još poželjnije najmanje oko 90%>, oko 92%>, oko 94%, oko 96%>, oko 98%> ili oko 99%> aminokiselinskih ostataka u datoj aminokiselinskoj sekvenci od najmanje oko 1000, poželjnije je oko 700 do 950, poželjnije je oko 350 do 700, još poželjnije oko 100 do 350, još poželjnije oko 80 do 100, oko 70 do 80, oko 60 do 70, oko 50 do 60, oko 40 do 50, ili oko 30 do 40 uzastopnih aminokiselina u sekvenci, bude identično aminokiselinama koje se nalaze u odgovarajućim pozicijama u referentnoj sekvenci kao što su one koje je objavio Kabat (1991) ili koje su objavljene u sličnim kolekcijama srodnih imunoglobulinskih sekvenci, kao što su one koje mogu da se dobiju iz javnih baza podataka (npr. Genebank, SwissProt, itd.) korišćenjem pomagala za poravnavanje sekvenci kao što su, na primer, ona predhodno opisana. U određenim poželjnim rešenjima, posmatrana imunoglobulinska sekvenca ili nje region, deo, derivat ili fragment je više od 95%o identična odgovarajućoj referentnoj sekvenci, a u određenim poželjnim rešenjima takva posmatrana sekvenca može da odstupa od odgovarajuće reference u ne više od 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih pozicija.

Na primer, u određenim rešenjima predmetni pronalazak je usmeren ka konstruktu, uključujući fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji se dobrim delom sastoji od polipeptida varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka ili neke druge vrste a koji sadrži mutaciju, promenu ili deleciju u aminokiselinskom položaju ili položajima koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih položaja 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 i 112

u, na primer, sekvenci čiji je ID broj: , koja sadrži, na primer, mišju sekvencu dobijenu iz Vh.

U relativno ograničenom broju položaja u VHsekvenci imunoglobulina, na primer, uključujući položaj 11, uočava se očuvanje aminokiselinske sekvence u velikoj većini Vhsekvenci kroz linije različitih sisarskih vrsta (npr., Leul 1, Val37, Gly44, Leu45, Trp47; Nguvenet al,1998J. Mol. Biol.275: 413). Različiti ovakvi aminokiselinski ostaci, a stoga i njihovi bočni lanci, nalaze

se na površini varijabilnog domena (Vh). Oni mogu da dodiruju ostatke ChI (npr., Leul 1) i VLdomena (npr., Val37, Gly44, Leu45 i Trp47) i mogu, u odsustvu lakih lanaca, da doprinose stabilnosti i rastvorljivosti proteina (videti, npr., Chothiaet al,1985J. Mol. Biol.186: 651; Muyldermanset al,1994Prot. Engineer.7: 1129; Desmvteret al.1996,Nat. Struct. Biol.3: 803; Davieset al,1994FEBS Lett.339: 285). U određenim rešenjima, na primer, predmetni pronalazak je usmeren i na konstrukt, uključujući fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji se značajnim delom sastoji od polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina, ili polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina neke druge vrste, koji sadrži mutaciju, promenu ili deleciju na položaju ili položajima koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih položaja 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 i 108. U, opet, određenim drugim rešenjima, na primer, predmetni pronalazak je usmeren na konstrukt, uključujući fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji se značajnim delom sastoji od (1) polipeptida varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina ili polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina neke vrste, koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, date sekvence teškog lanca koja ima mutaciju, promenu ili deleciju na položaju ili položajima koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih položaja 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 i 112 i (2) polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina ili polipeptida varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina neke druge vrste, koji sadrži, suštinski se sastoji od ili se sastoji od, date sekvence lakog lanca koja ima mutaciju, promenu ili deleciju na položaju ili položajima koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih položaja 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 i 108.

Kao još jedan primer, po referenci na kolekcije imunoglobulinskih sekvenci i baza podataka kao što su one predhodno navedene, na primer, srodnost dve ili više imunoglobulinskih sekvenci može da se ustanovi brzo i bez nepotrebnih eksperimenata na način koji omogućava identifikaciju životinjske vrste od koje su potekle, klase i podklase (npr., izotipa) konkretnog imunoglobulina ili polipeptidne sekvence regiona imunoglobulina. Bilo koja od polipeptidnih sekvenci varijabilnog regiona imunoglobulina, uključujući nativne ili inžinjeringom dobijene sekvence VHi/ili VLi/ili jednolančanog varijabilnog regiona (sFv) ili druge nativne ili inžinjeringom dobijene sekvence dobijene iz V regiona ili slične, može da se koristi kao vezujući region ili vezujući domen. Inžinjeringom dobijene sekvence obuhvataju sekvence imunoglobulina iz bilo koje vrste, poželjno je da to bude čovek ili miš, na primer, koje obuhvataju, na primer, mutaciju, promenu ili deleciju aminokiseline na položaju ili položajima koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih položaja 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 i 112 u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca ili scFv, i/ili mutaciju, promenu ili deleciju aminokiseline na položaju ili položajima koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih položaja 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 i 108 u sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca ili scFv.

Različita poželjna antitela obuhvataju, na primer, nativne ili genetskim' inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence V regiona imunoglobulina, koje su izvedene, na primer, iz antitela u koja spadaju monoklonska antitela, kao što su misija ili druga antitela glodara, ili antitela ili monoklonska antitela koja su izvedena iz drugih bioloških izvora kao što su koza, zec, konj, goveče, kamelid ili organizam druge vrste, uključujući transgene životinje, a takođe uključujući humana ili humanizovana antitela ili monoklonska antitela. Neograničavajući primeri obuhvataju polipeptidne sekvence varijabilnog regiona koje su izvedene iz monoklonskih antitela, kao što su ona koja su navedena ovde i/ili koja su opisana detaljnije u odeljku sa primerima koji se nalazi u tekstu koji sledi; na primer, to su CD20-vezujuća ili specifična mišija monoklonska antitela{ npr.,2H7), druga CD20-vezujuća ili specifična mišija monoklonska antitela koja nisu 1F5 antitela, monoklonska antitela L6 (specifična za epitop koji je definisan ugljenim hidratom, dostupna od strane ATCC, Manassas, VA, kao hibridomska ćelijska linija HB8677), kao i monoklonska antitela koja se vezuju za ili su specifična za CD28( npr.,monoklonsko antitelo 2E12), CD40, CD80, CD 137( npr.,monoklonsko antitelo 5B9 ili monoklonsko antitelo 1D8, koja prepoznaju mišiji homolog CD 137 molekula, tj., 41BB) i CD 152 (CTLA-4).

Drugi vezujući regioni, uključujući polipeptide vezujućeg domena, mogu da obuhvate bilo koji protein ili njegov deo koji zadržava sposobnost da se vezuje ili da se specifično vezuje za antigen, kao što je to opisano ovde, uključujući molekule koji nisu imunoglobulini. Shodno konstruktima prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine, obuhvaćeni su: vezujući region ili polipeptidi vezujućeg domena koji su izvedeni iz polipeptidnih liganada, kao što su hormoni, citokini, hemokini i slični; receptori na površini ćelije ili rastvorni receptori za takve polipeptidne Ugande; lecitini; intercelularni adhezioni receptori, kao što su specifični leukocitni integrini, selektini, članovi superporodice imunoglobulinskog gena, intercelularni adhezioni molekuli (ICAM-1, -2, -3) i slični; antigeni histokompatabilnosti i slični.

Primeri receptora na površini ćelije, koji su korisni kao vezujući regioni u dobijanju polipeptida vezujućeg domena ili koji mogu da obezbede polipeptid vezujućeg domena, a koji takođe mogu biti izabrani kao ciljni molekul ili antigen za koji se konstrukt poželjno vezuje, uključujući, na primer, vezujući domen - Ig fuzioni protein prema predmetnom pronalasku, obuhvataju sledeće ili slične molekule: HER1( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U48722, SEG_HEGFREXS, K03191), HER2 (Yoshinoet al,1994.J. Immunol 152: 2393; Disiset al.,1994Canc. Res.54 : 16videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena X03363, M17730, SEG_HUMHER20), HER3( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U29339, M34309), HER4 (Plovvmanet ni.,1993Nature366 : 473;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena L07868, T64105), receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U48722, SEG_HEGFREXS, K03193), vaskularni receptor za endotelni ćelijski factor rasta

(VEGF)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AF022375, 1680143, U48801, X62568), insulinu sličan factor rasta-I( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X00173, X56774, X56773, X06043,videti takođe,Evropski patent br. GB 2241703), insulinu sličan factor rasta-II( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X03562, X00910, SEG_HUMGFIA, SEG_HUMGFI2, M17863, M17862), receptor za transferin (Trovvbridge & Omary, 1981Proc. Nat. Acad. USA78:3039;videti takođe, ( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X01060, Ml 1507), receptor za estrogen( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M38651, X03635, X99101, U47678, M12674), receptor za progesteron( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X51730, X69068, M15716), receptor za folikul stimulirajući hormon (FSH-R)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena Z34260, M65085), receptor za retinoinsku kiselinu( npr.,pristupni brojevi u Banci gena L12060, M60909, X77664, X57280, X06538), MUC-1 (Barneset al,1989Proc. Nat. Acad. Sci. USA86: 7159;videti takođe. npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_MUSMUCIO, M65132, M64928), NY-ESO-l( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AJ003149, U87459), NA 17-A( npr.,Evropski patent br. WO 96/40039), Melan-A/MART-1 (Kavvakamiet al,1994Proc. Nat. Acad. Sci. USA91:3515;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena U06654, U06452), tirozinaza (Topalianet al,1994Proc. Nat. Acad. Sci. USA91:9461;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena M26729, SEG_HUMTYR0,videti takođeWeberet al, J. Clin. Invest(1998) 102:1258), Gp-100 (Kawakamiet al,1994Proc. Nat. Acad. Sci. USA91:3515;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena S73003,videti takođeevropski patent br. EP 668350; Ademaet al,1994J. Biol.

Chem.269:20126), MAGE (van den Bruggenet al,1991Science254:1643;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena U93163, AF064589, U66083, D32077, D32076, D32075, U10694, U10693, U10691, U10690, U10689, U10688, U10687, U10686, U10685, L18877, U10340, U10339, L18920, U03735, M77481), BAGE( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U19180;videti takođe,U.S. patenti br. 5,683,886 i 5,571,711), GAGE( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AF055475, AF055474, AF055473, U19147, U19146, U19145, U19144, U19143, U19142), kao i CTA klasa receptora uključujući, posebno, HOM-MEL-40 antigen koji je kodiran od strane SSX2 gena( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X86175, U90842, U90841, X86174), karcinoembrionski antigen (CEA, Gold & Freedman, 1985J. Exp. Med.121:439;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_HUMCEA, M59710, M59255, M29540, i PyLT( npr.,pristupni brojevi u Banci gena J02289, J02038).

Dodatni receptori na površini ćelije koji mogu biti izvor vezujućeg regiona ili polipeptida vezujućeg domena ili njihovih delova, ili koji mogu biti molekuli - mete, uključujući antigene - mete, obuhvataju sledeće ili slične molekule: CD2( npr.,pristupni brojevi u Banci gena Y00023, SEG_HUMCD2, M16336, M16445, SEG_MUSD2, M14362), 4-1BB (CDwl37,Kwon et a!.,1989Proc. Nat. Acad. Sci. USA86:1963, 4-1BB ligand (Goodvvinet al.,1993Eur. J. Immunol.23:2361; Meleroet al.,1998Eur. J. Immunol.3:116), CD5( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X78985, X89405), CD 10( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M81591, X76732) CD27( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M63928, L24495, L08096), CD28 (Juneet al,1990Immunol. Today11:211;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena J02988, SEG_HUMCD28, M34563), CD152/CTLA-4( npr.,pristupni brojevi u Banci gena L15006, X05719,'SEG_HUMIGCTL), CD40( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M83312, SEG_MUSC040A0, Y10507, X6787, X96710, U15637, L07414), interferon-y (IFN- y;videti takođe, npr.,Farraret al,1993Ann. Rev. Immunol.11:571, kao i reference koje su tamo citirane, Grayet al,1982Nature295:503, Rinderknechtet al,1984J. Biol. Chem.259:6790, DeGrado et al., 1982 Nature 300:379), interleukin-4 (IL-4;videti, npr.,53<rd>Forum in Immunology,1993Research in Immunol.144:553-643; Banchereauet al,1994 uThe Cytokine Handbook, 2izdanje, A. Thomson, urednik, Academic Press, NY, str. 99; Keeganet al,1994J Leukocyt. Biol,52:272, kao i reference koje su tamo navedene), interleukin-17 (IL-17)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U32659, U43088) i receptor za interleukin-17 (IL-17R)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U31993, U58917). Treba napomenuti da predmetni pronalazak ne obuhvata nijedan od imunoglobulinskih fuzionih proteina koji su opisani u U. S. 5,807,734 ili U. S. 5,795,572.

Dodatni receptori na površini ćelije koji mogu biti izvori polipeptida vezujućeg regiona

ili vezujućeg domena ili njihovih delova, ili koji mogu da služe kao molekuli - mete, uključujući

ciljne antigene ili vezujuća mesta, obuhvataju sledeće ili slične molekule: CD59( npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_HUMCD590, M95708, M34671), CD48( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M59904), CD58/LFA-3( npr.,pristupni brojevi u Banci gena A25933, Y00636, E12817;videti takođeJP1997075090-A), CD72( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AA311036, S40777, L35772), CD70( npr.,pristupni brojevi u Banci gena Y13636, S69339), CD80/B7.1 (Freemanet al,1989J. Immunol.43:2714; Freemanet al,1991J. Exp. Med.174:625;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena U33208, 1683379), CD86/B7.2 Freemanet al,1993J. Exp. Med.178:2185, Borielloet al,1995J. Immunol.155:5490;videti takođe, npr.,pristupni brojevi u Banci gena AF099105, SEGJVIMB72G, U39466, U04343, SEG_HSB725, L25606, L25259), B7-H1/B7-DCnpr.,pristupni brojevi u Banci gena NM_014143, AF177937, AF317088; Donget al,2002Nat. Med.Jun 24 [elektronska publikacija koja prethodi štampanoj verziji] PMID 12091876; Tseng et al., 2001 J. Exp. Med. 193:839; Tamura et al.. 2001 Blood 97:1809; Dong et al., 1999 Nat. Med. 5:1365), CD40 ligand( npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_HUMCD40L, X67878, X65453, L07414), IL-17( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U32659, U43088), CD43( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X52075, J04536), ICOS( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AH011568),CD3. ( npr.,pristupni brojevi u Banci gena NM_000073 (gama podjedinica), NM_000733 (epsilon podjedinica), X73617 (delta podjedinica)), CD4( npr.,pristupni brojevi u Banci gena NM_000616), CD25( npr.,pristupni brojevi u Banci gena NM_000417), CD8( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M12828), CDllb( npr.,pristupni brojevi u Banci gena J03925), CD14( npr.,pristupni brojevi u Banci gena XM_039364), CD56( npr.,pristupni brojevi u Banci gena U63041), CD69( npr.,pristupni brojevi u Banci gena NM_001781) 1 VLA-4 (a4p7)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena L12002, X16983, L20788, U97031, L24913, M68892, M95632). Sledeći receptori na površini ćelije su tipično udruženi sa B ćelijama: CD19( npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_HUMCD19W0, M84371, SEG_MUSCD19W, M62542), CD20( npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_HUMCD20, M62541), CD22( npr.,pristupni brojevi u Banci gena 1680629, Y10210, X59350, U62631, X52782, L16928), CD30( npr.,pristupni brojevi u Banci gena M83554, D86042), CD153 (CD30 ligand,npr.,pristupni brojevi u Banci gena L09753, M83554), CD37( npr.,pristupni brojevi u Banci gena SEG_MMCD37X, X14046, X53517), CD50 (ICAM-3,npr.,pristupni brojevi u Banci gena NM_002162), CD106 (VCAM-1) ( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X53051, X67783, SEG_MMVCAM1C, videti takođe U. S. patent br. 5,596,090), CD54 (ICAM-1)( npr.,pristupni brojevi u Banci gena X84737, S82847, X06990, J03132, SEG_MUSICAM0), interleukin-12( videti, npr.,Reiteret al,1993Crit. Rev. Immunol.13:1, kao I reference koje su tamo citirane), CD134 (OX40,npr.,pristupni brojevi u

Banci gena AJ277151), CD137 (41BB,npr.,pristupni brojevi u Banci gena L12964, NM_001561), CD83( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AF001036, AL021918), DEC-205( npr.,pristupni brojevi u Banci gena AF011333, U19271).

Konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, obuhvataju, na primer, vezujući domen, kao što je polipeptid vezujućeg domena koji, shodno određenim poželjnim predmetnim rešenjima, poseduju sposobnost da se vežu ili se specifično vezuju za barem jedan molekul - metu, na primer, ciljni antigen ili za neko drugo vezujuće mesto koje je prisutno na imunoj efektorskoj ćeliji. Na osnovu teorije koja nije ograničavajuća, takvi konstrukti u koje spadaju, na primer, fuzioni proteini vezujućeg domena imunoglobulina, mogu poželjno da pokrenu željene funkcije imunološke efektorske ćelije u terapeutskom kontekstu, pri čemu je dobro poznato da imunološke efektorske ćelije koje poseduju različite specijalizovane imunološke funkcije mogu da se identifikuju ili da se razlikuju jedna od druge na osnovu njihove diferencijalne ekspresije velikog broja različitih površinskih antigena, uključujući mnoge od antigena koji su ovde opisani i za koje se konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući polipeptide vezujućeg domena, specifično vezuju. Kao što je ovde naznačeno, imunološke efekorske ćelije obuhvataju svaku ćeliju koja je sposobna da direktno posreduje pri aktivnosti koja je komponenta funkcije imunog sistema, u šta spadaju ćelije koje takvu sposobnost poseduju prirodno ili kao rezultat genetskog inženjeringa.

U određenim rešenjima, imune efektorske ćelije sadrže receptor na površini ćelije za imunoglobulin ili za neki drugi molekul koji se vezuje za peptide, kao što je receptor za imunoglobulinski konstantni region, što obuhvata i klasu receptora koji se uobičajeno označavaju kao "Fc receptori" ("FcR-ovi"). Brojni FcR-ovi su strukturno i/ili funkcionalno okarakterisani i dobro su poznati u struci, uključujući FcR sa specifičnim svojstvima da interaguju sa ograničenim podsetom izotipova imunoglobulinskih teških lanaca, ili uključujući one FcR koji mogu da interaguju sa Fc donienima različitim afinitetima, i/ili koji mogu da budu eksprimirani na ograničenim podsetovima imunih efektorskih ćelija u određenim uslovima( npr.,Kijimoto-Ochichaiet al,2002Cell Mol. Life Sci.59:648; Davišet al,2002Curr. Top. Microbiol. Immunol.266:85; Pavvankar, 2001Curr. Opin. Allerg. Clin. Immunol1:3; Radaevet al,2002Mol. Immunol.38:1073; Wurzburget al,2002Mol. Immunol.38:1063; Sulicaet al,2001Int. Rev. Immunol20:371; Underhillet al, 2002 Ann Rev. Immunol.20:825; Coggeshall, 2002Curr, Dir. Autoimm.5:1; Mimuraet al,2001Adv. Exp. Med. Biol.495:49; Baumannet al,2001Adv. Exp. Med. Biol.495: 219; Santosoet al, 2001 Ital Heart J.2:811; Novaket al„2001Curr. Opin. Immunol.13:721; Fossatiet al,2001Eur. J. Clin. Invest.31:821).

Poželjni primeri imunih efektorskih ćelija prema predmetnom pronalasku jesu ćelije koje

su sposobne da posreduju pri ADCC. Drugi poželjni primeri obuhvataju ćelije prirodne ubice (NK ćelije), T limfocite koji se infiltriraju u tumor (TIL-ove), citotoksične T limfocite i granulocitne ćelije, kao što su ćelije koje učestvuju u mehanizmima alergijskog odgovora. Imunološke efektorske ćelije, stoga, obuhvataju, bez ograničenja, ćelije hematopoetskog porekla,

u šta spadaju i ćelije u različitim stupnjevima diferencijacije u okviru mijeloidnih i limfoidnih ćelijskih linija i koje mogu (mada nije neophodno) da eksprimiraju jedan ili više tipova funkcionalnih površinskih FcR, a to su konkretno T limfociti, B limfociti, NK ćelije, monociti, makrofagi, dendritske ćelije, neutrofili, bazofili, eozinofili, mastociti, trombociti, eritrociti, kao i njihovi prekursori, progenitori (npr., hematopoetske matične ćelije), što obuhvata uspavani, aktivirane i zrele oblike takvih ćelija. Druge imunološke efektorske ćelije su ćelije ne-hematopoetskog porekla, koje su sposobne da posreduju u imunološkim funkcijama, kao što su,

na primer, ćelije endotela, keratinociti, fibroblasti, osteoklasti, epitelne ćelije i druge ćelije. Imune efektorske ćelije takođe obuhvataju ćelije koje posreduju pri citotoksičnim ili citostatskim događajima, ili pri događajima koji podrazumevaju endocitozu, fagocitozu ili pinocitozu, ili koje dovode do indukcije apoptoze, ili koje dovode do pojave imuniteta prema mikroorganizmima ili do neutralizacije infekcije mikroorganizmima ili su to ćelije koje posreduju u alergijskim i inflamatornim reakcijama, reakcijama preosetljivosti i/ili u autoimunim reakcijama.

Mehanizmi alergijskog odgovora su dobro poznati u struci i obuhvataju antigen( npr.,alergen) - specifičnu komponentu, npr., molekul imunoglobulina( npr.,IgE), kao i ćelije i medijatore koji su odgovorni za posledice interakcije alergena i imunoglobulina( npr.,IgE)( npr.,Ottet al,2000J. Allerg. Clin. Immunol.106:429; Barnes, 2000J. Allerg. Clin. Immunol.106:5; Togias, 2000J. Allerg. Clin. Immunol.105:S599; Akdiset al,2000Int. Arch. Allerg. Immunol121:261; Beach, 2000Occup. Med.15:455). Posebno, kada su u pitanju konstrukti prema predmetnom pronalasku (uključujući fuzione proteine vezujućeg domena imunoglobulina) koji interaguju sa FcR, određena rešenja se odnose na one konstrukte u koje spadaju fuzioni proteini koji obuhvataju jedan ili više domena izvedenih od IgE, uključujući, na primer, one koji su sposobni da indukuju mehanizam alergijskog odgovora, što obuhvata IgE-specifični FcR, ili njihove delove, pri čemu IgE - specifični FcR-ovi obuhvataju one koji su naznačeni iznad i opisani ili identifikovani u citiranim člancima. Bez želje za vezivanje za određenu teoriju ili mehanizam dejstva, konstrukti koji su ovde opisani, uključujući fuzione proteine prema predmetnom pronalasku, obuhvataju delove polipeptida Fc domena teškog lanca IgE, na primer, nativnog ili genetskim inženjeringom dobijenog CH3 i CH4 domena IgE, bilo obezbeđenog iz komercijalnih izvora ili eksprimiranog kao proteina na površini ćelije( npr.,sa domenom za sidro za plazmalemu) ili obezbeđenog u vidu rastvorljivog proteina ili kao proteina koji nije vezan za ćeliju{ npr.,proteina bez domena za sidro za plazmalemu). Dalje, prema neograničavajućoj teoriji, pokretanje i pospešivanje mehanizma alergijskog odgovora( npr.,neke imunološke efektorske ćelije koja eksprimira FcR-e) može da nastane (kao što je ovde opisano) kao rezultat prisustva Fc domena IgE ili njegovog dela( npr.,nekog dela koji je sposoban da pokrene mehanizam alergije pomoću ukrštenog vezivanja sa FcR) i/ili kao rezultat prisustva molekula-mete, npr., antigena za koga se vezujući region, na primer, vezujući domen, vezuje ili specifično vezuje. Predmetni pronalazak, stoga, koristi indukciju mehanizama alergijskog odgovora u kontekstima koji do sada nisu poznati, npr., u kontekstu tretmana nekog malignog stanja ili B ćelijskog poremećaja, uključujući sve one poremećaje koji su ovde opisani ili referencirani.

Polipeptid regiona šarke imunoglobulina obuhvata bilo koji prirodni peptid regiona šarke,

ili veštački peptid ili peptid dobijen genetskim inženjeringom, koji se nalazi, na prifner, u polipeptidu teškog lanca imunoglobulina između aminokiselinskih ostataka koji su odgovori za formiranje unutarlančanih disulfidnih veza u CH1 i CH2 domenima imunoglobulina. Polipeptidi regiona šarke prema predmetnom pronalasku takođe obuhvataju mutirane ili na drugi način izmenjene polipeptide regiona šarke. Shodno tome, na primer, polipeptid regiona šarke imunoglobulina može biti izveden iz ili može biti deo ili fragment određenog regiona lanca imunoglobulinskog polipeptida (tj., to je jedna ili više aminokiselina koje su peptidno povezane, tipično oko 15-115 amino kiselina, poželjno oko 95-110, oko 80-94, oko 60-80, ili oko 5-65 amino kiselina, poželjno oko 10-50, još poželjnije oko 15-35, još poželjnije oko 18-32, još poželjnije oko 20-30, još poželjnije oko 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, ili 29 amino kiselina), koji klasično poseduje funkciju šarke, uključujući one polipeptide koji su ovde opisani, s tim da polipeptid regiona šarke koji se koristi u predmetnom pronalasku ne treba da bude toliko ograničen i može da obuhvata (što se određuje na osnovu strukturnih kriterij uma za dodeljivanje određenog ostatka određenom domenu, a što, kao što je poznato u struci, može da varira) jednu ili više aminokiselina koje se nalaze na susednom imunoglobulinskom domenu kao što je CH1 domen i/ili CH2 domen u slučajevima IgG, IgA i IgD, ili u susednom imunoglobulinskom domenu kao što je CH1 domen i/ili CH3 domen u slučaju IgE, ili u slučaju određenih veštačkih i genetskim inženjeringom dobij enih imunoglobulinskih konstrukata, u okviru domena varijabilnog regiona imunoglobulina.

Polipeptidi regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa obuhvataju bilo koji poznati ili naknadno otkriveni prirodni region šarke koji se nalazi između CH1 i CH2 domena konstantnog regiona određenog imunoglobulina, na primer, humanog imunoglobulina (ili između CHTi CH3 domena određenih tipova imunoglobulina, konkretno IgE). Prilikom upotrebe pri konstruisanju određenog tipa povezujućeg regiona, polipeptid regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa je poželjno polipeptid regiona šarke humanog imunoglobulina, poželjno region šarke humanog IgG, IgA ili IgD (ili CH2 region nekog IgE), a još poželjnije, na primer, to je polipeptid mutiranog ili humanog regiona šarke IgGl izotipa, kao što je ovde opisano.

Kao što je poznato u struci, uprkos ukupnoj velikoj raznolikosti aminokiselinskih sekvenci imunoglobulina, imunoglobulinska primarna struktura pokazuje visok .stepen konzerviranosti sekvence u određenim delovima lanaca polipeptida imunoglobulina, što se posebno odnosi na pojavu cisteinskih ostataka, koji zbog svojih sulfhidrilnih grupa, pružaju mogućnost formiranja disulfidne veze sa drugim dostupnim sulfhidrilnim grupama. Shodno tome, u kontekstu predmetnog pronalaska, polipeptidi regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa, koji se koriste kao povezujući regioni, obuhvataju one koji poseduju jednu ili više visoko konzerviranih (npr., prevalentnih u populaciji na statistički značajan način) cisteinskih ostataka, tako da u određenim poželjnim rešenjima, povezujući region može da obuhvati ili se u suštini sastoji od polipeptida mutiranog regiona šarke koji može biti tako izabran da sadrži manji broj cisteina od broja prirodno postojećih cisteina, na primer, može biti izabran tako da ne sadrži nijedan ili da sadrži jedan ili dva cisteinska ostatka u slučaju IgGl i IgG4 regiona šarke i koji je izveden ili konstruisan iz (ili korišćenjem) takvih navedenih sekvenci regiona šarke divljeg tipa.

U slučaju određenih poželjnih rešenja u kojima je povezujući region polipeptid regiona šarke i u kojima je polipeptid regiona šarke mutiran, genetskim inženjeringom dobijen ili na drugi način izmenjen polipeptid regiona šarke humanog IgGl i u kojima je polipeptid regiona šarke izveden iz ili konstruisan na osnovu sekvence regiona šarke divljeg tipa, treba napomenuti da sekvenca polipeptida regiona šarke humanog IgGl divljeg tipa sadrži tri nesusedna cisteinska ostatka, koji su označeni kao prvi cistein regiona šarke divljeg tipa, drugi cistein regiona šarke divljeg tipa i treći cistein regiona šarke divljeg tipa, respektivno, pri čemu su oni locirani na delu regiona šarke od N-terminala polipeptida ka C-terminalu polipeptida. Ovakav polipeptid može da se označi kao "CCC" region šarke (ili "WTH"- region šarke divljeg tipa). Primeri imitiranih ili genentskim inženjeringom izmenjenih regiona šarke obuhvataju one regione šarke koji ne .sadrže cisteinske ostatke i koji su ovde označeni kao"XXX" regioni šarke (ili, na primer, kao "MH-XXX", što označava mutirani ili genetskim inženjeringom izmenjeni region šarke sa tri amino kiseline ili sa drugim molekulima umesto prirodno postojećih cisteina, što je, na primer, slučaj sa "MH-SSS", koji predstavlja mutantni region šarke sa tri serinska ostatka umesto prirodno postojećih cisteinskih ostataka. Treba napomenuti da pojam "mutantni" označava činjenicu daje prisutan različiti molekul (ili molekuli) ili da se određeni molekul ne nalazi na položaju prirodno postojećeg ostatka, pri čemu ova definicija ne označava neki određeni postupak koji je primenjen, npr., ne označava supstituciju, alteraciju ili deleciju. Shodno tome, u određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, povezujući region može biti polipeptid regiona šarke, pri čemu je polipeptid regiona šarke mutirani polipeptid regiona šarke humanog IgGl koji sadrži dva cisteinska ostatka i u kome je prvi cistein regiona šarke divljeg tipa neizmenjen ili ne-deletiran. Ovakav region šarke može da se označi kao "MH-CXX" region šarke, konkretno, na primer, kao "MH-CSC" region šarke, u kome je cisteinski ostatak zamenjen serinskim ostatkom. U drugim rešenjima prema predmetnom pronalasku, mutirani polipeptid regiona šarke humanog IgGl ne sadrži više od jednog cisteinskog ostatka i obuhvata, na primer, "MH-CSS" region šarke ili "MH-SSC" region šarke ili "MH-CSC" region šarke, a u određenim drugim rešenjima mutirani polipeptid regiona šarke IgGl humanog imunoglobulina ne sadrži cisteinske ostatke, kao što je to slučaj, na primer, sa "MH-SSS" regionom šarke.

Konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena imunoglobulina, izričito ne obuhvataju neki od fuzionih proteina koji su opisani u U. S. patentu br. 5,892,019. Pomenuti U. S. patent br. 5,892,019 se odnosi na region šarke humanog IgGl u kome je prvi cisteinski ostatak regiona šarke IgGl izmenjen ili deletiran, pri čemu su zadržani i drugi i treći cisteinski ostatak regiona šarke IgGl koji odgovaraju drugom i trećem cisteinskom ostatku sekvence regiona šarke IgGl divljeg tipa. Navedeni patent tvrdi da je prvi cisteinski ostatak regiona šarke IgGl divljeg tipa zamenjen kako bi se sprečila interferencija prvog cisteinskog ostatka sa odgovarajućim savijanjem polipeptida, koji je tamo opisan kao dimer. Navedeni patent zahteva da drugi i treći cisteinski ostatak regiona šarke IgGl budu zadržani kako bi se obezbedila disulfidna veza između dva konstantna regiona teškog lanca u cilju promocije formiranja dimera, tako da molekul zadrži efektorsku funkciju, npr., sposobnost da posreduje pri ADCC.

Nasuprot tome, kao što je ovde opisano, konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena imunoglobulina, od kojih su mnogi sposobni za posredovanje, na primer, pri ADCC, CDC i/ili fiksaciji komplementa, nisu tako ograničeni i mogu da obuhvate u određenom delu, na primer, (i) polipeptid regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa, kao što je polipeptid regiona šarke humanog imunoglobulina divljeg tipa, na primer, polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina, (ii) mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke imunoglobulina, npr., mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog imunoglobulina, npr., mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina, izveden ili konstruisan iz (ili uz korišćenje) polipeptida ili odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline regiona ' šarke imunoglobulina divljeg tipa sa tri ili više cisteinskih ostataka, tako da navedeni mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina sadrži dva cisteinska ostatka, pri čemu je prvi cisteinski ostatak regiona šarke divljeg tipa je nemutiran ili ne-deletiran, (iii) mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke, npr., mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog imunoglobulina, npr., mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina, izveden ili konstruisan iz (ili uz korišćenje) polipeptida ili odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa sa tri ili više cisteinskih ostataka, tako da navedeni mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina ne sadrži više od jednog cisteinskog ostatka, (iv) mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke imunoglobulina, npr., mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog imunoglobulina, npr., mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina, izveden ili konstruisan iz (ili uz korišćenje) polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa sa tri ili više cisteinskih ostataka, tako da navedeni mutirani ili na drugi način izmenjeni (npr., promenom ili delecijom amino kiseline) polipeptid regiona šarke humanog IgGl imunoglobulina ne sadrži nijedan cisteinski ostatak. Predmetni pronalazak obezbeđuje neočekivane prednosti koje su udružene sa zadržavanjem sposobnosti konstrukata, uključujući ovde opisane fuzione proteine, da posreduju pri ADCC i/ili CDC i/ili fiksaciji komplementa, pri čemu je sposobnost dimerizacije putem uspostavljanja međulančanih disulfidnih veza u regionu šarke IgGl narušena ili kompromitovana uklanjanjem ili zamenom jednog, dva ili tri cisteinska ostatka regiona šarke, čak i kod konstrukata kod kojih je prvi cistein regiona šarke IgGl ostao, npr., nemutiran ili na drugi način neizmenjen ili nedeletiran.

Povezujući region može da sadrži mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke imunoglobulina, koji sam po sebi može da sadrži region šarke koji potiče iz molekula imunoglobulina određene vrste, imunoglobulina određenog izotipa ili klase ili određene potklase imunoglobulina koja je različita od one kojoj pripada region molekulskog repa, na primer, kada se region molekulskog repa suštinski sastoji od ili kada sadrži CH2 i CHS domene (ili u slučaju IgE, od CHS i CH4 domena). Na primer, u određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, konstrukt, na primer, fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina, može da sadrži vezujući region, kao što je to polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan ili koji je na drugi način povezan sa polipeptidom regiona šarke imunoglobulina koji sadrži ili koji se u suštini sastoji od polipeptida regiona šarke humanog IgA divljeg tipa ili od mutiranog ili na drugi način izmenjenog polipeptida regiona šarke humanog IgA koji ne sadrži ili koji sadrži samo jedan ili više cisteinskih ostataka (ali u svakom slučaju manje od broja cisteina nego kod molekula divljeg tipa), kao stoje ovde opisano, ili koji sadrži region šarke humanog IgG divljeg tipa, kao što je to polipeptid regiona šarke IgGl, ili region koji funkcioniše kao region šarke humanog IgE divljeg tipa, tj., polipeptid CH2 regiona IgE, ili je to mutirani ili na drugi način izmenjeni region šarke humanog IgG, kao što je to polipeptid regiona šarke IgGl, koji je mutirani ili na drugi način izmenjen tako da ne sadrži ili sadrži jedan ili dva cisteinska ostatka, pri čemu prvi cisteinski ostatak u regionu šarke imunoglobulina divljeg tipa nije mutiran ili izmenjen ili deletiran, što je takođe ovde opisano. Takav polipeptid regiona šarke može biti fuzionisan ili na drugi način povezan sa, na primer, regionom molekulskog repa koji sadrži ili se u suštini sastoji od polipeptida CH2 regiona teškog lanca imunoglobulina koji pripada različitom izotipu ili klasi Ig,

na primer, koji pripada podklasi IgA ili IgE ili IgG (ili je to CHS region IgE podklase imunoglobulina), pri čemu je u određenim rešenjima poželjno da se koristi IgGl ili IgA ili IgE podklasa, a u određenim drugim poželjnim rešenjima to može biti i molekul iz podklasa IgG2, IgG3 ili IgG4.

Na primer, kao što je veoma detaljno opisano ovde, u poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku povezujući region može biti izabran tako da je to polipeptid regiona šarke imunoglobulina koji jeste ili je izveden iz regiona šarke humanog IgA divljeg tipa koji prirodno sadrži tri cisteinska ostatka, pri čemu je izabrani polipeptid regiona šarke nepotpun ili je na drugi način izmenjen ili je supstituisan u odnosu na kompletni i/ili prirodni region šarke tako da sadrži jedan ili dva cisteinska ostatka( npr,sekvenca čiji je ID br. 35-36). Slično tome, u određenim drugim rešenjima prema predmetnom pronalasku, konstrukt može biti fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan ili na drugi način povezan sa polipeptidom regiona šarke imunoglobulina, koji dalje sadrži mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke u kome je broj cisteinskih ostataka smanjen upotrebom aminokiselinske supstitucije ili delecije, na primer, to je mutirani ili na drugi način izmenjeni region šarke IgGl koji ne sadrži ili sadrži jedan ili đva cisteinska ostataka kao što je ovde opisano, ili je to region šarke IgD koji ne sadrži cisteinske ostatake.

Mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke može biti izveden ili konstruisan na osnovu (ili korišćenjem) regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa koji sadrži jedan ili više cisteinskih ostataka. U određenim rešenjima mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke može da ne sadrži nijedan ili da sadrži samo jedan cisteinski ostatak, pri čemu je mutirani ili na drugi način izmenjeni region šarke izveden iz regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa koji sadrži, respektivno, jedan ili više ili dva ili više cisteinskih ostataka. Kod mutiranog ili na drugi način izmenjenog polipeptida regiona šarke, cisteinski ostaci u regionu šarke imunoglobulina divljeg tipa su poželjno deletirani ili supstituisani amino kiselinama koje nisu sposobne da formiraju disulfidnu vezu. U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke jeste ili je izveden iz polipeptida regiona šarke humanog IgG divljeg tipa, koji može da pripada bilo kojoj od izotipskih podklasa humanog IgG, npr., može da pripada podklasi IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. U određenim poželjnim rešenjima, mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke je izveden iz (ili je dobijen korišćenjem) polipeptida regiona šarke humanog IgA ili IgD divljeg tipa. Primera radi, mutirani ili na drugi način izmenjeni polipeptid regiona šarke koji je izveden iz polipeptida regiona šarke humanog IgGl ili IgA divljeg tipa može da sadrži mutacije, alteracije ili delecije dva od tri cisteinska ostatka regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa, ili mutacije, alteracije ili delecije sva tri cisteinska ostatka.

Cisteinski ostaci koji su prisutni u regionu šarke imunoglobulina divljeg tipa, a koji su uklonjeni ili izmenjeni mutagenezom ili upotrebom drugih tehnika shodno određenom poželjnom rešenju prema predmetnom pronalasku, obuhvataju cisteinske ostatke koji formiraju ili koji su sposobni da formiraju međulančane disulfidne veze. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju ili mehanizam dejstva, predmetni pronalazak svojim obimom zaštite obuhvata mutaciju ili deleciju ili drugu alteraciju takvih cisteinskih ostatka regiona šarke, za koje se veruje da su uključeni u formiranje međulančanih disulfidnih mostova, pri čemu se smanjuje sposobnost fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku da dimerizuje (ili da formira više oligomere) putem formiranja međulančanih disulfidnih veza, pri čemu neočekivano ne narušava ili na neželjeni način kompromituje sposobnost fuzionog proteina ili drugih konstrukata da pospešuju ADCC, i/ili CDC i/ili da fiksiraju komplament. Posebno, Fc receptori koji posreduju u ADCC( npr.,FcRIII, CD 16) pokazuju mali afinitet za Fc domene imunoglobulina, što podržava ideju da funkcionalno vezivanje Fc za FcR zahteva stabilizaciju Fc-FcR kompleksa posredstvom dimerne strukture teških lanaca u sastavu konvencionalnog antitela i/ili FcR agregaciju i ukršteno vezivanje posredovano Fc strukturom konvencionalnog antitela (Sondermanet al,2000Nature406:267; Radaevet al,2001J. Biol Chem.276:16469; Radaevet al,2001J. Biol. Chem.276:16478; Koolvvijket al, 1989 J. Immunol.143:1656; Katoet al,2000Immunol. Today21:310). Stoga, konstrukti, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku, pokazuju prednosti koje su udružene sa jednolančanim konstruktima, uključujući jednolančane imunoglobulinske fuzione proteine, a istovremeno neočekivano zadržavaju jednu ili više imunoloških aktivnosti. Slično tome, sposobnost fiksacije komplementa je tipično udružena sa imunoglobulinima koji su dimerni, posebno u pogledu konstantnih regiona teškog lanca, kao što su oni koji sadrže Fc, dok različiti konstrukti, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena imunoglobulina prema predmetnom pronalasku, mogu, usled zamene ili delecije cisteinskih ostataka regiona šarke ili usled drugih strukturnih modifikacija koje su ovde opisane, da onemoguće ili da spreče uspostavljanje međulančanih disulfidnih veza, pri čemu se neočekivano zadržava sposobnost fiksacije komplementa. Dodatno, prema određenim rešenjima predmetnog pronalaska, fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina može da sadrži povezujući region i region molekulskog repa koji se sastoje ili se suštinski sastoje od jednog ili od više regiona koji deluju kao region šarke humanog IgE, to jest, od polipeptida CH2 regiona IgE, od polipeptida CH3 konstantnog regiona humanog IgE i od polipeptida konstantnog regiona CH4 humanog IgE, pri čemu konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine, neočekivano zadržavaju imunološku aktivnost u posredovanju ADCC i/ili indukovanja mehanizma alergijskog odgovora.

Izbor polipeptida regiona šarke imunoglobulina kao povezujućeg regiona, prema određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku za konstrukte kao što su fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina, može da se zasniva na upotrebi polipeptidne sekvence "alternativnog regiona šarke", koja obuhvata polipeptidnu sekvencu koja nije obavezno izvedena iz sekvence regiona šarke imunoglobulina. Umesto toga, pojam "alternativni region šarke" se odnosi na polipeptid regiona šarke koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ili drugu molekulsku sekvencu od najmanje deset uzastopnih amino kiselina ili molekula, a u određenim rešenjima od najmanje 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30, 31-50, 51-60, 71-80, 81-90 ili 91-110 amino kiselina ili molekula koji su prisutni u sekvenci koja je izabrana iz grupe sekvenci čiji su brojevi - , npr., to je polipeptidna sekvenca koja je izvedena iz regiona koji je lociran između unutar lančanih disulfidnih veza formiranih od petlji imunoglobulinima sličnih domena koji pripadaju molekulima iz superporodice proizvoda imunoglobulinskog gena, kao što su CD2{ npr.,Genbank pristupni br. NM_001767), CD4{ npr.,Genbank pristupni br. NM_000616), CD5{ npr.,Genbank pristupni br. BC027901), CD6{ npr.,Genbank pristupni br. NM_006725), CD7{ npr.,Genbank pristupni br. XM_046782, BC009293, NM_006137) ili CD8( npr.,Genbank pristupni br. Ml2828), ili drugih članova superporodice Ig. Primera radi, bez ograničenja, alternativni region šarke koji se koristi kao povezujući region, na primer, može da obezbedi mesto za glikozilaciju, kao što je to slučaj ovde, ili može da obezbedi polipeptidnu sekvencu koja je izvedena iz humanog gena, a čiji je cilj pospešivanje stepena "humanizacije" fuzionog proteina, ili može da se sastoji ili da se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence koja eliminiše ili umanjuje sposobnost konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., fuzionog proteina, da formira multimere ili oligomere ili agregate. Određene alternativne polipeptidne sekvence regiona šarke, uključujući one koji su opisani ovde, mogu biti izvedene ili konstruisane na osnovu (ili korišćenjem) polipeptidnih sekvenci članova superporodice imunoglobulinskog gena koji sami po sebi nisu imunoglobulini. Na primer, shodno neograničavajućoj teoriji, određene polipeptidne sekvence koje se nalaze između međulančanih disulfidnih veza, formiranih između petlji imunoglobulinskog domena kod proteina koji su članovi superporodice imunoglobulinskog gena, mogu da se koriste u celosti ili delimično kao alternativni polipeptidi regiona šarke, na način kako je to opisano ovde, ili mogu biti dalje modifikovani radi takve upotrebe.

Kao što je naznačeno gore, na osnovu neograničavajuće teorije, moguće je narušiti sposobnost konstrukta prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, da dimerizuju putem uspostavljanja među lančanih disulfidnih veza, što je, prema pomnutoj teoriji, posledica smanjenja (potpunog ozostavljanja ili delimičnog smanjenja) broja cisteinskih ostataka koji su prisutni u polipeptidu regiona šarke imunoglobulina koji su izabrani za uključivanje u konstrukt, npr., konstrukt fuzionog proteina. Određivanje relativne sposobnosti polipeptida da dimerizuje je dobro poznata u struci i za detekciju dimerizacije proteina može da se upotrebi neka od brojnih poznatih metodologija( videti, npr.,Scopes,Protein Purification: Principles and Practice,1987 Springer-Verlag, New York). Na primer, za određivanje stepena dimerizacije ili oligomerizacije polipeptida, kao i za određivanje mogućeg doprinosa disulfidnih veza u uspostavljanju takve potencijalne kvaternerne strukture, mogu da se koriste tehnike biohemijske separacije proteina na osnovu veličine molekula( npr.,gel elektroforeza, gel filtraciona hromatografija, analitičko ultracentrifugiranje, i si.) i/ili za upoređivanje fizičko-hemijskih svojstava proteina pre i nakon uvođenja sulfhidril-aktivnih sredstava( npr.,jodoacetamid, N-etilmaleimid) ili disulfid-redukujućih sredstava( npr., 2-merkaptoetanol, ditiotreitol) ili korišćenjem drugih ekvivalentnih metodologija. U određenim rešenjima predmetni pronalazak se odnosi na konstrukt( npr.,fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina) koji pokazuje smanjenu (tj., statistički značajno smanjenu u odnosu na odgovarajuću kontrolu izvedenu iz IgG) sposobnost da dimerizuje, u odnosu na polipeptid regiona šarke humanog IgG, kao što je to opisano ovde. Stručnjaci lako mogu da odrede da li određeni fuzioni protein pokazuje smanjenu sposobnost da dimerizuje.

Preparati i postupci za dobijanje imunoglobilinskih fuzionih proteina su dobro poznati u struci. Videti, na primer, U. S. Patent br. 5,892,019, koji opisuje rekombinantne proteine koji su proizvod jednog kodirajućeg polinukleotida, pri čemu tamo navedeni proteini nisu konstrukti prema predmetnom pronalasku, tj., nisu fuzioni proteini vezujućeg domena imunoglobilina.

Za konstrukt, na primer, imunoglobulinski fuzioni protein prema predmetnom pronalasku, koji je namenjen upotrebi kod ljudi, bilo koji od konstantnih Ig regiona treba tipično da bude humanog porekla ili humanizovan, kako bi se na minimum sveo potencijalni anti-humani imuni odgovor i kako bi se obezbedilo postojanje željenih efektorskih funkcija. Manipulacija sekvencama koje kodiraju konstantne regione antitela opisana je u referenci: PCT publikacija Morrison & Oi, WO 89/07142. U posebno poželjnim rešenjima, region molekulskog repa se dobija iz kostantnog regiona teškog lanca imunoglobulina u kome je CH1 domen izbrisan (ili su CH1 i CH2 regioni izbrisani u slučaju IgE), odakle se dobija i karboksilni kraj vezujućeg domena, ili vezujući domen sadrži dva polipeptida varijabilnog regiona imunoglobulina, pri čemu je drugi (proksimalniji C-terminalu) varijabilni region povezan sa amino terminalom CH2 preko jednog ili preko više povezujućih regiona, npr., preko regiona šarke ili izmenjenog regiona šarke. Šematski dijagram koji opisuje strukture dva fuziona proteina vezujućeg domena i imunoglobulina prikazan je na slici 11. U određenim poželjnim rešenjima nisu prisutne međulančane disulfidne veze, a u drugim rešenjima je prisutan ograničen broj disulfidnih veza u odnosu na broj takvih veza prisutnih u polipeptidima regiona šarke divljeg tipa. U drugim rešenjima za konstrukt prema predmetnom pronalasku, fuzioni protein obuhvata ili se suštinski sastoji od mutiranog ili na drugi način izmenjenog polipeptida regiona šarke koji pokazuje smanjenu sposobnost da dimerizuje u odnosu na polipeptid regiona šarke humanog IgG divljeg tipa. Stoga, izolovani molekul polinukleotida koji kodira takav jednolančani konstrukt, kao što je to imunoglobulinski fuzioni protein, poseduje vezujući region, na primer, domen koji obezbeđuje specifično ili na drugi način željeno vezivanje i selektivnost za metu, kao što je to željeni antigen.

Predmetni pronalazak, takođe, u određenim rešenjima obuhvata konstrukte u koje spadaju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrže fuzionisane ili na drugi način povezane polipeptidne sekvence ili njihove delove koji su izvedeni iz ili su dobijeni od mnoštva genetskih izvora, na primer, upotrebom molekulske tehnike "izmene domena"". Stručnjaci shvataju da izbor takvih polipeptidnih sekvenci koje treba da se uklope u konstrukt, npr., fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, može da obuhvati određivanje odgovarajućih delova svake od komponentnih polipeptidnih sekvenci, na osnovu njihovih stukturnih i/ili funkcionalnih svojstava( videti, npr.,Caravannopouloset al,1996 J.Exp. Med.183:1579; Harlovvet al,urednici,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor (1988)). Komponentne polipeptidne sekvence od kojih je konstukt, npr., fuzioni protein, sastavljen ili pripremnjen, mogu da sadrže intaktni vezujući domen pune dužine, imunoglobulin, veznik i/ili polipeptidnu sekvencu domena sidra za plazmalemu, ili može da sadrži njihove nepotpune verzije ili varijante, kao što je to ovde opisano. Prema ovim i povezanim rešenjima prema predmetnom pronalasku, bilo koja dva ili više kandidata za komponentne polipeptide konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., fuzionih proteina, mogu da se dobiju ili da se izvedu ili da se pripreme iz nezavisnih izvora, na primer, iz imunoglobulinskih sekvenci različitih alotipova, izotipova, podklasa, klasa ili vrsta porekla (tj., iz različitih ksenotipova). Stoga, kao neograničavajući primer može da posluži polipeptid vezujućeg domena (ili njegovi konstituentni polipeptidi, npr., jedan ili više polipeptida varijabilnog regiona i/ili polipeptida veznika), polipeptid regiona šarke, polipeptidi konstantnih regiona CH2 i CH3 teškog lanca imunoglobulina i opciono polipeptid konstantnog regiona CH4 teškog lanca imunoglobulina, koji mogu da se dobiju iz IgM ili IgE teškog lanca, polipeptid domena sidra za plazmalemu, pri čemu svi oni mogu da se odvojeno dobiju iz različiti genetskih izvora i da se genetskim inženjeringom uklope u himerični ili fuzioni protein korišćenjem dobro poznatih tehnika i metodologija koje su ovde opisane.

Konstrukti prema predmetnom pronalasku, npr., fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina, shodno određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, takođe mogu da sadrže u određenom delu polipeptid CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, koji je, u stvari, polipeptid CH3 domena konstantnog regiona IgA divljeg tipa, ili alternativno, koji je mutiran ili na drugi način izmenjen ili supstituisan ili nepotpun polipeptid CI 13 domena konstantnog regiona IgA, koji nije sposoban da se udruži sa J lancem, ili koji nije sposoban da se udruži u neželjenom stepenu sa J lancem; poželjno, to su polipeptidi CH3 domena konstantnog regiona IgA koji se koriste u delu konstrukta regiona molekulskog repa i koji su humanog porekla ili su humanizovani. Radi brzog opšteg pregleda, IgA molekuli su poznati po tome što se sekretuju u telesne tečnosti mehanizmom koji obuhvata udruživanje IgA u polimere povezane disulfidnim mostovima( npr.,kao dimeri) pomoću polipeptida J lanca( npr.,pristupni brojevi u Genbank XM_059628, Ml2378, Ml2759; Johansenet al,1999Eur. J. Immunol.29:1701), pri čemu je neophodna interakcija tako nastalog kompleksa sa drugim proteinom koji deluje kao receptor za polimerne imunoglobuline i koji je poznat kao transmembranska sekretorna komponenta (SC; Johansenet al.,2000Sc. J. Immunol.52:240;takođe videti, npr.,Sorensenet al.,2000Int. Immunol.12:19; Yooet al.,1999J. Biol. Chem.274:33771; Yooet al.,2002J. Immunol. Meth.261:1; Corthesv, 2002Trends Biotechnol.20:65; Symerskyet al,2000Mol. Immunol.37:133; Crottetet al,1999Biochem. J.341:299). Stvaranje međulančanih disulfidih veza između Fc domena IgA i J lanca je posredovano cisteinskim ostatkom koji se nalazi u okviru C-terminalnog produžetka od osamnaest aminokiselina, koji formira deo polipeptida CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca IgA (Yooet al,1999; Sorensenet al,2000). U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku koji se odnose na konstrukte u koje spadaju fuzioni proteini, oni sadrže sekvencu polipeptida konstantnog regiona teškog lanca IgA divljeg tipa sposobnu za udruživanje sa J lancem. Međutim, u određenim drugim rešenjima prema predmetnom pronalasku, obezbeđeni su fuzioni proteini koji sadrže mutirani ili na drugi način izmenjeni, supstituisani ili nepotpuni polipeptid CH3 domena konstantnog regiona IgA koji nije sposoban za udruživanje sa J lancem. Prema takvim rešenjima, dva ili više ostatka iz C-terminala polipeptida CH3 domena konstantnog regiona IgA, kao što je to polipeptid CH3 domena konstantnog regiona humanog IgA, mogu biti deletirani, kako bi se dobio nepotpuni polipeptid CH3 domena konstantnog regiona, kao što je to opisano ovde. U poželjnim rešenjima i na način kako je to ovde detaljno opisano, mutirani polipeptid CH3 domena konstantnog regiona humanog IgA koji nije sposoban za udruživanje sa J lancem sadrži navedenu deleciju na C terminalu koja obuhvata od četiri ili od 18 amino kiselina. Međutim, predmetni pronalazak nije na takav način ograničen, tako da polipeptid konstantnog regiona CH3 mutiranog IgA može da sadrži deleciju od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-25, 26-30 ili više amino kiselina, tj., može da sadrži onoliki broj delecija koji kod konstrukta, npr., fuzionog proteina ne narušava sposobnost specifičnog vezivanja antigena i ispoljavanja barem jedne imunološke aktivnosti koja je ovde opisana. Alternativno, predmetni pronalazak takođe obuhvata konstrukte koji poseduju region molekulskog repa koji sadrži polipeptid CH3 domena konstantnog regiona mutiranog IgA koji nije sposoban za udruživanje sa J lancem, što se ostvaruje putem zamene cisteina ili hemijskom modifikacijom tog aminokiselinskog ostatka, na način kojim se sprečava ili inhibira neželjeni nivo stvaranja međumolekulskih disulfidnih veza ili multimera. Postupci za određivanje sposobnosti konstrukta, npr., fuzionog proteina da se udruži sa J lancem, poznat je stručnjacima i opisan je ili u vidu reference navedene ovde.

Ovde je opisano i određeno na osnovu postupaka koji su poznati u struci, da konstrukt, npr., fuzioni protein, može dalje da bude rutinski testiran na prisustvo određene imunološke aktivnosti, npr., u testovima za određivanje ADCC ili CDC. Kao ilustrativni primer, konstrukt, npr., fuzioni protein, shodno određenom rešenju, može da sadrži polipeptid vezujućeg domena koji je izveden iz ili koji je konstruisan na osnovu (ili korišćenjem) nativne ili genetskim inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence varijabilnog regiona humanog teškog lanca, nativne ili genetskim inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence regiona šarke imunoglobulina humanog IgA, nativne ili genetskim inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence CH2 domena konstantnog regiona teškog lanca IgGl imunoglobulina, nativne ili genetskim inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina IgG2 i opciono nativne ili genetskim inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence CH4 domena konstantnog regiona teškog lanca humanog IgGl imunoglobulina IgE i/ili nativne ili genetskim inženjeringom dobijene polipeptidne sekvence domena sidra za plazmalemu humanog TNF-a receptora tipa 1 (TNFR1), pri čemu konstrukt sadrži polipeptid citoplazmatskog molekulskog repa koji je sposoban za prevođenje signala za apoptozu ili koji na drugi način pospešuje apoptozu. Predmetni pronalazak, stoga, obuhvata ova i druga rešenja u kojima dve ili više polipeptidnih sekvenci prema predmetnom pronalasku u okviru konstrukta, npr., fuzionog proteina, poseduju različito genetsko poreklo.

Kao što je naznačeno gore, u određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, konstrukt, npr., fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, sadrži barem jedan nativni ili genetskim inženjeringom dobijeni polipeptid varijabilnog regiona imunoglobulina, a to može biti nativan ili genetskim inženjeringom dobijen polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca ili lakog lanca, a u određenim rešenjima fuzioni protein sadrži barem jedan takav nativni ili genetskim inženjeringom dobijeni V-region lakog lanca ili jedan takav nativni ili genetskim inženjeringom dobijeni V-region teškog lanca i barem jedan povezujući peptid koji je fuzionisan ili na drugi način povezan sa svakim od nativnih ili genetskim inženjeringom dobijenih V-regiona. Konstrukcija takvih vezujućih domena, na primer, jednolančanih Fv domena, poznata je u struci i detaljnije je opisana u primerima koji slede u daljem tekstu, i opisana je, na primer, u različitim dokumentima koji su ovde citirani; takođe, u struci je poznata i ovde je opisana selekcija i sklapanje jednolančanih varijabilnih regiona i veznika, koji mogu biti fuzionisani ili na drugi način povezani, u slučaju svakog V regiona izvedenog iz teškog lanca i iz lakog lanca( npr.,u slučaju formiranja povezujućeg regiona, kao što je to povezujući domen koji obuhvata jednolančani Fv polipeptid).Videti, npr.,U. S. Patente br. 5,869,620, 4,704,692, i 4,946,778. U određenim rešenjima, svi delovi ili neki deo ili neki delovi imunoglobulinske sekvence koja je izvedena iz izvora koji nije human, mogu biti "humanizovani" primenom poznatih postupaka za dobijanje humanizovanih antitela, tj., imunoglobulinskih sekvenci u kojima se humane Ig sekvence uvode u cilju smanjenja stepena verovatnoće da human imuni sistem prepozna ove proteine kao strane( videti, npr.,U. S. Patente br. 5,693,762; 5,585,089; 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101, kao i dokumente koji su citirani tamo).

Konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, koji su ovde opisani, poželjno sadrže mesta za glikozilaciju, npr., za kovalentno vezivanje ugljenohidratnih molekula, kao što su, na primer, monosaharidi ili oligosaharidi. Uvođenje aminokiselinskih sekvenci koje obezbeđuju supstrate za glikozilaciju polipeptida poznato je u struci i obuhvata, na primer, upotrebu genetskog inženjeringa, ili postupaka za proteinski inženjering kako bi se dobila polipeptidna sekvenca koja sadrži, na primer, klasično Asn-X-Ser/Thr mesto za N-(asparagin)-povezanu glikozilaciju ili sekvencu koja obuhvata Ser ili Thr ostatke koji su pogodni supstrati za O-povezanu glikozilaciju ili obuhvata sekvence koje mogu da se podvrgnu C-manozilaciji, glipijaciji / glikozilfosfatidilinozitol modifikaciji ili fosfoglikaciji, pri čemu svaka od navedene tehnike može da se izabere u konkretnom slučaju na osnovu kriterijuma poznatih u struci( npr.,Spiro, 2002Glybiology12:43R). Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju ili mehanizam, poznato je da glikozilirani konstrukti, kao što su fuzioni proteini sa posebnim aminokiselinskim sekvencama, mogu da poseduju svojstva kao što su poboljšana rastvorljivost, povećana stabilnost u rastvoru, poboljšana fiziološka stabilnost, poboljšana biološka raspoloživost, uključujući in vivo biodistribuciju, kao i superiornu rezistenciju na proteaze, što se smatra poželjnim, pri čemu su sve navedene osobine izraženije u statistički značajnoj meri u odnosu na konstrukte, npr., fuzione proteine, koji poseduju iste ili slične aminokiselinske sekvence, ali koje nemaju glikozilirane molekule. U određenim poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, konstrukti, kao što su fuzioni proteini, mogu da sadrže mesto za glikozilaciju koje je prisutno u vezniku, što je ovde opisano, a u određenim drugim poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, konstrukt, npr., fuzioni protein, sadrži mesto za glikozilaciju koje je prisutno u regionu za povezivanje, npr., u polipeptidnoj sekvenci regiona šarke, što je ovde opisano.

U određenim poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, kao što su ona koja se odnose na gensku terapiju ili na sisteme za prikazivanje ili ispitivanje, uključujući sisteme za prikazivanje u vidu biblioteke i testove za ispitivanje biblioteke, konstrukti, npr., fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina, obezbeđen je protein ili glikoprotein koji je sposoban da bude eksprimiran od strane ćelije domaćina o koji je lokalizovan na površini ćelije. Konstrukti, kao što su fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina, koji su lokalizovani na ćelijskoj površini, mogu biti eksprimirani kao površinski proteini posredstvom prirodno postojećih ili veštački uvedenih strukturnih karakteristika koje usmeravaju fuzioni protein ka površini ćelije( npr.,Nelsonet al,2001Trends Cell Biol.11:483; Ammonet al.,2002Arch. Physiol. Biochem.110:137; Kasaiet al,2001J. Cell Sci114:3115; VVatsonet al,2001Am. J. Physio\. Cell Physiol.281:C215; Chatterjeeet al,2000J. Biol. Chem.275:24013), navedene karakteristike obuhvataju, ilustracije radi, bez ograničenja, postojanje sekretornih signalnih sekvenci, vodećih sekvenci, polipeptida domena sidra za plazmalemu i transmembranskih domena, kao što su hidrofobni transmembranski domeni( npr.,Heucket al,2002Cell Biochem. Biophys.36:89; Sadlishet al,2002Biochem J.364:777; Phoenixet al,2002Mol. Membr. Biol19:1; Minkeet al,2002Physiol. Rev.84:429) ili mesta za kačenje glikozilfosfatidilinozitola ("mesta za glipijaciju",npr., videtiu Chatterjeeet al,2001Cell Mol. Life Sci.58:1969; Hooper, 2001Proteomics1:748; Spiro, 2002Glycobiol.12:43R), zatim postojanje domena za vezivanje za ćelijske površinske receptore, domena za vezivanje ekstracelularnog matriksa ili bilo koje druge strukturalne osobine koje dovode do toga da se barem željeni deo populacije fuzionog proteina lokalizuje, u potpunosti ili delimično, na ćelijskoj površini. Posebno su poželjni konstrukti fuzionih proteina koji sadrže domen sidra za plazmalemu, što obuhvata transmembranski polipeptidni domen, koji se tipično sastoji od domena koji se proteže kroz membranu i koji obuhvata hidrofobni region koji je sposoban za energetski poželjnu interakciju sa repovima fosfolipidnih masnih kiselina koji formiraju unutrašnjost dvosloja plazmaleme. Navedene osobine su poznate stručnjacima koji poznaje postupke za uvođenje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju ove osobine u željeni ekspresioni konstrukt putem genetskog inženjeringa, kao i kojima je poznat način rutinskog ispitivanja takvih konstrukata u cilju verifikacije lokalizacije proizvoda na površini ćelije.

Prema određenim daljim rešenjima, polipeptid domena sidra za plazmalemu sadrži polipeptid transmembranskog domena i polipeptid citoplazmatskog molekulskog repa, koji se odnosi na region ili deo polipeptidne sekvence koja je u kontaktu sa citoplazmatskom površinom plazmaleme i/ili koja je u kontaktu sa citosolom ili drugim citoplazmatskim komponentama. Poznat je veliki broj polipeptida citoplazmatskog molekulskog repa koji sadrže intracelularne delove transmembranskih proteina plazmaleme, a takođe je identifikovan određeni broj diskretnih funcija za mnoge od takvih polipeptida, uključujući prevođenje biološkog signala( npr.,aktivaciju ili inhibiciju protein kinaza, protein fosfataza, G-proteina, cikličnih nukleotida i drugih sekundarnih glasnika, jonskih kanala, sekretornih signalnih kaskada), zatim otpuštanje biološki aktivnih medijatora, stabilnu ili dinamičku asocijaciju sa jednom ili sa više komponenti citoskeleta, ćelijsku diferencijaciju, ćelijsku aktivaciju, mitogenezu, citostazu, apoptozu i slične funkcije( n<pr>,Maheret al,2002Immunol. Cell Biol.80:131; El Faret al,2002Biochem J.365:329; Tenget al,2002Genome Biol2REVIEWS:3012; Simonset al,2001Cell Signal13:855; Furieet al,2001Thromb. Haemost.86:214; Gaffen, 2001Cytokine14:63; Dittel, 2000Arch. Immunol. Ther. Exp.(Warsz.) 48:381; Pameset al,2000Immunol. Rev.176: 75; Morettaet al,2000Semin Immunol.12:129; Ben Ze'ev, 1999Ann. N. Y. Acad. Sci.886:37; Marsterset al, Recent Prog. Horm. Res.54:225).

Slika 70 ilustruje vezivanje rastvorljivih fuzionih proteina FcRlU (CD16) konjugovanih fluorceinom za konstrukte 2H7 vezujućeg domena jednolančanog Fv koji su prikačeni za CD20 eksprimiran od strane ćelija, u ovom slučaju CHO ćelija. Vezivanje CD16 za konstrukt prema predmetnom pronalasku, npr., za konstrukt vezujućeg domena jednolančanog Fv, predstavlja jedan primer testa za ispitivanje koji može da se koristi za detekciju i/ili kvantifikaciju promena vezivanja CD 16 za izmenjene konstrukte prema predmetnom pronalasku, uključujući konstrukte vezujućeg domena jednolančanog Fv, koji sadrže ciljane ili za mesto specifične mutacije, supstitucije, delecije ili druge alteracije. Promene u svojstvima vezivanja CD16 mogu da se ogledaju, na primer, u promenama u vezivanju visoko afinitetnog proteina (158V) za CD 16 ili nisko afinitetnog proteina (158F) za CD16 ili u promenama u vezivanju oba proteina.

Šematski prikaz jednog primera takvog postupka ispitivanja je prikazan u vidu dijagrama

na drugom crtežu na slici 70, pri čemu su konstrukti vezujućeg domena jednolančanog Fv eksprimirani na ćelijskoj površini određene sisarske ćelije. Molekuli vezujućeg domena jednolančanog Fv u ovom primeru su eksprimirani na površini ćelije pomoću molekula koji služi kao sidro za transmembranski domen. Ovi molekuli su ili određeni konstrukti vezujućeg domena jednolančanog Fv ili mogu da se uvedu u populaciju sisarskih ćelija u vidu biblioteke takvih molekula. Potom, transficirane ćelije sa izmenjenim vezujućim svojstvima mogu, na primer, da budu prikupljene, sortirane ili na drugi način izolovane od drugih ćelija pomoću izmene parametara kriterijuma i uslova selekcije i korišćenjem CD16 fuzionih proteina u vidu proba za vezivanje. Na ovaj način mogu biti izolovane ćelije koje eksprimiraju scFv-Ig molekule sa izmenjenim svojstima vezivanja za visoko afinitetni alel (158V) za CD16 ili za nisko afinitetni alel (158F) za CD 16 ili za oba alela.

Ovaj sistem prikazivanja može da se koristi, na primer, za kreiranje biblioteke konstrukata prema predmetnom pronalasku sa mutiranim ili na drugi način izmenjenim regionima molekulskog repa, pri čemu su kratki delovi CH2 sekvence zamenjeni nasumično izabranim nukleotidima ili, na primer, randomizacijom jednog ostatka sa svim mogućim aminokiselinskim supstitucijama, onim koji se javljaju prirodno ili veštački, uključujući sintetske aminokiseline. Kada je takva biblioteka konstruisana, ona može da bude transficirana u odgovarajuće ćelije, na primer, u COS ćelije, postupcima koji su poznati u struci, potom, transfektanti mogu da budu vezani, na primer, za obeležene CD 16 konstrukte i mogu da se prikupe ili sortiraju na osnovu njihovih relativnih ili željenih vezujućih svojstava za višestruke alelotipove/izoforme. Željene ćelije mogu biti prikupljene, a zatim njihova DNK, na primer, plazmidska DNK, može biti izolovana i onda transformisana u bakterije. Ovaj proces može biti iterativno ponavljan više puta, sve dok se odgovarajući klonovi ne izoluju iz grupe sisarskih ćelija domaćina. Videti, Seed B and Aruffo A, Pro. Nat'l Acad Sci USA 1987 84:3365-3369; Aruffo A and Seed B, Pro. Nat'l Acad Sci USA 1987 84:8573-8577.

Jedna od takvih primena ovog tipa sistema za ispitivanje jeste sistem za identifikaciju i/ili izolaciju konstrukata prema predmetnom pronalasku sa regionima molekulskog repa ili regionima molekulskog repa koji se vezuju podjednako dobro i za visoko afinitetne i za nisko afinitetne alele za CD 16, pri čemu je cilj postupka poboljšanje efektorskih funkcija posredovanih konstruktima vezujućeg domena jednolančanog Fv u brojnim subpopulacijama pacijenata. Konstrukti prema predmetnom pronalasku koji poseduju regione molekulskih repova ili regione molekulskih repova sa izmenjenim vezujućim svojstvima za druge Fc receptore, mogu, takođe, biti izabrani korišćenjem navedenog sistema za prikazivanje, na primer, sistema za prikazivanje koji je ovde opisan. Drugi sistemi za prikazivanje koji ne vrše glikozilaciju proteina, na primer, oni koji koriste bakteriofag ili gljivice, generalno nisu poželjni za izbor konstrukata prema predmetnom pronalasku sa regionima molekulskog repa izvedenim iz imunoglobulina ili sa regionima molekulskog repa izvedenim iz imunoglobulina sa izmenjenim vezujućim svojstvima za scFv. Većina ne-sisarskih sistema ne vrši glikozilaciju proteina.

Ekspresija konstrukata prema predmetnom pronalasku, na primer, konstrukata vezujućeg domena jednolančanog Fv, konkretno ekspresija na površini sisarske ćelije postiže se inkorporacijom odgovarajućeg molekula u konstrukt, na primer, inkorporacijom transmembranskog domena ili signala za GPI sidro, što se, takođe, koristi i u drugim sistemima za prikazivanje koji su korisni, npr., za izbor konstrukata prema predmetnom pronalasku, npr., za izbor izmenjenih molekula vezujućeg domena jednolančanog Fv, koji se proizvode u većim ili u drugim poželjnim nivoima. U jednom takvom rešenju, ćelije koje su korisne u proizvodnji glikoziliranih proteina, na primer, sisarske ćelije kao što su COS ćelije, bivaju transficirane bibliotekom konstrukata vezujućeg domena jednolančanog Fv u plazmid koji usmerava njihovu ekspresiju ka površini ćelije. Ćelije, kao što su COS ćelije, koje eksprimiraju najviše ili druge željene nivoe molekula vezujućeg domena jednolančanog Fv, biraju se se tehnikama koje su poznate u struci (na primer, panelizacijom, sterilnim sortiranjem ćelija, separacijom magnetnim kuglicama i si.), a njihova DNK, npr., plazmidska DNK, izoluje se da bi sc ubacila transformacijom u druge ćelije, npr., u bakterije. Nakon jednog ili nakon više ponovljenih izbora pojedinačnih klonova, izoluju se oni koji kodiraju molekule vezujućeg domena jednolančanog Fv koji su sposobni za ekspresiju većih ili drugih željenih nivoa. Izolovani klonovi zatim mogu biti izmenjeni na način kojim se uklanja membransko sidro i kojim se eksprimiraju u odgovarajućim ćelijskim sistemima, npr., u nekom sisarskom ćelijskom sistemu, u kome sekonstrukti vezujućeg domena jednolančanog Fv proizvode, npr., sekrecijom u podlogu kulture u željenim nivoima. Bez vezivanja za bilo koji određeni mehanizam ili teoriju, veruje se da ovo nastaje zbog opšte potrebe sekretovanih glikoproteina i glikoproteina na površini ćelije za signalnim peptidom i zbog obrade u Goldži aparatu. Stoga, izbor molekula koji pokazuje poboljšane nivoe ekspresije na površini ćelije, takođe, dovodi do olakšavanja identifikacije molekula koji poseduje navedeno povećanje nivoa sekretovanog proteina.

Navedeni sistemi za prikazivanje koji koriste konstrukt prema predmetnom pronalasku mogu takođe da se upotrebe za ispitivanje i/ili identifikaciju i/ili izolaciju afinitetnih varijanti vezujućeg domena u okviru konstrukta.

Posebno su poželjni oni sistemi za prikazivanje i/ili ispitivanje koji obuhvataju, ili koji koriste konstrukte: (1) polipeptidne sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina, uključujući VH i/ili VL i/ili jednolančani varijabilni region (sFv), i koji sadrže, na primer, mutaciju, alteraciju

ili deleciju amino kiseline na položaju 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 i 112 u sekvenci VHregiona (uključujući i sekvencu VHregiona u okviru scFv ili drugog konstrukta) i/ili (2) polipeptidnu sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulina, uključujući nativne ili genetskim izženjeringom dobijene Vhi/ili Vli/ili jednolančane sekvence varijabilnog regiona (sFv), i koji obuhvataju mutaciju, alteraciju ili deleciju jedne ili više amino kiselina na položajima 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 i 108, u sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (uključujući sekvencu Vlregiona u okviru scFv ili nekog drugog konstrukta). Posebno su poželjni oni sistemi za prikazivanje i/ili ispitivanje koji obuhvataju, ili koji koriste konstrukte sa genetskim inženjeringom dobijenom Vhsekvencom (bilo daje ona udružena ili da nije udružena sa jednom ili sa više drugih sekvenci, uključujući sekvence izvedene iz imunoglobulina ili druge sekvence koje se nalaze, na primer, u okviru konstrukta sa sFv ili sa scFv), koja dalje sadrži mutaciju, alteraciju ili deleciju amino kiseline na položaju 11. Ukoliko je supstituisana amino kiselina na položaju 11 Vh, onda ona može biti supstituisana drugom amino kiselinom, kao što je to opisano ovde, ili nekim drugim molekulom po želji.

Što se tiče drugih postupaka prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je upotreba konstrukata, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, u tretmanu malignog stanja ili B ćelijskog poremećaja, u koje spadaju, na primer, jedan ili više postupaka genske terapije i postupci dopremanja tih konstrukata, pri čemu predmetni pronalazak, takođe, obuhvata određena rešenja u kojima konstrukt, npr., fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina, sadrži polipeptid domena sidra za plazmalemu, tako da je eksprimiran (ili je sposoban za ekspresiju) na površini ćelije i može dalje da sadrži polipeptid citoplazmatskog molekulskog repa koji sadrži polipeptidnu sekvencu za signalizaciju apoptoze. U struci su poznate brojne polipeptidne sekvence koje signaliziraju početak apoptoze, što je revijski prikazano, na primer, u radu:When Cell Die: A Comprehensive Evaluation of Apoptosis and Programmed Cell Death(R. A. Lockshinet al,urednici, 1998 John Wiley & Sons, New York;videti takođe, npr.,Greenet al.,1998Science281:1309 i reference citirane ranije; Ferreiraet al.,2002Clin. Canc. Res.8:2024; Gurumurthyet al,2001Cancer Metastas. Rev.20:225; Kanducet al,2002Int. J. Oncol.21:165). Tipično, polipeptidna sekvenca za signalizaciju apoptoze

sadrži sve delove ili samo neki deo, ili je izvedena iz, ili je konstruisana na osnovu polipeptida domena za receptor smrti, na primer, FADD( npr.,pristupni br. u Genbank U24231, U43184, AF009616, AF009617, NMJH2115), TRADD( npr.,pristupni br. u Genbank NM_003789), RAIDD( npr.,pristupni br. u Genbank U87229), CD95 (FAS/Apo-1; npr., pristupni br. u Genbank X89101, NM_003824, AF344850, AF344856), TNF-a-receptor-1 (TNFR1, npr., pristupni br. u Genbank S63368, AF040257), DR5( npr.,pristupni br. u Genbank AF020501, AF016268, AF012535) ITIM domen( npr.,pristupni br. u Genbank AF081675, BC015731, NM_006840, NM_006844, NM_006847, XM_017977;videti, npr.,Billadeauet al,2002J. Clin. Invest.109:161), ITAM domen( npr.,pristupni br. u Genbank NM_005843, NMJ303473, BC030586;videti, npr.,Billadeauet al,2002), ili navedena sekvenca obuhvata u struci poznate polipeptide domena koji je udružen sa receptorom smrti pri apoptozi, na primer, TNFR2( npr.,pristupni br. u Genbank L49431, L49432), kaspaza/ prokaspaza-3( npr.,pristupni br. u Genbank XM_54686), kaspaza/ prokaspaza-8( npr.,AF380342, NM_004208, NM_001228, NM_033355, NM_033356, NM_033357, NM_033358), kaspaza/ prokaspaza-2( npr.,pristupni br. u Genbank AF314174, AF314175).

Ćelije u biološkim uzrocima za koje se sumnja da podležu apoptozi mogu biti ispitane morfološki, mogu biti ispitane njihove promene u permeabilnosti membrane ili druge promene koje su ukazuju na odvijanje procesa apoptoze. Na primer, ilustacije radi, bez ograničenja, apoptoza u mnogim tipovima ćelija može da izazove izmenu morfologije, na primer, bubrenje plazma membrane, promenu ćelijskog oblika, gubljenje svojstava povezanih sa adhezijom za supstrat ili do drugih morfoloških promena koje lako mogu da se detektuju od strane stručnjaka koji, na primer, koristi svetlosni mikroskop. Kao drugi primer, ćelije koje podležu apoptozi mogu da pokažu fragmentaciju i dezintegraciju hromozoma, što može da bude vidljivo mikroskopski i/ili putem upotrebe DNK specifičnih ili za hromatin specifičnih boja koje su poznate u struci, a u koje sapdaju fluorescentne boje. Takve ćelije, takođe, mogu da pokažu promene propusnosti plazma membrane, što lako može da se detektuje upotrebom vitalnih boja( npr.,propidijum jodida, tripan plavog) ili detekcijom otpuštanja laktat dehidrogenaze u ekstracelularni prostor. Ovi i drugi načini detekcije apoptotičnih ćelija na osnovu morfoloških kriterijuma, promene propusnosti plazma membrane i primećivanja srodnih promena, poznati su stručnjacima.

U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku koje se odnosi na konstrukt, npr., fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina, koji je eksprimiran na površini ćelije, sadrži domen sidra za plazma membranu i poseduje transmembranski domen i citoplazmatski molekulski rep koji obuhvata polipeptid za signalizaciju apoptoze, ćelije u biološkom uzroku mogu biti ispitane na postojanje translokacije fosfatidilserina (PS) iz ćelijske membrane sa unutrašnje na spoljašnji sloj, što se detektuje, na primer, određivanjem vezivanja spoljašnjeg sloja plazmaleme sa aneksinom, proteinom koji je specifičan za PS (Martinet al, J. Exp. Med.182:1545, 1995; Fadoket al., J. Immunol.148:2207, 1992). U još nekim povezanim rešenjima prema predmetnom pronalasku koja se odnose na konstrukt, npr., fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina, koji je eksprimiran na površini ćelije i sadrži domen sidra plazma membranu i polipeptid za signalizaciju apoptoze, a takođe i u rešenjima u kojima je konstrukt, npr., fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina, rastvorljiv protein kome nedostaje domen sidra za plazma membranu i koji je sposoban za indukciju apoptoze, ćelijski odgovor na apoptogen se određuje testom za indukciju aktivnosti specifične proteaze kod bilo kog člana porodice proteaza koje su aktivirane apoptozom i koje su poznate kao kaspaze( videti, npr.,Greenet al,1998Science281:1309). Stručnjacima su poznati postupci za određivanje aktivnosti kaspaze, na primer, određivanje kaspazom posredovanog cepanja proteinskih supstrata koji se specifično prepoznaju. U navedene supstrate spadaju, na primer, poli-(ADP-riboza) polimeraza (PARP) ili drugi prirodni ili sintetski peptidi i proteini koji bivaju obrađeni od strane kaspaza i koji su poznati u struci( videti, npr.,Ellerbvet al.,1997J. Neurosci.17:6165). Jedan od supstrata je sintetski peptid (Z-Tyr-Val-Ala-Asp-AFC (sekvenca ID br: ;)) pri čemu "Z" označava benzoil karbonil podjedinicu, a AFC označava 7-amino-4-trifluorometilkumarin (Klucket al,1997Science275:1132; Nicholsonet al,1995Nature376:37). Drugi neograničavajući primeri supstrata obuhvataju jedarne proteine, kao što su Ul od 70 kDa i DNK-PKcs (Rosen & Casciola-Rosen, 1997J. Cell. Biochem.64:50; Cohen, 1997Biochem. J.326:1). Takođe, ćelijska apoptoza može biti detektovana određivanjem citohroma c koji je poreklom iz mitohondrija u apoptotičnim ćelijama( npr.,Liuet al, Cell86:147, 1996). Takva detekcija citohroma c može biti izvedena spektrofotometrijski, imunohemijski ili na neki drugi poznati način za određivanje prisustva specifičnog proteina. Stručnjaci shvataju da postoje i drugi odgovarajući postupci za kvantifikaciju apoptoze.

Posebno poželjna rešenja konstrukata koji su korisni za gensku terapiju odnose se na konstrukte koji sadrže domen sidra za plazma membranu i/ili polipeptid citoplazmatskog molekulskog repa (uključujući, na primer, signalnu sekvencu za apoptozu), i u takve konstrukte spadaju: (1) polipeptidna sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina, uključujući prirodne ili genetskim inženjeringom dobijene sekvence Vh i/ili Vl i/ili sekvencu jednolančanog varijabilnog regiona (sFv), koji sadrže, na primer, mutaciju, alteraciju ili deleciju amino kiseline ili aminokiselina na položaju ili na položajima 9, 10, 11, 12, 108, 110, 111 i 112 u sekvenci Vhregiona (uključujući sekvencu VHregiona u okviru scFv ili drugog konstrukta) i/ili (2) polipeptidna sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina, uključujući nativnu ili genetskim inženjeringom dobijenu VHi/ili VL i/ili jednolančanu sekvencu jednolančanog varijabilnog regiona (sFv), koja sadrži mutaciju, alteraciju ili deleciju jedne ili više aminokiselina na položaju ili na položajima 12, 80, 81, 82, 83, 105, 106, 107 i 108 u sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (uključujući sekvencu VLregiona u okviru scFv ili drugog konstrukta). Posebno su poželjni konstrukti koji obuhvataju genetskim inženjeringom izmenjenu sekvencu VH(bilo daje ona udružena ili da nije udružena sa jednom ili sa više drugih sekvenci, uključujući sekvence koje su izvedene iz imunoglobulina ili druge sekvence koje se nalaze, na primer, u okviru konstrukta sFv ili scFv konstrukta), pri čemu promene obuhvataju mutaciju, alteraciju ili deleciju amino kiseline na položaju 11. Ukoliko je supstituisana amino kiselina 11 u VH, ona može biti supstituisana drugom amino kiselinom, kao što je opisano ovde, ili nekim drugim molekulom po želji.

Kada je konstrukt, kao što je, na primer, fuzioni protein vezujućeg domena imunoglobulina koji je ovde opisan, već dizajniran, tada mogu biti sintetisani polinukleotidi koji sadrže DNK koja kodira konstrukt, korišćenjem postupka oligonukleotidne sinteze za dobijanje cele ili dela sekvence DNK, kao što je opisano, na primer, u Sinhaet al, Nucleic Acids Res.,12:4539-4557

(1984); pri čemu se sklapanje odvija putem PCR kao što je opisano, na primer, u Innis, urednici,PCR Protocols, Academic Press(1990) I takođe u Betteret al, J. Biol. Chem.267:16712-16118

(1992); potom DNK sekvenca može biti klonirana i eksprimirana putem standardnih postupaka koji su opisani, na primer, u Ausubelet al,urednici,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, New York (1989) i takođe u Robinsonet al, Hum. Antibod. Hybridomas,2:84-93 (1991); a potom proteinska sekvenca može biti testirana na željenu aktivnost, na primer, na vezivanje za metu, ili na specifičnu aktivnost vezivanja za antigen, kao što je opisano, na primer, u Harlowet al,urednici,Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14,Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor (1988) i Munsonet al,Anal. Biochem., 107:220-239

(1980).

U struci je poznat način dobijanja molekula jednolančanih peptida vezujućeg domena Fv regiona, jednolančanih Fv molekula. Videti,npr.,U. S. patent br. 4,946,778. U predmetnom pronalasku, jednolančani molekuli slični Fv molekulima, koji mogu da budu uključeni u konstrukte prema predmetnom pronalasku, mogu da se sintetišu kodiranjem prvog varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca, nakon čega sledi jedan ili više veznika za varijabilni region odgovarajućeg lakog ili teškog lanca, respektivno. Izbor različitih odgovarajućih povezujućih molekula između dva varijabilna regiona je opisan u U. S. patentu br. 4,946,778 (videti takođe,npr.,Hustonet al,1993Int. Rev. Immunol.10:195). Primer veznika koji je ovde dat jeste (Gly-Gly- Gly-Gly-Ser)3iali može da se koristi veznik bilo koje željene dužine. Veznik se koristi da bi prirodno agregirani, ali hemijski različiti, teški i laki lanac formirali N-terminalni antigen-vezujući deo jednolančanog polipeptida u kome će ovaj antigen-vezujući deo da zauzme konformaciju koja je slična originalnoj strukturi koju čine ova dva polipeptidna lanca, pri čemu novonastali opisani polipeptid zadržava sposobnost da se vezuje za ciljni molekul, na primer, za ciljni antigen. U slučaju navedenih konstrukata koji sadrže scFv kao vezujući region, zatim nativni ili genetskim inženjeringom dobijeni region šarke imunoglobulina kao povezujući region i jedan ili više nativnih ili genetskim inženjeringom dobij enih konstantnih regiona teškog lanca kao vezujućih regiona, nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione nativnih ili genetskim inženjeringom dobijenih teških i lakih lanaca, spojenih sekvencom koja kodira veznik, spojene su u nukleotidnu sekvencu koja kodira konstante regione nativnog ili genetskim inženjeringom dobijenog antitela, što se smatra poželjnim. Konstantni regioni mogu biti takve strukture da omogućavaju dobijenom polipeptidu da formira međulančane disulfidne veze, pri čemu nastaje dimer koji poseduju željene efektorske funkcije, npr., sposobnost da posreduju pri ADCC, CDC ili da fiksira kompement, mada su poželjni oni nativni ili genetskim inženjeringom dobijeni konstantni regioni koji ne pospešuju stvaranje dimera ili drugih multimera ili agregaciju komponenti uopšte. U slučaju konstrukta, kao što je imunoglobulinu sličan molekul prema predmetnom pronalasku, koji je namenjen za upotrebu kod ljudi, sekvence konstantnog regiona koje su uključene u konstrukt i/ili koje poseduju željene funkcije konstantnog regiona, tipično su humane ili su u značajnoj meri humane ili su humanizovane, kako bi se na minimum sveo potencijalni anti-humani imuni odgovor i kako bi se obezbedile odgovarajuće željene efektorske funkcije. Manipulacija sekvencama koje kodiraju konstantne regione antitela opisana je u referentnoj PCT publikaciji Morrison & Oi, WO 89/07142. U poželjnim rešenjima, CH1 domen je deletiran u potpunosti ili delimično iz regiona molekulskog repa koji obuhvata ili koji se suštinski sastoji od nativnog ili genetskim inženjeringom dobijenog konstantnog regiona imunoglobulina (na primer, koji se sastoji od nativnog ili genetskim inženjeringom dobijenog CH2 i/ili CH3 domena konstantnog regiona, ili od nativnog ili genetskim inženjeringom dobijenog CH2 i/ili CH3 i/ili CH4 domena konstantnog regiona), kao i od C-terminalnog vezujućeg regiona, npr., od polipeptida vezujućeg domena, npr., od polipeptida varijabilnog regiona imunoglobulina, koji je povezan sa amino-terminalom, npr., od CH2 domena, pomoću povezujućeg regiona, npr., nativnog ili genetskim inženjeringom dobijenog polipeptida regiona šarke, na način koji je ovde opisan.

Kao što je opisano u tekstu iznad, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantne konstrukte za ekspresiju koji poseduju sposobnost usmeravanja ekspresije konstrukta prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, na način na koji je to opisano ovde. Aminokiseline koje se javljaju u različitim aminokiselinskim sekvencama koje su naznačene ovde, mogu da se identifikuju na osnovu konvencionalnih skraćenica od tri ili od jednog slova. Nukleotidi koji se javljaju u različitim DNK sekvencama ili njihovim fragmentima koji su naznačeni ovde, označeni su standardnim oznakama od jednog slova, koje se rutinski koriste u struci. Data aminokiselinska sekvenca takođe može da obuhvati slične, ali izmenjene aminokiselinske sekvence, kao što su one sa manjim promenama, npr., ilustarcije radi, bez ograničenja, kao pto su one koje poseduju kovalentne hemijske modifikacije, insercije, delecije, i supstitucije, i koje dalje mogu da sadrže konzervativne supstitucije ili supstitucije aminokiselinama koje se na javljaju u prirodi. Aminokiselinske sekvence koje su međusobno slične mogu da poseduju značajne regione sa homologijom sekvence. Na sličan način, nukleotidne sekvence mogu da obuhvate nukleotidne sekvence koje su značajno slične, ali koje poseduju samo manje promene, npr., ilustracije radi, bez ograničenja, mogu da obuhvataju one sekvence koje poseduju kovalentne hemijske modifikacije, insercije, delecije, i supstitucije i koje dalje mogu da sadrže tihe mutacije nastale degeneracijom genetskog koda. Nukleotidne sekvence koje su slične jedna drugoj mogu da poseduju homologe regione sekvence značajne dužine.

Pojam "prisustvo malignog stanja kod subjekta" označava postojanje displastičnih, kanceroznih i/ili transformiranih ćelija kod subjekta uključujući, npr., neoplastične ćelije, tumorske ćelije, ćelije bez kontaktne inhibicije ili onkogeno transformirane ćelije i njima slične ćelije( npr.,to su ćelije melanoma, zatim karcinoma, kao što su adenokarcinom, skvamocelularni karcinom, sitnoćelijski karcinom, kao i ćelije drugih karcinoma, ćelije sarkoma, npi., hondrosarkoma, osteosarkoma, itd.), koje su poznate u struci i za koje su ustanovljeni kriterijumi njihovog dijagnostikovanja i klasifikacije. U poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, navedene kancerske ćelije su maligne hematopoetske ćelije, npr., transformirane ćelije limfoidne linije, a posebno, ćelije B ćelijskih limfoma i slične, pri čemu navedene karcenske ćelije mogu u određenim poželjnim rešenjima takođe biti epitelne ćelije, kao što su karcinomske ćelije. Predmetni pronalazak takođe obuhvata poremećaje B ćelija, u koja spadaju određena maligna stanja koja pogađaju B ćelije( npr.,limfom B ćelija), pri čemu navedena definicija nema ograničavajući karakter, jer su, takođe, obimom zaštite obuhvaćene i auto-imune bolesti, a posebno ona oboljenja, poremećaji i stanja čija je larakteristika proizvodnja auto-antitela.

Auto-antitela su antitela koja reaguju sa antigenima sopstvenog organizma. Auto-antitela se detektuju u brojnim auto-imunim bolestima (to jest, u oboljenju, poremećaju ili stanju u kome imunološki sistem domaćina pokreće neodgovarajuće imunološke reakcije usmerene protiv samog sebe), u kojima su uključena u razvoj same bolesti. Postojeći tretmani za različite auto-imune bolesti obuhvataju imunosupresivne lekove koji zahtevaju kontinuiranu primenu, ne poseduju specifičnost i izazivaju značajne neželjene efekte. Novi pristupi kojima može da se eliminiše proizvodnja auto-antitela uz minimalnu toksičnost, zadovoljili bi ogromnu potrebu u medicini za tretmanom širokog spektra, koji je potreban ogromanom broju ljudi. Konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, dizajnirani su tako da poseduju poboljšanu sposobnost penetracije u limfoidna tkiva. Smanjenje broja B limfocita prekida ciklus proizvodnje auto-antitela i omogućava imunološkom sistemu da proizvede nove B limfocite iz prekursora u kostnoj srži.

Prema teoriji koja nije ograničavajuća, identifikovana su brojna oboljenja, poremećaji i stanja na čiji bi tok terapija tokom koje bi došlo do smanjenja broja B ćelija ispoljila poželjan efekat. Navedena oboljenja, poremećaji i stanja obuhvataju, bez ograničenja, Grejvsovu bolest, Hašimotovu bolest, reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus, Sjegrenov sindrom, imunološku trombocitopenijsku purpuru, multiplu sklerozu, miasteniju gravis, sklerodermu, psorijazu, inflamatornu bolest creva, uključujući Hronovu bolest i ulcerativni kolitis. Inflamatorna bolest creva, uključujući Hronovu bolest i ulcerativni kolitis, jesu autoimune bolesti digestivnog sistema.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleotidne konstrukte koji kodiraju polipeptidne konstrukte prema predmetnom pronalasku, npr., fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, a posebno na postupke na primenu rekombinantnih postupaka koji kodiraju takve proteine, što se koristi u genskoj terapiji, pri čemu navedeni nukleotidni konstrukti mogu biti eksprimirani, npr., u vidu fragmenata, analoga, i derivata navedenih polipeptida.

Pojmovi "fragment", "derivat" i "analog", kada se upotrebljavaju da opišu konstrukte prema predmetnom pronalasku, npr., kada se odnose na fuzione polipeptide ili proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, označavaju bilo koji konstrukt, npr., fuzioni polipeptid ili protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koji zadržava suštinski istu biološku funkciju ili aktivnost kao i navedeni polipeptid. Prema tome, analog obuhvata pro- ili pre- oblik konstrukta, npr., pro-protein koji može biti aktiviran proteolizom dela pro-proteina, čime se dobija aktivni konstrukt, npr., aktivni fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina.

Fragment, derivat ili analog konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., fuzionog polipeptida ili proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, uključujući fuzione polipeptide i fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina koji su kodirani ovde naznačenim molekulima cDNK, obuhvataju: (i) fragment, derivat ili analog konstrukta kod koga su jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstituisani konzervativnim ili ne-konzervativnim aminokiselinskim ostatacima (poželjno konzervativnim aminokiselinskim ostatacima), pri čemu navedeni supstituisani aminokiselinski ostatak može, mada ne mora, da bude kodiran genetskim kodom, ili (ii) fragment, derivat ili analog konstrukta u kome jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadrže supstituisanu grupu, ili (iii) fragment, derivat ili analog konstrukta u kome su dodatne amino kiseline fuzionisane ili na drugi način povezane sa konstruktom, npr., sa polipeptidom vezujućeg domena i imunoglobulina, pri čemu se navedene aminokiseline koriste za detekciju ili za specifičnu funkcionalnu izmenu konstrukta, npr., konstrukta fuzionog polipeptida vezujućeg domena i imunoglobulina. Navedeni fragmenti, derivati i analogi su poznati stručnjacima i dodatno su objašnjeni u predmetnoj specifikaciji.

Konstrukti, npr., polipeptidni konstrukti prema predmetnom pronalasku, obuhvataju, npr., fuzione polipeptide i fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, koji poseduju vezujuće regione, kao što su aminokiselinske sekvence polipeptida vezujućeg domena, koje su identične ili slične sekvencama koje su poznate u struci, ili njihovi fragmenti. U cilju dodatne ilustracije, bez ograničenja, predmetni pronalazak obuhvata upotrebu ekstracelularnog domena humanog CD154 molekula [sekvenca ID br: ], kao i njegovih delova i/ili polipeptida koji poseduju najmanje oko 70% sličnosti (poželjno više od 70% identičnosti), poželjno više od 90%> sličnosti (poželjno više od 90% identičnosti) u odnosu na navedeni polipeptid, a još poželjnije koji poseduju oko 95%> sličnosti (još poželjnije koji poseduju više od 95% identičnosti) u odnosu na navedeni polipeptid i njegove delove, pri čemu delovi fuzionog polipeptida vezujućeg domena i imunoglobulina generalno sadrže manje od 30 amino kiselina, a poželjno manje od 50 amino kiselina. Ekstracelularni domeni obuhvataju, npr., delove molekula na površini ćelija, a u posebno poželjnim rešenjima obuhvataju molekule na površini ćelije koji su integralni delovi membranskih proteina ili koji sadrže transmembranski domen koji se proteže kroz plazmalemu, i koji su tako konstruisani da se protežu van granice spoljašnjeg sloja dvoslojne fosfolipidne plazma membrane u slučaju kada je molekul eksprimiran na površini ćelije, poželjno na takav način da je ekstracelularni domen takvog molekula izložen spoljašnjoj sredini ćelije, koja se označava i kao ekstracelularno okruženje. Postupci za određivanje ekstracelularnog domena površinskog molekula su dobro poznati u struci, i obuhvataju, npr., eksperimentalno određivanje (direktno ili indirektno obeležavanje molekula, procenu da li molekul može biti strukturno izmenjen dejstvom sredstava za koje plazma membrana nije propusna, kao što su proteolitički ili lipolitički enzimi) ili određivanje tipološkom predikcijom koja se zasniva na strukturi molekula( npr.,analizom aminokiselinske sekvence polipeptida) ili primenu drugih metodologija.

Kao što se ovde koristi, pojam "amino kiselina" označava molekul koji poseduje takvu strukturu u kojoj je centralni ugljenikov atom (alfa (a)-ugljenikov atom) povezan sa atomom vodonika, sa karboksilnom grupom (tj., sa atomom ugljenika koji se ovde označava kao "karboksilni ugljenikov atom"), sa amino grupom (sa atomom azota koji je ovde označen kao "amino azotni atom"), i sa bočnom grupom koja se označava kao R. Kada je inkorporirana u peptid, polipeptid ili protein amino kiselina gubi jedan ili više atoma u svojoj amino i karboksilnoj grupi u reakciji dehidratacije kojom se jedna amino kiselina povezuje za drugu. Kao rezultat ovoga kada je inkorporirana u protein, amino kiselina takođe može biti označena kao "aminokiselinski ostatak". U slučaju prirodnih proteina, R grupa aminokiselinskog ostatka, pravi razliku između 20 amino kiselina od kojih su proteini tipično sačinjeni iako jedna ili više aniino kiselina u okviru proteina može biti izvedena ili modifikovana nakon inkorporacije u pr6tein u biološkim sistemima( npr.,putem glikozilacije i/ili putem formiranja čistina tokom oksidacije tiolnih bočnih lanaca dva nesusedna cisteinska aminokiselinska ostatka, što dovodi do formiranja disulfidne kovalentne veze koja često igra važnu ulogu u stabilizaciji savijene konformacije proteina). Stručnjacima je poznato da amino kiseline koje ne postoje u prirodi takođe mogu da se inkorporiraju u proteine, što se posebno odnosi na one koje su proizvedene sintetskim postupcima, uključujući postupke sinteze u čvrstoj fazi i druge automatizovane postupke. Primeri navedenih amino kiselina obuhvataju, bez ograničenja, a-amino izobuternu kiselinu, 4-amino buternu kiselinu, L-amino buternu kiselinu, 6-amino heksanoičnu kiselinu, 2-amino izobuternu kiselinu, 3-amino propionsku kiselinu, ornitin, norlensin, norvalin, hidroksiprolin, sarkozin,

citralin, cistinsku kiselinu, t-butilglicin, t-butilalanin, fenililicin, cikloheksialanin, P-alanin, fluoro-amino kiseline, specijalno dizajnirane aminokiseline( npr.,P-metil aminokiseline, a-metil aminokiseline, N a-metil aminokiseline), kao i analoge aminokiselina u opštem slučaju. Dodatno, onda kada a-ugljenikov atom poseduje četiri različite grupe (kao u slučaju 20 amino kiselina koje koriste biološki sistemi za sintezu proteina, izuzev u slučaju glicina, koji poseduje dva vodonikova atoma koji su vezani za a-ugljenični atom), tada postoje dva enantiomerna oblika svake amino kiseline, koji se označavaju kao D i L oblik. Kod sisara, samo L-amino kiseline bivaju inkorporirane u prirodne polipeptide. Predmetni pronalazak obuhvata proteine koji inkorporiraju jednu ili više D- i L- amino kiselina, kao i proteine koji se sastoje isključivo od D- ili L- aminokiselinskih ostataka.

U predmetnoj specifikaciji, sledeće skraćenice mogu da se koriste za sledeće amino kiseline (kao i za njihove ostatke): alanin (Ala, A); arginin (Arg, R); asparagin (Asri, N);

asparaginska kiselina (Asp, D); cistein (Cys, C); glicin (Gly, G); glutaminska kiselina (Glu, E);

glutamin (Gln, Q); histidin (His, H); izoleucin (Ile, I); leucin (Leu, L); lizin (Lys, K); metionin

(Met, M); fenilalanin (Phe, F); prolin (Pro, P); serin (Ser, S); treonin (Thr, T); tripotofan (Trp, W); tirozin (Tyr, Y); i valin (Val, V). Nepolarne (hidrofobne) amino kiseline su alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, tripotofan i metionini. Neutralne amino kiseline obuhvataju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin. Amino kiseline sa pozitivnim naelektrisanjem (bazne amino kiseline) su arginin, lizin i histidin. Amino kiseline sa negativnim naelektrisanjem (acidične) su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina.

Pojam "protein" označava bilo koji polimer dve ili više individualnih aminokiselina (bez obzira da li su one prirodne ili ne), koje su povezane peptidnom vezom i koje nastaju kada se karboksilni ugljenični atom iz karboksilne grupe koji je povezan sa a-ugljeničnim atomom jedne amino kiseline (ili aminokiselinskog ostatka) kovalentno poveže sa amino azotnim atomom amino grupe koja je povezana a-ugljenični atomom susedne amino kiseline. Pojam "protein" obuhvata pojmove "polipeptid" i "peptid" (koji povremeno ovde mogu da se koriste naizmenično) u okviru istog značenja. Dodatno, proteini koji sadrže veći broj polipeptidnih podjedinica ili drugih komponenti takođe su obuhvaćeni obimom pojma "protein", na način kako je to ovde definisano. Slično tome, fragmenti proteina, peptida i polipeptida su takođe obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska i ovde mogu biti označeni kao "proteini".

U biološkim sistemima (bilo da su u pitanjuin vivoiliin vitrobiološki sistemi, uključujući bezćelijske sisteme), aminokiselinska sekvenca datog proteina (tj., "primarna struktura" polipeptida, kada je navedena počevši od amino-terminala ka karboksi-terminalu) određena je nukleotidnom sekvencom kodirajućeg dela iRNK, koja je sa svoje strane specifična za određenu genetsku informaciju tipično sadržanu u genomskoj DNK (koja, u slučaju predmetnog pronalaska, obuhvata i DNK organela, npr., mitohondrijsku DNK i DNK hloroplasta). Naravno, podrazumeva se da bilo koji tip nukleinske kiseline koji sačinjava genom određenog organizma( npr.,dvostruka DNK u slučaju većine životinja i biljaka, jednolančana DNK ili dvolančana RNK u slučaju nekih virusa i si.) kodira određen proizvod gena datog organizma. Informaciona RNK se translira na ribozomu koji katalizuje polimerizaciju slobodnih amino kiselina, čiji je identitet specifično određen odgovarajućim kodonom iRNK (u slučaju iRNK, kodon sačinjavaju tri susedna A, G, C ili U ribonukleotida u okviru kodirajućeg regiona iRNK), koji se potom translira u nascentni polipeptid. Tehnika rekombinantne DNK je omogućila sintezu proteina i polipeptida u velikoj razmeri( npr.,sintezu humanog insulina, humanog hormona rasta, eritropoetina, faktora stimulacije rasta granulocitnih kolonija i si) koji poseduju istu primarnu sekvencu kao i polipeptidi koji se prirodno proizvode u živim organizmima. Dodatno, navedena tehnologija je omogućila sintezu analoga ovih i drugih proteina, pri čemu analogi mogu da sadrže jednu ili više delecija, insercija i/ili supstitucija amino kiselina u poređenju sa nativnim proteinima. Tehnologija rekombinantne DNKtakođe omogućava sintezu u potpunosti novih proteina.

U sistemima koji nisu biološki( npr.,u onim sistemima koji koriste postupak sinteze u čvrstom stanju), primarna struktura proteina (koja takođe sadrži mesta za disulfidnu (cistinsku) vezu) može biti određena od strane proizvođača. Kao rezultat toga, mogu se dobiti polipeptidi sa primarnom strukturom koja je duplikat biološki proizvedenog proteina, kao i analogi takvih proteina. Dodatno, kompletno novi polipeptidi takođe mogu biti sintetisani, kao i proteini koji sadrže amino kiseline koje se ne javljaju u prirodi.

Kao što je poznato u struci, "sličnost" između dva polipeptida može da se odredi upoređivanjem aminokiselinske sekvence (uključujući i konzervirane aminokiselinske supstitucije sadržane u njima) jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. Fragmenti ili delovi nukleinskih kiselina koje koje kodiraju polipeptide prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za sintezu nukleinskih kiselina pune dužine prema predmetnom pronalasku. Kao što se ovde koristi, pojam "% identičnosti" označava procenat identičnosti amino kiselina koje se nalaze na odgovarajućim položajima aminokiselinskih ostataka onda kada su dva ili više polipeptida poravnati, a njihove sekvence analizirane korišćenjem, npr., BLAST algoritma sa prazninama( npr.,Altschulet al,1997Nucl. Ac. Res.25:3389; Altschulet al,1990J. Mol. Biol,215:403-410), koji procenjuje praznine u sekvenci i neslaganja u sekvencama prema osnovnim parametrima za ocenjivanje obezbeđenim od strane baze podataka nacionalnog instituta za zdravlje/NCBI (Bethesda, MD;videtiwww. ncbi. nlm. nih. gov/ cgi- bin/ BLAST/ nph-newblast). Drugi postupci za poravnavanje obuhvataju BLITZ (MPsrch) (Sturrock & Collins, 1993), i FASTA (Pearson & Lipman, 1988Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 85:2444-2448)..

Pojam "izolovan" označava, u slučaju prirodnog materijala, činjenicu da je materijal uklonjen iz ili da više nije udružen sa svojom prirodnom ili originalnom okolinom. Na primer, prirodna nukleinska kiselina ili protein ili polipeptid koji je prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali je ista nukleinska kiselina ili polipeptid koji je izdvojen iz nekog ili iz svih materijala sa kojima zajedno postoji u prirodnom sistemu, izolovan. Takve nukleinske kiseline mogu biti deo vektora i/ili takve nukleinske kiseline mogu biti deo preparata, pri čemu su oni idalje izolovani u takvom vektoru ili preparatu, jer on nije deo njihovog prirodnog okruženja. Pojam "izolovan", u slučaju materijala koji se ne javlja u prirodi, npr., u slučaju rekombinantno proizvedenih konstrukta prema predmetnom pronalasku, obuhvata one materijale koji su u značajnoj meri ili praktično u potpunosti oslobođene od komponenti koje ih prirodno prate tokom procesa proizvodnje, što se konkretno odnosi na proteine i polipeptide koji su prečišćeni

do željenog stepena, poželjno, npr., do stepena čistoće od oko 80%, poželjnije od najmanje 90%>,

a još poželjnije od najmanje 95%>, što se određuje tehnikama koje su poznate u struci.

Pojam "gen" označava segment DNK koji je uključen u proizvodnju polipeptidnog lanca;

on takođe može da obuhvati regione koji prethode i slede kodirajući region polipeptida, npr., takozvane "vodeće i prateće" sekvence, kao i umetnute sekvence (introne) između relevantnih individualnih kodirajućih segmenata (eksoni).

Kao što je ovde opisano, predmetni pronalazak obezbeđuje konstrukte, uključujući fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, koji mogu biti kodirani u potpunosti ili delimično od strane nukleinskih kiselina koje poseduju kodirajuću sekvencu za vezujući region,

npr., koje poseduju kodirajuću sekvencu vezujućeg domena fuzionisanu ili na drugi način povezanu u istom ramu očitavanja sa dodatnom nativnom ili genetskim inženjeringom dobijenom kodirajućom sekvencom imunoglobulinskog domena, u cilju obezbeđivanja ekspresije, npr., polipeptidne sekvence vezujućeg domena fuzionisane ili na drugi način povezane sa dodatnom funkcionalnom polipeptidnom sekvencom koja omogućava, na primer, ilustracije radi, bez ograničenja, detekciju, funkcionalnu operativnost, izolaciju i/ili prečišćavanje fuzionog proteina. Navedeni fuzioni proteini mogu da omoguće funkcionalnu alteraciju vezujućeg domena, tako što sadrže dodatne polipeptidne sekvence izvedene iz imunoglobulina koje utiču na ponašanje fuzionog proizvoda, npr., kao što je i opisano iznad putem smanjenja dostupnosti sulfhidrilnih grupa u reakciji formiranja disulfidne veze, i putem omogućavanja sposobnosti da se pospeše ADCC i/ili CDC i/ili fiksacija komplementa.

Modifikacija polipeptida može da se postigne bilo kojim od postupaka koji su poznati stručnjaku. Poželjni postupci koji su ovde opisani sa zasnivaju na modifikaciji DNK koja kodira, npr., fuzioni protein, kao i na ekspresiji modifikovane DNK. DNK koja kodira jedan od konstrukata prema predmetnom pronalasku, npr., jedan od ovde opisanih fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, može biti, na primer, izmenjena ili'mutirana korišćenjem standardnih postupaka uključujući one koji su ovde opisani. Na primer, cisteinski ostaci koji inače pospešuju formiranje multimera ili pospešuju formiranje određenih molekulskih konformacija, mogu biti deletirani iz polipeptida ili zamenjeni, npr., to se odnosi na cisteinske ostatke koji su odgovorni za formiranje agregata. Ukoliko je to potrebno, npr., identitet cisteinskih ostataka koji doprinose stvaranju agregata može biti određen empiriski putem delecije i/ili zamene cisteinskog ostatka i procenjivanjem da li nastali protein stvara agregate u rastvoru koji sadrži fiziološki prihvatljive bufere i soli. Dodatno, i fragmenti fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina mogu biti konstruisani i upotrebljeni na opisani način. Kao što je naznačeno gore, domeni za vezivanje odgovarajućeg receptora i liganda za mnoge kandidate fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina već su opisani tako da stručnjak može lako da izabere odgovarajuće polipeptidne domene koje će uključiti u kodirajuće proizvode instant konstukata za ekspresiju.

Konzervativne supstitucije amino kiselina su dobro poznate i mogu da se postignu u opštem slučaju bez izmene biološke aktivnosti nastalog proteinskog fuzionog molekula vezujućeg domena i imunoglobulina. Na primer, navedene supstitucije se u opštem slučaju prave izmenom jedne amino kiseline drugom amino kiselinom u okviru iste grupe amino kiselina određene popularnosti, električnom naboju, hidrofobnosti, veličini i slično. Ukoliko je to potrebno, takve supstitucije mogu biti empirjiski određene isključivo testiranjem dobijenih modifikovanih proteina na sposobnost da se vežu za odgovarajuće površinske receptore tokom in vitro bioloških testova ili na osnovu sposobnosti da se vežu za odgovarajuće antigene ili željene ciljne molekule.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinske kiseline koje hibridizuju sa konstruktima prema predmetnom pronalasku, uključujući npr., polinukleotidne sekvence koje kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, koje su ovde obezbeđene, ili koje hibridizuju sa njima komplementarnim sekvencama, što je sasvim jasno stručnjacima, uz uslov da navedene sekvence koje hibridiizuju poseduju međusobnu identičnost od najmanje 70%, poželjno od najmanje 80-85%), još poželjnije od najmanje 90%, još poželjnije od najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%.

Predmetni pronalazak se posebno odnosi na nukleinske kiseline koje hibridizuju pod strogim uslovima sa, npr., nukleinskim kiselinama koje kodiraju fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina koje su ovde opisane. Kao što se ovde koristi pojam "hibridizovati" pod uslovima odgovarajuće strogosti, koristi se da opiše stabilnost hibrida koji nastaju između dva jednolančana molekula nukleinske kiseline. Strogost hibridizacije se tipično izražava u jedinicama jonske jačine i temperature pri kojoj se takvi hibridi razgrađuju i ispiraju. Pojam "strogi uslovi" označava stanja koja obezbeđuju hibridizaciju između polinukleotida. Strogi uslovi mogu biti definisani pomoću koncentracije soli, pomoću koncentracije organskog rastvarača( npr,,formamida), temperature i drugih uslova koji su dobro poznati u struci. Posebno, strogost uslova može da se poveća smanjenjem koncentracije soli, povećanjem koncentracije organskog rastvarača( npr.,formamida) ili povišenjem temperature hibridizacije. Na primer, koncentracija soli koja spada u stroge uslove će uobičajno biti manja od oko 750 mM NaCl i 75 mM trinatrijum citrata, poželjno manja od 500 mM NaCl i 50 mM trinatrijum citrata, a još poželjnije manje od 250 mM NaCl i 25 trinatrijum citrata. Hibridizacija u uslovima smanjenje strogosti može da se postigne u odsustvu organskog rastvarača,npr.,formamida, dok hibridizacija u uslovima velike strogosti može da se postigne u prisustvu organskog rastvarača( npr.,u prisustvu najmanje 35% formamida, poželjnije najmanje 50%> formamida). Strogi uslovi koji se odnose na temperaturu uobičajno obuhvataju temperature od najmanje 30°C, još poželjnije od najmanje 37°C, a najpoželjnije od najmanje 42°C. Drugi dodatni parametri, na primer, vreme hibridizacije, koncentracija detergenta,npr.,natrijum duodecil sulfata (SDS), i uključivanje ili isključivanje nosioca DNK, dobro su poznati stručnjacima. Različiti nivoi strogosti se postižu kombinacijom navedenih različitih uslova po potrebi, što je poznato stručnjacima. Drugi tipični "visoki", "srednji" i "niski" uslovi strogosti obuhvataju sledeće uslove ili njihove ekvivalente: (i) uslovi visoke strogosti: 0,1% x SSPE ili SSC, 0,1% SDS, 65°C; (ii) uslovi srednje strogosti: 0,2 x SSPE ili SSC, 0,1% SDS, 50°C; (iii) uslovi male strogosti: 1,0 * SSPE ili SSC, 0,1% SDS, 50°C. Stručnjacima je takođe poznato da varijacije u stepenu strogosti hibridizacije mogu da se postignu promenom vremena, temperature i/ili koncentarcije rastvora koji se koriste za prehibridizaciju, hibridizaciju, i za korak ispiranja, a odgovarajući uslovi takođe mogu da zavise delimično od određene nukleotidne sekvence probe koja se koristi, kao i od probandnog uzorka nukleinske kiseline koji je blotovan. Prema tome, treba napomenuti da odgovarajući uslovi strogosti mogu lako da se izaberu bez nepotrebne eksperimentacije onda kada je identifikovana željena selektivnost probe, što se zasniva na njenoj sposobnosti da hibridizuje sa jednom ili sa više određenih probandnih sekvenci, dok istovremeno ne hibridizujue sa određenim drugim probandnim sekvencama.

Kao što se ovde koristi, poželjni "uslovi strogosti", generalno označavaju hibridizaciju koja će se javiti samo ukoliko postoji identičnost između sekvenci od najmanje 90-95%), a još poželjnije od najmanje 97%. Konstrukti nukleinske kiseline koji hibridizuju sa, npr., nukleinskim kiselinama koje kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji je ovde opisan,

u poželjnim rešenjima, kodiraju polipeptide koji zadržavaju praktično iste biološke funkcije ili aktivnost kao i fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina koji su kodirani od strane cDNK.

Nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, koje se ovde takođe označavaju kao polinukleotidi, mogu da se nalaze u obliku RNK, npr., iRNK, ili u obliku DNK, pri čemu DNK obuhvata cDNK (takođe nazvana i "komplementarna DNK", koja predstavlja molekul DNK koji je komplementaran specifičnoj informacionoj RNK), genomsku DNK, i sintetsku DNK. DNK može biti dvolančana ili jednolančana, a ukoliko je jednolančana, ona može biti kodirajuća ili nekodirajuća nit. Kodirajuća sekvenca koja kodira konstrukt prema predmetnom pronalasku, npr., fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina koji se upotrebljava shodno predmetnom pronalasku, može da sadrži delove koji su identični kodirajućoj sekvenci koja je poznata u struci ili koja je opisana ovde, tj., njenim delovima, ili to može biti različita kodirajuća sekvenca koja usled redundancije ili degeneracije genetskog koda kodira isti konstrukt ili njegov deo, uključujući komplentan ili nepotpuni fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina.

Nukleinske kiseline koje kodiraju konstrukte prema predmetnom pronalasku, npr., fuzione polipeptide vezujućeg domena i imunoglobulina, koji se koriste shodno predmetnom pronalasku, obuhvataju, bez ograničenja: isključivo kodirajuću sekvencu konstrukta, kao što je fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina; kodirajuću sekvencu konstrukta, kao što je fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina i dodatnu kodirajuću sekvencu; kodirajuću sekvencu konstrukta, kao što je fuzioni polipeptid vezujućeg domena (i opciono dodatnu kodirajuću sekvencu) i nekodirajuću sekvencu, u koje spadaju introni ili nekodirajuće sekvence na 5' i/ili 3' kraju kodirajuće sekvence za fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina ili njihove delove, pri čemu ovde dalje mogu biti uključene, bez ograničenja, jedna ili više regulatornih sekvenci nukleinske kiseline, kao što je slučaj sa promoterom koji reguliše ili može biti regulisan, zatim sekvenca pojačivača, druga sekvenca za regulaciju transkripcije, sekvenca represora vezivanja, sekvenca za regulaciju translacije ili bilo koja druga regulatorna sekvenca nukleinskih kiselina. Stoga, pojam "nukleinska kiselina koja kodira" ili "polinukleotid koji kodira" neki konstrukt, npr., fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina, obuhvata nukleinsku kiselinu koja sadrži samo kodirajuću sekvencu za, npr., fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina, kao i nukleinsku kiselinu kao što je dodatna kodirajuća i/ili nekodirajuća sekvenca.

Nukleinske kiseline i oligonukleotidi koji se koriste na ovde opisane načine mogu biti sintetisani bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjacima( videti, npr.,WO 93/01286, U. S. patentna prijava br. 5,218,088; U. S. patent br. 5,175,269; U. S. patent br. 5,109,124). Postupci ... koji su poznati u struci su takođe koriste za identifikaciju različitih oligonukleotida i sekvenci nukleinskih kiselina. Na primer, dobro su poznata željena svojstva, dužine i druge karakteristike oligonukleotida koji su od koristi za kloniranje. U određenim rešenjima sintetski oligonukleotidi i sekvence nukleinskih kiselina mogu biti tako dizajnirani da su otporni na degradaciju endogenim nukleolitičkim enzimima ćelije domaćina zbog toga što sadrže sledeće hemijske veze: fosforotioatne, metilfosfonatne, sulfonske, sulfatne, ketil, fosforoditioatne, fosforamidatne, fosfatno estarske i druge slične hemijske veze koje su dokazano korisne u pomenutim primenama.Videti, npr.,Agrvvalet al, Tetrehedron Lett.28:3539-3542 (1987); Milleret al., J. Am. Chem. Soc.93:6657-6665 (1971); Stecet al, Tetrehedron Lett.26:2191-2194 (1985); Letsingeret al, Tetrehedron40:137-143 (1984); Eckstein,Annu. Rev. Biochem.54:367-402

(1985); Eckstein,Trends Biol. Sci.14:97-100 (1989); Stein In:Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors ofGene Expression, Cohen,Ed, Macmillan Press, London, pp 97-117 (1989); Jageret

al, Biochemistry27:7237-7246 (1988).

U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje komponente nepotpune dužine (npr., polipeptid vezujućeg domena, polipeptid regiona šarke, veznik itd.) koji se koriste u konstruktu prema predmetnom pronalasku, npr., u fuzionom proteinu vezujućeg domena i imunoglobulina. U drugom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju konstrukt prema predmetnom pronalasku, npr., fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina koji sadrži navedene komponente nepotpune dužine. Molekul nepotpune dužine može biti bilo koji molekul koji predstavlja kraću verziju molekula pune dužine od interesa. Molekul nepotpune dužine koji obezbeđuje predmetni pronalazak obuhvataju biološke polimere nepotpune dužine, a u poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku navedeni molekuli nepotpune dužine mogu biti molekuli nukleinske kiseline nepotpune dužine ili polipeptidi nepotpune dužine. Molekuli nukleinske kiseline nepotpune dužine imaju kraću nukleotidnu sekvencu u odnosu na nukleotidnu sekvencu pune dužine određenog poznatog ili nekog opisanog molekula nukleinske kiseline, pri čemu je navedeni poznati ili opisani molekul nukleinske kiseline prirodan, sintetski ili rekombinantni molekul nukleinske kiseline, sve dotle dok ga stručnjak prihvata kao molekul pune dužine. Stoga, molekuli nukleinske kiseline nepotpune dužine koji odgovaraju sekvenci gena sadrže sekvencu gena koja je kraća od sekvence pune dužine, pri čemu gen sadrži kodirajuće i nekodirajuće sekvence, promotere, pojačivače i druge regulatome sekvence, bočne sekvence i slične, kao i druge funkcionalne i nefunkcionalne sekvence koje su poznate kao deo određenog gena. U drugom primeru, molekuli nukleinske kiseline nepotpune dužine koji odgovaraju iRNK sekvenci sadrže sekvencu iRNK transkripta koja je kraća od sekvence pune dužine, a koja može da sadrži različite regione koji se transliraju ili se ne transliraju, kao i druge funkcionalne i nefunkcionalne sekvence.

U drugim poželjnim rešenjima molekuli nepotpune dužine su polipeptidi koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je kraća od sekvence pune dužine određenog proteina ili polipeptidne komponente. Kao što se ovde koristi, pojam "delecija" poseduje svoje uobičajno značenje koje je poznato stručnjacima i može da se odnosi na molekule kojima nedostaje jedan ili više delova sekvence na bilo kom terminalu ili neterminalskom regionu, u odnčsu na odgovarajući molekul pune dužine, na primer, kao što je to slučaj sa molekulima nepotpune dužine koji su ovde opisani. Molekuli nepotpune dužine koji su linearni biološki polimeri, kao što je to slučaj sa molekulima nukleinske kiseline ili sa polipeptidima, mogu da poseduju jednu ili više delecija na bilo kom kraju molekula i/ili jednu ili više delecija na nekom regionu delecija koji nije terminalan, pri čemu navedene delecije obuhvataju od 1-1500 uzastopnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, poželjno od oko 1-500 uzastopnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, a još poželjnije oko 1-300 uzastopnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, uključujući tu i delecije od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ... 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31-40, 41-50, 51-74, 75-100, 101-150, 151-200, 201-250 ili 251-299 uzastopnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka. U određenim posebno poželjnim rešenjima, molekuli nukleinske kiseline nepotpune dužine mogu da poseduju delecije od oko 270-330 uzastopnih nukleotida. U određenim posebno poželjnim rešenjima, molekuli polipeptida nepotpune dužine mogu da poseduju deleciju od, na primer, 80-140 uzastopnih amino kiselina.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na varijante ovde referenciranih nukleinskih kiselina koje kodiraju fragmente, analoge i/ili derivate konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., fuzionog polipeptida vezujućeg domena i imunoglobulina. Varijante nukleinskih kiselina koje kodiraju konstrukte prema predmetnom pronalasku, npr., fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, mogu da se javljaju u prirodi kao alelne varijante jednog ili više delova sekvenci nukleinskih kiselina koje su ovde uključene, ili to mogu biti varijante koje se ne javljaju u prirodi navedenih sekvenci ili delova tih sekvenci, uključujući sekvence koje su izmenjene putem molekularnog inženjeringa upotrebom, na primer, postupaka koji su poznati u struci za izmenu sekvenci. Kao što je poznato u struci, alelna varijanta jeste drugačiji oblik sekvence nukleinske kiseline koji može posedovati najmanje jednu deleciju, supstituciju ili adiciju jednog ili više nukleotida, pri čemu bilo koji od njih ne menja u značajnoj meri ili na neželjeni način funkciju kodiranog fuzionog polipeptida vezujućeg domena i imunoglobulina.

Varijante i derivati konstrukta prema predmetnom pronalasku, na primer, fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, mogu da se dobiju mutacijama nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, npr., fuzione polipeptide vezujućeg domena i imunoglobulina, ili.nekog njihovog dela. Alteracije nativne aminokiselinske sekvence mogu da se ostvare na bilo koji od brojnih uobičajnih postupaka. Mutacije mogu da se uvedu na odgovarajuća mesta, na primer, sintezom oligonukleotida koji sadrže mutantnu sekvencu, uvođenjem bočnih sekvenci čiji krajevi sadrže restrikciona mesta koja omogućavaju oligaciju za fragmente nativne sekvence. Nakon ligacije, rezultujuća rekonstruisana sekvenca kodira analog koji poseduje željenu inserciju, supstituciju ili deleciju odgovarajuće amino kiseline.

Alternativno, na primer, može da se koristi specifična mutageneza koja je oligonukleotidom usmerena na određeno mesto, kako bi se obezbedio izmenjeni gen u kome prethodno određeni kodoni mogu biti izmenjeni supstitucijom, delecijom ili insercijom. Primeri postupaka za izvođenje takvih izmena su opisani od Walderet al,1986Gene42:133; Baueret al,1985Gene 31:13;Craik, January 1985BioTechniques12-19; Smithet al,January 1985Genetic Engineering: Principles and Methods BioTechniques12-19; Costa GL,et al,"Site-directed mutagenesis using a rapid PCR-based method", 1996Methods Mol Biol57:239-48; Rashtchian A., "Novel methods for cloning and engineering genes using the polymerase chain reaction", 1995Curr Opin Biotechnol.6(l):30-6; Sharon J,et al,"Oligonucleotide-directed mutagenesis of antibody combining sites", 1993Int Rev Immunol10(2-3): 113-27; Kunkel, 1985Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:488; Kunkelet al,1987Methods in Enzymol.154:367; i U. S.

Patent br. 4,518,584 i 4,737,462.

Primera radi, modifikacija DNK može da se izvede pomoću mutageneze DNK koja kodira protein usmerene na određeno mesto, u kombinaciji sa upotrebom postupaka za amplifikaciju DNK korišćenjem prajmera za uvođenje i amplifikaciju alteracija u polaznoj DNK,

na primer, korišćenjem PCR isecanja uz ekstenziin preklapajućeg regiona (SOE). Mutageneza usmerena na određeno mesto se tipično izvodi korišćenjem fagnog vektora koji poseduje jednolančane i dvolančene oblike, na primer Ml3 fagnih vektora, koji su dobro poznati i komercijalno dostupni. Drugi pogodni vektori koji sadrže mesto početka replikacije jednolančanog faga mogu takođe da se koriste.Videti, npr.,Veiraet al,1987Meth. Enzymol.15:3. Generalno, mutageneza usmerena na određeno mesto se izvodi pripremanjem jednolančanog vektora koji kodira protein od interesa (npr., kompletni ili samo deo datog fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina). Oligonukleotidni prajmer koji sadrži željenu mutaciju u regionu homologije sa DNK u jednolančanom vektoru se povezuje sa vektorom, nakon čega se dodaje DNK polimeraza, kao što je DNK polimeraza i E. coli (Klenovv fragment), koji koristi dvolančani region kao prajmer da bi proizveo heterodupleks u kome jedna nit kodira izmenjenu sekvencu, a druga originalnu sekvencu. Heterodupleks se uvodi u odgovarajuće bakterijske ćelije i klonira se tako da obuhvati željenu mutaciju. Dobijeni izmenjeni molekuli DNK mogu biti rekombinantno eksprimirani u odgovarajućim ćelijama domaćina kako bi se dobio modifikovani protein.

Ekvivalent DNK konstrukata koji obuhvataju kod za adicije ili supstitucije aminokiselinskih ostataka ili sekvenci, ili za delecije terminalnih ili internih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne ili nisu poželjne za biološku aktivnost, takođe su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska. Na primer, kao što je diskutovano gore, sekvence koje kodiraju cisteinske ostatke koje nisu poželjni ili neophodni za biološku aktivnost mogu biti izmenjeni tako da budu deletirani ili zamenjeni sa drugim amino kiselinama, čime se sprečava formiranje neodgovarajućih ili neželjenih unutar molekulskih disulfidnih mostova nakon sinteze molekula ili nakon renatunacije.

Pojam "ćelija domaćin" ili "rekombinantna ćelija" označava ćeliju koja sadrži vektor, npr., vektor za ekspresiju ili označava ćeliju koja je na drugi način izmenjena rekombinantnim tehnikama tako da eksprimira protein od interesa. Organizmi domaćini obuhvataju one organizme u kojima je moguća rekombinantna proizvodnja konstrukata prema predmetnom pronalasku, na primer, fuzionih proizvoda vezujućeg domena i imunoglobulina, koji su kodirani rekombinantnim konstruktima prema predmetnom pronalasku, kao što su bakterije (na primer, E. coli), gljivice (na primer,Saccharomyces cerevisiaeiPichia pastoris),ćelije insekata i ćelije sisara, uključujući ekspresijuin vitroiin vivo.Stoga, organizmi domaćini mogu da obuhvate organizme za konstrukciju, propagaciju, ekspresiju, ili za druge korake u proizvodnji drugih molekula koji su ovde opisani. Organizmi domaćini obuhvataju subjekte u kojima imunološki odgovori postoje, kao što je ovde opisano. Poželjni organizmi domaćini prema predmetnom pronalasku koji se koriste za proizvodnju konstrukata koji su ovde opisani i koji proizvode glikozilirane proteine jesu ćelije sisara ili drugi sistemi ćelija koji omogućavaju ekspresiju i prikupljanje glikoziliranih proteina druge ćelijske linije obuhvataju u srodstvu ukrštene sojeve miševa i misije ćelijske linije, kao i humane ćelije i ćelijske linije.

DNK konstrukt koji kodira željeni konstrukt prema predmetnom pronalasku, npr., fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, uvodi se u vektor, u neki plazmid, radi ekspresije u odgovarajućem organizmu domaćina. U poželjnim rešenjima organizam domaćin je sisar, na primer, to je ćelijska linija sisara. Sekvenca koja kodira ligand ili vezujući domen nukleinske kiseline poželjno je izmenjen tako da sadrži optimizovane kodone za ekspresiju u određenom organizmu domaćina. Stoga, na primer, ukoliko je potrebno da se fuzioni protein humanog vezujućeg domena i imunoglobulina eksprimira u bakterijama kodoni mogu biti optimizovani za upotrebu u bakterijama. U slučaju malih kodirajućih regiona, gen može biti sintetisan kao pojedinačni oligonukleotid. Kod većih proteina, mogu da se koriste tehnike isecanja višestrukih oligonukleotida, mutageneza ili druge tehnike koje su poznate u struci. Sekvence nukleotida u plazmidima ili drugim vektorima koje predstavljaju regulatorne regione, npr., promotere i operatere, bivaju operativno udruženi jedni sa drugima radi transkripcije. Sekvence nukleotida koje kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina takođe mogu da sadrže DNK koja kodira signal za sekreciju, pri čemu je peptid koji se dobija prekursorski protein. Dobijeni obrađeni protein može da se prikupi iz periplazmatskog prostora ili iz podloge za fermentaciju.

U poželjnim rešenjima DNK plazmidi takođe mogu da sadrže sekvencu za okončanje transkripcije. Kao što se ovde koristi, pojam "region za terminaciju transkripcije" predstavlja sekvencu koja signalizira terminaciju transkripcije. Celokupni terminator transkripcije može da se dobije iz gena koji kodira protein, i može biti isti ili različit od onog koji pripada genu koji kodira fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina ili može biti iz istog izvora iz koga je promoter. Terminatori transkripcije su opciono komponente ovde opisanih ekspresionih sistema, i koriste se u poželjnim rešenjima.

Plazmidi ili drugi vektori koji se ovde koriste sadrže promoter koji je operativno povezan sa DNK koja kodira protein ili polipeptid od interesa i dizajnirani su za ekspresiju proteina u odgovarajućim organizmima domaćinima, kao što je opisano gore (npr., za ekspresiju u bakterijama, mišijim ili humanim sistemima), što zavisi od željene upotrebe plazmida (npr., primena vakcine koja sadrži kodirajuće sekvence za fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina). Odgovarajući promoteri za ekspresiju proteina i polipeptida prema predmetnoj specifikaciji su široko dostupni i dobro poznati u struci. Poželjni su induciobilni promoteri ili konstitutivni promoteri koji su povezani sa regulatornim regionima. Takvi promoteri su, na primer, bez ograničenja T7 fagni promoter i drugi promoteri koji su slični T7 fagnom promoteru kao što su T3, T5 i SP6 promoteri, zatim to su trp, lpp i lac promoteri, kao što su lacUV5, iz E. coli; PIO ili promoter polihedrilskog gena bakulovirusnog sistema ili ekspresionog sistema u insekatskim ćelijama( videti, npr.,U. S. patente br. 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051 i 5,169,784), kao i inducibilni promoteri iz drugih eukariotskih ekspresionih sistema. Radi ekspresije proteina, navedeni promoteri su insertovani u plazmid i operativno povezani sa kontrolnim regionom, kao što je lac operon.

Željeni promoterski regioni su oni koji su inducibilni i funkcionalni u ćelijama sisara. Primeri odgovarajućih inducibilnih promotera i promoterskih regiona za ekspresiju u bakterijama, obuhvataju, bez ograničenja, lac operator E. coli koji reaguje na izopropil (3-D-tiogalaktopiranozid (IPTG;videtiNakamuraet al.,1979Cell18:1109-1117); metalotionein promoter sa regulatornim elementima osetljivim na metale, koji je indukovan teškim metalom( npr.,cinkom)( videti, npr.,U. S. Patent br. 4,870,009); fagni T71ac promoter koji je osetljiv na IPTG( videti, npr.,U. S. Patent br. 4,952,496; i Studieret al,1990Meth. Enzymol.185:60-89) kao i TAC promoter. U zavisnosti od ekspresionog sistema organizma domaćina koji se koristi, plazmidi mogu opciono da obuhvate selektibilni marker gen ili gene koji su funkcionalni u organizmu domaćina. Tako, na primer, selektibilni marker gen obuhvata bilo koji gen koji ispoljava određeni fenotip u bakterijama koji omogućava da transformisane bakterijske ćelije budu identifikovane i selektivno uzgajane u odnosu na veliki broj netransformiranih'ćelija. Odgovarajući selektibilni marker geni za bakterije obuhvataju gen za rezistenciju prema ampicilinu (Amp<r>), gen za rezistenciju na tetraciklin (Tc<r>) i gen za rezistenciju na kanamicin

(Kan<r>). Trenutno je poželjan gen za rezistenciju na kanamicin kada je u pitanju ekspresija u bakterijama.

U različitim ekspresionim sistemima, plazmidi ili drugi vektori mogu takođe da obuhvate DNK koja kodira signal za sekreciju proteina sa kojim je operativno povezan. Signali za sekreciju koji su pogodni za upotrebu prema predmetnom pronalasku su široko dostupni i dobro poznati u struci. Prokariotski i eukariotski signali za sekreciju koji su funkcionalni u E. coli mogu da se koriste u ovim rešenjima. U zavisnosti od ekspresionih sistema signali za sekreciju koji su poželjni u predmetnom pronalasku su, bez ograničenja oni koji su kodirani od sledećih gena E. coli: ompA, ompT, ompF, ompC, beta-laktamaza, i alkalna fosfataza, kao i slični (von Heijne,J.. Mol. Biol.184:99-105, 1985). Dodatno, mogu da se koriste sekrecioni signal bakterijskog pelB (Leiet al., J. Bacteriol.169:4379, 1987), phoA sekrecioni signal i cek2 koji je funkcionalan u insekatskim ćelijama. Najpoželjniji signal za sekreciju za određene sisteme za ekspresiju predstavlja ompA sekrecioni signal E. coli. Drugi prokariotski i eukariotski signali za sekreciju koji su poznati stručnjacima takođe mogu da se koriste( videti, npr.,von Heijne,J. Mol. Biol.184:99-105, 1985). Korišćenjem postupaka koji su ovde opisani stručnjak može izvršiti zamenu signala za sekreciju koji su funkcionalni, na primer, u gljivicama, insekatskim ili sisarskim ćelijama kako bi izazvao sekreciju proteina iz navedenih ćelija.

Poželjni plazmidi za transformaciju ćelija E. coli obuhvataju pET ekspresione vektore( npr.,pET-1 la, pET-12a-c, pET-15b;videtiU. S. Patent br. 4,952,496; koji je dostupan od strane Novagen, Madison, WI). Drugi poželjni plazmidi obuhvataju pKK plazmide, posebno pKK 223-3, koji sadrži tac promoter (Brosiuset al,1984Proc. Natl Acad. Sci.81:6929; Ausubelet al, Current Protocols in Molecular Biology;U. S. Patenti br. 5,122,463, 5,173,403, 5,187,153, 5,204,254, 5,212,058, 5,212,286, 5,215,907, 5,220,013, 5,223,483 i 5,229,279). pKK plazmid je modifikovan zamenom gena za rezistenciju prema ampicilinu genom rezistencije prema kanamicinu (Dostupno od strane Pharmacia; dobijeno iz pUC4K,videti, npr.,Vieiraet al,(1982Gene19:259-268; i U. S. Patent br. 4,719,179). Za ekspresiju polipeptida u insekatskim ćelijama, takođe mogu da se koriste bakulovirusni vektori, kao što je pBlueBac (takođe se naziva pJVETL, kao i njegovi derivati), posebno pBlueBac III( videti, npr.,U. S. Patenti br. 5,278,050, 5,244,805, 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051 I 5,169,784; dostupno od strane Invitrogen, San Diego). Drugi plazmidi su pIN-IIIompA plazmidi( videti,U. S. patent br. 4,575,013;videti takođeDuffaudet al., Meth. Enz.153:492-507, 1987), konkretno to je pIN-IIIompA2.

Poželjno, ukoliko se jedan ili više DNK molekula replicira u bakterijskim ćelijama, poželjno je da organizam domaćin bude E. coli. Poželjni DNK molekuli u takvom sistemu takođe obuhvataju bakterijsko mesto početka replikacije, kako bi se osigurala propagacija i održavanje DNK molekula iz generacije u generaciju bakterijskih ćelija. Na ovaj način, replikacijom u bakterijama mogu da se proizvedu velike količine DNK molekula. U takvim ekspresionim sistemima, poželjna bakterijska mesta početka replikacije obuhvataju, bez ograničenja, fl-ori i col El. Poželjni organizmi domaćini za takve sisteme sadrže hromozomske kopije DNK koja kodira T7 RNK polimerazu koja je operativno povezana sa inducibilnim promoterom, kao što je lacUV promoter( vidiU. S patent br. 4,952,496). Takvi organizmi domaćini obuhvataju, bez ograničenja, lizogene sojeve E. coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) i BL21(DE3). Poželjan je soj BL21(DE3). pLys sojevi obezbeđuju niske nivoe T7 lizozima, prirodnog inhibitora T7 RNK polimeraze.

DNK molekuli koji su obezbeđeni prema predmetnom pronalasku mogu takođe da sadrže gen koji kodira represorski protein. Represorski protein je sposoban da izvrši represiju transkripcije promotera koji sadrži nukleotidnu sekvencu za koju se represorski protein vezuje. Dejstvo represora na promoter može biti uklonjeno izmenom fizioloških uslova u ćeliji. Na primer, alteracija uslova može da se postigne dodavanjem u podlogu za uzgajanje molekula koji inhibira sposobnost operatora da interaguje ili sa regulatornim proteinima ili sa drugim regionima DNK ili izmenom temperature podloge za uzgajanje. Poželjni represorski proteini obuhvataju, bez ograničenja, lacl represor iz E. coli koji je osetljiv na indukciju sa IPTG, zatim je to na temperature osetljiviXcI857 represor i slični. Poželjan represor je lacl iz E. coli.

Generalno, rekombinantni konstrukti prema predmetnom pronalasku takođe sadrže elemente koji su potrebni za transkripciju i translaciju. Posebno, takvi elementi su poželjni onda kada rekombinantni ekspresioni konstrukt sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina koji su namenjeni ekspresiji u ćeliji domaćinu ili u organizmu domaćinu. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, poželjna je ekspresija specifična za određeni ćelijski tip odgovarajućeg gena koji kodira fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, što se postiže stavljanjem gena pod regulaciju odgovarajućeg promotera. Izbor promotera zavisi od ćelijskog tipa koji treba da bude transformiran i od stepena ili od tipa željene kontrole. Promoteri mogu biti konstitutivni ili aktivni i mogu dalje biti specifični za odgovarajući ćelijski tip, tkivo, specifični za individualnu ćeliju, specifični za odgovarajući događaj, vremenski specifični, ili mogu biti inducibilni. Promoteri koji su specifični za određeni ćelijski tip i promoteri koji su specifični za određeni tip događaja poželjni su prema predmetnom pronalasku. Primeri konstruktivnih ili nespecifičnih promotera obuhvataju rani promoter SV40 (U. S. Patent br. 5,118,627), kasni promoter SV40 (U.

S. patent br. 5,118,627), rani genski promoter CMV (U. S. patent br. 5,168,062), i promoter adenovirusa. Kao dodatak virusnim promoterima, ćelijski promoteri su takođe obuhvaćeni obimom zaštite prema predmetnom pronalasku. Posebno, poželjni su ćelijski promoteri za takozvane "housekeeping" gene. Virusni promoteri su poželjni jer su oni generalno jači promoteri od ćelijskih. Promoterski regioni su identifikovani u genima mnogih eukariota uključujući više eukariote, tako da odgovarajući promoteri koji se koriste u određenom organizmu domaćinu mogu biti lako izabrani od strane stručnjaka.

Takođe mogu da se koriste inducibilni promoteri. Ovi promoteri obuhvataju MMTV LTR (PCT WO 91/13160), koji je inducibilan od strane deksametazona; metalotioneinski promoter, koji je inducibilan od strane teških metala; i promoteri sa elementima koji su osetljivi na cAMP, koji su inducibilni od strane cAMP. Korišćenjem inducibilnog promotera sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina može da se dopremi do ćelije putem ekspresionog konstrukta prema predmetnom pronalasku i da ostane mirna (uspavana) sve do dodavanja odgovarajućeg induktora. Na ovaj način se postiže dalja kontrola vremena proizvodnje genskog proizvoda.

Promoteri koji su specifični za tip događaja su aktivni ili se njihova aktivnost povećava samo nakon odigravanja odgovarajućeg događaja, kao što je nastanak tumora ili virusne infekcije. HIV LTR je odličan primer promotera koji je specifičan za tip događaja. Promoter ostaje neaktivan sve dok proizvodtatgena ne bude prisutan, što se javlja nakon virusne infekcije. Neki promoteri koji su specifični za tip događaja su takođe specifični i za tip tkiva.

Dodatno, promoteri koji su koordinirano regulisani odgovarajućim ćelijskim genom mogu da se koriste prema predmetnom pronalasku. Na primer, promoteri gena koji su koordinirano eksprimirani mogu da se koriste kada je poželjna ekspresija odgovarajućeg vezujućeg konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., kada je poželjna ekspresija gena koji kodira fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, zajedno sa ekspresijom jednog ili više dodatnih endogenih ili egzogeno uvedenih gena. Ovaj tip promotera je posebno koristan onda kada je poznat obrazac genske ekspresije koji je relevantan za indukciju imunog odgovora u odgovarajućem tkivu imunog sistema, tako da specifične imuno komponentne ćelije u okviru tkiva mogu da se aktiviraju ili na drugi način regrutuju kako bi učestvovale u imunom odgovoru.

Kao dodatak promoteru, mogu biti insertovane sekvence represora, negativnih regulatora ili umanjivača specifičnih za tkivo, kako bi se u određenim situacijama smanjila nespecifična ekspresija gena koji kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina, kao što je to slučaj kod organizma domaćina koji je prolazno imuno kompromitovan u sklopu terapeutske strategije. U region promotera mogu biti insertovani brojni represorski elementi. Represija transkripcije je nezavisna od orijentacije represorskih elemenata ili od udaljenosti od promotera. Jedan tip represorske sekvence predstavlja insulatorna sekvenca. Takve sekvence inhibiraju transkripciju (Dunawayet al,1997Mol Cell Biol 17:182-9;Gdulaet al,1996Proc Natl Acad Sci USA93:9378-83, Chanet al.,1996J Virol70:5312-28; Scott & Geyer, 1995EMBO J14:6258-67; Kalos & Fournier, 1995Mol Cell Biol 15:198-207;Chunget al.,1993Cell74:505-14) i umanjuju neželjenu pozadinsku transkripciju.

Represorski elementi su takođe identifikovani u promoterskim regionima gena za tip II kolagena (kolagen hrskavice), za holin acetiltransferazu, albumin (Huet al.,1992J. Cell Growth Differ.3(9):577-588), fosfoglicerat kinazu (PGK-2) (Misunoet al,1992Gene119(2):293-297), i za 6-fosfofrukto-2-kinazu/fruktoza-2, 6-bifosfatazu (Lemaigreet al, Mol. Cell Biol.11(2): 1099-1106). Dalje, negativni regulatorni element Tse-1 je identifikovan u brojnim genima koji su specifični za jetru i pokazano je da blokira indukciju genske aktivacije u hepatocitima koja je posredovana elementima osetljivim na cAMP (CRE) (Boshartet al,1990Cell 61(5):905-916).

U poželjnim rešenjima, elementi koji povećavaju ekspresiju željenog proizvoda uvode se u konstrukt. Takvi elementi obuhvataju interna mesta vezivanja ribozoma (IRES; Wang & Siddiqui, 1995Curr. Top. Microbiol. Immunol203:99; Ehrenfeld & Semler, 1995 Curr.Top. Microbiol. Immunol.203:65; Reeset al,1996Biotechniques20:102; Sugimotoet al,1994Biotechniques12:694). IRES povećava efikasnost translacije. Takođe, na sličan način druge sekvence mogu da pospeše ekspresiju. U slučaju određenih gena, sekvence koje se posebno nalaze na 5' kraju inhibiraju transkripciju i/ili translaciju. Ove sekvence su obično palindrome koji formiraju strukture oblika ukosnice. Neka od takvih sekvenci u molekulu nukleinske kiseline koji treba da bude uveden u organizam su generalno deletirane. Nivoi ekspresije transkripta ili transliranog proizvoda ispituju se kako bi se potvrdila ili utvrdila koja od sekvenci utiče na ekspresiju. Nivoi transkripta mogu da se ispitaju bilo kojim poznatim postupkom, uključujući Northern blot hibridizaciju, zaštitu probe na RN-azu i slični. Nivoi proteina mogu da se ispitaju bilo kojim poznatim postupkom, uključujući ELISA, vvestern blot, imunocistohemijski metod ili druge dobro poznate tehnike.

I drugi elementi mogu biti inkorporirani u konstrukte prema predmetnom pronalasku, npr., u konstrukte koji kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina. U poželjnim rešenjima, konstrukt sadrži sekvencu za terminaciju transkripcije, uključujući sekvencu za poliadenilaciju, donorska mesta za isecanje i akceptorska mesta za isecanje, kao i pojačivačku sekvencu. Takođe, i drugi elementi koji su korisni za ekspresiju i održavanje konstrukta u ćelijama sisara ili u drugim eukariotskim ćelijama mogu biti inkorporirani u konstrukt prema predmetnom pronalasku (npr., mesto početka replikacije). S obzirom da se konstrukti poželjno proizvode u bakterijskim ćelijama, u konstrukte se inkorporiraju elementi koji su neophodni za, ili koji pospešuju propagaciju u bakterijama. Takvi elementi obuhvataju mesto početka replikacije, selektibilni marker i slične.

Kao što je ovde opisano, dodatni nivo kontrole ekspresije kodirajućih konstrukata nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku, npr., koji kodiraju fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, dopremaju se do ćelija putem genske terapije, npr., simultanim dopremanjem dva ili više na različiti način regulisanih konstrukata nukleinskih kiselina. Upotreba takvog pristupa koji koristi veći broj konstrukata nukleinskih kiselina može da omogući koordinisanu regulaciju imunog odgovora, kao što je, npr., vremensko-prostorna koordinacija koja zavisi od tipa ćelije i/ili prisustva druge eksprimirane kodirane komponente. Stručnjaci shvataju da regulacija genske ekspresije na više nivoa može da se postigne na sličan način izborom odgovarajućih regulatornih sekvenci, uključujući, bez ograničenja, promotere, pojačivače i druge dobro poznate elemente za regulaciju gena.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektore i na konstrukte koji su dobijeni iz poznatih vektora koji sadrže nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, a posebno se odnosi na "rekombinantne konstrukte za ekspresiju", uključujući sve različite poznate konstrukte, konstrukte za dopremanje koji su korisni u genskoj terapiji i koji podrazumevaju korišćenje bilo kojih nukleinskih kiselina koje kodiraju, npr., fuzione proteine i polipeptide vezujućeg domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku, na način koji je ovde opisan. Odnosi se na ćelije domaćine koje su dizajnirane genetskim inženjeringom korišćenjem vektora i/ili drugih konstrukata prema predmetnom pronalasku i na postupke primene konstrukata za ekspresiju i drugih konstrukata koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju, npr., fuzione proteine ili polipeptide vezujućeg domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku, ili njihove fragmente ili varijante primenom rekombinantnih tehnika.

Različiti konstrukti prema predmetnom pronalasku, uključujući, npr., fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina, mogu biti eksprimirani u praktično svakoj ćeliji u domaćinu, uključujućiin vivoćelije domaćine u slučaju upotrebe genske terapije, pod kontrolom odgovarajućih promotera, što zavisi od prirode samog konstrukta (npr., od tipa promotera, kao što je opisano gore), kao i od prirode željene ćelije domaćina (npr., bilo da je u pitanju post-mitotski terminalno diferencirana ćelija ili ćelija koja se aktivno deli; npr; bilo da se ekspresioni konstrukt javlja u ćeliji domaćinu kao epizom ili je integrisan u genom ćelije domaćina).

Odgovarajući vektori za kloniranje i ekspresiju koji se koriste sa prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćinima opisani su, npr., od strane Sambrook,et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989); kao što je ovde naznačeno, u posebno poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, rekombinantna ekspresija se izvodi u ćelijama sisara koje su transficirane ili transformirane konstruktima za ekspresiju dobijenim rekombinantnom tehnikom prema predmetnom pronalasku. Videti takođe, na primer, Machida, CA, "Viral Vectors for Gene Therapv: Methods and Protocols"; Wolff, JA, "Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer" (Birkhauser 1994); Stein, U and Walther, W (eds.P, "Gene Therapv of Cencer: Methods and Protocols" (Humana Press 2000); Robbins, PD (ed.), "Gene Therapy Protocols" (Humana Press 1997); Morgan JR (ed.), "Gene Therapy Protocols" (Humana Press 2002); Meager, A (ed.), "Gene Therapy Techonologies, Applications and Regulations: From Laboratory to Clinic" (John Wiley & Sons Inc. 1999); MacHida, CA &Constant, JG, "Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols" (Humana Press 2002); "Nevv Methods Of Gene Therapy For Genetic Metabolic Diseases NIH Guide", volumen 22, broj 35, 1. oktobar 1993. Videti, takođe, skorašnje U. S. patente koji se odnose na gensku terapiju, uključujući one koji se odnose na vakcine, gde spadaju U. S. patent br. 6,384,210 ("Solvent for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and methods of use"); 6,384,203 ("Family of immunoregulators designated leukocyte immunoglobulin-like receptors (LIR)"); 6,384,202 ("Cell-specific active compounds regulated by the cell cycle"); 6,384,018 ("Polynucleotide tuberculosis vaccine"); 6,383,814 ("Cationic amphiphiles for intercellular delivery of therapeutic molecules"); 6,383,811 ("Polyamholytes for delivering polyions to a cell"); 6,383,795 ("Efficient purification of adenovirus"); 6,383,794 ("Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus"); 6,383,785 ("Self-enhancing, pharmacologically controllable expression systems"); 6,383,753 ("Yeast mammalian regulators of cell proliferation"); 6,383,746 ("Functional promoter for CCR5"); 6,383,743 ("Method for serial analysis of gene expression"); 6,383,738 ("Herpes simplex virus ORF P is a repressor of viral protein synthesis"); 6,383,737 ("Human oxalyl-CoA Decarboxylase"); 6,383,733 ("Methods of screening for pharmacologically active compounds for the treatment of tumour diseases"); 6,383,522 ("Toxicity reduced composition containing an anti-neoplastic agent and a shark cartilage extract"); 6,383,512 ("Vesicular complexes and methods of making and using the same"); 6,383,481 ("Method for transplantation of hemopoietic stem cell"); 6,383,138 ("Method for transdermal sampling of analytesM); 6,380,382 ("Gene encoding a protein having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses"); 6,380,371 ("Endoglycan: a novel protein having selectin ligand and chemokine presentation activity"); 6,380,369 ("Human DNA mismatch repair proteins"); 6,380,362 ("Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use"); 6,380,170 ("Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes"); 6,380,169 ("Metal complex containing oligonucleoside cleavage compounds and therapies"); 6,379,967 ("Herpesvirus saimiri as viral vector"); 6,379,966 ("Intravascular delivery of non-viral nucleic acid protease proteins, and uses thereof).

Tipično, na primer, konstrukti za ekspresiju su izvedeni iz plazmidskih vektora. Jedan od poželjnih konstrukata je modifikovani pNASS vektor (Clontech, Palo Alto, CA), koji poseduje sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju gen za rezistenciju na amplicilin, signal za poliadenelaciju i mesto T7 promotera. Drugi odgovarajući vektori za ekspresiju kod sisara su dobro poznati u struci( videti, npr.,Ausubelet al,1995; Sambrooket al.,supra;videti takođe, npr.,catalogues from Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ; i druge). Trenutno poželjni konstrukti mogu da se pripreme tako da sadrže kodirajuću sekvencu za dihidrofolat reduktazu (DHFR) koja se nalazi pod odgovarajućom kontrolom regulatorne sekvence, radi promocije povećanih nivoa proizvodnje fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, pri čemu navedeni povišeni nivoi nastaju kao posledica amplifikacije gena nakon primene odgovarajućeg sredstva za selekciju( npr.,metotreksata).

Generalno, rekombinantni vektori za ekspresiju sadrže mesta za početak replikacije i selektibilne markere koji omogućavaju transformaciju ćelije domaćina, a sadrže i promoter koji je izveden iz gena koji je izraženo eksprimiran kako bi se transkripcija usmerila na nizvodnu strukturnu sekvencu, kao što je opisano gore. Heterologa strukturna sekvenca je sklopljena u odgovarajućoj fazi sa sekvencama za inicijaciju translacije i za terminaciju translacije. "Stoga, npr., nukleinske kiseline koje kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku, mogu da budu sadržane u bilo kom od različitih konstrukata vektora za ekspresiju u vidu konstrukata za rekombinantnu ekspresiju u cilju ekspresije fuzionog polipeptida vezujućeg domena i imunoglobulina u ćeliji domaćinu. U određenim željenim rešenjima konstrukti se nalaze u formulacijama koje se primenjujuin vivo.Takvi vektori i konstrukti obuhvataju sekvence hromozomske, nehromozoniske i sintetske DNK, npr., derivate SV40, bakterijske plazmide; DNK faga; plazmide gljivica; vektore izvedene iz kombinacije plazmida i DNK faga, virusne DNK, kao što su DNK vakcinie, adenovirusa, virusa kravljih boginja i virusa pseudorabiesa, ili retrovirusa sa deficijentnom replikacijom, kao što je opisano u tekstu koji sledi. Međutim, za pripremanje rekombinantnog konstrukta za ekspresiju može da se koristi bilo koji vektor, a u poželjnim rešenjima navedeni vektor poseduje sposobnost replikacije i vijabilnosti u ćeliji domaćinu.

Odgovarajuće sekvence DNK mogu biti insertovane u vektor, npr., primenom brojnih postupaka. Generalno, DNK sekvenca se insertuje u odgovarajuće mesto restrikcione endonukleaze postupcima koji su poznati u struci. Stručnjacima su poznate brojne standardne tehnike za kloniranje, za izolaciju DNK, amplifikaciju i prečišćavanje, za enzimske reakcije koje uključuju DNK ligazu, DNK polimerazu, restrikcione endonukleaze i slično, kao i različite tehnike separacije. Brojne standardne tehnike su opisane, na primer, u Ausubelet al,(1993Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc.John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrooket al,(1989Molecular Cloning,Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainvievv, NY); Maniatiset al,(1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainvievv, NY); Glover (Ed.) (1985DNA Cloning Vol. I and II,IRL Pres, Oxford, UK); Hames and Higgins (Eds.) (1985Nucleic Acid Hybridization,IRL Pres, Oxford, UK); kao i drugde.

Sekvenca DNK u vektoru za ekspresiju je operativno povezana sa barem jednom sekvencom za kontrolu ekspresije( npr.,sa konstitutivnim promoterom ili sa promoterom koji je regulisan), u cilju usmeravanja sinteze iRNK. Reprezentativni primeri takvih sekvenci za kontrolu ekspresije obuhvataju promotere eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, kao što je opisano gore. Promoterski regioni mogu biti izabrani iz bilo kog željenog gena korišćenjem CAT ( hloramfenikol transferaza) vektora ili drugih vektora sa selektibilnim markerima. Eukariotski promoteri obuhvataju rani trenutni CMV promoter, HSV timidin kinaze, rani kasni SV40 promoter, LTR-ove iz retrovirusa, kao i promoter mišijeg metalotioneina-I. Izbor odgovarajućeg vektora i promotera spada u domen kompentencije stručnjaka, a ovde je opisano dobijanje određeno posebno poželjnih rekombinantnih konstrukata za ekspresiju koji sadrže barem jedan promoter ili barem jedan regulisani promoter koji je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira fuzioni polipeptid vezujućeg domena i imunoglobulina prema predmetnom pronalasku.

Transkripcija sa DNK koja kodira proteine i polipeptide prema predmetnom pronalasku od strane viših eukariota može biti pospešena insercijom pojačivačke sekvence u vektor. Pojačivači su m-delujući elementi DNK, obično dužine od 10-300 baznih parova, koji deluju na promoter u smislu povećanja njegove transkripcije sa genom. Primier pojačivača obuhvataju pojačivač SV40 na kasnoj strani mesta početka replikacije od bp 100 do 270, pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma virusa na kasnoj strani mesta početka replikacije i pojačivače adenovirusa.

Genska terapija predstavlja upotrebu genetskog materijala u cilju lečenja bolesti. Ona obuhvata strategije zamene defektnih gena ili dodavanja novih gena u ćelije i/ili tkiva i razvija se za primenu u tretmanu kancera, u korekciji metaboličkih bolesti i u području imuno terapije. Genske terapije prema predmetnom pronalasku obuhvataju upotrebu različitih konstrukata prema predmetnom pronalasku, sa ili bez odvojenog nosača ili vehikuluma za dopremanje konstrukta, u cilju tretmana oboljenja, poremećaja i/ili stanja koja su ovde navedena. Navedeni konstrukti takođe mogu da se koriste kao vakcine za tretman ili sprečavanje nastanka oboljenja, poremećaja i/ili stanja koja su ovde naznačena. DNK vakcine, na primer, koriste polinukleotide koji kodiraju imunogeni protein i determinante nukleinske kiseline u cilju stimulcije imunog sistema protiv patogena ili tumorskih ćelija. Takve strategije mogu da stimulišu stečeni ili urođeni imunitet ili mogu da uključe modifikaciju imunoloških funkcija putem ekspresije citokina.In vivogenska terapija obuhvata direktno injektiranje genetskog materijala u organizam pacijenta ili u životinjskom modelu humane bolesti. Vakcine i imunomodulacija spadaju u sistemske terapije.

U slučaju tkivno specifičnihin vivoterapija, kao što su one čiji je cilj lečenje kancera, poželjna je upotreba lokalizovanog dopremanja gena i/ili korišćenje sistema za ekspresiju/ciljanje. Različiti vektori za gensku terapiju su dizajnirani da bi se naciljala specifična tkiva, a takođe su razvijene tehnike za fizičko ciljanje određenih tkiva, na primer, korišćenje tehnologija koje se zasnivaju na kateterizaciji, pri čemu su svi navedeni postupci obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska. Obuhvaćeni su predmetnim pronalaskom iex vivopristupi genskoj terapiji, koji obuhvataju prikupljanje, genetsku modifikaciju, ekspanziju i ponovnu primenu pacijentovih sopstvenih ćelija. Primeri navedenog obuhvataju transplantaciju kostne srži u okviru tretmana kancera ili genetsku modifikaciju limfoidnih progenitorskih ćelija. Ex vivo genske terapija se poželjno primenjuje u tretmanu ćelija koje su lako dostupne i koje mogu da prežive u kulturi tokom procesa transfera gena (to je slučaj sa ćelijama krvi ili kože).

Korisni vektori za gensku terapiju obuhvataju adenovirusne vektore, lentivirusne vektore, vektore virusa koji je udružen sa adenovirusom (AAV, vektore herpes simpleks virusa (Hsv) i retrovirusne vektore. Postupci genetske terapije takođe mogu da se izvedu korišćenjem "gole DNK", dopremanja koje se zasniva na lipozomima, dopremanja koje se zasniva lipidima (uključujući DNK koja je prikačena za pozitivno naelektrisane lipide), i elektroporaciju.

Kao što je ovde opisano u određenim rešenjima, uključujući, bez ograničenja, rešenja koja se odnose na gensku terapiju, vektor može biti virusni vektor, kao što je, npr., retrovirusni vektor (Milleret al.,1989BioTechniques7:980; Coffin & Varmus, 1996Retroviruses,Cold Spring Harbor Laboratorv Press, NY). Na primer, retrovirusi iz kojih mogu da se izvedu retrovirusni plazmidski vektori obuhvataju, bez ograničenja, Molonev virus mišije leukemije, virus nekroze slezine, retroviruse kao što je rous sarcoma virus, Harvev sarcoma virus, virus leukoze ptica, virus leukemije gibona, virus humane imunodeficijencije, adenovirus, virus mieloproliferativnog sarcoma i virus tumora mlečne žlezde.

Retrovirusi su RNK virusi koji mogu da se repliciraju i integrišu u genom ćelije domaćina putem DNK intermedijera. Ovaj DNK intermedijer ili provirus, može biti stabilno integrisan u DNK ćelije domaćina. Prema određenim rešenjima predmetnog pronalaska, konstrukt za ekspresiju može da sadrži retrovirus u koji je inkorporiran strani gen koji kodira strani protein umesto normalne retrovirusne RNK. Kada retrovirusna RNK uđe u ćeliju domaćina koincidentno sa infekcijom, strani gen takođe biva uveden u ćeliju i može biti integrisan u DNK ćelije domaćina kao daje deo retrovirusnog genoma. Ekspresija ovog stranog gena u ćeliji domaćinu dovodi do ekspresije stranog proteina.

Većina sistema sa retrovirusnim vektorom koji su razvijeni za gensku terapiju zasniva se

na mišijim retrovirusima. Navedeni retrovirusi postoje u dva oblika, kao slobodne virusne čestice označene kao virioni ili kao provirusi koji su integrisani u DNK ćelije domaćina. Virusni oblik viriona sadrži strukturne i enzimske proteine retrovirusa (uključujući , enzim reverznu transkriptazu), dve RNK kopije virusnog genoma i delove plazma membrane ćelije domaćina koji sadrže virusni glikoprotein omotača. Retrovirusni genom je organizovan u četiri glavna regiona: dugačka terminalna ponovna sekvenca (LTR), koja sadrži c/s-delujuće elemente neophodne za inicijaciju i terminaciju transkripcije i koja je locirana i na 5' i na 3' kraju kodirajućih gena, kao i tri kodirajuća genagag, pol i env.Ova tri gena( gag, pol i env)kodiraju, respektivno, unutrašnje virusne strukture, enzimske proteine (kao što je integraza) i glikoprotein omotača (koji je označen kao gp70 i pl5e) i zaslužni su za infektivnost i specifičnost koja se odnosi na ćeliju domaćina za dati virus, a odgovorni su i za pojava "R" peptida koji još nema određenu funkciju.

Razdvojene su ćelijske linije za pakovanje i ćelijske linije za proizvodnju vektora zbog problema sigurnosti prilikom korišćenja retrovirusa, uključujući njihovo korišćenje u konstruktima za ekspresiju prema predmetnom pronalasku. Ukratko, pomenuta metodologija koristi dve komponente, retrovirusni vektor i ćelijsku liniju za pakovanje (PCL). Retrovirusni vektor sadrži dugačku terminalnu ponovnu sekvencu (LTR), stranu DNK koja treba da bude transferisana i sekvencu za pakovanje (y). Pomenuti retrovirusni vektor ne može da se reprodukuje sam po sebi zbog toga što geni koji kodiraju strukturne proteine i proteine omotača nisu uključeni u genom vektora. PCL sadrži gene koji kodirajugag, pol i envproteine, ali ne sadrži signal za pakovanje "y". Stoga, PCL može da formira samo prazne čestice viriona sam po sebi. Po ovom opštem postupku, retrovirusni vektor se uvodi u PCL, pri čemu nastaje ćelijska linija koja proizvodi vektor (VCL). VCL proizvodi čestice viriona koje sadrže samo genom retrovirusnog vektora (strani genom) zbog čega je ranije ovaj pristup označen kao sigurni retrovirusni vektor za terapijsku upotrebu.

Pojam "konstrukt retrovirusnog vektora" označava sklop koji je prema poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska sposoban za usmeravanje ekspresije sekvence ili gena od interesa, npr., sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina. Ukratko, konstrukt retrovirusnog vektora mora da obuhvati jedan 5' LTR, jedno tRNK vezujuće mesto, signal za pakovanje, mesto početka sinteze druge nit DNK i 3' LTR. U konstrukt vektora mogu biti uključeni brojne heterologe sekvence, uključujući, npr., sekvence koje kodiraju protein (npr., citotoksični protein, antigen koji je udružen sa oboljenjem, imunološki akcesorski molekul ili gen za zamenu) ili one sekvence koje su korisne kao molekul sam po sebi (npr., kao ribozom ili nekodirajuća sekvenca).

Konstrukti retrovirusnog vektora prema predmetnom pronalasku mogu lako da se konstruišu iz raznih brojnih retrovirusa, uključujući, npr., B, C i D tip retrovirusa, kao i spumaviruse i lentiviruse( videti, npr.,RNA Tumor Viruses, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv, 1985). Navedeni retrovirusi mogu lako da se dobiju iz banki ili kolekcija, kao što je američka kolekcija tipskih kultura ("ATCC"; Rockville, Merilend), ili se izoluju iz poznatih izvora korišćenjem uobičajnih tehnika. Svaki od gore navedenih retrovirusa može lako da se iskoristi za sklapanje ili konstrukciju konstrukata retrovirusnog vektora, za dobijanje ćelija za pakovanje ili ćelija koje proizvode vektor prema predmetnom pronalasku, što je opisano u predmetnoj specifikaciji, korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika (npr., Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1989; Kunkle, 1985 PNAS 82:488).

Odgovarajući promoteri koji se koriste u virusnim vektorima generalno sadrže, bez ograničenja, retrovirusni LTR; promoter SV40; i promoter humanog citomegalovirusa (CMV) što je opisano u Miller,et al.,1989Biotechniques7:980-990, ili bilo koji drugi promoter (npr., ćelijske promotere kao što su ćelijski promoteri eukariota, uključujući, bez ogianičenja, histonske promotere, promoter pol III, i (3-aktina). Drugi virusni promoteri koji mogu da se koriste obuhvataju, bez ograničenja, promotere adenovirusa, promotere timidin kinaze (TK) i promotere parvovirusa BI 9. Kriterij umi za selekciju odgovarajućeg promotera su jasni stručnjacima na osnovu ovde navedenih opisa, a izabrani promoteri se nalaze ili u grupi regulisanih promotera ili promotera koji su ovde opisani.

Kao stoje opisano gore, retrovirusni plazmidski vektor se koristi za transdukciju ćelijskih linija za pakovanje pri čemu se dobijaju ćelijske linije za proizvodnju. Primeri ćelije za pakovanje koje mogu biti transficirane, obuhvataju, bez ograničenja, PE501, PA317, v|/-2,\|/-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, yCRE,\|/CRIP, GP+E-86, GP+envAml2, i DAN ćelijske linije kao što je opisano u Miller,Human Gene Therapy,1:5-14 (1990). Vektor može da izvrši transdukciju ćelijskih linija za pakovanje bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Takvi postupci obuhvataju, bez ograničenja, elektroporaciju, upotrebu lipozoma i precipitaciju sa CaP04. U jednom alternativnom rešenju, retrovirusni plazmidski vektor može biti enkaspuliran u lipozom ili povezan sa lipidom, a zatim primenjen kod ćelije domaćina.

Ćelijske linije za proizvodnju stvaraju infektivne retrovirusne čestice sa vektorom koje sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju fuzione polipeptide i proteine vezujućeg domena i imunoglobulina. Takve retrovirusne čestice sa vektorom se zatim koriste za transdukciju eukariotskih ćelijain vitroiliin vivo.Transdukovane eukariotske ćelije eksprimiraju sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju fuzioni polipeptid ili protein vezujućeg domena i imunoglobulina. Eukariotske ćelije koje su transdukovane obuhvataju, bez ograničenja, embrionske matične ćelije, kao i hematopoetske matične ćelije, hepatocite, fibroblaste, mononuklearne i polimorfonuklearne ćelije u cirkulišućoj perifernij krvi, uključujući mielomonocitne ćelije, limfocite, mioblaste, tkivne makrofage, dendritske ćelije, Kupferove ćelije, limfoidne i retikuloendotelialne ćelije limfnih čvorova i slezine, keratinocite, endotelne ćelije i ćelije epitela bronha.

Još jedan primer rešenja prema predmetnom pronalasku u kome se koristi virusni vektor za dobijanje, npr., rekombinantnog konstrukta za ekspresiju fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, obuhvata ćelije domaćine koje su transdukovane rekombinantnim virusnim konstruktom koji usmerava ekspresiju fuzionog polipeptida ili proteina vezujućeg domena i imunoglobulina, čime se postiže proizvodnja virusnih čestica koje sadrže konstrukte za ekspresiju fuzionih polipeptida ili protein vezujućeg domena i imunoglobulina i koje su obložene delovima membrane ćelije domaćina, što se odigrava u procesu virusnog pupljenja.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na ćelije domaćine koje sadrže ovde opisane konstrukte nukleinskih kiselina, kao što su, npr., konstrukti za ekspresiju fuzionih polipeptida vezujućeg domena i imunoglobulina dobijenih rekombinantnom tehnikom. Ćelije domaćini su genetskim inženjeringom izmenjene (transdukovane, transformirane ili transficirane) sa vektorima i/ili konstruktima za ekspresiju prema predmetnom pronalasku i mogu biti, npr., vektor za kloniranje, vektor za prenos ili konstrukt za ekspresiju. Vektor ili konstrukt mogu biti, na primer, u obliku plazmida, čestice virusa, faga, itd. Ćelije domaćini dobijeni genetskim inženjeringom mogu biti kultivisane u uobičajnim podlogama za ishranu koje su modifikovane prema odgovarajućem promoterima za aktivaciju, transformantima za selekciju ili posebnim genima za amplifikaciju, kao što su geni koji kodiraju fuzione polipeptide ili proteine vezujućeg domena i imunoglobulina. Uslovi kultivacije za određene ćelije domaćine izabrane za ekspresiju, poznate su stručnjacima i obuhvataju odgovarajuću temperaturu, pH vrednost i slično.

Ćelija domaćin za proizvodnju ili ekspresiju konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., može biti ćelija višeg eukariota, kao što je ćelija sisara, ili ćelija nižeg eukariota, kao što je ćelija gljivice ili ćelija domaćin može biti prokariotska ćelija, npr., bakterijska ćelija. Reprezentativni primeri odgovarajućih ćelija domaćina, shodno predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, bakterijske ćelije, kao što suE. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium\ćelije gljiva, npr., ćelije gljivica; insekatske ćelije kao što su ćelijske linijeDrosophila S2iSpodoptera Sf9;ćelije životinja kao što su CHO, COS ili 293 ćelije; adenovirusi; ćelije biljaka ili bilo koje pogodne ćelije koje su adaptirane zain vitropropagaciju ili su ustanovljenede novo.Izbor odgovarajućeg domaćina se nalazi u okviru kompetencije stručnjaka i delimično je objašnjen u predmetnoj specifikaciji.

Takođe, za ekspresiju rekombinantnog proteina mogu da se koriste različiti sistemi ćelijske kulture sisara. Primeri sistema za ekspresiju u ćelijama sisasra obuhvataju COS-7 ćelijske linije fibroblasta bubrega majmuna, koje su opisane u Gluzman, 1981 Cell 23:175, kao i druge ćelijske linije koje su sposobne za ekspresiju kompatabilnog vektora, na promer, to su C127, 3T3, CHO, HeLa i BHK ćelijske linije. Vektori za ekspresiju kod sisara sadrže mesto početka replikacije, odgovarajući promoter i pojačivač, a takođe mogu da sadrže bilo koje neophodno mesto za vezivanje ribozoma, mesto za poliadenilaciju, donarsko mesto i akceptorsko mesto za isecanje, sekvence za terminaciju transkripcije i 5' bočne sekvence koje se ne transkribuju , na primer, kao što je opisano ovde kod dobijanja konstrukata za ekspresiju fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina. DNK sekvence koje su izvedene iz mesta isecanja SV40 i mesta za poliadenelaciju mogu da se koriste da bi se obezbedili potrebni genetski elementi koji se ne transkribuju. Uvođenje konstrukta u ćeliju domaćina može da se postigne brojnim postupcima koji su poznati stručnjacima, i koji uključuju, bez ograničenja, transfekciju pomoću kalcijumfosfata, DEAE-Dextranom posredovanu transfekciju, ili elektroporaciju (Davišet al.,1986Basic Methods in Molecular Biology).

Konstrukti prema predmetnom pronalasku, npr., fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina ili preparati koji sadrže jedan ili više polinukleotida koji kodiraju navedene konstrukte kao što je ovde opisano (na primer, koji treba da se primene u uslovima i tokom vremena koje je dovoljno da omogući ekspresiju fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina u ćeliji domaćinuin vivoiliin vitro,radi genske terapije, između drugih stvari), mogu biti formulisani u obliku farmaceutskih preparata shodno dobro poznatim metodologijama. Farmaceutski preparati generalno sadrže jedan ili više rekombinantnih konstrukata za ekspresiju i/ili proizvoda ekspresije takvih konstrukata, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem, ekscipientom ili diluentom. Takvi nosioci su netoksični za recipijenta u svim doznim opsezima i koncentracijama koje se koriste. U slučaju formulacija koje sadrže nukleinske kiseline ili u slučaju formulacija koje sadrže proizvode ekspresije rekombinantnih konstrukata prema predmetnom pronalasku, primenjuje se doza od oko 0,01 jJ,g/kg do oko 100 mg/kg telesne mase, tipično intradermalno, subkutano, intramuskularno ili intravenski, između ostalih načina primene. Posebno je poželjna doza oko 1 pg/kg do oko 1 mg/kg, a još poželjnija doza od oko 5 u.g/kg do oko 200 pg/kg. Stručnjacima je jasno da broj i učestalost primena zavisi od odgovora organizma recipijenta. "Farmaceutski prihvatljivi nosioci" koji se koriste za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro urednik, 1985). Na primer, mogu da se koriste sterilni fiziološki rastvor i fosfatom buferovani fiziološki rastvor sa fiziološkom pH vrednošću. U farmaceutskom preparatu mogu da se upotrebe konzervansi, stabilizatori, veštačke boje čak i veštačke arome. Na primer, kao konzervansi mogu da se dodaju natrijumbenzoat, sorbinska kiselina i estri p-hidroksibenzoeve kiseline (ibidem str. 1449). Dodatno, mogu da se koriste antioksidantna sredstva i sredstva za suspendovanje (ibidem).

Pojam "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na soli jedinjena prema predmetnom pronalasku koje su izvedene iz kombinacije tih jedinjena ili organskih i neorganskih kiselina (adicione soli kiselina) ili organskih ili neorganskih baza (adicione soli baza). Jedinjena'prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste i u obliku slobodne baze ili u obliku soli, pri čemu su oba ova oblika obuhvaćena obimom zaštite predmetnog pronalaska.

Farmaceutski preprati koji sadrže jedan ili više konstrukata nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku, npr., koji sadrže konstrukte koji kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina (ili njihove eksprimirane proizvode) mogu da se nalaze u obliku koji omogućava da preparat bude primenjen kod pacijenta. Na primer, preparat može da se nalazi u obliku čvrste supstance, tečnosti ili gasa (aerosol). Tipični putevi primene obuhvataju, bez ograničenja, oralnu, topijsku, parenteralnu( npr.,sublingvalnu ili bukalnu), rektalnu, vaginalnu i intranazalnu primenu. Pojam "parenteralni" koji se ovde koristi obuhvata subkutane injekcije, intravenske, intramuskularne, intrasternalne, intrakavernozne, intratekalne, intrameatalne, intrauretalne injekcije ili infuzije. Farmaceutski peparat se formuliše na taj način da omogući da aktivni sastojci koji se u njemu nalaze budu biološki raspoloživi nakon primene preparata kod pacijenta. Preparati koji treba da se primene kod pacijenta se nalaze u obliku jednostruke ili višestruke dozne jedinice, pri čemu, na primer, tableta može biti jedinični dozni oblik, a kontejner sa jednim ili više jedinjenja prema predmetnom pronalasku u obliku aerosola može da sadrži višestruke dozne jedinice.

U slučaju oralne primene, u preparatu mogu da se nalaze ekscipijent i/ili vezujuće sredstvo. Primeri navedenih su sukroza, kaolin, glicerin, dekstrini škroba, natrijum alginat, karboksimetilceluloza i etil celuloza. U preparatu mogu da postoje veštačke boje i/ili veštačke arome. Takođe može da se koristi oblaganje preparata određenom oblogom.

Preparat može da se nalazi u obliku tečnosti, na primer, eliksira, sirupa, rastvora, emulzije ili suspenzije. Tečnost može da se primeni za oralnu primenu ili za dopremanje injekcije. Kada se koristi za oralnu primenu, poželjni preparati sadrže, kao dodatak jednom ili više fuzionih konstrukata ili proizvoda ekspresije vezujućeg domena i imunoglobulina, jedno ili više sredstava za zaslađivanje, konzervanse, veštačke boje i pojačivače arome. U preparatu koji treba da se primeni injekcijom, mogu biti uključeni jedan ili više surfaktanata, konzervans, sredstvo za vlaženje, sredstvo za dispergovanje, sredstvo za suspendovanje, bufer, stabilizator i sredstvo za postizanje izotoničnosti.

Tečni farmaceutski preparat koji se ovde opisuje, bilo da se nalazi u obliku rastvora, suspenzije ili u nekom drugom obliku može da sadrži jedan ili više sledećih adijuvansa: sterilne diluente, kao što su voda za injekciju, rastvor natrijumhlorida, poželjno fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, fiksirana ulja, kao što su sintetski mono ili digliceridi koji mogu da posluže kao rastvarač ili podloga za suspendovanje, polietilenglikole, glicerin, propilen glikol ili druge rastvarače; antibakterijska sredstva kao što je benzili alkohol ili metil paraben; antioksidante, kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfid; helirajuća sredstva, kao što je etilendiamintetresirćetna kiselina; bufere kao što su acetatni, citratni ili fosfatni buferi i sredstva za podešavanje toničnosti kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. Preparat za parenteralnu upotrebu može da se nalazi u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili bočicama sa višestrukim dozama napravljenim od stakla ili plastike. Kao adijuvant je poželjan fiziološki rastvor. Farmaceutski preparat za primenu putem injekcije je poželjno sterilan.

Takođe, može biti poželjno da preparat sadrži i druge komponente, kao što su vehikulumi za dopremanje, uključujući, bez ograničenja, soli aluminij uma, emulzije voda u ulju, uljne vehikulume koji su biološki razgradljivi, emulzije ulje u vodi, mikrokaspule koje su biološki razgradljive i lipozomi. Primeri imunostimulatornih supstanci (adijuvanata) koja se koriste u takvim vehikulumima obuhvataju N-acetilmuramil-L-alanin-D-izoglutamin (MDP), lipopoli-saharide (LPS), glukan, IL-12, GM-CSF, gama interferon ili IL-15.

U farmaceutskim preparatima prema predmetnom pronalasku može se primeniti bili koji pogodni nosilac, pri čemu tip nosioca zavisi od načina primene i od toga da li je poželjno produženo otpuštanje. U slučaju parenteralne primene, kao što je primena subkutanom injekcijom, u nosioce poželjno spadaju voda, rastvor natrijumhlorida, alkohol, mast, vosak ili bufer. U slučaju oralne primene, može da se koristi bilo koji od gore navedenih nosioca ili neki čvrasti nosilac kao što je manitol, laktoza, škrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celuloza, glukoza, sukroza i magnezijum karbonat. Takođe, kao nosioci za farmaceutske preparate prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste mikrosfere koje su biološki razgradljive( npr.,sačinjene od poliaktinskog galaktida). Odgovarajuće biološki razgradljive mikrosfere su opisane u U.S. patentima 4,897,268 i 5,075,109. U ovom slučaju poželjno je da mikrosfere budu veće od 25 mikrometara.

Farmaceutski preparati takođe mogu da sadrže diluente kao što su buferi, antioksidante kao što je askorbinska kiselina, polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka), proteine, amino kiseline, ugljene hidrate uključujući glukozu, sukrozu ili dekstrine, helirajuća sredstva kao što je EDTA, glutation i druge stabilizatore ili ekscipiente. Primeri odgovarajućih diluenata jesu neutralni buferovani rastvor NaCl ili rastvor NaCl koji je pomešan sa nespecifičnim serumskim albuminom. Poželjno, proizvod je formulisan u obliku liofilizata korišćenjem odgovarajućih rastvora ekscipienata (npr., sukroze) kao diluenata.

Kao što je opisano gore, predmetni pronalazak obuhvata preparate koji su sposobni za dopremanje molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju fuzione proteine vezujućeg domena i imunoglobulina. Takvi preparati obuhvataju rekombinantne virusne vektore( npr.,retroviruse( videtiWO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 i WO 94/03622), adenoviruse( videtiBerkner, 1988Biotechniques6:616-627; Liet al., 1993 Hum. Gene Ther.4:403-409; Vincentet al, Nat. Genet.5:130-134; i Kollset al.,1994Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:215-219), poks viruse( videtiU. S. Patent br. 4,769,330;U. S. Patent br. 5,017,487; i WO 89/01973)), rekombinantne konstrukte za ekspresiju molekula nukleinske kiseline koji se nalaze u kompleksu sa polikationskim molekulom (videti WO 93/03709), i nukleinske kiseline koje su udružene sa lipozomima( videtiWanget al,1987Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:7851). U određenim rešenjima DNK može biti povezana sa ubijenim ili inaktiviranim adenovirusom( videtiCurielet al,1992Hum. Gene Ther.3:147-154; Cottonet al,1992Proc. Natl Acad. Sci. USA89:6094). Drugi pogodni preparati sadrže DNK-ligand( videtiWuet al,1989J. Biol. Chem.264:16985-16987) i lipid-DNK kombinacije( videtiFelgneret al,1989Proc. Natl. Acad. Sci USA84:7413-7417).

Kao dodatak direktnimin vivopostupcima, mogu da se koriste iex vivopostupci u kojima se ćelije prikljupljaju iz ćelije domaćina, potom modifikuju i vraćaju nazad u istu ili u drugu životinju domaćina. Očigledno je da može da se koristi bilo koji od preparata koji je naznačen gore za uvođenje konstrukata prema predmetnom pronalasku, npr., za uvođenje fuzionih proteina vezujućeg domena i imunoglobulina ili molekula ukleinske kiseline koje kodiraju fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina u ćelije tkiva u navedenomex vivokontekstu. U struci su poznati protokoli za virusne, fizičke i hemijske postupke preuzimanja preparata.

Shodno navedenom, predmetni pronalazak je koristan u tretiranju pacijenata koji poseduju poremećaj B ćelija ili maligno stanje, ili u tretmanu ćelijske kulture koja je izvedena iz takvih pacijenata. Kao što se ovde koristi "pacijent" označava bilo koju toplokrvnu životinju, poželjno čoveka. Pacijent može biti zahvanćen kancerom ili nekim drugim stanjem, kao što je limfom B ćelija ili može biti normalan (tj., da ne poseduje bilo koje detektabilno oboljenje i infekciju). Pojam "ćelijska kultura" označava svaki preparat koji je pogodan zaex vivotretman,

na primer, neki preparat koji sadrži imunokompetentne ćelije ili izolovane ćelije imunog sistema (uključujući, bez ograničenja, T ćelije, makrofage, monocite, B ćelije i dendritske ćelije). Navedene ćelije mogu biti izolovane upotrebom neke od mnoštva tehnika koje su dobro p'oznate stručnjacima( npr.,upotrebom Ficoll-hypaque centrifugiranjem po gustini). Ćelije mogu (mada ne moraju) da budu izolovane iz pacijenta koji je pogođen poremećajem B ćelija ili malignim stanjem i mogu biti ponovo uvedene u organizam pacijenta nakon tretmana.

Tečni preparat koji je namenjen parenteralnoj ili oralnoj primeni treba da sadrži količinu konstrukta prema predmetnom pronalasku, npr., konstrukta koji kodira fuzioni protein vezujućeg domena i imunoglobulina ili eksprimiranog proizvoda, koja je dovoljna da se nakon primene u organizmu pacijenta postigne određeni dozni nivo. Tipično, navedena količina je najmanje 0,01% (maseni) konstrukta ili eksprimiranog proizvoda fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina u preparatu. U slučaju oralne primene ova količina varira od 0,1 do 70% mase preparata. Poželjni oralni preparati sadrže od oko 4 do oko 50% konstrukta ili eksprimiranog proizvoda fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina. Poželjni preparati i sastavi se pripremaju tako da, na primer, dozna jedinica za parenteralnu primenu sadrži 0,01 do 1%

(maseni) aktivnog jedinjenja.

Farmaceutski preparat može biti namenjen topiskoj primeni, a u tom slučaju nosilac može

da sadrži odgovarajući rastvor, emulziju, mast ili gel bazu. Baza, npr., može da sadrži jednu ili više sledećih supstanci: petrolej, lanolin, polietilen glikole, pčelinji vosak, mineralno ulje, diluente kao što su voda i alkohol i sredstva za emulgovanje i stabilizatore. Sredstva za očvršnjavanje mogu biti prisutna u farmaceutskom preparatu za topisku primenu. U slučaju transdermalne primene, preparat može da sadrži transdermalni flaster ili uređaj za jontoforezu. Topiske formulacije mogu da sadrže koncentraciju konstrukta prema predmetnom pronalasku,

npr., konstrukta ili eksprimiranog proizvoda fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina od oko 0,1 do oko 10% w/v (masa po jedinici zapremine).

Preparat može biti namenjen rektalnoj primeni, kada se nalazi u obliku, npr., supozitorije koja će se istopiti u rektumu i otpustiti lek. Prepatrat za rektalnu primenu može da sadrži uljastu bazu kao odgovarajući neiritirajući ekscipijent. U takve baze spadaju, bez ograničenja, lanolin, kakao puter i polietilen glikol.

U postupcima prema predmetnom pronalasku, konstrukt, na primer, kodirajući konstrukt

ili eksprimirani proizvod fuzionog proteina vezujućeg domena i imunoglobulina može<*>da se primeni upotrebom sredstva za inserciju, perlica, formulacije sa programiranim otpuštanjem leka, flastera ili formulacije za brzo otpuštanje leka.

Konstrukti prema predmetnom pronalasku, npr., antigen-vezujući konstrukti, mogu da se primene ili da se primene zajedno sa drugim sredstvima kod životinje ili pacijenta u kombinaciji sa drugim jedinjenjima u isto vreme ili otprilike u isto vreme. U jednom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata, primenjuje se kod životinja ili pacijenta zajedno sa jednim ili više hemoterapeutskih jedinjenja kao što su alkilirajuća sredstva, analogi nukleozida i slična sredstva. Primena ili zajednička primena jednog ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku i jednog ili više hemoterapeutskih sredstava može da sc koristi za tretman tumora ili kancera kod životinje ili pacijenta. Primeri kancera obuhvataju, bez ograničenja, kancer glave i vrata, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer želudca, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer pluća (ne-sitnoćelijski), kancer jajnika,

■ kancer gušterače, kancer kestenjače, horiokarcinom (kancer pluća), leukemiju vlasastih ćelija, hroničnu limfatičnu leukemiju, akutnu limfatičnu leukemiju (dojka i mokraćna bešika), akutnu mijelogenu leukemiju, meningealnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, eritroleukemiju. Uobičajeni kanceri koji se tretiraju na navedeni način obuhvataju ne-Hočkinov limfom (osteogeni sarkom, sarkom mekih tkiva odraslih), T-ćelijski limfom, hroničnu limfatičnu leukemiju, sporo rastuće ne-Hočkinove limfome, HoČkinove limfome i kancer jajnika.

Primeri alkilirajućih sredstava koja mogu da se zajednički primene sa jednim ili sa više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, obuhvataju mehloretamin, hlorambucil, ifosfamid, malfalan, busulfan, karmustin, lomustin, prokarbazin, dakardazin, cisplatin, karboplatin, mitomicin C, ciklofosfamid, izosfamid, heksametilmelamin, tiotepa i dakarbazin, kao i njihove analoge. Videti, na primer, U. S. Patent br. 3,046,301 koji opisuje sintezu hlorambucila, U. S. Patent br. 3,732,340 koji opisuje sintezu ifosfamida, U. S. Patent br. 3,018,302 koji opisuje sintezu ciklofosfamida, U. S. Patent br.

3,032,584 koji opisuje sintezu melfalana i Braunvvaldet al,"Harrison's Principles of Internal Medicine", petnaesto izdanje, McGravv-Hill, Nevv York, NY, str. 536-544 (2001) za kliničke aspekte primene ciklofosfamida, hlorambucila, melfalana, ifosfamida, prokarbazina, heksametilmelamina, cisplatina i karboplatina. Primeri nukleozidnih analoga, uključuju, bez ograničenja, fludarabin pentostatin, metotreksat, fluorouracil, fluorodeoksiuridin, CB3717, azacitidin, citarabin, floksuridin, merkaptopurin, 6-tioguanin, kladribin i njihove analoge. Jedan primer predstavlja kombinacija konstrukata, uključujući antigen-vezujuće konstrukte koji vezuju CD20. Ovaj konstrukt deluje kao sredstvo za hemosenibilizaciju i deluje zajedno sa hemoterapeutskim sredstvima, tako daje neophodna primena manje količine hemoterapeutskog sredstva da bi se postigao anti-tumorski ili anti-kancerski efekat. Na primer, U. S. Patent br. 3,923,785 opisuje sintezu pentostatina, U. S. Patent br. 4,080,325 opisuje sintezu metotrekstata,

U. S. Patent br. 2,802,005 opisuje sintezu fluorouracila, a u referenci "Harrison's Principles of Internal Medicine", petnaesto izdanje, McGravv-Hill, Nevv York, NY, str. 536-544 (2001) videti kliničke aspekte primene metotreksata, 5-fluorouracila, citozin arabinozida, 6-merkaptopurina, 6-tioguanina i fludarabin fosfata.

U drugom rešenju jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajednički primeni sa jedinjenjima koja inhibiraju topoizomerazu II ili sa jedinjenjima koja na drugi način interaguju sa nukleinskim kiselinama u ćelijama. Takva jedinjenja obuhvataju, na primer, doksorubicin, epirubicin, etopozid, tenipozid, mitoksantron i njihove analoge. U jednom primeru, ova kombinacija se koristi u tretmanu čiji je cilj smanjivanje kontaminacije progenitorskih ćelija periferne krvi tumorskim ćelijama zajedno sa hemoterapijom visoke doze i sa podrškom autologim matičnim ćelijama (videti U. S patent 6,586,428 od strane Geroniet al

U drugom rešenju jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajednički primeni sa terapeutskim lekovima. Na primer, moguća je zajednička primena sa Virulizinom (Lorus Therapeutics), za koji se veruje da stimuliše otpuštanje faktora nekroze tumora (TNF-a) od strane tumorskih ćelijain vitroi da stimuliše aktivaciju makrofaga. Ovaj lek može da se koristi u kombinaciji sa jednim ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, u cilju povećanja apoptoze kancerskih ćelija i tretiranja različitih tipova kancera uključujući kancer gušterače, maligni melanom, Kapošijev sarkom (KS), kancer pluća, kancer dojke, kancer materice, jajnika i grlića materice. Drugi primer leka je CpG 7909 (Coley Pharmaceutical Group) za koji se veruje da aktivira NK ćelije i monocite i da pospešuje ADCC. Ovaj lek može da se koristi u kombinaciji sa konstruktima koji su specifični za kancer ili za tumor, uključujući antigen vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku, kao što su anti-CD20 konstrukti, u cilju tretiranja ne Hočkinovog limfoma i drugih kancera.

Takođe jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se kombinuje sa inhibitorima angiogeneze kako bi se povećao anti-tumorski efekat. Angiogeneza predstavlja rast novih krvnih sudova. Ovaj proces dozvoljava tumorima da rastu i metastaziraju. Inhibicija angiogeneze može da spreči nastanak metastaza i da zaustavi širenje tumorskih ćelija. Inhibitori angiogeneze su, bez ograničenja, angiostatin, endostatin, trombospondin, faktor trombocita 4, inhibitor izveden iz hrskavice (CDI), retinoidi, interleukin-12, tkivni inhibitor metaloproteinaze 1, 2 i 3 (TIMP-1, TIMP-2 i TIMP-3) i proteini koji blokiraju signalnu kaskadu angiogeneze kao što su anti-VEGF (vaskularni endotelni faktor rasta) i IFN-alfa. Inhibitori angiogenze mogu da se primene ili zajednički primene sa konstruktima koji su specifični za tumor, uključujući antigen-vezujuće konstrukte koji su sposobni za posredovanje pri, npr., ADCC i/ili fiksaciji komplementa ili vezivanju konstrukta prema predmetnom pronalasku konjugovanog sa hemoterapeutskim sredstvom za antigen u cilju lečenja različitih kancera, na primer, solidnih kancera kao što su kancer pluća ili kancer dojke.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajednički primeni sa anti-reumatskim sredstvima za modifikaciju bolesti (DMAR sredstvima) pri tretiranju reumatoidnog artritisa, psorijaze, ulcerativnog kolitisa, sistemskog eritematoznog lupusa, Hronove bolesti, ankilozirajućeg spondilitisa i različitih procesa kod inflamatornih bolesti. U takvom tretmanu, konstrukti, npr., antigen-vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku, se uobičajno primenjuju zajedno sa jedinjenjima kao što su azatioprin, ciklosporin, zlato, hidroksihlorokin, metotreksat, penicalamin, sulfasalazin i slični.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajednički primeni sa sredstvima koja se suprotstavljaju biološkim efektima interleukina-1, uključujući, na primer, inhibitore interleukina-1 i antagoniste receptora za interleukin-1. Smatra se da interleukin-1 ima važnu ulogu u nastanku reumatoidnog artritisa, inflamacije i destrukcije zglobova. Inhibitori IL-1 takođe mogu da se koriste zajedno sa konstruktima, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku, u cilju tretiranja artritisa, inflamatorne bolesti creva, sepse i septičnog šoka, ishemične povrede, reperfuzione povrede, ishemične moždane povrede i cerebralne paralize i multiple skleroze (videti, U. S. Patent br. 6,159,460 podnet od strane Thompson et al.). U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajednički primeni kod životinja ili pacijenta zajedno sa jednim ili sa više glukokortikoida, npr., sa metilprednizilonom, deksametazonom, hidrokortizonom i sličnim. Glukokortikoidi se koriste da indukuju apoptozu i inhibiraju rast, nezavisno od ADCC i CDC. Ova jedinjenja mogu da se kombinuju sa konstruktima, uključujući, antigen-vezujuće konstrukate prema predmetnom pronalasku, koja su sposobna za indukciju apoptoze u ćelijama kancera. U jednom primeru, anti-CD20 i anti-CD40 antigen-vezujući konstrukati, koji se koriste za indukciju apoptoze kod B ćelija, kombinuju se sa glukokortikoidima u tretiranju B-ćelijskog ne-Hočkinovog limfoma.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može biti primenjen ili zajedno primenjen sa p38 inhibitorima ili antagonistima. Signalni put protein kinaze koja je aktivirana sa p38 mitogena uključenje u brojne ćelijske procese koji su zaslužni za razvoj reumatoidnog artritisa. Na primer, aktivacija i filtracija leukocita, kao i proizvodnja inflamatornih citokina su procesi koji su zavisni od p38.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, se primenjuje ili se zajedno primenjuje sa jedinjenjima koja pospešuju diferencijaciju i proliferaciju B-ćelija. Citokini kao što su interleukin-4 (IL-4) i interleukin-6 (IL-6), pored svojih bioloških aktivnosti, pokazano je da stimulišu sintezu antitela i sekreciju od strane aktiviranih B-limfocita. U posebnom rešenju prema predmetnom pronalasku, konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte koji prepoznaju i koji se vezuju za CD20 se zajedno primenjuju sa interleukinom-4 (IL-4) i interleukinom-6 (IL-6) ili sa oba.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajedno primeni sa interleukinom-2 (IL-2). IL-2 je limfokin koji povećava proizvodnju efektorskih ćelija, kao što su CD4+ T-helper ćelije, CD8 citotoksične ćelije, antitelo-produkujuće B ćelije, ćelije prirodne ubice (NK ćelije) i monociti/makrofagi. IL-2 pomaže u proizvodnji T ćelija, koje zauzvrat vrše sekreciju još većih količina IL-2 ("autokrina pozitivna povratna sprega"). IL-2 može da se koristi za pospešivanje od antitela zavisne ćelijske posredovane citotoksičnosti (ADCC) i za imunoterapije koje koriste konstrukte prema predmetnom pronalasku. U jednom rešenju anti-CD20 konstrukt prema predmetnom pronalasku I IL-2 se koriste u tretmnu pacijenata sa relapsom ili refraktornim folikularnim oblikom ne-Hočkinovog limfoma. U drugom primeru IL-2 se primenjuje ili zajedno primenjuje sa imunoterapijama za HIV, kako bi se pomoglo oporavku T ćelija.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajedno primeni sa interleukinom-12 (IL-12). Za IL-12 je pozanto da povećava citolitičke T-ćelijske odgovore, da pospešuje razvoj helper T-ćelija, da povećava aktivnost ćelija prirodnih ubica i da indukuje sekreciju IFN-y kod T i NK ćelija. IL-12 takođe povećava broj mnogih helper i receptorskih ćelija koje posreduju u apoptozi. U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, se primenjuje ili se zajedno primenjuje sa IL-12 u tretmanu životinje ili pacijenta sa tumorom ili kancerom. Na primer, određeni konstrukt, uključujući antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku koji se vezuje za CD20 primenjuje se zajedno sa IL-12 u tretmanu pacijenata sa B-ćelijskim ne-Hočkinovim limfomom (NHL).

Jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigena-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, može takođe da se kombinuje sa imunomodulatorima koji pospešuju efikasnost antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku. U imunomodulatore spadaju, bez ograničenja, faktori stimulacije kolonija (CSF), faktori nekroze tumora (TNF) i interferoni (IFN).

CSF-ovi obuhvataju granulocitno-makrofagni CSF (GM-CSF), granulocitno-CSF (G-CSF) i makrofagni CSF (M-CSF). Za GM-CSF se smatra da reguliše razvoj neutrofila, makrofaga, monocita i eozinofila. G-CSF dokazano indukuje proizvodnju neutrofila, i proizvodnju M-CSF. Za M-CSF je pokazano da stimuliše makrofage i monocite. Upotreba CSF-ova u tretmanu neutropenie kod pacijenata sa kancerom je davno ustanovljena praksa. U jednom primeru, konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku, mogu da se kombinuju sa GM-CSF, G-CSF ili njihovim kombinacijama kako bi se ubrzao oporavak od neutropenije kod pacijenata nakon transplantacije koštane srži i hemoterapije. Neutrofili igraju glavnu ulogu u borbi protiv mikroba kao što su bakterije, gljivice i paraziti. Pacijenti sa neutropeniom su posebno podložni bakterijskim i generalizovanim gljivičnim infekcijama. U drugom primeru, konstrukt, uključujući antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku može da se kombinuje sa GM-CSF-tretiranim neutrofilima, monocitima i makrofagima kako bi se povećala aktivnost protiv bakterija, gljivica i sličnih mikroba, uključujući i Pneumocvstis carinik

Primer za interferon jeste interferon alfa (IFN-a). IFN-a se prirodno stvara od strane nekih tipova belih krvnih ćelija u sklopu imunog odgovora u kome organizam reaguje na kancere ili virusne infekcije. Ovaj molekul poseduje dva načina napada, interferirajući sa rastom i proliferacijom kancerskih ćelija i pospešujući proizvodnju T ćelija ubica i drugih ćelija koje napadaju kancerske ćelije. Takođe, smatra se da interferon potstiče kancerske ćelije da eksprimiraju hemijske signale koji ih čine boljim metama za napad od strane imunološkog sistema, i u skorije vreme se koristi za tretman različitih tipova kancera, posebno za tretman kancera bubrega, melanoma, multiplog mijeloma, i nekih tipova leukemije. Takođe, interferon se koristi za tretman virusnih infekcija, kao što je hepatitis. Na primer, interferon-alfa2a pospešuje ADCC i može da se kombinuje sa jednim ili više konstrukata, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku u cilju povećanja efikasnosti ADCC aktivnosti koja je udružena sa primenom konstrukta. U drugom primeru, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, primenjuje se ili se zajedno primenjuje kod životinje ili pacijenta sa IFN-y za koji je pokazano da povećava broj anti-CD20 antigena na B ćelijama i na plazma ćelijama iz kostne srži (BMPC). Ovaj pristup je posebno koristan u tretmanu pacijenata sa multiplim mielomom , koji poseduju smanjenu ekspresiju CD20 na njihovim B ćelijama i plazma ćelijama iz kostne srži. Shodno navedenom, prilikom tretmana pacijenata sa multiplim mijelomom upotrebom konstrukata, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku, posebno uključujući konstrukte koji vezuju CD-20, može biti od koristi zajednička primena sa IFN-y.

TNF predstavlja klasu prirodnih hemikalija sa antikancerskim svojstvima. Jedan od primera za TNF jeste TNF-a. TNF-a dokazano poseduje sinergističke efekte sa IFN-y i IL-12. U drugom primeru, TNF može da se primeni ili zajedno primeni sa jednim ili sa više konstrukata koji su specifični za tumor, uključujući jedan ili više antigen-vezujući konstrukata prema predmetnom pronalasku i uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku koji su konjugovani sa hemoterapeutskim sredstvima, zajedno sa IFN-gama, IL-12 ili njihovim različitim kombinacijama. Takođe, poznato je da je TNF molekul koji reguliše inflamaciju. AntiTNF-alfa antitela ili antagonisti TNF-alfa mogu da se kombinuju sa'anti-T ćelijskim konstruktima, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku,

u tretmanu pacijenata sa reumatoidnim artritisom, psorijazom, ulcerativnim kolitisom, sistemskim eritematoznim lupusom, Hronovom bolešću, ankilozirajućim spondilitisom i različitim inflamatornim procesima.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku mogu da se primene sami ili zajedno da se primene sa drugim antitelom ili antigen-vezujućim konstruktom. U jednom rešenju, konstrukt, npr., antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku koji je sposoban za vezivanje CD20, kombinuje se sa konstruktom koji je sposoban za vezivanje CD22, CD19 ili sa njihovim kombinacijama. Ova kombinacija je efektna kao tretman za indolentne i agresivne oblike B-ćelijskih limfoma, kao i za akutne i hronične oblike limfatičnih leukemija( videtiU. S. Patent 6,306,393, podnet od strane Goldberg). U drugom primeru, konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku, se zajedno primenjuju sa drugim konstruktima kao što su antigen-vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku koji pomažu u posredovanju apoptoze. Na primer, kombinacija jednog ili više konstrukata uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku koji su sposobni za vezivanje CD28, CD3, CD20 ili njihovu kombinaciju. Kombinacija anti-CD28 i anti-CD3 obezbeđuje postupak za poduženu proliferaciju T-ćelija( videtiU. S. Patent br. 6,352,694 podnet od strane Juneet al).Pomenuta produžena T-ćelijska proliferacija povećava efikasnost citotoksičnosti zavisne od imunološkog sistema, posebno one koja je udružena sa anti-CD20.

U drugom rešenju, konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku, mogu da se primene sa jednim ili sa više molekulima koji regulišu T-ćelije. Jedan primer jeste kombinacija sa interleukinom-12 (IL-12). IL-12 je citokin koji stimuliše ćelijski imunitet, poseduje angiostatičnu aktivnost i značajna anti-tumorska dejstva u mnogim modelima tumora. Za IL-12 je pokazano da stimuliše proizvodnju interferona-gama (IFN-y). Shodno tome, očekuje se da tretman pacijenata sa multiplim mielomom primenom jednog ili više konstrukata uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku, posebno konstrukta koji vezuje CD20, bude efikasniji kada se vrši zajednička primena sa IL-12. U drugom primeru, jedan ili više konstrukata uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukta prema predmetnom pronalasku, može da se primeni ili zajedno primeni sa konstruktom vezujućeg domena prema predmetnom pronalasku i drugim proteinom koji je sposoban za vezivanje CTLA-4 u cilju pospešivanja antitumorskog imunološkog odgovora, posredstvom inhibicije regulacije na dole te ćelijske aktivacije.

U drugom rešenju, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku može da se kombinuje sa genskim terapijama. U jednom primeru, konstrukt koji je konjugovan sa hemoterapeutskim sredstvom prema predmetnom pronalasku primenjuje se ili se zajedno primenjuje sa Bcl-2 besmislenim oligonukleotidom. Bcl-2 je udružen sa rezistencijom tumora na antikancerske terapije i smatra se da blokira hemoterapeutskim sredstvom indukovanu ćelijsku smrt. U drugom primeru, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku primenjuje se ili se zajedno primenjuje sa adenovirusom radi dopremanja "gena za samoubistvo". Adenovirus vrši inserciju gena direktno u tumorske ćelije, što čini ove ćelije osetljive na inače neefikasan lek. Tretman lekom zatim uništava tumorske ćelije, dok zdrave ćelije ostavlja netaknutim. Međutim, jednom kada je terapija kompletna, preostale kancerske ćelije koje su izbegle dejstvo terapije mogu da se ponovo uspostave i metastaziraju. Kombinacijom genske terapije sa jednim ili više konstrukata uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata omogućava da se preostale kancerske ćelije ubiju i na taj način da se minimizira ponovna pojava kancera.

Slična kombinacija može da se koristi sa paliativnim (neradikalnim) operacijama namenjenim hirurškom uklanjanju tumora. U ovom primeru, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku može da se primeni pre i nakon hirurške ekstracije tumora u cilju povećanja imunološkog odgovora i smanjivanja verovatnoće ponovne pojave tumora tako što će ubiti sve kancerske ćelije koje nisu uklonjene tokom hirurške intervencije.

U drugom rešenju koristi se kombinacija vakcine protiv kancera ili antigena i molekula

koji reguliše te ćelije. Na primer, vezujući deo, npr., antigen-vezujući deo konstrukta može biti specifičan za kancersku ćeliju ili određeni antigen ili za proteinski fragment iz kancerske ćelije ili antigena. Ovo može da pomogne u posredovanju imunološkog odgovora usmerenog protiv određenog tumora ili antigena. Takvi konstrukti mogu da se kombinuju sa T ćelijskim regulatorima kako bi se povećala efikasnost imunološkog odgovora.

U drugom primeru, jedan ili više konstrukata, uključujući jedan ili više antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku primenjuje se ili se zajedno primenjuje sa retinoidima. Retinoidi obuhvataju vitamin A i njegove derivate, koji poseduju sposobnost da zaustave deobu ćelija i da izazovu njihovu diferencijaciju. Vitamin A se kombinuje sa antikancerskim konstruktima, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku u borbi protiv različitih oblika kancera.

Pojam "vezujući konstrukt" i "antigen-vezujući konstrukt", kao što se ovde koriste, odnose se na polipeptide dobijene genetskim inženjeringom, rekombinantne polipeptide, sintetske, polu-sintetske ili druge fuzione proteine koji su sposobni da se vezuju za metu, npr., za antigen. Antigen-vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u različitim primenama, uključujući one u okviru mnoštva drugih primena u kojima se primenjuju antitela ili konstrukti koji su povezani sa imunoglobulinom. Konstrukti uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku mogu da se koristein vivoiin vitroeksperimentima u terapeutske, dijagnostičke, istraživačke i druge svrhe. Takve upotrebe obuhvataju, na primer, sledeće.

Konstrukti uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za imunohistohemijske postupke. Na primer, oni mogu da se koriste za imunolokalizaciju određenog antigena ili grupe antigena u tkivu. Tkivo može biti fiksirano i inkubirano sa anti gen-vezujućim konstruktima od interesa. Ovi konstrukti potom mogu biti lokalizovani korišćenjem sekundarnih antitela ili korišćenjem vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku koji su povezani sa određenom oznakom, na primer, sa česticom zlata ili sa enzimom koji je odgovoran za određenu hemijsku reakciju, kao što je to slučaj sa peroksidazom rena ili sa beta-galaktozidazom. Sekundarno antitelo ili vezujući konstrukt se često konstruiše tako da je reaktivno na, npr., deo primarno vezujućeg konstrukta. Stoga, na primer, ukoliko primarni vezujući konstrukt poseduje deo humanog molekulskog repa, sekundarno antitelo ili vezujući konstrukt može biti, na primer, zečije anti-mišije antitelo ili antigen-vezujući konstrukt koji je povezan sa beta-galaktozidazom. Alternativno, antitelo ili vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku može da se prečisti a potom konjuguje sa drugim molekulom kako bi se dobilo fluorescentno antitelo ili vezujući konstrukt.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za detekciju lokcije antigena na površini ćelija ili za detekciju lokacije unutar ćelijskih materijala korišćenjem, na primer, imunoelektronske mikroskopije. Materijali sa velikom elektronskom gustinom, kao što su feritin ili koloidi zlata, mogu biti konjugovani sa antigen-vezujućim konstruktima. Za detekciju lokalizacije kompleksa antigena-vezujućeg konstrukta može da se upotrebi u tim slučajevima skenirajuća elektronska mikroskopija.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se upotrebe za kvantifikaciju prisustva antigena korišćenjem jednog od brojnih formata imunoloških testova, na primer, korišćenjem formata radioimuno testa (RIA) ili formata sa enzimom povezanog imunosorbentnog testa (ELISA). Postoje mnoge varijante ovog pristupa,

ali su svi oni zasnovani na istoj ideji. Na primer, ukoliko antigen može biti vezan za čvrstu potporu ili površinu, ili se nalazi u rastvoru, on može biti detektovan reakcijom sa specifičnim antigen-vezujućim konstruktom prema predmetnom pronalasku. Prisustvo određene količine konstrukta zatim može biti detektovano ili kvantifikovano reakcijom sa, npr., sekundarnim antitelom ili sekundarnim antigen-vezujućim konstruktom prema predmetnom pronalasku, putem inkorporacije oznake direktno u primarno antitelo. Alternativno, na primer, antigen-vezujući peptid prema predmetnom pronalasku može biti vezan za čvrstu površinu, a potom se dodaje antigen. Sekundarno antitelo ili antigen-vezujući peptid prema predmetnom pronalasku koji prepoznaje određeni epitop na antigenu zatim mogu biti dodati i detektori. Ova tehnika se

uobičajno naziva kao "sendvič test", i često se koristi za izbegavanje problema izraženih pozadinskih ili nespecifičnih reakcija, između ostalih razloga za njeno korišćenje.

Usled toga što vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku mogu imati visoki afinitet (afinitete) i/ili selektivnost (elektivnosti) za određeni epitop ili epitope, oni takođe mogu da se koriste kao afinitetni reagensi, na primer, prilikom prečišćavanja proteina ili antigena. U jednom primeru takvog postupka, antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku se imobiliše na odgovarajućoj podlozi, na primer, na Sephadeks smoli ili na filter papiru. Imobilisani konstrukt se izlaže uzorku koji sadrži ili za koji se sumnja da sadrži željeni protein (proteine) ili antigen (antigene). Podloga se ispira odgovarajućim buferom koji uklanja neželjene materijale. Podloga se ispir sa drugim buferom koji oslobađa vezane proteine ili antigene.

S obzirom da određeni konstrukti za vezivanje prema predmetnom pronalasku mogu da

se vežu za proteine ili druge antigene sa visokim afinitetom i selektivnošću, oni takođe mogu da se koriste kao kriterijum za važnost odgovarajućeg enzima ili drugog makromolekula u određenoj reakciji Ukoliko antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku interferira sa reakcijom u rstvoru, ovo ukazuje da se konstrukt možda vezuje specifično za protein ili druge antigene materijale koji su uključeni u datu reakciju.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste kao blokatori receptora ili njihovi inhibitori ili antagoisti.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste u identifikaciji i ispitivanju funkcije proteina. Ukoliko antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku reaguje sa specifičnim proteinom, npr., taj protein može naknadno da bude iztaložen iz rastvora. Taloženje se tipično izvodi korišćenjem sekundarnog antitela ili antigen-vezujućeg konstrukta prema predmetnom pronalasku koje se povezuje sa primarnim kompleksima. Alternativno, kompleks može biti uklonjen reakcijom rastvora ili sa proteinom A ili sa, na primer, u zavisnosti od konstrukta, sa anti-Fc antitelom, koje je prikačeno za perlice tako da lako može biti uklonjeno iz rastvora.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste zajedno sa eksperimentima pomaka u gelu u cilju identifikacije specifičnih proteina koji se vezuju sa nukleinske kiseline, kao što su proteini koji se vezuju za DNK. Na primer, proteini koji se vezuju za DNK mogu da se ispitaju na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju visokim afinitetom za određene oligonukleotide. Pokretljivost nekog oligonukleotida koji je udružen sa proteinom je bitno različita od pokretljivosti slobodnog oligonukleotida i dovodi do pojave obrasca migracije u gelu koji predstavlja signal koji se uobičajno označava kao pomak u gelu. Dodavanje konstrukta u testu vezivanja može imati dva efekta. Ukoliko se konstrukt vezuje sa regionom proteina koji nije uključen u vezivanje sa DNK, nastaje kompleks koji poseduje još manju pokretljivost i detektuje se veći pomak u pokretljivosti (takozvani super pomak). Alternativno, ukoliko se konstrukt vezuje za region proteina koji je uključen u prepoznavanje DNK, onda to može da spreči vezivanje i da eliminiše pomak. U svakom slučaju podaci dobijeni ovim eksperimentima mogu da služe kao kriterijum za identifikaciju proteina koji se vezuje za DNK.

Takođe je moguće upotrebiti konstrukte, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku za detekciju proteina upotrebom western blot tehnike nakon frakcionisanja pomoću SDS-PAGE. Jednom frakcionisani proteini se prebacuju na membranu,

npr., na list nitroceluloze, potom se eksponiraju određenom antigen-vezujućem konstruktu prema predmetnom pronalasku koji specifično prepoznaje ili u željenom stepenu proteine koji su imobilisani na blotu. Ovo omogućava da određeni proteini budu identifikovani. Navedeni pristup je posebno koristan ukoliko se pokretljivost proteina menja tokom eksperimenta. Na primer, inkorporacija fosfata ili ugljenohidrata ili cepanje proteina dovodi do promene u pokretljivosti koja može biti praćena veoma jednostavno vvestern analizom. Zajedno sa odgovarajućim kontrolama, ovaj pristup može da se koristi za merenje količine proteina kao odgovor na eksperimentalne manipulacije.

Kombinacija SDS gelova i imunoprecipitacije takođe može biti ekstremno efikasna. Ukoliko određeni protein može biti imunoprecipitiran u rastvoru, supernatant i precipitirane frkcije mogu biti razdvojeni na SDS gelu i ispitani korišćenjem antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku.

Ponekad je antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku usmeren protiv jednog proteina ali takođe precipitira drugi protein koji interaguje sa prvim proteinom.<*>Drugi protein, kao i prvi može potom biti vizualizovan bojenjem gela ili autoradiografijom. Ovaj odnos je često prva indikacija da protein funkcioniše kao deo kompleksa i on takođe može biti korišćen za pokazivanje fizičke interakcije dva proteina za koje postoji hipoteza da interaguju na osnovu dokaza (npr., u slučaju ispitivanja dva hibrida ili supresorske mutacije). Navedeni pristup takođe može biti kombinovan sa vvestern blot analizom na nekoliko ekstremnih načina.

Tako, na primer, antigen-vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u kombinaciji imunoprecipitacije i vvestern analize prilikom ispitivanja, na primer, prevođenja signala i obrade proteina. Na primer, imunoprecipitirani protein može biti naknadno ispitan vvestern analizom korišćenjem različitog antitela ili antigen-vezujućeg konstrukta prema predmetnom pronalasku koje se vezuje za protein. Najkorisniji su oni pristupi koji su usmereni protiv određenih strukturnih determinanti koje mogu biti prisutne u proteinu. Tako, antitelo ili antigen-vezujući konstrukt prema predmetnom pronalasku koje je usmereno protiv regiona proteina koji podleže proteolitičkoj obradi može da se koristi za praćenje proteolitičke obrade. Dodatno, konstrukt prema predmetnom pronalasku ili smeša antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku koji prepoznaju fosforilisane peptide( npr.,anti-PY (fosforilisani tirozin)) mogu da se koriste za praćenje stepena fosforilacije proteina (korišćenjem vvestern analize) nakon što je on precipitiran ili obrnut. Takođe, mogu biti praćene i reakcije glikozilacije pomoću antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku koji su usmereni protiv ugljenohidratnog epitopa (ili putem lecitina, tj., proteina koji prepoznaju ugljenehidrate). Slično tome, neki antigen-vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku mogu da budu sačinjeni tako da specifično prepoznaju fosforilisani epitop, na primer, koji prepoznaje tirozin ili serinski ostatak nakon fosforilacije, ali koji se ne vezuje (ili se direktno ne vezuje) za epitop u odsustvu fosfata. Ovaj pristup može da se koristi za određivanje stanja fosforilacije određenog proteina. Na primer, fosforilacija CREB (proteina koji vezuje element koji je osetljiv na cAMP) može da

se prati pomoću antitela koje specifično prepoznaje epitop na način koji je zavistan od fosforilacije serina 133.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste za ispitivanje ekspresionih biblioteka u cilju izolacije kandidatskih polinukleotida koji eksprimiraju ili predstavljaju određeni epitop ili koji poseduju određeni afinitet ili karakteristike ekspresije.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku koji

se vezuju za površinu ćelije takođe mogu da se koriste kao markeri za kvantifikaciju udela ćelija koje eksprimiraju navedeni marker korišćenjem protočne citometrije. Ukoliko se koriste kombinacije različitih antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku i fluorescentne boje, udeo ćelija koje eksprimiraju određene antigene može biti određen.

Konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku koji funkcionišu kao anti-idiotipska antitela, tj., kao antitela protiv vezujućeg domena drugog antitela, mogu da se koriste na brojne načine u postupcima u kojima je poželjno ili korisno da se prikrije struktura antigena. U takve upotrebe spadaju, na primer, upotreba kancerskih vakcina (uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku koji inkorporiraju molekulski adjuvant), upotreba kao proba za receptore, kao agonista receptora, kao antagonista receptora, kao blokatora ili inhibitora receptora i tako dalje.

U drugom rešenju, konstrukti, uključujući antigen-vezujuće konstrukte prema predmetnom pronalasku mogu biti bispecifični i tako sposobni da vezuju dva različita epitopa, koji mogu biti prisutni na istim ili na različitim ćelijskim tipovima.

In vivoupotrebe konstrukata prema predmetnom pronalasku uključujući antigen-vezujuće konstrukte, obuhvataju terapiju, samu ili u kombinaciji sa jednom ili više drugih terapijskih tehnika, za različita oboljenja uključujući kancere kao i B-ćelijske poremećaje uključujući autoimune bolesti. U nekim slučajevima konstrukti prema predmetnom pronalasku se primenjuju kod pacijenta. U drugim slučajevima, konstrukt može da se poveže sa drugim molekulom tehnikama koje su poznate u struci, npr., sa fluoroscentnim molekulom u cilu pomaganja vizualizacije mete ili mogu da se povežu sa terapeutskim lekom i/ili toksinom u cilju pomaganja ubijanja mete.

Na primer, obeležavajući molekul ili atom može biti konjugovan ili na drugi način povezan sa antigen-vezujućim konstruktom prema predmetnom pronalasku u cilju vizualizacije ili olakšavanja stvaranja dijagnostičkog sredstva. Ovde spadaju, bez ograničenja, enzimske oznake, radioizotopi ili radioaktivna jedinjenja ili elementi, fluorescentna jedinjenja ili metali, hemiluminescentna jedinjenja i bioluminescentna jedinjenja. Tako, vezujući konstrukti ili antigen-vezujući konstrukti prema predmetnom pronalasku mogu biti konjugovani sa lekom koji omogućava specifično navođenje leka i povećavanje efikasnosti onda kada lek dospe do mete.

Na ovaj način se pospešuje terapija lekom, dok se istovremeno smanjuju sistemska toksičnost i neželjene dejstva. Ovo omogućava upotrebu leka koji bi na drugi način bio neprihvatljiv kada se primeni sistemski. Doziranje zavisi od jačine leka i efikasnosti konstrukta za prenos. Drugi primeriin vivoupotreba obuhvataju korišćenje vezujućih konstrukata ili antigen-vezujućih konstrukata prema predmetnom pronalasku u kojima se toksin hemijski povezuje ili konjuguje sa polipeptidom prema predmetnom pronalasku kako bi nastao, na primer, molekul koji može biti označen kao "imunokonjugat" ili "imunotoksin". Tipično, na primer, takav toksin obuhvata jedan ili više radioizotopa (na primer, jod-131, itrium-90, renium-186, bakar-67 i/ili bizmut-212), prirodne toksine, hemoterapijska sredstva, modifikatore biološkog odgovora ili bilo koju drugu supstancu koja je sposobna da pomogne u oštećivanju ili ubijanju ciljne ćelije, u inhibiciji replikacije ciljne ćelije ili je efikasna u disrupciji željene ćelijske funkcije u ciljnoj ćeliji.

Deo subjedinica toksina imunotoksina može biti izvedena iz različitih izvora. Toksini se uobičajno izvode iz biljaka ili bakterija, ali takođe mogu da se koriste toksini humanog porekla ili sintetski toksini. Primeri toksina koji su izvedeni iz bakterija ili biljaka obuhvataju, bez ograničenja, abrin, a-sarcin, difterija toksin, ricin, saporin ipseudomonasekzotoksin. Primeri sisarskih enzima obuhvataju, bez ograničenja, ribonukleaze (RNK-aze) i deoksiribonukleaze. Brojni imunotoksini koji mogu da se koriste sa jednim ili sa više konstrukata prema predmetnom pronalasku su opisani u struci. Videti, na primer, U. S. Patent br. 4,753,894 podnet od Frankelet al;U. S. Patent br. 6,099,842 podnet od Pastanet al;Nevelle,et al,1982Immunol Rev.t32:75- ■

91; Pastan et al., 1992Ann Rev Biochem61:331-354; Chaudaryet o/.,1989 Nature339:394; i Batraet al.,1991Mol. Cell. Biol.11:2200. Ovde opisani modifikovani toksini i oni koji su opisani u različitim publikacijama takođe su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska.

Generalno, imunotoksini i druga terapijska sredstva prema predmetnom pronalasku se primenjuju u koncentraciji koja je terapijski efikasna u cilju tretiranja ili sprečavanja nastanka određenog oboljenja, poremećaja ili stanja, na primer, u tretmanu tumora i maligniteta, tretmanu autoimunih bolesti, alergija i inflamacije, kao i sličnih. Ova efektivna doza i način primene zavisi od životinje ili pacijenta koje se tretira, od oboljenja ili stanja koje se tretira, od ,jačine imunokonjugata ili imunotoksina i od efikasnosti konjugata. Kako bi se postigao ovaj cilj, imunotoksini mogu biti formulisani korišćenjem brojnih prihvatljivih formulacija i ekscipijenata koji su poznati u struci. Tipično, na primer, imunotoksini se primenjuju injekcijom, intravenskom ili intraperitonealnom. Postupci kojima se postiže ova administracija su poznati stručnjacima. U drugom rešenju, predmetni pronalazak obuhvata topisku ili oralnu primenu preparata, npr., u vidu aerosola ili krema ili flastera koji su sposobni za prenošenje aktivne supstance preko sluzokože.

Različite druge komponente formulacije mogu biti dodate imunokonjugatima ili imunotoksinima prema predmetnom pronalasku pre primene kod pacijenta koji se tretira. Najčešće se primenjuje tečna formulacija, ali druge formulacije su obuhvaćene takođe obimom zaštite predmetnog pronalaska. Dodatni sastojci formulacije mogu, na primer, da obuhvataju ulja, polimere, vitamine, ugljenehidrate, amino kiseline, soli, bufere, albumin, surfaktante ili sredstva za bubrenje. U ugljenehidrate spadaju šećer ili šećerni alkoholi kao što su mono, di ili polisaharidi ili glikani koji su rastvorljivi u vodi. Saharidi ili glukani obuhvataju, na primer, fruktozu, dekstrozu, laktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, sukrozu, dekstran, pululan, dekstrin, alfa i beta ciklodekstrin, rastvorljivi škrob, hidroksetil škrob i karboksimetilcelulozu ili njihove smeše. Pojam "šećerni alkohol" može da se definiše kao C4do Cg ugljovodonik koji poseduje hidroksilnu grupu i ovde spadaju, na primer, galaktitol, inozitol, manitol, ksilitol, sorbitol, glicerol i arabitol. Ovi prethodno pomenuti šećeri ili šećerni alkoholi mogu da se koriste pojedinačno ili u kombinaciji. Ne postoji konkretno ograničenje upotrebljene količine, sve dok su šećer ili šećerni alkohol rastvorni u vodenom preparatu. U jednom rešenju, koncentracija šećera ili šećernog alkohola je između 0,5 % w/v i 15 % w/v, obično između 1,0 % w/v i 7,0 % w/v, još uobičajenije između 2,0 % w/v i 6,0 % w/v.

Primeri amino kiselina obuhvataju levorotatorne (L) oblike kamitina, arginina i betaina; međutim, mogu da se dodaju i druge aminokiseline. Polimeri koji se obično koriste obuhvataju polivinilpirolidon (PVP) sa prosečnom molekulskom masom između 2000 i 3000, na primer, ili p . i:;; oi (PEG) sa prosečnom molekulskom masom između 3000 i 5000, na primer. U |- . v. e da se koristi pufer kako bi se promene pH u rastvoru svele na najmanju moguću

izacije, ili nakon rekonstitucije. Može da se koristi bilo koji fiziološki pufer, ali se : lc citratni, fosfatni, sukcinatni i glutamatni puferi ili njihove smeše. Koncentracija

. na primer, 0,01 do 0,3 molarna. Mogu da se koriste i niže i više koncentracije. , toksini predmetnog pronalaska mogu da budu hemijski modifikovani kovalentnom v. za polimer kako bi se produžio njihov poluživot u cirkulaciji, na primer. Primeri

rner -tupaka za njihovo vezivanje za peptide opisani su u U.S. patentnima br. 4,766,106

. : . , 4,179,337za Daviš et al;4,495,285za Shimizu e/ al; i4,609,546 za Hiratani.

ai koji slede dati su samo kao ilustracija a ne kao ograničenje.

Primeri

im er 1: Kloniranje varijabilnih regiona 2H7 i dobijanje i sekvenciranje 2H7scFv- Ig

-ai primer prikazuje kloniranje cDNK molekula koji kodiraju varijabilne regione teških lanac: . :.ih lanaca monoklonskog antitela 2H7. Ovaj primer opisuje i dobijanje, sekvenciranje i eksp " u 2H7scFv-Ig.

i ;o sakupljanja, ćelije koje eksprimiraju monoklonsko antitelo 2H7 koje se specifično vez . ) za CD20 održavane su u log fazi rasta nekoliko dana u podlozi RPMI 1640 (Invitiu;-en/Life Technologies, Gaithersburg, MD) kojoj su dodati glutamin, piruvat, DMEM neeser ilne aminokiseline i penicilin - streptomicin. Ćelije su staložene centrifugiranjem podlo u kojoj je kultura rasla, te je upotrebljeno 2 x IO7 ćelija da bi se dobila RNK. RNK je izolovatia iz ćelija hibridoma koje proizvode 2H7 uz pomoć Pharmingen (San Diego, CA) kompleta za izolaciju ukupnih RNK (kataloški br. 45520K) prema uputstvima proizvođača dobijenim uz komplet. Jedan mikrogram (1 pg) ukupne RNK korišćenje kao model za dobijanje cDNK reverznom transkripcijom. RNK i 300 ng prajmera sa nasumičnom sekvencom je pomešano i denaturisano na 72 °C 10 minuta pre dodavanja enzima. Smeši RNK i prajmera dodata je Superscript II reverzna transkripraza (Life Technologies) u ukupnoj zapremini od 25 u.1

u prisustvu 5X pufera drugog lanca i 0,1 M DTT koji je dobijen uz enzim. Reakcija reverzne transkripcije trajala je na 42 °C tokom jednog časa.

2H7 cDNK dobijena u reakciji reverzne transkripcije sa prajmerima sa nasumičnom sekvencom i prajmeri specifični za V region upotrebljeni su za amplifikaciju varijabilnih regiona lakog i teškog lanca 2H7 antitela pomoću PCR. Kao primer za dobijanje prajmera specifičnih za V region korišćena je objavljena sekvenca (Genbank red. br. M17954 za Vli M17953 za Vh).

Dva varijabilna lanca sintetisana su tako da su im sekvence na krajevima kompatibilne, kako bi scFv mogao da bude sastavljen vezivanjem dva V regiona nakon amplifikacije i hidrolize restrikcionim enzimima.

Povezujući peptid (Gly4Ser)3koji je trebalo ubaciti između dva V regiona povezan je dodavanjem dodatnih nukleotida na prajmer komplementarnog smisla (antisens) za VL2H7. Na mestu spajanja dva V regiona ubačeno je Sac I restrikciono mesto. Prajmer istog smisla (sens)

koji je korišćen za amplifikaciju 2H7 Vla koji sadrži Hindlll restrikciono mesto i vodeći (lider) peptid lakog lanca bio je: 5'-gtcaaz cttgcc gcc atg gat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). Prajmer komplementarnog smisla bio je: 5'-gtc gtcgag ctccea cet cet cea gat cea cea ccg cee gag cea ccg cea cet ttc age tec age ttg gtc cc-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). Okvir čitanja V regiona označen je kao kodon ispisan debelim, podvučenim slovima. Hindlll i

SacI mesta označena su sekvencama ispisanim podvučenim i iskošenim slovima.

Vhdomen je amplifikovan bez vodećeg peptida, ali je obuhvatao 5' SacI restrikciono mesto za fuziju za VLi Bell restrikciono mesto na 3' kraju za fuziju sa različitim repovima, uključujući Fc domen humanog IgGl i skraćene oblike CD40 liganda, CD 154. Prajmer istog smisla bio je: 5'-gct get<g>a<g>ctctca ggc tta tet aca gca agt ctg g-3' (sekvenca čiji je ID broj: ).

SacI restrikciono mesto je označeno iskošenim i podvučenim slovima, dok je okvir čitanja kodona prve aminokiseline Vhdomena označen debelim, podvučenim slovima. Prajmer komplementarnog značenja bio je: 5'-gtt gtctza tca gagacg gtg ace gtg gtc cc-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). Bell mesto označeno je iskošenim, podvučenim slovima a poslednji serin u sekvenci Vhdomena označen je debelim, podvučenim slovima.

scFv-Ig sastavljen je ubacivanjem 2H7 scFv Hindlll - Bell fragmenta u pUC19 koji sadrži humani region šarke, CH2 i CH3 regione humanog IgGl, koji je hidrolizovan pomoću restrikcionih enzima, Hindlll i Bell. Nakon vezivanja, proizvodi vezivanja transformisani su u DH5ot bakterije. Pozitivni klonovi su ispitivani na prisustvo pravilno ubačenih fragmenata korišćenjem SacI mesta na mestu spoja VL- Vhu 2H7 kao dijagnostičkog mesta. 2H7scFv-Ig cDNK podvrgnuta je cikličnom sekvenciranju na PE 9700 termocikleru korišćenjem programa sa 25 ciklusa denaturacijom na 96 °C 10 sekundi, ciklizacijom na 50 °C tokom 30 sekundi a zatim produžavanjem na 72 °C tokom 4 minuta. Prajmeri za sekvenciranje bili su pUC prajmeri za reakciju ka napred ("forward primer") i za reakciju u suprotnom smeru ("reverse primer") kao i

interni prajmer koji je ciklizovao sa CH2 domenom u delu konstantnog regiona humanog IgG. Reakcije sekvenciranja vršene su pomoću Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix smeše za sekvenciranje (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA), prema uputstvima proizvođača. Nakon toga, uzorci su prečišćeni u Centrisep kolonama (kataloški br. CS-901, Princeton Separations, Adelphia, N.J.), eluenti su osušeni u vakumskoj sušilici Savant, denaturisani u reagensu za supresiju Template Supression Reagent (PE-ABI) i analizirani pomoću genetskog analizatora ABI 310 (PE - Applied Biosystems). Sekvnca je ispravljena, translirana i analizirana pomoću Vector Niti verzije 6,0 (Informax, North Bethesda, MD). Slika 1 prikazuje cDNK i predviđene aminokiselinske sekvence 2H7scFv-Ig konstrukta.

Primer 2: Eskpresija 2H7scFv- Ig u stabilnim ćelijskim linijama CHO

Ovaj primer opisuje ekspresiju 2H7scFv-Ig u eukariotskoj ćelijskoj liniji i karakterizaciju eksprimiranog 2H7scFv-Ig pomoću SDS-PAGE analize i funkcionalnih testova, uključujući ADCC i fiksaciju komplementa.

2H7scFv-Ig Hindlll - Xbal (~1,6 kb) fragment sa tačnom sekvencom ubačen je u sisarski ekspresioni vektor pD18, a DNK iz pozitivnih klonova je amplifikovana pomoću QIAGEN kompleta za dobijanje plazmida (QUIAGEN, Valencia, Ca). Rekombinantna plazmidna DNK (100 pg) linearizovana je u neesencijalnom regionu hidrolizom pomoću AscI, prečišćena ekstrakcijom fenolom i ponovo suspendovana u podlozi sa kulturom tkiva, Excell 302 (kataloški br. 14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa, KS). Ćelije za transfekciju, CHO DG44 ćelije, održavane su logaritamskog fazi rasta, te je sakupljeno po 107 ćelija za svaku reakciju transfekcije. Linearizovana DNK dodata je CHO ćelijama u ukupnoj zapremini za elektroporaciju od 0,8 ml.

Stabilna proizvodnja 2H7 scFv-Ig fuzionog proteina (sekvenca čiji je ID broj: 10) postignuta je elektroporacijom pazmida koji je moguće selektovati i amplifikovati, pD18, koji sadrži 2H7 scFv-Ig cDNK pod kontrolom CMV promotera, u ćelije jajnika kineskog hrčka ("Chinease Hamster Ovary", CHO) (sve ćelijske linije dobijene od American Type Culture Collection, Manassas, VA, osim ukoliko je drugačije naznačeno). Ekspresiona kaseta 2H7 podklonirana je nishodno od CMV promotera u mesto za višestruko kloniranje vektora kao fragment Hindlll - Xbal od~1,6 kb. Vektor pD18 je modifikovana verzija pcDNK3 koji kodira DHFR marker za selekciju sa prigušenim promoterom, kako bi se povećao selekcioni pritisak za plazmid. DNK plazmida je dobijena korišćenjem kompleta Qiagen maxiprep, dok je prečišćeni plazimd linearizovan na jedinstvenom AscI mestu pre ekstrakcije fenolom i taloženja etanolom.

DNK iz sperme lososa (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO) dodata je kao noseća DNK, te je po 100

pg plazmidne i noseće DNK up'otrebljeno za transfekciju IO<7>CHO DG44 ćelija elektroporacijom. Ćelije su gajene u fazi logaritamskog rasta u Excel 302 podlozi (JRH Biosciences) koja sadrži glutamin (4 mM), piruvat, rekombinantni insulin, penicilin - streptomicin i 2X DMEM neesencijalne aminokiseline (sve od Life Technologies, Gaithersburg, Marvland), koja će se odsad nazivati "potpuna Excel 302 podloga". Podloga za netransficirane ćelije sadržala je takođe i HT (razblažen iz 100x rastvora hipoksantina i timidina)

(Invitrogen/Life Technologies). Podloga za transfekcije pod selekcijom sadržala je različite koncentracije metotreksata (Sigma - Aldrich) kao sredstva za selekciju, od 50 nM do 5 uM. Elektorporacije su vršene pri 275 volti, 950 uF. Transficiranim ćelijama dozvoljeno je da se oporave preko noći u neselektivnoj podlozi pre nego što su zasejane u selektivnoj podlozi u pločama sa po 96 polja sa ravnim dnom (Costar) pri različitim serijskim razblaženjima, od 125 ćelija po polju do 2000 ćelija po polju. Podloga za kulturu ćelija za kloniranje bila je potpuna Excel 302 podloga, koja je sadržala 100 nM metotreksat. Kada su klonovi dostigli dovoljan rast, serijska razblaženja supernatanata kulture iz glavnih polja ispitivana su na vezivanje za transficirane ćelije CD20 - CHO. Klonovi sa najvećom proizvodnjom fuzionog proteina razmnoženi su u T25 a zatim i T75 bocama kako bi se obezbedio dovoljan broj ćelija za zamrzavanje i za skaliranje proizvodnje 2H7scFvIg. Proizvodnja je dalje povećana u kulturama tri klona progresivnom amplifikacijom u podlozi za kulturu koja je sadržala metotreksat. Pri svakom sledećem presejavanju ćelija, Excel 302 potpuna podloga sadržala je sve. veću koncentraciju metotreksata, tako da su samo ćelije koje amplifikuju DHFR plazmid mogle da prežive.

Supernatanti iz CHO ćelija koje eksprimiraju 2H7scFv-Ig su sakupljeni, zatim proceđeni kroz PES ekspres filtere od 0,2pm(Nalgene, Rochester, NY) i propuštene kroz kolonu Protein A - agaroze (IPA 300 unakrsno povezana'agaroza) (Repligen, Needham, MA). Kolona je isprana

u PBS, a zatim je vezani protein eluiran korišćenjem 0,1 M citratnog pufera pH 3,0. Sakupljane su frakcije te je eluirani protein neutralizovan IM Tris-om, pH 8,0, pre dijalize u PBS preko noći. Koncentracija prečišćenog 2H7scFv-Ig (sekvenca čiji je ID broj: ) određena je pomoću apsorpcije na 280 nm. Ekstinkcioni koeficijent od 1,77 određen je pomoću alata za analizu proteina u Vector Niti softverskom paketu verzije 6.0 (Infomax, North Bethesda, MD). Ovaj program koristi podatke o aminokiselinskom sastavu za računanje ekstincionih koeficijenata.

Proizvodnja 2H7scFv-Ig od strane transficiranih, stabilnih CHO ćelija analizirana je pomoću protočne citometrije. Dopušteno je da se prečišćeni 2H7scFv-Ig iz CHO ćelija veže za

CHO ćelije koje eksprimiraju CD20 (CD20 CHO), nakon čega je izvršena analiza pomoću protočne citometrije u kojoj je korišćen reagens za drugi korak anti-humanog IgG konjugovanog za fiuorescin (kataloški br. H10101 i H10501, CalTag, Burlingame, CA). Slika 2 (na vrhu) prikazuje standardnu krivu dobijenu titracijom 2H7scFv-Ig vezivanja za CD20 CHO. Prikazana je srednja vrednost jačine fluorescinskog signala pri svakoj koncenctraciji 2H7scFv-Ig. Po.tom je dopušteno da se supernatanti sakupljeni iz T boca koje sadrže stabilne klonove CHO koji eksprimiraju 2H7scFv-Ig vežu za CD20 CHO te je vezivanje analizirano protočnom citometrijom. Meren je fluorescinski signal koji odaje 2H7scFv-Ig prisutan u supernatantima, te je izračunata koncentracija 2H7scFv-Ig u supernatantima pomoću standardne krive (Slika 2, dno).

Prečišćeni 2H7scFv-Ig (sekvenca čiji je ID broj: ) analiziranje elektroforezom na SDS

- poliakrilamidnim gelovima. Uzorci 2H7scFv-Ig prečišćeni u nezavisnim prolascima kroz kolonu Protein A agaroze, prokuvani su u SDS puferu za uzorke bez redukcije disulfidnih veza i naneseni na SDS 10% Tris-BIS gelove (kataloški br. NP0301, Novex, Carlsbad, CA). Dvadeset mikrograma iz svakog prečišćenog uzorka naneseno je na gelove. Nakon elektroforeze proteini su vizuelizovani bojenjem bojom Coomassie Blue (Pierce Gel Code Blue Stain Reagent, kataloški br. 24590, Pierce, Rockford, IL) a obezbojavani destilovanom vodom. Na isti gel naneseni su i markeri molekulske mase (Kaleidoscope Prestained Standards, kataloški br. 161-0324, Bio-Rad, Hercules, CA). Rezultati su prikazani na slici 3. Brojevi iznad traka pokazuju odvojene prečišćene uzorke. Molekulske mase markera veličine, izražene u kilodaltonima, date su na levoj strani slike. Dalji eksperimenti sa različitim uslovima pripreme uzoraka pokazali su da redukcija disulfidnih veza kuvanjem proteina u SDS puferu za uzorke koji sadrži DTT ili 2-merkaptoetanol dovodi do agregacije 2H7scFv-Ig.

Bilo koji od velikog broja imunoloških parametara može da se prati korišćenjem rutinskih testova koji su dobro poznati struci. Oni mogu da uključuju, na primer' testove citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela (ADCC), sekundarnih odgovora antitelain vitro,analize različitih podpopulacija mononuklearnih (jednojedarnih) ćelija iz periferne krvi ili limfe pomoću analize protočnom imunocitofluorimetrijom korišćenjem dobro razvijenih sistema markera antigena, imunohemije ili drugih odgovarajućih testova. Ovi i drugi testovi mogu da se nađu, na primer, u Roseet al,(urednici)Manual of Clinical Laboratorj Immunology, 5. izdanje,1997 American Societv of Microbiologv, Washington, DC.

Sposobnost 2H7scFv-Ig da usmrti CD20 pozitivne ćelije u prisustvu komplementa ispitivana je korišćenjem B ćelijskih linija Ramos i Bjab. U testu je korišćen zečji komplement (Pel-Freez, Rogers, AK) pri konačnom razblaženju od 1/10. Prečišćeni 2H7scFv-Ig inkubiran je sa B ćelijama i komplementom 45 minuta na 37 °C, nakon čega su brojane žive i mrtve ćelije pomoću ekskluzije tripan plavog. Rezultati na slici 4A pokazuju da u prisustvu zečjeg komplementa, 2H7scFv-Ig lizira B ćelije koje eksprimiraju CD20.

Sposobnost 2H7scFv-Ig da usmrti CD20 pozitivne ćelije u prisustvu mononuklearnih ćelija periferne krvi ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMC) ispitivana je merenjem oslobađanja<51>Cr iz obeleženih Bjab ćelija u četvoročasovnom testu korišćenjem odnosa 100 : 1 PBMC prema Bjab ćelijama. Rezultati prikazani na slici 4B pokazuju da 2H7scFv-Ig može da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti posredovanoj antitelima (ADCC) zbog toga što je oslobađanje<51>Cr bilo veće u prisustvu PBMĆ i 2FI7scFv-Ig nego u prisustvu samo PBMC ili samo 2H7scFv-Ig.

Primer 3: Dejstvo istovremenog vezivanja CD20 i CD40 na rast normalnih B ćelija kao i

na ekspresiju CD95 i pokretanje apo potoze

Ovaj primer pokazuje dejstvo unakrsnog vezivanja CD20 i CD40, eksprimiranih na površini ćelije, na proliferaciju ćelija.

Guste B ćelije u mirovanju izolovane su iz humanih krajnika pomoću Percoll gradijenta u skokovima, te su T ćelije uklonjene građenjem E-rozeta. Proliferacija gustih B ćelija krajnika u mirovanju merena je unosom<3>[H]-timidina tokom poslednjih 12 časova četvorodnevnog eksperimenta. Proliferacija je merena u kvadriplikatima kulture pri čemu su dobijene prikazane srednje vrednosti i standardne devijacije. Mišje anti-humano CD20 monoklonsko antitelo 1F5 (anti-CD20) korišćeno je samo ili unakrsno vezano za anti-mišjekmonoklonsko antitelo 187.1 (anti-CD20XL). Aktivacija CD40 postignuta je korišćenjem rastvornog humanog CD154 fuzionisanog za mišji CD8 (CD154) (Hollenbaughet al, EMBOJ.11: 4212 - 21 (1992)), dok je unakrsno vezivanje CD40 postignuto korišćenjem 53-6 monoklonskog antitela na mišji CD8 (CD154XL). Ova procedura omogućava istovremeno unakrsno povezivanje CD20 i CD40 na površini ćelije. Rezultati su prikazani na slici 5.

Ispitivano je dejstvo unakrsnog vezivanja CD20 i CD40 na Ramos ćelije, ćelijsku liniju B limfoma. Analizirana je ekspresija CD95 (Fas) u Ramos ćelijama, kao i procenat apoptoze osamnaest časova nakon tretmana (bez kozjeg anti-mišjeg IgG (GAM)) i/ili unakrsnog vezivanja (+GAM) korišćenjem mišjih monoklonskih antitela koja specifično vezuju CD20 (1F5) i CD40 (G28-5). Kontrolne ćelije su tretirane nevezujućim izotipom (64.1) specifičnim za DC3 kao kontrolom.

Tretirane Ramos ćelije su sakupljene, inkubirane sa FITC-anti-CD95 i analizirane pomoću protočne citometrije kako bi se utvrdili relativni nivoi ekspresije Fas na površini ćelija nakon unakrsnog vezivanja CD20 ili CD40. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost fluorescencije ćelija nakon tretmana sa naznačenim stimulusima (slika 6A).

Tretirane Ramos ćelije iz istog eksperimenta su sakupljene, te je mereno vezivanje aneksina V kako bi se odredio procenat apoptoze u tretiranim kulturama. Apoptoza je merena pomoću vezivanja aneksina V 18 časova nakon unakrsnog vezivanja CD20 i CD40 pomoću 1F5

i G28-5, koje je pratilo unakrsno vezivanje pomoću GAM. Vezivanje aneksina V mereno je pomoću FITC-Annexin V kompleta (kataloški br. PN-IM2376, Immunotech, Marseille, France). Poznato je da se vezivanje aneksina V odvija rano u progresiji ćelija u apoptozu. Apoptoza, ili programirana ćelijska smrt, je proces koji se odlikuje kaskadom kataboličkih reakcija koje dovode do ćelijske smrti samoubistvom. U ranoj fazi apoptoze, pre nego što ćelije promene morfologiju i hidrolizuju DNK, integritet ćelijske membrane se održava ali ćelije gube asimetriju fosfolipida u svojim membranama, izlažući negativno naelektrisane fosfolipide, kao što je fosfatidilserin, na ćelijskoj površini. Aneksin V, protein koji vezuje fosfolipide i kalcijum, najradije se vezuje, sa velikim afinitetom, za fosfatidilserin. Rezultati koji pokazuju dejstvo unakrsnog vezivanja i CD20 i CD40 na ekspresiju Fas receptora (CD95) prikazani su na slici 6B. Dejstvo unakrsnog vezivanja i CD20 i CD40 na vezivanje aneksina V za ćelije prikazano je na

slici 6B.

Primer 4: Konstrukcija i karakteri zaci i a 2H7 scFv- CD154 fuzionih proteina

Da bi se konstruisao molekul sposoban za vezivanje i CD20 i CD40, cDNK koja kodira 2H7 scFv je fuzionisana sa cDNK koja kodira CD 154, koji je CD40 ligand. 2H7 scFv cDNK kodirana na Hindlll-Bcll fragmentu uklonjena je iz 2H7 scFv Ig konstrukta i ubačena u pD18 vektor zajedno sa cDNK fragmentom BamHI-XbaI koji kodira vanćelijski domen humanog CD154. Vanćelijski domen kodiran je na karboksi kraju CD154, slično kao i kod drugih membranskih proteina tipa II.

Vanćelijski domen humanog CD154 amplifikovan je pomoću PCR korišćenjem cDNK dobijene upotrebom prajmera nasumične sekvence i RNK iz humanih T limfocita aktiviranih pomoću PHA (fitohemaglutinina). Kompleti prajmera su obuhvatali dva različita 5' ili prajmera istog smisla (sens) koji su doveli do stvaranja fuzionih spojeva na dva različita položaja u okviru vanćelijskog domena CD 154. Dva različita fuziona spoja konstruisana su tako da daju kratak ili skraćeni oblik (S4 oblik) koji obuhvata aminokiseline od 108 (Glu) do 261 (Leu) + (Gly) i dugačak ili potpun oblik (oblik L2) koji obuhvata aminokiseline od 48 (Arg) do 261 (Leu) +

(Gly) vanćelijskog domena CD154, pri čemu su oba konstruisani kao BamHI-XbaI fragmenti. Prajmer istog smisla koji spaja dva različita vanćelijska domena za 2H7scFv uključuje i BamHI mesto za kloniranje. Prajmer istog smisla za S4 oblik CD154 cDNK označen je kao sekvenca čiji je ID broj: 11 ili CD154BAM108 i kodira oligonukleotid sa 34 nukleotida sa sledećom sekvencom: 5'-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tga aat gca a-3', dok je prajmer komplementarnog smera označen kao sekvenca čiji je ID broj: 12 ili CD154XBA i kodira oligonukleotid sa 44 nukleotida sa sledećom sekvencom: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'.

Oligonukleotidni prajmeri koji su korišćeni za amplifikaciju dugačkog oblika (L2) vanćelijskog domena CD154 koji kodira aminokiseline 48 (Arg) do 261 (Leu) + (Glu), gde je: prajmer istog smisla označen kao CD154BAM48 (sekvenca čiji je ID broj: 13) kodirao oligonukleotid sa 35 nukleotida sa sledećom sekvencom: 5'-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3. Prajmer komplementarnog smisla označen kao CD154XBA (sekvenca čiji je ID broj: ) kodirao je oligonukleotid sa 44 nukleotida: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'. Drugi uslovi PCR reakcije bili su identični kao oni upotrebljeni pri amplifikaciji 2H7 scFv (videti primer 1). Fragmenti dobijeni pomoću PCR prečišćeni su korišćenjem PCR quick kompleta (QIAGEN, San Diego, CA), eluirani u 30 ul ddFbO, i hidrolizo vani dejstvom restrikcionih endonukleaza BamHI i Xbal (Roche) u reakcionoj zapremini od 40 p.1 na 37 °C tokom 3 časa. Fragmenti su prečišćeni na gelu, prečišćeni korišćenjem QIAEX kompleta prema uputstvima proizvođača (QIAGEN) i spojeni, zajedno sa 2H7 Hindlll-Bcll fragmentom u ekspresioni vektor pD18 hidrolizovan pomoću Hindlll i Xbal. Proizvodi dobijeni spajanjem transformisani su u DH5 - alfa hemijski kompetentne bakterije koje su zasejane na LB ploče koje sadrže 100 pg/ml ampicilina. Transformanti su gajeni preko noći na 37 °C nakon čega su izolovani klonovi upotrebljeni za inokulaciju tečnih kultura od 3 ml

'u Luria Broth tečnoj podlozi koja sadrži 100 pg/ml ampicilina. Klonovi su ispitani nakon pripremanja mini-plazmida (QIAGEN) na prisustvo ubačenih fragmenata i 2H7 scFv i CD 154 vanćelijskog domena.

cDNK konstrukti 2H7 scFv-CD154 podvrgnuti su cikličnom sekvenciranju na PE 9700 thermocycler korišćenjem programa sa 25 ciklusa koji je obuhvatao denaturaciju na 96 °C, 10 sekundi, ciklizaciju na 50 °C tokom 5 sekundi i produžavanje na 60 °C tokom 4 minuta. Za sekvenciranje su upotrebljeni sledeći prajmeri: pD18 prajmer za reakciju ka napred (sekvenca čiji je ID broj: , 5'-gtctatataagcagagctctggc-3') i pD18 prajmer za reverznu reakciju (sekvenca čiji je ID broj: , 5'-cgaggctgatcagcgagctctagca-3'). Uz to, korišćenje i unutrašnji prajmer koji

je homolog sa sekvencom humanog CD154 (sekvenca čiji je ID broj: , 5'-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3'). Reakcije sekvenciranja su obuhvatale prajmere pri 3,2 pmol, približno 200 ng DNK modela, i 8 u.1 sekvencione mešavine. Reakcije sekvenciranja su izvršene korišćenjem Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix mešavine za sekvenciranje (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA), prema uputstvima proizvođača. Potom su uzorci prečišćeni korišćenjem Centristep kolona Princeton Separations, 25 Adelphia, NJ). Eluati su osušeni u Savant vakuumskoj sušionici sa brzim sušenjem, denturisani u 20 ul reagensa za supresiju modela Template Supression Reagent (ABI) na 95 °C tokom 2 minuta, i analizirani na ABI 310 Genetic Analyzer (PE-Applied Biosystems) analizatoru. Sekvenca je ispravljena, translirana i analizirana pomoću Vektor Niti verzije 6.0 (Infomax, North Bethesda, MD). cDNK sekvenca L2 2H7scFv-CD154, kao i predviđena aminokiselinska sekvenca predstavljene su na slici 7A, dok su cDNK sekvenca S4 2H7scFv-CD154, kao i predviđena aminokiselinska sekvenca predstavljene na slici 7B.

Vezivna aktivnost 2H7scFv-CD154 fuzionih proteina (sekvence čiji su ID brojevi: i ) za CD20 i CD40 određene su istovremeno korišćenjem protočne citometrije. U testu se koriste CHO ciljne ćelije koje eksprimiraju CD20. Nakon inkubacije CD20 CHO ćelija sa supernatantima iz ćelija transficiranih sa 2H7 scFv-CD154 ekspresionim plazmidom tokom 45 minuta, CD20 CHO ćelije su isprane dva puta i inkubirane sa CD40-Ig fuzionim proteinom konjugovanim sa biotinom u PBS/2% FBS. Nakon 45 minuta, ćelije su isprane dva puta a zatim inkubirane sa streptavidinom obeleženim fikoeritrinom (PE) pri odnosu 1 : 100 u PBS/2% FBS (Molecular Probes, Eugene OR). Nakon dodatnih 30 minuta inkubacije, ćelije su isprane 2 X i analizirane pomoću protočne citometrije. Rezultati su pokazali daje 2H7 scFv-CD154 molekul bio u stanju da se veže za CD20 na ćelijskoj površini i da veže CD40 konjugovan za biotin iz rastvora (slika 8).

? Kako bi se utvrdio efekat 2H7scFv-CD154 na rast i vijabilnost ćelijske linije B limfoma i limfoblastiodne ćelijske linije, ćelije su inkubirane sa 2H7scFv-CD154 L2 (sekvenca čiji je ID broj: ) toko 12 časova a potom ispitane na vezivanje aneksina V. Vezivanje aneksina V mereno je pomoću FITC-Annexin V kompleta (Immunotech, Marseille, France, kataloški br. PN-IM2376). Ćelijske linije B ćelija inkubirane su u kulturama od po 1 ml sa razblaženjima koncentrovanih, dijalizovanih supernatanata iz ćelija koje eksprimiraju izlučene oblike 2H7scFv-CD154 fuzionih proteina. Rezultati su predstavljeni na slici 9.

Brzina rasta ćelijske linije Ramos B limfoma u prisustvu 2H7scFv-CD154 ispitana je pomoću unosa<3>H-timidina u toku poslednjih 6 časova dvadeset četvoročasovnog gajenja u kulturi. Dejstvo 2H7scFv-CD154 na proliferaciju ćelija prikazano je na slici 10.

Primer 5: Konstrukcija i karakterizacija derivata CitoksB antitela

CitoksB antitela su pripremljena korišćenjem polipeptida 2H7 scFv-IgG. 2H7 scFv (videti primer 1) vezanje za Fc domen humanog IgGl preko promenjenog regiona šarke (videti sliku 11). Ostaci cisteina u regionu šarke supstituisani su ostacima serina pomoću mutageneze upravljene ka određenom mestu i drugih postupaka poznatih struci. Mutirani region šarke fuzionisan je bilo za Fc domen divljeg tipa kako bi se dobio jedan konstrukt, označen kao CytoxB-MHWTGlC, ili je fuzionisan za mutirani Fc domen (CytoxB-MHMG 1C) u čiji CH2 domen su uvedene dodatne mutacije. Aminokiselinski ostaci u CH2 koji učestvuju u efektorskim funkcijama prikazani su na slici 11. Mutacije jednog ili većeg broja ovakvih ostataka mogu da smanje vezivanje za FcR i posredovanje u efektorskim funkcijama. U ovom primeru, ostatak leucina na položaju 234, za koji je u struci poznato da je važan za vezivanje za Fc receptor, mutiran je u 2H7 scFv fuzionom proteinu, CytoxB-[MGlH/MGlC]. U još jednom konstruktu, region šarke humanog IgGl supstituisan je delom regiona šarke humanog IgA, koji je fuzionisan za humani Fc domen divljeg tipa, (CytoxB-IgAHWTHGlC). (Videti sliku 11). Ovaj mutirani region šarke omogućio je ekspresiju smeše monomernih i dimernih molekula koji zadržavaju funkcionalna svojstva CH2 i CH3 domena humanog IgGl. Konstruisane su sintetičke, rekombinantne ekspresione kasete cDNK za ove molekule, a polipeptidi su eksprimirani u CHODG44 ćelijama prema postupcima opisanim u primeru 2.

Prečišćeni molekuli derivata fuzionih proteina CitoksB-scFvIg analizirani su pomoću SDS-PAGE prema postupcima opisanim u primeru 2. Analiza na poliakrilamidnim gelovima izvršena je i u neredukujućim i u redukujućim uslovima. Na svaki gel su nanesena i dva različita kompleta markera molekulske mase, predhodno obojeni markeri BioRad (BioRad, Hercules, CA) i markeri molekulske mase Novex Multimark. Na slici 12 su prikazani profili migracije različitih konstrukta i Rituximab™.

Sposobnost različitih derivata CytoxB-scFvIg molekula da posreduju pri ADCC merena

je korišćenjem Bjab ćelija B limfoma kao ciljnih ćelija i sveže pripremljenih humanih PBMC kao efektorskih ćelija (videti primer 2). Odnos efektorskih i ciljnih ćelija menjan je na sledeći način: 70 : 1, 35 : 1 i 18 : 1, pri čemu je broj Bjab ćelija po polju ostajao stalan ali se menjao broj PMBC. Bjab ćelije su obeležavane tokom 2 časa<51>Cr te su uzimani alikvoti pri gustini ćelije od 5 x IO4 ćelija/polju za svako polje u pločama sa po 96 polja sa ravnim dnom. Prečišćeni fuzioni proteini ili rituksimab dodavani su u koncentraciji od p.g/ml u različita razblaženja PBMC. Mereno je spontano oslobađanje bez prisustva PBMC ili fuzionog proteina, a izmereno je i

najveće oslobađanje pomoću dodavanja detergenta (1% NP-40) u odgovarajuća polja. Reakcije su inkubirane tokom 4 časa te je sakupljeno po 100 ul supernatanta kulture u Lumaplate (Packard Instruments) ploče, i ostavljeno da se osuši preko noći pre nego što su prebrojani oslobođeni cpm. Rezultati su prikazani na slici 13.

Merena je i aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) derivata CitoksB. Reakcije su izvršene, suštinski, na način opisan u primeru 2. Rezultati su prikazani na slici 14, izraženi kao procenat mrtvih ćelija u odnosu na ukupan broj ćelija za svaku koncentraciju fuzionog proteina.

Primer 6:In vivostudije u makaki majmunima

Prvobitnein vivostudije CitoksB derivata sprovedene su sa ne-humanim primatima. Slika 15 prikazuje podatke o odlikama poluživota CitoksB u serumu majmuna. Merenja su izvršena na uzorcima dobijenim iz dva različita makaki majmuna (J99231 i K99334) nakon što su svakom majmunu date doze od 6 mg/kg u danima označenim strelicama. Za svaki uzorak procenjivana je koncentracija prisutnog 2H7scFvIg poređenjem sa standardnom krivom dobijenom vezivanjem prečišćenog fuzionog proteina CitoksB-(MHWTGlC)-Ig za CD20 CHO ćelije (videti primer 2). Podaci su navedeni u tabeli na dnu slike 15.

Ispitivano je dejstvo fuzionog proteina CitoksB-(MHWTGlC)-Ig na koncentraciju CD40+ ćelija u cirkulaciji makaki majmuna. Svakog dana koji je označen na slici 16 vršeno je potpuno određivanje broja krvnih ćelija. Uz to, vršeni su i FACS ("Fluorescence activated cell sorter", sorter ćelija aktiviran fluorescencijom) testovi na limfocitima iz periferne krvi korišćenjem antitela specifičnog za CD40 konjugovanog za fluorescin kako bi se u populaciji ćelija detektovale B ćelije. Procenat pozitivnih ćelija je, potom, upotrebljen kako bi se izračunao broj B ćelija u prvobitnim uzorcima. Na grafiku su podaci izraženi u hiljadama B ćelija po mikrolitru krvi mereno u označenim danima nakon injekcije (slika 16).

Primer 7: Dobijanje i ekspresija anti- CD19 scFv- lg fuzionog proteina

Anti-CD19 scFv-Ig fuzioni protein je konstruisan, transficiran u eukariotske ćelije i eksprimiran prema postupcima predstavljenim u primerima 1, 2 i 5, koji su standardni u struci. Varijabilni regioni teškog lanca i varijabilni regioni lakog lanca klonirani su iz RNK izolovane iz ćelija hibridoma koje proizvode HD37 antitelo, koje se specifično vezuje za CD19. Nivoi ekspresije HD37scFv-IgAHWTGlC i HD37scFv-IgMHWTGlC su izmereni i upoređeni sa standardnom krivom dobijenom korišćenjem prečišćenog HD37 scFvIg. Rezultati su prikazani na slici 17.

Primer 8: Pobijanje i ekspresija anti- L6 scFv- Ig fuzionog proteina

Konstruisan je fuzioni protein scFv-Ig korišćenjem varijabilnih regiona dobijenih iz anti-karcinomskog antitela, L6. Fuzioni protein je konstruisan, transficiran u eukariotske ćelije i eksprimiran prema postupcima predstavljenim u primerima 1, 2 i 5, koji su standardni u struci. Nivoi ekspresije L6 scFv-IgAH WCH2 CH3 i L6 scFv-(SSS-S)H WCH2 CH3 su izmereni i upoređeni sa standardnom krivom dobijenom korišćenjem prečišćenog L6 scFvIg. Rezultati su prikazani na slici 18.

Primer 9: Karakterizacija različitih scFv- Ig fuzionih proteina

Uz scFv-Ig fuzione proteine koji su predhodno opisani, fuzioni proteini G28-1 (anti-CD37) scFv-Ig pripremljeni su, suštinski, na način opisan u primerima 1 i 5. Varijabilni regioni lakih i teških lanaca klonirani su prema postupcima koji su poznati u struci. ADCC aktivnost 2H7-MHWTG1C, 2H7-IgAHWTGlC, G28-1-MHWTG1C, G28-1 IgAHWTGlC, HD37-MHWTG1C i HD37- IgAHWTGlC određena je prema postupcima koji su predhodno opisani

(videti primer 2). Rezultati su predstavljeni na slici 19. ADCC aktivnost L6scFv-IgAHWTGlC i L6scFv-IgMHWTGlC izmerena je korišćenjem 2981 ćelijske linije humanog karcinoma pluća. Rezultati su predstavljeni na slici 20. Poznato je da mišje L6 monoklonsko antitelo ne pokazuje ADCC aktivnost.

Prečišćeni proteini su analizirani pomoću SDS-PAGE pod redukujućim i neredukujućim uslovima. Uzorci su pripremljeni i analiza je izvršena, u suštini, na način opisan u primerima 2 i 5. Rezultati za fuzione proteine L6 i 2H7 scFv-Ig predstavljeni su na slici 21 a rezultati za fuzione proteine G28-1 i HD37 scFv-Ig prikazani su na slici 22.

Primer 10: Konstrukcija i ekspresija anti- CD20 fuzionih proteina scFv- Ig lame

Ovaj primer opisuje kloniranje domena konstantnih regiona IgGl, IgG2 i IgG3 lame i konstrukciju fuzionih proteina imunoglobulina sa svakim od tri konstantna regiona i anti-CD20 scFv.

Konstantni regioni IgGl, IgG2 i IgG3 imunoglobulina lame su klonirani i ubačeni u konstrukte sisarskih vektora koji sadrže jednolančani anti-CD20 Fv, 2H7 scFv. Iz mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC) lame izolovane su ukupne RNK (Triple J Farms, Bellingham, WA) liziranjem limfocita u TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) prema uputstvima proizvođača. Jedan mikrogram (1 pg) ukupnih RNK je upotrebljen kao model za dobijanje cDNK reverznom transkripcijom. RNK i 200 ng prajmera sa nasumičnom sekvencom je pomešano i denaturisano na 72 °C tokom 10 minuta pre dodavanja enzima. Smeši ukupne RNK i prajmera dodata je Superscript II reverzna transkriptaza (Invitrogen Life Technologies) u ukupnoj reakcionoj zapremini od 25 ul u prisustvu 5 X pufera drugog lanca i 0,1 M DTT koji je dobijen uz enzim. Reakcija reverzne transkripcije odvijala se na 42 °C tokom jednog časa. cDNK je amplifikovana pomoću PCR korišćenjem prajmera specifičnih za sekvencu. 5' prajmeri su konstruisani prema objavljenim sekvencama za Vhhi Vhdomene kamelida. 3' prajmer, koji je korišćen za amplifikaciju sva tri izotipa, konstruisan je prema sekvencama sisarskih CH3 domena. Korišćeni su sledeći konkretni prajmeri. Bcl i Xbal mesta su označena iskošenim, podvučenim slovima.

5' prajmer za konstantni region IgGl lame

LLGl-5'bgl: 5'-gt rsat caagaa cea cat gga gga tgc acg tg-3'

(sekvenca čiji je ID broj: )

5' prajmer za konstantni region IgG2 lame

LLG2-5'bgl: 5'-gtts Xt sat caagaa cee aag aca cea aaa cc-3'

(sekvenca čiji je ID broj: )

5' prajmer za konstantni region IgG3 lame

LLG3-5'bgl: 5'-gttg tf sat caageg cac cac age gaa gac ccc-3 (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer za konstantne regione IgGl, IgG2 i IgG3 lame

LLG123-3'X: 5'-gtt gtttct asatta cta ttt ace ega aga ctg ggt gat gga-3'

(sekvenca čiji je ID broj: )

PCR fragmenti očekivanih veličina klonirani su u TOPO® vektore za kloniranje (Invitrogen Life Technologies) a potom sekvencirani. Prajmer za sekvenciranje istog smisla LLseqsense, imao je sekvencu 5'-ctg aga teg agt tca get g-3' (sekvenca čiji je ID broj: ), a prajmer za komplementarni smisao, LLseqAS, imao je sekvencu 5'-cct cet ttg get ttg tct c-3'

(sekvenca čiji je ID broj: ). Sekvenciranje je izvršeno kako je opisano u primeru 1. Na slici 23 prikazano je poređenje aminokiselinskih sekvenci tri izotipa konstantnih regiona lame koji

sadrže region šarke, CH2 i CH3 domena, sa aminokiselinskom sekvencom regiona šarke humanog IgGl, CH2 i CH3 domena.

Nakon proveravanja sekvence, amplifikovani proizvodi dobijeni u PCR hidrolizo vani su dejstvom restrikcionih enzima Bell i Xbal kako bi se dobila kompatibilna restrikciona mesta. Hidrolizovani fragmenti su potom prečišćeni na gelu, te je DNK eluirana korišćenjem QIAquick

Gel Extraction Kit kompleta za ekstrakciju (QIAGEN,Valencia, CA). Konstrukt sisarskog vektora 2H7scFv-Ig pD18 (videti primer 2) hidrolizovan je pomoću Bell i Xbal kako bi se uklonili humani domeni šarke, CH2 i CH3. pD18 vektor je modifikovani derivat pCDNA3 koji sadrži prigušeni gen DHFR, koji služi kao marker za selekciju u ekspresiji u sisarima (Haydenet al, Tissue Antigens48: 242 - 54 (1996)). Prečišćeni konstantni regioni IgGl, IgG2 i IgG3 lame dobijeni u PCR spojeni su pomoću T4 DNK ligaze (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) u dvostruko hidrolizovani 2H7 scFv-pD18 vektor, na sobnoj temperaturi preko noći, prema uputstvima proizvođača. Nakon povezivanja, dobijeni proizvodi transformacijom su uneti u bakterijeE. coliDH5a (BD Biosciences, Palo Alto, CA), koje' su zasejane prema standardnim procedurama molekularne biologije i prema uputstvima proizvođača. Izolovane kolonije su izabrane za ispitivanje i pronalaženje onih transformanata koji sadrže željene ubačene sekvence.

Za ekspresiju kodiranih polipeptida, plazmidna DNK iz pozitivnih klonova prolazno je transficirana u COS-7 ćelije korišćenjem DEAE-dekstrana (Havdenet al, Ther Immunol.1:3-15 (1994)). COS-7 ćelije su zasejane pri gustini od približno 3 x IO6 ćelija po ploči od 150 mm i gajene preko noći sve dok ćelije nisu postigle približno 75% konfluentan rast. Ćelije su potom isprane jedanput sa DMEM bez seruma (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY). Supernatant transfekcije (10 ml) koji je sadržao 400 p-g/ml DEAE-dekstrana, 0,1 mM hlorkina i

5 ug/ml DNK konstrukata dodat je ćelijama, koje su potom inkubirane na 37 °C tokom 3 do 4 časa. Nakon inkubacije, ćelije su podvrgnute pulsiranju i 10 ml 10%> dimetil šulfoksida (DMSO)

u 1 x PBS na sobnoj temperaturi tokom 2 minuta. Potom su ćelije vraćene u DMEM sa svim dodacima/10%) FBS (1% L-glutamina, 1% penicilina/streptomicina, 1%> natrijum piruvata, 1% MEM esencijalnih aminokiselina) (Invitrogen Life Technologies). Nakon 24 časa, podloga je zamenjena DMEM podlogom bez seruma sa svim dodacima (Invitrogen Life Technologies), te su ćelije održavane do 21 dan sa menjanjem podloge svaka 3 do 4 dana.

Ig-fuzioni proteini su prečišćeni propuštanjem supernatanata kulture COS ćelija kroz kolone protein A agaroze (Repligen, Cambridge, MA). Nakon nanošenja supernatanta kulture, kolone proteina A isprane su 1 x PBS (Invitrogen Life Technologies). Vezani Ig-fuzioni proteini su eluirani 0,1 M limunskom kiselinom (pH 2,8) te su sakupljene frakcije odmah neutralizovane pomoću Tris baze (pH 10,85). Frakcije koje su sadržale protein su identifikovane merenjem optičke gustine (A280) i spojene, zatim dijalizovane naspram 1 x PBS (Invitrogen Life Technologies) i proceđene kroz filter od 0,2 pm.

Prečišćeni Ig-fuzioni proteini analizirani su pomoću SDS-PAGE. Alikvoti 2H7 scFv-IgGl lame, 2H7 scFv-IgG2 lame i 2H7 scFv-IgG3 lame kao i Rituxan® (Rituksimab, anti-CD20 antitelo, Genentech, Inc. & IDEC Pharmaceuticals Corp.) (5 u.g proteina) pomešani su sa 25 ul 2

X NuPAGE® SDS Sample Buffer pufera za uzorak (Invitrogen Life Technologies)

(neredukujući uzorci). Uzorci svakog proteina su pripremljeni i u redukujućem puferu koji sadrži 5% 2-merkaptoetanola (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Markeri molekulske mase (Invitrogen Life Technologies) naneseni su na gel samo u neredukujućem puferu. Proteini su frakcionisani

na NuPAGE® 10% Bis-Tris gelovima (Invitrogen Life Technologies). Nakon elektroforeze (približno 1 čas), gelovi su isprani tri puta, svaki put po pet minuta, u destilovanoj vodi (Invitrogen Life Technologies), a zatim obojeni u boji Bio-Safe Coomassie Stain (BioRad, Hercules, CA) preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja u destilovanoj vodi, gelovi su fotografisani. Na slici 24 prikazani su putevi migracije svakog od Ig-fuzionih proteina.

Sposobnost fuzionih proteina 2H7 scFv-Ig lame da se vezuju za ćelije koje eksprimiraju CD20 pokazana je pomoću protočne citometrije. Serijska razblaženja, počev od 25 pg/ml prečišćenog 2H7 scFv-IgGl lame, 2H7 scFv-IgG2 lame i 2H7 scFv-IgG3 lame pripremljeni su i inkubrani sa CD20-transficiranim (CD20+) CHO ćelijama (iz laboratorije Dr. S. Skov, Institute of Medical Microbiologv and Immunologv, Copenhagen, Danska) u 1%> FBS 1 x PBS podlozi (Invitrogen Life Technologies) tokom 1 časa, na ledu. Nakon inkubacije, ćelije su centrifugirane i isprane sa 1% FBS u 1 x PBS. Kako bi se detektovao vezani 2H7 scFv-Ig lame, ćelije su inkubirane tokom jednog časa, na ledu, sa kozjim anti-kamelidnim IgG (teški i laki Janac) konjugovanim sa fluorescinom (1 : 100) (Triple J Farms). Ćelije su potom centrifugirane i ponovo suspendovane u 1% FBS - 1 X PBS i analizirane korišćenjem Coulter Epics XL sortera ćelija (Beckman Coulter, Miami, FL). Podaci (u procentima maksimalne osvetljenosti) dati su na slici 25.

Primer 11: Efektorska funkcija anti- CD20 fuzionih proteina scFv- Ig lame

Ovim primerom pokazuje se sposobnost anti-CD20 fuzionih proteina IgGl, IgG2 i IgG3 lame da posreduju pri citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) i citotoksičnosti posredovanoj ćelijama zavisnoj od antitela (ADCC). Sposobnost fuzionih proteina 2H7 scFv-Ig lame da usmrćuju CD20 pozitivne ćelije u prisustvu komplementa ispitana je korišćenjem BJAB ćelijske linije humanih B ćelija. Zečji komplement je dobijen iz zečeva starih 3 do 4 nedelje (Pel-Freez, Brown Deer, WI). BJAB ćelije (2 x IO6 ćelija/ml) pomešane su sa zečjim komplementom

(pri konačnom razblaženju 1 : 10) i prečišćenim fuzionim proteinima 2H7 scFv Ig. 2H7 scFv-IgGl lame, 2H7 scFv-IgG2 lame, 2H7 scFv-IgG3 lame i 2H7 scFv-humani IgGl sa regionom šarke divljeg tipa-CH2-CH3 (primer 1) dodati su u 1 : 3 serijskim razblaženjima, sa početnom koncentracijom od 30 pg/ml. Nakon jednog časa na 37 °C, utvrđena je vijabilnost ćelija brojanjem živih i mrtvih ćelija pomoću eksluzije tripan plavog (0,4%) (Invitrogen Life Technologies) korišćenjem hemacitometra (Bright-line, Horsham, PA). Procenat usmrćenih ćelija izračunat je deljenjem broja mrtvih ćelija sa ukupnim brojem ćelija (mrtvih i živih ćelija). Podaci predstavljeni na slici 26 pokazuju da su svi fuzioni proteini Ig imali CDC aktivnost.

ADCC aktivnost fuzionih proteina 2H7 scFv-Ig lame određena je korišćenjem BJAB ćelija kao ciljnih ćelija i humanih ili mononuklearnih ćelija iz periferne krvi lame (PBMC) kao efektorskih ćelija. BJAB ćelije su predhodno inkubirane tokom približno 2 časa sa<51>Cr (100 uCi) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) u IMDM podlozi sa svim dodacima (Invitrogen Life Technologies) koja sadrži 15%> FBS. Ćelije su, tokom ove inkubacije, s vremena na vreme mešane. Sveže humane PBMC u mirovanju su prečišćene iz pune krvi korišćenjem podloge za razdvajanje limfocita Lymphocyte Separation Media (LSM) (ICN Pharmaceuticals, Nevv York, NY). PBMC su pomešane sa obeleženim BJAB ćelijama (5 x 104 ćelija po polju u pločama za gajenje kulture tkiva sapo 96 polja) pri odnosima od 25 : 1, 50 : 1 i 100 : 1. Svakoj smeši dodato je 10 pg/ml prečišćenog 2H7 scFv-IgGl lame, 2H7 scFv-IgG2 lame, 2H7 scFv-IgG3 lame, Rituksimaba ili ni jedno anti-CD20 antitelo. Smeše su inkubirane 6 časova na 37 °C. Supernatanti iz svake reakcije koji sadrže<51>Cr oslobođen iz liziranih ćelija sakupljeni s u LumaPlate-96 filter ploče (Packard, Meriden, CT) koje su ostavljene da se osuše preko noći. Količina<51>Cr merena je pomoću TopC'ount NXT čitača ploča (Packard). Na slici 27 prikazano je

da je fuzioni protein 2H7 scFv-IgG2 lame bio najdelotvorniji fuzioni protein lame u posredovanju pri ADCC. Svaki podatak predstavlja prosečnu vrednost merenja triplikata polja.

Izvor efektorskih ćelija uticao je na ADCC aktivnost PBMC lame izolovane iz krvi lame (Triple J Farms) korišćenjem LSM. Efektorske ćelije lame dodate su u istim odnosima prema BJAB ciljnim ćelijama, kao što je opisano za ADCC test u kome su korišćene humane efektorske ćelije. Ćelije su kombinovane sa 10 u,g/ml prečišćenog 2H7 scFv-IgGl lame, 2H7 scFv-IgG2 lame i 2H7 scFv-IgG3 lame, Rituksimaba ili ni jednog anti-CD20 antitela. Rezultati su prikazani na slici 28.

Primer 12: Pobijanje i karakterizacija scFv Ig fuzionih proteina eksprimiranih na površini

ćelije

Ovaj primer prikazuje retrovirusni sistem transfekcije za ektopičnu površinsku ekspresiju receptora sa površine ćelija dobijenih genetskim inžinjeringom koji se sastoje od scFv koji vezuju kostimulatorne receptore. Ovaj primer takođe prikazuje efektorsku funkciju ovih različitih scFv Ig fuzionih proteina eksprimiranih na površini ciljnih ćelija.

Varijabilni regioni teških i lakih lanaca su klonirani iz mišjih monoklonskih antitela specifičnih za različite kostimulatorne receptore, te su jednolančani Fv konstrukti dobijeni, u suštini, na način opisan u primeru 1. Antitela su obuhvatala: 2H7, anti-humani CO20; 40.2.220, anti-humani CD40; 2E12, anti-humani CD28; 10A8, anti-humani CD152 (anti-CTLA-4); i 500A2, anti-mišji CD3. Varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca svakog od antitela klonirani su standardnim postupcima za kloniranje imunoglobulinskih gena opisanim u primeru 1. Jednolančani konstrukti scFv dobijeni su kao što je opisano u primeru 1, ubacivanjem nukleotidne sekvence koja kodira (gly4ser)3povezujući peptid između VLregiona nukleotidnih sekvenci 40.2.220, 2E12, 10A8 i 500A2, respektivno (sekvence čiji su ID brojevi: , respektivno) i nukeotidne sekvence VHregiona 40.2.220, 2E12, 10A8 i 500A2, respektivno (sekvence čiji su ID brojevi: , respektivno). Polipeptidne sekvence za Vl40.2.220, 2E12, 10A8 i 500A2 prikazane su u sekvencama čiji su ID brojevi: , respektivno, a polipeptidne sekvence za VH40.2.220, 2E12, 10A8 i 500A2 prikazane su u sekvencama čiji su ID brojevi: , respektivno. Svaki polinukleotid scFv (sekvence čiji su ID brojevi: , za 40.2.220, 2E12, 10A8

i 500A2, respektivno) je potom fuzionisan za mutirani region šarke humanog IgGl (CCC —* SSS), mutirani domen CH2 (mutacija prolina u serin na ostatku 238 (238 označeno prema EU nomenklaturi, Wardet al,1995Therap. Immunol2: 77 - 94; ostatak 251 prema Kabatet al))i CH3 domen divljeg tipa prema postupcima opisanim u primerima 5 i 11. Svaka sekvenca fuzionog polinukleotidnog scFv i mutiranog IgGl je potom fuzionisana u okviru za sekvence koje kodiraju transmembranski domen i citoplazmatski rep humanog CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ), tako da, kada je fuzioni protein eksprimiran u transficiranoj ćeliji, CD80 je obezbeđivao sidro za površinsku ekspresiju fuzionog proteina scFv Ig. cDNK koje kodiraju fuzione proteine scFv-IgG-CD80 (sekvence čiji su ID brojevi: , za 40.2.220-, 2E12-, 10A8- i 500A2-scFv-IgG-CD80, respektivno) ubačene su u retrovirusni vektor pLNCX (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), prema standardnim procedurama molekularne biologije i prema uputstvima prodavca. cDNK za scFv-Ig-CD80 ubačena je između sekvence 5'LTR-gena za

rezistenciju na neomicin - CMV promotera i 3' LTR sekvence. Retrovirusni konstrukti transficirani su u Reh, ćelijsku liniju akutne limfocitne leukemije (ATCC CRL-8286). Transficirane ćelije su ispitivane kako bi se odabrali klonovi koji eksprimiraju fuzione proteine scFv-Ig na površini ćelije.

Testovi za CDC i ADCC izvršeni su na transficiranim Reh ćelijama kako bi se utvrdilo da li je ekspresija polipeptida scFv-Ig na površini ćelija pojačala efektorsku funkciju ćelija. Reh ćelije koje esprimiraju anti-humani CD152 scFv-mutirani IgG-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ); Reh anti-humani CD28 scFv-mutirani IgG-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ); Reh anti-humani CD28 scFv-mutirani IgG-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ); Reh anti-humani CD40 scFv-mutirani IgG-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ); Reh anti-humani CD20 scFv-mutirani IgG-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ) pomešani su sa humanim PBMC (videti primer 11) i zečjim komplementom (10 pg/ml) i inkubirani jedan čas na 37 °C. Netransficirane Reh ćelije upotrebljene su kao kontrola. Vijabilnost ćelija određivana je pomoću ekskluzije tripan plavog, te je izračunat procenat usmrćenih ćelija (videti primer 11). Na slici 29 prikazana je delotvornost fuzionih proteina scFv-IgG-CD80 u posredovanju u citotoksičnosti posredovanoj komplementom, kada su eksprimirani na ćelijskoj površini ćelija tumora.

Iste transficirane Reh ćelije koje su ispitivane u CDC testu, kao i Reh ćelije transficirane polinukleotidnim konstruktom koji kodira anti-mišji CD3-scFv-Ig-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ) ispitivane su na ADCC altivnost (videti primer 11). Netransficirane i transficirane Reh ćelije predhodno su obeležene inkubiranjem sa<51>Cr (100 pCi) (Amersham Biosciences, Piscatavvav, NJ) tokom 2 časa na 37 °C. Kao efektorske ćelije korišćene su humane PBMC koje su dodate ciljnim Reh ćelijama (5 x 10<4>ćelija po polju u pločama sa po 96 polja) pri odnosima 5 : 1, 2,5 : 1 i 1,25 : 1. Nakon pet časova na 37 °C, supernatanti kulture su sakupljeni i analizirani, kako je opisano u primeru 11. Procenat specifičnog usmrćivanja izračunat je prema sledećoj jednačini: ((oslobađanje u eksperimentu minus spontano oslobađanje)/(najveće moguće oslobađanje minus spontano oslobađanje)) x 100. Podaci su predstavljeni na slici 30. Svaki pojedinačni podatak predstavlja srednju vrednost uzoraka u kvadriplikatu.

Korišćenjem predhodno opisanih procedura, dobijeni su isti rezultati sa drugim vezujućim domenima, korišćenjem sledećih monoklonskih antitela kao izvora sFv: za CD20, 1F5 (Genbank AY 058907 & AY058906); za CD40,2.36 i G28.5; za CD28, 9.3.

Ekspresija vezujućih domena antitela na ćelijskoj površini postiže se fuzionisanjem scFv antitela za regione šarke i konstantne regione IgA i za region IgE koji se ponaša kao region šarke, t.j. IgE CH2 i konstantne regione IgE. Polinukleotidi koji kodiraju anti-4-lBB scFv, 5B9 (anti-humani 4-1BB) scFv i 2el2 (anti-humani CD40) fuzionisani za IgAH IgA T4 (sa delirana četiri terminalna ostatka CH3) fuzionisani za transmembranske i citoplazmatske domene CD80 i Fc regione IgE prikazani su u sekvencama čiji su ID brojevi: . Kodirani polipeptidi prikazani su u sekvencama čiji su ID brojevi: .

Primer 13: Pobijanje i sekvenca mutanata humanog regiona šarke Ig- CH2- CH3 i

mutanata varijabilnog regiona 2H7

Ovaj primer opisuje dobijanje scFv fuzionih proteina koji sadrže mutirane konstantne regione humanog IgGl i IgA. Ovaj primer opisuje i dobijanje 2H7 mutanta sa pojedinačnom tačkastom mutacijom u varijabilnom regionu teškog lanca. Mutacije su uvedene u domene varijabilnih i konstantnih regiona prema postupcima koji su ovde opisani i poznati stručnjacima molekularne biologije. Slika 31 prikazuje nomenklaturu konstrukata konstantnih regiona Ig.

Region šarke humanog IgGl fuzionog proteina 2H7 scFv regiona šarke humanog IgGl-CH2-CH3 mutiran je tako da su supstituisani cisteinski ostaci koji u ćelom imunoglobulinu učestvuju u nastanku disulfidnih veza između dva molekula teških lanaca. Jedan mutant, 2H7 scFv fuzionisan za region šarke humanog IgGl kod kojeg su sva tri cisteinska ostatka mutirana u serinske ostatke (MTH (SSS)), dobijen je kao što je opisano u primeru 5 (u primeru 5 označen je kao CitoksB-MHWTGlC (koji uključuje CH2 i CH3 domene divljeg tipa IgGl)) (koji se sad naziva 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3) i sadrži polinukleotidnu sekvencu čiji je ID broj: koja kodira polipeptid koji je predstavljen kao sekvenca čiji je ID broj: . Polinukleotidna sekvenca koja kodira ovaj mutant (sekvenca čiji je ID broj: ) upotrebljena je kao model za dobijanje mutiranih regiona šarke u kojima su prva dva cisteinska ostatka supstituisana serinskim ostacima (IgG MTH (SSC)). Konstruisan je oligonukleotid kojim će treći serinski ostatak biti supstituisan cisteinom, koji je imao sledeću sekvencu: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tct cea ccg tgc cea gca cet g-3' (HuIgGMHncs3, sekvenca čiji je ID broj: ). Pripremljen je drugi mutant u kome je mutirani region šarke imao serinske ostatke kojima su supstituisani prvi i treći cisteinski ostatci (IgG MTH (SCS)). Sekvenca oligonukleotida kojim je dobijen ovaj mutant bila je: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tgc cea ccg-3'

(HuIgGMHncs2, sekvenca čiji je ID broj: ). Pripremljen je treći mutant u kome su supstituisani cisteinski ostaci u drugom i trećem položaju (IgG MTH (CSS)), takođe korišćenjem IgG MTH (SSS) mutanta kao modela i oligonukleotida sa sekvencom: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac-3' (HulgGMHncsl, sekvenca čiji je ID broj: ).

Oligonukleotidi kojima su uvedene mutacije u region šarke pomešani su sa modelom i 3' oligonukleotidom koji sadrži Xbal mesto (označeno podvučenim, iskošenim slovima) (5'-gtt gtttct a<g>atca ttt acc cgg aga cag gga gag get ctt ctg cgt gta g-3' (sekvenca čiji je ID broj: ) kako bi se amplifikovale sekvence mutiranog regiona šarke-divljeg tipa (WT)-CH2-CH3 pomoću PCR. Mutirane sekvence IgG MTH CSS i IgG MTH SCS su amplifikovane u 25 ciklusa sa profilom denaturacije 94 °C, ciklizacije na 52 °C tokom 30 sekundi i produžavanjem na 72 °C tokom 30 sekundi. Mutirana sekvenca IgG MTH SSC amplifikovana je pod nešto drugačijim uslovima: profilom denaturacije na 94 °C, ciklizacije na 45 °C tokom 30 sekundi i produžavanjem na 72 °C tokom 45 sekundi. Amplifikovani polinukleotidi ubačeni su u TOPO® vektor za kloniranje (Invitrogen Life Technologies) te su sekvencirani kao što je opisano u primeru 1 da bi se potvrdilo prisustvo mutacije. pD18 vektor koji sadrži 2H7 scFv hidrollzovan je da bi se uklonile sekvence konstantnog regiona, u suštini na način opisan u primeru 10. Regioni mutiranog regiona šarke-divljeg tipa CH2-CH3 ubačeni su u okvir u hidrolizovanu DNK vektora kako bi se dobili vektori koji sadrže DNK koja kodira 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); DNK koja kodira 2H7 scFv MTH (SCS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J; i DNK koja kodira 2H7 scFv MTH (SSC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _).

Mutacija leucina u serin u položaju 11 u prvom regionu okvira varijabilnog regiona teškog lanca (numeracija prema Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.izdanje. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)) uvedena je u fuzioni protein 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _). Ostatak leucina divljeg tipa supstituisan je serinom pomoću mutageneze usmerene na određeno mesto korišćenjem oligonukleotida Vhserl 1: 5'-gga ggt ggg age tct cag get tat cta cag cag tct ggg get gag teg gtg agg cc-3' (sekvenca čiji je ID broj: ) (ova sekvenca, ili aminokiselinska sekvenca koju ona kodira, mogu opciono da se izuzmu iz nekih konkretnih rešenja podvedenih pod obim zaštite patentnih zahteva predmetnog pronalaska). 3' prajmer za PCR bio je huIgGl-3' sa sekvencom 5'-gtctct a<g>acta tca ttt acc cgg aga cag-3' (sekvenca čiji je ID broj: ) (Xbal mesto je označeno podvučenim, iskošenim slovima). Nakon amplifikacije pomoću PCR fragmenti su ubačeni u TOPO® vektor za kloniranje i sekvencirani kako bi se potvrdilo prisustvo mutacije VHI 1 leucina u serin. DNK koja kodira 2H7 scFv-IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 prebačena je u PSL1180 vektor za kloniranje (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Konstrukt PSL1180-2H7 scFv-IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 hidrolizovan je pomoću Sac i Xbal kako bi se uklonili '•'VH domen divljeg tipa i region šarke i domeni CH2 i CH3. PCR proizvod koji je sadržao VHI 1 mutant hidrolizovan je pomoću Sac i Xbal a potom ubačen u hidrolizovani PSL1180 konstrukt prema standardnim procedurama molekularne biologije. Konstrukt je potom hidrolizovan je pomoću Hind III i Xbal i ubačen u sisarski ekspresioni vektor pD18 (videti postupke u primeru 1 i primeru 10). Mutant je označen kao 2H7 scFv VH11SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (slika 31). Polinukleotidna sekvenca predstavljena je kao sekvenca čiji je ID broj: , a polipeptidna sekvenca koju ona kodira predstavljena je kao sekvenca čiji je ID broj: (ove sekvence mogu opciono da se izuzmu iz nekih konkretnih rešenja podvedenih pod obim zaštite patentnih zahteva predmetnog pronalaska).

Pripremljena su četiri konstrukta koja sadrže konstantne regione IgA. Jedan konstrukt je sadržao region šarke divljeg tipa IgA fuzionisan za CH2 i CH3 domene humanog IgGl (IgAH

IgG V/TCH2CH3) (slika 31). Kako bi se supstituisao region šarke humanog IgGl 2H7 scFv konstrukta nukleotidnim sekvencama koje kodiraju region šarke IgA izvršene su sekvencijalne amplifikacije pomoću PCR. 5' oligonukleotidni prajmer (huIgA/Gchim5) za prvu PCR reakciju imao je sekvencu 5'-cea tct ccc tca act cea cet acc cea tct ccc tca tgc gca cet gaa ctc ctg-3'

(sekvenca čiji je ID broj: ). Prajmer (huIgAhg-5') za drugu PCR reakciju u kojoj se dodaje još jedan deo sekvence regiona šarke specifične za IgA i restrikciono mesto za Bell enzim (predstavljeno iskošenim, podvučenim slovima) imao je sekvencu: 5'-gttgtt_ gqt_ cagcea gtt ccc tca act cea cet acc cea tct ccc caa ct-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). 3' prajmer za oba koraka amplifikacije bio je huIgGl-3' sa sekvencom 5'-gtc tct aga cta tca ttt acc cgg aga cag-3'

(sekvenca čiji je ID broj: ). Sekvenca PRC proizvoda potvrđena je pomoću TOPO® kloniranja, kao što je predhodno opisano. Fragment prečišćen u gelu hidrolizovan je pomoću Bell i Xbal a potom ubačen u 2H7 scFv-pD18 vektor koji je predhodno hidrolizovan je pomoću Bell i Xbal kako bi se uklonili svi konstantni regioni IgGl. Vezivanje je izvršeno kao što je opisano u primeru 10 kako bi se obezbedio sisarski ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira polipeptid 2H7 scFv region šarke IgA-IgGl CH2-CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ).

Konstruisan je drugi sisarski ekspresioni vektor pD18 koji je sadržao polinukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira 2H7 scFv fuzionisan za region šarke, CH2 i CH3 domene divljeg tipa IgA (sekvenca čiji je ID broj: ). Sekvence konstantnih regiona humanog IgA dobijene su korišćenjem prajmera sa nasumičnim sekvencama kako bi se izvršila reverzna transkripcija ukupnih RNK izolovanih iz humanih krajnika praćena amplifikacijom cDNK pomoću PCR uz upotrebu prajmera specifičnih sekvenci, u suštini, na način opisan u primeru 10. Nukleotidna sekvenca regiona šarke humanog IgA-CH2-CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) koja kodira IgA-CH2-CH3 polipeptid (IgAH IgACH2CH3, slika 31) (sekvenca čiji je ID broj: ) amplifikovana je korišćenjem 5' oligonukleotida huIgAhg-5' (sekvenca čiji je ID broj:predhodno naveden,) i 3' oligonukleotida huIgA3' koji ima sekvencu 5'-gtt gtt tct aga tta tca gta gca ggt gcc gtc cac ctc ege cat gac aac-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). Izlučivanje polipeptida 2H7 regiona šarke IgA-CH2-CH3 iz transficiranih sisarskih ćelija zahtevalo je koekspresiju humanog J lanca koji se kovalentno vezuje za dva CH3 domena IgA preko disulfidnih veza. Iz B ćelija iz krajnika izolovane su ukupne RNK, nakon čega je reverznom transkripcijom iz njih dobijena cDNK, kao što je predhodno opisano. PCR amplifikacija nukleotidne sekvence koja kodira J lanac izvršena je uz upotrebu prajmera specifičnih za J lanac. Sekvenca 5' prajmera za PCR, HUJCH5nl bila je: 5'-gtt gtt aga tct caa gaa gat gaa agg att gtt ctt-

3' (sekvenca čiji je ID broj: ) dok je 3' prajmer HUJCH3 imao sekvencu 5'-gtt gtt tct aga tta gtc agg ata gca ggc atc tgg-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). cDNK je klonirana u TOPO® za sekvenciranje, kao što je opisano u primeru 10. Potom je cDNK koja kodira J lanac (sekvenca čiji je ID broj: _J ubačena u vektore pD18 i pCDNA3-Hygro (+) (Invitrogen Life Technologv)

za kotransfekciju sa konstruktima 2H7 scFv region šarke IgA-CH2-CH3. J lanac ima predviđenu aminokiselinsku sekvencu, koja je predstavljena kao sekvenca čiji je ID broj: .

Izlučivanje konstrukta scFv konstantnog regiona IgA u odsustvu J lanca postignuta je dobijanjem skraćenog CH3 domena sa delecijom četiri krajnja aminokiselinska ostatka sa karboksi kraja (GTCY, sekvenca čiji je ID broj: ) (IgAH IgA-T4, slika 31), koja obuhvata cisteinski ostatak koji gradi disulfidnu vezu sa J lancem. Nukleotidna sekvenca regiona šarke IgA-CH2-CH3 koja sadrži deleciju u CH3 regionu (sekvenca čiji je ID broj: ) dobijena je korišćenjem 5' prajmera za PCR (huIgAhg-5<1>) čija je sekvenca 5'-gtt g ttgat ca &cea gtt ccc tca act cea cet acc cea tct ccc tca act-3' (sekvenca čiji je ID broj: ) (Bell mesto je označeno podvučenim, iskošenim slovima) i 3' prajmera (HUIGA3T1) čija je sekvenca: 5'-gtt gtt tct aga tta tca gtc cac ctc ege cat gac aac aga cac-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). Ova imitirana nukleotidna sekvenca konstantnog regiona IgA ubačena je u 2H7 scFv pD18 vektor kao sto je opisano za dobijanje prethodnih 2H7 scFv-Ig konstrukata (videti primer 1 i ovaj primer), koji sadrži polinukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira 2H7 IgAH IgA-T4 polinukleotid (sekvenca čiji je ID broj: ).

Pripremljen je i četvrti konstrukt koji kodira fuzioni protein 2H7 scFv - konstantnog regiona IgA sa delecijom 14 dodatnih aminokiselinskih ostataka, od kojih su većina hidrofobni ostaci, sa karboksi terminalnog kraja CH3 IgA. Polinukleotid koji kodira 2H7 scFv-IgAH IgA-

T4 upotrebljen je kao model za dobijanje delecije nukleotidne sekvence koja kodira PTHVNVSVVMAEVD (sekvenca čiji je ID broj: ). 5' oligonukleotidni prajmer imao je sekvencu 5'-gttgtr mt cagcea gtt ccc tca act cea cet acc cea tct ccc tca act 3' (sekvenca čiji je ID broj: ) (Bell mesto je označeno podvučenim, iskošenim slovima). Sekvenca 3' oligonukleotida bila je 5'-gtt gtt tct aga tta tca ttt acc ege caa geg gtc gat ggt ctt-3' (sekvenca čiji je ID broj: ). Delirani CH3 region IgA amplifikovan je korišćenjem predhodno opisanih oligonukleotida za amplifikaciju konstantog regiona IgA iz RNK izolovanih iz humanih krajnika tako daje cDNK sadržavala delirani kodirajući region za 18 aminokiselina na karboksi kraju. Konstantni region IgAH IgA-T18 ubačen je u 2H7 scFv pD18 vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira 2H7 IgAH IgA-T18 polinukleotid (sekvenca čiji je ID broj: ), kao što je predhodno opisano.

Primer 14: Efektorska funkcija fuzionih proteina CTLA- 4- IgG

U ovom primeru porede se efektorske funkcije fuzionih proteina CTLA-4 Ig u CDC i ADCC testovima.

Konstruisana su dva fuziona proteina CTLA-4 IgG. Jedan fuzioni protein sadrži vanćelijski domen CTLA-4 fuzionisan za region šarke, CH2 i CH3 domene divljeg tipa humanog IgGl i označen je kao CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _). Sisarski ekspresioni vektor pD18 koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) dobijen je fuzionisanjem nukleotidne sekvence koja kodira vanćelijski domen CTLA-4 (sekvenca čiji je ID broj: ) u okvir (videti U.S. patent br. 5,844,095) za nukleotidnu sekvencu koja kodira IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) prema postupcima opisanim u primerima 1 i 10. Nukleotidna sekvenca vanćelijskog domena sadrži i restrikciono mesto za Bell enzim na 3' kraju, kao i nukleotidnu sekvencu vodećeg peptida (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira oncoM vodeći peptid (sekvenca čiji je ID broj: ). Drugi fuzioni protein CTLA-4 IgG, označen kao CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, sadržao je vanćelijski domen CTLA-4 (plus sekvencu oncoM vodećeg peptida) fuzionisan za mutirani region šarke IgG kod kojeg su sva tri cisteinska ostatka supstituisana serinskim ostacima.. Region šarke je fuzionisan za mutirani CH2 domen IgGl koji je imao mutaciju u izotopskom položaju 238 (EU numeracija, Wardet al, supra;položaj 251 prema numeraciji po Kabatet al, supra;položaj 209, ako numeracija počinje od prvog ostatka u CH1 IgGl; t.j., PAPELLDGPS (sekvenca čiji je ID broj: ) IgGl divljeg tipa promenjena je u PAPELLDGSS (sekvenca čiji je ID broj: )), koji je fuzionisan sa CH3 divljeg tipa IgGl (U.S. patent br. 5,844,095). Polinukleotid CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2V/TCH3 sadrži nukleotidnu sekvencu predstavljenu kao sekvenca Čiji je ID broj: dok izvedena aminokiselinska sekvenca sadrži sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID broj: . CTLA-4 fuzioni proteini su takođe dobijeni korišćenjem sekvenci koje kodiraju vanćelijsku membranu bez vodećeg peptida (sekvenca čiji je ID broj: ).

Da bi se izmerila CDC aktivnost, prečišćeni CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (2 pg/ml) ili CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (2 pg/ml) dodat je Reh ćelijama (videti primer 12), kao i Reh ćelijama transficiranim kostimulatornim molekulom CD80, tako da je CD80 eksprimiran na ćelijskoj površini (Reh CD80.10; videti Dotyet al,1998J. Immunol.161: 2700; Dotyet al,1996J. Immunol.157: 3270), u prisustvu ili odsustvu zečjeg komplementa (10 pg/ml). Prečišćeni fuzioni proteini CTLA-4 Ig dobijeni su iz supernatanata kulture prolazni transficiranih COS ćelija prema postupcima opisanim u primeru 10. Testovi su sprovedeni, u suštini, kao što je opisano u primerima 11 i 12. Podaci predstavljeni na slici 32 pokazuju da su u prisustvu komplementa i fuzionog proteina CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 usmrćene samo Reh ćelije transficirane sa CD80.

Prečišćeni fuzioni proteini CTLA-4 Ig su ispitivani i u ADCC testovima. Humane PBMC, koje su služile kao efektorske ćelije, dodate su Reh ili Reh CD80.1 ciljnim ćelijama pri odnosima od 1,25 : 1; 2,5 : 1; 5,0 : 1 i 10 : 1. Ćelije su obeležene te su testovi sprovedeni, u suštini, kao što je opisano u primerima 11 i 12. Rezultati su prikazani na slici 33. Svaki podatak predstavlja prosečnu vrednost četiri nezavisna polja sa kulturom, za svaki odnos efektorskih : ciljnim ćelijama. Podaci pokazuju daje samo CTLA-4 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 doveo do značajne ADCC Reh CD80.1 ćelija.

Primer 15: Efektorska funkcija fuzionih proteina CTLA- 4 IgA

Fuzioni proteini CTLA-4 IgA dobijeni su kao što je opisano za IgG fuzione primere

(videti primere 1, 13 i 14). Nukleotidna sekvenca vanćelijskog domena CTLA-4 (sekvenca čiji je ID broj: ) fuzionisana je u otvorenom okviru čitanja za nukleotide koji kodiraju IgAH IgACH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) kako bi se dobila nukleotidna sekvenca (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira fuzioni protein CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ). Fuzioni protein se prolazno eksprimira u COS ćelijama (videti primer 10) ili stabilno eksprimira u CHO ćelijama (videti primer 11). Izlučivanje fuzionog proteina CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 zahteva kotransfekciju sa konstruktom koji sadrži polinukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: __) koja kodira humani J lanac (sekvenca čiji je ID broj: ). Fuzioni protein CTLA-4 IgAH IgACH2CH3 izolovan je kao što je opisano u primerima 10 i 14. Kako bi se CTLA-4 Ig konstrukt eksprimirao bez prisustva J lanca, pripremljen je CTLA-4 IgAH IgA-T4 konstrukt koji je potom transficiran u sisarske ćelije. Na način sličan onom opisanom za CTLA-4 vanćelijski fragment fuzionisan za region šarke-CH2CH3 divljeg tipa IgA, nukleotidna sekvenca vanćelijskog domena CTLA-4 (sekvenca čiji je ID broj: ) fuzionisana je u otvorenom okviru

za čitanje za nukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira IgAH IgA-T4 polipeptid (sekvenca čiji je ID broj: ) kako bi se dobila nukleotidna sekvenca koja sadrži sekvencu čiji je ID broj: koja kodira CTLA-4 IgAH IgA-T4 polipeptid (sekvenca čiji je ID broj: ). Efektorska funkcija svakog konstrukta ispitana je pomoću CDC i ADCC kao što je opisano u primeru 14.

Primer 16: Vezivanje fuzionih proteina anti- CD20 scFv humanog Ig za CHO ćelije koje

eksprimiraju CD20

Ovaj primer opisuje vezivanje 2H7 scFv Ig fuzionih proteina za CHO ćelije koje eksprimiraju CD20. Analiza je sprovedena pomoću protočne citometrije. Sakupljeni su supernatanti kulture iz prolazno transficiranih COS ćelija koje eksprimiraju 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) VVTCH2CH3 (SEQ ID NO:_); i 2H7 scFv VHSER11 WTH WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ), nakon čega su pripremljena dvostruka serijska razblaženja. Serijska dvostruka razblaženja prečišćenog 2H7 scFv IgG MTH

(SSC) "VVTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) pripremljena su počev od koncentracije od 5 pg/ml. Supernatanti kulture i prečišćeni uzorci fuzionih proteina inkubirani su sa (CD20+) CHO ćelijama tokom jednog časa na ledu. Ćelije su isprane dva puta a potom inkubirane sa 1 : 100 kozjim anti-humanim IgG konjugovanim sa FITC (CalTag) tokom 40 minuta. Nevezani konjugat uklonjen je ispiranjem ćelija, te je izvršena analiza pomoću protočne citometrije korišćenjem Coulter Epics sortera ćelija. Rezultati su prikazani na slici 34.

Primer 17: Imunoblot analiza fuzionih proteina anti- CD20 scFv humanog IgG i IgA

U ovom primeru opisana je imunoblot analiza 2H7 scFv IgG i 2H7 scFv IgA fuzionih proteina koji su staloženi imunoprecipitacijom iz supernatanata kulture transficiranih ćelija.

COS ćelije su prolazno transficirane plazmidima koji sadrže nukleotidne sekvence za 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) VVTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ); 2H7 scFv IgA H IgG VVTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ); i scFv IgG MTH (SSS) V/TCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ), u suštini prema postupcima opisanim u primeru 10. Ćelije su takođe transficirane i samo vektorom. Nakon 48 do 72 časa na 37 °C, supernatanti kulture su sakupljeni i pomešani sa granulama protein-A agaroze (Repligen) i ostavljeni tokom jednog časa na 4 °C. Granule su odvojene centrifugiranjem i isprane nekoliko puta u TNEN [20 mM Tris baze, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, i 0.05% NP-40, pH 8,0). Imunoprecipitati su pomešani sa 25 pl 2x NuPAGE® SDS Sample Buffer (Invitrogen Life Technologies) pufera za uzorke (neredukovani uzorci). Proteini su frakcionisani na NuPAGE®

10%> Bis-Tris gelovima (Invitrogen Life Technologies). Nakon elektroforeze (približno 1 čas), proteini su prebačeni iz gela na Immobilon P poliviniliden fluoridnu (PVDF) membranu (Millipore, Bedford, MA) korišćenjem polusuvog blotera (Ellard Instrumentation, Monroe, WA). PVDF membrana je blokirana u PBS koji sadrži 5%> nemasnog mleka, a potom testirana sa kozjim anti-humanim IgG konjugovanim sa HRP (specifičnim za Fc) (CalTag). Nakon ispiranja imunoblota nekoliko puta u PBS, blot je razvijen korišćenjem ECL (Amersham Biosciences). Rezultati su prikazani na slici 35.

Primer 18: Vezivanje fuzionih proteina anti- CD20 scFv humanog IgA za CD20+ CHO

ćelije

Ovaj primer opisuje analizu vezivanja fuzionih proteina 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) i 2H7 scFv IgAH IgAT4 (sekvenca čiji je ID broj: ) za (CD20+) CHO ćelije pomoću protočne imunocitofluorimetrije.

COS ćelije su prolazno kotransficirane, kao što je opisano u primeru 10, plazmidnom DNK koja sadrži polinukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira polipeptid 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) i odvojenim plazmidom koji%sadrži polinukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira polipeptid humanog J lanca (sekvenca čiji je ID broj: ). COS ćelije su takođe transficirane polinukleotidnom sekvencom (sekvenca čiji je ID broj: ) koja kodira fuzioni protein 2H7 scFv IgA koji ima deleciju četiri aminokiselinska ostatka na karboksi kraju CH3 (2H7 scFv IgAH IgA-T4, sekvenca čiji je ID broj: ). Transfekcije su izvršene kao što je opisano u primeru 10. Supernatanti kulture iz transficiranih COS ćelija pomešani su sa (CD20+) CHO ćelijama (videti primer 1) i inkubirani jedan čas na ledu. Ćelije su isprane dva puta u PBS-2%o FBS a potom pomešane sa kozjim anti-humanim IgA lancem konjugovanim sa FITC (CalTag) (1 : 100) i inkubirane 40 minuta. Ćelije su ponovo isprane i potom analizirane pomoću protočne citometrije, korišćenjem Coulter Epics XL ćelijskog sortera. Na slici 36 vidi se da za izlučivanje 2H7 scFv IgAH IgAT4, fuzionog proteina 2H7 IgA sa skraćenim karboksi krajem CH3 regiona (sekvenca čiji je ID broj: _"J, nije neophodna kotransfekcija sa J lancem.

Primer 19: Efektorske funkcije fuzionih proteina anti- CD20 scFv humanih IgA

Ovaj primer opisuje ADCC aktivnost fuzionih proteina 2H7 IgG i IgA prema ćelijama koje eksprimiraju CD20. BJAB ćelije su predhodno obeležene inkubiranjem sa<51>Cr (100 pCi)

(Amercham) tokom 2 časa na 37 °C. Efektorske ćelije su dobijene iz sveže pune humane krvi u mirovanju, koja je razblažena u jednakoj zapremini Alseverovog rastvora kako bi se sprečila koagulacija. Fuzioni proteini 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj:

__); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __); 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J; i 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) prečišćeni su iz supernatanata prolazno transficiranih COS ćelija (100 - 200 ml) pomoću hromatografije na proteinu A, kao što je opisano u primeru 10. COS ćelije transficirane plazmidom koji kodira 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 kotransficirane su plazmidom koji kodira humani J lanac kao što je opisano u primeru 18. Dvostruka serijska razblaženja prečišćenih fuzionih proteina 2H7 Ig, počev od koncentracije od 5 pg/ml, dodata su obeleženim BJAB ćelijama (5 x IO4 ćelija po polju u pločama za kulturu sa po 96 polja) u prisustvu pune krvi (100 ul potpune krvi razblažene 1 : 1 u Alseverovom rastvoru, sa konačnim razblaženjem od 1 *: 4), te je smeša inkubirana pet Časova na 37 °C. Supernatanti kulture su sakupljeni i analizirani kao što je opisano u primeru 11. Procenat specifičnog usmrćivanja izračunat je prema sledećoj jednačini: ((oslobađanje u eksperimentu minus spontano oslobađanje)/(najveće moguće oslobađanje minus spontano oslobađanje)) x 100. Podaci su predstavljeni na slici 37. Svaki pojedinačni podatak predstavlja srednju vrednost uzoraka u kvadriplikatu.

U drugom testu za ADCC, broj obeleženih BJAB ćelija održavan je stalnim u svakom uzorku, dok je puna krv dodavana u razblaženjima od 0,25, 0,125 i 0,00625. Prečišćeni fuzioni proteini 2H7 IgG i IgA dodati su pri koncentraciji od 5 pg/ml. BJAB ćelije, puna krv i fuzioni proteini su inkubirani, te su sakupljeni supernatanti i izračunat procenat specifičnog usmrćivanja kao što je predhodno opisano. Procenat specifičnog usmrćivanja za svaki od 2H7 fuzionih proteina dat je na slici 38.

ADCC aktivnosti prečišćenog 2H7 scFv IgG MTH (SSS) VVTCH2CH3 (5 Lig/ml) i 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (5 pg/ml) poređene su u prisustvu različitih populacija efektorskih ćelija. PBMC izolovane su iz potpune krvi kao što je opisano u primerima 11 i 12. PBMC su pomešane sa obeleženim BJAB ćelijama (5 x IO<4>ćelija po polju u pločama za kulturu sa po 96 polja) pri odnosima od 50 : 1, 25 : 1 i 12,5 : 1. Test je sproveden i analiza izvršena kao što je predhodno opisano. Slika 39A pokazuje da je samo 2H7 scFv IgG MTH (SSS) V/TCH2CH3 fuzioni protein imao ADCC aktivnost kada su korišćene PBMC kao efektorske ćelije. Slika 39B pokazuje da su i 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 i 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 pokazivali ADCC aktivnost kada je kao izvor ćelija korišćena puna krv (kao što je prikazano na slici 38).

Primer 20: Nivo ekspresije fuzionog proteina 2H7 scFv VHllSer IgG MTH ( SSS)

WTCH2CH3

Ovaj primer poredi nivo ekspresije fuzionog proteina 2H7 scFv VHllSer IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _) sa drugim konstruktima 2H7 scFv koji ne sadrže mutaciju u varijabilnom domenu teškog lanca. Sisarski ekspresioni vektor pDl"8 koji sadrži nukleotidne sekvence 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __); 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: __); i 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (videti primere 1 i 13) prolazno su transficirani u COS ćelije kao što je opisano u primeru 10. Nakon 72 časa na 37 °C sakupljeni su supernatanti kulture, te je po 1 ul svakog supernatanta pomešan sa neredukujućim puferom za uzorak (videti postupak opisan u primeru 10). Uzorci supernatanata kulture i alikvoti prečišćenog 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (40 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng i 2,5 ng) razdvojeni su na 10% Bis-Tris (MOPS) NuPAGE® gelovima (Invitrogen Life Technologies). Multimark® standardi proteina (Invitrogen Life Technologies) su takođe razdvajani na gelu. Proteini su prebačeni na PDVF membranu te je izvršen imunoblot kao što je opisano u primeru 17. Imunoblot je prikazan na slici 40. Količine fuzionih proteina određene su denzitometrijskom analizom blotova pomoću Scionlmage računarskog programa za Windows i poređenjem sa standardnom krivom. Konstrukt 2H7 scFv IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 dao je približno 12 ng/ul ili 10 mikrograma/ml, 2H7 scFv IgG MTH (CSS) WTCH2CH3 dao je približno 10 ng/ul ili 10 mikrograma/ml, konstrukt 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3 dao je približno 1 ng/ul ili 1 mikrogram/ml, a konstrukt 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 dao je približno 30 ng/ul ili 30 mikrograma/ml. U određenim rešenjima podvedenim pod obim zaštite patentnih zahteva predmetnog pronalaska, aminokiselinska sekvenca 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) V/TCH2CH3, ili polinukleotidna sekvenca koja kodira 2H7 scFv VHSER11 IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 može opciono da bude isključena iz predmetnog pronalaska. Slično tome, aminokiselinska sekvenca 2H7 scFv VHSER11 IgG WTH (CCC) VVTCH2CH3 ili polinukleotidna sekvenca koja kodira 2H7 scFv VHSER11 IgG WTH (CCC) WTCH2CH3 može opciono da bude isključena iz određenih rešenja podvedenih pod obim zaštite patentnih zahteva predmetnog pronalaska. Uz to, aminokiselinska supstitucija leucina na položaju 11 u serin u varijabilnom domenu teškog lanca, ili polinukleotidi koji kodiraju aminokiselinsku supstituciju leucina na položaju 11 u serin u varijabilnom domenu teškog lanca, mogu opciono da budu isključeni iz određenih rešenja podvedenih pod obim zaštite patentnih zahteva predmetnog pronalaska.

Primer 21: Konstrukcija fuzionog proteina 2H7 scFv IgG sa mutiranim CH3 domenom

U CH3 domen fuzionog proteina 2H7 IgG uvedene su aminokiselinske mutacije. pD18 vektor koji sadrži 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J hidrolizovan je pomoću Bell i Xbal kako bi se uklonio fragment MTH V/TCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ), koji je potom podkloniran u pShuttle vektor (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) koji je dvostruko hidrolizovan pomoću Bell i Xbal. Podkloniranje je izvršeno u vektoru rezistentnom na kanamicin zbog toga što gen za rezistenciju na ampicilin ima,XmnI mesto koje je neophodno za ovu proceduru kloniranja. Pripremljeno je pet konstrukata sa sledećim supstitucijama: (1) fenilalaninski ostatak u položaju 405 (numeracija prema Kabatet al, supra)supstitisan je tirozinom pomoću oligonukleotida CH3Y405; (2) fenilalaninski ostatak u položaju 405 supstitisan je alaninom pomoću oligonukleotida CH3A405; (3) ostatak tirozina u položaju 407 supstitisan je alaninom pomoću oligonukleotida CH3A407; (4) oba aminokiselinska ostatka divljeg tipa u položajima 405 i 407 supstituisana su tirozinom i alaninom, respektivno, pomoću oligonukleotida CH3Y405A407; i (5) oba aminokiselinska ostatka divljeg tipa u položajima 405 i 407 supstituisana su alaninom, pomoću oligonukleotida CH3A405A407. Olinukleotidi su bili 3' prajmeri za PCR amplifikaciju dela CH3 domena. Nukleotidne sekvence za svaki 3' oligonukleotid bile su:

Mutirani region šarke MHWTCH2CH3 humanog IgGl upotrebljen je kao model. 5' oligonukleotidni prajmer za PCR bio je huIgGMHWC (sekvenca čiji je ID broj: ). Amplifiovani proizvodi klonirani su pomoću TOPO® i sekvencirani kao što je opisano u primerima 1 i 10. DNK iz klonova sa tačnom sekvencom hidrolizovana je pomoću Bell i Xbal i prebačena u pShuttle koji sadrži sekvencu MTH WTCH2CH3, koja je takođe hidrolizovana istim restrikcionim enzimima. Mutirane sekvence IgG su potom uklonjene hidrolizom pomoću-Bell i Xbal i ubačene u pD18 vektor koji sadrži 2H7 scFv koji je takođe hidrolizovan pomoću Bell i Xbal. Polinukleotidne sekvence za mutirane CH3 domene, MTCH3 Y405, MTCH3 A405, MTCH3 A407, MTCH3 Y405A407 i MTCH3 A405A407 prikazane su u sekvencama čiji su

ID brojevi: , respektivno, a polipeptidne sekvence za svaku od njih prikazane su u sekvencama

čiji su ID brojevi: , respektivno. Polinukleotidne sekvence za 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407, scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405A407, i scFv MTH WTCFI2 MTCH3 A405A407, respektivno, i izvedene aminokiselinske sekvence prikazane su u sekvencama čiji su ID brojevi: , respektivno.

Primer 22: Konstrukcija fuzionih proteina 2H7 scFv IgG sa mutacijama regiona šarke

Konstruisan je fuzioni protein 2H7 scFv IgG sa trećim cisteinskim ostatkom u regionu šarke IgGl supstituisanim serinskim ostatkom. Model za uvođenje mutacija bio je polinukleotid koji kodira 2H7 scFv WTH WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ). Oligonukleotid kojim je uvedena mutacija bio je 5' oligonukleotidni prajmer za PCR HIgGMHcys3 sa sekvencom: 5'-gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgt cea ccg tcc cea gca cct-3'. Oligonukleotid kojim je uvedena mutacija u region šarke pomešan je sa modelom i 3' oligonukleotidom koji sadrži Xbal mesto (označeno podvučenim i iskošenim slovima) (5'-gtt gtttct asatca ttt acc cgg aga cag gga gag get ctt ctg cgt gta g-3' (sekvenca čiji je ID broj: )) kako bi se amplifikovale sekvence mutiranog regiona šarke-divljeg tipa (WT)-CH2-CH3 pomoću PCR. IgG MTH CCS mutirana sekvenca amplifikovana je u 30 ciklusa sa denaturacionim profilom od 94 °C, ciklizacijom na 50 °C tokom 30 sekundi i produžavanjem na 72 °C tokom 30 sekundi. Amplifikovani polinukleotidi ubačeni su u TOPO® vektor za kloniranje (Invitrogen Life Technologies) a potom sekvencirani kao što je opisano u primeru 1 kako bi se potvrdilo prisustvo mutacije. pD18 vektor koji sadrži 2H7 scFv hidrolizovan je kako bi se uklonile sekvence konstantnih regiona, u suštini na način opisan u primeru 10. Regioni mutiranog regiona šarke-divljeg tipa-CH2-CH3 ubačeni su u okvir u hidrolizovani DNK vektor kako bi se-dobili vektori koji sadrže DNK koja kodira 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J. Izvedena polipeptidna sekvenca prikazana je u sekvenci čiji je ID broj: .

Primer 23: Pobijanje anti- CD20 IgE fuzionih proteina

Vezujući domen fuzionisan je za sekvence konstantnog regiona IgE tako da je eksprimirani polipeptid u stanju da pokrene mehanizam alergijskog odgovora. Nukleotidna sekvenca jednolančanog Fv 40.2.220 (sekvenca čiji je IP broj: ), anti-CP20 antitela, fuzionisana je za IgE CH2-CH3-CH4 prema postupcima opisanim za druge konstrukte scFv konstantnih regiona imunoglobulina (videti primere 1, 5, 10 i 13). Kako bi se domeni IgE CH2-CH3-CH4 amplifikovali pomoću PCR, upotrebljeni su 5' oligonukleotidni prajmer, hIgE5Bcl, sa sekvencom: 5'-gtt gtt gat cac gtc tgc tcc agg gac ttc acc cc-3', i 3' oligonukleotidni prajmer hIgE3stop, sa sekvencom 5'- gtt gtt tct aga tta act ttt acc ggg att tac aga cac cgc teg ctg g-3'.

Za konstrukciju fuzionog proteina 40.2.220 scFv IgE-CP80 koristi se retrovirusni sistem

za transfekciju za ektopičnu površinsku ekspresiju receptora sa površine ćelija, dobijenih genetskim inžinjeringom, koji se sastoje od scFv koji vežu kostimulatorne receptore opisane u primeru 12. Fuziona polinukleotidna sekvenca 40.2.220 scFv IgE fuzionisana je u okvir u sekvence koje kodiraju transmembranski domen i citoplazmatski rep humanog CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ), tako da, kada se fuzioni protein eksprimira u transficiranoj ćeliji, CD80 obezbeđuje sidro za površinsku ekspresiju fuzionog proteina scFv Ig. cDNK koja kodira fuzione proteine anti-CD40 scFv-IgE-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ) ubačena je u retrovirusni vektor pLNCX (BD Biosciences Clontech) prema standardnim procedurama molekularne biologije i prema uputstvima prodavca. cDNK 40.2.220 scFv-Ig-CD80 ubačena je između sekvenci 5' LTR - gena za rezistenciju na neomicin - CMV promotera i 3' LTR sekvence. Retrovirusni konstrukti su transficirani u ćelijsku liniju karcinoma, nakon čega su transficirane ćelije ispitane kako bi se odabrali klonovi koji eksprimiraju fuzione proteine 40.2.220 scFv-Ig-CD80 na ćelijskoj površini.

Primer 24: Pobijanje IgA- T4 mutanata koji se eksprimiraju na ćelijskoj površini •

Za dobijanje fuzionog proteina 2H7 scFv regiona šarke IgA-T4-CP80 koristi se retrovirusni sistem za transfekciju za ektopičnu površinsku ekspresiju receptora sa površine ćelija dobij enih genetskim inžinjeringom, koji se sastoje od scFv koji vežu kostimulatorne receptore opisane u primeru 12. Fuziona polinukleotidna sekvenca 2H7 scFv IgAH IgA-T4 (sekvenca čiji je IP broj: ) fuzionisana je u okvir u sekvence koje kodiraju transmembranski domen i citoplazmatski rep humanog CP80 (sekvenca čiji je IP broj: ), tako da, kada se fuzioni protein eksprimira u transficiranoj ćeliji, CP80 obezbeđuje sidro za površinsku ekspresiju fuzionog proteina scFv Ig. cPNK koja kodira fuzione proteine 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CP80 (sekvenca čiji je IP broj: ) ubačena je u retrovirusni vektor pLNCX (BP Biosciences Clontech) prema standardnim procedurama molekularne biologije i prema uputstvima prodavca. cPNK 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CP80 ubačena je između sekvenci 5' LTR - gena za rezistenciju na neomicin - CMV promotera i 3' LTR sekvence. Retrovirusni konstrukti su transficirani u Reh, ćelijsku liniju akutne limfocitične leukemije (ATCC CRL-8286). Transficirane ćelije su ispitane kako bi se odabrali klonovi koji eksprimiraju fuzione proteine 2H7 scFv-Ig na ćelijskoj površini.

Primer 25: Karakterizacija anti- 4- lBB scFv Ig- CP80 fuzionih proteina eksprimiranih na

ćelijskoj površini ćelija tumora i rast ćelija tumorain vivo

Ovaj primer opisuje dobijanje anti-mišjeg 4-1BB (CP137) scFv fuzionog proteina koji ima region šarke i CH2 i CH3 domene divljeg tipa IgG fuzionisane za transmembranski domen i domen citoplazmatskog repa CP80. Ovaj primer takođe prikazuje dejstvo ekspresije polipeptida anti-4-lBB scFv IgG CD80 na ćelijskoj površini kada se transficirane ćelije tumora presade u miševe.

Klonirani su varijabilni regioni teškog i lakog lanca anti-4-lBB (CD 137) monoklonskog antitela (1D8) pacova, te je pripremljen jednolančani Fv konstrukt, u suštini kao što je opisano u primeru 1. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca svakog antitela klonirani su prema standardnim postupcima za kloniranje gena imunoglobulina i kao što je opisano u primeru 1. Jednolančani Fv konstrukt dobijen je kao što je opisano u primeru 1, ubacivanjem nukleotidne sekvence koja kodira (gly4ser)3povezujući peptid između nukleotidne sekvence VL regiona 1D8 (sekvenca čiji je ID broj: ) i nukleotidne sekvence VH regiona 1D8 (sekvenca čiji je ID broj: ). Polipeptidna sekvenca VL 1D8 je prikazana kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je polipeptidna sekvenca VH domena prikazana kao sekvenca čiji je ID broj: . Polinukleotid scFv (sekvenca čiji je ID broj: ) je potom fuzionisan za region šarke-CH2-CH3 domene humanog IgGl prema postupcima opisanim u primeru 1. Sekvenca fuzionog polinukleotida scFv IgGl je, zatim, fuzionisana u okviru u sekvence koje kodiraju transmembranski domen i citoplazmatski rep humanog CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ), suštinski na način opisan u primeru 12, tako da kada je fuzioni protein eksprimiran u transficiranoj ćeliji, CD80 obezbeđuje sidro za površinsku ekspresiju fuzionog proteina scFv Ig. cDNK koja kodira fuzione proteine scFv-IgG-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ) ubačena je u retrovirusni vektor pLNCX (BD Biosciences Clontech) prema standardnim procedurama molekularne biologije i prema uputstvima prodavca. cDNK scFv-IgG-CD80 ubačena je između sekvenci 5' LTR - gena.za rezistenciju na neomicin - CMV promotera i 3' LTR sekvence.

Retrovirusni konstrukti su transficirani u metastazirani M2 klon K1735, ćelijsku liniju melanoma, dobijenu preko Dr. I. Hellstrom, PNRI, Seattle, WA. Transficirane ćelije su ispitane kako bi se odabrali oni klonovi koji eksprimiraju scFv-Ig fuzione proteine na ćelijskoj površini. Kako bi se pokazalo daje konstrukt 1D8 scFv IgG-CD80 eksprimiran na ćelijskoj površini ćelija tumora, transficirane ćelije analizirane su pomoću protočne imunocitofluorimetrije. Transficirane ćelije (K1735-1D8) inkubirane su jedan čas na ledu u kozjem anti-humanom IgG F(ab')2konjugovanim sa fikoeritrinom. Nevezani konjugat je potom uklonjen ispiranjem ćelija, te je izvršena protočna citometrijska analiza pomoću Coulter Epics XL sortera ćelija. Rezultati su prikazani na slici 41 A.

Rast transficiranih ćelija K1735-1D8 ispitan jein vivo.K1735-WT ćelije su progresivno rasle kada su potkožno (s.c.) usađene u neiskusne CH3 miševe. Iako je ista doza ćelija Kl735-1D8 prvobitno dovela do razvoja tumora površine približno 30 mm , tumori su ušli u regresiju oko sedmog dana da bi do dvadesetog dana u potpunosti nestali, kao što se vidi na slici 41B. Ćelije tumora koje su bile transficirane sa slično konstruisanim vektorom koji je kodirao nevezujući scFv, konstrukt humanog anti-CD28 scFv, rasle su kao i ćelije tumora koje nisu bile transficirane. Prisustvo stranog proteina, to jest, konstantnih domena humanog IgGl ili varijabilnih regiona pacova, nije učinilo K1735-VVT ćelije imunogenim; rast K1735-1D8 ćelija u CH3 miševima bio je isti kao rast K1735-WT ćelija (netransficiranih).

Kako bi se ispitala uloga CD4<+>i CD8<+>T limfocita i NK ćelija u regresiji K1735-1D8 tumora, monoklonska antitela (monoklonska antitela, obično 50 pg u zapremini od 0,1 ml) intraperitonealno (i.p.) su ubrizgana neiskusnim miševima, kako bi se uklonili CD8<+>, CD4<+>ili i CD4<+>i CD8<+>T limfociti, ili su im ubrizgana zečja anti-asijalo GM1 antitela kako bi se uklonile NK ćelije. Nakon dvanaest dana, kada je protočna citometrijska analiza ćelija slezine miševa koji su identično tretirani pokazala da su ciljane populacije T ćelija iskorenjene, K1735-LD8 su presađene s.c. svakoj grupi sa iskorenjenim T ćelijama. K1735-1D8 su imale sličnu kinetiku rasta u miševima kojima su ubrizgani anti-CD8 Mab ili kontrolni IgG pacova, dok je uklanjanje CD4<+>dovelo do rasta K1735-1D8 sa istom kinetikom kao i K1735-WT. Ova nemogućnost zaustavljanja rasta tumora nakon uklanjanja CD4<+>T ćelija primećena je bez obzira na prisustvo ili odsustvo CD8<+>T ćelija. K1735-1D8 su rasle u svim miševima sa iskorenjenim NK, iako je rasla sporije u grupi kojoj su iskorenjene CD4 ćelije. Rezultati su prikazani na slici 41C.

Primer 26: Terapeutsko dejstvo tumorskih ćelija koje eksprimiraju anti- 4- lBB scFv IgG-CD80 fuzione proteine

U ovom primeru se ispituje sposobnost tumorskih ćelija transficiranih K1735-1D8 koje eksprimiraju anti-CD137 scFv na svojoj ćelijskoj površini, da kod miševa izazovu dovoljan imuni odgovor koji će dovesti do odbacivanja razvijenih, netransficiranih tumora divljeg tipa. CH3 miševima presađeni su K1735-WT tumori (2 x IO<6>ćelija po životinji) i gajeni približno šest dana. U eksperimentima su korišćeni miševi sa razvijenim K1735-WT tumorima površine od oko 30 mm . Miševi su vakcinisani s.c. injekcijom K1735-1D8 ili ozračenih K1735-WT ćelija na kontralateralnoj strani. Identične injekcije ponavljane su u danima označenim na slici 42. Jednoj grupi životinja date su četiri nedeljne injekcije K1735-1D8 ćelija. Prema istom rasporedu, drugoj grupi su davane ozračene (12000 rad) K1735-WT ćelije, dok je trećoj grupi davan PBS. WT tumori su progresivno rasli kod svih kontrolnih miševa, kao i kod svih miševa koji su primali ozračene K1735-WT ćelije. Nasupiot tome, kod 4 od 5 miševa tretiranih imunizacijom pomoću K1735-1D8 došlo je do regresije tumora. Kada je eksperiment završen, tri meseca kasnije, kod ovih životinja tumor se nije ponovo javio, niti su se javili znaci toksičnosti. Kod petog miša, modul tumora bio je smanjen sve dok je životinja primala terapiju K1735-1D8 ćelijama, ali je tumor ponovo porastao kada je terapija prekinuta.

U drugom eksperimentu sa po pet miševa u svakoj grupi, miševima je intravenski (i.v.) davano po 3 x 10<5>K1735-WT ćelija kako bi se izazvale metastaze na plućima. Nakon tri dana, K1735-1D8 ćelije presađene su s.c. Ova procedura ponavljana je jednom nedeljno tokom mesec dana; kontrolnim miševima ubrizgavan je PBS. Eksperiment je prekinut kada je uginuo jedan miš u kontrolnoj grupi, 37 dana nakon što je primio K1735-WT ćelije. U tom trenutku, pluća kontrolnih miševa imala su po više od 500 metastatičkih fokusa. Nasuprot tome, u plućima imunizovanih miševa bilo je po manje od 10 metastatičkih fokusa.

U trećem eksperimentu, imunokompetentnim singeničnim CH3 miševima ubrizgavana je smeša K1735-WT ćelija i K1735-1D8 ćelija. Miševima su potkožno ubrizgavane same K1735-WT ćelije, ili smeša 2 x IO<6>K1735-WT ćelija i 2 x IO<5>K1735-1D8 ćelija. Rast tumora praćenje u petodnevnim intervalima.

Primer 27: Ekspresija anti- 4- lBB scFv- CD80 fuzionog proteina na ćelijskoj površini

ćelija sarkoma

Ovaj primer pokazuje ekspresiju anti-CD137 scFv na ćelijskoj površini drugog tipa ćelija tumora transficiranjem mišje ćelijske linije sarkoma konstruktom anti-CD137 scFv Ig-CD80.

Polinukleotid 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80 (sekvenca čiji je ID broj: _J prebačen je iz pLNCX vektora u pCDNA3-hygro vektor pomoću hidrolize restrikcionim enzimom i povezivanjem prema standardnim postupcima molekularne biologije. Konstrukt je isečen pomoću Hindlll + Clal, scFv fragment je dopunjen sa Klenow (Roche) pa je fragment sa tupim ivicama povezan u EcoRV mesto pcDNA3. Ćelije tumora Agi04 mišjeg sarkoma su transficirane pCDNA3-hygro vektorom koji sadrži fuzioni protein 1D8 scFv IgG CD80. Klonovi rezistentni na higromicin ispitani su protočnom citometrijom pomoću anti-humanog IgG antitela konjugovanog sa FITC kako bi se detektovala ekspresija transgena. Prvobitno je samo kod 15% klonova bio detektovan fuzioni protein. Pozitivne ćelije identifikovane protočnom citometrijom više puta su izdvajane u bocama presvučenim imobilizovanim anti-humanim IgG (10 pg/ml) prema standardnim postupcima. Izdvajanje je izvršeno inkubiranjem ćelija na presvučenim pločama 30 minuta na 37 °C; ploče su potom ispirane 2 do 3 puta u versenu ili PBS. Nakon svakog kruga izdvajanja, ispitivana je ekspresija IgG u ćelijama pomoću FACS. Histogram na slici 44 ptikazuje profil bojenja nakon četiri kruga izdvajanja prema anti-humanom IgG (crno). Netransficirane ćelije su obojene, i označene su sivom bojom. Sve ćelije u populaciji bile su pozitivne.

Primer 28: Dobijanje i kategorizacija bispecifičnog fuzionog proteina scFv Ig i fuzionih

proteina scFv Ig sa mutacijom u CH2 domenu IgGl

Dobijen je anti-CD20 (2H7) scFv IgG fuzioni protein koji je imao mutirani region šarke (MT (SSS)) i mutirani CH2 domen u kome je ostatak prolina na položaju 238 (numeracija prema Wardet al, supra)supstituisan serinom. Polipeptid koji kodira 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) dobijen je, u suštini, prema postupcima opisan u primerima 1, 5 i 13. Mutirani region šarke IgG-mutirani CH2 domen-domen CH3 divljeg tipa fuzionisani su još i za anti-CD20 (2H7)-anti-CD40 (40.2.220) bispecifično scFv. Polinukleotid koji kodira anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 prikazanje u sekvenci čiji je ID broj: , dok je polipeptid koji on kodira prikazan kao sekvenca čiji je ID broj: .

COS ćelije su prolazno transficirane vektorima koji sadrže polinukleotidne sekvence koje kodiraju 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J; anti-CD20-anti-CD40 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _); i 2H7 scFv IgAH IgG VVTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ) kao što je opisano u primeru 10. Supernatanti kulture su sakupljeni,

te su fuzioni proteini prečišćeni pomoću hromatografije na proteinu A (videti primer 10). Rituksimab (anti-CD20 monoklonsko antitelo) i već obojeni standardi molekulske mase od Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) i standardi molekulske mase Multimark® (Invitrogen Life Technologies) takođe su naneti na gel. Rezultati su prikazani na slici 45.

Fuzioni protein koji sadrži mutaciju u CH2 domenu upoređen je u ADCC testu sa fuzionim proteinima koji sadrže CH2 domen divljeg tipa. Testovi su izvršeni, u suštini, kao što je opisano u primerima 11 i 19. Svže PBMC u mirovanju (efektorske ćelije) dodate su BJAB ćelijama obeleženim pomoću<51>Cr (ciljnim ćelijama) u odnosima naznačenim na slici 46. Prečišćeni 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3 i Rituksimab, svaki u koncentraciji od 10 pg/ml dodati su smešama efektorskih i ciljnih ćelija i inkubirani pet časova na 37 °C. Supernatanti su sakupljeni, pa je određena količina oslobođenog hroma kao što je opisano u primerima 11 i 19. Procenat specifičnog usmrćivanja za svaki fuzioni protein dat je na slici 46.

Primer 29: Ekspresija anti- humanog CD3 scFv IgG fuzionog proteina na površini ćelija

tumora

Anti-humani CD3 scFv Ig CD80 fuzioni protein dobijen je, u suštini, kao što je opisano u primerima 1 i 12. Fuzioni protein sadržao je anti-humani CD3 scFv fuzionisan za region šarke divljeg tipa IgGl (sekvenca čiji je ID broj: ), CH2 (sekvenca čiji je ID broj: ) i CH3 domene divljeg tipa (sekvenca čiji je ID broj: ), fuzionisane za transmembranski i citoplazmatski domen CD80 (sekvenca čiji je ID broj: ) kako bi se omogućila ekspresija anti-CD3 scFv na ćelijskoj površini. Polinukleotid anti-humanog CD3 scFv IgG WTH WTCH2CH3:CD80

(sekvenca čiji je ID broj: ) koji kodira dati polipeptid (sekvenca čiji je ID broj: ) transficiran je u Reh ćelije i u T51 ćelije (limfoblastoidna ćelijska linija). Ekspresija anti-humanog CD3 scFv

IgG fuzionog proteina detektovana je protočnom citometrijom pomoću kozjeg anti-humanog IgG konjugovanog za FITC (videti postupke u primerima 4, 10, 16, 18). Na slici 47A prikazana je ekspresija fuzionog proteina anti-humanog CD3 na ćelijskoj površini Reh ćelija, dok je na slici 47B prikazana ekspresija fuzionog proteina na T41 ćelijama.

Na transficiranim Reh i T51 ćelijama izvršeni su ADCC testovi da bi se utvrdilo da li je ekspresija scFv-Ig polipeptida na površini ćelija pojačavala efektorske funkcije ćelija. Netransficirane i transficirane Reh ćelije i netransficirane i transficirane T51 ćelije predhodno suobeležene inkubiranjem sa 51 Cr (100 uCi) (Amercham) tokom 2 časa na 37 °C. Humane PBMC ćelije korišćene su kao efektorske ćelije i dodate su ciljnim ćelijama (5 x IO4 ćelija po polju u pločama sa po 96 polja) pri odnosima 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1 i 2,5 : 1. Nakon četiri časa na 37 °C supernatanti kulture su sakupljeni i analizirani kao što je opisano u primerima 11 i 12. Procenat specifičnog usmrćivanja izračunat je kao što je opisano u primeru 12. Rezultati su prikazani na slici 48.

Primer 30: Indukcija ekspresije citokina u ćelijama tumora koje eksprimiraju anti- CD28

scFv na ćelijskoj površini

U ovom primeru opisano je dejstvo scFv eksprimiranih na ćelijskoj površini na indukciju iRNK citokina u stimulisanim limfocitima gajenim u kulturi sa ćelijama tumora transficiranim fuzionim proteinom anti-humanog CD28 scFv IgG-CD80.

PCR analiza u stvarnom vremenu izvršena je na uzorcima RNK iz humanih PBMC stimulisanih pomoću Reh, Reh-anti-CD28 (2el2) (videti primer 12 za dobijanje 2el2 scFv IgG WTH WTCH3CH2-CD80 i transfekciju Reh ćelija) i Reh-CD80 (videti primer 14) kako bi se izmerilo dejstvo scFv eksprimiranih na površini na proizvodnju citokina u PBMC efektorskim ćelijama. Za PCR test u stvarnom vremenu, korišćen je SYBR Green (QIAGEN) (Morrisonet al, Biotechniques24: 954 - 8, 960, 962 (1998)) a merenja su izvršena pomoću ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System sistema za detekciju sekvence (Applied Biosystems, Foster City, CA) kojim se meri nastajanje proizvoda PCR nakon svakog ciklusa amplifikacije. Ćelije iz kultura su sakupljene te je dobijena ukupna RNK pomoću QUIAGEN RNA kompleta, uključujući sistem za prečišćavanje QIA cepajuće kolone za homogenizaciju lizata ćelija, i RNeasv® mini kolona za prečišćavanje RNK. cDNK je dobijena reverznom transkripcijom korišćenjem jednakih količina RNK iz svake vrste ćelije i Superscript II reverzne transkriptaze (Life Technologies). Zatim je izvršena SYBR Green PCR analiza u stvarnom vremenu korišćenjem dobijene cDNK kao modela i parova prajmera specifičnih za proizvode gena citokina. Prosečna dužina PCR proizvoda koji su amplifikovani bila je u granicama od 150 do 250 baznih parova. Ispitivane su koncentracije cDNK mnogih molekula aktivacije, uključujući IFNy, TNFa, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, ICOSL, CD80 i CD86. U svakom testu merene su i koncentracije kontrolnih refernentnih cDNK za konstitutivno eksprimiranje gene, uključujući GAPDH, p-aktin, i CD3d. Najznačajnija indukcija specifičnih iRNK primećena je za IFN-y, dok je nešto slabija indukcija otkrivena kod CTLA-4 i ICOS.

Primer 31: Kloniranje anti- humanog 4- 1BB antitela i dobijanje fuzionog proteina anti-humanog 4- 1BB scFv Ig

Ćelijska linija hibridoma u kojoj se eksprimira mišje anti-humano monoklonsko antitelo (označena kao 5B9) dobijena je od Dr. Robert Mittler, Emory University Vaccine Genter, Atlanta, GA. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca klonirani su prema poznatim postupcima za kloniranje gena imunoglobulina i kao što je ovde opisano. Ćelije su gajene u IMDM/15% FBS (Invitrogen Life Technologies) podlozi tokom nekoliko dana. Ćelije u fazi logaritamskog rasta sakupljene su iz kultura, te je izolovana ukupna RNK pomoću QUIAGEN RNA kompleta, uključujući sistem za prečišćavanje QIA cepajuće kolone za homogenizaciju lizata ćelija, i RNeasy® mini kolona za prečišćavanje RNK, prema uputstvima proizvođača. cDNK je dobijena reverznom transkripcijom korišćenjem heksamernih prajmera nasumične sekvence i Superscript II reverzne transkriptaze (Invitrogen Life Technologies).

Na cDNK je dodat rep-sidro, korišćenjem terminalne transferaze i dGTP. Potom je izvršena PCR analiza korišćenjem prajmera komplementarnog repu-sidru i prajmeru koji je specifično ciklizovao za komplementarni lanac konstantnog regiona bilo mišjeg Ck (za amplifikaciju VL) ili odgovarajućeg izotopa mišjeg CH1 (za amplifikaciju VH). Amplifikovani fragmenti varijabilnog regiona klonirani su pomoću TOPO® (Invitrogen Life Technologies), te su klonovi sa ubačenim delovima željene dužine sekvencirani. Koncenzus sekvenca za svaki varijabilni region određena je iz sekvence bar četiri nezavisna klona. Polinukleotidne sekvence 5B9 VL i VH prikazane su kao sekvence čiji su ID brojevi: i , respektivno, dok su izvedene polipeptidne sekvence prikazane kao sekvence čiji su ID brojevi: i , respektivno. scFv je konstruisan pomoću "spajajućih" (sewing) PCR postupka korišćenjem preklapajućih prajmera koji sadrže sintetički (Gly4Ser)3povezujući domen ubačen između varijabilnih regiona lakog i teškog lanca (videti primer 1). Polipeptid 5B9 scFv (sekvenca čiji je ID broj: ) kodiran je polinukleotidnom sekvencom koja sadrži sekvencu čiji je ID broj: .

Polinukleotidna sekvenca 5B9 scFv fuzionisana je u okviru za polinukleotidnu sekvencu

koja kodira mutirani regiona šarke humasnog IgGl i CH2 i CH3 divljeg tipa (MTH (SSS) WTCH2CH3, sekvenca čiji je ID broj: ) prema postupcima opisanim u primerima 5, 10 i 13. COS ćelije su prolazno transficirane vektorom koji sadrži polinukleotidnu sekvencu 5B9 scFv

IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: ). Supernatant je sakupljen, pa je mereno vezivanje 5B9 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3 polipeptida (sekvenca čiji je ID broj: ) pomoću protočne imunocitofluorimetrije, u suštini kao što je opisano u primerima 4, 10, 16 i 18. Supernatant kulture iz 5B9 linije hibridoma takođe je uključen u test vezivanja. Sveže humane PBMC su inkubirane u prisustvu imobilizovanog anti-CD3 četiri dana pre eksperimenta vezivanja kako bi se_ izazvala ekspresija CD137 na površini aktiviranih T ćelija. Stimulisane PBMC su isprane i inkubirane sa supernatantima kulture COS ili hibridoma, koji sadrže fuzioni protein 5B9 scFv IgG ili 5B9 monoklonsko antitelo, respketivno, tokom jednog časa na ledu. Vezivanje fuzionog proteina 5B9 scFv IgG ili 5B9 monoklonskog antitela detektovano je pomoću kozjeg anti-humanog IgG ili anti-mišjeg IgG, respektivno, konjugovanog za FITC. Rezultati su prikazani na slici 49.

Primer 32: Pobijanje fuzionog proteina 2H7 scFv IgG sa mutacijama regiona šarke

Fuzioni proteini 2H7 scFv IgG konstruisani su sa prvim ostatkom cisteina i drugim ostatkom cisteina u regionu šarke IgGl supstituisanim serinskim ostacima, čime se dobija MTH (SCC) i MTH (CSC). Model za uvođenje mutacija je polinukleotid koji kodira 2H7 scFv WTH WTCH2CH3 (sekvenca čiji je IP broj: ). Oligonukleotidi kojim se uvode mutacije su 5' oligonukleotidni prajmeri za PCR HIgGMHcvsl (sekvenca čiji je ID broj: ) i HIgGMHcys2 (sekvenca čiji je ID broj: ). Konstrukti su dobijeni kao stoje opisano u sekvenci čiji je ID broj: . Kodirajući polinukleotidi mutanata predstavljeni su u sekvencama čiji su ID brojevi: a polipeptidne sekvence date su u sekvenci čiji je ID broj: .

Primer 33: Pobijanje 2H7 VHL11S scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Promena leucina u serin u položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca (obeležavanje brojeva prema Kabatet al, Sequences of Proteins of Immunological lnterest,5. izdanje, Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)) uvedena je u fuzioni protein 2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J. Ostatak leucina divljeg tipa supstituisan je serinom pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu, upotrebom oligonukleotida Vhserl 1: 5'-gga ggt ggg age tct cag get tat cta cag cag tct ggg get gag teg gtg agg cc-3' (sekvenca čiji je ID broj: __). 3' prajmer za PCR bio je huIgGl-3" cija je sekvenca: 5'-gtctct asacta tca ttt acc cgg aga cag-3' (sekvenca čiji je ID broj: _) (Xbal mesto označeno je podvčenim, iskošenim slovima). Nakon amplifikacije pomoću PCR, fragmenti su ubačeni u TOPO® vektor za kloniranje i sekvencirani kako bi se potvrdilo postojanje mutacije VHII leucina u serin. DNK koja kodira 2H7 scFv-IgG (SSS-S)H WCH2 WCH3 prebačena je u PSL1180 vektor za kloniranje (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Konstrukt PSL1180-2H7 scFv-IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3 hidrolizovan je dejstvom Sac i Xbal kako bi se uklonio VH domen divljeg tipa i povezujući region i CH2 i CH3 domeni. Proizvod dobijen pomoću PCR

koji sadrži VHI 1 mutant hidrolizovan je dejstvom Sac i Xbal a potom ubačen u hidrolizovani konstrukt PSL1180 prema standardnim procedurama molekularne biologije. Konstrukt je potom hidrolizovan dejstvom Hind III i Xbal, i ubačen u sisarski vektor za ekspresiju pD18 (videti postupke opisane u primeru 1 i primeru 10). Mutant je označen kao 2H7 scFv VH L11S IgG (SSS-S) H WCH2 WCH3. Polinukleotidna sekvenca dataje kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je kodirana polipeptidna sekvenca data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 34: Ekspresija 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H WCH2 WCH3 u stabilnim linijama

CHO

CHO DG44 ćelije elektroporacijom su transficirane sa približno 150 mikrograma linearizovanog plazmida za ekspresiju koji kodira 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3. Kulture su zasejane na ploče sa selektivnom podlogom koja sadrži 100 nM metotreksata

u pločama za gajenje kulture sa po 96 polja sa ravnim dnom pri različitom broju ćelija/polju, u granicama od 125 do 2000. Selekcionisani su klonovi rezistentni na metotreksat te su supernatanti kultura ispitani pomoću testa vezivanja CD20CHO, sličnog onom opisanom za sliku

1, kako bi se pronašao najveći nivo ekspresije fuzionog proteina. Nakon prvobitne selekcije klonovi su amplifikovani postepenim povećavanjem doze metotreksata. Ćelije su dva puta presejavane na podlogu sa svakom od koncentracija metotreksata pre svakog povećanja doze na sledeću koncentraciju. Klonovi su amplifikovani pri konačnoj koncentraciji metotreksata od 1 pM.

Na slici 50B prikazani su nivoi proizvodnje 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3. Istrošeni supernatanti iz amplifikovanih CHO ćelija koje eksprimiraju ovaj molekul i koje su rasle u stacionarnim T25 bocama ispitivani su na kvantitativno vezivanje za CD20 CHO ćelije pomoću protočne citometrije. Aktivnost je prevedena u koncentraciju proteina pomoću standardne krive koja je dobijena korišćenjem istog molekula prečišćenog iz supernatanata pomoću afinitetne hromatografije na proteinu A (slika 50A). Koncentracija prečišćenog proteina utvrđena je pomoću A280, korišćenjem ekstinkcionog koeficijenta dobijenog iz aminokiselinskog sastava rekombinantnog proteina (Vector NTI). Iako se nivo proizvodnje razlikovao među ispitanim klonovima, veći broj klonova pokazao je proizvodnju veću od 1 mg/ml. Ovaj nivo ekspresije proteina je više od desetostruko viši nego nivo ekspresije istog molekula bez aminokiselinske promene u Vh.

Na slici 51 prikazani su nivoi proizvodnje 2H7 VH LI 1S scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 pomoću polukvantitativne SDS-PAGE analize. Deset mikrolitara istrošenog supernatanta iz amplifikovanih CHO ćelija koje eksprimiraju ovaj molekul a rasle su u stacionarnim T25 bocama pomešano je sa 10 mikrolitara 2X neredukujućeg SDS pufera za uzorak, analizirano na SDS-PAGE gelovima i obojeno pomoću boje coomassie blue.

Primer 35: Pobijanje i kapacitet vezivanja G28- 1 scFv Ig konstrukta

Konstrukcija G28-1 (anti-CP37) scFv izvršena je korišćenjem ukupnih RNK izolovanih

iz G28-1 hibridoma korišćenjem Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. CPNK je dobijena korišćenjem prajmera sa nasumičnom sekvencom i protokola koji je predhodno opisan za kloniranje 2H7 u primeru 1. Varijabilni domeni scFv klonirani su korišćenjem jednog od dva postupka: prvi postupak podrazumeva upotrebu porodice degenerisanih 5' oligonukleotida specifičnih za svaku porodicu gena V regiona i jedinstvenog 3' prajmera specifičnog za konstantni region bilo lakog bilo teškog lanca korišćenjem postupaka i prajmera opisanih u (Ig-Prime Kit Mouse Ig-Primer Set, Novagen). Prugi pristup podrazumeva upotrebu postupaka dodavanja repa-sidra i prajmera opisanih u (Gilliland LK et al, Tissue Antigens 47: 1 - 20 (1995)). U svakom slučaju, proizvodi amplifikovani pomoću PCR klonirani

su u TOPO vektor za kloniranje (Invitrogen). Klonovi su hidroliozovani dejstvom EcoRI i ispitivani na prisustvo ubačenih sekvenci željene veličine. Pozitivni klonovi su sekvencirani kao što je objašanjeno u primeru 1.

Potom su za svaki V region konstruisani specifični prajmeri, jedan sa vodećom sekvencom i jedan bez nje. Konstruisani su i prajmeri koji obuhvataju željene povezujuće regione i/ili restrikciona mesta na krajevima prajemera. PCR reakcije su izvođene na DNK kloniranoj u TOPO korišćenjem programa sa 25 ciklusa sa sledećim profilom: 94 C, 30 sek; 55

C, 30 sek; 72 C, 30 sek; praćenim konačnim produživanjem na 72 C tokom 8 minuta. Proizvodi dobijeni pomoću PCR prečišćeni su na gelu, te su dobijeni fragmenti izolovani korišćenjem

QIAQUICK kompleta za estrahovanje gelova (QIAGEN, Valencia, CA). Fragmenti su razblaženi 1 : 50, te je 1 mikrolitar upotrebljen za SEWING PCR (spajajuću PCR) prema postupcima opisanim u primeru 1. Sledeći oligonukleotidi korišćeni su za sekundarne PCR reakcije za VLdomen G28-1 scFv:

5' prajmeri sa Sali mestom bez vodeće sekvence: 5'-

5' prajmer sa Hindlll mestom i vodećom sekvencom; 5'- 3' prajmer: 5'-

Prajmeri korišćeni za Vhdomen prikazani su ispod:

5' prajmer istog smisla:

3' prajmer komplementarnog smisla sa Bell mestom: 5'-

Promena leucina u serin na položaju 11 u varijabilnom regionu teškog lanca (Kabat obeležavanje brojeva) uvedena je u G28-1 scFv pomoću mutageneze upravljene ka određenom mestu. Oblik G28-1 scFv divljeg tipa prvobitno je konstruisan pomoću spajajuće/preklapajuće PCR kako bi se ubacio (Gly4Ser)3povezujući region između VL i VH domena, kao što je predhodno opisano. Međutim, u ovoj fuziji varijabilnih domena nije ubačeno ni jedno SacI mesto, te su korišćena obližnja, alternativna restrikciona mesta (HaelI i PvuII) blizu leucina 11 kako bi se sintetisao domen VL + mutirani VH. Prajmeri su konstruisani tako da sadrže jedno od ovih mesta i DNK koja sadrži promenu L u S, za kojom slede 12 baznih parova divljeg tipa. Nekoliko pokušaja upotrebe ove strategije nije urodilo plodom, te je za uvođenje željene mutacije upotrebljena alternativna strategija koja podrazumeva upotrebu Genetailor (Invitrogen) postupka za mutagenezu upravljenu ka određenom mestu. Mutageneza je izvedena prema uputstvima proizvođača. Ukratko, procedura podrazumeva metilaciju plazmidne DNK pomoću DNK metilaze, amplifikaciju DNK u reakciji mutageneze sa dva preklapajuća prajmera, od kojih jedan sadrži ciljnu mutaciju, transformaciju plazmida u E. Coli divljeg tipa koja hidrolizuje svu metilovanu DNK čime opstaje samo nemetilovani, mutirani proizvod amplifikacije. Oba prajmera dugačka su približno 30 nukleotida (bez mutacije na mutagenom prajmeru), sa preklapajućim regionom na 5' krajevima koji obuhvata 15 do 20 nukleotida, za efikasnije spajanje krajeva proizvoda mutageneze. Kao model za reakciju mutageneze upotrebljeno je 100 ng plazmida koji sadrži konstrukt G28-1 scFv Ig, a prajmeri koji su korišćeni za mutagenezu VH G28-1 su sledeći:

Prajmer za reakciju ka napred:

Reverzni prajmer:

PCR reakcije su izvršene korišćenjem 15 ng metilovanog modela, prajmera koji su predhodno opisani i uobičajenih sastojke koji se koriste u reakcijama koji su predhodno opisani. Za amplifikaciju je korišćen program od 20 ciklusa sa sledećim profilom: 94C, 30 sek; 55C, 30 sek; 68 C, 8 min praćen konačnim korakom produžavanja koji je trajao 10 minuta. Proizvodi dobijeni pomoću PCR transformisani su u bakterije divljeg tipa, a kolonije su ispitivane sekvenciranjem. Klonovi koji su imali samo željeni mutaciju su izolovani te su plazmidi dobijeni na način opisan predhodno za primer 33. Mutant je označen kao G28-1 scFv VH LI 1S (SSS-S) H WCH2 WCH3. Sekvenca polinukleotida data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca kodiranog polipeptida data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Nivo ekspresije fuzionog proteina G28-1 potvrđen je pomoću imunoblot analize prema postupcima opisanim u primeru 10. Na slici 53 prikazanje veliki porast ekspresije proteina kod VH L11S mutanata G28-1 fuzionih proteina u poređenju sa G28-1 fuzionim proteinima bez mutacije.

G28-1 scFv Ig fuzioni proteini prolazno su transficirani i eksprimirani u COS ćelijama prema postupcima opisanim u primeru 10. Na slici 52 prikazan je kapacitet G28-1 scFv Ig fuzionih proteina iz COS supernatanata da vežu CD37. I Ramos i BJAB ćelije eksprimiraju humani CD37, te su stoga upotrebljenje pri ispitivanju funkcionalne aktivnosti supernatanata G28-1. Vezivanje G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 i G28-1 scFv VH LI 1S (SSS-S) H WCH2 WCH3 za CD37+ Ramos ćelije mereno je pomoću protočne citometrije -prema postupcima opisanim u primeru 2. Svaki podatak na grafiku predstavlja srednju vrednost pet preslikanih transfekcija. Grafik pokazuje daje G28-1 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 bio u stanju da veže CD37+ Ramos ćelije.

Pripremljeni su adicioni konstrukti sa različitim povezujućim regionima. pD18 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 vektor hidrolizovan je dejstvom Bell i Xbal kako bi se uklonio povezujući region, CH3 i CH3. Ovi regioni su supstituisani svaki različitim povezujućim regionom, CH2 i CH3, prema postupcima opisanim u primeru 13. Novi konstrukti označeni su kao G28-1 scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), G28-I scFv VHL11S (CSC-S) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), G28-1 scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: __), G28-1 scFv VHL11S (SSC-P) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: __), G28-1 scFv VHL11S (SCS-S) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: _), G28-1 scFv VHL11S (CCS-P) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: _J i G28-1 scFv VHL11S (SCC-P) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je ID broj: _).

G28-1 takođe je vezan za povezujući region IgA, CH2, CH3 kao i za CH2, CH3, CH4 IgE..Plazmid pD18 G28-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 hidrolizovan je prema predhodno opisanim postupcima kako bi se uklonio povezujući region CH2 i CH3. Regioni IgA

su ubačeni prema postupcima opisanim u primeru 13. Konstrukt je označen kao G28-1 scFv VHL11S IgAH IgACH2 T4CH3 (sekvenca čiji je ID broj: _). Region CH2 CH3 CH4 IgE ubačen je u predhodno opisani hidrolizovani vektor pD18 korišćenjem postupaka opisanih u primeru 39. Konstrukt je označen kao G28-1 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4 (sekvenca čiji je ID broj:_).

Primer 36: Karakterizacija mutiranih fuzionih proteina 2H7 scFv Ig

Na slici 54 prikazan je kapacitet vezivanja prečišćenih konstrukata 2H7 scFv Ig za CD20+ CHO ćelije. Proteini su transficirani u stabilne CHO ćelije prema postupcima opisanim u primeru 2. Vezivanje je određeno pomoću protočne citometrije prema postupcima opisanim u primeru 2. Grafik na slici 54 pokazuje da ovi proteini zadržavaju funkciju vezivanja za CD20 i sa promenjenim povezujućim regionima. Uporedivi rezultati dobijeni su sa svakim od mutiranih proteina 2H7 scFv VHL11S sa svakim od promenjenih povezujućih regiona (rezultati su izostavljeni).

Sposobnost konstrukata 2H7scFv-Ig sa mutiranim povezujućim regionima da usmrćuju CD20 pozitivne ćelije u prisustvu mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC) preko ADCC, ispitivana je merenjem oslobađanja<51>Cr iz obeleženih BJAB ćelija u četvoročasovnom testu, pri čemu je upotrebljen odnos PBMC prema BJAB ćelijama od 100 : 1. Rezultati, koji su prikazani na slici 55, ukazuju da 2H7scFv-Ig mutanti mogu da posreduju u ćelijskoj citotoskičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), s obzirom daje oslobađanje<51>Cr bilo značajno više u prisustvu i PBMC i 2H7scFv-Ig nego u prisustvu samo 2H7scFv-Ig ili samo PBMC. Uporedivi rezultati dobijeni su sa svakim od mutiranih proteina 2H7 scFv VHL11S sa svakim od promenjenih povezujućih regiona (rezultati su izostavljeni).

Sposobnost mutiranih fuzionih proteina 2H7scFv-Ig da usmrćuju CD20 pozitivne ćelije u prisustvu komplementa ispitana je korišćenjem B ćelijske linije Ramos kao ciljnih ćelija. Zečji komplement nabavljen je preko Pel-Freez (Rogers, AK) a u testu je korišćen pri konačnoj koncentraciji 1/10. Prečišćeni 2H7scFv-Ig inkubiran je sa B ćelijama i komplementom tokom 45 minuta na 37 °C, nakon čega su prebrojane žive i mrtve ćelije pomoću ekskluzije tripan plavog. Rezultati na slici 56 pokazuju da mutanti 2H7scFv-Ig liziraju B ćelije koje eksprimiraju GD20 u prisustvu zečjeg komplementa.

Primer 37: Komparativno vezivanje IgA, IgG i IgE 2H7 scFv konstrukata

Kapacitet vezivanja Ig konstrukata IgA, IgG i IgE meren je pomoću protočne citometrije prema postupcima opisanim u primeru 2, korišćenjem komercijalno dostupnog (Caltag) drugog koraka specifičnog za svaki Ig rep. Rezultati na slici 57 pokazuju da su svi IgE konstrukti bili u stanju da vežu CD20+ CHO ćelije, sa kapacitetom uporedivim sa kapacitetima vezivanja IgG i IgA. Rezultati takođe pokazuju da su IgE konstrukti detektovani pomoću drugog koraka za IgE,

ali ne i pomoću drugog koraka za IgG ili IgA.

Primer 38: Pobijanje i karakterizacija 2H7 VH LI 1S IgE konstrukata

RNK repa IgE izolovana je iz SKO-007 ćelija (ATCC) pomoću QIAGEN QIAshredder homogenizacije i RNK mini kompleta. cPNK dobijena je pomoću prajmera sa nasumičnom sekvencom, korišćenjem standardnih postupaka, sa 4 mikrolitra RNK koja je eluirana sa QIAGEN kolona. Humani IgE, od početka CH1 do kraja CH4 (približno 1,2 kb) izolovan je amplifikacijom 5 mikrolitara cDNK pomoću PCR sa profilom amplifikacije: 94C, 60 sek; 72C, 2 minuta tokom 35 ciklusa, i sledećih prajmera:

5' prajmer: 5'-ggatccacccgctgctgcaaaaacattccctccaatgccacctccgtgac-3' (sekvenca čiji je ID broj:

_)

3' prajmer: 5'-tcatttaccgggatttacagacaccgctcgctggacggtctgtgaggggctcgctgc-3' (sekvenca čiji je ID broj:_)

Fragemtni dobijeni pomoću PCR povezani su u PCR 2.1-TOPO vektor, pa su transformanti ispitani na prisustvo ubačenih sekvenci željene dužine hidrolizom pomoću EcoRI prema postupcima opisanim u primeru 1. Jedan od klonova sa željenom sekvencom upotrebljen je kao model za amplifikaciju CH2-CH4 domena sa odgovarajućim restrikcionim mestima ubačenim za podkloniranje rastvornih oblika ili oblika sa ćelijske površine (ORF). Uz profil amplifikacije: 94C, 60 sek; 55C, 60 sek; 72C, 2 min, tokom 35 ciklusa, za amplifikaciju fragmenta od približno 950 bp korišćeni su sledeći prajmeri:

5' prajmer (vezuje Bell mesto na 5' kraj CH2 domena IgE):

5'-gttgttgatcacgtctgctccagggacttcacc-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer (vezuje stop kodon i Xbal mesto za 3' kraj CH4 IgE):

5'-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer (vezuje Sful i BamHI za 3' kraj CH4 bez stop kodona):

5'-gttgttttcgaaggatccgctttaccagatttacagacaccgctcgctg-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

CH2CH3CH4 rep IgE sa stop kodonom hidrolizovan je dejstvom Bell i Xbal i ubačen u pD18 vektor koji sadrži 2H7 VHL11S scFv. Ovaj konstrukt označen je kao 2H7 IgECH2CH3CH4. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: . 2H7 IgECH2CH3CH4 rep bez stop kodona (ORF) hidrolizovan je dejstvom Bell i Xbal i ubačen u pD18 vektor koji sadrži 2H7 VHL11S scFv. Konstrukt je označen kao 2H7 IgECH2CH3CH4(ORF). Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok

je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Humani IgE je takođe amplifikovan kao fragment kome nedostaju i CH1 i CH2 domen,

koji ima samo CH3 i CH4 domene vezane za region šarke humanog IgGl. Kako bi se vezao region šarke IgGl za CH3 domen humanog IgE korišćene su sekvencijalne PCR reakcije u kojima se koriste preklapajući 5' oligonukleotidi. Prajmeri za prvi korak PCR: 5' prajmer: 5'-actcacacatccccaccgtccccagcatccaacccgagaggggtgagc-3' (sekvenca čiji je ID broj: _j Prajmeri za drugi korak PCR:

5' prajmer: 5'-tctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccg-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer: 5'-gttgtttctagattatcatttaccaggatttacagacaccgctcgctg-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Proizvod dobijen pomoću PCR hidrolizovan je dejstvom EcoRI i sekvenciran prema postupcima opisanim u primeru 1. Pozitivni klonovi su ubačeni u pD18 plazmid koji sadrži 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H. Konstrukt je označen kao 2H7 VHL11S scFv (SSS-S) H IgE CH3CH4. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Kapacitet vezivanja 2H7 VH L11S scFv (SSS-S) H IgECH2 CH3CH4 izmeren je pomoću protočne citometrije, u suštini prema primeru 2. Protein je prečišćen pomoću MEP

HvperCel, (Cipergen, kataloški br. 12035-010, serijski br. 200920/0271) hromatografske smole i hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja (Hvdrophobic Charge Induction Chromatographv, HCIC). Adsorbens za HCIC je adsorbens visokog kapaciteta, visoke selektivnosti napravljen za vezivanje i prečišćavanje monoklonskih i poliklonskih antitela iz različitih izvora, uključujući supernatante kultura. Kolone su napakovane sa 10 ml zapremine granula MEP Hvpercel i ekvilibrisane u PBS, pH 7,4 koji sadrži 0,1% NaN3. Kroz kolonu je potom propušten približno 1 litar supernatanta kulture 2H7 scFv VHL11S IgE CH2CH3CH4 CHO. Pripremljena je serija citratnih pufera čije se pH vrednosti kreću od 3 do 6 za eluciju fuzionog proteina. Kolona je isprana pomoću PBS. Protein je eluiran u petnaest frakcija od po 1 ml na pH 6, 5 i 4. Konačna frakcija od 15 ml sakupljena je na pH 3,5. Alikvoti svake od frakcija analizirani su na A280 i pomoću SDS-PAGE, pri čemu je naneseno približno 10 mikrograma po polju na osnovu vrednosti dobijene pomoću A280. Rezultati ove dve analize pokazali su da većina proteina nije eluirana citratnim puferima sa višim pH, ali je eluirana na pH 4, dok je frakcija dobijena ispiranjem na pH 3,5 nakon elucije takođe sadržala značajnu količinu proteina.

Sposobnost ovih prečišćenih proteina 2H7 VH LI 1S IgE da vežu CD20+ CHO ćelije određena je pomoću protočne citometrije prema postupcima opisanim u primeru 2, korišćenjem kozjeg anti-humanog IgE konjugovanog za FITC. Slika 58A pokazuje da su oba prečišćena proteina bila u stanju da vežu CD20+ CHO ćelije.

Sposobnost ovih prečišćenih proteina 2H7 VH L11S IgE da posreduju pri ADCC naspram BJAB ciljnih ćelija sa PBMC ćelijama kao efektorskim ćelijama, merena je prema postupcima opisanim u primeru 2. Slika 58B pokazuje da su oba proteina bila u stanju da posreduju pri ADCC sa sličnom delotvornošću.

Primer 39: Dobijanje i kapacitet vezivanja scFv VH L11S mutanata sa regionima repa

mišjeg IgA i IgE

Mišji IgA kloniranje iz RNK iz slezine miša korišćenjem, suštinski, istih postupaka koji su korišćeni za kloniranje regiona repa humanog IgE u primeru 38. PCR je vršen sa profilom amplifikacije 94C, 60 sek; 52C, 60 sek; 72C 2 min, sa 35 ciklusa. Prajmeri upotrebljeni za kloniranje CH1-CH4 regiona pomoću PCR bili su:

5' prajmer: 5'-atctgttctcctcctactactcctcctccacct-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer: 5'-tcagtagcagatgccatctccctctgacatgatgacagacacgct-3' (sekvenca čiji je ID broj: ) PCR prajmeri korišćeni za deleciju CH1 regiona: 5' prajmer: 5'-gttgttgatcacatctgttctcctcctactactcctcctccacct-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Kapacitet vezivanja 2H7 VH L11S mlgE i mlgA (sa mišjim regionima repa) CD20+ CHO ćelija izmeren je pomoću protočne citometrije prema postupcima opisanim u primeru 2, korišćenjem komercijalno dostupnih IgE ili IgA reagenasa drugog koraka (Caltag). Svaka tačka na slici 59 predstavlja srednju vrednost populacije, pri čemu je intenzitet svetlosti korigovan oduzimanjem vezivanja samo drugog koraka. Na ovoj slici prikazano je da ovi konstrukti imaju sposobnost da vežu CD20+ CHO ćelije.

Primer 40: HPLC profili mutiranih fuzionih proteina 2H7 scFv Ig

Izvršena je HPLC analiza prečišćenih mutiranih fuzionih proteina 2H7 scFv-Ig sa promenjenim povezujućim i CH3 regionima. Svaki protein prečišćen je afmitetnom hromatografijom na proteinu A iz supernatanata transficiranih COS ili CHO ćelija. Dvadeset pet do pedeset mikrograma svakog uzorka je analizirano pri 1 ml/min u PBS na TSK-GEL G3000SWxl koloni od 30 cm (Tosoh Biosep, Stuttgart, Nemačka). Strelica blizu početka svakog

od profila predstavlja tačku ubrizgavanja uzorka. Standardi za gel filtraciju (Bio-Rad) obuhvatali su tiroglobulin (670 kDa), gama globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), mioglobin (12,5 kDa)

i vitamin B-12 (1,35 kDa). Standardi su analizirani na početku i kraju svakog eksperimenta. Položaji migracije standarda su prikazani i nisu se menjali od eksperimenta do eksperimenta (slike od 60 do 62).

Primer 41: Kapacitet vezivanja mutiranih fuzionih proteina 2H7 VH LI 1S

Dejstva vezivanja CH3 mutanata poređena su sa fuzionim proteinima sa nemutiranim CH3. Konstrukti su transficirani u COS ćelije i prečišćeni iz supernatanta korišćenjem tehnika prečišćavanja na proteinu A opisanih u primeru 2. Na slici 63 prikazana su diferencijalna dejstva CH3 mutacija na vezivanje, korišćenjem protočne citometrije prema postupcima opisanim u primeru 2. Na ovoj slici prikazano je da se određeni deo sposobnosti za vezivanje gubi kada se uvede dvostruka tačkasta mutacija u CH3 region.

Vezivanje mutiranih proteina 2H7 VH LI 1S konjugovanih za fluorescein izotiocijanat (FITC) određeno je pomoću protočne citometrije. Pripremljen je rastvor koncentracije 1 mg/ml FITC u DMSO. Fuzioni proteini su dijalizovani u bikarbonatnom puferu pH 9,3 preko noći na 4C u zapremini od 2 litra. Koncentracija proteina podešena je na 1 do 5 mg/ml pre konjugacije. Postavljena je serija Falcon epruveta od 5 ml sa različitim odnosima proteina i FITC, u granicama od 15 do 60, ali sa minimalnim odnosima od 20 i 40. Reakcione smeše za konjugaciju inkubirane su na 37C 30 minuta, zaštićene od svetla. Protein obeležen fluoresceinom odvojen je od slobodnog fluoresceina na koloni od 2 ml Sephadex G-25 ekvilibrisanoj u PBS, 0,5 M NaCl i 1% NaN3. Protein obeležen fluoresceinom prvi je eluiran sa kolone i sakupljen je u epruvetu od 5 ml. Stepen obeleženosti određen je merenjem apsorbance razblaženog konjugata na 280 i 494

nm i upotrebom formula dobijenih od tehničke službe pri Molecular Probes (Eugene, OR). Podaci su korigovani za odnos FITC : protein. Na slici 64 prikazano je da ovi konstrukti ne gube kapacitet vezivanja kada se konjuguju za fluorescentni marker.

Prečišćeni konstrukti 2H7 VH L11S analizirani su na neredukujućem SDS gelu prema postupcima opisanim u primeru 2. Položaji migracije predstavljeni su na slici 65.

Primer 42: Karakterizacija 2H7 scFv VH LI 1S ( CSC- S) H WCH2 WCH3 u Leci 3 CHO

ćelijama

2H7 scFv VH LI 1S (CSC-S) H WCH2 WCH3 prolazno su transficirani i eksprimirani u '•' Leci3 CHO ćelijama. Leci3 CHO ćelije su upotrebljene kao sisarske ćelije domaćini ekspresione plazmide za bilo 2H7 scFv VHS11 hlgGl (CSS-S)H WCH2 WCH3 i (CSC-S)H WCH2 WCH3, u uporednim transfekcijama. Sve transfekcije izvršene su u šoljama za gajenje kultura od 100 mm. Ćelije su tranficirane kada su dostigle približno 90% konfluentnog rasta korišćenjem lipofektamina 2000 (Invitrogen, kataloški br. 11668-027, 0,75ml) prema uputstvima proizvođača. Obe ćelijske linije su gajene u prisustvu seruma kako bi se pospešilo i održalo prijanjanje za šolje za gajenje kulture, čime se pojednostavljuju manipulacije neophodne pri transfekciji, ispiranje i sakupljanje supernatanata. Dozvoljeno je da se izgrade kompleksi DNK i lipofektamina u odsustvu seruma i antibiotika, prema predloženom protokolu i uslovima zapisanim u uputstvima za upotrebu proizvoda. Supernatanti kulture su sakupljeni 72 časa nakon transfekcije i ponovo, 72 časa nakon prvog sakupljanja. Fuzioni protein iz dva izvora CHO izolovan je prečišćavanjem sa proteinom A, kao što je predhodno opisano i upotrebljeno u testovima vezivanja CD20 i testovima ADCC.

Sposobnost mutiranih fuzionih proteina da posreduju ADCC kod CD20 pozitivnih ćelija određena je prema postupcima opisanim u primeru 2. Konstrukti eksprimirani u Leci3 CHO ćelijama pokazivali su bolje vezivanje za CD20 CHO ciljne ćelije, a pokazivali su i značajno pojačanu aktivnost u ADCC testovima u odnosu na proteine dobijene iz CHO DG44, pri ekvivalentnim koncentracijama, kao što je prikazano na slici 67.

Primer 43: Pobijanje alela CD16 visokog i niskog afiniteta

Aleli niskog (L) i visokog (F) afiniteta na položaju 158 vanćelijskog domena humanog CD16 klonirani su iz cPNK dobijene iz humanih PBMC korišćenjem PCR testa. U PCR je korišćena cPNK dobijena uz pomoć prajmera nasumične sekvence, dobijena iz PBMC koje su 3 dana pre sakupljanja stiulisane imobilizovanim anti-CP3 antitelom (64.1). Za PCR je korišćeno 2, 4, 6 ili 8 mikrolitara cPNK, svakoj su dodati prajmeri pri 25 pmol, dok je profil amplifikacije bio: 94C, 60 sek; 55C, 60 sek; 72C, 2 min, u 35 ciklusa. Prajmeri za PCR su navedeni ispod: 5' prajmer bez vodećeg peptida: 5'-GTTGTTACCGGTGCAATGCGGACTGAAGATCTCCC AAAGGCTGTG-3' (sekvenca čiji je IP broj: _J

3' prajmer komplementarnog smisla: 5'-GTTGTTTGATCAGCCAAACCTTGAGTGATGGTG ATGTTCACA-3" (sekvenca čiji je IP broj: __)

Pozitivni klonovi su sekvencirani i ubačeni u vektor koji sadrži delotvoran vodeći peptid i (SSS-S)H P238SCH2 WCH3 rep humanog IgG. Eksprimirane su dve različite verzije CP 16 EP fuzionih proteina. Prva je sadržala alel F158 (visokog afiniteta) dok je druga sadržala alel VI58 (niskog afiniteta). Konstrukti su klonirani u pP18 (SSS-S)H P238S CH2 WCH3 i eksprimirani u COS i CHO ćelijama kao što je predhodno opisano u primerima 1 i 10. Klonovi CHO su ispitani

na ekspresiju pomoću IgG sendvič ELISA testa kako bi se utvrdili relativni nivoi ekspresije fuzionih proteina u supernatantu kulture, korišćenjem sledećeg protokola: Immulon IV ploče presvučene su sa 0,4 mikrograma/ml kozjeg anti-humanog IgG na 4C (mišji adsorbovani), (CalTag, kataloški br. H10500) u PBS puferu. Ploče su potom blokirane u PBS/1,5% nemasnom mleku na 4C preko noći. Ploče su isprane tri puta u PBS/0,1% Tvveen 20, potom inkubirane sa 100 mikrolitara serijskih razblaženja supernatanata kulture CHO klonova na sobnoj temperaturi 3 časa. Po četiri razblaženja za svaki klon dodaje se, u susedna polja, i to petostruka razblaženja počev od 1 : 5 do 1 : 375. Uz to, dobijena je i standardna kriva korišćenjem CTLA4 hlgGl (SSS-S)H P238SCH2 WCH3 kao standarda koncentracije. U seriji razblaženja korišćena su petostruka razblaženja počev od 0,5 mikrograma/ml; druga serija od 8 polja upotrebljena je da se dobiju dvostruka razblaženja počev od 0,34 mikrograma/ml. Ploče su isprane 3 puta u PBS/0,1% Tvveen 20 i inkubirane 1 čas sa kozjim anti-humanim IgG konjugovanim za peroksidazu iz rena (GAH IgG-HRP) pri odnosu od 1 : 5000, u PBS/0,5% BSA. Ploče su isprane 4 puta u PBS/0,1 % Tvveen ' 20, potom je dodat TMB hromogeni supstrat (BD-Pharmingen), te su ploče inkubirane 10 minuta, nakon čega je reakcija zaustavljena dodavanjem 100 mikrolitara IN sumporne kiseline. Apsorbanca je čitana na 415 nm na čitaču ploča SpectraCount. Koncentracije fuzionog proteina

procenjene su na osnovu poređenja OD u linearnom opsegu sa standardnom krivom CTLA4Ig koja je dobijena zasebno za svaku ploču.

Proteini su prečišćeni na proteinu A i neposredno konjugovani za fluorescein izotiocijanat (FITC) kao što je opisano u primeru 42. Ovi proteini analizirani su na SDS gelovima pod redukujućim i neredukujućim uslovima prema postupcima opisanim u primeru 2. Migracija ovih proteina prikazana je na slici 68.

Sposobnost alela CD16 visokog i niskog afiniteta da vežu 2H7 VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3 ili da vežu 2H7 VHL11S (SSS-S) H (P238S)CH2 WCH3 eksprimirane na ćelijskoj površini CD20+ CHO ciljnih ćelija određuje se pomoću protočne citometrije prema postupcima opisanim u primeru 2. Rezultati prikazani na slici 69 pokazuju da su i alel niskog afiniteta i alel visokog afiniteta bili u stanju da vežu 2H7 VHL11S (CSC-S) H WCH2 WCH3 (sekvenca čiji je ID broj: ), a da su izgubili deo sposobnosti vezivanja kada je u CH2 region konstrukta uvedena P238S mutacija (sekvenca čiji je ID broj: ).

Primer 44: Sisarski sistem izlaganja

Na slici 70A prikazano je kako FITC konjugati rastvornih proteina FcRIII (CD 16) vezuju 2H7 scFv-Ig konstrukte koji su vezani za CD20 eksprimiran u CHO ćelijama. Vezivanje CD 16

za 2H7 scFv-Ig obezbeđuje postupak testiranja za detekciju promena u vezivanju CD16 za promenjene konstrukte scFv-Ig koji sadrže ciljane mutacije ili mutacije specifične za dato mesto. Promene u vezujućim osobinama CD16 mogu da budu promene u vezivanju bilo CD16 proteina viškog afiniteta (158F) ili CD16 proteina niskog afiniteta (158V), ili oba.

Sematski prikaz ovakvog procesa testiranja dat je kao dijagram na slici 70B, gde su konstrukti scFv-Ig izloženi na ćelijskoj površini ćelija sisara. Molekuli scFv-Ig u ovom primeru izloženi su na površini ćelije zbog toga što sadrže transmembranski domen sidra. Ovi molekuli mogu da predstavljaju pojedinačan konstrukt scFv-Ig ili mogu da budu uvedeni u populaciju ćelija sisara kao biblioteka takvih molekula. Transficirane ćelije sa promenjenim osobinama vezivanja mogu da se izdvoje, sortiraju ili na drugi način izoluju od drugih ćelija menjanjem strogosti uslova selekcije i korišćenjem fuzionih proteina CD 16 kao probe za vezivanje. Mogu da se izoluju ćelije koje eksprimiraju scFv-Ig molekule sa izmenjenim vezivanjem bilo za alel visokog afiniteta CD16 (158F) bilo za alel niskog afiniteta CD16 (158V), bilo za oba. Na primer,

ovaj izložbeni sistem može da se upotrebi za stvaranje biblioteke mutiranih repova Ig sa kratkim delovima sekvence CH2 zamenjenim sa oligonukleotidima nasumične sekvence, ili sa

supstitucijom jednog ostatka nasumično izabranim svakim od ostalih aminokiselinskih ostataka, uključujući i sintetičke aminokiselinske ostatke. Jednom kada je takva biblioteka napravljena,

ona može da se transficira u COS ćelije postupcima koji su dobro poznati u struci. Transfektanti potom mogu da se vežu za obeležene konstrukte CD16 i da se izdvoje ili sortiraju u zavisnosti od svojih relativnih osobina vezivanja za različite alelotipove/izoforme. Izdvojene ćelije se sakupe,

te se izoluje plazmidna DNK koje se potom transformiše u bakterije. Ovaj proces može da se ponavlja više puta dok se ne izoluje pjedinačan klon iz sisarske ćelije domaćina (videti Seed B & Aruffo A, PNAS 84: 3365 - 3369 (1987) i Aruffo A & Seed B, PNAS 84: 8573 - 8577 (1987)). Jedna takva upotreba ovog tipa sistema ispitivanja bila bi da se izoluju Ig repovi koji se podjednako dobro vezuju i za alel niskog afiniteta i za alel viskokog afiniteta CD156, u cilju poboljšavanja efektorskih funkcija u kojima posreduju konstrukti scFv-Ig u višestrukim podpopulacijama pacijenata. Ig repovi sa promenjenim osobinama vezivanja za druge Fc receptore takođe mogu da se odaberu upotrebom opisanog izložbenog sistema. Drugi izložbeni sistemi, na primer oni kod kojih se koriste bakteriofagi ili kvasci, nisu pogodni za selekciju Ig repova sa promenjenim osobinama vezivanja za FcR zbog neophodnosti glikozilacije u CH2 domenu Ig koja se ne bi odigrala u ne-sisarskim sistemima.

Ovaj sistem je takođe koristan za selekciju promenjenih scFv-Ig molekula čija bi proizvodnja bila veća. U ovom primeru, sisarske ćelije kao što su COS ćelije mogu da budu transficirane bibliotekom konstrukata scFv-I u plazmidu koji njihovu ekspresiju upravlja ka površini ćelije. COS ćelije koje pokazuju najveću proizvodnju molekula scFv-Ig mogu da budu selekcionisane pomoću tehnika koje su u struci dobro poznate (na primer, izdvajanjem, sterilnim sortiranjem ćelija, odvajanjem na magnentnim granulama itd) te se DNK plazmida izoluje za transformaciju u bakterije. Nakon nekoliko krugova selekcije izoluju se pojedinačni klonovi koji kodiraju molekule scFv-Ig sposobne za ekspresiju sa visokom proizvodnjom. Kada se izolovani klonovi promene tako da se ukloni membranski domen sidra, a potom eksprimiraju u sisarskim ćelijama, konstrukti scFv-Ig biće izlučeni u tečnost kulture u velikim količinama. Ovo odslikava uobičajenu potrebu za signalnim peptidom i preradom u Goldžijevom aparatu, neophodnim za ekspresiju glikoproteina koji se izlučuju kao i membranskih glikoproteina, tako da će selekcija za molekul koji pokazuje poboljšanje u nivou ekspresije na ćelijskoj površini takođe biti i selekcija za molekul koji pokazuje poboljšanje u nivou ekspresije proteina koji se izlučuje.

Primer 45: Karakterizacija G28- 1 mAb i scFv

Sposobnost G28-1 mAb i scFv da pokrenu apoptozu izmerena je vezivanjem Aneksina V, prema postupcima opisanim u primeru 3. Rezultati na slici 71 pokazuju daje vezivanje Aneksina V za G28-1 antitela i scFv povećano kada se tretira zajedno sa 2H7 antitelima i scFv konstruktima.

Primer 46: Pobijanje FC2- 2 scFv konstrukata

Pobijanje FC2-2 (anti-CP16) scFv izvršeno je pomoću ukupnih RNK izolovanih iz FC2-2 hibridoma i kloniranih prema postupcima opisanim u primeru 35. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je IP broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je IP broj: . Specifični prajmeri za sekundarnu reakciju u PCR dati su ispod. Slede prajmeri za varijabilni region lakog lanca:

5' prajmer sa Hindlll mestom bez vodećeg peptida: 5'-

5' prajmer sa Sali mestom i vodećim peptidom: 5'- 3' prajmer:

Slede prajmeri za varijabilni region teškog lanca:

Supstitucija leucina u serin u položaju 11 u varijabilnom regionu teškog lanca (obeležavanje brojeva po Kabatu) uvedena je u FC2-2 scFv pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu prema postupcima opisanim u primeru 33. scFv je vezan za (SSS-S)H WCH2 WCH3 IgG rep prema postupcima opisanim u primeru 33. Mutant je označen kao FC2-2 scFv VH L11S (SSS-S)H WCH2 WCH3. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 47: Pobijanje 5B9 scFv konstrukata

Dobijanje 5B9 (anti-CP137) scFv izvršeno je korišćenjem ukupnih RNK izolovanih iz 5B9 hibridoma, dok je kloniranje izvršeno korišćenjem postupaka opisanih u primeru 35. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je IP broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je IP broj: . Specifični prajmeri za sekundarnu reakciju u PCR dati su ispod. Slede prajmeri za varijabilni region lakog lanca:

5' prajmer sa Hindlll mestom bez vodećeg peptida: 5'-

5' prajmer sa Sali mestom i vodećim peptidom: 5'-

Slede prajmeri za varijabilni region teškog lanca:

Supstitucija leucina u serin u položaju 11 u varijabilnom regionu teškog lanca (obeležavanje brojeva po Kabatu) uvedena je u 5B9 scFv pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu, te je on vezan za (SSS-S)H WCH2 WCH3 prema postupcima opisanim u primeru 33. Ovaj konstrukt je označen kao 5B9 scFv VH L11S (SSS-S)H WCH2 WCH3. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je IP broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je IP broj: .

Primer 48: Pobijanje UCHL1 scFv konstrukata

Dobijanje UCHL1 (anti-CD45RO) scFv izvršeno je korišćenjem ukupnih RNK izolovanih iz UCHL1 hibridoma, dok je kloniranje izvršeno korišćenjem postupaka opisanih u primeru 35. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: . Specifični prajmeri za sekundarnu reakciju u PCR dati su ispod. Slede prajmeri za varijabilni region lakog lanca:

5' prajmer sa Hindlll mestom: 5'-

TTGGTGCTG-3' (sekvenca čiji je ID broj: _)

3' prajmer sa Sac mestom: 5'-

Slede prajmeri za varijabilni region teškog lanca:

Supstitucija leucina u serin u položaju 11 u varijabilnom regionu teškog lanca (obeležavanje brojeva po Kabatu) uvedena je u 5B9 scFv pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu, te je on vezan za (SSS-S)H WCH2 WCH3 prema postupcima opisanim u primeru 33. Ovaj konstrukt je označen kao UCHL1 scFv VH L11S (SSS-S)H WCH2 WCH3. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 49: L6 VHL11S scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Supstitucija leucina u serin u položaju 11 u varijabilnom regionu teškog lanca (obeležavanje brojeva po Kabatu) uvedena je u L6 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 (koji je dobijen prema postupcima opisanim u primeru 106) pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu prema postupcima opisanim u primeru 33. L6scFvIg (SSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 plazmid je upotrebljen kao model. Pozitivni klonovi su ubačeni u pD18 plazmid koji sadrži (SSS-S) H WCH2 WCH3 prema postupcima opisanim u primeru 33. Mutant je označen kao L6 scFv VH LI 1S (SSS-S) H WCH2 WCH3. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca<*>čiji je ID broj:_.

Prajmeri za PCR su navedeni ispod:

5' prajmer sa PstI restrikcionim mestom: 5'-ggcggatctctgcagatccagttggtgcagtctggacctgagtcgaagaagcct

ggagag-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Primer 50: Pobijanje HD37 scFv VHL11S konstrukta

Supstitucija leucina u serin u položaju 11 u varijabilnom regionu teškog lanca (obeležavanje brojeva po Kabatu) uvedena je u HP37 scFv pomoću mutageneze usmerene ka određenom mestu prema postupcima opisanim u primeru 33. HP37 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 pD18 plazmid je upotrebljen kao model. Pozitivni klonovi su ubačeni u pP18 plazmid koji sadrži (SSS-S) H WCH2 WCH3 prema postupcima opisanim u primeru 33. Mutant je označen kao HP37 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je IP broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je IP broj: .

Prajmeri za PCR su navedeni ispod:

Primer 51: 2H7 scFv VHL11S konstrukti

Pobijeni su dodatni 2H7 VHL11S konstrukti sa različitim povezujućim regionima. pP18 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 vektor je hidrolizovan pomoću Bell i Xbal kako bi se uklonio povezujući region, CH2 i CH3. Oni su supstituisani svaki sa različitim povezujućim regionom, CH2 i CH3 prema postupcima opisanim u primeru 13. Novi konstrukti označeni su kao: 2H7scFv VHL11S (CSS-S) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je IP broj: _), 2H7scFv VHL11S (CSC-S) H WH2 WH3 (sekvenca čiji je IP broj: __). 2H7 scFv VHL11S je takođe vezan za povezujući region CH2, CH3 IgA i za IgE CH2, CH3, CH4. pD18 2H7 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3 plazmid je hidrolizovan prema predhodno opisanim postupcima kako bi se uklonio povezujući region, CH2 i CH3. IgA regioni su ubačeni prema postupcima opisanim u primeru 13. Konstrukt je označen kao 2H7 scFv VHL11S IgAH IgACH2 T4CH3 (sekvenca čiji je IP broj: ). IgE CH2 CH3 CH4 region ubačen je u predhodno opisani hidrolizovani pD18 vektor prema postupcima opisanim u primeru 39. Konstrukt je označen kao 2H7 scFv VHL11S IgECH2 CH3 CH4 (sekvenca čiji je ID broj: _J.

Primer 52: 2H7 scFv LI 1S ( CSC- S^) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezan* je za povezujući region, CH2 i CH3 humanog IgGl, u kojem su drugi cisteinski ostatak i prolinski ostatak u povezujućem regionu supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) kao što je opisano u primeru 32. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 53: 2H7 scFv VH LI 1S IgE CH2 CH3 CH4

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezan je za konstantni region humanog IgE koji sadrži CH2, CH3 i CH4 kao što je opisano u primeru 38. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 54: 2H7 scFv VH LI 1S mlgE CH2 CH3 CH4

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezan je za konstantni region mišjeg IgE koji sadrži CH2, CH3 i CH4 kao što je opisano u primeru 39. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 55: 2H7 scFv VH LI 1S mlgAH WIgACH2 T4CH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region iz humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region mišjeg IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre stop kodona na 3' kraju kao što je opisano u primeru 39. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 56: 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H K322S CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao stoje opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su svi cisteini i jedan prolin supstituisani serinima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Povezujući region vezanje za mutirani CH2 region IgG i CH3 region divljeg tipa IgG. K322S mutacija u CH2 regionu nalazi se u položaju 322, gde je leucin supstituisan serinom korišćenjem preklapajućeg PCR testa. Za PCR amplifikaciju korišćen je (SSS-S) H WCH2 WCH3 IgGl model, kako bi se dobili (SSS-S) H derivati koji sadrže ove mutacije u CH2. Za PCR je korišćen profil ciklusa od 94C, 30 sek; 55C, 30 sek; 72C, 30 sek; tokom 37 ciklusa, kako bi se izvršile reakcije. Ovaj IgGl derivat konstruisan je korišćenjem niza PCR reakcija sa preklapajućim oligonukleotida u primarnim i sekundarnim reakcijama. Primarna amplifikacija je uvela mutaciju(e), ali je delirala jedan kraj Fc domena. Prajmeri za sekundarnu reakciju ponovo su vezali ove krajeve koristeći preklapajuće prajmere. Prvi preklapajući prajmer dodat je na početku PCR, reakcije su se odvijale u 12 ciklusa, zatim su zaustavljene, pa je dodat drugi preklapajući prajmer nakon čega je izvršeno još

25 ciklusa kako bi se završile preklapajuće reakcije produžavanja u PCR.

Prajmeri za prvu PCR:

Proizvodi PCR su klonirani u TOPO vektore i sekvencirani radi potvrde. Pozitivni vektori korišćeni su kao modeli za drugu preklapajuću reakciju u PCR. 5' preklapajući prajmer: 5'-

3' prajmer: 5'-caggaaacagctatgac-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Proizvod PCR je kloniran u TOPO vektor i sekvenciran. Polinukleotidna sekvenca data je

kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 57: 2H7 scFv VH LI 1S fCSS- S) H K322S CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su drugi i treći cistein supstituisani serinima i prolin supstituisan serinom (CSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 31. Povezujući region vezan je za mutirani CH2 region IgG i CH3 region divljeg tipa IgG. K322S mutacija u CH2 regionu nalazi se u položaju 322, gde je leucin supstituisan serinom korišćenjem preklapajućeg PCR testa. Region je vezan za mutirani CH2 region IgG i CH3 region divljeg tipa IgG. Mutacija

u CH2 regionu uvedena je pomoću preklapajuće reakcije u PCR, u suštini prema primeru.57, sa

(CSS-S) H WCH2 WCH3 IgGl pD18 vektorom kao modelom u prvoj reakciji u PCR i različitim prajmerima u drugoj reakciji u PCR, navedenim ispod.

Proizvod PCR je kloniran u TOPO vektor i sekvenciran. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 58: 2H7 scFv VH L11S ( SSS- S) H P331S CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom

mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su svi cisteini i jedan prolin supstituisani serinima

(SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Povezujući region vezan je za mutirani CH2 region IgGl i CH3 region divljeg tipa IgGl. P331S mutacija u CH2 regionu, gde je prolin u položaju 331 supstituisan serinom, uvedena je korišćenjem pojedinačne reakcije u PCR, pri čemu je kao model korišćen (SSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 i profil ciklusa od 94C, 30 sek; 55C, 30 sek; 72C, 30 sek; tokom 37 ciklusa. Specifični prajmeri su dati ispod.

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 59: 2H7 scFv VH LI 1S ( CSS- S) H P331S CH2 WCH3

Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region IgG u kojem su drugi i treći cistein supstituisani serinima i prolin supstituisan serinom (CSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 13. Povezujući region vezanje za mutirani CH2 region IgG i CH3 region divljeg tipa IgG. P331S mutacija u CH2 regionu, gde je prolin u položaju 331 supstituisan serinom, uvedena

je korišćenjem pojedinačne reakcije u PCR, pri čemu je kao model korišćen (CSS-S) H WCH2 WCH3 pD18 i profil ciklusa od 94C, 30 sek; 55C, 30 sek; 72C, 30 sek; tokom 37 ciklusa. Specifični prajmeri su dati ispod.

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 60: 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H T256N CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su svi cisteini i jedan prolin supstituisani serinima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Povezujući region vezanje za mutirani CH2 region IgG i CH3 region divljeg tipa IgG. T256N mutacija u CH2 regionu, gde je treonin u položaju 256 supstituisan asparaginom, uvedena je korišćenjem preklapajućih PCR postupaka opisanih u primeru 56. Specifični prajmeri dati su ispod.

Prajmeri za prvu reakciju u PCR:

3' prajmer: 5'-ggacagtgggagtggcacc-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Proizvod PRC je kloniran u TOPO vektor i sekvenciran. Ovaj proizvod upotrebljen je kao model u drugoj TOPO reakciji. Prajmeri za drugu PCR reakciju: 5' preklapajući prajmer: 5' -

3' prajmer: 5'-caggaaacagctatgac-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 61: 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H RTPE/ ONAK ( 255 - 258) CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom 'mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su svi cisteini i jedan prolin supstituisani serinima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Povezujući region vezanje za mutirani CH2 region IgG i CH3 region divljeg tipa IgG. RTPE/QNAK mutacija u CH2 regionu, gde su ostaci u položajima od 255 do 258 mutirani iz arginina, treonina, prolina i glutaminske kiseline u glutamin, asparagin, alanin i lizin, resektivno, uvedena je korišćenjem preklapajućih PCR postupaka opisanih u primeru 56. Specifični prajmeri dati su ispod.

Prajmeri za prvu reakciju u PCR:

Proizvod PRC je kloniran u TOPO vektor, sekvenciran i upotrebljen kao model u drugoj TOPO reakciji. Prajmeri za drugu PCR reakciju: 5' preklapajući prajmer: 5'-

3' prajmer: 5'-caggaaacagctatgac-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 62: 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H K290O CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteini i jedan prolin supstituisani serinima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Povezujući region vezan je za mutirani CH2 region IgGl i CH3 region divljeg tipa IgGl. K290Q mutacija u CH2 regionu, gde je ostatak lizina u položaju 290 supstituisan glutaminom, uvedena je korišćenjem PCR postupaka sa pojedinačnom reakcijom opisanog u primeru 58. Specifični prajmeri dati su ispod.

Proizvodi PRC klonirani su u TOPO i sekvencirani. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: _.

Primer 63: 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H A339P CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteini i jedan prolin supstituisani serinima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Povezujući region vezan je za mutirani CH2 region IgGl i CH3 region divljeg tipa IgGl. A339P mutacija u CH2 regionu, gde je alanin u položaju 339 supstituisan prolinom, uvedena je korišćenjem PCR postupaka sa pojedinačnom reakcijom opisanog u primeru 58. Specifični prajmeri dati su ispod.

Proizvodi PRC klonirani su u TOPO i sekvencirani. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 64: G28- 1 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region dobijen prema postupcima opisanim u primeru 35. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je ranije označen kao G28-1 MHWTG1C i G28-1 scFv Ig, pri čemu oba imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 65: G28- 1 scFv IgAH WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region dobijen prema postupcima opisanim u primeru 35. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region humanog IgA i CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgG kao što je opisano u primeru 5. Ovaj konstrukt je ranije označen kao G28-1 IgAHVVTGIC. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 66: G28- 1 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 5. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 67: G28- 1 scFv VH LI 1S ( CSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima i prolinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (CSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 68: G28- 1 scFv VH LI 1S ( CSC- S) H VVCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan je za nuitirani povezujući region humanog IgGl u kojem su drugi cisteinski i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (CSC-S) prema postupcima opisanim u primeru 32. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 69: G28- 1 scFv VH L11S ( SSC- P) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su prvi i drugi cisteinski ostaci supstituisani serinskim ostacima (SSC-P) prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: ;, dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 70: CTLA4 ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima vanćelijski vezujući region CTLA-4, kao što je opisano u primeru 14. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću PCR. Reakcije u PRC izvršene su korišćenjem cDNK dobijene iz RNK B ćelija iz humanih krajnika uz pomoć prajmera nasumične sekvence. U amplifikaciji pomoću PCR je korišćen amplifikacioni profil od 94C 4 min; 94C 1 min; 55C 1 min; 72C 1 min; tokom 30 ciklusa, koje prati konačni korak produžavanja od 6 min na 72C. Fragmenti dobijeni u PCR su klonirani u TOPO, te su klonovi sa ubačenim sekvencama,EcoRI od približno 800 bp sekvencirani kao što je opisano u primeru 1. Prajmeri koji su upotrebljeni za PCR dati su ispod:

Ovaj konstrukt je predhodno označen kao CTLA-4 IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3,

koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je IDbroj:_.

Primer 71: CTLA4 ( CCC- P) WH WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima vanćelijski vezujući region CTLA-4, kao što je opisano u primeru 14. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region divljeg tipa humanog IgGl (CCC-P) kao što

je opisano u primeru 1. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao CTLA-4 IgG WTH (CCC) V/TCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 72: FC2- 2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima FC2-2 (anti-CD16) jednolančani Fv dobijen prema postupcima opisanim u primeru 46. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 73: FC2- 2 scFv VHL11S ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima FC2-2 (anti-CD16) jednolančani Fv sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 46. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 74: UCHL- 1 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt sadrži UCHL-1 (anti-CD45RO) jednolančani Fv dobijen prema postupcima opisanim u primeru 48. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 75: UCHL- 1 scFv VHL11S ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt sadrži UCHL-1 (anti-CD45RO) jednolančani Fv sa tačkastom mutacijom

na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 48. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstante regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 76: 5B9 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt sadrži 5B9 (anti-CD137) jednolančani Fv dobijen prema postupcima opisanim u primeru 47. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 5B9 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 77: 5B9 scFv VHL11S ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt sadrži 5B9 (anti-CD137) jednolančani Fv sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao stoje opisano u primeru 47. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 78: 2H7 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt sadrži 2H7 (anti-CD20) vezujući region jednolančanog Fv kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci ijedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa IgGl kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt predhodno je označen kao 2H7-MHWTG1C, CytoxB-(MHWTGlC)-Ig, anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, CytoxB-MHWTGlC, 2H7 scFv-region šarke divljeg tipa humanog IgGl-CH2-CH3 i 2H7 scFv IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, koji svi imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .....

Primer 79: 2H7 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3

Ovaj konstrukt sadrži 2H7 (anti-CD20) vezujući region jednolančanog Fv kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kome su svi cisteinski ostaci ijedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezan je za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. Ovaj konstrukt predhodno je označen kao 2H7 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3, anti-CD20 scFv IgG MTH (SSS) MTCH2CH3 i CytoxB-MHMG 1C, koji svi imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 80: 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region humanog IgA i CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgG kao što je opisano u primeru 5. Ovaj konstrukt je ranije označen kao 2H7 scFv IgAH IgG WTCH2CH3, 2H7 scFv region šarke IgA-IgGl CH2-CH3 i CytoxB-IgAHWTHGlC, koji svi imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 81: 2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region humanog IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona u kojem postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre 3' stop kodona, kao što je opisano u primeru 13. Ovaj konstrukt je ranije označavan kao 2H7 scFv IgAH IgAT4, koji ima istu sekvencu kao i gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 82: 2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + J lanac

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgA prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj konstantni region je vezan za region J lanca kao što je opisano u primeru 13. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:

Primer 83: 2H7 scFv ( CCC- P) WH WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region divljeg tipa humanog IgGl (CCC-P) kao što je opisano u primeru 1. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv Ig WTH (CCC) WTCH2CH3, 2H7 scFv IgG WTH WTCH2CH3 i 2H7 scFv-Ig, koji svi imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: _.

Primer 84: 2H7 scFv ( SSS- S) H WCH2 F405YCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl (SSS-S) u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima, prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 region divljeg tipa humanog IgGl i mutirani CH3 region humanog IgGl. Mutacija F405Y, gde je ostatak fenilalanina na položaju 405 supstituisan tirozinom, uvedena je prema postupcima opisanim u primeru 21. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 85: 2H7 scFv ( SSS- S) H WCH2 F405ACH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl (SSS-S) u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima, prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 region divljeg tipa humanog IgGl i mutirani CH3 region humanog IgGl. Mutacija F405A, gde je ostatak fenilalanina na položaju 405 supstituisan alaninom. uvedena je prema postupcima opisanim u primeru 21. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 86: 2H7 scFv ( SSS- S) H WCH2 Y407ACH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl (SSS-

S) u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima, prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 region divljeg tipa humanog IgGl i mutirani CH3 region humanog IgGl. Mutacija Y407A, gde je ostatak tirozina na položaju 407 supstituisan alaninom, uvedena je prema postupcima opisanim u primeru 21. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao scFv MTH WTCH2 MTCH3 A407, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:

Primer 87: 2H7 scFv ( SSS- S) H WCH2 F405A. Y407ACH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl (SSS-

S) u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima, prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 region divljeg tipa humanog IgGl i mutirani CH3 region IgGl. Mutacija F405A i Y407A, gde je ostatak fenilalanina na položaju 405 supstituisan alaninom i ostatak tirozina u položaju 407 supstituisan alaninom, uvedena je prema postupcima opisanim u primeru 21. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao scFv MTH WTCH2 MTCH3 A405A407, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 88: 2H7 scFv ( CSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

ir primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima i prolinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (CSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH (CSS) V/TCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 89: 2H7 scFv ( SCS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su prvi i treći cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima i prolinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (SCS-S), prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv IgG MTH (SCS) WTCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 90: 2H7 scFv ( SSC- P) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su prvi i drugi cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSC-P), prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH (SSC) WTCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 91: 2H7 scFv ( CSC- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su drugi cisteinski ostatak i prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (CSC-S), prema postupcima opisanim u primeru 32. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH (CSC) "VVTCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 92: 2H7 scFv ( CCS- P) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem je treći cisteinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (CCS-P), prema postupcima opisanim u primeru 22. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 93: 2H7 scFv ( SCC- P) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao stoje opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem je prvi cisteinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (SCC-P), prema postupcima opisanim u primeru 32. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv MTH (SCC) V/TCH2CH3, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 94: 2H7 scFv VHL11S ( SSS- S) H WCH2 F405A. Y407ACH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv VHL11S MTH (SSS) WTCH2CH3 i 2H7 VHSER11 WTH WTCH2CH3, koji imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 95: 2H7 scFv VH LI 1S ( CSS- S) H WCH2 F405A, Y407ACH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao stoje opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima i jedan prolinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (CSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 96: G28- 1 scFv VH LI 1S ( SCS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao stoje opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su prvi i treći cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima i prolinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (SCS-S), prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: [ , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID^broj: .

Primer 97: G28- 1 scFv VH LI 1S ( CCS- P) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem je treći cisteinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (CCS-P), prema postupcima opisanim u primeru 22. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 98: G28- 1 scFv VH LI 1S ( SCC- P) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem je prvi cisteinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (SCC-P), prema postupcima opisanim u primeru 32. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 99: G28- 1 scFv VH LI 1S mlgE CH2 CH3 CH4

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan je za CH2, CH3 i CH4 regione divljeg tipa mišjeg IgE pomoću postupaka opisanih u primeru 39. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 100: G28- 1 scFv VH LI 1S mlgAH WIgACH2 T4CH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je.leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region iz mišjeg IgA kao što je opisano u primeru 39. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region mišjeg IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka opisanih u primeru 39. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 101: G28- 1 scFv VH LI 1S hlgE CH2 CH3 CH4

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan je za konstantni region divljeg tipa humanog IgE koji sadrži CH2, CH3 i CH4 regione, kao što je opisano u primeru 38. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 102: G28- 1 scFv VH LI 1S MgAH WIgACH2 T4CH3

Ovaj konstrukt ima G28-1 (anti-CD37) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 35. Ovaj vezujući region vezan, je za povezujući region iz humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region humanog IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre stop kodona na 3' kraju kao što je opisano u primeru 13. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 103: HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3

HD37 scFv kloniran je iz HD37 hibridoma pomoću Novagen kompleta prajmera iz porodice Ig, TOPO kloniranja i sekvenciranja, kao i spajajućeg PCR testa. Za prve reakcije u PCR pre spajanja, modeli za TOPO kloniranje HD37 Vh C-l i HD37 KVL B-9 upotrebljeni su

pri 1 : 100 sa amplifikacionim profilom od 94C, 30 sek; 55C, 30 sek; 72C, 30 sek, u 25 ciklusa. Kako bi se obezbedili modeli za sekundarne reakcije u SENVTNG PCR, proizvodi primarnih reakcija su prečišćeni u gelu, zatim prečišćeni pomoću QIAQUICK, nakon čega su eluati razblaženi 50 puta. Po jedan mikrolitar VL i VH preklapajućih modela dodato je u reakcije u PCR sa sledećim amplifikacionim profilom: 94C, 60 sek; 55C, 60 sek; 72C, 60 sek, u 30 ciklusa. Nakon dva ciklusa, mašina je zaustavljena, u reakcije su dodati bočni 5'VL i 3'VH prajmeri, po 25 pmol svakog, te je PCR nastavljen. Proizvodi PCR su ispitani na gelu za prisustvo fragmenta od 750 do 800 bp, pa su reakcioni proizvodi prečišćeni pomoću QIAQUICK i hidrolizovani dejstvom odgovarajućih restrikcionih enzima kako bi se izvršila insercija pD18 Ig ekspresionih vektora.

PCR VL domena sa nativnim vodećim peptidom i delom glvser povezujućeg peptida:

PCR VL domena bez vodećeg peptida (Sali mesto) i deo glvser povezujućeg peptida:

PCR VH domena sa delom glvser povezujućeg peptida i Bell mestom za fuziju sa -Ig repovima.

Vezujući region je vezan za povezujući region divljeg tipa humanog IgA i CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgG kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao stoje opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je ranije označen kao HD37 scFv-IgAHVVTGlC i HD37-IgAHWTGlC, koji oba imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: _, dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 104: HD37 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima HD 37 jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano u primeru 103. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i GH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao HD37- MHWTG1C i HD37 scFv-MHWTGlC, koji oba imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 105: HD37 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima HD 37 jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, prema postupcima opisanim u primeru 50. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 106: L6 scFv IgAH WCH2 WCH3

L6 scFv kloniranje iz L6 hibridoma (I Hellstrom) korišćenjem postupka sa dodavanjem sidra-repa opisanog u Tissue Antigens radu iz 1996. PCR profil bio je 94C, 1 min; 50C, 2 min; 72C, 2 min; u 35 ciklusa. Jednom kada je dobijena koncezus sekvenca za VL i VH regione iz najmanje 4 TOPO klona, naručeni su prajmeri za reakcije u PCR koje prethode PCR reakcijama spajanja, kao što sledi: Za prvobitne reakcije u PCR pre spajanja, proizvodi primarne reakcije su prečišćeni u gelu, zatim prečišćeni pomoću QIAQUICK, nakon čega su eluati razblaženi 50 puta. Po jedan mikrolitar VL i VH preklapajućih modela dodato je u PCR reakcionu smešu sa sledećim amplifikacionim profilom: 94C, 60 sek; 55C, 60 sek; 72C, 60 sek; u 30 ciklusa. Nakon dva ciklusa, mašina je zaustavljena,UTeakcije su dodati bočni 5'VL i 3'VH prajmeri, po 25 pmol svakog, te je PCR nastavljen. Proizvodi PCR su ispitani na gelu za prisustvo fragmenta od 750

do 800 bp, pa su reakcioni proizvodi prečišćeni pomoću QIAQUICK i hidrolizovani dejstvomodgovarajućih restrikcionih enzima kako bi se izvršila insercija pD18 Ig ekspresionih vektora.

PCR VL domena sa nativnim vodećim peptidom i delom glvser povezujućeg peptida: L6VLHindIII: S'-gttgttaagcttgccgccatggattttcaagtgcagattttcagcttc-S' (sekvenca čiji je ID broj:

)

PCR VL domena bez vodećeg peptida (Sali mesto) i deo glvser povezujućeg peptida:

PCR VH domena sa delom glvser povezujućeg peptida i Bell mestom za fuziju sa -Ig repovima.

Ovaj vezujući region je vezan za povezujući region divljeg tipa humanog IgA i *CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je ranije označen kao L6 scFv-IgAHWTGlC, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 107: L6 scFv VHL11S ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima L6 jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na

aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 49. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani

serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 108: 2H7 scFv - IgGl lame

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region, kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za region šarke, CH2 i CH3 regione IgGl lame prema postupcima opisanim u primeru 10. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 109: 2H7 scFv - IgG2 lame

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za region šarke, CH2 i CH3 regione IgG2 lame prema postupcima opisanim u primeru 10. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čijf je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 110: 2H7 scFv - IgG3 lame

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za region šarke, CH2 i CH3 regione IgG3 lame prema postupcima opisanim u primeru 10. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 111: CD16 niski ( ED) ( SSS- S) H P238SCH2 CH3

Ovaj konstrukt ima vanćelijski vezujući region CD 16 alela niskog afiniteta kao što je opisano u primeru 43. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezan je za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 112: CD16- 9 visoki ( ED) ( SSS- S) H P238SCH2 CH3

Ovaj konstrukt ima vanćelijski vezujući region CD 16 alela visokog afiniteta kao što je opisano u primeru 43. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci ijedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezan je za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 113: 2el2 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3 - hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezan je za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region je vezan za transmembranski i region citoplazmatkog repa humanog CD80 (hCD80 TM/CT). hCD80 TM/CT je kloniran pomoću cDNK dobijene iz BJAB ćelijske linije pomoću prajmera nasumične sekvence, prema postupcima opisanim u primeru 12. Ovaj region TM/CT ■ vezan je za CH3 region Ig sa otvorenim okvirom čitanja ("Open Reading Frame", ORF). Verzije željenih scFv Ig konstrukata sa otvorenim okvirom čitanja dobijeni su supstitucijom rastvorne varijante svakog -Ig repa ORF verzijama ovih repova. Prajmeri za PCR napravljeni su prema postojećim klonovima rastvornih -Ig repova, sa delecijom stop kodona i adicijom jednog ili više restrikcionih mesta na 3' kraju novih -Ig kaseta. Željene sekvence transmembranskog i regiona citoplatmatskog repa potom mogu da se podkloniraju nishodno od ovih novih -Ig kaseta. Kod svakog konstrukta, za reakcije u okviru PCR upotrebljen je postojeći dostupni 5' BCL1 oligonukleotid korišćen za amplifikaciju rastvornih verzija repova. 3' oligonukleotidi supstituišu stop kodon restrikcionim mestima izvan okvira fuzionisanim za kodirajući region proteina koji učestvuju u regulaciji apoptoze.

PCR amplifikacija je izvršena sa po 25 pmol svakog prajmera, standardnim reagensima za PCR, i različitim zapreminama bilo kloniranih domena ili cDNK dobijne iz RNK iz PBMC, slezine ili timusa. U reakcijama je korišćen profil ciklusa od 94C, 60 sek; 55C, 60 sek; 72C, 2 min, u 35 ciklusa. Prajmeri za IgG ORF dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 114: 10A8 scFv ( SSS- S) H P238SS CH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 10A8 (anti-CD2152) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region je vezan za hCD80 TM/CT prema postupcima opisanim u primeru 113. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 115: 40. 2. 220 scFv ( SSS- S) H P238SS CH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 40.2.220 (anti-CD40) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezan je za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region je vezan za hCD80 TM/CT prema postupcima opisanim u primeru 113. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .....

Primer 116: 2H7 scFv ( SSS- S) H P238SS CH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 1.

Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region je vezan za hCD80 TM/CT prema postupcima opisanim u primeru 113. Ovaj konstrukt je ranije označen kao: Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 117: G19- 4 scFv ( SSS- S) H P238SS CH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima G19 (anti-CD3) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 29. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region je vezan za hCD80 TM/CT prema postupcima opisanim u primeru 113. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 118: 2el2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region je vezan za hCD80 TM/CT prema postupcima opisanim u primeru 113. Ovaj konstrukt je ranije označen kao 2el2 scFv IgG WTH WHTCH3CH2-CD80, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 119: 2el2 scFv IgAH IgACH2 T4CH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 12. Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region iz humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region humanog IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre stop kodona na 3' kraju kao što je opisano u primeru 13. Ovaj CH3 region je vezan za hCD80 TM/CT prema postupcima opisanim u primeru 113. Specifični prajmeri upotrebljeni za dobijanje IgA ORF dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 120: 2el2 scFv IgE CH2CH3CH4- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezan je za konstantni region humanog IgE koji sadrži CH2, CH3 i CH4 regione, kao što je opisano u primeru 38. Ovaj CH4 region je vezan za hCD80 TM/CT, u suštini prema postupcima opisanim u primeru 113. Specifični prajmeri upotrebljeni za dobijanje IgE ORF dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 121: 2el2 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3 - mFADD- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), -prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region je vezan za transmembranski region i region citoplazmatkog repa mišjeg FADD (mFADD TM/CT). Ovaj region kloniranje korišćenjem, u suštini, postupaka opisanih u primeru 113. Ovaj domen amplifikovan je pomoću PCR iz cDNK iz RNK slezine miša i prajmera nasumične sekvence. Specifični prajmeri dati su ispod:

Specifični prajmeri upotrebljeni za dobijanje IgG ORF miša dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 122: 2el2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- mFADD- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), -prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region je vezan za mFADD TM/CT prema postupcima opisanim u primerima 113 i 121. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 123: 2el2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- mcasp3- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region je vezan za transmembranski region i region citoplazmatskog repa mišjeg casp3 prema postupcima opisanim u primerima 113 i 121. Specifični prajmeri upotrebljeni za izolaciju regiona mcasp3 TM/CT dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 124: 2el2 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- mcasp3- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem*su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezan je za mcasp3 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113, 121 i 123. Polinukleotidna sekvenca data je" kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 125: 2el2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- mcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region je vezan za

transmembranski region i region citoplazmatskog repa mišjeg casp8 (mcasp8 TM/CT) prema postupcima opisanim u primerima 113 i 121. Specifični prajmeri upotrebljeni za kloniranje mcasp8 TM/CT dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 126: 2el2 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- mcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezan je za mutirani CH2 region huhianog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezanje za mcasp8 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113, 121 i 125. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 127: 2el2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- hcasp3- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region je vezan za transmembranski region i region citoplazmatskog repa humanog casp3 (hcasp3 TM/CT) prema postupcima opisanim u primeru 113. Specifični prajmeri upotrebljeni za kloniranje hcasp3 TM/CT regiona dati su ispod:

5' prajmer: 5'-gttgtggatccttcgaacatggagaacactgaaaactcagtggat-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

3' prajmer: 5'-gttgttatcgatctcgagttagtgataaaaatagagttcttttgtgag-3' (sekvenca čiji je ID broj: )

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 128: 2el2 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- hcasp3- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezanje za hcasp3 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 127. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 129: 2el2 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- hcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region je vezan za transmembranski region i region citoplazmatskog repa humanog casp8 (hcasp8 TM/CT) prema postupcima opisanim u primeru 133. Specifični prajmeri upotrebljeni za izolaciju region hcasp8 TM/CT dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca Čiji je ID broj: .

Primer 130: 2el2 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- hcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

12. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog

IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezan je za hcasp8 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 129. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 131: 1D8 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezan je za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primeru 113. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 132: 1D8 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region vezan je za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primeru 113. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3-CD80, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 133: 1D8 scFv - mlgAH CH2 T4CH3 - hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region iz humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region mišjeg IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre stop kodona na 3' kraju kao što je opisano u primeru 39. CH3 region može da bude vezan za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primeru 113, korišćenjem prajmera koji grade IgA ORF.

Primer 134: 1D8 scFv IgE CH2CH3CH4 - hCD80TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 25. Ovaj vezujući region vezan je za konstantni region divljeg tipa humanog IgE koji sadrži

CH2, CH3 i CH4 regione, kao što je opisano u primeru 38. CH4 region vezan je za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 120. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao - sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 135: 1D8 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- mFADD- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 25. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi

cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na

položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezanje za mFADD TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 121.

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 136: 1D8 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- mFADD- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi

cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne

regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region vezan je za mFADD TM/TM region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 121. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .,

Primer 137: 1D8 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- mcasp3- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region vezan je za mcasp3 TM/TM region prema postupcima opisanim u primerima 113,121 i 123. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: ..<.>.<.>

Primer 138: 1D8 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- mcasp3TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezanje za mcasp3 TM/TM region prema postupcima opisanim u primerima 113, 121 i 123. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 139: 1D8 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- mcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region vezan je za mcasp8 TM/TM region prema postupcima opisanim u primerima 113, 121 i 125. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 140: 1D8 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- mcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), .prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezan je za mcasp8 TM/TM region prema postupcima opisanim u primerima 113, 121 i 125. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 141: 1D8 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- hcasp3TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region vezan je za hcasp3 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 127. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 142: 1D8 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- hcasp3TM7CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezanje za hcasp3 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 127. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 143: 1D8 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3- hcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezan je za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. CH3 region vezan je za hcasp8 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 129. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona'kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 143: 1D8 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3- hcasp8- TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 1D8 (anti-4-lBB) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru

25. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj region šarke vezanje za mutirani CH2 region humanog IgGl i CH3 region divljeg tipa humanog IgGl. P238S mutacija, gde je prolinski ostatak na položaju 238 supstituisan serinom, uvedena je pomoću postupaka opisanih u primeru 70. CH3 region vezan je za hcasp8 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 129. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 145: L6 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima L6 jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 105. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl, kao što je opisano u primeru 1. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao L6 scFv-IgMHWTGlC, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 146: 2H7 scFv CD154 ( L2)

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za vanćelijski domen CD 154 prema postupcima opisanim u primeru 4. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 147: 2H7 scFv CD154 ( S4)

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za vanćelijski domen CD 154 prema postupcima opisanim u primeru 4, tako da su postupci vezivanja doveli do stvaranja verzije koja je skraćena u odnosu na konstrukt opisan u primeru 146. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 148: CTLA4 IgAH IgACH2CH3

Ovaj konstrukt ima vanćelijski vezujući domen CTLA-4 kao što je opisano u primeru 14. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region iz humanog IgA kao stoje opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za CH2 i CH3 konstantne regione humanog IgA prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj konstantni region je vezan za region J lanca kao što je opisano u primeru 13. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao CTLA-4 IgAH IgACH2CH3,

koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 149: CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3

Ovaj konstrukt ima vanćelijski vezujući domen CTLA-4 kao što je opisano u primeru 14.

Ovaj vezujući region vezan je za povezujući region iz humanog IgA kao što je opisano u primeru

5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region humanog IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre stop kodona na 3' kraju kao što je opisano u primeru 13. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao CTLA-4 IgAH IgA-T4, koji ima istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 150: 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za povezujući region divljeg tipa humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgA prema postupcima opisanim u primeru 13. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 151: 2H7 scFv IgAH IgACH2 T18CH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za povezujući region divljeg tipa humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za konstantni region divljeg tipa humanog IgA koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona u kojem postoji delecija 18 aminokiselinskih ostataka pre 3' stop kodona, kao što je opisano u primeru 13. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 152: 2H7- 40. 2. 220 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3

Dobijen je bispecifični fuzioni protein između 2H7 scFv (anti-CD20) i 40.2.220 (anti-CD40), koji, oba, imaju za ciljne molekule receptore na B ćelijama. 2H7 scFv hlgGl (SSS-S)H WCH2 WCH3 konstrukt u pD18 vektoru propušten je kroz dam" bakterije kako bi se omogućila hidroliza na Bell mesta. Hidrolizovani plazmid tretiranje alkalnom fosfatazom pre spajanja sa fragmentom povezujući peptid-CD40 scFv koji je takođe hidrolizovan pomoću Bell. Ovaj fragment je sintetisan iz postojećeg 40.2.220 scFv uzastopnim reakcijama u PCR sa preklapajućim prajmerima. Povezujući peptid koji je vezan je predhodno patentirani (izdat patent BMS) povezujući peptid helikoidnog oblika sa velikim brojem ostataka lizina i glutaminske kiseline. scFv za CD40 amplifikovan je pomoću PCR bez vodećeg peptida kao SalI-BclI fragment, ali sa repom uključenim u postojeći scFv konstrukt za CD20 (2H7 scFv hlgGl konstrukti). 3' kraj je sličan drugim VH scFv molekulima sa Bell mestom izvan okvira fuzionisanim za sekvencu tipa VTVSS na kraju VH domena. PCR oligonukleotidi:

40.2.220 scFv:

BclI-SalI fragment dobijen je ciklizacijom komplementarnih oligonukleotida. Ovaj fragment je potom vezan u vektor hidrolizovan dejstvom Bell zajedno sa SalI-BclI scFv kako bi se- dobio

(povezujući peptid-scFv) Bell fragment poželjan za prebacivanje.

5' prajmer: 5'-

Ovaj Bell fragment je potom vezan nishodno od 2H7 scFv u pDl 8-Ig. Transformanti su ispitani na prisustvo HindIII-Xba ubačene sekvence od 2,4 kb, te su pozitivni klonovi sekvencirani pre daljih istraživanja. Izvršene su prolazne transfekcije COS ćelija ovim konstruktom i supernatantima kultura ispitanim na prisustvo proteina predviđene veličine i na vezivanje za CD20 i za CD40 transficirane CHO ćelije.

Novi bispecifični konstrukti mogu da se dobiju izradom povezujućih regiona tipa regiona šarke, koji sadrže jedan, ili poželjnije, dva restrikciona mesta na svakom kraju povezujućeg peptida, čime se omogućava nastanak asimetrično hidrolizovanih proizvoda i prebacivanje (povezujući peptid-scFv) ili (scFv-povezujući peptid) kaseta između različitih konstrukata. Ovi konstrukti takođe sadrže mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S) prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 humanog IgGl iste sekvence kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 153: 2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3- hCD80 TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region kao što je opisano

u primeru 1. Ovaj vezujući region je vezan za povezujući region divljeg tipa humanog IgA kao što je opisano u primeru 5. Ovaj povezujući region je vezan za konstantni region humanog IgA

koji se sastoji od CH2 regiona divljeg tipa i mutiranog CH3 regiona gde postoji delecija 4 aminokiselinska ostatka pre stop kodona na 3' kraju kao što je opisano u primeru 13. Ovaj CH3 region vezanje za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primerima 113 i 119. Ovaj konstrukt je predhodno označen kao 2H7 scFv region šarke IgA IgA-T4-CD80 i 2H7 scFv IgAH IgA-T4-CD80, koji, oba, imaju istu sekvencu kao gore navedeni konstrukt. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida

koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 154: Gl9- 4 scFv ( CCC- P) WH WCH2 WCH3 - hCD80 TM/ CT

Ovaj konstrukt ima G19 (anti-CD3) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 29. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region divljeg tipa humanog IgGl (CCC-P) kao što je opisano u primeru 1. Ovaj povezujući region vezan je za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 1. Ovaj CH3 region vezanje za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primeru 113. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: _.

Primer 155: 2el2 scFv ( CCC- P) WH WCH2 WCH3 - hCD80 TM/ CT

Ovaj konstrukt ima 2el2 (anti-CD28) jednolančani Fv vezujući region opisan u primeru 12. Ovaj vezujući region vezanje za povezujući region divljeg tipa humanog IgGl (CCC-P) kao što je opisano u primeru 1. Ovaj povezujući region vezanje za CH2 i CH3 konstantne regione divljeg tipa humanog IgGl kao što je opisano u primeru 1. Ovaj CH3 region vezanje za hCD80 TM/CT region prema postupcima opisanim u primeru 113. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj:_.

Primer 156: 2H7 VHL11S scFv ( SSS- S) IgECH3CH4

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgGl u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj vezujući region vezan je za CH3 i CH4 konstantne region divljeg tipa humanog IgE. Ovaj skraćeni konstantni region dobijen je u skladu sa postupcima opisanim u primeru 38. Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 157: Region šarke IgD

• Alternativni region šarke može da se izoluje iz regiona šarke imunoglobulina humanog IgD pomoću PCR testa kojim se izoluje željeni region. Reakcije upotrebljene u okviru PCR su iste kao u primeru 1. Ovaj region šarke skraćen je za 6 aminokselinskih ostataka na 3' kraju. Prajmeri koji su korišćeni za ove reakcije u PCR dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 158: hCD28 TM/ CT

Za neke od ORF konstrukata na ćelijskoj površini transmembranski domen CD80 supstituisan je transmembranskim domenom humanog CD28 zbog toga što gradi dimer na ćelijskoj površini, a ne monomer kao što to čini CD80. Nekoliko molekula koji pokreću program apoptoze zahtevaju oligomerizaciju/trimerizaciju kako bi nagradili signalni kompleks; stoga je važno da postoji način kontrole početka signalizacije kontrolisanjem stepena oligomerizacije ovih rekombinantnih receptora na površini ćelije.

Prajmeri upotrebljeni za PCR amplifikaciju CD28 repa dati su ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca

polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 159: 2H7 scFv VH LI 1S ( SSS- S) H K322L CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je'leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su svi cisteinski ostaci i jedan prolinski ostatak supstituisani serinskim ostacima (SSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 5. Ovaj povezujući region vezan je za mutirani CH2 region humanog IgG i CH3 region divljeg tipa humanog IgG. K322L mutacija u CH2 regionu je na ostatku 322, gde je lizinski ostatak

supstituisan leucinskim pomoću preklapajuće PCR opisane u primeru 56, ali sa različitim prajmerima za prvi reakciju u okviru PCR, koji su dati ispod:

Polinukleotidna sekvenca data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 160: 2H7 scFv VH LI 1S ( CSS- S) H K322L CH2 WCH3

Ovaj konstrukt ima 2H7 (anti-CD20) jednolančani Fv vezujući region sa tačkastom mutacijom na aminokiselinskom ostatku 11 u varijabilnom regionu teškog lanca, gde je leucin supstituisan serinom, kao što je opisano u primeru 33. Ovaj vezujući region vezanje za mutirani povezujući region humanog IgG u kojem su drugi i treći cisteinski ostaci supstituisani serinskim i prolinski ostatak supstituisan serinskim ostatkom (CSS-S), prema postupcima opisanim u primeru 13. Ovaj povezujući region vezanje za mutirani CH2 region humanog IgG i CH3 region divljeg tipa humanog IgG. K322L mutacija u CH2 regionu je na ostatku 322, gde je lizinski ostatak supstituisan leucinskim pomoću preklapajuće PCR opisane u primeru 56, korišćenjem prajmera iz primera 159 u prvoj reakciji u okviru PCR i prajmera iz primera 57 za drugu reakciju u okviru PCR.

PCR proizvodi su klonirani u TOPO vektor i sekvencirani. Polinukleotidna sekvenea data je kao sekvenca čiji je ID broj: , dok je sekvenca polipeptida koji ona kodira data kao sekvenca čiji je ID broj: .

Primer 161: Iskoreniivanje B ćelijain vivopomoću 2H7 scFv ( SSS- S) H WCH2 WCH3 i

2H7 scFv ( SSS- S) H P238SCH2 WCH3

Ovaj primer opisuje eksperimente koji se odnose na ADCC efektorske mehanizme u iskorenjivanju B ćelija kroz poređenje aktivnosti anti-CD20 konstrukta (2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3) i anti-CD20 konstrukta sa supstitucijom prolinskog ostatka u CH2 domenu serinskim (2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3). Na slici 72 prikazani su rezultati eksperimenta u kojem je ispitivano pokretanje apoptoze pomoću ovih konstrukata. Rezultati su ukazali da oba molekula vezuju CD20 i pokreću apoptozu koja je posredovana aktivnošću kapsaze 3.

Na slici 73 prikazano je da anti-CD20 konstrukti posreduju CDC aktivnost prema CD20 pozitivnim ćelijama. Konstrukt 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3, konstrukt 2H7 scFv (SSS-S)

H P238SCH2 WCH3 ili Rituksimab su inkubirani, u rastućim koncentracijama, sa 10<4>Bjab ciljnih ćelija pri razblaženju zečjeg komplementa od 1 : 10 (PelFreez) u zapremini od 100 mikrolitara šezdeset minuta. Alikvoti su obojeni tripan plavim (Invitrogen), i prebrojani korišćenjem hemacitometra kako bi se utvrdio procenat ćelija usmrćenih tokom tretmana. Negativne kontrole koje su sadržale samo ćelije i jedan od reagenasa su takođe obuhvaćene eksperimentom. Na slici 74 se vidi da je konstrukt 2H7 scFv (SSS-S)H VVCH2 WCH3 bio •• • delotvoran u ADCC sa mononuklearnim ćelijama iz periferne krvi. ADCC aktivnost 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 ili Rituksimaba merena jein vitronaspram BJAB ćelijske linije B limfoma kao ciljnih ćelija, dok su kao efektorske ćelije upotrebljene sveže humane PBMC. Odnos efektorskih prema ciljnim ćelijama menjan je na sledeći način: 100 : 1, 50 : 1 i 25 : 1, pri čemu je broj BJAB ćelija održavan stalnim dok je menjan broj PBMC. BJAB ćelije su obeležene tokom 2 časa pomoću<51>Cr, a alikvoti su uzeti pri gustini ćelija od 5 x IO<4>ćelija/polju za svako polje u pločama od po 96 polja sa ravnim dnom. Prečišćeni fuzioni proteini ili Rituksimab dodati su pri koncentraciji od 10 u.g/ml, dok su PBMC dodate pri koncentraciji od 1,25.x IO<6>ćelija/polju (25 : 1), 2,5 x IO<6>ćelija/polju (50 : 1) ili 5 x IO<6>ćelija/polju (100 : 1), u konačnoj zapremini od 200 ul. Prirodno usmrćivanje mereno je pri svakom odnosu efektorskih i ciljnih ćelija, izostavljanjem konstrukta ili MAb. Spontano oslobađanje mereno je bez dodavanja PBMC

i fuzionih proteina, dok je najveće oslobađanje izmereno dodavanjem detergenta (1% NP-40) u odgovarajuća polja. Reakcione smeše su inkubirane 5 časova, nakon čega je sakupljeno po 100

ul supernatanta kulture u Lumaplate ploče (Packard Instruments) i ostavljeno preko noći da se osuši, pre merenja oslobođenih cpm na scintilacionom brojaču Packard Top Count NXT Microplate Scintillation Counter. Na slici 75 prikazano je da je konstrukt 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 vezivao rastvorni fuzioni protein CD 16 (konstruisan bilo iz alela visokog afiniteta

ili iz alela niskog afiniteta (158V/F)), dok konstrukt 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 nije pokazivao vezivanje koje bi bilo moguće registrovati. CD20 CHO ćelije (10<6>) inkubirane su sa zasićujućim količinama 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 ili 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 (10 pg/ml) tokom jednog časa na ledu u PBS/2% FBS. Ćelije su isprane u PBS/2% FBS i inkubirane sa serijom razblaženja 0,5 mg/ml FITC-CD16 jedan čas, na ledu. Ćelije su isprane, nakon čega je specifično vezivanje mereno protočnom citometrijom na Beckman-Coulter Epics C uređaju. Rezultati su analizirani pomoću Expo softvera za analizu i normalizovanih jedinica fluorescencije koje su predstavljne na grafiku u funkciji koncentracije. Na slici 76 prikazan je eksperiment u kome je ispitivana sposobnost 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 i 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 konstrukata da vežu U937 ćelije. U937 ćelije (10<6>) koje eksprimiraju CD64 inkubirane su u PBS/0,2% FBS tokom jednog časa, na ledu sa 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 ili 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3. Ćelije su isprane i •■• inkubirane jedan čas na ledu sa FITC-kozjim anti-humanim IgGl (specifičnim za Fc) (Caltag)

pri konačnom razblaženju od 1 : 100. Ćelije su isprane te je fluorescencija analizirana pomoću protočnog citometra Beckman-Coulter Epics C. Rezultati su analizirani pomoću Expo softvera za analizu, te je intenzitet fluorescencije prikazan na grafiku u funkciji koncentracije 2H7 scFv

(SSS-S)H WCH2 WCH3 ili 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3. Na ovoj slici vidi se da i konstrukt 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 i konstrukt 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 vezuju U937 sa ekvivalentnim titracionim krivama. Rezultati su ukazali da nije došlo do gubitka vezivanja za FcyRI visokog afiniteta (CD64) kod konstrukta 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3. Činjenica daje vezivanje za visoko afinitetni FcyRI na U937 ćelijama bilo slično za oba molekula u ovom eksperimentu ukazuje daje supstitucija aminokiselinskog ostatka P238S selektivno smanjila vezivanje za FcyRIII. Na slici 77 prikazano je iskorenjenje B ćelija

kod makaki majmuna posredovano anti-CD20 konstruktom (2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3)

i anti-CD20 scFv sa mutacijom u CH2 domenu. 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 ili 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 dati su makaki majmunima(M fasicularis)intravenskom injekcijom pri dozi od 6 mg/kg, pri čemu su dve infuzije date sa razmakom od nedelju dana. Uticaj na B ćelije u cirkulaciji meren je detekcijom CD40 pozitivnih B ćelija u perifernoj krvi. Uzorci krvi iz tretiranih životinja uzimani su u danima 7, 0, 1, 3, 7, 8, 10, 14, 28 i 43. Iskorenjenje B ćelija procenjeno je vršenjem CBC ("complete blood counts", određivanje kompletne krvne slike) i dvobojne protočne citometrijske analize na krvi majmuna. Konjugati antitela na CD40, CD 19, CD20, IgG, CD3 i CD8 sa FITC ili PE korišćeni su u različitim kombinacijama. Podaci su izraženi kao zavisnost broja CD40 pozitivnih B ćelija u krvi (u hiljadama) po mikrolitru od vremena, u odnosu na prvobitnu koncentraciju B ćelija pre prve injekcije (najveća vrednost). Ovaj eksperiment je pokazao daje injekcija 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 dovela do brzog i potpunog iskorenjavanja B ćelija u koncentraciji koje je trajalo više od 28 dana nakon druge injekcije. Injekcija 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3 nije dovela do potpunog iskorenjenja B ćelija iako su epitopi CD20 bili zasićeni. Sporo smanjenje broja B ćelija do približno 50% prvobitne koncentracije primećeno je tokom prve dve nedelje, ali se broj B ćelija kod ovih životinja brzo vratio na prvobitni nivo. Ovi rezultati ukazuju da sposobnost za vezivanje visoko afinitetnog FcyRI i posredovanje u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa nisu dovoljne da bi CitoksB20G molekul mogao u potpunosti da iskoreni B ćelije u cirkulaciji, a daje ADCC posredovana interakcijom sa CD16 verovatno neophodna za brzo i dugotrajno iskorenjenje B ćelija.

Ovi eksperimenti su ukazivali da su 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 sposobni da pokrenu funkcije iskorenjavanja B ćelija kroz tri različita mehanizma: (1) pokretanjem apoptoze;

(2) CDC efektorskim mehanizmima i (3) ADCC efektorskim mehanizmima. Sva tri mehanizma verovatno doprinose iskorenjavanju B ćelijain vivo.Podaci ukazuju da potpuno i dugotrajno iskorenjivanje B ćelija zahteva netaknute ADCC efektorske mehanizme. Međutim, delimično iskorenjavanje dobijeno pomoću ADCC negativnog mutanta takođe ukazuju da apoptoza i CDC mehanizmi doprinose posredovanju u delu efekata ukupnog iskorenjavanja B ćelija. Rezultati govore u prilog upotrebe 2H7 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3 scFv kod pacijenata sa CD20 pozitivnim malignitetima B ćelija ili autoimunim bolestima.

Primer 162: Pokretanje apoptoze B ćelija pomoću anti- CD37 GS- 1 VL11S scFv ( SSS) H

WCH2WCH3 konstrukata

U ovom primeru, procenjuje se sposobnost anti-CD37 GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 konstrukata da vežu ciljne ćelije, kao i njihova sposobnost da pokrenu apoptozu. Konstrukti se takođe fizički karakterišu hromatografijom ekskluzije na osnovu veličine ("Siže Exclusion Chromatographv", SEC). Na slici 78 prikazan je SEC profil G28-1 (anti-CD37) konstrukata koji imaju SSC oblik domena šarke (GS-1 VL11S scFv (SSC)H WCH2 WCH3). G28-1 (anti-CD37) konstrukti su su prečišćeni iz supernatanata kulture CHO ćelija pomoću afinitetne hromatografije na proteinu A. Prečišćeni alikvoti od 10 - 25 mg propušteni su kroz HPLC sa kolonom Tosoh Biosep, Inc., TSK 3000 SWXL HPLC, sa veličinom pore od 5 mm. Brzina protoka podešena je na 1 ml/min, u PBS pH 7,2 radnom puferu. Ispod slike su naznačene brzine migracije standarda molekulske mase. GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 konstrukt je označen plavom bojom, dok je GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 konstrukt označen crvenom. GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 konstrukt davao je jednoličan vrh na približno 75 do 100 kDa, dok je GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 konstrukt davao manji oblik i druge heterogene oblike, uključujući oblik velike molekulske mase preko 200 kDa.

Na slici 79 prikazano je vezivanje G28-1 (anti-CD37) konstrukata za ćelijske linije B limfoma. Serijska razblaženja prečišćenih GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 ili GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 inkubirana su sa po IO<6>ćelija svake od ćelijskih vrsta tokom 60 min na ledu u PBS/2%FBS. Uzorci su isprani dva puta, potom inkubirani sa smešom FITC kozjeg anti-humanog IgG i FITC kozjeg anti-humanog IgG F(ab')2 (CalTag) pri 1 : 100 za svaki, na ledu tokom 45 minuta. Uzorci su isprani i analizirani pomoću protočne citometrije uz upotrebu FACsCalibur (Becton-Dickinson). Rezultati ovog eksperimenta pokazuju da se i GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 i GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 konstrukti vezuju za '' BJAB i Ramos ćelije, a delimično za WIL-2 ćelije. G28-1 (anti-CD37) (SSS) G scFv ili G28-1 (SSC)H G scFv konstrukti vezivali su Raji i Namlavva ćelije u nižim koncentracijama tokom ovih eksperimenata. Vezivanje za sve linije bilo je značajno zbog toga što je pozadinska fluorescencija oduzeta od podataka prikazanih na slici 79. Na slici 80 prikazano je vezivanje aneksinaV-propidijum jodida za Ramos ćelije nakon inkubacije sa GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 ili GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 oblika scFv preko noći. Bojenje Ramos ćelija inkubiranih tokom 24 časa sa G28-1 (anti-CD37) scFv izvršeno je pomoću AneksinV-PI. Ramos ćelije, pri koncentraciji od IO<6>ćelija/ml, inkubirane su u sudovima sa po 12 polja tokom 24 časa sa G28-1 (anti-CD37) scFv pri koncentraciji od 10 mg/ml, u ukupnoj zapremini od 2 ml. Ćelije su obojene pomoću aneksinaV i propidijum jodida u kompletu dobij enom preko Immunotech, prema uputstvima proizvođača. Uzorci su analizirani pomoću protočne citometrije uz upotrebu FACsCalibur (Becton-Dickinson) protočnog citometra. Procenat ukupnih ćelija u svakom kvadrantu naznačen je pored svakog grafika. Na slici 83 prikazano je vezivanje aneksinaV-propidijum jodida za ćelije nakon inkubacije sa GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 ili GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 oblika scFv preko noći. Rezultati ukazuju da su i GS-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 i GS-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 konstrukti bili u stanju da pokrenu apoptozu, ali da je SSC oblik pokretao više apoptoze nego SSS oblik. Na slici 81 prikazana je inhibicija proliferacije Ramos ćelija gaj enih u prisustvu G28-1 (anti-CD37) konstrukata. Ramos B ćelije su inkubirane sa serijskim razblaženjima prečišćenih G28-1 (anti-CD37) konstrukata koji sadrže ili region šarke IgGl označen kao (SSS)H ili (SSC)H. Kulture su inkubirane u sudovima za gajenje kulture sa po

96 polja sa ravnim dnom (Costar), pri temperaturi od 37 °C, 5% CO2tokom 36 časova pre pulsiranja sa<3>timidinom tokom najmanje 12 časova inkubacije koja je trajala 48 časova (0,75 mCi/polju). Ćelije su sakupljene na GFC ploče sa po 96 polja pomoću sakupljača ćelija Packard, osušene, nakon čega im je dodato 25 ml Microscint scintilacione tečnosti pre brojanja na TopCountNXT scintilacionom brojaču mikroploča (Packard). Podaci su prikazani kao zavisnost inkorporiranih cpm od koncentracije proteina. Svaki konstrukt pokazao je rastuću inhibiciju proliferacije sa porastom koncentracije proteina. Na slici 82 prikazano je pokretanje apoptoze Ramos B ćelija gajenih u prisustvu 2H7 (anti-CD20) i G28-1 (anti-CD37) konstrukata. Ramos B ćelije su inkubirane sa konstruktima čiji su ciljni molekuli bili CD20 i/ili CD37 (10 mg/ml) tokom 10 časova, u rastvoru. Ćelije su potom sakupljene, isprane i inkubirane u aneksinuV i propidijum jodidu korišćenjem kompleta za bojenje od Immunotech, pre dvobojne protočne citometrije FACsCalibur (Becton-Dickinson) protočnim citometrom. Sa grafika se vidi da je procenat aneksin V pozitivnih ćelija, identifikovanih njihovim bojenjem u desnim kvadrantima grafika. Rezultati ovog eksperimenta ukazuju da su oba G-28 konstrukta bila delotvornija nego 2H7 konstrukt, kao i daje G28-1 VL11S scFv (SSS) H WCH2WCH3 konstrukt bio efikasniji od G28-1 VL11S scFv (SSC) H WCH2WCH3 konstrukta. Međutim, najveća količina apoptoze Ramos ćelija dobijena je kada su konstrukti 2H7 i G28-1 korišćeni u kombinaciji. Na slici 83 prikazano je usmrćivanje Ramos ćelija pomoću citotoksičnosti posredovane komplementom (CDC) koju pokreću 2H7 (anti-CD20) konstrukti i G28-1 (anti-CD37) konstrukti sa mutacijama u regionu šarke. 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3 (anti-CD20), G28-1 scFv (SSS)H G, *G28-1 (SCS)H (anti-CD37-scFv), G28-1 (CSS)H (anti-CD37-scFv), ili G28-1 (SSC)H (anti-CD37-scFv) inkubirani su pri koncentraciji od 10 mg/ml sa 10<4>Ramos ciljnih ćelija i 1 : 10 razblaženjem zečjeg komplementa (PelFreez) u zapremini od 150 ml tokom 90 minuta. Alikvoti su obojeni tripan plavim (Invitrogen), i prebrojani korišćenjem hemacitometra kako bi se odredio procenat populacije ćelija usmrćenih tokom tretmana. Negativne kontrole koje su sadržale ćelije i samo jedan od reagenasa su takođe obuhvaćene. I G28-1 (SSS) (anti-CD37 scFv) i G28-1 (SSC) (anti-CD37 scFv) su brzo usmrćivali Ramos ćelije u prisustvu zečjeg komplementa u ovom eksperimentu. Aktivnost G28-1 (SSC) (anti-CD37 scFv) bila je veća od aktivnosti G28-1 (SSS) (anti-CD37 scFv), i, u ovom testu, bila je skoro podjednako moćna kao scFv molekul 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3 usmeren ka CD20. Na slici 84 prikazano je pokretanje ADCC Ramos ćelija inkubiranih sa G28-1 (anti-CD37) scFv. G28-1 (anti-CD37) konstrukti, pri koncentraciji od 10 mg/ml inkubirani su u pločama sa po 96 polja sa ravnim dnom sa IO<4>Ramos ćelija obeleženih<51>Cr i sa humanim PBMC u mirovanju pri različitim odnosima efektorskih ćelija i ciljnih ćelija u granicama od 0 do 100. Sve inkubacije rađene su u triplikatu za svaki odnos efektorskih : ciljnim ćelijama. Prirodno usmrćivanje mereno je pri svakom odnosu efektorskih : ciljnim ćelijama izostavljanjem konstrukata. Spontano oslobađanje mereno je bez dodavanja PBMC ili fuzionog proteina, dok je najveće moguće oslobađanje mereno dodavanjem detergenta (1% NP-40) u odgovarajuća polja. Reakcione smeše su inkubirane tokom 6 časova, nakon čega je 100 ml supernatanta kulture sakupljeno u Lumaplate ploču (Packard Instruments) i ostavljeno da se osuši preko noći, pre brojanja oslobođenih cpm na TopCount NXT scintilacionom brojču mikroploča. Rezultati ovih eksperimenata ukazuju da se G28-1* (anti-CD37) konstrukti vezuju za ciljne ćelije, da pokreću apoptozu u B ćelijskim linijama i da posreduju u efektorskim funkcijama uključujući CDC i ADCC.

Sledeći neograničavajući reprezentativni konstrukti ili sekvence koje se u njima nalaze ili koje su

od koristi prema predmetnom pronalasku su sledeći:

HulgGl divlji tip region šarke, CH2, CH3(nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID: )

HulgGl divlji tip region šarke, CH2, CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Llama IgGl region šarke, CH2, CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Llama IgGl region šarke, CH2, CH3 ( na Slici 23 prikazan kao Llama IgGl)

(aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

Llama IgG2 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Llama IgG2 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Llama IgG3 Fc (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl divlji tip region šarke (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl divlji tip region šarke (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl H2, divlji tip region šarke sa leu na drugom položaju (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl H2, divlji tip region šarke sa leu na drugom položaju (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

NT HulgGl divlji tip CH2 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) ■

HulgGl divlji tip CH2 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl divlji tip CH3 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl divlji tip CH3 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl mutirani region šarke ( C- C- C- >S- S- S) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl mutirani region šarke ( C- C- C- >S- S- S) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HIgGIMTH WTCH2CH3 (mutantni region šarke sa CH2 i CH3 regionima divljeg tipa (očitavanja sa regiona šarke i Ig repa) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Mutantni region šarke, ali sa CH2 i CH3 divljeg tipa (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv Hama IgGl (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv llama IgGl (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv llama IgG2 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

AA 2H7 scFv llama IgG2 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

NT 2H7 scFv llama IgG3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv llama IgG3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv WTH WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

2H7 scFv WTH WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

NT CD80 transmembranski domen i citaplazmatski rep (+ restrikciona mesta) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

CD80 transmembranski domen i citoplazmatski rep (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220 VL ( anti- humani CD40 scFv # 1- VL) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220 VL ( anti- humani CD40 scFv # 1- VL) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220 VH ( za anti- humani CD40 scFv # 1- VH) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220 VH ( za anti- humani CD40 scFv # 1-- VH) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220 scFv ( anti- humani CD40 scFv # 1) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220 scFv ( anti- humani CD40 scFv # 1) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2VL ( sa L6 VK lider peptidom) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2 VL ( sa L6 VK lider peptidom) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2 VH ( bez lider peptida) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2 VH (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2scFv(+ restrikciona mesta) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2scFv (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 je anti-CD152 (CTLA-4) 10A8 VL ( sa L6 VK lider peptidom) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 VL (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 VH ( bez lider peptida) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 VH (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 SCFV (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 SCFV (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220- hmtIgGl- hCD80 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

40. 2. 220- hmtIgGl- hCD80 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2scFv- hmtIgGl- CD80 fuzioni protein (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2scFv- hmtIgGl- CD80 fuzioni protein (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 scFv- hmtIgGl- CD80 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

10A8 scFv- hmtIgGl- CD80 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

500A2- hmtIgGl- CD80 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

500A2- hmtIgGl- CD80 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH( SSS) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH( SSS) WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgAH IGG WT CH2CH3 (2H7 scFv sa IgA regionom šarke i WT CH2 i CH3)

(nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgAH IGG \VT CH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (2H7 scFv IgA region šarke i IgA CH2 i CH3) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgAH IgACH2CH3 (2H7 scFv IgA region šarke i IgA CH2 i CH3)

(aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

IgA region šarke- CH2- CH3 (Humani IgA rep, puna dužina) (nukleotidna sekvenca) .

(sekvenca čiji je ID br: )

IgA region šarke- CH2- CH3 (Humani IgA rep, puna dužina) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Human J lanac (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) Human J lanac (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

4 karboksi- terminalne amino kiseline koje su deletirane iz IgA CH3 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

GTCY

IgAH IgAT4 (humani IgA rep, nepotpuni (3Tl)-(nedostaju poslednje 4 amino kiseline sa karboksi-terminala) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

IgAH IgAT4 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgAH IgAT4 (2H7 scFv IgA 3T1 konstrukt; nedostaje CH3 domen na 3' kraju)

(nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgAH- T4 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

14 aminokiselina deletirano iz IgAH- T4 (tako da je ukupno 18 amino kiselina deletirano iz IgA CH3 divljeg tipa) (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

PTHVNVSVVMAEVD

IgAH IgA- T18 (nepotpuni humani IgA rep, 3T2) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

IgAH IgA- T18 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv I<g>AH I<g>AT18 (nepotpuni humani IgA rep, 3T2) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br:_ )

2H7 scFv IgAH IgAT18 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) CTLA- 4 IgG WTH WTCH2CH3 (humani-oncoMLP-CTLA4EC-hIgGWT) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

CTLA- 4 IgG VVTH WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Humani OncoM lider peptid + CTLA4 EC ( Bell) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Humani OncoM lider peptid + CTLA4 EC (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Humana OncoM lider sekvenca (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatg Humana OncoM lider sekvenca (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) Humani CTLA4 EC (bez LP) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) Humani CTLA4 EC (bez LP) (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

Humani CTLA4 IgG MTH ( SSS) MTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Humani CTLA4 IgG MTH ( SSS) MTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

CTLA- 4 IgAH IgACH2CH3 (humani oncoMLP-CTLA4EC-IgA)

(nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

CTLA- 4 IgAH IgACH2CH3 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

CTLA- 4 IgAH IgA- T4 (humani oncoMLP-CTLA4EC-IgA3Tl) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

CTLA- 4 IgAH IgA- T4 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

Humani IgGl CH2 sa mutacijom 238 pro- >ser (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Human IgGl CH2 sa mutacijom 238 pro- >ser (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Amino kiseline koje okružuju mutaciju Pro u Ser kod CH2 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Amino kiseline koje okružuju mutaciju Pro u Ser kod CH2 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

hIgE3BB (ostavlja otvoreni ram očitavanja na kraju gena kaka bi se očitao u transmembranskom i cotoplazmatskom domenu repa prikačenom ili za BamHI ili za Sful mesto) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

Humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4) ORF (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Human IgE Fc ( CH2- CH3- CH4) ORF (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

IFhIgGwtBcl5 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

HuIgGMHWC (kodirajući, 5' prajmer za mutiranje divljeg tip regiona šarke CCC u mutanta SSS) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

1D8 VH (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 1D8 VH (bez lider sekvence) (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 1D8 VL (bez lider sekvence) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 1D8 VL (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 1D8 scFv (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 1D8 scFv (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

1D8 scFv IgG MTH MTCH2CH3- CD80 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

1D8 scFv IgG MTH MTCH2CH3- CD80 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3- CD80 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

1D8 scFv IgG WTH WTCH2CH3- CD80 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Anti- humani CD3 scFv WTH WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Anti- humani CD3 scFv WTH WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7- antiCD40 scFv MTH ( SSS) MTCH2WTCH3 (2h7-40.2.220Ig + restrikciona mesta)

(nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

2H7- antiCD40 scFv MTH ( SSS) MTCH2WTCH3 (2H7-40.2.220Ig)

(aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

5B9 VH (obuhvata VH lider peptid) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

5B9 VH (bez lider sekvence) (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 5B9 VH (obuhvata lider peptid) (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 5B9 VH (no Ieader peptide) (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 5B9 VL (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 5B9 VL (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) 5B9 scFv (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

5B9 scFv (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

5B9 scFv- hmtIgGl- hCD80 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

5B9 scFv- hmtIgGl- hCD80 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji jc ID br: )

2el2 scFv WTH CH2 CH3 (2el2 scFv-WthIgG-CD80) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2el2 scFv WTH CH2 CH3 (2el2 scFv-WthIgG-CD80) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7- humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4) (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv IgE ( CH2- CH3- CH4) (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MH ( SSS) MCH2WTCH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MH ( SSS) MCH2WTCH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

5B9 scFv MTHWTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

Mutacije humanog IgGl regiona šarke

2H7 scFv- MTH ( CSS) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv- MTH ( CSS) WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv- MTH ( SCS) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv- MTH ( SCS) VVTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv- MTH ( SSC) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv- MTH ( SSC) WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

HIgGMHcvsl (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) gtt gtt gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tg HIgGMHcys2 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

HIgGMHcvs3 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl MTCH3Y405 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3Y405 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3A405 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3A405 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3A407 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl MTCH3A407 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )

HulgGl MTCH3Y405A407 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3Y405A407 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3A405A407 (nukleotidna sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: ) HulgGl MTCH3A405A407 (aminokiselinska sekvenca) (sekvenca čiji je ID br: )<*>

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3Y405 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3Y405 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3A405 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3A405 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3A407 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3A407 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3Y405A407 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3Y405A407 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) VVTCH2MTCH3A405A407 (nukleotidna sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SSS) WTCH2MTCH3A405A407 (aminokiselinska sekvenca)

(sekvenca čiji je ID br: )

2H7 scFv MTH ( SCC) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca) 2H7 scFv MTH ( SCC) WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca) 2H7 scFv MTH ( CSC) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca) 2H7 scFv MTH ( CSC) WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca) 2H7 scFv MTH ( CCS) WTCH2CH3 (nukleotidna sekvenca) 2H7 scFv MTH ( CCS) WTCH2CH3 (aminokiselinska sekvenca) HuIgAHIgA- T4- ORF (nukleotidna sekvenca) HuIgAHIgA- T4- ORF (aminokiselinska sekvenca) ! D8- IgAH IgA- T4- CD80 (nukleotidna sekvenca) 1D8 scFv IgAH IgA- T4- CD80 (aminokiselinska sekvenca)

Humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4) ORF (nukleotidna sekvenca)

Humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4) ORF (aminokiselinska sekvenca) 1D8 scFv- human IgE Fc ( CH2- CH3- CH4VCD80 (nukleotidna sekvenca) lD8- scFv- humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4)- CD80 (aminokiselinska sekvenca) 5B9- IgAH IgA- T4- CD80 (nukleotidna sekvenca) 5B9- IgAH IgA- T4- CD80 (aminokiselinska sekvenca) 5B9- scFv- humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4)- CD80 (nukleotidna sekvenca) 5B9- scFv- humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4)- CD80 (aminokiselinska sekvenca) 2el2- scFv- IgAH IgA- T4- CD80 (nukleotidna sekvenca) 2el2- scFv- IgAH IgA- T4- CD80 (aminokiselinska sekvenca) 2el2-scFv-humani IgE Fc (CH2-CH3-CH4)-CD80 (nukleotidna sekvenca) 2el2- scFv- humani IgE Fc ( CH2- CH3- CH4)- CD80 (aminokiselinska sekvenca) 500A2 scFv (nukleotidna sekvenca) 500A2 scFv (aminokiselinska sekvenca)

NT

5' oligo:

Ime: IgGWTS

NT

3' oligo:

Ime: hIgGWT5

NT

5' oligo:

Ime: FADD5 Sekvenca:

NT

3' oligo: Ime: FADD3

Sekvenca:

NT

FADD- CSSCFV(nukleotidna sekvenca)

FAĐD- CSSCFV (aminokiselinska sekvenca)

HCD28tm5B (nukleotidna sekvenca)

HCD28tm3S (nukleotidna sekvenca) HCD28tm5' (nukleotidna sekvenca) HCD28tm3' (nukleotidna sekvenca) HCD80tm5' (nukleotidna sekvenca) HCD80tm3' (nukleotidna sekvenca) MFADD5BB (nukleotidna sekvenca) MFADD3XC (nukleotidna sekvenca)

MišijaFADDnukleotidna sekvenca (pune dužine, ali bez bočnih -Ig ili transmembranskih sekvenci) (nukleotidna sekvenca)

Mišija FADD (aminokiselinska sekvenca) MCASP3- 5 (nukleotidna sekvenca) MCASP3- 3 (nukleotidna sekvenca) MCASP8- 5 (nukleotidna sekvenca) hcasp3- 5 (nukleotidna sekvenca) hcasp3- 3 (nukleotidna sekvenca) hcasp8- 5 (nukleotidna sekvenca) hcasp8- 3 (nukleotidna sekvenca) 1. 2H7scFv sa alternativnim VHL11 mutacijama:

Nukleotidna sekvenca

Aminokiselinska sekvenca

2. DelecijaVHLll

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

3.2H7 VL L106 sa alternativnim mutacijama

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:MDFQVQIFSFLLISASVIIARGQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWY QQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWS

FNPPTFGAGTKLE (S,T, R, K, H, Q, N, D,E,kao i sintetski derivati ovih amino kiselina na položaju 106)KDGGGSGGGGSGGGGSS

4. Delecija VL L106

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

5.IgE CH3 CH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

6. hIgGIH/IgE WCH3 WCH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

7.IgE WCH2 WCH3 WCH4

Nukleotidna sekvenca:.

Aminokiselinska sekvenca:

8. hIgGIH/IgE CH3 CH4 (ORF)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

9. 2H7 VHL11S scFv HgGl(SSS-S)H hlgE WCH3 WCH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

10. 2H7 VHL11S scFv hIgGl(SSS-P)H hlgE WCH3 WCH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca: 10. 2H7 VL L106S

Aminokiselinska sekvenca:

11.2H7 VL L106S scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

12. 2H7 scFv VL L106S VHL11S scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

10. Human IgDregion šarke linker with attached restriction sites

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

Sekvenca domena nativnog IgD regiona šarke:

(obuhvata cisteinski ostatak - odstranjen je region šarke pre tog ostatka kod ovih konstrukata:)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

12.2H7VHL11S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

13.2H7VHLllSscFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

14. 2H7 scFv VH L11S hlgGl (CSC-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

15.2H7 scFv VH L11S IgE WCH2 WCH3 VVCH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

16. 2H7 scFv VH L11S mlgE WCH2 WCH3 WCH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

17. 2H7 scFv VH L11S hlgA WH WCH2 T4CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

18. 2H7 scFv VH L11S mlgA WH WCH2 T4 CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

A. mlgA WCH2 T4CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

21. K322SCH2WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

1. K322L CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

22.2H7 scFv VHL11S hlgGl (SSS-S)H K322SCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

23. 2H7 scFvVHLUS hlgGl (SSS-S)H K322LCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

24. 2H7 scFvVHL11S hlgGl (CSS-S)H K322SCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

25.P331SCH2

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

26.P331S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

27.2H7scFv VH L11S (SSS-S)H P331S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

28. 2H7 scFvVH L11S (CSS-S)H P331S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

29. T256N CH2 region

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

30. T256NCH2WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

31. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H T256N CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

32. 2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H T256N CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

34. RTPE/QNAK(255-258) CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

35. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H RTPE/QNAK (255-258)CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

33. RTPE/QNAK (255-258) CH2

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca 36. 2H7 scFv VH L11S (CSS-S)H RTPE/QNAK (255-258)CH2 WCH3 Nukleotidna sekvenca: Aminokiselinska sekvenca

36. K290Q CH2 region

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

37. K290Q CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

38. 2H7 scFvVH L11S (SSS-S)H K290Q CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

39.2H7 scfv VHL11S (CSS-S)H K290Q CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

40.A339PCH2

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

41.A339P CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

42. 2H7 scFv VHL11S (SSS-S)H A339P CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

43. 2H7 scFv VHL11S (CSS-S)H A339P CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

44.G28-1VH

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

45.G28-1VL

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

46. G28-lscFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

47. G28-1VHL11S

Nukleotidna sekvenca:

gatcag

Aminokiselinska sekvenca:

48.G28-1 VHL11S scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

49. G28-1scFv (SSS-S)HWCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

50.G28-1 scFv IgAW H IgGlWCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekenca:

51. G28-1 scFvVHL11S (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

52.G28-1 scFv VHL11S (CSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

53. G28-1 scFvVH L11S (CSC-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

54. G28-1 scFvVH L11S (SSC-P)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

II. 54. HCTLA4 HIGG1 (SSS-S)H P238SCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

55. Fc2-2 VL

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

56.FC2-2VH

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

57. FC2-2scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

58. FC2-2 VHL11S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

59. FC2-2VHLllSscFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

60. FC2-2 (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

61. FC2-2 VHL11S(SSS-S)HWCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

62.UCHL-1 VH

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

63.UCHL-1 VL

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

64.UCHL-1 scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

65. UCHL-1 VHII 1SL12S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

66. UCHL-1 scFvVH LI 1S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

67.UCHL-1scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

68.UCHL-1 scFv VHL11S (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

69. 5B9VHL11S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

73. 5B9 VHLllSscFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

70.5B9 scFv VHL11S (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

76. 2H7scFvVHLllS(SSS-S)HP238SCH2WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

78. 2H7 scFv VH L11S (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

79. 2H7scFvVHLllS(CSS-S)HWCH2WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

77. G8-1 scFvVHL11S (SCS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

79. G28-lscFvVHLllS(CCS-P)HWCH2WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

80. G28-1 scFv VH L11S (SCC-P)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

81. G28-1 scFv VH L11S mlgE CH2 CH3 CH4

Nukleotidna sekvenca:

? Aminokiselinska sekvenca:

82. G28-1 scFvVH LI 1S mlgA WH WCH2 T4CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

83. G28-1 scFv Vh L11S hlgE CH2 CH3 CH4

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

84. G28-1scFvVH L11S hlgA WH WCH2 T4CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

85. HD37 VL

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

86. HD37 VH

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

87.HD37 scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

88. HD37 VHL11S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

89. HD37scFvVHLllS

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

90. HD37 scFvIgAH hlgGl WCH2 T4CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

91. HD37 scFv (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

92. HD37 scFvVH L11S (SSS-S)H WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

91.L6VL

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

92. L6VH

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

93.L6 scFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

94.L6VHL11S

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

95.L6VHLllSscFv

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

96. L6 ili L6 VHL11S scFv IgAH hlgGl WCH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca: ( Prikazana je L6 VHL11S)

Aminokiselinska sekvenca:

97. L6scFvVHLUS(SSS-S)HWCH2WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

98. P238CH2WCH3 a. P238S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

b. (SSS-S)H P238S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

99. a.CD16-6niska (ED) +NL+ (SSS-S)H P238S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

100. b. CD16-6 niska (ED)+HE4LP+(SSS-S)H P238S CH2 WCH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

101. CD16-9visoka (ED) (SSS-S)H P238S CH2 CH3 a. CD16-9 high (ED)NL+(SSS-S)H P238S CH2 CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

CD16-9 visoka(ED)+HE4LP+hIgG 1 (SSS-S)H P238S CH2 CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

102. a. CD16 ED niska (nativna lider sekvenca)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:mwqlllptallllvsagmrtedlpkawlfepqvvy^ geyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqapnwflceedpihlrchswkntalhkvtylqn syfcrglvgsknvssetvnititqgladq

b. CD16 ED niska (HE4 lider)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

103. a. GD16 ED visoka (nativna lider sekvenca)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

b. CD16 EDvisoka(HE4 lider)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

104. 2el2 scFv(SSS-S)H P238S CH2 WCH3-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

105. 10A8scFv (SSS-S)H P238S CH2 WCH3-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

106. 2H7 scFv VHL11S (SSS-P)H P238S CH2CH3-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

107. G19-4 scFv (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

108.2el2scFv IgA WH WCH2 T4 CH3-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

109. 2el2 scFV(SSS-P)H P238S CH2 WCH3-mFADD-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

110. 2el2 scFv(SSS-P)H WCH2WCH3-mFADD-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

111.mcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

112. 2el2 scFv(SSS-P)H WCH2WCH3-mcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

113.2el2 scFv (SSS-P)H P238SCH2WCH3-mcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

114.mcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

115. 2el2scFv hlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

116. 2el2scFv hlgGl (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

117. hcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

118. 2el2 scFvhlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

123. 2el2 scFv hlgGl (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

124.hcasp8-TM/CT hKapsaza8B:Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

hKapsaza8C:Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

125. 2el2 scFvhlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

126. 2el2scFv hlgGl (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hcasp8B-TM/CT

(druge izoforme kapsaze 8 su slične)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

128. 2el2 scFv-hlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-hFADD-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

129. 2el2 scFv-hlgGl (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hFADD-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

130.1D8scFv hlgGl (SSS-P)H VVCH2 WCH3-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

131.1D8 scFvmIgAT4-hCD80TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

132.1D8 scFv hlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

133.1D8 scFv hlgGl (SSS-P)H P238S CH2 WCH3-mFADD-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

134.1D8scFv hlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

135.1D8 scFv hlgGl (SSS-P)H P238S CH2 WCH3-mcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

136.1D8 scFv hlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

137.1D8 scFv hlgGl (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

138.1D8scFv hlgGl (SSS-P)H WCH2 WCH3-hcasp3-TM7CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

139. 1D8 scFv hlgGl (SSS-P)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

140.1D8scFv hlgGl (SSS-S)H WCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

141.1D8 scFv hlgGl (SSS-S)H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

145.hCTLA4 IgAH IgACH2CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

146. hCTLA4 IgA WH WCH2 T4CH3 (hCTLA4 IgAH IgACH2CH3)

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

147. hlgA WH WCH2 T18CH3

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

150. G19-4 scFv (SSS-P)WH WCH2 WCH3-hCD80TMCT

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

HCD16niskaFL+NL

Nukleotidna sekvenca:

Aminokiselinska sekvenca:

Iz napred navedenog je jasno da, iako su specifična rešenja predmetnog pronalaska koja su ovde opisana data samo radi ilustracije, moguće je napraviti razne modifikacije bez odstupanja od duha i obima zaštite predmetnog pronalaska. Shodno tome, predmetni pronalazak nije ograničen drugim, izuzev pridodatim patentnim zahtevima.

Svi patentni, patentne prijave, publikacije, naučni članci, internet stranice i drugi dokumenti i materijali koji su ovde navedeni kao reference ili su pomenuti na drugi način, namenjeni su iskusnim stručnjacima, na koje se predmetni pronalazak i odnosi, a svaki dokument koji je naveden kao referenca, kao i navedeni materijal, smatra se da je ovde idividualno inkorporiran po referenci u potpunosti ili da je ovde predstavljen u potpunosti. Dodatno, svi patentni zahtevi ove patentne prijave i sve prioritetne patentne prijave, uključujući, bez ograničenja, originalne patentne zahteve, inkorporirane su ovde u potpunosti i čine sastavni deo pisanog opisa predmetnog pronalaska. Prijavioci zadržavaju pravo da fizički inkroporiraju u ovu specifikaciju bilo koji, kao i sve materijale i informacije iz bilo kog od tih patenata, patentnih prijava, publikacija, naučnih članaka, internet stranica, elektronski dostupnih izvora i drugih referenciranih materijala ili dokumenata. Prijavioci zadržavaju pravo da u specifikaciju fizički inkorporiraju bilo koji deo ovog dokumenta, uključujući bilo koji deo ovog pisanog opisa, patentne zahteve koji se odnose na gore navedeno, uključujući, bez ograničenja, originalne patentne zahteve.

Specifični postupci i preparati koji su ovde opisani predstavljaju poželjna rešenja i dati su radi primera, a ne sa namerom da ograniče obim zaštite predmetnog pronalaska. Drugi objekti, aspekti i rešenja će biti očigledni stručnjacima nakon razmatranja patentne specifikacije i obuhvaćeni su obimom zaštite predmetnog pronalaska, koji je definisan pridodatim patentnim zahtevima. Stručnjacima je jasno da je moguće načiniti brojne supstitucije i modifikacije ovde opisanog predmetnog pronalaska, bez odstupanja od duha i obima zaštite predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak koji je ovde ilustrativno opisan, može da se na odgovarajući način praktikuje u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ili bez ograničenja, koja nisu ovde specifično navedena kao esencijalna. Tako, na primer, u svakom od ovde navedenih slučaja, u rešenjima ili u primerima prema predmetnom pronalasku, svaki od pojmova "koji sadrži", "koji se suštinski sastoji od" i "koji se sastoji od", može da se zameni bilo kojim od druga dva navedena pojma u predmetnoj specifikaciji. Takođe, pojmovi "koji sadrži", "koji uključuje", "koji obuhvata" i si., treba da budu shvaćeni u njihovom širokom značenju i bez ograničenja. Postupci i procesi koji su ovde ilustrativno opisani, mogu da se praktikuju na odgovarajući način u različitim redosledima koraka, tako da praksa nije obavezno ograničena na redoslede koraka koji su naznačeni ovde ili u patentnim zahtevima. Takođe, kao što je to slučaj ovde i u patentnim zahtevima, pojmovi u jednini "jedna", "jedan", "jedno" obuhvataju i oblike u množini, osim ako nije drugačije jasno naznačeno. Tako, na primer, pominjanje "ćelije domaćina" podrazumeva i množinu (na primer, kulturu ili populaciju) takvih ćelija domaćina, i tome slično. Ni u kom slučaju ne treba smatrati daje predmetni pronalazak ograničen na specifične primere ili rešenja ili postupke koji su specifično opisani ovde. Ni u kom slučaju ne treba smatrati da je patent ograničen bilo kojom izjavom od strane Ispitivača ili bilo kog drugog zvaničnika ili zaposlenog u Patentnom zavodu, osim ako takva izjava nije specifično i bez kvalifikacije ili rezervisanosti eksplicitno prihvaćena u pisanom odgovoru Prijavioca.

Pojmovi i izrazi koji su ovde upotrebljeni, korišćeni su kao pojmovi za opisivanje, a ne ograničavanje i ne postoji namera da se upotreba tih termina i izraza koristi za isključivanje bilo kog ekvivalenta ovde opisanih karakteristika ili njihovih segmenata, već se smatra daje moguće načiniti razne modifikacije u okviru obima zaštite predmetnog pronalaska, koji je definisan patentnim zahtevima. Shodno tome, treba napomenuti da bez obzira što je predmetni pronalazak specifično opisan putem poželjnih rešenja, moguće je da stručnjaci načine modifikacije i varijacije ovde opisanih koncepta, pri čemu se smatra da su navedene modifikacije i varijacije obuhvaćene obimom zaštite prema predmetnom pronalasku, koji je definisan pridodatim patentnim zahtevima.

Predmetni pronalazak je ovde opisan u širokom značenju i generički. Svako od užih značenja i subgeneričkih grupacija koja spadaju u generički opis, takođe čine deo predmetnog pronalaska. Ovim je obuhvaćen generički opis predmetnog pronalaska, uz uslov ili negativno ograničenje koje uklanja bilo koju subjektnu materiju iz genusa, bez obzira da li je ili nije ekscidirani materijal specifično naveden ovde. Na primer, subjektna materija predmetnog pronalaska može opciono da isključi bilo koju subjektnu materiju ili sekvence koje su opisane ili koje su uključene u povezanoj patentnoj prijavi objavljenoj kao U.S.S.N. 2003/0118592 Al, podnetoj 26.06.2003. (što se odnosi i na liste sekvenci ID brojeva 1 - 427 koje su objavljene od strane USPTO), podnete od strane Ledbetter et al., sa naslovom "Fuzioni proteini vezujućeg domena i imunoglobulina".

Druga rešenja se nalaze u okviru patentnih zahteva koji slede. Dodatno, tamo gde su karakteristike ili aspekti predmetnog pronalaska opisani od strane Markush grupa, stručnjaci razumeju da se smatra da je predmetni pronalazak takođe opisan od strane bilo kog individualnog člana ili podgrupe Markush grupe.

Claims (413)

1. Jednolančani polipeptid koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se vezuje za molekul - metu, pri čemu navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca, gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku supstituciju ili deleciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka; ii) drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom; i iii) treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani polipeptid koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

2. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv.

3. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što jedna ili više aminokiselinskih supstitucija ili delecija u pomenutom varijabilnom regionu teškog lanca efikasno povećava ekspresiju ili stabilnost navedenog proteina u odnosu na protein bez navedene delecije ili supstitucije.

4. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina

5. Protein prema zahtevu 4, naznačen time što dalje sadrži drugi polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za drugi molekul - metu, pri čemu navedeni drugi polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.

6. Protein prema zahtevu 5, naznačen time što su prvi molekul - meta i drugi molekul - meta različiti.

7. Protein prema zahtevu 5, naznačen time što su prvi molekul - meta i drugi molekul - meta isti.

8. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuti polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u položajima 9, 10, 11,

12, 108,110, 112 navedenog varijabilnog regiona teškog lanca.

9. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju 11 pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca.

10. Protein prema zahtevu 9, naznačen time što je aminokiselina kojom je supstituisana aminokiselina na položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca jednolančanog Fv izabrana iz grupe koju čine serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin, glutamin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, lizin, arginin i histidin.

11. Protein prema zahtevu 9, naznačen time stoje leucin na položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca jednolančanog Fv zamenjen aminokiselinom koja se razlikuje od serina.

12. Protein prema zahtevu 9, naznačen time što je leucin zamenjen serinom na položaju 11 i pri čemu je navedeni protein sposoban da posreduje pri ćelijski posredovanoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela i pri fiksaciji komplementa i što poseduje sposobnost da se vezuje za navedeni molekul - metu, smanjujući tako broj ćelija - meta.

13. Protein prema zahtevu 9, naznačen time što je leucin zamenjen des-leucinom na položaju 11.

14. Protein prema zahtevu 12, naznačen time što poseduje povećanu rekombinantnu ekspresiju ili stabilnost u odnosu na navedeni protein koji nema aminokiselinsku supstituciju na položaju 11.

15. Protein prema zahtevu 14, naznačen time što je ekspresija navedenog proteina koji poseduje aminokiselinsku supstituciju na položaju 11 veća od 10 do 600 puta u odnosu na naVedeni protein bez supstitucije na položaju 11.

16. Protein prema zahtevu 14, naznačen time što se navedena ekspresija odvija u ćelijama sisara.

17. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuti polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv i što je aminokiselina na položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca navedenog jednolančanog Fv deletirana.

18. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuti polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv i što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region lakog lanca poseduje aminokiselinsku deleciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina na položajima 12, 80, 81, 83,105, 106 i 107.

19. Protein prema zahtevu 18, naznačen time što je aminokiselina na položaju 106 supstituisana ili deletirana.

20. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za tumorski antigen.

21. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za antigen na nekoj efektorskoj imunološkoj ćeliji.

22. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za antigen kancerske ćelije.

23. Protein prema zahtevu 22, naznačen time što je navedeni antigen kancerske ćelije površinski antigen.

24. Protein prema zahtevu 22, naznačen time što je navedeni antigen kancerske ćelije intracelularni antigen.

25. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za B ćelijski antigen.

26. Protein prema zahtevu 25, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD 19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86.

27. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što se navedeni jednolančani Fv vezuje za B ćelijski antigen.

28. Protein prema zahtevu 27, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86.

29. Protein prema zahtevu 28, naznačen time što je navedeni jednolančani Fv izabran iz grupe koju čine HD37 jednolančani Fv, 2FI7 jednolančani Fv, G28-1 jednolančani Fv i 4.4.220 jednolančani Fv.

30. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što je jednolančani Fv izabran iz grupe koju čine HD37 jednolančani Fv, 2H7 jednolančani Fv, G28-1 jednolančani Fv, FC2-2, UCHL-1, 5B9, L6, 10A8, 2el2, 40.2.36, G19-4, 1D8 i 4.4.220 jednolančani Fv.

31. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je polipeptid vezujućeg domena scFv, koji se vezuje za B ćelijski antigen diferencijacije.

32. Protein prema zahtevu 31, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD37 i CD40.

33. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za molekule - mete izabrane iz grupe koji čine CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD 10, CDllb, CDR CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50 (ICAM3), CD54 (ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD 152 (CTLA-4), CD 153 (ligand za CD30), CD 154 (ligand za CD40), ICOS, L6, B7-Hl i HLA klase II.

34. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni protein sposoban da formira kompleks koji sadrži dva ili više takvih proteina.

35. Protein prema zahtevu 34, naznačen time što je navedeni kompleks dimer.

36. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni protein monomer.

37. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je povezan sa molekulom leka, toksina, imunomodulatora, polipeptidnog efektora, izotopa, oznake ili sa efektorskom podjedinicom.

38. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je tamo navedena imunološka aktivnost izabrana iz grupe koju čine ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, fiksacija komplementa, indukcija apoptoze, indukcija jednog ili više biološki aktivnih signala, indukcija jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija, aktivacija ćelijske diferencijacije, ćelijska aktivacija, otpuštanje jednog ili više biološki aktivnih molekula i neutralizacija infektivnog agensa ili toksina.

39. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što navedena imunološka aktivnost obuhvata dve imunološke aktivnosti koje su izabrane iz grupe koju čine ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, fiksacija komplementa, indukcija apoptoze, indukcija jednog ili više biološki aktivnih signala, indukcija jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija, aktivacija ćelijske diferencijacije, ćelijska aktivacija, otpuštanje jednog ili više biološki aktivnih molekula i neutralizacija infektivnog agensa ili toksina.

40. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što je sposoban da indukuje biološki aktivne signale putem aktivacije ili inhibicije jednog ili više molekula koji su izabrani iz grupe koju čine protein kinaze, protein fosfataze, G-proteini, ciklični nukleotidi ili drugačiji drugi glasnici, jonski kanali, kao i komponente sekretornog puta, ili koji je sposoban da indukuje jednu ili više imunoloških efektorskih ćelija koje su izabrane iz grupe koju čine NK ćelije, monociti, makrofagi, B ćelije, T ćelije, mastociti, neutrofili, eozinofili i bazofili.

41. Protein prema zahtevu 40, naznačen time što indukcija jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija dovodi do ćelijski posredovane citotoksičnosti koja je zavisna od antitela ili do otpuštanja jednog ili više biološki aktivnih molekula.

42. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što je sposoban da izvrši ćelijsku aktivaciju, pri čemu navedena aktivacija dovodi do promena ćelijske transkripcione aktivnosti.

43. Protein prema zahtevu 42, naznačen time što je navedena ćelijska transkripciona aktivnost povećana.

44. Protein prema zahtevu 42, naznačen time što je navedena ćelijska transkripciona aktivnost smanjena.

45. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što su jedan ili više biološki aktivnih molekula proteaze.

46. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što su jedan ili više biološki aktivnih molekula citokini. ?

47. Protein prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni citokin izabran iz grupe koju čine monokini, limfokini, hemokini, faktori rasta, faktori stimulacije kolonija, interferoni i interleukini.

48. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što je sposoban da neutrališe infektivni agens, pri čemu je pomenuti infektivni agens bakterija, virus, parazit ili gljivica.

49. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je pomenuti toksin izabran iz grupe koju čine endotoksini i egzotoksini.

50. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je navedeni toksin egzotoksin koji je izabran iz grupe koju čine toksin antraksa, toksin kolere, toksin difterije, toksin pertusisa, LT termolabilni toksin E. coli, ST termostabilni toksin E. coli, šiga toksin, egzotoksin A Pseudomonas-a, botulinum toksin, tetanus toksin, AC toksin Bordetella pertussis-a i EF toksin Bacillus anthracis-a.

51. Protein prema zahtevu 38, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je navedeni toksin endotoksin izabran iz grupe koju čine saksitoksini, tetrodotoksin, toksini gljiva, aflatoksin, pirolizidinski alkaloidi, fitohemaglutinini i grajanotoksin.

52. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni protein sposoban da se veže za intracelularni molekul - metu, čime utiče na ćelijsku funkciju.

53. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region lakog lanca koji je povezan sa navedenim varijabilnim regionom teškog lanca putem vezujućeg domena regiona za povezivanje, pri čemu pomenuti vezujući domen povezujućeg regiona sadrži jedan ili više peptida čija je sekvenca Gly - Gly - Gly - Gly - Ser.

54. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži tri peptida Gly - Gly - Gly - Gly - Ser.

55. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži imunoglobulinski varijabilni region divljeg tipa ili onaj koji je dobijen genetskim inženjeringom, a koji je poreklom iz organizma čoveka, miša, pacova, svinje i majmuna.

56. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži humanizovani varijabilni region imunoglobulina.

57. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona .teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu sadrži polipeptid CH2 domena konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca IgG.

58. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što se navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu suštinski sastoji od polipeptida CH2 domena konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca IgG.

59. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu sadrži polipeptid CH2 domena konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca IgG.

60. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što se navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu suštinski sastoji od polipeptida CH2 domena konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca IgG.

61. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži barem deo humanog konstantnog regiona.

62. Protein prema zahtevu 2, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži barem deo humanog konstantnog regiona.

63. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži region šarke koji se javlja u prirodi i koji je izabran iz grupe koju čine humani region šarke ili neki njegov deo, humani region šarke IgG ili neki njegov deo, humani region šarke IgA ili neki njegov deo, humani region šarke IgE ili neki njegov deo, region šarke kamelida ili neki njegov deo,-region šarke IgGl lame ili neki njegov deo, region šarke Ginglvmostoma cirratum-a ili neki njegov deo i region šarke Hvdrplagus colliei-a ili neki njegov deo.

64. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgE ili njegov deo.

65. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 koji ne sadrže uopšte il sadrže jedan cisteinski ostatak.

66. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgA koji poseduje od 0 do 2 cisteinska ostatka.

67. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgGl divljeg tipa.

68. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mesto za glikozilaciju.

69. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region ne sadrži cisteinske ostatke koji su sposobni da formiraju disulfidne veze.

70. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži jedan cisteinski ostatak.

71. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mutirani polipeptid regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa koji ne sadrži više od jednog cisteinskog ostatka.

72. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni povezujući region izmenjen tako da navedeni protein poseduje smanjenu sposobnost dimerizacije.

73. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži tri cisteinska ostatka i jedan prolinski ostatak, pri čemu je jedan ili više od navedenih cisteinskih ostataka deletiran ili supstituisan i pri čemu je navedeni prolinski ostatak supstituisan ili deletiran.

74. Protein prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mutirani polipeptid regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa koji obuhvata prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na pomenuti drugi cistein, a drugi cistein je N-terminalno lociran u odnosu na treći cistein i gde je navedeni prvi cisteinski ostatak supstituisan ili deletiran.

75. Protein prema zahtevu 74, naznačen time što navedeni polipeptid regiona šarke divljeg tipa potiče iz humanog IgGl.

76. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, pri čemu navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca sa jednom ili sa više aminokiselinskih delecija ili supstitucija na položajima 9, 10, 11, 12, 108, 110, 112; ii) drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa prvim polipeptidom; i iii) treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost i gde navedeni protein poseduje povećanu rekombinantnu ekspresiju ili stabilnost u odnosu na navedeni protein koji ne poseduje aminokiselinsku deleciju ili supstituciju.

77. Jednolančani Fv protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu na ciljnoj ćeliji, pri čemu navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca u kome je leucin na položaju 11 u prvom okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca deletiran ili supstituisan drugom aminokiselinom; ii) drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa prvim polipeptidom; i iii) treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi (1) sposoban da se veže za navedeni molekul - metu, (2) sposoban je da izazove ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela i (3) sposoban je da smanji broj ciljnih ćelija.

78. Protein prema zahtevu 77, naznačen time što dalje sadrži supstituciju ili deleciju aminokiseline na položaju 10 u prvom okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca.

79. Protein prema zahtevu 77, naznačen time što navedena aminokiselinska supstitucija na položaju 11 dovodi do povećanja ekspresije ili stabilnosti navedenog jednolančanog Fv proteina u odnosu na jednolančani Fv protein bez navedene delecije ili supstiucije.

80. Protein prema zahtevu 77, naznačen time što je numeracija ostataka sprovedena korišćenjem EU indeksiranja po Kabat-u.

81. Protein prema zahtevu 77, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prolin i prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na pomenuti drugi cistein, a drugi cistein je N-terminalno lociran u odnosu na treći cistein, a navedeni treći cisteinski ostatak je N-terminalno lociran u odnosu na navedeni prolinski ostatak.

82. Protein prema zahtevu 77, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo.

83. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv poreklom iz 2H7 hibridoma, pri čemu je navedeni drugi cisteinski ostatak zamenjen serinom, navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom u povezujućem regionu, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

84. Protein prema zahtevu 82, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv poreklom iz 2H7 hibridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA miša ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz mišijeg IgA, pri čemu navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca.

85. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, pri čemu su prvi, drugi i treći cisteinski ostatak u povezujućem regionu zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak u povezujućem regionu je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je lizin zamenjen serinom na položaju 322 u navedenom CH2 regionu.

86. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni drugi i treći cisteinski ostaci zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je lizin zamenjen serinom na položaju 322 u navedenom CH2 regionu.

87. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostaci zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je prolin zamenjen serinom na položaju 331 u navedenom CH2 regionu.

88. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je prolin zamenjen serinom na položaju 331 u navedenom CH2 regionu.

89. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi,i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je treonin zamenjen asparaginom na položaju 256 u navedenom CH2 regionu.

90. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene 2H7 jednolančanog Fv iz IgGl, pri čemu je arginin iz CH2 domena zamenjen glutaminom na položaju 255, treonin je zamenjen asparaginom na položaju 256, prolin je zamenjen alaninom na položaju 257, a glutaminska kiselina je zamenjena lizinom na položaju 258.

91. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je lizin zamenjen glutaminom na položaju 290 u navedenom CH2 regionu.

92. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je alanin zamenjen prolinom na položaju 339 u navedenom CH2 regionu.

93. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani proten sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

94. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

95. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu je u povezujućem regionu navedeni drugi cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a naVedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

96. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu prvi i drugi cisteinski ostatak zamenjeni serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

97. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz FC2-2 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

98. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz UCHL-1 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

99. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 5B9 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

100. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

101. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

102. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

103. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, koji sadrži povezujući region u kome je navedeni treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

104. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu je u povezujućem regionu navedeni prvi cisteinski ostatak zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

105. Protein prema zahtevu 82, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu navedeni povezujući region sadrži region šarke mišijeg IgA, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz mišijeg IgA, a navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline, što konstantni region teškog lanca IgA čini nesposobnim za udruživanje sa polipeptidom J lanca.

106. Protein prema zahtevu 82, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma, pri čemu navedeni povezujući region sadrži region šarke humanog IgA, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz humanog IgA, a navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline, što konstantni region teškog lanca IgA čini nesposobnim za udruživanje sa polipeptidom J langa.

107. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz HD37 hibridoma, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostaci zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

108. Protein prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen L6 jednolančanog Fv, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugiu treći cisteinski ostaci zamenjeni serinom, i prolinski ostatak je zamenjen serinom, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

109. Jednolančani Fv protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, pri čemu navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca u kome je leucin zamenjen serinom na položaju 11 u prvom okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca; pri čemu navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi poseduje povećanu ekspresiju ili stabilnost u ćelijama sisara u odnosu na protein koji ne poseduje navedenu aminokiselinsku supstituciju; ii) drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa prvim polipeptidom; i iii) treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani Fv protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

110. Jednolančani Fv protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, pri čemu navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region teškog lanca u kome je leucin zamenjen serinom na položaju 11 u prvom okvirnom regionu varijabilnog regiona teškog lanca; i ii) drugi polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina IgE koji je nepotpun na N-terminalu koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

111. Protein prema zahtevu 110, naznačen time što aminokiselinska supstitucija na položaju 11 dovodi do povećanja ekspresije ili stabilnosti navedenog jednolančanog Fv proteina u odnosu na jednolančani Fv protein koji ne poseduje navedenu deleciju ili supstituciju.

112. Protein prema zahtevu 110, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2, CH3 i CH4 domene iz IgE.

113. Protein prema zahtevu 110, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2, CH3 i CH4 domene iz mišijeg IgE.

114. Protein prema zahtevu 110, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2, CH3 i CH4 domene iz mišijeg IgE.

115. Protein prema zahtevu, 110, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hibridoma i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2, CH3 i CH4 domene iz humanog IgE.

116. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa prvim polipeptidom, treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu navedeni povezujući region sadrži prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, gde je prvi cisteinski ostatak lociran N-terminalno u odnosu na drugi cisteinski ostatak, a navedeni drugi cisteinski ostatak je lociran N-terminalno u odnosu na navedeni treći cistein, i pri čemu su i drugi i treći navedeni cisteinski ostatak supstituisani ili deletirani i pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

117. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv.

118. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.

119. Protein prema zahtevu 118, naznačen time što dalje sadrži drugi polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za drugi molekul - metu, pri čemu drugi polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.

120. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži varijabilni region teškog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region teškog lanca poseduje aminokiselinsku deleciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina na položajima 9, 10, 11,12, 108, 110, 112.

121. Protein prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region lakog lanca poseduje aminokiselinsku deleciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina na položajima 80, 81, 83, 105, 106 i 107.

122. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži varijabilni region teškog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region teškog lanca poseduje aminokiselinsku supstituciju na aminokiselnskom položaju 11.

123. Protein prema zahtevu 122, naznačen time što je aminokiselina na položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca jednolančanog Fv izabrana iz grupe koju čine serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin, glutamin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, lizin, arginin i histidin.

124. Protein prema zahtevu 122, naznačen time što je aminokiselina koja supstituiše aminokiselinu na položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca jednolančanog Fv izabrana iz grupe koju čine serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin.

125. Protein prema zahtevu 122, naznačen time što je leucin zamenjen serinom na položaju 11.

126. Protein prema zahtevu 122, naznačen time što je leucin zamenjen des-leucinom na položaju 11.

127. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv i Što je aminokiselina na položaju 11 varijabilnog regiona teškog lanca navedenog jednolančanog Fv deletirana.

128. Protein prema zahtevu 122, naznačen time što je leucin zamenjen serinom na položaju 106.

129. Protein prema zahtevu 117, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za tumorski antigen.

130. Protein prema zahtevu 117, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za antigen na imunološkoj efektorskoj ćeliji.

131. Protein prema zahtevu 117, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za antigen kancerske ćelije.

132. Protein prema zahtevu 131, naznačen time što je navedeni antigen kancerske ćelije površinski antigen.

133. Protein prema zahtevu 131, naznačen time što je navedeni antigen kancerske ćelije intracelularni antigen.

134. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za B ćelijski antigen.

135. Protein prema zahtevu 135, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86.

136. Protein prema zahtevu 117, naznačen time što se navedeni jednolančani Fv vezuje za B ćelijski antigen.

137. Protein prema zahtevu 136, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD 19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86.

138. Protein prema zahtevu 137, naznačen time što je navedeni jednolančani Fv izabran iz grupe koju čine jednolančani Fv HD37, jednolančani Fv 2H7, jednolančani Fv G28-1 i jednolančani Fv 4.4.220.

139. Protein prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni jednolančani Fv izabran iz grupe koju čine jednolančani Fv HD37, jednolančani Fv 2H7, jednolančani Fv G28-1, FC2-2, UCHL-1, 5B9, L6, 10A8, 2el2, 40.2.36, G19-4, 1D8 i 4.4.220 jednolančani Fv.

140. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena scFv koji se vezuje za B ćelijski antigen diferencijacije.

141. Protein prema zahtevu 136, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD37 i CD40.

142. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za molekule - mete izabrane iz grupe koji čine CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD 10, CDllb, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50 (ICAM3), CD54 (ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA-4), CD153 (ligand za CD30), CD154 (ligand za CD40), ICOS, L6, B7-Hl i HLA klase II.

143. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni protein sposoban da formira kompleks koji sadrži dva ili više takvih proteina.

144. Protein prema zahtevu 143, naznačen time što je navedeni kompleks dimer.

145. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni protein monomer.

146. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je povezan sa molekulom leka, toksina, imunomodulatora, polipeptidnog efektora, izotopa, oznake ili sa efektorskom podjedinicom.

147. Protein prema zahtevu 116, naznačen time Što je tamo navedena imunološka aktivnost izabrana iz grupe koju čine ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, fiksacija komplementa, indukcija apoptoze, indukcija jednog ili više biološki aktivnih signala, indukcija - jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija, aktivacija ćelijske diferencijacije, ćelijska aktivacija, otpuštanje jednog ili više biološki aktivnih molekula i neutralizacija infektivnog agensa ili toksina.

148. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da izazove indukciju biološki aktivnih signala putem aktivacije ili inhibicije jednog ili više molekula koji su izabrani iz grupe koju čine protein kinaze, protein fosfataze, G-proteini, ciklični nukleozidi ili drugačiji drugi glasnici, jonski kanali i komponente sekretornog puta.

149. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da indukuje jednu ili više imunoloških efektorskih ćelija koje su izabrane iz grupe koju čine NK ćelije, monociti, makrofagi, B ćelije, T ćelije, mastociti, neutrofili, eozinofili i bazofili.

150. Protein prema zahtevu 149, naznačen time što. indukcija jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija dovodi do ćelijski posredovane citotoksičnosti koja je zavisna od antitela ili do otpuštanja jednog ili više biološki aktivnih molekula.

151. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da izvrši ćelijsku aktivaciju, pri čemu navedena aktivacija dovodi do promena ćelijske transkripcione aktivnosti.

152. Protein prema zahtevu 151, naznačen time što je navedena ćelijska transkripciona aktivnost povećana.

153. Protein prema zahtevu 151, naznačen time što je navedena ćelijska transkripciona aktivnost smanjena.

154. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što su jedan ili više biološki aktivnih molekula proteaze.

155. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što su jedan ili više biološki aktivnih molekula citokini.

156. Protein prema zahtevu 155, naznačen time što je navedeni citokin izabran iz grupe koju čine monokini, limfokini, hemokni, faktori rasta, faktori stimulacije kolonija, interferoni i interleukini.

157. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da neutrališe infektivni agens, pri čemu je pomenuti infektivni agens bakterija, virus, parazit ili gljivica.

158. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je pomenuti toksin izabran iz grupe koju čine endotoksini i egzotoksini.

159. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je navedeni toksin egzotoksin koji je izabran iz grupe koju čine toksin antraksa, toksin kolere, toksin difterije, toksin pertusisa, LT termolabilni toksin E. coli, ST termostabilni toksin E. coli, šiga toksin, egzotoksin A Pseudomonas-a, botulinum toksin, tetanus toksin, AC toksin Bordetella pertussis-a i EF toksin Bacillus anthracis-a.

160. Protein prema zahtevu 147, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je navedeni toksin endotoksin izabran iz grupe koju čine saksitoksini, tetrodotoksin, toksini gljiva, aflatoksin, pirolizidinski alkaloidi, fitohemaglutinini i grajanotoksin.

161. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region lakog lanca koji je povezan sa navedenim varijabilnim regionom teškog lanca putem vezujućeg domena povezujućeg regiona, pri čemu pomenuti vezujući domen povezujućeg regiona sadrži jedan ili više peptida čija je sekvenca Gly - Gly - Gly - Gly - Ser.

162. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što sadrži tri peptida Gly - Gly - Gly - Gly - Ser.

163. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži imunoglobulinski varijabilni region divljeg tipa ili onaj koji je dobijen genetskim inženjeringom, a koji je poreklom iz organizma čoveka, miša, pacova, svinje i majmuna.

164. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni protein sposoban da se veže za intracelularni molekul - metu, čime utiče na ćelijsku funkciju.

165. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu sadrži polipeptid CH2 konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 konstantnog regiona teškog lanca IgG.

166. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina ne sadrži funkcionalno aktivni CH1 domen.

167. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu u suštini sastoji od polipeptida CH2 konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 konstantnog regiona teškog lanca IgG.

168. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što sadrži barem deo humanog konstantnog regiona.

169. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži region šarke koji se javlja u prirodi koji je izabran iz grupe koju čine humani region šarke ili neki njegov deo, humani region šarke IgG ili neki njegov deo, humani region šarke IgA ili neki njegov deo, humani region šarke IgE ili neki njegov deo, region šarke kamelida ili neki njegov deo, region šarke IgGl lame ili neki njegov deo, region šarke Ginglymostoma cirratum-a ili neki njegov deo i region šarke Hvdrolagus colliei-a ili neki njegov deo.

170. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgE ili njegov deo.

171. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 koji ne sadrže uopšte il sadrže jedan cisteinski ostatak.

172. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgA koji poseduje od 0 do 2 cisteinska ostatka.

173. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgGl divljeg tipa.

174. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mesto za glikozilaciju.

175. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region ne sadrži cisteinske ostatke koji su sposobni da formiraju disulfidne veze.

176. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži jedan cisteinski ostatak.

177. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mutirani polipeptid regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa koji ne sadrži više od jednog cisteinskog ostatka.

178. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što je navedeni povezujući region izmenjen tako da navedeni protein poseduje smanjenu sposobnost dimerizacije.

179. Protein prema zahtevu 116, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prolinski i prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na pomenuti drugi cistein, a drugi cistein je N-terminalno lociran u odnosu na treći cistein i gde je navedeni treći cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na prolinski ostatak.

180. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen CTLA-4 jednolančanog Fv, pri čemu su u povezujućem regionu navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom, i navedeni prolinski ostatak je zamenjen serinom, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je porlin zamenjen serinom na položaju 238 u pomenutom CH2 domenu.

181. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen CTLA-4 jednolančanog Fv i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

182. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen FC2-2 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

183. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen UCHL-1 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

184. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 5B9 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

185. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

186. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu je navedeni prolinski ostatak zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

187. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži jednolančani 2H7 Fv koji sadrži povezujući region u kome su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl, gde je fenilalanin zamenjen tirozinom na položaju 405 u navedenom CH3 regionu.

188. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je fenilalanin zamenjen alaninom na položaju 405 u navedenom CH3 regionu.

189. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je tirozin zamenjen alaninom na položaju 407 u navedenom CH3 regionu.

190. Protein prema zahtevu 189, naznačen time što poseduje prividnu molekulsku masu od oko 75 kDa.

191. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je fenilalanin zamenjen alaninom na položaju 405, a tirozin je zamenjen alaninom na položeju 407 u navedenom CH3 regionu.

192. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

193. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

194. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi i drugi cisteinski ostatak zamenjeni serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2iCH3 domene iz IgGl.

195. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži jednolančani 2H7 Fv, koji sadrži povezujući region u kome je navedeni drugi cisteinski ostatak zamenjen serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

196. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži jednolančani 2H7 Fv, koji sadrži povezujući region u kome je navedeni treći cisteinski ostatak zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

197. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog 2H7 Fv, u čijem je povezujućem regionu navedeni prvi cisteinski ostatak zamenjen serinom i u kome navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene jednolančanog 2H7 Fv.

198. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen HD37 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

199. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži polipeptide CH2 i CH3 domena konstantnog regiona iz IgGl lame.

200. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži polipeptide CH2 i CH3 domena konstantnog regiona iz IgG2 lame.

201. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2H7 jednolančanog Fv i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži polipeptide CH2 i CH3 domena konstantnog regiona iz IgG3 lame.

202. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen CD-16-6 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu.

203. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein" sadrži vezujući domen za receptor za CD16, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu.

204. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 2el2 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

205. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen 10A8 scFv jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

206. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 40.2.36 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

207. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

208. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G19-4 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

209. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G19-4 hibridoma i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

210. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

211. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mFADD.

212. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i-gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mFADD.

213. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp3.

214. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp3.

215. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp8.

216. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp8.

217. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp3.

218. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp3.

219. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein'sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp8.

220. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp8.

221. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hibridoma, kod koga navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

222. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

223. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 scFv hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

224. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mFADD.

225. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedenfprvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mFADD.

226. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp3.

227. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp3.

228. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp8.

229. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa mcasp8.

230. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp3.

231. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp3.

232. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp8.

233. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hibridoma, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl gde je prolin zamenjen serinom na položaju 238 u navedenom CH2 regionu i gde je navedeni CH3 domen povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa hcasp8.

234. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen L6 jednolančanog Fv, kod koga u povezujućem regionu su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

235. Protein prema zahtevu 179, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži G28-1 jednolančani Fv, koji sadrži povezujući region u kome su navedeni prvi, drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinom i prolinski ostatak je zamenjen serinom i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene G28-1 jednolančanog Fv.

236. Postupak za redukciju populacije ciljnih ćelija kod subjekta, naznačen time što obuhvata primenu kod navedenog subjekta terapijski efikasne količine proteina koji ima molekulsku masu manju od oko 150 kDa, i koji obuhvata korake: a) korak tretiranja populacije ciljnih ćelija prvim proteinom ili peptidom koji se vezuje za ćelije navedene populacije ciljnih ćelija i b) korak tretiranja populacije ciljnih ćelija drugim proteinom ili peptidom koji poseduje barem jednu od sledećih sposobnosti: i) vezivanje za Fc receptor, ii) indukcija apoptoze ciljne ćelije, ili iii) fiksacija komplementa, pri čemu je navedeni molekul prvog proteina ili peptida direktno povezan sa navedenim molekulom drugog proteina ili peptida, ili opciono, navedeni molekul prvog proteina ili peptida i navedeni molekul drugog proteina ili peptida su međusobno povezani pomoću molekula trećeg proteina ili peptida, i pri čemu navedeni molekul proteina nije antitelo, član TNF porodice molekula ili porodice molekula TNF receptora, i nije konjugovan sa molekulom bakterijskog toksina, citotoksičnog leka ili radioizotopa.

237. Postupak za redukciju populacije ciljnih ćelija kod subjekta, naznačen time što obuhvata primenu kod navedenog subjekta terapijski efikasne količine proteina koji ima molekulsku masu V manju od oko 150 kDa, i koji se suštinski sastoji od koraka: a) tretiranja populacije ciljnih ćelija prvim proteinom ili peptidom koji se vezuje za ćelije navedene populacije ciljnih ćelija i b) tretiranja populacije ciljnih ćelija drugim proteinom ili peptidom koji poseduje barem jednu od sledećih sposobnosti: i) vezivanje za Fc receptor, ii) indukcija apoptoze ciljne ćelije, ili iii) fiksacija komplementa, pri čemu je navedeni molekul prvog proteina ili peptida direktno povezan sa navedenim molekulom drugog proteina ili peptida, ili opciono, navedeni molekul prvog proteina ili peptida i navedeni molekul drugog proteina ili peptida su međusobno povezani pomoću molekula trećeg proteina ili peptida, i pri čemu navedeni molekul proteina nije antitelo, član TNF porodice molekula ili porodice molekula TNF receptora, i nije konjugovan sa molekulom bakterijskog toksina, citotoksičnog leka ili radioizotopa.

238. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: a) prvi polipeptid koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, pri čemu se navedeni polipeptid vezujućeg domena sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca sa jednom ili više aminokiselinskih delecija ili supstitucija; ii) drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, i iii) treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

239. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: a) prvi polipeptid koji ima polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, pri čemu se navedeni polipeptid vezujućeg domena sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca sa jednom ili više aminokiselinskih delecija ili supstitucija na položajima 12, 80, 81, 83, 105, 106 i 107; ii) drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, i iii) treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

240. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što jedna ili više aminokiselinskih supstitucija ili delecija u navedenom varijabilnom regionu lakog lanca efikasno povećava ekspresiju ili stabilnost navedenog proteina u odnosu na protein bez navedne delecije ili supstitucije.

241. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv.

242. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena saarži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.

243. Protein prema zahtevu 242, naznačen time što dalje sadrži drugi polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za drugi molekul - metu, pri čemu navedeni drugi polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. ?

244. Protein prema zahtevu 241, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv i što navedeni varijabilni region lakog lanca navedenog jednolančanog Fv ima aminokisleinsku deleciju ili supstituciju na položaju 106.

245. Protein prema zahtevu 241, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jdenolančani Fv i što je aminokiselina na položaju 106 varijabilnog regiona teškog lanca navedenog jednolančanog Fv deletirana.

246. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv i što navedeni varijabilni region teškog lanca navedenog jednolančanog Fv ima aminokiselinsku supstituciju na položaju 106.

247. Protein prema zahtevu 244, naznačen time što je leucin zamenjen serinom na položaju 106.

248. Protein prema zahtevu 244, naznačen time što je leucin zamenjen des-leucinom na položaju 106.

249. Protein prema zahtevu 244, naznačen time što je aminokiselina kojom se supstituiše aminokiselina na položaju 106 varijabilnog regiona lakog lanca jednolančanog Fv izabrana iz grupe koju čine serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin, glutamin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, lizin, arginin i histidin.

250. Protein prema zahtevu 244, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži varijabilni region teškog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region teškog lanca ima aminokiselinsku supstituciju na položaju 11.

251. Protein prema zahtevu 241, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za tumorski antigen.

252. Protein prema zahtevu 241, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za antigen na imunološkoj efektorskoj ćeliji.

253. Protein prema zahtevu 241, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za antigen kancerske ćelije.

254. Protein prema zahtevu 253, naznačen time što je navedeni antigen kancerske ćelije površinski antigen.

255. Protein prema zahtevu 253, naznačen time što je navedeni antigen kancerske ćelije intracelularni antigen.

256. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za B ćelijski antigen.

257. Protein prema zahtevu 256, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD 19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86.

258. Protein prema zahtevu 241, naznačen time što se navedeni jednolančani Fv vezuje za B ćelijski antigen.

259. Protein prema zahtevu 258, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD 19, CD20, CD22, CD37, CD40, CD80 i CD86.

260. Protein prema zahtevu 259, naznačen time što je navedeni jednolančani Fv izabran iz grupe koju čine HD37 jednolančani Fv, 2H7 jednolančani Fv, G28-1 jednolančani Fv i 4.4.220 jednolančani Fv. V

261. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena scFv koji se vezuje za B ćelijski antigen diferencijacije.

262. Protein prema zahtevu 261, naznačen time što je navedeni B ćelijski antigen izabran iz grupe koju čine CD 19, CD20, CD22, CD37 i CD40.

263. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što se navedeni polipeptid vezujućeg domena vezuje za molekule - mete izabrane iz grupe koji čine CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD10, CDllb, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD28, CD30, CD37, CD40, CD43, CD50 (ICAM3), CD54 (ICAM1), CD56, CD69, CD80, CD86, CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA-4), CD153 (ligand za CD30), CD154 (ligand za CD40), ICOS, L.6, B7-Hl i HLA klase II.

264. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedeni protein sposoban da formira kompleks koji sadrži dva ili više takvih proteina.

265. Protein prema zahtevu 264, naznačen time što je navedeni kompleks dimer.

266. Protein prema zahtevu 23 8, naznačen time što je navedeni protein monomer.

267. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedena imunološka aktivnost izabrana iz grupe koju čine ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, fiksacija komplementa, indukcija apoptoze, indukcija jednog ili više biološki aktivnih signala, indukcija jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija, aktivacija ćelijske diferencijacije, ćelijska aktivacija, otpuštanje jednog ili više biološki aktivnih molekula i neutralizacija infektivnog agensa ili toksina.

268. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da indukuje biološki aktivne signale putem aktivacije ili inhibicije jednog ili više molekula koji su izabrani iz grupe koju čine protein kinaze, protein fosfataze, G-proteini, ciklični nukleotidi ili drugačiji drugi glasnici, jonski kanali, kao i komponente sekretornog puta.

269. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da indukuje jednu ili više imunoloških efektorskih ćelija koje su izabrane iz grupe koju čine NK ćelije, monociti, makrofagi, B ćelije, T ćelije, mastociti, neutrofili, eozinofili i bazofili.V

270. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što navedena indukcija jedne ili više imunoloških efektorskih ćelija dovodi do ćelijski posredovane citotoksičnosti koja je zavisna od antitela ili do otpuštanja jednog ili više biološki aktivnih molekula.

271. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da izvrši ćelijsku aktivaciju, pri čemu navedena aktivacija dovodi do promena ćelijske transkripcione aktivnosti.

272. Protein prema zahtevu 271, naznačen time što je navedena ćelijska transkripciona aktivnost povećana.

273. Protein prema zahtevu 271, naznačen time što je navedena ćelijska transkripciona aktivnost smanjena.

274. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što su jedan ili više biološki aktivnih molekula proteaze.

275. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što su jedan ili više biološki aktivnih molekula citokini.

276. Protein prema zahtevu 275, naznačen time što je navedeni citokin izabran iz grupe koju čine monokini, limfokini, hemokni, faktori rasta, faktori stimulacije kolonija, interferoni i interleukini.

277. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da neutrališe infektivni agens, pri čemu je pomenuti infektivni agens bakterija, virus, parazit ili gljivica.

278. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je pomenuti toksin izabran iz grupe koju čine endotoksini i egzotoksini.

279. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je navedeni toksin egzotoksin koji je izabran iz grupe koju čine toksin antraksa, toksin kolere, toksin difterije, toksin pertusisa, LT termolabilni toksin E. coli, ST termostabilni toksin E. coli, šiga toksin, egzotoksin A Pseudomonas-a, botulinum toksin, tetanus toksin, AC toksin Bordetella pertussis-a i EF toksin Bacillus anthracis-a.

280. Protein prema zahtevu 267, naznačen time što je sposoban da neutrališe toksin, pri čemu je navedeni toksin endotoksin izabran iz grupe koju čine saksitoksini, tetrodotoksin, toksini gljiva, aflatoksin, pirolizidinski alkaloidi, fitohemaglutinini i grajanotoksin.

281. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedeni protein sposoban da se veže za intracelularni molekul - metu, čime utiče na ćelijsku funkciju.

282. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu sadrži polipeptid CH2 konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 konstantnog regiona teškog lanca IgG.

283. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što se navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu suštinski sastoji od polipeptida CH2 konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 konstantnog regiona .teškog lanca IgG.

284. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što sadrži barem deo humanog konstantnog regiona.

285. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži region šarke koji se javlja u prirodi koji je izabran iz grupe koju čine humani region šarke ili neki njegov deo, humani region šarke IgG ili neki njegov deo, humani region šarke IgA ili neki njegov deo, humani region šarke IgE ili neki njegov deo, region šarke kamelida ili neki njegov deo, region šarke IgGl lame ili neki njegov deo, region šarke Ginglvmostoma cirratum-a ili neki njegov deo i region šarke Hvdrolagus colliei-a ili neki njegov deo.

286. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgE ili njegov deo.

287. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 koji ne sadrže uopšte il sadrže jedan cisteinski ostatak.

288. Protein prema zahtevu 238, naznačen iime što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgA koji poseduje od 0 do 2 cisteinska ostatka. ?

289. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži humani region šarke IgGl divljeg tipa.

290. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mesto za glikozilaciju.

291. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region ne sadrži cisteinske ostatke koji su sposobni da formiraju disulfidne veze.

292. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži jedan cisteinski ostatak.

293. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži mutirani polipeptid regiona šarke imunoglobulina divljeg tipa koji ne sadrži više od jednog cisteinskog ostatka.

294. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što je navedeni povezujući region izmenjen tako da navedeni protein poseduje smanjenu sposobnost dimerizacije.

295. Protein prema zahtevu 238, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prolinski i prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na pomenuti drugi cistein, a navedeni drugi cistein je N-terminalno lociran u odnosu na treći cistein i gde je navedeni treći cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na navedeni prolinski ostatak.

296. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, drugi polipeptid koji sadrži povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, pri čemu navedeni povezujući region sadrži barem deo regiona šarke IgA i treći polipeptid koji sadrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

297. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina

298. Protein prema zahtevu 297, naznačen time što dalje sadrži drugi polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za drugi molekul - metu, pri čemu navedeni drugi polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina

299. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni povezujući region suštinski sadrži barem deo regiona šarke IgA.

300. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni povezujući region suštinski sadrži region šarke IgA.

301. Protein prema zahtevu 300, naznačen time što je eksprimiran kao protein koji ima prividnu molekulsku masu od barem 70 kDa.

302. Protein prema zahtevu 300, naznačen time što je eksprimiran kao protein koji ima prividnu molekulsku masu od oko 70 kDa do oko 700 kDa.

303. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što je navedeni povezujući region sadrži između 10 i 50 aminokiselina.

304. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži modifikovani humani polipeptid regiona šarke IgA.

305. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži samo jedan cisteinski ostatak.

306. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži dva cisteinska ostatka.

307. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu u trećem polipeptidu sadrži konstantne regione teškog lanca IgA.

308. Protein prema zahtevu 307, naznačen time što sadrži CH2 i CH3 domene iz konstantnih regiona teškog lanca IgA.

309. Protein prema zahtevu 308, naznačen time što navedeni CH3 domen konstantnog regiona IgA dalje sadrži supstituciju ili deleciju jedne ili više aminokiselina koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca.

310. Protein prema zahtevu 308, naznačen time što je navedeni konstantni region teškog lanca IgA sposoban da se udruži sa polipeptidom J lanca.

311. Protein prema zahtevu 309, naznačen time što navedeni CH3 domen regiona IgA sadrži deleciju između četiri i dvadeset aminokiselina.

312. Protein prema zahtevu 309, naznačen time što navedeni domen regiona IgA sadrži deleciju četiri aminokiseline.

313. Protein prema zahtevu 309, naznačen time što navedeni domen regiona IgA sadrži deleciju dvadeset aminokiselina.

314. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen L6 jednolančanog Fv, pri čemu povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

315. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein'sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz L6 hibridoma, u kome povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

316. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz CTLA-4 hibridoma, u kome povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz mišijeg IgA.

317. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz CTLA-4 hibridoma, u kome povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz mišijeg IgA, a navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca.

318. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hibridoma, u kome povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz mišijeg IgA.

319. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgA, a navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju osamnaest aminokiselina koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca.

320. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgA, pri čemu navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca i gde je CH3 domen prikačen za polipeptid koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

321. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgA, pri čemu navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca i gde je CH3 domen prikačen za polipeptid koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

322. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 1D8 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, i navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgA, pri čemu navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca i gde je CH3 domen prikačen za polipeptid koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

323. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz G28-1 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

324. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein .sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hidbridoma, u kome navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgGl.

325. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hidbridoma, u kome navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgA, pri čemu navedeni CH3 domen sadrži deleciju ili supstituciju četiri aminokiseline koje konstantni region teškog lanca IgA čine nesposobnim da se udruži sa polipeptidom J lanca i gde je CH3 domen prikačen za polipeptid koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

326. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2H7 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 i CH3 domene iz IgA, pri čemu je konstantni region teškog lanca IgA sposoban da se udruži sa polipeptidom J lanca.

327. Protein prema zahtevu 296, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz HD37 hidbridoma, navedeni povezujući region sadrži region šarke IgA ili njegov deo, a navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2 j CH3 domene iz IgA.

328. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji sadrži polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu i ii) drugi polipeptid koji sadrži makar deo polipeptida konstantnog regiona teškog lanca IgE koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji makar jednu imunološku aktivnost.

329. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži varijabilni region koji ne potiče iz IgE.

330. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji je izabran iz grupe koju čine HD37 jednolančani Fv, 2H7 jednolančani Fv, G28-1 jednolančani Fv, FC2-2, UCHL-1, 5B9, L6, 10A8, 2el2, 40.2.36, G19-4, 1D8 i 4.4.220 jednolančani Fv.

331. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina

332. Protein prema zahtevu 331, naznačen time što dalje sadrži drugi polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za drugi molekul - metu, pri čemu navedeni drugi polipeptid vezujućeg domena sadrži polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina i polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.

333. Protein prema zahtevu 332, naznačen time što navedeni laki i teški lanac imunoglobulina obuhvataju laki i teški lanac IgG ili njegove delove.

334. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži makar deo varijabilnog regiona IgG.

335. Protein prema zahtevu 334, naznačen time što navedeni varijabilni region IgG sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca.

336. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što poseduje sposobnost da se veže za Fc receptor koji je specifičan za IgE.

337. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što ne poseduje varijabilni region lanca IgE.

338. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što se vezujući domen sastoji suštinski od regiona lakog lanca IgG i od regiona lakog i teškog lanca IgG.

339. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca IgE sadrži CH2 i CH3 domene.

340. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca IgE sadrži CH2, CH3 i CH4 domene.

341. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što je navedeni polipeptid vezujućeg domena jednolančani Fv koji sadrži varijabilni region teškog lanca, pri čemu navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži supstituciju aminokiseline na položaju 11.

342. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što je navedeni jednolančani protein jednolančani Fv koji je izabran iz grupe koju čine HD37 jednolančani Fv, 2H7 jednolančani Fv, G28-1 jednolančani Fv i 4.4.220 jednolančani Fv.

343. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što je navedeni jednolančani protein jednolančani Fv koji obuhvata 2H7 jednolančani Fv i G28-1 jednolančani Fv.

344. Postupak za smanjenje populacije ciljnih ćelija kod subjekta, naznačen ime što obuhvata primenu kod navedenog subjekta terapijski efikasne količine jednolančanog proteina koji se ne javlja u prirodi, pri čemu navedeni protein sadrži prvi polipeptid koji poseduje polipeptid vezujućeg domena, gde navedeni polipeptid vezujućeg domena sadrži barem deo varijabilnog regiona IgG i koji je sposoban da se veže za molekul - metu, sadrži drugi polipeptid koji obuhvata povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, kao i treći polipeptid koji dsrži polipeptid konstantnog regiona teškog lanca IgE koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji barem jednu imunološku aktivnost.

345. Postupak prema zahtevu 344, naznačen time što se navedeni protein primenjuje u krvotok pacijenta.

346. Postupak prema zahtevu 344, naznačen time što se kao posledica primene proteina aktiviraju monociti, ali se ne aktiviraju mastociti.

347. Postupak prema zahtevu 344, naznačen time što se protein primenjuje ili zajednički primenjuje sa blokatorom otpuštanja histamina.

348. Postupak za smanjivanje broja ćelija kod sisara, naznačen time što obuhvata primenu modifikovanog proteina IgE u krvotok neke životinje.

349. Postupak prema zahtevu 348, naznačen time što se modifikovani protein IgE primenjuje ili zajednički primenjuje sa blokatorom otpuštanja histamina.

350. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži region šarke IgG ili njegov deo, a navedeni konstantni region teškog lanca je poreklom iz IgE i sadrži CH3 i CH4 domene bez CH2 domena.

351. Protein prema zahtevu 328, naznačen time što navedeni jednolančani protein sadrži vezujući domen jednolančanog Fv iz 2el2, i što navedeni konstantni region teškog lanca sadrži CH2, CH3 i CH4 domene iz IgE, pri čemu je navedeni konstantni region teškog lanca povezan sa polipeptidom koji sadrži transmembranski domen i domen citoplazmatskog molekulskog repa CD80.

352. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži: i) prvi polipeptid koji obuhvata polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu; ii) drugi polipeptid koji obuhvata povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, pri čemu navedeni povezujući region sadrži tri cisteinska ostatka i jedan prolinski ostatak, gde je jedan ili više navedenih cisteinskih ostataka deletirano ili supstituisano; i iii) treći polipeptid koji obuhvata polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji makar jednu imunološku aktivnost.

353. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prvf, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na navedeni drugi cisteinski ostatak, a navedeni drugi cisteinski ostatak je N-terminalno lociran u odnosu na navedni treći cistein, pri čemu navedeni prvi cisteinski ostatak nije supstituisan ili deletiran, i gde su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani ili deletirani.

354. Protein prema zahtevu 353, naznačen time što su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani drugom aminokiselinom.

355. Protein prema zahtevu 354, naznačen time što su drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani serinskim ostacima.

356. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što je eksprimiran kao homogeni protein koji poseduje prividnu molekulsku masu od oko 75 kDa.

357. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na navedeni drugi cisteinski ostatak, a navedeni drugi cisteinski ostatak je N-terminalno lociran u odnosu na navedni treći cistein, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak supstituisan ili deletiran.

358. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni drugi i treći cisteinski ostatak u navedenom povezujućem regionu nisu supstituisani ili deletirani.

359. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na navedeni drugi cisteinski ostatak, a navedeni drugi cisteinski ostatak je N-terminalno lociran u odnosu na navedni treći cistein, pri čemu je navedeni drugi cisteinski ostatak supstituisan ili deletiran.

360. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni prvi i treći cisteinski ostatak u navedenom povezujućem regionu nisu supstituisani ili deletirani.

361. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na navedeni drugi cisteinski ostatak, a navedeni drugi cisteinski ostatak je N-terminalno lociran u odnosu na navedni treći cistein, pri čemu je navedeni treći cisteinski ostatak supstituisan ili deletiran.

362. Protein prema zahtevu 10, naznačen time što navedeni prvi i drugi cisteinski ostatak u navedenom povezujućem regionu nisu supstituisani ili deletirani.

363. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži između 5 i 65 aminokiselina.

364. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži između 10 i 50 aminokiselina.

365. Protein prema-zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži između 15 i 35 aminokiselina.

366. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem pet uzastopnih aminokiselina regiona šarke.

367. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem deset uzastopnih aminokiselina regiona šarke.

368. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem petnaest uzastopnih aminokiselina regiona šarke.

369. Protein prema zahtevu 353, naznačen time što su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinskim ostacima i što navedeni povezujući region sadrži barem deo regiona šarke IgGl.

370. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem pet uzastopnih aminokiselina regiona šarke IgGl.

371. Protein prema zahtevu 353, naznačen time što su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinskim ostacima i što navedeni povezujući region sadrži barem deo regiona šarke IgG2.

372. Protein prema zahtevu 371, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem pet uzastopnih aminokiselina regiona šarke IgG2.

373. Protein prema zahtevu 353, naznačen time što su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinskim ostacima i što navedeni povezujući region sadrži barem deo regiona šarke IgG3.

374. Protein prema zahtevu 373, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem pet uzastopnih aminokiselina regiona šarke IgG3.

375. Protein prema zahtevu 353, naznačen time što su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak zamenjeni serinskim ostacima i što navedeni povezujući region sadrži barem deo regiona šarke IgG4.

376. Protein prema zahtevu 375, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži barem pet uzastopnih aminokiselina regiona šarke IgG4.

377. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što su navedeni drugi i treći cisteinski ostatak supstituisani ili deletirani i što je prolinski ostatak supstituisan ili deletiran, pri čemu navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH3 domen, u kome je tirozin zamenjen • alaninom na položaju 407, i gde navedeni protein poseduje prividnu molekulsku masu od oko 75 kDa.

378. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što su navedeni prvi i treći cisteinski ostatak supstituisani ili deletirani i što je prolinski ostatak supstituisan ili deletiran, pri čemu navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH3 domen, u kome je tirozin zamenjen alaninom na položaju 407, i gde navedeni protein poseduje prividnu molekulsku masu od oko 75 kDa.

379. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži prvi polipeptid koji obuhvata polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, drugi polipeptid koji obuhvata povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom i treći polipeptid koji obuhvata polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu i koji je povezan sa drugim polipeptidom, pri čemu navedeni povezujući region sadrži prvi, drugi i treći cisteinski ostatak, pri čemu je navedeni prvi cisteinski ostatak N-terminalno lociran u odnosu na navedeni drugi cisteinski ostatak, a navedeni drugi cisteinski ostatak je N-terminalno lociran u odnosu na navedni treći cistein, pri čemu su navedeni drugi i/ili treći cisteinski ostatak supstituisani ili deletirani, i gde je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji makar jednu imunološku aktivnost.

380. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži modifikovani polipeptid regiona šarke humanog IgGl.

381. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni povezujući region ima samo jedan cisteinski ostatak.

382. Protein prema zahtevu 381, naznačen time što navedeni povezujući region sadrži modifikovani polipeptid regiona šarke humanog IgGl.

383. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu sadrži polipeptid CH2 domena konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 domena konstantnog regiona IgG.

384. Protein prema zahtevu 352, naznačen time što se navedeni polipeptid konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je nepotpun na N-terminalu suštinski sastoji od polipeptida CH2 domena konstantnog regiona IgG koji je povezan sa polipeptidom CH3 domena konstantnog regiona IgG.

385. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što obuhvata prvi polipeptid koji sadrži polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, drugi polipeptid koji obuhvata povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, treći polipeptid koji obuhvata polipeptid CH2 domena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptid CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, pri čemu navedeni polipeptid CH3 domena konstantnog regiona sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija ili delecija koje inhibiraju dva od navedenih proteina da se udruže kako bi formirali nekovalentni dimer, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji makar jednu imunološku aktivnost.

386. Jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što obuhvata prvi polipeptid koji sadrži polipeptid vezujućeg domena koji je sposoban da se veže za molekul - metu, drugi polipeptid koji obuhvata povezujući region koji je povezan sa navedenim prvim polipeptidom, treći polipeptid koji obuhvata polipeptid CH2 domena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i polipeptid CH3 domena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, pri čemu navedeni polipeptid CH3 domena konstantnog regiona sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija ili delecija na položajima 405 i 407, pri čemu je navedeni jednolančani protein koji se ne javlja u prirodi sposoban da ispolji makar jednu imunološku aktivnost.

387. Protein prema zahtevu 252 ili 253, naznačen time što sadrži aminokiselinske supstitucije na položaju 405 i položaju 407.

388. Protein prema zahtevu 387, naznačen time što je fenilalanin zamenjen alaninom na položaju 405, a tirozin je supstituisan alaninom na položaju 407.

389. Protein prema zahtevu 387, naznačen time što poseduj eprividnu molekulsku masu između oko 40 i oko 50 kDa.

390. Protein prema zahtevu 387, naznačen time što poseduje biološku aktivnost agoniste ili antagoniste.

391. Protein prema zahtevu 390, naznačen time što poseduje biološku aktivnost antagoniste.

392. Protein prema zahtevu 387, naznačen time što je samo jedna od aminokiselina na položaju 405 i položaju 407 supstituisana.

393. Protein prema zahtevu 392, naznačen time što poseduje prividnu molekulsku masu između oko 70 kDa i 80 kDa.

394. Protein prema zahtevu 387, naznačen time što je fenilalanin zamenjen alaninom na položaju 405.

395. Protein prema zahtevu 387, naznačen time što je fenilalanin zamenjen tirozinom na položaju 405.

396. Protein prema zahtevu 386, naznačen time što je tirozin zamenjen alaninom na položaju 407.

397. Protein prema zahtevu 386, naznačen time što sadrži aminokiselinske supstitucije na položaju 405 i položaju 407.

398. Protein prema zahtevu 393, naznačen time stoje fenilalanin zamenjen alaninom na položaju 405 i stoje tirozin zamenjen alaninom položaju 407.

399. Polinukleotid naznačen time što kodira protein iz bilo kog od zahteva 1, 8, 9, 12, 18, 30 i 112-109.

400. Polinukleotid naznačen time što kodira protein iz bilo kog od zahteva 116, 120, 121 i 180 - 235.

401. Polinukleotid naznačen time što kodira protein iz bilo kog od zahteva 238, 239, 296, 328, 352, 353, 385 i 386.

402. Polinukleotid prema bilo kom od zahteva 399 - 401, naznačen time što je operativno povezan sa promoterom ili drugom sekvencom koja pospešuje ekspresiju polinukleotida u ćeliji.

403. Ćelija naznačena time što sadrži polinukleotid iz bilo kog od zahteva 399 - 401.

404. Rekombinantni vektor naznačen time što je sposoban da eksprimira protein iz bilo kog od zahteva 1, 8, 9, 12,18, 30 i 112 -109.

405. Rekombinantni vektor naznačen time što je sposoban da eksprimira protein iz bilo kog od zahteva 116, 120, 121 i 180-235.

406. Postupak ekspresije proteina iz bilo kog od zahteva 1, 8, 9,12,18, 30 i 112 - 109, naznačen time što se odvija u uslovima u kojima se protein eksprimira.

407. Postupak ekspresije proteina iz bilo kog od zahteva 116, 120, 121 i 180 - 235, naznačen time što se odvija u uslovima u kojima se protein eksprimira.

408. Postupak ekspresije proteina iz bilo kog od zahteva 238, 239, 296, 328, 352, 353, 385 i 386, naznačen time što se odvija u uslovima u kojima se protein eksprimira.

409. Preparat naznačen time što sadrži protein iz bilo kog od zahteva 238, 239, 296, 328, 352, 353, 385 i 386, u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih terapeutskih jedinjenja.

410. Postupak tretiranja subjekta naznačen time što obuhvata korake primene kod navedenog subjekta jednog ili više jedinjenja iz bilo kog od zahteva 238, 239, 296, 328, 352, 353, 385 i 386, kao i korak primene ili zajedničke primene drugog jedinjenja kod subjekta u kombinaciji sa prvim navedenim jedinjenjem, pri čemu je tretman efikasan u lečenju ili sprečavanju nastanka oboljenja, bolesti ili neželjenog stanja.

411. Postupak prema zahtevu 410, naznačen time što je drugo jedinjenje izabrano iz grupe koju čine hemoterapijsko jedinjenje, terapeutski lek, inhibitor angiogeneze, steroidi, aktivatori B ćelija, faktori stimulacije kolonija, faktori nekroze tumora, interferoni, antitelo, vezujući konstrukt prema pedmetnom pronalasku, genska terapija, retinoidi, hirurški postupci, alkilirajuća sredstva, analogi nukleozida, topoizomeraza II, VEGF, IFN-alfa, DMAR agensi, interleukin-1, glikokortikoidi, inhibitori p38, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, interleukin-12, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, anti-CTLA-4, Bcl-2 nekodirajuća nit, vitamin A, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD28 ili anti-CD3.

412. Postupak za prikazivanje rekombinantnih molekula, naznačen time što navedeni molekuli obuhvataju nativni ili genetskim inženjeringom dobijeni varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, pri čemu region teškog lanca imunoglobulina sadrži poboljšanje koje obuhvata jednu ili više mutacija, supstitucija, alteracija i/ili delecija jednog ili više aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju položajima 9, 10, 11, 12, 108, 110 i 112 u navedenom varijabilnom regionu teškog lanca.

413. Jednolančani antigen - vezujući protein koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što sadrži protein sa formulom koja je izabrana iz grupe koju čine 2H7 scFv VH LI 1S (CSC-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S IgE CH2 CH3 CH4, 2H7 scFv VH L11S mlgE CH2 CH3 CH4, 2H7 scFv VH L11S mlgAH WIgACH2 T4CH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K322S CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (CSS-S) H K322S CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H P331S CH2 WCH3, 2HU scFv VH L11S (CSS-S) H P331S CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H T256N CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H RTPE/ONAK (255-258) CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H A339P CH2 WCH3, G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv IgAH WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (CSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (CSC-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SSC-P) H WCH2 WCH3, CTLA4 (SSS-S) H P238SCH2 WCH32, CTLA4 (CCC-P) WH WCH2 WCH3, FC2-2 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, FC2-2 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, UCHL-1 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, UCHL-1 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 5B9 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, 5B9 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, 2H7 scFv IgAH WCH2 WCH3, 2H7 scFv IgAH WIgACH2 T4CH3, 2H7 scFv IgAH WIgACH2 WCH3 + J lanac, 2H7 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405YCH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 F405ACH3, 2H7 scFv (SSS-S) H WCH2 Y407ACH3, 2H4 scFv (SSS-S) HWCH2 F405A, Y407ACH3, 2H7 scFv (CSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SCS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SSC-P) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (CSC-S) H WCH2 VVCH3, 2H7 scFv (CCS-P) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv (SCC-P) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3,2H7 scFv VH LI 1S (CSS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH LI 1S (SCS-S) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (CCS-P) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S (SCC-P) H WCH2 WCH3, G28-1 scFv VH L11S mlgE CH2 CH3 CH4, G28-1 scFv VH L11S mlgAH WIgACH2 T4CH3, G28-1 scFv VH L11S hlgE CH2 CH3 CH4, G28-1 scFv VH L11S hlgAH WIgACH2 T4CH3, HD37 scFv IgAH WCH2 WCH3, HD37 scFv (SSS-S) H VVCH2 VVCH3,<*>'" HD37 scFv VH L11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, L6 scFv IgAH WCH2 VVCH3, L6 scFv VHL11S (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv-llama IgGl, 2H7 scFv-llama IgG2, 2H7 scFv-llama IgG3, CD 16-6 niska (ED)(SSS-S) H P238SCH2 WCH3, CD 16-9 high (ED)(SSS-S) H P238SCH2 WCH3, 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 10A8 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 40.2.36 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 2H7 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, G19-4 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 2el2 scFv IgAH IgACH2 T4CH3- hCD80TM/CT, 2el2 scFv IgE CH2CH3CH4-hCD80TM/CT, 2el2 "■ scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3- mcasp3-TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp3- -TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 2e.l2 scFv (SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp8~TM/CT, 2el2 scFv (SSS-s)H P238SCH2 WCH3- hcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-mIgAT4- hCD80TM/CT, 1D8 scFv~hIgE-hCD80TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3- mFADD-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3-mFADD-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3- mcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3-mcasp8~TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-mcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H WCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp3-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H VVCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT, 1D8 scFv-hlgGl (SSS-s)H P238SCH2 WCH3-hcasp8-TM/CT, L6 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3, 2H7 scFv CD 154 (L2), 2H7 scFv CD 154 (S4), CTLA4 IgAH IGACH2CH3, CTLA4 IgAH IgACH2 T4CH3, 2H7 scFv IgAH IgACH2CH3, 2H7 scFv IgAH IgAHCH2 T18CH3, 2H&-40.2.220 scFv (SSS-S) H WCH2 WCH3 (bispecifično anti-ccd20-anti-cd40), 2H7 scFv IgAH IgACH2 T4CH3-hCD89 TM/CT, G19-4 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT, i 2el2 scFv (CCC-P) WH WCH2 WCH3-hCD89 TM/CT.