RS53996B1

RS53996B1 - Kompozicije koje sadrže core-1 pozitivni mikroorganizam i njihova primena za lečenje ili profilaksu tumora

Info

Publication number: RS53996B1
Application number: RS20150240A
Authority: RS
Inventors: Steffen Goletz
Original assignee: Glycotope Gmbh
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2015-10-30
Also published as: CY1116319T1; DK1920781T3; CN101600454A; UA103153C2; ES2533965T3; HRP20150363T1; PT1920781E; SI1920781T1

Abstract

Formulacija koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od nutraceutske i/ili farmaceutske kompozicije, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1), i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, koji sadrži najmanje jednu Core-1 pozitivnu komponentu.Prijava sadrži još 10 patentnih zahteva.

Description

OBLASTTEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast prevencije i lečenja gastrointestinalnih poremećaja i kancera. Preciznije, predmetni pronalazak se odnosi na prevenciju i lečenje Ćore-1-pozitivnih karcinoma. Pronalaskom su realizovani nutraceutici i farmaceutske kompozicije koji sadrže Core-1 pozitivni mikroorganizam i njegove frakcije, kao stoje definisano u priloženim patentnim zahtevima.

DEFINICIJE

[0002] Prema predmetnom pronalasku izraz " nutraceutik" označava bilo koji nutrijent, kompoziciju nutrijenata ili formulaciju koju mogu oralno uzimati čovek ili životinja, kao što su, ali bez ograničavanja na sledeće: nutrijenti, nutritivni aditivi, prehrambeni aditivi, dijetetski suplementi, medicinska hrana, klinička hrana, parenteralna hrana, enteralna hrana, hrana za specijalnu dijetetsku pnmenu, hrana za specifikovanu zdravstvenu primenu ili funkcionalna hrana koja se može primeniti oralno u različitim oblicima, kao što su, ali bez ograničavanja na kapsule, tablete, emulzije, praškove, tečnosti, kao i u obliku bilo koje hrane ili pića ili kao njihov deo. U specijalnim slučajevima nutraceutik može biti davan parenteralno (parenteralna hrana). Nutraceutik može biti davan sam ili pomešan sa najmanje jednim drugim sastojkom. Sam nutraceutik ili njegova smeša sa najmanje jednim drugim sastojkom mogu biti davani sami ili umešani u hranu ili piće. Izraz nutraceutik takođe označava bilo koju hranu, piće, kapsulu,

tabletu, emulziju, prašak ili tečnost.

[0003] Prema predmetnom pronalasku izraz " nutraceutik" označava bilo koji nutrijent, kompoziciju nutrijenata ili formulaciju koju oralno mogu uzimati čovek ili životinja, kao što su, ali bez ograničavanja na sledeće: nutrijenti, nutritivni aditivi, prehrambeni aditivi, dijetetski suplementi, klinička hrana ili nutrijenti, medicinska hrana ili nutrijenti, enteraina hrana, enteralna klinička hrana, nutrijenti ili hrana za zdravstvenu negu, hrana za specijalnu dijetetsku primenu, hrana za specifikovanu zdravstvenu primenu ili funkcionalna hrana koja se može primeniti oralno u različitim oblicima, kao što su, ali bez ograničavanja na kapsule, tablete, emulzije, praškove, tečnosti, kao i u obliku bilo koje hrane ili pića ili kao njihov deo. U specijalnim slučajevima nutraceutik može biti davan parenteralno (parenteralna hrana). Nutraceutik može biti davan sam ili pomešan sa najmanje jednim drugim sastojkom. Sam nutraceutik ili njegova smeša sa najmanje jednim drugim sastojkom mogu biti davani sami ili umešani u hranu ili piće. Izraz nutraceutik takođe označava bilo koju hranu, piće, kapsulu, tabletu, emulziju, prašak ili tečnost.

[0004] Prema predmetnom pronalasku izraz "farmaceutska kompozicija" označava bilo koju kompoziciju koja se može primeniti kao lek ili farmaceutik ili biologik ili je komponenta leka ili farmaceutika ili biologika.

[0005] Prema predmetnom pronalasku izraz " Core- 1" označava ugljenohidratnu strukturu galaktoza beta 1-3 vezanu za N-acetil-galaktozamin alpha 1- vezanu (Gal betal-3GalNAc alphal-; TF alpha, TFa, TFa). Na proteinu ili polipeptidu Core-1 je kovalentno vezan preko O-glikozidne veze za aminokiselinu serin ili treonin (Gal beta1-3GalNAc alphal-O-Ser/Thr). Core-1 takođe može biti vezan preko različitih linkera i u različitim gustinama za prirodne ili sintetičke nosače, kao što je poliaknlamid (ovde se takođe naziva PAA), ili druge molekule, kao što su materijali hromatografskih slojeva (npr. sefaroza), biotin ili proteini, kao što su goveđi serumski albumin (BSA), ovalbumin (Ova), humani serumski albumin (HSA) ili hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (engl. Kevhole limpet hemocvanin, skr. KLH), toksine, toksoide, perle ili nanočestice.

[0006]U smislu ovog pronalaska izraz Core-1 takođe označava Core-1 mimikrićne strukture, kao što su polipeptidi, peptidi, lipidi ili ugljeni hidrati ili njihove kombinacije sa hemijskom strukturom različitom od Core-1, ali koji takođe imaju konformacionu strukturu koju mogu prepoznati Core-1 specifična antitela prema pronalasku.

[0007]Prema predmetnom pronalasku izraz " Core- 1 specifično antitelo" označava (i) bilo koje antitelo koje se specifično vezuje za Gal beta1-3GalNAc alpha1-PAA (TFa-PAA, TFoPAA, Core-1-PAA), ali ne i za bilo koju od supstanci sa #liste 1#.

#lista 1#

[0008]

GlcNAcQ,1-2GalE1-3GalNAca-PAA (GlcNAcft1-2' TF)

Fuca1-2Galft1-3GalNAca-PAA (H tip 3)

GalNAca1-3Gal(3-PAA (Ađi)

Gala1-3-GalNAcP-PAA (Ta(3)

koje su nabavljene od firme Lectinitv holdings, Inc.

[0009]Alternativno tome, sve strukture može generisati stručnjak iz odgovarajuće oblasti, koji takođe može izabrati drugi podesni poliakrilamid za konjugaciju ili drugi podesni noseći molekul, kao i podesne metode konjugacije za kuplovanje u zavisnosti od ugljenohidratne strukture i sinteze neophodnih međuproizvoda. (ii) ili bilo koje antitelo koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin, i ovo vezivanje je osetljivo na perjodat, (iii) još poželjnije bilo koje antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA (Gal betal-3GalNAc betal- PAA), ali ne i za bilo koju od supstanci sa #liste 2#:

#lista 2#

proteini:

[0010]

glikoforin

BSA (goveđi serumski albumin)

PAA-konjugati:

[0011]

aminoglucitol

p-N-acetilneuraminska kiselina (beta-N-acetilneuraminska kiselina) a-D-glukoza (alfa-D-glukoza)

P-glukoza (beta-D-glukoza)

a-D-galaktoza (alfa-D-galaktoza)

P-D-galaktoza (beta-D-galaktoza)

a-D-manoza (alfa-D-manoza)

a-D-manoza-6-fosfat (alfa-D-manoza-6-fosfat)

a-L-fukoza (alfa-L-fukoza)

P-N-acetil-D-glukozamin (beta-N-acetil-D-glukozamin) a-N-acetil-D-galaktozamin (alfa-N-acetil-D-galaktozamin, Tn, Tn) P-D-galaktoza-3-sulfat (beta-D-galaktoza-3-suIfat) a-N-acetilneuraminska kiselina (alfa-N-acetilneuraminska kiselina) P-N-acetil-D-glukozamin-6-sulfat (beta-N-acetil-D-glukozamin-6-sulfat) Lac-di-NAc (GalNAcpi-4GlcNAcP-, GalNAcbeta1-4GtcNAcbeta-) GlcNAcp3Gal (GIcNAcpi-3Gaip-, GlcNAcbeta1-3Galbeta-)

Gala4GlcNAc (Gala1-4GlcNAcp-, Galalfa1-4GlcNAcbeta) maltoza

GalS3Gal (Galp1-3Gaip-, Galbeta1-3Galbeta) Le<c>(Gaipi-3GlcNAcP-, Galbeta1-3GlcNAcbeta-)

Lac (Gaipi-4Glcp-, Galbeta1-4Glcbeta)

LacNAc (Galp1-4GlcNAcP-, Galbeta1-4GlcNAcbeta-,) Fuca3GlcNAc (Fuca1-3GlcNAcp-, Fucalfa1-3GlcNAcbeta-) Fuca4GlcNAc, (Fuca1-4GlcNAcp-, Fucalfa1-4GlcNAcbeta-) Fs-2 (GalNAca1-3GalNAcP-, GalNAcalfa1-3GalNAcbeta)

Ćore 5 (GalNAca1-3GalNAca-, GalNAcalfa1-3GalNAcalfa-) Taa (Gala1-3GalNAca-, Galalfa1-3GalNAcalfa-, Talfa alfa) Gala2Ga1 (Gala1-2Gaip-, Galalfa1-2Galbeta-, Gala2Gal) SiaTn (Neu5Aca2-6GalNAca-; Neu5Acalfa2-6GalNAcalfa sTn) 3 -su-LacNAc (3'-0-su-LacNAcp-, 3'-0-su-LacNAcbeta-)

3'-su-Le<c>(3'-0-su-Galp1-3GlcNAcp-, 3'-0-su-Galbeta1-3GlcNAcbeta) melibiose (Gala1-6GlcP-, Galalfa1-6Glcbeta-)

(Sia)2(Neu5Aca2-8Neu5Aca- Neu5Acalfa2-8Neu5Acalfa) Gal2pGal (Gaipi-2Gaip-, Galbeta1-2Galbeta-,Galbeta2Gal-) 6-O-su-LacNAc (Gaipi-4(6-0-su)GlcNAcp-,

Galbeta1-4(6-0-su)GlcNAcbeta-)

Ađ,(GalNAcct1-3Galp-,

GalNAcaifa1-3Galbeta-)

Bdl (Galal -3Galp-, Galalfal -3Galbeta)

6'-0-su-LacNAc (6'-su-LacNAcp-, 6'-su-LacNAcbeta-)

Hdi(Fuca1-2Gai<p->, Fucalfa1-2Galbeta)

3'-0-su-TF(3'-0-su-Gaipi -3GalNAca-, 3'-0-su-Galbeta1 -3GalNAcalfa-) di-GalNAcP (GalNAcpi-3GalNAcp-, GalNAcbeta1-3GalNAcbeta)

ćore 3 (GlcNAcpi-3GalNAco>, GlcNAcbeta1-3GalNAcalfa)

ćore 6 (GlcNAcpi-6GalNAca-, GlcNAcbeta1-6GalNAcalfa)

GA1, GgOse3 (Ga!NAcpi-4Gaipi-4Glcp-, GalNAcbeta1-4Galbeta1-4Glcbeta) Gala1-3'Lac (Gala1-3Gaipi-4Glcp-, Galalfal-3Galbeta1-4Glcbeta) GlcNAcpi-2TF (GlcNAcbeta1-2Galbeta1-3GalNAcalfa-)

Man3 Mana1-6

Mana -Mana1-3

3'SLN (Neu5Acalfa2-3Galbeta1-4GlcNAcbeta-)

Pk (Gb3, GbOse3,Gala1-4Gaipi-4GlcP-)

Le<a>Fuca1-4

GlcNAcp-Gaipi-3

Le<d>(H tip 1, Fuca1-2Galp1-3GlcNAcp-)

Le* Fuca1-3

GlcNAcP-Gai<p>i-4

3'-SiaLe<c>(Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAc<p->)

H tip 3 (Fuca1-2Galp1-3GalNAca-)

3-SL (Neu5Aca2-3Gaipi-4Glcp-)

6'-SL (Neu5Aca2-6Gaipi-4Glcp-)

3'-0-su-Le<a>Fuca1-4

GlcNAcp-0-su-3Gaipi -3

3'-Osu-Lex Fuca1-3

GlcNAcp-0-su-3Gaipi-4

Gala1-3'LacNAc (Gala1-3Gaipi-4GlcNAcp-)

(Sia)3(Neu5Aca2-8Neu5Aca2-8Neu5Aca2-)

GIcNAcpl -3TF(GlcNAcp1 -3Galp1 -3GalN Aca-)

Atn Fuca1-2

Galp-GalNAca1-3

koji su nabavljeni od firme Lectinity holdings, Inc.

[0012]Alternativno tome, sve strukture može generisati stručnjak iz odgovarajuće oblasti, koji takođe može izabrati drugi podesni poliakrilamid za konjugaciju ili drugi podesni noseći molekul, kao i podesne metode konjugacije za kuplovanje u zavisnosti od ugljenohidratne strukture i sinteze neophodnih međuproizvoda. (iv) čak još poželjnije bilo koje antitelo od sledećih antitela: HB-T1 (IgM) (DakoCvtomation GmbH, Hamburg; Giuffre G, Vitarelli E, Tuccari G, Ponz de Leon M, Barresi G: Detection of Tn, sialosyl-Tn i T antigens in hereditarv nonpolvposis colorectal cancer. Virchows Arch 429:345-352 (1996)], HH8 (IgM) [Ciausen H, Stroud M, Parker J, Springer G, Hakomori S: Monoclonal antibodies directed to the blood group A associated structure. galactosvl- A: specificitv and relation to the Thomsen-Friedenreich antigen. Mol Immunol 25:199-204 (1988)], A78- G/A7 [Glvcotope GmbH, Berlin; Karsten U, Butschak G, Cao Y, Goletz S, Hanisch FG. A new monoclonal antibodv (A78-G/A7) to the Thomsen-Friedenreich pan-tumor antigen. Hvbridoma 1995 Feb;14(1):37-44], A68-B/A11 [Glvcotope GmbH, Berlin, www.glycotope.com], Nemod-TF1 [Glvcotope GmbH, Berlin; Goletz S, Cao Y, Danielczyk A, Ravn P, Schoeber U, Karsten U. Thomsen-Friedenreich antigen: the "hidden" tumor antigen. Adv Exp Med Biol. 2003:535:147-62], ili Nemod-TF2 [Glycotope GmbH, Berlin; Goletz S, Cao Y, Danielczyk A, Ravn P, Schoeber U, Karsten U. Thomsen-Friedenreich antigen: the "hidden" tumor antigen. Adv Exp Med Biol. 2003;535:147-62], (v) čak još poželjnije bilo koje antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za bilo koji od proteina i X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i ovo vezivanje je osetljivo na perjodat, (vi) čak još poželjnije bilo koje antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za bilo koji od proteina i X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2 # i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4 [DSM ACC2605], NM-F9 [DSM ACC2606], ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF2 ili A78-G/A7, (vii) još poželjnije bilo koje antitelo sa bilo kojom od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, kao što je NEMOD-TF1, (viii) čak još poželjnije bilo koje antitelo sa bilo kojom od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA,

(ix) najpoželjnije bilo koje antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA i ne vezuje se za bilo koji od proteina i X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje bar za ćelije NM-D4, NM-F9 [DSM ACC2606] i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF1.

[0013]Pomenuto Core-1 specifično antitelo može biti celo antitelo od bilo koje životinje ili čoveka, kao što je misije, pacovsko, humano, kamilje, humanizovano ili himerićno antitelo iz različitih klasa antitela, kao što su, ali bez ograničavanja na IgM, IgG, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgD ili bilo koji fragment antitela sve dok sadrži specifičnost vezivanja protiv Cor-1, kao što su Fab, F(ab)2, jednolančani Fv, ili antitela sa samo jednim domenom. Ta antitela takođe mogu sadržati najmanje jednu dodatnu aminokiselinu ili mutacije ili polipeptidne sekvence, kao što su tagovi, linkeri ili multimerizacioni domeni i oni takođe mogu poticati iz drugačijih izvora od životinja, kao što su biljke i kao što je selekcija iz biblioteka sintetičkih antitela uz korišćenje, na primer, ispoljavanja faga ili ispoljavanja ribozoma ili rekombinantne konstrukcije.

[0014]Tretman perjodatom da bi se testirala osetljivost na perjodat vezivanja Core-1 specifičnog antitela prema TFa-PAA; TFb-PAA (TFB-PAA, TF beta- PAA) ili drugim PAA-konstruktima (X-PAA), azialoglikoforinu, ili tumorskim ćelijama je u skladu sa VVoodvvard et al. [Woodward MP et al., (1985) J. Immunol. Methods 78: 143-153] i opisan je detaljnije u pnmerima. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu usvojiti tehnologiju i optimizirati uslove za alternativne metode koje su opisane ovde na drugim mestima.

[0015]Prema predmetnom pronalasku izraz " osetljiv na perjodat" označava daje vezivanje antitela za antigen ili ćeliju manje kada je taj antigen ili ćelija bio tretiran sa perjodatom nego njegovo vezivanje za isti antigen ili ćeliju koji su bili tretirani bez perjodata, kao što je detaljnije opisano pod Tretmanom perjodatom u primeru 9. Da bi se odredila osetljivost na perjodat antitela za njegovu Core-1 specifičnost, osetljivost na perjodat njegovog vezivanja se prvenstveno testira sa TFa-PAA, TFb-PAA, azialoglikoforinom, NM-D4 [03018576.3 (EP), PCT/EP2004/009281, VVO2005/017130 A2, EP1654353]) i/ili drugim tumorskim ćelijama. Posle tretmana antigena ili ćelije perjodatom vezivanje je prvenstveno smanjeno na manje od 50% nego kod njegovog parnjaka koji nije bio tretiran perjodatom, i čak još poželjnije na manje od 20% vezivanja za isti antigen ili ćeliju koja nije bila tretirana perjodatom.

[0016]Core-1 specifična antitela u smislu pronalaska su NEMOD-TF1, NEMOD-TF2 A76-G/A7, HB-T1, HH8, poželjna antitela su NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, A76-G/A7, i HH8, još poželjnija su NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, i A76-G/A7 (mogu se nabaviti od firme Glvcotope GmbH Berlin, Nemačka), čak još poželjnije NEMOD-TF1 i NEMOD-TF2, i najpoželjnije NEMOD-TF1

[0017]Vezivanje antitela za Gal beta 1-3 GalNAc alpha1-PAA, Gal beta 1-3 GalNAc beta 1-PAA, GIcNAc betal-2 Gal beta 1-3 GalNAc alpha 1-PAA, azialoglikoforin, i glikoforin se prvenstveno određuje u ELISI, a vezivanje za tumorske ćelije se prvenstveno određuje analizama protočnom citometrijom ili imunofluorescentnim analizama koje su detaljno opisane u primerima. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu upotrebiti i usvojiti alternativne metode za testiranje vezivanja takvih antitela, kao što su, ali bez ograničavanja na sledeće: „scatchard" analize za vezivanje ćelija, BIACORE analiza, VVestern blot analiza, ili Dot blot analiza za vezivanje antigena. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu takođe upotrebiti druge molekule koji nose Core-1 za testiranje Core-1 vezivanja, kao što su (Gal betal-3

GalNAc alphal-) kuplovan sa ili bez podesnog linkera sa KLH, biotinom ili BSA, međutim, gore opisani poželjni primeri izvođenja su poželjni u smislu pronalaska

[0018]Prema predmetnom pronalasku izraz " Core- 1 pozitivni mikroorganizam" označava bilo koji mikroorganizam koji se vezuje za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo. U drugom primeru izvođenja pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam se vezuje za najmanje dva različita lektina, pri čemu je lektin molekul za vezivanje ugljenog hidrata i nije molekul antitela koje se vezuje za Core-1. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam se vezuje za najmanje jedno Core-1-specifično antitelo i za najmanje jedan protein koji se vezuje za Core-1 i nije antitelo (lektin), kao što su (ali bez ograničavanja na njih)Arachis hypogaea(kikiriki) aglutinin (PNA),Amaranthus caućatusaglutinin (ACA),Artocarpus integrifolialektin (Jacalin),Bauhinia purpurealektin (BPL), iliAgaricus bisporus aglutinin(ABA) [lektini se mogu nabaviti od firmi Vector Labs., Burlingame, CA.USA, Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA, ili iz drugih izvora]. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam se vezuje za najmanje dva Core-1 specifična antitela. U još poželjnijem primeru izvođenja, pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam je vezan sa najmanje dva Core-1 specifična antitela i vezivanje je osetljivo na perjodat. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, Core-1 specifična antitela koja se upotrebljavaju u bilo kom od narednih primera izvođenja su NEMODTFI, NEMOD-TF2 ili A76-G/A7 i vezivanje je osetljivo na perjodat. U najpoželjnijem primeru izvođenja pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam se vezuje za NEMOD-TF1 i NEMOD-TF2 ili NEMOD-TF1 i A76-G/A7 i vezivanje je osetljivo na perjodat.

[0019]Metodi za testiranje da li se Core-1 specifično antitelo vezuje za mikroorganizam prema ovom pronalasku su ELISA i imunofluorescencija (vidi primere), ali stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogli bi upotrebiti druge sisteme za testiranje kao što je protočna citometrija ili nekoliko tehnika adsorpcije da bi identifikovali Core-1 pozitivne mikroorganizme.

[0020]Tretman perjodatom da bi se testirala osetljivost na perjodat vezivanja Core- 1 specifičnog antitela za mikroorganizam je detaljno opisana u primeru 9. Prema predmetnom pronalasku izraz " Core- 1 osetljivost na perjodat mikroorganizma" označava da je vezivanje Core-1 specifičnog antitela za pomenuti mikroorganizam manje ili veće kada je pomenuti mikroorganizam bio tretiran sa perjodatom od njegovog vezivanja za isti mikroorganizam koji nije bio tretiran sa perjodatom, kao što je detaljnije opisano u primerima. U poželjnom primeru izvođenja pomenuto vezivanje Core-1 specifičnog antitela za pomenuti mikroorganizam je manje kada je pomenuti mikroorganizam bio tretiran sa perjodatom od njegovog vezivanja za isti mikroorganizam koji nije bio tretiran sa perjodatom. U još poželjnijem primeru izvođenja pomenuto manje vezivanje Core-1 specifičnog antitela za pomenuti mikroorganizam posle tretmana perjodatom mikroorganizma je manje od 80% nego za njegovog parnjaka koji nije tretiran sa perjodatom, i čak još poželjnije je manje od 50% i najpoželjnije je manje od 30%.

[0021]Core-1 pozitivni mikroorganizam može biti bilo koji mikroorganizam, kao što su, ali bez ograničavanja na bakterije, cijanobakterije, eubakterije, alge, gljive (pečurke, kvasce, gareži, plesni itd.), viruse i protozoe, a prvenstveni su bakterijski mikroorganizmi, kao što su, ali bez ograničavanja na mikroorganizme izolovane iz zemljišta, biljaka, životinja, ljudi ili drugih viših organizama, kao što su mačke, psi, svinje, krave, koze, zečevi, miševi, šimpanze. U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam je mikroorganizam koji potiče iz humanog gastrointestinalnog sistema.

[0022]Prema predmetnom pronalasku izraz frakcija Core-1-pozitivnog mikroorganizma označava preparate ili prečišćavanja manjih delova pomenutih mikroorganizama, kao što su preparat ćelijskih zidova, preparat omotača, lizati, lipopoltsaharidni preparat, preparat od kapsula, ili preparat od polisaharidnih kapsula. One prvenstveno sadrže najmanje jednu Core-1 pozitivnu komponentu pomenutog Core-1 pozitivnog mikroorganizma. One se mogu dobiti preparatima ili prečišćavanjima iz najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma. Pomenuti preparati i prečišćavanja se mogu dobiti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, kao što su one koje su gore opisane, ili pojedinačnom ili sekvencijalnom ćelijskom frakcinacijom, ekstrakcijama fenol voda, ekstrakcijama etra, lizozimskim digestijama ili hromatografskim metodama. Core-1 pozitivna komponenta ili frakcija koja sadrži Core-1 pozitivnu komponentu se detektuje vezivanjem frakcije za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo u sistemima za testiranje, kao što su, ali bez ograničavanja na ELISU ili Dot blotove, koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, frakcija koja sadrži Core-1 pozitivnu komponentu se dobija afinitetnom hromatografijom korišćenjem najmanje jednog Core-1 specifičnog antitela. U poželjnom primeru izvođenja se upotrebljava samo jedan preparat ili korak prečišćavanja. U sledećem poželjnom primeru izvođenja se upotrebljava kombinacija najmanje dva preparata ili koraka prečišćavanja.

[0023]Prema predmetnom pronalasku izraz Core-1 pozitivna komponenta označava bilo koju komponentu Core-1 pozitivnog mikroorganizma koja se vezuje za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo. Pomenuta Core-1 pozitivna komponenta sadrži najmanje jednu Core-1 ugljenohidratnu strukturu ili Core-1 mimikričnu strukturu, koja može biti na raspolaganju u obliku svog prirodnog molekula, koji predstavlja deo na mikroorganizmu, kao što je peptid, oligopeptid, polipeptid, lipid, keramid, ugljeni hidrat, lipoprotein, polisaharid, oligosaharid, polisahand, proteoglikan ili glikoprotein, ili je deo pomenutog prirodnog molekula ili je on sam. Core-1 I pozitivna komponenta se može upotrebljavati u smislu pronalaska kao frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma, kao takva ili kuplovana sa drugim neprirodnim nosećim strukturama, kao što su proteini, lipidi, hemijski molekuli, kao što je poliakrilamid. Prvenstveno se upotrebljava u svom prirodnom obliku. Core-1 pozitivna komponenta može sadržati pojedinačnu Core-1 ugljenohidratnu strukturu ili Core-1 mimikričnu strukturu ili ponavljajuće jedinice pomenutih struktura i može sadržati dodatne ugljenohidratne strukture ili jedinice ili druge biomolekulske strukture. Pomenuta Core-1 mimikrična struktura je struktura koja se može vezivati za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo i/ili može indukovati imunu reakciju protiv Core-1, a prvenstveno humoralnu imunu reakciju protiv Core-1 ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1, i još poželjnije humoralnu imunu reakciju protiv Core-1 i ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1

[0024]Prema predmetnom pronalasku izraz koreotičan označava nutraceutik ili nutraceutsku formulaciju koji sadrže najmanje jedan Core-1-pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju.

[0025]Prema predmetnom pronalasku izraz "Core-1 pozitivna bolest" označava bilo koju bolest koja je povezana sa virusom, mikroorganizmom, eukariotskom ćelijom, tumorskom ćelijom ili drugim biološkim materijalom za koji se može vezati najmanje jedno od Core-1 specifičnih antitela ili koja je povezana sa sastavnim delom tela ili koja se pojavljuje u telu čoveka životinje, kao što su ćelija, tumorska ćelija, mikroorganizam, virus ili čestica za koju se može vezati najmanje jedno od Core-1 specifičnih antitela.

[0026]"Terapeutski agens", kada se ovde koristi, sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju i može dalje sadržati komponente ili elemente ili poželjni nosač farmaceutske kompozicije, leka i medikamenta poznat stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Pomenuti nosač je supstanca koja može biti sjedinjena sa aktivnim jedinjenjem pre davanja čoveku ili pacijentu, a generalno za svrhe kontrolisanja stabilnosti ili bioraspoloživosti jedinjenja. Nosači za primenu u takvim formulacijama su generalno biokompatibilni i takođe mogu biti biodegradabilni. Nosači obuhvataju, na primer, monovalentne ili multivalentne molekule, kao što su serumski albumin (npr. humani ili goveđi), albumin iz jaja, peptidi, polilizin i poli-saharidi, kao što su aminodekstran i poliamidoamini. Nosači takođe obuhvataju čvrste noseće materijale, kao što su perle i mikročestice, koje sadrže, na primer, polilaktat poligliko-lat, poli(laktideko-glikolid), poliakrilat, lateks, škrob, celulozu ili dekstran. Nosač može nositi jedinjenja na mnoštvo načina, uključujući kovalentno vezivanje, bilo direktno ili preko vezne grupe, nekovalentnu interakciju ili smešu.

[0027]Indukovanje imune reakcije protiv Core-1 kao što je ovde opisano na drugim mestima u smislu pronalaska takođe označava pojačanje već postojeće imune reakcije protiv Core-1.

STANJE TEHNIKE

[0028]Aberantna glikozilacija je tipična karakteristika kancerskih ćelija. Core-1 antigen je maskiran drugim ugljenohidratnim komponentama u zdravom i benigno obolelom tkivu, ali je otkriven kod većine karcinoma i u nekim ne-epitelijalnim malignitetima. Zato je core-1 antigen specifični pankarcinomski antigen.

[0029]Core-1 je disaharid GalB 1-3 GalNAc, koji je O-glikozidno povezan u a-anomernoj konfiguraciji sa serinom ili treoninom kao aminokiselinama proteina u ćelijama karcinoma. Core-1 je izražen u preko 60% primarnih karcinoma debelog creva, odn. kolona i u preko 90% metastaza na jetri od kancera kolona, kao kod većine karcinoma drugih najčešćih indikacija uključujući tu dojku, pluća, jajnike, prostatu i druge gastrointestinalne kancere, kao što su karcinom želuca i pankreasa. Core-1 je nezavisni prognostički marker za pacijente sa karcinomom kolona, a stopa mortaliteta se povećava, dok se prosečno preživljavanje smanjuje u skladu sa povećanjem intenziteta ekspresije Core-1. Razvoj metastaza na jetri je u korelaciji sa ekspresijom Core-1. Pacijenti sa Core-1 pozitivnim primamim karcinomom razvijaju metastaze na jetri u skoro 60% slučajeva, dok je rizik od metastaza na jetri kod Core-1-negativnih tumora značajno niži (manji od 20%). Pored posredovanja pri metastaziranju u jetru, Core-1 može takođe igrati ulogu u metastaziranju preko endotelijuma

[0030]Izuzetno visoka pan-karcinomska specifičnost, prognostička relevantnost i direktna uključenost u metastaze na jetri čini Core-1 primarnim ciljem za imunoterapuju kancera. Zbog kompleksnosti i specifičnosti vrste mehanizma glikozilacije pacijentima sa kancerom nije na raspolaganju nijedna imunoterapija bazirana na Core-1. Još važnije je to što pacijentima na raspolaganju ne postoji nijedan agens koji može sprečiti razvoj Core-1 pozitivnih tumora. Uobičajene terapije obično započinju posle dijagnoze tumora, kada su tumori već dobro razvijeni i teško ih je lečiti Zbog toga se primenjuju agresivne terapije sa ozbiljnim neželjenim dejstvima (hemoterapija, radioterapija, hirurgija) da bi se pacijenti oslobodili od tumorske mase. Imunoterapeutske opcije se uglavnom primenjuju u adjuvantnom okruženju sa minimalnom rezidualnom bolesti.

[0031]Nasuprot tome, predmetni pronalazak je fokusiran na sprečavanje razvoja Core-1 pozitivnih tumora uspostavljanjem mehanizma imunonadzora, koji eliminiše ćelije tumora koje se pojavljuju, čime se sprečava primarni rast tumora. Uobičajeni probiotici i prebiotici rezultuju generalno nespecifičnom stimulacijom imunog sistema. Nije uključen sistem specifičan za tumor Nasuprot tome, predmetni pronalazak aktivira imuni sistem na način specifičan za tumor indukovanjem visokih nivoa anti-Core-1 antitela. Prema našem saznanju, predmetni pronalazak je prvi antigenski-specifičan prehrambeni aditiv/ nutraceutik, koji može da aktivira specifičnu imunu barijeru protiv tumora i prvi prehrambeni aditiv koji može da indukuje imunu reakciju koja je specifična za ugljeno-hidratni tumorski antigen. Pored toga, ne postoji sistemska imuna terapija protiv Core-1 pozitivnih tumora koja sadrži Core-1 pozitivne mikroorganizme u farmaceutskoj kompoziciji, niti raspoložive metode za pribavljanje takvih mikroorganizama

[0032]Cilj predmetnog pronalaska je da se realizuje tehničko rešenje koje ne bi imalo gore pomenute nedostatke iz stanja tehnike, a omogućilo bi laku, bezbednu i efikasnu profilaksu i lečenje Core-1 pozitivnih tumora i gastrointestinalnih poremećaja.

SUŠTINA PRONALASKA

[0033]Prema prvom aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovana formulacija koja je izabrana iz grupe koja sadrži nutraceutsku i/ili farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili najmanje jedan njihov lizat ili frakciju.

[0034]Prema drugom aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili njihovog lizata ili frakcije za primenu kao medikamenta i/ili nutraceutika za terapiju ili profilaksu tumora, ili za in vivo ili in vitro primenu u metodu indukovanja ili pojačavanja Core-1 specifične imune reakcije i/ili za genensanje funkcionalnih dendritskih ćelija ili aktiviranih T ćelija, T ćelijskih linija ili T ćelijskih klonova ili antitela protiv Core-1. U nastavku se AG6 i MU1 takođe nazivaju i mikroorganizam, odnosno mikroorganizmi ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, odnosno mikroorganizmi u skladu sa ili prema pronalasku.

[0035]Prema trećem aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovan bakterijski soj koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili njihovog lizata ili frakcije.

[0036]Prema četvrtom aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovan kit za indukovanje specifične humoraine i/ili ćelijske imune reakcije kod čoveka ili životinje protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija, koji sadrži neutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, ili koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), ili njihove frakcije i informaciju o primeni kita.

[0037]Prema petom aspektu, predmetnim pronalaskom je realizovan kit za smanjenje ili prevenciju pojave core-1 pozitivne bolesti ili tumora, koji sadrži neutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, ili koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), ili njihove frakcije i informaciju o primeni kita.

[0038]Predmetnim pronalaskom je realizovano sredstvo za indukovanje ili podizanje nivoa anti- Core-1 antitela kod ljudi, čime se indukuje zaštitna imuna reakcija protiv tumora, a naročito Core-1 pozitivnih tumora Pored toga, pronalaskom je po prvi put realizovano sredstvo za indukovanje specifične ćelijske imune reakcije protiv ugljeno-hidratnog cilja, a naročito protiv tumorski specifičnog ugljeno-hidratnog cilja. Predmetnim pronalaskom je takođe po prvi put realizovano sredstvo za indukovanje specifične imune reakcije, a ne tolerancije protiv tumorskog cilja oralnom pnmenom. Pronalazak takođe po prvi put opisuje metode za identifikaciju i izolaciju podesnog mikroorganizma. Sledeća prednost predmetnog pronalaska je ta što zbog prirode formulacije njena proizvodnja zahteva veoma male troškove. Pored toga, formulacija se može proizvesti brzo u industrijskim fermentorima.

[0039]Bilo je iznenađujuće što anti-Core-1 antitela, indukovana formulacijom prema predmetnom pronalasku, služe kao mehanizam za imunološki nadzor koji sprečava razvoj primarnih tumora i distribuciju metastaza u najvećem broju (neprepoznatih) slučajeva, ukoliko je specifična imuna reakcija dovoljno visoka. Zato je cilj pronalaska da se realizuje sredstvo za indukovanje visokog specifičnog anti-Core-1 titra, a prvenstveno u kombinaciji sa specifičnom ćelijskom reakcijom, korišćenjem Core-1 pozitivnih mikroorganizama vijabilne intestinalne flore zdravih donora kao prehrambenih aditiva da bi se formirala specifična imuna barijera protiv tumora ili da bi se sprečila ili smanjila pojava Core-1 pozitivnih tumora i/ili njihovih metastaza.

[0040]Iznenađujuće je da su mikroorganizmi koji su realizovani prema pronalasku bili sposobni da

aktiviraju humane T ćelije na Core-1 specifičan način, kada su ih prezentovale humane dendritske ćelije (in vitro). Nema izveštaja koji dokumentuju ćelijsku imunu reakciju, a naročito citotoksičnu ćelijsku imunu reakciju protiv ugljeno-hidratnog tumorskog antigena, a naročito protiv malog nenaelektrisanog ugljenog hidrata. Nema izveštaja o prezentaciji humanih tumorskih ugljeno-hidratnih antigena na humanim dendritskim ćelijama, ključnim regulatorima imunog sistema, a naročito ne humane ugljeno-hidratne strukture koja potiče od mikroorganizma. Nasuprot tome, preovlađujuće naučno mišljenje je da ljudi ne razvijaju ugljeno-hidratnu specifičnu ćelijsku imunu reakciju, a naročito ne protiv ugljeno-hidratnih tumorskih antigena. Mikroorganizmi prema ovom pronalasku su prerađeni i prezentovani od strane humanih dendritskih ćelija, a te koreotične dendritske ćelije bi se mogle primeniti za aktiviranje primarnih humanih T ćelija specifično protiv Core-1. One T ćelije koje su genensane senzibilizacijom sa lizatima od Core-1 pozitivnih bakterija prema predmetnom pronalasku pokazuju jake imune reakcije posle restimulacije sa lizatima Core-1 pozitivnih humanih tumorskih ćelija, što je dokumentovano izlučivanjem citokina, koji dokazuju specifičnu reakciju T ćelija, a naročito citotoksičnu reakciju T ćelija.

[0041]Kao iznenađujuće se pokazalo to što je moguće snabdeti humane dendritske ćelije sa Core-1 pozitivnim mikroorganizmom prema predmetnom pronalasku ili sa molekulima koji nose Core-1 i ostvariti Core-1 specifičnu aktivaciju humanih T ćelija. Kao još više iznenađujuće se pokazalo to što imune ćelije aktivirane sa humanim dendritskim ćelijama snabdevenim sa pomenutim Core-1 pozitivnim mikroorganizmima mogu biti dalje aktivirane ili restimulisane primenom humane dendritske ćelije snabdevene sa molekulima koji nose Core-1, kao što su lizati od NM-D4 ili NM-F9 ili azialoglikoforin, što pokazuje da (i) Core-1 specifične T ćelije mogu biti aktivirane sa Core-1 pozitivnim mikroorganizmom, i što (ii) ove imune reakcije sadrže Core-1 specifične T ćelije, koje se mogu dalje aktivirati ili restimulisati sa DC snabdevenim sa molekulima koji nose Core-1. Dalje se kao iznenađujuće pokazalo da se Core-1 struktura može detektovati sa Core-specifičnim antitelima na DC snabdevenim sa Core-1 pozitivnim mikroorganizmom, kao i sa DC snabdevenim sa azialoglikoforinom. Dalje se kao iznenađujuće pokazalo da se primenom Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku mogu potentno indukovati ne samo izlučivanje GM-CSF i proliferacija T-ćelija, već takođe i izlučivanje INFgamma (interferona gamma) i još više kao iznenađujuće TNFalpha (faktora nekroze tumora alfa), što dokazuje aktivaciju Core-1 specifičnih citotoksičnih T-ćelija. Dalje se kao iznenađujuće pokazalo da se Core-1 specifične T-ćelije mogu restimulisati najmanje 4 puta in vitro, što ukazuje na jaku i specifičnu ćelijsku imunu reakciju protiv tumorskog antigena i tumora posredovanu sa T-ćelijama. Ove imune reakcije su stručnjacima iz odgovarajuće oblasti dokaz da su Core-1 pozitivni mikroorganizmi prema predmetnom pronalasku sposobni za indukovanje potentne anti-Core-1 ćelijske imune reakcije kod ljudi.

[0042]Aktiviranje ćelijskog imuniteta pored humoralnog imuniteta znatno pojačava profilaktički i terapeutski potencijal mikroorganizama prema predmetnom pronalasku. Primena bakterija koje obično nastanjuju gastrointestinalni trakt ljudi rezultuje profilaktičkim i terapeutskim agensom koji ne izaziva nepoželjna neželjena dejstva Ugljeno-hidratna priroda je odgovorna za nedostatak relevantne tolerogenosti i neispoljavanje relevantnih alergijskih reakcija.

[0043]Kao iznenađujuće, formulacija prema predmetnom pronalasku (npr. hrana ili lek koji sadrže Core-1 pozitivni mikroorganizam) se mogu primeniti za profilaktičke i terapeutske svrhe i za podržavanje imunoloških aktivnosti. Farmaceutska formulacija prema pronalasku sadrži Core-1 pozitivni mikroorganizam i farmaceutski prihvatljivi nosač. Pripremanje i primena formulacije prema pronalasku (npr. lek koji sadrži Core-1 pozitivni mikroorganizam) su u skladu sa poznatim tehnikama. Na primer, formulacija se može sjediniti sa uobičajenim galenskim adjuvansima da bi se formirala kompozicija koja je podesna za željeni način primene. Na primer, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu se primeniti u smeši sa uobičajenim ekscipijensima, tj. farmaceutski prihvatljivim organskim ili neorganskim nosećim supstancama koje su podesne za parenteralnu ili enteralnu primenu, a koje ne reaguju na škodljiv način sa aktivnim jedinjenjima. Podesni farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na vodu, slane rastvore, alkohole, biljna ulja, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, viskozni parafin, eterično ulje, monogliceride i digliceride masnih kiselina, pentaeritol estre masnih kiselina, hidroksi metilcelulozu, polivinil pirolidon, talk itd.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0044]Pronalaskom su realizovani nutraceutici i farmaceutske kompozicije koji sadrže najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihovih frakcija, kao i Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 i njihovih frakcija, koji su podesni za indukovanje imunih reakcija protiv tumorskih ćelija koje nose Core-1 i molekula koji nose Core-1. Pored toga, opisani su metodi identifikacije, selekcije i izolacije Core-1 pozitivnog mikroorganizma, koji je podesan kao efektivni deo nutraceutskih ili farmaceutskih kompozicija koje indukuju imunu reakciju protiv Core-1 kod ljudi ili životinja Opisani su test sistemi za specifičnu humoralnu i ćelijsku imunu reakciju, koji su namenjeni za testiranje Core-1 imunih reakcija i opisani su metodi generisanja anti Core-1 antitela i kompozicija antitela, kao i anti Core-1 T ćelijske linije i klonovi.

A) Nutraceutici, farmaceutske kompozicije i testovi imunih reakcija

[0045]Pronalaskom je realizovana formulacija koja je izabrana iz grupe koja sadrži nutraceutsku i/ili farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0046]U poželjnom primeru izvođenja pomenuta formulacija indukuje ili pojačava imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog čoveka ili životinje koji prepoznaje Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju. U poželjnom primeru izvođenja pomenuta formulacija indukuje ili pojačava humoralnu i/ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog čoveka ili životinje koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju, a prvenstveno Th1 tip ćelijske imune reakcije. U poželjnom primeru izvođenja, formulacija indukuje ili pojačava humoralnu i/ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog čoveka ili životinje koji prepoznaje Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju, a prvenstveno ćelijsku imunu reakciju koja sadrži aktivaciju CD4 pozitivnih T ćelija od Th1 ćelija i^ili CD8 pozitivnih citotoksičnih T ćelija.

[0047]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, formulacija indukuje ili pojačava pomenutu Core-1 specifičnu imunu reakciju kod najmanje jednog čoveka ili životinje kada se daje/primenjuje i/ili koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija time što ima potencijal da uništi Core-1 pozitivnu kancersku ćeliju i/ili time što smanjuje ili sprečava pojavu Core-1 pozitivne bolesti, tumora ili metastaza, i/ili time što smanjuje ili sprečava širenje ili metastaze Core-1 pozitivne bolesti ili tumora, i/ili time što pojačava imuni sistem i/ili poboljšava imunu reakciju.

[0048]Pronalaskom je realizovana nutraceutska ili farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili najmanje jedne njihove frakcije, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0049]Pronalaskom je realizovan nutraceutik koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcije, koji indukuje imunu reakciju kod ljudi ili životinja koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju i/ili Core-1 pozitivnu bolest. Pronalaskom je realizovan nutraceutik, koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcija, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo i što indukuje ili pojačava imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog čoveka ili životinje koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju.

[0050]Pronalaskom je realizovana farmaceutska kompozicija, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcije, koja indukuje imunu reakciju kod ljudi ili životinja koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju i/ili Core-1 pozitivnu bolest. Pronalaskom je realizovana farmaceutska formulacija, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcije, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo i što indukuje ili pojačava imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog čoveka ili životinje koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju. Pronalaskom je realizovana nutraceutska ili farmaceutska formulacija, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcije, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo i što indukuje ili pojačava humoralnu i/ili ćelijsku imunu reakciju kod najmanje jednog čoveka ili životinje protiv Core-1.

[0051]Pomenuto Core- 1 sp ecifično antitelo, a prvenstveno Core-1 specifična antitela, kombinacije Core-1 specifičnih antitela ili poželjne kombinacije Core-1 specifičnih antitela su detaljno opisane ovde u odeljku Definicije i na drugim mestima.

[0052]U poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana nutraceutska ili farmaceutska formulacija kao što je gore opisano, pri čemu je pomenuti najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za Core-1 specifično antitelo NEM0DTF1, a još poželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i za NEMOD-TF1 i pomenuto vezivanje je osetljivo na perjodat, i najpoželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEMOD-TF1, ali ne za A68-B/A11.

[0053]Pomenuti Core- 1 pozitivni mikroorganizam, a prvenstveno Core-1 pozitivni mikroorganizam, frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma i poželjne frakcije Core-1 pozitivnih mikroorganizama i njihove kombinacije su detaljno opisane ovde u odeljku Definicije i na drugim mestima, kao i metode za identifikaciju i izolovanje pomenutih mikroorganizama ili njihovih frakcija.

[0054]Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova frakcija predstavlja aktivni sastojak koji indukuje specifičnost imune reakcije protiv Core-1, Core-1 antigena i/ili Core-1 pozitivne tumorske ćelije i /ili bolesti.

[0055]Pomenuta imuna reakcija je humoralna imuna reakcija protiv Core-1 i/ili ćelijska imuna reakcija protiv Core-1.

[0056]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam je vezan: (i) za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo od sledećih antitela: HB-T1 (IgM) [DakoCvtomation GmbH, Hamburg; Giuffre G, Vitarelli E, Tuccari G, Ponz de Leon M, Barresi G: Detection of Tn, sialosyl-Tn i T antigens in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Virchows Arch 429:345-352 (1996)], HH8 (IgM) [Clausen H, Stroud M, Parker J, Spnnger G, Hakomori S: Monoclonal antibodies directed to the blood group A associated structure, galactosyl- A: specificity i relation to the Thomsen-Friedenreich antigen. Mol Immunol 25:199-204 (1988)], A78- G/A7 [Glycotope GmbH, Berlin; Karsten U, Butschak G, Cao Y, Goletz S, Hanisch FG. A new monoclonal antibody (A78-G/A7) to the Thomsen-Friedenreich pan-tumor antigen. Hybridoma 1995 Feb;14(1):37-44], A68-B/A11 [Glycotope GmbH, Berlin, www.glycotope.com], Nemod-TF1 [Glvcotope GmbH, Berlin; Goletz S, Cao Y, Danielczyk A, Ravn P, Schoeber U, Karsten U. Thomsen-Friedenreich antigen: the "hidden" tumor antigen. Adv Exp Med Biol. 2003;535:147-62], ili Nemod-TF2 [Glycotope GmbH, Berlin; Goletz S, Cao Y, Danielczyk A, Ravn P, Schoeber U, Karsten U Thomsen-Friedenreich antigen: the "hidden" tumor antigen. Adv Exp Med Biol. 2003;535:147-62], te još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA, a manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, ali ne za bilo koju od supstanci sa #liste 2#, (ii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA, a manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i ovo vezivanje je osetljivo na perjodat, (iii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA, a manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4, NM-F9 [DSM ACC2606], ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF2 ili A78-G/A7, (iv) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo sa bilokojom od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, (v) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA, a manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA i ne za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje bar za ćelije NM-D4, NM-F9 [DSM ACC2606] i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF1,

(vi) čak još poželjnije za najmanje dva od gore opisanih antitela,

(vii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA, a manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2 # i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4, NM-F9 [DSM ACC2606], ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF2 ili A78-G/A7, i za najmanje jedno antitelo sa bilo kojom od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa

PAA,

(viii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA, a manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA i ne za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje bar za ćelije NM-D4, NM-F9[DSM ACC2606] i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF1,

(ix) čak još poželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEM0D-TF1,

(x) i najpoželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEM0D-TF1, ali ne za A68-B/A11

[0057]U poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana formulacija koja je iizabrana iz grupe koja sadrži nutraceutsku i/ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo, pri čemu je Core-1 specifično antitelo izabrano iz grupe koja sadrži NEMOD-TF1, NEMOD-TF2, A78-G/A7, AS8-B/A11, HB-T1 i/ili HH8. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana pomenuta formulacija, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za Core-1 specifična antitela NEMOD-TF2 i Nemod-TF1, pri čemu vezivanje pomenutih antitela osetljivo na perjodat pokazuje znatno smanjenje vezivanja posle tretmana perjodatom.

[0058]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana nutraceutska ili farmaceutska formulacija koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcije, koja indukuje humoralnu i ćelijsku imunu reakciju kod ljudi ili životinja koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku nutraceutska ili farmaceutska kompozicija indukuje ili pojačava Core-1 specifičnu imunu reakciju kod najmanje jednog čoveka ili životinje koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivne kancerske ćelije koja ima potencijal da uništi Core-1 pozitivne kancerske ćelije.

[0059]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku nutraceutska kompozicija prema pronalasku se primenjuje za stvaranje Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi te ćelije, kao što je ovde pokazano, na primer, indukovanjem Core-1 specifičnih antitela, Core-1 specifičnom komplementarno zavisnom citotoksičnosti Core-1 antitela protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ubijajući iste efektivno, ili izlučivanjem TNFalpha i/ili INFgamma pomoću Core-1 specifičnih reakcija T ćelija koje su od strane stručnjaka iz odgovarajuće oblasti naučno prepoznate kao surogat marken za specifično citotoksično T ćelijama posredovano ubijanje tumorskih ćelija za one tumorske ćelije koje nose Core-1, kao što je pokazano u primerima i ovde je opisano.

[0060]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska nutraceutska kompozicija prema pronalasku se koristi za stvaranje Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi te ćelije, kao što je ovde pokazano, na primer, indukovanjem Core-1 specifičnih antitela, Core-1 specifičnom komplementarno zavisnom citotoksičnosti Core-1 antitela protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ubijajući iste efektivno, ili izlučivanjem TNFalpha i/ili INFgamma putem Core-1 specifičnih reakcija T ćelija koje su od strane stručnjaka iz odgovarajuće oblasti naučno prepoznate kao surogat marken za specifično citotoksično T ćelijama posredovano ubijanje tumorskih ćelija za one tumorske ćelije koje nose Core-1, kao što je pokazano u primerima i ovde je opisano.

[0061]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska nutraceutska kompozicija prema pronalasku se primenjuje za stvaranje pomenute Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi te ćelije, kao što su gore opisane, oralnom primenom nutraceutika kod (najmanje jednog) zdravog pojedinca. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska nutraceutska kompozicija prema pronalasku se primenjuje sa ciljem da smanji ili još poželjnije da spreči pojavu Core-1 pozitivne bolesti ili tumora oralnom primenom nutraceutika kod (najmanje jednog) zdravog pojedinca.

[0062]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku farmaceutska kompozicija prema pronalasku se koristi za stvaranje Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi te ćelije, kao što je ovde pokazano, na primer, indukovanjem Core-1 specifičnih antitela, Core-1 specifičnom komplementarno zavisnom citotoksičnosti Core-1 antitela protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ubijajući iste efektivno, ili izlučivanjem TNFalpha i/ili INFgamma putem Core-1 specifičnih reakcija T ćelija koje su od strane stručnjaka iz odgovarajuće oblasti naučno prepoznate kao surogat markeri za specifično citotoksično T ćelijama posredovano ubijanje tumorskih ćelija za one tumorske ćelije koje nose Core-1, kao što je pokazano u primerima i opisano je ovde.

[0063]Nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku se primenjuje za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kod najmanje jednog čoveka ili životinje

[0064]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska nutraceutska ili farmaceutska formulacija prema pronalasku se primenjuje sa ciljem da smanji ili još poželjnije da spreči pojavu Core-1 pozitivne bolesti ili tumora ili metastaza. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana nutraceutska ili farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1 ili njihove frakcije, koja smanjuje ili sprečava širenje ili metastaziranje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kod najmanje jednog čoveka ili životinje kada se primenjuje. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska nutraceutska ili farmaceutska formulacija sadrži najmanje dva različita Core-1 pozitivna mikroorganizma ili njihove frakcije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska nutraceutska ili farmaceutska formulacija sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegovu frakciju sjedinjenu sa najmanje jednim drugim korisnim mikroorganizmom. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku nutraceutska kompozicija prema pronalasku se primenjuje sa ciljem da se leči Core-1 pozitivna bolest ili tumor oralnom primenom nutraceutika kod pacijenata koji boluju od ove bolesti.

[0065] U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku farmaceutska formulacija prema pronalasku se upotrebljava sa ciljem da se leči Core-1 pozitivna bolest ili tumor kod pacijenata koji boluju od ove bolesti. U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku napred navedena nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku i najmanje jednu frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma, a prvenstveno više od jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma.

[0066]Dendritske ćelije, koje se ovde takođe nazivaju DC, mogu biti bilo koje dendritske ćelije ili smeša dendritskih ćelija ili smeša ćelija koja sadrži dendritske ćelije ili najmanje jednu dendritsku ćeliju. One mogu poticati od humanih donora koji su zdravi ili koji imaju bolest, kao što su, ali bez ograničavanja na tumorsku bolest ili Kronovu bolest ili Core-1 pozitivnu bolest ili jednu od bolesti navedenih ovde na drugim mestima, ili od životinja. Pomenute DC se mogu dobiti i snabdeti kao što je poznato stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, a obično se dobijaju od CD34 pozitivnih prekursorskih ćelija ili CD 14 pozitivnih monocitnih ćelija iz humane krvi ili koštane srži, koje se diferenciraju do nezrelih dendritskih ćelija (iDC) korišćenjem izvesnih kombinacija podesnih molekula koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. iDCs se snabdevaju sa Core-1 pozitivnim mikroorganizmom ili sa molekulom koji nosi Core-1 ili odgovarajućim kontrolama i onda dalje sazrevaju korišćenjem izvesne kombinacije podesnih molekula koja je poznata stručnjacima iz odgovarajuće oblasti da bi se dobile snabdevene dendritske ćelije koje odgovaraju snabdevenim zrelim dendritskim ćelijama (mDC) koje mogu da aktiviraju T-ćelije.

[0067]Pomenute DC mogu poticati od dendritske ćelijske linije, kao što su, ali bez ograničavanja na humanu dendritsku ćelijsku liniju NEMOD-DC (može se nabaviti od Glvcotope GmbH Berlin, Nemačka; www.glycotope.com) ili Mutz-3.

[0068]Snabdevanje d endritskih ćelija označava da se dendritske ćelije inkubiraju u odgovarajućem stanju za diferencijaciju i sazrevanje sa podesnim količinama Core-1 pozitivnog mikroorganizma, ili njegovih frakcija ili lizata ili najmanje jednim molekulom koji nosi Core-1 tokom podesnog vremena, a obično se ovo dešava tokom koraka sazrevanja koji je gore opisan u kombinaciji sa podesnim molekulima, obično od 24 do 48 sati, što dovodi do snabdevenih dendritskih ćelija koje mogu da aktiviraju imune ćelije, a prvenstveno T ćelije, koje sadrže Core-1 specifične T-ćelije.

[0069]Imune ćelije mogu biti PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi) ili druge ćelijske populacije koje sadrže CD4+ i /ili CD8+ T-ćelije, a prvenstveno CD4+ i CD8+ T-ćelije. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti znaju kako da dobiju te ćelije od čoveka ili životinje i da genensanja tih ćelija može obuhvatati pripremanje gratijentom fikola iz humane krvi ili krvnih ćelija leukaferaze i da u slučaju daljeg obogaćivanja može obuhvatati tehnologije magnetnog sortiranja specifičnog za T ćelije.

[0070]U poželjnom primeru izvođenja dendritske ćelije odgovaraju najmanje jednoj MHC klasi molekula sa imunim ćelijama, a prvenstveno MHC klasi I molekula ili MHC klasi II molekula, još poželjnije najmanje jednoj MHC klasi I i jednoj MHC klasi II molekula, još poželjnije više MHC molekula i najpoželjnije svim MHC molekulima. Zadnje pomenuto se može ostvariti uzimanjem dendritskih ćelija i imunih ćelija od istog pojedinca.

[0071]Odgovarajuća vremena i uslovi za kultivaciju imunih ćelija sa snabdevenim dendritskim ćelijama i za prateće dodavanje snabdevenih dendritskih ćelija su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i oni ih mogu optimizovati uzimanjem u obzir stanja u kome se nalaze ćelije. Obično je vreme inkubacije od 7 do 10 dana za svaki od dva koraka (primarna aktivacija i restimulacija).

[0072]Dendritske ćelije su prvenstveno funkcionalne dendritske ćelije dobijene od ćelijske linije leukemije MUTZ-3 ili ćelije poreklom od MUTZ-3, kao što su NEMOD-DC [kao što je opisano u DE10139428 A1. VVO2003/023023 A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287, 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260. 02758474.7 (EP), US10/486,966, CA2.457.287)] i mogu se nabaviti od firme Glvcotope GmbH Berlin, Nemačka [www.Glycotope.com]. Te dendritske ćelije su aktivne dendritske ćelije koje su potpuno sposobne da aktiviraju T ćelije i prerade i/ili prezentuju antigene na svojoj površini uključujući MHC klasu molekula. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska dendritske ćelije su funkcionalne dendritske ćelije dobijene od MUTZ-3 ili ćelije poreklom od MUTZ-3, kao što je NMD-200, i imune ćelije odgovaraju MHC klasi I molekula, kao što su HLA-A2 ili HLA-B44, a prvenstveno HLA-A2 i HLA-B44. U sledećem poželjnom primeru izvođenja se upotrebljava lizat NM-D4 ili NM-F9 kao molekul koji nosi Core-1 i NM-wt [koji je roditeljska ćelija NM-D4 ili NMF9, kao što je opisano u VVO2005/017130 A2 i EP1654353] ili NM-H9 [NM-H9D8, DSM ACC2806], koji se razlikuje po potencijalu za sijalilat i zato, za razliku od NM-D4 i NM-F9, ne nosi Core-1 na svojoj površini, kao kontrola u odgovarajućem formatu, kao što je živ ili mrtav, ili lizat od tih ćelija ili njihovih frakcija, još poželjnije lizat, oba snabdevena na DC i primenjena za restimulaciju. U sledećem poželjnom primeru izvođenja gtikoforinom ili perjodatom tretiranim azialoglikoforinom kao kontrolom za azialoglikoforin su snabdeveni DC i primenjeni su za restimulaciju. U poželjnijem primeru izvođenja, lizat od NM-D4 ili NM-F9 i azialoglikoforin se upotrebljavaju kao molekul koji nosi Core-1 za restimulaciju i NM-wt [NM-H9] i glikoforin ili perjodatom tretirani azialoglikoforin i/ili nesnabdeveni DC su upotrebljeni kao negativne kontrole.

[0073]Pomenuti nutraceutik prema pronalasku se može sastojati od pomenutog najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili same njegove frakcije, kao što su, ali bez ograničavanja na

mikroorganizam koji je živ ili mrtav, liofilizovan ili pasterizovan ili njegovi lizati ili komponente ili frakcije ili u najmanje deiimično rastvorenom obliku u tečnosti, ili se može sastojati od dodatnih komponenata, kao što su, ali bez ograničavanja na druge nutrijente, prehrambene aditive ili hranu ili aditive za pića, rastvore ili emulzije koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Pomenuti nutraceutik se može primeniti oralno u različitim oblicima, kao što su kapsule, tablete, emulzije, praškovi, tečnosti. Nutraceutik se može davati sam ili umešan u hranu ili pića. Pomenuti nutraceutik može takođe biti bilo koja hrana, piće,

komponenta pića ili hrane, prehrambeni aditiv ili samostalni nutraceutik.

[0074]U poželjnom primeru izvođenja nutraceutik koji se upotrebljava je u obliku kapsule ili tablete. U sledećem poželjnom primeru izvođenja nutraceutik je umešan u hranu ili pića kao što su, ali bez ograničavanja na one koji su navedeni ovde na drugim mestima u opisu pronalaska.

B) Snabdevanje Core- 1 pozitivnim mikroorganizmom

[0075]Pronalaskom je realizovan Core-1 pozitivni mikroorganizam koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 i MU1, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0076]Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku je podesan za primenu kao komponenta za nutraceutsku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0077]Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku indukuje specifičnu imunu reakciju protiv Core-1. Core-1 antigena, Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ili Core-1 pozitivne bolesti kod ljudi ili životinja.

[0078]Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku je podesan za primenu kao komponenta za nutraceutsku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, pri čemu Core-1 pozitivni mikroorganizam indukuje specifičnu imunu reakciju protiv Core-1. Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja.

[0079]Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku predstavlja aktivni sastojak nutraceutske ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku koja indukuje specifičnost imune reakcije protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivne tumorske ćelije kod ljudi ili životinja.

[0080]Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku indukuje ili pojačava specifičnu imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja kada se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji prema pronalasku U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam je vezan za

(i) najmanje jedno Core-1 specifično antitelo od sledećih antitela HB-T1, HH8, A78-G/A7, A68-B/A11, Nemod-TF1, ili Nemod-TF2; (ii) još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, ali ne i za bilo koju od supstanci navedenih u #listi 2#, (iii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne za bilo koju od supstanci navedenih u #list 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i ovo vezivanje je osetljivo na perjodat; (iv) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne za bilo koju od supstanci navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204. i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat (kao što je NEMOD-TF2 ili A78-G/A7); (v) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo sa bilo kojim od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa- PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, ni za bilo koji od XPAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje najmanje za ćelije NM-D4, NM-F9 i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat (kao što je NEMOD-TF1); (vi) čak još poželjnije za najmanje dva od gore opisanih antitela; (vii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćeliju od NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF2 ili A78-G/A7, i za najmanje jedno antitelo sa bilo kojim od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, (viii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, niti za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje najmanje za ćelije NM-D4, NM-F9 i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF1;

(ix) čak još poželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEM0D-TF1;

(x) i čak još poželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEMOD-TF1. ali ne za A68-B/A11;

(xii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, niti za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u # listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i ovo vezivanje je osetljivo na perjodat;

(xiii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, niti za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu vezivanje je osetljivo na perjodat, kao stoje NEMOD-TF2 ili A78-G/A7;

(xiv) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo sa bilo kojom od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA,

(xv) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA i ne vezuje se za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, niti za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje bar za ćelije NM-D4, NM-F9 i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF1,

(xvi) čak još poželjnije za najmanje dva od gore opisanih antitela;

(xvii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, niti za bilo koji od X-PAA konstrukata navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, kao što je NEMOD-TF2 ili A78-G/A7, i za najmanje jedno antitelo sa bilo kojim od gore navedenih karakteristika vezivanja, ali koje se ne vezuje za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA;

(xviii) čak još poželjnije za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, ali ne i za trisaharid Core-2 kuplovan sa PAA, niti za bilo koje od supstanci navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje bar za ćelije NM-D4, NM-F9 i ZR-75-1, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat (kao što je NEMOD-TF1);

(xix) čak još poželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEMOD-TF1 ;

(xx) i čak još poželjnije za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 i NEMOD-TF1. ali ne i za A68-B/A11.

[0081]U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za najmanje dva Core-1 specifična antitela.

[0082]U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za najmanje jedno antitelo koje se vezuje za TFa-PAA i manje se vezuje ili se ne vezuje za TFb-PAA, niti za bilo koju od supstanci navedenih u #listi 2# i koje se vezuje za azialoglikoforin, ali ne i za glikoforin i koje se vezuje za najmanje jednu humanu tumorsku ćelijsku liniju od NM-D4, NM-F9, ZR-75-1, CAMA-1, KG-1, ili A-204, i pri čemu je vezivanje osetljivo na perjodat, i koje se vezuje za najmanje jedno antitelo sa bilo kojim gore navedenim karakteristikama vezivanja, ali se ne vezuje za trisaharid Ćore- 2 kuplovan sa PAA. U još poželjnijem primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za NEMOD-TF2 ili A78-G/A7 ili NEMOD-TF1. U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za Core-1 specifično antitelo Nemod-TF1, pri čemu se vezivanje testira u ELISI i ELISA signal sa Core-1 specifičnim antitelom Nemod-TF1 je najmanje 3 puta veći od osnovnog, kada je obložena sa mikroorganizmom u koncentraciji od 1x107/ml, još poželjnije od 5x10<6>/ml, čak još poželjnije od 1x10<6>/ml, najpoželjnije od 1x10<5>/ml. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za Core-1 specifično antitelo Nemod-TF2, pri čemu se vezivanje testira u ELISI i ELISA signal sa Core-1 specifičnim antitelom Nemod-TF2 je najmanje 3 puta veći od osnovnog, kada je obložena sa mikroorganizmom u koncentraciji od 1x107ml, još poželjnije od 5x10<6>/ml, čak još poželjnije od 1x10<6>/ml, najpoželjnije od 1x10<5>/ml. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za Core-1 specifično antitelo Nemod-TF2, pri čemu se vezivanje testira u ELISI i ELISA signal sa Core-1 specifičnim antitelom Nemod-TF2 je najmanje 3 puta veći od osnovnog, odn, pozadinskog, kada je obložena sa mikroorganizmom u koncentraciji od 1x10'7mf još poželjnije od 5x10<f>7mt, čak još poželjnije od 1x10<6>/ml, najpoželjnije od 1x106/ml i pri čemu vezivanje osetljivo na perjodat pokazuje smanjeni ELISA signal posle tretmana sa perjodnom kiselinom, a prvenstveno ELISA signal pokazuje redukciju od najmanje 30%, još poželjnije od najmanje 50% i najpoželjnije od najmanje 80%. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za Core-1 specifično antitelo Nemod-TF1, pri čemu se vezivanje testira u ELISI i ELISA signal sa Core-1 specifičnim antitelom Nemod-TF1 je najmanje 3 puta veći od pozadinskog, kada je obložena sa mikroorganizmom koncentracije od 1x10<7>/ml, još poželjnije od 5x10<6>/ml, čak još poželjnije od 1x10<6>/ml, najpoželjnije od 1x10<5>/ml i pri čemu vezivanje osetljivo na perjodat pokazuje smanjeni ELISA signal posle tretmana sa perjodnom kiselinom, a prvenstveno ELISA signal pokazuje redukciju od najmanje 30%, još poželjnije od najmanje 50% i najpoželjnije od najmanje 80%. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se vezuje za Core-1 specifična antitela Nemod-TF1 i Nemod-TF2, pri čemu se vezivanje testira u ELISI i ELISA signal je najmanje 3 puta veći od pozadinskog, kada je obložena sa mikroorganizmom u koncentraciji od 1x10'7ml, još poželjnije od 5x106/ml, čak još poželjnije od 1x10D/ml, najpoželjnije od 1x105/ml i pri čemu vezivanje osetljivo na perjodat pokazuje smanjeni ELISA signal posle tretmana sa perjodnom kiselinom, a prvenstveno ELISA signal pokazuje redukciju od najmanje 30%, još poželjnije od najmanje 50% i najpoželjnije od najmanje 80%.

[0083]U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku indukuje ili pojačava specifičnu humoralnu i/ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja,

[0084]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuta imuna reakcija je humoralna imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ili ćelijska imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Ccre-1 pozitivnih tumorskih ćelija.

[0085]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska pomenuta imuna reakcija je humoralna imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija i ćelijska imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija.

[0086]Pomenuto Core- 1 specifično antitelo, a prvenstveno Core-1 specifična antitela, kombinacije Core-1 specifičnih antitela ili poželjne kombinacije Core-1 specifičnih antitela su detaljno opisane u Definicijama i ovde na drugim mestima. Pomenute nutraceutske ili farmaceutske kompozicije i njihovi poželjni primeri izvođenja su detaljno opisani ovde na drugim mestima.

[0087]Pomenuta humoralna imuna reakcija protiv Core-1 i pomenuta ćelijska imuna reakcija protiv Core-1 je detaljno opisana na drugim mestima u opisu predmetnog pronalaska. U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku indukuje ili pojačava specifičnu humoralnu i ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja koja se može detektovati najmanje jednim testom humoralne imune reakcije i najmanje jednim testom ćelijske imune reakcije.

[0088]U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se može primeniti za stvaranje Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi te ćelije kao što je ovde pokazano, na primer, indukovanjem Core-1 specifičnih antitela, Core-1 specifičnom komplementarno zavisnom citotoksičnosti Core-1 antitela protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija, ubijajući iste efektivno, i/ili izlučivanjem TNFalpha i/ili INFgamma putem Core-1 specifičnih reakcija T ćelija koje su od strane stručnjaka iz odgovarajuće oblasti naučno prepoznate kao surogat marken za specifično citotoksično ubijanje tumorskih ćelija posredovano T ćelijama za one tumorske ćelije koje nose Core-1, kada se koristi kao nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku.

[0089]U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se može primeniti za stvaranje pomenute Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija, koja ima potencijal za uništavanje tih ćelija, kao što je ovde opisano na drugim mestima, oralnim davanjem nutraceutika (najmanje jednom) zdravom pojedincu.

[0090]U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se može primeniti za smanjivanje ili čak još poželjnije za sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora njenim oralnim davanjem kao komponente nutraceutika prema pronalasku (najmanje jednom) zdravom pojedincu.

[0091]U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se može primeniti za smanjivanje ili čak još poželjnije za sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora, kada se daje kao komponenta farmaceutske formulacije prema pronalasku (najmanje jednom) pojedincu

[0092]U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se primenjuje kao aktivni sastojak nutraceutika za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora oralnim davanjem nutraceutika pacijentima koji boluju od ove bolesti.

[0093]U poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku se primenjuje kao aktivni sastojak farmaceutske kompozicije za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kod pacijenata koji boluju od ove bolesti davanjem farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana na drugim mestima.

[0094]U poželjnom primeru izvođenja pronalaskom su realizovani ili se primenjuju

(i) Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku, ili

(ii) nutraceutska ili farmaceutska formulacija koja sadrži Core-1 pozitivni mikroorganizam

koji je izabran iz grupe koja sadrži novi soj Bacteroides ovatus AG6(DSM 18726) i novi soj Bacteroides ovatus MU 1 (DSM 18728) koji je deponovan kod "DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" u Braunšvajgu (Nemačka), od strane firme Glvcotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (Nemačka) 20. oktobra 2006.

[0095]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 pozitivni mikroorganizam (aktivna komponenta) iz nutraceutske ili farmaceutske formulacije je kombinacija Core-1 pozitivnih mikroorganizama različitih sojeva. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pomenuta aktivna komponenta je kombinacija Core-1 pozitivnih mikroorganizama različitih sojeva koji su izabrani između sojeva AG6, MU1 i LH2. U sledećem poželjnom primeru izvođenja nutraceutska ili farmaceutska kompozicija (formulacija) prema pronalasku sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku, kombinovan sa najmanje jednim drugim korisnim mikroorganizmom, kao što je, ali bez ograničavanja na lactobacillus i/ili bifidobacterium, čak još poželjnije kombinacija Core-1 pozitivnih mikroorganizama različitih sojeva kombinovanih sa drugim korisnim mikroorganizmima.

[0096]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku Core-1 mikroorganizam nije patogeni mikroorganizam. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam je izolovan iz zdravog donora. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam se može izolovati od zdravog donora. [0097JU sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku i/ili njegova frakcija se primenjuje u proizvodnji medikamenta i/ili nutraceutika za terapiju ili profilaksu tumora, tehnikama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0098]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku i/ili njegova frakcija se primenjuje in vivo ili in vitro za indukovanje ili pojačanje Core-1 specifične imune reakcije i/ili za generisanje funkcionalnih dendritskih ćelija ili aktiviranih T ćelija, T ćelijskih linija ili T ćelijskih klonova ili antitela protiv Core-1.

[0099]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji kao živi organizam U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku se primenjuje kao živi organizam i daje se oralno

[0100]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji je osetljiv na najmanje jedan antibiotik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u nutraceutiku može kolonizovati creva. U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji je mrtav. U još više poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji je pasterizovan. U čak još poželjnijem primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji kao živi organizam i on je bio izolovan iz zdravog humanog donora i može kolonizovati humana creva i osetljiv je na antibiotike. U čak još poželjnijem primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u nutraceutiku je u pasterizovanom obliku i bio je izolovan iz creva zdravog humanog donora i osetljiv je na antibiotike.

[0101]U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u farmaceutskoj kompoziciji je mrtav ili liziran. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska Core-1 mikroorganizam prema pronalasku koji se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji je liofilizovan.

[0102]Izabrani Core-1 pozitivni sojevi su bili karakterisani na osnovu njihove senzibilnosti protiv različitih antibiotika (vidi tabelu 1) i njihovim vezivanjem za Core-1 specifična antitela (vidi tabelu 2).

C) Pribavljanje frakcija Core- 1 pozitivnog mikroorganizma

[0103]Pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku, pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam vezan za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0104]Pronalaskom je realizovana podesna frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku za primenu kao komponenta za nutraceutsku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, pri čemu se Core-1 pozitivni mikroorganizam vezuje za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0105]Pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja indukuje specifičnu imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja.

[0106]Pronalaskom je realizovana podesna frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku za primenu kao komponenta za nutraceutsku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, pri čemu frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma indukuje specifičnu imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja

[0107]Pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja predstavlja aktivni sastojak nutraceutske ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku i koja indukuje specifičnost imune reakcije protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja.

[0108]Pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja indukuje ili pojačava specifičnu imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija kod ljudi ili životinja kada se primenjuje u nutraceutskoj ili farmaceutskoj kompoziciji prema pronalasku.

[0109]Pomenuto Core- 1 specifično antitelo, poželjna Core-1 specifična antitela, kombinacije Core-1 specifičnih antitela ili poželjne kombinacije Core-1 specifičnih antitela su detaljno opisane u odeljku Definicije i ovde na drugim mestima. Pomenute nutraceutske ili farmaceutske kompozicije i njihovi poželjni primeri izvođenja su detaljno opisani ovde na drugim mestima.

[0110]Pomenuta frakcija core- 1- pozitivnog mikroorganizma označava pripreme, odn. preparate ili prečišćavanja manjih delova pomenutih mikroorganizama, kao što su preparat od ćelijskih zidova, preparat od ćelijskih omotača, lizati, lipopolisaharidni preparat, preparat od kapsula, ili preparat od polisaharidnih kapsula, koji su opisani u primerima (primer 10) ili bi neki stručnjak iz odgovarajuće oblasti mogao da optimizira i izabere jedan podesan metod ili kombinaciju podesnih metoda. One prvenstveno sadrže najmanje jednu Core-1 pozitivnu komponentu pomenutog Core-1 pozitivnog mikroorganizma. Oni se mogu dobiti pripremama ili prečišćavanjima od najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma. Pomenute pripreme i prečišćavanja se mogu dobiti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, kao što su one koje su gore opisane ili pojedinačnom ili sekvencijalnom ćelijskom frakcinacijom, ekstrakcijama fenol voda, ekstrakcijama etrom, digestijama lizozima i hromatografskim metodama. Core-1 pozitivna komponenta ili frakcija koja sadrži Core-1 pozitivnu komponentu se detektuje vezivanjem frakcije za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo u sistemima za testiranje, kao što su, ali bez ograničavanja na ELISU ili Dot blotove, koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku frakcija koja sadrži Core-1 pozitivnu komponentu sedobija afinitetnom hromatografijom uz korišćenje najmanje jednog Core-1 specifičnog antitela U poželjnom primeru izvođenja se upotrebljava samo po jedan korak pripreme ili prečišćavanja. U sledećem poželjnom primeru izvođenja se upotrebljava bar kombinacija koraka pripreme i prečišćavanja. U sledećem poželjnom primeru izvođenja pomenuta frakcija je obogaćena Core-1 pozitivnom komponentom kada se uporedi sa celim mikroorganizmom, što se može odrediti povećanim vezivanjem najmanje jednog Core-1 specifičnog antitela za frakciju u poređenju sa mikroorganizmom, na primer, pomoću ELISE, a prvenstveno onda kada je težina sadržanog biološkog materijala u istoj zapremini jednaka.

[0111]Pomenuta Core- 1 pozitivna komponenta označava bilo koju komponentu Core-1 pozitivnog mikroorganizma koja je vezana za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo. Pomenuta Core-1 pozitivna komponenta sadrži najmanje jednu Core-1 ugljeno-hidratnu strukturu ili Core-1 mimikričnu strukturu koja može biti na raspolaganju u obliku svog prirodnog molekula, koji je deo mikroorganizma, kao što je peptid, oligopeptid, polipeptid, lipid, keramid, ugljeni hidrat, lipoprotein, polisaharid, oligosaharid, polisaharid. proteoglikan, lipopolisaharid ili glikoprotein, ili kao stoje deo pomenutog prirodnog molekula ili on sam. U smislu pronalaska Core-1 pozitivna komponenta se može upotrebiti kao frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma kao takvog ili kuplovana sa drugim neprirodnim nosećim strukturama, kao što su proteini, lipidi, hemijski molekuli, kao što je poliakrilamid. Prvenstveno se upotrebljava u svom prirodnom obliku. Core-1 pozitivna komponenta može sadržati pojedinačnu Core-1- ugljeno-hidratnu strukturu ili Core-1 mimikričnu strukturu ili ponavljajuće jedinice pomenute strukture i može sadržati dodatne ugljeno-hidratne strukture ili jedinice ili druge biomolekulske strukture. Pomenuta Core-1 mimikrična struktura je struktura koja je vezana za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo i/ili indukuje imunu reakciju protiv Core-1, a prvenstveno humoralnu imunu reakciju protiv Core-1 ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1, i još poželjnije humoralnu imunu reakciju protiv Core-1 i ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1.

[0112]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuta imuna reakcija je humoralna imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ili ćelijska imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija.

[0113]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska pomenuta imuna reakcija je humoralna imuna reakcija protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija i ćelijska imuna reakcija protiv Core-1. Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija.

[0114]Pomenuta humoralna imuna reakcija protiv Core-1 i pomenuta ćelijska imuna reakcija protiv Core-1 su detaljno opisane na drugim mestima u predmetnoj prijavi pronalaska.

[0115]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku, koja se može primeniti za stvaranje Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal za uništavanje tih ćelija kao što je ovde pokazano, na primer, indukovanjem Core-1 specifičnih antitela, Core-1 specifičnom komplementarno zavisnom citotoksičnosti Core-1 antitela protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ubijajući iste efektivno, i/ili izlučivanjem TNFalpha i/ili INFgamma putem Core-1 specifičnih reakcija T ćelija koje su naučno prepoznate od strane stručnjaka iz odgovarajuće oblasti kao surogat markeri za specifično citotoksično T ćelijama posredovano ubijanje tumorskih ćelija za one tumorske ćelije koje nose Core-1, kada se primenjuje kao nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku.

[0116]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku, koja se može primeniti za stvaranje pomenute Core-1 specifične imune reakcije koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija, koja ima potencijal za uništavanje tih ćelija koje su gore opisane oralnom primenom nutraceutika kod (najmanje jednog) zdravog pojedinca.

[0117]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja se može primeniti za smanjenje ili čak još poželjnije za sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora njenom oralnom primenom kao komponente nutraceutika prema pronalasku kod (najmanje jednog) zdravog pojedinca.

[0118]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja se može primeniti za smanjenje ili čak još poželjnije za sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kada se primenjuje kao komponenta farmaceutske formulacije prema pronalasku kod (najmanje jednog) pojedinca

[0119]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku, koja se primenjuje kao aktivni sastojak nutraceutika za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora oralnim davanjem nutraceutika pacijentima koji boluju od ove bolesti.

[0120]U poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja se primenjuje kao aktivni sastojak farmaceutske kompozicije za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kod pacijenata koji boluju od ove bolesti davanjem farmaceutske kompozicije koja je opisana ovde na drugim mestima.

[0121]U još poželjnijem primeru izvođenja predmetnim pronalaskom je realizovana frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku koja je podesna komponenta nutraceutske formulacije koja prvenstveno dovodi do indukovanja imune reakcije kod ljudi koji prepoznaju Core-1 antigen i/ili Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju time što su pozitivni posle oralne primene frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma u najmanje jednom humoralnom ili ćelijskom imuno-testu koji je ovde opisan i čiji poželjni primeri izvođenja su gore opisani.

[0122]U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku Core-1 pozitivna komponenta nije deo bakterijskog lipopolisaharida.

[0123]U poželjnom primeru izvođenja pronalaskom je realizovana ili se primenjuje

(iii) frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku, ili

(iv) nutraceutska iii farmaceutska formulacija koja sadrži najmanje jednu frakciju najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku,

pri čemu je Core-1 pozitivni mikroorganizam izabran iz grupe koja sadrži nove sojeve AG6(DSM 18726) i MU1(DSM 18728) koji su deponovani kod "DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" u Braunšvajgu (Nemačka), od strane firme Glvcotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (Nemačka) 20. oktobra 2006.

[0124]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku (aktivna komponenta) nutraceutske ili farmaceutske formulacije sadrži kombinaciju frakcija jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili prvenstveno različitih Core-1 pozitivnih mikroorganizama od različitih sojeva. Frakcije mogu biti od istog ili različitog tipa pripreme ili prečišćavanja, a prvenstvena je kombinacija Core-1 pozitivnih komponenata koje imaju različiti molekulski nosač ili mimikrične strukture, kao što su, ali bez ograničavanja na peptid, oligopeptid, polipeptid, lipid. keramid, ugljeni hidrat, lipoprotein. polisaharid, oligosaharid, polisaharid, proteoglikan ili glikoprotein, ili kao deo drugog prirodnog ili sintetičkog molekula.

[0125]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pomenuta frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku (aktivna komponenta) sadrži kombinaciju Core-1 pozitivnih komponenti Core-1

pozitivnih mikroorganizama od najmanje dva različita soja, a prvenstveno je izabrana iz grupe koja sadrži nove sojeve AG6 (DSM 18726), MU1 (DSM 18728) i LH2 (DSM 18727). U sledećem poželjnom primeru izvođenja pomenuta frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku (aktivna komponenta) sadrži Core-1 pozitivne komponente Core-1 pozitivnih mikroorganizama soja AG6.

[0126]U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuta frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku sadrži ugljeno-hidratne strukture izabrane iz grupe koja sadrži #1, #2, #3 i/ili #4 sa Fig. 19. U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuta frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku sadrži ponavljajuće jedinice ugljeno-hidratne strukture izabrane iz grupe koja sadrži #1, #2, #3 i/ili #4 sa Fig. 19. U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, pomenuta frakcija sadrži najmanje jednu ugljeno-hidratnu strukturu izabranu iz grupe koja sadrži #1, #2, #3 i/ili #4 sa Fig. 19 i/ili njihove ponavljajuće jedinice.

[0127]U sledećem poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku pomenuta ugljeno-hidratna struktura ili njene pomenute ponavljajuće jedinice se dobijaju obogaćivanjem i/ili prečišćavanjem i/ili izolacijom iz Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku.

[0128]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pronalaska pomenuta ugljeno-hidratna struktura ili njene pomenute ponavljajuće jedinice se dobijaju obogaćivanjem i/ili prečišćavanjem i/ili izolacijom iz soja AG6. Detalji su prikazani u primeru 10.

[0129]U sledećem poželjnom primeru izvođenja pomenuta frakcija Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku (aktivna komponenta) sadrži Core-1 pozitivne komponente Core-1 pozitivnih mikroorganizama soja MU1.

[0130]U sledećem poželjnom primeru izvođenja nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku sadrži najmanje jednu frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku i najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku

[0131]U sledećem poželjnom primeru izvođenja nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku sadrži najmanje jednu frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku kombinovanu sa najmanje jednim drugim korisnim mikroorganizmom, kao što su, ali bez ograničavanja na lactobacillus i/ili bifidobacterium, čak još poželjnije kombinaciju frakcija Core-1 pozitivnih mikroorganizama različitih sojeva kombinovanih sa drugim korisnim mikroorganizmima.

[0132]U sledećem poželjnom primeru izvođenja nutraceutska ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku sadrži najmanje jednu frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma prema pronalasku i najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku kombinovan sa najmanje jednim drugim korisnim mikroorganizmom, kao što su, ali bez ograničavanja na lactobacillus i/ili bifidobacterium. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija indukuje ili pojačava humoralnu i/ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivne tumorske ćelije kod najmanje jednog čoveka ili životinje kada se daje u podesnoj kompoziciji ili formulaciji. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija indukuje ili pojačava Core-1 specifičnu imunu reakciju kod najmanje jednog čoveka ili životinje koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal za uništavanje Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija kada se daje u podesnoj kompoziciji ili formulaciji. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija smanjuje ili sprečava pojavu Core-1 pozitivne bolesti, tumora ili metastaza kod najmanje jednog čoveka ili životinje kada se daje u podesnoj kompoziciji ili formulaciji. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija smanjuje ili sprečava širenje ili metastaziranje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kod najmanje jednog čoveka ili životinje kada se daje u podesnoj kompoziciji ili formulaciji. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija se primenjuju za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora kod najmanje jednog čoveka ili životinje kada se daje u podesnoj kompoziciji. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija se primenjuju kao aktivni sastojak nutraceutika za sprečavanje, smanjenje rizika od razvoja ili smanjenja pojave Core-1 pozitivnog tumora oralnim davanjem nutraceutika zdravom pojedincu. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija se primenjuje kao aktivni sastojak nutraceutika za sprečavanje ili smanjenje širenja tumora ili metastaziranje ili širenja metastaza ili vremena do pojave recidiva Core-1 pozitivnog tumora ili tumorskih ćelija, radi poboljšanja kvaliteta života ili prosečnog preživljavanja ili dužine vremena do pojave recidiva, ili za lečenje pacijenta sa tumorom koji ima ili je imao Core-1 pozitivne tumorske ćelije oralnim davanjem nutraceutika pacijentima koji boluju od ove bolesti. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku ili njegova frakcija se primenjuju kao aktivni sastojak farmaceutske kompozicije za sprečavanje, smanjenje rizika od razvoja ili smanjenje pojave Core-1 pozitivnog tumora davanjem farmaceutske kompozicije zdravom pojedincu. U sledećem poželjnom primeru izvođenja Core-1 pozitivni mikroorganizam prema pronalasku iii njegova frakcija se primenjuju kao aktivni sastojak farmaceutske kompozicije za sprečavanje ili smanjenje širenja tumora ili metastaziranja ili širenja metastaza ili vremena do pojave recidiva Core-1 pozitivnog tumora ili tumorskih ćelija, za poboljšanje kvaliteta života ili prosečnog preživljavanja ili dužine vremena do pojave recidiva, ili za lečenje pacijenta sa tumorom koji ima ili je imao Core-1 pozitivne tumorske ćelije davanjem farmaceutske kompozicije pacijentima koji boluju od ove bolesti.

D) Metodi za indukovanje imune barijere protiv Core- 1 pozitivnih kancerskih ćelija, radi

sprečavanja i/ ili tečenja Core- 1 pozitivnih tumora i za tečenje ili sprečavanje Core- 1 pozitivne

bolesti

[0133]Metod za indukovanje ili pojačanje specifične humoralne i/ili ćelijske imune reakcije protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske kompozicije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma, ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje sadrže iste.

[0134]U poželjnom primeru izvođenja, metod za indukovanje ili pojačanje specifične humoralne i/ili ćelijske imune reakcije protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili lizata kao što je opisano ovde na drugim mestima.

[0135]U poželjnom primeru izvođenja, u gore navedenom metodu pomenuti nutraceutik, ili pomenuta farmaceutska formulacija, ili pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegova pomenuta frakcija ili pomenute formulacije koje obuhvataju one koji sadrže najmanje jedan mikroorganizam, lizat ili frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma vezanog za Nemod-TF1 ili A78-G/A7 i Nemod-TF2. Prema ovom metodu, indukovana ili pojačana Core-1 specifična imuna reakcija funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi najmanje jednu Core-1 pozitivnu kancersku ćeliju. U poželjnom primeru izvođenja metoda, indukovana Core-1 specifična imuna reakcija funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija koja ima potencijal da uništi te ćelije kao što je ovde pokazano, na primer, indukovanjem Core-1 I specifičnih antitela, Core-1 specifičnom komplementarno zavisnom citotoksičnosti Core-1 antitela protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija ubijajući iste efektivno, i/ili izlučivanjem TNFalpha i/ili INFgamma putem Core-1 specifičnih reakcija T ćelija koje su od strane stručnjaka iz odgovarajuće oblasti naučno prepoznate kao surogat markeri za specifično citotoksično T ćelijama posredovano ubijanje tumorskih ćelija za one tumorske ćelije koje nose Core-1, kao što je pokazano u primerima i ovde je opisano, koja sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika, ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije koji su opisani ovde na drugim mestima ili formulacija koje ih sadrže.

[0136]Metod za smanjenje ili čak još poželjnije sprečavanje pojave tumora, a prvenstveno Core-1 pozitivnog tumora, koji sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika, ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koja ih sadrže, a prvenstveno zdravom pojedincu.

[0137]Metod za smanjenje ili čak još poželjnije sprečavanje širenja ili metastaziranja tumora, a prvenstveno Core-1 pozitivnog tumora, koji sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika, ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže.

[0138]Metod za lečenje tumora, a prvenstveno Core-1 pozitivnog tumora, koji sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže.

[0139]Metod za smanjenje ili čak još poželjnije pojave Core-1 pozitivne bolesti koji sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže, a prvenstveno zdravom pojedincu.

[0140]Metod vakcinacije ili imunizacije čoveka ili životinje protiv Core-1 sadrži (v) davanje čoveku ili životinji efektivne količine funkcionalnih dendritskih ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu funkcionalnu dendritsku ćeliju usmerenu protiv Core-1 najmanje jednom i indukovanje imune reakcije sa pomenutim funkcionalnim dendritskim ćelijama kod čoveka ili životinje i (vi) pojačavanje imune reakcije davanjem efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam i/ili njegovu frakciju i/ili lizat najmanje jednom.

[0141]Metod vakcinacije čoveka ili životinje protiv ugljeno-hidratnog epitopa koji je prisutan na molekulu humane ili životinjske ćelije koji sadrži i) davanje čoveku ili životinji efektivne količine aktiviranih T ćelija, T ćelijskih klonova, T ćelijske linije ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu aktiviranu T ćeliju usmerenu protiv Core-1 najmanje jednom i indukovanje imune reakcije sa pomenutim aktiviranim T ćelijama kod čoveka ili životinje i ii) pojačavanje imune reakcije davanjem efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži Core-1 pozitivni mikroorganizam i/ili njegovu frakciju i/ili lizat najmanje jednom.

[0142]Generisanje funkcionalnih dendritskih ćelija, aktiviranih T ćelija, T ćelijskih linija i T ćelijskih klonova je opisano ovde na drugim mestima. U poželjnom primeru izvođenja davanje prethodnim metodima pod (i) se vrši jednom. U sledećem poželjnom primeru izvođenja davanje prethodnim metodima pod (i) se vrši dva puta. U sledećem poželjnom primeru izvođenja davanje prethodnim metodima pod (i) se vrši najmanje tri do pet puta. U poželjnom primeru izvođenja pojačanje imune reakcije davanjem efektivne količine farmaceutske kompozicije prethodnim metodama pod (ii) se vrši jednom, u sledećem poželjnom primeru izvođenja pojačanje se vrši 2-10 puta, još poželjnije više od 10 puta, još poželjnije do 20 puta, a najpoželjnije se pojačanje vrši kontinualno u redovnim vremenskim intervalima tokom perioda od nekoliko meseci do nekoliko godina. U poželjnom primeru izvođenja pojačanje imune reakcije se vrši 1-5 puta blisko prajmiranju, a posle toga u intervalima od 3 meseca do 1 godine ili 1 godine do 10 godina. Generisanje funkcionalnih dendritskih ćelija, aktiviranih T ćelija, T ćelijskih linija i T ćelijskih klonova je opisano ovde na drugim mestima.

[0143]Metod za smanjenje ili čak još poželjnije sprečavanje širenja Core-1 pozitivne bolesti sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika, ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže.

[0144]Metod za lečenje Core-1 pozitivne bolesti sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže.

[0145]Metod za pojačanje imunog sistema ili za poboljšanje imune reakcije koji sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže. Ovo može biti, na primer, ali bez ograničavanja na opšte poboljšanje kondicije imunog sistema, na primer, protiv infektivnih bolesti ili tumora, poboljšanje aktivnosti drugih imunostimulatornih agenasa ili probiotika ili prebiotika ili dejstva, na primer, kao adjuvansa.

[0146]U poželjnom primeru izvođenja nutraceutik ili farmaceutska formulacija ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegova frakcija, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže u gore opisanim metodama sadrže najmanje jedan mikroorganizam, lizat ili frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma vezane za Nemod-TF1 i/ili A78-G/A7 i Nemod-TF2.

[0147]U poželjnom primeru izvođenja nutraceutik ili farmaceutska formulacija ili Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova frakcija, koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže u gore opisanim metodama sadrže najmanje jedan mikroorganizam, lizat ili frakciju soja AG6 (DSM 18726), MU1 (DSM 18728) i/ili LH2 (DSM 18727), još poželjnije soja AG6 i/ili MU1.

[0148]Izraz formulacija označava bilo koju supstancu ili kompoziciju supstanci u podesnom obliku za davanje, koji sadrži najmanje jedan od nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, a koji može sadržati farmaceutski prihvatljivi nosač ili nosač koji je prihvatljiv za prehrambene aditive i/ili nutraceutik iii nutraceutsku, farmaceutsku kompoziciju, Core-1 pozitivni mikroorganizam ili samo njegovu frakciju.

[0149]Izraz sprečavanje pojave se odnosi na nutraceutik, farmaceutsku kompoziciju, Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju ili formulacije koje ih sadrže namenjene za subjekta sa ciljem da se smanji rizik ili brzina ili verovatnoća razvoja Core-1 pozitivnog kancera ili Core-1 pozitivne bolesti.

[0150]Izraz smanjenje ili sprečavanje širenja tumora ili Core-1 pozitivne bolesti ili metastaziranja tumora se odnosi na nutraceutik, farmaceutsku kompoziciju, Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju ili formulacije koje ih sadrže namenjene za subjekta sa ciljem da se smanji rizik ili brzina ili verovatnoća metastaziranja ili širenja bolesti na druge organe ili druga mesta u telu ili kod drugih pojedinaca.

[0151]Izraz lečenje se odnosi na primenu nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže na pojedincu ili subjektu sa ciljem lečenja, ozdravljenja, ublažavanja, olakšanja, promene, izlečenja, popravljanja, poboljšanja ili dejstva na kancer, simptoma kancera, predispozicije prema kanceru, vremena preživljavanja, ili vremena do progresije.

[0152]Pomenuta Core-1 pozitivna bolest je bilo koja bolest koja je povezana sa virusom, mikroorganizmom ili drugim biološkim materijalom koji se može vezati za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo ili koja je povezana sa komponentom tela ili se dešava u telu čoveka ili životinje kao što je, ali bez ograničavanja na ćeliju, mikroorganizam, virus ili česticu koja se vezuje za najmanje jedno Core-1 specifično antitelo.

[0153]"Efektivna količina" bilo kojeg nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže, sadrži živi ili mrtvi mikroorganizam, ili lizate ili frakcije ovih mikroorganizama koji odgovaraju ili potiču od oko 1x10<6>do oko 1x 10<14>cfu po osobi dnevno (cfu/po osobi/dnevno), pri čemu je cfu jedinica formiranih kolonija kao mera za jedan mikroorganizam, koja je poznata kao takva i mogu je odrediti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti. U sledećem primeru izvođenja efektivna količina je količina nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže, koja indukuje humoralnu ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog pojedinca, a prvenstveno humoralnu i ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1, koja se može detektovati pomoću najmanje jednog od imuno-reaktivnih testova protiv Core-1 koji su opisani ovde na drugim mestima. U sledećem primeru izvođenja efektivna količina je količina nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže, koja je potrebna za stvaranje imune barijere protiv Core-1 pozitivne tumorske ćelije, koja ima profilaktički efekat protiv kancera ili koja ima terapeutski efekat protiv kancera, ili koja ima profilaktički ili terapeutski efekat protiv druge Core-1 pozitivne bolesti, kod najmanje jednog pojedinca.

[0154]Efektivnu količinu za pojedinca ili grupu pojedinaca mogu odrediti i/ili optimizirati stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, a prvenstveno korišćenjem najmanje jednog imuno-reaktivnog testa protiv Core-1 koji je opisan ovde na drugim mestima, a prvenstveno one kombinacije imuno-reaktivnih testova protiv Core-1 koji su opisani ovde na drugim mestima kao poželjni primeri izvođenja i /ili kliničkih reaktivnih testova koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti ili su opisani ovde na drugim mestima. Za konkretnu osobu ove efektivne količine mogu varirati u odnosu na gore opisane količine ili doze, ili količine ili doze koje su opisane ovde na drugim mestima, u zavisnosti, na primer, od subjekta, broja i vremenskog rasporedadoza, od formata ili formulacije nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije, načina i vremena primene, od svrhe zbog koje se primenjuju, kao što su profilaksa ili lečenje, od stanja Core-1 pozitivne bolesti ili kancera, i one mogu varirati u zavisnosti od vrsta, rasa i između pojedinačnih životinja ili pojedinih ljudi koji dobijaju nutraceutik, farmaceutsku kompoziciju, Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju ili formulacije koje ih sadrže. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu da odrede podesne i/ili optimalne doze, načine primene i vremenske rasporede za pojedinca ili grupu pojedinaca, a prvenstveno korišćenjem opisa i primera izvođenja pronalaska koji su ovde opisani.

[0155]Poželjne su one efektivne količine i doze nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže, koje indukuju ili pojačavaju pomenutu imunu reakciju protiv Core-1 kod više od jednog pojedinca, još poželjnije kod značajnog broja pojedinaca, još poželjnije kod najmanje 10%, još poželjnije kod najmanje 20%, još poželjnije kod najmanje 30%, još poželjnije kod najmanje 40%, još poželjnije kod najmanje 50%, i najpoželjnije kod većine pojedinaca.

[0156]U poželjnom primeru izvođenja efektivna količina je količina pomenutog nutraceutika, pomenute farmaceutske kompozicije, pomenutog Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove pomenute frakcije ili pomenutih formulacija koje ih sadrže ona koja indukuje imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog pojedinca

[0157]U poželjnom primeru izvođenja, efektivna količina je količina pomenutog nutraceutika, pomenute farmaceutske kompozicije, pomenutog Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove pomenute frakcije ili pomenutih formulacija koje ih sadrže, koja je potrebna za stvaranje imune barijere protiv Core-1 pozitivne tumorske ćelije, koja ima profilaktički efekat protiv kancera ili koja ima terapeutski efekat protiv kancera, ili koja ima profilaktički ili terapeutski efekat protiv druge Core-1 pozitivne bolesti, kod najmanje jednog pojedinca. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, efektivna količina je količina pomenutog nutraceutika, pomenute farmaceutske kompozicije, pomenutog Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove pomenute frakcije ili pomenutih formulacija koje ih sadrže, koja indukuje maksimalnu iii skoro maksimalnu imunu reakciju protiv Core-1 kod najmanje jednog pojedinca.

[0158]U poželjnom primeru izvođenja, efektivna količina pomenutog nutraceutika, pomenute farmaceutske kompozicije, pomenutog Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove pomenute frakcije ili pomenutih formulacija koje sadrže živi ili mrtvi mikroorganizam, ili lizate ili frakcije ovih mikroorganizama odgovara ili potiče od oko 1x106do oko 1x10<l4>cfu po pojedincu po dozi. U još poželjnijem primeru izvođenja efektivna količina nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje sadrže živi ili mrtvi mikroorganizam, lizate ili frakcije ovih mikroorganizama odgovara ili potiče od 1x10<7>do 1x10<13>cfu</p>o osobi/dnevno, još poželjnije od 2x108 do 1x10<12>, i najpoželjnije 1x10<9->1x10<11>cfu/po osobi/dnevno.

[0159]Efektivne količine ili efektivne doze mogu takođe varirati, kao što će shvatiti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, u zavisnosti od načina primene, upotrebljenih ekscipijenasa i mogućnosti zajedničke primene sa drugim agensima, kao što su oni za pojačanje imuniteta, za indukovanje imune reakcije, ili stvaranje imune barijere ili sprečavanje ili lečenje kancera. Efektivne količine ili efektivne doze takođe mogu varirati, kao što će shvatiti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, u zavisnosti od formata primene, kao što je nutraceutik, kao što je farmaceutska kompozicija, kao što je Core-1 pozitivni mikroorganizam ili kao što je njegova frakcija ili kao što su formulacije koje ih sadrže, kao i od toga da li oni sadrže žive, mrtve lizate ili njihove frakcije, kao i od količina doza, kao i od vremenskih intervala između doza. Njih mogu odrediti i optimizirati stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, a prvenstveno primenom predmetnog pronalaska, testova i metoda koji su ovde opisani

[0160]U poželjnom primeru izvođenja, nutraceutik se daje oralno u više od jedne doze dnevno, do jedne doze dnevno, nedeljno, ili mesečno, od kratkog vremenskog intervala do upotrebe duge godinu dana, a prvenstveno se koristi dnevno ili nedeljno preko4nedelje do 2 godine. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pojedincu se daje pojedinačna doza. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pojedincu se daju višestruke doze. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, efektivna količina odgovara pojedinačnoj dozi. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, efektivna količina odgovara višestrukim dozama.

[0161]U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija se može davati sistemski bilo samo kao jedna doza, bilo kao bilo koje doze, a prvenstveno nedeljno do mesečno, do 3 meseca ili 6 meseci ili u njihovoj naizmeničnoj kombinaciji i može se kombinovati sa 6-to mesečnim do godišnjim, do 5-to godišnjim, do desetogodišnjim osvežavanjem imunizacije. U sledećem poželjnom primeru izvođenja efektivno doziranje nutraceutske formulacije koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegov lizat ili frakciju kod ljudi je 0,1 mg/m2 - 10g/m<2>, još poželjnije 10mg/m<2->10g/m<2>. čak još poželjnije 0,1 g/m2 - 10g/m<2>.

[0162]U sledećem poželjnom primeru izvođenja formulacija se daje prvo sistemski uz sledstvena oralna osveženja imunizacije.

[0163]Izraz administracija, odnosno davanje označava dovođenje u kontakt čoveka ili životinje sa efektivnom količinom nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže za koje se mogu upotrebiti dodatni nosači. Načini primene obuhvataju bilo koji način za dovođenje čoveka ili životinje u kontakt sa nutraceutikom, farmaceutskom kompozicijom, Core-1 pozitivnim mikroorganizmom ili njegovom frakcijom ili formulacijama koje ih sadrže. Poželjni su ovi načini primene, ali nisu ograničeni na oralnu primenu, sistemsku primenu, primenu putem inhalacije ili putem dovođenja u kontakt sa kožom ili drugim epidermisom, što dovodi do imune reakcije protiv Core-1, imune barijere protiv Core-1 ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija, profilaktičkog efekta protiv kancera ili terapeutskog efekta protiv kancera, koji se može odrediti u svojim poželjnim oblicima, kao što je opisano gore ili ovde na drugim mestima. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu izabrati najpodesniji način primene.

[0164]Primeri i poželjni načini primene i formulacije su opisani kao što sledi:

[0165]Nutraceutici se prvenstveno daju oralno, na primer, bilo kao kapsule, tablete, emulzije, prašak, tečnosti, u obliku bilo koje hrane ili pića ili kao komponenta hrane ili pića, kao što je prehrambeni aditiv. Nutraceutik može biti davan sam ili pomešan sa najmanje jednim drugim sastojkom. Sam nutraceutik ili njegova smeša sa najmanje jednim drugim sastojkom može biti davan sam ili umešan u hranu ili piće.

[0166]Formulacija nutraceutika, ali takođe i farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže za oralnu primenu može biti bilo koji oralno prihvatljivi dozirani oblik ili efektivna količina nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacije koje ih sadrže, uključujući, ali bez ograničavanja na tablete, kapsule, nanočestice, emulzije i vodene suspenzije, disperzije i rastvore. Uobičajeni nosači za tablete obuhvataju laktozu i kukuruzni škrob. Tabletama se takođe obično dodaju lubrikansi, kao što je magnezijum stearat. Za oralnu primenu u obliku kapsule, korisni razređivači obuhvataju laktozu i osušeni kukuruzni škrob. Kada se vodene suspenzije ili emulzije daju oralno, onda se aktivni sastojak može suspendovati ili rastvoriti u uljanoj fazi sjedinjenoj sa emulgujućim ili suspendujućim agensima. Ako je poželjno, mogu biti dodati izvesni zaslađivači, arome ili boje.

[0167]Formulacija za oralnu primenu može biti bilo koji oralno prihvatljivi dozirani oblik ili efektivna količina nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacije koje ih sadrže, uključujući, ali bez ograničavanja na tablete, kapsule, nanočestice, emulzije i vodene suspenzije, disperzije i rastvore. Uobičajeni nosači za tablete obuhvataju laktozu i kukuruzni škrob. Tabletama se takođe obično dodaju lubrikansi. kao što je magnezijum stearat. Za oralnu primenu u obliku kapsule, korisni razređivači obuhvataju laktozu i osušeni kukuruzni škrob. Kada se vodene suspenzije ili emulzije daju oralno, onda se aktivni sastojak može suspendovati ili rastvoriti u uljanoj fazi sjedinjenoj sa emulgujućim ili suspendujućim agensima. Ako je poželjno, mogu biti dodati izvesni zaslađivači, arome ili boje.

[0168]Formulacija predmetnog pronalaska se može davati oralno ili parenteralno. Parenteralna primena obuhvata injekcije, kao što su kapljična infuzija, hipodermijske, intravenske ili intramuskutarne injekcije, transdermalnu primenu melemom ili transdermalnim lekom i rektalnu primenu supozitorijom. Kada se kompozicija daje oralno, onda se ona može pripremiti u obliku tvrde kapsule, meke kapsule, granula, praška, finih granula, pilula, pastila, sistema za postepeno oslobađanje aktivnog sastojka, tečnosti i suspenzije. Preparat se može pripremiti lako, uobičajenim metodama iz oblasti farmacije. Naravno da će način primene i dozirani oblici uticati na količine jedinjenja ili kompozicija koje su poželjne i efikasne za primenu u datom tečenju. Kada se formulacija predmetnog pronalaska priprema u obliku za oralnu primenu, onda se kompozicija može pripremiti korišćenjem uobičajenih farmaceutskih sastojaka u normalni medikament, kao što su punilac, produžavač, vezivo, sredstvo za raspadanje, surfaktant, razređivača kao što su lubrikans i ekscipijens. Posebni primer uobičajenih sastojaka obuhvata recipijense, kao što su mlečni šećer, beli šećer, natrijum hlorid, glukoza, urea, škrob, kalcijum karbonat, kaolin, kristalna celuloza i silicijumova kiselina; veziva, kao što su voda, etanol, obični sirup, tečna glukoza, tečni škrob, rastvor želatina, karboksimetil celuloza, šeiak, metil celuloza, kalijum fosfat i polivinil pirolidon; sredstva za raspadanje, kao što su osušeni škrob, natrijum alginat, agar u prahu, laminaran prah, natrijum bikarbonat, kalcijum karbonat, polioksietilen sorbitan estri masnih kiselina, natrijum lauril sulfat, stearinska kiselina monoglicerid, škrob i mlečni šećer: mhibitore raspadanja, kao što su beli šećer, stearinska kiselina, kakao puter i hidrogenovano ulje; absorbefacijente, kao što su kvaternarna amonijumska so i natrijum lauril sulfat; sredstva za vlaženje, kao što su glicerin i škrob; absorbente, kao što su škrob, mlečni šećer, kaolin, bentonit i koloidna silicijumova kiselina, i lubrikanse, kao što je prečišćeni talk i stearat. Ako je potrebno, preparat dalje sadrži boju, konzervans, miris, aromu i zaslađivač. Podesne farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju bazne soli neorganskih i organskih kiselina, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, metan sulfonska kiselina, etan sulfonska kiselina, sirćetna kiselina, jabučna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, mlečna kiselina, oksalna kiselina, ćilibarna kiselina, fumarna kiselina, maleinska kiselina, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, fenilsirćetna kiselina i bademova kiselina. Pored toga, farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja prema predmetnom pronalasku takođe mogu biti formirana sa farmaceutski prihvatljivim katjonom, na primer, ako supstituentna grupa sadrži karboksi radikal. Podesni farmaceutski prihvatljivi katjoni su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju alkalne, zemnoalkalne, amonijumske i kvatername amonijumske katjone.

[0169]U poželjnom primeru izvođenja, način primene farmaceutske kompozicije onaj koji je izabran iz grupe koja se sastoji od intravenske injekcije, intraperitonealne injekcije, intra-muskularne injekcije, intrakranijalne injekcije, intratumoralne injekcije, intraepitelijalne injekcije, transkutanog davanja, per ezofagealne primene, intraabdominalne primene, intraapendikulame primene, intraarterijalne primene, intraartikularne primene, intrabronhijalne primene, intrabukalne primene, intrakapsularne primene, intrakardijalne primene, intrakartilaginozne primene, intrakavitarne primene, intracefalne primene, intrakolične primene, intrakutane primene, intracistične primene, intradermalne primene, intraduktalne primene, intraduodenalne primene, intrafascikularne primene, intrafatne primene, intrafilarne primene, intrafisuralne primene, intragastrične primene, intraglandularne primene, intrahepatičke primene, intraintestinalne primene, intralamelarne primene, intralezione primene, intraligamentne primene, intralingvalne primene, intramamarne primene, intramedularne primene, intrameningealne primene, intramiokardijalne primene, intranazalne primene, intraokularne primene, intraoperativne primene, intraoralne primene, intraoseozne primene, intraovarijalne primene, intrapankreasne primene, intraparijetalne primene, intrapelvične primene, intraperikardijalne primene, intraperinealne primene, intraperitonealne primene, intraplacentalne primene, intrapleuralne primene, intrapontinske primene, intraprostatične primene, intrapulmonarne primene, intrarahidijanske primene, intrarektalne primene, intrarenalne primene, intraskleralne primene, intraskrotalne primene, intrasegmentalne primene, intraselarne primene, intraspinalne primene, intrasplenične primene, intrastemalne primene, intrastromalne primene, intrasinovijalne primene. intratarzalne primene, intratestikularne primene, intratorakalne primene, intratonzilarne primene, intratrahealne primene, intratubalne primene, intratimpanske primene, intraureteralne primene, intrauretralne primene, intrauterine primene, intravaginalne primene, intravaskularne primene, intraventrikularne primene, intravertebralne primene, intravezikalne primene i intravitreozne primene.

[0170] U još poželjnijem primeru izvođenja prema pronalasku primeri načina primene (= dovođenja u kontakt) obuhvataju parenteralnu, npr. intravensku, intradermalnu. subkutanu, oralnu, transdermalnu (topičku), transmukoznu, intraperitonealnu, intranazalnu, rektalnu, enteralnu i oralnu primenu.

[0171] Formulacija prema predmetnom pronalasku može sadržati farmaceutski prihvatljive soli njenih komponenti. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju kisele adicione soli koje su formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili sa organskim kiselinama, kao što su sirćetna, vinska, bademova i slično Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se takođe dobiti od neorganskih baza, kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili feri hidroksidi, i od organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamino, 2-etilamino etanol, histidin, prokain i slično. Fiziološki tolerabilni nosači su dobro poznati iz odgovarajuće oblasti Na primer, tečni nosači su sterilni vodeni rastvori koji ne sadrže druge materijale osim aktivnih sastojaka i vode, ili sadrže pufer, kao što je natrijum fosfat, na fiziološkoj pH vrednosti, fiziološki slani rastvor ili oba, kao što je fosfatni puferovani slani rastvor. Dalje, vodeni nosači mogu sadržati više od jedne puferske soli, kao i soli kao što su natrijum i kalijum hloridi, dekstrozu, propilen glikol, polietilen glikol i druge rastvorene supstance. Tečne kompozicije pored tečne faze mogu takođe sadržati vodu ili je voda isključena iz njih. Primeri takvih dodatnih tečnih faza su glicerin, biljna ulja. kao što je ulje od semena pamuka, organske estre, kao što je etil oleat, i emulzije voda-ulje. Formulacija sadrži Core-1 pozitivni mikroorganizam prema predmetnom pronalasku, njegov lizat ili frakciju, a obično u količini od najmanje 0,1 težinskog procenta Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije po težini cele kompozicije. Težinski procenat je udeo težine Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije u celoj kompoziciji Shodno tome, na primer, 0,1 težinski procenat predstavlja 0,1 gram Core-1 pozitivnog mikroorganizma i to Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije na 100 grama cele kompozicije.

[0172]Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na one soli jedinjenja koje zadržavaju biološku efektivnost i svojstva slobodnih baza i koje se dobijaju reakcijom sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slično. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju, na primer, soli alkalnih metala, kao što su natrijum i kalijum, soli zemnoalkalnih metala i amonijumske soli.

[0173]Formulacija koja kao aktivni sastojak sadrži Core-1 pozitivni mikroorganizam, njegov lizat ili frakciju može biti u obliku koji je podesan za oralnu upotrebu, kao što su, na primer, tablete, pastile, lozenge, vodene ili uljane suspenzije, disperzibilni praškovi ili granule, emulzije, tvrde ili meke kapsule ili sirupi ili eliksiri. Kompozicije namenjene za oralnu primenu mogu biti pripremljene bilo kojim metodom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti za proizvodnju farmaceutskih kompozicija i takve kompozicije mogu sadržati jedan ili više agenasa koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od zaslađivača, aroma, boja i konzervanasa da bi se realizovali farmaceutski elegantni i ukusni preparati. Tablete sadrže aktivni sastojak pomešan sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima koji su podesni za proizvodnju tableta. Ovi ekscipijensi mogu biti, na primer, inertni razređivači, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat, laktoza, kalcijum fosfat ili natrijum fosfat; agensi za granulisanje i raspadanje, kao što su, na primer, kukuruzni škrob, ili alginska kiselina; veziva, kao što su, na primer, škrob, želatin ili akacija, i lubrikanti, kao što su. na primer, magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Tablete mogu biti bez obloge ili mogu biti obložene poznatim tehnikama radi odlaganja dezintegracije i absorpcije u gastrointestinalnom traktu, čime se obezbeđuje produženo dejstvo tokom dužeg perioda. Na primer, može se upotrebiti materijal za odlaganje dejstva kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat One takođe mogu biti obložene tehnikama koje su opisane u US pat. br. 4,256,108; 4,166,452; i 4,265,874, da bi se formirale osmotičke terapeutske tablete za kontrolisano oslobađanje. Formulacija prema predmetnom pronalasku može takođe ili alternativno sadržati jedan ili više lekova, koji mogu biti povezani sa modulišućim agensom ili mogu biti slobodni u okviru kompozicije. Praktično bilo koji lek se može davati u kombinaciji sa modulišućim agensom, kao što je ovde opisano, za mnoštvo različitih svrha, kao što je opisano dole. Primeri vrsta lekova koji se mogu primenjivati sa modulišućim agensom obuhvataju analgetike, anestetike, antianginike, antimikotike, antibiotike, antikancerske lekove (npr. taksol ili mitomicin C), antinflamatorne (npr. ibuprofen i indometacin), antihelmintike, antidepresive. antidote, antiemetike, antihistaminike, antihipertenzive, antimalarike, antimikrotubulinske agense (npr. kolhicin ili vinka alkaloidi), antimigrenske agense, antimikrobne, antipsihotike, antipiretike, antiseptike, anti-signalne agense (npr. inhibitori protein kinaze C ili inhibitori intraćelijske mobilizacije kalcijuma), antiartritike, antitrombinske agense, antituberkulotike, antitusike, antiviralne, supresante apetita, kardioaktivne lekove, hemijski zavisne lekove, katartike, hemoterapeutske agense, koronarne, cerebralne ili periferne vazodilatatore, kontraceptivne agense, depresante, diuretike, ekspektorante, faktore rasta, hormonske agense, hipnotike, imunosupresivne agense, narkotičke antagoniste, parasimpatomimetike, sedative, stimulante, simpatomimetike,toksine (npr kolera toksin), sedative i urinarne antiinfektive.

[0174]Formulacije za oralnu primenu mogu takođe biti prisutne kao tvrde želatinske kapsule, u kojima je aktivni sastojak pomešan sa inertnim čvrstim razređivačem, na primer, kalcijum karbonatom, kalcijum fosfatom ili kaolinom, ili kao meke želatinske kapsule, pri čemu je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljanim medijumom, na primer, uljem od kikirikija, tečnim parafinom ili maslinovim uljem. Vodene suspenzije sadrže aktivne materijale u smeši sa ekscipijensima koji su podesni za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi ekscipijensi su agensi za suspendovanje, kao što su, na primer, natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksi-propilmetilceluloza, natrijum alginat polivinil-pirolidon, guma tragakanta i guma akacija, agensi za dispergovanje ili vlaženje mogu biti prirodni fosfatidi, kao što su, na primer, lecitin, ili proizvodi kondenzacije alkilen oksida sa masnim kiselinama, na primer, polioksietilen stearat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa alifatičnim alkoholima dugog lanca, na primer, heptadekaetilenoksicetanol, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa parcijalnim estrima dobijenim od masnih kiselina i heksitola, kao što je polioksietilen, sa parcijalnim estrima dobijenim od masnih kiselina i anhidrida heksitola, na primer, polioksietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije mogu takođe sadržati jedan ili više konzervanasa, na primer, etil, ili n-propil, p-hidroksibenzoat, jednu ili više boja, jednu ili više aroma, i jedan ili više zaslađivača, kao što su saharoza ili saharin.

[0175]Uljane suspenzije mogu biti formulisane suspendovanjem aktivnog sastojka u biljnom ulju, na primer, ulju od kikirikija, maslinovom ulju, susamovom ulju ili ulju od kokosa, ili u mineralnom ulju, kao što je tečni parafin. Uljane suspenzije mogu sadržati zgušnjavač, na primer, pčelinji vosak, čvrsti parafin ili cetil alkohol. Zaslađivači su oni koji su gore navedeni, a mogu se dodati arome da bi se realizovao ukusan oralni preparat. Ove kompozicije se mogu sačuvati dodavanjem antioksidansa, kao što je askorbinska kiselina.

[0176]Disperzibilni praškovi i granule kao preparat koji je podesan za dobijanje vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju aktivni sastojak u smeši sa agensom za dispergovanje ili vlaženje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervanasa. Takođe mogu biti prisutni podesni agensi za dispergovanje ili vlaženje i agensi za suspendovanje, čiji primeri su već dati, na primer, zaslađivači, arome i boje.

[0177]Formulacija prema pronalasku može takođe biti u obliku emulzija ulje-u-vodi. Uljana faza može biti biljno ulje, na primer, maslinovo ulje ili ulje od kikirikija, ili mineralno ulje, na primer, tečni parafin ili njihove smeše. Podesni emulgatori mogu biti prirodne gume, na primer, guma akacija ili guma tragakanta, prirodni fosfatidi, na primer, soja, lecitin, i estri ili parcijalni estri dobijeni od masnih kiselina i anhidrida heksitola, na primer, sorbitan monooleat i proizvodi kondenzacije pomenutih parcijalnih estara sa etilen oksidom, na primer, polioksietilen sorbitan monooleat. Emulzije mogu takođe sadržati zaslađivače i arome.

[0178]Sirupi i eliksiri mogu biti formulisani sa zaslađivačima, na primer, glicerolom, propilen glikolom, sorbitolom ili saharozom Takve formulacije mogu takođe sadržati demulcent, konzervans i arome i boje. Farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku sterilne injektabilne vodene ili uljane suspenzije. Ova suspenzija može biti formulisana na način koji je poznat iz odgovarajuće oblasti korišćenjem podesnih agensa za dispergovanje ili vlaženje i agenasa za suspendovanje, koji su bili gore navedeni. Sterilni injektabilni preparat može takođe biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razređivaču ili rastvaraču, na primer, kao što je rastvor u 1,3-butan diolu. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračimakoji se mogu upotrebiti su voda, Rmgerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, kao rastvarač ili medijum za suspendovanje se obično koriste sterilna, fiksirana ulja. Za ove svrhe bilo koje blago fiksirano ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, u injektabilnim preparatima primenu nalaze masne kiseline, kao što je oleinska kiselina. Nivoi doza koji se nalaze od oko 0,01 mg do oko 140 mg po kilogramu telesne težine dnevno su korisni za lečenje gore navedenih stanja (oko 2,5 mg do oko 7 g po pacijentu dnevno). Na primer, Core-1 pozitivni tumor se može efektivno tretirati primenom od oko 0,01 do 50 mg jedinjenja po kilogramu telesne težine dnevno (oko 0,5 mg do oko 3,5 g po pacijentu dnevno). Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa nosećim materijalima da bi se proizveo pojedinačni dozirni oblik će varirati u zavisnosti od tretiranog domaćina i načina primene. Na primer, formulacija namenjena za oralnu primenu kod ljudi može varirati od oko 5 do oko 95% cele kompozicije. Pojedinačni dozirani oblici generalno sadrže između oko 1 mg i oko 10 g aktivnog sastojka. Podrazumeva se, međutim, da će specifični nivo doze za bilo kojeg konkretnog pacijenta zavisiti od mnoštva faktora uključujući tu aktivnost primenjenog specifičnog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, dijetu, vreme primene, način primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova i ozbiljnost konkretne bolesti koja se podvrgava terapiji. Efektivna količina doze jedinjenja prema pronalasku će varirati u zavisnosti od faktora, uključujući tu konkretna jedinjenja, toksičnost i inhibitornu aktivnost, stanje tretiranog, kao i da li se jedinjenje daje samo ili sa drugim terapijama. Obično se efektivna količina doze nalazi u opsegu od oko 0,0001 mg/kg do 1500 mg/kg, još poželjnije od 1 do 1000 mg/kg, još poželjnije od oko 1 do 150 mg/kg telesne težine, a najpoželjnije od oko 50 do 100 mg/kg telesne težine. Pronalazak se takođe odnosi i na proces ili metod lečenja gore navedenih patoloških stanja. Jedinjenja prema predmetnom pronalasku se mogu davati profilaktički ili terapeutski, a prvenstveno u količini koja je efektivna protiv navedenih poremećaja, toplokrvnoj životinji, na primer, čoveku, kome je potrebno takvo lečenje, pri čemu se ta jedinjenja prvenstveno primenjuju u obliku farmaceutskih kompozicija ili nutraceutika.

[0179]Formulacija farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa i rastvora nosača je dobro poznata stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, kao i razvoj podesnih doza i režima lečenja za primenu konkretnih ovde opisanih kompozicija u mnoštvu režima lečenja, uključujući tu npr. oralnu, parenteralnu, intravensku, intranazalnu i intramuskularnu primenu i formulaciju.

A. Oralno davanje

[0180]U izvesnim primenama, ovde opisane formulacije se mogu davati oralnim putem čoveku ili životinji. Kao takve, ove kompozicije mogu biti formulisane sa inertnim razređivačem ili sa jestivim nosačem koji se može asilimovati ili mogu biti zatvorene u želatinskim kapsulama sa tvrdim ili mekim omotačem, ili se mogu komprimovati u tablete ili mogu biti inkorporirane direktno u režim ishrane.

[0181]Aktivna jedinjenja mogu čak biti inkorporirana sa ekscipijensima i primenjena u obliku svarljivih

tableta, bukalnih tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafla, i sličnog. Tablete, pastile, pilule, kapsule i slično mogu takođe sadržati sledeće: vezivo, kao što su guma tragakanta, akacija, kukuruzni škrob, ili želatin; ekscipijense, kao što je dikalcijum fosfat; agens za raspadanje, kao što je kukuruzni škrob, krompirov škrob, alginska kiselina i slično; lubrikans, kao što je magnezijum stearat; a može biti dodat i zaslađivač, kao što je saharoza, laktoza ili saharin, ili aroma, kao što je pepermint, ulje zimzelena, ili aroma višnje. Kada dozirana jedinica ima oblik kapsule, onda ona pored materijala gore navedenog tipa može sadržati i tečni nosač. Različiti drugi materijali mogu biti prisutni kao obloge ili da bi na neki drugi način modifikovali fizički oblik dozirane jedinice. Na primer, tablete, pilule ili kapsule mogu biti obložene sa šelakom. šećerom ili sa oba. Sirup ili eliksir mogu sadržati aktivno jedinjenje, saharozu kao zaslađivač, metil i propilparabene kao konzervanse, boju i aromu, kao što je aroma višnje ili narandže. Naravno da bilo koji materijal koji se upotrebljava u pripremanju bilo koje dozirane jedinice treba da bude farmaceutski čist i u suštini netoksičan u upotrebljenim količinama. Pored toga, aktivna jedinjenja mogu biti inkorporirana u preparate i formulacije sa odloženim dejstvom.

[0182]Obično ove formulacije mogu sadržati najmanje oko 0,1 % aktivnog jedinjenja ili više, mada

procenat aktivnog sastojka, odnosno sastojaka može varirati i obično može biti između oko 1 ili 2% i oko 60% ili 70% ili više od težine ili zapremine cele formulacije. Prirodno, količina aktivnog, odnosno aktivnih jedinjenja u svakoj terapeutski primenjivoj kompoziciji može biti pripremljena tako da se ostvari podesno doziranje sa bilo kojom datom pojedinačnom dozom jedinjenja. Faktori, kao što su rastvorljivost,

bioraspoloživost, biološki polu-život, način primene, rok trajanja proizvoda, kao i druga farmakološka razmatranja će uzeti u obzir stručnjak iz odgovarajuće oblasti pri pripremanju takvih farmaceutskih formulacija, i kao takve, mogu biti poželjne različite doze i režimi lečenja.

[0183]Alternativno tome, za oralnu primenu kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu biti inkorporirane zajedno sa jednim ili više ekscipijenasa u vidu rastvora za ispiranje usta, paste za zube, bukalne tablete, oralnog spreja ili sublingvalne formulacije za oralnu primenu. Na primer, rastvor za ispiranje usta može biti pripremljen tako da sadrži aktivni sastojak u željenoj količini u odgovarajućem rastvaraču, kao što je rastvor natrijum borata (Dobelov rastvor). Alternativno tome, aktivni sastojak može biti inkorporiran u oralni rastvor, kao što je onaj koji sadrži natrijum borat, glicerin i kalijum bikarbonat, ili može biti dispergovan u pasti za zube ili dodat u terapeutski-efektivnoj količini/ efektivnoj dozi kompoziciji koja može sadržati vodu, veziva, abrazive, arome, sredstva za penjenje i sredstva za vlaženje. Alternativno tome, kompozicije mogu biti pripremljene kao tablete ili rastvori koji se mogu staviti ispod jezika ili na neki drugi način rastvoriti u ustima.

B. Injektabiino davanje

[0184]Pod izvesnim okolnostima može biti poželjno da se ovde opisane formulacije daju parenteralno, intravenski, intramuskularno ili čak intraperitonealno. Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodnih baza ili farmakološki prihvatljivih soli se mogu pripremiti u vodi, podesno pomešanoj sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans radi sprečavanja rasta mikroorganizama.

[0185]Farmaceutski oblici koji su podesni za injektabilnu primenu obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporani preparat sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do te mere da se može lako ušpricati. On mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti sačuvan od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili medijum za dispergovanje koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), njihove podesne smeše i/ili biljna ulja. Odgovarajuća tečljivost se može održati, na primer, korišćenjem obloge, kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i primenom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama se može olakšati različitim antibakterijskim i antimikotičkim agensima, kao što su, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerozal, i slično. U mnogim slučajevima, poželjno je da budu uključeni agensi za podešavanje izotoničnosti, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena absorpcija injektabilnih kompozicija se može ostvariti korišćenjem u kompozicijama agenasa za odlaganje absorpcije, kao što su, na primer, aluminijum monostearat i želatin.

[0186]Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor bi trebao da bude podesno puferovan, ako je potrebno, i tečni rastvarač prvo treba učiniti izotonićnim sa dovoljnom količinom slanog rastvora ili glukoze. Ovi posebni vodeni rastvori su naročito podesni za intravensku, intramuskularnu, subkutanu i intraperitonealnu primenu. U vezi sa time, stručnjacima iz odgovarajuće oblasti je poznat sterilni vodeni medijum koji se može upotrebiti, a u svetlu predmetnog opisa. Na primer, jedna doza može biti rastvorena u 1 ml izotoničnog NaCI rastvora i može biti dodato do 1000 ml hipodermokliznog fluida ili injektirano na mestu predviđenom za infuziju. Neke varijacije doziranja će biti neophodne u zavisnosti od stanja subjekta koji se leči. Osoba koja je odgovorna za davanje će u svakom slučaju odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog subjekta. Pored toga, za humanu primenu, preparati moraju da zadovolje standarde u pogledu sterilnosti, pirogenosti i opšte bezbednosti i čistoće, što je regulisano od strane nacionalnih ili regionalnih organa za biološke standarde.

[0187]Sterilni injektabilni rastvori se pripremaju inkorporiranjem aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa različitim sastojcima koji su gore navedeni, što po potrebi, može biti praćeno sterilizacijom filtriranjem. Generalno se disperzije pripremaju inkorporiranjem različitih sterilizovanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač, koji sadrži osnovni medijum za dispergovanje i željene druge sastojke od onih koji su gore navedeni. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, prvenstvene metode pripreme su tehnike sušenja u vakuumu i liofilizacije, kojima se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo kog dodatnog željenog sastojka od njegovog prethodno sterilno isfiltriranog rastvora.

[0188]Ovde opisane kompozicije mogu biti formulisane u neutralnom obliku ili u oblik soli. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i one su formirane sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili sa organskim kiselinama, kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama se mogu dobiti od neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum, ili feri hidroksidi, i sa organskim bazama, kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično. Posle formulisanja, rastvori se daju na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze i u takvoj količini koja je terapeutski efektivna. Formulacije se lako daju u mnoštvu doziranih oblika, kao što su injektabilni rastvori, kapsule za oslobađanje leka i slično.

[0189]Kada se ovde koristi, onda "nosač" obuhvata bilo koji i sve rastvarače, medijume za dispergovanje, nosače, obloge, razređivače, antibakterijske i antimikotičke agense, agense za

podešavanje izotoničnosti i usporavanje absorpcije, pufere, noseće rastvore, suspenzije, koloide i slično. Primena takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata iz odgovarajuće oblasti. Izuzev ako je bilo koji od uobičajenih medijuma ili agenasa inkompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova primena u terapeutskim kompozicijama je prihvatljiva U kompozicije takođe mogu biti inkorporirani i dodatni aktivni sastojci.

[0190]Fraza "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na molekulske entitete i kompozicije koje ne izazivaju alergijsku ili sličnu nepoželjnu reakciju kada se daju čoveku. Preparat u obliku vodene kompozicije koja sadrži protein kao aktivni sastojak je dobro poznat iz odgovarajuće oblasti Obično se takve kompozicije pripremaju kao injektabilne, ili kao tečni rastvori ili suspenzije; takođe se mogu pripremiti čvrsti oblici koji su podesni za rastvaranje ili suspendovanje u tečnosti pre injektiranja. Preparat takođe može biti emulgovan.

[0191]U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku nutraceutik ili njegove formulacije koje sadrže najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju se primenjuju kao prehrambeni aditivi za ljude. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku nutraceutik ili njegove formulacije koje sadrže najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju se primenjuju kod ljudi kao medicinska hrana.

[0192]Pronalazak se takođe odnosi na nutraceutik ili njegovu formulaciju koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju prema pronalasku kao prehrambeni aditiv ili kao hranu ili kao njenu komponentu. Hrana je u kontekstu pronalaska bilo koja supstanca koju konzumiraju živi organizmi, uključujući tečna pića. Hrana je osnovni izvor energije i hranljivih materija za životinje/ljude i obično je životinjskog ili biljnog porekla. Hrana je prvenstveno veganska hrana, koja predstavlja generalno sve tipove hrane koji ne sadrže proizvode životinjskog porekla, kao što su meso, mleko iii jaja. Hrana je u kontekstu pronalaska takođe prvenstveno ne-veganska hrana, koja sadrži proizvode životinjskog porekla. Hrana u kontekstu pronalaska je: (i) bilo koja supstanca ili proizvod, bilo da je prerađen, delimično prerađen ili neprerađen, a koji je namenjen ili je razumno očekivati da bude konzumiran od strane ljudi, bilo da ima nutritivnu vrednost ili ne; (ii) voda i druga pića;

(iii) žvakaća guma ili proizvodi tipa slatkiša; i/ili

(iv) proizvodi i supstance koje se upotrebljavaju kao sastojak ili komponenta prehrambenog proizvoda. Hrana u kontekstu pronalaska se tradicionalno dobija zemljoradnjom, gajenjem stoke i ribarenjem, uz lov, sakupljanje i druge metode koje su u suštini od lokalnog značaja za neke populacije, ali su od minornog za druge. U modernoj eri, kod razvijenih nacija, snabdevanje hranom je visoko zavisno od poljoprivrede, industrijske zemljoradnje, akvakulture i tehnike gajenja ribe, koja pomažu maksimiziranju proizvedene količine hrane, uz minimizaciju troškova. One obuhvataju oslanjanje na razvijenu mehanizaciju, od vršalice, sejalice, preko traktora i kombajna itd. Ovo je kombinovano sa primenom pesticida da bi se ostvarili visoki prinosi useva i da bi se kontrolisali insekti ili sisari koji smanjuju prinos. U skorije vreme pojavio se rastući trend prema održivijim poljoprivrednim praksama. Ovaj pristup - koji je delimično podstaknut zahtevima potrošača - stimuliše biodiverzitet, oslanjanje na lokalne resurse i metode organske zemljoradnje.

[0193]Tipovi proizvedene hrane (hrane koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju) u kontekstu pronalaska su: ■ pića: pivo, sok, bezalkoholna pića, squash (piće od limunovog soka), vino, pića koja sadrže mleko, mlečne proizvode ili druga alkoholna ili bezalkoholna pića; npr. voda, uključujući gaziranu vodu, voćni sokovi i sokovi od povrća, bezalkoholna pića, aguas frescas, limunada, kola, đumbirovo pivo, im bru, root beer, sarsaparilja, cream soda, dandelion and burdock (medovina), squash, sirup sa aromom voća koji se razređuje vodom, sportska pića, infuzije, kafa, čaj, pića na bazi mleka, na primer, mleko, tečni jogurt, čokoladno mleko, milkšejk, egg nog, bademovo mleko, horchata, alkoholna pića, kokteli - mešana pića, topla pića. na primer, topla čokolada, topla jabukovača, kapućino ili penušavi čaj,

• hleb je osnovna hrana za mnoge nacije, koja se pravi od dizanog testa od pšenice ili drugih žitarica; npr. raženo-pšenični, tost-hleb (beli hleb), hleb od celog zrna, pšenično-raženi, beli hleb, hleb od više vrsta zrnevlja, raženi, sa semenom suncokreta, sa semenom bundeve, pica, chapatis, tortilje, bageti, pite, lavaš, biskviti, perece, naan, đevreci, puris, kolač, crni raženi hleb, hleb od prekrupe, hleb sa

prirodnim kvasnim testom, od celog zrna, granarv bread (hleb sa zrnevljem) i mnoge druge varijacije,

• torte i kolači; npr. angelfood cake, kolač sa jabukama, babka, buccellato, bundt cake, butter cake, butterflv cake, kolač sa šargarepom, čizkejk, čokoladni kolač, božični kolač, chiffon cake, croquembouche (krokembuš), kapkejk, devil's food cake, ekleri, fairy cake, voćni kolač, nemački čokoladni kolač, genoise cake, gingerbread, gob, gooey butter cake. hot milk cake, ice cream cake, jaffa cake, leavened cake, mooncake, panettone, kolač sa ananasom, pound cake, kolač kraljice Elizabete, red bean cake, red velvet cake, saher torta, simnel cake, špice cake, sponge cake, suncake, čajni kolač, tarte tatin, vanilla sliče ili svadbeni kolač, • sir je proizvod od usirenog mleka, pri čemu postoje mnoge vrste; npr. sardo sir, testouri sir, bokmakiri sir, kvvaito sir, vvookie sir, ackavvi sir. basket sir, labneh, jibneh arabieh sir, kenafa sir, naboulsi sir, paneer, affineur, bergkase, brimsen, dachsteiner, tirolski sivi sir, luneberg, beauvoorde sir, briselski sir, herve sir, limburger sir, maredsous sir, passendale sir, plateau de herve sir, postel sir, remedou sir, danski plavi sir, danski tilsit ili tilsit havarti, allgau emmental sir, cambozola sir, harzer sir. limburger sir, spundekSs sir, feta sir, halumi sir ili mocarela sir, • dezert je jelo, obično slatko, a generalno se služi posle glavnog jela, npr. sladoled; npr. biskviti ili kolačići, kolači, prhki deserti, deserti sa kremom od vanile, voćni, sa želatinom, sladoledi, kolači od belanaca, kolači, pite ili tartovi, pudinzi, sorbei, suflei ili trifle,

• pomfrit, čips; npr. krompirov čips ili "krisps", tortilja čips ili kukuruzni čips

• funkcionalna hrana (funkcionalna hrana se naziva nutraceutskom, ,,a portmanteau of nutrition" i farmaceutskom i može obuhvatati hranu koja je genetski modifikovana; generalno ova kategorija obuhvata prerađenu hranu napravljenu od sastojaka funkcionalne hrane ili pojačanu sa aditivima koji stimulišu zdravlje, kao što su "vitaminimski obogaćeni" proizvodi, a takođe i sveža hrana (npr. povrće) kojoj se pripisuju specifična svojstva), • džem i žele; npr. džem ili žele od ogrozda, crvenih ribizli, crnih ribizli, citrusnog voća, jabuka, malina, jagoda i kupina, pasta (testenina), npr. oblikovana pasta, campanelle, casarecci, cavatelli, conchiglie, conchiglioni, farfalle, fiori, fusilli, fusilli bucati, gemelli, gigli, gramigna, lumache, lumaconi, maltagliati, orecchiette, pipe, quadrefiore, radiatori, ricciolini, rotelle, rotini, spiralini, strozzapreti, torchio ili trofie

■ pite; npr. pita sa slaninom i jajima, pita sa piletinom i pečurkama, pita sa govedinom, komvolsko testo, pita sa ribom, kalakukko, kulebjaka, pica pita, pita sa svinjetinom, pita iz lonca, škotska pita, pastirska pita, pita sa haringom, pita od odreska, pita od odreska i bubrega, pita sa jabukama, pita sa kremom od banana, pita od kupina, pita od borovnica, bostonska krem pita, pita od šumskog voća, pita sa višnjama, pita sa kremom od čokolade, pita sa kremom od kokosa, pita sa kremom od vanile, holandska pita sa jabukama, pita od grožđa, pita sa limetom, meringue pita od limuna, pita od limuna, pita od mešanog bobičastog voća, pita od narandže, pita od breskve, pita od rabarbare, pita od jagoda-rabarbare, pita od jagoda ili pita sa sirćetom,

pizza; npr. svi klasični tipovi i njihovi odgovarajući gornji slojevi uključujući sledeće: marinara ili napolitana: paradajz, maslinovo ulje, origano, i beli luk; margarita: paradajz, maslinovo ulje, sveži listovi bosiljka, i fior-di-latte (mocarela napravljena od kravljeg mleka) ili mozzarella di bufala; formaggio e pomodoro: paradajz, maslinovo ulje i rendani sir parmezan, listovi bosiljka su opcioni; ripieno ili calzone: fior-di-latte ili mozzarella di bufala, ponekad takođe rikota sir, maslinovo ulje i kobasica, druge vrste mesa, povrća itd. ili stromboli: mocarela, meso, povrće itd.

■ prerađeno meso; npr. meso od vodozemaca, žablje, veštačko meso, imitacija mesa, in vitro meso, goveđe (govedina), bivolje, od stoke, odresci, teleće (teletina), od jaka, živinsko (ptičje), pileće, pačije, od pernate divljači, ćureće, pseće, morski plodovi, riblje, od ajkula, Ijuskara, kraba, zečije, ovčije (ovčetina), jagnjeće, svinjsko (svinjetina), šunka (od buta), slanina (dimljeni kaiševi mesa) ili od insekata, ■ sendviči; npr. aram sendvič, filled baguette, bacon butty. bun, burger, burnto, chip butty, klub sendvič, pohovani kačkavalj, dOner kebab, georgia hots, topli sendviči: tuna melt, itd., panini, sendvič sa odreskom, takos, čajni sendvič, grilovani sendvič, slagani ili zavijeni, • salate; npr. cezar salata, chef salata, salata sa kukuruzom, grčka salata, italijanska salata, mesclun salata, nicoise salata, salate sa leguminozama, kao što je salata za boranijom, salata od sedan vrsta zrna, pileća salata, salata sa jajima, voćna salata (isečeno, oljušteno voće servirano u sopstvenom soku ili sa prelivom), larb, salata sa testeninom. salata od paradajza, somen salata, som tam, tabouli, vvaldorf salata ili vvatergate salata, ■ sosevi; npr. beli sos, sos od pečuraka, sauce allemande, sauce americaine, sauce supreme, eloute brown sauces, bordelaise sauce, bourguignonne sauce, chateaubnand sauce, sauce africaine, sauce robert, bešamel sos, mornay sauce, emulgovani sosevi, bearnaise sauce, hollandaise sauce, majonez, tartar sos, salad cream, butter sauces, beurre blanc, cafe de pariš, salatni sosevi, riblji sos, sambal, barbekju sos, mole, sos od paradajza ili caciki. • kobasice; npr. andouille, black pudding, krvavica, boerewors, bratwurst, breakfast sausage, butifarra, chorizo, cumberland sausage, falukorv, fuet,haggis, kieska, kielbasa, kishka, kishke, knackwurst, kovbasa, landjager, linguica, džigernjača,lukanka, mettvvurst, mincemeat, mortadela, kobasica za picu (salami), sudžuk, thuringer, weifiwurst ili white pudding, ■ brza hrana: poslastice, krompirov čips, čokolada, dvopek, slatke štanglice, džank fud, npr. marinirani kikiriki, slatke štanglice, cheetos, chex mix, kolačići, krekeri, combos, fudge rounds, hula hoops, sladoled, moon pies, pirate's booty, kokice, pork rinds, krompirov čips, perece, smart puffs, bezalkoholna pića, snow balls, studentska hrana, svvisscake rolls, tings, tvvinkies, veggie booty ili zebra cakes, • supe, npr. desertne supe (ginataan, filipino supa napravljena od kokosovog mleka, mleka, voća i usitnjene tapioke); oshiruko, japanska supa od azuki pasulja ili voćne supe, supa od lubenice, miso supa, pho, ramen, saimin, rumunska supa od krompira, avgolemono, boršč, bujabes, callaloo, cock-a-leekie, fanesca, gaspaćo, lentil soup, minestrone, mulligatawny soup, scotch broth, snert, solyanka, tarator ili vvaterzooi.

■ šećeri ili šećerni proizvodi; npr. zlatni sirup, slatkiši ili čokolade.

jogurt, gruševina, pavlaka, šlag; npr. lassi, kefir, ajran, doogh ili tarator

• praškovi ili tablete za pripremanje pića; npr. vitaminska pića ili mineralna pića

■ kapsule ili tablete

• terapeutska hrana (terapeutska hrana je hrana namenjena za specifične, a obično nutritivne, terapeutske svrhe), funkcionalna hrana, medicinska hrana, enteralna hrana, parenteralna hrana, hrana za specifikovanu zdravstvenu primenu

[0194]Primeri su Ensure, obogaćeno piće tipa milkšejka, namenjeno prvenstveno za starije osobe i Plumpy'nut, hrana na bazi kikirikija namenjena za urgentno hranjenje ozbiljno pothranjene dece.

[0195]U sledećem poželjnom primeru izvođenja formulacija prema pronalasku se proizvodi kao lek koji se izdaje bez recepta.

[0196]Prema metodu za indukovanje ili pojačanje Core-1 specifične imune reakcije i/ili za sprečavanje ili lečenje Core-1 pozitivne bolesti; pomenuti nutraceutik, pomenuta farmaceutska kompozicija, pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova pomenuta frakcija ili pomenute formulacije koje ih sadrže se daju zdravom pojedincu. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, prema metodu za indukovanje ili pojačanje Core-1 specifične imune reakcije i/ili za sprečavanje ili lečenje Core-1 pozitivne bolesti; pomenuti nutraceutik, pomenuta farmaceutska kompozicija, pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova pomenuta frakcija ili pomenute formulacije koje ih sadrže se daju pojedincu sa kancerom, tumorom, najmanje jednom tumorskom ili kancerskom ćelijom ili najmanje jednom metastazom.

[0197] Nutraceutik. farmaceutska kompozicija, Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova frakcija ili formulacije koje ih sadrže se mogu primeniti za indukovanje imune reakcije protiv kancera, tumora, kancerske ćelije ili kancerskih ćelija ili metastaza koje potiču od njih, za indukovanje imune reakcije koja funkcioniše kao imuna barijera protiv tumorskih ćelija, kancera, tumora, kancerske ćelije ili kancerskih ćelija ili metastaza koje potiču od njih, za lečenje tumora ili kancera, metastaze i/ili metastaza i/ili za smanjenje ili sprečavanje pojave, širenja ili metastaziranja kancera, tumora, kancerske ćelije ili kancerskih ćelija ili metastaza koje potiču od njih kod zdravih pojedinaca ili pacijenata, respektivno, pri čemu svaki prvenstveno sadrži najmanje jednu Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju, izabranu između kancera, tumora ili kanceroznih ili tumorskih bolesti koje su opisane dole ili ovde na drugim mestima. Na primer, lečenje je usmereno protiv primarnih tumora ili kancera, minimalnih rezidualnih tumorskih ili kancerskih bolesti, pojave recidiva i/ili metastaza ili njihovih delova Lečenje tumora ili kancera takođe se može ostvariti kao adjuvantno lečenje. Nutraceutik, farmaceutska kompozicija, Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova frakcija ili formulacije koje ih sadrže mogu se takođe primeniti u profilaksi Ćore 1-pozitivnih tumorskih bolesti, tumora ili tumorskih ćelija. Na primer, profilaktička primena je usmerena na profilaksu tumora i metastaza. Ovi anti-tumorski agensi se daju u podesnom obliku prema dobro poznatim metodama ili onima koje su ovde opisane na drugim mestima. Poželjna varijanta je injekcija ili davanje ovih anti-tumorskih agenasa ili lekova oralno, intravenski, lokalno u telesne šupljine, npr. intraperitonealno, intrarektalno, intragastrointestinalno, lokalno, npr. direktno u tumor, u organe ili limfne sudove (intranodalno), a takođe i subkutano, intradermalno ili na kožu, i intramuskularno. Poželjno je da se razne vrste primene takođe mogu kombinovati, u kom slučaju se primena može ostvariti tokom različitih dana lečenja ili tokom jednog dana lečenja, kao što je opisano detaljno ovde na drugim mestima. Prema pronalasku, takođe je moguće da se kombinuju dva ili više nutraceutika, farmaceutske kompozicije, Core-1 pozitivna mikroorganizma ili njihove frakcije ili formulacije koje ih sadrže, kao i da se kombinuje jedan od njih ili njihova kombinacija sa jednim ili više tumorskih lekova ili terapija, kao što su terapije antitelima, hemoterapije ili radioterapije, za koje je podesno da se primenjuju ili daju istovremeno ili vremenski odvojeno.

[0198]Kancer, tumor, tumorske ćelije, kancerske ćelije ili metastaze koje potiču od njih su izabrani iz grupe kanceroznih bolesti ili tumorskih bolesti regiona uho-grlo-nos, pluća, medijastinuma, gastrointestinalnog trakta, urogenitalnog sistema, ginekološkog sistema, dojke, endokrinog sistema, sarkoma kože, kostiju i mekih tkiva, mezotelioma, melanoma, neoplazmi centralnog nervnog sistema, kanceroznih bolesti ili tumorskih bolesti tokom detinjstva, limfoma, leukemija, paraneoplastičnih sindroma, metastaza sa nepoznatog primarnog tumora (CUP sindroma), peritonealnih karcinomatoza, maligniteta povezanih sa imunosupresijom i/ili tumorskih metastaza

[0199]Preciznije, kancer, tumor, tumorske ćelije, kancerske ćelije ili metastaze koje potiču od njih mogu obuhvatati sledeće tipove kancera: adenokarcinom dojke, prostate i debelog creva; sve oblike kancera pluća polazeći od bronhijalne cevi; kancer koštane srži, melanom, hepatom, neuroblastom; papilom; apudom, horistom, branhiom; maligni karcinoidni sindrom; karcinoidna srčana bolest, karcinom (na primer, Vokerov karcinom, karcinom bazalnih ćelija, skvamobazalni karcinom, Braun-Pirsov karcinom, duktalni karcinom, Erlihov tumor,in situkarcinom, kancer-2 karcinom, karcinom Merkelovih ćelija, mukozni kancer, ne-parvićelijski bronhijalni karcinom, karcinom malih ćelija pluća, papilarni karcinom, karcinom vezivnog tkiva, bronhio-alveolarni karcinom, bronhijalni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija i karcinom prelaznih ćelija); histiocitni funkcionalni poremećaj, leukemija (npr. kao što su leukemija B ćelija, leukemija mešovitih ćelija, leukemija nultih ćelija, leukemija T ćelija, hronična leukemija T ćelija, sa HTLV-ll-povezana leukemija, akutna limfocitna leukemija, hronična limfocitna leukemija, mastocitna leukemija, i mijeloidna leukemija); maligna histiocitoza, Hodžkinova bolest, ne-Hodžkinom limfom, solitarni tumor plazma ćelija, retikuloendotelioza, hondroblastom; hondrom, honđrosarkom; fibrom; fibrosarkom; tumori džinovskih ćelija; histiocitom; lipom; liposarkom; leukosarkom; mezoteliom; miksom; miksosarkom; osteom; osteosarkom; Juingov sarkom; sinoviom, adenofibrom; adenolimfom; karcinosarkom, hordom, kraniofaringiom, disgerminom, hamartom, mezenhimom; mezonefrom, miosarkom, ameloblastom, cementom; odontom; teratom; timom, horioblastom, adenokarcinom, adenom; holangiom; holesteatom; cilindrom; cistadenokarcinom, cistadenom; tumor granuloznih ćelija; ginadroblastom; hidradenom; tumor ćelija ostrvaca; tumor Lejdigovih ćelija; papilom, tumor Sertolijevih ćelija, tumor teka ćelija, lejomiom; lejomiosarkom, mioblastom, miom, miosarkom; rabdomiom; rabdomiosarkom; ependimom, ganglioneurom, gliom; meduloblastom, meningiom; neurilemom; neuroblastom, neuroepiteliom, neurofibrom, neurom, paragangliom, ne-hromafinski paragangliom, angiokeratom, angiolimfoidna hiperplazija sa eozinofilijom; sklerotizirajući angiom; angiomatoza; glomangiom; hemangioendoteliom; hemangiom; hemangiopericitom, hemangiosarkom; limfangiom, limfangiomiom, limfangiosarkom; pinealom; cistosarkom filoides; hemangiosarkom; limfangiosarkom; miksosarkom. ovarijalni karcinom; sarkom (na primer, Juingov sarkom, eksperimentalni, Kapošijev sarkom i sarkom mastocitnih ćelija); neoplazme (na primer, neoplazme kostiju, neoplazme dojke, neoplazme digestivnog sistema, kolorektalne neoplazme, neoplazme jetre, neoplazme pankreasa, neoplazme hipofize, neoplazme testisa, orbitalne neoplazme, neoplazme glave i vrata, centralnog nervnog sistema, neoplazme slušnih organa, karlice, respiratornog trakta i urogenitalnog trakta); neurofibromatoza i displazija cervikalnih skvamoznih ćelija, i/ili metastaze koje potiču od bilo kog od ovih.

[0200]U poželjnom primeru izvođenja kancer, tumor, tumorske ćelije, kancerske ćelije ili metastaze koje potiču od njih su izabrane iz grupe kanceroznih bolesti ili tumorskih bolesti koja sadrži najmanje jednu ćeliju ili prvenstveno značajan broj ćelija ili još poželjnije većinu tumorskih ćelija koje su pozitivne za Core-1 u definiciji prema pronalasku, koje su izabrane iz grupe sledećih: tumori regiona uho-grlo-nos, koji obuhvataju tumore unutrašnjosti nosa, nosnog sinusa, nazofarinksa, usana, usne duplje, orofarinksa, larinksa, hipofarinksa, uha, pljuvačnih žlezda i paragangliome, tumori pluća, koji obuhvataju ne-parvićelijski bronhijalni karcinom, parvićelijski bronhijalni karcinom, tumori mediastinuma, tumori gastrointestinalnog trakta, koji obuhvataju tumore ezofagusa, želuca, pankreasa, jetre, žučne kese i bilijarnog trakta, karcinome tankog creva, debelog creva i rektuma i analni karcinom, urogenitalni tumori koji obuhvataju tumore bubrega, uretre, mokraćne bešike, prostate, uretre, penisa i testisa, ginekološki tumori koji obuhvataju tumore grlića materice, vagine, vulve, kancer materice, malignu trofoblastnu bolest, ovarijalni karcinom, tumore jajovoda (Tuba Faloppii), tumore trbušne duplje, karcinom mlečnih žlezda, tumori endokrinih organa, koji obuhvataju tumore štitne žlezde, paraštitne žlezde, adrenalnog korteksa. tumore endokrinog pankreasa, karcinoidne tumore i karcinoidni sindrom, multiple endokrine neoplazije, sarkome kostiju i mekih tkiva, mezoteliome, tumori kože, melanomi koji obuhvataju kutane i intraokularne melanome, tumori centralnog nervnog sistema, tumori tokom detinjstva, koji obuhvataju retinoblastom, Vilmsov tumor, neurofibromatozu, neuroblastom, tumorsku familiju Juingovog sarkoma, rabdomiosarkom, limfome koji obuhvataju ne-Hodžkinove limfome.kutane limfome T ćelija, primarni limfomi centralnog nervnog sistema, Hodžkinova bolest, leukemije koje obuhvataju akutne leukemije, hronične mijeloidne i limfatične leukemije, neoplazme plazma ćelija, sindrome mijelodisplazije, paraneoplastične sindrome, metastaze sa nepoznatim primarnim tumorom (CUP sindrom), peritonealnu karcinomatozu, malignitete koji su u vezi sa imunosupresijom koji obuhvataju malignitete povezane sa AIDS-om, kao što je Kapošijev sarkom, limfome povezane sa AIDS-om, limfome centralnog nervnog sistema povezane sa AIDS-om, Hodžkinovu bolest povezanu sa AIDS-om, i anogenitalne tumore povezane sa AIDS-om, malignitete povezane sa transplantacijom, metastazirale tumore koji obuhvataju metastaze na mozgu, metastaze na plućima, kancer jetre, metastaze na jetri, metastaze na kostima, pleuralne i perikardijalne metastaze, i maligne ascite i/ili metastaze koje potiču od bilo kog od ovih.

[0201]U sledećem poželjnom primeru izvođenja kancer, tumor, tumorske ćelije, kancerske ćelije ili metastaze koje potiču od njih su izabrani iz grupe koja sadrži kancerozne bolesti ili tumorske bolesti, kao što su karcinom mlečnih žlezda, gastrointestinalni tumori, uključujući karcinom debelog creva, karcinom želuca, karcinom pankreasa, kancer debelog creva, rani kancer želuca, kancer tankog creva, ovarijalni karcinom, karcinom grlića materice, kancer pluća, kancer prostate, karcinom bubrežnih ćelija, maligni melanom i/ili kancer jetre i/ili metastaze koje potiču od bilo kog od njih

[0202]U sledećem poželjnom primeru izvođenja kancer, tumor, tumorske ćelije, kancerske ćelije ili metastaze koje potiču od njih su izabrane iz grupe kanceroznih bolesti ili tumorskih bolesti koja obuhvata najmanje jednu ćeliju, a prvenstveno značajan broj ćelija, ili još poželjnije većinu tumorskih ćelija, koje su pozitivne za Core-1 u definiciji prema pronalasku, izabranih iz grupe karcinoma mlečnih žlezda, gastrointestinalnih tumora, uključujući karcinom debelog creva, karcinom želuca, karcinom pankreasa, kancer debelog creva, rani kancer želuca, kancer tankog creva, ovarijalni karcinom, karcinom grlića materice, kancer pluća, kancer prostate, karcinom bubrežnih ćelija, maligni melanom i/ili kancer jetre i/ili metastaze koje potiču od bilo kog od ovih.

[0203]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za indukovanje ili pojačanje Core-1 specifične imune reakcije i/ili za sprečavanje ili lečenje Core-1 pozitivne bolesti, kancer, tumor, najmanje jedna tumorska ili kancerska ćelija, ili najmanje jedna metastaza sadrže najmanje jednu ćeliju koja je Core-1 pozitivna. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za indukovanje ili pojačanje Core-1 specifične imune reakcije i/ili za sprečavanje ili lečenje Core-1 pozitivne bolesti, pojedinac ima kancer, tumor, najmanje jednu tumorsku ili kancersku ćeliju, ili najmanje jednu metastazu koja je izabrana iz grupe kanceroznih bolesti ili tumorskih bolesti koja obuhvata karcinom mlečnih žlezda, gastrointestinalne tumore, uključujući karcinom debelog creva, karcinom želuca, karcinom pankreasa, kancer debelog creva, rani kancer želuca, kancer tankog creva, ovarijalni karcinom, karcinom grlića materice, kancer pluća, kancer prostate, karcinom bubrežnih ćelija, maligni melanom, i/ili kancer jetre i/ili metastaze koje potiču od bilo kog od ovih.

[0204]U studiji sa zdravim ljudskim dobrovoljcima su bili praćeni serumski titri antitela protiv Core-1 određivanjem postojeće reakcije antitela protiv Core-1 pre prve primene nutraceutika, a prvenstveno za ispitivanja na ljudima su izabrani dobrovoljci bez ili sa nižim nivoima anti-Core-1 antitela. Tim dobrovoljacima je nutraceutik koji sadrži AG6 ili MU1 ili placebo davan oralno tokom perioda od 3 do 30 nedelja. Vršeno je oralno davanje najmanje dve različite doze. Imune reakcije su bile praćene određivanjem reakcije antitela i/ili T ćelija protiv Core-1 pre i u podesnim intervalima posle početka oralnog davanja nutraceutika. Postoji značajan porast reakcije antitela protiv Core-1 i/ili T ćelija protiv Core-1 koji je uočen kod značajnog broja dobrovoljaca u grupi dobrovoljaca koja je primala nutraceutik u poređenju sa titrom pre studije, što je testiranjem potvrđeno kao pozitivno. U placebo grupi je porast reakcije antitela ili T-ćelija protiv Core-1 bio rede uočavan ili u manjoj meri. Ovo pokazuje efektivnost nutraceutika kod ljudi za stvaranje imune reakcije protiv Core-1 koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija za prevenciju, redukciju ili širenje Core-1 pozitivnih tumora ili metastaza ili ' njegovo lečenje.

[0205]U studiji sa humanim imunokompetentnim pacijentima sa kancerom sa Core-1 pozitivnim tumorima serumski titri antitela protiv Core-1 su bili praćeni određivanjem postojeće reakcije antitela protiv Core-1 pre prvog davanja farmaceutske kompozicije. Farmaceutska kompozicija koja sadrži AG6 ili MU1 ili placebo je davana nekoliko puta oralno, intraperitonealno ili intravenski tokom perioda od 3 do 70 nedelja Izvršeno je davanje najmanje dve različite podesne doze. Imune reakcije su praćene određivanjem reakcije antitela i/ili T ćelija protiv Core-1 i /ili su bile praćene kliničke reakcije određivanjem vremena do progresije, preživljavanja bez tumora i/ili zapremina i/ili mesta tumora, i to svakog od njih pre i u podesnim intervalima posle početka davanja farmaceutske kompozicije. Postojao je značajan porast reakcije antitela protiv Core-1 ili reakcije T ćelija protiv Core-1 koji je bio uočen kod značajnog broja dobrovoljaca u grupi koja je primila formulaciju prema pronalasku u poređenju sa titrom pre studije i/ili parcijalne ili kompletne kliničke reakcije ili produženog vremena do progresije ili vremena preživljavanja kod značajnog broja pacijenata koji su primili formulaciju. U placebo grupi porast reakcije antitela ili reakcije T-ćelija protiv Core-1 je bio manje često uočen ili je bio manjeg obima i/ili nije uočen ili je uočena znatno manja klinička reakcija.

[0206]Ovo pokazuje efektivnost farmaceutske kompozicije kod ljudi za stvaranje imune reakcije protiv Core-1 koja funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija za prevenciju, redukciju ili pojavu širenja Core-1 pozitivnih tumora ili metastaza ili njihovo lečenje.

[0207]Dovođenje u kontakt Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije unutar tela živog organizma (čoveka/životinje) inicira stvaranje antitela koja se vezuju za Core-1, Core-1 antigen, ili Core-1 pozitivne tumorske ćelije. Kao iznenađujuće, antitela protiv Core-1 funkcionišu kao imunonadzorni mehanizam protiv novonastalih kancerskih ćelija.

E) Metode za lečenje ili sprečavanje gastrointestinalnog poremećaja

[0208]Metod za smanjenje ili sprečavanje pojave ili širenja gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije, ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže.

[0209]Efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže su opisane ovde na drugim mestima.

[0210]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za smanjenje ili sprečavanje pojave ili širenja gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti, pomenuti nutraceutik ili pomenuta farmaceutska formulacija ili pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegova pomenuta frakcija koji su opisani ovde na drugim mestima, ili pomenute formulacije su ili sadrže najmanje jedan mikroorganizam, lizat ili frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma koji se vezuju za Nemod-TF1 ili A78-G/A7 i Nemod-TF2.

[0211]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za smanjenje ili sprečavanje pojave ili širenja gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti, pomenuti nutraceutik ili pomenuta farmaceutska formulacija, ili pomenuti Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegova pomenuta frakcija koji su opisani ovde na drugim mestima ili pomenute formulacije sadrže najmanje jedan mikrorganizam, lizat ili frakciju od soja AG6

(DSM 18726), MU1 (DSM 18728) i LH2 (DSM 18727), još poželjnije od sojeva AG6 ili MU1. a najpoželjnije od soja AG6.

[0212]U sledećem poželjnom primeru izvođenja metod za lečenje gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma, ili njegove frakcije ili formulacija koje ih sadrže. U sledećem poželjnom primeru izvođenja metoda za lečenje gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti, gastrointestinalna bolest je zapaljenska crevna bolest ili funkcionalni crevni poremećaj.

[0213]Metod za smanjenje ili prvenstveno za sprečavanje pojave gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti, a prvenstveno zapaljenska crevna bolest iii funkcionalni crevni poremećaji, sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže, a prvenstveno zdravom pojedincu.

[0214]Metod za smanjenje ili još poželjnije za sprečavanje širenja gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti, a prvenstveno zapaljenske crevne bolesti ili funkcionalnih crevnih poremećaja, sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije koji su opisani ovde na drugim mestima ili formulacija koje ih sadrže.

[0215]Metod za lečenje gastrointestinalnog poremećaja ili bolesti, a prvenstveno zapaljene stomačne bolesti ili funkcionalnih stomačnih poremećaja, sadrži davanje čoveku ili životinji efektivne količine nutraceutika ili farmaceutske formulacije ili Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili njegove frakcije koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacija koje ih sadrže.

[0216]U poželjnom primeru izvođenja, nutraceutik ili farmaceutska formulacija ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegova frakcija koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže u gore opisanim metodama sadrže najmanje jedan mikrorganizam, lizat ili frakciju Core-1 pozitivnog mikroorganizma vezan za Nemod-TF1 ili A78-G/A7 i Nemod-TF2

[0217]U poželjnom primeru izvođenja, nutraceutik ili farmaceutska formulacija ili Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegova frakcija koji su opisani ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže u gore opisanim metodama sadrže najmanje jedan mikroorganizam, lizat ili frakciju od soja AG6 (DSM 18726), soja MU 1 (DSM 18728), i/ili soja LH2 (DSM 18727), još poželjnije od soja AG6 i/ili MU1, najpoželjnije od soja AG6.

[0218]Načini primene, efektivne doze, formulacije su onakve kao što je ovde opisano na drugim mestima, a prvenstveno one koje su opisane u okviru metoda za lečenje ili sprečavanje Core-1 pozitivnih bolesti ili tumora. U poželjnom primeru izvođenja dve doze dnevno koje sadrže od 10<9>do 1012 Core-1 pozitivnih mikroorganizama se daju tokom najmanje dve nedelje.

[0219]Gastrointestinalni poremećaji su prvenstveno izabrani iz grupe koja sadrži funkcionalne crevne poremećaje i zapaljenske crevne bolesti; pri čemu su zapaljenske crevne bolesti izabrane iz grupe koja sadrži Kronovu bolest, ileitis, i/ili ulcerativni kolitis i funkcionalnih crevnih poremećaja koji su izabrani iz grupe koja sadrži gastro-ezofagealni refluks, dispepsiju, sindrom iritabilnih creva i/ili funkcionalni stomačni bol. Gastrointestinalni trakt u kontekstu pronalaska se sastoji od sledećih komponenti; usta (usna duplja; obuhvata pljuvačne žlezde, mukozu, zube i jezik), farinks, ezofagus i kardiju, želudac, koji obuhvata antrum i pilorus, creva ili utrobu: tanko crevo, koje ima tri dela: duodenum, jejunum, ileum; debelo crevo, koje ima tri dela. slepo crevo, odnosno cecum (vermiformni apendiks je vezan za cecum); kolon (uzlazni kolon, poprečni kolon, silazni kolon i sigmoidna fleksura); rektum i/ili anus.

[0220]U studiji sa humanim pacijentima sa sindromom intabilnih creva, Kronovom bolesti (CD), ileitisom ili ulcerativnim kolitisom oralno se daju nutraceutik ili farmaceutska kompozicija koja sadrži AG6 ili MU1 ili placebo tokom perioda od 3 do 30 nedelja. Davanje najmanje dve različite podesne doze je izvršeno. Kliničke reakcije, kao što je smanjenje nadutosti ili nadimanja, zadržavanje remisije kod CD, poboljšanje kvaliteta života, redukcija trajanja ili ozbiljnosti nastupa, smanjenje dijareje, zadržavanje remisije kod paučitisa, indukovanje ili zadržavanje remisije kod aktivnog ulcerativnog kolitisa, su praćeni, respektivno pre i u podesnim intervalima posle početka davanja nutraceutika ili farmaceutske kompozicije. Postoji značajno poboljšanje najmanje jednog od gore navedenih simptoma ili kliničkih reakcija uočenih kod značajnog broja pacijenata koji primaju nutraceutik ili farmaceutsku kompoziciju u odnosu na one u placebo grupi. Ovo pokazuje efektivnost nutraceutika ili farmaceutske kompozicije kod ljudi za prevenciju, smanjenje širenja ili lečenje gastrointestinalnih poremećaja.

F) Generisanje Core- 1 specifičnih dendritskih ćeiija, T ćelija, T ćelijskih klonova i T ćelijskih linija

[0221]Metod za generisanje funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 može sadržati dovođenje u kontakt podesne količine dendritske ćelije ili smeše dendritskih ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu dendritsku ćeliju sa podesnom količinom najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije, kao što je opisano ovde na drugim mestima ili molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija, njihovog lizata ili frakcije, tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi generisanja najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1.

[0222]Metod za generisanje funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 može sadržati dovođenje u kontakt podesne količine dendritskih ćelija ili smeše dendritskih ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu dendritsku ćeliju sa podesnom količinom najmanje jednog Core-1 I pozitivnog mikroorganizma, njegovim lizatom ili frakcijom, kao što je opisano ovde na drugim mestima, tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi generisanja najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1.

[0223]Metod za generisanje funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 može sadržati dovođenje u kontakt podesne količine dendritskih ćelija ili smeše dendritskih ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu dendritsku ćeliju sa podesnom količinom najmanje jednog molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njegovim lizatom ili frakcijom, kao što je opisano ovde na drugim mestima, tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi generisanja najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1

[0224]U poželjnom primeru izvođenja pronalaska funkcionalna dendritska ćelija protiv Core-1 je dobijena dovođenjem u kontakt nezrele dendritske ćelije ili smeše nezrelih dendritskih ćelija ili smeše dendritskih ćelija koja sadrži najmanje jednu nezrelu dendritsku ćeliju sa podesnom količinom najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovim lizatom ili frakcijom, kao što je ovde opisano na drugim mestima, tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima da bi pomenuta dendritska ćelija sazrela korišćenjem podesnih uslova, kao što su oni koji su opisani ovde na drugim mestima i poznati su stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, koji sadrže na primer, molekule TNFalpha (faktor nekroze tumora alfa), LPS (lipopolisaharid) ili BCG (Bacille Calmette Guerin), INFgamma (interferon gama), deksametazon i/ili TGFbeta (transformišući faktor rasta beta), funkcionalnoj dendritskoj ćeliji snabdevenoj sa Core-1. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku dendritska ćelija potiče od MUTZ-3 ili NemodDC (mogu se nabaviti od firme Glvcotope GmbH Berlin, Nemačka; www.glycotope. com), i onda su dalje poželjne nezrele dendritske ćelije bile generisane od MUTZ-3 ćelije ili NemodDC pod podesnim uslovima koji sadrže korišćenje IL-4 i GM-CSF, obično tokom oko jedne nedelje, a rezultujuće nezrele dendritske ćelije ili iNMDC se dovode u kontakt sa pomenutom podesnom količinom najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma njegovim lizatom ili frakcijom, pa te ćelije sazrevaju korišćenjem podesnih uslova koji sadrže na primer, TNFalpha, LPS, BCG, INFgamma, deksametazon ili TGFbeta, a prvenstveno TNFalpha, obično tokom oko jednog do dva dana, što rezultuje zrelim dendritskim ćelijama snabdevenim sa Core-1 koje odgovaraju pomenutoj funkcionalnoj dendritskoj ćeliji protiv Core-1.

[0225]Poželjni primeri izvođenja pronalaska su opisani u primerima.

[0226]Metod za generisanje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 može sadržati

(a) dovođenje u kontakt podesne količine funkcionalnih dendritskih ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu funkcionalnu dendritsku ćeliju, snabdevenih sa podesnim količinama Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije sa najmanje jednom T ćelijom ili T ćelijama (b) kultivaciju pomenute T ćelije ili T ćelija zajedno sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi aktiviranja ili prajmiranja T ćelije ili T ćelija protiv Core-1.[0227]Metod za generisanje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 može sadržati (a) dovođenje u kontakt podesne količine funkcionalnih dendritskih ćelija ili smeše ćelija koje sadrže najmanje jednu funkcionalnu dendritsku ćeliju, snabdevenih sa podesnim količinama molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom sa T ćelijom ili T ćelijama ili smešom ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju (b) kultivaciju pomenutih T ćelije iii T ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju zajedno sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi aktiviranja ili prajmiranja T ćelije ili T ćelija protiv Core-1.[0228]U poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 sadrži (a) dovođenje u kontakt podesne količine funkcionalnih dendritskih ćelija snabdevenih sa podesnim količinama Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije sa T ćelijom ili T ćelijama (b) kultivaciju pomenutih T ćelije ili T ćelija zajedno sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi aktiviranja ili prajmiranja T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 (c) dodavanje funkcionalnih dendritskih ćelija snabdevenih sa molekulom koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom radi restimulacije (d) kultivaciju tokom odgovarajućih vremena i pod odgovarajućim uslovima.

[0229]U poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 sadrži

a) dovođenje u kontakt podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa podesnom količinom najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovom lizatom ili

frakcijom sa podesnom količinom najmanje jedne T ćelije ili smeše T ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju

b) kultivaciju pomenute T ćelije ili smeše T ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama tokom podesnog vremena pod

podesnim uslovima radi aktiviranja ili prajmiranja T ćelije ili T ćelija protiv Core-1.

[0230]U poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 sadrži

a) dovođenje u kontakt podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa podesnom količinom najmanje jednog molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom

ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom sa podesnom količinom najmanje jedne T ćelije ili smešom T ćelija ili smešom ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju

[0231]U sledećem poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1 sadrži korake (a) i (b) prethodnih metoda i kao sledeće sadrži,

(c) dodavanje podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa podesnom količinom najmanje jednog molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom radi restimulacije; ili dodavanje podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa podesnom količinom najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovim lizatom ili frakcijom radi restimulacije; i (d) kultivaciju tokom odgovarajućeg vremena i pod odgovarajućim uslovima

[0232]U sledećem poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje T ćelijske linije protiv Core-1 sadrži korake (a), (b), (c) i (d) iz prethodnog metoda i kao sledeće sadrži najmanje jedan sledeći ciklus restimulacije, pri čemu jedan ciklus restimulacije sadrži bilo korake (e) i (f) ili korake (g) i (h), sa (e) dodavanjem podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa podesnom količinom najmanje jednog molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom radi restimulacije,

(f) kultivacijom tokom odgovarajućeg vremena i pod odgovarajućim uslovima i

(g) dodavanjem podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa podesnom količinom najmanje jednog Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije radi restimulacije

(h) kultivacijom tokom odgovarajućeg vremena i pod odgovarajućim uslovima.

[0233]U sledećem poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje T ćelijske linije protiv Core-1 dodatno sadrži dva naredna ciklusa pomenutog ciklusa restimulacije. U još poželjnijem primeru izvođenja metod za generisanje T ćelijske linije protiv Core-1 sadrži tri naredna ciklusa pomenutog ciklusa restimulacije U čak još poželjnijem primeru izvođenja metod za generisanje T ćelijske linije protiv Core-1 sadrži pet narednih ciklusa pomenutog ciklusa restimulacije.

[0234]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za generisanje T ćelijskog klona protiv Core-1 se izvodi dodatni korak kloniranja ćelija najmanje pre jednog ciklusa od pomenutih ciklusa restimulacije U poželjnom primeru izvođenja aktivirana T ćelija ili T ćelije su T ćelijska linija protiv Core-1, pri čemu se prvenstveno (c) i (d) koji odgovaraju jednom ciklusu restimulacije izvode dva puta, još poželjnije tri puta, još poželjnije 4 puta, i najpoželjnije T ćelijska linija za koju se izvodi više od 4 ciklusa restimulacije

[0235]U poželjnom primeru izvođenja aktivirana T ćelija ili T ćelije su T ćelijski klon protiv Core-1, pri čemu se prvenstveno (c) i (d) koji odgovaraju jednom ciklusu restimulacije izvode dva puta, još poželjnije tri puta, još poželjnije 4 puta, i najpoželjnije T ćelijska linija za koju se izvodi više od 4 ciklusa restimulacije, i ćelije se kloniraju najmanje jednom, na primer, razređivanjem pojedinačne ćelije, pre restimulacije

[0236]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za generisanje T ćelijskog klona protiv Core-1 pomenuta funkcionalna dendritska ćelija je zrela dendritska ćelija. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za generisanje T ćelijskog klona protiv Core-1 pomenuta funkcionalna dendritska ćelija i T ćelija ili T ćelije su humane ćelije.

[0237]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za generisanje aktiviranih T ćelija, T ćelijske linije ili T ćelijskog klona protiv Core-1, pomenuta funkcionalna dendritska ćelija potiče od MUTZ-3 [prijave patenata 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7 (EP), US10/486,966, CA2.457.287, DE10139428A1, VVO2003/023023A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287] kao što je Nemod-DC (može se nabaviti od firme Glvcotope GmbH Berlin, Nemačka, www.glycotope. com).

[0238]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za generisanje aktiviranih T ćelija, T ćelijske linije ili T ćelijskog klona protiv Core-1. pomenuta funkcionalna dendritska ćelija i T ćelija ili T ćelije odgovaraju najmanje jednoj MHC klasi molekula.

[0239]U poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje aktivirane T ćelije, T ćelija, T ćelijskog klona ili T ćelijske linije protiv Core-1 sadrži

a. dovođenje u kontakt podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 kao što je ovde opisano na drugim mestima sa podesnom količinom najmanje jedne T ćelije ili smeše T ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju; i

b. kultivaciju pomenute T ćelije ili smeše T ćelija zajedno sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi aktiviranja ili prajmiranja T ćelije ili T ćelija protiv Core-1.

[0240]U poželjnom primeru izvođenja metod za generisanje aktivirane T ćelije, T ćelija, T ćelijskog klona ili T ćelijske linije protiv Core-1, sadrži ili

a) dovođenje u kontakt podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 snabdevene sa pomenutim Core-1 pozitivnim mikroorganizmom, njegovim lizatom ili frakcijom, sa

podesnom količinom najmanje jedne T ćelije ili smeše T ćelija ili smeše ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju; i

b) kultivaciju pomenute T ćelije ili smeše T ćelija zajedno sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama tokom podesnog vremena pod podesnim uslovima radi aktiviranja ili prajmiranja

T ćelije ili T ćelija protiv Core-1.

c) dodavanje podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa pomenutim molekulom koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili

frakcijom radi restimulacije; i

d) kultivaciju tokom podesnog vremena i pod podesnim uslovima,

ili

a) dovođenje u kontakt podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 snadevene sa pomenutim molekulom koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom,

njihovim lizatom ili frakcijom sa podesnom količinom najmanje jedne T ćelije ili smeše T ćelija ili smešom ćelija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju; i

T ćelije ili T ćelija protiv Core-1; i

c) dodavanje podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije snabdevene sa pomenutim Core-1 pozitivnim mikroorganizmom, njegovim lizatom ili frakcijom prema bilo kom od

prethodnih zahteva radi restimulacije; i

d) kultivaciju tokom podesnog vremena i pod podesnim uslovima.

[0241]Poželjni primeri izvođenja pronalaska su opisani u primerima.

[0242]U sledećem poželjnom primeru izvođenja aktivirana T ćelija ili T ćelije protiv Core-1, ćelijska kompozicija koja sadrži T ćelije protiv Core-1, T ćelijska linija protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 kao što su gore opisani sadrže najmanje jednu CD4+ helpersku, odnosno pomoćnu ćeliju protiv Core-1.

[0243]U sledećem poželjnom primeru izvođenja aktivirana T ćelija ili T ćelije protiv Core-1, ćelijska kompozicija koja sadrži T ćelije protiv Core-1, T ćelijska linija protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 kao što su gore opisani sadrže najmanje jednu citotoksičnu T ćeliju protiv Core-1.

[0244]U sledećem poželjnom primeru izvođenja aktivirana T ćelija ili T ćelije protiv Core-1, ćelijska kompozicija koja sadrži najmanje jednu T ćeliju protiv Core-1, T ćelijsku liniju protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 kao što su gore opisani ubija najmanje jednu Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju ili izlučuje molekule koji posreduju u ubijanju najmanje jedne tumorske ćelije

[0245]Aktivirana T ćelija ili T ćelije protiv Core-1, ćelijska kompozicija koja sadrži T ćelije protiv Core-1, T ćelijska linija protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 koji ubijaju najmanje jednu Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju ili izlučuju molekule koji posreduju u ubijanju najmanje jedne tumorske ćelije pomoću pomenute citotoksične T ćelije ili ćelija protiv Core-1 ubijaju Core-1 pozitivne tumorske ćelije, što se može utvrditi ili korišćenjem testa ćelijske imune reakcije koji je opisan ovde na drugim mestima merenjem izlučivanja INFgamma ili TNFalpha ili testom citotoksičnosti, pri čemu se najmanje jedna obeležena Core-1 pozitivna tumorska ćelija lizira pomoću pomenutih T ćelija, što je u suštini poznato stručnjacima iz odgovarajuće oblasti primenom T ćelija prema pronalasku, na primer, CTL ili Thl reakcije ili indukovanjem reakcije CD4 T helpera, koji posreduje u aktivaciji humoralne i ćelijske imune reakcije, što rezultuje ubijanjem najmanje jedne Core-1 pozitivne tumorske ćelije.

[0246]Metod za lečenje pacijenta sa kancerom može sadržati davanje bilo koje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1, ćelijske kompozicije koja sadrži najmanje jednu T ćeliju protiv Core-1, T ćelijsku liniju protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 kao što je gore opisano ili kompoziciju koja ih sadrži. U poželjnom primeru izvođenja metod za lečenje pacijenta sa kancerom sadrži davanje podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 kao što je gore opisano ili kompozicije koja ih sadrži. U poželjnom primeru izvođenja, u metodu za lečenje pacijenta sa kancerom pacijent ima ili je imao kancersku ćeliju pozitivnu za Core-1. U još poželjnijem primeru izvođenja, u metodu za lečenje pacijenta sa kancerom funkcionalna dendritska ćelija je autologa. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, u metodu za lečenje pacijenta sa kancerom funkcionalna dendritska ćelija je alogenska koja potiče od donora. U poželjnom primeru izvođenja, u metodu za lečenje pacijenta sa kancerom funkcionalna dendritska ćelija potiče od MUTZ-3. U poželjnom primeru izvođenja, u metodu za lečenje pacijenta sa kancerom funkcionalna dendritska ćelija deli najmanje jednu MHC klasu molekula sa pomenutim pacijentom.

[0247]Metod za lečenje pacijenta sa kancerom može sadržati davanje bilo koje aktivirane T ćelije ili T ćelija protiv Core-1, ćelijske kompozicije koja sadrži najmanje jednu T ćeliju protiv Core-1, T ćelijsku liniju protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 koji su opisani ovde na drugim mestima ili kompoziciju koja sadrži najmanje jedno od njih. Metod za lečenje pacijenta sa kancerom može sadržati davanje podesne količine najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1 koja je opisana ovde na drugim mestima ili kompozicije koja ih sadrži. U poželjnom primeru izvođenja najmanje jedan od pomenutih metoda se primenjuje za pacijenta koji ima ili je imao Core-1 pozitivnu kancersku ćeliju, koja se može detektovati sa najmanje jednim Core-1 specifičnim antitelim i u svom poželjnom primeru izvođenja je opisana ovde na drugim mestima. Dalje su poželjne pomenute metode kod kojih je funkcionalna dendritska ćelija autologa. dalje je poželjno da je funkcionalna dendritska ćelija alogena, dalje je poželjno kada funkcionalna dendritska ćelija potiče od donora, čak je još poželjnije kada funkcionalna dendritska ćelija potiče od MUTZ-3, čak još poželjnije kada bilo koja od opisanih funkcionalnih dendritskih ćelija deli najmanje jednu MHC klasu molekula sa pojedincem kome se daje.

[0248]Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu da izvrše opisani zadatak korišćenjem ovde opisanih metoda i materijala. Oni mogu odrediti najbolje uslove za dobijanje tih funkcionalnih dendritskih ćelija ili T ćelija, najbolje načine primene, i/ili podesne kompozicije koje ih sadrže i/ili koje su dalje opisane u poželjnim primerima izvođenja za generisanje i primenu u prijavama patenata DE10139428A1, VVO2003/023023A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287

[0249]Prvenstveno, pomenuta aktivirana T ćelija ili T ćelije protiv Core-1 sadrže jednu CD4+ pomoćnu ćeliju, i čak još poželjnije najmanje jednu citotoksičnu T ćeliju koja može da ubije najmanje jednu Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju.

[0250]Pomenuta T ćelija ili T ćelije koje se koriste za dovođenje u kontakt su najmanje jedna CD4+ i/ili CD8+ T-ćelija koja je pre toga bila izolovana ili obogaćena standardnim metodama ili je ćelijska

kompozicija koja sadrži najmanje jednu CD4+ i/ili CD8+ T-ćeliju. Pomenuti lizat može biti bilo koji lizat od Core-1 pozitivnog mikroorganizma ili od Core-1 pozitivne tumorske ćelije, respektivno, kao što je, ali bez ograničavanja na lizat generisan ponovljenim zamrzavanjem-odmrzavanjem ultrazvukom, mehaničkom silom ili temperaturskom indukcijom.

[0251]Za detalje generisanja Core-1 specifičnih T ćelija, vidi primer 12.

[0252]Funkcionalna dendritska ćelija je ćelija koja može da aktivira T ćeliju. Aktivacija T ćelija označava stimulaciju proliferacije i/ili konverzije iz naivne u aktivnu T ćeliju. Aktivna T ćelija izlučuje molekule koji indukuju ili pomažu imunu reakciju protiv ciljnog Core-1 ili tumorskih ćelija koje nose Core-1, a prvenstveno onih citotoksičnih T ćelija koje posreduju u ubijanju Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija.

[0253]U poželjnom primeru izvođenja pomenuta funkcionalna dendritska ćelija je zrela dendritska ćelija. Još poželjnije dendritska ćelija prekursor od koje potiče zrela ćelija je dobijena od čoveka, još poželjnije od čoveka od koga su takođe bile dobijene T ćelija ili T ćelije ili koje odgovaraju najmanje jednoj MHC klasi molekula. U još poželjnijem primeru izvođenja funkcionalna dendritska ćelija potiče od MUTZ-3, i čak još poželjnije MUTZ-3 ćelije ili ćelije koje potiču od nje su diferencirane korišćenjem H-4 i GM-CSF, snabdevenih sa odgovarajućim količinama Core-1 pozitivnog mikroorganizma, njegovog lizata ili frakcije ili molekula koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivne tumorske ćelije, njenog lizata ili frakcije, i dalje sazrevaju korišćenjem, na primer, podesnih količina TNF-alpha za sazrevanje dendritskih ćelija koje odgovaraju funkcionalnim dendritskim ćelijama prema pronalasku. U čak još poželjnijem primeru izvođenja snabdevene funkcionalne dendritske ćelije se upotrebljavaju zajedno sa P8MC (mononuklearnim ćelijama periferne krvi) koje odgovaraju bar MHC klasi I (HLAA2) i (HLA-B44).

[0254]Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu da odrede podesne uslove za generisanje funkcionalnih dendritskih ćelija snabdevenih sa Core-1 pozitivnim mikroorganizmom, njegovim lizatom ili frakcijom ili molekulom koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom, kao i podesne količine i procedure za obogaćivanje ili prečišćavanje T ćelije ili T ćelija, te podesne uslove za kultivaciju obe ćelije zajedno, kao što su oni koji obuhvataju vremena, medijume, uslove kultivacije i dodatne potrebne faktore Funkcionalne dendritske ćelije se obično diferenciraju od prekursorskih ćelija tokom 6-10 dana i snabdevaju se i sazrevaju tokom narednih 1 do 2 dana. Kultivacija pomenute T ćelije ili T ćelija zajedno sa pomenutim snabdevenim funkcionalnim dendritskim ćelijama traje obično od 7 do 10 dana, a dodavanje i kultivacija snabdevenih funkcionalnih dendritskih ćelija radi restimulacije traje obično od 7 do 9 dana za svaki ciklus restimulacije. Naredni detalji su prikazani u primeru 12.

[0255]U sledećem poželjnom primeru izvođenja upotrebljavaju se različite dendritske ćelije ili funkcionalne dendritske ćelije iz različitih izvora, kao što su dendritske ćelije poreklom od MUTZ-3 i poreklom od čoveka, za različite korake prajmiranja i restimulacije. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu da izaberu najbolju kombinaciju.

[0256]Opis koji se ovde upotrebljava za dendritske ćelije, njihovu upotrebu i podesne uslove i molekule za njihovu primenu takođe važi za testove ćelijskih imunih reakcija koji su opisani ovde na drugim mestima i obratno i važiće i za sve druge delove pronalaska.

[0257]U poželjnom primeru izvođenja T ćelijska linija ili T ćelijski klon je bio generisan korišćenjem funkcionalnih dendritskih ćelija poreklom od MUTZ-3 snabdevenih sa Core-1 pozitivnim mikroorganizmom, njegovim lizatom ili frakcijom u kombinaciji sa najmanje jednim ciklusom restimulacije sa funkcionalnim dendritskim ćelijama poreklom od MUTZ-3 snabdevenim sa najmanje jednim molekulom koji nosi Core-1 ili Core-1 pozitivnom tumorskom ćelijom, njenim lizatom ili frakcijom od donora, i čak još poželjnije od pacijenata sa tumorom, i čak još poželjnije od pacijenta sa tumorom čiji tumor je pozitivan za vezivanje sa Core-1 specifičnim antitelom.

[0258]Metod za generisanje najmanje jedne aktivirane T ćelije za primenu kao terapije tumora može sadržati davanje aktiviranih T ćelija protiv Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija pacijentu. U poželjnom primeru izvođenja funkcionalna dendritska ćelija protiv Core-1, aktivirana T ćelija ili T ćelije protiv Core-1, ćelijska kompozicija koja sadrži T ćelije protiv Core-1, T ćelijska linija protiv Core-1, ili T ćelijski klon protiv Core-1 proizvedeni metodom koji je gore opisan indukuju humoralnu i/ili ćelijsku imunu reakciju protiv Core-1 pozitivnih ćelija i/ili bolesti.

[0259]U sledećem poželjnom primeru izvođenja formulacija i/ili funkcionalne dendritske ćelije i/ili aktivirana T ćelija, T ćelije, T ćelijski klon ili T ćelijska linija koji su gore opisani se upotrebljavaju za proizvodnju medikamenta i/ili nutraceutika za profilaksu ili terapiju tumora tehnikama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0260]Poželjni primeri izvođenja pronalaska su opisani u primerima.

G) KITOVI

[0261]Pronalazak se takođe odnosi na kit, odnosno komplet za indukovanje specifične humoralne i/ili ćelijske imune reakcije kod čoveka ili životinje protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija, kao što je ovde opisano na drugim mestima, koji sadrži nutraceutik ili farmaceutik koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili najmanje jedan njihov lizat ili frakciju, ili koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728). ili njihove frakcije ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0262]U još poželjnijem primeru izvođenja pomenuta Core-1 specifična imuna reakcija funkcioniše kao barijera protiv Core-1 pozitivnih kancerskih ćelija.

[0263]Pronalazak se takođe odnosi na kit za smanjenje ili sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora, a prvenstveno Core-1 pozitivnog tumora, koji sadrži nutraceutik ili farmaceutik koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), i/ili najmanje jedan njihov lizat ili frakciju ili koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od AG6 (DSM 18726) i MU1 (DSM 18728), ili njihovu frakciju ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0264]Kit za smanjenje ili sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora, a prvenstveno Core-1 pozitivnog tumora, može sadržati nutraceutik ili farmaceutsku formulaciju ili Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju ili njihove formulacije koje su opisane ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0265]Kit za lečenje Core-1 pozitivne bolesti ili tumora, a prvenstveno Core-1 pozitivnog tumora, koji sadrži nutraceutik ili farmaceutsku formulaciju ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegovu frakciju ili njegove formulacije koje su opisane ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita

[0266]Kit za prevenciju i lečenje gastrointestinalnih poremećaja može sadržati nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegovu frakciju ili njegove formulacije koje su opisane ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0267]Kit za jačanje imunog sistema ili za poboljšanje imune reakcije kao što je ovde opisano na drugim mestima može sadržati nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju, ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegovu frakciju ili njegove formulacije koje su opisane ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0268]Nutraceutska ili farmaceutska formulacija, ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegova frakcija ili formulacije koje su sadržane u gore opisanim kitovima sadrže najmanje jedan mikrorganizam, njegov lizat ili frakciju od soja AG6 (DSM 18726), i/ili soja MU1 (DSM 18728), i još poželjnije od soja AG6.

[0269]Kit može sadržati informacije (listić sa instrukcijama, internet adresu) koje objašnjavaju kako da se kombinuju komponente kita Pomenute informacije se takođe mogu odnositi na terapeutski režim.

[0270]Kit za generisanje anti Core-1 antitela ili kompozicije antitela kao što je ovde opisano na drugim mestima, može sadržati nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju, ili Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju ili njihove formulacije koje su opisane ovde na drugim mestima, ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0271]Kit za generisanje najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelije protiv Core-1, može sadržati nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju ili Core-1 pozitivni mikroorganizam, ili njegovu frakciju ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita. U poželjnom primeru izvođenja kit za generisanje najmanje jedne funkcionalne dendritske ćelija protiv Core-1 dalje sadrži nezrele dendritske ćelije koje potiču od dendritske ćelijske linije kao što su, ali bez ograničavanja na MUTZ-3 ili Nemod-DC.

[0272]Kit za generisanje najmanje jedne aktivirane T ćelije, T ćelija, T ćelijskog klona ili T ćelijske linije protiv Core-1, može sadržati nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju ili Core-1 pozitivni mikroorganizam ili njegovu frakciju ili njegove formulacije ili formulacije koje ih sadrže i informacije o primeni kita.

[0273]Pronalazak ima sledeće prednosti:

- iskorak sa utabane staze

- nova percepcija problema

- zadovoljenje dugo-postojeće potrebe ili želje

- svi dosadašnji napori eksperata su bili uzaludni

- jednostavnost rešenja dokazuje njegovu inventivnost, a naročito zato što zamenjuje kompleksniju doktrinu

- razvoj naučne tehnologije usmeren u drugim pravcima

- ostvarivanje daljeg razvoja

- pogrešni koncepti u pogledu rešenja problema (predrasude)

- tehnički progres, kao što je: poboljšanje, bolje performanse, smanjenje cene, ušteda vremena, materijala, radnih koraka, troškova ili resursa koje je teško nabaviti, poboljšana pouzdanost, uklanjanje nedostataka, poboljšani kvalitet, bez održavanja, povećana efikasnost, bolji prinos, povećanje broja tehničkih mogućnosti, obezbeđivanje sledećeg proizvoda, otvaranje drugog puta, otvaranje nove oblasti, prvo rešenje zadatka, rezervni proizvod, alternative, mogućnost racionalizacije, automatizacije ili minijaturizacije ili obogaćivanja farmaceutskog fonda

- specijalni izbor (pošto je izvesna mogućnost, čiji rezultat se ne može predvideti, bila izabrana između većeg broja mogućnosti, sledi daje patentabilan slučajni izbor)

- greška u citiranju

- mlada oblast tehnologije

- kombinovani pronalazak; kombinacija više poznatih elemenata, sa iznenađujućim efektom

- licenciranje

- pohvale eksperata i

- komercijalni uspeh.

[0274]Bez namere za ograničavanjem, pronalazak će biti detaljnije opisan sa pozivom na sledeće primere

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0275]

Fig. 1.

Neukorenjeno stablo bazirano na jednoznačno poravnatim sekvencama (1248 parova baza) izolata AG6, MU1, njihovi najbliži srodnici iE. colisoj tipa dobijenog Neighbor-Joining metodom (7).

Fig. 2

2a: LHE. colisa] PCR proizvoda dobijenih posle amplifikacije sa prajmerom OPL07 - traka 1-1kb lestvice, trake 2-11- LH sojevi 2-5, 8, 13-16, 18; traka 12 - soj 32E. coliDSMZ 8697 2b: MU sojevi i AG6 dobijeni posle amplifikacije sa prajmerom OPA18- traka 1 - 1 kb lestvice; trake 2-5 - MU sojevi 1, 3-5; traka 6 - AB12; traka 7 -B. thetaiotaomicronDSMZ 2079; traka 8 - B.ovatusDSMZ 1896; traka 9 -B. vulgatus DSMZ1447; traka10 - B. acidifaciens DSMZ15896; trake 11-13-AG6

Fig.3:

ELISA sa obloženim bakterijskim sojevima AG6, LH2 i MU1 (5x 10S bakterija/ml) i Core-1 specifičnim monoklonskim antitelima Nemod-TF1, Nemod-TF2 i A68-B/A11 i kontrolnim antitelom A63-B/C2.

Fig.4:

SDS-PAGE i vvestern blot analize preparata kapsula soja AG6

A) Alcian blue bojenje SDS- poliakrilamidnog gela

B) bojenje DIG-glikanom u vvestern blotu

C) bojenje u vvestern blotu sa Nemod-TF2

Fig. 5:

Obogaćivanje core-1-pozitivnih polisaharida reverzno faznom hromatografijom

Fig. 6:

Sekvenca ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog kapsularnog polisaharidaB. ovatussoja AG6

Fig. 7:

Struktura ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog kapsularnog polisaharidaB. ovatusAG6 (L-Fuc: L-fukoza, D-Gal: D-galaktoza. HexNAc: /V-acetilheksozamin, D-Hex: D-heksoza, OMe: O-metil grupa)

Fig. 8:

Struktura ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog kapsularnog polisaharidaB. ovatusAG6 (L-Fuc: L-fukoza, D-Gal: D-galaktoza, HexNAc: A/-acetilheksozamin, D-Hex: D-heksoza, OMe. O-metil grupa)

Fig. 9:

Analize mišijih seruma testom humoralne imune reakcije 1 IgM antitela protiv AGP i perjodnom kiselinom tretiranog AGP su bile određene ELISOM u serumima miševa imunizovanih sa PBS (grupa L), Core-1 negativnim bakterijama (grupa I) i Core-1 pozitivnim bakterijama (grupa K).

Razređivanje seruma 1:200, na dan 21

Fig. 10:

ELISA signali imunih seruma na konjugatima ugljeni hidrat-PAA

srednja vrednost ELISA signala od 4 C3H miševa protiv PAA konjugata Gal betal-3GalNAc alphal-PAA u odnosu na ELISA signal protiv GlcNAcB1-2GalB1-3GalNAca-PAA (razređivanje seruma 1:100)

Fig. 11:

FACS analiza mišijih seruma od miševa imunizovanih sa PBS (grupa L), Core-1 negativnim bakterijama (grupa l) i Core-1 pozitivnim bakterijama (AG6, grupa K) na dan 21

A) srednji intenzitet fluorescencije iz FACS analize

B) šematski histogram (crno: grupa L, plavo: grupa I, crveno: grupa K)

Fig. 12:

Test 1 humoralne imune reakcije seruma miševa bez mikroorganizama (kontrolni miš i 3 različita miša imunizovana sa bakterijama soja AG6)

Fig. 13:

Test 1 humoralne imune reakcije seruma od C3H miševa oralno imunizovanih sa A) 2x1011 (grupa A) ili B) 2x1010 (grupa B) pasterizovanih bakterija soja AG6 dnevno za dane 0 do 28. Prikazani su ELISA signali za dan 21 protiv glikoforina (GP), azialoglikoforina (AGP) i perjodatom tretiranog AGP (AGP + PJ) za pojedinačne miševe

Fig. 14:

Test 3 humoralne imune reakcije seruma od C3H miševa oralno imunizovanih sa pasterizovanim Core-1 pozitivnim bakterijama (soj AG6). Serumi od dana 0 i dana 28 su bili razređeni 1:300 i analizirani su protočnom citometrijom radi određivanja vezivanja za ćelijske linije NM-wt i NM-D4.

Fig. 15

Produkcija citokina od strane T ćelija generisanih lizatima Core-1 pozitivnih bakterija (AG6 i MU1) posle restimulacija sa DC snabdevenim sa Corel-pozitivnim MN-D4 (DC/D4) ili negativnim NMwt (DC/wt) ćelijskim lizatima od humanih tumorskih ćelijskih linija. Inhibicija produkcije citokina pre-inkubacijom sa lizatom snabdevenih NM-DC sa Corel-specifičnim antitelom (DC/D4+Ak)

A) GM-CSF produkcija sa T ćelijama (CIRT 1)

B) TNF alpha produkcija sa T ćelijama (CIRT 2)

Fig. 16:

Test 2 ćelijske imune reakcije: Rezultati ELISpot testa za IFN-gamma produkciju sa responderskim T ćelijama posle restimulacije sa DC snabdevenim sa Corel-pozitivnim (DC/D4) ili negativnim (DC/wt) ćelijskim lizatima od humanih tumorskih ćelijskih linija i inhibicija produkcije citokina pre-inkubacijom sa lizatom snabdevenih NM-DC sa Corel-specifičnim antitelom (DC/D4+Ak).

Fig.17:

Test 3 ćelijske imune reakcije: test proliferacije T ćelija (VVST) na responderskim ćelijama (R) posle restimulacije sa DC snabdevenim sa Corel-pozitivnim (DC/D4) ili negativnim (DC/wt) ćelijskim lizatima od humanih tumorskih ćelijskih linija i inhibicija proliferacije pre-inkubacijom lizata snabdevenog sa NM-DC sa Corel-specifičnim antitelom (DC/D4+Ak).

Fig. 18:

Test 4 ćelijske imune reakcije: imunofluorescentna analiza mNM-DC snabdevenog sa Core-1 negativnim (AG3) ili Core-1 pozitivnim (AG6) bakterijama ili Core-1 negativnom (NM-wt) ili Core-1 pozitivnom (NM-D4) humanom ćelijskom linijom.

Fig. 19:

Ugljeno-hidratna struktura Core-1 pozitivne komponente L-Fuc: L-fukoza, D-GalNAc:N~acetilgalaktozamin, D-Gal: D-galaktozamin, Hex: heksoza, HexNAc: /V-acetilheksozamin, OMe: O-metilacija

PRIMERI

Primer 1 Anaerobne tehnike kultivacije i medijumi

[0276]Anaerobne tehnike koje su upotrebljene u kultivaciji bakterija su bile bazirane na prethodno opisanim metodama (3, 5, 9, 11), koje su sumirali Breznak i Costilovv (4). Medijumi pripremljeni sa cisteinom HCI kao redukujućim agensom su bili raspodeljeni u epruvete za anaerobne kulture (Ochs, Bovenden. Nemačka) ili staklene serumske boce, pri čemu je u njihovom gornjem delu bilo ostavljeno približno od polovine do trećine ukupne zapremine suda kao prostor ispunjen gasom, pa su onda zatvorene sa butil gumenim čepovima. Rastvori koji su bili pripremljeni bez redukujučih agenasa (npr. PBS-a) su ključali pre raspodeljivanja. Pre autoklaviranja, gasna faza je bila zamenjena sa N2/C02(80/20,v/v). Da bi se ovo ostvarilo, kroz butil gumene čepove kojima su bile zatvorene boce su bile provučene igle, pa je iz boca izvučen gas pomoću vakuum pumpe (Vacuubrand, VVertheim, Nemačka). Posle izvlačenja gasa, u boce, koje su bile mućkane više puta tokom celog procesa, je uveden gas N2/C02 (80/20,v/v). Ova procedura izvlačenja i uvođenja gasa je bila izvedena ukupno tri puta. Pre ulaska u sud, smeša gasova je bila propuštena preko vrelog paladijumskog katalizatora da bi se odstranili rezidualni tragovi kiseonika prisutnog u smeši gasova. Kao indikator redukcije-oksidacije je bio upotrebljen Resazurin (1 mg 1<1>).

[0277]Medijumi za kultivaciju su izliveni ispod pokrivača u vidu laminarnog toka, pa su zatim čuvani pod anoksičnim uslovima tokom najmanje 24 h pre upotrebe. Ovo je bilo ostvareno u anaerobnim teglama pod pritiskom (1,5 * 10<3>Pa) sa 3,5 1 AnaeroGen (Oxoid, Basingstoke, Engleska) ili višekratnim ispiranjem hermetički zatvorene anaerobne komore sa N2/C02/H2(80/10/10, v/v/v) (Don Whitley Scientific, Shipley, Engleska). Manipulacija uzorcima je izvršena u anaerobnoj komori (MACS radna stanica sa promenljivom atmosferom, Don Whitley Scientific, Shipley, England ili Coy Laboratory Products, Grass Lake, USA).

[0278]Nesterilni rastvori i materijali su bili sterilisani autoklaviranjem (121 "C, 1,2 x 10<5>Pa, 15 min). Termolabilna jedinjenja su bila napravljena kao koncentrovani gotovi rastvori u mili-Q vodi, pa su sterilno isfiltrirana (0,22 pm, mešoviti celuloza estar, Roth, Karlsruhe, Nemačka) i dodata su medijumima u željenim koncentracijama.

Primer 2: Afinitetno obogaćivanje Core-1 pozitivnih mikroorganizama

2.1 Preparatsa TF1 i TF2 obloženim Dvnabeads<®>

[0279]Zapremine od 100 ul Dynabeads<®>(M-450 pacovski anti-mišiji IgM, Dynal Biotech ASA, Oslo, Norveška) su bile stavljene u Eppendorf epruvete od 2 ml Safe-Lock (sa sigurnosnom bravom)

(Eppendorf, Hamburg, Nemačka), pa su isprane dva puta sa 2 ml fosfatnog puferovanog slanog rastvora (PBS-a: 8,1 g 1"<1>NaCI, 0,16 g 1"<1>NaH2P04 H20, 0,98 g1"<1>Na2HP04-2H20, 1 g 1~<1>BSA, pH 7,4) uz korišćenje Dynal Magnetic Particle Concentrator<®->S (MPC<®->S, Dynal Biotech, Oslo, Norveška) i onda su suspendovane u 25 pl PBS-a. Supernatanti liofilizovanih TF1 ili TF2 ćelijskih kultura su bili rastvoreni u 1 ml mili-Q vode kvaliteta za sintezu (Millipore, Billerica, MA, USA). Rastvoreni supernatanti TF1 ili TF2 ćelijskih kultura (1 ml) su bili dodati u epruvete sa Dynabeads® i zatim su inkubirani tokom 30 min na 4°C na rotatoru za test epruvete (model 34528, Snijders Scientific, Holandija). Epruvete su bile stavljene u MPC<®->S, pa je ostavljeno da stoje tokom 3 min pre odstranjivanja fluida pipetom. Dynabeads<®>su bile resuspendovane u 2 ml PBS-a, te su stavljene u MPC<®->S i fluid je onda bio odstranjen pipetiranjem. Ovaj korak ispiranja je bio izveden tri puta. Isprane Dynabeads<®>su bile suspendovane u svojoj originalnoj zapremini od 100 pl PBS-a. Dynabeads pripremljene na ovaj način su bile upotrebljene odmah ili u roku od dve nedelje posle pripreme ponavljanjem trostrukog koraka ispiranja sa 2 ml PBS-a.

2.2 Sakupljanje i prerada uzoraka fecesa za Dvnabeads<®>obogaćivanje

[0280]Uzorci fecesa od osam dobrovoljaca (tabela 3) su bili sakupljeni u perforiranim plastičnim epruvetama, pa su održavani pod anoksičnim uslovima uz konšćenje AnaeroGen Compact (Oxoid, Basingstoke, Engleska), te su čuvani na 4 °C maksimalno 4 h pre prerade. Dobrovoljci su bili zdrave odrasle osobe, koje nisu uzimale antibiotike najmanje 3 meseca pre dana uzimanja uzoraka i konzumirale su svoje uobičajene dijete.

[0281]Desetostruko (w/v) razređivanje uzoraka fecesa je bilo izvršeno u PBS-b (PBS-b: 8,5 g I"1 NaCI, 0,3 g I"<1>KH2P04, 0,6 g l"<1>Na2HP04, pH 7,0 koji je sadržao 0,1 g I<1>peptona i 0,25 g I"<1>cisteina-HCI). Bilo je dodato šest sterilnih staklenih perli prečnika 3 mm, pa su razređeni uzorci homogenizovani obrtanjem malom brzinom. Homogenizovani uzorak je bio centrifugiran (300 x g, 1 min, 21 °C) do ostataka sedimenta. Porcija od 200 pl rezultujućeg supernatanta je bila dodata u 1,8 ml PBS-b, što je rezultovalo približno sa 100-strukim razređivanjem originalnog uzorka fecesa. Ova razređivanja su bila isprana jednom sa 2 ml PBS-b (8000 xg,5 min, 21 °C), a pelete su bile suspendovane u 2 ml PBS-b.

2.3 Procedura obogaćivanja sa Dvnabeads<®>

[0282]Zapremina od 20 pl od 100-strukog razređivanja je bila dodata u epruvetu od 2 ml koja je sadržala 180 pl PBS-a i 5 pl Dvnabeads® obloženih bilo sa TF1 ili TF2 antitelom. Epruvete su bile inkubirane tokom 30 min na 4 °C na rotatoru za test epruvete. Epruvete su bile stavljene u MPC<®->S i ostavljene su da stoje 3 min pre nego što je iz njih odstranjeno onoliko supernatanta koliko je bilo moguće usisavanjem sa špricom i iglom. Uzorci su bili isprani tri puta sa 2 ml PBS-a, pa je ponovo odstranjeno onoliko supernatanta koliko je bilo moguće.

2.4 Zasejavanje na selektivnim i neselektivnim medijumima

[0283]Isprani uzorci su bili suspendovani u 1 ml PBS-b, pa su alikvoti od 100 pl bili zasejani širenjem preko različitih selektivnih i neselektivnih medijuma (tabela 4), te su zatim bili inkubirani 48h na 37°C u anaerobnoj komori

[0284]Čvrsti medijumi su bili pripremljeni prema instrukcijama proizvođača. Kompozicija ST agara je bila kao što sledi: 1 g I"<1>proteoza peptona, 9 g I"<1>peptona iz mesa, 3 g f1 NaCI, 2 g 1<1>Na2HPGy2H20, 3 g I"<1>mesnog ekstrakta, 4 g I'1 ekstrakta kvasca, 6 g I"<1>D (+)-glukoze, 0,5 ml T1 Tvveen 80, 0,25 g I"<1>cistein-HCI, 1 mg I"1 resazurina, 0,1 g r1 MgS04- 7 H20, 5 mg I"<1>FeSCy7 H20, 0,5 g I"', 3,4 mg I"<1>MnS04 2H20, 1,5 g I"<1>bakteriološkog agara, pH 7,0.

[0285]Za subjekte od 1 do 4, kolonije iz procedure jednog obogaćivanja su bile izabrane za skrining baziran na ELISI. Za subjekte od 5 do 8, Dvnabeads® procedura obogaćivanja je bila ponovljena dva puta kao što sledi: posle 48 h inkubacije, kolonije su bile sastrugane sa ploča, pa su suspendovane u PBS-b u okviru opsega McFarlandovih standarda mutnoće 3 do 5 (pripremljene kao u (13)) Kao i pre, alikvot od 20 pl ove suspenzije je bio dodat u 180 pl PBS-a. Procedura obogaćivanja i zasejavanja je bila izvršena ukupno tri puta, kao što je prethodno opisano.

[0286]Uzorci fecesa za sledeća četiri subjekta (5 AB, 6 MU, 7 LH i 8 CA) su bili obogaćeni sa Ćore 1 pozitivnim bakterijama. Procedura obogaćivanja je bila blago modifikovana time što je obogaćivanje bilo izvršeno ukupno tri puta, tj. kolonije dobijene posle inicijalne izolacije su bile sastrugane sa ploča, pa su podvrgnute daljem obogaćivanju. Na ovaj način je bilo dobijeno šezdeset novih izolata.

3. Identifikacija izolata

3.1 Biohemijska

[0287]Bakterije su bile identifikovane sa VITEK sistemom (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Francuska). Bakterije su bile pripremljene prema instrukcijama proizvođača, a identifikacione kartice su bile upotrebljene kao što sledi: ANI kartice za anaerobne izolate i fakultativno anaerobne Gram-pozitivne izolate koji su mogli da rastu u MRS čorbi (suspektni lactobacilli), GPI kartice za Gram-pozitivne izolate i GNI+ kartice za Gram negativne aerobne izolate.

[0288]Biohemijski identitet izolata dobijen korišćenjem VITEK sistema (Biomerieux, Marcv l'Etoile, Francuska) je sumiran u tabeli 5. Svi anaerobni izolati AG6, MU (1, 3 - 5) i AB12 pripadajuBacteroides fragilisgrupi, dok su svi aerobni izolati članoviEnterobacteriaceae,i jedni i drugi su Gram-negativni.

3.2 Molekularna (sekvenciranje)

[0289]DNKje bila ekstrahovana sa Invisorb Genomic DNA Kitom III (Invitek. Berlin, Nemačka) prema instrukcijama proizvođača za protokol III B sa ispranim ćelijskim peletama dobijenim od tečnih kultura suspendovanih u 1 ml pufera D za lizu. Prajmeri 27f (5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) i 1492r (5' TAC CTT GTT ACG ACT T) (10) su bili upotrebljeni za amplifikaciju bakterijskog 16S ribozomskog RNK gena.

[0290]Svaki PCR je bio izveden u triplikatu, a reakciona smeša (50 pl) je sadržala: 50 mM KCI, 20 mM Tris-HCI, 1 mM MgCI2, 0,25 mM svakog dNTP, 1 pM svakog prajmera, 2,5 jedinice Taq DNA polimeraze (Invitrogen. Karlsrue, Nemačka) i 1 pl DNK koja je služila kao šablon/model. PCR program je bio: 94°C tokom 5 min, 30 ciklusa na 94°C tokom 1 min, 55°C tokom 1 min i 72"C tokom 1 min, i konačno 72°C tokom 10 min. PCR proizvodi su bili prečišćeni sa High Pure PCR Product Purification Kitom (Roche, Indijanapolis, USA) prema instrukcijama proizvođača. Proizvodi su bili analizirani elektroforezom na 1 % agaroza gelu (w/v) u Tris-Acetat-EDTA puferu (4,84 g r1 Tris, 1,142 ml 1 1 ledeno hladne sirćetne kiseline 0,372 g 1"<1>EDTA, pH 8,0). Koncentracija DNKje bila određena uz korišćenje the Low DNA Mass Ladder (Invitrogen. Karlsbad, USA).

[0291]Za sekvenciranje, koristili smo bilo prajmer 27f, 338f (5' GCT GCC TCC CGT AGG AGT) (2), 338r (5' ACT CCT ACG GGA GGC AGC), 968f (5' AAC GCG AAG AAC CTT AC) (14), ili 1492r. Reakcije sekvenciranja su bile izvršene sa DVEnamic™ ET Dve Terminator Cycle Sequencing Kitom (Amersham Biosciences. Little Chalfont, Engleska) prema instrukcijama proizvođača. Proizvodi sekvenciranja su bili analizirani sa MegaBACE 1000 Sistemom (Molecular Dynamics, Sanivejl, USA). Sekvencesu bile sastavljene i ručno podešene korišćenjem the ContigExpress funkcije u Vector NTI Suite 9.0.0 (Invitrogen, Karlsbad, USA). One su bile posle toga poravnate sa veoma sličnim sekvencama (92% sličnosti ili veće) dobijenim sa BLAST funkcijom the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (1). Procenti sličnosti su bili izračunati sa jednoznačno poravnatih sekvenci korišćenjem the Sequence ldentity Matrix funkcije u the Bioedit softvvare version 5.0.9 ili the Similarity Matrix version 1.1 od the Ribosomal Database Project. Rezultati sekvenciranja su bili potvrđeni poređenjem sa sekvencama dobijenim od 16S rRNK gena provajdera usluga sekvenciranja (AMODIA, Braunšvajg, Nemačka).

[0292]Identitet izolata je prikazan u tabeli 6, a neukorenjeno filogenetsko stablo bazirano na sekvencama izolata AG6, MU1, njihovih najbližih srodnika iE. coli1ATCC11755 tipu soja je prikazano na

Fig. 1

3.3Slučajno amplifikovana polimorfna DNK (RAPD)

[0293] Neki Ćore 1 pozitivni izolati dobijeni ponovljenom procedurom obogaćivanja Dvnabead<®>su izgledali veoma slično po svojoj morfologiji ćelija i kolonija, uprkos tome što su bili izolovani iz različitih medijuma. Ovi sojevi su bili takođe veoma slični u pogledu svojih biohemijskih profila dobijenih sa VITEK sistemom. Postavlja se pitanje da li su izolovane bakterije identični sojevi, RAPD je metod koji ne zahteva informaciju o sekvencama, a koji se može primeniti za razlikovanje sojeva. Ukratko, cela genomska DNKje PCR amplifikovana sa prajmerom od 10 parova baza sa malom stringencijom, tako da su bile amplifikovane slučajne sekvence DNK na bazi homologih sekvenci u odnosu na prajmer koji je bio prisutan u ciljnoj DNK. Rezultujući PCR proizvodi se mogu razdvojiti elektroforezom na agaroznom gelu, a rezultujuća slika se može uporediti sa sojevima. Rezultujući prikazi traka za sve LH sojeve su bili analogni za pet upotrebljenih RAPD prajmera (OPL07, M13, OPX14, OPA16, OPA18) Prikaz se jasno razlikuje od onog zaE. colisoj DSMZ 8697 (Fig. 2a), soj za koji je navedeno da ima aktivnost krvne grupe B MU sojevi takođe izgledaju veoma slično (Fig. 2b); međutim, njihov prikaz traka se jasno razlikuje od one za drugeBacteroidessojeve, uključujući AG6. Izgleda da je po jedan Ćore 1 pozitivni soj od svakog pozitivnog donora bio ponovljeno obogaćen tokom procesa izolacije. Ti sojevi su bili izolovani od različitih pojedinaca.

Primer 4 Gajenje i fiksacija bakterija za skrining na bazi ELISE

[0294] Dobro razdvojene kolonije su bile sakupljene na slučajan način sa selektivnih i neselektivnih agar ploča i ponovo su stavljene u vidu linije tri puta na neselektivne medijume. Pojedinačne kolonije su bile sakupljene i inokulisane u ST (kao gore, uz izostavljanje agara), VVC ili MRS čorbi, u zavisnosti od toga šta je obezbedilo najbolji rast, pa su gajene preko noći na 37°C. Ove kulture su bile inokulisane (1 %) u 300 ml svežeg ST, VVC ili MRS čorbe, te su rasle preko noći na 37°C. Ćelije su bile peletirane (8000 * g, 15 min, 4 C) i re-suspendovane u 10 ml PBS-c (8 g 1~1 NaCI, 0,2 g 1 1 KCI, 1,44 g 1~1 Na2HP04, 0,24 g T1 KH2P04) (12) Ova suspenzija je bila fiksirana od 3 do 4 h na 4 °C dodavanjem 30 ml 4 % rastvora paraformaldehida (PFA) (pripremljen prema (8)) u PBS-c. Kao sledeće, uzorci su bili isprani sa 40 ml PBS-c (8000 *g,15 min, 4 °C), a pelete su bile suspendovane u 15 ml PBS-c, što je bilo praćeno dodavanjem jednake zapremine 96 % ledeno hladnog etanola. Uzorci su bili čuvani na -20 °C sve do analize.

[0295] Čistoća kultura je bila proverena upoređivanjem morfologije ćelija, kao i ponašanja pri Gram bojenju. Kulture su bile aerobno zasejane na CBA da bi se utvrdila njihova sposobnost da rastu u prisustvu kiseonika i da bi se proverila odsutnost aerobnih kontaminanata.

Primer 5 Održavanje izolata

[0296] Krio-zalihe su bile držane u Microbank epruvetama (MAST Diagnostica, Rajnfeld, Nemačka) prema instrukcijama proizvođača i čuvane su na -80 °C. Radne zalihe su bile držane u VVC, ST ili MRS čorbi. One su bile subkultivisane svakih 14 dana. Čistoća kultura je bila konstatovana opservacijom ponašanja pri Gram-bojenju. morfologije ćelija i periodičnim upoređivanjem morfologija kolonija na CBA pločama za širenje i pod aerobnim i pod anaerobnim uslovima.

Primer 6 Gajenje, fiksacija i liofilizacija bakterija za eksperimente sa životinjama

[0297] Za primenu u eksperimentima sa životinjama bakterije su bile gajene i fiksirane, kao što je bilo opisano u sekciji 3 sa sledećim modifikacijama: inicijalna zapremina kulture je iznosila približno 4 1. Pre fiksacije, bakterije su bile isprane jednom sa 100 ml PBS-b (8000 *g,15 min, 4 !,C) i resuspendovane u minimalnoj mogućoj zapremini PBS-b. Ova suspenzija je bila podeljena u dva jednaka dela, jedan za fiksaciju (7.1), drugi za liofilizaciju (7.2).

6. 1 Fiksacija

[0298JDeo za fiksaciju je bio ispran (8000 * g, 15 min, 4 °C) i resuspendovan u 30 ml PBS-c. Ova suspenzija je bila dodata u 90 ml 4 % PFA rastvora u PBS-c, pa je zatim fiksirana od 3 do 4 h na 4 °C. Da bi se poboljšalo odstranjivanje PFA, uzorci su bili isprani tri puta sa 120 ml PBS-c (8000 *g,15 min, 4 °C). Ćelijske pelete su bile suspendovane u 45 ml PBS-c, što je bilo praćeno dodavanjem jednake zapremine 96 % ledeno hladnog etanola. Uzorci su bili čuvani na -20°C.Pre davanja životinjama, fiksirane bakterije su bile liofilizirane pod sterilnim uslovima u LidBac epruvetama (Eppendorf, Hamburg, Nemačka) da bi etanol ispario. Da bi se obezbedila nevijabilnost fiksiranih bakterija, one su bile inokulisane (1 %) u VVC čorbi, pa su onda zasejane na CBA i praćeno je odsustvo rasta tokom perioda od jedne nedelje.

6. 2 Pasterizacija

[0299]Bakterijske suspenzije su bile isprane dva puta u PBS, pa su resuspendovane u maloj zapremini PBS. Bakterijske suspenzije su bile inkubirane na 72°C tokom 30 min. Kao kontrola uspešne inaktivacije, bakterije su bile inkubirane u podesnom medijumu za kultivaciju koji je opisan u primeru 4.

6. 3 Liofilizacija

[0300]Deo za liofilizaciju je bio dodat u jednaku zapreminu 24 % sterilno isfiltrirane saharoze, te je alikvotiran u porcijama od 300 pl u LidBacepruvete od 2 ml. Ovi alikvoti su bili trenutno zamrznuti u tečnom azotu tokom 1 h, pa su zatim liofilizirani (Alpha 2-4, Christ, Osterode, Nemačka) posle stavljanja na stalke prethodno ohlađene na -80 °C. Posle liofilizacije, poklopci epruveta su bili zatvoreni, a one su čuvane na 4 "C korišćenjem Anaerocult<®>C mini gasnog generatorskog sistema (Merck, Darmštat, Nemačka) uz dodavanje silika gel narandžaste (Roth, Karlsruhe, Nemačka) kao desikanta.

6. 4 Prebrojavanje preparata bakterija

[0301]Ukupan broj ćelija preparata fiksiranih i liofiliziranih bakterija je bio određen pomoću Thoma-chambera dubine od 0,41 mm (LO-Laboroptik, Fridrihsdorf, Nemačka) Za liofilizovane bakterije, jedinice formiranja kolonija (engl. colonv-forming units, skr. CFU) su bile određene zasejavanjem 10-strukih serijskih razređivanja kultura na VVC agaru preko noći, i neposredno pre i posle liofilizacije. Za ovu svrhu, liofilizat je bio rastvoren u 300 pl VVC čorbe, pa je ostavljeno da stoji 15 min, te je resuspendovan obrtanjem malom brzinom i serijski je razređen. CFU liofilizovanih preparata su bili prebrajani pre i posle upotrebe u eksperimentima sa životinjama da bi se obezbedila vijabilnost. Čistoća preparata je bila proverena kao što je bilo opisano u sekciji 4.

Primer7 Uzorci seruma

[0302]Krv je bila sakupljena sa S-monvette sistemom (Sarstedt, Numbreht, Nemačka), a serum je bio pripremljen prema instrukcijama proizvođača. Uzorci seruma su bili čuvani u alikvotima na -80°C pre analize.

Primer 8 Ekstrakcija fekalnog IgA

[0303]Sakupljeni su uzorci fecesa, pa su čuvani na -80 °C. Feces je bio liofiliziran, pa su zabeležene neto suve težine. Sve manipulacije su bile izvedene na ledu. Fekalni IgA je bio ekstrahovan prema Grevvalu (6) uz neke modifikacije. Liofilizovani uzorci (-30 mg) su bili suspendovani u odnosu od 15 pl/mg suve težine u puferu za ekstrakciju igA (PBS-Dulbecco (Biochrom, Berlin, Nemačka) sa 1 g I"<1>BSA) sa inhibitorima proteaze (5 pg ml"1 leupeptina (Calbiochem, Merck), 48 pg ml"<1>4-(2-aminoetil)-benzensulfonilfluorida (Merck), 1 pg ml"' aprotinina, 2 pg ml"<1>bestatina (Sigma, Steinheim, Nemačka) i onda su homogenizovani. Uzorci su bili mešani obrtanjem svakih 10 min. Posle perioda inkubacije od 1 h, uzorci su bili centrifugirani (16000 x g, 10 min, 4 °C), pa je supernatant bio sakupljen u novu epruvetu. Preostala peleta je bila suspendovana u odnosu od 10 pl/mg suve težine u puferu za ekstrakciju IgA, pa je zatim homogenizovana. Procedura ekstrakcije je bila ponovljena, a rezultujući supernatant je bio sjedinjen sa supernatantom iz prvog koraka ekstrakcije. Ovi supernatanti su bili centrifugirani (16000 x g, 10 min, 4 °C), a rezultujući supernatant je bio raspodeljen u nove epruvete, te je trenutno zamrznutu tečnom azotu i čuvan je na -80 °C sve do analize.

Primer 9 Skrining bakterijskih sojeva enzimski vezanim imunosorbentnim testom

[0304]Fiksirane bakterije su bile razređene u PBS, broj ćelija je bio podešen na 1x10<3>, 1x10<6>, 5x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>ili 5x10<8>ćeiija/ml. Mikrotitarska ploča sa 96 bunarčića je bila obložena sa 50 pl bakterijskog rastvora po bunarčiću preko noći na 37°C. Ploče su bile isprane 3 puta sa PBS/ 0,02 % Tween 20 (identični koraci ispiranja su bili izvršeni posle svakog koraka inkubacije). Posle blokiranja ploča sa PBS/2% BSA, ELISA ploče su bile inkubirane sa supernatantima kulture hibridoma koja je sadržala različita monoklonska antitela koja prepoznaju Core-1 (Nemod-TF1, Nemod-TF2 ili A68/BA11,) ili kontrolno antitelo (A63- B/C2) u različitim razređivanjima. Kao sekundarno antitelo služio je poliklonski kozji-anti-mišiji imunoglobulin konjugovan sa peroksidazom (Dako P0260). Test je bio razvijen sa TMB kao supstratom, reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 2,5 N H2S04i ekstinkcija je bila izmerena na 450 / 630 nm. Za određivanje osetljivosti vezivanja antitela na perjodat, obložene ELISA ploče su bile inkubirane prvo sa natrijum perjodatom pre inkubacije sa antitelima. Zbog toga, ploče su bile isprane sa natrijum acetatnim puferom (50mM, pH 4,5) tokom 5 min, a posle toga su bile inkubirane sa 10mM perjodne kiseline u natrijum acetatnom puferu tokom 1h u tami. Ploče su bile isprane sa natrijum acetatnim puferom (5 min), pa je reakcija bila zaustavljena dodavanjem 50mM natrijum borohidrida u PBS (30min)

[0305]Primer takvih ELISA rezultata je prikazan na Fig. 3.

Primer 10: Preparat komponenata bakterija koje sadrže Core-1

10. 1. Analiza sirovih preparatakapsula sa SDS- PAGE i Western blot analizama

[0306]Sirovi preparati kapsula soja AG6 su bili pripremljeni prema Pantosti etal. (1991, Infect. Immun. 59, 2075-2082)

[0307]Preparat kapsula je bio analiziran sa SDS-PAGE, a polisaharid u preparatu koji je bio detektovan sa bojenjem alcijan plavim prema Karlvshev et al. (2001, J. Clin. Microbiol. 39, 279-284) je pokazivao mnoštvo različitih traka koje su sadržale ugljeni hidrat i visoki procenat ugljenih hidrata velike molekulske težine u preparatu (Fig. 4A). Posle VVestern blota, polisaharidi su bili detektovani sa DIG-Glycan Detection Kitom (LaRoche Diagnostics). Jake trake su se pokazale na 37 i 26 kDa. (Fig. 4B). Detekcija polisaharida koji sadrži core-1 na westem blotu je izvršena uz korišćenje core-1-specifičnog antitela NEMOD-TF2 (supernatant kulture), stoje pokazalo core-1-pozitivnu traku na 37kDa (Fig. 4C).

10. 2. Hromatografsko obogaćivanje core- 1 pozitivnih polisaharida

[0308]U preparatu kapsula soja AG6 je još uvek bilo kontaminanata lipopolisaharida, kao što su pokazala merenja KDO sadržaja od 11,2 pmol/pg prema Haraetal. 1989, Anal. Biochem. 179, 162-166) i sa SDS-PAGE.

[0309]Zbog toga su kapsulami polisaharidi i lipopolisaharidi bili razdvojeni reverzno faznom hromatografijom na C18 koloni korišćenjem propanolsko/metanolskog-gradijenta (vidi Fig. 5) prema Hashimoto et al. (2001, Eur. J. Biochem. 268, 3139-3144). Polisaharidi su eluirani sa gradijentom etuenta B (72% propanola/ 8% metanola u 0,1M amonijum acetata pH 4,5). Detekcija polisaharida u okviru frakcija je bila izvršena sa dot blotom i DIG-Glycan-Kitom. Detekcija core-1 je bila izvršena korišćenjem core-1 specifičnih antitela Nemod-TF1 i Nemod-TF2. Polisaharidi su bili eluirani sa koncentracijama propanola od 14-19% i 25-43%. Core-1 specifični ugljeni hidrat je bio detektovan samo sa 29-29,4% propanola (RP1) i 39-42% propanola (RP2), vidi Fig. 5 koja pokazuje jako obogaćivanje core-1 pozitivnog polisaharida ovim metodom.

[0310]Core-1 pozitivne frakcije su bile upotrebljene za dodatna hromatografska razdvajanja blago kiselom hidrolizom, praćenom sa DEAE-hromatografijom uz korišćenje 0-0,5M NaCI gradijenta prema Tzianabos et al. (1992, J. Biol. Chem. 267, 18230-18235). Ovim metodom su Core-1-pozitivni polisaharidi bili razdvojeni na tri frakcije koje su eluirane sa 0 M NaCI (D1), 0,04 M NaCI (D2) i 0,9-0,17 M NaCI (D3), što je rezultovalo daljim obogaćivanjem core-1-pozitivnih polisaharida.

[0311]Kapsulami polisaharidiB. ovatusAG6 su prečišćeni, a struktura je analizirana masenom spektrometrijom. Prvenstveno su kapsulami polisaharidiB. ovatus AG6akumulirani ekstrakcijom fenol voda praćenom sa ekstrakcijom etrom, kao što su već opisali Pantosti et al. 1991. Posle toga, core-1-pozitivni polisaharid je akumuliran iz grubog kapsularnog preparata (CPS) reverzno faznom hromatografijom (C18 Synergi 4p Fusion-RP 80i, 250 mm x 10mm, Phenomenex). Sadržaji monosaharida u grubom kapsularnom polisaharidnom ekstraktu i prečišćenom core-1-pozitivnom polisaharidu su određeni pomoću HPAEC-PAD analiza (anjonska izmenjivačka hromatografija sa visokim pH, impulsna amperometrijska detekcija). Konačno je masenom spektrometrijom analizirana struktura core-1-pozitivnog kapsularnog polisaharida.

70.3 Analiza monosaharida ekstrakta grubog kapsularnog preparata i prečišćenog kapsularnog ekstrakta

B. ovatus AG6

[0312]U prvom koraku, core-1-pozitivni polisaharid grubog kapsularnog preparataB. ovatus AG6 jeakumuliran reverzno faznom hromatografijom, kao što je već bilo opisano. Posle toga je bio određen prinos prečišćavanja, kao i sadržaj monosaharida u akumulisanom core-1-pozitivnom polisaharidu sa HPAEC-PAD analizama.

[0313]Pre nego što je izvršena analiza monosaharida, ekstrakti polisaharida su bili kompletno hidrolizovani sa 2 N tnfluorosirćetne kiseline (TFA) na 100 °C tokom 4 h. Tokom TFA hidrolize su se izgubile acetil grupe. Zato se monosaharidi glukozamin i galaktozamin (GlcNH2i GalNH2) nisu mogli razlikovati od N-acetilglukozamina i /V-acetilgalaktozamina (GIcNAc i GalNAc). Monosaharidi su bili razdvojeni anjonsko izmenjivačkom hromatografijom sa visokim pH i zatim su detektovani impulsnom amperometrijom kao što je već bilo opisano. Da bi se identifikovali monosaharidi i da bi se odredile njihove koncentracije, bili su upotrebljeni eksterni i interni monosaharidni standardi.

[0314]Proporcionalni sadržaj monosaharida u grubom CPS ekstraktu, koji je bio određen za poređenje LPS i CPS (ranije pomenuti). očigledno odstupa od proporcionalnog sadržaja monosaharida grubog CPS ekstrakta koji je određen za ovo poređenje. Oba gruba CPS ekstrakta su bila pripremljena od različitih kultura B.ovatusAG6, koje bi mogle biti objašnjenje za pomenuto odstupanje sadržaja monosaharida.

[0315]Prinos core-1-pozitivnih polisaharida akumuliranih sa reverzno faznom hromatografijom je bio 30 %. Poređenje proporcionalnih sadržaja monosaharida i prečišćenih kapsularnih ekstrakata je otkrilo povećanu količinu fukoze, GalNAc/GalNH2, galaktoze i glukoze, dok bi glukoza mogla biti kontaminacija (tabela 7). Proporcionalni sadržaj ramnoze, GlcNH2/GlcNAc i manoze bi mogao biti smanjen reverzno faznom hromatografijom (tabela 7). Galakturonska kiselina i glukuronska kiselina, koje su karakteristične komponente kapsularnih polisaharida, ne bi mogle biti identifikovane u prečišćenom ekstraktu core-1-pozitivnog polisaharida. Ovo bi moglo ukazivati daB. ovatusAG6 ima više od jednog kapsularnog polisaharida. Oba kapsulama polisaharida bi mogla biti međusobno razdvojena reverzno faznom hromatografijom. Tzianabos et al. (1992) takođe opisuju da se kapsulaB. fragilissastoji od dva različita polisaharida.

[0316]Akumulacija fukoze, GalNH2/GalNAc i galaktoze mogla bi biti indikacija da su ovi monosaharidi komponente ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog polisaharida, dok bi jako smanjeni monosaharidi mogli biti male kontaminacije.

10. 4 Strukturna analiza core- 1 pozitivnog polisaharida masenom spektrometrijom

[0317]Struktura core-1-pozitivnog polisaharida je bila analizirana masenom spektrometrijom sa matricom potpomognutom laserskom desorpcijom (MALDI-TOF-MS), kao što je već bilo gore opisano i elektrosprej masenom spektrometrijom sa jonskom zamkom (ESI-lon-Trap-MS).

[0318]Za ESI-lon-Trap masenu spektrometriju je akumulirani core-1-pozitivni polisaharid bio fragmentiran bilo hidrolizom sa 1% sirćetne kiseline (1,5h, na 100°C) ili enzimskom digestijom sa hondroitinazom ABC (kidaranje B1-4GalNAc/GlcNAc veza) ili sa B1-3 galaktozidazom. Pored toga, dolazi do fragmentacije sa dvostrukom digestijom sa hondroitinazom ABC/a 1-3,4 fukozidazom ili 1% sirćetnom kiselinom / B1-3 galaktozidazom (svi enzimi su bili nabavljeni od Glyko GmbH). Sve enzimske digestije su bile inkubirane na 37°C preko noći. Analize masenom spektrometrijom (MS, kao i MS/MS) su bile izvedene u pozitivnom i u negativnom modu. Pre nego što su izvršene analize, svi uzorci su bili desalinizovani sa Carbograph SPE (Aalltech Associates Inc.), kao što je bilo opisano u uputstvima proizvođača i razređeni su u 2,5 mM NH3/40% acetonitrila.

[0319]Struktura core-1-pozitivnih glikanskih fragmenata, koja je već bila identifikovana sa MALDI-MS analizama, mogla je biti verifikovana sa ESI-lon-Trap određivanjem. Dodatni fragmenti su takođe bili identifikovani sa ESI-lon-Trap masenom spektrometrijom (tabela 8).

[0320]Sekvenca ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog kapsularnog polisaharida je bila određena preklapanjem fragmenata (Fig. 6).

[0321]Analize masenom spektrometrijom enzimski digestiranih core-1-pozitivnih polisaharida su dale indikacije o glikozidnim vezama između monosaharida. Pored toga, mogle bi biti identifikovane galaktoza (uspešno kidanje sa (31-3 galaktozidazom) i fukoza (uspešno kidanje sa a 1-3,4 fukozidazom) (Fig. 7).

[0322]Ovaj rezultat je u skladu sa ranije pomenutim analizama monosaharida, koje otkrivaju akumulaciju fukoze, galaktoze i GalNAc.

10 5 Verifikacija core- 1 - strukture kao razgranatog disahanda ponavljajuće jedinice kapsularnog

polisaharida

[0323]Razgranata core-1-struktura, GalB1-3GalNAc, u ponavlljajućoj jedinici je mogla biti identifikovana dvostrukom digestijom sa egzoglikozidazama B1-3 galaktosidazom i HexNAkazom (B1-2,3,4,6 GalNAc/GIcNAc kidanje) praćenom sa analizama monosaharida, kao što je gore opisano.

[0324]Dva uzorka koja su sadržala jednake količine core-1-pozitivnog polisaharida su bila isfiltrirana radi njihovog prečišćavanja od slobodnih monosaharida. Potom je jedan od dva uzorka bio digestiran sa B1-3 galaktozidazom na 37"C preko noći. Oba uzorka su bila jednom isfiltrirana da bi se ponovo razdvojila slobodna galaktoza od digestiranog uzorka, dok je nedigestirani uzorak bio upotrebljen kao negativna kontrola. Posle toga, retentati su sakupljeni i digestirani sa HexNAkazom. Konačno su oba uzorka bila ponovo isfiltrirana Svi eluati su bili analizirani sa HPAEC-PAD.

[0325]Da bi se provenlo da li je core-1-struktura bila odstranjena dvostrukom digestijom, a da je bila nedodirnuta sa digestijom sa HexNAkazom (negativna kontrola), retentati su bili analizirani sa dot-blot korišćenjem DIG-Glycan Detection Kita (Roche Diagnostics) da bi se detektovali polisaharidi i core-1-specifično antitelo Nemod-TF1 da bi se identifikovala core-1-struktura.

[0326]U oba eluata dvostruko digestirani uzorak galaktoze (prvi eluat) i GalNAc (drugi eluat) bi mogli biti identifikovani analizom monosaharida. U eluatu negativne kontrole, koji je bio digestiran samo sa egzoglikozidazom HexNAkazom, nisu mogli biti identifikovani ni galaktoza, ni GalNAc. Ovo je jaka indikacija o grananju core-1- strukture, GalB1-3GalNAc.

[0327]Dot-Blot analize dvostruko digestiranog retentata i HexNAkazom digestiranog uzorka korišćenjem DIG-Glycan detection Kita otkrile su slične koncentracije polisaharida, koji je bio nanet na nitroceluloznu membranu. Core-1- struktura nije mogla biti detektovana u bilo kom dvostruko digestiranom uzorku, dok je u HexNAkazom digestiranom uzorku core-1-struktura bila još uvek identifikovana imunoblotom uz korišćenje Nemod-TF I antitela.

10. 6 Verifikacija struktura core- 1- pozitivnog polisaharida analizama posebnih fragmenata.

[0328]Za dalju verifikaciju strukture core-1-pozitivnog polisaharida, glikan je fragmentisan hidrolizom sa

1 % sirćetne kiseline (1,5 h, 100°C). Fragmenti glikana su bili obeleženi sa fluorofor 2-amino benzamidom (2-AB), kao što su već opisali J.C. Bigge et al. (1995) Za ovu proceduru, uzorci su bili oslobođeni od čestica i od soli prečišćavanjem na Carbograph SPE koloni (Alltech Associates Inc.), pa su liofilizovani Peleta je bila rastvorena u 5 pl 2- AB u DMSO/ledeno hladnoj sirćetnoj kiselini/ natrijum cijanoborohidndu, pa je inkubirana na 60 °C tokom 2 h. Sa 2-AB obeleženi fragmenti su bili razdvojeni od slobodnog 2-AB hromatografijom na papiru. Konačno su sa 2-AB konjugovani fragmenti bili eluirani sa vodom. Posle liofilizacije peleta je bila rastvorena u 50% acetonitrila. Na bazi njihove veličine, fragmenti su bili razdvojeni normalno faznom HPLC (kolona: Luna 3p NH2 A100, Phenomenex, eluent A: 15 mM NH4-acetat, eluent B: acetonitril) detekcijom fluorescencije. Sekvenca fragmenata je bila analizirana ESI masenom spektrometrijom. Konačno, radi verifikacije glikozidnih veza i bolje identifikacije monosaharida koji su bili komponente fragmenata, oligosaharidi su bili razgrađeni sa egzoglikozidazom (31-3 galaktozidazom. a1-3,4 fukozidazom i HexNAkazom, kao što je već bilo opisano. Uspeh digestije je bio kontrolisan sa ESI masenom spektrometrijom, a odstranjivanje terminalnih monosaharida je bilo identifikovano sa HPAEC-PAD, kao što je već bilo opisano.

[0329]Već identifikovana struktura ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog polisaharida je bila potvrđena sa obe analize dobijanjem očekivanih fragmenata oligosaharida i pokidanih monosaharida (tabela 9).

[0330]Kao zaključak, struktura ponavljajućih jedinica core-1-pozitivnog kapsularnog polisaharida (Fig. 8) je bila potvrđena mnoštvom analiza.

Primer 11 Životinjski model

11. 1 Intraperitoneaina imunizacija miševa sa mrtvim bakterijama

11- 1. 1 Analiza mišijih seruma testom 1 humoralne imune reakcije

[0331]Ženski Balb/c miševi (Charles River, 4 po grupi) su bili tretirani sa Ciklofosfamidom u dozi od 50 mg/kg telesne težine dnevno na dan -1. U danima 0, 7 i 14 miševima je bio peritonealno injektirano 5 x 108 bakterija (core-1 negativni sojevi AG3 (grupa I), 32 ili 53 ili core-1 pozitivni soj AG6 (grupa K)) u PBS ili samo PBS (grupa L). Uzorci seruma su bili uzeti u danima -4, 21, 27 i 30.

[0332]Mišiji serumi su bili analizirani radi određivanja vezivanja za core-1 u ELISI. Kao antigen koji nosi Core-1 je služio azialoglikoforin. Kao negativna kontrola je bio upotrebljen azialoglikoforin tretiran sa perjodnom kiselinom. Tretman perjodatom uništava spoljašnji ugljeno-hidratni prsten core-1, čime uništava Core-1 epitope

[0333]Mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom su bile obložene sa azialoglikoforinom A (AGP) u koncentraciji od 2ug/ml. Ploča je bila isprana 3 puta sa PBS/Tween.

[0334]Pola ploče je bilo tretirano sa perjodatom kao što sledi.

[0335]Bunarčići su bili inkubirani 5 minuta sa 50mM natrijum acetatnog pufera pH 4,5 što je bilo praćeno sa 1h inkubacije sa 10mM perjodne kiseline u acetatnom puferu u tami. Bunarčići su bili inkubirani tokom 5 minuta sa 50mM natrijum acetatnog pufera pH 4.5. Reakcija je bila zaustavljena inkubacijom sa natrijum borohidridom (50mM u PBS, 30 min). Kao sledeće, ploče su bile isprane 5 puta sa PBS/Tween.

[0336]Ploče su onda bile blokirane dodavanjem 2% BSA tokom 30min

[0337]Inkubacija sa različitim razređivanjima mišijih seruma je bila izvršena tokom 1,5h. Vezani misiji imunoglobulin je bio detektovan kozjim anti-mišijim IgM antitelom konjugovanim sa peroksidazom (1:5000 u PBS/1% BSA) Test je bio razvijen sa TMB kao supstratom, a reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 2,5 N H2S04.

[0338]Fig 9 prikazuje vezivanje serumskih IgM-antitela za core-1 pozitivni AGP i core-1 negativni AGP (AGP+PJ). Serumi samo tri od 4 miša imunizovana sa Core-1-pozitivnim bakterijama (grupa K) su pokazali jako vezivanje za AGP, dok je signal smanjen posle kidanja Core-1 sa PJ.

[0339]Zbog toga su core-1-pozitivne bakterije sposobne za indukovanje core-1-usmerenog humoralnog imuniteta kod miševa.

11. 1. 2 Analiza mišijih seruma testom 2 humoralne imune reakcije

[0340]Muški C3H miševi (Charles River, 4 po grupi) su bili intraperitonealno imunizovani sa 5x10<8>pasterizovanih bakterija od Core-1 pozitivnih i Core-1 negativnih sojeva u 200pl PBS u danima 0, 7 i 14. Serumi su bili sakupljeni pre imunizacije i u danima 13, 21 i 28, pa su analizirani u testu 2 humoralne imune reakcije,

[0341]Mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića i ravnim dnom su bile obložene sa različitim konjugatima ugljeni hidrat-PAA (GlcNAcpi-2Galp1-3GalNAca-PAA, Fuca1-2Gaipi-3GalNAca-PAA, GalNAcal-3Gaip-PAA, Gala1-3-GalNAcP-PAA, Gal beta1-3GalNAc alphal-PAA) sa 5pg/ml u puferu za oblaganje (8,4 g/l NaHC03, 3,56g/l Na2C03, pH=9,49) i inkubirani su preko noći na 4"C.

[0342]Ploča je bila isprana 3 puta sa PBS/Tween.

[0343]Ploče su onda bile blokirane dodavanjem 2% BSA tokom 30min

[0344]Inkubacije sa različitim razređivanjima mišijih seruma su bile izvršene tokom 1,5h. Vezani misiji imunoglobulin je bio detektovan kozijim anti-mišijim IgM antitelom konjugovanim sa peroksidazom (1:5000 u PBS/1% BSA). Test je bio razvijen sa TMB kao supstratom, a reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 2,5 N H2S04.

[0345]Fig. 10 prikazuje srednju vrednost ELISA signala protiv PAA konjugata Gal betal-3GalNAc alphal-PAA u odnosu na ELISA signal protiv GlcNAcpi-2Gaipi-3GalNAca-PAA, za serume od 4 miša po grupi za dan 0 (preimuni serum) i dan 21 [relativni ELISA signal je izračunat pomoću jednačine: (ELISA signali protiv Gal beta1-3GalNAc alphal-PAA)<*>100/ (ELISA signal protiv GlcNAcpi-2Galp1-3GalNAcct-PAA)]. Serumi su bili računati kao pozitivni, ako je imuni serum pokazao povećanje od najmanje 50% u poređenju sa pre-imunim serumom. Trebalo bi da bude pokazano da samo Core-1-pozitivni sojevi AG6 i MUI indukuju Core-1 specifičnu humoralnu imunu reakciju kod miševa.

11. 1. 3 Analiza mišijih seruma testom 3 humoralne imune reakcije

[0346]Ženski Balb/c miševi (Charles River, 4 po grupi) su bili tretirani sa ciklofosfamidom u dozi od 50 mg/kg telesne težine na dan -1. U danima 0, 7 i 14 miševima je bilo intraperitonealno injektirano5 x 10<8>bakterija (core-1 negativni sojevi AG3 (grupa I), 32 ili 53 ili core-1 pozitivni soj AG6 (grupa K)) u PBS ili samo PBS (grupa L) Uzorci seruma su bili uzeti u danima -4, 21, 27 i 30.

[0347]Bile su izvršene analize protočnom citometrijom sa ciljem da se analizira vezivanje mišijih seruma za Core-1 pozitivne i core-1 negativne humane tumorske ćelijske linije (NM-wt i NM-D4, respektivno; NM-wt je roditeljska ćelija od NM-D4 kao što je opisano u VVO2005/017130 A2 i EP1654353, NM-D4 je deponovan kod DSMZ pod DSM ACC2605). Bilo je peletirano 3 x 10<b>ćelija po epruveti, pa je peleta bila resuspendovana u 50 pl mišijeg seruma (razređenog 1:50 u PBS/10%FCS), kontrolnom antitelu ili samom PBS/10%FCS. Uzorci su bili inkubirani tokom 20 min na 4°C, pa su isprani sa PBS i centrifugirani Kao sledeće, ćelije su bile inkubirane sa kozijim anti-mišijim-lgM antitelom konjugovanim sa Cy3 (Jackson Immuno Research, 1:200 u PBS/10%FCS) tokom 20 min na 4°C, te su isprane sa PBS i resuspendovane su u 200 ml PBS za analizu protočnom citometrijom.

[0348]Fig. 11 prikazuje vezivanje IgM antitela iz mišijih seruma za humane ćelijske linije NM-wt (Core-1 negativne) i NM-D4 (core-1 pozitivne). Dok je vezivanje za Core-1 negativnu NM-wt liniju uporedivo između miševa imunizovanih sa Core-1 negativnim bakterijama (grupa I) i Core-1 pozitivnim bakterijama (grupa K), postoji znatno jače vezivanje kod 3 od 4 miša iz grupe K za Core-1 pozitivnu NM-D4 liniju. Ovo je indikacija core-1 specifičnosti humoralne imune reakcije kod miševa imunizovanih sa Core-1 pozitivnim bakterijama.

11. 2. Oralna imunizacija miševa bez klica sa živim Core- 1 pozitivnim bakterijama

[0349]C3H-miševi bez klica su bili oralno imunizovani sa 2x169 živih bakterija soja AG6 u danima 2, 3, 4, 9,10,11, 16, 17 i 18 Uzorci seruma su bili uzeti na dan 0 (pre-imuni serumi) i u danima 14 i 21 i bili su analizirani u pogledu AGP- specifičnih IgM antitela u testu 1 humoralne imune reakcije.

[0350]Kod imunizovanih miševa su se pojavili povećani anti-core-1 titri u poređenju sa kontrolnim miševima, što je pokazano vezivanjem mišijih seruma za mikrotitarske ploče obložene sa AGP. Detekcija vezanog mišijeg IgM je bila izvršena sa anti-mišijim-lgM antitelima kuplovanim sa peroksidazom. Specifičnost signala za core-1 je bila prikazana smanjenjem ELISA signala posle tretmana sa perjodnom kiselinom (koja uništava ugljenohidratnu strukturu). Posle 14-tog ili 21-vog dana 3 od 3 miša su imala povećane nivoe IgM-antitela za Core-1, dok kontrolni miševi nisu pokazali povećanje ELISA signala za AGP u poređenju sa AGP +PJ, kao što je pokazano na Fig. 12.

11. 3 Oralna imunizacija C3H miševa sa pasterizovanim Core- 1 pozitivnim bakterijama

[0351]C3H-miševi su bili oralno imunizovani sa 2x10<11>(grupa A) ili 2x10<10>(grupa B) pasterizovanih bakterija soja AG6 dnevno u danima 0 do 28. Uzorci seruma su biliuzeti nadan -1(pre-imuni serumi) i u danima 13. 21, 28 i 35. te su analizirani radi određivanja AGP- specifičnih IgM antitela u testu 1 humoralne imune reakcije.

[0352]Imunizovani miševi su ispoljili povećane anti-Core-1 titre u poređenju sa kontrolnim miševima, što je pokazano vezivanjem mišijih seruma za mikrotiterske ploče obložene sa GP ili AGP (sa i bez lečenja sa perjodnom kiselinom). Detekcija vezanog mišijeg IgM je bila izvršena sa anti-mišijim-lgM antitelima kuplovanim sa peroksidazom. Specifičnost signala za core-1 je bila pokazana smanjenjem ELISA signala posle tretiranja sa perjodnom kiselinom (smanjenje uništavanja ugljenohidratne strukture od najmanje 30%) i manjim signalom protiv GP (povećanje AGP signala od najmanje 50%)

[0353]Pokazano je da su 5 od 6 miševa iz grupe A i 5 od 8 miševa iz grupe B imali razvijena Core-1 specifična antitela na dan 21 (Fig. 13).

[0354]U testu 3 humoralne imune reakcije misiji serumi su bili analizirani radi određivanja vezivanja za

Core-1 pozitivnu tumorsku ćeliju liniju NM-D4 u poređenju sa Core-1 negativnom ćelijskom linijom NM-wt protočnom citometrijom Bilo je peletirano 3 x 105 ćelija po epruveti, a peleta je bila resuspendovana u 50 pl mišijeg seruma (razređenog 1:300 u PBS/1%BSA), kontrolnom antitelu ili samom PBS/1%BSA. Uzorci su bili inkubirani tokom 60 min na 4°C, pa su isprani sa PBS i centrifugirani. Kao sledeće, ćelije su bile inkubirane sa kozijim anti-mišijim-lgM antitelom konjugovanim sa biotinom (Jackson Immuno Research; 1:200 u PBS/1%BSA) tokom 60 min na 4°C, a onda su isprane sa PBS. Posle toga, ćelije su bile inkubirane sa streptavidinom konjugovanim sa Cy3 (Jackson Immuno Research, 1:200 u PBS/1%BSA) tokom 60 min na 4°C i zatim su resuspendovane u 200pl PBS za analizu protočnom citometrijom.

[0355]Rezultati su bili izračunati prema sledećoj formuli: (% pozitivnih ćelija na NM-D4imuniserum- % pozitivnih ćelija na NM-D4pre.imuniserum) / (%<p>ozitivnih ćelija na NM-w<t>imuniserum- % pozitivnih ćelija naNM-wtpre.imunjserum)<=>X

[0356]Misiji serumi sa količinikom X>10 su smatrani pozitivnim (sa % pozitivnih ćelija na NM-wtimuniserum

- % pozitivnih ćelija na NM-wtpre.imuniserum<ž1>).

[0357]Na dan 28, 11 od 13 miševa je razvilo humoralnu imunu reakciju protiv Core-1 pozitivne humane tumorske ćelijske linije NM-D4, kao što je prikazano na Fig. 14

Primer 12. Potenticijal Core-1 pozitivnih bakterija za indukovanje ćelijske imune reakcije( in vitro)

12. Generisanje funkcionalnih dendritskih ćelija

[0358]Dendritska ćelijska linija NemodDC (pNM-DC)je bila upotrebljena kao izvor ćelija koje su prezentovale antigen (APC). pNMDC su bile diferencirane u iNM-DC, što je bilo praćeno snabdevanjem sa bakterijskim lizatima (BaLy) sledećih sojeva bakterija: AG6, MU1, 52 i 53. U medijum za kultivaciju je bilo dodato 50pg/ml svakog BaLy zajedno sa sazrelim citokinima, pa su iNMDC bili diferencirani do njihovog zrelog statusa (mNM-DC).

[0359]Preciznije, u prvom koraku su pNM-DC (1 x 10<5>/ml) bile diferencirane u iNM-DC 7-modnevnom inkubacijom u NemodDC medijumu (70% MEM-a, 20% FCS, 10% CM5637) uz dodavanje 1000 U/ml GM-CSF, 100 U/ml IL-4 i 2.5 ng/ml TNF-a. Kao sledeće, 1x10<6>/ml nezrelih NM-DC (iNM-DC) su bile snabdevene bilo sa lizatima bakterija (50pg/ml), lizatima tumorskih ćelija (1x106 liziranim tumorskim ćelijama za snabdevanje na 1 x10<6>NM-DC) ili AGP- i GP-proteinima (20pg/ml) i sazrevale su 2 dana uz dodavanje 75 ng/ml TNF-a.

[0360]Sazrevanje fenotipa mNM-DC je veoma važno za uspešnu aktivaciju T-ćelija, pa je bio testiran pomoću protočne citometnje radi izražavanja CD1a, CD11c. CD14, CD40, CD35, CD80, CD83, CD86, CD116, HLA-ABC i HLA-DR. Samo one DC koje imaju fenotip koji odgovara fenotipu zrelih DC su bile upotrebljene za aktivaciju T-ćelija.

12. 2 Generisanje aktiviranih T ćelija protiv Core- 1 i detekcija GM- CSF ( test 1 ćelijske imune reakcije) i

proizvodnja TNF- a ( test 2 ćelijske imune reakcije) korišćenjem ELISE

[0361]Posle 7-10 dana prajmiranja T limfocita sa NM-DC snabdevenim sa Core-1-pozitivnim bakterijskim lizatima, rezultujuće T ćelije (0,7-1x10<6>/ml) su bile restimulisane sa mNM-DC (1x105/ml) snabdevenim sa lizatima Corel-pozitivnih tumorskih ćelija (50pg/ml) Posle 48 sati inkubacije, bili su prikupljeni supernatanti, pa su testirani korišćenjem za evaluaciju produkcije citokina kao reakcije na humanu Core-1-pozitivnu tumorsku ćelijsku liniju NM-D4 GM-CSF- i TNF-a- BD OptElA™ Kits.

[0362]Ploče sa 96 bunarčića su bile prethodno obložene sa 50pl odgovarajućih uhvaćenih anti-humanih (GM-CSF ili TNF-a) antitela razređenih 1:250 u puferu za oblaganje Posle koraka ispiranja i blokiranja, bilo je dodato 100pl supernatanata ili standarda u mikrobunarčiće, pa su onda inkubirani 2 sata na sobnoj temperaturi. Za standardnu krivu su bila upotrebljena rekombinantna humana GM-CSF u koncentracijama od 0; 7,8; 15,6; 31,2; 62,5; 125; 250 pg/ml i rekombinantna humana TNF-a u koncentracijama od 0, 4,7: 9,4. 18,8; 37,5; 75; 150; 300 pg/ml. Posle ispiranja bilo je dodato po 100pl pripremljenog VVorking Detector rastvora po bunarčiću, i ploča je bila inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. U sledećem koraku je bilo dodato 100 pl TMB One-Step Substrate Reagenta po bunarčiću. Posle finalne inkubacije od 30 minuta i dodavanja 50pl Stop Solution ekstenzije su bile očitane na 450nm.

[0363]Rezultati prikazani na Fig. 15A i B jasno pokazuju da su T ćelije generisane za lizate Corel-pozitivnih bakterija bile sposobne da prepoznaju DC snabdevene sa Corel-pozitivnim ćelijskim lizatom od humane ćelijske linije NM-D4 produkcijom tumorski-mhibitornih citokina, kao što su TNF-alpha i GM-CSF. Nasuprot tome, veoma niski nivo citokina je bio stvoren kao reakcija na Corel-negativne ćelijske lizate. Pored toga, ovo prepoznavanje je bilo specifično inhibirano putem pre-inkubacije sa lizatom snabdevenih NM-DC sa Corel-specifičnim antitelom.12. 3 ELISPOT test za evaluaciju sekrecije IFN- y aktiviranim T limfocitima usmerenim protiv Core- 1 ( test

2 ćelijske imune reakcije)

[0364]ELISpot test je bio upotrebljen za evaluaciju sekrecije IFN-v kao reakcije na antigenski specifičnu stimulaciju. Ovaj test omogućava kvantifikaciju funkcionalne sposobnosti prethodno senzibilizovanih T ćelija da prepoznaju Corel antigene na antigenski specifičan način.

[0365]T limfociti su bili prvo aktivirani in vitro ko-kultivacijom sa DC snabdevenim sa bakterijskim lizatima. Posle 7 do 10 dana od prajmiranja, aktivirane T ćelije su bile sakupljene i ponovo suočene sa DC (u odnosu T ćelije prema DC 10:1) snabdevenim sa lizatima Corel-pozitivnih (NM-D4) i Corel-negativnih (NM-wt) humanih tumorskih ćelija.

[0366]Bunarčići ELISpot ploče su bili prethodno obloženi sa mišijim-anti-humanim-IFN-Y-antitelom (Mabtech-Kit) koje se vezuje za nitroceluloznu osnovu ELISpot ploče. Ponovo izložene T ćelije su bile prenete u bunarčiće, i citokini su bili oslobođeni tokom perioda inkubacije. IFN-y koji se oslobodio lokalno oko svake T ćelije se vezivao i zato je 'uhvaćen' specifičnim antitelom. Posle 24 sata inkubacije ćelije su bile odstranjene. Drugo anti-humano- IFN-y antitelo u koncentraciji od 1 pg/ml je bilo dodato u bunarčiće; ovo biotinilovano antitelo je kuplovano sa enzimom koji može da pretvori supstrat u nerastvorljivi obojeni proizvod. Ploče su isprane još jednom, pa je dodat streptavidin konjugovan sa enzimom-AP u koncentraciji od 1 pg/ml. Konačno je dodat taložeći supstrat BCIP+NBT i ploča je onda bila inkubirana sve dok se nisu pojavile mrlje na strani koja odgovara T ćelijama. Obojene mrlje su bile izbrojane i analizirane korišćenjem digitalnog sistema za snimanje.

[0367]Rezultati pokazuju da T ćelije koje su generisale Corel-pozitivne bakterijske lizate (AG6 i MU1) mogu da prepoznaju DC snabdevene sa Corel-pozitivnim ćelijskim lizatima od humane tumorske ćelijske linije NM-D4 produkcijom tumorski-inhibitornog citokina IFN-gamma (Fig 16). Veoma niski nivoi citokina su bili stvoreni kao reakcija na Corel-negativne ćelijske lizate (R+DC/wt). Pored toga. specifičnost prepoznavanja Corel-pozitivnog ćelijskog lizata (R+DC/D4) je bila dokazana blokiranjem oslobađanja citokina sa Core-1 specifičnim antitelom Nemod-TF1 (R+DC/D4+Ak).

12. 4 Test 3 ćelijske imune reakcije: test proliferacije T- ćelija

[0368]Senzibilizovane i re-stimulisane T ćelije, kao što je opisano gore za ELISpot analizu, su bile prenete posle inkubacije iz ELISpot ploče u ploču sa 96 bunarčića, pa su bile testirane uz korišćenje kolorimetrijskog Cell Proliferation reagensa VVST-1 (Roche Molecular Biochemicals), čiji tetrazolijum je tako odvojen sa mitohondrijalnim enzimima daje razvijena količina boje (očitavanje na 450 nm) u direktnom korelaciji sa brojem metabolički aktivnih ćelija u kulturi. Absorbansa medijuma za kultivaciju plus wst-1 u odsustvu ćelija je bila prazna pozicija za čitač sa enzimom povezanog imunosorbentnog testa. Procedura se sastoji od dodavanja u jednom koraku 10pl po bunarčiću VVST-Proliferation reagensa (Roche) i inkubacije tokom 3 sata na 37°C, posle merenja na 450nm.

[0369]Rezultati pokazani na Fig. 17, jasno pokazuju da T ćelije generisane sa Corel-pozitivnim bakterijskim lizatima, prepoznaju DC snabdevene sa Corel-pozitivnim ćelijskim lizatom humane tumorske ćelijske linije NM-D4, kao što je pokazano specifičnom proliferacijom! Pored toga, ovo prepoznavanje je bilo specifično inhibirano putem pre-inkubacije sa lizatom snabdevenih NM-DC sa Corel-specifičnim antitelom.

72.5 Test 4 ćelijske imune reakcije Test imunofluorescencije za Core- 1 prezentaciju na DC

snabdevenim sa bakterijskim lizatima

[0370]Da bi se analizirala prerada i prezentacija Core-1 sa bakterijskim lizatom snabdevenim NM-DC, bile su izvršene imunofluorescentne analize uz korišćenje core-1 specifičnih monoklonskih antitela (Nemod-TF1, NEMOD-TF2). Prezentacija prerađenog Corel-antigena na površini zrelih DC je bila demonstrirana uz pomoć imunofluorescencije. Imunofluorescencija (IF)je tehnika koja omogućava vizualizaciju specifičnog antigena (Corel) na ćelijama vezivanjem specifičnog Core-1 antitela posle dodavanja sekundarnog antitela obeleženog sa fluorohromom, koji se upotrebljava za prepoznavanje primarnog antitela

[0371]U prvom koraku pNM-DC (1 x 10<5>/ml) su bile diferencirane u iNM-DC 7-dnevnom inkubacijom u NemodDC medijumu (70% MEM-o, 20% FCS, 10% CM5637) uz dodavanje 1000 U/ml GM-CSF, 100 U/ml IL-4 i 2.5 ng/ml TNF-a Kao sledeće 1x10<6>/ml nezrelog NM-DC (iNM-DC) je bilo dodato bilo bakterijskim lizatima (50pg/ml), lizatima tumorskih ćelija (1x106 liztranih tumorskih ćelija za snabdevanje na 1x106 NM-DC) ili AGP- i GP-proteinima (20mg/ml) i onda su sazrevale 2 dana dodavanjem 75 ng/ml TNF-a.

[0372]Zrele i antigenom snabdevene DC su bile isprane, pa je 1x106 ćelija po 50 pl bilo stavljeno na mikrotitarske ploče za imunofluorescentno bojenje. 3pg/ml Core-1-specifičnog antitela (Nemod-TF1)

razređenog u medijumu za kultivaciju (10%FCS) je bilo inkubirano sa suspenzijom ćelija tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle koraka ispiranja je bilo dodato 50pl 1:200 razređenih sekundarnih kozijih anti-mišijih IgM, sa Cy3-obeleženih Ab (Jackson/Dianova), a zatim inkubiran tokom 30 minuta. Posle koraka ispiranja, 20 pl suspenzije ćelija je bilo stavljeno u svaki bunarčić u Multitest slide (10 bunarčića, Roth).

[0373]Imunofluorescencijom obojeni uzorci su bili ispitani sa Axioplan 2 fluorescencijskim mikroskopom snabdevenim sa digitalnom kamerom AxioCam (Zeiss).

[0374]Fig. 18 prikazuje pozitivno Core-1-specifično bojenje zrelih mNM-DC, koji su preradili AG6- i NMD4- Corel-pozitivne lizate; i negativnu imunofluorescenciju na mNM-DC snabdevenim sa Corel-negativnim lizatima (AG3 i NM-wt).

[0375]Dok je pronalazak bio opisan u smislu prirnera izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se mogu napraviti različite modifikacije, supstitucije, izostavljanja i promene. Shodno tome, namera je da obim predmetnog pronalaska bude ograničen samo obimom priloženih patentnih zahteva. Konkretni primeri izvođenja predmetnog pronalaska, koji su opisani gore, se zato smatraju u svim aspektima za ilustrativne, a ne za restriktivne. Obim predmetnog pronalaska je naveden u priloženim patentnim zahtevima, umesto da bude ograničen na primere sadržane u prethodnom opisu.

Claims

1.Formulacija koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od nutraceutske i/ili farmaceutske kompozicije, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1), i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, koji sadrži najmanje jednu Core-1 pozitivnu komponentu.

2.Formulacija prema zahtevu 1, koja, kada se daje, indukuje ili pojačava Core-1 specifičnu imunu reakciju kod najmanje jednog čoveka ili životinje.

3.Formulacija prema zahtevu 1 ili 2, koja smanjuje ili sprečava pojavu Core-1 pozitivnog tumora ili metastaziranja, ili širenje metastaza Core-1 pozitivnog tumora.

4.Formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koja pojačava imuni sistem i/ili poboljšava imunu reakciju

5.Formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu pomenuta frakcija sadrži najmanje jednu od ugljenohidratnih struktura izabranih iz grupe koja se sastoji od i/ili njihovih ponavljajućih jedinica.

6. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1 do 5 za primenu u metodu indukovanja ili pojačavanja specifične humoralne i/ili ćelijske imune reakcije protiv Core-1, Core-1 antigena ili Core-1 pozitivnih tumorskih ćelija, pri čemu je to formulacija za davanje čoveku ili životinji u efektivnoj količini.

7. Core-1 pozitivni mikroorganizam koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1), i/iii njihovog lizata ili frakcije, koji sadrži najmanje jednu Core-1 pozitivnu komponentu, za primenu kao lek i/ili nutraceutik za terapiju ili profilaksu tumora.

8.Core-1 pozitivni mikroorganizam koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1). i/ili njihove frakcije ili lizata za in vivo ili in vitro primenu u metodu indukovanja ili pojačanja Core-1 specifične imune reakcije i/ili za generisanje funkcionalnih dendritskih ćelija ili aktiviranih T ćelija, T ćelijskih linija ili T ćelijskih klonova ili antitela protiv Core-1.

9. Bakterijski soj koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1) i/ili njihovih frakcija ili lizata.

10.Kit za indukovanje specifične humoralne i/ili ćelijske imune reakcije kod čoveka ili životinje protiv Core-1. Core-1 antigena ili Core-1 pozitivne tumorske ćelije, koji sadrži nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1), i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, ili koji sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1), ili njihovih frakcija, i informaciju o primeni kita.

11.Kit za smanjenje ili sprečavanje pojave Core-1 pozitivne bolesti ili tumora, koji sadrži nutraceutsku ili farmaceutsku formulaciju, koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe, koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1) i/ili najmanje jednog njihovog lizata ili frakcije, ili koja sadrži najmanje jedan Core-1 pozitivni mikroorganizam, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od DSM 18726 (AG6) i DSM 18728 (MU1), ili njihove frakcije, i informaciju o primeni kita.