RS54822B1 - Kompozicija i formulacija koja obuhvata rekombinovanu humanu iduronat-2-sulfatazu i postupak za njeno dobijanje - Google Patents

Abstract

Kompozicija iduronat-2-sulfataze (IDS) koja ima amino kiselinsku sekvencu SEQID NO: 1, u kojoj je cisteinski ostatak na položaju 59 u IDS amino kiselinskoj sekvenci konvertovan u formilglicin (FGly) pri molarnom odnosu od 65% ili više, poželjno pri molarnom odnosu od 75% ili više.Prijava sadrži još 13 patentnih zahteva.

Description

[0001] Tehničko polje

[0002] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju koja obuhvata humanu iduronat 2-sulfatazu (u daljem tekstu "IDS"), formulacija koja je obuhvata, postupak za njeno pripremanje i njihovu upotrebu za tretiranje Hanterovog sindroma.

[0003] Preciznije, kompozicija za tretiranje Hanterovog sindroma prema ovom pronalasku obuhvata kao aktivni sastojak IDS koji ima amino kiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 1, gde je cisteinski ostatak na položaju 59 u IDS amino kiselinskoj sekvenci SEOJD NO: 1 konvertovan u formilglicin (FGIy: 2-amino-3-oksopropionska kiselina) pri molarnom odnosu od 65% ili više, poželjno pri molarnom odnosu od 75% ili više, a poželjnije u molarnom odnosu od 80% ili više. Pored toga, IDS sadržana u kompoziciji za tretiranje Hanterovog sindroma sadrži manoza-6-fosfat u količini od 2.0 do 4.0 mola po molu IDS, poželjno u količini od 2.3 do 3.5 mola, a poželjnije u količini od 2.5 do 3.0 mola.

[0004] Postupak za dobijanje kompozicije za tretiranje Hanterovog sindroma prema ovom pronalasku obuhvata: (1) kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja transformisanog sa genom koji kodira IDS predstavljenu sa SEQ ID NO: 1 i dobijanje kulture; i (2) prečišćavanje kulture putem anjonizmenjivačke hromatografije, hidrofobne hromatografije, katjonizmenjivačke hromatografije, i afinitetne hromatografije,

[0005] okarakterisan time što se katjonizmenjivačka hromatografija izvodi korišćenjem elucionog pufera sa pH od 4.0 do 6.0.

[0006] Imajući prednosti u odnosu na konvencionalne proizvode u smislu sigurnosti i farmaceutske efikasnosti, terapeutska kompozicija koja obuhvata IDS i formulacija koja je obuhvata može se efikasno koristiti za tretiranje Hanterovog sindroma.

[0007] Stanje tehnike

[0008] Hanterov sindrom ili mukosaharidoza tip II je bolest lizozomalnog skladištenja (LSD) u kojem se mukopolisaharidi, takođe poznati kao glikozaminoglikani (GAG), ne cepaju ispravno i gomilaju se u telu zbog nedostatka IDS. Kako GAG nastavljaju da se gomilaju kroz ćelije organizma, razni znaci Hanterovog sindroma postaju vidljivi. Fizičke manifestacije za ljude sa Hanterovim sindromom uključuju različite facijalne crte i veliku glavu. Predstavnici među simptomima Hanterovog sindroma su uvećani abdomen zbog hepatomegalije ili splenomegalije, gluvoća, valvularne bolesti srca, opstruktivne bolesti disajnih puteva i apneja u spavanju. Isto tako, glavni zglobovi mogu biti pogođeni Hanterovim sindromom, što dovodi do zglobne ukočenosti i ograničenog kretanja. U nekim slučajevima Hanterovog sindroma, umešanost centralnog nervnog sistema dovodi do kašnjenja u razvoju i problema nervnog sistema. Hanterov sindrom je poznat da se događa po stopi od 1 u 162,000 i genetski je poremećaj u vidu hromozom X-vezani recesiva i tako daje veliku patnju porodici kao i pacijentu.

[0009] Različita ispitivanja izvedena su u vezi tretiranjem Hanterovog sindroma, uključujući transplantaciju koštane srži, zamenu enzima i gensku terapiju. Dok je transplantacija koštane srži u stanju da zaustavi većinu simptoma, teško je naći HLA (humani leukocitni antigen) koji odgovara svim pacijentima. Dalje, transplantacija koštane srži je velika hirurška operacija koju prati nekoliko negativnih efekata, uključujući i to da se život pacijenta stavlja pod visok rizik ako HLA nije odgovarajuć. Genska terapija za Hanterov sindrom isporučuje normalan IDS gen u telo pomoću virusnog vektora što su adenovirusni ili retrovirusni ili ne-virusni vektor. Međutim, genska terapija ostaje eksperimentalna tehnika, i klinički nije primenjena. Što se tiče tretmana zamene enzima za Hanterov sindrom, on se sastoji od davanja eksterno proizvedene IDS i ima prednost u tome što je jednostavan. Međutim, zamena enzima se mora sprovesti kontinuirano što povlači veliki trošak. Elaprase5* (Shire Pharmaceuticals Group), proizvedena upotrebom rekombinovane DNK tehnologije, odobren je od strane FDA kao tretman za zamenu enzima za Hanterov sindrom. Međutim, ovaj lek je veoma skup, a kao nedostatak smatra se da je slabog efekta i sigurnosti.

[0010] Dokument MUEMZER, J. ET AL, MOL. GENET. METAB., Vol. 90, br. 3, Mart 2007 (2007-03), str 329-337, pokazuje rezultate faze I/II kliničkog ispitivanja terapije zamene enzima kod mukopolisaharidoze II (Hanterovog sindroma). Korišćeni enzim - idursulfaza (Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cambridge, MA), je rekombinovani oblik ljudske iduronat-2-suifataze koja ima obim post-translacione modifikacije cisteina 59 u formilglicin od približno 50%.

[0011] Kao što je gore opisano, iako su razvijene različite terapije za Hanterov sindrom, još uvek postoji potreba za novom terapijom i agensom koji pokazuje visoku terapijsku efikasnost sa visokom bezbednosti.

[0012] Opis pronalaska

[0013] Tehnički problem

[0014] Cilj ovog pronalaska je da se prevaziđu problemi iz prethodnog stanja tehnike i da se obezbedi kompozicija za tretiranje Hanterovog sindroma, koja obuhvata rekombinovanu IDS kao aktivni sastojak, koja garantuje visoku terapeutsku efikasnost i bezbednost, kako je proizvedena poboljšanim postupcima kultivisanja i prečišćavanja, i formulaciju koja je obuhvata.

[0015] Drugi predmet prema ovom pronalasku je da se obezbedi postupak za dobijanje kompozicije za tretiranje Hanterovog sindroma i formulaciju koja je obuhvata.

[0016] Rešenje problema

[0017] Da bi se postigao gornji cilj, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za tretiranje Hanterovog sindroma, koja obuhvata kao aktivni sastojak IDS koja ima amino kiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 1, pri čemu je cisteinski ostatak na položaju 59 konvertovan u formilglicin (FGfy) pri molarnom odnosu od 65% ili više, poželjno pri molarnom odnosu od 75% ili više, poželjnije pri molarnom odnosu od 80% ili više.

[0018] IDS, koja se ovde takođe naziva iduronat-2-su!fataza ili I2S, ima molekularnu veličinu od 56 kDa kada je izolovana i prečišćena iz ljudskog jetre, bubrega ili placente (Bielicki, J. et al. (1990) Biochem, J., 271: 75<~>86). fDS je izražena kao monomerni protein 550 amino kiselina i luči se u medijum kao zreo aktivni protein 525 aminokiseline nakon čega sledi cepanje signalnog peptida 25 aminokiselina. Molekularna težina IDS varira sa glikozilacijom i smatra se da se kreće u rasponu od približno 60 do 90 kDa nakon tretmana sa endoglikozidazom F, mereno pomoću SDS-PAGE.

[0019] IDS sadrži dve disulfidne veze i osam N-povezanih mesta glikozilacije i proizvodena je kao glikoprotein posle podvrgavajuće post-translacione modifikacije u kojoj su N-povezana mesta glikozilacije zauzeta kompleksnim, hibridnim i visoko manoznim tipom oligosaharidnih lanaca u eukariotima. Kada se jednom izluči u medijum kulture, IDS se može koristiti kao lek nakon prolaska kroz uobičajene postupke izolovanja i prečišćavanja. IDS može biti u obliku glikoproteina sa različitim obrascima glikozilacije, u zavisnosti od različitih faktora, uključujući, na primer, IDS genetičku rekombinaciju, transformaciju (npr. upotrebljene ćeiijske linije), kulturu i tehniku prečišćavanja.

[0020] U ovom pronalasku, opisano je da sadržaj manoza-6-fosfata (M6P) i odnos konverzije Cvs 59 u FGiy imaju veliki uticaj na terapeutsku efikasnost i bezbednost iDS. Prisustvo manoza-6-fosfatnog (M6P) ostataka dozvoljava specifično vezivanje enzima za M6P receptore na površini ćelije, što dovodi do ćeiijske internalizacije enzima, ciljanja lizozoma i naknadnog katabolizma akumuliranih GAG. Biološka aktivnost IDS takođe zavisi od post-modifikacije očuvanog cisteina (položaj 59) u formilgiiđnu.

[0021] Ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "IDS", kako se ovde koristi, označava IDS protein prikačen za ugljovodonik, to jest, glikozilovana IDS. IDS prema ovom pronalasku ima amino kiselinsku sekvencu u SEQ ID NO: 1.

[0022] Kako se ovde koristi, termin "glikozilacioni obrazac" IDS odnosi se na profil oligosaharida vezanih za osam mesta glikozilacije rezultujuće IDS (npr. mesta glikozilacije i vrste oligosaharida).

[0023] U jednom ostvarenju, IDS sadržan u kompoziciji za terapiju Hanterovog sindroma prema ovom pronalasku ima istu amino kiselinsku sekvencu kao što je poznato (SEQ ID NO: 1), ali ima različiti glikozilacioni obrazac i drugačiji odnos konverzije cisteina na položaju 59 u formil glicin, kako je gore opisano {pogledati Primere 1-5 i 1-6).

[0024] To jest, IDS korišćena u kompoziciji za terapiju Hanterovog sindroma prema ovom pronalasku ima amino kiselinsku sekvencu SEO. ID NO: 1 sa konverzijom cisteina na položaju 59 u formil glicin (FGIy) pri molarni odnosu od 65% ili više, poželjno pri molarnom odnosu od 75% ili više, poželjnije pri molarnom odnosu od 80% ili više, dok je odnos konverzije u Elaprazi oko 50% (Genet Med 2006: 8 (8): 465-473). Poznato je da je formilglicin duboko umešan u sposobnosti IDS da degradira supstrat, to jest aktivnost IDS. Stoga, kako su kompozicija prema ovom pronalasku i konvencionalni agens Elapraze različiti, kompozicija i formulacija prema ovom pronalasku mogu pokazivati veću terapeutsku efikasnost za Hanterov sindrom nego konvencionalni agens Elapraze zbog veće konverzije citozina u formilglicin na položaju 59 amino kiselinske sekvence za IDS.

[0025] Pored toga, IDS korišćena u kompoziciji ili formulaciji za tretiranje Hanterovog sindroma prema ovom pronalasku sadrži manoza-6-fosfat u količini od 2,0 do 4.0 mola po molu IDS, poželjno u količini od 2.3 do 3.5 mola i poželjnije u količini od 2.5 do 3.0 mola. M6P igra važnu ulogu u ćelijskoj internalizaciji IDS i naknadnom ciljanju na intracelularne lizozome. Tako, formulacija prema ovom pronalasku koja obuhvata IDS sa visokim sadržajem M6P garantuje visoke performanse receptor-posredovanog mehanizma preuzimanja za taj enzim i ciljanje do lizozoma, što rezultira u efikasnom katabolizmu akumuliranih GAG.

[0026] Formulacija za tretiranje Hanterovog sindroma koja obuhvata IDS prema ovom pronalasku može biti pripremljena formulisanjem kompozicije prema ovom pronalasku sa farmaceutski prihvatljivim nosačem u pogodnom obliku.

[0027] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv" nosač odnosi se na netoksični, fiziološki kompatibilni nosač za aktivni sastojak, koji je pogodan za davanje životinjama, bez izazivanja toksičnosti, nekompatabilnosti, nestabilnosti, iritacije, alergijskog odgovora i slično.

[0028] Kompozicija prema ovom pronalasku može biti formulisana sa pogodnim nosačem u zavisnosti od načina primene. Formulacija prema ovom pronalasku može se davati oralno ili parenteralno, ali nije ograničena na njih. 2a parenteralno davanje, može se izabrati putanja izabrana između transdermalne, intranazalne, intraperitonealne, intramuskularne, subkutane ili intravenske putanje.

[0029] Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može biti formulisana u kombinaciji sa pogodnim oralnim nosačem u praškove, granule, tablete, pilule, pastile, kapsule, tečnosti, gelove, sirupe, suspenzije i obloge koristeći postupak poznat u ovoj oblasti. Primeri pogodnog nosača korisnog u formulaciji uključuju šećere kao što su laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitot, manitol, ksilitol, eritritol i maltitol, škrobove kao što su kukuruzni škrob, pšenični škrob, pirinčani škrob, i krompirovi škrobovi, celuloze kao što su celuloza, metil celuloza, natrijum karboksimetil celuloza i hidroksipropil metil celuloza i punioce kao na primer želatin i polivinilpirolidon. Opciono, formulacija može dalje da sadrži dezintegrant kao što je umreženi polivinilpirolidon, agar, alginska kiselina ili natrijum alginat. Pored toga, dalje se mogu koristiti anti-aglomeraciono sredstvo, lubrikant, agens za vlaženje, agens za miris, emulgator i konzervans.

[0030] Takođe, kompozicija prema ovom pronalasku može biti formulisana u kombinaciji sa parenteralnim nosačem u parenteralni dozni oblik kao što je injektabilni preparat, transdermalni preparat ili intranazalna inhalacija koristeći uobičajeni postupak iz ove oblasti. Za upotrebu u injekciji, formulacija mora biti sterilisana i zaštićena od kontaminacije mikroorganizmima kao što su bakterije i gljivice. Primeri nosača pogodnih za injekcije mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, vodu, etanol, poliol {npr. glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol, itd), njihove kombinacije, i/ili rastvarač koji sadrži biljno ulje ili disperzioni medijum. Poželjnije, nosač može biti izotonični rastvor poput Hankovog rastvora, Ringerovog rastvora, PBS {fosfatni pufer) koji sadrži trietanol amin ili injekciona sterilna voda, 10% etanol, 40% propilen glikol i 5% dekstroza. U cilju zaštite injektabilnog preparata od mikrobne kontaminacije, on može dalje obuhvatati antibakterijska i antifungalna sredstva kao što paraben, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerosal, itd. Takođe, injektabilni preparati dalje mogu da obuhvataju, u većini slučajeva, izotonični agens poput šećera ili natrijum hlorida. Ove formulacije su opisane u dokumentu koji je dobro poznat u farmaceutskoj oblasti {Remington's Pharmaceutical Science, ISth Edition, 1975., Mack Publishing Companv, Easton, Pennsvlvania). Što se tiče inhalacije, formulacija prema ovom pronalasku može se isporučiti pogodno u obliku aerosol spreja iz kompresovanog pakovanja ili prskalice korišćenjem pogodnog propelanta, kao što su dihlorofluorometan, trihiorofiuorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljen dioksid ili pogodni gas. U slučaju komprimovanog aerosola, veličina dozne jedinice može se odrediti pomoću ventila za isporuku odmerene količine. Na primer, želatinske kapsule i kertridži za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže praškastu mešavinu jedinjenja i pogodne praškaste baze kao što je laktoza ili škrob za ove sisteme.

[0031] Drugi pogodni farmaceutski nosači opisani su u Remington's Pharmaceuticai Sciences, 19th ed., Mack Publishing Companv, Easton, PA, 1995.

[0032] Pored toga, formulacija prema ovom pronalasku može dalje da obuhvata jedan ili više pufera (npr. fiziološki rastvor ili PBS), ugljene hidrate (npr. glukoza, manoza, saharoza ili dekstran), stabilizatore (natrijum bisulfit, natrijum sulfit ili askorbinska kiselina), anti-oksidante, bakteriostatike, helacione agense (npr. EDTA ili glutation), adjuvanse (npr. aluminijum hidroksid), agense za suspendovanje, sredstva za zgušnjavanje i/ili konzervanse (benzalkonijum hlorid, metil- ili propil-paraben i hlorobutanol).

[0033] Takođe, kompozicija prema ovom pronalasku može se formulisati u doznom obliku koji omogućava brzo, produženo ili odloženo oslobađanje aktivnog sastojka nakon davanja sisaru. Efikasna količina formulacije pripremljene na ovaj način može se davati preko različitih putanja uključujući oralnu, transdermalnu, subkutanu, intravenoznu i intramuskularnu putanju. Izraz "efektivna količina" kako se ovde koristi odnosi se na količinu IDS koja omogućava praćenje dijagnostičkog ili terapeutskog efekta koji se dešava kada se primeni na pacijenta. Doza formulacije prema ovom pronalasku može da varira u zavisnosti od različitih faktora uključujući, putanju davanja, tip subjekta koji se leči, tip bolesti koja se leči, način administracije, ozbiljnost bolesti, i starosti, pola, težine, stanja pacijenta, i zdravstvenog stanja. Formulacija koja obuhvata IDS prema ovom pronalasku može se koristiti u dozi od 0.1 do 10 mg/kg, a poželjno u dozi od 0.5 do 1.0 mg/kg po dozi.

[0034] Postupak za pripremu terapeutske kompozicije prema ovom pronalasku obuhvata:

[0035] (1) kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja transformisanog genom koji kodira IDS predstavljenu sa SEQ ID NO: 1 i dobijanje kulture; i (2) prečišćavanje kulture putem anjonizmenjivaćke hromatografije, hidrofobne hromatografije, katjonizmenjivacke hromatografije, i afinitetne hromatografije,

[0036] gde se katjonizmenjivačka hromatografija izvodi korišćenjem elucionog pufera sa pH od 4.0 do 6.0.

[0037] Preciznije, postupak za dobijanje terapeutske kompozicije prema ovom pronalasku obuhvata: (1) transformisanje ćelije domaćina sa ekspresionim vektorom koji nosi IDS gen za dobijanje rekombinovanog ćelijskog soja; (2) kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja u prisustvu hidrolizata u medijumu bez seruma i dobijanje kulture; (3) prečišćavanje IDS iz kulture putem anjonizmenjivaćke hromatografije, hidrofobne hromatografije, katjonizmenjivačke hromatografije i afinitetne hromatografije, pri čemu se pomenuta katjonizmenjivačka hromatografija izvodi korišćenjem elucionog pufera sa pH u rasponu od 4.0 do 6.0; i (4) kombinovanje prečišćene IDS sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0038] U ovom postupku, faza (1) usmerena je ka uspostavljanju rekombinovanog ćelijskog soja uvođenjem ekspresionog vektora koji nosi IDS gen u ćeliju domaćina. Amino kiselinska sekvenca za IDS i gen koji kodira IDS poznati su u stanju tehnike. Gen koji kodira za IDS koja ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 je poželjan, ali nije predviđen kao ograničavajući primer. Ako amino kiselinska sekvenca zadržava aktivnost IDS koja treba da se izvede, a u vezi sa ovim pronalaskom, iako mutiran insertovanjem, delecijom i/ili supstitucijom nekih aminokiselinskih ostataka u amino kiseiinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1, njen gen može da se koristiti u ovom pronalasku. Ekspresioni vektor koji nosi gen može se konstruisati korišćenjem uobičajenog postupka poznatog u struci. Pored toga, ekspresioni vektor može sadržati gen obeleživač koji omogućava uvođenje gena koji se identifikuju. Primerigena obeleživača uključuju dihidrofolat reduktaza gen (dhfr), ali nisu ograničeni na njega. Poželjan je pJK-dhfr Or2-IDS vektor (FIG. 2).

[0039] Ćelije domaćini dostupne u fazi (1) mogu biti životinjske ćelije, a njihove primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), bubrežne ćeije humanog embriona (HEK), bubrežne ćelije mladunca hrčka (BHK), bubrežne majmunske ćelije 7(COS7), i NSO ćelije, a najčešće CHO ćelije. CHO ćeiijske linije su jedne od najčešće korišćenih u proizvodnji biomedicinskih proizvoda zahvaljujući visokoj stopi rasta ćelija i produktivnosti, lakoj genetskoj manipulaciji, rapidnoj proliferaciji u

[0040] suspenzionim kulturama velike skale i visokom prilagođavanju medijimu bez proteina. Transformacija u fazi (1) može se izvesti prema protokolu poznatom u ovoj oblasti.

[0041] U ovom postupku, faza (2) odnosi se na kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja koji ankeriše IDS ekspresioni vektor u njemu u medijumu bez seruma. Kultivisanje može biti izvedeno u medijumu i pod uslovima optimizovanim za vrstu ćelije domaćina. Poželjan je medijum bez seruma. Kako je bez seruma (npr, goveđi serum), takav medijum izbegava verovatnoću izazivanja sporednih efekata ili rizike povezane sa serumima.

[0042] Kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja transformisanog sa IDS ekspresionim vektorom može se dalje podići na višu skalu. Na primer, rekombinovani ćelijski soj prema ovom pronalasku može se kultivisati u boci za mešanje i potom se uvećati do od stotinu do hiljadu litara u bioreaktoru. Faza kultivisanja izvodi se u prisustvu hidrolizata, koji ima značajan uticaj na određivanje sadržaja formilglicina. Poželjno, hidrolizat se dodaje u takvoj količini da bi se formirala krajnja koncentracija od 0.1 ~ 10.0 g/L. Hidrolizat koristan u ovom pronalasku može biti onaj dobijen hidrolizom životinjskog ili biljnog materijala. Određenije, hidrolizat se može dobiti hidrolizom najmanje jednog odabranog iz grupe koju čine, a!i nisu ograničeni na, soju, krompir, pšenične klice i kvasac.

[0043] U ovom postupku, faza (3) odnosi se na prečišćavanja IDS iz ćeiijske kulture putem anjonizmenjivaćke hromatografije, hidrofobne hromatografije, katjonizmenjivačke hromatografije, i afinitetne hromatografije.

[0044] Poželjno, ova četiri hromatografska postupka mogu biti izvedena tim redosledom. Međutim, stručnjaku bi trealo da je očigledno da može da promeni redosled ukoliko je to potrebno. Pored ređosleda hromatografskih postupaka, smole i pH vrednosti elucionih pufera takođe su važni u određivanju obrasca glikozilacije i sadržaja formilglicina za IDS.

[0045] Anjonizmenjivačka hromatografija namenjena je za uklanjanje boja i nečistoća iz ćeiijske kulture i izvodi se na koloni ispunjenom sa QSepharose<®>smolama koristeći elucioni pufer sa pH od 5.5 do 7.5.

[0046] Hidrofobna hromatografija je namenjena da otkloni boje i nečistoće koje ostaju nakon anjonizmenjivaćke hromatografije. Izvodi se na koloni ispunjenom sa fenil Sepharose<®>smolama, koristeći elucioni pufer sa pH od 5.0 do 7.0,

[0047] Katjonizmenjivačka hromatografija ima za cilj da visoko izabere sadržaj formilglicina i ukloni preostale nečistoće. Izvodi se na koloni ispunjenom katjonizmenjivačkim smolama, koristeći elucioni pufer sa pH od 4.0 do 6.0. Primeri katjonizmenjivačkih smola korisnih u ovom pronalasku mogu uključivati CM Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, S Sepharose Fast Flow i Capto MMC, sve iz GE Healthcare, ali nisu ograničeni na njih. Poželjno, elucioni pufer ima pH u rasponu od 4.0 do 6.0.

[0048] Afinitetna hromatografija namenjen je da ukloni glicerol korišćen u katjonizmenjivačkoj hromatografiji i koncentruje zapreminu eluata. Izvodi se na kofoni ispunjenom sa Biue Sepharose ™ smolama, koristeći elucioni pufer sa pH od 6,0 do 8,0.

[0049] Uslovi svake vrste hromatografije mogu se optimalno modifikovati od strane stručnjaka. U pogledu konkretnih uslova za hromatografiju, može se pogledati Primer 1-5 opisan u nastavku.

[0050] Postupak za pripremu kompozicije koja obuhvata IDS kao aktivni sastojak prema ovom pronalasku može dalje sadržati inaktivirajuće viruse koji se mogu ugraditi u kompoziciju. Inaktivađja se može izvesti na različite načine, a poželjno održavanjem kulture na pH 3.0<~>4.0 ili pod visokim pH uslovom tokom unapred utvrđenog vremenskog perioda. Postupak inaktivacije može se postići tokom postupka prečišćavanja, poželjno tokom hromatografije, a poželjnije između hidrofobne hromatografije i katjonizmenjivačke hromatografije.

[0051] Nakon hromatografskih postupaka, aktivna frakcija tako dobijena može se koncentrovati i filtrirati dajući IDS koja se može koristiti kao aktivni sastojak farmaceutske kompozicije.

[0052] Kompozicija može biti pomešana sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i formulisana u pogodan dozni oblik.

[0053] Kompozicija koja obuhvata IDS, pripremljena postupkom prema ovom pronalasku, ima prednosti u odnosu na konvencionalne IDS kompozicije zbog sledećeg 1) ona tspoljava veću farmaceutsku efikasnost zahvaljujući većem sadržaju formilglicina, 2) može efikasnije da kataboliše GAG akumulirane unutar lizozoma, 3) nema serum životinjskog porekla te je na taj način sigurna, i 4) bezbedna je i efikasna zahvaljujući čistoći od 99,9% ili više.

[0054] Povoljni efekti pronalaska

[0055] Kompozicija koja obuhvata rekombinovanu IDS i formulacija koja je obuhvata u skladu sa ovim pronalaskom, superiorne su u pogledu farmaceutske efikasnosti i bezbednosti u odnosu na konvencionalni agens Elapraze i tako se mogu efikasno koristiti za tretiranje Hanterovog sindroma.

[0056] Kratak opis crteža

[0057] FIG. 1 prikazuje šemu za izgradnju pJK-dhfr-IDS-Sl vektora koji se koristi da izgradi IDS ekspresioni vektor. FIG. 2 prikazuje šemu za izgradnju IDS ekspresionog vektora pJK-dhfr-Or2-IDS iz pJK-dhfr-IDS-Sl sa FIG. 1. FIG. 3 je dijagram toka koji prikazuje izolaciju i prečišćavanje IDS iz transformisanog CHO-DG44. FIG. 4 je fotografija koja prikazuje SDS-PAGE rezultat IDS za analiziranje N-terminalne sekvence gde je marker izveden na traci M, glikozilovana IDS na traci 1, PNGaza F na traci 2 i deglikozilovana IDS na traci 3. FIG. 5 je dijagram toka koji prikazuje postupak analiziranja amino kiselinske sekvence za IDS. FIG. 6 prikazuje amino kiselinsku sekvencu za IDS prema ovom pronalasku kako je analizirana pomoću MALDI-MS/MS i LC-ESI-MS/MS. FIG. 7 je RP-HPLC hromatogram ne-redukovanih i redukovanih IDS uzoraka koji pokazuju položaj disulfidnih veza u IDS. FIG. 8 pokazuje položaje disulfidnih veza u IDS prema ovom pronalasku kako je analizirana pomoću MALDI-MS. FIG. 9 pokazuje položaje disulfidnih veza u IDS prema ovom pronalasku kako je analizirana pomoću MALDI-MS/MS. FIG. 10 pokazuje položaje disulfidnih veza u IDS prema ovom pronalasku, dobijeno pomoću

[0058] MALDI-MS/MS.

[0059] FIG. 11 je fotografija koja prikazuje IDS vođenu pomoću SDS-PAGE posle tretmana sa različitim glikozidnim hidrolaza enzimima kako bi se ispitala glikozilacija IDS prema ovom pronalasku. FIG. 12 su HPAEC-PAD hromatogrami koji prikazuju sadržaj manoza-6 fosfata u IDS prema ovom pronalasku. FIG. 13 je hromatogram ekskluzije po veličini koji pokazuje čistoću IDS prema ovom pronalasku. FIG. 14 je jonski hromatogram koji pokazuje katalitičku aktivnost IDS prema ovom pronalasku na prirodnom supstratu. FIG. 15 je Lajnviver-Burk dijagram koji pokazuje odnose količina ćelijskog preuzimanja IDS u odnosu na količinu IDS dodatu normalnim ćelijama fibroblasta. FIG. 16 je grafikon koji pokazuje količinu IDS prema ovom pronalasku internalizovana u normalnim ljudskim ćelijama fibroblasta i ćelijama bolesnika sa Hanterovim sindromom.

[0060] FIG. 17 pokazuje merenja sadržaja formilglicina u IDS prema ovom pronalasku.

[0061] FIG. 18 pokazuje IEF (tzoelektrično fokusiranje) tačaka IDS prema ovom pronalasku pre i posle katjonizmenjivačke hromatografije gde je Ivi izveden na Ivi traci, uneti uzorak za katjonizmenjivačku hromatografiju na traci 1, eluat katjonizmenjivačke hromatografije na traci 2, i regeneracioni rastvor nakon katjonizmenjivačke hromatografije na traci 3.

[0062] Režim pronalaska

[0063] Bolje razumevanje ovog pronalaska može se dobiti kroz sledeće primere koji su ilustrativni, ali ih ne treba tumačiti kao ograničavanje ovog pronalaska.

[0064] [74] PRIMER 1; Pripremanje IDS

[0065] <!-! > Prikupljanje gena

[0066] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz ljudske krvi kako je prethodno opisano [S. Beckebaum etal., Immunologv, 2003, 109: 487-495]. Ukupna RNK je ekstrahovana iz PBMC prema protokolu koji je prethodno opisan [M. J. Holland et al., Clin. Exp. Immunol., 1996, 105: 429-435]. Kako bi se izgradila cDNK biblioteka iz ukupne RNK, jednolančana cDNK je sintetisana primenom oligo-

[0067] (dT) prajmera kitom za jednolančanu sintezu (Boehringer mannheim). U tom smislu, DEPC-tretirana destilovana voda dodata je u Eppendorf epruvetu koja sadrži 1 pg ukupne RNK tako da formira konačnu zapreminu od 12,5 p.£. Zatim 1 pg 20pmol oligo(dT) prajmera dodato je u epruvetu, nakon čega sledi inkubacija na 70°C tokom 2 min i hlađenje. Ovoj reakcionoj smeši dodato je 4u.g reakcionog pufera, lpg dNTP, l|ig inhibitora RNaze, i lpg reverzne transkriptaze koji su zatim dovedeni u reakciju na 42°C tokom jednog sata kako bi se sintetisala jednolančana cDNK. PCR je izvedena na cDNK kao kalup u prisustvu prajmera SEQ ID NOS: 2 do 4 za amplifikaciju humanog IDS gena. U tom kontekstu, svaki prajmer je konstruisan da sadrži mesto prepoznavanja restrikcionog enzima za upotrebu u genskom kloniranju.

[0068] <l- 2> Konstruisanje ekspresionog vektora

[0069] A. Konstruisanje pJK- dhfr- IDS- Sl vektora

[0070] Signalna sekvenca lakog lanca antitela (izvedeno iz dela lakog lanca humanog igG) kao nekodirajuća sekvenca uvedena je u 5'-termtnus IDS gena dobijenog u Primeru <1-1> pre PCR. Nakon što je PCR proizvod dobijen na taj način nanesen na gel elektroforezom, humani IDS gen je izolovan korišćenjem gel ekstrakcionog kita. Izolovani IDS gen i pJK-dhfr-Or2 vektor (Aprogen) digestovani su sa EcoRV i Apal i međusobno povezani na 16°C tokom 20 časova. Rekombinovani vektor tako konstruisan transformisan je uE. coli(DH5ct) koja je zatim posuta po LB ploči koja sadrži 50 u.g/mL ampicilina i inkubirana preko noći. Kolonije gajene na pločama izabrane su i kultivisane tako da se iz njih izoluje plazmid {FIG. 1).

[0071] B. Konstruisanje rekombinovanog humanog IDS ekspresionog plazmida

[0072] Da bi se promenila ne-kodirajuća sekvenca plazmida konstruisanog iznad signalne sekvence, rekombinovana humana IDS je subklonirana na pJK-dhfr-or2 vektor. U tom cilju, pJK-dhfr-IDS-Svektor digestovan je sa EcoRV i Apal dajući delimični IDS gen (1233 bp) koji je zatim umetnut u pJK-dhfr-Or2 vektor prethodno tretiran sa istim restrikcionim enzimima, kako bi se konstruisao pJK-dhfr-IDS-S2 vektor. U cilju uvođenja ne-kodirajuće sekvence i signalne sekvence na 5'-terminus, IDS NI napredni prajmer (SEQ ID NO: 5) i IDS 4 nazadni prajmer (SEQ ID NO: 7) korišćeni su za PCR sa pJK-dhfr-lDS-Svektorom koji je služio kao kalup. Nakon pokretanja na 94°C tokom 5 min, PCR je izvedena u 30 ciklusa na 94°C tokom 1 min, 55°C tokom 30 sekundi i 72°C tokom 40 sekundi i završena produžetkom na 72°C tokom 10 min.

[0073] PCR amplifikacija obezbedila je delimičan IDS gen koji je 448 bp. Ovaj gen je korišćen kao kalup za PCR koja je ponovo izvedena u prisustvu IDS N2 naprednog prajmera (SEQ ID NO: 6) i IDS 4 nazadnog prajmera {SEQ ID NO: 7) pod istim uslovima kao što je gore opisano. To je rezultiralo kao sinteza DNK fragmenta 476 bp dugi.

[0074] Nakon toga, pJK-dhfr-IDS-S2 vektor i fragment rekombinovanog humanog IDS gena (476bp) odvojeno su digestovani sa EcoRV. Digestati su odvojeni na gelu elektroforezom kako bi se dobio vektor i 476 bp-dugi IDS fragment. Ovaj vektor i umetak povezani su na 16°C tokom 12 časova u prisustvu T4 DNK ligaze kako bi se konstruisao pJK-dhfr-Or2-IDS plazmid. Ovi postupci prikazani su na FIG. 2.

[0075] Da bi se potvrdilo konstruisanje IDS ekspresionog plazmida, DHS je transformisana sa pJK-dhfr-Or2-IDS i kultivisana 24 časa na LB ploči koja sadrži ampicilin (50 pg/mL). Iz tako razvijenih kolonija, plazmid je izolovan i dtgestovan radi merenja veličine umetka. Takođe, bazno sekvenciranje sprovedeno je korišćenjem T7 prajmera (SEQ ID NO: 8).

[0076] <l- 3> Odabir rekombinovanog humanog IDS ekspresionog soja

[0077] A. Transfekcija CH0- DG44

[0078] CHO-DG44 je upotrebljen kao ćelija domaćin za ekspresiju IDS prema ovom pronalasku. Mutant jajna ćelija kineskog hrčka CHO-DG44 nosi dvostruku deleciju za endogeni dhfr (dihidrofolat reduktaza) gen koji kodira DHFR enzim. DHFR enzim je uključen u konverziju folata kroz dihidrofolat (FH2) u tetrahidrofolat (FH4) koji je uključen u de novo sintezu nukleinskin kiselina. Nivo dhfr u ćelijama zavisi od koncentracije MTX. MTX, koji je strukturno sličan folnoj kiselini, supstrat DHFR, ulazi u kompeticiju sa foinom kiselinom za vezivanje dihidrofolat reduktaze, tako da većina dihidrofolat reduktaze gubi svoju aktivnost u prisustvu MTX. Stoga, ako ćelije ne amplifikuju dovoljnu količinu dhfr, umiru jer ne mogu da sintetišu nukleinske kiseline neophodne za njihov život. Nasuprot tome, ako je amplifikacija dovoljna, ćelije mogu da opstanu pri visokoj koncentraciji MTX jer obiluju dovoljno sa dhfr. Ovaj sistem se može primeniti na životinjskim ćelijama kako bi se odabrala transfektovana ćelijska linija koja može povećati dhfr gen i samim strukturni gen od interesa.

[0079] U tom cilju, dhfr gen uveden je kao amplificioni marker u IDS ekspresioni vektor pJK-dhfr-Or2-IDS, konstruisan u Primeru 1-2, a amplifikacija gena sprovedena je primenom MTX i dhfr gena.

[0080] U tom smislu, DG44 ćelijska linija (dobijena od Dr. Chaisin, Columbia Universitv) suspendovana je u 10 mL DMEM/F12 (dopunjen sa nukleotidima i nukleozidima, i 10% fetalnim goveđim serumom (FBS)) i sakupljena obrtanjem pri 1000 o/min tokom 5 min. Ćelije su inokulirane u 50 mL medijuma kulture u T-175 boci i inkubirane na 37 ± 1°C u 5 ± 1% CO<2>inkubatoru. Jedan dan pre transfekcije, medijum kulture za DG44 ćelije uklonjen je iz T 175 boce, a ćelije su isprane dva puta sa PBS i odvojene tripsinizacijom. Zatim su zasejane pri gustini od 5 x 10<b>ćelija u T-25 boci i kultivisane na 37 ± 1°C tokom 24 sata u 5 +1%CO; inkubatoru. Bakterijska ili gljivična kontaminacija ispitana je pod optičkim mikroskopom, a PCR-ELISA je izvedena kako bi se ispitalo da li su ćelije kontaminirane mikoplazmom.

[0081] DG-44 ćelije bez mikroba transfektovane su sa IDS ekspresionim vektorom pJK-dhfr-Or2-IDS, konstriusan u Primeru 1-2, koristeći Lipofektaminski kit. U tom smislu, 5pg ekspresionog vektora i 50u.g Lipofektamina zasebno su razblaženi u 800ug Opti-MEM I, pomešani pažljivo tako da se ne formiraju mehurići i ostavljeni na sobnoj temperaturi 15 min. U međuvremenu, DG44 ćelije su jednom isprane sa sterilnim PBS i tri puta sa Opti-MEM I. U DG44 ćelije pažljivo je dodata DNK-lipofektaminska mešavina i zatim 6.4 mL OPTI-MEM pre inkubacije na 37 ± 1°C tokom 5 sati u 5 ± 1% COj inkubatoru. Posle toga, inkubacija je sprovedena tokom dodatnih 48 sati u medijumu sa dodatkom 8 mL DMEM/F12 i 1.6 mL FBS-a kako bi se poboljšalo dobijanje ćelijskih membrana i rast ćelija.

[0082] B. Odabir geneticin( G418)- rezistentnog ćelijskog soja

[0083] Kultivisane ćelije odvojene su sa 0,25% tripsina, izbrojane i zasejane pri gustini od 5xl0<3>ćelija/bunarčić u ploče sa 96 bunarčića koje sadrže lOOpg MEM-alfa medijuma (sa dodatkom 10% dijaliziranog FBS i 550pg/mL G418) po bunarčiću. Sutradan isti medijum je dodat u količini od 100u.g/bazenčić i ćelije su kultivisane 2-3 nedelje kako bi se formirate kolonije. Kada su ćelije porasle do 50% konfluencije, medijum je zamenjen sa svežim. Nakon održavanja tokom 3 dana, medijiumi kulture su sakupljeni radi analize enzima.

[0084] Medijum je zamenjen sa 200u.g svežeg medijuma svaka tri dana. Na dan 3<~>4 nakon kultivisanja, ne-transficirane ćelije, to jest, ćelije koje nisu rezistentne na geneticin počele su da se odvajaju sa dna ploča sa 96 bunarčića što je primećeno optičkim mikroskopom. Odabrani klonovi su kultivisani dok su sekvencijalno transferovani iz ploča sa 96 bunarčića u ploče sa 24 bunarčića, ploče sa 6 bunarčića i 100-mm posude ovim redosledom. Kada su ćelije porasle do 80<~>90% konfluencije u 100-mm posudama, nivo ekspresije je ponovo izmeren. Ćelije su odvojene sa 0,25% tripsinom, izbrojane i nanete pri gustini od 5xl0<5>ćelija/bunarčić/3 ml u ploče sa 6 bunarčića, održavane 3 dana i prebrojane. Nivo ekspresije proteina je kvantitativno analiziran. Prema rezultatima analize, izabrano je 15 klonova.

[0085] [ 941 C. Odabir IDS ekspresionog soja sa visokim ekspresionim kapacitetom

[0086] 15 odabranih klonova kultivisano je pri povećanoj koncentraciji MTX kako bi se odabrali ćelijski sojevi u kojima je IDS amplificirana.

[0087] U ovom kontekstu, ćelije su inokulisane pri gustini od lxl0<6>ćelija/100 mm posuda/10 ml medijuma koji sadrži MTX i kultivisane do 80<~>90% konfluencije. Jedna desetina zapremine ćeiijske kulture ponovo je inokulisana u 100 mm posudi/IO mL. Ovaj postupak subkultivisanja ponovljen je dva puta. Ćelije su ostavljene da prođu najmanje tri prolaza, tako da su dovoljno prilagođene na povećane koncentracije MTX. Koncentracija MTX je povećana, od 5 nM za klonove odabrane nakon sprovođenja analize za prva tri dana, do 20 nM. U svakoj fazi, klonovi prilagođeni za povećanu koncentraciju MTX kultivisane su tokom tri dana radi merenja brzine rasta ćelija. IDS ekspesioni nivoi mereni su kako bi se odabrali ćelijski sojevi u kojima se dogodila amplifikacija IDS gena, odnosno sojevi ćelija u kojima je rekombinovana IDS eksprimirana po visokoj stopi. Od odabranih ćelijskih sojeva, NI4 je korišćen u

[0088] narednim eksperimentima jer ima najviši nivo ekspresije.

[0089] D. Odabir pojedinačnog soja ograničenim razblaživanjem

[0090] Postojala je mogućnost da se soj IMI4 može mešati sa drugim vrstama. Dakle, soj je odvojen u pojedinačan soj. N14 klonovi koji su preživeli 20 Nm MTX subklonirani su preko ograničenog razblaženja kako bi se odabrao željeni ćelijski soj.

[0091] Prvo, NI4 je inokulisan pri gustini od 0,5 ćelija/bunarčić u IMDM medijumu (Gibco BRL, Cat#12200) u pločama sa 96 bunarčića i kultivisan tako što je medijum dopunjavan svaka tri dana. Trećeg dana, pod mikroskopom tokom posmatranja ploča, isključuju se bunarčići u kojima su formirane dve ili više kolonija po bunarČiću. Bunarčići u kojima je formirana samo jedna kolonija po bunarčiću odabrani su i nastavljeno je sa kultivisanjem. Nakon kultivisanja od 15 dana, ćelije su sub-kultivisane u pločama sa 96 bazenČića i kada su ćelije porasle do 90% konfluencije, dopunjen je svež medijum.

[0092] Ukupno 263 pojedinačnih sojeva je identifikovano iz N14 soja. Od njih, za soj S46 utvrđeno je da ima najvišu IDS aktivnost i nazvan je NI4-S46.

[0093] <l-4> Ćelijska kultura

[0094] A. Boca za mešanje kulture

[0095] NI4-S46 soj kultivisan je na velikoj skali kako bi se proizvela IDS prema ovom pronalasku. Soj je inokulisan u EX-ćelijskom 302 serum-slobodnom medijumu (koji sadrži glutamin, dekstran sulfat, i pluroničnu F-68} u 125 mL bocama za kulturu i kultivisan na 37 + 1°C u 5 + 1% C0<2>inkubatoru. Nakon toga, ćelije su dodavane u razmeri 1:5<~>1:8 svaka dva do tri dana pomoću boca za mešanje. Nakon prolaza, zapremina kulture je postepeno povećavana do približno 2,400 mL. U mnogim bocama za mešanje, ćelije su kultivisane do nivoa koji je dovoljan da se inokuliše u fermentoru.

[0096] B. Kultura u 30L Fermentoru ( radna zapremina 20L)

[0097] Kada je gustina ćelija u boci za mešanje dostigla l,3xl0<6>ćelija/mL, inokulisane su u 30L fermentoru. Tokom kultivisanja ćelija, uslovi kulture održavani su na sadržaju rastvorenog kiseonika od 10% ili više, temperaturi kulture od 37 ± 1°C i pH 7.0 + 0.2. Ako je potrebno, uzimani su uzorci ćelija i posmatrani pod mikroskopom. Ćelijska kultura je ispitana kako bi se analiziralo ćelijsko brojanje, vitalnost ćelija, pH, koncentracija glukoze i koncentracija glutamina. Na osnovu rezultata analize, kada je odlučeno da su ćelije dovoljno porasle, ćelije su inokulisane u 150L fermentoru.

[0098] C. Kultura u 150L Fermentoru ( radna zapremina 100L)

[0099] Kada su ćelije u 30L fermentoru dostigle gustinu od 0,9xl0<6>ćelija/ml ili više, inokulisane su u 150L fermentoru. Tokom kultivisanja ćelija, uslovi kulture održavani su na sadržaju rastvorenog kiseonika od 10% ili više, temperaturi kulture 37 ± 1°C i pH 7.0 + 0.2. Ako je potrebno, uzimani su uzorci ćelija i posmatrani pod mikroskopom. Ćelijska kultura je ispitana kako bi se analiziralo ćelijsko brojanje, vitalnost ćelija, pH, koncentracija glukoze i koncentracija glutamina. Na osnovu rezultata analize, kada je odlučeno da su ćelije dovoljno porasle, ćelije su inokulisane u 650L fermentoru.

[0100] D. Kultura u 650L Fermentoru ( radna zapremina 500L)

[0101] Kada su ćelije u 150L fermentoru dostigle gustinu od 0.9xl0<5>ćelija/ml ili više, inokulisane su u 650L fermentoru. Tokom kultivisanja ćelija, uslovi kulture održavani su na sadržaju rastvorenog kiseonika od 10% ili više, temperaturi kulture 34 ± 1°C i pH 6,9 ± 0,2 tokom tri dana, a zatim na temperaturi kulture od 32 + 1°C i pH 6.9 + 0.2. Ako je potrebno, uzimani su uzorci ćelija i posmatrani pod mikroskopom kako bi se analizirala ćelijska brojanja, vitalnost ćelija, pH, koncentracija glukoze i koncentracija glutamina. U zavisnosti od rezultata analize, koncentracije glukoze i glutamina prilagođene su kako bi se nastavio rast ćelija. Tokom fermentacije, hidrolizat je dodat kako bi se povećala konverzija formilglicina.

[0102] <l- 5> Prečišćavanja IDS

[0103] IDS je izolovana iz ćeiijske kulture primenom serija sledeća četiri hromatografska postupka.

[0104] A. Sakupljanje i filtracija medijuma kulture

[0105] Kada je vitalnost ćelija ostala u opsegu od 80<~>85% 10 dana nakon inokulacije u 650 L fermentoru, kultivisanje je zaustavljeno. Ćelije su sa<K>upijene iz kulture korišćenjem Millipore POD filtracionog sistema i DOHCfiltera (Millipore) pod pritiskom od 0,9 bara ili manje. Nakon što su ćelije uklonjene, supernatant je filtriran kroz predfilter (Millipore, 0.5 + 0,2u.m) i filterod 0.45 + 0.2 pm i izolovan u jednokratnu sterilnu vinil kesu. Sakupljen rastvor kulture čuvan je na 2~8°C.

[0106] B. Koncentrovanje i Dijafiltracija

[0107] Filtrat izolovan u A koncentrovan je oko 10-puta pomoću ultrafiltracionog sistema (Filtracioni Membranski Sistem sa Tangencijalnim Protokom). Membrana (isečak: 30K, Pali) postavljena unutar ultrafiltracionog sistema isprana je VVFI (voda za injekcije) pri brzini protoka od 20<~>25 L/min, a zatim uravnotežena sa puferom (pH 7.0~8.0) koji sadrži 20 mM natrijum fosfat (natrijum dihidrofosfat monohidrat i natrijum hidrofosfat heptahidrat). Nakon uravnoteženja, filtrat je uveden u membranu izolovajući frakcije koje nisu prošle membranu. Kada je izolovana zapremina dostigla oko 1/10 prvobitne zapremine filtrata, postupak koncentrovanja je zaustavljen. Pufer je neprekidno razmenjivan u zapremini tri do četiri puta velikoj kao kod koncentrata. Ukoliko bi provodljivost i pH bile u okviru

[0108] kriterijuma, postupak je zaustavljen. [Kriterijum - provodljivost: = 5.0 mS/cm, pH 7,0 ~ 8,0].

[0109] C. Ajonizmenjivačka hromatografija

[0110] Kako bi se uklonile boje i nečistoće iz koncentrata dobijenog u B, anjonizmenjivačka hromatografija sprovedena je na koloni (GE Healthcare) ispunjenoj sa Q Sepharose smolama (GE Healthcare). Kolona je uravnotežena sa puferom za uravnoteženje (pH 7,0 ~ 8,0) koji sadrži 20mM natrijum fosfat (natrijum dihidrofosfat monohiđrata i natrijum hidrofosfat heptahidrata). Koncentrat dobijen u B je filtriran kroz 0.45 + 0.2u.m filter (Sartorius) i usut pri brzini protoka od 100<~>120 cm/h u kolonu za uravnoteženje. Postoje unošenje završeno, kolona je prvo isprana puferom za uravnoteženje, a zatim puferom za ispiranje (pH 5,5<~>7,5) koji sadrži natrijum hlorid. Nakon toga, ciljani protein je eluiran elucionim puferom (pH 5,5<~>7,5) koji sadrži natrijum hlorid.

[0111] D. Hidrofobna hromatografija

[0112] Za uklanjanje boja i nečistoća koje su ostale nakon anjonizmenjivaćke hromatografije, hidrofobna hromatografija je izvedena na koloni (GE Healthcare) ispunjenoj fenil Sepharose smolama (GE Healthcare). Kolona je uravnotežena sa puferom za uravnoteženje (pH 5,0 ~ 7,0) koji obuhvata natrijum hlorid. Eluat dobijen u C je filtriran kroz 0.45 + 0.2u.m filter (Sartorius) i usut pri brzini protoka od 70<~>100 cm/h u kolonu za uravnoteženje. Pošto je unošenje završeno, kolona je isprana puferom za uravnoteženje. Nakon toga, ciljani protein je eluiran sa elucionim puferom (pH 5,0 ~ 7,0) koji sadrži glicerol.

[0113] E. Inaktivacija virusa niskom pH

[0114] Virusi koji mogu biti izvedeni iz ćelija domaćina ili bilo kog korišćenog materijala u izvedenim postupcima inaktivirani su niskim pH uslovima. U tom smislu, eluat dobijen u D je održavan 2 sata na pH 3.0 ~ 4.0 čija je kiselost korigovana 25% sirćetnom kiselinom. Nakon toga, pH eluata povećana je na 4.0<~>5.0 upotrebom 0.5 M natrijum hidroksida za upotrebu u sledećem postupku. Inaktivacija niskom pH izvedena je na 12 ± 2°C.

[0115] F. Katjonizmenjivačka hromatografija

[0116] IDS je glikoprotein sa oligosa ha riđima, i postoji kao izomer koji ima drugačiju izoelektričnu tačku prema sadržaju sialinske kiseline na kraju glikanskog lanca. Kao oligosaharidi sa negativnim naelektrisanjem, sialinska kiseline pokazuje razliku u smislu stepena vezivanja za katjon izmenjivačke smole prema sadržaju sialinske kiseline. Koristeći ovu karakterizaciju, katjonizmenjivačka hromatografija je sprovedena da bi se dobila IDS koja pokazuje visoku aktivnost (visok sadržaj formilglicina) sa visokim sadržajem sijalne kiseline i kako bi se uklonile druge nečistoće [nečistoće proizvoda (nagomilana IDS, obrađena IDS), nečistoće postupka (proteini ćelije domaćina)]. Detaljnije, kolona ispunjena katjon izmenjivačkim Capto ™ MMC smolama (GE Healthcare) uravnotežena je puferom za uravnoteženje sa dodatkom glicerola (pH 4.0<~>5.0). Inaktivirani eluat dobijen u E filtriran je kroz 0,45 + 0,2u.m filter (Sartorius) i usut pri brzini protoka od 100 do 120 cm/h u kolonu za uravnoteženje. Potom, kolona je isprana sa puferom za uravnoteženje, a zatim eluirana sa puferom za uravnoteženje sa dodatkom glicerola (pH 4,0<~>6,0) dajući IDS sa visokim sadržajem sijalinske kiseline (izoelektrična tačka 3.5 ili manje), visokom aktivnošću (sadržaj formilglicina: 80 ± 15%) i visoke čistoće (SE-HPLC, 98% ili više).

[0117] G. Afinitetna hromatoerafija

[0118] Afinitetna hromatografija (Blue Sepharose, GE Healthcare) sprovedena je da bi se uklonio glicerol koji je primenjen u katjonizmenjivačkoj hromatografiji i kako bi se smanjila zapremina eluata. Eluat dobijen u F filtriran je kroz 0.45 + 0,2pm filter (Sartorius) i usut pri brzini protoka od 100<~>120 cm/h u kolonu ispunjenu Blue Sepharose smolom (GE Healthcare) koja je prethodno uravnotežena puferom za uravnoteženje sa dodatkom glicerola (pH 4,5<~>5,5). Pošto je unošenje završeno, kolona je isprana puferom za ispiranje (pH 4,5<~>5,5), a ciljani protein je eluiran sa elucionim puferom (pH 6,0<~>8,0).

[0119] H. Koncentrovanje i zamena pufera

[0120] Ultrafiltracioni sistem (Filtracioni Membranski Sistem sa Tangencijalnim Protokom) korišćen je da se podesi koncentracija proteina eluata dobijenog u G i za zamenu pufera prečišćenog proteina sa formulacionim puferom. Membrana (isečak: 10K, Pali) postavljena unutar ultrafiltracionog sistema isprana je sa WFI (voda za injekcije) pri brzini protoka od 450 ~ 650 ml/min, a zatim uravnotežena sa formulacionim puferom (2,25 g/L natrijum dihidrofosfat monohidrata, 0,99 g/L natrijum hidrofosfat heptahidrata, 8 g/L natrijum hlorida, pH 6.0<~>7.0) bez polisorbata 20, praćeno koncentrovanjem ciljanog proteina. Pufer je uzastopno razmenjivan u zapremini tri do četiri puta velikoj kao kod koncentrata. Ako su provodijivost i pH bili u okviru kriterijuma, postupak je zaustavljen, [kriterijumi - provodljivost: 15.0 + 3.0 mS/cm, pH 6,0 ~ 7,0]. Podesiti sadržaj koncentrovanog rastvora do 4.0 ± 0.5 mg/mL.

[0121] I. Nanofiltracija

[0122] Korišćenjem nano filtera (NFP, Millipore), nano filtracija je izvedena radi uklanjanja virusa koji mogu doći iz ćelija domaćina ili bilo kojeg od upotrebljenih materijala. Test integriteta za filter izveden je nakon pranja nano filtera vodom za injekcije. Kada je prošao test integriteta, nanofilter je uravnotežen sa 1 L formulacionog pufera (2,25 g/L natrijum dihidrofosfat monohidrata, 0.99 g/L natrijum hidrofosfata, 8 g/L natrijum hlorida, pH 6,0 ~ 7,0) bez polisorbata 20. Po završetku uravnotežavanja, koncentrat dobijen u H propušten je kroz filter pod pritiskom od oko 2 bara kako bi se proizveo nano- filtrat. Postoje filtriracija završena, filter je ispran formulacionim puferom (rastvor za naknadno ispiranje). Nakon kombinovanja nano fiitracionog rastvora i rastvora za naknadno ispiranje, sadržaj proteina je izmeren.

[0123] J. Supstanca leka

[0124] Koncentracija proteina filtrata dobijenog u I podešena je sa formulacionim puferom bez polisorbata 20. Posle dodavanja polisorbata, rastvor je filtriran kroz filter promera pora 0.2u.m kako bi se proizvela supstanca leka. Supstanca leka je podeljena na jednake delove i ostavljena u dubokom zamrzivaču (-70 ± 10°C) do upotrebe.

[0125] K. Proizvod leka ( punjenje, etiketiranje, pakovanje)

[0126] Količina ostavljena u dubokom zamrzivaču otopljena je u vodenom kupatilu koje je održavano na 28 ± 1°C i razblažena do koncentracije proteina od oko 2,05 ± 0,2 mg/mL koristeći formulacioni pufer (2,25 g/L natrijum dihidrofosfat monohidrata, 0,99 g/L natrijum hidrofosfat heptahidrata, 8 g/L natrijum hlorida, 0,23 g/l polisorbata 20, pH 6,0<~>7,0). Posle toga, razblaženje rastvora filtrirano je kroz filter od 0.2pm kako bi se proizvela finalna masa rastvora. Ova finalna masa rastvora ispunjena je u 6 ml bočicu sa oko 3,3 g koristeći automatsko punjenje. Kada je inspekciono testiranje bočice završeno, bočice su upakovane kako bi se proizveo proizvod leka.

[0127] Postupak od kultivisanja soja do finalne proizvodnje proizvoda prikazan je na FIG. 3.

[0128] UPOREDNI PRIMER 1: Dobijanje Elapraze

[0129] Elaprase<®>komercijalno dostupna rekombinovana IDS, korišćena je kao komparativni primer.

[0130] EKSPERIMENTALNI PRIMER 1: Strukturna analiza i karakterizacija nove IDS

[0131] <1 1> Amino kiselinsko sekvencionisanje - Interno sekvencionisanje

[0132] Deglikozilovana IDS odvojena je pomoću SDS-PAGE, nakon čega sledi sečenje gela. Nakon toga, digestati koji su rezultat tretmana sa raznim endoprotenazama (tripsin, himotripsin, AspN, himotripsin/tripsin, AspN/tripsin, Gluc i GluC/tripsin) analizirani su primenom MALDI-MS/MS i LC ESI-MS/MS {FIG. 5). Kao rezultat toga, identifikovano je ukupno 525 amino kiselinskih sekvenci. Amino kiselinske sekvence poklopaju se sa teoretskom sekvencom ljudske IDS (FIG. 6).

[0133] <l- 2> Analiza disulfidne veze

[0134] Kod polipeptida, disulfidna veza je neko kovalentno vezivanje, obično izvedeno sparivanjem dve SH grupe cisteinskih ostataka, koja igra važnu ulogu u stabilizaciji veće strukture proteina. Teoretski, 525 amino kiselina IĐS-a sadrže Šest cisteinskih ostataka, od kojih četiri formiraju disulfidne veze. U ovom primeru, identifikovana je lokacija cisteinskih ostataka odgovornih za disulfidne veze IDS, Prvo, IDS je deglikozilovana tretiranjem sa PNGazom F kako bi se isključilo mešanje šećera. Radi sprečavanja cisteinskih ostataka koji ne učestvuju u formiranju disulfidnih veza od delovanja kao ometajući faktor, 4-vinilpiridin je korišćen za pretvaranje IDS u neredukujući uzorak tako da su SH grupe zadržane od nasumičnog formiranja S-S veza. U međuvremenu, disulfidne veze su razdvojene sa DTT, nakon čega sledi blokiranje sa 4-vinilpiridinom dajući redukovani uzorak. Tripsin i AspN, izabran na osnovu rezultata eksperimentalnog Primera 1-3, primenjeni su na neredukovani i redukovani uzorak. Peptidni fragmenti ovako dobijeni razdvojeni su pomoću RP-HPLC. RP-HPLC hromatogrami neredukovanih i redukovanih uzoraka poređeni su tako da se diskriminišu pikovi koji su pronađeni kod neredukovanog uzorka, ali ne i u redukovanom uzorku (FIG. 7).

[0135] Za precizniju analizu, frakcije na diskriminisanim pikovima redukovane su po veličini dodatnim tretiranjem sa endoproteinazama, a pikovi koji sadrže disulfidne veze analizirani su primenom MALDI-MS (FIG. 8).

[0136] Pikovi sa disuifidnim vezama ponovo su sekveniono analizirani primenom MALDI-MS/MS (FIG. 9) kako bi se ispitali položaji cisteinskih ostataka koji formiraju disulfidne veze među S25 IDS aminokiselinskim ostacima. Kao što je prikazano na FIG. 10, primećeno je da se disulfidne veze formiraju između C146-C159 i između C397-C407.

[0137] <l- 3> Analiza sadržaja formilglicina

[0138] IDS degradira heparan sulfat i dermatan sulfat, a oba su neka vrsta glikozaminoglikana (GAG). Ova degradaciona aktivnost nije stečena sve dok cisteinski ostatak na položaju 59 u aktivnom mestu (Cys59) nije konvertovan u formilglicin (FGIy) post-translacionom modifikacijom. Stoga, degradaciona aktivnost IDS je analizirana ispitivanjem post-translacione modifikacije Cys59 u FGIy. Za ovu analizu, koriščen je AOUA (apsolutna kvantifikacija), postupak kvantitativne analiza zasnovane na MS (masena spektroskopija), u kojoj je radio-obeleženi sintetički supstrat (AQUA peptid) ubačen u uzorak. Kako bi se kvantitativno analizirao formilglicin na Cys59 položaju, serijsko razblaženje AQ.UA peptida ubačeno je u uzorak, i iscrtana je kriva kalibracije. Odnosi peptida tipa FGIy u odnosu na peptit tipa Cys izmereni su LC-ESI-MS analizom, i primenjeni na AQUA kalibracionoj krivi kako bi se izračunao sadržaj formilglicina.

[0139] Ova analiza utvrdila je konverziju Cys59 u FGIy pri brzini od 80 ± 15%. S obzirom na Cis50 u FGIy brzinu konverzije od oko 50% kod komercijalno dostupnog agensa Elapraze (Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007; Genet Med, 2006: 8 (8): 465-473), terapeutska kompozicija koja obuhvata IDS prema ovom pronalasku i formulacija pripremljena sa ovom kompozicijom smatra se da ima mnogo veću terapeutsku aktivnost u poređenju sa Elaprazom.

[0140] <l- 4> Identifikacija obrazca glikozilacije

[0141] Ispitivanje je izvedeno kako bi se ispitalo da li je IDS prema ovom pronalasku je glikozilovana i kako bi se identifikovao glikozilacioni obrazac ukoliko ga ima. U tom cilju, IDS je tretirana sa različitim enzimima glikozilacione hidrolaze, a digestati su razdvojeni sa SDS-PAGE i njihovi obrasci pokretljivosti su analizirani.

[0142] Detaljnije, uzorci IDS su digestovani kombinacijama sledeća četiri enzima glikozilacione hidrolaze i razdvojeni sa SDS-PAGE.

[0143] Kao što se može videti na FIG. 11, IDS prema ovom pronalasku pocepana je od strane PNGaze F i Endo H, ali ne i O-glikozidaze, pokazujući da je IDS prema ovom pronalasku N-glikozilirani protein. Pored toga, IDS je u potpunosti pocepana PNGazom F, ali njena redukcija veličine je neznatna nakon tretmana sa Endo H. PNGaza F deluje na glikozMaciona mesta sva tri obrazaca dok Endo H deluje na glikozilaciona mesta tipa visoke manoze i hibridnog tipa. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da IDS sadrži kompleks tri obrasca glikozilacije, visoku-manozu i hibrid.

[0144] <l- 5> Analiza manoza- 6- fosfatnog sadržaja

[0145] Vezivanjem za M6P receptor na ćelijama, manoza-6-fosfat (M6P) omogućava IDS da se internalizuje u ćelije i tako da hidrolizuje heparan sulfat ili dermatan sulfat u lizozomima. U ovom primeru, IDS je kiselina hidrolizovana sa trifluorosirćetnom kiselinom (TFA) i podvrgnuta HPAEC-PAD (Bio-LC) kako bi se kvantitativno analizirao manoza-6-fosfat.

[0146] IDS je hidrolizovana sa 6,75M TFA, a hidrolizat je analiziran korišćenjem tečne hromatografije (Anjonizmenjivačka hromatografija visokog učinka sa pulsnom amperometrijskom detekcijom; HPAEC-PAD). M6P koncentracija koja je već poznata analizirana je pod istim uslovima, a molarni odnosi M6P u odnosu na glikoprotein dobijeni su poređenjem područja. Analiza je sprovedena u triplikatu. M6P standardni materijali i M6P kompozicioni hromatogram! IDS prikazani su na FIG. 12, a molarni odnosi M6P sumirani u Tabeli 2 koja sledi.

[0147] Kao što se može videti iz podataka Tabele 2, pojavljuje se oko 3 mola M6P po molu IDS. Iz ovih rezultata može se zaključiti da terapeutska kompozicija koja obuhvata IDS prema ovom pronalasku i formulacija pripremljena sa ovom kompozicijom imaju visoku sposobnost da katabolišu GAG akumuliran u lizozomima.

[0148] < 1- 6 > Masena analiza

[0149] Mase glikozilovane IDS i deglikozilovane IDS izmerene su primenom MALDI-TOF-MS. Tretiranje glikozilirane IDS sa PNGazom F obezbedilo je deglikozilovanu IDS. MALDI-TOF-MS izvedena je korišćenjem Voyager-DE PRO Biospektrometrije (Applied Biosvstems, USA) kombinovana sa laser-desorpcionim spektrometrom sa odloženom ekstrakcijom. Instrument je normalizovan sa goveđim serumom albumina i IgGl. Rezultati analize sumirani su u Tabeli 3, u nastavku.

[0150] Kao Što očigledno iz podataka Tabele 3, molekularna veličina je 77.244 Da za glikozilovanu IDS i 59,399 Da za deglikozilovanu IDS, što je slično molekularnoj masi izračunatoj na osnovu amino kiselinske sekvence, koja je 59,298 Da.

[0151] <l- 7> Merenje Čistoće

[0152] Čistoća IDS izmerena je hromatografijom ekskluzije po veličini. Hromatografija ekskluzije po veličini je hromatografski postupak u kojem se molekuli u rastvoru razdvajaju po svojoj relativnoj molekularnoj masi i obliku. U hromatografiji ekskluzije po veličini, proteini veći od veličine pore kolone ne mogu da prodru kroz sistem pora i prolaze kroz kolonu odjednom. Nakon toga, analiti sa manjim molekularnim masama ili veličinama eluiraju kasnije. Za ovu hromatografiju, uposlen je Alliance 2695 HPLC sistem (VVaters Wl, USA) u kombinaciji sa 2487 UV/VIS detektorom (VVaters VVI, USA). Proteini su detektovani na 214 nm, i analizirani korišćenjem Empovver 2 Softvera. Analiti su uneti u TSK G3000SWXL kolonu povezanu sa TSK SWXL kolonom za čuvanje (Tosoh, Japan). IDS, nakon razblaženja do koncentracije od 1.0 mg/mL u formulacionom puferu, uneta je u zapremini od 10u.m na kolonu. Dozvoljen je tok sa mobilnom fazom (20 mM natrijum fosfatni pufer, 200 mM NaCI, pH 7,0) pri brzini protoka od 0,5 ml/min, tokom 60 min.

[0153] Rezultati analize prikazani su na FIG. 13. Kao što se može videti, IDS monomeri imali su

[0154] reteciono vreme od približno 16.4 min, i bili su eluirani sa 100% čistoće.

[0155] <l- 8> Merenje aktivnosti korišćenjem sintetičkog supstrata

[0156] Reakcija IDS sa sintetičkim supstratom (4-metilumbeliferil-L-iduronid-2-sulfat Na<?>(MU-ldoA-2S) od 4 sata oslobađa sulfatni ostatak (primarna reakcija). Nakon primarne reakcije, dodavanje LEBT (lizozomni enzimi prečišćeni iz goveđih testisa) indukuje sekundarnu enzimsku reakciju sa supstratom 4-metilumbeliferi-L-iduronidom (reaktant koji je ostao nakon oslobađanja sulfatnog ostatka u primarnoj reakciji) kako bi se odvojio 4-metilumbeliferilni ostatak iz L-iduronidnog ostatka. Pošto je preostali 4-metilumbeliferil fluorogeničan, aktivnost IDS je procenjena merenjem intenziteta fluorescencije (Ex.355nm/Em.460nm). Pronađeno je da IDS prema ovom pronalasku varira u specifičnoj aktivnosti od 19 do 55 nmol/min/pg. Ova aktivnost ukazuje da formilglicin postoji u aktivnom mestu enzima kao rezultat post-translacione modifikacije cisteinskog ostatka na položaju 59 u IDS.

[0157] <l- 9> Merenje aktivnosti korišćenjem prirodnog supstrata

[0158] Da bi se utvrdilo da li postoji reakcija sa IDS i prirodnim supstratom, izmereni su sulfatni joni oslobođeni iz supstrata (heparin disaharid) reakcijom sa IDS. Reakciona smeša je uneta u jonsku kolonu (Vydac 302IC) i ostavljena da teče sa mobilnom fazom 0,49 g/L ftalne kiseline pri brzini protoka od 2 ml/min, tokom kojih su detektovani slobodni sulfatni joni na 290 nm u negativnom modu.

[0159] Kao što je prikazano na FIG. 14, IDS je potvrdila da hidrolizuje sulfatni jon iz heparin disaharida, ukazujući da je IDS sposobna da degradira O-vezani sulfat dermatana i heparan sulfat in vivo.

[0160] <1- 10> Aktivnost in vivo ćelijskog preuzimanja

[0161] Ćelijska internalizaciona aktivnost IDS izmerena je upotrebom normalnih ćelija fibroblasta i ćelija pacijenta sa Hanterovim sindromom. U tom smislu, normalne ćelije fibroblasta i ćelije pacijenta sa Hanterovim sindromom (dobijene iz Samsung Medical Center, Seul, Koreja) kultivisane su i omogućeno im je da se internalizuju u ćelije dok su inkubirane sa različitim koncentracijama IDS na 37°C tokom 20 sati u 5% COj inkubatoru. Nakon sakupljanja, ćelije su lizirane i u lizatu je utvrđen nivo IDS internalizovanih u ćelija.

[0162] Na osnovu koncentracionog odnosa internalizovane IDS prema IDS dodate u normalne ćelije fibroblasta, konstruisani su Michaelis-Menten graf i Lineweaver-Burk dijagram iz kojih je izračunato Kp<reuz>iman<j>ellDS koncentracija pri kojoj je brzina reakcije polovina od maksimalne brzine postignute pri zasićenim koncentracijama supstrata). Kp<feuzimanje>izračunato je da iznosi 18,0 nM ili manje, što ukazuje da je IDS intemalizovana u ćelijama vezivanjem M6P IDS za M6P receptore na površini ćelije (FIG. 15).

[0163] Takođe, analizirano je ćelijsko preuzimanje i aktivnost IDS u ćelijama pacijenta sa Hanterovim sindromom kao i normalnih humanih ćelija fibroblasta. Preuzimanje i aktivnost IDS povećani su i u jednim i u drugim ćelijama, pokazujući da je IDS prema ovom pronalasku efikasnije internalizovana u ćelijama (FIG. 16).

[0164] EKSPERIMENTALNI PRIMER 2: Klinička analiza efekta IDS

[0165] Trideset i jedan pacijenata sa Hanterovim sindromom podeljeni su u tri grupe, data im je IDS prema ovom pronalasku i analizirani su na parametre povezane sa Hanterovim sindromom. Elaprase<®>komercijalno dostupan terapeutski agens za Hanterov sindrom, korišćen je kao pozitivna kontrola.

[0166] <2- l> Promena u nivou GAG u urinu ( osnovni parametar provere za test validnosti)

[0167] Trima grupama pacijenata sa Hanterovim sindromom davano je 24 nedelja Elapraza (0,5 mg/kg) i IDS prema ovom pronalasku (0.5 mg/kg i 1.0 mg/kg), a nivoi GAG (glikozaminoglikan) u urinu izmereni su kao što je prethodno prijavljeno (Conn. Tissue Res. Vol.28, pp317-324, 1990.<J>Ann. Clin. Biochem. Vol.31, ppl47-152,1994). Merenja su sumirana u Tabeli 4, u nastavku.

[0168] Kod pacijenata sa Hanterovim sindromom, kao stoje prikazano u Tabeii 4, nivoi GAG u urinu smanjeni su za 18,7% nakon injekcije Elapraze, a za 29,5% nakon injekcije IDS prema ovom pronalasku u istoj dozi. Pored toga, kada je injektovana u dozi od 1.0 mg/kg, IDS prema ovom pronalasku smanjila je nivo GAG u urinu za čak 41.1 %. Ovi rezultati pokazuju da je IDS prema ovom pronalasku efektivna terapija za Hanterov sindrom, bolest izazvana kao rezultat akumulacije GAG.

[0169] < 2- 2 > 6 - MWT ( 6 minutni test buđenja) promena ( sekundarna provera parametra za test validnosti)

[0170] Pošto su pacijentima sa Hanterovim sindromom davane Elapraza i IDS prema ovom pronalasku tokom 24 nedefje, merene su razdaljine koje su prešli za 6 minuta prema postupku opisanom u AM. J. Respir. Crit. Care. Med., Vol 166, pp 111-117, 2002. Rezultati su dati u Tabeli 5, u nastavku.

[0171] Kao što je prikazano u Tabeli 5, 6-WMT promena iznosila je samo 1.3 % za pacijente kojima je davana Elapraza, ali je povećana na 18,2% za pacijente kojima je davana ista doza IDS prema ovom pronalasku. Pacijenti sa Hanterovim sindromom otežano su se kretali zbog kontrakture. Međutim, IDS prema ovom pronalasku poboljšava simptome i stoga je efikasna za tretiranje Hanterovog sindroma.

[0172] Slobodantekst Liste sekvenci

[0173]

Claims (14)

1. Kompozicija iđuronat-2-sulfataze (IDS) koja ima amino kiselinsku sekvencu SEO. ID NO: 1, u kojoj je cisteinski ostatak na položaju 59 u IDS amino kiselinskoj sekvenci konvertovan u formilglicin (FGIy) pri molarnom odnosu od 65% ili više, poželjno pri molarnom odnosu od 75% ili više.

2. IDS kompozicija prema zahtevu 1, gde IDS koja ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 sadrži manoza-6-fosfat u količini od 2,0 do 4,0 mola po molu IDS, poželjno u količini od 2,5 do 3,0 mola po molu IDS.

3. Formulacija, koja obuhvata IDS kompoziciju prema bilo kom od zahteva 1 i 2.

4. Formulacija prema zahtevu 4, koja dalje obuhvata: farmaceutski prihvatljiv nosač; i opciono jednu ili više supstanci izabranih iz grupe koju čine pufer, ugljovodonik, stabilizator, antioksidans, bakteriostatici, helacioni agens, adjuvans, agens za suspendovanje, sredstvo za zgušnjavanje, i konzervans.

5. Postupak za dobijanje kompozicije prema bilo kom od zahteva 1 i 2, koji obuhvata: (1) kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja transformisanog genom koji kodira IDS predstavljena sa SEQ ID NO: 1 i dobijanje kulture; i (2) prečišćavanje kulture putem anjonizmenjivaćke hromatografije, hidrofobne hromatografije, katjonizmenjivačke hromatografije, i afinitetne hromatografije, pri čemu se katjonizmenjivačka hromatografija izvodi primenom elucionog pufera sa pH od 4,0 do 6,0.

6. Postupak prema zahtevu 5, koji obuhvata: (1) transformisanje ćelije domaćina ekspresionim vektorom koji nosi IDS gen radi dobijanja rekombinovanog ćelijskog soja; (2) kultivisanje rekombinovanog ćelijskog soja u prisustvu hidrolizata u medijumu bez seruma i dobijanje kulture; (3) prečišćavanje IDS iz kulture putem anjorioizmenjivačke hromatografije, hidrofobne hromatografije, katjonimenjivačke hromatografije i afinitetne hromatografije; i EP 12803297.6 (4) kombinovanje prečišćene IDS sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

7. Postupak prema bilo kom od zahteva 5 i 6, u kojem je ćelija domaćin jajna ćelija kineskog hrčka.

8. Postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 7, u kojem se hidrofobna hromatografija izvodi primenom elucionog pufera sa pH od 5,0 do 7,0.

9. Postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 7,u kojem se afinitetna hromatografija izvodi upotrebom elucionog pufera sa pH od 6,0 do 8,0.

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 7, u kojem se anjonizmenjivačka hromatografija izvodi upotrebom elucionog pufera sa pH od 5,5 do 7,5.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 10, koji dalje obuhvata inaktivaciju virusa pri pH od 3,0 do 4,0.

12. Kompozicija pripremljena postupkom prema bilo kom od zahteva 5 do 11.

13. Postupak za pripremanje formulacije, koji obuhvata formulisanje kompozicije prema zahtevima 1 ili 2 sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i opciono sa jednom ili više supstanđ odabranih iz grupe koju čine pufer, ugljovodonik, stabilizator, antioksidans, bakteriostatik, helacioni agens, adjuvans, agens za suspendovanje, sredstvo za zgušnjavanje, i konzervans.

14. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1, 2 i 12, ili formulacija prema bilo kom od zahteva 3 i 4, za upotrebu u tretiranju Hanterovog sindroma.