RS54822B2 - Kompozicija i formulacija koja obuhvata rekombinovanu humanu iduronat-2-sulfatazu i postupak za njeno dobijanje - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na postupak pripreme kompozicije iduronat-2-sulfataze (kasnije u ovom tekstu "IDS", iduronate-2-sulfatase) za lečenje Hunter-ovog sindroma.

[0002] Preciznije, kompozicija za lečenje Hunter-ovog sindroma kao aktivan sastojak sadrži IDS sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom kao SEQ ID NO: 1, pri čemu je cisteinska rezidua na poziciji 59 u IDS aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1 konvertovana u formilglicin (FGly: 2-amino-3-oksopropionska kiselina) sa molarnim odnosom od 75% ili više, i poželjno sa molarnim odnosom od 80% ili više.

[0003] Postupak pripreme kompozicije za lečenje Hunter-ovog sindroma prema predmetnom pronalasku uključuje:

(1) kultivisanje rekombinantnog ćelijskog soja transformisanog genom koji kodira IDS predstavljenu SEQ ID NO: 1 i dobijanje kulture; i

(2) prečišćavanje kulture anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom,

što se karakteriše time što se katjonska izmenjivačka hromatografija izvodi uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 4.0 do 6.0, pri čemu pomenuti postupak uključuje:1) transformisanje ćelije-domaćina ekspresionim vektorom koji nosi IDS gen da bi se dobio rekombinantni ćelijski soj; 2) kultivisanje rekombinantnog ćelijskog soja u prisustvu hidrolizata u medijumu koji ne sadrži serum i dobijanje kulture; 3) prečišćavanje IDS iz kulture anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom; 4) kombinovanje prečišćene IDS sa farmaceutski prihvatljivim nosačem; i pri čemu je ćelijadomaćin ćelija ovarijuma kineskog hrčka.

[0004] S obzirom na to da ima prednosti u odnosu na konvencionalne proizvode u pogledu sigurnosti i farmaceutske efikasnosti, terapijska kompozicija koja sadrži IDS i formulacija koja je sadrži, mogu se efikasno koristiti za lečenje Hunter-ovog sindroma.

Stanje tehnike

[0005] Hunter-ov sindrom ili mukosaharidoza tipa II lizozomska je bolest skladištenja (lysosomal storage disease, LSD) u kojoj se mukopolisaharidi, poznati i kao glikozaminoglikani (glycosaminoglycans, GAG), ne razlažu pravilno i nagomilavaju se u telu zbog deficijencije IDS. Kako GAG nastavljaju da se nagomilavaju u telesnim ćelijama, različiti znaci Hunter-ovog sindroma postaju vidljiviji. Kod nekih ljudi sa Hunter-ovim sindromom, fizičke manifestacije uključuju specifične crte lica i veliku glavu. Od simptoma Hunter-ovog sindroma reprezentativni su uvećani abdomen zbog hepatomegalije ili splenomegalije, gluvoća, oboljenje srčanih zalistaka, opstruktivna bolest disajnih puteva i apnea tokom sna. Isto tako, Hunter-ovim sindromom mogu biti zahvaćeni veliki zglobovi, što dovodi do krutosti zglobova i ograničenih pokreta. U nekim slučajevima Hunter-ovog sindroma, zahvaćenost centralnog nervnog sistema dovodi do zaostajanja u razvoju i problema na nivou nervnog sistema. Poznato je da se Hunter-ov sindrom sreće sa stopom od 1 u 162000, da je recesivni genetički poremećaj vezan za X hromozom i da dovodi do velike patnje i porodice i samog pacijenta.

[0006] U vezi sa lečenjem Hunter-ovog sindroma vršena su različita ispitivanja, uključujući kalemljenje kostne srži, enzimsku supstituciju, i gensku terapiju. Iako kalemljenje kostne srži može da zaustavi većinu simptoma, teško je naći poklapanje HLA (human leukocyte antigen, antigen humanih leukocita) za sve pacijente. Pored toga, kalemljenje kostne srži je velika hirurška intervencija udružena sa više neželjenih efekata, uključujući ozbiljno ugrožavanje života pacijenta u slučaju lošeg poklapanja HLA. Genskom terapijom Hunter-ovog sindroma normalan IDS gen se u telo isporučuje virusnim vektorom kao što je adenovirusni ili retrovirusni vektor, ili nevirusnim vektorom. Međutim, genska terapija ostaje eksperimentalna tehnika, i ne primenjuje se klinički. Što se tiče tretmana enzimskom supstitucijom za Hunterov sindrom, u njemu se primenjuje eksterno proizvedena IDS, i on ima tu prednost što je jednostavan. Međutim, enzimska supstitucija mora da se vrši kontinuirano, što iziskuje velike troškove. Elaprase<®>(Shire Pharmaceuticals Group), proizvedenu korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK, odobrila je FDA kao enzimski supstitucioni tretman za Hunter-ov sindrom. Međutim, ovaj lek je veoma skup i ima nedostatke loše efikasnosti i bezbednosti. Dokument MUENZER, J. ET AL., MOL. GENET. METAB., vol. 90, br.3, mart 2007 (2007-03), str. 329-337, pokazuje rezultate faze I/II kliničkog ispitivanja terapije enzimskom supstitucijom u mukopolisaharidozi II (Hunter-ov sindrom). Upotrebljeni enzim - idursulfaza (Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cambridge, MA) je rekombinantna forma humane iduronat-2-sulfataze sa opsegom post-translacione modifikacije cisteina 59 u formilglicin od približno 50%.

[0007] Kako je opisano gore, iako su razvijene različite terapije za Hunter-ov sindrom, i dalje postoji goruća potreba za novom terapijom i sredstvom koje ispoljava visoku terapijsku efikasnost, uz visoku bezbednost.

Objava pronalaska

Tehnički problem

[0008] Cilj predmetnog pronalaska je prevazilaženje problema koji se sreću u stanju tehnike i obezbeđivanje postupka za pripremanje kompozicije IDS za lečenje Hunter-ovog sindroma. Kompozicija kao aktivni sastojak sadrži rekombinantnu IDS koja garantuje visoku terapijsku efikasnost i bezbednost, i koja je proizvedena poboljšanim postupcima kultivisanja i prečišćavanja.

Rešenje problema

[0009] Da bi se postigao gore navedeni cilj, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremanje kompozicije IDS za lečenje Hunter-ovog sindroma, koja kao aktivni sastojak sadrži IDS koja ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO: 1, pri čemu je cisteinska rezidua na poziciji 59 konvertovana u formilglicin (FGly) sa molarnim odnosom od 75% ili više, i poželjno sa molarnim odnosom od 80% ili više.

[0010] IDS, u ovom tekstu nazvana i iduronat-2-sulfataza ili I2S, ima molekulsku veličinu od 56 kDa, posle izolovanja i prečišćavanja iz jetre, bubrega ili placente ljudi (Bielicki, J. et al. (1990) Biochem, J., 271: 75∼86). IDS se eksprimira kao monomerni protein od 550 aminokiselina i, posle isecanja signalnog peptida od 25 amino-kiselina, sekretuje se u medijum kao zreli aktivni protein od 525 amino-kiselina. Molekulska težina IDS varira sa glikozilacijom i nađeno je da je, posle tretmana endoglikozidazom F, u opsegu od približno 60 do 90 kDa, kako je izmereno pomoću SDS-PAGE.

[0011] IDS sadrži dve disulfidne veze i osam N-glikozilacionih mesta i sintetiše se kao glikoprotein, pošto podlegne post-translacionoj modifikaciji tokom koje, kod eukariota, N-glikozilaciona mesta bivaju zauzeta oligosaharidnim lancima kompleksnog, hibridnog i visokomanoznog tipa. Kada se sekretuje u medijum kulture, IDS se može koristiti kao lek, posle podvrgavanja tipičnim postupcima izolacije i prečišćavanja. IDS može biti u formi glikoproteina sa različitim obrascima glikozilacije, u zavisnosti od različitih faktora, uključujući, na primer, tehnike genetičke rekombinacije IDS, transformacije (npr., upotrebljene ćelijske linije), kulture i prečišćavanja.

[0012] U ovom pronalasku, objavljeno je da sadržaj manoza-6-fosfata (mannose-6-phosphate, M6P) i stopa konverzije Cys-59 u FGly u velikoj meri utiču na terapijsku efikasnost i bezbednost IDS. Prisustvo manoza-6-fosfatnih (M6P) rezidua dopušta specifično vezivanje enzima za M6P receptore na površini ćelije, dovodeći do ćelijske internalizacije enzima koji cilja lizozome, i zatim katabolisanja akumuliranih GAG. Biološka aktivnost IDS zavisi i od postmodifikacije konzerviranog cisteina (pozicija 59) u formilglicin.

[0013] Ukoliko nije drugačije navedeno, izraz "IDS", kako se koristi u ovom tekstu, označava IDS protein povezan sa ugljenim hidratima, to jest, glikozilovanu IDS. IDS opisana u ovom tekstu ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.

[0014] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "obrazac glikozilacije" IDS odnosi se na profil oligosaharida vezanih za osam mesta glikozilacije rezultujuće IDS (npr., mesta glikozilacije i vrste oligosaharida).

[0015] IDS sadržana u kompoziciji za lečenje Hunter-ovog sindroma, kako je opisano u ovom tekstu, ima poznatu aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1), ali ima različiti obrazac glikozilacije i različitu stopu konverzije cisteina na poziciji 59 u formil glicin, kako je gore opisano (vidi Primere 1-5 i 1-6).

[0016] Znači, IDS upotrebljena u kompoziciji za lečenje Hunter-ovog sindroma, kako je opisano u ovom tekstu, ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 sa konverzijom cisteina na poziciji 59 u formil glicin (FGly) sa molarnim odnosom od 75% ili više, i poželjno sa molarnim odnosom od 80% ili više, dok stopa konverzije u elaprazi iznosi približno 50% (Genet Med 2006:8(8):465-473). Poznato je da je formilglicin duboko uključen u sposobnost IDS da razgrađuje supstrat, što predstavlja aktivnost IDS. Prema tome, pošto su kompozicija opisana u ovom tekstu i konvencionalno sredstvo elapraza različiti, kompozicija i formulacija opisane u ovom tekstu mogu pokazati višu terapijsku efikasnost u Hunter-ovom sindromu nego što može konvencionalno sredstvo elapraza, zbog veće stope konverzije cisteina u formilglicin na poziciji 59 aminokiselinske sekvence IDS.

[0017] Pored toga, IDS upotrebljena u kompoziciji ili formulaciji za lečenje Hunter-ovog sindroma može sadržati manoza-6-fosfat u količini od 2.0 do 4.0 mola po molu IDS, poželjno u količini od 2.3 do 3.5 molova i još poželjnije u količini od 2.5 do 3.0 mola. M6P igra važnu ulogu u ćelijskoj internalizaciji IDS i posledičnom ciljanju unutarćelijskih lizozoma. Prema tome, formulacija koja sadrži IDS sa visokim sadržajem M6P garantuje visoke performanse receptorima posredovanog mehanizma preuzimanja ovog enzima i ciljanja lizozoma, što za rezultat ima efikasno katabolisanje akumuliranih GAG.

[0018] Formulacija za lečenje Hunter-ovog sindroma, koja sadrži IDS, može se pripremiti formulisanjem kompozicije opisane u ovom tekstu sa farmaceutski prihvatljivim nosačem u pogodnoj formi.

[0019] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "farmaceutski prihvatljivi" nosač odnosi se na netoksični, fiziološki kompatibilni prenosnik aktivnog sastojka, pogodan za ingestiju od strane životinje, bez neželjene toksičnosti, inkompatibilnosti, nestabilnosti, iritacije, alergijskog odgovora i slično.

[0020] Kompozicija opisana u ovom tekstu može se formulisati sa odgovarajućim prenosnikom u zavisnosti od odabranog puta primene. Formulacija opisana u ovom tekstu može se primeniti oralno ili parenteralno, bez ograničavanja. Za parenteralnu primenu, može se koristiti put koji se bira između transdermalnog, intranazalnog, intraperitonealnog, intramuskularnog, supkutanog ili intravenskog.

[0021] Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može se, u kombinaciji sa pogodnim oralnim prenosnikom, formulisati u praškove, granule, tablete, pilule, troheje, kapsule, tečnosti, gelove, sirupe, suspenzije i vafere, korišćenjem postupka poznatog u struci. Primeri pogodnog prenosnika korisnog u formulaciji uključuju šećere kao što su laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitol, manitol, ksilitol, eritritol i maltitol, skrobove kao što su kukuruzni skrob, pšenični skrob, pirinčani skrob, i krompirov skrob, celuloze kao što su celuloza, metil celuloza, natrijum karboksimetil celuloza, i hidroksipropil metil celuloza, potporne supstance kao što su želatin i polivinilpirolidon. Opciono, formulacija može sadržati još i dezintegrišuće sredstvo, na primer unakrsno povezani polivinilpirolidon, agar, alginsku kiselinu ili natrijum alginat. Pored toga, mogu se koristiti i sredstvo protiv aglomerisanja, lubrikans, sredstvo za vlaženje, mirisno sredstvo, emulgator, i prezervans.

[0022] Isto tako, kompozicija opisana u ovom tekstu može se, u kombinaciji sa parenteralnim prenosnikom, formulisati u parenteralnu doznu formu, na primer injektabilni preparat, transdermalni preparat ili intranazalno inhalaciono sredstvo, korišćenjem postupka dobro poznatog u struci. Za upotrebu u injekciji, formulacija mora biti sterilisana i zaštićena od kontaminacije mikroorganizmima kao što su bakterije i gljive. Primeri prenosnika pogodnih za injekciju mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol, itd.), njihove kombinacije, i/ili rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži biljno ulje. Poželjnije, prenosnik može biti izotonični rastvor kao Hankov rastvor, Ringer-ov rastvor, trietanol amin-sadržavajući PBS (phosphate buffered saline, fosfatom puferisani slani rastvor) ili injektabilna sterilna voda, 10% etanol, 40% propilen glikol i 5% dekstroza. Da bi se injektabilni preparat zaštitio od kontaminacije mikrobima, on može sadržati još i antibakterijsko i antigljivično sredstvo kao paraben, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerosal, itd. Isto tako, injektabilni preparati mogu sadržati, u većini slučajeva, još i izotonično sredstvo kao šećer ili natrijum hlorid. Ove formulacije objavljene su u dokumentu koji je dobro poznat u oblasti farmacije (Remington’s Pharmaceutical Science, 15. izdanje, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania). Što se tiče inhalacije, ovde opisana formulacija može se pogodno dostaviti u formi aerosolnog spreja, iz komprimovanog pakovanja ili raspršivača, uz pomoć odgovarajućeg propelanta kao dihlorofluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljen-dioksid ili pogodni gas. U slučaju komprimovanog aerosola, veličina jedinične doze može se odrediti pomoću ventila za isporučivanje odmerene količine. Na primer, želatinske kapsule i kertridži za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže praškastu smešu jedinjenja i za ove sisteme pogodnu praškastu bazu, na primer laktozu ili skrob.

[0023] Drugi pogodni farmaceutski prenosnici opisani su u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19. izd., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995.

[0024] Pored toga, formulacija, kako je ovde opisano, može sadržati još i jedan ili više pufera (npr. fiziološki slani rastvor ili PBS), ugljene hidrate (npr. glukozu, manozu, saharozu ili dekstran), stabilizere (natrijum hidrogen sulfit, natrijum sulfit ili askorbinsku kiselinu), antioksidanse, bakteriostatike, helirajuća sredstva (npr. EDTA ili glutation), adjuvanse (npr. aluminijum hidroksid), suspendujuća sredstva, zgušnjivače i/ili konzervanse (benzalkonijum hlorid, metil- ili propil-paraben i hlorobutanol).

[0025] Isto tako, kompozicija, kako je ovde opisano, može se formulisati u doznu formu koja, posle primene kod sisara, omogućava brzo, kontinuirano ili odloženo oslobađanje aktivnog sastojka. Efikasna količina tako pripremljene formulacije može se primeniti različitim putevima, uključujući oralni, transdermalni, supkutani, intravenski i intramuskularni put. Izraz "efikasna količina", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na količinu IDS koja dopušta praćenje dijagnostičkog ili terapijskog efekta do kojeg dolazi posle primene kod pacijenta. Doza formulacije, kako je opisano u ovom tekstu, može varirati u zavisnosti od različitih faktora koji uključuju način primene, tip subjekta koji se leči, tip bolesti koju treba lečiti, put primene, težinu bolesti i starost pacijenta, pol, težinu, kondiciju i zdravstveno stanje.

Formulacija koja sadrži IDS, kako je opisano u ovom tekstu, može se koristiti u dozi od 0,1 do 10 mg/kg, i poželjno u dozi od 0,5 do 1,0 mg/kg, po doziranju.

[0026] Postupak za pripremanje kompozicije iduronat-2-sulfataze (IDS) za lečenje Hunterovog sindroma, koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, pri čemu je cisteinska rezidua na poziciji 59 u aminokiselinskoj sekvenci IDS konvertovana u formilglicin (FGly) sa molarnim odnosom od 75% ili više, prema predmetnom pronalasku, uključuje:

kultivisanje rekombinantnog ćelijskog soja transformisanog genom koji kodira IDS predstavljenu SEQ ID NO: 1 i dobijanje kulture; i

prečišćavanje kulture anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom,

pri čemu se katjonska izmenjivačka hromatografija izvodi uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 4.0 do 6.0;

pri čemu pomenuti postupak uključuje:

(1) transformisanje ćelije-domaćina ekspresionim vektorom koji nosi IDS gen da se dobije rekombinantni ćelijski soj;

(2) kultivisanje rekombinantnog ćelijskog soja u prisustvu hidrolizata u medijumu koji ne sadrži serum i dobijanje kulture;

(3) prečišćavanje IDS iz kulture anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom; i

(4) kombinovanje prečišćene IDS sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i pri čemu je ćelija-domaćin ćelija ovarijuma kineskog hrčka.

[0027] U postupku, korak (1) usmeren je ka uspostavljanju rekombinantnog ćelijskog soja uvođenjem, u ćeliju-domaćina, ekspresionog vektora koji nosi IDS gen. Aminokiselinska sekvenca IDS i gen koji kodira IDS poznati su u struci. Poželjan je gen koji kodira IDS koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, ali on nije dat kao ograničavajući primer. Ukoliko je aminokiselinska sekvenca zadržala aktivnost IDS koja je potrebna za ostvarenje svrhe predmetnog pronalaska, čak i u slučaju mutacije insercijom, delecijom i/ili supstitucijom nekih aminokiselinskih rezidua na aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1, njen gen se može koristiti u ovom pronalasku. Ekspresioni vektor koji nosi gen može se konstruirati korišćenjem tipičnog postupka poznatog u struci. Dodatno, ekspresioni vektor može sadržati markerski gen koji omogućava identifikovanje uvođenja gena. Primeri markerskog gena uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr), ali nisu ograničeni na njega. Poželjan je vektor pJK-dhfr-Or2-IDS (SL.2).

[0028] Zahvaljujući visokoj stopi rasta i produktivnosti, lakoj genetičkoj manipulaciji, brzoj proliferaciji u suspenziji u kulturi velikog obima i visokoj sposobnosti adaptacije na medijum koji ne sadrži proteine, CHO ćelijske linije su među najšire korišćenim za proizvodnju biomedicinskih proizvoda. Transformacija u koraku (1) može da se izvede prema protokolu koji je poznat u struci.

[0029] U postupku, korak (2) usmeren je ka kultivisanju, u medijumu koji ne sadrži serum, rekombinantnog ćelijskog soja u koji se ugrađuje IDS ekspresioni vektor. Kultivisanje može da se obavi u medijumu i pod uslovima optimizovanim za vrstu ćelije-domaćina. Poželjan je medijum koji ne sadrži serum. Pošto ne sadrži serum (npr., goveđi serum), upotrebom takvog medijuma izbegava se verovatnoća indukovanja sporednih efekata ili rizika povezanih sa serumom.

[0030] Srazmere kultivisanja rekombinantnog ćelijskog soja transformiranog IDS ekspresionim vektorom mogu se dodatno povećati. Na primer, rekombinantni ćelijski soj predmetnog pronalaska može se kultivisati u flakonu za mućkanje i zatim, u bioreaktoru, uvećavati do mere od više stotina do više hiljada litara. Korak kultivisanja izvodi se u prisustvu hidrolizata koji ima važan uticaj na određivanje sadržaja formilglicina. Poželjno, hidrolizat se dodaje u količini takvoj da se dobije konačna koncentracija od 0.1 - 100 g/L. Hidrolizat koristan u predmetnom pronalasku može biti onaj koji je dobijen hidrolizom životinjskog ili biljnog materijala. Tačnije, hidrolizat se može dobiti hidrolizovanjem najmanje jednog odabranog iz grupe koja se sastoji, ali nije ograničena na soju, krompir, pšenične klice i kvasac.

[0031] U postupku, korak (3) usmeren je ka prečišćavanju IDS iz ćelijske kulture, anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom.

[0032] Poželjno, četiri postupka hromatografije mogu se izvesti tim redom. Međutim, uobičajeno obučenom stručnjaku mora biti jasno da se redosled po potrebi može promeniti. Zajedno sa redosledom hromatografskih procesa, smole i pH vrednosti pufera za eluiranje važni su za određivanje obrasca glikozilacije i sadržaja formilglicina u IDS.

[0033] Anjonska izmenjivačka hromatografija namenjena je uklanjanju boja i različitih nečistoća iz ćelijske kulture, a izvodi se na koloni napunjenoj Q Sepharose<®>smolama, uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 5.5 do 7.5.

[0034] Hromatografija hidrofobnih interakcija namenjena je uklanjanju boja i nečistoća koje zaostaju posle anjonske izmenjivačke hromatografije. Izvodi se na koloni napunjenoj fenil Sepharose<®>smolama, uz korišćenje pufera za eluiranje pri pH od 5.0 do 7.0.

[0035] Katjonska izmenjivačka hromatografija namenjena je selekciji materijala sa visokim sadržajem formilglicina i uklanjanju preostalih nečistoća. Izvodi se na koloni napunjenoj smolama za katjonsku izmenu, uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 4.0 do 6.0. Primeri smola za katjonsku izmenu, koje su korisne u ovom pronalasku mogu uključivati CM Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, S Sepharose Fast Flow i Capto MMC, sve od GE Healthcare, ali nisu ograničeni na njih. Poželjno je da pH pufera za eluiranje bude u rasponu od 4.0 do 6.0.

[0036] Afinitetna hromatografija namenjena je uklanjanju glicerola korišćenog u katjonskoj izmenjivačkoj hromatografiji i koncentrovanju zapremine eluata. Izvodi se na koloni napunjenoj smolama Blue Sepharose™, uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 6.0 do 8.0.

[0037] Prosečno obučeni stručnjak može optimalno modifikovati uslove za odvijanje svake vrste hromatografije. U vezi sa konkretnim uslovima hromatografije, upućuje se na Primer 1-5, opisan u nastavku ovog teksta.

[0038] Postupak za pripremanje kompozicije koja, kao aktivni sastojak, sadrži IDS prema predmetnom pronalasku može uključivati još i inaktiviranje virusa koji se mogu inkorporisati u kompoziciju. Inaktivacija se može izvesti na različite načine, a poželjno je držanjem kulture na pH 3.0 - 4.0 ili pod uslovima visokog pH, tokom unapred određenog vremenskog perioda. Proces inaktivacije može se sprovesti tokom procesa prečišćavanja, poželjno tokom hromatografije, a poželjnije između hromatografije hidrofobnih interakcija i katjonske izmenjivačke hromatografije.

[0039] Posle hromatografskih procesa, tako dobijena aktivna frakcija može se koncentrisati i filtrirati kako bi se dobila IDS koja se može koristiti kao aktivni sastojak farmaceutske kompozicije.

[0040] Kompozicija može da se pomeša sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i da se formuliše u pogodnu doznu formu.

[0041] Kompozicija koja sadrži IDS, pripremljena postupkom prema predmetnom pronalasku, ima sledeće prednosti u odnosu na konvencionalne kompozicije IDS: 1) ispoljava

1

veću farmaceutsku efikasnost zahvaljujući višem sadržaju formilglicina, 2) može efikasnije katabolisati GAG akumulirane u lizozomima, 3) ne sadrži serum životinjskog porekla i, prema tome, bezbedna je, i 4) bezbedna je i efikasna zahvaljujući svojoj čistoći od 99,9% ili više.

Povoljni efekti pronalaska

[0042] Kompozicija koja sadrži rekombinantnu IDS i formulacija koja je sadrži, superiornije su po farmaceutskoj efikasnosti i bezbednosti od konvencionalnog sredstva elapraze i stoga se mogu efikasno koristiti u lečenju Hunter-ovog sindroma.

Kratak opis crteža

[0043]

SL. 1 je prikaz koji ilustruje šemu konstruisanja pJK-dhfr-IDS-S1 vektora upotrebljenog za konstruisanje IDS ekspresionog vektora.

SL. 2 je prikaz koji ilustruje šemu konstruisanja IDS ekspresionog vektora pJK-dhfr-Or2-IDS od pJKdhfr- IDS-S1 sa SL.1.

SL. 3 je protočni dijagram koji ilustruje izolaciju i prečišćavanje IDS iz transformisanih CHO-DG44.

SL. 4 je fotografija koja prikazuje rezultat SDS-PAGE IDS za analiziranje N-terminalne sekvence, pri čemu je marker pušten na traci M, glikozilovana IDS na traci 1, PNGaza F na traci 2, i deglikozilovana IDS na traci 3.

SL. 5 je protočni dijagram koji ilustruje postupak analiziranja aminokiselinske sekvence IDS.

SL. 6 je prikaz koji pokazuje aminokiselinsku sekvencu IDS predmetnog pronalaska, analiziranu pomoću MALDI-MS/MS i LC-ESI-MS/MS.

SL. 7 je RP-HPLC hromatogram neredukovanih i redukovanih IDS uzoraka, koji prikazuje poziciju disulfidnih veza u IDS.

SL. 8 je prikaz koji pokazuje pozicije disulfidnih veza u IDS predmetnog pronalaska, posle analize MALDI-MS.

SL. 9 je prikaz koji pokazuje pozicije disulfidnih veza u IDS predmetnog pronalaska posle analize MALDIMS/MS.

SL. 10 je prikaz koji ukazuje na pozicije disulfidnih veza u IDS predmetnog pronalaska, dobijen pomoću MALDI-MS/MS.

SL. 11 je fotografija koja prikazuje IDS puštenu na SDS-PAGE posle tretmana različitim glikozid-hidrolaznim enzimima da bi se ispitala glikozilacija IDS predmetnog pronalaska.

SL. 12 predstavlja HPAEC-PAD hromatograme koji prikazuju sadržaj manoza-6-fosfata u IDS predmetnog pronalaska.

SL. 13 predstavlja hromatogram hromatografije zasnovane na veličini, koji pokazuje čistoću IDS predmetnog pronalaska.

SL. 14 je jonski hromatogram koji prikazuje katalitičku aktivnost IDS predmetnog pronalaska prema prirodnom supstratu.

SL. 15 je Lineweaver-Burk-ov dijagram koji prikazuje odnos količine ćelijskog preuzimanja IDS prema količini IDS dodate normalnim fibroblastnim ćelijama.

SL. 16 je grafikon koji prikazuje količinu IDS predmetnog pronalaska, internalizovane u normalne humane fibroblasnte ćelije i ćelije pacijenata obolelih od Hunter-ovog sindroma.

SL. 17 je prikaz koji pokazuje merenja sadržaja formilglicina u IDS predmetnog pronalaska.

SL. 18 je prikaz koji pokazuje IEF (isoelectric focusing, izoelektrično fokusiranje) tačke IDS predmetnog pronalaska pre i posle katjonske izmenjivačke hromatografije, pri čemu je M pušten na M traci, naneti uzorak za katjonsku izmenjivačku hromatografiju na traci 1, eluat katjonske izmenjivačke hromatografije na traci 2, i regeneracioni rastvor posle katjonske izmenjivačke hromatografije na traci 3.

Način ostvarivanja pronalaska

[0044] Bolje razumevanje predmetnog pronalaska može se postići zahvaljujući primerima koji slede, koji su prikazani radi ilustracije, ali ih ne treba razumeti kao da ograničavaju predmetni pronalazak.

[74] PRIMER 1: Pripremanje IDS

<1-1> Dobijanje gena

[0045] Mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) izoluju se iz krvi čoveka, kako je ranije opisano [S. Beckebaum et al., Immunology, 2003, 109:487-495]. Iz PBMC ekstrahuje se ukupna RNK, prema ranije opisanom protokolu [M. J. Holland et al., Clin. Exp. Immunol., 1996, 105:429-435]. Da bi se od ukupne RNK konstruisala biblioteka cDNK, jednolančana cDNK se sintetiše korišćenjem oligo-(dT) prajmera, pomoću kita za sintezu pojedinačnih lanaca (Boehringer mannheim). U vezi sa tim, DEPC-tretretirana destilovana voda doda se u ependorf koji sadrži 1 µg ukupne RNK tako da se dobije finalna zapremina od 12.5 µl. Zatim se u ependorf doda 1 µg 20 pmol oligo(dT) prajmera, što je praćeno inkubacijom na 70°C u trajanju od 2 min, i hlađenjem. U ovu reakcionu smešu dodaju se 4 µg reakcionog pufera, 1 µg dNTP, 1 µg inhibitora RNaze, i 1 µg reverzne transkriptaze, što onda reaguje na 42°C, tokom jednog sata da se sintetiše jednolančana cDNK. PCR se izvede na cDNK kao templatu u prisustvu prajmera SEQ ID NO: 2 do 4, da bi se amplifikovao humani IDS gen. U tom kontekstu, svaki prajmer je dizajniran tako da sadrži mesto za prepoznavanje restrikcionog enzima, za upotrebu u kloniranju gena.

<1-2> Konstrukcija ekspresionog vektora

A. Konstrukcija pJK-dhfr-IDS-S1 vektora

[0046] Signalna sekvenca lakog lanca antitela (poreklom iz dela lakog lanca humanog IgG) kao nekodirajuća sekvenca se uvede na 5’-terminus IDS gena dobijenog u Primeru <1-1> pre PCR. Pošto se proizvod dobijen PCR pusti na gel-elektroforezu, korišćenjem kita za ekstrakciju sa gela izoluje se humani IDS gen. Izolovani IDS gen i pJK-dhfr-Or2 vektor (Aprogen) digestiraju se korišćenjem EcoRV i ApaI i povezuju se jedan sa drugim na 16°C, 20 sati. Tako konstruisani rekombinantni vektor se transformiše u E. coli (DH5α) koja se zatim zaseje na LB ploču koja sadrži 50 µg/mL ampicilina, i inkubira preko noći. Kolonije izrasle na pločama selektuju se i kultivišu tako da se iz njih izoluje plazmid (SL.1).

B. Konstrukcija ekspresionog plazmida rekombinantne humane IDS

[0047] Da bi se nekodirajuća sekvenca plazmida konstruisanog gore promenila u signalnu sekvencu, rekombinantni humani IDS supklonira se u pJK-dhfr-or2 vektor. U tom cilju, pJK-dhfr-IDS-S vektor se digestira korišćenjem EcoRV i ApaI da se dobije parcijalni IDS gen (1233 bp) koji se zatim insertuje u pJK-dhfr-Or2 vektor prethodno tretiran istim restrikcionim enzimima, da se konstruiše pJK-dhfr-IDS-S2 vektor. Da bi se na 5’-terminus uvele nekodirajuća sekvenca i signalna sekvenca, IDS N1 ushodni prajmer (SEQ ID NO: 5) i IDS 4 reverzni prajmer (SEQ ID NO: 7) koriste se za PCR sa pJK-dhfr-IDS-S vektorom koji služi kao templat. Posle otpočinjanja na 94°C u trajanju od 5 min, PCR se izvodi sa 30 ciklusa od

1

94°C tokom 1 min, 55°C tokom 30 s i 72°C tokom 40 s i završava ekstenzijom na 72°C tokom 10 min.

[0048] PCR amplifikacija dala je parcijalni IDS gen od 448 bp. Ovaj gen korišćen je kao templat za PCR koja se izvodi ponovo u prisustvu IDS N2 ushodnog prajmera (SEQ ID NO: 6) i IDS 4 reverznog prajmera (SEQ ID NO: 7) pod istim uslovima kao što je opisano gore. Ovim se sintetiše DNK fragment dug 476 bp.

[0049] Posle toga, pJK-dhfr-IDS-S2 vektor i rekombinantni humani IDS genski fragment (476 bp) se zasebno digestiraju korišćenjem EcoRV. Digestati se razdvoje elektroforezom na gelu da se dobiju vektor i 476 bp dug IDS fragment. Ovaj vektor i insert se povezuju na 16°C, 12 sati u prisustvu T4 DNK ligaze da se konstruiše pJK-dhfr-Or2-IDS plazmid. Ovi postupci ilustrovani su na SL.2.

[0050] Da bi se potvrdilo konstruisanje IDS ekspresionog plazmida, DH5 se transformiše korišćenjem pJK-dhfr-Or2-IDS i kultiviše 24 sata na LB ploči koja sadrži ampicilin (50 µg/mL). Iz tako formirane kolonije, izoluje se plazmid i digestira da bi se izmerila veličina inserta. Isto tako, izvrši se sekvencioniranje baza korišćenjem T7 prajmera (SEQ ID NO: 8).

<1-3> Selekcija ekspresionog soja za rekombinantnu humanu IDS

A. Transfekcija CHO-DG44

[0051] CHO-DG44 koristi se kao ćelija-domaćin za ekspresiju IDS predmetnog pronalaska. Mutantna ćelija ovarijuma kineskog hrčka CHO-DG44 nosi duplu deleciju za endogeni dhfr (dihidrofolat reduktaza) gen koji kodira DHFR enzim. DHFR enzim je uključen u konverziju folata preko dihidrofolata (FH2) u tetrahidrofolat (FH4) koji je uključen u de novo sintezu nukleinskih kiselina. Nivo dhfr u ćelijama zavisi od koncentracije MTX. MTX koji je strukturno sličan folnoj kiselini, supstratu DHFR, kompetira sa folnom kiselinom u vezivanju sa dihidrofolat reduktazom, tako da najveći deo dihidrofolat reduktaze gubi svoju aktivnost u prisustvu MTX. Prema tome, ako ćelije ne amplifikuju dovoljnu količinu dhfr, umreće jer ne mogu sintetisati nukleinske kiseline koje su im neophodne za život. Nasuprot tome, ako je amplifikacija dovoljna, ćelije mogu da prežive u uslovima visoke koncentracije MTX jer su relativno dobro snabdevene dhfr. Ovaj sistem može da se primeni na životinjske ćelije da bi se selektovala transfektovana ćelijska linija koja može da amplifikuje dhfr gen, a time i strukturni gen od interesa.

[0052] Sa tim ciljem, dhfr gen se, kao marker koji može da se amplifikuje, introdukuje u IDS ekspresioni vektor pJK-dhfr-Or2-IDS, konstruisan u Primeru 1-2, i amplifikacija gena se izvede korišćenjem MTX i dhfr gena.

[0053] U vezi sa tim, DG44 ćelijska linija (dobijena od Dr. Chaisin, Columbia University) suspenduje se u 10 mL DMEM/F12 (dopunjenog nukleotidima i nukleozidima, i 10% fetalnim goveđim serumom (fetal bovine serum, FBS)) i ćelije se sakupe obaranjem na 1000 rpm, 5 min. Ćelije se inokulišu u 50 mL medijuma za kulturu u T-175 flakonu i inkubiraju na 37±1°C u inkubatoru sa 5±1% CO2. Jedan dan pre transfekcije, kultivacioni medijum za DG44 ćelije se ukloni iz T-175 flakona i ćelije se isperu u dve promene PBS i odvoje tripsinizacijom. Zatim, zaseju se pri gustini od 5 ×10<5>ćelija u T-25 flakonu i kultivišu na 37±1°C, 24 sata u inkubatoru sa 5±1% CO2. Kontaminacija bakterijama ili gljivama ispituje se pod optičkim mikroskopom, dok se PCR-ELISA izvodi da bi se ispitalo da li su ćelije kontaminirane mikoplazmom.

[0054] DG-44 ćelije bez klica, transfektuju se IDS ekspresionim vektorom pJK-dhfr-Or2-IDS, konstruisanim u Primeru 1-2, korišćenjem lipofektaminskog kita. U vezi sa tim, 5 µg ekspresionog vektora i 50 µg lipofektamina se odvojeno razblaže u 800 µg Opti-MEM I, to se pažljivo izmeša da se ne formiraju mehurići, i ostavi na sobnoj temperaturi 15 min. Za to vreme, DG44 ćelije se isperu u jednoj promeni sterilnog PBS i tri promene Opti-MEM I. DG44 ćelijama se pažljivo doda smeša DNK-lipofektamin i zatim 6.4 mL Opti-MEM, pre inkubacije na 37±1°C, 5 sati u inkubatoru sa 5±1% CO2. Posle toga, inkubacija se obavlja još 48 sati u medijumu dopunjenom sa 8 mL DMEM/F12 i 1.6 mL FBS da se pokrene oporavak ćelijskih membrana i rast ćelija.

B. Selekcija ćelijskog soja rezistentnog na geneticin(G418)

[0055] Kultivisane ćelije se odvoje korišćenjem 0.25% tripsina, broje i zaseju u gustini od 5x10<3>ćelija/bunarčiću, na ploče sa 96 bunarčića koji sadrže 100 µg MEM-alfa medijuma (dopunjenog 10% dijaliziranim FBS i G418, 550 µg/mL) po bunarčiću. Sledećeg dana, isti medijum se doda u količini od 100 µg/bunarčiću i ćelije se kultivišu 2-3 nedelje da se formiraju kolonije. Kada ćelije dostignu 50% konfluencije, medijum se zameni svežim. Posle 3 dana održavanja, medijum kulture se sakupi za enzimsku analizu.

[0056] Medijum se zamenjuje sa 200 µg svežeg medijuma svaka tri dana. Na dan 3∼4 posle kultivisanja, netransfektovane ćelije, to jest, ćelije koje nisu bile rezistentne na geneticin počele su da se odvajaju sa dna ploče sa 96 bunarčića, posmatrano pomoću optičkog

1

mikroskopa. Odabrani klonovi se kultivišu uz sekvencijalno prebacivanje iz ploča sa 96 bunarčića u ploče sa 24 bunarčića, ploče sa 6 bunarčića, i posude od 100 mm, tim redom. Kada ćelije dostignu 80∼90% konfluencije u posudama od 100 mm, nivo ekspresije se ponovo meri. Ćelije se odvoje od podloge pomoću 0.25% tripsina, broje i zaseju pri gustini od 5x10<5>ćelija/bunarčiću/3 mL u ploče sa 6 bunarčića, gaje 3 dana i broje. Nivo ekspresije proteina se kvantitativno analizira. Prema rezultatima analize, selektovano je 15 klonova.

[94] C. Selektovanje IDS ekspresionog soja sa visokim kapacitetom ekspresije

[0057] Petnaest selektovanih klonova kultiviše se u rastućoj koncentraciji MTX da se selektuju ćelijski sojevi u kojima se IDS amplifikuje.

[0058] U tom kontekstu, ćelije se inokulišu pri gustini od 1x10<6>ćelija/posudi od 100 mm/10 mL medijuma koji sadrži MTX i kultivišu do 80∼90% konfluencije. Desetina zapremine ćelijske kulture inokuliše se ponovo u posude od 100 mm/10 mL. Ovaj postupak supkultivisanja ponovi se dva puta. Ćelije se ostave da prođu najmanje tri pasaže tako da se dovoljno prilagode povećanju koncentracija MTX. Koncentracija MTX se povećava, od 5 nM za klonove selektovane posle sprovođenja analize za prva tri dana, do 20 nM. U svakom koraku, klonovi adaptirani na povišenu koncentraciju MTX kultivišu se tri dana da bi se izmerile stope rasta ćelija. Nivoi ekspresije IDS mere se da bi se selektovali sojevi ćelija u kojima se dešava amplifikacija IDS gena, to jest, sojevi ćelija sa visokom stopom ekspresije rekombinantne IDS. Od odabranih ćelijskih sojeva, NI4 se koristi u eksperimentima koji slede jer ima najviši nivo ekspresije.

D. Selekcija jednog soja graničnim razblaživanjem

[0059] Postoji mogućnost da je soj NI4 mogao da se pomeša sa drugim sojevima. Prema tome, soj se razdvaja u pojedinačne sojeve. N14 klonovi koji su preživeli 20 nM MTX supkloniraju se graničnim razblaživanjem tako da se selektuje željeni ćelijski soj.

[0060] Prvo, NI4 se inokuliše pri gustini od 0.5 ćelija/bunarčiću u IMDM medijum (Gibco BRL, kat.#12200) u pločama sa 96 bunarčića i kultiviše uz dopunjavanje medijuma svaka tri dana. Na dan tri, ploče se posmatraju pod mikroskopom da se isključe bunarčići u kojima su se formirale dve ili više kolonija po bunarčiću. Bunarčići u kojima se formirala samo jedna kolonija po bunarčiću selektuju se i nastavljaju da se kultivišu. Posle 15 dana kultivisanja, ćelije se supkultivišu u pločama sa 96 bunarčića i kada ćelije dostignu 90% konfluencije, medijum se dopuni svežim.

1

[0061] Od N14 soja identifikovana su ukupno 263 pojedinačna soja. Od njih, nađeno je da soj S46 ima najvišu IDS aktivnost i on je označen kao NI4-S46.

<1-4> Ćelijska kultura

A. Kultura u flakonu na šejkeru

[0062] NI4-S46 soj se kultiviše u velikim razmerama da bi se proizvela IDS predmetnog pronalaska. Soj se inokuliše u EX-cell 302 medijum koji ne sadrži serum (sadrži glutamin, dekstran sulfat, i pluronik F-68) u flakonima od 125 mL za kulturu i kultiviše na 37±1°C u inkubatoru sa 5±1% CO2. Zatim, ćelije se pasažiraju u odnosu od 1:5∼1:8, svaka dva do tri dana, korišćenjem flakona za šejker. Posle pasaže, zapremina kulture se postepeno povećava do približno 2400 mL. U mnogim flakonima za šejker, ćelije se kultivišu do nivoa dovoljnog da se inokulišu u fermentor.

B. Kultura u fermentoru od 30L (radna zapremina 20L)

[0063] Kada gustina ćelija u flakonima za šejker dostigne 1.3x10<6>ćelija/mL, one se inokulišu u fermentor od 30L. Tokom kultivisanja ćelija, uslovi kulture se održavaju, uz sadržaj rastvorenog kiseonika od 10% ili više, temperaturu kulture od 37±1°C i pH od 7.0±0.2. Po potrebi, uzorci ćelija se uzimaju i posmatraju pod mikroskopom. Ćelijska kultura se ispituje radi analize broja ćelija, vijabilnosti ćelija, pH, koncentracije glukoze i koncentracije glutamina. Na osnovu rezultata analize, kada se odluči da je rast ćelija bio dovoljan, ćelije se inokulišu u fermentor od 150L.

C. Kultura u fermentoru od 150L (radna zapremina 100L)

[0064] Kada ćelije u fermentoru od 30L dostignu gustinu od 0.9x10<6>ćelija/mL ili više, one se inokulišu u fermentor od 150L. Tokom kultivisanja ćelija, uslovi kulture se održavaju, uz sadržaj rastvorenog kiseonika od 10% ili više, temperaturu kulture od 37±1°C i pH od 7.0±0.2. Po potrebi, uzorci ćelija se uzimaju i posmatraju pod mikroskopom. Ćelijska kultura se ispituje radi analize broja ćelija, vijabilnosti ćelija, pH, koncentracije glukoze i koncentracije glutamina. Na osnovu rezultata analize, kada se odluči da je rast ćelija bio dovoljan, ćelije se inokulišu u fermentor od 650L.

D. Kultura u fermentoru od 650L (radna zapremina 500L)

1

[0065] Kada ćelije u fermentoru od 150L dostignu gustinu od 0.9x10<6>ćelija/mL ili više, one se inokulišu u fermentor od 650L. Tokom kultivisanja ćelija, uslovi kulture se održavaju, uz sadržaj rastvorenog kiseonika od 10% ili više, temperaturu kulture od 34±1°C i pH of 6.9±0.2 tokom tri dana i zatim, na temperaturi kulture od 32±1°C i pH od 6.9±0.2. Po potrebi, uzorci ćelija se uzimaju i posmatraju pod mikroskopom radi analize broja ćelija, vijabilnosti ćelija, pH, koncentracije glukoze i koncentracije glutamina. U zavisnosti od rezultata analize, koncentracije glukoze i glutamina se podešavaju za kontinuirani rast ćelija. Tokom fermentacije, hidrolizat se dodaje da bi se povećala konverzija u formilglicin.

<1-5> Prečišćavanja IDS

[0066] IDS se izoluje iz ćelijske kulture korišćenjem niza hromatografskih postupaka koji slede.

A. Sakupljanje i filtracija kultivacionog medijuma

[0067] Kada se ćelijska vijabilnost održava u rasponu od 80~85% 10 dana posle inokulacije u fermentor od 650 L, kultivisanje se zaustavlja. Ćelije se sakupe iz kulture koriščenjem Millipore POD filter-sistema i D0HC filtera (Millipore) pri pritisku od 0.9 bar ili manje. Posle uklanjanja ćelija, supernatant se filtrira kroz pre-filter (Millipore, 0.5 0.2 µm) i filter od 0.45+0.2 µm i oporavlja u dispozabilnoj sterilnoj vinilskoj kesi. Sakupljeni rastvor kulture skladišti se na 2∼8°C.

B. Koncentrisanje i dijafiltracija

[0068] Filtrat oporavljen u A koncentruje se oko 10 puta korišćenjem sistema za ultrafiltraciju (membranski filtracioni sistem sa tangencijalnim protokom). Membrana (pražna molekulska masa: 30K, Pall) instalirana unutar ultrafiltracionog sistema ispere se korišćenjem WFI (water for injection, voda za injekciju) pri stopi protoka od 20∼25 L/min i zatim ekvilibriše puferom (pH 7.0∼8.0) koji sadrži 20 mM natrijum fosfat (natrijum dihidrogen fosfat monohidrat i natrijum hidrogen fosfat heptahidrat). Posle ekvilibrisanja, filtrat se dovodi do membrane, uz preuzimanje frakcija koje ne prođu membranu. Kada preuzeta zapremina dostigne oko 1/10 početne zapremine filtrata, postupak koncentrovanja se zaustavlja. Pufer se uzastopno menja u zapremini koja iznosi tri do četiri zapremine koncentrata. Ako su konduktivnost i pH u granicama kriterijuma, postupak se zaustavlja. [kriterijum - konduktivnost: =5.0 mS/cm, pH 7.0∼8.0].

1

C. Anjonska izmenjivačka hromatografija

[0069] Da bi se uklonile boje i različite nečistoće iz koncentrata preuzetog u B, izvodi se anjonska izmenjivačka hromatografija na koloni (GE Healthcare) napunjenoj Q-sefaroznim smolama (Q Sepharose, GE Healthcare). Kolona se ekvilibriše puferom za ekvilibrisanje (pH 7.0~8.0) koji sadrži 20 mM natrijum fosfat (natrijum dihidrogen fosfat monohidrat i natrijum hidrogen fosfat heptahidrat). Koncentrat dobijen u B filtrira se kroz filter od 0.45+0.2 µm (Sartorius) i nanosi na ekvilibrisanu kolonu pri brzini protoka od 100∼120 cm/h. Po završetku nanošenja, kolona se prvo ispere puferom za ekvilibrisanje i zatim puferom za ispiranje (pH 5.5∼7.5) koji sadrži natrijum hlorid. Zatim se ciljni protein eluira puferom za eluiranje (pH 5.5∼7.5) koji sadrži natrijum hlorid.

D. Hromatografija hidrofobnih interakcija

[0070] Da bi se uklonile boje i nečistoće zaostale posle anjonske izmenjivačke hromatografije, izvodi se hromatografija hidrofobnih interakcija na koloni (GE Healthcare) ispunjenoj fenil sefaroznim smolama (GE Healthcare). Kolona se ekvilibriše puferom za ekvilibrisanje (pH 5.0∼7.0) koji sadrži natrijum hlorid. Eluat dobijen u C filtrira se kroz filter od 0.45+0.2 µm (Sartorius) i nanosi na ekvilibrisanu kolonu pri brzini protoka od 70∼100 cm/h. Po završetku nanošenja, kolona se prvo ispere puferom za ekvilibrisanje. Zatim se ciljni protein eluira puferom za eluiranje (pH 5.0∼7.0) koji sadrži glicerol.

E. Inaktivacija virusa niskim pH

[0071] Virusi koji mogu poticati iz ćelija-domaćina ili materijala korišćenog u izvedenim postupcima, inaktiviraju se u uslovima niskog pH. U vezi sa tim, eluat dobijen u D drži se 2 sata na pH 3.0 ∼ 4.0, pri čemu se kiselost podešava korišćenjem 25% sirćetne kiseline. Posle toga, pH eluata se povisi do 4.0∼5.0 korišćenjem 0.5 M natrijum hidroksida, za upotrebu u sledećem postupku. Inaktivacija niskim pH izvodi se na 12±2°C.

F. Katjonska izmenjivačka hromatografija

[0072] IDS je glikoprotein sa oligosaharidima, i postoji kao izomer koji ima različitu izoelektričnu tačku zavisno od sadržaja sijlinske kiseline na kraju glikanskog lanca. Kao oligosaharidi sa negativnim naelektrisanjem, sijalinska kiselina pokazuje razlike u pogledu stepena vezivanja za katjonsku izmenjivačku smolu zavisno od sadržaja sijalinske kiseline.

1

Korišćenjem ove karakterizacije, katjonska izmenjivačka hromatografija se izvodi da bi se dobila IDS koja pokazuje visoku aktivnost (visok sadržaj formilglicina), sa visokim sadržajem sijalinske kiseline, i da bi se uklonile druge nečistoće [Nečistoća proizvoda (Agregirana IDS, obrađena IDS), nečistoća postupka (protein ćelije-domaćina)]. Tačnije, kolona napunjena katjonskim izmenjivačkim Capto™ MMC smolama (GE Healthcare) ekvilibriše se korišćenjem pufera za ekvilibrisanje sa dodatkom glicerola (pH 4.0 ∼ 5.0). Inaktivirani eluat dobijen u E filtrira se kroz filter od 0.45+0.2 µm (Sartorius) i nanosi na ekvilibrisanu kolonu pri brzini protoka od 100∼120 cm/h. Zatim se kolona ispere puferom za ekvilibrisanje, posle čega sledi eluiranje puferom za eluiranje kojem je dodat glicerol (pH 4.0~6.0) da se dobije IDS sa visokim sadržajem sijalinske kiseline (izoelektrična tačka 3.5 ili manje), visokom aktivnošću (sadržaj formilglicina: 80±15%) i visokom čistoćom (SE-HPLC, 98% ili više).

G. Afinitetna hromatografija

[0073] Afinitetna hromatografija (Blue Sepharose, GE Healthcare) se izvodi da bi se uklonio glicerol upotrebljen u katjonskoj izmenjivačkoj hromatografiji i da bi se smanjila zapremina eluata. Eluat dobijen u F filtrira se kroz filter od 0.45+0.2 µm (Sartorius) i nanosi, pri brzini protoka od 100∼120 cm/h, na kolonu napunjenu Blue Sepharose smolom (GE Healthcare), prethodno ekvilibrisanu puferom za ekvilibrisanje sa dodatkom glicerola (pH 4.5∼5.5). Posle završetka nanošenja, kolona se ispere puferom za ispiranje (pH 4.5∼5.5) i ciljni protein se eluira puferom za eluiranje (pH 6.0 ∼ 8.0).

H. Koncentrovanje i zamena pufera

[0074] Ultrafiltracioni sistem (membranski filtracioni sistem sa tangencijalnim protokom) koristi se za podešavanje koncentracije proteina eluata dobijenog u G i za zamenu pufera prečišćenog proteina formulacionim puferom. Membrana (pražna molekulska masa: 10K, Pall) instalirana unutar ultrafiltracionog sistema ispere se korišćenjem WFI (voda za injekciju) pri stopi protoka od 450∼650 mL/min i zatim ekvilibriše formulacionim puferom (2.25 g/L natrijum dihidrogen fosfat monohidrata, 0.99 g/L natrijum hidrogen fosfat heptahidrata, 8 g/L natrijum hlorida, pH 6.0 ∼ 7.0) bez polisorbata 20, što je praćeno koncentrovanjem ciljnog proteina. Pufer se uzastopno menja u zapremini koja iznosi tri do četiri zapremine koncentrata. Ako konduktivnost i pH budu u okvirima kriterijuma, postupak se zaustavlja.

[kriterijum - konduktivnost: 15.0±3.0 mS/cm, pH 6.0∼7.0]. Podesiti sadržaj koncentrovanog rastvora na 4.0 ±0.5 mg/mL.

2

I. Nanofiltracija

[0075] Korišćenjem nanofiltera (NFP, Millipore), nanofiltracija se izvodi da bi se uklonili virusi koji bi mogli poticati iz ćelije-domaćina ili bilo kojeg upotrebljenog materijala. Test integriteta filtera obavlja se posle ispiranja nanofiltera vodom za injekcije. Kada prođe test integriteta, nanofilter se ekvilibriše pomoću 1 L formulacionog pufera (2.25 g/L natrijum dihidrogen fosfat monohidrata, 0.99 g/L natrijum hidrogen fosfata, 8 g/L natrijum hlorida, pH 6.0∼7.0) bez polisorbata 20. Posle završetka ekvilibrisanja, koncentrat dobijen u H propusti se kroz filter pri pritisku od oko 2 bar da se proizvede nanofiltrat. Posle završene filtracije, filter se ispere puferom za formulisanje (rastvor posle ispiranja). Posle kombinovanja nanofiltracionog rastvora i rastvora posle ispiranja, meri se sadržaj proteina.

J. Lekovita supstanca

[0076] Koncentracija proteina u filtratu dobijenom u I podesi se formulacionim puferom bez polisorbata 20. Posle dodavanja polisorbata, rastvor se filtrira kroz filter od 0.2 µm da se proizvede lekovita supstanca. Lekovita supstanca se alikvotira i do upotrebe čuva u zamrzivaču za duboko zamrzavanje (-70±10°C).

K. Lek kao gotov proizvod (punjenje, obeležavanje, pakovanje)

[0077] Stok uskladišten u zamrzivaču za duboko zamrzavanje otopi se u vodenom kupatilu koje se održava na 28±1°C, i razblaži do koncentracije proteina od oko 2.05±0.2 mg/mL koriščenjem pufera za formulisanje (2.25 g/L natrijum dihidrogen fosfat monohidrata, 0.99 g/L natrijum hidrogen fosfat heptahidrata, 8 g/L natrijum hlorida, 0.23 g/L polisorbata 20, pH 6.0∼7.0). Posle toga, dilucioni rastvor se filtrira kroz filter od 0.2 µm da se proizvede finalni osnovni rastvor. Fiole od 6 mL pune se sa približno 3.3 g ovog finalnog rastvora, uz korišćenje automatskog načina punjenja. Kada prođu test inspekcije fiola, fiole se pakuju da bi se dobio lek kao gotov proizvod.

[0078] Postupak od kultivisanja soja do finalnog proizvoda ilustrovan je na SL.3.

UPOREDNI PRIMER 1: Pripremanje elapraze

[0079] Elaprase<®>komercijalno dostupna rekombinantna IDS, koristi se kao komparativni primer.

EKSPERIMENTALNI PRIMER 1: Strukturna analiza i karakterizacija IDS pronalaska <1-1> Sekvenciranje amino-kiselina - interno sekvenciranje

[0080] Deglikozilovana IDS separiše se pomoću SDS-PAGE, što je praćeno slajsovanjem gela. Zatim se digestati dobijeni tretmanom različitim endoproteazama (tripsin, himotripsin, AspN, himotripsin/tripsin, AspN/tripsin, GluC i GluC/tripsin) analiziraju korišćenjem MALDI-MS/MS i LC-ESI-MS/MS (SL. 5). Kao rezultat, identifikovane su sekvence od ukupno 525 amino-kiselina. Aminokiselinske sekvence koincidiraju sa teorijskom sekvencom humane IDS (SL.6).

<1-2> Analiza disulfidnih veza

[0081] U polipeptidu, disulfidna veza je kovalentna veza, obično dobijena povezivanjem dve SH grupe cisteinskih rezidua, koja ima važnu ulogu u stabilisanju više strukture proteina. Teorijski, IDS sa 525 amino-kiselina sadrži šest cisteinskih rezidua, od kojih četiri formiraju disulfidne veze. U ovom primeru, identifikovane su pozicije cisteinskih rezidua odgovornih za formiranje disulfidnih veza IDS. Prvo, IDS se deglikoziluje tretmanom PNGazom F da se isključi interferencija šećera. Da bi se sprečilo da cisteinske rezidue koje ne učestvuju u formiranju disulfidnih veza deluju kao interferirajući faktor, koristi se 4-vinilpiridin da konvertuje IDS u neredukovani uzorak, tako da se spreči da SH grupe nasumično formiraju S-S veze. U međuvremenu, disulfidne veze se seku korišćenjem DTT, posle čega sledi blokiranje 4-vinilpiridinom da se dobije redukovani uzorak. Tripsin i AspN, selektovani prema rezultatu Eksperimentalnog primera 1-3, primenjuju se na neredukovanom i redukovanom uzorku. Tako dobijeni peptidni fragmenti razdvajaju se pomoću RP-HPLC. RP-HPLC hromatogrami neredukovanih i redukovanih uzoraka upoređuju se tako da se diskriminišu pikovi koji se nalaze u neredukovanom uzorku, ali ne i u redukovanom uzorku (SL. 7).

[0082] Za precizniju analizu, frakcije na diskriminisanim pikovima smanjuju se po veličini dodatnim tretmanom endoproteinazama, i pikovi koji sadrže disulfidne veze analiziraju se korišćenjem MALDI-MS (SL.8).

[0083] Pikovi sa disulfidnim vezama se ponovo podvrgavaju sekvencionoj analizi korišćenjem MALDI-MS/MS (SL.9) da se ispitaju pozicije cisteinskih rezidua koje formiraju disulfidne veze, među 525 aminokiselinskih rezidua IDS. Kako je prikazano na SL. 10, zapaženo je da se disulfidne veze formiraju između C146-C159 i između C397-C407.

<1-3> Analiza sadržaja formilglicina

[0084] IDS degradira heparan sulfat i dermatan sulfat, koji su vrste glikozaminoglikana (GAG). Ove degradacione aktivnosti nema dok se cisteinska rezidua na poziciji 59 aktivnog mesta (Cys59) post-translacionom modifikacijom ne konvertuje u formilglicin (FGly). Prema tome, degradaciona aktivnost IDS analizira se ispitivanjem post-translacione modifikacije Cys59 u FGly. Za ovu analizu, koristi se AQUA (absolute quantification, apsolutna kvantifikacija), postupak kvantitativne analize na bazi MS (mass spectroscopy, masena spektroskopija) u kojem se uzorak spajkuje radio-obeleženim sintetskim supstratom (AQUA peptid). Za kvantitativnu analizu formilglicina na poziciji Cys59, serijsko razblaženje AQUA peptida uvede se u uzorak i konstruiše se kalibraciona kriva. Odnosi FGly-tipa peptida prema Cys-tipu peptida mere se pomoću LC-ESI-MS analize, i nanose na AQUA kalibracionu krivu da bi se izračunao sadržaj formilglicina.

[0085] Ovom analizom određeno je da se Cys59 konvertuje u FGly sa stopom od 80±15%. Uzimajući u obzir stopu konverzije Cys50 u FGly od oko 50% u komercijalno dostupnom sredstvu elaprazi (Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007; Genet Med 2006:8(8):465-473), predviđa se da će terapijska kompozicija koja sadrži IDS predmetnog pronalaska i formulacija pripremljena sa kompozicijom, imati mnogo veću terapijsku aktivnost u poređenju sa elaprazom.

<1-4> Identifikacija obrasca glikozilacije

[0086] Izveden je test da bi se ispitalo da li je IDS predmetnog pronalaska glikozilovana i da bi se identifikovao obrazac glikozilacije, ako je prisutna. U tom cilju, IDS se tretira različitim glikozid-hidrolaznim enzimima, digestati se razdvoje na SDS-PAGE i analiziraju se obrasci njihovog kretanja.

[0087] Preciznije, uzorci IDS se digestiraju kombinacijama sledeća četiri glikozid-hidrolazna enzima i razdvajaju pomoću SDS-PAGE.

TABELA 1. Osobine enzima koji seku šećere

2

[0088] Kao što se može videti na SL. 11, IDS predmetnog pronalaska seče se PNGazom F i Endo H, ali ne i O-glikozidazom, što ukazuje na to da je IDS predmetnog pronalaska N-glikozilovani protein. Dodatno, IDS se kompletno seče PNGazom F, ali smanjenje njene veličine je blago posle tretmana pomoću Endo H. PNGaza F deluje na mestima sva tri obrasca glikozilacije dok Endo H deluje na mestima glikozilacije visokomanoznog tipa i hibridnog tipa. Ovi rezultati zajedno ukazuju na to da IDS sadrži tri obrasca glikozilacije - kompleksni, visokomanozni i hibridni.

<1-5> Analiza sadržaja manoza-6-fosfata

[0089] Vezivanjem za M6P receptor na ćelijama, manoza-6-fosfat (M6P) omogućava da se IDS internalizuje u ćelije i tako da hidrolizuje heparan sulfat ili dermatan sulfat u lizozomima. U ovom Primeru, IDS podleže kiseloj hidrolizi trifluorosirćetnom kiselinom (trifluoroacetic acid, TFA) i HPAEC-PAD (Bio-LC) da bi se izvršila kvantitativna analiza manoza-6-fosfata.

[0090] IDS se hidrolizuje korišćenjem 6.75M TFA i hidrolizat se analizira tečnom hromatografijom (High Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection, anjonska izmenjivačka hromatografija visokih performansi sa pulsnom amperometrijskom detekcijom; HPAEC-PAD). M6P čija je koncentracija već poznata analizira se pod istim uslovima, a molarni odnosi M6P prema glikoproteinu dobijaju se upoređivanjima područja. Analiza se izvodi u triplikatu. Hromatogrami standarnog M6P i kompozicije M6P IDS prikazani su na Sl.12, a molarni odnosi M6P sumirani su u Tabeli 2, u nastavku.

TABELA 2 Analiza rezultata za sadržaj manoza-6-fosfata

[0091] Kao što se može razumeti na osnovu podataka iz Tabele 2, postoje približno 3 mola M6P po molu IDS. Iz ovih rezultata zaključuje se da terapijska kompozicija koja sadrži IDS predmetnog pronalaska i formulacija pripremljena sa kompozicijom imaju visoku sposobnost katabolisanja GAG akumuliranih u lizozomima.

<1-6> Analiza mase

[0092] Mase glikozilovane IDS i deglikozilovane IDS izmerene su pomoću MALDI-TOF-MS. Tretman glikozilovane IDS PNGazom F dao je deglikozilovanu IDS. MALDI-TOF-MS izvedena je korišćenjem Voyager-DE PRO biospektrometra (Applied Biosystems, SAD) povezanog sa masenim spektrometrom sa odloženom ekstrakcijom/laserskom desorpcijom. Instrument je normalizovan goveđim serumskim albuminom i IgG1. Rezultati analize sumirani su u Tabeli 3, u nastavku.

TABELA 3 Rezultati analize IDS korišćenjem MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS

2

[0093] Kao što se vidi iz podataka u Tabeli 3, molekulska veličina je 77244 Da za glikozilovanu IDS i 59399 Da za deglikozilovanu IDS, što je slično molekulskoj težini izračunatoj na osnovu aminokiselinske sekvence, koja iznosi 59298 Da.

<1-7> Merenje čistoće

[0094] Čistoća IDS meri se korišćenjem hromatografije zasnovane na veličini. Hromatografija zasnovana na veličini je hromatografski postupak u kojem se molekuli u rastvoru razdvajaju prema svojoj relativnoj molekulskoj težini i obliku. U hromatografiji zasnovanoj na veličini, proteini veći od veličine pora kolone ne mogu da uđu u sistem pora i prolaze kroz kolonu bez zadržavanja. Zatim se redom eluiraju analiti sa manjim molekulskim težinama ili veličinama. Za ovu hromatografiju korišćen je Alliance 2695 HPLC sistem (Waters, WI, SAD) povezan sa 2487 UV/VIS detektorom (Waters, WI, SAD). Detekcija proteina vršena je na 214 nm i analizirani su pomoću softvera Empower 2. Analiti se nanesu na kolonu TSK G3000SWXL povezanu sa zaštitnom kolonom TSK SWXL (Tosoh, Japan). IDS, pošto se razblaži do koncentracije od 1.0 mg/mL u puferu za formulisanje, nanese se na kolonu u zapremini od 10 µm. Puste se da protiču sa mobilnom fazom (20 mM natrijum fosfatni pufer, 200 mM NaCl, pH 7,0) sa brzinom protoka od 0.5 mL/min, tokom 60 minuta.

[0095] Analiza rezultata prikazana je na SL. 13. Kao što se može videti, IDS monomeri imali su vreme retencije od približno 16.4 min, i eluiraju se sa čistoćom od 100%.

<1-8> Merenje aktivnosti korišćenjem sintetskog supstrata

[0096] Reakcijom IDS sa sintetskim supstratom (4-metilumbeliferil-L-iduronid-2-sulfat Na2(MU-IdoA-2S) tokom 4 sata oslobađa se sulfatna komponenta (primarna reakcija). Posle primarne reakcije, dodavanjem LEBT (lysosomal enzymes purified from bovine testes, lizozomski enzimi prečišćeni iz goveđih testisa) indukuje se sekundarna enzimska reakcija sa supstratom 4-metilumbeliferi-L-iduronidom (reaktant ostao posle oslobađanja sulfatne komponente u primarnoj reakciji) da bi se 4-metilumbeliferilna komponenta odvojila od L-iduronidne komponente. Zbog toga što je preostali 4-metilumbeliferil fluorogen, aktivnost IDS se evaluira merenjem intenziteta fluorescencije (eksc. 355nm/em. 460nm). Nađeno je da je specifična aktivnost IDS predmetnog pronalaska u opsegu od 19 do 55 nmol/min/µg. Ova aktivnost ukazuje da se formilglicin nalazi na aktivnom mestu enzima, kao rezultat posttranslacione modifikacije cisteinske rezidue na poziciji 59 u IDS.

<1-9> Merenje aktivnosti korišćenjem prirodnog supstrata

2

[0097] Da bi se utvrdilo da li postoji reakcija IDS sa prirodnim supstratom, mere se sulfatni joni oslobođeni iz supstrata (heparinski disaharid) posle reakcije sa IDS. Reakciona smeša se nanese na jonsku kolonu (Vydac 302IC) i ostavi da teče sa mobilnom fazom od 0.49 g/L ftalne kiseline, stopom protoka od 2 ml/min, tokom čega se detektuju slobodni sulfatni joni na 290 nm, u negativnom modu.

[0098] Kao što je prikazano na SL. 14, potvrđeno je da IDS hidrolizuje sulfatni jon iz heparinskog disaharida, što ukazuje da je IDS sposobna da razgradi O-vezani sulfat dermatan sulfata i heparan sulfata in vivo.

<1-10> Aktivnost ćelijskog preuzimanja in vivo

[0099] Aktivnost ćelijske internalizacije IDS merena je korišćenjem normalnih fibroblastnih ćelija i ćelija pacijenata sa Hunter-ovim sindromom. U vezi sa tim, normalne fibroblastne ćelije i ćelija pacijenta sa Hunter-ovim sindromom (dobijene iz Samsung Medical Center, Seoul, Korea) kultivišu se i ostave se da vrše internalizaciju u ćelije, tokom inkubacije sa različitim koncentracijama IDS, na 37°C u trajanju od 20 sati u inkubatoru sa 5% CO2. Posle sakupljanja, ćelije se liziraju, i u lizatu se određuje nivo IDS internalizovane u ćelije.

[0100] Na osnovu odnosa koncentracija internalizovane IDS i IDS dodate normalnim fibroblastnim ćelijama, konstruišu se Michaelis-Menten-ov grafikon i Lineweaver-Burk-ov dijagram, na osnovu čega se izračunava Kpreuzimanja(koncentracija IDS pri kojoj stopa reakcije iznosi polovinu maksimalne stope postignute pri zasićujućim koncentracijama supstrata). Izračunato je da Kpreuzimanjaiznosi 18.0 nM ili manje, što ukazuje na to da se IDS internalizuje u ćelije vezivanjem M6P IDS za M6P receptore na površini ćelija (SL.15).

[0101] Isto tako, vrši se analiza ćelijskog preuzimanja i aktivnosti IDS u ćelijama pacijenata sa Hunter-ovim sindromom kao i normalnim humanim fibroblastnim ćelijama. Preuzimanje i aktivnost IDS bili su povišeni u obe ćelije, što je pokazalo da se IDS predmetnog pronalaska efikasnije internalizuje u ćelije (SL.16).

EKSPERIMENTALNI PRIMER 2: Klinička analiza efekata IDS

[0102] Trideset i jedan pacijent sa Hunter-ovim sindromom podeli se u tri grupe, daje im se IDS predmetnog pronalaska i analiziraju se parametri povezani sa Hunter-ovim sindromom. Elaprase<®>, komercijalno dostupno terapijsko sredstvo za Hunter-ov sindrom, koristi se kao pozitivna kontrola.

<2-1> Promene nivoa GAG u urinu (primarni parametar provere validnosti testa)

2

[0103] Tri grupe pacijenata sa Hunter-ovim sindromom primaju 24 nedelje elaprazu (0.5 mg/kg) i IDS predmetnog pronalaska (0.5 mg/kg i 1.0 mg/kg), i mere se nivoi GAG (glikozaminoglikana) u urinu, kako je saopšteno ranije (Conn. Tissue Res. Vol. 28, str. 317-324, 1990.; Ann. Clin. Biochem. Vol.31, str.147-152, 1994). Merenja su sumirana u Tabeli 4, u nastavku.

TABELA 4. Promena nivoa GAG u urinu uz primenu IDS

[0104] Kod pacijenata sa Hunter-ovim sindromom, kao što je prikazano u Tabeli 4, nivoi GAG u urinu smanjeni su za 18,7% posle injekcije elapraze, ali za 29,5% posle injekcije IDS predmetnog pronalaska u istoj dozi. Dodatno, kada je injektirana u dozi od 1.0 mg/kg, IDS predmetnog pronalaska smanjila je nivo GAG u urinu za čak 41,1%. Ovi rezultati pokazuju da je IDS predmetnog pronalaska efikasan terapeutik za Hunter-ov sindrom, bolest uzrokovanu akumuliranjem GAG.

<2-2> Promena 6-MWT (šestominutni test hodanja) (sekundarni parametar provere validnosti testa)

[0105] Posle 24 nedelje tokom kojih su pacijenti sa Hunter-ovim sindromom primali elaprazu i IDS predmetnog pronalaska, merena je udaljenost koju su mogli da pređu hodajući, tokom 6 minuta, prema postupku koji je opisan u AM. J. Respir. Crit. Care. Med., Vol 166, str 111-117, 2002. Rezultati su prikazani u Tabeli 5, u nastavku.

TABELA 5: Rezultati šestominutnog testa hodanja (6-MWT)

2

[0106] Kao što je prikazano u Tabeli 5, promena u 6-WMT iznosila je samo 1.3% za pacijente koji su primali elaprazu, ali se povećala na 18.2% za pacijente koji su primali istu dozu IDS predmetnog pronalaska. Pacijenti sa Hunter-ovim sindromom imaju problema sa hodanjem zbog kontraktura. Međutim, IDS predmetnog pronalaska poboljšava simptome i stoga je efikasna u lečenju Hunter-ovog sindroma.

Slobodan tekst liste sekvenci

[0107]

SEQ ID NO:1 IDS aminokiselinska sekvenca

SEQ ID NO:2 IDS-1 sekvenca ushodnog prajmera

SEQ ID NO:3 IDS-2 sekvenca ushodnog prajmera

SEQ ID NO:4 IDS-3 sekvenca nishodnog prajmera

SEQ ID NO:5 IDS-N1 sekvenca ushodnog prajmera

SEQ ID NO:6 IDS-N2 sekvenca ushodnog prajmera

SEQ ID NO:7 IDS-4 sekvenca nishodnog prajmera

SEQ ID NO:8 T7 sekvenca ushodnog prajmera

<110> Green Cross Corporation GCBio Corp.

<120> Kompozicija i formulacija koje sadrže rekombinantnu humanu iduronat-2-sulfatazu i postupak njihove pripreme

<150> US61/500,994

<151> 2011-06-24

<160> 8

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> Nepoznato

<220>

<223> IDS protein

<400> 1

2

�

<211> 48

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> IDS 1 ushodni prajmer

<400> 2

ctatgggtat ctggtacctg tgggatgccg ccaccccgga ccggccga 48 <210> 3

<211> 73

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> IDS 2 ushodni prajmer

<400> 3

<210> 4

<211> 28

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> IDS 3 reverzni prajmer

<400> 4

gggccctcaa ggcatcaaca actggaaa 28

<210> 5

<211> 48

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> IDS N1 ushodni prajmer

<400> 5

2

cagcaagcag gtcattgttc caacatgccg ccaccccgga ccggccga 48 <210> 6

<211> 49

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> IDS N2 ushodni prajmer

<400> 6

tgcagatatc ccagctacag tcggaaacca tcagcaagca ggtcattgt 49 <210> 7

<211> 24

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> IDS 4 reverzni prajmer

<400> 7

gaagatatcc cagggtgaaa gact 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNK

<213> Arteficijalna sekvenca

<220>

<223> T7 ushodni prajmer

<400> 8

aatacgactc actataggga 20

Claims (5)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Postupak za pripremanje kompozicije iduronat-2-sulfataze (IDS) za lečenje Hunterovog sindroma, koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, naznačen time, što je cisteinska rezidua na poziciji 59 u aminokiselinskoj sekvenci IDS konvertovana u formilglicin (FGly) sa molarnim odnosom od 75% ili više, koji uključuje:

kultivisanje rekombinantnog ćelijskog soja transformisanog genom koji kodira IDS predstavljenu SEQ ID NO: 1 i dobijanje kulture; i

prečišćavanje kulture anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom, pri čemu se katjonska izmenjivačka hromatografija izvodi uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 4.0 do 6.0; pri čemu pomenuti postupak uključuje:

(1) transformisanje ćelije-domaćina ekspresionim vektorom koji nosi IDS gen da se dobije rekombinantni ćelijski soj;

(2) kultivisanje rekombinantnog ćelijskog soja u prisustvu hidrolizata u medijumu koji ne sadrži serum i dobijanje kulture;

(3) prečišćavanje IDS iz kulture anjonskom izmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom hidrofobnih interakcija, katjonskom izmenjivačkom hromatografijom, i afinitetnom hromatografijom; i (4) kombinovanje prečišćene IDS sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i

pri čemu je ćelija-domaćin ćelija ovarijuma kineskog hrčka.

2. Postupak iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što se hromatografija hidrofobnih interakcija izvodi uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 5.0 do 7.0.

3. Postupak iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što se afinitetna hromatografija izvodi uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 6.0 do 8.0.

4. Postupak iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što se anjonska izmenjivačka hromatografija izvodi uz korišćenje pufera za eluiranje sa pH od 5.5 do 7.5.

4

5. Postupak iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time, što uključuje još i inaktiviranje virusa na pH od 3.0 do 4.0.