RS55690B1 - So inhibitora ljudske histonske metiltransferaze ezh2 - Google Patents

Description

POZADINA PRONALASKA

Procenjeno je da će tokom 2012. godine kod više od 1.6 miliona ljudi biti dijagnosticiran rak. Na primer, najčešći tip raka kod žena je rak dojke, a ova bolest je odgovorna za najveće stope smrtnih slučajeva od svim tipova raka koje pogađaju žene. Sadašnji tretman raka dojke je ograničen na potpunu, ili delomičnu, mastektomiju, terapiju zračenjem, ili hemoterapiju. Gotovo 230000 slučajeva raka tokom 2012. će otpasti na rak dojke, koje će dovesti do procenjenih 40000 smrtnih slučajeva (Siegel et al, Ca Cancer J Clin 2012; 62:10-29).

Veliki broj smrtnih slučajeva usled raka otpada na tipove raka koji zahvataju krv uključujući leukemije, mijelome, i limfome. Tokom 2012., gotovo 80000 slučajeva raka će biti limfomi, koje će uzrokovati procenjenih 20000 smrtnih slučajeva.

Terapija zračenjem, hemoterapija, i hirurški zahvat su primarni postupci za tretman raka. Međutim, pomenute terapije su uspešne samo ako je rak detektovan u ranoj fazi. Jednom kada rak dosegne invazionu/metastatsku fazu(e), linije invazionih ćelija ili metastazirajućih ćelija mogu da ostanu nedetektovane, koje rezultuje povratkom bolesti, koje zahteva primenu terapije koja je veoma toksična. Tada su i ćelije raka i pacijentove zdrave ćelije izložene toksičnoj terapiji, koje, osim ostalih komplikacija, dovodi do slabljenja imuno-sistema.

Prema tome, stanje tehnike treba nove postupke za tretiranje raka, poput raka dojke ili raznih limfoma.

REZIME PRONALASKA

U skladu sa gore navedenim, ovde je obezbeđen N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)meti1)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-i1)amino)-4-meti1-4'-(moifo1inometil)-[l,T-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid:

Takođe, ovde je obezbeđena posebna polimorfna forma N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,l'-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida ("Polimorf A", ili "Polimorf A N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida"). Kao šta je opisano, ovde obezbeđena hidrobromidna so, kao i Polimorf A, pokazuje fizičke osobine koje mogu da se koriste sa ciljem da se ostvare nove farmakološke karakteristike, koje mogu da se upotrebe za razvoj lekovite supstance i lekovitog proizvoda.

U jednoj izvedbi, pomenuti hidrobromid je kristalan. U drugoj izvedbi, pomenuti hidrobromid je uglavnom oslobođen od primesa. U drugoj izvedbi, pomenuti hidrobromid je čvrsta kristalna materija uglavnom oslobođena od amorfnog N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida.

U drugom aspektu, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži ovde opisani hidrobromid, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili razređivač.

U jednom aspektu, ovde opisani hidrobromid se priprema uz pomoć postupka koji obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

Polimorf A N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamida može da se definiše uz pomoć svoga obrasca difrakcije (prelamanja) X-zraka na prahu. Prema tome, u jednoj izvedbi, pomenuti polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka koji sadrži jedan ili više karakterističnih šiljaka izraženima u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, i oko 22.0 +/- 0.3 stepena 2-teta. U drugoj izvedbi, pomenuti polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka koji sadrži karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, i oko 22.0 +/- 0.3 stepena 2-teta. U još jednoj izvedbi, pomeni polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka koji sadrži karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/-0.3 stepena 2-teta. U još jednoj izvedba, pomenuti polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka koji suštinski odgovara onom iz Slike 1. U drugoj izvedba, pomenuti polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka koji suštinski odgovara onom iz Tabele 1.

Polimorf A takođe može da se definiše prema njegovom terminogramu diferencijane skening kalorimetrije. U jednoj izvedbi, polimorf ima terminograf diferencijalne skening kalorimetrije koji sadrži karakteristične šiljke izražene u ° C na temperaturi od 255 +/- 5° C. U jednoj izvedbi, pomenuti polimorf ima terminograf diferencijalne skening kalorimetrije koji se suštinski poklapa sa onim na Slici 3.

U jednom aspektu, Polimorf A se priprema uz pomoć postupka koji kombinuje N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,T-bifenil]-3-karboksamid sa bromovodoničnom kiselinom.

U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za ponovno kristalizovanje Polimorfa A, koji obuhvata sledeće korake: (a) rastvaranje Polimorfa A u prvom rastvaraču, i (b) dodavanje drugog rastvarača, tako da se pomenuti polimorf ponovo kristalizuje. U jednoj izvedbi, pomenuti prvi rastvarač je etanol, a drugi rastvarač je MTBE. U drugoj izvedbi, pomenuti postupak obuhvata (a) rastvaranje Polimorfa A u etanolu, (b) grejanje smeše, (c) dodavanje MTBE u smešu, nastanak precipitata koji sadrži pomenuti polimorf, i filtriranje pomenutog precipitata tako da se pomenuti polimorf ponovo kristalizuje.

U još jednom aspektu, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži Polimorf A, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili razređivač.

Takođe, ovde je opisan postupak za tretiranje raka koji obuhvata administriranie nekom subjektu u potrebi terapeutski efektivnu količinu ovde opisanog hidrobromidnog jedinjenja, Polimorfa A, ili neke farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od pomenutih jedinjenja. Mogu da se tretiraju brojni tipovi tumora, uključujući i ne-Hodgkin-ov limfom ili rak dojke.

Ovde je dodatno opisan postupak inhibiranja delovanja histonske metiltransferaze EZH2 u nekom subjektu u potrebi koji obuhvata administriranje pomenutom subjektu neku efektivnu količinu ovde opisanog hidrobromidnog jedinjenja, Polimorfa A, ili neke farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od pomenutih jedinjenja.

U još jednom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za inhibiranje delovanja histonske metiltransferaze EZH2 u uslovimain vitrokoji obuhvata administriranje pomenutog ovde opisanog hidrobromidnog jedinjenja, ili Polimorfa A.

Takođe, ovde je obezbeđena upotreba ovde opisanog hidrobromidnog jedinjenja, Polimorfa A, ili neke farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od pomenutih jedinjenja, za pripremu leka za tretman raka u nekom subjektu u potrebi.

KRATKI OPIS SLIKA

Slika 1 prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prahu Polimorfa A (monohidrobromid). Slika 2 prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prahu dihidrobromidnog jedinjenja. Slika 3 prikazuje terminogram diferencijalne skening kalorimetrije za Polimorf A. Slika 4 prikazuje dinamičku sorpciju pare Polimorfa A, koje ukazuje na nisku higroskopnost pomenutog jedinjenja.

Slika 5 prikazuje HPLC analizu Polimorfa A tokom tri dana na povišenoj temperaturi. Tokom tog vremena, polimorf A je imao minimalne primese.

Slika 6 prikazuje dinamičku sorpciju pare natrijumove soli Jedinjenja I, koje ukazuje na značajnu higroskopnost ovoga jedinjenja.

Slika 7 prikazuje dinamičku sorpciju pare hemisulfatne soli Jedinjenja I, koje ukazuje da ovo jedinjenje ima blago povišenu higroskopnost.

Slika 8 pokazuje podatke za diferencijalnu skening kalorimetriju monohidrohloridne soli Jedinjenja I, koje ukazuje daje ovo jedinjenje slabo kristalizovano.

Slika 9 prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prah sintetičkog intermedijara 5. Slika10prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prahu Polimorfa B.

Slika11 prikazuje kristalnu strukturu (difrakcija X-zraka) monohidrobromida Jedinjenja I.

Slike 12-14 prikazuju rezultatein vivostudija delovanja hidrobromida Jedinjenja I na ćelijskoj liniji humanog limfoma.

Slike 15-16 pokazuju anti-tumorski efekt hidrobromida Jedinjenja I u modelu mišjeg limfoma (ksenograf).

Slika 17 prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prahu sintetičkog intermedijara 2. Slika 18A i B prikazuje (A) obrazac difrakcije X-zraka na prahu trihidrohloridne soli Jedinjenja I i (B) dinamičku sorpciju pare monohidrohloridne soli Jedinjenja I, koje ukazuje na značajnu higroskopnost ovog jedinjenja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

HBr so i Polimorf A

Ovde je obezbeđen N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid:

Kao šta se ovde koristi, "Jedinjenje I" se odnosi na N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropilidin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamid. Pomenuti hidrobromid Jedinjenja I može da se koristi za inhibiranje delovanja histonske metiltransferaze EZH2, u nekom subjektu iliin vitro.Pomenuti hidrobromid Jedinjenja I takođe može da se koristi za tretman raka u nekom subjektu u potrebi.

Jedinjenje I može da bude protonovano na jednom ili više od njegovih baznih mesta, poput morfolinskih, disupstituisanih anilinskih, i/ili piridonskih ostataka. Prema tome, u nekim izvedbama, ovde je obezbeđen monohidrobromid, dihidrobromid, ili trihidrobromid Jedinjenja I. U jednoj izvedbi, ovde je obezbeđen monohidrobromid Jedinjenja I. Kada se pomenuto jedinjenje nalazi u formi monohidrobromida, tada isto može da bude protonovano na bilo kojem baznom mestu. U jednoj izvedbi koja ne ograničava, Jedinjenje I je protonovano na azotu iz morfolinskog supstituenta dajući monohidrobromid Jedinjenja I koji ima sledeću strukturu:

Ovaj monohidrobromid može da se nazove "4-((3'-(((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4'-metil- [1,1 '-bifenil] -4-il)metil)morfolin-4-iujm bromid". Slika 11 prikazuje kristalnu strukturu (X-zrake) ove posebne soli.

Hidrobromid Jedinjenja I poseduje brojne napredne fizičke karakteristike u odnosu na svoju slobodnu bazu, kao i na druge soli pomenute slobodne baze. Konkretno, hidrobromid Jedinjenja I ima nižu higroskopnost ako se uporedi sa drugim formama Jedinjenja I. Kako bi pomenuto jedinjenje moglo da bude efektivno u terapiji, uopšteno rečeno, potrebno je da pomenuto bude minimalno higroskopno. Forme leka koje su visoko higroskopne mogu da budu nestabilne, jer se stopa lekovite forme može promeniti ako je lek uskladišten u prostorijama sa promenljivom vlažnosti. Takođe, higroskopnost može da utiče na proces rukovanja sa velikim količinama jedinjenja i sa procesom njegove proizvodnje, jer može da bude otežano da se odredi tačna težina higroskopno aktivnog agensa tokom pripreme farmaceutske kompozicije koja ga sadrži. Hidrobromid Jedinjenja I ima nisku higroskopnost ako se uporedi sa drugim formama Jedinjenja I. Kao takvo, jedinjenje može da se skladišti tokom prihvatljivih vremenskih perioda bez da poprimi štetne promene, na primer, u odnosu na svoju rastvorljivost, gustinu, ili čak hemijski sastav.

Osim pomenutih prednosti, hidrobromid Jedinjenja I može da se proizvede u visoko kristalnoj formi, koja je korisno za pripremu farmaceutskih formulacija, a poboljšava i opšte rukovanje, manipulaciju i skladištenje lekovitog jedinjenja. U jednoj preferiranoj izvedbi, kristalna forma hidrobromida Jedinjenja I se označava kao "Polimorf A".

Sposobnost neke supstancije da postoji i više od jedne kristalne forme se definiše kao polimorfizam; različite kristalne forme neke specifične supstance se nazivaju "polimorfi". Uopšteno, polimorfizam je uslovljen sposobnošću molekula neke supstance da promene svoju konformaciju ili da formiraju različite inter-molekularne ili intra-molekularne interakcije, posebno vodonikove veze, koje dovodi do različitih atomskih aranžmana u kristalnim rešetkama različitih polimorfa. Suprotno, ukupna spoljna forma neke supstance je poznata kao "morfologija", a odnosi se na spoljnu formu kristala i prisutnih ploha, bez da se obazire na unutrašnju strukturu. Kristali mogu da zauzmu različitu morfologiju u različitim uslovima poput, na primer, stope rasta, mešanja, i prisutnosti primesa.

Različiti polimorfi neke supstance mogu da poseduju različite energije kristalne rešetke pa, tako, u čvrstom stanju mogu da imaju različite fizičke karakteristike poput forme, gustine, tačke topljenja, boje, stabilnosti, rastvorljivosti, stope rastvaranja, itd., koje sa svoje strane može da utiče na stabilnost, stopu rastvaranja i/ili biodostupnost određenog polimorfa i njegove prikladnosti za upotrebu kao farmaceutika i u farmaceutskim kompozicijama.

Polimorf A je veoma kristalan, i ima nisku higroskopnost. Takođe, ovaj polimorf može da se dobije na ponovljiv način, a blage promene u uslovima kristalizovanja ne dovode do pojave različitih kristalnih forma.

Mogućnost dobijanja različitih polimorfa hidrobromida Jedinjenja I je poželjna zbog više razloga. Jedan takav razlog je taj šta pojedinačni polimorfi mogu da ugrade različite primese, ili hemijske ostatke, nakon kristalizovanja. Na primer, primese mogu da se odstrane tokom procesa konvertovanja Jedinjenja I u Polimorf A.

Bez da se vežemo na neku specifičnu teoriju, forme polimorfa koje imaju kompaktne kristalne oblike donose prednosti zbog lake filtracije i jednostavnog protoka. Polimorf A ima kompaktni kristalni oblik pa prema tome poseduje pomenute prednosti.

U nekim izvedbama, Polimorf A može da se identifikuje na bazi karakterističnih šiljaka iz obrasca difrakcije X-zraka na prahu. Difrakcija X-zraka na prahu, takođe označena kao XRPD, je naučna tehnika koja koristi difrakciju X-zraka, neutrona, ili elektrona na prahu, mikrokristalu, ili nekom drugom čvrstom materijalu za strukturno karakterizovanje pomenutih materijala. U jednoj izvedbi, Polimorf A ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži jedan ili više karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, i oko 22.0 +/- 0.3 stepena 2-teta. U drugoj izvedbi, pomenuti polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji ima karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, i oko 22.0 +/- 0.3 stepena 2-teta.

U jednoj izvedbi, Polimorf A ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži najmanje 5 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/-0.3 stepena 2-teta. U drugoj izvedbi, Polimorf A ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži barem 6 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/-0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta. U još jednoj izvedbi, Polimorf A ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži barem 7 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta. U drugoj izvedbi, Polimorf A ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži barem 8 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta. U još jednoj izvedbi, Polimorf A ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži barem 9 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/-0.3 nivo 2-teta. U još jednoj izvedbi, polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži barem 10 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/-0.3 stepena 2-teta.

U još jednoj izvedbi, polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 14.3 +/- 0.3 stepena, oko 18.7 +/- 0.3 stepena, oko 23.3 +/- 0.3 stepena, i oko 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

U još jednoj izvedbi, polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 10.1 +/- 0.3 stepena, oko 14.3 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, oko 18.7 +/- 0.3 stepena, oko 20.6 +/- 0.3 stepena, oko 20.9 +/- 0.3 stepena, oko 21.8 +/- 0.3 stepena, oko 22.0 +/- 0.3 stepena, oko 23.3 +/- 0.3 stepena i oko 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta. U još jednoj izvedbi, polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji suštinski odgovara onom iz Slike 1. U drugoj izvedbi, polimorf ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji uglavnom sadrži 2-teta vrednosti koje su navedene u Tabeli 1.

Kao šta se ovde koristi, termin "oko", kada se koristi za označavanje stepena 2-teta vrednosti odgovara navedenoj vrednosti uz varijaciju od +/- 0.3 stepena 2-teta.

Farmaceutske kompozicije koja sadrže Polimorf A mogu da se identifikuju ako se njihovi obrasci difrakcije X-zraka na prahu uporede sa obrascem difrakcije X-zraka na prahu za Polimorf A. Podrazumeva se da farmaceutske kompozicije koje sadrže Polimorf A mogu da imaju obrasce difrakcije X-zraka na prahu koji nisu identični sa obrascem difrakcije X-zraka na prahu za čisti Polimorf A.

U nekim izvedbama, Polimorf A može da se identifikuje na bazi karakterističnog šiljka iz termograma diferencijalne skening kalorimetrije. Diferencijalna skening kalorimetrija, ili DSC, je termoanalitička tehnika preko koje se određuje (meri) razlika u količini topline, koja je potrebna za povećanje temperatura primerka i reference, kao funkcija temperature. U jednoj izvedbi, Polimorf A ima termogram diferencijalne skening kalorimetrije sa karakterističnim šiljkom izraženim u ° C na temperaturi od oko 255 +/- 5° C. U drugoj izvedbi, Polimorf A ima termogram diferencijalne skening kalorimetrije sa pojedinačnim endotermičkim šiljkom koji se pojavljuje u temperaturnom rasponu od 250-255° C. U drugoj izvedbi, Polimorf A ima termogram diferencijalne skening kalorimetrije koji suštinski odgovara onom iz Slike 3.

U nekim izvedbama, Polimorf A može da sadrži primese. Ne-ograničavajući primeri za primese uključuju neželjene polimorfne forme, ili rezidualne organske i anorganske molekule poput rastvarača, vode ili soli. U jednoj izvedbi, Polimorf A je uglavnom očišćen od primesa. U drugoj izvedbi, Polimorf A sadrži manje od 10% (po težini) ukupno primesa. U drugoj izvedbi, Polimorf A sadrži manje od 5% (po težini) ukupno primesa. U drugoj izvedbi, Polimorf A sadrži manje od 1% (po težini) ukupno primesa. U još jednoj izvedbi, Polimorf A sadrži manje od 0.1 % (po težini) ukupno primesa.

U nekim izvedbama, Polimorf A je kristalna čvrsta materija uglavnom oslobođena od amorfnog hidrobromida Jedinjenja I. kao šta se ovde koristi, termin "uglavnom oslobođen od amorfnog hidrobromida Jedinjenja 1" označava da pomenuto jedinjenje ne sadrži značajnu količinu amorfnog hidrobromida Jedinjenja I. U nekim izvedbama je prisutno najmanje oko 95% (po težini) kristalnog Polimorfa A. U još nekim izvedbama ovoga pronalaska je prisutno najmanje oko 99% (po težini) kristalnog Polimorfa A.

In drugoj izvedba, Polimorf A je uglavnom oslobođen od Polimorfa B.

So iz ovoga pronalaska, i njena kristalna forma (Polimorf A), mogu da budu pomešane sa drugim supstancama ili mogu da budu izolovani. U nekim izvedbama, so iz ovoga pronalaska, ili njegova kristalna forma, su uglavnom izolovani. Pod "uglavnom izolovani" se misli daje so, ili njena kristalna forma, barem delomično ili uglavnom odvojena od okoline u kojoj je nastala ili gde je detektovana. Delomična separacija može da uključuje, na primer, neku kompoziciju koja je obogaćena sa soli iz ovoga pronalaska. Značajna separacija može da obuhvata kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% (po težini) hidrobromida Jedinjenja I i Polimorfa A. Postupci za izolovanje jedinjenja i njihovih soli su rutina u stanju tehnike.

Hidrobromid Jedinjenja I i Polimorf A mogu da postoje kao bilo koji normalni tautomer, ili kao smeša normalnih tautomera. Kao šta se ovde koristi, "tautomer"se odnosi na jedan od dva ili više strukturnih izomera koji postoje u ravnoteži i mogu lako da se konvertuju iz jedne izomerne forme u drugu. Primeri uključuju keto-enolne tautomere, poput aceton/propen-2-ol, i slično. Hidrobromid Jedinjenja I i Polimorf A mogu da imaju jedan ili više tautomera pa prema tome obuhvataju brojne izomere,tj.,piridin-2(lH)-on i odgovarajući piridin-2-ol. Sve takve izomerne forme pomenutih jedinjenja su ekspresno uključeni u ovaj pronalazak.

Priprema HBr soli i Polimorfa A

Hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A, mogu da se pripreme uz pomoć poznatih tehnika. Konvencionalno, so se priprema uz pomoć kombinovanja (u rastvoru) slobodne baze jedinjenja i kiseline koja sadrži anjon željene soli, a tada se izoluje čvrsta so (proizvod) iz reakcionog rastvora (na primer, uz pomoć kristalizovanja, precipitacije, isparavanja, itd.). Mogu da se koriste i druge tehnike za formiranje soli.

Shema 1 ispod prikazuje posebnu izvedbu za proizvodnju slobodne baze Jedinjenja 1, kao i hidrobromida Jedinjenja I. Ukratko, metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoat (1) je reagovan sa dihidro-2H-piran-4(3H)-on u uslovima reduktivne aminacije sa ciljem da se dobije metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoat (2) u koraku 1. U koraku 2 se ponovo koristi reduktivna aminacija sa ciljem da se dobije 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoat (3). Ovo jedinjenje je tada u koraku 3 reagovano u uslovima kuplovanja po Suzuki-ju sa ciljem da se dobije metil 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksilat (4), koji je hidrolizovan u odgovarajuću kiselinu (5) u koraku 4. U koraku 5, kiselina (5) je reagovana u uslovima amidnog kuplovanja sa 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(lH)-on hidrohloridom sa ciljem da se dobije Jedinjenje I.

Kao šta je prikazano, Jedinjenje I može tada da reaguje sa vodenim HBr sa ciljem da se dobije hidrobromid Jedinjenja I.

Sinteza koja je opisana iznad ima brojne prednosti. Na primer, iskorištava brojne intermedijare koji mogu da se pripreme u kristalnim formama koje mogu da se izoluju. Korišćenje kristalnih intermedijara omogućava primenu minimalnih tehnika prečišćavanja (na primer, hromatografije), koje dovodi do ukupnog poboljšanja u prinosu finalnog Jedinjenja I.

Prema tome, ovde je obezbeđeno intermedijarno jedinjenje 1 u kristalnoj formi. U drugoj izvedbi, ovde je obezbeđeno intermedijarno jedinjenja 2 u kristalnoj formi. Slika 17 prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prahu za kristalno jedinjenje 2. U još jednoj izvedbi, pomenuto intermedijarno jedinjenje 5 je kristalno. Slika 9 prikazuje obrazac difrakcije X-zraka na prahu kristalnog jedinjenja 5. U drugoj izvedbi, jedinjenja 2 i/ili 5 su proizvedena uglavnom u čistoj formi bez upotrebe hromatografije. Podrazumeva se da kristalizovanje intermedijara nije jednostavno ili potpuno efikasno.

Takođe, ovde je obezbeđen postupak za pripremu N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamida koji obuhvata reagovanje 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-

(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksilne kiseline (5) sa soli 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(lH)-on. U jednoj izvedba ovoga postupka, (5) je u kristalnoj formi.

Jedinjenje I može da bude reagovano sa vodenom HBr u prisutnosti odgovarajućeg rastvarača kako bi se dobio Polimorf A, a posebno kristalna forma hidrobromida. U jednoj izvedbi, Jedinjenje I je reagovano sa vođinim HBr u prisutnosti etanola i etil acetata sa ciljem dobijanja Polimorfa A.

Jednom kada se polimorf pripremi, može da bude ponovo kristalizovan uz korišćenje istog rastvarača (ili više rastvarača) koji je bio korišćen za pripremu polimorfa, ili nekog drugog rastvarača (ili više rastvarača), sa ciljem da se dobije kompozicija sa povećanom kristalnosti. Opšte uzeto, Polimorf A može da se ponovo kristalizuje uz pomoć rastvaranja polimorfa u jednom ili više rastvarača, uz opciono grejanje, nakon opcionog koraka hlađenja, a tada sledi izolovanje kristalne strukture, uz pomoć,na primer,filtriranja. Nakon šta je polimorf inicijalno rastvoren u prvom rastvaraču (ili kombinaciji rastvarača), može da se doda dodatni, ali različiti rastvarač tokom bilo koje tačke duž procesa (pre ili nakon grejanja, pre ili nakon hlađenja,itđ.)sa ciljem da se proizvede željena kristalna struktura. Na primer, prvi rastvarač može da se koristi sa ciljem da se rastvori polimorfno jedinjenje, a tada može da se doda drugi rastvarač

( na primer,anti-rastvarač) sa ciljem da se potakne da polimorf precipitira iz rastvora. U jednoj izvedbi, voda se dodaje u prvi rastvarač sa ciljem da se ubrza rastvaranje polimorfa.

Ne-ograničavajući primeri za rastvarače koji mogu da se koriste za ponovno kristalizovanje Polimorfa A su sledeći: metanol, etanol, etil acetat, metil tert-butil etar, voda, izopropil alkohol, tetrahidrofuran, aceton, acetonitril, i 2-metiltetrahidrofuran, kao i njihove kombinacije. Ne-ograničavajući primeri za kombinacije rastvarača koji su korisni za ponovno kristalizovanje Polimorfa A su (rastvarač i anti-rastvarač, pri čemu voda može da se doda u prvi rastvarač sa ciljem da se ubrza rastvaranje polimorfa): metanol/voda i etil acetat, izopropil alkohol/voda i etil acetat, tetrahidrofuran/voda i etil acetat, aceton i etil acetat, acetonitril/voda i etil acetat, etanol/voda i metil tert-butil etar, izopropil alkohol/voda i metil tert-butil etar, etanol/voda i tetrahidrofuran, izopropil alkohol/voda i aceton, i etanol/voda i etil acetat. U posebnim izvedbama, kombinacije rastvarača su metanol/voda i etil acetat, izopropil alkohol/voda i etil acetat, etanol/voda i 2-metiltetrahidrofuran, i metanol/2-metiltetrahidrofuran.

U jednom aspektu, Polimorf A se priprema primenom postupka koji obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za ponovno kristalizovanje Polimorfa A, koji obuhvata sledeće korake: (a) rastvaranje Polimorfa A u prvom rastvaraču, i (b) dodavanje drugog rastvarača, tako da pomenuti polimorf ponovo kristalizuje. U jednoj izvedbi, prvi rastvarač je etanol, a drugi rastvarač je MTBE. U drugoj izvedbi, postupak obuhvata (a) rastvaranje Polimorfa A u etanolu, (b) grejanje smeše, (c) dodavanje MTBE u smešu, formiranje precipitata koji sadrži pomenuti polimorf, i filtriranje precipitata tako da pomenuti polimorf ponovo kristalizuje.

Farmaceutske kompozicije

U drugom aspektu, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži hidrobromid Jedinjenja I, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili razređivač. Takođe, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži Polimorf A, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili razređivač.

Termin "farmaceutska kompozicija" obuhvata preparate koji su prikladni za administriranje sisarima, na primer, ljudima. Kada se jedinjenja iz ovoga pronalaska administriraju kao farmaceutici sisarima, na primer, ljudima, pomenuti mogu da se dajuper seili kao farmaceutska kompozicija koja sadrži, na primer, 0.1% do 99.9% (bolje, 0.5 do 90%) aktivnog sastojka zajedno sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosiocem.

Ovde opisana jedinjenja( tj.,hidrobromid Jedinjenja I i Polimorf A) mogu da se kombinuju sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosiocem primenom konvencionalnih tehnika za pripremu farmaceutski jedinjenja. Kao šta se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosilac" može da obuhvata bilo koji i sve rastvarače, razređivače, ili druge tečne prenosnike, pomagala za dispergovanje ili suspendovanje, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za ugušćivanje i stvaranje emulzije, konzervanse, čvrste veznike, lubrikante i slično, prema potrebi određene dozne forme.Remington' s Pharmaceutical Sciences,16. izdanje, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) opisuje brojne nosioce koji se koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim ako je neki (bilo koji) konvencionalni nosilac (medijum) nekompatibilan sa pomenutim jedinjenjima, tako da stvara bilo kakav neželjeni biološki efekt ili da na bilo koji drugi način deluje štetno sa bilo kojom drugom komponentom(ama) iz farmaceutske kompozicije, njegova upotreba je predviđena i obuhvaćena sa okvirima ovoga pronalaska. Neki primeri za materijale koji mogu da služe kao farmaceutski prihvatljivi nosioci obuhvataju, ali bez ograničenja, šećere poput laktoze, glikoze i saharoze; razne tipove škroba poput kukuruznog škroba i krompirovog škroba; celulozu i njene derivate poput natrijum karboksimetil celuloze, etil celuloze i celuloze acetata; tragakant u prahu; slad; želatinu; talk; ekscipijente poput kakao maslaca i voskova za čepiće; ulja poput ulja od kikirikija, semena pamuka; suncokreta, sušama; maslina; kukuruza i soje; glikole, poput propilen glikola; estere poput etil oleata i etil laurata; agar; agense za puferovanje poput magnezijum hidroksida i aluminijum hidroksida; alginsku kiselinu; vodu bez pirogena; izotonični slani rastvor; Ringer-ov rastvor; etil alkohol, i rastvore puferovane sa fosfatom, kao i druge ne-toksične kompatibilne lubrikante poput natrijum lauril sulfata i magnezijum stearata, kao i agense za bojenje, agense za otpuštanje, agense za prekrivanje, zaslađivaće, agense za ukus i miris, dok konzervansi i antioksidansi takođe mogu da budu prisutni u kompoziciji, u skladu sa procenom proizvođača.

Nadalje, nosilac može da zauzme brojne forme u zavisnosti o željenoj formi za administriranje preparata, na primer, oralna, nazalna, rektalna, vaginalna, parenteralna (uključujući intravenozne injekcije ili infuzije). Kod pripreme kompozicija za oralno doziranje, može da se primeni bilo koji uobičajeni farmaceutski medijum. Uobičajeni farmaceutski medijumi obuhvataju, na primer, vodu, glikole, ulja, alkohole, agense za ukus, konzervanse, agense za bojanje, i slično u slučaju oralnih tečnih preparata (poput na primer, suspenzija, rastvora, emulzija i eliksira); aerosoli; ili nosioci poput raznih tipova škroba, šećera, mikrokristalne celuloze, razređivača, agenasa za granuliranje, lubrikanata, veznika, agenasa za raspadanje i slično, u slučaju oralnih čvrstih preparata (poput na primer, prahova, kapsula, i tableta).

Agensi za vlaženje, emulzifajeri i lubrikanti, poput natrijum lauril sulfata i magnezijum stearata, kao i agensi za bojenje, agensi za otpuštanje, agensi za prekrivanje, zaslađivaći, agensi za ukus i miris, konzervansi i antioksidansi takođe mogu da budu prisutni u kompozicijama.

Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa obuhvataju: antioksidanse koji su rastvorljivi u vodi, poput askorbinske kiseline, cistein hidrohlorida, natrijum bisulfata, natrijum metabisulfita, natrijum sulfita i slično; antioksidanse koji su rastvorljivi u ulju, poput askorbil palmitata, butilovanog hidroksianizola (BHA), butilovanog hidroksitoluena (BHT), lecitina, propil galata, tokoferola, i slično; i metalne agense za heliranje, poput limunske kiseline, etilendiamin tetrasirćetne kiseline (EDTA), sorbitola, vinske kiseline, fosforne kiseline, i slično.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenuta jedinjenja mogu da se formulišu tako da imaju željenu koncentraciju. U nekim izvedbama, kompozicija se formuliše tako da sadrži neku terapeutski efektivnu količinu. U nekim izvedbama, kompozicija se formuliše tako da sadrži količinu koja ne uzrokuje jedan ili više neželjenih nus-pojava.

Zbog toga šta se kristalna forma hidrobromida Jedinjenja I lakše održava tokom pripreme, čvrste dozne forme su preferirana forma za farmaceutsku kompoziciju iz ovoga pronalaska. Čvrste dozne forme za oralno administriranje, poput kapsula, tableta, pilula, prahova, i granula, su posebno preferirane. Ako je poželjno, tablete mogu da budu omotane uz pomoć tehnika koje su poznate stručnjacima.

Farmaceutske kompozicije obuhvataju one koje su prikladne za oralno, suplingvalno, nazalno, rektalno, vaginalno, topikalno, bukalno i parenteralno (uključujući supkutano, intramišićno, i intravenozno) administriranje, mada najprikladnija ruta zavisi o prirodi i ozbiljnosti stanja koje se tretira. Pomenute kompozicije mogu konvencionalno da budu u formi unitarnih doza, koje su pripremljene primenom bilo kojeg postupka koji je poznat stručnjacima. U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija se formuliše za oralno administriranje u formi pilule, kapsule, pastile ili tablete. U drugim izvedbama, farmaceutska kompozicija je u formi suspenzije.

Ovde obezbeđena jedinjenja su prikladna kao aktivni agensi za farmaceutske kompozicije koje su posebno efikasne za tretiranje poremećaja povezanih sa EZH2, posebno raka. Pomenuta farmaceutska kompozicija u brojnim izvedbama sadrži farmaceutski efektivnu količinu hidrobromida Jedinjenja I ili Polimorfa A, zajedno sa drugim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima, nosiocima, filerima, razređivačima i slično.

Terapeutski ili farmaceutski "efektivna količina" je ona količina jedinjenja (hidrobromid Jedinjenja I ili Polimorf A) koja, kada se administrira pacijentu, ublažava neki simptom bolesti ili stanja, na primer, sprečava brojne morfološke i somatske simptome raka. U jednom primeru, efektivna količina hidrobromida Jedinjenja I ili Polimorfa A je količina koja je dovoljna da se tretira rak u nekom subjektu. Pomenuta količina može da varira u zavisnosti o faktorima poput veličine ili težine subjekta, tipu bolesti, ili specifičnog jedinjenja iz pronalaska. Pomenuta količina hidrobromida Jedinjenja I ili Polimorfa A koja predstavlja "efektivnu količinu" može da varira u zavisnosti o samom jedinjenju, bolesnom stanju i njegove ozbiljnosti, dobi tretiranog pacijenta, i slično. Pomenuta efektivna količina može da se odredi rutinski od strane stručnjaka uzimajući u obzir njegovu ekspertizu i ovde priloženi opis.

Režim administrirani a može da utiče na farmaceutski efektivnu količinu. Hidrobromid Jedinjenja I ili Polimorf A, i kompozicije koje sadrže bilo koje od oba pomenuta jedinjenja, mogu da se administriraju nekom subjektu pre ili nakon pojave bolesti. Nadalje, nekoliko pojedinačnih doza, kao i raspoređenih doza može da se administrira dnevno ili uzastopno, ili doza može da se kontinuirano daje infuzijom, ili uz pomoć bolus-injekcije. Nadalje, doza može da se proporcionalno povećava ili smanjuje na osnovu toga koliko je hitna terapeutska ili profilaktička situacija.

Postupci za tretman

Jedinjenja iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) inhibiraju delovanje histonske metiltransferaze EZH2 ili nekog njenog mutanta pa, prema tome, u jednom aspektu ovoga pronalaska, neka od ovde opisanih jedinjenja su kandidati za upotrebu u tretmanu, ili sprečavanju nekih stanja i bolesti. Ovaj opis obezbeđuje postupke za tretiranje stanja i bolesti na čije napredovanje može da se utiče uz pomoć moduliranja statusa metilacije histona ili drugih belančevina, pri čemu pomenuti status metilacije je posredovana barem delomično delovanjem EZH2. Modulacija statusa metilacije histona sa svoje strane može da utiče na nivo ekspresije ciljanih gena koji se aktivišu uz pomoć metilacije, i/ili ciljanih gena koji se utišavaju uz pomoć metilacije. Ovaj postupak obuhvata administriranje nekom subjektu u potrebi, terapeutski efektivnu količinu jedinjenja iz ovoga pronalaska.

Poremećaj kod kojeg EZH2-posredovana metilacija belančevina ima uticaja može da bude rak ili pre-tumorsko stanje. Ovaj pronalazak nadalje obezbeđuje upotrebu jedinjenja iz ovoga pronalaska{ tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) u tretmanu raka ili pre-tumorskog stanja na čije napredovanje može da se utiče uz pomoć moduliranja EZH2-posredovane metilacije belančevina, ili, njihovu upotrebu u pripremi leka koji je koristan u tretmanu pomenutog raka ili pre-tumorskog stanja. Primeri za tumore koji mogu da se tretiraju na ovaj način obuhvataju limfome, uključujući ne-Hodgkin-ov limfom, folikularni limfom (FL) i difuzni limfom velikih B-ćelija (DLBCL); melanom; i leukemiju, uključujući CML. Primeri za pre-tumorska stanja obuhvataju mijelodisplastični sindrom (MDS; ranije poznat kao pre-leukemija).

U još jednoj izvedbi, ovde je opisan postupak za tretiranje limfoma koji obuhvata administriranje nekom subjektu u potrebi efektivnu količinu hidrobromida Jedinjenja I.

U još jednoj izvedbi, ovde je opisan postupak za tretiranje limfoma koji obuhvata administriranje nekom subjektu u potrebi efektivnu količinu Polimorfa A.

Ovaj opis takođe obezbeđuje postupke za zaštitu od poremećaja, u kojem EZH2-posredovana metilacija belančevina igra ulogu, uz pomoć administrirani a terapeutski efektivne količine jedinjenja iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) nekom subjektu u potrebi. Pomenuti poremećaj može da bude rak, na primer, rak u kojem EZH2-posredovana metilacija belančevina igra ulogu. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) za pripremu leka koji je koristan za prevenciju proliferativnog ćelijskog poremećaja koji je povezan, barem delomično, sa EZH2-posredovanom metilacijom belančevina.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za moduliranje metilacije belančevina (na promer, histona), na primer, za moduliranje delovanja histonske metiltransferaze ili histonske demetilaze. Barem neka od jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se koriste zain vivoiliin vitromoduliranje metilacije belančevina. Objavljeno je da je metilacija histona uključena u aberantne ekspresije određenih gena u tumorima, a i u utišavanju neuronskih gena u ćelijama koje nisu neuronske. Barem neka od ovde opisanih jedinjenja su prikladni kandidati za tretiranje pomenutih bolesti, tj., za smanjivanje metilacije ili obnavljanje metilacije približno do stepena u odgovarajućim normalnim ćelijama.

Jedinjenja koja su modulatori metilacije mogu da se koriste za moduliranje ćelijske proliferacije. Na primer, u nekim slučajevima prekomerna proliferacija može da se smanji uz pomoć agenasa koji smanjuju metilaciju, dok nedovoljna proliferacija može da se stimuliše sa agensima koji povećavaju metilaciju. Prema tome, bolesti koji mogu da se tretiraju sa jedinjenjima iz ovoga pronalaska mogu da obuhvataju hiperproliferativne bolesti, poput benignog rasta ćelija i malignog rasta ćelija.

Kao šta se ovde koristi, "subjekt u potrebi" je subjekt koji ima poremećaj kod kojeg EZH2-posredovana metilacija belančevina igra ulogu, ili subjekt koji pokazuje povećani rizik razvijanja takvog poremećaja u odnosu na ostatak populacije. Subjekt u potrebi proživljava pre-tumorsko stanje. Preferirano, subjekt u potrebi ima rak. "Subjekt" obuhvata sisare. Pomenuti sisar može da budena primer,čovek ili odgovarajući sisar koji nije čovek, poput primata, miša, pacova, psa, mačke, goveda, konja, koze, kamile, ovce ili svinje. Pomenuti subjekt takođe može da bude ptica ili živina. U jednoj izvedbi, pomenuti sisar je čovek.

Kao šta se ovde koristi, termin "ćelijski proliferativni poremećaj" se odnosi na stanja kod kojih neregulisani ili abnormalni rast, ili oba, ćelija može da dovede do razvoja nekog neželjenog stanja ili bolesti, koja ne mora da bude tumorska. Primeri za ćelijske proliferativne poremećaje koji mogu da se tretiraju sa jedinjenjima iz ovoga pronalaska obuhvataju brojna stanja u kojima je ćelijska deoba deregulisana. Primeri za ćelijske proliferativne poremećaje obuhvataju, ali bez ograničenja, neoplazme, benigne tumore, maligne tumore, pre-tumorska stanja,in situtumore, enkapsulirane tumore, metastatske tumore, tečne tumore, čvrste tumore, imunološke tumore, hematološke tumore, razne tipove rak, karcinome, leukemije, limfome, sarkome, i ćelije koje se brzo dele. Termin "ćelije koje se brzo dele", kao šta se ovde koristi, definiše ćeliju koja se deli sa stopom koja prevazilazi ili je veća od očekivane ili primećene rate deljenja susednih ili bliskih ćelija u istom tkivu. Ćelijski proliferativni poremećaj obuhvata pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja. Ćelijski proliferativni poremećaj obuhvata rak. U jednom aspektu, ovde obezbeđeni postupci se koriste za tretman ili ublažavanje nekog simptoma raka ili za identifikovanje prikladnih kandidata za takve ciljeve. Termin "rak" obuhvata čvrste tumore, kao i hematološke tumore i/ili maligna stanja. "Pre-kancerozna ćelija" ili "pre-tumorska ćelija" je ona ćelija koja manifestuje neki ćelijski proliferativni poremećaj koji predstavlja pre-kancerozno ili pre-tumorsko stanje. "Ćelija raka" ili "tumorska ćelija" je ćelija koja manifestuje ćelijski proliferativni poremećaj koji je rak. Za identifikovanje ćelija raka ili pre-tumorskih ćelija može da se koristi bilo koji reproducibilni način merenja. Ćelije raka ili pre-tumorske ćelije mogu da se identifikuju uz pomoć histološkog tipiziranja ili ocenjivanja primeraka tkiva( na primer,primerak za biopsiju). Ćelije ili pre-tumorske ćelije mogu da se identifikuju preko upotrebe odgovarajućih molekularnih markera.

Primeri za ne-tumorska stanja ili poremećaje koji mogu da se tretiraju uz pomoć jednog ili više jedinjenja iz ovoga pronalaska obuhvataju, ali bez ograničenja, reumatoidni artritis; zapaljenje; autoimunu bolest; limfo-proliferativna stanja; akromegaliju; reumatoidni spondilitis; osteoartritis; giht, druga artritična stanja; sepsu; septički šok; endotoksični šok; sepsu zbog gram-negativnih bakterija; sindrom toksičnog šoka; astmu; respiratorni distres sindrom odraslih; hroničnu opstruktivnu bolest pluća; hronično pulmonalno zapaljenje; upalnu bolest creva; Crohn-ovu bolest; psorijazu; ekcem; ulcerativni kolitis; fibrozu pankreasa; fibrozu jetra; akutnu i hroničnu bolest bubrega; sindrom iritabilnog creva; pirezu; restenozu; cerebralnu malariju; kap i ishemičnu ozledu; neuralnu traumu; Alzheimer-ovu bolest; Huntington-ovu bolest; Parkinson-ovu bolest; akutnu i hroničnu bol; alergijski rinitis; alergijski konjunktivitis; hronično zatajenje srca; akutni koronarni sindrom; kaheksiju; malariju; lepru; lišmanijazu; Lajmsku bolest; Reiter-ov sindrom; akutni sinovitis; mišićnu degeneraciju, burzitis; tendonitis; tenosinovitis; herniju, rupture, ili sindrom prolapsa intervertebralnog diska; osteopetrozu; trombozu; restenozu; silikozu; pulmonalnu sarkozu; bolesti resorpcije kostiju, poput osteoporoze; reakcija presadak-/7os/?raw-domaćina; multiplu sklerozu; lupus; fibromijalgiju; AIDS i druge viralne bolesti poput herpes zostera, herpes simpleks I ili II, virusa influence i citomegalovirusa; idiabetes mellitus.

Primeri za tipove raka koji mogu da se tretiraju uz pomoć jednog ili više jedinjenja iz ovoga pronalaska obuhvataju, ali bez ograničenja, adrenokortikalni karcinom, tumore povezane sa AIDS-om, limfom povezan sa AIDS-om, analni rak, anorektalni rak, rak analnog kanala, rak slepog creva, mladenački cerebelarni astrocitom, karcinom bazalnih ćelija, rak kože (koji nije melanom), rak žuči, rak izvanjetrinog žučnog kanala, rak unutarjetrinog žučnog kanala, rak bešike, rak mokraćovoda, rak kostiju i zglobova, osteosarkom i maligni fibrozni histiocitom, rak mozga, tumor mozga, gliom moždanog stabla, cerebelarni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, ependimom, meduloblastom, supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, gliom vizualnih puteva i hipotalamusa, rak dojke, bronhijalni adenomi/karcinoidi, karcinoidni tumor, gastrointestinalni rak, rak nervnog sistem, limfom nervnog sistema, rak centralnog nervnog sistema, limfom centralnog nervnog sistema, rak vrata materice, mladenački tumori, hroničnu limfocitnu leukemiju, hronično mijelogenu leukemiju, hronične mjeloproliferativne poremećaje, rak debelog creva, kolorektalni rak, limfom kutanih T-ćelija, limfoidnu neoplazmu,mycosis fungoides,Seziary-ov sindrom, rak tela materice, rak jednjaka, tumor ekstrakranijalni germinativnih ćelija, tumor ekstragonadalnih germinativnih ćelija, rak izvanjetrinog žučnog kanala, rak oka, intraokularni melanom, retinoblastom, rak žučne kese, rak želuca, gastrointestinalni karcinoidni tumor, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), tumor germinativnih ćelija, tumor ćelija jajnika, gestacijski trofoblastni tumor gliom, rak glave i vrata, hepatocelularni rak (jetra), Hodgkin-ov limfom, hipofaringealni rak, intraokularni melanom, okularni rak, tumor ćelija Langerhansovih ostrvca (endokrini pankreas), Kaposi-ev sarkom, rak bubrega, rak mokraćnog sistema, laringealni rak, akutnu limfoblastičnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, leukemiju vlasastih ćelija, rak usana i usne šupljine, rak jetra, rak pluća, nesitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, limfom povezan sa AIDS-om, ne-Hodgkin-ov limfom, primarni limfom centralnog nervnog sistema, Waldenstram-ovu makroglobulinemiju, meduloblastom, melanom, intraokularni melanom (oko), karcinom Merkel-ovih ćelija, maligni mezoteliom, mezoteliom, metastatski skvamozni rak vrata, rak usta, rak jezika, sindrom multiple endokrine neoplazije,mycosis fungoides,mijelodisplastični sindromi, mijelodisplastične/mijeloproliferativne bolesti, hroničnu mijelogenu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, multipli mijelom, hronične mijeloproliferativne poremećaje, nazofaringealni rak, neuroblastom, oralni rak, rak oralne šupljine, orofaringealni rak, rak jajnika, epitelijalni rak jajnika, tumor jajnika sa malim malignim potencijalom, rak pankreasa, rak Langerhansovih ostrvca pankreasa, rak paranazalnog sinusa i nosne šupljine, rak paraštitne žlezde, rak penisa, rak grla, feohromocitom, pineoblastom i supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, tumor hipofize, neoplazma/multipli mijelom ćelija plazme, pleuropulmonalni blastom, rak prostate, rak rektuma, rak bubrežnog pelvisa i uretera, rak tranzicionih ćelija, retinoblastom, rabdomiosarkom, rak pljuvačnih žlezda, tumore iz Ewing-porodice sarkoma, Kaposi-ev sarkom, sarkom mekog tkiva, rak materice, sarkom materice, rak kože (koji nije melanom), rak kože (melanom), karcinom Merkel-ovih ćelija kože, rak tankog creva, sarkom mekog tkiva, karcinom skvamoznih ćelija, rak želuca, supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, rak testisa, rak grla, timom, timom i karcinom timusa, rak štitaste žlezde, rak tranzicionih ćelija bubrežnog pelvisa i uretera i drugih mokraćnih organa, gestacioni trofoblastni tumor, rak uretre, rak tela materice, sarkom materice, rak tela materice, rak vaginalne, rak vulve, i Wilm-ov tumor.

"Ćelijski proliferativni poremećaj hematološkog sistema" je ćelijski proliferativni poremećaj koji uključuje ćelije hematološkog sistema. Ćelijski proliferativni poremećaj hematološkog sistema obuhvata limfom, leukemiju, mijeloidne neoplazme, neoplazme mastocita, mijelodisplaziju, benignu monoklonsku gamopatiju, limfomatoidnu granulomatozu, limfomatoidnu papulozu, policitemija vera, hroničnu mijelocitnu leukemiju, agnogenu mijeloidnu metaplaziju, i esencijalnu trombocitemiju. Ćelijski proliferativni poremećaj hematološkog sistema obuhvata hiperplaziju, displaziju, i metaplaziju ćelija hematološkog

sistema. U jednom aspektu, kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman raka koji je izabran iz grupe koja obuhvata hematološki rak iz ovoga pronalaska ili proliferativni poremećaj hematološke ćelije iz ovoga pronalaska, ili se pomenuta koriste da se identifikuju prikladni kandidati za takve svrhe. Hematološki rak iz ovoga pronalaska obuhvata multipli mijelom, limfom (uključujući Hodgkin-ov limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, mladenačke limfome, i limfome limfocitnog i kutanog porekla), leukemiju (uključujući mladenačku leukemiju, leukemiju vlasastih ćelija, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijelocitnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiji, i leukemiju mastocita), mijeloidne neoplazme i neoplazme mastocita.

"Ćelijski proliferativni poremećaj pluća" je ćelijski proliferativni poremećaj koji uključuje ćelije pluća. Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije pluća. Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju rak pluća, pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja pluća, benigni rast ili lezije pluća, i maligni rast ili lezije pluća, i metastatske lezije u tkivu i organima tela koji nisu pluća. U jednom aspektu, kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretiranje raka pluća ili ćelijskih proliferativnih poremećaja pluća, ili pomenute mogu da se koriste za identifikovanje prikladnih kandidata za takve svrhe. Rak pluća obuhvata sve forme raka pluća. Rak pluća obuhvata maligne plućne neoplazme, karcinomin situ,tipične karcinoidne tumore, i atipične karcinoidne tumore. Rak pluća obuhvata sitnoćelijski karcinom pluća ("SCLC"), nesitnoćelijski karcinom pluća ("NSCLC"), karcinom skvamoznih ćelija, adenokarcinom, sitnoćelijski karcinom, nesitnoćelijski karcinom, karcinom adenoskvamoznih ćelija, i mezoteliom. Rak pluća obuhvata "karcinom ožiljka", bronhioalveolarni karcinom, karcinom gigantskih ćelija, karcinom ćelija vezivnog tkiva, i karcinom velikih neuroendokrinih ćelija. Rak pluća obuhvata plućne neoplazme koje su histološki i ultrastrukturno heterogene (na primer, mešani tipovi ćelija).

Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju plućne ćelije. Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju rak pluća, pre-tumorska stanja pluća. Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju hiperplaziju, metaplaziju, i displaziju pluća. Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju hiperplaziju indukovanu azbestozom, skvamoznu metaplaziju, i benignu reaktivnu mezotelijalnu metaplaziju. Ćelijski proliferativni poremećaji pluća obuhvataju zamenu epitala

debelog creva sa stratifikovanim skvamoznim epitelom, i mukozalnu displaziju. Osobe koje su izložene udisanju štenih agenasa iz okoline poput dima cigareta i azbesta imaju povećani rizik od razvijanja ćelijskih proliferativnih poremećaja pluća. Prethodne plućne bolesti koje mogu da prethode razvoj ćelijskih proliferativnih poremećaja pluća obuhvataju hroničnu intersticijalnu bolest pluća, nekrotizirajuću pulmonalnu bolest, sklerodermu, reumatoidnu bolest, sarkoidozu, intersticijalni pneumonitis, tuberkulozu, ponovljene pneumonije, idiopatsku pulmonalnu fibrozu, granulomat, azbestozu, fibrozni alveolitis, i Hodgkin-ovu bolest.

"Ćelijski proliferativni poremećaj debelog creva" je ćelijski proliferativni poremećaj koji uključuje ćelije debelog creva. Preferirano, ćelijski proliferativni poremećaj debelog creva je rak debelog creva. U jednom aspektu, kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman raka debelog creva ili ćelijskih proliferativnih poremećaja debelog creva, ili pomenute mogu da se koriste za identifikovanje prikladnih kandidata za takve svrhe. Rak debelog creva obuhvata sve forme raka debelog creva. Rak debelog creva obuhvata sporadične i nasledne tumore debelog creva. Rak debelog creva obuhvata maligne neoplazme debelog creva, karcinomin situ,tipične karcinoidne tumore, i atipične karcinoidne tumore. Rak debelog creva obuhvata adenokarcinom, karcinom skvamoznih ćelija, i karcinom adenoskvamoznih ćelija. Rak debelog creva može da bude povezan sa naslednim sindromom koji je izabran iz grupe koja obuhvata nasledni nepolipozni kolorektalni rak, familijarnu adenomatoznu polipozu, Gardner-ov sindrom, Peutz-Jeghers-ov sindrom, Turcot-ov sindrom i mladenačku polipozu. Rak debelog creva može da bude uzrokovan sa naslednim sindromom koji je izabran iz grupe koja obuhvata nasledni nepolipozni kolorektalni rak, familijarnu adenomatoznu polipozu, Gardner-ov sindrom, Peutz-Jeghers-ov sindrom, Turcot-ov sindrom i mladenačku polipozu.

Ćelijski proliferativni poremećaji debelog creva obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije debelog creva. Ćelijski proliferativni poremećaji debelog creva obuhvataju rak debelog creva, pre-tumorska stanja debelog creva, adenomatozne polipe debelog creva i metahrone lezije debelog creva. Ćelijski proliferativni poremećaj debelog creva obuhvata adenom. Ćelijski proliferativni poremećaji debelog creva mogu da budu karakterizovani sa hiperplazijom, metaplazijom, i displazijom debelog creva. Prethodne bolesti debelog creva koje mogu da dovedu do pojave ćelijskih proliferativnih poremećaja debelog creva obuhvataju raniji rak debelog creva. Postojeće bolesti koje mogu da dovedu do pojave ćelijskih proliferativnih poremećaja debelog creva obuhvataju Crohn-ovu bolest i ulcerativni

kolitis. Ćelijski proliferativni poremećaj debelog creva može da bude povezan sa mutacijom gena koji je izabran iz grupe koja obuhvata p53,ras, FAPiDCC.Osoba može da pokazuje povećani rizik razvijanja ćelijskog proliferativnog poremećaja debelog creva zbog prisustva neke mutacije u genu koji je izabran iz grupe koja obuhvata p53,ras, FAPiDCC.

"Ćelijski proliferativni poremećaj pankreasa" je ćelijski proliferativni poremećaj koji se odnosi na ćelije pankreasa. Ćelijski proliferativni poremećaji pankreasa obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije pankreasa. Ćelijski proliferativni poremećaji pankreasa obuhvataju rak pankreasa, pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja pankreasa, hiperplaziju pankreasa, disaplaziju pankreasa, benigni rast ili lezije u pankreasu, i maligni rast ili lezije pankreasa, i metastatske lezije u tkivima i organima tela koji nisu pankreas. Rak pankreasa obuhvata sve forme raka pankreasa. Rak pankreasa obuhvata duktalni adenokarcinom, adenoskvamozni karcinom, pleomorfni karcinom gigantskih ćelija, adenokarcinom, karcinom gigantskih ćelija koje sliče osteoklastima, cistadenokarcinom sluzokože, acinarni karcinom, karcinom neklasifikovanih velikih ćelija, karcinom malih ćelija, pankreatoblastom, papilularnu neoplazmu, cistadenom sluzokože, papilarnu cističnu neoplazmu, i serozni cistadenom. Rak pankreasa takođe obuhvata neoplazme pankreasa koje su histološki i ultrastrukturno heterogene (na primer, mešani tipovi ćelija).

"Ćelijski proliferativni poremećaj prostate" je ćelijski proliferativni poremećaj koji se odnosi na ćelije prostate. Ćelijski proliferativni poremećaji prostate obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije prostate. Ćelijski proliferativni poremećaji prostate obuhvataju rak prostate, pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja prostate, benigni rast ili lezije prostate, i maligni rast ili lezije prostate, i metastatske lezije u tkivima i organima u telu koji nisu prostata. Ćelijski proliferativni poremećaji prostate obuhvataju hiperplaziju, metaplaziju, i displaziju prostate.

"Ćelijski proliferativni poremećaj kože" je ćelijski proliferativni poremećaj koji obuhvata ćelije kože. Ćelijski proliferativni poremećaji kože obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije kože. Ćelijski proliferativni poremećaji kože obuhvataju pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja kože, benigni rast ili lezije kože, melanom, maligni melanom i druge tipove malignog rast ili lezija kože, i metastatske lezije u tkivima i organima u telu koji nisu koža. Ćelijski proliferativni poremećaji kože obuhvataju hiperplaziju, metaplaziju, i displaziju kože.

"Ćelijski proliferativni poremećaj jajnika" je ćelijski proliferativni poremećaj koji zahvata ćelije jajnika. Ćelijski proliferativni poremećaji jajnika obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije jajnika. Ćelijski proliferativni poremećaji jajnika obuhvataju pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja jajnika, benigni rast ili lezije jajnika, rak jajnika, maligni rast ili lezije jajnika, i metastatske lezije u tkivima i organima u telu koji nisu jajnici. Ćelijski proliferativni poremećaji kože obuhvataju hiperplaziju, metaplaziju, i displaziju ćelija jajnika.

"Ćelijski proliferativni poremećaj dojke" je ćelijski proliferativni poremećaj koji zahvata ćelije dojke. Ćelijski proliferativni poremećaji dojke obuhvataju sve forme ćelijskih proliferativnih poremećaja koji zahvataju ćelije dojke. Ćelijski proliferativni poremećaji dojke obuhvataju rak dojke, pre-kancerozna ili pre-tumorska stanja dojke, benigni rast ili lezije dojke, i maligni rast ili lezije dojke, i metastatske lezije u tkivima i organima u telu koji nisu dojka. Ćelijski proliferativni poremećaji dojke obuhvataju hiperplaziju, metaplaziju, i displaziju dojke.

Ćelijski proliferativni poremećaj dojke može da bude pre-tumorsko stanje dojke. Kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman pre-tumorskog stanja dojke. Pre-tumorska stanja dojke obuhvataju atipičnu hiperplaziju dojke, duktalni karcinomin situ(DCIS), intraduktalni karcinom, lobularni karcinomin situ(LCIS), lobularnu neoplaziju, i rast ili leziju dojke u fazi 0 ili stanju 0( na primer,rak dojke u fazi 0 ili stanju 0, ili karcinomin situ).Pre-tumorska stanja dojke mogu da se klasifikuju prema TNM klasifikacionoj shemi koja je prihvaćena od strane Američkog združenog komiteta za rak( American Joint Committee on Cancer - AJCC),gde primarnom tumoru (T) se pripisuje faza TO ili Tis; a regionalnim limfnim čvorovima (N) faza NO; dok udaljenim metastazama (M) faza MO.

Ćelijski proliferativni poremećaj dojke je rak dojke. U jednom aspektu, kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman raka dojke, ili da se koriste za identifikovanje prikladnih kandidata za takve svrhe. Rak dojke obuhvata sve forme raka dojke. Rak dojke obuhvata primarne epitelne tumore dojke. Rak dojke obuhvata tumore u kojima je dojka uključena preko drugih tumora poput limfoma, sarkoma ili melanoma. Rak dojke obuhvata karcinom dojke, duktalni karcinom dojke, lobularni karcinom dojke, nediferencirani karcinom dojke, filoidni tumor dojke, angiosarkom dojke, i primarni limfom dojke. Rak dojke obuhvata tumore dojke u fazi I, II, IIIA, IIIB, IIIC i IV. Duktalni karcinom dojke obuhvata invazioni

karcinom, invazioni karcinomin situsa predominantnom intraduktalnom komponentom, upalni rak dojke, i duktalni karcinom dojke sa histološkim tipom koji je izabran iz grupe koja se sastoji od pojmova miteser, mucinozno (koloidno), medularno, medularno sa limfocitnim infiltratom, papilamo, tvrdo sa vezivnim tkivom, i tubularno. Lobularni karcinom dojke obuhvata invazioni lobularni karcinom sa predominantnomin situkomponentom, invazioni lobularni karcinom, i infiltrirani lobularni karcinom. Rak dojke obuhvata Paget-ovu bolest, Paget-ovu bolest sa intraduktalnim karcinomom, i Paget-ovu bolest sa invazionim duktalnim karcinomom. Rak dojke obuhvata neoplazme dojke koje su histološki i ultrastrukturno heterogene( naprimer,mešani tipovi ćelija).

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman raka dojke, ili mogu da se koriste za identifikovanje prikladnih kandidata za takve svrhe. Rak dojke koji može da se tretira obuhvata familijarni rak dojke. Rak dojke koji može da se tretira obuhvata sporadični rak dojke. Rak dojke koji može da se tretira može da se pojavi u kod muškaraca. Rak dojke koji može da se tretira može da se pojavi kod žena. Rak dojke koji može da se tretira može da se pojavi kod žena pre menopauze ili nakon menopauze. Rak dojke koji može da se tretira može da se pojavi u subjektu koji ima 30 ili više godina, ili u subjektu koji je mađi od 30 godina. Rak dojke koji može da se tretira može da se pojavi u subjektu koji ima 50 ili više godina, ili u subjektu koji je mlađi od 50 godina. Rak dojke koji može da se tretira može da se pojavi u subjektu koji ima 70 ili više godina, ili u subjektu koji je mlađi od 70 godina.

Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao familijarni tip tumora ili tip tumora kod kojeg se pojavila spontana mutacija u genimaBRCA1, BRCA2,ili p53. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao takav koji sadrži amplifikaciju genaHER2lneu,da prekomerno eksprimira genHER2lneu,ili daje nivo ekspresije genaHERlIneunizak, intermedijaran ili visok. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao takav koji sadrži marker koji je izabran iz grupe koja obuhvata estrogeni receptor (ER), progesteronski receptor (PR), receptor-2 za ljudski epidermalni faktor rasta, Ki-67, CA15-3, CA 27-29, i c-Met. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao ER-nepoznato, ER-bogat ili ER-siromašan. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao ER-negativan ili ER-pozitivan. ER-tipiziranje raka dojke može da se provede primenom reproducibilnih metoda. ER-tipiziranje raka dojke može da se provede primenom postupka koji je opisan u literaturi: Onkologie 27: 175-179 (2004). Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao PR-nepoznato, PR-bogat, ili PR-siromašan. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao PR-negativan ili PR-pozitivan. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao receptor-pozitivan ili receptor-negativan. Rak dojke koji može da se tretira može da se genotipizira kao takav kod kojeg su povećani nivoi CA 15-3, ili CA 27-29, ili oba u krvi.

Rak dojke koji može da se tretira obuhvata lokalizovani tumor dojke. Rak dojke koji može da se tretira obuhvata tumor dojke kod kojeg je biopsija prvog( sentinel)limfnog čvora (SLN) negativna. Rak dojke koji može da se tretira obuhvata tumor dojke kod kojeg je biopsija prvog limfnog čvora (SLN) pozitivna. Rak dojke koji može da se tretira obuhvata tumor dojke kod kojeg je jedan ili više aksilarnih limfnih čvorova pozitivno, pri čemu su pomenuti aksilarni limfni čvorovi klasifikovani primenom bilo kojeg prikladnog postupka. Rak dojke koji može da se tretira obuhvata tumor dojke koji je genotipiziran kao takav koji ima negativni nodalni status( na primer,čvor-negativan) ili pozitivni nodalni status( na primer,čvor-pozitivan). Rak dojke koji može da se tretira obuhvata tumor dojke koji je metastazirao na druge lokacije u telu. Rak dojke koji može da se tretira može da bude klasifikovan kao takav koji je metastazirao na lokaciju koja je izabrana iz grupe koja obuhvata kosti, pluća, jetra, ili mozak. Rak dojke koji može da se tretira može da bude klasifikovan na osnovu karakteristika izabranih iz grupe koja obuhvata termine metastatski, lokalizovani, regionalni, lokalno-regionalni, lokalno napredovao, udaljeni, multicentričan, bilateralan, ipsilateralan, kontralateralan, novo dijagnosticirani, povratni, i neoperabilan.

Jedinjenje iz ovoga pronalaska može da se koristi za tretman ili sprečavanje ćelijskog proliferativnog poremećaja dojke, ili za tretman ili sprečavanje raka dojke, u subjektu koji pokazuje povećani rizik razvijanja raka dojke u odnosu na opštu populaciju, ili pomenuto može da se koristi za identifikovanje prikladnih kandidata za takve svrhe. Subjekt sa povećanim rizikom razvijanja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je žena sa familijarnom povesti ili ličnom povesti raka dojke. Subjekt sa povećanim rizikom razvijanja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je žena koja je dobila spontanu mutaciju ili u germinativnoj liniji nosi mutaciju u genuBRCA1iliBRCA2,ili u oba. Subjekt sa povećanim rizikom razvijanja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je žena sa familijarnom povesti raka dojke ili koja je dobila spontanu mutaciju ili u germinativnoj liniji nosi mutaciju u genuBRCA1iliBRCA2,ili u oba. Subjekt sa povećanim rizikom razvijanja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je žena koja je starija od 30 godina, starija od 40 godina, starija od 50 godina, starija od 60 godina, starija od 70 godina, starija od 80 godina, ili starija od 90 godina. Subjekt sa povećanim rizikom razvijanja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je neki subjekt sa atipičnom hiperplazijom dojke, duktalnim karcinomomin situ(DCIS), intraduktalnim karcinomom, lobularnim karcinomomin situ(LCIS), lobularnom neoplazijom, ili rastom ili lezijom u dojci u fazi 0( na primer,rak dojke u fazi 0 ili stepenu 0, ili karcinomin situ).

Rak dojke koji može da se tretira može da se histološki klasifikuje primenom Scarff-Bloom-Richardson-ovog sistema, pri čemu tumoru dojke se pripisuje bod za mitotski indeks od 1, 2, ili 3; bod za pleomorfizam jedara od 1, 2, ili 3; bod za formiranja tubula od 1, 2, ili 3; pri čemu se ukupni Scarff-Bloom-Richardson rezultat (bod) kreće između 3 i 9. Rak dojke koji može da se tretira može da se klasifikuje primenom sistema Međunarodnog konsenzus panela za tretman raka dojke( International Consensus Panel on the Treatment of Breast Cancer)tako da se koriste stepeni iz grupe koja obuhvata stepenl, stepen 1-2, stepen 2, stepen 2-3, ili stepen 3.

U jednoj izvedbi, ovde je opisan postupak za tretiranje raka dojke koji obuhvata administriranje nekom subjektu u potrebi efektivne količine hidrobromida Jedinjenja

U drugoj izvedbi, ovde je opisan postupak za tretiranje raka dojke koji obuhvata administriranje nekom subjektu u potrebi efektivne količine Polimorfa A.

Rak koji može da se tretira može da se klasifikuje primenom TNM klasifikacionog sistema Američkog združenog komiteta za rak( American Joint Committee on Cancer - AJCC),pri čemu se tumoru (T) pripisuje faza TX, TI, Tlmic, Tla, Tlb, Tlc, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c, ili T4d; a regionalnim limfnim čvorovima (N) faza NX, NO, NI, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b, ili N3c; dok udaljena metastaza (M) može da ima fazu MX, M0, ili Ml. Rak koji može da se tretira može da bude klasifikovan primenom klasifikacionog sistema Američkog združenog komiteta za rak (AJCC) tako da mu se pripiše Faza I, Faza IIA, Faza IIB, Faza IIIA, Faza IIIB, Faza IIIC, ili Faza IV. Rak koji može da se tretira može da bude klasifikovan primenom klasifikacionog sistema AJCC tako da mu se pripiše Stepen GX (na primer, stepen ne može da se odredi), Stepen 1, Stepen 2, Stepen 3, ili Stepen 4. Rak koji može da se tretira može da bude klasifikovan primenom patološkog klasifikacionog sistema (pN) AJCC kao pNX, pNO, PNO (I-), PNO (I+), PNO (mol-), PNO (mol+), PN1, PNl(mi), PNla, PNlb, PNlc, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b, ili pN3c.

Rak koji može da se tretira obuhvata tumor za kojeg je određeno da je manji ili jednak oko 2 cm u dijametru. Rak koji može da se tretira obuhvata tumor za kojeg je utvrđeno daje velik od oko 2 do oko 5 cm u dijametru. Rakkoji može da se tretira obuhvata tumor za kojeg je utvrđeno daje veći ili jednak oko 3 cm u dijametru. Rak koji može da se tretira obuhvata tumor za kojeg je utvrđeno daje veći od 5 cm u dijametru. Rak koji može da se tretira, mikroskopski može da bude klasifikovan kao dobro diferenciran, umereno diferenciran, slabo diferenciran, ili nediferenciran. Rak koji može da se tretira, mikroskopski može da bude klasifikovan tako da se u obzir uzme mitotski indeks( naprimer,količina ćelija koje se dele) ili pleomorfizam jedara( na primer,promene u ćelijama). Rak koji može da se tretira, mikroskopski može da bude klasifikovan kao takav koji sadrži delove nekroze( na primer,delovi u kojima ćelije umiru ili su degenerirane). Rak koji može da se tretira može da bude klasifikovan kao takav koji ima abnormalan kariotip, koji ima abnormalan broj hromosoma, ili koji ima jedan ili više hromosoma koji ne izgledaju normalno. Rak koji može da se tretira može da se klasifikuje kao takav koji je aneuploidan, triploidan, tetraploidan, ili takav koji ima promenjenu ploidiju. Rak koji može da se tretira može da bude klasifikovan kao takav koji ima hromosomsku translokaciju, ili deleciju ili duplikaciju celog hromosoma, ili koji sadrži region sa delecijom, duplikacijom ili amplifikacijom u nekom delu nekog hromosoma.

Rak koji može da se tretira može da se proceni uz pomoć DNA citometrije, protočne citometrije, ili /mage-citometrije. Rak koji može da se tretira može da se klasifikuje kao da sadrži 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% ćelija koje se nalaze u fazi sinteze DNA (na primer, u S-fazi ćelijske deobe). Rak koji može da se tretira može da se klasifikuje kao takav koji sadrži malu frakciju ćelija u S-fazi ili veliku frakciju ćelija u S-fazi.

Kao šta se ovde koristi, "normalna ćelija" je ćelija koja ne može da bude klasifikovana kao da je deo "ćelijskog proliferativnog poremećaja". Normalna ćelija ne pokazuje neregulisan ili abnormalan rast, ili oba, koji mogu da dovedu do razvoja nekog neželjenog stanja ili bolesti. Preferirano, u normalnoj ćeliji mehanizmi u kontrolnim tačkama ćelijskog ciklusa funkcioniraju normalno.

Kao šta se ovde koristi, "kontaktiranje ćelije" se odnosi na stanje tokom kojeg neko jedinjenje ili kompozicija materije dolazi u direktan kontakt sa nekom ćelijom, ili je dovoljno blizu da indukuje neki željeni biološki efekt u pomenutoj ćeliji.

Kao šta se ovde koristi, "jedinjenje-kandidat" se odnosi na neko jedinjenje iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) koje je bilo ili će se testirati u jednom ili višein vitroiliin vivobioloških ogleda, sa ciljem da se utvrdi da li pomenuto jedinjenje može da potakne željeni biološki ili medicinski odgovor u nekoj ćeliji, tkivu, sistemu, životinji ili čoveku koji su predviđeni od starne istraživača ili kliničara. Jedinjenje-kandidat je neko jedinjenje iz ovoga pronalaska. Pomenuti biološki ili medicinski odgovor može da bude pomenuti tretman raka. Pomenuti biološki ili medicinski odgovor može da bude tretman ili prevencija ćelijskog proliferativnog poremećaja. Pomenuti biološki odgovor ili efekt takođe može da obuhvata neku promenu u proliferaciji ili rastu ćelija koji nastupain vitroili u nekom životinjskom modelu, kao i ostale biološke promene koje mogu da se primetein vitro. In vitroiliin vivobiološki ogledi obuhvataju, ali bez ograničenja, oglede encimske aktivnosti, oglede pomaka elektroforetske pokretljivosti, oglede sa reporter-genom,in vitrooglede ćelijske vijabilnosti, i oglede koji su ovde opisani.

Kao šta se ovde koristi, "monoterapija" se odnosi na administriranje pojedinačnog aktivnog ili terapeutskog jedinjenja nekom subjektu u potrebi. Preferirano, monoterapija obuhvata administriranje neke terapeutski efektivne količine aktivnog jedinjenja. Na primer, to je monoterapija raka sa jednim od jedinjenja iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) nekom subjektu kod kojeg se treba tretirati rak. Alternativa monoterapiji je kombinovana terapija, kod koje se administrira kombinacija više aktivnih jedinjenja. Preferirano, svaka komponenta pomenute kombinovane terapije se daje u svojoj terapeutski efektivnoj količini. U jednom aspektu, monoterapija sa jedinjenjem iz ovoga pronalaska je efektivni]a od kombinovane terapija šta se tiče indukovanja željenog biološkog efekta.

Kao šta se ovde koristi, "tretiranje" ili "tretman" opisuje medicinsku brigu o pacijentu sa ciljem spravljanja ili borbom sa nekom bolesti, stanjem, ili poremećajem i obuhvata administriranje nekog jedinjenja iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) sa ciljem da se ublaže simptome ili komplikacije bolesti, stanja ili poremećaja, ili da se eliminiše pomenuta bolest, stanje ili poremećaj. Termin "tretman" takođe obuhvata tretman ćelija uin vitrouslovima ili u životinjskom modelu.

Jedinjenje iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) takođe može da se koristi sa ciljem da se spreči neka bolest, stanje ili poremećaj, ili da se identifikuju prikladni kandidati za takve svrhe. Kao šta se ovde koristi, "sprečavanje" ili "prevencija" opisuje ublažavanje ili sprečavanje pojave simptoma ili komplikacija pomenute bolesti, stanja ili poremećaja.

Kao šta se ovde koristi, termin "ublaži" je namenjen da opisuje proces uz pomoć kojeg se smanjuje ozbiljnost (snaga) nekog znaka ili simptoma nekog poremećaja. Važno, neki znak ili simptom može da se ublaži bez da se eliminiše. U jednoj preferiranoj izvedbi, administriranje farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska dovodi do eliminisanja nekog znaka ili simptom, ali međutim, eliminacija nije obavezna. Očekuje se da efektivne doze smanje ozbiljnost nekog znaka ili simptoma. Na primer, znak ili simptom nekog poremećaja poput raka, koji može da se pojavi na više lokacija, je ublažen ako se ozbiljnost pomenutog tumora smanji barem na jednoj od pomenutih više lokacija.

Kao šta se ovde koristi, termin "ozbiljnost" je namenjen da opisuje potencijal tumora da se transformiše od pre-tumorskog, ili benignog, stanja u neko maligno stanje. Alternativno, ili dodatno, ozbiljnost treba da opisuje fazu tumora, na primer, u skladu sa TNM-sistemom (koji je prihvaćen od starne Međunarodne unije protiv raka( International Union Against Cancer - UICC)i Američkog komiteta za rak( American Joint Committee on Cancer - AJCC))ili u skladu sa nekim drugim postupcima koji su poznati stanju tehnike. Faza raka se odnosi na obim ili ozbiljnost tumora, na bazi faktora poput lokacije primarnog tumora, veličine tumora, broju tumora, i zahvaćenosti limfnih čvorova (širenje raka na limfne čvorove). Alternativno, ili dodatno, ozbiljnost treba da opisuje stepen tumora u skladu sa postupcima koji su poznati stanju tehnike (vidi,National Cancer Institute,www. cancer. gov). Stepen tumora je sistem koji se koristi sa ciljem da se klasifikuju ćelije raka na bazi toga koliko izgledaju abnormalno pod mikroskopom i koliko je verovatno da tumor naraste i brzo se raširi. Mnogi faktori se uzimaju u obzir kada se određuje stepen tumora, uključujući strukturu i obrazac rasta ćelija. Specifični faktori koji se koriste da se odredi stepen tumora variraju kod svakog tipa raka. Ozbiljnost takođe opisuje i histološki stepen, koji se takođe naziva diferencijacija, a koji se odnosi na to koliko tumorske ćelije sliče normalnim ćelijama iz istog tipa tkiva (vidi,National Cancer Institute,www. cancer. gov). Nadalje, ozbiljnost opisuje stepen jedra, koji se odnosi na veličinu i oblik jedara u tumorskim ćelijama i na procenat tumorskih ćelija koje se dele (vidi,National Cancer Institute,www. cancer. gov).

In drugom aspektu ovoga pronalaska, ozbiljnost opisuje nivo sekrecije faktora rasta od strane tumora, da li degradira ekstracelularnu matricu, postaje vaskularizovan, gubi sposobnost adhezije prema susednim tkivima, ili metastazira. Štaviše, ozbiljnost opisuje broj lokacija na koje je primarni tumor metastazirao. Konačno, ozbiljnost obuhvata složenost tretiranja tumora koji pripadaju raznim tipovima raka i se nalaze na raznim lokacijama. Na primer, neoperabilni tumori, oni tipovi raka koji imaju veći pristup brojnim telesnim sistemima (hematološki i imunološki tumori), i oni koji su najotporniji na tradicionalne tipove tretmana se smatraju najozbiljnijima. U takvim situacijama, produženje preživljavanja subjekta i/ili smanjivanje boli, smanjivanje proporcije tumorskih ćelija ili njihovo ograničavanje na jedan sistem, i poboljšanje (spuštanje na nižu razinu) faze tumora/stepena tumora/histološkog stepena/stepena jedra se smatraju ublažavanje znakova ili simptoma pomenutog raka.

Kao šta se ovde koristi, termin "simptom" se definiše kao indikacija bolesti, poremećaja, ozlede, ili da jednostavno nešto nije u redu u telu. Simptome oseća ili primećuje osoba koja ih proživljava, ali pomenuti ne mora da budu lako primetljivi ostalima. Ostali se ovde definišu kao osobe koje nisu zdravstveni radnici.

Kao šta se ovde koristi, termin "znak" se takođe definiše kao indikacija da nešto nije u redu u telu. No, znakovi se definišu kao fenomeni koji mogu da budu primećeni od strane doktora, medicinske sestre ili nekog drugog zdravstvenog radnika.

Rak je grupa bolesti koje mogu da uzrokuju gotovo bilo kakav znak ili simptom. Znakovi i simptomi zavise o tome gde se rak nalazi, o njegovo veličini, i koliko utiče na susedne organe ili strukture. Ako se rak širi (metastazira), tada simptomi mogu da se pojave u različitim delovima tela.

Kako rak raste, počinje da gura susedne organe, krvne žile, i nerve. Ovakav pritisak uzrokuje neke od znakova i simptoma raka. Ako se rak nalazi u nekom kritičnom delu, na primer u određenim delovima mozga, čak i najmanji tumor može da uzrokuje rane simptome.

No, ponekad tumori se pojavljuju na mestima gde ne uzrokuju nikakve simptome dok ne narastu veoma veliki. Tumori pankreasa, na primer, obično ne narastu dovoljno veliki da ih se oseti sa spoljne strane tela. Neki tumori pankreasa ne uzrokuju simptome sve dok ne počnu rasti oko susednih nerava (koje uzrokuje bol u leđima). Drugi rastu oko žučnog kanala, koje blokira protok žući i dovodi do požutivanja kože - stanje koje poznato kao žutica. Do trenutka kada je rak pankreasa počeo da uzrokuje pomenute znakove ili simptome, obično je dosegao naprednu fazu.

Rak takođe može da uzrokuje simptome poput groznice, umora, ili gubitka težine. To može da nastupi zbog toga šta ćelije raka koriste puno telesne energije ili oslobađaju supstance koje menjaju telesni metabolizam. Sa druge strane, rak može da uzrokuje da imuno-sistem reaguje tako da dovede do pojave pomenutih simptoma.

Ponekad, ćelije raka oslobađaju supstancije u krvotok koje uzrokuju simptome za koje se misli da nisu rezultat pojave tumora. Na primer, neki tipovi raka pankreasa mogu da oslobode supstancije koje uzrokuju da se krvni ugrušci razvijaju u venama nogu. Neki tipovi raka pluća proizvode supstancije slične hormonima koje utiču na nivo kalcijuma u krvi, koje utiče na nerve i mišiće i uzrokuje slabost i vrtoglavicu.

Rak dovodi do nekoliko opštih znakova ili simptoma koji se javljaju kada su prisutni brojni pod-tipovi tumorskih ćelija. Najveći deo ljudi koji imaju rak će izgubiti na težini u nekom trenutku njihove bolesti. Neobjašnjeni (nenamerni) gubitak 10 funti (4.5 kg) ili više može da bude prvi znak raka, posebno kod raznih tipova raka pankreasa, želuca, jednjaka, ili pluća.

Groznica je veoma uobičajena kod raka, ali češće je prisutna kada je bolest uznapredovala. Gotovo svi pacijenti koji imaju rak dobiju groznicu u nekom trenutku tokom bolesti, posebno ako sam rak ili njegov tretman utiče na imuno-sistem otežavajući telu da se bori protiv infekcije. Rede, groznica može da bude rani znak raka, poput na primer kod leukemije ili limfoma.

Umor može da bude važan simptom kako rak napreduje. Međutim, može da se dogodi rano kod tumora poput leukemije, ili ako rak uzrokuje stalan gubitak krvi, kao kod nekih tipova raka debelog creva ili želuca.

Bol može da bude rani simptom kod nekih tipova raka poput raka kostiju ili testisa. No, najčešće bolje simptom uznapredovale bolesti.

Zajedno sa tumorima kože (vidi sledeći paragraf), neki interni tumori mogu da uzrokuju kožne znakove koji mogu da se vide. Ove promene obuhvataju kožu koja izgleda tamnije (hiper-pigmentacija), žuto (žutica), ili ima crvenilo (ertem); svrab; ili prekomerni rast kose.

Alternativno, ili dodatno, pod-tipovi raka pokazuju svoje znakove ili simptome. Promene navike pražnjenja ili funkcioniranja creva mogu da upućuju na rak. Dugotrajna konstipacija, proliv, ili promena veličine stolice može da bude znak raka debelog creva. Bol kod mokrenja, krv u urinu, ili promena funkcije bešike (poput češće ili rede mokrenje) mogu da budu povezani sa rakom bešike ili prostate.

Promene stanja kože ili nova stanja kože mogu da upućuju na rak. Tumori kože mogu da krvare i da izgledaju poput ranica koje ne mogu da zacele. Dugotrajne ranice (afte) u ustima može da budu neki oralni rak, posebno kod pacijenata koji puše, žvaću duvan, ili često piju alkohol. Ranice na penisu ili vagini mogu da budu znakovi neke infekcije, ali i rani znakovi raka.

Neuobičajeno krvarenje ili pražnjenje može da upućuje na rak. Neuobičajeno krvarenje može da se dogodi kod ranog, ali i kod naprednog tumora. Krv u ispljuvku može da bude znak raka pluća. Krv u stolici (ili tamna ili crna stolica) može da bude znak raka debelog creva ili rektuma. Rak vrata ili endometrijuma (tela) materice može da uzrokuje vaginalno krvarenje. Krv u urinu može da bude znak raka bešike ili bubrega. Curenje krvi iz bradavice može da bude znak raka dojke.

Zadebljanja ili grumeni u dojci ili drugih delova tela mogu da upućuju na prisustvo raka. Mnogu tumori mogu da se opipaju preko kože, uglavnom tumori dojke, testisa, limfnih čvorova (žlezda), i mekih tkiva tela. Zadebljanja ili grumeni mogu da bude rani ili kasni znak rak. Bilo koje zadebljanje ili grumen može da upućuje na rak, posebno ako se radi o novoj formaciji ili o takvoj koja se povećava.

Loša probava ili problemi sa gutanjem mogu da upućuju na rak. Dok ovi simptomi uobičajeno imaju i druge uzroke, loša probava ili problemi sa gutanjem mogu da budu znak tumora jednjaka, želuca, ili grla.

Novije promene na bradavicama ili belezima na koži mogu da upućuju na rak. Bilo koja bradavica, madež, ili pega koja menja boju, veličinu, ili oblik, ili gubi oštre jasne ivice upućuje na potencijalni razvoj raka. Na primer, kožne lezije mogu da budu melanom.

Ustrajni kašalj ili promuklost može da upućuje na rak. Kašalj koji ne prestaje može da bude znak raka pluća. Promuklost može da bude znak raka grkljana ili štitaste žlezde.

Dok su iznad navedeni znakovi i simptomi česti znakovi kod raka, postoje i mnogu drugi koji nisu tako česti (ovde nisu nabrojani). Međutim, sve znakove i simptome raka, koji su poznati struci, su predviđeni i obuhvaćeni sa ovim pronalaskom.

Tretiranje raka može da dovede do smanjivanja veličine tumora. Smanjivanje veličine tumora može takođe da se označi "povlačenje tumora". Preferirano, nakon tretmana, veličina tumora se smanjuje za 5% ili više od njegove veličine pre tretmana; bolje, tumorska veličina se smanjuje za 10% ili više; bolje, za 20% ili više; bolje, za 30% ili više; bolje, za 40% ili više; još bolje, za 50% ili više; a najbolje, za više od 75% ili više. Veličina tumora može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Veličina tumora može da se izmeri kao dijametar tumora.

Tretiranje raka može da dovede do smanjivanja volumena tumora. Preferirano, nakon tretmana, tumorski volumen se smanjuje za 5% ili više u odnosu na njegov volumen pre tretmana; bolje, tumorski volumen se smanjuje za 10% ili više; bolje, za 20% ili više; bolje, za 30% ili više; bolje, za 40% ili više; još bolje, za 50% ili više; a najbolje, za više od 75% ili više. Tumorski volumen može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja.

Tretiranje raka rezultuje smanjivanjem broja tumorski izraslina. Preferirano, nakon tretmana, broj tumorskih izraslina se smanji za 5% ili više u odnosu na njihov broj pre tretmana; bolje, za 10% ili više; bolje, za 20% ili više; bolje, za 30% ili više; bolje, za 40% ili više; još bolje, za 50% ili više; a naj bolje, za više od 75%. Broj tumorskih izraslina može da se odredi uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Broj tumorskih izraslina može da se odredi brojanjem tumora koji su vidljivi golim okom ili kod nekog specifičnog povećanja. Preferirano, specifična povećanja su 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, ili 50x.

Tretiranje raka može da rezultuje smanjivanjem broja metastatskih lezija u drugim tkivima ili organima koji su različiti od mesta nastanka primarnog tumora. Preferirano, nakon tretman, broj metastatskih lezija se smanjuje za 5% ili više u odnosu na njihov broj pre tretmana; bolje, za 10% ili više; bolje, za 20% ili više; bolje, za 30% ili više; bolje, za 40% ili više; još bolje, za 50% ili više; a najbolje, za više od 75%. Broj metastatskih lezija može da se odredi uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Broj metastatskih lezija može da se odredi uz pomoć brojanja metastatskih lezija koje su vidljive golim okom ili pod nekim specifičnim povećanjem. Preferirano, pomenuto specifično povećanje je 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, ili 50x.

Tretiranje raka može da rezultuje povećanjem prosečnog vremena preživljenja populacije tretiranih subjekata u odnosu na populaciju koja je primala samo nosioca. Preferirano, pomenuto prosečno vreme preživljenja se povećava za više od 30 dana; bolje, za više od 60 dana; još bolje, za više od 90 dana; a najbolje, za više od 120 dana. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečne dužine preživljenja nakon inicijacije tretmana sa aktivnim jedinjenjem. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije takođe može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečne dužine preživljenja nakon kompletovanja prve runde tretmana sa aktivnim jedinjenjem.

Tretiranje raka može da rezultuje povećanjem prosečnog vremena preživljenja populacije tretiranih subjekata u odnosu na populaciju sa netretiranim subjektima. Preferirano, prosečno vreme preživljenja se povećava za više od 30 dana; bolje, više od 60 dana; još bolje, za više od 90 dana; a najbolje, za više od 120 dana. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečne dužine preživljenja nakon inicijacije tretmana sa aktivnim jedinjenjem. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije takođe može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečne dužine preživljenja nakon kompletovanja prve runde tretmana sa aktivnim jedinjenjem.

Tretiranje raka može da rezultuje povećanjem prosečnog vremena preživljenja populacije tretiranih subjekata u odnosu na populaciju koja prima monoterapiju sa lekom koji nije neko od jedinjenja iz ovoga pronalaska. Preferirano, prosečno vreme preživljenja se povećava za više od 30 dana; bolje, za više od 60 dana; još bolje, za više od 90 dana; a najbolje, za više od 120 dana. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečne dužine preživljenja nakon inicijacije tretmana sa aktivnim jedinjenjem. Povećanje prosečnog vremena preživljenja populacije takođe može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečne dužine preživljenja nakon kompletovanja prve runde tretmana sa aktivnim jedinjenjem.

Tretiranje raka može da rezultuje smanjenjem stope smrtnosti u populaciji tretiranih subjekata u odnosu na populaciju koja prima samo nosioca. Tretiranje raka može da rezultuje smanjenjem stope smrtnosti u populaciji tretiranih subjekata u odnosu na netretiranu populaciju. Tretiranje raka može da rezultuje smanjenjem stope smrtnost u populaciji tretiranih subjekata u odnosu na populaciju koja prima samo monoterapiju sa lekom koji nije jedno od jedinjenja iz ovoga pronalaska. Preferirano, stopa smrtnost se smanjenje za više od 2%; bolje, za više od 5%; još bolje, za više od 10%; a najbolje, za više od 25%. Smanjenje stope smrtnosti u populaciji tretiranih subjekata može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina. Smanjenje stope smrtnosti u populaciji može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečnog broja smrtnih slučajeva povezanih sa bolešću po jedinici vremena nakon inicijacije tretmana sa aktivnim jedinjenjem. Smanjenje stope smrtnosti u populaciji takođe može da se izmeri, na primer, uz pomoć izračunavanja prosečnog broja smrtnih slučajeva povezanih sa bolešću po jedinici vremena nakon kompletovanja prve runde tretmana sa aktivnim jedinjenjem.

Tretiranje raka može da rezultuje smanjenjem stope rasta tumora. Preferirano, nakon tretmana, stopa rasta tumora se smanjuje za najmanje 5% u odnosu na istu pre tretmana; bolje, stopa rasta tumora se smanjuje najmanje 10%; još bolje, smanjuje se najmanje 20%; još bolje, smanjuje se najmanje 30%; još bolje, smanjuje se najmanje 40%; još bolje, smanjuje se najmanje 50%; čak još bolje, smanjuje se najmanje 50%; a najbolje, smanjuje se najmanje 75%. Stopa rasta tumora može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Stopa rasta tumora može da se izmeri na osnovu promene dijametra tumora u jedinici vremena.

Tretiranje raka može da rezultuje smanjenjem ponovnog rasta tumor. Preferirano, nakon tretman, ponovni rast tumora je manji od 5%; bolje, ponovni rast tumora je manji od 10%; još bolje, manji od 20%; još bolje, manji od 30%; još bolje, manji od 40%; još bolje, manji od 50%; čak još bolje, manji od 50%; a najbolje, manji od 75%. Ponovni rast tumora može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Ponovni rast tumora se meri, na primer, uz pomoć merenja povećanja dijametra tumora nakon prethodnog smanjenja tumora, koje je bilo posledica tretmana. Smanjenje ponovnog rasta tumora se vidi preko nemogućnosti da se tumor(i) ponovo pojave nakon prestanka tretmana.

Tretiranje ili sprečavanje ćelijskog proliferativnog poremećaja može da rezultuje smanjivanjem stope ćelijske proliferacije. Preferirano, nakon tretmana, stopa ćelijske proliferacije se smanjuje za najmanje 5%; bolje, za najmanje 10%; još bolje, za najmanje 20%; još bolje, za najmanje 30%; još bolje, za najmanje 40%; još bolje, za najmanje 50%; čak još bolje, za najmanje 50%; a najbolje, za najmanje 75%. Stopa ćelijske proliferacije može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Stopa ćelijske proliferacije se meri, na primer, uz pomoć merenja broja ćelija koje se dele u primerku tkiva po jedinici vremena.

Tretiranje ili sprečavanje ćelijskog proliferativnog poremećaja može da rezultuje smanjenjem proporcije ćelija koje proliferiraju. Preferirano, nakon tretmana, proporcija ćelija koje proliferiraju se smanjuje za najmanje 5%; još bolje, za najmanje 10%; još bolje, za najmanje 20%; još bolje, za najmanje 30%; još bolje, za najmanje 40%; još bolje, za najmanje 50%; čak još bolje, za najmanje 50%; a najbolje, za najbolje 75%. Proporcija ćelija koje proliferiraju može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Preferirano, proporcija ćelija koje proliferiraju može da se izmeri, na primer, uz pomoć kvantifikovanja broj ćelija koje se dele u odnosu na broj ćelija koje se ne dele u primerku tkiva. Proporcija ćelija koje proliferiraju može da bude ekvivalent mitotskom indeksu.

Tretiranje ili sprečavanje ćelijskog proliferativnog poremećaja može da rezultuje smanjenjem veličine područja ili zone gde ćelije proliferiraju. Preferirano, nakon tretmana, veličina područja ili zone gde ćelije proliferiraju se smanjuje za najmanje 5% u odnosu na veličinu pre tretmana; još bolje, smanjuje se za najmanje 10%; još bolje, smanjuje se za najmanje 20%; još bolje, smanjuje se za najmanje 30%; još bolje, smanjuj se za najmanje 40%; još bolje, smanjuje se za najmanje 50%; čak još bolje, smanjuje se za najmanje 50%; a najbolje, smanjuje se za najmanje 75%. Veličina područja ili zone gde ćelije proliferiraju može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina merenja. Veličina područja ili zone gde ćelije proliferiraju može da se izmeri kao dijametar ili širina područja ili zone gde ćelije proliferiraju.

Tretiranje ili sprečavanje ćelijskog proliferativnog poremećaja može da rezultuje smanjenjem broja ili proporcije ćelija koje ne izgledaju normalno ili imaju abnormalnu morfologiju. Preferirano, nakon tretmana, broj ćelija koje imaju abnormalnu morfologiju se smanjuje za najmanje 5% u odnosu na vrednost pre tretmana; još bolje, smanjuje se za najmanje 10%; još bolje, smanjuje se za najmanje 20%; još bolje, smanjuje se za najmanje 30%; još bolje, smanjuje se za najmanje 40%; još bolje, smanjuje se za najmanje 50%; čak još bolje, smanjuje se za najmanje 50%; a najbolje, smanjuje se za najmanje 75%. Ćelije koje ne izgledaju normalno ili imaju abnormalnu morfologiju mogu da se odrede (prepoznaju) uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina uporedbe. Abnormalna ćelijska morfologija može da se odredi uz pomoć mikroskopa, na primer, primenom inverznog mikroskopa za kulturu tkiva. Abnormalna ćelijska morfologija može da se očituje preko nuklearnog pleomorfizma.

Kao šta se ovde koristi, termin "selektivno" označava tendenciju da se pojavljuje pod većom frekvencijom u jednoj populaciji u odnosu na neku drugu populaciju. Populacije koje se upoređuju mogu da budu populacije ćelija. Preferirano, jedinjenje iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) deluje selektivno na ćelije raka ili pre-tumorske ćelije, ali ne i na normalne ćelije. Preferirano, jedinjenje iz ovoga pronalaska deluje selektivno kako bi uticalo na jednu molekularnu metu (na primer, ciljna proteinska metiltransferaza), ali ne utiče značajno na neku drugu molekularnu metu( tj.,ne-ciljana proteinska metiltransferaza). Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za selektivno inhibiranje delovanja nekog encima, poput proteinske metiltransferaze. Preferirano, neki događaj u populaciji A, u odnosu populaciju B, deluje selektivno ako nastupa više od dva puta češće u populaciji A. Pomenuti događaj deluje selektivno ako nastupa više od pet puta češće u populaciji A. Pomenuti događaj deluje selektivno ako nastupa više od deset puta češće u populaciji A; još bolje, više od pedeset puta češće; čak još bolje, više od 100 puta; a najbolje, više od 1000 puta češće u populaciji A u odnosu na populaciju B. Na primer, selektivna smrt ćelija raka će nastupati više od dva puta češće u odnosu na smrt normalnih ćelija.

Jedinjenje iz ovoga pronalaska može da utiče na delovanje neke molekularne mete( naprimer,ciljana proteinska metiltransferaza). Moduliranje (uticaj) se odnosi na stimuliranje ili inhibiranje delovanja molekularne mete. Preferirano, jedinjenje iz ovoga pronalaska utiče na delovanje neke molekularne mete ako stimuliše ili inhibira delovanje pomenute molekularne mete za najmanje 2-puta u odnosu na delovanje pomenute molekularne mete u istim uslovima, ali bez prisutnosti pomenutog jedinjenja. Još bolje, jedinjenje iz ovoga pronalaska utiče na delovanje neke molekularne mete ako stimuliše ili inhibira delovanje pomenute molekularne mete za najmanje 5-puta, najmanje 10-puta, najmanje 20-puta, najmanje 50-puta, najmanje 100-puta u odnosu na delovanje pomenute molekularne mete u istim uslovima, ali bez prisutnosti pomenutog jedinjenja. Delovanje neke molekularne mete može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina. Delovanje molekularne mete može da se izmeriin vitroiliin vivo.Na primer, delovanje neke molekularne mete može da se izmeriin vitroprimenom ogleda encimskog delovanja ili ogleda DNA-vezanja, ili delovanje neke molekularne mete može da se izmeriin vivouz pomoć testiranja ekspresije reporter-gena.

Jedinjenje iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) ne utiče značajno na delovanje neke molekularne mete ako dodavanje pomenutog jedinjenja ne stimuliše ili inhibira delovanje pomenute molekularne mete za više od 10% u odnosu na delovanje pomenute molekularne mete u istim uslovima, ali bez prisustva pomenutog jedinjenja.

Kao šta se ovde koristi, termin "izozim-selektivno" označava preferencijalnu inhibiciju ili stimulaciju prve izoforme nekog encima u odnosu na neku drugu izoformu nekog encima (na primer, preferencijalna inhibicija ili stimulacija izozima alfa proteinske metiltransferaze u odnosu na izozim beta proteinske metiltransferaze). Preferirano, jedinjenje iz ovoga pronalaska ima minimalni diferencijal od četiri-puta, bolje diferencijal od deset-puta, još bolje diferencijal od pedeset-puta, šta se tiče doze koja je potrebna da se postigne neki biološki efekt. Preferirano, jedinjenje iz ovoga pronalaska zadržava pomenuti diferencijal kroz ceo raspon inhibicije, pri čemu se diferencijal očituje sa IC50,tj.,50%-inhibicija, za neku molekularnu metu od interesa.

Administriranje nekog jedinjenja iz ovoga pronalaska ćeliji ili subjektu u potrebi može da rezultuje moduliranjem( tj.,stimulacijom ili inhibicijom) delovanja proteinske metiltransferaze od interesa.

Tretiranje raka ili nekog ćelijskog proliferativnog poremećaja može da rezultuje smrću ćelija, a preferirano, pomenuta smrt ćelija rezultuje smanjenjem od najmanje 10% od broja ćelija u početnoj populaciji. Još bolje, ćelijska smrt znači smanjenje od najmanje 20%; još bolje, smanjenje od najmanje 30%; još bolje, smanjenje od najmanje 40%; još bolje, smanjenje od najmanje 50%; a najbolje, smanjenje od najmanje 75%. Broj ćelija u populaciji može da se izmeri uz pomoć bilo kojeg reproducibilnog načina. Broj ćelija u populaciji može da se izmeri uz pomoć fluorescencijski aktivisanog sortiranja ćelija (FACS), imuno-fluorescencijske mikroskopije i svetlosne mikroskopije. Postupci za merenje ćelijske smrti su opisani u radu Li et al, Proc Natl Acad Sci USA. 100(5): 2674-8,2003. Ujednom aspektu, ćelijska smrt nastupa apoptozom.

Preferirano, efektivna količina nekog jedinjenja iz ovoga pronalaska nije značajno citotoksična normalnim ćelijama. Terapeutski efektivna količina nekog jedinjenja nije značajno citotoksična normalnim ćelijama ako administriranje jedinjenja u nekoj terapeutski efektivnoj količini ne potiče smrt više od 10% normalnih ćelija. Terapeutski efektivna količina nekog jedinjenja ne utiče značajno na vijabilnost normalnih ćelija ako administriranje jedinjenja u nekoj terapeutski efektivnoj količini ne potiče smrt više od 10% normalnih ćelija. Ujednom aspektu, ćelijska smrt nastupa preko apoptoze.

Dovođenje ćelija u kontakt sa nekim od jedinjenja iz ovoga pronalazak može da selektivno potakne ili da aktiviše smrt tumorskih ćelija. Administriranje nekog jedinjenja iz ovog pronalaska nekom subjektu u potrebi može da selektivno indukuje ili da aktiviše smrt tumorskih ćelija. Dovođenje ćelija u kontakt sa nekim od jedinjenja iz ovoga pronalazak može da selektivno potakne ćelijsku smrt u jednoj ili više ćelija koje su zahvaćene sa nekim ćelijskim proliferativnim poremećajem. Preferirano, administriranje nekog jedinjenja iz ovoga pronalaska nekom subjektu u potrebi selektivno potiče smrt u jednoj ili više ćelija zahvaćenih sa nekim ćelijskim proliferativnim poremećajem.

Ovaj opis se odnosi na postupak za tretiranje ili sprečavanje raka (na primer, tumor na čije napredovanje može da se utiče delovanjem na metilaciju belančevina koja je posredovana sa EZH2) uz pomoć administrirani a nekog od jedinjenja iz ovoga pronalaska( tj.,hidrobromid Jedinjenja I, kao i Polimorf A) nekom subjektu u potrebi, pri čemu pomenuto administriranje pomenutog jedinjenja iz ovog pronalaska rezultuje u jedno ili više od sledećih: sprečavanje proliferacije tumorskih ćelija uz pomoć akumuliranja ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa (na primer, Gi, Gi/S, G2/M), ili indukovanja ćelijskog starenja, ili poticanja diferencijacije tumorskih ćelija; poticanje smrti ćelija raka preko citotoksičnosti, nekroze ili apoptoze, bez značajne smrtnosti normalnih ćelija, anti-tumorskog delovanja kod životinja sa terapeutskim indeksom od najmanje 2. Kao šta se ovde koristi, "terapeutski indeks" je maksimalna tolerisana doza podeljena sa efikasnom dozom. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak koji se koristi za identifikuje prikladnih kandidata za tretiranje ili sprečavanje raka. Stručnjak može da se posluži sa opštom literaturom za detaljne opise poznatih tehnika, o kojima se ovde govori, i ekvivalentnih tehnika. Pomenuta literatura obuhvata Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley and Sons, hic. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (3. izdanje), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al, Current Protocols in Immunologv, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacologv, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18. izdanje (1990). Pomenuta literatura takođe može, naravno, da se citira kod pripreme ili primene određenih aspekata ovoga pronalaska.

Primeri

Materijali i postupci

Difrakcija X- zraka na prahu

PXRD za sve primerke je snimljen na aparatuRigaku MultiFlex(Meta: Cu; Voltaža tube: 40 kV; Struja u tubi: 30 mA).

Diferencijalna skening kalorimetrija

DSC za sve primerke je provedena na aparatuMettler- Toledo DSC 1/ 700(Uslovi: početna temperatura 35° C; finalna temp. 325° C, stopa grejanja 30° C/min).

Rendgenska strukturna analiza( X - Ray Crvstallographv )

Bezbojan ravan kristal sa dimenzijama 0.28 x 0.22 x 0.06 mm je bio postavljen na najlonskoj omči( nilon loop)uz pomoć veoma male količine paratonskog ulja. Podaci su sakupljeni primenomBruker CCD ( charge conpled device)na bazi difraktometra koji je bio opremljen sa aparatomOxford Cryostream low- temperaturekoji je radio na 173 K. Podaci su izmeri primenom omega- i fi-skeniranja od 0.5° po okviru tokom 45 s. Ukupan broj slika se bazirao na rezultatima programaCOSMOpri čemu je bila očekivana redundancija od 4.0 i potpunost od 100% sve do 0.83 A. Ćelijski parametri su bili preuzeti uz pomoćAPEXIIsoftvera, a rafinirani uz pomoćSAINTsoftvera za sve primećene refleksije. Reduciranje podataka je provedeno primenomSAINTsoftvera koji korigira za Lp. Korekcije performanse i apsorpcije su uvedene primenomSADABS multi- skentehnike (George Sheldrick). Strukture su rešene uz pomoć direktnog postupka primenomSHELXS- 97programa, a rafinirane su postupkom najmanjeg kvadrata (F<2>,SHELXL- 97,koji su ugrađeni uSHELXTL- PC V6. 10).

Struktura prikazana na Slici 11 je razrešena u prostornoj grupi P2i/c (# 14). Svi ne-vodonikovi atomi su refinirani anizotropno. Vodonici su izračunati uz pomoć geometrijskih postupaka, a rafinirani su kaoriding- model.Kristal koji je korišćen za studiju difrakcije nije se raspadao (bio je stabilan) tokom sakupljanja podataka. Svi crteži su napravljeni kod 50% elipsoida.

Dinamička sorpcija pare( Dvnamic Vapor Sorption )

DVS je izmerena na sistemuVTI Model SGA- 100.Postupak merenja: relativna vlaga (RH) je menjana na kontrolisani način, u koracima od po 5% započinjući sa 5.0% pa sve do 95.0%, a tada nazad do 5.0% uz primenu sistema za gravimetrijsku sorpciju pare i merenje procentualne promene težine (wt%) primerka u svakom koraku.

HPLC

HPLC je provedena na aparatuAgilent 1200 HPLC(kvaternarna pumpa, mešanje pod niskim pritiskom,in- linedegazer). Uslovi za analitički postupak: 8 uL primerka (20 mg ER-581982-06 razređeno u 50 mL metanola kako bi se dobio rastvor: približno 0.4 mg/mL) je injektirano u kolonuAgilent Zorbax Eclipse XDB- C18(4.6 x 150 mm, 3.5 um); uslovi za hromatografiju: mobilna faza A, voda sa 5 mM amonijum formatom; mobilna faza B, 5 mM amonijum format u smeši acetonitril/metanol/voda (50/45/5); stopa protoka, 1.5 ml/min.; gradijent: izokratski kod 10% B od 0 do 3 min; linearno povećanje do 70% B od 3 do 7 min; izokratski kod 70% B od 7 do 12 min; linearno povećanje do 100% B od 12 do 15 min; izokratski kod 100% B od 15 do 20 min; temperatura kolone, 35° C; detekcija, UV 230 nm. Približno retenciono vreme Jedinjenja I = 10.7 min.

Sinteza Polimorfa A

5-bromo-2-metil-3-nitrobenzojeva kiselina:mešani rastvor 2-metil-3-nitrobenzojeve kiseline (100 g, 552 mmol) u konc. H2S04(400 mL), l,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindiona (88 g, 308 mmol) je dodan deo po deo na sobnoj temperaturi, a reakciona smeša je tada mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 h. Reakciona smeša je izlivena u vodu s

ledom, a precipitirana čvrsta materija je odstranjena filtriranjem, isprana sa vodom i osušena u vakuumu koje daje željeno jedinjenje u formi čvrste materije (140 g, 98%). Izolovano jedinjenje je direktno korišćeno u sledećem koraku. 'H NMR(DMSO-c/đ,400 MHz) 8 8.31 (s, IH), 8.17 (s, IH), 2.43 (s, 3H).

Metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoat:u mešani rastvor 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzojeve kiseline (285 g, 1105 mmol) u DMF (2.8 L) na sobnoj temperaturi je dodan natrijum karbonat (468 g, 4415 mmol), a nakon toga i metil jodid (626.6 g, 4415 mmol). Nastala reakciona smeša je grejana na 60° C tokom 8 h. Nakon kompletovanja (praćeno uz pomoć TLC), reakciona smeša je odstranjena filtriranjem (kako bi se odstranio natrijum karbonat) i isprana sa etil acetatom (1 L x 3). Spojeni filtrat je ispran sa vodom (3 L x 5), a vodena faza je ponovo ekstrahovana sa etil acetatom (1 Lx 3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata, filtrirani i koncertovani pod smanjenim pritiskom koje daje jedinjenje iz naslova u formi čvrste materije (290 g, 97% prinos). Izolovano jedinjenje je direktno korišćeno u sledećem koraku. 'H NMR (CDCb, 400 MHz) 8 8.17 (s, IH), 7.91 (s, IH), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).

Metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoat(1): u mešani rastvor metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoata (290 g, 1058 mmol) u etanolu (1.5 L) je dodan vodeni amonijum hlorid (283 g, 5290 mmol rastvoreno u 1.5 L vode). Nastala smeša je mešana na 80° C, a tada je dodano gvožđe u prahu (472 g, 8451 mmol), deo po deo. Nastala reakciona smeša je grejana na 80° C tokom 12 h. Nakon kompletovanja reakcije (određeno sa TLC), reakciona smeša je još vruća filtrirana kroz celit<®>, a pločica od celita je isprana sa metanolom (5 L) nakon čega je usledilo ispiranje sa 30% MeOH u DCM (5 L). Spojeni filtrat je koncertovanin vacuo,dobiveni talog je razređen sa vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 L) i ekstrahovan sa etil acetatom (5 L x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod smanjenim pritiskom koje daje jedinjenje iz naslova u formi čvrste materije

(220 g, 85%). Jedinjenje je direktno korišćeno u sledećem koraku. 'H NMR (CDCh, 400 MHz) 8 7.37 (s, IH), 6.92 (s, IH), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).

Metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoat(2): reaktor je nabijen sa metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoatom (455.8 g, 1.87 mol), 1,2-dihloroetanom (4.56 L), i sirćetnom kiselinom (535 ml, 9.34 mol). U smešu su dodani dihidro-2H-piran-4(3H)-on (280 g, 2.80 mol) i natrijum triacetoksiborohidrid (594 g, 2.80 mol) uz održavanje interne temperature ispod 40° C. Smeša je mešana na 25° C tokom 2.5 h, a tada je reakcija ugašena sa rastvorom natrijum hidroksida (448 g, 11.20 mol) u vodi (5.61 L). Nakon mešanja tokom 20 min na ambijentalnoj temperaturi, organski sloj je odvojen, a vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (3.65 L). Organski slojevi su spojeni, isprani sa slanicom (1.5 L) i koncentrovani u vakuumu.

Talog je tretiran sa etil acetatom (1.8 L) i grejan do 65-70° C. Smeša je mešana na 65-70° C tokom 15 min kako bi nastao bistar rastvor koji je tada tretiran sa n-heptanom (7.3 L) uz održavanje temperature između 60-70° C. Jednom kada je dodavanje heptana kompletovano, smeša je držana na 65-70° C tokom 15 min, a tada je ostavljena da se ohladi do 18-22° C tokom 3 h. Nastala suspenzija je mešana na 18-22° C tokom 4 h, ohlađena do 0-5° C tokom 1 h, pa je držana na 0-5° C tokom 2 h. Precipitat je filtriran, dva puta ispran sa n-heptanom (1.4 L), i osušen u vakuumu koje daje jedinjenje iz naslova (540 g, 88%). XRPD-obrazac ovog jedinjenja je prikazan na Slici 17.

Metil 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoat(3): u mešani rastvor of metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino benzoata (14 g, 42.7 mmol) u dihloroetanu (150 mL) su dodani acetaldehid (3.75 g, 85.2 mmol) i sirćetna kiselina (15.3 g, 256 mmol). Nastala reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Smeša je ohlađena do 0° C pa je dodan natrijum triacetoksiborohidrid (27 g, 128 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 h. Nakon kompletovanja reakcije, koje je određeno sa TLC, u reakcionu smešu je dodavan vodeni rastvor natrijum bikarbonata do postizanja pH 7-8, organska faza je odvojena, a vodena faza je ekstrahovana sa etil acetatom. Spojeni organski slojevi su osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod smanjenim pritiskom. Sirovo jedinjenje je prečišćeno uz pomoć kolonske hromatografije (silika-gel: sito 100-200) uz eluciju sa smešom etil acetat:heksan koje daje željeno jedinjenje u formi viskozne tečnosti (14 g, 93%). 'H NMR( DMSO- ds,400 MHz) 5 7.62 (s, IH), 7.52 (s, IH), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, IH), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3H, J=6.8 Hz).

Metil 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,l'-bifenil]-3-karboksilat (4): smeša metil 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoata (580 g, 1.63 mol), 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)benzil)morfolina (592 g, 1.95 mol), 1,4-dioksana (3.86 L), natrijum karbonata (618 g, 5.83 mol), i vode (771 ml) je degazirana uz pomoć propuštanja mehurića azota kroz smešu na 20° C tokom 20 min, a tada je tretirana sa tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (14.11 g, 12.21 mmol). Nastala smeša je degazirana tokom dodatnih 20 min, a tada je grejana do 87-89° C tokom 17 h. Nakon hlađenja do 20° C, smešaje razređena sa etil acetatom (5.80 L) i rastvorom (R)-2-amino-3-merkaptopropionske kiseline (232 g) u vodi (2.320 L). Nakon mešanja tokom 1 h na 20° C, organski sloj je odvojen i ponovo ispran sa rastvorom (R)-2-amino-3-merkaptopropionske kiseline (232 g) u vodi (2.320 L). Vodeni slojevi su spojeni i ekstrahovani sa etil acetatom (5.80 L). Organski slojevi su spojeni, isprani sa rastvorom natrijum hidroksida (93 g) u vodi (2.32 L), i koncentrovani u vakuumu na 35° C koje daje jedinjenje iz naslova u formi narandžastog ulja (1.21 kg, 164% prinos).

5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,l'-bifenil]-3-

karboksilna kiselina (5): metil 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksilat (69.0 g, 152.5 mmol) (na bazi teoretskog prinosa iz prethodnog koraka) je suspendovan u etanolu (380 mL) i tretiran sa rastvorom natrijum hidroksida (24.84 g, 621.0 mmol) u vodi (207 mL). Smeša je mešana na 40° C tokom 18 h. Nakon hlađenja do 0-5° C, smeša je neutralizovana do pH 6.5 uz pomoć 1 N hlorovodonične kiseline (580 mL) uz održavanje temperature ispod 25° C. Tada, smeša je ekstrahovana dva puta sa smešom dihlorometana (690 mL) i metanola (69.0 mL). Organski slojevi su spojeni i koncentrovani u vakuumu koje daje sirovi proizvod u formi žute čvrste materije (127g).

Ovaj sirovi proizvod je rastvoren u 2-metiltetrahidrofuranu (656 mL) na 70° C, a tada je tretiran sa IPA (828 mL). Smeša je ostavljena da se ohladi do ST (sobna temperatura) tokom 3-4 h, a tada je mešana tokom noći na ST. Precipitat je filtriran, dva puta ispran sa IPA (207 mL), i osušen u vakuumu koje daje jedinjenje iz naslova u formi kremove čvrste materije (53.54 g, 80%). XRPD-obrazac ovog jedinjenja je prikazan na Slici 9.

N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-

il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,l'-bifenil]-3-karboksamid (Jedinjenje I):smeša 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[ 1, l'-bifenil]-3-karboksilne kiseline (540 g, 1.23 mol) i 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(lH)-on hidrohlorida (279 g, 1.48 mol) je suspendovana u DMSO (2.70 L) pa je tretirana sa trietilaminom (223 ml, 1.60 mol). Smeša je mešana na 25° C tokom 30 min pa je tretirana sa EDC-HC1 (354 g, 1.85 mol) i HOBT hidratom (283 g, 1.85 mol). Reakciona smeša je mešana na ST tokom 16 h. Nakon dodavanja trietilamina (292 ml, 2.09 mol), smeša je ohlađena do 15°

C, razređena sa vodom (10.1 L) uz održavanje temperature ispod 30° C, pa je mešana na 19-25° C tokom 4 h. Nastao precipitat je filtriran, dva puta ispran sa vodom (2.70 L), i osušen u vakuumu koje daje sirovi proizvod (695 g,wt- wtanaliza = 78%).

Za dodatno prečišćavanje ovog proizvoda je provedeno ponovno kristalizovanje. Sirovi proizvod (20.00 g, 34.92 mmol) je suspendovan u smeši etanola (190 ml) i vode (10.00 ml), a sve je grejano do 75° C dok nije dobiven bistar rastvor. Ovaj rastvor je ostavljen da se ohladi do ST tokom noći. Precipitat je filtriran, dva puta ispran sa smešom etanola (30.0 ml) i vode (30.0 ml), i osušen u vakuumu na 35° C koje daje jedinjenje iz naslova u formi kremove čvrste materije (14.0 g, 70% obnavljanje sirove materije i 90% prinos na baziwt- wtanalize).

4-((3'-(((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4'-metil-[l,l'-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-iijum bromid (Polimorf A): sirovi N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamid (595 g, 464 g na baziwt- wtanalize, 810.3 mmol) je suspendovan u etanolu (3.33 L). Nakon grejanja do 70° C, smeša je tretirana sa 48% vodenim HBr (97 ml, 850.8 mmol) i mešana na 70° C tokom 30 min. Nastao narandžasto-crveni rastvor je tretiran sa etil acetatom (3.33 L) uz održavanje temperature iznad 60° C. Smeša je polako ohlađena do ST tokom 18 h. Smeša je ohlađena do 0° C tokom 1 h pa je mešana na istoj temperaturi tokom 5.5 h. Nastao precipitat je filtriran, dva puta ispran sa etil acetatom (1.39 L), pa je osušen u vakuumu koje daje jedinjenje iz naslova u formi kremove čvrste materije (515 g, 97% prinos).

Ponovno kristalizovanje Polimorfa A: 4-((3'-(((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4'-metil- [1,1 '-bifenil] -4-il)metil)morfolin-4-ijum bromid (0.50 g, 0.77 mmol; 95.6% čistoća na osnovu HPLC) je suspendovan u etanolu (3.0 mL) pa je grejan do 80° C do pojave bistrog rastvora. U ovaj rastvor polako je dodan MTBE (5.0 mL). Nastao rastvor je ostavljen da se ohladi do 18-22° C tokom

3 h pa je mešan na 18-22° C tokom 15 h. Precipitat je filtriran, dva puta ispran sa MTBE (2 mL) pa je osušen u vakuumu koje daje 0.45 g jedinjenja iz naslova (89% obnavljanje, 96.6% čistoća na osnovu HPLC). Obrazac difrakcije X-zraka na prahu za Polimorf A (monohidrobromid) je prikazan na Slici 1. Tabela 1, ispod, prikazuje najvažnije signale (šiljke).

Procena hidrobromida JedinjenjaI iPolimorfaA

Brojne različite forme Jedinjenja I su pripremljene i ispitane, uključujući hidrohlorid, hidrobromid, hemisulfat, i soli natrijuma, fosfata, nitrata, maleata, malonata, i L-tartarata. Među njima, hidrobromidna (HBr) soje pokazala najbolje fizičko-hemijske karakteristike kada se govori o jednostavnosti precipitacije i higroskopnosti.

Provedene su detaljne studije slobodne baze Jedinjenja I kao i njegove HC1 soli. Najmanje pet različitih kristalnih forma je detektovano iz slobodne forme Jedinjenja I tokom preliminarnog ispitivanja polimorfa primenom XRD i DSC. Zbog visokog stepena varijabilnosti koje je primećeno tokom kristalizovanja slobodne forme, razmatrane su i kristalne forme drugih soli. Od ispitanih soli, kristalne su bile monohidrohlorid, monohidrobromid, hemisulfat, fosfat, maleat, L-tartarat i natrijumova so. Fosfatna i maleatna so su bile veoma higroskopne, a L-tartaratna je slabo kristalizovala.

Bilo je teško da se ostvari visoki nivo kristalnosti i kod HC1 soli Jedinjenja I. Smeša kristala i amorfnog materijala je dobivena bez obzira na uslove kristalizovanja. Kao šta je prikazano na Slici 8, DSC podaci monohidrohloridne soli Jedinjenja I upućuju na postojanja određenog nivoa ne-kristalnosti sa endotermom kod 190.5° C. Takođe, dobiveni su i podaci dinamične sorpcije pare (DVS) za monohidrohloridnu so Jedinjenja 1 pri čemu je otkrivena mala higroskopnost: između 4-6% težinskog priraštaje primećeno kod 75% relativne vlažnosti (RH) na 25° C (Slika 18B). Ovo može da se pripiše postojanju određene količine ne-kristalne materije u monohidrohloridnoj soli. Vidi,na primer,Sliku 18A, koja prikazuje amorfno trihidrohloridno Jedinjenje I. Zbog toga šta se nivo kristalnosti nije mogao kontrolisati, HC1 so nije razmatrana za daljnji razvoj.

Kao šta je prikazano na Slici 6, DVS-analiza natrijumove soli Jedinjenja I je otkrila značajnu higroskopnost: približno 15% težinskog prirasta je primećeno kod 75% relativne vlažnosti (RH) na 25° C. Kao šta je prikazano na Slici 7, hemisulfatna so Jedinjenja I je pokazala umereno visoku higroskopnost: između 9-11% težinskog prirasta je primećeno kod 75% relativne vlažnosti (RH) na 25° C. Ovo može da se pripiše visoko ne-kristalne prirode samog jedinjenja, jer DSC podaci za hemisulfatnu so ukazuju na veoma visoki nivo ne-kristalne materije bez jasne endoterme.

Između pomenutih kristalnih jedinjenja, monohidrobromid je bio najkristalniji i najmanje higroskopan (vidi Slike 1, 3, i 4). Nadalje, monohidrobromid je veoma stabilan, i sprečava pojavu primesa (nečistoća) (Slika 5 prikazuje HPLC-analizu Polimorfa A tokom tri dana na povišenoj temperaturi. Polimorf A je pokazao najmanje primesa tokom tri dana na 100° C). Interesantno, di-HBr so Jedinjenja I je primarno amorfna (Slika 2).

Dve različite kristalne forme monohidrobromida Jedinjenja I (Polimorfi A i B) su dobivene iz različitih sistema rastvarača, a karakterizovane su primenom XRD, DSC i TGA-DSC analiza. XRD i DSC podaci pomenutih dveju različitih kristalnih forma iz reprezentativnih serija Jedinjenja I su prikazane na Slici 1, Slici 3, i Slici 10. Polimorf B je karakterizovan na osnovu XRD-obrasca na prahu koji sadrži šiljke kod 8.5,10.9,16.7,17.4,20.9,22.1 i25.7±0.2 stepena 2 teta (vidi Sliku 10). Od dveju pomenutih forma, Polimorf A je imao kristalniju prirodu. Studije dinamičke apsorpcije pare (DVS) su pokazale da polimorf A nije higroskopan (Slika 4). Tokom termalnih analiza je primećen samo jedan endotermički šiljak koji se pojavljuje kod temperature od približno 251° C. Osim toga, iz DSC-analize je bilo evidentno da ponovno kristalizovanje polimorfa A značajno povećava kristalnost materijala (vidi Sliku 3).

Tokom više laboratorijskih pokušaja, Polimorf A se mogao dobivati na reproducibilan način, a blage promene uslova kristalizovanja nisu rezultovale pojavom drugih kristalnih forma.

Ogledi sa divljim tipom i mutiranim PRC2 encimom

Opšti materijali.S-adenozilmetionin (SAM), 5-adenozilhomocistein (SAH), bicin, KC1,Tween20,dimetilsulfoksid (DMSO) i želatin iz goveđe kože (BSG) su nabavljeni kod Sigma-Aldrich pri čemu su nabavljeni proizvodi sa najvećim mogućim nivoom čistoće. Ditiotreitol (DTT) je nabavljeni kod EMD. 3H-SAM je nabavljen kod American Radiolabeled Chemicals (specifično delovanje od 80 Ci/mmol). Streptavidinske fleš-pločice sa 384-rupica su nabavljeni kod PerkinElmer.

Supstrati.Peptidi koji predstavljaju ostatke 21-44 ljudskog histona H3, koji sadrže nemodifikovani lizin 27 (H3K27meO) ili dimetilirani lizin 27 (H3K27me2), su sintetizovani kod 21<st>Centurv Biochemicals, ali tako da sadrže motiv sa C-terminalnim G(K-biotin) linkerom-afinitetnim priveskom i C-terminalnu amidnu kapu. Peptidi su prečišćeni uz pomoć tečne hromatografije visoke-performanse (HPLC), a čistoća je bila veća od 95% koje je potvrđeno sa tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS). Sekvence su navedene ispod:

Oligonukleosomi iz kokošijih eritrocita su prečišćeni iz ptičje krvi primenom poznatih procedura.

Rekombinantni PRC2 kompleksi.Human PRC2 kompleksi su prečišćeni u formi 4-komponentnih encimskih komplekasa ko-eksprimiranih u ćelijamaSpođoptera frugiperđa(sf9) primenom ekspresionog sistema iz bakulovirusa. Eksprimirane pod-jedinice su bile divljeg-tipa EZH2 (NM 004456) ili EZH2 Y641F, N, H, S ili C-mutanata koji su generisani iz konstrukta za divlji-tip EZH2, EED (NM 003797), Suzl2 (NM 015355) i RbAp48 (NM 005610). EED pod-jedinica je sadržavala N-terminalni FLAG-privesak koji je bio korišćen za prečišćavanje celog 4-komponentnog kompleksa iz lizata sf9-ćelija. Čistoća komplekasa je prevazilazila 95% koje je određeno primenom SDS-PAGE i analizom na aparatuAgilent Bioanalvzer.Koncentracije encimskih stokova (generalno 0.3-1.0 mg/mL) su određene primenom Bradford-ovog ogleda korišćenjem albumina iz goveđeg seruma (BSA) (albumin je korišćen kao standard).

Opštaprocedura za oglede sa PRC2 encimom napeptidnimsupstratima. Pomenuti ogledi su provedeni u puferu koji se sastojao od 20 mM bicina (pH=7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG i 0.002%Tween20,a pripremanje neposredno pre upotrebe. Jedinjenja u 100% DMSO (1 \ iL) su nakapana u polipropilenske pločice sa V-dnom i 384-rupica (Greiner) uz korišćenjePlatemate(2 x 3) koji je bio opremljen sa glavom od 384-kanala (Thermo). DMSO (1 uT) je dodan u kolone 11, 12, 23, 24, redovi A-H kao kontrola za maksimalni signal, a SAH (poznati proizvod i inhibitor PRC2; 1 uL) je dodan u kolone 11,12, 23, 24, redove I-P kao kontrola za minimalni signal. Kokteli (40 uL) koji su sadržavali divlji-tip PRC2 encima i H3K27meO peptid ili bilo kojeg od Y641 mutiranih encima i H3K27me2 peptid su dodan uz pomoćMultiđrop Combi(Thermo). Jedinjenja su ostavljena da se inkubiraju sa PRC2 tokom 30 min na 25° C, a tada je dodan koktel (10 uT) koji je sadržavao smešu ne-radioaktivnog SAM i<3>H-SAM sa ciljem da se potakne reakcija (finalni volumen = 51 uT). Za sve, finalne koncentracije su bile kako sledi: divlji-tip ili mutirani PRC2 encim - 4 nM, SAH u rupicama sa kontrolom za minimalni signal - 1 mM, a koncentracija DMSO je bila 1%. Finalne koncentracije ostalih komponenta su navedene u Tabeli 2, ispod. Ogledi su bili stopirani uz pomoć dodavanja ne-radioaktivnog SAM (10 (LiL) u finalnoj koncentraciji od 600 uM, koje dovodi od razređivanja<3>H-SAM do stepena kada njegova ugradnja u peptidni supstrat više nije detektabilna. 50 |uL reakcionih smeša iz polipropilenske pločice sa 384-rupica je tada premešteno u fleš-pločicu sa 384-rupica, a biotinilovani peptidi su ostavljen da se vežu na streptavidin sa površine tokom najmanje 1 h pre no su tri puta isprani sa 0.1%Tween20u aparatu za ispiranje pločica( Biotek ELx405).Pločice su tada očitane u čitačupločica PerkinElmer TopCountsa ciljem da se izmeri količina<3>H-označenih peptida koji su se vezali na površinu fleš-pločica, pri čemu se mere raspadi u minutu (dpm) ili alternativno, izražavaju se kao udari u minutu (cpm).

Opštaprocedura za ogled sa divljim-tipom PRC2 encima na supstratu od oligonukleosoma. Ogledi su provedeni u puferu koji je sadržavao 20 mM bicina (pH=7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG, 100 mM KC1 i 0.002%Tween20,a pripreman je neposredno pre upotrebe. Jedinjenja u 100% DMSO (1 |uL) su nakapana u polipropilenske pločice sa V-dnom i 384-rupica (Greiner) primenomPlatemate(2 x 3) koji je bio opremljen sa glavom sa 384-kanala (Thermo). DMSO (1 \ xL) je dodan u kolone 11, 12, 23, 24, redovi A-H kao kontrola za maksimalni signal, a SAH (poznati proizvod i inhibitor PRC2; 1 |liL) je dodan u kolone 11,12, 23, 24, redovi I-P kao kontrola za minimalni signal. Koktel (40 |uL) koji je sadržavao divlji-tip PRC2 encima i oligonukleosom iz kokošijih eritrocita je dodan uz pomoćMultidrop Combi(Thermo). Jedinjenja su ostavljena do se inkubiraju sa PRC2 tokom 30 min na 25° C, a tada je dodan koktel (10 |uL) koji je sadržavao smešu ne-radioaktivnog SAM i<3>H-SAM sa ciljem da se potakne reakcija (finalni volumen = 51 |iL). Finalne koncentracije su bile kako sledi: divlji-tip PRC2 encim - 4 nM, ne-radioaktivni SAM - 430 nM,<3>H-SAM - 120 nM, olignonukleosom iz kokošijih eritrocita 120 nM, SAH u rupicama sa kontrolom za minimalni signal 1 mM, a koncentracija DMSO je bila 1%. Ogled je zaustavljen uz pomoć dodavanja ne-radioaktivnog SAM (10 uL) do finalne koncentracije od 600 uM, pri čemu pomenuto dodavanje razređuje<J>H-SAM do stepena kada njegova ugradnja u supstrat od olignonukleosoma iz kokošijih eritrocita više nije detektabilna. 50 uT reakcionih smeša iz polipropilenskih pločica sa 384-rupica je preneseno u fleš-pločicu sa 384-rupica, pri čemu su se nukleosomi iz kokošijih eritrocita imobilizirali na površinu pločice, koja je tada tri puta isprana sa 0.1%Tween20u aparatu za ispiranje pločica( Biotek ELx405).Pločice su tada očitane u čitaću pločicaPerkinElmer TopCountsa ciljem da se izmeri količina<3>H-označenih oligonukleosoma iz kokošijih eritrocita koji su se vezali na površinu fleš-pločica, pri čemu se mere raspadanja u minutu (dpm) ili alternativno, se izražavaju kao udari u minutu (cpm).

Račun za %inhibicije:

pri čemu dpm = raspadi u minutu, jed. = signal iz oglednih rupica, a min i maks su odgovarajuće kontrole za minimalne i maksimalne signale.

Četiri-parametarskoIC50podešavanje

pri čemu vrh i dno su normalno ostavljeni da variraju, ali mogu da budu fiksirani na 100 ili 0 u 3-parametarskom podešavanju. Hill-ov koeficijent je normalno ostavljen da varira, ali takođe može da bude fiksiran na 1 u 3-parametarskom podešavanju. Y je % inhibicije, a X je koncentracija jedinjenja.

IC50vrednosti iz ogleda sa PRC2 encimom na peptidnim supstratima (na primer, EZH2 divlji-tip iY641F) su predstavljeni u Tabeli 3 ispod.

Ogled WSU-DLCL2 metilacije

Ćelijska suspenzija WSU-DLCL2 je nabavljena kod DSMZ( German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig, Nemačka). Medijum RPMI/Glutamaks, penicilin-streptomicin, fetalni goveđi serum inaktivisan toplinom, i D-PBS su nabavljeni kod Life Technologies, Grand Island, NY, SAD. Pufer za ekstrahovanje i pufer za neutralizovanje (5x) su nabavljeni kod Active Motif, Carlsbad, CA, SAD. Zečje antitelo protiv histona H3 je nabavljeno kod Abcam, Cambridge, MA, SAD. Zečje antitelo protiv H3K27me3 i HRP-konjugovani anti-zečji-IgG su nabavljeni kod Cell Signaling Technologv, Danvers, MA, SAD. TMB "super osetljivi" supstrat je nabavljen kod BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, USA. Albumin iz goveđeg seruma koji ne sadrži IgG je nabavljen kod Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA. PBS saTween(10x PBST) je nabavljeni kod KPL, Gaithersburg, MD,

SAD. Sumporna kiselina je nabavljeni kod Ricca Chemical, Arlington, TX, SAD. ELISA-pločice (Immulon) su nabavljene kod Thermo, Rochester, NY, SAD. Pločice sa V-dnom za ćelijsku kulturu su nabavljene kod Corning Inc., Corning, NY, SAD. Polipropilenske pločice sa V-dnom su nabavljene kod Greiner Bio-One, Monroe, NC, SAD.

Ćelijska suspenzija WSU-DLCL2 je održavana u medijumu za rast (RPMI 1640, obogaćen sa 10% v/v fetalnim goveđim serumom koji je bio inaktivisan sa toplinom +100 jedinica/mL penicilina-streptomicina), a kultivirana je na 37° C u atmosferi 5% CO2. U uslovima ogleda, ćelije su inkubirane u medijumu za testiranje (RPMI 1640, obogaćen sa 20% v/v fetalnim goveđim serumom koji je bio inaktivisan sa toplinom + 100 jedinica/mL penicilina-streptomicina) na 37° C u atmosferi 5% CO2na šejkeru za pločice.

WSU-DLCL2 ćelije su posejane u medijumu za ogled u koncentraciji od 50000 ćelija/mL u pločici za kulturu ćelija sa V-dnom i 96-rupica pri čemu je svaka rupica dobila 200 uL. Jedinjenje (1 uL) iz početnih pločica sa 96 rupica je direktno dodano u pločice sa V-dnom. Pločice su inkubirane na šejkeru za titar-pločice na 37° C, uz 5% CO2, tokom 96 h. Nakon četiri dana inkubacije, pločice su centrifugovane na 241 g tokom pet minuta, a medijum je pažljivo izvučen iz svake rupica pločice sa ćelijama bez da se narušava konsistencija peleta. Pelet je ponovo suspendovan u 200 uL DPBS, a pločice su opet centrifugovane na 241 g tokom pet minuta. Supernatant je izvučen i ohlađen (4° C). U svaku rupicu je dodan pufer za ekstrakciju (100 uL). Pločice su inkubirane na 4° C u orbitalnom šejkeru tokom dva časa. Pločice su centrifugovane na 3427 g tokom 10 min. Supernatant (80 uL po rupici) je prenesen u odgovarajuću rupicu na polipropilenskoj pločici sa V-dnom i 96 rupica. U polipropilensku pločicu sa V-dnom sa supernatantima je dodan pufer za neutralizovanje (5x, 20 uL po rupici). Polipropilenske pločice sa V-dnom koje su sadržavale sirovi histonski precipitat (CHP) su inkubirane na orbitalnom šejkeru tokom pet minuta. Sirovi histonski precipitati su dodani (2 uL po rupici) u svaku odgovarajuću rupicu (u duplikatu) na ELISA-pločici sa 96 rupica koje su sadržavale 100 uL pufera za prekrivanje (lx PBS + BSA 0.05% w/v). Pločice su začepljene i inkubirane tokom noći na 4° C. Sledećeg dana, pločice su tri puta isprane sa 300 uL po rupici sa lx PBST. Rupice su blokirane tokom dva časa sa 300 uL po rupici sa ELISA-razređivačem ((PBS (lx) BSA (2% w/v) iTween20(0.05% v/v)). Pločice su tri puta isprane sa lx PBST. Za detekciju pločica sa histonom H3, dodano je 100 uL po rupici antitela protiv histona H3 (Abcam, abl791), koje je bilo razređeno 1:10000 u ELISA-razređivaču. Za detekciju pločica sa H3K27 trimetilacijom, dodano je 100 uL po rupici antitela protiv H3K27me3, koje je bilo razređeno 1:2000 u ELISA-razređivaču. Pločice su inkubirane tokom 90 min na sobnoj temperaturi. Pločice su isprane tri puta sa 300 uL lx PBST po rupici. Za detekciju histona H3, dodano je 100 uL HRP-konjugovanog anti-zečjeg IgG-antitela po rupici, pri čemu je pomenuto antitelo bilo razređeno 1:6000 u ELISA-razređivaču. Za H3K27me3 detekciju, dodano je 100 uL HRP-konjugovanog anti-zečjeg IgG-antitela po rupici, pri čemu je pomenuto antitelo bilo razređeno 1:4000 u ELISA-razređivaču. Pločice su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 90 min. Pločice su isprane četiri puta sa lx PBST (300 uL po rupici). 100 uL TMB-supstrata je dodano po rupici. Pločice sa histonom H3 su inkubirane tokom pet minuta na sobnoj temperaturi. Pločice sa H3K27me3 su inkubirane tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena uz pomoć sumporne kiseline (1 N; 100 uL po rupici). Apsorbancija za svaku pločicu je očitana na 450 nm.

Prvo, omer za svaku rupicu je određen uz pomoć jednačine:

Svaka pločica sadrži osam kontrolnih rupica u kojima je proveden tretman samo sa DMSO (minimalna inhibicija) kao i osam kontrolnih rupica za maksimalnu inhibiciju (pozadinske rupice).

Prošek omera vrednosti za svaki tip kontrole je izračunat i korišćen za određivanje procenta inhibicije u svakoj test-rupici na pločici. Testirano jedinjenje je serijski razređeno tri puta u DMSO za ukupno deset testiranih koncentracija, započinjući sa 25 uM. Određenje procenat inhibicije, a IC50krive su generisane primenom dupliranih rupica po koncentraciji jedinjenja. IC50vrednosti za ovaj ogled su predstavljene u Tabeli 3 ispod.

Analiza ćelijske proliferacije

Ćelijska suspenzija WSU-DLCL2 je nabavljena kod DSMZ( German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig, Nemačka). Medijum RPMI/Glutamaks, penicilin-streptomicin, fetalni goveđi serum koji je inaktivisan toplinom su nabavljeni kod Life

Technologies, Grand Island, NY, SAD. Polipropilenske pločice sa V-dnom i 384-rupica su nabavljene kod Greiner Bio-One, Monroe, NC, SAD. Bele neprozirne pločice za kulturu ćelija sa 384-rupica su nabavljene kod Perkin Elmer, Waltham, MA, SAD.Cell- Titer Glo<®>je nabavljen kod Promega Corporation, Madison, WI, SAD. Čitač pločicaSpectraMcvc M5je nabavljeni kod Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, SAD.

Ćelijska suspenzija WSU-DLCL2 je održavana u medijumu za rast (RPMI 1640, obogaćen sa 10% v/v fetalnim goveđim serumom koji je bio inaktivisan sa toplinom), a kultivirana je na 37° C u atmosferi 5% CO2. U uslovima ogleda, ćelije su inkubirane u medijumu za testiranje (RPMI 1640, obogaćen sa 20% v/v fetalnim goveđim serumom koji je bio inaktivisan sa toplinom + 100 jedinica/mL penicilina-streptomicina) na 37° C u atmosferi 5% CO2.

Za procenu uticaja jedinjenja na proliferaciju WSU-DLCL2 ćelijske linije, ćelije koje su rasle eksponencijalno su uzgajane u belim neprozirnim pločicama sa 384-rupica u koncentraciji od 1250 ćelija/ml u finalnom volumena od 50\ i\u medijumu za testiranje. Početne pločice sa jedinjenjem su pripremljene uz pomoć triplikata od devet-tačaka sa serijskim razređenjem od 3-puta u DMSO, započinjući sa 10 mM (finalna gornja koncentracija jedinjenja u ogledu je 20 uM, a za DMSO je 0.2%). Alikvot od 100 nL jedinjenja iz stok-pločice je dodan u odgovarajuću rupicu na pločici sa ćelijama. Kontrola za 100% inhibiciju se sastojala od ćelija tretiranih sa 200 nM staurosporinom (finalna koncentracija), a kontrola za 0% inhibiciju se sastojala od ćelija tretiranih sa DMSO. Nakon dodavanja jedinjenja, test-pločice su inkubirane tokom 6 dana na 37° C, uz 5% CO2i relativne vlažnosti > 90%. Vijabilnost ćelija je izmerena uz pomoć kvantifikovanja ATP koji je prisutan u ćelijskim kulturama uz dodavanje 35 ulCell Titer Glo<®>reagenasa u pločici sa ćelijama. Luminiscencija je očitana u aparatuSpectraMcvc M5.Koncentracija koja inhibira ćelijsku vijabilnost za 50% je određena uz pomoć 4-parametrijskog podešavanja normalizovanih kriva odgovora na dozu. IC50vrednosti za ovaj ogled su prikazane u Tabeli 3 ispod.

In vivostudija - Ćelijska linija SUDHL10 humanog limfoma

Miševi

Ženke miševa sojaFox Chase SCID<®>( CBllflcr- Prkdcscid/ IcrlcoCrl,Beijing Vitalriver Laboratorv Animal Co., LTD) su bile 6-8 sedmica stare, a telesne težine (BW) su se kretale u rasponu od 16.0-21.1 g tokom Dl studije. Životinje su vodu i hranu (sterilnu) uzimalead libitum,a hranile su se sa suvim granulama koje su bile sterilizovane zračenjem. Miševi su držani na podlozi od kukuruznih klipova u statičkim mikroizolatorima pod režimom 12-časovne rasvete na 20-22° C (68-72 °F) i 40-60% vlažnost. Sve procedure su bile u skladu sa preporukama Priručnika za brigu i korišćenje laboratorijskih životinja( Guide for Care and Use of Laboratory Animals)šta se tuče ograničenja kretanja, razmnožavanja, hirurških procedura, regulisanja hrane i tečnosti, i veterinarske brige.

Kultura tumorskih ćelija

Ćelijska linija humanog limfoma SUDHL10 je dobivena od DSMZ, a održavana je u CRO kao suspenzija u RPMI-1640 medijumu koji je sadržavao 100 jedinica/mL natrijumove soli penicilina G, 100 g/mL streptomicina i 10% fetalnog goveđeg seruma. Ćelije su kultivirane u bocama za kulturu tkiva u vlažnom inkubatoru na 37° C, u atmosferi od 5% CO2i 95% vazduha. Za implantaciju su bile korišćene samo kulture ispod pasaže 12.

In vivoimplantacija tumora

Ćelijska linija humanog limfoma SUDHL10 je sakupljena tokom srednje-log faze rasta, a ponovo je suspendovana u PBS sa 50% Matrigel™ (BD Biosciences). Svaki mišje supkutano, u desnom boku, primio 1 x IO<7>ćelija (0.2 mL ćelijske suspenzije). Tumori su mereni šestarom (dve dimenzije) sa ciljem da se prati njihov rast kako je srednji volumen dosezao željeni raspon od 80-120 mm<3>. Veličina tumora, u mm<3>, je izračunata iz:

pri čemuw= širina, a / = dužina, u mm, tumora. Težina tumora može da se proceni ako se uzme u obzir da 1 mg odgovara 1 mm<3>tumorskog volumena. Nakon 10 dana, miševi sa veličinom tumora od 72-256 mm<3>su sortirani u četiri grupe (n = 16 po grupi) koje su imale srednje tumorske volumene od 173-179 mm<3>.

Testirani članovi

Hidrobromid Jedinjenja I je uskladišten na sobnoj temperaturi zaštićen od svetla. Tokom svakog dana tretmana, pripremane su sveže formulacije jedinjenja uz pomoć suspendovanja praha u 0.5% natrijum karboksimetilcelulozi (NaCMC) i 0.1%Tween<®>80 u dejonizovanoj vodi. Prenosnik, 0.5% NaCMC i 0.1%Tween<®>80 u dejonizovanoj vodi, je korišćen sa ciljem tretiranja kontrolne grupe primenom istog rasporeda. Pre administriranja, formulacije su uskladištene zaštićene od svetla na 4 °C.

Plan tretmana

Miševi su tretirani sa dozama hidrobromida Jedinjenja I u rasponu od 125-500 mg/kg primenom režima BID (dva puta na dan, svakih 12 h) tokom 28 dana uz pomoć oralne gavaže. Svaka doza je bila dostavljena u volumenu od 0.2 mL/20 g mišjeg tela (10 mL/kg), a bila je podešena na poslednju zabeleženu težinu svake pojedinačne životinje. Tokom dana 25, 8 miševa sa najmanjim tumorima po grupi je izabrano kao izlazna tačka za procenu odgađanja tumorskog rasta (opservacija od najviše 60 dana). Preostale životinje su žrtvovane dana 28, 3 h nakon poslednje doza za sakupljanje tumora.

Medijana tumorskog volumena (MTV) i analiza inhibicije rasta tumora (TGI) Efikasnost tretmana je određena tokom poslednjeg dana tretmana. MTV(n), medijana tumorskog volumena za n broj životinja, koja se procenjuje poslednjeg dana, je određena za svaku grupu. Procenat inhibicije rasta tumora (%TGI) može da se definiše na nekoliko načina. Prvo, razlika između MTV(n) označene kontrolne grupe i MTV(n) grupe koja je tretirana sa lekom se izražava kao procenat MTV(n) kontrolne grupe:

Drugi način izračunavanja %TG1 uzima u obzor promenu veličine tumora od dana 1 do dana n pri čemu je n dan poslednjeg tretmana.

Analizaodgađanja rasta tumora

Osam miševa po grupi je držano na životu nakon poslednjeg dana tretmana za analizu odgađanja rasta tumora. Tumori su mereni šestarom dva puta sedmično, a svaka testirana životinja je žrtvovana kada je njena neoplazma dosegla volumen izlazne tačke od 2000 mm<3>ili tokom pre-speciifkovanog dana studije, koje god se dogodilo prvo. Provedena je analiza preživljenja po Kaplan-Meier-u.

Toksičnost

Životinje su vagane dnevno tokom Dana 1-5, a tada dva puta sedmično do kompletovanja studije. Miševi su često proveravani za vidljive znakove bilo kojeg štetnog efekta, koji je bio povezan sa tretmanom, a sve je dokumentovano. Prihvatljiva toksičnost za maksimalno tolerisanu dozu (MTD) je definisana kao srednja vrednost gubitka telesne mase u određenoj grupi koja je bila manja od 20% tokom testa, pri čemu smrtnost povezana sa tretmanom nije bila veća od 10%. Smrt je bila klasifikovana kao takva koja je povezana sa tretmanom (TR) ako ju se moglo povezati sa nus-pojavama tretmana koje su bile označene kao klinički znaci i/ili su bili otkriveni autopsijom, ili usled nepoznatih uzroka tokom perioda doziranja. Smrt je trebala biti klasifikovana kao takva koja nije povezana sa tretmanom (NTR) ako je bilo naznaka da ista nije imala veze sa nus-pojavama tretmana. NTR smrtni slučajevi tokom doznog intervala tipično će biti kategorizovani kao NTRa (usled nesreće ili ljudske pogreške) ili NTRm (usled širenja tumora invazijom i/ili metastaziranjem koje je bilo potvrđeno autopsijom). Oralno tretirane životinje koje su umrle od nepoznatih uzroka tokom doznog perioda mogu da se klasifikuju kao NTRu kada grupna performansa ne podupire TR-klasifikaciju, a autopsija, koja bi odbacila pogrešku doziranja, nije bila provedena.

Uzimanjeuzoraka

Tokom dana 28 osam miševa sa najvećim tumorima je uzorkovano primenom pre-specifikovanog načina sa ciljem da se proceni ciljana inhibicija u tumorima. Tumori su sakupljeni sa specifikovanih miševa u uslovima bez prisustva RNAze, a tada su secirani. Izmerena je totalna tumorska težina. Sakupljeno tumorsko tkivo sa svake životinje je brzo smrznuto u tečnom N2, a tada je pretvoreno u prah (pulverizovano) u avanu.

Statističke i grafičke analize

Sve statističke i grafičke analize su provedeneu Prism 3. 03(GraphPad) za Windows. Sa ciljem testiranja statičkog značaja razlika između kontrole i tretiranih grupa tokom celog trajanja tretmana primenjena su ponovljena merenja sa ANOVA-testo, nakon čega je proveden Dunnet-ov test multiple uporedbe. RezultatiPrismnisu bili značajni (ne-signifikantni - ns) akoP >0.05, značajni (označeni sa "<*>") ako 0.01<P<0.05, veoma značajni ("<**>") ako 0.001 <P <0.01 i izrazito značajni ("<***>") akoP <0.001. Šta se tiče ogranka studije odgađanja rasta tumora, procenat preostalih životinja u svakoj grupi u odnosu na protok vremena je predstavljen u grafikonu Kaplan-Meier-ovog preživljenja.

Ekstrakcija histona

Kod izolovanja histona, 60-90 mg tumorskog tkiva je homogenizovano u 1.5 ml pufera za ekstrakciju jedara (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 25 mM KC1, 1% Triton X-100, 8.6% Saharoza, plus jedna tableta 1836145 inhibitora proteaze od Roche) i inkubirano na ledu tokom 5 min. Jedra su sakupljena uz pomoć centrifugovanja na 600 g tokom 5 min na 4° C pa su jednom isprana sa PBS. Supernatant je odstranjen, ahistoni su ekstrahovani tokom jednog časa, uz vorteksovanje svakih 15 min, sa 0.4 N hladnom sumpornom kiselinom. Ekstrakti su centrifugovani na 10000 g tokom 10 min na 4° C pa su prebačeni u nove tube za mikro-centrifugu koji su sadržavale 10 volumena ledenog acetona. Histoni su precipitirani na -20° C tokom 2 h preko noći, oboreni u talog centrifugovanjem kod 10000 g tokom 10 min pa su ponovo suspendovani u vodi.

ELISA

Histoni su pripremljeni u ekvivalentnim koncentracijama u puferu za prekrivanje (PBS + 0.05% BSA) koje daje 0.5 ng/ul po primerku, a tada je dodano 100 ul primerka ili standarda u duplikatu u ELISA-pločicu sa 296-rupica (Thermo Labsvstems, Immulon 4HBX #3885). Pločice su začepljene i inkubirane tokom noći na 4° C. Sledećeg dana, pločice su isprane 3x sa 300 ul/rupici PBST (PBS + 0.05%Tween20;10x PBST, KPL #51-14-02) u aparatu za ispiranje pločicaBioTek.Pločice su blokirane sa 300 ul/rupici razređivača (PBS + 2% BSA + 0.05%Tween20),inkubirane na ST tokom 2 h, i isprane 3x sa PBST. Sva antitela su razređena u razređivaču. U svaku pločicu je dodano 100 ul/rupici anti-H3K27me3 (CST #9733, 50% stok u glicerolu, 1:1000) ili anti-total H3 (Abcam abl791, 50% stok u glicerolu, 1:10000). Pločice su inkubirane tokom 90 min na ST pa su isprane 3x sa PBST. Po 100 ul/rupici anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technologv, 7074) je dodano u H3K27Me3-pločicu (1:2000) i u H3-pločicu (1:6000), a obe su inkubirane tokom 90 min na ST. Pločice su isprane 4x sa PBST. Za detekciju, u obe pločice je dodano po 100 ul/rupici TMB supstrata (BioFx Laboratories, #TMBS), a pločice su inkubirane u tami na ST tokom 5 min. Reakcija je zaustavljena sa 100 ul/rupica IN H2SO4. Apsorbancija na 450 nm je očitana u čitaču mikro-pločicaSpectaMaks

M5.

Rezulti:

Miševi koji su nosili SUDHL10 tumorske ksenografe su bili tretirani sa hidrobromidom Jedinjenja I u maksimalno tolerisanoj dozi od 500 mg/kg BID i frakcije MTD( Vii !4 MTD). Sve doze su bile dobro tolerisane (podnete) tokom 28 dana bez bilo kakvog značajnog gubitka telesne težine. Primećena je jedna smrt koja nije bila povezana sa tretmanom u grupi sa 500 mg/kg tokom dana 15 zbog pogreške doziranja. Sve doze su rezultovale inhibicijom rasta tumora ako se uporedi sa prenosnikom tokom dana 28 (Tabela 4), a doze od 250 mg/kg i 500 mg/kg (BID grupe) su indukovale regresiju (TGI > 100%).

Slika 12A pokazuje rast ksenografa sa SUDHL10 tumorima tokom vremena za različite tretirane grupe. BID grupa sa dozom od 125 mg/kg je značajno različita u odnosu na grupu sa prenosnikom (ponovljena ANOVA merenja i Dunnett-ov post-test), ali srednja veličina terminalnog tumora tokom dana 28 je značajno manja u odnosu na veličinu u prenosnik-grupi (dvostruka ANO VA sa Bonferroni-evim post-testom, p < 0.0001). Doziranje od 250 mg/kg BID i 500 mg/kg BID hidrobromida Jedinjenja I tokom 28 dana indukuje uporedive odgovore regresije jer su težine terminalnih tumora tokom dana 28 bile manje u obe pomenute grupe (Slika 12B).

Histoni koji su bili izolovani iz tumora koji su sakupljeni tokom dana 28 (3 h nakon zadnje doze) su podvrgnuti ELISA-analizi za proveru nivoa globalnog H3K27me3. Slika 13 pokazuje jasno dozno-zavisno opadanje metilne oznake kod H3K27me3 kada se primenjuje tretman sa hidrobromidom Jedinjenja I. Ova slika pokazuje globalnu metilaciju H3K27me3 u SUDHL10 tumorima iz miševa tretiranih sa hidrobromidom Jedinjenja I tokom 28 dana.

Tokom dana 25 osam miševa po grupi sa najmanjim tumorima je odabrano za studiju odgađanja rasta tumora sa ciljem da se proceni ponovni rast tumora nakon prestanka doziranja tokom dana 28. Miševi su bili žrtvovani kada su njihovi tumori dosegli veličinu od 2000 mm<3>ili tokom dana 60 (koji god događaj je nastupilo prvi). Ovi podaci su korišćeni da se provede Kaplan-Meier-ova analiza preživljenja. Slika 14A pokazuje daje ponovni rast tumora bio jasno dozno-zavisan, a svi miševi tretirani sa najvišom dozom od 500 mg/kg BID tokom 28 dana su preživeli sve do dana 60. Jedino 2 miša su morala biti žrtvovana u grupi sa dozom od 250 mg/kg pre dana 60. Miševi iz grupe sa dozom od 125 mg/kg su pokazali jasnu prednost (šta se tiče preživljenja) u odnosu na miševa koji su bili tretirani samo sa prenosnikom pri čemu se medijana preživljenja povećala za 15.5 dana (Slika 14B).

Anti- tumorski efekt hidrobromida Jedinjenja I u mišjem modelu sa Pfeiffer- ovim

humanim difuznim limfomom velikih B- ćelija ( ksenogaf model)

Monohidrobromid Jedinjenja I je testiran na anti-tumorsko delovanje u mišjem modelu sa Pfeiffer-ovom ksenografom (miš nosi presadak ljudskog difuznog limfoma velikih B-ćelija). Ženke 5-sedmica starih NSG miševa (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) su supkutano dobile 20 do 25 mg tumorskih fragmenata. Tretman je započet približno 31 dana nakon implantacije tumora, kada su prosečni tumori dosegli približno 365 mm<3>. Shema za tretman je opisana u Tabeli 5.

Kroz eksperiment je praćen tumorski volumen. Tumorski volumen je meren dva puta sedmično nakon početka tretmana. Opterećenje sa tumorom (mg = mm<3>) je izračunato iz merenja sa šestarom primenom formule za volumen izduženog elipsoida (L x W<2>)/2 pri čemu L i W su ortogonalna dužina i širina (mm).

Dan 1 je dan prvog tretmana, a Dan 28 je dan poslednjeg tretmana. Ova studija je završena 36 dana nakon poslednje doze, tako daje Dan 64 bio dan završetka studije. Primame izlazne tačke koje su korišćene za procenu efikasnosti u ovoj studiju su potpuna regresija tumora (CR), tumorska veličina u pojedinim grupama, i procenat inhibicije tumora na kraju studije. Kompletan odgovor je bio definisan kao smanjenje veličine tumora do veličine koja ne može da se detektuje (< 20mm<3>) na kraju studije. Vrednosti za procenat inhibicije tumora su izračunate iz formule [1-(AT/AC)] x 100, gde AT i AC su promene srednjeg tumorskog volumena (A rast) u svakoj tretiranoj (T) i kontrolnoj (samo prenosnik) grupi (C). To i Co (jedan dan pre prve doze) su korišćeni za početni tumorski volumen. Dodatno, tumorski volumeni koji su izmereni jedan dan nakon poslednje doze (T29i C29) su korišćeni za izračunavanje AT i AC. Kada su vrednost bile veće od 100%, bile su zaključene kao da su 100%. Formula koja je korišćena za izračunavanje procenta inhibicije tumora je prikazana ispod.

Tokom perioda tretmana, bilo je pronađeno da životinje ne mogu da tolerišu dnevni tretman od 1142 mg/kg hidrobromida Jedinjenja I zbog čega su tri životinje u ovoj grupi (grupa E) morače biti eutanazirane nakon prve sedmice tretmana zbog gubitka od više od 20% osnovne telesne težine. Tako, administriranje leka u ovoj grupi je zaustavljeno nakon 12 doza. Životinje iz ostale tri dozne grupe, osim jedne životinje u grupi D (342 mg/kg hidrobromida Jedinjenja I), su dobro tolerisale 28-dnevni tretman uz minimalan gubitak telesne težine. Relativna mišja telesna težina je prikazana na Slici 15. Telesna težine životinje, koja je izmerena tokom Dana 0, u grafikonu je korišćena kao osnovna telesna težina.

Hidrobromid Jedinjenja I je pokazao snažno i dugotrajno anti-tumorsko delovanje u Pfeiffer-ovom modelu sa CR-stopom od 100% u tri od četiri dozne grupe (Tabela 6). Staviše, ponovni rast tumora nije primećen čak 36 dana nakon prekida tretmana. Ovo sugeriše da su tokom tretmana poubijane sve tumorske ćelije. Mada je ponovni rast tumora primećen u grupi sa najmanjom dozom (grupa B, 34.2 mg/kg), jasno delovanje prema tumorskoj stazi je primećeno tokom perioda tretmana (Slika 16). Tumor je jedino ponovo počeo da raste nakon prekida tretmana (Slika 16). Ovaj rezultat takođe sugeriše daje tumorska staza, primećena u grupi B, uistinu indukovana delovanjem ispitivanog jedinjenja.

Claims (30)

1. Jednjenje, naznačeno time, što je N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-ilmetil-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)- [1,1 '-bifenil] -3 - karboksamid hidrobromid.

2. Jedinjenje iz zahteva l, naznačeno time, što jer monohidrobromid.

3. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1-2, naznačeno time, što pomenuto jedinjenje je kristalno.

4. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva iznad, naznačeno time, što pomenuto jedinjenje je uglavnom oslobođeno od primesa.

5. Jedinjenje iz bilo kojeg od prethodnih zahteva, naznačeno time, što pomenuto jedinjenje je kristalna čvrsta materija uglavnom oslobođena od amorfnog N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)- [1,1 '-bifenil] -3 -karboksamid hidrobromida.

6. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1-5, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili razređivač.

7. Postupak za pripremu jedinjenja iz zahteva 1, naznačen time, što obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

8. Polimorf A, naznačen time, što je polimorf N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-ilmetil-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil] -3 -karboksamid hidrobromida.

9. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži jedan ili više karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, i oko 22.0 +/- 0.3 stepena 2-teta.

10. Polimorf u skladu sa bilo kojem od zahteva od 8-9,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 17.5 +/- 0.3 stepena, i oko 22.0 +/- 0.3 stepena 2-teta.

11. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji obuhvata jedan ili više karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, oko 14.3 +/- 0.3 stepena, oko 18.7 +/- 0.3 stepena, oko 23.3 +/- 0.3 stepena, i oko 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

12. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži najmanje 5 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

13. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži najmanje 6 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

14. Polimorf u skladu sa zahtevom 8, naznačentime,što ima obrazac difrakcije X-zraka koji sadrži najmanje 7 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/-0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

15. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži najmanje 8 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

16. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži najmanje 9 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

17. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži najmanje 10 karakterističnih šiljaka izraženih u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/- 0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

18. Polimorf u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji sadrži karakteristične šiljke izražene u stepenima 2-teta kod oko 3.9 +/-0.3 stepena, 10.1 +/- 0.3 stepena, 14.3 +/- 0.3 stepena, 17.5 +/- 0.3 stepena, 18.7 +/- 0.3 stepena, 20.6 +/- 0.3 stepena, 20.9 +/- 0.3 stepena, 21.8 +/- 0.3 stepena, 22.0 +/- 0.3 stepena, 23.3 +/- 0.3 stepena i 23.6 +/- 0.3 stepena 2-teta.

19. Polimorf iz bilo kojeg od zahteva od 8-18,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji se suštinski poklapa sa onim na Slici 1.

20. Polimorf iz bilo kojeg od zahteva od 8-19,naznačen time,što ima obrazac difrakcije X-zraka na prahu koji se suštinski poklapa sa podacima iz Tabele 1.

21. Polimorf iz bilo kojeg od zahteva od 8-20,naznačen time,što ima termogram diferencijalne skening kalorimetrije koji sadrži karakteristični šiljak izražen u ° C i koji se pojavljuje na temperaturi od 255 +/- 5° C.

22. Polimorf iz bilo kojeg od zahteva od 8-21, naznačen time, što ima termogram diferencijalne skening kalorimetrije koji se suštinski poklapa sa onim iz Slike 3.

23. Postupak za pripremu polimorfa iz bilo kojeg od zahteva od 8-22, naznačen time, što obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-ilmetil-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

24. Postupak ponovnog kristalizovanja polimorfa iz bilo kojeg od zahteva od 8-22, naznačen time, što obuhvata sledeće korake: (a) rastvaranje Polimorf A u prvom rastvaraču, i (b) dodavanje drugog rastvarača tako da se pomenuti polimorf ponovo kristalizuje.

25. Postupak iz zahteva 24, naznačen time, što pomenuti prvi rastvarač je etanol, a drugi rastvarač je MTBE.

26. Postupak iz zahteva 16, naznačen time, što obuhvata (a) rastvaranje Polimorfa A u etanolu, (b) grejanje smeše, (c) dodavanje MTBE u pomenutu smešu, formiranje precipitata koji sadrži pomenuti polimorf, i filtriranje precipitata tako da se pomenuti polimorf ponovo kristalizuje.

27. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži pomenuti polimorf iz bilo kojeg od zahteva od 8-22, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili razređivač.

28. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1-5, polimorf iz bilo kojeg od zahteva od 8-22, ili neka farmaceutska kompozicija iz bilo kojeg od zahteva 6 ili 27, naznačeni time, što se koriste u postupku za tretiranje raka.

29. Jedinjenje, polimorf, ili neka farmaceutska kompozicija za upotrebu iz zahteva 28, naznačeni time, što pomenuti rak je ne-Hodgkin-ov limfom, folikulami limfom (FL), difuzni limfom velikih B-ćelija (DLBCL), ili rak dojke.

30. Postupak za pripremu N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-ilmetil-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l, 1 '-bifenil]-3-karboksamida,naznačen time,što obuhvata reagovanje 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[l,r-bifenil]-3-karboksilne kiseline (5) sa soli 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2( 1 H)-on.