RS59392B1 - N-((4,6-dimetil-2-okso-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2h-piran-4-il)amino)-4-metil-4’ (morfolinometil)-[l,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid za upotrebu u lečenju proliferativnih poremećaja ćelija hematološkog sistema - Google Patents

Description

Opis

OSNOV PRONALASKA

[0001] Procenjuje se da je u 2012. kod više od 1.6 miliona ljudi dijagnostifikovan kancer. Na primer, najčešća vrsta raka kode žena je rak dojke, i ova bolest je odgovorna za jednu od najviših stopa smrtnosti od svih kancera koji pogađaju žene. Trenutno lečenje raka dojke je ograničeno na potpunu ili parcijalnu mastektomiju, radioterapiju ili hemioterapiju. Skoro 230,000 slučajeva raka u 2012. će biti rak dojke, što će, kako se procenjuje, dovesti do 40,000 smrtnih slučajeva. Videti, Siegel et al, Ca Cancer J Clin 2012; 62:10-29.

[0002] Izvestan broj smrtnih slučajeva do kojih dovodi rak, posledica su hematoloških kancera, uključujući leukemije, mijelome i limfome. U 2012. godini, 80,000 slučajeva raka će biti limfomi, što će, kako se procenjuje, dovesti do 20,000 smrtnih slučajeva.

[0003] Radioterapija, hemioterapija i operacije su primarne metode za lečenje raka. Međutim, ove terapije su najuspešnije samo kada se rak otkrije u ranom stadijumu. U momentu kada je kancer došao do invazivnog/metastatskog stadijuma, linije invazivnih ćelija ili metastazirajućih ćelija mogu da izbegnu detekciju, što dovodi do recidiva, čime postaje neophodna upotreba veoma toksične terapije. U tom trenutku, kako ćelije raka, tako i nepogođene ćelije pacijenta, izložene su toksičnoj terapiji, što, između ostalih komplikacija, dovodi do slabljenja imunog sistema.

[0004] U tom smislu, u oblasti ostaje potreba za novim metodama za lečenje raka, kao što su rak dojke ili limfomi, kod pacijenta.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima.

[0006] Shodno tome, ovde je prikazan N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid:

[0007] Ovde je takođe prikazan konkretan polimorfni oblik N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida ("polimorf A," ili "polimorf A N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida"). Kao što je ovde opisano, ovde obezbeđena so hidrobromida, kao i polimorf A, prikazuju fizička svojstva koja mogu da se iskoriste kako bi se dobila nova farmakološka svojstva, a to može da se koristi u razvoju supstanci i proizvoda koji predstavljaju lekove.

[0008] U jednom primeru izvođenja, hidrobromid je kristalna supstanca. U drugom primeru izvođenja, hidrobromid ne sadrži nečistoće. U drugom primeru izvođenja, hidrobromid je kristalna čvrsta supstanca koja suštinski ne sadrži amorfni N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid.

[0009] Ovde je prikazana farmaceutska kompozicija koja sadrži hidrobromid opisan prethodno u tekstu i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0010] Hidrobromid opisan prethodno u tekstu može da se pripremi upotrebom postupka koji obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

[0011] Polimorf A N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida može da se definiše na osnovu svog rendgenskog difraktograma praha. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima jedan ili više karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 17.5 /- 0.3 stepeni i 22.0 /- 0.3 stepena 2-teta. U drugom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove izražene u stepenima 2-teta na 3.9 /-0.3 stepeni, 17.5 /- 0.3 stepeni i 22.0 /- 0.3 stepena 2-teta. U dodatnom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove izražene u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta. U dodatnom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha suštinski saglasan slici 1. U drugom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha suštinski saglasan tabeli 1.

[0012] Polimorf A može da se definiše i prema svom termogramu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije. U jednom primeru izvođenja, polimorf prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji ima karakterističan pik izražen u jedinicama °C na temperaturi od 255 /-5°C. U jednom primeru izvođenja, polimorf prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji je suštinski saglasan slici 3.

[0013] Polimorf A može da se pripremi upotrebom postupka koji obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil 2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

[0014] Ovde je opisan postupak za rekristalizaciju polimorfa A, koji obuhvata sledeće korake: (a) rastvaranje polimorfa A u prvom rastvaraču i (b) dodavanje drugog rastvarača, tako da se pomenuti polimorf rekristališe. Na primer, prvi rastvarač je etanol a drugi rastvarač je MTBE. Na primer, postupak obuhvata (a) rastvaranje polimorfa A u etanolu, (b) zagrevanje smeše, (c) dodavanje MTBE smeši, obrazovanje precipitata koji sadrži pomenuti polimorf i filtriranje precipitata tako da se pomenuti polimorf rekristališe.

[0015] Ovde je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži polimorf A i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0016] Ovde je takođe opisan postupak za lečenje raka koji obuhvata primenu, kod subjekta kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine jedinjenja hidrobromida koje je opisano prethodno u tekstu, polimorfa A, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od ovih jedinjenja. Moguće je lečiti niz kancera, uključujući ne-Hočkinov limfom ili rak dojke.

[0017] Ovde je opisan postupak inhibiranja histon metiltransferazne aktivnosti EZH2 kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu kod subjekta efikasne količine hidrobromida jedinjenja koje je opisano prethodnom u tekstu, polimorfa A, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od ovih jedinjenja.

[0018] Ovde je opisan postupak inhibiranja histon metiltransferazne aktivnosti EZH2 in vitro koji obuhvata primenu jedinjenja hidrobromida koje je opisano prethodno u tekstu ili polimorfa A.

[0019] Ovde je opisana upotreba jedinjenja hidrobromida, opisanog prethodno u tekstu, polimorfa A, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od ovih jedinjenja, za pripremu medikamenta za lečenje raka kod subjekta kome je to potrebno.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]

Slika 1 prikazuje rendgenski difraktogram praha polimorfa A (monohidrobromid).

Slika 2 prikazuje rendgenski difraktogram praha dihidrobromida jedinjenja I.

Slika 3 prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije polimorfa A.

Slika 4 prikazuje dinamičku sorpciju pare polimorfa A, koja pokazuje nisku higroskopnost ovog jedinjenja.

Slika 5 prikazuje HPLC analizu polimorfa A tokom tri dana, na povišenoj temperaturi. Polimorf A je tokom ovog vremena proizveo minimalne nečistoće.

Slika 6 prikazuje dinamičku sorpciju pare natrijumove soli jedinjenja I, koja pokazuje značajnu higroskopnost ovog jedinjenja.

Slika 7 prikazuje dinamičku sorpciju pare hemisulfatne soli jedinjenja I, koja pokazuje da ovo jedinjenje ima umereno visoku higroskopnost.

Slika 8 prikazuje diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju monohidrohloridne soli jedinjenja I, koja ukazuje na to da ovo jedinjenje slabo kristalizuje.

Slika 9 prikazuje rendgenski difraktogram praha sintetskog intermedijera 5.

Slika 10 prikazuje rendgenski difraktogram praha polimorfa B.

Slika 11 prikazuje rendgensku kristalnu strukturu monohidrobromida jedinjenja I.

Slike 12-14 prikazuju rezultate in vivo studija hidrobromida jedinjenja I u ćelijskoj liniji humanog limfoma.

Slike 15-16 prikazuju antikancersko delovanje hidrobromida jedinjenja I kod mišijeg ksenograft modela za limfom.

Slika 17 prikazuje rendgenski difraktogram praha sintetskog intermedijera 2.

Slike 18A i B prikazuju (A) rendgenski difraktogram praha trihidrohlorida soli jedinjenja I i (B) dinamičku sorpciju pare monohidrohloridne soli jedinjenja I, koja pokazuje značajnu higroskopnost ovog jedinjenja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Oblik soli HBr i oblik polimorfa A

[0021] Ovde je opisan N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid:

[0022] Kako se ovde koristi, "Jedinjenje I" odnosi se na N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid. Hidrobromid jedinjenja I može da se koristi da inhibira histon metiltransferaznu aktivnost EZH2, bilo u subjektu ili in vitro. Hidrobromid jedinjenja I može takođe da se koristi za lečenje raka kod subjekta kome je to potrebno.

[0023] Jedinjenje I može da bude protonizovano na jednom ili više svojih baznih mesta, kao što su morfolinski, disupstituisani anilinski i/ili piridonski ostaci. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni monohidrobromidi, dihidrobromidi ili trihidrobromidi jedinjenja I. U jednom primeru izvođenja, ovde je obezbeđen monohidrobromid jedinjenja I. Kada je jedinjenje monohidrobromid, ono može da se protonizuje na bilo kom baznom mestu. U neograničavajućem primeru izvođenja, jedinjenje I je protonizovano na azotu morfolinskog supstituenta, obezbeđujući monohidrobromid jedinjenja I koji ima sledeću strukturu:

[0024] Ovaj konkretni monohidrobromid može da se označava kao "4-((3’-(((4,6-dimetil-2-okso 1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-5’-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil-[1,1’-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-ijum bromid". Slika 11 prikazuje rendgensku kristalnu strukturu ovog konkretnog oblika soli.

[0025] Hidrobromid jedinjenja I poseduje izvestan broj povoljnijih fizičkih svojstava u odnosu na oblik svoje slobodne baze, kao i druge soli slobodne baze. Naročito, hidrobromid jedinjenja I ima nisku higroskopnost u poređenju sa drugim oblicima soli jedinjenja I. Da bi neko jedinjenje bilo efikasno u terapiji, u principu se traži da to jedinjenje bude minimalno higroskopno. Oblici lekova koji su visoko higroskopni mogu da budu nestabilni, pošto stopa rastvaranja datog oblika leka može da se menja ako se on čuva u sredini sa varijabilnom vlažnošću. Higroskopnost takođe može da utiče i na rukovanje i proizvodnju velikih količina jedinjenja, pošto može da bude teško sa se odredi prava težina higroskopnog aktivnog agensa prilikom pripremanja farmaceutske kompozicije koja sadrži taj agens. Hidrobromid jedinjenja I ima nisku higroskopnost u poređenju sa drugim oblicima soli jedinjenja I. Kao takav, on može da se čuva tokom značajnijih perioda vremena a da ne pretrpi štetne promene, na primer, rastvorljivosti, gustine, ili čak i hemijskog sastava.

[0026] Uz prethodno pomenute prednosti, hidrobromid jedinjenja I može da se proizvodi u visoko kristalnom obliku, koji je koristan za pripremanje farmaceutskih formulacija, i koji će uopšteno poboljšati rukovanje, manipulaciju i skladištenje jedinjenja leka. U poželjnom primeru izvođenja, kristalni oblik hidrobromida jedinjenja I je u obliku koji se označava kao "polimorf A."

[0027] Sposobnost neke supstance da postoji u više od jednog kristalnog oblika definiše se kao polimorfizam; različiti kristalni oblici određene supstance označavaju se kao "polimorfi." U principu, na polimorfizam utiče sposobnost molekula supstance da promeni svoju konformaciju ili da obrazuje različite intermolekularne ili intra-molekularne interakcije, naročito vodonične veze, što se odražava u vidu različitih atomskih aranžmana u kristalnim rešetkama različitih polimorfa. Nasuprot tome, opšti spoljašnji oblik supstance je poznat kao "morfologija," što se odnosi na spoljašnji oblik kristala i prisutnih ravni, bez referenci na unutrašnju strukturu. Kristali mogu da prikazuju različitu morfologiju na osnovu različitih uslova kao što su, na primer, stopa rasta, mešanje ili prisustvo nečistoća.

[0028] Različiti polimorfi neke supstance mogu da poseduju različite energije kristalne rešetke i stoga oni u čvrstom stanju mogu da prikazuju različita fizička svojstva kao što su oblik, gustina, tačka topljenja, boja, stabilnost, rastvorljivost, stopa rastvaranja, itd., koja, sa svoje strane, mogu da utiču na stabilnost, stopu rastvaranja i/ili biodostupnost datog polimorfa i njegovu pogodnost za upotrebu u vidu farmaceutske supstance i u farmaceutskim kompozicijama.

[0029] Polimorf A je visoko kristalna supstanca i prikazuje nisku higroskopnost. Takođe, ovaj polimorf može da se dobija reproducibilno i neznatne promene u uslovima kristalizacije ne dovode do nastanka različitih kristalnih oblika.

[0030] Pristup različitim polimorfima hidrobromida jedinjenja I je poželjno zbog niza razloga. Jedan od tih razloga je to što pojedinačni polimorfi mogu da inkorporiraju različite nečistoće, ili hemijske ostatke, tokom kristalizacije. Na primer, nečistoće mogu da se uklone tokom procesa konvertovanja jedinjenja I u polimorf A.

[0031] Bez želje za teorijskim ograničenjem, oblici polimorfa koji prikazuju kompaktne kristalne oblike poseduju prednosti u smislu lakoće filtriranja i lakoće protoka. Polimorf A prikazuje kompaktan kristalni oblik i stoga poseduje ove prednosti.

[0032] U nekim primerima izvođenja, polimorf A može da se identifikuje na osnovu karakterističnih pikova dobijenih difrakcionom analizom rendgenskih zraka na prahu. Rendgenska difrakcija praha, koja se označava i kao XRPD, je naučna tehnika kod koje se za strukturnu karakterizaciju materijala koristi difrakcija rendgenskih zraka, neutrona ili elektrona na prahu, mikrokristalima ili drugim čvrstim materijalima. U jednom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima jedan ili više karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 17.5 /- 0.3 stepeni i 22.0 /- 0.3 stepena 2-teta. U drugom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove izražene u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 17.5 /- 0.3 stepeni i 22.0 /- 0.3 stepena 2-teta.

[0033] U jednom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 5 karakterističnih pikova koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /-0.3 stepeni 2-teta. U drugom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 6 karakterističnih pikova koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /-0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta. U još jednom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 7 karakterističnih pikova koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /-0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta. U drugom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 8 karakterističnih pikova koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /-0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta. U dodatnom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 9 karakterističnih pikova koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /-0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta. U još jednom dodatnom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 10 karakterističnih pikova koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.

[0034] U još jednom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 18.7 /- 0.3 stepeni, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.

[0035] U još jednom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove koji su izraženi u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /-0.3 stepena 2-teta. U još jednom dodatnom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji je suštinski saglasan sa slikom 1. U drugom primeru izvođenja, polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji je suštinski saglasan sa 2-teta vrednostima datim u tabeli 1.

[0036] Kako se ovde koristi, izraz "oko", kada se upotrebljava tako da se odnosi na stepen 2-teta vrednosti, odnosi se na navedenu vrednost /- 0.3 stepena 2-teta.

[0037] Farmaceutska kompozicija koja sadrži polimorf A može da se identifikuje putem poređenja rendgenskog difraktograma praha kompozicije sa rendgenskim difraktogramom praha polimorfa A. Treba imati u vidu da farmaceutske kompozicije koje sadrže polimorf A mogu da prikazuju rendgenske difraktograme praha koji nisu identični sa rendgenskim difraktogramom praha čistog polimorfa A.

[0038] U nekim primerima izvođenja, polimorf A je moguće identifikovati na osnovu karakterističnog pika uočenog na termogramu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija, ili DSC, je termoanalitička tehnika u kojoj se razlika u količini toplote neophodne da se poveća temperatura uzorka i referentnog uzorka, meri u funkciji temperature. U jednom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji ima karakterističan pik u jedinicama °C na temperaturi od oko 255 /- 5°C. U drugom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji ima jedinstven endotermni pik koji se uočava pri temperaturnom opsegu od 250-255°C. U drugom primeru izvođenja, polimorf A prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji je suštinski saglasan slici 3.

[0039] U nekim primerima izvođenja, polimorf A može da sadrži nečistoće. Neograničavajući primeri nečistoća uključuju neželjene oblike polimorfa, ili rezidualne organske i neorganske molekule kao što su rastvarači, voda ili soli. U jednom primeru izvođenja, polimorf A ne sadrži nečistoće. U drugom primeru izvođenja, polimorf A sadrži manje od 10% po težini, ukupnih nečistoća. U drugom primeru izvođenja, polimorf A sadrži manje od 5% po težini, ukupnih nečistoća. U drugom primeru izvođenja, polimorf A sadrži manje od 1% po težini, ukupnih nečistoća. U još jednom primeru izvođenja, polimorf A sadrži manje od 0.1% po težini, ukupnih nečistoća.

[0040] U nekim primerima izvođenja, polimorf A je kristalna čvrsta supstanca koja suštinski ne sadrži amorfni hidrobromid jedinjenja I. Kako se ovde koristi, izraz "suštinski ne sadrži amorfni hidrobromid jedinjenja I" znači da jedinjenje ne sadrži značajnu količinu amorfnog hidrobromida jedinjenja I. U nekim primerima izvođenja, prisutno je najmanje oko 95% po težini kristalnog polimorfa A. U dodatnim primerima izvođenja prema pronalasku, prisutno je najmanje oko 99% po težini kristalnog polimorfa A.

[0041] U drugom primeru izvođenja, polimorf A suštinski ne sadrži polimorf B.

[0042] So prema pronalasku i njen kristalni oblik, polimorf A, mogu da se nalaze zajedno sa drugim supstancama ili mogu da budu izolovani. U nekim primerima izvođenja, so prema pronalasku, ili njen kristalni oblik, suštinski su izolovani. Pod "suštinski izolovan" misli se na to da su so ili njen kristalni oblik, najmanje delimično, ili suštinski, odvojeni od okoline u kojoj se obrazuju ili detektuju. Delimična odvojenost može da uključuje, na primer, kompoziciju obogaćenu solju prema pronalasku. Suštinska odvojenost može da uključuje kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% po težini, hidrobromida jedinjenja I i polimorfa A. Postupci za izolovanje jedinjenja i njihovih soli su rutinski postupci u oblasti.

[0043] I hidrobromid jedinjenja I i polimorf A mogu da se javljaju u vidu bilo kog smislenog tautomera, ili smeše smislenog tautomera. Kako se ovde koristi, "tautomer" se odnosi na jedan od dva ili više strukturnih izomera koji postoje u ravnoteži i koji se lako prevode iz jednog izomernog oblika u drugi. Primeri uključuju keto-enolne tautomere, kao što su aceton/ propen-2-ol i slični. Hidrobromid jedinjenja I i polimorf A mogu da imaju jedan ili više tautomera i, dakle, uključuju različite izomere, tj., piridin-2(1H)-on i odgovarajući piridin-2-ol. Svi takvi izomerni oblici ovih jedinjenja, izričito su uključeni u predmetni pronalazak.

Pripremanje oblika HBr soli i polimorfa A

[0044] Hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A, mogu da se pripremaju upotrebom poznatih tehnika. Uobičajeno, oblik soli se priprema kombinovanjem slobodne baze jedinjenja i kiseline koja sadrži anjon željenog oblika soli, u rastvoru, a zatim izolovanjem iz reakcionog rastvora

1

proizvoda koji je čvrsta so (npr., kristalizacijom, precipitacijom, isparavanjem, itd.). Mogu se koristiti i druge tehnike za pravljenje soli.

[0045] Šema 1 u tekstu koji sledi, opisuje u kratkim crtama konkretan primer izvođenja za proizvodnju slobodne baze jedinjenja I, kao i hidrobromida jedinjenja I. Ukratko, metil 3-amino-5-bromo-2 metilbenzoat (1) izlaže se reakciji sa jedinjenjem dihidro-2H-piran- 4(3H)-on, u uslovima reduktivne aminacije, kako bi se u koraku 1 obrazovao metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoat (2). U koraku 2, ponovo se koristi reduktivna aminacija kako bi se obrazovao 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4 il)amino)-2-metilbenzoat (3). Ovo jedinjenje zatim, u koraku 3, reaguje u uslovima Suzuki-kuplovanja kako bi dalo metil 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksilat (4), koji u koraku 4 hidrolizuje do odgovarajuće kiseline (5). U koraku 5, kiselina (5) reaguje u uslovima reakcije amidnog kuplovanja sa 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro piridin-2(1H)-on hidrohloridom kako bi dala jedinjenje I.

[0046] Kao što je prikazano, jedinjenje I može zatim da reaguje sa HBr kako bi se obrazovao hidrobromid jedinjenja I.

[0047] Ova sinteza, prethodno opisana u tekstu, ima izvestan broj prednosti. Na primer, u njoj se koristi određeni broj intermedijera koji mogu da se pripremaju u kristalnim oblicima koje je moguće izolovati. Pošto se koriste kristalni intermedijeri, neophodne su minimalne tehnike prečišćavanja (npr., hromatografija), što dovodi do sveukupno povećanog prinosa finalnog jedinjenja I.

[0048] Shodno tome, ovde je obezbeđeno intermedijerno jedinjenje 1 u kristalnom obliku. U drugom primeru izvođenja obezbeđeno je intermedijerno jedinjenje 2 u kristalnom obliku. Slika 17 prikazuje rendgenski difraktogram praha kristalnog jedinjenja 2. U dodatnom primeru izvođenja, intermedijerno jedinjenje 5 je kristalno. Slika 9 prikazuje rendgenski difraktogram praha kristalnog jedinjenja 5. U drugim primerima izvođenja, jedinjenja 2 i/ili 5 proizvedena su u suštinski čistom obliku bez upotrebe hromatografije. Stručnjaku u oblasti će biti jasno da se kristalizacija intermedijera ne odvija nužno bez napora ili efikasno.

[0049] Ovde je takođe obezbeđen postupak za pripremanje N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida koji obuhvata reakciju 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’ (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksilne kiseline (5) i soli jedinjenja 3-(aminometil)-4,6-dimetil dihidro-piridin-2(1H)-on. U jednom primeru izvođenja prema ovom postupku, (5) je u kristalnom obliku.

[0050] Jedinjenje I može da reaguje sa vodenim HBr u prisustvu odgovarajućeg rastvarača kako bi se obrazovao polimorf A, poseban kristalni oblik hidrobromida. U primeru izvođenja, jedinjenje I reaguje sa vodenim HBr u prisustvu etanola i etil acetata kako bi se obrazovao polimorf A.

[0051] Već pripremljeni polimorf može da se rekristališe upotrebom istog rastvarača (ili više njih) koji su upotrebljeni da se pripremi polimorf, ili različitog rastvarača (ili više njih), da bi se proizvela kompozicija koja ima povećan sadržaj kristala. U principu, polimorf A može da se rekristališe rastvaranjem polimorfa u jednom ili više rastvarača, opciono, zagrevanjem, nakon toga, opcionim korakom hlađenja, i zatim, izolovanjem kristalne strukture, putem, npr. koraka filtracije. Pošto se polimorf inicijalno rastvori u prvom rastvaraču (ili kombinaciji rastvarača), dodatni, različit rastvarač može da se doda u bilo kojoj tački procesa (pre ili posle zagrevanja, pre ili posle hlađenja, itd.) kako bi bila proizvedena željena kristalna struktura. Na primer, prvi rastvarač može da se koristi da bi se polimorfno jedinjenje rastvorilo, a zatim može da se doda drugi rastvarač (npr., anti-rastvarač) da bi doveo do precipitacije polimorfa iz rastvora. U primeru izvođenja, prvom rastvaraču se dodaje voda kako bi se potpomoglo rastvaranje polimorfa.

[0052] Neograničavajući primeri rastvarača koji mogu da se koriste za rekristalizaciju polimorfa A su sledeći: metanol, etanol, etil acetat, metil terc-butil etar, voda, izopropil alkohol, tetrahidrofuran, aceton, acetonitril i 2-metiltetrahidrofuran, kao i njihove kombinacije. Neograničavajući primeri kombinacija rastvarača koje su korisne za rekristalizaciju polimorfa A su (rastvarač i anti-rastvarač, pri čemu voda može da se doda u prvi rastvarač kako bi potpomogla rastvaranje polimorfa): metanol/voda i etil acetat, izopropil alkohol/voda i etil acetat, tetrahidrofuran/voda i etil acetat, aceton i etil acetat, acetonitril/voda i etil acetat, etanol/voda i metil terc-butil etar, izopropil alkohol/voda i metil terc-butil etar, etanol/voda i tetrahidrofuran, izopropil alkohol/voda i aceton, i etanol/voda i etil acetat. U konkretnim primerima izvođenja, kombinacije rastvarača su metanol/voda i etil acetat, izopropil alkohol/voda i etil acetat, etanol/voda i 2-metiltetrahidrofuran, i metanol/2-metiltetrahidrofuran.

[0053] U jednom aspektu, polimorf A se priprema upotrebom postupka koji obuhvata kombinovanje N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’ (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida sa bromovodoničnom kiselinom.

[0054] U drugom aspektu, obezbeđen je metod rekristalizacije polimorfa A, koji obuhvata sledeće korake: (a) rastvaranje polimorfa A u prvom rastvaraču, i (b) dodavanje drugog rastvarača, tako da navedeni polimorf rekristališe. U jednom primeru izvođenja, prvi rastvarač je etanol, a drugi rastvarač je MTBE. U drugom primeru izvođenja, postupak obuhvata (a) rastvaranje polimorfa A u etanolu, (b) zagrevanje smeše, (c) dodavanje smeši MTBE rastvarača, obrazovanje precipitata koji sadrži pomenuti polimorf, i filtriranje precipitata tako da navedeni polimorf rekristališe.

Farmaceutske kompozicije

[0055] Ovde je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži hidrobromid jedinjenja I i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Ovde je takođe opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži polimorf A i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0056] Izraz "farmaceutska kompozicija" uključuje preparacije pogodne za primenu kod sisara, npr., ljudi. Kada se ovde opisana jedinjenja primenjuju kao farmaceutska jedinjenja kod sisara, npr., ljudi, mogu da se daju ili sama ili u vidu farmaceutske kompozicije koja sadrži, na primer, 0.1% do 99.9% (poželjnije, 0.5 do 90%) aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0057] Ovde opisana jedinjenja (tj., hidrobromid jedinjenja I i polimorf A) mogu da se kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem u skladu sa uobičajenim tehnikama farmaceutske sinteze. Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" može da uključuje,

1

bez izuzetka, rastvarače, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćne supstance za dispergovanje ili suspendovanje, površinski aktivne agense, izotonične agense, sredstva za zgušnjavanje i emulgovanje, konzervanse, čvrsta sredstva za vezivanje, lubrikante i slično, u skladu sa konkretnim željenim oblikom doze. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) prikazuje različite nosače koji se koriste u formulaciji farmaceutskih kompozicija i poznate tehnike za njihovo pripremanje. Izuzev ukoliko je neki uobičajeni medijum nosača nekompatibilan sa jedinjenjima zbog toga što proizvodi bilo koje neželjeno biološko dejstvo ili na drugi štetan način interaguje sa bilo kojom drugom komponentom (komponentama) farmaceutske kompozicije, smatra se da je njegova upotreba u okviru obima ovog pronalaska. Neki primeri materijala koji mogu da služe kao farmaceutski prihvatljivi nosači, uključuju, ali nisu ograničeni na, šećere kao što su glukoza i saharoza; skrob kao što je kukuruzni skrob i krompirov skrob; celulozu i njene derivate kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i acetat celuloze; tragakant u prahu; slad; želatin; talk; ekscipijense kao što je kakao puter i voskovi za supozitorije; ulja, kao što je ulje kikirikija, ulje pamuka, ulje šafranike, susamovo ulje; maslinovo ulje; kukuruzno ulje i sojino ulje; glikole kao što je propilen glikol; estre kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferska sredstva kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginičnu kiselina; vodu bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol i rastvore fosfatnog pufera, kao i druge netoksične kompatibilne lubrikante kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat, kao i sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, sredstva za zaslađivanje, davanje ukusa i mirisa, tako i konzervansi i antioksidansi mogu takođe da budu prisutni u kompoziciji, u skladu sa procenom stručnjaka koji pravi formulaciju.

[0058] Osim toga, nosač može da bude u veoma različitim oblicima, u zavisnosti od toga koji je oblik preparacije poželjan za primenu, npr. oralni, nazalni, rektalni, vaginalni, parenteralni (uključujući intravenske injekcije ili infuzije). Pri pripremanju kompozicije za oralni oblik doze može da se upotrebi bilo koji od uobičajenih farmaceutskih medijuma. Uobičajeni farmaceutski medijumi uključuju, na primer, vodu, glikole, ulja, alkohole, sredstva za davanje ukusa, konzervanse, sredstva za bojenje, i slično, u slučaju tečnih oralnih preparacija (kao što su, na primer, suspenzije, rastvori, emulzije i eliksiri); aerosoli; ili nosače kao što su skrob, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblaživači, sredstva za granulaciju, lubrikanti, sredstva za vezivanje, sredstva za raspadanje i slično, u slučaju čvrstih oralnih preparacija (kao što su, na primer, praškovi, kapsule i tablete).

[0059] U kompozicijama takođe mogu da budu prisutna sredstva za vlaženje, emulgatori i lubrikanti, kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat, kao i sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, sredstva za zaslađivanje, davanje ukusa i mirisa, konzervansi i antioksidansi.

[0060] Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, tokoferoli, i slično; i helirajući agensi za metale, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0061] Farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja mogu da budu formulisane tako da imaju bilo koju željenu koncentraciju. U nekim primerima izvođenja, kompozicija je formulisana tako da sadrži najmanje terapeutski efikasnu količinu. U nekim primerima izvođenja, kompozicija je formulisana tako da sadrži količinu koja ne dovodi do jedne ili više neželjenih nus pojava.

[0062] Usled toga što se kristalni oblik hidrobromida jedinjenja I lakše održava tokom pripremanja, čvrsti oblici doze predstavljaju poželjni oblik farmaceutske kompozicije prema pronalasku. Naročito su poželjni čvrsti oblici doze za oralnu primenu, kao što su kapsule, tablete, pilule, praškovi i granule. Po želji, tablete mogu da se oblože tehnikama koje su poznate stručnjaku u oblasti.

[0063] Farmaceutske kompozicije uključuju kompozicije pogodne za oralnu, sublingvalnu, nazalnu rektalnu, vaginalnu, topikalnu, bukalnu i parenteralnu (uključujući potkožnu, intramuskularnu i intravensku) primenu, iako će najpogodnija ruta primene zavisiti od prirode i težine stanja koje se leči. Kompozicije mogu pogodno da budu predstavljene u obliku jedinične doze, i mogu da se pripremaju bilo kojim od postupaka dobro poznatih u oblasti farmacije. U izvesnim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana za oralnu primenu u obliku pilule, kapsule, lozenge ili tablete. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je u obliku suspenzije.

[0064] Ovde opisana jedinjenja su pogodni aktivni agensi u farmaceutskim kompozicijama koje su efikasne, naročito za lečenje poremećaja povezanih sa EZH2, posebno kancera. Farmaceutska kompozicija u različitim primerima izvođenja ima farmaceutski efikasnu količinu hidrobromida jedinjenja I ili polimorfa A, zajedno sa drugim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, nosačima, puniocima, razblaživačima, i slično.

[0065] Terapeutski ili farmaceutski "efikasna količina" je količina jedinjenja (hidrobromida jedinjenja I ili polimorfa A), koja, kada se primeni kod pacijenta, poboljšava simptome bolesti ili stanja, npr., sprečava različite morfološke i somatske simptome kancera. U jednom primeru, efikasna količina hidrobromida jedinjenja I ili polimorfa A je količina dovoljna za lečenje raka

1

kod subjekta. Količina može da varira u zavisnosti od faktora kao što su veličina i težina subjekta, vrsta bolesti ili konkretno jedinjenje prema pronalasku. Količina hidrobromida jedinjenja I ili polimorfa A koja predstavlja "efikasnu količinu" variraće u zavisnosti od jedinjenja, stanja bolesti i njene težine, starosti pacijenta koga je potrebno lečiti, i sličnih faktora. Stručnjak u oblasti može da određuje efikasnu količinu rutinski, oslanjajući se na svoje znanje i na ovaj prikaz.

[0066] Režim primene može da utiče na farmaceutski efikasnu dozu. Hidrobromid jedinjenja I ili polimorf A, i kompozicije koje sadrže bilo koje od ovih jedinjenja, mogu da se primene kod subjekta ili pre ili posle pojave bolesti. Osim toga, nekoliko podeljenih doza kao i doze koje se postepeno menjaju, mogu da se primenjuju dnevno ili uzastopno, ili se doze mogu kontinuirano davati kroz infuziju ili mogu da budu u vidu bolus injekcija. Osim toga, doze mogu proporcionalno da se povećavaju ili smanjuju, već prema potrebama terapijske ili profilaktičke situacije.

Postupci lečenja

[0067] Hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A inhibiraju histon metiltransferaznu aktivnost EZH2 ili njegovog mutanta i, u skladu sa tim, u jednom aspektu pronalaska, oba jedinjenja opisana u njemu, predstavljaju kandidate za lečenje ili prevenciju određenih stanja i bolesti. Predmetni pronalazak obezbeđuje ta jedinjenja za lečenje stanja i bolesti na čiji tok može da utiče modulacija statusa metilacije histona ili drugih proteina, pri čemu je pomenuti status metilacije bar delom posredovan aktivnošću EZH2. Modulacija statusa metilacije histona, sa svoje strane, može da utiče na nivo ekspresije ciljnih gena koji su aktivirani metilacijom, i/ili ciljnih gena koji su metilacijom suprimirani. Upotreba može da uključuje primenu terapeutski efikasne količine ovde opisanog jedinjenja kod subjekta kome je takvo lečenje potrebno.

[0068] Poremećaj u kome EZH2-posredovana metilacija proteina igra ulogu, može da bude rak ili prekancerozno stanje. Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A, za upotrebu u lečenju kancera ili pre-kancera na čiji tok može da utiče modulacija EZH2-posredovane metilacije proteina, ili, za pripremanje medikamenta korisnog u lečenju takvog kancera ili pre-kancera. Primeri kancera koji se mogu lečiti uključuju limfome, uključujući ne-Hočkinov limfom, folikularni limfom (FL) i difuzni limfom krupnih B-ćelija (DLBCL); melanome; i leukemije, uključujući CML. Primer prekanceroznog stanja uključuje mijelodisplastični sindrom (MDS; ranije poznat kao preleukemija).

[0069] U dodatnom primeru izvođenja, obezbeđena su jedinjenja za upotrebu u lečenju limfoma, koje obuhvata primenu efikasne količine hidrobromida jedinjenja I kod subjekta kome je to potrebno.

1

[0070] U još jednom dodatnom primeru izvođenja, obezbeđen je polimorf A za lečenje limfoma.

[0071] Takođe su opisani postupci za zaštitu, kod subjekta kome je to potrebno, od poremećaja u kojima EZH2-posredovana metilacija proteina igra ulogu, time što se terapeutski efikasna količina jedinjenja (tj., hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A) primenjuje kod subjekta kome je ovakav tretman neophodan. Taj poremećaj može da bude rak, npr., rak kod koga ulogu igra EZH2-posredovana metilacija proteina. Takođe je opisana upotreba jedinjenja (tj., hidrobromida jedinjenja I, kao i polimorfa A) za pripremanje medikamenta koji je koristan u prevenciji proliferativnih ćelijskih poremećaja koji su bar delom u vezi sa EZH2-posredovanom metilacijom proteina.

[0072] Ovde opisana jedinjenja mogu da se koriste za modulaciju metilacije proteina (npr., histona), npr., za modulaciju enzimske aktivnosti histon metiltransferaze ili histon demetilaze. Bar neka od jedinjenja mogu da se koriste in vivo ili in vitro za modulaciju metilacije proteina. Postoje publikacije po kojima je metilacija histona uključena u neregularnu ekspresiju određenih gena kod kancera, i u utišavanju neuronskih gena u ćelijama koje nisu neuroni. Bar neka ovde opisana jedinjenja su pogodni kandidati za lečenje ovih bolesti, tj., pogodna da smanje metilaciju ili uspostave metilaciju na otprilike istom nivou koji je prisutan u odgovarajućim normalnim ćelijama.

[0073] Jedinjenja koja predstavljaju modulatore metilacije mogu da se koriste za modulaciju proliferacije ćelija. Na primer, u nekim slučajevima proliferacija može da se smanji agensima koji smanjuju metilaciju, dok nedovoljna proliferacija može da se stimuliše agensima koji povećavaju metilaciju. Shodno tome, bolesti koje mogu da se leče jedinjenjima prema pronalasku mogu da uključuju hiperproliferativne bolesti, kao što su benigni rast ćelija i maligni rast ćelija.

[0074] Kako se ovde koristi, "subjekat kome je to potrebno“ je subjekat sa poremećajem kod koga EZH2 posredovana metilacija proteina igra ulogu, ili subjekat sa povećanim rizikom od razvoja takvog poremećaja u odnosu na širu populaciju. Subjekt kome je to potrebno može da ima prekancerozno stanje. Poželjno, subjekat kome je lečenje potrebno, ima kancer. A "Subjekt" uključuje sisara. Sisar može da bude npr., čovek ili odgovarajući sisar koji nije čovek, kao što je primat, miš, pacov, pas, mačka, krava, konj, koza, kamila, ovca ili svinja. Subjekt može takođe da bude i ptica ili kokoš. U jednom primeru izvođenja, sisar je čovek.

[0075] Kako se ovde koristi, izraz "proliferativni ćelijski poremećaj" odnosi se na uslove u kojima neregulisan ili poremećen rast ćelija, ili oba fenomena, mogu da dovedu do razvoja neželjenog stanja ili bolesti, koji mogu da budu ili da ne budu kancerozni. Primeri proliferativnih ćelijskih poremećaja koji mogu da se leče ovde opisanim jedinjenjima obuhvataju niz stanja kod kojih je ćelijska deoba deregulisana. Primeri proliferativnog ćelijskog poremećaja uključuju ali

1

nisu ograničeni na, neoplazme, benigne tumore, maligne tumore, prekancerozna stanja, in situ tumore, inkapsulirane tumore, metastatske tumore, tečne tumore, čvrste tumore, imunološke tumore, hematološke tumore, kancere, karcinome, leukemije, limfome, sarkome, i ćelije koje se rapidno dele. Izraz "ćelija koja se rapidno deli", kako se ovde koristi, definisan je kao bilo koja ćelija koja se deli brzinom koja prevazilazi ili je veća od onoga što se očekuje ili uočava među susednim ili obližnjim ćelijama u istom tkivu. Proliferativni ćelijski poremećaj uključuje prekancer ili prekancerozno stanje. Proliferativni ćelijski poremećaj uključuje kancer. Ovde opisani postupci mogu da se koriste za lečenje ili olakšavanje simptoma kancera ili za identifikaciju kandidata pogodnih za te svrhe. Izraz "kancer" uključuje čvrste tumore, kao i hematološke tumore i/ili malignitete. "Prekancerska ćelija" ili "prekancerozna ćelija" je ćelija koja prikazuje proliferativni ćelijski poremećaj koji je prekancer ili prekancerozno stanje. "Ćelija kancera" ili "kancerozna ćelija" je ćelija koja prikazuje proliferativni ćelijski poremećaj koji predstavlja kancer. Da bi se identifikovale ćelije kancera ili prekancerozne ćelije, mogu da se koriste bilo koja reproducibilna sredstva za merenje. Ćelije kancera ili prekancerozne ćelije mogu da se identifikuju histološkom tipizacijom ili gradiranjem uzorka tkiva (npr., uzorka biopsije). Ćelije kancera ili prekancerozne ćelije mogu da se identifikuju upotrebom odgovarajućih molekulskih markera.

[0076] Primeri nekanceroznih stanja ili poremećaja koji mogu da se leče upotrebom jednog ili više ovde opisanih jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, reumatoidni artritis; inflamaciju; autoimune bolesti; limfoproliferativna stanja; akromegaliju; reumatoidni spondilitis; osteoartritis; giht, druga artritisna stanja; sepsu; septički šok; endotoksični šok; gram-negativnu sepsu; sindrom toksičnog šoka; astmu; respiratorni distres sindrom odraslih; hroničnu opstruktivnu bolest pluća; hroničnu inflamaciju pluća; inflamatornu bolest creva; Kronovu bolest; psorijazu; ekcem; ulcerozni kolitis; fibrozu pankreasa; fibrozu jetre; akutnu i hroničnu bubrežnu bolest; sindrom iritabilnog creva; groznicu; restenozu, cerebralnu malariju; moždani udar i ishemijsku povredu; traumu nerva; Alchajmerovu bolest; Hantingtonovu bolest; Parkinsonovu bolest; akutni i hronični bol; alergijski rinitis; alergijski konjunktivitis; hroničnu srčanu insuficijenciju; akutni koronarni sindrom; kaheksiju; malariju; lepru; lejšmaniozu; Lajmsku bolest; Rajterov sindrom; akutni sinovitis; degeneraciju mišića, burzitis; tendonitis; tenosinovitis; sindrom hernijacije, rupture ili protruzije intervertebralnog diska; osteopetrozu; trombozu; restenozu; silikozu; plućnu sarkozu; bolesti resorpcije kosti, kao što je osteoporoza; reakciju „kalem-protiv-domaćina“; multiplu sklerozu; lupus; fibromijalgiju; AIDS i druge virusne bolesti kao što su herpes zoster, herpes simpleks I ili II, virus gripa i citomegalovirus; i dijabetes melitus.

[0077] Primeri kancera koji mogu da se leče upotrebom jednog ili više ovde opisanih jedinjenja, uključuju, ali nisu ograničeni na, adrenokortikalni karcinom, kancere u vezi sa AIDS-om,

1

limfom u vezi sa AIDS-om, analni kancer, anorektalni kancer, kancer analnog kanala, kancer slepog creva, cerebelarni astrocitom dečjeg uzrasta, cerebralni astrocitom dečjeg uzrasta, karcinom bazalnih ćelija, rak kože (ne- melanomski), rak žučnih puteva, ekstrahepatični kancer žučnog kanala, intrahepatični kancer žučnog kanala, rak bešike, rak mokraćne bešike, rak kosti i zglobova, osteosarkom i maligni fibrozni histiocitom, rak mozga, tumor mozga, gliom moždanog stabla, cerebelarni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, ependimom, meduloblastom, supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, gliom vizuelnih puteva i hipotalamusa, rak dojke, bronhijalne adenome/karcinoide, karcinoidne tumore, gastrointestinalni, kancer nervnog sistema, limfom nervnog sistema, kancer centralnog nervnog sistema, limfom centralnog nervnog sistema, cervikalni kancer, kancere dečjeg uzrasta, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, hronične mijeloproliferativne poremećaje, rak debelog creva, kolorektalni kancer, kožni T-ćelijski limfom, limfoidnu neoplazmu, mycosis fungoides limfom, Sezarov sindrom, kancer endometrijuma, rak jednjaka, ekstrakranijalni tumor klicinih ćelija, ekstragonadalni tumor klicinih ćelija, ekstrahepatični kancer žučnog kanala, kancer oka, intraokularni melanom, retinoblastom, kancer žučne kese, gastrični (želudačni) kancer, gastrointestinalni karcinoidni tumor, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), tumor klicinih ćelija, ovarijalni tumor klicinih ćelija , gestacioni trofoblastni tumor glioma, kancer glave i vrata, hepatocelularni (jetra) kancer, Hočkinov limfom, hipofaringealni kancer, intraokularni melanom, okularni kancer, tumore ćelija ostrvaca (endokrini pankreas), Kapoši sarkom, rak bubrega, renalni kancer, bubrežni kancer, larinksni kancer, akutnu limfoblastnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, leukemiju vlasastih ćelija, rak usana i usne šupljine, rak jetre, rak pluća, nesitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, limfom u vezi sa AIDS-om, ne-Hočkinov limfom, primarni limfom centralnog nervnog sistema, Valdenstramovu makroglobulinemiju, meduloblastom, melanom, intraokularni (oko) melanom, karcinom Merkelovih ćelija, maligni mezoteliom, mezoteliom, metastatski skvamozni rak vrata, rak usta, rak jezika, sindrom multiple endokrine neoplazme, mycosis fungoides limfom, mijelodisplastične sindrome, mijelodisplastične/ mijeloproliferativne bolesti, hroničnu mijelogenu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, multipli mijelom, hronične mijeloproliferativne poremećaje, nazofaringealni kancer, neuroblastom, oralni kancer, kancer usne šupljine, orofaringealni kancer, rak jajnika, rak ovarijalnog epitela, nisko maligni potencijalni tumor jajnika, kancer pankreasa, kancer ćelija ostrvaca pankreasa, rak paranazalnog sinusa i nosne šupljine, paratiroidni kancer, rak penisa, rak ždrela, feohromocitom, pineoblastom i supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, tumore hipofize, neoplazmu plazma ćelija/multipli mijelom, pleuropulmonarni blastom, rak prostate, rektalni kancer, renalni pelvis i ureter, kancer prelaznih

1

ćelija, retinoblastom, rabdomiosarkom, rak pljuvačnih žlezda, familiju Juingovih tumora sarkoma, Kapoši sarkom, sarkom mekog tkiva, rak materice, sarkom materice, rak kože (nemelanom), rak kože (melanom), rak kože Merkelovih ćelija, rak tankog creva, sarkom mekog tkiva, karcinom skvamoznih ćelija, rak želuca (gastrični), supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, rak testisa, rak grla, timom, timom i timusni karcinom, tiroidni kancer, kancer prelaznih ćelija bubrežne karlice i uretera i drugih urinarnih organa, gestacioni trofoblastni tumor, rak uretre, endometrijalni rak materice, sarkom materice, kancer tela materice, vaginalni kancer, kancer vulve i Vilmov tumor.

[0078] "Proliferativni poremećaj ćelija hematološkog sistema" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije hematološkog sistema. Proliferativni poremećaj ćelija hematološkog sistema može da uključuje limfom, leukemiju, mijeloidne neoplazme, neoplazme mastocita, mijelodisplaziju, benignu monoklonalnu gamopatiju, limfomatoidnu granulomatozu, limfomatoidnu papulozu, primarnu policitemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, angiogenu mijeloidnu metaplaziju, i esencijalnu trombocitemiju. Proliferativni poremećaj ćelija hematološkog sistema može da uključuje hiperplaziju, displaziju i metaplaziju ćelija hematološkog sistema. U jednom aspektu, ovde opisane kompozicije mogu da se koriste za lečenje kancera odabranog iz grupe koja se sastoji od hematološkog kancera ili hematološkog proliferativnog ćelijskog poremećaja, ili za identifikaciju kandidata pogodnih za te svrhe. Hematološki kancer može da uključuje multipli mijelom, limfom (uključujući Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom, limfome dečjeg uzrasta, i limfome limfocitnog i kutanog porekla), leukemiju (uključujući leukemiju dečjeg uzrasta, leukemiju vlasastih ćelija, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijelocitnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, hroničnu mijelogenu leukemiju, i leukemiju mastocita), mijeloidne neoplazme i neoplazme mastocita.

[0079] "Proliferativni ćelijski poremećaji pluća " je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije pluća. Proliferativni ćelijski poremećaji pluća mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije pluća. Proliferativni ćelijski poremećaji pluća mogu da uključuju rak pluća, pre-kancer ili prekancerozno stanje pluća, benigne izraštaje ili lezije pluća, i maligne izraštaje ili lezije pluća, i metastatske lezije u drugim tkivima i organima tela pored pluća. U jednom aspektu, ovde opisane kompozicije mogu da se koriste za lečenje raka pluća ili proliferativnih ćelijskih poremećaja pluća, ili za identifikaciju kandidata pogodnih za te svrhe. Rak pluća može da uključuje sve oblike raka pluća. Rak pluća može da uključuje maligne neoplazme pluća, karcinom in situ, tipične karcinoidne tumore i atipične karcinoidne tumore. Rak pluća može da uključuje sitnoćelijski rak pluća ("SCLC"), nesitnoćelijski rak pluća ("NSCLC"), karcinom skvamoznih ćelija, adenokarcinom, karcinom sitnih

2

ćelija, karcinom krupnih ćelija, karcinom adenoskvamoznih ćelija i mezoteliom. Rak pluća može da uključuje "karcinom na ožiljku," bronhioalveolarni karcinom, karcinom gigantskih ćelija, karcinom vretenastih ćelija i neuroendokrini karcinom krupnih ćelija. Rak pluća može da uključuje neoplazme pluća koje imaju histološku i ultrastrukturnu heterogenost (npr., mešani tipovi ćelija).

[0080] Proliferativni poremećaji ćelija pluća mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije pluća. Proliferativni poremećaji ćelija pluća mogu da uključuju rak pluća, prekancerozna stanja pluća. Proliferativni poremećaji ćelija pluća mogu da uključuju hiperplaziju, metaplaziju i displaziju pluća. Proliferativni poremećaji ćelija pluća mogu da uključuju azbestnu hiperplaziju, skvamoznu metaplaziju i benignu reaktivnu metaplaziju mezotela. Proliferativni poremećaji ćelija pluća mogu da uključuju zamenu cilindričnog epitela stratifikovanim skvamoznim epitelom i displaziju mukoze. Pojedinci izloženi udisanju štetnih materija iz okoline kao što su dim cigareta i azbest mogu da imaju povećan rizik od razvoja proliferativnih poremećaja ćelija pluća. Prethodne bolesti pluća koje kod pojedinaca mogu da dovedu do predispozicije za razvoj proliferativnih poremećaja ćelija pluća, mogu da uključuju hroničnu intersticijsku bolest pluća, nekrotizirajuću bolest pluća, sklerodermu, reumatoidnu bolest, sarkoidozu, intersticijski pneumonitis, tuberkulozu, ponovljene pneumonije, idiopatsku plućnu fibrozu, granulomat, azbestozu, fibrozirajući alveolitis i Hočkinovu bolest.

[0081] "Proliferativni poremećaj ćelija debelog creva" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije debelog creva. Poželjno, proliferativni poremećaj ćelija debelog creva je rak debelog creva. U jednom aspektu, ovde opisane kompozicije mogu da se koriste za lečenje raka debelog creva ili proliferativnih poremećaja ćelija debelog creva, ili za identifikaciju kandidata pogodnih za te svrhe. Rak debelog creva može da uključuje sve oblike kancera debelog creva. Rak debelog creva može da uključuje sporadične i nasledne kancere debelog creva. Rak debelog creva može da uključuje maligne neoplazme debelog creva, karcinom in situ, tipične karcinoidne tumore i atipične karcinoidne tumore. Rak debelog creva može da uključuje adenokarcinom, karcinom skvamoznih ćelija i karcinom adenoskvamoznih ćelija. Rak debelog creva može da bude povezan sa naslednim sindromom odabranim iz grupe koja se sastoji od naslednog nepolipoznog kolorektalnog kancera, familijarne adenomatozne polipoze, Gardnerovog sindroma, Peutz-Jeghers sindroma, Turkotovog sindroma i juvenilne polipoze. Rak debelog creva može da bude izazvan naslednim sindromom odabranim iz grupe koja se sastoji od naslednog nepolipoznog kolorektalnog kancera, familijarne adenomatozne polipoze, Gardnerovog sindroma, Peutz-Jeghers sindroma, Turkotovog sindroma i juvenilne polipoze.

[0082] Proliferativni poremećaji ćelija debelog creva mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije debelog creva. Proliferativni poremećaji ćelija debelog creva mogu da uključuju rak debelog creva, prekancerozna stanja debelog creva, adenomatozne polipe debelog creva i metahrone lezije debelog creva. Proliferativni poremećaji ćelija debelog creva mogu da uključuju adenom. Proliferativni poremećaji ćelija debelog creva mogu da se karakterišu hiperplazijom, metaplazijom i displazijom debelog creva. Prethodne bolesti debelog creva usled kojih pojedinci mogu da imaju predispoziciju da razviju proliferativne poremećaje ćelija debelog creva mogu da uključuju prethodni rak debelog creva. Tekuća bolest usled koje pojedinci mogu da imaju predispoziciju da razviju proliferativne poremećaje ćelija debelog creva, mogu da uključuju Kronovu bolest i ulcerozni kolitis. Proliferativni poremećaj ćelija debelog creva može da bude povezan sa mutacijom gena odabranog iz grupe koja se sastoji od p53, ras, FAP i DCC. Pojedinac može da ima povišen rizik od razvoja proliferativnog ćelijskog poremećaja debelog creva usled prisustva mutacije u genu odabranom iz grupe koja se sastoji od p53, ras, FAP i DCC.

[0083] "Proliferativni poremećaj ćelija pankreasa" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije pankreasa. Proliferativni poremećaji ćelija pankreasa mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije pankreasa. Proliferativni poremećaji ćelija pankreasa mogu da uključuju rak pankreasa, pre-kancer ili prekancerozno stanje pankreasa, hiperplaziju pankreasa i displaziju pankreasa, benigne izraštaje ili lezije pankreasa i maligne izraštaje ili lezije pankreasa, i metastatske lezije u drugim tkivima i organima tela osim pankreasa. Rak pankreasa uključuje sve oblike raka pankreasa. Rak pankreasa može da uključuje adenokarcinom kanala, adenoskvamozni karcinom, karcinom pleomorfnih džinovskih ćelija, mucinozni adenokarcinom, karcinom džinovskih ćelija tipa osteoklasta, mucinozni cistadenokarcinom, acinusni karcinom, neklasifikovani karcinom velikih ćelija, karcinom malih ćelija, pankreatoblastom, papilarnu neoplazmu, mucinozni cistadenom, papilarnu cističnu neoplazmu i serozni cistadenom. Rak pankreasa može takođe da uključuje neoplazme pankreasa koje imaju histološku i ultrastrukturnu heterogenost (npr., mešane tipove ćelija).

[0084] " Proliferativni poremećaj ćelija prostate" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije prostate. Proliferativni poremećaji ćelija prostate mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije prostate. Proliferativni poremećaji ćelija prostate mogu da uključuju rak prostate, pre-kancer ili prekancerozno stanje prostate, benigne izraštaje ili lezije prostate, i maligne izraštaje ili lezije prostate, i metastatske lezije u drugim tkivima i organima tela osim prostate. Proliferativni poremećaji ćelija prostate mogu da uključuju hiperplaziju, metaplaziju i displaziju prostate.

[0085] "Proliferativni ćelijski poremećaj kože" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije kože. Proliferativni ćelijski poremećaji kože mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije kože. Proliferativni ćelijski poremećaji kože mogu da uključuju pre-kancer ili prekancerozno stanje kože, benigne izraštaje ili lezije kože, melanom, maligni melanom i druge maligne izraštaje ili lezije kože, i metastatske lezije u drugim tkivima i organima tela osim kože. Proliferativni ćelijski poremećaji kože mogu da uključuju hiperplaziju, metaplaziju i displaziju kože.

[0086] "Proliferativni poremećaj ćelija jajnika" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije jajnika. Proliferativni poremećaji ćelija jajnika mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije jajnika. Proliferativni poremećaji ćelija jajnika mogu da uključuju prekancer ili prekancerozno stanje jajnika, benigne izraštaje ili lezije jajnika, rak jajnika, maligne izraštaje ili lezije jajnika, i metastatske lezije u drugim tkivima i organima tela osim jajnika. Proliferativni ćelijski poremećaji jajnika mogu da uključuju hiperplaziju, metaplaziju i displaziju ćelija jajnika.

[0087] "Proliferativni poremećaj ćelija dojke" je proliferativni ćelijski poremećaj koji uključuje ćelije dojke. Proliferativni poremećaji ćelija dojke mogu da uključuju sve oblike proliferativnih ćelijskih poremećaja koji pogađaju ćelije dojke. Proliferativni poremećaji ćelija dojke mogu da uključuju rak dojke, pre-kancer ili prekancerozno stanje dojke, benigne izraštaje ili lezije dojke i maligne izraštaje ili lezije dojke, i metastatske lezije u drugim tkivima i organima tela osim dojke. Proliferativni poremećaji ćelija dojke mogu da uključuju hiperplaziju, metaplaziju i displaziju dojke.

[0088] Proliferativni poremećaj ćelija dojke može da bude prekancerozno stanje dojke. Ovde opisane kompozicije mogu da se koriste za lečenje prekanceroznog stanje dojke. Prekancerozno stanje dojke može da uključuje atipičnu hiperplaziju dojke, duktalni karcinom in situ (DCIS), intraduktalni karcinom, lobularni karcinom in situ (LCIS), lobularnu neoplazmu, i izraštaj ili leziju dojke stadijuma 0 ili gradusa 0 (npr., rak dojke stadijuma 0 ili gradusa 0, ili karcinom in situ). Prekancerozno stanje dojke može da se svrsta u stadijume prema TNM klasifikacionoj šemi koju je prihvatio Američki združeni komiteta za rak (AJCC), gde se primarnom tumoru (T) dodeljuje stadijum T0 ili Tis; i gde se regionalnim limfnim čvorovima (N) dodeljuje stadijum N0; i gde se udaljenim matastazama (M) dodeljuje stadijum M0.

[0089] Proliferativni poremećaj ćelija dojke može da bude rak dojke. U jednom aspektu, ovde opisane kompozicije mogu da se koriste za lečenje raka dojke, ili da se koriste za identifikaciju pogodnih kandidata za te svrhe. Rak dojke može da uključuje sve oblike raka dojke. Rak dojke može da uključuje primarne epitelne kancere dojke. Rak dojke može da uključuje kancere gde je dojka uključena preko drugih tumora kao što je limfom, sarkom ili melanom. Rak dojke može da uključuje karcinom dojke, duktalni karcinom dojke, lobularni karcinom dojke, nediferencirani karcinom dojke, filoidni cistosarkom dojke, angiosarkom dojke, i primarni limfom dojke. Rak

2

dojke može da uključuje rak dojke stadijuma I, II, IIIA, IIIB, IIIC i IV. Duktalni karcinom dojke može da uključuje invazivni karcinom, invazivni karcinom in situ sa predominantnom intraduktalnom komponentom, inflamatorni rak dojke, i duktalni karcinom dojke sa histološkim tipom odabranim iz grupe koja se sastoji od komedo, mucinoznog (koloidnog), medularnog, medularnog sa limfocitnim infiltratom, papilarnog, sciroznog i tubularnog tipa. Lobularni karcinom dojke može da uključuje invazivni lobularni karcinom sa predominantnom in situ komponentom, invazivni lobularni karcinom, i infiltrirajući lobularni karcinom. Rak dojke može da uključuje Padžetovu bolest, Padžetovu bolest sa intraduktalnim karcinomom, i Padžetovu bolest sa invazivnim duktalnim karcinomom. Rak dojke može da uključuje neoplazme dojke koje imaju histološku i ultrastrukturnu heterogenost (npr., mešane tipove ćelija).

[0090] Ovde opisana jedinjenja mogu da se koriste za lečenje raka dojke, ili da se koriste za identifikaciju pogodnih kandidata za te svrhe. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje familijarni rak dojke. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje sporadični rak dojke. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se pojavi kod muškog subjekta. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se pojavi kod ženskog subjekta. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se pojavi kod ženskog subjekta pre menopauze ili posle menopauze. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se pojavi kod subjekta koji ima, ili je stariji od, 30 godina, ili kod subjekta koji je mlađi od 30 godina. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se pojavi kod subjekta koji ima, ili je stariji od, 50 godina, ili kod subjekta koji je mlađi od 50 godina. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se pojavi kod subjekta koji ima, ili je stariji od, 70 godina, ili kod subjekta koji je mlađi od 70 godina.

[0091] Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se tipizira kako bi se identifikovala porodična ili spontana mutacija u BRCA1, BRCA2, ili p53. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da ima amplifikaciju HER2/neu gena, da preterano eksprimira HER2/neu, ili da ima nizak, srednji ili visok nivo HER2/neu ekspresije. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se tipizira kako bi se identifikovao marker odabran iz grupe koja se sastoji od estrogenog receptora (ER), progesteronskog receptora (PR), receptora-2 za humani epidermalni faktor rasta, Ki-67, CA15-3, CA 27-29 i c-Met. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je ER-nepoznatog statusa, ER-bogat ili ER-siromašan. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je ER-negativan ili ER-pozitivan. ER-tipizacija raka dojke može da se obavi bilo kojim reproducibilnim sredstvima. ER-tipizacija raka dojke može da se obavi na način izložen u publikaciji Onkologie 27: 175-179 (2004). Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je ER-nepoznatog statusa, ER-bogat ili ER-siromašan. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je ER-negativan ili ER-pozitivan. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je PRnepoznatog statusa, PR-bogat ili PR-siromašan. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je PR-negativan ili PR-pozitivan. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je receptor-negativan ili receptor-pozitivan. Za rak dojke koji je potrebno lečiti, tipizacijom može da se utvrdi da je povezan sa povišenim nivoima CA 15-3 ili CA 27-29, ili oba, u krvi.

[0092] Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje lokalizovani tumor dojke. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor dojke koji je povezan sa negativnom biopsijom sentinelnog limfnog čvora (SLN). Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor dojke povezan sa pozitivnom biopsijom sentinelnog limfnog čvora (SLN). Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor dojke koji je povezan sa jednim ili više pozitivnih aksilarnih limfnih čvorova, pri čemu su aksilarnih limfnih čvorova svrstani u stadijume bilo kojom primenjivom metodom. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor dojke za koji je tipizacijom utvrđeno da ima negativan nodalni status (npr., čvorovi su negativni) ili pozitivan nodalni status (npr., čvorovi su pozitivni). Rak dojke koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor dojke koji je metastazirao na druge lokacije u telu. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se klasifikuje kao rak koji je metastazirao na lokaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od kosti, pluća, jetre ili mozga. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se klasifikuje u skladu sa karakteristikama odabranim iz grupe koja se sastoji od metastatskog, lokalizovanog, regionalnog, lokalno-regionalnog, lokalno uznapredovalog, udaljenog, multicentričnog, bilateralnog, ipsilateralnog, kontralateralnog, novo-dijagnostifikovanog, rekurentnog i neoperabilnog.

[0093] Ovde opisano jedinjenje može da se koristi za lečenje ili prevenciju proliferativnog ćelijskog poremećaja dojke, ili za lečenje ili prevenciju raka dojke, kod subjekta koji ima povećan rizik od razvoja raka dojke u odnosu na opštu populaciju, ili da se koristi za identifikaciju kandidata pogodnih u te svrhe. Subjekt sa povećanim rizikom od razvoja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je ženski subjekt sa porodičnom istorijom ili ličnom istorijom raka dojke. Subjekt sa povećanim rizikom od razvoja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je ženski subjekt koji ima naslednu ili spontanu mutaciju u BRCA1 ili BRCA2, ili u oba gena. Subjekt sa povećanim rizikom od razvoja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je ženski subjekt sa porodičnom istorijom raka dojke i naslednom ili spontanom mutacijom u BRCA1 ili BRCA2, ili sa obe mutacije. Subjekt sa povećanim rizikom od razvoja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je žena koja je starija od 30 godina, starija od 40 godina, starija od 50 godina, starija od 60 godina, starija od 70 godina, starija od 80 godina ili starija od 90 godina. Subjekt sa povećanim rizikom od razvoja raka dojke u odnosu na opštu populaciju je ženski subjekt sa atipičnom hiperplazijom dojke, duktalnim karcinomom in situ (DCIS), intraduktalnim

2

karcinomom, lobularnim karcinomom in situ (LCIS), lobularnom neoplazmom ili izraštajem ili lezijom dojke stadijuma 0 (npr., rak dojke stadijuma 0 ili gradusa 0, ili karcinom in situ).

[0094] Rak dojke koji je potrebno lečiti može da se gradira histološki prema Skarf-Blum-Ričardsonovom sistemu, gde se tumoru dojke dodeljuje skor broja mitoza od 1, 2 ili 3; skor nuklearnog pleomorfizma od 1, 2, ili 3; skor obrazovanja tubula od 1, 2 ili 3; i ukupni Skarf-Blum-Ričardsonov skor između 3 i 9. Rak dojke koji je potrebno lečiti može da dobije tumorski gradus u skladu sa Internacionalnim konsenzusnim panelom o lečenju raka dojke, odabran iz grupe koja se sastoji od gradusa 1, gradusa 1-2, gradusa 2, gradusa 2-3 ili gradusa 3.

[0095] Ovde je opisan postupak za lečenje raka dojke koji obuhvata primenu efikasne količine hidrobromida jedinjenja I kod subjekta kome je to potrebno.

[0096] Ovde je takođe opisan postupak za lečenje raka dojke koji obuhvata primenu efikasne količine polimorfa A kod subjekta kome je to potrebno.

[0097] Rak koji je potrebno lečiti može da se svrsta u stadijume u skladu sa TNM klasifikacionim sistemom Američkog združenog komiteta za rak (AJCC), gde se tumoru (T) dodeljuje stadijum TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c, ili T4d; i gde se regionalnim limfnim čvorovima (N) dodeljuju stadijumi NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b, ili N3c; i gde udaljenim metastazama (M) može da bude dodeljen stadijum MX, M0 ili M1. Rak koji je potrebno lečiti može da se svrsta u stadijume u skladu sa TNM klasifikacionim sistemom Američkog združenog komiteta za rak (AJCC), i to u stadijum I, stadijum IIA, stadijum IIB, stadijum IIIA, stadijum IIIB, stadijum IIIC ili stadijum IV. Rak koji je potrebno lečiti može da dobije dodeljen gradus u skladu sa AJCC klasifikacijom, kao gradus GX (npr., gradus ne može da se proceni), gradus 1, gradus 2, gradus 3 ili gradus 4. Rak koji je potrebno lečiti može da se, u skladu sa AJCC patološkom klasifikacijom (pN), svrsta u stadijume označene kao pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b, ili pN3c.

[0098] Rak koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor za koji je utvrđeno da je manji od, ili jednak, oko 2 centimetra u prečniku. Rak koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor za koji je utvrđeno da je prečnika od oko 2 do oko 5 centimetara. Rak koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor za koji je utvrđeno da je veći od, ili jednak, oko 3 centimetra u prečniku. Rak koji je potrebno lečiti može da uključuje tumor za koji je utvrđeno da je veći od 5 centimetara u prečniku. Rak koji je potrebno lečiti, po mikroskopskom izgledu može da bude klasifikovan kao dobro diferenciran, umereno diferenciran, slabo diferenciran i nediferenciran. Rak koji je potrebno lečiti, po mikroskopskom izgledu može da bude klasifikovan u odnosu na broj mitoza (tj. količinu ćelijske deobe) ili nuklearni pleomorfizam (npr. promenu u ćeliji). Rak koji je potrebno lečiti, po mikroskopskom izgledu može da bude klasifikovan kao rak povezan sa

2

nekrotičnim oblastima (npr. oblastima sa ćelijama koje umiru ili degenerišu). Rak koji je potrebno lečiti može da bude klasifikovan kao rak koji ima abnormalni kariotip, abnormalni broj hromozoma, ili jedan ili više hromozoma koji su abnormalnog izgleda. Rak koji je potrebno lečiti može da bude klasifikovan kao aneuploidni, triploidni, tetraploidni ili rak sa izmenjenom ploidijom. Rak koji je potrebno lečiti može da bude klasifikovan kao rak koji ima hromozomsku translokaciju, ili deleciju ili duplikaciju čitavog hromozoma, ili region sa delecijom, duplikacijom ili amplifikacijom dela hromozoma.

[0099] Rak koji je potrebno lečiti može da se procenjuje DNK citometrijom, protočnom citometrijom, ili imidž citometrijom. Tipizacijom se može utvrditi da rak koji je potrebno lečiti ima 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% ćelija u stadijumu sinteze ćelijske deobe (npr. u S fazi ćelijske deobe). Tipizacijom se može utvrditi da rak koji je potrebno lečiti ima nisku frakciju S-faze ili visoku frakciju S-faze.

[0100] Kako se ovde koristi, “normalna ćelija“ je ćelija koja ne može da se klasifikuje kao deo “proliferativnog ćelijskog poremećaja”. Normalna ćelija nema neregulisan ili abnormalni rast, ili i jedno i drugo, koji mogu da vode do razvoja neželjenog stanja ili bolesti. Poželjno, normalna ćelija poseduje kontrolni mehanizam sa tačkama provere ćelijskog ciklusa, koji normalno funkcioniše.

[0101] Kako se ovde koristi, “ćelija u kontaktu ILI kontakt sa ćelijom“ odnosi se na stanje pri kome su jedinjenje ili druga kompozicija materije u direktnom kontaktu sa ćelijom ili dovoljno blizu da izazovu željeni biološki efekat u ćeliji.

[0102] Kako se ovde koristi, “jedinjenje-kandidat“ odnosi se na ovde opisano jedinjenje (tj. hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A) koje je bilo, ili će biti, testirano u jednom ili više in vivo ili in vitro bioloških testova kako bi se utvrdilo da li je verovatno da to jedinjenje izaziva željeni biološki ili medicinski efekat u ćeliji, tkivu, sistemu, životinji ili čoveku, a za kojim su istraživač ili kliničar u potrazi. Jedinjenje-kandidat je ovde opisano jedinjenje. Biološki ili medicinski odgovor može da bude lečenje raka. Biološki ili medicinski odgovor može da bude lečenje ili prevencija proliferativne ćelijske bolesti. Biološki odgovor ili efekat može da uključuje promenu proliferacije ili rasta ćelija koji se dešavaju in vitro ili u životinjskom modelu, kao i druge biološke promene koje je moguće uočiti in vitro. In vivo ili in vitro biološki testovi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, testove enzimske aktivnosti, testove promene elektroforetske pokretljivosti, testove sa reporter-genima, in vitro testove ćelijske vijabilnosti i ovde opisane testove.

[0103] Kako se ovde koristi, “monoterapija” se odnosi na primenu jednog aktivnog ili terapeutskog jedinjenja kod subjekta kome je to potrebno. Poželjno, monoterapija će uključivati primenu terapeutski efikasne količine aktivnog jedinjenja. Na primer, monoterapija raka, jednim

2

od ovde opisanih jedinjenja (tj. hidrobromidom jedinjenja I, kao i polimorfom A) kod subjekta kome je potrebno lečenje raka. Monoterapija može da se uporedi sa kombinovanom terapijom kod koje se primenjuje kombinacija više aktivnih jedinjenja, poželjno tako da je svaka od komponenti kombinacije prisutna u trapeutski efikasnoj količini. U jednom aspektu, monoterapija ovde opisanim jedinjenjem je efikasnija u indukovanju željenog biološkog efekta od kombinovane terapije.

[0104] Kako se ovde koristi, “lečenje” ili “tretira” opisuje praćenje i negu pacijenta u cilju borbe sa bolešću, stanjem ili poremećajem, i uključuje primenu ovde opisanog jedinjenja (tj. hidrobromida jedinjenja I, kao i polimorfa A) kako bi se ublažili simptomi ili komplikacije bolesti, stanja ili poremećaja. Izraz “tretira” može takođe da uključuje tretman ćelije in vitro ili u životinjskom modelu.

[0105] Ovde opisano jedinjenje (tj. hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A) može takođe da se koristi i za prevenciju bolesti ili da se koristi za identifikaciju pogodnih kandidata u te svrhe. Kako se ovde koristi, prevencija ili prevenirati opisuje smanjenje ili eliminisanje pojave simptoma ili komplikacija bolesti, stanja ili poremećaja.

[0106] Kako se ovde koristi, podrazumeva se da izraz “ublažiti”opisuje proces kojim se ozbiljnost znaka ili simptoma bolesti smanjuje. Važno je da se znak ili simptom mogu ublažiti a da ne budu eliminisani. Primena ovde opisanih farmaceutskih kompozicija može da vodi eliminaciji znaka ili simptoma, međutim, eliminacija nije neophodna. Očekuje se da efikasne doze smanje ozbiljnost znaka ili simptoma. Na primer, znak ili simptom bolesti kao što je rak, koja može da se javi na više lokacija, ublažena je ukoliko se ozbiljnost raka ublaži na najmanje jednoj od više lokacija.

[0107] Kako se ovde koristi, predviđeno je da izraz “ozbiljnost” opisuje potencijal raka da transformiše prekancerozno ili benigno stanje u maligno stanje. Alternativno, ili dodatno, predviđeno je da ozbiljnost opisuje stadijum raka, na primer, u skladu sa TNM sistemom (koji prihvata Internacionalna unija protiv raka (UICC) i Američki združeni komitet za rak (AJCC)) ili drugim postupcima priznatim u oblasti. Stadijum raka se odnosi na stepen ili ozbiljnost raka na osnovu faktora kao što su lokacija primarnog tumora, veličina tumora, broj tumora i uključenost limfnih čvorova (raširenost raka na limfne čvorove). Alternativno, ili dodatno, predviđeno je da ozbiljnost opisuje gradus tumora prema postupcima priznatim u oblasti (videti Nacionalni insitut za rak, www.cancer.gov ). Gradus tumora je sistem koji se koristi za klasifikaciju ćelija raka na osnovu toga u kojoj meri su abnormalnog izgleda pod mikroskopom, i na osnovu verovatnoće i brzine širenja i rasta tumora. kada se određuje gradus tumora u obzir se uzimaju mnogi faktori uključujući strukturu i obrazac rasta ćelija. Specifični faktori koji se koriste za određivanje gradusa tumora razlikuju se u zavisnosti od vrste raka. Ozbiljnost takođe opisuje histološki

2

stepen gradus, koji se zove i diferencijacija, i koji se odnosi na to koliko ćelije tumora liče na normalne ćelije iste vrste tkiva. (videti Nacionalni insitut za rak, www.cancer.gov ). Dodatno, ozbiljnost opisuje nukleusni stepen, koji se odnosi na veličinu i oblik jedra u ćelijama tumora i procenta ćelija tumora koje se dele. (videti Nacionalni insitut za rak, www.cancer.gov).

[0108] Ozbiljnost opisuje stepen u kome je tumor izlučio faktore rasta, razgradio ekstracelularni matriks, postao vaskularizovan, izgubio adheziju sa susednim tkivima ili metastazirao. Osim toga, ozbiljnost opisuje broj lokacija na koje je primarni tumor metastazirao. Na kraju, ozbiljnost uključuje teškoću lečenja tumora različitih vrsta i na različitim lokacijama. Na primer, tumori koji ne mogu da se operišu, oni kanceri koji imaju pristup ka više sistema u telu (hematološki i imunološki tumori) i oni koji su najotporniji na uobičajene načine lečenja, smatraju se najozbiljnijim. U ovim situacijama, smatra se da produžavanje očekivane dužine života subjekta i/ili smanjenje bola, smanjenje udela kanceroznih ćelija ili ograničavanje ćelija na jedan sistem i poboljšavanje stadijuma raka/gradusa tumora/histološkog gradusa/nukleusnog gradusa, predstavlja ublažavanje znaka ili simptoma raka.

[0109] Kako se ovde koristi, izraz "simptom" je definisan kao pokazatelj bolesti, oboljenja, povrede, ili da nešto u telu nije kako treba. Simptome oseća ili primećuje osoba koja ima simptom, a moguće je da ih drugi ne primete lako. Drugi se definišu kao osobe koje se zdravstvenom negom ne bave profesionalno.

[0110] Kako se ovde koristi izraz "znak" je takođe definisan kao pokazatelj da u telu nešto nije kako treba. Ali znakovi se definišu kao ono što može da vidi doktor, medicinska sestra, ili druge osobe koje se profesionalno bave zdravstvenom zaštitom.

[0111] Rak predstavlja grupu bolesti koje mogu da izazovu skoro bilo kakav znak ili simptom. Znakovi i simptomi zavisiće od toga gde se rak nalazi, od veličine raka, i od toga koliko on utiče na susedne organe ili strukture. Ukoliko se rak raširi (metastazira), tada simptomi mogu da se pojave u drugim delovima tela.

[0112] Kada rak raste, on počinje da vrši pritisak na obližnje organe, krvne sudove i nerve. Ovaj pritisak stvara neke od znakova i simptoma raka. Ako se rak nalazi u kritičnom području, kao što su neki delovi mozga, čak i najmanji tumor može da dovede do ranih simptoma.

[0113] Ali ponekad kanceri počinju na mestima na kojim ne izazivaju nikakve simptome dok ne postanu prilično veliki. Kanceri pankreasa, na primer, obično ne porastu u dovoljnoj meri da bi mogli da se osete na spoljašnjosti tela. Neki kanceri pankreasa ne uzrokuju simptome dok ne počnu da razrastaju oko susednih nerava (ovo izaziva bolove u leđima). Drugi razrastaju oko žučnog kanala, što blokira protok žuči i dovodi do žutila kože poznatog kao žutica. Do momenta kada kancer pankreasa izazove ove znakove ili simptome, obično je dostigao uznapredovali stadijum.

2

[0114] Rak može da izazove i simptome kao što su povišena temperatura, zamor ili gubitak težine. Do ovoga može da dođe zbog toga što ćelije kancera troše mnogo energetskih zaliha tela ili oslobađaju supstance koje menjaju metabolizam tela. Ili rak može da uzrokuje reakciju imunog sistema na načine koji dovode do ovih simptoma.

[0115] Ponekad, ćelije kancera oslobađaju u krvotok supstance koje izazivaju simptome za koje se obično ne misli da su rezultat raka. Na primer, neke vrste raka pankreasa mogu da oslobađaju supstance koje dovode do razvoja krvnih ugrušaka u venama nogu. Neke vrste raka pluća proizvode hormonima slične supstance koje utiču na nivoe kalcijuma u krvi, pogađajući nerve i mišiće i izazivajući slabost i vrtoglavicu

[0116] Rak prezentuje nekoliko opštih znakova ili simptoma koji se javljaju kada su prisutni različiti podtipovi ćelija raka. Većina ljudi koji imaju rak sa bolešću u nekom trenutku gube težinu. Neobjašnjeni (nenamerni) gubitak težine od 10 funti ili više može da bude prvi znak raka, naročito raka pankreasa, želuca, jednjaka ili pluća.

[0117] Povišena temperatura je veoma uobičajeno stanje kod raka, ali se češće uočava kod uznapredovale bolesti. Skoro svi pacijenti sa rakom, imaće u nekom trenutku povišenu temperaturu, posebno ako rak ili njegovo lečenje utiču na imuni sistem i otežavaju telu borbu protiv infekcije. Ređe, povišena temperatura može da bude rani znak kancera, kao kod leukemije ili limfoma.

[0118] Zamor može da bude važan simptom kako rak napreduje. Može, međutim da se pojavi i ranije, kod kancera kao što je leukemija, ili ako kancer izaziva stalan gubitak krvi, kao što je to slučaj kod nekih vrsta raka debelog creva ili želuca.

[0119] Bol može da bude rani simptom za neke kancere kao što su rak kosti ili testisa. Ali bol je najčešće simptom uznapredovale bolesti.

[0120] Uz kancere kože (videti sledeći odeljak), neki unutrašnji kanceri mogu da izazovu znake na koži koji mogu da se uoče. Ove promene uključuju to da koža izgleda tamnije (hiperpigmentacija), žuto (žutica), ili crveno (eritem); da svrbi; ili da dlake rastu prekomerno.

[0121] Alternativno, ili dodatno, podtipovi raka prezentuju specifične znakove ili simptome. Promene u pražnjenju creva ili funkcionisanju bešike mogu da ukazuju na rak. Dugotrajna konstipacija, dijareja ili promena veličine stolice može da bude znak raka debelog creva. Bol prilikom mokrenja, krv u urinu, ili promena u funkcionisanju bešike (kao što je češće ili manje učestalo mokrenje) mogu da budu u vezi sa rakom bešike ili prostate.

[0122] Promene kod stanja kože ili pojava novog stanja kože može da ukazuje na rak. Kanceri kože mogu da krvare ili da izgledaju kao čirevi koji ne zarastaju. Dugotrajni čir u ustima može da predstavalja oralni kancer, posebno kod pacijenata koji puše, žvaću duvan ili često piju alkohol. alkohol. Čirevi na penisu ili vagini mogu da budu ili znakovi infekcije ili rani kancer.

[0123] Neuobičajeno krvarenje ili sekret mogu da ukazuju na rak. Neuobičajeno krvarenje može da se dogodi ili kod ranog ili kod uznapredovalog raka. Krv u ispljuvku (sluz) može da bude znak raka pluća. Krv u stolici (ili tamna ili crna stolica) može da bude znak raka debelog creva ili rektuma. Rak grlića materice ili endometrijuma (sluzokoža materice) mogu da dovedu do vaginalnog krvarenja. Krv u urinu može da bude znak raka bešike ili bubrega. Krvavi sekret iz bradavice može da bude znak raka dojke.

[0124] Zadebljanje ili grudvica u dojci ili u drugim delovima tela može da ukaže na prisustvo raka. Mnogi kanceri mogu da se osete kroz kožu, uglavnom u dojci, testisu, limfnim čvorovima (žlezdama), i u mekim tkivima tela. Grudvica ili zadebljanje mogu da budu rani ili kasni znak raka. Bilo koja grudvica ili zadebljanje mogu da ukazuju na rak, posebno ako je formacija nova ili se povećala.

[0125] Loše varenje ili problemi sa gutanjem mogu da ukazuju na rak. Premda ovi simptomi uobičajeno imaju druge uzroke, problemi sa varenjem ili gutanjem mogu da budu znak za rak jednjaka, želuca ili ždrela (grla).

[0126] Nedavne promene bradavice ili mladeža mogu da ukazuju na rak. Bilo koja bradavica, mladež ili fleka koje menjaju boju, veličinu ili oblik, ili gube svoje definisane granice, ukazuju na potencijal za razvoj raka. Na primer, lezija na koži može da bude melanom.

[0127] Dugotrajni kašalj ili promuklost mogu da ukazuju na rak. Kašalj koji ne prolazi može da bude znak raka pluća. Promuklost može da bude znak raka grkljana (govornog aparata) ili štitne žlezde.

[0128] Premda su prethodno navedeni znakovi i simptomi oni koji se češće sreću kod raka, postoje i mnogi drugi koji su manje uobičajeni i nisu ovde navedeni. Međutim, svi znakovi i simptomi raka poznati u oblasti, razmatrani su i obuhvaćeni ovim pronalaskom.

[0129] Lečenje raka može da dovede do smanjenja veličine tumora. Smanjenje veličine tumora može da se označava i kao "regresija tumora". Poželjno, nakon lečenja, veličina tumora se smanjuje za 5% ili više, u odnosu na svoju veličinu pre lečenja; poželjnije, veličina tumora se smanjuje za 10% ili više; poželjnije, smanjuje se za 20% ili više; još poželjnije, smanjuje se za 30% ili više; još poželjnije, smanjuje se za 40% ili više; još poželjnije, smanjuje se za 50% ili više; i najpoželjnije, smanjuje se za više od 75%, ili više. Veličina tumora može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Veličina tumora može da se meri kao prečnik tumora.

[0130] Lečenje raka može da dovede do smanjenja zapremine tumora. Poželjno, nakon lečenja, zapremina tumora se smanjuje za 5% ili više u odnosu na svoju veličinu pre lečenja; poželjnije, zapremina tumora se smanjuje za 10% ili više; poželjnije, smanjuje se za 20% ili više; poželjnije, smanjuje se za 30% ili više; poželjnije, smanjuje se za 40% ili više; još poželjnije, smanjuje se za

1

50% ili više; i najpoželjnije, smanjuje se za više od 75%, ili više. Zapremina tumora može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje.

[0131] Lečenje raka dovodi do smanjenja broja tumora. Poželjno, nakon lečenja, broj tumora se smanjuje za 5% ili više u odnosu na broj pre lečenja; poželjnije, broj tumora se smanjuje za 10% ili više; poželjnije, smanjuje se za 20% ili više; poželjnije, smanjuje se za 30% ili više; poželjnije, smanjuje se za 40% ili više; još poželjnije, smanjuje se za 50% ili više; i najpoželjnije, smanjuje se za više od 75%. Broj tumora može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Broj tumora može da se meri brojanjem tumora koji se vide golim okom ili pri određenom uveličanju. Poželjno, određeno uveličanje je 2x, 3x, 4x, 5x, 10x ili 50x.

[0132] Lečenje raka može da dovede do smanjenja broja metastatskih lezija u drugim tkivima ili organima udaljenim od primarne lokacije tumora. Poželjno, nakon lečenja, broj metastatskih lezija se smanjuje za 5% ili više u odnosu na broj pre lečenja; poželjnije, broj metastatskih lezija se smanjuje za 10% ili više; poželjnije, smanjuje se za 20% ili više; poželjnije, smanjuje se za 30% ili više; poželjnije, smanjuje se za 40% ili više; još poželjnije, smanjuje se za 50% ili više; i najpoželjnije, smanjuje se za više od 75%. Broj metastatskih lezija može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Broj metastatskih lezija može da se meri brojanjem metastatskih lezija vidljivih golim okom ili pri određenom uveličanju. Poželjno, određeno uveličanje je 2x, 3x, 4x, 5x, 10x ili 50x.

[0133] Lečenje raka može da dovede do povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji lečenih subjekata, u poređenju sa populacijom koja prima samo nosač. Poželjno, prosečno vreme preživljavanja povećava se za više od 30 dana; poželjnije, za više od 60 dana; poželjnije, za više od 90 dana; i najpoželjnije, za više od 120 dana. Povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima. Povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može da se meri, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja u populaciji nakon početka lečenja aktivnim jedinjenjem. Povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može takođe da se meri, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja u populaciji nakon završetka prve runde lečenja aktivnim jedinjenjem.

[0134] Lečenje raka može da dovede do povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji lečenih subjekata, u poređenju sa populacijom nelečenih subjekata. Poželjno, prosečno vreme preživljavanja povećava se za više od 30 dana; poželjnije, za više od 60 dana; poželjnije, za više od 90 dana; i najpoželjnije, za više od 120 dana. Povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Povećanje prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može da se meri, na primer,

2

izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja nakon početka lečenja aktivnim jedinjenjem. Povećanje prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može takođe da se meri, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja nakon završetka prve runde lečenja aktivnim jedinjenjem.

[0135] Lečenje raka može da dovede do povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima monoterapiju sa lekom koji nije ovde opisano jedinjenje. Poželjno, prosečno vreme preživljavanja se povećava za više od 30 dana; poželjnije, za više od 60 dana; poželjnije, za više od 90 dana; i najpoželjnije, za više od 120 dana. Povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Povećanja prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može da se meri, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja nakon početka lečenja aktivnim jedinjenjem. Povećanje prosečnog vremena preživljavanja u populaciji može takođe da se meri, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja nakon završetka prve runde lečenja aktivnim jedinjenjem.

[0136] Lečenje raka može da dovede do smanjenja stope mortaliteta u populaciji lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima samo nosač. Lečenje raka može da dovede do smanjenja stopa mortaliteta u populaciji lečenih subjekata u poređenju sa nelečenom populacijom. Lečenje raka može da dovede do smanjenja stopa mortaliteta u populaciji lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima monoterapiju sa lekom koji nije ovde opisano jedinjenje. Poželjno, stopa mortaliteta smanjuje se za više od 2%; poželjnije, za više od 5%; poželjnije, za više od 10%; i najpoželjnije, za više od 25%. Smanjenje stope mortaliteta u populaciji može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Smanjenje stope mortaliteta u populaciji može da se meri, na primer, izračunavanjem prosečnog broja smrti u vezi sa bolešću, po jedinici vremena, u populaciji, nakon početka lečenja aktivnim jedinjenjem. Smanjenje stope mortaliteta u populaciji može takođe da se meri, na primer, izračunavanjem prosečnog broja smrtnih slučajeva u vezi sa bolešću, po jedinici vremena, u populaciji, nakon završetka prve runde lečenja aktivnim jedinjenjem.

[0137] Lečenje raka može da dovede do smanjenja stope rasta tumora. Poželjno, nakon lečenja, stopa rasta tumora se smanjuje za najmanje 5% u odnosu na broj pre lečenja; poželjnije, stopa rasta tumora se smanjuje za najmanje 10%; poželjnije, smanjuje se za najmanje 20%; poželjnije, smanjuje se za najmanje 30%; poželjnije, smanjuje se za najmanje 40%; poželjnije, smanjuje se za najmanje 50%; još poželjnije, smanjuje se za najmanje 50%; i najpoželjnije, smanjuje se za najmanje 75%. Stopa rasta tumora može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Stopa rasta tumora može da se meri na osnovu promene prečnika tumora po jedinici vremena.

[0138] Lečenje raka može da dovede do smanjenja ponovnog rasta tumora. Poželjno, nakon lečenja, ponovni rast tumora iznosi manje od 5%; poželjnije, ponovni rast tumora iznosi manje od 10%; poželjnije, manje od 20%; poželjnije, manje od 30%; poželjnije, manje od 40%; poželjnije, manje od 50%; još poželjnije, manje od 50%; i najpoželjnije, manje od 75%. Ponovni rast tumora može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Ponovni rast tumora se meri, na primer, merenjem povećanja prečnika tumora posle prethodnog smanjenja tumora koje je usledilo nakon lečenja. Na smanjenja ponovnog rasta tumora ukazuje izostajanje ponovne pojave tumora nakon što se lečenje završilo.

[0139] Lečenje ili prevencija proliferativnog ćelijskog poremećaja mogu da dovedu do smanjenja stope proliferacije ćelija. Poželjno, nakon lečenja, stopa proliferacije ćelija je smanjena za najmanje 5%; poželjnije, za najmanje 10%; poželjnije, za najmanje 20%; poželjnije, za najmanje 30%; poželjnije, za najmanje 40%; poželjnije, za najmanje 50%; još poželjnije, za najmanje 50%; i najpoželjnije, za najmanje 75%. Stopa proliferacije ćelija može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Stopa proliferacije ćelija se meri, na primer, merenjem broja ćelija koje se dele u uzorku tkiva, po jedinici vremena.

[0140] Lečenje ili prevencija proliferativnog ćelijskog poremećaja može da dovede do smanjenja udela proliferišućih ćelija. Poželjno, nakon lečenja, udeo proliferišućih ćelija je smanjen za najmanje 5%; poželjnije za najmanje 10%; poželjnije za najmanje 20%; poželjnije za najmanje 30%; poželjnije za najmanje 40%; poželjnije za najmanje 50%; još poželjnije za najmanje 50%; i najpoželjnije, za najmanje 75%. Udeo proliferišućih ćelija može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima merenja. Poželjno, udeo proliferišućih ćelija se meri, na primer, kvantifikacijom broja ćelija koje se dele u odnosu na broj ćelija koje se ne dele, u uzorku tkiva. Udeo proliferišućih ćelija može da bude ekvivalentan mitotskom indeksu.

[0141] Lečenje ili prevencija proliferativnog ćelijskog poremećaja može da dovede do smanjenja veličine oblasti ili zone proliferacije ćelija. Poželjno, nakon lečenja, veličina oblasti ili zone proliferacije ćelija smanjena je za najmanje 5% u odnosu na svoju veličinu pre lečenja; poželjnije, smanjena je za najmanje 10%; poželjnije, smanjena je za najmanje 20%; poželjnije, smanjena je za najmanje 30%; poželjnije, smanjena je za najmanje 40%; poželjnije, smanjena je za najmanje 50%; još poželjnije, smanjena je za najmanje 50%; i najpoželjnije, smanjena je za najmanje 75%. Veličina oblasti ili zone proliferacije ćelija može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Veličina oblasti ili zone proliferacije ćelija može da se meri kao prečnik ili širina oblasti ili zone proliferacije ćelija.

[0142] Lečenje ili prevencija proliferativnog ćelijskog poremećaja može da dovede do smanjenja broja ili udela ćelija koje imaju abnormalan izgled ili morfologiju. Poželjno, nakon lečenja, broj ćelija koje imaju abnormalnu morfologiju smanjen je za najmanje 5% u odnosu na svoju veličinu

4

pre lečenja; poželjnije, smanjen je za najmanje 10%; poželjnije, smanjen je za najmanje 20%; poželjnije, smanjen je za najmanje 30%; poželjnije, smanjen je za najmanje 40%; poželjnije, smanjen je za najmanje 50%; još poželjnije, smanjen je za najmanje 50%; i najpoželjnije, smanjen je za najmanje 75%. Abnormalan izgled ili morfologija mogu da se mere bilo kojim reproducibilnim sredstvima za merenje. Abnormalna morfologija ćelija može da se meri mikroskopijom, npr., upotrebom invertovanog mikroskopa za ćelijsku kulturu. Abnormalna morfologija ćelija može da bude u formi nuklearnog pleomorfizma.

[0143] Kako se ovde koristi, izraz "selektivno" označava težnju pojavljivanja sa većom učestalošću u jednoj populaciji nego u drugoj populaciji. Poređene populacije mogu da budu populacije ćelija. Poželjno, ovde opisano jedinjenje (tj., hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A) deluje selektivno na kancer ili prekanceroznu ćeliju ali ne i na normalnu ćeliju. Poželjno, ovde opisano jedinjenje deluje selektivno na modulaciju jednog ciljnog molekula (npr., ciljnu protein metiltransferazu) ali ne modulira značajno drugi ciljni molekul (npr., protein metiltransferazu koja nije ciljni molekul). Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za selektivnu inhibiciju aktivnosti enzima kao što je proteinska metiltransferaza. Poželjno, neki događaj se javlja selektivno u populaciji A u odnosu na populaciju B ukoliko se javlja više od dva puta češće u populaciji A u odnosu na populaciju B. Neki događaj se javlja selektivno ukoliko se javlja više od pet puta češće u populaciji A. Neki događaj se javlja selektivno ukoliko se javlja više od deset puta češće u populaciji A; poželjnije, više od pedeset puta; još poželjnije, više od 100 puta; i najpoželjnije, više od 1000 puta češće u populaciji A u poređenju sa populacijom B. Na primer, moglo bi se reći da se ćelijska smrt javlja selektivno u ćelijama raka kada bi se javljala dva puta češće u ćelijama raka u poređenju sa normalnim ćelijama.

[0144] Ovde opisano jedinjenje može da modulira aktivnost ciljnog molekula (npr., ciljne proteinske metiltransferaze). Modulacija se odnosi na stimulaciju ili inhibiciju aktivnosti ciljnog molekula. Poželjno, ovde opisano jedinjenje modulira aktivnost ciljnog molekula ukoliko stimuliše ili inhibira aktivnost ciljnog molekula najmanje dvostruko u odnosu na aktivnost ciljnog molekula pod istim uslovima, ali kada pomenuto jedinjenje nedostaje. Poželjnije, ovde opisano jedinjenje modulira aktivnost ciljnog molekula ukoliko stimuliše ili inhibira aktivnost ciljnog molekula najmanje 5-ostruko, najmanje 10-ostruko, najmanje 20-ostruko, najmanje 50-ostruko, najmanje 100-ostruko u odnosu na aktivnost ciljnog molekula pod istim uslovima, ali kada jedino pomenuto jedinjenje nedostaje. Aktivnost ciljnog molekula može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima. Aktivnost ciljnog molekula može da se meri in vitro ili in vivo. Na primer, aktivnost ciljnog molekula može da se meri in vitro, testom za enzimsku aktivnost ili testom vezivanja DNK, ili aktivnost ciljnog molekula može da se meri in vivo tako što se testira ekspresija reporter-gena.

[0145] Ovde opisano jedinjenje (tj., hidrobromid jedinjenja I, kao i polimorf A) ne modulira značajno aktivnost ciljnog molekula ukoliko dodavanje tog jedinjenja ne stimuliše ili inhibira aktivnost ciljnog molekula za više od 10% odnosu na aktivnost ciljnog molekula pod istim uslovima, ali kada jedino pomenuto jedinjenje nedostaje.

[0146] Kako se ovde koristi, izraz "izozim-selektivan" označava preferencijalnu inhibiciju ili stimulaciju prve izoforme enzima u odnosu na drugu izoformu enzima (npr., preferencijalnu inhibiciju ili stimulaciju izozima alfa proteinske metiltransferaze u poređenju sa izozimom beta proteinske metiltransferaze). Poželjno, ovde opisano jedinjenje pokazuje minimalno četvorostruku razliku, poželjno desetostruku razliku, poželjnije pedesetostruku razliku u dozi neophodnoj za postizanje biološkog efekta. Poželjno, ovde opisano jedinjenje pokazuje ovu razliku u okviru opsega inhibicije, i primer za tu razliku je IC50, tj., 50% inhibicije, za ciljni molekul od interesa.

[0147] Primena ovde opisanog jedinjenje na ćeliju ili na subjekt kome je to potrebno, može da dovede do modulacije (tj., stimulacije ili inhibicije) aktivnosti proteinske metiltransferaze od interesa.

[0148] Lečenje kancera ili proliferativnog ćelijskog poremećaja može da dovede do ćelijske smrti, i poželjno, ćelijska smrt dovodi do smanjenja broja ćelija u populaciji od najmanje 10%. Poželjnije, ćelijska smrt podrazumeva smanjenje od najmanje 20%; poželjnije, smanjenje od najmanje 30%; poželjnije, smanjenje od najmanje 40%; poželjnije, smanjenje od najmanje 50%; najpoželjnije, smanjenje od najmanje 75%. Broj ćelija u populaciji može da se meri bilo kojim reproducibilnim sredstvima. Broj ćelija u populaciji može da se meri fluorescencijom aktiviranim ćelijskim sortiranjem (FACS), imunofluorescentnom mikroskopijom i svetlosnom mikroskopijom. Metode merenje ćelijske smrti prikazani su u Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8, 2003. U jednom aspektu, do ćelijske smrti dolazi usled apoptoze.

[0149] Poželjno, efikasna količina ovde opisanog jedinjenja nije u značajnoj meri citotoksična za normalne ćelije. Terapeutski efikasna količina jedinjenja nije u značajnoj meri citotoksična za normalne ćelije ukoliko primena jedinjenja u terapeutski efikasnoj količini ne indukuje ćelijsku smrt kod više od 10% normalnih ćelija. Terapeutski efikasna količina jedinjenja ne utiče znčajno na vijabilnost normalnih ćelija ukoliko primena jedinjenja u terapeutski efikasnoj količini ne indukuje ćelijsku smrt kod više od 10% normalnih ćelija. U jednom aspektu, do ćelijske smrti dolazi usled apoptoze.

[0150] Kontakt ćelija sa ovde opisanim jedinjenjem može da indukuje ili aktivira ćelijsku smrt selektivno u ćelijama raka. Primena ovde opisanog jedinjenja kod subjekta kome je to potrebno može da indukuje ili aktivira ćelijsku smrt selektivno u ćelijama raka. Kontakt ćelije sa ovde opisanim jedinjenjem može da indukuje ćelijsku smrt selektivno u jednoj ili više ćelija koje su pogođene proliferativnim ćelijskim poremećajem. Poželjno, primena ovde opisanog jedinjenja kod subjekta kome je to potrebno indukuje ćelijsku smrt selektivno u jednoj ili više ćelija koje su pogođene proliferativnim ćelijskim poremećajem.

[0151] Ovde je opisan postupak za lečenje ili prevenciju raka (npr, na onog na čiji se tok može uticati modulacijom EZH2-posredovane metilacije proteina) primenom ovde opisanog jedinjenja (tj., hidrobromida jedinjenja I, kao i polimorfa A) kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu primena jedinjenja dovodi do jedne ili više sledećih mogućnosti: sprečavanja proliferacije ćelija raka nagomilavanjem ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa (npr. G1, G1/S, G2/M), ili do indukcije ćelijskog starenja, ili stimulacije diferencijacije ćelije tumora; stimulacije ćelijske smrti u ćelijama raka putem citotoksičnosti, nekroze ili apoptoze, bez značajne količine ćelijske smrti kod normalnih ćelija, antitumorske aktivnosti kod životinja sa terapeutskim indeksom od najmanje 2. Kako se ovde koristi, "terapeutski indeks" je maksimalna tolerisana doza podeljena sa efikasnom dozom. Ovde je takođe opisan postupak za identifikaciju pogodnih kandidata za lečenje ili prevenciju raka.

[0152] Stručnjak u oblasti može da konsultuje opšte referentne tekstove kako bi našao detaljne opise poznatih tehnika koje se ovde razmatraju, ili ekvivalentne tehnike. Ovi tekstovi uključuju Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990). Ovi tekstovi se, naravno, mogu konsultovati i prilikom pravljenja ili upotrebe nekog aspekta pronalaska.

Primeri

Materijali i metode

Rendgenska difrakcija praha

[0153] PXRD za sve uzorke određena je na instrumentu Rigaku MultiFlex (meta: Cu; napon u cevi: 40 kV; struja u cevi: 30 mA).

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

[0154] DSC za sve uzorke određena je na instrumentu Mettler-Toledo DSC 1/700 (uslovi rada: inicijalna temperatura 35°C, finalna temp.325°C, stopa zagrevanja 30°C/min).

Rendgenska kristalografija

[0155] Bezbojni ravan kristal dimenzija 0.28 x 0.22 x 0.06 mm postavljen je na najlonsku petlju upotrebom veoma male količine paratonskog ulja. Podaci su sakupljeni uz pomoć Bruker difraktometra na bazi CCD (uređaja sa spregnutim naelektrisanjem), opremljenog Oxford Cryostream nisko-temperaturnim aparatom koji funkcioniše na 173 K. Podaci su izmereni uz pomoć omega- i fi-skeniranja od 0.5° po okviru, tokom 45 s. Ukupan broj slika je bio zasnovan na rezultatima dobijenim pomoću programa COSMO gde je očekivana redundansa bila 4.0 i potpunost od 100% sve do 0.83 Å. Ćelijski parametri su preuzeti pomoću softvera APEX II i utačnjeni koristeći softver SAINT na svim uočenim refleksijama. Redukcija podataka je sprovedena koristeći softver SAINT koji vrši korekciju za Lp. Korekcije skaliranja i apsorpcije su primenjen upotrebom SADABS tehnike višestrukog skeniranja, koju je obezbedio Džordž Šeldrik. Strukture su rešene direktnom metodom, upotrebom SHELXS-97 programa, i utačnjene metodom najmanjih kvadrata baziranom na F2 , SHELXL- 97, koji su ugrađeni u SHELXTL-PC V 6.10.

[0156] Struktura prikazana na slici 11 rešena je u prostornoj grupi P21/c (# 14). Svi ne-vodonični atomi su utačnjeni anizotropno. Vodonici su izračunati geometrijskim postupcima i utačnjeni primenom jašućeg modela. Kristal koji je korišćen za studiju difrakcije nije pokazao raspadanje tokom sakupljanja podataka. Svi crteži su urađeni prema 50% elipsoidima.

Dinamička sorpcija pare

[0157] DVS je merena na sistemu VTI Model SGA-100. Metod merenja: relativna vlažnost (RH) je menjana na kontrolisan način u koracima od po 5%, od 5.0% do 95.0% a zatim natrag do 5.0% upotrebom gravimetrijskog sistema za sorpciju pare, i u svakom stadijumu merena je promena težinskog procenta (tež%) uzorka.

HPLC

[0158] HPLC je sprovedena na Agilent 1200 HPLC sa kvaternernom pumpom, sa mešanjem na niskom pritisku i sa linijskim degazerom. Uslovi analitičke metode: 8 µL uzorka (20 mg of ER-581982-06 razblažen sa 50 mL metanola kako bi se obezbedio rastvor od približno 0.4 mg/mL) injektiran je na kolonu Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 150 mm, 3.5 um), Uslovi hromatografije: mobilna faza A, voda sa 5mM amonijum formijata; mobilna faza B, 5 mM amonijum formijat u 50/45/5 acetonitril/metanol/vodi; stopa protoka, 1.5 ml/min.; gradijent: izokratski pri 10% B od 0 do 3 min; linearno povećanje 70% B od 3 do 7 min; izokratski pri 70% B od 7 to 12 min; linearno povećanje do 100% B od 12 do 15 min izokratski pri 100% B od 15 do 20 min; temperatura kolone, 35 °C; detekcija, UV 230 nm. Približno retenciono vreme jedinjenja I = 10.7 min.

Sinteza polimorfa A

[0159]

[0160] 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzojeva kiselina U rastvor 2-metil-3-nitrobenzojeve kiseline (100 g, 552 mmol) u konc. H2SO4(400 mL), koji se mešao na sobnoj temperaturi, dodavan je postepeno 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindion (88 g, 308 mmol) i reakciona smeša je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 h. Reakciona smeša je zatim sipana na ledenohladnu vodu, istaložena čvrsta supstanca je filtrirana, oprana vodom i osušena u vakuumu kako bi se dobilo željeno jedinjenje u vidu čvrste supstance (140 g, 98%). Izdvojeno jedinjenje korišćeno je direktno u sledećem koraku.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).

[0161] Metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoat U rastvor 5-bromo-2-metil-3 nitrobenzojeve kiseline (285 g, 1105 mmol) u DMF (2.8L), koji se mešao na sobnoj temperaturi je dodat natrijum karbonat (468 g, 4415 mmol) nakon čega je dodat metil jodid (626.6 g, 4415 mmol). Dobijena reakciona smeša je zagrevana na 60 °C tokom 8 h. Nakon završetka (što je praćeno pomoću TLC), reakciona smeša je filtrirana (da bi se uklonio natrijum karbonat) i oprana etil acetatom (1L X 3). Kombinovani filtrat je opran vodom (3L X 5) i vodena faza je ponovo ekstrahovana etil acetatom (1L X 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pri smanjenom pritisku kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu čvrste supstance (290g, 97% prinos). Izdvojeno jedinjenje korišćeno je direktno u sledećem koraku.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).

[0162] Metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoat (1) U rastvor metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoata (290 g, 1058 mmol) u etanolu (1.5L), koji se mešao, dodat je vodeni amonijum hlorid (283 g, 5290 mmol rastvoren u 1.5L vode). Dobijena smeša u koju je, deo po deo, dodato gvožđe u prahu (472 g, 8451 mmol), mešana je na 80°C. Dobijena reakciona smeša je zagrevana na 80 °C tokom 12 h. Nakon završetka, što je utvrđeno pomoću TLC, reakciona smeša je vruća filtrirana kroz celite® i punjenje od celita je oprano metanolom (5L) nakon čega je oprano pomoću 30% MeOH u DCM (5L). Kombinovani filtrat je koncentrovan u vakuumu, dobijeni ostatak je razblažen vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (2L) i ekstrahovan etil acetatom (5L X 3). Kombinovani organski slojevi osušeni su preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pri sniženom pritisku kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu čvrste supstance (220 g, 85%). Jedinjenje je korišćeno direktno u sledećem koraku.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).

[0163] Metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino) benzoat (2) Reaktor je napunjen metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoatom (455.8 g, 1.87 mol), 1,2-dihloroetanom (4.56 L) i sirećetnom kiselinom (535 ml, 9.34 mol). U smešu su dodati dihidro-2H-piran-4(3H)-on (280 g, 2.80 mol) i natrijum triacetoksiborohidrid (594 g, 2.80 mol) uz održavanje unutrašnje temperature ispod 40°C. Smeša je mešana na 25 °C tokom 2.5 h, a zatim je reakcija prekinuta rastvorom natrijum hidroksida (448 g, 11.20 mol) u vodi (5.61 L). Posle mešanja u trajanju od 20 minuta na temperaturi okoline, organski sloj je razdvojen, a vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom (3.65 L). Organski slojevi su kombinovani, oprani fiziološkim rastvorom (1.5 L), i koncentrovani u vakuumu.

[0164] Ostatak je tretiran etil acetatom (1.8 L) i zagrevan do 65-70 °C. Smeša je mešana na 65-70 °C tokom 15 minuta kako bi se dobio bistar rastvor i onda tretirana n-heptanom (7.3 L) uz održavanje temperature između 60-70 °C. Kada je heptan sasvim dodat u rastvor, smeša je držana na 65-70 °C tokom 15 minuta, a zatim ostavljena da se hladi do 18-22 °C tokom 3 h.

4

Dobijena suspenzija je mešana na 18-22 °C tokom 4 h, ohlađena do 0-5 °C tokom 1 h, i držana na 0-5 °C tokom 2 h. Precipitat je filtriran, opran dva puta n-heptanom (1.4 L), i osušen u vakuumu kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (540 g, 88%). XRPD difraktogram ovog jedinjenja je prikazan na slici 17.

[0165] Metil 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzoat (3) U rastvor metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il) amino) benzoata (14 g, 42.7 mmol) u dihloroetanu (150 mL), koji se mešao, dodati su acetaldehid (3.75 g, 85.2 mmol) i sirćetna kiselina (15.3 g, 256 mmol). Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Smeša je ohlađena do 0 °C i dodat je natrijum triacetoksiborohidrid (27 g, 128 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Po završetku reakcije, što je utvrđeno pomoću TLC, vodeni rastvor natrijum bikarbonata je dodavan u rekacionu smešu dok nije postignut pH 7-8, organska faza je odvojene, a vodena faza je ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pri smanjenom pritisku. Sirovo jedinjenje je prečišćeno hromatografijom na koloni (silikagel sa porama 100-200) uz eluciju pomoću smeše etil acetat:heksan kako bi se dobilo željeno jedinjenje u vidu viskozne tečnosti (14 g, 93%).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3H, J=6.8 Hz).

[0166] Metil 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksilat (4): Smeša metil 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoata (580 g, 1.63 mol), 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2il)benzil)morfolina (592 g, 1.95 mol), 1,4-dioksana (3.86 L), natrijum karbonata (618 g, 5.83 mol) i vode (771 ml) degazirana je sprovođenjem mehurića azota kroz smešu na 20 °C tokom 20 minuta i tretirana tetrakis(tripfenilfosfin)paladijumom(0) (14.11 g, 12.21 mmol). Dobijena smeša je degazirana dodatnih 20 minuta a zatim zagrevana na 87-89 °C tokom 17 h. Posle hlađenja do 20°C, smeša je razblažena etil acetatom (5.80 L) i rastvorom (R)-2-amino-3-merkaptopropionske kiseline (232 g) u vodi (2.320 L). Nakon mešanja tokom 1 h na 20 °C, organski sloj je odvojen i ponovo opran rastvorom (R)-2-amino-3-merkaptopropionske kiseline (232 g) u vodi (2.320 L). Vodeni slojevi su kombinovani i ekstahovani etil acetatom (5.80 L). Organski slojevi su kombinovani, oprani rastvorom natrijum hidroksida (93 g) u vodi (2.32 L), i koncentrovani u vakuumu na 35 °C kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu narandžastog ulja (1.21 kg, 164% prinos).

[0167] 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksilna kiselina (5): Metil 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksilat (69.0 g, 152.5 mmol) (na osnovu teorijskog prinosa iz prethodnog koraka) suspendovan je u etanolu (380 mL) i tretiran rastvorom natrijum hidroksida (24.84 g, 621.0 mmol) u vodi (207 mL). Smeša je mešana na 40°C tokom 18 h. Nakon hlađenja do 0-5 °C, smeša je neutralisana do pH 6.5 pomoću 1 N hlorovodonične kiseline (580 mL) uz održavanje temperature ispod 25 °C. Zatim je smeša dva puta ekstrahovana smešom dihlorometana (690 mL) i metanola (69.0 mL). Organski slojevi su kombinovani i koncentrovani u vakuumu, kako bi se dobio sirovi proizvod u vidu žute čvrste supstance (127g).

[0168] Sirovi proizvod je rastvoren u 2-metiltetrahidrofuranu (656 mL) na 70 °C i zatim tretiran sa IPA (828 mL). Smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature tokom 3-4 h i zatim mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Precipitat je filtriran, opran dva puta pomoću IPA (207 mL), i osušen u vakuumu kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu beličaste čvrste supstance (53.54 g, 80%). XRPD difraktogram ovog jedinjenja je prikazan na slici 9.

[0169] N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid (jedinjenje I): Smeša 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksilne kiseline (540 g, 1.23 mol) i 3-(aminometil)- 4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-on hidrohlorida (279 g, 1.48 mol) suspendovana je u DMSO (2.70 L) i tretirana trietilaminom (223 ml, 1.60 mol). Smeša je mešana na 25 °C tokom 30 min i tretirana pomoću EDC-HCl (354 g, 1.85 mol) i HOBT hidrata (283 g, 1.85 mol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Nakon dodavanja trietilamina (292 ml, 2.09 mol), smeša je ohlađena do 15 °C, razblažena vodom (10.1 L) uz održavanje temperature ispod 30 °C, i mešana na 19-25 °C tokom 4 h. Dobijeni precipitat je filtriran, dva puta opran vodom (2.70 L), i osušen u vakuumu kako bi dao sirovi proizvod (695 g, tež-tež analiza = 78%).

[0170] U cilju dodatnog prečišćavanja proizvoda, sprovedena je rekristalizacija. Sirovi proizvod (20.00 g, 34.92 mmol) je suspendovan u smeši etanola (190 ml) i vode (10.00 ml) i zagrevan do 75°C dok nije dobijen bistar rastvor. Rastvor je ostavljen da se ohladi do sobne temperature preko noći. Precipitat je filtriran, dva puta opran smešom etanola (30.0 ml) i vode (30.0 ml), i osušen u vakuumu na 35 °C kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu beličaste čvrste supstance (14.0 g, 70% oporavak iz sirovog i prinos 90% na osnovu tež-tež testa).

[0171] 4-((3’-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-5’-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil-[1,1’-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-ijum bromid (polimorf A): Sirovi N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid

4

(595 g, 464 g na osnovu tež- tež testa, 810.3 mmol) suspendovan je etanolu (3.33 L). Posle zagrevanja do 70 °C, smeša je tretirana 48% vodenim HBr (97 ml, 850.8 mmol) i mešana na 70 °C tokom 30 min. Dobijeni narandžasto-crveni rastvor tretiran je etil acetatom (3.33 L) uz održavanje temperature iznad 60 °C. Smeša je polako ohlađena na sobnu temperaturu tokom 18 h. Smeša je ohlađena do 0 °C tokom 1 h i mešana na toj temperaturi tokom 5.5 h. Dobijeni precipitat je filtriran, opran dva puta etil acetatom (1.39 L), i osušen u vakuumu kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu beličaste čvrste supstance (515 g, 97% prinos).

[0172] Rekristalizacija polimorfa A: 4-((3’-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-5’-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4’-metil-[1,1’-bifenil]-4il)metil)morfolin-4-ijum bromid (0.50 g, 0.77 mmol; 95.6% čistoća prema HPLC) suspendovan je u etanolu (3.0 mL) i zagrevan do 80 °C dok nije dobijen bistar rastvor. U rastvor je polako dodavan MTBE (5.0 mL). Dobijeni rastvor je ohlađen na 18-22 °C tokom 3 h i mešan na 18-22 °C tokom 15 h. Precipitat je filtriran, dva puta opran sa MTBE (2 mL) i osušen u vakuumu kako bi se dobilo 0.45 g jedinjenja iz naslova (89% oporavak, 96.6% čistoća prema HPLC). Rendgenski difraktogram praha polimorfa A (monohidrobromida) prikazan je na slici 1. U tabeli 1, u tekstu koji sledi, navedeni su najznačajniji pikovi.

Tabela 1

Procena hidrobromida jedinjenja I i polimorfa A

[0173] Niz različitih oblika soli jedinjenja I je pripremljen i testiran, uključujući soli hidrohlorida, hidrobromida, hemisulfata, natrijuma, fosfata, nitrata, maleata, malonata i L-tartrata. Među njima, so hidrobromida (HBr) je imala najviše povoljnih fizičko-hemijskih svojstava u smislu lakoće pripreme i higroskopnosti.

[0174] Sprovedeno je detaljno proučavanje slobodne baze jedinjenja I kao i HCl soli ovog jedinjenja. Tokom preliminarnog testiranja polimorfa upotrebom XRD i DSC, detektovano je najmanje pet različitih kristalnih oblika jedinjenja I izvedenih od slobodnog oblika jedinjenja I. Usled velikog stepena varijabilnosti koji je uočen tokom kristalizacije slobodnog oblika, dalje su praćeni kristalni oblici drugih soli. Od testiranih soli, oblici soli monohidrohlorida, monohidrobromida, hemisulfata, fosfata, maleat fosfata, maleata, L-tartarata i natrijuma su bile kristalne. Soli fosfata i maleata bile su veoma higroskopne, a L tartarat je imao slabu kristalnost.

[0175] Bilo je teško da se dobije visok stepen kristalnosti od HCl soli jedinjenja I. Dobijana je smeša kristalnog i amorfnog materijala, bez obzira na uslove kristalizacije. Ko što je prikazano na slici 8, DSC podaci za monohidrohloridnu so jedinjenja I ukazuju na izvestan stepen nekristalnosti sa endotermom na 190.5°C. Takođe su dobijeni podaci o dinamičkoj sorpciji pare (DVS) za monohidrohloridnu so jedinjenja I i nađeno je da pokazuju izvesnu higroskopnost: pri 75% relativne vlažnosti (RH) na 25°C (slika 18B) uočeno je povećanja težine između 4 - 6 %. Ovo bi moglo da se pripiše izvesnoj količini ne-kristalne prirode monohidrohloridne soli. Videti, npr., sliku 18A, koja prikazuje amorfni trihidrohlorid jedinjenja I. Zbog toga što nivo kristalnosti nije bilo moguće kontrolisati, dalji razvoj HCl soli nije razmatran.

[0176] Kao što je prikazano na slici 6, DVS analiza natrijumove soli jedinjenja I pokazala je značajnu higroskopnost: pri 75% relativne vlažnosti (RH) na 25°C, uočeno je približno 15% povećanja težine. Kao što je prikazano na slici 7, hemisulfatna so jedinjenja I prikazala je umereno visoku higroskopnost: uočeno je povećanje težine od 9 - 11% pri relativnoj vlažnosti (RH) od 75% na 25°C. Ovo može da se pripiše izuzetno ne-kristalnoj prirodi ovog jedinjenja, pošto DSC podaci o hemisulfatnoj soli ukazuju na veoma visok stepen ne-kristalnosti bez jasne endoterme.

[0177] Od ovih kristalnih jedinjenja, monohidrobromid je bio najkristalniji i najmanje higroskopan (videti slike 1, 3 i 4). Osim toga, monohidrobromid je veoma stabilan, i opire se stvaranju nečistoća (slika 5 predstavlja HPLC analizu polimorfa A tokom tri dana na povišenoj temperaturi. Polimorf A je proizveo minimalne nečistoće tokom tri dana na 100°C). Interesantno, nađeno je da je di HBr so jedinjenja I primarno amorfna (slika 2).

[0178] Dva različita kristalna oblika monohidrobromida jedinjenja I (polimorfi A i B) dobijeni su iz različitih sistema rastvarača i okarakterisani pomoću XRD, DSC i TGA-DSC analiza. XRD i DSC podaci za ova dva različita kristalna oblika iz reprezentativnih serija jedinjenja I prikazani su na slici 1, slici 3 i slici 10. Polimorf B karakteriše se XRD difraktogramom praha sa pikovima na 8.5, 10.9, 16.7, 17.4, 20.9, 22.1 i 25.7 /- 0.2 stepeni 2 teta (videti sliku 10). Nađeno je da je od ova dva, polimorf A u većoj meri kristalne prirode. Studije dinamičke adsorpcije pare (DVS) pokazale su da polimorf A nije higroskopan (Slika 4). Prilikom termičkih analiza, uočen je samo

4

jedan endotermni pik sa pojavljivanjem na temperaturi od približno 251°C. Pored toga, iz DSC analize je bilo očigledno da rekristalizacija polimorfa A značajno povećava stepen kristalnosti materijala (videti sliku 3).

[0179] Tokom višestrukih postupaka za dobijanje laboratorijskih količina, polimorf A je dobijan reproducibilno, a male promene u uslovima kristalizacije nisu dovodile do različitih kristalnih oblika.

Testovi sa divljim tipom PRC2 enzima i mutiranim PRC2 enzimom

[0180] Opšti materijali. S-adenozilmetionin (SAM), S-adenozilhomocistein (SAH), bicin, KCl, Tween20, dimetilsulfoksid (DMSO) i želatin goveđe kože (BSG) najvišeg mogućeg stepena čistoće, kupljeni su od kompanije Sigma-Aldrich. Ditiotreitol (DTT) je kupljen od kompanije EMD. 3H-SAM80 sa specifičnom aktivnošću od 80 Ci/mmol kupljen je od kompanije American Radiolabeled Chemicals. Flashplates ploče sa streptavidinom, sa 384 bunarčića, kupljene su od kompanije PerkinElmer.

[0181] Supstrati. Peptidi koji predstavljaju ostatke 21 - 44 humanog histona H3 koji sadrži ili nemodifikovani lizin 27 (H3K27me0) ili dimetilovani lizin 27 (H3K27me2), sintetisala je kompanija 21st Century Biochemicals, sa C-terminalnim marker-motivom koji ima afinitet za G (K-biotin) linker i sa C-terminalnom amidnom kapom. Peptidi su prečišćeni tečnom hromatografijom visoke performase (HPLC) do čistoće veće od 95% i potvrđeni tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS). Sekvence su navedene u tekstu ispod.

H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotin)-amid (SEQ ID NO: 1) H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotin)-amid (SEQ ID NO: 2)

[0182] Nukleozomi iz pilećih eritrocita prečišćeni su iz pileće krvi prema ustanovljenim procedurama.

[0183] Rekombinantni PRC2 kompleksi. Humani PRC2 kompleksi su prečišćeni kao 4-komponentni enzimski kompleksi, koeksprimirani u Spodoptera frugiperda (sf9) ćelijama upotrebom bakulovirusnog ekspresionog sistema. Eksprimirane subjedinice su EZH2 divljeg tipa (NM_004456) ili EZH2 Y641F, N, H, S ili C mutanti dobijeni od konstrukta EZH2 divljeg tipa, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) i RbAp48 (NM_005610). EED subjedinica sadržala je N-terminalni FLAG peptidni marker koji je korišćen da se ceo 4-komponentni kompleks prečisti iz lizata sf9 ćelija. Čistoća kompleksa je dostizala ili premašivala 95% što je utvrđeno analizom uz pomoć SDS PAGE i Agilent bioanalizatora. Koncentracije enzimskog stoka (u principu, 0.3 -

4

1.0 mg/mL) određene su pomoću Bredfordovog testa uz upoređivanje sa goveđim serumskim albuminom (BSA) kao standardom.

[0184] Opšti postupak za testove sa PRC2 enzimom na peptidnim supstratima. Svi testovi su izvedeni u puferu koji se sastoji od 20 mM bicina (pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG i 0.002% Tween20, pripremljenom na dan upotrebe. Jedinjenja u 100% DMSO (1 µL) nakapana su na polipropilenske ploče sa 384 bunarčića sa V dnom (Greiner) upotrebom Platemate 2 X 3 uređaja sa namontiranim 384-kanalnim nastavkom za pipetiranje (Thermo). DMSO (1 µL) je dodavan u kolone 11, 12, 23, 24, redovi A - H kako bi se formirale kontrole za maksimalni signal, a SAH, poznati proizvod i inhibitor PRC2 enzima (1 µL) dodavan je u kolone 11,12, 23, 24, redovi I - P kao kontrola za minimalni signal. Koktel (40 µL) sa PRC2 enzimom divljeg tipa i H3K27me0 peptidom ili bilo kojim od Y641 mutiranih enzima i H3K27me2 peptidom, dodavan je pomoću uređaja Multidrop Combi (Thermo). Jedinjenja su ostavljena da se inkubiraju sa PRC2 tokom 30 min na 25 °C, a zatim je koktel (10 µL) sa smešom neradioaktivnog i 3H-SAM dodat kako bi se inicirala reakcija (finalna zapremina = 51 µL). U svim slučajevima, finalne koncentracije su bile sledeće: PRC2 enzim divljeg tipa ili mutirani PRC2 enzim bio je 4 nM, SAH u kontrolnim bunarčićima za minimalni signal bio je 1 mM a DMSO koncentracija bila je 1%. Finalne koncentracije ostalih komponenti prikazane su u tabeli 2, u tekstu koji sledi. Testovi su zaustavljeni dodavanjem neradioaktivnog SAM (10 µL) do finalne koncentracije od 600 µM, čime se<3>H-SAM razblažuje do nivoa pri kome njegovo ugrađivanje u peptidni supstrat više ne može da se detektuje. Zatim je po 50 µL reakcije iz polipropilenske ploče sa 384 bunarčića prebačeno u Flashplate ploču sa 384 bunarčića i omogućeno je vezivanje biotinilizovanih peptida za površinu sa streptavidinom tokom najmanje 1h, pre trostrukog ispiranja sa 0.1% Tween20 u Biotek ELx405 uređaju za ispiranje ploča. Ploče su zatim očitavane u čitaču PerkinElmer TopCount kako bi se izmerila količina<3>H-obeleženog peptida vezanog za površinu Flashplate ploče, što je mereno kao raspadi po minuti (dpm) ili alternativno, označeno kao događaji po minuti (cpm).

Tabela 2: Finalne koncentracije komponenti za svaku od varijacija testa na osnovu EZH2 identiteta (divlji tip ili Y641 mutantni EZH2)

4

[0185] Opšta procedura za test sa PRC2 enzimom divljeg tipa na oligonukleozomskom supstratu. Testiranje je sprovedeno u puferu koji se sastoji od 20 mM bicina (pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG, 100 mM KCl i 0.002% Tween20, i koji je pripreman na dan upotrebe. Jedinjenja u 100% DMSO (1 µL) nakapana su na polipropilenske ploče sa 384 bunarčića sa V-dnom (Greiner) upotrebom Platemate 2 X 3 uređaja sa namontiranim 384-kanalnim nastavkom za pipetiranje (Thermo). DMSO (1 µL) je dodavan u kolone 11, 12, 23, 24, redovi A - H kako bi se formirale kontrole za maksimalni signal, a SAH, poznati proizvod i inhibitor PRC2 enzima (1 µL) dodavan je u kolone 11,12, 23, 24, redovi I - P kao kontrola za minimalni signal. Koktel (40 µL) sa PRC2 enzimom divljeg tipa i oligonukleozomom iz pilećih eritrocita, dodavan je pomoću uređaja Multidrop Combi (Thermo). Jedinjenja su ostavljena da se inkubiraju sa PRC2 tokom 30 min na 25 °C, a zatim je koktel (10 µL) sa smešom neradioaktivnog i<3>H-SAM dodat kako bi se inicirala reakcija (finalna zapremina = 51 µL). Finalne koncentracije su bile sledeće: PRC2 enzim divljeg tipa bio je 4 nM, neradioaktivni SAM bio je 430 nM, 3H-SAM je bio 120 nM, SAH u kontrolnim bunarčićima za minimalni signal bio je 1 mM a DMSO koncentracija bila je 1%. Testovi su zaustavljeni dodavanjem neradioaktivnog SAM (10 µL) do finalne koncentracije od 600 µM, čime se<3>H-SAM razblažuje do nivoa pri kome njegovo ugrađivanje u oligonukleozom iz pilećih eritrocita više ne može da se detektuje. Zatim je po 50 µL reakcije iz polipropilenske ploče sa 384 bunarčića prebačeno u Flashplate ploču sa 384 bunarčića i oligonukleozom iz pilećih eritrocita je imobilisan na površini ploče koja je zatim tri puta ispirana sa 0.1% Tween20 u Biotek ELx405 uređaju za ispiranje ploča. Ploče su zatim očitavane u čitaču PerkinElmer TopCount kako bi se izmerila količina<3>H-obeleženog oligonukleozoma iz pilećih eritrocita vezanog za površinu Flashplate ploče, što je mereno kao raspadi po minuti (dpm) ili alternativno, označeno kao događaji po minuti (cpm).

Izračunavanje % inhibicije

[0186]

Gde su dpm = raspadi po minuti, cmpd = signal u test bunarčiću, i min i maks su redom minimalni i maksimalni signali kontrola.

Četvoroparametarsko podešavanje IC50

4

[0188] Uobičajeno je omogućeno variranje gornje i donje vrednosti, ali kod 3-parametarskog podešavanja, one mogu da budu i fiksirane na 100 ili 0, redom. Uobičajeno je omogućeno variranje Hilovog koeficijenta ali kod 3-parametarskog podešavanja on može da bude i fiksiran na 1. Y je % inhibicije, a X je koncentracija jedinjenja.

[0189] IC50vrednosti za testove sa PRC2 enzimom na peptidnim supstratima (npr., EZH2 divljeg tipa i Y641F) predstavljeni su u tabeli 3 u tekstu koji sledi.

Test metilacije WSU-DLCL2

[0190] WSU-DLCL2 ćelije u suspenziji nabavljene su od DSMZ (Nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura, Braunschweig, Germany). RPMI/Glutamax medijum, penicilin-streptomicin, toplotom inaktivirani fetalni goveđi serum i D-PBS nabavljeni su od kompanije Life Technologies, Grand Island, NY, SAD. Pufer za ekstrakciju i pufer za neutralizaciju (5X) nabavljeni su od kompanije Active Motif, Carlsbad, CA, SAD. Zečije antihistonsko H3 antitelo, nabavljeno je od kompanije Abcam, Cambridge, MA, SAD. Zečiji anti-H3K27me3 i HRP-konjugovan anti-zečiji-IgG nabavljeni su od kompanije Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA. TMB supstrat "Super Sensitive" dobijen je od BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, USA. Goveđi serumski albumin bez IgG-a nabavljen je od kompanije Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA. PBS sa Tween-om (10X PBST) nabavljen je od kompanije KPL, Gaithersburg, MD, USA. Sumporna kiselina je nabavljena od kompanije Ricca Chemical, Arlington, TX, USA. Immulon ELISA ploče nabavljene su od kompanije Thermo, Rochester, NY, USA. Ploče za ćelijsku kulturu sa V dnom, nabavljene su od kompanije Corning Inc., Corning, NY, USA. Polipropilenske ploče sa V dnom nabavljene su od kompanije Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA.

[0191] WSU-DLCL2 ćelije u suspenziji održavane su u ćelijskom medijumu za rast (RPMI 1640 suplementiran sa 10% zap/zap toplotom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma i 100 jedinica/mL penicilin-streptomicina) i gajene na 37°C u 5% CO2. U uslovima izvođenja testa, ćelije su inkubirane u medijumu za testiranje (RPMI 1640 suplementiran sa 20% zap/zap toplotom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma i 100 jedinica/mL penicilin-streptomicina) na 37°C u 5% CO2, na šejkeru za mikrotitar-ploče.

4

[0192] WSU-DLCL2 ćelije su zasejane u medijumu za testiranje, pri koncentraciji od 50,000 ćelija po mL, u ploče za ćelijsku kulturu sa 96 bunarčića sa V dnom, u 200 µL po bunarčiću. Jedinjenje (1µL) iz stok-ploča sa 96 bunarčića, dodavano je direktno u ćelijske ploče sa V dnom. Ploče su inkubirane na šejkeru za mikro-titar ploče na 37°C, 5% CO2tokom 96 sati. Nakon četiri dana inkubacije, ploče su centrifugirane na 241 x g pet minuta i medijum je pažljivo aspiriran iz svakog bunarčića ploče tako da se ćelijski talog ne poremeti. Talog je resuspendovan u 200 µL DPBS i ploče su opet centrifugirane na 241 x g tokom pet minuta. Supernatant je aspiriran i hladni (4°C) pufer za ekstrakciju (100 µL) je dodavan u bunarčiće. Ploče su inkubirane na 4°C na orbitalnom šejkeru tokom dva sata. Ploče su centrifugirane na 3427 x g x 10 minuta. Supernatant (80 µL po bunarčiću) je prebačen u svoj odgovarajući bunarčić u polipropilenskoj ploči sa 96 bunarčića sa V dnom. Pufer za neutralizaciju 5X (20 µL po bunarčiću) je dodavan u polipropilensku ploču sa V dnom koja je sadržala supernatant. Polipropilenske ploče sa V dnom koje su sadržale sirovu preparaciju histona (CHP) inkubirane su na orbitalnom šejkeru x pet minuta. Sirove preparacije histona su dodate (2 µL po bunarčiću) u svaki odgovarajući bunarčić ELISA ploča sa 96 bunarčića, koje su sadržale po 100 µL pufera za oblaganje (1X PBS BSA 0.05% tež/zap), u duplikatu. Ploče su zaptivene i inkubirane preko noći na 4°C. Narednog dana, ploče su tri puta isprane sa po 300 µL 1X PBST po bunarčiću. Bunarčići su blokirane tokom 2 sata sa po 300 µL ELISA razblaživača ((PBS (IX) BSA (2% tež/zap) i Tween20 (0.05% zap/zap) po bunarčiću). Ploče su ispirane tri puta sa 1X PBST. U slučaju ploče za detekciju histona H3, po bunarčiću je dodavano 100 µL anti-histon-H3 antitela (Abcam, ab1791) razblaženog 1:10,000 u ELISA razblaživaču. U slučaju ploče za detekciju H3K27 trimetilacije, po bunarčiću je dodavano 100 µL anti-H3K27me3 razblaženog 1:2000 u ELISA razblaživaču. Ploče su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su tri puta ispirane sa po 300 µL 1X PBST po bunarčiću. Za detekciju histona H3, po bunarčiću je dodavano 100 µL HRP- konjugovanog antizečijeg IgG antitela razblaženog do 1:6000 u ELISA razblaživaču. Za detekciju H3K27me3, po bunarčiću je dodavano 100 µL HRP konjugovanog anti-zečijeg IgG antitela razblaženog do 1:4000 u ELISA razblaživaču. Ploče su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su četiri puta ispirane sa po 300 µL 1X PBST po bunarčiću.100 µL TMB supstrata je dodavano po bunarčiću. Histon H3 ploče su inkubirane pet minuta na sobnoj temperaturi. H3K27me3 ploče su inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena sumpornom kiselinom IN (100 µL po bunarčiću). Apsorbancija je za svaku ploču očitana na 450 nm.

[0193] Prvo je udeo za svaki bunarčić određen jednačinom;

[0194] Svaka ploča je uključivala osam kontrolnih bunarčića gde je DMSO bio jedini tretman (minimalna inhibicija) kao i osam kontrolnih bunarčića za maksimalnu inhibiciju (bunarčići sa pozadinskim signalom).

[0195] Prosečne vrednosti udela za svaki tip kontrole su izračunate i upotrebljene za određivanje procenta inhibicije za svaki test-bunarčić na ploči. Testirano jedinjenje je trostruko serijski razblaženo u DMSO sa ukupno deset koncentracija za testiranje, počevši od 25 µM. Određen je procenat inhibicije i napravljene su IC50krive koristeći duplikate bunarčića po koncentraciji jedinjenja. IC50vrednosti za ovaj test prikazane su u tabeli 3, u tekstu koji sledi.

Analiza proliferacije ćelija

[0196] WSU-DLCL2 ćelije u suspenziji nabavljene su od DSMZ (Nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura, Braunschweig, Germany). RPMI/Glutamax medijum, penicilin- streptomicin, toplotom inaktivirani fetalni goveđi serum nabavljeni su od kompanije Life Technologies, Grand Island, NY, USA. Polipropilenske ploče sa 384-bunarčića sa V dnom nabavljene su od kompanije Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA. Bele neprozirne ploče za ćelijsku kulturu, sa 384 bunarčića nabavljene su od kompanije Perkin Elmer, Waltham, MA, USA. Cell-Titer Glo® je nabavljen od kompanije Promega Corporation, Madison, WI, USA. SpectraMax M5 čitač mikrotitar-ploča nabavljen je od kompanije Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA.

[0197] WSU-DLCL2 ćelije u suspenziji održavane su u ćelijskom medijumu (RPMI 1640 suplementiran sa 10% zap/zap toplotom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma i gajene na 37°C u 5% CO2. U uslovima izvođenja testa, ćelije su inkubirane u test medijumu (RPMI 1640 siplementiran sa 20% zap/zap toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom i 100 jedinica/mL penicilin- streptomicina) na 37°C u 5% CO2.

[0198] U cilju procene efekta jedinjenja na proliferaciju WSU-DLCL2, ćelije u eksponencijalnoj fazi rasta su zasejane u bele neprozirne ploče sa 384 bunarčića, pri gustini od 1250 ćelija/ml u finalnoj zapremini od 50 µl test medijuma. Izvorna ploča sa jedinjenjima je pripremljena tako što su napravljena trostruka serijska razblaženja u DMSO-u, sa devet tačaka u triplikatu, počevši sa 10 mM (najviša finalna koncentracija jedinjenja u testu je bila 20 µM i DMSO je bio 0.2%). Alikvoti od 100 nL iz ploče sa stokom jedinjenja dodavani su u odgovarajuće bunarčiće ploče sa ćelijama. Kontrola sa 100% inhibicije sastojala se od ćelija tretiranih staurosporinom finalne koncentracije od 200 nM, a kontrola sa 0% inhibicije sastojala se od ćelija tretiranih sa DMSO. Nakon dodavanja jedinjenja, test ploče su inkubirane 6 dana na 37°C, 5% CO2, relativna

1

vlažnost > 90% tokom 6 dana. Vijabilnost ćelija je merena kvantifikacijom ATP-a prisutnog u ćelijskim kulturama, tako što je u ploče sa ćelijama dodavano po 35 µl Cell Titer Glo® reagensa. Luminescencija je očitavana na instrumentu SpectraMax M5. Koncentracija koja je inhibirala vijabilnost ćelija za 50% određena je upotrebom 4-parametarskog podešavanja normalizovanih krivih koje prikazuju odgovor na dozu. IC50vrednosti za ovaj test su predstavljene u tabeli 3 u tekstu koji sledi.

Tabela 3

In vivo studija - humana ćelijska linija limfoma SUDHL10

Miševi

[0199] Ženke Fox Chase SCID® miševa (CB 17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Beijing Vitalriver Laboratory Animal Co., LTD) bile su stare 6 - 8 nedelja i imale su telesnu težinu (BW) u opsegu od 16.0-21.1 g na D1 studije. Životinjama je ad libitum davana voda (sterilna) i zračenjem sterilisana suva hrana u granulama. Miševi su bili smešteni na prostirkama od kukuruznih klipova u statičkim mikroizolatorima pri 12-časovnom svetlosnom ciklusu, na 20-22 °C (68-72 °F) i 40-60% vlažnosti. Sto se tiče ograničavanja, uzgoja, hirurških procedura, regulisanja hrane i tečnosti i veterinarske nege, svi postupci su u skladu sa preporukama publikacije Vodič za negu i upotrebu laboratorijskih životinja.

Tumorske ćelijske kulture

[0200] Humana ćelijska linija limfoma SUDHL10 dobijena je od DSMZ i održavana u CRO u vidu kultura u suspenziji u RPMI-1640 medijumu sa 100 jedinica/mL natrijumove soli penicilina G, 100 g/mL streptomicina i 10% fetalnog goveđeg seruma. Ćelije su gajene u flaskovima za ćelijsku kulturu u vlažnom inkubatoru na 37 °C, u atmosferi sa 5% CO2i 95% vazduha. Za implantaciju su korišćene samo kulture ispod 12 pasaža

In vivo implantacija tumora

[0201] Ćelije humane ćelijske linije limfoma SUDHL10 sakupljene su tokom srednje logaritamske faze rasta, i resuspendovane u PBS-u sa 50% Matrigel™ (BD Biosciences). Svaki miš je primio 1 x 10<7>ćelija (0.2 mL ćelijske suspenzije), potkožno u desni bok. Kada se srednja

2

zapremina približila željenom opsegu od 80-120 mm<3>, tumori su mereni u dve dimenzije kako bi se pratio rast. Veličina tumora, u mm<3>, izračunavana je iz:

Gde je w = širina i l = dužina tumora u mm. Težina tumora može da se proceni, uz pretpostavku da je 1 mg ekvivalentan 1 mm3 zapremine tumora. Posle 10 dana, miševi sa tumorima od 72-256 mm3 razvrstani su u četiri grupe (n=16 po grupi) sa srednjim zapreminama tumora od 173-179 mm3.

Testirani artikli

[0202] Hidrobromid jedinjenja I čuvan je na sobnoj temperaturi i zaštićen od svetlosti. Svakog dana tokom tretmana, sveže formulacije jedinjenja su pripremane suspendovanjem praha u 0.5% natrijum karboksimetilcelulozi (NaCMC) i 0.1% Tween® 80 u dejonizovanoj vodi. Vehikulum, 0.5% NaCMC i 0.1% Tween® 80 u dejonizovanoj vodi, korišćen je za tretiranje kontrolne grupe po istom rasporedu. Pre primene, formulacije su čuvane zaštićene od svetlosti, na 4 °C.

Plan tretmana

[0203] Miševi su tretirani dozama hidrobromida jedinjenja I u opsegu od 125 - 500 mg/kg i po BID (dva puta dnevno, na 12 h) rasporedu tokom 28 dana, uz pomoć oralne sonde. Svaka doza je isporučivana u zapremini od 0.2 mL/20 g miša (10 mL/kg), i podešavana u odnosu na poslednju zabeleženu težinu pojedinačnih životinja. Na dan 25, po 8 miševa sa najmanjim tumorima u grupi odabrano je da budu ishodna tačka analize odloženog rasta tumora (posmatranje u trajanju do 60 dana). Preostale životinje su eutanazirane na dan 28, 3h nakon poslednje doze, u cilju sakupljanja tumora.

Srednja vrednost zapremine tumora (MTV) i analiza inhibicije rasta tumora (TGI)

[0204] Efikasnost tretmana je određivana poslednjeg dana tretmana. MTV(n), srednja vrednost zapremine tumora za broj životinja n, koja je mogla da se utvrdi poslednjeg dana, određena je za svaku grupu. Procenat inhibicije rasta tumora (%TGI) može da se definiše na nekoliko načina. Prvo, razlika između MTV(n) određene kontrolne grupe i MTV(n) grupe tretirane lekom izražena kao procenat MTV(n) vrednosti kontrolne grupe:

[0205] Drugi način za računanje %TGI uzima u obzir promenu veličine tumora od dana 1 do dana n, gde je n poslednji dan tretmana.

Analiza odloženog rasta tumora

[0206] Osam miševa po grupi držano je u životu nakon poslednjeg dana tretmana, u cilju analize odloženog rasta tumora. Tumori su mereni dva puta nedeljno i svaka testirana životinja je eutanazirana kada bi njene neoplazme dostigle konačnu zapreminu od 2000 mm<3>ili prethodno određenog dana studije, u zavisnosti od toga šta bi prvo nastupilo. Sprovedena je Kaplan-Majerova analiza preživljavanja.

Toksičnost

[0207] Težina životinja je merena svakog dana, na dane 1-5, a zatim dva puta nedeljno sve dok studija nije okončana. Miševi su često pregledani u potrazi za jasnim znacima bilo kakvog neželjenog sporednog efekta povezanog sa tretmanom, što je i dokumentovano. Prihvatljiva toksičnost za maksimalnu tolerisanu dozu (MTD) definisana je kao srednji gubitak telesne težine grupe od manje od 20% tokom testa, i mortalitet ne veći od 10% usled TR smrti. Smrt je bila klasifikovana kao TR ukoliko je mogla da se pripiše sporednim efektima tretmana, o čemu svedoče klinički znaci i/ili nekropsija, ili usled nepoznatih uzroka tokom perioda doziranja. Smrt je bila klasifikovana kao NTR ukoliko je bilo dokaza da smrt nije povezana sa sporednim efektima tretmana. NTR smrti tokom intervala doziranja uobičajeno bi bile kategorisane kao NTRa (usled nezgode ili ljudske greške) ili NTRm (usled nekropsijom potvrđenog rasejavanja tumora invazijom i/ili metastazama). Oralno tretirane životinje koje umiru iz nepoznatih razloga tokom perioda doziranja mogu da se klasifikuju kao NTRu kako bi se isključila mogućnost greške u doziranju, ukoliko performanse grupe ne dozvoljavaju TR klasifikaciju ili nekropsiju.

4

Izuzimanje uzoraka

[0208] Na dan 28, osam miševa sa nejvećim tumorima je izdvojeno na prethodno definisan način, kako bi se u tumorima ocenila ciljana inhibicija u tumorima. Tumori su izdvojeni iz definisanih miševa u uslovima bez prisustva RNKaza i prepolovljeni. Merena je ukupna težina tumora. Zamrznuto tkivo tumora iz svake životinje je trenutno smrznuto u tečnom N2i sprašeno tučkom u avanu.

Statističke i grafičke analize

[0209] Sve statističke i grafičke analize sprovedene su pomoću programa Prism 3.03 (GraphPad) za operativni sistem Windows. U cilju testiranja statističke značajnosti između kontrolnih i tretiranih grupa tokom čitavog vremena trajanja tretmana korišćen je ANOVA test ponovljenih merenja praćen Dunnet-ovim post-hoc testom višestrukog poređenja. Program Prism označava rezultate kao ne-značajne (ns) sa P > 0.05, značajne (označene simbolom "*") sa 0.01 < P < 0.05, veoma značajne ("**") sa 0.001 < P < 0.01 i ekstremno značajne ("***") sa P < 0.001. Što si tiče dela studije koji se bavio odloženim rastom tumora, procenat životinja koje su preostajale u svakoj grupi u studiji, predstavljen je Kaplan-Majerovim grafikom preživljavanja.

Ekstrakcija histona

[0210] U cilju izolacije histona, 60-90 mg tumorskog tkiva je homogenizovano u 1.5 ml ekstrakcionog pufera za jedra (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% Triton X-100, 8.6% saharoza, plus tableta za inhibiciju proteaza 1836145, kompanije Roche) i inkubirano na ledu 5 minuta. Jedra su sakupljena centrifugiranjem na 600 g tokom 5 minuta na 4° C i oprana jednom u PBS. Supernatant je uklonjen i histoni su ekstrahovani tokom jednog sata, uz vorteksovanje na svakih 15 minuta, pomoću 0.4 N hladne sumporne kiseline. Ekstrakti su izbistreni centrifugiranjem na 10000 g tokom 10 minuta na 4°C i prebačeni u svežu epruvetu za mikrocentrifugu koja je sadržala 10x zapremine hladnog acetona na temperaturi leda. Histoni su precipitirani na -20° C tokom 2 sata-preko noći, talog je sakupljen centrifugiranjem na 10000 g tokom 10 minuta i resuspendovan u vodi.

ELISA

[0211] Histoni su pripremljeni u jednakim koncentracijama u puferu za oblaganje (PBS+0.05%BSA) dajući uzorke sa 0.5 ng/ul, i 100 ul uzorka ili standarda dodavano je u duplikatu u 2 ELISA ploče sa 96 bunarčića (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Ploče su zaptivene i inkubirane preko noći na 4°C. Narednog dana, ploče su oprane 3x sa po 300 ul/bunarčiću PBST (PBS+0.05% Tween 20; 10X PBST, KPL #51-14-02) na Bio Tek aparatu za ispiranje ploča. Ploče su blokirane sa 300 ul/bunarčiću razblaživača (PBS+2%BSA+0.05% Tween 20), inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi, i oprane 3x sa PBST. Sva antitela su razblažena u razblaživaču. 100 µl/bunarčiću anti-H3K27me3 (CST #9733, 50% glicerol stok 1:1,000) ili anti-total H3 (Abcam ab1791, 50% glicerol 1:10,000) dodato je u svaku ploču. Ploče su inkubirane tokom 90 min na sobnoj temperaturi i oprane 3x sa PBST. 100 ul/bunarčiću anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) dodato je u razblaženju 1:2,000 u H3K27Me3 ploču i razblaženju 1:6,000 u H3 ploču i inkubirano 90 min na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane 4X sa PBST. Za detekciju je dodato 100 ul/bunarčiću TMB supstrata (BioFx Laboratories, #TMBS) i ploče su inkubirane u mraku na sobnoj temperaturi, tokom 5 min. Reakcija je zaustavljena pomoću 100 ul/bunarčiću IN H2SO4. Apsorbancija na 450 nm očitavana je na SpectaMax M5 čitaču mikro-titar ploča.

Rezultati:

[0212] Miševi koji su nosili SUDHL10 tumorske ksenografte tretirani su hidrobromidom jedinjenja I u maksimalnoj podnošljivoj dozi od 500 mg/kg BID i frakcijama MTD (1⁄2 i 1⁄4 MTD). Sve doze su dobro podnošene tokom 28 dana bez bilo kakvog značajnog gubitka telesne težine. Usled greške u doziranju na dan 15 u grupi tretiranoj sa 500 mg/kg došlo je do smrti bez povezanosti sa tretmanom. Sve doze su dovele do inhibicije rasta tumora kada su poređene sa vehikulumom na dan 28 (tabela 4), a kod BID grupa sa 250 mg/kg i 500 mg/kg došlo je do indukcije regresija (TGI > 100%).

Tabela 4:

[0213] Slika 12A prikazuje rast SUDHL10 ksenograft tumora tokom vremena za različite grupe tretmana. 125 mg/kg BID grupa nije bila značajno različita od grupe sa vehikulumom kada je merena ponovljeno pomoću ANOVA i Dunett-ovog post-hoc testa, ali je srednja veličina terminalnog tumora na dan 28 bila značajno manja od veličine u grupi sa vehikulumom (2-smerna ANOVA sa Bonferroni post-hoc testom, p < 0.0001). Doziranje od 250 mg/kg BID i 500 mg/kg BID hidrobromida jedinjenja I tokom 28 dana indukovala je uporedive odgovore u vidu regresije pošto su težine terminalnih tumora na dan 28 bile slične u ove 2 grupe (slika 12B).

[0214] Histoni izolovani iz tumora sakupljenih na dan 28 (3h nakon poslednje doze) podvrgnuti su ELISA analizi ukupnog nivoa H3K27me3. Slika 13 prikazuje jasno dozno-zavisno smanjenje H3K27me3 metil markera usled tretmana hidrobromidom jedinjenja I. Ova slika prikazuje ukupnu metilaciju H3K27me3 u SUDHL10 tumorima iz miševa tretiranih hidrobromidom jedinjenja I tokom 28 dana.

[0215] Na dan 25 po osam miševa sa najmanjim tumorima u svakoj grupi izabrano je za studiju odloženog rasta tumora, kako bi se ocenio ponovni rast tumora nakon završetka doziranja na dan 28. Miševi su eutanazirani kada bi njihovi tumori dostigli veličinu od 2000 mm<3>ili na dan 60 (u zavisnosti od toga šta prvo nastupi). Ovi podaci su korišćeni za sprovođenje Kaplan Majerove analize preživljavanja. Slika 14A pokazuje da je ponovni rast tumora bio jasno dozno-zavisan, i da su svi miševi tretirani najvećom dozom od 500 mg/kg BID tokom 28 dana, preživeli do dana 60. Samo 2 miša u grupi tretiranoj sa 250 mg/kg, morala su da budu eutanazirana pre dana 60. Miševi u grupi tretiranoj sa 125 mg/kg imali su jasnu prednost u preživljavanju u odnosu na miševe tretirane vehikulumom, sa povećanjem srednjeg preživljavanja od 15.5 dana (slika 14B).

Antikancerski efekat hidrobromida jedinjenja I na humani difuzni B-krupnoćelijski limfom u Pfajferovom mišjem ksenograft modelu

[0216] Antikancerska aktivnost monohidrobromida jedinjenja I testirana je u Pfajferovom mišijem ksenograft modelu, koji predstavlja ksenograft model za humani difuzni B-krupnoćelijski limfom. 5 nedelja starim ženkama NSG miša (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) potkožno su implantirani fragmenti tumora od 20 do 25 mg. Tretman je otpočeo približno 31 dan nakon implantacije tumora, kada su tumori u proseku dostigli približno 365 mm<3>. Šema tretmana je opisana u tabeli 5.

Tabela 5. Šema doziranja

[0217] Zapremina tumora praćena je tokom celog trajanja eksperimenta. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno nakon početka tretmana. Tumorsko opterećenje (mg = mm<3>) je izračunato na osnovu merenja kaliperom, po formuli za zapreminu izduženog elipsoida (LxW<2>)/2 gde su L i W ortogonalna merenja dužine i širine (mm), redom.

[0218] Dan 1 je bio dan prvog tretmana, a dan 28 je bio dan poslednjeg tretmana. Ova studija je okončana 36 dana nakon poslednje doze, tako da je dan 64 bio dan kada se studija završila. Primarni ishodi koji su korišćeni u ovoj studiji da se oceni efikasnost bili su potpuna regresija tumora (CR), veličina tumora u različitim grupama, i procenat inhibicije tumora na kraju studije. Ukupan odgovor je definisan kao smanjenje veličine tumora na nedetektabilnu veličinu (< 20mm3) na kraju studije. Vrednosti za procenat inhibicije tumora izračunavane su iz formule [1-(ΔT/ΔC)] x 100, gde su ΔT i ΔC promene srednje zapremine tumora (Δ rast) za svaku tretiranu grupu (T) i kontrolnu grupu sa vehikulumom (C). T0i C0(jedan dan pre prve doze) su upotrebljene kao početna zapremina tumora. Pored toga, zapremine tumora koje su izmerene jedan dan nakon poslednje doze (T29i C29) upotrebljene su za izračunavanje ΔT i ΔC. Kada je vrednost bila veća od 100%, smatrano je da je 100%. Formula korišćena za izračunavanje procenta inhibicije tumora prikazana je ispod ovog teksta.

[0219] Tokom trajanja tretmana, utvrđeno je da životinje ne mogu da podnesu dnevni tretman sa 1142 mg/kg hidrobromida jedinjenja I i za tri životinje u ovoj grupi (grupa E) bila je neophodna eutanazija posle prve nedelje tretmana, usled gubitka više od 20% bazalne telesne težine. Dakle, primena leka za ovu grupu je prekinuta nakon 12 doza. Životinje u druge tri grupe sa različitim dozama, izuzev jedne životinje u grupi D (342 mg/kg hidrobromida jedinjenja I), sve su dobro podnele tretman od 28 dana uz minimalni gubitak telesne težine. Relativna telesna težina miševa predstavljena je grafikonom na slici 15. Telesna težina životinja dobijena na dan 0 korišćena je kao bazalna telesna težina na grafikonu.

[0220] Hidrobromid jedinjenja I pokazao je potentno i dugotrajno antikancersko delovanje u Pfajferovom modelu sa CR stopom od 100% kod tri od četiri grupe sa različitim doziranjem (tabela 6). Osim toga, ponovni rast tumora nije uočen čak ni 36 dana posle prestanka tretmana. Ovo ukazuje na mogućnost da su sve ćelije tumora ubijene tokom tretmana. Iako je ponovni rast tumora uočen u grupi sa najnižom dozom (grupa B, 34.2 mg/kg), tokom perioda tretmana je uočeno jasno delovanje u smislu stagnacije tumora (slika 16). Tumor je počeo da raste tek kada je tretman završen (slika 16). Ovaj rezultat takođe ukazuje na to da je delovanje u smislu stagnacije tumora, uočeno u grupi B, zaista delovanje koje indukuju testirani artikli.

Tabela 6. Tabela sa reledom rezultata

Claims (23)

1. Patentni zahtevi 1. N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromid za upotrebu u lečenju proliferativnog poremećaja ćelija hematološkog sistema.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, koje je monohidrobromid.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačeno time što je pomenuto jedinjenje kristalno.
4. 4. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodno navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što je pomenuto jedinjenje bez nečistoća.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodno navedenih patentnih zahteva, naznačeno time što je pomenuto jedinjenje kristalna čvrsta supstanca koja je suštinski bez amorfnog N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida.
6. 6. Polimorf A N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid hidrobromida za upotrebu u lečenju proliferativnog poremećaja ćelija hematološkog sistema; naznačen time što polimorf A prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima jedan ili više karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 17.5 /- 0.3 stepeni i 22.0 /- 0.3 stepena 2-teta.
7. 7. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove izražene u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 17.5 /- 0.3 stepeni i 22.0 /- 0.3 stepena 2-teta.
8. 8. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima jedan ili više karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 18.7 /- 0.3 stepeni, 23.3 /- 0.3 stepena, i oko 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
9. 9. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 5 karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 +/- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
10. 10. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 6 karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
11. 11. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 7 karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
12. 12. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 8 karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
13. 13. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 9 karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
14. 14. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima najmanje 10 karakterističnih pikova izraženih u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta.
15. 15. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 7; naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji ima karakteristične pikove izražene u stepenima 2-teta na 3.9 /- 0.3 stepeni, 10.1 /- 0.3 stepeni, 14.3 /- 0.3 stepena, 17.5 /- 0.3 stepeni, 18.7 /- 0.3 stepeni, 20.6 /- 0.3 stepeni, 20.9 /- 0.3 stepeni, 21.8 /- 0.3 stepeni, 22.0 /- 0.3 stepena, 23.3 /- 0.3 stepena i 23.6 /- 0.3 stepeni 2-teta. 1
16. 16. Polimorf za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 15, naznačen time što polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji je suštinski u skladu sa slikom 1 i/ili polimorf prikazuje rendgenski difraktogram praha koji je suštinski u skladu sa tabelom 1: Tabela 1
17. 17. Polimorf za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 16, naznačen time što polimorf prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji ima karakterističan pik izražen u jedinicama °C, na temperaturi od 255 /- 5°C.
18. 18. Polimorf za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 17, naznačen time što polimorf prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koji je suštinski u skladu sa slikom 3.
19. 19. Polimorf za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je proliferativni poremećaj ćelija hematološkog sistema hematološki kancer.
20. 20. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, naznačen time što je hematološki kancer odabran od multiplog mijeloma, limfoma, leukemije, mijeloidnih neoplazmi i neoplazmi mastocita.
21. 21. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačen time što je limfom odabran od Hočkinovog limfoma, limfoma dečjeg uzrasta i limfoma limfocitnog i kutanog porekla.
22. 22. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačen time što je leukemija odabrana od leukemije dečjeg uzrasta, leukemije vlasastih ćelija, akutne limfocitne leukemije, akutne mijelocitne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije i leukemije mastocita. 2
23. 23. Polimorf za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačen time što je hematološki kancer multipli mijelom.