RS56339B1 - Antigen-specifični t ćelijski receptori i t ćelijski epitopi - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] Evolucija imunog sistema je kod kičmenjaka rezultovala u visoko efikasnoj mreži zasnovanoj na dva tipa odbrane: urođeni i stečeni imunitet.

[0002] Za razliku od evoluciono starog urođenog imunog sistema koji se oslanja na invarijantne receptore koji prepoznaju uobičajene molekulske obrasce povezane sa patogenima, stečeni imunitet je zasnovan na visoko specifičnim receptorima za antigen na B ćelijama (B limfocitima) i T ćelijama (T limfocitima) i klonalnoj selekciji.

[0003] Dok B ćelije podižu humoralni imuni odgovor sekrecijom antitela, T ćelije posreduju u ćelijskim imunim odgovorima koji dovode do uništavanja prepoznatih ćelija.

[0004] T ćelije imaju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu kod ljudi i životinja. Prepoznavanje i vezivanje određenog antigena je posredovano T ćelijskim receptorima (TCRs) eksprimiranim na površini T ćelija.

[0005] T ćelijski receptor (TCR) T ćelije može stupiti u interakciju sa imunogenim peptidima (epitopima) vezanim za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i prikazanim na površini ciljnih ćelija. Specifično vezivanje TCR okida signalnu kaskadu unutar T ćelije koja vodi do proliferacije i diferencijacije u zrelu efektornu T ćeliju. Da bi bili sposobni da ciljaju veoma raznovrsne antigene, T ćelijski receptori moraju imati veliki diverzitet.

[0006] Ovaj diverzitet se dobija genetskim rearanžmanom različtih diskontinuiranih segmenata gena koji kodiraju različite strukturne regione TCRs. TCRs su sastavljeni od jednog α-lanca i jednog β-lanca ili od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. TCR α/β lanci su sastavljeni od N-terminalnog visoko polimorfnog varijabilnog regiona uključenog u prepoznavanje antigena i invarijantnog konstantnog regiona. Na genetskom nivou, ovi lanci su razdvojeni u nekoliko regiona, varijabilni (V) region, (D) region diverziteta (samo β- i δ-lanaca), spajajući (J) region i konstantni (C) region. Humani geni β-lanca sadrže preko 60 varijabilnih (V), 2 diverzitetna (D), preko 10 spajajućih (J) segmenata, i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Humani geni α-lanca sadrže preko 50 V segmenata, i preko 60 J segmenata, ali ne D segmente, kao i jedan C segment. Mišji geni β-lanca sadrže preko 30 varijabilnih (V), 2 diverzitetna (D), preko 10 spajajućih (J) segmenata, i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Mišji geni α-lanca sadrže skoro 100 V segmenata, 60 J segmenata, nijedan D segment, ali jedan C segment. Tokom diferencijacije T ćelija, specifični geni T ćelijskog receptora se stvaraju rearanžmanom jednog V, jednog D (samo β- i δ-lanac), jednog J i jednog gena C regiona. Diverzitet TCRs je dodtno uvećan nepreciznim V-(D)-J rearanžmanom gde su slučajni nukleotidi introdukovani i/ili deletirani na mestima rekombinacije. Kako se rearanžman TCR genskih lokusa dešava u genomu tokom sazrevanja T ćelija, svaka zrela T ćelija eksprimira samo jedan specifični δ/β TCR ili γ/δ TCR.

[0007] MHC i vezivanje antigena je posredovano regionima koji određuju komplementarnost 1, 2 i 3 (CDR1, CDR2, CDR3) TCR. CDR3 β-lanca koji je najkritičniji za prepoznavanje antigena kodiran je V-D-J spojem rearanžiranog gena TCR β-lanca.

[0008] TCR je deo kompleksne signalne mašinerije, koja uključuje heterodimerni kompleks TCR α- i β-lanaca, ko-receptor CD4 ili CD8 i CD3 modul za transdukciju signala (Slika 1). Dok CD3 lanci prenose aktivacioni signal unutar ćelije, TCR α/β heterodimer je jedini odgovoran za prepoznavanje antigena. Stoga, prenos TCR α/β lanaca pruža priliku za preusmeravanje T ćelija ka bilo kom antigenu od interesa.

Imunoterapija

[0009] Antigen-specifična imunoterapija ima za cilj da poboljša ili indukuje specifične imune odgovore kod pacijenata da bi se kontrolisale infektivne ili maligne bolesti. Identifikacija rastućeg broja patogen- i tumorpovezanih antigena (TAA) dovela je do velike kolekcije pogodnih ciljnih mesta za imunoterapiju. Ćelije koje prikazuju imunogene peptide (epitope) izvedene od ovih antigena mogu se specifično ciljati strategijama aktivne ili pasivne imunizacije. Aktivna imunizacija teži da indukuje i dovede do ekspanzije antigen-specifične T ćelije kod pacijenta, koje su sposobne da specifično prepoznaju i ubiju obolele ćelije. Nasuprot tome, pasivna imunizacija se oslanja na adoptivni transfer T ćelija, koje su umnožene i izborno genetički konstruisane in vitro (adoptivna terapija T ćelijama).

Vakcinacija

[0010] Tumor vakcine imaju za cilj da indukuju endogene tumor-specifične imune odgovore aktivnom imunizacijom. Različiti formati antigena mogu se koristiti za tumor vakcinaciju uključujući cele ćelije kancera, proteine, peptide ili imunizujuće vektore kao što su RNK, DNK ili virusni vektori koji se mogu primeniti ili direktno in vivo ili in vitro pulsiranjem DCs nakon transfera u pacijenta.

[0011] Broj kliničkih studija gde se mogu identifikovati imuni odgovori indukovani terapijom stalno raste usled poboljšanja strategija imunizacije i postupaka za detekciju antigen-specifičnih imunih odgovora (Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res.68, 3931-3940; Schmitt, M. et al. (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser, D.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 3849-3854; Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776-784). Međutim, u većini slučajeva detektovani imuni odgovori ne mogu se sistemski korelisati sa kliničkim ishodima (Curigliano, G. Et al. (2006) Ann. Oncol.17, 750-762; Rosenberg, S.A. et al. (2004) Nat. Med.10, 909-915).

[0012] Precizno definisanje peptidnih epitopa izvedenih iz tumor antigena može stoga doprineti poboljašnju specifičnosti i efikasnosti strategija vakcinacije kao i postupaka za imunomonitoring.

Adoptivni transfer ćelija (ACT)

[0013] ACT zasnovana imunoterapija može se u širem smislu definisati kao oblik pasivne imunizacije sa prethodno senzitizovanim T ćelijama koje su prenete u ne-imune recipijente ili u autolognog domaćina nakon ex vivo ekspanzije iz niskih prekursorskih frekvencija do klinički relevantnih brojnosti ćelija. Ćelijski tipovi korišćeni za ACT eksperimente su limfokin aktivirane ćelije ubice (LAK) (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), tumor-infiltrirajući limfociti (TILs) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), donor limfociti nakon transplantacije hematopoetskih stem ćelija (HSCT) kao i tumor-specifične T ćelijske linije ili klonovi (Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother.24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173).

[0014] Pokazano je da adoptivni transfer T ćelija ima terapeutsku aktivnost protiv humanih virusnih infekcija kao što je CMV. Dok je CMV infekcija i reaktivacija endogenih latentnih virusa kontrolisana od strane imunog sistema kod zdravih pojedinaca, ona rezultuje u značajnom morbiditetu i mortalitetu kod imunokompromitovanih pojedinaca kao što su primaoci transplanta ili pacijenti sa AIDS. Riddell i saradnici pokazali su rekonstituciju virusnog imuniteta sa adoptivnom terapijom T ćelijama kod imuno suprimiranih pacijenata nakon transfera CD8+ CMV-specifičnih T ćelijskih klonova izvedenih iz HLA-uparenih CMV-seropositivnih transplant donora (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241).

[0015] Kao alternativni pristup poliklonske donor-izvedene CMV- ili EBV-specifične T ćelijske populacije su prenete u recipijente transplanta što je rezultovalo u povećanom održavanju prenetih T ćelija (Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375-1377).

[0016] Za adptivnu imunoterapiju melanoma Rosenberg i saradnici su ustanovili ACT pristup koji se zasniva na infuziji in vitro umnoženih autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita (TILs) izolovanih iz izvađenih tumora u kombinaciji sa ne-mijeloabaltivnom limfodepletirajućom hemoterapijom i visokom dozom IL2. Nedavno publikovana klinička studija rezultovala je u objektivnoj stopi odgovora od ∼50% tretiranih pacijenata koji su bolovali od metastaznog melanoma (Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol.23: 2346-2357).

[0017] Međutim, pacijenti moraju ispuniti nekoliko uslova da bi imali pravo na ACT imunoterapiju. Moraju imati resektabilne tumore. Tumori moraju generisati vijabile TILs pod uslovima kulture ćelija. TILs moraju biti reaktivni protiv tumor antigena, i moraju se umnožiti in vitro do dovoljne brojnosti. Naročito kod kancera različitih od melanoma, teško je dobiti takve tumor reaktivne TILs. Dodatno, ponovljena in vitro stimulacija i klonalna ekspanzija normalnih humanih T limfocita rezultuje u progresivnom smanjenju aktivnosti telomeraze i skraćivanja telomera što rezultuje u replikativnoj senescenciji i smanjenom potencijalu za održavanje prenetih T ćelija (Shen, X. et al. (2007) J. Immunother.30: 123-129).

[0018] Pristup koji prevazilazi ograničenja ACT je adoptivni transfer autolognih T ćelija reprogramiranih da eksprimiraju tumor-reaktvne TCR definisane specifičnosti tokom kratkotrajne ex vivo kulture praćene reinfuzijom u pacijenta. Ova strategija čini ACT primenjivim na raznovrsne uobičajene malignitete čak iako su tumorreaktivne T ćelije odsutne kod pacijenta. Kako je antigena specifičnost T ćelija potpuno zasnovana na heterodimernom kompleksu TCR α- i β-lanca, transfer kloniranih TCR gena u T ćelija pruža potencijal da se one preusmere ka bilo kom antigenu od interesa. Stoga, TCR genska terapija obezbeđuje atraktivnu strategiju da se razvije antigen-specifična imunoterapija sa autolognim limfocitima kao opcija tretmana. Glavne prednosti transfera TCR gena su stvaranje terapeutskih količina antigen-specifičnih T ćelija u okviru od nekoliko dana i mogućnost da se introdukuju specifičnosti koje nisu prisutne u endogenom TCR repertoaru pacijenta.

[0019] Nekoliko grupa je demonstriralo, da je transfer TCR gena atraktivna strategija da se preusmeri antigenspecifičnost primarnih T ćelija (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol.171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238). WO 2006/026002 A2 opisuje postupke tretmana infektivnih, proliferativnih, ili limfocit-posredovanih bolesti koji uključuju obezbeđivanje β lanca (TCR β) T ćelijskog receptora sa osetljivijim prepoznavanjem antigena od TCR β lanca divljeg tipa i introdukovanje TCR β lanca direktno ili indirektno u subjekta sa bolešću pod uslovima efikasnim za tretiranje bolesti.

[0020] Izvodljivost TCR genske terapije kod ljudi je nedavno demonstrirana u kliničkim studijama za tretman malignog melanoma od strane Rosenberg i njegove grupe. Adoptivni transfer autolognih limfocita retroviralno transdukovanih sa melanom/melanocit antigen-specifičnim TCRs rezultovalo je u regresiji kancera kod do 30% tretiranih pacijenata sa melanomom (Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546).

Ciljne strukture za antigen-specifičnu imunoterapiju

[0021] Otkriće višestrukih tumor-povezanih antigena (TAAs) obezbedilo je osnovu za koncepte antigenspecifične imunoterapije (Novellino, L. et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). TAAs su neobični proteini eksprimirani na ćelijama tumora usled njihove genetičke nestabilnosti, koji se ne eksprimiraju ili se ograničeno eksprimiraju u normalnim ćelijama. Ovi TAAs mogu voditi specifičnom prepoznavanju malignih ćelija od strane imunog sistema.

[0022] Molekulsko kloniranje TAAs skriningom tumor-izvedenih cDNK ekspresionih biblioteka korišćenjem autolognih tumor-specifičnih T ćelija (van der Bruggen, P. et al. (1991) Science 254, 1643-1647) ili cirkulišućih antitela (Sahin, U. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 11810-11813), reverzni imunološki pristupi, biohemijski postupci (Hunt, D.F. et al. (1992) Science 256, 1817-1820), analize ekspresije gena ili in silico strategije kloniranja (Helftenbein, G. et al. (2008) Gene 414, 76-84) dovele su do značajnog broja ciljnih kandidata za imunoterapeutske strategije. TAAs spadaju u nekoliko kategorija, uključujući diferencijacione antigene, prekomerno eksprimirane antigene, tumor-specifične splajs varijante, proizvode mutiranih gena, virusne antigene i takozvane antigene kancera testisa (CTAs). Porodica kancera testisa je veoma obećavajuća kategorija TAAs jer je njihova ekspresija ograničena na testis i moštvo različitih tumor entiteta (Scanlan, M.J. et al. (2002) Immunol. Rev. 188, 22-32). Do sada je opisano više od 50 CT gena (Scanlan, M.J. et al. (2004) Cancer Immun. 4, 1) i neki od njih su adresirani u kliničkim studijama (Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776-784; Atanackovic, D. et al. (2004) J. Immunol. 172, 3289-3296; Chen, Q. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9363-9368; Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Davis, I.D. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 10697-10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 12198-12203; Marchand, M. et al. (1999) Int. J. Cancer 80, 219-230; Schuler-Thurner, B. et al. (2000) J. Immunol. 165, 3492-3496).

[0023] Uprkos rastućeg broja atraktivnih ciljnih struktura za imunoterapeutske pristupe specifični T ćelijski klonovi ili linije sa definisanom HLA restrikcijom postoje samo za nekoliko njih (Chaux, P. et al. (1999) J. Immunol. 163, 2928-2936; Zhang, Y. et al. (2002) Tissue Antigens 60, 365-371; Zhao, Y. et al. (2005) J. Immunol.174, 4415-4423). Za većinu CTAs, uključujući TPTE, čak nedostaju i dokazi za odgovore specifičnih T ćelija.

OPIS PRONALASKA

Rezime pronalaska

[0024] Imunoterapeutske strategije su obećavajuće opcije za tretman infektivnih bolesti i kancer. Identifikacija rastućeg broja patogen- i tumor-povezanih antigena dovela je do velike kolekcije pogodnih ciljeva za imunoterapiju.

[0025] Preko adoptivnog transfera T ćelija konstruisanih da eksprimiraju definisani antigen-specifični T ćelijski receptor (TCR) ovi se antigeni mogu specifično ciljati čime se dovodi do selektivne destrukcije ciljanih malignih ili inficiranih ćelija. Kako je TCR specifičnost ograničena visoko polimorfnim MHC molekulima, široka primenjivost adoptivnog TCR transfera je zavisna od generisanja mnoštva TCR reagenasa za "direktnu" upotrebu, što pokriva širok opseg antigena i MHC ograničenja. Međutim, do sada je identifikovan samo ograničen broj pogodnih TCR kandidata. Ovo je uglavnom usled teškog ustanovljavanja T ćelijskih klonova za izolaciju TCR gena.

[0026] Predmetni pronalazak se odnosi na efikasne postupke za obezbeđivanje antigen-specifičnih limfoidnih ćelija. Ove limfoidne ćelije mogu se koristiti da bi se obezbedili antigen-specifični T ćelijski receptori sa definisanim MHC ograničenjem i da bi se identifikovali imunološki relevantni T ćelijski epitopi.

[0027] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za obezbeđivanje antigen-specifičnih limfoidnih ćelija koji sadži korake:

(a) obezbeđivanja T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen iz uzorka koji sadrži T ćelije, gde je pomenuti uzorak dobijen od subjekta prethodno izloženog pomenutom antigenu i gde je pomenuta T ćelija reaktivna na pojedinačni antigen izolovana iz uzorka koji sadrži T ćelije korišćenjem protočne citometrije;

(b) obezbeđivanje nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen; i

(c) introdukcija pomenute nukleinske kiseline u limfoidnu ćeliju da bi se obezbedile antigen-specifične limfoidne ćelije.

[0028] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži korak određivanja specifičnosti epitopa pomenutih antigen-specifičnih limfoidnih ćelija i/ili korak određivanja MHC ograničenja pomenutih antigen-specifičnih limfoidnih ćelija.

[0029] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuta T ćelija reaktivna na pojedinačni antigen i pomenuta nukleinska kiselina koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen su reaktivne sa antigenom primenjenim na subjekta.

[0030] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti epitop je MHC prikazani peptid. U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti korak određivanja specifičnosti epitopa pomenutih antigen-specifičnih limfoidnih ćelija sadrži određivanje reaktivnosti pomenutih antigen-specifičnih limfoidnih ćelija sa MHC molekulima izloženim, poželjno pulsiranim, tj. napunjenim sa, peptidom izvedenim iz antigena. Poželjno, pomenuti MHC molekuli su MHC molekuli eksprimirani kod subjekta. Poželjno, pomenuti MHC molekuli su prisutni na ciljnim ćelijama. Pomenuti peptid može biti deo peptidne biblioteke izvedene iz antigena i peptidna biblioteka može sadržati set preklapajućih peptida izvedenih iz pomenutog antigena. Poželjno, set preklapajućih peptida pokriva celu sekvencu pomenutog antigena.

[0031] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti korak određivanja MHC ograničenja pomenutih antigen-specifičnih limfoidnih ćelija sadrži određivanje reaktivnosti pomenutih antigenspecifičnih limfoidnih ćelija na izabrane MHC molekule. Poželjno, pomenuti izabrani MHC molekuli su prisutni na ciljnim ćelijama. Poželjno, pomenuti izabrani MHC molekuli su MHC molekuli eksprimirani kod subjekta. Poželjno, pomenuti izabrani MHC molekuli su prisutni na ciljnim ćelijama koje eksprimiraju antigen ili njegov deo. Poželjno, pomenute antigen-specifične limfoidne ćelije ili njihov T ćelijski receptor ograničeni su na MHC molekule eksprimirane kod subjekta.

[0032] Poželjno, određivanje reaktivnosti antigen-specifičnih limfoidnih ćelija sadrži određivanje sekrecije citokina od strane limfoidnih ćelija, gde pomenuti citokin može biti interferon-γ (IFNγ). Drugi aktivacioni markeri koji se mogu koristiti su npr., CD154 i/ili CD137.

[0033] U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalaskau, pomenuta nukleinska kiselina koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen je RNK, poželjno in vitro transkribovana RNK. Poželjno, pomenuta limfoidna ćelija nema površinsku ekspresiju endogenog TCR ili je specifična za nesrodni antigen. U jednom primeru izvođenja, pomenuta limfoidna ćelija je limfocit, poželjno T ćelija.

[0034] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti korak obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen sadrži obezbeđivanje nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji sadrži najmanje CDR sekvence, poželjno najmanje varijabilni region T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen.

[0035] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti korak obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen sadrži izolovanje RNK, poželjno poli-A+-RNK, iz pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen ili njene klonske populacije i poželjno dodatno sadrži dobijanje cDNK od pomenute RNK. U jednom primeru izvođenja, pomenuti korak obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen dodatno sadrži umnožavanje najmanje dela cDNK koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje CDR sekvence, poželjno najmanje varijabilni region T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen.

[0036] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti subjekt je seropozitivan na pomenuti antigen ili na agens koji sadrži pomenuti antigen. Seropozitivnost subjekta se može odrediti određivanjem imunog odgovora na antigen ili agens ili njegovu komponentu.

[0037] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenute T ćelije pre obezbeđivanja T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen podvrgnute su antigen-specifičnoj ekspanziji i ponovnoj imunizaciji, gde antigen-specifična ekspanzija i ponovna imunizacija mogu biti izvedeni izlaganjem T ćelija poželjno autolognim antigen prikazujućim ćelijama koje prikazuju antigen. U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuta T ćelija reaktivna na pojedinačni antigen je pozitivna na aktivacioni marker kao što je IFNγ ili CD137 i CD8 ili CD4.

[0038] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuta T ćelija reaktivna na pojedinačni antigen je izolovana iz uzorka koij sadrži T ćelije korišćenjem protočne citometrije, gde je sortiranje izvedeno na osnovu pozitivnosti na aktivacioni marker, naročito IFNγ ili CD137, i CD8 ili CD4.

[0039] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti T ćelijski receptor sadrži α- i β-lance T ćelijskog receptora.

[0040] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuta nukleinska kiselina koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen sadrži sekvencu nukelinske kiseline koja kodira najmanje CDR sekvence, poželjno najmanje varijabilni region T ćelijskog receptora pomenute T ćelije reaktivne na pojedinačni antigen.

[0041] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, pomenuti subjekat je sisar, poželjno čovek. Poželjno, pomenuti subjekat ima bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen, poželjno bolest povezanu sa T ćelijom. Pomenuta bolest može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od poremećaja imunog sistema, infekcija, i malignih bolesti.

[0042] Druge karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

Detaljan opis pronalaska

[0043] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja kao što su uobičajeno poznati stručnjacima.

[0044] Poželjno, ovde korišćeni termini su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland..

[0045] Izvođenje predmetnog pronalaska će upotrebljavati, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke biohemije, biologije ćelije, imunologije, i rekombinantne DNK tehnike koje su objašnjene u literaturi u oblasti (cf., npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0046] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrži", i varijacije kao što su "koji sadrži" i "sadržava", shvatiće se da podrazumevaju uključivanje navedenog broja, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takvi drugi članovi, celi brojevi ili koraci ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključena, tj. predmet se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili korak. Termini "a" i "an" i "the" i slične reference korišćene u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu patentnih zahteva) treba shvatiti da pokrivaju i jedninu i množinu, ukoliko ovde nije naznačeno drugačije ili jasno kontraindikovano kontekstom.

[0047] Svi postupci opisani ovde mogu se izvesti po bilo kom pogodnom redosledu ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili drugačije jasno kontraindikovano kontekstom. Namera je da upotreba bilo kog i svih primera, ili jezičkih primera (npr., "kao što je"), obezbeđena ovde samo bolje ilustruje pronalazak.

[0048] Termin "rekombinantni" u kontekstu predmetnog pronalaska znači "napravljen genetičkim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu predmetnog pronalaska ne postoji u prirodi.

[0049] Termin "postoji u prirodi" kao što je ovde korišćeno odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može se izolovati iz prirodnog izvora i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji postoji u prirodi.

[0050] Termin "imuni odgovor" odnosi se na integrisani odgovor tela na antigen i poželjno se odnosi na ćelijski imuni odgovor ili ćelijski kao i humoralni imuni odgovor. Imuni odgovor može biti protektivni/preventivni/profilaktički i/ili terapeutski.

[0051] "Izazivanje imunog odgovora" može značiti da nije bilo imunog odgovora protiv određenog antigena pre indukcije, ali može takođe značiti da je bio određen nivo imunog odgovora protiv određenog antigena pre indukcije i nakon indukcije pomenuti imuni odgovor je poboljšan. Stoga, "izazivanje imunog odgovora" takođe uključuje "poboljšanje imunog odgovora". Poželjno, nakon izazivanja imunog odgovora kod subjekta, pomenuti subjekat je zaštićen od razvoja bolesti kao što je infektivna bolest, naročito virusna bolest kao što je opisano ovde, ili maligna bolest ili bolesno stanje je ublaženo izazivanjem imunog odgovora. Na primer, imuni odgovor na virusni antigen kao što je hCMV-pp65 može se izazvati kod pacijenta koji ima virusnu bolest ili kod subjekta koji je u riziku od razvoja virusne bolesti. Na primer, imuni odgovor na tumor-povezani antigen kao što je NY-ESO-1, TPTE ili PLAC1 može se izazvati kod pacijenta koji ima malignu bolest ili kod subjekta koji ima rizik da razvije malignu bolest. Izazivanje imunog odgovora u ovom slučaju može značiti da je bolesno stanje subjekta ublaženo, da subjekat ne razvija metastaze, ili da subjekat u riziku od razvoja maligne bolesti ne razvija malignu bolest.

[0052] Namera je da "ćelijski imuni odgovor", "ćelijski odgovor", "ćelijski odgovor na antigen" ili sličan termin uključuje ćelijski odgovor usmeren na ćelije karakterisan prikazivanjem antigena sa klasom I ili klasom II MHC. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije označene kao T ćelije ili T-limfociti koji deluju ili kao’pomoćne’ ili ’ubice’.

Pomoćne T ćelije (takođe označene kao CD4+ T ćelije) imaju centralnu ulogu u regulisanju imunog odgovora i ćelije ubice (takođe označene kao citotoskične T ćelije, citolitične T ćelije, CD8+ T ćelije ili CTLs) ubijaju bolesne ćelije kao što su inficirane ćelije ili maligne ćelije, sprečavajući proizvodnju dodatnih bolesnih ćelija.

[0053] Termin "antigen" se odnosi na agens koji sadrži epitope protiv koga se stvara imuni odgovor. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnog pronalaska je molekul koji, izborno nakon obrade, indukuje imunu reakciju, koja je poželjno specifična za antigen. Termin "antigen" uključuje naročito proteine, peptide, polisaharide, nukleinske kiseline, naročito RNK i DNK, i nukleotide.

[0054] Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je izveden iz antigena koji se nalazi u prirodi. Takvi antigeni koji se javljaju u prirodi mogu uključivati ili mogu biti izvedeni iz alergena, virusa, bakterija, gljiva, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena ili antigen može takođe biti tumor-povezani antigen. Prema predmetnom pronalasku, antigen može odgovarati proizvodu koji se nalazi u prirodi, na primer, proteinu virusa, ili njegovom delu.

[0055] Termin "agens koji sadrži antigen" odnosi se na entitet koji sadrži antigen kao što je virus koji sadrži virusni antigen. Jedan primer je hCMV koji sadrži hCMV-pp65.

[0056] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je tumor-povezani antigen, tj., konstituent malignih ćelija koji može biti izveden iz citoplazme, površine ćelije i jedra ćelije, naročito oni antigeni koji su proizvedeni, poželjno u velikoj količini, kao intracelularni ili površinski antigeni na malignim ćelijama.

[0057] Naročito, antigen ili njegovi peptidi moraju biti prepoznati od strane T ćelijskog receptora. Poželjno, antigen ili peptid ukoliko je prepoznat od strane T ćelijskog receptora je sposoban da indukuje u prisustvu odgovarajućih ko-stimulatornih signala, klonalnu ekspanziju T ćelija koje nose T ćelijski receptor koji specifično prepoznaje antigen ili peptid. U kontekstu primera izvođenja predmetnog pronalaska, antigen je poželjno prikazan od strane ćelije, poželjno od strane antigen prikazujuće ćelije i/ili bolesne ćelije, u kontekstu MHC molekula, što rezultuje u imunoj reakciji protiv antigena.

[0058] U kontekstu predmetnog pronalaska, termini "tumor-povezani antigen" ili "tumor antigen" odnose se na proteine koji su pod normalnim uslovima eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili na specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, tumor-povezani antigen može biti pod normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu želudca, poželjno u gastričnoj mukozi, u reproduktivnim organima, npr., u testisu, u tkivu trofoblasta, npr., u placenti, ili u ćelijama klicine linije, i eksprimirani su ili su aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U ovom konetkstu, "ograničen broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumor-povezani antigeni u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju, na primer, diferencijacione antigene, poželjno diferencijacione antigene specifične za tip ćelije, tj., proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom ćelijskom tipu na određenom razvojnom stadijumu, kancer/testis antigene, tj., proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisu i ponekad u placenti, i antigeni specifični za klicinu liniju. U kontekstu predmetnog pronalaska, tumor-povezani antigen je poželjno povezan sa ćelijskom površinom maligne ćelije i poželjno nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima. Poželjno, tumor-povezni antigen ili aberantna ekspresija tumor-povezanog antigena identifikuje maligne ćelije. U kontekstu predmetnog pronalaska, tumor-povezani antigen koji je eksprimiran od strane maligne ćeline u subjektu, npr., pacijentu koji boluje od maligne bolesti, poželjno je sopstveni protein u pomenutom subjektu. U poželjnim primerima izvođenja, tumor-povezani antigen u kontekstu predmetnog pronalaska je eksprimiran pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji nije esencijalan, tj., tkivima ili organima koji su kada su oštećeni od strane imunog sistema ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu ili su samo teško dostupne imunom sistemu. Poželjno, aminokiselinska sekvenca tumor-povezanog antigena je identična između tumor-povezanog antigena koji je eksprimiran u normalnim tkivima i tumor-povezanog antigena koji je eksprimiran u malignim tkivima. Požejlno, tumor-povezani antigen je prikazan od strane maligne ćelije u kojoj je eksprimiran.

[0059] U poželjnim primerima izvođenja, antigen je virusni antigen kao što je hCMV-pp65 i predmetni pronalazak uključuje stimulaciju CTL odgovora protiv inficiranih ćelija koje eksprimiraju takav virusni antigen i poželjno prikazuju takav virusni antigen sa klasom I MHC.

[0060] Citomegalovirus je rod herpes virusa grupe herpesvirusa. Kod ljudi je uobičajeno poznat kao hCMV ili Humani Herpesvirus 5 (HHV-5). Svi herpes virusi dele karakterističnu sposobnost da ostanu latentni unutar tela tokom dugih perioda.

[0061] hCMV infekcije su često povezane sa pljuvačnim žlezdama, iako se mogu naći u celom telu. hCMV infekcije takođe mogu biti opasne po život za pacijente koji su imunokompromitovani (npr. pacijenti sa HIV, primaoci transplanta organa, ili novorođenčad). Drugi CMV virusi se nalaze kod nekoliko vrsta sisara, ali se vrste izolovane iz sisara razlikuju od hCMV u odnosu na genomsku strukturu, i nije zabeleženo da izazivaju bolest kod ljudi.

[0062] hCMV je pronađen na svim geografskim lokacijama i socioekonomskim grupama, i inficira između 50% i 80% odraslih u Sjedinjenim državama (40% na svetskom nivou) što je naznačeno prisustvom antitela u većini opšte populacije. hCMV je takođe virus koji se najčešće prenosi na fetus u razvoju. hCMV infekcija je više raširena u zemljama u razvoju i u zajednicama nižeg socioekonomskog statusa i predstavlja najznačajniji virusni uzrok urođenih defekata u industrijski razvijenim zemljama.

[0063] Dva CMV proteina, fosfoprotein 65 (pp65; CMV-pp65) i neposredni rani protein-1 (IE-1), su glavna ciljna mesta ćelijskog imunog odgovora.

[0064] Termin "hCMV-pp65" poželjno se odnosi na protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0065] Kada je god prema pronalasku uključen hCMV-pp65, naročito SEQ ID NO: 1, sekvenca epitopa hCMVpp65, naročito SEQ ID NOs: 108-110, ili sekvenca T ćelijskog receptora specifičnog za hCMV-pp65, naročito SEQ ID NOs: 4-29, cilj je poželjno da se indukuje ili odredi imuni odgovor protiv hCMV ili ciljne ćelije inficirane sa hCMV i poželjno su karakterisani prikazivanjem hCMV-pp65, i da se dijagnostikuje, tretira ili spreči hCMV infekcija. Poželjno imuni odgovor uključuje stimulaciju anti-hCMV-pp65 CTL odgovora protiv inficiranih ćelija koje eksprimiraju hCMV-pp65 i poželjno prikazuju hCMV-pp65 sa klasom I MHC.

[0066] U poželjnim primerima izvođenja, antigen je tumor-povezani antigen kao što je NY-ESO-1, TPTE ili PLAC1 i predmetni pronalazak uključuje stimulaciju anti-tumor CTL odgovora protiv malignih ćelija koje eksprimiraju takav tumor-povezani antigen i poželjno prikazuju takav tumor-povezani antigen sa klasom I MHC.

[0067] NY-ESO-1 je kancer/testis antigen eksprimiran kod normalnih tkiva odraslih isključivo u klicinim linijama testisa normalnih odraslih osoba i kod različitih kancera. On indukuje specifičan humoralni i ćelijski imunitet kod pacijenata sa NY-ESO-1-eksprimirajućim kancerom.

[0068] Termin "NY-ESO-1" se poželjno odnosi na humani NY-ESO-1, i, naročito, na protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2 iz listinga sekvenci ili varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0069] Kada god je prema pronalasku uključen NY-ESO-1, naročito SEQ ID NO: 2, sekvenca epitopa NY-ESO-1, naročito SEQ ID NOs: 111-117 i 175 ili sekvenca T ćelijskog receptora specifična za NY-ESO-1, naročito SEQ ID NOs: 30-47, 140-151, 176 i 177, cilj je da se poželjno indukuje ili odredi imuni odgovor protiv malignih ćelija koje eksprimiraju NY-ESO-1 i poželjno su karakterisane prikazivanjem NY-ESO-1, i da se dijagnostikuje, tretira ili spreči maligna bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju NY-ESO-1. Poželjno imuni odgvor uključuje stimulaciju anti-NY-ESO-1 CTL odgovora protiv malignih ćeija koje eksprimiraju NY-ESO-1 i poželjno prikazuju NY-ESO-1 sa klasom I MHC.

[0070] Termin "TPTE" odnosi se na "transmembranransku fosfastazu sa tenzim homologijom". Termin "TPTE" se poželjno odnosi na humani TPTE, i, naročito, na protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 3 iz listinga sekvenci ili varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0071] TPTE ekspresija u zdravim tkivima je ograničena na testis i količine transkripta su ispod granice detekcije u svim drugim uzorcima normalnog tkiva. Nasuprot tome, TPTE ekspresija je nađena kod različitih tipova kancera uključujući maligni melanom, kancer dojke, kancer pluća, kancer prostate, kancer dojke, kancer jajnika, karcinom ćelija bubrega i kancer grlića materice.

[0072] TPTE transkripcija je inicirana tokom maligne transformacije sa kancer-povezanom DNK hipometilacijom. Dodatno, TPTE promoviše progresiju kancera i matastazno širenje ćelija kancera. Naročito, TPTE je vitalan za efikasnu hemotaksiju, proces koji je uključen u višestruke aspekte progresije kancera uključujući invaziju kancera i metastazu sa uticajem na destinacije vraćanja i metastaze ćelija kancera. TPTE ekspresija u primarnim tumorima je povezana sa značajno većom stopom metastazirajuće bolesti.

[0073] Kada god je prema pronalasku uključen TPTE, naročito SEQ ID NO: 3, sekvenca epitopa TPTE, naročito SEQ ID NOs: 118-139 i 178-187, ili sekvenca T ćelijskog receptora specifična za TPTE, naročito SEQ ID NOs: 48-107 i 188-193, cilj je da se poželjno indukuje ili odredi imuni odgovor protiv malignih ćelija koje eksprimiraju TPTE i koje su poželjno karakterisane prikazivanjem TPTE, i da se dijagnostikuje, tretira ili spreči maligna bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju TPTE. Poželjno imuni odgovor uključuje stimulaciju anti-TPTE CTL odgovora protiv malignih ćelija koje eksprimiraju TPTE i poželjno prikazuju TPTE sa klasom I MHC.

[0074] Termin "PLAC1" se odnosi na "placenta-specifični protein 1". Termin "PLAC1" se poželjno odnosi na humani PLAC1, i, naročito, na protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 174 iz listinga sekvenci ili varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0075] PLAC1 je placenta-specifični gen koji je često aberantno aktiviran i visoko eksprimiran kod različitih tipova tumora. PLAC1 ekspresija je nađena, na primer, kod kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želudca, kancera prostate, kancera pankreasa, kancera ćelija bubrega, kancera jetre, sarkoma, kancera tiroidee, i kancera glave i vrata. PLAC1 je eksprimiran u 82% pacijenata sa kancerom dojke. U pogledu kancera pluća i kancera želudca, PLAC1 je eksprimiran u 42 i 58% slučajeva, respektivno.

[0076] RNKi-posredovano utišavanje PLAC1 kod MCF-7 i BT-549 ćelija kancera dojke duboko pogoršava pokretljivost, migraciju, i invaziju i indukuje blok G1/S ćelijskog ciklusa sa skoro potpunim ukidanjem proliferacije. „Knock down“ PLAC1 je povezan sa smanjenom ekspresijom ciklina D1 i smanjenom fosforilacijom AKT kinaze. PLAC1 je uključen ne samo u proliferaciju ćelija već takođe u pokretljivost ćelija, migraciju i invaziju.

[0077] Kada god je prema pronalasku uključen PLAC1, naročito SEQ ID NO: 174, sekvenca epitopa PLAC1, naročito SEQ ID NOs: 172, 173 i 196, ili sekvenca T ćelijskog receptora specifična za PLAC1, naročito SEQ ID NOs: 152-171, 194 i 195, cilj je da se poželjno indukuje ili odredi imuni odgovor protiv malignih ćelija koje eksprimiraju PLAC1 i koje su poželjno karakterisane prikazivanjem PLAC1, i da se dijagnostikuje, tretira ili spreči maligna bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju PLAC1. Poželjno imuni odgovor uključuje stimulaciju anti-PLAC1 CTL odgovora protiv malignih ćelija koje eksprimiraju PLAC1 i poželjno prikazuju PLAC1 sa klasom I MHC.

[0078] Prethodno opisane sekvence antigena uključuju bilo koje varijante pomenutih sekvenci, naročito mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrste i homologa vrsta, naročite one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji značaj je često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je nukelinska kiselina ili aminokiselinska sekvenca sa različitim vrstama sa poreklom od onog od date sekvence nukelinske kiseline ili aminokiseline. Termin "CMV-pp65", " NY-ESO-1", "TPTE" i "PLAC1" će obuhvatati (i) spjals varijante, (ii) post-translaciono modifikovane varijante, naročito uključujući varijante sa različitom glikozilacijom kao što je N-glikozilacioni status, (iii) konformacione varijante, i (iv) varijante povezane i nepovezane sa bolešću. Poželjno, "CMV-pp65", "NY-ESO-1", "TPTE" ili "PLAC1" je prisutan u svojoj nativnoj konformaciji.

[0079] "Ciljna ćelija" označavaće ćeliju koja je ciljno mesto imunog odgovora kao što je ćelijski imuni odgovor. Ciljne ćelije uključluju ćelije koje prikazuju antigen ili epitop antigena, tj. peptidni fragment izveden iz antigena, i uključuju bilo koju neželjenu ćeliju kao što je ćelija inficirana virusom ili maligna ćelija kao što je prethodno opisano. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen kao što je ovde opisano i poželjno prikazuje pomenuti antigen sa klasom I MHC.

[0080] Termin "subjekat prethodno izložen antigenu" označava subjekat kao što je ljudsko biće koje je prethodno imalo kontakt sa antigenom i koje je poželjno seropozitivno za antigen i/ili agens koji sadrži antigen. Takva seropozitivnost može se odrediti određivanjem imunog odgovora na antigen ili na agens koji sadrži antigen ili komponentu pomenutog agensa koji je različit od antigena, npr. drugi antigen, u subjektu. Pomenuto određivanje imunog odgovora poželjno sadrži određivanje odgovora antitela kao što je IgG odgovor.

[0081] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj., na deo u ili fragment molekula koji je prepoznat od strane imunog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane T ćelije, naročito kada je prikazan u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina kao što je tumor-povezani antigen ili virusni antigen poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poeželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na primer, epitop može poželjno biti dužine 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina. Naročito je poželjno da je epitop u kontekstu predmetnog pronalaska T ćelijski epitop.

[0082] Termini "epitop", "fragment antigena", "peptid antigena" i "peptid" su ovde naizmenično korišćeni i poželjno se odnose na nepotpuno prikazivanje antigena koji je poželjno sposoban da izazove imuni odgvor protiv antigena ili ćelije koja eksprimira ili sadrži i poželjno prikazuje antigen. Poželjno, termini se odnose na imunogeni deo antigena. Poželjno, to je deo antigena koji je prepoznat (tj., specifično vezan) od strane T ćelijskog receptora, naročito ukoliko je prisutan u kontekstu MHC molekula. Određeni poželjni imunogeni delovi vezuju se za MHC molekul klase I ili klase II. Kao što je ovde korišćeno, kaže se da se imunogeni deo "vezuje za" MHC molekul klase I ili klase II ukoliko je takvo vezivanje detektabilno korišćenjem bilo kog testa poznatog u tehnici.

[0083] Poželjno, peptidi antigena opisani ovde koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 108 do 139, 172, 173, 175, 178 do 187 i 196 ili varijantu pomenute aminokiselinske sekvence sposobni su da stimulišu imuni odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena iz koga su izvedeni ili ćelija koje su karakterisane ekspresijom antigena i poželjno karakterisane prikazivanjem antigena. Poželjno, peptid antigena je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije karakterisane prikazivanjem antigena sa klasom I MHC i poželjno je sposoban da stimuliše antigen-responsivni CTL. Poželjno, peptidi antigena opisani ovde su MHC klase I i/ili klase II prikazani peptidi ili mogu biti obrađeni da proizvedu MHC klase I i/ili klase II prikazane peptide. Poželjno, sekvenca vezana sa MHC molekulom je izabrana od SEQ ID NOs: 108 do 139, 172, 173, 175, 178 do 187 i 196.

[0084] Ukoliko se antigen peptida prikazuje direktno, tj. bez obrade, naročito bez sečenja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, naročito molekulom klase I MHC, i poželjno je dužine 7-20 aminokiselina, poželjnije dužine 7-12 aminokiselina, poželjnije dužine 8-11 aminokiselina, naročito dužine 9 ili 10 aminokiselina. Poželjno sekvenca peptida antigena koji treba da se prikaže suštinski odgovara i poželjno je kompletno identična sekvenci izabranoj od SEQ ID NOs: 108 do 139, 172, 173, 175, 178 do 187 i 196.

[0085] Ukoliko peptid antigena treba prikazati nakon obrade, naročito nakon sečenja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje sa MHC molekulom, naročito molekulom klase I MHC, i poželjno je dužine 7-20 aminokiselina, poželjnije dužine 7-12 aminokiselina, poželjnije dužine 8-11 aminokiselina, naročito dužine 9 ili 10 aminokiselina. Poželjno, sekvenca peptida koji treba da se prikaže nakon obrade suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična sekvenci izabranoj od SEQ ID NOs: 108 do 139, 172, 173, 175, 178 do 187 i 196. Stoga, peptid antigena opisana ovde u jednom primeru izvođenja sadrži sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 108 do 139, 172, 173, 175, 178 do 187 i 196 i nakon obrade peptida antigena čini sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 108 do 139, 172, 173, 175, 178 do 187 i 196.

[0086] Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje suštinski odgovaraju sekvenci peptida koji je prikazan od strane MHC molekula mogu se razlikovati na jednom ili više ostataka koji nisu esencijalni za TCR prepoznavanje peptida kao što je prikazan sa MHC, ili za peptid koji se vezuje za MHC. Takvi suštinski odgovarajući peptidi poželjno su takođe sposobni da stimulišu antigen-specifični ćelijski odgovor kao što je antigen-specifični CTL. Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje se razlikuju od prikazanog peptida na ostacima koji ne utiču na TCR prepoznavanje, ali poboljšavaju stabilnost vezivanja sa MHC, mogu poboljšati imunogenost peptida antigena, i ovde se mogu označavati kao "optimizovani peptidi". Korišćenjem postojećeg znanja o tome koji od ovih ostatka može verovatnije uticati na vezivanje ili sa MHC ili sa TCR, može se upotrebiti racionalni pristup dizajnu suštinski odgovarajućih peptida. Rezultujući peptidi koji su funkcionalni smatraju se kao peptidi antigena. Sekvence kao što su prethodno razmatrane obuhvaćene su ovde korišćenim terminom "varijanta".

[0087] Peptid antigena može se vezati za MHC molekule kao što su MHC molekuli na površini ćelije i stoga, mogu biti "MHC vezujući peptid". Termin "MHC vezujući peptid" odnosi se na peptid koi se vezuje sa MHC molekulom klase I i/ili MHC molekulom klase II. U slučaju klasa I MHC/peptid kompleksa, vezujući peptidi su tipično dužine 8-10 aminokiselina iako duži ili kraći peptidi mogu biti efikasni. U slučaju klase II MHC/peptid kompleksa, vezujući peptidi su tipično dužine 10-25 aminokiselina i naročito su dužine 13-18 aminokiselina, gde duži i kraći peptidi mogu biti efikasni.

[0088] Termin "deo" odnosi se na frakciju. U odnosu na određenu strukturu kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein termin njegov "deo" može označavati kontinuiranu ili diskontinuiranu frakciju pomenute strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 90% aminokiselina od pomenute aminokiselinske sekvence. Poželjno, ukoliko je deo diskontinuirana frakcija, pomenuta diskontinuirana frakcija je sastavljena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, gde je svaki deo strukture kontinuirani element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija aminokiselinske sekvence može biti sastavljena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela pomenute aminokiselinske sekvence, gde svaki deo poželjno sadrži najmanje 5 kontinuiranih aminokiselina, najmanje 10 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih aminokiselina od aminokiselinske sekvence.

[0089] Termini "deo" i "fragment" korišćeni su ovde naizmenično i odnose se na kontinuirani element. Na primer, deo strukture kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein odnosi se na kontinuirani element pomenute strukture. Porcija, deo ili fragment strukture poželjno sadrži jednu ili više funkcionalnih karakteristika pomenute strukture. Na primer, porcija, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina je poželjno imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu od koga je izveden. U kontekstu predmetnog pronalaska, "deo" strukture kao što je aminokiselinska sekvenca poželjno sadrži, poželjno se sastoji od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% cele strukture ili aminokiselinske sekvence. Porcije, delovi ili fragmenti kao što su prethodno razmatrani obuhvaćeni su terminom "varijanta" koji je ovde korišćen.

[0090] "Obrada antigena" odnosi se na degradaciju antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti pomenutog antigena (npr., degradacija proteina u peptide) i spajanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., preko vezivanja) sa MHC molekulima za prikazivanje od strane ćelija, poželjno antigen prikazujućim ćelijama specifičnim T ćelijama.

[0091] Ćelija koja prikazuje antigen (APC) je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na svojoj površini. T ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks korišćenjem njihovihb T ćelijskih receptora (TCR). Antigen-prikazujuće ćelije obrađuju antigene i prikazuju ih T ćelijama.

[0092] Profesionalne antigen-prikazujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, ili fagoitozom ili receptor-posredovanom endocitozom, i zatim prikazivanju fragmenta antigena, vezanog sa molekulom klase II MHC, na njihovoj membrani. T ćelija prepoznaje i interaguje sa antigen-klasa 11 MHC molekul kompleksom na membrani antigen-prikazujuće ćelije. Dodatni ko-stimulatorni signal se zatim stvara od strane antigen-prikazujuće ćelije, što vodi aktivaciji T ćelije. Ekspresija ko-stimulatornih molekula je definišuća karakteristika profesionalnih antigen-prikazujućih ćelija.

[0093] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prikazujućih ćelija su dendritske ćelije, koje imaju najširi opseg prikazivanja antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prikazujuće ćelije, makrofage, B-ćelije, i određene aktivirane epitelijalne ćelije.

[0094] Ne-profesionalne antigen-prikazujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno MHC proteine klase II neophodne za interakciju sa naivnim T ćelijama; oni su eksprimirani samo nakon stimulacije ne-profesionalnih antigen-prikazujućih ćelija sa određenim citokinima kao što je IFNγ.

[0095] Dendritske ćelije (DCs) su populacije leukocita koje prikazuju antigene zarobljene u perifernim tkivima sa T ćelijama preko i MHC klase II i I puteva prikazivanja antigena. Dobro je poznato da su dendritske ćelije potentni induktori imunih odgovora i aktivacija ovih ćelija je kritični korak za indukciju antitumorskog imuniteta.

[0096] Dendritske ćelije i progenitori se mogu dobiti iz periferne krvi, kostne srži, tumor-infiltrirajućih ćelija, infiltrirajućih ćelija peritumorskih tkiva, limfnih čvorova, slezine, kože, krvi pupčane vrpce ili bilo kojeg drugog pogodnog tkiva ili tečnosti. Na primer, dendritske ćelije mogu biti diferencirane ex vivo dodavanjem kombinacije citokina kao što su GM-CSF, IL-4, IL-13 i/ili TNFa kulturama monocita sakupljenih iz periferne krvi. Alternativno, CD34 pozitivne ćelije sakupljene iz periferne krvi, krvi pupčane vrpce ili kostne srži mogu se diferencirati u dendritke ćelije dodavanjem medijumu kulture kombinacije GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 liganda, LPS, flt3 liganda i/ili dugog jedinjenja (ili više njih) koji indukuju diferencijaciju, sazrevanje i proliferaciju dendritskih ćelija.

[0097] Dendritske ćelije su konvencionalno kategorizovane kao "nezrele" i "zrele" ćelije, koje se mogu koristiti kao jednostavan način da se razlikuju dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ne treba smatrati da ova nomenklatura isključuje sve moguće intermedijerne stadijume diferencijacije.

[0098] Nezrele dendritske ćelije su okarakterisane kao antigen prikazujuće ćelije sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i manoza receptora. Zreli fenotip se tipično karkateriše niskom ekspresijom ovih markera, ali sa visokom ekspresijom molekula ćelijske površine odgovornih za aktivaciju T ćelija kao što su klasa I i klasa II MHC, adhezioni molekuli (npr. CD54 i CD11) i kostimulatorni molekuli (npr., CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).

[0099] Sazrevanje dendritskih ćelija je označeno kao status aktivacije dendritske ćelije na kome takve antigenprikazujuće dendritske ćelije dovode do prajminga T ćelija, dok prikazivanje od strane nezrelih dendritskih ćelija rezultuje u toleranciji. Sazrevanje dendritske ćelije je najvećim delom izazvano biomolekulima sa mikrobnim karakteristikama detektovanim od strane urođenih receptora (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), pro-inflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFNs), vezivanjem CD40 na površini dendritske ćelije sa CD40L, i supstancama oslobođenim iz ćelija koje prolaze kroz stresnu ćelijsku smrt. Dendritkse ćelije mogu se izvesti kultivisanjem ćelija kostne srži in vitro sa citokinima, kao što je faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i faktor alfa nekroze tumora.

[0100] Ćelije kao što su antigen prikazujuće ćelije ili ciljne ćelije mogu se napuniti sa MHC klasa I prikazanim peptidima izlaganjem, tj. pulsiranjem, ćelija sa peptidom ili transdukcijom ćelija sa nukleinskom kiselinom, poželjno RNK, koja kodira peptid ili protein koji sadrži peptid koji treba da se prikaže, npr. nukleinska kiselna koja kodira antigen.

[0101] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisano sadrži antigen prikazujuću ćeliju napunjenu sa peptidom antigena. U ovom pogledu, protokoli se mogu zasnivati na in vitro kultivisanju/diferencijaciji dendritskih ćelija manipulisanih na takav način da veštački prikazuju peptid antigena. Proizvodnja dendritskih ćelija genetičkim inženjeringom može uključivati introdukciju nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene ili peptide antigena u denditske ćelije. Transfekcija dendritskih ćelija sa mRNK je obećavajuća tehnika za punjenje antigena za stimulisanje jakog antitumorskog imuniteta. Takva transfekcija se može odigrati ex vivo, i farmaceutska kompozicija koja sadrži takve transficirane ćelije se zatim može koristiti u terapeutske svrhe. Alternativno, vehikulum za dopremanje gena koji cilja dendritsku ili drugu antigen prikazujući ćeliju može se primeniti na pacijenta, što rezultuje u transfekciji koja se dešava in vivo. In vivo i ex vivo transfekcija dendritskih ćelija, na primer, može se generalno izvesti korišćenjem bilo kojih postupaka poznatih u tehnici, kao što su one opisane u WO 97/24447, ili pristupom sa genskim pištoljem opisanim od strane Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456-460,1997. Punjenje dendritskih ćelija antigenom može se postići inkubacijom dendritskih ćelija ili progenitorskih ćelija sa antigenom, DNK (golom ili unutar plazmidnog vektora) ili RNK; ili sa antigen-eksprimirajućim rekombinantnim bakterijama ili virusima (npr., vakcinia, virus boginja živine, adenovirus ili lentivirus vektori).

[0102] Termin "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost antigena da indukuje imunu reakciju.

[0103] Termin "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na ćeliju koja izvodi efektorske funkcije tokom imune reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" je poželjno sposobna da se vezuje za antigen ili ćeliju karakterisanu prikazivanjem antigena ili peptida antigena izvedenog iz antigena i posreduje u imunom odgovoru. Na primer, takve ćelije luče citokine i/ili hemokine, ubijaju mikrobe, izlučuju antitela, prepoznaju infektivne ili kancerozne ćelije, i izborno eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije sadrže T ćelije (citotoksične T ćelije, pomoćne T ćelije, tumor infiltrirajuće T ćelije), B ćelije, ćelije prirodne ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog pronalaska, "imunorekativne ćelije " su T ćelije, poželjno CD4+ i/ili CD8+ T ćelije.

[0104] Poželjno, "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen ili peptid antigena izveden iz antigena sa određenim stepenom specifičnosti, naročito ukoliko je prikazan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen prikazujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su maligne ćelije ili ćelije inficirane sa virusom. Poželjno, pomenuto prepoznavanje omogućuje ćeliji koja prepoznaje antigen ili peptid antigena izveden iz pomenutog antigena da bude responsivna ili reaktivna. Ukoliko je ćelija pomoćna T ćelija (CD4+ T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili peptid antigena izveden iz antigena u kontekstu MHC klase II molekula takva responsivnost ili reaktivnost može uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTLs) i/ili B-ćelija. Ukoliko je ćelija CTL takva responsivnost ili reaktivnost može uključivati eliminaciju ćelija prikazanih u kontekstu MHC klasa I molekula, tj., ćelija karakterisanih prikazivanjem antigena sa klasom I MHC, na primer, preko apoptoze ili perforin-posredovane ćelijske lize. Prema pronalasku, CTL responsivnost može uključivati produženi fluks kalcijuma, deobu ćelija, proizvodnju citokina kao što je IFN-γ i TNF-α, ushodnu regulaciju aktivacionih markera kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje antigen prikazujućih ciljnih ćelija. CTL responsivnost se takođe može odrediti korišćenjem veštačkog reportera koji precizno pokazuje responsivnost CTL. Takvi CTL koji prepoznaju antigen ili peptid antigena izveden iz antigena i koji su responsivni ili reaktivvni takođe su ovde označeni kao "antigen-responsivni CTL". Ukoliko je ćelija B ćelija takva responsivnost može uključivati oslobađanje imunoglobulina.

[0105] Prema pronalasku, termin "imunoreaktivna ćelija" takođe uključuje ćeliju koja može sazreti u imunu ćeliju (kao što je T ćelija, naročito pomoćna T ćelija, ili citolitička T ćelija) sa pogodnom stimulacijom. Imunoreaktivne ćelije sadrže CD34+ hematopoetske stem ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Ukoliko je poželjna proizvodnja citolitičkih ili pomoćnih T ćelija koje prepoznaju antigen, imunoreaktivna ćelija je dovedena u kontakt sa ćelijom koja prikazuje antigen ili peptid antigena pod uslovima koji favorizuju proizvodnju, diferencijaciju i/ili selekciju citolitičkih T ćelija i T helper ćelija. Diferencijacija T ćelijskih prekursora u citolitičku T ćeliju, kada je izložena antigenu, slična je klonskoj selekciji imunog sistema.

[0106] "Limfoidna ćelija" je ćelija koja je, izborno nakon pogodne modifikacije, npr. nakon transfera T ćelijskog receptora, sposobna da proizvodi imuni odgovor kao što je ćelijski imuni odgovor, ili prekursorska ćelija takve ćelije, i uključuje limfocite, poželjno T limfocite, limfoblaste, i plazma ćelije. Limfoidna ćelija može biti imunoreaktivna ćelija kao što je ovde opisano. Poželjna limfoidna ćelija je T ćelija kojoj nedostaje endogena ekspresija T ćelijskog receptora i koja se može modifikovati da eksprimira takav T ćelijski receptor na površini ćelije.

[0107] Termini "T ćelija" i "T limfocit" ovde su korišćeni naizmenično i uključuju T helper ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTLs, CD8+ T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije.

[0108] T ćelje pripadaju grupi belih krvnih ćelija poznatih kao limfociti, i i maju centralnu ulogu u ćelijskiposredovanom imunitetu. One se mogu razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i ćelijeprirodne ubice po prisustvu specijalnog receptora na njihovoj ćelijskoj površini nazvani T ćelijski receptori (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za sazrevanje T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih subsetova T ćelija, svaki sa različtiom funkcijom.

[0109] T helper ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, uključujući, između ostalih funkcija, sazrevanje B ćelija u plazma ćelije i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4+ T ćelije jer eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. Helper T ćelije postaju aktivirane kada su prikazane sa peptidnim antigenima sa MHC klasom II molekula koji su eksprimirani na površini antigen prikazujućih ćelija (APCs). Po aktivaciji, one se brzo dele i izlučuju male proteine nezvane citokini koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunom odgovoru.

[0110] Citotoksične T ćelije uništavaju ćelije inficirane virusom i ćelije tumora, i takođe su uključene u odbacivanju transplanta. Ove ćelije su takođe poznate kao CD8+ T ćelije jer eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljeve vezivanjem za antigen povezan sa MHC klasom I, koji je prisutan na površini skoro svake ćelije tela.

[0111] Većina T ćelija ima T ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Stvarni T ćelijski receptor je sastavljen od dva zasebna peptidna lanca, koji su proizvedeni iz nezavisnih alfa i beta (TCRα i TCRβ) gena T ćelijskog receptora i nazvani su α- i β-TCR lanci. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju mali subset T ćelija koji poseduje poseban T ćelijski receptor (TCR) na njihovoj površini. Međutim, kod γδ T ćelija, TCR je sastavljen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo manje zastupljena (2% ukupnih T ćelija) od αβ T ćelija.

[0112] Struktura T ćelijskog receptora je veoma slična imunoglobulinskim Fab fragmentima, regionima koji su definisani kao kombinovani laki i teški lanac ruke antitela. Svaki lanac TCR je član superfamilije imunoglobulina i poseduje jedan N-terminalni imunoglobulinski (Ig)-varijabilni (V) domen, jedan Ig-konstantni (C) domen, transmembranski/koji se proteže kroz ćelijsku membranu region, i kratak citoplazmatksi rep na C-terminalnom kraju.

[0113] Prema pronalasku, termin "varijabilni region T ćelijskog receptora" odnosi se na varijabilne domene TCR lanaca.

[0114] Varijabilni domen oba TCR α-lanca i β-lanca imaju tri hipervarijabilna ili regiona koji određuju komplementarnost (CDRs), dok varijabilni region β-lanca ima dodatno područje hipervarijabilnosti (HV4) koji normalno ne dolazi u kontakt sa antigenom i stoga se ne smatra CDR. CDR3 je glavni CDR odgovoran za prepoznavanje obrađenog antigena, iako je takođe pokazano da CDR1 α-lanca interaguje sa N-terminalnim delom antigenog peptida, dok CDR1 β-lanca inetraguje sa C-terminalnim delom peptida. Smatra se da CDR2 preoznaje MHC. Ne smatra se da CDR4 β-lanca učestvuje u preoznavanju antigena, ali je pokazano da interaguje sa superantigenima.

[0115] Prema pronalasku, termin "najmanje jedna od CDR sekvenci" poželjno znači najmanje CDR3 sekvenca. Termin "CDR sekvence lanca T ćelijskog receptora" poželjno se odnosi na CDR1, CDR2 i CDR3 α-lanca ili βlanac T ćelijskog receptora.

[0116] Konstantni domen TCR domena sastoji se od kratkih vezujućih sekvenci u kojima cisteinski ostatak formira disulfidne veze, koje formiraju vezu između dva lanca.

[0117] Sve T ćelije potiču od hematopoetskih stem ćelija u kostnoj srži. Hematopoetski progenitori izvedeni iz hematopetskih stem ćelija naseljuju timus i vrše ekspanziju ćelijskom deobom da bi stvorili veliku populaciju nezrelih timocita. Najraniji timociti ne eksprimiraju CD4 niti CD8, i stoga su klasifikovani kao dvostrukonegativne (CD4-CD8-) ćelije. Kako napreduju u razvoju postaju dvostruko-pozitivni timociti (CD4+CD8+), i konačno sazrevaju u pozitivne (CD4+CD8- ili CD4-CD8+) timocite koji se zatim oslobađaju iz timusa u periferna tkiva.

[0118] Prvi signal u aktivaciji T ćelija je obezbeđen vezivanjem T ćelijskog receptora za kratki peptid prikazan od strane glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na drugoj ćeliji. Ovo osigurava da je aktivirana samo T ćelija sa TCR specifičnim za taj peptid. Partnerska ćelija je obično profesionalna antigen prikazujuća ćelija (APC), obično dendritska ćelija u slučaju naivnih odgovora, iako B ćelije i makrofage mogu biti važne APCs. Peptidi prikazani CD8+ T ćelijama od strane MHC klasa I molekula su dužine 8-10 aminokiselina; peptidi prikazani CD4+ T ćelijama od strane MHC klasa II molekula su duži, jer su krajevi vezujućeg rascepa MHC klasa II molekula otvoreni.

[0119] T ćelije se generalno mogu pripremiti in vitro ili ex vivo, korišćenjem standardnih procedura. Na primer, T ćelije mogu biti prisutne u (ili izolovane iz) kostne srži, periferne krvi ili dela kostne srži ili periferne krvi sisara, kao što je pacijent, korišćenjem komercijalno dostupnog sistema za separaciju ćelija. Alternativno, T ćelije se mogu izvesti iz srodnih ili nesrodnih ljudi, ne-humanih životinja, ćelijskih linija ili kultura. "Uzorak koji sadrži T ćelije" mogu, na primer, biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).

[0120] T ćelije se mogu stimulisati sa antigenom, peptidom, nukleinskom kiselinom i/ili antigen prikazujućim ćelijama (APCs) koje eksprimiraju antigen. Takva stimulacija je izvedena pod uslovima i u vremenu dovoljnom da dozvoli stvaranje T ćelija koje su specifične za antigen, peptid i/ili ćelije koje prikazuju antigen ili peptid.

[0121] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija može se detektovsti na različtite načine. Postupci za detektovanje specifične aktivacije T ćelija uključuju detekciju proliferacije T ćelija, proizvodnju citokina (npr., limfokina), ili stvaranje citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjan postupak za detekciju specifične aktivacije T ćelije je detekcija proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, poželjan postupak za detekciju specifične aktivacije T ćelije je detekcija stvaranja citolitičke aktivnosti.

[0122] Da bi se stvorile CD8+ T ćelijske linije, kao stimulatorne ćelije mogu se koristiti antigen-prikazujuće ćelije, poželjno autologne antigen-prikazujuće ćelije, transficirane sa nukleinskom kiselinom koja proizvodi antigen.

[0123] Nukleinske kiseline kao što je RNK koja kodira lance T ćelijskog receptora (TCR) može se introdukovati u limfoidne ćelije kao što su T ćelije ili druge ćelije sa litičkim potencijalom. U pogodnom primeru izvođenja, TCR α- i β-lanci su klonirani iz antigen-specifične T ćelijske linije i korišćeni su za adoptivnu T ćelijsku terapiju. Ovde su opisani T ćelijski receptori specifični za antigen ili peptid antigena koji su opisani ovde. Generalno, T ovde su opisani ćelijski receptori koji prepoznaju ili vezuju peptide antigena prikazane u MHC kontekstu. Nukleinske kiseline koje kodiraju α- i β-lance T ćelijskog receptora, npr. ovde opisani T ćelijski receptor, mogu se nalaziti na zasebnim molekulima nukleinske kiseline kao što su ekspresini vektori ili alternativno, na jednom molekulu nukleinske kiseline. Shodno tome, termin "nukleinska kiselina koja kodira T ćelijski receptor" odnosi se na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lance T ćelijskog receptora na istim ili poželjno različitim molekulima nukleinske kiseline.

[0124] Termin "imunoreaktivna ćelija reaktivna sa peptidom" odnosi se na imunoreaktivnu ćeliju koja kada prepozna peptid, naročito ukoliko je prikazan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen prikazujjuće ćelije ili bolesnih ćelija kao što su maligne ćelije ili ćelije inficirane virusom, izvodi efektorske funkcije imunoreaktivnih ćelija kao što je prethodno opisano.

[0125] Termin "T ćelijski receptor reaktivan sa peptidom" odnosi se na T ćelijski receptor koji kada je prisutan na imunoreaktivnoj ćeliji prepoznaje peptid, naročito ukoliko je prikazan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen prikazujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su maligne ćelije ili ćelije inficirane virusom, tako da imunoreaktivna ćelija izvodi efektorske funkcije imunoreaktivnih ćelija kao što je prethodno opisano.

[0126] Termin "antigen-reaktivna T ćelija" odnosi se na T ćeliju koja prepoznaje antigen ukoliko je prikazan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen prikazujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su maligne ćelije ili ćelije inficirane virusom i izvodi efektorske funkcije T ćelija kao što je prethodno opisano.

[0127] Termin "antigen-specifična limfoidna ćelija" odnosi se na limfoidnu ćeliju koja, naročito kada je obezbeđena sa antigen-specifičnim T ćelijskim receptorom, prepoznaje antigen ukoliko je prikazan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen prikazujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su maligne ćelije ili ćelije inficirane virusomi poželjno izvodi efektorske funkcije T ćelija kao što je prethodno opisano. Smatra se da su T ćelije i druge limfoidne ćelije specifične za antigen ukoliko ćelije ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju antigen i/ili prikazuju peptid antigena. Specifičnost T ćelija može se proceniti korišćenjem bilo koje od različlitih standardnih tehnika, na primer, u testu oslobađanja hroma ili testu proliferacije. Alternativno, sinteza limfokina (kao što je interferon-γ) može se meriti

[0128] Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju MHC klase I i MHC klase II molekule i odnose se na kompleks gena koji se pojavljuju kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i atigen prikazujućih ćelija ili bolesnih ćelija u imunim reakcijama, gde MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prikazuju ih za prepoznavanje od strane T ćelijskih receptora. Proteini kodirani sa MHC su eksprimirani na površini ćelija, i prikazuju i sopstvene antigene (peptidni fragmenti od same ćelije) i nesopstvene antigene (npr., fragmenti invazivnih mikroorganizama) T ćeliji.

[0129] MHC region je podeljenu tri podgrupe, klasa I, klasa II, i klasa III. MHC klasa I proteina sadrži α-lanac i β2-mikroglobulin (nije deo MHC kodiran sa hromnozomom 15). Ona prikazuje fragmente antigena citotoksičnim T ćelijama. Na većini ćelija imunog sistema, specifično na antigen-prikazujućim ćelijama, MHC klasa II proteini sadrže α- i β-lance i prikazuju fragmente antigena T-helper ćelijama. MHC klase III region kodira druge imune komponente, kao što su komponente komplementa i neke koji kodiraju citokine.

[0130] Kod ljudi, geni u MHC regionu koji kodiraju antigen-prikazujuće proteine na površini ćelije označeni su kao humani leukocitni antigen (HLA) geni. Međutim skraćenica MHC je često korišćena da označava proizvode HLA gena. HLA geni uključuju devet takozvanih klasičnih MHC gena: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, i HLA-DRB1.

[0131] U jednom poželjnom primeru izvođenja pronalaska MHC molekul je HLA molekul.

[0132] Pod "ćelijom karakterisanom prikazivanjem antigena", "ćelija koja prikazuje antigen", "antigen prikazan od strane ćelije", "antigen prikazujuća" ili sličnim izrazima podrazumeva se ćelija kao što je bolesna ćelija kao što je ćelija inficirana virusom ili maligna ćelija, ili antigen prikazujuća ćelija koja prikazuje antigen koji eksprimira ili fragment izveden iz pomenutog antigena, npr. obradom antigena, u kontekstu MHC molekula, naročito MHC klasa I molekula. Slično, termini "bolest karakterisana prikazivanjem antigena" označava bolest koja uključuje ćelije karakterisane prikazivanjem antigena, naročito sa klasom I MHC. Prikazivanje antigena od strane ćelije može se izvesti transficiranjem ćelije sa nukleinskom kiselinom kao što je RNK koja kodira antigen.

[0133] Pod "fragmentom antigena koji je prikazan" ili sličnim izrazima podrazumeva se da fragment može biti prikazan od strane MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, npr. kada je dodat direktno antigen prikazujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji je u prirodi prikazan od strane ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0134] Neki terapeutski postupci su zasnovani na reakciji imunog sistema pacijenta, što rezultuje u lizi bolesnih ćelija koje prikazuju antigen sa klasom I MHC. U vezi toga, na primer, autologne citotoksični T limfociti specifični za kompleks peptida antigena i MHC molekula mogu se primeniti na pacijenta koji ima bolest. Poznata je proizvodnja takvih citotoksičnih T limocita in vitro. Primer postupka za diferencijaciju T ćelija može se naći u WO-A-9633265. Generalno, uzorak koji sadrži ćelije kao što su ćelije krvi uzet je od pacijenta i ćelije su dovedene ukontakt sa ćelijama koje prikazuju kompleks i koje mogu izavati propagaciju citotoksičnih T limfocita (npr. dendritske ćelije). Ciljne ćelije mogu biti transficirane ćelije kao što je COS ćelija. Ove transficirane ćelije prikazuju željeni kompleks na njihovoj površini i, kada su u kontaktu sa citotoksičnim T limfocitima, stimulišu propagaciju poslednje pomenutih. Klonalno ekspandovani autologni citotoksični T limfociti su zatim primenjeni na pacijenta.

[0135] U sledećem postupku selekcije citotoksičnih T limfocita, fluorogeni tetrameri MHC klasa I molekul/peptid kompleksa korišćeni su za dobijanje specifičnih klonova citotoksičnih T limfocita (Altman et al. (1996), Science 274:94-96; Dunbar et al. (1998), Curr. Biol.8:413-416, 1998).

[0136] Dodatno, ćelije koje prikazuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) mogu se kombinovati sa citotoksičnim T limfocitima zdravih pojedinaca ili drugih vrsta (npr. miša) što može rezultovati u propagaciji specifičnih citotoksičnih T limfocita sa visokim afinitetom. T ćelijski receptor visokog afiniteta ovih propagiranih specifičnih T limfocita može biti kloniran ili izborno humanizovan do različitog stepena, i tako dobijeni T ćelijski receptori su zatim transdukovani preko genskog transfera, na primer korišćenjem retrovirusnih vektora, u T ćelije pacijenata. Adoptivni transfer se zatim može izvesti korišćenjem ovih genetički iznmenjenih T limfocita (Stanislawski et al. (2001), Nat Immunol.2:962-70; Kessels et al. (2001), Nat Immunol.2:957-61.

[0137] Citotoksični T limfociti se takođe mogu stvoriti in vivo na način poznat per se. Jedan postupak koristi neproliferativne ćelije koje eksprimiraju MHC klasa I/peptid kompleks. Ovde korišćene ćelije biće one koje obično eksprimiraju kompleks, kao što su zračene ćelije tumora ili ćelije transficirane sa jednim ili oba gena neophodna za prikazivanje kompleksa (tj. antigeni peptid i prikazujući MHC molekul). Drugi poželjni oblik je introdukcija antigena u obliku rekombinantne RNK koja može biti ntrodukovana u ćelije lipozomalnim transferom ili elektroporacijom, na primer. Rezultujuće ćelije prikazuju kompleks od interesa i prepoznate su od strane autolognih citotoksičnih T limfocita koji zatim propagiraju.

[0138] Sličan efekat se može postići kombinovanjem antigena ili peptida antigena sa ađuvansom da bi se omogućila inkorporacija u antigen-prikazujuće ćelije in vivo. Antigen ili peptid antigena može biti prikazan kao protein, kao DNK (npr. unutar vektora) ili kao RNK. Antigen se može obraditi da bi se proizveo peptidni partner za MHC molekul, dok njegov fragment može biti prikazan bez potrebe za daljom obradom. Poslednje navedeno je slučaj naročito, ukoliko se ovi mogu vezati za MHC molekule. Prednost je data oblicima primene kod kojih je kompletan antigen obrađen in vivo od strane dendritske ćelije, jer ovo može takođe proizvesti odgovore T helper ćelija koji su potrebni za efikasni imuni odgovor (Ossendorp et al., Immunol Lett. (2000), 74:75-9; Ossendorp et al. (1998), J. Exp. Med. 187:693-702. Generalno, moguće je primeniti efikasnu količinu tumor-povezanog antigena na pacijenta sa intradermalnom injekcijom, na primer. Međutim, se takođe može izvesti intranodalno u limfni čvor (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303.

[0139] Prema pronalasku, "referentni" kao što je referentni uzorak ili referentni organizam može se koristiti za korelisanje i poređenje rezultata dobijenih u postupcima pronalaska iz test uzorka ili test organizma. Tipično referentni organizam je zdrav organizam, naročito organizam koji ne pati od bolesti kao što je maligna bolest ili virusna bolest. "Referentna vrednost" ili "referentni nivo" može se odrediti iz referentnog empirijski merenjem dovoljnog broja referentnih. Poželjno referentna vrednost je određena merenjem najmanje 2, najmanje 3, poželjno najmanje 5, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjno najmanje 20, poželjno najmanje 30, poželjno najmanje 50, ili poželjno najmanje 100 referentnih.

[0140] Termin "imunoglobulin" odnosi se na proteine superfamilije imunoglobulina, poželjno na receptore antigena kao što su antitela ili B ćelijski receptor (BCR). The imunoglobulini su karakterisani strukturnim domenom, tj., imunoglobulinskim domenom, koji ima karakteristično imunoglobulinsko (Ig) savijanje. Termin obuhvata imunoglobuline vezane za membranu kao i rastvorljive imunoglobuline. Imunoglobulini vezani za membranu se takođe označavaju kao površinski imunoglobulini ili membraniski imunoglobulini, koji su generalno deo BCR. Rastvorljivi imunoglobulini se generalno označavaju kao antitela. Imunoglobulini generalno sadrže nekoliko lanaca, tipično dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su povezani preko disulfidnih veza. Ovi lanci se primarno sastoje od imunoglobulinskih domena, kao što je VL (varijabilnog lakog lanca) domen, CL (konstantnog lakog lanca) domen, i CH (konstantnog teškog lanca) domeni CH1, CH2, CH3, i CH4. Postoji pet tipova sisarskih imunoglobulinskih teških lanaca, tj., α, δ, ε, γ, i m koji su odgovorni za različite klase antitela, tj., IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. Nasuprot teškim lancima rastvorljivih imunoglobulina, teški lanci membranskih ili površinskih imunoglobulina sadrže transmembranski domen i kratak citoplazmatski domen na njihovom karboksi-terminusu. Kod sisara postoje dva tipa lakih lanaca, tj., lambda i kapa. Lanci imunoglobulina sadrže varijabilni region i konstantni region. Konstantni region je suštinski konzervisan unutar različitih izotipova imunoglobulina, pri čemu je varijabilni deo veoma različit i odgovoran je za prepoznavanje antigena.

[0141] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, i ukljčuje bilo koji molekul koji sadrži njegov deo za vezivanje antigena. Termin "antitelo" uključuje monoklonska antitela i njihove fragmente ili derivate, uključujući, bez ograničenja, humana monoklonska antitela, humanizovana monoklonska antitela, himerna monoklonska antitela, jednolančana antitela, npr., scFv’s i antigen-vezujući fragmenti antitela kao što su Fab i Fab’ fragmenti i takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, npr., antitela eksprimirana kod prokariota, neglikozilovana antitela, i bilo koje antigen-vezujuće fragmente ili derivate antitela. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regioan lakog lanca. VH i VL regioni se dalje mogu podeliti u regione hipervarijabilnosti, označeni regioni koji određuju komplementarnost (CDR), rasuti između regionima koji su više konzervisani, označeni kao okvirni region (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDRs i četiri FRs, raspoređenih od aminoterminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati vezivanje imunoglobulina sa tkivom ili faktorima domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvom komponentom (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0142] Prema predmentnom pronalasku, T ćelijski receptor ili antitelo je sposobno da se vezuje za predodređeni cilj ukoliko ima značajan afinitet za pomenuti predodređeni cilj i vezuje se za pomenuti predodređeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "afinitet vezivanja" se često meri ravnotežnom konstantnom disocijacije (KD). T ćelijski receptor ili antitelo nije (suštinski) sposobno da se vezuje za cilj ukoliko nema značajan afinitet za pomenuti cilj i ne vezuje se značajno za pomenuti cilj u standardnim testovima.

[0143] T ćelijski receptor ili antitelo je poželjno sposobno da se specifično veže za predodređeni cilj. T ćelijski receptor ili antitelo je specifično za predodređeni cilj ukoliko je sposobno da se vezuje za pomenuti predodređeni cilj uz to da istovremeno nije (suštinski) sposobno da se vezuje za druge ciljeve, tj. nema značajan afinitet za druge ciljeve i nevezuje se značajno za druge ciljeve u standardnim testovima.

[0144] Termin "imunološki ekvivalent" označava da imunološki ekvivalentni molekul kao što je ’imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca koja pokazuje iste ili suštinski iste imunološke karakteristike i/ili izvodi iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr., u odnosu na tip imunološkog efekta kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunog odgovora, jačina i/ili trajanje indkovane imunološke reakcije, ili specifičnost indukovane imune reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "imunološki ekvivalentno" je poželjno korišćen u odnosu na imunološke efekte ili karakteristike peptida ili peptidne varijante korišćene za imunizaciju. Na primer, aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj aminokiselinskoj sekvenci ukoliko pomenuta amiokiselinska sekvenca kada je izložena imunom sistemu subjekta indukuje imunu reakciju koja ima specifičnost reakcije sa referentnom aminokiselinskom sekvencom.

[0145] Termin "imune efektorne funkcije" u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju bilo koje funkcije posredovane komponentama imunog sistema koje rezultuju, na primer, u ubijanju ćelija inficiranih sa virusom ili ćelija tumora, ili u inhibiciji rasta tumora i/ili inhibiciji razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i metastazu. Poželjno, imune efektorske funkcije u kontekstu predmetnog pronalaska su efektorske funkcije posredovane T ćelijom. Takve funkcije sadrže u slučaju helper T ćelije (CD4+ T ćelije) prepoznavanje antigena ili peptida antigena izvedenog iz antigena u kontekstu MHC klase II molekula od strane T ćelijskih receptora, oslobađanje citokina i/ili aktivacija CD8+ limfocita (CTLs) i/ili B-ćelija, i u slučaju CTL prepoznavanje antigen ili peptida antigena izvedenih iz antigena u kontekstu MHC klase I molekula od strane T ćelijskih receptora, eliminacija ćelija prikazanih u kontekstu MHC klase I molekula, tj., ćelija karakterisanih sa prikazivanjem antigena sa klasom I MHC, na primer, preko apoptoze ili perforin-posredovane ćelijske lize, proizvodnje citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifičnim citolitičkim ubijanjem ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0146] Termin "T ćelijski receptor koji ima specifičnost drugog T ćelijskog receptora" znači da dva T ćelijska receptora, naročito kada su prisutna na imunoreaktivnoj ćeliji, prepoznaju isti epitop, naročito kada je prikazan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen-prikazujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su ćelije inficirane virusom ili maligne ćelije i poželjno obezbeđuju imunoreaktivnu ćeliju sa efektorskim funkcijama kao što je prethodno opisano. Poželjno, specifičnost vezivanja i/ili afinitet vezivanja T ćelijskih receptora su slični ili identični. U jednom poželjnom primeru izvođenja, "T ćelijski receptor koji ima specifičnost dugog T ćelijskog receptora" odnosi se na T ćelijski receptor koji sadrži najmanje CDR regione, poželjno najmanje varijabilni region drugog T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, dva T ćelijska receptora su suštinski identični ili identični.

[0147] Nukleinska kiselina je prema pronalasku poželjno dezoksiribonuleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK). Nukleinske kiseline uključuju prema pronalasku genomsku DNK, cDNK, mRNK, rekombinantno pripremljene i hemijski sintetisani molekuli. Nukleinska kiselina prema pronalaskau može biti u obliku molekula koji je jednolančani ili dvolančani i linearni ili zatvoren kovalentno da bi formirao krug. Nukelinska kiselina se može upotrebiti za introdukciju u, tj. transfekciju, ćelija, na primer, u obliku RNK koja se može pripremiti sa in vitro transkripcijom iz DNK šablona. RNK može biti dodatno modifikovana pre primene sa stabilizujućim sekvencama, dodavanja cap strukture, i poliadenilacije.

[0148] Ovde opisane nukelinske kiseline mogu se sadržati u vektoru. Termin "vektor" kao što je ovde korišćeno uključuje vektore poznate stručnjacima uključujući plazmidne vektore, kozmidne vektore, fagne vektore kao što je lambda fag, virusne vektore kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektori veštački hromozomi kao što su bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC), ili P1 veštački hromozomi (PAC). Pomenuti vektori uključuju i ekspresione kao i klonirajuće vektore. Ekspresioni vektori sadže plazmide kao i virusne vektore i generalno sadrže željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno vezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu (npr., bakterija, kvasac, biljka, insekt, ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Klonirajući vektori su generalno korišćeni za inženjering i umnožavanje određenog željenog DNK fragmenta i mogu im nedostajati sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata.

[0149] Kao vektor za ekspresiju T ćelijskog receptora može se koristiti, ili tip vektora u kome su lanci T ćelijskog receptora prisutni u različitim vektorima ili tip vektora u kome su lanci T ćelijskog receptora prisutni u istom vektoru.

[0150] U onim slučajevima pronalaska u kojima MHC molekul prikazuje antigen ili peptid antigena, nukelinska kiselina takođe može sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti MHC molekul. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira MHC molekul može biti prisutna na istom molekulu nukleinske kiseline kao i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen ili peptid antigena, ili obe sekvence nukleinske kiseline mogu biti prisutne na različitim molekulima nukleinska kiseline. U poslednje pomenutom slučaju, dva molekula nukleinske kiseline mogu biti transficirana u ćeliju. Ukoliko ćelija domaćin ne eksprimira ni antigen ili peptid antigena niti MHC molekul, obe kodirajuće sekvence nukleinske kiseline mogu biti transficirane u ćeliju ili na istom molekulu nukleinske kiseline ili na različitim molekulima nukleinske kiseline. Ukoliko ćelija već eksprimira MHC molekul, samo sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen ili peptid antigena može se transficirati u ćeliju.

[0151] Kao što je ovde korišćeno, termin "RNK" označava molekul koji sadrži najmanje ribonukleotidni ostatak. Pod "ribonukleotidom" podrazumeva se nukleotid sa hidroksil grupom na 2’-pozicijom beta-D-ribo-furanoznog dela. Termin uključuje dvolančane RNK, jednolančane RNK, izolovane RNK kao što je delimično prečišćena RNK, suštinski prečišćena RNK, sintetička RNK, rekombinantno proizvedena RNK, kao i izmenjena RNK koja se razlikuje od RNK koja je prisutna u prirodi sa dodavnjem, delecijom, supstitucijom i/ili izmenom jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati dodavanje nenukleotidnog materijala, kao što je na kraju (krajevima) RNK ili interno, na primer na jedan ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima mogu takođe sadržati ne-standardne nukleotide, kao što su nukelotidi koji nisu prisutni u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNKs se mogu označiti kao analozi ili analozi RNK koja se javlja u prirodi.

[0152] Prema predmetnom promalasku, termin "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "iRNK" koja označava "informacionu RNK" i odnosi se na "transkript" koji se može proizvesti korišćenjem DNK kao šablona i kodira peptid ili protein. iRNK tipično sadrži 5’ netranslatirani region, region koji kodira protein ili peptid i 3’ netranslatirani region. iRNK ima ograničeno poluvreme u ćelijama i in vitro. Poželjno, iRNK je proizvedena sa in vitro transkripcijom korišćenjem DNK šablona. U jednom primeru izvođenja pronalaska, RNK koju treba introdukovati u ćeliju dobijena je in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK šablona.

[0153] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "transkripcija" se odnosi na proces, gde je genetski kod u DNK sekvenci transkribovan u RNK. Nakon toga, RNK se može translatirati u protein. Prema predmetnom pronalasku, termin "transkripcija" sadrži "in vitro transkripciju", gde se termin "in vitro transkripcija" odnosi na proces gde RNK, naročito iRNK, je in vitro sintetisana u sistemu bez ćelija, poželjno korišćenjem odgovarajućih ekstrakata ćelija. Poželjno, klonirajući vektori su primenjeni za stvaranje transkripta. Ovi klonirajući vektori su generalno označeni kao transkripcioni vektori i prema predmetnom pronalasku obuhvaćeni su terminom "vektor". Prema predmetnom pronalasku, RNK se može dobiti in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK šablona. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Specifični primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. DNK šablon za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukjleinske kiseline, naročito cDNK, i njegovom introdukcijom u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK. Poželjno su klonirajući vektori korišćeni za proizvodnju transkripata koji su generalno označeni kao transkripcioni vektori.

[0154] cDNK koja sadrži šablon vektora može sadržati vektore koji nose različite cDNK inserte koji nakon transkripcije rezultuju u populaciji različitih RNK molekula koji su izborno sposobni da eksprimiraju različite faktore ili mogu sadržati vektore koji nose samo jednu vrstu cDNK inserta koji nakon transkripcije rezultuje samo u populaciji jedne RNK vrste sposobne da eksprimira samo jedan faktor. Stoga, moguće je proizvesti RNK sposobnu da eksprimira samo jedan ili da proizvede kompozicije različitih RNKs.

[0155] Nukleinske kiseline opisane prema pronalasku poželjno su izolovane. Termin "izolovana nukleinska kiselina" označava prema pronalasku da nukleinska kiselina bila (i) umnožena in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer sečenjem i gel-elektroforetskim frakcionisanjem, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovan nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju tehnikama rekombinantne DNK.

[0156] Nukleinske kiseline mogu, prema pronalasku, biti prisutne zasebno ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologe ili heteerologe. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalano vezana za kontrolne sekvence ekspresije koje mogu biti homologe ili heterologe u odnosu na pomenutu nukleinsku kiselinu. Termin "homolog" označava da su nukleinske kiseline takođe prirodno funkcionalno vezane i termin "heterologni" označava da nukleinske kiseline nisu prirodno funkcionalno vezane.

[0157] Nukleinska kiselina i kontrolna sekvenca ekspresije su "funkcionalno" međusobno vezane, ukoliko su kovalentno međusobno vezane na takav način da je ekspresija ili transkripcija pomenute nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem pomenute kontrolne sekvence ekspresije. Ukoliko nukleinska kiselina treba da bude translatirana u funkcionalni protein, zatim, sa kontrolnom sekvencom ekspresije funkcionalno vezanom za kodirajuću sekvencu, indukcija poemnute kontrolne sekvence ekspresije rezultuje u transkripciji pomenute nukleinske kiseline, bez izazivanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili pomenuta kodirajuća sekvenca nije sposobna da se translatira u željeni protein ili peptid.

[0158] Termin "kontrolna sekvenca ekspresije" ili "kontrolni element ekspresije" sadrži prema pronalasku promotore, vezujuća mesta ribozoma, enhansere i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. Naročito primeri izvođenja pronalaska, kontrolne sekvence ekspresije mogu se regulisati. Tačna struktura kontrolne sekvence ekspresije može varirati u funkciji vrste ili ćelijskog tipa, ali generalno sadrži 5’-netranskribovane i 5’- i 3’-netranslatirane sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, respektivno, kao što je TATA box, sekvenca sa cap strukturom, CAAT sekvenca, i slično. Specifičnije, 5’-netranskribovane kontrolne sekvence ekspresije sadrže region promotora koji uključuje sekvencu promotora za transkripcionu kontrolu funkcionalno vezane nukleinske kiseline. Kontrolne sekvence ekspresije mogu takođe sadržati enhanser sekvence ili ushodne aktivatorske sekvence.

[0159] Prema pronalasku termin "promotor" ili "region promotora" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja je lociran ushodno (5’) u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline koja se eksprimira i kontroliše ekspresiju sekvence obezbeđivanjem mesta za prepoznavanje i vezivanje RNK-polimeraze. "Region promotora" može uključiti dodatna mesta za prepoznavanje i vezivanje za dodatne faktore koji su uključeni u regulaciju transkripcije gena. Promotor može kontrolisati transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Dodatno, promotor može biti "inducibilan" i može inicirati transkripciju kao odgovor na indukujući agens ili može biti "konstitutivni" ukoliko transkripcija nije kontrolisana indukujućim agensom. Gen koji je pod kontrolom indukujućeg promotora nije eksprimiran ili je eksprimiran samo u malom stepenu u odsustvu indukujućeg agensa. U prisustvu indukujućeg agensa gen je uključen ili je nivo transkripcije povećan. Ovo je posredovano, generalno, vezivanjem specifičnog transkripcionog faktora.

[0160] Promotori koji su poželjni prema pronalasku uključuju promotore za SP6, T3 i T7 polimerazu, humani U6 RNK promotor, CMV promotor, i njihove veštačke hibridne promotore (npr. CMV) gde je deo ili delovi fuzionisani sa delom ili delovima promotora gena drugih ćelijskih proteina kao što je npr. humani GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), i uključujući ili ne uključujući dodatni intron(e).

[0161] Termin "ekspresija" je ovde korišćen u svom najširem značenju i sadrži proizvodnju RNK ili RNK i proteina ili peptida. U odnosu na RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" odnosi se naročito na proizvodnju peptida ili proteina. Ekspresija može biti prolazna ili može biti stabilna. Prema pronalasku, termin ekspresija takođe uključuje "aberantnu ekspresiju " ili "abnormalnu ekspresiju".

[0162] "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" označava prema pronalasku da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referentnom vrednošću, npr. stanjem u subjektu koji nema bolest povezan sa abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., tumor-povezanog antigena. Povećanje ekspresije odnosi se na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se nalazi samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta.

[0163] Termin "specifično eksprimiran" označava da je protein suštinski eksprimiran samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumor-povezani antigen specifično eksprimiran u mukozi želudca označava da je pomenuti protein primarno eksprimiran u mukozi želudca i nije eksprimiran u drugim tkivima ili nije eksprimiran u značajnom stepenu u drugom tipu tkiva ili organa. Stoga, protein koji je ekskluzivno eksprimiran u ćelija mukoze želudca i u značajno manjem stepenu u bilo kom drugom tkivu, kao što je testis, specifično je eksprimiran u ćelijama mukoze želudca. U nekim primerima izvođenja, tumor-povezani antigen može takođe biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tipa tkiva ili organa, kao što je u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U ovom slučaju, tumor-povezani antigen je zatim specifično eksprimiran u ovim organima. Na primer, ukoliko je tumor-povezani antigen eksprimiran pod normalnim uslovima poželjno do približno jednakom stepenu u plućima i želudcu, pomenuti tumor-povezani antigen je specifično eksprimiran u plućima i želudcu.

[0164] Termin "translacija" prema pronalasku odnosi se na proces u ribozomima ćelije kojim lanac informacione RNK upravlja sastavljanjem sekvence aminokiselina da bi se stvorio protein ili peptid.

[0165] Prema pronalasku, termin "nukleinska kiselina koja kodira" označava da nukleinska kiselina, ukoliko je prisutna u odgovarajućoj sredini, poželjno unutar ćelije, može biti eksprimirana da proizvede protein ili peptide koji kodira.

[0166] Prema pronalasku, stabilnost i efikasnost translacije RNK introdukavane u ćeliju može se po potebi modifikovati. Na primer, RNK može biti stabilizovana i njena translacija povećanja sa jednom ili više modifikacija koje imaju stabilizacione efekte i/ili povećavaju efikasnost translacije RNK. Takve modifikacije su opisane, na primer, u PCT/EP2006/009448 koja je ovde uključena na osnovu reference.

[0167] Na primer, RNK sa nemaskiranom poli-A sekvencom translatirana je efikasnije od RNK sa maskiranom poli-A sekvencom. Termin "poli-A sekvenca" ili "poly-A+" odnosi se na sekvencu adenil (A) ostataka koja se tipično nalazi na 3’-kraju RNK molekula i "nemaskirana poli-A sekvenca" označava da se poli-A sekvenca na 3’-kraju RNK molekula završava sa A od poli-A sekvence i nije praćena nukleotidima koji nisu A lociranim na 3’-kraju, tj. nishodno, od poli-A sekvence. Dodatno, dugačka poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova rezultuje u optimalnoj stabilnosti transkripta i translacionoj efikanosnosti RNK.

[0168] Stoga, da bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK korišćene u skladu sa predmetnim pronalaskom, može se modifikovati tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, poželjno sa dužinom od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i 100 do 150 adenozinskih ostataka. U naročito poželjnom primeru izvođenja poli-A sekvenca ima dužinu od oko 120 adenozinskih ostataka. Da bi se dodatno povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK korišćen prema pronalasku, poli-A sekvenca može biti nemaskirana.

[0169] Dodatno, inkorporacija 3’-netranslatiranog regiona (UTR) u 3’-netranslatirani region RNK molekula može rezultovati u poboljašanju efikasnosti translacije. Sinergistički efekat se može postići inkorporacijom dva ili više takvih 3’-netranslatiranih regiona. 3’-netranslatirani regioni mogu biti autologni ili heterologni sa RNK u kojoj su introdukovani. U jednom naročitom primru izođenja 3’-netranslatirani region je izveden iz humanog β-globin gena.

[0170] Kombinacija prethodno opisanih modifikacija, tj. inkorporacija poli-A sekvence, demaskiranje poli-A sekvence i inkorporacija jednog ili više 3’-netranslatiranog regiona, ima sinergistički uticaj na stabilnost RNK i povećanje efikasnosti translacije.

[0171] Da bi se povećala ekspresija RNK korišćene prema pronalasku, on se može modifikovati unutar kodirajućeg regiona, tj. sekvence koja kodira eksprimirani faktor, poželjno bez izmene sekvence eksprimiranog faktora, tako da bi se povećao GC-sadržaj i stoga, poboljšala translacija u ćelijama.

[0172] U dodatnim primerima izvođenja pronalaska, RNK koju treba introdukovati u ćelijuz ima, na svom 5’-kraju, Cap struktutu ili regulatornu sekvencu, koja promoviše translaciju u ćeliji domaćinu. Poželjno, RNK ima cap strukturu na svom 5’-kraju sa izborno modifikovanim 7-metilguanozinom vezanim sa 5’-5’ mostom sa prvim transkribovanim nukleotidom lanca iRNK. Poželjno, 5’-kraj RNK uključuje Cap strukturu sa sledećom generalnom formulom:

gde R1i R2su nezavisno hidroksi ili metoksi i W-, X- i Y- su nezavisno kiseonik ili sumpor. U poželjnom primeru izvođenja, R1i R2su hidroksi i W-, X- i Y- su kiseonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, jedan od R1i R2, poželjno R1 je hidroksi i drugi je metoksi i W-, X- i Y- su kiseonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R1 i R2 su hidroksi i jedan od W-, X- i Y-, poželjno X- je sumpor dok su drugi kiseonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, jedan od R1i R2, poželjno R2je hidroksi i drugi je metoksi i jedan od W-, X i Y-, poželjno X-je sumpor dok su drugi kiseonik. U svim prethodno opisanim primerima izvođenja, naročito u onim primerima izvođenja gde X- je definisan kao sumpor, X- može alternativno biti bor ili selen.

[0173] U prethodnoj formuli, nukleotid na desnoj strani je vezan za RNK lanac preko svoje 3’-grupe.

[0174] One Cap strukture gde je najmanje jedan od W-, X- i Y- sumpor, tj. koji imaju fosforotioatni deo, postoje u različitim dijasteroizomernim oblicima pri čemu su svi ovde obuhvaćeni. Dodatno, predmetni pronalazak obuhvata sve tautomere i stereoizomere prethodne formule.

[0175] Naravno, ukoliko je prema predmetnom pronalasku poželjno smanjiti stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK, moguće je modifikovati RNK tako da se utiče na funkciju elemenata kao što je prethodno opisano koji povećavaju stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK.

[0176] Prema predmetnom pronalasku, može se koristiti bilo koja tehnika koja je korisna za introdukciju, tj. prenos ili transfekciju, nukleinskih kiselina u ćelije. Poželjno, RNK je transficirana u ćelije standardnim tehnikama. Takve tehnike uključuju elektroporaciju, lipofekciju i mikroinjekciju. U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, RNK je introdukovana u ćelije elektroporacijom.

[0177] Elektroporacija ili elektropermeabilizacija odnosi se na značajno povećanje u električnoj provodljivosti i permeabilnosti ćelijske plazma membrane izazvane eksterno primenjenim električnim poljem. Uobičajeno je korišćena u molekularnoj biologiji kao način za introdukciju neke supstance u ćeliju.

[0178] Elektroporacija je obično izvedena sa elektroporatorima, uređajima koji stvaraju elektromagnetno polje u rastvoru ćelija. Ćelijska suspenzija je pipetirana u staklenu ili plastičnu kivetu koja ima dve aluminijumske elektrode na svojim stranama. Za elektroporaciju, tipično se koristi ćelijska suspenzija od oko 50 mikrolitara. Pre elektroporacije pomešana je sa nukleinskom kiselinom koja se transficira. Smeša je pipetirana u kivetu, podešena je voltaža i kapacitivnost i kiveta je ubačena u elektroporator. Poželjno, dodat je tečni medijum neposredno nakon elektroporacije (u kivetu ili u ependorf epruvetu), i epruveta je inkubirana na optimalnoj temperaturi za ćelije jedan čas ili više da bi se dozvolila rekuperacija ćelija i izborno ekspresija rezistencije na antibiotike.

[0179] Prema pronalasku poželjno je da introdukcija nukelinske kiseline koja kodira protein ili peptid u ćelije rezultuje u ekspresiji pomenutog proteina ili peptida.

[0180] Termin "peptid" sadrži oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 9 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, naročito 100 aminokiselina kovalentno vezanih peptidnim vezama. Termin "protein" odnosi se na velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali generalno termini "peptidi" i "proteini" su sinonimi i ovde su korišćeni naizmenično.

[0181] Poželjno, izolovani su proteini i peptidi opisani prema pronalasku. Termini "izolovani protein" ili "izolovani peptid" označava da je protein ili peptid izdvojen iz svog prirodnog okruženja. Izolovani protein ili peptid može biti u suštinski prečišćenom stanju. Termin "suštinski prečišćen" označava da je protein ili peptid je suštinski oslobođen drugih supstanci sa kojima je povezan u prirodi ili in vivo.

[0182] Ovde data saznanja u vezi specifičnih aminokiselinskih sekvenci, npr. one prikazane u listingu sekvenci, treba shvatiti tako da se takođe odnose na modifikacije, tj. vaijante, pomenutih specifičnih sekvenci što rezultuje u sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentno pomenutim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinskim sekvencama koje pokazuju osobine identične ili slične onima od specifičnih aminokiselinskih sekvenci. Jedna važna karakteristika je zadržavanje vezivanja peptida sa MHC molekulom i/ili sa T ćelijskim receptorom ili T ćelijskog receptora za njegov cilj ili da se zadrže efektorske funkcije T ćelije. Poželjno, sekvenca modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zamenjuje specifičnu sekvencu u T ćelijskom receptor zadržava vezivanje pomenutog T ćelijskog receptora sa targetom i poželjno funkcije pomenutog T ćelijskog receptora ili T ćelije koja nosi T ćelijski receptor kao što je ovde opisano.

[0183] Stručnjaci će ceniti da naročito sekvence CDR sekvenci, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu biti modifikovani bez gubljenja sposobnosti da se vezuju za target. Na primer, CDR sekvence će biti ili identične ili visoko homologe sa CDR sekvencama specificiranim ovde.

[0184] Peptdina "varijanta" može zadržati imunogenost datog peptida (npr. sposobnost varijante da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima nije značajno umanjena u odnosu na dati peptid). Drugim rečima, sposobnost varijante da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima može biti poboljšana ili nepromenjena, u odnosu na dati peptid, ili može biti smanjena manje od 50%, i poželjno manje od 20%, u odnosu na dati peptid.

[0185] Varijanta može biti identifikovana procenjivanjem njene sposobnosti da se vezuje za MHC molekul. U jednom poželjnom primeru izvođenja, varijanta peptida ima takvu modifikaciju da je sposobnost varijante peptida da se veže za MHC molekula povećana u odnosu na dati peptid. Sposobnost varijante peptida da se veže za MHC molekul može se povećati najmanje 2-puta, poželjno najmanje 3-puta, 4-puta, ili 5-puta u odnosu na onu datog peptida. Shodno tome, sa određenim poželjnim primerima izvođenja, peptid sadrži varijantu u kojoj je 1 do 3 aminokiselinskih ostataka unutar imunogenog dela je supstituisano tako da je sposobnost da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima stattistički veća nego ona za nemodifikovani peptid. Takve supstitucije su poželjno locirane unutar MHC vezujućeg mesta peptida. Poželjne supstitucije omogućuju vezivanje sa molekulima MHC klase I ili klase II. Određene varijante sadrže konzervativne supstitucije.

[0186] Pod "visoko homologim" predviđeno je da se može načiniti od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je od 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucija.

[0187] Termin "varijanta" prema pronalasku takođe uključuje mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alalne varijante, varijante vrste i homologe vrste, naročito one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji značaj je često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za date gene. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline sa različitim vrstama sa različitim poreklom od onog za datu sekvencu nukleinske kiseline ili aminokiseline.

[0188] Za svrhe predmetnog pronalaska, "varijante" aminokiselinske sekvence sadrže aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante. Aminokiselinske delecione varijante koje sadže deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina su takođe nazvane Nterminalne i/ili C-terminalne skraćene varijante.

[0189] Aminokiselinske insercione varijante sadrže insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenoj aminokiselinskoj sekvenci. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka je inserirano na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je moguća insercija po principu slučajnosti sa odgovarajućim skriningom rezultujućeg proizvoda.

[0190] Aminokiselinske adicione varijante sadrže amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina.

[0191] Aminokiselinske delecione varijante su karakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina. Delecije mogu biti na bilo kom položaju proteina.

[0192] Aminokiselinske supstitucione varijante su karakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom inseriranim na njegovo mesto. Preferenca je data modifikacijama na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koje nisu konzervisane između homologih proteina ili peptida i/ili zameni aminokiselina sa drugima sa sličnim osobinama. Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama su konzervativne aminokiselinske izmene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna aminokiselinska promena uključuje supstituciju jedne iz familije aminokiselina koje su srodne u njihovim bočnim lancima. Aminokiseline koje se nalaze u prirodi su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), ne-polarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan, i tirofin se nekada zajedno klasifikuju kao aromatične aminokiseline.

[0193] Poželjno stepen sličnosti, poželjno identičnosti između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta pomenute date aminokiselinske sekvence biće najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti dat je poželjno za aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% ukupne dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ukoliko se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvence, poželjno identičnosti sekvence može se izvesti sa poznatim alatima u tehnici, poželjno korišćenjem najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, korišćenjem Align, korišćenjem standardnih podešavanja, poželjno EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

[0194] "Sličnost sekvence" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve aminokiselinske sekvence označava procenat aminokiselina ili nukleotida koji su identični između sekvenci.

[0195] Namera je da termin "procenat identičnosti" označava procenat aminoksielinskih ostataka koje su identične između dve sekvence koje se porede, dobijene nakon najboljeg poravnanja, pri čemu je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su distribuirane po principu slučajnosti i duž cele njihove dužine. Poređenja sekvenci između dve aminokiselinske sekvence se pogodn mogu izvesti poređenjem ovih sekvenci nakon što su optimalno poravnate, pri čemu je poređenje izvedeno po segmentu ili po "prozoru poređenja" da bi se identifikovali i poredili lokalni regioni sličnosti sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se proizvesti, osim ručno, putem algoritma za lokalnu homologiju od Smith i Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, putem algoritma za lokalnu homologiju od Neddleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, putem postupka za pretraživanje sličnosti od Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili putem kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0196] Procenat identičnosti je izračunat određivanjem broja identičnih položaja između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem poređenih i množenjem dobijenog rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0197] Homologe mainokiselinske sekvence pokazuju prema pronalasku najmanje 40%, naročito najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98 ili najmanje 99% identičnosti aminokiselinskih ostataka.

[0198] Varijante aminokiselinske sekvence opisane ovde mogu se lako pripremiti od strane stručnjaka, na primer, manipulacijom rekombinantne DNK. Manipulacija DNK sekvencama za pripremanje proteina i peptida koje imaju supstitucije, adicije, insercije ili delecije, detaljno je opisana u Sambrook et al. (1989), na primer. Dodatno, peptidi i aminokiselinske varijante ovde opisane mogu se lako pripremiti uz pomoć poznatih tehnika za sintezu peptida kao što je, na primer, sintezom solidne faze i sličnim postupcima.

[0199] Pronalazak uključuje derivate peptida ili proteina ovde opisanih koji su obuhvaćeni sa terinima "peptid" i "protein". Prema pronalasku, "derivati" proteina i peptida su modifikovani oblici proteina i peptida. Takve modifikacije uključuju hemijsku modifikaciju i sadrže pojedinačne ili višestruke supstitucije, delecije i/ili adicije bilo kojih molekula povezanih sa proteinom ili peptidom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i/ili proteini ili peptidi. U jednom primeru izvođenja, "derivati" proteina ili peptida uključuju one modifikovane analoge koji nastaju iz glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, palmitoilacije, miristoilacije, izoprenilacije, lipidacije, alkilacije, derivatizacije, introdukcije protektivnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili vezivanja sa antitelom ili sa drugim ćelijskim ligandom. Termin "derivat" takođe se proširuje na sve funkcionalne hemijske ekvivalente pomenutih proteina i peptida. Poželjno, modifikovani peptid ima povećanu stabilnost i/ili povećanu imunogenost.

[0200] Takođe su uključeni mimetici peptida. Takvi mimetici mogu sadržati aminokiseline vezane za jedan ili više mimetika aminokiselina (tj., jedna ili više aminokiselina unutar peptida može biti zamenjena sa mimetikom aminokiseline) ili mogu biti potpuno nepeptidni mimetici. Mimetik aminokiseline je jedinjenje koje je konformaciono slično aminokiselini, npr. tako da može biti supstituisano umesto aminokiseline bez značajnog smanjenja sposobnosti da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima. Nepeptidni mimetik je jedinjenje koje ne sadrži aminoksieline, koje ima opštu konformaciju koja je slična peptidu, npr. tako da sposobnost mimetika da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima nije značajno smanjena u odnosu na sposobnost datog peptida.

[0201] Prema pronalasku, varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina poželjno ima funkcionalnu karakteristiku aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina, respektivno, iz koje je izveden, tj. funkcionalno je ekvivalentan. U jednom primeru izvođenja, varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina je imunološki ekvivalentan aminokiselinskoj sekvenci, peptidu ili proteinu, respektivno, iz koga je izveden. U jednom primeru izvođenja, funkcionalna karakteristika je imunološka karakteristika.

[0202] Naročita karakteristika je sposobnost formiranja kompleksa sa MHC molekulima i, gde je pogodno, stvaranje imunog odgovora, poželjno stimulacijom citotoksičnih ili T helper ćelija.

[0203] Termin "izveden" označava prema pronalasku da je određen entitet, naročito određena sekvenca, prisutna u objektu iz koga je izveden, naročito organizma ili molekula. U slučaju aminokiselinskih sekvenci, naročito određenih regiona sekvenci, "izveden" naročito označava da je relevantna aminokiselinska sekvenca izvedena iz aminokiselinske sekvence u kojoj je prisutna.

[0204] Termin "ćelija" ili "ćelija domaćin" poželjno je intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom koja nije osobodila svoje normalne intracelularne komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da izvede svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno navedeni termin se prema pronalasku odnosi na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transficirati sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Termin "ćelija" uključuje prema pronalasku prokariotske ćelije (npr., E. coli) ili eukariotske ćelije (npr., dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca, i ćelije insekta). Egzogena nukleinska kiselina može se naći unutar ćelije (i) slobodno dispergovana kao takva, (ii) inkorporisana u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ćelije domaćina ili mitohondrijalnu DNK. Ćelije sisara su naročito poželjne, kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, i primata. Ćelije mogu biti izvedene iz velikog broja tipova tkiva i uključujhu primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, stem ćelije kostne srži, i embrionalne stem ćelije. U dodatnim primerima izvođenja, ćelija je antigen-prikazujuća ćelija, naročito dendritska ćelija, monocit, ili makrofag.

[0205] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili protein kodiran od strane nukleinske kiseline.

[0206] Ćelija može biti rekombinantna ćelijan i može izlučivati kodirani peptid ili protein, može ga eksprimirati na površini i poželjno može dodatno eksprimirati MHC molekul koji se vezuje za pomenuti peptid ili protein ili proizvod njihove obrade. U jednom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul endogeno. U dodatnom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul i/ili peptid ili protein ili proizvod njihove obrade na rekombinantni način. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigenprikazujuća ćelija, naročito dendritksa ćelija, monocit ili makrofag. Termin "klonalna ekspanzija" se odnosi na proces gde je specifični entitet umnožen. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin se poželjno koristi u kontekstu imunološkog odgovora u kom limfociti stimulisani sa antigenom, proliferišu, i specifični limfociti koji prepoznaju pomenuti antigen su amplifikovani. Poželjno, klonalna ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.

[0207] Bolest povezana sa ekspresijom antigena može se detektovati na osnovu prisustva T ćelija koje specifično reaguju sa peptidom u biološkom uzorku. Unutar određenih postupaka, biološki uzorak koji sadrži CD4+ i/ili CD8+ T ćelije izolovane iz pacijenta inkubiran je sa peptidom kao što je ovde opisano, nukelinskom kiselinom koja kodira takav peptid i/ili antigen-prikazujućom ćelijom koja eksprimira i/ili prikazuje najmanje imunogeni deo takvog peptida, i detektovano je prisustvo ili odsustvo specifične aktivacije T ćelija. Pogodni biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovane T ćelije. Na primer, T ćelije mogu biti izolovane iz pacijenta rutinskim tehnikama (kao što je sa Ficoll/Hypaque centrifugiranjem limfocita periferne krvi u gradijentu gustine). Za CD4+ T ćelije, aktivacija je poželjno detektovana procenom proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, aktivacija je pogodno detektovana sa procenom citolitičke aktivnosti. Nivo proliferacije koji je najmanje dva puta veći i/ili nivo citolitičke aktivnosti koji je najmanje 20% veći nego kod subjekata bez bolesti ukazuje na prisustvo bolesti povezane sa ekspresijom antigena kod subjekta.

[0208] "Redukovati" ili "inhibirati" kao što je ovde korišćeno označava sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili veće, 10% ili veće, 20% ili veće, poželjnije od 50% ili veće, i najpoželjnije od 75% ili veće, u nivou. Termin "inhibira" ili slične fraze uključuju kompletnu ili suštinski kompletnu inhibiciju, tj. smanjenje na nulu ili suštinski na nulu.

[0209] Termini kao što su "povećati" ili "poboljšati" poželjno se odnose na povećanje ili poboljšanje od oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%.

[0210] Agensi, kompozicije i postupci opisani ovde mogu se koristiti za lečenje subjekta sa bolešću, npr., bolesti karakterisanom prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju antigen i prikazuju peptid antigena. Primeri bolesti koje se mogu tretirati i/ili sprečiti obuhvataju sve bolesti koje eksprimiraju jedan od antigena opisanih ovde. Naročito poželjne bolesti su virusne bolesti kao što je hCMV infekcija i maligne bolesti.

[0211] Agensi, kompozicije i postupci ovde opisani mogu se takođe korisitti za imunizaciju ili vakcinaciju da bi se sprečila bolest opisana ovde.

[0212] Prema pronalasku, termin "bolest" odnosi se na bilo koje patološko stanje, uključujući virusne infekcije i maligne bolesti, naročito one oblike virusnih infekcija i malignih bolesti opisanih ovde.

[0213] Termini "normalno tkivo" ili "normalni uslovi" odnose se na zdravo tkivo ili uslovi kod zdravog subjekta, tj., nepatološke uslove, gde "zdravo" poželjno označava nevirusno inficirane ili nekancerozne.

[0214] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen" označava prema pronalasku da je ekspresija antigena u ćelijama obolelog tkiva ili organa poželno povećana u odnosu na stanje u zdravom tkivu ili organu. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili još veće. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je nađena samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta. Prema pronalasku, bolesti koje uključuju ili koje su povezane sa ćelijama koje eksprimiraju antigen uključuju virusne infekcije i maligne bolesti, naročito one oblike virusnih infekcija i malignuh bolesti opisane ovde.

[0215] Malignost je tendencija medicinskog stanja, naročito tumora, da postane progresivno gore i da potencijalno rezultuje smrću. Karakterisano je osobinama anaplazije, invazivnosti i metastaze. Maligno je odgovarajući pridevski medicinski termin korišćen da se opiše teška i progresivno pogoršavajuća bolest. Termin "maligna bolest" kao što je ovde korišćeno poželjno se odnosi na bolest kancera ili tumora. Slično, termin "maligne ćelije" kao što je ovvde korišćeno odnose se na ćelije kancera ili ćelije tumora. Maligni tumor može se razlikovati od nekanceroznog benignog tumora po tome što malignitet nije samo ograničavajući u pogledu sopstvenog rasta, sposoban je da izvrši invaziju u susedna tkiva, i može biti sposoban da se raširi na udaljena tkiva (metastaziranje), dok benigni tumor nema nijednu od ovih karakteristika. Maligni tumor je suštinski sinonim kanceru. Malignitet, maligna neoplazma, i maligni tumor su suštinski sinonimi kancera.

[0216] Prema pronalasku, termin "tumor" ili "tumorska bolest" odnosi se na otok li leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (nazvane neoplastične ćelije ili ćelije tumora). Pod "ćelijom tumora" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste rapidnom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon stimulusa koji je inicirao zaustavljanje novog rasta. Tumori pokazuju delimični ili kompletni nedostatk strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično formiraju zasebnu masu tkiva, koja može biti ili benigna, pre-mailgna ili maligna.

[0217] Benigni tumor je tumor kome nedostaju sve tri maligne osobine kancera. Stoga, po definiciji, benigni tumor ne raste na neograničeni, agresivni način, ne vrši invaziju okolnih tkiva, i ne širi se na ne-susedna tkiva (metastazira). Uobičajeni primeri benignih tumora uključuju mladeže i fibroide materice.

[0218] Termin "benigni" implicira blagu i neprogresivnu bolest, i zaista, monoge vrste benignih tumora su bezopasni po zdravlje. Međutim, neke neoplazme koje su definisane kao "benigni tumori" jer im nedostaju invazivne osobine kancera, i dalje mogu proizvesti negativne efekte po zdravlje. Primeri uključuju tumore koji proizvode "efekat mase" (kompresija vitalnih organa kao što su krvni sudovi), ili "funkcionalni" tumori endokrinog tkiva, koji mogu prekomerno proizvoditi određene hormone (primeri uključuju tireoidne adenome, adrenokortikalne adenom, i adenome hipofize).

[0219] Benigni tumori su tipično okruženi spoljnom površinom koja sprečava njihovu sposobnost da se ponašaju na maligni način. U nekim slučajevima, određeni "benigni" tumori mogu kasnije dovesti do malignih kancera, što rezultuje iz dodatnih genetskih promena u subpopulaciji neoplastičnih ćelija tumora. Istaknuti primer ovog fenomena je tubularni adenom, uobičajeni tip polipa debelog creva koji je važan prekursor kancera debelog creva. Ćelije kod tubularnog adenom, kao većina tumora koji često prerastu u kancer, pokazuju određene abnormalnosti sazrevanja ćelija i izgleda koje su kolektivno poznate kao displazija. Ove ćelijske abnormalnosti nisu uočene kod benignih tumora koji retko ili nikada ne postanu kancerozni, ali je uočeno u drugim pre-kanceroznim abnormalnostima tkiva koje ne formiraju diskretne mase, kao što su pre-kancerozne lezije grlića materice. Neki od autoriteta radije označavaju displastične tumore kao "premaligne", i rezervišu termin "benigni" za tumore koji retko ili nikada ne dovode do kancera.

[0220] Neoplazma je abnormalna masa tkiva koja je rezultat neoplazije. Neoplazija (novi rast na grčkom) je abnormalna proliferacija ćelija. Rast ćelija premašuje, i nije koordinisan sa onim kod normalnih okolnih tkiva. Rast traje na isti prekomerni način čak i nakon prestanka stimulusa. Obično izaziva izraslinu ili tumor. Neoplazme mogu biti benigne, pre-maligne ili maligne.

[0221] "Rast tumor" ili "tumorski rast" prema pronalasku se odnosi na tendenciju tumora da poveća svoju veličinu i/ili na tendenciju tumorskih ćelija da proliferišu.

[0222] Poželjno, "maligna bolest" prema pronalasku je kancerska bolest ili tumorska bolest, i maligna ćelija je ćelija kancera ili ćelija tumora. Poželjno, "maligna bolest" je karakterisana ćelijama koje eksprimiraju tumorpovezani antigen kao što je NY-ESO-1, TPTE ili PLAC1.

[0223] Kancer (medicinski termin: maligna neoplazma) je klasa bolesti kod kojih grupa ćelija prikazuje nekontrolisani rast (deobe preko normalnih granica), invaziju (ulazak i uništavanje susednih tkiva), i nekada metastazu (širenje na druge lokacije u telu preko limfe ili krvi). Ove tri malgne osobine kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su samo-ograničavajući, i ne vrše invaziju ili metastaziraju. Većina kancera formira tumor ali neki ne, kao leukemija.

[0224] Kanceri su klasifikovani po tipu ćelija na koji podseća tumor i, stoga, tkivo za koje se pretpostavlja da je poreklo tumora. To su histologija i lokacija, respektivno.

[0225] Termin "kancer" prema pronalasku sadrži leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, rektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer nadbubrega, tiroidni kancer, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, kancer grlića materice, kancer creva, kancer jetre, kancer debelog creva, kancer želudca, kancer creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnog čvora, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, nosa i grla (ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, kancer jajnika i kancer pluća i njihove metastaze. Njihovi primeri su karcinomi pluća, karcinomi dojke, karcinomi prostate, karcinomi debelog creva, karcinomi bubrežnih ćelija, karcinomi grlića materice, ili metastaze tipova kancera ili tumora prethodno opisanih. Termin kancer prema pronalasku takođe obuhvata metastaze kancera.

[0226] Glavni tipovi kancera pluća su sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC) i nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC). Postoji tri glavna podtipa nesitnoćelijskog karcinoma pluća: karcinom pluća sa skvamoznim ćelijama, adenokarcinom, i krupnoćelijski karcinom pluća. Adenokarcinom čini oko 10% kancera pluća. Ovaj kancer se obično uočava periferno u plućima, nasuprot sitnoćelijskom kanceru pluća i kanceru pluća sa skvamoznim ćelijama, koji teže da budu locirani više centralno.

[0227] Kancer kože je malični rast na koži. Najčešći kanceri kože su kancer bazalnih ćelija, kancer skvamoznih ćelija, i melanom. Maligni melanom je ozbiljan tip kancera kože. Nastaje usled nekontrolisanog rasta pigmentnih ćelija, nazvanih melanocite.

[0228] Prema pronalasku, "karcinom" je maligni tumor izveden iz epitelnih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i debelog creva.

[0229] "Bronhiolo-alveolarni karcinom" je karcinom pluća, za koji se smatra da je izveden iz epitela terminalnih bronhiola, kod kojeg se neoplastično tkivo pruža duž zidova alveola i raste u malim masama unutar alveola. Može se pokazati mucin u nekim ćelijama i u materijalu u alveolama, koji takođe uključuje gole ćelije.

[0230] "Adenokarcinom" je kancer sa poreklom od žlezdanog tkiva. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznatog kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i mnoštvo drugih tkiva koje oivičava šupljine i organe tela. Epitel je embrionalno izveden iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi bile klasifikovane kao adenokarcinom, ćelije ne moraju biti deo žlezde, sve dok imaju sekretorne osobine. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi imaju tendenciju da podsećaju na žlezdano tkivo iz kojeg su izvedeni, dok slabo diferencirani ne moraju. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinom se može pojaviti u mnogim tkivima tela usled sveprisutne prirode žlezda unutar tela. Iako svaka žlezda ne mora izlučivati istu supstancu, dok postoji egzokrina funkcija ćelije, smatra se žlezdanom i njen maligni oblik se stoga naziva adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju drugih tkiva i često metastaziraju ukoliko im se dozvoli dovoljno vremena. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. Uključuje serozne i mukozne adenokarcinome, adenokarcinom sa bistrim ćelijama i endometrijalni adenokarcinom.

[0231] Karcinom ćelija bubrega takođe poznat kao kancer ćelija bubrega ili adenokarcinom ćelija bubrega je kancer bubrega sa poreklom u omotaču proksimalne savijene tubule, veoma malih tubula u bubregu koji filtriraju krv i uklanjaju otpadne proizvode. Karcinom ćelija bubrega je ubedljivo najčešći tip kancera bubrega kod odraslih i najsmrtonosniji od svih genitourinarnih tumora. Distinktni podtipovi karcinoma ćelija bubrega su karcinom ćelija bubrega sa bistrim ćelijama i papilarni karcinom ćelija bubrega. Karcinom ćelija bubrega sa bistrim ćelijama je najčešći oblik karcinoma ćelija bubrega. Pod mikroskopom, ćelije koje čine karcinom ćelija bubrega sa bistrim ćelijama izgledaju veoma bledo ili bistro. Papilarni karcinom ćelija bubrega je drugi najčešći podtip. Ovi kanceri formiraju izrašteje nalik na mali prst (nazvani papile) kod nekih, ako ne svih, tumora.

[0232] Limfom i leukemija su maligniteti izvedeni iz hematopoetskih (koje formiraju krv) ćelija.

[0233] Blastni tumor ili blastom je tumor (obično maligni) koji podseča na nezrelo ili embrionalno tkivo. Mnogi od ovih tumora su najčešći kod dece.

[0234] Pod "metastazom" podrazumeva se širenje ćelija kancera sa mesta porekla do drugog dela tela. Formiranje metastaza je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstraceularnog matriksa, penetracije endotelne bazalne membrane da bi se ušlo u telesne šupljine i sudove, i zatim, nakon transportovanja krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora, tj. sekundarnog tumora ili metastaznog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora se često dešava čak i nakon uklanjanja primarnog tumora jer ćečije tumora ili komponente mogu ostati i razviti metastazni potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema pronalasku odnosi se na "udaljene metastaze" koje se odnose na metastaze koje su udaljene od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnog čvora.

[0235] Ćelije sekundarnog ili metastaznog tumora su iste kao u originalnom tumoru. To znači, na primer, da, ukoliko kancer jajnika metastazira u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od abnormalnih ćelija jajnika, ne od abnormalnih ćelija jetre. Tumor u jetri se zatim naziva metastazirani kancer jajnika, ne kancer jetre.

[0236] Kod kancera jajnika, metastaza se može javiti na sleeće načine: direktnim kontaktom ili širenjem, može izvršiti invaziju bliskih tkiva ili organa lociranih blizu ili oko jajnika, kao što su jajovodi, materica, bešika, rektum, itd.; sejanjem ili odbacivanjem u abdominalnu šupljinu, što je najčešći način na koji se širi kancer jajnika. Ćelije kancera probijaju zid ovarijalne mase i "upadaju" u druge strukture u abdomenu kao što su jetra, želudac, debelo crevo ili dijafragma; izlaskom iz ovarijane mase, invazijom limfnih sudova i zatim putovanjem u druge delove tela ili udaljene organe kao što su pluća ili jetra; izlaskom iz ovarijane mase, invazijom krvnog sistema i putovanjem do drugih delova tela ili udaljenih organa.

[0237] Prema pronalasku, metastazni kancer jajnika uključuje kancer jajovoda, kancer organa abdomena kao što je kancer u crevima, kancer u materici, kancer u bešici, kancer u rektumu, kancer u jetri, kancer u želudcu, kancer u debelom crevu, kancer u dijafragmi, kancer u plućima, kancer u ovojnici abdomena ili karlice (peritoneum), i kancer u mozgu. Slično tome, metastazni kancer pluća odnosi se na kancer koji se proširio od pluća u udaljena i/ili nekoliko mesta u telu i uključuje kancer u jetri, kancer u nadbubrežnim žlezdama, kancer u kostima, i kancer u mozgu.

[0238] Relaps ili ponovna pojava dešava se kada je osoba ponovo pogođena stanjem koje je imala u prošlosti. Na primer, ukoliko je pacinet bolovao od tumorske bolesti, primio uspešan tretman za pomenutu bolest i ponovo razvio pomenutu bolest pomenuta novo razvijena bolest može se smatrati relapsom ili ponovnim pojavljivanjem. Međutim, prema pronalasku, relaps ili ponovna pojava tumorske bolesti može se ali se ne mora obavezno desiti na mestu

originalne tumorske bolesti. Stoga, na primer, ukoliko je pacijent bolovao od tumora jajnika i primio uspešan tretman relaps ili ponovno pojavljivanje može biti pojava tumora jajnika ili pjava tumora na mestu različitom od jajnika. Relaps ili ponovno pojavljivanje tumora takođe uključuje situacije gde se tumor javlja na mestu različitom od mesta originalnog tumora as kao i na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor za koji je pacijent primio tretman je primarni tumor i tumor na mestu različitom od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastazni tumor.

[0239] Pod "tretiranjem" podrazumeva se primena jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano na subjekta da bi se sprečila ili eliminisala bolest, uključujući smanjenje veličine tumra ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanje ili usporavanje bolesti kod subjekta; inhibicija ili usporavanje razvoja nove bolesti kod subekta; smanjenje učestalosti ili težine simptoma i/ili ponovnog pojavljivanja kod subjekta koji trenutno ima ili koji je prethodno imao bolest; i/ili produžavanje, tj. povećanje dužine života subjekta.

[0240] Naročito, termin "tretiranje bolesti" uključuje lečenje, smanjenje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiciju progresije ili pogoršanja, ili psrečavanje ili odlaganje pojave bolesti ili njenih simptoma.

[0241] Pod "biti u riziku" podrazumeva se da je subjekat, tj. pacijent, koji je identifikovan da ima veću od normalne šanse da razvije bolest, naročito kancer, u poređenju sa opštom populacijom. Dodatno, subjekat koji je imao, ili koji trenutno ima, bolest, naročito kancer je subjekat koji ima povećani rizik za razvoj bolesti, jer takav subjekat može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju, ili koji su imali, kancer takođe imaju povećan rizik za metastaze kancera.

[0242] Termin "imunoterapija" se odnosi na tretman koji uključuje specifičnu imunu reakciju. U kontekstu predmetnog pronalaska, termini kao što su "zaštita", "sprečavanje", "profilaksa", "preventivno", ili "zaštitno" odnose se na prevenciju ili tretman ili oba za pojavu bolesti i/ili propagaciju bolesti kod subjekta i, naročito, na minimizovanje šanse da će subjekat razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba koja je u riziku od tumora, kao što je prethodno opisano, bila bi kandidat za terapiju za sprečavanje tumora.

[0243] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena kompozicije opisane ovde, poželjno štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapeutska primena imunoterapije, na primer, terapeutksa primena kompozicije opisane ovde, može dovesti do inhibicije napredovanja/rasta bolesti. Ovo obuhvata usporenje napredovanja/rasta bolesti, naročito remećenje napredovanja bolesti, što poželjno vodi eliminaciji bolesti.

[0244] Imunoterapija se može izvesti korišćenjem bilo koje od mnoštva tehnika, u kojima ovde obezbeđeni agens su u funkciji uklanjanja antigen-prikazujućih ćelija iz pacijenta. Takvo uklanjanje se može odigrati kao rezultat poboljšanja ili indukcije imunog odgovora kod pacijenta specifičnog za antigen ili ćeliju koja eksprimira antigen.

[0245] Unutar određenih primera izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, u kojoj se tretman zasniva na in vivo stimulaciji endogenog imunog sistema domaćina da reaguje protiv bolesnih ćelija sa primenom agenasa koji modifikuju imuni odgovor (kao što su peptidi i nukleinske kiseline kao što je ovde opisano).

[0246] Unutar drugih primera izvođenja, imunoterapija može biti pasivna imunoterapija, kod koje tretman uključuje dopremanje agenasa sa ustanovljenom tumor-imunom reaktivnošću (kao što su efektorne ćelije) koji mogu direktno ili indirektno posredovati u antitumorskim efektima i ne zavise obavezno od intaktnog imunog sistema domaćina. Primeri efektornih ćelija uključuju T limfocite (kao što su CD8+ citotoksični T limfociti i CD4+ T-helper limfociti), i antigen-prikazujuće ćelije (kao što su dendritske ćelije i makrofage). T ćelijski receptori specifični za peptide navedene ovde mogu se klonirati, eksprimirati i preneti u druge efektorske ćelije za adoptivnu imunoterapiju.

[0247] Kao što je prethodno navedeno, imunoreaktivni peptidi kao što je ovde opiano mogu biti korišćeni da rapidno prošire antigen-specifične T ćelijske kulture da bi se stvorio dovoljan brpj ćelija a imunoterapiju. Naročito, antigen-prikazujuće ćelije, kao što su dendritske ćelije, makrofage, monocite, fibroblasti i/ili B ćelije, mogu se pulsirati sa imunoreaktivnim peptidima ili transfcirane sa jednom ili više nukleinskih kiselina korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u tehnici. Kultivisane efektorne ćelije za upotrebu u terapiji moraju biti sposobne da rastu i da se distribuiraju brzo, i da prežive u dužem roku in vivo. Studije su pokazale da kultivisane efektorne ćelije mogu biti indukovane da rastu in vivo i da preživljavaju u dužem roku u značajnom broju ponovljenom stimulacijom sa antigen sa dodatkom IL-2 (videti, na primer, Cheever et al. (1997), Immunological Reviews 157, 177.

[0248] Alternativno, nukelinska kiselina koja eksprimira peptid naveden ovde može se introdukovati u antigenprikazujuće ćelije uzete od pacijenta i klonalno propagirane ex vivo za transplantaciju nazad u istog pacijenta.

[0249] Transficirane ćelije mogu biti reintrodukovane u pacijenta korišćenjem bilo kojih načina poznatih u tehnici, poželjno u sterilnom obliku sa intravenskom, intrakavitarnom, intraperitonealnom ili intratumorskom primenom.

[0250] Ovde opisani postupci mogu uključivati primenu autolognih T ćelina koje su aktivirane kao odgovor na peptid ili antigen prikazujuću ćeliju koja eksprimira peptid. Takve T ćelije mogu biti CD4+ i/ili CD8+, i mogu se proliferisati kao što je prethodno opisano. T ćelije se mogu primeniti na subjekta u količini efikasnoj da inhibira razvoj bolesti.

[0251] Agensi i kompozicije opisani ovde mogu se koristiti zasebno ili u kombinaciji sa konvencionalnim režimima kao što je hirurški zahvat, zračenje, hemoterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).

[0252] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuje proces tretiranja subjekta sa svrhom indukcije imunog odgovora iz terapeutskih ili profilaktičkih razloga.

[0253] Termin "in vivo" odnosi se na situaciju u subjektu.

[0254] Termini "subjekat", "individua", "organizam" ili "pacijent" korišćeni su naizmenično i odnose se na kičmenjake, poželjno sisare. Na primer, sisari u kontekstu predmetnog pronalaska su ljudi, ne-humani primati, domaće životinje kao što su psi, mačke, ovce stoka, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd. Kao i životinje u zarobljeništvu kao što su životinje u zoološkim vrtovima. Termin "životinja" kao što je ovde korišćen takođe uključuje ljude. Termin "subjekat" može takođe uključiti pacijenta, tj., životinju, poželjno čoveka sa bolešću, poželjno sa bolešću kao što je ovde opisano.

[0255] Termin "autologni" je kjorišćen da se opiše bilo šta što je izvedeno iz istog subjekta. Na primer, "autologni transplant" odnosi se na transplant tkiva ili organa izvedenih iz istog subjekta. Takve procedure predstavljaju prednost jer prevazilaze imunološku barijeru koja inače rezultuje u odbacivanju.

[0256] Termin "heterologni" je korišćen da se opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Kao primer, transfer kostne srži iz jedne individue u različitu individuu čini heterologni transplant. Heterologni gen je gen izveden iz izvora raztličitog od subjekta.

[0257] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinaciju, poželjno jedan ili više agenasa kao što je ovde opisano je primenjeno zajedno sa jednim ili više ađuvansa za indukovanje imunog odgovora ili za povećanje imunog odgovora. Termin "ađuvans" odnosi se na jedinjenja koja prolongiraju ili poboljšavaju ili ubrzavaju imuni odgovor. Kompozicija opisana ovde poželjn oizvodi svoj efekat bez dodavanja ađuvanasa. Ipak, kompozicija ovde opisana može sadržati bilo koji poznati ađuvans. Ađuvansi čine heterogenu grupu jedinjenja kao što su uljane emulzije (npr., Freund-ov ađuvans), mineralna jedinjenja (kao što je stipsa), bakterijske proizvode (kao što je toksin Bordetella pertussis), lipozome, i imuno-stimulatorne komplekse. Primeri ađuvanasa su monofosforil-lipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponini kao što je QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, and QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), nekompletni Freund-ov ađuvans, kompletni Freund-ov ađuvans, vitamin E, montanid, stipsa, CpG oligonukleotidi (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), i različite voda-u-ulju emulzije koje su pripremljene iz biološki razgradivih ulja kao što je skvalen i/ili tokoferol.

[0258] Prema pronalasku, "uzorak" može biti bilo koji uzorak koristan prema predmetnom pronalasku, naročito biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti, i/ili uzorak ćelija i može se dobiti na konvencionalni način kao što je biopsijom tkiva, uključujući biopsiju ubodom, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, pljuvačke, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti. Prema pronalasku, termin "uzorak" takođe uključuje obrađene uzorke kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. nukelinska kiselina i izolati peptida/proteina.

[0259] Mogu se takođe primeniti druge supstance koje stimulišu imuni odgovor pacijenta. Moguće je, na primer, koristiti citokine za vakcinaciju, usled njihovih regulatornih osobina prema limfocitima. Takvi citokini sadrže, na primer, interleukin-12 (IL-12) za koji je pokazano da povećava zaštitne aktivnosti vakcine (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF and IL-18.

[0260] Postoji više jedinjenja koja poboljšavaju imuni odgovor i koja se stoga mogu koristiti za vakcinaciju. Pomenuta jedinjenja sadrže ko-stimulišuće molekule obezbeđene u obliku proteina ili nukleinskih kiselina kao što su B7-1 i B7-2 (CD80 i CD86, respektivno).

[0261] Terapeutski aktivni agensi opisani ivde mogu se primeniti preko bilo kojeg konvencionalnog načina, uključujući injekciju ili infuziju. Primena se može izvesti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, potkožno ili transdermalno.

[0262] Ovde opisani agensi primenjeni su u efikasnim količinama. "Efikasna količina" odnosi se na količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat zasebno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo obuhvata usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, remećenje ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja može takođe biti odlaganje pojave ili prevencija pojave pomenute bolesti ili pomenutog stanja.

[0263] Efikasna količina agensa opisana ovde zavisiće od stanja koje se tretira, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje tretmana, tip prateće terapije (ukoliko je prisutna), specifičnog puta primene i sličnih faktora. Shodno tome, primenjene doze agenasa opisanih ovde mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa inicijalnom dozom, mogu se koristiti veće doze (ili efikasno veće doze postignute različitim, lokalizovanijim putem primene).

[0264] Ovde opisane farmaceutske kompozicije su poželjno sterilen i sadrže efikasnu količinu terapeutski aktivne supstance da bi se stvorila željena reakcija ili željeni efekat.

[0265] Ovde opisane farmaceutske kompozicije se generalno primenjeuju u farmaceutski kompatibilnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Termin "farmaceutski kompatibilan" odnosi se na netoksični materijal koji ne onteraguje sa aktivnošću aktivne komponente farmaceutske kompozicije. Preparati ovog tipa mogu obično sadržati soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, suplementne imuno-pojačivačke supstance kao što su ađuvansi, npr. CpG oligonukleotidi, citokini, hemokini, saponin, GM-CSF i/ili RNK i, gde je pogodno, druga terapeutski aktivna jedinjenja. Kada su korišćene u medicini, soli treba da budu farmaceutski prihvatljive. Međutim, soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se koristiti za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli i uključene su. Farmakološki i farmaceutski komptibilne soli ovog tipa sadrže na neograničavajući način one pripremljene iz sledećih kiselina: hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, azotna, fosforna, maleinska, sirćetna, salicilna, limunska, mravlja, malonska, ćilibarna kiselina, i slično. Farmaceutski kompatibilne soli se takođe mogu pripremiti kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala kao što su soli natrijuma, soli kalijuma ili kalcijuma.

[0266] Farmaceutska kompozicija opisana ovde može sadržati farmaceutski kompatibilan nosač. Termin "nosač" odnosis se na organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili vištačku, u ojoj je aktivna komponenta kombinovan da bi se olakšala primena. Termin "farmaceutski kompatibilan nosač" kao što je ovde korišćeno uključuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili supstanci za inkapsulaciju, koji su pogodni za primenu na pacijenta. Komponente farmaceutske kompozicije opisane ovde su obično takve da se ne dešava nikakava interakcija koja značajno umanjuje željenu farmaceutsku efikasnost.

[0267] Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu sadržati pogodne puferske supstance kao što je sirćetna kiselina u soli, limunska kiselina u soli, borna kiselina u soli i fosforna kiselina u soli.

[0268] Farmaceutske kompozcije mogu, gde je pogodno, takođe sadržati pogodne konzervanse kao što je benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0269] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u uniformnom doznom obliku i mogu biti pripremljene na način poznat per se. Farmaceutske kompozicije kao što su ovde opisane mogu biti u obliku kapsula, Tabelata, lozengi, rastvora, suspenzija, sirupa, eliksira ili u obliku emulzije, na primer.

[0270] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže strerilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koje je poželjno izotonično sa krvlju recipijenta. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringer rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, obično sterilna, neisparljiva ulja korišćena su kao medijum za rastvor ili suspenziju.

SLIKE

[0271]

Slika 1: Prikaz TCR-CD3 kompleksa. Intracitoplazmatski CD3 imunoreceptor tirozin-zasnovani aktivacioni motivi (ITAMs) označeni su kao cilindri (prilagođeno prema "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).

Slika 2. Tehnološka platforma za TCR izolaciju/validaciju. Pristup integriše sve korake od izolacije antigenspecifičnih T ćelija (vrh) do TCR klomniranja (sredina) i TCR validacije (dno). Izvršen je skrining pacijenata za odgovore autoantitela protiv antigena od interesa sa CrELISA (Crude lysate Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Antigen-specifične T ćelije od seropozitivnih donora stimulisane su sa peptidom ili RNK napunjenim autolognim DCs i CD8+ ili CD4+ T ćelije koje izlučuju IFNγ izolovane su protočnom citometrijom (vrh). Pojedinačne ćelije su sakupljene u višekomorne ploče i podvrgnute cDNK sinetzi prema prvom lancu i obogaćivanje globalnim korakom PCR amplifikacije. TCR α/β varijabiln i regioni su klonirani u vektore za in vitro transkripciju (IVT) koji sadrže kasete konstantnog regiona (sredina). TCR α/β lanci RNKs su preneti u CD4+ ili CD8+ T ćelije, kokultivisane sa APCs koje eksprimiraju odgovarajući antigen i HLA molekule i testirane su u odnosu na funkcionalno reprogramiranje inženjeringom dobijenih T ćelija (dno).

Slika 3. Protočno citometrijsko sortiranje pp65-specifičnih CD8+ T ćelija iz CMV-seropozitvnog donora nakon jedne nedelje ekspanzije. CD8+ T ćelije koje izlučuju IFNg izolovane su nakon ponovne imunizacije sa autolognim pp65 RNKtransficiranim iDCs. Kontrola: iDCs transficirane sa eGFP RNK.

Slika 4. Verifikacija površinske ekspresije TCR na TCR-transficiranim SupT1 ćelijama anlaiziranim sa protočnom citometrijom.

SupT1 ćelije elektroporisane sa RNKs za TCR α/β lanac obojene su sa pan TCR antitela i analizirani sa protočnom citometrijom. SupT1 ćelije elektroporisane bez RNK služile su kao negativna kontrola.

Slika 5. Testiranje specifičnosti TCRs dobijenih od CMV-pp65-specifičnih CD8+ T ćelija CMV seropozitivnog donora nakon in vitro ekspanzije sa IFNγ-ELISPOT. TCR-inženjeringom dobijene IVSB ćelije su testirane na antigen-napunjenim autolognim iDCs i K562-A*0201 ćelijama za specifično prepoznavanje pp65 peptidnog pula, pp65495-503 ili pp65 IVT RNK. Delimično preklapajući peptidi izvedeni iz TPTE korišćeni su kao kontrolni peptidni pul i SSX-2241-249 je korišćen kao kontrola pojedinačnog peptida. Tirozinaza izvedeni Tyr368-376 epitop je primenjen kao pozitivna kontrola. Kontrola TCR: TCR klonirana iz CMV seronegativnog donora.

Slika 6. Određivanje HLA restrikcije i specifičnosti peptida TCRCD8-CMV#1 sa IFNγ-ELISPOT.

TCRtransgene IVSB ćelije su analizirane za prepoznavanje K562 ćeilja koje eksprimiraju izabrane HLA klasa I alele donora pulsiranog sa pp65 preklapajućim peptidima ili bez antigena kao kontrola. K562-B*3501 ćelije su nakon toga korišćene za analizu TCRCD8-CMV#1-posredovanog prepoznavanja individualnih 15-mernih peptida izvedenih iz CMV-pp65.

Slika 7. testiranje specifičnosti TCRs kloniranih iz ex vivo izolovanih CMV-pp65-specifičnih CD8+ T ćelija od CMV seropozitivnog donora sa IFNγ-ELISPOT. IVSB ćelije su transficirane sa RNKs TCR α/β lancem i stimulisane sa K562-A*0201 pulsiranim sa pp65495-503. Nesrodni peptid SSX-2241-249 i TCR kloniran iz CMV-seronegativnog donora služili su kao negativna, tirozinaza izvedeni Tyr368-376 epitop služio je kao pozitivna kontrola.

Slika 8. Specifično ubijanje ciljnih ćelija sa TCR-transficiranim T ćelijama analiziranim sa testom citotoksičnosti sa luciferazom.

Peptid-pulsirane K562 ciljne ćelije koje eksprimiraju odgovarajući HLA alelotip korišćene su kao ciljne za IVSB ćelije dobijene inženjeringom sa CMV-pp65-specifičnim TCRs. Kao referenca, analizirano je ubijanje Tyr368-376-pulsiranih ciljnih ćelija posredovano sa endogenim receptorom. TCR dobijen od CMV seronegativnog donora korišćen je kao kontrola da se isključi nespecifična liza. E:T: efektor-prema-target odnos.

Slika 9. Testiranje specifičnosti TCRs izolovanih iz NY-ESO-1-specifičnih CD8+ T ćelija sa IFNγ-ELISPOT.

TCRCD8-NY#2 i -#5 su transficirane u IVSB ćelije i testirane su u odnosu na prepoznavanje autolognih iDCs napunjenih sa NY-ESO-1 RNK ili peptidnim pulom. Negativne kontrole: iDCs pulsirane sa TPTE peptidnim pulom; kontrolni TCR izolovan iz zdravog donora. Pozitivna kontrola: Tyr368-376-pulsirane K562-A*0201.

Slika 10. Identifikacija HLA restriktivnih elemenata za NY-ESO-1-specifične TCRs sa IFNγ-ELISPOT.

TCRinženjeringom dobijene IVSB ćelije su analizirane sa IFNg-ELISPOT za prepoznavanje K562 ćelija transficiranih sa individualnim HLA klasa I alelima donora i pulsirani sa NY-ESO-1 peptidnim pulom. Negativne kontrole: HIV-gag peptidni pul; K562 elektroporisan bez HLA RNK (lažna proba). Pozitivna kontrola: Tyr368-376 peptid.

Slika 11: Identifikacija 15mernih peptida prepoznatih sa NY-ESO-1-specifičnim TCRs sa IFNγ-ELISPOT.

TCRtransficirane IVSB T ćelije su analizirane u odnosu na prepoznavanje K562 ćelija koje eksprimiraju odgovarajuće HLA klasa I alele i pulsirane sa individualnim delimično preklapajućim 15-merima izvedenim iz NY-ESO-1.

Slika 12. Mapiranje epitopa za NY-ESO-1-specifične TCRs sa IFNγ-ELISPOT. IVSB ćelije transficirane sa TCRCD8-NY#5, #6, #8 ili #15 su analizirane u odnosu na prepoznavanje K562-B*3508 ćelija pulsiranih sa individualnim noamernim peptidima koje pokrivaju aminokiseline 77-107 NY-ESO-1 proteina.

Slika 13. Specifično ubijanje ciljnih ćelija posredovano sa TCRCD8-NY#2 anlizirano sa testom citotoksičnosti sa luciferazom.

Specifična liza K562-A*6801 ćelija pulsiranih sa NY-ESO-1 peptidnim pulom sa TCRCD8-NY#2-transficiranim IVSB ćelijama je analizirana korišćenjem različitih efektor-prema-target odnosa (E:T). Kontrola: ciljne ćelije pulsirane sa TPTE peptidnim pulom.

Slika 14: Određivanje HLA restrikcionih elemenata za NY-ESO-1-specifične TCRs dobijene od CD4+ T ćelija sa IFNγ-ELISPOT. TCR-transfcirane CD4+ T ćelije su analizirane za prepoznavanje K562 koje eksprimiraju individualne HLA klasa II alele pacijenat pulsirane sa peptidnimpulovima ili NY-ESO-1 ili HIV-gag kao negativna kontrola.

Slika 15. Mapiranje epitopa za TCRCD4-NY#5 sa IFNγ-ELISPOT. TCR-inženjeringom dobijene CD4+ T ćelije su testirane za prepoznavanje K562 ćelija koje eksprimiraju odgovarajuće HLA klasa II alel i pulsirane sa delimično preklapajućim 15-merima koji predstavljaju NY-ESO-1 protein.

Slika 16. Određivanje HLA restrikcije i peptidne specifičnosti TCRCD8-TPT#3 sa IFNγ-ELISPOT.

TCRtransficirane IVSB ćelije su analizirane za prepoznavanje K562 ćelija koje eksprimiraju HLA klasa I molekule pacijenta pulsirane sa TPTE peptidnim pulom (vrh). K562-B*3501 ćelije pulsirane sa individualnim 15merom koji predstavlja ceo antigen (sredina) i 9-merne peptide koji pokrivaju aminokiseline 521-535 TPTE (dno) korišćeni su sa se definiše epitop prepoznat od strane TCRCD8-TPT#3. Aminokiseline sidra prepoznatog epitopa za vezivanje za HLA B*3501 prikazane su u boldu.

Slika 17. Određivanje HLA restrikcionih elemenata za TPTE-specifične TCRs izolovane iz CD4+ T ćelija sa IFNy-ELISPOT.

TCR-transficirane CD4+ T ćelije su analizirane u odnosu na prepoznavanje K562 ćelija transficiranih sa HLA klasa II alela pacijenta i pulsirane sa preklapajućim peptidima koji odgovaraju TPTE ili HIV-gag kao kontroli. Slika 18. Mapiranje epitopa TPTE-specifičnih TCRs izolovanih iz CD4+ T ćelija sa IFNγ-ELISPOT.

Lokacije epitopa TCRs određene su korišćenjem TCR-transficiranih CD4+ T ćelija u kombinaciji sa K562 ćelijama transficiranim sa odgovarajućom HLA klasa II antigenom i pulsirane sa individualnim delimično preklapajućim 15-mernim peptidima koji pokrivaju TPTE protein.

Slika 19. Protočno citometrijsko sortiranje PLAC1-specifičnih CD8+ T ćelija dobijenih iz imunizovanih miševa. Ćelije slezine PLAC1-imunizovanih HLA A*0201-transgenih miševa (A2.1/DR1 miševi) su pulsirani sa preklapajućim peptidima koji odgovaraju PLAC1 ili kontrolnim antigenom (WT1). 24 č kasnije ćelije su sakupljene, obojene sa fluorohrom konjugovanim antitelima i CD3+/CD8+/CD137+ ćelije su izolovane. Histogrami su iscrtani prema CD3+/CD8+ ćelijama. M1-5: PLAC1-imunizovani miševi; Kontrola 1-3: kontrolni miševi.

Slika 20. Testiranje specifičnosti TCRs kloniranih iz CD8+ T ćelija PLAC1-imunizovanih miševa sa IFNγ-ELISPOT.

TCR-inženjeringom dobijene IVSB ćelije su testirane za prepoznavanje K562-A*0201 ćelija pulsiranih sa preklapajućim peptidima koji odgovaraju PLAC1 ili NY-ESO-1 kao kontrolnom antigenu. Kao pozitivna kontrola, sekrecija IFNγ kao odgovor na Tyr368-376-pulsirane ciljne ćelije.

Slika 21. Određivanje peptidne specifičnosti TCRCD8-Pl#8 sa IFNγ-ELISPOT.

TCR-transficirane CD8+ T ćelije su testirane za specifično preponavanje K562-A*0201 ćelija pulsiranih sa individualnim delimično preklapajućim 15-mernim peptidima koji pokrivaju PLAC1 protein.

Slika 22. Definicija A*0201-ograničenih imunodominantnih epitopa prepoznatih sa PLAC1-specifičnim TCRs sa IFNγ-ELISPOT.

TCR-transficirane IVSB ćelije su analizirane za prepoznavanje K562-A*0201 ćelija pulsiranih sa individualnim 9-mernim peptidima koji pokrivaju aminokiseline 25-43 PLAC1 da bi se definisao epitop prepoznat sa TCRCD8-Pl#11. Prepoznati peptidi su prikazani u boldu. Pozitivna kontrola: PLAC115-merni peptid 7.

PRIMERI

[0272] Ovde korišćene tehnike i postupci su ovde opisani ili izvedeni na način poznat per se i kao što je napisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci uključujući korišćenje kompleta i reagensa izvedeni su u skladu sa informacijama od proizvođača ukoliko nije drugačije naznačeno.

Primer 1: Materijal i metode

Serotipizacija

[0273] ELISA zasnovana na sirovim lizatima bekterija (CrELISA ili Crude Lysate Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) koje eksprimiraju ili NY-ESO-1 pune dužine ili N-terminus TPTE (aminokiseline 1-51) korišćena je prema prethodno opisanom protokolu za određivanje IgG autoantitela (Tureci, O. et al. (2004), J. Immunol. Methods 289, 191-199). CMV-seropozitivnost je analizirana standardnom ELISA detektovanjem poliklonskih CMV-specifičnih IgG odgovora.

Ćelijske linije i reagensi

[0274] Humane ćelijske linije limfoma SupT1 (ATCC br. CRL-1942) il iJurkat76 (Heemskerk, M.H. et al. (2003), Blood 102, 3530-3540), obe bez površinske ekspresije endogenog TCR, ćelijska linija mišjeg embrionalnog fibroblasta NIH3T3 (DSMZ br. ACC 59) i ćelijska linija K562 humane hronične mijeloidne leukemije (Lozzio, C.B. & Lozzio, B.B (1975), Blood 45, 321-334) kultivisaane su pod standardnim uslovima. K562 ćelije prolazno ili stabilno transficirane sa HLA alelotipovima (Britten, C.M. et al. (2002), J. Immunol. Methods 259, 95-110) (označene npr. kao K562-A*0201) korišćene su za testove validacije. Ćelijska linija CCD-1079Sk primarnih humanih ćelija fibroblasta prepucijuma novorođenčeta (ATCC No. CRL-2097) kultivisana je prema uputstvima proizvođača. Monospecifična CTL ćelijska linija IVSB specifična za HLA A*0201 ograničeni tirozinaza-izvedeni epitop Tyr368-376 (Wolfel, T. et al. (1993), Int. J. Cancer 55, 237-244; Wolfel, T. et al. (1994) Eur. J. Immunol.

24, 759-764) kultivisana je u AIM-V medijumu (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) sa 10% humanim AB serumom (Lonza, Basel, Switzerland), 350 IU/ml IL-2 (Richter-Helm BioLogics, Hamburg, Germany), 5 ng/mL IL-7 (PeproTech, Frankfurt, Germany) i 10 ng/ml IL-15 (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany) i stimulisana nedeljno sa zračenim SK29-Mel i AK-EBV ćelijama.

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs), monociti i dendritske ćelije (DCs)

[0275] PBMCs su izolovane sa Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) centrifugiranjem u gradijentu gustine iz leukocitnog sloja ili iz uzoraka krvi. HLA alelotipovi su određeni sa standardnim PCR postupcima. Monociti su obogaćeni sa anti-CD 14 mikrokuglicama (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany). Nezrele DCs (iDCs) su dobijene diferenciranjem monocita 5 dana u medijumu kulture sa dodatkom citokina kao što je opisano u Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.

Peptidi i pulsiranje peptida stimulatorskih ćelija

[0276] Pulovi N- i C-terminalno slobodnih 15-mernih peptida sa 11 aminokiselinskih preklapanja koji odgovaraju sekvencama CMV-pp65, HIV-gag, TPTE, NY-ESO-I ili PLAC1 (označene kao antigen peptidni pul) sintetisane su standardnom hemijom čvrste faze (JPT GmbH, Berlin, Germany) i rastvoreno u DMSO do krajnje koncentracije od 0.5 mg/ml. Nonamerni peptidi su rekonstituisani u PBS 10% DMSO. Za pulsiranje stimulatorne ćelije su inkubirane 1 č na 37 °C u medijumu kulture korišćenjem različitih koncentracija peptida.

Vektori za in vitro transkripciju (IVT) RNK

[0277] Svi konstrukti su varijante prethodno opisanog pST1-sec-insert-2ßgUTR-A(120)-Sap1 plazmida (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017). Da bi se dobili plazmidi koji kodiraju humane TCR lance, cDNK koja kodira TCR-α ili TCR-ß1 i TCR-β2 konstantne regione amplifikovani su iz humanih CD8+ T ćeija i klonirani u ovaj osnovni lanac. Za stvaranje plazmida koji kodiraju mišje TCR lance, cDNKs koja kodira TCR-α, -β1 i -β2 konstantne regione naručeni su od komercijalnog dobavljača i analogno klonirani (GenBank pristupni brojevi M14506, M64239 i X67127, respektivno). Specifični V(D)J PCR proizvodi su introdukovani u takve kasete da bi se dobili TCR lanci pune dužine (označeni kao pST1-humani/mišji-2ßgUTR-A(120)).

[0278] Analogno, individualni HLA klasa I i II aleli klonirani iz PBMCs donora i beta-2-mikroglobulin (B2M) cDNK iz humanih DCs su ubačene u ovaj osnovni lanac (označen kao pST1-HLA klasa I/II-2ßgUTR-A(120) i pST1-B2M-2ßgUTR-A(120)).

[0279] Plazmidi koji kodiraju pp65 antigen CMV (pST1-sec-pp65-MITD-2ßgUTR-A(120)) i NY-ESO-I (pST1-sec-NY-ESO-1-MITD-2ßgUTR-A(120)) vezani za sekretorni signal (sec) i MHC klasa I prometni signal (MITD) opisani su prethodno (Kreiter, S. et al. (2008), J. Immunol. 180, 309-318). PLAC1 koji kodira plazmid pST1-sec-PLAC1-MITD-2ßgUTR-A(120) stvoren je kloniranjem cDNK dobijene od komercijalnog dobavljača (GenBank pristupni broj NM_021796) u Kreiter et al. Osnovni lanac. TPTE koji kodira plazmide pST1-αgUTR-TPTE-2ßgUTR-A(120) i pST1-αgUTR-TPTE-MITD-2ßgUTR-A(120) stvoreni su kloniranjem cDNK dobijene od komercijalnog dobavljača (GenBank pristupni broj AF007118) u varijantu Holtkamp et al. vektora sa dodatnim alfa-globin 5’-netranslatiranim regionom.

[0280] Prajmeri su kupljeni od Operon Biotechnologies, Cologne, Nemačka.

Stvaranje in vitro transkribovanih (IVT) RNK i transfer u ćelije

[0281] Stvaranje IVT RNK je izvedeno kao što je prethodno opisano (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017) i dodata je ćelijama suspendovanim u X-VIVO 15 medijum (Lonza, Basel, Switzerland) u prethodno ohlađenoj 4-mm gap sterilnoj elektroporacionoj kiveti (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany). Elektroporacija je izvedena sa Gene-Pulser-II aparatom (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany) (T ćelije: 450 V/250 mF; IVSB T ćelije: 350 V/200 mF; SupT1 (ATCC No. CRL-1942): 300 V/200 mF; humane DC: 300 V/150 mF; K562: 200 V/300 mF).

In vitro ekspanzija antigen-specifičnih T ćelija

[0282] 2.5x106 PBMCs/komorici je zasejano u 24-komorne ploče, pulsirano sapeptidnim pulom i kultivisano nedelju dana u kompletnom medijumu kulture sa dodatkom 5% AB seruma, 10 U/ml IL-2 i 5 ng/ml IL-7. Za neke eksprerimente CD8+ ili CD4+ T ćelije su prečišćene iz PBMC pozitivnim magnetnim sortiranjem ćelija (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany) i zatim je omogućena ekspanzija kokultivisanjem 2x10<6>efektora sa 3x10<5>autologmnih DCs ili elektroporisanih sa antigen-kodirajućom RNK ili pulsirano sa preklapajćim peptidnim pulom jednu nedelju u kompletnom medijumu sa dodatkom 5% AB seruma, 10 U/ml IL-2, i 5 ng/ml IL-7.

Sortiranje CD8+ ili CD4+ T ćelija specifičnih za pojedinačni antigen nakon testa sa sekrecijom IFNγ

[0283] Protočn citometrijsko sortiranje CD8+ ili CD4+ T ćelija psecifičnih za pojedinačni antigen izvedeno je ili direktno ex vivo iz sveže izolovanih T ćelija ili PBMC ili nakon nedelju dana antigen-specifične ekspanzije.2x10<6>T ćelija ili PBMC stimulisano je sa 3x10<5>autolognih DCs napunjenih sa peptidnim pulom ili transficiranih sa IVT RNK koja kodria respektivni antigen ili kontrolni antigen 4 ili 15 časova u zavisnosti od načina stimulacije. Ćelije su sakupljene, tretirane sa fikoeritrin (PE)-konjugovanim anti-IFNγ antitelom, florescinizotiocijanat (FITC)-konjugovanim anti-CD8 i alofikocijanin (APC)-konjugovanim anti-CD4 antitelom prema test kompletu za sekreciju IFNγ (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany). Sortiranje je izvedeno na BD FACS Aria protočnom citometru (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Ćelije dvostruko pozitivne na IFNγ i CD8 ili CD4 su sortirane i jedna ćelija po komorici je sakupljena u 96-komornoj ploči sa dnom u obliku slova V (Greiner Bio-One GmbH, Solingen, Germany) koja sadrži NIH3T3 mišje fibroblaste kao ćelije za hranjenje, centrifugirano na 4 °C i odmah uskladišteno na -80 °C.

In vivo prajming T ćelija intranodalnom imunizacijom HLA A2.1/DR1 miša sa IVT RNK

[0284] T ćelije A2.1/DR1 miša (Pajot A. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) prajmovane su in vivo protiv antigena od interesa repetitivnom intranodalnom imunizacijom korišćenjem antigen-kodirajuće IVT RNK (Kreiter S. et al. (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Za intranodalne imunizacije, miševi su anestezirani sa ksilazinom/ketaminom. Preponski limfni čvor je hirurški izložen, 10 µL RNK (20µg) rastvoreno u Ringer rastvoru i vodi bez Rnkaze sporo je injektirano korišćenjem šprica za jednokratnu upotrebu od 0.3-ml sa ultrafinom iglom (31G, BD Biosciences), i rana je zatvorena. Nakon šest ciklusa imunizacije miševi su žrtvovani i izolovane su ćelije slezine.

Sakupljanje ćelija slezine

[0285] Nakon njihove disekcije u sterilnim uslovima, slezine su prenete u falkon epruvete sa PBS. Slezine su mehanički isitnjene sa forcepsom i ćelijske supsenzije su dobijene sa ćelijskim sitom (40 µm). Splenocite su isprane sa PBS centrifugirane i resuspendovane u hipotoničnom puferu za lizu eritrocita. Nakon 5 min inkubacije na RT, reakcija je zaustavljena dodavanjem 20-30 ml medijuma ili PBS. Ćelije slezine su centrifugirane i dva puta isprane sa PBS.

Sortiranje pojedinačnihćelija antigen-specifičnih CD8+ T ćelija nakon CD137 bojenja

[0286] Za antigen-specifičnu restimulaciju 2.5x10^6/komorici ćelija slezine od imunizovanih A2.1/DR1 miševa zasejano je u 24-komornu ploču i pulsirano sa pulom preklapajućih peptida koji kodiraju antigen od interesa ili kontrolni antigen. Nakon 24 č inkubacije ćelije su sakupljene, obojene sa FITC-konjugovanim anti-CD3 antitelom, PE-konjugovanim anti-CD4 antitelom, PerCP-Cy5.5-konjugovanim anti-CD8 antitelom i Dylight-649-konjugovanim anti-CD137 antitelom. Sortiranje je izvedeno na BD FACS Aria protočnom citometru (BD Biosciences). Ćelije pozitivne za CD137, CD3 i CD8 ili CD4 su sortirane, jedna ćelija po komorici je sakupljena u 96-komornu ploču sa dnom u obliku slova V (Greiner Bio-One) koja sadrži humane CCD-1079Sk ćelije kao ćelije za hranjenje, centrifugirane na 4 °C i odmah uskladištene na -80 °C.

RNK ekstrakcija, SMART-based cDNK sinteza i nespecifična amplifikacija od sortiranih ćelija

[0287] RNK iz sortiranih T ćelija je ekstrahovana sa RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany) prema instrukcijama dobavljača. Koiršćen je modifikovani BD SMART protokol za sintezu cDNK: BD PowerScript Reverse Transcriptase (BD Clontech, Mountain View, CA) je kombinovana sa oligo(dT)-T-primer long za prajming reakcije sinteze prvog lanca i TS-short (Eurogentec S.A., Seraing, Belgium) introdukujući oligo(riboG) sekvencu da bi se omogućilo stvaranje proširenog šablona termininalne transferazne aktivnosti reverzne transkriptaze i za zamenu šablona (Matz, M. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1558-1560). Prvi lanac cDNK sintetisan prema instrukcijama proizvođača podvrgnut je 21 ciklusu amplifikacije sa 5 U PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNK Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) i 0.48 µM prajmera TS-PCR prajmer u prisustvu 200 µM dNTP (ulovi ciklusa: 2 min na 95 °C, 30 s na 94 °C, 30 s na 65 °C, 1 min na 72 °C, finalna elongacija 6 min na 72 °C). Uspešna amplifikacija TCR gena je kontrolisana ili sa humanim ili mišjim specifičnim prajmerima za TCR-β konstantni region i uzastopne klonotip-specifične humane ili mišje Vα-/Vß-PCRs su izvedene samo ukoliko su detektovane izražene trake.

[0288] Prvi lanac cDNK za amplifikaciju HLA klasa I ili II sekvenci sinetetisan je sa SuperScriptII Reverse Transcriptase (Invitrogen) i Oligo(dT) prajmerom sa 1-5 µg RNK ekstrahovanom iz PBMCs izvedenih iz pacijenta.

Dizajn PCR prajmera za TCR i HLA amplifikaciju

[0289] Za dizajn humanih TCR konsenzis prajmera, svi 67 TCR-Vß i 54 TCR-Vα geni (otvoreni okviri čitanja i pseudogeni) kao što su nabrojani u ImMunoGeneTics (IMGT) bazi (http://www.imgt.org) zajedno sa njihovim odgovarajućim lider sekvencama su poravnati sa BioEdit Sequence Alignment Editor (e.g. http://www.biosoft.net). „Forward“ prajmeri od 24 do 27 bp dužine sa maksimumom od 3 degenerisane baze, GC-sadržajem između 40-60% i G ili C na 3’kraju su dizajnirani da bi se izveo aniling sa što je moguće više lider sekvenci i opremljeni sa 15 bp 5’ekstenzijom sa mestom retkog restrikcionog enzima i Kozak sekvencom. „Reverse“ prajmeri su dizajnirani za aniling sa prvim egzonima gena konstantnog regiona, sa prjamerom TRACex1_as koji se vezuje za sekvence koje odgovaraju aminokiselinama 7 do 16 Cα i TRBCex1_as aminokiselinama (aa) 8 do 16 u Cß1 i Cß2. Oba oligonukleotida su sintetisana sa 5’ fosfatom. Prajmeri su pakovani u pulove od 2-5 „forward“ oligo sa identičnom temperaturom anilinga.

[0290] Ova strategija je replicirana za dizajn mišjih TCR konsenzusnih prajmera, koji poravnavaju 129 izlistanih TCR-Vα i 35 izlistanih TCR-Vβ gena. „Reverse“ prajmeri mTRACex1_as i mTRBCex1_as su homologi sekvencama koji odgovaraju aa 24 do 31 i 8 do 15, respektivno.

[0291] HLA konsenzus prajmeri su dizajnirani poravnanjem svih HLA klasa I i II sekvenci izlistanih na Anthony Nolan Research Institute veb sajtu (www.anthonynolan.com) sa BioEdit Sequence Alignment Editor. „Forward“ prajmeri od 23 do 27 bp dužine sa maksimumom od 3 degenerisane ali baze koje čuvaju kod čiji se aniling vrši sa što je više mogućih HLA sekvenci jednog lokusa opremljeni su sa 5’-fosfatom i ekstenzijom Kozak sekvence. „Reverse“ prajmeri su dizajnirani analogno ali bez introdukcije nestabilnih baza i opremljeni sa 14 bp 5’-ekstenzijom koja kodira mesto AsiSI restrikcionog enzima.

PCR amplifikacija i kloniranje V(D)J i HLA sekvenci

[0292] 3-6 µl preamplifikovane cDNK iz izolovanih T ćelija podvrgnuto je 40 ciklusa PCR u prisustvu of 0.6 µM Vα-/Vß-specifičnog oligo pula, 0.6 µM Cα- ili Cß-oligo, 200 µM dNTP i 5 U Pfu polimeraze (uslovi ciklusa: 2 min na 95 °C, 30 s na 94 °C, 30 s temperatura anilinga, 1 min na 72 °C, vreme finalne elongacije 6 min na 72 °C). PCR proizvodi su analizirani korišćenjem Qiagen’s sistema za kapilarnu elektroforezu. Uzorci sa trakama na 400-500 bp su frakcionisani prema veličini na agaroznim gelovima, trake su isečene i prečišćene korišćenjem Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Analiza sekvence je izvedena da bi se otkrila sekvenca i V(D)J domena i β konstantnog regiona, kao TRBCex1_as i mTRBCex1_as prajmera, respektivno, koja se poklapa i sa genima TCR konstantnog regiona β1 i β2 kod ljudi i miša, respektivno. DNK je digestovana i klonirana u IVT vektore koji sadrže odgovarajući osnovni lanac za kompletan TCR-α/β lanac.

[0293] HLA sekvence su amplifikovane prema uputstvu proizvođača sa 2,5 U Pfu polimeraze od donor specifične cDNK korišćenjem specifičnih HLA klasa I ili II sens i antisens prajmera. Kako je transkripcija DRB3 gena najmanje pet puta manja od one kod DRB1 gena (Berdoz, J. et al. (1987) J. Immunol. 139, 1336-1341), amplifikacija DRB3 gena je izvedena u dva koraka korišćenjem pristupa ugnežđene PCR. PCR fragmenti s prečišćeni, AsiSI-digestoavi i klonirani u EcoRV- i AsiSI-digestovani IVT vektor. EciI- ili SapI-mesta unutar inserta mutirani su korišćenjem QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kits (Stratagene, La Jolla, CA).

Protočno citometrijske analize

[0294] Ekspresija na površini ćelije transficiranih TCR gena analizirana je sa protočnom citometrijom korišćenjem PE-konjugovanog anti-TCR antitela na odgovarajuću familiju varijabilnog regiona ili konstantni region TCR β lanca (Beckman Coulter Inc., Fullerton, USA) i FITC-/APC-obeležena anti-CD8/-CD4 antitela (BD Biosciences). HLA antigeni su detektovani bojenjem sa FITC-labeled HLA klasa II-specifičnim (Beckman Coulter Inc., Fullerton, USA) i PE-obeleženim HLA klasa I-specifičnim antitelima (BD Biosciences). Protočna citometrijska analiza je izvedena na a FACS Calibur analitičkom protočnom citometru korišćenjem Cellquest-Pro software (BD Biosciences).

Citotoksični test sa luciferazom

[0295] Za procenu ćelijski posredovane citotoksičnosti ustanovljen je test zasnovan na bioluminescenciji kao alternativa i optimizacija na<51>Cr oslobađanje. Za razliku od standardnog testa oslobađanja hroma, ovaj test meri litičku aktivnost efektornih ćelija izračunavanjem broja vijabilnih ciljnih ćelija koje eksprimiraju luciferazu nakon koinkubacije. Ciljne ćelije su stabilno ili prolazno transficirane sa genom za luciferazu koja kodira luciferazu svica iz svica Photinus pyralis (EC 1.13.12.7). Luciferaza je enzim koji katalizuje oksidaciju luciferina. Reakcija je zavisna od ATPi odigrava se u dva koraka:

luciferin ATP → luciferil adenilat PPi

luciferil adenilat O2→ oksiluciferin AMP svetlost

[0296] Ciljne ćelije su postavljene na ploču sa koncentracijom od 10<4>ćelija po komorici u belim 96-komornim pločama (Nunc, Wiesbaden, Germany) i kokultivisane su sa različitim brojem TCR-transficiranih T ćelija u krajnjoj zapremini od 100 µl. 3 č kasnije ćelijama je dodato 50 µl D-Luciferina (BD Biosciences) koij sadrži reakcionu smešu (Luciferin (1 µg/ml), HEPES-buffer (50 mM, pH), Adenozin 5’-trifosfataza (ATPaza, 0.4 µU/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Dodavanjem ATPaze reakcionoj smeši nestala je luminescencija koja je rezultat luciferaze oslobođene iz mrtvih ćelija.

[0297] Nakon ukupnog vremena inkubacije od 4 č bioluminescencija emitovana od strane vijabilnih ćelija merena je korišćenjem Tecan Infinite 200 reader (Tecan, Crailsheim, Germany). Ktivnost ubijanja ćelija izračunata je u odnosu na vrednosti luminescence dobijene nakon kompletne lize ćelije indukovane dodavanjem 2% Triton-X 100 i u odnosu sa luminescenciju emitovanu od strane samih ciljnih ćelija. Izlazni podaci su bili u obliku broja u sekundi (CPS) i procenat specifične lize je izračunat kao što sledi:

[0298] Maksimalna luminescencija (maksimum broja po sekundi, CPSmax) procenjena nakon inkubacije ciljnih ćelija bez efektorske i minimalne luminescencije (CPSmin) procenjena je nakon tretmana ciljnih ćelija sa deterdžentom Triton-X-100 za potpunu lizu.

ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSPOT test)

[0299] Mikrotitarske ploče (Millipore, Bedford, MA, USA) obložene su preko noći na sobnoj temperaturi sa anti-IFNγ antitelom 1-Dlk (Mabtech, Stockholm, Sweden) i blokirane sa 2% humanog albumina (CSL Behring, Marburg, Germany). 2-5x10<4>/komorici antigen prikazujućih stimulatornih ćelija je postavljeno na ploču u triplikatu zajedno sa 0.3-3x105/komorici TCR-transficiranih CD4+ ili CD8+ efektorskih ćelija 24 č after nakon elektroporacije. Ploče su inkubirane preko noći (37 °C, 5% CO2), isprane sa PBS 0.05% Tween 20, i inkubirane 2 časa sa anti-IFNγ biotinilovanim mAB 7-B6-1 (Mabtech) na krajnjoj koncenraciji od 1 µg/ml na 37 °C. Avidinvezana peroksidaza rena H (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, USA) dodata je komoricama, inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi i razvijena sa 3-amino-9-etil karbazolom (Sigma, Deisenhofen, Germany).

Primer 2: Izolacija TCRs specifičnih za virusni antigen CMV-pp65

[0300] Protokol za izolaciju/validaciju TCR (Slika 2) ustanovljen je korišćenjem humanog citomegalovirus (CMV)-fosfoproteina 65 (CMV-pp65, pp65, 65kDa niži matriks fosfoprotein, UL83) kao model antigena, za koje je poznato da indukuje visoke učestalosti antigen-specifičnih T ćelija u perifernoj krvi zdravih donora.

[0301] CMV je sveprisutni ß-herpesvirus koji inficira domaćina preko telesnih tečnosti kao što su krv ili pljuvačka. Kod zdravih individua primarna CMV infekcija i reaktivacija endogenih latentnih virusa kontrolisana je imunim sistemom, dok je kod imunokompromitovanih individua kao što su primaoci transplanta ili pacijenti sa AIDS rezultuje u značajnom morbiditetu i mortalitetu.

[0302] Protein pp65 virusnog omotača je jedan od glavnih ciljeva CMV-specifičnih citotksičnih T limfocita, koji su prisutni sa visokom učestalošću u perifernoj krvi ne-imunokompromitovanih seropozitivnih individua (Kern, F. et al. (1999), J. Virol. 73, 8179-8184; Wills, M.R. et al. (1996), J. Virol. 70, 7569-7579; Laughlin-Taylor, E. et al. (1994), J. Med. Virol. 43, 103-110). CMV-pp65-specifične CD8+ T ćelije koje izlučuju IFNγ seropozitivnog zdravog donora izolovane su protočnom citometrijom nakon nedelju dana antigen-specifične ekspanzije i ponovne imunizacije sa autolognim DCs transficiranim sa IVT RNK koja kodira celi pp65 antigen (Slika 2 vrh, Slika 3).

[0303] TCR α/β varijabilni regioni su amplifikovani iz pojedinačnih T ćelija korišćenjem seta specifičnih za sekvencu, delimično degenerisanih oligonukleotida. Proizvodi amplifikacije su klonirani usmereno ka mestu u vektoru koji sadrže TCR α/β konstantne regione koji obezbeđuju šablone pune dužine za trenutnu in vitro transkripciju (Slika 2 sredina).

[0304] Za verifikaciju ekspresije na ćelijskoj površini TCR α/β RNKs su prenete u SupT1 ćelije kojima inače nedosatje ekspresija endogenih TCR lanaca i analizirane su protočnom citometrijom (Slika 4).

[0305] Za funkcionalnu validaciju kloniranih TCRs, monospecifična T ćelijska linija IVSB koja prepoznaje tirozinaza-izvedeni epitop Tyr368-376 (Wölfel T. et al. (1994), Eur. J. Immunol 24, 759-64) transficirana je sa TCR RNK i analizirana u odnosu na specifičnu sekreciju citokina kao odgovor na pp65 antigen sa IFNγ-ELISPOT (Slika 2 dno, Slika 5). kako su TCRs stvoreni stimulacijom sa celim antigenom, procenjeni su u odnosu na posredovanje specifičnog prepoznavanja autolognih DCs bilo puliranih sa pp65 peptidnim pulom ili pp65 koji kodira IVT RNK. Nesrodni TPTE peptidni pul je korišćen kao kontrola. Oba TCRCD8-CMV#1 i TCRCD8-CMV#4 specifično su prepoznali pp65 koji eksprimira ciljne ćelije u poređenju sa kontrolnim TCR izolovanim iz CMV seronegativnog donora.

[0306] Da bi se determinisao HLA ograničavajući element, IVSB ćelije transficirane sa TCRCD8-CMV#1 su analizirane u odnosu na specifičnu IFNγ sekreciju nakon kokultivisanja sa peptid-pulsiranih K562 ćelijama koje eksprimiraju izabrane HLA alele pacijenta (Slika 6 vrh). HLA B*3501 je identifikovan kao restrikcioni element. Analiza individualnih 15-mera pp65 peptidnog pula otkrila je prepoznavanje peptida P30, P31 i P32, uz reaktivnost koja se postepeno smanjivala (Slika 6 dno). Ovo je lokalizovalo epitop prepoznate sa TCRCD8-CMV#1 unutar regiona aminokiselina 117-131 pp65 sugerišući njegov identitet sa prethodno objavljenim i visoko imunogenim HLA-B*3501-ograničenim epitopom CMV-pp65123-131 (Seq. IPSINVHHY) (Gavin, M.A. et al. (1993), J. Immunol.151, 3971-3980).

[0307] Nakon uspešne izolacije TCRs iz pp65-specifičnih CD8+ T ćelija koje su podvrgnute ekspanziji in vitro do vidokih učestalosti, protokol za izolaciju TCR je primenjen ex vivo na sortirane T ćelije prisutne u manjem broju.

[0308] CD8+ T ćelije magnetno prečišćene iz PBMCs HLA A*0201 pozitivnog donora stimulisane su sa autolognim ciljnim ćelijama pulsiranim sa imunodominantnim HLA A*0201-ograničenim epitopom pp65495-503 i aktivirane T ćelije koje izlučuju IFNγ sortirane su protočnom citometrijom.

[0309] Specifičnost TCRs dobijenih ex vivo iz CD8+ T ćelija nakon pre-senzitizacije sa pp65495-503 analizirana je u IFNγ-ELISPOT testu. Kao što je prikazano na Slici 7, četiri od šest TCRs bile su sposobne da preusmere IVSB ćelije da prepoznaju K562-A*0201 ćelije pulsirane sa pp65495-503 u poređenju sa kontrolnim peptidom. Nasuprot tome, IVSB ćelije opremljene sa kontrolnim TCR izolovanim sa CMV-seronegativnim donorom nisu izlučivale IFNγ nakon kokultivisanja sa K562-A*0201 ćelijama pulsiranim sa pp65495-503.

[0310] Da bi se pokazalo da su klonirani pp65-specifični TCRs takođe sposobni da posreduju citolitičku efektorsku funkciju izveden je citotoksični test zasnovan na luciferazi korišćenjem IVSB ćelija transficiranih sa TCRCD8-CMV#1 ili TCRCD8-CMV#14.

[0311] Specifično ubijanje odgovarajućih ciljnih ćelija (K562-B*3501 ćelije pulsirane sa pp65117-131 i K562-A*0201 ćelije pulsirane sa peptidom pp65495-503, respektivno) poređeno je sa ubijanjem Tyr368-376-pulsiranih K562-A*0201 ćelija posredovano endogenim TCR IVSB efektora (Slika 8).

[0312] Titracija efektor-prema-targetu (E:T) odnosa potvrdila je da su ciljne ćelije pulsirane sa odgovarajućim pp65 peptidom specifično lizirane sa TCR-transficiranim IVSB ćelijama. Do 85% ciljnih ćelija je ubijeno sa IVSB ćelijama transficiranim sa TCRCD8-CMV#1 i TCRCD8-CMV#14, respektivno. Izvanredno, rekombinantni TCRs posredovali su jednako efikasnu lizu kao prirodni TCR u širokom opsegu E:T odnosa.

[0313] Ukratko, 13 hCMV-pp65-specifični TCRs su izolovani iz CD4+ i CD8+ T ćelija dobijenih iz četiri različita CMV seropozitivna donora ili ex vivo ili nakon antigen-specifične ekspanzije kao što je dato nabrojano u Tabli 1.

Primer 3: Izolacija TCRs specifičnih za tumor antigen NY-ESO-1

[0314] Nakon dokazivanja koncept studija korišćenjem CMV-pp65 kao virusnog modela antigena koji izaziva visoke učestalosti antigen specifičnih T ćelija, procenili smo sposobnost našeg pristupa u kloniranju TCRs iz tumor antigen-specifičnih T ćelijskih populacija niske abundance. Učestalosti prethodno postojećih T ćelija protiv tumor-povezanih sopstvenih proteina su generalno mnogo niže od učestalosti T ćelija izazvanih sa perzistentnim virusima. Za primenu našeg postupka na tumorsku situaciju pribegli smo visoko imunogenim tumor antigenu NY-ESO-1.

[0315] NY-ESO-1 je kancer/testis antigen eksprimiran kod normalnih adultnih tkiva samo u testikularnim klicinim ćelijama. NYESO-1 (sinonimi: CTG. CTAG, CTAG1, ESO1, LAGE-2, LAGE2, LAGE2A, LAGE2B, OTTHUMP00000026025, OTTHUMP00000026042) je jedan od najbolje karakterisanih kancer testis antigena identifikovnih sa SEREX (Chen, Y.T. et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1914-1918), koji je eksprimiran u mnogim različitim malignim neoplazmama, uključujući melanome, kancere jednjaka, dojke, prostate, urinarnog trakta, jajnika i pluća (Chen, Y.T. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 1914-1918; Jungbluth, A.A. et al. (2001) Int. J. Cancer 92, 856-860; Schultz-Thater, E. et al.

(2000) Br. J. Cancer 83, 204-208). Usled svoje prirodne imunogenosti poželjan je kao model antigen za strategije vakcinacije tumora. NY-ESO-1 često izaizva odgovore antitela sa visokim titrom kod pacijenata koji nose NY-ESO-1 eksprimirajuće tumore i pokazano je da odgovori autoantitela na NY-ESO-1 su često povezani sa prisustvom antigen specifičnih CD8+ i CD4+ T ćelija (Zeng, G. et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 3964-3969; Jager, E. et al. (1998), J. Exp. Med. 187, 265-270; Gnjatic, S. et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 8862-8867; Valmori, D. et al. (2007), Clin. Immunol.122, 163-172).

[0316] Izabrali smo NSCLC pacijenta na osnovu njegove reaktivnosti autoantitela protiv NY-ESO-1, pulsirali masu njegovih PBMCs sa NY-ESO-1 peptidnim pulom i vršili ekspanziju nedelju dana. Nakon izlaganja autolognim NY-ESO-1 RNK transficirane DCs CD8+ T ćelije koje izlučuju IFNγ sortirane su i TCRs su klonirani iz pojedinačnih ćelija. Validacija identifikovanih TCRs za specifično prepoznavanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju NY-ESO-1 sa IFNγ ELISPOT testom rezultovala je u sedam funkcionalnih NY-ESO-1-specifičnih TCRs dobijenih od ovog pacijenta. Kao što je prikazano na Slici 9, TCRs prepoznati DCs ili pulsirani sa NY-ESO-1 peptidnim pulom ili transficirani sa NY-ESO-1 RNK, poslednje pomenuto potvrđuje prepoznavanje prirodno obrađenog epitopa.

[0317] HLA ograničenja NY-ESO-1-specifičnih TCRs su određna sa IFNγ-ELISPOT korišćenjem TCR-transficiranih IVSB efektora kokultivisanih sa K562 ćelijama koje eksprimiraju individualne HLA klasa I alele pacijenta i pulsirane sa NY-ESO-1 peptidnim pulom. Reprezentativni rezultat je prikazan na Slici 10.

[0318] Za mapiranje epitopa IVSB T ćelije su transficirane sa NY-ESO-1-specifičnim TCRs i kokultivisane sa K562 ćelijama koje eksprimiraju odgovarajući HLA antigen pulsiran sa individualnim preklapajućim 15mernim peptidima koji obuhvataju NY-ESO-1 protein. Reaktivnost TCR-transficiranih T ćelija protiv NY-ESO-1 peptida testirana je u IFNγ-ELISPOT testovima (Slika 11).

[0319] Izvanredno, epitopi svih sedam TCRs lokalizovnai su na aminokiselinama 85-111 NY-ESO-1 proteina (Slika 11, 12). Poznato je da ovaj region podleže efikasnom proteozomalnom cepanju usled hidrofobnih sekvenci i obrađen je u višestruke epitope sa različitim HLA ograničenjima (Valmori, D. et al. (2007), Clin. Immunol. 122, 163-172). Skriningom serijskih nonamera, suzili smo HLA-B*3508 ograničeni epitop TCRCD8-NY#5, #6, #8 and #15 do NY-ESO-192-100 (sekv. LAMPFATPM) (Slika 12).

[0320] Da bi se pokazalo da NY-ESO-1-specifični TCRs izolovani iz CD8+ T ćelija sposobni da posreduju citolitičke efektorske funkcije, TCR-transgene IVSB ćelije su analizirane u odnosu na specifično ubijanje peptidpulsiranih K562-A*6801 ćelija. Kao što je pokazano na Slici 13, IVSB efektori su reprogramirani sa TCRCD8-NY#2 da specifično liziraju ciljne ćelije na različitim E:T odnosima.

[0321] Validacija TCRs izolovanih iz CD4+ T ćelija iz druga dva seropozitivna NSCLC pacijenta rezultovalo je u kloniranju 9 nezavisnih NY-ESO-1-specifičnih TCRs. Određivanje restrikcionih elemenata (Slika 14) and ograničavanje lokalizacije epitopa (Slika 15) otkrilo je da 7 od ovih TCRs prepoznatih epitopa u peptidnom delu koji sadrži aa 117-147 u kontekstu različitih HLA klasa II alelotipa, sugerišući „hot spot“ za epitope T helper ćelija (Tabela 5).

[0322] Do danas, 16 NY-ESO-1-specifični TCRs su klonirani iz CD4+ i CD8+ izvedenih iz tri različita NSCLC pacijenat i karakterisane u odnosu na HLA ograničenje i peptidnu specifičnost (Tabela 2).

Primer 4: Izolacija TCRs specifičnih za tumor antigen TPTE

[0323] TPTE (Transmembranska fosfataza sa Tensin homologijom; sinonimi: CT44, PTEN2, EC 3.1.3.48, OTTHUMP00000082790), je lipidna fosfataza specifična za ćeliju sperme koja je aberantno transkribovana u mnogim humanim kancerima (Chen, H. et al. (1999), Hum. Genet. 105, 399-409; Dong, X.Y. et al. (2003), Br. J. Cancer 89, 291-297; Singh, A.P. et al. (2008), Cancer Lett. 259, 28-38), ali se malo zna o njenoj imunogenosti i T ćelijski odgovori do sada nisu registrovani.

[0324] Da bi se izolovali TPTE-specifični TCRs, 3 NSCLC pacijenti koji pokazuju značajne vrednosti apsorbance u pre-skriningu sa CrELISA izabrani su za antigen-specifičnu ekspanziju i sortiranje protočnom citometrijom TPTE-specifičnih CD8+ i CD4+ T ćelija.

[0325] TCRs izolovani iz CD8+ T ćelija validirani su u odnosu na prepoznavanje TPTE eksprimirajućih ciljnih ćelija i kakrakterisani su u odnosu na HLA ograničenje i specifičnost epitopa kao što je primerom pokazano za TCRCD8TPT#3 na Slici 16. Pokazano je da ovaj TCR reprogramira IVSB ćelije za psecifično prepoznavanje K562 ćelija koje prikazuju TPTE peptide na HLA B*3501 (Slika 16 vrh). HLA-B*3501-ograničeni epitop može se lokalizovati na TPTE 15-mere P130, P131 i P132, sa njavećom reaktivnošću na peptid P131 koji predstavlja aminokiseline 521-535 od TPTE (Slika 16 sredina). Analizom serijskih nonamera koji pokrivaju ovaj region, novi epitop TPTE527-535 (sekv. YPSDFAVEI) se mogla definisati, koja je u saglasnosti sa zahtevima B*3501 vezujućeg motiva sa prolinom kao sidro ostatkom na položaju 2, asparaginskom kiselinom kao naelektrisanim ostatkom na položaju 4 i izoleucinom kao hidrofobnom aminokiselinom na položaju 9 (Falk, K. et al. (1993), Immunogenetics 38, 161-162) (Slika 16 dno).

[0326] Analogno, TCRs izolovani iz CD4+ T ćelija su validirani za specifično prepoznavanje K562 ćelija koje eksprimiraju TPTE i individualne HLA klasa II alele donora (Slika 17). Nakon određivanja HLA ograničenja TPTE-specifični TCRs su analizirani u odnosu na prepoznavanje TPTE 15mernih peptida da bi se lokalizovali prepoznati epitopi (Slika 18).

[0327] Ukupno je do sada identifikovan 31 funkcionalni TPTE-reaktivni TCRs, od kojih su dva izvedena iz CD8+ ćelija i 29 je izvedeno iz CD4+ T ćelija iz tri različitia NSCLC pacijenta (Tabela 3). Fino mapiranje epitopa korišćenjem pojedinačni-peptid-pulsiranih HLA alel-eksprimirajućih K562 ciljnih ćelija, otkirlo je da su epitopi bili poremećeni duž cele sekvence TPTE proteina (Tabela 5).

Primer 5: Izolacija PLAC1-specifičnih TCRs visokog afiniteta iz T ćelija imunizovanih A2.1/DR1 miševa

[0328] Trofoblast-specifični gen PLAC1 (PLACenta-specifični 1, sinonimi: OTTHUMP00000024066; kancer/testis antigen 92) je novi član kancer-povezanih placentalnih gena (Koslowski M. et al. (2007), Cancer Research 67, 9528-34). PLAC1 je ektopično eksprimiran u širokom opsegu humanih maligniteta, najčešće kod kancera dojke, i suštinski je uključen u proliferaciju, migraciju, i invaziju ćelija kancera.

[0329] Da bi se dobili TCRs specifični za PLAC1, izmenili smo izvor antigen-specifičnih T ćelija. Kako su TCRs izolovani iz prirodnog repertoara pacijenata sa kancerom obično niskog afiniteta usled mehanizama centralne tolerancije, primenili smo alternativni pristup koji zaobilazi toleranciju da bi se stvorile T ćelije specifične za PLAC1 visokog afiniteta. T ćelije HLA A2.1/DR1 transgenih miševa (Pajot A. et al. (2004), Eur. J. Immunol.34, 3060-69) prajmovane su in vivo protiv humanog PLAC1 antigena repetitivnom intranodalnom imunizacijom korišćenjem PLAC1-kodirajuće IVT RNK (Kreiter S. et al. (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Ćelije slezine dobijene od ovih miševa ponovo su imunizovane sa PLAC1 preklapajućim peptidima nakon detekcije i izolacije antigen-specifičnih T ćelija na osnovu njihove aktivacijom-indukovane ushodne regulacije CD137 (Slika 19). Značajno je da je kod svih pet miševa značajan procenat PLAC1-specifičnih T ćelija (od 16-48% CD8+ ćelija) mogao biti ustanovljen sa intranodalnom imunizacijom sa PLAC1 IVT RNK.

[0330] Za validaciju TCRs kloniranih iz mišjih CD8+ T ćelija TCR-inženjeringom dobijene IVSB ćelije su analizirane u odnosu na specifičnu sekreciju citokina kao odgovor na PLAC1 peptid-pulsirane K562-A*0201 ćelije sa IFNγ-ELISPOT (Slika 20). Pokazano je da ukupno 11 TCRs posreduje specifično prepoznavanje K562-A*0201 ćelija pulsiranih sa peptidima izvedenim iz PLAC1 u poređenju sa kontrolnim antigenom. Izvanredno, IFNγ sekrecija posredovana sa PLAC1-specifičnim TCRs bila je čak viša u poređenju sa onima posredovanim sa endogenim TCR od IVSB efektora. Mapiranje epitopa upotrebom pojedinačni-peptid pulsiranih HLA alelaksprimirajućih K562 ciljnih ćelija, otkrilo je da svi identifikovani PLAC1-specifični TCRs prepoznaju 15merne peptide 7 i 8 koji predstavljaju aminokiseline 25-43 PLAC1 (Slika 21). Skriningom serijskih nonamera koji pokrivaju ovaj region, identifikovali smo dva HLA-A*0201 ograničena epitopa: PLAC1 aminokiseline 28-36 i aminokiseline 30-41, sa najboljim prepoznavanjem aminoksielina 31-39 (Slika 22, Tabela 5). Značajno je da je pokazano da svi PLAC1-specifični TCRs dobijeni od 4 različita miša prepoznaju ova dva epitopa koji ukazuju na preferencijalnu obradu ovih PLAC1 peptida kao i efikasno vezivanje i prikazivanje na HLA A*0201. Svi TCRs posredovli su povećanje IFNγ sekrecije kao odgovor na minokiseline 31-39 u poređenju sa aminokiselinama 28-36. Poslednje pomenute su ispravno prepoznati samo od strane nekih TCRs.

[0331] Kloniranjem 11 PLAC1-specifičnih TCRs (Tabela 4) i identifikacijom dva HLA A*0201-prikazana imunodominantna PLAC1 epitopa (Tabela 5) mogli smo pokazati da T ćelije A2/DR1 miševa prajmovanih in vivo sa intranodalnom vakcinacijom sa antigen-kodirajućom IVT RNK mogu koristiti kao izvor za izolaciju TCR.

Zaključak

[0332] Bili smo u stanju da ustanovimo prilagodnljivu tehnološku platformu za efikasno kloniranje i rapidnu karakterizaciju imunološki relevantnih TCRs iz malih antigen-specifičnih T ćelijskih populacija bez potrebe za stvaranjem T ćelijskih klonova ili linija i prethodnog poznavanja restrikcionih elemenata ili T ćelijskih epitopa.

[0333] Korišćenje našeg pristupa u TCR izolaciji/validaciji za virusne i tunirske antigene rezultovalo je u otkriću više od 70 antigen-specifičnih TCRs (Tabele 1,2,3,4), od kojih je više od polovine bilo usmereno protiv novih HLA prikazanih epitopa (Tabela 5).

[0334] Značajno, od pojedinačnih donora nekoliko TCR specifičnosti izvedenih iz CD8+ kao i CD4+ T limfocita je klonirano paralelno i pokazano je da reprogramiraju T ćelijske efektore za prepoznavanje respektivnog antigena.

[0335] Ovaj pristup omogućava stvaranje velike biblioteke TCRs u prihvatljivom vremenu za direktnu upotrebu popunjavajući prazninu između dostupnosti velike količine ciljnih struktura i malog broja pogodnih TCR kandidata za pristupe u antigen-specifičnoj terapiji u oblasti kancera, autoimuniteta i infektivnih bolesti.

TABELE

[0336]

Tabela 1: hCMV pp65-specifični TCRs

Tabela 2: NY-ESO-1- specifični TCRs

Tabela 3: TPTE- specifični TCRs

Tabela 4: PLAC1- specifični TCRs

Tabela 5: T ćelijski epitopi izvedeni iz antigena hCMV pp65, NY-ESO-I, TPTE, PLAC1

[0337] U sledećem, prikazane su dobijene sekvence T ćelijskog receptora. Podvučene sekvence su CDR sekvence, gde prva sekvenca u svakom lancu T ćelijskog receptora je CDR1, praćena sa CDR2 i CDR3.

1. hCMV pp65-specifični T ćelijski receptori

TCRCD8-CMV#1:

[0338]

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Postupak za obezbeđivanje antigen-specifičnih limfoidnih ćelija koji sadrži korake:

(a) obezbeđivanja jedne antigen-reaktivne T ćelije iz uzorka koji sadrži T ćelije, pri čemu je navedeni uzorak dobijen od subjekta koji je prethodno izložen navedenom antigenu i pri čemu je navedena jedna antigenreaktivna T ćelija izolovana iz uzorka koji sadrži T ćelije upotrebom protočne citometrije;

(b) obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora navedene jedne antigen-reaktivne T ćelije; i

(c) uvođenja navedene nukleinske kiseline u limfoidnu ćeliju da bi se obezbedile navedene antigenspecifične limfoidne ćelije.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedena nukleinska kiselina je RNK.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što navedeni korak obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji ima specifičnost T ćelijskog receptora navedene jedne antigen-reaktivne T ćelije sadrži obezbeđivanje nukleinske kiseline koja kodira T ćelijski receptor koji sadrži najmanje CDR sekvence, poželjno najmanje varijabilni region T ćelijskog receptora navedene jedne antigen-reaktivne T ćelije.

4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što navedeni subjekat je seropozitivan za navedeni antigen ili agens koji sadrži navedeni antigen.