JP5292550B2 - Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子及びα鎖遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質、並びにＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子、該遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質発現ベクター、及び該発現ベクターが導入された形質転換体に関する。また、本発明は、Ｔ細胞レセプターα鎖タンパク質、並びにＴ細胞レセプターα鎖遺伝子、該遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターα鎖タンパク質発現ベクター、及び該発現ベクターが導入された形質転換体に関する。
悪性黒色腫は、インターロイキン２などを用いた免疫療法が比較的有効な癌である（例えば、非特許文献１参照）が、生体内における抗腫瘍効果には、腫瘍細胞に反応する細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）が重要であることが示されている（例えば、非特許文献２参照）。免疫療法後、腫瘍反応性Ｔ細胞が活性化され、Ｔ細胞上のＴ細胞レセプター（T cell receptor：ＴＣＲ）が、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子によって腫瘍細胞表面に提示される腫瘍細胞タンパク質が分解されてできたペプチド（腫瘍抗原）を認識し、腫瘍細胞を傷害する。更に各種サイトカインを分泌し、マクロファージ等の他の免疫細胞をも誘導活性化し、生体内で腫瘍拒絶を起こすと考えられている。腫瘍反応性Ｔ細胞には自己腫瘍細胞のみならず、ＨＬＡを共有する他の患者からの腫瘍細胞にも反応するような共通腫瘍抗原を認識する場合と、自己腫瘍細胞しか反応しない固有抗原を認識する場合がある。
ヒト腫瘍細胞に対する免疫応答機構を解明して、新しい免疫療法を開発するためには、これらの腫瘍反応性Ｔ細胞が認識する腫瘍抗原を同定することが重要である。腫瘍反応性Ｔ細胞が樹立されている場合には、その反応性を利用した機能的ｃＤＮＡ発現クローニング法を用い、悪性黒色腫抗原の単離が可能である。例えば、転移メラノーマ患者からの腫瘍反応性細胞傷害性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍細胞株とを用いて、メラノーマの予防、診断及び治療に用いることができる悪性黒色腫抗原を単離することが可能であり（例えば、特許文献１参照）、その一つＭＡＲＴ１は同様な方法によって単離、同定されたものである。現在までに代表的なものとして、上記ＭＡＲＴ１やｇｐ１００のような色素細胞（メラノサイト）組織特異的タンパク質、各種腫瘍と正常組織では精巣に発現が認められるＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ等のＣＴ抗原（Cancer-Testis抗原）、腫瘍細胞の遺伝子異常により産生されるβカテニン、ＣＤＫ４（cyclin dependent kinase 4）、ｐ１５、ＧｎＴ−Ｖ等の変異ペプチド抗原が単離されている（例えば、非特許文献３参照）。一方、ＭＡＧＥ抗原は、メラノーマのみならず肺がんや消化器がんなど多くの固形がんでの高い発現が報告されている。
また、cytomegalovirus（ＣＭＶ）感染症は、通常の免疫状態である健常人ではあまり問題にはならないが、特に臓器移植後など免疫低下状態では、重篤な間質性肺炎などの合併症を起こしうる深刻な疾患である。現在、抗ウイルス剤の投与によりＣＭＶ感染症の臨床症状は緩和されるが、根治対策となり得る抗ウイルス剤は現在のところまだ知られていない。これまでに主にＣＭＶｐｐ６５タンパク由来のＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープに関する研究が行われており、ＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを用いた特異的ＣＴＬ細胞の誘導やテトラマー試薬を用いたＣＴＬクローンの評価が行われている。しかし、進行がん患者でのＣＭＶに対するＣＴＬ細胞の誘導反応に関して、それほど多くの知見は得られておらず、ＣＭＶ感染症に特異的なＣＴＬ細胞のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子については何ら知られていない。特に日本人に多いＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＭＶエピトープに関する研究は、まだ始まったばかりである。
Ｔ細胞はＴ細胞レセプターによりＭＨＣ分子／抗原ペプチド複合体を認識して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの標的細胞に結合するが、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し(ＭＨＣクラスＩ拘束性)、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞はＭＨＣクラスII分子／抗原ペプチドの複合体のみしか結合できない（ＭＨＣクラスII拘束性）とされている。また、ＭＨＣクラスＩ分子はほとんどの有核細胞に発現しているが、ＭＨＣクラスII分子は限られた一部の細胞しか発現していない。このためＴｈ細胞はＭＨＣクラスII分子を発現した樹状細胞やＢ細胞、活性化Ｔ細胞などとは結合できるが、これら以外の腫瘍細胞や感染細胞などには直接結合することができない。しかし遺伝子操作によってＭＨＣクラスＩ拘束性とされるＣＴＬ由来のＴ細胞レセプター遺伝子を導入したＭＨＣクラスII拘束性とされるＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞が、対応抗原をパルスしたＡＰＣとＣＤ８非依存的に反応して活性化されることができ、対応抗原に結合できるＴ細胞レセプターを発現していることが示された。また、非特異的な抗腫瘍活性をもつ末梢血リンパ球に腫瘍抗原特異的ＣＴＬ由来のＴ細胞レセプター遺伝子を導入することにより、特異的に腫瘍を傷害することができることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
他方、Ｔ細胞表面に存在する膜表面タンパク質であり、抗原認識を担うＴ細胞レセプターには、α鎖・β鎖から成るヘテロ二量体とγ鎖・δ鎖から成るヘテロ二量体の二種類が同定されている。Ｔ細胞レセプター遺伝子は免疫グロブリン遺伝子と同様に、可変領域（Ｖ：variable）、多様性領域（Ｄ：diversity）、結合領域（Ｊ：joining）からなり分子の多様性を生じるＶドメインと、細胞外定常領域、膜貫通領域、細胞内領域を含む定常領域（Ｃ：constant）からなるＣドメインにより構成されている。これらのアミノ酸配列はＴ細胞ごとに異なっていることから、Ｔ細胞レセプターは抗原認識分子であると同時に個々のＴ細胞の目印にもなっている。このＴ細胞レセプターの多様性は後天的なＴ細胞レセプター遺伝子の再構成によって生みだされており、Ｔ細胞レセプターβ，δ鎖はＶ−Ｄ−Ｊを、Ｔ細胞レセプターα，γ鎖はＶ−Ｊを再構成することが知られている。
Ｔ細胞の初期分化は、Ｂ細胞と同様にＴ細胞レセプターのα鎖及びβ鎖遺伝子の再構成と密接に関わっている。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子の再構成はＤＮ−Ｔ細胞（double negative：ＣＤ４−８−）の段階で開始され、β鎖遺伝子の再構成に成功した細胞はβ鎖タンパク質と代替α鎖（ｐｒｅＴα）の複合体、つまりプレＴ細胞レセプターを細胞表面に発現する。そして、ＣＤ４及びＣＤ８分子の発現が誘導され、ＤＰ−Ｔ細胞（double positive：ＣＤ４＋８＋）へと移行し、ＤＰとなったＴ細胞は、次にＴ細胞レセプターのα鎖遺伝子の再構成に成功した細胞のみが、Ｔ細胞レセプターを表面に発現できることが知られている。
Ｔ細胞レセプターβ鎖の遺伝子構成に関しては、ヒトゲノム遺伝子配列情報データベースによれば、Ｔ細胞レセプターβ鎖の遺伝子は約３０種類の亜族（遺伝子自体は約７０種）からなるＶ遺伝子、２種類のＤ遺伝子、１４種類のＪ遺伝子、２種類のＣ遺伝子によって構成され、Ｖβ中に２つの可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２）が存在することも知られている。これらの中からＶβ、Ｄβ、Ｊβが各１つずつ選ばれて結合し、Ｔ細胞レセプターβ鎖をコードするＤＮＡが構成されている。この際、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβの結合部にはランダムな塩基の挿入や欠失が起こり、無限に近い多様性が生みだされている。このＶβ−Ｄβ−Ｊβの結合部位（連結部分）は、ＣＤＲ３（相補性決定領域３：third complementarity determining region）、結合部（junctional）領域と呼ばれ、Ｔ細胞レセプターの中で最も多型性に富む部分であり、塩基の挿入・欠失が起こるため、各遺伝子構成が同じであっても連結部分も含めて同一配列になることは極めて稀である。
また、Ｔ細胞レセプターα鎖の遺伝子構成に関しては、ヒトゲノム遺伝子配列情報データベースによれば、Ｔ細胞α鎖の遺伝子は約４０種類の亜族（遺伝子自体は約５０種）からなるＶ遺伝子、約６０種のＪ遺伝子、１種類のＣ遺伝子によって構成される。Ｔ細胞の分化の過程で起きる遺伝子組み換えによって、前述の中からＶα、Ｊα、Ｃαが各１種ずつ選ばれて結合し、染色体上でＴ細胞レセプターα鎖をコードするＤＮＡが構成される。染色体上で構成されたＴ細胞レセプターα鎖遺伝子は発現してそのタンパク質が細胞表面に表出する。Ｔ細胞α鎖のＶα−Ｊαの結合部位（連結部分）は、多型性に富む部分であり、塩基の挿入・欠失が起こるため、各遺伝子構成が同じであっても、連結部分を含めて同一配列になることは極めて稀である。
Ｔ細胞レパートリー（Ｔ細胞レパトワ）の多様性は、Ｔ細胞間での多様な抗原認識能と密接に関係していることから、Ｔ細胞の機能，免疫応答，免疫機能を考える上でＴ細胞レセプターレパートリーの機能解明を行うことは極めて重要である。最近、癌，自己免疫疾患，アレルギー疾患等において、患部局所に存在するＴ細胞のＴ細胞レセプターレパートリー解析の研究が進められ、疾患特異的なＴ細胞が解明されつつある。しかし、そのＴ細胞上のＴ細胞レセプター分子が、どのような働きをしているか、ということは、Ｔ細胞レセプター分子の単離が困難であること等の問題があり、まだその詳細が明らかにされるに至っていない。本発明の課題は、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＧＥ１ １３５−１４３（ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ：以下、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドと称する場合がある）、ＭＡＧＥ３ １９５−２０３（ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ：以下、ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチドと称する場合がある）、ＭＡＲＴ１ ２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ：以下、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドと称する場合がある）、ｇｐ１００ ２０９−２１７（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ：以下、ｇｐ１００−Ａ２ペプチドと称する場合がある）、ＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９（ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ：以下、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドと称する場合がある）、又はＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ：以下、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチドと称する場合がある）を特異的に認識するＴ細胞レセプターβ鎖及びその遺伝子を提供することにある。
また、本発明の課題は、ＣＴＬ細胞膜上で上記Ｔ細胞レセプターβ鎖とヘテロ二量体を構成したときに、がん細胞由来の抗原ペプチドに特異性が高いＴ細胞レセプターα鎖及びその遺伝子を提供することにもある。
また、本発明の課題は、ＣＴＬ細胞膜上で上記Ｔ細胞レセプターβ鎖とヘテロ二量体を構成したときに、がん細胞由来の抗原ペプチドに特異性が高いＴ細胞レセプターα鎖及びその遺伝子を提供することにもある。
Ｔ細胞レセプター分子が、Ｔ細胞を介する免疫応答および免疫機構に重要な役割を果たしていることから、これら免疫応答および免疫機構の解析には、個々のＴ細胞レセプター分子を得ることが必要である。しかし、膜表面タンパク質を細胞から精製すると、１０１０個の細胞からせいぜい１０μｇ程度しか得られない。しかも、Ｔ細胞レセプターの多様性により、一種類のＴ細胞レセプターを分取するためには、それぞれのＴ細胞レセプターを持つＴ細胞株を樹立し、その各々からＴ細胞レセプターを単離することが必須となる。しかし、Ｔ細胞のＴ細胞レセプターレパートリーは１０１０種類にも及んでおり、１０１０種のＴ細胞株を樹立することは、実質的に極めて困難である。
ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１及びｇｐ１００はメラノーマに発現する癌抗原であり、ペプチドワクチンによる治療を受けている転移性のメラノーマ患者において、抗原抗体反応を強く誘導するものである。また、ＣＭＶｐｐ６５は、ＣＭＶ感染症に発現するＣＭＶ抗原であり、ＣＭＶ感染症患者において、抗原抗体反応を誘導するものである。ＭＡＧＥ１やＭＡＧＥ３はＨＬＡ−Ａ２４限局的な抗原決定部位を持っており（ＭＡＧＥ１ １３５−１４３：ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ； ＭＡＧＥ３ １９５−２０３：ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ）、ＭＡＲＴ１やｇｐ１００はＨＬＡ−Ａ２限局的な抗原決定部位を持っている（ＭＡＲＴ１ ２７−３５：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ； ｇｐ１００ ２０９−２１７：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ）。また、ＣＭＶｐｐ６５はＨＬＡ−Ａ２４限局的な抗原決定部位（ＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ）と、ＨＬＡ−Ａ２限局的な抗原決定部位（ＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）を持っている。
本発明者らは、樹状細胞に基づく上記ペプチド特異的なＣＴＬ細胞の誘導方法を構築し、該ＣＴＬ細胞をＡｕｔｏ−ＭＡＣＳ法にて純化し、純化した細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いＴＣＲレパトワ解析により、発現ＴＣＲの遺伝子分類を行い、解析結果に基づいてＴＣＲ遺伝子をクローニングした。クローニングした断片のＤＮＡシークエンスを解析し、上記ペプチドを特異的に認識する新規なＴ細胞レセプターβ鎖及びそれとヘテロ二量体を形成するα鎖を同定した。本発明は、上記知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、（１）配列番号７若しくは９で表される塩基配列、又は、配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子や、（２）上記（１）に記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターや、（３）上記（２）に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体に関する。
また本発明は、（４）配列番号４６、４８、５０若しくは５２で表される塩基配列、又は、配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子や、（５）上記（４）に記載のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターや、（６）上記（５）に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体や、（７）上記（１）に記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子及び上記（４）に記載のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質及びＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターや、（８）上記（７）に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質及びＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体や、（９）組換えベクターが導入されたリンパ球である上記（３）、（６）又は（８）に記載の形質転換体に関する。
さらに本発明は、（１０）配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質や、（１１）配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
またさらに本発明は、（１２）配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターα鎖タンパク質や、（１３）配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターα鎖タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
また本発明は、（１４）配列番号７若しくは９で表される塩基配列、又は、配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物に関する。
さらに本発明は、（１５）配列番号４６、４８、５０若しくは５２で表される塩基配列、又は、配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物や、（１６）配列番号７若しくは９で表される塩基配列、又は、配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子と、配列番号４６、４８、５０若しくは５２で表される塩基配列、又は、配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子とが組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質及びＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物に関する。
本発明によると、ＭＡＧＥ１，３陽性の固形がんやメラノーマやＣＭＶ感染症等の特定の疾患におけるＴ細胞の機能、免疫応答、免疫機能を解明する上で有用である。また、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子やα鎖遺伝子を利用した遺伝子治療や養子免疫療法により、患者の細胞性免疫を疾患特異的に向上させ、ＭＡＧＥ１，３陽性の固形がんやメラノーマやＣＭＶ感染症等の特定の疾患を治療しうる可能性がある。
本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子ともいう）は、疾患特異的抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＲβ鎖遺伝子である限り特に制限されず、例えばメラノーマ特異的抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＲβ鎖遺伝子や、ＣＭＶ感染症特異的抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＲβ鎖遺伝子等を好ましく例示することができる。
前記メラノーマ特異的抗原ペプチドとしては、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００等が知られており、中でも、ＭＡＧＥ１ １３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド：ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ；配列番号１）、ＭＡＧＥ３ １９５−２０３（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド：ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ；配列番号２）、ＭＡＲＴ１ ２７−３５（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３）、ｇｐ１００ ２０９−２１７（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号４）を好ましく例示することができ、上記ＣＭＶ感染症特異的抗原ペプチドとしては、ＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ；配列番号５）、ＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号６）を好ましく例示することができる。
前記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子として具体的には、配列番号７や配列番号９で表される塩基配列（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１１で表される塩基配列（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１３で表される塩基配列（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１５で表される塩基配列（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１７や配列番号１９や配列番号２１で表される塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号２３で表される塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号８や配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号１８や配列番号２０や配列番号２２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）、配列番号２４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子を好ましく例示することができる。
本発明のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子（ＴＣＲα鎖遺伝子ともいう）は、疾患特異的抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＲα鎖遺伝子である限り特に制限されず、例えば前述のメラノーマ特異的抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＲα鎖遺伝子や、前述のＣＭＶ感染症特異的抗原ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞のＴＣＲα鎖遺伝子等を好ましく例示することができる。
前記本発明のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子として具体的には、配列番号３２や配列番号３４や配列番号３６や配列番号３８や配列番号４０や配列番号４２で表される塩基配列（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号４４で表される塩基配列（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号４６や配列番号４８や配列番号５０や配列番号５２で表される塩基配列（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号５４や配列番号５６で表される塩基配列（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号５８や配列番号６１で表される塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号６３や配列番号６５や配列番号６７や配列番号６９や配列番号７１や配列番号７４や配列番号７６で表される塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号３３や配列番号３５や配列番号３７や配列番号３９や配列番号４１や配列番号４３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号４５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号４７や配列番号４９や配列番号５１や配列番号５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号５５や配列番号５７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号５９や配列番号６２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）、配列番号６４や配列番号６６や配列番号６８や配列番号７０や配列番号７２や配列番号７５や配列番号７７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖遺伝子）からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子を好ましく例示することができる。
本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した前記塩基配列や前記アミノ酸配列の各情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば、細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質は、配列番号８や配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質）、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質）、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質）、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質）、配列番号１８や配列番号２０や配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質）、又は配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質）である。
また、本発明のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質は、配列番号３３や配列番号３５や配列番号３７や配列番号３９や配列番号４１や配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖タンパク質）、配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖タンパク質）、配列番号４７や配列番号４９や配列番号５１や配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖タンパク質）、配列番号５５や配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖タンパク質）、配列番号５９や配列番号６２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖タンパク質）、配列番号６４や配列番号６６や配列番号６８や配列番号７０や配列番号７２や配列番号７５や配列番号７７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲα鎖タンパク質）である。
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現しているＴ細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
また、本発明のタンパク質をマーカータンパク質やペプチドタグと結合させることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子及び／又はＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質及び／又はＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターである限り特に制限されないが、動物細胞において発現しうるものが好ましい。本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入された宿主細胞であれば特に制限されないが、リンパ球が好ましく、中でもナイーブＴ細胞が好ましい。中でも、上記本発明の組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球、好ましくは、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができる疾患（該組換えベクターに組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子やＴ細胞レセプターα鎖遺伝子にコードされるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質が特異性を示す抗原ペプチドを特異的に発現する疾患）に対する治療用組成物として有用である。特に、該組換えベクターに組み込まれた本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子の塩基配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５で表される塩基配列や、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる場合や、前記組換えベクターに組み込まれた本発明のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子の塩基配列が、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６で表される塩基配列や、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる場合は、前記リンパ球、好ましくは、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができるＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物として有用であり、該組換えベクターに組み込まれた本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子の塩基配列が、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３で表される塩基配列や、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる場合や、前記組換えベクターに組み込まれた本発明のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子の塩基配列が、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７４、配列番号７６で表される塩基配列や、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる場合は、前記リンパ球、好ましくは、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができるＣＭＶ感染症治療用組成物として有用である。
なお、本発明における「ＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物」とは、メラノーマ； ＭＡＧＥ１陽性の固形がん（但しメラノーマを除く）； 及び、ＭＡＧＥ３陽性の固形がん（但しメラノーマを除く）；から選ばれる１つ又は２つ以上の疾患に対して治療効果を奏する組成物を意味する。
なお、本発明における「ＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物」とは、メラノーマ； ＭＡＧＥ１陽性の固形がん（但しメラノーマを除く）； 及び、ＭＡＧＥ３陽性の固形がん（但しメラノーマを除く）；から選ばれる１つ又は２つ以上の疾患に対して治療効果を奏する組成物を意味する。
養子免疫療法等免疫治療剤に用いる場合は、形質転換Ｔ細胞クローンを精製することが好ましく、その手法としては、リン酸緩衝液等に混合して遠心する方法、分離剤を用いた比重遠心法などを用いることができる。ＭＡＧＥ１，３陽性の固形がんやメラノーマやＣＭＶ感染症等の疾患の治療用組成物の投与量は、１回あたり形質転換リンパ球として１０６〜１０１２個の細胞が好ましい。投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、形質転換リンパ球をヒト血清アルブミンを０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、５０〜５００ｃｃとするのが好ましく、この液量に前記の形質転換リンパ球が含まれるようにするのが好ましい。投与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は少なくとも１回、好ましくは５回以上とすることができる。
本発明の抗体は、上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質又はＴ細胞レセプターα鎖タンパク質に特異的に結合する抗体である限り特に制限されず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を例示することができる。本発明のこれらの抗体は上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性に優れている点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、メラノーマやＣＭＶ感染症等の疾患の診断や本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質又はこれらのタンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に本発明のＴ細胞レセプタータンパク質として、ヒトＴ細胞由来の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を例に挙げてマウス由来の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖マウスモノクローナル抗体の作製方法を説明する。
上記抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体は、抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質又は該タンパク質を膜表面に発現したＴ細胞を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
また、本発明の上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
また上記本発明の抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質やＴ細胞レセプターα鎖タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例１における実験概要は、樹状細胞ワクチン投与を受けたメラノーマ患者（ＨＬＡ−Ａ２４陽性）リンパ球の入手→メラノーマ抗原ペプチドＭＡＧＥ１（Ａ２４拘束性）にて処理した樹状細胞の作製→樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞刺激によるペプチド特異的ＣＴＬ細胞の誘導・増幅→増幅したＣＴＬ細胞のマーカー解析（ＦＡＣＳ）と定量（テトラマー染色）及び機能解析（刺激されたＣＴＬ細胞からのＩＦＮ−γ産生解析）→ＡｕｔｏＭＡＣＳ法による、テトラマー又はレパトワ抗体陽性ＣＴＬ細胞の純化→ＲＮＡ抽出→逆転写反応→ＰＣＲによるＴＣＲ遺伝子（β鎖）の増幅→ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ３１００）を用いたＤＮＡ断片解析（ＴＣＲβ鎖遺伝子の同定）→ＰＣＲによるタンパク質コード領域の増幅とクローニング→ＡＢＩ３１００による塩基配列の決定である。その他の実施例３、５、７及び９における実験概要は、用いるペプチドが異なる点を除いて、ほぼ同様である。また、実施例１０における実験概要は、用いるペプチドの他、増幅や同定する対象がＴＣＲβ鎖遺伝子ではなく、ＴＣＲα鎖遺伝子である点を除いて、ほぼ同様である。
［ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖について］
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＧＥ１ １３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド：ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ；配列番号１）にて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行った。今回リンパ球を使用したＭＥＬ−００１の患者では、ＭＡＧＥ１ １３５−１４３にて処理した樹状細胞の投与を行ったが、約４ｃｍ大の肺転移巣が著明に縮小を認め、明確な臨床的効果が得られている（図１）。また免疫反応のモニタリング検査であるＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、末梢血中にＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドに対する特異的なＣＴＬ細胞の陽性反応（Δ）が確認され、臨床効果と相関した結果が得られている（図２）。
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＧＥ１ １３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド：ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ；配列番号１）にて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行った。今回リンパ球を使用したＭＥＬ−００１の患者では、ＭＡＧＥ１ １３５−１４３にて処理した樹状細胞の投与を行ったが、約４ｃｍ大の肺転移巣が著明に縮小を認め、明確な臨床的効果が得られている（図１）。また免疫反応のモニタリング検査であるＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、末梢血中にＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドに対する特異的なＣＴＬ細胞の陽性反応（Δ）が確認され、臨床効果と相関した結果が得られている（図２）。
ｅｘ ｖｉｖｏにて前述のＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球から誘導・増幅されたペプチド特異的なＣＴＬ細胞（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞）をテトラマーにて染色し、増幅されたＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞について定量的な評価を行った。その結果を図３に示す。図３に示されているとおり、対照コントロールのテトラマーであるＨＩＶ−Ａ２４テトラマーでは、ほとんど陽性細胞は認められない（０．０４％）が、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー染色では１８．４％と高率に陽性ＣＴＬ細胞の増幅が認められた。
また、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞について、ＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体パネル（ＩＯＴｅｓｔＲ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ，Beckman Coulter社製）を用いて、有意に増加したレパトワの同定を行った。その結果を図４に示す。図４に示されているとおり、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭＥＬ−００１症例では、レパトワ抗体パネルのスクリーニングにて２種類のレパトワ（ＴＣＲＶβ５．１及びＴＣＲＶβ７．１）の増加が検出された。レパトワ陽性細胞の比率は、ＴＣＲＶβ５．１が１２．８％、ＴＣＲＶβ７．１が２７．１％であった。
ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー及び、ＴＣＲＶβ５．１又はＴＣＲＶβ７．１にて染色し、陽性細胞について定量的な評価を行った。その結果を図５に示す。図５に示されているとおり、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭＥＬ−００１症例では、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー及びＴＣＲＶβ７．１の両方が陽性であった細胞が１０．６％、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー及びＴＣＲＶβ５．１の両方が陽性であった細胞が０．８４％であり、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー陽性のＣＴＬ細胞の大半は、ＴＣＲＶβ７．１が陽性であった。一方、コントロール用のテトラマーであるＨＩＶ−Ａ２４テトラマーは、ほとんど染色されなかった。
ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドにて処理を行ったＬＣＬ（ＥＢ ｖｉｒｕｓにて不死化したヒトＢ細胞培養株）であるＴＩＳＩ細胞にて、前述のＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を刺激し、その刺激により細胞内に産生されたＩＦＮ−γを細胞内染色してフローサイトメトリーで検出した。その結果を図６に示す。図６に示されているとおり、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー及びＩＦＮ−γが共に陽性の細胞比率は９．１％であり、ＴＣＲＶβ７．１及びＩＦＮ−γが共に陽性の細胞比率は９．９％であり、ＴＣＲＶβ５．１及びＩＦＮ−γが共に陽性の細胞比率は０．７１％であった。これらの結果より、ＭＡＧＥ１−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞において、上述の刺激によってＩＦＮ−γを産生しうる細胞は、ほとんどがＴＣＲＶβ７．１陽性の細胞であることが明らかとなった。
上記図５及び図６の実験の結果を考慮して、ＴＣＲＶβ７．１陽性ＣＴＬ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー又は特異的なＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体及び磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化したところ、陽性細胞は９７％であった。これらの純化したＣＴＬ細胞を、次のＴＣＲβ鎖の遺伝子解析に用いた。
上述の純化した細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴＣＲレパトワ解析により発現ＴＣＲの遺伝子分類を行い、その解析結果に基づいてＴＣＲタンパク質コード領域遺伝子をクローニングした。ＣＴＬは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体のＴＣＲタンパク質を発現する。今回我々の決定した遺伝子配列はβ鎖に対応するものである。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、前述のＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする２クローンの遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）にそれぞれ対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、各増幅断片の塩基配列を解析した。具体的には、前述のＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1）に対応するセンスプライマー（gctagcatgggctgcaggctgctctgc：配列番号２５）とアンチセンスプライマー（tcagaaatcctttctcttgaccatggc：配列番号２６）を用いて、本ＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1）のタンパク質コード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1）の塩基配列を配列番号７に、そのアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、前述のもう一方のＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）についてもそれに対応するセンスプライマー（配列番号２５）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、本ＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）のタンパク質コード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）の塩基配列を配列番号９に、そのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。クローニングした２つの配列を解析した結果、これらのＴＣＲβ鎖遺伝子は同じ遺伝子ではあるが、異なるクローンであることが判明した。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、前述のＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする２クローンの遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）にそれぞれ対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、各増幅断片の塩基配列を解析した。具体的には、前述のＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1）に対応するセンスプライマー（gctagcatgggctgcaggctgctctgc：配列番号２５）とアンチセンスプライマー（tcagaaatcctttctcttgaccatggc：配列番号２６）を用いて、本ＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1）のタンパク質コード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1）の塩基配列を配列番号７に、そのアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、前述のもう一方のＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）についてもそれに対応するセンスプライマー（配列番号２５）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、本ＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）のタンパク質コード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）の塩基配列を配列番号９に、そのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。クローニングした２つの配列を解析した結果、これらのＴＣＲβ鎖遺伝子は同じ遺伝子ではあるが、異なるクローンであることが判明した。
本実施例及び後述の実施例に使用したプライマーの配列は、ＴＣＲレパトワ解析ではJeffry R. Currier and Mary Ann Robinsonが成書Current Protocols in Immunology※３ に記載したものを使用し、タンパク質コード領域のクローニングでは、公開データベース（ＮＣＢＩ）に収載されるゲノム配列にもとづいた。
※１ ImMunoGeneTics:1125985409921_0
※２ National Center for Biotechnology Information:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
※３ Current Protocols in Immunology, John E. Coligan et al. ed. (2000) 10.28.1-10.28.24. John Wiley & Sons, Inc.
※１ ImMunoGeneTics:1125985409921_0
※２ National Center for Biotechnology Information:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
※３ Current Protocols in Immunology, John E. Coligan et al. ed. (2000) 10.28.1-10.28.24. John Wiley & Sons, Inc.
実施例１で得られたＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲβ鎖遺伝子がＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞へ導入された場合に、該遺伝子産物である受容体タンパク質が発現し、腫瘍特異的な細胞障害活性を誘導しうるか否かにつき検討した。ここで、ナイーブＴ細胞とは、胸腺での分化後、抗原にまだ遭遇していないＴ細胞のことである。
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性のメラノーマ患者由来のナイーブリンパ球細胞をＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製）＋５％ヒト血清（Cambrex社製）培地に懸濁した。あらかじめ抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ，ヤンセンファーマ社製）と抗ヒトＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ，BD Pharmingen社製）にて２時間コーテイングを行った７５ｃｍ２フラスコに、上記培地に懸濁したナイーブリンパ球を２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で播種し、５日間培養を行った。上記の抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体との併用により増殖刺激されたリンパ球を回収し、Human T cell Nucleofector kit (Amaxa社製)を用いて、取扱説明書に従い当該ＴＣＲβ鎖遺伝子のエレクトロポレーション法（Nucleofector装置, Amaxa社製）による遺伝子導入を行った。エレクトロポレーション法による遺伝子導入は、具体的には、以下のように行った。
まず５×１０６個の刺激後のリンパ球をそれぞれ１００μｌのエレクトロポレーション用ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、ｍｏｃｋ（４μｇ）、ＧＦＰ（２μｇ）又はＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）を加え、キュベットに移し変えてNucleofector装置にサンプルをセットし、プログラムＮｏ．２３でエレクトロポレーションを実施した。その際、ｍｏｃｋとして使用したベクターはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子を切り出したものを用い、ＧＦＰ遺伝子としてはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターを用い、ＴＣＲβ鎖遺伝子としては、ｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子をＴＣＲβ鎖遺伝子に乗せ変えたものを作製し、使用した。細胞を回収後、１２−ウェルプレートに移してＧＴ−Ｔ−５０３＋５％ヒト血清培地にて４８時間培養を行った後、フローサイトメトリー（FACSCalibur, BD社製）にてＧＦＰ及びＴＣＲβ鎖遺伝子の導入効率を検討した。その結果を図７に示す。発現用のコントロール遺伝子であるＧＦＰ遺伝子は、全リンパ球の５９．３％に導入発現されており（Ｔリンパ球全体の約６２％）、エレクトロポレーション法によるヒトリンパ球細胞への遺伝子導入実験自体は、成功したものと考えられた。また、ＭＡＧＥ１−Ａ２４特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子は、クローン１については２９．４％の細胞で、クローン２については３２．４％の細胞で発現が確認され、良好な発現効率が認められた。
また、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドにて処理したＴＩＳＩ細胞に対する、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的なＴＣＲβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を評価した。ＴＣＲβ鎖遺伝子（clone1又はclone2）を導入発現したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞としては、前記エレクトロポレーションによりＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）又はＧＦＰ（２μｇ）を導入した細胞を使用した。また、ＴＩＳＩ細胞をＰＢＳ(Ｍｇ, Ｃａ含有、Cambrex社製)＋１％ヒト血清アルブミン溶液に懸濁し、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドを最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートした。該ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド処理したＴＩＳＩ細胞１×１０５個を、同数の前記ＴＣＲβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞と共に混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド処理したＴＩＳＩ細胞に対する、前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。その結果を図８に示す。図８の結果から分かるように、ＴＣＲβ鎖遺伝子（clone2）を導入したリンパ球のみＩＦＮ−γが刺激され、本ＴＣＲβ鎖遺伝子がコードするＴＣＲβ鎖を発現したＴ細胞が、腫瘍特異的な細胞障害活性を有することが示唆された。
［ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖について］
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＧＥ３ １９５−２０３（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド：ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ；配列番号２）にて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行った。今回リンパ球を使用したＭＥＬ−００７の患者では、ＭＡＧＥ３ １９５−２０３にて処理した樹状細胞の投与を行ったが、約２ｃｍ大の頚部リンパ節転移巣が著明に縮小を認め、明確な臨床的効果が得られている（図９）。また免疫反応のモニタリング検査であるＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、末梢血中にＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチドに対する特異的なＣＴＬ細胞の陽性反応（◇）が確認され、臨床効果と相関した結果が得られている（図１０）。
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＧＥ３ １９５−２０３（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド：ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ；配列番号２）にて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行った。今回リンパ球を使用したＭＥＬ−００７の患者では、ＭＡＧＥ３ １９５−２０３にて処理した樹状細胞の投与を行ったが、約２ｃｍ大の頚部リンパ節転移巣が著明に縮小を認め、明確な臨床的効果が得られている（図９）。また免疫反応のモニタリング検査であるＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、末梢血中にＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチドに対する特異的なＣＴＬ細胞の陽性反応（◇）が確認され、臨床効果と相関した結果が得られている（図１０）。
ｅｘ ｖｉｖｏにて前述のＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球から誘導・増幅されたペプチド特異的なＣＴＬ細胞（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞）について、ＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体パネル（ＩＯＴｅｓｔＲ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ， Beckman Coulter社）を用いて、有意に増加したレパトワの同定を行った。その結果を図１１に示す。図１１に示されているとおり、ほとんどのレパトワ抗体では、比率が５％以下であったが、ＴＣＲＶβ３．０（ＴＣＲＶβ３）とＴＣＲＶβ１３．１に対する陽性ＣＴＬ細胞の比率の増加が確認された。より具体的には、図１２に示されているとおり、ＴＣＲＶβ３．０陽性細胞の比率は２４．７％、ＴＣＲＶβ１３．１陽性細胞の比率は１１．０％であった。
ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチドにて処理を行ったＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡーＡ−＊２４０２遺伝子を導入後、Ａ２４陽性細胞をクローニングした細胞）にて、前述のＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を刺激し、その刺激により細胞内に産生されたＩＦＮ−γを細胞内染色してフローサイトメトリーで検出した。その結果を図１３に示す。図１３に示されているとおり、上述の刺激により全体の６．８％の比率のＣＴＬ細胞にＩＦＮ−γの産生が認められた。一方、ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチドによる処理を行わなかったＴ２−Ａ２４細胞による刺激を行った場合（コントロール）は、ＩＦＮ−γの産生は見られなかった。
上記図１２及び図１３の実験の結果を考慮して、最終的に増幅効率が高かったＴＣＲＶβ３．０陽性のＣＴＬ細胞を、特異的なＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体及び磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化したところ、陽性細胞は９７％であった。これらの純化したＣＴＬ細胞を、次のＴＣＲβ鎖の遺伝子解析に用いた。
上述の純化した細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴＣＲレパトワ解析により発現ＴＣＲの遺伝子分類を行い、その解析結果に基づいてＴＣＲタンパク質コード領域遺伝子をクローニングした。ＣＴＬは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体のＴＣＲタンパク質を発現する。今回我々の決定した遺伝子配列はβ鎖に対応するものである。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、前述のＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅断片の塩基配列を解析した。具体的には、前述のＴＣＲβ鎖遺伝子に対応するセンスプライマー（gcagccatgggaatcaggctcctctgt：配列番号２７）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、そのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。このＴＣＲβ鎖遺伝子の構成はＴＲＢＶ２８＊０１―ＴＲＢＤ１＊０１―ＴＲＢＪ１−１＊０１―ＴＲＢＣ１であった。また、Ｖ−Ｄ−Ｊの接合部分の塩基配列につき、前述のＩＭＧＴの公開ソフト（JunctionAnalysis）を用いた解析結果を図１４に示す。また、ＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列についてＮＣＢＩの相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ）による解析を行った。その結果、全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合領域を含む部分断片（３３７−３７２、３６塩基）の塩基配列については、完全に一致するものはなかった。全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合部を中心とした部分断片（６０アミノ酸）のアミノ酸配列について検索した場合でも、相同性が高いものはあるが、抗原特異性を決定する接合領域に関して完全に一致する登録はなかった。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、前述のＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅断片の塩基配列を解析した。具体的には、前述のＴＣＲβ鎖遺伝子に対応するセンスプライマー（gcagccatgggaatcaggctcctctgt：配列番号２７）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、そのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。このＴＣＲβ鎖遺伝子の構成はＴＲＢＶ２８＊０１―ＴＲＢＤ１＊０１―ＴＲＢＪ１−１＊０１―ＴＲＢＣ１であった。また、Ｖ−Ｄ−Ｊの接合部分の塩基配列につき、前述のＩＭＧＴの公開ソフト（JunctionAnalysis）を用いた解析結果を図１４に示す。また、ＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列についてＮＣＢＩの相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ）による解析を行った。その結果、全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合領域を含む部分断片（３３７−３７２、３６塩基）の塩基配列については、完全に一致するものはなかった。全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合部を中心とした部分断片（６０アミノ酸）のアミノ酸配列について検索した場合でも、相同性が高いものはあるが、抗原特異性を決定する接合領域に関して完全に一致する登録はなかった。
実施例３で得られたＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲβ鎖遺伝子がＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞へ導入された場合に、該遺伝子産物である受容体タンパク質が発現し、腫瘍特異的な細胞障害活性を誘導しうるか否かにつき検討した。
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性のメラノーマ患者由来のナイーブリンパ球細胞をＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製）＋５％ヒト血清（Cambrex社製）培地に懸濁した。あらかじめ抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ，ヤンセンファーマ社製）と抗ヒトＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ，BD Pharmingen社製）にて２時間コーテイングを行った７５ｃｍ２フラスコに、上記培地に懸濁したナイーブリンパ球を２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で播種し、５日間培養を行った。上記の抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体との併用により増殖刺激されたリンパ球を回収し、Human T cell Nucleofector kit (Amaxa社製)を用いて、取扱説明書に従い当該ＴＣＲβ鎖遺伝子のエレクトロポレーション法（Nucleofector装置, Amaxa社製）による遺伝子導入を行った。エレクトロポレーション法による遺伝子導入は、具体的には、以下のように行った。
まず５×１０６個の刺激後のリンパ球をそれぞれ１００μｌのエレクトロポレーション用ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、ｍｏｃｋ（４μｇ）、ＧＦＰ（４μｇ）又はＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）を加え、キュベットに移し変えてNucleofector装置にサンプルをセットし、プログラムＮｏ．２３でエレクトロポレーションを実施した。その際、ｍｏｃｋとして使用したベクターはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子を切り出したものを用い、ＧＦＰ遺伝子としてはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターを用い、ＴＣＲβ遺伝子としては、ｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子をＴＣＲβ鎖遺伝子に乗せ変えたものを作製し、使用した。細胞を回収後、１２−ウェルプレートに移してＧＴ−Ｔ−５０３＋５％ヒト血清培地にて４８時間培養を行った後、フローサイトメトリー（FACSCalibur, BD）にてＧＦＰ及びＴＣＲβ鎖遺伝子の導入効率を検討した。その結果を図１５に示す。発現用のコントロール遺伝子であるＧＦＰ遺伝子は、全リンパ球の５９．３％に導入発現されており（Ｔリンパ球全体の約６２％）、エレクトロポレーション法によるヒトリンパ球細胞への遺伝子導入実験自体は、成功したものと考えられた。また、ＭＡＧＥ３−Ａ２４特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子の発現は３３．９％の細胞に確認され、良好な発現効率が認められた。
なお、ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子発現リンパ球の細胞障害活性などの機能解析実験は今後行う予定である。
［ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド又はｇｐ１００−Ａ２特異的ＴＣＲβ鎖について］
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ１ ２７−３５（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３）又はｇｐ１００ ２０９−２１７（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号４）にて処理した樹状細胞及びＴ２細胞を用いて４回刺激を行った。
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ１ ２７−３５（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３）又はｇｐ１００ ２０９−２１７（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号４）にて処理した樹状細胞及びＴ２細胞を用いて４回刺激を行った。
ｅｘ ｖｉｖｏにて前述のＨＬＡ−Ａ２陽性の患者由来のリンパ球から誘導・増幅されたＡ２ペプチド（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド又はｇｐ１００−Ａ２ペプチド）特異的なＣＴＬ細胞をテトラマーにて染色し、増幅されたＡ２ペプチド特異的テトラマー陽性ＣＴＬ細胞（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞やｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞）について定量的な評価を行った。その結果を図１６に示す。図１６に示されているとおり、対照コントロールのテトラマーであるＦｌｕ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）−ＭＰテトラマーでは、ほとんど陽性細胞は認められない（０．０４％）が、ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー染色やｇｐ１００−Ａ２テトラマー染色では、それぞれ７８．８％、４４．３％と高率に陽性ＣＴＬ細胞の増幅が認められた。
ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞について、ＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体パネル（ＩＯＴｅｓｔＲ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ，Beckman Coulter社）を用いて、有意に増加したレパトワの同定を行った。その結果、ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭＥＬ−００６症例（case1）では、レパトワ抗体パネルのスクリーニングにて４種類のレパトワ（ＴＣＲＶβ１、ＴＣＲＶβ２、ＴＣＲＶβ７．１及びＴＣＲＶβ１４）の増加が検出された。
ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理を行ったＴ２細胞にて、前述のＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞又はｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を刺激し、その刺激により細胞内に産生されたＩＦＮ−γを細胞内染色してフローサイトメトリーで検出した。その結果を図１７に示す。図１７に示されているとおり、ＴＣＲＶβ１陽性のＣＴＬ細胞群において、ＩＦＮ−γの産生が最も強く認められた。そこで、ＴＣＲＶβ１陽性のＣＴＬ細胞を、特異的なＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体及び磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化したところ、陽性細胞は９５％以上であった。これらの純化したＣＴＬ細胞を、後述のＴＣＲβ鎖の遺伝子解析に用いた。
また、ｇｐ１００−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭＥＬ−００８症例（case2）において、ＨＬＡ−Ａ２テトラマーに対するモノクローナル抗体及び磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化したところ、９８％以上の純度でｇｐ１００−Ａ２テトラマー陽性細胞の集団が得られた（図１８左）。また、得られたｇｐ１００−Ａ２テトラマー陽性細胞を、レパトワ抗体で染色したところ、テトラマーsortingされたほとんどすべての細胞は、ＴＣＲＶβ８を有していることが確認された（図１８右）。そこで、前述の陽性細胞を、次のＴＣＲβ鎖の遺伝子解析に用いた。
上述の純化した細胞（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞又はｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞）からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴＣＲレパトワ解析により発現ＴＣＲの遺伝子分類を行い、その解析結果に基づいてＴＣＲタンパク質コード領域遺伝子をクローニングした。ＣＴＬは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体のＴＣＲタンパク質を発現する。今回我々の決定した遺伝子配列はβ鎖に対応するものである。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅断片の塩基配列を解析した。具体的には、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的タンパク質遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するセンスプライマー（cctgccatgggcttcaggctcctctgc：配列番号２８）とアンチセンスプライマー（ctagcctctggaatcctttctcttgacc：配列番号２９）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、そのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。また、ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的タンパク質遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）についても、それに対応するセンスプライマー（tctgccatggactcctggaccctctgc：配列番号３０）とアンチセンスプライマー（配列番号２９）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、そのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅断片の塩基配列を解析した。具体的には、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的タンパク質遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するセンスプライマー（cctgccatgggcttcaggctcctctgc：配列番号２８）とアンチセンスプライマー（ctagcctctggaatcctttctcttgacc：配列番号２９）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、そのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。また、ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的タンパク質遺伝子（ＴＣＲβ鎖遺伝子）についても、それに対応するセンスプライマー（tctgccatggactcctggaccctctgc：配列番号３０）とアンチセンスプライマー（配列番号２９）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、そのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
実施例５で得られたＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲβ鎖遺伝子、又は、ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲβ鎖遺伝子がＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ナイーブＴ細胞へ導入された場合に、該遺伝子産物である受容体タンパク質が発現し、腫瘍特異的な細胞障害活性を誘導しうるか否かにつき検討した。
実施例５で得られたＴＣＲβ鎖遺伝子をクローニングした患者とは異なるＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のメラノーマ患者由来のナイーブリンパ球細胞をＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製）＋５％ヒト血清（Cambrex社製）培地に懸濁した。あらかじめ抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ，ヤンセンファーマ社製）と抗ヒトＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ，BD Pharmingen社製）にて２時間コーテイングを行った７５ｃｍ２フラスコに、上記培地に懸濁したナイーブリンパ球を２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で播種し、５日間培養を行った。上記の抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体との併用により増殖刺激されたリンパ球を回収し、Human T cell Nucleofector kit (Amaxa社製)を用いて、取扱説明書に従い当該ＴＣＲβ鎖遺伝子のエレクトロポレーション法（Nucleofector装置, Amaxa社製）による遺伝子導入を行った。エレクトロポレーション法による遺伝子導入は、具体的には、以下のように行った。
まず５×１０６個の刺激後のリンパ球をそれぞれ１００μｌのエレクトロポレーション用ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、ＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）を加え、キュベットに移し変えてNucleofector装置にサンプルをセットし、プログラムＮｏ．２３でエレクトロポレーションを実施した。その際、ＴＣＲβ鎖遺伝子としては、ｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子をＴＣＲβ鎖遺伝子に乗せ変えたものを作製し、使用した。細胞を回収後、１２−ウェルプレートに移してＧＴ−Ｔ−５０３＋５％ヒト血清培地にて４８時間培養を行った後、フローサイトメトリー（FACSCalibur, BD社製）にてＧＦＰ及びＴＣＲβ鎖遺伝子の導入効率を検討した。その結果を図１９に示す。図１９に示されているとおり、ＴＣＲＶβ１遺伝子（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）及びＴＣＲＶβ８遺伝子（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子）の導入効率は、それぞれ２３．９％、１３．３％であった。
また、実施例６の上記遺伝子導入実験において、ＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡに代えてＧＦＰ遺伝子（４μｇ）を用いて同様の実験を行った。その結果を図２０に示す。図２０に示されているとおり、ＧＦＰ遺伝子のエレクトロポレーション法（ＥＰ法）によるナイーブＴ細胞への導入効率は４３．３％であり、良好であった。
また、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理したＴ２細胞に対する、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴＣＲβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を評価した。ＴＣＲβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ナイーブＴ細胞としては、前記エレクトロポレーションによりＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）、ｍｏｃｋ（４μｇ）、又はＧＦＰ（２μｇ）を導入した細胞を使用した。また、Ｔ２細胞をＰＢＳ＋１％ヒト血清アルブミン溶液に懸濁し、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドを最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートした。該ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド処理したＴ２細胞１×１０５個を、同数の前記ＴＣＲβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ナイーブＴ細胞と共に混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド処理したＴ２細胞に対する、前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。その結果を図２１に示す。また、ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的なＴＣＲβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性についても同様に評価した。その結果を図２１に示す。図２１の結果から分かるように、ＭＡＲＴ１−Ａ２及びｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的なＴＣＲβ鎖遺伝子を導入されたナイーブＴ細胞は、それぞれ標的細胞を処理したペプチド特異的に刺激され、有意なＩＦＮ−γの産生が確認された。これにより、これらＴＣＲβ鎖遺伝子が細胞障害活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
［ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖について］
本研究では、末期がんであるＨＬＡ−Ａ２４陽性の転移性メラノーマ患者６例（Ｍ３、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１８）由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ；配列番号５）にて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行い、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドに特異的なＣＴＬ ｌｉｎｅの作製を試みた（図２２）。ＣＴＬ ｌｉｎｅの作製は具体的には以下のようなプロトコールで行った。
本研究では、末期がんであるＨＬＡ−Ａ２４陽性の転移性メラノーマ患者６例（Ｍ３、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１８）由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ；配列番号５）にて処理した樹状細胞及びＴ２−Ａ２４細胞（Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を導入し発現させたもの）を用いて４回刺激を行い、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドに特異的なＣＴＬ ｌｉｎｅの作製を試みた（図２２）。ＣＴＬ ｌｉｎｅの作製は具体的には以下のようなプロトコールで行った。
まず最初に、患者由来のリンパ球を２．５〜５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で、６−ウェルプレートに播種した後、非接着細胞の回収を行い、一時凍結保存した。一方、接着細胞については、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＴＮＦ−αの存在下にて培養し、成熟樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ：ＤＣ）を得た。播種から７日後に、樹状細胞をＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド及びβ２−ミクログロブリンにて処理後、放射線照射した。放射線照射した成熟樹状細胞（ＤＣ）と、凍結保存しておいた前述の非接着細胞（Ｔ細胞）とで共培養を行った。（ＤＣ：Ｔ＝１：１０〜１：１００（細胞数比））。共培養中の培養液にＩＬ−７、ＩＬ−２を必要量添加した。播種から１４日後に、同様の刺激をＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的なＣＴＬ細胞に対して再度行った。さらに、播種から２１日後及び２８日後に、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドにて処理したＴ２−Ａ２４細胞により、ＣＴＬ細胞を刺激増幅した（Ｔ２−Ａ２４：ＣＴＬ＝１：１０（細胞数比））。播種から３５日後に、増幅されたＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を、後述のＩＦＮ−γの産生刺激などの機能的アッセイやＭＡＣＳによるソーテイングの実験に利用した。
ｅｘ ｖｉｖｏにて前述のＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球から誘導・増幅されたペプチド特異的なＣＴＬ細胞（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞）をテトラマーにて染色し、増幅されたＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞（ＣＭＶｐｐ６５ Ａ２４テトラマー＋ＣＤ８＋陽性ＣＴＬ）について定量的な評価を行った。その結果を図２３に示す。図２３左に示されているように、６例中４例（Ｍ３、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１８）で、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の比率が、刺激前の１％以下から、最大平均３３．３％[６５．９％（Ｍ３）１１．２％（Ｍ７）、３５％（Ｍ９）、２１％（Ｍ１８）]にまで増幅した。特にＭ３症例では、樹状細胞２回のみの刺激で著明な増幅効果が見られた。しかし、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の細胞数については、明らかな増加を確認できたのは３例（Ｍ３、Ｍ７、Ｍ１８）であった（図２３右）。また、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の細胞数の増幅の程度を、刺激前の細胞数を１００とし、刺激後の細胞数をそれに対する比率で示した（図２４）。刺激増幅後、細胞数の明らかな増加が認められた３例（Ｍ３、Ｍ７、Ｍ１８）では、経過中に２．１〜２０７倍の範囲内で増加が認められ、最大で平均８０．９倍の増幅効果が確認された。特に、最も増幅効果の高かったＭ３症例では、最大２０７倍にまでＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を増加させることができた。
なお、図２３でテトラマー陽性細胞比率の増加が認められた各症例（Ｍ３、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１８）における、増幅前後のフローサイトメトリーのデータをそれぞれ図２５、図２６、図２７、図２８に示す。これらの図から、テトラマー染色のコントロールとして用いたＨＬＡ−Ａ２４ＨＩＶテトラマーによる染色では、前述の陽性細胞は確認されなかったことが示された。
また、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞について、ＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体パネル（ＩＯＴｅｓｔＲ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて、有意に増加したレパトワの同定を行った。その結果、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭ３症例では、レパトワ抗体パネルのスクリーニングにてＴＣＲＶβ７．１の増加が検出され、Ｍ７症例ではＴＣＲＶβ１７の増加が検出され、Ｍ９症例ではＴＣＲＶβ７．１の増加が検出された。
ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を、各症例について増加が検出されたレパトワにて染色し、陽性細胞について定量的な評価を行った。その結果を図２９に示す。図２９に示されているとおり、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭ３症例では、ＴＣＲＶβ７．１が陽性であった細胞が９４．９％、Ｍ７症例では、ＴＣＲＶβ１７が陽性であった細胞が６２．５％、Ｍ９症例では、ＴＣＲＶβ７．１が陽性であった細胞が５４．３％であった。
ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドにて処理を行ったＬＣＬ（ＥＢ ｖｉｒｕｓにて不死化したヒトＢ細胞培養株）であるＴＩＳＩ細胞にて、前述のＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を刺激し、その刺激により細胞内に産生されたＩＦＮ−γを細胞内染色してフローサイトメトリーで検出した。その結果を図３０に示す。図３０に示されているとおり、すべての症例のＣＴＬ細胞において、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド処理したＴＩＳＩ細胞にて刺激した場合にのみ、大量のＩＦＮ−γが産生された。また、Ｍ９症例のＩＦＮ−γの産生量は、他の２症例と比較して低い傾向があった。
また、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４テトラマー又はＴＣＲレパトワ特異的に細胞障害活性が誘導されるかを確認する目的で、標的細胞にて刺激したＭ３症例由来のＣＴＬ細胞のＩＦＮ−γ抗体を用いた細胞内染色を行った。その結果を図３１に示す。図３１に示されているとおり、コントロールペプチドであるＣＥＡ Ａ２４ペプチドによる刺激では、ＩＦＮ−γの産生は見られなかったが、ＣＭＶ Ａ２４ペプチドによる刺激の場合、テトラマー陽性細胞の６１．５％に、ＴＣＲＶβ７．１抗体陽性細胞の７０．１％にＩＦＮ−γの産生が確認された。
上記図２９の実験の結果を考慮して、Ｍ３症例からはＴＣＲＶβ７．１陽性ＣＴＬ細胞を、Ｍ７症例からはＴＣＲＶβ１７陽性ＣＴＬ細胞を、Ｍ９症例からはＴＣＲＶβ７．１細胞を、特異的なＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体及び磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化したところ、各陽性細胞は９５％以上であった。これらの純化した各ＣＴＬ細胞を、次のＴＣＲβ鎖の遺伝子解析に用いた。
上述の純化した３種の細胞からそれぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴＣＲレパトワ解析により発現ＴＣＲの遺伝子分類を行い、その解析結果に基づいて３種のＴＣＲタンパク質コード領域遺伝子（Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子、Ｍ７ＴＣＲβ鎖遺伝子、Ｍ９ＴＣＲβ鎖遺伝子）をクローニングした。ＣＴＬは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体のＴＣＲタンパク質を発現する。今回我々の決定した遺伝子配列はβ鎖に対応するものである。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、前述のＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする３種の遺伝子（Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子、Ｍ７ＴＣＲβ鎖遺伝子、Ｍ９ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行い、３種の増幅断片の塩基配列を解析した。Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子について具体的には、該ＴＣＲβ鎖遺伝子に対応するセンスプライマー（配列番号２５）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１７に、そのアミノ酸配列を配列番号１８に示す。また、Ｍ７ＴＣＲβ鎖遺伝子について具体的には、該ＴＣＲβ鎖遺伝子に対応するセンスプライマー（tgcactatgagcaaccaggtgctctgc：配列番号３１）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号１９に、そのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。また、Ｍ９ＴＣＲβ鎖遺伝子について具体的には、該ＴＣＲβ鎖遺伝子に対応するセンスプライマー（配列番号２５）とアンチセンスプライマー（配列番号２９）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号２１に、そのアミノ酸配列を配列番号２２に示す。これら３クローンのＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を決定したところ、Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子の構成はＴＲＢＶ４−１＊０１―ＴＲＢＤ１＊０１―ＴＲＢＪ１−２＊０１―ＴＲＢＣ１であり、Ｍ７ＴＣＲβ鎖遺伝子の構成は、ＴＲＢＶ１９＊０１―ＴＲＢＤ１＊０１―ＴＲＢＪ１−２＊０１―ＴＲＢＣ１であり、Ｍ９ＴＣＲβ鎖遺伝子の構成はＴＲＢＶ４−１＊０１―ＴＲＢＤ２＊０１―ＴＲＢＪ１−２＊０１―ＴＲＢＣ１であった。また、これら３クローンのＴＣＲβ鎖遺伝子のＶ−Ｄ−Ｊの接合部分の塩基配列につき、前述のＩＭＧＴの公開ソフト（JunctionAnalysis）を用いた解析結果をそれぞれ図３２〜３４に示す。また、これら３クローンのＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列についてＮＣＢＩの相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ）による解析を行った。その結果、全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合領域を含む部分断片（Ｍ３： ３３７−３７８、４２塩基）（Ｍ７：３３７−３７２、３６塩基）（Ｍ９：３３７−３７８、４２塩基）の塩基配列については、完全に一致するものはなかった。全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合部を中心とした部分断片（６０アミノ酸）のアミノ酸配列について検索した場合でも、相同性が高いものはあるが、抗原特異性を決定する接合領域に関して完全に一致する登録はなかった。
実施例７で得られたＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲβ鎖遺伝子がＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞へ導入された場合に、該遺伝子産物である受容体タンパク質が発現し、腫瘍特異的な細胞障害活性を誘導しうるか否かにつき検討した。
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性のメラノーマ患者由来のナイーブリンパ球細胞をＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製）＋５％ヒト血清（Cambrex社製）培地に懸濁した。あらかじめ抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ，ヤンセンファーマ社製）と抗ヒトＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ，BD Pharmingen社製）にて２時間コーテイングを行った７５ｃｍ２フラスコに、上記培地に懸濁したナイーブリンパ球を２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で播種し、５日間培養を行った。上記の抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体との併用により増殖刺激されたリンパ球を回収し、Human T cell Nucleofector kit (Amaxa社製)を用いて、取扱説明書に従い当該ＴＣＲβ鎖遺伝子のエレクトロポレーション法（Nucleofector装置, Amaxa社製）による遺伝子導入を行った。エレクトロポレーション法による遺伝子導入は、具体的には、以下のように行った。
まず５×１０６個の刺激後のリンパ球をそれぞれ１００μｌのエレクトロポレーション用ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、ＧＦＰ（２μｇ）又はＭ３ＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）を加え、キュベットに移し変えてNucleofector装置にサンプルをセットし、プログラムＮｏ．２３でエレクトロポレーションを実施した。その際、ＧＦＰ遺伝子としてはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターを用い、Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子としては、ｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子をＭ３ＴＣＲβ鎖遺伝子に乗せ変えたものを作製し、使用した。細胞を回収後、１２−ウェルプレートに移してＧＴ−Ｔ−５０３＋５％ヒト血清培地にて４８時間培養を行った後、フローサイトメトリー（FACSCalibur, BD社製）にてＧＦＰ及びＭ３ＴＣＲβ鎖遺伝子の導入効率を検討した。その結果を図３５に示す。発現用のコントロール遺伝子であるＧＦＰ遺伝子は、全リンパ球の５９．３％に導入発現されており（Ｔリンパ球全体の約６２％）、エレクトロポレーション法によるヒトリンパ球細胞への遺伝子導入実験自体は、成功したものと考えられた。一方、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子（Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子）は、３８．３％の細胞で発現が確認され、良好な発現効率が認められた。
また、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドにて処理したＴＩＳＩ細胞に対する、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的なＴＣＲβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を評価した。前述のＴＣＲβ鎖遺伝子（Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子）を導入発現したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞としては、前記エレクトロポレーションによりＭ３ＴＣＲβ鎖遺伝子のＤＮＡ（４μｇ）又はＧＦＰ（２μｇ）を導入した細胞を使用した。また、ＴＩＳＩ細胞をＰＢＳ＋１％ヒト血清アルブミン溶液に懸濁し、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチドを最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートした。該ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド処理したＴＩＳＩ細胞１×１０５個を、同数の前記Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性ナイーブＴ細胞と共に混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド処理したＴＩＳＩ細胞に対する、前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。その結果を図３６に示す。図３６の結果から分かるように、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子（Ｍ３ＴＣＲβ鎖遺伝子）を導入したリンパ球のみＩＦＮ−γが刺激され、本ＴＣＲβ鎖遺伝子がコードするＴＣＲβ鎖を発現したＴ細胞が、ＣＭＶ特異的な細胞障害活性を有することが示唆された。
［ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖について］
本研究では、末期がんであるＨＬＡ−Ａ２陽性の転移性メラノーマ患者４例（Ｍ８、Ｍ１０、Ｍ１９、Ｍ５−ＳＣＣ）由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号６）にて処理した樹状細胞及びＴ２細胞を用いて４回刺激を行い、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチドに特異的なＣＴＬ ｌｉｎｅの作製を試みた（図３７）。ＣＴＬ ｌｉｎｅの作製は具体的には以下のようなプロトコールで行った。
本研究では、末期がんであるＨＬＡ−Ａ２陽性の転移性メラノーマ患者４例（Ｍ８、Ｍ１０、Ｍ１９、Ｍ５−ＳＣＣ）由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号６）にて処理した樹状細胞及びＴ２細胞を用いて４回刺激を行い、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチドに特異的なＣＴＬ ｌｉｎｅの作製を試みた（図３７）。ＣＴＬ ｌｉｎｅの作製は具体的には以下のようなプロトコールで行った。
まず最初に、患者由来のリンパ球を２．５〜５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で、６−ウェルプレートに播種した後、非接着細胞の回収を行い、一時凍結保存した。一方、接着細胞については、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＴＮＦ−αの存在下にて培養し、成熟樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ：ＤＣ）を得た。播種から７日後に、樹状細胞をＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド及びβ２−ミクログロブリンにて処理後、放射線照射した。放射線照射した成熟樹状細胞（ＤＣ）と、凍結保存しておいた前述の非接着細胞（Ｔ細胞）とで共培養を行った。（ＤＣ：Ｔ＝１：１０〜１：１００（細胞数比））。共培養中の培養液にＩＬ−７、ＩＬ−２を必要量添加した。播種から１４日後に、同様の刺激をＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的なＣＴＬ細胞に対して再度行った。さらに、播種から２１日後及び２８日後に、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチドにて処理したＴ２細胞により、ＣＴＬ細胞を刺激増幅した（Ｔ２：ＣＴＬ＝１：１０（細胞数比））。播種から３５日後に、増幅されたＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を、後述のＩＦＮ−γの産生刺激などの機能的アッセイやＭＡＣＳによるソーテイングの実験に利用した。
ｅｘ ｖｉｖｏにて前述のＨＬＡ−Ａ２陽性の患者由来のリンパ球から誘導・増幅されたペプチド特異的なＣＴＬ細胞（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞）をテトラマーにて染色し、増幅されたＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー＋ＣＤ８＋陽性ＣＴＬ）について定量的な評価を行った。その結果を図３８上に示す。図３８上に示されているように、４例中１例（Ｍ８）で、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の比率が、刺激前の１％以下から、最大２０％以上にまで増幅した。一方、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の細胞数については、３例（Ｍ８、Ｍ１０、Ｍ５−ＳＳＣ）で増加傾向が見られ、特に、Ｍ８症例では、刺激前の４４８倍と、最も効率的に特異的ＣＴＬ細胞の誘導が見られた（図３８下）。
なお、Ｍ８における、増幅前後のフローサイトメトリーのデータをそれぞれ図３９に示す。増幅前のテトラマー陽性細胞比率は１％以下（０．２７％）であったが、ＤＣ２回刺激後は２．１４％に、さらにＴ２細胞で２回刺激後は２４．８％まで増加した。一方、テトラマー染色のコントロールとして用いたＨＬＡ−Ａ２ Ｆｌｕ−ＭＰテトラマーによる染色では、陽性細胞の増幅は確認されなかった。
また、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞について、ＴＣＲレパトワに対するモノクローナル抗体パネル（ＩＯＴｅｓｔＲ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ，Beckman Coulter社）を用いて、有意に増加したレパトワの同定を行った。その結果を図４０に示す。図４０に示されているように、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞の増幅を認めたＭ８症例では、レパトワ抗体パネルのスクリーニングにてＴＣＲＶβ８及びＴＣＲＶβ１４の増加が検出された。すなわち、ＴＣＲＶβ８が陽性であった細胞が１４．８％、ＴＣＲＶβ１４が陽性であった細胞が７．３％であった。
ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチドにて処理を行ったＴ２細胞にて、前述のＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を刺激し、その刺激により細胞内に産生されたＩＦＮ−γを細胞内染色してフローサイトメトリーで検出した。その結果を図４１に示す。図４１に示されているとおり、ＣＤ８及びＩＦＮ−γの両方が陽性のＣＴＬ細胞の比率は２１．２％であり、そのうち、ＩＦＮ−γ陽性のＣＴＬ細胞のほとんどすべてがＴＣＲＶβ８陽性のＣＴＬ細胞であった（２２．７％）。この結果から、細胞障害活性を有するＣＴＬ細胞のＴＣＲレパトワは、ＴＣＲＶβ８であることが確認された。
後述のＴＣＲβ鎖遺伝子の解析に利用するために、Ｍ８由来のＴＣＲＶβ８陽性ＣＴＬ細胞を以下の方法で選別した。
Ｍ８症例由来のリンパ球をＩｎ ｖｉｔｒｏにてＤＣで２回、Ｔ２細胞で３回刺激をして得られた増幅されたＣＭＶＡ２テトラマー陽性細胞を、テトラマーｓｏｒｔｉｎｇしたところ、増幅後のＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー及びＣＤ８陽性ＣＴＬ細胞（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー＋ＣＤ８＋陽性ＣＴＬ）並びにＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー及びＴＣＲＶβ８陽性ＣＴＬ細胞（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２テトラマー＋ＴＣＲＶβ８＋陽性ＣＴＬ）の細胞の比率は、それぞれ４３．１％及び４４．６％であった（図４２）。ＰＥ−ＣＭＶＡ２テトラマー試薬と抗ＰＥ抗体−マイクロビーズを用いてＣＴＬ細胞を染色し、ＭＡＣＳ法にてテトラマー陽性細胞を選別したところ、該陽性細胞の純度は９５．６％であった（図４２）。選別された前記陽性細胞のうち、ほとんどすべてがＴＣＲＶβ８陽性であった。これらの純化したＣＴＬ細胞を、次のＴＣＲβ鎖の遺伝子解析に用いた。
上述の純化した細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴＣＲレパトワ解析により発現ＴＣＲの遺伝子分類を行い、その解析結果に基づいてＴＣＲタンパク質コード領域遺伝子（Ｍ８ＴＣＲβ鎖遺伝子）をクローニングした。ＣＴＬは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体のＴＣＲタンパク質を発現する。今回我々の決定した遺伝子配列はβ鎖に対応するものである。
ＴＣＲレパトワ解析の結果に基づいて、前述のＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードする遺伝子（Ｍ８ＴＣＲβ鎖遺伝子）に対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅断片の塩基配列を解析した。Ｍ８ＴＣＲβ鎖遺伝子について具体的には、該ＴＣＲβ鎖遺伝子に対応するセンスプライマー（配列番号３０）とアンチセンスプライマー（配列番号２６）を用いて、該ＴＣＲβ鎖遺伝子のコード領域全域の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした。このＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を配列番号２３に、そのアミノ酸配列を配列番号２４に示す。このＭ８ＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列を決定したところ、Ｍ８ＴＣＲβ鎖遺伝子の構成はＴＲＢＶ１２−４＊０１―ＴＲＢＤ１＊０１―ＴＲＢＪ１−２＊０１―ＴＲＢＣ１であった。また、このＭ８ＴＣＲβ鎖遺伝子のＶ−Ｄ−Ｊの接合部分の塩基配列につき、前述のＩＭＧＴの公開ソフト（JunctionAnalysis）を用いた解析結果をそれぞれ図４３に示す。また、このＭ８ＴＣＲβ鎖遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列についてＮＣＢＩの相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ）による解析を行った。その結果、全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合領域を含む部分断片（３４０−３６９、３０塩基）の塩基配列については、完全に一致するものはなかった。全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合部を中心とした部分断片（６０アミノ酸）のアミノ酸配列について検索した場合でも、相同性が高いものはあるが、抗原特異性を決定する接合領域に関して完全に一致する登録はなかった。
なお、ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子発現リンパ球の細胞障害活性などの機能解析実験は今後行う予定である。
［ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＴＣＲα鎖について］
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、前述のＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４の患者（Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９）を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ１ ２７−３５（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３）、ｇｐ１００ ２０９−２１７（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号４）、ＭＡＧＥ１ １３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド：ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ；配列番号１）若しくはＭＡＧＥ３ １９５−２０３（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド：ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ；配列番号２）、又は、サイトメガロウイルスに特異的なペプチドであるＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ；配列番号５）若しくはＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号６）にて処理した樹状細胞を用いて４回刺激を行った。この刺激によって誘導された、前記の各種ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞を、ＰＥで標識した各種テトラマーにて染色し、テトラマー染色陽性のＣＴＬ細胞を、磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化した。純化して得られた各種のテトラマー染色陽性ＣＴＬ細胞を、次のＴＣＲα鎖のレパトワ解析に用いた。
国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られた転移性メラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、前述のＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４の患者（Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９）を対象に腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本臨床研究では、樹状細胞ワクチン投与を受けたＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ１ ２７−３５（ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３）、ｇｐ１００ ２０９−２１７（ｇｐ１００−Ａ２ペプチド：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号４）、ＭＡＧＥ１ １３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド：ＮＹＫＨＣＦＰＥＩ；配列番号１）若しくはＭＡＧＥ３ １９５−２０３（ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド：ＩＭＰＫＡＧＬＬＩ；配列番号２）、又は、サイトメガロウイルスに特異的なペプチドであるＣＭＶｐｐ６５ ３４１−３４９（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ；配列番号５）若しくはＣＭＶｐｐ６５ ４９５−５０３（ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号６）にて処理した樹状細胞を用いて４回刺激を行った。この刺激によって誘導された、前記の各種ペプチドに特異的なＣＴＬ細胞を、ＰＥで標識した各種テトラマーにて染色し、テトラマー染色陽性のＣＴＬ細胞を、磁気ビーズ細胞分離装置（Ａｕｔｏ−ｍａｇｎｅｔ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を利用して純化した。純化して得られた各種のテトラマー染色陽性ＣＴＬ細胞を、次のＴＣＲα鎖のレパトワ解析に用いた。
［ＴＣＲα鎖のレパトワ解析］
上記実施例１０で得られた各種のテトラマー染色陽性ＣＴＬ細胞のうち、まずＭ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ（ＭＡＲＴ−Ａ２テトラマー陽性）についてＴＣＲα鎖のレパトワ解析を行った。すなわち、このＣＴＬからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ２μｇを用いた逆転写反応にてｃＤＮＡを合成し、合成により得られたｃＤＮＡ全量に対して１／４０量のｃＤＮＡとＴＣＲα鎖ｃＤＮＡレパトワ解析用プライマーとを用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の解析を試みた。ＴＣＲα鎖ｃＤＮＡレパトワ解析用プライマーとしては、３３種類のセンスプライマー（HAV1Aセンスプライマー：TCTGGTATGTGCAATACCCCAACC：配列番号７９； HAV1Bセンスプライマー：CTGAGGAAACCCTCTGTGCA：配列番号８０； HAV2センスプライマー：GATGGAAGGTTTACAGCACAGCTC：配列番号８１； HAV3センスプライマー：CACAGTGGAAGATTAAGAGTCACGC：配列番号８２； HAV4Aセンスプライマー：AACAGAATGGCCTCTCTGGC：配列番号８３； HAV4Bセンスプライマー：GGATTGCGCTGAAGGAAGAG：配列番号８４； HAV5センスプライマー：TGAAGGTCACCTTTGATACCACCC：配列番号８５； HAV6センスプライマー：AATCCGCCAACCTTGTCATCTCCG：配列番号８６； HAV7センスプライマー：AACTGCACGTACCAGACATC：配列番号８７； HAV8センスプライマー：ACCCTGAGTGTCCAGGAGGG：配列番号８８； HAV9センスプライマー：CACTGCTGACCTTAACAAAGGCG：配列番号８９； HAV10センスプライマー：TCCTGGTGACAGTAGTTACG：配列番号９０； HAV11センスプライマー：AGGCTCAAAGCCTTCTCAGCAGGG：配列番号９１； HAV12センスプライマー：TCCACCAGTTCCTTCAACTTCACC：配列番号９２； HAV13センスプライマー：TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC：配列番号９３； HAV14センスプライマー：CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT：配列番号９４； HAV15センスプライマー：GGATAAACATCTGTCTCTGCG：配列番号９５； HAV16センスプライマー：GATAGCCATACGTCCAGATG：配列番号９６； HAV18センスプライマー：TGCCACTCTTAATACCAAGGAGGG：配列番号９７； HAV19センスプライマー：ACACTGGCTGCAACAGCATC：配列番号９８； HAV20センスプライマー：TTACAAACGAAGTGGCCTCC：配列番号９９； HAV21センスプライマー：ACCCTGCTGAAGGTCCTACATTCC：配列番号１００； HAV22センスプライマー：CTTGGAGAAAGGCTCAGTTC：配列番号１０１； HAV23センスプライマー：TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG：配列番号１０２； HAV24センスプライマー：TCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCC：配列番号１０３； HAV25センスプライマー：GTCCTGTCCTCTTGATAGCC：配列番号１０４； HAV26センスプライマー：AGCCCAGCCATGCAGGCATCTACC：配列番号１０５； HAV27センスプライマー：TTGATACCAAAGCCCGTCTC：配列番号１０６； HAV28センスプライマー：GAACATCACAGCCACCCAGACCGG：配列番号１０７； HAV29センスプライマー：GCAAAGCTCCCTGTACCTTACGG：配列番号１０８； HAV30センスプライマー：TTTCTGCACAGCACAGCCCC：配列番号１０９； HAV31センスプライマー：AGCAAAAACTTCGGAGGCGG：配列番号１１０； HAV32センスプライマー：AAGGAGAGGACTTCACCACG：配列番号１１１）からなる群から選ばれる１種類のセンスプライマーと、アンチセンスプライマー（HTCA3アンチセンスプライマー：GTTGCTCTTGAAGTCCATAGACC：配列番号１１２）とを用いた。
上記実施例１０で得られた各種のテトラマー染色陽性ＣＴＬ細胞のうち、まずＭ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ（ＭＡＲＴ−Ａ２テトラマー陽性）についてＴＣＲα鎖のレパトワ解析を行った。すなわち、このＣＴＬからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ２μｇを用いた逆転写反応にてｃＤＮＡを合成し、合成により得られたｃＤＮＡ全量に対して１／４０量のｃＤＮＡとＴＣＲα鎖ｃＤＮＡレパトワ解析用プライマーとを用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の解析を試みた。ＴＣＲα鎖ｃＤＮＡレパトワ解析用プライマーとしては、３３種類のセンスプライマー（HAV1Aセンスプライマー：TCTGGTATGTGCAATACCCCAACC：配列番号７９； HAV1Bセンスプライマー：CTGAGGAAACCCTCTGTGCA：配列番号８０； HAV2センスプライマー：GATGGAAGGTTTACAGCACAGCTC：配列番号８１； HAV3センスプライマー：CACAGTGGAAGATTAAGAGTCACGC：配列番号８２； HAV4Aセンスプライマー：AACAGAATGGCCTCTCTGGC：配列番号８３； HAV4Bセンスプライマー：GGATTGCGCTGAAGGAAGAG：配列番号８４； HAV5センスプライマー：TGAAGGTCACCTTTGATACCACCC：配列番号８５； HAV6センスプライマー：AATCCGCCAACCTTGTCATCTCCG：配列番号８６； HAV7センスプライマー：AACTGCACGTACCAGACATC：配列番号８７； HAV8センスプライマー：ACCCTGAGTGTCCAGGAGGG：配列番号８８； HAV9センスプライマー：CACTGCTGACCTTAACAAAGGCG：配列番号８９； HAV10センスプライマー：TCCTGGTGACAGTAGTTACG：配列番号９０； HAV11センスプライマー：AGGCTCAAAGCCTTCTCAGCAGGG：配列番号９１； HAV12センスプライマー：TCCACCAGTTCCTTCAACTTCACC：配列番号９２； HAV13センスプライマー：TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC：配列番号９３； HAV14センスプライマー：CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT：配列番号９４； HAV15センスプライマー：GGATAAACATCTGTCTCTGCG：配列番号９５； HAV16センスプライマー：GATAGCCATACGTCCAGATG：配列番号９６； HAV18センスプライマー：TGCCACTCTTAATACCAAGGAGGG：配列番号９７； HAV19センスプライマー：ACACTGGCTGCAACAGCATC：配列番号９８； HAV20センスプライマー：TTACAAACGAAGTGGCCTCC：配列番号９９； HAV21センスプライマー：ACCCTGCTGAAGGTCCTACATTCC：配列番号１００； HAV22センスプライマー：CTTGGAGAAAGGCTCAGTTC：配列番号１０１； HAV23センスプライマー：TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG：配列番号１０２； HAV24センスプライマー：TCCCAGCTCAGCGATTCAGCCTCC：配列番号１０３； HAV25センスプライマー：GTCCTGTCCTCTTGATAGCC：配列番号１０４； HAV26センスプライマー：AGCCCAGCCATGCAGGCATCTACC：配列番号１０５； HAV27センスプライマー：TTGATACCAAAGCCCGTCTC：配列番号１０６； HAV28センスプライマー：GAACATCACAGCCACCCAGACCGG：配列番号１０７； HAV29センスプライマー：GCAAAGCTCCCTGTACCTTACGG：配列番号１０８； HAV30センスプライマー：TTTCTGCACAGCACAGCCCC：配列番号１０９； HAV31センスプライマー：AGCAAAAACTTCGGAGGCGG：配列番号１１０； HAV32センスプライマー：AAGGAGAGGACTTCACCACG：配列番号１１１）からなる群から選ばれる１種類のセンスプライマーと、アンチセンスプライマー（HTCA3アンチセンスプライマー：GTTGCTCTTGAAGTCCATAGACC：配列番号１１２）とを用いた。
上記のＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した結果を図４４（Ａ）に示す。図４４（Ａ）において、両脇のマーカーのレーンを除くと、上段の左側のレーンから順に、センスプライマーとして上記HAV1AからHAV14までの１６種類をそれぞれ用いたＰＣＲ産物を電気泳動し、下段の左側のレーンから順に、センスプライマーとして上記HAV15からHAV32までの１７種類をそれぞれ用いたＰＣＲ産物を電気泳動した。図４４（Ａ）から分かるように、HAV2, 6, 9, 24, 26及び32の各レーンにおいて、ＰＣＲの増幅産物のバンドが確認された。これらのバンドをゲルから回収し、ＴＡクローニング法（TOPO TA Cloning Kit、インビトロジェン社製）によりベクターへ組み込んだ。
このベクターに組み込まれたバンド部分（ＰＣＲ産物）の塩基配列を決定したところ、HAV2, 9及び32のＰＣＲ産物はＴＣＲα鎖遺伝子由来のＤＮＡ断片であるが、その他のＰＣＲ産物は非特異的反応による増幅産物であることが判明した。HAV2, 9及び32のＤＮＡ断片が含まれる遺伝子は、ＮＣＢＩにより使用される新規名称TRAV12-2, 16及び25にそれぞれ相当する遺伝子であった。これら３種類のＴＣＲα遺伝子レパトワについて、全タンパク質コード領域の遺伝子取得を目的として、上記のｃＤＮＡ断片を鋳型に各レパトワ特異的な１６種類のセンスプライマー（TRAV1-2センスプライマー：CAGCAGATGTGGGGAGTTTTCCTTCTT：配列番号１１３； TRAV4センスプライマー：TAGAATATGAGGCAAGTGGCGAGAGTG：配列番号１１４； TRAV8-2センスプライマー：TCAGCCATGCTCCTGCTGCTCGTCCCA：配列番号１１５； TRAV8-3センスプライマー：TCAGCCATGCTCCTGGAGCTTATCCCA：配列番号１１６； TRAV8-4センスプライマー：TCAGCCATGCTCCTGCTGCTCGTCCCA：配列番号１１７； TRAV12-1センスプライマー：AAAAGAATGATGATATCCTTGAGAGTT：配列番号１１８； TRAV12-2センスプライマー：AGAAGAATGATGAAATCCTTGAGAGTT：配列番号１１９； TRAV16センスプライマー：TCAGACATGAAGCCCACCCTCATCTCA：配列番号１２０； TRAV17センスプライマー：AGAAGAATGGAAACTCTCCTGGGAGTG：配列番号１２１； TRAV21センスプライマー：GAAGGAATGGAGACCCTCTTGGGCCTG：配列番号１２２； TRAV22センスプライマー：AGCATCATGAAGAGGATATTGGGAGCT：配列番号１２３； TRAV24センスプライマー：GGAAACATGGAGAAGAATCCTTTGGCA：配列番号１２４； TRAV25センスプライマー：AGGGAGATGCTACTCATCACATCAATG：配列番号１２５； TRAV13-1センスプライマー：ACAAGGATGACATCCATTCGAGCTGTA：配列番号１２６； TRAV35センスプライマー：ATAAGGATGCTCCTTGAACATTTATTA：配列番号１２７； TRAV38-2センスプライマー：GTGAGCATGGCATGCCCTGGCTTCCTG：配列番号１２８）からなる群から選ばれる１種類のセンスプライマーと、終止コドンを含む定常領域アンチセンスプライマー（TRACアンチセンスプライマー：TCAGCTGGACCACAGCCGCAGCGTCAT：配列番号１２９）とを用いて遺伝子増幅を行った。増幅したＰＣＲ産物（各遺伝子のタンパク質コード領域のＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動した結果を図４４（Ｂ）に示す。いずれのＰＣＲ産物についても、想定された位置にバンドが検出された。
このベクターに組み込まれたバンド部分（ＰＣＲ産物）の塩基配列を決定したところ、HAV2, 9及び32のＰＣＲ産物はＴＣＲα鎖遺伝子由来のＤＮＡ断片であるが、その他のＰＣＲ産物は非特異的反応による増幅産物であることが判明した。HAV2, 9及び32のＤＮＡ断片が含まれる遺伝子は、ＮＣＢＩにより使用される新規名称TRAV12-2, 16及び25にそれぞれ相当する遺伝子であった。これら３種類のＴＣＲα遺伝子レパトワについて、全タンパク質コード領域の遺伝子取得を目的として、上記のｃＤＮＡ断片を鋳型に各レパトワ特異的な１６種類のセンスプライマー（TRAV1-2センスプライマー：CAGCAGATGTGGGGAGTTTTCCTTCTT：配列番号１１３； TRAV4センスプライマー：TAGAATATGAGGCAAGTGGCGAGAGTG：配列番号１１４； TRAV8-2センスプライマー：TCAGCCATGCTCCTGCTGCTCGTCCCA：配列番号１１５； TRAV8-3センスプライマー：TCAGCCATGCTCCTGGAGCTTATCCCA：配列番号１１６； TRAV8-4センスプライマー：TCAGCCATGCTCCTGCTGCTCGTCCCA：配列番号１１７； TRAV12-1センスプライマー：AAAAGAATGATGATATCCTTGAGAGTT：配列番号１１８； TRAV12-2センスプライマー：AGAAGAATGATGAAATCCTTGAGAGTT：配列番号１１９； TRAV16センスプライマー：TCAGACATGAAGCCCACCCTCATCTCA：配列番号１２０； TRAV17センスプライマー：AGAAGAATGGAAACTCTCCTGGGAGTG：配列番号１２１； TRAV21センスプライマー：GAAGGAATGGAGACCCTCTTGGGCCTG：配列番号１２２； TRAV22センスプライマー：AGCATCATGAAGAGGATATTGGGAGCT：配列番号１２３； TRAV24センスプライマー：GGAAACATGGAGAAGAATCCTTTGGCA：配列番号１２４； TRAV25センスプライマー：AGGGAGATGCTACTCATCACATCAATG：配列番号１２５； TRAV13-1センスプライマー：ACAAGGATGACATCCATTCGAGCTGTA：配列番号１２６； TRAV35センスプライマー：ATAAGGATGCTCCTTGAACATTTATTA：配列番号１２７； TRAV38-2センスプライマー：GTGAGCATGGCATGCCCTGGCTTCCTG：配列番号１２８）からなる群から選ばれる１種類のセンスプライマーと、終止コドンを含む定常領域アンチセンスプライマー（TRACアンチセンスプライマー：TCAGCTGGACCACAGCCGCAGCGTCAT：配列番号１２９）とを用いて遺伝子増幅を行った。増幅したＰＣＲ産物（各遺伝子のタンパク質コード領域のＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動した結果を図４４（Ｂ）に示す。いずれのＰＣＲ産物についても、想定された位置にバンドが検出された。
次いで、上記のＰＣＲ産物をベクターにクローニングした後、これら３クローンのＰＣＲ産物（ＴＣＲα鎖遺伝子）の塩基配列を決定したところ、TRAV12-2（HAV2）、TRAV16（HAV9）、TRAV25（HAV32）のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、それぞれ「TRAV12-2*01―TRAJ10*01」（図５１：配列番号３８の塩基配列； 図５２：配列番号３９のアミノ酸配列）、「TRAV16*01―TRAJ38*01」（図５３：配列番号４０の塩基配列； 図５４：配列番号４１のアミノ酸配列）、「TRAV25*01―TRAJ31*01」（図５５：配列番号４２の塩基配列； 図５６：配列番号４３のアミノ酸配列）であることが分かった。
また、上記実施例１０で得られた各種のテトラマー染色陽性ＣＴＬ細胞のうち、Ｍ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ（ＭＡＲＴ−Ａ２テトラマー陽性）以外のＣＴＬ（Ｍ６症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ、Ｍ８症例ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ、Ｍ１症例ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ、Ｍ７症例ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ、Ｍ８症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ、Ｍ３症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ、Ｍ７症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ、及び、Ｍ９症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ）についても、同様の手法によってＴＣＲα鎖のレパトワ解析を行った。その結果、Ｍ６症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV12-2*01―TRAJ40*01」（図４５：配列番号３２の塩基配列； 図４６：配列番号３３のアミノ酸配列）、「TRAV12-2*01―TRAJ50*01」（図４７：配列番号３４の塩基配列； 図４８：配列番号３５のアミノ酸配列）、「TRAV25*01―TRAJ21*01」（図４９：配列番号３６の塩基配列； 図５０：配列番号３７のアミノ酸配列）であり、Ｍ８症例ｇｐ１００−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV8-4*01―TRAJ9*01」（図５７：配列番号４４の塩基配列； 図５８：配列番号４５のアミノ酸配列）であり、Ｍ１症例ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV1-2*01―TRAJ10*01」（図５９：配列番号４６の塩基配列； 図６０：配列番号４７のアミノ酸配列）、「TRAV12-1*01―TRAJ49*01」（図６１：配列番号４８の塩基配列； 図６２：配列番号４９のアミノ酸配列）、「TRAV17*01―TRAJ23*01」（図６３：配列番号５０の塩基配列； 図６４：配列番号５１のアミノ酸配列）、「TRAV22*01―TRAJ40*01」（図６５：配列番号５２の塩基配列； 図６６：配列番号５３のアミノ酸配列）であり、Ｍ７症例ＭＡＧＥ３−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV13-1*01―TRAJ45*01」（図６７：配列番号５４の塩基配列； 図６８：配列番号５５のアミノ酸配列）、「TRAV38-2/DV8*01―TRAJ57*01」（図６９：配列番号５６の塩基配列； 図７０：配列番号５７のアミノ酸配列）であり、Ｍ８症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV8-2*01―TRAJ23*01」（図７１：配列番号５８の塩基配列； 図７２：配列番号５９のアミノ酸配列）、「TRAV26―stop codon」（図７３：配列番号６０の塩基配列）、「TRAV35*02―TRAJ50*01」（図７４：配列番号６１の塩基配列； 図７５：配列番号６２のアミノ酸配列）であり、Ｍ３症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV8-3*01―TRAJ39*01」（図７６：配列番号６３の塩基配列； 図７７：配列番号６４のアミノ酸配列）、「TRAV24*01―TRAJ54*01」（図７８：配列番号６５の塩基配列； 図７９：配列番号６６のアミノ酸配列）、「TRAV38-2/DV8*01―TRAJ49*01」（図８０：配列番号６７の塩基配列； 図８１：配列番号６８のアミノ酸配列）であり、Ｍ７症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV21*02―TRAJ28*01」（図８２：配列番号６９の塩基配列； 図８３：配列番号７０のアミノ酸配列）、「TRAV24*01―TRAJ47*02」（図８４：配列番号７１の塩基配列； 図８５：配列番号７２のアミノ酸配列）、「TRAV35―stop codon」（図８６：配列番号７３の塩基配列）であり、Ｍ９症例ＣＭＶｐｐ６５−Ａ２４ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖遺伝子の構成は、「TRAV4*01―TRAJ44*01」（図８７：配列番号７４の塩基配列； 図８８：配列番号７５のアミノ酸配列）、「TRAV16*01―TRAJ49*01」（図８９：配列番号７６の塩基配列； 図９０：配列番号７７のアミノ酸配列）、「TRAV17―stop codon」（図９１：配列番号７８の塩基配列）であった。
［ＴＣＲα鎖／β鎖遺伝子の導入発現］
上記の腫瘍関連ペプチドに特異的なＴＣＲβ鎖遺伝子とα鎖遺伝子とを同時にmutant Jurkat細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）へ導入した場合に、ＴＣＲβ鎖タンパク質及びα鎖タンパク質が発現し、細胞障害活性を誘導し得るか否かにつき検討した。
すなわち、実施例５で得られたＭ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲβ鎖遺伝子と、実施例１１で得られたＭ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲα鎖遺伝子とを、エレクトロポレーション法（Amaxa社のNucleofector装置を使用）にて同時にmutant Jurkat細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）に導入し、それらＴＣＲα鎖やβ鎖の発現の解析を行った。なお、Mutant Jurkat細胞は、Jurkat細胞のE6-1クローンの変異型で、ＴＣＲのβ鎖を欠失しており、さらに、膜上にＴＣＲα鎖及びβ鎖からなるheterodimer並びにＣＤ３タンパク質を発現しないことが知られているため、ＴＣＲβ鎖遺伝子の導入実験によく使用される。
上記の腫瘍関連ペプチドに特異的なＴＣＲβ鎖遺伝子とα鎖遺伝子とを同時にmutant Jurkat細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）へ導入した場合に、ＴＣＲβ鎖タンパク質及びα鎖タンパク質が発現し、細胞障害活性を誘導し得るか否かにつき検討した。
すなわち、実施例５で得られたＭ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲβ鎖遺伝子と、実施例１１で得られたＭ８症例ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞由来のＴＣＲα鎖遺伝子とを、エレクトロポレーション法（Amaxa社のNucleofector装置を使用）にて同時にmutant Jurkat細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）に導入し、それらＴＣＲα鎖やβ鎖の発現の解析を行った。なお、Mutant Jurkat細胞は、Jurkat細胞のE6-1クローンの変異型で、ＴＣＲのβ鎖を欠失しており、さらに、膜上にＴＣＲα鎖及びβ鎖からなるheterodimer並びにＣＤ３タンパク質を発現しないことが知られているため、ＴＣＲβ鎖遺伝子の導入実験によく使用される。
まずpmax-GFP発現ベクターをmutant Jurkat細胞へ導入し、pmax-GFP／mutant Jurkat細胞を作製した。その際、mutant Jurkat細胞への遺伝子導入の至適条件を設定した。pmax-GFP発現ベクターの導入から４８時間後に、フローサイトメトリー（FACSCalibur（登録商標）：ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、pmax-GFP／mutant Jurkat細胞中のＧＦＰ遺伝子及びＣＤ３タンパク質の発現効率を測定した。その結果を、図９２に示す。図９２から分かるように、全細胞の６１．８％にＧＦＰ遺伝子の発現が確認されたが、ＣＤ３タンパク質の発現はほとんど認められなかった。
また、TCRVβ3.0（ＮＣＢＩにより使用される新規名称はTRBV28）を乗せたpmaxベクター８μｇと、各ＴＣＲα鎖遺伝子（TRAV12、TRAV16又はTRAV25）を乗せたpmaxベクター８μｇとを、同時に２×１０６個のmutant Jurkat細胞に導入し、pmax-TCRVβ3.0・pmax-TCRα／mutant Jurkat細胞を作製した。また、コントロールとして、TCRVβ3.0を乗せたpmaxベクターのみを導入したmutant Jurkat細胞（pmax-TCRVβ3.0／mutant Jurkat細胞）を作製した。
各発現ベクターの導入から４８時間後に、フローサイトメトリー（FACSCalibur：ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、pmax-TCRVβ3.0・pmax-TCRα／mutant Jurkat細胞中のTCRVβ3.0 (TRBV28)遺伝子、及び、ＣＤ３タンパク質の発現効率を測定した。その結果を、図９３に示す。図９３から分かるように、TCRVβ3.0 (TRBV28)の発現は、ＴＣＲα鎖遺伝子を同時導入した場合の方が高く、TRAV12やTRAV16遺伝子を同時導入した場合はそれぞれ１１．５％、１０．３％と発現の増加を認めた（TCRVβ3.0単独では、１．７％）。また同様の実験におけるＣＤ３タンパク質の発現も、TRAV12やTRAV16遺伝子を同時導入した場合は、１９．８％、２１．８％と発現の増加を認めた(TCRVβ3.0単独では、８．７％)（図９４）。
これらの結果から、上記のＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の組み合わせによって、ＣＤ３の発現が向上し、細胞障害活性が誘導されることが示された。
各発現ベクターの導入から４８時間後に、フローサイトメトリー（FACSCalibur：ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、pmax-TCRVβ3.0・pmax-TCRα／mutant Jurkat細胞中のTCRVβ3.0 (TRBV28)遺伝子、及び、ＣＤ３タンパク質の発現効率を測定した。その結果を、図９３に示す。図９３から分かるように、TCRVβ3.0 (TRBV28)の発現は、ＴＣＲα鎖遺伝子を同時導入した場合の方が高く、TRAV12やTRAV16遺伝子を同時導入した場合はそれぞれ１１．５％、１０．３％と発現の増加を認めた（TCRVβ3.0単独では、１．７％）。また同様の実験におけるＣＤ３タンパク質の発現も、TRAV12やTRAV16遺伝子を同時導入した場合は、１９．８％、２１．８％と発現の増加を認めた(TCRVβ3.0単独では、８．７％)（図９４）。
これらの結果から、上記のＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の組み合わせによって、ＣＤ３の発現が向上し、細胞障害活性が誘導されることが示された。
Claims (16)
- 配列番号７若しくは９で表される塩基配列、又は、配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子。
- 請求項１に記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクター。
- 請求項２に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体。
- 配列番号４６、４８、５０若しくは５２で表される塩基配列、又は、配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子。
- 請求項４に記載のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクター。
- 請求項５に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項１に記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子及び請求項４に記載のＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれた、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質及びＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクター。
- 請求項７に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質及びＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体。
- 組換えベクターが導入されたリンパ球である請求項３、６又は８に記載の形質転換体。
- 配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質。
- 配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体。
- 配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターα鎖タンパク質。
- 配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターα鎖タンパク質に特異的に結合する抗体。
- 配列番号７若しくは９で表される塩基配列、又は、配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物。
- 配列番号４６、４８、５０若しくは５２で表される塩基配列、又は、配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物。
- 配列番号７若しくは９で表される塩基配列、又は、配列番号８若しくは１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子と、配列番号４６、４８、５０若しくは５２で表される塩基配列、又は、配列番号４７、４９、５１若しくは５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＴ細胞レセプターα鎖遺伝子とが組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質及びＴ細胞レセプターα鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするＭＡＧＥ１，３陽性の固形がん又はメラノーマ治療用組成物。
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