Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS56663B1 - Irnk sastavi komponente komplementa c5 i metode za njihovu upotrebu - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS56663B1 - Irnk sastavi komponente komplementa c5 i metode za njihovu upotrebu - Google Patents

Irnk sastavi komponente komplementa c5 i metode za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS56663B1
RS56663B1 RS20171204A RSP20171204A RS56663B1 RS 56663 B1 RS56663 B1 RS 56663B1 RS 20171204 A RS20171204 A RS 20171204A RS P20171204 A RSP20171204 A RS P20171204A RS 56663 B1 RS56663 B1 RS 56663B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleotides
nucleotide
dsrna
mrna
dsrna agent
Prior art date
Application number
RS20171204A
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Fitzgerald
James Butler
Brian Bettencourt
Anna Borodovsky
Satyanarayana Kuchimanchi
Klaus Charisse
Muthiah Manoharan
Martin Maier
Kallanthottathil G Rajeev
Donald Foster
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS56663B1 publication Critical patent/RS56663B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Description

Opis
Povezane patentne prijave
[0001] Ova patentna prijava zahteva prednosti provizorne patentne prijave SAD br.:61/782,531, podnete 14. Marta, 2013, provizorne patentne prijave SAD br.:61/837,399, podnete 20. Juna, 2013, i provizorne patentne prijave SAD br.:61/904,579, podnete 15.
Novembra, 2013, provizorne patentne prijave SAD br.:61/912,777, podnete 6. Decembra, 2013, i provizorne patentne prijave SAD br.:61/942367, podnete 20. Februara, 2014.
Spisak sekvenci
[0002] Predmetna patentna prijava sadrži spisak sekvenci koji je elektronski podnet u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana je 10. Marta, 2014, nazvana je 121301-00520_SL.txt i iznosi 734,486 bajtova u veličini.
Pozadina pronalaska
[0003] Komplement je prvi put pronađem 1890-ih kada je pronađeno da pomaže ili „dopunjava“ ubijanje bakterija pomoću toplotno-stabilnih antitela prisutnih u normalnom serumu (Walport, M.J. (2001) N Engl J Med.344:1058). Sistem komplementa sastoji se iz više od 30 proteina koji su prisutni ili kao rastvorljivi proteini u krvi ili kao proteini povezani sa membranom. Aktiviranje komplemenata dovodi do sekvencijalne kaskade enzimskih reakcija, poznate kao putevi aktiviranja komplementa, što se ispoljava u formiranju potentnih anafilatoksina C3a i C5a koji izmamljuju pletoru fiziološkog odgovora koji je u rasponu od hemoatrakcije do apoptoze. U početku se smatralo da komplement ima glavnu ulogu u urođenom imunitetu gde su robusni i brzi odgovor postavljeni prema napadajućim patogenima. Međutim, nedavno je postalo sve više očigledno da komplement takođe ima značajnu ulogu u adaptivnom imunitetu uključujući T i B ćelije koju pomažu eliminaciju patogena (Dunkelberger JR and Song WC. (2010) Cell Res.20:34; Molina H, i dr. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A.93:3357), u održavanju imunologičke memorije koja sprečava ponovno napadanje patogena, i uključen je u brojna patološka stanja ljudi (Qu, H, i dr. (2009) Mol Immunol. 47:185; Wagner, E. and Frank MM. (2010) Nat Rev Drug Discov.9:43).
[0004] Poznato je da se aktiviranje komplemenata vrši kroz tri različita puta: alternativni, klasični i lektinski (Slika 1), uključujući proteine koji većinski postoje kao neaktivni zimogeni koji se zatim sekvencijalno cepaju i aktiviraju. Svi putevi aktiviranja komplementa dovode do cepanja C5 molekula stvarajući anafilatoksin C5a i C5b koji redom formiraju terminalni kompleks komplementa (C5b-9). C5a vrši pretežnu pro-inflamatornu aktivnost kroz interakciju sa klasičnim G-protein spojenim receptorom C5aR (CD88) kao i sa ne-G protein povezanim receptorom C5L2 (GPR77), izraženim na različitim imunim i ne-imunim ćelijama. C5b-9 izaziva citolizu kroz formiranje kompleksa napada membrane (MAC), i sublitičkog MAC i rastvorljivi C5b-9 takođe poseduje više ne-citolitičkih imunih funkcija. Ova dva efektora komplementa, C5a i C5b-9, stvorena iz cepanja C5, ključne su komponente sistema komplementa odgovorne za propagaciju i/ili inicijaciju patologije kod različitih bolesti, uključujući paroksizimalnu noćnu hemoglobinuriju, reumatoidni artritis, povrede ishemije reperfuzije i neurodegenerativne bolesti. WO2009/108931 opisuje terapeutsku upotrebu komponente komplementa C5 koja cilja siRNK. Do danas, samo je jedan terapeutik koji cilja C5-C5a osu dostupan za tretiranje bolesti povezanih sa komponentom komplementa C5, anti-C5 antitelo, ekulizumab (Soliris®). Iako je ekulizumab pokazao da je delotvoran pri tretiranju paroksizimalne noćne hemogloburnije (PNH) i atipičnog hemolitičkog uremičnog sindroma (aHUS) i trenutno se procenjuje u kliničkim ispitivanjima za dodatne bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, terapija sa ekulizumabom zahteva visoke nedeljne doze infuzije praćene sa dvonedeljnim infuzijama održavanja pri godišnjim troškovima od oko $400,000. U skladu sa time, postoji potreba u stanju tehnike za alternativnim terapijama i kombinovanim terapijama za subjekte koji imaju bolest povezanu sa komponentom komplementa C5.
Rezime
[0005] Predmetni pronalazak daje agens dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) pogodan za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5, gde se navedena dsRNK sastoji iz smisao lanca i antismisao lanca, antismisao lanac sadrži oblast komplementarnosti koja sadrži barem 15 susednih nukleotida nukleotidne sekvence SEQ ID NO:113. Dalji aspekti pronalaska definisani su u patentnim zahtevima.
[0006] Predmetno obelodanjivanje odnosi se na iRNK sastave koji utiču na cepanje RNK transkripta C5 gena posredovano RNK-uzrokovanim utišavajućim kompleksima (RISC). C5 gen može biti unutar ćelije, npr., ćelije unutar subjekta, kao što je čovek. Predmetno obelodanjivanje takođe daje metode i kombinovane terapije za tretiranje subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od inhibiranja ili smanjenja ekspresije C5 gena, npr., bolesti povezane sa komponentom komplementa, kao što su paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH) i atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS) upotrebom iRNK sastava koji utiču na cepanje RNK transkripta C5 gena posredovano RNK-uzrokovanim utišavajućim kompleksom (RISC) za inhibiranje ekspresije C5 gena.
[0007] U predmetnom obelodanjivanju uključeni su agensi dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5, gde se dsRNK sastoji iz smisao lanca i antismisao lanca, antismisao lanac se sastoji iz oblasti komplementarnosti koja se sastoji iz barem 15 susednih nukleotida različitih u ne više od 3 nukleotida sa bilo kojom od antismisao sekvenci izlistanih u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, i 23.
[0008] Neki smisao i antismisao lanci sadrže sekvence izabrane iz grupe koju čine A-118320, A-118321, A-118316, A-118317, A-118332, A-118333, A-118396, A-118397, A-118386, A-118387, A-118312, A-118313, A-118324, A-118325, A-119324, A-119325, A-119332, A-119333, A-119328, A-119329, A-119322, A-119323, A-119324, A-119325, A-119334, A-119335, A-119330, A-119331, A-119326, A-119327, A-125167, A-125173, A-125647, A-125157, A-125173, i A-125127. Smisao
i antismisao lanci sadrže sekvence izabrane iz grupe koju čine bilo koje od sekvenci u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21, i 23.
[0009] dsRNK agens može da sadrži barem jedan modifikovani nukleotid.
[0010] U jednom aspektu, predmetni pronalazak daje agens dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5, gde dsRNK agens sadrži smisao lanac i antismisao lanac, gde se smisao lanac sastoji iz nukleotidne sekvence AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA (SEQ ID NO:62) i gde se antismisao lanac sastoji iz nukleotidne sekvence UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUU (SEQ ID NO: 113). U jednom otelotvorenju, dsRNK agens sadrži barem jedan modifikovani nukleotid, kao što je opisano ispod.
[0011] U jednom aspektu,
suštinski svi nukleotidi smisao lanca i suštinski svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi, gde je smisao lanac konjugovan sa ligandom povezanim na 3’-terminusu.
[0012] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju.
[0013] U jednom otelotvorenju, suštinski svi nukleotidi smisao lanca su modifikovani nukleotidi izabrani iz grupe koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminal dezoksi-timin (dT) nukleotid. U drugom otelotvorenju, suštinski svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi izabrani iz grupu koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminal dezoksi-timin (dT) nukleotid. U drugom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su kratke sekvence dezoksi-timin (dT) nukleotida. U drugom otelotvorenju, smisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu. U jednom otelotvorenju, antismisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu i dve fosforotioat međunukleotidne veze na 3’-terminusu. U još jednom otelotvorenju, smisao lanac je konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata povezanih preko granatog bivalentnog ili trivalentnog linkera na 3’-terminusu.
[0014] U jednom otelotvorenju, barem jedan od modifikovanih nukleotida je izabran iz grupe koja sadrži 3’-terminalni dezoksi-timin (dT) nukleotid, 2’-O-meil modifikovani nukleotid, 2’-fluoro modifikovani nukleotid, 2’-dezoksi-modifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid, 2’-amino-modifikovani nukleotid, 2’-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, ne-prirodnu bazu koja sadrži nukleotid, nukleotid koji sadrži 5’-fosforotioat grupu, i terminalni nukleotid povezan za derivat holesterola ili bisdecilamid grupu dodekanoične kiseline.
[0015] U drugom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi sadrže kratku sekvencu 3’-terminalnog dezoksi-timin (dT) nukleotida.
[0016] U jednom otelotvorenju, oblast komplementarnosti je barem 17 nukleotida dugačka. U drugom otelotvorenju, oblast komplementarnosti je između 19 i 21 nukleotida dugačka.
[0017] U jednom otelotvorenju, oblast komplementarnosti je 19 nukleotida dugačka.
[0018] U jednom otelotvorenju, svaki lanac ima ne više od 30 nukleotida dugačak.
[0019] U jednom otelotvorenju, barem jedan lanac sadrži 3’ produžetak barem 1 nukleotida. U drugom otelotvorenju, barem jedan lanac sadrži 3’ produžetak barem 2 nukleotida.
[0020] U jednom otelotvorenju, dsRNK dalje sadrži ligand.
[0021] U jednom otelotvorenju, ligand je konjugovan sa 3’ krajem smisao lanca dsRNK agensa.
[0022] U jednom otelotvorenju, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc) derivat.
[0023] U jednom otelotvorenju, ligand je
[0024] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens je konjugovan za ligand kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde X je O ili S.
[0025] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0026] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens je izabran iz grupe koju čine AD-58123,
[0027] AD-58643, AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, i AD-62651.
[0028] U drugom aspektu, predmetni pronalazak daje agens dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5, gde dsRNK agens sadrži smisao lanac i antismisao lanac, gde smisao lanac sadrži nukleotidnu sekvencu AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA (SEQ ID NO:62) i gde antismisao lanac sadrži nukleotidnu sekvencu UAUUAUAAAAAUAUCUUGCUUUUdTdT (SEQ ID NO:2899).
[0029] U drugom aspektu, predmetni pronalazak daje agens dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5, gde dsRNK agens sadrži smisao lanac i anti smisao lanac, gde smisao lanac sadrži nukleotidnu sekvencu asasCrfcAfaCrfaUfAfUfuUfuuAfuAfauaL96 (SEQ ID NO:2876) i antismisao lanac sadrži nukleotidnu sekvencu usAfsUfuAfuaAfaAfauaUfcUfuCrfcuususudTdT (SEQ ID NO:2889).
[0030] U jednom otelotvorenu, dvolančana oblast je 15-30 nukleotidnih parova dugačka.
[0031] U jednom otelotvorenju, dvolančana oblast je 17-23 nukleotidnih parova dugačka. U drugom otelotvorenju, dvolančana oblast je 17-25 nukleotidnih parova dugačka. U jednom otelotvorenju, dvolančana oblast je 23-27 nukleotidnih parova dugačka. U jednom otelotvorenju, dvolančana oblast je 19-21 nukleotidnih parova dugačka. U jednom otelotvorenju, dvolančana oblast je 21-23 nukleotidnih parova dugačka.
[0032] U jednom otelotvorenju, svaki lanac ima 15-30 nukleotida.
[0033] U jednom otelotvorenju, modifikacije na nukleotidima izabrane su iz grupe koju čine LNA, HNA, CeNA, 2’-metoksietil, 2’-O-alkil, 2’-O-alil, 2’-C- alil, 2’-fluoro, 2’-dezoksi, 2’-hidroksil, i njihove kombinacije.
[0034] U jednom otelotvorenju, modifikacije na nukleotidima su 2’-O-metil ili 2’-fluoro modifikacije.
[0035] U jednom otelotvorenju, ligand je jedan ili više GalNAc derivata povezanih preko bivalentnog ili trivalentnog granatog linkera.
[0036] U jednom otelotvorenju, ligand je
[0037] U jednom otelotvorenju, ligand je povezan za 3’ kraj smisao lanca.
[0038] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan za ligand kao što je prikazano na sledećoj šemi
[0039] U jednom otelotvorenju, agens dalje sadrži barem jednu fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidnu vezu.
[0040] U jednom otelotvorenju, fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidna veza je na 3’-terminusu lanca.
[0041] U jednom otelotvorenju, lanac je antismisao lanac. U drugom otelotvorenju, lanac je smisao lanac.
[0042] U jednom otelotvorenju, fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidna veza je na 5’-terminusu lanca.
[0043] U jednom otelotvorenju, lanac je antismisao lanac. U drugom otelotvorenju, lanac je smisao lanac.
[0044] U jednom otelotvorenju, fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidna veza je na oba, 5’- i 3’-terminusu jednog lanca.
[0045] U jednom otelotvorenju, lanac je antismisao lanac.
[0046] U jednom otelotvorenju, osnovni par na 1 poziciji 5’-kraja antismisao lanca dupleksa je AU osnovni par.
[0047] U jednom otelotvorenju, Y nukleotidi sadrže 2’-fluoro modifikaciju. U jednom otelotvorenju, Y’ nukleotidi sadrže 2’-O-metil modifikaciju.
[0048] U jednom otelotvorenju, p’>0.
[0049] U jednom otelotvorenju, p’=2.
[0050] U jednom otelotvorenju, q’=0, p=0, q=0, i p’ produžeci nukleotida su komplementarni sa ciljanom mRNK.
[0051] U jednom otelotvorenju, q’=0, p=0, q=0, i p’ produžeci nukleotida su nekomplementarni sa ciljanom mRNK.
[0052] U jednom otelotvorenju, smisao lanac ima ukupno 21 nukleotid i antismisao lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0053] U jednom otelotvorenju, barem jedan np’ je povezan za susedni nukleotid preko fosforotioat veze.
[0054] U jednom otelotvorenju svi np’ su povezani za susedne nukleotide preko fosforotioat veze.
[0055] Grupa RNKi agenasa je izlistana u Tabeli 4, Tabeli 18, Tabeli 19 ili Tabeli 23. RNKi agensi obuhvataju AD-58123, AD-58111, AD-58121, AD-58116, AD-58133, AD-58099, AD-58088, AD-58642, AD-58644, AD-58641, AD-58647, AD-58645, AD-58643, AD-58646, AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, i AD-62651.
[0056] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi. U drugom otelotvorenju, svaki lanac ima 19-30 nukleotida.
[0057] U jednom od aspekata, predmetni pronalazak daje ćelije koje sadrže dsRNK agens prema pronalasku.
[0058] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje odnosi se na vektor koji kodira barem jedan lanac dsRNK agensa, gde dsRNK agens sadrži oblast komplementarnosti do barem dela mRNK koji enkodira komponentu komplementa C5, gde je dsRNK 30 osnovnih parova ili manje dugačak, i gde dsRNK agens cilja mRNK za cepanje.
[0059] Ovde, oblast komplementarnosti je barem 15 nukleotida dugačka. U jednom otelotvorenju, oblast komplementarnosti je 19 do 21 nukleotida dugačka. U drugom otelotvorenju svaki lanac ima 19-30 nukleotida.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak daje ćelije koje sadrže vektor prema pronalasku, kao što je definisano u patentnim zahtevima. U jednom aspektu, predmetni pronalazak daje farmaceutski sastav za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5 gena koji sadrži dsRNK agens prema pronalasku.
[0060] U jednom otelotvorenju, RNKi agens se daje u rastvoru bez pufera.
[0061] U jednom otelotvorenju, rastvor bez pufera je fiziološki rastvor ili voda.
[0062] U jednom otelotvorenju, RNKi agens se daje sa rastvorom sa puferom.
[0063] U jednom otelotvorenju, rastvor sa puferom sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0064] U drugom otelotvorenju, rastvor sa puferom je fosfatom puferisan fiziološki rastvor (PBS).
[0065] U drugom aspektu, predmetni pronalazak daje farmaceutski sastav koji sadrži dvolančani RNKi agens prema pronalasku i lipidnu formulaciju.
[0066] U jednom otelotvorenju, lipidna formulacija sadrži LNP. U drugom otelotvorenju, lipidna formulacija sadrži MC3.
[0067] U jednom aspektu predmetno obelodanjivanje daje metode za tretiranje subjekta koji ima bolest ili poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije komponente komplementa C5. Metode obuhvataju davanje subjektu terapeutski delotvorne količine dsRNK agensa koji sadrži smisao lanac i antismisao lanac kao što je ovde obelodanjeno.
[0068] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji ima bolest ili poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije komponente komplementa C5. Metode obuhvataju davanje subjektu terapeutski delotvorne količine dsRNK agensa kao što je ovde obelodanjeno.
[0069] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode za tretiranje subjekta koji ima bolest ili poremećaj koji bi imao korist od smanjivanja ekspresije komponente komplementa C5. Metode obuhvataju davanje subjektu terapeutski delotvornu količinu dsRNK agensa kao što je ovde obelodanjeno.
[0070] U još jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji ima bolest ili poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije komponente komplementa C5. Metode uključuju davanje subjektu profilaktički delotvornu količinu dsRNK agensa kao što je ovde obelodanjeno.
[0071] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode za tretiranje subjekta koji ima bolest ili poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije komponente komplementa C5 koje obuhvataju davanje subjektu terapeutski delotvornu količinu dvolančanog RNKi agensa kao što je ovde obelodanjeno.
[0072] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi.
[0073] U jednom otelotvorenju, primena je subkutana primena.
[0074] U jednom otelotvorenju, suštinski svi nukleotidi smisao lanca su modifikovani nukleotidi izabrani iz grupe koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminal dT nukleotida. U drugom otelotvorenju, suštinski svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi izabrani iz grupe koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminal dT nukleotida. U drugom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su kratke sekvence dezoksi-timin (dT) nukleotida. U drugom otelotvorenju, smisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu. U jednom otelotvorenju, antismisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu i dve fosforotioat međunukleotidne veze na 3’-terminusu. U još jednom otelotvorenju, smisao lanac je konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata povezanih preko granatih bivalentnih ili trivalentnih linkera na 3’-terminusu.
[0075] U jednom otelotvorenju, davanje dsRNK subjektu izaziva smanjenje u intravaskularnoj hemolizi, stabilizaciju nivoa hemoglobina i/ili smanjenje u akumulaciji C5 proteina.
[0076] U jednom otelotvorenju poremećaj je bolest povezana sa komponentom komplementa C5. U jednom otelotvorenju bolest povezana sa komponentom komplementa C5 izabrana je iz grupe koju čine paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH), atipični hemolitičkouremijski sindrom (aHUS), astma, reumatoidni artritis (RA); sindrom antifosfolipidnih antitela; lupus nefritis; povreda ishemije-reperfuzije; tipični ili infektivni hemolitički uremični sindrom (tHUS); bolest gustih depozita (DDD); neuromijelistis optika (NMO); multifokalna motorna neuropatija (MMN); multipla skleroza (MS); makularna degeneracija (npr., makularna degeneracija povezana sa starošću (AMD)); hemoliza, sindrom povišenih enzima u jetri, i niskih trombocita (HELLP); trombocitička trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis; bulozna epidermoliza; rekurentni fetalni gubitak; pre-eklampsija, traumatska povreda mozga, mijastenija gravis, bolest hladnog aglutinina, bulozni dermatomiozitis pemfigoid, Shiga toksin E. coli-povezani hemolitički uremični sindrom, C3 nefropatija, anti-neutrofil citoplazmični vaskulitis povezan sa antitelima, humoralno i vaskularno odbijanje transplanata, disfunkcija kalema, infarkt miokarda, alogena transplantacija, sepsa, koronarna arterijska bolest, dermatomiozitis, bolest Graves-a, ateroskleroza, Alchajmerova bolest, sepsa sistemskog inflamatornog odgovora, septički šok, povreda kičmene moždine, glomerulonefritis, Hashimoto-ov tiroiditis, tip I dijabetes, psorijaza, pemfigus, autoimuna hemolitička anemija (AIHA), ITP, Goodpasture-ov sindrom, Degos bolest, antifosfolipidni sindrom (APS), katastrofični APS (CAPS), kardiovaskularni poremećaj, miokarditis, cerebrovaskularni poremećaj, periferni vaskularni poremećaj, renovaskularni poremećaj, mesenteričan/enteričan vaskularni poremećaj, vaskulitis, Henoch-Schönlein purpura nefritis, sistemski lupus eritematozus-povezani vaskulitis, vaskulitis povezan sa reumatoidnim artritisom, vaskulitis imunog kompleksa, Takayasu-ova bolest, proširena kariomiopatija, dijabetska angiopatija, Kawasaki-jeva bolest (arteritis), venska gasna embolija (VGE), i restenoza koja prati postavljanje stenta, rotaciona aterektomija, membranska nefropatija, Guillain-Barre sindrom, i perkutana transluminalna koronarna angioplastika (PTCA). U drugom otelotvorenju, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH). U još jednom otelotvorenju, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je atipični hemolitičkouremijski sindrom (aHUS).
[0077] U jednom otelotvorenju, subjekat je čovek.
[0078] U drugom otelotvorenju, upotreba pronalaska dalje obuhvata davanje komponente anti-komplementa C5 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta subjektu.
[0079] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, inhibira cepanje komponente komplementa C5 u fragmente C5a i C5b. U drugom otelotvorenju, komponenta anti-komplementa C5 antitela je ekulizumab.
[0080] U drugom otelotvorenju, upotreba pronalaska dalje obuhvata davanje meningokokne vakcine subjektu.
[0081] U jednom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg tokom 4 nedelje što je praćeno sa petom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 900 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 900 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0082] U drugom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 900 mg tokom 4 nedelje što je praćeno sa petom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 1200 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 1200 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0083] U jednom otelotvorenju, subjekat ima manje od 18 godina starosti i ekulizumab se daje subjektu nedeljno pri dozi manjoj od 900 mg tokom 4 nedelje što je praćeno sa petom dozom oko nedelju dana kasnije manjom od 1200 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 1200 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0084] U drugom otelotvorenju, subjekat ima manje od 18 godina starosti i ekulizumab se daje subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg tokom 2 nedelje što je praćeno sa trećom dozom nedelju dana kasnije od oko 900 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 900 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0085] U drugom otelotvorenju, subjekat ima manje od 18 godina starosti i ekulizumab se daje subjektu nedeljno pri dozi omanjoj od oko 600 mg tokom 2 nedelje što je praćeno sa trećom dozom nedelju dana kasnije od oko 600 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 600 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0086] U još jednom otelotvorenju, subjekat ima manje od 18 godina starosti i ekulizumab se daje subjektu nedeljno pri dozi manjo od 600 mg tokom 1 nedelje što je praćeno sa drugom dozom nedelju dana kasnije od oko 300 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 300 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0087] U jednom otelotvorenju, subjekat ima manje od 18 godina starosti i ekulizumab se daje subjektu nedelju pri dozi manjoj od oko 300 mg tokom 1 nedelje što je praćeno sa drugom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 300 mg, što je praćeno sa dozom manjom odo oko 300 mg svake dve nedelje nakon toga.
[0088] U drugom otelotvorenju, upotreba pronalaska dalje obuhvata plazmaferezu ili razmenu plazme u subjektu. U jednom takvom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu pri dozi manjoj od oko 600 mg ili pri dozi manjoj od oko 300 mg.
[0089] U drugom otelotvorenju, upotreba pronalaska dalje obuhvata infuziju plazme subjektu. U jednom takvom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjekat pri dozi manjoj od oko 300 mg.
[0090] U jednom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu pri dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0.5 mg/kg do oko 15 mg/kg. U drugom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu pri dozi od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg.
[0091] U jednom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjekti pri dozi izabranoj iz grupe koju čine 0.5 mg/.kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, i 15 mg/kg.
[0092] U jednom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu preko intravenozne infuzije.
[0093] U drugom otelotvorenju, ekulizumab se daje subjektu subkutano.
[0094] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens se daje pri dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0.5 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0095] U drugom otelotvorenju, dsRNK agens se daje pri dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0096] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens se daje pri dozi izabranoj iz grupe koju čine 0.5 mg/kg 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 30 mg/kg.
[0097] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens se daje subjektu jednom nedeljno. U drugom otelotvorenju, dsRNK agens se daje subjektu dva puta nedeljno. U drugom otelotvorenju, dsRNK agens se daje subjektu dva puta mesečno.
[0098] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens se daje subjektu subkutano.
[0099] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens i ekulizumab se daju subjektu subkutano. U drugom otelotvorenju, dsRNK agens i ekulizumab se daju subjektu zajedno.
[0100] U jednom otelotvorenju, dsRNK agens se daje subjektu prvo tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za smanjenje nivoa komponente komplementa C5 u subjektu, i ekulizumab se daje subkutano pri dozi manjoj od oko 600 mg.
[0101] U jednom otelotvorenju, nivoi komponente komplementa C5 u subjektu su smanjeni barem za oko 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%.
[0102] U jednom otelotvorenju, ekulizumab se daje pri dozi od oko 100-500 mg.
[0103] U jednom otelotvorenju, upotreba pronalaska dalje obuhvata merenje hemoglobina i/ili nivoa LDH kod subjekta.
[0104] U jednom otelotvorenju, dsRNK je konjugovana za ligand.
[0105] U jednom otelotvorenju, ligand je konjugovan za 3’-kraj smisao lanca dsRNK.
[0106] U jednom otelotvorenju, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc) derivat.
[0107] U jednom od aspekata, predmetno obelodanjivanje daje metode za inhibiranje komponente komplementa C5 u ćeliji. Metode obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom kao što je ovde obelodanjeno.
[0108] U jednom aspektu, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi.
[0109] U jednom aspektu, suštinski svi nukleotidi smisao lanca su modifikovani nukleotidi izabrani iz grupe koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminal dT nukleotida. U drugom aspektu suštinski svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi izabrani iz grupe koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminal dT nukleotida. U drugom aspektu, modifikovani nukleotidi su kratke sekvence dezoksi-timin (dT) nukleotida. U drugom aspektu, smisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu. U jednom aspektu, antismisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’ terminusu i dve fosforotioat međunukleotidne veze na 3’-terminusu. U još jednom aspektu, smisao lanac je konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata povezanih preko granatog bivalentnog ili trivalentnog linkera na 3’-terminusu.
[0110] U jednom aspektu, ćelija je unutar subjekta.
[0111] U jednom aspektu, subjekat je čovek.
[0112] U jednom aspektu, ljudski subjekat ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5.
[0113] U jednom aspektu, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je izabrana iz grupe koju čine paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH), atipični hemolitičkouremijski sindrom (aHUS), astma, reumatoidni artritis (RA); sindrom antifosfolipidnih antitela; lupus nefritis; povreda ishemije-reperfuzije; tipični ili infektivni hemolitički uremični sindrom (tHUS); bolest gustih depozita (DDD); neuromijelistis optika (NMO); multifokalna motorna neuropatija (MMN); multipla skleroza (MS); makularna degeneracija (npr., makularna degeneracija povezana sa starošću (AMD)); hemoliza, sindrom povišenih enzima u jetri, i niskih trombocita (HELLP); trombocitička trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis; bulozna epidermoliza; rekurentni fetalni gubitak; pre-eklampsija, traumatska povreda mozga, mijastenija gravis, bolest hladnog aglutinina, bulozni dermatomiozitis pemfigoid, Shiga toksin E. coli-povezani hemolitički uremični sindrom, C3 nefropatija, anti-neutrofil citoplazmični vaskulitis povezan sa antitelima, humoralno i vaskularno odbijanje transplanata, disfunkcija kalema, infarkt miokarda, alogena transplantacija, sepsa, koronarna arterijska bolest, dermatomiozitis, bolest Graves-a, ateroskleroza, Alchajmerova bolest, sepsa sistemskog inflamatornog odgovora, septički šok, povreda kičmene moždine, glomerulonefritis, Hashimoto-ov tiroiditis, tip I dijabetes, psorijaza, pemfigus, autoimuna hemolitička anemija (AIHA), ITP, Goodpasture-ov sindrom, Degos bolest, antifosfolipidni sindrom (APS), katastrofični APS (CAPS), kardiovaskularni poremećaj, miokarditis, cerebrovaskularni poremećaj, periferni vaskularni poremećaj, renovaskularni poremećaj, mesenteričan/enteričan vaskularni poremećaj, vaskulitis, Henoch-Schönlein purpura nefritis, sistemski lupus eritematozus-povezani vaskulitis, vaskulitis povezan sa reumatoidnim artritisom, vaskulitis imunog kompleksa, Takayasu-ova bolest, proširena kariomiopatija, dijabetska angiopatija, Kawasaki-jeva bolest (arteritis), venska gasna embolija (VGE), i restenoza koja prati postavljanje stenta, rotaciona aterektomija, membranska nefropatija, Guillain-Barre sindrom, i perkutana transluminalna koronarna angioplastika (PTCA). U drugom otelotvorenju, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH). U još jednom otelotvorenju, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je atipični hemolitičkouremijski sindrom (aHUS).
[0114] U jednom aspektu, metode dalje obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa komponentom anti-komplementa C5 antitela, ili sa njegovim antigen-vezujućim fragmentom.
[0115] U jednom aspektu, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, inhibira cepanje komponente komplementa C5 u fragmente C5a i C5b.
[0116] U jednom aspektu, komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigenvezujući fragment je ekulizumab.
[0117] U jednom aspektu, metode dalje obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa meningokoknom vakcinom.
[0118] U jednom aspektu ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg tokom 4 nedelje što je praćeno sa petom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 900 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 900 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0119] U drugom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno pri dozi manjoj od 900 mg tokom 4 nedelje što je praćeno petom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 1200 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 1200 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0120] U drugom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno pri dozi manjoj od oko 900 mg tokom 4 nedelje što je praćeno sa petom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 1200 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 1200 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0121] U još jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg tokom 2 nedelje što je praćeno trećom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 900 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 900 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0122] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg tokom 2 nedelje što je praćeno sa trećom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 600 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 600 oko svake dve nedelje nakon toga.
[0123] U drugom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno po dozi od oko 600 mg tokom 1 nedelje što je praćeno sa drugom dozom nedelju dana kasnije manjom od oko 300 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 300 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0124] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom nedeljno pri dozi od oko 300 mg tokom 1 nedelje što je praćeno sa drugom dozom nedelju dana kasnije manjom od 300 mg, što je praćeno sa dozom manjom od 300 mg oko svake dve nedelje nakon toga.
[0125] U jednom aspektu, ćelija je unutar subjekta.
[0126] U jednom aspektu, metode prema predmetnom obelodanjivanju dalje obuhvataju plazmaferezu ili razmenu plazme u subjektu. U jednom aspektu, ekulizumab se daje subjektu pri dozi manjoj od 600 mg. U drugom aspektu, ekulizumab se daje subjektu pri dozi manjoj od oko 300 mg.
[0127] U jednom aspektu, metode prema predmetnom obelodanjivanju dalje obuhvataju infuziju plazme subjektu. U jednom aspektu, ekulizumab se daje subjektu pri dozi manjoj od oko 300 mg.
[0128] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom pri dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0.5 mg/kg do oko 15 mg/kg.
[0129] U drugom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom pri dozi od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg.
[0130] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom pri dozi izabranoj iz grupe koju čine 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, i 15 mg/kg.
[0131] U jednom aspektu, ekulizumab se daje subjektu preko intravenozne infuzije. U drugom aspektu, ekulizumab se daje subjektu subkutano.
[0132] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom pri dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0.5 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0133] U drugom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom pri dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0134] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom pri dozi izabranoj iz grupe koju čine 0.5 mg/kg 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 30 mg/kg.
[0135] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom jednom nedeljno. U drugom aspektu, dsRNK agens se daje subjektu dva puta nedeljno. U drugom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom dva puta mesečno.
[0136] U jednom aspektu, dsRNK agens se daje subjektu subkutano.
[0137] U jednom aspektu, dsRNK agens i ekulizumab se daju subjektu subkutano. U drugom aspektu, dsRNK agens i ekulizumab se daju subjektu zajedno.
[0138] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom i ekulizumabom zajedno.
[0139] U jednom aspektu, dsRNK agens se daje subjektu prvo tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da smanji nivoe komponente komplementa C5 kod subjekta, i ekulizumab se daje subkutano pri dozi manjoj od 600 mg.
[0140] U jednom aspektu, nivoi komponente komplementa C5 kod subjekta smanjeni su za barem 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%.
[0141] U jednom aspektu, ekulizumab se daje pri dozi od oko 100-500 mg.
[0142] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa dsRNK agensom prvo tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da smanji nivoe komponente komplementa C5 u ćeliji, i ćelija se zatim dovodi u kontakt sa ekulizumab pri dozi manjoj od oko 600 mg.
[0143] U jednom aspektu, nivoi komponente komplementa C5 u ćeliji smanjeni su za barem 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90%.
[0144] U jednom aspektu, ćelija se dovodi u kontakt sa ekulizumabom pri dozi od oko 100-500 mg.
[0145] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode za inhibiranje ekspresije C5 kod subjekta. Metode obuhvataju davanje subjektu terapeutski delotvorne količine dsRNK agensa kao što je ovde obelodanjeno.
Kratak opis slika
[0146]
Slika 1 je šema sva tri puta komplementa: alternativni, klasični i lektinski.
Slika 2 je grafikon koji prikazuje procenat komponente komplementa C5 koji preostaje kod C57BL/6 miševa nakon pojedinačne doze od 10 mg/kg naznačenih iRNK.
Slika 3 je grafikon koji prikazuje procenat komponente komplementa C5 koji preostaje kod C57BL/6 miševa nakon pojedinačne doze od 10 mg/kg naznačenih iRNK.
Slika 4 je grafikon koji prikazuje procenat komponente komplementa C5 koji preostaje kod C57BL/6 miševa 48 sati nakon pojedinačne doze od 10 mg/kg naznačenih iRNK.
Slika 5A je grafikon koji prikazuje procenat hemolize koji preostaje na dane 4 i 7 kod pacova nakon pojedinačne subkutane AD-58642 doze od 2.5 mg/kg, 10 mg/kg, ili 25 mg/kg.
Slika 5B je Western blot koji prikazuje količinu komponente komplementa C5 koja preostaje na dan 7 kod pacova nakon pojedinačne subkutane AD-58642 doze od 2.5 mg/kg, 10 mg/kg, ili 25 mg/kg.
Slike 6A i 6B su grafikoni koji prikazuju procenat komponente komplementa C5 koji preostaje kod C57BL/6 miševa 5 dana nakon pojedinačne AD-58642 doze od 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 25 mg/kg.
Slike 7A i 7B su grafikoni koji prikazuju procenat hemolize koji je preostao na dan 5 kod C57BL/6 miševa nakon pojedinačne AD-58642 doze od 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 25 mg/kg.
Slika 8 je Western blot koji prikazuje količinu komponente komplementa C5 koja preostaje na dan 5 kod C57BL/6 miševa nakon pojedinačne AD-58642 doze od 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 25 mg/kg.
Slika 9 je grafikon koji prikazuje količine komponente komplementa C5 proteina koji preostaje na dane 5 i 9 u serumu miševa nakon pojedinačne AD-58641 doze od 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, ili 10 mg/kg. Donja granica kvanitativnosti (LLOQ) testa prikazana je kao isprekidana linija.
Slika 10 je grafikon koji prikazuje količinu komponente komplementa C5 proteina koja preostaje na dan 8 u serumu miša nakon AD-58641 doze od 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, ili 2.5 mg/kg na dane 0, 1, 2 i 3. Donja granica kvanitativnosti (LLOQ) testa je prikazana kao isprekidana linija.
Slike 11A i 11B prikazuju delotvornost kumulativnog efekta ponavljanja davanja jedinjenja AD-58641 kod pacova. Slika 11A je grafikon koji prikazuje hemolitičku aktivnost koja preostaje u serumu pacova na dane 0, 4, 7, 11, 14, 18, 25 i 35 nakon ponavljanja davanja pri 2.5 mg/kg/dozi ili 5.0 mg/kg/dozi, q2w x3 (dva puta nedeljno u toku 3 nedelje). Slika 11B je Western blot koji prikazuje količinu komponente komplementa C5 proteina koja preostaje u serumu životinja.
Slika 12 je grafikon koji prikazuje količinu komponente komplementa C5 proteina u serumu cinomolgus makakija pri različitim vremenskim tačkama pre, u toku i nakon dve serije subkutanog doziranja od 2.5 mg/kg ili 5 mg/kg sa AD-58641 svaki treći dan u toku osam doza. Nivoi C5 proteina su normalizovani do srednje vrednosti tri uzorka pre doziranja.
Slika 13 je grafikon koji prikazuje procenat hemolize koji je preostao u serumu cinomolgus makakija pri različitim vremenskim tačkama pre, u toku i nakon dve serije subkutanog doziranja od 2.5 mg/kg ili 5 mg/kg sa AD-58641 svaki treći dan u toku osam doza. Procenat hemolize je izračunat relativno u odnosu na maksimalnu hemolizu i na pozadinsku hemolizu u kontrolnim uzorcima.
Slika 14 je grafikon koji prikazuje procenat komponente komplementa C5 proteina koji je preostao na dan 5 u serumu C57BL/6 miša nakon pojedinačne doze od 1 mg/kg navedenih iRNK.
Slika 15 je grafikon koji prikazuje procenat komponente komplementa C5 proteina koji je preostao na dan 5 u serumu C57BL/6 miševa nakon pojedinačne doze od 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, ili 2.0 mg/kg naznačenih iRNK.
Slika 16 je grafikon koji prikazuje procente komponente komplementa C5 proteina koji je preostao u serumu C57BL/6 miševa na dane 6, 13, 20, 27 i 34 nakon pojedinačne doze od 1 mg/kg naznačenih iRNK.
Slika 17 je grafikon koji prikazuje procente hemolize koji su preostali u serumu pacova pri različitim vremenskim tačkama nakon davanja doze od 5 mg/kg naznačenih jedinjenja na dane 0, 4 i 7.
Slika 18A prikazuje nukleotidne sekvence komponente komplementa 5 (C5) Homo sapiensa (SEQ ID NO:1); Slika 18B prikazuje nukleotidne sekvence komponente komplementa 5 (C5) za Macaca mulatta (SEQ ID NO:2); Slika 18C prikazuje nukleotidne sekvence komponente komplementa 5 (C5) za Mus musculus (SEQ ID NO:3); Slika 18D prikazuje nukleotidne sekvence komponente komplementa 5 (C5) za Rattus norvegicus (SEQ ID NO:4); Slika 18E prikazuje reverzni komplement SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:5); Slika 18F prikazuje reverzni komplement SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:6); Slika 18G prikazuje reverzni komplement SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:7); i Slika 18H prikazuje reverzni komplement SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO:8).
Detaljni opis
[0147] Predmetni pronalazak daje iRNK agense, kao što je definisano u patentnim zahtevima, koji utiču na cepanje RNK transkripta posredovanih RNK-uzrokovanim utišavajućim kompleksom (RISC) komponente komplementa C5 gena.
[0148] iRNK prema pronalasku obuhvata RNK lanac (antismisao lanac) koji ima oblast koja je oko 30 nukleotida ili manje dugačka, npr., 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida dugačka, gde je oblast suštinski komplementarna barem sa jednim delom mRNK transkripta C5 gena. Upotreba ovih iRNK omogućuje ciljanu degradaciju mRNK C5 gena kod sisara. Veoma niske doze iRNK od C5, naročito, mogu specifično i delotvorno posredovati RNK interferenciju (RNKi), što se ispoljava u značajnoj inhibiciji ekspresije C5 gena. Predmetni pronalazači pokazali su da iRNK koje ciljaju C5 mogu posredovati RNKi in vitro i in vivo, što se ispoljava u značajnoj inhibiciji ekspresije C5 gena. Stoga, metode i sastavi koji obuhvataju ove iRNK od koristi su pri tretiranju subjekta koji bi imao korist od smanjenja nivoa i/ili aktivnosti C5 proteina, kao što je subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, kao što je paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH).
[0149] Predmetno obelodanjivanje takođe daje metode i kombinovane terapije za tretiranje subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od inhibiranja ili smanjenja ekspresije C5 gena, npr., bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, kao što je paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH) i atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS) upotrebom i RNK sastava koji utiču na cepanje RNK transkripta posredovanih RNK-uzrokovanim utišavajućim kompleksom (RISC) komponente komplementa C5 gena.
[0150] Predmetno obelodanjivanje takođe daje metode za sprečavanje barem jednog simptoma, npr., hemolize, kod subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od inhibiranja ili smanjenja ekspresije C5 gena, npr., bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, kao što je paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH) i atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS). Predmetno obelodanjivanje dalje daje iRNK sastave koji utiču na cepanje RNK transkripta posredovanih RNK-uzrokovanim utišavajućim kompleksom (RISC) komponente komplementa C5 gena. C5 gen može biti unutar ćelije, npr., ćelije unutar subjekta, kao što je čovek.
[0151] Kombinovane terapije predmetnog obelodanjivanja obuhvataju davanje subjektu koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, iRNK agensa prema pronalasku i dodatnog terapeutika, kao što je komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili antigenvezujućeg fragmenta, npr., ekulizumab. Kombinovane terapije smanjuju nivoe C5 kod subjekata (npr., za oko 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili oko 99%) ciljanjem C5 mRNK sa iRNK agensom i u skladu sa time omogućuju terapeutski (profilaktički) delotvornoj količini ekulizumaba potrebnoj za tretiranje subjekta da bude smanjena, time smanjujući troškove tretiranja i omogućavajući lakše i lagodnije načine davanja ekulizumaba, kao što je subkutano davanje.
[0152] Sledeći detaljni opis obelodanjuje način kako da se naprave i upotrebe sastavi koji sadrže iRNK za inhibiranje ekspresije C5 gena, kao i sastave, upotrebe i metode za tretiranje subjekata koji imaju bolest koja bi imala korist od inhibiranja i/ili smanjenja ekspresije ovog gena.
I. Definicije
[0153] U cilju lakog razumevanja predmetnog pronalaska, prvo su definisani određeni termini. Dodatno, treba napomenuti da bilo da su vrednost opsega ili vrednosti parametara navedene, da je namereno da vrednosti i opsezi posredovani navedenim vrednostima su takođe namereni da budu deo ovog pronalaska.
[0154] Artikli „a“ i „an“ kada se ovde koriste odnose sa na jedan ili više od jednog (tj. do barem jedan) gramatičkog objekta artikla. U vidu primera, „element“ označava jedan element ili više od jednog elementa, npr., množinu elemenata.
[0155] Termin „obuhvata“ ovde se koristi da označava, i koristi se naizmenično sa frazom „obuhvata ali nije ograničen na“.
[0156] Termin „ili“ ovde se koristi da označava, i koristi se naizmenično sa terminom „i/ili“, ikoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0157] Kao što je ovde korišćeno, „komponenta komplementa C5“, korišćeno naizmenično sa terminom „C5“ odnosi se na dobro poznati gen i polipeptid, takođe poznat u struci kao CPAMD4, C3 i protein koji sadrži alfa-2-makroglobulin domen nalik PZP, anafilatoksin C5a analog, hemolitički komplement (Hc) i komplement C5. Sekvenca ljudskog C5 mRNK transkripta može biti pronađena, na primer, u GenBank Accession No. GI:38016946 (NM_001735.2; SEQ ID NO:1). Sekvenca C5 mRNK rezusa može biti pronađena, na primer, u GenBank Accession No. GI:297270262 (XM_001095750.2; SEQ ID NO:2). Sekvenca C5 mRNK miša može biti pronađena, na primer, u GenBank Accession No. GI:291575171 (NM_010406.2; SEQ ID NO:3). Sekvenca C5 mRNK pacova može biti pronađena, na primer, u GenBank Accession No. GI:392346248 (XM_345342.4; SEQ ID NO:4). Dodatni primeri C5 mRNK sekvenci su lako dostupni upotrebom javno dostupnih baza podataka, npr., GenBank.
[0158] Termin „C5“, kao što se ovde koristi, takođe se odnosi na prirodne varijacije DNK sekvenci C5 gena, kao što je pojedini nukleotidni polimorfizam u C5 genu. Brojni SNP-ovi u C5 genu, su identifikovani i mogu biti pronađeni, na primer, u NCBI dbSNP (videti, npr., ncbi.nlm.nih.gov/snp). Neograničavajući primeri SNP-ova u C5 genu mogu biti pronađeni u NCBI dbSNP Accession Nos. rs121909588 i rs121909587.
[0159] Kao što je ovde korišćeno, „ciljane sekvence“ odnose se na neprekidni deo nukleotidne sekvence mRNK molekula formiranog za vreme transkripcije C5 gena, uključujući mRNK koja je produkt RNK procesiranja primarnog transkripcionog proizvoda. U jednom aspektu, ciljani deo sekvence će biti dugačak barem onoliko da služi kao supstrat za iRNK-upravljano cepanje na ili blizu dela nukleotidne sekvence mRNK molekula formiranog za vreme transkripcije C5 gena.
[0160] Ciljana sekvenca može biti od oko 9-36 nukleotida dugačka, npr., oko 15-30 nukleotida dugačka. Na primer, ciljana sekvenca može biti od oko 15-30 nukleotida, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30,19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida dugačka. Opsezi i dužine posredovane iznad navedenim opsezima i dužinama takođe se smatraju delom obelodanjivanja.
[0161] Kao što je ovde korišćeno termin „lanac koji sadrži sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji sadrži lanac nukleotida koji je opisan sekvencom što se odnosi na upotrebu standardne nomenklature nukleotida.
[0162] „G,“ „C,“ „A,“ „T“ i „U“ uopšteno svako stoji za nukleotid koji sadrži guanin, citozin, adenin, timidin i uracil kao bazu, redom. Međutim, biće prihvaćeno da se termin „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ takođe odnosi na modifikovani nukleotid, kao što je detaljnije opisano ispod, ili na surogat grupu (videti, npr., Tabelu 2). Stručna osoba je svesna da guanin, citozin, adenin i uracil mogu biti zamenjeni sa drugim grupama bez suštinskog menjanja svojstava baznih parova oligonukleotida koji sadrži nukleotid koji nosi takvu grupu za zamenjivanje. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji sadrži inozin na svojoj bazi može se bazno upariti sa nukleotidom koji sadrži adenin, citozin il uracil. Stoga, nukleotidi koji sadrže uracil, guanin ili adenin mogu biti zamenjeni u nukleotidnim sekvencama dsRNK koje se nalaze u pronalasku sa nukleotidom koji sadrži, na primer inozin. U drugom primeru, adenin i citozin bilo gde na oligonukleotidu mogu biti zamenjeni sa guaninom i uracilom, respektivno kako bi formirali G-U Wobble bazni par sa ciljanom mRNK. Sekvence koje sadrže takve grupe za zamenjivanje pogodne su za sastave i metode koje se nalaze u pronalasku.
[0163] Termini „iRNK”, „RNKi agens“, „iRNK agens“, „agens RNK interferencije“ ovde se koriste naizmenično, i odnose se na agens koji sadrži RNK kao što je termin ovde definisan i koji vrši posredovanje ciljanog cepanja RNK transkripta putem RNK-uzrokovanog utišavajućeg kompleksa (RISC). iRNK navodi degradaciju specifičnu za sekvencu mRNK interferencije (RNKi). iRNK modulati, npr., inhibiraju ekspresiju C5 u ćeliji, npr., ćeliji unutar subjekta, kao što je subjekat sisara.
[0164] Ovde, RNKi agens obuhvata jednolančanu RNK koja interaguje sa ciljanom RNK sekvencom, npr., C5 ciljanom mRNK sekvencom, do direktnog cepanja ciljane RNK. Bez želje za ograničavanjem sa teorijom, veruje se da se dugačka dvolančana RNK uvedena u ćeliju razbija u siRNK preko Tipa III endonukleaze poznate kao Dicer (Sharp i dr. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, enzim nalik ribonukleazi-III, procesira dsRNK u kratak 19-23 bazni par koji interferira RNK sa svojstvima dve baze 3’ produžetka (Bernstein, i dr., (2001) Nature 409:363). siRNK su zatim inkorporirane u RNK-uzrokovanom utišavajućem kompleksu (RISC) gde jedna ili više helikaza odmotava siRNK dupleks, omogućavajući komplementarnom antismisao lancu da navodi ciljano prepoznavanje (Nykanen, i dr., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljanu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepa cilj kako bi uzrokovala utišavanje (Elbashir, i dr., (2001) Genes Dev.
15:188). Stoga, u jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje odnosi se na jednolančanu RNK (siRNK) stvorenu sa ćelijom i koja promoviše formulaciju RISC kompleksa kako bi uticala na utišavanje ciljanog gena, tj., C5 gena. U skladu sa time, termin „siRNK“ se takođe ovde koristi odnoseći se na RNKi kao što je opisano iznad.
[0165] U drugom aspektu, RNKi agens može biti jednolančana siRNK koji se uvodi u ćeliju organizma kako bi inhibirao ciljanu mRNK. Jednolančani RNKi agens vezuje se za RISC endonukleazu, Argonaut 2, koji zatim cepa ciljanu mRNK. Jednolančane siRNK su generalno od 15-30 nukleotida i hemijski su modifikovane. Dizajn i testiranje jednolančanih siRNK opisani su u patentu SAD br.8,101,348 i u Lima i dr., (2012) Cell 150: 883-894.
[0166] Bilo koja od antismisao nukleotidnih sekvenci ovde opisanih može se koristiti kao jednolančana siRNK kao što je ovde opisano ili kao hemijski modifikovana pomoću metoda opisanih u Lima i dr., (2012) Cell 150;:883-894.
[0167] U drugom aspektu, „iRNK“ za upotrebu u sastavima, upotrebe i metode ovde je dvolančana RNK i ovde se odnosi na „agens dvolančane RNKi“, „molekul dvolančane RNK (dsRNK), „dsRNK agens“, ili „dsRNK“. Termin „dsRNK“, odnosi se na kompleks molekula ribonukleinske kiseline, koji ima dupleksnu strukturu koja sadrži dva antiparalelna i suštinski komplementarna lanca nukleinske kiseline, koji se označavaju da imaju „smisao“ i „antismisao“ orijentaciju u odnosu na ciljanu RNK, tj., C5 gen. U nekim otelotvorenjima prema pronalasku, dvolančana RNK (dsRNK) izaziva degradaciju ciljane RNK, npr., mRNK kroz mehanizam post-transkripcijskog utišavanja gena koji se ovde označava kao RNK interferencija ili RNKi.
[0168] Uopšteno, većina nukleotida svakog lanca dsRNK molekula su ribonukleotidi, ali kako je detaljno opisano ovde, svaki ili oba lanca takođe mogu obuhvatati jedan ili više ribonukleotida, npr., dezoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Dodatno, kao što je korišćeno u ovoj specifikaciji, „RNKi agens“ može obuhvatati ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; RNKi agens može obuhvatati suštinske modifikacije na više nukleotida. Takve modifikacije mogu obuhvatati sve tipove modifikacija koje su ovde obelodanjene ili poznate u stanju tehnike. Bilo koje takve modifikacije, kao što je korišćeno u siRNK tipu molekula, obuhvaćene su sa „RNKi agensom“ za svrhe ove specifikacije i patentnih zahteva.
[0169] Oblast dupleksa može biti bilo koje dužine koja dozvoljava specifičnu degradaciju željene ciljane RNK kroz RISC put, i može biti u rasponu od oko 9 do 36 baznih parova dugačka, npr., oko 15-30 baznih parova dugačka, na primer, oko 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ili 36 baznih parova dugačka, kao što je oko 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 baznih parova dugačka. Opsezi i dužine koje se odnose na iznad navedene opsege i dužine takođe se smatraju delom pronalaska.
[0170] Dva lanca koji formiraju dupleks strukturu mogu biti različiti delove jednog većeg RNK molekula, ili mogu biti različiti RNK molekule. Gde su dva lanca deo nekog većeg molekula, i time su povezani neprekidnim lancem nukleotida između 3’-kraja jednog lanca i 5’-kraja respektivnog drugog lanca koji formiraju dupleks strukturu, povezujući RNK lanac označava se kao „petlja ukosnice“. Petlja ukosnice može da sadrži barem jedan neupareni nukleotid. U nekim otelotvorenjima petlja ukosnice može sadržati barem 2, barem 3, barem 4, barem 5, barem 6, barem 7, barem 8, barem 9, barem 10, barem 20, barem 23 ili više neuparenih nukleotida.
[0171] Kada su dva suštinski komplementarna lanca dsRNK napravljena od odvojenih RNK molekula, ti molekuli ne moraju, ali mogu biti kovalentno povezani. Kada su dva lanca povezana kovalentno na način različit od neprekidnog lanca nukleotida između 3’-kraja jednog lanca i 5’-kraja respektivnog drugog lanca koji formiraju dupleks strukturu, struktura povezivanja označava se „linker“. RNK lanci mogu imati isti ili različiti broj nukleotida. Maksimalni broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNK minus bilo koja produženja koja su prisutna u dupleksu. Dodatno dupleks strukturi, RNKi može sadržati jedan ili više produžetaka nukleotida.
[0172] Jedan RNKi agens ovog obelodanjivanja je dsRNK od 24-30 nukleotida koji interaguju sa ciljanom RNK sekvencom, npr., C5 ciljanom mRNK sekvencom, do direktnog cepanja ciljane RNK. Bez želje da se veže sa teorijom, dugačke dvolančane RNK uvedene u ćelije su razbijene u siRNK sa Tipom III endonukleaze poznate kao Dicer (Sharp i dr. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, enzim nalik ribonukleaze-III, procesira dsRNK u 19-23 bazni par koji interferira sa kratkim RNK sa svojstvima dve baze 3’ produžetka (Bernstein, i dr., (2001) Nature 409:363). siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-uzrokovani utišavajući kompleks (RISC) gde jedna ili više helikaza odmotava siRNK dupleks omogućavajući komplementarnom antismisao lancu da navodi ciljano prepoznavanje (Nykanen, i dr., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljanu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepa cilj kako bi indukovala utišavanje (Elbashir, i dr., (2001) Genes Dev.
15:188).
[0173] Kao što je ovde korišćeno, termin „nukleotidni produžetak“ odnosi se barem na jedan neupareni nukleotid koji se produžava u odnosu na strukturu dupleksa iRNK, npr., dsRNK. Na primer, kada se 3’-kraj jednog lanca dsRNK produžava van 5’-kraja drugog lanca, ili obrnuto, postoji nukleotidni produžetak. dsRNK može da sadrži produžetak barem na jednom nukleotidu; alternativno produžetak može da sadrži barem dva nukleotida, barem tri nukleotida, barem četiri nukleotida, barem pet nukleotida ili više. Nukleotidni produžetak može da sadrži ili da se sastoji iz nukleotid/nukleozid analoga, uključujući dezoksinukleotid/nukleotid. Produžeci mogu biti na smisao lancu, antismisao lancu, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Dalje, nukleotidi produžetka mogu biti prisutni na 5’-kraju, 3’-kraju ili na oba kraja ili bilo na antismisao ili smisao lancu dsRNK.
[0174] Antismisao lanac dsRNK može imati 1-10 nukleotida, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida, produžetaka na 3’-kraju i/ili 5’-kraju. Smisao lanac dsRNK može imati 1-10 nukleotida, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida, produžetaka na 3’-kraju i/ili 5’-kraju. Jedan ili više nukleotida na produžetku mogu biti zamenjeni sa nukleozid trifosfatom.
[0175] „Tup“ ili „tupi kraj“ označava da ne postoje neupareni nukleotidi na onom kraju agensa dvolančanog RNKi, tj., bez nukleotidnog produžetka. RNKi agens „sa tupim krajem“ je dsRNK koji je dvolančani duž cele svoje dužine, tj., bez nukleotidnog produžetka na bilo kom kaju molekula. RNKi agens prema pronalasku obuhvataju RNKi agense sa nukleotidnim produžecima na jednom kraju (tj., agensi sa jednim produžetkom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim produžecima na oba kraja.
[0176] Termin „antismisao lanac“ ili „lanac vodič“ odnosi se na lanac iRNK, npr., dsRNK, koji sadrži oblast koja je suštinski komplementarna sa ciljanom sekvencom, npr., C5 mRNK. Kao što je ovde korišćeno termin „oblast komplementarnosti“ odnosi se na oblast antismisao lanca koji je suštinski komplementaran sa sekvencom, na primer ciljanom sekvencom, npr., C5 nukleotidnom sekvencom, kao što je ovde definisano. Kada oblast komplementarnosti nije potpuno komplementarna sa ciljanom sekvencom, neusklađenosti mogu biti u unutrašnjim ili terminalnim oblastima molekula. Generalno, većina tolerisanih neusklađenosti su u terminalnoj oblasti, npr., unutar 5, 4, 3 ili 2 nukleotida 5’- i/ili 3’-terminusa iRNK.
[0177] Termin „smisao lanac“ ili „lanac pratilac“ kao što se ovde koristi, odnosi se na lanac iRNK koji obuhvata oblast koja je suštinski komplementarna sa oblasti antismisao lanca gde je termin ovde definisan.
[0178] Kao što je ovde korišćeno, termin „oblast cepanja“ odnosi se na region koji se nalazi neposredno susedno do mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na cilju na kome se dešava cepanje. U nekim slučajevima, oblast cepanja sadrži tri baze na svakom kraju i neposredno je susedna mestu cepanja. U nekim slučajevima oblast cepanja sadrži dve baze na svakom kraju i neposredno je susedna mestu cepanja. U nekim slučajevima, mesto cepanja specifično se nalazi na mestu povezanom sa nukleotidima 10 i 11 antismisao lanca, i oblast cepanja sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0179] Kao što je ovde korišćeno, ukoliko drugačije nije naznačeno, termin „komplementaran“, kada se koristi za opisivanje jedne nukleotidne sekvence u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji čine prvu nukleotidnu sekvencu da hibridizuju i formiraju dupleks strukturu pod određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji čini drugu nukleotidnu sekvencu, kao što će biti jasno stručnoj osobi. Takvi uslovi mogu, na primer, biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu obuhvatati: 400nM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4,1 nM EDTA, 50°C ili 70°C za vreme 12-16 sati i zatim ispiranje (videti, npr., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, i dr. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Drugi uslovi, kao što su fizikološki značajni uslovi kao što se mogu susresti unutar organizma, mogu se primeniti. Stručna osoba će biti u stanju da odredi sklop uslova najpogodniji za test komplementarnost dve sekvence u skladu sa krajnjom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0180] Komplementarne sekvence unutar iRNK, npr., unutar dsRNK kao što je ovde opisano, obuhvataju bazne parove između oligonukleotida ili polinukleotida koji čine prvu nukleotidnu sekvencu i oligonukleotida ili polinukleotida koji čine drugu nukleotidnu sekvencu duž cele dužine jedne ili druge nukleotidne sekvence. Takve sekvence mogu se označavati kao „potpuno komplementarne“ u odnosu na svaku drugu koja se ovde pojavljuje. Međutim, kada se prva sekvenca označava kao „suštinski komplementarna“ u odnosu na drugu sekvencu, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili mogu formirati jedan ili više, ali generalno ne više od 5, 4, 3 ili 2 neusklađenih baznih parova nakon hibridizacije dupleksa koji ima do 30 baznih parova, održavajući sposobnost hibridiziranja pod uslovima koji najviše odgovaraju njihovoj krajnjoj primeni, npr., inhibiranju ekspresije gena preko RISC puta. Međutim, kada su dva oligonukleotida dizajnirana da formiraju, nakon hibridiziranja, jedan ili više jednolančanih produžetaka, takvi produžeci se neće smatrati kao neusklađenosti u pogledu određivanja komplementarnosti. Na primer, dsRNK koji sadrži jedan oligonukleotid je 21 nukleotid dugačak i još jedan oligonukleotid je 23 nukleotida dugačak, gde duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koji je potpuno komplementaran sa kraćim oligonukleotidom, može se označavati kao „potpuno komplementarna“ za ovde opisano upotrebe.
[0181] „Komplementarne“ sekvence, kao što se ovde koristi, takođe mogu obuhvatati, ili mogu biti sačinjene u potpunosti iz, ne-Watson-Crick baznih parova i/ili baznih parova formiranih iz ne-prirodnih i modifikovanih nukleotida, ukoliko su zahtevi od gore koji se odnose na njihovu sposobnost da se hibridizuju ispunjeni. Takvi ne-Watson-Crick bazni parovi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, G:U Wobble ili Hoogstein bazne parove.
[0182] Termini „komplementaran“, „potpuno komplementaran“ i „suštinski komplementaran“ ovde se mogu koristiti u odnosu na baznu neusklađenost između smisao lanca i antismisao lanca dsRNK, ili između antismisao lanca iRNK agensa i ciljane sekvence, kao što će biti jasno iz konteksta njihove upotrebe.
[0183] Kao što je ovde korišćeno, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran barem sa delom“ informacione RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je suštinski komplementaran sa neprekidnim delom te mRNK (npr., mRNK koja enkodira C5). Na primer, polinukleotid je komplementaran barem sa delom C5 mRNK ukoliko je sekvenca suštinski komplementarna sa delom mRNK koji nije prekidan koja enkodira C5.
[0184] Uopšteno, većina nukleotida svakog lanca su ribonukleotidi, ali kao što je ovde detaljno opisano, svaki od oba lanca takođe može obuhvatati jedan ili više ne-ribonukleotida, npr., dezoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Dodatno, „iRNK“ može obuhvatati ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama. Takve modifikacije mogu obuhvatiti sve tipove modifikacija koji su ovde obelodanjeni ili poznati u stanju tehnike. Bilo koje takve modifikacije, kao što je korišćeno u iRNK molekulu, obuhvaćene su sa „iRNK“ za svrhu ove specifikacije i patentnih zahteva.
[0185] U jednom aspektu ovde, agens za upotrebu u metodama i sastavima prema predmetnom obelodanjivanju je jednolančani antismisao RNK molekul koji inhibira ciljanu mRNK preko antismisao inhibitornog mehanizma. Jednolančani antismisao RNK molekul je komplementaran sa sekvencom unutar ciljane mRNK. Jednolančani antismisao oligonukleotidi mogu inhibirati translaciju na stehiometrijski način sa baznim parovima mRNK i fizičkim preprekama translacionog mehanizma, videti Dias, N. i dr., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Jednolančani antismisao RNK molekul može biti oko 15 do oko 30 nukleotida dugačak može imati sekvencu koja je komplementarna sa ciljanom sekvencom. Na primer, jednolančani antismisao RNK molekul može obuhvatati sekvencu koja ima barem oko 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više neprekidnih nukleotida od bilo koje antismisao sekvence koja je ovde opisana.
[0186] Termin „lipidna nanočestica“ ili „LNP“ je nosač koji ima lipidni sloj koji inkapsulira farmaceutski aktivan molekul, kao što je molekul nukleinske kiseline, npr., iRNK ili plazmid iz kojeg je iRNK transkribovana. LNP su opisani, na primer, u patentu SAD br.6,858,225, 6,815,432, 8,158,601, i 8,058,069.
[0187] Kao što je ovde korišćeno, „subjekat“ je životinja kao što je sisar, uključujući primate (kao što je čovek, primat koji nije čovek, npr., majmun ili šimpanza), ne-primate (kao što je krava, svinja, kamila, lama, konj, koza, zec, ovca, hrčak, zamorče, mačka, pas, pacov, miš, konj, i kit) ili ptice (npr., patka ili guska). U otelotvorenju, subjekat je čovek, kao što je čovek koji se tretira ili procenjuje za bolest, poremećaj ili stanje koje bi imalo korist od smanjenja ekspresije C5; čovek pri riziku od bolesti, poremećaja ili stanja koje bi imalo korist od smanjenja ekspresije C5; čovek koji ima bolest, poremećaj ili stanje koje bi imalo korist od smanjenja ekspresije C5; i/ili čovek koji se tretira za bolest, poremećaj ili stanje koje bi imalo korist od smanjenja ekspresije C5, kao što je ovde opisano.
[0188] Kao što je ovde korišćeno, termini „tretirati“ ili „tretiranje“ odnose se na koristan ili željeni rezultat uključujući, ali ne ograničavajući se, na poboljšavanje ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa neželjenim putem aktivacije komplementa (npr., hemoliza i/ili hronična inflamacija); smanjivanjem obima puta aktivacije komplementa; stabilizacijom (tj., ne pogoršanjem) stanja hronične inflamacije i/ili hemolize; poboljšanje palacije neželjenog puta aktivacije komplementa (npr., hronična inflamacija i/ili hemoliza) bilo detektabilna ili ne. „Tretiranje“ takođe može označavati produženo preživljavanje u poređenju sa očekivanim preživljavanjem u odsustvu tretiranja.
[0189] Termin „manje“ u kontekstu nivoa komponenta komplementa C5 u subjektu ili oznake bolesti ili simptoma odnosi se na statistički značajno smanjenje takvog nivoa.
Smanjenje može biti, na primer, barem 10%, barem 15%, barem 20%, barem 25%, barem 30%, barem 35%, barem 40%, barem 45%, barem 50%, barem 55%, barem 60%, barem 65%, barem 70%, barem 75%, barem 80%, barem 85%, barem 90%, barem 95%, ili više i poželjno je do nivoa koji je prihvaćen da je unutar normalnog opsega za pojedinca bez takve bolesti.
[0190] Kao što je ovde korišćeno, „sprečavanje“ ili „sprečavati“, kada se koristi u odnosu na bolest, poremećaj ili stanje koji bi imalo korist od smanjenja ekspresije C5, odnosi se na smanjenje verovatnoće da subjekat razvije simptom povezan sa takvom bolesti, poremećajem ili stanjem, npr., simptom neželjene aktivacije komplementa, kao što je hronična inflamacija, hemoliza i/ili tromboza. Verovatnoća od razvijanja tromboze se smanjuje, na primer kada pojedinac koji ima jedan ili više faktora za trombozu, ne uspe da razvije trombozu ili razvije manje ozbiljnu prognozu u poređenju sa populacijom koja ima iste faktore rizika i koji ne primaju tretiranje kao što je ovde opisano. Neuspeh razvijanja bolesti, poremećaja ili stanja, ili smanjenje razvoja simptoma povezanog sa takvom bolesti, poremećajem ili stanjem (npr., barem za oko 10% na klinički prihvatljivoj skali za bolest ili poremećaj), ili ispoljavanje produženih simptoma koje je produženo (npr., za dane, nedelje, mesece ili godine) smatra se delotvornim sprečavanjem.
[0191] Kao što je ovde korišćeno, termin „bolest povezana sa komponentom komplementa C5“ je bolest ili poremećaj koji je izazvan sa, ili je povezan sa aktivacijom komplementa. Takve bolesti obično su povezane sa inflamacijom i/ili aktivacijom imunog sistema, npr., liza posredovana sa kompleksom napada na membranu, anafilaksa, i/ili hemoliza.
Neograničavajući primeri bolesti povezanih sa komponentom komplementa C5 su paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH), atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS), astma, reumatoidni artritis (RA); sindrom antifosfolipidnih antitela; lupus nefritis; povreda ishemije-reperfuzije; tipični ili infektivni hemolitički uremični sindrom (tHUS); bolest gustih depozita (DDD); neuromijelistis optika (NMO); multifokalna motorna neuropatija (MMN); multipla skleroza (MS); makularna degeneracija (npr., makularna degeneracija povezana sa starošću (AMD)); hemoliza, sindrom povišenih enzima u jetri, i niskih trombocita (HELLP); trombocitička trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis; bulozna epidermoliza; rekurentni fetalni gubitak; preeklampsija, traumatska povreda mozga, mijastenija gravis, bolest hladnog aglutinina, bulozni dermatomiozitis pemfigoid, Shiga toksin E. coli-povezani hemolitički uremični sindrom, C3 nefropatija, anti-neutrofil citoplazmični vaskulitis povezan sa antitelima (npr., granulomatoza sa poliangiitisom (prethodno poznata kao Wegener granulomatoza), Churg-Strauss sindrom, i mikroskopski poliangiitis), humoralno i vaskularno odbijanje transplanata, disfunkcija kalema, infarkt miokarda (npr., oštećenje tkiva i ishemija kod infarkta miokarda), alogena transplantacija, sepsa (npr., loš ishod sepse), koronarna arterijska bolest, dermatomiozitis, bolest Graves-a, ateroskleroza, Alchajmerova bolest, sepsa sistemskog inflamatornog odgovora, septički šok, povreda kičmene moždine, glomerulonefritis, Hashimoto-ov tiroiditis, tip I dijabetes, psorijaza, pemfigus, autoimuna hemolitička anemija (AIHA), ITP, Goodpasture-ov sindrom, Degos bolest, antifosfolipidni sindrom (APS), katastrofični APS (CAPS), kardiovaskularni poremećaj, miokarditis, cerebrovaskularni poremećaj, periferni (npr., muskuloskeletni) vaskularni poremećaj, renovaskularni poremećaj, mesenteričan/enteričan vaskularni poremećaj, vaskulitis, Henoch-Schönlein purpura nefritis, sistemski lupus eritematozus-povezani vaskulitis, vaskulitis povezan sa reumatoidnim artritisom, vaskulitis imunog kompleksa, Takayasu-ova bolest, proširena kariomiopatija, dijabetska angiopatija, Kawasaki-jeva bolest (arteritis), venska gasna embolija (VGE), i restenoza koja prati postavljanje stenta, rotaciona aterektomija, membranska nefropatija, Guillain-Barre sindrom, i perkutana transluminalna koronarna angioplastika (PTCA) (videti, e.g., Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316; Holers and Thurman (2004) Molecular Immunology 41:147-152; objava patentna SAD br.20070172483).
[0192] U jednom otelotvorenju, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH). PNH može biti klasična PNH ili PNH u vidu drugog sindroma neuspeha kičmene moždine i/ili mijelodisplastičnog sindroma (MDS), npr., citopenije. U drugom otelotvorenju, bolest povezana sa komponentom komplementa C5 je atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS).
II. iRNK
[0193] Predmetni pronalazak daje iRNK kao što je definisano u patentnim zahtevima koji inhibiraju ekspresiju komponente komplementa C5 gena. U ovom obelodanjivanje iRNK agens obuhvata molekule dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiranje ekspresije C5 gena u ćelijama, kao što su ćelije unutar subjekta, npr., sisara, kao što je čovek koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, npr., PNH. dsRNK obuhvata antismisao lanac koji ima oblast komplementarnosti koji je komplementaran sa barem jednim delom mRNK formirane ekspresijom C5 gena. Oblast komplementarnosti je oko 30 nukleotida ili manje dugačka (npr., oko 30,29,28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 ili 18 nukleotida dugačka). Nakon kontakta sa ćelijom koja vrši ekspresiju C5 gena, iRNK inhibira ekspresiju C5 gena (npr., C5 gen čoveka, primata, ne-primata, ili ptice) za barem oko 10% kao što je testirano, na primer, sa PCR ili granatom DNK (bDNK)-zasnovanom metodom, ili sa metodom zasnovanom na proteinima, kao što je analiza imunofluorescencije, upotrebom, na primer Western blot ili tehnike protočne citometrije.
[0194] dsRNK obuhvata dva RNK lanca koji su komplementarni i hibridizuju se kako bi formirali dupleks strukturu pod uslovima u kojima će se koristiti dsRNK. Jedan lanac dsRNK (antismisao lanac) obuhvata oblast komplementarnosti koja je suštinski komplementarna i generalno potpuno komplementarna sa ciljanom sekvencom. Ciljana sekvenca može biti izvedena iz sekvence mRNK formirane u toku ekspresije C5 gena. Drugi lanac (smisao lanac) obuhvata oblast koja je komplementarna sa smisao lancem, tako da se dva lanca hibridizuju i formiraju dupleks strukturu kada su kombinovani u pogodnim uslovima. Kao što je opisano bilo gde ovde i kao što je poznato u tehnici, komplementarne sekvence dsRNK takođe mogu biti sadržane u samo-komplementarnim oblastima molekula sa jednom nukleinskom kiselinom, u suprotnosti sa time da su na različitim oligonukleotidima.
[0195] Uopšteno, dupleks struktura je između 15 i 30 baznih parova dugačka, npr., između 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30,19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 baznih parova dugačka. Opsezi i dužine između onih navedenih iznad opsega i dužina takođe se smatraju delom ovog pronalaska.
[0196] Slično, oblast komplementarnosti ciljane sekvence je između 15 i 30 nukleotida dugačka, npr., između 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida dugačka. Opsezi i dužine između onih navedenih iznad opsega i dužina takođe se smatraju delom ovog pronalaska.
[0197] U nekim otelotvorenjima, dsRNK je između 15 i oko 20 nukleotida dugačka, ili između oko 25 i 30 nukleotida dugačka. Uopšteno, dsRNK je dovoljno dugačka da služi kao zamena za Dicer enzim. Na primer, dobro je poznato u struci da dsRNK koje su duže od oko 21-23 nukleotida mogu da služe kao zamene za Dicer. Kao što je određena stručna osoba prepoznati, oblast DNK ciljana za cepanje će najčešće biti deo većeg RNK molekula, često mRNK molekula. Kada je bitno, „deo“ mRNK cilja je neprekidna sekvenca mRNK cilja dovoljne dužine koja dozvoljava da bude zamena za RNKi-posredovano cepanje (tj., cepanje preko RISC puta).
[0198] Osoba stručna u ovoj oblasti takođe će prepoznati da dupleks oblast je primarni funkcionalni deo dsRNK, npr., dupleks oblast je od oko 9 do 36 baznih parova, npr., oko 10-36,11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 baznih parova. Stoga, u jednom otelotvorenju, do granice kada postaje procesiran do funkcionalnog dupleksa, od npr., 15-30 baznih parova, koji ciljanu željenu RNK za cepanje, RNK molekul ili kompleks RNK molekula koji ima dupleks oblast veću od 30 baznih parova je dsRNK. Stoga, osoba stručna u ovoj oblasti će prepoznati da u jednom otelotvorenju, miRNK je dsRNK. U drugom otelotvorenju, dsRNK nije miRNK koja se prirodno pronalazi. U drugom otelotvorenju, iRNK agens kod koristi za ciljanje C5 ekspresije nije generisan u ciljanoj ćeliji cepanjem veće dsRNK.
[0199] dsRNK kao što je ovde opisano dalje mogu obuhvatati jedan ili više jednolančanih nukleotidnih produžetaka od npr., 1, 2, 3 ili 4 nukleotida. dsRNK koje imaju barem jedan nukleotidni produžetak mogu imati neočekivano visoka inhibitorna svojstva u odnosu na njih suprotni tupi kraj. Nukleotidni produžetak može sadržati ili se sastojati od nukleotid/nukleozid analoga, uključujući dezoksinukleotid/nukleotid. Produžeci mogu biti na smisao lancu, antismisao lancu i bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Dalje, nukleotidi produžetka mogu biti prisutni na 5’-kraju, 3’-kraju ili na obra kraja ili na antismisao ili smisao lancu dsRNK.
[0200] dsRNK može biti sintetisana standardnim metodama poznatim u tehnici kao što je dalje razmatranu ispod, npr., upotrebom automatizovanog DNK sintetizera, kao što je komercijalno dostupan od, na primer, Applied Biosystems, Inc.
[0201] Ovde obelodanjena iRNK može se pripremiti upotrebom postupka od dva koraka. Prvo, pojedinačni lanci dvolančanog RNK molekula se pripreme odvojeno. Zatim se komponentni lanci prekale. Pojedinačni lanci siRNK jedinjenja se mogu pripremiti upotrebom organske sinteze sa fazom rastvora ili fazom čvrste supstance ili sa obe. Organska sinteza nudi prednost toga da se oligonukleotidni lanci koji sadrži neprirodne ili modifikovane nukleotide mogu lako pripremiti. Jednolančani oligonukleotidi prema pronalasku mogu se pripremiti upotrebom organske sinteze sa fazom rastvora ili fazom čvrste supstance ili sa obe. U jednom aspektu, dsRNK prema predmetnom obelodanjivanju obuhvata barem dve nukleotidne sekvence, smisao sekvencu i anti-smisao sekvencu. Smisao lanac je izabran iz grupe sekvenci datu u jednoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 i odgovarajući antismisao lanci smisao lanca su izabrani iz grupe sekvenci iz bilo koje od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23. U ovom aspektu, jedna od dve sekvence komplementarna je sa drugom od dve sekvence, gde je jedna od sekvenci suštinski komplementarna sa sekvencom mRNK generisane ekspresijom C5 gena. Kao takva, u ovom aspektu, dsRNK će obuhvatati dva oligonukleotida, gde je jedan oligonukleotid opisan kao smisao lanac u bilo kojem odgovarajućem antismisao lancu smisao lanca iz bilo koje od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 ili 23. U jednom aspektu, suštinski komplementarne sekvence dsRNK su sadržane na različitim oligonukleotidima. U jednom aspektu, suštinski komplementarne sekvence dsRNK su sadržane u jednom oligonukleotidu.
[0202] Biće prihvaćeno da, bez obzira što su neke sekvence iz Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 opisane kao modifikovani i/ili konjugovane sekvence, RNK i iRNK ovde obelodanjene, npr., dsRNK, mogu sadržati bilo koju od sekvenci iznetih u Tabelama 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 koje su nemodifikovane, nisu modifikovane i/ili modifikovane i/ili konjugovane različite u odnosu kako je ovde opisano.
[0203] Stručnjak je svestan da dsRNK koje imaju dupleks strukturu između oko 20 i 23 bazna para, npr., 21 bazni par, su označene kao naročito delotvorne u izazivanju RNK interferencije (Elbashir i dr., EMBO 2001, 20:6877-6888). Međutim, drugi su pronašli da kraće ili duže RNK dupleks strukture takođe mogu biti delotvorne (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim i dr. (2005) Nat Biotech 23:222-226). U gore opisanim otelotvorenjima, svojstvom prirode oligonukleotidnih sekvenci datih u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23, dsRNK ovde opisane mogu obuhvatati barem jedan lanac dužine najmanje 21 nukleotid. Razumno je očekivati da kraći dupleksi imaju jednu od sekvenci iz bilo koje od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 minus samo nekoliko nukleotida na jednom ili oba kraja, budu slično delotvorni u poređenju sa dsRNK opisanim iznad. Stoga, dsRNK koje imaju sekvencu od barem 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više neprekidnih nukleotida izvedenih iz jedne od sekvenci iz bilo koje od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23, i koje se razlikuju u svojoj sposobnosti da inhibiraju ekspresiju C5 gena za ne više od 5, 10, 15, 20, 25 ili 30% inhibicije dsRNK koja čini punu sekvencu, smatraju se da su u okviru predmetnog pronalaska.
[0204] Dodatno, RNK date u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 određuju mesta na C5 transkriptu koja su podložna RISC-posredovanom cepanju. Kakvo, predmetno otelotvorenje dalje obuhvata iRNK koje ciljaju jedno od ovih mesta. Kao što je ovde korišćeno, iRNK je rečeno da cilja unutar određenog mesta RNK transkripta ukoliko RNK promoviše cepanje transkripta bilo gde unutar određenog mesta. Takvo iRNK će generalno obuhvatati barem oko 15 neprekidnih nukleotida od jedne od sekvenci datih u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 spojenih do dodatnih nukleotidnih sekvenci uzetih iz oblasti neprekidne za izabrane sekvence C5 gena.
[0205] Dok je ciljana sekvenca uglavnom oko 15-30 nukleotida dugačka, postoji velika varijacija u pogodnosti određenih sekvenci u ovom opsegu za usmeravanje cepanja bilo koje ciljane RNK. Razni softverski paketi i smernice postavljene u ovom dokumentu pružaju smernice za identifikaciju optimalnih ciljanih sekvenci za bilo koji ciljani gen, ali se takođe može primeniti empirijski pristup u kojem je „prozor“ ili „maska“ određene veličine (kao neograničavajući primer, 21 nukleotid) je bukvalno ili figurativno (uključujući, na primer, u silicijumu) postavljen na ciljanu RNK sekvencu za identifikaciju sekvenci u opsegu veličine koji mogu poslužiti kao ciljne sekvence. Pomeranjem sekvence „prozora“ progresivno jednom nukleotidu uzvodno ili nizvodno od početne lokacije ciljane sekvence, može se identifikovati sledeća potencijalna ciljana sekvenca dok se ne identifikuje kompletan niz mogućih sekvenci za bilo koju odabranu ciljanu veličinu. Ovaj proces, zajedno sa sistematskom sintezom i testiranjem identifikovanih sekvenci (pomoću analiza kako je opisano ovde ili kako je poznato u tehnici) za identifikaciju onih sekvenci koje obavljaju optimalno, mogu identifikovati one RNK sekvence koje, kada su ciljane sa iRNK agensom, posreduju najbolje inhibiciju ekspresije ciljnog gena. Tako, dok sekvence koje su identifikovane, na primer, u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23 predstavljaju delotvorne ciljane sekvence, pretpostavlja se da se može postići dalja optimizacija delotvornosti inhibicije progresivno „pomeranjem prozora“ jedan nukleotid uzvodno ili nizvodno od datih sekvenci da bi se odredile sekvence sa jednakim ili boljim svojstvima inhibicije.
[0206] Dalje, predviđeno je da za bilo koju identifikovanu sekvencu, npr., u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23, dodatno optimiziranje može biti sistematično postignuto ili dodavanjem ili uklanjanjem nukleotida kako bi se generisale duže ili kraće sekvence i testirale one sekvence koje generišu pomeranjem prozora sa dužom ili kraćom veličinom uzvodno ili nizvodno ciljanu RNK od te tačke. Ponovo, povezivanje ovog pristupa sa generiranjem novih ciljeva kandidata sa testiranjem efikasnosti iRNK na bazi tih ciljanih sekvenci u testu inhibicije kao što je poznato u struci i/ili kako je opisano ovde može dovesti do daljeg poboljšanja u delotvornosti inhibicije. Dalje, takve optimizovane sekvence mogu se prilagoditi npr., uvođenjem modifikovanih nukleotida kao što je ovde opisano ili kao što je poznato u tehnici, dodatka ili promene u produžetku ili drugim modifikacijama koje su poznate u struci i/ili su ovde razmatrane radi dalje optimizacije molekula (npr. povećanje stabilnosti seruma ili poluraspad cirkulacije, povećanje termičke stabilnosti, poboljšanje transmembranske isporuke, ciljanje na određenu lokaciju ili tip ćelije, povećanje interakcije sa enzimima puta za utišavanje, povećanje oslobađanja od endozoma) kao inhibitora ekspresije.
[0207] iRNK kao što je ovde opisano može sadržati jednu ili više neusklađenosti sa ciljanom sekvencom. U jednom slučaju, iRNK kao što je ovde opisano ne sadrži više od 3 neusklađenosti. Ako antismisao ćelija iRNK sadrži neusklađenost prema ciljanoj sekvenci, poželjno je da se oblast neusklađenosti ne nalazi u centru oblasti komplementarnosti. Ako antismisao ćelija iRNK sadrži neusklađenost prema ciljanoj sekvenci, poželjno je da se neusklađenost ograniči na zadnjih 5 nukleotida sa ili 5’- ili 3’-kraja oblasti komplementarnosti. Na primer, za iRNK agens sa 23 nukleotida lanac koji je komplementaran sa oblasti C5 gena, generalno ne sadrži neusklađenost unutar centralnih 13 nukleotida. Metode ovde opisane ili metode poznate u stanju tehnike mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li je iRNK koja sadrži neusklađenost sa ciljanom sekvencom delotvorna u inhibiciji ekspresije C5 gena. Razmatranje delotvornosti iRNK sa neusaglašenostima u inhibiciji ekspresije C5 gena je važno, posebno ako je poznato da određena oblast komplementarnosti u C5 gena ima polimorfnu varijaciju sekvence unutar populacije.
III. Modifikovane iRNK
[0208] U jednom otelotvorenju, RNK od iRNK prema pronalasku, tj., dsRNK kao što je definisano u patentnim zahtevima, je nemodifikovana, i ne sadrži, npr., hemijske modifikacije i/ili konjugacije poznate u tehnici i koje su ovde opisane. U drugom otelotvorenju, RNK od iRNK prema pronalasku
[0209] je hemijski modifikovana kako bi se poboljšala stabilnost drugih korisnih svojstava. U određenim otelotvorenjima prema pronalasku, suštinski svi nukleotidi iRNK prema pronalasku su modifikovani. U drugim otelotvorenjima prema pronalasku, svi nukleotidi iRNK prema pronalasku su modifikovani. iRNK prema pronalasku u kojima su „suštinski svi nukleotidi modifikovani“ su u velikom delu ali ne u potpunosti modifikovane i mogu da obuhvataju ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nemodifikovani nukleotid.
[0210] Nukleinske kiseline koje se nalaze u ovom pronalasku mogu biti sintetisane i/ili modifikovane metodama dobro ustanovljenim u tehnici, kao što su one opisane u „Current protocols in nucleic acid chemistry“, Beaucage, S.L. i dr. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, što je ovde uključeno sa referencom. Modifikacije obuhvataju, na primer, modifikacije na krajevima, npr., modifikacije na 5’-kraju (fosforilacija, konjugacija, inverzne veze) ili modifikacije na 3’-kraju (konjugacija, DNK nukleotidi, inverzne veze, itd.); bazne modifikacije, npr., zamena sa stabilizirajućim bazama, destabilizirajućim bazama ili bazama koji imaju bazni par sa proširenim izborom partnera, uklanjanje baza (abazni nukleotidi) ili konjugovane baze; modifikacije sa šećerom (npr., na 2’-poziciji ili 4’-poziciji) ili zamenom šećera; i/ili modifikacije glavnog lanca, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiester veza. Specifični primeri iRNK jedinjenja koja su od koristi u ovde opisanim otelotvorenjima obuhvataju, ali nisu ograničena na RNK koje imaju modifikovani glavni lanac ili nemaju prirodne međunukleozidne veze. RNK koje imaju modifikovani glavni lanac obuhvataju, između ostalih, one koje nemaju atom fosfora u glavnom lancu. Za svrhe ove specifikacije, i kao što se nekad navodi u tehnici, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u svojim međunukleozidnim glavnim lancima takođe se mogu smatrati oligonukleozidima. U nekim otelotvorenjima, modifikovana iRNK će imati atom fosfora na svojem međunukleozidnom glavnom lancu.
[0211] Modifikovani RNK glavni lanci obuhvataju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestere, aminoalkilfosfotriestere, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3’-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3’-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestere, i boranofosfate koji imaju normalne 3’-5’ veze, 2’-5’-povezane njihove analoge, i one koji imaju inverzni polaritet gde su susedni parovi nukleozida povezani 3’-5’ do 5’-3’ ili 2’-5’ do 5’-2’. Razne soli, pomešane soli i slobodne forme kiseline takođe su uključene.
[0212] Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje iznad navedenih veza koje sadrže fosfor obuhvataju, ali nisu ograničeni na, patent SAD br.3,687,808; 4,469,863;
4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6,239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i pat SAD RE39464.
[0213] Modifikovani RNK glavni lanci koji ne obuhvataju atom fosfora imaju glavne lance koji su formirani sa kratim lancem alkil ili cikloalkil međunukleozidnim vezama, pomešanim heteroatomima i alkil ili cikloalkil međunukleozidnim vezama, ili jednom ili više heteroatomskih ili heterocikličnih međunukleozidnih veza kratkog lanca. Ovo obuhvata one koje imaju morfolino veze (formirane u delu od šećera nukleozida); siloksan glavne lance, sulfid, sulfoksid i sulfon glavne lance; formacetil i tioformacetil glavne lance; metilen formacetil i tioformacetil glavne lance; glavne lance koji sadrže alken; sulfamat glavne lance; metileneimino i metilenehidrazino glavne lance; sulfonat i sulfonamid glavne lance; amid glavne lance; i druge koji imaju pomešane N, O, S i CH2komponentne delove.
[0214] Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje iznad navedenih oligonukleozida obuhvataju, ali nisu ograničeni na, patent SAD br.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i, 5,677,439.
[0215] U drugim otelotvorenjima, pogodni RNK mimetici razmatrani su za upotrebu u iRNK, u kojima su oba, šećer i međunukleozidna veza, tj., glavni lanac, nukleotidnih jedinica zamenjeni sa novim grupama. Ove bazne jedinice održavane su za hibridizaciju sa odgovarajućim ciljanim jedinjenjem sa nukleinskom kiselinom. Jedno takvo oligometrijsko jedinjenje, RNK mimetik koji je pokazao da ima odlična svojstva hibridizacije, označava se kao peptidna nukleinska kiselina (PNA). Kod PNA jedinjenja, glavni lanac šećera RNK je zamenjen sa amidom koji sadrži glavni lanac, konkretno aminoetilglicin glavni lanac.
Nukleobaze su zadržane i vezane direktno ili indirektno za azot atome amidnog dela glavnog lanca. Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje PNA jedinjenja obuhvataju ali nisu ograničeni na, patent SAD br.5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262.
Dodatna PNA jedinjenja pogodna za upotrebu kod iRNK prema pronalasku opisana su, na primer, u Nielsen i dr., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0216] Neka otelotvorenja koja se nalaze u pronalasku obuhvataju RNK sa fosforotioat glavnim lancem i oligonukleozide sa glavnim lancem sa heteroatomom, i naročito --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[poznat kao metilen (metilimino) ili MMI glavni lanac], --CH2--O-N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2--[gde je matični fosfodiester glavni lanac predstavljen kao --O--P--O--CH2--] iz iznad navedenog patenta SAD br.5,489,677, i amid glavne lance iz iznad navedenog patenta SAD br. 5,602,240. U nekim otelotvorenjima, RNK koje se ovde nalaze imaju morfolino glavne strukture iz iznad navedenog patenta SAD br.5,034,506.
[0217] Modifikovane RNK takođe mogu sadržati jednu ili više supstituisanih grupa šećera. iRNK, npr., dsRNK, koje se nalaze ovde mogu obuhvatati jedno od sledećeg na 2’-poziciji: OH; F; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, gde alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Primerno pogodne modifikacije obuhvataju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugim otelotvorenjima dsRNK obuhvataju jedno od sledećeg na 2’ poziciji: C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, RNK cepajuću grupu, reporter grupu, interkalator, grupu za poboljšanje farmakokinetskih svojstava iRNK, i druge supstituente koji imaju slična svojstva. U nekim otelotvorenjima, modifikacija obuhvata 2’-metoksietoksi (2’-O--CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2’-O-(2-metoksietil) ili 2’-MOE) (Martin i dr., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj., alkoksi-alkoksi grupu.
Druga primerna modifikacija je 2’-dimetilaminooksietoksi, tj., a O(CH2)2ON(CH3)2grupa, takođe poznata kao 2’-DMAOE, kao što je opisano u primerima ispod, i 2’-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznata u tehnici kao 2’-O-dimetilaminoetoksietil ili 2’-DMAEOE), tj., 2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
[0218] Druge modifikacije obuhvataju 2’-metoksi (2’-OCH3), 2’-aminopropoksi (2’-OCH2CH2CH2NH2) i 2’-fluoro (2’-F). Slične modifikacije mogu biti izvršene na drugim pozicijama RNK od iRNK, naročito na 3’ pozicijama šećera na 3’ terminalnom nukleotidu ili na 2’-5’ povezanim dsRNK i 5’ poziciji 5’ terminalnog nukleotida. iRNK takođe mogu imati mimetike šećera kao što su ciklobutil grupe na mestu pentofuranozil šećera. Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje takvih modifikovanih struktura šećera obuhvataju, ali nisu ograničeni na, patent sad br.4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920, od kojih su neki uopšteno u vlasništvu trenutnog prijavioca.
[0219] iRNK takođe može obuhvatati modifikacije ili supstitucije nukleobaze (često se u tehnici označavaju jednostavno kao „baze“). Kao što je ovde korišćeno, „nemodifikovana“ ili „prirodna“ nukleobaza obuhvata adenin purinske baze (A) i guanin (G), i timin pirimidinske baze (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze obuhvataju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su dezoksi-timin (dT), 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivati adenina i guanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil anal drugi 8-supstituisani adenini i guanini, 5-halo, naročito 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisane uracili i citozini, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-daazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze obuhvataju one obelodanjene u patentu SAD br.3,687,808, one obelodanjene u Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; one obelodanjene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, strane 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, one obelodanjene u Englisch i dr., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, i one obelodanjene u Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNK Research and Applications, strane 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press,1993. Neke od ovih nukleobaza su naročito korisne za povećavanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja koja se nalaze u pronalasku. Ovo obuhvata 5-supstituisane pirimidin, 6-azaprimidin i N-2, N-6 i 0-6 supstituisani purin, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin.5-metilcitozin supstituenti su pokazali da povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline pri 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNK Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) i odlični su supstituenti baza, čak i još više kada su u kombinaciji sa 2’-O-metoksietil modifikacijama šećera.
[0220] Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje nekih od iznad navedenih modifikovanih nukleobaza kao i drugih modifikovanih nukleobaza obuhvataju, ali nisu ograničeni na, iznad navedene, patente SAD br.3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0221] RNK od iRNK može takođe biti modifikovana kako bi obuhvatala jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNA). Zaključane nukleinske kiseline su nukleotid koji ima modifikovanu grupu riboze gde grupa riboze sadrži dodatnu vezu sa mostom kod 2’ i 4’ ugljenika. Ova struktura delotvorno „zaključava“ ribozu sa 3’-endo strukturnom konformacije. Dodavanje zaključane nukleinske kiseline siRNK je pokazalo da povećava stabilnost siRNK u serumu, i da smanjuje dejstvo van cilja Elmen, J. i dr., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. i dr., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843;
Grunweller, A. i dr., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[0222] Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje zaključanih nukleotida nukleinske kiseline obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sledeće: patent SAD br.6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; i 7,399,845.
[0223] Potencijalno stabilizirajuće modifikacije krajeva RNK molekula mogu da obuhvataju N-(acetilaminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(kaproil-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroksiprolinol (Hyp-NHAc), timidin-2’-O-dezoksitimidin (etar), N-(aminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-dokosanoil-uridin-3“- fosfat, inverzne baze dT(idT) i drugo. Obelodanjivanje ove modifikacije može biti pronađeno u PTC objavi br. WO 2011/005861.
A. Modifikovane iRNK koje sadrže motive prema pronalasku
[0224] U određenim aspektima pronalaska, dvolančani RNKi agensi prema pronalasku obuhvataju agense sa hemijskim modifikacijama kao što je obelodanjeno, na primer, u provizornoj patentnoj prijavi SAD br.61/561,710, podnetoj 18. novembra 18,2011, ili u PCT/US2012/065691, podnetoj 16. novembra, 2012.
[0225] Kao što je pokazano ovde i u provizornoj patentnoj prijavi br.61/561,710 ili PCT prijavi br. PCT/US2012/065691, bolji rezultat može se dobiti uvođenjem jednog ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u smisao lanac i/ili antismisao lanac RNKi agensa, naročito blizu mesta cepanja. U nekim otelotvorenjima, smisao lanac i antismisao lanac RNKi agensa mogu u suprotnom biti potpuno modifikovani. Uvođenje ovih motiva prekida šablon modifikacije, ukoliko je prisutna, smisao i/ili antismisao lanca. RNKi agens može opciono biti konjugovan sa ligandom GalNAc derivata, na primer na smisao lancu. Dobijeni RNKi agensi predstavljaju bolju aktivnost pri utišavanju gena.
[0226] Konkretno, neočekivano je otkriveno da kada su smisao lanac i antismisao lanac agensa dvolančane RNKi potpuno modifikovani da imaju jedan ili više motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida ili blizu mesta cepanja barem jednog lanca RNKi agensa, aktivnost utišavanja gena RNKi agensa se značajno poboljšala.
U skladu sa time, predmetno obelodanjivanje agensa dvostruke RNKi koji je u stanju da inhibira ekspresiju ciljanog gena (tj., komponentu komplementa C5 (C5) gena) in vivo. RNKi agens sadrži smisao lanac i antismisao lanac. Svaki lanac RNKi agensa može biti u rasponu od 12-30 nukleotida dugačka. Na primer, svaki lanac može biti između 14-30 nukleotida dugačka, 17-30 nukleotida dugačka, 25-30 nukleotida dugačka, 27-30 nukleotida dugačka, 17-23 nukleotida dugačka, 17-21 nukleotid dugačka, 17-19 nukleotida dugačka, 19-25 nukleotida dugačka, 19-23 nukleotida dugačka, 19-21 nukleotid dugačka, 21-25 nukleotida dugačka ili 21-23 nukleotida dugačka.
[0227] Smisao lanac i antismisao lanac obično formiraju dupleks dvolančanu RNK („dsRNK“), koja se takođe ovde označava kao „RNKi agens“. Dupleks oblast RNKi agensa može biti 12-30 nukleotidnih parova dugačka. Na primer, dupleks oblast može biti između 14-30 nukleotidnih parova dugačka, 17-30 nukleotidnih parova dugačka, 27-30 nukleotidnih parova dugačka, 17 - 23 nukleotidnih parova dugačka, 17-21 nukleotidnih parova dugačka, 17-19 nukleotidnih parova dugačka, 19-25 nukleotidnih parova dugačka, 19-23 nukleotidnih parova dugačka, 19- 21 nukleotidnih parova dugačka, 21-25 nukleotidnih parova dugačka, ili 21-23 nukleotidnih parova dugačka. U drugom otelotvorenju, dupleks oblast je izabrana iz nukleotida dužine 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, i 27.
[0228] U jednom otelotvorenju, RNKi agens može sadržati jednu ili više oblasti produžetka i/ili ograničavajuću grupu na 3’-kraju, 5’-kraju, ili na oba kraja jednog ili oba lanca.
Produžetak može biti 1-6 nukleotida dugačak, na primer 2-6 nukleotida dugačak, 1-5 nukleotida dugačak, 2-5 nukleotida dugačak, 1-4 nukleotida dugačak, 2-4 nukleotida dugačak, 1-3 nukleotida dugačak, 2-3 nukleotida dugačak, ili 1-2 nukleotida dugačak.
Produžeci mogu biti rezultat toga što je jedan lanac duži od drugog, ili rezultat toga što su dva lanca iste dužine pomereni. Produžetak može formirati neusklađenost sa ciljanom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencom gena koja se cilja ili može biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac takođe mogu biti spojeni, npr., dodavanjem baza iz ukosnice, ili iz drugih nebaznih linkera.
[0229] U jednom otelotvorenju, nukleotidi u oblasti produžetka RNKi agensa mogu pojedinačno nezavisno biti modifikovani ili nemodifikovani nukleotidi uključujući, ali ne ograničavajući se na 2’-šećer modifikacije, kao što su 2-F, 2’-Ometil, timidin (T), 2’-O-metoksietil-5-metiluridin (Teo), 2’-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2’-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo), i bilo koju kombinaciju navedenih. Na primer, TT može biti sekvenca produžetka za bilo koji kraj svakog lanca. Produžetak može da formira neusklađenost sa ciljanom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencom gena koji je ciljan ili može biti druga sekvenca.
[0230] 5’- ili 3’- produžeci smisao lanca, antismisao lanca ili oba lanca RNKi agensa mogu biti fosforilisani. U nekim otelotvorenjima oblasti produžetaka sadrže dva nukleotida sa fosforotioatom između dva nukleotida, gde dva nukleotida mogu biti ista ili različita. U jednom otelotvorenju, produženje je prisutno na 3’-kraju smisao lanca, antismisao lanca, ili oba lanca. U jednom otelotvorenju, ovaj 3’-produžetak prisutan je u antismisao lancu. U jednom otelotvorenju, ovaj 3’-produžetak prisutan je u smisao lancu.
[0231] RNKi agens može sadržati samo jedan produžetak, koji može ojačati dejstvo interferencije RNKi, bez uticanja na opštu stabilnost. Na primer, jednolančani produžetak može biti prisutan na 3’-terminalnom kraju smisao lanca ili, alternativno, na 3’-terminalnom kraju antismisao lanca. RNKi može takođe imati tupi kraj, koji se nalazi na 5’-kraju antismisao lanca (ili na 3’-kraju smisao lanca) i obrnuto. Generalno, antismisao lanac RNKi ima nukleotidni produžetak na 3’-kraju, a 5’-kraj je tup. Bez želje za obavezivanje sa teorijom, asimetrični tupi kraj 5’-kraja antismisao lanca i produžetak 3’-kraja antismisao lanca idu u korist postavljanju lanca vodiča u RISC procesu.
[0232] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je bluntmer sa dva kraja od 19 nukleotida dugačak, gde smisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 7, 8, 9 na 5’ kraju. Antismisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 na 5’ kraju.
[0233] U drugom otelotvorenju, RNKi agens je bluntmer sa dva kraja od 20 nukleotida dugačak, gde smisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 8, 9, 10 na 5’ kraju. Antismisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 na 5’ kraju.
[0234] U još jednom otelotvorenju, RNKi agens je bluntmer sa dva kraja od 21 nukleotida dugačak, gde smisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 na 5’ kraju. Antismisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 na 5’ kraju.
[0235] U jednom otelotvorenju, RNKi agens sadrži smisao lanac od 21 nukleotida i antismisao lanac od 23 nukleotida, gde smisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 na 5’ kraju; antismisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 na 5’ kraju, gde je jedan kraj RNKi agensa tup, dok drugi kraj sadrži 2 nukleotidna produžetka. Poželjno, 2 nukleotidna produžetka su na 3’-kraju antismisao lanca.
Kada su 2 nukleotidna produžetka na 3’-kraju antismisao lanca, mogu postojati dve fosforotioat međunukleotidne veze između terminala tri nukleotida, gde su dva od tri nukleotida nukleotidi produžetka, a treći nukleotid je uparen sa nukleotidnom susednim nukleotidu produžetka. U jednom otelotvorenju, RNKi agens dodatno ima dve fosforotioat međunukleotidne veze između terminala tri nukleotida na oba, 5’-kraju smisao lanca i 5’-kraju antismisao lanca. U jednom otelotvorenju, svaki nukleotid u smisao lancu i antismisao lancu RNKi agensa, uključujući nukleotide koji su deo motiva su modifikovani nukleotidi. U jednom otelotvorenju svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2’-O-metil ili 3’-fluoro, npr., u naizmeničnom motivu. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc3).
[0236] U jednom otelotvorenju, RNKi agens ima smisao i antismisao lanac, gde je smisao lanac 25-30 nukleotidnih ostataka dugačak, i počevši od 5’ terminala nukleotida (pozicija 1) pozicije 1-23 prvog lanca čini barem 8 ribonukleotida; antismisao lanac je 36-66 nukleotidnih ostataka dugačak i, počevši od 3’ terminala nukleotida, čini barem 8 ribonukleotida u pozicijama uparenim sa pozicijama 1 – 23 smisao lanca radi formiranja dupleksa; gde je barem 3’ terminal nukleotida antismisao lanca neuparen sa smisao lancem i do 6 uzastopnih 3’ terminala nukleotida su neupareni sa smisao lancem, time formirajući 3’ jednolančani produžetak 1-6 nukleotida; gde 5’ terminus antismisao lanca sadrži 10-30 uzastopnih nukleotida koji su neupareni sa smisao lancem, time formirajući 10-30 nukleotidnih jednolančanih 5’ produžetaka; gde je barem smisao lanac 5’ terminala i 3’ terminala nukleotida bazno uparen sa nukleotidima antismisao lanca kada su smisao i antismisao lanci poravnati za maksimalnu komplementarnost, time formirajuću suštinski dupleks oblast između smisao i antismisao lanaca; i antismisao lanac je dovoljno komplementaran da cilja RNK duž barem 19 ribonukleotida dužine antismisao lanca kako bi se smanjila ekspresija gena kada je dvolančana nukleinska kiselina dovedena u ćeliju sisara; i gde smisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se barem jedan od tri motiva pojavljuje blizu mesta cepanja. Antismisao lanac sadrži barem jedan motiv od tri 2’-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida ili blizu mesta cepanja
[0237] U jednom otelotvorenju, RNKi agens sadrži smisao i antismisao lance, gde RNKi agens sadrži prvi lanac koji ima dužinu koja je barem 25 i najviše 29 nukleotida i drugi lanac koji ima dužinu koja je najviše 30 nukleotida sa barem jednim motivom od 2’-O-metil modifikacija na tri uzastopna nukleotida na poziciji 11, 12, 13 na 5’ kraju, gde 3’ kraj prvog lanca i 5’ drugog lanca formiraju tupi kraj i drugi lanac je 1-4 nukleotida duži na svom 3’ raju od prvog lanca, gde je dupleks oblast barem 25 nukleotida dugačka, i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa ciljanom mRNK duž barem 19 nukleotida dužine drugog lanca kako bi se smanjila ekspresija ciljanog gena kada RNKi agens dođe u kontakt sa ćelijom sisara, i gde se dicer cepanje RNKi agensa preferencijalno ispoljava u siRNK koja sadrži 3’ kraj na drugom lancu, time smanjujući ekspresiju ciljanog gena kod sisara. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand.
[0238] U jednom otelotvorenju, smisao lanac RNKi agensa sadrži barem jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva pojavljuje na mestu cepanja smisao lanca.
[0239] U jednom otelotvorenju, antismisao lanac RNKi agensa takođe može sadržati barem jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva pojavljuje na ili blizu mesta cepanja antismisao lanca.
[0240] Za RNKi agens koji ima dupleks oblast koja je od 17-23 nukleotida dugačka, mesto cepanja antismisao lanca obično je oko 10, 11 i 12 pozicije na 5’-kraju. Stoga motivi tri identične modifikacije mogu se projaviti na 9, 10, 11 pozicijama; 10, 11, 12 pozicijama; 11, 12, 13 pozicijama; 12, 13, 14 pozicijama; ili 13, 14, 15 pozicijama antismisao lanca, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks oblasti na 5’-kraju antismisao lanca. Mesto cepanja u antismisao lancu može se takođe promeniti u skladu sa družinom dupleks oblasti RNKi na 5’-kraju.
[0241] Smisao lanac RNKi agensa može sadržati barem jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida kod mesta cepanja lanca; i antismisao lanac može imati jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili blizu mesta cepanja lanca. Kada smisao lanac i antismisao lanac formiraju dsRNK dupleks, smisao lanac i antismisao lanac mogu biti poravnati tako da jedan motiv od tri nukleotida na smisao lancu i jedan motiv od tri nukleotida na antismisao lancu imaju barem jedno nukleotidno preklapanje, tj., barem jedan od tri nukleotida motiva u smisao lancu formira bazni par sa barem jednim od tri nukleotida u antismisao lancu. Alternativno, barem dva nukleotida se mogu preklapati, ili sva tri nukleotida se mogu preklapati.
[0242] U jednom otelotvorenju, smisao lanac RNKi agensa može sadržati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv može se pojaviti na ili blizu mesta cepanja lanca a drugi motiv može biti modifikacija krila. Termin „modifikacija krila“ ovde označava motiv koji se pojavljuje na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na ili u blizini mesta cepanja na istom lancu. Modifikacija krila je ili susedna sa prvim motivom ili je razdvojena sa jednim ili više nukleotida. Kada su motivi međusobno neposredno susedni onda je hemija motiva različita između njih a kada su motivi razdvojeni pomoću jednog ili više nukleotida onda hemije mogu biti iste ili različite. Dve ili više modifikacija krila mogu biti prisutne. Na primer, kada su prisutne dve modifikacije krila, svaka modifikacija krila može se pojaviti na jednom kraju relativnom u odnosu na drugi motiv koji je na ili u blizini mesta cepanja ili na drugoj strani glavnog motiva.
[0243] Kao i smisao lanac, antismisao lanac RNKi agensa može sadržati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se barem jedan od motiva pojavljuje na ili u blizini mesta cepanja lanca. Antismisao lanac takođe može sadržati jednu ili više modifikacija krila u poravnanju sličnom sa modifikacijom krila koja može biti prisutna na smisao lancu.
[0244] U jednom otelotvorenju, modifikacija krila na smisao lancu ili antismisao lancu RNKi agensa obično ne obuhvata prvi ili prva dva terminalna nukleotida na 3’-kraju, 5’-kraju ili na oba kraja lanca.
[0245] U drugom otelotvorenju, modifikacija krila na smisao lancu ili antismisao lancu RNKi agensa obično ne obuhvata prvi ili prva dva uparena nukleotida unutar dupleks oblasti na 3’-kraju, 5’-kraju ili na oba kraja lanca.
[0246] Kada smisao lanac i antismisao lanac RNKi agensa svaki sadrže barem jednu modifikaciju krila, modifikacija krila može se zadesiti na istom kraju dupleks oblasti, i imati preklapanje sa jednim, dva ili tri nukleotida.
[0247] Kada smisao lanac i antismisao lanac RNKi agensa svaki sadrže barem dve modifikacije krila, smisao lanac i antismisao lanac mogu biti tako poravnati da se dve modifikacije svaka od jednog lanca mogu pronaći na jednom kraju dupleks oblasti, imajući preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida, dve modifikacije svaka od jednog lanca mogu pronaći na drugom kraju dupleks oblasti, imajući preklapanje sa jednim, dva ili tri nukleotida, dve modifikacije jednog lanca mogu se pronaći na svakoj strani glavnog motiva, imajući preklapanje sa jednim, dva ili tri nukleotida u dupleks oblasti.
[0248] U jednom otelotvorenju, svaki nukleotid u smisao lancu i antismisao lancu RNKi agensa, uključujući nukleotide koji su delovi motiva, mogu biti modifikovani. Svaki nukleotid može biti modifikovan sa istom ili različitom modifikacijom koja može obuhvatati jednu ili više izmena jednog ili više ne-vezujućih fosfata, kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih, fosfata, kiseonika; izmenu konstituenta šećera riboze, npr., 2’hidroksil na šećeru riboze; veliku zamenu fosfatne grupe sa „defosfo“ linkerima; modifikaciju ili zamenu baza koje se prirodno nalaze; i zamenu ili modifikaciju riboza-fosfat glavnog lanca.
[0249] Kako su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge od modifikacija dešavaju se na pozicijama koje su ponovljene unutar nukleinske kiseline, npr., modifikacija baze, ili fosfat grupe, ili ne-vezujuće O fosfatne grupe. U nekim slučajevima modifikacija će se desiti u svim predmetnim pozicijama u nukleinskoj kiselini ali u mnogim slučajevima neće. Putem primera, modifikacija se može desiti samo na 3’ ili 5’ terminalnoj poziciji, može se desiti samo u terminalnoj oblasti, npr., na poziciji na terminalnom nukleotidu ili u poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija se može desiti u dvolančanoj oblasti, jednolančanoj oblasti ili u obe. Modifikacija se može desiti samo u dvolančanoj oblasti RNK ili može se desiti samo u jednolančanoj oblasti RNK. Na primer, fosforotioat modifikacija na nevezujućoj O poziciji može se desiti na jednom ili oba terminusa, može se desiti u terminalnoj oblasti, npr., na poziciji na terminalnom nukleotidu ili na poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca, ili može se desiti na dvolančanoj ili jednolančanoj oblasti, naročito na terminusu. 5’ kraj ili krajevi mogu biti fosforilisani.
[0250] Može biti moguće, npr., za poboljšanje stabilnosti, da se određene baze obuhvate u produžecima, ili da se obuhvate modifikovani nukleotidi ili surogat nukleotidi, u jednolančanim produžecima, npr., u 5’ ili 3’ produžetku, ili u oba. Na primer, može biti poželjno da se obuhvati purin nukleotid u produžecima. U nekim otelotvorenjima, sve ili neke od baza na 3’ ili 5’ produžetku mogu biti modifikovane, npr., sa ovde opisanom modifikacijom. Modifikacije mogu da obuhvataju, npr., upotrebu modifikacija na 2’ poziciji šećera riboze sa modifikacijama koje su poznate u tehnici, npr., upotreba dezoskiribonukleotida, 2’dezoksi-2’fluoro (2’-F) ili 2’-O-metil modifikacije umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacije u fosfatnoj grupi, npr., fosforotioat modifikacije.
Produžeci ne moraju biti homologni sa ciljanom sekvencom.
[0251] U jednom otelotvorenju, svaki ostatak smisao lanca i antismisao lanca nezavisno je modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2’-metoksietil, 2’-O-metil, 2’-O-alil, 2’-C-alil, 2’-dezoksi, 2’-hidroksil ili 2’-fluoro. Lanci mogu sadržati više od jedne modifikacije. U jednom otelotvorenju, svaki ostatak smisao lanca i antismisao lanca nezavisno su modifikovani sa 2’-O-metil ili 2’-fluoro.
[0252] Barem dve modifikacije obično su prisutne na smisao lancu i antismisao lancu. Te dve modifikacije mogu biti 2’-O-metil ili 2’-fluoro, modifikacije ili druge.
[0253] U jednom otelotvorenju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije za izmenjivanje šablona. Termin „izmenjujući motiv“ kao što je ovde korišćeno odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, gde se svaka modifikacija pojavljuje na izmenjujućim nukleotidima jednog lanca. Izmenjujući nukleotid može se odnositi na jedan na svaki drugi nukleotid ili na jedan na svaki treći nukleotid ili na slični šablon. Na primer, ukoliko A, B i C predstavljaju jedan tip modifikacije za nukleotid, izmenjujući motiv može biti „ABABABABABAB...,“ „AABBAABBAABB...,“ „AABAABAABAAB...,“ „AAABAAABAAAB...,“ „AAABBBAAABBB...,“ ili „ABCABCABCABC...,“ itd.
[0254] Tip modifikacije koja se nalazi u izmenjujućem motivu može biti isti ili različit. Na primer, ukoliko A, B, C, D svaki predstavlja jedan tip modifikacije nukleotida, izmenjujući šablon, tj., modifikacija na svakom drugom nukleotidu, može biti isti, ali svaki od smisao lanca ili antismisao lanca može biti izabran iz nekoliko mogućnosti modifikacija unutar izmenjujućeg motiva kao što je „ABABAB...“, „ACACAC...“ „BDBDBD...“ ili "CDCDCD...," itd.
[0255] U jednom otelotvorenju, RNKi agens prema pronalasku sadrži šablon modifikacije za izmenjujući motiv na smisao lancu relativan u odnosu na šablon modifikacije za izmenjujući motiv na antismisao lancu je pomeren. Ovo pomeranje može biti takvo da se modifikovane grupe nukleotida smisao lanca odnose na direktno modifikovanu grupu nukleotida antismisao lanca i obrnuto. Na primer, smisao lanac kada se upari sa antismisao lancem u dsRNK dupleksu, izmenjujući motiv smisao lanca može počinjati sa „ABABAB“ od 5’-3’ na lancu unutar dupleks oblasti. Kao drugi primer, izmenjujući motiv na smisao lancu može početi sa „AABBAABB“ od 5’-3’ lanca i izmenjujući motiv na antismisao lancu može početi sa „BBAABBAA“ od 5’-3’ lanca unutar dupleks oblasti, tako da postoji kompletno ili delimično pomeranje šablona modifikacije između smisao lanca i antismisao lanca.
[0256] U jednom otelotvorenju, RNKi agens sadrži šablon izmenjujućeg motiva 2’-O- metil modifikacije i 2’-F modifikacija na smisao lancu početno ima pomeranje relativno u odnosu na šablon izmenjujućeg motiva 2’-O-metil modifikacije i 2’-F modifikacija na antismisao lancu početno, tj., 2’-O-metil modifikovani nukleotid na smisao lancu ima bazni par sa 2’-mofikovanim nukleotidom na antismisao lancu i obrnuto. Pozicija 1 smisao lanca može početi sa 2’-F modifikacijom i pozicija 1 antismisao lanca može početi sa 2’-O-metil modifikacijom.
[0257] Uvođenje jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na smisao lancu i/ili antismisao lancu prekida početni šablon modifikacije koji je prisutan u smisao lancu i/ili antismisao lancu. Ovo prekidanje šablona modifikacije smisao i/ili antismisao lanca uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna motiva na smisao i/ili antismisao lancu iznenađujuće poboljšava dejstvo utišavanja gena na ciljanom genu.
[0258] U jednom otelotvorenju, kada je motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uveden u bilo koji od lanaca, modifikacija nukleotida pored motiva je različita modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koja sadrži motiv je „...NaYYYNb...,“ gde „Y“ predstavlja modifikaciju motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „Na“ i „Nb“ predstavljaju modifikacije na nukleotidu pored motiva „YYY“ koje su različite od modifikacije Y, i gde Nai Nbmogu biti iste ili različite modifikacije. Alternativno Nai/ili Nbmogu biti prisutne ili odsutne kada postoji modifikacija krila.
[0259] RNKi agens može dalje sadržati barem jednu fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidnu vezu. Modifikacije fosforotioat i metilfosfonat međunukleotidne veze mogu se pojaviti na bilo kom nukleotidu smisao lanca ili antismisao lanca ili na oba lanca u bilo kojoj poziciji lanca. Na primer, modifikacija međunukleotidne veze može se pojaviti na svakom nukleotidu na smisao lancu i/ili antismisao lancu; svaka modifikacija međunukleotidne veze može se pojaviti u izmenjujućem šablonu na smisao lancu ili antismisao lancu; ili smisao lanac i antismisao lanac mogu sadržati obe modifikacije međunukleotidne veze u izmenjujućem šablonu. Izmenjujući šablon modifikacija međunukleotidne veze na misao lancu može biti isti ili različit od antismisao lanca, i izmenjujući šablon modifikacije međunukleotidne veze na smisao lancu može imati pomeranje relativno u odnosu na izmenjujući šablon modifikacije međunukleotidne veze na antismisao lancu. U jednom otelotvorenju, agens dvolančane RNKi sadrži 6-8 fosforotioat međunukleotidnih veza. U jednom otelotvorenju, antismisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’ terminusu i dve fosforotioat međunukleotidne veze na 3’-terminusu, i smisao lanac sadrži barem dve fosforotioat međunukleotidne veze ili na 5’-terminusu ili na 3’-terminusu.
[0260] U jednom otelotvorenju, RNKi sadrži modifikaciju fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidne veze u oblasti produžetka. Na primer, oblast produžetka može sadržati dva nukleotida koji imaju fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidnu vezu između dva nukleotida. Modifikacije međunukleotidnih veza mogu biti napravljene kako bi povezivale produžetak nukleotida sa terminalno uparenim nukleotidima unutar dupleks oblasti. Na prime, barem 2, 3, 4 ili svi produžeci nukleotida mogu biti povezani preko fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidne veze, i opciono, mogu postojati i dodatne fosforotioat ili metilfosfonat međunukleotidne veze koje povezuju produžetak nukleotida sa uparenim nukleotidom koji je susedan nukleotidu produžetka. Na primer, mogu postojati dve fosforotioat međunukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, gde su dva od tri nukleotida nukleotidi produžetka, a treći je upareni nukleotid susedan nukleotidu produžetka. Ova tri terminalna nukleotida mogu biti na 3’-kraju antismisao lanca, 3’-kraju smisao lanca, 5’-kraju antismisao lanca i/ili na 5’-kraju antismisao lanca.
[0261] U jednom otelotvorenju, produžetak od dva nukleotida je na 3’-kraju antismisao lanac i postoje dve fosforotioat međunukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, gde su dva od tri nukleotida nukleotidi produžetka, i treći nukleotid je upareni nukleotid pored nukleotida produžetka. Opciono, RNK agens može dodatno imati dve fosforotioat međunukleotidne veze između tri terminalna nukleotida na oba 5’-kraju misao lanca i 5’-kraju antismisao lanca.
[0262] U jednom otelotvorenju, RNKi agens sadrži neusklađenost sa ciljem, unutar dupleksa ili njihove kombinacije. Neusklađenost se može pojaviti u oblasti produžetka ili u dupleks oblasti. Bazni par može biti rangiran na osnovu njegove sklonosti promovisanja disocijacije ili topljenja (npr., na osnovu slobodne energije asocijacije ili disocijacije određenog para, najjednostavniji pristup jeste da se ispitaju parovi na pojedinačnim baznim parovima, preko sledećeg suseda ili sličnom analizom). U pogledu promovisanja disocijacije: A:U je poželjnije u odnosu na G:C; G:U je poželjnije u odnosu na G:C; i I:C je poželjnije od G:C (I=inozin). Neusklađenosti, npr., ne-kanonski ili drugi koji nisu kanonski parovi (kao što je opisano na drugom mestu ovde) poželjni su u odnosu na kanonske (A:T, A:U, G:C) parove; i parovi koji obuhvataju univerzalne baze se poželjniji od kanonskih parova.
[0263] U jednom otelotvorenju, RNKi agens sadrži barem jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova unutar dupleks oblasti od 5’-kraja antismisao lanca nezavisno izabranog iz grupe od: A:U, G:U, I:C, i neusklađenih parovi, npr., ne-kanonski ili drugi koji nisu kanonski parovi ili parovi koju obuhvataju univerzalnu bazu, kako bi promovisali disocijaciju antismisao lanca na 5’-kraju dupleksa.
[0264] U jednom otelotvorenju, nukleotid na poziciji 1 unutar dupleks oblasti na 5’-kraju antismisao lanca izabran je iz grupe koju čine A, dA, dU, U i dT. Alternativno, barem jedan od prvih 1, 2 ili 3 baznih parova unutar dupleks oblasti na 5’-kraju antismisao lanca je AU bazni par. Na primer, prvi bazni par unutar dupleks oblasti na 5’-kraju antismisao lanca je AU bazni par.
[0265] U drugom otelotvorenju, nukleotid na 3’-kraju smisao lanca je dezoksi-timin (dT). U drugom otelotvorenju, nukleotid na 3’-kraju antismisao lanca je dezoksi-timin (dT). U jednom otelotvorenju, postoji kratka sekvenca dezoksi-timin nukleotid, na primer, dva dT nukleotida na 3’-kraju smisao i/ili antismisao lanca.
[0266] Različite objave opisuju multimer RNKi agense koji mogu biti korišćeni u ovde obelodanjenim metodama. Takve objave obuhvataju WO2007/091269, patent SAD br.
7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0267] Kao što je detaljnije opisano ispod, RNKi agensi koji sadrže konjugacije jedne ili više grupa ugljenih hidrata sa RNKi agensom mogu optimizovati jedno ili više svojstava RNKi agensa. U mnogim slučajevima, grupa ugljenih hidrata će biti povezana za modifikovanu podjedinicu RNKi agensa. Na primer, šećer riboze jedne ili više ribonukleotidnih podjedinica dsRNK agensa može biti zamenjen sa drugom grupom, npr., nosačem koji nije ugljeni hidrat (poželjno ciklični) za koji je povezan ligand ugljenih hidrata. Ribonukleotidna podjedinica u kojoj je šećer riboze podjedinice zamenjen ovde se označava kao podjedinica modifikacije zamene riboze (RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični sistem prstena, tj., svi atomi prstena su ugljenikovi atomi, ili heterociklični sistem prstena, tj., jedan ili više atoma prstena može biti heteroatom, npr., azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični sistem prstena, ili može sadržati dva ili više prstena, npr., spojena prstena. Ciklični nosač može biti potpuno zasićen sistem prstena, ili može sadržati jednu ili više duplih veza.
[0268] Ligand može biti povezan za polinukleotid uz pomoć nosača. Nosač obuhvata (i) barem jednu „tačku povezivanja glavnog lanca“ poželjno dve „tačke povezivanja glavnog lanca“ i (ii) barem jednu „tačku prenošenja veze“. „Tačka povezivanja glavnog lanca“ kao što se ovde koristi odnosi se na funkcionalnu grupu, npr., hidroksil grupu, ili generalno, vezu koja je slobodna za, i koja je pogodna za uključivanje nosača u glavni lanac, npr., fosfata ili modifikovanog fosfata, npr., onog koji sadrži sumpor, glavni lanac i ribonukleinske kiseline. „Tačka prenošenja veze“ (TAP) u nekim otelotvorenjima odnosi se na konstituent atoma prstena cikličnog nosioca, npr., atom ugljenika ili heteroatom (koji se razlikuje od atoma koji daje mesto vezivanja glavnog lanca) koji povezuje izabranu grupu. Grupa može biti, npr., ugljeni hidrat, npr., monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, izabrane grupe su povezane sa povezujućim lancem za ciklični nosač. Stoga, ciklični nosač će često obuhvatati funkcionalnu grupu, npr., amino grupu, ili generalno, davati vezu koja je pogodna za uključivanje lanca drugog hemijskog entiteta, npr., liganda za konstituent prstena.
[0269] RNKi agensi mogu biti konjugovani za ligand pomoću nosača, gde nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; poželjno, ciklična grupa je izabrana iz pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila,
[1,3]dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, kvinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekalina; poželjno, aciklična grupa je izabrana iz serinol glavnog lanca ili dietanolamin glavnog lanca.
[0270] U određenim specifičnim otelotvorenjima, RNKi agens za upotrebu u metodama ovde je agens izabran iz grupe agenasa izlistane u bilo kojoj od Tabela 3, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 i 23. Ovi agensi mogu dalje sadržati ligand.
IV. iRNK konjugovane sa ligandima
[0271] Još jedna modifikacija RNK od iRNK prema pronalasku obuhvata hemijsko vezivanje sa RNK jednog ili više liganda, grupa ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju, ćelijski unos iRNK. Takve grupe obuhvataju ali nisu ograničene na lipidne grupe kao što su holesterol grupe (Letsinger i dr., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), holna kiselina (Manoharan i dr., Biorg. Med. Chem. Let., 1994,4:1053-1060), tioeter, npr., beril-S-tritiltiol (Manoharan i dr., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992,660:306-309; Manoharan i dr., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), tioholesterol (Oberhauser i dr., Nucl. Acids Res., 1992,20:533-538), alifatni lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras i dr., EMBO J, 1991,10:1111-1118; Kabanov i dr., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk i dr., Biochimie, 1993, 75:49-54), fosfolipid, npr., diheksadecil-rak-glicerol ili trietil-amonijum, 1,2-di-O-heksadecil-rak-glicero-3-fosfonat (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995,36:3651-3654; Shea i dr., Nucl. Acids Res., 1990,18:3777-3783), poliamin ili polietilen glikol lanac (Manoharan i dr., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), palmitil grupa (Mishra i dr., Biochim. Biophys. Acta, 1995,1264:229-237) ili oktadecilamin ili heksilamino-karboniloksiholesterol grupa (Crooke i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
[0272] U jednom otelotvorenju, ligand menja distribuciju, ciljanje ili vreme života iRNK agensa u kojem je sadržan. U poželjnim otelotvorenjima ligand daje poboljšani afinitet za izabrani cilj, npr., molekul, ćeliju ili tip ćelije, deo, npr., ćelijski ili organski deo, tkivo, organ ili oblast tela, u poređenju, npr., sa odsutnim vrstama kao što je ligand. Poželjni ligandi neće imati ulogu u dupleks uparivanju u dupleksnoj nukleinskoj kiselini.
[0273] Ligandi mogu obuhvatati supstance koje se mogu prirodno pronaći, kao što je protein (npr., ljudski serum albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL), ili globulin); ugljeni hidrat (npr., dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin, N-acetilgalaktozamin, ili hijaluronova kiselina); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr., sintetička poliamino kiselina. Primeri poliamino kiselina obuhvataju poliamino kiselinu su polilizin (PLL), poli L-asparaginska kiselina, poli L-glutaminska kiselina, kopolimer anhidrid stiren-maleinske kiseline, poli(L-laktid-koglikolisani) kopolimer, kopolimer anhidrid etar-maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etirilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamid polimeri ili polifosfazin. Primeri poliamina obuhvataju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarna so poliamina, ili alfa spiralni peptid.
[0274] Ligandi takođe mogu obuhvatiti ciljane grupe, npr., agens koji cilja ćeliju ili tkivo, npr., lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr., antitelo, koje vezuje određeni tip ćelije kao što je ćelija bubrega. Ciljana grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktant protein A, mucin ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-glaktozamin, N-acetil-glukoseamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilisane poliaminokiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, polispartat, lipit, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitabin B12, vitamin A, biotin, ili RGD peptid ili mimik RGD peptida.
[0275] Drugi primeri liganda obuhvataju boje, interkalatirajuće agense (npr., akridine), poprečne linkere (npr., psoralen, mitomicin C), fosforine (TPPC4, teksafirin, Sapfirin), policiklične aromatične ugljene hidrate (npr., fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze (npr., EDTA), lipofilne molekule, npr., holesterol, holnu kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-Bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupu, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanediol, heptadecil grupu, palmitinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, 03-(oleoil)litoholnu kiselinu, O3-(oleoil)holensku kiselinu, dimetoksitritil, ili fenoksazin) i konjugate peptida (npr., antenapedija peptid, Tat peptid), alkilacione agense, fosfate, amino, merkapto, PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radio-obeležene markere, enzime, haptene (npr., biotin), facilitatore transporta/apsorpcije (npr., aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol klasteri, akridin-imidazol konjugati, Eu3+ oftetraazamakrocikl kompleksi), dinitrofenil, HRP ili AP.
[0276] Ligandi mogu biti proteini, npr., glikoproteini, ili peptidi, npr., molekuli koji imaju poseban afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr., antitela, koja se vezuju za određeni tip ćelije kao što je hepatična ćelija. Ligandi mogu takođe obuhvatati hormone i receptore hormona. Takođe mogu obuhvatati ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetilgulukozamin multivalentna manoza, ili multivalentna fukoza. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze, ili aktivator NF-κB.
[0277] Ligand može biti supstanca, npr., lek, koji može da poveća unos iRNK agensa u ćeliju, na primer, prekidanjem citoskeleta ćelije, npr., prekidanjem mikrotubula ćelije, mikrofilamenata, i/ili filamenata između. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0278] U nekim otelotvorenjima, ligand povezan za iRNK kao što je ovde opisano ponaša se kao farmakokinetske modulator (PK modulator). PK modulatori obuhvataju lipofile, žučne kiseline, steroide, fosforolipid analoge, peptide, agense koji vezuju proteine, PEG, vitamine itd. Primerni PK modulatori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilglicerid, fosforolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotid itd. Oligonukleotidi koji sadrže broj fosforotioat veza takođe su poznati da se vezuju za serum protein, time kratki oligonukleotidi, npr., nukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza koji čine više fosforotioat veza u glavnom lancu takođe su prikladni za predmetni pronalazak kao ligandi (npr., kao PK modulirajući ligandi). Dodatno, aptameri koji vezuju serum komponente (npr., serum proteine) takođe su pogodni za upotrebu kao PK modulirajući ligandi u ovde opisanim otelotvorenjima.
[0279] Ligand-konjugovani oligonukleotidi prema pronalasku mogu biti sintetisani upotrebom oligonukleotida koji ima privezanu reaktivnu funkcionalnost, kao što su oni izvedeni iz veze povezujućeg molekula na oligonukleotidu (opisano je ispod). Ovaj reaktivni oligonukleotid može reagovati direktno sa komercijalno-dostupnim ligandima, ligandima koji su sintetisani i koji imaju bilo koju od mnogih zaštitnih grupa, ili ligandi koji imaju povezanu povezujuću grupu.
[0280] Oligonukleotidi koji se koriste u konjugatima prema predmetnom pronalasku mogu se konvencionalno i rutinski napraviti putem dobro poznatih tehnika sinteze čvrstih supstanci. Oprema za takvu sintezu prodaje se od strane nekoliko prodavaca, na primer, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Bilo koje druge mere za takvu sintezu poznate u tehnici mogu dodatno ili alternativno biti primenjene. Takođe je poznato da se koriste slične tehnike za pripremanje drugih oligonukleotida, kao što su fosforotioati i alkilisani derivati.
[0281] Ligand-konjugovani oligonukleotidi i ligand-molekuli koji imaju sekvencu posebno povezanih nukleotida prema predmetnom pronalasku, oligonukleotidi i oligonukleozidi, mogu biti napravljeni na pogodnim DNK sintetizeru upotrebom standardnih nukleotidnih ili nukleozidnih prekursora, ili prekursora nukleotidnih ili nukleozidnih konjugata koji već nosi vezujuću grupu, prekursora ligand-nukleotidnih ili nukleozidnih-konjugata koji već nose ligand molekul, ili ne-nukleozidnih blokova koji nose ligand.
[0282] Kada se upotrebljavaju prekursori nukleotidnih konjugata koji već nosi povezujuću grupu, sinteza sekvenci posebno vezanih nukleotidi obično se završava, i ligand molekul zatim reaguje sa vezujućom grupom kako bi formiraju ligand-konjugovani oligonukleotid. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi ili vezani nukleotidi prema predmetnom pronalasku sintetisani su pomoću automatizovanog sintetizera, upotrebom fosforamidita izvedenih iz ligand-nukleozid konjugata dodatno standardnim fosforamiditima i ne-standardnim fosforamiditima koji su komercijalno dostupni i rutinski se koriste u sintezi oligonukleotida.
A. Lipidni konjugati
[0283] U jednom otelotvorenju, ligand ili konjugat su lipidni ili lipidno-baziran molekul. Takav lipid ili lipidno-baziran molekul poželjno se vezuje za serum protein, npr., ljudski serum albumin (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata do ciljanog tkiva, npr., ciljano tkivo tela koje nije tkivo bubrega. Na primer, ciljano tkivo može biti od jetre, uključujući parenhimalne ćelije jetre. Drugi molekuli koji vezuju HSA mogu takođe biti korišćeni kao ligandi. Na primer, naproksen ili aspirin mogu biti korišćeni. Lipid ili lipidnobaziran ligand može (a) povećavati otpornost na degradaciju konjugata, (b) povećavati ciljanje ili transport u ciljanu ćeliju ili membranu ćelije, i/ili (c) može biti korišćen da podesi vezivanje za serum protein, npr., HSA.
[0284] Lipidno baziran ligand može se koristiti da inhibira, npr., kontroliše vezivanje konjugata za ciljano tkivo. Na primer, lipid ili lipidno-baziran ligand koji se jače vezuje za HSA će imati manju verovatnoću da bude ciljan do bubrega i time će manje verovatno biti izbačen iz tela. Lipid ili lipidno-baziran ligand koji se slabije vezuje za HSA može se koristiti da cilja konjugat bubrega.
[0285] U poželjnom otelotvorenju, lipidno baziran ligand vezuje HSA. Poželjno, vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u tkivu koje nije tkivo bubrega. Međutim, poželjno je da afinitet ne bude toliko jak da se HSA-ligand vezivanje ne može povratiti.
[0286] U još jednom poželjnom otelotvorenju, lipidno baziran ligand slabo vezuje HSA ili ne vezuje uopšte, tako da će konjugat biti poželjno distribuiran u bubregu. Druge grupe koje ciljanju ćelije bubrega će se takođe koristiti umesto ili dodatno lipidno baziranom ligandu.
[0287] U drugom aspektu, ligand je grupa, npr., vitamin, koji uzet od strane ciljane ćelije, npr., proliferativne ćelije. Oni su naročito korisni za treniranje poremećaja okarakterisanih sa neželjenom proliferacijom, npr., malignog ili ne-malignog tipa, npr., ćelije kancera. Primerni vitamini obuhvataju vitamin A, E i K. Drugi primerni vitamini obuhvataju B vitamin, npr., folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal i druge vitamine ili nutrijente uzete od strane ciljane ćelije kao što su ćelije jetre. Takođe su obuhvaćeni HSA i lipoprotein male gustine (LDL).
B. Agensi za prodiranje u ćeliju
[0288] U drugom aspektu, ligand je agens za prodiranje u ćeliju, poželjno spiralni agens za prodiranje u ćeliju. Poželjno, agens je amfipatik. Primerni agens je peptid kao što su tat ili antenopedija. Ukoliko je agens peptid, može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik invertomere, ne-peptidne ili pseudo-peptidne veze, i upotrebu D-amino kiselina. Spiralni agens je poželjno alfa-spiralni agens, koji poželjno ima lipofiličnu i lipofobičnu fazu.
[0289] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (takođe se ovde označava kao oligopeptidomimetik) je molekul koji je u stanju da se savije u definisanu tridimenzionu strukturu sličnu prirodnom peptidnu. Povezivanje peptida i peptidomimetika za iRNK agense može uticati na farmakokinetsku distribuciju iRNK, kao što je poboljšavanje prepoznavanja ćelije i apsorpcije. Peptid ili peptidomimetik grupa može biti oko 5-50 aminokiselina dugačka, npr., oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 amino kiselina dugačka.
[0290] Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid koji prodire u ćeliju, katjonski peptid, amfipatični peptid, hidrofobični peptid (npr., koji se primarno sastoji iz Tyr, Trp ili Phe). Peptidna grupa može biti dendrimer peptid, ograničeni peptid ili poprečno povezani peptid. U drugim alternativama, peptid grupa može obuhvatati sekvencu translokacije hidrofobne membrane (MTS). Primerni peptid koji sadrži hidrofobnu MTS je RFGF analog koji ima sekvencu amino kiseline AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 9). RGFG analog (npr., sekvenca amino kiseline AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10) koji sadrži hidrofobnu MTS takođe može biti ciljana grupa. Peptidna grupa može biti peptid za „isporuku“, koji može da nosi velike polarne molekule, uključujući peptide, oligonukleotide i proteine preko ćelijske membrane. Na primer, sekvence iz HIV tat proteina (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 11) i drosofila antenapedija proteina (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12) pronađene su da su u stanju da funkcionišu kao peptidi za isporuku. Peptid ili peptidomimetik mogu biti enkodirani nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke prikaza faga, ili kombinatorne biblioteke jedno-zrno-jedno-jedinjenje (OBOC) (Lam i dr., Nature, 354:82-84, 1991). Primeri peptida i peptidomimetika vezanih za dsRNK agens preko inkorporisane monomer jedinice za svrhe ciljanja ćelije su arginin-glicinasparaginska kiselina (RGD)-peptid ili RGD mimik. Peptidna grupa može imati opseg dužine od oko 5 amino kiselina do oko 40 amino kiselina. Peptidne grupe mogu imati strukturnu modifikaciju, kao što je za povećavanje stabilnost ili direktnih konformacionih svojstava. Bilo koja strukturna modifikacije ovde opisana može biti iskorišćena.
[0291] RGD peptid za upotrebu u sastavima i metodama ovde opisanim može biti linearni ili ciklični, i može biti modifikovan, npr., glikozilisani ili metilisani, kako bi stvorio ciljanje određenog tkiva. Peptidi koji sadrže RGD i peptidiomimetici mogu obuhvatati D-amino kiseline, kao i sintetičke RGD mimetike. Dodatno RGD, mogu se koristiti druge grupe koje ciljaju integrin ligand. Poželjni konjugati ovog liganda ciljaju PECAM-1 ili VEGF.
[0292] „Peptid koji prodire u ćeliju“ je u stanju da prodire u ćeliju, npr., mikrobnu ćeliju, kao što je bakterijska ili fungalna ćelija, ili ćelija sisara, kao što je ćelija čoveka. Peptid koji prodire mikrobnu ćeliju može biti, na primer, α-sferni linearni peptid (npr., LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr., α-defenzin, β-defenzin ili baktenecin), ili peptid koji sadrži jednu ili dve dominantne amino kiseline (npr., PR-39 ili indolicin). Peptid koji prodire ćeliju može takođe obuhvatati signal nuklearne lokalizacije (NLS). Na primer, peptid koji prodire ćeliju može biti bipartit amfipatični peptid, kao što je MPG, koji je izveden iz domena fuzionog peptida za HIV-1 gp41 i NLS od SV40 velikog T antigena (Simeoni i dr., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724,2003).
C. Konjugati ugljenih hidrata
[0293] U nekim otelotvorenjima sastava i metoda ovde obelodanjenim, iRNK oligonukleotid dalje sadrži ugljeni hidrat. Ugljeni hidrat konjugovana iRNK pogodna je za in vivo isporuku nukleinskih kiselina, kao i sastavi pogodni za in vivo terapeutsku upotrebu, kao što je ovde opisano. Kao što je ovde korišćeno, „ugljeni hidrat“ odnosi se na jedinjenje koje je ili ugljeni hidrat samo po sebi napravljeno od jedne ili više monosaharidnih jedinica koje imaju više od 6 atoma ugljenika (koja može biti linearna, granata ili ciklična) sa atomom kiseonika, azota ili sumpora vezanim za svaki atom ugljenika; ili na jedinjenje koje ima kao deo grupu ugljenog hidrata napravljenu od jedne ili više jedinica monosaharida koja ima poslednjih šest atoma ugljenika (koja može biti linearna, granata ili ciklična) sa atomom kiseonika, azota ili sumpora povezanim za svaki ugljenikov atom. Reprezentativni ugljeni hidrati obuhvataju šećere (mono-, di-, tri- i oligosaharide koji sadrže od oko 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 monosaharidnih jedinica), i polisaharide kao što su skrobovi, glikogen, celuloza i polisaharidne gume. Specifični monosaharidi obuhvataju C5 i iznad (npr., C5, C6, C7 ili C8) šećere; di- i trisaharidi obuhvataju šećere koji imaju dve ili tri monosaharidne jedinice (npr., C5, C6, C7 ili C8).
[0294] U jednom otelotvorenju, konjugat ugljenog hidrata za upotrebu u sastavima i metodama ovde je monosaharid. U jednom otelotvorenju, monosaharid je N-acetilgalaktozamin, kao što je
[0295] U drugom otelotvorenju, konjugat ugljenog hidrata za upotrebu u sastavima i metodama ovde je izabran iz grupe koju čine:
[0296] Drugi reprezentativni konjugati ugljenog hidrata za upotrebu u otelotvorenjima ovde opisanim obuhvataju, ali nisu ograničeni na
gde je jedan od X ili Y oligonukleotid, a drugi je vodonik.
[0297] U nekim otelotvorenjima, konjugat ugljenog hidrata dalje sadrži jedan ili više dodatnih liganda kao što je opisano iznad, kao što su, ali bez ograničavanja, PK modulator i/ili peptid koji prodire ćeliju.
D. Linkeri
[0298] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani konjugat ili ligand mogu biti povezani za iRNK oligonukleotid sa različitim linkerima koji se cepaju ili ne cepaju.
[0299] Termin „linker“ ili „povezujuća grupa“ označava organsku grupu koja povezuje dva dela jedinjenja, npr., kovalentno povezana dva dela jedinjenja. Linkeri obično sadrže direktnu vezu ili atom kao što su vodonik ili sumpor, jedinicu kao što je NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ili lanac atoma kao što su, bez ograničenja supstituisani ili nesupstituisani supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani alkenil, supstituisani ili nesupstituisani alkinil, arilalkil, arilalkenil, arilalkinil, heteroarilalkil, heteroarilalkenil, heteroarilalkinil, heterociklilalkil, heterociklilalkenil, heterociklilalkinil, aril, heteroaril, heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil, alkilarilalkil, alkilarilalkenil, alkilarilalkinil, alkenilarilalkil, alkenilarilalkenil, alkenilarilalkinil, alkinilarilalkil, alkinilarilalkenil, alkinilarilalkinil, alkilheteroarilalkil, alkilheteroarilalkenil, alkilheteroarilalkinil, alkenilheteroarilalkil, alkenilheteroarilalkenil, alkenilheteroarilalkinil, alkinilheteroarilalkil, alkinilheteroarilalkenil, alkinilheteroarilalkinil, alkilheterociklilalkil, alkilheterociklilalkenil, alkilhererociklilalkinil, alkenilheterociklilalkil, alkenilheterociklilalkenil, alkenilheterociklilalkinil, alkinilheterociklilalkil, alkinilheterociklilalkenil, alkinilheterociklilalkinil, alkilaril, alkenilaril, alkinilaril, alkilheteroaril, alkenilheteroaril, alkinilhereroaril, gde jedan ili više metilena može biti prekinut ili završen sa O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), supstituisanim ili nesupstituisanim arilom, supstituisanim ili nesupstituisanim heteoarilom, supstituisanim ili nesupstituisanim heterociklom; gde je R8 vodonik, acil, alifatik ili supstituisani alifatik. U jednom otelotvorenju, linker je između oko 1-24 atoma, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 atoma, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16, ili 8-16 atoma.
[0300] Povezujuća grupa koja se može cepati je ona koja je dovoljno stabilna van ćelije, ali koja se nakon dolaska u ciljanu ćeliju cepa kako bi oslobodila dva dela koji linker drži zajedno. U poželjnom otelotvorenju, povezujuća grupa koja se može cepati se cepa barem oko 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta ili više, ili barem 100 puta brže u ciljanoj ćeliji ili pod prvim referentnim uslovom (koji može biti, npr., izabran da imitira ili predstavlja međućelijske uslove) nego u krvi subjekta, ili pod drugim referentnim uslovom (koji može, npr., biti izabran da imitira ili predstavlja uslove koji se mogu pronaći u serumu ili krvi).
[0301] Povezujuće grupe koje se mogu cepati osetljive su na, npr., pH, redoks potencijal ili prisustvo degradativnih molekula agenasa za cepanje. Generalno, agensi za cepanje više preovlađuju pri višim nivoima ili aktivnostima unutar ćelija nego u serumu ili krvi. Primeri takvih degradativnih agenasa obuhvataju: redoks agense koji su izabrani iz određenih supstrata ili one koji nemaju specifičnost supstrata, uključujući, npr., oksidativne ili reduktivne enzime ili reduktivne agense kao što su merkaptani, prisutni u ćelijama koje mogu degradirati redoks povezujuću grupu koja se može cepati putem redukcije; esteraze; endozomi ili agensi koji mogu da stvore kiselo okruženje, npr., ono koje se ispoljava sa pH od pet ili manje; enzime koji mogu da hidrolizuju ili degradiraju kiselinu povezujućih grupa koje se mogu cepati tako što imaju ulogu generalne kiseline, peptidaza (koje mogu biti specifične za supstrat) i fosfataza.
[0302] Povezujuća grupa koja se može cepati, kao što je disulfid veza može biti osetljiva na pH. pH ljudskog seruma je 7.4, dok je srednja međućelijska pH malo niža, u opsegu od oko 7.1-7.3. Endozomi imaju više kiselu pH, u opsegu od 5.5-6.0, dok lipozomi imaju još više kiselu pH od oko 5.0. Neki linkeri će imati povezujuću grupu za cepanje koja se cepa pri poželjnoj pH, time oslobađajući katjonski lipid iz liganda unutar ćelije, ili u željeni deo ćelije.
[0303] Linker može obuhvatati povezujuću grupu koja se može cepati koja sa određenim enzimom može cepati. Tip povezujuće grupe koja se može cepati koja je uključena u linkeru može zavisiti od ćelije koja se cilja. Na primer, ligand koji cilja jetru može biti povezan za katjonski lipid preko linkera koju obuhvata ester grupu. Ćelije jetre bogate su sa esterazama, i stoga će linker biti cepan delotvornije u ćelijama jetre nego u tipovima ćelija koje nisu bogate sa esterazom. Drugi tipovi ćelija bogati sa esterazom obuhvataju ćelije pluća, renalnog korteksa i testisa.
[0304] Linkeri koji sadrže peptidne veze mogu biti korišćene pri ciljanju tipova ćelija koje su bogate sa peptidazama, kao što su ćelije jetre i sinoviociti.
[0305] Uopšteno, pogodnost kandidata za povezujuću grupu koja se može cepati može biti procenjena testiranjem sposobnosti degradativnog agensa (ili stanja) da izvrši cepanje kandidata povezujuće grupe. Takođe će biti poželjno da se testira i kandidat povezujuće grupe koja se može cepati za sposobnost da se odupre cepanju u krvi ili kada je u kontaktu sa drugim tkivom koje nije ciljano. Stoga, može se odrediti relativna osetljivost na cepanje između prvog i drugog stanja, gde je prvo izabrano da bude indikativno za cepanje ciljane ćelije i drugo je izabrano da bude indikativno za cepanje u drugim tkivima ili biološkim fluidima, npr., krvi ili serumu. Procenjivanja se mogu izvršiti u sistemu bez ćelija, u ćeliji, u kulturi ćelija, u organu ili kulturi tkiva, ili u celoj životinji. Takođe može biti od koristi da se naprave početne procene kod uslova bez ćelija ili sa kulturom i da se potvrde sa daljim procenjivanjem kod celih životinja. U poželjnom otelotvorenju, korisni kandidati jedinjenja se cepaju barem oko 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili oko 100 puta brže u ćeliji (ili pod in vitro uslovima izabranim da imitiraju međućelijske uslove) u poređenju sa krvi ili serumom (ili pod in vitro uslovima izabranim da imitiraju međućelijske uslove).
i. Redoks povezujuće grupe koje se mogu cepati
[0306] U jednom otelotvorenju, povezujuće grupe koje se mogu cepati su redoks povezujuća grupa koja se može cepati i koja se cepa nakon redukcije ili oksidacije. Primer reduktivne povezujuće grupe koja se cepa je disulfid povezujuća grupa (-S-S-). Za određivanje da li je kandidat povezujuće grupa koja se može cepati „reduktivna povezujuća grupa koja se može cepati“ ili na primer, da li je pogodna za upotrebu sa partikularnom iRNK grupom i partikularnim ciljanim agensom može se pogledati u ovde opisanim metodama. Na primer, kandidat može biti procenjen inkubiranjem sa ditiotreitolom (DTT), ili drugim reduktivnim agensom upotrebom reagenasa koji su poznati u tehnici, koji mogu da imitiraju stopu cepanja koja bi se osmotrila u ćeliji, npr., ciljanoj ćeliji. Kandidati takođe mogu biti procenjeni pod uslovima koji su izabrani da imitiraju uslove u krvi ili serumu. U jednom otelotvorenju, kandidati jedinjenja se cepaju pri najviše 10% u krvi. U drugim otelotvorenjima, korisni kandidati jedinjenja degradiraju se barem oko 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili oko 100 puta brže u ćeliji (ili pod in vivo uslovima izabranim da imitiraju međućelijske uslove) u poređenju sa krvi (ili pod in vivo uslovima izabranim da imitiraju međućelijske uslove). Stopa cepanja kandidata jedinjenja može biti određena upotrebom standardnih testova kinetike enzima pod uslovima izabranim da imitiraju međućelijsku sredinu i poređenjem sa uslovima izabranim da imitiraju vanćelijsku sredinu.
ii. Fosfatno-bazirane povezujuće grupe koje se mogu cepati
[0307] U drugom otelotvorenju, linker koji se može cepati sadrži fosfatno-baziranu povezujuću grupu koja se može cepati. Fosfatno-bazirana povezujuća grupa koja se može cepati se cepa sa agensima koji degradiraju ili hidrolizuju fosfat grupu. Primer agensa koji cepa fosfatne grupe u ćelijama su enzimi kao što su fosfataze u ćelijama. Primeri fosfatnobaziranih povezujućih grupa su -OP(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Poželjna otelotvorenja su -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Poželjno otelotvorenje je -O-P(O)(OH)-O-. Ovi kandidati mogu biti procenjeni upotrebom metoda analognih sa onima opisanim iznad.
iii. Kisele povezujuće grupe koje se mogu cepati
[0308] U drugom otelotvorenju, linker koji se može cepati sadrži kiselu povezujuću grupu koja se može cepati. Kisela povezujuća grupa koja se može cepati je povezujuća grupa koja se cepa u kiselim uslovima. U poželjnom otelotvorenju kisela povezujuća grupa koja se može cepati se cepa u kiselim okruženju sa pH od oko 6.5 ili manje (npr., oko 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0, ili manje)., ili sa agensima kao što su enzimi koju mogu da imaju ulogu generalne kiseline. U ćeliji, organele sa posebno niskom pH, kao što su endozomi i lipozomi modu pružiti okruženje za cepanje za kiselu povezujuću grupu koja se može cepati. Primer kisele povezujuće grupa koja se može cepati obuhvataju ali nisu ograničeni na hidrazone, estere, i estere amino kiselina. Kisele povezujuće grupe koje se mogu cepati imaju generalnu formulu -C=NN-, C(O)O, ili -OC(O). Poželjno otelotvorenje je kada je ugljenik povezan na kiseonik estera (alkoksi grupa) aril grupa, supstituisana alkil grupa, ili tercijarna alkil grupa kao što je dimetil pentil ili t-butil. Ovi kandidati mogu biti procenjeni upotrebom metoda analognim sa onima koje su opisane iznad.
iv. Ester-bazirane povezujuće grupe
[0309] U drugom otelotvorenju, linker koji se može cepati sadrži ester-baziranu povezujuću grupu koja se može cepati. Ester-bazirana povezujuća grupa koja se može cepati se cepa sa enzimima kao što su estaraze i amidaze u ćelijama. Primer ester-baziranih povezujućih grupa koje se mogu cepati obuhvataju ali nisu ograničeni na estere alkilena, alkilen i alkinilen grupe. Ester povezujuće grupe koje se mogu cepati imaju generalnu formulu -C(O)O- ili -OC(O)-. Ovi kandidati mogu biti procenjeni upotrebom metoda analognim sa onima koje su opisane iznad.
v. Peptidno-bazirane grupe koje se mogu cepati
[0310] U još jednom otelotvorenju, linker koji se može cepati sadrži peptidno-baziranu povezujuću grupu koja se može cepati. Peptidno-bazirana povezujuća grupa koja se može cepati se cepa sa enzimima kao što su peptidaze i proteaze u ćelijama. Peptidno-bazirane povezujuće grupe koje se mogu cepati su peptidne veze formirane između aminokiselina kako bi prinele oligonukleotide (npr., dipeptide, tripeptide, itd.) i polipeptide. Peptidnobazirane grupe koje se mogu cepati ne obuhvataju amid grupu (-C(O)NH-). Amid grupa može biti formirana između bilo kog alkilena, alkenilena ili alkinelena. Peptidna grupa je poseban tip amidne veze formirane između amino kiselina kako bi prinela peptide i proteine. Peptidno-bazirana grupa koja se može cepati je generalno ograničena na peptidnu vezu (tj., amidnu vezu) formiranu između amino kiselina koje prinose peptide i proteine i ne obuhvata celokupnu amidnu funkcionalnu grupu. Peptidno-bazirana povezujuća grupa koja se može cepati ima generalnu formulu--NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, gde RA i RB su R grupe dve susedne amino kiseline. Ovi kandidati mogu biti procenjeni upotrebom metoda analognim sa onima koje su opisane iznad.
[0311] U jednom otelotvorenju, iRNK prema pronalasku je konjugovana za ugljeni hidrat preko linker. Neograničavajući primeri konjugata ugljenih hidrata iRNK sa linkerima od sastava i metoda prema pronalasku obuhvataju ali nisu ograničeni na,
gde je jedan od X ili Y oligonukleotidi, a drugi je.
[0312] U određenim otelotvorenjima jedinjenja i metoda ovde obelodanjenim, ligand je jedan ili više „GalNAc“ (N-acetilgalaktozamin) derivata povezanih preko bivalentnog ili trivalentnog granatog linkera.
[0313] U jednom otelotvorenju, dsRNK prema pronalasku je konjugovana sa bivalentnim ili trivalentnim granatim linkerom koji je izabran iz grupe struktura prikazane u bilo kojoj od formula (
gde:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B i q5C nezavisno predstavljaju svako pojavljivanje 0-20 i gde jedinica ponavljanja može biti ista ili različita;
P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su svaki nezavisno za svako odsutno pojavljivanje, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su svaki nezavisno za svako odsutno pojavljivanje, alkilen, supstituisani alkilen, gde jedan ili više metilena može biti prekinut ili završen sa jednim ili O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R’)=C(R"), C≡C ili C(O); R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su svaki nezavisno za svako odsutno pojavljivanje,
NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(R<a>)C(O), -C(O)-CH(R<a>)-NH-, CO, CH=N-O,
ili heterociklil;
L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand; tj., svaki nezavisno za svako pojavljivanje monosaharida (kao što he GalNAc), disaharida, trisaharida, tetrasaharida, oligosaharida ili polisaharida; i R<a>je H ili bočni lanac amino kiseline. Trivalentni konjugujući GalNAc derivati su naročito koristi za upotrebu sa RNKi agensima za inhibiranje ekspresije ciljanog gena, kao što su oni u formuli (XXXV):
gde L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je GalNAc derivat.
[0314] Primeri pogodnih bivalentnih i trivalentnih granatih povezujućih grupa koje konjuguju GalNAc derivati obuhvataju, ali nisu ograničeni na, strukture navedene iznad kao formule II, VII, XI, X, i XIII.
[0315] Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje RNK konjugata obuhvataju, ali nisu ograničeni na, pat. SAD. br 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717,5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022.
[0316] Nije neophodno za sve pozicije u datom jedinjenju da budu podjednako modifikovane, čak i više od jedne gore navedene modifikacije može biti obuhvaćeno u jednom jedinjenju ili čak u pojedinom nukleozidu unutar iRNK. Predmetni pronalazak takođe obuhvata iRNK jedinjenja koja su himerna jedinjenja.
[0317] „Himerna“ iRNK jedinjenja ili „himere“, u kontekstu ovog pronalaska, su iRNK jedinjenja, poželjno dsRNK, koje sadrže dve ili više hemijski različitih oblasti, gde je svaka napravljena barem od jedne monomerne jedinice, tj., nukleotida u slučaju dsRNK jedinjenja. Ove iRNK obično sadrže barem jednu oblast gde je RNK modifikovana tako da dodeljuje iRNK povećanu otpornost na degradaciju nukleaze, povećani ćelijski unos i/ili povećani afinitet vezivanja za ciljanu nukleinsku kiselinu. Dodatna oblast iRNK može da služi kao supstrat za enzime koji su u stanju da cepaju RNK:DNK ili RNK:RNK hibride. Putem primera, RNaza H je ćelijska endonukleaza koja cepa RNK lanac od RNK:DNK dupleksa. Aktiviranje RNaze H, stoga, ispoljava se u cepanju RNK cilja, time znatno poboljšavajući delotvornost iRNK inhibicije ekspresije gena. Stoga, uporedivi rezultati često se mogu dobiti sa kraćim iRNK kada se himerne dsRNK koriste, u poređenju sa fosforotioat dezoksi dsRNK hibridiziranjem iste ciljane oblasti. Cepanje RNK cilja može se rutinski detektovati sa elektroforezom na gelu i, ukoliko je neophodno, povezanim tehnikama hibridizacije nukleinske kiseline poznatim u tehnici.
[0318] U određenim slučajevima, RNK od iRNK može biti modifikovana sa grupom koja nije ligand. Broj ne-ligand molekula je konjugovan sa iRNK u cilju poboljšavanja aktivnosti, ćelijske distribucije ili ćelijskog unosa iRNK, i procedure za izvršenje takvih konjugacija su dostupne u naučnoj literaturi. Takve ne-ligand grupe obuhvataju lipidne grupe, kao što su holesterol (Kubo, T. i dr., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), holinska kiselina (Manoharan i dr., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994,4:1053), tioetar, npr., heksil-S-tritiltiol (Manoharan i dr., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan i dr., Bioorg. Med Chem. Let., 1993, 3:2765), tioholesterol (Oberhauser i dr., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), alifatni lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras i dr., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov i dr., FEBS Lett., 1990,259:327; Svinarchuk i dr., Biochimie, 1993, 75:49), fosfolipid, npr., diheksadecil-rak-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rak-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea i dr., Nucl. Acids Res., 1990,18:3777), poliamin ili polietilen glikol lanac (Manoharan al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), palmitil grupa (Mishra i dr., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterol grupa (Crooke i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996,277:923). Reprezentativni patenti SAD koji pokazuju pripremanje takvih RNK konjugata navedeni su iznad. Obično protokoli konjugacije obuhvataju sintezu RNK koje nose aminolinkere na jednoj ili više pozicija u sekvenci. Amino grupa zatim reaguje sa molekulom koji se konjuguje upotrebom odgovarajućeg vezivanja ili aktivacionih reagenasa. Reakcija konjugacije može biti izvršena ili sa RNK koja je još uvek vezana za čvrsti oslonac ili sa pratećim cepanjem RNK, u fazi rastvora. Prečišćavanje RNK konjugata sa HPLC obično daje čist konjugat.
IV. Isporuka iRNK prema pronalasku
[0319] Isporuka iRNK prema pronalasku u ćeliju, npr., ćeliju unutar subjekta, kao što je ljudski subjekat (npr., subjekat koji ima takvu potrebu, kao što je subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5) može se ostvariti na brojne različite načine. Na primer, isporuka može biti izvršena dovođenjem ćelije u kontakt sa iRNK prema pronalasku, ili in vitro ili in vivo. In vivo isporuka može takođe biti izvršena direktno davanjem sastava koji sadrži iRNK, npr., dsRNK, subjektu. Alternativno, in vivo isporuka može biti izvršena indirektno davanjem jednog ili više vektora koji enkodiraju i upravljaju ekspresijom iRNK. Ove alternativne su dalje razmotrene ispod.
[0320] Uopšteno, bilo koja metoda isporuke molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može se prilagoditi za upotrebu sa iRNK prema pronalasku (videti, npr., Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.2(5):139-144 i WO94/02595.
[0321] Za in vivo isporuku, faktori koje treba razmatrati u cilju isporuke iRNK molekula obuhvataju, na primer, biološku stabilnost izvedenog molekula, prevenciju ne-specifičnih dejstava, i akumulaciju izvedenog molekula u ciljanom tkivu. Ne specifična dejstva iRNK mogu biti minimizirana lokalnim davanjem, na primer, direktnom injekcijom ili implantacijom u tkivo ili topikalnim davanjem preparata. Lokalno davanje na mestu tretiranja maksimizuje lokalnu koncentraciju agensa, ograničava izlaganje agensa sistemskim tkivima koja u suprotnom može škoditi agensu ili može degradirati agens, i dozvoljava manju ukupnu dozu iRNK molekula koja se daje. Nekoliko ispitivanja je pokazalo uspešno obaranje proizvodnje gena kada se iRNK daje lokalno. Na primer, intraokularno davanje VEGF dsRNK putem intravitrealne injekcije kod cinomolgus majmuna (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138) i Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis.9:210-216 subretinalne injekcije kod miševa (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis.9:210-216) su obe pokazale da sprečavaju neovaskularizaciju u eksperimentalnom modelu makularne degeneracije povezane sa starošću. Dodatno, direktna intratumoralna injekcija dsRNK kod miševa smanjuje zapreminu tumora (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274) i može da produži preživljavanje kod miševa koji imaju tumor (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther.14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther.15:515-523). RNK interferencija je takođe pokazala uspeh sa lokalnim davanjem u CNS direktnom injekcijom (Dorn, G., i dr. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther.12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci.3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol.93:594-602) i u pluća intranazalnim davanjem (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem.279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). Za sistemsko davanje iRNK kod tretiranja bolesti, RNK se može modifikovati ili alternativno davati upotrebom sistema za davanje lekova; obe metode služe da spreče brzu degradaciju dsRNK sa endo- i ekso-nukleazama in vivo. Modifikacije RNK ili farmaceutski nosač takođe mogu da dozvole ciljanje iRNK sastava do ciljanog tkiva i izbegavanje neželjenih dejstava van cilja. iRNK molekuli mogu biti modifikovani hemijskom konjugacijom sa lipofilnim grupama kao što je holesterol radi poboljšanja ćelijskog unosa i sprečavanja degradacije. Na primer, iRNK navođena protiv ApoB konjugovana sa lipofilnom holesterol grupom injektovana je sistemski u miševe i ispoljila se u obaranju apoB mRNK u oba, jetri i jejunumu (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Konjugacija iRNK sa aptamerom je pokazala da inhibira rast tumora i da posreduje regresiju tumora kod modela kancera prostate miševa (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol.24:1005-1015). U alternativnom otelotvorenju, iRNK može biti izvedena upotrebom sistema za isporuku lekova kao što su nanočestice, dendrimer, polimer, lipozomi ili katjonski sistem za isporuku.
Pozitivno naelektrisani sistemi za isporuku olakšavaju vezivanje iRNK molekula (negativno naelektrisanog) i takođe poboljšavaju interakciju kod negativno naelektrisane ćelijske membrane kako bi dozvolili delotvoran unos iRNK u ćeliju. Katjonski lipidi, dendrimeri, ili polimeri mogu ili biti vezani za RNK, ili indukovani kako bi formirali nosač ili miceliju (videti, npr., Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) koja oblaže iRNK. Formiranje nosača ili micelija dalje sprečava degradaciju iRNK kada se daje sistemski. Metode za pravljenje i davanje katjonskih iRNK kompleksa su u okviru sposobnosti stručne osobe (videti npr., Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res.9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J.
Hypertens. 25:197-205, koji su obuhvaćeni ovde sa referencom u celini). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku lekova koji su korisni za sistemsko davanje iRNK obuhvataju DOTAP Sorensen, DR., et al (2003), iznad; Verma, UN., et al (2003), iznad), Oligofektamin, „čvrste lipidne čestice nukleinske kiseline“ (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), kariolipin (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol.26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol.
71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptide (Liu, S. (2006) Mol. Pharm.3:472-487), i poliamidoamine (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res.16:1799-1804). U nekim otelotvorenjima, iRNK formira kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsko davanje. Metode za davanje i farmaceutski sastavi iRNK i ciklodekstrina mogu se pronaći u patentu SAD br.7,427,605.
A. iRNK prema pronalasku enkodirane sa vektorom
[0322] iRNK koja cilja C5 gen može se izraziti iz transkripcionih jedinica ubačenih u DNA ili RNK vektore (videti npr., Couture, A, i dr., TIG. (1996),12:5-10; Skillern, A., i dr., međunarodnu PCT objavu br. WO 00/22113, Conrad, International PCT objavu br. WO 00/22114, i Conrad, patent SAD br.6,054,299). Ekspresija može biti prolazna (u smislu od nekoliko sati do nedelja) ili održana (nedelje do meseci ili duže), u zavisnosti od specifičnog konstrukta koji se upotrebljava i ciljanog tkiva ili tipa ćelije. Ovi transgeni mogu se uvesti kao linearni konstrukt, kružni plazmid ili virusni vektor, koji može biti integrišući ili neintegrišući vektor. Transgen takođe može biti konstruisan tako da se dozvoli nasleđivanje kao ekstrahromozomni plazmid (Gassmann, i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0323] Pojedinačni lanac ili lanci iRNK mogu se transkribovati iz promotera na ekspresionom vektoru. Kada dva odvojena lanca treba izvrše ekspresiju da bi generisali, na primer, dsRNK, dva odvojena ekspresiona vektora mogu biti zajedno uvedena (npr., transfekcija ili infekcija) u ciljanu ćeliju. Alternativno, svaki pojedinačni lanac dsRNK može se transkribovati od strane promotera koji su oba smeštena na istom ekspresionom plazmidu. U jednom otelotvorenju, dsRNK vrši ekspresiju kao inverzni ponovljeni polinukleotidi spojeni sa povezujućom polinukleotidnom sekvencom, tako da dsRNK ima strukturu stabla i petlje.
[0324] iRNK ekspresioni vektori su generalno DNK plazmidi ili virusni vektori. Ekspresioni vektori kompatabilni sa eukariotskim ćelijama, poželjno oni kompatabilni sa ćelijama kičmenjaka, mogu se koristiti za proizvodnju rekombinantnih konstrukta za vršenje ekspresije iRNK kao što je ovde opisano. Ekspresioni vektori eukariotske ćelije su dobro poznati u tehnici i dostupni su od brojnih komercijalnih izvora. Obično, takvi vektori sadrže pogodno mesto zadržavanja za unošenje željenog segmenta nukleinske kiseline. Isporuka iRNK ekspresionih vektora može biti sistemska, kao što je intravenozno ili intramuskularno davanje, davanjem do ciljane ćelije uzete iz pacijenta i zatim ponovnim unošenjem u pacijenta, ili putem bilo koje druge mere koja omogućava uvođenje u željenu ćeliju.
[0325] iRNK ekspresioni plazmidi mogu biti transfektovani u ciljane ćelije kao kompleksi sa nosačima katjonskih lipida (npr., Oligofektamin) ili sa nosačima baziranim na ne-katjonskim lipidima (npr., Transit-TKO™). Više lipidnih transfekcija za iRNK-posredovana obaranja koja ciljaju različite oblasti ciljane RNK preko perioda od nedelju dana ili više je takođe obuhvaćeno pronalaskom. Uspešno uvođenje vektora u ćelije domaćina može biti praćeno upotrebom različitih poznatih metoda. Na primer, prelazna transfekcija može biti signalizirana sa reporterom, kao što je fluorescentni marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP). Stabilna transfekcija ćelija ex vivo može biti osigurana upotrebom markera koji daju transfektovanoj ćeliji otpornost na određene faktore sredine (npr., antibiotici i lekovi), kao što je otpornost na higromicin B.
[0326] Sistemi virusnih vektora koji mogu biti iskorišćeni sa metodama i sastavima koji su ovde opisano obuhvataju, ali nisu ograničeni na, (a) adenovirus vektore; (b) retrovirus vektore, uključujući, ali bez ograničenja, lentivirusne vektore, virus leukemije moloney miševa, itd.; (c) adeno-povezane virusne vektore; (d) herpes simpleks virusne vektore; (e) SV 40 vektore; (f) polioma virusne vektore; (g) papiloma virusne vektore; (h) pikomavirusne vektore; (i) poks virusne vektore kao što je ortopoks, npr., vektore virusa vakcinije ili avipoks, npr., boginje kanarinca ili boginje ptica; i (j) zavisne od pomoćnika ili gutless viruse. Virusi koji su defektivni za replikaciju mogu takođe biti pogodni. Različiti vektori će ili neće postati inkorporisani u genom ćelija. Konstrukti mogu da obuhvataju virusne sekvence za transfekciju, ukoliko je poželjno. Alternativno, konstrukt može biti inkorporisan u vektore koji su u stanju da vrše episomalnu replikaciju, npr., EPV i EBV vektori.
Konstrukti za rekombinantnu ekspresiju iRNK će generalno zahtevati regulatorne elemente, npr., promotere, pojačivače, itd., kako bi osigurali ekspresiju iRNK u ciljanim ćelijama. Drugi aspekti za razmatranje kod vektora i konstrukta su dalje opisani ispod.
[0327] Vektori koji su korisni za isporuku iRNK će obuhvatati regulatorne elemente (promoter, pojačivač, itd.) koji su dovoljni za ekspresiju iRNK u željenoj ciljanoj ćeliji ili tkivu. Regulatorni elementi mogu biti izabrani da vrše ili konstruktivnu ili regulisanu/inducibilnu ekspresiju.
[0328] Ekspresija iRNK može biti precizno regulisana, na primer, upotrebom inducibilne regulatorni sekvence koja je osetljiva na određenje fiziološke regulatore, npr., cirkulišuće nivoe glukoze, ili hormone (Docherty i dr., 1994, FASEB J.8:20-24). Takvi inducibilni ekspresioni sistemi, pogodni za kontrolu ekspresije dsRNK u ćelijama ili kod sisara obuhvataju, na primer, regulaciju sa ekdizonom, sa estrogenom, progesteronom, tetraciklinom, hemijskim induktorima za dimerizaciju, i izopropil-beta-D1-tiogalaktopiranozidom (IPTG). Stručna osoba će biti u stanju da izabere odgovarajuću regulatornu/promotersku sekvencu na osnovu željene upotrebe iRNK transgena.
[0329] Virusni vektori koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koji enkodiraju iRNK mogu se koristiti. Na primer, retrovirusni vektor se može koristiti (videti Miller i dr., Meth.
Enzymol. 217:581-599 (1993)). Ovi retrovirusni vektori sadrže komponente koje su neophodne za ispravno pakovanje genoma virusa i integraciju u DNK ćelije domaćina.
Sekvence nukleinske kiseline koje enkodiraju iRNK su klonirane u jedan ili više vektora, koji olakšavaju isporuku nukleinske kiseline pacijentu. Detaljnije o retrovirusnim vektorima može se pronaći, na primer, u Boesen i dr., Biotherapy 6:291-302 (1994), koje opisuje upotrebu retrovirusnog vektora za isporuku dmrl gena do hematopoetske matične ćelije kako bi napravio matične ćelije otpornijim na hemoterapiju. Druge reference koje prikazuju upotrebu retrovirusnih vektora u genskoj terapiji su: Clowes i dr., J. Clin. Invest.93:644-651 (1994); Kiem i dr., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel.3:110-114 (1993). Lentivirusni vektori razmatrani za upotrebu obuhvataju, na primer, HIV zasnovane vektore opisane u patentu SAD br.6,143,520; 5,665,557; i 5,981,276.
[0330] Adenovirusi su takođe razmatrani za upotrebu u isporuci iRNK prema pronalasku. Adenovirusi su posebno pogodni nosači, npr., za isporuku gena do respiratorne epitelije. Adenovirusi prirodno inficiraju respiratornu epiteliju gde izazivaju blagu bolest. Drugi ciljevi za sisteme isporuke zasnovane na adenovirusu su jetra, centralni nervni sistem, endotelijalne ćelije i mišići. Adenovirusi imaju prednost u tome što su sposobni da inficiraju ćelije koje ne mogu razdvojiti. Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) pokazuju razmatranje terapije gena zasnovanoj na adenovirusu. Bout i dr., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) je demonstrirao upotrebu vektora adenovirusa za transfer gena do respiratorne epitelije rezus majmuna. Drugi primeri upotrebe adenovirusa u terapiji gena mogu biti pronađeni u Rosenfeld i dr., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld i dr., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli i dr., J. Clin. Invest.91:225-234 (1993); PCT objavi WO94/12649; i Wang, i dr., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Pogodan AV vektor za vršenje ekspresije iRNK nalazi se u pronalasku, metoda za pravljenje rekombinantnog AV vektora, i metoda za isporuku vektora u ciljane ćelije, opisani su u Xia H i dr. (2002), Nat. Biotech.20: 1006-1010.
[0331] Adeno-povezani virusni (AVV) vektori takođe se mogu koristiti za isporuku iRNK prema pronalasku (Walsh i dr., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993); patent SAD br. 5,436,146). U jednom otelotvorenju, iRNK može biti izražena kao dva odvojena, komplementarna jednolančana molekula iz rekombinantog AVV vektora koji imaju, na primer, ili U6 ili H1 RNK promotere, ili citomegalovirus (CMV) promoter. Pogodni AVV vektori za vršenje ekspresije dsRNK koja se nalazi u pronalasku, metode za pravljenje rekombinantog AV vektora, i metode za isporuku vektora u ciljane ćelije, opisani su u Samulski R i dr. (1987), J. Virol.61: 3096-3101; Fisher K J i dr. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R i dr. (1989), J. Virol.63: 3822-3826; pat. SAD br.5,252,479; U.S. Pat. No.
5,139,941; međunarodnoj prijavi patenta br. WO 94/13788; i međunarodnoj prijavi patenta br. WO 93/24641.
[0332] Još jedan virusni vektor pogodan za isporuku iRNK prema pronalasku je poks virus kao što je virus vakcinije, na primer, otežane vakcinije kao što je modifikovani virus ankara (MVA) ili NYVAC, avipoks kao što su boginje ptica ili boginje kanarinca.
[0333] Tropizam virusnih vektora može biti modifikovan pseudotipovanjem vektora sa omotnim proteinima ili drugim površinskim antigenima od drugih virusa, ili supstituisannjem različitih virusnih kapsidnih proteina, kao što je prikladno. Na primer, lentivirusni vektori mogu biti pseudotipovani sa površinskim proteinima iz vezikularnog stomatitis virusa (VSV), besnila, ebole, mokole i slično. AVV vektori mogu biti napravljeni da ciljaju različite ćelije upravljajući vektorima da bi vršili ekspresiju različitih serotipova kapsidnih proteina; videti, npr., Rabinowitz J E i dr. (2002), J Virol 76:791-801.
[0334] Farmaceutsko pripremanje vektora može obuhvatati vektor u prihvatljivom diluentu, ili može obuhvatati sporo oslobađanje matrice u kojoj se nalazi nosač za isporuku gena.
Alternativno, tamo gde se kompletan vektor za isporuku gena može proizvesti neizmenjen iz rekombinantnih ćelija, npr., retrovirusni vektori, farmaceutsko pripremanje može obuhvatati jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.
V. Farmaceutski sastavi prema pronalasku
[0335] Predmetni pronalazak takođe obuhvata farmaceutske sastave i formulacije koje obuhvataju iRNK prema pronalasku. U jednom otelotvorenju, ovde su dati farmaceutski sastavi koji sadrže iRNK, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0336] Fraza „farmaceutski prihvatljiv“ ovde se upotrebljava kada se odnosi na ona jedinjenja, materijale, sastave i/ili oblike doziranja koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskog subjekta i životinjskog subjekta bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, u skladu sa razumnim odnosom koristi/rizika.
[0337] Fraza „farmaceutski-prihvatljiv nosač“ kao što se ovde koristi označava farmaceutski prihvatljiv materijal, sastav ili nosač, kao što su tečni ili čvrsti ispunjivač, diluent, ekscipijens, pomagala u proizvodnji (npr., lubrikant, talk magnezijum, kalcijum ili cink stearat, ili stearinska kiselina), ili materijal koji enkapsulira rastvarač, koji se uključen u nošenje ili transport predmetnog jedinjenja iz jednog organa, ili dela tela, u drugi organ ili deo tela. Svaki nosač mora biti „prihvatljiv“ u smislu toga da bude kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije i da nije škodljiv za subjekat koji se tretira. Neki primeri materijala koji mogu služiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju: (1) šećere, ako što su laktoza, glukoza i sukroza; (2) skrobove, kao što su kukuruzni skrob i skrob krompira; (3) celulozu, i njene derivate, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat; (4) puderisani tragakant; (5) slad; (6) želatin; (7) lubrikantne agense, kao što su magnezijum stanje, natrijum lauril sulfat i talk; (8) ekscipijense kao što su kakao puter i supozitorije sa voskom; (9) ulja, kao što su ulje kikirikija, kokosovo ulje, suncokretovo ulje, susamovo ulje, kukuruzovo ulje i sojino ulje; (10) glikole, kao što je propilen glikol; (11) poliole, kao što su glicerin, sorbitol, manintol i polietilen glikol; (12) estere, kao što su etil oleat i etil laurat; (13) agar; (14) puferske agense, kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; (15) alginsku kiselinu; (16) vodu bez pirogena; (17) izotonični fiziološki rastvor; (18) Ringerov rastvor; (19) etil alkohol; (20) pH puferisane rastvore; (21) poliestere, polikarbonate i/ili polianhidride; (22) agense za punjenje, kao što su polipeptidi i amino kiseline (23) serum komponentu, kao što je serum albumin, HDL i LDL; i (22) druge netoksične pogodne supstance koje se koriste u farmaceutskim formulacijama.
[0338] Farmaceutski sastavi koji sadrže iRNK su korisni pri tretiranju bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom ili aktivnošću C5 gena, npr., bolesti povezane sa komponentom komplementa C5. Takvi farmaceutski sastavi formulisani su na osnovu načina isporuke. Jedan primer su sastavi koji su formulisani za sistemsko davanje putem parenteralne isporuke, npr., subkutana (SC) ili intravenozna (IV) isporuka. Drugi primer su sastavi koji su formulisani za direktnu isporuku u parenhimiju mozga, npr., infuzijom u mozak, kao što je putem infuzije sa neprekidnom pumpom. Farmaceutski sastavi prema pronalasku mogu biti davani u dozama koje su dovoljne da inhibiraju ekspresiju C5 gena. Uopšteno, pogodna doza iRNK prema pronalasku će biti u opsegu od 0.001 do oko 200.0 miligrama po kilogramu telesne težine na dan, generalno u opsegu od 1 do 50 mg po kilogramu telesne težine na dan. Na primer, dsRNK se može davati pri oko 0.01 mg/kg, oko 0.05 mg/kg, oko 0.5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1.5 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, ili oko 50 mg/kg po pojedinačnoj dozi.
[0339] Na primer, dsRNK može biti davana pri dozi od oko 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjene da budu deo ovog pronalaska.
[0340] U drugom otelotvorenju, dsRNK se daje pri dozi od oko 0.1 do oko 50 mg/kg, oko 0.25 do oko 50 mg/kg, oko 0.5 do oko 50 mg/kg, oko 0.75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1.5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2.5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3.5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4.5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7.5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0.1 do oko 45 mg/kg, oko 0.25 do oko 45 mg/kg, oko 0.5 do oko 45 mg/kg, oko 0.75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1.5 do oko 45 mg/kg, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2.5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3.5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4.5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7.5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0.1 do oko 40 mg/kg, oko 0.25 do oko 40 mg/kg, oko 0.5 do oko 40 mg/kg, oko 0.75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1.5 do oko 40 mg/kg, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2.5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3.5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4.5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7.5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0.1 do oko 30 mg/kg, oko 0.25 do oko 30 mg/kg, oko 0.5 do oko 30 mg/kg, oko 0.75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1.5 do oko 30 mg/kg, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2.5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3.5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4.5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7.5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0.1 do oko 20 mg/kg, oko 0.25 do oko 20 mg/kg, oko 0.5 do oko 20 mg/kg, oko 0.75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1.5 do oko 20 mg/kg, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2.5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3.5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4.5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7.5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjene da budu deo ovog pronalaska.
[0341] Na primer, dsRNK može biti davana pri dozi od oko 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjene da budu deo ovog pronalaska.
[0342] U drugom otelotvorenju, dsRNK se daje pri dozi od oko 0.5 do oko 50 mg/kg, oko 0.75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1.5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2.5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3.5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4.5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7.5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0.5 do oko 45 mg/kg, oko 0.75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1.5 do oko 45 mg/kg, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2.5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3.5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4.5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7.5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0.5 do oko 40 mg/kg, oko 0.75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1.5 do oko 40 mg/kg, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2.5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3.5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4.5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7.5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0.5 do oko 30 mg/kg, oko 0.75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1.5 do oko 30 mg/kg, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2.5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3.5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4.5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7.5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0.5 do oko 20 mg/kg, oko 0.75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1.5 do oko 20 mg/kg, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2.5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3.5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4.5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7.5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. U jednom otelotvorenju, dsRNK se daje pri dozi od oko 10mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjene da budu deo ovog pronalaska.
[0343] Na primer, subjektima može biti davano, npr., subkutano ili intravenozno, pojedinačna terapeutska količina iRNK, kao što je oko 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42,43,44,45,46,47,48,49, ili oko 50 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjene da budu deo ovog pronalaska.
[0344] U nekim otelotvorenjima, subjektima se daje, npr., subkutano ili intravenozno, više doza terapeutske količine iRNK, kao što je doza od oko 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49, ili oko 50 mg/kg. Režim od više doza može obuhvatati davanje terapeutske količine iRNK dnevno, kao što je u toku dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana, šest dana, sedam dana ili duže.
[0345] U drugim otelotvorenjima, subjektima se daje, npr., subkutano ili intravenozno, ponovna doza terapeutske količine iRNK, kao što je doza od oko 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1,1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili oko 50 mg/kg. Režim ponovne doze može obuhvatati davanje terapeutske količine iRNK na regularnoj bazi, kao što je svaki drugi dan, svaki treći dan, svaki četvrti dan, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom svake druge nedelje ili jednom mesečno.
[0346] Farmaceutski sastavi mogu se davati intravenoznom infuzijom u toku vremenskog perioda, kao što je u toku 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 21, 22, 23, 24, ili oko 25-minutnog perioda. Davanje može biti ponavljano, na primer, na regularnoj bazi, kao što je nedeljno, dvonedeljno (tj., svake dve nedelje) tokom jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima tretiranja, tretiranja mogu biti davana na manje učestaloj bazi. Na primer, nakon davanja nedeljno ili dvonedeljno tokom tri meseca, davanje može biti ponovljeno jednom mesečno, tokom šest meseci ili godinu dana ili duže.
[0347] Farmaceutski sastav može biti dat jednom dnevno, ili iRNK može biti davana kao dve, tri ili više pod-doza pri odgovarajućim intervalima u toku dana ili čak upotrebom neprekidnih infuzija ili isporuke preko formulacije sa kontrolisanim otpuštanjem. U tom slučaju, iRNK koja je sadržana u svakoj pod-dozi mora biti odgovarajuće umanjena u cilju ostvarenja ukupne dnevne doze. Jedinice doziranja takođe mogu biti sastavljene za isporuku u toku nekoliko dana, npr., upotrebom konvencionalnih formulacija sa produženim oslobađanjem koje pružaju produženo oslobađanja iRNK preko perioda od nekoliko dana. Formulacije sa produženim oslobađanjem su dobro poznate u tehnici i naročito su korisne za isporuku agenasa na određeno mesto, kao što bi se moglo koristiti sa agensima prema predmetnom pronalasku. U ovom otelotvorenju, jedinica doziranja sadrži odgovarajuće umnoženu dnevnu dozu.
[0348] U drugim otelotvorenjima, pojedinačna doza farmaceutskih sastava može duže trajati, tako da se naredne doze daju pri intervalima koji nisu veći od 3, 4 ili 5 dana, ili nisu veći od 1, 2, 3 ili 4 nedelje. U nekim otelotvorenjima prema pronalasku, pojedinačna doza farmaceutskog sastava prema pronalasku se daje jednom nedeljno. U drugim otelotvorenjima prema pronalasku, pojedinačna doza farmaceutskog sastava se daje dva puta mesečno.
[0349] Stručna osoba će prihvatiti da određeni faktori mogu uticati na doze i vremena potrebna za delotvorno tretiranje subjekta, uključujući ali ne ograničavajući se na jačinu bolesti ili poremećaja, prethodno tretiranja, generalno zdravstveno stanje i/ili starost subjekta, i druge bolesti koje su prisutne. Štaviše, tretiranje subjekta sa terapeutski delotvornom količinom sastava može obuhvatati pojedinačno tretiranje ili seriju tretiranja. Procenjivanje delotvorne doze i in vivo polu-raspada za pojedinačne iRNK obuhvaćene pronalaskom može biti izvršeno korišćenjem konvencionalnih metodologija ili na osnovu in vivo testiranja upotrebom odgovarajućeg modela životinje, kao što je ovde opisano na drugom mestu.
[0350] Napredovanja u genetici miševa su stvorili broj modela miševa za ispitivanje različitih bolesti kod ljudi, kao što su poremećaji koji bi imali korist od smanjenja ekspresije C5. Takvi modeli mogu biti korišćeni za in vivo testiranje iRNK, kao i za određivanje terapeutski delotvorne doze. Pogodni modeli miševa su poznati u tehnici i uključuju, na primer model artritisa uzrokovanog kolagenom kod miševa (Courtenay, J.S., i dr. (1980) Nature 283, 666-668), ishemija miokarda (Homeister JW and Lucchesi BR (1994) Annu Rev Pharmacol Toxicol 34:17-40), model astme indukovane sa ovalbuminom kod miševa (npr., Tomkinson A., i dr. (2001). J. Immunol.166, 5792-5800), (NZB×NZW)F1, MRL/Fas<lpr>(MRL/lpr) i BXSB modeli miševa (Theofilopoulos, A. N. and Kono, D. H.1999. Murine lupus models: gene-specific and genome-wide studies. In Lahita R. G., ed., Systemic Lupus Erythematosus, 3rd edn, p.145. Academic Press, San Diego, CA), mišiji aHUS model (Goicoechea de Jorge i dr. (2011). Razvijanje atipičnih hemolitičko-uremijskih sindroma zavisi na komplementu C5,, J Am Soc Nephrol 22:137-145.
[0351] Farmaceutski sastav prema predmetnom pronalasku mogu biti davani na različite načine u zavisnosti od toga da li je lokalno ili sistemsko tretiranje poželjno i na osnovu površine koja se tretira. Davanje može biti topikalno (npr., pomoću transdermalne obloge), plućno, npr., putem inhalacije ili insuflacije pudera ili aerosoli, uključujući putem nebulizera; intratrahenalno, intranazalno, epidermalno i transdermalno, oralno ili parenteralno.
Parenteralno davanje obuhvata intravenoznu, intraarterijalnu, subkutanu, intraperitonealnu ili intramuslularnu injekciju ili infuziju; subdermalno, npr., putem implantacionog uređaja; ili intrakranijalno, npr., intraparenhimalno, intratekalno ili intraventrikularno davanje.
[0352] iRNK se može davati na takav način da se cilja određeno tkivo, kao što je tkivo jetre (npr., hepatociti jetre).
[0353] Farmaceutski sastavi i formulacije za topikalno davanje mogu obuhvatati transdermalne obloge, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i pudere. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene baze, puderi ili uljne baze, zgušnjivači i slično može biti neophodno ili poželjno. Obloženi kondomi, rukavice i slično može biti korisno. Pogodne topikalne formulacije obuhvataju one kod koje je iRNK prema pronalasku u dodatku sa agensom za topikalnu isporuku kao što su lipidi, lipozomi, masne kiseline, esteri masnih kiselina, steroidi, helatni agensi i surfaktanti. Pogodni lipidi i lipozomi obuhvataju neutralne (npr., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamin, dimiristoilfosfatidil holin DMPC, distearolifosfatidil holin), negativne (npr., dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) i katjonske (npr., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP i dioleoilfosfatidil etanolamin DOTMA). iRNK koje se nalaze u pronalasku mogu biti obuhvaćene u lipozomima ili mogu formirati kompleks sa njim, konkretno sa katjonskim lipozomima. Alternativno, iRNK mogu biti kompleksirane sa lipidima, naročito sa katjonskim lipidima. Pogodne masne kiseline i esteri obuhvataju ali nisu ograničeni na arahidonsku kiselinu, oleinsku kiselinu, eikozanojsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristatnu kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearnu kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, tricaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili C1-20 alkil estar (npr., izopropilmiristat IPM), monoglicerid, diglicerid ili farmaceutski prihvatljive soli navedenih). Topikalne formulacije su opisane detaljno u patentu SAD br.6,747,014.
A. iRNK formulacije koje sadrže membranske molekularne sklopove
[0354] iRNK za upotrebu u sastavima i metodama prema pronalasku može biti formulisana za isporuku u membranski molekularni sklop, npr., lipozom ili micel. Kao što se ovde koristi termin „lipozom“ odnosi se na nosač koji se sastoji od amfifiličnih lipida postavljenih u barem jedan dvosloj, npr., jedan dvosloj ili više dvoslojeva. Lipozomi obuhvataju unilamenarne i multilamenarne nosače koji imaju membranu formiranu iz lipofilnih materijala i vodene unutrašnjosti. Vodeni deo sadrži iRNK sastav. Lipofilni materijal izolira vodenu unutrašnjost od vodene spoljašnjosti, koja obično ne sadrži iRNK sastav, mada u nekim primerima, može sadržati. Lipozomi su korisni za prenos i isporuku aktivnih sastojaka do mesta delovanja. Zato što je lipozomalna membrana strukturno slična biološkim membranama, kada se lipozomi primene na tkivo, lipoznomni dvosloj se spaja sa dvoslojem ćelijske membrane. Kako se spajanje lipozoma i ćelije nastavlja, sadržaj unutrašnje vode koja obuhvata iRNK se isporučuje u ćeliju gde se iRNK specifično vezuje sa ciljanu RNK i može da posreduje iRNK. U nekim slučajevima, lipozomi su specifično ciljani, npr., da navode iRNK do određenih tipova ćelija.
[0355] Lipozom koji sadrži iRNK agens može biti pripremljen putem različitih metoda. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma rastvara se u deterdžentu tako da se miceli formiraju sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatična katjonska tečnost ili konjugat lipida. Deterdžent može imati visoku kritičnu koncentraciju micela i može biti nejonski. Primerni deterdženti obuhvataju holate, CHAPS, oktiglukozid, dezoksiholat i lauroil sarkozin. Preparat RNKi agensa zatim se dodaje u micele koje sadrže lipidnu komponentu. Katjonske grupe na lipidu reaguju sa RNKi agensom i kondenzuju se oko RNKi agensa kako bi formirali lipozome. Nakon kondenzacije, deterdžent se uklanja, npr., dijalizom, kako bi se doprineo preparat RNKi agensa.
[0356] Ukoliko je neophodno, jedinjenje nosača koje pomaže kondenzaciju može biti dodato u toku reakcije kondenzacije, npr., kontrolisanim dodavanjem. Na primer, jedinjenje nosača može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr., spermin ili spermidin). pH se takođe može podesiti da ide u prilog kondenzaciji.
[0357] Metode za proizvodnju stabilnih polinukleotidnih nosača za isporuku, koju uključuju polinukleotidni/katjonski lipidni kompleks kao strukturne komponente nosača za isporuku, su dalje opisane, npr., u WO 96/37194, celokupne komponente koje su ovde obuhvaćene sa referencom. Lipozomna formacija takođe može da sadrži jedan ili više aspekata primernih metoda opisanih u Felgner, P. L. i dr., Proc. Natl. Acad Sci., USA 8:7413-7417, 1987; pat. SAD br.4,897,355; pat. SAD br.5,171,678; Bangham, i dr. M. Mol. Biol.23:238, 1965; Olson, i dr. Biochim. Biophys. Acta 557:9,1979; Szoka, i dr. Proc. Natl. Acad. Sci.75:
4194,1978; Mayhew, i dr. Biochim. Biophys. Acta 775:169,1984; Kim, i dr. Biochim.
Biophys. Acta 728:339,1983; i Fukunaga, i dr. Endocrinol.115:757,1984. Najčešće korišćene tehnike za pripremanje lipidnih agregata odgovarajuće veličine za upotrebu kao nosači za isporuku obuhvataju sonikaciju i zamrzavanje-odmrzavanje plus ekstruziju (videti, npr., Mayer, i dr. Biochim. Biophys. Acta 858:161,1986). Mikrofuidizacija može biti korišćena kada su konzistentno mali (50 do 200 nm) i relativno uniformni agregati poželjni (Mayhew, i dr. Biochim. Biophys. Acta 775:169,1984). Ove metode se brzo adaptiraju pakovanju preparata RNKi agensa u lipozome.
[0358] Lipozomi padaju u dve široke klase. Katjonski lipozomi pozitivno su naelektrisani lipozomi koji interaguju sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinske kiseline kako bi formirali stabilan kompleks. Pozitivno naelektrisani kompleks nukleinske kiseline/lipozoma vezuje se za negativno naelektrisanu površinu ćelije i internalizovan je u endozom. Zbog kisele pH u endozomu, lipozomi se prekidaju, ispuštajući svoj sadržaj u citoplazmu ćelije (Wang i dr., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987,147,980-985).
[0359] Lipozomi koji su pH-osetljivi ili negativno naelektrisani, zarobljavaju nukleinsku kiseline pre nego kompleks sa njom. Kako su oba, nukleinska kiselina i lipid slično naelektrisani, odbijanje se dešava pre formiranja kompleksa. Međutim, neke nukleinske kiseline zarobljene su u vodenoj unutrašnjosti ovih lipozoma. pH-osetljivi lipozomi su korišćeni za isporuku nukleinske kiseline koja enkodira gen timidin kinaze do monoslojeva u kulturi. Ekspresija egzogenih gena je detektovana u ciljanim ćelijama (Zhou i dr., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0360] Jedan glavni tip lipozomnih sastava obuhvata fosfolipide koji nisu prirodno-izvedeni fosfatidilholin. Neutralni lipoznomni sastavi, na primer, mogu biti formirani iz dimiristoil fosfatidiholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonski lipozomni sastavi generalno su formirani iz dimiristoil fosfatidilglicerola, dok su anjonski fuzogeni lipozomi formirani primarno iz dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Drugi tip lipozomnog sastava formira se iz fosfatidilholina (PC) kao što je, na primer, PC soje, i PC jaja. Drugi tip je formiran iz smeše fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0361] Primeri drugih metoda za uvođenje lipozoma u ćelije in vitro i in vivo obuhvataju pat. SAD br.5,283,185; U.S. Pat. No.5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90:11307, 1993;
Nabel, Human Gene Ther.3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143,1993; i Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
[0362] Ne-jonski lipozomni sistemi su takođe ispitani za određivanje njihove upotrebljivosti u isporuci lekova u kožu, naročito sistemi koji sadrže ne-jonski surfaktant i holesterol. Nejonske lipozomne formulacije koje sadrže Novasome™ I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i Novasome™ II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku ciklosporina-A u dermis kože miša. Rezultati su ukazali da su takvi ne-jonski lipozomni sistemi bili delotvorni u olakšavanju taloženja ciklasporina A u različite slojeve kože (Hu i dr. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[0363] Lipozomi takođe sadrže „sterilno stabilizovane“ lipozome, termin koji, kako je ovde korišćeno, odnosi se na lipozome koji sadrže jedan ili više specijalizovanih lipida, koji kada su inkorporirani u lipozome, ispoljavaju se u poboljšanom polu-raspadu cirkulacije u odnosu na lipozome koji nemaju takve specijalizovane lipide. Primeri sterilno stabilizovanih lipozoma su oni kod kojih deo lipida koji formiraju nosač lipozoma (A) sadrži jedan ili više glikolipida, kao što monosialogangliozid GM1, ili (B) su derivatizovani sa jednim ili više hidrofilnih polimera, kao što su polietilen glikol (PEG) grupe. Bez želje za ograničavanjem sa bilo kojom teorijom, veruje se u tehnici da, barem za sterilno stabilizovane lipozome koji sadrže gangliozide, sfingomielin ili PEG-izvedene lipide, da je poboljšani polu-raspad cirkulacije ovih sterilno stabilizovanih lipozoma posledica smanjenog unosa u ćelije retikuloendotelijalnog sistema (RES) (Allen i dr., FEB.S Letters, 1987, 223, 42; Wu i dr., Cancer Revearch, 1993, 53, 3765).
[0364] Razni lipozomi koji sadrže jedan ili više glikolipida poznati su u tehnici.
Papahadjopoulos i dr. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987,507,64) pokazali su sposobnost monosialogangliozida GM1, galaktocerebrozid sulfata i fosfatidilinozitola da poboljšavanju polu-raspad krvi kod lipozoma. Ovi pronalasci su izneti od strane Gabizon i dr. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). pat SAD br.4,837,028 i WO 88/04924, oba u vlasništvu Allen i dr., i obelodanjuju lipozome koji sadrže (1) sfingomielin i (2) gangliozid GM1ili galaktocerebrozid sulfat estar. Pat. SAD br.5,543,152 (Webb i dr.) obelodanjuje lipozome koji sadrže sfingomielin. Lipozomi koji sadrže 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilholin obelodanjeni su u WO 97/13499 (Lim et al).
[0365] U jednom otelotvorenju, koriste se katjonski lipozomi. Katjonski lipozomi poseduju prednost u tome što su u stanju da se spoje sa ćelijskom membranom. Ne-katjonski lipozomi, bez obzira što nisu u stanju da se toliko efektivno spoje sa plazmom membranom, uzeti su od strane markofaga in vivo i mogu biti korišćeni za isporuku RNKi agenasa u markofage.
[0366] Dalje prednosti lipozoma obuhvataju: lipozomi dobijeni iz prirodnih fosfolipida su bikompatibilni i biorazgradivi; lipozomi mogu inkorporisati širok opseg lekova koji se rastvaraju u vodi ili lipidu; lipozomi mogu zaštiti enkapsulirane RNKi agense u svojim unutrašnjim odeljcima od metabolizma i degradacije (Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p.245). Važna razmatranja pri pripremanju lipozomnih formulacija su naelektrisanje lipidne površne, veličina nosača i zapremina vode lipozoma.
[0367] Pozitivno naelektrisani sintetički katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) može biti korišćen da formira male lipozome koji interaguju spontano sa nukleinskom kiselinom kako bi formirali komplekse lipida-nukleinske kiseline koji su u stanju spajanja sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana tkiva kultura ćelija, što se ispoljava u isporuci RNKi agensa (videti, npr., Felgner, P. L. i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417,1987 i pat SAD br.4,897,355 za opis DOTMA i njegovu upotrebu sa DNK).
[0368] DOTMA analog, 1,2-bis(oleiloksi)-3-(trimetilamonija)propan (DOTAP) može biti korišćen u kombinaciji sa fosfolipidom kako bi formirao DNK-kompleksirajuće nosače. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) je delotvoran agens za isporuku visoko anjonskih nukleinskih kiselina u živo tkivo kultura ćelija koje sadrže pozitivno naelektrisane DOTMA lipozome koje interaguju spontano sa negativno naelektrisanim polinukleotidima kako bi formirali komplekse. Kada se koristi dovoljno pozitivno naelektrisanih lipozoma, neto naelektrisanje na rezultujućem kompleksu takođe je pozitivno. Pozitivno naelektrisani kompleksi pripremljeni na ovaj način će spontano privući funkcionalne nukleinske kiseline do, na primer, tkiva kulture ćelija. Drugi komercijalno dostupni katjonski lipidi, 1,2-bis(oleiloksi)-3,3-(trimetilamonija)propane ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) razlikuju se od DOTMA u tome što su oleoil grupe povezane sa esterom, umesto drugim vezama.
[0369] Druga primećena katjonska lipidna jedinjenja obuhvataju ona koja su konjugovana za više grupa uključujući, na primer, karboksispermin koji je konjugovan za jedan od dva tipa lipida i obuhvata jedinjenja kao što su 5-karboksispermilglicin dioktaoleoilamid („DOGS“) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) i dipalmitoilfosfatidiletanolamin 5-karboksispermil-amid („DPPES“) (videti, npr., pat. SAD br.5,171,678).
[0370] Drugi katjonski lipidni konjugati obuhvataju derivatizaciju lipida sa holesterolom („DC-hol“) koji je formulisan u lipozome u kombinaciji sa DOPE (videti, Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun.179:280,1991). Lipopolilizin, napravljen konjugovanjem polilizina sa DOPE, je pokazalo da je delotvorno za transfekciju u prisustvu seruma (Zhou, X. i dr., Biochim. Biophys. Acta 1065:8,1991). Za određene ćelijske linije, ovi lipozomi koji sadrže konjugovane katjonske lipide rečeno je da pokazuju manju toksičnost i daju delotvorniju transfekciju u poređenju sa sastavima koji sadrže DOTMA. Drugi komercijalno dostupni proizvodi katjonskih lipida obuhvataju DMRIE i DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) i Lipofektamin (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Drugi katjonski lipidi pogodni za isporuku oligonukleotida opisani su u WO 98/39359 i WO 96/37194.
[0371] Lipozomne formulacije su naročito pogodne za topikalno davanje, lipozomi predstavljaju nekoliko prednosti u odnosu na druge formulacije. Takve prednosti obuhvataju smanjena neželjena dejstva povezana sa visokom sistemskom apsorpcijom davanog leka, povećanu akumulaciju davanog leka u željenom cilju, i sposobnost davanja RNKi agensa u kožu. U nekim implementacijama, lipozomi su korišćeni za isporuku RNKi agensa u epidermalne ćelije i takođe za pojačavanje penetracije RNKi agensa u dermalna tkiva, npr., u kožu. Na primer, lipozomi se mogu primeniti topikalno. Topikalna isporuka lekova formulisanih kao lipozomi u kožu je dokumentovana (videti, npr., Weiner i dr., Journal of Drug Targeting, 1992, vol.2,405-410 i du Plessis i dr., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. i Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690,1988; Itani, T. i dr. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. i dr. Meth. Enz. 149:157-176,1987; Straubinger, R. M. i Papahadjopoulos, D. Meth. Enz.101:512-527, 1983; Wang, C. Y. i Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855,1987).
[0372] Ne-jonski lipozomni sistemi su takođe ispitani radi određivanja njihove upotrebljivosti pri isporuci lekova u kožu, naročito sistemi koji sadrže ne-jonski surfaktant i holesterol. Ne-jonske lipozomne formulacije koje sadrže Novasome I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i Novasome II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku lekova u dermis kože miša. Takve formulacije sa RNKi agensima su korisne pri tretiranju dermatoloških poremećaja.
[0373] Lipozomi koji sadrže iRNK mogu biti napravljeni visoko deformabilnim. Takva deformabilnost može omogućiti lipozomima da penetriraju kroz pore koje su manje od prosečnog prečnika lipozoma. Na primer, transferzomi su tip deformbilnih lipozoma.
Transferzomi mogu biti napravljeni dodavanjem površinskih aktivatora, obično surfaktanata, standardnom lipozomnom sastavu. Transferzomi koji sadrže RNKi agense mogu biti isporučeni, na primer, subkutano pomoću infekcije u cilju isporuke RNKi agensa u keratinocite u koži. U cilju da prođe kroz nepromenjenu kožu sisara, lipidni nosači moraju proći kroz niz finih pora, svaka sa prečnikom manjim od 50 nm, pod uticajem pogodnog transdermalnog gradijenta. Dodatno, usled lipidnih svojstava, ovi transferozomi mogu se samostalno optimizovati (adaptivni su obliku pora, npr., u koži), samostalno popravljati, i mogu frekventno dostizati svoje ciljeve bez fragmentiranja, i često se mogu samostalno puniti.
[0374] Druge formulacije koje su pogodne za predmetni pronalazak opisane su u patentnim prijavama SAD US2011/0117125, US2011/0097720 i PCT objavi WO2009132131. PCT objava br WO2008/042973, podneta 3. oktobra, 2007, takođe opisuje formulacije koje su pogodne za predmetni pronalazak.
[0375] Transferzomi su još jedan tip lipozoma, i visoko su deformabilni lipidni agregati koji su privlačni kandidati za nosače za isporuku lekova. Transferzomi mogu biti opisani kao lipidne kapi koje su visoko deformabilne pa mogu lako penetrirati kroz pore koje su manje od kapi. Transferzomi su prilagodljivi okruženju u kojem se koriste npr., sami se optimiziraju (prilagodljivi su obliku pora u koži), sami se popravljaju, često dostižu svoje mete bez fragmentiranja i često se samostalno pune. Kako bi se transferzomi napravili moguće je dodati površinske aktivatore, obično surfaktante, standardnom lipozomnom sastavi.
Transferzomi su korišćeni da bi se isporučio serum albumin u kožu. Isporuka serum albumina posredovana sa transferzomima je pokazala da je delotvorna kao i subkutana injekcija sa rastvorom koji sadrži serum albumin.
[0376] Surfaktanti pronalaze široku primenu u formulacijama sa emulzijama (uključujući mikroemulzije) i lipozomima. Najčešći način klasifikovanja i rangiranja svojstava mnogih različitih tipova surfaktanata, kako prirodnih tako i sintetičkih, je upotrebom balansa hidrofila/lipofila (HLB). Priroda hidrofilne grupe (takođe poznata kao „glava“) daje najkorisnije mere za kategorizaciju različitih surfaktanata korišćenih u formulaciji (Rieger, in "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.285).
[0377] Ukoliko molekul surfaktanta nije jonizovan, klasifikovan je kao nejonski surfaktant. Nejonizovani surfaktanti pronalaze široku primenu u farmaceutskim i kozmetičkim proizvodima i upotrebljivi su u širokom opsegu pH vrednosti. Generalno, njihove HLB vrednosti su u opsegu od 2 do oko 18, u zavisnosti od njihove strukture. Nejonski surfaktanti obuhvataju nejonizovane ester kao što su etilen glikol esteri, propilen glikol esteri, gliceril esteri, poligliceril esteri, sorbitan esteri, esteri sukroze i etoksilisani esteri. Nejonski alkanolamidi i esteri kao što su masni alkohol etoksilati, propoksilisani alkoholi i etoksilisani/propoksilisani blok polimeri takođe su obuhvaćeni klasom. Polioksietilen surfaktanti su najpopularniji članovi nejonske surfaktantske klase.
[0378] Ukoliko molekul surfaktanta ima negativno naelektrisanje kada se rastvara ili disperguje u vodi, onda se surfaktant klasifikuje kao anjonski. Anjonski surfaktanti obuhvataju karboksilate kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi amino kiselina, esteri sumporne kiseline kao što su alkil sulfati i etoksilisani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil isetionati, acil taurati i sulfosukcinati i fosfati. Najznačajniji članovi anjonske surfaktantske klase su alkil sulfati i sapuni.
[0379] Ukoliko molekul surfaktanta ima pozitivno naelektrisanje kada se rastvara ili disperguje u vodi, onda se surfaktant klasifikuje kao katjonski. Katjonski surfaktanti obuhvataju kvaternarne soli amonijaka i etoksilisane amine. Kvaternarne soli amonijaka su najkorišćeniji članovi ove klase.
[0380] Ukoliko molekul surfaktanta ima sposobnost da bude pozitivno ili negativno naelektrisan surfaktant se klasifikuje kao amfoterni. Amfoterni surfaktanti obuhvataju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetaine i fosfatide.
[0381] Upotreba surfaktanata u proizvodima lekova, formulacijama i emulzijama je razmotrena (Rieger, u "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.285).
[0382] iRNK za upotrebu u metodama prema pronalasku takođe može biti kao micelarna formulacija. „Miceli“ su ovde definisani kao određeni tip molekularnog sklopa u kojem su amfipatični molekuli postavljeni u sfernu strukturu tako da su svi hidrofobni delovi molekula postavljeni ka unutra, ostavljajući hidrofilne delove u kontaktu sa okružujućom vodenom fazom. Suprotan aranžman postoji ukoliko je okruženje hidrofobno.
[0383] Pomešana micelarna formulacija pogodna za isporuku preko transdermalnih membrana može biti pripremljena mešanjem vodenog rastvora sa siRNK sastavom, alkalnim metalom C8do C22alkil sulfatom i jedinjenjima koja formiraju micel. Primerna jedinjenja koja formiraju micel obuhvataju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavaca, oleinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurate, ulje borača, ulje žutog noćurka, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njihove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen eteri i njihove analoge, poliokanol alkil etre i njihove analoge henodezoksiholat, dezoksiholat i njihove smeše. Jedinjenja koja formiraju micel mogu se dodati istovremeno ili posle dodavanja alkalnog metil alkil sulfata. Mešani miceli će se formirati sa suštinski bilo kojom smešom sastojaka ali je potrebno snažno mešanje kako bi se dobili miceli manje veličine.
[0384] U jednoj metodi, prvi micelarni sastav se priprema koji sadrži siRNK sastav i barem jedan alkil sulfat alkalnog metala. Prvi micelarni sastav se zatim meša sa barem tri jedinjenja koja formiraju micel kako bi se formirala smeša micelarnog sastava. U drugoj metodi, micelarni sastav se priprema mešanjem siRNK sastava, alkil sulfata alkalnog metala i barem jednog jedinjenja koje formira micel, što je praćeno dodavanjem preostalih jedinjenja koja formiraju micel, i snažnim mešanjem.
[0385] Fenol i/ili m-krezol mogu se dodati u mešani micelarni sastav kako bi stabilizovali formulaciju i sprečili rast bakterija. Alternativno, fenol i/ili m-krezol mogu se dodati sa sastojcima koji formiraju micel. Izotonični agens kao što je glicerin može se takođe dodati nakon formulisanja mešanog micelarnog sastava.
[0386] Za isporuku micelarne formulacije kao sprej, formulacija se može staviti u aerosol dispenzer i dispenzer se puni sa propelantom. Propelant, koji je pod pritiskom, je u tečnom obliku u dispenzeru. Odnosi sastojaka su podešeni tako da vodena i propelantna faza postaju jedna, tj., da postoji jedna faza. Ukoliko postoje dve faze, neophodno je promućkati dispenzer pre ispuštanja dela sadržaja, npr., kroz merni ventil. Ispuštena doza farmaceutskog agensa pokrenuta je od mernog ventila kao fini sprej.
[0387] Propelanti mogu obuhvatati hlorofluorougljenike koji sadrže vodonik, fluorougljenike koji sadrže vodonik, dimetil etar i dietil etar. U određenim otelotvorenjima, HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetan) može biti korišćen.
[0388] Specifične koncentracije suštinskih sastojaka mogu biti određene relativno direktnim ispitivanjem. Za apsorbovanje kroz oralne šupljine, često je poželjno povećati, npr., barem duplo ili troduplo, doze za injekciju ili davanje preko gastrointestinalnog trakta.
B. Lipidne čestice
[0389] iRNK, npr., dsRNK prema pronalasku mogu biti potpuno obuhvaćene u lipidnoj formulaciji, npr., LNP ili druga lipidna čestica sa nukleinskom kiselinom.
[0390] Kao što je ovde korišćeno, termin „LNP“ odnosi se na stabilnu lipidnu česticu sa nukleinskom kiselinom. LNP obično sadrže katjonski lipid, ne-katjonski lipid i lipid koji sprečava agregaciju čestica (npr., PEG-lipidni konjugat). LNP su obično veoma korisne za sistemske primene, kako ispoljavaju produžene polu-raspade cirkulacije kod intravenozne (i.v.) injekcije i akumulišu distalna mesta (npr., mesta fizički odvojena od mesta davanja). LNP obuhvataju „pSPLP“ koji obuhvata kompleks kondenzirajućeg agensa nukleinske kiseline kao što je iznetu u PCT objavi br. WO 00/03683. Čestice predmetnog pronalaska obično imaju srednji prečnik od oko 50 nm do oko 150 nm, obično od oko 60 nm do oko 130 nm, obično od oko 70 nm do oko 110 nm, najčešće od oko 70 nm do oko 90 nm, i suštinski su netoksične. Dodatno, nukleinske kiseline kada su prisutne u lipidnim česticama sa nukleinskom kiselinom prema predmetnom pronalasku otporne su u vodenom rastvoru na degradaciju sa nukleazom. Lipidne čestice sa nukleinskom kiselinom i metode za njihovu pripremu obelodanjene su u patentima SAD br.5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; objavi SAD br.2010/0324120 i PCT objavu br. WO 96/40964.
[0391] U jednom otelotvorenju, odnos lipida i leka (odnos masa/masa) (npr., odnos lipida i dsRNK) će biti u opsegu od oko 1:1 do oko 50:1, od oko 1:1 do oko 25:1, od oko 3:1 do oko 15:1, od oko 4:1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 9:1, ili od oko 6:1 do oko 9:1. Opsezi između onih navedenih iznad se takođe smatraju delom pronalaska.
[0392] Katjonski lipid može biti, na primer, N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid (DODAC), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(I -(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTAP), N-(I -(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloksi)propilamin (DODMA), 1,2-Dilinoleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 1,2-Dilinoleniloksi-NN-dimetilaminopropan (DLenDMA), 1,2-Dilinoleilkarbamoiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleioksi-3-(dimetilamino)acetoksipropan (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleioksi-3-morfolinopropan (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropan (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropan (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-2-DMAP), 1,2-Dilinoleiloksi-3-trimetilaminopropan hlorid so (DLin-TMA.Cl), 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropan hlorid so (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleiloksi-3-(N-metilpiperazino)propan (DLin-MPZ), ili 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propandiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propandio (DOAP), 1,2-Dilinoleilokso-3-(2-N,N-dimetilamino)etoksipropan (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan (DLin-K-DMA) ali analogi navedenih, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciklopenta[d][1,3]dioksol-5-amin (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamina)butanoat (MC3), 1,1’-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroksidodecil)amino)etil)(2-hidroksidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanediil)didodekan-2-ol (Tech G1), ili smeša navedenih. Katjonski lipid može da sadrži od oko 20 mol % do oko 50 mol % ili oko 40 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0393] U drugom otelotvorenju, jedinjenje 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan može biti korišćeno da se pripremi lipidna siRNK nanočestica. Sinteza 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana opisana je provizornom patentu SAD broj 61/107,998 podnetom 23. oktobra, 2008.
[0394] U jednom otelotvorenju lipidna-siRNK čestica sadrži 40% 2, 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana: 10% DSPC: 40% holesterola: 10% PEG-C-DOMG (procenat mola) sa veličinom čestice 63.0 ± 20 nm i 0.027 siRNK/Lipid odnosom.
[0395] Lipidi koji se mogu jonizovati/ne-katjonski lipidi mogu biti anjonski lipid ili neutralni lipid obuhvatajući, ali bez ograničenja, distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleoilfosfatidilholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksane-1- karboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamin (DMPE), distearoilfosfatidil-etanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1 -stearoil-2-oleoil- fosfatidietanolamin (SOPE), holesterol, i smeše navedenih. Ne-katjonski lipid može biti od oko 5 % do oko 90 mol %, od oko 10 mol %, ili oko 58 % ukoliko je holesterol sadržan, ukupnog lipida koji je prisutan u čestici.
[0396] Konjugovani lipid koji inhibira agregaciju čestica može biti, na primer, polietilenglikol (PEG)-lipid koji obuhvata, bez ograničenja, PEG-diacilglicerol (DAG), PEG-dialkiloksipropil (DAA), PEG-fosfolipid, PEG-ceramid (Cer) ili smešu navedenih. PEG-DAA konjugat može biti, na primer, PEG-dilauriloksipropil (Ci2), PEG-dimiristiloksipropil (Ci4), PEG-dipalmitiloksipropil (Ci6), PEG-disteariloksipropil (C]8). Konjugovani lipid koji sprečava agregaciju čestica može biti od 0 mol % do oko 20 mol % ili oko 2 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0397] U nekim otelotvorenjima, lipidna čestica sa nukleinskom kiselinom dalje obuhvata holesterol pri, npr., oko 10 mol % do oko 60 mol % ili oko 48 mol % ukupnog prisutnog lipida u čestici.
[0398] U jednom otelotvorenju, lipidoid ND98·4HCl (MW 1487) (videti patentu prijavu SAD br.12/056,230, podnetu 26.3.2008), holesterol (Sigma-Aldrich), i PEG-Ceramid C16 (Avanti Polar Lipids) mogu se koristiti za pripremanje lipidnih-dsRNK nanočestica (tj., LNP01 čestica). Matični rastvori svakog u etanolu mogu biti pripremljeni kao što sledi: ND98,133 mg/ml; Holesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramid C16,100 mg/ml. ND98, Holesterol, i PEG-Ceramid C16 matični rastvori se onda mogu pomešati u, npr., 42:48:10 molarnom odnosu. Kombinovani lipidni rastvori mogu biti pomešani sa vodenom dsRNK (npr., u natrijum acetatu sa pH 5) tako da konačna koncentracija etanola bude oko 35-45% i da konačna koncentracija natrijum acetata bude oko 100-300 nM. Lipidne-dsRNK nanočestice obično se formiraju spontano nakon mešanja. U zavisnosti od željene distribucije veličine čestica, rezultujuća smeša nanočestica može biti istisnuta kroz polikarbonatnu membranu (npr., 100 nm odsečak) upotrebom, na primer, termobarel ekstrudera, kao što je Lipex ekstruder (Northern Lipids, Inc). U nekim slučajevima korak istiskivanja može biti izostavljen. Uklanjanje etanola i simultana razmena pufera može biti ostvarena, na primer, sa dijalizom ili tangencijalnom filtracijom protoka. Pufer može biti razmenjen sa, na primer, fosfatom puferisan fiziološkim rastvorom (PBS) pri oko pH 7, npr., oko pH 6.9, oko Ph 7.0, oko pH 7.1, oko pH 7.2, oko pH 7.3 ili oko pH 7.4.
[0399] LNP01 formulacije su opisane, npr., u međunarodnoj objavi patentne prijave br. WO 2008/042973.
[0400] Dodatne primerne lipidne-dsRNK formulacije su opisane u Tabeli 1.
Tabela 1
DSPC: distearoilfosfatidilholin
DPPC: dipalmitoilfosfatidilholin
PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG, ili PEG-C14) (PEG sa srednjom mol masom od 2000)
PEG-DSG: PEG-distiril glicerol (C18-PEG, ili PEG-C18) (PEG sa srednjom mol masom od 2000)
PEG-cDMA: PEG-karbamoil-1,2-dimiristiloksipropilamin (PEG sa srednjom mol masom od 2000) SNALP (1,2-Dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA)) formulacije koje sadrže iznad navedena jedinjenja opisana su u međunarodnoj objavi br. WO2009/127060, podnetoj 15. aprila, 2009. Formulacije koje sadrže XTC opisane su, npr., u US2012/0101148 i WO2010/088537. Formulacije koje sadrže MC3 opisane su, npr., u objavi SAD br.2010/0324120, podnetoj 10. juna, 2010.
Formulacije koje sadrže ALNY-100 opisane su, npr., u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2010/054406, podnetoj 10. novembra 10,2009.
Formulacije koje sadrže C12-200 opisane su, npr., objavi SAD br. US2012/0128760, podnetoj 5. maja, 2009 i međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2010/129709, podnetoj 5. maja, 2010.
Sinteza jonizabilnih katjonskih lipida
[0401] Bilo koje od jedinjenja, npr., katjonski lipidi i slično, korišćeni u lipidnim česticama sa nukleinskom kiselinom prema pronalasku, može biti pripremljeno poznatim tehnikama organske sinteze, uključujući metode opisane detaljnije u Primerima. Svi supstituenti su kao što je definisano ispod, ukoliko drugačije nije naznačeno.
[0402] „Alkil“ označava pravolinijski lanac ili granati, neciklični ili ciklični, zasićeni alifatni ugljovodonik koji sadrži od 1 do 24 atoma ugljenika. Reprezentativni zasićeni alkili pravolinijskog lanca obuhvataju metil, etil, n-propil, n-butil, n-pentil, n-heksil i slično; dok zasićeni alkili granatog lanca obuhvataju izopropil, sek-butil, izobutil, terc-butil, izopentil i slično. Reprezentativni zasićeni ciklični alkili obuhvataju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i slično; dok nezasićeni ciklični alkili obuhvataju ciklopentenil i cikoheksenil i slično.
[0403] „Alkenil“ označava alkil, kao što je definisano iznad, koji sadrži barem jedno dvostruku vezu između atoma ugljenika. Alkenili obuhvataju oba, cis i trans izomere.
Reprezentativni alkenili pravolinijskog i granatog lanca obuhvataju etilenil, propilenil, 1-butenil, 2-butenil, izobutenil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-metil-1-butenil, 2-metil-2-butenil, 2,3-dimetil-2-butenil i slično.
[0404] „Alkinil“ označava bilo koji alkil ili alkenil, kao što je definisani iznad, koji dodatno sadrži barem jednu trostruku vezu između susednih ugljenika. Reprezentativni alkenili pravolinijskog ili granatog lanca obuhvataju acetilenil, propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, 2-pentinil, 3-metil-1 butinil i slično.
[0405] „Acil“ označava bilo koji alkil, alkenil ili alkinil, gde je ugljenik na mestu povezivanja supstituisan sa okso grupom, kao što je definisano ispod. Na primer, -C(=O)alkil, -C(=O)alkenil, i -C(=O)alkinil su acil grupe.
[0406] „Heterocikl“ označava 5- do 7-člani monociklični, ili 7- do 10-člani biciklični, heterociklični prsten koji je ili zasićen, nezasićen ili aromatičan i koji sadrži od 1 ili 2 heteroatoma nezavisno izabrana iz azota, kiseonika i sumpora, i gde azot i sumpor heteroatomi mogu biti opcioni oksidovani, i azot heteroatom može biti opciono kvaternizovan, uključujući biciklične prstenove kod kojih je bilo koji heterocikl od iznad spojen sa prstenom benzena. Heterocikl može biti povezan preko bilo kojeg heteroatoma ili atoma ugljenika. Heterocikli obuhvataju heteroarile kao što je definisano ispod. Heterocikli obuhvataju morfolinil, pirolidinoil, pirolidinil, piperidinil, piperizinil, hidantoinil, valerolaktamil, oksiranil, oksetanil, tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, tetrahidropiridinil, tetrahidroprimidinil, tetrahidrotiofenil, tetrahidropiranil, tetrahidropirimidinil, tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiopiranil i slično.
[0407] Termini „opciono supstituisani alkil“, „opciono supstituisani alkenil“, „opciono supstituisani alkinil“, „opciono supstituisani acil“ i „opciono supstituisani heterocikl“ označavaju da, kada su supstituisani, barem jedan atom vodonika je zamenjen sa supstituentom. U slučaju okso supstituenta (=O) dva atoma vodonika su zamenjena. U tom smislu, supstituenti obuhvataju okso, halogen, heterocikl, -CN, -ORx, NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx i -SOnNRxRy, gde n je 0,1 ili 2, Rx i Ry su isti ili različiti i nezavisno su vodonik, alkil ili heterocikl, i svaki od navedenih alkil i heterocikl supstituenata dalje može biti supstituisan sa jednim ili više od okso, halogen, -OH, -CN, alkil, -ORx, heterocikl, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx i -SOnNRxRy.
[0408] „Halogen“ označava fluor, hlor, brom i jod.
[0409] U nekim otelotvorenjima, metoda prema pronalasku mogu zahtevati upotrebu zaštitnih grupa. Metodologija zaštitne grupe je dobro poznata onima koji su stručni u ovoj oblasti (videti, na primer, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. i dr., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Ukratko, zaštitne grupe u kontekstu ovog pronalaska su bilo koja grupa koja smanjuje ili eliminiše neželjenu reaktivnost funkcionalne grupe. Zaštitna grupa može biti dodana funkcionalnoj grupi kako bi maskirala njenu reaktivnost u toku određenih reakcija i zatim se uklanja kako bi pokazala originalnu funkcionalnu grupu. U nekim otelotvorenjima „alkohol zaštitna grupa“ se koristi. „Alkohol zaštitna grupa“ ne bilo koja grupa koja smanjuje ili eliminiše neželjenu reaktivnost alkohol funkcionalne grupe. Zaštitne grupe mogu biti dodate ili uklonjene upotrebom tehnika koje su poznate u struci.
Sinteza Formule A
[0410] U nekim otelotvorenjima, lipidne čestice sa nukleinskom kiselinom prema pronalasku formulisane su upotrebom katjonskog lipida Formule A:
gde su R1 i R2 nezavisno alkil, alkenil ili alkinil, svaki može opciono supstituisan a R3 i R4 su nezavisno niži alkil ili R3 i R4 mogu biti uzeti zajedno kako bi formirali opciono supstituisani heterociklični prsten. U nekim otelotvorenjima, katjonski lipid je XTC (2,2-Dilinoeil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan). Uopšteno, lipid formule A iznad može biti napravljen praćenjem Reakcionih Šema 1 ili 2, gde su svi supstituenti kao što je definisano iznad, ukoliko nije drugačije naznačeno.
Lipid A, gde su R1 i R2 nezavisno alkil, alkenil ili alkinil, svaki može biti nezavisno supstituisan a R3 i R4 su nezavisno niži alkil ili R3 i R4 mogu biti uzeti zajedno kako bi formirali opciono supstituisani heterociklični prsten, može biti pripremljen u skladu sa Šemom 1. Keton 1 i bromid 2 mogu biti kupljeni ili pripremljeni u skladu sa metodama poznatim onima koji su stručni u ovoj oblasti. Reakcije 1 i 2 daju ketal 3. Tretiranje ketala 3 sa aminom 4 daje lipide formule A. Lipidi formule A mogu biti konvertovani u odgovarajuću so amonijuma sa organskom soli formule 5, gde je X anjon protiv jon izabran iz halogena, hidroksida, fosfata, sulfata ili slično.
[0411] Alternativno, keton 1 početni materijal može biti pripremljen u skladu sa Šemom 2. Grignard reagens 6 i cijanid 7 mogu biti kupljeni ili pripremljeni u skladu sa metodama poznatim onima koji su stručni u ovoj oblasti. Reakcije 6 i 7 daju keton 1. Konverzija ketona 1 u odgovarajuće lipide formule A je kao što je opisano u Šemi 1.
Sinteza MC3
[0412] Pripremanje DLin-M-C3-DMA (tj., (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoata) je kao što sledi. Rastvor (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-ola (0.53 g), ugljovodonika 4-N,N-dimetilaminobutirne kiseline (0.51), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0.61 g) i ugljovodonika 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodimida (0.53 g) u dihlorometanu (5mL) je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvor je ispran sa razblaženom hlorovodoničnom kiselinom što je praćeno razblaženim vodenim natrijum bikarbonatom. Organske frakcije su osušene preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrirane i rastvarač je uklonjen na rotovap-u. Ostatak je prenet na kolonu sa silikagelom (20 g) upotrebom 1-5% metanol/dihlorometan elucionog gradijenta. Frakcije koje su sadržale prečišćeni proizvod su kombinovane i rastvarač je uklonjen, dajući bezbojno ulje (0.53 g). Sinteza ALNY-100
[0413] Sinteza ketala 519 [ALNY-100] je izvršena upotrebom sledeće šeme 3:
Sinteza 515
[0414] U mešanu suspenziju LiAlH4(3.74 g, 0.09852 mol) u 200 ml anhidrovanog ZJF u RBF (1L) sa dva grla, je dodat rastvor 514 (10g, 0.04926mol) u 70 mL THF polako pri 00C pod atmosferom azota. Nakon potpunog dodavanja reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i zatim je zagrevana uz refluks 4 sata. Progres reakcije je praćen sa TLC. Nakon završetka reakcije (sa TLC) smeša se hladi do 00C i gasi se pažljivim dodavanjem zasićenog Na2SO4rastvora. Reakciona smeša je mešana 4 sata na sobnoj temperaturi i filtrirana je. Ostatak je ispran sa TNF. Filtrat i ono što je isprano je pomešano i razblaženo sa 400 mL dioksana i 26 mL konc. HCl i mešano je 20 minuta na sobnoj temperaturi. Volatilnosti su uklonjene pod vakumom za pripremanje hlorovodonične soli 515 kao bele čvrste supstance. Prinos: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (jasan, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
Sinteza 516
[0415] Mešanom rastvoru jedinjenja 515 u 100 mL suvog DCM u 250 mL RBF sa dva grla, je dodat NEt3(37.2 mL, 0.2669 mol) i ohlađen je do 00C pod atmosferom azota. Nakon sporog dodavanja N-(benziloksi-karboniloksi)sukcinimida (20 g, 0.08007 mol) u 50 mL suvog DCM, reakciona smeša je puštena da se zagreje do sobne temperature. Nakon završetka reakcije (2-3 sata sa TLC) smeša je isprana sukcesivno sa IN HCl rastvorom (1 x 100 mL) i zasićenim NaHCO3rastvorom (1x 50 mL). Organski sloj je zatim osušen preko anhid. Na2SO4 i rastvarač je evaporiran kako bi se dobio sirovi materijal koji je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom kako bi se dobilo 516 kao lepljiva masa. Prinos: 1g (89%). 1H-NMR (CDC13, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
Sinteza 517A i 517B
[0416] Ciklopenten 516 (5 g, 0.02164 mol) je razblažen u rastvoru od 220 mL acetona i vode (10:1) u RBF od 500 mL sa jednim grlom i dodat je N-metil morfolin-N-oksid (7.6 g, 0.06492 mol) što je praćeno sa 4.2 mL 7.6% rastvora OsO4 (0.275 g, 0.00108 mol) u tercbutanolu na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije (~ 3 sata), smeša je ugašena dodavanjem čvrstog Na2SO3i rezultujuća smeša je mešana 1.5 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (300 mL) i isprana sa vodom (2 x 100 mL) što je praćeno sa zasićenim NaHCO3(1 x 50 mL) rastvorom, vodom (1x30 mL) i konačno fiziološkim rastvorom (1x50 mL). Organska faza je osušena preko anhid. Na2SO4i rastvarač je uklonjen u vakumu. Prečišćavanje na koloni sa silikagelom sirovog materijala je dalo smešu diastereomera, koja je razdvojena sa prep. HPLC. Prinos: -6 g sirovog
[0417] 517A - Vrh-1 bela čvrsta supstanca), 5.13 g (96%).1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72-1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 ]-283.5 trenutno, HPLC-97.86%. Stereohemija je potvrđena rendgenskim zračenjem.
Sinteza 518
[0418] Upotreba procedure analogne onoj opisanoj za sintezu jedinjenja 505, jedinjenje 518 (1.2 g, 41%) je dobijeno kao bezbojno ulje.1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,lH), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,BH), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m,4H), 1.48(m,2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
Generalna procedura za sintezu jedinjenja 519
[0419] Rastvor jedinjenja 518 (1 ekv) u heksanu (15 ml) je dodat u vidu kapi ledenohladnom rastvoru LAH u THF (1 M, 2 ekv). Nakon potpunog dodavanja, smeša je zagrejana na 400C 0.5 sati i zatim je ponovo ohlađena u ledenom kupatilu. Smeša je pažljivo hidrolizovana sa zasićenim vodenim Na2SO4i zatim je filtrirana kroz celit i redukovana je do ulja. Hromatografija na koloni je dala čisto 519 (1.3 g, 68%) koje je dobijeno kao bezbojno ulje. 13C NMR 8 = 130.2,130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9 (x2), 29.7,29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226,14.1; Elektrosprej MS (+ve): Molekularna masa za C44H80NO2 (M H)+ izr.654.6, Pronađeno 654.6.
[0420] Formulacije pripremljene ili standardnim ili sa metodama bez ekstrudiranja mogu biti okarakterisane na slične načine. Na primer, formulacije su obično okarakterisane vizuelnim pregledanjem. Trebalo bi da budu beli translucentni rastvori bez agregata ili sedimenata. Veličina čestice i distribucija veličine čestica lipidnih-nanočestica može biti izmerena rasipanjem svetlosti upotrebom, na primer, Malvem Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Čestice bi trebalo da budu 20-300 nm, kao što je 40-100 nm u veličini. Distribucija veličine čestica bi trebala da bude unimodalna. Ukupna koncentracija dsRNK u formulaciji, kao i zarobljena frakcija, procenjena je upotrebom testa uklanjanja boje. Uzorak formulisane dsRNK može biti inkubiran sa RNK-vezujućom bojom, kao što je Ribogreen (Molecular Probes) u prisustvu ili odsustvu surfaktanta koji prekida formulaciju, npr.,.5% Triton-X100. Ukupna dsRNK u formulaciji može biti određena signalom uzorka koji sadrži surfaktant u odnosu na standardnu krivu. Zarobljena frakcija se određuje oduzimanjem „slobodnog“ dsRNK sadržaja (kao što je mereno signalom u odsustvu surfaktanta) od ukupnog dsRNK sadržaja. Procenat zarobljene dsRNK obično je >85%. Za SNALP formulaciju, veličina čestice je barem 30 nm, barem 40 nm, barem 50 nm, barem 60 nm, barem 70 nm, barem 80 nm, barem 90 nm, barem 100 nm, barem 110 nm, i barem 120 nm. Pogodan opseg je obično od oko barem 50 nm do barem 110 nm, oko barem 60 nm do oko barem 100 nm, ili oko barem 80 nm do oko barem 90 nm.
[0421] Sastavi i formulacije za oralnu primenu obuhvataju pudere ili granule, mikročestice, nanočestice, suspenzije ili rastvore u vodenoj ili ne-vodenoj sredini, kapsule, kapsule sa gelom, kesice, tablete ili mini tablete. Zgušnjivači, aromatični agensi, diluenti, emulgatori, disperziona pomagala ili vezivna sredstva mogu biti poželjna. U nekim otelotvorenjima, oralne formulacije su one kod kojih se dsRNK koje se pojavljuju u pronalasku daju u konjugaciji sa jednim ili više surfaktanata pojačivača penetracije i helatora. Pogodni surfaktanti obuhvataju masne kiseline i/ili estere ili njihove soli, žučne kiseline i/ili njihove soli. Pogodne žučne kiseline/soli obuhvataju henodezoksiholnu kiselinu (CDCA) i ursodezoksihenodezoksiholnu kiselinu (UDCA), holnu kiselinu, dehidroholnu kiselinu, dezoksiholnu kiselinu, gluholnu kiselinu, gliholnu kiselinu, glikodezoksiholnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, taurodezoksiholnu kiselinu, natrijum tauro-24,25-dihidro-fuzidat i natrijum glikodihidrofuzidat. Pogodne masne kiseline obuhvataju arahidonsku kiselinu, undekanoičnu kiselinu, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kapronsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linoleičnu kiselinu, linoleničnu kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat,1dodecilazacikloheptan-2-on, acilkamitin, acilholin ili monoglicerid, diglicerid ili farmaceutski prihvatljive soli navedenih (npr., natrijum). U nekim otelotvorenjima, kombinacije pojačivača penetracije su korišćene, na primer, masne kiseline/soli u kombinaciji sa žučnim kiselinama/solima. Jedna primerna kombinacija je natrijumova so laurinske kiseline, kaprilne kiseline i UDCA. Dalje pojačivači penetracije obuhvataju polioksietilen-9-lauril etar, polioksietilen-20-cetil etar. DsRNK koje se pojavljuju u pronalasku mogu biti ispostavljene oralno, u granuliranom obliku što obuhvata čestice osušene prskanjem, ili one koje su kompleksirane kako bi se formirale mikro ili nanočestice. DsRNK kompleksirajući agensi obuhvataju poli-amino kiseline; poliimine; poliakrilate; polialkilakrilate, polioksetane; polialkilcijanoakrilate; katjonizovane želatine, albumine, skrobove, akrilate, polietilenglikole (PEG) i skrobove; polialkilcijanoakrilate; DEAE-izvedene poliimine, polutane, celuloze i skrobove. Pogodni kompleksirajući agensi obuhvataju hitozan, N-trimetilhitozan, poli-L-lizin, polihistidin, polimitin, polispermine, protamin, polivinilpiridin, politiodietilaminometiletilen P(TDAE), poliaminostiren (npr., p-amino), poli(metilcijanoakrilat), poli(etilcijanoakrilat), poli(butlcijanoakrilat), poli(izobutilcijanoakrilat), poli(izoheksilcijanoakrilat), DEAE-metakrilat, DEAE-heksilakrilat, DEAE-akrilamid, DEAE-albumin i DEAE-dekstran, polimetilakrilat, poliheksilakrilat, poli(D,L-mlečnu kiselinu), poli(DL-mlečnu-ko-glikolnu kiselinu (PLGA), alginat i polietilenglikol (PEG). Oralne formulacije za dsRNK i njihovo pripremanje detaljno su opisane u patentu SAD 6,887,906, objavi SAD br.20030027780 i patentu SAD br.
6,747,014.
[0422] Sastavi formulacije za parenteralno, intraparenhimalno (u mozak), intratekalno, intraventrikularno ili intrahepatično davanje mogu obuhvatati sterilne vodene rastvore koji mogu takođe sadržati pufere, diluente ili druge pogodne aditive kao što su, bez ograničenja, pojačivači penetracije, jedinjenja nosača i drugi farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijenti.
[0423] Farmaceutski sastavi prema predmetnom pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozom. Ovi sastavi mogu biti napravljeni iz više komponenti koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, prethodno formirane tečnosti i samo-emulgirajuće čvrste supstance i samo-emulgirajuće polu čvrste supstance. Naročito su poželjne formulacije koje ciljaju jetru pri tretiranju hepatičnih poremećaja kao što su hepatični karcinomi.
[0424] Farmaceutske formulacije prema predmetnom pronalasku, koje konvencionalno mogu biti prisutne u jediničnom obliku doziranja, mogu biti pripremljene u skladu sa konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike obuhvataju korak dovođenja u kontakt aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačima ili ekscipijentima. Uopšteno, formulacije su pripremljene uniformnim i intimnim dovođenjem aktivnih sastojaka u kontakt sa tečnim nosačima ili fino odvojenim čvrstim nosačima, ili oba, i zatim, ukoliko je potrebom, oblikovanjem proizvoda.
[0425] Sastavi prema predmetnom pronalasku mogu biti formulisani u bilo koji od mnogo oblika doziranja kao što su, bez ograničenja, tablete, kapsule, kapsule sa gelom, tečni sirupi, meki gelovi, supozitorije i klistiri. Sastavi prema predmetnom pronalasku takođe mogu biti formulisani kao suspenzije u vodenoj, ne-vodenoj ili mešanoj sredini. Vodene suspenzije mogu dalje sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, što uključuje, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzije takođe mogu sadržati stabilizatore.
C. Dodatne formulacije
i. Emulzije
[0426] Sastavi prema predmetnom pronalasku mogu biti pripremljeni i formulisani kao emulzije. Emulzije su obično heterogeni sistemi od jedne tečnosti disperzirane u drugoj u vidu kapi koje obično dostižu 0.1µm u prečniku (videti npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p.245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p.335; Higuchi i dr., in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.301). Emulzije su obično dvofazni sistemi koji sadrže dve nepomešane tečne faze intimno pomešane i disperzirane jedna sa drugom- Uopšteno, emulzije mogu biti ili voda-u-ulju (v/u) ili ulje-u-vodi (u/v). Kada se vodena faza fino podeli i disperzira kao minut kapi u glavnu uljanu fazu, rezultujući sastav se naziva emulzija vode-u-ulju (v/u). Alternativno, kada se uljana faza fino podeli i disperzira kao minut kapi u glavnu vodenu fazu, rezultujući sastav se naziva emulzija ulja-u-vodi (u/v). Emulzije mogu sadržati dodatne komponente dodatno disperzivnim fazama, i aktivni lek može biti prisutan kao rastvor bilo u vodenoj fazi, uljanoj fazi ili zasebno kao odvojena faza. Farmaceutski ekscipijenti kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i anti-oksidanti takođe mogu biti prisutni u emulzijama po potrebi. Farmaceutske emulzije takođe mogu biti od više emulzija koje su sačinjene od više od dve faze kao što je, na primer, u slučaju emulzija uljau-vodi-u-ulju (u/v/u) i vode-u-ulju-u-vodi (v/u/v). Takve kompleksne formulacije čestu daju podređene prednosti koje obične binarne emulzije ne pružaju. Više emulzija u kojima pojedinačne kapi ulja u/v emulzije zatvaraju male kapi vode čine v/u/v emulziju. Slično sistem kap ulja zatvoren u globulama vode stabilizovanim u uljanoj neprekidnoj fazi daje u/v/u emulziju.
[0427] Emulzije su okarakterisane sa malo ili bez termodinamičke stabilnosti. Često disperzivne ili isprekidane faze emulzije su dobro disperzirane u spoljašnju ili neprekidnu fazu i održavane su u tom obliku preko mera u vidu emulgatora ili viskoznosti formulacije. Bilo koja od faza emulzije može biti polu čvrsta ili čvrsta supstanca, kao što je slučaj kod masnih baza i krema nalik emulzijama. Drugi vidovi stabilizacije emulzije zahteva upotrebu emulgatori koji se mogu inkorporirati u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori se mogu široko klasifikovati u četiri kategorije: sintetički surfaktanti, emulzije koje je javljaju u prirodi, apsorpcione baze i fino disperzne čvrste supstance (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0428] Sintetički surfaktanti, takođe poznati kao površinski aktivni agensi, pronašli su široku primenu u formulacijama emulzija i razmotreni su u literaturi (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199). Surfaktanti su obično amfifilni i sadrže hidrofilne i hidrofobne delove. Odnos hidrofilne i hidrofobne prirode surfaktanata je nazvan kao hidrofil/lipofil ravnoteža (HLB) i vredan je alat u kategorizaciji i odabiru surfaktanata pri pripremanju formulacija. Surfaktanti mogu biti klasifikovani u različite klase na osnovu prirode hidrofilne grupe: nejonski, anjonski, katjonski i amfoterni (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.285).
[0429] Emulgatori koji se prirodno javljaju koji se koriste u formulacijama emulzija obuhvataju lanolin, pčelinji vosak, fosfatide, lecitin i akaciju. Apsorpcione baze poseduju hidrofilna svojstva tako da mogu upiju vodu kako bi formirale v/u emulziju dok održavaju svoju polu čvrstu konzistenciju, kao što je anhidrovani lanolin i hidrofilni petrolatum. Fino podeljene čvrste supstance su takođe korišćene kao dobri emulgatori posebno u kombinaciji sa surfaktantima i viskoznim preparatima. To obuhvata polarne neorganske čvrste supstance, kao što su hidroksidi teških metala, neobuhavajuće gline kao što su bentonit, atapulgit, hektorit, kaolin, montmorilonit, koloidni aluminijum silikat i koloidni magnezijum aluminijum silikat, pigmenti i nepolarne čvrste supstance kao što su ugljenik ili glicerol tristearat.
[0430] Veliki broj različitih ne-emulgatorskih materijala takođe je uključen u formulaciju emulzije i doprinosi svojstvima emulzija. To obuhvata masti, ulja, voskove, masne kiseline, masne alkohole, masne estere, humektante, hidrofilne koloide, konzervanse i antioksidante (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0431] Hidrofilni koloidi ili hidrokoloidi obuhvataju gume koje se prirodno javljaju i sintetičke polimere kao što su polisaharidi (na primer, akacija, agar, alginska kiselina, karagenan, guar guma, karaja guma i tragakant ) derivati celuloze (na primer, karboksimetilceluloza i karboksipropilceluloza) i sintetički polimeri (na primer, karbomeri, etri celuloze i karboksivinil polimeri). Oni se disperguju ili bubre u vodi kako bi formirali koloidni rastvor koji stabilizuje emulzije formiranjem jakih graničnih filmova oko kapi disperzivne faze i povećava viskoznost spoljašnje faze.
[0432] Kako emulzije često sadrže različite sastojke kao što su ugljeni hidrati, proteini, steroli i fosfatidi, koji mogu lako podržati rast mikroba, ove formulacije često sadrže konzervanse. Najčešće korišćeni konzervansi u formulacijama emulzije obuhvataju metil paraben, propil paraben, kvaternarne amonijumove soli, benzalkonijum hlorid, estere ofphidroksibenzoične kiseline i borne kiseline. Antioksidansi se takođe najčešće dodaju u formulacije emulzija kako bi sprečili kvarenje formulacije. Korišćeni antioksidansi mogu biti sakupljači slobodnih radikala kao što su tokoferoli, alkil galati, butilisani hidroksianizol, butilisani hidroksitoluen ili agensi za redukovanje kao što su askorbinska kiselina i natrijum metabisulfit, i sinergisti antioksidansa kao što su limunska kiselina, vinska kiselina i lecitin.
[0433] Primena formulacija emulzija dermatološkim, oralnim ili parenteralnim putem i metode za njihovu proizvodnju su razmatrane u literaturi (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Formulacije emulzija za oralnu isporuku su bile veoma široko korišćene zbog lakoće formulisanja, kao i iz stanovišta apsorpcije i biodostupnosti (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Laksativi na bazi mineralnog ulja, vitamini koji se rastvaraju u ulju i nutritivni preparati sa visokim sadržajem masti su među materijalima koji su najčešće koristili oralno kao u/v emulzije.
ii. Mikroemulzije
[0434] U jednom otelotvorenju prema predmetnom pronalasku, sastavi iRNK i nukleinskih kiselina su formulisani kao mikroemulzije. Mikroemulzija može biti definisana kao sistem vode, ulja i amfifila koji je pojedinačna optički izotropan i termodinamički stabilni tečni rastvor (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245).
Mikroemulzije su obično sistemi koji su pripremljeni prvo disperzijom ulja u vodenom surfaktantnom rastvoru i zatim dodavanjem dovoljne količine četvrte komponente, obično alkohol srednje dužine lanca kako bi se formirao transparentni sistem. Stoga, mikroemulzije su opisane kao termodinamički stabilne, izotropski čiste disperzije dve pomešane tečnosti koje su stabilizovane sa graničnim filmovima površinski aktivnih molekula (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, strane 185-215). Mikroemulzije su najčešće pripremane preko kombinacije od tri do pet komponenata koje obuhvataju ulje, vodu, surfaktant, kosurfaktant i elektrolit. Bilo da je mikroemulzija voda-u-ulju (v/u) ili ulje-u-vodi (u/v) tip zavisi od svojstava ulja i surfaktanta koji se koristi i strukture geometrijskog pakovanja polarnih glava i ostataka ugljenih hidrata surfaktantnih molekula (Schott, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.271).
[0435] Fenomenološki pristup upotrebljavanju faznih dijagrama je opsežno ispitan i doprineo je opsežno znanje, onome ko je stručan u ovoj oblasti, o tome kako formulisati mikroemulzije (videti, npr., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.335). U poređenju sa konvencionalnim emulzijama, mikroemulzije nude prednost rastvaranja lekova koji se ne rastvaraju u vodi u formulaciji termodinamički stabilnih kapi koje se spontano formiraju.
[0436] Surfaktanti korišćeni pri pripremanju mikroemulzija obuhvataju, ali nisu ograničeni na, jonske surfaktante, ne-jonske surfaktante, Brij 96, polioksietilen oleil etre, estere poliglicerol masnih kiselina, tetraglicerol monolaurat (ML310), tetraglicerol monooleat (MO310), heksaglicerol monooleat (PO310) heksaglicerol pentaoleat (PO500), dekaglicerol monokaprat (MCA 750), dekaglicerol monooleat (MO750), dekaglicerol sekvioleat (SO750), dekaglicerol dekaoleat (DAO750), samostalno ili u kombinaciji sa kosurfaktantima.
Kosurfaktant je obično alkohol kratkog lanca kao što su etanol, 1-propanol i 1-butanol, i služi da poveća graničnu protočnost penetriranjem u film surfaktanta i time stvarajući poremećeni film usled praznog prostora koji se stvara između molekula surfaktanta. Mikroemulzije mogu, međutim biti pripremljene bez upotrebe surfaktanta i sistemi mikroemulzija koje su samostalni-emulgatori bez alkohola su poznate u tehnici. Vodena faza obično može biti, ali nije ograničena na, vodu, vodeni rastvor leka, glicerol, PEG300, PEG400, poliglicerole, propilen glikole i derivate etilen glikola. Uljana faza može sadržati, ali nije ograničena na, materijale kao što su Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, estere masnih kiselina, kratkog lanca (C8-C12) mono, di i tri-gliceride, estere polioksietilisanih gliceril masnih kiselina, masne alkohole, poliglikolisane gliceride, zasićene poliglikolisane C8-C10 gliceride, bilja ulja i silikonska ulja.
[0437] Mikroemulzije su naročito interesantne iz stanovišta rastvaranja leka i pojačane apsorpcije lekova. Emulzije bazirane na lipidima (obe u/v i v/u) su predložene da pojačavaju oralnu biodostupnost lekova, uključujući peptide (videti, npr., patent SAD br.6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i dr., Pharmaceutical Research, 1994,11,1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205).
Mikroemulzije daju prednosti poboljšanog rastvaranja leka, zaštite leka od enzimatične hidrolize, moguće poboljšanje apsorpcije zbog izmena u protočnosti i propustljivosti membrane uzrokovane surfaktantom i lakoću pripremanja, lakoću oralne primene u poređenju sa čvrstim oblicima doziranja, poboljšanu kliničku potentnost i smanjenu toksičnost (videti, npr., patent SAD br.6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099;
Constantinides i dr., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho i dr., J. Pharm. Sci., 1996,85,138-143). Mikroemulzije se često mogu spontano formirati kada su njihove komponente dovedene zajedno pri temperaturi okoline. Ovo može biti naročito korisno pri formulisanju termolabilnih lekova, peptida ili iRNK. Mikroemulzije su takođe delotvorne pri transdermalnoj isporuci aktivnih komponenata u obe, kozmetičkoj i farmaceutskoj primeni. Očekuje se da će sastavi mikroemulzije i formulacije prema predmetnom pronalasku olakšati povećanu sistemsku apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina iz gastrointestinalnog trakta, kao i da će poboljšati lokalni ćelijski unos iRNK i nukleinskih kiselina.
[0438] Mikroemulzije prema predmetnom pronalasku mogu sadržati dodatne komponente i aditive kao što su sorbitan monostearat (Grill 3), Labrazol i pojačivače penetracije kako bi poboljšali svojstva formulacije i kako bi poboljšali apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina prema predmetnom pronalasku. Pojačivači penetracije kod mikroemulzija prema predmetnom pronalasku mogu biti klasifikovani tako da pripadaju u jednu od pet širokih kategorija—surfaktanti, masne kiseline, žučne soli, helatni agensi i ne-helatni ne-surfaktanti (Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od ovih klasa je bila razmatrana iznad.
iii. Mikročestice
[0439] iRNK agens prema pronalasku može biti inkorporiran u česticu, npr., mikročesticu. Mikročestice mogu biti proizvedene sušenjem sprejom, ali takođe mogu biti proizvedene drugim metodama koje obuhvataju liofilizaciju, evaporaciju, sušenje na fluidnom sloju, ili kombinacijom ovih tehnika.
iv. Pojačivači penetracije
[0440] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak koristi različite pojačivače penetracije kako bi uticao na delotvornu isporuku nukleinskih kiselina, naročito iRNK, u kožu životinja. Većina lekova je prisutno u oba, jonizovanom i nejonizovanom obliku. Međutim, obično samo lipidno rastvorljivi i lipofilni lekovi lako prolaze kroz ćelijsku membranu. Otkriveno da čak i ne-lipofilni lekovi mogu proći membranu ukoliko se membrana koju je potrebno proći tretirana sa pojačivačem penetracije. Dodatno pomaganju difuzije ne-lipofilnih lekova duž ćelijske membrane, pojačivači penetracije pojačavaju propustljivost lipofilnih lekova.
[0441] Pojačivači penetracije mogu biti klasifikovani tako da pripadaju u jednu od pet širokih kategorija, tj., surfaktanti, masne kiseline, žučne soli, helatni agensi i ne-helatni nesurfaktanti (videti, npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od iznad pomenutih klasa pojačivača penetracije je opisana ispod detaljnije.
[0442] Surfaktanti (ili „površinski aktivni agensi“) su hemijski entiteti koji, kada se rastvaraju u vodenom rastvoru, smanjuju površinski napon rastvora ili granični napon između vodenog rastvora i druge tečnosti, što se ispoljava poboljšavanjem apsorpcija iRNK kroz mukozu. Dodatno žučnim solima i masnim kiselinama, ovi pojačivači penetracije obuhvataju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril etar i polioksietilen-20-cetil etar) (videti, npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); i perfluorohemijske emulzije, kao što je FC-43. Takahashi i dr., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0443] Različite masne kiseline i njihovi derivati koji se ponašaju kao pojačivači penetracije obuhvataju, na primer, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kapronsku kiselinu (ndekanoična kiselina), miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linoleičnu kiselinu, linoleničnu kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein (1-monooleoil-rakglicerol), dilaurin, kaprilnu kiselinu, arahidoničnu kiselinu, glicerol 1-monokaprat,1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, C1-20alkil estere navedenog (npr., metil izopropil i t-butil), i mono- i di-gliceride navedenog (tj., oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat, itd.) (videti, npr., Touitou, E., i dr. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; El Hariri i dr., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[0444] Fiziološko pravilo za žuč obuhvata olakšavanje disperzije i apsorpcije lipida i vitamina koji se rastvaraju u masti (videti, npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman i dr. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp.934-935). Različite prirodne žučne soli i njihovi sintetički derivati, ponašaju se kao pojačivači penetracije. Stoga, termin „žučna so“ obuhvata bilo koju komponentu žuča koja se prirodno pojavljuje kao i njeni sintetičke derivati.
Pogodne žučne soli obuhvataju, na primer, holnu kiselinu (ili njen farmaceutski prihvatljivu natrijumovu so, natrijum holat), dehidroholnu kiselinu (natrijum dehidroholat), dezoksiholnu kiselinu (natrijum dezoksiholat), gluholnu kiselinu (natrijum gluholat) gliholnu kiselinu (natrijum gliholat), glikodezoksiholnu kiselinu (natrijum glikodezoksiholat), tauroholnu kiselinu (natrijum tauroholat), taurodezoksiholnu kiselinu (natrijum taurodezoksiholat), henodezoksiholnu kiselinu (natrijum henodezoksiholat), ursodezoksiholnu kiselinu (UDCA), natrijum tauro-24,25-dihidro-fuzidat (STDHF), natrijum glikodihidrofuzidat i polioksietilen-9-lauril etar (POE) (videti, npri., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, strane 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990, 7, 1-33; Yamamoto i dr., J. Pharm. Exp. Ther.,1992, 263, 25; Yamashita i dr., J. Pharm. Sci., 1990,79,579-583).
[0445] Helatni agensi, kao što je korišćeno u vezi sa predmetnim pronalaskom, mogu biti definisani za jedinjenja koja uklanjanju jone metala iz rastvora formiranjem kompleksa sa njima, to se ispoljava poboljšanim apsorbovanjem iRNK kroz mukozu. U vezi sa njihovom upotrebom kao pojačivačima penetracije u predmetnom pronalasku, helatni agensi dodaju prednost u tome što služe kao inhibitori DNaze, kako većina karakterisanih DNK nukleaza zahteva divalentni jon metala za katalizu i stoga se inhibira sa helatnim agensom (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Pogodni helatni agensi obuhvataju ali nisu ograničeni na dinatrijum etilendiamintetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (npr., natrijum salicilat, 5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, lauret-9 i N-amino acil derivate beta-diketona (enamina) (videti npr., Katdare, A. i dr., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur i dr., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0446] Kao što je ovde korišćeno, jedinjenja ne-helatnih ne-surfaktantnih poboljšivača penetracije mogu biti definisana kao jedinjenja koja pokazuju nedovoljnu aktivnost kao helatni agensi ili kao surfaktanti ali bez obzira na to poboljšavaju apsorpciju iRNK kroz prehrambenu mukozu (videti, npr., Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990, 7, 1-33). Ova klasa pojačivača penetracije obuhvata, na primer, nezasićene ciklične uree, 1-alkil- i 1-alkenilazaciklo-alkanon derivate (Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92); i ne-steroidne anti-inflamatorne agense kao što su diklofenak natrijum, indometacin i fenilbutazon (Yamashita i dr., J. Pharm.
Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0447] Agensi koji poboljšavaju unos iRNK na ćelijskom nivou takođe mogu biti dodati i drugim sastavima prema predmetnom pronalasku. Na primer, katjonski lipidi, kao što je lipofektin (Junichi et al, U.S. Pat. No.5,705,188), derivati katjonskog glicerola i polikatnojski molekuli kao što je polilizin (Lollo i dr., PCT prijava WO 97/30731), su takođe poznati da poboljšavaju ćelijski unos dsRNK. Primeri komercijalno dostupnih transfekcijskih reagenasa obuhvataju, na primer, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 transfekcioni reagens (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), DOTAP Lipozomni transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Switzerland), DOSPER Lipozomni transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Switzerland), ili Fugen (Grenzacherstrasse, Switzerland), Transfectam® Reagent (Promega; Madison, WI), TransFast™ transfekcioni reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-20 reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-50 reagens (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France), TransPass<a>D1 transfekcioni reagens (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, USA), PerFektin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), NeuroPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 2 transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), Citofektin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), BaculoPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), TroganPORTER™ transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International;
Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), ili HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA), između ostalog.
[0448] Drugi agensi se mogu koristiti kako bi poboljšali penetraciju davane nukleinske kiseline, uključujući glikole kao što je etilen glikol i propilen glikol pirole kao što je 2-pirol, azone i terpene kao što je limonen i menton.
v. Nosači
[0449] Određeni sastavi prema predmetnom pronalasku takođe obuhvataju jedinjenja nosača u formulaciji. Kao što je ovde korišćeno, „jedinjenje nosača“ ili „nosač“ može da se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen analog, koji je intertan (tj., ne poseduje biološku aktivnost sam po sebi) ali je prepoznat od strane nukleinske kiseline in vivo procesima koji smanjuju biodostupnost nukleinske kiseline koja ima biološku aktivnost putem, na primer, degradiranja biološki aktivne nukleinske kiseline ili promovisanjem njenog uklanjanja iz cirkulacije.
Zajedno davanje nukleinske kiseline i jedinjenja nosača, obično sa viškom kasnije supstance, može se ispoljiti u suštinskom smanjivanju količine nukleinske kiseline dobijene u jetri, bubregu ili drugim ekstracirkulacionim rezervoarima, verovatno zbog konkurencije između jedinjenja nosača i nukleinske kiseline za uobičajeni receptor. Na primer, dobijanje delimične fosforotioat dsRNK u hepatičnom tkivu može biti smanjeno kada se zajedno daje sa plinosiničnom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidičnom kiselinom ili 4-acetamido-4’izotiocijano-stilben-2,2’disulfoničnom kiselinom (Miyao i dr., DsRNK Res. Dev., 1995, 5,115-121; Takakura i dr., DsRNK & Nucl. Acid Drug Dev., 1996,6,177-183.
vi. Ekscipijensi
[0450] Za razliku od jedinjenja nosača, „farmaceutski nosač“ ili „ekscipijens“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, suspendujući agens ili bilo koje drugo farmakološki inertno sredstvo za isporuku jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijens može biti tečan ili čvrst i izabran je, sa planiranim načinom davanja u vidu, kako bi se obezbedio željeni sadržaj, konzistencija itd., u kombinaciji sa nukleinskom kiselinom i ostalim komponentama datog farmaceutskog sastava. Tipični farmaceutski nosači obuhvataju, bez ograničenja, sredstva za vezivanje (npr., preželatinizovani skrob kukuruza, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilcelulozu itd.); sredstva za ispunu (npr. laktoza i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati ili kalcijum hidrogenfosfat itd.); lubrikante (npr., magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenizovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilen glikoli, natrijum benzoat, natrijum acetat itd.); dezintegrante (npr., skrob, natrijum skrob glikolat, itd.); i sredstva za vlaženje (npr., natrijum lauril sulfat itd.).
[0451] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralno davanje koje ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama takođe se mogu koristiti za formulaciju sastava prema predmetnom pronalasku. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali se ne ograničavaju na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silikatnu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0452] Formulacije za lokalnu primenu nukleinskih kiselina mogu obuhvatati sterilne i nesterilne vodene rastvore, ne-vodene rastvore u zajedničkim rastvaračima kao što su alkoholi ili rastvori nukleinskih kiselina u čvrstim ili tečnim bazama ulja. Rastvori mogu takođe sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Mogu se koristiti farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za ne-parenteralnu primenu, koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama.
[0453] Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, vodu, rastvore soli, alkohol, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
vii. Druge komponente
[0454] Sastavi prema predmetnom pronalasku mogu dodatno da sadrže druge dodatne komponente koje se konvencionalno nalaze u farmaceutskim sastavima, pri njihovim nivoima ustanovljenim u tehnici. Tako, na primer, sastavi mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruriti, astringenti, lokalni anestetici ili antiinflamatorni agensi ili mogu sadržati dodatne materijale koji su korisni u fizičkom formulisanju različitih oblika doziranja sastava prema predmetnom pronalasku, kao što su boje, aromatični agensi, konzervansi, antioksidansi, sredstva za raspršivanje, zgušnjivači i stabilizatori. Međutim, takvi materijali, kada se dodaju, ne bi trebalo da se preterano mešaju u biološke aktivnosti komponenata sastava prema predmetnom pronalasku. Formulacije se mogu sterilisati i, ako je poželjno, pomešati sa pomoćnim agensima, npr., lubrikantima, konzervansima, stabilizatorima, agensima za vlaženje, emulgatorima, solima za uticaj na osmotski pritisak, puferima, bojama, aromama i/ili aromatičnim supstancama i slično što ne utiče štetno sa nukleinskom kiselinom formulacije.
[0455] Vodene suspenzije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može sadržati stabilizatore.
[0456] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi koji se nalaze u pronalasku obuhvataju (a) jedno ili više iRNK jedinjenja i (b) jedan ili više agenasa koji funkcionišu sa ne-RNKi mehanizmom i koji su od koristi pri tretiranju hemolitičkog poremećaja. Primeri takvih agenasa su, bez ograničenja, anti-inflamatorni agensi, agensi anti-steatoze, anti-virusni i/ili anti-fibrozni agensi. Dodatno, druge supstance koje se najčešće koriste da zaštite jetru, kao što je silimarin, se takođe mogu koristiti u konjugaciji sa ovde opisanim iRNK. Drugi agensi koji su od koristi pri tretiranju bolesti jetre obuhvataju telbivudin, entekavir i inhibitore proteaze kao što su telaprevir i drugi obelodanjeni, na primer, u Tung i dr., objavi patenta SAD br.2005/0148548, 2004/0167116, i 2003/0144217; i in Hale i dr., objavi patenta SAD br.2004/0127488.
[0457] Toksičnost i terapeutska delotvornost takvih jedinjenja može biti određena standardnim farmaceutskih procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50 (doza koja izaziva smrt kod 50% populacije) i ED50 (doza koja je terapeutski delotvorna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapeutskih dejstava je terapeutski indeks i može biti izražen kao odnos LD50/ED50.
Jedinjenja koja ispoljavaju velike terapeutske indekse su poželjna
[0458] Podaci dobijeni iz testova ćelijskih kultura i ispitivanja životinja mogu biti korišćeni pri formulisanju opsega doza za upotrebu kod ljudi. Doziranje sastava koje se nalazi ovde u pronalasku generalno pada u opseg za cirkulaciju koncentracija što obuhvata ED50 sa malo ili bez toksičnosti uopšte. Doziranje može varirati u ovom opsegu u zavisnosti od oblika doziranja koji se koristi i režima davanja koji se upotrebljava. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u metodama koje se nalaze u pronalasku, terapeutski delotvorna doza može biti određena inicijalno iz testova ćelijske kulture. Doza može biti formulisana u modelu životinja kako bi se ostvarilo opseg koncentracije cirkulišuće plazme jedinjenja ili, kada je prikladno, polipeptidnog proizvoda ciljane sekvence (npr., postizanjem smanjene koncentracije polipeptida) koja obuhvata IC50 (tj., koncentracija test jedinjenja koje postiže polumaksimalnu inhibiciju simptoma) kao što je određeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu se koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivo u plazi mogu biti mereni, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0459] Dodatno njihovoj primeni, kao što je razmatrano iznad, iRNK koje se nalaze u pronalasku mogu biti date u kombinaciji sa drugim poznatim agensima koji su delotvorni pri tretiranju patoloških procesa posredovanih sa C5 ekspresijom. U bilo kom slučaju, lekar koji vrši davanje leka može da prilagodi količinu i vremena davanja iRNK na osnovu rezultata osmotrenih upotrebom standardnih merenja delotvornosti poznatih u tehnici ili kao što je ovde opisano.
VI. Metode za inhibiranje ekspresije C5
[0460] Predmetni pronalazak daje metode za inhibiranje ekspresije C5 u ćeliji. Metode obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa RNKi agensom, npr., dvolančanim RNKi agensom, u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije C5 u ćeliji, time inhibirajući ekspresiju C5 u ćeliji.
[0461] Dovođenje ćelije u kontakt sa dvolančanim RNKi agensom može biti izvršeno in vitro ili in vivo. Dovođenje ćelije in vivo u kontakt sa RNKi agensom obuhvata dovođenje ćelije ili grupe ćelija u subjektu, npr., ljudskom subjektu, u kontakt sa RNKi agensom.
Kombinacije in vitro i in vivo metoda dovođenja u kontakt takođe su moguće. Dovođenje u kontakt može biti direktno ili indirektno, kao što je razmatrano iznad. Osim toga, dovođenje ćelije u kontakt može biti ostvareno putem ciljnog liganda, uključujući bilo koji ligand koji je opisan ovde ili je poznat u tehnici. U poželjnom otelotvorenju, ciljani ligand je ugljovodonična grupa, npr., GalNAc3ligand, ili bilo koji drugi ligand koji navodi RNKi agens do željenog mesta, npr., jetre subjekta.
[0462] Termin „inhibiranje“, kao što se ovde koristi, koristi se naizmenično sa „smanjivanjem“, „utišavanjem“, „regulacijom na dole“, i drugim sličnim terminima, i podrazumeva bilo koji nivo inhibicije.
[0463] Fraza „inhibiranje ekspresije C5“ namenjena je da se odnosi na inhibiranje ekspresije bilo kog C5 gena (kao što su, npr., C5 gen miševa, C5 gen pacova, C5 gen majmuna ili C5 gen čoveka) kao i varijanti mutacija C5 gena. Stoga, C5 gen može biti C5 gen divljeg tipa, mutant C5 gen ili transgeni C5 gen u kontekstu genetski manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0464] „Inhibiranje ekspresije C5 gena“ obuhvata bilo koji nivo inhibiranja C5 gena, npr., barem pri delimičnoj supresiji ekspresije C5 gena. Ekspresija C5 gena može biti ispitana na osnovu nivoa, ili promene u nivou, ili bilo koje varijable povezane sa ekspresijom C5 gena, npr., mRNK nivo C5, nivo proteina C5, ili na primer CH50aktivnost kao mera ukupnog hemolitičkog komplementa, AH50za merenje hemolitičke aktivnosti alternativnog puta komplementa, i/ili nivoi laktat dehidrogenaze (LDH) kao mera intravaskularne hemolize, i/ili nivoi hemoglobina. Nivoi C5a, C5b i rastvorljivog kompleksa C5b-9 mogu takođe biti mereni radi procenjivanja ekspresije C5. Ovaj nivo može biti procenjen na pojedinačnoj ćeliji ili na grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak uzet iz subjekta.
[0465] Inhibicija može biti procenjena smanjenjem u apsolutnim ili relativnim nivoima jedne ili više varijabli koje su povezane sa ekspresijom C5 u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koji tip kontrolnog nivoa koji je upotrebljiv u tehnici, npr., početni nivo pre davanja doze, ili nivo određen u sličnom subjektu, ćeliji ili uzorku koji nije tretiran ili je tretiran sa kontrolom (kao što je, npr., kontrola samo sa puferom ili kontrola sa neaktivnim agensom).
[0466] U nekim otelotvorenjima metoda prema pronalasku ekspresija C5 gena je inhibirana barem za oko 5%, barem za oko 10%, barem za oko 15%, barem za oko 20%, barem za oko 25%, barem za oko 30%, barem za oko 35%, barem za oko 40%, barem za oko 45%, barem za oko 50%, barem za oko 55%, barem za oko 60%, barem za oko 65%, barem za oko 70%, barem za oko 75%, barem za oko 80%, barem za oko 85%, barem za oko 90%, barem za oko 91%, barem za oko 92%, barem za oko 93%, barem za oko 94%. barem za oko 95%, barem za oko 96%, barem za oko 97%, barem za oko 98%, ili barem za oko 99%.
[0467] Inhibicija ekspresije C5 gena može se ispoljiti smanjenjem količine mRNK čija je ekspresija izvršena od strane prve ćelije ili grupe ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku uzetom iz subjekta) kod kojih je transkribovan C5 gen i koji je tretiran (npr., dovođenjem ćelije ili ćelija u kontakt sa RNKi agensom prema pronalasku, ili davanjem RNKi agensa prema pronalasku subjektu u kome su ili su bile prisutne takve ćelije) tako da je ekspresija C5 gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija suštinski identičnim sa prvom ćelijom ili grupom ćelija ali koje nisu bile tako tretirane (kontrolne ćelije). U poželjnom otelotvorenju, inhibicija se procenjuje ekspresijom nivoa mRNK u tretiranim ćelijama kao procenat nivoa mRNK u kontroli, upotrebom sledeće formule:
[0468] Alternativno, inhibicija ekspresije C5 gena može biti procenjena u vidu smanjenja parametara koji su funkcionalno povezani za ekspresiju C5 gena, npr., ekspresija C5 proteina, ekspresija hepcidin gena ili proteina, ili nivoi gvožđa u tkivu ili serumu. Utišavanje C5 gena može biti određeno u bilo kojoj ćeliji koja vrši ekspresiju C5 gena, ili konstitutivno ili putem izmenjivanja genoma, i putem bilo kog testa poznatog u tehnici. Jetra je glavno mesto ekspresije C5. Druga značajna mesta ekspresije obuhvataju jetru i matericu.
[0469] Inhibicija ekspresije C5 proteina može se ispoljiti smanjivanjem nivoa C5 proteina čiju ekspresiju viši ćelija ili grupa ćelija (npr., nivo ekspresije proteina u uzorku uzetom iz subjekta). Kao što je objašnjeno iznad za procenjivanje supresije mRNK, nivoi inhibicije ekspresije proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija mogu biti slično izraženi kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija.
[0470] Kontrolna ćelija ili grupa ćelija koja se može koristiti za procenjivanje inhibicije ekspresije C5 gena obuhvata ćeliju ili grupu ćelija koja još uvek nije dovedena u kontakt sa RNKi agensom prema pronalasku. Na primer, kontrolna ćelija ili grupa ćelija mogu biti izvedene iz pojedinačnog subjekta (npr., ljudskog ili životinjskoj subjekta) pre tretiranja subjekta sa RNKi agensom.
[0471] Nivoi ekspresije C5 mRNK od strane ćelija ili grupe ćelija može biti određen upotrebom bilo koje poznate metode u tehnici za određivanje mRNK ekspresije. U jednom otelotvorenju, nivo ekspresije C5 u uzorku određen je detekcijom transkribovanog polinukleotida ili njegovog dela, npr., mRNK C5 gena. RNK može biti uzeta iz ćelije upotrebom tehnika ekstrakcije RNK koje obuhvataju, na primer, upotrebu kiselog ekstrakta fenol/guanidin izotiocinata (RNAzol B; Biogenesis), RNeasy kompleta za pripremanje RNK (Qiagen) ili PAXgen (PreAnalytix, Switzerland). Obični formati testova koji upotrebljavaju hibridizaciju kiselina obuhvataju nuklearne probne testove, RT-PCR, test zaštite RNaze (Melton i dr., Nuc. Acids Res.12:7035), Northern blot, in situ hibridizacija, i analiza mikronizova.
[0472] U jednom otelotvorenju, nivo ekspresije C5 određen je upotrebom sonde nukleinske kiseline. Termin „sonda“, kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koji molekul koji je u stanju da se selektivno vezuje za određeni C5. Sonde mogu biti sintetisane od strane stručne osobe, ili izvedene iz odgovarajućih bioloških preparata. Sonde mogu biti posebno dizajnirane da budu označene. Primeri molekula koji mogu biti upotrebljivi kao sonde obuhvataju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteine, antitela i organske molekule.
[0473] Izolovane mRNK se mogu koristiti pri test hibridizacije ili amplifikacije koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Southern ili Northern analize, analize lančane reakcije pomimeraze (PCR) i nizove sondi. Jedan metod za određivanje mRNK nivoa obuhvata dovođenje izolovane mRNK u kontakt sa molekulom nukleinske kiseline (sonde) koji može da hibridizuju C5 mRNK. U jednom otelotvorenju, mRNK je onesposobljena na čvrstoj podlozi i dovedena u kontakt sa sondom, na primer, postavljanjem izolovane mRNK na agarozni gel i prenošenjem mRNK iz gela u membranu, kao što je nitroceluloza. U alternativnom otelotvorenju, sonde su onesposobljene na čvrstoj podlozi i mRNK se dovodi u kontakt sa sondama, na primer, u nizu Affymetrix genskog čipa. Stručna osoba može lako prilagoditi poznate metode detekcije mRNK za upotrebu u određivanju nivoa mRNK C5.
[0474] Alternativna metoda za određivanje nivoa ekspresije C5 u uzorku obuhvata proces amplifikacije nukleinske kiseline i/ili reverznu transkriptazu (za pripremanje cDNK) ili na primer mRNK u uzorku, npr., sa RT-PCR (eksperimentalno otelotvorenje izneto u Mullis, 1987, U.S. Pat. No.4,683,202), reakcijom lanca ligaza (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replikacijom samoodržive sekvence (Guatelli i dr. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripcionim sistemom amplifikacije (Kwoh i dr. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replikazom (Lizardi i dr. (1988) Bio/Technology 6:1197), replikacijom valjanog ciklusa (Lizardi i dr., U.S. Pat. No.
5,854,033) ili bilo kojom metodom amplifikacije nukleinske kiseline, što je praćeno detekcijom pojačanih molekula upotrebom tehnika koje su poznate osobi koja je stručna u ovoj oblasti. Ove detekcione šeme su naročito koriste za određivanje molekula nukleinske kiseline ukoliko su takvi molekuli prisutni u veoma malim brojevima. U posebnim aspektima pronalaska, nivoi ekspresije C5 su određeni kvantitativnim fluorogenim RT-PCR (tj., TaqMan™ Sistem).
[0475] Ekspresija nivoa C5 mRNK može biti praćena upotrebom membranskog blota (ka što je korišćeno u analizi hibridizacije, kao što su Northern, Southern, dot i slično), ili mikrootvora, cevi za uzorke, gelova, mehurova ili vlakana (ili bilo koja čvrsta podloga koja sadrži vezanu nukleinsku kiselinu). Videti patent SAD br.5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 i 5,445,934.
[0476] Određivanje nivoa ekspresije C5 takođe može obuhvatati korišćenje sondi nukleinske kiseline u rastvoru.
[0477] U poželjnim otelotvorenjima, nivo mRNK ekspresije je procenjen upotrebom testa granate DNK (bDNK) ili trenutnog PCR (qPCR). Upotreba ovih metoda je opisana i data primerima u Primerima koji su ovde izloženi.
[0478] Nivo ekspresije C5 proteina može biti određen upotrebom bilo koje metode poznate u tehnici za određivanje nivoa proteina. Takve metode obuhvataju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), hromatografiju na tankom sloju (TLC), hiperdifuzionu hromatografiju, reakcije tečnog ili gelskog percipitina, apsorpcionu spektroskopiju, kolometrijke testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imunodifuziju (pojedinačnu ili dvostruku), imunoelektroforezu, Western blot, radioimunotest (RIA), testove imunosorbenta povezane sa enzimom (ELISA), imunofluorestence testove, testove elektrohemiluminescencije i slično.
[0479] Termin „uzorak“ kao što se ovde koristi odnosi se na skup sličnih fluida, ćelija ili tkiva izolovanih iz subjekta, kao i fluide, ćelije i tkiva prisutna u subjektu. Primeri bioloških tečnosti obuhvataju krv, serum i serozalne tečnosti, plazmu, limfu, urin, cerebrospinalnu tečnost, slavu, okularne tečnosti i slično. Uzorci tkiva mogu obuhvatati uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih oblasti. Na primer, uzorci mogu biti uzeti iz određenih organa, delova organa ili tečnosti ili ćelija u tim organima. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti uzeti iz jetre (npr., cela jetra ili određeni segmenti jetre ili određeni tip ćelije u jetri, kao što su hepatociti). U poželjnim otelotvorenjima, „uzorak uzet iz subjekta“ odnosi se na uzetu krv ili plazmu iz subjekta. U daljim otelotvorenjima, „uzorak uzet iz subjekta“ odnosi se na tkivo jetre uzeto iz subjekta.
[0480] U nekim otelotvorenjima metoda prema pronalasku, RNKi agens se daje subjektu tako da se RNKi agens ispostavlja na određeno mesto u subjektu. Inhibicija ekspresije C5 može biti procenjena upotrebom merenja nivoa ili promene u nivou C5 mRNK ili C5 proteina u uzorku uzetom iz tečnosti ili tkiva sa određenog mesta iz subjekta. U poželjnim otelotvorenjima, mesto je jetra. Mesto može biti odeljak ili podgrupa ćelija bilo kojeg od prethodno navedenih mesta. Mesto takođe mogu biti ćelije koje vrše ekspresiju određenog tipa receptora.
[0481] Fraza „dovođenje ćelije u kontakt sa RNKi agensom“, kao što je dsRNK, kao što je ovde korišćeno, obuhvata dovođenje ćelije u kontakt na bilo koji mogući način. Dovođenje ćelije u kontakt sa RNKi agensom obuhvata dovođenje ćelije u kontakt in vitro sa iRNK ili dovođenje ćelije u kontakt in vivo sa iRNK. Dovođenje u kontakt može biti izvršeno direktno ili indirektno. Stoga, na primer, RNKi agens može biti doveden u fizički kontakt sa ćelijom pojedinačnim izvršenjem metode, ili alternativno, RNKi agens može biti doveden u situaciju koja će dozvoliti ili izazvati naknadno dovođenje u kontakt sa ćelijom.
[0482] Dovođenje ćelije u kontakt in vitro može biti izvršeno, na primer, inkubiranjem ćelije sa RNKi agensom. Dovođenje ćelije u kontakt in vivo može biti izvršeno, na primer, injektiranjem RNKi agensa u ili blizu tkiva gde se nalazi ćelija, ili injektiranjem RNKi agensa u drugu oblasti, npr., krvotok ili subkutani prostor, tako da će agens naknadno dostići u tkivo gde se nalazi ćelija koju treba dovesti u kontakt. Na primer, RNKi agens može sadržati i/ili biti spojen za ligand, npr., GalNAc3, koji navodi RNKi agens do željenog mesta, npr., jetre. Kombinacija in vitro i in vivo metoda dovođenja u kontakt je takođe moguća. Na primer, ćelija može biti dovedena u kontakt in vitro sa RNKi agensom a naknadno preneta u subjekat.
[0483] U jednom otelotvorenju, dovođenje ćelije u kontakt sa iRNK obuhvata „uvođenje“ ili „ispostavljanje iRNK u ćeliju“ olakšavanjem ili uticanjem na unos ili apsorpciju u ćeliju. Apsorpcija ili unos iRNK može se odigrati bez pomoći difuzivnim ili aktivnim ćelijskim procesima, ili sa pomoćnim agensima ili uređajima. Uvođenje iRNK u ćeliju može biti in vitro i/ili in vivo. Na primer, za in vivo uvođenje, iRNK može biti injektirana u tkivo ili data sistemski. In vivo isporuka može biti izvršena sa sistemom isporuke beta-glukan, kao što je opisano u patentu SAD br.5,032,401 i 5,607,677, i objavi SAD br.2005/0281781.
[0484] In vitro uvođenje u ćeliju obuhvata metode poznate u tehnici kao što su elektroportacija i lipofekcija. Dalji pristupi su ovde opisani ispod i/ili su poznati u tehnici.
VII. Metode za tretiranje ili sprečavanje bolesti povezane sa komponentom komplementa C5
[0485] Predmetni pronalazak takođe daje terapeutske i profilaktičke metode koje obuhvataju davanje subjektu koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS, iRNK agens, farmaceutski sastav koji sadrži iRNK agens ili vektor koji sadrži RNK prema pronalasku. U nekim aspektima metode dalje sadrže davanje subjektu dodatnog terapeutskog agensa, kao što je komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigenvezujući fragment (npr., ekulizumab).
[0486] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode tretiranja subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5, npr., bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS. Metode za tretiranje (i njihova upotreba) obuhvataju davanje subjektu, npr., čoveku, terapeutski delotvornu količinu iRNK agensa koji cilja C5 gen ili farmaceutski sastav koji sadrži iRNK agens koji cilja C5 gen, time tretirajući subjekat koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5.
[0487] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje metode za tretiranje subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5, npr., bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS, koje obuhvataju davanje subjektu, npr., čoveku, terapeutski delotvornu količinu iRNK agensa koji cilja C5 gen ili farmaceutski sastav koji sadrži iRNK agens koji cilja C5 gen, i dodatni terapeutski agens kao što je komponenta anti-komplementa C5 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), time tretirajući subjekat koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5.
[0488] U jednom aspektu, obelodanjivanje daje metode za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5, npr., bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS. Metode obuhvataju davanje subjektu profilaktički delotvorniju količinu iRNK agensa, npr., dsRNK ili vektor prema pronalasku, time sprečavajući barem jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5. Na primer, metode za sprečavanje hemolize kod subjekata koji imaju poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5, npr., bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS.
[0489] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metode za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5, npr., bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS. Metode obuhvataju davanje subjektu profilaktički delotvornu količinu iRNK agensa, npr., dsRNK ili vektor prema pronalasku, i dodatni terapeutski agens, kao što je komponenta antikomplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), time sprečavajući barem jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5.
[0490] „Terapeutski delotvorna količina“, kao što se ovde koristi, namenjeno je da obuhvati količinu RNKi agensa ili komponente anti-komplementa C5 antitela, ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta (npr., ekulizumab), koja, kada se daje subjektu koji ima bolest povezanu sa komplimentom komponenta, bude dovoljna za delotvorno tretiranje bolesti (npr., smanjujući, poboljšavajući ili održavajući postojeću bolest ili jedan ili više simptoma bolesti). „Terapeutski delotvorna količina“ može se menjati u zavisnosti od RNKi agensa ili antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, načina kako se agens primenjuje, bolesti i njene težine i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, tipa prethodnih i trenutnih tretiranja, ukoliko postoje, i drugih pojedinačnih karakteristika subjekta koji bi trebalo da se tretira.
[0491] „Profilaktički delotvorna količina“, kao što je ovde korišćeno, namenjena je da obuhvati količinu iRNK agensa ili komponente anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), koja, kada se daje subjektu koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ali još uvek (ili trenutno) nema ili ne pokazuje simptome bolesti, i/ili subjektu koji je pri riziku od razvijanja bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, npr., subjekat koji ima kalem i/ili transplantat, npr., osetljiv ili alogeni recipijent, subjekat koji ima sepsu, i/ili subjekat koji ima infarkt miokarda, je dovoljna da spreči ili poboljša bolest ili jedan ili više simptoma bolesti. Poboljšavanje bolesti obuhvata usporavanje toka bolesti ili smanjivanje jačine bolesti koja se razbija kasnije.
„Profilaktički delotvorna količina“ može se menjati u zavisnosti od iRNK agensa ili komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, načina kako se komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuju, stepena rizika bolesti, i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetičkog sklopa, tipa prethodnog ili trenutnog tretiranja, ukoliko postoji, i drugih pojedinačnih karakteristika pacijenta koji bi trebalo da se tretira.
[0492] „Terapeutski delotvorna količina“ ili „profilaktički delotvorna količina“ takođe obuhvataju količinu RNKi agensa ili komponente anti-komplementa C5 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta (npr., ekulizumab), koja proizvodnji neko željeno lokalno ili sistemsko dejstvo pri razumnom odnosu koristi/rizika primenjivom za bilo koje tretiranje.
iRNK agensi koji se koriste u ovde obelodanjenim metodama mogu biti dati u dovoljnoj količini za proizvodnju razumnog odnosa koristi/rizika primenjivom za takvo tretiranje.
[0493] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje upotrebu terapeutski delotvorne količine iRNK agensa prema pronalasku za tretiranje subjekta, npr., subjekta koji bi imao korist od smanjivanja i/ili inhibicije C5 gena.
[0494] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje upotrebu terapeutski delotvorne količine iRNK agensa prema pronalasku i dodatnog terapeutskog agensa, kao što je komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), za tretiranje subjekta, npr., subjekta koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5.
[0495] U još jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje upotrebu iRNK agensa, npr., dsRNK, ciljanog C5 gena prema pronalasku ili farmaceutskog sastava koji sadrži iRNK agens koji cilja C5 gen u proizvodnji lekova za tretiranje subjekta, npr., subjekta koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, kao što je subjekat koji ima bolest koja bi imala korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, npr., bolest povezana sa komponentom komplementa C5, PNH ili aHUS.
[0496] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje daje upotrebu iRNK agensa, npr., dsRNK, ciljanog C5 gena prema pronalasku ili farmaceutskog sastava koji sadrži iRNK agens koji cilja C5 gen u proizvodnji lekova za upotrebu u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensom, kao što je komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), za tretiranje subjekta, npr., subjekta koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, npr., bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS.
[0497] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje upotrebu iRNK, npr., dsRNK, prema pronalasku za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ili inhibiranja ekspresije C5, kao što je bolest povezana sa komponentom komplementa C5, npr., PNH.1 ili aHUS.
[0498] U još jednom aspektu, obelodanjivanje daje upotrebu iRNK agensa, npr., dsRNK, prema pronalasku, i dodatnih terapeutskih agenasa, kao što je komponenta anti-komplementa C5, ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji boluje od poremećaja koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, kao što je bolest povezana sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS.
[0499] U daljem aspektu, predmetni pronalazak daje upotrebu iRNK agensa prema pronalasku u proizvodnji lekova za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji boluje od poremećaja koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, kao što je bolest povezana sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS.
[0500] U daljem aspektu, predmetni pronalazak daje upotrebu iRNK agensa prema pronalasku u proizvodnju lekova za upotrebu u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensima, kao što je komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., ekulizumab), za sprečavanje barem jednog simptoma kod subjekta koji boluje od poremećaja koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, kao što je bolest povezana sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS.
[0501] U jednom aspektu, iRNK agensi koji ciljaju C5 daju se subjektu koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 tako da se nivoi C5, npr., u ćeliji, tkivu, krvi, urinu ili drugom tkivu ili tečnosti subjekta smanje za barem oko 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili barem oko 99% ili više, nakon što dodatni terapeutik (kao što je opisano ispod) dat subjektu.
[0502] Dodatni terapeutik može biti komponenta anti-komplementa C5 antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment ili derivat. U jednom otelotvorenju, komponenta antikomplementa C5 antitela je ekulizumab (SOLIRIS<®>), ili njegov antigen-vezujući fragment ili derivat. Ekulizumab je humanizovani monoklonalni IgG2/4, kapa antitelo lakog lanca koji specifično vezuje komponentu komplementa C5 sa visokim afinitetom i inhibira cepanje od C5 do C5a i C5b, time inhibirajući stvaranje terminalnog kompleksa komplementa C5b-9. Ekulizumab je opisan u patentu SAD br.6,355,245.
[0503] Ovde obelodanjene metode koje sadrže davanje iRNK agensa prema pronalasku i ekulizumab subjektu dalje mogu sadržati davanje meningokokne vakcine subjektu.
[0504] Dodatni terapeutik, npr., ekulizumab i/ili menigokokna vakcina, mogu biti dati subjektu u isto vreme kao i iRNK agens koji cilja C5 ili u različito vreme.
[0505] Štaviše, dodatni terapeutik, npr., ekulizumab, može biti dat subjektu u istoj formulaciji kao iRNK agens koji cilja C5 ili u različitoj formulaciji u odnosu na iRNK koja cilja C5.
[0506] Rasporedi doziranja za ekulizumab su opisani, na primer, u opisu proizvoda za ekulizumab (SOLIRIS<®>) i u patentnoj prijavi SAD br.2012/0225056.
[0507] U primernim metodama prema pronalasku za tretiranje bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, npr., PNH ili aHUS, iRNK agens koji cilja C5 se daje (npr., subkutano) subjektu, prvo, tako da su nivoi C5 kod subjekta smanjeni (npr., za barem oko 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili za barem oko 99% ili više) i zatim se ekulizumab daje pri dozama manjim od onih opisanih u opisu proizvoda za SOLIRIS<®>. Na primer, ekulizumab može biti dat subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg u toku 4 nedelje što je praćeno sa petom dozom oko nedelju dana kasnije manjoj od oko 900 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 900 mg svake dve nedelje nakon toga. Ekulizumab se takođe može davati nedeljno pri dozi manjoj od oko 900 mg u toku 4 nedelje što je praćeno petom dozom oko nedelju dana kasnije od oko 1200 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 1200 mg svake dve nedelje nakon toga. Ukoliko subjekat ima manje od 18 godina starosti, ekulizumab se može davati subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 900 mg u toku 4 nedelje što je praćeno petom dozom oko nedelju dana kasnije manjom od oko 1200 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 1200 mg svake dve nedelje kasnije; ili ukoliko subjekat ima manje od 18 godina starosti, ekulizumab se može davati subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg u toku 2 nedelje što je praćeno trećom dozom oko nedelju dana kasnije manjom od oko 900 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 900 mg svake dve nedelje kasnije; ili ukoliko subjekat ima manje od 18 godina starosti, ekulizumab se može davati subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg u toku 2 nedelje što je praćeno trećom dozom oko nedelju dana kasnije manjom od oko 600 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 600 mg svake dve nedelje kasnije; ili ukoliko subjekat ima manje od 18 godina starosti, ekulizumab se može davati subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 600 mg u toku 1 nedelje što je praćeno drugom dozom oko nedelju dana kasnije manjom od oko 300 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 300 mg svake dve nedelje kasnije; ili ukoliko subjekat ima manje od 18 godina starosti, ekulizumab se može davati subjektu nedeljno pri dozi manjoj od oko 300 mg u toku 1 nedelje što je praćeno drugom dozom oko nedelju dana kasnije manjom od oko 300 mg, što je praćeno sa dozom manjom od oko 300 mg svake dve nedelje kasnije. Ukoliko subjekat prima plamaferezu ili razmenu plazme, ekulizumab se može davati subjekti pri dozi manjoj od oko 300 mg (npr., ukoliko je najskorija doza bila oko 300 mg) ili manjoj od oko 600 mg (npr., ukoliko je najskorija doza bila oko 600 mg). Ukoliko subjekat prima infuziju plazme, ekulizumab se može davati subjektu pri dozi manjoj od oko 300 mg (npr., ukoliko je najskorija doza ekulizumaba bila oko 300 mg ili više). Niže doze ekulizumaba omogućavaju ili subkutanu ili intravenoznu primenu ekulizumaba.
[0508] U kombinacionoj terapiji koja sadrži ekulizumab, ekulizumab se može davati subjektu, npr., subkutano, pri dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg, ili oko 5 mg/kg do oko 10 mg/kg, ili oko 0.5 mg/kg do oko 15 mg/kg. Na primer ekulizumab može biti dat subjektu, npr., subkutano, pri dozi od 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14 mg/kg, 14.5 mg/kg, ili 15 mg/kg.
[0509] Metode i upotrebe obelodanjene ovde obuhvataju davanje sastava ovde opisanog tako da se smanjuje ekspresija ciljanog C5 gena, u trajanju od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, ili oko 80 sati. U jednom otelotvorenju, ekspresija ciljanog C5 gena je smanjena za produženi vremenski period, npr., barem dva, tri, četiri, pet, šest, sedam dana ili više, npr., oko jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje ili oko četiri nedelje ili duže.
[0510] Davanje dsRNK prema metodama u upotrebama ovde može se ispoljiti u smanjenju jačine, znakova, simptoma i/ili markera takvih boleti ili poremećaja kod pacijenta koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5. „Smanjenje“ u ovom kontekstu označava statistički značajno smanjenje u takvom nivou. Smanjenje može biti, na primer, barem oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili oko 100%.
[0511] Delotvornost tretiranja ili sprečavanja bolesti može biti procenjena, na primer, merenjem progresa bolesti, remisije bolesti, jačine simptoma, smanjenja bola, kvaliteta života, doze leka potrebne da održi delotvorno tretiranje, nivo markera bolesti ili bilo koji drugi merljivi parametar koji je pogodan za datu bolest koja se tretira ili cilja za sprečavanje. U okviru je sposobnosti stručne osobe da nadgleda delotvornost tretiranja ili sprečavanja merenjem jednog od parametara, ili bilo koje kombinacije parametara. Na primer, delotvornost tretiranja hemolitičkog poremećaja može biti procenjena, na primer, periodičnim praćenjem LDH i CH50nivoa. Upoređivanje sa kasnijih očitavanja sa početnim očitavanjima daje lekaru indikaciju o tome da li je tretiranje delotvorno. U okviru je sposobnosti stručne osobe da nadgleda delotvornost tretiranja ili sprečavanja merenjem jednog od parametara, ili bilo koje kombinacije parametara. U vezi sa davanjem iRNK koja cilja C5 ili njenog farmaceutskog sastava, „delotvornog protiv“ bolesti povezane sa komponentom komplementa C5, pokazalo se da se davanje na odgovarajući način ispoljilo u korisnom dejstvu za barem statistički značajan deo pacijenata, u vidu poboljšanja simptoma, leka, smanjenja bolesti, produžetka života, poboljšanje kvaliteta života ili u drugim dejstvima generalno prepoznatim kao pozitivnim od strane doktora upoznatog sa tretiranjem bolesti povezane sa komponentom komplementa C5 i povezanim slučajevima.
[0512] Tretiranje ili preventivno dejstvo je očigledno kada postoji statistički značajno poboljšanje kod jednog ili više parametara statusa bolesti, ili neuspešno pogoršanje razvijanja simptoma gde bi se u suprotnom pojavili. Na primer, poželjna promena od barem 10% merljivih parametara bolesti, i poželjno barem 20%, 30%, 40%, 50% ili više može biti indikativno kao delotvorno tretiranje. Delotvornost za dati iRNK lek ili formulaciju tog leka takođe može procenjena upotrebom eksperimentalnog modela životinje za datu bolesti poznatog u struci. Kada se koristi eksperimentalni model, delotvornost tretiranja se evidentira kada se primeti statistički značajno smanjenje u markeru simptoma.
[0513] Alternativno, delotvornost se može meriti smanjenjem jačine bolesti kako je određeno od strane stručne osobe na osnovu klinički prihvaćene graduirane skale za jačinu bolesti, kao što je na primer skala za jačinu reumatoidnog artritisa (RASS). Bilo koja pozitivna promena koja se ispoljava u npr., smanjenju jačine bolesti merena upotrebom odgovarajuće skale, predstavlja adekvatno tretiranje upotrebom iRNK ili iRNK formulacije kao što je ovde opisano.
[0514] Subjektima se može davati terapeutska količina iRNK, kao što je oko 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1.0 mg/kg,1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg dsRNK, 2.6 mg/kg dsRNK, 2.7 mg/kg dsRNK, 2.8 mg/kg dsRNK, 2.9 mg/kg dsRNK, 3.0 mg/kg dsRNK, 3.1 mg/kg dsRNK, 3.2 mg/kg dsRNK, 3.3 mg/kg dsRNK, 3.4 mg/kg dsRNK, 3.5 mg/kg dsRNK, 3.6 mg/kg dsRNK, 3.7 mg/kg dsRNK, 3.8 mg/kg dsRNK, 3.9 mg/kg dsRNK, 4.0 mg/kg dsRNK, 4.1 mg/kg dsRNK, 4.2 mg/kg dsRNK, 4.3 mg/kg dsRNK, 4.4 mg/kg dsRNK, 4.5 mg/kg dsRNK, 4.6 mg/kg dsRNK, 4.7 mg/kg dsRNK, 4.8 mg/kg dsRNK, 4.9 mg/kg dsRNK, 5.0 mg/kg dsRNK, 5.1 mg/kg dsRNK, 5.2 mg/kg dsRNK, 5.3 mg/kg dsRNK, 5.4 mg/kg dsRNK, 5.5 mg/kg dsRNK, 5.6 mg/kg dsRNK, 5.7 mg/kg dsRNK, 5.8 mg/kg dsRNK, 5.9 mg/kg dsRNK, 6.0 mg/kg dsRNK, 6.1 mg/kg dsRNK, 6.2 mg/kg dsRNK, 6.3 mg/kg dsRNK, 6.4 mg/kg dsRNK, 6.5 mg/kg dsRNK, 6.6 mg/kg dsRNK, 6.7 mg/kg dsRNK, 6.8 mg/kg dsRNK, 6.9 mg/kg dsRNK, 7.0 mg/kg dsRNK, 7.1 mg/kg dsRNK, 7.2 mg/kg dsRNK, 7.3 mg/kg dsRNK, 7.4 mg/kg dsRNK, 7.5 mg/kg dsRNK, 7.6 mg/kg dsRNK, 7.7 mg/kg dsRNK, 7.8 mg/kg dsRNK, 7.9 mg/kg dsRNK, 8.0 mg/kg dsRNK, 8.1 mg/kg dsRNK, 8.2 mg/kg dsRNK, 8.3 mg/kg dsRNK, 8.4 mg/kg dsRNK, 8.5 mg/kg dsRNK, 8.6 mg/kg dsRNK, 8.7 mg/kg dsRNK, 8.8 mg/kg dsRNK, 8.9 mg/kg dsRNK, 9.0 mg/kg dsRNK, 9.1 mg/kg dsRNK, 9.2 mg/kg dsRNK, 9.3 mg/kg dsRNK, 9.4 mg/kg dsRNK, 9.5 mg/kg dsRNK, 9.6 mg/kg dsRNK, 9.7 mg/kg dsRNK, 9.8 mg/kg dsRNK, 9.9 mg/kg dsRNK, 9.0 mg/kg dsRNK, 10 mg/kg dsRNK, 15 mg/kg dsRNK, 20 mg/kg dsRNK, 25 mg/kg dsRNK, 30 mg/kg dsRNK, 35 mg/kg dsRNK, 40 mg/kg dsRNK, 45 mg/kg dsRNK, ili oko 50 mg/kg dsRNK. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjeni da budu deo ovog pronalaska.
[0515] U nekim slučajevima, na primer, kada sastav prema pronalasku sadrži dsRNK kao što je ovde opisano i lipid, subjektima se može davati terapeutska kolicna iRNK, kao što je oko 0.01 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.01 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 0.05 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.05 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 0.1 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.1 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 0.2 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.2 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 0.3 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.3 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 0.4 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.4 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 0.5 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 0.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 1 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 1 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 1.5 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 1.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 2 mg/kg to oko 2.5 mg/kg, oko 2 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 3 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 3 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 3.5 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 4.5 mg/kg to oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 4.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 5.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 6 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 6.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 7 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 7.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 8 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 8.5 mg/kg to oko 10 mg/kg, oko 9 mg/kg to oko 10 mg/kg, ili oko 9.5 mg/kg to oko 10 mg/kg.
Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjeni da budu deo ovog pronalaska.
[0516] Na primer, dsRNK može biti davana pri dozi od oko 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1,1.1,1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2,2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8,9.9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjeni da budu deo ovog pronalaska.
[0517] U drugim slučajevima, na primer, kada sastav prema pronalasku sadrži dsRNK kao što je ovde opisano i N-acetilgalaktozamin, subjektu se može davati terapeutska količina iRNK, kao što je doza od oko 0.1 do oko 50 mg/kg, oko 0.25 do oko 50 mg/kg, oko 0.5 do oko 50 mg/kg, oko 0.75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1.5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2.5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3.5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4.5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7.5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0.1 do oko 45 mg/kg, oko 0.25 do oko 45 mg/kg, oko 0.5 do oko 45 mg/kg, oko 0.75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1.5 do oko 45 mg/kg, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2.5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3.5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4.5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7.5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0.1 do oko 40 mg/kg, oko 0.25 do oko 40 mg/kg, oko 0.5 do oko 40 mg/kg, oko 0.75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1.5 do oko 40 mg/kg, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2.5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3.5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4.5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7.5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0.1 do oko 30 mg/kg, oko 0.25 do oko 30 mg/kg, oko 0.5 do oko 30 mg/kg, oko 0.75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1.5 do oko 30 mg/kg, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2.5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3.5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4.5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7.5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0.1 do oko 20 mg/kg, oko 0.25 do oko 20 mg/kg, oko 0.5 do oko 20 mg/kg, oko 0.75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1.5 do oko 20 mg/kg, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2.5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3.5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4.5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7.5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. U jednom otelotvorenju, gada sastav prema pronalasku sadrži dsRNK kao što je ovde opisano i N-acetilgalaktozamin, subjektu može biti davana terapeutska količina od oko 10 do oko 30 mg/kg dsRNK. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjeni da budu deo ovog pronalaska.
[0518] Na primer, subjektima može biti davana terapeutska količina iRNK, kao što je oko 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5.
25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49, ili oko 50 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti su takođe namenjeni da budu deo ovog pronalaska.
[0519] iRNK se može davati putem intravenozne infuzije za određeni vremenski period, kao što je vremenski period od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 minuta. Davanje može biti ponovljeno, na primer, na regularnoj bazi, kao što je nedeljno, dvonedeljno (tj. svake dve nedelje) u toku jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima tretiranja, tretiranja mogu biti davana na manje učestaloj bazi. Na primer, nakon davanja nedeljno ili nedeljno tokom tri meseca, davanje se može ponoviti jednom mesečno, u toku šest meseci ili godinu ili duže.
[0520] Davanje iRNK može da smanji nivoe C5, npr., u ćeliji, tkivu, krvi, urinu ili drugom delu pacijenta za barem oko 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili za barem oko 99% ili više.
[0521] Pre davanja potpune doze iRNK, pacijentima može biti data manja doza, kao što je 5% infuzija, i posmatraju se štetna dejstva, kao što je alergijska reakcija. U drugom primeru, pacijent može biti posmatran za neželjena imunostimulatorna dejstva, kao što su povišeni nivo citokina (npr., TNF-alfa ili INF-alfa).
[0522] Zbog inhibitornog dejstva na ekspresiju C5, sastav prema pronalasku ili farmaceutski sastav pripremljen iz njega može poboljšati kvalitet života.
[0523] iRNK prema pronalasku može biti data u „golom“ obliku ili kao „slobodna iRNK“. Gola iRNK se daje u prisustvu farmaceutskog sastava. Gola iRNK može biti pogodan puferski rastvor. Puferski rastvor može sadržati acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferski rastvor je fosfatom puferisan fiziološki rastvor (PBS). pH i osmolarnost puferskog sastava koji sadrži iRNK može biti podešen tako da bude pogodan za davanje pacijentu.
[0524] Alternativno, iRNK prema pronalasku može biti davana kao farmaceutski sastav, kao što je dsRNK lipozomna formulacija.
[0525] Subjekti koji bi imali korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5 gena su oni koji imaju bolest ili poremećaj povezan sa komponentom komplementa C5 kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima paraksimalnu noćnu hemoglobinuriju (PNH). U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima astmu. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima reumatoidni artritis. U još jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima sistemski lupus kritmatozis. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima glomerulonefritis. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima psorijazu. U još jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima bulozni dermatomiozitis pemfigoid. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima atipični hemolitičko-uremijski sindrom. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima Shiga toksin E. coli-povezani hemolitički uremični sindrom. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima miasteniju gravis. U još jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima neuromijelistis optika. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima bolest gustih depozita. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima C3 neuropatiju. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima makularnu degradaciju povezanu sa starošću. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima bolest hladnog aglutinina. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima anti-neutrofil citoplazmični vaskulitis povezan sa antitelima. U drugom otelotvorenjima, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima odbijanje humoralnog i vaskularnog transplanta. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima disfunkciju kalema. U jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima infarkt miokarda. U drugom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima preosetljivo primanje transplanata. U još jednom otelotvorenju, subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5 ima sepsu.
[0526] Tretiranje subjekta koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5 gena obuhvata terapeutsko i profilaktičko (npr., subjekat treba da prođe osetljivu (ili alogenu) operaciju transplanta) tretiranje.
[0527] Obelodanjivanje dalje daje metode za upotrebu iRNk agensa ili njegovog farmaceutskog sastava () za tretiranje subjekta koji bi imao korist od smanjenja i/ili inhibiranja ekspresije C5, npr., subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, u kombinaciji sa drugim farmaceuticima i/ili drugim terapeutskim metodama, npr., sa poznatim farmaceuticima i/ili poznatim terapeutskim metodama, kao što su, na primer, one koje se trenutno koriste za tretiranje ovih bolesti. Na primer, u određenim slučajevima, iRNK koja cilja C5 se daje u kombinaciji sa, npr., agensom korisnim pri tretiranju bolesti povezane sa komponentom komplementa C5 kao što je ovde opisano na drugom mestu.
[0528] Na primer, obuhvaćeni dodatni terapeutici i terapeutske metode pogodne za tretiranje subjekta koji bi imao korist od smanjenja ekspresije C5, npr., subjekat koji ima bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, su plazmaforeza, terapija trombocita (npr., streptokinaza), antiplatentni agensi, folna kiselina, kortikosteroidi; imunosupresivni agensi; estrogeni, metotreksat, 6-MP, azatioprin sulfasalazin, mesalazin, olsalazin, hlorokvinin/hidroksihlorokvin, pencilamin, aurotiomalat (intramuskularni i oralni), azatioprin, kohicin, kortikosteroidi (oralni, inhalacioni i za lokalnu injekciju), beta-2 adrenoreceptor agonisti (salbutamol, terbutalin, salmeteral), ksantini (teofilin, aminofilin), kromoglikat, nedokromil, ketotifen, ipratropijum i oksitropijum, ciklosporin, FK506, rapamicin, mikofenolat mofetil, leflunomid, NSAID, na primer, ibuprofen, kortikosteroidi kao što su prednizolon, inhibitori fosfodiesteraze, adenozin agonisti, antitrombocitni agensi, inhibitori komplementa, adrenergični agensi, agensi koji deluju signaliziranjem proinflamatornih citokina, kao što su TNF-α ili IL-1 (npr., IRAK, NIK, IKK, p38 ili MAP inhibitori kinaze), IL-1β konvertujući inhibitori enzima, TNF α konvertujući inhibitori enzima (TACE), inhibitori signaliziranja T-ćelija, kao što su inhibitori kinaze, inhibitori metaloproteinaze, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopurini, angiotenzin konvertujući inhibitori enzima, rastvorljivi citokini receptori i njihovi derivati (npr., rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori i derivati p75TNFRIgG (Enbrel™ i p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, i sIL-6R), antiinflamatorni citokini (npr., IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFβ), celekoksib, folna kiselina, hidroksihlorokvin sulfat, rofekoksib, etanercept, infliksimonoklonalno antitelo, naproksen, valdekoksib, sulfasalazin, metilprednizolon, meloksikam, metilprednizolon acetat, zlato natrijum tiomalat, aspirin, triamkinolon acetonid, propoksifen napsilat/apap, folat, nabumeton, diklofenak, prioksikam, etodolak, diklofenak natrijum, oksaprozin, oksikodon hcl, hidrokodon bitartat/apap, diklofenak natrijum/mizoprostol, fetanil, anakinra, ljudski rekombinant, tramadol hcl, salsalat, sulindak, cijanokobalamin/fa/piridoksin, acetaminofen, alendronat natrijum, prednizolon, morfin sulfat, lidokain, hidroklorid, indometacin, glukozamin sulf/hondroitin, amitriptilin hcl, sulfadiazin, oksikodon hcl/acetaminofen, olopatadin hcl, mizoprostol, naproksen natrijum, omeprazol, ciklofosfamid, rituksimonoklono antitelo, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, Anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801, Mezopram, ciklosporin, citokini supresivni inflamatorni lekovi (CSAID);
CDP-571/BAY-10-3356 (humanizovano anti-TNFα antitelo; CelltechBayer); cA2/infliksimonoklonalno antitelo (himerno anti-TNFα antitelo; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/etanercept (75 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein; Immunex; videti npr., (1994) Arthr. Rheum. 37: S295; (1996) J. Invest. Med.44: 235A); 55 kdTNF-IgG (55 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anti-CD4 ne-opadajuće primatizovano antitelo; IDEC/SmithKline; videti npr., (1995)Arthr. Rheum.38: S185); DAB 486-IL-2 i/ili DAB 389-IL-2 (IL-2 fuzioni proteini; Seragen; videti npr., (1993) Arthrit.
Rheum. 36: 1223); Anti-Tac (humanizovani anti-IL-2Rα; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (anti-inflamatorni citokin; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; rekombinantni IL-10, antiinflamatorni citokin; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 i/ili IL-4 agonisti (npr., antitela agonista); IL-1RA (IL-1 receptor antagonist; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret<®>/Amgen); TNF-bp/s-TNF (rastvorljivi TNF vezujući protein; videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement)): S284; (1995) Amer. J. Physiol. - Heart and Circ. Physiol. 268: 37-42); R973401 (inhibitor fosfodiesteraze tipa IV; videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S282); MK-966 (COX-2 Inhibitor; videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S81); Iloprost (videti npr., (1996) Arthr. Rheum.39(9 (suplement): S82); metotreksat; talidomid (videti npr., (1996) Arthr. Rheum.39(9 (suplement): S282) i talidomid-povezane lekove (npr., Celgen); leflunomid (anti-inflamatorni i citokini inhibitor; videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S131; (1996) Inflamm. Res.45: 103-107); tranesaminska kiselina (inhibitor plazminogen aktivacije; videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S284); T-614 (inhibitor citokina; videti npr., (1996) Arthr. Rheum.
39(9 (suplement): S282); prostaglandin E1 (videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S282); Tenidap (ne-steroidni anti-inflamatorni lek; videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S280); Naproksen (ne-steroidni anti-inflamatorni lek; videti npr., (1996) Neuro. Report 7: 1209-1213); Meloksikam (ne-steroidni anti-inflamatorni lek);
Ibuprofen (ne-steroidni anti-inflamatorni lek); Piroksikam (ne-steroidni anti-inflamatorni lek); Diklofenak (ne-steroidni anti-inflamatorni lek); Indometacin (ne-steroidni antiinflamatorni lek); Sulfasalazin (videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S281); Azatioprin (videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S281); ICE inhibitor (inhibitor enzima interleukin-1β konvertujućeg enzima); zap-70 i/ili 1ck inhibitor (inhibitor tirozin kinaze zap-70 ili lck); VEGF inhibitor i/ili VEGF-R inhibitor (inhibitori faktora rasta vaskularne endotelijalne ćelije ili receptora faktora rasta endotelijalne ćelije; inhibitori angiogeneze); kortikosteroidni anti-inflamatorni lekovi (npr., SB203580); inhibitori TNF-konvertaze; anti-IL-12 antitela; anti-IL-18 antitela; interleukin-11 (videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S296); interleukin-13 (videti npr., (1996) Arthr. Rheum.39(9 (suplement): S308); interleukin -17 inhibitori (videti npr., (1996) Arthr. Rheum. 39(9 (suplement): S120); zlato; penicilamin; hlorokvin; hlorambucil; hidroksihlorokvin; ciklosporin; ciklofosfamid; ukupna limfoidna radijacija; anti-tiomocit globulin; anti-CD4 antitela; CD5-toksini, oralno-davani peptidi i kolagen; lobenzarit dinatrijum; agensi za regulisanje citokina (CRA) HP228 i HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 antismisao fosforotioat oligo-dezoksinukleotidi (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); rastvorljivi komplement receptor 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednizon; orgotein; glikozaminoglikan polisulfat; minociklin; anti-IL2R antitela; morski i botanički lipidi (masne kiseline riba i biljnih semena; videti npr., DeLuca i dr. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am.
21: 759-777); auranofin, fenilbutazon; meklofenamična kiselina, flufenamična kiselina, intravenozni imuni globulin; zileuton; azaribin; mikofenolna kiselina (RS-61443); takrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicin); amipriloza (terafektin); kladribin (2holorodezoksiadenozin); metotreksan; bcl-2 inhibitori (videti Bruncko, M. i dr. (2007) J. Med. Chem. 50(4): 641-662); antivirusni i imuni-modulirajući agensi, inhibitori malih molekula KDR, inhibitori malih molekula Tie-2; metotreksat; prednizon; celekoksib; folna kiselina; hidroksihlorokvin sulfat; rofekoksib; etanercept; infliksimonoklonalno antitelo; leflunomid; naproksen, valdekoksib, sulfasalazin; metilprednizolon; ibuprofen; meloksikam; metilprednizolon acetat; zlato natrijum tiomalat; aspirin; azatioprin; triamcinolon acetonid; propoksifen napsilat/apap; folat; nabumeton; diklofenak; piroksikam; etodolak; diklofenak natrijum; oksaprozin; oksikodon hcl; hidrokodon bitartat/apap; diklofenak natrijum/mizoprostol; fentanil; anakinra, ljudski rekombinantni tramadol hcl; salsalat; sulindak; cijanokobalamin/fa/piridoksin; acetaminofen; alendronat natrijum, prednizolon, morfijum sulfat; lidokain hidrohlorid; indometacin; glukozamin sulfat/hondroitin; ciklosporin; amitriptilin hcl; sulfadiazin; oksikodon hcl/acetaminofen; olopatadin hcl; mizoprostol; naproksen natrijum; omeprazol; mikofenolat mofetil; ciklofosfamid; rituksimonoklonalno antitelo; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801; mezopram, albuterol, salmeterol/flutikazon, montelukast natrijum, flutikazon propionat, budesonid, prednizon, salmeterol ksinafoat, levalbuterol hcl, albuterol sulfat/ipratropijum, prednizolon natrijum fosfat, triamkinolon acetonid, beklometazon dipropionat, ipratropijum bromid, azitromicin, pirbuterol acetat, prednizolon, anhidrovani teofilin, metilprednizolon natrijum sukcinat, klaritromicin, zafirlukast, formoterol fumarat, vakcina protiv influenza virusa, metilprednizolon, amoksicilin trihidrat, funizolid, alergijska injekcija, kromolin natrijum, feksofenadin hidrohlorid, funizolid/mentol, amoksicilin/klavulanat, levofloksacin, uređaj za pomaganje inhalacije, guaifenezin, deksametozan natrijum fosfat, moksifloksacin hcl, doksicicilin hiklat, guaifenezin/dmetorfan, p-efedrin/cod/hlorfenir, gatifloksacin, cetirizin hidrohlorid, mometazon furoat, salmeterol ksinafoat, benzonatat, cefaleksin, pe/hidrokodon/hlorfenir, cetirizin hcl/pseudoefed, fenilefrin/cod/prometazin, kodein/prometazin, cefprozil, deksametazon, guaifenezin/pseudoefedrin, hlorfeniramin/hidrokodon, nedokromil natrijum, terbutalin sulfat, epinefrin, metilprednizolon, metaproterenol sulfat, aspirin, nitroglicerin, metopropol tartat, enoksaparin natrijum, heparin natrijum, klopidogrel bisulfat, karvedilol, atenolol, morfijum sulfat, metopropol sukcinat, varfarin natrijum, lizinopril, izosorbid mononitrat, digoksin, furozemid, simvastatin, ramipril, tenekteplaza, enalapril maleat, torzemid, retavaza, losartan kalijum, kvinapril hcl/mag karb, bumetanid, alteplaza, enalaprilat, amiodaron hidrohlorid, tirofiban hcl m-hidrat, diltiazem hidrohlorid, kaptopril, irbesartan, valsartan, propanol hidrohlorid, fosinopril natrijum, lidokain hidrohlorid, eptifibatid, cefazolin natrijum, atropin sulfat, aminokaprinska kiselina, spironolakton, interferon, solatol hidrohlorid, natrijum hlorid, dokusat natrijum, dobutamin hcl, alprazolam, pravastatin natrijum, atorvastatin kalcijum, midazolam hidrohlorid, meperidin hidrohlorid, izosorbid, dinitrat, epinefrin, dopamin hidrohlorid, bivalirudin, rosuvastatin, ezetimib/simvastatin, avasimib i kariporid.
[0529] iRNK agens (i/ili komponenta anti-komplementa C5 antitela) i dodatni terapeutski agens i/ili tretiranje mogu biti davani u isto vreme i/ili u istoj kombinaciji, npr., parenteralno, ili dodatni terapeutski agens može biti dat kao deo različitog sastava ili u različitim vremenima i/ili putem drugim metode koja je poznata u struci ili je ovde opisana.
[0530] Predmetno obelodanjivanje takođe daje metode za upotrebu iRNk agensa prema pronalasku i/ili sastava koji sadrži iRNK agens prema pronalasku za smanjivanje i/ili inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5 u ćeliji. U drugim aspektima, predmetno obelodanjivanje daje iRNK prema pronalasku i/ili sastava koji sadrži iRNK prema pronalasku za upotrebu pri smanjivanju i/ili inhibiranju ekspresije C5 u ćeliji. U drugim aspektima, upotreba iRNK prema pronalasku i/ili sastava koji sadrži iRNK prema pronalasku u proizvodnju lekova za smanjivanje i/ili inhibiranje ekspresije C5 u ćeliji je data.
[0531] Metode i upotrebe obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa iRNK, npr., dsRNK, prema pronalasku i održavanje ćelije u toku vremenskog perioda dovoljnog da bi se ostvarila degradacija mRNK transkripta C5 gena, time inhibirajući ekspresiju C5 gena u ćeliji.
[0532] Smanjenje ekspresije gena može biti procenjeno bilo kojom metodom poznatoj u tehnici. Na primer, smanjenje ekspresije C5 može biti određeno određivanjem nivoa ekspresije mRNK C5 upotrebom metoda koje su rutinske stručnoj osobi, npr., Northern blot, qRT-PCR, određivanjem nivoa proteina C5 upotrebom metoda koje su rutinske stručnoj osobi, kao što su Western blot, imunologičke tehnike, metode protočne citometrije, ELISA, i/ili određivanjem biološke aktivnosti C5, kao što su CH50i AH50testovi hemolize, i/ili određivanjem biološke aktivnosti jednog ili više molekula povezanih sa sistemom komplementa, npr., C5 proizvodima, kao što su C5a i C5b (ili, u in vivo podešavanju, npr., hemoliza).
U metodama i upotrebama iz ovog obelodanjivanja, ćelija može biti dovedena u kontakt in vitro ili in vivo, tj. ćelija može biti unutar subjekta. U slučajevima kada je ćelija unutar subjekta, metode mogu obuhvatati dalje dovođenje ćelije u kontakt sa komponentom antikomplementa C5 antitela, npr., ekulizumabom.
[0533] Ćelija pogodna za tretiranje upotrebom metoda prema pronalasku može biti bilo koja ćelija koja vrši ekspresiju C5 gena. Ćelije koje su pogodne za upotrebu u metodama i upotrebama prema pronalasku može biti ćelija sisara, npr., ćelija primata (kao što je ćelija čoveka ili primata koji nije čovek, npr., ćelija majmuna ili ćelija šimpanze), ćelija koja nije od primata (kao što je ćelija krave, ćelija svinje, ćelija kamile, ćelija lame, ćelija konja, ćelija koze, ćelija zeca, ćelija ovce, ćelija hrčka, zamorčeta, ćelija mačke, ćelija psa, ćelija pacova, ćelija miša, ćelija lava, ćelija tigra, ćelija medveda ili ćelija bivola), ćelija ptice (npr., ćelija patke ili ćelija guske), ili ćelija kita. U jednom otelotvorenju, ćelija je ljudska ćelija, npr., ljudska ćelija jetre.
[0534] Ekspresija C5 može biti inhibirana u ćeliji za barem oko 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili oko 100%.
[0535] In vivo metode i upotrebe ovde mogu obuhvatati davanje subjektu sastava koji sadrži iRNK, gde iRNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa barem delom RNK transkripta C5 gena ćelije sisara koja se tretira. Kada je organizam koji se tretira sisar kao što je čovek, sastav može biti dat na bilo koji način koji je poznat u tehnici uključujući, bez ograničenja, subkutano, intravenozno, oralno, intraperitonealno, ili parenteralno, uključujući intrakranijalno (npr., intraventrikularno, intraparenhimalno i intratekalno), intramuskularno, transdermalno, putem vazduha (aerosol), nazalno, rektalno i topikalno (uključujući bukalno i sublingvalno) davanje. U određenim slučajevima, sastavi mogu biti dati subkutanom ili intravenoznom infuzijom ili injekcijom.
[0536] U nekim slučajevima, davanje je putem depo injekcije. Depo injekcija može osloboditi iRNK na konzistentan način u toku produženog vremenskog perioda. Stoga, depo injekcija može smanjiti učestalost doziranja potrebnog za ostvarenje željenog dejstva, npr., željene inhibicije C5, ili terapeutskog ili profilaktičkog dejstva. Depo injekcija takođe može dati konzistentniju koncentraciju seruma. Depo injekcija može obuhvatati subkutane injekcije ili intramuskularne injekcije. U poželjnim slučajevima, depo injekcija je subkutana injekcija.
[0537] U nekim slučajevima, davanje je putem pumpe. Pumpa može biti spoljašnja pumpa ili hirurški postavljena pumpa. U nekim slučajevima, pumpa je subkutano postavljena osmotska pumpa. U drugim slučajevima, pumpa je infuziona pumpa. Infuziona pumpa može biti korišćena za intravenozne, subkutane, arterijske ili epiduralne infuzije. U poželjnim slučajevima, infuziona pumpa je subkutana infuziona pumpa. U drugim slučajevima, pumpa je hirurški postavljena pumpa koja vrši isporuku iRNK u jetru.
[0538] Način davanja može biti izabran na osnovu toga da li je lokalno ili sistemsko tretiranje poželjni i na osnovu površine koja se tretira. Put i mesto davanja može biti izabran za pojačano ciljanje.
[0539] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje takođe daje metode za inhibiranje ekspresije C5 gena kod sisara, npr., kod čoveka. Takođe daje sastave koji sadrže iRNK, npr., dsRNK, koja cilja C5 gen u ćeliji sisara za upotrebu u inhibiciji ekspresije C5 gena kod sisara. U drugom aspektu, daje upotrebu iRNK, npr., dsRNK, koja cilja C5 gen u ćeliji sisara u proizvodnju leka za inhibiranje ekspresije C5 gen kod sisara.
[0540] Metode i upotrebe obuhvataju davanje sisaru, npr., čoveku, sastav koji sadrži iRNK, npr., dsRNK, koja cilja C5 gen u ćeliji sisara i koji se održava u sisaru u toku vremenskog perioda koji je dovoljan za ostvarenje degradacije mRNK transkripta C5 gena, time inhibirajući ekspresiju C5 gena kod sisara. U nekim slučajevima, metode dalje sadrže davanje komponente anti-komplementa C5 antitela, npr., ekulizumaba subjektu.
[0541] Smanjenje ekspresije gena može biti procenjeno bilo kojim metodama poznatim u tehnici i metodama, npr., qRT-PCR, opisanim ovde. Smanjenje u proizvodnju proteina može biti procenjeno metodama poznatim u tehnici, npr., ELISA ili Western blot, opisanim ovde. U jednom slučaju, uzorak punkturne biopsije jetre služi kao materijal za tkivo za praćenje smanjenja ekspresije C5 gena i/ili proteina. U drugom slučaju, uzorak krvi služi kao materijal za tkivo za praćenje smanjenja ekspresije C5 gena ili proteina. U drugim slučajevima, inhibiranje ekspresije C5 gena je praćeno indirektno, na primer, određivanjem ekspresije i/ili aktivnosti gena u putu C5, uključujući, na primer, C5a, C5b i rastvorljivi C5b-9 (videti, npr., Sliku 1). Na primer, aktivnost CD59 može biti praćena za određivanje inhibicije ekspresije C5 gena. CH50, AH50, formiranje ugruška i/ili laktat dehidrogenaze seruma (LDH), u uzorku, npr., uzorku krvi ili jetre, mogu biti mereni. Pogodni testovi su dalje opisani u odeljku o Primerima, ispod.
[0542] Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini ovde korišćeni imaju isto značenje koje je opšte prihvaćeno od strane stručnih osoba u tehnici kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako metode i materijali slični ili ekvivalenti onima opisanim ovde mogu biti korišćeni u praksi ili testiranju iRNK i metoda koje se ovde nalaze, pogodne metode i materijali su opisani ispod.
[0543] U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije će kontrolisati. Dodatno, materijali, metode i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da vrše ograničenje pronalaska koji je definisan u patentnim zahtevima.
PRIMERI
Primer 1. iRNK sinteza
Izvor reagensa
[0544] Tamo gde izvor reagensa nije naročito naveden, takav reagens može se nabaviti od bilo kog dobavljača reagensa za molekularnu biologiju pri standardu za kvalitet/čistoću za primene u molekularnoj biologiji.
Transkripcije
[0545] siRNK dizajn je izveden za identifikovanje siRNK koje ciljaju C5 transkripte čoveka, rezusa (Macaca mulatta), miša i pacova u NCBI bazi podataka gena.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).
Dizajn je koristio sledeće transkripte iz NCBI RefSeq kolekcije: Čovek - NM_001735.2; Rezus - XM_001095750.2; Miš - NM_010406.2; Pacov - XM_345342.4. siRNK dupleksi su dizajnirani u nekoliko različitih serija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, serije koje sadrže duplekse koji se poklapaju samo sa transkriptima čoveka i rezusa; samo sa transkriptima čoveka, rezusa i miša; samo sa transkriptima čoveka, rezusa miša i pacova; i samo sa transkriptima miša i pacova. Svi siRNK dupleksi dizajnirani su tako da dele 100% identiteta sa izlistanim ljudskim transkriptom i transkriptima drugih vrsta razmatranim u svakoj seriji dizajna (iznad).
siRNK dizajn, specifičnost i predviđanje delotvornosti
[0546] Predviđena specifičnost svih mogućih 19mera je predviđena iz svake sekvence.
Kandidati 19mera koji nisu imali ponavljanja duža od 7 nukleotida su zatim izabrani. Ovih 2971 kandidata čovek/rezus, 142 čovek/rezus/miš, 54 čovek/rezus/miš/pacov i 807 miš/pacov siRNK korišćeno je u obimnim pretraživanjima protiv odgovarajućih transkriptoma (definisanih kao set NM_ i XM_ snimaka u NCBI Refseq setovima za čoveka, rezusa, psa, miša ili pacova) upotrebom iscrpljujućeg „brute-force“ algoritma implementiranog u phyton skripti ‘BruteForce.py’. Skripta je zatim raščlanila transkript-oligo poklapanja u cilju stvaranja rezultata zasnovanog na poziciji i broju nepoklapanja između siRNK i bilo kog potencijalnog transkripta van cilja. Rezultat van cilja je osrednjen za naglašavanje razlika u oblasti ‘zasejavanja’ iRNK, na pozicijama 2-95’-kraja molekula.
[0547] Svakom oligo-transkript paru iz brute-force pretrage dodeljen je rezultat nepoklapanja sumiranjem pojedinačnih rezultata nepoklapanja; nepoklapanja na pozicijama 2-9 izbrojana su kao 2.8, nepoklapanja pozicija na mestu cepanja 10-11 izbrojana su kao 1.2, i nepoklapanja u oblasti 12-19 izbrojana su kao 1.0. Dodatno predviđanje van cilja je izvršeno upoređivanjem učestalosti heptamera i oktamera izvedenih iz 3 različita, heksamera svakog oligo izvedenog iz zasejavanja. Heksameri sa pozicija 2-7 relativnih 5’ početku su korišćeni za stvaranje 2 heptamera i jednog oktamera. ‘Heptamer1’ je stvoren dodavanjem 3’-A heksameru; heptamer2 je stvoren dodavanjem 5’-A heksameru; oktomer je stvoren dodavanjem A oba, 5’- i 3’- krajevima heksamera. Učestalost oktamera i heptamera u 3’-UTRome čoveka, rezusa, miša ili pacova (definisan kao pod sekvenca transkriptoma iz NCBI Refseq baze podataka gde je kraj oblasti kodiranja, ‘CDS’, jasno definisan) je prethodno izračunat. Učestalost oktamera je normalizovana do učestalosti heptamera upotrebom srednje vrednosti iz opsega učestalosti oktamera. ‘mirSeedScore’ je zatim izračunat računanjem sume ((3 X normalizovani broj oktamera)+(2 X broj heptamera2)+(1 X broj heptamera1)).
[0548] Oba siRNK lanca su dodeljena kategoriji specifičnosti u skladu sa izračunatim rezultatima: rezultat iznad 3 kvalifikuje se kao visoko specifičan, jedan 3 kao specifičan i između 2.2 i 2.8 kao srednje specifičan. Dupleksi su sortirani na osnovu specifičnosti antismisao lanca i ti dupleksi čiji su antismisao oligo-i imali manjak GC na prvoj poziciji, imali manjak G na obe pozicije 13 i 14, i imali 3 ili manje U ili A u oblasti zasejavanja su izabrani.
[0549] Za GalNaC-konjugovane duplekse, smisao 21mer i antismisao 23mer oligo-i dizajnirani su produžavanjem antismisao 19mera (opisanog iznad) na 23 nukleotida ciljane komplementarne sekvence. Transkripti svih vrsta uključeni u dizajniranu seriju su provereni za komplementarnost. Samo su 23meri koji su održali 100% komplementarnost sekvence u barem 2 vrste korišćeni.Za svaki dupleks, smisao 21mer je naznačen kao reverzni komplement prvih 21 nukleotida antismisao lanca.
Odabir siRNK sekvence
[0550] Ukupno 23 smisao i 23 antismisao izvedenih čovek/rezus, 6 smisao i 6 antismisao čovek /rezus/miš, 6 smisao i 6 antismisao izvedenih čovek/rezus/miš/pacov, i 13 smisao i 13 antismisao izvedenih miš/pacov siRNK 19mer oligo je sintetisano i formirano u duplekse.
[0551] 19mer setovi iznad su prošireni na 21/23mer duplekse za dizajn GalNac konjugata i re-klasifikovani u skladu sa njihovim novim poklapanjem sa vrstama. Dvadeset sedam smisao i 27 antismisao izvedenih čovek/rezus, 1 smisao i 1 smisao izvedeni čovek/rezus/miš, 3 smisao i 3 antismisao izvedeni čovek/rezus/pacov, 4 smisao i 4 antismisao izvedeni čovek/rezus/miš/pacov, i 13 smisao i 13 antismisao izvedeni miš/pacov 21mer (smisao) i 23mer (antismisao) oligo su sintetisani i formirani u duplekse.
[0552] Detaljni spisak C5 smisao i antismisao lanca sekvenci je prikazan u Tabelama 3-6. siRNK sinteza
Generalna procedura sinteze RNK male i srednje skale
[0553] RNK oligonukleotidi su sintetisani pri skalama između 0.2-500 µmol upotrebom komercijalno dostupnih 5’-O-(4,4’-dimetoksitritil)-2’-O-t-butildimetilsilil-3’-O-(2-cijanoetil-N,N-diizopropil)fosforamidit monomera uridina, 4-N-acetilcitidina, 6-N-benzoiladenozina i 2-N-izobutirilguanozina i odgovarajućih 2’-O-metil i 2’-fluoro fosforamidita u skladu sa standardnim protokolom sinteze čvrste faze oligonukleotida. Rastvori amidita su pripremljeni pri koncentracijama od 0.1-0.15 M i 5-etiltio-1H-tetrazol (0.25-0.6 M u acetonitrilu) je korišćen kao aktivator. Fosforotioat modifikacije glavnog lanca su uvedene u toku sinteze upotrebom 0.2 M fenilacetil disulfida (PADS) u lutidin:acetonitril (1:1) (v:v) ili 0.1 M 3(dimetilaminometilen) amino-3H-1,2,4-ditiazol-5tiona (DDTT) u piridinu za korak oksidacije. Nakon završetka sinteze, sekvence su skinute sa čvrste podloge i deprotektovane upotrebom metilamina što je praćeno sa trietilamin.3HF za uklanjanje prisutnih 2’-O-tbutildimetilsilil zaštitnih grupa.
[0554] Za skalu sinteze između 5-500 µmol i potpuno 2’ modifikovanih sekvenci fluoro i/ili 2’-O-metil ili njihova kombinacija) oligonukleotidi su deprotekovani upotrebom 3:1 (v/v) etanola i koncentrovanog (28-32%) vodenog amonijaka ili pri 35°C 16 h ili 55°C z toku 5.5 h. Pre deprotekcije sa amonijakom oligonukleotidi su tretirani sa 0.5 M piperidina u acetonitrilu tokom 20 minuta na čvrstoj podlozi. Sirovi oligonukleotidi su analizirani sa LC-MC i HPLC (IEX-HPLC) sa anjonskom razmenom. Prečišćavanje oligonukleotida izvršeno je sa IEX HPLC upotrebom: 20 nM fosfata, 10%-15% ACN, pH = 8.5 (pufer A) i 20 mM fosfata, 10%-15% ACN, 1 M NaBr, pH = 8.5 (pufer B). Frakcije su analizirane sa čistoću analitičkom HPLC. Proizvodi koji su sadržali frakcije sa pogodnom čistoćom su objedinjeni i koncentrovani na rotirajućem evaporatoru pre uklanjanja soli. Uzorcima je uklonjena so pomoću ekskluzione hromatografije i uzorci su liofilizovani dok nisu postali suvi. Jednake molarne količine smisao i antismisao lanca su prekaljene u 1x PBS puferu za pripremanje odgovarajućih siRNK dupleksa.
[0555] Za male skale (0.2-1 µmol), sinteza je izvršena na MerMade 192 sintetizeru u formatu sa 96 otvora. U slučaju potpuno 2’-modifikovanih sekvenci (2’-fluoro i/ili 2’-O-metil ili njihova kombinacija) oligonukleotidi su deprotekovani upotrebom metilamina na sobnoj temperaturi u toku 30-60 minuta što je praćeno inkubacijom pri 60 °C u toku 30 minuta ili upotrebom 3:1 (v/v) etanola i koncentrovanog (28-32%) vodenog amonijaka na sobnoj temperaturi u toku 30-60 min što je praćeno inkubacijom na 40 °C 1.5 sat. Sirovi oligonukleotidi su zatim precipitirani u rastvoru acetonitril:acetan (9:1) i izolovani centrifugiranjem i dekantiranjem supernatanta. Sirovi pelete oligonukleotida je ponovo suspendovan u 20 mM NaOAc puferu i analiziran sa LC-MS i HPLC sa razmenom anjona. Sekvencama sirovog oligonukleotida je uklonjena so u pločama sa 96 otvora na 5 mL HiTrap Sephadex G25 koloni (GE Healthcare). U svakom otvoru uzorci od 1.5 mL koji odgovaraju pojedinačnoj sekvenci su skupljeni. Ovi prečišćeni oligonukleotidi kojima je uklonjena so su analizirani sa LC-MS i hromatografijom sa razmenom anjona. Dupleksi su pripremljeni prekaljivanjem ekvimolarnih količina smisao i antismisao sekvenci na Tecan robotu.
Koncentracije dupleksa su podešene na 10 µM in 1x PBS puferu.
Sinteza GalNAc-konjugovanih oligonukleotida za in vivo analizu
[0556] Oligonukleotidi konjugovani sa GalNAc ligandom na njihovom 3’-terminusu su sintetisani pri skalama između 0.2-500 µmol upotrebom čvrste podloge prethodno napunjene sa Y-oblikovanim linkerom koji nosi 4,4’-dimetoksitritil (DMT)-zaštitnu primarnu hidroksi grupu za sintezu oligonukleotida i GalNAc ligand povezan preko tetera.
[0557] Za sintezu GalNAc konjugata u skalama između 5-500 µmol, protokol sinteze za RNK od iznad je praćen sa sledećim adaptacijama: Za polistiren-baziranu podlogu sinteze 5% dihlorosirćetna kiselina u toluenu je korišćena za DMT-cepanje u toku sinteze. Cepanje od podloge i deprotekcija je izvršena kao što je opisano iznad. Fosforotioatom bogata sekvenca (obično > 5 fosfotioata) je sintetisana bez uklanjanja konačne 5’-DMT grupe („DMT-na“) i, nakon cepanja i deprotekcije kao što je opisano iznad, prečišćena je HPLC sa reverznom fazom upotrebom 50 mM amonijum acetata u vodi (pufer A) i 50 mM amonijum acetata u 80% acetonitrilu (pufer B). Frakcije su analizirane za čistoću analitičkom HPLC i/ili LC-MS. Frakcije koje su sadržale proizvod sa pogodnom čistoćom su objedinjene u koncentrovane na rotirajućem evaporatoru. DMT-grupe su uklonjene upotrebom 20%-25% sirćetne kiseline u vodi do završetka. Uzorcima je uklonjena so ekskluzionom hromatografijom i liofilisani su dok nisu bili suvi. Jednake molarne količine smisao i antismisao lanca su prekaljene u 1x PBS puferu za pripremanje odgovarajućih siRNK dupleksa.
[0558] Za sintezu male skale GalNAc konjugata (0.2-1 µmol), uključujući sekvence sa više fosforotioat veza, protokoli opisani iznad za sintezu RNK ili potpune sekvence koja sadrži 2’-F/2’-OMe na MerMade platformi su primenjeni. Sinteza je izvršena na prethodno napunjenim kolonama koje sadrže GalNAc-funkcionalizovanu kontrolnu podlogu od poroznog stakla.
Primer 2. In vitro proveravanje
Ćelijska kultura i transfekcije
[0559] Hep3B ćelije (ATCC, Manassas, VA) su uzgajane skoro do spajanja pri 37°C u atmosferi 5% CO2 u Eagle’s Minimum Essential Medium (ATCC) dopunjenog sa 10% FBS, streptomicinom, i glutaminom (ATCC) pre oslobađanja iz ploče sa tripsinizacijom. Ćelije su isprane i ponovo suspendovane pri 0.25x10<6>ćelija/ml. U toku transfekcija, ćelije su stravljene u ploču od 96 otvora sa oko 20,000 ćelija po otvoru.
[0560] Primarni hepatociti miša (PMH) su sveže izolovani iz C57BL/6 ženki miševa (Charles River Labortories International, Inc. Willmington, MA) manje od sat vremena pre transfekcija i uzgajani su u sredini primarnih hepatocita. Ćelije su ponovo suspendovane pri 0.11x10<6>ćelija/ml u InVitroGRO CP (stavljanje u ploče) medijumu za pacove (Celsis In Vitro Technologies, kataloški broj S01494). U toku transfekcija, ćelije su postavljene na BD BioCoat kolagenske ploče sa 96 otvora (BD, 356407) pri 10,000 ćelija po otvoru i inkubirane su pri 37°C u atmosferi od 5% CO2.
[0561] Primarni krioprezervirani Cynomolgus hepatociti (Celsis In Vitro Technologies, M003055-P) odmrznuti su na 37°C u vodenom kupatilo odmah pre upotrebe i ponovo su suspendovani pri 0.26x10<6>ćelija/ml in InVitroGRO CP (stavljanje u ploče) medijumu (Celsis In Vitro Technologies, kataloški broj Z99029). U toku transfekcija, ćelije su postavljene na BD BioCoat kolagenske ploče sa 96 otvora (BD, 356407) pri 25,000 ćelija po otvoru i inkubirane su pri 37°C u atmosferi od 5% CO2.
[0562] Za Hep3B, PMH, i primarne Cynomolgus hepatocite, transfekcija je izvršena dodavanjem 14.8 µl Opti-MEM plus 0.2 µl Lipofektamina RNAiMax po otvoru (Invitrogen, Carlsbad CA. kataloški brojl3778-150) u 5 µl svaki siRNK dupleks u pojedinom otvoru na ploči od 96 otvora. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi u toku 20 minuta.
Osamdeset µl potpuno formirane sredine bez antibiotika koji sadrži odgovarajući broj ćelija su zatim dodati siRNK smeši. Ćelije su inkubirani tokom 24 sata pre prečišćavanja RNK.
[0563] Eksperimenti sa jednom dozom su izvršeni pri 10nM i 0.1nM konačne koncentracije dupleksa za GalNAC modifikovane sekvence ili pri 1nM i 0.01nM konačne koncentracije dupleksa za sve sekvence. Eksperimenti odaziva na dozu su izvršeni pri 3,1, 0.3, 0.1, 0.037, 0.0123, 0.00412, i 0.00137 nM konačne koncentracije dupleksa za primarne hepatocite kod miševa i pri 3,1,0.3,0.1, 0.037, 0.0123, 0.00412, 0.00137, 0.00046, 0.00015, 0.00005, i 0.000017 nM konačne koncentracije dupleksa za Hep3B ćelije.
Transfekcija slobodnog unosa
[0564] Eksperimenti slobodnog unosa izvršeni su dodavanjem 10µl siRNK dupleksa u PBS u svaki otvor na ploči sa 96 otvora. Devedeset µl potpuno formirane sredine koja sadrži odgovarajući broj ćelija je zatim dodato siRNK. Ćelije su inkubirane 24 sata pre prečišćavanja RNK. Eksperimenti sa jednom dozom su izvršeni pri 500nM i 5nM koncentracije krajnjeg dupleksa i eksperimenti odgovora na dozu su izvršeni pri koncentracijama krajnjeg dupleksa od 1000, 333, 111, 37, 12.3, 4.12, 1.37, 0.46 nM.
Ukupna izolacija RNK upotrebom DYNABEADS mRNK izolacionog kompleta (Invitrogen, part #: 610-12)
[0565] Ćelije su sakupljene i lizirane u 150 µl lize/vezujućeg pufera i mešane 5 minuta pri 850 rpm upotrebom Eppendorf Thermomixer (brzina mešanja je bila ista u toku celog procesa). Deset mikrolitara magnetnih zrna i 80 µl smeše lize/vezujućeg pufera je dodato ploči sa okruglim dnom i mešanje je vršeno 1 minut. Magnetna zrna su uhvaćena upotrebom magnetnog stalka i supernatant je uklonjen bez uticanja na zrna. Nakon uklanjanja supernatanta, lizirane ćelije su dodate preostalim zrnima i mešane su 5 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, magnetna zrna su isprana 2 puta sa 150 µl pufera za ispiranje A i mešane su 1 minut. Zrna su ponovo uhvaćena i supernatant je uklonjen. Zrna su isprana sa 150 µl pufera za ispiranje B, uhvaćena i supernatant je uklonjen. Na kraju, zrna su ostavljena da se osuše 2 minuta. Nakon sušenja, 50 µl elucionog pufera je dodato i mešano je 5 minuta na 70°C. Zrna su uhvaćena na magnetu 5 minuta. Četrdeset pet µl supernatanta je uklonjeno i dodato u ploče sa 96 otvora.
cDNK sinteza upotrebom ABI visokog kapaciteta cDNK reverznog transkripcionog kompleta (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)
[0566] Master smeša 2 µl 10X pufera, 0.8 µl 25X dNTP, 2 µl nasumična primera, 1 µl reverzne transkriptaze, 1 µl inhibitora RNaze i 3.2 µl H2O po reakciji je pripremljeno.
Jednake zapremine master smeše i RNK su pomešane za krajnju zapreminu od 12 µl za in vitro proveravanje ili 20 µl za in vivo proveravanje uzoraka. cDNK je stvorena upotrebom Bio-Rad C-1000 ili S-1000 termalnog ciklera (Hercules, CA) kroz sledeće korake: 25°C u toku 10 minuta, 37°C u toku 120 minuta, 85°C u toku 5 sekundi, i zadržavanje na 4°C.
PCR u stvarnom vremenu
[0567] Dva µl cDNK je dodato u master mešavinu koja sadrži 2µl H2O, 0.5µl GAPDH TaqMan Probe (Life Technologies kataloški broj 4326317E za Hep3B ćelije, kataloški broj 352339E za primarne hepatocite miševa ili poručene sonde za primarne hepatocite cynomolgus), 0.5µl C5 TaqMan probe (Life Technologies c kataloški broj Hs00156197_ml za Hep3B ćelije ili mm00439275_ml za primarne hepatocite miševa ili poručene sonde za primarne hepatocite cynomolgus) i 5µl Lightcycler 480 sonda master smešu (Roche kataloški broj 04887301001) po otvoru na ploči sa 384 otvora (Roche kataloški broj 04887301001). PCR u stvarnom vremenu je izvršen na Roche LC480 Real Time PCR sistemu (Roche) upotrebom ΔΔCT(RQ) testa. Za in vitro proveravanje, svaki dupleks je testiran sa dve biološke replike ukoliko nije drugačije naznačeno i svaki PCR u stvarnom vremenu je izvršen u tehnički duplim replikama. Za in vivo proveravanje, svaki dupleks je testiran u jednom ili više eksperimenata (3 miša po grupi) i svaki PCR u stvarnom vremenu je izvršen u tehnički duplim replikama.
[0568] Za računanje relativnog broja promena u C5 mRNK nivoima, podaci u stvarnom vremenu su analizirani upotrebom ΔΔCt metode i normalizovani su za testove izvršene sa ćelijama transfektovanim sa 10 nM AD-1955, ili sa lažnim transfektovanim ćelijama. IC50vrednosti su izračunate upotrebu modela sa 4 odgovarajuća parametra upotrebom XLFit i normalizovane su za ćelije transfektovane sa AD-1955 u istom opsegu doza, ili do njene najmanje doze.
[0569] Smisao i antismisao sekvence AD-1955 su:
SMISAO: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 13);
ANTISMISAO: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 14).
Tabela 7 pokazuje rezultate provere pojedinačne doze u Hep3B ćelijama transfektovanim sa ukazanim GalNAc konjugovanim modifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat poruke relativno u odnosu na netretirane ćelije.
Table 8 pokazuje rezultate provere transfekcije pojedinačne doze kod primarnih hepatocita miševa transfektovanih sa ukazanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat poruke relativno u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 9 pokazuje rezultate provere pojedinačne doze za slobodan unos kod Cynomolgus hepatocita sa ukazanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat poruke relativno u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 10 pokazuje rezultate provere pojedinačne doze za slobodan unos kod primarnih hepatocita miševa sa ukazanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat poruke relativno u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 11 pokazuje proveru odgovora na dozu za slobodan unos kod primarnih Cynomolgus hepatocita sa ukazanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK.
Ukazane IC50vrednosti predstavljaju IC50vrednosti relativne u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 12 pokazuje proveru odgovora na dozu za slobodan unos kod primarnih hepatocita miševa sa ukazanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK.
Ukazane IC50vrednosti predstavljaju IC50vrednosti relativne u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 13 pokazuje rezultate provere za pojedinačnu dozu u Hep3B ćelijama transfektovanim sa ukazanim modifikovanim i nemodifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat poruke relativno u odnosu na netretirane ćelije.0.01nM doza je jedna biološka transfekcija i 1nM doza je duplikat biološke transfekcije.
Tabela 14 pokazuje rezultate provere za pojedinačnu dozu kod primarnih hepatocita miševa transfektovanih sa ukazanom modifikovanim i nemodifikovanim iRNK.
Podaci su izraženi kao procenat poruke relativno u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 15 pokazuje odgovor na dozu kod Hep3B ćelija transfektovanih sa ukazanim modifikovanim i nemodifikovanim iRNK. Ukazane IC50vrednosti predstavljaju IC50vrednosti relativne u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 16 pokazuje odgovor na dozu kod primarnih hepatocita miševa transfektovanih sa ukazanim modifikovanim i nemodifikovanim iRNK. Ukazane IC50vrednosti predstavljaju IC50vrednosti relativne u odnosu na netretirane ćelije.
Tabela 2: Skraćenice nukleotidnih monomera korišćenih u reprezentaciji sekvenci nukleinskih kiselina. Biće prihvaćeno da su ovi monomeri, kada predstavljaju oligonukleotid, međusobno povezani sa 5’-5’-fosfodiester vezama.
Tabela 3. Nemodifikovane i modifikovane sekvence smisao i antismisao lanca C5
Tabela 4. GalNAC konjugovane modifikovane sekvence smisao i antismisao lanca C
Tabela 5. Nemodifikovane sekvence smisao i antismisao lanca C5 dsRNK
Tabela 6. Modifikovane sekvence smisao i antismisao lanca C5 dsRNK
Oligo naziv vrste i pozicija u nukleotidnoj sekvenci GenBank zapisuju da se ciljevi antismisao lanca odnose n Tabela 7 – Proveravanje C5 pojedinačne doze u Hep3B ćelijama sa GalNAC konjugovanim iRNK
Tabela 8 – Provera transfekcije C5 pojedinačne doze kod primarnih hepatocita miševa sa GalNAC konjugovanim iRNK
Tabela 9 – Provera C5 pojedinačne doze kod primarnih Cynomolgus hepatocita sa GalNAC konjugovanim iRNK
Tabela 10 – Provera slobodnog unosa C5 pojedinačne doze kod primarnih hepatocita miša sa GalNAC konjugovanim iRNK
Tabela 11-IC50podaci kod primarnih Cynomolgus hepatocita sa GalNAC konjugovanim iRNK
Tabela 12-IC50podaci kod primarnih hepatocita miševa sa GalNAC konjugovanim iRNK
Tabela 13 – Provera C5 pojedinačne doze u Hep3B ćelijama sa modifikovanim i nemodifikovanim iRNK
Tabela 14 – Provera C5 pojedinačne doze kod primarnih hepatocita miševa sa modifikovanim i nemodifikovanim iRNK
Tabela 15 -IC50podaci u Hep3B ćelijama sa modifikovanim i nemodifikovanim iRNK
Tabela 16 -IC50podaci kod primarnih hepatocita miševa sa modifikovanim i nemodifikovanim iRNK
Primer 3. In vivo proveravanje
[0570] Pod set od sedam GalNAC konjugovanih iRNK izabran je za sledeće in vivo procenjivanje.
[0571] C57BL/6 miševi (N=3 po grupi) injektirani su subkutano sa 10mg/kg GalNAc konjugovanih dupleksa ili jednakom zapreminom Dulbecco’s fosfatom puferisanog fiziološkog rastvora (DPBS) (Life Technologies, Cat# 14040133). Četrdeset osam sati kasnije, miševi su primili eutanaziju i jetre su secirane i šok zamrznute u tečnom azotu. Jetre su postavljene u 2000 Geno/Grinder (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ). Približno 10mg praha jetre po uzorku korišćeno je za RNK izolaciju. Uzorci su homogenizovani u TissueLyserII (Qiagen Inc, Valencia, CA) i zatim je RNK ekstrahovana upotrebom RNeasy 96 Universal Tissue Kit (Qiagen Inc, , Cat#74881) što je praćeno protokolom od strane proizvođača upotrebom vakumske/rotirajuće tehnologije. RNK koncentracija je merena sa NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) i podešena je do 100ng/µl. cDNK i RT-PCR su izvršene kao što je opisano iznad.
[0572] Rezultati provere pojedinačnih doza prikazani su na Slici 2. Tabela 17 prikazuje rezultate provere in vivo pojedinačne doze sa ukazanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat preostale mRNK relativno u odnosu na DPBS tretirane miševe. Kolona „Eksperimenti“ daje spisak brojeva eksperimenata iz kojih je izračunata srednja vrednost. Standardna devijacija izračunata je od svih miševa u grupi iz svih analiziranih eksperimenata.
Tabela 17 -In vivo provera C5 pojedinačne doze
[0573] Dve najdelotvornije GalNAC konjugovane iRNK su dalje modifikovane tako da sadrže dodatne fosforotioat veze (Tabela 18) i delotvornost ovih dupleksa je određena in vivo kao što je opisano iznad. Rezultati provere pojedinačne doze prikazani su na Slici 3 i demonstriraju da su iRNK agensi sa dodatnim fosforotioat vezama delotvorniji nego oni iRNK agensi bez ili sa manje fosforotioat veza.
Tabela 18 - Fosforotioat modifikovane GalNAC konjugovane C5 iRNK
[0574] Imajući u vidu uticaj dodatnih fosforotioat veza na svojstvo utišavanja iRNK agenasa opisanih iznad, delotvornost GalNAC konjugovanih iRNK dupleksa uključujući fosforotioat veze (Tabela 19) određena je in vivo kao što je opisano iznad. Rezultati provere ovih pojedinačnih doza prikazani su na Slici 4.
[0575] Trajanje utišavanja AD-58642 in vivo određeno je davanjem pojedinačne doze od 2.5 mg/kg, 10 mg/kg, ili 25 mg/kg pacovima i određivanjem količine C5 proteina (Slika 5B) na dan 7 i aktivnosti C5 proteina (Slika 5A) na dane 4 i 7. Kao što je pokazano na Slici 5, postoji 50% smanjenja aktivnosti C5 proteina na dan 4 pri dozi od 25 mg/kg i na dan 7, više od 70% smanjenja aktivnosti C5 proteina.
[0576] Količina C5 proteina određena je Western blot analizom celog seruma. Aktivnost C5 proteina određena je hemolitičkim testom. Ukratko, fiksirani rastvor ljudskog C5 osiromašenog ljudskog seruma pomešan je sa serumom miša i inkubiran sa crvenim krvnim zrncima ovce obloženim antitelima u trajanju 1 sata. Apsorbancija hemoglobina je merena i % hemolize u poređenju sa referentnom krivom (pripremanje upotrebom serija rastvora seruma miša) je izračunat.
[0577] Delotvornost AD-58642 in vivo je takođe testirano kod miševa što je praćeno pojedinačnom subkutanom injekcijom od 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 25 mg/kg AD-58642. Na dan 5 C5 mRNK je testirana u uzorcima jetre upotrebom qPCR, C5 aktivnost je testirana za hemolizu i količina C5 proteina određena je sa Western blot analizom celog seruma.
[0578] Kao što je prikazano na Slikama 6A i 6B, bez obzira što ima samo malo poboljšanje (tj., oko 5%) delotvornosti AD-58462 pri inhibiranju C5 mRNK pri dozi od 25 mg/kg u poređenju sa dozom od 10 mg/kg, postoji srednja vrednost utišavanja od 85% sa dozom od 25 mg/kg. Dodatno, postoji dejstvo odgovora na dozu sa IC50od oko 2.5 mg/kg.
[0579] Slike 7A i 7B i 8 demonstriraju da je AD-58642 delotvorno za smanjenje količine C5 proteina (Slika 8) i C5 aktivnosti proteina (Slike 7A i 7B).
[0580] Trajanje utišavanja AD-58641 in vivo je takođe određeno subkutanim davanjem pojedinačne doze od 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, ili 10 mg/kg AD-58641 C57Bl/6 (n=3) miševima i određivanjem količine C5 proteina prisutne u ovim životinjama na dane 5 i 9 pomoću ELISA. Ukratko, serum je prikupljen na dane 0, pre krvarenja, dan 5 i dan 9 i nivoi proteina su kvantifikovani sa ELISA. Nivoi C5 proteina su normalizovani na dan 0 nivo pre krvarenja. Kao što je prikazano na Slici 9, rezultati su demonstrirali da postoji potentno i održivo obaranje C5 proteina u serumu zavisno od doze (ED50za pojedinačnu dozu je bila 0.6 mg/kg).
[0581] Jedinjenje AD-58641 takođe je testirano za delotvornost kod C57Bl/6 miševa upotrebom protokola sa davanjem više doza. Miševima je subkutano dato jedinjenje AD-58641 pri dozi od 0.625 mg/kg, 1.25 mg/kg, ili 2.5 mg/kg na dane 0, 1, 2, i 3. Serum je prikupljen na dane 0 i 8 kao što je prikazano na Slici 10 i analizirani su nivoi C5 proteina sa ELISA. C5 nivoi su normalizovani do nivoa pre krvarenja na dan 0. Slika 10 pokazuje da više doziranja AD-58641 ostvaruje utišavanje C5 proteina u svim testiranim dozama, sa više od 90% utišavanja C5 proteina pri dozi od 2.5 mg/kg.
[0582] Jedinjenje AD-58641 je dalje testirano za delotvornost i za određivanje kumulativnog dejstva jedinjenja kod pacova upotrebom ponovljenog protokola davanja. Sprague Dawley pacovi divljeg tipa su subkutano primili injekciju sa jedinjenjem AD-58641 pri 2.5 mg/kg/dozi ili 5.0 mg/kg/dozi dva puta nedeljno u toku 3 nedelje (q2w x3). Serum je prikupljen na dane 0, 4, 7, 11, 14, 18, 25, i 32. Hemolitička aktivnost seruma je kvantifikovana upotrebom testa hemolize u kojem je 1:150 rastvor seruma pacova inkubiran sa osetljivim crvenim krvnim zrncima ovce u GVB++ puferu u toku 1 sata i oslobađanje hemoglobina je kvantifikovano merenjem apsorbancije pri 415 nm (videti Sliku 11A).
Količina C5 proteina prisutna u uzorcima je takođe određena sa ELISA (Slika 11B). Rezultati pokazuju potentno i održivo smanjenje hemolitičke aktivnosti zavisno od doze, koje postiže inhibiranje 90% hemolitičke aktivnosti.
Tabela 19 – Dodatne fosforotioat modifikovane GalNAC konjugovane iRN
Primer 4: Dizajn, sinteza i in Vitro proveravanje dodatnih siRNK
siRNK dizajn
[0583] C5 dupleksi, dugački 19 nukleotida za oba, smisao i antismisao lanac, dizajnirani su upotrebom ljudske C5 mRNK sekvence iznete u GenBank Accession No. NM_001735.2. Petsto šezdeset devet dupleksa je prvenstveno identifikovano koji nisu sadržali ponavljanja duža od 7 nukleotida, proširujući suštinski celokupan transkript od 5480 nukleotida. Svih 569 dupleksa je zatim ocenjeno za predviđenu delotvornost u skladu sa linearnim modelom koji procenjuje nukleotidni par na svakoj poziciji u dupleksu, i doze i ćelijsku liniju koja se koristi za svako proveravanje. Dupleksi su se takođe poklapali sa svim transkriptima u ljudskoj RefSeq zbirci upotrebom nekomercijalnog brute-force algoritma, i ocenjeni su za najmanji broj nepoklapanja (po lancu) za transkripte koji nisu C5. Dupleksi koji treba da se sintetišu i provere su zatim izabrani iz 569, u skladu sa sledećom šemom: sa početkom na 5’ kraju transkripta, dupleks je izabran unutar „prozora“ svakog 10 ± 2 nukleotida koji
1) je imao najvišu predviđenu delotvornost,
2) je imao barem jedno nepoklapanje u oba lanca sa svim transkriptima koji nisu SERPINC1,
3) nije već bio sintetisan i proveren kao deo dupleks seta.
[0584] Ukoliko nijedan dupleks nije identifikovan u okviru datog prozora koji zadovoljava kriterijum, taj prozor je preskočen.
[0585] Detaljni spisak 569 C5 sekvence smisao i antismisao lanca prikazan je u Tabeli 20. In vitro delotvornost dupleksa koji sadrže smisao i antismisao sekvence izlistani u Tabeli 20 određeni su upotrebom sledećih metoda.
Ćelijska kultura i transfekcije
[0586] HepG2 ćelije (ATCC, Manassas, VA) su uzgajane skoro do spajanja pri 37°C u atmosferi od 5% CO2 u Eagle’s Minimum Essential Medium (ATCC) dopunjenom sa 10% FBS, streptomicinom i glutaminom (ATCC) pre oslobađanja sa ploče pomoću tripsinizacijom. Transfekcija je izvršena dodavanjem 14.8µl Opti-MEM plus 0.2µl Lipofectamine RNAiMax po otvoru (Invitrogen, Carlsbad CA. kat # 13778-150) u 5µl svakog od 164 siRNK dupleksa u pojedinačnom otvoru na ploči sa 96 otvora. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi u toku 15 minuta. 80µl potpuno formirane sredine bez antibiotika koja sadrži ~2.5 x10<4>HepG2 ćelija je zatim dodana u siRNK smešu. Ćelije su inkubirane 24 sata pre RNK prečišćavanja. Eksperimenti su izvršeni pri 20nM i obuhvatali su naivne ćelije i ćelije transfektovane sa AD-1955, iRNK koja cilja luciferazu kao negativne kontrole.
Ukupna RNK izolacija upotrebom DYNABEADS mRNK izolacioni komplet Kit (Invitrogen, deo #: 610-12)
[0587] Ćelije su prikupljene i lizirane u 150µl lizi/vezujućem puferu i zatim mešane 5 minuta pri 700 rpm na platformnom šejkeru (brzina mešanja je bila ista kroz ceo proces). Deset mikrolitara magnetnih zrna i 80µ sfmeše lize/vezujućeg pufera je dodato u ploču sa okruglim dnom i mešano je 1 minut. Magnetna zrna su uhvaćena upotrebom magnetnog stalka i supernatant je uklonjen bez remećenja zrna. Nakon uklanjanja supernatanta, lizirane ćelije su dodate preostalim zrnima i mešane su 5 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, magneta zrna su isprana 2 puta sa 150µl pufera za ispiranje A, i mešana su 1 minut. Zrna su opet uhvaćena i supernatant je uklonjen. Zrna su zatim isprana sa 150µl pufera za ispiranje B, uhvaćena i supernatant je uklonjen. Zrna su zatim isprana sa 150µl elucionog pufera, uhvaćena i supernatant je uklonjen. Zrna su ostavljena da se osuše 2 minuta. Nakon sušenja, 50µl elucionog pufera je dodato i mešano 5 minuta pri 70°C. Zrna su uhvaćena na magnetu 5 minuta. Četrdeset µl supernatanta, koji sadrži izolovanu iRNK je uklonjeno i dodato u drugu ploču sa 96 otvora.
cDNK sinteza upotrebom ABI visokog kapaciteta cDNK reverznog transkripcionog kompleta (Applied Biosystems, Foster City, CA, Kat #4368813)
[0588] Master smeša od 2µl 10X pufera, 0.8µl 25X dNTP, 2µl nasumičnih primera, 1µl reverzne transkriptaze, 1µl inhibitora RNaze i 3.2µl H2O po reakciji je dodato u 10µl ukupne RNK. cDNK je stvorena upotrebom Bio-Rad C-1000 ili S-1000 termalnog ciklera (Hercules, CA) kroz sledeće korake: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 sek, 4°C zadržavanje.
PCR u stvarnom vremenu
[0589] Dva µl cDNK je dodato u master smešu koja sadrži 0.5 µl ljuskog GAPDH TaqMan Probe (Applied Biosystems Kat #4326317E), 0.5µl ljudske SERPINC1 TaqMan sonde (Applied Biosystems kat # Hs00892758_ml) i 5µl Lightcycler 480 sonde master smeše (Roche Kat #04887301001) po otvoru u ploči sa 384 otvora (Roche kat # 04887301001). PCR u stvarnom vremenu je izvršen u LC480 Real Time PCR mašini (Roche).
[0590] Za računanje relativnog broja promena, podaci iz stvarnog vremena su analizirani upotrebom ΔΔCt metode i normalizovani su za testove izvršene sa ćelijama transfektovanim sa 20nM AD-1955.
Tabela 20: Dodatne C5 nemodifikovane sekvence smisao i antismisao lanc
Primer 5: In Vivo utišavanje C5
[0591] Grupe od tri ženke cynomolgus makakija tretirane su sa C5-siRNA AD-58641 subkutano u plećnim i srednje-dorzalnim oblastima leća pri dozama od 2.5 mg/kg ili 5 mg/kg ili sa kontrolom nosača. Dve ture doziranja su date sa osam doza u svakoj turi datim svakog trećeg dana. C5 u serumu je prikupljen i procenjen upotrebom ELISA testa specifičnog za C5 detekciju (Abcam) pri ukazanim vremenskim tačkama (Slika 13). Nivoi C5 su normalizovani do srednje vrednosti tri uzorka pre doziranja. Uzorci prikupljeni pre doziranja, i na dan 23 (24 sata nakon poslednje date doze u prvoj turi tretiranja) su analizirani kompletnom hemijom seruma, hematologijom i panelima koagulacije.
[0592] Analiza seruma nivoa C5 proteina u serumu relativnog u odnosu na nivo C5 proteina u serumu pre tretiranja pokazala je da režim doziranja 5 mg/kg AD-58641 smanjio nivoe C5 proteina u serumu do 98% (Slika 12). Srednji nivoi C5 u serumu su smanjeni za 97% pri nadiru, ukazujući da većina cirkulišućeg C5 je hepatskog porekla. Postojalo potentno i održivo obaranje nivoa C5 proteina u serumu zavisno od doze sa subkutanim davanjem AD-58641. Nisu primećene nikakve promene u hematologiji, hemiji seruma ili koagulacionim parametrima 24 sata nakon prve ture doze.
[0593] Hemolitička aktivnost u serumu je takođe analizirana upotrebom testa osetljivih eritrocita ovce za menjanje klasične aktivnosti puta. Procenat hemolize je izračunat relativno u odnosu na maksimalnu hemolizu i na hemolizu u pozadini u kontrolnim uzorcima. Srednje vrednosti hemolize /- SEM za tri životinje su izračunate i analizirane (Slika 13). Hemoliza je smanjena do 94% u 5 mg/kg režimu doziranja sa srednjom inhibicijom 92% u nadiru. Smanjenje hemolize je održavano više od dve nedelje nakon poslednje doze.
Primer 6: In Vitro proveravanje dodatnih siRNK
[0594] C5 sekvence smisao i antismisao lanca prikazane u Tabeli 20 su modifikovane na 3’-terminusu sa kratkom sekvencom dezoksi-timin nukleotida (dT) (Tabela 21). In vitro delotvornost dupleksa koji sadrže smisao i antismisao sekvence izlistane u Tabeli 21 je određen upotrebom sledećih metoda.
Ćelijska kultura i transfekcije
[0595] Hep3B ćelije (ATCC, Manassas, VA) su uzgajane skoro do spajanja pri 37°C u atmosferi od 5% CO2u EMEM (ATCC) dopunjenoj sa 10% FBS, pre nego što su oslobođene sa ploče tripsinizacijom. Transfekcija je izvršena dodavanjem 5 µl Opti-MEM plus 0.1 µl Lipofectamine RNAiMax po otvoru (Invitrogen, Carlsbad CA. kat # 13778-150) u 5 µl siRNK dupleksa po otvoru u ploči sa 384 otvora i inkubiranjem na sobnoj temperaturi 15 minuta. 40µl potpuno formirane sredine koja sadrži ∼5 x10<3>Hep3B ćelija je zatim dodato siRNK smeši. Ćelije su inkubirane 24 sata pre RNK prečišćavanja. Eksperimenti su izvršeni pri 10nM krajnje koncentracije dupleksa.
Ukupna RNK izolacija upotrebom DYNABEADS mRNK izolacionog kompleta (Invitrogen, deo #: 610-12)
[0596] RNK izolacija je izvršena upotrebo polu-automatizovanog procesa Biotek EL 405 ispirača. Ukratko, ćelije su lizirane 75 µl u lizi/vezujućem puferu koji sadrži 2ul Dynabead-a, i zatim su mešane 10 minuta na podešavanju 7 elektromagnetnog šejkera (Union Scientific). Magnetna zrna su zahvaćena upotrebom magnetnog stalka i supernatant je uklonjen. Nakon uklanjanja supernatanta, magnetna zrna su isprana sa 90µl pufera za ispiranje A, što je praćeno sa 90µl pufera za ispiranje B. Zrna su zatim isprana dva puta sa 100µl elucionog pufera koji je zatim aspiriran i cDNK se stvorila direktno na zrnima vezanim za RNK u ploči sa 384 otvora.
cDNK sinteza upotrebom ABI visokog kapaciteta cDNK reverznog transkripcionog kompleta (Applied Biosystems, Fester City, CA, Kat #4368813)
[0597] Master smeša 2µl 10X pufera, 0.8µl 25X dNTP, 2µl nasumičnih primera, 1µl reverzne transkriptaze, 1µl inhibitora RNaze i 3.2µl H2O po reakciji je dodato direktno u zrna vezana za RNK u ploči sa 384 otvora korišćenih za RNK izolaciju. Ploče su zatim tresene na elektromagnetom šejkeru 10 minuta i zatim su postavljene u inkubator na 37°C 2 sata. Nakon ove inkubacije, ploče su postavljene da se tresu u inkubatori na 80°C 7 minuta kako bi se deaktivirali enzimi i eluirale RNK/cDNK iz zrna.
PCR u stvarnom vremenu
[0598] 2µl cDNK je dodato u master smešu koja sadrži 0.5µl GAPDH TaqMan sondu (Applied Biosystems Kat #4326317E), 0.5µl C5 TaqMan sondu (Applied Biosystems kat # Hs00156197_M1) i 5µl Lightcycler 480 sondu master smešu (Roche Kat #04887301001) po otvoru u pločama sa 384 otvora (Roche kat # 04887301001). PCR u stvarnom vremenu je izvršeno u Roche LC480 Real Time PCR sistemu (Roche). Svaki dupleks je testiran u barem dve nezavisne transfekcije i svaka transfekcija je testirana u duplikatu.
[0599] Za računanje relativnog broja izmena, podaci u stvarnom vremenu su analizirani upotrebom ΔΔCt metode i normalizovani do testova izvršenih sa ćelijama transfektovanim sa 10nM AD-1955, ili sa lažnim transfektovanim ćelijama.
[0600] Tabela 22 pokazuje rezultate provere pojedinačne doze u Hep3B ćelijama transfektovanim sa ukazanim dT modifikovanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat preostale poruke relativne netretiranim ćelijama.
Tabela 21. dT modifikovane C5 iRNK
Tabela 22. Provera C5 pojedinačne doze (10mM) u Hep3B ćelijama sa dT modifikovanim iRNK
Primer 7: In Vivo proveravanje dodatne siRNK
[0601] Na osnovu sekvence AD-58643, dodatne četiri smisao i tri antismisao sekvence su sintetisane i upotrebljene za pripremanje dvanaest, 21/25 mer jedinjenja (Tabela 23).
Uopšteno, antismisao lanci ovih jedinjenja su produženi sa dTdT i dupleksi su imali manje fluoro-modifikovanih nukleotida.
[0602] C57BL/6 miševi (N=3 po grupi) je injektirano subkutano sa 1 mg/kg ovih GalNAc konjugovanih dupleksa, serum je prikupljen pre krvarenja na dan 0, i dan 5 i nivoi C5 proteina su kvantifikovani sa ELISA. Nivoi C5 proteina su normalizovani do nivoa pre krvarenja na dan 0.
[0603] Slike 14 pokazuju rezultate provere in vivo pojedinačne doze sa ukazanim iRNK. Podaci su izraženi kao procenat preostalog C5 proteina relativno u odnosu na nivoe pre krvarenja. Ove iRNK imaju poboljšanu delotvornost u poređenju sa uključenim roditeljskim jedinjenjem AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, i AD-62651. Ove iRNK su takođe pokazale slične potentnosti (IC50od oko 23-59 pM).
[0604] Delotvornost ovih iRNK je takođe testirana u C57B1/6 miševima upotrebom protokola sa davanjem pojedinačne doze. Miševima je subkutano davane AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, i AD-62651 pri dozama od 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, i 2.5 mg/kg. Serum je prikupljen na dane 0 i 5 i analiziran za nivoe C5 proteina sa ELISA. C5 nivoi su normalizovani da nivo pre krvarenja na dan 0.
[0605] Slika 15 pokazuje da postoji odgovor na dozu kod svih testiranih iRNK i da pojedinačno doziranje ovih iRNK ostvarilo utišavanje C5 proteina slično ili bolje od AD-58641.
[0606] Trajanje utišavanja AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, i AD-62651 in vivo je određeno davanjem pojedinačne doze od 1.0 mg/kg C57B1/6 miševima i određivanjem količine C5 proteina prisutne na dane 6, 13, 20, 27, i 34 sa ELISA. C5 nivoi su normalizovani na nivo pre krvarenja na dan 0.
[0607] Kao što je pokazano na Slici 16, svaki od testiranih iRNK ima istu kinetiku oporavka kao AD-62643 težeći najboljem utišavanju, ali unutar greške testa.
[0608] AD-62510, AD-62643, AD-62645, AD-62646, AD-62650, i AD-62651 dalje su testirani za delotvornost i za procenjivanje ukupnog dejstva iRNK kod pacova upotrebom protokola ponovljenog davanja. Sparague Dawley pacovi divljeg tipa su subkutano injektirani sa svakom iRNK pri 5.0 mg/kg/dozi na dane 0,4, i 7. Serum je prikupljen na dane 0,4,7,11, 14,18,25,28, i 32. Hemolitička aktivnost seruma je kvantifikovana kao što je opisano iznad.
[0609] Rezultati prikazani na Slici 17 pokazuju da sve od testiranih iRNK imaju potentnost i održivo smanjenje hemolitičke aktivnosti i imaju sličan oporavak hemolize sa praćenim AD-58641 tretiranja.
Tabela 23: Modifikovane sekvence smisao i antismisao lanca GalNac-konjugovanih C5

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi 1. Agens dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) pogodan za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5, gde navedena dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac, antismisao lanac sadrži oblast komplementarnosti koja sadrži barem 15 neprekidnih nukleotida iz nukleotidne sekvence SEQ ID NO:113. 2. dsRNK agens prema patentnom zahtevu 1, gde se oblast komplementarnosti sastoji iz nukleotidne sekvence SEQ ID NO:113. 3. dsRNK agens prema patentnom zahtevu 1, gde smisao i antismisao lanci sadrže nukleotidne sekvence SEQ ID NO:62 i SEQ ID NO:113, respektivno. 4. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde navedena dsRNK sadrži barem jedan modifikovani nukleotid, opciono, gde svi nukleotidi smisao lanci i svi nukleotidi antismisao lanci sadrže modifikaciju. 5. dsRNK agens prema patentnom zahtevu 4, gde je barem jedan od navedenih modifikovanih nukleotida izabran iz grupe koju čine 3’-terminalni dezoksi-timin (dT) nukleotid, 2’-O-metil modifikovani nukleotid, 2’-fluoro modifikovani nukleotid, 2’-dezoksimodifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid, 2’-amino-modifikovani nukleotid, 2’-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, nukleotid koji sadrži bazu koja nije prirodna, nukleotid koji sadrži 5’-fosforotioat grupu i terminalni nukleotid povezan za derivat holesterola ili bisdecilamid grupu dodekanoične kiseline. 6. dsRNK agens prema patentnom zahtevu 5, gde navedeni modifikovani nukleotidi sadrže kratku sekvencu 3’-terminalnih dezoksi-timin nukleotida (dT). 7. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde su suštinski svi nukleotidi smisao lanca i/ili antismisao lanca modifikovani nukleotidi izabrani iz grupe koju čine 2’-O-metil modifikacija, 2’-fluoro modifikacija i 3’-terminalni dezoksi-timin (dT) nukleotid. 8. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde (a) oblast komplementarnosti je barem 17 nukleotida dugačka, opciono je između 19 i 21 nukleotida dugačka, i dalje opciono je 19 nukleotida dugačka; (b) svaki lanac nije dugačak više od 30 nukleotida; (c) barem jedan lanac sadrži 3’ produžetak od barem 1-og nukleotida, opciono barem 2 nukleotida; i/ili (d) gde navedeni antismisao lanac sadrži barem 16, 17, 18, 19, ili 20 neprekidnih nukleotida iz nukleotidne sekvence SEQ ID NO:113, i gde se navedeni dsRNK agens razlikuje u svojoj sposobnosti da inhibira ekspresiju C5 gena za ne više od oko 5, 10, 15, 20, 25 ili 30% inhibicije iz dsRNK koja sadrži potpunu sekvencu. 9. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 dalje sadrži ligand, gde je ligand opciono konjugovan sa 3’ krajnja smisao lanca dsRNK agensa, gde je ligand dalje opciono derivat N-acetilgalaktozamina (GalNAc). 10. dsRNK agens prema patentnom zahtevu 9, gde je ligand
    gde je dsRNK agens opciono konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    i, gde X je O ili S; poželjno O. 11. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, gde je dsRNK agens izabran iz grupe koju čine of AD-58123 (SEQ ID NO: 122 i 173), AD-58643 (SEQ ID NO: 2873 i 2886), AD-62510 (SEQ ID NO: 2875 i 2888), AD-62643 (SEQ ID NO: 2876 i 2889), AD62645 (SEQ ID NO: 2878 i 2891), AD-62646 (SEQ ID NO: 2879 i 2892), AD-62650 (SEQ ID NO: 2884 i 2897), i AD-62651 (SEQ ID NO: 2885 i 2898). 12. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, gde smisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu i/ili antismisao lanac sadrži dve fosforotioat međunukleotidne veze na 5’-terminusu i dve fosforotioat međunukleotidne veze na 3’-terminusu. 13. Vektor koji enkodira barem jedan lanac dsRNK agensa prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je navedena dsRNK 30 ili manje baznih parova dugačka, i gde navedeni dsRNK agens cilja navedenu mRNK za cepanje. 14. Ćelija koja sadrži dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 ili vektor prema patentnom zahtevu 13. 15. Farmaceutski sastav pogodan za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5 gena koji sadrži dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12. 16. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 15, za upotrebu u metodi za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5 gena, gde je u navedenoj metodi RNKi agens opciono dat u nepuferisanom rastvoru, gde je dalje navedeni nepuferisani rastvor opciono fiziološki rastvor ili voda. 17. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, gde je navedeni RNKi agens dat u puferskom rastvoru, gde navedeni puferski rastvor opciono sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju kombinaciju navedenih, gde je navedeni puferski rastvor poželjno fosfatom puferisan fiziološki rastvor (PBS). 18. Farmaceutski sastav koji sadrži dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 i lipidna formulacija, gde lipidna formulacija opciono sadrži LNP, i/ili MC3. 19. In vitro metoda za inhibiranje ekspresije komponente komplementa C5 u ćeliji, gde metod obuhvata: (a) dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 ili farmaceutskim sastavom prema bilo kom od patentnih zahteva 15-18; i (b) održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) za vreme koje je dovoljno za ostvarenje degradacije mRNK transkripta komponente komplementa C5 gena, time inhibirajući ekspresiju komponente komplementa C5 gena u ćeliji, gde je ekspresija komponente komplementa C5 opciono inhibirana za barem oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 98% ili oko 100%. 20. dsRNK agens prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12 za upotrebu u metodi za tretiranje subjekta koji ima bolest ili poremećaj koji bi imao korist od smanjenja ekspresije komponente komplementa C5, ili za sprečavanje barem jednog simptoma kod navedenog subjekta, gde metoda obuhvata davanje subjektu terapeutski ili profilaktički delotvornu količinu dsRNK agensa ili farmaceutskog sastava prema bilo kom od patentnih zahteva 15-18, time tretirajući navedenog subjekta ili time sprečavajući barem jedan simptom kod subjekta, gde je navedeni subjekat opciono čovek, i gde dalje opciono (a) davanje dsRNK subjektu izaziva smanjenje intravaskularne hemolize, stabilizaciju nivoa hemoglobina i/ili smanjenje C5 proteina, ili (b) poremećaj predstavlja bolest povezanu sa komponentom komplementa C5, gde je bolest povezana sa komponentom komplementa C5 opciono izabrana iz grupe koju čine paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH), atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS), astma, reumatoidni artritis (RA); sindrom antifosfolipidnih antitela; lupus nefritis; povreda povezana sa ishemijom-reperfuzijom; tipični ili infektivni hemolitičko-uremijski sindrom (tHUS); bolest gustih depozita (DDD); neuromijelitis optika (NMO); multifokalna motorna neuropatija (MMN); multipla skleroza (MS); makularna degeneracija (npr., makularna degeneracija povezana sa starošću (AMD)); hemoliza, povišeni enzimi u jetri, i sindrom niskih trombocita (HELLP); trombocitička trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis, bulozna epidermoliza; rekurentan gubitak fetusa; pre-eklampsija, traumatska povreda mozga, mijastenija gravis, bolest hladnog aglutinina, bulozni dermatomiozitis pemfigoid, Shiga toksin E. coli-povezani hemolitičko-uremijski sindrom, C3 neuropatija, anti-neutrofil citoplazmični vaskulitis povezan sa antitelima, humoralno i vaskularno odbacivanje transplanta; disfunkcija kalema, infarkt miokarda, alogeni transplant, sepsa, koronarna bolest arterija, dermatomiozitis, Graves-ova bolest, ateroskleroza, Alchajmerova bolest, sepsa sistemskog inflamatornog odgovora, septički šok, povreda kičmene moždine, glomerulonefritis, Hashimoto-ov tiroiditis, tip I dijabetes, psorijaza, pemfigus, autoimuna hemolitička anemija (AIHA), ITP, Goodpasture-ov sindrom, Degos bolest, antifosfolipidni sindrom (APS), katastrofični APS (CAPS), kardiovaskularni poremećaj, miokarditis, cerebrovaskularni poremećaj, periferni vaskularni poremećaj, renovaskularni poremećaj, mesentrični/enterični vaskularni poremećaj, vaskulitis, Henoch-Schönlein purpura nefritis, vaskulitis povezan sa sistemskim lupus eritematozusom, vaskulitis povezan sa reumatoidnim artritisom, vaskulitis imunog kompleksa, Takayasu poremećaj, zakasnela kardiomiopatija, dijabetska angiopatija, Kawasaki bolest (arteritis), venska gasna embolija (VGE), i restenoza nakon postavljanja stenta, rotaciona aterektomija, membranska neuropatija, Guillain-Barre sindrom, i perkutana transluminalna koronarna angioplastika (PTCA), gde je bolest povezana sa komponentom komplementa C5 poželjno paroksizimalna noćna hemoglobinurija (PNH) ili atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS). 21. dsRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, gde (a) metoda dalje obuhvata davanje komponente anti-komplementa C5 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, subjektu; i/ili (b) se dsRNK agens daje u dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili od oko 0.5 mg/kg do oko 50 mg/kg, gde se opciono (i) dsRNK agens daje u dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg, ili u dozi izabrane iz grupe koju čine 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 30 mg/kg; (ii) dsRNK agens daje subjektu jednom nedeljno; (iii) dsRNK agens daje subjektu dva puta nedeljno; (iv) dsRNK agens daje subjektu dva puta mesečno; ili (v) dsRNK agens daje subjektu jednom mesečno; i/ili (c) dsRNK agens daje subjektu subkutano.
RS20171204A 2013-03-14 2014-03-13 Irnk sastavi komponente komplementa c5 i metode za njihovu upotrebu RS56663B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361782531P 2013-03-14 2013-03-14
US201361837399P 2013-06-20 2013-06-20
US201361904579P 2013-11-15 2013-11-15
US201361912777P 2013-12-06 2013-12-06
US201461942367P 2014-02-20 2014-02-20
PCT/US2014/025882 WO2014160129A2 (en) 2013-03-14 2014-03-13 Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
EP14722018.0A EP2970974B1 (en) 2013-03-14 2014-03-13 Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56663B1 true RS56663B1 (sr) 2018-03-30

Family

ID=50678278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171204A RS56663B1 (sr) 2013-03-14 2014-03-13 Irnk sastavi komponente komplementa c5 i metode za njihovu upotrebu

Country Status (35)

Country Link
US (7) US9249415B2 (sr)
EP (3) EP4649950A3 (sr)
JP (5) JP6524060B2 (sr)
KR (5) KR102905197B1 (sr)
CN (3) CN120574828A (sr)
AU (4) AU2014244116B9 (sr)
BR (1) BR112015022876B1 (sr)
CA (2) CA2904654C (sr)
CL (4) CL2015002710A1 (sr)
CR (1) CR20150493A (sr)
CY (1) CY1120289T1 (sr)
DK (1) DK2970974T3 (sr)
DO (1) DOP2015000234A (sr)
EA (1) EA201591707A1 (sr)
ES (1) ES2649490T3 (sr)
GT (1) GT201500293A (sr)
HK (1) HK1252501A1 (sr)
HR (1) HRP20171813T1 (sr)
HU (1) HUE034987T2 (sr)
IL (3) IL288931B2 (sr)
LT (1) LT2970974T (sr)
ME (1) ME03043B (sr)
MX (2) MX418589B (sr)
MY (1) MY201504A (sr)
NZ (1) NZ712336A (sr)
PE (2) PE20211393A1 (sr)
PL (1) PL2970974T3 (sr)
PT (1) PT2970974T (sr)
RS (1) RS56663B1 (sr)
SG (3) SG10201912286TA (sr)
SI (1) SI2970974T1 (sr)
SM (1) SMT201700552T1 (sr)
TW (5) TWI881304B (sr)
UY (2) UY35442A (sr)
WO (1) WO2014160129A2 (sr)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
SI3366775T2 (sl) 2011-11-18 2025-12-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modificirana sredstva RNAI
IL288931B2 (en) * 2013-03-14 2025-05-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions comprising a complementary portion of C5 IRNA and methods of using them
EP2978451B1 (en) 2013-03-29 2019-11-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
EA036496B1 (ru) * 2014-05-01 2020-11-17 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Конъюгированные олигонуклеотиды для модулирования экспрессии фактора комплемента b
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
WO2016040589A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
WO2016044419A1 (en) * 2014-09-16 2016-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
TW202503057A (zh) * 2014-10-10 2025-01-16 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於抑制hao1(羥酸氧化酶1(乙醇酸鹽氧化酶))基因表現的組合物及方法
US10036017B2 (en) 2015-02-17 2018-07-31 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of complement component 5(C5) by double-stranded RNA
US20190135903A1 (en) * 2015-03-31 2019-05-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patients
JP6695902B2 (ja) * 2015-05-06 2020-05-20 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）、及びキニノーゲン１（ＫＮＧ１）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
WO2016201301A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
CN107849567B (zh) * 2015-06-26 2024-07-23 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用
JP6666002B2 (ja) * 2015-10-07 2020-03-13 国立大学法人京都大学 Ｔｄｐ−４３プロテノパシーの予防又は治療用組成物
CA3024618A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis
EP3469083A1 (en) * 2016-06-10 2019-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
US20190351071A1 (en) * 2016-11-11 2019-11-21 Dnalite Therapeutics, Inc. Structures and methods for gene therapy
CA3043768A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
KR102365871B1 (ko) * 2017-01-31 2022-02-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 C5-관련 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 및 c5-관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법
TWI826364B (zh) * 2017-04-03 2023-12-21 德商因夫萊亞斯有限公司 活性抑制劑於發炎性疾病之治療
TWI786132B (zh) * 2017-06-23 2022-12-11 德商因夫萊亞斯有限公司 活性抑制劑於發炎性疾病之治療
CA3069451A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
SG11202002940QA (en) 2017-11-01 2020-04-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
DK3719128T3 (da) 2017-12-01 2025-03-03 Suzhou Ribo Life Science Co Ltd Dobbelt-strenget oligonukleotid, sammensætning og konjugat bestaende dobbelt-strenget oligonukleotid, fremgangsmåde herfor og anvendelse heraf
CA3083970A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
CN110944675B9 (zh) 2017-12-01 2024-08-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
EP3719126B1 (en) 2017-12-01 2025-01-01 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing nucleic acid, preparation method therefor and use thereof
EP3719127A4 (en) 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH IT, MANUFACTURING METHOD AND USE
AU2018394875B2 (en) 2017-12-29 2023-08-03 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
GB201800620D0 (en) 2018-01-15 2018-02-28 Univ Manchester C3b Binding Polypeptide
EP3597222A1 (en) 2018-07-16 2020-01-22 Easemedcontrol R & D GmbH & Co KG Treatment and diagnosis of unresolved inflammatory diseases
WO2020038377A1 (zh) 2018-08-21 2020-02-27 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途
WO2020060987A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use
US11896674B2 (en) 2018-09-30 2024-02-13 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof
US10526603B1 (en) 2018-10-26 2020-01-07 Eisai R&D Management Co., Ltd. Double-stranded ribonucleic acid capable of suppressing expression of complement C5
WO2020135673A1 (zh) 2018-12-28 2020-07-02 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
US11510939B1 (en) 2019-04-19 2022-11-29 Apellis Pharmaceuticals, Inc. RNAs for complement inhibition
KR20220011689A (ko) 2019-05-22 2022-01-28 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드 핵산, 약제학적 조성물, 접합체, 제조 방법, 및 용도
US12590304B2 (en) 2019-05-22 2026-03-31 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition, conjugate, preparation method, and use
AU2020280439B2 (en) 2019-05-22 2025-08-14 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, pharmaceutical composition, conjugate, preparation method, and use
CN113795582B (zh) 2019-05-24 2024-05-24 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN113795280B (zh) * 2019-05-24 2024-04-05 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
WO2021034639A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration anti-c5 formulations
BR112022003513A2 (pt) * 2019-08-27 2022-05-17 Silence Therapeutics Gmbh Ácidos nucleicos para inibição da expressão de c3 em uma célula
WO2021081026A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
CA3153195A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 John Davis Dosing regimens for treating or preventing c5-associated diseases
CN110865182B (zh) * 2019-11-19 2023-06-27 东莞市东阳光诊断产品有限公司 一种阻断剂及其在免疫检测中的应用
KR20220110827A (ko) 2019-12-09 2022-08-09 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 시신경척수염 스펙트럼 장애의 치료를 위한 항-c5 항체
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN111134115B (zh) * 2019-12-24 2021-08-10 东华大学 一种农药保持剂及其制备方法
JP6918197B2 (ja) * 2019-12-26 2021-08-11 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 脂質複合体を含む医薬組成物及び脂質ナノ粒子を含む医薬組成物
BR112022010742A2 (pt) * 2019-12-26 2022-08-16 Eisai R&D Man Co Ltd Composição farmacêutica contendo ácido ribonucleico de fita dupla que inibe a expressão de c5 complementar
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
IL295517A (en) * 2020-02-14 2022-10-01 Apellis Pharmaceuticals Inc Rnas for complement inhibition
EP4114947A1 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
JP2023523790A (ja) 2020-04-30 2023-06-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体因子Ｂ（ＣＦＢ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
TW202208427A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商因夫萊亞斯有限公司 人源化抗ｃ５ａ抗體
US20230323357A1 (en) * 2020-06-09 2023-10-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR ASSOCIATED FACTOR 6 (TRAF6) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
WO2022056127A2 (en) * 2020-09-09 2022-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing growth factor receptor bound protein 10 (grb10) or growth factor receptor bound protein 14 (grb14) in the liver
JP2024535850A (ja) 2021-09-17 2024-10-02 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体成分（Ｃ３）をサイレンシングするためのｉＲＮＡ組成物および方法
CN118302525A (zh) 2021-10-29 2024-07-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体因子B（CFB）iRNA组合物及其使用方法
US11957178B2 (en) 2021-11-15 2024-04-16 Apackaging Group Llc Aerosol actuator
WO2023088455A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
JP2024539149A (ja) * 2021-12-22 2024-10-28 エヌエー ヴァクシン インスティテュート 虚血・再灌流障害を予防または治療するための組成物及びその用途
WO2024008158A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 北京福元医药股份有限公司 用于抑制c5基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
CN119816596A (zh) * 2023-05-26 2025-04-11 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种抑制C5基因表达的dsRNA分子及其应用
US12180274B2 (en) 2023-05-26 2024-12-31 Inflarx Gmbh Treatment of pneumonia and ARDS with inhibitors of C5a and IL-6 activity
WO2024255747A1 (zh) * 2023-06-16 2024-12-19 施能康医药科技(苏州)有限公司 靶向补体成分5的核酸及其用途
WO2025034560A1 (en) * 2023-08-04 2025-02-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Aminoadipate-semialdehyde synthase (aass) irna compositions and methods of use thereof
WO2025143001A1 (ja) * 2023-12-27 2025-07-03 東亞合成株式会社 Ｃ５ ｒｎａ配列に基づく新規二本鎖ｒｎａ及びその利用
WO2025148349A1 (zh) * 2024-01-08 2025-07-17 润佳(上海)医药技术有限公司 一种抑制C5基因表达的dsRNA及其用途
WO2025252196A1 (zh) * 2024-06-06 2025-12-11 苏州吉玛基因股份有限公司 一种用于抑制补体成分C5表达的siRNA及其应用和产品

Family Cites Families (285)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
FR2623508B1 (fr) 1987-11-20 1990-04-20 Commissariat Energie Atomique Proteine basique denommee phospholipase a2 isolee de venin de serpent de la famille des elapides et sa sequence en amino-acides, derives et fragments de ladite proteine, leur procede d'obtention, compositions therapeutiques et agents de diagnostic contenant ladite proteine et/ou ses derives et/ou ses fragments
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
MY107332A (en) 1990-08-03 1995-11-30 Sterling Drug Inc Compounds and methods for inhibiting gene expression.
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
CA2124087C (en) 1991-11-22 2002-10-01 James L. Winkler Combinatorial strategies for polymer synthesis
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
JP3131222B2 (ja) 1991-12-24 2001-01-31 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
KR100283601B1 (ko) 1993-02-19 2001-03-02 아만 히데아키 글리세롤 유도체, 디바이스 및 의약 조성물
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
CA2176256A1 (en) 1993-11-16 1995-05-26 Lyle John Arnold, Jr. Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
WO1996027606A1 (en) 1995-03-06 1996-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
CA2220950A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5976567A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Inex Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
CA2234931C (en) 1995-10-16 2010-01-19 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
CA2294988C (en) 1997-07-01 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
EA200000702A1 (ru) 1997-12-24 2000-12-25 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Пролекарства ингибиторов аспартилпротеаз
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
AU747597B2 (en) 1998-07-20 2002-05-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
JP2002527061A (ja) 1998-10-09 2002-08-27 インジーン・インコーポレイテッド ｓｓＤＮＡの酵素的合成
MXPA01003643A (es) 1998-10-09 2003-07-21 Ingene Inc Produccion de adnss in vivo.
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
TNSN00027A1 (fr) 1999-02-12 2005-11-10 Vertex Pharma Inhibiteurs de l'aspartyle protease
EP1156812A4 (en) 1999-02-23 2004-09-29 Isis Pharmaceuticals Inc MULTIPARTICULAR FORMULATION
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US7053207B2 (en) 1999-05-04 2006-05-30 Exiqon A/S L-ribo-LNA analogues
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
JP4413493B2 (ja) 2000-10-04 2010-02-10 サンタリス ファーマ アー／エス プリンｌｎａ類似体の改善された合成方法
AU2002323151A1 (en) 2001-08-13 2003-03-03 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
AU2003295600A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
WO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
WO2006126040A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Rosetta Genomics Ltd. Bacterial and bacterial associated mirnas and uses thereof
WO2007090071A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1989307B1 (en) 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
NZ571791A (en) 2006-03-08 2012-03-30 Archemix Llc Complement binding aptamers and anti-C5 agents useful in the treatment of ocular disorders
KR101221589B1 (ko) 2006-04-07 2013-01-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물
CA2927045A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations
ES2526295T5 (es) * 2006-10-18 2021-05-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos antisentido
CN101657097A (zh) * 2007-03-01 2010-02-24 先进视觉疗法公司 以炎症为特征的疾病的治疗
AU2008228247A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
EP2357231A2 (en) 2007-07-09 2011-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds
WO2009073809A2 (en) 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
CA2713379A1 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
US8940299B2 (en) * 2008-02-28 2015-01-27 Case Western Reserve University Method of treating cancer
WO2009111701A2 (en) * 2008-03-06 2009-09-11 Case Western Reserve University Method of treating t cell mediated disorders
WO2011056972A2 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Case Western Reserve University Compositions and methods of treating a t cell mediated disorder
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
CA2962219C (en) * 2008-10-22 2020-08-25 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating eye disorders
CA2742802C (en) 2008-11-10 2019-11-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating complement-associated disorders
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
JP5894913B2 (ja) * 2009-06-15 2016-03-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
CA2766565A1 (en) 2009-06-23 2010-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2011078672A1 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Prosensa Technologies B.V. Molecule for treating an inflammatory disorder
ES2615732T3 (es) 2010-03-01 2017-06-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Composiciones para tratar la enfermedad de Degos
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
SI3366775T2 (sl) * 2011-11-18 2025-12-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modificirana sredstva RNAI
EP3730618A1 (en) * 2011-11-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
CA2873776A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating pten expression
IL288931B2 (en) 2013-03-14 2025-05-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions comprising a complementary portion of C5 IRNA and methods of using them
EP2978451B1 (en) 2013-03-29 2019-11-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
US10278986B2 (en) 2014-08-14 2019-05-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Antibody-siRNA conjugates and uses therefor
WO2016040589A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
WO2016044419A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
US10036017B2 (en) 2015-02-17 2018-07-31 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of complement component 5(C5) by double-stranded RNA
WO2016201301A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
EP3469083A1 (en) 2016-06-10 2019-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
CN116769024A (zh) 2016-06-14 2023-09-19 瑞泽恩制药公司 抗c5抗体及其用途
US11504391B1 (en) 2016-11-23 2022-11-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNA agents with reduced off-target effect
CA3274059A1 (en) 2017-12-13 2026-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody combinations and uses thereof
WO2020060987A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use
WO2020097044A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double stranded oligonucleotides
WO2021034639A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration anti-c5 formulations
CA3153195A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 John Davis Dosing regimens for treating or preventing c5-associated diseases
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2024008158A1 (zh) 2022-07-07 2024-01-11 北京福元医药股份有限公司 用于抑制c5基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
JP2025531341A (ja) 2022-09-19 2025-09-19 カイロンノヴァ （シャーメン） バイオファーマ カンパニー，リミテッド 炭水化物－オリゴヌクレオチド複合体、薬物組成物および治療への応用
IL319076A (en) 2022-09-20 2025-04-01 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co Ltd A defined modified RNAi factor and its composition
JP2025536552A (ja) 2022-10-28 2025-11-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗Ｃ５抗体／Ｃ５ ｉＲＮＡ合剤および併用療法
WO2024169908A1 (zh) 2023-02-17 2024-08-22 苏州时安生物技术有限公司 一种调节补体C5表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途

Also Published As

Publication number Publication date
IL288931A (en) 2022-02-01
KR20210156330A (ko) 2021-12-24
MY201504A (en) 2024-02-27
US20160244763A1 (en) 2016-08-25
NZ712336A (en) 2020-03-27
AU2023200132A1 (en) 2023-04-13
TW202528542A (zh) 2025-07-16
DOP2015000234A (es) 2015-12-31
TW201505637A (zh) 2015-02-16
CA3216595A1 (en) 2014-10-02
AU2020204161B2 (en) 2022-10-13
CN114015692B (zh) 2024-12-31
CN120574828A (zh) 2025-09-02
KR20260006699A (ko) 2026-01-13
IL265594B (en) 2022-01-01
JP2021176868A (ja) 2021-11-11
AU2023200132B2 (en) 2025-07-24
TWI881304B (zh) 2025-04-21
JP7404308B2 (ja) 2023-12-25
ES2649490T3 (es) 2018-01-12
KR102605775B1 (ko) 2023-11-29
HK1252501A1 (en) 2019-05-31
EP2970974A2 (en) 2016-01-20
SMT201700552T1 (it) 2018-01-11
PE20160046A1 (es) 2016-02-14
US20220090068A1 (en) 2022-03-24
US20160108401A1 (en) 2016-04-21
GT201500293A (es) 2018-12-18
BR112015022876B1 (pt) 2022-03-15
CL2019000107A1 (es) 2020-04-03
TW201932597A (zh) 2019-08-16
ME03043B (me) 2018-10-20
TWI808369B (zh) 2023-07-11
MX2019008380A (es) 2019-09-09
US9850488B2 (en) 2017-12-26
CN105324485A (zh) 2016-02-10
WO2014160129A3 (en) 2014-12-04
JP2019142944A (ja) 2019-08-29
DK2970974T3 (en) 2017-12-04
UY40039A (es) 2023-01-31
JP7717783B2 (ja) 2025-08-04
US20170268005A1 (en) 2017-09-21
TW202325847A (zh) 2023-07-01
PT2970974T (pt) 2017-11-29
KR102234620B1 (ko) 2021-04-05
HRP20171813T1 (hr) 2017-12-29
KR102905197B1 (ko) 2025-12-31
TW202118875A (zh) 2021-05-16
SG11201507400SA (en) 2015-10-29
AU2014244116A1 (en) 2015-10-01
KR20230162998A (ko) 2023-11-29
PE20211393A1 (es) 2021-07-27
AU2014244116B9 (en) 2020-08-13
NZ751385A (en) 2021-05-28
LT2970974T (lt) 2017-12-11
US11162098B2 (en) 2021-11-02
AU2025256083A1 (en) 2025-11-13
EP4649950A2 (en) 2025-11-19
CL2017002014A1 (es) 2018-04-27
JP6914292B2 (ja) 2021-08-04
IL288931B2 (en) 2025-05-01
EP2970974B1 (en) 2017-08-23
CN105324485B (zh) 2021-11-23
MX2015012796A (es) 2016-02-03
PL2970974T3 (pl) 2018-01-31
IL317249A (en) 2025-01-01
BR112015022876A2 (pt) 2017-11-07
KR102342916B1 (ko) 2021-12-24
CN114015692A (zh) 2022-02-08
IL288931B1 (en) 2025-01-01
CR20150493A (es) 2016-03-28
HK1221484A1 (zh) 2017-06-02
US20200032259A1 (en) 2020-01-30
US20150247143A1 (en) 2015-09-03
MX418589B (es) 2024-12-09
JP2024037871A (ja) 2024-03-19
AU2014244116B2 (en) 2020-03-26
WO2014160129A2 (en) 2014-10-02
CY1120289T1 (el) 2019-07-10
TWI660731B (zh) 2019-06-01
HUE034987T2 (en) 2018-05-02
US12590305B2 (en) 2026-03-31
EP3312281A3 (en) 2018-06-27
US9249415B2 (en) 2016-02-02
AU2020204161A1 (en) 2020-07-09
CL2016000882A1 (es) 2016-12-09
SG10201912286TA (en) 2020-02-27
UY35442A (es) 2014-10-31
CL2015002710A1 (es) 2016-04-22
TWI745684B (zh) 2021-11-11
IL265594A (en) 2019-05-30
KR20150127243A (ko) 2015-11-16
JP2025160304A (ja) 2025-10-22
US20240271136A1 (en) 2024-08-15
MX366660B (es) 2019-07-18
JP2016518331A (ja) 2016-06-23
US9701963B2 (en) 2017-07-11
EP3312281A2 (en) 2018-04-25
JP6524060B2 (ja) 2019-06-05
CA2904654A1 (en) 2014-10-02
CA2904654C (en) 2023-12-05
KR20210034124A (ko) 2021-03-29
SG10201700239UA (en) 2017-02-27
SI2970974T1 (sl) 2017-12-29
EA201591707A1 (ru) 2016-03-31
US11873491B2 (en) 2024-01-16
EP4649950A3 (en) 2026-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12590305B2 (en) Complement component C5 iRNA compositions and methods of use thereof
JP7602507B2 (ja) 補体成分ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
US20200032258A1 (en) Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
JP2025081296A (ja) 補体成分Ｃ５ｉＲＮＡ組成物及び発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）を処置するためのその使用方法
EP3307316A1 (en) Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof