RS57255B1

RS57255B1 - Anti-il-17 antitela

Info

Publication number: RS57255B1
Application number: RS20180601A
Authority: RS
Inventors: Barrett Allan; Chi-Kin Chow; Lihua Huang; Ling Liu; Jirong Lu; Kingman Ng; Jonathan Wendell Tetreault; Andrew Gordon Werner
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-05
Publication date: 2018-08-31
Also published as: US20110027290A1; CY1113097T1; LTC1963368I2; LT2481753T; CY1120365T1; PL2481753T3; JP5063612B2; PL1963368T6; EP2481753B1; AU2006325860B2; KR101158959B1; DK2481753T3; DK1963368T6; US20080269467A1; HUS1600037I1; CY2016030I2; RS52509B2; US7838638B2; NO20082905L; PT2481753T

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti medicine, naročito u oblasti monoklonskih antitela na IL-17 čoveka. Pronalazak se odnosi na neutralizaciju anti-IL-17 monoklonskih antitela koja se sa visokim afinitetom vezuju za IL-17 ne-linearni ili konformacioni antigenski epitop koji sadrži aminokiseline DGNVDYH. Antitela pronalaska mogu da budu himerna, humanizovana ili humana antitela, imunokonjugati antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti i korisna su kao lekovi za lečenje autoimunih, inflamatornih poremećaja, poremećaja ćelijske proliferacije i poremećaja razvoja.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Familija IL-17 citokina trenutno obuhvata IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E i IL-17F. Svi članovi familije IL-17 imaju visoko konzervirane ostatke cisteina koji su uključeni u formiranje intralančanih disulfidnih veza i imaju dva ili više cisteinska ostatka koji se mogu uključiti u interlančano disulfidno vezivanje. Članovi IL-17 familije nemaju sekvencu sličnu bilo kojim drugim citokinima. Međutim, virusni homolog IL-17A je nađen u otvorenom okviru čitanja 13 herpesvirus saimiri (Yao, Z. et al., Immunity, 3:811, 1995) i ima 72% identičnosti aminokiselinskih ostataka sa humanim IL-17A. Višestruke funkcije su prijavljene za članove familije IL-17 koji pretežno mogu da obuhvataju regulaciju imunog odgovora.

[0003] Interleukin 17 (IL-17, takođe označen i kao IL-17A) je homodimerni glikoprotein od 20-30 kD dobijen pretežno pomoću aktiviranih CD4+ T ćeija i deluje kao proinflamatorni citokin. Kada je određeni član familije IL-17 označen jednostavno kao "IL-17," treba shvatiti da je član familije na koji se odnosi označen kao IL-17A. IL-17 izlučuju aktivirane T ćelije na mesta inflamacije, a ne u sistemskoj cirkulaciji. IL-17 se vezuje za tip I transmembranski receptor označen kao IL-17R koji je veliki sveprisutan eksprimiran protein koji ne pokazuje značajnu sličnost se sekvencama drugih poznatih receptora citokina. IL-17 ima brojne biološke osobine, uključujući ushodnu regulaciju adehzionih molekula i indukovanje proizvodnje višestrukih inflamatornih citokina i hemokina od različitih ćelijskih tipova uključujući sinoviocite, hondrocite, fibroblaste, endotelne ćelije, epitelijalne ćelije, keratinocite i makrofage. Takođe, IL-17 indukuje angažovanje neutrofila na inflamatorno mesto preko indukcije oslobađanja hemokina, stimuliše proizvodnju prostaglandina i metaloproteinaza i inhibira sintezu proteoglikana. Dalje, IL-17 igra važnu ulogu u sazrevanju hematopoetičnih progenitor ćelija. Pokazano je da IL-17 ima signalizirajuću ulogu u različitim organima i tkivima uključujući pluća, artikularnu hrskavicu, kosti, mozak, hematopoetske ćelije, bubrege, kožu i creva. Za pregled bioaktivnosti IL-17 videti, npr., Kolls and Linden, lmmunity 21:467-476, 2004, ili Fossiez, et al. Int. Rev. Immunol. 16:541, 1998.

[0004] Povećani nivoi IL-17 (tj., IL-17A) su povezani sa nekoliko stanja, bolesti ili poremećaja koji uključuju inflamaciju disajnih puteva, reumatoidni artritis ("RA"), osteoartritis, eroziju kostiju, intraperitonealne abscese i adhezije, inflamatorni poremećaj creva ("IBD"), odbacivanje alografta, psorijazu, određene tipove kancera, angiogenezu, aterosklerozu i multiplu sklerozu ("MS") (za pregled videti Witkowski, et al, Cell. Mol. Life Sci. 61:567-579, 2004). I IL-17 i IL-17R su ushodno regulisani u sinovijalnom tkivu RA pacijenata. Blokiranje bioaktivnosti IL-17 vezivanjem IL-17 specifičnog antitela ili rastvorljivog receptora za IL-17 smanjuje inflamaciju i eroziju kostiju u različitim modelima artritisa kod životinja. (videti, npr., Lubberts et al, Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004). Dalje, IL-17 ima IL-13 nezavisne efekte na razlaganje matriksa kolegena i inflamaciju i oštećenje zglova, dok IL-17 ima sinergiju sa TNF-a tako da pojačava inflamaciju.

[0005] Tako, prema lokalizovanoj distribuciji na mestu inflamacije, čini se da je IL-17 novo ciljno mesto za lečenje RA i drugih inflamatornih ili autoimunih bolesti sa potencijalno boljim profilom bezbednosti od lekova koji ciljno deluju na sistemsku cirkulaciju proinflamatornih citokina kao što je TNF-a. Trenutno je FDA odobrila bioproizvode (ENBREL®, REMICADE® i HUMIRA® antitela) koja se vezuju za i neutrališu TNF-a, a koja pokazuju efikasnost u smanjenju znakova i simptoma RA i u usporavanju napredovanja bolesti u podgrupi pacijenata sa RA. Međutim, svi pacijenti sa RA ne odgovaraju jednako na inhibiciju TNF-a bioaktivnosti sa ovim bioproizvodima. Dodatno, iRNK IL-17 je povećana u lezijama multiple skelroze i u mononuklearnim ćelijama u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti pacijenata sa MS-om, posebno tokom kliničkog pogoršanja. Shodno ovom, postoji potreba za kompozicijama koje antagonizuju ili neutrališu aktivnost IL-17 da bi se lečili poremećaji, bolesti ili stanja gde prisustvo bioaktivnosti IL-17 uzrokuje ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili gde smanjenje bioaktivnosti IL-17 doprinosi željenom terapeutskom efektu, uključujući inflamatorne poremećaje, poremećaje ćelijske proliferacije i poremećaje u razvoju i autoimune poremećaje kao što su RA i MS i IBD.

[0006] Giavedoni, L D, Journal of Immunological Methods, Vol. 301, Nos.1-2, 89-101, June 2005, opisuje istovremenu detekciju višestrkih citokina i hemokina od nehumanih primata upotrebom lumineks tehnologije. Tri anti-IL-17 antitela su navedena u Tabeli 1.

[0007] Moseley, T a, et al, Cytokine and Growth Factor Reviews, Vol. 14, No. 2, 155-174, April 2003, opisuju familiju interleukina-17 i IL-17 receptora.

[0008] WO 2004/106377 opisuje postupak dobijanja antitela sa željenom funkcijom. Anti-IL-17 antitela C9 i D12 opisana su u Tabeli 4.

[0009] Hofstetter et al, Gellular Immunology, Vol.237, No.2 123-130, October 2005, opisuju terapeutsku efikasnost neutralizacije IL-17 kod mišijeg eksperimentalnog autoimunog encefalomijeltisa. Nađeno je da neutralizacija IL-17 sa monoklonskim antitelom poboljšava tok bolesti. Postoji potreba za neutralizacijom anti-IL-17 antitela koje specifično vezuje IL-17 humanog porekla kao i IL-17 nehumanog sisara na taj način omogućavajući da se antitelo upotrebi u prekliničkim i kliničkim in vivo ispitivanjima. Dalje, postoji potreba za antitelom specifičnim za IL-17 koje vezuje IL-17 sa visokim afinitetom i/ili sporo disocira omogućavajući time da se efikasna terapeutska doza minimizuje, što omogućuje ređe doziranje takvim antitelom nego antitelom koje vezuje IL-17 sa manjim afinitetom (tj. većom KD) i/ili ima bržu disocijaciju. Specifično antitelo sa visokim afinitetom za IL-17 je takođe poželjno tako da može da omogući antitelu da bude primenjeno na pacijenta subkutano, pre nego intravenski. Takođe postoji potreba za IL-17-specifičnim antitelom sa niskom vrednošću IC50u testu bioaktivnosti IL-17 da bi se dobilo terapeutsko anti-IL-17 antitelo sa minimalnom efikasnom terapeutskom dozom. Takođe je poželjno obezbediti antitelo specifično za IL-17 pri čemu je imuni odgovor na antitelo koji je izazavan kod pacijenta koji prima antitelo, smanjen na minimum. Predmetni pronalazak zadovoljava ove potrebe i pruža povezane prednosti.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0010] Prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovano anti-IL-17 monoklonsko antitelo, pri čemu navedeno antitelo sadrži LCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 241 i HCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 118 i pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4.

[0011] Poželjno, farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijens.

[0012] Poželjnije, farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku sadrži antitelo koje gradi kontakt sa peptidom DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) unutar konteksta humanog IL-17 cele dužine. Farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku je poželjno za upotrebu u lečenju jednog ili više stanja izabranih od reumatoidnog artritisa, inflamatornog poremećaja creva, psorijaze i multiple skleroze.

[0013] Antitela pronalaska su himerna, humanizovana ili potpuno humana anti-IL-17 monoklonska antitela, i njegovi antigen-vezujući delovi, koji vezuju ne-linearni epitop koji sadrži IL-17 aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) i antagonizuju ili neutrališu najmanje jednu in vitro ili in vivo biološku aktivnost povezanu sa IL-17 ili njegovim delom.

[0014] U jednom primeru izvođenja, antitela imaju IC50manje od ili jednake oko 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600pM, 560 pM ili 500 pM u in vitro IL-8 reporter analizi, kao što je opisano, na primer, u Primeru 6A ili manju od ili jednaku 560 pM u in vitro GROα Reporter analizi kao što je opisano, na primer, u Primeru 6B ovde.

[0015] U sledećem primeru izvođenja, antitela su okarakterisana snažnim afinitetom vezivanja (Kd) za humani IL-17, tj., manjim od oko 7 pM, 6.5 pM, 6.0 pM, 5.5 pM, 5.0 pM, 4.5 pM ili 4.0 pM. Alternativno, antitela su okarakterisana sa KDza humani IL-17 ne većim od oko 7 pM, 6.5 pM, 6.0 pM, 5.5 pM, 5.0 pM, 4.5 pM li poželjno ne većim od oko 4.0 pM. Poželjno, antitela pronalaska su dalje okarakterisana stopom koffza humani IL-17 ili manjom od 2 x 10<-5>s<-1>. Antitelo je okarakterisano specifičnim vezivanjem humanog IL-17 kao i IL-17 makaki majmuna, dok ne vezuje IL-17 miša ili pacova na nivoima većim od početne vrednosti. Dodatno, anti-IL-17 antitelo pronalaska vezuje humani IL-17 (tj., IL-17A), ali ne vezuje i humani IL-17B, C, D, E ili F. Antitelo može da sadrži/sadrži varijabilni region lakog lanca ("LCVR") polipeptida koji sadrži 3 CDR sekvence koje su prisutne zajedno u Fab navedene u Tabeli 3 u daljem tekstu i koje se nalaze u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenim Tabeli 3. Poželjno anti-IL-17 monoklonsko antitelo sadrži LCVR polipeptid sa amino kiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 178-243. Antitelo može da sadrži varijabilni region teškog lanca ("HCVR") polipeptida koji sadrži 3 CDR koji su zajedno prisutni u Fab navedenim u Tabeli 2 u daljem tekstu i koji su prisutni u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenim u Tabeli 2. Poželjno, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska sadrži HCVR polipeptid sa aminokiselinskom sevencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BRs: 56-121. Anti-IL-17 antitelo može da sadrži LCVR polipeptid koji sadrži 3 CDR koji su zajedno prisutni u Fab navedenim u Tabeli 3 i koji su poželjno prisutni u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenom u Tabeli 3 i dalje sadrži HCVR polipeptid koji sadrži 3 CDR koji su zajedno prisutni u Fab navedenim u Tabeli 2 i koji su prisutni u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenom u Tabeli 2. Poželjno, 6 CDR antitela pronalaska ili njegovog funkcionalnog fragmenta postoje zajedno u Fab navedenim u Tabeli 1 u daljem tekstu i prisutni su u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenom u Tabeli 1. Anti-IL-17 antitelo može da sadrži (i) LCVR polipeptid sa aminokiseinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoj iod SEQ ID NOs: 178-243 i (ii) HCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 56-121. U poželjnijem primeru izvođenja, antitelo pronalaska koje sadrži LCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 178-243 dalje sadrži HCVR polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji iod SEQ ID NOS: 56-121 prisutan u Fab navedenom u Tabeli 1 koji sadrži određeni LCVR prsutan u antitelu. Anti-IL-17 antitelo može biti ono koje može da bude u kompeticiji za vezivanje za humani IL-17, ili deo humanog IL-17, sa konkurentnim antitelom, pri čemu konkurentno antitelo sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NOS: 241 i 118. Anti-IL-17 antitelo može da sadrži 1, 2 ili 3 peptida, poželjno 3 peptida, odabrana iz grupe koja se sastoji od peptida sa sekvencom kao što je prikazana u (a) SEQ ID NOs: 122-149; (b) SEQ ID NOs: 150-167, i (c) SEQ ID NOs:168-177 (tj. jedan peptid iz (a), jedan peptid iz (b) i jedan peptid iz (c) za antitelo koje sadrži 3 navedena peptida). Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 122-149, kada je prisutan u antitelu pronalaska je na CDRL1. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska je na CDRL2. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska je na CDRL3. HCVR anti-IL-17 antitela može da sarži 1, 2 ili 3 peptida, poželjno 3 peptida, odabrana iz grupe koja se sastoji od peptida sa sekvencom kao što je prikazana u (a) SEQ ID NOs: 11-28; (b) SEQ ID NOs: 29-32, i (c) SEQ ID NOs: 33-55 i 261 (tj., jedan peptid iz (a), jedan peptid iz (b) i jedan peptid iz (c) za antitelo sadrži 3 navedena peptida). Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 11-28, kada je prisutan u navedenom antitelu je na CDRH1. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 29-32, kada je prisutan u navedenom antitelu je na CDRH2. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 33-55 i 261, kada je prusutan u navedenom antitelu je na CDRH3. Dalje je otkriveno anti-IL-17 monoklonsko antitelo koje sadrži šest peptida koji su odrabrani iz grupe koja se sastoji od peptida sa sekvencom kao što je prikazana u (a) SEQ ID NOs: 122-149; (b) SEQ ID NOs: 150-167, (c) SEQ ID NOs:168-177, (d) SEQ ID NOs: 1128; (e) SEQ ID NOs: 29-32, i (f) SEQ ID NOs: 33-55 i 261 (tj., jedan peptid iz svake od (af)); poželjno šest peptida koegzistiraju u Fab u Tabeli 1 ovde. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 122- 149, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL1. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL2. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL3. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 11-28, kada je prisutan u navedenom antitelu, je na CDRH1. Peptid sa sekvencom SEQ ID NOs: 29-32, kada je prisutan u navedenom antitelu, je na CDRH2 Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs: 33-55 I 261, kada je prisutan u navedenom antitelu, je na CDRH3. Dalje je otkriveno anti-IL-17 monoklonsko antitelo koje sadrži šest peptida sa sekvencama kao što su prikazane u SEQ ID NOs: 247, 248, 249, 244, 245 i 246. Peptid sa sekvencom SEQ ID NO: 247 je na CDRL1. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 248 je na CDRL2. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 249 je na CDRL3. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 244 je na CDRH1. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 245 je na CDRH2. Peptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 246 je na CDRH3.

[0016] Anti-IL-17 monoklonsko antitelo može da sadrži ili da se sastoji od intaktnog antitela (tj., cele dužine), značajno intaktnog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, npr., Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta ili jednolančanog Fv fragmenta. Dalje, antitelo pronalaska može da bude obeleženo oznakom koja se može detektovati, imobilizovano na čvrstoj fazi i/ili konjugovano sa heterolognim jedinjenjem, npr., enzimom, toksinom ili molekulom polietilen glikola. Otkriven je postupak za pripremu anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska koji sadrži održavanje ćelije domaćina pronalaska (tj., ćelije domaćina koja je tranformisana, pretvorena ili inficirana vektorom (ili vektorima) pronalaska koja eksprimira antitelo pronalaska) pod uslovima koji su odgovarajući za eksprimiranje monoklonskog antitela pronalaska, pri čemu je eksprimirano takvo antitelo. Postupak može dalje da obuhvata korak izolovanja monoklonskog antitela pronalaska iz ćelije ili poželjno iz medijuma kulture u kome je ćelija gajena.

[0017] Razmatrane su dijagnostičke upotrebe za monoklonska antitela pronalaska. U jednoj dijagnostičkoj primeni, pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje nivoa IL-17 proteina u uzorku koji sadrži izlaganje uzorka koji se testira anti-IL-17 antitelu pronalaska pod uslovima vezivanja i određivanje specifičnog vezivanja antitela za uzorak. Anti-IL-17 antitelo pronalaska može se upotrebiti za određivanje nivoa IL-17 u test uzorcima poređenjem vrednosti test uzorka sa standardnom krivom koja je dobijena vezivanjem navedenog antitela za uzorke sa poznatim količinima IL-17. Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži antitelo pronalaska i poželjno, uputstva za upotrebu antitela za detekciju IL-17 proteina u uzorku.

[0018] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju, poželjno farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska. Farmaceutska kompozicija pronalaska može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens i/ili razblaživač. U navedenoj farmaceutskoj kompoziciji, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska je jedini aktivni sastojak. Poželjno farmaceutska kompozicija sadrži homogenu ili značajno homogenu populaciju anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska. Kompozicija za terapeutsku upotrebu je fiziološki kompatibilna, sterilna i može da bude liofilizovana i izborno sa odgovarajućim razblaživačem.

[0019] Pronalazak daje postupak za inhibiciju najmanje jedne bioaktivnosti IL-17 kod životinje, poželjno sisara, poželjnije čoveka, kojem je to potrebno, koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine ili IL-17 neutrališuće količine, anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska na navedenu životinju. Pronalazak takođe daje postupak za lečenje bolesti ili poremećaja koji su poboljšani neutralizacijom ili antagonizacijom bioaktivnosti IL-17, npr., inhibicijom prenosa signala nastalog od vezivanja IL-17 za svoj receptor, koji sadrži primenu na pacijenta (npr., čoveka) kod koga postoji potreba za takvim lečenjem ili prevencijom, terapeutski efikasne količine IL-17 neutralizujuće količine monoklonskog antitela pronalaska.

[0020] Pronalazak obuhvata anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za primenu na sisara, poželjno čoveka, za lečenje npr., autoimunog poremećaja ili inflamatornog poremećaja ili poremećaja ćelijske proliferacije. Dalje je otkriven prozvodni artikl koji sadrži materijal za pakovanje i antitelo pronalaska koje se nalazi unutar navedenog materijala za pakovanje, pri čemu materijal za pakovanje sadrži uputstvo na kojem je naznačeno da antitelo specifično neutralizuje aktivnost IL-17 ili snižava nivo funkcionalnog IL-17 prisutnog u sistemu. Dalje su otkriveni izolovani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitelo pronalaska ili njihov laki ili teški lanac; vektor (ili vektore) koji sadrže navedene nukleinske kiseline, izborno operativno vezane za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćin transformisana vektorom; ćelija domaćin koja sadrži navedeni vektor; postupak za proizvodnju antitela pronalaska koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina tako da je nukleinska kiselina eksprimirana i izborno, izolaciju antitela iz medijuma kulture ćelije domaćina.

KRATAK OPIS CRTEŽA

SL. 1 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence članova humane IL-17 familije proteina (IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E I IL-17F).

SL. 2 prikazuje poravnanje aminokiselinske sekvence IL-17 iz vrste čoveka, zeca, pacova, makaki majmuna i miša.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0022] Obim pronalaska je definisan zahtevima.

Definicije

[0023] "Interleukin 17" takođe označen i kao "IL-17" ili "IL-17A" je 20-30 kD glikozilovani homodimerni protein. Humani IL-17 gen kodira protein od 155 aminokiselina, koji ima signalnu sekvencu od 19 aminokiselina i zreo segment od 136 aminokiselina Humani IL-17 pokazuje identičnost aminokiselinske sekvence od 62.5% i 58% sa mišijim ili pacovskim aminokiselinskim sekvencama IL-17, respektivno, kao što je prikazano na Slici 2. Humani IL-17 pokazuje indentičnost aminokiselinske sekvence od 97.4% sa IL-17 makaki majmuna.

[0024] Antitelo cele dužine kao što prirodno postoji je molekul imunoglobulina koji se sastoji od četiri peptidna lanca, dva teška (H) lanca (oko 50-70 kDa kada je cele dužine) i dva laka (L) lanca (oko 25 kDa kada je cele dužine) međusobno povezana disulfidnim vezama. Aminoterminalni deo svakog lanca obuhvata varijablni region od oko 100-110 ili više aminokiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantan region prvenstveno odgovoran za efektorsnu funkciju.

[0025] Laki lanci se klasifikuju kao kapa ili lambda i odlikuju se određenim konstantnim regionom. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona N-terminalnog lakog lanca (ovde "LCVR") i konstantnog regiona lakog lanca koji se sastoji od jednog domena, CL. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE, respektivno i nekoliko od ovih može da bude dalje podeljeno na podklase (izotipe) npr., IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1i IgA2. Svaki tip teškog lanca je okarakterisan određenim konstantnim regionom. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona N-terminalnog teškog lanca (u ovom tekstu "HCVR") i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena (CH1, CH2, i CH3) za IgG, IgD, i IgA; i 4 domena (CH1, CH2, CH3, i CH4) za IgM i IgE.

[0026] Regioni HCVR i LCVR mogu se dalje podeliti u regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), između kojih su konzervativniji regioni, nazvani okvirni regioni (FR). Svaki HCVR i LCVR se sastoji od tri CDR i četiri FR koji su poređani od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Za antitela pronalaska cele dužine, laki lanci poželjno sadrže, nihoshodno od FR4, polipeptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 277. Za antitela pronalaska cele dužine, teški lanci poželjno sadrže, nishodno od FR4, polipeptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 278. Ovde, 3 CDR teškog lanca su označena kao "CDRH1, CDRH2 i CDRH3" i 3 CDR lakog lanca su označeni kao "CDRL1, CDRL2 i CDRL3." CDR regioni sadrže većinu ostatataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Numeracija i položaj aminokiselinskih ostataka CDR unutar HCVR i LCVR regiona je u skladu sa dobro poznatom konvencijom numeracije prema Kabat-u.

[0027] Izraz "antitelo," u odnosu na anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska (ili jednostavno "antitelo pronalaska"), kao što je ovde korišćen, označava monoklonsko antitelo. "Monoklonsko antitelo" kao što je ovde korišćen, odnosi se na antitelo glodara, poželjno antitelo miša, himerno antitelo, humanizovano antitelo ili potpuno humano antitelo, osim ako je drugačije naznačeno. Monoklonska antitela ovog pronalaska mogu se proizvesti upotrebom, npr. tehnika hibridoma dobro poznatih u stanju tehnike, kao i rekombinantnih tehnologija, tehnologija prikaza faga, sintetičkih ili rekombinantnih tehnologija ili kombinacija takvih tehnologija koje su poznate u tehnici. Termin "monoklonsko antitelo" kao što je ovde korišten, nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. "Monoklonsko antitelo" označava antitelo koje je izvedeno iz jedne kopije ili klona, uključujući npr., eukariotski, prokariotski klon ili klon faga, a ne postupkom kojom je proizvedeno. "Monoklonsko antitelo" može biti intaktno antitelo (koje sadrži kompletan Fc region ili Fc region cele dužine), značajno intaktno antitelo, ili deo ili fragment antitela koji sadrži antigen-vezujući deo, npr., Fab fragment, Fab' fragment ili F(ab')2fragment antitela miša ili himernog, humanizovanog ili humanog antitela. "Fab" fragment sadrži varijabilne I konstantne domene lakog lanca i varijablni domen i prvi kosntantan domen (CH1) teškog lanca. "F(ab')2" fragmenti antitela sadrže par Fab fragmenata koji su generalno kovalentno vezani u blizini karboksilnog terminusa preko zglobnih cisteina smeštenih između njih. Ostala hemijska kuplovanja fragmenata antitela su takođe poznata u tehnici.

[0028] Varijabilni region svakog para lakog lanca formira antigen-vezujuće mesto antitela. Tako, intaktno IgG antitelo ima dva mesta vezivanja. Izuzev u bifunkcionalnim ili bispecifičnim antitelima, dva antigen-vezujuća mesta antitela su ista. Kao što je ovde upotrebljeno, "antigen- vezujući deo" ili "antigen-vezujući region" ili "antigen-vezujući domen" označavaju naizmenično taj deo molekula antitela koji sadrži aminokiselinske ostatke koji interaguju sa antigenom i daju antitelu njegovu specifičnost i afinitet za antigen. Ovaj deo antitela obuhvata "okvir" aminokiselinskih ostatataka koji je neophodan za održavanje odgovarajuće konformacije antigen-vezujućih ostataka. Poželjno, CDR antigen-vezujućeg regiona antitela pronalaska su u potpunosti ili značajno mišijeg porekla, izborno sa određenim izmenjenim amino kiselinskim ostacima, npr. supstituisan različitim aminokiselinskim ostacima, (videti npr., Tabele 2 i 3) za optimizaciju određene osobine antitela, npr., KD, koff, IC50. Poželjno okvirni regioni antitela pronalaska su humanog porekla ili značajno humanog porekla (najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% humanog porekla. Poželjni okvirni regioni antitela pronalaska imaju sledeće sekvence: SEQ ID NOs: 262 (HCVR FR1), 263 (HCVR FR2), 264 (HCVR FR3), 265 (HCVR FR4), 266 (LCVR FR1), 267 (LCVR FR2), 268 (LCVR FR3), 269 (LCVR FR4) i prate numeraciju prema Kabat-u. U drugim primerima izvođenja, antigen-vezujući region IL-17 antitela pronalaska može se izvesti od drugih ne-humanih vrsta uključujući, ali bez ograničenja na, zeca, pacova ili hrčka. Alternativno, antigen-vezujući region može se izvesti iz humane sekvence.

[0029] Dalje, "monoklonsko antitelo" kao što je ovde korišćeno može da bude jednolančani Fv fragment koji može biti proizveden spajanjem DNK koja kodira LCVR i DNK koja kodira HCVR sa linker sekcencom. (videti, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore cds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994). Treba razumeti da bez obzira na to da li su fragmenti naznačeni, termin "antitelo" kao što je ovde korišćen obuhvata takve fragmente kao i jednolančane oblike. Dokle god protein zadržava sposobnost da se specifično ili preferencijalno vezuje za svoje naznačeno ciljno mesto (tj., epitop ili antigen), obuhvaćen je unutar termina "antitelo." Antitela mogu ili ne moraju biti glikozilovana, ali su i dalje obuhvaćena pronalaskom.

[0030] Populacija "monoklonskih antitela," se odnosi na homogenu ili značajno homogenu populaciju antitela (tj., najmanje oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, poželjnije najmanje oko 97% ili 98% ili najpoželjnije najmanje 99% antitela u populaciji će biti u kompeticiji u ELISA testu za isti antigen ili epitop ili poželjnije antitela su identična u aminokiselinskoj sekvenci. Antitela mogu ili ne moraju biti glikozilovana i još uvek su obuhvaćena obimom pronalaska. Monoklonska antitela mogu da budu homogena ukoliko imaju identične aminokiselinske sekvence iako mogu da se razlikuju u post-translacionoj modifikaciji, npr., obrascu glikozilacije.

[0031] "Varijanta" antitela ovde se odnosi na molekul koji se razlikuje po aminokiselinskoj sekvenci od aminokiselinske sekvence "ishodnog" antitela prema adiciji, deleciji i/ili supstituciji jedne ili više aminokiselinskih ostataka ishodne sekvence antitela. "U poželjnom primeru izvođenja, varijanta antitela sadrži najmanje jednu aminokiselinsku (npr., od jedan do deset, a poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8) adiciju, deleciju i/ili supstituciju u CDR regionima ishodnog antitela. Identičnost ili homologija u odnosu na sekvencu varijante antitela ovde je definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci varijante antitela koji su identični sa ostacima u ishodnom antitelu posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je neophodno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvenci. Varijanta antitela zadržava sposobnost da vezuje antigen, ili poželjno, epitop, za koje se vezuje ishodno antitelo i poželjno ima najmanje jednu osobinu ili bioaktivnost koja je bolja u odnosu na ishodno antitelo. Na primer, poželjno je da varijanta antitela ima jači afinitet za vezivanje, sporiju brzinu disocijacije, manju IC50ili povećanu sposobnost da inhibira bioaktivnost antigena nego ishodno antitelo. Varijanta antitela od posebnog interesa je ono koje ispoljava najmanje oko 2-struko, poželjno najmanje oko 5-struko, 10-struko ili 20-struko poboljšanje osobina ili bioaktivnosti u odnosu na ishodno antitelo.

[0032] "Ishodno" antitelo ovde je ono koje je kodirano aminokiselinskom sekvencom korišćenom za pripremu varijante antitela. Ishodno antitelo može da ima okvirnu sekvencu mišjeg porekla, ali poželjno okvirna sekvenca je u potpunosti ili značajno humanog porekla. Ishodno antitelo može da bude mišije, himerno, humanizovano ili humano antitelo.

[0033] Izraz "specifično vezuje" kao što je ovde korišćen odnosi se na situaciju u kojoj se jedan član para specifičnog vezivanja ne vezuje značajno za molekule osim za svoje specifične partnere vezivanja. Ovaj termin se takođe može primeniti kada je npr., antigenvezujući domen antitela pronalaska specifičan za određeni epitop koji nose brojni antigeni, u kom slučaju će specifično antitelo koje nosi antigen-vezujući domen biti sposobno da se vezuje za različite antigene koji nose epitop. Shodno ovom, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje humani IL-17 (tj., IL-17A), dok ne vezuje specifično humani IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F. Dalje, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje humani IL-17 i IL-17 makaki majmuna, ali ne vezuje specifično IL-17 pacova ili IL-17 miša. Dalje, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje nelinearni ili konformacioni humani IL-17 epitop koji sadrži aminokiseline DGNVDYH, ali ne vezuje humani IL-17 epitop koji ne sadrži aminokiseline DGNVDYH.

[0034] Izraz "preferencijalno vezuje" kao što je ovde upotrebljen, označava situaciju u kojoj antitelo vezuje specifični antigen oko 20% više, poželjno najmanje oko 50%, 2-struko, 20struko, 50-struko ili 100-struko više nego što vezuje različit antigen kao što je mereno pomoću tehnike dostupne u stanju tehnike, npr., kompetitivna ELISA ili merenje KDsa BIACORE ili KINEXA analizom. Antitelo može preferencijalno da veže jedan epitop unutar antigena u odnosu na drugi epitop unutar istog antigena. Shodno ovome, antitelo pronalaska preferencijalno vezuje humani IL-17 u odnosu na zečiji IL-17.

[0035] Termin "epitop" odnosi se na onaj deo molekula koji antitelo može da prepozna i da se veže za njega preko jednog ili više antigen-vezujučih regiona antitela. Epitopi se često sastoje od grupe molekula sa hemijski aktivnom površinom kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. "Inhibirajući epitop" i/ili "neutrališući epitop" je namenjeni epitop, koji kada je u kontekstu intaktnog antigenskog molekula i kada je vezan antitelom specifičnim za epitop, rezultuje u gubitku ili smanjenju biološke aktivnosti molekula in vivo ili in vitro ili u organizmu koji sadrži ovaj molekul.

[0036] Termin "epitop," kao što je ovde korišćen, dodatno se odnosi na deo polipeptida koji ima antigensku i/ili imunogenu aktivnost kod životinje, poželjno sisara, npr., miša ili čoveka. Termin "antigenski epitop," kao što je ovde korišćen, je definisan kao deo polipeptida za koji se specifično vezuje antitelo što je određeno bilo kojim postupkom koji je poznat u tehnici, na primer, uobičajenim imunološkim analizama. Antigenski epitopi nisu neophodno imunogeni, ali mogu biti imunogeni. "Imunogeni epitop," kao što je ovde korišćen, je definisan kao deo polipeptida koji izaziva odogovor antitela kod životinje, što je određeno bilo kojim postupkom koji je poznat u tehnici. "Nelinearni epitop" ili "konformacioni epitop" sadrži nekontinuirane polipeptide (ili aminokiseline) unutar antigenog proteina za koji se vezuje antitelo specifično za epitop.

[0037] Fraze "biološka osobina" ili "biološka karakteristika," ili termini "aktivnost" ili "bioaktivnost," u odnosu na antitelo predmetnog pronalaska, su ovde naizmenično korišćeni i obuhvataju, ali nisu ograničeni na, afinitet i specifičnost za epitop/antigen, sposobnost da neutrališu ili antagonizuju aktivnost IL-17 in vivo ili in vitro, IC50, in vivo stabilnost antitela i imunogene osobine antitela. Druge biološke osobine ili karakteristike antitela priznate u struci koje se mogu identifikovati obuhvataju, na primer, unakrsnu reaktivnost (tj., sa nehumanim homologima ciljanog peptida, ili, sa drugim proteinima ili tkivima, generalno) i sposobnost da očuvaju visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama Prethodno navedene osobine ili karakteristike mogu se zapaziti, meriti ili proceniti primenom tehnika poznatih u stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja na, ELISA, kompetitivnu ELISA, BIACORE ili KINEXA analizu površinske plazmon rezonancije, in vitro ili in vivo analize neutralizacije bez ograničenja, vezivanje receptora, proizvodnja i/ili izlučivanje citokina ili faktora rasta, prenos signala i imunohistohemija sa isečcima tkiva iz različitih izvora uključujući čoveka, primata, ili drugi izvor.

[0038] Termin "inhibira" ili "neutrališe" kao što je ovde korišćen u vezi sa aktivnošću antitela pronalaska označava sposobnost za značajnu antagonitzaciju, zabranu, sprečavanje, ograničavanje, usporavanje, remećenje, eliminaciju, zaustavljanje ili preusmeravanje npr., napredovanja ili težine toga što je inhibirano, uključujući ali bez ograničenja na biološku aktivnost (npr., aktivnost IL-17) ili osobinu, bolest ili stanje. Inhibicija ili neutralizacija aktivnosti IL-17 koja je rezultat vezivanja antitela pronalaska sa IL-17 poželjno je najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više.

[0039] Termin "izolovan" kada je korišćen u vezi sa nukelinskom kiselinom ili proteinom (npr., antitelom) označava molekul nukleinske kiseline ili proteina koji je identifikovan i odvojen od bar jedne nečistoće koje je obično prateća u njihovim prirodnim izvorima. Poželjno, "izolovano antitelo" je antitelo koje je značajno bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., farmaceutske kompozicije pronalaska sadrže izolovano antitelo koje specifično vezuje IL-17 i značajno je bez antitela koja specifično vezuju antigene osim IL-17).

[0040] Termini "numeracija prema Kabat-u" i "obeleževanje prema Kabat-u" su ovde naizmenično korišćeni. Ovi termini, koji su priznati u tehnici, odnose se na sistem numeracije aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj., hipervarijabilni) nego ostali aminokiselinski ostataci u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 (1991)).

[0041] Polinukleotid je "operativno vezan" sa drugim polinukleotidom kada se postavi u funkcionalan odnos sa drugim polinukleotidom. Na primer, promotor ili pojačivač je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju te sekvence. Peptid je "operativno vezan" sa drugim peptidom kada su polinukleotidi koji ih kodiraju operativno vezani, poželjno oni su u istom otvorenom okviru čitanja.

[0042] Termini "individua," "subjekt," i "pacijent," koji su ovde naizmenično korišćeni, odnose se na sisara, uključujući ali ne ograničavajući se na, miševe, majmune, ljude, domaće životinje sisare, sisare sportske životinje i sisare kućne ljubimce; poželjno se termin odnosi na ljude. U određenim primerima izvođenja, subject, poželjno sisar, poželjno čovek, je dalje okarakterisan bolešću ili poremećajem koje će imati koristi od smanjene bioaktivnosti IL-17.

[0043] Termin "vektor" obuhvata molekul nukleinske kiseline koja može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan, uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmide i virusne vektore. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni, dok ostali vektori mogu da budu integrisani u genom ćelije domaćina posle uvođenja u ćeliju domaćina, i shodno tome, su replicirani zajedno sa genomom domaćina. Dalje, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koji su operativno vezani. Takvi vektori su ovde označeni kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno "ekspresioni vektori") i primeri vektora su dobro poznati u tehnici.

[0044] Kao što su ovde korišćeni, izrazi "ćelija," "ćelija domaćin," "ćelijska linija," i "ćelijska kultura" su naizmenično korišćeni i ouhvataju individualnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja je primalac bilo kog izolovanog polinukleotida pronalaska ili bilo kog rekombinantog vektora (rekombinantnih vektora), koji sadrži sekvencu koja kodira HCVR, LCVR ili monoklonsko antitelo pronalaska. Ćelije domaćina sadrže potomstvo jedne ćelije domaćina i potomstvo ne mora neophodno da bude potpuno identično (po morfologiji ili komplementu cele DNK) originalnoj ishodnoj ćeliji zbog prirodnih, slučajnih, ili namernih mutacija i/ili promena. Ćelija domaćin obuhvata ćelije koje su transformisane, transdukovane ili inficirane rekombinantnim vektorom ili polinukleotidom koji eksprimira monoklonsko antitelo pronalaska ili njegov laki ili težak lanac. Ćelija domaćin koja sadrži rekombinanti vektor pronalaska, ili stablilno inkorporiran u hromozom domaćina ili ne, može se takođe označiti kao "rekombinantna ćelija domaćin". Poželjne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku su CHO ćelije (npr., ATCC CRL-9096), NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, COS ćelije (ATCC npr., CRL-1650, CRL-1651) i HeLa (ATCC CCL-2). Dodatne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku uključuju ćelije biljaka, ćelije kvasca, ostale sisarske ćelije i prokariotske ćelije.

Karakterizacija antitela

[0045] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana, monoklonska antitela koja specifično vezuju humani IL-17 (tj., IL-17A) sa visokim afinitetom. Antitela pronalaska su definisana antitelima patentnih zahteva pronalaska, to su poželjno himerna, humanizovana ili humana antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi. Dalje, antitela pronalaska neutralizuju ili antagonizuju najmanje jednu biološku aktivnost IL-17 in vivo i/ili in vitro. Specifično vezivanje anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska, (uključujući njihove antigenvezujuće delove) za IL-17 omogućava da navedeno antitelo bude korišćeno kao lek za bolesti i poremećaje koji su povezani sa IL-17, tj., stanja, bolesti ili poremećaje koje će imati koristi od inhibicije biološke aktinosti IL-17.

[0046] Antigenski IL-17 epitop za koji se vezuju antitela pronalaska je ne-linearni epitop koji sadrži aminokiseline ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 275), poželjnije aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) humanog IL-17. Antitela koja vezuju ovaj epitop, specifično i preferencijalno vezuju humani IL-17 i IL-17 makaki majmuna u poređenju sa njihovim vezivanjem za mišiji IL-17 ili IL-17 pacova. Monoklonska antitela pronalaska vezuju humani IL-17 najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100-puta više (npr., veći afinitet ili veća specifičnost) nego sa kojim vezuju mišiji IL-17 ili IL-17 pacova; poželjnije najmanje 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ili 600- puta više nego što vezuje mišiji IL-17 ili IL-17 pacova, čak poželjnije ne vezuje mišiji IL-17 ili IL-17 pacova na nivoma većim od početnog nivoa kao što je određeno npr. pomoću ELISA analize, kompetitivne ELISA analize ili KDvrednosti u BIACORE ili KINEXA analizi.

[0047] U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-IL-17 monoklonsko antitelo koje poseduje snažan vezujući afinitet za humani IL-17, tj., vezuje humani IL-17, ili njegov deo koji sadrži DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) [tj., antitelo stupa u kontakt sa DGNVDYH polipeptidom], sa afinitetom vezivanja (KD) za humani IL-17 manjim od oko 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno manjim od oko 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i najpoželjnije manjim od oko 4 pM. Alternativno, antitela pronalaska su okarakterisana sa KDza humani IL-17 ne većim od oko 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno ne većim od oko 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i najpoželjnije ne većim od oko 4 pM. Afiniteti antitela mogu se odrediti kao što je opisano u primerima u daljem tekstu ili drugim postupcima dostupnim u tehnici. Poželjno anti-IL-17 antitela pronalaska koja imaju snažan vezujući afinitet kao što je prethodno opisano, takođe vezuju ne-linearni humani IL-17 epitop koji sadrži aminokiseline ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 266), poželjnije aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 267), gde se antitelo vezuje za polipeptid DGNVDYH.

[0048] U jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska imaju brzinu disocijacije (koff) za humani IL-17 manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>. U poželjnom primeru izvođenja, antitela pronalaska okarakterisana time što imaju snažan vezujući afinitet za humani IL-17 kao što je prethodno opisano (KDmanje od oko 7 pM ili 6 pM, poželjno manje od oko 5 pM ili 4.5 pM i najpoželjnije manje od oko 4 pM) takođe imaju brzinu disocijacije (koff) za IL-17 čoveka, manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>i čak poželjnije vezuju ne-linearni IL-17 epitop čoveka koji sadrži aminokiseline ADGNVDYHMN (SEQ ID BR: 266), poželjnije aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 267) humanog IL-17.

[0049] U sledećem primeru izvođenja, antitela pronalaska imaju IC50manju od 1nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM u npr., in vitro IL-8 reporter analizi ili manju od oko 560 pM u GROα reporter analizi (videti Primer 6). U poželjnom primeru izvođenja, antitela pronalaska su okarakterisana time što imaju snažan vezujući afinitet za humani IL-17 kao što je prethodno opisano (KDmanji od oko 7 pM ili 6 pM, poželjno manji od oko 5 pM ili 4.5 pM i najpoželjnije manji od oko 4 pM) i takođe imaju IC50manje od 1nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM u npr., in vitro IL-8 reporter analizi ili manje od 560 pM u GROα reporter analizi i čak poželjnije takođe imaju brzinu disocijacije (koff) za IL-17 čoveka manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>i čak poželjnije takođe vezuju ne-linearni IL- 17 epitop čoveka koji sadrži aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID NO: 267) IL-17 čoveka, pri čemu antitelo se vezuje za DGNVDYH polipeptid.

[0050] Najpoželjniji primer izvođenja pronalaska je anti-IL-17 antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca antitela koja se sastoji od SEQ ID NO: 279 i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja se sastoji od SEQ ID NO: 280. Poželjno ovo antitelo sadrži dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Poželjno laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazana u SEQ ID NO: 279 je kodirana nukelinskom kiselinom koja sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 281 (uključujući signalnu sekvencu) ili SEQ ID NO 283 (bez signalne sekvence). Poželjno težak lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je prikazana u SEQ ID NO: 280 je kodiran nukelinskom kiselinom koja sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 282 (uključujući signalnu sekvencu) ili SEQ ID NO: 284 (bez signalne sekvence).

[0051] Monoklonska antitela ("mAbs") mogu se dobiti prema postupku hibridoma koji je široko poznat u stanju tehnike (videti npr., Kohler et al., Nature, 256:495, 1975) ili se može dobiti metodama rekombinantne DNK (npr., kao u SAD patentu br 4,816,567). Generalno, hibridom se može dobiti fuzijom pogodne besmrtne ćelijske linije (npr., ćelijska linija mijeloma kao što je SP2/0) sa ćelijama imunizovane životinje, koje proizvode antitelo. Ćelije koje proizvode antitelo, poželjno ćelije slezine ili limfnih čvorova, dobijene su od životinja koje su imunizovane antigenom od interesa. Ćelije koje su fuzionisane (hibridomi) mogu se izolovati upotrebom selektivnih uslova kulture i klonirati pod ograničenim razblaženjem. Medijum kulture u kome su gajene ćelije hibridoma je analiziran za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih proptiv antigena. Poželjno, specifičnost vezivanja mAbs koje su proizvele ćelije hibridoma određena je imunoprecipitacijom ili in vitro analizom vezivanja, kao što je radioimunološka analiza ili ELISA. Ćelije koje proizvode antitela sa željenim osobinama vezivanja mogu se odabrati pomoću pogodne analize. Metode za takvu izolaciju i skrining su poznate u tehnici.

[0052] Mogu se koristiti i ostale pogodne metode za proizvodnju ili izolovanje antitela pronalaska, uključujući humana ili veštačka antitela, uključujući, na primer, metode koje selektuju rekombinantno antitelo (npr., jednolančani Fv ili Fab) iz biblioteke, ili koje se oslanjaju na imunizaciju transgenskih životinja (npr., miševa) koje mogu da proizvode repertoar humanih antitela (videti npr., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; SAD patenti brojevi 5,545,806 i 5,545,807).

[0053] Jednolančana antitela, i himerna, humanizovana ili primatizovana (CDR-graftovana) antitela, kao i himerna ili CDR-graftovana jednolančana antitela, i slično, sadrže delove izvedene od različitih vrsta, su takođe otkrivena. Različiti delovi ovih antitela mogu se zajedno hemijski spojiti uobičajenim tehnikama, sintetički ili se mogu pripremiti kao kontinuirani protein upotrebom tehnika genetičkog inženjeringa. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju himerni ili humanizovani lanac mogu se eksprimirati tako da proizvedu kontinuirani protein. Videti npr., SAD patent br. 4,816,567; evropski patent br. 125,023 B1; SAD patent br.4,816,397; evropski patent br.120,694 B1; WO 86/01533; evropski patent br.

194,276 B1; SAD patent br. 5,225, 539; evropski patent br. 239,400 B1 i SAD patente br.

5,585,089 i 5,698,762.

[0054] Dodatno takođe se mogu proizvesti funkcionalni fragmenti antitela (tj., antigenvezujući fragmenti), uključujući fragmente himernih, humanizovanih, primatizovanih ili jednolančanih antitela. Poželjni funkcionalni fragmenti zadržavaju antigen-vezujuću funkciju odgovarajućeg antitela cele dužine. Posebno poželjni funkcionalni fragmenti zadržavaju sposobnost da inhibiraju jednu ili više funkcija ili bioaktivnosti karakterističnih za humani zreli IL-17, poželjno humani IL-17, kao što je aktivnost vezivanja, aktivnost signalizacije i/ili stimulacije ili inhibicije ćelijskog odgovora. Na primer, u jednom primeru izvođenja, funkcionalni fragment može da inhibira interakciju zrelog IL-17 sa svojim receptorom i/ili može da inhibira jednu ili više funkcija posredovanih preko receptora.

[0055] Fab, Fab' i F(ab')2fragmenti mogu biti proizvedeni enzimatskim cepanjem ili rekombinantnim tehnikama. Na primer, cepanje intaktnog antitela papainom ili pepsinom mogu se dobiti Fab ili F(ab')2fragmenti, respektivno. Digestija antitela papainom proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazvana "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigenvezujućim mestom. Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Tretman pepsinom proizvodi F(ab')2fragment koji ima dva antigen-kombinujuća mesta i još uvek je sposoban da unakrsno veže antigen.

[0056] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto prepoznavanja I vezivanja antigena. Ovaj region se sastoji od dimera od varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji tri CDR svakog varijabnog domena interaguju tako da definišu antigen- vezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest CDR pružaju antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Za prevazilaženje tendencije nekovalentno vezanih HCVR i LCVR domena u Fv da disociraju kada su koeksprimirani u ćeliji domaćinu, može se konstruisati jednolančani Fv fragment (scFv) u kojem fleksibilni i adekvatno dugačak polipeptid vezuje ili C- terminus HCVR-a za N-terminus LCVR-a ili C-terminus LCVR-a za N-terminus HCVR-a. Linker koji se obično koristi je (Gly4Ser)3peptid sa 15-ostataka. Za pregled sFv-a, videti Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Antitela se takođe mogu proizvoditi u različitim skraćenim oblicima koristeći gene antitela u kojma su jedan ili više stop kodona uvedeni ushodno od prirodnog stop mesta. Na primer, himerni gen koji kodira deo teškog lanca F(ab')2može se označiti tako da obuhvata DNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i zglobni region teškog lanca.

[0057] Izbor fragmenata antitela iz biblioteka primenom tehnologija obogaćivanja kao što je fagni prikaz (Matthews DJ and Wells JA. Science. 260:1113-7, 1993), prikaz ribozoma (Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:14130-5, 1998), bakterijski prikaz (Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002) ili prikaz kvasca (Kieke M.C., et al., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997) su se pokazali kao uspešne alternative klasičnoj tehnologiji hibridoma (Review: Little M. et al., lmmunology Today, 21:364- 70, 2000).

Varijante Antitela

[0058] Mišije monoklonsko antitelo ili humano antitelo (proizvedeno npr., u transgenom mišu) gajeno protiv IL-17 može da bude ishodno antitelo. Ishodno antitelo može dalje da bude izmenjeno tako da se formira himerni ili humanizovani oblik antitela ili drugi varijantni oblik antitela upotrebom postupaka koji su dostupni u tehnici, npr., PCR mutagenezom. Takve himerne, humanizovane, ili ostale varijante antitela, mogu da posluže kao ishodna antitela za dalje varijacije ili mutagenezu. Ishodna antitela pronalaska mogu da budu mutagenizovana, npr., unutar CDR domena (jednog ili više) (videti, npr., Tabele 2 i 3) za stvaranje varijanti antitela koje mogu da budu ispitivane na prisustvo osobine od interesa, npr., vezujući afinitet (niža KD), IC50, specifičnost, preferencijalno vezivanje, itd. Poželjno osobina od interesa u varijanti antitela je poboljšanje te osobine u odnosu na ishodno antitelo. Supstitucija aminokiselina u varijanti antitela je poželjna i ima najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka uklonjenih iz molekula ishodnog antitela i različit ostatak umetnut na njihovo mesto. Mesto od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu je jedan ili više CDR regiona, ali takođe su razmatrane FR izmene. Konzervativne supstitucije aminokiselina su poželjne, iako za značajnije promene, ne-konzervativne promene aminokiselina mogu da budu uvedene i rezultujuća antitela ispitivana za osobine od interesa.

[0059] Uobičajeni način za generisanje supstitucionih varijanti ishodnog antitela je afinitetno sazrevanje upotrebom fagnog prikaza. Ukratko, polinukleotidni molekul koji kodira ishodno antitelo je mutiran unutar jednog ili više CDR regiona za generisanje svih mogućih susptitucija aminokiselina na svakom aminokiselinskom ostatku na kome je susptitucija poželjna. Ovako generisane varijante antitela su prikazane na monovalentan način od filamentoznih čestica faga kao fuzije sa proizvodom gena III, M13 pakovanog unutar svake čestice. Varijante antitela sa prikazanim fagima su zatim ispitivane za svoju biološku aktivnost (npr., vezujući afinitet, specifičnost, IC50). Da bi se identifikovala mesta CDR regiona kandidati za modifikaciju, mogu se izvesti alanin skenirajući mutageni da bi se identifikovali ostaci CDR regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena.

[0060] Alternativno, ili dodatno, može da bude korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i IL-17. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde opisane ili su poznate u tehnici. Alternativno, ili dodatno, slučajna mutageneza ili tačkasta mutageneza se može izvesti na jednom ili više polinukleotidnih molekula koji kodiraju najmanje jedan CDR. Mutageneza može biti izvedena, na jednom ili više položaja ili dok je CDR operativno vezan za okvirni region unutar varijabnog regiona ili dok je CDR nezavisan od ostalih sekvenci varijabnog regiona i zatim je izmenjen CDR vraćen do varijablnog regiona upotrebom tehnologije rekombinantne DNK. Kada su generisane takve varijante antitela, panel varijanti je podvrgnut ispitivanju za osobinu ili aktivnost od interesa i antitela sa boljim osobinama u jednoj ili više relevantnih analiza mogu da budu izabrana za dalji razvoj.

[0061] Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje odgovaruće konformacije anti- IL-17 antitela pronalaska može da bude supstituisan, generalno serinom, za poboljšanje oksidativne stabilnosti molekula i sprečavanje aberantnog unakrsnog vezivanja. Obratno, cisteinska veza(e) mogu da budu dodate u antitelo da poboljšale njegovu stabilnost (posebno kada je antitelo, fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0062] Sledeći tip aminokiselinske varijante antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Pod menjanjem podrazumeva se delecija jedne ili više grupe ugljenih hidrata koje se nalaze u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u ishodnom antitelu. Glikozilacija antitela je tipično N-vezana ili O-vezana. N-vezana označava vezivanje grupe ugljenog hidrata za bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde X je bilo koja aminokiselina izuzev prolina su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje grupe ugljenog hidrata za bočni lanac asparagina. Tako prisustvo jedne od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalna mesta glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze za hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilzin.

[0063] Dodavanje mesta glikozilacije u antitelo se obično postiže menjanjem aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više prethodno opisanih tripeptidnih sekcenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Promene takođe mogu biti napravljene dodavanjem ili supstitucijom jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvencu originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).

Sekvenca

[0064] Poželjno monoklonsko antitelo može da sadrži LCVR koji sadrži peptid sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 178-243 i/ili HCVR koji sadrži peptid sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 56-121. U poželjnom primeru izvođenja, antitelo sadrži LCVR koji sadrži peptid se sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 178-243 i dalje sadrži HCVR koji sadrži peptid sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 56-121, gde HCVR i LCVR prisutni u antitelu postoje zajedno u Fab navedenom u Tabeli 1. Na primer, antitelo koje sadrži LCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvecom SEQ ID NO: 178, poželjno dalje sadrži HCVR polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 56, 60, 68-93 i 95. Dalje, antitelo pronalaska koje sadrži LCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 241, poželjno dalje sadrži HCVR polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 118 i 106. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti činjenicu da antitela pronalaska nisu ograničena na specifične sekvence HCVR LCVR kao što su navedene u Tabeli 1 ovde, već takođe obuhvataju i varijante ovih sekvenci koje, kada su prisutne u anti-IL-17 antitelu pronalaska, zadržavaju ili poboljšavaju antigen-vezujuću sposobnost i najmanje jednu drugu funkcionalnu osobinu ishodnog antitela, npr., specifičnost epitopa, sposobnost da su u kompeticiji sa ishodnim antitelom za vezivanje za IL-17, IC50i/ili KDili koffvrednosti za vezivanje humanog IL-17.

[0065] Dalje, monoklonsko antitelo pronalaska je ono koje je kompetitivno inhibrano od vezivanja humanog IL-17 (ili njegovog dela koji sadrži DGNVDYH) putem kompeticije monoklonskog antitela koje sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NOs: 241 (LCVR) i 118 (HCVR). Takva kompetitivna inhibicija između antitela može da se meri pomoću analiza poznatih u tehnici, npr., kompetitivnom ELISA analizom.

[0066] Poželjno, antitelo pronalaska koje je u kompeticiji sa kompetitivnim antitelom koje je prethodno definisano je dalje okarakterisano specifičnim vezivanjem humanom IL-17, ali ne i vezivanjem humanog IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ili IL-17F. Dodato, antitelo je dalje okarakterisano specifičnim vezivanjem humanog IL-17 i IL-17 makaki majmuna, ali ne i vezivanjem IL-17 pacova ili mišijeg IL-17 na nivoima većim od početnog.

Poželjnije, antitelo pronalaska koje je u kompeticiji za vezivanje za humani IL-17 sa konkurentnim antitelom koje sadrži aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NOs: 241 i 118 dalje je okarakterisano vezivanjem humanog IL-17 nelinearnog epitopa koji sadrži aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276). Još poželjnije, antitelo pronalaska koje je u kompeticiji za vezivanje za humani IL-17 sa konkurentnim antitelom koje sadrži aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NOs: 241 i 118 dodatno je okarakterisano time što ima KDza humani IL-17 manju od oko 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno manju od oko 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i najpoželjnije, manju od oko 4 pM i/ili je okarakterisano sa IC50, poželjno u in vitro IL-8 reporter analizi, koja je manja od 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM, ili sa IC50u in vitro GROα reporter analizi manjoj od oko 560 pM, i/ili ima brzinu disocijacije (koff) za humani IL-17 manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>.

[0067] U jednom primeru izvođenja, anti-IL-17 antitelo pronalaska ima varijabilan region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama: CDRH1 (SEQ ID NO: 244), CDRH2 (SEQ ID NO: 245), i CDRH3 (SEQ ID NO: 246); i/ili gde varijabilni region lakog lanca sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama: CDRL1 (SEQ ID NO: 247), CDRL2 (SEQ ID NO: 248) i CDRL3 (SEQ ID NO: 249). Poželjno, šest CDR antitela pronalaska postoje zajedno kao u Fab navedenom u Tabeli 1. Još poželjnije, CDR regioni teškog lanca su u kontekstu sledećih okvirnih sekvenci: FR1 sa SEQ ID NO: 262, FR2 sa SEQ ID NO: 263, FR3 sa SEQ ID NO: 264 i FR4 sa SEQ ID BR: 265 i CDR regioni lakog lanca su u kontekstu sledećih okvirnih sekvenci: FR1 sa SEQ ID NO: 266, FR2 sa SEQ ID NO: 267, FR3 sa SEQ ID NO: 268 i FR4 sa SEQ ID NO: 269, pri čemu redosled od amino terminusa je FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0068] Dalje je razmatrano da anti-IL-17 antitelo pronalaska sadrži HCVR koji sadrži CDRH1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11-28, i/ili CDRH2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 29-32, i/ili CDRH3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 33-55 i 261. U sledećem primeru izvođenja, anti-IL-17 antitelo pronalaska sadrži LCVR koji sadrži CDRL1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 122-149, i/ili CDRL2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 150-167, i/ili a CDRL3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 168-177. U poželjnom primeru izvođenja, anti-IL-17 antitelo pronalaska sadrži HCVR koji sadrži CDRH1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 11-28, i/ili CDRH2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 29-32, i/ili CDRH3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 33-55 i 261, i dalje sadrži LCVR koji sadrži CDRL1 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 122-149, i/ili CDRL2 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 150-167, i/ili CDRL3 koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 168-177.

[0069] Kompozicija koja sadrži CDR pronalaska će generalno sekvenca teškog ili lakog lanca antitela ili njen značajan deo, gde je CDR lociran na mestu u skladu sa numeracijom prema Kabat-u. Tri regiona CDR regiona za svaki lanac, težak i lak, su data u okvirnom regionu kao kontinuirana sekvenca predstavljena sledećom formulom: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4. FR1, FR2, FR3 i FR4 teškog lanca ili lakog lanca se kombinuju tako da formiraju potpun okvirni regiona antitela kada su uređeni kao kontinuirana sekvenca sa CDR regionima u navedenom redosledu. Poželjno okvirni regioni antitela pronalaska su humanog porekla ili značajno humanog porekla (tj., više od 80, 82, 85, 87, 90,92, 95, 97%).

[0070] U humanizovanom antitelu za terapeutsku upotrebu na ljudima, okvirna sekvenca je poželjno u potpunosti ili značajno humanog porekla. Poželjno okvirni region lakog lanca humanizovanog, humanog ili himernog antitela pronalaska sadrži FR1 sa SEQ ID NO: 266, FR2 sa SEQ ID NO: 267, FR3 sa SEQ ID NO: 268 i FR4 sa SEQ ID NO: 269. Poželjno okvirni region teškog lanca humanizovanog, humanog ili himernog antitela pronalaska sadrži FR1 sa SEQ ID NO: 262, FR2 sa SEQ ID NO: 263, FR3 sa SEQ ID NO: 264, i FR4 sa SEQ ID NO: 265. Na primer, poželjan primer izvođenja LCVR antitela 126 pronalaska, kao što je opisano u Tabelama 1, 2 i 3 ovde sadrži (polipeptide u redosledu od N terminusa) FR1 sa SEQ ID NO: 266, CDR1 sa SEQ ID NO: 131, FR2 sa SEQ ID NO: 267, CDR2 sa SEQ ID NO: 167, FR3 sa SEQ ID NO: 268, CDR3 sa SEQ ID NO: 168 i FR4 sa SEQ ID NO: 269. Potpuna sekvenca LCVR, operativno vezana za humani kapa konstantni region je kao što je prikazano u SEQ ID NO: 274. Dalje, poželjan primer izvođenja HCVR antitela 126 pronalaska sadrži (u redosledu od N terminusa) FR1 sa SEQ ID NO: 262, CDR1 sa SEQ ID NO: 26, FR2 sa SEQ ID NO: 262, CDR2 sa SEQ ID NO: 30, FR3 sa SEQ ID NO: 264, CDR3 sa SEQ ID NO: 52 i FR4 sa SEQ ID NO: 265. Celokupna sekvenca HCVR, operativno vezana za humani IgG4Fc region je kao što je prikazano u SEQ ID NO: 273.

[0071] U jednom primeru izvođenja, anti-IL-17 antitelo pronalaska, gde je ceo ili deo varijablnog regiona ograničen određenom sekvencom kao što je prikazana ovde u SEQ ID NO (videti, npr., Tabele 1-3) je dalje okarakterisano kao himerno, humanizovano ili potpuno humano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji antagonizuje ili neutralizuje bar jednu aktivnost in vivo ili in vitro humanog IL-17. IL-17 antitelo pronalaska, gde je ceo ili deo varijablnog regiona ograničen određenom sekvencom kao što je prikazano ovde sa SEQ ID NO, dalje je okarakterisan specifičnim vezivanjem humanog IL-17, ali ne i vezivanjem humanog IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ili IL-17F. Dodatno, antitelo je dalje okarakterisano specifičnim vezivanjem humanog IL-17 i IL-17 makaki majmuna, ali ne i vezivanjem IL-17 pacova ili mišijeg IL-17 na nivoima većim od pozadine.

Poželjnije, takvo antitelo je dalje okarakterisano vezivanjem humanog IL-17 nelinearnog epitopa koji sadrži aminokiseline DGNVDYH (SEQ ID NO: 276), pri čemu antitelo pravi kontakt sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 276. Još poželjnije, takvo antitelo je dalje okarkaterisano sa KDza humani IL-17 manjim od oko 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno manjim od oko 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i najpoželjnije manjim od oko 4 pM i/ili je okarakterisano sa IC50, poželjno u in vitro IL-8 reporter analizi, koja je manja od 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM, ili sa IC50u in vitro GROα reporter analizi manjom od oko 560 pM, i/ili ima brzinu disocijacije (koff) za humani IL-17 manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>.

Ekspresija antitela

[0072] Takođe su otkrivene ćelijske linije koje eksiprimiraju anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska ili njegov deo. Stvaranje i izolovanje ćelijskih linija koje proizvode monoklonsko antitelo pronalaska može se postići upotrebom standardnih tehnika koje su pozante u tehnici. Poželjne ćelijske linije obuhvataju COS, CHO, SP2/0, NS0 i kvasca (dostupne iz javnih zbirki kao što je ATCC, American Type Kulture Collection, Manassas, VA).

[0073] Može se koristiti široki opseg ekspresionih sistema domaćina za eksprimiranje antitela predmetnog pronalaska uključujući prokariotske i enukariotske eksprimirajuće sisteme (kao što je kvasac, bakulovirus, biljka, ćelije sisara ili ćelije drugih životinja, transgenske životinje, i hibridoma ćelije), kao i ekspresioni sistemi fagnog prikaza. Primer pogodnog bakterijskog ekspresionog vektora je pUC 119 i pogodan eukariotski ekspresioni vektor je modifikovan pcDNA3.1 vektor sa oslabljenim sistemom selekcije dhfr. Drugi ekspresioni sistemi antitela su takođe poznati u tehnici i ovde su razmatrani.

[0074] Antitelo pronalaska se može pripremiti rekombinantnom ekpresijom gena lakih i teških lanaca imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Za rekombinantno eksprimiranje antitela, ćelija domaćin je transformisana, transdukovana, inficirana ili slično jednim ili više rekombinantnih vektora ekspresije koji nose fragmente DNK koji kodiraju lake i/ili teške lance imunoglobulina antitela tako da su laki i/ili teški lanci eksprimirani u ćeliji domaćinu. Teški lanac i laki lanac mogu da budu eksprimirani nezavisno od različitih promotora za koje su operativno vezani u jedan vektor ili, alternativelno, težak lanac i laki lanac mogu da budu eksprimirani nezavisno od drugih promotora za koji su operativno vezani u dva vektora -jedan koji eksprimira težak lanac i jedan koji eksprimira laki lanac. Izborno, težak lanac i laki lanac mogu da budu eksprimirani u različitim ćelijama domaćina. Poželjno, rekombinantna antitela su izlučena u medijum u kojem su kultivisane ćelije domaćini, iz kojih se antitela mogu izolovati ili prečistiti. Metodologije standardne rekombinantne DNK su korišćene za dobijanje gena teškog i lakog lanca antitela, ugradnju ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore, i uvođenje vektora u ćelije domaćine. Takve standardne rekombinante DNK tehnologije su opisane, na primer, u Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, et al (Eds.) Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989.

[0075] Izolovana DNK koja kodira HCVR region može se konvertovati u gen teškog lanca cele dužine operativnim vezivanjem DNK koja kodira HCVR za drugi molekul DNK koji kodira konstante regione teškog lanca (CH1, CH2, i CH3). Sekvence humanih gena konstantnog regiona teškog lanca su poznate u tehnici. Videti, npr., Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991). Fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti npr., standardnom amplifikacijom PCR. Konstantni region teškog lanca može biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgA, IgE, IgM ili IgD), klase (npr., IgG1, IgG2, lgG3i IgG4) ili potklase konstantnog regiona ili njihove alotipna varijante kao što je opisano u Kabat (supra). Alternativno, deo koji se vezuje za antigen može da bude Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fd, ili jednolančani Fv fragment (scFv). Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira HCVR može biti operativno vezana za drugi molekul DNK koji kodira samo konstantni region CH1 teškog lanca.

[0076] Izolovana DNK koja kodira LCVR region može da bude konvertovana u gen lakog lanaca cele dužne (kao i u gen lakog lanca Fab) operativnim vezivanjem DNK koja kodira LCVR za drugi molekul DNK koji kodira konstantan region lakog lanca CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca su poznate u tehnici. Videti, npr., Kabat, supra. DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantan region lakog lanca može da bude kapa ili lambda konstantan region.

[0077] Za dobijanje scFv gena, fragmenti DNK koji kodiraju HCVR i LCVR su operativno vezani za drugi fragment koji kodira fleksiblni linker, npr., kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, kao što su HCVR i LCVR sekvence mogu se eksprimirati kao kontrinuirani jednolančani protein, sa LCVR i HCVR regionima povezanim fleksiblnim linkerom. Videti, npr., Bird, et al., Science 242:423-6, 1988; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988; McCafferty, et al., Nature 348:552-4, 1990.

[0078] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje vektor, poželjno (ali ne i ogainičen na) plazmid, rekombinantni ekspresioni vektor, vektor ekspresije kvasca, ili retrovirusni ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska. Alternativno, vektor pronalaska sadrži polinukleotid koji kodira LCVR i/ili polinukleotid koji kodira HCVR pronalaska. Kada su kodirajuće sekvence LCVR i HCVR prisutne u istom vektoru, mogu se nezavisno transkribovati, svaki od posebnog promotora za koji su funkcionalno vezani. Ako su sekvence koje kodiraju LCVR i HCVR prisutne u istom vektoru i transkribovane od jednog promotra za koji su obe operativno vezane, LCVR može da bude 5' prema HCVR ili LCVR može da bude 3' prema HCVR, dalje, kodirajući region LCVR i HCVR kodirajući region u vektoru može da bude odvojen linkerskom sekvencom bilo koje veličine ili sastava, poželjno takav linker, kada je prisutan je polinukleotid koji kodira unutrašnje ribozomalno ulazno mesto.

[0079] Za eksprimiranje antitela pronalaska, DNK koja kodira laki i/ili težak lanac parcijalan ili cele dužine, dobijena kao što je prethodno opisano, je umetnuta u ekspresioni vektor tako da je gen operativno vezan za transkripcione i translacione kontrolne sekvence. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su odabrane tako da budu kompatibilne sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćinom. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu se umetnuti u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena su umetnuta u isti ekspresioni vektor. Geni antitela su umetnuti u ekspresioni vektor standardnim metodama. Dodatno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava izlučivanje lakog i/ili teškog lanca anti-IL-17 monoklonskog antitela iz ćelije domaćina. Gen lakog i/ili teškog lanca anti-IL-17 monoklonskog antitela se može klonirati u vektor tako da je signalni peptid operativno vezan u okviru za amino-terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid.

[0080] Pored gena (jednog ili više) teškog i/ili lakog lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektor pronalaska nosi regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena (jednog ili više) lanca antitela u ćeliji domaćina. Termin "regulatorna sekvenca" je određena tako da obuhvata promotore, pojačivače i druge ekspresione kontrolne elemente (npr., poliadenilacioni signali), prema potrebi, koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena (jednog ili više) lanca antitela. Dizajn ekspresionog vektora, uključujući selekciju regulatornih sekvenci može zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koji se transformiše, nivo ekspresije željenog proteina. Poželjne regulatorne sekvence za eksprimiranje sisarskih ćelija domaćina obuvhataju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili pojačivači poreklom od citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr., glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma virusa.

[0081] Pored gena teškog i/ili lakog lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr., oridžini replikacije) i jedan ili više selektabilnih marker gena. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je uveden vektor. Na primer, tipično selektabilni marker gen pruža otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin, ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je uveden vektor. Poželjni selektabilni marker geni uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr) (za upotrebu u dhfrminus ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata), neo gen (za G418 selekciju), i glutamin sintetazu (GS) u GS-negativnoj ćelijskoj liniji (kao što je NS0) za selekciju/amplifikaciju.

[0082] Za ekspresiju lakih /ili teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teške i/ili lake lance su uvedeni u ćeliju domaćina prema standardnim tehnikama npr., elektroporacijom, taloženjem kalcijum fosfata, transfekcijom DEAE-dekstranom, transdukcijom, infekcijom i slično. Iako je teorijski moguće eksprimirati antitela pronalaska u ili prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima, eukariotske ćelije su poželjne, i najpoželjnije sisarske ćelije domaćini, zato što takve ćelije verovatnije se sakupljaju i izlučuju odgovarajuće savijeno i imunološki aktivno antitelo. Poželjne sisarske ćelije domaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela pronalaska obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) [uključujućoi dhfr minus CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982] NS0 mijeloma ćelije, COS ćelije, I SP2/0 ćelije. Kada su rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedeni u sisarske ćelije domaćine, antitela su proizvedena kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćinima ili, poželjnije, izlučivanje antitela u medijum za kulturu u kome su gajene ćelije domaćini pod odgovarajućim uslovima poznatim u tehnici. Antitela se mogu izolovati iz ćelija domaćina i/ili medijuma kulture upotrebom standardnih postupaka prečišćavanja.

[0083] Ćelije domaćini se takođe mogu koristiti za proizvodnju delova, ili fragmenata intaktnih antitela, npr., Fab fragmenata ili scFv molekula tehnikama koje su uobičajene. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da su varijacije prethodno opisanog postupka obuhvaćene obimom predmetnog pronalaska. Na primer, može da bude poželjno transfektovati ćeliju domaćina sa DNK koja kodira laki lanac ili težak lanac antitela ovog pronalaska. Rekombinantna DNK tehnologija se takođe može koristiti za uklanjanje nešto ili sve DNK koja kodira bilo koji ili oba od lakih i teških lanaca koja nije neophodna za vezivanje za IL-17. Molekuli eksprimirani iz ovih skraćenih molekula DNK su takođe obuhvaćeni antitelima pronalaska.

[0084] Pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska. Poželjno ćelija domaćina predmetnog pronalaska sadrži jedan ili više vektora ili konstrukata koji sadrže molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin predmetnog pronalaska je ćelija u koju je uveden vektor pronalaska, gde dati vektor sadrži polinukleotid koji kodira LCVR antitela pronalaska i/ili polinukleotid koji kodira HCVR pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina u koju su uvedena dva vektora pronalaska; jedan koji sadrži polinukleotid koji kodira LCVR antitela pronalaska i jedan koji sadrži polinukleotid koji kodira HCVR prisutan u antitelu pronalaska, pri čemu je svaki operativno vezan za promotorsku sekvencu. Tipovi ćelije domaćina obuhvataju sisarske, bakterijske, biljne ćelije i ćelije kvasca. Poželjno ćelija domaćin je CHO ćelija, COS ćelija, SP2/0 ćelija, NS0 ćelija, ćelija kvasca ili derivat ili potomstvo bilo kojeg poželjnog tipa ćelija.

[0085] U poželjnom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela pronalaska, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira težak lanac antitela i lak lanac antitela je uveden u dhfr-minus CHO ćelije pomoću npr., transfekcije koja je posredovana kalcijum fosfatom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, svaki od gena teškog i lakog lanca antitela su operativno vezani za pojačivačke/promotorske regulatorne elemente (npr., poreklom od SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što je CMV pojačivač/AdMLP promotorski regulatorni element ili SV40 pojačivač/AdMLP promotorski regulatorni element) za stimulaciju visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi dhfr gen, koji omogućava izbor CHO ćelija koje su transficirane sa vektorom upotrebom selekcije/amplifikacije metotreksata. Izabrane transformante ćelije domaćini su kultivisane tako da omoguće eksprimiranje teških i lakih lanaca antitela i intaktno antitelo je izolovano iz medijuma za kulturu. Standardne tehnike molekularne biologije su primenjene za dobijanje rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija domaćina, izbor transformanata, kultivisanje ćelija domaćina i izolaciju antitela iz medijuma za kulturu. Antitela, ili njihovi antigen-vezujući delovi, pronalaska mogu se eksprimirati u životinji (npr., mišu) koja je transgenska za gene humanog imunoglobilna (videti, npr., Taylor, et al., Nucleic Acids Res.

20:6287-95, 1992).

[0086] Eksprimirana, intaktna antitela, njihovi dimeri, individualni laki i teški lanci, ili drugi oblici imunoglobulina predmetnog pronalaska mogu se prečistiti prema standardnim postupcima iz tehnike, uključujući taloženje amonijum sulfatom, jono-izmenjivačku, afinitetnu, reverzno faznu hromatografiju na koloni, hromatografiju na koloni sa hiodrofobnim interakcijama, gel elektroforezu i slično. Poželjni su značajno čisti imunoglobulini od najmanje 90%, 92%, 94% ili 96% homogenosti, a najpoželjnije 98 do 99% ili više homogenosti, za farmaceutsku upotrebu. Kada su prečišćeni, delimično ili do željene homogenosti, peptidi se zatim mogu upotrebiti terapeutski ili profilaktički, kao što je ovde dato.

Himerno antitelo

[0087] Kao što je ovde korišćen, termin "himerno antitelo" obuhvata monovalentne, divalentne ili polivalentne imunoglobuline. Monovalentno himerno antitelo je dimer formiran od himernog teškog lanca koji je preko disulfidnih mostova vezan za himerni laki lanac. Divalentno himerno antitelo je tetramer formiran od dva dimera teškog lanca-lakog lanca koji su povezani preko disulfidnih mostova.

[0088] Himerni težak lanac antitela sadrži antigen-vezujući region poreklom od teškog lanca ne-humanog antitela specifičnog za IL-17, koji je operativno vezan za najmanje jedan deo humanog, ili značajno humanog (ili vrste koja se razlikuje od onog od kojeg potiče antigenvezujući region), konstantnog regiona teškog lanca kao što je CH1 ili CH2, ili poželjno za konstantan region teškog lanca cele dužine. Himerni laki lanac antitela za upotrebu kod ljudi sadrži antigen-vezujući region poreklom potpuno ili značajno od lakog laca ne-humanog antitela specifičnog za IL-17, koji je operativno vezan za najmanje jedan deo humanog, ili značajno humanog (ili vrste koja se razlikuje od one od koje potiče antigen-vezujući region), konstanog regiona lakog lanca (CL), ili poželjno za konstantan region teškog lanca cele dužine. Antitela, fragmenti ili derivati koji imaju himerne teške lance i lake lance iste ili različite specifičnosti vezivanja varijablnog regiona, takođe se mogu pripremiti odgovarajućim vezivanjem individualnih polipeptidnih lanaca, prema poznatim koracima postupka.

[0089] Sa ovim pristupom, domaćini koji eksprimiraju himerne teške lance su posebno kultivisani od domaćina koji eksprimiraju himerne lake lance, i imunoglobulinski laci su posebno izolovani i zatim povezani. Alternativno, domaćini mogu da budu zajedno kultivisani i lanci mogu da se vezuju spontano u medijumu za kulturu, nakon čega sledi izolacija sastavljenog imunoglobulina ili fragmenta. Metode za proizvodnju himernih antitela su poznate u tehnici (videti, npr., SAD patent br.: 6,284,471; 5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397).

Humanizovana antitela

[0090] Poželjno antitelo pronalaska koje se koristi u terapeutske svrhe, imaće sekvencu okvira i konstantnog regiona (u meri u kojoj postoji u antitelu) poreklom od sisara u kome se može koristiti kao lek, tako da umanji mogućnost da će sisar izazvati imuni odgovor na terapeutsko antitelo. Humanizovana antitela su od posebnog interesa budući da se smatraju korisnim za terapeutsku primenu i izbegavanje odgovora humanog anti-mišijeg antitela koji su često zabeleženi kod antitela glodara. Dodatno, u humanizovanim antitelima, efektorni deo antitela je humanog porekla tako da mogu da interaguju bolje sa ostalim delovima humanog imunog sistema (npr., uništiti ciijne ćelije efikasnije preko komplement-zavisne citotoksičnosti ili ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela). Takođe, injektirana humanizovana antitela mogu da imaju polu-život više kao kod prirodnih humanih antitela nego što imaju npr., antitela miša, omogućavajući na taj način smanjenje i ređe doziranje. Termin "humanizovano antitelo" kao što je ovde korišćen označava antitelo koje sadrži delove antitela različitog porekla, pri čemu je najmanje jedan deo humanog porekla. Na primer, humanizovano antitelo može da sadrži delove poreklom od antitela nehumanog porekla sa potrebnom specifičnošću, kao što je mišije, i od antitela humanog porekla, koji su hemijski spojeni uobičajenim tehnikama (npr., sintetički) ili dobijeno kao kontrinuirani polipeptid upotrebom tehnika genetičkog inženjeringa.

[0091] Poželjno, "humanizovano antitelo" ima CDR koji potiču (ili značajno potiču) od nehumanog antitela (poželjno mišjeg monoklonskog antitela) dok okvirni i konstantni region, u meri u kojoj je prisutan, (ili njegov značajni ili znatan deo, tj., najmanje oko 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) su kodirani informacijom sekvence nukleinskih kiselina koja se javlja u regionu imunoglobulina humane klicine linije (videti, npr., International ImMunoGeneTics Database) ili u njihovim rekombinovanim ili mutiranim oblicima bilo da su data antitela proizvodena u humanim ćelijama ili ne.

[0092] CDR humanizovanog antitela može da bude izmenjeno ili optimizovano od CDR regiona ne-humanog ishodnog antitela od kojeg potiču tako da se generišu željene osobine, npr., specifičnost, afinitet i/ili preferencijalno vezivanje. Izmenjeni ili optimizovani CDR regioni mogu da imaju aminokiselinske supstitucije, adicije i/ili delecije u poređenju sa ishodnim CDR regionima, poželjno oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ukupno unutar šest CDR domena. Na primer, aminokiselinski položaji u CDR regionima koji su podvučeni i u boldu u Tabelama 2 i 3 su položaji koji su izmenjeni u odnosu na CDR regione kao što su prikazani u Fab 1 u Tabelama 2 i 3. Alternativno mišije antitelo 2321 može da bude ishodno antitelo za poređenje CDR regiona antitela pronalaska.

[0093] Humanizovani oblici ne-humanog (npr., mišijeg ) antitela obuhvataju intaktno antitelo, značajno intaktno antitelo, deo antitela koji sadrži antigen-vezujuće mesto, ili deo antitela koji sadrži Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2, ili jednolančani Fv fragment. Humanizovana antitela poželjno sadrže minimalnu sekvencu poreklom od ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela takođe mogu da sadrže ostatke koji nisu nađeni ni u antitelu primaocu niti u uvezenim CDR ili okvirnim sekvencama. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati značajno sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijablna domena, u kojima sve ili značajno sve aminokseline u CDR regionima odgovaraju onima od ne-humanog imunoglobulina i sve ili značajno sve aminokiseline u FR regionima su one od konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo optimalno takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona (Fc) imunoglobulina, tipično onog od humanog imunoglobulina. [Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329,1988; i Presta, Cur. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992.]

[0094] Humanizovana antitela mogu se podvrgnuti in vitro mutagenezi upotrebom metoda koje se rutinski koriste u tehnici (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i shodno tome aminokiselinske sekvence okvirnog regiona od HCVR i LCVR regiona humanizovanih rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako poreklom od onih koje su povezane sa HCVR i LCVR sekvencama humane klicine linije, ne moraju da prirodno postoje unutar repertoara klicine linije humanog antitela in vivo. Razmatrano je da takve aminokiselinske sekvence HCVR i LCVR okvirnih regiona humanizovanih rekombinantnih antitela su najmanje 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ili najpoželjnije najmanje 99% identične sekvenci humane klicine linije. Poželjno, ovi okvirni ostaci ishodnog antitela (npr., mišijeg antitela ili generalno antitela od koga je poreklom humanizovano antitelo) koje održava ili utiče na struktre kombinovag mesta, će biti sačuvani. Ovi ostaci mogu da budu identifikovani npr., rengdenskom kristalografijom ishodnog antitela ili Fab fragmenta, određujući tako trodiumenzionalnu strukuturu antigen-vezujućeg mesta. Jedna strategija za humanizaciju antitela je odabrati sekvencu humane klicine linije sa najvećom homologijom sa okvirom ishodnog antitela, budući da okvir prima donorske CDR regione. Ovaj pristup klicine linije je baziran na istoj logici kao strategija „best-fit“, ali su u bazama podataka pretražene samo sekvence klicine linije.

[0095] Humanizovano antitelo predmetnog pronalaska može da sadrži ili da bude izvedeno od okvira lakog lanca humane klicine linije. U posebnom primeru izvođenja, sekvenca lakog lanca klicine linije je izabrana od humanih VK sekvenci uključujući, ali bez ograničenja na, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012, 014, 018, 02, 04, i 08. U određenim primerima izvođenja, ovaj okvir lakog lanca humane klicine linije je izabran od V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, i V5-6.

[0096] U drugim primerima izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalska može da sadrži ili da bude poreklom od okvira teškog lanca humane klicine linije. U posebnim primerima izvođenja, ovaj okvir teškog lanca humane klicine linije je izabran od VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3- 49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4- 34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, i VH7-81. Videti PCT WO 2005/005604 za opis različitih sekvenci klicine linije.

[0097] U posebnim primerima izvođenja, varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca sadrži okvirni region ili najmanje deo okvirnog regiona (npr., koji sadrži 2 ili 3 subregiona, kao što su FR2 i FR3). U određenim primerima izvođenja, najmanje FRL1, FRL2, FRL3, ili FRL4 je potpuno human. U ostalim primerima izvođenja, najmanje FRH1, FRH2, FRH3, ili FRH4 je potpuno human. U nekim primerima izvođenja, najmanje FRL1, FRL2, FRL3, ili FRL4 je sekvenca klicine linije (npr., humane klicine linije) ili sadrži humane konsenzus sekvence za određeni okvir. U ostalim primerima izvođenja, najmanje FRH1, FRH2, FRH3, ili FRH4 je sekvenca klicine linije (npr., humane klicine linije) ili sadrži humane konsenzus sekvence za određeni okvir. U poželjnim primerima izvođenja, sav okvirni region je humani okvirni region.

[0098] Generalno, humanizovana antitela mogu se proizvesti dobijanjem sekvenci nukelinskih kiselina koje kodiraju HCVR i LCVR antitela, npr., mišijeg antitela ili antitela pripremljenog pomoću hibridoma, koji vezuje IL-17 epitop pronalaska, identifikujući CDR regione u navedenim HCVR i LCVR (nehumani), i graftujući takve sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju CDR na izabrane humane sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju okvir. Izborno, CDR region može da bude optimizovan nasumičnom mutagenizom ili na određenim mestima da bi se susptituisala jedna ili više aminokiselina u CDR sa različitim aminokiselinima pre graftovanja CDR regiona u okvirni region. Alternativno, CDR region može da bude optimizovan posle insercije u humani okvirni region pomoću metoda koje su dostupne stručnjaku iz date oblasti tehnike. Poželjno, humane aminokiselinske sekvence okvira su izabrane tako da je rezultujuće antitelo verovatno pogodno za in vivo primenu kod ljudi. Ovo se može odrediti, npr., na osnovu prethodne upotrebe antitela koja sadrže takvu humanu okvirnu sekvencu. Poželjno, humana okvirna sekvenca neće biti sama značajno imunogena.

[0099] Alternativno, aminokiselinske sekvence okvira za antitelo koje se humanizuje mogu se porediti sa onima od poznatih humanih okvirnih sekvenci koje se koriste za CDR-grafting i koje su izabrane na osnovu njihovih sekvenci koje su veoma slične sekvencama ishodnog antitela, npr., mišijeg antitela koje vezuje IL-17 (npr., antitelo koje sadrži HCVR sa SEQ ID NO: 270 i dodatno sadrži LCVR sa SEQ ID NO: 271). Brojne humane okvirne skevence su izolovane i njihove sekvence objavljene u tehnici. Ovo povećava verovatnoću da rezultujuće CDR-graftovano humanizovano antitelo, koje sadrži CDR regione roditelja (npr., miša) ili optimizovane CDR regione ishodnog antitela graftovane u izabrane humane okvire (i moguće takođe humani konstantni region) će značajno zadržati antigen vezujuću strukturu i na taj način zadržati vezujući afinitet ishodnog antitela. Da bi se u značajnoj meri zadržao antigenvezujući afinitet, izabrani humani okvirni regioni će poželjno biti oni za koje se očekuje da budu pogodni za in vivo primenu, tj., ne-imunogeni.

[0100] U jednoj od metoda, dobijena je DNK sekvenca koja kodira HCVR i LCVR regione poželjno mišijeg anti-IL-17 antitela. Metode za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju imunoglobuline su poznate u stanju tehnike. Takve metode mogu, na primer, da obuhvate amplifikaciju sekvenci koje kodiraju imunoglobulin za kloniranje upotrebom odgovarajućih prajmera pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR). Prajmeri pogodni za amplifikaciju sekvenci nukleinskih kiselina imunoglobulina, a posebno mišijih HCVR i LCVR sekvenci su objavljeni u literaturi. Posle kloniranja takvih sekvenci koje kodiraju imunoglobulin, to će biti sekvence prema metodama koje su dobro poznate u tehnici.

[0101] Nakon što su CDR-kodirajuće sekvence graftovane u izabrane humane sekvence koje kodiraju okvir, rezultujuće DNK sekvence koje kodiraju "humanizovane" varijabilne sekvence teškog i lakog lanca su zatim eksprimirane tako da se proizvodi humanizovani Fv ili humanizovano antitelo koje vezuje IL-17. Humanizovani HCVR i LCVR mogu da budu eksprimirani kao deo celog molekula anti-IL-17 antitela, tj., kao fuzioni protein sa humanim sekvencama konstantnog domena čije kodirajuće DNK sekvence su dobijene iz komercijalno dostupne biblioteke ili koje su dobijene upotrebom, npr., jedne od prethodno opisanih metoda za dobijanje DNK sekvenci, ili koje su poznate u tehnici. Međutim, HCVR i LCVR sekvence se takođe mogu eksprimirati u odsustvu konstantnih sekvenci da bi se proizveo humanizovani anti-IL-17 Fv. Ipak, fuzija humanih konstatnih sekvenci na varijablni region je potencijalno poželjna zbog toga što rezultujuće humanizovano anti-IL-17 antitelo može da poseduje humane efektorske funkcije.

[0102] Metode za sintezu DNK koja kodira protein poznate sekvence su dobro poznate u tehnici. Primenom takvih metoda, DNK sekvence koje kodiraju predmetne humanizovane HCVR and LCVR sekvence (sa ili bez konstantnih regiona) su sintetisane, i zatim eksprimirane u sistemu vektora pogodnom za eksprimiranje rekombinantnih antitela. Ovo se može postići u bilo kom vektorskom sistemu koji obezbeđuje ekspresiju predmetnih humanizovanih HCVR i LCVR sekvenci kao fuzioni protein sa humanim sekvencama konstatnog domena i povezuju tako da proizvode funkcionalna (antigen vezujuća) antitela ili fragmente antitela.

[0103] Sekvence humanog konstanog domena su poznate u tehnici i objavljene su u literaturi. Poželjne sekvence humanog konstantnog lakog lanca obuhvataju sekvence kapa i lambda konstantnog lakog lanca. Poželjne sekvence humanog konstantnog teškog lanca obuhvataju humani IgG1, humani lgG2, humani lgG3, humani lgG4(videti, npr., SEQ ID NOs: 257-260 respektivno) i njihove mutirane varijante koje obezbeđuju izmenjenu efektorsku funkciju, npr., veći in vivo polu-život, smanjeno vezivanje za Fc receptor, izmenjeni profil deamidacije i slično.

[0104] Ukoliko su prisutni, humani okvirni regioni su poželjno poreklom od varijabilnog regiona humanog antitela koji ima sličnost sekvence sa analognim ili ekvivalentnim regionom antigen vezujućeg regiona donora (tj., ishodno antitelo). Ostali izvori okvirnih regiona za delove humanog porekla humanizovanog antitela uključuju humane varijabilne konsenzus sekvence (videti npr., Kettleborough, C.A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carteret al., WO 94/04679. Na primer, sekvence antitela ili varijablnog regiona koje su korišćene za dobijanje nehumanog dela mogu se porediti sa humanim sekvencama kao što su opisane u Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). U posebno poželjnom primeru izvođenja, okvirni regioni humanizovanog antitela su poreklom od humanog varijabilnog regiona koji ima najmanje oko 60% ukupne identičnosti sekvence, poželjno najmanje oko 70%, 80%, ili 90% ukupne identičnosti sekvence i poželjnije najmanje oko 85% ukupne identičnosti sekvence, sa varijabilnim regionom nehumanog donora. Humani deo takođe može da bude poreklom od humanog antitela koji ima najmanje oko 65% identičnosti sekvence, a poželjno najmanje oko 70% identičnosti sekvence, unutar određenog dela (npr., FR) koji je korišćen, u poređenju sa ekvivalentnim delom (npr., FR) ne-humanog donora.

[0105] Reference dalje opisuju metode uključene u humanizaciju mišijeg antitela koje se mogu koristiti su npr., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; SAD patent br. 5,693,761; SAD patent br. 4,816,397; SAD patent br. 5,225,539; kompjuterski programi ABMOD i ENCAD kao što su opisani u Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620, 1983; humanizacija se uglavnom može izvesti praćenjem postupka koji su dali Winter i saradnici (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988).

Humana Antitela

[0106] Kao alternativa humanizaciji, mogu se generisati humana antitela. Humana antitela se mogu proizvesti upotrebom različitih tehnika koje su poznate u tehnici, uključujući biblioteke fagnog prikaza (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Tehnike od Cole et al. i Boerner et al. su takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) i Boerner et al., J. Immunol., 147:86-95, 1991). Slično, humana antitela se mogu dobiti uvođenjem humanih lokusa imunoglobulina u transgene životinje, npr., miševe u kojima su endogeni imunoglobulinski geni delimično ili potpuno inaktivirani. Posle imunizacije, npr., sa antigenom koji sadrži imunogeni epitop pronalaska, dobijen je pun repertoar proizvodnje humanog antitela, koji liči na onaj zabeležen kod ljudi u svakom smislu, uključujući preuređivanje gena, sklapanje i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, u SAD patentima br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,589,369; 5,591,669; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, i u sledećim naučnim publikacijama: Marks et al., BioTechnology 10:779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) i Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993.

[0107] Humani imunoglobulinski geni koji su uvedeni u miša, stvarajući tako transgene miševe koji su sposobni da odgovaraju na antigene antitelima koja imaju humane sekvence su takođe opisani u Bruggemann et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713, 1989). Postoji nekoliko strategija za stvaranje sisara koji mogu da proizvode humana antitela. Posebno, postoji i pristup "minilokus" u kojem je egzogeni Ig lokus oponašan kroz inkluziju delova (npr., individualnih gena) iz Ig lokusa (videti, npr., SAD Pat. br.5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650 i 5,814,318, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215), YAC uvođenje velikih i značajno fragmenata klicinih linija lokusa Ig (Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156, 1997; Green and Jakobovits J. Exp. Med.

188:483- 495, 1998), i uvodi cele ili značajno cele lokuse preko upotrebe mikroćelijske fuzije (videti evropsku patentnu prijavu br. EP 0843 961 A1).

[0108] Bilo koji transgeni miš sposoban da odgovori na imunizaciju sa antitelima koja imaju humane sekvence može se koristiti za proizvodnju anti-IL-17 antitela pronalaska kada se koriste metode dostupne stručnjaku iz date oblasti tehnike, npr., kada je miš imunizovan sa polipeptidom koji sadrži imunogeni epitop pronalaska.

Upotrebe

[0109] Antitela predmetnog pronalaska su korisna u terapeutskim, profilaktičkim, dijagnostičkim i istraživačkim primenama kao što je ovde opisano. Antitelo pronalaska se može koristiti za dijagnozu poremećaja ili bolesti povezanih sa ekspresijom humanog IL-17. Na sličan način, antitelo pronalaska se može koristiti u analizi za praćenje nivoa IL-17 kod subjekta koji je testiran na stanje povezano sa IL-17. Primena u istraživanjima obuhvata metode koje koriste antitelo pronalaska i oznaku za detekciju IL-17 u uzorku, npr., u telesnim tečnostima čoveka ili ćelijskom ili tkivnom ekstraktu. Antitela pronalaska se mogu koristiti sa ili bez modifikacije, i obeležena su kovalentnom ili nekovalentnom vezom detektabilne grupe. Detektabilna grupa može biti ona koja je sposobna da proizvodi, bilo direktno ili indirektno, detektabilni signal. Na primer, detektabilna grupa može biti radioizotop kao što je, npr.,<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I, fluorescentno ili hemiluminescentno jedinjenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin, ili luciferin; ili enzim, kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, ili peroskidaza iz rena. Može se koristiti bilo koja metoda poznata u tehnici za odvojenu konjugaciju antitela za detektabilnu grupu, uključujući i one koje su opisali Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219, 1981; i Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407, 1982.

[0110] Različiti uobičajeni protokoli za merenje IL-17, uključujući npr., ELISAs, RIAs, i FACS, su poznati u tehnici i obezbeđuju osnovu za dijagnozu izmenjenih ili abnormalnih nivoa ekspresije IL-17. Normalne ili standardne vrednosti ekspresije su utvrđene upotrebom bilo koje tehnike poznate u stanju tehnike, npr., kombinovanjem uzorka koji sadrži IL-17 polipeptid sa, npr., antitelima pod uslovima koji su pogodni za formiranje kompleksa antigen:antitelo. Antitelo je direktno ili indirektno obeleženo detektabilnom supstancom da bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne detektabilne supstance obuhvataju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima obuhvataju peroksidazu iz rena, alkalnu fosfatazu, (β-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala obuhvataju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlortriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala obuhvata luminol; i primeri radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S, ili<3>H. (Videti, npr., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Količina formiranog standardnog kompleksa je kvantitativno određena različitim metodama, kao što je, npr., fotometrijska metoda. Količine IL-17 polipeptida eksprimirane u uzorcima su zatim upoređivane sa standardni vrednostima.

[0111] lz praktičnih razloga, antitelo predmetnog pronalaska može da bude obezbeđeno u kompletu, upakovanoj kombinaciji reagenasa u prethodno izmerenim količinama sa uputstvima za izvođenje dijagnostičke analize. Kada je antitelo obeleženo enzimom, komplet će sadržati supstrate i kofaktore potrebne za enzim (npr., odgovarjaući prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilnu hromoforu ili fluoroforu). Dodatno, mogu da se dodaju ostali aditivi kao što su stabilizatori, puferi (npr., blokirajući puferi ili puferi za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu veoma da variraju da bi se obezbedile koncentracije reagenasa u rastvoru koje značajno optimizuju osetljivost analize. Posebno, reagensi mogu da budu obezbeđeni kao suvi prahovi, obično liofilizirani, uključujući eksipijense koji će posle rastvaranja da obezbede rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.

Terapeutske upotrebe antitela

[0112] IL-17 je pro-inflamatorni citokin koji izlučuju aktivirane T ćelije na mestima inflamacije, a ne u sistemskoj cirkulaciji; nije ga jednostavno detektovati u serumu ili tkivima zdrave osobe. IL-17 ushodno reguliše adhezione molekule, indukuje proizvodnju višestrukih inflamatornih citokina i hemokina iz različitih tipova ćelija uključujći sinoviocite, hondrocite, fibroblaste, endotelne ćelije, epitelijalne ćelije, na taj način indukujući angažovanje neutrofila na mestu inflamacije, stimuliše proizvodnju prostaglandina i metaloproteinaza, i inhibira sintezu proteoglikana. Dalje, IL-17 igra važnu ulogu u sazrevanju hematopoetskih progenitorskih ćelija. IL-17 ima signalne uloge u različitim organima i tkivima uključujući pluća, zglobnu hrskavicu, kosti, mozak, hematopoetske ćelije, bubrege, kožu i creva. IL-17 deli 15-27% aminokiselinske homologije sa IL-17 B, C i E i 44-50% aminokiselinske homologije sa IL-17 D i F. IL-17 se vezuje za receptor IL-17 sa niskim afinitetom (oko 1 nM), dok se ostali članovi IL-17 familje ne vezuju za receptor IL-17.

[0113] Povećani nivoi IL-17 (i.e., IL-17A) su povezani sa nekoliko stanja uključujući inflamaciju disajnih puteva, RA, osteoartritis, eroziju kostiju, intraperitonealne abscese i adhezije, IBD, odbacivanje alografta, psorijazu, određene tipove kancera, angiogenezu, aterosklerozu i MS. IL-17 i IL-17R su ushodno regulisani u sinovijalnim tkivima pacijenata sa RA. IL-17 ispoljava svoju ulogu u patogenezi RA preko IL-1-β i TNF-α zavisne i nezavisne puteve. IL-17 stimuliše izlučivanje ostalih citokina i hemokina, npr., TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 i Gro-α. IL-17 direktno doprinosi napredovanju bolesti u RA. Injekcija IL-17 u koleno miša stimuliše destrukciju zgloba nezavisno od aktivnosti IL-1β (Ann. Rheum. Dis. 59:529-32, 2000). Anti-IL-1β antitelo nema efekat na inflamaciju indukovanu sa IL-17 i oštećenje zgloba (J. Immunol. 167:1004-1013, 2001). U mišijem modelu SCW-indukovanog artritisa, IL-17 indukovana infiltracija inflamatornih ćelija i deplecija proteoglikana u divljem tipu i IL-1β knock out i TNF-α knock out miševima. 11-17 knock out miševi su fenotipski normalni u odsustvu antigenog izazova, ali su primetno umanjili artritis posle imunizacije sa kolagenom tipa II (J. Immunol.171:6173-6177, 2003).

[0114] Multipla skleroza ("MS") je autoimuna bolest okarakterisana inflamacijom centralnog nervnog sistema ("CNS") sa oštećenjem mijelinskog omotača kojim su obavijeni aksoni. Obeležje MS je to da se T ćelije infiltriraju u CNS. MS pogađa više od 350,000 osoba u SAD-u i 2.5 miliona širom sveta. Postoje više oblika i najčešće je to relapsna/remisiona bolest (RRMS) nakon čega sledi sekundarni progresivni stadijum. Trenutna terapija se sastoji od Interferona-β (AVONEX, BETASERON i REBIF) koji smanjuje stope relapsa/pogoršanja za 31%-34%, ali može da proizvede simptome slične gripu i/ili sintezu neutralizujućih antitela (npr., oko 15% pacijenata koji primaju AVONEX proizvode neutralizujuća antitela za 18 meseci. TYSABRI, koji je FDA odobrila za RRMS je naknadno uklonjen sa tržišta zbog problema imunosupresije CNS-a. I dalje postoji neispunjena medicinska potreba za tretmanom MS. iRNK IL-17 je povećana u MS lezijama i u mononuklearnim ćelijama (MNC) u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti kod pacijenata sa MS. Povišen broj MNC u krvi koje eskprimiraju iRNK koja eksprimira IL-17 je detektovan tokom MS kliničkog pogoršanja u poređenju na remisiju (Multiple Sclerosis, 5:101-104, 1999). Dalje, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis ("EAE"), preklinički životinjski model za MS je značajno potisnut kod IL-17 knockout miševa.

[0115] Shodno ovom, farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska može da bude korisna za lečenje ili prevenciju stanja u kojima prisustvo IL-17 uzrokuje ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili smanjenje aktivnosti IL-17 ima terapeutsku korist kod sisara, poželjno ljudi, uključujući, ali bez ograničenja na, inflamaciju disajnih puteva, astmu, RA, osteoartritis, eroziju kostiju, intraperitonealne abscese i adhezije, IBD, odbacivanje alografta, psorijazu, određene tipove kancera, angiogenezu, aterosklerozu i MS, kao i druge inflamatorme poremećaje, stanja, bolesti ili oboljenja uključujući bez ograničenja: eritematozu, odgovor na izlaganje alergenu, gastiritis povezan sa Helicobacter pylori, bronhijalnu astmu, i odbacivanje alografta (npr., renalno), sistemski eritematozni lupus i lupus nefritis. Ovde je razmatrana upotreba anti-IL-17 monoklonskog antitela predmetnog pronalaska za lečenje ili prevenciju najmanje jednog od prethodno navedenih poremećaja u kojima je aktivnost IL-17 štetna ili koja ima koristi od smanjenih nivoa bioaktivnog IL-17. Dodatno, razmatarana je upotreba anti-IL-17 monoklonskog antitela predmetnog pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje najmanje jednog od prethodno navedenih poremećaja.

[0116] Kao što su ovde korišćeni, termini "tretman", "tretiranje/ lečenje", i slično, odnose se na dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može da bude profilaktički u smislu potpune ili delimične prevencije bolesti ili njenih simporma i/ili može da bude terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja za bolest i/ili štetni efekat koji doprinosi bolesti. "Tretman", kao što je ovde korišćen, obuhvata primenu jedinjenja predmetnog pronalaska za lečenje bolesti ili stanja kod sisara, naročito kod ljudi, i obuhvata: (a) prevenciju bolesti kod subjekta koji može biti sklon bolesti, ali kome još uvek nije postavljena dijagnoza bolesti; (b) inhibiranje bolesti, tj., zaustavljanje bolesti; i (c) ublažavanja bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti ili poremećaja ili ublažavanje simptoma ili njihovih komplikacija. Dozni režimi se mogu podesiti tako da se obezbedi optimalan željeni odgovor (npr., terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može da bude primenjen jedan bolus, nekoliko podeljenih doza može da bude primenjeno tokom vremena ili doza može da bude proprcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno potrebama terapeutske situacije.

Farmaceutska kompozicija

[0117] Antitelo pronalaska se može inkorporirati u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu na subjekta (videti, npr., Primer 14). Jedinjena pronalaska mogu se primenjivati sama ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem i/ili eksipijensom, u jednoj ili više podeljenih doza. Farmaceutske kompozicije za primenu su dizajnirane tako da su pogodne za izabrani način primene, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač i/ili eksipijensi kao što su: dispergujući agensi, puferi, surfaktanti, konzervansi, solubilizujući agensi, izotonični agensi, stabilizatori i slično su korišćeni prema potrebi (videti, npr., Primer 14 u ovom tekstu). Navedene kompozicije su dizajnirane u skladu sa uobičajenim tehnikama kao u npr., Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 koji daje pregled tehnika formulacija koje su opšte poznate prosečnom stručnjaku.

[0118] Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-IL-17 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska može se primenjivati na subjekta koji je pod rizikom od ili ispoljava patologije kao što su ovde opisane upotrebom standardnih tehnika primene uključujući oralnu, intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, pulmonalnu, transdermalnu, intramuskularnu, intranazalnu, bukalnu, sublingvalnu primenu ili primenu preko supozitorija.

[0119] Farmaceutska kompozicija pronalaska poželjno je "terapeutski efikasna količina" ili "profilaktički efikasna količina" antitela pronalaska. "Terapeutski efikasna količina" označava količinu koja je efikasna, u dozama i tokom neophodnih vremenskih perioda, za postizanje željenog terapeutskog rezultata. Terapeutski efikasna količina antitela može da varira prema faktorima kao što je stanje bolesti, starost, pol, i telesna težina individue, i sposobnost antitela ili dela antitela da izazove željeni odgovor kod individue. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti antitela, su nadmašeni terapeutski korisnim efektima. "Profilaktički efikasna količina" označava količinu koja je efikasna, u dozama i u toku vremensskih perioda neophodnih za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, budući da je profilaktička doza korišćena na subjektima pre oboljevanja ili u ranom stadijumu bolesti, profilaktički efikasna količina će biti manja od terapeutski efikasne količine.

[0120] Terapeutski efikasna ili profilaktički efikasna količina je najmanje minimalna doza, ali manja od toksične doze, aktivnog agensa koja je neophodna da se obezbedi terapeutska korist subjektu. Drugim rečima, terapeutski efikasna količina antitela pronalaska je količina koja kod sisara, poželjno ljudi, smanjuje bioaktivnost IL-17, npr., vezivanje za IL17R, pri čemu prisustvo IL-17 izaziva ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili smanjenje nivoa IL-17 dovodi do korisnog terapeutskog efekta kod sisara, poželjno čoveka.

[0121] Put primene antitela predmetnog pronalaska može da bude oralan, parenteralan, inhalacijom, ili topikalan. Poželjno, antitela pronalaska se mogu inkorporirati u farmaceutsku kompoziciju koja je pogodna za parenteralnu primenu. Termin parenteralan kao što je ovde korišćen obuhvata intravensku, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu, vaginalnu, ili intraperitonealnu primenu. Periferna sistemska isporuka intravenskom ili intraperitonealnom ili subkutanom injekcijom je poželjna. Pogodni nosači za takve injekcije su poznati iz stanja tehnike.

[0122] Farmaceutska kompozicija tipično mora biti sterilna i stabilna pod uslovima proizvodnje i čuvanja u obezbeđenom spremniku, uključujući npr., hermetički zatvorenu bočicu ili špric. Prema tome, farmaceutske kompozicije mogu da budu sterilno filtrirane posle pripreme formulacije, ili na drugi način mikrobiološki prihvatljive. Tipična kompozicija za intravensku infuziju mogla bi da ima zapreminu od 250-1000 ml tečnosti, kao što je sterilan Ringerov rastvor, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze i Hank-ov rastvor i terapeutski efikasna doza (npr., 1 do 100 mg/ml, ili veća). koncentracije antitela. Doza može da varira u zavisnosti od tipa i težine bolesti. Kao što je poznato u stanju medicinske tehnike, doze mogu za bilo kog subjekta da zavise od brojnih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela pacijenta, starost, određeno jedinjenje koje se primenjuje, pol, vreme i put primene, opšte zdravlje, i druge lekove koji se istovremeno primenjuju. Tipična doza može da bude, na primer, u opsegu od 0.001 do 1000 µg; međutim, doze date kao primer u daljem tekstu ili prethodno, se mogu predvideti, naročito uzimajući u obzir prethodno iznete faktore. Dnevni parenteralni dozni režim može da bude oko 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg ukupne težine tela, poželjno od oko 0.3 µg/kg do oko 10 mg/kg i poželjnije od oko 1 µg/kg do 1 mg/kg, još poželjnije od oko 0.5 do 10 mg/kg telesne težine na dan. Napredovanje se može pratiti periodičnom procenom. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman je ponavljan sve do pojave željene supresije simptoma bolesti. Međutim, ostali dozni režimi mogu da budu korisni i nisu izuzeti. Željeni dozni oblik se može isporučivati preko individualne bolus primene, preko višestrukih bolus primena, ili preko kontinuirane infuzione primene antitela, u zavisnosti od obrasca farmakokinetičkog razlaganja koje lekar želi da postigne.

[0123] Ove predložene količine antitela u velikoj meri su predmet terapeutskog nahođenja. Ključni faktor u izboru odgovarajuće doze i režima doziranja je dobijeni rezultat. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu obuhvataju određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke antitela, određenog tipa antitela, postupka primene, rasporeda primene i drugih faktora koji su poznati lekarima.

[0124] Terapeutski agensi pronalaska mogu da budu zamrznuti ili liofilizovani za skladištenje i rekonstituisani u odgovarajućem sterilnom nosaču pre upotrebe. Liofilizacija i rekonstitucija mogu da dovedu do različtih stepena gubitka aktivnosti antitela. Doze moraju da budu podešene da bi se ovo nadoknadilo. Generalno, pH između 6 i 8 je poželjna.

Proizvodni artikl

[0125] Otkriven je proizvodni artikl koji sadrži materijale korisne za lečenje ili prevenciju prethodno opisanih poremećaja ili stanja. Proizvodni artikal sadrži spremnik i oznaku. Odgovarajući spremnici obuhvataju, na primer, bočice, ampule, špriceve i test epruvete.

Spremnici se mogu formirati od različitih materijala kao što je staklo ili plastika. Spremnik sadržu kompoziciju antitela pronalaska koja je efikasna za prevenciju ili lečenje poremećaja ili stanja i može imati sterilni priključak (na primer spremnik može biti kesa sa intravenskim rastvorom ili ampula koja ima poklopac koji se može probušiti hipodermičkom iglom za injekcije). Aktivno sredstvo u kompoziciji je anti-IL-17 antitelo pronalaska. Oznaka na spremniku, ili povezana sa spremnikom ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Proizvodni artikal može dalje da sadrži drugi spremnik koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je fosfatno-puferisani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da sadrži druge materijale koji su poželjni za komercijalne i korisničke tačke glediša, uključujuči ostale pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve, i umetke u pakovanju sa uputstvima za upotrebu.

[0126] Sledeći primeri su dati isključivo u ilustrativne svrhe, i nisu namenjeni da ni na koji način ograniče obim predmetnog pronalaska.

TABELA 1 SEQ ID BROJEVI

Tabela 2 Poravnanje CDR teškog lanca

Konsenzus:

SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 SEQ ID NO: 246 X1YX3FX5X6X7XSX9X10VINPX5YGTTDYNQRFKG YDX3X4X5X6TGX9Y X1je H ili G X5je N, A, M ili E X3je Y, A ili P

X3je S, H ili P X4je Y, F, H, S, W, L ili A X5je G,R,T,N ili P X5je T ili P

X6je D ili W X6je G ili S

X7je Y ili F X9je A,G,L,V ili T X8je N ili H

X9je M,T,L ili I

X10je N,G,H or S

Tabela 3 Poravnanje CDR lakog lanca

NO:

Konsenzus:

SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 SEQ ID NO: 246

X1YX3FX5X6X7X8X9X10VINPX5YGTTDYNQRFKG YDX3X4X5X6TGX9Y

X1je H ili G X5je N,A,M or E X3je Y,A ili P

X3je S,H ili P X4je Y,F,H,S,W,L ili A

X5je G,R,T,N ili P X5je T ili P

X6je D ili W X6je G ili S

X7je Y ili F X9je A,G,L,V ili T

X8je N ili H

X9je M,T,L ili I

X10je N,G,H ili S

PRIMERI

Primer 1 ELISA I: Vezivanje antitela za IL-17 različitih vrsta

[0127] Primer ELISA analize za merenje vezivanje antitela za IL-17 koristi zatvorene Costar 3366 mikrotitarske ploče koje su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl 1.0 µg/ml humanog IL-17 po bunarčiću (R&D Systems, #317-IL/CF) u karbonatnom puferu za oblaganje (50 mM natrijum karbonat, pH 9.0). Alternativno, korišćen je IL-17 miša, pacova, zeca ili makaki majmuna. Humani IL-22 (R&D Systems) je korišćen kao kontrolni antigen. IL-17 zeca i makaki majmuna nisu komercijalno dostupni i shodno tome zahtevaju kloniranje i ekspresiju, ili veštačku sintezu, prema metodama koje su poznate u tehnici koristeći aminokiselinske sekvence za IL-17 različitih vrsta datih na Slici 2 (SEQ ID NOs: 9 i 10). Primeri nukleotidnih sekvenci koje kodiraju IL-17 različitih vrsta prikazane su u SEQ ID NOs: 250-254.

[0128] Ploča je zatim bliokirana dodavanjem 100 µl pufera za blokiranje (Pierce #37515). Ploče su inkubirane 1 čas na 37°C, zatim isprane pti puta u puferu za ispiranje (PBS pH 7.4 i 0.05% Tween). Zatim, po 50 µl svakog uzorka antitela ili kontrolnog antitela (razblažen do različitih koncentracija u PBS pH 7.4, npr., 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 i 0 µg/ml) je dodato u svaki bunarčić i ploča je dalje inkubirana 1 čas na 37°C. Ploča je zatim isprana tri puta sa puferom za ispiranje pre nego što je dodato 50 µl po bunarčiću konjugata anti-humane kapaalkalne fosfataze razblaženog do 1:1000 u PBS -u, pH 7.4. Test uzorci su inkubirani 1 čas na 37°C. Zatim, sveže je pripremljena p-nitrofenil fosfat dinatrijumova so (PNPP, Pierce #37620) rastvaranjem u puferu dietanolamin supstrata prema uputstvima proizvođača i 50 µl je dodato u svaki bunarčić. Razvijanje boje je omogućeno da traje oko 10 minuta na sobnoj tempeturi, zatim signal boje meren na apsrobanci od 405 nm korišćenjem bilo kog odgovarajućeg čitača ploča ELISA. Stepen vezivanja je proporcionalan proizvodnji signala boje.

[0129] Antitela pronalaska vezuju humani IL-17 u ELISA analizi kao što je ovde opisano, ali ne vezuju IL-17 pacova ili miša. Predviđeno je, uzimajući u obzir Biacore podatake iz Primera 4 koja pokazuju da antitela pronalaska vezuju IL-17 čoveka i majmuna, da će antitela pronalaska takođe pokazati vezivanje za IL-17 majmuna u ELISA analizi, kao što je ovde opisano.

Primer 2 ELISA II: Vezivanje antitela za proteine iz familije IL-17

[0130] ELISA je upotrebljena za merenje da li antitela pronalaska selektivno i/ili prefencijalno vezuju određene humane članove IL-17 (npr., IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ili IL-17F) ili humani IL-22 (negativna kontrola).

[0131] U primeru analize, bunarčići ELISA ploče (Nunc Immuno Maxisorp) su obložene sa 100 µl (0.5 µg/ml u 1X puferu za oblaganje (BioFx)) proteina člana IL-17 familije (R&D Systems), hermetički zatvorena i inkubirana preko noći na 4°C. Rastvor u bunarčiću je uklonjen lakim treskanjem i dodat je pufer za blokiranje (200 µl 1.5% BSA u PBS-u). Ploče su inkubirane na rotirajućoj mućkalici 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, u svaki bunarčić je dodato 100 µl antitela za testiranje u različitim koncentracijama (npr., 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 i 0 µg/ml). Ploče su ponovo inkubirane preko noći (4°C), zatim su zagrevane na rotirajućoj mućkalici (60 min sobna temp.). Svaki bunarčić u ploči je zatim ispran pet puta puferom (1X Ish puferom, BioFX). Posle ispiranja, dodato je odgovarajuće komercijalno dostupno HRP-konjugovano sekundarno antitelo (1:2000 u PBS-u sa 1.5% BSA) (100 µl/ležištu). Ploče su ponovo inkubirane na rotirajućoj mućkalici (60 min. sobna temp.) nakon čega su isprane puferom (5X) kao što je opisano u prethodnom tekstu. Kolorimetrijski signal je razvijen dodatkom TMB (100 µl/ležištu) do zasićenja (oko 3-5 min.), zatim je dalje razvijanje zaustavljeno dodatkom stop rastvora (100 µl/ bunarčiću, BioFX). Signal boje je meren na 450 nm apsorbance upotrebom bilo kog uređaja za očitavanje ELISA ploče. Stepen vezivanja je proporcionalan proizvodnji signala boje. Antitela pronalaska (npr., Fabs 103, 104, 118, 121, 126 i 131 kao što su opisana u Tabeli 1) specifično vezuju humani IL-17 (tj., IL-17A), ali pod sličnim uslovima, ne vezuju se na nivou većem od početnog za humani IL-17B, humani IL-17C, humani IL-17D, humani IL-17E, humani IL-17F, mišiji IL-17 ili humani IL-22.

Primer 3 Izolacija i aktivacija ćelija za kloniranje IL-17

A. Splenociti pacova

[0132] Korišćenjem sterilnih forcepsa i makaza, ukloniti slezinu pacova koji je eutanaziran inhalacijom CO2i postaviti slezinu u eperuvetu koja sadrži 5 ml RPMI 1640 medijuma 10% fetusnog goveđeg seruma i penicilin/streptomicin (rastvor medjuma). Sipati sadržaj epruvete u Petri sud od 10 cm i ukloniti mast od slezine. Homogenizovati slezinu pažljivo koristeći par potpuno zamrznutih prethodno autoklaviranih mikroskopskih pločica. Isprati ćelije sa pločica pomoću rastvora medijuma, pipetirati nekoliko puta i filtrirati ćelije kroz ćelijski filter (Fisher Scientific). Isprati ćelije jednom sa rastvorom medijuma, izbrojati ćelije i resuspendovati ih do konačne koncentracije od 2 x 10<7>ćelija/ml u 80 ml. Dodati ćelijski rastvor u posudu T150, dodati konkanavalin A do krajnje koncentracije od 3 µg/ml i inkubirati na 37°C u trajanju od oko 15 časova. Sakupiti ćelije, isprati sa PBS-om, zamrznuti ćelijski talog na suvom ledu i odmah nastaviti sa standardnim procedurama izolovanja RNK.

B. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) makaki majmuna i zeca

[0133] Naneti oko 7 ml cele krvi makaki majmuna ili 10 ml krvi New Zealand belog zeca u BD Vacutainer™ CPT™ System za odvajanje mononuklearnih ćelija iz krvi. Centrifugirati CPT epruvetu u trajanju od 20 min na 1500 x g u horizontalnom rotoru sa rotirajućim bocama. Sakupiti limfocite i monocite na međusloju, dva puta isprati rastvorom medijuma, izbrojati i resuspendovati u rastvoru medijuma do krajnje koncetracije od 10<6>ćelija/ml. Dodati konkanavalin A do krajnje koncentracije od 3 µg/ml i inkubirati na 37°C u trajanju od 15 časova. Sakupiti ćelije, isprati sa PBS-om, zamrznuti ćelijski talog na suvom ledu i odmah nastaviti sa standardnim procedurama izolovanja RNK.

Primer 4 Merenje kinetičkih konstanti vezivanja

[0134] A BIACORE® 2000 instrument je korišćen za merenje kinetike i afiniteta vezivanja antigen-antitelo. Instrument koristi optičke osobine površinske plazmon rezonance za detekciju promena u koncentraciji proteina interagujućih molekula unutar biosenzornog matriksa dekstrana. Osim kada je naznačeno, svi reagensi i materijali su kupljeni od BIACORE® AB. Sva merenja su izvedena na 25°C. Uzorci su resuspendovani u HBS-EP puferu do krajnje koncentracije od 2 µg/ml (150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA, 0.005% (tež./zapr.) surfaktant P-20, i 10 mM HEPES, pH 7.4). Protein A je imobilisan na protočnim ćelijama 1 do 4 CM4 senzornog čipa na nivou od 500 jednica odgovora koristeći komplet za kuplovanje amina.

[0135] Vezivanje je procenjeno upotrebom multiplih analitičkih ciklusa. Svaki ciklus je izveden pri stopi protoka od 50 µl/minuti i sastoji se od sledećih koraka: injekcije oko 20 µl kompozicije antitela u koncentraciji od 2 µg/ml ciljno delujući na sakupljanje 100-200 jedinica odgovora, injekcija od 250 µl humanog IL-17, IL-17 makaki majmuna, IL-17 New Zealand belog zeca, IL-17 pacova ili mišjeg IL-17 (polazeći od 10 nM i upotrebom dovstrukih serijskih razblaženja za svaki ciklus) nakon čega sledi 20 minuta za disocijaciju i regeneraciju upotrebom 30 µl, 10 mM glicin hidrohlorida, pH 1.5. Brzine asocijacije i disocijacije za svaki ciklus procenjivane su upotrebom modela vezivanja "1:1 sa transferom masa" u BIAevaluation softveru.

[0136] mAbs 103, 104,118, 121, 126 i 131 cele dužine (videti Tabelu 1) koja imaju IgG4Fc regionom ispoljavaju visok afinitet vezivanja za humani IL-17 i za IL-17 majmuna, sa KDmanjom od 5 µM, Koffsporijom od 2 x 10<-5>s<-1>i Konod najmanje 5 x 10<6>M"V<1>. KDi koffsu poboljšane (tj., niža Kd, sporija koff) u ovim varijantama mAbs u odnosu na Fab 2321 mAb (ishodni Fab od npr., Fab 103 i 104) sadrži mišiji varijablni region [SEQ ID NOs: 261 (VH od 2321), 262 (VL 2321)], konstantni region teškog lanca humanog IgG4(SEQ ID BR: 260) i konstantne regione kapa lakog lanca (SEQ ID BR: 272). Antitela pronalaska ispoljavaju vezivanje ne veće od pozadinskih nivoa za mišiji IL-17 ili IL-17 pacova; nije detektovano vezivanje do 200 nM mišijeg IL-17 i nije detektovano vezivanje do 1 µM IL-17 pacova. Kada su testirani mAbs 103, 104, 121 i 126 cele dužine, pod istim uslovima kao što je prethodno opisano, za vezivanje za IL-17 makaki majmuna i IL-17 zeca; vezivanje za IL-17 majmuna je slabo i bifazno dok je vezivanje za IL-17 majmuna slično vezivanju za humani. Specifične vrednosti za određena monoklonska antitela (vrednosti su prikazane kao srednja vrednost ± standardna greška) pronalaska kada su testirani u ovoj analizi, date su u Tabeli 4 u daljem tekstu. Smatrano je da Fc regioni osim onih od IgG4značajno ne utiču na KDi koff

Tabela 4

Primer 5 Studije kompeticije vezivanja IL-17 receptora/anti-IL-17 antitela

[0137] Ovaj primer pokazuje da su antitela pronalaska u kompeticiji za vezivanje za IL-17 sa receptorom IL-17.

[0138] Ispitivanja vezivanja BIACORE su izvedena upotrebom IL-17 receptor Fc-fuzionog proteina (R&D #177-IR). Da bi se prikazalo da IL-17 receptor Fc-fuzioni protein vezuje humani IL-17, izvedena je BIACORE analiza u BIACORE vezujućem puferu (HBS-EP) 1 mg/ml BSA na 25°C na BIACORE 2000 instrumentu. CM4 čip je korišćen sa približno 600 jedinica odgovora Proteina A koji je imobilizovan na protočnim ćelijama 1, 2 i 3 čipa. Približno 100 jedinica odgovora receptora IL-17 Fc-fuzionog proteina je sakupljeno na protočnoj ćeliji 2 čipa. Humani IL-17 je zatim izložen protočnoj ćeliji 1 i 2 u koncentracijama u opsegu od 600 nM do 9.4 nM. Posle svake injekcije od 250 µl humanog IL-17, kompleks je ostavljen da disocira oko 12 minuta, tako što se pufer nanosi preko čipa. Na kraju disocijacije, 20 µl injekcije 100 mM glicina sa pH 1.5 je upotrebljeno za regeneraciju čipa pre početka sledećeg ciklusa vezivanja. Protočna ćelija 1 je korišćena kao referentna protočna ćelija. Podaci su aproksimirani pomoću "Bivalent analyte" modela u BIAevaluation Version 3.2 softveru. Rezultati ukazuju na to da ova interakcija ima brzinu od 1.06 x 10<5>M<-1>s<-1>, i brzinu disocijacije od 20.3 s<-1>kao i sporu disocijaciju od 1.63 x 10<-4>s<-1>. Prema tome, ova interakcija ima KDili vezujući afinitet od 1.5 nM i 0.19 mM koji je mnogo slabiji nego vezujući afiniteti antitela pronalaska za humani IL-17.

[0139] Vezivanje za eksperiment kompeticije je takođe mereno u HBS-EP 1 mg/ml BSA na 25°C na BIACORE 2000 instrumentu sa CM4 čipom. Približno 1000 jedinica odgovora antitela pronalaska je imobilizovano na protočnim ćelijama 2, 3 i 4 čipa; dok je protočna ćelija 1 ostavljena kao slepa proba. Upotrebom stope protoka od 50 µl/ml, injektirano je 25 µl od 500 nM humanog IL-17 preko svih protočnih ćelija, formirajući kompleks antitelo:antigen na površini čipa. Pošto je injektiranje završeno i kompleks formiran, injektirano je 250 µl od 500 nM humanog IL-17 receptor Fc fuzionog proteina preko sve četiri protočne ćelije. Na kraju ove injekcije, injekcija od 25 µl 100 mM glicina sa pH 1.5 je upotrebljena za regeneraciju čipa. Isti eksperiment vezivanja je zatim ponovljen upotrebom injekcije 250 µl pufera pre nego IL-17 receptor Fc fuzionog proteina.

[0140] Profili vezivanja za injekcije receptora u odnosu na kompleks antitelo:antigen i za injekciju puferske kontrole u odnosu na kompleks antitelo:antigen su identični. Ovo ukazuje na to da nema raspoloživih mesta za vezivanje dimernog IL-17 za svoj receptor pošto je vezan za antitelo pronalaska. Ovaj rezultat takođe ukazuje na to da receptor nije sposoban da "povuče" IL-17 od bilo kog od antitela pošto je kompleks formiran. Ova antitela mogu da inhibiraju humani IL-17 od vezivanja za svoje receptore, na taj način neutralizujući biološku aktivnost humanog IL-17.

Primer 6A In vitro reporter analiza IL-8

[0141] Za testiranje sposobnosti antitela pronalaska da neutralizuje ili antagonizuje bioaktivnost IL-17, stručnjak može da primeni reporter analizu IL-8 kao što je ovde opisana. Ovaj pristup se takođe može koristiti za određivanje potencije Fabs ili mAbs pronalaska u ćelijski-baziranom testu. Humana HS27 ćelijska linija (ATCC #CRL-1634) izlučuje IL-8 kao odgovor na IL-17. Izlučivanje IL-8 indukovano sa IL-17 je inhibirano neutralizacijom anti-IL-17 antitela (videti, npr., J. Imm. 155:5483-5486, 1995 ili Cytokine 9:794-800, 1997). Shodno tome, IL-17-indukovano izlučivanje IL-8 treba da se nastavi bez ograničenja ukoliko je dodato dovoljno IL-17 u HS27 ćelije u odsustvu neutralizujućeg anti-IL-17 antitela.

[0142] HS27 ćelije su održavane medijumu za analizu: DMEM medijum sa visokim sadržajem glukoze bez fenol crvenog (Invitrogen #31053-028) sa 10% fetusnim goveđim serumom, 4 mM L-glutaminom, 1 mM natrijum piruvatom, penicilinom G (100 U/500 ml) i streptomicinom (100 µg/500 ml). Ćelije su gajene u bočicama T150 dok nije dostignuta 8090% konfluentnost na dan analize. Humani IL-17 (R&D Systems, #317-IL-050) je rekonstituisan u sterilnom PBS-u bez Ca<2+>i Mg<2+>, čuvan smrznut, sveže je odmrznut za upotrebu i razblažen do 200 ng/ml u medijumu za analizu. Alikvota od 50 µl razblaženog IL-17 je dodato u svaki bunarčić 96-komorne ploče za kulturu tkiva sa ravnim dnom (Falcon #35-3072), pri čemu su spoljašnji bunarčići ostavljeni prazni. Dvostruki bunarčići su korišćeni za kontrolu samo sa medijumom (100 µl/ bunarčiću) i samo IL-17 kao kontrola (100 µl/ bunarčiću). Testiranje je izvedeno u duplikatu ili triplikatu. Sterilni mAb proteini cele dužine su razblaženi do maksimalne koncentracije od 24 µg/ml u medijumu za analizu. Serijska razblaženja (tipično 1:5) su pripremljena u posebnoj ploči za analizu i 50 µl uzoraka Fab u različitim razblaženjima je dodato u bunarčiće koji sadrže IL-17, zatim su inkubirani na 37°C u trajanju od 1 časa. Sam medijum za analizu je korišćen kao negativna kontrola.

[0143] HS27 ćelije (tipično oko 20,000 ćelija u 100 µl medijuma za analizu) su dodate u svaki bunarčić ploče koja sadrži Fab IL-17 (ili kontrole) i inkubirani su oko 48 h na 37°C. Supernatanti medijuma su zatim sakupljeni posle centrifugiranja ploče sa 96 bunarčića u trajanju od 5 minuta na 500 x g i razblaženi 1:15 ili 1:10 u medijumu. Nivo neutralizacije IL-17 je meren određivanjem količina IL-8 u supernatantu upotrebom komercijalnog ELISA kompleta prema uputstvima proizvođača izuzev što je medijum zamenjen standardnim razblaživačem i zapremina substrata je 100 µl/bunarčiću (R&D Systems, ELISA D-8000C ili R&D DuoSet ELISA #DY208hIL-8). ELISA merenja (450 nm) su izvedena na uređaju za očitavanje mikroploča. Kalibracione krive su dobijene upotrebom 4-paramaterske logističke aproksimacije sa IL-8 vrednostima (µg/ml) koje su određene iz kalibracionih krivih upotrebom standardnih statističkih tehnika. IC50vrednosti su dobijene upotrebom standardnih statističkih tehnika.

[0144] Monoklonska antitela pronalaska 103, 104, 121 i 126 cele dužine (sa IgG4Fc regionom), kada su testirana u opisanoj analizi (2-4 ponavljanja), imaju srednju vrednost IC50(na osnovu procenjene molekulske težine od 150 kD za svaki mAb) od između 450 i 500 µM sa opsegom svih merenih vrednosti između 365 i 618 µM.

Primer 6B In vitro reporter analiza GROα

[0145] Za testiranje sposobnosti antitela pronalaska da neutralizuje ili antagonizuje bioaktivnost IL-17, stručnjak može da koristi sledeću analizi na bazi ćelija. IL-17 može da stimuliše epitelijalne ćelije i ostale ćelije da izlučuju GROα. U ovoj analizi testirana je sposobnost antitela pronalaska da neutralizuje IL-17- indukovano izlučivanje GROα iz humane epitelijalne ćelijske linije kolorektalnog adenokarcinoma HT-29.

[0146] Za testiranje da li humani IL-17 zavisno od doze indukuje izlučivanje GROα iz ćelija HT-29, rekombinantni IL-17 (R&D Systems #317-IL-050/CF; rekonstituisan u sterilnom Dulbecco-ovom PBS bez Ca<2+>i Mg<2+>(D-PBS)) je razblažen (do 4.5 µg/ml; 3X najveće testirane koncentracije) u medijumu za analiziranje/kulturu (McCoy's 5A (Invitrogen); 10% FBS (Invitrogen); penicilin G (100 U/500 ml); i streptomicin (100 µg/500 ml. IL-17 je dalje serijski razblažen (1:5) u medijumu za analizu. Različite koncentracije IL-17 (0.096 ng/ml -1,500 ng/ml; 3.0 pM - 46,875 pM) su dodate (po 50 µl) u unutrašnje bunarčiće ploče sa 96 bunarčića tretirane kulturom tkiva. Medijum za analizu (50 µl) je dodat u 3 bunarčića za tretman "samo medijumom". Testiranje je izvedeno u tri ponavljanja (3 bunarčića po tretmanu). Ploča koja sadrži IL-17 u medijumu za analizu je inkubirana približno 60-90 minuta na 37°C, 5% CO2, pre dodavanja HT-29 ćelija.

[0147] Za procenu antitela pronalaska, npr., mAb 126 sa IgG4Fc regionom, korišćena je koncentracija IL-17 koja je dala približno 70% maksimalnog izlučivanja GROα iz HT-29 ćelija (60 ng/ml). Rekombinantni humani IL-17 (R&D Systems) je rablažen (do 240 ng/ml; 4X radna koncentracija) u medijumu za analizu/kulturu. Razblaženi IL-17 je dodat (50 µl) u 60 posebnih unutrašnjih bunarčića ploča sa 96 bunarčića tretiranih kuluturom tkiva (Becton Dickinson Falcon #35-3072). Medijum za analizu (50 µl) je dodat u 3 bunarčića za tretman "samo medijumom".

[0148] Opseg doza antitela pronalaska za testiranje je tipično od 2.56 - 40,000 pM. U posebnoj ploči za razblaženje, antitelo pronalaska i kontrolno antitelo (sterilno, u 1X PBS, pH 7.4) razblaženi su do 160,000 pM u medijumu za analizu. Antitelo pronalaska i kontrolno antitelo su dalje razblaženi serijski (1:5) u medijumu za analizu. Svaka testirana koncentracija antitela pronalaska za testiranje je zatim dodata (50 µl) u bunarčiće koje sadrže IL-17. Testiranje se obično izvodi u tri ponavljanja. Sam medijum za testiranje (50 µl) je korišćen kao kontrola "samo medijuma" i kontrola "samo IL-17". Ploče koje sadrže smeše IL-17 i antitela pronalaska su inkubirane 60-90 minuta na 37°C, 5% CO2, pre dodavanja HT-29 ćelija.

[0149] HT-29 ćelije (humane epitelialne ćelije kolorektalnog adenokarcinoma, ATCC #HTB-38), su održavane u medijumu za kulturu/analizu u bočicama tretiranim kulturom tkiva upotrebom standardnih tehnika. HT-29 ćelije su gajene u bočicama kulture tkiva sve dok nisu bile 50-80% konfluentne na dan analize. Na dan analize, ćelije su isprane sa HBSS (Cambrex #CC- 5024) i odvojene od bočica sa kulturom sa tripsinom EDTA. Tripsin je inaktiviran sa kompletnim medijumom za analizu. HT-29 ćelije su zatim centrifugirane na 500Xg tokom 5 min. na sobnoj temperaturi. Ćelijski talog je zatim resuspendovan u medijumu za analizu i dodato je 20,000 HT-29 ćelija (u 100 µl) u svaki bunarčić ploča sa 96 bunarčića. Iste zapremine D-PBS su dodate u svaki od neupotrebljenih ivičnih bunarčića (bez ćelija) da bi se smanjili efekti ivice koji nastaju kao posledica isparavanja. Ploče sa 96 bunarčića su postavljene u inkubator za kulturu tkiva (37°C, 5% CO2) u trajanju od približno 48 časova.

[0150] Na kraju analize, ploče su centrifugirane (500Xg u trajanju od 5 min. na sobnoj temperaturi), i ćelijski medijum za kulturu je prebačen u polipropilenske ploče sa 96 bunarčića. Nivoi GROα su mereni pomoću GROα sendvič ELISA (R+D Systems DuoSet #DY275), prema uputstvima proizvođača, izuzev za: upotrebu medijuma za kulturu kao standardnog razblaživača, upotrebu 1X ELISA pufera za ispiraje od BioFX Labs, upotrebu uzorka i standardne zapremine 50 µl po bunarčiću, upotrebu supstrata od BioFX Labs (HRP substrate, #TMBW-1000-01), i upotrebu stop rastvora od BioFX Labs (#LSTP-1000-01) (100 µl po ležištu). Na kraju ELISA reakcija, ploče su očitane na 450 nm na uređaju za očitavanje mikroploče. Kalibracione krive za GROα su dobijene izvođenjem 4-paramaterske logističke aproksimacije. Vrednosti za GROα (koncentracija u pg/ml) za uzorke dobijene su iz kalibracionih krivih. Epitelijalna ćelijska linija HT-29 humanog kolorektalnog adenokarcinoma izlučivala je GROα kada je stimulisana sa IL-17, na način zavisan od doze (Tabela 5). Kontrolni humani lgG4 nije izazvao smanjenje u IL-17- indukovanom izlučivanju GROα. Ovi rezultati (Tabela 6) pokazuju da mAb 126 može potpuno da neutralizuje izlučivanje GROα indukovano humanim IL-17 iz HT-29 ćelija in vitro upotrebom opisanih uslova. Vrednost IC50za mAb 126 u ovoj analizi je približno 560 µM.

Tabela 5

Tabela 6

Primer 7 In vivo Neutralizacija hIL-17

[0151] Humani IL-17 je sposoban da veže i stimuliše mišiji IL-17 receptor, što dovodi do povećanja i zatim izlučivanja mišjeg KC (CXCL1) hemokina. Eksperimenti sa vremenom i opsegom doza su izvedeni radi identifikacije optimalne doze humanog IL-17 i optimalnog vremena za indukciju mišjeg KC. Ovi eksperimenti ukazuju na to da doza od 150 µg/kg humanog IL-17 i vreme od 2 časa posle primene IL-17 daju maksimalne nivoe KC u mišjem serumu. Antitela cele dužine predmetnog pronalaska (npr., Fab 126 ili Fab 121 sa HCVR operativno vezanim za humani IgG4Fc, SEQ ID BR:260 [ili SEQ ID NO: 278] i LCVR operativno vezanim za humani konstantni region kapa, SEQ ID BR: 263 [ili SEQ ID NO: 277]) su primenjeni intravenski na miševe u 1, 10, 100 i 1000 µg/kg, jedan sat pre subkutane injekcije humanog IL-17. Dva sata posle primene humanog IL-17, miševi su žrtvovani i nivoi KC su određeni pomoću ELISA upotrebom komercijalno dostupnog kompleta prema uputstvima proizvođaća (KC Quantikine, R&D). Antitela odgovarajućeg izotipa su korišćena kao negativne kontrole. Antitela blokiraju sposobnost humanog IL-17 da stimulište mišji IL-17 receptor, što dovodi do inhibicije povećanja mišjeg KC, na način zavisan od doze. Mab126 (antitelo cele dužine koji sadrži Fab 126), u dozi od 20 µg/miša pod opisanim uslovima, smanjuje srednju vrednost nivoa KC oko četiri puta u odnosu na kontrolno antitelo koje nije imalo efekat. Mab 121, u dozi od 20 µg/mišu pod opisanim uslovima, smanjuje srednju vrednost nivoa KC oko tri puta u odnosu na kontrolno antitelo.

Primer 8 Mapiranje epitopa

[0152] Dva od anti-IL-17 antitela (Fab 126 i Fab 104) su korišćena za određivanje da li humanizacija i optimizacija ishodnog mišjeg Fab (2321, SEQ ID NOs: 261 i 262) ne menjaju sposobnost Fab za vezivanje za epitop nastalu kao rezultat humanizacije i optimizacije ishodnog Fab. Humanizovani, optimizovani Fab koji se vezuju za isti epitop kao i ishodni mišji Fab kao što je utvrđeno standardnom kompetitivnom ELISA ili sa H-D izmenom i masenom spektrometrijskom analizom za mapiranje epitopa (Videti, npr., Hoofnagle, A., et al., Methods Mol. Biol. 250:283-298, 2004; Hoofnagle, A„ et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32:1-25, 2003; Baerga-Ortiz, A., et al., Protein Sci. 11:1300-8,2002) prema tome, očekuje se da Fab 1-132 pronalaska poreklom od istog ishodnog Fab, vezuju isti epitop.

[0153] Koristeći H-D izmene i masene spektrometrijske analize (H/DXMS) za mapiranje epitopa, određeno je da aminokiseline između položaja 80 i 89 [ADGNVDYHMN (SEQ ID NO: 266)] humanog IL-17 (SEQ ID NO: 1) su obuhvaćene unutar diskontinuiranog epitopa za koji se vezuju antitela pronalaska. DGNVDYH (SEQ ID BR: 267) je esencijalna sekvenca koja je obuhvaćena unutar diskontinuiranog epitopa za koji se antitela pronalaska vezuju na osnovu poređenja varijacije sekvence IL-17 između različitih vrsta i kapaciteta vezivanja. Menjanje aminokiselinske sekvence SEQ ID BR: 267 unutar konteksta cele sekvence IL-17, dovodi do nedektabilnog vezivanja antitela pronalaska za izmenjen IL-17. Antitela pronalaska se ne vezuju za IL-17 pacova ili miša na nivoima većim od kontrolnog antitela.

[0154] H/DXMS analiza je korišćena za identifikaciju regiona IL-17 za koja se vezuju antitela pronalaska. Brzina izmene vodonika amida zavisi od strukture i dostupnosti rastvarača vodoniku amida. Slobodan IL-17 ili kompleks IL-17:antitelo u vodi je pomešan sa deuterisanom vodom (D2O) da bi se omogućila izmena protona amida deuterijumom. Ove amido grupe osnovnog lanca koje učestvuju u vezivanju proteina su zaštićene od izmena i ostaju protonovane. Ovi regioni su zatim identifikovani peptičkom proteolizom, zajedno sa LC i elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom. Humani IL-17 koji sadrži C-terminalni His i Flag obeleživač (IL-17-Flis) je eksprimiran i prečišćen iz GS-CHO ćelija na IMAC koloni. Dve alikvote od 10 µg (7.7 µl) rastvora IL-17-Flis je prebačeno u 2 Microcon, i 100 µg mAb 104 ili mAb 126 (molarni odnos IL-17/Mab = 1/2) je dodato u Microcon. Dvadeset µg rastvora IL-17-Flis je prebačeno u drugi Microcon i nije dodato antitelo. Zatim je 1x PBS pufer dodat u svaki od Microcon do krajnje zapremine od ~180 µl i centrifugirano na 14,000g u trajanju od 14 min. Zatim je 150 ml 1x PBS pufera dodato u svaki Microcon i centrifugirano na 14,000g tokom 14 min. Ovi koraci su neophodni da bi se obezbedilo da su slobodni antigen i kompleks antigena:antitela u identičnim puferskim uslovima.

[0155] Deo proteina je skupljen i krajnja zapremina je podešena do 50 µl (kompleks) ili 80 µl (samo IL-17-Flis) sa 1xPBS-a. Šest mikrolitara IL-17-Flis ili kompleksa IL-17-Flis i mAb kompleksa je prebačeno u plastične mikro vijalice, i dodato je 14 µl 100% D2O, što daje 70% D2O u uzorku. Rastvor je inkubiran na temperaturi sredine u trajanju od 10 min. Izmena je odmah ugašena, digestirana dodavanjem 20 µl 1% rastvora mravlje kiseline i 2 µl 2 mg/ml rastvora pepsina, i inkubirano je na sobnoj temperaturi, 30 sek. ili na 0°C u trajanju od 10 min. Digestirani proizvod je odmah ručno injektiran na kolonu. Waters 2795 HPLC i Micromass LTC Premier su korišćeni za sve analize. HPLC tok iz HPLC pumpe je povezan sa metalnom cevi (oko 1 ml), za manuelni injektor, za Zorbax C18 kolonu (2.1*50mm), pri čemu je pod ovim uslovima izvršena analiza (Temperatura kolone:0°C; Pokretna Faza C: 0.15% mravlja kiselina u H2O, D: 0.12% mravlja kiselina u ACN; vreme analize:23 min). Kolona je ekvilibrisana sa 98% A (0.15% vodeni rastvor mravlje kiseline) i 2% B (0.12% rastvor mravlje kiseline u acetonitrilu) pri stopi protoka od 0.2 ml/min. Eluiranje gradijentom je izvedeno od 2% do 10% B tokom 0.5 min, zatim do 40% B tokom 14.5 min, zatim do 90% B tokom 1 min sa 2 min. zadržavanja, i onda je vraćeno na 2%B za 1 min.). Uzorak iz HPLC je analiziran masenim spektrometrom koji funkcioniše pod sledećim podešavanjima (Jonski režim: Pozitivan; opseg masenog skeniranja: 300-2000; napon cevi uzorka: 80; protok desolvatacionog gasa (L/Hr):700; temperatura desolvatacije: 300°C). Metalna cev, petlja injektora i kolona su potopljeni u ledenu vodu tokom analize. Maseni spektar svakog od peptičnih peptida IL-17 je dobijen nakon izmene H/D sa ili bez testiranog anti-IL-17 mAb. Za male peptide, srednja masa svakog peptida je izračunata na osnovu njegovih izotopskih jona i intenziteta. Za veće peptide, srednje mase su dobijene iz dekonvolutiranih masenih spektara posle unutrašnje kalibracije.

[0156] Kada antitelo obrazuje kompleks sa IL-17, vezujući region (epitop) u IL-17 je zaštićen od rastvarača. Ovo dovodi do sporije brzine izmene vodonika amida u poređenju sa onima od samog IL-17. Poređenjem mase peptida iz slobodnih i kompleksa posle izmene deuterijuma, peptidi koji su zaštićeni stvaranjem kompleksa trebalo da se razlikuju od odgovarajućeg peptida u slobodnom IL-17. Tabela 7 u daljem tekstu navodi spisak razlika u masi koje su dobijene pomoću H/DXMS za peptične peptide IL-17. Ovi peptički peptidi pokrivaju celu sekvencu IL-17-Flis. Kao što podaci u tabeli pokazuju, razlika u masi IL-17-Flis peptida između kompleksa i samog peptida je slična za oba testirana antitela, tj. ona vezuju isti epitop. Glavna razlika u masama je nađena za peptički peptid 24-87+117-133 (tj., aminokiseline 24 do 87 i 117 do 133 u IL-17) (ova dva peptida su povezana preko disulfidnih veza) i 66-87+117-134, što ukazuje na to da su ostaci unutar ova dva regiona uključeni u vezivanje. Budući da su ovi peptički peptidi prilično veliki, drugi proizvodi enzimske digestije su neophodni za sužavanje specifičnih aminokiselinskih ostataka koji su uključeni u vezivanje. Pored ovih podataka, antitela pronalaska se ne vezuju za druge članove familije IL-17 (IL-17 B, C, D, E i F) i ona se takođe ne vezuju za mišiji ili pacovski IL-17. Ovi podaci zajedno sa poređenjem sekvenci i ispitivanjem homologije IL-17 strukturnog modela ukazuje na to da su ostaci 80-89 obuhvaćeni unutar nelinearnog epitopa IL-17 za koji se vezuju antitela pronalaska.

Tabela 7

Primer 9 Ekspresija IL-17 u tkivima kancera

[0157] Različiti lizati humanih ne-kanceroznih i kanceroznih ćeliija su testirani na prisustvo proteina IL-17. Tkiva (deo oko 50-100 mg) su trenutno smrznuta na suvom ledu, otopljena na ledu, odmrznuta i lizirana u 350 µl TPER bufera (Pierce #78510) uključujući inhibitore proteaze (Pierce #78410) i inhibitore fosfataze u epruveticama koje sadrže keramičke kuglice za liziranje (Qbiogene #6913-050; 1.4 mm keramičke kuglice u eprivetama od 2.0 ml). Epruvete su postavljene na led 5-10 min, zatim centrifugirane na 13,000 x g u tajanju od 10 min na 4°C i materijal je prebačen u nove eprivete da bi se uklonili ostaci. Ostatak je ponovo centrifugiran kao što je opisano i prebačen u novu epruvetu. Koncentracija proteina je određena primenom standardne BSA metode. Uzorci su analizirani za IL-17 upotrebom komercijalnog kompleta IL-17 ELISA prema uputstvima proizvođača (R&D #DY317 upotrebom pufera za ispiranje, rastvora supstrata i stop rastvora iz BioFX Labs). Nivoi IL-17 su normalizvani do ukupne koncentracije proteina. Nivoi IL-17 su povećani između dva i tri puta u kanceroznom tkivu debelog creva (testirano 60 uzoraka) u poređenju sa normalnim tkivom debelog creva (testirano 63 uzroraka). Nivoi IL-17 su povećani u proseku tri do četiri puta u kanceroznom tkivu bubrega (testiran 21 uzorak). Nivoi IL-17 u kanceroznom tkivu prostate (testirano 44 uzorka) su povećani u poređenju sa normalnim tkivom prostate (testirano 7 uzoraka). Nivoi IL-17 nisu povećani u ostalim testiranim tipovima tkiva tumora uključujući tkiva tumora dojke, vrata, pluća, jednjaka, štitne žlezde, jezika, jajnika i mozga.

Primer 10 IL-17 aktivacija mikroglijalnih ćelija

[0158] IL-17 indukuje mikroglijalnu ćelijsku liniju (BV-2) mišijeg mozga da izlučuje IFN i IL-12p70. BV-2 mišja mikroglijalna ćelijska linija [dobijena od Scios, sa dozvolom od Elisabeta Blasi (Microbiology University of Perugia, ltaly) koji su ih originalno izolovali (E. Blasi et al., J. Immunology 1990, 27:229-237)] kultiviane su na posudama za kulturu tkiva obloženim poli-D-lizinom, do ne više od 60% konfulentnosti u DMEM sa visokim sadržajem glukoze (Invitrogen #31053-028) sa 2 mM L-glutaminom (Invitrogen/GIBCO #25030-081), 10% FBS (inaktiviran toplotom; Invitrogen/GIBCO #10082-147), 1 mM natrijum piruvatom (Invitrogen/GIBCO #11360- 070), 100 µg/ml Normocinom (InvivoGen) na 37°C, 5% CO2.

[0159] Na dan 0 analize, BV-2 ćelije su isprane (Dulbecco-ov PBS bez Ca2+ i Mg2+; Invitrogen), odvojene (0.25% tripsin EDTA), zatim su inaktivirane tripsinom, potom centrifugirane (500Xg 5 min. na sobnoj temperaturi). Dobijeni ćelijski talog je ponovo suspendovan do gustine ćelija od ~7,000 ćelija/100 µl medijuma. 100 µl ćelijske suspenzije je dodato u 60 posebnih unutrašnjih bunarčića ploča sa 96 bunarčića obloženih poli-D-lizinom i tretiranih kulturom tkiva. Ploče su inkubirane kao što je opisano, oko 48 časova pre tretmana sa IL-17.

[0160] Na dan 2 analize, rekombinantni mišji IL-17 (mIL-17) (bez nosača; R&D Systems); rekonstituisan u sterilnom Dulbecco-ovom PBS bez Ca<2+>i Mg<2+>je razblažen u polipropilenskoj ploči do 1.5 µg/ml (najviša testirana koncetracija) u medijumu kulture. Mišji IL-17 je dalje serijski razblažen u polipropilenskoj ploči. Pozitivna kontrola LPS je razblažena u medijumu kulture do 1 µg/ml (najviša testirana koncentracija). Medijum za analizu je korišćen kao negativna kontrola. Medijum je pažljivo aspiriran od ćelija, pre dodavanja tretmana (150 µl/komorici). Testiranje je izvedeno u tri ponavljanja (3 bunarčića po tretmanu). Posebne kopije ploča su inkubirane 24 časa ili 48 časova na 37°C, 5% CO2.

[0161] Na dane 3 i dan 4 analize, ploče su centrifugirane (500Xg u trajanju od 5 min. sobna temperatura), zatim je medijum kulture prebačen u polipropilenske ploče sa 96 bunarčića, koje su zatvorene poklopcem i zamrznute (-80°C). Uzorci medijuma su odmrznuti i analizirani za nivoe citokina i hemokina sa mišjim 22-strukim multipleks kompletom (Linco), prema uputstvima prozvođača (izuzev: polikarbonatna filter ploča (Millipore) sa crnim zidovima menja filter ploču koja je uključena u komplet). Fluorescencija je očitana na Luminex® instrumentu (50 kuglica po grupi kuglica, malo povećane RP1). Podaci su prikazani u Tabeli 8 u daljem tekstu.

[0162] Standardne krive su dobijene upotrebom četiri- ili peto-parametarske logističke aproksimacije. IFNγ i IL-12p70 vrednosti (pg/ml) su određene iz standardnih krivih primenom standardnih statističkih tehnika.

Tabela 8

Primer 11 model sindroma iritabilnog creva indukcijom sa DSS

[0163] IBD je hronična inflamatorna bolest koja obuhvata Crohn-ovu bolest i ulcerozni kolitis. Nivoi proteina IL-17 su značajno povećani u serumima i u tkivima debelog creva od pacijenata sa ulceroznim kolitisom i Crohn-ovom bolešću. Međutim, IL-17 se ne može detektovati u serumu od normalnih individua, ili pacijenata sa infektivnim kolitisom ili ishemičnim kolitisom. DSS (Dekstran natrijum sulfat) model je jedan od najstarijih i najreprezentativnijih prekliničkih modela za bolest iritabilnog creva (IBD). U DSS modelu (videti, npr., FASEB Journal. 2004;18:1550-1552) indukovane su i akutne i hronične inflamatorne lezije. Miševi imaju visok stepen uniformnosti lezija uz gubljenje telesne težine i dužine debelog creva. Može se ponoviti u smislu vremenskog toka i težine kod pojedinačnih miševa. Za indukovanje bolesti, miševi primaju 5% DSS 30-40 Kd) u pijaćoj vodi tokom 7 dana. Indeks aktivnosti bolesti (DAI) uključujući pozitivan hemokult test ili rektalno krvarenje, meku stolicu i gubitak telesne težine (5-8%) je zapaženo na oko dana 8. Telesna težina miševa je praćena svaki dan tokom 2 nedelje. Miševi su žrtvovani od dana 12 do dana 15. Protein IL-17 je značajno povećan kod debelog creva tretiranog sa DSS-om, u odnosu na naivno debelo crevo. Tretman sa IL-17 antitelom može da smanji indeks aktivnosti bolesti.

Primer 12 EAE Model za multiplu sklerozu

[0164] EAE je CD4+ T ćelijski posredovana bolest demijelinacije centralnog nervnog sistema (CNS) koji služi kao model za MS kod ljudi. Patogeni mehanizmi razvoja EAE obuhvataju aktivaciju antigen-specifičnih T ćelija i diferencijaciju Th1, zatim infiltraciju T ćelija i makrofaga u CNS-u. IL-17 doprinosi patologiji multiple skleroze (MS). Analiza MS lezija sa mikronizom humanih pacijenata je pokazala povećanje IL-17 (Lock, etal. Nat. Med. 8:500-508, 2002). Mononuklearne ćelije (MNC) koje eksprimiraju iRNK IL-17 u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti su značajno povećani kod određenog broja MS pacijenata i veći broj mononuklearnih ćelija (MNC) koje eksprimiraju iRNK IL-17 u krvi je detektovano tokom kliničkog pogoršanja MS u poređenju sa remisijom (Matusevicius, et al. Multiple Sclerosis.

5:1-1-104, 1999). EAE je značajno potisnuto kod IL-17 nokaut miševa (Nakae et al. , J. Immun. 171:6173-6177).

[0165] Ovde opisan primer pokazuje da je nivo IL-17 proteina povećan u kičmenoj moždini kod EAE miševa i da tretman sa anti-mišijim IL-17 antitelom smanjuje skor EAE u modelu aktivnog EAE. Za indukovanje bolesti, ženke C57BL/6 miševa starosti 8-9 nedelja su subkutano imunizovane na dan 0 sa (i) 200 µl 5 mg/ml pertuzijskim toksinom (PT) i kompletnim Freund-ovim ađuvansom (CFA) ili (ii) PT, CFA i 300 µg/200 µl MOG35-55 (mijelinski oligodendrocitni glikoprotein emulgovan u CFA koji sadrži 5 mg/ml toplotom inaktivirane Mycobacterium tuberculosis). Na dan 2, miševi su tretirani ponovo sa PT. Miševi su ocenjivani tokom ispitivanja prema nivou paralize. Bolest je očekivana u grupi koja prima MOG. Pacovsko anti-mišje IL-17 monoklonsko IgG1 antitelo ili izotip kontrolno antitelo je primenjeno na miša na dane 1, 7 i 15 (BD Biosciences za pacovsko anti-mišije IL-17 antitelo). Miševi koji primaju MOG su žrtvovani kada klinički rezultat dostigne između 1-3 (na skali od 0-4); ovo je između dana 14-31 za ispitivanje 1 u Tabeli 9 u daljem tekstu i između dana 14-16 za ispitivanje 2 u Tabeli 10 u daljem tekstu tekstu. Klinički znaci bolesti se razvijaju oko dana 10. Pojedinačne životinje su subjektivno ocenjene sa najmanje 2 ocene nezavisno i sa skrivenim oznakama, svrstane u tretirane grupe prema kliničkoj težini CNS bolesti. Ocena 0 je normalna životinja; Ocena 1 je sa potpuno mlitavim repom, Ocena 2 je unilateralna delimična slabost zadnjih udova; Ocena 3 je potpuna paraliza zadnjih udova; i ocena 4 je znak da je životinja na samrti. (videti J. Exp. Med.194: 873-881, 2001). Kontrolni miš je žrtvovan istog dana kada i miš tretiran sa MOG. Kičmene moždine su izolovane u vreme žrtvovanja i brzo zamrznute da bi se koristile za analizu IL-17 proteina sa ELISA. Grupa tretirana IL-17 antitelom ima značajno niže ocene bolesti u poređenju sa izotipskom kontrolnom grupom.

[0166] Lizati svake cele kičmene moždine su pripremljeni u 1 ml (ispitivanje 1 u Tabeli 9 u daljem tekstu) ili 0.4 ml (ispitivanje 2 u Tabeli 7 u daljem tekstu) reagensa za ekstrakciju proteina TPER (Pierce #78510) sa kompletnim inhibitorima proteaze (Roche Applied Science #11697498), u epruvetama od 2 ml koje sadrže keramičke kuglice (lizirajući matriks D, QBiogene #6913050), i FastPrep instrument (Bio101) tokom 30 sekundi na skali od 5.5. Posle lize, uzorci su centrifugirani (5 min. na 14,000 rpm u mikrocentrifugi) da bi se ukloili ostaci. Supernatanti su prebačeni u nove epruvete za mikrocentrifugu. Ukupna koncetracija proteina u svkom lizatu je određena sa BCA kompletom za analizu protiena (Pierce #23225), upotrebom protokola mikroploče proizvođača. Lizati su zamrznuti i uskladišteni na -80°C.

[0167] Posle odmrzavanja lizata na ledu i posle bistrenja centrifugiranjem, nivoi IL-17 miša su mereni u nerazblaženim uzorcima pomoću ELISA (R&D Ouantikine #M1700) prema uputstvima proizvođača. Standardne krive su dobijene primenom četvoro-parametarske logističke aproksimacije. Vrednosti za IL-17 su određene iz standardnih krivih upotrebom standardnih statističkih tehnika. Nivoi IL-17 su normalizovani prema koncetraciji proteina u svakom uzorku i izraženi kao µg IL-17/ml ukupnog proteina u svakom lizatu u Tabelama 9 i 10 u daljem tekstu. Kao što je pokazano podacima u tabelama, povećani nivoi IL-17 su detektovani kod EAE miševa.

Tabela 9

Sve IL-17 ELISA vrednosti su unutar opsega detekcije ELISA, srednja vrednost dva ponavljanja

Tabela 10

Primer 13 Model artritisa indukovanog kolagenom

[0168] Artritis indukovan kolagenom (CIA) je široko korišćen model na glodarima za reumatoidni artritis ("RA") i ima histopatološke karakteristike zajedničke sa RA čoveka. Eksperimentalni artritis, indukovan kod DBA/1 miševa imunizacijom i bustingom emulzijama kolagena tipa II, je poliartritična bolest okarakterisana inflamacijom malih zglobova i progresivnom erozijom hrskavice i kostiju (Trentham, D, et al, J. Exp. Med. 146:857-858, 1977). Nedavno, Lubberts, et al, (Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004; ovde obuhvaćeno) su pokazali da je poliklonsko zečije anti-mišje IL-17 antitelo, primenjeno na početku ili u kasnijem stadijumu CIA miša, poboljšalo kliničke znake artritisa.

[0169] U modelu CIA, miševi kojima je davana jedna injekcija anti-mišijeg IL-17 IgG2a mAb pacova intraperitonealno (8mg/kg R&D, MAB421 klon 50104.11) pokazuju značajno niže kliničke ocene od miševa kojima je injektirano 16 mg/kg kontrolnog IgG2a pacova. Reaktant akutne faze, C-reaktivni protein (CRP), je prihvaćen indeks aktivnosti bolesti kod pacijenata sa RA. Slično CRP-u, serum amiloidni protein (SAP) miša služi kao indikator bolesti u modelu CIA miša (Bliven, M., et al, Arthritis & Rheumatism, 29:1131-1138, 1986). Kod životinja koje su tretirane sa 8 mg/kg anti-mišijeg IL-17, nivoi SAP su bili značajno niži nego kod onih tretiranih sa kontrolnim antitelom. Dalje, smanjenje kliničkih ocena i vrednosti SAP može se porediti sa grupom anti-mišijeg IL-1(B (8 mg/kg) koji je korišćen kao pozitivna kontrola. Konačno, značajno smenjenje sinovijalne inflamacije pri koncentraciji antitela od 8mg/kg i resorpcije kostiju u koncentraciji antitela od 16 mg/kg je prisutno u odnosu na iste kod miševa koji su tretirani kontrolnim antitelom. Ispitivanje doze-odgovora može biti izvedeno u modelu CIA sa anti-mišijim IL-17 antitelom (npr., u 0.1, 1 i 8 mg/kg). Kliničke ocene za anti-mišiji IL-17 pacova pokazuju trend za odgovor na dozu. Slična analiza se može izvesti kod makaki majmuna kao model za RA upotrebom antitela pronalaska.

Primer 14 prečišćavanje Anti-IL-17 mAb

[0170] Vektor koji eksprimira mAb pronalaska je stablno inkorporiran u odgovarajuću ćeliju domaćina, (npr., CHO DG44 (dhfr-) ćelije (Chasin) ili NSO ćelije) upotrebom standardnih procedura i prečišćen upotrebom Protein A afinitetne kolone. Ukratko, bistar kondicionirani medijum je nanet na kolonu 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF (Amersham Biosciences) koja je ekvilibrisana sa PBS-om (pH 7.4). Kolona je isprana sa 5 zapremina kolona pufera za ekvilibraciju na protoku od 110 cm/čas da bi se isprale nespecifične vezujuće komponente. Vezano antitelo je eluirano upotrebom linearnog pH gradijenta (0.1 M natrijum fosfatni pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citratni pufer pH 2.5). Sakupljen je glavni pik proteina prilikom eluiranja i njegova pH je podešena na neutralne sa 1 M Tris puferom (pH 8.5). Proteinski pul je koncentrovan do 1-2 mg/ml upotrebom 10K Vivaspin membrane (Vivasciences) i sterilno filtriran (0.45 µm) pre skladištenja na 4°C.

[0171] Za velike preparate mAb pronalaska, koncentrat slobodnih ćelija je prečišćen kroz tri uzastopne hromatografske kolone (Protein A, Anion Exchange, i Hydrophobic Interaction chromatography). Čistoća mAb posle ovih hromatografskih koraka je iznad 99% što je procenjeno analitičkom ekskluzionom hromatografijom. mAb je izmenjen u puferu kao što je dato u daljem tekstu, zavisno od koncentracije antitela. Rezultati hemijske stabilnosti ukazuju na to da je poželjno pH između 6.i 7.0 (uključujući); iako za preparate od 20mg/ml, pH može biti između 5.5 i 7.0 (uključujući, npr., 5.5., 5.6, 5.7., 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6., ili 7.0). Za liofilizovan proizvod, poželjan je nivo natrijum hlorida od 90- 30mM (90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ili 30 mM ili bilo koja vrednost između 30 i 90mM), dok za tečne formulacije (npr., subkutanu primenu) poželjan je nivo natrijum hlorida od 100 - 150 mM (100, 110,120,130,140, ili 150 mM ili bilo koja vrednost od 100 i 150 mM). Proizvod je zatim koncentrovan do krajnje koncentracije od oko 10, 20 ili 25 mg/ml (alternativno više, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mg/ml ili više) i sterilno profiltriran. Profiltriran proizvod može da bude trenutno zamrznut na -70°C ili može da bude liofilizovan. Minimalni težinski odnos od 1:2 antitela prema lioprotektantu, (npr., sukroza ili trehaloza) je potreban za stabilno liofiliziranu formulaciju, ali nije potreban za tečnu formulaciju. Dodatno, 0.02% surfaktant (tež./zapr.), tj., polisorbat-80, je dodat i u rastvor formulacije i rastvore za liofilizaciju. Liofilizovani materijal je ponovo suspendovan u sterilnoj vodi za injekciju ili sterilnom 0.9% natrijum hloridu pre primene.

Tabela 11

Primer 15 In vivo poluživot antitela

[0172] Farmakokinetika antitela pronalaska (npr., mAb 126 and 121 [IgG4 Fc region sa Fab 126 ili 121 respektvno]) u serumu određena je posle intravenske ili subkutane primene na mužjake makaki majmuna. Koncentracije antitela u serumu su određene upotrebom standardne ELISA analize za hvatanje antigena, u kojoj su ploče obložene sa humanim IL-17 i vezano antitelo seruma je detektovano upotrebom anti-lgG4sekundarnog antitela. Posle intravenske primene 1 mg/kg, mAb 126 je elminisan sa srednjim polu-životom od 6.5 dana i mAb 121 je eliminisan sa srednjim polu-životom od oko 11 dana. Posle subkutane primene 1 mg/kg, mAb 126 ima srednji polu-život eliminacije od 10.3 dana i mAb 121 ima srednji poluživot eliminacije od 13 dana.

Primer 16 Model ksenografta tumora

[0173] Da bi se utvrdili modeli ksenografta tumora kojim bi se testirala antitumorska aktivnost anti-IL-17 antitela pronalaska, 5 miliona ćelija HCT116 kolorektalnog karcinoma je pomešano sa Matrigel-om i subkutano injektirano u levi bok atimičnih ženki starosti 56-nedelja (nu/nu) (Charles River laboratories, Wilmington. MA). Miševi su tretirani subkutanom injekcijom svakih 7 dana sa kontrolnim antitelima (npr., humani IgG4 i mišji IgG1), 4 mg/kg anti-humanog-IL-17, 8 mg/kg anti-mišjeg IL-17, ili kombinacija 4 mg/kg anti-humanog-IL-17 i 8 mg/kg anti-mišijeg-IL-17 tokom 4 nedelje. Prva primena antitela počinje dan pre implantiranja ćelija. Tumori su mereni dva puta svake nedelje sa nonijusom i praćena je telesna težina dva puta nedeljno. Plazma je sakupljena od svakog miša 34-og dana i nivoi KC su mereni pomoću KC ELISA kompleta prema uputstvima proizvođača (R&D System). U poređenju sa kontrolnim miševima kojima je injektiran IgG, miševi tretirani kombinacijom anti-humanog IL-17 antitela i anti-mišjeg-IL-17 antitela imaju značajno smanjenu zapreminu tumora. Dalje, miševi tretirani anti-humanim IL17 antitelom i antimišijim IL-17 antitelom imaju značajno snižene vrednosti KC u plazmi. Miševi tretirani sa 4 mg/kg anti-humanog IL17 antitela ili sa 8 mg/kg anti-mišijeg IL17 antitela ne pokazuju značajno smanjenje zapremine tumora i nivoa KC u plazmi. Podaci su prikazani u Tabelama 12 i 13 ovde.

[0174] Za merenje nivoa IL17 u tumorima, tumori iz modela mišijeg ksenografta su pripremljeni uglavnom kao što je opisano u Primeru 9. Za merenje proteina, lizati tumora su razblaženi 1:10 u TPER 1X Halt u polipropilenskoj 96-komornoj ploči. Koncentracija proteina je određena upotrebom protokola za mikroploče Coomassie Plus Protein Assay (Pierce #23236). BSA standard je razblažen u TPER Halt. Nivoi IL-17 proteina su određeni upotrebom humanog i mišijeg IL-17 ELISA kompleta od R&D System prema uputstvima proizvođača (humani IL-17 DuoSet ELISA, R+D Systems, Cat. #DY317; mišji IL-17 ELISA, R+D System, kat. # 421). IL-17 čoveka i miša su povećani u tumorima iz ksenograft modela HCT116 i HT29 tumora debelog creva u poređenju sa ksenograft modelom H460 tumora pluća.

Tabela 12 Zapremina tumora

Zapremina tumora je izračunata upotrebom LogVol,AR postupka

Tabela 13 Nivoi KC hemokina u plazmi 35 dana posle implantacije

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovano anti-IL-17 monoklonsko antitelo naznačeno time da navedeno antitelo sadrži LCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 241 i HCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 118 i pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4.

2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač i/ili ekscipijens.

3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 pri čemu antitelo uspostavlja kontakt sa peptidom DGNVDYH (SEQ ID NO: 276) unutar konteksta humanog IL-17 cele dužine.

4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u lečenju jednog ili više stanja izabranih od reumatoidnog artritisa, inflamatornog poremećaja creva, psorijaze i multiple skleroze.