RS57492B1 - Stabilne formulacije antitela za humani receptor programirane smrti pd-1 i srodni tretmani - Google Patents

Description

Opis

UNAKRSNA REFERENCA NA SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava ima prioritet SAD privremene patentne prijave br. 61/470,121, podnete 31.3.2011.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na stabilne formulacije antitela protiv humanog receptora programirane smrti PD-1. Predmetni pronalazak dalje daje stabilne formulacije antitela protiv humanog PD-1 za upotrebu u postupcima za lečenje različitih kancera i hroničnih infekcija.

OSNOVA PRONALASKA

[0003] Programirana smrt 1 (PD-1), član CD28 kostimulatorne genske familije, je umereno eksprimiran na naivnim T, B i NKT ćelijama i ushodno regulisan preko prenosa signala T/B ćelijskog receptora na limfocitima, monocitima i mijeloidnim ćelijama (1). PD-1 ima dva poznata liganda sa posebnim ekspresionim profilima, PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (B7-DC). Ekspresija PD-L2 je relativno ograničena i nalazi se na aktiviranim dendritskim ćelijama, makrofagama i monocitima i na vaskularnim endotelijalnim ćelijama (1-3). Nasuprot tome, PD-L1 je eksprimiran šire uključujući na naivnim limfocitima i njegova ekspresija je indukovana na aktiviranim B i T ćelijama, monocitima i dendritskim ćelijama. Pored toga, preko iRNK, on je eksprimiran od strane nelimfoidnih tkiva uključujući vaskularne endotelijalne ćelije, epitelijalne ćelije i mišićne ćelije.

[0004] PD-1 se prepoznaje kao važan igrač u imunoj regulaciji i održavanju periferne tolerancije. Kod miša, pokazano je da ovo zahteva ekspresiju PD-L1 na perifernim tkivima i ligaciju PD-1 na potencijalno autoreaktivnim T ćelijama da bi se negativno modulirala aktivacija T ćelija koja uključuje ITIM sekvencu u PD-1 citoplazmatičnom domenu (1, 4).

[0005] U zavisnosti od specifične genetičke osnove, pdcdl<-/->miševi spontano razvijaju fenomen sličan lupusu ili dilatiranu kardiomiopatiju (5, 6). Pored toga, pokazano je da antitelom-indukovana blokada PD-1 / PD-L1 puta ubrzava početak autoimunog insulitisa i dijabetesa kod NOD miševa (7).

[0006] Nađeno je da humani kanceri koji nastaju u različitim tkivima prekomerno eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2. U velikim grupama uzoraka npr. kancera jajnika, bubrega, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera jetre i melanoma nađeno je da je ekspresija PD-L1 u korelaciji sa slabom prognozom i smanjenim ukupnim preživljavanjem bez obzira na kasniji tretman (15-26). Slično, nađeno je da ekspresija PD-1 na limfocitima koji infiltriraju tumor obeležava disfunkcionalne T ćelije u kanceru dojke i melanomu (27-28) i da je u korelaciji sa slabom prognozom kod kancera bubrega (29). Upotrebom primarnih uzoraka pacijenta, pokazano je da blokada PD-1 ili PD-L1 in vitro rezultuje u pojačanju aktivacije T ćelija specifičnih za humani tumor i proizvodnji citokina (30). Posledično, kod nekoliko mišjih singeneičnih tumorskih modela, blokada PD-1 ili PD-L1 je značajno inhibirala rast tumora ili indukovala potpunu regresiju.

[0007] mAb koje blokira PD-1 (h409A11) je otkriveno i razvijeno za upotrebu za lečenje humanih pacijenata sa kancerom i pacijenata hronično inficiranih virusom (opisano u istovremeno važećoj prijavi WO2008/156712).

[0008] Antigen-specifična T ćelijska disfunkcija ili tolerancija je ilustrovana akumuliranim gubitkom potencijala za proizvodnju interleukina 2 (IL-2), faktora nekroze tumora (TNF) α, perforina, interferona (IFN) γ (8) i nesposobnosti da se formira proliferativni odgovor na pokretanje T ćečijskog receptora (1). PD-1 put kontroliše antigen-specifičnu T ćelijsku toleranciju i nađeno je da se koristi u virusnoj infekciji i razvoju tumora za kontrolu i izbegavanje efikasnog T ćelijskog imuniteta.

[0009] Kod hronične infekcije sa LCMV (miš), HIV, HBV ili HCV (čovek), nađeno je da antigen-specifične T ćelije eksprimiraju aberantno visoke nivoe PD-1 što je u korelaciji sa njuihovim stanjem energije ili disfunkcije (9). Pokazano je da blokiranje PD-1 - PDL1 interakcije in vivo (LCMV) ili in vitro (HIV, HCV, HBV) oživljava anti-virusnu T ćelijsku aktivnost (10-12). Blokada PD-1 kod makaki majmuna nedavno inficiranih virusom majmunske imunodeficijencije rezultovala je u snažnoj redukciji virusne koncentracije i povećala je preživljavanje (13). Slično, redukcija u koncentraciji virusa je potvrđena u drugoj studiji upotrebom dugotrajno SIV-inficiranih rezus makaki majmuna (14).

[0010] Ukupno, PD-1/PD-L1 put je dobro validirano ciljno mesto za razvoj terapeutika antitela za lečenje kancera. Anti-PD-1 antitela su takođe korisna za lečenje hronične virusne infekcije. Memorijske CD8+T ćelije generisane posle akutne virusne infekcije su visoko funkcionalne i čine važnu komponentu zaštitnog imuniteta. Nasuprot tome, hronične infekcije su često okarakterisane različitim stepenima funkcionalnog oštećenja (iscrpljenosti) T ćelijskih odgovora specifičnih za virus, i ovaj defekt je glavni razlog za nesposobnost domaćina da eliminiše istrajnog patogena. Iako su funkcionalne efektorne T ćelije početno generisane u toku ranih stadijuma infekcije, one postepeno gube funkciju u toku hronične infekcije. Barber et al. (Barber et al., Nature 439: 682-687 (2006)) su pokazali da su miševi inficirani laboratorijskim sojem LCMV razvili hroničnu infekciju koja rezultuje u visokim nivoima virusa u krvi i drugim tkivima. Ovi miševi početno su razvili snažan T ćelijski odgovor, ali konačno su podlegli infekciji posle iscrpljenja T ćelija. Autori su našli da bi mogla da se izvrši reverzija opadanja broja i funkcije efektornih T ćelija kod hronično inficiranih miševa putem injektiranja antitela koje je blokiralo interakciju između PD-1 i PD-L1.

[0011] Takođe je pokazano da je PD-1 visoko eksprimiran na T ćelijama individua inficiranih HIV-om i da je receptorna ekspresija u korelaciji sa oštećenom T ćelijskom funkcijom i napredovanjem bolesti (Day et al., Nature 443:350-4 (2006); Trautmann L. et al., Nat. Med.

12: 1198-202 (2006)). U obe studije, blokada PD-1 puta upotrebom antitela protiv liganda PD-Ll značajno je povećala ekspanziju HIV-specifičnih ćelija koje proizvode IFN-gama in vitro.

[0012] Ostale studije takođe impliciraju značaj PD-1 puta u kontroli virusne infekcije. PD-1

„knockout“ miševi ispoljavaju bolju kontrolu adenovirusne infekcije od miševa divljeg tipa (Iwai et al., Exp. Med. 198:39-50 (2003)). Takođe, adoptivni transfer HBV- specifičnih T ćelija u HBV transgene životinje započeo je hepatitis (Isogawa M. et al., Immunity 23:53-63 (2005)). Stanje bolesti ovih životinja oscilira kao posledica prepoznavanja antigena u jetri i ushodne regulacije PD-1 od strane ćelija jetre.

[0013] Terapeutska antitela mogu biti korišćena za blokadu aktivnosti citokina. Značajno ograničenje u upotrebi antitela kao terapeutskog sredstva in vivo je imunogenost antitela. Kako je većina monoklonskih antitela poreklom od nehumanih vrsta, ponovljena upotreba kod ljudi rezultuje u stvaranju imunog odgovora protiv terapeutskog antitela. Takav imuni odgovor rezultuje u gubitku terapeutske efikasnosti na minimum, i potencijalno fatalnom anafilaktičkom odgovoru. Prema tome, antitela smanjene imunogenosti kod ljudi, kao što su humanizovana ili potpuno humana antitela, su poželjna za lečenje humanih subjekata. Primeri terapeutskih antitela specifičnih za humani PD-1 otkriveni su u uobičajeno prenetoj SAD objavi patentne prijave br. US2010/0266617, i objavi međunardnog patenta br. WO2008/156712.

[0014] Antitela za upotrebu kod humanih subjekata moraju biti čuvana pre upotrebe i transportovana do tačke primene. Ponovljivost postizanja željenog nivoa leka antitela kod subjekta zahteva da se lek čuva u formulaciji koja održava bioaktivnost leka. Postoji potreba za stabilnim formulacijama anti-humanih PD-1 antitela za farmaceutsku upotrebu, npr., za lečenje različitih kancera i infektivnih bolesti. Poželjno, takve formulacije će da ispolje dugačak rok trajanja, biće stabilne kada su čuvane i transportovane i biće podložne primeni u visokim koncentracijama, npr. za upotrebu u subkutanoj primeni, kao i niskim koncentracijama, npr. za intravensku primenu.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0015] Predmetni pronalazak se odnosi na stabilne formulacije antitela protiv humanog receptora programirane smrti PD-1. Predmetni pronalazak dalje daje stabilne formulacije antitela protiv humanog receptora programirane smrti PD-1 za upotrebu u postupcima za lečenje različitih kancera i hroničnih infekcija.

[0016] U određenim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na stabilnu liofilizovanu formulaciju anti-humanog PD-1 antitela, koja sadrži: a) navedeno anti-humano PD-1 antitelo; b) histidinski pufer; c) polisorbat 80; i d) saharozu.

[0017] U određenim primerima izvođenja, formulacija ima pH između 5.0 i 6.0 kada je rekonstituisana.

[0018] U određenim primerima izvođenja, stabilna liofilizovana formulacija omogućava rekonstituciju antitela, u koncentraciji od između 25 mg/mL i 100 mg/mL.

[0019] U određenim primerima izvođenja, polisorbat 80 je prisutan u težinskom odnosu od približno 0.02% (tež./zapr.).

[0020] U određenim primerima izvođenja, saharoza je prisutna u težinskom odnosu od približno 7% (tež./zapr.).

[0021] U dodatnim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na stabilnu liofilizovanu farmaceutsku formulaciju anti-humanog PD-1 antitela, pripremljenog liofilizacijom vodenog rastvora koji sadrži: a) 25-100 mg/mL antitela; b) 70 mg/mL saharoze; c) 0.2 mg/mL polisorbata 80; i d) 10 mM histidinskog pufera na pH 5.0-6.0.

[0022] U određenim primerima izvođenja, anti-humano PD-1 antitelo je prisutno u 25 mg/mL u vodenom rastvoru. U određenim primerima izvođenja, vodeni rastvor ima pH od 5.5.

[0023] U dodatnim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na stabilnu liofilizovanu farmaceutsku formulaciju anti-humanog PD-1 antitela, koja kada je rekonstituisana sadrži: a) 25-100 mg/mL anti-humanog PD-1 antitela; b) 70 mg/mL saharoze; c) 0.2 mg/mL polisorbata 80; i d) 10 mM histidinskog pufera na pH 5.0- pH 6.0.

[0024] U određenim primerima izvođenja, anti-humano PD-1 antitelo, je prisutno u 25 mg/mL u rekonstituisanom rastvoru. U određenim primerima izvođenja, rekonstituisani rastvor ima pH od 5.5.

[0025] U dodatnim primerima izvvođenja, pronalazak se odnosi na stabilnu tečnu farmaceutsku formulaciju antihumanog PD-1 antitela: a) 25-100 mg/mL antitela; b) 70 mg/mL saharoze; c) 0.2 mg/mL polisorbata 80; i d) 10 mM histidinskog pufera na pH 5.0-6.0.

[0026] U dodatnim primerima izvođenja, pronalazak se odnosi na stabilnu farmaceutsku formulaciju anti-humanog PD-1 antitela koja sadrži: a) navedeno anti-humano PD-1 antitelo; b) histidinski pufer; c) polisorbat 80; i d) saharozu. U određenim primerima izvođenja, formulacija ima pH između 5.0 i 6.0 kada je rekonstituisana. U određenim primerima izvođenja, polisorbat 80 je prisutan u težinskom odnosu od približno 0.02% (tež./zapr.). U određenim primerima izvođenja, saharoza je prisutna u težinskom odnosu od približno 7% (tež./zapr.).

[0027] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na bilo koju od formulacija koje su ovde opisane, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sadrži laki lanac koji sadrži tri CDR sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 15, 16, i 17.

[0028] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na bilo koju od formulacija koje su ovde opisane, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sadrži težak lanac koji sadrži tri CDR sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 18, 19 i 20.

[0029] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na bilo koju od formulacija koje su ovde opisane, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sadrži: i) laki lanac koji sadrži tri CDR sekvence SEQ ID NOs: 15, 16 i 17; i ii) težak lanac koji sadrži tri CDR sekvence SEQ ID NOs: 8, 19 i 20.

[0030] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na bilo koju od formulacija koje su ovde opisane, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 130 od SEQ ID NO:32.

[0031] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na bilo koju od formulacija koje su ovde opisane, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:31.

[0032] Pronalazak se odnosi na formulacije koje su ovde opisane, pri čemu antitelo sadrži: i) laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 od SEQ ID NO: 36 i ii) težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 od SEQ ID NO: 31.

[0033] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na bilo koju od formulacija koje su ovde opisane, pri čemu je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od h409A11, h409A16 i h409A17.

[0034] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na postupak za lečenje hronične infekcije kod sisarskog subjekta kod koga postoji potreba za njim koji sadrži: primenu efikasne količine bilo koje od formulacija koje su ovde opisane.

[0035] U dodatnim primerima izvođenja, otkriće se odnosi na postupak za lečenje kancera kod sisarskog subjekta kod koga postoji potreba za tim, pri čemu postupak sadrži primenu efikasne količine bilo koje od formulacija koje su ovde opisane. U određenim primerima izvođenja, efikasna količina sadrži dozu anti-humanog PD-1 antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od 1.0, 3.0 i 10 mg/kg.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0036]

SLIKE 1A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na pH 5.5 čuvane na 5°C (24 meseca).

SLIKE 2A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na pH 5.5 čuvane na 25H uslovima (25°C, 60% relativne vlažnosti, 12 meseci).

SLIKE 3A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na pH 5.5 čuvane na RH4 uslovima (40°C, 75% relativne vlažnosti, 6 meseci).

SLIKE 4A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 čuvane na 5°C (24 meseca).

SLIKE 5A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na pH 5.5 čuvane na 25H uslovima (25°C, 60% relativne vlažnosti, 6 meseci).

SLIKE 6A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na pH 5.5 čuvane na RH4 uslovima (40°C, 75% relativne vlažnosti, 6 meseci).

SLIKE 7A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 čuvane na 5°C (24 meseca).

SLIKE 8A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na 25H uslovima (25°C, 60% relativne vlažnosti, 6 meseci).

SLIKE 9A-B prikazuju podatke o stabilnosti za liofilizovane formulacije od h409A11 na RH4 uslovima (40°C, 75% relativne vlažnosti, 6 meseci).

DETALJAN OPIS

[0037] Predmetno otkriće daje formulacije anti-PD-1 antitela i njihove upotrebe za lečenje različitih kancera i infektivnih bolesti.

[0038] Anti-PD-1 antitelo h409A11 je primer antitela u stabilnim formulacijama koje su ovde opisane. Tri humanizovana anti-PD-1 monoklonska antitela (tj., h409A11, h409A16 i h509A17) pogodna za predmetne formulacije opisana su u istovremeno važećoj patentnoj objavi WO2008/156712. Dodatno, formulacije koje su ovde opisane su korisne za lečenje određenih kancera kao i hronične infekcije. Tabela 2 daje spisak odgovarajućih CDR sekvenci za h409A11. Tabela 6 daje spisak sekvenci primera anti-PD-1 antitela.

[0039] U skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti korišćene konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, ekspresije i prečišćavanja proteina, antitela i rekombinantne DNK koje su unutar znanja date oblasti tehnike. Takve tehnike su potpuno objašnjene u literaturi. Videti, npr., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; i Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ.; Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins eds. (1985); Transcription And Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); i Harlow and Lane. Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988).

I. Definicije

[0040] Kao što je ovde korišćen, termin "antitelo" označava bilo koji oblik antitela koji ispoljava željenu biološku aktivnost. Na taj način, ono je korišćeno u najširem smislu i specifično pokriva monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), himerna antitela, humanizovana antitela, potpuno humanizovana antitela, itd. sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost.

Ađuvans

[0041] Kao što je ovde korišćen, termin "ađuvans" označava jedinjenje ili smešu koja pojačava imuni odgovor na antigen. Ađuvans može da služi kao tkivni depo koji sporo oslobađa antigen i takođe kao aktivator lifoidnog sistema koji ne-specifično pojačava imuni odgovor (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p. 384). Često, primarno izloženi samom antigenu, u odsustvu ađuvansa, neće uspeti da izazovu humoralni ili ćelijski imuni odgovor. Ađuvansi obuhvataju, ali bez ograničenja na, kompletni Freund-ov ađuvans, nekompletan Freund-ov ađuvans, saponin, mineralne gelove kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronski polioli, polianjoni, peptidi, uljane ili ugljovodonične emulzije, hemocijanini prilepka i potencijalno korisni humani ađuvansi kao što su N-acetil-muramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-izoglutamin, N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin, BCG (bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Poželjno, ađuvans je farmaceutski prihvatljiv.

Citokin

[0042] Termin "citokin" je generički termin za proteine koje oslobađa jedna populacija ćelija koji deluju na drugu ćeliju kao intercelularni medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini, hemokini i tradicionalni polipeptidni hormoni. Primeri citokina obuhvataju: humani IL-2, IFN-γ, IL-6, TNFα, IL-17 i IL-5.

Citotoksično sredstvo

[0043] Termin "citotoksično sredstvo" kao što je ovde koprišćen označava supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva uništavanje ćelija. Termin je namenjen za obuhvatanje radioaktivnih izotopa (npr., I131 , I125, Y90 i Re186), hemoterapeutsih sredstava i toksina kao što su enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti.

Terapeutske upotrebe i postupci

[0044] Sredstva koja blokiraju PD-1 obuhvataju ona koja se specifično vezuju za humani PD-1, mogu se koristiti za povećanje, pojačanje, stimulaciju ili ushodnu regulaciju imunog odgovora. Poželjni subjekti obuhvataju humane pacijente kod kojih postoji potreba za pojačanjem imunog odgovora uključujući pacijente sa kancerom i/ili hroničnom virusnom infekcijom.

Kancer

[0045] Termini "kancer", "kancerozan", ili "maligni" označavaju ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje je tipično okarakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri kancera obuhvataju, ali bez ograničenja na, karcinom, limfom, leukemiju, blastom i sarkom. Posebni primeri takvih kancera obuhvataju karcinom skvamoznih ćelija, mijelom, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, gliom, Hodgkin-ov limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, gastrointestinalni (trakta) kancer, kancer bubrega, kancer jajnika, kancer jetre, limfoblastičnu leukemiju, limfocitnu leukemiju, kolorektalni kancer, endometrijalni kancer, kancer bubrega, kancer prostate, tiroidni kancer, melanom, hondrosarkom, neuroblastom, kancer pankreasa, glioblastoma multiforme, kancer grlića materice, kancer mozga, kancer želudca, kancer bešike, hepatom, kancer dojke, karcinom debelog creva i kancer glave i vrata.

[0046] Sredstva koja blokiraju PD-1 obuhvataju ona koja se koriste za lečenje kancera (tj., za inhibiciju rasta ili preživljavanja tumorskih ćelija). Poželjni kanceri čiji rast može biti inhibiran upotrebom anti-PD-1 antitela kao što je humanizovano anti-PD-1 antitelo h409A11 i obuhvataju kancere koji su tipično responsivni na imunoterapiju, ali takođe kancere koji nisu do sada bili povezani sa imunoterapijom. Neograničavajući primeri poželjnih kancera za lečenje obuhvataju melanom (npr., metastatski maligni melanom), kancer bubrega (npr. karcinom providnih ćelija), kancer prostate (npr. hormonski refraktorni adenokarcinom prostate), adenokarcinom pankreasa, kancer dojke, kancer debelog creva, kancer pluća (npr.

1

nesitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, kancer jetre, kancer jajnika, kancer grlića materice, tiroidni kancer, glioblastom, gliom, leukemiju, limfom i ostale neoplastične malignitete. Maligniteti koji pokazuju poboljšano preživljavanje bez bolesti ili ukupno preživljavanje u vezi sa prisustvom limfocita koji infiltriraju tumor u biopsiji ili hirurškom materijalu, npr. melanom, kolorektalni kancer, kancer jetre, bubrega, želudca/jednjaka, dojke, pankreasa i jajnika su obuhvaćeni u postupcima i tretmanima koji su ovde opisani. Takvi podtipovi kancera su poznati kao podložni imunoj kontroli pomoću T limfocita. Dodatno, obuhvaćeni su refraktorni ili povratni maligniteti čiji rast može biti inhibiran upotrebom antitela koja su ovde opisana. Naročito poželjni kanceri obuhvataju one okarakterisane povišenom ekspresijom PD-1 i/ili njegovih liganada PD-L1 i/ili PD-L2 u testiranim uzorcima tkiva, uključujući: kancere jajnika, bubrega, kolorektalni, pankreasa, dojke, jetre, želudca, jednjaka i melanom. Dodatni kanceri koji mogu da imaju koristi od tretmana sa anti-PD-1 antitelima kao što je humanizovano anti-PD-1 antitelo h409A11 obuhvataju ona povezana sa perzistentnom infekcijom sa virusima kao što su virusi humane imunodeficijencije, virusi hepatitisa klase A, B i C, Epstein Barr virus, humani papiloma virusi koji su poznati kao uzročno povezani sa na primer Kaposi-ev sarkom, kancer jetre, nazofaringealni kancer, limfom, kancere grlića materice, vulve, analne, penisa i oralne kancere.

Hemoterapeutsko sredstvo

[0047] "Hemoterapeutsko sredstvo" je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju kancera. Anti-PD-1 antitela mogu biti korišćena sa jednim ili više pogodnih hemoterapeutskih sredstava. Primeri takvih hemoterapeutskih sredstava obuhvataju alkilaciona sredstva kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktiin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su enediin antibiotici (npr. kaliheaamicin, naročito kaliheamicin gama1I i kaliheamicin phiI1, videti, npr., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonati, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromofore hromoprotein enediin antibiotika), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenale kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopuna folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; majtanzinoidi kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel i doksetaksel; hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; novantron; teniposid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoeva kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od gore navedenih. Takođe su uključena anti-hormonalna sredstva koja deluju tako da regulišu ili inhibiraju aktivnost hormona na tumore kao što su antiestrogeni i selektivni modulatori receptora za estrogen (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen, raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston); inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat, eksemestan, formestan, fadrozol, vorozol, letrozol i anastrozol; i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih.

Sredstva za inhibiciju rasta

[0048] "Sredstvo za inhibiciju rasta" kada je ovde korišćeno označava jedinjenje ili kompoziciju koja inhibira rast ćelije, naročito ćelije kancera koja prekomerno eksprimira bilo koji od gena koji su ovde identifikovani, bilo in vitro ili in vivo. Na taj način, sredstvo za inhibiciju rasta je ono koje značajno redukuje procenat ćelija koje prekomerno eksprimiraju takve gene u S fazi. Primeri sredstava za inhibiciju rasta obuhvataju sredstva koja blokiraju napredovanje ćelijskog ciklusa (na mestu osim S faze), kao što su sredstva koja indukuju zaustavljanje G1 i zaustavljanje M-faze. Klasični blokatori M-faze obuhvataju taksane vinke (vinkristin i vinblastin) i inhibitore topo II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin i etoposid. Ona sredstva koja zaustavljaju G1 takođe se prelivaju u zaustavljanje S-faze, na primer, DNK alkilaciona sredstva kao što su dakarbazin, mehloretamin i cisplatin. Dodatne informacije mogu se naći u The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995).

Antitelo ili fragmenti antitela u kombinaciji sa dodatniim sredstvima

[0049] Anti-PD-1 antitelo ili fragmenti antitela mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji sa: drugim anti-neoplastičnim sredstvima ili imunogenim sredstvima (na primer, atenuiranim kanceroznim ćelijama, tumorskim antigenima (uključujući rekombinantne molekule proteina, peptida i ugljenih hidrata), antigen predstavljajućim ćelijama kao što su dendritske ćelije pulsirane sa antigenom ili nukleinskim kiselinama poreklom iz tumora, imunim stimulirajućim citokinima (na primer, IL-2, IFNα2, GM-CSF), i ćelijama transficiranim genima koji kodiraju imune stimulirajuće citokine kao što su, ali bez ograničenja na GM-CSF); standardnim tretmanima za kancer (na primer, hemoterapijom, radioterapijom ili

1

operacijom); ili drugim antitelima (uklju;ujući, ali bez ograničenja na antitela za VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF receptore, druge receptore za faktore rasta, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB i ICOS).

Infektivne bolesti

[0050] Antagonistčka anti-PD-1 antitela ili fragmenti antitela takođe mogu biti korišćeni za prevenciju ili lečenje infekcija i infektivne bolesti. Ova sredstva mogu biti korišćena pojedinačno, ili u u kombinaciji sa vakcinama, za stimulaciju imunog odgovora na patogene, toksine i auto-antigene. Antitela ili njihov antigen-vezujući fragment mogu biti korišćeni za stimulaciju imunog odgovora na viruse infektivne za ljude, uključujući, ali bez ograničenja na: viruse humane imunodeficijencije, viruse hepatitisa klase A, B i C, Epstein Barr virus, humani citomegalovirus, humane papiloma viruse i herpes viruse. Antagonistčka anti-PD-1 antitela ili fragmenti antitela mogu biti korišćeni za stimulaciju imunog odgovora na infekciju sa bakterijskim ili gljivičnim parazitima i drugim patogenima. Virusne infekcije hepatitisom B i C i HIV-om su među onima koje se smatraju hroničnim virusnim infekcijama.

[0051] Kao što su ovde korišćeni, termini "PD-1 vezujući fragment," "njegov antigenvezujući fragment," "njegov vezujući fragment" ili "njegov fragment" obuhvataju fragment ili derivat antitela koji još uvek značajno zadržava svoju biološku aktivnost vezivanja za antigen (humani PD-1) i inhibicije njegove aktivnosti (npr., blokiranje vezivanja PD-1 za PDL1 i PDL2). Prema tome, termin "fragment antitela" ili PD-1 vezujući fragment označava deo antitela pune dužine, generalno njegov antigen-vezujući ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela obuhvataju Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela, npr., sc-Fv; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Tipično, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 10% svoje aktivnosti inhibicije PD-1. Poželjno, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% (ili više) svoje aktivnosti inhibicije PD-1, iako će biti koristan bilo koji vezujući fragment sa dovoljnim afinitetom za ispoljavanje željenog biološkog efekta. Takođe je bila namera da PD-1 vezujući fragment može da obuhvata varijante koje imaju konzervativne aminokiselinske supstitucije koje ne menjaju značajno svoju biološku aktivnost.

[0052] "Domen antitelo" je imunološki funkcionalni fragment imunoglobulina koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, svi ili više VHregiona su kovalentno spojeni sa peptidnim linkerom tako da se stvori bivalentno domen antitelo. Dva VHregiona bivalentnog domen antitela mogu ciljno da deluju na iste ili različite antigene.

[0053] "Bivalentno antitelo" sadrži dva antigen-vezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezujuća mesta imaju iste antigenske specifičnosti. Međutim, bivalentna antitela mogu biti bispecifična. Kao što je ovde korišćen, termin "bispecifično antitelo" označava antitelo, tipično monoklonsko antitelo, koje ima vezujuće specifičnosti za najmanje dva različita antigtena epitopa. U jednom primeru izvođenja, epitopi su iz istog antigena. U sledećem primeru izvođenja, epitopi su iz dva različita antigena. Postupci za pripremu bispecifičnih antitela su poznati u stanju tehnike. Na primer, bispecifična antitela mogu biti proizvedena rekombinantno upotrebom ko-ekspresije dva para teškog lanca/lakog lanca imunoglobulina. Videti, npr., Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativno, bispecifična antitela mogu biti pripremljena upotrebom hemijske veze. Videti, npr., Brennan et al. (1985) Science 229:81. Bispecifična antitela obuhvataju bispecifične fragmente antitela. Videti, npr., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol.

152:5368.

[0054] Kao što je ovde korišćen, termin "jednolančano Fv" ili "scFv" antitelo označava fragmente antitela koji sadrže VHi VLdomene antitela, pri čemu su ti domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućavaju sFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za prikaz sFv, videti Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

[0055] Monoklonska antitela ovde takođe obuhvataju kamelizovana antitela sa jednim domenom. Videti, npr., Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; SAD pat. br.

6,005,079). Takođe su uključena antitela sa jednim domenom koja sadrže dva VHdomena sa modifikacijama tako da su formirana antitela sa jednim domenom.

[0056] Kao što je ovde korišćen, termin "diatela" označava male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, koji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VLili VL-VH). Upotrebom linkera koji je prekratak da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prinuđeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Ditela su opisana potpunije u, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Za prikaz

1

konstruisanih varijanti antitela generalno videti Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol.

23:1126-1136.

[0057] Kao što je ovde korišćen, termin "humanizovano antitelo" označava oblike antitela koji sadrže sekvence iz nehumanih (npr., mišjih) antitela kao i humanih antitela. Takva antitela sadrže minimalnu sekvencu poreklom od nehumanog imunoglobulina. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati značajno sve od najmanje jednog i tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili značajno sve od hipervarijabilnih petlji odgovaraju onima od nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi od FR regiona su oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo izborno takođe će sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od humanog imunoglobulina. Humanizovani oblici glodarskih antitela će generalno da sadrže iste CDR sekvence matičnih glodarskih antitela, iako određene aminokiselinske supstitucije mogu biti uključene za povećanje afiniteta, povećanje stabilnosti humanizovanog antitela ili iz drugih razloga.

[0058] Antitela prema predmetnom otkriću takođe obuhvataju antitela sa modifikovanim (ili blokiranim) Fc regionima da bi se obezbedile promenjene efektorne funkcije. Videti, npr., SAD Pat. br. 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Takve modifikacije mogu biti korišćene za pojačanje ili supresiju različitih reakcija imunog sistema, sa mogućim korisnim efektima u dijagnozi i terapiji. Promene Fc regiona obuhvataju aminokiselinske promene (supstitucije, delecije i insercije), glikozilaciju ili deglikozilaciju i dodavanje višestrukih Fc. Promene Fc takođe mogu da promene polu-život antitela u terapeutskim antitelima, i duži polu-život bi rezultirao u ređem doziranju, sa istovremenom povećanom pogodnošću i smanjenom upotrebom materijala. Videti Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731 at 734-35.

[0059] Termin "potpuno humano antitelo" označava antitelo koje sadrži samo humane imunoglobulinske proteinske sekvence. Potpuno humano antitelo može da sadrži mišje ugljenohidratne lance ako je proizvedeno u mišu, u mišjoj ćeliji ili u hibridomu poreklom od mišje ćelije. Slično, "mišje antitelo" označava antitelo koje sadrži samo mišje mmunoglobulinske sekvence. Potpuno humano antitelo može biti generisano u čoveku, u transgenoj životinji koja ima humane imunoglobulinske sekvence klicine linije, fagnim prikazom ili drugim metodama molekularne biologije.

[0060] Kao što je ovde korišćen, termin "hipervarijabilni region" označava aminokiselinske ostatake antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (npr. ostatke 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) i 89-97 (CDRL3) u varijabilnom domenu lakog lanca i

1

ostatke 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) i 95-102 (CDRH3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (tj. ostatke 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901-917). Kao što je ovde korišćen, termin "okvirni" ili "FR" ostaci označava one ostatke varijabilnog domena osim ostataka hipervarijabilnog regiona definisane ovde kao CDR ostaci. Numeracija ostataka u prethodnom tekstu se odnosi na Kabat sistem numeracije i ne odgovara neophodno u detaljima numeraciji sekvenci u pratećem Listingu sekvenci.

[0061] "Konzervativno modifikovane varijante" ili "konzervativna supstitucija" označava suptitucije aminokiseline koje su poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike i mogu biti pripremljene generalno bez promene biološke aktivnosti rezultujućeg molekula, čak u esencijalnim regionima polipeptida. Takvi primeri supstitucija su poželjno pripremljeni u skladu sa onima navedenim u Tabeli 1 kao što sledi:

Tabela 1

1

[0062] Pored toga, stručnjaci iz date oblasti tehnike će razumeti da, uopšteno, jedna aminokiselinska supstitucija u neesencijalnim regionima polipeptida značajno ne menja biološku aktivnost. Videti, npr., Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4th Edition).

[0063] Izraz "uglavnom se sastoji od," ili varijante kao što su "sastoji se uglavnom od" ili "koji se uglavnom sastoji od," kao što su korišćeni u specifikaciji i patentnim zahtevima, označavaju uključivanje bilo kojih navedenih elemenata ili grupa elemenata, i izborno uključenje drugih elemenata, slične ili različite prirode od navedenih elemenata, koji materijalno ne menjaju osnovne ili nove osobine naznačenog režima doziranja, postupka ili kompozicije. Kao neograničavajući primer, vezujuće jedinjenje koje se uglavnom sastoji od navedene aminokiselinske sekvence takođe može da obuhvata jednu ili više aminokiselina, uključujući supstitucije jedne ili više aminokiselinskih ostataka, koji materijalno ne utiču na osobine vezujućeg jedinjenja.

[0064] "Imuno stanje" ili "imuni poremećaj" obuhvata, npr., patološku inflamaciju, inflamatorni poremećaj i autoimuni poremećaj ili bolest. "Imuno stanje" takođe označava infekcije, uporne infekcije i proliferativna stanja, kao što su kancer, tumori i angiogeneza, uključujući infekcije, tumore i kancere koji su otporni na iskorenjivanje pomoću imunog sistema. "Kancerozno stanje" obuhvata, npr., kancer, ćelije kancera, tumore, angiogenezu i prekancerozna stanja kao što je displazija.

[0065] Antitelo, ili vezujuća kompozicija poreklom od antigen-vezujućeg mesta antitela, razmatrane formulacije ili postupka vezuje se za svoj antigen sa afinitetom koji je najmanje dva puta veći, poželjno najmanje deset puta veći, poželjnije najmanje 20-puta veći i najpoželjnije najmanje 100-puta veći od afiniteta sa nesrodnim antigenima. U poželjnom primeru izvođenja antitelo će imati afinitet koji je veći od oko 10<9>litara/molu, kao što je određeno, npr., pomoću Scatchard analize. Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239.

Definicije farmaceutske kompozicije

1

[0066] Termin "agens punjenja" sadrži sredstva koja obezbeđuju strukturu proizvoda osušenog zamrzavanjem. Uobičajeni primeri korišćeni za agense punjenja obuhvataju manitol, glicin, laktozu i saharozu. Pored obezbeđivanja farmaceutski elegantnog kolača, agensi za punjenje takođe mogu da obezbede korisne kvalitete u vezi sa modifikacijom temperature kolapsa, obezbeđujući zaštitu od zamrzavanja-odmrzavanja i pojačanje stabilnosti proteina tokom dugotrajnog čuvanja. Ti agensi takođe mogu da služe kao modifikatori toničnosti.

[0067] Termin "pufer" obuhvata ona sredstva koja održavaju pH rastvora u prihvatljivom opsegu preliofilizacije i mogu da obuhvataju sukcinat (natrijum ili kalijum), histidin, fosfat (natrijum ili kalijum), tris (tris(hidroksimetil)aminometan), dietanolamin, citrat (natrijum) i slično. Pufer ovog otkrića ima pH u opsegu od oko 5.0 do oko 6.0; i poželjno ima pH od oko 5.5. Primeri pufera koji će da vrše kontrolu pH u ovom opsegu obuhvataju sukcinat (kao što je natrijum sukcinat), glukonat, histidin, citrat i ostale organske kisele pufere. U dolaženju do primera formulacije, histidinski, acetatni i citratni puferi u pH opsegu od 5.0-6.0 su ispitivani za pogodnost. Histinski i acetatni puferski sistemi su imali bolji učinak od citrantnog sistema. Histidinski pufer je poželjan puferski sistem, zbog toga što acetatni puferski sistemi nisu kompatibilni sa procesom liofilizacije.

[0068] Termin "krioprotektanti" generalno obuhvata sredstva koja obezbeđuju stabilnost proteinu protiv stresova indukovanih zamrzavanjem, verovatno time što su poželjno isključeni iz proteinske površine. Oni takođe mogu da ponude protekciju u toku primarnog i sekundarnog sušenja, i dugotrajnog čuvanja proizvoda. Primeri su polimeri kao što su dekstran i polietilen glikol; šećeri kao što su saharoza, glukoza, trehaloza i laktoza; surfaktanti kao što su polisorbati; i aminokiseline kao što su glicin, arginin i serin.

[0069] Termini "liofilizacija," "liofilizovan," i "osušen zamrzavanjem" označavaju proces pomoću koga materijal koji se suši je prvo zamrznut i zatim je led ili zamrznuti rastvarač uklonjen sublimacijom u vakuumskoj sredini. Ekscipijens može biti uključen u preliofilizovane formulacije da bi se pojačala stabilnost liofilizovanog proizvoda posle čuvanja.

[0070] Termin "lioprotektant" obuhvata sredstva koja obezbeđuju stabilnost proteinu u toku procesa sušenja ili ’dehidratacije’ (primarni i sekundarni ciklusi sušenja), verovatno obezbeđivanjem amorfnog staklenog matriksa i vezivanjem sa proteinom preko vodonične veze, menjajući molekule vode koji su uklonjeni u toku postupka sušenja. Ovo pomaže u održavanju konformacije proteina, minimizuje degradaciju proteina u toku ciklusa liofilizacije i poboljšava dugotrajnu stabilnost proizvoda. Primeri obuhvataju poliole ili šećere kao što su saharoza i trehaloza.

1

[0071] Termin "farmaceutska formulacija" označava preparate koji su u takvom obliku da se dozvoli da aktivni sastojci budu efikasni, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su toksične za subjekte na koje će se formulacija primenjivati.

[0072] "Farmaceutski prihvatljivi" ekscipijensi (nosači, aditivi) su oni koji mogu razumno biti primenjeni na subjekta sisara da bi se obezbedila efikasna doza korišćenog aktivnog sastojka.

[0073] "Vreme rekonstitucije" je vreme koje je potrebno za rehidrataciju liofilizovane formulacije sa rastvorom do izbistrenog rastvora bez čestica.

[0074] "Stabilna" formulacija je ona u kojoj protein esencijalno zadržava svoju fizičku stabilnost i/ili hemijsku stabilnost i/ili biološku aktivnost posle čuvanja. Različite analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina su dostupne u stanju tehnike i prikazane u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993). Stabilnost može biti merena na izabranoj temperaturi tokom izabranog vremenskog perioda.

[0075] "Stabilna" liofilizovana formulacija antitela je liofilizovana formulacija antitela bez značajnih promena zabeleženih na temperaturi hlađenja (2-8°C) u trajanju od najmanje 12 meseci, poželjno 2 godine i poželjnije 3 godine; ili na sobnoj temperaturi (23-27°C) u trajanju od najmanje 3 meseca, poželjno 6 meseci i poželjnije 1 godine. Tipični prihvatljivi kriterijumi za stabilnost su kao što sledi. Ne više od 10%, poželjno 5%, monomera antitela je razloženo kao što je mereno pomoću SEC-HPLC. Rehidratisani rastvor je tipično bezbojan ili bistar do neznatno opalescentan u vizuelnoj analizi. Koncentracija, pH i osmolarnost formulacije imaju ne više od /-10% promene. Potencija je tipično unutar opsega od 50-150% reference. Zabeleženo je ne više od 10%, poželjno 5% isecanja. Formirano je ne više od 10%, poželjno 5% agregacije.

[0076] "Stabilna" farmaceutska formulacija antitela (uključujući liofilizovanu formulaciju, rekonstituisanu tečnost, kao i tečnu formulaciju koja je "finalna" formulacija (tj., nije prethodno liofilizovana)) je farmaceutska formulacija antitela bez značajnih promena zabeleženih na temperaturi hlađenja (2-8°C) u trajanju od najmanje 3 meseca, poželjno 6 meseci i poželjnije 1 godine, i čak poželjnije do 2 godine. Dodatno, "stabilna" tečna formulacija obuhvata onu koja ispoljava željene karakteristike na temperaturama uključujući na 25°C i 40°C tokom perioda uključujući 1 mesec, 3 meseca, 6 meseci, 12 meseci i/ili 24 meseca. Tipični prihvatljivi kriterijumi za stabilnost su kao što sledi. Tipično, ne više od oko 10%, poželjno oko 5%, monomera antitela je razloženo kao što je mereno pomoću SEC-HPLC. Farmaceutska formulacija antitela je bezbojna ili bistra do neznatno opalescentna u vizuelnoj analizi. Koncentracija, pH i osmolarnost formulacije imaju ne više od /-10%

2

promene. Potencija je tipično unutar 50-150 od reference. Zabeleženo je tipično, ne više od oko 10%, poželjno oko 5% isecanja. Tipično, formirano je ne više od oko 10%, poželjno oko 5% agregacije.

[0077] Antitelo "zadržava svoju fizičku stabilnost" u farmaceutskoj formulaciji ako ne pokazuje značajno povećanje agregacije, precipitacije i/ili denaturacije posle vizuelnog pregleda boje i/ili bistrine, ili kao što je mereno pomoću rasipanja UV svetlosti, ekskluzione hromatografije (SEC) i dinamičkog rasipanja svetlosti. Promene konformacije proteina mogu biti procenjene fluorescentnom spektroskopijom, koja određuje tercijarnu strukturu proteina, i pomoću FTIR spektroskopije, koja određuje sekundarnu strukturu proteina.

[0078] Antitelo "zadržava svoju hemijsku stabilnost" u farmaceutskoj formulaciji, ako ne pokazuje značajnu hemijsku promenu. Hemijska stabilnost može biti pocenjena detekcijom i kvantitativnim određivanjem hemijski promenjenih oblika proteina. Procesi razlaganja koji često menjaju hemijsku strukturu proteina obuhvataju hidrolizu ili isecanje (procenjeno pomoću postupaka kao što je ekskluziona hromatografija i SDS-PAGE), oksidaciju (procenjena pomoću postupaka kao što su putem peptidnog mapiranja zajedno sa masenom spektroskopijom ili MALDI/TOF/MS), deamidaciju (procenjena pomoću postupaka kao što su jono-izmenjivačka hromatografija, kapilarno izoelektrično fokusiranje, peptidno mapiranje, merenje izoasparaginske kiseline) i izomerizaciju (procenjena merenjem sadržaja izoasparaginske kiseline, peptidnog mapiranja, itd.).

[0079] Antitelo "zadržava svoju biološku aktivnost" u farmaceutskoj formulaciji, njegova biološka aktivnost antitela u dato vreme je unutar unapred određenog opsega biološke aktivnosti ispoljene u vreme kada je pripremljena farmaceutska formulacija. Biološka aktivnost antitela može biti određena, na primer, pomoću analize vezivanja antigena.

[0080] Termin "izotoničan" označava da formulacija od interesa ima uglavnom isti osmotski pritisak kao humana krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 270-328 mOsm. Neznatno hipotoničan pritisak je 250-269 i neznatno hipertoničan pritisak je 328-350 mOsm. Osmotski pritisak može biti meren, na primer, upotrebom osmometra tipa pritiska pare ili tipa leda-zamrzavanja.

[0081] Modifikatori toničnosti: Soli (NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, itd.) su korišćene kao modifikatori toničnosti za kontrolu osmotskog pritiska. Pored toga, krioptotektanti/lioprotektanti i/ili agensi punjenja kao što su saharoza, manitol, glicin itd. mogu da služe kao modifikatori toničnosti.

Analitički postupci

[0082] Analitički postupci pogodni za procenu stabilnosti proizvoda obuhvataju ekskluzionu hromatografiju (SEC), dinamički test rasipanja svetlosti (DLS), diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), izo-asp kvantitativno određivanje, potenciju, UV na 340 nm, UV spektroskopiju i FTIR. SEC (J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994); Pharm. Res., 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986)) meri procenat monomera u proizvodu i daje informacije o količini rastvorljivih agregata. DSC (Pharm. Res., 15:200 (1998); Pharm. Res., 9:109 (1982)) daje informacije o temperaturi denaturacije proteina i temperaturi staklenog prelaza. DLS (American Lab., November (1991)) meri srednji difuzioni koeficijent i daje informaciju o količini rastvorljivih i nerastvorljivih agreagata. UV na 340 nm meri intenzitet rasute svetlosti na 340 nm i daje informaciju o količinama rastvorljivih i nerastvorljivih agreagata. UV spektroskopija meri apsorbancu na 278 nm i daje informaciju o koncentraciji proteina. FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm., 45:231 (1998); Pharm. Res., 12:1250 (1995); J. Pharm. Scien., 85:1290 (1996); J. Pharm. Scien., 87:1069 (1998)) meri IR spektar u jednom regionu amida i daje informaciju o sekundarnoj strukturi proteina.

[0083] Sadržaj izo-asp u uzorcima je meren upotrebom „Isoquant Isoaspartate Detection System“ (Promega). Komplet koristi enzim protein izoaspartil metiltransferazu (PIMT) za specifičnu detekciju prisustva ostataka izoasparaginske kiseline u ciljnom proteinu. PIMT katalizuje transfer metil grupe sa S-adenozil-L-metionina do izoasparaginske kiseline na alfakarboksil položaju, generišući S-adenozil-L-homocistein (SAH) u procesu. Ovo je relativno mali molekul, i može obično biti izolovan i kvantitativno određen pomoću reverzno-fazne HPLC upotrebom SAH HPLC standarda obezbeđenih u kompletu.

[0084] Potencija ili bioidentitet antitela mogu biti mereni preko njegove sposobnosti da se veže za svoj antigen. Specifično vezivanje antitela za njegov antigen može biti kvantitativno određeno pomoću bilo kog postupka poznatog stručnjaku iz date oblasti tehnike, na primer, imunološke analize, kao što je ELISA (enzimski-vezana imunosorbent analiza).

[0085] "Rekonstituisana" formulacija je ona koja je pripremljena rastvaranjem liofilizovane formulacije proteina u razblaživaču tako da je protein dispergovan u rekonsituisanoj formulaciji. Rekonstituisana formulacija je pogodna za primenu, (npr. parenteralnu primenu), može izborno biti pogodna za subkutanu primenu.

Humanizovana anti-PD-1 antitela

[0086] Konstrukti DNK koji kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca humanizovanih antitela h409A11, h409A16 i h409A17 opisani su u WO2008/156712.

[0087] Gore navedena pisana specifikacija smatra se dovoljnom da omogući stručnjaku iz date oblasti tehnike da izvodi pronalazak. Predmetni pronalazak ne bi trebalo da je ograničen u obimu deponovanom kulturom, s obzirom na to da je deponovani primer izvođenja namenjen kao jedna ilustracija jednog aspekta pronalaska i bilo koja kultura koja je funkcionalno ekvivalentna je unutar obima ovog pronalaska. Depozit materijala ovde ne čini povrdu da je pisani opis koji je ovde sadržan neadekvatan za obezbeđivanje izvođenja bilo kog aspekta pronalaska, uključujući najbolji njegov način, niti bi ga trebalo tumačiti kao ograničavajući za obim patentnih zahteva na specifičnu ilustraciju koju on predstavlja. Zaista, različite modifikacije pronalaska pored onih prikazanih i opisanih ovde postaće očigledne stručnjacima iz date oblasti tehnike iz gore navedenog opisa i spadaju unutar obima priloženih patentnih zahteva.

[0088] Sekvence su obezbeđene za primer anti-humanih PD-1 antitela; tabela sa rezimiranim sekvencama je data u Tabeli 6. CDR regioni su dati pod posebnim identifikatorima sekvence, kao što je naznačeno u Tabeli 2 za h409A11.

[0089] Obično, varijante aminokiselinske sekvence humanizovanog anti-PD-1 antitela će imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskim sekvencama originalnog humanizovanog antitela teškog ili lakog lanca poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95, 98 ili 99%. Identičnost ili homologija u odnosu na ovu sekvencu je ovde definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa humanizovanim anti-PD-1 ostacima, posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je neophodno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvenci, i ne smatrajući bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvenci. Nijedna od N-terminalnih, C-terminalnih ili unutrašnjih ekstenzija, delecija ili insercija u sekvenci antitela neće biti tumačena kao da utiče na identičnost ili homologiju sekvenci.

[0090] Humanizovano antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE. Poželjno, antitelo je IgG antitelo. Bilo koji izotip IgG može biti korišćen, uključujući IgG1, IgG2, IgG3i IgG4. Različiti konstantni domeni mogu biti dodati na humanizovane VLi VHregione koji su ovde obezbeđeni. Na primer, ako je određena nameravana upotreba antitela (ili fragmenta) predmetnog otkrića bila traženje promenjenih efektornih funkcija, može biti korišćen konstantni domen teškog lanca osim IgG1. Iako IgG1antitela obezbeđuju dugotrajan polu-život i efektorne funkcije, kao što je aktivacija

2

komplementa i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, takve aktivnosti ne moraju biti poželjne za sve upotrebe antitela. U takvim slučajevima, može biti korišćen na primer konstantni domen IgG4.

[0091] Slično, bilo koja klasa lakog lanca može biti korišćena u kompozicijama i postupcima ovde. Specifično, kapa, lambda ili njihove varijante su korisni u predmetnim kompozicijama i postupcima.

[0092] CDR i FR ostaci su određeni prema standardnoj definiciji sekvence prema Kabat-u. Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md.

[0093] Signalne sekvence, ili sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju signalne sekvence, mogu biti dodate na N-terminus odgovarajućih lanaca antitela da bi se stvorio prekursorski protein za izlučivanje iz ćelije domaćina. Alternativne signalne sekvence takođe mogu biti korišćene, i nekoliko se može naći u "SPdb: a Signal Peptide Database." Choo et al. (2005) BMC Bioinformatics 6:249.

TABELA 2

Biološka aktivnost humanizovanog anti-PD-1

[0094] Formulacije predmetnog otkrića obuhvataju antitela i njihove fragmente koji su biološki aktivni kada su rekonstituisani ili u tečnom obliku. Kao što je ovde korišćen, termin "biološki aktivan" označava antitelo ili fragment antitela koje je sposobno da veže željeni antigeni epitop i direktno ili indirektno ispolji biološki efekat. Tipično, ovi efekti su rezultat neuspeha PD-1 da se veže za svoje ligande. Kao što je ovde korišćen, termin "specifično" označava selektivno vezivanje antitela za ciljni antigeni epitop. Antitela mogu biti testirana za specifičnost vezivanja poređenjem vezivanja za PD-1 sa vezivanjem za irelevantni antigen ili smešu antigena pod datim setom uslova.

Liofilizovane farmaceutske kompozicije

[0095] Liofilizovane formulacije terapeutskih proteina obezbeđuju nekoliko prednosti. Liofilizovane formulacije uopšteno nude bolju hemijsku stabilnost od formulacija rastvora i na taj način povećani polu-život. Liofilizovana formulacija takođe može biti rekonstituisana u različitim koncentracijama u zavisnosti od kliničkih faktora, kao što su put primene ili doziranje. Na primer, liofilizovana formulacija može biti rekonstituisana na visokoj koncentraciji (tj. u maloj zapremini) ako je neophodno za subkutanu primenu, ili na nižoj koncentraciji ako je primenjena intravenski. Visoke koncentracije takođe mogu biti neophodne ako je visoko doziraje potrebno za određenog subjekta, naročito ako su primenjene subkutano gde zapremina injekcije mora biti minimizovana. Jedna takva liofilizovana formulacija antitela je otkrivena u SAD pat. br. 6,267,958. Liofilizovane formulacije drugog terapeutskog proteina su otkrivene u SAD pat. br.7,247,707.

[0096] Tipično, liofilizovana formulacija je pripremljena u očekivanju rekonstitucije na visokoj koncentraciji proizvoda leka (DP, u ilustrativnom primeru izvođenja humanizovanog anti-PD-1 antitela h409A11, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta), tj. u očekivanju rekonstitucije u niskoj zapremini vode. Kasnije razblaženje vodom ili izotoničnim puferom zatim može biti korišćeno za razblaženje DP do niže koncentracije. Tipično, ekscipijensi su uključeni u liofilizovanu formulaciju predmetnog otkrića u nivoima koji će imati za rezultat približno izotoničnu formulaciju kada je rekonstituisana na visokoj koncentraciji DP, npr. za subkutanu primenu. Rekonstitucija u većoj zapremini vode da bi se dobila niža koncentracija DP neophodno će smanjiti toničnost rekonstituisanog rastvora, ali takva redukcija može biti od manjeg značaja kod nesubkutane, npr. intravenske, primene. Ako je izotoničnost željena na nižoj koncentraciji DP, liofilizovani prah može biti rekonstituisan u standardnoj niskoj zapremini vode i zatim razblažen izotoničnim razblaživačem, kao što je 0.9% natrijum hlorid.

[0097] U primeru izvođenja predmetnog otkrića, humanizovano anti-PD-1 antitelo (ili njegov antigen-vezujući fragment) je formulisano kao liofilizovani prah za rekonstituciju i upotrebu za intravensku primenu. Primeri formulacija su opisani u Tabelama 3-4, i na Slikama 1-9. U određenim primerima izvođenja, antitelo (ili njegov antigen-vezujući fragment) je

2

obezbeđeno u oko 50 mg/bočici, i rekonstituisano je sa sterilnom vodom za injekciju pre upotrebe. Ako je poželjno, rekonstituisano antitelo može biti aseptički razblaženo sa 0.9% injekcijom natrijum hlorida USP u sterilnom IV spremniku. Ciljna pH rekonstituisane formulacije je 5.5±0.5. U različitim primerima izvođenja, liofilizovana formulacija predmetnog otkrića omogućava rekonstituciju anti-PD-1 antitela do visokih koncentracija, kao što su oko 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100 ili više mg/mL.

[0098] Predmetno otkriće daje u određenim primerima izvođenja, liofilizovanu formulaciju koja sadrži humanizovano anti-PD-1 antitelo, histidinski pufer na oko pH 5.5 ili na oko pH 5.0, na primer na oko 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 ili 6.0.

[0099] Kada je naveden opseg pH vrednosti, kao što je "pH između pH 5.5 i 6.0," opseg je određen tako da uključuje navedene granične vrednosti. Osim ukoliko je drugačije naznačeno, pH označava pH posle rekonstitucije liofilizovanih formulacija predmetnog otkrića. pH je tipično merena na 25°C upotrebom standardnog ph-metra sa staklenom elektrodom. Kao što je ovde korišćen, rastvor koji sadrži "histidinski pufer na pH X" označava rastvor na pH X i koji sadrži histidinski pufer, tj. pH je određena tako da označava pH rastvora.

[0100] Formulacija u Tabeli 3 reflektuje težinu komponenti u formulaciji šarže, kao liofilizovana u bočicama, i kao rekonstituisana. Liofilizovane formulacije su po definiciji uglavnom suve, i na taj način koncept koncentracije nije koristan u njihovom opisivanju. Opisivanje liofilizovane formulacije prema težini komponenti u bočici jedinične doze je korisnije, ali je problematično zbog toga što varira za različite doze ili veličine bočice. U opisivanju liofilizovanih formulacija predmetnog pronalaska, korisno je eksprimirati količinu komponente kao odnos težine komponente u poređenju sa težinom supstance leka (DS) u istom uzorku (npr. bočici). Ovaj odnos može biti izražen kao procenat. Takvi odnosi reflektuju intrinzičku osobinu liofilizovanih formulacija predmetnog pronalaska, nezavisno od veličine bočice, doziranja i protokola rekonstitucije.

[0101] U drugim primerima izvođenja, liofilizovana formulacija anti-humanog PD-1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, je definisana prema pre-liofilizacionom rastvoru korišćenom za pripremu liofilizovane fomrulacije, kao što je pre-liofilizacioni rastvor. U jednom primeru izvođenja pre-liofilizacioni rastvor sadrži antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, u koncentraciji od oko 25mg/mL. Takvi pre-liofilizacioni rastvori mogu biti na pH 4.4 - 5.2 (uključujući oko 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1. i 5.2), npr. poželjno oko pH 4.8, ili oko pH 5.5.

[0102] U drugim primerima izvođenja, liofilizovane formulacije anti-humanog PD-1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, su definisane prema rekonstituisanom rastvoru

2

generisanom od liofilizovane formulacije, kao što je rekonstituisani rastvor otkriven u Tabeli 4.

[0103] Rekonstituisani rastvori mogu da sadrže antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, u koncentracijama od oko 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 ili 100 mg/mL ili višim koncentracijama kao što su 150mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL ili do oko 300 mg/mL. Takvi rekonstituisani rastvori mogu biti na oko pH 5.5, ili opsegu od oko pH 5.0 do oko 6.0

[0104] Liofilizovane formulacije predmetnog pronalaska su formirane lifilizacijom (sušenje zamrzavanjem) preliofilizacionog rastvora. Sušenje zamrzavanjem je postignuto zamrzavanjem formulacije i kasnijom sublimacijom vode na temperaturi pogodnoj za primarno sušenje. Pod ovim uslovima, temperatura proizvoda je ispod eutektičke tačke ili temperature kolapsa formulacije. Tipično, temperatura polica za primarno sušenje biće u opsegu od oko -30 do 25°C (uz uslov da proizvod ostaje zamrznut u toku primarnog sušenja) na pogodnom pritisku, u opsegu tipično od oko 50 do 250 mTorr. Formulacija, veličina i tip spremnika koji drži uzorak (npr., staklena bočica) i zapremina tečnosti će diktirati vreme koje je potrebno za sušenje, koje može biti u opsegu od nekoliko časova do nekoliko dana (npr.40-60 časova). Stadijum sekundarnog sušenja može se izvesti na oko 0-40°C, u zavisnosti primarno od tipa i veličine spremnika i tipa korišćenog proteina. Vreme sekundarnog sušenja je diktirano željenim nivoom rezidualne vlage u proizvodu i tipično je najmanje oko 5 časova. Tipično, sadržaj vlage liofilizovane formulacije je manji od oko 5%, i poželjno manji od oko 3%. Pritisak može biti isti kao onaj korišćen u toku koraka primarnog sušenja. Uslovi sušenja zamrzavanjem mogu biti varirani u zavisnosti od formulacije i veličine bočice.

[0105] U nekim slučajevima, može biti poželjno liofilizovati formulaciju proteina u spremniku u kome se rekonstitucija proteina izvodi u cilju izbegavanja koraka transfera. Spremnik u ovom slučaju može, na primer, biti bočica od 3, 5, 10, 20, 50 ili 100 cc.

[0106] Liofilizovane formulacije predmetnog pronalaska su rekonstituisane pre primene. Protein može biti rekonstituisan u koncentraciji od oko 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 ili 100 mg/mL ili višim koncentracijama kao što su 150mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL ili 300 mg/mL do oko 500 mg/mL. Visoke koncentracije proteina su naročito korisne gde je nameravana subkutana isporuka rekonstituisane formulacije. Međutim, za ostale puteve primene, kao što je intravenska primena, mogu biti željene niže koncentracije proteina (npr. od oko 5-50 mg/mL).

[0107] Rekonstitucija se generalno izvodi na temperaturi od oko 25°C da bi se osigurala potpuna hidratacija, iako ostale temperature mogu biti korišćene ako je poželjno. Vreme koje je potrebno za rekonstituciju zavisiće, npr., od tipa razblaživača, količine ekscpijensa

2

(ekscipijenasa) i proteina. Primeri razblaživača obuhvataju sterilnu vodu, bakteriostatičku vodu za injekciju (BWFI), pH puferisani rastvor (npr. fosfatno-puferisani fiziološki rastvor), sterilni fiziološki rastvor, Ringer-ov rastvor ili rastvor dekstroze.

[0108] Liofilizovane formulacije predmetnog pronalaska očekuje se da su stabilne najmanje oko 36 meseci (na osnovu podataka os tabilnosti sa Slika 1-9). Pored toga, očekuje se da tečna formulacije ispoljavaju stabilnost u trajanju od najmanje 24 meseca, na osnovu 24 meseca podataka o stabilnosti iz rekonstituisane formulacije h409A11 u plipropilenskim epruvetama na 2-8°C.

[0109] U skladu sa rezultatima prikazanim na Slikama 1-9, stabilnost je beležena tokom 2 godine za rashlađenu rekonstituisanu formulaciju h409A11. Uzorci od 2mL u polipropilenskim epruvetama su čuvani na 5°C, i 25H i RH4 uslovima i testirani na početku, i u periodima od 1, 3, 6, 9, 12, 18 i 24 meseca. Ova rekonstituisana formulacija h409A11 ima iste supstituente u istoj koncentraciji kao tečna formulacija h409A11 (tj., formulacija koja nije liofilizovana) i očekuje se da je stabilnost ista.

Tečne farmaceutske kompozicije

[0110] Tečna formulacija antitela može biti pripremljena uzimanjem supstance leka (npr., anti-humanizovanog PD-1) koja je u tečnom obliku (npr., h409A11 u vodenoj farmaceutskoj formulaciji) i njenoj puferskoj izmeni u željeni pufer kao poslednji korak postupka prečišćavanja. U ovom primeru izvođenja nema koraka liofilizacije. Supstanca leka u krajnjem puferu je koncentrisana do željene koncentracije. Ekscipijensi kao što su saharoza i polisorbat 80 su dodati u supstancu leka i ona je razblažena upotrebom odgovarajućeg pufera do krajnje koncentracije proteina. Krajnja formulisana supstanca leka je filtrirana upotrebom 0.22µm filtera i punjena je u krajnji spremnik (npr. staklene bočice). Takva tečna formulacija je ilustrovana krajnjom tečnom formulacijom koja sadrži 10 mM histidin pH 5.5, 7% saharozu, 0.02% polisorbat 80 i 25 mg/mL h409A11.

[0111] Različite literaturne reference su dostupne za olakšanje izbora farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopoeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984); Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al.

2

(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY.

[0112] Toksičnost je razmatranje u izboru podesnog doziranja terapeutskog sredstva, kao što je humanizovano anti-PD-1 antitelo (ili njegov antigen-vezujući fragment). Toksičnost i terapeutska efikasnost kompozicija antitela mogu biti određeni pomoću standardnih farmaceutskih postupaka u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50(doze letalne za 50% populacije) i ED50(doze koja je terapeutski efikasna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapeutskih efekata je terapeutski indeks i može biti izražen kao odnos LD50prema ED50. Poželjna su antitela koja ispoljavaju visoke terapeutske indekse. Podaci dobijeni iz ovih analiza ćelijske kulture i studija na životinjama mogu biti korišćeni u formulaciji opsega doza za upotrebu kod čoveka. Doza takvih jedinjenja poželjno leži unutar opsega koncentracija u cirkulaciji koje obuhvataju ED50sa malo ili bez toksičnosti. Doza može da varira unutar ovog opsega u zavisnosti od korišćenog oblika doze i korišćenog puta primene.

[0113] Pogodni putevi primene mogu, na primer, obuhvataju parenteralnu isporuku, uključujući intramuskularne, intradermalne, subkutane, intramedularne injekcije, kao i intratekalne, direktne intraventrikularne, intravenske, intraperitonealne. Lekovi mogu biti primenjeni na različite konvencionalne načine, kao što su intraperitonealna, parenteralna, intraarterijska ili intravenska injekcija. Načini primene u kojima zapremina rastvora mora biti ograničena (npr. subkutana primena) zahtevaju liofilizovanu formulaciju da bi se omogućila rekonstitucija na visokoj koncentraciji.

[0114] Alternativno, moguće je primeniti antitelo na lokalan pre nego sistemski način, na primer, preko injekcije antitela direktno u leziju indukovanu patogenom okarakterisanu imunopatologijom, često u depo formulaciji ili formulaciji sa produženim oslobađanjem. Pored toga, moguće je primeniti antitelo u ciljanom sistemu za isporuku leka, na primer, u lipozomu obloženom tkivno-specifičnim antitelom, ciljno delujući, na primer, na leziju indukovanu patogenom okarakterisanu imunopatologijom. Lipozomi će biti usmereni na i selektivno preuzeti od strane pogođenog tkiva.

[0115] Izbor režima primene za lek zavisi od nekoliko faktora, uključujući stopu promena entiteta u serumu ili tkivu, nivo simptoma, imunogenost entiteta i pristupačnost ciljnih ćelija u biološkom matriksu. Poželjno, režim primene maksimizuje količinu leka isporučenu do pacijenta što je u skladu sa prihvatljivim nivoom sporednih efekata. Prema tome, količina biološkog sredstva koja je isporučena zavisi delimično od određenog entiteta i težine stanja

2

koje se leči. Vodič u izboru odgovarajućih doza antitela, citokina i malih molekula je dostupan. Videti, npr., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med.348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med.341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med.344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med.

342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med.343:1594-1602; Physicians’ Desk Reference 2003 (Physicians’ Desk Reference, 57th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002).

[0116] Određivanje odgovarajuće doze je izvedeno od strane lekara, npr., upotrebom parametara ili faktora poznatih u stanju tehnike ili za koje se u stanju tehnike sumnja da utiču na tretman ili za koje se predviđa da utiču na tretman. Odgovarajuća doza ("terapeutski efikasna količina") proteina zavisiće, na primer, od stanja koje se leči, težine i toka stanja, od toga da li je protein primenjen za preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na protein, tipa proteina koji se koristi i mišljenja nadležnog lekara. Generalno, doza počinje sa količinom nešto manjom od optimalne doze i ona je zatim povećavana u malim povećanjima sve dok se ne postigne željeni ili optimalni efekat u odnosu na bilo koje negativne sporedne efekte. Važne dijagnostičke mere obuhvataju one za simptome, npr., inflamacije ili nivo proizvedenih inflamatornih citokina. Antitelo je pogodno primenjeno na pacijenta ujedno vreme ili više puta. Antitelo može biti primenjeno pojedinačno ili u zajedno sa drugim lekovima ili terapijama.

[0117] Farmaceutska formulacija antitela može biti primenjena kontinuiranom infuzijom, ili preko doza u intervalima od, npr., jednog dana, 1-7 puta nedeljno, jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, mesečno, na dva meseca, itd. Poželjan protokol doziranja je onaj koji uključuje maksimalnu dozu ili učestalost doziranja koji izbegava značajane neželjene sporedne efekte. Ukupna nedeljna doza je generalno najmanje 0.05 µg/kg, 0.2 µg/kg, 0.5 µg/kg, 1 µg/kg, 10 µg/kg, 100 µg/kg, 0.2 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg telesne težine ili više. Videti, npr., Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych.

67:451-456; Portielji et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144. Željena doza terapeutika malog molekula, npr., peptidnog mimetika, prirodnog proizvoda ili organske hemikalije, je oko ista kao za antitelo ili polipeptid, na bazi mola/kg.

[0118] U određenim primerima izvođenja, doziranje će sadržati primenu na subjekta rastućih doza od 1.0, 3.0 i 10 mg/kg farmaceutske formulacije, tj, formulacije koja sadrži h409A11, tokom tretmana. Formulacija koja sadrži h409A11 može biti rekonstituisana tečna formulacija, ili može biti tečna formulacija koja nije prethodno liofilizovana. Vremenski tokovi mogu da variraju i mogu da se nastave sve dok se dobijaju željeni efekti. U određenim primerima izvođenja, rast doze će se nastaviti do doze od oko 10mg/kg. U određenim primerima izvođenja, subjekat će imati histološku ili citološku dijagnozu melanoma ili drugog oblika solidnog tumora, i u određenim slučajevima, subjekat može imati nemerljivu bolest. U određenim primerima izvođenja, subjekat će biti tretiran drugim hemoterapeuticima, dok u drugim primerima izvođenja, subjekat će biti naivan za tretman.

[0119] U dodatnim primerima izvođenja, režim doziranja će sadržati primenu doze od 1, 3 ili 10mg/kg bilo koje od farmaceutskih formulacija koje su ovde opisane (tj., formulacije koja sadrži h409A11), tokom tretmana. Za takav konstantan režim doziranja, interval između doza će biti oko 14 dana (± 2 dana). U određenim primerima izvođenja, interval između doza će biti oko 21 dan (± 2 dana).

[0120] U određenim primerima izvođenja, režim doziranja će sadržati primenu doze od oko 0.005mg/kg do oko 10mg/kg, sa rastom doze unutar pacijenta. U određenim primerima izvođenja, doza od 5 mg/kg ili 10 mg/kg biće primenjivana u intervalima na svake 3 nedelje, ili svake 2 nedelje. U dodatnim primerima izvođenja, doza od 3mg/kg biće primenjivana u intervalima od tri nedelje za pacijente sa melanomom ili pacijente sa drugim solidnim tumorima. U ovim primerima izvođenja, pacijenti bi trebalo da imaju neresektabilnu bolest; međutim, može biti da su pacijenti imali prethodnu operaciju.

[0121] U određenim primerima izvođenja, na subjekta će se primeniti 30-minutna IV infuzija bilo koje od farmaceutskih formulacija koje su ovde opisane. U određenim primerima izvođenja za rast doze, interval doziranja će biti oko 28 dana ((± 1 dan) između prve i druge doze. U određenim primerima izvođenja, interval između druge i treće doze će biti oko 14 dana (± 2 dana). U određenim primerima izvođenja, interval doziranja će biti oko 14 dana (± 2 dana), za doze posle druge doze.

[0122] U određenim primerima izvođenja, upotreba markera ćelijske površine i/ili citokinskih markera, kao što je opisana u istovremeno važećim patentnim objavama WO2012/018538 ili WO2008/156712 biće korišćena u biološkim analizama za praćenje, dijagnozu, izbor pacijenata i/ili režime lečenja koji obuhvataju blokadu PD-1 puta.

1

[0123] Subkutana primena može biti izvedena injektiranjem upotrebom šprica, ili upotrebom drugih injekcionih uređaja (npr. Inject-ease® uređaja); injektorskih olovaka; ili uređaja bez igle (npr. MediJector i BioJector®).

[0124] Široki opseg ovog pronalaska se najbolje razume u vezi sa sledećim primerima, koji su određeni tako da ograničavaju pronalazak na specifične primere izvođenja. Specifični primeri izvođenja koji su ovde opisani su ponuđeni samo radi primera i pronalazak je ograničen terminima priloženih patentnih zahteva, zajedno sa punim obimom ekvivalenata na koje takvi patentni zahtevi imaju pravo.

PRIMERI

PRIMER 1

Proizvodnja antitela

[0125] h409A11 je humanizovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za humani PD-1 i blokira interakciju između PD-1 i njegovih liganada PDL1 i PDL2. Antitelo je IgG4/kapa izotipa sa promenom stabilizujuće S228P sekvence u Fc regionu. Tabela 2 obezbeđuje spisak CDR sekvenci. Teorijske molekulske težine teških i lakih lanaca poreklom od aminokiselinskih sekvenci, isključujući glikozilaciju, su 49.3kDa i 23.7 kDa, respektivno. Matično antitelo (hPD-1.09A) je proizvedeno imunizacijom miševa sa hPD-1 DNK. h409A11 antitelo je generisano humanizacijom matičnog mišjeg anti-humanog PD-1 antitela od strane Medical Research Council (Cambridge, UK) upotrebom CDR grafting tehnologije, (npr., SAD patent br.5,225,539), kao što je opisano u istovremeno važećem WO2008/156712.

[0126] Ekspresioni plazmid je konstruisan za ekspresiju lakih i teških lanaca h409A11. Nukleotidne sekvence koje kodiraju teške i lake lance, zajedno sa njihovim respektivnim promotorima i poli A signalnom sekvencom, potvrđene su pomoću analize DNK sekvence. Ekspresioni vektor je zatim korišćen za transfekciju CHO ćelijske linije. Klon koji eksprimira antitelo je izabran za generisanje Master Seed Bank (MSB), na bazi rasta, produktivnosti i stabilnosti proizvodnje. Ovaj MSB je zatim korišćen za pripremu antitela i za generisanje Master Cell Bank (MCB).

[0127] Ćelije iz MCB su proširene u bočicama za mućkanje, kesama za kulturu i bioreaktoru za zasejavanje za stvaranje inokuluma za proizvodni bioreaktor za proizvodnju proizvoda antitela. Dodatna obrada je obuhvatala tri koraka hromatografije (protein A afinitetna,

2

katjonsko izmenjivačka i anjonsko izmenivačka hromatografija), dva ortogonalna koraka klirensa virusa (virusna inaktivacija niskom pH i filtracija za redukciju virusa), ultrafiltraciju/diafiltraciju i krajnji korak 0.2µm filtracije.

Struktura i karakteristike h409A11

[0128] h409A11 je visoko selektivno humanizovano monoklonsko antitelo koje blokira interakciju između humanog PD-1 i njegovih liganada PD-L1 i PD-L2. h409A11 je heterogeno glikozilovan na asparaginu 297 unutar Fc domena svakog teškog lanca, proizvodeći molekulske težine tipično u opsegu između 148.9 i 149.5 kDa, u zavisnosti od vezanih glikanskih lanaca. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca h409A11 nađene su u SEQ ID NO:31 i SEQ ID NO:36. Laki lanac bez vodećih sekvenci sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 od SEQ ID NO: 36 i težak lanac bez vodećih sekvenci sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 od SEQ ID NO: 31.

Stabilne humanizovane formulacije PD-1

[0129] U određenim primerima izvođenja, stabilni humanizovani PD-1 npr., h409A11 je vodeni rastvor čuvan pod rashlađenim uslovima (temp. opseg: tipično oko 2-8°C, ali u određenim okolnostima, vodena formulacija može da ispolji stabilnost na drugim temperaturama uključujući na oko 25°C i oko 40°C tokom perioda do oko 12 meseci) na koncentraciji od ≥ 25mg/mL u 10 mM histidinskom puferu, pH 5.0-6.0. U određenim primerima izvođenja, stabilni humanizovani PD-1 npr., h409A11 je vodeni rastvor u koncentraciji od oko 25 mg/mL u 10 mM histidinskom puferu, pH 5.0-6.0. Stabilna formulacija (tj., supstanca leka) je tipično bistar do opalescentan rastvor i može da sadrži čestice.

[0130] U određenim primerima izvođenja, tečan ili zamrznuti rastvor h409A11 je formulisan u histidinskom puferu (pH 5.5) koji sadrži saharozu i polisorbat 80.

[0131] Dodatni primer formulacije obuhvata: h409A11 formulisano u histidinskom puferu (pH 5.5) koje sadrži saharozu i polisorbat 80 u liofilizovanom obliku.

[0132] U određenim primerima izvođenja, stabilna humanizovana PD-1 formulacija je obezbeđena kao liofilizovani prah u bočicama namenjenim za jednu upotrebu.

[0133] U određenim primerima izvođenja, stabilna humanizovana PD-1 formulacija je rekonstituisana sa vodom za injekciju (WFI) i aseptički razblažena sa odgovarajućim zapreminama 0.9% natrijum hlorida za injekciju u sterilnom IV spremniku da bi se formirao rastvor mešavine.

Biološka aktivnost

[0134] Biološka aktivnost humanizovanog anti-PD-1 antitela je merena preko njegove sposobnosti da bude u kompeticiji sa PD-L1 (prirodni ligand PD-1) u vezivanju za humani PD-1, kvantitativno određen u kompetitivnoj ELISA u odnosu na referentni materijal. Stabilne formulacije koje su ovde opisane ispoljavaju biološku aktivnost za duge vremenske periode uključujući do najmanje oko osamnaest meseci. Stabilnost nekoliko šarži h409A11, pod različitim uslovima čuvanja je ilustrovana na slikama 1-9.

Stabilne formulacije humanizovanih anti-PD-1 antitela

[0135] Liofilizovane formulacije anti-PD-1 antitela su pripremljene na sledeći način. Primer šarže formule za h409A11 antitelo je obezbeđen u Tabeli 3. Krajnja koncentracija antitela je 25 mg/mL. Ova šaržna formulacija može biti korišćena za pripremu liofilizovanih jedinica od 50 mg/bočici, kao što je razmatrano u vezi sa Tabelom 4, u daljem tekstu. Korišćen je polisorbat 80 iz biljnog izvora. Dodatna hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid mogu biti dodati da bi se podesila pH do željene vrednosti od približno 5.5 (60.2). Komponente su dovedene do krajnje zapremine od 14 L sa sterilnom vodom za injekciju (WFI). Odgovarajuće manje serije mogu biti pripremljene proporcionalnom redukcijom količina navedenih u Tabeli 3.

[0136] Primer tečne formulacije antitela je pripremljen uzimanjem supstance leka (npr., antihumanizovanog PD-1 iz šaržne formule koja je ovde opisana) koja je u tečnom obliku (npr., h409A11 u vodenoj formulaciji) i pufera i njenom izmenom u željenom puferu kao poslednji korak postupka prečišćavanja. U ovom slučaju, nije bilo prethodnog koraka liofilizacije. Supstanca leka u krajnjem histidinskom puferu je koncentrovana do željene koncentracije. Ekscipijensi kao što su saharoza i polisorbat 80 su dodati u supstancu leka i to je razblaženo upotrebom odgovarajućeg pufera do krajnje koncentracije proteina. Krajnja formulisana supstanca leka je filtrirana upotrebom 0.22µm filtera i punjena u krajnji spremnik (npr. staklene bočice). Takva tečna formulacija obuhvata krajnju tečnu formulaciju koja sadrži 10 mM histidin pH 5.5, 7% saharozu, 0.02% polisorbat 80 i 25 mg/mL h409A11.

4

Tabela 3

[0137] Jedinična kompozicija primera krajnje liofilizovane formulacije humanizovanog anti-PD-1 je obezbeđena u Tabeli 4.

Tabela 4

[0138] Jedinična formulacija iz Tabele 4 sadrži 1/20,000-tinu šaržne formulacije iz Tabele 3 posle liofilizacije da bi se uklonila voda.50 mg DS je dodato kao 2.0 mL od 25 mg/mL šaržne formulacije iz Tabele 3. Svaka bočica je napunjena sa 2.4 mL i rekonstituisana sa 2.3 mL sWFI, rezultujući u približno 2.4 mL rekonstituisanog rastvora kao posledica širenja zapremine liofilizovanog kolača.

[0139] Lek je pakovan u sterilne 6R DIN, staklene bočice tipa 1 sa grlićem od 20 mm, zatvorene sa 20-mm sivim butil gumenim zapušačima i zaptivene aluminijumskim zateznim zaptivačima. Bočice su čuvane na 2 - 8°C, i hlađene prilikom isporuke.

[0140] Priprema obuhvata sledeće korake. Sipati potrebnu količinu vode za injekciju (WFI) u tariranu posudu za pripremu. Sipati i rastvoriti uz mešanje, saharozu, histidin i polisorbat 80 iz biljnog izvora. Izmeriti pH i podesiti ako je potrebno da bi se pH dovela do oko 5.4 --5.6. Upotrebiti hlorovodoničnu kiselinu i/ili natrijum hidroksid da bi se podesila pH. Ekvilibrisati supstancu leka do temperature sredine i sipati supstancu leka lagano u posudu za pripremu. Nastaviti mešanje pažljivo da bi se izbeglo penušanje. Izmeriti ponovo pH i podesiti ako je potrebno da se pH dovede do približno 5.5. Sipati WFI do krajnje težine rastvora za punjenje sa nastavljenim pažljivim mešanjem.

[0141] Filtracija obuhvata sledeće korake. Povezati filter za razbistrenje (0.22 µm) i sterilizujući filter (0.22 µm) za posudu za pripremu. Sakupiti alikvotu rastvora za punjenje za testiranje biološkog opterećenja posle koraka filtracije za bistrenje. Izvesti aseptičku filtraciju upotrebom 0.22 µm filtera u sterilni spremnik. Ukloniti alikvotu uzorka posle aseptičke filtracije za šaržno testiranje steriliteta. Izvesti testiranje celovitosti filtera posle filtracije proizvoda.

[0142] Punjenje obuhvata sledeće korake. Upotrebom pogodne opreme zapunjenje, aseptički napuniti rastvor proizvoda u sterilizovane epruvete sa cevnim staklom tipa I da bi se potigla ciljna zapremina punjenja od 2.4 mL. Izvesti provere težine punjenja u toku punjenja. U napunjene bočice delimično postaviti sterilizovane zapušače lio-oblika. Napunjene bočice postaviti u pogodni uređaj za sušenje zamrzavanjem.

[0143] Liofilizacija, postavljanje zapušača i poklopca obuhvataju sledeće korake. Liofilizovati napunjene bočice upotrebom odgovarajućeg liofilizacionog ciklusa. Pošto je liofilizacija završena, ponovo napuniti bočice sa 0.22 µm filtriranim azotom i potpuno zatvoriti zapušačem. Izvaditi bočice zatvorene zapušačima iz liofilizatora i zapečatiti ih.

[0144] Dobijene bočice su pregledane za vizuelne defekte i čuvane na 2-8°C. Završene bočice jedinične doze su isporučene pod rashlađenim uslovima.

PRIMER 2

Testiranje stabilnosti liofilizovanih formulacija humanizovanih anti-PD-1 antitela

[0145] Slike 1-9 daju rezultate testiranja stabilnosti liofilizovanih formulacija humanizovanog anti-humanog PD-1 antitela pod različitim uslovima čuvanja. Bočice su čuvane u uspravnim konfiguracijama. Kao što je detaljnije razmatrano u daljem tekstu, formulacije predmetnog pronalaska pokazuju stabilnost tokom najmanje 24 meseca za antitela liofilizovana na pH 5.5 (histidinski pufer), kao i slične tečne formulacije.

[0146] Stabilnost je procenjena na sledeći način. Uzorci su liofilizovani u 6R DIN staklenim bočicama tipa I, i zaptiveni sa 20 mm bromobutil lio zapušačima (Helvoet Rubber & Plastic Technologies BV, Hellevoetsluis, The Netherlands) i „flip-off“ aluminijumskim zaptivačima. Bočice su postavljene na stanice stabilnosti pod sledećim uslovima čuvanja: 5°C (5±3°C), 25H (25, 60% relativne vlažnosti) ili RH4 (40°C, 70% relativne vlažnosti). Uzorci su dobijeni na početnoj vremenskoj tački i za određene uzorke na različitim vremenskim tačkama uključujući 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18 i 24 meseca.

[0147] Stabilnost uzoraka je ilustrovana različitim karakteristikama predstavljenim u tabelama na SL. 1-9. Liofilizovani uzorci su vizuelno pregledani, rekonstiuisani i rekonstituisana formulacija je vizuelno pregledana. Merena je pH uzoraka posle rekonstitucije, i koncentracija proteina je određena preko U.V. apsorbance. Uzorci su analizirani pomoću CE-SDS tehnike u kojoj je protein denaturisan sa natrijum dodecil sulfatom (SDS) pod redukcionim i neredukcionim uslovima i odvojen upotrebom kapilarne elektroforeze (CE). Proteini se razdvajaju na osnovu njihove vidljive molekulske težine. Pod neredukcionim uslovima, sve vrste osim glavnog IgG pika su klasifikovane kao nečistoće. Pod redukcionim uslovima, IgG je razložen u teške i lake lance. Sve druge vrste su klasifikovane kao nečistoće.

[0148] Čistoća uzorka je dalje procenjena pomoću ekskluzione hromatografije visokog učinka (HPSEC) u kojoj je određivan procenat monomera, kao i procenti vrsta visoke molekulske težine (moguće agregati) i kasno eluirajućih pikova (moguće proizvodi razlaganja).

[0149] Dodatni podaci o karakterizaciji podataka su obezbeđeni na Slikama 1-9. Jonoizmenjivačka hromatografija visokog učinka (HP-IEX) je korišćena za procenu čistoće otkrivanjem prisustva kiselih ili baznih varijanti. Rezultati su predstavljeni kao procenat ukupnog posmatranog materijala. Uzorci su dalje okarakterisani za biološku funkciju upotrebom enzimski-vezane imunosorbent analize (ELISA) za vezivanje za humani PD-1. Koncentracija antitela koja je neophodna za postizanje polovine maksimalnog vezivanja je označena kao EC50. Potencija test uzorka je procenjena upoređivanjem krivih vezivanja test uzoraka za referentni materijal (ili kontrolu) preko odnosa EC50vrednosti. Potencija je izražena kao procenat relativne potencije referentnog materijala (ili kontrole). Sadržaj vlage liofilizovanog praha je takođe određen kolorimetrijskom titracijom. Merenja broja čestične materije su izvedena za brojanje čestica ≥ 10 µm i ≥ 25 µm. Postupak koji je korišćen za ova merenja je zasnovan na USP<788>.

[0150] Ovi rezultati pokazuju formulacije visoke stabilnosti predmetnog pronalaska tokom najmanje 24 meseca na oko pH 5.5. Podaci ne otkrivaju nikakav trend tokom vremena koji bi reflektovao nestabilnost za uzorke testiranih uslova čuvanja.

PRIMER 3: POČETNI KLINIČKI REZULTATI

Studija faze 1 za h409A11 (anti-PD-1 monoklonsko antitelo) kod pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorima

[0151] Ispitivanje faze 1 ispitvalo je bezbednost, PK, PD i antitumorsku aktivnost h409A11. Otvorena studija sa povećanjem doze je izvedena kod pacijenata sa uznapredovalim malignitetom refraktornim na standardnu hemoterapiju. U početnoj postavci pacijenta, pacijenti sa uznapredovalim solidnim tumorima su tretirani stabilnom formulacijom h409A11 kao što je ovde opisano. Tu nije bilo ograničenja/restrikcije u vezi sa operacijom; međutim, pacijenti nisu trenutno hirurški kandidati. Obuhvaćene su lohorte od 3-6 pacijenata (3+3 dizajn) na IV dozama od 1, 3 ili 10 mg/kg. Posle početne doze i 28-dnevnog ciklusa 1, pacijentima je omogućeno da zatim primaju višestruke doze svake 2 nedelje. Za fazu 1 deo A, tri pacijenta su tretirana u 1 mg/kg, tri pacijenta su tretirana na 3mg/kg i devet pacijenata je tretirano na 10 mg/kg i svi su dozirani svake 2 nedelje. Nije bilo povećanja doze unutar pacijenta. Radiografska procena je izvođena svakih 8 nedelja upotrebom RECIST 1.1 vodiča.

[0152] Devet pacijenata, 3 na svakom nivou doze, završili su period toksičnosti koji ograničava dozu (DLT) (28 dana). Pacijenti su imali nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC, n=3), rektalni kancer (n=2), melanom (MEL, n=2), sarkom (n=1) ili karcinoid (n=1). Do danas, ukupno je primenjeno 63 doza (medijana 7/pacijentu; maks. 12) bez DLT. Šteni efekti vezani za lek (AEs) u svim dozama obuhvatali su umor stadijuma 1 (n=3), mučninu (n=2), dijareju (n=1), disgeuziju (n=1), bol u dojkama (n=1) i pruritus (N=1). Zabeležen je jedan štetan efekat povezan sa lekom stadijuma 2, pruritus. Nije zabeležen nijedan štetan efekat povezan sa lekom ≥ stadijuma 3. PK podaci su prikazani u Tabeli 5. Na osnovu RECIST, 1 pacijent sa MEL na terapiji >6 mešeci imao je delimičan odgovor i preliminarni dokazi redukcije veličine tumora (stabilna bolest) su zabeleženi kod 3 dodatna pacijenta sa uznapredovalim kancerom. Ovi rezultati pokazuju da je h409A11 dobro tolerisan bez DLT u 3 testirana nivoa doze. (tj., 1, 3 i 5 mg/kg). Zabeležen je dokaz antitumorske aktivnosti.

TABELA 5. Srednja vrednost (CV%) vrednosti PK parametra od MK-3475 posle jedne IV doze od 1, 3 ili 10 mg/kg u ciklusu 1

Tabela 6 daje kratak opis sekvenci u listingu sekvenci.

[0153] Kao što su ovde korišćeni, uključujući prateće patentne zahteve, oblici reči u jedinini obuhvataju njihove odgovarajuće reference u množini osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, proteini i subjekti koji su ovde navedeni su humani proteini i subjekat, pre nego od druge vrste.

REFERENCE

[0154]

4

1. Sharpe, A.H, Wherry, E.J., Ahmed R., and Freeman G.J. The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nature Immunology (2007); 8:239-245.

2. Greenwald R.J., Freeman G.J., and Sharpe A.H. The B7 family revisited. Annual Reviews of Immunology (2005); 23:515-548.

3. Okazaki T and Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International immunology (2007);19:813-824.

4. Chemnitz et al. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents activation. J. Immunol. (2004): 173: 945-954.

5. Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H. et al. Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity (1999);11:141-151.

6. Okazaki T et al. Autoantibodies against cardiac troponin I are responsible for dilated cardiomyopathy in PD-1 deficient mice. Nature Medicine (2003): 9: 1477-1483.

7. Ansari MJ. The programmed death-1 pathway regulates diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice. J Exp. Med. (2003), Jul 7;198(1):63-9.

8. Riley J and June C. The road to recovery: translating PD-1 biology into clinical benefit. Trends in Immunology (2006): 28:48-50.

9. Barber DL. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature (2006):439: 682-687.

10. Trautmann L et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nature Medicine (2006) 12: 1198-1202.

11. Petrovas C et al. PD-1 is a regulator of virus-specific CD8+ T cell survival in HIV infection. J Exp. Med. (2006): 203: 2281-2292.

12. Day CL et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression, Nature.2006 Sep 21;443(7109):350-4.

13. Velu V et al. 2009. Enhancing SIV-specific immunity in vivo by PD-1 blockade. Nature (2009) 458: 206-210.

14. Finnefrock et al. PD-1 blockade in rhesus macaques: inpact on chronic infection and prophylactic vaccination. J. of Immunol. (2009): 182: 980-987.

15. Dong H et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med.2002 Aug;8(8):793-800.

16. Yang et al. PD-1 interaction contributes to the functional suppression of T-cell responses to human uveal melanoma cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 Jun;49(6 (2008): 49: 2518-2525.

17. Ghebeh et al. The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk propgnostic factors. Neoplasia (2006) 8: 190-198.

18. Hamanishi J et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proceeding of the National Academy of Sciences (2007): 104: 3360-3365.

19. Thompson RH et al. Significance of B7-H1 overexpression in kidney cancer. Clinical genitourin Cancer (2006): 5: 206-211.

20. Nomi, T. Sho, M., Akahori, T., et al. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death- 1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clinical Cancer Research (2007);13:2151-2157.

21. Ohigashi Y et al. Clinical significance of programmed death-1 ligand-1 and programmed death-1 ligand 2 expression in human esophageal cancer. Clin. Cancer Research (2005): 11: 2947-2953.

22. Inman et al. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer (2007): 109: 1499-1505.

23. Shimauchi T et al. Augmented expression of programmed death-1 in both neoplasmatic and nonneoplastic CD4+ T-cells in adult T-cell Leukemia/ Lymphoma. Int. J. Cancer (2007): 121:2585-2590.

24. Gao et al. Overexpression of PD-L1 significantly associates with tumor aggressiveness and postoperative recurrence in human hepatocellular carcinoma. Clinical Cancer Research (2009) 15: 971-979.

25. Nakanishi J. Overexpression of B7-H1 (PD-L1) significantly associates with tumor grade and postoperative prognosis in human urothelial cancers. Cancer Immunol Immunother. (2007) 56: 1173- 1182.

26. Hino et al. Tumor cell expression of programmed cell death-1 is a prognostic factor for malignant melanoma. Cancer (2010): 00: 1-9.

[0155] Navođenje referenci ovde nije namenjeno da bude potvrda da je referencea relevantno stanje tehnike, niti čini bilo kakvu potvrdu u vezi sa sadržajem ili datumom ovih objava ili dokumenata.

4

LISTING SEKVENCI

[0156]

LISTING SEKVENCI

4

4

4

4

4

1

2

4

1

2

4

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Stabilna liofilizovana formulacija anti-humanog PD-1 antitela, pripremljena liofilizacijom vodenog rastvora koji sadrži:

a) 25-100 mg/mL anti-humanog PD-1 antitela;

b) 70 mg/mL saharoze;

c) 0.2 mg/mL polisorbata 80; i

d) 10 mM Histidinski pufer na pH 5.0 - pH 6.0, i

pri čemu antitelo sadrži:

laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 od SEQ ID NO: 36 i težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 od SEQ ID NO:31.

2. Stabilna tečna farmaceutska formulacija anti-humanog PD-1 antitela, koja sadrži:

a) 25-100 mg/mL anti-humanog PD-1 antitela;

b) 70 mg/mL saharoze;

c) 0.2 mg/mL polisorbata 80; i

d) 10 mM histidinskog pufera na pH 5.0-6.0,

pri čemu antitelo sadrži:

laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 od SEQ ID NO: 36 i težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 od SEQ ID NO:31.

3. Formulacija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što anti-humano PD-1 antitelo je prisutno u 25 mg/mL u vodenom rastvoru.

4. Formulacija prema patentnom zahtevu 1, 2 ili 3, naznačena time što vodeni rastvor ima pH od 5.5.

2

5. Formulacija prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što antitelo je h409A11.

6. Stabilna liofilizovana farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, naznačena tiome što vodeni rastvor sadrži 25.0 mg/ml anti-humanog PD-1 antitela, 1.55 mg/ml histidina, 0.2 mg/ml polisorbata 80, 70 mg/ml saharoze i ima pH od 5.5; pri čemu anti-humano PD-1 antitelo je h409A11.

7. Tečna farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 6, za upotrebu u postupku za tretman terapijom.

8. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 naznačena time što terapija je tretman kancera.

9. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što je doza izabrana od 1.0, 3.0 i 10 mg/kg primenjivana u intervalima od 14 dana ili 21 dana tokom trajanja tretmana.

10. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što anti-humano PD-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je primenjeno u dozi od 5.0 mg/kg ili 10 mg/kg primenjivanim u intervalima od svake 2 nedelje ili svake 3 nedelje tokom trajanja tretmana.

11. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što terapija je tretman melanoma, pri čemu anti-humano PD-1 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, je primenjeno u dozi od 3.0 mg/kg primenjivanoj u intervalima od svake 3 nedelje u toku trajanja tretmana.

12. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, koja je primenjivana u 30-minutoj IV infuziji.

13. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8-12, naznačena time što se tretman izvodi na naivnom subjektu.

14. Tečna farmaceutska formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8-12, naznačena time što tretman se izvodi na subjektu koji je prethodno tretiran dodatnim hemoterapeuticima.

4