RS58255B1 - Ciljana modifikacija genoma pacova - Google Patents
Ciljana modifikacija genoma pacovaInfo
- Publication number
- RS58255B1 RS58255B1 RS20181446A RSP20181446A RS58255B1 RS 58255 B1 RS58255 B1 RS 58255B1 RS 20181446 A RS20181446 A RS 20181446A RS P20181446 A RSP20181446 A RS P20181446A RS 58255 B1 RS58255 B1 RS 58255B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- rat
- nucleic acid
- locus
- cell
- acid sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61D19/04—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo transplantation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis
REFERENCA NA LISTING SEKVENCI KOJI JE PODNET KAO TEKST FAJL PUTEM EFS MREŽE
[0001] Zvanična kopija listinga sekvenci je podneta elektronski putem EFS-Veb-a, kao ASCII formatirani listing sekvenci sa nazivom datoteke 444701SEQLIST.TXT, kreirane 16. aprila 2014. godine i veličine od 15 kilobajta, a podneta je istovremeno sa specifikacijom.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Izolovane ne-humane totipotentne ili pluripotentne matične ćelije, naročito embrionske matične ćelije pacova, koje su sposobne da održe pluripotentnost nakon jedne ili više serijskih genetskih modifikacija in vitro i koje su sposobne za prenošenje ciljanih genetskih modifikacija na sledeće generacije kroz germinativnu liniju. Kompozicije i postupci za modifikovanje genomskog lokusa pacova od interesa putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji. Kompozicije i metode za genetsko modifikovanje genomskog lokusa pacova od interesa korišćenjem velikog vektora za ciljanje (LTVEC) u kombinaciji sa endonukleazama. Kompozicije i postupci za proizvodnju genetski modifikovanog pacova koji sadrži jednu ili više ciljanih genetskih modifikacija.
POZADINA PRONALASKA
[0003] Iako se pacovi smatraju važnim životinjskim model sistemom koji može rekapitulirati patologiju različitih ljudskih bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kardiovaskularne (npr., hipertenziju), metaboličke (npr., gojaznost, dijabetes), neurološke (npr., patologije bola) i različite vrsta karcinoma, upotreba pacova u modelovanju ljudskih bolesti je ograničena u poređenju sa miševima, delom zbog nedostupnosti pluripotentnih ćelija pacova koje se mogu prenositi na germinalnu liniju, što može da održi njihovu pluripotentnost nakon serija genetskih modifikacija in vitro, npr., jedna ili više serijskih elektroporacija, a delom zbog nedostatka efikasnih tehnologija ciljanja koje omogućavaju uvođenje ili brisanje velikih genomskih DNK sekvenci ili zamenu velikih endogenih genomskih DNK sekvenci sa egzogenim sekvencama nukleinskih kiselina u pluripotentnim ćelijama pacova.
[0004] U tehnici postoji potreba za kompozicijama i metodama koje omogućavaju precizne ciljane promene u genomu pacova, koje mogu otvoriti ili proširiti trenutna područja otkrivanja cilja i brže i lakše validirati terapeutske agense.
REZIME
[0005] U jednom aspektu, pronalazak je postupak za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji, koji obuhvata (a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova velikog vektora za ciljanje (LTVEC) koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim delom komplementarno prvoj sekvenci nukleinske kiseline u genomskom lokusu od interesa i 3' homolognim delom komplementarno drugoj sekvenci nukleinske kiseline u genomskom lokusu od interesa, pri čemu je zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova najmanje 10 kb; i (b) identifikovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije koja sadrži ciljanu genetsku modifikaciju u genomskom lokusu od interesa, pri čemu je ciljana genetska modifikacija sposobna da se prenosi preko germinativne linije; pri čemu je pluripotentna ćelija pacova koja će biti korišćena za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa dobijena kultivisanjem izolovanih embrionalnih matičnih ćelija pacova na ćelijskom sloju podloge koji nije modifikovan za eksprimiranje inhibitornog faktora leukemije (LIF) sa medijumom koji sadrži oko 50 U/ml do oko 150 U/ml LIF-a i kombinaciju inhibitora koja se sastoji od inhibitora MEK puta i GSK3 inhibitora; pri čemu pluripotentnoj ćeliji pacova nedostaje ekspresija c-Myc; pri čemu pluripotentna ćelija pacova obrazuje sferične, slobodnoplutajuće kolonije u kulturi; i pri čemu modifikovana pluripotentna ćelija pacova ima normalni kariotip.
[0006] U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija je izvedena od ne-humane životinje, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, vola, jelena, ovce, koze, pileta, mačke, psa, lasice, primata (npr. marmozet, rhesus majmuna), gajenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo kojeg drugog organizma od interesa.
[0007] U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija je ne-humana pluripotentna ćelija. U jednoj realizaciji, ne-humana pluripotentna ćelija je pluripotentna ćelija sisara. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija sisara je pluripotentna ćelija glodara. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija glodara je pluripotentna ćelija pacova ili pluripotentna ćelija miša. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija je humano indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija.
[0008] U jednom primeru, pluripotentna ćelija je ne-humano oplođeno jaje u jednoj ćelijskoj fazi. U jednom primeru, ne-humano oplođeno jaje je oplođeno jaje sisara. U jednom primeru, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje glodara u jednoj ćelijskoj fazi. U jednom primeru, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje miša u jednoj ćelijskoj fazi. U jednoj realizaciji, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje pacova u jednoj ćelijskoj fazi.
[0009] U nekim realizacijama, ukupan zbir 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je najmanje 10 kb. U nekim realizacijama, ukupan zbir 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je najmanje 10 kb, ali manje od 100kb ili je ukupan zbir 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a najmanje 10 kb, ali manje od 150kb. U drugim realizacijama, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, ili oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U nekim realizacijama, (a) zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do oko 150 kb; ili (b) zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je od oko 16 kb do oko 150 kb. U jednoj realizaciji, veličina delecije je ista ili slična veličini zbira ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a.
[0010] U nekim takvim realizacijama, ciljana genetska modifikacija je bialelna.
[0011] U nekim realizacijama, pluripotentna ćelija je pluripotentna ćelija pacova. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija pacova je embrionska matična (ES) ćelija pacova. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija pacova je izvedena iz DA soja ili ACI soja. U nekim realizacijama, pluripotentna ćelija pacova je karakterisana ekspresijom najmanje jednog pluripotentnog markera odabranog iz grupe koja se sastoji od Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptora, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 i Utf1. U nekim takvim postupcima, pluripotentna ćelija pacova je karakterisana jednom ili više od sledećih karakteristika: (a) izvedena je od DA soja ili ACI soja; (b) nedostatkom ekspresije jednog ili više pluripotentnih markera koji sadrže Ecat1 i Rexo1; (c) nedostatkom ekspresije jednog ili više mezodermalnih markera Brachyury i Bmpr2; (d) nedostatkom ekspresije jednog ili više endodermalnih markera Gata6, Sox17 i Sox7; i (e) nedostatkom ekspresije jednog ili više neuronskih markera Nestin i Pax6. Takvi postupci obezbeđuju da je ukupan zbir 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a od oko 10kb do oko 30kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80 kb, ili od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 150kb, ili od oko 10 kb, ali manje od oko 150kb. U nekim realizacijama, ukupan zbir 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je od oko 16Kb do oko 100Kb. U drugim realizacijama, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U jednoj realizaciji, veličina brisanja je ista ili slična veličini suma ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a. U nekim realizacijama, koncentracija LIF-a u medijumu je između oko 75 U/ml do oko 125 U/ml, poželjno između oko 90 U/ml do oko 110 U/ml i poželjnije oko 100 U/ml. U nekim realizacijama, inhibitor MEK puta je MEK inhibitor PD0325901 i/ili GSK3 inhibitor je CHIR99021. U nekim realizacijama, inhibitor MEK puta je MEK inhibitor PD0325901 u koncentraciji od 0,8 μM do 1,2 μM i GSK3 inhibitor je CHIR99021 u koncentraciji od 2,5 μM do 3,5 μM. U nekim realizacijama, koncentracija LIF-a u medijumu je oko 100 U/ml, inhibitor MEK puta je MEK inhibitor PD0325901 pri koncentraciji od oko 1 μM i GSK3 inhibitor je CHIR99021 pri koncentraciji od oko 3,0 μM. U nekim realizacijama, medijum sadrži: DMEM/F12 bazalni medijum u koncentraciji od 1x; neuro-bazalni medijum u koncentraciji od 1x; penicilin/streptomicin u koncentraciji od 1%; L-glutamin u koncentraciji od 4mM; 2-merkaptoetanol u koncentraciji od 0,1 mM; N2 suplement u koncentraciji od 1x; B27 suplement u koncentraciji od 1x; LIF u koncentraciji od 100U/ml; PD0325901 u koncentraciji od 1 μM i CHIR99021 u koncentraciji od 3,0 μM.
[0012] Metode dalje obezbeđuju da ciljana genetska modifikacija (a) obuhvata zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom nukleinske kiseline sisara; (b) sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova; (c) obuhvata deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova, pri čemu je delecija u rasponu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1,5 Mb, od oko 1,5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2,5 Mb, ili od oko 2,5 Mb do oko 3 Mb; (d) sadrži sekvencu egzogene nukleinske kiseline koja je u rasponu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (e) obuhvata egzogenu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sa endogenom sekvencom nukleinske kiseline pacova; (f) obuhvata himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline i sekvencu nukleinske kiseline pacova; (g) u rasponu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb; (h) obuhvata uslovni alel okružen sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifičnih za lokaciju; ili, (i) obuhvata reporter gen operativno povezan sa promoterom aktivnim u ćeliji pacova.
[0013] Dalje, obezbeđena je metoda za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova putem ciljane genetske modifikacije, pri čemu genomski lokus od interesa sadrži (i) prvu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 5' homolognim krakom pacova; i (ii) drugu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 3' homolognim krakom pacova. U nekim takvim realizacijama, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je odvojena pomoću najmanje 5kb. U nekim realizacijama prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je odvojena od najmanje 5kb, ali manje od 3Mb. U nekim takvim postupcima, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je odvojena najmanje 5kb, ali manje od 10kb, najmanje 10kb, ali manje od 20kb, najmanje 20kb, ali manje od 40kb, najmanje 40kb ali manje od 60kb, najmanje 60kb, ali manje od 80kb, najmanje oko 80kb, ali manje od 100kb, najmanje 100kb, ali manje od 150kb, ili najmanje 150kb, ali manje od 200kb, najmanje oko 200kb, ali manje od oko 300kb, najmanje oko 300kb, ali manje od oko 400kb, najmanje oko 400kb, ali manje od oko 500kb, najmanje oko 500kb, ali manje od oko 1Mb, najmanje oko 1Mb, ali manje od oko 1,5Mb, najmanje oko 1,5Mb, ali manje od oko 2Mb, najmanje oko 2Mb, ali manje od oko 2,5Mb, najmanje oko 2,5Mb, ali manje od oko 3Mb, najmanje oko 1Mb, ali manje od oko 2Mb, najmanje oko 2Mb, ali manje od oko 3Mb.
[0014] U nekim realizacijama, korak uvođenja (a) dalje obuhvata uvođenje nukleinske kiseline koja kodira nukleazni agens koji promoviše homolognu rekombinaciju između LTVEC-a i genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova. U nekim takvim realizacijama, nukleazni agens sadrzi: (a) nukleazu cinkovog prsta; ili, (b) Transkripcionu efektornu nukleazu poput aktivatora (TALEN). U nekim realizacijama, nukleazni agens sadrži CRISPR/CAS sistem koji sadrži Cas9 nukleazu i vodeću RNK (gRNK) koja sadrži fuzionisanu crRNK-tracrRNK.
[0015] U nekim postupcima, korak uvođenja dalje obuhvata, uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova: (i) prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvog promotera operativno povezanog sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezani (Cas) protein, (ii) drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugog promotera operativno povezanog sa sekvencom druge nukleinske kiseline koja kodira genomsku ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa vodećom RNK (gRNK), pri čemu je genomska ciljana sekvenca odmah okružena na 3' kraju sekvencom engl. Protospacer Adjacent Motif (PAM). U jednom izvođenju, genomski lokus od interesa sadrži nukleotidnu sekvencu od SEK ID BR: 1. U jednoj realizaciji, gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNA (crRNA) i trans-aktivirajuću CRISPR RNA (tracrRNA). U drugoj realizaciji, genom pluripotentne ćelije pacova sadrži ciljni DNK region komplementarno genomskoj ciljanoj sekvenci. U nekim takvim postupcima, Cas protein je Cas9. U nekim takvim postupcima gRNK sadrži (i) himernu RNK od sekvence nukleinske kiseline SEK ID BR: 2; ili, (ii) himernu RNK od sekvence nukleinske kiseline SEK ID BR: 3. U nekim takvim postupcima, crRNK sadrži SEK ID BR: 4, SEK ID BR: 5 ili SEK ID BR: 6. U nekim takvim postupcima, tracrRNK sadrži SEK ID BR: 7 ili SEK ID BR: 8. U nekim realizacijama, korak identifikacije koristi kvantitativni test za procenu modifikacije alela (MOA) u genomskom lokusu od interesa. U nekim realizacijama, ciljani genomski lokus je Interlerukin-2 receptorski gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus ili Rag2/Rag1 lokus.
[0016] U nekim realizacijama, ciljana genetska modifikacija sadrži (i) ubacivanje homologne ili ortologne humane sekvence nukleinske kiseline; (ii) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova na endogenom genomskom lokusu sa homolognom ili ortolognom humanom sekvencom nukleinske kiseline; (iii) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline i sekvencu nukleinske kiseline pacova; ili (iv) njihovu kombinaciju. U nekom takvom genomskom lokusu pacova, veličina umetanja ili zamene je od oko 5kb do oko 400kb. U nekom takvom genomskom lokusu pacova, veličina umetanja ili zamene je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb ili od oko 350 kb do oko 400 kb. U nekom takvom genomskom lokusu pacova, veličina umetanja ili zamene je najmanje oko 200kb, ali manje od oko 300kb, najmanje oko 300kb, ali manje od oko 400kb.
[0017] Dalje, obezbeđen je postupak za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova, koji obuhvata: (a) ciljanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova, prema postupku iz pronalaska za obrazovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova, pri čemu ubačena nukleinska kiselina sadrži humanu nukleinsku kiselinu; i (b) uvođenje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova u embrion domaćina pacova; Ovaj pronalazak takođe opisuje i (c) nošenje embriona pacova domaćina u surogatnoj majci; gde surogatna majka proizvodi potomstvo pacova koji sadrži modifikovani genomski lokus koji obuhvata: (i) umetanje sekvence humane nukleinske kiseline; (ii) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu od interesa sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline; (iii) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline čoveka i pacova; ili (iv) njihovu kombinaciju, pri čemu modifikovani genomski lokus može da se prenosi kroz germinativnu liniju.
[0018] U nekim takvim postupcima, konstrukt za ciljanje je veliki vektor ciljanja (LTVEC), a zbir ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a je najmanje 10 kb, ali manje od 100kb ili zbir ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a je najmanje 10 kb, ali manje od 150kb. U nekim takvim metodama, zbir ukupnih 5' i 3' homolognih krakova konstrukta za ciljanje je od oko 10kb do oko 30kb, od oko 20kb do 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U nekim takvim postupcima, sekvenca humane nukleinske kiseline je najmanje 5kb, ali manje od 400kb. U nekim takvim postupcima, sekvenca humane nukleinske kiseline je najmanje 5kb, ali manje od 10kb, najmanje 10kb, ali manje od 20kb, najmanje 20kb, ali manje od 40kb, najmanje 40kb, ali manje od 60kb, najmanje 60kb, ali manje od 80kb, najmanje oko 80kb, ali manje od 100kb, najmanje 100kb, ali manje od 150kb, najmanje 150kb, ali manje od 200kb, najmanje 200kb, ali manje od 250kb, najmanje 250kb, ali manje od 300kb, najmanje 300kb, ali manje od 350kb, ili najmanje 350kb, ali manje od 400kb. U drugim realizacijama, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U jednom primeru, veličina brisanja je ista ili slična veličini suma ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a.
[0019] Pronalazak se takođe odnosi na metode za izradu humanizovanog pacova, pluripotentna ćelija pacova je embrionalna matična (ES) ćelija pacova. U nekim takvim postupcima, pluripotentna ćelija pacova je izvedena iz DA soja ili ACI soja. U nekim takvim postupcima, pluripotentna ćelija pacova je karakterisana ekspresijom najmanje jednog pluripotentnog markera koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 , Utf1, i / ili njihovu kombinaciju. U nekim takvim postupcima, pluripotentna ćelija pacova je karakterisana pomoću jedne ili više od sledećih karakteristika: (a) nedostatkom ekspresije od jednog ili više pluripotentnih markera koji sadrže c-Myc, Ecat1 i / ili Rexo1; (b) nedostatkom ekspresije od jednog ili više mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i / ili Bmpr2; (c) nedostatkom ekspresije od jednog ili više endodermalnih markera koji sadrže Gata6, Sox17 i / ili Sox7; ili (d) nedostatkom ekspresije od jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i / ili Pax6.
[0020] Dalje obezbeđen je genetski modifikovani pacov koji sadrži humanizovani genomski lokus, gde genetski modifikovani pacov sadrži: (i) umetanje homologne ili ortologne humane sekvence nukleinske kiseline; (ii) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline na endogenom genomskom lokusu sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline; (iii) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline čoveka i pacova; ili (iv) njihovu kombinaciju, pri čemu je humanizovani genomski lokus sposoban da se prenosi kroz germinativnu liniju. U nekim takvim genetski modifikovanim pacovima, humanizovani genomski lokus sadrži himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline čoveka i pacova.
[0021] Takođe su opisani postupci za modifikovanje ciljnog genomskog lokusa pacova putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) i obuhvataju: uvođenje u prokariotsku ćeliju velikog vektora ciljanja (LTVEC) koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krakom pacova i 3' homolognim krakom pacova, pri čemu prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu pacova i sposobna je da eksprimira rekombinazu koja posreduje BHR na ciljnom lokusu, a pri čemu je zbir ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a najmanje 10kb, ali manje od 100kb ili zbir ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a je najmanje 10 kb, ali manje od 150kb. U drugim primerima, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, ili oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120 kb do oko 150kb. U jednom primeru, veličina brisanja je ista ili slična veličini suma ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a.
[0022] U nekim takvim postupcima, ciljani lokus nukleinske kiseline pacova sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna homolognom kraku 5' i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna homolognom kraku 3'. U nekim takvim postupcima, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je odvojena pomoću najmanje 5kb, ali manje od 10kb, najmanje 10kb, ali manje od 20kb, najmanje 20kb, ali manje od 40kb, najmanje 40kb, ali manje od 60kb, najmanje 60kb, ali manje od 80kb, najmanje oko 80kb, ali manje od 100kb, najmanje 100kb, ali manje od 150kb, ili najmanje 150kb, ali manje od 200kb, najmanje oko 200kb, ali manje od oko 300kb, najmanje oko 300kb, ali manje od oko 400 kb, najmanje oko 400 kb, ali manje od oko 500 kb, najmanje oko 500 kb, ali manje od oko 1 Mb, najmanje oko 11 Mb, ali manje od oko 2 Mb, najmanje oko 2 Mb, ali manje od oko 3 Mb.
[0023] U nekim takvim postupcima, uvođenje vektora ciljanja u prokariotskoj ćeliji dovodi do: (i) uklanjanja endogene sekvence nukleinske kiseline pacova iz ciljanog genomskog lokusa; (ii) dodavanja egzogene sekvence nukleinske kiseline na ciljanom genomskom lokusu; (iii) zamene endogene sekvence nukleinske kiseline pacove sa egzogenom sekvencom nukleinske kiseline na ciljanom lokusu; ili (iv) njihove kombinacije. U nekim takvim postupcima, ubačena nukleinska kiselina sadrži (a) polinukleotid koji je homologan ili ortologan sekvenci nukleinske kiseline pacova na ciljanom genomskom lokusu; ili (b) uslovni alel okružen sa sekvencama za prepoznavanje specifičnog mesta rekombinacije.
[0024] Pronalazak se takođe odnosi na prokariotsku ćeliju domaćina koja obuhvata vektor ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova i 3' homolognim krajem pacova, pri čemu je ubačena nukleinska kiselina raspona od oko 5k do oko 400kb. U nekim prokariotskim ćelijama domaćina, veličina ubačene nukleinske kiseline je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80 kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od 350kb do oko 400kb. U nekim prokariotskim ćelijama domaćina, prokariotska ćelija sadrži rekombinazni gen operativno povezan sa konstitutivno aktivnim promoterom ili indukovanim promoterom.
[0025] Pronalazak se takođe odnosi na postupke za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u ćeliji putem ciljane genetske modifikacije koja obuhvata uvođenje u ćeliju:
(a) velikog vektora za ciljanje (LTVEC) koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krakom i 3' homolognim krakom, pri čemu je zbir ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a najmanje 10kb; i
(b) (i) prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvog promotera operativno povezanog sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezani (Cas) protein, (ii) drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugog promotera operativno povezanog sa drugom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira genomsku ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa RNK za navođenje (gRNK); i identifikovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije koja obuhvata ciljanu genetsku modifikaciju u genomskom lokusu od interesa.
[0026] U jednoj realizaciji, genomski lokus od interesa sadrži nukleotidnu sekvencu navedenu u SEK ID BR: 1, pri čemu gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNA (crRNA) i transaktivirajuću CRISPR RNA (tracrRNA), i gde genom ćelije sadrži ciljni DNK region komplementarno genomskoj ciljnoj sekvenci. Kod nekih takvih metoda, Cas protein je Cas9. U takvim metodama, ćelija može biti pluripotentna ćelija (kao što je embrionalna matična ćelija) ili prokariotska ćelija. U jednom primeru, pluripotentna ćelija je od ne-humane životinje, ne-humanog sisara, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, vola, jelena, ovce, koze, pileta, mačke, psa, lasice, primata (npr. marmozet, rhesus majmun), gajenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo koji drugi organizam od interesa. U drugom primeru, prokariotska ćelija je iz bakterije, kao što je E. coli.
[0027] U drugim izvođenjima, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, ili oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U jednoj realizaciji, veličina brisanja je ista ili slična veličini iznosa ukupnih 5' i 3' homolognih krakova LTVEC-a.
[0028] U jednom primeru, pluripotentna ćelija je ne-humana pluripotentna ćelija. U jednom primeru, pluripotentna ćelija koja nije humana je pluripotentna ćelija sisara. U jednom primeru, pluripotentna ćelija sisara je pluripotentna ćelija glodara. U jednom primeru, pluripotentna ćelija glodara je pluripotentna ćelija pacova ili miša. U jednom primeru, pluripotentna ćelija je humano indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija.
[0029] U jednom primeru, pluripotentna ćelija je ne-humano oplođeno jaje u jednoj ćelijskoj fazi. U jednom primeru, ne-humano oplođeno jaje je oplođeno jaje sisara. U jednom primeru, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje glodara u jednoj ćelijskoj fazi. U jednom primeru, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje pacova ili miša u jednoj ćelijskoj fazi.
[0030] Pronalazak se takođe odnosi na pacova ili ćeliju pacova koja sadrži ciljanu genetsku modifikaciju u svom genomskom lokusu, pri čemu je genomski lokus Interleukin-2 receptorski gama lokus, ApoE lokus, lokus Rag1, lokus Rag2 ili lokus Rag2 / Rag1, gde ciljana genetska modifikacija sadrži: (a) uklanjanje endogene sekvence nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu; (b) ubacivanje homologne nukleinske kiseline, ortologne nukleinske kiseline ili himerne nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline čoveka i pacova; ili (c) njihovu kombinaciju. U takvoj ćeliji pacova ili pacovu, ciljana genetska modifikacija se prenosi preko germinativne linije pacova ili pacova odgajenog od ćelije pacova.
[0031] Kod nekih takvih pacova ili ćelija pacova, uklanjanje endogene nukleinske kiseline pacova u genomskom lokusu je najmanje oko 10kb, ili je umetanje egzogene sekvence nukleinske kiseline u genomskom lokusu najmanje oko 5 kb.
[0032] Dalje je opisan pacov ili ćelija pacova, gde (a) ciljana genetska modifikacija na lokusu Interleukin-2 receptora gama dovodi do smanjenja ili odsustva aktivnosti Interleukin-2 receptorskog gama proteina; (b) ciljana genetska modifikacija na lokusu ApoE rezultira smanjenjem ili odsustvom aktivnosti ApoE proteina; (c) ciljana genetska modifikacija na lokusu Rag1 rezultira u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag1 proteina; (d) ciljana genetska modifikacija na lokusu Rag2 dovodi do smanjenja ili odsustva aktivnosti Rag2 proteina; ili, (e) ciljana genetska modifikacija na lokusu Rag2 / Rag1 rezultira u smanjenju ili odsustvu aktivnosti Rag2 proteina i aktivnosti Rag1.
[0033] U nekim primerima, ciljana genetska modifikacija Interleukin-2 receptorskog gama lokusa obuhvata: (a) uklanjanje celokupnog regiona kodiranja Interleukin-2 receptora gama pacova ili njegovog dela; (b) zamenu celokupnog regiona kodiranja pacova Interleukin-2 receptora gama ili njegovog dela sa humanim regionom za kodiranje Interleukin-2 receptora gama ili njegovim delom; (c) zamenu ekto domena kodirajućeg regiona Interleukin-2 receptora gama kod pacova sa ekto domenom humanog Interleukin-2 receptora gama; ili, (d) najmanje 3 kb brisanja Interleukin-2 receptorskog gama lokusa. Kod drugih takvih pacova ili ćelija pacova ciljana genetska modifikacija lokusa ApoE obuhvata: (a) uklanjanje celokupnog regiona kodiranja ApoE-a ili njegovog dela; ili, (b) najmanje 1,8 kb brisanja ApoE lokusa koji obuhvata region kodiranja ApoE.
[0034] Dalje opisan je pacov ili ćelija pacova, pri čemu ciljana genetska modifikacija lokusa Rag2 obuhvata: (a) uklanjanje celokupnog regiona kodiranja Rag2 ili njegovog dela; ili (b) najmanje 5,7 kb brisanja Rag2 lokusa koji sadrži Rag2 kodirajući region. U nekim primerima, ciljana genetska modifikacija lokusa Rag2 / Rag1 obuhvata: (a) uklanjanje celokupnog regiona za kodiranje Rag2 ili njegovog dela i uklanjanje celokupnog regiona za kodiranje Rag1 ili njegovog dela; ili (b) uklanjanje najmanje 16 kb lokusa Rag2 / Rag1 koji sadrži region za kodiranje Rag2.
[0035] Dalje opisan je pacov ili ćelija pacova, pri čemu ciljana genetska modifikacija sadrži umetanje ekspresione kasete koja sadrži selektivni marker na gama lokusu Interleukin-2 receptora, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu ili Rag2 / Rag1 lokusu. U nekim takvim pacovima ili ćelijama pacova, ekspresiona kaseta sadrži lacZ-gen operativno povezan sa endogenim promoterom u genomskom lokusu i promoterom humanog ubikvitina operativno povezanog sa selektivnim markerom.
[0036] Dalje opisan je pacov ili ćelija pacova, pri čemu ciljana genetska modifikacija u lokusu Interleukin-2 receptora gama, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu ili Rag2 / Rag1 lokusu obuhvata ubacivanje selekcione kasete za samouklanjanje. U nekim takvim pacovima ili ćelijama pacova, samo-brišuća kaseta za selekciju sadrži selektivni markerski gen operativno povezan sa promoterom aktivnim u ćeliji pacova i rekombinaznim genom koji je operativno povezan sa promoterom specifičnim za muške germinativne ćelije, pri čemu je kaseta za samo-brisanje okružena sa mestima prepoznavanja rekombinacije od strane rekombinaza. Kod nekih takvih pacova ili ćelija pacova, promoter specifičan za germinativne ćelije mužjaka je promoter Protamin-1; rekombinazni gen kodira Cre, a mesta za prepoznavanje rekombinacije su loxP lokacije. U jednom primeru, Protamin-1 promoter je mišji ili pacovski Protamin-1 promoter.
[0037] Dalje opisan je pacov ili ćelija pacova, pri čemu umetanje egzogene sekvence nukleinske kiseline u genomskom lokusu obuhvata reportersku nukleinsku kiselinu koja je operativno vezana za endogenog Interleukin-2 receptorskog gama promotera, endogenog ApoE promotera, endogenog Rag1 promotera, ili endogenog Rag2 promotera. Kod nekih takvih pacova ili ćelija pacova, reporterska nukleinska kiselina kodira reporter koji sadrži βgalaktozidazu, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, poboljšani žuti fluorescentni protein (EYFP), Emerald, poboljšani zeleni fluorescentni protein (EGFP), CyPet, cijan fluorescentni protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu ili njihovu kombinaciju.
[0038] Dalje opisana je ćelija pacova, pri čemu je ćelija pacova pluripotentna ćelija pacova ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova. U nekim takvim ćelijama pacova, pluripotentna ćelija pacova ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova (a) je izvedena iz soja DA ili soja ACI; (b) karakterisana je ekspresijom najmanje jednog pluripotentnog markera koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, ili njihovu kombinaciju; ili (c) karakterisana je pomoću jedne ili više od sledećih karakteristika: (i) nedostatkom ekspresije jednog ili više pluripotentnih markera koji sadrže c-Myc, Ecat1 i Rexo1; (ii) nedostatkom ekspresije mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i Bmpr2; (iii) nedostatkom ekspresije jednog ili više endodermalnih markera koji sadrže Gata6, Sox17 i Sox7; ili (iv) nedostatkom ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i Pax6.
[0039] Pronalazak se takođe odnosi na metodu za modifikovanje ciljanog genomskog lokusa u Interleukin-2 receptorskom gama lokusu, ApoE lokusu, Rag1 lokusu, Rag2 lokusu ili Rag2 / Rag1 lokusu, u pluripotentnoj ćeliji pacova, metodu koja obuhvata: (a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova velikog vektora ciljanja koji sadrži umetnutu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' i 3' homolognim kracima pacova homolognim sa ciljanim genomskim lokusom; i (b) identifikovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova koje obuhvata ciljanu genetsku modifikaciju na ciljnom genomskom lokusu, pri čemu ciljana genetska modifikacija može da se prenese kroz germinativnu liniju pacova propagiranu od pluripotentne ćelije pacova. U nekim takvim metodama, vektor ciljanja je veliki vektor ciljanja (LTVEC), pri čemu je zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova pacova najmanje oko 10kb. U nekim izvođenjima, ukupan iznos 5' i 3' homolognih krajeva pacova je najmanje 10kb, ali manje od 150kb. U nekim realizacijama, ukupan zbir 5' i 3' homolognih krakova pacova je najmanje oko 10kb, ali manje od oko 100kb. U nekim realizacijama, uvođenje vektora ciljanja u pluripotentnu ćeliju pacova dovodi do: (i) uklanjanja endogene sekvence nukleinske kiseline pacova na ciljanom genomskom lokusu; (ii) umetanja egzogene sekvence nukleinske kiseline na ciljanom genomskom lokusu; ili (iii) njihove kombinacije.
[0040] U nekim izvođenjima, uklanjanje endogene nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu je najmanje oko 10 kb; uklanjanje endogene sekvence nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu se kreće od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80 kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 500kb, od oko 500kb do oko 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, ili od oko 2,5Mb do oko 3Mb; ubacivanje egzogene sekvence nukleinske kiseline u genomski lokus je najmanje oko 5 kb; ili umetanje egzogene sekvence nukleinske kiseline se kreće od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb.
[0041] U nekim realizacijama, (a) ciljana genetska modifikacija na lokusu gama Interleukin-2 receptora rezultira smanjenjem ili odsustvom aktivnosti Interleukin-2 receptorskog gama proteina; (b) ciljana genetska modifikacija na lokusu ApoE rezultira smanjenjem ili odsustvom aktivnosti ApoE proteina; (c) ciljana genetska modifikacija na lokusu Rag1 rezultira smanjenjem ili odsustvom aktivnosti Rag1 proteina; (d) ciljana genetska modifikacija na lokusu Rag2 dovodi do smanjenja ili odsustva aktivnosti Rag2 proteina; ili, (e) ciljana genetska modifikacija na Rag2 / Rag1 lokusu dovodi do smanjenja ili odsustva aktivnosti Rag2 proteina i aktivnosti Rag1 proteina.
[0042] U nekim realizacijama, ciljana genetska modifikacija na Interleukin-2 receptorskom gama lokusu obuhvata (a) uklanjanje celokupnog regiona kodiranja Interleukin-2 receptora gama pacova ili njegovog dela; (b) zamenu celokupnog regiona kodiranja pacovskog Interleukin-2 receptora gama ili njegovog dela sa humanim regionom za kodiranje interleukin-2 receptora gama ili njegovog dela; (c) zamenu ekto-domena kodirajućeg regiona Interleukin-2 receptora gama kod pacova sa ekto-domenom humanog interleukin-2 receptora gama; ili, (d) najmanje 3 kb brisanja Interleukin-2 receptorskog gama lokusa koji obuhvata region za kodiranje Interleukin-2 receptora gama.
[0043] U nekim realizacijama, ciljana genetska modifikacija na lokusu ApoE obuhvata: (a) uklanjanje celokupnog regiona za kodiranje ApoE ili njegovog dela; ili, (b) najmanje 1,8 kb brisanja ApoE lokusa koji obuhvata region kodiranja ApoE.
[0044] U nekim realizacijama, ciljana genetska modifikacija na lokusu Rag2 obuhvata: (a) uklanjanje čitavog regiona kodiranja Rag2 ili njegovog dela; ili, (b) najmanje 5,7 kb brisanja Rag2 lokusa koji sadrži Rag2 kodirajući region. U drugim metodama, ciljana genetska modifikacija lokusa Rag1 / Rag2 obuhvata: (a) uklanjanje celokupnog regiona kodiranja Rag2 ili njegovog dela i uklanjanje celokupnog regiona kodiranja Rag1 ili njegovog dela; ili, (b) brisanje najmanje 16 kb lokusa Rag2 / Rag1 koji sadrži Rag2 i Rag1 kodirajuće regione.
[0045] U nekim takvim realizacijama za modifikovanje ciljanog genomskog lokusa, ubačena nukleinska kiselina sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira selektivni marker. U nekim takvim realizacijama, ekspresiona kaseta sadrži lacZ-gen operativno povezan sa endogenim promoterom na genomskom lokusu i promoterom humanog ubikvitina koji je operativno vezan za gen selektivnog markera.
[0046] U nekim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina obuhvata samo-uklanjajuću selekcionu kasetu. U nekim takvim realizacijama, samo-uklanjajuća kaseta za selekciju sadrži selektivni marker koji je operativno povezan sa promoterom aktivnim u pluripotentnoj ćeliji pacova i polinukleotid koji kodira rekombinazu operativno povezanu sa promoterom specifičnim za reproduktivne ćelije mužjaka, pri čemu je kaseta za samo-brisanje okružena pomoću prepoznatljivih mesta rekombinacije prepoznatih pomoću rekombinaza. U nekim takvim izvođenjima, promoter koji je specifičan za reproduktivne ćelije mužjaka je promoter Protamin-1; ili, rekombinazni gen kodira Cre, a mesta za prepoznavanje rekombinacije su loxP lokacije. U nekim izvođenjima, Protamin-1 promoter je mišji ili pacovski Protamin-1 promoter.
[0047] U drugim metodama, ubacivanje egzogene sekvence nukleinske kiseline u genomski lokus sadrži reportersku sekvencu nukleinske kiseline operativno vezanu za endogenog promotera Interleukin-2 receptora gama, endogenog promotera ApoE, endogenog promotera Rag1 ili endogenog promotera Rag2. U nekim takvim izvođenjima, reporterska sekvenca nukleinske kisline kodira reportera koji sadrži β-galaktozidazu, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, poboljšani žuti fluorescentni protein (EYFP) Emerald, poboljšani zeleni fluorescentni protein (EGFP), CyPet, cijan fluorescentni protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu ili njihovu kombinaciju.
[0048] U nekim realizacijama za modifikovanje ciljanog genomskog lokusa, pluripotentna ćelija pacova je embrionalna matična (ES) ćelija pacova. U nekim takvim realizacijama, pluripotentna ćelija pacova (a) izvedena je iz DA soja ili ACI soja; (b) karakterisana je ekspresijom pluripotentnog markera koji sadrži Oct-4, Sox-2, alkalnu fosfatazu ili njihovu kombinaciju; ili (c) karakterisana je jednom ili više od sledećih karakteristika: (i) nedostatkom ekspresije jednog ili više pluripotentnih markera koji sadrže c-Myc, Ecat1 i Rexo1; (ii) nedostatkom ekspresije mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i Bmpr2; (iii) nedostatkom ekspresije jednog ili više endodermalnih markera koji sadrže Gata6, Sox17 i Sox7; ili (iv) nedostatkom ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i Pax6.
[0049] U nekim realizacijama, metoda dalje obuhvata identifikaciju ciljane genetske modifikacije na ciljnom genomskom lokusu, pri čemu identifikacioni korak koristi kvantitativni test za procenu modifikacije alela (MOA) na ciljnom genomskom lokusu.
[0050] U nekim realizacijama, korak uvođenja dalje obuhvata uvođenje druge nukleinske kiseline koja kodira nukleaznog agensa koji promoviše homolognu rekombinaciju između vektora ciljanja i ciljnog genomskog lokusa u pluripotentnoj ćeliji pacova. U nekim takvim izvođenjima, nukleazni agens sadrži jedan himerni protein koji sadrži domen za vezivanje DNK na bazi cinkovih prstiju koji je fuzionisan sa Fokl endonukleazom. Neki takvi postupci rezultiraju bialelnom modifikacijom ciljnog genomskog lokusa.
[0051] U nekim realizacijama, korak uvođenja prema postupku, dalje obuhvata uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova: prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvog promotera operativno povezanog sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) - povezani (Cas) protein i drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugog promotera operativno povezanog sa drugom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira genomsku ciljnu sekvencu koja je operativno vezana za RNK za navođenje (gRNK), pri čemu je genomska ciljna sekvenca odmah okružena na 3' kraju pomoću Protospacer Adjacent Motif (PAM) sekvence. U jednom izvođenju, genomska ciljna sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja je navedena u SEK ID BR: 1. U jednoj realizaciji, gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNA (crRNA) i transaktivirajuću CRISPR RNA (tacrRNA). U nekim takvim izvođenjima, Cas protein je Cas9. U nekim takvim izvođenjima, (a) gRNK je himerna RNK od sekvence nukleinske kiseline koja je navedena u SEK ID BR: 2; (b) gRNK je himerna RNK od sekvence nukleinske kiseline koja je navedena u SEK ID BR: 3; (c) crRNK sadrži sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 4, SEK ID BR: 5, SEK ID BR: 6; ili, (d) tracrRNK sadrži sekvencu koja je navedena u SEK ID BR: 7 i / ili SEK ID BR: 8.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0052] Patentni ili aplikacioni dosije sadrži najmanje jedan crtež izveden u boji. Kopije ovog patenta ili publikacije patentne prijave sa crtežom(ima) u boji biće obezbeđene od strane Kancelarije na zahtev i plaćanje potrebne naknade.
Slika 1 prikazuje ESC ćelije pacova, koje rastu kao kompaktne sferične kolonije koje se rutinski odvajaju i plutaju u sudu.
Slika 2A do D prikazuje različite pluripotentne markere izražene od strane pacovskih ESC ćelija: A prikazuje Oct-4 (zeleno); B prikazuje Sox-2 (crveno); C prikazuje DAPI (plavo); D prikazuje prekrivanje pluripotentnih markera izraženih pomoću rESC-ova. Slika 3 prikazuje da ESC ćelije pacova eksprimiraju lagane nivoe alkalne fosfataze (pluripotentni marker) (levo), a kariotip za liniju DA.2B je 42X, Y (desno).
Kariotipovanje je izvršeno zato što pacovske ESC čelije često postaju tetraploidne; linije su, stoga, bile prethodno pregledane brojanjem metafaznih hromozomskih širenja, a linije sa uglavnom normalnim brojem su onda formalno kariotipovane.
Slika 4A-B obezbeđuje fotografiju koja prikazuje analizu broja hromozoma ACI.G1 ES ćelijske linije pacova.
Slika 5A-B obezbeđuje fotografiju koja prikazuje analizu broja hromozoma DA.2B ES ćelijske linije pacova.
Slika 6A-B obezbeđuje fotografiju koja prikazuje analizu broja hromozoma DA.C2 ES ćelijske linije pacova.
Slika 7 prikazuje bliži prikaz pacovske embrionalne matične ćelije (ESC) sa slike 1. Slika 8 prikazuje proizvodnju himera pomoću blastocistne injekcije i prenošenje ESC genoma pacova kroz reproduktivnu liniju; himere proizvedene ubrizgavanjem blastocista korišćenjem roditeljskih ACI.G1 pacovskih ESC-a; visoko procentne himere obično imaju albino njuške.
Slika 9 prikazuje mladunčad F1 agouti sa albino rasutim parom, od ACI / SD
himere obeležene zvezdicom (*) na slici 8. ;Slika 10 obezbeđuje shemu pacovskog ApoE lokusa i označava sivim barovima mesto sečenja nukleaza sa cinkovim prstima (ZFN1 i ZFN2). Genomski regioni koji odgovaraju 5' i 3' homolognim krajevima (5 kb i 5,4 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Ekson 1 ApoE gena je ne-kodirajući i prikazan je kao otvorena kutija koja je najbliža homolognom kraju 5'. Tri introna gena ApoE su označena kao linije. ;Eksoni 2 i 3 sadrže regione za kodiranje i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i ne-kodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim senčenjem i otvorenom kutijom. ;Slika 11 obezbeđuje pregled efikasnosti ciljanja ApoE kada je izvedena u prisustvu nukleaza sa cinkovim prstima (ZFN1 ili ZFN2) ;Slika 12 prikazuje ciljanje pacovskog Rosa 26 lokusa, koji leži između Setd5 i Thumpd3 gena kao kod miša, sa istim razmakom. Panel A prikazuje strukturu mišjeg Rosa 26 lokusa. Mišji Rosa26 transkripti se sastoje od 2 ili 3 eksona. Panel B prikazuje strukturu pacovskog lokusa Rosa26; lokus pacova sadrži drugi ekson 1 (Ex1b) pored homolognog eksona prema eksonu1 miša (Ex1a); nijedan treći ekson nije identifikovan kod pacova. Panel C prikazuje ciljani pacovski Rosa26 alel; homologni krajevi od 5Kb svaki su klonirani pomoću PCR-a korišćenjem genomske DNK iz DA rESC; ciljani alel sadrži vezivni primalac (SA)-lacZ-hUB-neo kasetu koja zamenjuje 117bp deleciju u intronu Rosa26 pacova. ;Slika 13A prikazuje kontrolni mozak pacova divljeg tipa starog 14 nedelja, koji je bio obojen sa X-galom. Kontrolni mozak je pokazao nizak nivo bojenja pozadine za LacZ (dorzalna projekcija). ;Slika 13B prikazuje LacZ ekspresiju u mozgu heterozigotnog pacova rRosa26 (staru 14 nedelja). Reporter lacZ je bio izražen sveobuhvatno kroz mozak rRosa26 heterozigota. Slika 13C prikazuje kontrolno srce i timus (umetak) pacova divljeg tipa starosti od 14 nedelja, koji su tretirani sa X-galom. Kontrolno srce i timus su pokazali nizak nivo bojenja pozadine za LacZ. ;Slika 13D prikazuje LacZ ekspresiju u srcu i timusu (umetak) rRosa26 heterozigotnog pacova starosti 14 nedelja. LacZ reporter je bio svuda prisutno izražen kroz srce i timus heterozigota rROSA26. ;Slika 13E prikazuje kontrolna pluća pacova divljeg tipa starosti 14 nedelja, koji je tretiran sa X-galom. Kontrolna pluća su pokazala nizak nivo pozadinskog bojenja za LacZ. ;Slika 13F prikazuje LacZ ekspresiju u plućima heterozigotnog pacova rRosa26 od 14 nedelja. LacZ reporter je bio svuda prisutno izražen s kraja na kraj pluća rRosa26 heterozigota. ;Slika 13G i H prikazuju LacZ ekspresiju kod E12.5 embriona pacova. Za razliku od kontrolnog embriona divljeg tipa (H), koji pokazuje nizak nivo pozadinskog LacZ bojenja, heterozigotni embrion rRosa26 pokazuje svuda prisutnu ekspresiju LacZ reportera kroz embrion. ;Slika 13I i J prikazuju LacZ ekspresiju kod E14.5 embriona pacova. Za razliku od kontolnog embriona divljeg tipa (J), koji pokazuje nizak nivo pozadinskog LacZ bojenja, heterozigotni pacovski embrion rRosa26 je ispoljio svuda prisutnu ekspresiju LacZ reportera kroz embrion. ;Slika 14 ilustruje homologni ili ne-homologni rekombinacioni događaj koji se javlja unutar ES ćelije pacova nakon elektroporacije vektora ciljanja koji sadrži selekcionu kasetu (lacZ-neo kaseta). ;Slika 15 ilustruje mehanizam pomoću kojeg endonukleaze koje uređuju genom (npr. ZFN i TALEN) uvode prekid dvostrukog lanca (DSB) u ciljanoj genomskoj sekvenci i aktiviraju nehomologno spajanje krajeva (NHEJ) u ES ćeliji. ;Slika 16 ilustruje tehniku ciljanja gena koja koristi nukleaze ZFN / TALEN za poboljšanje efikasnosti homologne rekombinacije vektora ciljanja. DSB predstavlja prekid dvostrukog lanca. ;Slika 17 obezbeđuje rezime proizvodnje himera i prenosa germinativne linije modifikovanog lokusa ApoE pacova. Ciljana modifikacija je pomognuta od strane nukleaza sa cinkovim prstima. ;Slika 18 daje shematski prikaz događaja za ciljanje IL2r-γ u kombinaciji sa nukleazama cinkovih prstiju koje ciljaju ZFN U i ZFN D. ZFN lokacije sečenja se uočavaju na slici. ;Slika 19 obezbeđuje ciljajuću efikasnost kada je ciljanje IL2r-γ u kombinaciji sa sistemom CRISPR / Cas9. ;Slika 20 obezbeđuje shematski prikaz ApoE lokusa pacova i plazmida za ciljanje. Gornja shema prikazuje genomsku strukturu lokusa ApoE pacova i genomske regione koji odgovaraju 5' i 3' homolognim krajevima (5 kb i 5,4 kb respektivno; tamno sive kutije). Ekson 1 gena ApoE je ne-kodirajući i prikazan je kao otvorena kutija koja je najbliža homolognom kraju 5'. Tri introna gena ApoE su označena kao linije. Eksoni 2 i 3 sadrže regione za kodiranje i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i ne-kodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim osenčenjem i otvorenom kutijom. Donji panel pokazuje plazmid za ciljanje. Homologni krajevi 5' i 3' (5 kb i 5,4 kb, respektivno) su označeni pomoću tamno sivih kutija. Vektor ciljanja obuhvata reporter gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje okruženu pomoću loxP lokacija (otvorene strelice). Kaseta za samobrisanje sadrži mišji Prm1 promoter operativno povezan sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži humani ubikvitinski promoter operativno povezan sa genom otpornosti na neomicin. ;Slika 21 obezbeđuje shematski prikaz za ciljanje lokusa ApoE u ES ćelijama pacova korišćenjem nukleaza zinkovih prstiju i vektora ciljanja koji obuhvata reporter gen (LacZ) i kasetu za samobrisanje koja sadrži mišjeg Prm1 promotera operativno povezanog sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži humanog ubikvitinskog promotera operativno povezanog sa genom otpornosti na neomicin. ;Slika 22 obezbeđuje shematski prikaz lokusa ApoE pacova i velikog vektora ciljanja (LTVEC). Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju pacovskog ApoE lokusa i genomske regione koji odgovaraju homolognim kracima 5' i 3' (45 kb i 23 kb, respektivno; tamno sive kutije). Ekson 1 iz ApoE-a je ne-kodirajući i prikazan je kao otvorena kutija do 5' homolognog kraka. Tri introna gena ApoE su označena kao linije, a eksoni 2 i 3 sadrže regione kodiranja i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i ne-kodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim zatamnjenjem i otvorenom kutijom. Donji panel prikazuje LTVEC za modifikaciju lokusa ApoE pacova. Homologni krajevi 5' i 3' (45 kb i 23 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. LTVEC obuhvata reporterski gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje na kojoj se nalaze loxP lokacije (otvorene strelice), koja obuhvata mišji Prm1 promoter operativno povezan sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži humani ubikvitinski promoter koji je operativno povezan sa genom otpornosti na neomicin. ;Slika 23 daje shemu pacovskog ApoE lokusa i označava sivim barovima mesta za odsecanja za nukleaze s cinkovim prstima (ZFN1 i ZFN2) koji se koriste zajedno sa velikim vektorom ciljanja (LTVEC) radi poboljšanja homologne rekombinacije između vektora ciljanja i ciljnog srodnog hromozomskog regiona. ;Slika 24 prikazuje lokus IL2r-γ pacova koji je raskinut uklanjanjem 3,2 kb i ubacivanjem reporter gena (eGFP) i kasete za samobrisanje koja sadrži kasetu za odabir leka (hUbneo) i Crei gen operativno povezan sa mišjim Prm1 promoterom. ;Slika 25 daje rezime prenošenja germinativne linije, matičnih ćelijskih linija embriona pacova koje se mogu ciljati. ;Slika 26 daje još jedan prikaz lokusa IL2r-γ pacova koji je prekinut delecijom od 3,2 kb i umetanje reporter gena (eGFP) i kasete za samobrisanje koja sadrži Crei gen operativno povezan sa mišjim Prm1 promoterom i kasetu za odabir leka (hUb-Neo). ;Slika 27 daje shemu pacovskog lokusa Rag2 i veliki vektor ciljanja (LTVEC) za modifikovanje lokusa Rag2 pacova. Gornja tabla prikazuje genomsku organizaciju pacovskog lokusa Rag2 i srodnih genomskih regiona koji odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3' (48 kb i 15 kb, respektivno; tamno sivih kutija). Rag2 sadrži pojedinačni ekson označen pomoću tačkastog sivog zatamnjenja. Donji panel je LTVEC. Homologni krajevi 5' i 3' (48 kb i 15 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. LTVEC obuhvata reporter gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje na kojoj se nalaze loxP lokacije (otvorene strelice), a koja sadrži promoter Prm1 pacova operativno povezan sa Crei genom i kasetu za selekciju leka koja sadrži humani ubikvitinski promoter operativno povezan sa genom rezistentnim na neomicin. ;Slika 28 daje genomsku strukturu lokusa Rag1 / Rag2 pacova i genomske regione izbrisane bilo ciljanjem Rag2 (brisanje Rag2) ili dvostrukim ciljanjem Rag2 / Rag1 (brisanje Rag2 / Rag1 ). ;Slika 29 daje shemu lokusa Rag2 i Rag1 pacova i velikog vektora za ciljanje (LTVEC) korišćenog za modifikovanje lokusa. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju lokusa Rag1 i Rag2 i srodnih genomskih regiona koji odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3' (48 kb i 84 kb, respektivno; tamno sive kutije). Rag2 i Rag1 svaki sadrže jedan egzon označen tačkastim sivim zatamnjenjem. Donji panel je LTVEC. Homologni krajevi 5' i 3' (48 kb i 84 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. LTVEC obuhvata reporter gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje na kojoj se nalaze loxP lokacije (otvorene strelice), koja sadrži pacovski Prm1 promoter operativno povezan sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži humani ubikvitinski promoter koji je operativno povezan sa genom otpornim na neomicin. ;Slika 30 prikazuje da IL2rg- / y PBMC ne izražava zrele limfocitne markere. GFP-pozitivni limfociti su detektovani u perifernoj krvi u 2 od 3 himere. ;Slika 31 daje shematski prikaz lokusa IL-2rg pacova i plazmida za ciljanje za potpunu humanizaciju lokusa IL-2rg pacova. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju lokusa IL-2rg pacova i srodne genomske regione koji odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3' (4,4 kb i 5,0 kb, respektivno; tamno sive kutije). Donji panel je plazmid za ciljanje. ;Homologni krajevi 5' i 3' (4,4 kb i 5,0 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Ciljajući plazmid obuhvata humani IL-2rg genomski region, reporterski gen (GFP) i kasetu za samobrisanje okruženu loxP lokacijama (otvorene strelice) koja sadrži promotor miša Prm1 operativno povezan sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži promoter humanog ubikvitina operativno povezan sa genom otpornosti na neomicin. ;Slika 32 daje shemu lokusa IL-2rg pacova i plazmid za ciljanje za ekto-domensku humanizaciju lokusa IL-2rg pacova. Gornji panel prikazuje genomsku organizaciju lokusa IL-2rg pacova i srodne genomske regione koji odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3' (4,4 kb i 5,0 kb, respektivno; tamno sivih kutija). Donji panel je ciljajući plazmid. ;Homologni krajevi 5' i 3' (4,4 kb i 5,0 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Ciljajući plazmid obuhvata humani ekto-domen genomskog regiona IL-2Rg, reporterski gen (GFP) i kasetu za samobrisanje okruženu loxP lokacijama (otvorene strelice) koja sadrži promoter Prm1 miša koji je operativno povezan sa Crei genom i kasetu za odabir leka promotera humanog ubikvitina operativno povezanog sa genom otpornosti na neomicin. ;Slika 33 daje sekvenciono poravnanje humanog IL-2rg proteina (SEK ID BR: 20; NP_ 000197.1); protein IL-2rg pacova (SEK ID BR: 21; NP_543165.1); i himerni IL-2rg protein (SEK ID BR: 22) koji sadrži humani ekto domen IL-2rg fuzionisan sa ostatkom proteina IL-2rg pacova. Veza između humanog i pacovskog IL-2rg je zabeležena vertikalnom linijom. ;;DETALJNI OPIS PRONALASKA ;;Tumač pojmova ;;[0053] Izraz "embrionalna matična ćelija" ili "ES ćelija", kako se ovde koristi, uključuje totipotentnu ili pluripotentnu ćeliju koja je izvedena od embriona koja može da doprinese bilo kom tkivu razvojnog embriona nakon uvođenja u embrion. Izraz "pluripotentna ćelija", kako se ovde koristi, uključuje nediferenciranu ćeliju koja poseduje sposobnost da se razvije u više od jednog diferenciranog tipa ćelija. ;[0054] Izraz "homologna nukleinska kiselina", kako se ovde koristi, uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja je ili identična ili suštinski slična sa poznatom referentnom sekvencom. U jednoj realizaciji, izraz "homologna nukleinska kiselina" je korišćen da karakteriše sekvencu koja ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100% identična sa poznatom referentnom sekvencom. ;[0055] Izraz "ortologna nukleinska kiselina", kako se ovde koristi, uključuje sekvencu nukleinske kiseline iz jedne vrste koja je funkcionalno ekvivalentna poznatoj referentnoj sekvenci u drugoj vrsti. ;[0056] Izraz "veliki vektor ciljanja" ili "LTVEC", kako se ovde koristi uključuje velike vektore ciljanja za eukariotske ćelije koji su izvedeni iz fragmenata klonirane genomske DNK veće od onih koje obično koriste drugi pristupi, namenjeni da izvrše homologno ciljanje gena u eukariotskim ćelijama. Primeri LTVEC-a, uključuju, ali nisu ograničeni na, bakterijski homologni hromozom (BAC) i veštački hromozom kvasca (YAC). ;[0057] Izraz "modifikacija alela" (MOA), kako se ovde koristi, obuhvata modifikaciju tačne DNK sekvence jednog alela gena ili hromozomskog lokusa (lokusa) u genomu. Primeri "modifikacije alela (MOA)" kao što je ovde opisano uključuju, ali nisu ograničeni na, delecije, zamene ili umetanja tako mala, poput pojedinačnog nukleotida ili delecije mnogih kilobaza koji obuhvataju gen (e) ili hromozomski lokus (lokuse) od interesa, kao i bilo koje moguće modifikacije između ova dva ekstrema. ;[0058] Izraz "mesto rekombinacije", kako se ovde koristi, uključuje nukleotidnu sekvencu koja je prepoznata pomoću rekombinaze specifične za mesto i koja može poslužiti kao supstrat za rekombinacioni događaj. ;[0059] "Serijske" genetske modifikacije uključuju, dve ili više modifikacija, na primer, pacovske ES ćelije, sprovedene nezavisno. Na primer, prva modifikacija je napravljena na genomu ES ćelije pacova koji koristi odgovarajući prvi konstrukt nukleinske kiseline. Prva modifikacija se može postići elektroporacijom, ili bilo kojom drugom metodom poznatom u struci. Zatim je izvršena druga modifikacija istog genoma ES ćelije pacova koji koristi odgovarajući drugi konstrukt nukleinske kiseline. Druga modifikacija se može postići pomoću druge elektroporacije, ili bilo koje druge metode poznate u struci. U različitim realizacijama, prateći prvu i drugu genetsku modifikaciju iste ES ćelije pacova, treću, četvrtu, petu, šestu i tako dalje, serijske genetske modifikacije (jedna nakon druge) mogu se postići korišćenjem, na primer, serijske elektroporacije ili bilo koje druge pogodne metode (serijski) poznate u struci. ;[0060] Izraz "rekombinaza specifična za mesto", kako se ovde koristi, uključuje grupu enzima koji mogu olakšati rekombinaciju između "mesta rekombinacije" gde su dve lokacije rekombinacije fizički odvojene unutar jednog molekula nukleinske kiseline ili na odvojenim molekulima nukleinske kiseline. Primeri "rekombinaze specifične za lokaciju" uključuju, ali nisu ograničeni na, Cre, Flp i Dre rekombinaze. ;[0061] Izraz "germinativna linija" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline uključuje, sekvencu nukleinske kiseline koja se može preneti na potomstvo. ;[0062] Fraza "teški lanac," ili "teški lanac imunoglobulina" uključuje, sekvencu teškog lanca imunoglobulina, uključujući sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, iz bilo kog organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju, tri CDR-a teškog lanca i četiri FR regiona, osim ako nije drugačije naznačeno. Fragmenti teških lanaca uključuju, CDR, CDR i FR regione i njihove kombinacije. Tipičan teški lanac ima, prateći varijabilni domen (od N-terminala do C-terminala), CH1 domen, šarku, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje, fragment koji je sposoban da specifično prepozna epitop (npr. epitop za prepoznavanje sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban da se eksprimira i sekretuje iz ćelije i koji sadrži najmanje jedan CDR. Varijabilni domeni teškog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona, koji generalno obuhvata VH, DHi JHsegmente izvedene iz repertoara VH, DHi JHsegmenata prisutnih u germinativnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za segmente teškog lanca V, D i J za različite organizme se mogu naći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna preko interneta na svetskom vebu (www) na URL-u "imgt.org." ;[0063] Fraza "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, a osim ako nije drugačije naznačeno, uključuje humane kappa (κ) i lambda (λ) lake lance i VpreB, kao i surogatne lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca obično uključuju, tri CDR-a lakog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, osim ako nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac u punoj dužini uključuje, od amino završetka do karboksilnog završetka, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni domeni lakog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca, koja obično sadrži genske segmente VLlakog lanca i JLlakog lanca, izvedene iz repertoara genskih segmenata lakih lanaca V i J prisutnih u germinativnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za genske segmente lakog lanca V i J za različite organizme se mogu naći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna preko interneta na svetskom vebu (www) na URL-u "imgt.org." Laki lanci uključuju one, npr., koji se selektivno ne vezuju ni za prvi ili ni za drugi epitop selektivno vezan od strane epitop-vezujućeg proteina u kojem se pojavljuju. Laki lanci takođe, uključuju one koji vezuju i prepoznaju ili pomažu teškim lancima za vezivanje i prepoznavanje, jednog ili više epitopa selektivno vezanih od proteina koji se vezuje za epitop u kojem se pojavljuju. ;[0064] Fraza "operativno povezan" obuhvata vezu pri čemu komponente operativno povezuju funkciju na njihov namenjeni način. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein, može biti operativno povezana sa regulatornim sekvencama (npr., promoterom, inhenserom, silencer sekvencom itd.) kako bi zadržala odgovarajuću transkripcionu regulaciju. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina (ili V (D) J segmensta) može biti operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulina kako bi se omogućila pravilna rekombinacija između sekvenci u sekvenci teškog ili lakog lanca imunoglobulina. ;;1. Ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu pacova ;;[0065] Različiti postupci i preparati su obelodanjeni, koji omogućavaju integraciju najmanje jedne ubačene nukleinske kiseline u ciljnom lokusu. Kao što se ovde koristi, "genomski lokus od interesa" sadrži bilo koji segment ili region DNK unutar genoma koji jedini želi da integriše ubačenu nukleinsku kiselinu. Izrazi "genomski lokus od interesa" i "ciljni genomski lokus od interesa" mogu se koristiti naizmenično. Genomski lokus od interesa, može biti izvorno u ćeliji, ili alternativno može sadržati heterologni ili egzogeni segment DNK koji je integrisan u genom ćelije. Takvi heterologni ili egzogeni segmenti DNK, mogu uključivati transgene, ekspresione kasete, selekcione markere koji kodiraju polinukleotid, ili heterologne ili egzogene regione genomske DNK. Izraz "lokus" je ovde definisan kao segment DNK unutar genomske DNK. Genetske modifikacije, kao što je ovde opisano, mogu da uključuju jednu ili više delecija iz lokusa od interesa, dopunjavanja lokusa od interesa, zamenu lokusa od interesa i / ili bilo koje njihove kombinacije. Lokus od interesa može obuhvatati regione kodiranja ili nekodirajuće regulatorne regione. ;[0066] Genomski lokus od interesa, može dalje da sadrži bilo koju komponentu ciljanog integracionog sistema, uključujući, na primer, mesto prepoznavanja, selekcionog markera, prethodno integrisanu ubačenu nukleinsku kiselinu, polinukleotide koji kodiraju nukleazne agense, promotere i sl. Alternativno, genomski lokus od interesa, može biti lociran u veštačkom hromozomu kvasca (YAC), bakterijskom veštačkom hromozomu (BAC), humanom veštačkom hromozomu ili bilo kom drugom konstruisanom genomskom regionu koji se nalazi u odgovarajućoj ćeliji domaćina. U različitim primerima, ciljani lokus može da sadrži nativnu, heterolognu ili egzogenu sekvencu nukleinske kiseline iz prokariota, eukariota, kvasca, bakterije, ne-humanog sisara, ćelije koja nije humana, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, vola, jelena, ovce, koze, pileta, mačke, psa, lasice, primata (npr. marmozet, rhesus majmun), gajenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo kojeg drugog organizma od interesa ili njegove kombinacije. ;[0067] U specifičnim realizacijama, genomski lokus od interesa sadrži ciljni lokus od "nukleinske kiseline pacova". Ovakav region sadrži nukleinsku kiselinu od pacova koja je integrisana unutar genoma ćelije. ;[0068] Neograničavajući primeri ciljnog lokusa uključuju, genomski lokus koji kodira protein izražen u B ćeliji, genomski lokus koji izražava polipeptid u nezreloj B ćeliji, genomski lokus koji izražava polipeptid u zreloj B ćeliji, lokusi imunoglobulina (Ig) ili lokusi T ćelijskog receptora, uključujući, na primer, alfa lokus T ćelijskog receptora. Dodatni primeri ciljnog genomskog lokusa uključuju, FcERI lokus, TLR4 lokus, PRLR lokus, Notch4 lokus, Accn2 lokus, Adamts5 lokus, TRPA1 lokus, FolH1 lokus, LRP5 lokus, lokus IL2 receptora, uključujući, na primer, lokus IL2 receptora gama (IL2Rg), ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus, Rag1 / Rag2 lokus i ERBB4 lokus. Svaki takav ciljni lokus, može biti od pacova. ;[0069] U jednom primeru, ciljni lokus kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina sisara. U jednoj realizaciji, ciljni lokus kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova. U jednom primeru, ciljni lokus sadrži sekvencu genomske DNK koja sadrži neuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša ili čoveka koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša ili čoveka odabrana od CH1, šarke, CH2, CH3 i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-šarka-CH2-CH3. U jednoj realizaciji, ciljni lokus sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša, ili čoveka operativno povezanu sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U jednom primeru, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova, miša ili čoveka odabrana od CH1, šarke, CH2, CH3 i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-spoj-CH2-CH3. ;[0070] U jednom primeru, ciljni lokus sadrži genomsku DNK sekvencu koja kodira sekvencu aminokiseline varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara. U jednom primeru, sekvenca genomske DNK sadrži neuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i / ili κ lakog lanca sisara. ;[0071] U jednom primeru, genomska DNK sekvenca sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i / ili κ lakog lanca sisara. U jednom primeru, nepreuređena sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca λ ili κ je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara, izabranom od sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ i sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca κ. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina pacova. U jednom primeru, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca mišjeg imunoglobulina. U jednom primeru, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina sisara je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina. ;[0072] Kao što se ovde koristi, ApoE lokus pacova, Interleukin-2 receptorski gama (II-2rg) lokus pacova, Rag2 lokus pacova, Rag1 lokus pacova i / ili Rag2 / Rag1 lokus pacova obuhvataju odgovarajuće regione genoma pacova u kojima se nalazi svaki od ovih gena ili kombinacija gena. Modifikovanje bilo kog od pacovskog ApoE lokusa, pacovskog interleukin-2 receptorskog gama lokusa, pacovskog lokusa Rag2, pacovskog lokusa Rag1 i / ili kombinovanog lokusa Rag2 / Rag1 pacova, mogu sadržati bilo koju željenu izmenu datog lokusa. Neograničavajući primeri modifikacije u datom lokusu pacova su ovde detaljno dalje razmotreni. ;[0073] Na primer, u specifičnim realizacijama, jedan ili više lokusa ApoE pacova, lokusa interleukin-2 receptora gama pacova, lokusa Rag2 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 je modifikovano tako da su aktivnost i / ili nivo kodiranog ApoE proteina ili proteina interleukin-2 receptora gama ili Rag1 proteina ili Rag2 proteina ili kombinacije proteina Rag1 i Rag2 smanjeni. U drugim realizacijama, nije prisutna aktivnost ApoE proteina, proteina interleukin-2 receptora gama, proteina Rag1, ili proteina Rag2, ili kombinacije proteina Rag1 i Rag2. ;[0074] Pod "smanjivanjem" namenjeno je bilo kakvo smanjenje nivoa ili aktivnosti gena / proteina kodiranog na lokusu od interesa. Na primer, smanjenje aktivnosti može sadržati ili (1) statistički značajno smanjenje ukupnog nivoa ili aktivnosti datog proteina (tj. ApoE, gama interleukin-2 receptora gama, Rag1, Rag2 ili kombinacije Rag1 i Rag2) uključujući, na primer, smanjeni nivo ili aktivnost od 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ili višu u poređenju sa odgovarajućom kontrolom. Metode ispitivanja za smanjenje koncentracije i / ili aktivnosti bilo kog od ApoE, interleukin-2 receptora gama, Rag1 i Rag2 su poznate u struci. ;[0075] U drugim realizacijama, jedan ili više lokusa ApoE pacova, lokusa interleukin-2 receptora gama pacova, lokusa Rag2 pacova, lokusa Rag1 pacova i / ili lokusa Rag2 / Rag1 pacova obuhvata modifikaciju, tako da je aktivnost i / ili nivo kodiranog ApoE polipeptida, polipeptida interleukin-2 receptora gama, polipeptida Rag2, polipeptida Rag1 ili oba polipeptida Rag1 i Rag2 povećana. Pod "povećanim" namerava se bilo kakvo povećanje nivoa ili aktivnosti gena / polipeptida kodiranog na lokusu od interesa. Na primer, povećanje aktivnosti može da obuhvati ili (1) statistički značajno povećanje ukupnog nivoa ili aktivnosti datog proteina (tj. ApoE, interleukin-2 receptora gama, Rag1, Rag2 ili Rag1 i Rag2) uključujući, na primer, povećani nivo ili aktivnost od 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ili višu u odnosu na odgovarajuću kontrolu. Metode za ispitivanje povećanja koncentracije i / ili aktivnosti bilo kojeg od proteina ApoE, Rag1, Rag2 i interleukin-2 gama receptora su poznate u struci. ;[0076] Genetska modifikacija pacovskog ApoE lokusa, pacovskog interleukin-2 receptora gama lokusa, pacovskog Rag2 lokusa, pacovskog Rag1 lokusa i / ili pacovskog Rag2 / Rag1 lokusa, može sadržati brisanje endogene sekvence nukleinske kiseline pacova na genomskom lokusu, ubacivanje egzogene nukleinske kiseline na genomskom lokusu, ili njihovu kombinaciju. Brisanje i / ili umetanje, mogu se javiti bilo gde u datom lokusu, kao što je ovde navedeno na drugom mestu. ;[0077] Dalje realizacije ovde opisane, obuhvataju modifikaciju jednog ili više lokusa ApoE pacova, lokusa interleukin-2 receptora gama pacova, lokusa Rag2 pacova, lokusa Rag1 pacova i / ili lokusa Rag2 / Rag1 pacova kroz zamenu dela pacovskog ApoE lokusa, interleukin-2 receptorskog gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa sa odgovarajućim homolognim ili ortolognim delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptorskog gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0078] Još uvek u drugim realizacijama, modifikacija jednog ili više lokusa ApoE pacova, pacovskog interleukin-2 receptorskog gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa je izvršena zamenom dela pacovskog ApoE lokusa, pacovskog interleukin-2 receptorskog gama lokusa i / ili pacovskog Rag2 lokusa i / ili Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa sa ubačenom polinukleotidnom raspodelom preko njegove pune dužine najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% na delu ApoE lokusa, lokusa interleukin-2 receptora gama, lokusa Rag2, lokusa Rag1 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 koji se zamenjuje. ;[0079] Dati insert polinukleotida i / ili odgovarajući region pacovskog lokusa koji se briše, može biti region za kodiranje, intron, ekson, neprevedeni region, regulatorni region, promoter ili inhenser ili bilo koja njihova kombinacija ili bilo koji njegov deo. Pored toga, dati umetnuti polinukleotid i / ili region pacovskog lokusa koji se briše, može biti bilo koje željene dužine, uključujući, na primer između 10-100 nukleotida u dužini, 100-500 nukleotida u dužini, 5001kb nukleotida u dužini, 1Kb do 1,5kb nukleotida u dužini, 1,5kb do 2kb nukleotida u dužini, 2kb do 2,5kb dužine nukleotida, 2,5kb do 3kb nukleotida u dužini, 3kb do 5kb nukleotida u dužini, 5kb do 8kb nukleotida u dužini, 8kb do 10kb nukleotida u dužini ili više. U drugim slučajevima, veličina umetanja ili zamene je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb od oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, od oko 350kb do oko 400kb, od oko 400kb do od oko 800kb, od oko 800kb do 1Mb, od oko 300kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 500kb, od oko 500kb do 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, od oko 2,5Mb do oko 2,8Mb, od oko 2,8Mb do oko 3Mb. U drugim realizacijama, dati insert polinukleotida i / ili region pacovskog lokusa koji se briše je najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ili 900 nukleotida ili najmanje 1 kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 1lkb, 12kb, 13kb, 14kb, 15kb, 16kb ili više. ;[0080] Dati polinukleotidni insert, može biti iz bilo kojeg organizma, uključujući, na primer, glodara, pacova, miša, hrčka, sisara, sisara koji nije čovek, čoveka, poljoprivredne životinje ili domaće životinje. ;[0081] Kao što je detaljno ovde razmatrano, obezbeđene su različite metode kako bi se generisale ciljane modifikacije bilo kog lokusa od interesa, uključujući na primer, ciljane modifikacije pacovskog ApoE lokusa, interleukin-2 receptorskog gama lokusa pacova, pacovskog Rag2 lokusa, pacovskog Rag1 lokusa i / ili pacovskog Rag2 / Rag1 lokusa. Dalje su opisani genetski modifikovani pacovi ili genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova (npr. ES ćelije pacova), koje obuhvataju uklanjanje, ubacivanje, zamenu i / ili bilo koju njihovu kombinaciju na lokusu interleukin-2 receptora gama, na ApoE lokusu, na lokusu Rag2 pacova, na lokusu Rag1 pacova i / ili na lokusu Rag2 / Rag1 pacova. Takve genetske modifikacije (uključujući, one koje rezultiraju odsustvom, smanjenjem, povećanjem ili modulacijom aktivnosti ciljnog lokusa) i takođe se mogu prenositi preko germinativne linije. U specifičnim realizacijama, genetske modifikacije rezultiraju u izbacivanju željenog ciljnog lokusa. Takvi pacovi nalaze upotrebu u različitim eksperimentalnim sistemima, kao što je ovde razmatrano na drugim mestima. ;[0082] Na primer, ApoE (Apolipoprotein E) nokauti kod pacova nude životinjski model za proučavanje endotelne funkcije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, formiranje plaka, transkripcijske promene (sekvenciranje ubrizgavanja celokupnog transkripta (RNK-Sek) i ex vivo funkcije. Štaviše, veća veličina pacova olakšava sve ove analize i potencijalno poboljšava kvalitet RNK-Sek podataka. ApoE je važna transportna molekula i može transportovati lipide, kao što je holesterol, kroz krvotok. ApoE može takođe, da funkcioniše u nervnom sistemu, na primer, za čišćenje β-amiloida iz mozga. Modifikacije u ApoE-u su implicirane u različitim stanjima, uključujući, na primer, aterosklerozu, hiperlipidemiju i Alchajmerovu bolest. ApoE nokaut životinje pokazuju oštećeno čišćenje lipoproteina iz krvi i razvoj ateroskleroze. Stoga, ApoE nokaut životinje pružaju model za proučavanje uslova i / ili procesa kao što su, na primer, endotelna funkcija, formiranje plaka, transkripcijske promene (RNK-Sek), hiperlipidemija, ateroskleroza i Alchajmerova bolest. Analize za merenje ApoE aktivnosti su poznate u tehnici. Na primer, smanjenje aktivnosti ApoE se može meriti ispitivanjem smanjenja nivoa ApoE-a u uzorku krvi dobijenom od subjekta pomoću imunoanalize, kao što je ELISA ili pomoću tehnike imunoblottinga. Štaviše, velika veličina pacova olakšava sve ove analize i poboljšava kvalitet podataka. ;[0083] RAG1 (gen 1 za aktiviranje rekombinacije) i RAG2 (gen 2 za aktiviranje rekombinacije) su enzimi koji su deo multi-podjediničnog kompleksa, a koji imaju VDJ rekombinacionu aktivnost i igraju važnu ulogu u preuređivanju i rekombinaciji imunoglobulina i gena T-ćelijskih receptora u limfocitima. RAG1 i RAG2 indukuju cepanje dvostruko lančane DNK radi olakšanja rekombinacije i pridruživanja genskih segmenata T ćelijskog receptora i B ćelijskog receptora (tj. imunoglobulina). Ukidanje RAG1 i / ili RAG2 uzrokuje gubitak B ćelija i T ćelija u životinji koja dovodi do teške imunodeficijencije. RAG1 i / ili RAG2 knockout životinje pronalaze primenu, na primer, u studijama ksenografta (tj. ksenografta humanih ćelija kod pacova), raka, razvoja vakcina, autoimunih bolesti, zaraznih bolesti i bolesti grafta versus domaćin (GVHD). Različiti testovi za merenje aktivnosti RAG1 i / ili RAG2 su poznati u struci i uključuju, na primer, merenje efikasnosti rekombinacije ili ispitivanje prisustva ili odsustva B ćelija i / ili T ćelija kod subjekta. Štaviše, velika veličina pacova olakšava sve ove analize i potencijalno poboljšava kvalitet podataka. ;[0084] IL-2 receptor (IL-2R) je izražen na površini određenih imunskih ćelija i vezuje se za citokinski interleukin-2 (IL-2). IL-2R je integralni membranski protein koji sadrži najmanje tri odvojena podjedinična lanca, uključujući alfa lanac (IL-2Ra, CD25), beta lanac (IL-2Rb, CD122) i gama lanac (IL2-Rg, CD132). IL-2 receptorski gama (takođe nazvan IL2r-y ili IL2Rg) lanac je uobičajeni gama lanac koji je deljen od strane različitih citokinskih receptora, uključujući, na primer, receptore za IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21. IL-2Rg sadrži ektodomen na ekstracelularnoj površini ćelije, što doprinosi vezivanju liganda, transmembranski domen i intracelularni domen koji može da stupi u interakciju sa različitim molekulima da indukuje intracelularne puteve transdukcije signala. Gen IL2rg se nalazi na Xhromozomu kod sisara, a određene mutacije u genu gama lanca kod ljudi mogu uzrokovati humanu X-povezanu tešku kombinovanu imunodeficijenciju (XSCID) karakterisanu dubokim T-ćelijskim defektom. Pored toga, ekto-domen gama lanca, može biti izbačen iz transmembranskog receptora i oslobođen kao rastvorljivi receptor gama lanca. Rastvorljivi receptor gama lanca se može detektovati u krvi subjekta i može funkcionisati za regulisanje signalizacije citokina. ;[0085] U nekim realizacijama, lanac IL-2Rg pacova je zamenjen sa humanim IL2-Rg lancem tako da pacov eksprimira potpuno humani IL-2Rg lanac. U drugim slučajevima, može biti korisno da se zameni samo ektodomen pacovskog IL-2Rg lanca sa ektodomenom humanog IL-2Rg lanca. U takvim slučajevima, dobijeni humanizovani IL-2Rg lanac izražen u pacovu sadrži humani ektodomen, a ostatak molekula je od pacova. ;[0086] Humanizacija IL-2Rg pune dužine je korisna jer pacovi koji imaju ovaj modifikovani lokus će proizvesti humani IL-2Rg. Ovo će omogućiti otkrivanje humanog IL-2Rg kod pacova sa antitelima specifičnim za humani IL-2Rg. Ekto-humanizacija (tj. zamena ektodomena IL-2Rg pacova sa humanim ekto domenom IL-2Rg) rezultiraće polipeptidom IL-2Rg koji će vezati humane ligande za IL2-Rg, ali pošto je citoplazmatski domen i dalje pacovski, ekto-humanizovani oblik IL-2Rg će takođe stupiti u interakciju sa mehanizmom za signalizaciju pacova. ;;2. Modifikovanje ciljnog lokusa pacova ;;A. Ciljajući vektori i ubačene nukleinske kiseline ;;i. Insert nukleinske kiseline ;;[0087] Kao što se ovde koristi, "ubačena nukleinska kiselina" sadrži segment DNK koji se želi integrisati na ciljnom lokusu. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više polinukleotida od interesa. U drugim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina, može da sadrži jednu ili više ekspresionih kaseta. Data ekspresiona kaseta može da sadrži polinukleotid od interesa, polinukleotid koji kodira selekcioni marker i / ili reporter gen zajedno sa različitim regulatornim komponentama koje utiču na ekspresiju. Neograničavajući primeri polinukleotida od interesa, selekcionih markera i reporterskih gena koji mogu biti uključeni u umetnutu nukleinsku kiselinu, detaljno su razmatrani na drugim mestima ovde. ;[0088] U specifičnim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina može da sadrži nukleinsku kiselinu od pacova, a koja može obuhvatiti segment genomske DNK, cDNK, regulatornog regiona ili bilo kog dela ili njihove kombinacije. U drugim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina može da sadrži nukleinsku kiselinu od ne-humanog sisara, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, vola, jelena, ovce, koze, pileta, mačke, psa, lasice, primata (npr. marmozet, rhesus majmun), domaćeg sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo koji drugi organizam od interesa. Kao što je ovde detaljno opisano, ubačena nukleinska kiselina upotrebljena u različitim metodama i kompozicijama, može da rezultira "humanizacijom" ciljnog lokusa koji sadrži nukleinsku kiselinu pacova. ;[0089] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži knock-in alel od najmanje jednog eksona endogenog gena. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži knock-in alel celokupnog endogenog gena (tj., engl. "gene-swap knock-in"). ;[0090] U jednoj realizaciji, insertovana nukleinska kiselina sadrži regulatorni element, uključujući, na primer, promotera, inhensera ili transkripcioni represorski-vezivni element. ;[0091] U daljim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina sadrži uslovni alel. U jednoj realizaciji, uslovni alel je multifunkcionalni alel, kao što je opisano u US 2011/0104799. U specifičnim realizacijama, uslovni alel obuhvata: (a) podstaknutu sekvencu u smisaonoj orijentaciji u odnosu na transkripciju ciljnog gena i kasetu za odabir leka u smisaonoj ili antismisaonoj orijentaciji; (b) nukleotidnu sekvencu od interesa (NSI) u antismisaonoj orijentaciji i zavisnu inverzionim modulom (COIN, koji koristi ekson-razdvajajući intron i invertibilni genetrap-nalik modul, videti, na primer, US 2011/0104799); i (c) rekombinantne jedinice koje se rekombiniju nakon izlaganja prvoj rekombinazi da bi se formirao uslovni alel kome (i) nedostaje podstaknuta sekvenca i DSC, i (ii) sadrži NSI u smisaonoj orijentaciji i COIN u antismisaonoj orijentaciji. ;[0092] Ubačena nukleinska kiselina se kreće od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100 kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200 kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb. ;[0093] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži deleciju genomske DNK sekvence pacova u rasponu od oko 1kb do oko 200kb, od oko 2kb do oko 20kb, ili od oko 0,5kb do oko 3Mb. U jednoj realizaciji, stepen brisanja sekvence genomske DNK je veći od ukupne dužine homolognog kraja 5' i homolognog kraja 3'. U jednoj realizaciji, stepen brisanja sekvence DNK genoma se kreće od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 70kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 110kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, od oko 190kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, od oko 350kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 800kb, od oko 800kb do 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, od oko 2,5 Mb do oko 2,8 Mb, od oko 2,8Mb do oko 3Mb, od oko 200kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 500kb, od oko 500kb do oko 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, ili od oko 2,5Mb do oko 3Mb. ;[0094] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži umetanje ili zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina obuhvata umetanje ili zamenu sekvence DNK pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline na endogenom lokusu pacova koji sadrži odgovarajuću sekvencu DNK pacova. ;[0095] U jednom izvođenju, genetska modifikacija je dodatak sekvence nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, dodata nukleotidna sekvenca se kreće od 5kb do 200 kb. ;[0096] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži genetsku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži mutaciju delecije kodirajuće sekvence. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži fuziju dve endogene kodirajuće sekvence. ;[0097] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži umetanje ili zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina obuhvata ubacivanje ili zamenu sekvence DNA pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline na endogenom lokusu pacova koji sadrži odgovarajuću sekvencu DNK pacova. ;[0098] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži deleciju ne-proteinske kodirajuće sekvence, ali ne sadrži brisanje sekvence za kodiranje proteina. U jednoj realizaciji, uklanjanje ne-proteinske kodirajuće sekvence obuhvata deleciju regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži deleciju promotera. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži dodatak promotera ili regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži zamenu promotera ili regulatornog elementa. ;[0099] U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline vektora za ciljanje, može da sadrži jedan polinukleotid koji će, kada je integrisan u genomu, proizvesti genetsku modifikaciju regiona pacovskog ApoE lokusa, pri čemu genetska modifikacija na ApoE lokusu rezultira smanjenjem aktivnosti ApoE, povećanjem aktivnosti ApoE ili modulacijom aktivnosti ApoE. U jednoj realizaciji generisan je ApoE knockout ("alel nula"). ;[0100] U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline vektora ciljanja, može da sadrži jedan polinukleotid koji će, kada se integriše u genom, proizvesti genetsku modifikaciju regiona lokusa interleukin-2 receptora pacova, pri čemu genetska modifikacija na lokusu interleukin-2 receptora rezultira smanjenjem aktivnosti interleukin-2 receptora. U jednoj realizaciji, generisan je knockout interleukin-2 receptora ("nula alel"). ;[0101] U daljim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina rezultira zamenom dela pacovskog ApoE lokusa, lokusa interleukin-2 receptora gama i / ili lokusa Rag2 i / ili lokusa Rag1 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 sa odgovarajućim homolognim ili ortolognim delom ApoE lokusa, interleukin-2 receptorskog gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0102] Još uvek u drugim izvođenjima, ubačena nukleinska kiselina sadrži raspodelu polinukleotida preko njene pune dužine najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% na delu ApoE lokusa, lokusa interleukin-2 receptora gama, lokusa Rag2, lokusa Rag1 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 koji se zamenjuje. ;[0103] Dati umetak polinukleotida i odgovarajući region lokusa pacova koji se zamenjuje, mogu biti region za kodiranje, intron, ekson, neprevedeni region, regulatorni region, promoter ili inhenser ili bilo koja njihova kombinacija. Pored toga, dati insert polinukleotida i / ili regiona pacovskog lokusa koji se briše, može biti od bilo koje željene dužine, uključujući, na primer između 10-100 nukleotida u dužini, 100-500 nukleotida u dužini, 500-1kb nukleotida u dužini, 1Kb do 1,5kb nukleotida u dužini, 1,5kb do 2kb nukleotida u dužini, 2kb do 2,5kb nukleotida u dužini, 2,5kb do 3kb nukleotida u dužini, 3kb do 5kb nukleotida u dužini, 5kb do 8kb nukleotida u dužini, 8kb do 10kb nukleotida u dužini ili više. U drugim slučajevima, veličina umetanja ili zamene je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, od oko 350kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 800kb, od oko 800kb do 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb, do oko 2,5Mb, od oko 2,5Mb do oko 2,8Mb, od oko 2,8Mb do oko 3Mb. U drugim realizacijama, dati insert polinukleotida i / ili regiona pacovskog lokusa koji se briše je najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ili 900 nukleotida ili najmanje 1 kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14 kb, 15kb, 16kb ili više. ;[0104] U jednoj realizaciji, promoter je konstitutivno aktivan promoter. ;[0105] U jednoj realizaciji, promoter je indukovani promoter. U jednoj realizaciji, indukovani promoter je hemijski regulisani promoter. U jednoj realizaciji, hemijski regulisani promoter je promoter regulisan alkoholom. U jednoj realizaciji, promoter regulisan alkoholom je promoter gena alkoholne dehidrogenaze (alcA). U jednoj realizaciji, hemijski regulisani promoter je promoter regulisan tetraciklinom. U jednoj realizaciji, promoter regulisan tetraciklinom je promoter koji odgovara na tetraciklin. U jednoj realizaciji, promoter regulisan tetraciklinom je sekvenca operatora tetraciklina (tetO). U jednoj realizaciji, promoter regulisan sa tetraciklinom je promoter tet-On. U jednoj realizaciji, promoter regulisan tetraciklinom je promoter tet-Off. U jednoj realizaciji, hemijski regulisani promoter je steroidno regulisani promoter. U jednoj realizaciji, steroidno regulisani promoter je promoter receptora glukokortikoida pacova. U jednoj realizaciji, steroidno regulisani promoter je promoter estrogenskog receptora. U jednoj realizaciji, steroidno regulisani promoter je promoter ekdizonskog receptora. U jednoj realizaciji, hemijski regulisani promoter je promoter regulisan sa metalom. U jednoj realizaciji, promoter regulisan metalom je promoter regulisan metaloproteinom. U jednoj realizaciji, indukovani promoter je fizički regulisani promoter. U jednoj realizaciji, fizički regulisani promoter je promoter regulisan temperaturom. U jednoj realizaciji, promoter regulisan temperaturom je promoter toplotnog šoka. U jednom izvođenju, fizički regulisani promoter je promoter regulisan sa svetlošću. U jednoj realizaciji, promoter koji reguliše svetlost je svetlosno indukovani promoter. U jednom izvođenju, promotor koji reguliše svetlost je promoter koji je suzbijen svetlošću. ;[0106] U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za tkivo. U jednoj realizaciji, promoter je promotor specifičan za neuron. U jednoj realizaciji, promoter je glija-specifični promoter. U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za mišićne ćelije. U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za srčanu ćeliju. U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za bubrežnu ćeliju. U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za koštanu ćeliju. U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za endotelne ćelije. U jednoj realizaciji, promoter je promoter specifičan za imuno ćelije. U jednoj realizaciji, promoter imunih ćelija je promoter B ćelija. U jednoj realizaciji, promoter imunih ćelija je promoter T ćelija. ;[0107] U jednoj realizaciji, promoter je razvojno regulisani promoter. U jednoj realizaciji, promoter regulisan razvojem je aktivan samo tokom embrionalne faze razvoja. U jednoj realizaciji, razvojno regulisani promoter je aktivan samo u odrasloj ćeliji. ;[0108] U nekim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina sadrži nukleinsku kiselinu okruženu sa ciljnim sekvencama rekombinacije specifičnim za mesto. Prepoznata je dok se celokupna ubačena nukleinska kiselina može okružiti od strane takvih ciljnih sekvenci rekombinacije specifičnih za lokaciju, bilo koji region ili pojedinačni polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline, može takođe da se okruži pomoću takvih mesta. Rekombinaza specifična za lokaciju, može biti uvedena u ćeliju bilo kojim sredstvima, uključujući, uvođenjem rekombinaznog polipeptida u ćeliju ili uvođenjem polinukleotida koji kodira rekombinazu specifičnu za mesto u ćeliji domaćina. Polinukleotid koji kodira mestospecifičnu rekombinazu se može nalaziti unutar ubačene nukleinske kiseline ili unutar odvojenog polinukleotida. Rekombinaza specifična za mesto, može biti operativno povezana sa promoterom koji je aktivan u ćeliji, uključujući, na primer, indukovanog promotera, promotera koji je endogen u ćeliji, promoter koji je heterologan u ćeliji, ćelijski specifičnog promotera, promotera koji je specifičan za tkivo ili promotera specifičnog za razvojni stadijum. Ciljne sekvence rekombinacije specifične za mesto, koje mogu da okruže ubačenu nukleinsku kiselinu ili bilo koji polinukleotid od interesa u umetku nukleinske kiseline, mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox i njihovu kombinaciju. ;[0109] U nekim realizacijama, rekombinacione lokacije koje su specifične za mesto okruže polinukleotid koji kodira selekcioni marker i / ili reporterski gen sadržan unutar ubačene nukleinske kiseline. U takvim slučajevima nakon integracije ubačene nukleinske kiseline u ciljani lokus, mogu biti uklonjene sekvence između mesto-specifičnih rekombinacionih mesta. ;[0110] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline sadrži polinukleotida koji kodira selekcionog markera. Selekcioni marker, može biti sadržan u selekcionoj kaseti. Takvi selekcioni markeri uključuju, ali nisu ograničeni na, neomicin, fosfotransferazu (neo<r>), higromicin B fosfotransferazu (hig<r>), puromicin-N-acetiltransferazu (puro<f>), blasticidin S deaminazu (bsr<r>), ksantin / guanin fosforibozil transferazu (gpt) ili timidin kinazu herpes simplex virusa (HSV-k) ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, polinukleotid koji kodira selekcionog markera je operativno povezan sa promoterom koji je aktivan u ćeliji, ćeliji pacova, pluripotentnoj ćeliji pacova ili ES ćeliji pacova. Kada se serijski ubacuju polinukleotidi od interesa u ciljanom lokusu, selekcioni marker može da sadrži mesto prepoznavanja za nukleazni agens, kao što je gore opisano. U jednoj realizaciji, polinukleotid koji kodira selekcionog markera je okružen sa sekvencama ciljane rekombinacije specifične za lokaciju. ;[0111] Umetnuta nukleinska kiselina, može dalje da sadrži reporterski gen operativno vezan za promotera, pri čemu reporterski gen kodira reporterski protein izabran iz grupe koja se sastoji od ili sadrži LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, Ypet, poboljšani žuti fluorescentni protein (EYFP), Emerald, poboljšani zeleni fluorescentni protein (EGFP), CyPet, cijan fluorescentni protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu i / ili njihovu kombinaciju. Ovakvi reporterski geni, mogu biti operativno povezani sa promoterom koji je aktivan u ćeliji. Takvi promoteri, mogu biti indukovani promoter, promoter koji je endogeni reporterskom genu ili ćeliji, promoter koji je heterologan za reporterski gen ili ćeliju, ćelijski specifični promoter, promoter specifičan za tkivo ili promoter specifičan za razvojni stadijum. ;[0112] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline, može da sadrži nukleinsku kiselinu sisara koja sadrži genomski lokus, koji kodira jedan protein eksprimiran u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, sistemu cirkulacije, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu ili njihovoj kombinaciji. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u koštanoj srži ili ćeliji izvedenoj iz koštane srži. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u ćeliji slezine. ;[0113] U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, sistemu cirkulacije, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu ili njihovoj kombinaciji. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u koštanoj srži ili ćeliji izvedenoj iz koštane srži. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u ćeliji slezine. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži mišju genomsku DNK sekvencu, pacovsku genomsku DNK sekvencu, humanu genomsku DNK sekvencu, ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, pacovske i humane genomske DNK sekvence. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, mišje i humane genomske DNK sekvence. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, mišje i pacovske genomske DNK sekvence. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, pacovske, mišje i humane genomske DNK sekvence. ;[0114] U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži mišju genomsku DNK sekvencu, pacovsku genomsku DNK sekvencu, humanu genomsku DNK sekvencu, ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, pacovske i humane genomske DNK sekvence. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, mišje i humane genomske DNK sekvence. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, genomske DNK sekvence miša i pacova. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, pacovske, mišje i humane genomske DNK sekvence. ;[0115] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži najmanje jedan alel humanog oboljenja iz humanog gena. U jednoj realizaciji, humana bolest je neurološka bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je kardiovaskularna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je bubrežna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je mišićna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je bolest krvi. U jednoj realizaciji, humana bolest je rak. U jednoj realizaciji, humana bolest je bolest imunog sistema. ;[0116] U jednoj realizaciji, alel za humanu bolest je dominantni alel. U jednoj realizaciji, alel za humanu bolest je recesivan alel. U jednoj realizaciji, alel za humanu bolest sadrži alel pojedinačnog nukleotidnog polimorfizma (SNP). ;[0117] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi mutantni oblik proteina sa izmenjenom karakteristikom vezivanja, izmenjenom lokalizacijom, izmenjenom ekspresijom i / ili izmenjenim ekspresionim šablonom. ;[0118] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline sadrži selekcionu kasetu. U jednoj realizaciji, selekciona kaseta sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira selektivni marker, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline operativno povezana sa promoterom aktivnim u ćelijama ES pacova. U jednoj realizaciji, selektivni marker je izabran od ili obuhvata gen za otpornost na higromicin ili gen za otpornost na neomicin. ;[0119] U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u B ćeliji. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u nezreloj B ćeliji. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira protein izražen u zreloj B ćeliji. ;[0120] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline sadrži regulatorni element. U jednoj realizaciji, regulatorni element je promoter. U jednoj realizaciji, regulatorni element je pojačivač. U jednoj realizaciji, regulatorni element je transkripcioni potiskujući-vezivni element. ;[0121] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži deleciju ne-proteinske kodirajuće sekvence, ali ne sadrži brisanje sekvence za kodiranje proteina. U jednoj realizaciji, delecija ne-proteinske kodirajuće sekvence obuhvata deleciju regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija obuhvata deleciju regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija obuhvata dodavanje promotera ili regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži zamenu promotera ili regulatornog elementa. ;;ii. Ekspresione kasete ;;[0122] Ovde su opisani polinukleotidi ili molekuli nukleinske kiseline koji sadrže različite komponente angažovane u ciljanom sistemu genomske integracije koji je ovde obelodanjen (tj. bilo koja od ili bilo koja kombinacija nukleaznih agenasa, mesta za prepoznavanje, umetanja nukleinskih kiselina, polinukleotida. ;[0123] Izrazi "polinukleotid", "polinukleotidna sekvenca", "sekvenca nukleinske kiseline" i "fragment nukleinske kiseline" su ovde korišćeni naizmenično. Ovi izrazi obuhvataju nukleotidne sekvence i slično. Polinukleotid može biti polimer od RNK ili DNK koji je jednostruko ili dvostruko-lančani, koji opciono sadrži sintetičke, ne-prirodne ili izmenjene nukleotidne baze. Polinukleotid u obliku polimera DNK može biti sastavljen od jednog ili više segmenata cDNK, genomske DNK, sintetičke DNK ili njihovih smeša. Polinukleotidi mogu da sadrže deoksiribonukleotide i ribonukleotide uključuju i prirodne molekule i sintetičke analoge, i bilo koju njihovu kombinaciju. Ovde opisani polinukleotidi obuhvataju sve oblike sekvenci, uključujući, ali nisu ograničeni na, jedno-lančane oblike, dvostrukolančane oblike, ukosnice, strukture kalem-i-okvir i slično. ;[0124] Dalje su opisani rekombinantni polinukleotidi koji sadrže različite komponente ciljanog sistema genomske integracije. Izrazi "rekombinantni polinukleotid" i "rekombinantni DNK konstrukt" su ovde korišćeni naizmenično. Rekombinantni konstrukt sadrži veštačku ili heterolognu kombinaciju sekvenci nukleinskih kiselina, npr. regulatorne i kodirajuće sekvence koje nisu pronađene zajedno u prirodi. U drugim realizacijama, rekombinantni konstrukt može da sadrži regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence koje su izvedene iz različitih izvora, ili regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence izvedene iz istog izvora, ali uređene na način drugačiji od onog koji se nalazi u prirodi. Takav konstrukt se može koristiti sam po sebi ili se može koristiti zajedno sa vektorom. Ako se koristi vektor, onda izbor vektora zavisi od metode koja se koristi za transformaciju ćelija domaćina, kako je dobro poznato stručnjacima. Na primer, može se koristiti vektor plazmida. Takođe su opisani genetski elementi koji su potrebni za uspešno transformisanje, selekciju i širenje ćelija domaćina koji sadrže bilo koji od izolovanih fragmenata nukleinske kiseline koji su ovde opisani. Skrining može da se postigne pomoću Southern analize DNK, Northern analize ekspresije mRNK, imunoblotting analize ekspresije proteina ili fenotipske analize, između ostalog. ;[0125] U specifičnim realizacijama, jedna ili više komponenti ciljanog sistema genomske integracije ovde opisane, mogu biti obezbeđene u ekspresionoj kaseti za ekspresiju u prokariotskoj ćeliji, eukariotskoj ćeliji, bakterijskoj ćeliji, ćeliji kvasca ili ćeliji sisara ili drugih organizama ili ćelijskom tipu od interesa. Kaseta može da uključi 5' i 3' regulatorne sekvence operativno povezane sa polinukleotidom koji je ovde obelodanjen. "Operativno povezan" sadrži odnos u kome komponente operativno povezuju funkciju na njihov nameravani način. Na primer, operativna veza između polinukleotida od interesa i regulatorne sekvence (tj., promotera) je funkcionalna veza koja dozvoljava ekspresiju polinukleotida od interesa. Operativno povezani elementi mogu biti susedni ili ne-susedni. Kada se koristi da se odnosi na spajanje dva regiona za kodiranje proteina, operativno povezan znači da su regioni za kodiranje u istom okviru za čitanje. U drugom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein, može biti operativno povezana sa regulatornim sekvencama (npr., promoterom, pojačivačem, silencer sekvencom itd.) kako bi se zadržala odgovarajuća regulacija transkripcije. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina (ili V (D) J segmenata) može biti operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulina kako bi se omogućila pravilna rekombinacija između sekvenci u sekvenci teškog ili lakog lanca imunoglobulina. ;[0126] Kaseta može dodatno da sadrži najmanje jedan dodatni polinukleotid od interesa koji će biti zajedno uveden u organizam. Alternativno, dodatni polinukleotid od interesa može biti obezbeđen na višestrukim ekspresionim kasetama. Ovakva ekspresiona kaseta je obezbeđena sa mnoštvom restrikcionih mesta i / ili mestima rekombinacije za ubacivanje rekombinantnog polinukleotida da bude pod regulacijom transkripcije regulatornih regiona. Kaseta za ekspresiju može dodatno da sadrži gene selekcionog markera. ;[0127] Ekspresiona kaseta može da uključuje u smeru 5'-3' transkripcije, region transkripcione i translacione inicijacije (tj. promoter), rekombinantni polinukleotid koji je ovde opisan, i region transkripcionog i translacionog okončanja (tj. region završetka) funkcionalan u ćelijama sisara ili u ćeliji domaćina od interesa. Regulatorni regioni (tj. promoteri, transkripcioni regulatorni regioni i regioni translacionog završetka) i / ili polinukleotid koji su ovde opisani, mogu biti prirodni / analogni ćeliji domaćina ili jedni drugima. Alternativno, regulatorni regioni i / ili polinukleotidi ovde opisani, mogu biti heterologni za ćeliju domaćina ili jedni drugima. Na primer, promoter operativno povezan sa heterolognim polinukleotidom je iz vrste koja je različita od vrste iz koje je polinukleotid izveden, ili ako je iz iste / analogne vrste, jedan ili oba su suštinski modifikovani iz njihovog originalnog oblika i / ili genomskog lokusa ili promoter nije prirodni promoter za operativno povezanog polinukleotida. Alternativno, regulatorni regioni i / ili rekombinantni polinukleotid koji su ovde obelodanjeni, mogu biti kompletno sintetički. ;[0128] Region okončanja može biti prirodan sa regionom uvođenja transkripcije, može biti prirodan sa operativno povezanim rekombinantnim polinukleotidom, može biti prirodan sa ćelijom domaćina ili može biti izveden iz drugog izvora (tj., stranog ili heterolognog) za promotera, rekombinantni polinukleotid, ćelija domaćina ili bilo koja njihova kombinacija. ;[0129] U pripremi ekspresione kasete, različiti DNK fragmenti mogu biti manipulisani, kako bi se obezbedile sekvence DNK u odgovarajućoj orijentaciji. U tom pravcu, adapteri ili linkeri mogu biti angažovani da spajaju DNK fragmente ili mogu biti uključene druge manipulacije kako bi se obezbedila pogodna restrikciona mesta, uklanjanje suvišne DNK, uklanjanje restrikcionih mesta ili slično. Za ovu svrhu, mogu biti uključene in vitro mutageneze, popravak prajmera, restrikcija, žarenje, ponovne supstitucije, npr. tranzicije i transverzije. ;[0130] U ekspresionim kasetama koje su ovde obelodanjene, može biti korišćen veliki broj promotera. Promoteri mogu biti izabrani na osnovu željenog ishoda. Prepoznato je da različite primene, mogu biti poboljšane upotrebom različitih promotera u ekspresionim kasetama kako bi se modulisao vremenski raspored, mesto i / ili nivo ekspresije polinukleotida od interesa. Takvi ekspresioni konstrukti takođe, mogu sadržati, ako je poželjno, regulatorni region promotera (npr. jedan koji daje indukovani, konstitutivan, regulisan od strane okoline ili razvojem, ili selektivnu ekspresiju specifičnu za ćeliju ili tkivo), mesto početka transkripcije, mesto za vezivanje ribozoma, signal za obradu RNK, mesto završetka transkripcije i / ili poliadenilacioni signal. ;[0131] Ekspresiona kaseta koja sadrži ovde opisane polinukleotide takođe, može da sadrži selekcioni markerski gen za selekciju transformisanih ćelija. Odabrani markerski geni se koriste za selekciju transformisanih ćelija ili tkiva. ;[0132] Gde je odgovarajuće, sekvence koje se koriste u postupcima i kompozicijama (tj., polinukleotid od interesa, nukleazni agens itd.) mogu biti optimizovani za povećanu ekspresiju u ćeliji. To jest, geni mogu biti sintetisani korišćenjem kodona koji su poželjni u datoj ćeliji od interesa uključujući, na primer, kodone koji su podesni za sisare, kodone koji su poželjni za ljude, kodone koji su poželjni za glodare, kodone poželjne za miša, kodone podesne za pacove itd. za poboljšanu ekspresiju. ;[0133] Različite metode i kompozicije ovde obelodanjene, mogu angažovati selekcione markere. Različiti selekcioni markeri, mogu biti korišćeni u postupcima i preparatima koji su ovde obelodanjeni. Takvi selekcioni markeri mogu, na primer, ispoljavati otpornost prema antibiotiku, kao što su G418, higromicin, blastocidin, neomicin ili puromicin. Takvi selekcioni markeri uključuju, neomicin fosfotransferazu (neo<r>), higromicin B fosfotransferazu (hig<r>), puromicin-N-acetiltransferazu (puro<f>) i blasticidin S deaminazu (bsr<f>). U još nekim realizacijama, selekcioni marker je operativno povezan sa indukovanim promoterom, a ekspresija selekcionog markera je toksična za ćeliju. Neograničavajući primeri takvih selekcionih markera uključuju: ksantin / guanin fosforibozil transferazu (gpt), hahipoksantinguanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu virusa herpes simplex (HSV-TK). Polinukleotid koji kodira selekcione markere je operativno povezan sa promoterom koji je aktivan u ćeliji. ;;iii. Vektori za ciljanje ;;[0134] Vektori za ciljanje se koriste za uvođenje umetka nukleinske kiseline u ciljni lokus nukleinske kiseline pacova. Vektor za ciljanje sadrži umetak nukleinske kiseline i dalje sadrži homologni kraj 5' i 3', koji okružuje ubačenu nukleinsku kiselinu. Homologni krajevi, koji okružuju ubačenu nukleinsku kiselinu, odgovaraju regionima unutar ciljnog lokusa nukleinske kiseline pacova. Radi lakšeg upućivanja, odgovarajući srodni genomski regioni unutar ciljanog genomskog lokusa se ovde nazivaju "ciljnim mestima". Na primer, vektor ciljanja može da sadrži prvu ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu prvim i drugim homolognim krajem komplementarno prvom i drugom ciljnom mestu. Kao takav, vektor za ciljanje na taj način pomaže u integraciji ubačene nukleinske kiseline u ciljni lokus pacovske nukleinske kiseline kroz homologni rekombinacioni događaj koji se javlja između homolognih krajeva i komplementarnih ciljnih mesta unutar genoma ćelije. ;[0135] U jednoj realizaciji, ciljni lokus nukleinske kiseline pacova sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 5' homolognim krakom i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sa 3' homolognim krakom. U jednoj realizaciji, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su odvojene pomoću najmanje 5kb. U drugoj realizaciji, prve i druge sekvence nukleinske kiseline su odvojene pomoću najmanje 5kb, ali manje od 200kb. U jednoj realizaciji, prva i druga sekvence nukleinske kiseline su odvojene najmanje 10kb. U jednoj realizaciji, prva i druga sekvence nukleinske kiseline su odvojene pomoću najmanje 20kb, najmanje 30kb, najmanje 40kb, najmanje 50kb, najmanje 60kb, najmanje 70kb, najmanje 80kb, najmanje 90kb, najmanje 100kb, najmanje 110kb, najmanje 120kb, najmanje 130kb, najmanje 140kb, najmanje 150kb, najmanje 160kb, najmanje 170kb, najmanje 180kb, najmanje 190kb ili najmanje 200kb. U još daljim izvođenjima, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline je odvojena pomoću najmanje 5kb, ali manje od 10kb, najmanje 5kb ali manje od 3Mb, najmanje 10kb ali manje od 20kb, najmanje 20kb ali manje od 40kb, najmanje 40kb ali manje od 60kb, najmanje 60kb ali manje od 80kb, najmanje oko 80kb, ali manje od 100kb, najmanje 100kb ali manje od 150kb, ili najmanje 150kb, ali manje od 200kb, najmanje oko 200kb ali manje od oko 300kb, najmanje oko 300kb ali manje od oko 400kb, najmanje oko 400kb ali manje od oko 500kb, najmanje oko 500kb ali manje od oko 1Mb, najmanje oko 1,5Mb, ali manje od oko 2Mb, najmanje oko 1Mb ali manje od oko 1,5Mb, najmanje oko 2Mb ali manje od 2,5Mb, najmanje oko 2,5Mb ali manje od 3Mb, ili najmanje oko 2Mb ali manje od oko 3Mb. ;[0136] Homologni deo vektora za ciljanje, može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše homologni rekombinacioni događaj sa odgovarajućim ciljnim mestom, uključujući na primer, najmanje 5-10kb, 5-15kb, 10-20kb, 20-30kb, 30-40kb, 40-50kb, 50-60kb, 60-70kb, 70-80kb, 80-90kb, 90-100kb, 100-110kb, 110-120kb, 120-130kb, 130-140kb, 140-150kb, 150-160kb, 160-170kb, 170-180kb, 180-190kb, 190-200kb dužine ili veću. Kao što je detaljno opisano u nastavku, veliki vektori ciljanja, mogu da angažuju delove za ciljanje veće dužine. U specifičnoj realizaciji, ukupan zbir 5' homolognog dela i 3' homolognog dela je najmanje 10 kb ili ukupan zbir 5' homolognog dela i 3' homolognog dela je najmanje oko 16 kB do oko 100 kb ili oko 30kb do oko 100kb. U drugim realizacijama, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, ili oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U jednoj realizaciji, veličina brisanja je ista ili slična veličini suma ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a. ;[0137] Kada se koriste nukleazni agensi, srodni genomski regioni koji odgovaraju 5' i 3' homolognim krajevima vektora za ciljanje se "nalaze u dovoljnoj blizini" ciljnim mestima nukleaze, kako bi se promovisao nastanak homolognog rekombinacionog događaja između srodnih genomskih regiona i homolognih krajeva na oštećenom mestu ili prekidu dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja. Na primer, ciljne lokacije nukleaze mogu se nalaziti bilo gde između srodnih genomskih regiona koji odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3'. U specifičnim realizacijama, mesto prepoznavanja je odmah u susedstvu sa najmanje jednim ili oba srodna genomska regiona. ;[0138] Kao što je ovde korišćeno, homologni kraj i ciljno mesto (tj. srodni genomski region) "komplement" ili su "komplementarni" jedno drugom kada dva regiona dele dovoljan nivo identičnosti sekvence jedan sa drugim da bi delovali kao supstrati za reakciju homologne rekombinacije. Pod "homolognim" podrazumevaju se sekvence DNK koje su ili identične ili dele identičnost sekvence sa odgovarajućom ili "komplementarnom" sekvencom. Identičnost sekvence između datog ciljnog mesta i odgovarajućeg homolognog kraja koji se nalazi na ciljajućem vektoru, može biti bilo koji stepen identičnosti sekvence koji omogućava da se desi homologna rekombinacija. Na primer, količina identičnosti sekvence koja se deli od strane homolognog kraja vektora ciljanja (ili njegovog fragmenta) i ciljnog mesta (ili njegovog fragmenta) može biti najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, tako da se sekvence podvrgavaju homolognoj rekombinaciji. Štaviše, komplementarni region homologije između homolognog kraja i komplementarne ciljne lokacije, može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše homolognu rekombinaciju na odsečenom mestu prepoznavanja. Na primer, dati homologni kraj i / ili komplementarno ciljno mesto, mogu da sadrže komplementarne regione homologije koji su najmanje 5-10kb, 5-15kb, 10-20kb, 20-30kb, 30-40kb, 40-50kb, 50-60kb , 60-70kb, 70-80kb, 80-90kb, 90-100kb, 100-110kb, 110-120kb, 120-130kb, 130-140kb, 140-150kb, 150-160kb, 160-170kb, 170-180kb, 180-190kb, 190-200kb dužine ili veći (kao što je opisano u LTVEC vektorima, ovde opisanim na drugom mestu), tako da homologni deo ima dovoljnu homologiju da podleže homolognoj rekombinaciji sa odgovarajućim ciljnim mestima unutar genoma ćelije. Radi lakšeg upućivanja, homologni krajevi se ovde nazivaju kao homologni kraj 5' i 3'. Ova terminologija se odnosi na relativni položaj homolognih krajeva prema ubačenoj nukleinskoj kiselini unutar vektora za ciljanje. ;[0139] Homologni krajevi ciljajućeg vektora su stoga dizajnirani da budu komplementarni sa ciljnim mestom sa ciljanim lokusom. Prema tome, homologni krajevi mogu biti komplementarni lokusu koji je izvorno u ćeliji, ili alternativno mogu biti komplementarni regionu heterolognog ili egzogenog segmenta DNK koji je integrisan u genomu ćelije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, transgene, ekspresione kasete ili heterologne ili egzogene regione genomske DNK. Alternativno, homologni krajevi vektora za ciljanje, mogu biti komplementarni regionu humanog veštačkog hromozoma ili bilo kog drugog konstruisanog genomskog regiona sadržanog u odgovarajućoj ćeliji domaćina. Još dalje, homologni krajevi vektora za ciljanje mogu biti komplementarni sa ili mogu biti izvedeni iz regiona biblioteke BAC, biblioteke kozmida ili biblioteke P1 faga. Stoga, u specifičnim realizacijama, homologni krajevi ciljajućeg vektora su komplementarni sa genomskim lokusom pacova koji je prirodan, heterologan ili egzogen u datoj ćeliji. U daljim realizacijama, homologni krajevi su komplementarni sa genomskim lokusom pacova koji nije ciljan korišćenjem konvencionalne metode ili može biti ciljan samo netačno ili samo sa značajno niskom efikasnošću, u odsustvu mesta oštećenja ili prekida dvostrukog lanca izazvanog nukleaznim agensom. U jednoj realizaciji, homologni krajevi su izvedeni iz sintetičke DNK. ;[0140] U još drugim realizacijama, 5' i 3' homologni krajevi su komplementarni prema istom genomu kao ciljanom genomu. U jednoj realizaciji, homologni krajevi su iz srodnog genoma, npr. ciljani genom je genom pacova iz prvog soja, a krajevi za ciljanje su iz genoma pacova drugog soja, pri čemu su prvi soj i drugi soj različiti. U drugim realizacijama, homologni krajevi su iz genoma iste životinje ili su iz genoma istog soja, npr. ciljani genom je genom pacova prvog soja, a krajevi za ciljanje su od genoma pacova iz istog pacova ili iz istog soja. ;[0141] Vektor ciljanja (kao što je veliki vektor ciljanja) takođe, može da sadrži selekcionu kasetu ili reporterski gen, kao što je ovde razmatrano na drugom mestu. Selekciona kaseta može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline operativno povezana sa promoterom. Promoter može biti aktivan u prokariotskoj ćeliji od interesa i / ili aktivan u eukariotskoj ćeliji od interesa. Takvi promoteri mogu biti indukovani promoter, promoter koji je endogeni reporter genu ili ćeliji, promoter koji je heterologni reporter genu ili ćeliji, promoter specifičan za ćelije, promoter specifičan za tkivo ili promoter specifičan za razvoj. U jednoj realizaciji, selekcioni marker je izabran od ili sadrži neomicin fosfotransferazu (neo<r>), higromicin B fosfotransferazu (hig<r>), puromicin-N-acetiltransferazu (puro<f>), blasticidin S deaminazu (bsr<r>), ksantin / guanin fosforibozil transferazu (gpt) i herpes simplex virusnu timidin kinazu (HSV-k) i / ili njihovu kombinaciju. Selekcioni marker ciljajućeg vektora, može biti okružen od strane 5' i 3' homolognih krajeva ili nađen bilo 5' ili 3' u odnosu na homologne krajeve. ;[0142] U jednoj realizaciji, vektor ciljanja (kao što je veliki vektor ciljanja) sadrži reporterski gen operativno povezan sa promoterom, pri čemu reporterski gen kodira reporterski protein izabran iz grupe koja se sastoji od ili sadrži LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, Ypet, poboljšani žuti fluorescentni protein (EYFP), Emerald, poboljšani zeleni fluorescentni protein (EGFP), CyPet, cijan fluoroscentni protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferazu, alkalnu fosfatazu i / ili njihovu kombinaciju. Ovakvi reporterski geni mogu biti operativno povezani sa promoterom aktivnim u ćeliji. Takvi promoteri mogu biti indukovani promoter, promoter koji je endogeni prema reporterskom genu ili ćeliji, promoter koji je heterologan reporterskom genu ili ćeliji, promoter specifičan za ćelije, promoter specifičan za tkivo ili promoter specifičan za razvojnu fazu. ;[0143] U jednoj realizaciji, kombinovano korišćenje vektora ciljanja (uključujući, na primer, velikog vektora ciljanja) sa nukleaznim agensom dovodi do povećane efikasnosti ciljanja u poređenju sa upotrebom samo vektora ciljanja. U jednoj realizaciji, kada se vektor ciljanja koristi zajedno sa nukleaznim agensom, efikasnost ciljanja vektora za ciljanje se povećava najmanje dva puta, najmanje tri puta ili najmanje 4 puta u poređenju sa upotrebom samo vektora za ciljanje. ;[0144] Kada se angažuje vektor ciljanja, dizajn vektora može biti takav da dozvoljava umetanje date sekvence koja je od oko 5kb do oko 200kb, kao što je ovde opisano. U jednoj realizaciji, umetanje je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 60kb, od od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 110kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb. ;[0145] Kada se angažuje vektor ciljanja, vektorski dizajn može biti takav da omogućava zamenu date sekvencu koja je od oko 5kb do oko 200kb ili od oko 5kb do oko 3,0Mb, kao što je ovde opisano. U jednoj realizaciji, zamena je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 110kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, od oko 190kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, ili od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 500kb, od oko 500kb do oko 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, ili od oko 2,5Mb do oko 3Mb. ;[0146] U jednoj realizaciji, vektor ciljanja sadrži gen rekombinaze specifičan za lokaciju. U jednoj realizaciji, gen rekombinaze specifičan za mesto kodira Cre rekombinazu. U jednoj realizaciji, rekombinazni gen Cre je Crei, gde su dva eksona koja kodiraju Cre rekombinazu odvojena intronom da bi sprečili njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. ;[0147] U jednoj realizaciji, rekombinazni gen Cre, dalje sadrži signal nuklearne lokalizacije radi olakšavanja lokalizacije Cre (ili bilo koje rekombinaze ili nukleaznog sredstva) u jedru (npr., gen je NL-Cre gen). U specifičnoj realizaciji, rekombinazni gen Cre dalje sadrži signal jezgrovite lokalizacije i intron (npr., NL-Crei). ;[0148] U različitim realizacijama, pogodan promoter za ekspresiju nukleaznog agensa (uključujući, Cre ili Crei rekombinazu gore razmatranu) je izabran iz ili sadrži Prm1, Blimp 1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 i / ili Pax.3. U specifičnoj realizaciji, promoter je promoter Gata6 ili Gata4. Različiti promoteri mogu biti iz bilo kog organizma, uključujući na primer glodare poput miša ili pacova. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je Prm1 promoter. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je promoter Prm1 pacova. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je promoter Prm1 miša. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je promoter Blimp 1 ili njegov fragment, npr., 1 kb ili 2 kb fragment od promotera Blimp 1. Videti, na primer, U.S. Patent 8,697,851 i U.S. objavu prijave 2013-0312129. ;;iv. Veliki vektori za ciljanje ;;[0149] Izraz "veliki vektor ciljanja" ili "LTVEC", kako se ovde koristi sadrži velike vektore ciljanja koji sadrže homologne krajeve koji odgovaraju i izvedeni su iz sekvenci nukleinskih kiselina većih od onih koje su obično korišćene pomoću drugih pristupa namenjenih za izvođenje homolognog ciljanja u ćelijama i / ili koji obuhvataju ubačene nukleinske kiseline koje sadrže sekvence nukleinske kiseline veće od onih koje se obično koriste od strane drugih pristupa koji imaju za cilj da izvrše ciljanje homologne rekombinacije u ćelijama. Na primer, LTVEC omogućuje modifikaciju velikih lokusa koji ne mogu biti prilagođeni tradicionalnim vektorima ciljanja na bazi plazmida zbog ograničenja njihove veličine. U specifičnim realizacijama, homologni krajevi i / ili ubačena nukleinska kiselina LTVEC-a sadrže genomsku sekvencu eukariotske ćelije. Veličina LTVEC-a je isuviše velika da omogući skrining događaja ciljanja konvencionalnim testovima, npr. southern blotting i PCR-a dugačkog opsega (npr., 1kb-5kb). Primeri LTVEC-a, uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore izvedene od bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), humanog veštačkog hromozoma ili kvaščevog veštačkog hromozoma (YAC). Neograničavajući primeri LTVEC-a i metode za njihovu izradu su opisani, npr., u US Pat. Br. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348 i WO 2002/036789 (PCT/USO1/45375), i US 2013/0137101. ;[0150] LTVEC može biti bilo koje dužine, uključujući, ali nije ograničen na, od oko 20kb do oko 400kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 75kb, od oko 75kb do oko 100kb, od oko 100kb do 125kb, od oko 125kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 175kb, oko 175kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 225kb, od oko 225kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 275kb, ili od oko 275kb do oko 300kb, od oko 200kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, od oko 350kb do oko 400kb, od oko 350kb do oko 550kb. U jednoj realizaciji, LTVEC je oko 100kb. ;[0151] U jednoj realizaciji, LTVEC sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu koja se proteže od oko 5kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 0,5kb do oko 30kb, od oko 0,5kb do oko 40kb, od oko 30kb do oko 150kb, od oko 0,5kb do oko 150kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb ili od oko 190kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb; ;[0152] Prilikom angažovanja LTVEC-a, vektorski dizajn može biti takav da dozvoljava zamenu date sekvencu koja je od oko 5kb do oko 200kb ili od oko 5kb do oko 3Mb, kao što je ovde opisano. U jednoj realizaciji, zamena je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 60kb, od od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 110kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, od oko 190kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, ili od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 500kb, od oko 500kb do oko 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, ili od oko 2,5Mb do oko 3Mb. ;[0153] U jednoj realizaciji, homologni krajevi LTVEC-a su izvedeni iz biblioteke BAC, biblioteke kozmida ili biblioteke P1 faga. U drugim realizacijama, homologni krajevi su izvedeni od ciljanog genomskog lokusa ćelije, a u nekim slučajevima ciljni genomski lokus, koji je LTVEC dizajniran da cilja, se ne može ciljati korišćenjem konvencionalne metode. U još nekim izvođenjima, homologni krajevi su dobijeni od sintetske DNK. ;[0154] U jednoj realizaciji, ukupan zbir 5' homolognog kraja i 3' homolognog kraja u LTVEC-u je najmanje 10kb. U drugim realizacijama, ukupan zbir 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je od oko 10kb do oko 30kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od 100kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 200kb. U jednoj realizaciji, ukupan zbir 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je od oko 30kb do oko 100bb. U drugim realizacijama, veličina ukupnog zbira od ukupnog broja 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, ili oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U jednoj realizaciji, veličina brisanja je ista ili slična veličini suma ukupnih 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a. ;[0155] U drugim realizacijama, 5' homologni kraj se proteže od oko 5kb do oko 100kb. U jednoj realizaciji, 3' homologni kraj se proteže od oko 5kb do oko 100kb. U drugim realizacijama, ukupni zbir 5' i 3' homolognih krajeva je od 5kb do oko 10Kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 70kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 110kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, od oko 190kb do oko 200kb, ili od oko 30kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. ;[0156] U jednoj realizaciji, LTVEC sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline pacova okruženu pomoću LTVEC homolognih krajeva. U jednoj realizaciji, sekvenca ubačene nukleinske kiseline je iz vrste koja nije pacov. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina koja je homologna ili ortologna sa sekvencom nukleinske kiseline pacova je nukleinska kiselina sisara. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara je nukleinska kiselina miša. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara je humana nukleinska kiselina. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina je genomska DNK. U jednoj realizaciji, umetak je od 5kb do 200kb, kao što je gore opisano. ;[0157] U jednoj realizaciji, LTVEC sadrži selekcionu kasetu ili reporterski gen. Različiti oblici kasete za selekciju i reporter gena koji se mogu angažovati su ovde razmatrani na drugim mestima. ;[0158] Kao što je ovde opisano na drugom mestu, LTVEC se takođe može koristiti u postupcima koji su ovde obelodanjeni u kombinaciji sa nukleaznim agensom koji potpomaže homolognu rekombinaciju između vektora ciljanja i ciljnog lokusa nukleinske kiseline pacova u pluripotentnoj ćeliji pacova. ;[0159] U jednoj realizaciji, veliki vektor ciljanja (LTVEC) sadrži gen rekombinaze specifičan za mesto. U jednom izvođenju, rekombinazni gen specifičan za mesto kodira Cre rekombinazu. U jednoj realizaciji, Cre rekombinazni gen je Crei, gde su dva eksona koja kodiraju Cre rekombinazu odvojena intronom da bi sprečili njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. U jednoj realizaciji, Cre rekombinazni gen dalje sadrži signal jezgrovite lokalizacije da olakša lokalizaciju Cre (ili bilo koje rekombinazne ili nukleaznog agensa) u jedru (npr., gen je NL-Cre gen). U specifičnoj realizaciji, rekombinazni gen Cre dalje sadrži signal jezgrovite lokalizacije i intron (npr. NL-Crei) ;[0160] U različitim realizacijama, pogodan promoter za ekspresiju nukleaznog agensa (uključujući, Cre ili Crei rekombinazu gore razmatrano) je izabran od ili sadrži Prm1, Blimp 1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 i / ili Pax3. U specifičnoj realizaciji, promoter je promoter Gata6 ili Gata4. Različiti promoteri mogu biti iz bilo kojeg organizma, uključujući na primer glodare poput miša ili pacova. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je Prml promoter. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je Prm1 promoter pacova. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je mišji Prm1 promoter. U drugoj specifičnoj realizaciji, promoter je promoter Blimp 1 ili njegov fragment, na primer, 1 kb ili 2 kb fragment promotera Blimp 1. Videti, na primer, U.S. Patent 8,697,851 i U.S. objavu prijave 2013-0312129. ;[0161] U jednoj realizaciji, LTVEC sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu koja može da proizvede deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona iz ApoE lokusa pacova, IL-2Rg lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa, kao što je detaljno razmatrano na drugom mestu ovde. U specifičnim realizacijama, genetska modifikacija na lokusu ApoE dovodi do smanjenja, povećanja ili modulacije ApoE aktivnosti, IL-2Rg aktivnosti, aktivnosti Rag2, aktivnosti Rag1 i / ili Rag2 i Rag1 aktivnosti. U jednom izvođenju, generisan je ApoE knockout i IL-2Rg knockout, Rag2 knockout, Rag1 knockout, Rag2 / Rag1 knockout. Kao što je niže razmatrano, nukleazni agensi mogu biti angažovani sa bilo kojim od LTVEC sistema za ciljanje kako bi se ciljao bilo koji genomski lokus od interesa. ;;v. Nukleazni agensi i mesta prepoznavanja nukleaznih agenasa ;;[0162] Kao što je već detaljno prethodno opisano, nukleazni agensi mogu biti korišćeni u postupcima i preparatima koji su ovde obelodanjeni kako bi se pomoglo u modifikaciji ciljnog lokusa i u prokariotskoj ćeliji ili u pluripotentnoj ćeliji pacova. Ovakav nukleazni agens može da potpomaže homolognu rekombinaciju između vektora ciljanja i ciljnog lokusa. U jednom izvođenju, nukleazni agens sadrži endonukleazni agens. ;[0163] Kao što je ovde korišćeno, izraz "mesto prepoznavanja nukleaznog agensa" sadrži sekvencu DNK na kojoj je mesto oštećenja ili prekid dvostrukog lanca indukovan nukleaznim agensom. Mesto prepoznavanja jednog nukleaznog agensa može biti endogeno (ili prirodno) u ćeliji ili mesto prepoznavanja može biti egzogeno u ćeliji. U specifičnim realizacijama, mesto prepoznavanja je egzogeno u ćeliji i na taj način se ne pojavljuje prirodno u genomu ćelije. U još daljim izvođenjima, mesto prepoznavanja je egzogeno za ćeliju i za polinukleotide od interesa koji je poželjno postaviti na ciljnom genomskom lokusu. U daljim izvođenjima, egzogeno ili endogeno mesto za prepoznavanje je prisutno samo jednom u genomu ćelije domaćina. U specifičnim realizacijama, identifikovana je endogena ili prirodna lokacija koja se javlja samo jednom u okviru genoma. Takvo mesto se zatim može koristiti za dizajn nukleaznih agenasa koji će proizvesti mesto oštećenja ili prekid dvostrukog lanca na mestu endogenog prepoznavanja. ;[0164] Dužina mesta prepoznavanja može varirati i uključuje, na primer, mesta prepoznavanja koja su najmanje dužine 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ili više nukleotida. U jednoj realizaciji, svaki monomer nukleaznog agensa prepoznaje mesto za prepoznavanje od najmanje 9 nukleotida. U drugim izvođenjima, mesto prepoznavanja je dužine od oko 9 do oko 12 nukleotida, od oko 12 do oko 15 nukleotida u dužini, od oko 15 do oko 18 nukleotida u dužini ili od oko 18 do oko 21 nukleotida u dužini i bilo koja kombinacija takvih podopsega (npr. 9-18 nukleotida). Mesto prepoznavanja bi moglo da bude palindromično, to jest, sekvenca na jednom lancu očitava isto u suprotnom smeru na komplementarnom lancu. Prepoznato je da dati nukleazni agens može da veže mesto prepoznavanja i da razdvoji to vezujuće mesto ili alternativno, nukleazni agens može da se veže za sekvencu koja je različita od mesta prepoznavanja. Štaviše, izraz mesto prepoznavanja obuhvata i mesto za vezivanje nukleaznog agensa i urez / mesto cepanja bez obzira na to da li je mesto oštećenja / cepanja unutar ili izvan mesta za vezivanje nukleaznih agenasa. U drugoj varijaciji, cepanje pomoću nukleaznog agensa može da se desi na nukleotidnim položajima koji su odmah suprotno jedni drugima, kako bi se dobio tupi završni rez ili, u drugim slučajevima, rezovi se mogu pokrenuti kako bi se proizvele jednolančane izbočine, takođe nazvane "lepljivi krajevi" koje mogu biti ili 5' izbočine ili 3' izbočine. ;[0165] Bilo koji nukleazni agens koji indukuje rez ili prekid dvostrukog lanca u željenom mestu prepoznavanja, može se koristiti u postupcima i kompozicijama koje su ovde otkrivene. Nukleazni agens koji se prirodno pojavljuje ili prirodni nukleazni agens, može biti angažovan, onoliko dugo sve dok nukleazni agens izaziva presecanje ili prekid dvostrukog lanca na željenom mestu prepoznavanja. Alternativno, može biti angažovan modifikovani ili konstruisani nukleazni agens. "Konstruisani nukleazni agens" obuhvata nukleazu koja je konstruisana (modifikovana ili izvedena) iz svog prirodnog oblika da specifično prepoznaje i izazove presecanje ili prekid dvostrukog lanca na željenom mestu prepoznavanja. Stoga, konstruisani nukleazni agens može biti izveden iz prirodnog prirodnog nukleaznog agensa ili se može veštački stvoriti ili sintetizovati. Modifikacija nukleaznog agensa, može biti mala poput jedne aminokiseline u agensu za cepanje proteina ili jednog nukleotida u agensu za cepanje nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, konstruisana nukleaza izaziva urez ili prekid dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja, pri čemu mesto prepoznavanja nije bila sekvenca koji bi bila prepoznata od strane prirodnog (ne-konstruisanog ili ne-modifikovanog) nukleaznog agensa. Proizvodnja ureza ili prekida dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja ili druge DNK se ovde može nazvati "sečenjem" ili "cepanjem" mesta prepoznavanja ili druge DNK. ;[0166] Takođe su obezbeđene aktivne varijante i fragmenti primernih mesta za prepoznavanje. Takve aktivne varijante mogu obuhvatati najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence za dato mesto prepoznavanja, pri čemu aktivne varijante zadržavaju biološku aktivnost i stoga mogu biti prepoznate i cepane pomoću nukleaznog agensa na način specifičan za sekvencu. Analize za merenje prekida dvostrukog lanca mesta prepoznavanja od strane nukleaznog agensa su poznate u struci i generalno mere sposobnost nukleaza da presecaju mesto prepoznavanja. ;[0167] Mesto prepoznavanja nukleaznog agensa, može biti pozicionirano bilo gde u blizini ili u blizini ciljnog lokusa. Mesto prepoznavanja može biti smešteno unutar regiona za kodiranje gena ili unutar regulatornih regiona koji utiču na ekspresiju gena. Prema tome, mesto prepoznavanja nukleaznog agensa, može biti smešteno u intronu, eksonu, promoteru, pojačivaču, regulatornom regionu ili bilo kom drugom ne-proteinskom kodirajućem regionu. ;[0168] U jednoj realizaciji, nukleazni agens je Efektorska nukleaza nalik transkripcijskom aktivatoru (TALEN). TAL efektorske nukleaze su klasa nukleaza specifičnih za sekvencu koje mogu biti korišćene da bi se napravili prekidi dvostrukog lanca na specifičnim ciljnim sekvencama u genomu prokariotskog ili eukariotskog organizma. TAL efektorske nukleaze se stvaraju fuzionisanjem prirodnog ili konstruisanog efektora nalik transkripcijskom aktivatoru (TAL) ili njegovog funkcionalnog dela sa katalitičkim domenom endonukleaze, kao što je, na primer, Fokl. Jedinstveni, modularni TAL efektorski DNK vezujući domen omogućava dizajn proteina sa potencijalno bilo kojom specifičnošću prepoznavanja date DNK. Prema tome, DNK vezujući domeni TAL efektorskih nukleaza, mogu biti konstruisani da prepoznaju specifične ciljne lokacije DNK i na taj način, koriste se za pravljenje prekida dvostrukog lanca na željenim ciljnim sekvencama. Videti, WO 2010/079430; Morbitzer i sar. (2010) PNAS 10. ;1073/pnas. 1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1: 428-432; Christian i sar. Genetics (2010) 186: 757-761; Li i sar. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi: 10.1093 / nar / gkq704; i Miller i sar. (2011) Nature Biotechnology 29: 143-148. ;[0169] Primeri pogodnih TAL nukleaza i postupaka za pripremu pogodnih TAL nukleaza su obelodanjeni, npr. u Američkoj patentnoj prijavi broj 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1 i 2006/0063231 A1. U različitim izvođenjima, TAL efektorske nukleaze su konstruisane da seku u ili blizu ciljne sekvence nukleinske kiseline, na primer, genomski lokus od interesa, pri čemu je ciljna sekvenca nukleinske kiseline u ili blizu sekvence koja će biti modifikovana pomoću vektora ciljanja. TAL nukleaze pogodne za upotrebu sa različitim metodama i kompozicijama, ovde obelodanjenim, uključuju, one koje su specifično dizajnirane da se vezuju za ili blizu ciljnih sekvenci nukleinskih kiselina koje će biti modifikovane pomoću vektora ciljanja, kao što je ovde opisano. ;[0170] U jednoj realizaciji, svaki monomer TALEN-a sadrži 12-25 TAL ponavljanja, pri čemu svaki TAL ponovo vezuje podmesto 1bp. U jednoj realizaciji, nukleazni agens je himerni protein koji sadrži domen za vezivanje DNK na bazi TAL ponavljanja operativno povezan sa nezavisnom nukleazom. U jednoj realizaciji, nezavisna nukleaza je Fokl endonukleaza. U jednoj realizaciji, nukleazni agens sadrži prvi domen za vezivanje DNK baziran na TAL-ponavljanju i drugi domen za vezivanje DNK baziran na TAL-ponavljanju, pri čemu je svaki od prvog i drugog vezujućeg domena za vezivanje DNK baziranog na TAL-ponavljanju operativno povezan sa Fokl nukleazom, pri čemu prvi i drugi domen za vezivanje DNK bazirani na TAL-ponavljanju prepoznaju dve susedne ciljne DNK sekvence u svakom lancu ciljne DNK sekvence odvojene pomoću mesta za cepanje oko 6 bp do oko 40 bp, a pri čemu Fokl nukleaze dimerizuju i čine prekid dvostrukog lanca u ciljnoj sekvenci. ;[0171] U jednoj realizaciji, nukleazni agens obuhvata prvi DNK vezujući domen baziran na TAL-ponavljanju i drugi DNK vezujući domen baziran na TAL-ponavljanju, pri čemu je svaki od prvog i drugog DNK vezujućeg domena baziranog na TAL-ponavljanju funkcionalno vezan za Fokl nukleazu, pri čemu prvi i drugi DNK vezujući domen bazirani na TAL-ponavljanju prepoznaju dve susedne ciljne DNK sekvence u svakom lancu ciljne DNK sekvence odvojene pomoću mesta za cepanje 5bp ili 6bp i gde Fokl nukleaze dimerizuju i čine prekid dvostrukog lanca. ;[0172] Nukleazni agens angažovan u različitim postupcima i kompozicijama, dalje ovde opisanim, može da sadrži nukleazu cinkovog prsta (eng. Zinc-finger nuclease, ZFN). U jednoj realizaciji, svaki monomer ZFN sadrži 3 ili više DNK vezujućih domena baziranih na zinkovim prstima, pri čemu se svaki DNK vezujući domen baziran na cinkovom prstu vezuje na podlokaciju 3bp. U drugim izvođenjima, ZFN je himerni protein koji obuhvata DNK vezujući domen baziran na cinkovim prstima operativno povezan sa nezavisnom nukleazom. U jednom izvođenju, nezavisna endonukleaza je Fokl endonukleaza. U jednoj realizaciji, nukleazni agens sadrži prvi ZFN i drugi ZFN, gde je svaki od prvog ZFN i drugog ZFN operativno povezan sa Fokl nukleazom, pri čemu prvi i drugi ZFN prepoznaju dve susedne ciljne DNK sekvence u svakom lancu od ciljne DNK sekvence odvojene pomoću oko 6 bp do oko 40 bp mesta za cepanje ili oko 5 bp do oko 6 bp mesta za cepanje, a pri čemu Fokl nukleaze dimerizuju i čine prekid dvostrukog lanca. Videti, na primer, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; i, WO/2011/017293 A2. ;[0173] U jednoj realizaciji od ovde opisanih metoda, nukleazni agens sadrži (a) himerni protein koji sadrži domen za vezivanje DNK baziran na zinkovim prstima fuzionisan na Fokl endonukleazu; ili, (b) himerni protein koji sadrži engl. Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) fuzionisan na Fokl endonukleazu. ;[0174] U još jednom izvođenju, nukleazni agens je meganukleaza. Meganukleaze su klasifikovane u četiri familije zasnovane na motivima održavane sekvence, familije su LAGLIDADG (SEK ID BR: 16), GIY-YIG, H-N-H i His-Cis familije kutije. Ovi motivi učestvuju u koordinaciji metalnih jona i hidrolizi fosfodiestarskih veza. HEaze su značajne za njihova dugačka mesta prepoznavanja, kao i za tolerisanje nekih polimorfizama sekvenci u njihovim DNK supstratima. Domeni, struktura i funkcija meganukleaza su poznati, videti, na primer, Guhan i Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38: 199-248; Lucas i sar., (2001) Nucleic Acids Res 29: 960-9; Jurica i Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55: 1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38: 49-95; i Moure i sar., (2002) Nat Struct Biol 9: 764. U nekim primerima se koristi varijanta koja se prirodno pojavljuje, i / ili konstruisana derivativna meganukleaza. Poznate su metode za modifikaciju kinetike, kofaktorske interakcije, ekspresiju, optimalne uslove i / ili specifičnosti mesta prepoznavanja i skrining za aktivnost, na primer, Epinat i sar., (2003) Nucleic Acids Res 31: 2952-62; Chevalier i sar. , (2002) Mol Cell 10: 895-905; Gimble i sar., (2003) Mol Biol 334: 993-1008; Seligman i sar., (2002) Nucleic Acids Res 30: 3870-9; Sussman i sar., (2004) J Mol Biol 342: 31-41; Rosen i sar., (2006) Nucleic Acids Res 34: 4791-800; Chames i sar., (2005) Nucleic Acids Res 33: e178; Smith i sar., (2006) Nucleic Acids Res 34: e149; Gruen i sar., (2002) Nucleic Acids Res 30: e29; Chen i Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33: e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; i WO2004031346. ;[0175] Bilo koja meganukleaza se može ovde koristiti, uključujući, ali bez ograničenja na, I-Scel, I-Scell, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Tlil, I-PpoI, PI-PspI, F-Scel, F-Scell, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LIaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TIiI, PI-TiiII, ili bilo koje aktivne varijante ili njihovi fragmenti. ;[0176] U jednoj realizaciji, meganukleaza prepoznaje dvostruko-lančanu sekvencu DNK od 12 do 40 parova baza. U jednoj realizaciji, meganukleaza prepoznaje jednu savršeno usaglašenu ciljnu sekvencu u genomu. U jednoj realizaciji, meganukleaza je ciljana nukleaza. U jednoj realizaciji, ciljana nukleaza je LAGLIDADG (SEK ID BR: 16) familija ciljane nukleaze. U jednoj realizaciji, familija ciljane nukleaze LAGLIDADG (SEK ID BR: 16) je odabrana od I-SceI, I-CreI i I-DmoI. ;[0177] Nukleazni agensi, mogu dalje da sadrže restrikcione endonukleaze, koje uključuju endonukleaze tipa I, tipa II, tipa III i tipa IV. Restrikcione endonukleaze tipa I i tipa III prepoznaju specifična mesta prepoznavanja, ali obično cepaju pri varijabilnom položaju od mesta za vezivanje nukleaze, koji može biti udaljen stotine baznih parova od mesta cepanja (mesta prepoznavanja). U sistemima tipa II, restrikciona aktivnost je nezavisna od bilo koje aktivnosti metilaze, a cepanje se tipično javlja na specifičnim mestima unutar ili blizu mesta vezivanja. Većina enzima tipa II seče palindromske sekvence, međutim, enzimi tipa IIa prepoznaju ne-palindromska mesta prepoznavanja i presecaju izvan mesta prepoznavanja, enzimi tipa IIb presecaju sekvence dva puta kod obe lokacije izvan mesta prepoznavanja, a enzimi tipa IIs prepoznaju asimetrično mesto prepoznavanja i presecaju sa jedne strane i na određenoj udaljenosti od oko 1-20 nukleotida od mesta prepoznavanja. Restrikcioni enzimi tipa IV ciljaju metilovane DNK. Restrikcioni enzimi su dalje opisani i klasifikovani, na primer u bazi podataka REBASE (web stranica na rebase.neb.com; Roberts i sar., (2003) Nucleic Acids Res 31: 418-20), Roberts i sar., (2003) Nucleic Acids Res 31: 1805-12, i Belfort i sar., (2002) u Mobilna DNK II, str. 761-783, Eds. Craigie i sar., (ASM Press, Washington, DC). ;[0178] Nukleazni agens angažovan u različitim metodama i kompozicijama takođe, može da sadrži sistem CRISPR / Cas. Takvi sistemi mogu koristiti, na primer, Cas9 nukleazu, koja je u nekim slučajevima kodonski optimizovana za željeni tip ćelija u kojima će biti izražena. Sistem dalje koristi fuzionisani crRNA-tracrRNA konstrukt koji funkcioniše sa kodonskioptimizovanim Cas9. Ova pojedinačna RNK se često naziva predvodećom RNK (engl., guide RNA) ili gRNK. U okviru gRNA, crRNA deo je identifikovan kao 'ciljna sekvenca' za dato mesto prepoznavanja, a tracrRNA se često naziva 'skela'. Ukratko, kratak DNK fragment koji sadrži ciljnu sekvencu je ubačen u vodeći RNK ekspresioni plazmid. Ekspresioni plazmid gRNK sadrži ciljnu sekvencu (u nekim izvođenjima oko 20 nukleotida), oblik tracrRNK sekvence (skela), kao i pogodnog promotera koji je aktivan u ćeliji i neophodne elemente za pravilnu obradu u eukariotskim ćelijama. Mnogi sistemi se oslanjaju na prilagođene, komplementarne oligose koji su žareni da formiraju dvostruko-lančanu DNK, a zatim klonirani u gRNK ekspresionom plazmidu. Ekspresiona kaseta gRNK i ekspresiona kaseta Cas9 se zatim uvode u ćeliju. Videti, na primer, Mali P i sar. (2013) Science 2013 Feb 15; 339 (6121): 823-6; Jinek M i sar. Science 2012 Aug 17; 337 (6096): 816-21; Hwang WY i sar. Nat Biotechnol 2013; Mar; 31 (3): 227-9; Jiang W i sar. Nat Biotechnol 2013 Mar; 31 (3): 233-9; i, Cong L i sar. Science 2013 Feb 15; 339 (6121): 819-23. ;[0179] U jednoj realizaciji, postupak za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova dalje sadrži uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova: (a) prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvog promotera operativno povezanog sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-udruženi (Cas) protein; (b) drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugog promotera operativno vezanog za genomsku ciljnu sekvencu vezanu za vodeću RNK (gRNK), pri čemu je genomska ciljna sekvenca okružena na kraju 3' pomoću engl. Protospacer Adjacent Motif (PAM) sekvence. U jednom izvođenju, genomska ciljna sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-;20GG, SEK ID BR: 1). U jednom izvođenju, genomska ciljna sekvenca sadrži SEK ID BR: 23, gde je N između 1 i 20 nukleotida u dužini. U drugom izvođenju, genomska ciljna sekvenca sadrži između 14 i 20 nukleotida u dužini od SEK ID BR: 1. ;[0180] U jednoj realizaciji, gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNA (crRNA) i transaktivirajuću CRISPR RNA (tracrRNA). U specifičnim realizacijama, Cas protein je Cas9. ;[0181] U nekim realizacijama, gRNK sadrži (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU; ;AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (SEK ID BR: 2); ili, (b) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEK ID BR: 3). ;[0182] U drugoj realizaciji, crRNA sadrži 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3' (SEK ID BR: 4); 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAG (SEK ID BR: 5); ili 5'-GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUA-3' (SEK ID BR: 6). ;[0183] U još nekim realizacijama, tracrRNA sadrži, 5'-AAGGCUAGUCCG-3' (SEK ID BR: 7) ili 5'-AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGG-UGCUUUU-3' (SEK ID BR: 8). ;[0184] U jednoj realizaciji, Cas protein je tip I Cas proteina. U jednoj realizaciji, Cas protein je tip II Cas proteina. U jednoj realizaciji, tip II Cas proteina je Cas9. U jednoj realizaciji, prva sekvenca nukleinske kiseline kodira Cas protein optimizovan humanim kodonom. ;[0185] U jednoj realizaciji, prva nukleinska kiselina sadrži mutaciju koja raskida najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aktivnih mesta nukleaze u Cas proteinu, pri čemu mutantni Cas protein generiše prekid u samo jednom lancu ciljnog DNK regiona, i gde mutacija umanjuje nehomolognu rekombinaciju u ciljnom DNK regionu. ;[0186] U jednoj realizaciji, prva nukleinska kiselina koja kodira Cas protein dalje sadrži signal jezgrovite lokalizacije (NLS). U jednoj realizaciji, signal nuklearne lokalizacije je signal SV40 nuklearne lokalizacije. ;[0187] U jednoj realizaciji, drugi promoter koji vodi ekspresiju genomske ciljne sekvence i predvodeće RNK (gRNA) je promotor RNK polimeraze III. U jednoj realizaciji, promotor RNK polimeraze III je humani U6 promoter. U jednom izvođenju, promoter RNK polimeraze III je promoter pacovske U6 polimeraze III. U jednom izvođenju, promotor RNK polimeraze III je promotor mišje U6 polimeraze III. ;[0188] U jednoj realizaciji, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju crRNK i tracrRNK su povezane preko sintetičke petlje, pri čemu, nakon ekspresije, crRNK i tracrRNK formiraju dupleks crRNK : tracrRNK. ;[0189] U jednoj realizaciji, prvi ekspresioni konstrukt i drugi ekspresioni konstrukt su eksprimirani iz istog plazmida. ;[0190] U jednoj realizaciji, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su uvedeni zajedno sa LTVEC-om. U jednoj realizaciji, prvi i drugi ekspresioni konstrukti su uvedeni odvojeno od LTVEC-a u određenom vremenskom periodu. ;[0191] U jednoj realizaciji, postupak obuhvata uvođenje mnoštva od drugog konstrukta i mnoštva od LTVEC-a za multipleksno uređivanje različitih ciljnih lokusa, kao što je ovde opisano. ;[0192] Takođe su obezbeđene aktivne varijante i fragmenti nukleaznih agenasa (tj., konstruisani nukleazni agens). Takve aktivne varijante mogu da sadrže najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ili više identičnosti sekvence sa prirodnim nukleaznim agensom, pri čemu aktivne varijante zadržavaju sposobnost presecanja na željenom mestu prepoznavanja i stoga zadržavaju aktivnost za indukovanje reza ili prekida dvostrukog lanca. Na primer, bilo koji od ovde opisanih nukleaznih agenasa, može biti modifikovan iz prirodne endonukleazne sekvence i dizajniran da prepozna i indukuje rez ili prekid dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja koje nije bilo prepoznato od strane prirodnog nukleaznog agensa. Prema tome, u nekim realizacijama, konstruisana nukleaza ima specifičnost da indukuje rez ili prekid dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja koje se razlikuje od odgovarajućeg mesta prepoznavanja prirodnog nukleaznog agensa. Poznata su ispitivanja za aktivnosti koje indukuju rez ili prekid dvostrukog lanca i generalno mere ukupnu aktivnost i specifičnost endonukleaze na DNK supstratima koji sadrže mesto prepoznavanja. ;[0193] Nukleazni agens se može uvesti u ćeliju bilo kojim sredstvima poznatim u stanju tehnike. Polipeptid koji kodira nukleazni agens se može direktno uvesti u ćeliju. Alternativno, polinukleotidno kodiranje nukleaznog agensa može biti uvedeno u ćeliju. Kada se polinukleotid koji kodira agens nukleaze uvodi u ćeliju, nukleazni agens može biti prolazno, uslovno ili konstitutivno izražen unutar ćelije. Stoga, polinukleotid koji kodira nukleazni agens, može biti sadržan u ekspresionoj kaseti i operativno je vezan za uslovnog promotera, indukovanog promotera, konstitutivnog promotera ili promotera specifičnog za tkivo. Takvi promoteri od interesa su detaljnije razmatrani na drugim mestima ovde. Alternativno, nukleazni agens se unosi u ćeliju kao mRNK koja kodira ili sadrži nukleazni agens. ;[0194] U jednoj realizaciji, cRNK i tracrRNK su izražene kao odvojeni transkripti RNK. ;[0195] U specifičnim realizacijama, polinukleotid koji kodira nukleazni agens je stabilno integrisan u genomu ćelije i operativno povezan sa promoterom aktivnim u ćeliji. U drugim izvođenjima, polinukleotid koji kodira nukleazni agens je u istom vektoru ciljanja koji sadrži insert nukleinske kiseline, dok je u drugim slučajevima polinukleotid koji kodira nukleazno sredstvo u vektoru ili plazmidu koji je odvojen od vektora ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu. ;[0196] Kada je nukleazni agens obezbeđen ćeliji kroz uvođenje polinukleotida koji kodira nukleazni agens, takav polinukleotid koji kodira nukleazni agens može biti modifikovan da zameni kodone koji imaju veću učestalost upotrebe u ćeliji od interesa, u odnosu na prirodno prisutnu polinukleotidnu sekvencu koja kodira nukleazni agens. Na primer, polinukleotid koji kodira nukleazni agens, može biti modifikovan da zameni kodone koji imaju veću učestalost upotrebe u datoj prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji od interesa, uključujući, bakterijsku ćeliju, kvaščevu ćeliju, humanu ćeliju, ne-humanu ćeliju, ćeliju sisara, ćeliju glodara, ćeliju miša, ćeliju pacova ili bilo koju drugu ćeliju domaćina od interesa, u odnosu na prirodnu sekvencu polinukleotida. ;[0197] U jednoj realizaciji, endonukleazni agens je uveden zajedno sa LTVEC-om. U jednoj realizaciji, endonukleazni agens je uveden odvojeno od LTVEC-a tokom vremenskog perioda. U jednoj realizaciji, endonukleazni agens je uveden pre uvođenja LTVEC-a. U jednoj realizaciji, endonukleazni agens je uveden u ES ćeliju pacova nakon uvođenja LTVEC-a. ;[0198] U jednoj realizaciji, endonukleazni agens je ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira endonukleazu, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline operativno vezana za promotera. U jednom izvođenju, promoter je konstitutivno aktivni promoter. U jednom izvođenju, promoter je indukovani promoter. U jednoj realizaciji, promoter je aktivan u pluripotentnoj ćeliji pacova. U jednoj realizaciji, endonukleazni agens je mRNK koja kodira endonukleazu. ;;B. Metode za integraciju polinukleotida od interesa u ciljni lokus ;;[0199] Obezbeđene su metode za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa. U jednoj realizaciji, ciljni lokus u pluripotentnoj ćeliji pacova je ciljan za genetsku modifikaciju. Takav postupak obuhvata: (a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova vektora ciljanja koji obuhvata ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova i 3' homolognim krajem pacova; i (b) identifikovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koje obuhvata ciljanu genetsku modifikaciju na ciljnom lokusu, pri čemu ciljana genetska modifikacija može da se prenosi preko germinativne linije. U specifičnim realizacijama, ukupni zbir 5' homolognog kraja i 3' homolognog kraja je najmanje 10 kb i koristi se veliki vektor ciljanja. ;[0200] U drugim realizacijama, veličina ukupnog zbira od ukupnih 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a je oko 10kb do oko 150kb, oko 10kb do oko 100kb, oko 10kb do oko 75kb, oko 20kb do oko 150kb, oko 20kb do oko 100kb, oko 20kb do oko 75kb, oko 30kb do oko 150kb, oko 30kb do oko 100kb, oko 30kb do oko 75kb, oko 40kb do oko 150kb, oko 40kb do oko 100kb, oko 40kb do oko 75kb, oko 50kb do oko 150kb, oko 50kb do oko 100kb, ili oko 50kb do oko 75kb, oko 10kb do oko 30kb, oko 20kb do oko 40kb, oko 40kb do oko 60kb, oko 60kb do oko 80kb, oko 80kb do oko 100kb, oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do oko 150kb. U jednoj realizaciji, veličina brisanja je ista ili slična veličini suma ukupnih 5' i 3' homolognih krajeva LTVEC-a. ;[0201] Pluripotentna ćelija pacova, može biti embrionalna matična ćelija pacova. U specifičnom izvođenju, (a) ES ćelija pacova je izvedena iz DA soja ili ACI soja; ili (b) ES ćelija pacova je karakterisana ekspresijom pluripotentnog markera koji sadrži Oct-4, Sox-2, alkalnu fosfatazu ili njihovu kombinaciju. U drugim slučajevima, korišćena embrionalna matična ćelija pacova sadrži ES ćeliju pacova, kao što je opisano u U.S. patentnoj prijavi br. ;14 / 185,103, podnetoj 20. februara 2014. godine. ;[0202] Kao što je ovde opisano na drugom mestu, ubačena nukleinska kiselina može biti bilo koja sekvenca nukleinske kiseline. U neograničavajućim izvođenjima, (a) insertovana nukleinska kiselina sadrži zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom nukleinske kiseline sisara; (b) ubačena nukleinska kiselina sadrži deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline pacova; (c) ubačena nukleinska kiselina sadrži deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova, pri čemu se brisanje kreće od 5kb do 200kb ili od 5kb do 3Mb (kao što je detaljno razmatrano na drugom mestu ovde); (d) ubačena nukleinska kiselina sadrži dodatak egzogene sekvence nukleinske kiseline (uključujući, na primer egzogenu sekvencu nukleinske kiseline koja se proteže od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb); (e) ubačena nukleinska kiselina sadrži egzogenu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži homolognu ili ortolognu sekvencu nukleinske kiseline; (f) homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline (a) gde je sekvenca nukleinske kiseline humana sekvenca nukleinske kiseline; (g) ubačena nukleinska kiselina sadrži homolognu ili ortolognu sekvencu nukleinske kiseline (a) gde je sekvenca nukleinske kiseline sekvenca himerne nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline čoveka i pacova; (h) ubačena nukleinska kiselina sadrži egzogenu sekvencu nukleinske kiseline (e), gde se ubačena nukleinska kiselina kreće od oko 5kb do oko 200kb; (i) ubačena nukleinska kiselina obuhvata uslovni alel okružen sa ciljnim sekvencama rekombinaze specifičnim za mesto; (j) ubačena nukleinska kiselina obuhvata reporterski gen operativno povezan sa promoterom; (k) ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više neuređenih genskih segmenta VHteškog lanca humanog imunoglobulina, jedan ili više neuređenih D genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina i jedan ili više neuređenih genskih segmenata, JHteškog lanca humanog imunoglobulina, koji su operativno povezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca glodara; (1) ubačena nukleinska kiselina sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezanu za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca glodara; (m) ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Vκili Vλgenskih segmenata i jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Jκili Jλgenskih segmenata, koji su operativno povezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca κ ili lakog lanca λ imunoglobulina sisara; (n) ubačena nukleinska kiselina sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ ili κ lakog lanca humanog imunoglobulina operativno vezanu za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili κ lakog lanca imunoglobulina sisara; (o) sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara od (k) i / ili (1) sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihovu kombinaciju; ili, (p) nukleinska kiselina konstantnog regiona λ ili κ lakog lanca imunoglobulina sisara od (m) i / ili (n) sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, humanu sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona ili njihovu kombinaciju. ;[0203] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata koji sadrže VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, ili njihovu kombinaciju. ;[0204] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih D genskih segmenta koji sadrže D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27 ili njihovu kombinaciju. ;[0205] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više funkcionalnih JHgenskih segmenata koji sadrže JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata koji sadrže Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6 -21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40, ili njihovu kombinaciju. ;[0206] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata koji sadrže Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0207] U jednoj realizaciji, insert nukleinske kiseline sadrži jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata koji sadrže Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 ili njihovu kombinaciju. ;[0208] U specifičnim realizacijama, nakon modifikacije ciljnog lokusa u pluripotentnoj ćeliji pacova, genetska modifikacija je prenesena preko germinativne linije. ;[0209] U jednoj realizaciji, ubačena sekvenca nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji će, kada bude integrisan u genomu, proizvesti genetsku modifikaciju regiona pacovskog ApoE lokusa, pri čemu genetska modifikacija na lokusu ApoE dovodi do smanjenja aktivnosti ApoE, povećanja aktivnosti ApoE ili modulacije aktivnosti ApoE. U jednoj realizaciji, generisan je ApoE knockout. ;[0210] U jednoj realizaciji, ubačena sekvenca nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji će, kada je integrisan u genomu, proizvesti genetsku modifikaciju pacovskog regiona lokusa interleukin-2 receptora gama, pri čemu genetska modifikacija na interleukin-2 receptorskom gama lokusu rezultira smanjenjem aktivnosti interleukin-2 receptora, povećanjem aktivnosti interleukin-2 receptora gama ili modulacijom aktivnosti interleukin-2 receptora. U jednom izvođenju, generiše se knockout interleukin-2 receptora. ;[0211] U još jednom izvođenju, ubačena sekvenca nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji će, kada je integrisan u genomu, proizvesti genetsku modifikaciju regiona pacovskog lokusa Rag1, pacovskog lokusa Rag2 i / ili pacovog lokusa Rag2 / Rag1, pri čemu genetska modifikacija na pacovskom lokusu Rag1, Rag2 i / ili Rag2 / Rag1 dovodi do smanjenja aktivnosti Rag1, Rag2 ili Rag1 i Rag2 proteina, povećanja aktivnosti Rag1, Rag2 ili Rag1 i Rag2 proteina ili modulacije u Rag1, Rag2 ili Rag 1 i Rag2 proteinskoj aktivnosti. U jednoj realizaciji, generisan je knockout Rag1, Rag2 ili Rag2 / Rag1. ;[0212] U daljim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina rezultira zamenom dela pacovskog ApoE lokusa, lokusa gamma interleukin-2 receptora i / ili lokusa Rag2 i / ili lokusa Rag1 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 sa odgovarajućim ortolognim delom ApoE lokusa, lokusom interleukin-2 receptora gama, lokusom Rag2, lokusom Rag1 i / ili lokusom Rag2 / Rag1 iz drugog organizma. ;[0213] Još uvek u drugim realizacijama, ubačena nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu raspodelu preko njene pune dužine najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% na delu ApoE lokusa, lokusa interleukin-2 receptora gama, lokusa Rag2, lokusa Rag1 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 koji se zamenjuje. ;[0214] Dati insert polinukleotida i odgovarajućeg regiona pacovskog lokusa koji se zamenjuje, mogu biti kodirajući region, intron, ekson, neprevedeni region, regulatorni region, promoter, ili pojačivač ili bilo koja njihova kombinacija. Štaviše, dati insert polinukleotida i / ili regiona pacovskog lokusa koji je zamenjen, mogu biti od bilo koje željene dužine, uključujući, na primer između 10-100 nukleotida u dužinu, 100-500 nukleotida u dužini, 500-1kb nukleotida u dužini, 1Kb do 1,5kb nukleotida u dužini, dužine od 1,5kb do 2kb nukleotida, dužine od 2kb do 2,5kb nukleotida, dužine 2,5kb do 3kb nukleotida, dužine 3kb do 5kb nukleotida, dužine 5kb do 8kb nukleotida, 8kb do 10kb nukleotida u dužini ili više. U drugim slučajevima, veličina umetanja ili zamene je od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, od oko 350kb do oko 400kb, od oko 400kb do oko 800kb, od oko 800kb do 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, od oko 2,5Mb do oko 2,8Mb, od oko 2,8Mb do oko 3Mb. U drugim realizacijama, dati insert polinukleotida i / ili region pacovskog lokusa koji se zamenjuje je najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ili 900 nukleotida ili najmanje 1 kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14 kb, 15kb, 16kb ili veći. ;;i. Metode za modifikovanje ciljnog lokusa nukleinske kiseline pacova preko bakterijske homologne rekombinacije (BHR) ;;[0215] Obelodanjene su metode i kompozicije za modifikovanje ciljnog lokusa nukleinske kiseline pacova putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji. Takvi postupci nalaze upotrebu u korišćenju bakterijske homologne rekombinacije u prokariotskoj ćeliji da bi se genetički modifikovao ciljni lokus nukleinske kiseline pacova kako bi se stvorio vektor ciljanja. Takav vektor ciljanja koji sadrži genetski modifikovan ciljni lokus može biti uveden u eukariotsku ćeliju, na primer, pluripotentnu ćeliju pacova. "Homologna rekombacija" uključuje razmenu fragmenata DNK između dva DNK molekula na unakrsnim mestima unutar regiona homologije. Stoga, "bakterijska homologna rekombinacija" ili "BHR" uključuje homolognu rekombinaciju koja se javlja kod bakterija. ;[0216] Obelodanjene su metode za modifikovanje ciljnog lokusa nukleinske kiseline pacova putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) koje obuhvataju uvođenje u prokariotsku ćeliju vektora ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova i 3' homolognim krajem pacova, pri čemu prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu pacova i sposobna je za izražavanje rekombinaze koja posreduje BHR na ciljnom lokusu. Takvi vektori ciljanja, mogu da uključe bilo koji od velikih vektora ciljanja koji su ovde opisani. ;[0217] U jednom primeru, postupak obuhvata uvođenje u prokariotsku ćeliju: (i) prvog konstrukta koji sadrži nukleinsku kiselinu pacova koja ima sekvencu DNK od interesa; (ii) drugog konstrukta za ciljanje koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem i 3' homolognim krajem pacova, i (iii) trećeg konstrukta koji kodira rekombinazu koja posreduje u bakterijskoj homolognoj rekombinaciji. U jednom primeru, prvi, drugi i treći konstrukt su uvedeni u prokariotsku ćeliju odvojeno tokom vremenskog perioda. U jednom primeru, prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazu, a metoda ne zahteva uvođenje trećeg konstrukta. U jednom primeru, rekombinaza je izražena pod kontrolom indukovanog promotera. ;[0218] U jednom primeru, prvi konstrukt koji sadrži nukleinsku kiselinu pacova je izveden iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) ili veštačkog hromozoma kvasca (YAC). ;[0219] Može biti odabrana prokariotska ćelija koja sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu na ciljnom genomskom lokusu. Ova metoda se može serijski ponoviti, kao što je ovde prikazano kako bi se omogućilo unošenje višestrukih umetaka nukleinskih kiselina na ciljanom lokusu pacova u prokariotskoj ćeliji. Kada je ciljni lokus nukleinske kiseline pacova "izgrađen" unutar prokariotske ćelije, vektor ciljanja koji sadrži modifikovani ciljni lokus pacova može biti izolovan iz prokariotske ćelije i uveden u ciljani genomski lokus unutar ćelije sisara (tj. pluripotentnu ćeliju pacova, ili embrionsku matičnu ćeliju pacova). ;[0220] Poželjne ćelije pacova za primanje vektora ciljanja su opisane u Američkoj prijavi 14 / 185,703, podnesenoj 20. februara 2014. godine, čiji su sadržaji ovde sumirani. Ove ćelije pacova su pluripotentne ćelije pacova sposobne da održe svoju pluripotenciju, nakon jedne ili više ciljanih genetskih modifikacija in vitro, i sposobne su za prenošenje ciljane genske modifikacije kroz germinativnu liniju. ;[0221] Elektroporirane pluripotentne ćelije pacova su nanesene na ploču, pri visokoj gustini za selekciju ćelija otpornih na lekove, koje sadrže vektor ciljanja. Proces selekcije lekova uklanja većinu nanetih ćelija na ploči (~99%), ostavljajući iza sebe pojedinačne kolonije, od kojih je svaki klon izveden iz pojedinačne ćelije. Od preostalih ćelija, većina ćelija (~ 80-100%) sadrži vektor ciljanja (koji sadrži kasetu za odabir leka) integrisan na slučajnoj lokaciji u genomu. Stoga su kolonije izabrane pojedinačno i genotipovane da bi se identifikovale ćelije ES pacova koje daju utočište vektoru ciljanja na tačnoj genomskoj lokaciji (npr., koristeći modifikaciju testa alela opisanog u nastavku). ;[0222] Za kvantitativno ispitivanje visokog protoka, odnosno, test modifikacije alela (MOA), može biti korišćen za genotipizaciju. Takav test dozvoljava široki skrining modifikovanog(ih) alela u roditeljskom hromozomu nakon genetske modifikacije. Analiza MOA može biti izvedena pomoću različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kvantitativni PCR, npr., PCR u realnom vremenu (qPCR). Na primer, PCR u realnom vremenu sadrži prvi skup prajmera koji prepoznaje ciljani lokus i drugi skup prajmera koji prepoznaje ne-ciljani referentni lokus. Pored toga, skup prajmera sadrži fluorescentnu sondu koja prepoznaje pojačanu sekvencu. U jednom primeru, kvantitativni test je izveden putem Invader Probes®. U jednom primeru, kvantitativni test je izveden preko MMP analiza®. U jednom primeru, kvantitativni test je izveden preko TaqMan® Molecular Beacon. U jednom primeru, kvantitativna analiza je izvedena pomoću tehnologije Eclipse ™ sonde. (Videti, na primer, US2005 / 0144655. ;[0223] Izabrana pluripotentna ćelija pacova ili ćelije ES pacova koje obuhvataju ciljanu genetsku modifikaciju, mogu se zatim uneti u embrion pacova domaćina, na primer, stadujuma pre-morula ili stadijuma blastociste embriona pacova i implantovani u matericu surogat majke da generišu pacovskog osnivača (F0 pacov). Posle toga, pacov osnivač se može uzgajati do pacova divljeg tipa kako bi se stvorio heterozigotni potomak F1 za genetsku modifikaciju. Sparivanje heterozigotnog F1 pacova može proizvesti homozigotno potomstvo za genetsku modifikaciju. Sparivanje heterozigotnog F1 pacova može proizvesti potomstvo homozigotno za genetsku modifikaciju. U nekim realizacijama, razne genetske modifikacije ciljnih lokusa koje su ovde opisane, mogu biti izvedene korišćenjem velikog vektora ciljanja (LTVEC), kao što je detaljno opisano na drugim mestima ovde. Na primer, LTVEC može biti izveden iz DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), korišćenjem tehnologije genetičkog inženjeringa VELOCIGENE® (videti, npr., US Pat. br.6,586,251 i Valenzuela, D. M. i sar. (2003), Visoko-povezani inženjering genomskog miša u sprezi sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotechnology 21 (6): 652-659). ;[0224] Upotreba bakterijske homologne rekombinacije (BHR) za generisanje velikog vektora ciljanja (LTVEC) prevazilazi ograničenja plazmida u smeštanju velikog genomskog fragmenta DNK i posledično nisku efikasnost od uvođenja ciljane modifikacije u endogenenom lokusu u pluripotentnim ćelijama pacova. Jedna ili više ciljanih genetskih modifikacija, mogu biti izvedene u generisanju LTVEC-a. Primeran LTVEC proizveden u prokariotskoj ćeliji, može da sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu koja nosi genomsku sekvencu pacova sa jednom ili više genetskih modifikacija ili egzogenu nukleinsku kiselinu (npr. homologa ili ortologa nukleinske kiseline pacova), koja je okružena pacovskim homolognim krajevima komplementarno sa specifičnim genomskim regionima. ;[0225] Takođe su obezbeđene prokariotske ćelije domaćina koje sadrže različite vektore ciljanja, ovde opisane. Takve prokariotske ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, bakterije kao što su E. coli. U jednoj realizaciji, prokariotska ćelija domaćina sadrži vektor ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova i 3' homolognim krajem pacova, pri čemu se ubačena nukleinska kiselina kreće od oko 5 kb do oko 200 kb. ;[0226] Prokariotska ćelija domaćina, može dalje da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazni polipeptid ili nukleinska kiselina koja kodira rekombinazni polipeptid, je operativno povezana sa indukovanim promoterom. ;[0227] Dalje su obelodanjene različite metode i kompozicije, koje angažuju LTVEC, kao što je ovde opisano u kombinaciji sa prokariotskom ćelijom kako bi se proizvele ciljane genetske modifikacije. Ovakve kompozicije i metode su ovde razmatrane na drugim mestima. ;[0228] Otkrivene su metode za modifikovanje ciljnog lokusa nukleinske kiseline putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) koje obuhvataju uvođenje u prokariotsku ćeliju vektora ciljanja koji sadrži umetak nukleinske kiseline okružen sa 5' homolognim krakom i 3' homolognim krakom, pri čemu prokariotska ćelija sadrži nukleinske kiseline koje odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3', a prokariotska ćelija je sposobna da izrazi rekombinazu koja posreduje BHR na ciljnom lokusu. Takvi vektori ciljanja, mogu da uključe bilo koji od velikih vektora ciljanja koji su ovde opisani. Takve metode mogu da koriste LTVEC, kao što je detaljno objašnjeno ovde i dalje koriste sistem CRISPR / Cas, kao što je ovde razmatrano na drugom mestu. ;;ii. Metode za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova ;;[0229] Dalje je obelodanjena metoda za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova putem ciljane genetske modifikacije, koja sadrži (a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova vektora ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova i 3' homolognim krajem pacova, pri čemu je ukupan zbir 5' homolognog kraka i 3' homolognog kraka najmanje 10 kb; i (b) identifikovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koje obuhvata ciljanu genetsku modifikaciju na ciljnom lokusu od interesa. U jednoj realizaciji, ukupan zbir 5' homolognog dela i 3' homolognog dela je najmanje oko 16kb do oko 30kb. U specifičnim realizacijama, ciljana genetska modifikacija je sposobna da se prenosi preko germinativne linije. Takvi vektori ciljanja mogu da uključe bilo koji od velikih vektora ciljanja koji su ovde opisani. ;[0230] Pronalazak koji se odnosi na postupak za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova putem ciljane genetske modifikacije je obezbeđen, koji sadrži: (a) obezbeđivanje pluripotentne ćelije pacova koja je u stanju da održi svoju pluripotenciju nakon najmanje jedne ciljane genetske modifikacije njenog genoma i sposobna je da prenese ciljanu modifikaciju na germinativnu liniju F1 generacije; (b) uvođenje velikog vektora ciljanja (LTVEC) u pluripotentnu ćeliju pacova, pri čemu LTVEC sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krakom i 3' homolognim krakom, pri čemu 5' homologni krak i 3' homologni krak sadrži genomski fragment DNK pacova; i (c) identifikovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koja sadrži ciljanu genetsku modifikaciju. ;[0231] Različite metode se mogu koristiti za identifikaciju ćelija koje sadrže ubačenu nukleinsku kiselinu integrisanu na ciljnom lokusu od interesu. Umetanje inserta nukleinske kiseline u ciljnom lokusu od interesa rezultira "modifikacijom alela". Izraz "modifikacija alela" i metode za detekciju modifikovanog alela su ovde razmatrane detaljnije na drugim mestima. ;[0232] Pronalazak se odnosi na metodu za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova putem obezbeđenog ciljanja gena posredovanog endonukleazom, metoda obuhvata: (a) obezbeđivanje izolovane pluripotentne ćelije pacova koja je sposobna da prenese genetski modifikovani genom u germinativnu liniju F1 generacije; (b) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova endonukleaznog agensa; pri čemu endonukleazni agens pravi rez ili prekid dvostrukog lanca u ciljnoj DNK sekvenci koja se nalazi u genomskom lokusu od interesa, a pri čemu rez ili prekid dvostrukog lanca u ciljnoj DNK sekvenci u ćeliji ES pacova prouzrokuje: (i) popravku DNK od reza ili prekida dvostrukog lanca posredovanu nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ), pri čemu NHEJ-posredovana DNK popravka generiše mutantni alel koji sadrži umetanje ili brisanje sekvence nukleinske kiseline na ciljnoj DNK sekvenci; ili (ii) popravku DNK posredovanu homolognom rekombinacijom koja dovodi do obnavljanja sekvence nukleinske kiseline divljeg tipa; i (c) identifikovanje modifikovanog genomskog lokusa od interesa. ;[0233] Pronalazak se odnosi na metodu za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u obezbeđenoj izolovanoj embrionalnoj matičnoj ćeliji (ES) pacova putem nukleaznog agensa, koji sadrži: (a) obezbeđivanje izolovane ES ćelije pacova koja je sposobna da prenosi ciljanu genetsku modifikaciju na germinativnu liniju F1 generacije; (b) uvođenje u ES ćeliju pacova: (i) velikog vektora ciljanja (LTVEC) koji sadrži umetak nukleinske kiseline okružen sa 5' homolognim krakom pacova i 3' homolognim krakom pacova, pri čemu je umetak sekvenca nukleinske kiseline koja je najmanje 5 kb; i (ii) endonukleaznog agensa, pri čemu endonukleazni agens pravi rez ili prekid dvostrukog lanca na ciljnoj DNK sekvenci koja se nalazi u genomskom lokusu od interesa i gde ciljna sekvenca nije prisutna u umetku nukleinske kiseline; i (c) identifikovanje ciljane genetske modifikacije u embrionalnoj matičnoj ćeliji (ES) pacova. ;[0234] Pronalazak se odnosi na postupak za modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova putem obezbeđenog genomskog inženjeringa sa vodećom RNK, postupak koji sadrži: (a) obezbeđivanje pluripotentne ćelije pacova koja je sposobna da prenese genetski modifikovani genom u germinativnu liniju F1 generacije; (b) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova: (i) prvog ekspresionog konstrukta koji sadrži prvog promotera operativno povezanog sa prvom sekvencom nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-povezani (Cas) protein, (ii) drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži drugog promotera operativno povezanog sa genomskom ciljnom sekvencom povezanom sa vodećom RNK (gRNA), pri čemu je genomska ciljna sekvenca okružena na 3' kraju pomoću engl. Protospacer Adjacent Motif (PAM) sekvence. U jednom izvođenju, genomska ciljna sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu od: GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20GG, SEK ID BR: 1). U jednom izvođenju, genomska ciljna sekvenca sadrži SEK ID BR: 1, gde je N dužine između 14 i 20 nukleotida. U jednoj realizaciji, gRNK sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) RNA (crRNA) i četvrtu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA). U jednoj realizaciji, po ekspresiji, Cas protein obrazuje kompleks CRISPR-Cas koji sadrži crRNA i tracrRNA, a kompleks CRISPR-Cas pravi rez ili prekid dvostrukog lanca na ciljnoj DNK sekvenci koja se nalazi u genomskom lokusu od interesa, i pri čemu rez ili prekid dvostrukog lanca na ciljnoj DNK sekvenci u pluripotentnoj ćeliji pacova indukuje: (i) popravku DNK posredovanu nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ), od reza ili prekida dvostrukog lanca kreiranog pomoću CRISPR-Cas kompleksa, pri čemu NHEJ generiše mutantni alel koji obuhvata umetanje ili uklanjanje sekvence nukleinske kiseline na ciljnoj DNK sekvenci; ili (ii) popravku DNK posredovanu homolognom rekombinacijom koja dovodi do obnavljanja sekvence nukleinske kiseline divljeg tipa; i (c) identifikovanje modifikovanog genomskog lokusa od interesa. ;[0235] U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija pacova je indukovana pluripotentna matična ćelija (iPS) pacova. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija pacova je razvojno ograničena ćelija progenitora. ;[0236] Prisustvo reza ili prekida dvostrukog lanca na mestu prepoznavanja unutar markera za selekciju, u različitim realizacijama, povećava efikasnost i / ili učestalost rekombinacije između vektora ciljanja (tj. LTVEC-a) i ciljanog lokusa od interesa. U jednoj realizaciji, rekombinacija je homologna rekombinacija. U drugoj realizaciji, rekombinacija je umetanje nehomolognim spajanjem krajeva. U različitim izvođenjima, u prisustvu reza ili prekida dvostrukog lanca, efikasnost ciljanja vektora za ciljanje (tj. LTVEC-a) na ciljnom genomskom lokusu je najmanje oko 2 puta veća, najmanje oko 3 puta veća, najmanje oko 4 puta veća nego u odsustvu reza ili dvostruko-lančanog prekida (koristeći npr. isti vektor ciljanja i iste homologne krajeve i odgovarajuće ciljne lokacije na genomskom lokusu od interesa, ali u odsustvu dodatog nukleaznog agensa koji pravi rez ili prekid dvostrukog lanca). ;[0237] U jednoj realizaciji, ciljana genetska modifikacija na ciljnom lokusu je bialelna. Pod "bialelnom" podrazumeva se da oba alela gena sadrže ciljanu genetsku modifikaciju. U određenim realizacijama, kombinovana upotreba vektora za ciljanje (uključujući, na primer, LTVEC-a) sa nukleaznim agensom rezultira bialelnom ciljanom genetskom modifikacijom genomskog lokusa od interesa u ćeliji, u poređenju sa upotrebom samo vektora ciljanja. Kada se vektor ciljanja koristi zajedno sa nukleaznim agensom, bialelna efikasnost ciljanja je povećana najmanje dva puta, najmanje tri puta, najmanje 4 puta ili više u odnosu na kada se vektor ciljanja koristi samostalno. U daljim realizacijama, bialelna efikasnost ciljanja je najmanje 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4% ili 5% ili viša. ;[0238] Obelodanjene su kompozicije koje sadrže genetski modifikovanog pacova koji ima ciljanu genetsku modifikaciju u lokusu interleukin-2 receptora gama ili u ApoE lokusu. Različiti postupci i preparati koji su ovde otkriveni omogućavaju da se ovi modifikovani lokusi prenose preko germinativne linije. ;[0239] U specifičnim realizacijama, genetički modifikovani pacov ili genetički modifikovana pluripotentna ćelija pacova sadrži genomski lokus koji ima ciljanu genetsku modifikaciju u lokusu interleukin-2 gama receptora ili ima ciljanu genetsku modifikaciju u ApoE lokusu, pri čemu interleukin-2 gama receptorski genomski lokus ili ApoE lokus obuhvataju: (i) deleciju najmanje jednog dela lokusa interleukin-2 gama receptora ili najmanje jednog dela ApoE lokusa; (ii) umetanje heterologne sekvence nukleinske kiseline u lokus ApoE ili u lokus interleukin-2 gama receptora; ili (iii) njihovu kombinaciju, pri čemu je genetski modifikovani genomski lokus sposoban da se prenese kroz germinativnu liniju. ;[0240] Dalje su obelodanjene metode koje omogućavaju izradu takvih genetički modifikovanih pacova i takvih genetički modifikovanih pluripotentnih ćelija pacova. Takvi postupci uključuju, postupak za modifikaciju ApoE genomskog lokusa ili lokusa interleukin-2 receptora gama u pluripotentnoj ćeliji pacova putem ciljane genetske modifikacije. Postupak obuhvata (a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova vektora za ciljanje koji sadrži umetak nukleinske kiseline okružene sa 5' homolognim krakom pacova do ApoE lokusa i 3' homolognim krakom pacova do ApoE lokusa, (b) identifikovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koja obuhvata ciljanu genetsku modifikaciju u ApoE genomskom lokusu od interesa, pri čemu ciljana genetska modifikacija može da se prenese preko germinativne linije. ;[0241] Dodatni postupci uključuju (a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova jednog vektora za ciljanje koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova na lokusu interleukin-2 receptora gama i 3' homolognim krajem pacova na lokusu interleukin-2 receptora gama, (b) identifikovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova koja obuhvata ciljanu genetsku modifikaciju na lokusu interleukin-2 receptora gama, pri čemu je ciljana genetska modifikaciju sposobna da se prenosi preko germinativne linije. ;;iii. Metode za integrisanje višestrukih polinukleotida od interesa na ciljanom lokusu ;;[0242] Različite metode i kompozicije koje su ovde opisane omogućavaju ciljanu integraciju višestrukih polinukleotida od interesa sa datim ciljnim lokusom. Različite metode koje su iznad navedene, mogu se sekvencijalno ponoviti kako bi se omogućila ciljana integracija bilo kog broja ubačenih nukleinskih kiselina u datom ciljanom lokusu. Prema tome, različiti postupci omogućavaju umetanje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više umetaka nukleinske kiseline u ciljni lokus. U posebnim realizacijama, takvi sekvencijalni postupci slaganja omogućavaju rekonstrukciju velikih genomskih regiona od ćelije sisara (tj. čoveka, ne-humane životinje, glodara, miša, majmuna, pacova, hrčka, gajenog sisara ili poljoprivredne životinje) u ciljanom lokusu. U takvim slučajevima, prenos i rekonstrukcija genomskih regiona koji uključuju i kodirajuće i ne-kodirajuće regione, a sve u cilju očuvanja složenosti datog regiona zadržavajući, barem delom, regione kodiranja, nekodirajuće regione i varijacije broja kopija nađenih u prirodnom genomskom regionu. Stoga, različite metode obezbeđuju, na primer, metode za generisanje "heterolognih" ili "egzogenih" genomskih regiona unutar bilo koje ćelije sisara ili životinje od interesa, naročito unutar prokariotske ćelije domaćina ili unutar pluripotentne ćelije pacova ili ćelije ES pacova. ;U jednom neograničavajućem primeru, generisan je "humanizovani" genomski region unutar ne-humane životinje (tj., unutar pacova). ;;3. Humanizovani genomski lokus ;;[0243] Ovde su otkrivene razne metode i kompozicije koje sadrže humanizovani lokus pacova. Kao što je ovde korišćeno, pod "humanizovanim" genomskim lokusom podrazumeva se region ne-humanog genoma koji sadrži najmanje jednu humanu sekvencu nukleinske kiseline. "Humanizovani lokus pacova" sadrži region od DNK pacova koji onda ima umetnutu humanu DNK sekvencu. Humana sekvenca DNK, može biti prirodna humana DNK sekvenca ili može biti modifikovana iz svog prirodnog oblika. U specifičnim realizacijama, humana DNK deli najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa prirodnom humanom sekvencom. Ako humana sekvenca nije prirodna humana sekvenca, ona ima barem veću identičnost sekvence sa prirodnom humanom sekvencom, nego što to čini prema ortolognoj sekvenci pacova. Štaviše, humana DNK sekvenca, može da sadrži cDNK, region humane genomske DNK, nekodirajući regulatorni region ili bilo koji deo kodirajućeg, genomskog ili regulatornog regiona humane DNK. Humana sekvenca DNK koja je ubačena u lokus pacova, može da sadrži bilo koji od ubačenih polinukleotida, kao što je ovde opisano na drugom mestu. U specifičnim realizacijama, sekvenca humane DNK je ortologna prema ciljnom lokusu pacova, dok je u drugim slučajevima sekvenca humane DNK homologna prema ciljnom lokusu pacova. ;[0244] U jednoj realizaciji, ciljana genetska modifikacija je umetanje ili zamena endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom humanom sekvencom nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, ciljana genetska modifikacija sadrži umetanje ili zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom humanom sekvencom nukleinske kiseline na endogenom lokusu pacova koji sadrži odgovarajuću sekvencu nukleinske kiseline pacova. ;[0245] Metode za izradu humanizovanog lokusa pacova (ili pacova ili ćelije pacova koja sadrži humanizovani lokus pacova) sadrže uvođenje u ciljni lokus koji sadrži pacovsku nukleinsku kiselinu, jedne humane sekvence nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, obezbeđen je metod za izradu humanizovanog pacova. Ovakav postupak obuhvata (a) modifikovanje genoma pluripotentne ćelije pacova sa vektorom za ciljanje koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu koja sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline kako bi se obrazovala donorska ćelija; (b) uvođenje donorske ćelije u embrion pacova domaćina; i (c) nošenje embriona pacova domaćina u surogatnoj majci; gde surogatna majka proizvodi potomstvo pacova koji sadrže humanu sekvencu nukleinske kiseline. U specifičnim realizacijama, humanizovani lokus pacova je sposoban da se prenosi preko germinativne linije. U daljem izvođenju, vektor za ciljanje sadrži jedan veliki vektor za ciljanje (LTVEC) i umetak nukleinske kiseline koji sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline je najmanje 5 kb. ;[0246] U drugim metodama, humanizovani lokus pacova je izrađen modifikovanjem ciljnog lokusa nukleinske kiseline pacova putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR). Metoda obuhvata uvođenje u prokariotsku ćeliju jednog vektora za ciljanje koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim krajem pacova i 3' homolognim krajem pacova, pri čemu ubačena nukleinska kiselina sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline i gde prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu pacova i sposobna je da eksprimira rekombinazu koja posreduje BHR na ciljnom lokusu. ;[0247] Humanizovani genomski lokus pacova može sadržati (a) umetanje homologne ili ortologne sekvence humane nukleinske kiseline; (b) zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline; ili (c) njihovu kombinaciju. U specifičnim realizacijama, humanizovani genomski lokus pacova je sposoban da se prenese kroz germinativnu liniju. U još nekim realizacijama, humana ortologna sekvenca zamenjuje odgovarajuću sekvencu koja se nalazi u pacovu. ;[0248] Bilo koja sekvenca humane nukleinske kiseline, može biti korišćena u postupcima i kompozicijama koje su ovde obelodanjene. Neograničavajući primeri sekvenci humane nukleinske kiseline koji se mogu koristiti u postupcima i kompozicijama su detaljno razmatrani na drugim mestima ovde. ;[0249] Sekvenca humane nukleinske kiseline za umetanje u lokus od interesa pacova, može biti bilo koje veličine. U jednoj realizaciji, sekvenca humane nukleinske kiseline može biti od oko 500 nukleotida do oko 200 kb, od oko 500 nukleotida do oko 5 kb, od oko 5kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb. U specifičnoj realizaciji, sekvenca humane nukleinske kiseline je najmanje 5 kb. ;[0250] Opisan je genomski lokus pacova, gde homologna ili ortologna sekvenca humane nukleinske kiseline sadrži (a) jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca VH, jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih genskih segmenata D teškog lanca i jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih genskih segmenta JHteškog lanca, koji su operativno vezani za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara; (b) preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koja je operativno vezana za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina sisara; (c) jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Vκili Vλgenskih segmenata i jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Jκili Jλgenskih segmenata, koji su operativno povezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ imunoglobulina sisara; ili (d) preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca λ ili κ humanog imunoglobulina koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ imunoglobulina sisara. ;[0251] Opisan je genomski lokus pacova gde (a) sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina sisara je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvenca nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihova kombinacija; ili (b) sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ sisarskog imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvenca nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihova kombinacija. ;[0252] Opisan je genomski lokus pacova gde je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulma odabrana od ili sadrži CH1, šarku, CH2, CH3 i / ili njihovu kombinaciju. ;[0253] U jednom primeru, pacovski genomski lokus sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih VHsegmenata gena koji sadrže VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30-3, VH3-30-5, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH4-4, VH4-28, VH4-30-1, VH4-30-2, VH4-30-4, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, VH7-4-1, VH7-81, ili njihovu kombinaciju. ;[0254] U jednom primeru, pacovski genomski lokus sadrži jedan ili više funkcionalnih humanih D genskih segmenata koji sadrže D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0255] U jednom primeru, pacovski genomski lokus sadrži jedan ili više funkcionalnih JHgenskih segmenata koji sadrže JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 i / ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata koji obuhvataju Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40, ili njihovu kombinaciju. ;[0256] U jednom primeru, pacovski genomski lokus sadrži jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata koji sadrže Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27, ili njihovu kombinaciju. ;[0257] U jednom primeru, pacovski genomski lokus sadrži jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata koji sadrže Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, ili njihovu kombinaciju. ;[0258] U još drugom primeru, obezbeđen je pacovski genomski lokus koji sadrži humanizovani genomski lokus koji sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline interleukin-2 receptora (IL2R) ili varijantu ili njen fragment. ;[0259] U daljim primerima, pacovski genomski lokus koji sadrži humanizovani genomski lokus koji sadrži deo humanog ApoE lokusa, humani interleukin-2 receptorski gama lokus, humani Rag2 lokus, humani Rag1 lokus i / ili humani Rag2 / Rag1 lokus koji zamenjuje odgovarajući homologni ili ortologni deo pacovskog ApoE lokusa, pacovskog interleukin-2 receptorskog gama lokusa, lokusa Rag2 pacova, pacovskog lokusa Rag1 i / ili pacovskog lokusa Rag2 / Rag1. U jednoj realizaciji, pacovski ekto-domen IL-2Rg je zamenjen sa ektodomenom humanog IL-2Rg, sa ostatkom molekula koji je od pacova. ;[0260] U drugom primeru, obezbeđen je genetski modifikovani pacov koji sadrži humanizovani genomski lokus. Takvi genetički modifikovani pacovi obuhvataju (a) ubacivanje homologne ili ortologne humane sekvence nukleinske kiseline; (b) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom humane nukleinske kiseline na endogenom genomskom lokusu; ili (c) njihovu kombinaciju, pri čemu je humanizovani genomski lokus sposoban da se prenese kroz germinativnu liniju. ;[0261] Takođe su obezbeđeni genetski modifikovani pacovi koji sadrže bilo koji od različitih humanizovanih genomskih lokusa koji su ovde obelodanjeni i gore opisani. ;;4. Polinukleotidi od interesa ;[0262] Bilo koji polinukleotid od interesa, može biti sadržan u raznim ubačenim nukleinskim kiselinama i na taj način integrisan u ciljni lokus. Metode koje su ovde obelodanjene, obezbeđuju najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više polinukleotida od interesa koji će biti integrisani u ciljani genomski lokus. ;[0263] Polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline kada je integrisan u ciljni genomski lokus, može uvesti jednu ili više genetskih modifikacija u ćeliju. Genetska modifikacija može da sadrži uklanjanje endogene sekvence nukleinske kiseline i / ili dodavanje egzogenog ili heterolognog ili ortolognog polinukleotida u ciljni genomski lokus. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline sa egzogenim polinukleotidom od interesa na ciljnom genomskom lokusu. Prema tome, ovde obelodanjene metode dozvoljavaju generisanje genetske modifikacije koja sadrži knockout, deleciju, ubacivanje, zamenu ("knock-in"), tačkastu mutaciju, zamenu domena, zamenu eksona, zamenu introna, zamenu regulatorne sekvence, zamenu gena ili njihovu kombinaciju. Takve modifikacije se mogu javiti nakon integracije prvog, drugog, trećeg, četvrtog, petog, šestog, sedmog ili bilo kog narednog umetka nukleinskih kiselina u ciljni genomski lokus. ;[0264] Polinukleotid od interesa unutar umetka nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu, može da sadrži sekvencu koja je prirodna za ćeliju u koju se unosi; polinukleotid od interesa može biti heterologan za ćeliju u koju se uvodi; polinukleotid od interesa može biti egzogen za ćeliju u koji se unosi; polinukleotid od interesa može biti ortologan za ćeliju u koju se unosi; ili polinukleotid od interesa može biti iz različite vrste od ćelije u koju se unosi. Kao što je ovde korišćeno, "prirodna" u odnosu na sekvencu ubačenu u ciljni lokus je sekvenca koja je prirodna za ćeliju koja ima ciljni lokus ili prirodna za ćeliju iz koje je izveden ciljni lokus (tj., od pacova). Kao što je ovde korišćeno, "heterologna" u odnosu na sekvencu uključuje, sekvencu koja potiče od strane vrste ili, ako je iz iste vrste, suštinski je različita ili modifikovana iz njenog prirodnog oblika u kompoziciji i / ili genomskom lokusu namernom ljudskom intervencijom. Kao što se ovde koristi, "egzogena" u odnosu na sekvencu je sekvenca koja potiče od strane vrste. Polinukleotid od interesa može biti od bilo kog organizma od interesa uključujući, ali ne ograničavajući se na, ne-čoveka, glodara, hrčka, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili nekog ne-poljoprivrednog sisara. Polinukleotid od interesa, može dalje da obuhvata kodirajući region, ne-kodirajući region, regulatorni region ili genomsku DNK. Stoga, 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. i / ili bilo koja od sledećih ubačenih nukleinskih kiselina može da sadrži takve sekvence. ;[0265] U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu, je prirodan za sekvencu nukleinske kiseline miša, humanu nukleinsku kiselinu, nukleinsku kiselinu koja nije humana, nukleinsku kiselinu glodara, nukleinsku kiselinu pacova, nukleinsku kiselinu hrčka, nukleinsku kiselinu majmuna, nukleinsku kiselinu poljoprivrednog sisara ili nukleinsku kiselinu sisara koji nisu poljoprivredni. U još daljim izvođenjima, polinukleotid od interesa integrisan na ciljnom lokusu je fragment genomske nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, genomska nukleinska kiselina je mišja genomska nukleinska kiselina, humana genomska nukleinska kiselina, nehumana nukleinska kiselina, nukleinska kiselina glodara, nukleinska kiselina pacova, nukleinska kiselina hrčka, nukleinska kiselina majmuna, nukleinska kiselina poljoprivrednog sisara ili ne-poljoprivredne sisarske nukleinske kiseline ili njihova kombinacija. ;[0266] U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa može da se proteže od oko 500 nukleotida do oko 200kb, kao što je gore opisano. Polinukleotid od interesa, može biti od oko 500 nukleotida do oko 5kb, od oko 5kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10 kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od od oko 40kb do oko 50kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb. ;[0267] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili ubačen u ciljani genomski lokus, može da kodira polipeptid, može da kodira miRNK ili može da sadrži bilo koji regulatorni region ili ne-kodujuće regione od interesa uključujući, na primer, regulatornu sekvencu, promotersku sekvencu, sekvencu pojačivača, transkripcionu sekvencu za vezivanje represora ili brisanje ne-proteinske kodirajuće sekvence, ali ne sadrži brisanje sekvence za kodiranje proteina. Dodatno, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili ubačen na ciljnom genomskom lokusu može da kodira jedan protein eksprimiran u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, sistemu cirkulacije, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu ili njihovoj kombinaciji. U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili ubačen u ciljani genomski lokus, kodira protein izražen u koštanoj srži ili ćeliji koja je izvedena iz koštane srži. U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar umetka nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu, kodira jedan protein izražen u ćeliji slezine. U još daljim realizacijama, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili ubačen na ciljni lokus kodira jedan protein izražen u B ćeliji, kodira jedan protein izražen u nezreloj B ćeliji ili kodira jedan protein izražen u zreloj B ćeliji. ;[0268] Polinukleotid od interesa unutar inserta polinukleotida, može da sadrži deo ApoE lokusa, IL-2-Rg lokusa, Rag1 lokusa, Rag2 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa. Ovakvi delovi ovih datih lokusa su ovde razmatrani na drugim mestima, kao i različiti homologni i ortologni regioni iz bilo kojeg organizma od interesa koji se mogu angažovati. ;[0269] U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili ubačen na ciljni lokus sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Fraza "teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina" su ovde opisani na drugim mestima. ;[0270] U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljni lokus sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina. ;[0271] U jednoj realizaciji, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži jedan ili više neuređenih genskih segmenta teškog lanca VHhumanog imunoglobulina, jedan ili više neuređenih genskih segmenata teškog lanca D humanog imunoglobulina i jedan ili više neuređenih genskih segmenata teškog lanca JHhumanog imunoglobulina, koji su operativno vezani za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara. U jednoj realizaciji, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezanu za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sisara. U jednoj realizaciji, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži jedan ili više neuređenih humanih imunglobulinskih Vκili Vλ, segmenata gena i jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Jκili Jλ, genskih segmenata, koji su operativno povezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ imunglobulina sisara. U jednoj realizaciji, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca λ ili κ humanog imunglobulina operativno povezanu sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ imunoglobulina sisara. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina konstantnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca λ ili κ sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihovu kombinaciju. ;[0272] U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je odabrana od ili sadrži CH1, šarku, CH2, CH3 i / ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-šarka-CH2-CH3. ;[0273] U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar umetka nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljnom lokusu sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca. Fraza "laki lanac" uključuje, sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca iz bilo kog organizma i opisana je na drugom mestu ovde. ;[0274] U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljnom genomskom lokusu sadrži genomsku sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina. ;[0275] U jednoj realizaciji, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Vκili Vλ, genskih segmenata i jedan ili više neuređenih humanih imunoglobulinskih Jκili Jλgenskih segmenata, koji su operativno povezani sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ imunoglobulina glodara. U jednoj realizaciji, genomska sekvenca nukleinske kiseline sadrži preuređenu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog lakog lanca λ ili κ operativno vezanu za sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca λ ili lakog lanca κ imunoglobulina glodara. U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina konstantnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca λ ili κ sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona pacova, sekvencu nukleinske kiseline humanog konstantnog regiona ili njihovu kombinaciju. ;[0276] Polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljnom lokusu, može da kodira ekstracelularni protein ili ligand za receptor. U specifičnim realizacijama, kodirani ligand je citokin. Citokini od interesa uključuju, hemokin odabran od ili koji sadrži CCL, CXCL, CX3CL i / ili XCL. Citokin takođe, može da sadrži faktor nekroze tumora (TNF). U još nekim realizacijama, citokin je interleukin (IL). U jednoj realizaciji, interleukin je izabran od ili sadrži IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 i / ili IL-36. U jednoj realizaciji, interleukin je IL-2. U specifičnim realizacijama, takvi polinukleotidi od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisani u ciljanom genomskom lokusu su od čoveka i, u specifičnijim realizacijama, mogu sadržati humanu genomsku sekvencu. ;[0277] Polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljani genomski lokus može da kodira Apolipoprotein E (ApoE). ;[0278] Polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu, može da kodira citoplazmatski protein ili membranski protein. U jednoj realizaciji, membranski protein je receptor, kao što je receptor citokina, interleukinski receptor, interleukin 2 receptor-alfa, interleukin-2 receptor beta, interleukin-2 receptor gama ili receptor tirozin kinaze. U drugim slučajevima, polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljni lokus, može da sadrži ortologni ili homologni region ciljnog lokusa. ;[0279] Polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu, može da sadrži polinukleotid koji kodira najmanje jedan region receptora T ćelija, uključujući T-ćelijski receptor alfa. U specifičnim postupcima svaka od ubačenih nukleinskih kiselina sadrži genomski region lokusa T ćelijskog receptora (tj. lokus T-ćelijskog receptora alfa) tako da po završetku serijske integracije, deo ili celina genomskog lokusa T-ćelijskog receptora je integrisana u ciljnom lokusu. Takve ubačene nukleinske kiseline, mogu da sadrže najmanje jedan ili više od varijabilnog segmenta ili segmenta za spajanje lokusa T-ćelijskog receptora (tj. lokusa T-ćelijskog receptora alfa). U još daljim izvođenjima, polinukleotid od interesa koji kodira region T ćelijskog receptora može biti od, na primer, polinukleotida sisara, ne-humanog sisara, glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara koji kodira mutantni protein. ;[0280] U drugim izvođenjima, polinukleotid od interesa integrisan u ciljnom lokusu kodira nuklearni protein. U jednoj realizaciji, nuklearni protein je nuklearni receptor. U specifičnim realizacijama, takvi polinukleotidi od interesa u ubačenoj nukleinskoj kiselini i / ili integrisani u ciljnom lokusu su od ljudi i, u specifičnim realizacijama, mogu da sadrže humanu genomsku sekvencu. ;[0281] Polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan u ciljni genomski lokus, može da sadrži genetsku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci. Takve genetske modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, delecionu mutaciju kodirajuće sekvence ili fuziju dve kodirajuće sekvence. ;[0282] Polinukleotid od interesa unutar ubačene nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu, može da sadrži polinukleotid koji kodira mutantni protein, uključujući, na primer, humani mutantni protein. U jednoj realizaciji, mutantni protein je karakterisan pomoću izmenjene karakteristike vezivanja, izmenjene lokalizacije, izmenjene ekspresije i / ili izmenjenog šablona ekspresije. U jednoj realizaciji, polinukleotid od interesa unutar inserta nukleinske kiseline i / ili integrisan na ciljnom lokusu sadrži najmanje jedan alel bolesti, uključujući na primer, alel od neurološke bolesti, alel od kardiovaskularnog oboljenja, alel od bolesti bubrega, alel od bolesti mišića, alel od bolesti krvi, alel od gena koji izaziva rak, ili alel od bolesti imunog sistema. U takvim slučajevima, alel za bolest može biti dominantni alel ili je alel za bolest recesivni alel. Štaviše, alel za bolest može da sadrži pojedinačni alel nukleotidnog polimorfizma (SNP). Polinukleotid od interesa koji kodira mutantnog proteina, može biti iz bilo kojeg organizma, uključujući, ali nije ograničen na polinukleotid sisara, nehumanog sisara, glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara koji kodira jedan mutantni protein. ;[0283] U jednoj realizaciji, genetička modifikacija proizvodi mutantni oblik proteina sa izmenjenom karakteristikom vezivanja, izmenjenom lokalizacijom, izmenjenom ekspresijom i / ili izmenjenim šablonom ekspresije. ;[0284] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju iz regiona pacovskog ApoE lokusa, pri čemu genetska modifikacija na lokusu ApoE rezultira smanjenjem aktivnosti ApoE. U jednoj realizaciji, generisan je ApoE nokaut. ;[0285] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona pacovskog Rag1 lokusa, pri čemu genetska modifikacija na lokusu Rag1 dovodi do smanjenja aktivnosti Rag1. U jednom izvođenju, generisan je Rag1 nokaut. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju regiona pacovskog lokusa Rag2, pri čemu genetska modifikacija na lokusu Rag2 dovodi do smanjenja aktivnosti Rag2. U jednoj realizaciji, generisan je Rag2 nokaut. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju od regiona pacovskog lokusa Rag1 / Rag2, pri čemu genetska modifikacija na lokusu Rag1 / Rag2 dovodi do smanjenja aktivnosti Rag1 i smanjenja aktivnosti Rag2. U jednoj realizaciji, generisan je Rag1 / Rag2 nokaut. ;[0286] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju pacovskog od regiona lokusa interleukin-2 receptora gama, pri čemu genetska modifikacija na lokusu interleukin-2 receptora gama dovodi do smanjenja interleukin-2 receptora gama. U jednoj realizaciji, generisan je nokaut interleukin-2 receptora gama. ;[0287] Kao što je ovde razmatrano na drugom mestu, dalje realizacije, ovde obelodanjene sadrže jedan ili više lokusa ApoE pacova, lokusa interleukin-2 receptora gama, lokusa Rag2, lokusa Rag1 i / ili lokusa Rag2 / Rag1 modifikovane kroz zamenu dela pacovskog ApoE lokusa, interleukin-2 receptorskog gama lokusa, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa sa odgovarajućim ortolognim delom ApoE lokusa, lokusa interleukin-2 receptora gama, Rag2 lokusa, Rag1 lokusa i / ili Rag2 / Rag1 lokusa iz drugog organizma. ;[0288] U jednoj realizaciji, generisane su višeštruke genetske modifikacije. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju od regiona pacovskog lokusa interleukin-2 receptora gama, pri čemu genetska modifikacija na lokusu gama interleukin-2 receptora dovodi do smanjenja interleukin-2 gama receptora i druga genetska modifikacija proizvodi deleciju, dodavanje, zamenu ili njihovu kombinaciju od regiona pacovskog lokusa Rag2, pri čemu genetska modifikacija na lokusu Rag2 dovodi do smanjenja aktivnosti Rag2. U jednom izvođenju, generisan je nokaut interleukin-2 receptora gama / Rag2. Takav pacov ima SCID fenotip. ;[0289] U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara sadrži genomski lokus koji kodira jedan protein izražen u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, sistemu cirkulacije, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, urinarnom sistemu, reproduktivnom sistemu ili njihovoj kombinaciji. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sisara sadrži genomski lokus koji kodira jedan protein izražen u koštanoj srži ili ćeliji izvedenoj iz koštane srži. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina sadrži genomski lokus koji kodira jedan protein izražen u ćeliji slezine. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži mišju genomsku sekvencu DNK, genomsku sekvencu DNK pacova, humanu genomsku sekvencu DNK, ili njihovu kombinaciju. U jednom izvođenju, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, pacovske i humane genomske DNK sekvence. U jednoj realizaciji, genomski lokus obuhvata, u bilo kojem redu, mišje i humane genomske sekvence DNK. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, genomske sekvence DNK miša i pacova. U jednoj realizaciji, genomski lokus sadrži, u bilo kojem redu, genomske sekvence DNK pacova, miša i čoveka. ;[0290] U jednoj realizaciji, ubačena nukleinska kiselina sadrži genetsku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci gena. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži mutaciju delecije u kodirajućoj sekvenci. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži fuziju dve endogene kodirajuće sekvence. ;[0291] U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži deleciju ne-proteinske kodirajuće sekvence, ali ne sadrži brisanje sekvence za kodiranje proteina. U jednoj realizaciji, uklanjanje ne-proteinske kodirajuće sekvence obuhvata uklanjanje regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži dodavanje promotera. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži zamenu promotera ili regulatornog elementa. U jednoj realizaciji, regulatorni element je inhenser. U jednoj realizaciji, regulatorni element je transkripcioni element za vezivanje represije. ;[0292] U jednom izvođenju, genetska modifikacija sadrži postavljanje humane sekvence nukleinske kiseline koja kodira mutantni humani protein. U jednoj realizaciji, genetska modifikacija sadrži najmanje jedan alel humanog oboljenja humanog gena. U jednoj realizaciji, humana bolest je neurološka bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je kardiovaskularna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je bubrežna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je mišićna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je krvna bolest. U jednoj realizaciji, humana bolest je rak. U jednoj realizaciji, humana bolest je bolest imunog sistema. U jednoj realizaciji, alel za humanu bolest je dominantni alel. U jednoj realizaciji, alel za humanu bolest je recesivni alel. U jednoj realizaciji, alel za humanu bolest sadrži alel pojedinačnog nukleotidnog polimorfizma (SNP). ;[0293] Polinukleotid od interesa u insertnoj nukleinskoj kiselini i / ili integrisan na ciljnom lokusu, može takođe sadržati regulatornu sekvencu, uključujući na primer, promotersku sekvencu, sekvencu pojačivača ili transkripcionu represor-vezujuću sekvencu. U specifičnim realizacijama, polinukleotid od interesa u ubačenoj nukleinskoj kiselini i / ili integrisan na ciljanom genomskom lokusu sadrži polinukleotid koji ima deleciju ne-proteinske kodirajuće sekvence, ali ne sadrži brisanje kodirajuće sekvence za proteine. U jednoj realizaciji, uklanjanje sekvence ne-proteinskog kodiranja sadrži deleciju regulatorne sekvence. U drugoj realizaciji, uklanjanje regulatornog elementa sadrži deleciju promoterske sekvence. U jednoj realizaciji, brisanje regulatornog elementa sadrži brisanje sekvence pojačivača. Takav polinukleotid od interesa, može biti iz bilo kojeg organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na polinukleotid sisara, ne-humanog sisara, glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara koji kodira mutanti protein. ;;5. Metode uvođenja sekvenci i generacija transgenih životinja ;;[0294] Kao što je prethodno opisano, ovde su obelodanjene metode i kompozicije kako bi se omogućila ciljana integracija jednog ili više polinukleotida od interesa u ciljni lokus. Ovakvi sistemi koriste razne komponente i radi lakšeg upućivanja, ovde izraz "ciljani sistem integracije" genetički sadrži sve komponente potrebne za integracioni događaj (tj. u neograničavajućim primerima, razne nukleazne agense, mesta za prepoznavanje, insert polinukleotida DNK, vektore ciljanja, ciljni genomski lokus i / ili polinukleotide od interesa). ;[0295] Metode koje su ovde otkrivene, obuhvataju uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida ili polipeptidnih konstrukata koji sadrže različite komponente ciljanog sistema genomske integracije. "Uvođenje" znači predstavljanje sekvence ćeliji (polipeptida ili polinukleotida) na takav način da sekvenca dobija pristup unutrašnjosti ćelije. Metode ovde obelodanjene ne zavise od određene metode za uvođenje bilo koje komponente ciljanog sistema genomske integracije u ćeliju, samo da polinukleotid dobija pristup u unutrašnjosti najmanje jedne ćelije. Metode za uvođenje polinukleotida u različite tipove ćelija su poznate u struci i uključuju, ali se ne ograničavaju na, stabilne metode transfekcije, prolazne transfekcione metode i metode posredovane virusom. ;[0296] U nekim izvođenjima, ćelije upotrebljene u metodama i kompozicijama imaju DNK konstrukt stabilno inkorporiran u njihovom genomu. "Stabilno inkorporiran" ili "stabilno uveden" podrazumeva unošenje polinukleotida u ćeliju tako da se nukleotidna sekvenca integriše u genom ćelije i sposobna je da se nasledi njegovim potomstvom. Svaki protokol se može koristiti za stabilno uključivanje DNK konstrukata ili različitih komponenti ciljanog genomskog sistema integracije. ;[0297] Transfekcioni protokoli kao i protokoli za uvođenje polipeptida ili polinukleotidnih sekvenci u ćelije se mogu razlikovati. Neograničavajuće metode transfekcije uključuju, metode transfekcije zasnovane na hemiji, uključuju upotrebu liposoma; nanočestica; kalcijum fosfata (Graham i sar. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti i sar. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 i Kriegler, M (1991). Prenos i ekspresija: laboratorijski priručnik. New York: W. H. Freeman and Company, str. 96- 97); dendrimera; ili katjonskih polimera kao što su DEAE-dekstran ili polietilenimin. Metode koje nisu hemijske uključuju, elektroporaciju; Sonoporaciju; i optičku transfekciju. Transfekcija zasnovana na čestici uključuje upotrebu genskog pištolja, transfekciju pomoću magneta (Bertram, J. (2006) Aktuelna farmaceutska biotehnologija 7, 277-28). Virusne metode se takođe mogu koristiti za transfekciju. ;[0298] U jednoj realizaciji, uvođenje jednog ili više polinukleotida u ćeliju je posredovano elektroporacijom, intracitoplazmatičnom injekcijom, virusnom infekcijom, adenovirusom, lentivirusom, retrovirusom, transfekcijom, transfekcijom posredovanom lipidima ili je posredovano putem Nucleofection ™. ;[0299] U jednom izvođenju, uvođenje jednog ili više polinukleotida u ćeliju dalje obuhvata: uvođenje ekspresionog konstrukta koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline od interesa operativno vezanu za promotera. U jednoj realizaciji, promoter je konstitutivno aktivan promoter. U jednom izvođenju, promoter je indukovani promoter. U jednom izvođenju, promotor je aktivan u embrionskoj matičnoj ćeliji pacova. ;[0300] U jednom izvođenju, ekspresioni konstrukt je uveden zajedno sa LTVEC-om. U jednom izvođenju, ekspresioni konstrukt je uveden odvojeno od LTVEC-a tokom vremenskog perioda. ;[0301] U jednom izvođenju, uvođenje jednog ili više polinukleotida u ćeliji, može biti izvršeno više puta tokom perioda vremena. U jednoj realizaciji, uvođenje jednog ili više polinukleotida u ćeliji se izvodi najmanje dva puta tokom vremenskog perioda, najmanje tri puta tokom vremenskog perioda, najmanje četiri puta tokom vremenskog perioda, najmanje pet puta u toku vremenskog perioda, najmanje šest puta u toku vremenskog perioda, najmanje sedam puta tokom vremenskog perioda, najmanje osam puta tokom vremenskog perioda, najmanje devet puta tokom vremenskih perioda, najmanje deset puta tokom vremenskog perioda, najmanje jedanaest puta, najmanje dvanaest puta tokom vremenskog perioda, najmanje trinaest puta u vremenskom periodu, najmanje četrnaest puta u vremenskom periodu, najmanje petnaest puta u toku perioda vremena, najmanje šesnaest puta tokom perioda vremena, najmanje sedamnaest puta tokom perioda vremena, najmanje osamnaest puta tokom perioda vremena, najmanje devetnaest puta tokom perioda vremena ili najmanje dvadeset puta u toku perioda vremena. ;[0302] U jednoj realizaciji, nukleazni agens je uveden u ćeliju istovremeno sa vektorom ciljanja ili velikim vektorom ciljanja (LTVEC). Alternativno, nukleazni agens je uveden odvojeno od vektora ciljanja ili LTVEC-a tokom vremenskog perioda. U jednoj realizaciji, nukleazni agens je uveden pre uvođenja vektora ciljanja ili LTVEC-a, dok u drugim realizacijama, nukleazni agens je uveden nakon uvođenja vektora ciljanja ili LTVEC-a. ;[0303] U jednoj realizaciji, korak skrininga sadrži kvantitativni test za procenu modifikacije alela (MOA) roditeljskog hromozoma. U jednom izvođenju, kvantitativni test se sprovodi putem kvantitativnog PCR-a. U jednom izvođenju, kvantitativni PCR je PCR u realnom vremenu (qPCR). U jednom izvođenju, PCR u realnom vremenu sadrži prvi set prajmera koji prepoznaje ciljni lokus i drugi set prajmera koji prepoznaje ne-ciljani referentni lokus. U jednom izvođenju, set prajmera sadrži fluorescentnu sondu koja prepoznaje amplifikovanu sekvencu. U jednom izvođenju, kvantitativno ispitivanje se vrši pomoću hibridizacije in situ posredovane fluorescencijom (FISH). U jednom izvođenju, kvantitativni test se sprovodi putem komparativne genomske hibridizacije. U jednom izvođenju, kvantitativni test se vrši putem izotermne DNK amplifikacije. U jednom izvođenju, kvantitativni test se vrši putem izotermne DNK amplifikacije. U jednom izvođenju, kvantitativni test se vrši pomoću kvantitativne hibridizacije na nepokretnoj sondi (ama). U jednom izvođenju, kvantitativni test se vrši preko Invader Probes®. U jednom izvođenju, kvantitativni test se sprovodi preko MMP eseja®. U jednom izvođenju, kvantitativni test se izvodi preko TaqMan® Molecular Beacon. U jednom izvođenju, kvantitativni test se vrši putem tehnologije Eclipse ™ sonde. (Videti, na primer, US2005/0144655). ;[0304] Dalje je obelodanjen postupak za izradu humanizovanog pacova, koji obuhvata: (a) modifikovanje genoma pluripotentne ćelije pacova sa vektorom ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline da bi se formirala donorska ćelija; (b) uvođenje donorske ćelije u pacovski embrion domaćina; i (c) nošenje embriona pacova domaćina u surogatnoj majci; gde surogatna majka proizvodi potomstvo pacova koje sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline. U jednoj realizaciji, ćelija donora se unosi u embrion pacovskog domaćina koji je u fazi blastociste ili u fazi pre-morula (tj., 4 ćelijska faza ili 8 ćelijska faza). Štaviše, korak (a) se takođe može izvesti sa velikim vektorom ciljanja (LTVEC) i / ili humanom sekvencom nukleinske kiseline najmanje 5Kb u dužini. U još daljim izvođenjima, genetska modifikacija je sposobna da se prenese preko germinativne linije. ;[0305] Genetski modifikovani pacovi, mogu biti generisani korišćenjem raznih metoda koje su ovde obelodanjene. Takve metode obuhvataju (1) integrisanje jednog ili više polinukleotida od interesa na ciljnom lokusu pluripotentne ćelije pacova da bi se generisala genetički modifikovana pluripotentna ćelija pacova koja sadrži insertovanu nukleinsku kiselinu u ciljanom genomskom lokusu, korišćenjem metoda koje su ovde obelodanjene; (2) odabiranje genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova koje imaju jedan ili više polinukleotida od interesa na ciljnom genomskom lokusu; (3) uvođenje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova u pacovski embrion domaćina; i (4) implantiranje embriona pacova domaćina koji sadrži genetski modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova u surogatnu majku. Generisano je potomstvo iz genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova. U jednoj realizaciji, donorska ćelija se unosi u embrion domaćina pacova u stadijumu blastociste ili u stadijumu pre-morula (tj., 4 ćelijska faza ili 8 ćelijska faza). Generisani su potomci koji su sposobni za prenošenje genetske modifikacije kroz germinativnu liniju. Pluripotentna ćelija pacova može biti ćelija ES pacova, kao što je ovde razmatrano na drugom mestu. ;[0306] Tehnike jezgrovitog transfera, mogu takođe biti korišćene za generisanje genetički modifikovanih pacova. Ukratko, metode jezgrovitog transfera uključuju korake: (1) uklanjanje jedra iz oocita; (2) izolovanje donorske ćelije ili jedra koje treba kombinovati sa enukleisanim oocitom; (3) ubacivanje ćelije ili jedra u oocite sa uklonjenim jedrom da bi se formirala rekonstituisana ćelija; (4) implantiranje rekonstituisane ćelije u matericu životinje da bi se formirao embrion; i (5) omogućavanje razvoja embriona. U takvim metodama oociti su generalno dobijeni od uginulih životinja, iako se mogu izolovati i iz jajovoda i / ili jajnika živih životinja. Oociti mogu sazrevati u različitim medijumima koji su poznati stručnjacima u struci pre enukleacije. Enukleacija oocita, može biti izvedena na niz načina poznatih stručnjacima u struci. Unošenje donorske ćelije ili jedra u oocite sa odstranjenim jedrom da bi se obrazovala rekonstituisana ćelija je obično mikroinjektovanjem donorske ćelije ispod zona pellucida pre fuzije. Fuzija se može indukovati primenom DC električnog impulsa preko kontaktne / fuzijske ravni (elektrofuzije), izlaganjem ćelija hemikalijama koje potpomažu fuziju, kao što je polietilenglikol ili putem inaktivisanih virusa, kao što je Sendai virus. Rekonstituisana ćelija se tipično aktivira električnim i / ili neelektričnim sredstvima pre, tokom i / ili nakon fuzije jezgrovitog donora i primaoca oocita. Metode aktivacije uključuju, električne impulse, hemijski indukovane šokove, penetraciju pomoću sperme, povećanje nivoa dvovalentnih katjona u oocitu i smanjenje fosforilacije ćelijskih proteina (kao putem inhibitora kinaze) u oocitu. Aktivirane rekonstituisane ćelije, ili embrioni, su obično kultivisane u medijumu koji je dobro poznat stručnjacima u struci i zatim prenesene u matericu životinje. Videti, na primer, US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/ 2008/017234A1 i US Patent br.7,612,250. ;[0307] Obezbeđen je metod za izradu genetski modifikovanog pacova, koji obuhvata modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova koji koristi ciljanje gena posredovano endonukleazom u cilju uvođenja modifikacije na genomskom lokusu pacova od interesa za formiranje modifikovane pluripotentne ćelije pacova, održavanje modifikovane pluripotentne ćelije pacova pod uslovima koji su dovoljni za održavanje pluripotencije, angažovanje modifikovane pluripotentne ćelije pacova kao donorske ćelije u embrionu domaćina pacova i nošenje embriona domaćina koji sadrži modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova u surogatnoj majci, gde je embrion domaćina nošen tokom trudnoće od strane surogatne majke i rođen je genetski modifikovan potomak pacova. ;[0308] U jednom primeru, ciljna sekvenca se nalazi u intronu. U jednom primeru, ciljna sekvenca se nalazi u eksonu. U jednom primeru, ciljna sekvenca se nalazi u promoteru. U jednom primeru, ciljna sekvenca se nalazi u regulatornom regionu promotera. U jednom primeru, ciljna sekvenca se nalazi u regionu inhensera. ;[0309] U jednom primeru, korak uvođenja je izvršen višekratno tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence. U jednom primeru, korak je izveden najmanje dva puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje tri puta u vremenskom periodu korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje četiri puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koji prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje pet puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje šest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje sedam puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje osam puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje devet puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje deset puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje jedanaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje dvanaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje trinaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje četrnaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje petnaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje šesnaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju određene ciljne sekvence, najmanje sedamnaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju posebne ciljne sekvence, najmanje osamnaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju posebne ciljne sekvence, najmanje devetnaest puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju posebne ciljne sekvence ili najmanje dvadeset puta tokom jednog vremenskog perioda korišćenjem mnoštva endonukleaza koje prepoznaju posebne ciljne sekvence. ;[0310] U jednom primeru, korak uvođenja je posredovan elektroporacijom, intracitoplazmatičnom injekcijom, adenovirusom, lentivirusom, retrovirusom, transfekcijom, transfekcijom posredovanom lipidom ili je posredovan putem Nucleofection™. ;[0311] U jednom primeru, postupak dalje obuhvata uvođenje egzogene nukleinske kiseline u genetski modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je transgen. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je uvedena u endogeni lokus. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je uvedena ektopično (npr., na lokusu različitom od njegovog endogenog lokusa). ;[0312] Obezbeđen je metod za izradu genetski modifikovanog pacova, koji obuhvata modifikovanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova angažovanjem inženjeringa genoma vođenog od strane RNK da uvede modifikaciju na genomskom lokusa pacova od interesa za formiranje modifikovane pluripotentne ćelije pacova, održavanje modifikovane pluripotentne ćelije pacova pod uslovima koji su dovoljni za održavanje pluripotencije, primenjujući modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova kao donorsku ćeliju u embrionu domaćina pacova i nošenjem embriona domaćina koji sadrži modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova u surogatnoj majci, gde je embrion domaćina nošen tokom trudnoće od strane surogatne majke i rođen je genetski modifikovan potomak pacova. ;[0313] U jednom primeru, metoda ima stopu ciljanja od oko 2% do oko 80%. ;[0314] U jednom primeru, metoda obuhvata zajedničko uvođenje mnoštva od drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži posebne genomske ciljne sekvence za multipleksno uređivanje određenih genomskih lokusa. U jednom primeru, metoda obuhvata uvođenje pluraliteta od drugog ekspresionog konstrukta koji sadrži posebne genomske ciljne sekvence za multipleksno uređivanje različitih genomskih lokusa tokom perioda vremena. ;[0315] U jednom primeru, korak uvođenja je izvršen višestruko tokom jednog vremenskog perioda. U jednom primeru, korak uvođenja (b) je izveden najmanje dva puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje tri puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje četiri puta tokom jednog perioda vremena, najmanje pet puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje šest puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje sedam puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje osam puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje devet puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje deset puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje jedanaest puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje dvanaest puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje trinaest puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje četrnaest puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje petnaest puta tokom jednog vremenskog perioda, najmanje šesnaest puta u jednom vremenskom periodu, najmanje sedamnaest puta u jednom vremenskom periodu, najmanje osamnaest puta u jednom vremenskom periodu, najmanje devetnaest puta u jednom vremenskom periodu, najmanje dvadeset puta u jednom vremenskom periodu. ;[0316] U jednom primeru, prvi ekspresioni konstrukt i drugi ekspresioni konstrukt su izraženi iz istog plazmida. ;[0317] U jednom primeru, korak uvođenja je posredovan elektroporacijom, intracitoplazmatičom injekcijom, adenovirusom, lentivirusom, retrovirusom, transfekcijom, putem transfekcije posredovane lipidom ili je posredovan putem Nucleofection ™. ;[0318] U jednom primeru, metoda dalje sadrži uvođenje egzogene nukleinske kiseline u pluripotentnu ćeliju pacova koja sadrži mutantni alel. ;[0319] U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je transgen. U jednoj realizaciji, egzogena nukleinska kiselina je uvedena u endogeni lokus. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je smeštena ektopično (npr., u lokusu drugačijem od njegovog endogenog lokusa). ;[0320] U jednom primeru, postupak dalje obuhvata uvođenje egzogene nukleinske kiseline u genetski modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je transgen. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je uneta u endogeni lokus. U jednom primeru, egzogena nukleinska kiselina je uvedena ektopično (npr., u lokusu drugačijem od njegovog endogenog lokusa). ;[0321] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu humanizovanog pacova, koji obuhvata postupak prema priključenim patentnim zahtevima, a koji obuhvata modifikovanje genoma pluripotentne ćelije pacova sa LTVEC-om koji sadrži umetak koji sadrži humanu sekvencu od najmanje 5 kb i koji angažuje pluripotentnu ćeliju pacova kao donorsku ćeliju, uvodeći donorsku ćeliju u embrion domaćina i nošenjem tokom trudnoće embriona domaćina u majci surogatu, pri čemu surogatna majka rađa potomka pacova koji obuhvata humanizaciju. ;[0322] Ostale metode za izradu genetski modifikovanog pacova koji sadrži u njegovoj germinativnoj liniji jednu ili više genetskih modifikacija, kao što je ovde opisano je obezbeđen, obuhvatajući: (a) modifikovanje ciljanog lokusa pacova koji se nalazi u prokariotskoj ćeliji koji koristi razne metode ovde opisane; (b) odabirom modifikovane prokariotske ćelije koja sadrži genetsku modifikaciju na ciljanom lokusu pacova; (c) izolovanje genetski modifikovanog vektora ciljanja iz genoma modifikovane prokariotske ćelije; (d) uvođenje genetski modifikovanog vektora ciljanja u pluripotentnu ćeliju pacova da bi se generisala genetički modifikovana pluripotentna ćelija koja sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu na ciljanom genomskom lokusu; (e) selektovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova; (f) uvođenje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova u embrion pacova domaćina u fazi pre-morula; i (g) implantiranje embriona pacova domaćina koji sadrži genetski modifikovanu pluripotentnu ćeliju pacova u surogatnu majku da generiše F0 generaciju izvedenu iz genetički modifikovane pluripotentne ćelije pacova. U takvim metodama vektor ciljanja može da sadrži veliki vektor ciljanja. Pluripotentna ćelija pacova može biti ES ćelija pacova. U daljim metodama, korak izolacije (c) dalje sadrži (c1) linearizaciju genetski modifikovanog vektora ciljanja (tj., genetski modifikovanog LTVEC-a). U još daljim primerima, korak uvođenja (d) dalje sadrži (d1) uvođenje nukleaznog agensa, kao što je ovde opisano u pluripotentnu ćeliju pacova. U jednom primeru, koraci odabira (b) i / ili (e) su izvršeni primenom selektivnog sredstva, kao što je ovde opisano u prokariotskoj ćeliji ili pluripotentnoj ćeliji pacova. U jednom primeru, koraci odabira (b) i / ili (e) su izvršeni putem ispitivanja modifikacije alela (MOA), kao što je ovde opisano. ;[0323] Dalji postupci za modifikovanje ciljnog genomskog lokusa ćelije sisara putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji su obelodanjeni i obuhvataju: (a) obezbeđivanje prokariotske ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu pacova, (b) unošenje u prokariotsku ćeliju vektora ciljanja koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5ʼ homolognim krajem pacova i 3ʼ homolognim krajem pacova, pri čemu ubačena nukleinska kiselina sadrži region sisara (uključujući, na primer, insert iz DNK čoveka), i (c) odabiranje ciljane prokariotske ćelije koja sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu na ciljnom lokusu pacova, pri čemu je prokariotska ćelija sposobna da eksprimira rekombinazu koja posreduje BHR. Korak (a1) može obuhvatati obezbeđivanje prokariotske ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži pacovsku nukleinsku kiselinu koja sadrži prvi polinukleotid koji sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvog nukleaznog agensa, a korak (b1) može dalje da sadrži eksprimiranje u prokariotskoj ćeliji nukleaznog agensa koji pravi rez ili prekid dvostrukog lanca na ili blizu prvog mesta za prepoznavanje. ;Koraci (a) - (c) se serijski mogu ponoviti, kako je ovde obelodanjeno kako bi se omogućilo unošenje višestrukih umetaka nukleinskih kiselina u ciljanom lokusu pacova u prokariotskoj ćeliji. Jednom kada je ciljani genomski lokus "izgrađen" sa prokariotskom ćelijom, vektor ciljanja koji sadrži modifikovani ciljni lokus pacova može biti izolovan iz prokariotske ćelije i uveden u ciljni genomski lokus unutar pluripotentne ćelije pacova. Pluripotentne ćelije pacova (tj., ćelije ES pacova) koje sadrže modifikovani genomski lokus, mogu se zatim izvesti u genetski modifikovane pacove. ;[0324] U nekim primerima, razne genetske modifikacije ciljnih genomskih lokusa, ovde opisane, mogu biti izvedene serijom homolognih rekombinacionih reakcija (BHR) u bakterijskim ćelijama koje koriste LTVEC dobijene od DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetičkog inženjeringa (videti npr. US Pat. Br. 6,586,251 i Valenzuela D.M. i sar. ( 2003), Inženjering visokog prolaska genomskog miša spojen sa ekspresionom analizom visoke rezolucije, Nature Biotechnology 21 (6): 652-659). ;[0325] U nekim realizacijama, ciljane ES ćelije pacova koje sadrže različite genske modifikacije, kao što je ovde opisano, korišćene su kao inserti ES ćelija i unošeni u embrion u stadijumu pre-morula iz odgovarajućeg organizma, na primer, embrion miša u 8. ćelijskom stadijumu, preko metode VELOCIMOUSE® (videti npr., US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754 i US 2008-0078000 A1). Embrion pacova koji sadrži genetski modifikovane ćelije ES pacova je inkubiran do stadijuma blastociste, a zatim implantiran u surogatnu majku kako bi proizvela F0. Pacovi sa genetički modifikovanim genomskim lokusom, mogu biti identifikovani putem analize modifikacije alela (MOA), kao što je ovde opisano. Dobijeni pacov generacije F0 koji je dobijen iz genetski modifikovanih ćelija ES pacova je ukršten sa pacovom divljeg tipa za dobijanje potomaka F1 generacije. Nakon genotipizacije sa specifičnim prajmerima i / ili probama, F1 pacovi koji su heterozigotni za genetski modifikovani genomski lokus su ukrštani jedni sa drugima da bi proizveli pacove koji su homozigotni za genetski modifikovani genomski lokus. Alternativno, ženka pacova F0 i mužjak pacova F0 od kojih svaki ima genetsku modifikaciju, mogu biti ukršteni da bi se dobio homozigotni F1 pacov za genetsku modifikaciju. ;[0326] Ovde je obezbeđen genetski modifikovani genom pacova, koji obuhvata ciljanu modifikaciju endogene sekvence nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom nukleinske kiseline koja nije od pacova. ;[0327] U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska je dužine od oko 5kb do oko 200kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 5kb do oko 10kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 10kb do oko 20kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 20kb do oko 30kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 30kb do oko 40kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 40kb do oko 50kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 50kb do oko 60kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 60kb do oko 70kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 70kb do oko 80kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 80kb do oko 90kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 90kb do oko 100bb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 100kb do oko 110kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 110kb do oko 120kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 120kb do oko 130kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 140kb do oko 150kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 150kb do oko 160kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije pacovska kreće se od oko 160kb do oko 170kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 170kb do oko 180kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 180kb do oko 190kb. U jednom primeru, homologna ili ortologna sekvenca nukleinske kiseline koja nije od pacova kreće se od oko 190kb do oko 200kb. Različiti polinukleotidi od interesa koji mogu biti korišćeni u insertu nukleinske kiseline su ovde opisani su na drugom mestu. ;;6. Ćelije ;;[0328] Različite metode i kompozicije koje su ovde opisane, koriste sistem za ciljanje genomskog lokusa u ćeliji. U jednom primeru, ćelija je pluripotentna ćelija. U jednom primeru, pluripotentna ćelija je ne-humana pluripotentna ćelija. U jednom primeru, nehumana pluripotentna ćelija je pluripotentna ćelija sisara. U jednom primeru, pluripotentna ćelija je humano indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. ;[0329] U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija je pluripotentna ćelija pacova. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija pacova je embrionalna matična (ES) ćelija pacova. U jednoj realizaciji, pluripotentna ćelija pacova je indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija ili je razvojno ograničena progenitorska ćelija. U drugim izvođenjima, pluripotentna ćelija pacova je u stanju da održi svoju pluripotenciju nakon najmanje jednog ciljanog genetičkog, modifikovanja njenog genoma i sposobna je da prenese ciljanu modifikaciju na germinativnu liniju F1 generacije. ;[0330] U jednom primeru, pluripotentna ćelija je nehumano oplođeno jaje u jednoj ćelijskoj fazi. U jednom primeru, nehumano oplođeno jaje je oplođeno jaje sisara. U jednom primeru, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje glodara u jednoj ćelijskoj fazi. U jednom primeru, oplođeno jaje sisara je oplođeno jaje pacova ili miša u jednoj ćelijskoj fazi. ;[0331] Različite ćelije korišćene u postupku i kompozicijama ovde opisanim, mogu takođe da sadrže prokariotske ćelije, kao što je bakterijska ćelija, uključujući E. Coli. U specifičnim primerima, prokariotska ćelija je soj E. Coli sposoban za rekombinaciju. U jednom primeru prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazu, dok u drugim slučajevima, prokariotska ćelija ne sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinazu, a nukleinska kiselina koja kodira rekombinazu je uvedena u prokariotsku ćeliju. U jednom primeru, nukleinska kiselina koja kodira rekombinazu sadrži DNK ili mRNK. U nekim primerima, nukleinska kiselina koja kodira rekombinazu je pABG. U jednom primeru rekombinaza je izražena pod kontrolom indukovanog promotera. U jednom izvođenju, ekspresija rekombinaze je kontrolisana pomoću arabinoze. ;;A. Embrionalne matične (ES) ćelije pacova ;;[0332] Kao što je detaljno opisano u prethodnom tekstu, različite kompozicije i postupci koji su ovde obelodanjeni, mogu da koriste embrionalne matične (ES) ćelije od pacova. U jednom izvođenju, pluripotentna ćelija pacova je ES ćelija pacova. U jednom izvođenju, ES ćelija pacova izvedena od soja pacova je Wistar pacov, LEA soj, soj Sprague Dawley, soj Fischer, F344, F6 i Dark Agouti ili ACI. U jednoj realizaciji, soj pacova je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova je izvedena iz prirodnog soja. U jednom izvođenju, ES ćelija pacova je izvedena iz soja odabranog od soja DA i soja ACI. U specifičnom izvođenju, ES ćelija pacova je izvedena iz soja ACI. U jednom izvođenju, ES ćelija pacova je izvedena od blastociste pacova. ;[0333] U drugim izvođenjima, ES ćelija pacova je karakterisana ekspresijom najmanje jednog pluipotentnog markera. U specifičnim realizacijama, ES ćelija pacova je karakterisana ekspresijom pluripotentnog markera koji sadrži Oct-4, Sox-2, alkalnu fosfatazu ili njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova je ES ćelija mužjaka (XY) pacova ili ES ćelija ženke (XX) pacova. ;[0334] U jednoj realizaciji, praćenjem jedne do 15 serijskih genetičkih modifikacija, genetički modifikovane ES ćelije pacova nakon izlaganja medijumu za diferencijaciju, mogu da se razlikuju u mnoštvu tipova ćelija. ;[0335] U jednoj realizaciji, sledeći od jedne do 15 serijskih genetskih modifikacija, genetički modifikovane ES ćelije pacova mogu da se održe u nediferenciranom stanju u kulturi. U jednom izvođenju, genetski modifikovane i kultivisane ES ćelije pacova u nediferenciranom stanju, kada se koriste kao donorske ćelije u embrionu domaćina pacova, nastanjuju embrion i formiraju blastocist koji sadrži jednu do petnaest genetskih modifikacija. U jednoj realizaciji, blastocist, kada se implantira u surogatnu majku pod uslovima pogodnim za trudnoću, razvija se u potomstvo F0 pacova koji sadrže jednu do 15. genetskih modifikacija. ;[0336] Obelodanjena je izolovana ES ćelija pacova koja je sposobna da održi pluripotenciju nakon jedne ili više genetskih modifikacija in vitro, a koja je sposobna da prenese genetički modifikovani genom u germinativnu liniju F1 generacije. ;[0337] U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova održava svoju pluripotenciju da se razvije u mnoštvo ćelijskih tipova nakon jedne ili više serijskih genetskih modifikacija in vitro (npr. dve, tri, četiri, pet ili šest ili više serijskih genetskih modifikacija). U jednoj realizaciji, genetička modifikacija je posredovana elektroporacijom, intracitoplazmatičnom injekcijom, virusnom infekcijom, adenovirusom, lentivirusom, retrovirusom, transfekcijom, putem transfekcije posredstvom lipida ili pomoću Nucleofaction™. ;[0338] U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova održava svoju pluripotenciju da se razvije u mnoštvo ćelijskih tipova nakon jednog kruga elektroporacije sa egzogenom nukleinskom kiselinom. U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova održava svoju pluripotenciju da se razvije u mnoštvo ćelijskih tipova nakon drugog, trećeg, četvrtog, petog, šestog, sedmog, osmog, devetog, desetog, jedanaestog, dvanaestog, trinaestog, četrnestog ili petnaestog kruga elektroporacije sa egzogenom nukleinskom kiselinom. ;[0339] U drugim izvođenjima, korišćene ES ćelije pacova su one koje su opisane u Američkoj prijavi br.14/185,703, podnetoj 20. februara 2014. ;[0340] Pluripotentna ćelija pacova angažovana u različitim postupcima i kompozicijama, ovde opisanim, može biti okarakterisana ekspresijom najmanje jednog pluripotentnog markera koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, i / ili njihovu kombinaciju. U drugim slučajevima, pluripotentna ćelija pacova koja se koristi u različitim postupcima i kompozicijama ovde opisanim, okarakterisana je pomoću jedne ili više od sledećih karakteristka: (a) nedostatkom ekspresije jednog ili više pluripotentnih markera koji sadrže c-Myc, Ecat1 i / ili Rexo1; (b) nedostatkom ekspresije jednog ili više mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury i / ili Bmpr2; (c) nedostatkom ekspresije jednog ili više endodermalnih markera koji sadrže Gata6, Sox17 i / ili Sox7; ili (d) nedostatkom ekspresije jednog ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin i / ili Pax6. Kako se ovde koristi, "nedostatak ekspresije", pošto se odnosi na ekspresiju pluripotentnog markera, znači da je ekspresija pluripotentnog markera na ili ispod eksperimentalne pozadine, kao što je određeno za svaki pojedinačni eksperiment. ;[0341] U jednom neograničavajućem izvođenju, ES ćelije pacova koje su ovde obelodanjene imaju jedno ili više od bilo kojih sledećih svojstava: ;;(a) imaju kompetentnost germinativne linije, što znači da kada se ES ćelija pacova implantira u embrion domaćina pacova, genom ES ćelijske linije pacova se prenosi na potomstvo; ;(b) poseduju kompetenciju reproduktivnih ćelija praćenjem najmanje jedne ciljane genetičke modifikacije, što znači kada se ES ćelija pacova koja ima ciljanu genetsku modifikaciju implantira u embrion domaćina pacova, ciljana genetska modifikacija unutar genoma ES ćelijske linije se prenosi na potomstvo; ;(c) poseduju pluripotenciju in vitro; ;(d) poseduju totipotenciju in vitro; ;(e) kada se kultivišu in vitro labavo adheriraju za sloj hranljivih ćelija; ;(f) kada se kultivišu in vitro oblikuju sferične kolonije kada su zasejane na ploči na sloju hranljivih ćelija in vitro; ;(g) održavaju pluripotenciju kada se kultivišu in vitro pod uslovima koji sadrže sloj hranljivih ćelija koji nije genetski modifikovan da eksprimira inhibitorni faktor leukemije (LIF), pri čemu medijum za kulturu sadrži dovoljnu koncentraciju LIF-a; (h) održavaju pluripotenciju kada se kultivišu in vitro pod uslovima koji sadrže sloj hranljivih ćelija, pri čemu medijum za kulturu sadrži LIF miša ili aktivnu varijantu ili njegov fragment; ;(i) sadrže molekularni signaturu koja je okarakterisana pomoću ;;i) ekspresije jednog ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, koji sadrže protein povezan sa adherenthim spojevima (Ajap1), Claudin 5 (Cldn5), faktor 9 Cdc42 guanin nukleotidne razmene (Arhgef9), kalcijum / kalmodulin-zavisnu protein kinazu IV (Camk4), ephrin-A1 (Efna1), EPH receptor A4 (Epha4), vezivni protein beta 5 (Gjb5), faktor rasta nalik insulinu koji vezuje protein-nalik 1 (Igfbpl1), Interleulin 36 beta (II1f8), interleukin 28 receptor, alfa (II28ra), faktor 1 za određivanje levo-desno (Lefty 1), alfa receptor leukemijskog inhibitornog faktora (Lifr), receptor 2 lizofosfatidne kiseline (Lpar2), Neuronalni pentraksinski receptor (Ntm), protein tirozin fosfataze ne-receptor tipa 18 (Ptpn18), homeokutiju 2 kaudalnog tipa (Cdx2), Fibronektin tipa III i domeni 1 ponavljanja ankirina (Fank1), Forkhead kutija E1 (tiroidni transkripcioni faktor 2) (Foxe1), dlakasti / inhenser rascepa povezan sa YRPW motivom 2 (Hey2), Faktor 1 za vezivanje limfoidnog inhensera (Lef1), Sal-like 3 (Drosophila) (Sall3), SATB homeokutija 1 (Satb 1), miR-632 ili njihovu kombinaciju; ;ii) ekspresije najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više gena specifičnih za ES ćelije pacova, koji sadrže protein povezan sa adherenthim spojevima (Ajap1), Claudin 5 (Cldn5), faktor 9 Cdc42 guanin nukleotidne razmene (Arhgef9), kalcijum/kalmodulin-zavisnu protein kinazu IV (Camk4), ephrin-A1 (Efna1), EPH receptor A4 (Epha4), vezivni protein beta 5 (Gjb5), faktor rasta nalik insulinu koji vezuje protein-nalik 1 (Igfbpl1), Interleulin 36 beta (II1f8), interleukin 28 receptor, alfa (II28ra), faktor 1 određivanja levo-desno (Lefty 1), alfa receptor leukemijskog inhibitornog faktora (Lifr), receptor 2 lizofosfatidne kiseline (Lpar2 ), Neuronalni pentraksinski receptor (Ntm), protein tirozin fosfataze ne-receptor tipa 18 (Ptpn18), homeobox 2 kaudalnog tipa (Cdx2), Fibronektin tipa III i ankirinski ponovljeni domeni 1 (Fank1), Forkhead kutija E1 (tiroidni transkripcioni faktor 2) (Foxe1), dlakasti / inhenser rascepa povezan sa YRPW motivom 2 (Hey2), Faktor 1 za vezivanje limfoidnog inhensera (Lef1), Sallike 3 (Drosophila) (Sall3), SATB homeokutija 1 (Satb 1), miR-632 ili njihovu kombinaciju; ;iii) povećanja ekspresije najmanje 20 puta od jednog ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je navedeno u Tabeli 9 u poređenju sa F1H4 mišjom ES ćelijom; ;iv) povećanja ekspresije najmanje 20 puta od najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je prikazano u Tabeli 9 u poređenju sa F1H4 mišjom ES ćelijom; ;v) ekspresije jednog ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je prikazano u Tabeli 10; ;vi) ekspresije najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je prikazano u Tabeli 10; ;;vii) povećanja ekspresije pri najmanje 20 puta jednog ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je navedeno u Tabeli 10 u poređenju sa F1H4 mišjom ES ćelijom; ;viii) povećanja ekspresije pri najmanje 20 puta od najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je prikazano u Tabeli 10 u poređenju sa F1H4 mišjom ES ćelijom; ;ix) smanjenja ekspresije pri najmanje 20 puta od jednog ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je prikazano u Tabeli 8 u poređenju sa F1H4 mišjom ES ćelijom; ;x) smanjenja ekspresije najmanje 20 puta od najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više gena specifičnih za ES ćeliju pacova, kao što je prikazano u Tabeli 8 u poređenju sa F1H4 mišjom ES ćelijom; ;xi) bilo koje kombinacije ekspresije specifičnih gena ES ćelije pacova ćelija iz delova (i) - (x); ;xii) relativnog nivoa ekspresije markera pluripotencije, kao što je prikazano u Tabeli 11 za najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18 navedenih markera pluripotencije. Videti, kolonu rangiranja pluripotencije u Tabeli 11 za nivoe relativne ekspresije; ;xiii) relativnog nivoa ekspresije mezodermalnih markera, kao što je prikazano u Tabeli 11 za najmanje 2, 3 ili 4 od prikazanih mezodermalnih markera. Videti, kolonu mezodermalnog rangiranja u Tabeli 11 za nivoe relativne ekspresije; xiv) relativnog nivoa ekspresije endodermalnih markera, kao što je prikazano u tabeli 11, za najmanje 2, 3, 4, 5 ili 6 od navedenih endodermalnih markera. Videti, kolonu endodermalnog rangiranja u Tabeli 11 za nivoe relativne ekspresije; xv) relativnog nivoa ekspresije neuronskih markera, kao što je prikazano u Tabeli 11 za najmanje 2 i 3 od navedenih neuronskih markera. Videti, kolonu neuronskog rangiranja u Tabeli 11 za nivoe relativne ekspresije; ;xvi) relativnog nivoa ekspresije markera trofektoderma, kao što je prikazano u Tabeli 11 za navedene trofektodermne markere. Videti, kolonu trofektodermnog rangiranja u Tabeli 11 za nivoe relativne ekspresije; ;xvii) bilo koji nivo relativne ekspresije jednog ili više (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30) markera pluripotencije, mezodermalnih markera, endodermalnih markera, neuronskih markera i / ili trofektodermnih markera prikazanih u tabeli 11; ;xviii) relativnog nivoa ekspresije za svaki od markera datih u tabeli 11; ;xix) bilo koje kombinacije signatura navedenih iz xii-xiix; i / ili; ;xx) bilo koje kombinacije potpisa navedenog u i-xiix; ;(j) imaju sposobnost da proizvedu F0 pacova; ;(k) sposobne su da budu subkultivisane i održavaju nediferencirano stanje; ;(l) imaju isti broj hromozoma kao normalne ćelije pacova; ;(m) održavaju pluripotenciju in vitro bez potrebe za parakrinskom LIF signalizacijom; (n) imaju sposobnost samo-obnove, što znači da se dele neodređeno uz održavanje pluripotencije; ;(o) pacovske ES ćelije izražavaju najmanje jednog pluripotentnog markera koji sadrži Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, i / ili njihovu kombinaciju; ;(p) ES ćelije pacova ne izražavaju jedan ili više diferencijacijskih markera koji sadrže c-Myc, Ecat1 i / ili Rexo1; ;(q) pacovske ES ćelije ne izražavaju jedan ili više mezodermalnih markera koji sadrže Brachyury, Bmpr2 i / ili njihovu kombinaciju; ;(r) pacovske ES ćelije ne izražavaju jedan ili više endodermalnih markera koji sadrže Gata6, Sox 17, Sox7 i / ili njihovu kombinaciju; i / ili ;(s) pacovske ES ćelije ne izražavaju jedan ili više neuronskih markera koji sadrže Nestin, Pax6 i / ili njihovu kombinaciju. ;;[0342] Jedna ili više karakteristika opisanih u (a) - (s) mogu biti prisutne u pacovskoj ES ćeliji, populaciji ES ćelija pacova ili ES ćelijskoj liniji pacova korišćenim u postupcima i kompozicijama, ovde opisanim, pri čemu ES ćelije pacova nisu podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji. Štaviše, nakon jedne ili više genetskih modifikacija ciljnog lokusa pacova, kao što je već detaljno prethodno opisano, jedna ili više karakteristika opisanih u (a) - (s) mogu biti zadržane u ES ćeliji pacova nakon genetske modifikacije ciljnog lokusa. ;[0343] U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova ispoljava efikasnost homologne rekombinacije od najmanje 2%, najmanje 3%, najmanje 4%, najmanje 5%, najmanje 6%, najmanje 7%, najmanje 8%, najmanje 9%, najmanje 10%, najmanje 11%, najmanje 12%, najmanje 13%, najmanje 14%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75% ili najmanje 80%. ;[0344] U jednoj realizaciji, efikasnost homologne rekombinacije koja koristi ES ćeliju pacova je veća od 4%. ;[0345] U jednoj realizaciji, pacovska ES ćelija ima vreme duplikacije u rasponu od 24 sata do 36 sati. U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova ima vreme duplikacije od 25 sati. ;[0346] U jednoj realizaciji, pacovska ES ćelija može biti pasažirana do najmanje 15 puta u 2i medijumu (Millipore kat. SF016-200). U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova može biti pasažirana najmanje 14 puta u 2i medijumu (Millipore kat. br. SF016-200). U jednoj realizaciji, pacovska ES ćelija može biti pasažirana najmanje 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 puta u 2i medijumu. ;[0347] U jednoj realizaciji, kada se transplantira u embrion pacova u stadijumu pre-morula, ES ćelija pacova može doprineti najmanje 90% ćelija u generaciji F0. U jednoj realizaciji, kada se transplantira u embrion pacova u stadijumu pre-morula, ES ćelija pacova može doprineti najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ćelija u generaciji F0. ;[0348] U specifičnim realizacijama, različite ES ćelije i ćelijske linije angažovane u različitim postupcima i preparatima, ovde opisanim, korišćene su za generisanje ciljane modifikacije na ciljnom lokusu. ES ćelija pacova koja ima ove ciljane genetske modifikacije, može biti kompetentna za germinativnu liniju, što znači kada se ES ćelija pacova koja ima ciljanu genetsku modifikaciju implantira u embrion domaćina pacova, ciljana genetska modifikacija ES ćelije pacova se prenosi na potomstvo (tj. populacija F1). Stoga, u različitim aspektima, ES ćelije pacova u različitim metodama i preparatima, angažovane su za dobijanje visoke frekvencije ili visoke efikasnosti transmisije reproduktivnih ćelija iz genoma pacovskih ćelija iz ES ćelija pacova koje su podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji. U različitim realizacijama, frekvencija prenosa germinativne linije je veća od 1: 600, veća od 1: 500, veća od 1: 400, veća od 1: 300, veća od 1: 200 i veća od 1: 100. U različitim realizacijama, frekvencija transmisije germinativne linije je veća od 1%, veća od 2%, veća od 3%, veća od 4%, veća od 5%, veća od 6%, veća od 7%, veća od 8%, veća od 9%, veća od 10%, do oko 16%, veća od 25%, veća od 50%, veća od 60%, veća od 65%, veća od 70%, veća od 75% ili veća. U različitim realizacijama, frekvencija transmisije germinativne linije se kreće od 9% do 16%. U različitim aspektima, procenat potomstva dobijenog od rESC donora u F1 generaciji je 1% ili više, 2% ili više, 3% ili više, 10% ili više, 20% ili više, 30% ili više, 40 % ili više, 50% ili više, 60% ili više, od 3% do oko 10% ili više; od 3% ili više do oko 63%, od oko 10% do oko 30 %, od oko 10% do oko 50%, od oko 30% do oko 70%, od oko 30% do oko 60%, od oko 20% do oko 40%, od oko 20% do 65%, ili od oko 40% do 70%. Stoga, ES ćelija pacova koja ima ciljanu genetsku modifikaciju, ima sposobnost da prenese njihov genom u populaciju F1. ;[0349] ES ćelija pacova koja ima ciljanu genetsku modifikaciju, može biti pluripotentna i / ili totipotentna. Različite metode se mogu koristiti da bi se utvrdilo da li je ES ćelija pacova pluripotentna. Na primer, ES ćelija se može analizirati za ekspresiju različitih pluripotentnih markera uključujući, ali bez ograničenja na, Oct-4, Sox2, alkalnu fosfatazu ili njihovu kombinaciju. Videti, na primer, Okamoto, K. i sar., Cell, 60: 461-472 (1990), Scholer, H.R. i sar., EMBO J. 9: 2185-2195 (1990)) i Nanog (Mitsui, K. i sar., Cell, 113: 631-642 (2003), Chambers, I. i sar., Cell, 113: 643-655 (2003) za različite metode ispitivanja prisustva ili nivoa takvih markera. Videti i slike 2 i 3, ovde obelodanjene. Drugi pluripotentni markeri uključuju, na primer, prisustvo najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5 pluripotentnog markera koji sadrži Nanog, Klf4, Dppa2, Fgf4, Rex1, Eras, Err-beta i / ili Sall3. Drugi pluripotentni markeri uključuju, na primer, odsustvo najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 pluripotentnog markera koji sadrži: T / Brachyury, Flk1, Nodal, Bmp4, Bmp2, Gata6, Sox17, Hhex1, Sox7 i / ili Pax6. ;[0350] U specifičnim realizacijama, ekspresija i / ili nivo ekspresije ovih markera mogu se odrediti korišćenjem RT-PCR-a. Na raspolaganju su različiti kompleti za određivanje nivoa i / ili prisustva alkalne fosfataze, uključujući, na primer, komplet za bojenje tkiva ALP (Sigma) i komplet I podloge vektor crveno alkalna fosfataza (Funakoshi) i slično. Dodatni testovi uključuju, in situ hibridizaciju, imunohistohemiju, imunofluorescenciju. U specifičnim realizacijama, ES ćelija pacova je karakterisana ekspresijom najmanje jednog pluripotentnog markera, uključujući, na primer ekspresiju Oct-4, Sox2, alkalne fosfataze ili njihovu kombinaciju, a poželjno sva tri od ovih markera. ;[0351] Različite ES ćelije pacova korišćene u postupku i preparatima, ovde opisanim, mogu biti u stanju održavanja pluripotencije i / ili totipotencije dok se održavaju u uslovima kultivisanja in vitro. Prema tome, različite ES ćelije pacova koje su ovde obezbeđene, mogu u nekim realizacijama da budu podkultivisane uz istovremeno održavanje nediferenciranog stanja. Različite metode kultivisanja ES ćelija pacova su detaljno razmotrene na drugim mestima ovde i u Američkoj patentnoj prijavi br. 14/185,103, podnetoj 20. februara 2014. godine. ;[0352] U nekim realizacijama, ovde korišćene embrionalne matične ćelije pacova, izolovane su od embriona pacova koji koriste različite tehnike izolacije, prečišćavanja i širenja kulture, koje se detaljno razmatrane u Američkoj prijavi u Američkoj patentnoj prijavi br. 14 / 185,103, podnetoj 20. februara , 2014. ;[0353] "Izolovana" pacovska ES ćelija ili pacovski embrion je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Izraz "izolovana" može značiti oslobođena od 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sastojaka sa kojima se komponenta nalazi u svom prirodnom stanju. Kao što je ovde korišćeno, pacovska ES "ćelijska linija" obuhvata populaciju izolovanih ćelija pacova koje su razvijene iz jedne ES ćelije pacova i stoga populacija ćelija unutar date ćelijske linije ima uniformni genetski sastav osim za mutacije ili kariotipske promene koje se javljaju tokom razmnožavanja ili tokom ciljanih genetskih modifikacija. Na primer, ES ćelije pacova mogu biti okarakterisane visokim nivoom euploidije. Ipak, u nekim ćelijskim linijama nivo euploidije je manji od 100% zbog kariotipskih promena u razmnožavanju linije iz jedne ćelije. Štaviše, data populacija pacovskih ES ćelija može sadržati najmanje 1x10<3>, 1x10<4>, 1x10<5>, 1x10<6>, 1x10<7>, 1x10<8>, 1x10<9>, ili 1x10<10>ćelija ili više. Neke ćelijske populacije imaju dovoljno ćelija da omoguće selekciju željene modifikovane ćelije, ali ne i preterano veći broj, kako bi se smanjila mogućnost mutacija ili kariotipskih promena koje se razvijaju u ćelijskoj liniji. Na primer, neke ćelijske populacije imaju 1x10<3>do 1x10<6>ćelija. ;[0354] Kao što je ovde razmatrano na drugom mestu, obezbeđene su različite metode za ciljanu genetsku modifikaciju ES ćelijske linije pacova. Kada se takve metode izvode, najmanje jedna ćelija unutar ES ćelijske linije pacova sadrži ciljanu genetsku modifikaciju. Kroz različite tehnike kultivisanja i / ili selekcije proizvedene su pacovske ES ćelijske linije koje imaju jednu ili više željenih ciljanih genetskih modifikacija. ;[0355] U specifičnim realizacijama, pacovska ES ćelija, populacija ES ćelija pacova ili pacovske ES ćelijske linije (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) su euploidne i stoga imaju broj hromozoma koji je tačno višestruk od haploidnog broja. U daljoj realizaciji, ES ćelija pacova, populacija ES ćelija pacova ili ES ćelijska linija pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) su diploidne i stoga imaju dva haploidna skupa homolognih hromozoma. Kada se odnosi na populaciju ES ćelija pacova ili populaciju ćelija iz date populacije ES ćelija pacova ili ES ćelijske linije pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju), najmanje oko 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% ćelija sa datom populacijom su euploidne i / ili diploidne. U drugim slučajevima, kada se odnosi na populaciju ES ćelija pacova ili populaciju ćelija iz date ćelijske linije ES pacova (koja nije prošla ciljanu genetsku modifikaciju i / ili ima ciljanu genetsku modifikaciju), najmanje oko 50% do 95%, oko 60% do 90%, oko 60% do 95%, oko 60% do 85%, oko 60% do 80%, oko 70% do 80%, oko 70% do 85%, oko 70% do oko 90%, oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 100%, oko 90% do oko 99%, oko 90% do oko 98%, oko 90% do oko 97%, oko 90% do oko 95% ćelija u datoj populaciji su euploidne i / ili diploidne. ;[0356] U još daljim realizacijama, ES ćelija pacova, populacija ES ćelija pacova ili ES ćelijska linija pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) imaju 42 hromozoma. Kada se odnosi na populaciju ES ćelija pacova ili populaciju ćelija iz date ćelijske linije ES pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) najmanje oko 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% ćelija sa datom populacijom ima 42 hromozoma. U drugim slučajevima, kada se odnosi na populaciju ES ćelija pacova ili populaciju ćelija iz date ćelijske linije ES pacova (koja nije prošla ciljanu genetsku modifikaciju i / ili ima ciljanu genetsku modifikaciju), najmanje oko 50% do 95%, oko 60% do 90%, oko 60% do 95%, oko 60% do 85%, oko 60% do 80%, oko 70% do 80%, oko 70% do 85%, oko 70% do oko 90%, oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 100%, oko 90% do oko 99%, oko 90% do oko 98%, oko 90% do oko 97%, oko 90% do oko 95% ćelija unutar date populacije ima 42 hromozoma. ;[0357] U daljim realizacijama, ES ćelija pacova, populacija ES ćelija pacova ili ES ćelijske linije pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ovde opisane, obrazuju sferne kolonije kada su zasejane na ploči na sloju hranljive ćelije in vitro. Morfologija "poput sfere" se odnosi na oblik kolonija ES ćelija pacova u kulturi, pre nego na oblik pojedinačnih ES ćelija. Kolonije ES ćelija pacova su sferične. Kolonije, koje su labavo vezane za hranljive ćelije, izgledaju kružno (imaju kružnu morfologiju). Slobodne plutajuće kolonije su nalik sferične. Kolonije ES ćelija pacova su sferične i vrlo kompaktne, što znači: granice između ćelija se veoma teško vide. Rub kolonije izgleda svetao i oštar. Pojedinačna jezgra je teško razlikovati jer su ćelije veoma male (tako da jedro preuzima većinu volumena ćelije). Mišje ES ćelije formiraju izdužene kolonije i snažno se povezuju sa hranljivim ćelijama. Morfologija mESC-a može varirati sa sojem; na primer, B6 kolonije su više okrugle i više kupolaste nego kolonije F1H4, ali su i dalje više izdužene od rESC-a. Humane kolonije ES ćelija su ravne i šire nego mESC kolonije. ES kolonije instant pacova nisu ravne i ne podsećaju na kolonije humanih ES ćelija. ;[0358] U još daljim realizacijama, ES ćelija pacova, populacija ES ćelija pacova ili ES ćelijska linija pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) imaju kružnu morfologiju. Skala morfologije za krug je data ispod, gde rezultat od 10 predstavlja savršen krug i skor od 1 predstavlja elipsu. ;[0359] Morfološka skala kruga: ;;10= Krug sa strukturom koja ima longitudinalnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture i jednake su dužine. ;9 = Struktura koja ima longitudinalnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,9999 do 0,9357 dužine druge ose. ;8 = Struktura koja ima longitudinalnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,9357 do 0,875 dužine druge ose. ;7 = Struktura koja ima longitudinalnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,875 do oko 0,8125 dužine od druge ose. 6 = Struktura koja ima uzdužnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,8125 do 0,750 dužine druge ose. ;5 = Struktura koja ima uzdužnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,750 do 0,6875 dužine druge ose. ;4 = Struktura koja ima uzdužnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,6875 do 0,625 dužine druge ose. ;3 = Struktura koja ima uzdužnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,625 do 0,5625 dužine druge ose. ;2 = Struktura koja ima uzdužnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar kruga, pri čemu je jedna od osi između 0,5625 do 0,523 dužine druge ose. ;1 = Elipsa je definisana da ima uzdužnu osu i vertikalnu osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,523 do 0,500 dužine druge ose. ;;[0360] U jednom neograničavajućem izvođenju, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ćelijske linije ES pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% od ćelija sa datom populacijom ima kružnu morfološku ocenu od 10, 9 ili 8. U drugim izvođenjima, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ćelijske linije ES pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50% do 95%, oko 60% do 90%, oko 60% do 95%, oko 60% do 85%, oko 60% do 80%, oko 70% do 80%, oko 70% do 85%, oko 70% do oko 90%, oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 100%, oko 90% do oko 99%, oko 90% do oko 98%, oko 90% do oko 97%, oko 90% do oko 95% ćelija unutar date populacije ima kružnu morfološku ocenu od 10, 9 ili 8. ;[0361] U drugom neograničavajućem izvođenju, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ES ćelijske linije pacova (koja nije podvrgnuta ciljanoj genetskoj modifikaciji i / ili ima ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% ćelija sa datom populacijom ima skor kružne morfologije od 7, 6, 5, 4 ili 3. U drugim neograničavajućim izvođenjima, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ćelijske linije ES pacova (koje nisu prošle ciljanu genetsku modifikaciju i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50% do 95, oko 60% do 90%, oko 60% do 95%, oko 60% do 85%, oko 60% do 80%, oko 70% do 80%, oko 70% do 85%, oko 70% do oko 90%, oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 100%, oko 90% do oko 99%, oko 90% do oko 98%, oko 90% do oko 97%, oko 90% do oko 95% ćelija unutar date populacije ima skor kružne morfologije od 7, 6, 5, 4 ili 3. ;[0362] U još daljem izvođenju, kolonije poput sfere se formiraju kada su ES ćelije pacova (koje nisu podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) zasejane na ploči na sloju hranljive ćelije in vitro. Skala morfologije za sferu je data ispod, gde skor od 10 predstavlja savršenu sferu, a skor od 1 predstavlja trodimenzionalnu eliptičnu strukturu. ;[0363] Morfološka skala strukture slične sferi: ;;10= Sfera je struktura koja ima X-osu i Y-osu i Z-osu od kojih svaka prolazi kroz centar strukture i jednake su dužine. ;9 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,9999 do 0,9357 dužine najmanje jedne od drugih osa. ;8 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,9357 do 0,875 dužine najmanje jedne ili obe od ostalih osa. 7 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,875 do 0,8125 dužine najmanje jedne ili obe od ostalih osa. 6 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,8125 do 0,750 dužine najmanje jedne ili obe ostale ose. ;5 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa 0,750 do 0,6875 dužine najmanje jedne ili obe druge ose. ;4 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa 0,6875 do 0,625 dužine najmanje jedne ili obe druge ose. ;3 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,625 do 0,5625 dužine najmanje jedne ili obe druge ose. ;2 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture, pri čemu je jedna od osa između 0,5625 do 0,523 dužine najmanje jedne ili obe od ostalih osa. 1 = Struktura koja ima X osu i Y-osu i Z-osu koja prolazi kroz centar strukture,pri čemu je jedna od osa između 0,523 do 0,500 dužine najmanje jedne ili obe ostale ose. ;;[0364] U jednom neograničavajućem izvođenju, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ES ćelijske linije pacova (koje nisu podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% kolonija koje se formiraju kada su ćelije zasejane na ploči na sloju hranljive ćelije in vitro imaju morfologiju poput sfere od 10, 9 ili 8. U drugim izvođenjima, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ES ćelijske linije pacova (koje nisu podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50% do 95%, oko 60% do 90%, oko 60% do 95%, oko 60% do 85%, oko 60% do 80%, oko 70% do 80%, oko 70% do 85%, oko 70% do oko 90%, oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 100%, oko 90% do oko 99%, oko 90% do oko 98%, oko 90% do oko 97%, oko 90% do oko 95% kolonija koje se formiraju kada su ćelije zasejane na ploči na sloju hranljive ćelije in vitro ima morfologiju poput sfere od 10, 9 ili 8. ;[0365] U drugom neograničavajućem izvođenju, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ES ćelijske linije pacova (koje nisu podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% od kolonija koje se formiraju kada su ćelije zasejane na ploči na sloju hranljive ćelije in vitro ima morfologiju poput sfere od 7, 6, 5, 4 ili 3. U drugim izvođenjima, populacija ES ćelija pacova ili populacija ćelija iz date ES ćelijske linije pacova (koje nisu podvrgnute ciljanoj genetskoj modifikaciji i / ili imaju ciljanu genetsku modifikaciju) ima najmanje oko 50% do 95%, oko 60% do 90%, oko 60% do 95%, oko 60% do 85%, oko 60% do 80%, oko 70% do 80%, oko 70% do 85%, oko 70% do oko 90%, oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 100%, oko 90% do oko 99%, oko 90% do oko 98%, oko 90% do oko 97%, oko 90% do oko 95% kolonija koje se formiraju kada su ćelije zasejane na ploči na sloju hranljive ćelije in vitro ima morfologiju poput sfere od 7, 6, 5, 4 ili 3. ;[0366] Data ES ćelija pacova, koja se koristi u različitim metodama i kompozicijama, ovde opisanim, može biti ES ćelija mužjaka (XY) pacova, populacija mužjaka (XY) od ES ćelija pacova ili ES ćelijska linija mužjaka (XY) pacova. U drugim izvođenjima, populacija ES ćelija pacova ili ES ćelijske linije pacova, koja se ovde koristi, ES ćelija ženke (XX) pacova, populacija ženke (XX) od ES ćelija pacova ili ES ćelijska linija ženke (XX) pacova. Svaka takva ES ćelija pacova, populacija ES ćelija pacova ili ES ćelijska linija pacova može sadržati euploidiju i / ili diploidiju, kao što je gore opisano. ;[0367] Različite ES ćelije pacova koji su korišćene u postupcima i preparatima, mogu biti iz bilo kog pacovskog soja, uključujući, ali bez ograničenja na, soj ACI pacova, soj Dark Agouti (DA) pacova, soj Wistar pacova, soj LEA pacova, Sprague Dawley (SD) pacovski soj, ili Fischerov pacovski soj, kao što je Fisher F344 ili Fisher F6. Razne ES ćelije pacova takođe, mogu biti dobijene iz soja dobijenog iz mešavine dva ili više sojeva gore navedenih. U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova je izvedena iz soja odabranog od DA soja i ACI soja. U specifičnom izvođenju, ES ćelija pacova je izvedena iz ACI soja. ACI soj pacova je karakterisan kao koji ima crni agouti, sa belim stomakom i stopalima i RT1av1 haplotipom. Takvi sojevi su dostupni iz različitih izvora, uključujući, Harlan Laboratorije. U drugim izvođenjima, različite ES ćelije pacova su iz soja pacova Dark Agouti (DA), koji je karakterisan kao koji ima agouti kaput i haplotip tipa RT1av1. Takvi pacovi su dostupni iz različitih izvora uključujući, Charles River i Harlan Laboratorije. U daljem izvođenju, različite ES ćelije pacova koje su ovde upotrebljene, su iz urođenog soja pacova. ;[0368] U specifičnim izvođenjima, ćelijska linija pacova ES je iz ACI pacova i obuhvata ACI.G1 pacovsku ES ćeliju, kao što je detaljno opisano u Američkoj patentnoj prijavi br.14 / 185,703, podnetoj 20. februara 2014. godine. U drugoj realizaciji, ćelijska linija pacova ES je iz DA pacova i obuhvata ES ćelijsku liniju DA.2B pacova ili ES ćelijsku liniju DA.2C pacova, kao što je detaljno opisano u Američkoj patentnoj prijavi br.14/185,703, podnetoj 20. februara 2014. godine. ;[0369] Data ES ćelija pacova, ovde opisana, može biti dobijena od embriona pacova u raznim fazama razvoja pacovskog embriona. Embrioni pacova koji su korišćeni da bi se dobile ES ćelije pacova, mogu biti embrion stadijuma morula, embrion stadijuma blastociste ili embrion pacova u razvojnoj fazi između embriona stadijuma morula i embriona stadijuma blastociste. Prema tome, u specifičnim realizacijama, korišćen je embrion pacova u ili između Witschi stadijuma od 5 i 7. U drugim izvođenjima, embrion pacova koji je korišćen se nalazi u Witschijevom stadijumu 5, 6 ili 7. ;[0370] U jednoj realizaciji, ES ćelija pacova je dobijena iz blastociste pacova. U drugim izvođenjima, ES ćelija pacova je dobijena iz blastociste superovulisanog pacova. U drugim izvođenjima, ES ćelije pacova su dobijene iz stadijuma osmoćelijskog embriona, koji je zatim kultivisan in vitro dok se ne razvije u stadijum morula, stadijum blastociste, embriona između Witschijevih stadijuma 5 i 7, ili u embrion stadijuma Witschi 5, 6 ili 7. U tom vremenu embrioni su onda zasejani na ploču. Embrioni stadijuma morula sadrže kompaktnu loptu ćelija bez unutrašnje šupljine. Embrioni stadijuma blastociste ima vidljivu unutrašnju šupljinu (blastocoel) i sadrži unutrašnju ćelijsku masu (ICM). ICM ćelije obrazuju ES ćelije. ;;B. Dobijanje i razmnožavanje embrionalnih matičnih (ES) ćelija pacova ;;[0371] Metode dobijanja i razmnožavanja embrionalnih matičnih ćelija pacova su poznate u stanju tehnike i otkrivene su, na primer, u Američkoj patentnoj prijavi broj 14/185,703, podnetoj 20. februara 2014. U specifičnim realizacijama, takvi postupci obuhvataju (a) obezbeđivanje in vitro kulture koja sadrži sloj hranljivih ćelija (podloga) i populaciju izolovanih embrionalnih matičnih (ES) ćelija pacova; (b) kultivisanje in vitro pod uslovima koji su dovoljni za održavanje pluripotencije i / ili totipotencije izolovane ES ćelije pacova. Ovakvi postupci na taj način omogućavaju razmnožavanje populacije ES ćelija pacova i / ili ES ćelijske linije pacova. ;[0372] Obezbeđena je metoda za kultivaciju linije embrionalnih matičnih ćelija pacova. Takvi postupci obuhvataju, kultivisanje in vitro sloja hranljive ćelije i ES ćelijske linije pacova, pri čemu uslovi kulture održavaju pluripotenciju ES ćelija pacova i sadrže medijum koji ima mišji inhibitorni faktor leukemije (LIF) ili aktivnu varijantu ili njegov fragment. Metode mogu dalje, obuhvatati pasažiranje (subkultivisanje) i kultivisanje in vitro ćelija iz ćelijske linije ES pacova, pri čemu svako sledeće in vitro kultivisanje obuhvata kultivisanje ES ćelija pacova na sloju hranljivih ćelija, pod uslovima koji održavaju pluripotenciju ES ćelija pacova i sadrže medijum koji ima LIF miša ili aktivnu varijantu ili njegov fragment. ;[0373] Medijum za kulturu koji se koristi u različitim metodama i kompozicijama, može da održi ES ćelije pacova. Izrazi "održavanje" i "očuvanje" se odnose na stabilno očuvanje najmanje jedne ili više karakteristika ili fenotipova ES ćelija pacova, ovde opisanih. Takvi fenotipovi, mogu uključivati održavanje pluripotencije i / ili totipotencije, ćelijske morfologije, profila ekspresije gena i drugih funkcionalnih karakteristika matičnih ćelija pacova koji su ovde opisani. Izraz "održava" takođe, može obuhvatiti razmnožavanje matičnih ćelija, ili povećanje broja kultivisanih matičnih ćelija. Izraz dalje posmatra uslove kulture koji omogućavaju da matične ćelije ostaju pluripotentne, dok matične ćelije mogu ili ne mogu nastaviti da se dele i povećavaju u broju. ;[0374] Izraz "hranljive ćelije " ili "sloj hranljivih ćelija" obuhvata kulturu ćelija koja raste in vitro i sekretuje najmanje jedan faktor u medijumu za kulturu, koji se koristi za podsticanje rasta druge ćelije od interesa u kulturi. Hranljive ćelije koje su ovde korišćene, pomažu u održavanju pluripotencije ES ćelija pacova i u specifičnim izvođenjima, jedne ili više drugih karakteristika ili fenotipova koji su ovde opisani. Mogu se koristiti različite hranljive ćelije, uključujući, na primer, embrionalne fibroblaste miša, uključujući embrionalne fibroblaste miša dobijene između 12. i 16. dana trudnoće. U specifičnim rešenjima, sloj hranljivih ćelija sadrži monosloj mitotički inaktivisanih embrionalnih fibroblasta miša (MEF-a). ;[0375] In vitro kulture ES ćelija pacova dalje, sadrže efikasnu količinu inhibitornog faktora leukemije (LIF) ili aktivne varijante ili njegovog fragmenta. Leukemijski inhibitorni faktor (LIF) pripada porodici IL-6 receptora. LIF se vezuje za heterodimerni membranski receptor sastavljen od LIF specifične podjedinice, gp190 ili LIFR, i podjedinice gp130, koji se deli sa ostalim članovima porodice IL-6. LIF inhibira diferencijaciju embrionalnih matičnih ćelija kod miševa i doprinosi samoobnavljanju matičnih ćelija. Ljudski i mišji LIF dele 79% homologije sekvence i ispoljavaju unakrsnu-vrsnu aktivnost. LIF pacova (rtLIF) je 22,1 kDa protein koji sadrži 202 aminokiselinska ostatka koji ispoljavaju 91% identičnosti aminokiselinske sekvence sa mišjim LIF-om (Takahama i sar., 1998). Postoji šest mogućih mesta glikozilacije (N-glikozilacije) povezanih sa asparaginom koja su konzervirana među LIF polipeptidom iz različitih vrsta i dodatno mesto Asn150 koje je specifično za LIF pacova. Tercijarna struktura mišjeg LIF-a i njegova funkcija je opisana detaljnije u Aikava i sar. (1998) Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 1318-1325 i Senturk i sar. (2005) Imunologija trudnoće, urednik Gil Mor., US Patent br. 5,750,654 i D P Gearing (1987) EMBO Journal 1987-12-20. Delimična LIF sekvenca miša je prijavljena na veb-sajtu SwissProt pod pristupnim brojem P09056. ;[0376] Aktivnost LIF-a miša je procenjena njegovom sposobnošću da indukuje diferencijaciju ćelija mijeloidne leukemije M1. Specifična aktivnost je 1 x 10<6>jedinica / ml (Kat. Br. 03-0011 od Stemgenta) i 1 x 10<7>jedinica / ml (Kat. br. 03-0011-100 od Stemgenta), gde je 50 jedinica definisano kao količina mišjeg LIF-a koja je potrebna da indukuje diferencijaciju u 50% M1 kolonija u 1 ml medijuma. Videti, takođe, Williams, R.L. i sar. (1988) Nature 336: 684-687. ; Metcalf, D. i sar. (1988) Leukemia 2: 216-221; Niwa, H. i sar. (2009) Nature 460: 118-122; Xu, J. i sar. (2010) Cell Biol Int. 34: 791-797; Fukunaga, N. i sar. (2010) Reprogram. ćelije. 12: 369-376; i, Metcalf D. (2003) Matične ćelije 21: 5-14. "Efikasna količina LIF-a" obuhvata koncentraciju LIF-a koja omogućava ES ćelijama pacova in vitro kulture da ostanu u nediferenciranom pluripotentnom stanju. Različiti markeri koji se mogu koristiti za ispitivanje ćelija koji su ostali u pluripotentnom stanju su ovde razmatrani na drugom mestu. ;[0377] LIF polipeptid koji se koristi u različitim postupcima i kompozicijama, ovde opisanim, može biti iz bilo kog organizma, uključujući od sisara, glodara, čoveka, pacova ili miša. U jednom izvođenju, LIF polipeptid je iz miša. U još daljim izvođenjima, mišji LIF polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u SwissProt-u pristupnog broja: P09056 i takođe je navedena u SEK ID BR: 9. ;[0378] U drugim izvođenjima, može se koristiti aktivna varijanta ili fragment mišjeg LIF polipeptida, kao što je prikazano u SEK ID BR: 9 ili u SwissProt-u pristupnog broja: P09056. Takve aktivne varijante i fragmenti (uključujući, aktivne varijante koje imaju najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 9 su detaljnije razmatrani na drugim mestima ovde. ;[0379] LIF polipeptid ili aktivna varijanta ili njegov fragment, mogu biti obezbeđeni u in vitro kulturi na različite načine. U jednom izvođenju, efikasna količina LIF polipeptida ili aktivne varijante ili njegovog fragmenta je dodata u medijum za kulturu. U drugim opisanim primerima, ćelije za hranjenje su genetski modifikovane da prekomerno eksprimiraju LIF polipeptid ili aktivnu varijantu ili njegov fragment. Takve ćelije za hranjenje uključuju, ćelije za hranjenje pripremljene od gama-ozračenih ili mitomicin-C tretiranih mišjih DIA-M fibroblasta koji eksprimiraju LIF povezan sa matriksom. Metode generisanja i korišćenja takvih genetički modifikovanih ćelija za hranjenje, mogu se naći, na primer, pogledati u, Buehr i sar. (2003) Biol Reprod 68: 222-229, Rathjen i sar. (1990) Cell 621105-1115 i Buehr i sar. (2008) Cell 135: 1287-1298. Heterologni LIF izražen u hranljivim ćelijama, može biti iz istog organizma kao i ćelije za hranjenje ili iz organizma koji je različit od onog u ćelijama za hranjenje. Pored toga, heterologni LIF izražen u ćelijama za hranjenje, može biti iz istog ili iz različitog organizma od ES ćelija koje nosi hranljivi sloj. ;[0380] U još nekim izvođenjima, ćelije za hranjenje koje su korišćene u različitim postupcima, ovde opisanim, nisu genetski modifikovane da eksprimiraju heterologni LIF polipeptid ili aktivnu varijantu ili njegov fragment. Prema tome, u posebnim izvođenjima, monosloj mitotički neaktivanog mišjeg embrionalnog fibroblasta koji je korišćen u postupcima nije genetski modifikovan da eksprimira heterologni LIF polipeptid. ;[0381] U drugim izvođenjima, LIF polipeptid ili aktivna varijanta ili njegov fragment se dodaje u medijum za kulturu. Kada se LIF dodaje u medijum za kulturu, LIF može biti iz bilo kog organizma, uključujući od sisara, glodara, čoveka, pacova ili miša. U jednoj realizaciji, LIF prisutan u medijumu za kulturu je od miša. U još daljim realizacijama, polipeptid LIF miša sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK ID BR: 9. U drugim izvođenjima, može biti korišćena aktivna varijanta ili fragment mišjeg LIF polipeptida, kao što je navedeno u SEK ID BR: 9. Takve aktivne varijante i fragmenti (uključujući, aktivne varijante koje imaju najmanje 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 9) se detaljnije razmatraju na drugim mestima ovde. ;[0382] U specifičnim primerima, pacovske ES ćelije i pacovske ES ćelijske linije koje su ovde obelodanjene, održavaju pluripotenciju in vitro bez potrebe za parakrinskom LIF signalizacijom. ;[0383] U specifičnim realizacijama, LIF ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan u medijumu za kulturu pri bilo kojoj koncentraciji koja održava ES ćelije pacova. LIF polipeptid ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan u medijumu za kulturu pri oko 25U/ml do oko 50U/ml, pri oko 50U/ml do oko 100U/ml, pri oko 100U/ml do oko 125U/ml, pri oko 125U/ml do oko 150U/ml, pri oko 150U/ml do oko 175U/ml, pri oko 175U/ml do oko 200U/ml, pri oko 200U/ml do oko 225U/ml, pri oko 225U/ml do oko 250U/ml, pri oko 250U/ml do oko 300U/ml, pri oko 300U/ml do oko 325U/ml, pri oko 325U/ml do oko 350U/ml, pri oko 350U/ml do oko 400U/ml, pri oko 400U/ml do oko 425U/ml, pri oko 425U/ml do oko 450U/ml, pri oko 450U/ml do oko 475U/ml, pri oko 475U/ml do oko 500U/ml, npri oko 75U/ml do oko 500U/ml ili više. U drugim izvođenjima, LIF polipeptid ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan u medijumu za kulturu pri oko 25U/ml do oko 50U/ml, pri oko 25U/ml do oko 100U/ml, pri oko 75U/ml do oko 125U/ml , pri oko 50U/ml do oko 150U/ml, pri oko 90U/ml do oko 125U/ml, pri oko 90U/ml do oko 110U/ml, pri oko 80U/ml do oko 150U/ml, ili pri oko 80U/ml do oko 125U/ml. U specifičnoj realizaciji, LIF polipeptid ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan u medijumu za kulturu pri oko 100U/ml. ;[0384] Kada se koristi LIF miša, LIF polipeptid miša ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan u medijumu za kulturu, pri bilo kojoj koncentraciji koja održava ES ćelije pacova. Mišji LIF polipeptid ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan pri oko 25U/ml do oko 50U/ml, pri oko 50U/ml do oko 100U/ml, pri oko 100U/ml do oko 125U/ml, pri oko 125U/ml do oko 150U/ml, pri oko 150U/ml do oko 175U/ml, pri oko 175U/ml do oko 200U/ml, pri oko 200U/ml do oko 225U/ml, pri oko 225U/ml do oko 250U/ml, pri oko 250U/ml do oko 300U/ml, pri oko 300U/ml do oko 325U/ml, pri oko 325U/ml do oko 350U/ml, pri oko 350U/ml do oko 400U/ml, pri oko 400U/ml do oko 425U/ml, pri oko 425U/ml do oko 450U/ml, pri oko 450U/ml do oko 475U/ml, pri oko 475U/ml do oko 500U/ml, npri oko 75U/ml do oko 500U/ml ili više. U drugim izvođenjima, LIF polipeptid miša ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan pri oko 25U/ml do oko 50U/ml, pri oko 25U/ml do oko 100U/ml, pri oko 75U/ml do oko 125U/ml, pri oko 50U/ml do oko 150U/ml, pri oko 90U/ml do oko 125U/ml, pri oko 90U/ml do oko 110U/ml, pri oko 80U/ml do oko 150U/ml, ili pri oko 80U/ml do oko 125U/ml. U specifičnoj realizaciji, LIF polipeptid miša ili aktivna varijanta ili njegov fragment je prisutan u medijumu za kulturu pri oko 100U/ml. ;[0385] Korišćeni medijumi za kulturu održavaju ES ćelije pacova. Kao takav, u specifičnim realizacijama, medijum za kulturu koji se koristi u različitim postupcima i kompozicijama će održati pluripotenciju svih ili većine (tj. preko 50%) ES ćelija pacova u ćelijskoj liniji tokom perioda od najmanje 5, 10 ili 15 pasaža. U jednoj realizaciji, medijum za kulturu sadrži jedno ili više jedinjenja koja pomažu u održavanju pluripotencije. U jednoj realizaciji, medijum za kulturu sadrži inhibitor MEK puta i inhibitor glikogen sintaze kinaze-3 (GSK-3). Takođe su opisani primeri gde medijum može dalje, da sadrži dodatne komponente koje pomažu u održavanju ES ćelija, uključujući, na primer, inhibitore FGF receptora, inhibitore ROCK i / ili inhibitore ALK (TGFb receptora). Neograničavajući primer inhibitora FGF receptora uključuje PD184352. Neograničavajući primer ROCK inhibitora uključuje Y-27632, a neograničavajući primer inhibitora ALK (TGFb receptora) uključuje A-83-01. U primerima, 2i medijum se koristi sa 10 uM ROCKi kada se otopi krioprezervisani rESC ili kada se ponovo prevlači rESC nakon disocijacije sa tripsinom. ;[0386] U drugim izvođenjima, medijum sadrži kombinaciju inhibitora koji se sastoje od inhibitora MEK puta i inhibitora glikogen sintaze kinaze-3 (GSK-3). ;[0387] U jednom neograničavajućem izvođenju, medijum za kulturu sadrži inhibitor GSK-3 koji sadrži CHIR99021 i / ili sadrži MEK inhibitor koji sadrži: PD0325901. U drugim izvođenjima, medijum sadrži kombinaciju inhibitora koji se sastoje od CHIR99021 i PD0325901. Može biti dobijeno bilo koje od ovih jedinjenja, na primer, iz Stemgenta. U specifičnim realizacijama, CHIR99021 je prisutan u medijumu za kulturu u koncentraciji od oko 0,5 μ do oko 3 μM, oko 0,5 μ do oko 3,5 μM, oko 0,5 μM do oko 4 μM, oko 0,5 μM do oko 1 μM, oko 1 μM do oko 1,5 μM, oko 1,5 μM do oko 2 μM, oko 2 μM do oko 2,5 μM, oko 2,5 do oko 3 μM, 3 μM do oko 3,5 μM. U daljim realizacijama, CHIR99021 je prisutan u medijumu za kulturu pri koncentraciji od oko 3 μM. U drugim realizacijama, PD0325901 je prisutan u medijumu za kulturu u koncentraciji od oko 0,4 μM do oko l μM, oko 0,4 μM do oko 1,5 μM, oko 0,4 μM do oko 2 μM, oko 0,4 μM do oko 0,8 μM, 0,8 μM do oko 1,2 μM, oko 1,2 do oko 1,5 μM. U daljim realizacijama, PD0325901 je prisutan u medijumu za kulturu pri koncentraciji od oko 1 μM. U specifičnim realizacijama, CHIR99021 je prisutan u medijumu za kulturu u koncentraciji od oko 3 μM i PD0325901 je prisutan u koncentraciji od oko 1 μM. ;[0388] U jednom neograničavajućem izvođenju, medijum za kulturu koji se koristi u različitim postupcima i kompozicijama, ovde opisanim je medijum 2i koji sadrži: DMEM / F12 bazalni medijum (u koncentraciji od 1x (50%)); Neurobazalni medijum (u koncentraciji od 1x (50%)); Penicilin / streptomicin (u koncentraciji od 1%); L-glutamin (u koncentraciji od 4 mM); 2-merkaptoetanol (u koncentraciji od 0,1 mM); N2 suplement (u koncentraciji od 1x); dodatak B27 (u koncentraciji 1x); LIF (u koncentraciji od 100U/ml); PD0325901 (MEK inhibitor) (u koncentraciji od 1 μM) i CHIR99021 (inhibitor GSK) (u koncentraciji od 3 μM). ;[0389] Dodatni medijumi koji mogu da se koriste su oni koji su otkriveni u Li i sar. (2008) Cell 135: 1299-1310, Yamamoto i sar. (2012) Transgeni pacovi 21: 743-755, Ueda i sar. (2008) PLoS ONE 3 (6): e2800, Meek i sar. (2010) PLoS ONE 4 (12): e14225; Tong i sar. (2010) Nature 467: 211-213; Američka patentna publikacija 2012/0142092, Buehr i sar. (2008) Cell 135: 1287-1298, Li i sar. (135) Cell 1299-1310, od kojih je svaka ovde uključena referencom u celini. Pri angažovanju takvih medijuma, koncentracija i izvor LIF-a mogu se modifikovati, kao što je ovde navedeno. U specifičnim realizacijama, različiti medijumi za kulturu se koriste u kombinaciji sa LIF-om miša ili aktivnom varijantom ili njegovim fragmentom, i u još daljim realizacijama, različiti medijumi za kulturu sadrže LIF miša ili aktivnu varijantu ili njegov fragment u koncentraciji od oko 50U/ml do oko 100U/ml, oko 50U/ml do oko 150U/ml, ili oko 100U/ml. ;[0390] Temperatura kultura od ćelija ES ćelija pacova, kako za proizvodnju ES ćelijske linije, tako i za kultivisanje i održavanje ES linije se obično izvodi na oko 35 ° C do oko 37,5 ° C. U specifičnom izvođenju, temperatura je 37,0 ° C. Kultura se obično izvodi pri 7,5% C02. ;;7. Identičnost sekvenci ;;[0391] Metode i kompozicije ovde obelodanjene, koriste različite komponente ciljanog sistema genomske integracije (tj. nukleazne agense, mesta prepoznavanja, umetke nukleinskih kiselina, polinukleotide od interesa, vektore ciljanja, markere selekcije i druge komponente). Prepoznato je kroz opis da neke komponente sistema ciljane genomske integracije mogu imati aktivne varijante i fragmente. Takve komponente uključuju, na primer, nukleazne agense (tj., konstruisane nukleazne agense), mesta za prepoznavanje nukleaznog agensa, polinukleotide od interesa, ciljne lokacije i odgovarajuće homologne krake vektora za ciljanje. Biološka aktivnost za svaku od ovih komponenata je opisana na drugom mestu ovde. ;[0392] Kao što je ovde korišćeno, "identičnost sekvence" ili "identičnost" u kontekstu dva polinukleotida ili polipeptidnih sekvenci upućuje na ostatke u dve sekvence koji su isti kada se poravnani za maksimalno slaganje preko specifikovanog prozora poređenja. Kada se procenat identičnosti sekvence koristi u odnosu na proteine, prepoznaje se da se položaji ostataka koji nisu identični često razlikuju pomoću konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, gde su aminokiselinski ostaci supstituisani sa drugim aminokiselinskim ostacima sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost) i stoga ne menjaju funkcionalne osobine molekule. Kada se sekvence razlikuju u konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvence se može podesiti naviše kako bi se ispravio za konzervativnu prirodu supstitucije. Za sekvence koje se razlikuju pomoću takvih konzervativnih supstitucija se kaže da imaju "sličnost sekvence" ili "sličnost". Sredstva za izvođenje ovog poravnanja su dobro poznata stručnjacima. Obično ovo podrazumeva postizanje konzervativne supstitucije kao parcijalne, a ne potpune neusklađenosti, čime se povećava procenat identičnosti sekvence. Tako, na primer, gde je identičnoj aminokiselini dat skor od 1, a nekonzervativnoj supstituciji je dat skor nule, konzervativnoj supstituciji je dat skor između nule i 1. Bodovanje konzervativnih supstitucija se izračunava, na primer, kako je implementirano u programu PC / GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). ;[0393] Kao što je ovde korišćeno, "procenat identičnosti sekvence" označava vrednost određenu upoređivanjem dve optimalno poravnane sekvence u prozoru poređenja, pri čemu deo polinukleotidne sekvence u prozoru upoređivanja može sadržati dodatke ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži dodatke ili delecije) za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja položaja u kojima se identična baza nukleinske kiseline ili ostatak aminokiselina pojavljuju u obe sekvence da bi se dobio broj usklađenih položaja, deljenjem broja usklađenih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru poređenja i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence. ;[0394] Osim ukoliko nije drugačije navedeno, vrednosti identičnosti sekvence / sličnosti, ovde opisane odnose se na vrednost dobijenu korišćenjem GAP verzije 10, korišćenjem sledećih parametara: % identičnosti i % sličnosti za nukleotidnu sekvencu korišćenjem GAP težine od 50 i dužinske težine 3, i nwsgapdna.cmp matrice bodovanja; % identičnosti i % sličnosti za sekvencu aminokiselina korišćenjem GAP težine 8 i dužinske težine 2, i BLOSUM62 matricu za bodovanje; ili bilo koji njegov ekvivalentni program. "Ekvivalentni program" znači svaki program za upoređivanje sekvenci koji, za bilo koji dve sekvence u pitanju, generiše poravnanje koje ima identična usaglašavanja nukleotida ili aminokiselinskog ostatka i identičan procenat identičnosti sekvence u poređenju sa odgovarajućim poravnanjem koje generiše GAP verzija 10. ;[0395] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato prosečnom stručnjaku u struci kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako sve metode i materijali slični ili ekvivalentni onima, ovde opisanim, takođe mogu biti korišćeni u praksi ili testiranju opisanog pronalaska, sada su opisane poželjne metode i materijali. ;[0396] Treba napomenuti da, kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "jedan", "i" i "izvesni" uključuju množinu referenci, ukoliko kontekst jasno ne diktira drugačije. Svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje. ;[0397] Publikacije koje se ovde razmatraju su obezbeđene isključivo za njihovo objavljivanje pre datuma podnošenja sadašnje prijave. Ništa ovde ne treba tumačiti kao pristup da opisani pronalazak nije ovlašćen da izda ranije takvu publikaciju na osnovu prethodnog pronalaska. Dalje, obezbeđeni datumi objave se mogu razlikovati od aktuelnih datuma objave, koji bi možda trebalo da budu nezavisno potvrđeni. ;;PRIMERI ;;[0398] Sledeći primeri su predstavljeni tako da obezbede stručnjacima u struci kompletno obelodanjivanje i opis kako da se napravi i koristi sadašnji pronalazak i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju njihovim pronalaskom, niti su namenjeni da predstavljaju da su eksperimenti niže navedeni svi ili jedini eksperimenti koji su izvođeni. Uloženi su napori kako bi se osigurala tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperature, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska masa je prosečna težina molekulske mase, temperatura je u stepenima Centigrada, pritisak je pri ili blizu atmosferskog. ;;Primer 1. Dobijanje ES ćelija pacova i karakterizacija ;;1.1. Karakterizacija ES ćelije pacova ;;[0399] Kao što je prikazano na slici 1, ES ćelije pacova rastu kao kompaktne sferične kolonije, koje se rutinski odvajaju i plutaju u sudu (krupni plan, slika 7). ESC pacova eksprimiraju pluripotentne markere, uključujući Oct-4 (slika 2A) i Sox2 (slika 2B), i izražavaju visoke nivoe alkalne fosfataze (slika 3, levi panel). Kariotip za liniju DA.2B je 42X,Y (slika 3, desni panel). ESC pacova često postaju tetraploidne; na taj način, linije su prethodno prikazane brojanjem metafaznih hromozomskih širenja; linije sa uglavnom normalnim brojem su onda formalno kariotipovane. ;[0400] ACI blastociste su sakupljene od superovulisanih ženki dobijenih komercijalno. DA blastociste su kultivisane od zamrznutih osmoćelijskih embriona dobijenih komercijalno. ;Zone pellucidae su uklonjene sa kiselim tirodima; i blastociste su nanesene na mitotički inaktivirane MEF-ove. Proizvodi su odabrani i prošireni korišćenjem standardnih metoda. Sve blastociste su nanesene, kultivisane i proširene korišćenjem 2i medijuma (Li i sar. (2008) Sposobne za razmnožavanje embrionalne matične ćelije su dobijene blastocisti pacova, Cell 135: 1299-1310). ;; ;;;
1.2. : Proizvodnja pacova ;;[0401] Himerni pacovi su proizvedeni injekcijom blastociste i prenošenjem genoma ESC pacova. Himere proizvedene mikroinjekcijom blastociste, korišćenjem roditeljskih ACI.G1 pacovkih ESC-a su prikazane na slici 8. F1 agouti mladunci sa albino sparenim nakotom, pomoću ACI / SD himera obeleženih zvezdicom (*) na slici 8, prikazani su na slici 9.
Prenos germinativne linije roditeljskog ESC pacova.
[0402] Tri euploidne ESC linije pacova su ocenjene za pluripotenciju mikroinjektiranjem u albino SD blastociste. Himere su identifikovane agouti bojom za bojenje, što ukazuje na doprinos ESC pacova. Za svaku liniju, većina himera je prenela rESC genom na F1 potomstvo (Tabela 2).
1.3. : Dobijanje embrionalnih matičnih ćelija pacova.
Protokol superovulacije, pacovi
[0403]
0. Dan : injektovani serumom trudne kobile: IP, 20 U (0,4 ml).
1. Dan : nema akcije
2. Dan: (46 sati kasnije): injektovanje hCG, IP, 50 U (1 ml).
- postaviti pojedinačne ženke za sparivanje.
3. Dan: proverena uključenja. Ženke su bile uključene. Ovo je dan 0,5.
6. Dan (e3.5): Eutanizovane ženke i isprani embrioni.
Protokol dobijanja ES ćelija (superovulacija)
[0404] 0. Dan:
1) Eutanizovana je ženka pacova sa CO2.
2) Obrisan je komadićem vate ventralni abdomen sa 70% etanolom; korišćenjem makaza, otvoren je ventralni zid tela kako bi se izložila utroba.
3) Secirani su jajovodi i rožnati izraštaji materice i postavljeni u posudu za kulturu tkiva koja sadrži topli medijum N2B27. Isprano je što više krvi i prebačeni su u novi sud sa N2B27.
4) Korišćenjem 1 ml šprica i tupe igle od 27 g, ispiran je medijum kroz izraštaje materice i jajovode za izbacivanje blastociste u medijum.
5) Blastociste su sakupljene pomoću usne pipete i prebačene u posudu za kulturu embriona koja sadrži KSOM 2i (1 μMP00325901, 3 μM CHIR99021). KSOM je medijum za kulturu koji proizvodi Millipore. Kataloški broj je MR-106-D.
6) Kultivisane su tokom noći na 37 °; 7,5% CO2.
Protokol dobijanja ES ćelija (smrznuti embrioni)
[0405] 0. Dan:
1) Odmrznuti su zamrznuti 8-ćelijski embrioni (komercijalno dobijeni) u M2 medijum. Kultivisani su 10 minuta na sobnoj temperaturi.
2) Prebačeni su u KSOM 2i i kultivisani preko noći.
Protokol dobijanja ES ćelija (isti za oba)
[0406] 1. dan :
1) Preneseni su kavitovani embrioni u 2i medijum & kultivisani preko noći.
2) Nastavak kultivisanja ne-kavitovanih embriona u KSOM 2i
[0407] 2. Dan :
1) Preneti su svi preostali embrioni u 2i medijum (bez obzira da li su kavitovani ili ne).
2) Kultivisanje preko noći; nastavljemo je kultivisanje ranijih embriona u 2i medijumu.
[0408] 3. Dan:
1) Preneseni su embrioni 30 do 60 sekundi sa kiselinom Tyrodes za uklanjanje zone pellucida.
2) Embrioni su ispirani 3x u 2i medijumu za uklanjanje kiseline Tyrodes.
3) Svaki embrion je deponovan u poseban bazenčić od hranljive ploče sa 96 bazenčića (bazenčić sadrži monosloj mitotički inaktiviranih mišjih embrionskih fibroblasta (MEF).
4) Kultivisani su preko noći u 2i medijumu.
[0409] 4 - 5. Dan:
1) Praćeni su embrioni naneseni na ploču na prisustvo rasta (amorfna nediferencirana masa ćelija). Proizvodi rasta su spremni za transfer kada su približno dvostruko veći od nanesenog embriona.
2) Svakog dana: ukloniti potrošene medijume mikropipetom i zameniti svežim 2i medijumom.
3) Prebačeni proizvodi rasta na nove hranljive bazenčiće:
a. Uklonjen je potrošeni medijum i nežno ispran bazenčić sa PBS-om. b. Uklonjen je PBS i dodato 30 μl 0,05% tripsina; inkubirano tokom 10 minuta. c. Zaustavljena je reakcija tripsina dodavanjem 30μ12i 10% FBS-a. d. Nežno izdvojiti ćelije mikropipetom i preneti čitav sadržaj bazenčića u novi bazenčić hranljive ploče sa 24 bazenčića. Ovo je bio pasaž 1 (P1).
e. Kultisanje preko noći u 2i medijumu.
[0410] 5 - 8. Dan: (vremenski raspon zavisi od toga koliko se brzo svaka linija širi)
1) Svakodnevno je menjan medijum (2i medijum) i praćeno je prisustvo kolonija sa morfologijom ESC-a.
2) Kada se pojavljuju kolonije, nastavljeno je kultivisanje dok se kolonije ne prošire na ~ 50% sastavljanja.
3) Tripsinizovane i subkultivisane kolonije kao i ranije; nanesene na hranljive podloge, 1 bazenčić po liniji, u posudi sa 6 bazenčića. Ovo je bio pasaž 2 (P2).
[0411] U toku:
1) Nastavak hranjenja i praćenja svake linije sve do oko 50% spajanja.
2) Tripsinizovane su ćelije kao i obično.
3) Zaustavljen tripsin sa 2i 10% FBS-a; peletirane su ćelije centrifugiranjem (5', 1200 obrtaja u minuti u Beckman-Coulter tabletop centrifugi).
4) Usisan je supernatant i nežno su resuspendovane ćelije u 400 μl medijuma za zamrzavanje (70% 2i, 20% FBS, 10% DMSO).
5) Raspodeljene su ćelije u 2 bočice i zamrznute na -80 °. Ovo je bio pasaž 3 (P3).
6) Za dugotrajno skladištenje, bočice su prenete za čuvanje u tečnom N2.
[0412] Medijum 2i je pripremljen kao što sledi u tabeli 3.
Materijali: serumski gonadotropin trudne kobile (PMSG)
Horionski gonadotropin iz urina humane trudnoće (HCG)
Ženke pacova (starosti 5-12 nedelja)
Mužjaci pacova (starosti 12 nedelja do 8 meseci), jedan po kavezu
Špricevi / igle
Životinjska soba sa svetlima na 6:00-18:00
Procedura:
[0413]
1. Dan : 8:00-10:00 pre podne
Injektovati ženke sa 20 IU PMSG (0,4 ml), IP
Odbaciti nekorišćeni PMSG.
3. Dan: 8:00-10:00 pre podne (48 sati nakon injekcije PMSG-a)
Injektovati ženke sa 50 IU HCG (1 ml), IP
Postaviti jednu ženku po mužjaku u kavezu za parenje.
Odbaciti nekorišćeni HCG.
4. Dan : 8:00-10:00 pre podne (24 h nakon injekcije HCG)
Proveriti ženke za uključenja.
Dobavljači hormona
[0414] PMSG: Sigma # G-4877 (1000 IU). Resuspendovati u PBS-u do krajnje količine [ ] od 50 IU / ml. Čuvati na -20° u 1 ml alikvotima.
[0415] HCG: Sigma # CG-5 (5000 IU). Resuspendovati u PBS-u do do krajnje količine [ ] od 50 IU / ml. Čuvati na -20° u 1 ml alikvotima.
1.4. : Kariotipovanje pacovskih embrionalnih matičnih ćelijskih linija
[0416] ES ćelijske linije pacova, ovde generisane su kariotipovane, a rezultati su sumirani u tabelama 4-7.
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7.
1.5.: Elektroporacija vektora u embrionalnu matičnu ćeliju pacova
[0417]
1. Pasažirane ES ćelije pacova 24-48 sati pre elektroporacije.
2. Promenjen medijum u RVG2i ROCKi (10μM Y-27632) 24 sati pre elektroporacije 3. Promenjen medijum 30' pre tripsinizacije.
4. Alikvotirana DNK koja će biti elektroporirana.
5. Omogućiti DNK da se zagreje na ST za > 10 min.
6. Zagrejana DNK za 5' @ 62 ° C. Postaviti DNK na ledu.
7. Tripsinizovane ćelije:
a. Sakupljene plutajuće kolonije. Isprana je ploča radi sakupljanja što je više moguće plutajućih materija.
b. Peletirane kolonije: 3' @ 750 o/min.
c. Isprane pelete 1x sa 5-10 ml PBS-a i ponovno centrifugirane / peletirane
d. Usisani supernatant; dodati 500 λ tripsina, 0,05% 1% pilećeg seruma.
i. Nije okupljeno više od 110 cm ploče od kolonija po epruveti. Ako je previše kolonija pakovano na dnu epruvete tokom tripsinizacije, one će se grupisati i većina ćelija će biti izgubljena.
e. 4' @ 37°. Pipetirane kolonije nekoliko puta kako bi se smanjilo grupisanje.
f. Ponovljeni koraci 1-2 x: 4 ' @ 37 °.
g. Zaustavljen tripsin sa 500λ RVG2i 10% FBS.
8. Peletirane ćelije: 5' @ 1200 rpm.
9. Resuspendovane ćelije u 10 ml PBS-a. Izbrojati dva 20 λ alikvota za određivanje ukupnog broja ćelija.
10. Peletirane ćelije (5'/1200 rpm); Izračunati ukupni broj ćelija i ukupni volumen resuspenzije da bi se postigla ispravna koncentracija ćelija (ciljni # / 75 μl EP pufer).
11. Resuspendovati u minimalnoj zapremini EP pufera; izmerena ukupna zapremina i podešena do ciljne zapremine sa EP puferom.
12. Dodato 75λ ćelija do 50λ DNK; preneti 125λ ćelije / DNK rastvor u jedan bazenčić BTX kivete sa 48-bazenčića.
a. Napunjeni prazni bazenčići u istoj koloni sa 125 λ EP puferom.
13. Pulsirati kivetu jednom u BTX elektroporatoru:
a. Podešavanja: 400V; 100 μE (podešavanja mogu varirati)
14. Postaviti kivetu na ledu 15' da se oporavi.
15. Uklonjene ćelije u 5 ml RVG2i 10 μM ROCKi.
16. Dodato na ploči od 15 cm 20 ml RVG2i 10 μΜ ROCKi. Ploča je imala 2x neoR MEF-ova (ili drugih MEF-ova u zavisnosti od projekta). NeoR selektibilni marker je neomicin fosfotransferaza (neo) gen od strane Beck i sar., (1982) Gene, 19, 327-36 ili u Američkom patentu br.7,205,148 ili 6,596,541.
17. Inkubirano @ 37 °. Početi selekciju 48h kasnije.
[0418] Korišćeni ROCK inhibitor je bio Y-27632.
1.6: Odabiranje ciljane genetske modifikacije u embrionalnoj matičnoj ćeliji pacova.
[0419]
1. Pasažirane ćelije tokom 24-48 sati pre elektroporacije.
2. Promenjen medijum u RVG2i ROCKi (10μM Y-27632) 24 sati pre elektroporacije 3. Promenjen medijum 30' pre tripsinizacije.
4. Alikvotirana DNK koja će biti elektroporirana.
5. Omogućiti DNK da se zagreje na ST za > 10 min.
6. Zagrejana DNK za 5' @ 62 ° C. Postaviti DNK na ledu.
7. Tripsinizovane ćelije:
a. Sakupljene plutajuće kolonije. Isprana je ploča radi sakupljanja što je više moguće plutajućih materija.
b. Peletirane kolonije: 3' @ 750 o/min.
c. Isprane pelete 1x sa 5-10 ml PBS-a i ponovno centrifugirane / peletirane d. Usisani supernatant; dodati 500 λ tripsina, 0,05% 1% pilećeg seruma.
i. Nije okupljeno više od 110 cm ploče od kolonija po epruveti. Ako je previše kolonija pakovano na dnu epruvete tokom tripsinizacije, one će se grupisati i većina ćelija će biti izgubljena.
e. 4' @ 37°. Pipetirane kolonije nekoliko puta kako bi se smanjilo grupisanje. f. Ponovljeno 1-2 X: 4 ' @ 37 °.
g. Zaustavljen tripsin sa 500λ RVG2i 10% FBS.
8. Peletirane ćelije: 5' @ 1200 rpm.
9. Resuspendovane ćelije u 10 ml PBS-a. Izbrojati dva 20 λ alikvota za određivanje ukupnog broja ćelija.
10. Peletirane ćelije (5'/1200 rpm); Izračunati ukupni broj ćelija i ukupni volumen resuspenzije da bi se postigla ispravna koncentracija ćelija (ciljni # / 75 μl EP pufer). 11. Resuspendovati u minimalnoj zapremini EP pufera; izmerena ukupna zapremina i podešena do ciljne zapremine sa EP puferom.
12. Dodato 75λ ćelija do 50λ DNK; preneti 125λ ćelije / DNK rastvor u jedan bazenčić BTX kivete sa 48-bazenčića.
a. Napunjeni prazni bazenčići u istoj koloni sa 125 λ EP puferom.
13. Pulsirati kivetu jednom u BTX elektroporatoru:
a. Podešavanja: 400V; 100 μE (podešavanja mogu varirati)
14. Postaviti kivetu na ledu 15' da se oporavi.
15. Uklonjene ćelije u 5 ml RVG2i 10 μM ROCKi.
16. Dodato na ploči od 15 cm 20 ml RVG2i 10 μΜ ROCKi. Ploča je imala 2x neoR MEF-a (ili drugih MEF-ova u zavisnosti od projekta).
17. Inkubirano @ 37 °. Početi selekciju 48h kasnije.
18. Protokol za izbor G418 je bio sledeći:
a. Dan 2 (drugog dana nakon EP): inkubirane ćelije u 2i medijumu G418, 75 μg/ml.
b. Dan 3: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
c. Dan 4: inkubirane ćelije u 2i medijimu G418, 75 μg/ml.
d. Dan 5: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
e. Dan 6: inkubirane ćelije u 2i medijimu G418, 75 μg/ml.
f. Dan 7: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
g. Dan 8: inkubirane ćelije u 2i medijimu G418, 75 μg/ml.
h. Dan 9: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
i. Dan 10: inkubirane ćelije u 2i medijimu G418, 75 μg/ml.
j. Dan 11: inkubirane ćelije u 2i medijumu bez G418
k. Dan 12: odabrane kolonije za širenje za skrining. Svaka kolonija je bila razdvojena u 0,05% tripsina 1% pilećeg seruma u trajanju od 10 minuta, a zatim nanesena u 1 bazenčić ploče za hranjenje sa 96 bazenčića.
19. Proširene kolonije tokom 3 dana u 2i medijumu.
20. Subkultivisani klonovi 1: 1 na nove ploče za hranjenje sa 96 bazenčića.
21. Prošireni klonovi tokom 3 dana u 2i medijimu.
22. Za svaki klon, razdvojene su kolonije u tripsinu. Zamrznuti 2/3 svakog klona i čuvati na -80 °; preneti preostalu 1/3 na lamininske ploče (ploče sa 96 bazenčića obložene sa 10 μg/ml laminina).
23. Kada su lamininske ploče bile spojene, prešle su u skrining laboratoriju za genotipizaciju klonova.
1.7. Molekularni potpis embrionalnih matičnih ćelija pacova
[0420] Geni navedeni u Tabeli 8 su izraženi 20 puta niže u ES ćelijama pacova od odgovarajućih gena u mišjim ES ćelijama. Geni navedeni u Tabeli 9 su izraženi pri nivoima koji su 20-puta viši u ćelijama ES pacova od odgovarajućih gena u mišjim ES ćelijama.
[0421] Podaci mikroreda u tabelama 8 i 9 su generisani na sledeći način. ES ćelije pacova (ACI.G2 i DA.2B) i mišje ES ćelije (F1H4) su kultivisane u 2i medijumu za 3 pasaže do spojenih. F1H4 ćelije su kultivisane na pločama obloženim sa želatinom u odsustvu hranilaca. F1H4 mišje ES ćelije su izvedene od 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac heterozigotnih embriona (videti npr. US patent br.7,294,754 i Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007).
[0422] Za pripremu uzorka korišćen je sledeći protokol: 1,5mL Eppendorf epruvete su označene sa ID-om uzorka. Ćelije koje se uzgajaju na ploči su isprane fosfatnim slanim puferom (PBS) 37 °C. PBS je uklonjen i dodato je 300 ul Trizol®. Strugač je korišćen za razbijanje ćelija u Trizol® (Life Technology). Lizirane ćelije su sakupljene u Trizol® u epruveti Epperdorf od 1,5 ml. Za ćelije koje rastu na suspenziji, ćelije su isprane u 37 ° C PBS-u i sakupljane u epruvetu od 1,5 ml. Ćelije su bile centrifugirane; PBS je uklonjen; i 300 ul Trizol®-a je dodato u ćelije. Ćelijske membrane su razbijene pipetiranjem. Uzorci su sortirani za FACS sa 10 do 10<5>ćelija, zapremina je koncentrovana na manje od 100 uL. Dodate su 4 zapremine pufera za lizu RNK i mešano pipetiranjem. Za uzorak, u 80 uL uzorka dodat je pufer za lizu RNK od 320uL. Uzorci su čuvani na -20 ° C.
[0423] RNK-Sek je korišćena za merenje nivoa ekspresije mišjih i pacovskih gena. Čitanja sekvenciranja su bila mapirana na referentnom genomu miša i pacova od strane Tophat, a RPKM (fragmenti po kilobazi eksona na milion fragmenata mapirani) su izračunati za gene miša i pacova. Homologni geni bazirani na simbolu gena su izabrani, a zatim je korišćen t-test za upoređivanje nivoa ekspresije svakog gena između miša i pacova. miR-632 je bio u vrhu 10 najviše izraženih u pacovskim ES ćelijama, ali nije bio izražen u mišjim ES ćelijama. Iako ne postoje komparativni podaci od miR-632, na osnovu nivoa njegove ekspresije u poređenju sa drugim genima eksprimiranim u pacovskim ESC-ima i njihovom poznatom funkcijom u embrionalnom razvoju, miR-632 je izabran kao marker za ES ćelije pacova.
Tabela 8. Navedeni geni su izraženi pri nivoima koji su 20 puta niži u ES ćelijama pacova od odgovarajućih gena u ES ćelijama miša.
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Tabela 9. Navedeni geni su izraženi pri nivoima 20 puta višim kod ES ćelija pacova nego odgovarajući geni u ES ćelijama miša.
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Tabela 10. Podskup gena iz Tabele 9, koji su izraženi pri nivoima 20 puta višim u ćelijama ES pacova od odgovarajućih gena u mišjim ES ćelijama.
[0424] Dodatni molekularni potpis koji koristi pluripotentne markere / gene za ES ćelije pacova je takođe razvijen. Tabela 11 obezbeđuje listu gena i njihova ekspresija je rangirana od podataka za profilisanje RNK. mRNA je izolovana iz ćelija ES pacova, a nivo ekspresije različitih markera je poređen relativno jedan prema drugom. Izraz "rangirati" označava komparativne nivoe ekspresije pojedinih gena: što je veće rangiranje (1 je najviše), to je veća ekspresija. Na primer, Oct4’s rang od 13 znači da je, od svih ispitivanih gena, on izražen više od svih, ali 12 gena. Pozadina u ovom eksperimentu bila je bilo koja vrednost ekspresije ispod 30; 6107 gena je imalo vrednosti ekspresije od 30 ili više.
Primer 2: Inaktivacija Genomskih Lokusa kod pacova
2.1: Inaktivacija endogenih genomskih lokusa korišćenjem endonukleaznog agensa
[0425] U cilju uvođenja mutantnog alela na endogenom genomskom lokusu pacova, ovde opisane ES ćelije pacova su elektroporirane sa ekspresionim vektorima (ili mRNK) koji izražavaju nukleaze ZFN 1 i 2 (ili TALEN-ove 1 i 2). Ovi proteini vezuju njihove ciljne sekvence na suprotnim lancima, odvojenim od oko 6 bp do oko 40 bp. Dvolančani prekid je formiran unutar ciljnog lokusa, koji ćelija pokušava da popravi nehomolognim mehanizmom popravke (nehomolognim spajanjem krajeva - NHEJ). U mnogim slučajevima, nehomologno spajanje krajeva (NHEJ) ima za rezultat stvaranje delecije, što često narušava funkciju gena (najčešće stvaranjem frameshift mutacije). Da bi se identifikovao pozitivni klon koji sadrži mutantni alel, elektroporirane ćelije su nanete na ploči pri niskoj gustini, jer se ne vrši selekcija leka. Kolonije su odabrane i analizirane na ciljnoj lokaciji da bi se videlo da li je proizvedena mutacija (npr., koristeći modifikaciju testa alela (MOA) gore opisano). Odabrane ES ćelije koje sadrže mutantni alel se zatim unose u embrion pacova domaćina, na primer, pre-morula stadijuma ili embrion pacova stadijuma blastociste i implantiraju u matericu surogatne majke za generisanje pacova osnivača (F0 pacov). Nakon toga, osnivač pacov je gajen do pacova divljeg tipa kako bi se stvorilo heterozigotno potomstvo F1 za mutantni alel. Spajanje heterozigotnog F1 pacova može proizvesti homozigotno potomstvo za mutantni alel.
2.2.: Ciljanje ESC pacova za inaktivaciju gena Apolipoproteina E (ApoE) pacova korišćenjem nukleaza cinkovih prstiju
[0426] Nukleaze sa cinkovim prstima koriste specifične modularne DNK vezujuće domene sekvence za upravljanje endonukleazne aktivnosti do jedinstvene ciljne sekvence u genomu. ZFN su konstruisani kao par monomera. Svaki monomer sadrži nespecifični domen cepanja iz Fokl endonukleaze spojen sa 3 ili više DNK vezujućih domena cinkovih prstiju. Svaki cinkov prst vezuje podmesto 3 bp i specifičnost je postignuta kombinovanim ciljnim mestima oba monomera. ZFN proizvode prekide dvostrukog lanca (DSB'S) u DNK, a mutacije (umetanja ili delecije) se često javljaju tokom nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ). DSB takođe stimulišu homologno usmerenu popravku (HDR) homolognom rekombinacijom ako je donorska sekvenca obezbeđena sa ZFN.
[0427] Takvi ZFN su korišćeni u kombinaciji sa različitim metodama i kompozicijama, ovde opisanim, kako bi se poboljšala efikasnost ciljanja. Lokus Apolipoproteina E (ApoE) pacova je ciljan kao što je opisano u Primeru 3.2 (a) (i), osim vektora ekspresije koji izražavaju ZFN-1 i 2 su takođe uneti u ćelije ES pacova. Videti sliku 10 koja pruža shematski prikaz događaja ciljanja ApoE u kombinaciji sa rTZFNIP i rTZFN2P. Efikasnost ciljanja je određena kao što je razmatrano niže u Primeru 6, a rezultati su prikazani na Slici 11. Iznenađujuće, je efikasnost ciljanja porasla 8-10 puta.
[0428] Vektor plazmidskog ciljanja je izgrađen sa samobrišućom kasetom za odabir leka i lacZ genom kao reporterskim genom. Dobijena je dobra efikasnost ciljanja i proizvedene su himere visokog %. Nukleaze zinkovih prstiju (ZFNs) su takođe testirane u kombinaciji sa vektorima ciljanja radi ispitivanja njihovog efekta na poboljšanje efikasnosti ciljanja. Vektor ciljanja je bio je zajedno izražen sa ekspresionim vektorima za 2 ZFN para koji su sekli ApoE lokus. Klonovi ESC pacova koji su elektroporirani i sa vektorima ciljanja i kompletom ZFN-a su pokazali efikasnost ciljanja 8-10 puta veću od one od klonova ESC pacova koji su elektroporirani samo sa vektorom ciljanja. Štaviše, detektovano je bialelno homozigotno ciljanje u oko 2% naših klonova. Dobijene su visoko % himere iz dva od ovih ciljanih klonova.
[0429] ApoE-ciljani (uz pomoć ZFN) ESC klonovi pacova su mikroinjektovani u SD blastociste, koje su zatim prebačene u lažno skotne ženke SD primaoce, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane bojom obloge; muške F0 himere su bile odgajane u SD ženkama. Fl mladunci germinativne linije su genotipovani na prisustvo ciljanog ApoE alela (slika 17). Bilo je visoko % himera od dva od ovih ciljanih klonova.
[0430] ApoE nokaut pacov obezbeđuje sredstvo za proučavanje različitih vrsta poremećaja i bolesti. Kod ljudi, Apolipoprotein je nađen u hilomikronu, HDL-u, LDL-u i VLDL-u. ApoE je od suštinskog značaja za normalni katabolizam lipoproteinskih sastojaka bogatih trigliceridima. Defekti u APOE rezultiraju brojnim bolesnim stanjima, uključujući, na primer, familijarnu hiperholesterolemiju, hiperlipemiju, betalipoproteinemiju, familijarnu disbetalipoproteinemiju, hiperlipoproteinemiju tipa III (HLP III), rizik od koronarne arterijske bolesti. Jedna izoforma (ApoE4) je povezana sa kasnim početkom familijarne i sporadične Alzheimerove bolesti, moguće sa MS-om.
[0431] Kod miševa, ApoE se prvenstveno nalazi u HDL-u; transportuje holesterol, kao kod ljudi. Miševi sa nedostatkom ApoE (2 nezavisna KOs) imaju 5 puta normalnog holesterola u plazmi; razvijene depozite bogate penastim ćelijama u njihovim proksimalnim aortama do 3 meseca (uporedivo s ljudskim sindromom).
[0432] ApoE nokauti kod pacova nude životinjski model za proučavanje endotelijalne funkcije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, formiranje plaka, transkripcione promene (RNK-Sek), ex vivo funkciju. Štaviše, veća veličina pacova bi olakšala sve ove analize i potencijalno poboljšala kvalitet RNK-Sek podataka.
2.3. Inaktivacija pacovskog lokusa Interleukin-2 Receptora Gama (IL2r-γ) korišćenjem nukleaza cinkovih prstiju
[0433] Lokus Interleukin-2 receptora gama (IL2r-γ) pacova je ciljan, kao što je opisano u primeru 3.3 (a), osim što su ekspresioni vektori koji eksprimiraju ZFN U (ZFN ushodno) i ZFN D (ZFN nishodno) takođe, uvedeni u ES ćelije pacova. Slika 18 daje šematski prikaz događaja ciljanja IL2r-γ u kombinaciji sa ZFN U i ZFN D. Sekvenca lokusa IL2r-γ koju vezuju ovi cinkovi prsti je označena na slici 18. Efikasnost ciljanja je određena kao što je niže razmatrano u Primeru 3.3 (a), a rezultati su prikazani na Slici 18. Ukratko, homozigotni ciljani klonovi su potvrđeni pomoću PCR-a. Za par ZFN1: 173 mutant klonova od 192 snimljenih (90%) i za par ZFN2: 162 klonova od 192 (84%) pregledanih.
[0434] IL2r-γ-ciljani (uz pomoć ZFN) pacovski ESC klonovi su mikroinjektovani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u lažno skotne ženke primaoce SD, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane bojom obloge; muške F0 himere su bile odgajane u ženkama SD. F1 mladunci germinativne linije su genotipovani na prisustvo ciljanog IL2r-γ alela.
2.4. : Inaktivacija gama receptora interleukina-2 (IL2r-γ) korišćenjem CRISPR / Cas9
[0435] Lokus IL2r-γ pacova je bio ciljan kao što je opisano u primeru 3.3 (a), osim što je sistem CRISPR / Cas9 takođe bio uveden u ES ćelije pacova kako bi se pomoglo u efikasnosti ciljanja. SBI: Sistem Biosciences Cas9 "SmartNuclease" svi-u-jednom vektori su korišćeni, a Cas9 ekspresija je vođena pomoću CAG, EF1a, PGK ili CMV promotera. Prilagođena gRNK je ligirana u vektor i izražena pomoću H1 promotera. Dizajnirane su 4 gRNK protiv Il2rg. Efikasnost ciljanja kod primene različitih vodećih RNK je prikazana na slici 19.
Primer 3: Ciljana modifikacija genomskog lokusa pacova
3.1: Ciljanje pacovskih ESC: Pacovski Rosa 26 Lokus.
[0436] Lokus Rosa26 pacova leži između gena Setd5 i Thumpd3 kao kod miša, sa istim razmakom. Lokus Rosa 26 pacova (slika 12, panel B) se razlikuje od mišjeg Rosa 26 lokusa (slika 12, panel A). Transkripti Rosa26 miša se sastoje od 2 ili 3 eksona. Lokus pacova sadrži 2. ekson 1 (Ex 1b) pored homolognog eksona prema eksonu1 miša (Ex1a). Nijedan treći ekson nije identifikovan kod pacova. Ciljanje alela pacova Rosa26 je prikazano na slici 12 (dno), gde su homologni kraci od 5Kb svaki klonirani pomoću PCR-a korišćenjem genomske DNK od DA pacova ESC. Ciljani alel sadrži SA (vezujućeg primalaca)-lacZ-hUb-neo kasetu koja zamenjuje brisanje od 117 bp u intronu Rosa26 pacova.
[0437] Utvrđena je efikasnost ciljanja na pacovskom lokusu Rosa 26 (Tabela 12). Linearizovani vektor je elektroporiran u ESC ćelije DA ili ACI pacova, a transfektovane kolonije su kultivisane u 2i medijumu G418, korišćenjem standardnih tehnika. Pojedinačne kolonije su odabrane i prikazane pomoću testa gubitka alela (LOA) (Valenzuela, D. i sar. (2003) Inženjering visokog prolaza od mišjeg genoma u kombinaciji sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech.21: 652-660).
[0438] Proizvodnja himera i transmisija germinativne linije korišćenjem Rosa26-ciljanih ESC klonova pacova. Ponovo potvrđeni Rosa26-ciljani pacovski ESC klonovi su mikroinjektovani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u lažno skotne ženke primaoce SD, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane bojom obloge; muške F0 himere su bile odgajane u ženkama SD. F1 mladunci (agouti) germinativne linije su genotipovani na prisustvo ciljanog alela Rosa26; devet od 22 agouti mladunaca genotipovani kao heterozigotni na lokusu Rosa26 (Tabela 13).
3.2.(a) (i): Ciljanje lokusa apolipoproteina E (ApoE) pacova.
[0439] Lokus Apolipoproteina E (ApoE) pacova je bio ciljan da poremeti funkciju ApoE. Ciljanje ApoE lokusa je izvršeno korišćenjem vektora za ciljanje koji sadrži kasetu lacZ-hUbneo okruženu sa 5' i 3' homolognim kracima do ApoE lokusa. Slika 20 prikazuje ApoE lokus genetski modifikovanog pacova koji je raskinut pomoću delecije od 1,8 kb i ubacivanjem kasete lacZ-hUb-neo, što dalje uključuje samo-uklanjajuću Cre kasetu koja sadrži Crei gen predvođen protaminskim promoterom. Uslovi elektroporacije su bili su sledeći: 6 ug DNK; 2,05 x 10<6>ćelija; 400V; 200 uF: 342 V, 593 upotrebe; ploča na 15 cm 2x gusti neoR MEFs u 2i 10 uM ROCKi.
[0440] Utvrđena je efikasnost ciljanja na ApoE lokusu i prikazana je u Tabeli 14. Linearizovani vektor je elektroporisan u ESC ćelije pacova DA.2B izvedene iz soja DA, a transfektovane kolonije su kultivisane korišćenjem standardnih tehnika. Pojedinačne kolonije su odabrane i prikazane korišćenjem testa gubitka alela (LOA).
[0441] Proizvodnja himere i transmisija germinativne linije korišćenjem ApoE ciljanih pacovskih ESC klonova je izvedena. ApoE ciljani pacovski ESC klonovi su mikroinjektovani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u lažno skotne ženke primaoce SD, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane bojom obloge; muške F0 himere su bile odgajane u ženkama SD. F1 mladunci su genotipizovani na prisustvo ciljanog ApoE alela (Tabela 15).
Tabela 15 Rezultati mikroinjektovanja
[0442] Dodatni podaci o ciljanju za ApoE su takođe dati na slici 21.
3.2.(a) (ii). Ciljanje ApoE u pacovima sa vektorom ciljanja
[0443] Slika 20 daje shemu pacovskog ApoE lokusa i plazmida za ciljanje. Gornja shema Slike 20 pokazuje genomsku strukturu pacovskog ApoE lokusa i genomske regione koji odgovaraju homolognim kracima 5' i 3' (5 kb i 5,4 kb, respektivno; tamno sive kutije). Ekson 1 ApoE-a je nekodirajući i prikazan je kao otvorena kutija najbliža homolognoj ruci 5'. 3 introna ApoE su označena kao linije, a eksoni 2 i 3 sadrže regione za kodiranje i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim zatamnjenjem i otvorenom kutijom.
[0444] Donja shema na slici 20 je vektor ciljanja. Homologni krajevi 5' i 3' (5 kb i 5,4 kb respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Vektor ciljanja obuhvata reporterski gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje okruženu sa loxP lokacijama (otvorene strelice). Kaseta za samobrisanje sadrži Crei-gen koji je operativno vezan za promoter miša Prm1 i selekcionu kasetu koja sadrži gen za otpornost na neomicin operativno povezan sa humanim promoterom ubikvitina.
[0445] Crei gen obuhvata dva eksona koja kodiraju Cre rekombinazu, koja su odvojena intronom (Crei) da spreče njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, Američki patent 8,697,851 i Američku objavu prijave 2013-0312129, koji detaljno opisuju kasetu za samobrisanje. Angažovanjem Prm1 promotera, kaseta za samobrisanje može biti obrisana specifično u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova. Vektor ciljanja je bio elektroporiran u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1, a ćelije su bile nanete na 15 cm 2x guste MEF-ove otporne na neomicin u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ćelije ES pacova su kultivisane, odabrane i održavane, kao što je opisano u Primeru 1.
[0446] Kao što je prikazano u Tabeli 23, ispitano je 384 kolonija i dobijeno je 23 ciljanih klonova. Efikasnost ciljanja je bila 5,99%. 3 klona su injektovana u blastociste, kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijena su 3 klona koji proizvode himere, a 2 klona su prenosila ciljanu modifikaciju kroz germinativnu liniju.
3.2.(a) (iii). Ciljanje ApoE-a pacova sa vektorom ciljanja u kombinaciji sa nukleazama zinkovih prstiju
[0447] Vektor ciljanja koji je korišćen u Primeru 3.2 (a) (ii) je korišćen u kombinaciji sa nukleazama zinkovih prstiju za ciljanje lokusa ApoE pacova. Tabela 16 obezbeđuje pregled genomske organizacije pacovskog ApoE lokusa. Položaji prikazani u Tabeli 16 su uzeti iz građe 5.0 referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). ApoE je na hromozomu 1 na (-) lancu.
[0448] Tabela 16. Pregled lokusa ApoE pacova i položaji mesta vezivanja nukleaza cinkovih prstiju i mesta sečenja.
(nastavak)
[0449] Slika 10 obezbeđuje shemu pacovskog ApoE lokusa i označava sa sivim barovima mesto presecanja za ZFN1 i ZFN2. Mesto sečenja za ZFN1 je u eksonu 3, a mesto sečenja za ZNF2 je u intronu 3. Tačan položaj obe ZFN lokacije je prikazan u Tabeli 16. Genomski regioni koji odgovaraju 5' i 3' homolognim krajevima (5 kb i 5,4 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Ekson 1 ApoE-a je nekodirajući i prikazan je kao otvorena kutija najbliža homolognoj ruci 5'. Tri introna ApoE gena su označena kao linije, a eksoni 2 i 3 sadrže regione kodiranja i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim zatamnjenjem i otvorenom kutijom.
[0450] Angažovani vektor ciljanja je bio isti kao u Primeru 3.2 (a) (ii) i prikazan na Slici 20. ZFN su uvedene kao dva ekspresiona plazmida, jedna za svaku polovinu ZFN para. Korišćeno je 20 ug plazmida za ZFN1 i 20 ug plazmida za ZFN2. ZFN su nabavljene od Sigme. Ekspresija svake ZFN nukleaze je vođena CMV promoterom.
[0451] Vektor ciljanja je bio elektroporiran u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su položene na 15 cm 2x guste neoR MEF-ove u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, odabrane i održavane, kao što je opisano u Primeru 1.
[0452] Kao što je prikazano u Tabeli 23, 384 kolonija je pregledano i dobijeno je 290 ciljanih klonova. Efikasnost ciljanja je bila 75,52%. 2 klona su injektovana u blastociste, kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijena su dva klona koja proizvede himere, a jedan od klonova je preneo ciljanu modifikaciju kroz germinativnu liniju.
[0453] Štaviše, angažovanjem ZFN1 i ZFN2 proizvedeno je 8 bialelnih ciljanih klonova sa efikasnošću od 2,08%.
3.2. (b) (i): Ciljana modifikacija lokusa Apolipoproteina E (ApoE) pacova korišćenjem velikog vektora ciljanja (LTC).
[0454] Ciljanje ApoE lokusa je izvršeno korišćenjem velikog vektora ciljanja (LTVEC) koji sadrži kasetu Prm1-Crei lacZ-miša okruženu sa 5' homolognim krakom do ApoE lokusa od oko 45 kb i 3' homolognim krakom do ApoE lokusa od oko 23 Kb. Na slici 22 prikazan je ApoE lokus pacova u kojem je ApoE lokus prekinut brisanjem 1,83 kb i ubacivanjem lacZ gena i kasete za samobrisanje koja sadrži kasetu mPrm1-Crei i kasetu za selekciju hUb-neo. Metode korišćene u primeru 3.2 (a) (i) mogu biti korišćene za uvođenje ovog vektora u ES ćelije pacova.
Primer 3.2. (b) (ii). Ciljanje lokusa ApoE pacova sa velikim vektorom ciljanja (LTVEC)
[0455] Slika 22 obezbeđuje shemu pacovskog ApoE lokusa i velikog vektora ciljanja (LTEVC). U gornjem shematskom prikazu na slici 22 prikazana je genomska organizacija pacovskog ApoE lokusa i genomskih regiona koji odgovaraju homolognim kracima 5' i 3' (45 kb i 23 kb, respektivno; tamno sive kutije). Ekson 1 ApoE-a je nekodirajući i prikazan je kao otvorena kutija najbliža homolognoj ruci 5'. 3 introna ApoE su označena kao linije, a eksoni 2 i 3 sadrže regione za kodiranje i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim zatamnjenjem i otvorenom kutijom.
[0456] Donja shema na slici 22 je LTVEC. Homologni krajevi 5' i 3' (45 kb i 23 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Vektor ciljanja obuhvata reporter gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje okruženu pomoću loxP lokacija (otvorene strelice), koja obuhvata Crei gen operativno povezan sa mišjim Prm1 promoterom i kasetu za odabir leka koja sadrži gen otpornosti na neomicin koji je operativno povezan sa promoterom humanog ubikvitina. Crei sadrži dva eksona koja kodiraju Cre rekombinazu koja su odvojena intronom (Crei) kako bi sprečili njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, U.S. Patent 8,697,851 i U.S. objavu prijave 2013-0312129, koja detaljno opisuje kasetu za samobrisanje. Korišćenjem mišjeg Prm1 promotera, kaseta za samobrisanje se može specifično izbrisati u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova.
[0457] LTVEC je elektroporiran u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1, a ćelije su nanete na ploči na 15 cm 2x guste neoR MEF-ove u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, odabrane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0458] Kao što je prikazano u Tabeli 23, ispitivano je 288 kolonija i dobijeno je 8 ciljanih klonova. Efikasnost ciljanja je bila 2,78%. 3 klona su injektovana u embrion domaćina u stadijumu blastociste, kako je ovde opisano u Primeru 2, da bi se proizveli himerni pacovi (F0). Štaviše, proizveden je jedan bialelni ciljani klon koji obezbeđuje bialelnu efikasnost od 0,35%.
3.2.(b) (iii). Ciljanje pacovskih ApoE-a sa velikim vektorom ciljanja (LTVEC) u kombinaciji sa nukleazama zinkovih prstiju
[0459] LTVEC angažovan u Primeru 3.2. (B) (ii) je bio korišćen u kombinaciji sa nukleazama zinkovih prstiju za ciljanje lokusa ApoE pacova. Tabela 16 daje pregled genomske organizacije pacovskog ApoE lokusa i pokazane pozicije su uzete iz građe 5.0 Referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL).
[0460] Slika 23 obezbeđuje shemu pacovskog ApoE lokusa i označava sivim barovima mesto sečenja za ZFN1 i ZFN2. Mesto sečenja za ZFN1 je u t eksonu 3, a mesto sečenja za ZNF2 je u intronu 3. Tačan položaj oba ZFN mesta je prikazan u Tabeli 16. Homologni kraci 5' i 3' (45 kb i 23 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. Ekson 1 ApoE gena je nekodirajući i prikazan je kao otvorena kutija koja je najbliža homolognom kraku 5'. Tri introna gena ApoE su označena kao linije. Eksoni 2 i 3 sadrže regione za kodiranje i prikazani su kao tačkaste sive kutije. Ekson 4 sadrži i kodirajuće i nekodirajuće sekvence, kao što je označeno tačkastim sivim zatamnjenjem i otvorenom kutijom.
[0461] Angažovani LTVEC je bio isti kao u Primeru 3.2 (b) (ii) i prikazan na Slici 22. ZFN su uvedeni kao dva ekspresiona plazmida, po jedan za svaku polovinu ZFN para. Korišćeno je 20 ug plazmida za ZFN 1 i 20 ug plazmida za ZFN2. ZFN su nabavljeni od Sigme. Ekspresija svakog ZFN-a je vođena CMV promoterom.
[0462] Vektor ciljanja je bio elektroporiran u ES ćelije koje su dobijene u Primeru 1 i ćelije su položene na 15 cm 2x guste neoR MEF u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, odabrane i održavane, kao što je opisano u Primeru 1.
[0463] Kao što je prikazano u Tabeli 23, ispitivano je 288 kolonija i dobijeno je 16 ciljanih klonova. Efikasnost ciljanja je bila 5,56%. Jedan klon je injektovan u blastociste, kao što je ovde opisano u Primeru 2.
[0464] Štaviše, angažovanje ZFN1 i ZFN2 proizvelo je jedan bialelni ciljani klon, sa efikasnošću od 0,35%.
3.3(a): Ciljanje pacovskog lokusa interleukin-2 receptora gama (IL2r-γ)
[0465] Lokus Interleukin-2 receptor gama (IL2r-γ) pacova je bio ciljan da poremeti funkciju IL2r-γ. IL2r-γ igra važnu ulogu u signalizaciji pomoću IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 i mutacije u IL2r-γ su povezane sa ozbiljnim defektima u razvoju T, B i NK ćelija.
[0466] Ciljanje lokusa IL2r-γ je izvršeno korišćenjem vektora ciljanja koji sadrži eGFP-hUbneo kasetu okruženu sa 5 'i 3' homolognim kracima homolognim za lokus IL2r-γ. Na slici 26 prikazana je genomska struktura IL2r-γ lokusa pacova u kome je lokus IL2r-γ prekinut pomoću delecije 3,2 kb. Ciljani IL2r-γ lokus takođe sadrži eGFP gen i kasetu za samobrisanje koja sadrži Crei funkcionalno povezan sa promoterom Protamine 1 miša i kasetu za selekciju lekova koja sadrži hUb promoter operativno povezan sa genom otpornosti na neomicin.
[0467] Utvrđena je i prikazana efikasnost ciljanja na lokusu IL2r-γ u Tabeli 17. Linearizovani vektor je elektroporiran u ESC ćelije pacova DA.2B, a transfektovane kolonije su kultivisane korišćenjem standardnih tehnika. Pojedinačne kolonije su odabrane i prikazane pomoću testa gubitka alela (LOA).
[0468] Proizvodnja himera i transmisija germinativne linije korišćenjem IL2r-γ ciljanih ESC klonova pacova je izvedena. IL2r-γ-ciljani pacovski ESC klonovi su mikroinjektovani u SD blastociste, koji su zatim prebačeni u lažno skotne ženke primaoce SD, korišćenjem standardnih tehnika. Himere su identifikovane bojom obloge; muške F0 himere su bile odgajane u ženkama SD. F1 mladunci germinativne linije su genotipovani na prisustvo ciljanog IL2r-γ alela (Tabela 18).
Tabela 18 Rezultati mikroinjektovanja
[0469] Fenotip Il2rg<-/Y>himera # 3 je dalje proučavan. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) su obojene antitelima koja prepoznaju antigene u nekoliko limfoidnih loza. GFP-pozitivne PBMC su detektovane od 2 himere. Osim toga, GFP ćelije su bile negativne za T-ćelijski marker CD3 i bile su uglavnom negativne za B-ćelijski marker B220 i NK ćelijski marker CD 161a. Videti, Slika 30. Male dvostruko pozitivne populacije su u skladu sa objavljenim I12rg nokaut fenotipom kod miševa. Ovi podaci su dobijeni iz himernog pacova, koji sadrži IL2 receptor gama-pozitivne ćelije, a ovo može komplikovati analizu fenotipa.
3.3(b): Ciljana modifikacija pacovskog lokusa interleukin-2 receptora gama (IL2r-γ)
[0470] Lokus interleukin-2 receptora gama (IL2r-γ) pacova je bio ciljan da poremeti funkciju IL2r-γ kod pacova. Na slici 26 prikazana je genomska struktura lokusa Il2rg pacova i vektora ciljanja uvedenog u lokus. eGFP je izabran kao reporter, tako da se imunofenotip genetski modifikovanih pacova može ispitati korišćenjem FACS-a. Kaseta za samobrisanje (hUb-Neo; Prm1-Cre) je korišćena za brisanje kasete za odabir leka i Cre gena specifično u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova. Dodatno, vektor ciljanja je bio dizajniran za brisanje čitavog regiona za kodiranje (oko 3,2 kb) gena I12rg pacova.
[0471] Veličina delecije u pacovskim ESC ćelijama pacova je potvrđena pomoću PCR-a korišćenjem prajmera specifičnih za lokus I12rg pacova. Nakon mikroinjektovanja ciljanih klonova u embrione domaćina u stadijumu blastociste, dobijen je visoki procenat himera. Te himere su postavljene za uzgoj. Da bi utvrdili da li je ciljanje funkcionisalo kako se očekivalo, periferna krv iz himera je sakupljena pre uzgajanja, a fenotip imunskih ćelija u perifernoj krvi je analiziran putem FACS-a. Kao što je prikazano na slici 30, GFP-pozitivne ćelije su otkrivene u perifernoj krvi u 2 od 3 ispitane himere (gornji desni panel), a himerni pacovi su sadržali manje od 1% T ćelija, manje od 1% B ćelija, i manje od 1% NK-ćelija, koje su pozitivne za GFP (tj. Il2rg KO ćelije).
3.4 (a). Ciljanje lokusa Rag2 kod pacova sa velikim vektorom za ciljanje (LTVEC)
[0472] Tabela 19 daje pregled genomske organizacije pacovskog lokusa Rag2, a prikazani položaji su preuzeti iz građe 5.0 referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). Rag2 je na hromozomu 3 na (+) lancu.
Tabela 19. Pregled genomske organizacije pacovskog lokusa Rag2.
[0473] Slika 27 daje shemu pacovskog lokusa Rag2 i velikog vektora ciljanja (LTVEC). Gornji shematski prikaz Slike 27 pokazuje genomsku organizaciju ApoE lokusa pacova i genomske regione koji odgovaraju homolognim kracima 5' i 3' (48 Kb i 15 Kb, respektivno; tamno sive kutije). Rag2 sadrži pojedinačni ekson označen tačkastim sivim zatamnjenjem.
[0474] Donji shematski prikaz na slici 27 je LTVEC. Homologni kraci 5' i 3' (48 kb i 15 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. LTVEC obuhvata reporter gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje okruženu pomoću loxP lokacija (otvorene strelice). Kaseta za samobrisanje sadrži mišjeg Prm1 promotera operativno povezanog sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži humani ubikvitinski promoter operativno povezan sa genom otpornim na neomicin. Crei sadrži dva eksona koja kodiraju Cre rekombinazu, odvojena su intronom (Crei) kako bi sprečili njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, Američki patent 8,697,851 i Američku publikaciju prijave 2013-0312129, koja detaljno opisuje kasetu za samobrisanje. Korišćenjem mišjeg Prm1 promotera, kaseta za samobrisanje može biti obrisana specifično u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova.
[0475] LTVEC je elektroporiran u ćelije ES pacova dobijene u Primeru 1 i ćelije su obložene na 15 cm 2x guste neoR MEF-ove u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane i održavane kako je opisano u Primeru 1. Kolonije su pregledane kao što je ovde opisano na drugom mestu i dobijeni su ciljani klonovi. Ciljani klonovi su zatim injektovani u embrion domaćina, kako je ovde opisano na drugom mestu da bi proizveli F0 pacova.
3.4. (b). Ciljanje Rag1 i Rag 2 lokusa u pacovima
[0476] Slika 28 daje genomsku strukturu pacovskog lokusa Rag1 / Rag2. CDS označava sekvencu kodiranja i sive kutije predstavljaju egzone. Rag2 je na "plus" lancu sa transkripcijom udesno. Rag1 se nalazi na "minus" lancu sa transkripcijom ulevo. Mbp = milion baznih parova.
[0477] Tabela 20 daje pregled genomske organizacije pacovskog Rag2 i Rag1 lokusa, a prikazani položaji su uzeti iz građe 5.0 Referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). Rag1 je na hromozomu 3 na (-) lancu.
Tabela 20. Pregled organizacije genoma pacovskog lokusa Rag1.
[0478] Slika 29 obezbeđuje shematski prikaz pacovskog Rag2 i Rag1 lokusa i velikog vektora ciljanja (LTVEC). Gornja shema Slike 29 prikazuje genomsku organizaciju lokusa Rag1 i Rag2 i genomske regione koje odgovaraju homolognim krajevima 5' i 3' (48 kb i 84 kb, respektivno; tamno sive kutije). Rag2 i Rag 1 svaki sadrže jedan egzon označen tačkastim sivim zatamnjenjem. Donja šema na slici 29 je LTVEC. Homologni kraci 5' i 3' (48 kb i 84 kb, respektivno) su označeni tamno sivim kutijama. LTVEC obuhvata reporter gen (lacZ) i kasetu za samobrisanje okruženu sa loxP lokacijama (otvorene strelice). Kaseta za samobrisanje sadrži promoter Prm1 pacova operativno povezan sa Crei genom i kasetu za odabir leka koja sadrži humani ubikvitinski promoter koji je operativno povezan sa genom otpornosti na neomicin. Crei sadrži dva eksona koji kodiraju Cre rekombinazu odvojena intronom (Crei) kako bi sprečili njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, U.S. Patent 8,697,851 i U.S. publikaciju prijave 2013-0312129, koja detaljno opisuje kasetu za samobrisanje. Angažovanjem Prm1 promotera pacova koji vodi ekspresiju Crei specifično u muškim germinativnim ćelijama, kaseta za samobrisanje može biti izbrisana iz muških germinativnih ćelija F0 pacova.
[0479] LTVEC je elektroporiran u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1, a ćelije su obložene na 15 cm 2x guste neoR MEF-ove u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0480] Kolonije su pregledane kao što je ovde opisano na drugom mestu i dobijeni su ciljani klonovi. Ciljani klonovi su zatim injektovani u embrion domaćina, kao što je opisano na drugom mestu ovde da proizvedu F0 pacova.
Primer 4. Humanizacija
4.1. Humanizacija genomskih lokusa pacova
[0481] Humanizacija genomskih lokusa pacova je izvršena korišćenjem ES ćelija pacova, ovde opisanih, koji su sposobni da održe svoju pluripotenciju nakon jedne ili više elektroporacija in vitro i sposobni su za prenošenje ciljane genske modifikacije na sledeće generacije. Pored toga, kako bi se zaobišla ograničenja plazmida u smeštanju velikog genomskog fragmenta DNK i prevazišla niska efikasnost uvođenja ciljane genetske modifikacije u endogeni lokus u ES ćelijama pacova, izvršena je jedna ili više ciljanih genetskih modifikacija u bakteriji, npr. E. coli, korišćenjem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) i angažovanjem velikog vektora ciljanja (LTVEC). LTVEC ovde opisan, na primer, uključuje veliki fragment endogene genomske sekvence pacova sa jednom ili više modifikacija ili sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu (npr., homolognu ili ortolognu humanu nukleinsku kiselinu), okruženu sa homolognim kracima pacova komplementarno specifičnim genomskim regionima.
4.2. Humanizacija imunoglobulinskih lokusa pacova
[0482] Humanizacija endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca pacova je izvršena uklanjanjem jedne ili više endogenih sekvenci nukleinskih kiselina teškog lanca imunoglobulina pacova (npr. jedan ili više endogenih genskih segmenata VH, jedan ili više humanih genskih segmenata D i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata); i uvođenje u modifikovani lokus imunoglobulina vektora ciljanja, npr. velikog vektora ciljanja (LTVEC) koji sadrži: (i) jednu ili više neuređenih sekvenci nukleinskih kiselina humanog varijabilnog regiona (npr. jedan ili više humanih genskih segmenata VH, jedan ili više humanih D genskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata) ili jednu ili više preuređenih sekvenci nukleinske kiseline humanog varijabilnog regiona (npr. jedan ili više humanih preuređenih V-D-J genskih segmenata); (ii) selekcionu kasetu (npr., gen za otpornost na neomicin okružen sa loxP mestima); i (iii) 5' i 3' homologne krake pacova.
[0483] Ukratko, jedan ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca pacova, (tj., jedan ili više VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih D genskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata) u pacovskom klonu BAC se uklanjaju ili inaktiviraju ciljanjem endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina pacova sa selekcionom kasetom okruženom sa homolognim kracima pacova. Konkretno, vektor ciljanja je konstruisan tako da sadrži kasetu za selekciju (npr. gen za otpornost na neomicin okružen sa loxP lokacijama) okružen sa 5' i 3' homolognim kracima pacova koji su komplementarni ciljnim genomskim sekvencama pacova (npr. ushodne i nishodne genomske sekvence DNK pacova koje obuhvataju jedan ili više genskih segmenata VHpacova, jedan ili više humanih genskih segmenata D i jedan ili više humanih genskih segmenata JH).
[0484] Sledeće, bakterijske ćelije koje sadrže veliki genomski fragment DNK pacova obuhvatajući lokus imunoglobulinskog teškog lanca pacova su odabrane i uvedene sa plazmidom (npr., pABG) kodirajući rekombinazu koja je operativno povezana sa prolazno indukovanim promoterom. Vektor ciljanja gore konstruisan je zatim uveden u bakterijske ćelije odgovorne za rekombinaciju. Nakon elektroporacije, bakterijske ćelije su tretirane sa induktorom (npr., arabinozidom) za iniciranje homologne rekombinacije između vektora ciljanja i ciljane genomske sekvence pacova u BAC klonu. Transformirane ćelije su nanete na ploču pri velikoj gustini i podvrgnute selekciji leka da bi se pronašle kolonije koje su otporne na lek. Kolonije otporne na lekove su izabrane i pregledane za ciljanu modifikaciju.
[0485] Da bi se olakšala identifikacija ciljane genetske modifikacije, korišćen je kvantitativni test visoke propustljivosti, naime, test modifikacije alela (MOA), koji omogućava skrining velikih razmera modifikovanog(ih) alela u roditeljskom hromozomu nakon genetske modifikacije. MOA test može biti izveden putem različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na, kvantitativni PCR, npr. PCR u realnom vremenu (qPCR). Na primer, PCR u realnom vremenu sadrži prvi set prajmera koji prepoznaje ciljani lokus i drugi set prajmera koji prepoznaje ne-ciljani referentni lokus. Osim toga, set prajmera može da sadrži fluorescentnu sondu koja prepoznaje pojačanu sekvencu. Alternativno, kvantitativni test se može izvesti putem različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hibridizaciju in situ posredovanu fluorescencijom (FISH), komparativnu genomsku hibridizaciju, izotermnu DNK amplifikaciju, kvantitativnu hibridizaciju na imobilizovanoj sondi(ama) , Invader Probes®, MMP testovi®, TaqMan® Molecular Beacon i Eclipse ™ probe tehnologija. (Videti, na primer, US2005 / 0144655).
[0486] Bakterijske ćelije koje sadrže modifikovani klon BAC pacova, tj. BAC klon koji sadrži genomsku sekvencu DNK pacova, gde su jedan ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca (genski segmenti VH, D i / ili JH) izbrisani ili inaktivirani, su zatim elektroporirane sa velikim vektorom ciljanja (LTVEC) koji sadrži: (i) jednu ili više neuređenih sekvenci nukleinske kiseline humanog varijabilnog regiona (npr. jedan ili više neuređenih humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih D genskih segmenta i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata) ili jednu ili više preuređenih sekvenci nukleinske kiseline humanog varijabilnog regiona (npr. jedan ili više preuređenih humanih V-D-J genskih segmenata).
[0487] Iniciranje homologne rekombinacije u bakterijskim ćelijama i selekcija pozitivnih klonova su izvedene, kao što je gore opisano. Neuređene ili preuređene sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, kada su ciljane u lokus endogenog imunoglobulinskog teškog lanca, postaju operativno povezane sa endogenom sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina pacova. Alternativno, endogeni lokus konstantnog regiona teškog lanca pacova može biti inaktiviran, na primer, brisanjem jednog ili više genskih segmenata konstantnog regiona teškog lanca (CH) pacova iz endogenog lokusa konstantnog regiona teškog lanca i može biti zamenjen sa humanom sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca.
[0488] Slično, humanizacija endogenog pacovskog lokusa imunoglobulinskog κ ili λ lakog lanca je izvršena uklanjanjem jedne ili više endogenih sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulinskog κ i / ili λ lakog lanca pacova (npr. jedan ili više endogenih genskih segmenta Vκpacova i jedan ili više endogenih genskih segmenata Jκpacova); i ciljanje modifikovanog lokusa lakog lanca imunoglobulina sa vektorom ciljanja, npr. velikim vektorom ciljanja (LTVEC), koji obuhvata: (i) jednu ili više neuređenih sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina (npr. jedan ili više humanih genskih segmenata Vκi jedan ili više humanih Jκgenskih segmenata) ili jednu ili više preuređenih sekvenci nukleinske kiseline humanog varijabilnog regiona (npr. jedan ili više humanih preuređenih Vκ- Jκgenskih segmenata); (ii) kasetu za selekciju (npr., gen otpornosti na neomicin na bočnoj strani sa loxP lokacijama); i (iii) 5' i 3' homologne krake pacova.
[0489] Neuređena ili preuređena sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog lakog lanca, kada je ciljana u endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina, postaje operativno povezana sa endogenom sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina pacova.
[0490] LTVEC koji je tako proizveden u bakterijskim ćelijama sadrži, na primer, ubačenu nukleinsku kiselinu koja sadrži humanizovani teški lanac imunoglobulina pacova ili lokus lakog lanca u kome je jedan ili više endogenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca pacova zamenjeno sa jednim ili više humanih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca; i homolognim kracima pacova (npr., u rasponu od 5kb do 150kb) komplementarno specifičnim genomskim ciljnim sekvencama. LTVEC koji sadrži gore opisanu genetsku modifikaciju je zatim linearizovan i elektroporiran u ES ćelije pacova. Elektroporirane ES ćelije pacova se oblažu pri visokoj gustini da odaberu ES ćelije otporne na lekove koje sadrže vektor ciljanja. Proces selekcije lekova uklanja većinu nanetih ćelija (~99%), ostavljajući iza sebe pojedinačne kolonije, od kojih je svaki klon izveden iz jedne ćelije. Od preostalih ćelija, većina ćelija (~ 80-100%) sadrži vektor ciljanja integrisan na slučajnu lokaciju u genomu. Zbog toga su kolonije izabrane i genotipovane pojedinačno kako bi se identifikovale ES ćelije pacova koje sadrže vektor ciljanja na tačnoj genomskoj lokaciji (npr., koristeći test modifikacije alela (MOA) gore opisanog).
[0491] Da bi se povećala efikasnost ciljane genetičke modifikacije, ES ćelije pacova se elektroporišu sa vektorima ekspresije (ili mRNK) koji izražavaju ZFNs 1 i 2 (ili TALENs 1 i 2) zajedno sa LTVEC. Homologni krajevi vektora ciljanja leže izvan ZFN ciljnog mesta, stoga, ciljni vektor nije cepan od strane ZFN-a. Prekid dvostrukog lanca proizveden od strane ZFN-a stimuliše popravku homologno usmerenu (HDR), što inače čini veoma mali procenat popravki koje se normalno javljaju u ćelijama sisara (u poređenju sa nehomolognim spajanjem krajeva; NHEJ).
[0492] Alternativno, ekspresioni vektori koji sadrže nukleazu povezanu sa CRISPR tipa II (npr., Cas9), vodeću RNK (uključujući CRISPR-RNK (cr-RNK) i transaktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNK)), kao što je ovde opisano, mogu biti uvedeni u bakterijske ćelije zajedno sa LTVEC-om radi povećanja efikasnosti homologne rekombinacije na ciljnom genomskom lokusu. Elektroporirane ćelije su nanete na ploču pri visokoj gustini i podvrgnute selekciji lekova da bi se pronašle kolonije koje su otporne na lekove. Kolonije otporne na lekove se odabiraju i pregleduju za ciljanu modifikaciju korišćenjem testa modifikacije alela (MOA), kao što je ovde opisano. Praćenjem ovih procedura, može se postići poboljšanje efikasnosti ciljanja. Na primer, količina poboljšanja može biti mala (na primer, poboljšati od 10% do 15%) ili velika (npr. poboljšati od 10% do 80%).
[0493] Izabrane ES ćelije pacova koje sadrže ciljanu genetsku modifikaciju su zatim uvedene u embrion pacova domaćina, na primer, pacovski embrion stadijuma pre-morula ili stadijuma blastociste i implantirane u matericu majke surogata da generišu tvorca pacova (F0 pacov). Nakon toga, osnivač pacova se odgaja do pacova divljeg tipa da bi stvorio heterozigot F1 potomstva za genetsku modifikaciju. Parenje heterozigotnog F1 pacova može proizvesti homozigotno potomstvo za genetsku modifikaciju.
4.3 (a). Zamena pacovskog IL2rg sa humanim IL2 receptorom gama
[0494] Tabela 21 daje pregled genomske organizacije pacovskog lokusa Interleukin 2 receptora gama i prikazani položaji su uzeti iz građe 5.0 Referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). IL2rg je na hromosomu X na (-) lancu.
Tabela 21. Pregled genomske organizacije lokusa Il2rg pacova
(nastavak)
[0495] Donja shema na slici 26 je vektor ciljanja za IL2rg deleciju od 3,2 kb. Vektor ciljanja sadrži reporter gen (eGFP) koji je operativno povezan sa endogenim promoterom i kasetom za samobrisanje okruženom pomoću loxP lokacija (otvorene strelice). Kaseta za samobrisanje sadrži Crei-gen koji je operativno vezan za promoter miša Prm1 i selekcionu kasetu koja sadrži gen za otpornost na neomicin koji je operativno povezan sa humanim promoterom ubikvitina.
[0496] Crei gena sadrži dva eksona koja kodiraju Cre rekombinazu, koja su odvojena intronom (Crei) da bi sprečili njegovu ekspresiju u prokariotskoj ćeliji. Videti, na primer, Američki patent 8,697,851 i Američku prijavnu publikaciju 2013-0312129, koja detaljno opisuje kasetu za samo-brisanje. Korišćenjem mišjeg Prm1 promotera, Cre ekspresiona kaseta i kaseta za odabir leka mogu biti obrisane specifično u muškim germinativnim ćelijama F0 pacova. Vektor ciljanja je bio elektroporiran u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1, a ćelije su bile obložene na 15 cm 2x gustim MEF-ovima otpornim na neomicin u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, odabrane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0497] Kao što je prikazano u Tabeli 23, pregledano je 168 kolonija i dobijeno je 6 ciljanih klonova. Efikasnost ciljanja je bila 3,57%.
[0498] Klonovi su injektovani u blastociste, kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijeni su klonovi koji proizvode F0 pacove i dobijeni su F0 pacovi koji prenose ciljanu modifikaciju kroz germinativnu liniju.
Primer 4.3 (b). Zamena pacovskog ekto-domena IL2rg sa humanim ekto-domenom IL2rg
[0499] Humanizacija u punoj dužini IL-2 receptora gama je korisna jer pacovi koji imaju ovaj modifikovani lokus će proizvesti humani Il2rg; i to bi omogućilo otkrivanje humanog Il2rg kod pacova sa antitelima specifičnim za humani Il2rg.
[0500] Ekto-humanizacija (tj. zamena ekto-domena pacova Il2rg sa humanim ekto-domenom Il2rg) će rezultirati polipeptidom Il2rg koji će vezati humane ligande za Il2rg, ali pošto je citoplazmatski domen i dalje pacovski, ekto-humanizovani oblik Il2rg će takođe stupiti u interakciju sa mehanizmom za signalizaciju pacova. Slika 33 daje poravnanje sekvence humanog IL-2rg proteina (SEK ID BR: 20; NP_ 000197.1); proteina IL-2rg pacova (SEK ID BR: 21; NP_ 543165.1); i himernog IL-2rg proteina (SEK ID BR: 22) obuhvatajući humani ekto-domen IL-2rg fuzionisan sa ostatkom proteina IL-2rg pacova. Veza između humanog i pacovskog IL-2rg je zabeležena vertikalnom linijom.
[0501] Tabela 22 daje pregled genomske organizacije pacovskog lokusa Interleukin 2 receptora gama i prikazani položaji su uzeti iz građe 5.0 Referentne sekvence genoma pacova (ENSMBL). IL2rg je na hromozomu X na (-) lancu. Dalje zabeležen je položaj ekto-domena IL2rg.
Tabela 22. Pregled genomske organizacije lokusa Il2rg pacova
[0502] Plazmidski vektori za ciljanje su konstruisani da zamene ekto-domen pacova od kodirajućeg regiona interleukin 2 receptora gama sa humanim ekto domenom, kao što je prikazano na slici 31. Vektor ciljanja je bio elektroporiran u ES ćelije pacova dobijene u Primeru 1, a ćelije su bile nanete na ploči na 15 cm 2x gustim MEF-ovima otpornim na neomicin u 2i 10 uM ROCKi. Transformisane ES ćelije pacova su kultivisane, odabrane i održavane kao što je opisano u Primeru 1.
[0503] Kao što je prikazano u Tabeli 23, pregledano je 192 kolonije i dobijeno je 13 ciljanih klonova. Efikasnost ciljanja je bila 6,77%.
[0504] Klonovi su injektovani u blastociste, kao što je ovde opisano u Primeru 1. Dobijeni su klonovi koji proizvode F0 pacove i dobijeni su F0 pacovi koji prenose ciljanu modifikaciju kroz germinativnu liniju.
Primer 5. Rezime
[0505] Tabela 23. Rezime ciljanja pacova sa različitim tipovima vektora i nukleaznim agensima razmatranim u Primerima 3 i 4.
[0506] Sve publikacije i patentne prijave pomenute u specifikaciji su indikativne od nivoa stručnjaka u oblasti tehnike na koju se ovaj pronalazak odnosi. Osim ako nije drugačije vidljivo iz konteksta bilo koje realizacije, aspekt, korak ili karakteristika pronalaska se može koristiti u kombinaciji sa bilo kojom drugom. Pozivanje na opseg uključuje, bilo koji broj u okviru opsega, bilo koji podopseg unutar opsega. Upućivanje na višestruke opsege uključuje kompozicije takvih opsega.
LISTING SEKVENCI
Claims (21)
1. Postupak za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova, koji obuhvata:
(a) uvođenje u pluripotentnu ćeliju pacova velikog vektora za ciljanje (LTVEC) koji sadrži ubačenu nukleinsku kiselinu okruženu sa 5' homolognim delom komplementarno prvoj sekvenci nukleinske kiseline u genomskom lokusu od interesa i 3' homolognim delom komplementarno drugoj sekvenci nukleinske kiseline u genomskom lokusu od interesa, pri čemu je zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova najmanje 10 kb; i
(b) identifikovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova koja sadrži ciljanu genetsku modifikaciju u genomskom lokusu od interesa,
naznačen time, da je ciljana genetska modifikacija sposobna da se prenosi preko germinativne linije;
naznačen time, da je pluripotentna ćelija pacova koja će biti korišćena za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa dobijena kultivisanjem izolovanih embrionalnih matičnih ćelija pacova na ćelijskom sloju podloge koji nije modifikovan za eksprimiranje inhibitornog faktora leukemije (LIF) sa medijumom koji sadrži oko 50 U/ml do oko 150 U/ml LIF-a i kombinaciju inhibitora koja se sastoji od inhibitora MEK puta i GSK3 inhibitora;
gde pluripotentnoj ćeliji pacova nedostaje ekspresija c-Myc;
gde pluripotentna ćelija pacova obrazuje sferične, slobodno-plutajuće kolonije u kulturi; i gde modifikovana pluripotentna ćelija pacova ima normalni kariotip.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, da je ciljana genetska modifikacija bialelna.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, da je pluripotentna ćelija pacova embrionalna matična (ES) ćelija pacova.
4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time, da je pluripotentna ćelija pacova karakterisana ekspresijom najmanje jednog pluripotentnog markera odabranog iz grupe koja se sastoji od Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptora, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 i Utf1.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time, da je pluripotentna ćelija pacova karakterisana jednom ili više od sledećih karakteristika:
(a) izvedena je od DA soja ili ACI soja;
(b) nedostatak ekspresije jednog ili više pluripotentnih markera Ecat1 i Rexo1;
(c) nedostatak ekspresije jednog ili više mezodermalnih markera Brachyury i Bmpr2; (d) nedostatak ekspresije jednog ili više endodermalnih markera Gata6, Sox17 i Sox7; i (e) nedostatak ekspresije jednog ili više neuralnih markera Nestin i Pax6.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time, da je koncentracija LIF-a u medijumu između oko 75 U/ml do oko 125 U/ml, poželjno između oko 90 U/ml do oko 110 U/ml i poželjnije oko 100 U/ml.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time, da je inhibitor MEK puta MEK inhibitor PD0325901 i/ili GSK3 inhibitor je CHIR99021.
8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time, da je inhibitor MEK puta MEK inhibitor PD0325901 u koncentraciji od 0,8 μM do 1,2 μM i GSK3 inhibitor je CHIR99021 u koncentraciji od 2,5 μM do 3,5 μM.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, da je koncentracija LIF-a u medijumu oko 100 U/ml, inhibitor MEK puta je MEK inhibitor PD0325901 u koncentraciji od oko 1 μM i GSK3 inhibitor je CHIR99021 u koncentraciji od oko 3,0 μM.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, da medijum sadrži: DMEM/F12 bazalni medijum u koncentraciji od 1x; neuro-bazalni medijum u koncentraciji od 1x; penicilin/streptomicin u koncentraciji od 1%; L-glutamin u koncentraciji od 4mM; 2-merkaptoetanol u koncentraciji od 0,1 mM; N2 suplement u koncentraciji od 1x; B27 suplement u koncentraciji od 1x; LIF u koncentraciji od 100U/ml; PD0325901 u koncentraciji od 1 μM i CHIR99021 u koncentraciji od 3,0 μM.
11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačen time:
(a) zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 120 kb, ili od oko 120 kb do oko 150 kb; ili
(b) zbir ukupnih 5' i 3' homolognih delova LTVEC-a je od oko 16 kb do oko 150 kb.
12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time, da ciljana genetska modifikacija sadrži:
(a) zamenu sekvence endogene nukleinske kiseline pacova sa homolognom ili ortolognom sekvencom nukleinske kiseline;
(b) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline pacova;
(c) deleciju sekvence endogene nukleinske kiseline pacova,
pri čemu je delecija u rasponu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1,5 Mb, od oko 1,5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2,5 Mb, ili od oko 2,5 Mb do oko 3 Mb;
(d) sekvenca egzogene nukleinske kiseline je u rasponu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb ili od oko 350 kb do oko 400 kb;
(e) egzogenu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sa endogenom sekvencom nukleinske kiseline pacova; (f) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline i sekvencu nukleinske kiseline pacova;
(g) uslovni alel okružen sa ciljanim sekvencama rekombinaza specifičnih za lokaciju; ili, (h) reporter gen operativno povezan sa promoterom aktivnim u ćeliji pacova.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačen time, da ciljana genetska modifikacija sadrži:
(i) uvođenje humane sekvence nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sa sekvencom nukleinske kiseline pacova na endogenom genomskom lokusu;
(ii) zamenu sekvence nukleinske kiseline pacova na endogenom genomskom lokusu sa homolognom ili ortolognom humanom sekvencom nukleinske kiseline;
(iii) himernu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži humanu sekvencu nukleinske kiseline i sekvencu nukleinske kiseline pacova;
ili
(iv) njihovu kombinaciju.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 13, naznačen time, da je veličina umetanja ili zamene od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb ili od oko 350 kb do oko 400 kb.
15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, naznačen time, da korak uvođenja (a) dalje sadrži uvođenje nukleinske kiseline koja kodira nukleazni agens koji promoviše homolognu rekombinaciju između LTVEC-a i genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova.
16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, naznačen time, da nukleazni agens sadrzi:
(a) nukleazu cinkovog prsta;
(b) Transkripcionu efektornu nukleazu poput aktivatora (TALEN).
17. Postupak prema patentnom zahtevu 15, naznačen time, da nukleazni agens sadrži CRISPR/CAS koji sadrži Cas9 nukleazu i vodeću RNK (gRNK) koja sadrži fuzionisanu crRNK-tracrRNK.
18. Postupak prema patentnom zahtevu 17, naznačen time:
(a) gRNK sadrži:
(i) himernu RNK od nukleinske kiseline SEK ID BR:2; ili
(ii) himernu RNK od nukleinske kiseline SEK ID BR:3;
(b) crRNK sadrži SEK ID BR:4; SEK ID BR:5; ili SEK ID BR:6;
ili
(c) tracrRNK sadrži SEK ID BR:7; ili SEK ID BR:8.
19. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-18, naznačen time, da korak identifikacije koristi kvantitativni test za ocenu modifikacije alela (MOA) na genomskom lokusu od interesa.
20. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19, naznačen time, da je ciljani genomski lokus Interlerukin-2 receptorski gama lokus, ApoE lokus, Rag1 lokus, Rag2 lokus ili Rag2/Rag1 lokus.
21. Postupak za ciljanu modifikaciju genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova, koji sadrži:
(a) ciljanje genomskog lokusa od interesa u pluripotentnoj ćeliji pacova prema postupku, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-20 za obrazovanje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova, pri čemu ubačena nukleinska kiselina sadrži humanu nukleinsku kiselinu; i
(b) uvođenje genetski modifikovane pluripotentne ćelije pacova u embrion domaćina pacova.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361812319P | 2013-04-16 | 2013-04-16 | |
| US201361914768P | 2013-12-11 | 2013-12-11 | |
| EP14784879.0A EP2986729B1 (en) | 2013-04-16 | 2014-04-16 | Targeted modification of rat genome |
| PCT/US2014/034412 WO2014172489A2 (en) | 2013-04-16 | 2014-04-16 | Targeted modification of rat genome |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS58255B1 true RS58255B1 (sr) | 2019-03-29 |
Family
ID=51687240
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20181446A RS58255B1 (sr) | 2013-04-16 | 2014-04-16 | Ciljana modifikacija genoma pacova |
| RS20211065A RS62263B1 (sr) | 2013-04-16 | 2014-04-16 | Ciljana modifikacija genoma pacova |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20211065A RS62263B1 (sr) | 2013-04-16 | 2014-04-16 | Ciljana modifikacija genoma pacova |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US20140310828A1 (sr) |
| EP (2) | EP2986729B1 (sr) |
| JP (1) | JP6411463B2 (sr) |
| KR (2) | KR20200136508A (sr) |
| CN (2) | CN105308184B (sr) |
| AU (2) | AU2014253942B9 (sr) |
| BR (1) | BR112015026197B1 (sr) |
| CA (1) | CA2908697C (sr) |
| CY (2) | CY1120845T1 (sr) |
| DK (2) | DK3456831T3 (sr) |
| ES (2) | ES2888250T3 (sr) |
| HR (2) | HRP20181648T1 (sr) |
| HU (2) | HUE040575T2 (sr) |
| IL (2) | IL241856B (sr) |
| LT (2) | LT2986729T (sr) |
| MX (1) | MX369747B (sr) |
| MY (1) | MY177850A (sr) |
| PL (2) | PL3456831T3 (sr) |
| PT (2) | PT3456831T (sr) |
| RS (2) | RS58255B1 (sr) |
| RU (1) | RU2676708C2 (sr) |
| SG (2) | SG10201808935WA (sr) |
| SI (2) | SI3456831T1 (sr) |
| SM (2) | SMT201800671T1 (sr) |
| WO (1) | WO2014172489A2 (sr) |
Families Citing this family (189)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SMT201700023T1 (it) | 2010-08-02 | 2017-03-08 | Regeneron Pharma | Topi che producono proteine leganti vl |
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| SG11201406547YA (en) | 2012-04-25 | 2014-11-27 | Regeneron Pharma | Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors |
| AU2013266968B2 (en) | 2012-05-25 | 2017-06-29 | Emmanuelle CHARPENTIER | Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription |
| PL3360964T3 (pl) | 2012-12-06 | 2020-03-31 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr |
| MX384291B (es) | 2013-02-20 | 2025-03-14 | Regeneron Pharma | Modificación genética de ratas. |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| CN112301024A (zh) | 2013-03-15 | 2021-02-02 | 通用医疗公司 | 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性 |
| WO2014204578A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
| DK3456831T3 (da) | 2013-04-16 | 2021-09-06 | Regeneron Pharma | Målrettet modifikation af rottegenom |
| JP6482546B2 (ja) * | 2013-07-19 | 2019-03-13 | ラリクス・バイオサイエンス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＬａｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｌｃ | 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物 |
| MY198884A (en) | 2013-08-07 | 2023-10-02 | Regeneron Pharma | Lincrna-deficient non-human animals |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| EP3988649B1 (en) * | 2013-09-18 | 2024-11-27 | Kymab Limited | Methods, cells and organisms |
| CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| EP3080279B1 (en) * | 2013-12-11 | 2018-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
| KR102170502B1 (ko) * | 2013-12-11 | 2020-10-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
| AU2015231025A1 (en) | 2014-03-21 | 2016-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
| CA3124228C (en) | 2014-03-21 | 2024-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that make single domain binding proteins |
| MX373055B (es) | 2014-05-30 | 2020-05-20 | Regeneron Pharma | Animales con dipeptidil peptidasa iv (dpp4) humanizada. |
| HRP20200529T1 (hr) | 2014-06-06 | 2020-09-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa |
| CN106604994B (zh) | 2014-06-23 | 2021-12-14 | 通用医疗公司 | 通过测序评估的DSBs的全基因组无偏鉴定(GUIDE-Seq) |
| SI3161128T1 (sl) | 2014-06-26 | 2019-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| BR112017007770A2 (pt) | 2014-10-15 | 2018-01-16 | Regeneron Pharma | cultura in vitro, população de hipscs, método para modificar um locus-alvo genômico, e, hipsc. |
| KR102531016B1 (ko) * | 2014-11-21 | 2023-05-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| CA2969619A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rna with chemical modifications |
| CN113412818B (zh) | 2014-12-09 | 2022-11-04 | 瑞泽恩制药公司 | 具有人源化分化簇274基因的非人动物 |
| ES2947714T3 (es) * | 2014-12-19 | 2023-08-17 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de múltiples direccionamientos en un solo paso |
| EP3245232B1 (en) | 2015-01-12 | 2021-04-21 | The Regents of The University of California | Heterodimeric cas9 and methods of use thereof |
| EP3250689B1 (en) | 2015-01-28 | 2020-11-04 | The Regents of The University of California | Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid |
| KR20230156800A (ko) | 2015-03-03 | 2023-11-14 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제 |
| AU2016233250C1 (en) | 2015-03-16 | 2022-08-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception |
| CA2979702A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
| KR102888521B1 (ko) | 2015-04-06 | 2025-11-19 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna |
| AU2016270587B2 (en) | 2015-05-29 | 2020-12-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a disruption in a C9ORF72 locus |
| WO2016196655A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | The Regents Of The University Of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| JP6799586B2 (ja) | 2015-08-28 | 2020-12-16 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ |
| CA2995248A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of prostate cancer |
| WO2017044843A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | The General Hospital Corporation | Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq) |
| CN105177110A (zh) * | 2015-09-11 | 2015-12-23 | 中国科学院微生物研究所 | 核酸的检测方法 |
| WO2017053729A1 (en) | 2015-09-25 | 2017-03-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof |
| JP2018529353A (ja) | 2015-09-30 | 2018-10-11 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ） |
| IL310721B2 (en) | 2015-10-23 | 2025-11-01 | Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| WO2017087780A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3 |
| US20190249172A1 (en) | 2016-02-18 | 2019-08-15 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for gene editing in stem cells |
| DK3422845T3 (da) | 2016-02-29 | 2021-08-30 | Regeneron Pharma | Gnavere med et humaniseret tmprss-gen |
| CN109414414A (zh) | 2016-03-16 | 2019-03-01 | 戴维·格拉德斯通研究所 | 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物 |
| CN113831407B (zh) * | 2016-05-20 | 2024-06-11 | 瑞泽恩制药公司 | 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法 |
| US20210010022A1 (en) * | 2016-05-27 | 2021-01-14 | Cambridge Enterprise Limited | Novel nucleic acid construct |
| KR102483193B1 (ko) | 2016-06-03 | 2023-01-04 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 외인성 말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소를 발현하는 비인간 동물 |
| US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
| US11572545B2 (en) | 2016-06-16 | 2023-02-07 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
| US10221395B2 (en) * | 2016-06-16 | 2019-03-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
| JP2019523009A (ja) | 2016-07-29 | 2019-08-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | Ｃ末端切断型フィブリリン−１の発現をもたらす変異を有するマウス |
| CN110214183A (zh) | 2016-08-03 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 腺苷核碱基编辑器及其用途 |
| WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| CN107815465B (zh) | 2016-08-31 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| US11279948B2 (en) | 2016-08-31 | 2022-03-22 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40 |
| CN109862785B (zh) | 2016-09-30 | 2022-09-06 | 瑞泽恩制药公司 | C9orf72基因座中具有六核苷酸重复扩增的非人类动物 |
| MX2019003674A (es) | 2016-09-30 | 2021-01-08 | Univ California | Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas. |
| US10669539B2 (en) | 2016-10-06 | 2020-06-02 | Pioneer Biolabs, Llc | Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries |
| KR102622411B1 (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-10 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
| AU2017378427A1 (en) | 2016-12-14 | 2019-06-20 | Ligandal, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| IL268049B2 (en) | 2017-01-19 | 2025-08-01 | Omniab Inc | Transgenic rodent human antibodies with multiple immunoglobulin heavy chain loci |
| CA3051442A1 (en) | 2017-02-14 | 2018-08-23 | Alejandro Soto-Gutierrez | Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue |
| AU2018224227A1 (en) | 2017-02-27 | 2019-08-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal models of Retinoschisis |
| US12390514B2 (en) | 2017-03-09 | 2025-08-19 | President And Fellows Of Harvard College | Cancer vaccine |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| CN108467873B (zh) * | 2017-03-17 | 2020-03-13 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用 |
| KR20240116572A (ko) | 2017-03-23 | 2024-07-29 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
| CN106987604B (zh) * | 2017-03-29 | 2021-05-28 | 北京希诺谷生物科技有限公司 | 一种制备动脉粥样硬化疾病模型犬的方法 |
| EP3612631A4 (en) | 2017-04-20 | 2021-01-13 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | RECOMBINATION ACTIVATING GENE (RAG) INDUCED V (D) J GENE TARGETING |
| US11591589B2 (en) | 2017-04-21 | 2023-02-28 | The General Hospital Corporation | Variants of Cpf1 (Cas12a) with altered PAM specificity |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| EP3630849A4 (en) | 2017-05-25 | 2021-01-13 | The General Hospital Corporation | BIPARTITE BASIC EDITOR (BBE) AND TYPE II-C-CAS9 ZINC FINGER EDITOR ARCHITECTURES |
| WO2018228534A1 (zh) * | 2017-06-16 | 2018-12-20 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用 |
| CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
| CN110891420B (zh) | 2017-07-31 | 2022-06-03 | 瑞泽恩制药公司 | Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用 |
| KR20200033259A (ko) | 2017-07-31 | 2020-03-27 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 생체내에서 CRISPR/Cas-매개된 파괴 또는 삭제 및 외인성 도너 핵산과의 CRISPR/Cas-유도된 재조합을 평가하기 위한 방법 및 조성물 |
| CA3073448A1 (en) | 2017-08-23 | 2019-02-28 | The General Hospital Corporation | Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity |
| EP3676376B1 (en) | 2017-08-30 | 2025-01-15 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| EP3679143A1 (en) * | 2017-09-08 | 2020-07-15 | Life Technologies Corporation | Methods for improved homologous recombination and compositions thereof |
| US11572574B2 (en) | 2017-09-28 | 2023-02-07 | Toolgen Incorporated | Artificial genome manipulation for gene expression regulation |
| JP2020536501A (ja) * | 2017-09-28 | 2020-12-17 | ツールゲン インコーポレイテッドＴｏｏｌｇｅｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ | 遺伝子発現調節のための人為的なゲノム操作 |
| EP3688161A1 (en) | 2017-09-29 | 2020-08-05 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis |
| RU2020112751A (ru) | 2017-09-29 | 2021-10-29 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Отличные от человека животные, у которых экспрессируется гуманизированный комплекс c1q |
| US20190098879A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use |
| WO2019075197A1 (en) | 2017-10-11 | 2019-04-18 | The General Hospital Corporation | METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES |
| KR20250107288A (ko) | 2017-10-16 | 2025-07-11 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 아데노신 염기 편집제의 용도 |
| JP7361031B2 (ja) | 2017-11-30 | 2023-10-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物 |
| HUE060608T2 (hu) | 2017-12-05 | 2023-03-28 | Regeneron Pharma | Genetikailag módosított immunglobulin lambda könnyûlánccal rendelkezõ egerek és azok alkalmazása |
| US12406749B2 (en) | 2017-12-15 | 2025-09-02 | The Broad Institute, Inc. | Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering |
| WO2020172587A1 (en) * | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Nemametrix Inc | Monogenic or polygenic disease model organisms humanized with two or more genes |
| EP3592140A1 (en) | 2018-03-19 | 2020-01-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
| EP3772927B1 (en) | 2018-03-24 | 2025-01-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice or rats for generating therapeutic antibodies against peptide-mhc complexes, methods of making and uses thereof |
| IL314733A (en) | 2018-03-26 | 2024-10-01 | Regeneron Pharma | Humanized rodents for testing therapeutic agents |
| US11447769B2 (en) | 2018-03-27 | 2022-09-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same |
| US11898203B2 (en) | 2018-04-17 | 2024-02-13 | The General Hospital Corporation | Highly sensitive in vitro assays to define substrate preferences and sites of nucleic-acid binding, modifying, and cleaving agents |
| CN108624622A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-10-09 | 湖南艾佳生物科技股份有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株 |
| US12157760B2 (en) | 2018-05-23 | 2024-12-03 | The Broad Institute, Inc. | Base editors and uses thereof |
| CN109868285A (zh) * | 2018-05-29 | 2019-06-11 | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 | 一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用 |
| US10463029B1 (en) | 2018-06-07 | 2019-11-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of steel syndrome |
| CA3099441A1 (en) | 2018-06-13 | 2019-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva |
| IL318469A (en) | 2018-06-14 | 2025-03-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses |
| US12522807B2 (en) | 2018-07-09 | 2026-01-13 | The Broad Institute, Inc. | RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof |
| JP2021530212A (ja) | 2018-07-13 | 2021-11-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California | レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法 |
| HRP20240999T1 (hr) | 2018-07-16 | 2024-10-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba |
| US12275964B2 (en) | 2018-08-22 | 2025-04-15 | The Regents Of The University Of California | Variant type V CRISPR/Cas effector polypeptides and methods of use thereof |
| EP3844272A1 (en) | 2018-08-28 | 2021-07-07 | Flagship Pioneering Innovations VI, LLC | Methods and compositions for modulating a genome |
| JP7222075B2 (ja) | 2018-09-13 | 2023-02-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｃ３糸球体症のモデルとしての補体因子ｈ遺伝子ノックアウトラット |
| US11407995B1 (en) | 2018-10-26 | 2022-08-09 | Inari Agriculture Technology, Inc. | RNA-guided nucleases and DNA binding proteins |
| WO2020092453A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | The Broad Institute, Inc. | Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof |
| US11434477B1 (en) | 2018-11-02 | 2022-09-06 | Inari Agriculture Technology, Inc. | RNA-guided nucleases and DNA binding proteins |
| WO2020097445A1 (en) | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Inari Agriculture, Inc. | Rna-guided nucleases and dna binding proteins |
| CN109504708A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-03-22 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法 |
| KR102925054B1 (ko) | 2018-12-20 | 2026-02-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 뉴클레아제-매개 반복부 팽창 |
| JP7509786B2 (ja) | 2019-01-17 | 2024-07-02 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 気分障害の齧歯類モデル |
| US12351837B2 (en) | 2019-01-23 | 2025-07-08 | The Broad Institute, Inc. | Supernegatively charged proteins and uses thereof |
| US11946040B2 (en) | 2019-02-04 | 2024-04-02 | The General Hospital Corporation | Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing |
| WO2020163856A1 (en) | 2019-02-10 | 2020-08-13 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Modified mitochondrion and methods of use thereof |
| CA3125380A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus |
| BR112021016173A2 (pt) | 2019-02-22 | 2021-11-03 | Regeneron Pharma | Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma |
| MX2021010559A (es) | 2019-03-07 | 2021-12-15 | Univ California | Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos. |
| US20200288683A1 (en) | 2019-03-15 | 2020-09-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Loss of function rodent model of solute carrier 39 member 5 |
| WO2020191233A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| KR102661779B1 (ko) | 2019-04-04 | 2024-04-30 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 응고 인자 12 좌위를 포함하는 비-인간 동물 |
| US12473543B2 (en) | 2019-04-17 | 2025-11-18 | The Broad Institute, Inc. | Adenine base editors with reduced off-target effects |
| US11891618B2 (en) | 2019-06-04 | 2024-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use |
| MX2021014893A (es) | 2019-06-05 | 2022-03-11 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que tienen un repertorio de cadena ligera lambda limitado expresado a partir del locus kappa y usos de estos. |
| MX2021015122A (es) | 2019-06-07 | 2022-04-06 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado. |
| EP3990475A1 (en) | 2019-06-27 | 2022-05-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modeling tdp-43 proteinopathy |
| EP4037481B1 (en) | 2019-10-03 | 2024-09-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A crnn loss of function rodent model |
| US12435330B2 (en) | 2019-10-10 | 2025-10-07 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing RNA |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| CN114786479B (zh) * | 2019-12-25 | 2023-12-15 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种il-15人源化小鼠模型及其用途 |
| WO2021151073A2 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | The General Hospital Corporation | Unconstrained genome targeting with near-pamless engineered crispr-cas9 variants |
| WO2021151085A2 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | The General Hospital Corporation | Crispr-cas enzymes with enhanced on-target activity |
| WO2021154791A1 (en) | 2020-01-28 | 2021-08-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use |
| EP4099821A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use |
| CN115279184A (zh) * | 2020-03-04 | 2022-11-01 | 雷杰纳荣制药公司 | B4galt1介导的功能的啮齿动物模型 |
| CN113355323B (zh) * | 2020-03-06 | 2023-07-11 | 生物岛实验室 | 人源化ace2基因改造小鼠模型的制备方法及应用 |
| CN113355325B (zh) * | 2020-03-06 | 2023-07-14 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 人源化ace2基因改造小鼠胚胎干细胞模型制备方法及应用 |
| US20230102342A1 (en) | 2020-03-23 | 2023-03-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| JP7765403B2 (ja) | 2020-04-21 | 2025-11-06 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化ｃｘｃｌ１３遺伝子を有する非ヒト動物 |
| IL297761A (en) | 2020-05-08 | 2022-12-01 | Broad Inst Inc | Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence |
| JP2023529846A (ja) | 2020-06-02 | 2023-07-12 | バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド | 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物 |
| KR20230078677A (ko) | 2020-10-01 | 2023-06-02 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간 cr1을 발현하는 설치류 동물 |
| JP2024500153A (ja) | 2020-12-21 | 2024-01-04 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ヒト化ｔｓｌｐ遺伝子、ヒト化ｔｓｌｐ受容体遺伝子、及び／又はヒト化ｉｌ７ｒａ遺伝子を有する非ヒト動物 |
| CN112852875B (zh) * | 2021-02-26 | 2022-10-21 | 福建省立医院 | 示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法 |
| CN113229213B (zh) * | 2021-05-14 | 2022-06-14 | 福州大学 | 通过近红外荧光探针标记血栓实现肺栓塞造模及无创定量检测的方法 |
| WO2023281114A1 (en) * | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Suprême | Foodstuffs comprising cells differentiated from engineered oligopotent stem cells |
| JP2024534945A (ja) | 2021-09-10 | 2024-09-26 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ |
| EP4596696A3 (en) | 2021-09-28 | 2025-08-27 | Acrigen Biosciences | Compositions and methods for nucleic acid modifications |
| CA3237482A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Precise genome editing using retrons |
| KR20240117571A (ko) | 2021-12-08 | 2024-08-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도 |
| US20230279442A1 (en) | 2021-12-15 | 2023-09-07 | Versitech Limited | Engineered cas9-nucleases and method of use thereof |
| WO2023141602A2 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
| WO2023150798A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
| AU2023218391A1 (en) | 2022-02-11 | 2024-07-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents |
| EP4514125A1 (en) | 2022-04-26 | 2025-03-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva |
| US20250344681A1 (en) | 2022-05-31 | 2025-11-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Animal model of tdp-43 proteinopathy |
| US20230417899A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Oshkosh Corporation | Position tracking for a lift device |
| JP2025525569A (ja) | 2022-07-18 | 2025-08-05 | レナゲード セラピューティクス マネージメント インコーポレイテッド | 遺伝子編集成分、システム、及び使用方法 |
| IL318159A (en) | 2022-07-19 | 2025-03-01 | Regeneron Pharma | Genetically modified animal model and its use to model the human immune system |
| WO2024044723A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
| EP4593590A1 (en) | 2022-09-29 | 2025-08-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
| CN116326540A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-06-27 | 新疆农业大学 | 一种调控哺乳期马驹肠道健康并促进生长发育的补饲方法 |
| KR20260025082A (ko) | 2023-06-16 | 2026-02-23 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 벡터, 유전자 변형 세포, 및 그것을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 |
| AU2024335327A1 (en) | 2023-09-01 | 2026-03-26 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome |
| AU2024357861A1 (en) | 2023-10-12 | 2026-04-23 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Nickase-retron template-based precision editing system and methods of use |
| WO2025122669A1 (en) | 2023-12-05 | 2025-06-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized complement factor b gene |
| WO2025155753A2 (en) | 2024-01-17 | 2025-07-24 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Improved gene editing system, guides, and methods |
| US20250255282A1 (en) | 2024-02-08 | 2025-08-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same |
| WO2025174765A1 (en) | 2024-02-12 | 2025-08-21 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents |
| WO2025250495A1 (en) | 2024-05-28 | 2025-12-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Acceleration of human hepatocyte engraftment in humanized liver animals by supplementing paracrine ligands or agonists that activate human liver regeneration signals |
| WO2026006542A2 (en) | 2024-06-26 | 2026-01-02 | Yale University | Compositions and methods for crispr/cas9 based reactivation of human angelman syndrome |
| WO2026035843A2 (en) | 2024-08-06 | 2026-02-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof |
| WO2026039661A1 (en) | 2024-08-15 | 2026-02-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals with humanized fc epsilon receptors that lack functional alpha-1, 3-galactosyltransferase (ggta1) |
Family Cites Families (229)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT87133B (pt) | 1987-04-02 | 1992-07-31 | Amrad Corp Ltd | Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif |
| EP0716690A1 (en) | 1993-08-30 | 1996-06-19 | Northwestern University | Rat pluripotent embryonic stem cells and method of obtaining and using same |
| CA2246712A1 (en) | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| US5830729A (en) | 1996-04-18 | 1998-11-03 | Institut Pasteur | I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells |
| US6136566A (en) | 1996-10-04 | 2000-10-24 | Lexicon Graphics Incorporated | Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same |
| AU8587598A (en) | 1997-07-26 | 1999-02-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Trans-species nuclear transfer |
| WO2000039316A1 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-06 | The J. David Gladstone Institutes | Transgenic rodents and rodent cell lines expressing hiv co-receptors |
| US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
| CA2361191A1 (en) | 1999-02-03 | 2000-08-10 | The Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site |
| US20030104526A1 (en) | 1999-03-24 | 2003-06-05 | Qiang Liu | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
| AU776576B2 (en) | 1999-12-06 | 2004-09-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
| US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| AU2002228841C1 (en) | 2000-12-07 | 2006-11-23 | Sangamo Biosciences, Inc | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| ES2389251T3 (es) | 2000-12-19 | 2012-10-24 | Altor Bioscience Corporation | Animales transgénicos que comprenden un sistema inmunitario humanizado |
| WO2002057293A2 (en) | 2001-01-22 | 2002-07-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified zinc finger binding proteins |
| AU2002225187A1 (en) | 2001-01-22 | 2002-07-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger polypeptides and their use |
| NZ527527A (en) | 2001-02-14 | 2005-08-26 | Leo T | Mammalian multipotent adult stem cells (MASC) with the capacity to differentiate into cells of mesodermal, ectodermal or endodermal origin and uses thereof |
| AUPR451401A0 (en) | 2001-04-20 | 2001-05-24 | Monash University | A method of nuclear transfer |
| WO2003087341A2 (en) | 2002-01-23 | 2003-10-23 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
| AU2003215869B2 (en) | 2002-03-15 | 2008-04-24 | Cellectis | Hybrid and single chain meganucleases and use thereof |
| WO2003080809A2 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| US7612250B2 (en) | 2002-07-29 | 2009-11-03 | Trustees Of Tufts College | Nuclear transfer embryo formation method |
| EP2806025B1 (en) | 2002-09-05 | 2019-04-03 | California Institute of Technology | Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting |
| AU2003290518A1 (en) | 2002-09-06 | 2004-04-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins |
| US20030175968A1 (en) | 2002-10-30 | 2003-09-18 | Golic Kent G. | Gene targeting method |
| US7344886B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-03-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product |
| EP1587545A2 (en) | 2003-01-13 | 2005-10-26 | Mahendra S. Rao | Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products |
| GB2398784B (en) | 2003-02-26 | 2005-07-27 | Babraham Inst | Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal |
| US7205148B2 (en) | 2003-06-11 | 2007-04-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genome mutation by intron insertion into an embryonic stem cell genome |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| KR20120091471A (ko) | 2004-03-04 | 2012-08-17 | 도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠간켄큐센터 | 래트 배아 줄기 세포 |
| EP1591521A1 (en) | 2004-04-30 | 2005-11-02 | Cellectis | I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof |
| US20090104158A1 (en) | 2004-09-03 | 2009-04-23 | Moraga Biotechnology Corporation | Non-Embryonic Totipotent Blastomere-Like Stem Cells And Methods Therefor |
| AU2005287278B2 (en) | 2004-09-16 | 2011-08-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
| ES2463476T3 (es) * | 2004-10-19 | 2014-05-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética |
| FR2879622B1 (fr) | 2004-12-17 | 2008-02-01 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs presentant une modification genomique ciblee |
| WO2006097784A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
| EP1863909B2 (en) | 2005-03-15 | 2014-09-10 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
| US10022457B2 (en) | 2005-08-05 | 2018-07-17 | Gholam A. Peyman | Methods to regulate polarization and enhance function of cells |
| GB0615327D0 (en) * | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
| JP5680850B2 (ja) | 2006-03-30 | 2015-03-04 | ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ | キナーゼインヒビターを含む培養培地およびその使用 |
| AU2007235496B2 (en) * | 2006-03-31 | 2013-11-21 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies |
| CN101117633B (zh) | 2006-08-03 | 2011-07-20 | 上海交通大学附属儿童医院 | 一种细胞核移植方法 |
| ES2586210T3 (es) | 2006-12-14 | 2016-10-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Proteínas de dedo de zinc no canónicas optimizadas |
| US7771967B2 (en) * | 2006-12-22 | 2010-08-10 | The J. David Gladstone Institutes | Nucleic acid encoding apolipoprotein E-I3 |
| US10155038B2 (en) | 2007-02-02 | 2018-12-18 | Yale University | Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof |
| DE602008003684D1 (de) | 2007-04-26 | 2011-01-05 | Sangamo Biosciences Inc | Gezielte integration in die ppp1r12c-position |
| PL2602323T3 (pl) | 2007-06-01 | 2018-06-29 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Kompozycje i sposoby hamowania endogennych genów immunoglobin i wytwarzania transgenicznych ludzkich przeciwciał typu idiotypowego |
| SG191561A1 (en) | 2008-08-22 | 2013-07-31 | Sangamo Biosciences Inc | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
| US20100076057A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| EP2180058A1 (en) | 2008-10-23 | 2010-04-28 | Cellectis | Meganuclease recombination system |
| EP2352369B1 (en) * | 2008-12-04 | 2017-04-26 | Sangamo BioSciences, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
| US20110030072A1 (en) | 2008-12-04 | 2011-02-03 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of immunodeficiency genes in animals |
| WO2010077955A1 (en) | 2008-12-17 | 2010-07-08 | The Scripps Research Institute | Generation and maintenance of stem cells |
| US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
| EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| EP2408921B1 (en) | 2009-03-20 | 2017-04-19 | Sangamo BioSciences, Inc. | Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins |
| WO2010124200A2 (en) | 2009-04-23 | 2010-10-28 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cancer |
| US8772008B2 (en) | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
| EP2449112A1 (en) | 2009-07-01 | 2012-05-09 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid) |
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| EP2456876A2 (en) | 2009-07-24 | 2012-05-30 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cytokine-cytokine signaling pathways |
| EP2456877A4 (en) | 2009-07-24 | 2012-05-30 | Sigma Aldrich Co Llc | METHOD OF GENOMIC PROCESSING |
| WO2011017293A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | The General Hospital Corporation | Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly |
| US8586526B2 (en) | 2010-05-17 | 2013-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | DNA-binding proteins and uses thereof |
| US8518392B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette |
| EP2493288B1 (en) | 2009-10-28 | 2015-02-18 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Homologous recombination in the oocyte |
| CA2779858C (en) | 2009-10-29 | 2019-10-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional alleles |
| WO2011053957A2 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for the regulation of multiple genes of interest in a cell |
| EP2508595B1 (en) | 2009-12-01 | 2016-11-23 | National Cancer Center | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
| WO2011072246A2 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
| CN102791865B (zh) | 2009-12-21 | 2015-07-01 | 凯津公司 | 用于转染原生质体的改进技术 |
| PH12012501467B1 (en) | 2010-01-22 | 2018-07-04 | Corteva Agriscience Llc | Excision of transgenes in genetically modified organisms |
| EP2660318A1 (en) | 2010-02-09 | 2013-11-06 | Sangamo BioSciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
| GB201009732D0 (en) | 2010-06-10 | 2010-07-21 | Gene Bridges Gmbh | Direct cloning |
| MY191870A (en) | 2010-06-11 | 2022-07-18 | Regeneron Pharma | Production of fertile xy female animals from xy es cells |
| AU2011281062B2 (en) | 2010-07-21 | 2015-01-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for modification of a HLA locus |
| WO2012018726A1 (en) | 2010-08-02 | 2012-02-09 | Cellectis Sa | Method for increasing double-strand break-induced gene targeting |
| EP2618656B1 (en) | 2010-09-20 | 2018-06-20 | Yale University, Inc. | HUMAN SIRPalpha TRANSGENIC ANIMALS AND THEIR METHODS OF USE |
| SG10202008003VA (en) | 2011-02-15 | 2020-10-29 | Regeneron Pharma | Humanized m-csf mice |
| WO2012129198A1 (en) * | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| WO2012168307A2 (en) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Improved recombination efficiency by inhibition of nhej dna repair |
| EP2747551B1 (en) * | 2011-08-26 | 2020-02-12 | Yecuris Corporation | Fumarylacetoacetate hydrolase (fah)-deficient and immunodeficient rats and uses thereof |
| CN107858333B (zh) | 2011-10-28 | 2022-05-27 | 瑞泽恩制药公司 | T细胞受体基因修饰小鼠 |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
| SG11201406547YA (en) * | 2012-04-25 | 2014-11-27 | Regeneron Pharma | Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors |
| DE102012103797A1 (de) | 2012-04-30 | 2013-10-31 | KRAH Elektronische Bauelemente GmbH | Flüssigkeitsgekühlter Widerstand |
| AU2013259647B2 (en) | 2012-05-07 | 2018-11-08 | Corteva Agriscience Llc | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes |
| AU2013266968B2 (en) | 2012-05-25 | 2017-06-29 | Emmanuelle CHARPENTIER | Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription |
| CN104540382A (zh) | 2012-06-12 | 2015-04-22 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物 |
| AU2013293270B2 (en) | 2012-07-25 | 2018-08-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| AU2013335451C1 (en) | 2012-10-23 | 2024-07-04 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof |
| PL3360964T3 (pl) | 2012-12-06 | 2020-03-31 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr |
| WO2014093479A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Montana State University | Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation |
| CN113355357B (zh) | 2012-12-12 | 2024-12-03 | 布罗德研究所有限公司 | 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化 |
| US20140186843A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-07-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| US20140310830A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-10-16 | Feng Zhang | CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes |
| EP3031921B1 (en) | 2012-12-12 | 2025-03-12 | The Broad Institute, Inc. | Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications |
| IL239344B2 (en) | 2012-12-12 | 2024-06-01 | Broad Inst Inc | Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation |
| WO2014093655A2 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains |
| WO2014093709A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| EP2840140B2 (en) | 2012-12-12 | 2023-02-22 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells |
| DK2931891T3 (da) | 2012-12-17 | 2019-08-19 | Harvard College | Rna-styret modificering af menneskelige genomer |
| ES2953523T3 (es) | 2012-12-27 | 2023-11-14 | Keygene Nv | Método para inducir una translocación dirigida en una planta |
| WO2014127287A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for in vivo tergated mutagenesis |
| MX384291B (es) | 2013-02-20 | 2025-03-14 | Regeneron Pharma | Modificación genética de ratas. |
| US10227610B2 (en) | 2013-02-25 | 2019-03-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption |
| EP2922393B2 (en) | 2013-02-27 | 2022-12-28 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases |
| WO2014143381A1 (en) | 2013-03-09 | 2014-09-18 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events |
| RU2662932C2 (ru) | 2013-03-14 | 2018-07-31 | Карибо Биосайенсиз, Инк. | Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты |
| US20140349400A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Programmable Modification of DNA |
| US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| WO2014204578A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
| US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
| US9937207B2 (en) | 2013-03-21 | 2018-04-10 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using talens |
| EP4286517A3 (en) | 2013-04-04 | 2024-03-13 | President and Fellows of Harvard College | Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems |
| DK3456831T3 (da) | 2013-04-16 | 2021-09-06 | Regeneron Pharma | Målrettet modifikation af rottegenom |
| US20160040155A1 (en) | 2013-04-16 | 2016-02-11 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering |
| US20160186208A1 (en) | 2013-04-16 | 2016-06-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal |
| EP2796558A1 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-29 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Improved gene targeting and nucleic acid carrier molecule, in particular for use in plants |
| EP2994531B1 (en) | 2013-05-10 | 2018-03-28 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| CN105683376A (zh) | 2013-05-15 | 2016-06-15 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
| ES2883131T3 (es) | 2013-05-29 | 2021-12-07 | Cellectis | Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN |
| AU2014273082B2 (en) | 2013-05-29 | 2018-11-08 | Cellectis | A method for producing precise DNA cleavage using Cas9 nickase activity |
| WO2014191128A1 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Cellectis | Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system |
| US20140359795A1 (en) | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Recombinetics, Inc. | Genetic techniques for making animals with sortable sperm |
| US9982277B2 (en) | 2013-06-11 | 2018-05-29 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for target DNA modification |
| CN105492611A (zh) | 2013-06-17 | 2016-04-13 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物 |
| RU2716420C2 (ru) | 2013-06-17 | 2020-03-11 | Те Брод Инститьют Инк. | Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени |
| WO2014204723A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions |
| WO2014204724A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| CN105683379A (zh) | 2013-06-17 | 2016-06-15 | 布罗德研究所有限公司 | 用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化 |
| MX374532B (es) | 2013-06-17 | 2025-03-06 | Broad Inst Inc | Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos. |
| BR112015031639A2 (pt) | 2013-06-19 | 2019-09-03 | Sigma Aldrich Co Llc | integração alvo |
| ES2929143T3 (es) | 2013-07-09 | 2022-11-25 | Harvard College | Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex |
| EP3019595A4 (en) | 2013-07-09 | 2016-11-30 | THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS | |
| EP3666892A1 (en) | 2013-07-10 | 2020-06-17 | President and Fellows of Harvard College | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing |
| JP6482546B2 (ja) | 2013-07-19 | 2019-03-13 | ラリクス・バイオサイエンス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＬａｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｌｃ | 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物 |
| US11306328B2 (en) | 2013-07-26 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
| CN120574876A (zh) | 2013-08-22 | 2025-09-02 | 纳幕尔杜邦公司 | 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法 |
| JP7118588B2 (ja) | 2013-08-29 | 2022-08-16 | テンプル ユニヴァーシティ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | Ｈｉｖ感染のｒｎａガイド処置のための方法および組成物 |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| EP3988649B1 (en) | 2013-09-18 | 2024-11-27 | Kymab Limited | Methods, cells and organisms |
| WO2015048690A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | The Regents Of The University Of California | Optimized small guide rnas and methods of use |
| WO2015052231A2 (en) | 2013-10-08 | 2015-04-16 | Technical University Of Denmark | Multiplex editing system |
| EP3441468B1 (en) | 2013-10-17 | 2021-05-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| JP5900942B2 (ja) | 2013-11-06 | 2016-04-06 | 国立大学法人広島大学 | 核酸挿入用ベクター |
| CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| US10787684B2 (en) | 2013-11-19 | 2020-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Large gene excision and insertion |
| JP2016538001A (ja) | 2013-11-28 | 2016-12-08 | ホライズン・ジェノミクス・ゲーエムベーハー | 体細胞半数体ヒト細胞株 |
| KR102170502B1 (ko) | 2013-12-11 | 2020-10-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| EP3470089A1 (en) | 2013-12-12 | 2019-04-17 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components |
| EP3080259B1 (en) | 2013-12-12 | 2023-02-01 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation |
| SG10201804975PA (en) | 2013-12-12 | 2018-07-30 | Broad Inst Inc | Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders |
| JP7103750B2 (ja) | 2013-12-12 | 2022-07-20 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用 |
| JP6712948B2 (ja) | 2013-12-12 | 2020-06-24 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法 |
| WO2015089427A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes |
| WO2015086798A2 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Cellectis | New method of selection of algal-transformed cells using nuclease |
| EP3083958B1 (en) | 2013-12-19 | 2019-04-17 | Amyris, Inc. | Methods for genomic integration |
| WO2015105928A1 (en) | 2014-01-08 | 2015-07-16 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided gene drives |
| US10034463B2 (en) | 2014-01-24 | 2018-07-31 | Children's Medical Center Corporation | High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities |
| US10233456B2 (en) | 2014-01-30 | 2019-03-19 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site |
| US20150291969A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-10-15 | Chromatin, Inc. | Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same |
| EP3690044B1 (en) | 2014-02-11 | 2024-01-10 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Crispr enabled multiplexed genome engineering |
| WO2015127439A1 (en) | 2014-02-24 | 2015-08-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration |
| US11028388B2 (en) | 2014-03-05 | 2021-06-08 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa |
| ES2745769T3 (es) | 2014-03-10 | 2020-03-03 | Editas Medicine Inc | Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10) |
| EP4659765A3 (en) | 2014-03-12 | 2026-02-18 | Precision Biosciences, Inc. | Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases |
| KR102450868B1 (ko) | 2014-03-14 | 2022-10-06 | 시버스 유에스 엘엘씨 | 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 |
| CN106459894B (zh) | 2014-03-18 | 2020-02-18 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物 |
| MX375361B (es) | 2014-03-26 | 2025-03-06 | Univ Maryland | Edicion de genoma dirigida en cigotos de animales grandes domesticos. |
| GB201406968D0 (en) | 2014-04-17 | 2014-06-04 | Green Biologics Ltd | Deletion mutants |
| US20170076039A1 (en) | 2014-04-24 | 2017-03-16 | Institute For Basic Science | A Method of Selecting a Nuclease Target Sequence for Gene Knockout Based on Microhomology |
| GB201407852D0 (en) | 2014-05-02 | 2014-06-18 | Iontas Ltd | Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
| EP3142706A1 (en) | 2014-05-16 | 2017-03-22 | Vrije Universiteit Brussel | Genetic correction of myotonic dystrophy type 1 |
| WO2015184259A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods to treat latent viral infections |
| HRP20200529T1 (hr) | 2014-06-06 | 2020-09-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa |
| ES2788426T3 (es) | 2014-06-16 | 2020-10-21 | Univ Johns Hopkins | Composiciones y métodos para la expresión de ARNs de guía de CRISPR utilizando el promotor de H1 |
| SI3161128T1 (sl) | 2014-06-26 | 2019-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe |
| KR20170032406A (ko) | 2014-07-15 | 2017-03-22 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포 |
| US9944933B2 (en) | 2014-07-17 | 2018-04-17 | Georgia Tech Research Corporation | Aptamer-guided gene targeting |
| EP3193944B1 (en) | 2014-07-17 | 2021-04-07 | University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education | Methods of treating cells containing fusion genes |
| EP3778891A1 (en) | 2014-08-27 | 2021-02-17 | New England Biolabs, Inc. | Synthon formation |
| SG11201701245QA (en) | 2014-08-27 | 2017-03-30 | Caribou Biosciences Inc | Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency |
| EP3188763B1 (en) | 2014-09-02 | 2020-05-13 | The Regents of The University of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification |
| JP7242180B2 (ja) | 2014-09-07 | 2023-03-20 | セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド | 抗ウイルス導入ベクター免疫応答を減弱化するための方法および組成物 |
| WO2016049024A2 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo |
| WO2016049163A2 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder |
| WO2016049258A2 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Functional screening with optimized functional crispr-cas systems |
| JP2017534295A (ja) | 2014-09-29 | 2017-11-24 | ザ ジャクソン ラボラトリー | エレクトロポレーションによる遺伝子改変哺乳動物の高効率ハイスループット生成 |
| EP3201340B1 (en) | 2014-10-01 | 2020-12-02 | The General Hospital Corporation | Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair |
| AU2015330699B2 (en) | 2014-10-10 | 2021-12-02 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for promoting homology directed repair |
| WO2016061073A1 (en) | 2014-10-14 | 2016-04-21 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Composition and method for in vivo engineering of chromosomal rearrangements |
| BR112017007770A2 (pt) | 2014-10-15 | 2018-01-16 | Regeneron Pharma | cultura in vitro, população de hipscs, método para modificar um locus-alvo genômico, e, hipsc. |
| CA2964796C (en) | 2014-10-17 | 2022-01-11 | The Penn State Research Foundation | Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies |
| WO2016061523A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Howard Hughes Medical Institute | Genomic probes |
| WO2016065364A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for enhancing homologous recombination |
| EP3215623A4 (en) | 2014-11-06 | 2018-09-26 | President and Fellows of Harvard College | Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells |
| EP4464338A3 (en) | 2014-11-07 | 2025-02-12 | Editas Medicine, Inc. | Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
| KR102531016B1 (ko) | 2014-11-21 | 2023-05-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| KR20170081268A (ko) | 2014-11-27 | 2017-07-11 | 단지거 이노베이션즈 엘티디. | 게놈 편집용 핵산 구조체 |
| US20170266320A1 (en) | 2014-12-01 | 2017-09-21 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing |
| WO2016094872A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Dead guides for crispr transcription factors |
| WO2016094874A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems |
| WO2016094880A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs) |
| WO2016097751A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | The University Of Bath | Method of cas9 mediated genome engineering |
| ES2947714T3 (es) | 2014-12-19 | 2023-08-17 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de múltiples direccionamientos en un solo paso |
| US10190106B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-01-29 | Univesity Of Massachusetts | Cas9-DNA targeting unit chimeras |
| WO2016108926A1 (en) | 2014-12-30 | 2016-07-07 | The Broad Institute Inc. | Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis |
| WO2016112242A1 (en) | 2015-01-08 | 2016-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Split cas9 proteins |
| EP3242938B1 (en) | 2015-01-09 | 2020-01-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection of genome editing |
| EP3245232B1 (en) | 2015-01-12 | 2021-04-21 | The Regents of The University of California | Heterodimeric cas9 and methods of use thereof |
| CN107429263A (zh) | 2015-01-15 | 2017-12-01 | 斯坦福大学托管董事会 | 调控基因组编辑的方法 |
| US9650617B2 (en) | 2015-01-28 | 2017-05-16 | Pioneer Hi-Bred International. Inc. | CRISPR hybrid DNA/RNA polynucleotides and methods of use |
| WO2016130697A1 (en) | 2015-02-11 | 2016-08-18 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules |
| BR112017017812A2 (en) | 2015-02-23 | 2018-04-10 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |
| WO2016135559A2 (en) | 2015-02-23 | 2016-09-01 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies |
| EP3265560B1 (en) | 2015-03-02 | 2021-12-08 | Sinai Health System | Homologous recombination factors |
| GB201504223D0 (en) | 2015-03-12 | 2015-04-29 | Genome Res Ltd | Biallelic genetic modification |
| EP3274453B1 (en) | 2015-03-26 | 2021-01-27 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-mediated gene conversion |
| US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
-
2014
- 2014-04-16 DK DK18187581.6T patent/DK3456831T3/da active
- 2014-04-16 SM SM20180671T patent/SMT201800671T1/it unknown
- 2014-04-16 CA CA2908697A patent/CA2908697C/en active Active
- 2014-04-16 SM SM20210516T patent/SMT202100516T1/it unknown
- 2014-04-16 SG SG10201808935WA patent/SG10201808935WA/en unknown
- 2014-04-16 HU HUE14784879A patent/HUE040575T2/hu unknown
- 2014-04-16 PL PL18187581T patent/PL3456831T3/pl unknown
- 2014-04-16 SG SG11201508028QA patent/SG11201508028QA/en unknown
- 2014-04-16 MX MX2015014487A patent/MX369747B/es active IP Right Grant
- 2014-04-16 LT LTEP14784879.0T patent/LT2986729T/lt unknown
- 2014-04-16 HU HUE18187581A patent/HUE056903T2/hu unknown
- 2014-04-16 JP JP2016509078A patent/JP6411463B2/ja active Active
- 2014-04-16 LT LTEP18187581.6T patent/LT3456831T/lt unknown
- 2014-04-16 KR KR1020207034258A patent/KR20200136508A/ko not_active Ceased
- 2014-04-16 MY MYPI2015703445A patent/MY177850A/en unknown
- 2014-04-16 DK DK14784879.0T patent/DK2986729T3/en active
- 2014-04-16 RU RU2015148637A patent/RU2676708C2/ru active
- 2014-04-16 PT PT181875816T patent/PT3456831T/pt unknown
- 2014-04-16 RS RS20181446A patent/RS58255B1/sr unknown
- 2014-04-16 WO PCT/US2014/034412 patent/WO2014172489A2/en not_active Ceased
- 2014-04-16 SI SI201431864T patent/SI3456831T1/sl unknown
- 2014-04-16 BR BR112015026197-3A patent/BR112015026197B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-04-16 EP EP14784879.0A patent/EP2986729B1/en active Active
- 2014-04-16 ES ES18187581T patent/ES2888250T3/es active Active
- 2014-04-16 SI SI201430914T patent/SI2986729T1/sl unknown
- 2014-04-16 PL PL14784879T patent/PL2986729T3/pl unknown
- 2014-04-16 RS RS20211065A patent/RS62263B1/sr unknown
- 2014-04-16 KR KR1020157031609A patent/KR102186281B1/ko active Active
- 2014-04-16 HR HRP20181648TT patent/HRP20181648T1/hr unknown
- 2014-04-16 US US14/254,715 patent/US20140310828A1/en not_active Abandoned
- 2014-04-16 CN CN201480033094.0A patent/CN105308184B/zh active Active
- 2014-04-16 PT PT14784879T patent/PT2986729T/pt unknown
- 2014-04-16 CN CN202010354904.XA patent/CN111500630A/zh active Pending
- 2014-04-16 EP EP18187581.6A patent/EP3456831B1/en active Active
- 2014-04-16 AU AU2014253942A patent/AU2014253942B9/en active Active
- 2014-04-16 ES ES14784879T patent/ES2699578T3/es active Active
- 2014-06-25 US US14/314,866 patent/US20140309487A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-10-06 IL IL241856A patent/IL241856B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-01-19 US US15/410,252 patent/US10385359B2/en active Active
-
2018
- 2018-11-14 CY CY181101202T patent/CY1120845T1/el unknown
-
2019
- 2019-06-25 US US16/451,859 patent/US10975390B2/en active Active
-
2020
- 2020-08-18 IL IL276772A patent/IL276772A/en unknown
- 2020-09-16 AU AU2020233694A patent/AU2020233694A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-03-09 US US17/196,408 patent/US12037596B2/en active Active
- 2021-08-31 HR HRP20211385TT patent/HRP20211385T8/hr unknown
- 2021-09-07 CY CY20211100789T patent/CY1124627T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2986729T3 (en) | TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH | |
| JP6670412B2 (ja) | ゲノムの標的改変のための方法及び組成物 | |
| DK3080279T3 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED MODIFICATION OF A GENOM | |
| RU2751237C1 (ru) | Способы и композиции для направленной модификации генома | |
| NZ713343B2 (en) | Targeted modification of rat genome | |
| NZ721985B2 (en) | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |