RS58481B1 - Kombinovana vakcina pcv/mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na svinjski cirkovirus, Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae ili M.hyo. Naročito, pronalazak se odnosi na multivalentnu imunogenu kompoziciju koja sadrži supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); i antigen svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2); pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin i njenu upotrebu u vakcini za zaštitu svinja od enzootične pneumonije i multisistemskog sindroma kržljavosti prasadi posle odlučenja (PMWS).

Osnova pronalaska

[0002] Uzročnik enzootičke pneumonije kod svinja, takođe označene kao mikoplazmalna pneumonija, je M.hyo. Bolest je hronična, nefatalna bolest koja pogađa svinje svih starosti. Inficirane svinje pokazuju samo blage simptome kašlja i groznice, ali bolest ima značajan ekonomski uticaj zbog smanjene efikasnosti ishrane i smanjenog dobitka telesne težine. Enzootička pneumonija se prenosi sa svinje na svinju preko nazalnih puteva preko organizama nošenih vazduhom koji su izbačeni iz pluća inficiranih svinja. Primarna infekcija čiji je uzročnik M.hyo može biti praćena sekundarnom infekcijom sa drugim vrstama mikoplazme (Mycoplasma hyorhinis i Mycoplasma flocculare) kao i drugim bakterijskim patogenima.

[0003] M.hyo je mali, prokariotski mikrob sposoban da egzistira kao slobodan organizam, iako se često nalazi u vezi sa eukariotskim ćelijama zbog toga što ima apsolutne potrebe za egzogenim sterolima i masnim kiselinama. Ove potrebe generalno zahtevaju rast u medijumu koji sadrži serum. M.hyo je ograničen ćelijskom membranom, ali ne ćelijskim zidom.

[0004] Fizička veza mikoplazmi sa površinom ćelije domaćina je osnova za razvoj i perzistenciju enzootičke pneumonije. M.hyo inficira respiratorni trakt svinje, kolonizujući traheju, bronhije i bronhiole. Mikoplazma proizvodi ciliostatični faktor koji izaziva zaustavljanje pokreta cilija koje oblažu respiratorne puteve. Konačno, cilije degenerišu, ostavljajući svinju podložnu infekciji sekundarnim patogenima. Karakteristične konsolidovane lezije ljubičastih do sivih površina zabeležene su kod inficiranih životinja. Ispitivanja žrtvovanih životinja otkrila su lezije kod 30 do 80% svinja. Rezultati iz 37 stada u 13 država pokazali su da su 99% stada imali svinje sa lezijama pneumonije tipične za enzootičku pneumoniju. Prema tome, potreba za efikasnim preventivnim merama i merama tretmana je velika.

[0005] Antibiotici kao što su tiamulin, trimetoprim, tetraciklini i lincomicin imaju izvesnu korist, ali su skupi i zahtevaju produženu upotrebu. Dodatno, nije pokazano da antibiotici efikasno eliminišu širenje ili ponovnu infekciju sa M.hyo. Prevencija putem održavanja stada bez patogena je nekada moguća, ali reintrodukcija M.hyo se često javlja. Zbog ozbiljnih ekonomskih posledica svinjske pneumonije, traže se vakcine protiv M.hyo. Vakcine koje sadrže preparate mikoplazmalnih organizama gajenih u medijumu koji sadrži serum su na tržištu, ali sa njima su povezani problemi vezani za štetne reakcije indukovane komponentama seruma (kao što su imunološki kompleksi ili neimunogeni specifični proteini) prisutni u imunizujućem materijalu. Drugi pokušaji za obezbeđivanje M. hyo vakcina bili su uspešni, ali bolest ostaje široko rasprostranjena. Vakcina zasnovana na supernatantu kulture M.hyo otkrivena je u Okada M. et al., 2000, Vaccine, 18: 2825-2831. WO 2009/126356 otkriva multivalentne kompozicije koje sadrže antigene iz M. hyo i PCV2. Primer prikazuje vakcinaciju prasića sa jednom dozom smeše tri vakcine: lngelvac® MycoFLEX™, lngelvac® PRRS MLV™ i lngelvac® CircoFlex™.

[0006] M.hyo i svinjski cirkovirus tipa 2 (PCV2) su dva najrasprostranjenija patogena koja se susreću u svinjskoj industriji. Svinja inficirana sa PCV2 ispoljava sindrom koji je uobičajeno označen kao multisistemski sindrom kržljavosti prasadi posle odlučenja (PMWS). PMWS je klinički okarakterisan kržljavošću, bledilom kože, slabošću, respiratornim distresom, diarejom, ikterusom i žuticom. Pored PMWS, PCV2 je povezan sa nekoliko drugih infekcija uključujući pseudorabies, svinjski reproduktivni i respiratornih sindrom (PRRS), Glasser-ovu bolest, streptokokalni meningitis, salmonelozu, kolibacilozu posle odlučenja, dijetetsku hepatozu i supurativnu bronhopneumoniju. M.hyo je povezan sa enzootičkom pneumonijom i takođe je uključen kao jedan od glavnih kofaktora u razvoju bolesti povezane sa svinjskim cirkovirusom (PCVAD).

[0007] Svinjski reproduktivni i respiratorni sindrom (PRRS) je uzrokovan arterivirusom, koji ima naročiti afinitet za makrofage naročito one koje se nalaze u pućima (alveolarne makrofage). Ove makrofage fagocitiraju i uklanjanju invadirajuće bakterije i viruse, ali ne u slučaju PRRS virusa (PRRSV). U slučaju PRRS virusa, on se umnožava unutar makrofaga proizvodeći više virusa i ubija makrofage. Pošto je PRRSV ušao u stado, on teži da ostane prisutan i aktivan neograničeno. Do 40% makrofaga je uništeno, što omogućava bakterijama i drugim virusima da proliferišu i izazivaju oštećenja. Uobičajeni primer ovoga je primetno povećanje u težini enzootičke pneumonije u jedinicama rast/završen rast kada postanu inficirane sa PRRS virusom. Više od polovine svinja starosti kada se dešava odlučenje koje su negativne na PRRS virus postaju inficirane pre odlaska na tržište.

[0008] Ono što je potrebno je PCV2/M.hyo kombinovana vakcina protiv oba, PCV2 i infekcije mikoplazmom kod svinje. Poželjno, ova multivalentna vakcina će biti kompatibilna sa drugim svinjskim antigenima, kao što je antigen PRRS virusa. Bilo bi visoko poželjno obezbediti jednu dozu kombinovane vakcine PCV2/M.hyo u jednoj boci koja je spremna za upotrebu.

Rezime pronalaska

[0009] Predmetni pronalazak daje multivalentnu imunogenu kompoziciju koja sadrži supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); i antigen svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2), pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin. U jednom aspektu, rastvorljivi deo preparata celih ćelija M.hyo je tretirano proteinom-A ili proteinom-G pre dodavanja imunogenoj kompoziciji. U dodatnom aspektu, kompozicija je u obliku tečne kompozicije koja je spremna za upotrebu.

[0010] Preparat M.hyo obuhvata antigene proteina M.hyo.

[0011] u nekim primerima izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku izaziva zaštitni imuni odgovor protiv M.hyo i PCV2. U jednom primeru izvođenja, PCV2 antigen je u obliku himernog tip-1-tip 2 cirkovirusa, pri čemu himerni virus obuhvata inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus tipa 1 koji eksprimira ORF2 protein svinjskog cirkovirusa tipa 2. U sledećem primeru izvođenja, PCV2 antigen je u obliku rekombinantnog ORF2 proteina. U sledećem primeru izvođenja, rekombinantni ORF2 protein je eksprimiran iz bakulovirusnog vektora.

[0012] U nekim primerima izvođenja, kompozicija PCV2/M. hyo prema predmetnom pronalasku dalje obuhvata najmanje jedan dodatni antigen. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen je zaštitan protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja.

[0013] U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam obuhvata bakterije, viruse ili protozoe. U sledećem primeru izvođenja, mikroorganizam je izabran od, ali bez ograničenja na, sledeće: virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bakteriju leptospiru, Lawsonia intracellularis, virus svinjske influence (SIV), antigen Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, virus svinjske epidemijske dijareje (PED), rotavirus, Torque teno virus (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjski enterovirusi, virus encefalomiokarditisa, patogen koji je uzročnik Aujesky-eve bolesti, klasične svinjske groznice (CSF) i patogen koji je uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa, ili njihove kombinacije.

[0014] U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku dalje obuhvata ađuvans. U jednom primeru izvođenja, ađuvans je izabran od, ali bez ograničenja na, sledećih: ulje-u-vodi ađuvans, polimerni i vodeni ađuvans, voda-u-ulju ađuvans, aluminijum hidroksid ađuvans, vitamin E ađuvans i njihove kombinacije. U sledećenm primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0015] U određenim primerima izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku izaziva zaštitni imuni odgovor protiv oba, M.hyo i PCV2 kada je primenjena kao jedna doza. U dodatnim primerima izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor protiv M.hyo, PCV2 i najmanje jednog dodatnog mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja kada se primenjuje kao jedna doza. U dodatnim primerima izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku izaziva zaštitni odgovor protiv oba, M.hyo i PCV2 kada je primenjena kao dve doze.

[0016] Predmetni pronalazak takođe daje postupak za imunizaciju svinje protiv M.hyo i PCV2. Ovaj postupak obuhvata primenu na svinju multivalentne imunogene kompozicije koja sadrži supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); antigen svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2), pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin. Rastvorljivi deo preparata M. hyo primenjene kompozicije obuhvata M. hyo proteinske antigene.

[0017] U jednom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, kompozicija je primenjivana intramuskularno, intradermalno, transdermalno ili subkutano. U sledećem primeru izvođenja postupka ovog pronalaska, kompozicija je primenjena u jednoj dozi. U sledećem primeru izvođenja postupka ovog pronalaska, kompozicija se primenjuje u dve doze.

[0018] U dodatnom primeru izvođenja postupka prema predmetnom pronalasku, kompozicija PCV2/M.hyo se primenjuje zajedno sa najmanje jednim dodatnim antigenom koji je zaštitan protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja, kao što je jedan ili više mikroorganizama opisanih u prethodnom tekstu. Takvi drugi antigeni mogu biti davani istovremeno sa kompozicijom PCV2/M.hyo (tj., kao osebne pojedinačne vakcine) ili kombinovani u vakcini koja je spremna za upotrebu.

[0019] U dodatnom primeru izvođenja, kompozicija je primenjena na svinje koje imaju antitela poreklom od majke protiv najmanje jednog od M.hyo i PCV2. U dodatnom primeru izvođenja, kompozicija je primenjena na svinje koje imaju antitela poreklom od majke protiv M.hyo i PCV2.

[0020] U jednom primeru izvođenja, kompozicija je primenjena na svinje sa 3 nedelje starosti ili kod starijih.

[0021] Predmetni pronalazak dalje daje komplet. Ovaj komplet sadrži bocu uključujući imunogenu kompoziciju. Ova imunogena kompozicija obuhvata oba, antigen PCV2 i supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja i ona je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, ovaj komplet dalje obuhvata uputstvo za upotrebu koje sadrži infromacije za primenu imunogene kompozicije. U sledećem primeru izvođenja, imunogena kompozicija u boci je obezbeđena kao tečna kompozicija koja je spremna za upotrebu.

[0022] Dodatno, pronalazak daje postupak za pripremu imunogene kompozicije. Ovaj postupak obuhvata i) kultivisanje M.hyo u pogodnom medijumu tokom perioda u opsegu od 18-144 časova; ii) zatim inaktivaciju kulture M. hyo; iii) sakupljanje tečnosti inaktivirane kulture, pri čemu tečnost inaktivirane kulture sadrži rastvorljivu tečnu frakciju i nerastvorljivi ćelijski materijal; iv) odvajanje rastvorljive tečne frakcije od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja; v) značajno uklanjanje oba IgG i imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina od odvojene rastvorljive tečne frakcije da bi se formirao supernatant kulture M. hyo bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin; i vi) zatim kombinovanje supernatanta sa PCV2 antigenom.

Kratak opis crteža

[0023]

Slika 1 je grafikon koji prikazuje efikasnost monovalentnih vakcina M.hyo pripremljenih sa antigenima M.hyo iz različitih tretmana (T02-T10 opisanih u Primeru 3) naspram placeba (T01). Rezultati su predstavljeni kao % srednjih vrednosti najmanjih kvadrata lezije pluća. Slika 2 je grafikon koji prikazuje rezultate potencije antigena PCV2 (ELISA PCV2 antigena) vakcina M.hyo u kombinaciji sa ubijenim PCV tip 1-tip 2 himernim virusom. Himerni virus je obuhvaćen u kompozicije na početnom nivou od oko 1.6≤ RP. Status svakog uzorka je izražen kao relativna potencija (RP).

Slika 3 je grafikon koji prikazuje rezultate viremije PCV2 (kvantitativan PCR PCV2) zabeležene sa PCV/M.hyo formulacijama vakcine koje koriste različite platforme ađuvansa. Slika 4 je grafikon koji prikazuje ELISA PCV2 antitela (S/P) serološke rezultate zabeležene sa PCV/M.hyo formulacijama vakcine koje koriste različite platforme ađuvansa na dane 1, 20 i 42 od veštačke infekcije.

Slika 5 je grafikon koji prikazuje fekalno praženjenje PCV2 dobijeno sa T02-T04 tretmanima opisanim u Primeru 7 naspram placeba (T01). Rezultati su izraženi kao kopije DNK PCV2/ml.

Slika 6 je grafikon koji prikazuje nazalno praženjenje PCV2 dobijeno sa T02-T04 tretmanima opisanim u Primeru 7 naspram placeba (T01). Rezultati su izraženi kao kopije DNK PCV2/ml.

Slika 7 (A & B) su grafikoni koji prikazuju rezultate testa interferona-gama (IFN-γ) koji meri PCV2-specifične ćelijski posredovane imune (CMI) odgovore. Rezultati posle vakcinacije/pre veštačke infekcije su predstavljeni na Slici 7A, i rezultati posle vakcinacije/posle veštačke infekcije su predstavljeni na Slici 7B. Stimulacija 5 x 10<6>ćelija smatra se značajnom.

Slika 8 prikazuje M.hyo efikasnost PCV2/M.hyo eksperimentalnih formulacija vakcine u SP-ulju. Ocene pluća za formulacije koje koriste M.hyo tretmane T02-T08 naspram placeba (T01) prikazane su grafički na Slici 8A. Tabela na Slici 8B prikazuje kontrast tretmana T02-T08 sa placebom.

Slika 9 je dijagram koji prikazuje jedan primer izvođenja postupka proizvodnje koršćenog za pripremu PCV2-kompatibilnog Protein-A tretiranog M.hyo antigena.

Slika 10 je tabela koja prikazuje procenu ađuvansa za viricidalnu aktivnost protiv PRRS virusa.

Kratak opis sekvenci

[0024]

SEQ ID NO: 1 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira p46 iz P-5722 soja M.hyo; SEQ ID NO: 2 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara p46 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 3 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira p97 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 4 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara p97 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 5 je jedan primer izvođenja genomske sekvence koja kodira himerni PCV1-2 virus;

SEQ ID NO: 6 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF2 svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 7 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 8 je jedan primer izvođenja genomske sekvence koja kodira himerni PCV1-2 virus;

SEQ ID NO: 9 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF2 svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 10 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 11 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 12 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselnsku sekvencu prema SEQ ID NO: 11;

SEQ ID NO: 13 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 14 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 15 je jedan primer izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 16 je jedan primer izvođenja genomske sekvence ne-virulentnog oblika severnoameričkog PRRS virusnog izolata označenog kao P129; i

SEQ ID NO: 17 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF2 do ORF5 od PRRS virusnog izolata označenog kao ISU-55.

SEQ ID NO: 18 je jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF6 i ORF7 od PRRS virusnog izolata označenog kao ISU-55.

Detaljan opis pronalaska

[0025] Predmetni pronalazak daje multivalentnu imunogenu kompoziciju koja sadrži supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); i antigen svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2), pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin. U jednom primeru izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor kod svinje protiv oba, PCV2 i M.hyo.

[0026] Prijavioci su iznenađujuće otkrili da je nerastvorljiva frakcija preparata celih ćelija M.hyo neimunogena. Nasuprot tome, rastvorljivi preparat M.hyo bez IgG je imunogen i može biti efikasno kombinovan sa antigenima iz drugih patogena, kao što su PCV2, bez analitičkih ili imunoloških smetnji između antigena. Ovo čini rastvorljivi preparat M.hyo efikasnom platformom za multivalentne vakcine ovog pronalaska, uključujući formulacije u jednoj boci koje su spremne za upotrebu. Prijavioci su takođe iznenađujuće otkrili da uklanjanje imunoglobulina i nerastvorljivih ćelijskih ostataka iz preparata M.hyo pojačava bezbednost imunogene kompozicije.

[0027] Kao što su korišćeni u specifikaciji i patentnim zahtevima, oblici u jedinini sa članovima na engleskom jeziku "a", "an" i "the" obuhvataju množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, termin "proteinski antigen" obuhvata množinu proteinskih antigena, uključujući njihove smeše.

[0028] Kao što je ovde korišćen, termin "sadrži" je određen tako da označava da kompozicije i postupci obuhvataju navedene elemente, ali ne isključuju druge elemente.

[0029] Kao što je ovde definisan, rastvorljivi deo preparata celih ćelija M.hyo označava supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtracijom ili taloženjem i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin. Frakcija supernatanta obuhvata rastvorljive proteine koje eksprimira M.hyo (M.hyo proteinske antigene) koji su odvojeni ili izolovani iz nerastvorljivih proteina, celih bakterija i drugog nerastvorljivog ćelijskog materijala M.hyo pomoću uobičajenih načina centrifugiranja, filtracije ili taloženja. Pored toga što obuhvata M.hyospecifične rastvorljive proteine, rastvorljivi deo preparata celih ćelija M.hyo takođe obuhvata heterologne proteine, kao što su oni sadržani u medijumu kulture korišćenom za fermentaciju M.hyo.

[0030] Termin "antigen" označava jedinjenje, kompoziciju ili imunogenu supstancu koja može da stimuliše proizvodnju antitela ili T-ćelijskog odgovora, ili oba, u životinji, uključujući kompozicije koje su injektirane ili apsorbovane u životinju. Imuni odgovor može biti generisan na ceo molekul ili na deo molekula (npr., epitop ili hapten).

[0031] Kao što je ovde definisana, "imunogena ili imunološka kompozicija", označava kompoziciju materije koja sadrži najmanje jedan antigen koji izaziva imunološki odgovor u domaćinu ćelijskog imunog odgovora ili imunog odgovora posredovanog preko antitela na kompoziciju ili vakcinu od interesa.

[0032] Termin "imuni odgovor" kao što je ovde korišćen označava odgovor izazvan u životinji. Imuni odgovor može da označava ćelijski imunitet (CMI); humoralni imunitet ili može da obuhvata oba. Predmetni pronalazak takođe razmatra odgovor ograničen na deo imunog sistema. Obično, "imunološki odgovor" obuhvata, ali bez ograničenja na, jedan ili više od sledećih efekata: proizvodnju ili aktivaciju antitela, B ćelija, pomoćnih T ćelija, supresorskih T ćelija i/ili citotoksičnih T ćelija i/ili yd T ćelija, usmerenih specifično na antigen ili antigene uključene u kompoziciju ili vakcinu od interesa. Poželjno, domaćin će ispoljiti terapeutski ili zaštitni imunološki odgovor tako da će rezistencija na novu infekciju biti pojačana i/ili će klinička težina bolesti biti smanjena. Takva zaštita će biti pokazana redukcijom ili nedostatkom simptoma koji se normalno ispoljavaju od strane inficiranog domaćina, kraćim vremenom oporavka i/ili nižim titrom virusa u inficiranom domaćinu.

[0033] Kao što je ovde korišćen, termin "imunogenost" označava sposobnost za proizvodnju imunog odgovora u životinji domaćinu protiv jednog ili više antigena. Ovaj imuni odgovor formira osnovu zaštitnog imuniteta izazvanog pomoću vakcine protiv specifičnog infektivnog organizma.

[0034] "Ađuvans" kao što je ovde korišćen označava kompoziciju jedne ili više supstanci koje pojačavaju imuni odgovor na antigen(e). Mehanizam funkcionisanja ađuvansa nije potpuno poznat. Veruje se da neki ađuvansi pojačavaju imuni odgovor sporim oslobađanjem antigena, dok su drugi ađuvansi snažno imunogeni sami po sebi i veruje se da funkcionišu sinergistički.

[0035] Kao što je ovde korišćen, termin "multivalentna" označava vakcinu koja sadrži više od jednog antigena bilo iz iste vrste (tj., različite izolate Mycoplasma hyopneumoniae), iz različitih vrsta (tj., izolate iz Pasteurella hemolytica i Pasteurella multocida), ili vakcinu koja sadrži kombinaciju antigena iz različitih rodova (na primer, vakcinu koja sadrži antigene iz Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus i Clostridium).

[0036] Termin "svinja" ili "prase" kao što je ovde korišćen označava životinju svinjskog porekla, dok "krmača" označava ženku reproduktivnog uzrasta i sposobnosti. "Neprašena krmača" je ženka svinje koja nikada nije bila bremenita.

[0037] Kao što je ovde korišćen, termin "virulentan" označava izolat koji zadržava svoju sposobnost da bude infektivan kod životinjskog domaćina.

[0038] "Inaktivirana vakcina" označava kompoziciju vakcine koja sadrži infektivni organizam ili patogen koji više nije sposoban da se replicira ili raste. Patogen može biti bakterijski, virusni, protozoalni ili gljivični po poreklu. Inaktivacija se može postići različitim postupcima uključujući zamrzavanje-odmrzavanje, hemijski tretman (na primer, tretman timerosalom ili formalinom), ultrazvučna obrada, zračenje, zagrevanje ili bilo koji drugi uobičajeni način dovoljan za sprečavanje replikacije ili rasta organizma uz održavanje njegove imunogenosti.

[0039] Termin "varijanta" kao što je ovde korišćen označava polipeptid ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid, koji ima jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih varijacija ili drugih manjih modifikacija tako da odgovarajući polipeptid ima značajno ekvivalentnu funkciju u poređenju sa polipeptidom divljeg tipa.

[0040] "Konzervativna varijacija" označava zamenu aminokiselinskog ostatka drugim biološki sličnim ostatkom, ili zamenu nukleotidne ili nukleinsko kiselinske sekvence tako da se kodirani aminokiselinski ostatak ne menja ili je drugi biološki sličan ostatak. Primeri konzervativnih varijacija obuhvataju supstituciju jednog hidrofobnog ostatka, kao što je izoleucin, valin, leucin ili metionin za drugi hidrofobni ostatak, ili supstituciju jednog polarnog ostatka, kao što je supstitucija arginina za lizin, glutaminske kiseline za asparaginsku kiselinu ili glutamina za asparagin, i slično. Termin "konzervativna varijacija" takođe obuhvata upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane ishodne aminokiseline, pod uslovom da antitela uzgojena na supstituisani polipeptid takođe imunološki reaguju sa nesupstituisanim polipeptidom.

[0041] Kao što su ovde korišćeni, termini "farmaceutski prihvatljiv nosač" i "farmaceutski prihvatljiv vehikulum" su naizmenični i označavaju tečni vehikulum za sadržanje antigena vakcine koji može biti injektiran u domaćina bez štetnih efekata. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači poznati u stanju tehnike obuhvataju, ali bez ograničenja na, sterilnu vodu, fiziološki rastvor, glukozu, dekstrozu ili puferisane rastvore. Nosači mogu da obuhvataju pomoćna sredstva uključujući, ali bez ograničenja na, razblaživače, stabilizatore (tj., šećere i aminokiseline), konzervanse, sredstva za vlaženje, emulgujuća sredstva, pH puferujuća sredstva, aditive za pojačanje viskoznosti, boje i slično.

[0042] Kao što je ovde korišćen, termin "kompozicija vakcine" obuhvata najmanje jedan antigen ili imunogen u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu koristan za indukciju imunog odgovora kod domaćina. Kompozicije vakcine mogu biti primenjivane u dozama i pomoću tehnika koje su dobro poznate stručnjacima iz oblasti medicine ili veterine, uzimajući u obzir takve faktore kao što su starost, pol, telesna težina, vrsta i stanje životinje primaoca, i put primene. Put primene može biti perkutani, preko mukozne primene (npr., oralne, nazalne, analne, vaginalne) ili preko parenteralnog puta (intradermalni, transdermalni, intramuskularni, subkutani, intravenski ili intraperitonealni). Kompozicije vakcine mogu biti primenjivane pojedinačno, ili mogu biti ko-primenjivane ili uzastopno primenjivane sa drugim tretmanima ili terapijama. Oblici primene mogu da obuhvataju suspenzije, sirupe ili eliksire, i preparate za parenteralnu, subkutanu, intradermalnu, intramuskularnu ili intravensku primenu (npr., injektabilna primena) kao što su sterilne suspenzije ili emulzije. Kompozicije vakcine mogu biti primenjene kao sprej ili mešane u hrani i/ili vodi ili isporučene u mešavini sa pogodnim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom kao što je sterilna voda, fiziološki rastvor, glukoza ili slično. Kompozicije mogu da sadrže pomoćne supstance kao što su sredstva za vlaženje ili emulgujuća sredstva, pH puferujuća sredstva, ađuvanse, gelirajuće aditive ili aditive koji pojačavaju viskozitet, konzervanse, sredstva za poboljšanje ukusa, boje i slično, u zavisnosti od puta primene i željenog preparata. Standardni farmaceutski tekstovi, kao što je "Remington’s Pharmaceutical Sciences," 1990 mogu se konsultovati za pripremu pogodnih preparata, bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0043] "Severno-američki PRRS virus" označava bilo koji PRRS virus koji ima genetičke karakteristke povezane sa severno-američkim PRRS virusnim izolatom, kao što je, ali bez ograničenja na PRRS virus koji je prvi put izolovan u Sjedinjenim Državama negde početkom 1990-tih (videti, npr., Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); severnoamerički PRRS virusni izolat MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296); Quebec LAF-exp91 soj PRRS virusa (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol.140:1405-1418); i severno-američki PRRS virusni izolat VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Dodatni primeri severno-američkih PRRS virusnih sojeva su opisani ovde. Genetičke karakteristike označavaju sličnost genomske nukleotidne sekvence i sličnost aminokiselinske sekvence koje dele severno-američki PRRS virusni sojevi. Kineski PRRS virusni sojevi generalno pokazuju oko 80-93% sličnosti nukleotidne sekvence sa severnoameričkim sojevima.

[0044] "Evropski PRRS virus" označava PRRS virus bilo kog soja koji ima genetičke karakteristike povezane sa PRRS virusom koji je prvi put izolovan u Evropi oko 1991. (videti, npr., Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130). "Evropski PRRS virus" je takođe nekada označen u stanju tehnike kao "Lelystad virus". Dodatni primeri evropskih PRRS virusnih sojeva su opisani ovde.

[0045] Genetički modifikovani virus je "atenuiran" ako je manje virulentan od njegovog nemodifikovanog ishodnog soja. Soj je "manje virulentan" ako pokazuje statistički značajno smanjenje u jednom ili više parametara koji određuju težinu bolesti. Takvi parametri mogu da obuhvataju nivo viremije, groznicu, težinu respiratornog distresa, težinu reproduktivnih simptoma ili broj ili težinu lezija pluća, itd.

[0046] "Infektivni klon" je izolovani ili klonirani genom agensa bolesti (npr. virusa) koji može biti specifično i svrsishodno modifikovan u laboratoriji i zatim korišćen za ponovno stvaranje živog genetički modifikovanog organizma. Živi genetički modifikovani virus proizveden iz infektivnog klona može biti korišćen u živoj virusnoj vakcini. Alternativno, inaktivirane virusne vakcine mogu biti pripremljene tretmanom živog virusa poreklom iz infektivnog klona sa inaktivirajućim agensima kao što je formalin ili hidrofobni rastvarači, kiseline, itd., zračenjem ultraljubičastom svetlošću ili rentgenskim zracima, zagrevanjem, itd.

[0047] Sve trenutno dostupne M.hyo i M.hyo kombinovane vakcine su pripremljene od preparata ubijenih celih ćelija mikoplazme (bakterini). Nasuprot tome, predmetni pronalazak koristi supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) i antigen svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2), pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiraja, filtracije ili taloženja i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin.

[0048] M.hyo ima apsolutne potrebe za egzogenim sterolima i masnim kiselinama. Ove potrebe generalno zahtevaju rast M.hyo u medijumu koji sadrži serum, kao što je svinjski serum. Odvajanje nerastvorljivog materijala iz rastvorljivog dela preparata celih ćelija M.hyo (npr., centrifugiranjem, filtracijom ili taloženjem) ne uklanja svinjski IgG ili imune komplekse. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rastvorljivi deo M.hyo je tretiran proteinom-A ili proteinom-G u cilju značajnog uklanjanja IgG i imunih kompleksa sadržanih u supernatantu kulture. U ovom primeru izvođenja, razume se da se tretman proteinom A javlja posle fermentacije M.hyo. Ovo je alternativno ovde označeno kao nishodni tretman proteinom A. U sledećem primeru izvođenja, može se koristiti ushodni tretman proteinom A medijuma za rast (tj., pre fermentacije M.hyo). Protein A se vezuje za Fc deo IgG. Protein G se vezuje preferencijalno za Fc deo IgG, ali takđe može da se vezuje za Fab region. Postupci za prečišćavanje/uklanjanje ukupnog IgG iz sirovih proteinskih smeša, kao što su supernatant kulture tkiva, serum i tečnost ascita su poznati u stanju tehnike.

[0049] Rastvorljivi deo preparata M.hyo obuhvata proteinske antigene M.hyo.

[0050] Frakcija supernatanta M.hyo obuhvata najmanje proteinske antigene M.hyo približne molekulske mase od 46kD (p46), 64kD (p64) i 97kD (p97). Protein M.hyo od približno 64kD (p64) može biti alternativno označen ovde kao p65 površinski antigen iz M.hyo opisan od strane Kim et al. [Infect. Immun.58(8):2637-2643 (1990)], kao u SAD patentu br.5,788,962.

[0051] Futo et al. opisali su kloniranje i karakterizaciju 46kD površinskog proteina iz M.hyo, koji može biti korišćen u kompozicijama ovog pronalaska [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. U jednom primeru izvođenja, supernatant kulture M.hyo obuhvata p46 čije su odgovarajuće nukleotidne i aminokiselinske sekvence iz P-5722 soja navedene u SEQ ID NOs: 1 i 2, respektivno. Dalje je razmatrano da se varijante takvih p46 sekvenci mogu koristiti u kompozicijama prema predmetnom pronalasku, kao što je opisano u daljem tekstu.

[0052] Zhang et al. su opisali i okarakterisali p97 adhezin protein od M.hyo [Infect. Immun.

63: 1013-1019, 1995]. Dodatno, King et al. su opisali 124kD protein označen terminom Mhp1 iz P-5722 soja M.hyo i predstavljeni podaci sugerišu da su Mhp1 i p97 isti protein [Vaccine 15:25-35 (1997)]. Takvi p97 proteini mogu biti korišćeni u kompozicijama ovog pronalaska. U jednom primeru izvođenja, supernatant kulture M.hyo obuhvata p97 čije su odgovarajuće nukleotidne i aminokiselinske sekvence iz P-5722 soja navedene u SEQ ID NOs: 3 i 4, respektivno. Dalje je razmatrano da varijante takvih p97 sekvenci mogu biti korišćeni u kompozicijama prema predmetnom pronalasku, kao što je opisano u daljem tekstu.

[0053] Supernatant kulture M.hyo može da obuhvata dodatne specifične proteinske antigene M.hyo kao što su, ali bez ograničenja na, proteini od približno 41kD (p41), 42kD (p42), 89kD (p89) i 65kD (p65). Videti, Okada et al., 2000, J. Vet. Med. B 47:527-533 i Kim et al., 1990, Infect. Immun. 58(8):2637-2643. Pored toga, supernatant kulture M.hyo može da obuhvata specifične proteinske antigene M.hyo od približno 102kD (p102) i 216kD (p216). Videti, SAD patente be.6,162,435 i 7,419,806 za Minnion et al.

[0054] Bilo koji M.hyo soj može biti korišćen kao početni materijal za proizvodnju rastvorljivog dela preparata M.hyo kompozicija prema predmetnom pronalasku. Pogodni sojevi M.hyo mogu biti dobijeni iz komercijalnih ili akademskih izvora, uključujući ustanove za deponovanje kao što je American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va.) i NRRL Culture Collection (Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Ill.). Samo ATCC navodi sledećih šest sojeva M.hyo za prodaju: M.hyo ATCC 25095, M.hyo ATCC 25617, M.hyo ATCC 25934, M.hyo ATCC 27714, M.hyo ATCC 27715 i M.hyo ATCC 25934D. Poželjan soj M.hyo za upotrebu u primerima izvođenja ovog pronalaska je identifikovan kao soj P-5722-3, ATCC #55052, deponovan 30.5.1990. u skladu sa pravilma za dostupnost zahtevanim od strane Zavoda za patentne i žigove SAD-a. U pogledu široko raširene diseminacije bolesti, sojevi takođe mogu biti dobijeni izolacijom M.hyo iz sekrecija pluća ili tkiva iz svinje inficirane poznatim sojevima uzročnicima mikoplazmalne pneumonije kod svinja.

[0055] Stručnjaci iz date oblasti tehnike razumeju da varijante sekvenci M.hyo mogu biti korišćene u kompozicijama prema predmetnom pronalasku. Takve varijante bi mogle da variraju za 10-20% u identičnosti sekvenci i još uvek zadržavaju antigene karakteristike koje ih čine korisnim u imunogenim kompozicijama. Poželjno, varijante M.hyo imaju najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, čak poželjnije najmanje 95% identičnosti sekvence sa celom genomskom sekvencom M.hyo soja divljeg tipa. Antigene karakteristike imunološke kompozicije mogu biti, na primer, procenjene pomoću eksperimenta veštačke infekcije kao što je dato u Primerima. Pored toga, antigena karakteristika modifikovanog antigena M.hyo je još uvek zadržana kada modifikovani antigen daje najmanje 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% zaštitnog imuniteta u poređenju sa proteinom M.hyo divljeg tipa.

[0056] U jednom primeru izvođenja, rastvorljivi p46 antigen M.hyo je uključen u kompozicije prema pronalasku u krajnjoj koncentraciji od oko 1.5 µg/ml do oko 10 µg/ml, poželjno oko 2 µg/ml do oko 6 µg/ml. Zabeleženo je da je p46 protein korišćen za test potencije M.hyo (videti deo sa primerima u daljem tekstu). U sledećem primeru izvođenja, antigen M.hyo može biti uključen u kompozicije u krajnjoj količini od oko 5.5% do oko 35% supernatanta cele kulture M.hyo tretirane proteinom A.

[0057] Rastvorljivi preparat M.hyo prema predmetnom pronalasku je bezbedan i efikasan protiv M.hyo i pogodan je za primenu jedne doze. Pored toga, prijavioci su iznenađujuće našli da rastvorljivi preparat M.hyo može biti efikasno kombinovan sa antigenima iz drugih patogena, uključujući PCV2, bez imunološke interferencije između antigena. Ovo čini rastvorljivi preparat M.hyo efikasnom platformom za multivalentne vakcine, uključujući PCV2/M.hyo kombinovanu vakcinu ovog pronalaska. Antigen PCV2 može se dati istovremeno sa kompozicijom M.hyo (tj., kao posebne pojedinačne vakcine), ali je poželjno kombinovan u vakcini u jednoj boci koja je spremna za upotrebu.

[0058] U jednom primeru izvođenja, imunogene PCV2/M.hyo kompozicije prema predmetnom pronalasku obuhvataju najmanje jedan dodatni antigen. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen je zaštitan protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja.

[0059] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna dodatna antigena komponenta je zaštitna protiv bakterija, virusa ili protozoa za koje je poznato da vrše infekciju svinja. Primeri takvih mikroorganizama obuhvataju, ali bez ograničenja na, sledeće: virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bakterije leptospira, Lawsonia intracellularis, virus svinjske influence (SIV), Escherichia coli antigen, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, virus svinjske epidemijske dijareje (PED), rotavirus, Torque teno virus (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjske enteroviruse, virus encefalomiokarditisa, patogen koji je uzročnik Aujeskye-eve bolesti, klasične svinjske groznice (CSF) i patogen uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa, ili njihove kombinacije.

[0060] u jednom primeru izvođenja, kombinovana vakcina PCV2/M.hyo prema predmetnom pronalasku je obezbeđena kao jedna doze vakcine u jednoj boci koja je spremna za upotrebu. Takva kombinovana vakcina koja je spremna za upotrebu ne zahteva mešanje posebnih vakcina, tako da nema rizika od kontaminacije ili dodatnog rada povezanog sa mešanjem i nema potrebe za upotrebom smeše u roku od nekoliko časova. Takođe, kombinovana vakcina PCV2/M.hyo u jednoj boci smanjuje otpad i prostor za rashlađivanje na pola. Pored toga, primena jedne doze eliminiše rad povezan sa primenom druge doze na životinju. Zabeleženo je da iako kombinovane vakcine PCV2/M.hyo trenurno postoje, one su obezbeđene kao dve doze vakcine spremne za upotrebu (Circumvent®PCVM) ili kao jedna doza vakcine u 2 boce koja zahteva istovremenu primenu posebnih vakcina (npr., Ingelvac CircoFLEX® i Ingelvac MycoFLEX®). Poželjno, kombinacija PCV2/M.hyo prema predmetnom pronalasku bi bila kompatibilna sa drugim antigenima, kao što je antigen PRRS virusa, tako da se svi antigeni mogu primenjivati u jednoj dozi.

[0061] U nekim primerima izvođenja, PCV2 antigena komponenta PCV2/M.hyo kombinovane vakcine je u obliku himernog tip-1-tip 2 cirkovirusa. Himerni virus obuhvata inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus tipa 1 koji eksprimira ORF2 protein svinjskog cirkovirusa tipa 2. Himerni svinjski cirkovirusi i postupci zua njihovu pripremu opisani su u WO 03/049703 A2, i takođe u SAD patentima br. 7,279,166 i 7,575,752, koji su obuhvaćeni ovde preko reference u njihovoj celini.

[0062] U jednom primeru izvođenja, cela DNK sekvenca genoma himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 5. ili njenim varijantama, kao što je opisano u daljem tekstu. U sledećem primeru izvođenja, imunogeni ORF2 kapsidni gen himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 6. U dodatnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca imunogenog ORF2 proteina eksprimiranog od strane himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 7.

[0063] U sledećem primeru izvođenja, cela DNK sekvenca genoma himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 8. U jednom primeru izvođenja, imunogeni ORF2 kapsidni gen himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 9. U dodatnom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca imunogenog ORF2 proteina eksprimiranog od strane himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 10.

[0064] Međutim, DNK ORF2 PCV2 i protein himernog PCV1-2 virusa nisu ograničeni na sekvence opisane u prethodnom tekstu s obzirom na to da je DNK ORF2 PCV2 i protein visoko konzervativan domen unutar PCV2 izolata.

[0065] U nekim primerima izvođenja, PCV2 antigena komponenta M.hyo/PCV2 kombinovane vakcine je u obliku rekombinantnog ORF2 proteina. U jednom primeru izvođenja, rekombinantni ORF2 protein je eksprimiran iz bakulovirusnog vektora. Alternativno, mogu se koristiti ostali poznati ekspresioni vektori, kao što su uključujući, ali bez ograničenja na, parapoks vektori.

[0066] U jednom primeru izvođenja, rekombinantni PCV2 ORF2 protein je onaj od SEQ ID NO: 11, koji je kodiran sa SEQ ID NO: 12 (GenBank pristupni br. AF086834). U sledećem primeru izvođenja, rekombinantni ORF2 protein je onaj od SEQ ID NO: 13, koji je kodiran sa SEQ ID NO: 14. U sledećem primeru izvođenja, rekombinantni ORF2 protein odgovara SEQ ID NO: 15. U sledećem primeru izvođenja, rekombinantni PCV2 ORF2 protein odgovara SEQ ID NO: 7. U sledećem primeru izvođenja, rekombinantni PCV2 ORF2 protein odgovara SEQ ID NO: 10.

[0067] Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na određeni DNK ORF2 o proteinske sekvence opisane u prethodnom tekstu. S obzirom na to da je DNK ORF2 PCV2 i protein visoko konzervativan domen unutar PCV2 izolata, bilo koji ORF2 PCV2 je visoko verovatno efikasan kao izvor DNK ORF2 PCV2 i/ili polipeptida kao što su korišćeni u himernom PCV1-2 virusu ili u rekombinantnom PCV2 proteinu.

[0068] Primer pogodnog PCV2 izolata iz kojih mogu biti izvedeni DNK ORF2 PCV2 i proteinske sekvence je PCV2 izolat broj 40895 (deponovan u ATCC 7.12.2001. i kome je dodetlejn ATCC Patent Deposit Designation PTA-3914). Genomska (nukleotidna) sekvenca PCV2 izolata broj 40895 je dostupna pod GenBank pristupnim brojem AF264042. Ostali primeri pogodnih PCV2 izolata iz kojih mogu biti izvedeni DNK ORF2 PCV2 i proteinske sekvence obuhvataju, ali bez ograničenja na, sledeće: Imp.999, Imp.1010-Stoon, Imp.1011-48121 i Imp.1011-48285. GenBank pristupni brojevi genomskih sekvenci koje odgovaraju ovim PCV2 izolatima su AF055391, AF055392, AF055393 i AF055394, respektivno.

[0069] U nekim oblicima, imunogeni delovi ORF2 proteina PCV2 su korišćeni kao antigena komponenta u kompoziciji. Na primer, skraćeni i/ili supstituisani oblici ili fragmenti ORF2 proteina PCV2 mogu biti korišćeni u kompozicijama prema predmetnom pronalasku.

[0070] Stručnjaci iz date oblasti tehnike takođe razumeju da se varijante PCV2 sekvenci mogu koristiti u kompozicijama prema predmetnom pronalasku. Takve varijante mogu da variraju za 10-20% u identičnosti sekvence i još uvek zadržavaju antigene karakteristike koje ih čine korisnim u imunogenim kompozicijama. Poželjno, PCV2 varijante imaju najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, čak poželjnije najmanje 95% identičnosti sekvence sa celom genomskom sekvencom PCV2 izolata divljeg tipa. Antigene karakteristike imunološke kompozicije mogu biti, na primer, procenjene pomoću eksperimenta veštačke infekcije kao što je dat u Primerima. Pored toga, antigene karakteristke modifikovanog PCV2 antigena su još uvek zadržane kada modifikovani antigen pruža najmanje 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% zaštitnog imuniteta u poređenju sa ORF2 proteinom PCV2 divljeg tipa.

[0071] PCV2 antigena komponenta je obezbeđena u imunogenoj kompoziciji na nivou uključenja antigena efikasnog za indukciju željenog imunog odgovora, naime redukcijom incidence ili smanjenja težine kliničkih znakova koji su rezultat PCV2 infekcije.

[0072] U jednom primeru izvođenja, himerni PCV1-2 virus je uključen u kompozicije prema pronalasku na nivou od najmanje 1.0 ≤ RP≤ 5.0, pri čemu RP je jedinica relativne potencije određena pomoću ELISA kvantitativnog određivanja antigena (in vitro test potencije) u poređenju sa referentnom vakcinom. U sledećem primeru izvođenja, himerni PCV1-2 virus je uključen u kompoziciju prema pronalasku u krajnjoj koncentraciji od oko 0.5% do oko 5% od 20-puta (20X) koncentrovane mase PCV1-2 antigena.

[0073] U sledećem primeru izvođenja, ORF2 rekombinantni protein PCV2 je uključen u kompozicije prema pronalasku na nivou od najmanje 0.2 µg antigena/ml finalne imunogene kompozicije (µg/ml). U dodatnom primeru izvođenja, inkluzioni nivo ORF2 rekombinantnog proteina PCV2 je od oko 0.2 do oko 400 µg/ml. U sledećem primeru izvođenja, inkluzioni nivo ORF2 rekombinantnog proteina PCV2 je od oko 0.3 do oko 200 µg/ml. U dodatnom primeru izvođenja, inkluzioni nivo ORF2 rekombinantnog proteina PCV2 je od oko 0.35 do oko 100 µg/ml. U sledećem primeru izvođenja, inkluzioni nivo ORF2 rekombinantnog proteina PCV2 je od oko 0.4 do oko 50 µg/ml.

[0074] U jednom primeru izvođenja, imunogena kompozicija prema predmetnom pronalasku obuhvata inventivnu kombinaciju rastvorljivih antigena M.hyo i antigena svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2), kao i antigena PRRS virusa. U sledećem primeru izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor kod svinje protiv M.hyo, PCV2 i PRRS virusa.

[0075] U jednom primeru izvođenja, PCV2/M.hyo/ PRRS kombinovana vakcina je obezbeđena kao vakcina u 2 boce, pojedinačne doze. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PCV2/M.hyo kombinacija je obezbeđena kao stabilna tečna kompozicija u prvoj boci i PRRS virus je obezbeđen u liofilizovanom stanju u drugoj boci. U nekim primerima izvođenja, dodatni svinjski antigeni mogu biti dodati u prvu ili drugu bocu.

[0076] U jednom primeru izvođenja, PRRS virusna komponenta je obezbeđena kao liofilizovani, genetički modifikovani živi virus. Pre primene, PCV2/M.hyo tečnost iz prve boce mogu se koristiti za rehidrataciju PRRS virusa u drugoj boci tako da sva tri antigena mogu biti primenjena na životinju u jednoj dozi. Zabeleženo je da iako PCV2/M.hyo/PRRS kombinovane vakcine trenutno postoje, one su obezbeđene kao vakcina jedne doze u 3 boce koja zahteva istovremenu primenu tri posebne vakcine (npr., Ingelvac CircoFLEX®, Ingelvac MycoFLEX® i Ingelvac®PRRS MLV).

[0077] PRRS etiološki agens je izolovan prvi put u Holandiji i označen je kao Lelystad virus. Ovaj virus je opisan u WO 92/21375 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Izolat evropskog PRRS virusa je deponovan u Institut Pasteur of Paris, broj 1-1102. Severnoamerički tip je izolovan skoro istovremeno sa izolacijom evropskog tipa virusa, i opisan je u WO-93/03760 (Collins et al.) Izolat severno-američkog tipa virusa je deponovan u American Type Culture Collection (ATCC), broj VR-2332.

[0078] Različiti sojevi su izolovani iz evropskih i severno-američkih tipova virusa. WO 93/07898 (Akzo) opisuje evropski soj, i vakcine poreklom od njega, deponovane u CNCM (Institut Pasteur), broj 1-1140. Takođe, WO 93/14196 (Rhone-Merieux) opisuje novi soj izolovan u Francuskoj, deponovan u CNCM (Institut Pasteur), broj 1-1153. Pored toga, EP0595436 B1(Solvay) opisuje novi severno-američki tip soja, virulentnij od onog koji je početno opisan, i njegove vakcine. Ovaj soj je deponovan u ATCC, ali broj deponovanja nije naveden u patentnoj prijavi. Pored toga, ES2074950 BA (Cyanamid Iberica) i njemu odgovarajući GB2282811 B2 opisuju takozvani "španski soj", koji se razlikuje od drugih evropskih i severno-američkih sojeva. Ovaj "španski soj" je deponovan u European Animal Cell Culture Collection (EACCC), broj V93070108.

[0079] Pogodni PRRS virusni antigeni za upotrebu u PCV2/M.hyo/PRRS kompozicijama prema predmetnom pronalasku obuhvataju sverno-američke PRRS virusne izolate, kineske PRRS virusne sojeve i evropske PRRS virusne sojeve, kao i genetički modifikovane verzije takvih izolata/sojeva. U jednom primeru izvođenja, PRRS virusna antigena komponenta korišćena u kompozicijama prema predmetnom pronalasku je severno-američki PRRS virus.

[0080] U nekim primerima izvođenja, PRRS virusna antigena komponenta korišćena u kompozicijama ovog pronalaska je severno-američki PRRS virusni izolat označen kao P129 ili njegova živa, genetički modifikovana verzija. Poželjno, genetički modifikovani PRRS virus je nesposoban da proizvede patogenu infekciju, sposoban je da izazove efikasan imunoprotektivni odgovor protiv infekcije PRRS virusom divljeg tipa.

[0081] Genetički modifikovani PRRS virus za upotrebu u kompozicijama prema pronalasku može biti proizveden iz infektivnog klona. Priprema infektivnog cDNK klona severnoameričkog PRRS virusnog izolata označenog kao P129 opisana je u SAD pat. br. 6,500,662 koji je ovde obuhvaćen u potpunosti putem reference. Sekvenca cDNK P129 je prikazana u Genbank pristupni broj AF494042 i u SAD pat. br.6,500,662.

[0082] U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca nevirulentnog oblika P129 za upotrebu u kompozicijama prema predmetnom pronalasku je predstavljena pomoću SEQ ID NO: 16. Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na ovu sekvencu. Ova sekvenca i sekvence drugih nevirulentnih oblika P129 opisane su u međunarodnoj prijavi br. PCT/IB2011/055003, koja je podneta 9.11.2011, čiji sadržaj (uključujući bilo koje nacionalne prijave iz SAD zasnovane na ovoj međunarodnoj prijavi) je obuhvaćen ovde preko reference u celini. Poželjno, PRRS virus je modifikovan tako da spreči nishodnu regulaciju funkcije posredovane preko interferona.

[0083] U drugim primerima izvođenja, PRRS virusna antigena komponenta korišćena u kompozicijama prema pronalasku je PRRS virusni izolat označen kao ISU-55. ISU-55 izolat je deponovan u American Type Culture Collection (ATCC), pod pristupnim brojem VR2430. Nukleotidna sekvenca ORF2 do ORF5 gena od ISU-55 izolata je predsatavljena sa SEQ ID NO:17. Nukleotidna sekvenca ORF6 i ORF7 gena od ISU-55 izolata je predstavljena sa SEQ ID NO: 18.

[0084] Sledeći pogodan severno-američki PRRS virusni izolat koji se može koristiti u kompozicijama je ISU-12, koji je deponovan u ATCC pod pristupnim brojevima VR2385 [3 x prečišćeni plakovi] i VR2386 [prečišćeni plakovi]. Drugi pogodni severno-američki PRRS virusni izolati koji se mogu koristiti u kompozicijama ovog pronalaska su sledeći: ISU-51, ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 i ISU-79, koji su deponovani u ATCC pod pristupnim brojevima VR2498, VR2431, VR2475, VR2429 i VR2474, respektivno. Genetički modifikovane verzije bilo kojih od ovih ISU izolata mogu se koristiti u kompozicijama prema ovom pronalasku. Ovi ISU izolati i ISU-55 izolat su detaljno opisani u sledećim SAD patentima od Paul, et al: US 5,695,766, 6,110,467, 6,251,397, 6,251,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7,264,802, 7,264,957 i 7,517,976, od kojih su svi obuhvaćeni ovde preko reference u njihovoj celini.

[0085] U drugim primerima izvođenja, PRRS virusna antigena komponenta korišćena u kompozicijama prema predmetnom pronalasku je severno-američki tip deponovan u American Type Culture Collection (ATCC), broj VR-2332 ili njegova genetički modifikovana verzija. Na primer, PRRS virus može biti modifikovan živi na bazi izolata identifikovanog kao ATCC VR2332, koji je korišćen u INGELVAC® PRRS ATP i INGELVAC® PRRS MLV, iz Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.

[0086] U drugim primerima izvođenja, PRRS virusna antigena komponenta korišćena u kompozicijama prema predmetnom pronalasku je evropski PRRS virusni izolat ili Lelystad virus ili njegova genetički modifikovana verzija. Primer pogodnog PRRS virusnog soja je identifikovan kao depozit br. 1-1102, opisan u prethodnom tekstu. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence koje odgovaraju 1-1102 depozitu su opisane u SAD patentu br.

5,620,691 od Wensvoort et al, koji je ovde potpuno obuhvaćen preko reference. Priprema infektivnog klona evropskog PRRS virusnog izolata ili Lelystad virusa opisana je u SAD pat. br. 6,268,199 koji je ovde obuhvaćen potpuno preko reference.

[0087] Drugi primeri pogodnih PRRS virusnih izolata obuhvataju, ali bez ograničenja na, one opisane u prethodnom tekstu. Takođe, žive, genetički modifikovane verzije PRRS virusnih izolata mogu biti korišćene u kompozicijama prema predmetnom pronalasku. Infektivni klon može biti korišćen za ponovno stvaranje takvih živih genetički modifikovanih organizama.

[0088] Stručnjaci iz date oblasti tehnike razumeju da se varijante PRRS virusnih sekvenci mogu koristiti u kompozicijama prema predmetnom pronalasku. Takve varijante bi mogle da variraju za 10-20% u identičnosti sekvence i još uvek zadrže antigene karakteristike koje ih čine korisnim u imunogenim kompozicijama. Poželjno, PRRS virusne varijante imaju najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, čak poželjnije najmanje 95% identičnosti sekvence sa celom genomskom sekvencom PPRS virusnog izolata divljeg tipa. Antigene karakteristike imunološke kompozicije mogu biti, na primer, procenjene pomoću eksperimenata veštačke infekcije. Pored toga, antigena karakteristika modifikovanog PRRS virusnog antigena je još uvek zadržavana kada modifikovani antigen pruža najmanje 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% zaštitnog imuniteta u poređenju sa PRRS virusnim antigenom divljeg tipa.

[0089] U jednom primeru izvođenja, PRRS virusna antigena komponenta je genetički modifikovani, živi virus koji je uključen u kompozicije prema pronalasku na nivou od najmanje 2.1 ≤ TCID50≤ 5.2, pri čemu TCID50 je infektivna doza kulture tkiva 50% određena pomoću kvantitativnog određivanja antigena (in vitro test potencije)

[0090] PCV2 antigena komponenta PCV2/M.hyo/PRRS kompozicija prema pronalasku može biti u obliku himernog tip-1-tip 2 cirkovirusa, pri čemu himerni virus sadrži inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus tip 1 koji eksprimira ORF2 protein svinjskog cirkovirusa tipa 2. U sledećem primeru izvođenja, PCV2 antigena komponenta PCV2/M.hyo/PRRS kompozicija prema pronalasku je u obliku rekombinantnog ORF2 proteina.

[0091] Pogodni PCV2 antigeni za upotrebu u PCV2/M.hyo/PRRS kompozicijama mogu biti poreklom od bilo kojih PCV2 izolata opisanih u prethodnom tekstu, kao i drugih PCV2 izolata. Pogodni PCV2 antigeni za upotrebu u kompozicijama prema pronalasku obuhvataju, ali bez ograničenja na, PCV2 sekvence koje su opisane u prethodnom tekstu i njihove varijante.

[0092] Vakcine prema predmetnom pronalasku mogu biti formulisane praćenjem prihvaćene konvencije za obuhvatanje prihvatljivih nosača za životinje, uključujući ljude (ako je primenljivo), kao što su standardni puferi, stabilizatori, razblaživači, konzervansi i/ili solubilizatori, i takođe mogu biti formulisani tako da olakšaju produženo oslobađanje. Razblaživači obuhvataju vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, etanol, glicerol i slično. Aditivi za izotoničnost obuhvataju natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol i laktozu, pored ostalih. Stabilizatori obuhvataju albumin, pored ostalih. Drugi pogodni vehikulumi i aditivi za vakcinu, uključujući one koji su naročito korisni u formulaciji modifikovanih živih vakcina, su poznati ili će biti očigledni stručnjacima iz date oblasti tehnike. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, koji je ovde obuhvaćen preko reference.

[0093] Vakcine prema predmetnom pronalasku mogu dalje da sadrže jednu ili više dodatnih imunomodulatornih komponenti kao što su, npr., ađuvans ili citokin, pored ostalih. Tipovi pogodnih ađuvanasa za upotrebu u kompozicijama prema predmetnom pronalasku obuhvataju sledeće: ulje-u-vodi ađuvans, polimerni i vodeni ađuvans, voda-u-ulju ađuvans, aluminijum hidroksid ađuvans, vitamin E ađuvans i njihove kombinacije. Neki specifični primeri ađuvanasa obuhvataju, ali bez ograničenja na, kompletan Freund-ov ađuvans, nekompletan Freund-ov ađuvans, Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, aluminijum hidroksid gel, glukan, dekstran sulfat, gvožđe oksid, natrijum alginat, Bacto-ađuvans, određene sintetičke polimere kao što su poli aminokiseline i ko-polimeri aminokiselina, blok kopolimer (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN® ađuvans, saponin, Quil A ili druga frakcija saponina, monofosforil lipid A i Avridin lipid-amin ađuvans (N,N-dioktadecil-N’,N’-bis(2-hidroksietil)-propandiamin), "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), parafinsko ulje, RIBI ađuvantni sistem (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), muramil dipeptid i slično.

[0094] Neograničavajući primeri ulje-u-vodi emulzija korisnih u vakcini prema pronalasku obuhvataju modifikovane SEAM62 i SEAM 1/2 formulacije. Modifikovana SEAM62 je uljeu-vodi emulzija koja sadrži 5% (zapr./zapr.) skvalena (Sigma), 1% (zapr./zapr.) SPAN® 85 deterdženta (ICI Surfactants), 0.7% (zapr./zapr.) TWEEN® 80 deterdženta (ICI Surfactants), 2.5% (zapr./zapr.) etanola, 200 µg/ml Quil A, 100 µg/ml holesterola i 0.5% (zapr./zapr.) lecitina. Modifikovana SEAM 1/2 je ulje-u-vodi emulzija koja sadrži 5% (zapr./zapr.) skvalen, 1% (zapr./zapr.) SPAN® 85 deterdžent, 0.7% (zapr./zapr.) Tween 80 deterdžent, 2.5% (zapr./zapr.) etanol, 100 µg/ml Quil A i 50 µg/ml holesterola.

[0095] Sledeći primer ađuvansa korisnog u kompozicijama prema pronalasku je SP-ulje. Kao što je korišćen u specifikaciji i patentnim zahtevima, termin "SP ulje" označava uljastu emulziju koja sadrži polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer, skvalan, polioksietilen sorbitan monooleat i puferisani rastvor soli. Polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri su surfaktanti koji pomažu u suspendovanju čvrstih i tečnih komponenti. Ovi surfaktanti su komercijalno dostupni kao polimeri pod trgovačkim nazivom Pluronic®. Poželjan surfaktant je poloksamer 401 koji je komercijalno dostupan pod trgovačkim nazivom Pluronic® L-121. Uopšteno, SP uljasta emulzija je imunostimulirajući ađuvantna smeša koja će da sadrži oko 1 do 3% zapr./zapr. blok kopolimera, oko 2 do 6% zapr./zapr. skvalana, naročito oko 3 do 6% skvalana i oko 0.1 do 0.5% zapr./zapr. polioksietilen sorbitan monooleata, pri čemu je ostatak puferisani rastvor soli. U jednom primeru izvođenja, emulzija SP-ulja je prisutna u finalnoj kompoziciji u količinama zapr./zapr. od oko 1% do 25%, poželjno oko 2% do 15%, poželjnije oko 5% do 12% zapr./zapr.

[0096] Sledeći primer pogodnog ađuvansa za upotrebu u kommpozicijama prema pronalasku je AMPHIGEN™ ađuvans koji se sastoji od od-uljenog lecitina rastvorenog u ulju, obično svetlom tečnom parafinu.

[0097] Ostali primeri ađuvanasa korisnih u kompozicijama prema pronalasku su sledeći vlasnički ađuvansi: Microsol Diluvac Forte® dvostruki emulzioni ađuvantni sistem, Emunade ađuvans i Xsolve ađuvans. Oba, Emunade i Xsolve ađuvansi su emulzije od svetlog mineralnog ulja u vodi, ali Emunade takođe sadrži alhidrogel i d,l-α-tokoferil acetat je deo XSolve ađuvansa. Sledeći primer pogodnog ađuvansa za upotrebu u kompozicijama prema pronalasku je ImpranFLEX™ ađuvans (voda-u-ulju ađuvans). Sledeći primer pogodnog ađuvansa je ađuvans na bazi karbomera (Carbopol®). Poželjni Carbopol® ađuvansi obuhvataju Carbopol® 934 polimer i Carbopol ®941 polimer.

[0098] U jednom primeru izvođenja, ađuvans ili ađuvantna smeša se dodaje u količini od oko 100 µg do oko 10 mg po dozi. U sledećem primeru izvođenja, ađuvans/ađuvantna smeša se dodaje u količini od oko 200 µg do oko 5 mg po dozi. U sledećem primeru izvođenja, ađuvans/ađuvantna smeša se dodaje u količini od oko 300 µg do oko 1 mg/dozi.

[0099] Ađuvans ili ađuvantna smeša je tipično prisutna u kompoziciji vakcine prema pronalasku u zapr./zapr. količinama od oko 1% do 25%, poželjno oko 2% do 15%, poželjnije oko 5% do 12% zapr./zapr.

[0100] Ostali "imunomodulatori" koji mogu biti uključeni u vakcinu obuhvataju, npr., jedan ili više interleukina, interferona ili drugih poznatih citokina. U jednom primeru izvođenja, ađuvans može biti derivat ciklodekstrina ili polianjonski polimer, kao što su oni opisani u SAD pat. br.6,165,995 i 6,610,310, respektivno.

[0101] Dodatni aspekt se odnosi na postupak za pripremu imunogene kompozicije prema predmetnom pronalasku. Ovaj postupak sadrži i) kultivisanje M.hyo u pogodnom medijumu tokom perioda u opsegu od 18-144 časova; ii) zatim inaktivaciju kulture M. hyo; iii) sakupljanje tečnosti inaktivirane kulture, pri čemu tečnost inaktivirane kulture sadrži rastvorljivu tečnu frakciju i nerastvorljivi ćelijski materijal; iv) odvajanje rastvorljive tečne frakcije od nerastvorljivog ćelijskog materijala pomoću centrifugiranja, filtracije ili taloženja; v) značajno uklanjanje IgG i imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina iz odvojene rastvorljive tečne frakcije da bi se formirao supernatant kulture M. hyo bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin; i vi) zatim kombinovanje supernatanta sa PCV2 antigenom.

[0102] Primer pogodnog medijuma za kultivisanje M.hyo je PPLO bujon (Mycoplasma bujon baza), koji kada je obogaćen hranljivim materijama, se koristi za izolaciju i kultivaciju Mycoplasma.

[0103] U nekim primerima izvođenja, kultura M.hyo je gajena do kasne log faze rasta, nakon čega je kultura inaktivirana. U nekim drugim primerima izvođenja, kultura je inaktivirana povišenjem pH (npr., do oko 7.8). Ovo se javlja izlaganjem produkcione kulture inaktivacionom agensu, kao što je binarni etilenimin (BEI). BEI je generisan in situ u toku inkubacije L-bromoetilamin hidrobromida (BEA) u proizvodnoj kulturi. Zatim, pH inaktivirane kulture je neutralizovana, kao što je dodavanjem ekvivalentne količine agensa koji neutralizuje inaktivacioni agens unutar rastvora. U nekim primerima izvođenja, inaktivacioni agens je BEI i neutralizacioni agens je natrijum tiosulfat. U jednom primeru izvođenja, pH inaktivirane kulture je podešena do oko 7.4 dodavanjem natrijum tiosulfata.

[0104] Rastvorljiva tečna frakcija preparata celih ćelija M.hyo je odvojena od nerastvorljivog ćelijskog materijala upotrebom uobičajenih postupaka. U jednom primeru izvođenja, ovo odvajanje je pomoću koraka filtracije. U sledećem primeru izvođenja, ovo odvajanje je pomoću koraka centrifugiranja. U sledećem primeru izvođenja, odvajanje je pomoću koraka taloženja.

[0105] U jednom primeru izvođenja, rastvorljiva tečna frakcija inaktiviranog, neutralizovanog preparata celih ćelija M.hyo je tretirana sa Protein A smolom da bi se značajno uklonili IgG i imunološki kompleksi antigena/imunoglobulina. U drugim primerima izvođenja, Protein G smola se može koristiti za značajno uklanjanje IgG i imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina sadržanih u rastvorljivoj tečnoj frakciji. Postupci za uklanjanje IgG i imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina sa Protein A ili Protein G smolama su dobro poznati u stanju tehnike.

[0106] Prema sledećem aspektu, postupak za pripremu multivalentne imunogene kompozicije prema predmetnom pronalasku sadrži pripremu rastvorljivog antigena M.hyo kao što je opisano u prethodnom tekstu i njegovo mešanje sa antigenom PCV2, pogodnim ađuvansom i jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Ovaj postupak izborno obuhvata dodavanje najmanje jednog dodatnog svinjskog antigena, kao što je, ali bez ograničenja na, antigen PRRS virusa kao što je opisan u prethodnom tekstu.

[0107] Dodatni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na komplet. "Komplet" označava više komponenti koje su grupisane zajedno. U jednom primeru izvođenja, komplet prema predmetnom pronalasku obuhvata prvu bocu (ili drugu pogodnu posudu) koja sadrži imunogenu kompoziciju. Ova imunogena kompozicija sadrži supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); i antigen svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2), pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala putem centrifugiranja, filtracije ili taloženja i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina. Izborno, komplet može dalje da sadrži uputstvo za upotrebu. Uputstvo za upotrebu obuhvata informacije za primenu imunogene kompozicije.

[0108] U nekim primerima izvođenja, kombinacija PCV2/M.hyo u prvoj boci kompleta obezbeđena je kao tečna kompozicija spremna za upotrebu. U drugim primerima izvođenja, komplet obuhvata drugu bocu koja sadrži antigen PRRS virusa. U nekim primerima izvođenja, antigen PRRS virusa je u obliku genetički modifikovanog, živog virusa koji je obezbeđen u liofilizovanom stanju. U takvim slučajevima, uputstva za upotrebu će obuhvatati uputstva za rehidrataciju PRRS virusne komponente sa tečnim sadržajem iz boce koja sadrži kombinaciju PCV2/M.hyo kombinaciju. Uputstva za upotrebu će takođe da obuhvataju informaciju za primenu rezultirajuće PCV2/M.hyo/PRRS trovalentne formulacije (formulacija).

[0109] U nekim primerima izvođenja, imunogena kompozicija prema ovom pronalasku je primenjena na svinje koje imaju antitela poreklom od majke protiv M.hyo. U drugim primerima izvođenja, imunogena kompozicija prema predmetnom pronalasku se primenjuje na svinje koje imaju antitela poreklom od majke protiv oba, M.hyo i PCV2.

[0110] U nekim primerima izvođenja, multivalentna imunogena kompozicija prema predmetnom pronalasku primenjuje se na prase starosti 3 nedelje ili starije. Međutim, razmatrano je da multivalentna kompozicija vakcine prema pronalasku takođe može biti korišćena za revakcinaciju neoprašenih krmača pre parenja. Kao što je poznato u stanju tehnike, neoprašena krmača je ženka svinje koja nikada nije bila bremenita. Vakcinisane neoprašene krmače će preneti antitela poreklom od majke na njihovu novorođenčad koji sisaju preko kolostruma.

[0111] Dalje je razmatrano da multivalentna vakcina prema pronalasku može biti korišćena za godišnju revakcinaciju uzgajanog stada. Poželjno, multivalentna vakcina prema predmetnom pronalasku se primenjuje na svinje (npr., prasiće ili neoprašene krmače) u jednoj dozi. U jednom primeru izvođenja, multivalentna vakcina prema predmetnom pronalasku ne zahteva mešanje posebnih monovalentnih vakcina pre primene, tj., obezbeđena je kao PCV2/M.hyo formulacija koja je spremna za upotrebu i koja je sadržana u jednoj boci. U sledećem primeru izvođenja, multivalentna formulacija zahteva mešanje dvovalentne vakcine prema predmetnom pronalasku sadržane u prvoj boci sa monovalentnom vakcinom sadržanom u drugoj boci. U jednom primeru izvođenja, monovalentna vakcina sadržana u drugoj boci obuhvata antigen PRRS virusa. Izborno, dodatni antigeni mogu biti dodati u bilo koju od ovih boca.

[0112] U nekim primerima izvođenja, početak imuniteta je od 2-3 nedelje posle vakcinacije sa multivalentnom kompozicijom vakcine prema predmetnom pronalasku. U drugim primerima izvođenja, trajanje imuniteta je oko 17-23 nedelja posle vakcinacije sa multivalentnom kompozicijom vakcine prema predmetnom pronalasku.

[0113] Sledeći primeri navode poželjne materijale i postupke u skladu sa predmetnim pronalaskom. Međutim, trebalo bi razumeti da su ovi primeri dati samo radi ilustracije, i ništa u njima ne bi trebalo smatrati ograničenjem ukupnog obima pronalaska.

Primeri

Primer 1: Postupci za proizvodnju Mycoplasma hyopneumoniae za antigen M. Hyo koji se može kombinovati sa PCV2

Fermentacija i inaktivacija M.hyo

[0114] Medijum za zasejavanje i proizvodnju antigena je pripremljen na sledeći način. Buljon izveden iz svinjskog srca sa organizmnom sličnim izazivaču pleuropneumonije (PPLO) (BD Biosciences kataloški br. 21498) je pripremljen prema uputstvima proizvođača (tj., 21g/L) i rastvor kvaščevog ekstrakta je pripremljen na 21g/L u USP. Rastvor kvaščevog ekstrakta je zatim dodat u PPLO na 6.25% i smeša je sterilizovana zagrevanjem do 121°C u trajanju od ≥ 30 minuta. Cistein hidrohlorid je pripremljen na 90g/L i sterilizovan filtriranjem. Rastvor dekstroze je pripremljen dodavanjem 450 g dekstroze po litru USP vode, nakon čega sledi toplotna sterilizacija. Da bi se pripremio finalni medijum, svinjski serum je dodat u bazni medijum na 10%, a zatim i cistein na 0.01% i dekstroza na 1.0%. Medijum je inokulisan sa 10% zapr.:zapr. log faze kulture M. hyopeumoniae (soj P5722-3). Kultura je održavana na 37°C i pH i dO su održavani na 7.0 i 25%, respektivno. Prilikom kasne log faze rasta, kultura je inaktivirana pomoću binarnog etilenimina (BEI), jedinjenja aziridina, proizvedena od 2-bromoetilamin hidrobromida. Specifično, inaktivacija se javila povećanjem pH do 7.8 dodavanjem 2-bromoetilaminhidrobromida (BEA) do finalne koncentracije od 4 mM i inkubacijom u trajanju od 24 časa. BEI je neutralizovan dodavanjem natrijum tiosulfata na 1:1 molarnom odnosu, što je praćeno sa dodatnih 24 časa inkubacije. Tečnost inaktivirane kulture je održavana na 2-8°C do dalje obrade.

Primer 2: Postupci proizvodnje himernog svinjskog cirkovirusa (cPCV)1-2

[0115] cPCV1-2 je konstruisan kloniranjem imunogenog kapsid gena patogenog svinjskog cirkovirusa tipa 2 (PCV2) u genomsku osnovu nepatogenog svinjskog cirkovirusa tipa 1 (PCV1). Postupak za konstrukciju himernog DNK klona je opisan, na primer, u SAD patentu br. 7,279,166, koji je ovde obuhvaćen preko reference u celini. Infektivni stok himernog virusa je dobijen iz Dr. X. J. Meng, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, i korišćen je za infekciju ćelija (PK)-15 bubrega svinje gajenih u minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) dopunjenom sa 0.05% laktalbumin hidrolizatom (LAH), 30 µg/mL gentamicin sulfatom i 5% fetusnim goveđim serumom. Rezultujuće cPCV1-2 inficirane PK-15 ćelije su dalje proširene serijskim pasažiranjem još četiri puta upotrebom istog medijuma za rast osim što je sa 2-3% fetusnog goveđeg seruma. Peti pasaž je zamrznut, odmrznut i filtriran, i rezultujući lizati su korišćeni za pripremu premaster klice i kasnije master klice.

[0116] Medijum koji je korišćen za proizvodnju virusne klice je bio isti kao onaj koji je korišćen u proizvodnji virusnog stoka. Za medijum za rast, MEM, OptiMEM, ili ekvivalent je bazalni medijum koji može biti korišćen za zasejavanje PK-15 ćelijske linije za rast. Medijum za rast može biti dopunjen sa do 10% goveđeg seruma, do 0.5% laktalbumin hidrolizata, do 0.5% goveđeg serum albumina i do 30 µg/mL gentamicina. Za medijum za umnožavanje virusa, korišćen je MEM, OptiMEM ili ekvivalent. Medijum za umnožavanje virusa može biti dopunjen sa do 0.5% laktalbumin hidrolizata, do 2% goveđeg seruma, do 0.5% goveđeg serum albumina i do 30 µg/mL gentamicina. Do 5 g/L glukoze i do 5 mmol/L L-glutamina može biti dodato u medijum za rast i/ili medijum za umnožavanje virusa kao što je potrebno za održavanje ćelija.

[0117] cPCV1-2 master virus za zasejavanje je dodat u ćelijsku suspenziju PK-15 ćelija i adsorpbovano u trajanju do 3 časa. Virus za zasejavanje je razblažen u bazalnom medijumu za rast da bi se obezbedio multiplicitet infekcije (MOI) od 0.1 - 0.0001.

[0118] Kulture PK-15 ćelija su početno inokulisane radnim virusom za zasejavanje u vreme zasejavanja ćelija, ili kada su ćelije dostigle približno 20% do 50% konfluencu. Ovaj početni pasaž može biti označen kao "postupak infekcije od jednog koraka" za proizvodnju stoka antigena, ili može biti dalje korišćen za serijske pasaže. Za serijske pasaže, PK-15 ćečije inficirane sa cPCV1-2 su dalje proširene do pasaža 7 pomoću serijskih deoba na odnosu od 1:5-20 za umnožavanje virusa. Medijum kulture koji sadrži suspenziju inficiranih ćelija iz prethodnog pasaža služi kao materijal za zasejavanje za sledeći pasaž. Ćelije inficirane sa cPCV1-2 su inkubirane tri (3) do 14 dana za svaki pasaž na 36 ± 2°C kada su ćelije dostigle ≥ 90% konfluencu. cPCV1-2 virus izaziva primetne citopatske promene u toku virusne replikacije. Prilikom sakupljanja, zabeleženo je da ćelije dobijaju okrugao oblik i zabeležen je i značajni plutajući ostaci. Kulture su takođe posmatrane za vizuelni dokaz bakterijske ili gljivične kontaminacije. Vreme inkubacije između sakupljanja za antigen cPCV je dat u Tabeli 1 u daljem tekstu:

Tabela 1 Minimalna i maksimalna vremena za sakupljanje cPCV antigena Minimalno/

Postupak Opseg temperatura Maksimalno vreme

Infekcija od jednog koraka 5 do 16 dana 36 ± 2°C

Serijski pasaž (MSV 3 do

16 do 36 dana 36 ± 2°C

MSV 7)

[0119] Tečnosti kultura cPCV1-2 su sakupljene u sterilne posude i uzorkovane su za testiranje na mikoplazmu upotrebom poznatih metoda. Višestruka sakupljanja mogu biti izvedena iz roler boca, bioreaktora i perfuzionih posuda.

[0120] Pre inaktivacije sakupljenog cPCV1-2 virusa, jedan ili više serija antigena mogu biti koncentrovane (npr., do 60X) ultrafiltracijom. Koncentrati mogu biti isprani ravnotežnim rastvorom soli da bi se redukovali proteini seruma.

[0121] Sada će biti opisan postupak inaktivacije, atenuacije ili detoksifikacije cPCV1-2 virusa. Posle koncentrovanja antigena cPCV, Beta-propiolakton (BPL) je dodat u pulovani cPCV1-2 virusni materijal da bi se dobila približna koncentracija od 0.2% zapr./zapr. Pulovane virusne tečnosti su zatim mešane u trajanju od minimalno 15 minuta i zatim inaktivirajuća masa tečnosti antigena je prebačena u drugu sterilnu posudu. Prebačene tečnosti antigena su održavane na 2 - 7°C, uz konstantno mešanje, tokom minimalno 24 časa. Posle minimalno 24 časa, izvedeno je drugo dodavanje 0.2% zapr./zapr. BPL u pulovanu suspenziju. Sadržaji su zatim mešani, prebačeni u treću posudu i održavani na 2 - 7°C, uz konstantno mešanje, tokom dodatnog vremena od ne manje od 84 časa. Uopšteno, ukupno vrme inaktivacije nije manje od 108 časova i nije veće od 120 časova. Postupak inaktivacije je rezimiran u Tabeli 2 u daljem tektu.

Tabela 2 Postupak inaktivacije

Inaktivant Finalna koncentracija Temp. opseg Vreme-časovi (Min/maks.) 0.4% zapr./zapr. (2 x

Beta-propiolakton 0.2%zapr./zapr. 2-7°C

(BPL) dodavanja) (w/mešanje) 108-120

[0122] Inaktivacija je završena dodavanjem finalne koncentracije od ne više od 0.1 M rastvora natrijum tiosulfata. pH stoka inaktiviranog antigena je podešena do oko 6.8 upotrebom NaOH ili HCl. Posle inaktivacije, reprezentativni uzorak je uzet iz pula i testiran za završetak inaktivacije. Inaktivirani proizvod cPCV1-2 antigena je standardizovan za ispunjavanje od više od 1.0 RP kao što je mereno preko ELISA potencije.

Primer 3: Nishodna obrada antigena M. hyo i analitičko testiranje ovih obrađenih antigena

Nishodna obrada antigena M.hyo:

[0123] Inaktivirana fermentaciona tečnost (pripremljena kao što je opisano u prethodnom tekstu u Primeru 1) tretirana je za svaku naznačenu grupu kao što sledi. Ovi obrađeni antigeni M.hyo su korišćeni u Primeru 4 u daljem tekstu.

[0124] T02: (cela masa) nije obrađena.

T03: (10X UF koncentrovan) Koncentrovan preko tangencijalne protočne filtracije preko granične membrane od 100 KDa molekulske mase (šuplje vlakno). Redukcija finalne zapremine bila je jednaka 10X.

T04 & T05: (10X UF koncentrovan & centrifugiran) Koncentrovane ćelije mikoplazme (iz T03) su sakupljene i isprane jednom sa PBS preko centrifugiranja na ~20,000xg (Sorvall model RC5B).

T06 & T07: (10X centrifugiran) Inaktivirana fermentaciona tečnost je centrifugirana na ~20,000xg (Sorvall RC5B) i isprana jednom resuspendovanjem ćelija u PBS, što je praćeno dodatnim centrifugiranjem. Redukcija finalne zapremine bila je jednaka 10X.

T08: (10X centrifugiran & zagrevan) Ćelije mikoplazme su koncentrovane i isprane prema T06 i zagrevane do 65°C u trajanju od 10 minuta.

T09: (Supernatant bez ćelija) Supernatant sakupljen iz prvog centrifugiranja kao što je opisano za T06 je filterski sterilizovan kroz 0.2 mikronski filter (Nalgene).

T10: (Supernatant bez ćelija tretiran Proteinom-A) Sterilni supernatant (pripremljen prema T09) je mešan sa Protein A smolom (Protein A Sepharose, Pharmacia Inc) na 10:1 odnosu zapremina u trajanju od 4 časa. Smola je uklonjena sterilnom filtracijom i filtrirana tečnost je čuvana na 2-8°C. Ovaj postupak koristi post-fermentacioni "nishodni" tretman proteinom A za uklanjanje antitela i imunoloških kompleksa. Iako predmetni pronalazak ne isključuje ushodni tretman proteinom A, pronalazači predmetnog pronalaska su našli da je u slučaju M.hyo, ushodan tretman proteinom A medijuma za rast doveo do p46 rezultata koji su bili niži i nedosledni u poređenju sa netretiranim medijumima (podaci nisu prikazani).

Analitičko testiranje nishodno obrađenih antigena M.hyo

[0125] Nishodno obrađeni preparati antigena M.hyo (pripremljeni kao što je opisano u prethodnom tekstu) su testirani za izolaciju M.hyo specifičnog p46 antigena, i prisustvo PCV2 antitela. Pored toga, ovi preparati antigena M.hyo su testirani za prisustvo Torque Teno Virusa (TTV), uključujući genotip 1 (g1TTV) i genotip 2 (g2TTV). Rezultati su predstavljeni u daljem tekstu u Tabeli 3.

Tabela 3 karakterizacija nishodno obrađenih antigena M.hyo

Masa PCV2

qPCR DNK

M.Hyo ab

p46 S/P

g1TTV g2TTV

Tretman RU/mL ratio

Cela masa 809 0.248 1.00E+03 1.78E+03 10x UF koncentr. 6666 0.819 1.00E+03 9.94E+03 10x UF konc.

614 0.019 0 0

centrifuga

10x centrifugiran 763 -0.015 1.90E+02 1.91E+02 10x centrifugiran

690 -0.012 0 2.07E+02 zagrevan

Supernatant bez

719 0.242 4.20E+02 3.23E+03

ćelija

Supernatant bez

826 -0.014 0 2.06E+03

ćelija (Prot A)

[0126] U vezi sa Tabelom 3 u prethodnom tekstu, izolacija M.hyo-specifičnog p46 antigena je pokazana za svaki od nishodno obrađenih preparata antigena M.hyo. Pored toga, sledeći tretmani su uspešno uklonili PCV2 antitelo: 10X UF koncentrovan & centrifugiran, 10x centrifugiran, 10X centrifugiran & zagrevan i supernatant bez ćelija (tretiran Proteinom-A). U vezi sa TTV, sledeći tretmani su uspešno uklonili g1TTV: 10X UF koncentrovan & centrifugiran, 10x centrifugiran & zagrevan i supernatant bez ćelija (tretiran Proteinom-A). Samo tretman označen sa 10X UF koncentrovan & centrifugiran je uklonio g2TTV. Izolati Torque teno virusa, uključujući genotipove 1 i 2 su opisani u US20110150913, koji je obuhvaćen ovde preko reference u njegovoj celini.

[0127] S obzirom da je u stanju tehnike poznato da Protein A vezuje IgG, stručnjaci iz date oblasti tehnike razumeju da će ne samo PCV2 antitelo, već i druga svinjska antitela, uključujući PRRS antitelo, HPS antitelo i SIV antitelo biti efikasno uklonjena pomoću tretmana Proteinom-A. Ovo čini supernatant M.hyo bez ćelija tretiran Proteinom A prema pronalasku kompatibilnim ne samo sa antigenom PCV2, već takođe sa drugim svinjskim antigenima zbog nedostatka imunološke interference između antigena. Dodatno, uklanjanje nezaštitnih ćelijskih ostataka i uklanjanje imunoglobulina i kompleksa antigena/imunoglobulina racionalno se očekuje da učini vakcine bezbednijim.

Primer 4: Priprema eksperimentalnih formulacija vakcine M.hyo

[0128] Sve eksperimentalne vakcine M.hyo su formulisane sa finalnom koncentracijom 5% Amfigen ađuvansa. Pored toga, sve vakcine su standardizovane sa p46 ELISA i konzervisane sa timerosolom. Eksperimentalne formulacije vakcine su pripremljene sa antigenima M.hyo obrađenim prema tretmanima T02-T10 iz prethodnog teksta. Pored toga, tretman T01 je odgovarao placebu (bez antigena M.hyo, samo 5% amfigen ađuvans), dok je tretman T11 pozitivna kontrola koja odgovara istekloj vakcini M.hyo na bazi bakterina (RespiSure-ONE®, Pfizer Animal Health). Ove formulacije su opisane u Tabeli 4 u daljem tekstu.

Tabela 4 Eksperimentalne formulacije vakcine M.hyo

Zapremina Ciljne p46 M. Hyo Ađuvans

IVP formulacije jedinice/ds antigen (mL) (mL)

Tretman Serijski* (mL)

T01<123639>Samo 5% amfigen only, bez antigena

(Placebo)

T02 L100211A 452 279.36 250 1000

T03 L100211B 452 6.78 50 200

T04 L100211C 452 73.62 50 200

T05 L100211D 816 132.90 50 200

T06 L100211E 452 59.24 50 200

T07 L100211F 816 106.95 50 200

T08 L100211G 452 65.51 50 200

T09 L100211H 452 62.87 50 200

T10 L100211J 452 54.72 50 200

T11 A827870 Istekla "RespiSure" vakcina

*serijski ispitivani veterinarski proizvod (IVP)

Primer 5: Procena in vivo efikasnosti vakcina M.hyo sa antigenima M.hyo iz različitih nishodnih postupaka

[0129] Ova studija je izvedena za procenu in vivo efikasnosti vakcina Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) sa antigenima M hyo iz različitih nishodnih postupaka (DSP). Svinje starosti 3 neelje su intramuskularno inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcine opisanih u Tabeli 4 u prethodnom tekstu. Šesnaest životinja je uključeno u svaku od grupa tretmana. Životinje su veštački inficirane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim M.hyo poljskim izolatom. Izvršena je autopsija životinja 28 dana posle veštačke infekcije i pluća su uklonjena i ocenjivana za konsolidaciju u skladu sa infekcijom M.hyo. Primarni kriterijum za zaštitu protiv veštačke infekcije sa M.hyo bile su ocene konsolidacije pluća. Generlano je prihvaćeno da postoji veza između veličine plućnih lezija uzrokovanih enzootičkom pneumonijom i štetnog efekta na stopu rasta. Tabela 5 u daljem tekstu sadrži ocene lezija pluća za odgovarajuće grupe tretmana. Statistička značajnost je određena pomoću analize mešanog modela ocene pluća za svaku grupu.

Tabela 5 Rezultati lezije pluća

p46 RP % lezija pluća Opseg %

pciljni/ koje su pluća sa Kontrast Značajnost vrednost Tretman Opis zabeleženi povratno lezijama

transformisane

LS srednje

vrednosti

Placebo (5%

T01 amfigen) N/A 11.7 1.2 -44.3 N/A N/A N/A T02 Cela masa 13/15.6 1.2 0.1 -18.5 T01 vs 02 0 Da Cela masa UF

Da T03 10x 13/11.9 0.3 0.0 -2.8 T01 vs 03 0

UF 10x

Da T04 centrifugiran 13/28.1 5.9 0.0 -40.5 T01 vs 04 0.1589

UF 10x T01 vs

Da T05 centrifugiran 24/48.2 3.7 0.0 -42.3 T05 0.0309

10x

Da T06 centrifugiran 13/30.4 4.7 0.0 -23.6 T01 vs 06 0.0388

10x T01 vs

Da T07 centrifugiran 24/57.4 4.6 0.3 -37.3 T07 0.0323

10x

centrifugiran T01 vs Da T08 Hzagrevanje 13/17.7 4.5 0.3 -21.7 T08 0.0137

Supernatant T01 vs

Da T09 (bez ćelija) 13/14.1 1.4 0.0 -33.0 T09 0.0004

Supernatant T01 vs

Da T10 Prot A 13/12.1 3.1 0.0 -25.8 T10 0.0094

T01 vs

Da T11 Istekao RSO 13/12.5 2.2 0.1 -32.1 T11 0.0009

[0130] U vezi sa Tabelom 5 u daljem tekstu, rezultati sa antigenima M.hyo iz različitih nishodnih postupaka ukazuju na to da su se sve eksperimentalne vakcine osim T04 značajno razlikovale od placeba. Ovi rezultati lezija M.hyo su prikazani grafički na slici 1. Kao što je prikazano na slici 1, T04 je dao neprihvatljive rezultate. Svi drugi tretmani su se značajno razlikovali od placeba (T01). Ocene konsolidacije pluća pokazale su da su T02, T03 i T09-T11 dali najefikasniju zaštitu protiv veštačke infekcije sa M.hyo.

[0131] p46 relativna potencija eksperimentalnih vakcina procenjivana je upotrebom sendvič imunoenzimski test (DAS ELISA). Rezultati p46 DAS ELISA predstavljeni u Tabeli 5 u prethodnom tekstu pokazuju da su sve eksperimentalne vakcine prevazišle ciljnu potenciju. Pored toga, p46 relativna potencija je bila održavana ili povećana u toku čuvanja vakcina tokom perioda od jednog meseca (podaci nisu prikazani). Opaženo povećanje u potenciji tokom vremena zabeleženo je kod centrifugiranih antigena sa izuzetkom onih antigena koji su bili podvrgnuti zagrevanju. Bez želje da se vežemo za bilo koju teoriju, verovatno je da se ćelijski "ostaci" razlažu tokom vremena i oslobađaju još p46 antigena vezanog za membranu u slučaju centrifugiranih antigena.

Primer 6: Procena kompatibilnosti eksperimentalnih vakcina M.hyo sa antigenom PCV2

[0132] Ova studija je izvedena za procenu kompatibilnosti eksperimentalnih vakcina M.hyo sa antigenima M hyo iz različitih nishodnih postupaka sa antigenom PCV2. Eksperimentalne formulacije vakcine M.hyo su opisane u Tabelama 4 i 5 u prethodnom tekstu. Zabeležene p46 relativne potencije za ove vakcine su opisane u Tabeli 5 u prethodnom tekstu. Ove eksperimentalne vakcine M.hyo su svaka kombinovane sa antigenom PCV2. U ovom primeru, antigen PCV2 je ubijen PCV tip 1-tip 2 himerni virus (Fostera PCV) pripremljen kao što je opisano u prethodnom tekstu u Primeru 2. Himerni virus je uključen u kompozicije na početnom nivou od oko 1.6 ≤ RP, pri čemu RP je jedinica relativne potencije određena pomoću kvantitativnog određivanja antigena ELISA PCV2 (in vitro test potencije) u poređenju sa efikasnom referentnom vakcinom.

[0133] Eksperimentalne kombinovane formulacije M.hyo/PCV2 su procenjivane pomoću ELISA PCV2. Rezultati su predstavljeni na Slici 2. Kao što je prikazano na Slici 2, samo preparati antigena M.hyo iz sledećih nishodnih postupaka su bili kompatibilni sa antigenom PCV2: ultrafiltracija & centrifugiranje (T04 & T05), centrifugiranje (T06 & T07), centrifugiranje plus zagrevanje (T08) i supernatant tretiran Proteinom A (T10). Od njih, supernatant M.hyo tretiran Proteinom A je bio najkompatibilniji sa antigenom PCV2 u poređenju sa placebo kontrolom koja je obuhvatala himerni virus i Amfigen ađuvans, ali ne antigen M.hyo. Nivo himernog PCV virusa u supernatantu tretiranom Proteinom-A bio je 1.5 RP u poređenju sa 1.69 RP za placebo. Prema tome, zaključeno je da ne postoji ili postoji minimalna imunološka interferenca između rastvorljivog preparata antigena M.hyo tretiranog Proteinom A i antigena PCV2 himernog virusa.

[0134] In vivo efikasnost supernatanta M.hyo tretiranog Proteinom A pokazana u Primeru 5 u prethodnom tekstu zajedno sa rezultatima opisanim u predmetnom primeru pokazala je da je supernatant tretiran Proteinom-A bio potencijalno efikasna platforma za M.hyo-PCV2 kombinacije.

Primer 7: Procena efikasnosti PCV2 1-boce PCV2/M.hyo kombinovane vakcine u različitim formulacijama ađuvansa

[0135] Ova studija je dizajnirana za procenu efikasnosti PCV2 u 1-boci PCV2/M.hyo kombinovane vakcine u različitim formulacijama ađuvansa. U ovom primeru, antigen PCV2 je ubijeni PCV tip 1-tip 2 himerni virus (Fostera PCV). Himerni virus je kombinovan sa rastvorljivim preparatom antigena M.hyo koji je značajno bez IgG (tj., supernatant tretiran Proteinom A).

Obrada tečnosti:

[0136] Inaktivirana fermentaciona tečnost Inactivated M.hyo (opisana u prethodnom tesktu u Primeru 1) tretirana je za svaku naznačenu grupu kao što sledi.

[0137] T02-T04: Cela fermentaciona tečnost koja sadrži žive ćelije M. hyopneumoniae (opisana u prethodnom tekstu) je centrifugirana na ~20,000xg (Sorvall RC5B) i supernatant je sakupljen i sterilizovan kroz 0.2 µM filter. rProtein A Sepharose (deo broj 17-5199-03, GE Healthcare) je pakovan u 1L hromatografsku kolonu. Posle ukalnjanja pufera za skladištenje i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćente kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone od 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.04. Približno 2 litara razbistrenih/filtriranih tečnosti koje sadrže antigen M. hyopneumoniae je pasažirano kroz Protein A smolu na stopi protoka od 100 cm/čas. Protok je sakupljen i sterilizovan preko 0.2 µM filter.

[0138] T05: Ovo je pozitivna kontrola koja odgovara Fostera PCV-sličnoj formulaciji (bez antigena M.hyo). Nivo himernog virusa u ovoj Fostera PCV-sličnoj formulaciji je bio približno na nivoima formulacije minimalne imunizujuće doze (MID). Himerni virus je uključen u eksperimentalne vakcine PCV2/M.hyo na sličnim nivoima formulacije.

[0139] Sve eksperimentalne vakcine PCV2/M.hyo su formulisane sa različitim formulacijama ađuvansa. Eksperimentalne formulacije vakcine su pripremljene sa antigenima M.hyo obrađenim prema tretmanima T02-T04 iz prethodnog teksta. Pored toga, tretman T01 je odgovarao placebu (sterilni fiziološki rastvor).

[0140] Sve vakcine su standardizovane sa p46 ELISA i konzervisane sa timerosolom. Ove eksperimentalne formualcije su opisane u Tabeli 6 u daljem tekstu, gde simbol * označava antigen M. hyo iz globalnog supernatanta globalne M hyo klice tretirane Proteinom A i simbol ** označava serijski ispitivan veterinarski proizvod (IVP).

Tabela 6 eksperimentalne formulacije vakcine PCV2/M.hyo korišćene za studiju efikasnosti PCV2

Tretman IVP Serijski** PCV1-2 M Hyo*

Ag Ag Ađuvans Ostalo NA Sterilni T01 87-244-DK fiziološki (Placebo) rastvor T02 L0411RK08 10% SP ulje

T03 L0411RK09<7.5 RP>5% amfigen

1.6 RP NA T04 L0611RK03 5% amfigen 5%

SLCD

T05 L0611RK04 NA 20% SLCD

[0141] Svinje starosti 3 nedelje su intramuskularno inokulisane sa jednom dozom različitih formulacija vakcine opisanih u Tabeli 6 u prethodnom tekstu. Šesnaest životinja je uključeno u svaku od grupa tretmana. Životinje su veštački inficirane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim PCV2 poljskim izolatom.

[0142] Slika 3 je grafikon koji prikazuje rezultate viremije PCV2 (PCV2 Quantitative PCR) zabeležene sa različitim platmofrmama ađuvansa. Zabeleženo je da je viremija PCV2 korišćena kao primarna promenljiva efikasnosti. Rezultati viremije PCV2 su predstavljeni kao kopije DNK/ml. Kao što je prikazano na Slici 3, svi tretmani su imali značajno manju viremiju u poređenju sa placebom na dane 28, 35 i 42 (veštačka infekcija je izvedena na dan 21). 10% ađuvans SP-ulje je imao značajno nižu viremiju u poređenju sa 5% amfigenom na dane 28 i 35. 5% Amfigen plus 5% SLCD ađuvans je imao značajno nižu viremiju u poređenju sa 5% amfigenom na dane 28 i 35. 20% SLCD platforma ađuvansa imala je značajno nižu viremiju u poređenju sa 5% amfigenom na dane 28, 35 i 42.

[0143] Serologija PCV2, fekalno praženjenje PCV2, nazalno praženjenje PCV2, ćelijski posredovani imuni (CMI) odgovori, limfoidna deplecija i imunohistohemija (IHC) su takođe praćeni kao sekundarne promenljive efikasnosti. Ovi rezultati će sada biti opisani u daljem tekstu.

[0144] Slika 4 je grafikon koji prikazuje rezultate ELISA PCV2 na dane 1, 20 i 42 studije (veštačka infekcija je izvedena na dan 21). Status svakog uzorka je izražen kao uzorak prema pozitivnom odnosu (S/P). Kao što je prikazano na slici 4, 20% SLCD je bio jedini tretman koji se značajno razlikovao od placeba (T01) na dan 20 i dan 42. Takođe, 5% amfigen je bio jedini tretman koji se nije značajno razlikovao od placeba na dan 20.

[0145] Slika 5 je grafikon koji prikazuje fekalno praženjenje PCV2 dobijeno sa T02-T04 tretmanima naspram placeba (T01). Ovi rezultati su izraženi kao kopije DNK PCV2/ml. Rezultati na Slici 5 pokazuju da su svi tretmani imali značajno manje fekalno pražnjenje u poređenju sa placebom na dan 42. Pored toga, 5% amfigen & 5% SLCD (T04) imao je značajne manje fekalno pražnjenje u poređenju sa 5% amfigenom (T03) na dan 42. Nisu zabeležene druge razlike tretmana.

[0146] Slika 6 je grafikon koji prikazuje nazalno praženjenje PCV2 dobijeno sa T02-T04 tretmanima naspram placeba (T01). Ovi rezultati su izraženi kao kopije DNK PCV2/ml. Rezultati na slici 6 pokazuju da su svi tretmani imali značajno manje nazalno pražnjenje u poređenju sa placebom na dan 42. Pored toga, 20% SLCD (T05) je imao značajno manje nazalno praženjenje u poređenju sa 5% amfigenom (T03) na dan 42. Nisu zabeležene druge razlike tretmana.

[0147] Slika 7 (A & B) predstavlja dva grafikona koji prikazuju rezultate testa interferonagama (IFN-γ) koji meri PCV2-specifične ćelijski posredovane imune (CMI) odgovore. CMI rezultati su prikazani posle vakcinacije/pre veštačke infekcije (slika 7A), i posle vakcinacije/posle veštačke infekcije (Slika 7B). U ovim grafikonima, stimulacija 5 x 10<6>ćelija smatra se značajnom (...). Sve eksperimentalne vakcine PCV2/M.hyo dale su detektabilan IFN-γ odgovor posle vakcinacije. 10% SP-ulje (T02) dalo je najjači IFN-γ odgovor posle vakcinacije. 20% SLCD (T05) je indukovao raniji odgovor, ali najniži odgovor na dan 20. Postojao je visok odgovor posle veštačke infekcije, naročito zabeležen u placebo grupi. Pored toga, odgovor posle veštačke infekcije je bio niži u grupama tretmana vakcinisanih svinja u poređenju sa placebo grupom.

[0148] Tabela 7 u daljem tekstu pokazuje limfoidnu depleciju dobijenu sa eksperimentalnim tretmanima naspram placeba.

Tabela 7 Histopatologija PCV2 (limfoidna deplecija)

Limfoidna deplecija Naspram placeba

%

P-Tretman Poziotivna Negativna ikad Značajnost vrednost

poz.

Placebo 9 7 56% NA NA

10% SP-ulje 1 15 6% 0.0059 Da

5% Amfigen 1 15 6% 0.0059 Da

5%

Amf+5% 0 16 0% 0.0008 Da

SLCD

20% SLCD 1 15 6% 0.0059 Da

[0149] Rezultati predstavljeni u Tabeli 7 u prethodnom tekstu pokazuju da su sve vakcine dale jaku zaštitu protiv limfoidne deplecije. Takođe, nisu zabeleženi statistički značajne razlike između tretmana vakcine. Tabela 8 u daljem tekstu prikazuje imunohistohemiju dobijenu sa eksperimentalnim tretmanima naspram placeba.

Tabela 8 Histopatologija PCV2 (Imunohistohemija)

Imunohistohemija Naspram placeba

%

P-Tretman Poziotivna Negativna ikad Značajnost

vrednost

poz.

Placebo 12 4 75% NA NA

10% SP-ulje 0 16 0% 0.0001 Da

5% amfigen 1 15 6% 0.0002 Da

5%

Amf+5% 0 16 0% 0.0001 Da

SLCD

20% SLCD 0 16 6% 0.0001 Da

[0150] Rezultati predstavljeni u Tabeli 8 u prethodnom tekstu pokazuju da su sve vakcine dale snažnu zaštitu protiv kolonizacije PCV2 kao što je dokazano pomoću imunohistohemije. Takođe, nisu zabeleženi statistički značajni kontrasti tretmana vakcine.

[0151] U zaključku, rezultati predstavljeni u ovom primeru pokazuju da rastvorljivi preparat antigena M.hyo ne utiče na efikasnost PCV2. Rezultati takođe pokazuju da sve eksperimentalne formulacije vakcine PCV/M.hyo daju efikasnost protiv veštačke infekcije sa PCV2. Pored toga, rezultati pokazuju da postoje izvesne statičke i brojčane razlike dobijene sa različitim formulacijama ađuvansa, pri čemu 10% SP-ulje proizvodi najveću efikasnost.

Primer 8: Procena efikasnosti M.hyo 1-boce kombinovane vakcine PCV2/M.hyo sa različitim formulacijama ađuvansa

[0152] Ova studija je dizajnirana za procenu efikasnosti M.hyo 1-boce kombinovane vakcine PCV2/M.hyo sa različitim formulacijama ađuvansa. Antigen M.hyo je kombinovan sa svinjskim cirkovirusom (tip 1-tip 2 himera, ili PCV1-2, ubijeni virus) u jednoj boci.

Obrada tečnosti:

[0153] Inaktivirana fermentaciona tečnost M.hyo (opisana u prethodnom tekstu u Primeru 1) je tretirana za svaku naznačenu grupu kao što sledi.

[0154] T02-T04: Ovi tretmani su bili isti kao oni opisani za grupe tretmana T02-T04 u Primeru 7 u prethodnom tekstu.

T05: Ovo je formulisano sa inaktiviranim ćelijama M.hyo (M.hyo bakterin) kao što je opisano u Primeru 1 u prethodnom tekstu pod naslovom "Fermentacija i inaktivacija".

[0155] Sve eksperimentalne vakcine PCV2/M.hyo su formulisane sa različitim formulacijama ađuvansa. Eksperimentalne formulacije vakcine su pripremljene sa antigenima M.hyo obrađenim prema tretmanima T02-T04. Pored toga, tretman T01 odgovara placebu (sterilni fiziološki rastvor). Tretman T05 je pozitivna kontrola koja odgovara istekloj RespiSure® vakcini, koja je vakcina na bazi M.hyo bakterina (Pfizer Animal Health).

[0156] Ove eksperimentalne formulacije su opisane u Tabeli 9 u daljem tekstu, pri čemu simbol * označava antigen M hyo iz supernatanta globalne M hyo klice, tretirane Proteinom A i simbol ** označava serijski ispitivani veterinarski proizvod (IVP).

Tabela 9 Eksperimentalne formulacije vakcine PCV2/M.hyo korišćene za studiju efikasnosti M.hyo kod različitih formulacija ađuvanta

PCV1-2 M Hyo*

Tretman IVP Serijski** Ađuvans Ostalo Ag Ag

NA Sterilni T01 87-244-DK

(Placebo) fiziološki rastvor T02 L0411RK08 10% SP Oil

T03 L0411RK09 1.6 RP 7.5 RP 5% Amfigen NA 5% Amfigen

T04 L0611RK03

5% SLCD

T05 A827870 Istekla "RespiSure" vakcina

[0157] Svinje starosti 3 nedelje su intramuskularno inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcine opisanih u Tabeli 9 u prethodnom tekstu. Četrnaest životinja je uključeno u grupe koje su primale placebo i 10% SP-ulje, trinaest životinja je uključeno u pozitivnu kontrolnu grupu i šesnaest životinja je uključeno u obe, grupu koja je primala 5% amfigen i 5% amfigen 5% SLCD.

[0158] Životinje su veštački inficirane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim M.hyo poljskim izolatom. Izvršena je autopsija životinja 28 dana posle veštačke infekcije i pluća su uklonjena i ocenjivana za konsolidaciju u skladu sa infekcijom M.hyo. Tabela 10 u daljem tekstu sadrži ocene lezije pluća za odgovarajuće grupe tretmana. Statistička značajnost je određivana pomoću analize mešanog modela ocena pluća za svaku grupu.

Tabela 10 Lezije pluća M.hyo

LS srednja

# Opseg % lezije Tretman vrednost lezije

životinja pluća

pluća

Placebo (T01) 14 13.1% 0.1 -50.5

10% SP-ulje (T02) 14 4.3% 0.0 -50.8

5% Amfigen (T03) 16 4.7% 0.0 -38.5

5% Amf+5% SLCD

16 12.0% 0.1 -55.8

(T04)

Istekao RSO (T05) 13 2.28% 0.0 -34.5

[0159] Kao što je naznačeno u Tabeli 10 u prethodnom tekstu, placebo grupa je imala srednju ocenu lezije pluća od 13.1%, u poređenju sa grupama koje su primale 10% SP-ulje i 5% amfigen koje su imale srednje ocene pluća od 4.3% i 4.7%, respektivno. Obe, formulacije 10% SP-ulje i 5% amfigen su redukovale i/ili sprečile lezije pluća. Na taj način, eksperimentalne vakcine PCV/M.hyo formulisane sa 10% SP-uljem ili 5% amfigenom su smatrane efikasnim. Antigen PCV2 izgleda da ne utiče na efikasnost M.hyo ovih formulacija.

[0160] Nasuprot tome, grupa koja je primala 5% amfigen 5% SLCD imala je srednju ocenu lezije pluća od 12.0%. što je bio neprihvatljiv rezultat po tome što se nije razlikovao od placeba. Posledično, eksperimentalna vakcina PCV/M.hyo formulisana sa 5% amfigenom 5% SLCD nije smatrana efikasnom.

[0161] Navodi se da zbog smanjenog broja životinja i visoke varijabilnosti u ocenama lezije pluća, nije bilo moguće ubedljivo pokazati statistički efekat tretmana u ovoj studiji. Iz tog razloga, odlučeno je da se dizajnira druga studija za testiranje efikasnosti M.hyo eksperimentalnih formulacija PCV/M.hyo u 10% SP-ulju. Ova ponovljena studija je predstavljena u Primeru 9 u daljem tekstu.

Primer 9: Procena efikasnosti M.hyo 1-boce kombinovane vakcine PCV2/M.hyo u 10% SP-ulju

[0162] Ova studija je dokaz koncepta dizajniranog za procenu efikasnosti frakcije M.hyo četiri eksperimentalne vakcine PCV2/M.hyo (serije L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 i L0711RK14 u Tabeli 11 u daljem tekstu) pripremljene pomoću različitih postupaka proizvodnje M.hyo koji koriste Protein A za uklanjanje IgG u poređenju sa kontrolnim vakcinama pripremljenim sa standardnim postupkom proizvodnje M.hyo. Svaka od ove četiri eksperimentalne vakcine PCV2/M.hyo obuhvatala je 10% SP-ulje kao ađuvans.

Obrada tečnosti:

[0163]

T02: Inaktivirani antigen M. hyopneumoniae kao što je opisan pod "Fermentacija i inaktivacija" u Primeru 1 u prethodnom tekstu.

T03 i T04: Formulisani sa inaktiviranim ćelijama M. hyopneumoniae kao što je opisano pod "Fermentacija i inaktivacija" u Primeru 1 u prethodnom tekstu.

T05: Tretman medijuma Proteinom A koji je korišćen za rast M. hyopneumoniae. PPLO (poreklom iz srca svinje) je pripremljen prema uputstvima proizvođača (tj., 21g/L) i rastvor kvaščevog ekstrakta je pripremljen na 21g/L u USP. Rastvor kvaščevog ekstrakta je dodat u PPLO na 6.25% i smeša je sterilizovana zagrevanjem do 121°C u trajanju od ≥ 30 minuta. Cistein hidrohlorid je pripremljen na 90g/L i filterski sterilizovan. Rastvor dekstroze je pripremljen dodavanjem 450 g dekstroze po litru USP vode, što je praćeno toplotnom sterilizacijom. Za pripremu finalnog medijuma, svinjski serum je dodat u bazni medijum na 10%, a zatim cistein na 0.01% i dekstroza na 1.0%. Antitela u kompletnom PPLO medijumu su uklonjena tretmanom sa proteinom A. Ukratko, jedan litar rProtein A Sepharose (deo broj 17-5199-03 GE Healthcare) je pakovan u staklenu kolonu (10 X 11.5 cm). Posle uklanjanja pufera za skladištenje, kolona je tretirana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline. Smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4, 1M NaCl puferom (pH 7.0). Petnaest litara kompletnog PPLO medijuma je sipano na smolu pri linearnoj stopi protoka od 140 cm/čas. Protok kolone je sakupljan i filterski sterilizovan kroz 0.2 mikronski filter (Sartorius). Tretirani medijum je korišćen za umnožavanje ćelija M. hyopneumoniae kao što je opisano pod "Fermentacija i inaktivacija" u prethodnom tekstu. Cela inaktivirana kultura (uključujući ćelije) je formulisana u finalnu vakcinu.

T06: Inaktivirane ćelije M. hyopneumoniae su pripremljene kao što je opisano pod "Fermentacija i inaktivacija" u Primeru 1 u prethodnom tekstu. Inaktivirana fermentaciona tečnost je centrifugirana na ~20,000xg (Sorvall RC5B) u trajanju od 30 min. i supernatant je sterilizovan preko 0.2 uM filtracije. Jedna stotina petnaest mililitara rProtein A smole (deo broj 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) upakovana je u hromatografsku kolonu (5x6 cm). Posle uklanjanja pufera za skladištenje i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.01. Približno 1.2 litara razbistrenih/filtriranih tečnosti antigena M. Hyopneumoniae je pasažirano kroz smolu na stopi protoka od 120 cm/čas. Protok je sakupljan i sterilizovan preko 0.2 µM filtera.

T07: Inaktivirane ćelije M. hyopneumoniae su pripremljene kao što je opisano pod "Fermentacija i inaktivacija" u Primeru 1 u prethodnom tekstu. Inaktivirana fermentaciona tečnost je razbistrena preko tangencijalne protočne filtracije. Ukratko, polietar sulfon filter (GE HealthCare, deo broj 56-4102-71) sa nominalnom veličinom pora od 0.2 µM je sterilisan sa 0.5N rastvorom natrijum hidroksida, a zatim ekstenzivnim ispiranjem sterilnom USP vodom. Tečnost inaktivirane kulture mikoplazme je uvedena u aparat na stopi recirkulacije ciljana na 14.6L/minuti i transmembranski pritisak od 2-3.4 PSI. Razbristravanje je izvedeno na sobnoj temperaturi. Filterski permeat je sakupljen i čuvan na 2-8C do dalje obrade. Jedna stotina petnaest mililitara rProtein A smole (deo broj 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) je pakovano u hromatografsku kolonu (5x6 cm). Posle uklanjanja pufera za skladištenje i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.01. Približno 2.3 litara razbistrenih/fultriranih tečnosti koje sadrže antigen M. hyopneumoniae propušteno je kroz smolu na stopi protoka od 120 cm/čas. Protok je sakupljen i sterilizovan preko 0.2 µM filtera.

T08: Inaktivirane ćelije M. hyopneumoniae su pripremljene kao što je opisano pod "Fermentacija i inaktivacija" u prethodnom tekstu. Inaktivirana fermentaciona tečnost je centrifugirana na ~20,000xg (Sorvall RC5B) u trajanju od 30 min. i supernatant je sterilizovan preko 0.2 uM filtracije. Jedna stotina petnaest mililitara rProtein A Sepharose (deo broj 17-5199-03 GE Healthcare) je pakovana u hromatografsku kolonu (5x6 cm). Posle uklanjanja pufera za skladištenje i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibirsana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.01. Približno 1.2 litara razbistrenih/filtriranih tečnosti koje sadrže antigen M. hyopneumoniae propušteno je kroz smolu na stopi protoka od 120 cm/čas. Protok je sakupljen i sterilizovan preko 0.2 uM filtera.

[0164] Eksperimentalne formulacije vakcine su pripremljene sa antigenima M.hyo obrađenim prema tretmanima T02-T08 u prethodnom tekstu. T02, T03 i T04 odgovarali su pozitivnim kontrolama. Pored toga, tretman T01 je odgovarao placebu (sterilni fiziološki rastvor).

[0165] Ove eksperimentalne formulacije su opisane u Tabeli 11 u daljem tekstu. Antigen M.hyo odgovara antigenu M.hyo iz supernatanta globalne M.hyo klice, tretirane Proteinom A. Informacije u "Tretman Proteinom A" koloni ukazuju na to da li je supernatant M.hyo tretiran Proteinom A pre ili posle primene.

Tabela 11 Eksperimentalne formulacije vakcine PCV2/M.hyo korišćene za studiju efikasnosti M.hyo u ađuvansu SP-ulje Postupak

Tretman Brend

Tretman Serijski br. PCV1-2 Ag M. hyo Ag razbistrenja Ađuvans Ostalo Proteinom A Proteina A

supernatanta

Sterilni fiziološki T01 L0311AS11 NA

rastvor

T02A828718 NA 13 Istekao RespiSure One Amfigen

T03L0711RK09 1.5 RP M. hyo bez tretmana Proteinom A i sa PCV-2

T04 L0711RK10NA M. hyo bez tretmana Proteinom A i bez PCV-2

T05 L0711RK11 Pre NA Sepharose NA

7.5 RP 10% SP ulje

T06 L0711RK12Posle Centrifuga MAbSelect

1.5 RP

T07 L0711RK13Posle Filter MAbSelect

T08 L0711RK14Posle centrifuga Sepharose

[0166] Svinje starosti 3 nedelje su intramuskularno inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcine opisanih u Tabeli 11 u prethodnom tekstu.18 svinja je uključeno u svaku grupu tretmana. Životinje su veštački inficirane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim M.hyo poljskim izolatom. Izvršena je autopsija životinja 28 dana posle veštačke infekcije i pluća su uklonjena i ocenjivana za konsolidaciju u skladu sa M.hyo infekcijom. Slika 8 (A & B) pokazuje ocene lezije pluća za odgovarajuće grupe tretmana. Statistička značajnost je određena pomoću analize mešanog modela ocene pluća za svaku grupu.

[0167] Rezultati lezije pluća prikazani na slikama 8A i 8B pokazuju da su od svih tretmana, samo dva (T07 i T08) imala 100% svinja u <5% katergoriji lezije pluća. Zabeleženo je da je velika statistička značajnost zabeležena u ovoj studiji.

[0168] Rezultati u predmetnom primeru pokazuju značajnu efikasnost M.hyo u 1-boci eksperimentalne formulacije PCV2/M.hyo koja koristi supernatant M.hyo tretiran Proteinom A i upotrebom SP-ulja kao ađuvansa. Pored toga, Primer 7 iz prehodnog teksta pokazuje efikasnost PCV2 u 1-boci formulacije PCV2/M.hyo koja koristi supernatant M.hyo tretiran Proteinom i upotrebom SP-ulja kao ađuvansa. Uzeti zajedno, efikasnost M.hyo i PCV2 je pokazana u 1-boci kombinacija PCV2/M.hyo koje koriste supernatant M.hyo tretiran Proteinom A.

Primer 10: In vivo bezbednost eksperimentalnih vakcina PCV2/M.hyo

[0169] Ova studija je izvedena za procenu in vivo bezbednosti eksperimentalnih vakcina PCV2-M.hyo formulisanih na maksimalnoj dozi antigena u različitim formulacijama ađuvansa u životinji domaćinu kada su davane na najmlađem uzrastu (3 nedelje starosti). Različite platforme ađuvansa su procenjivane u cilju određivanja koja od ovih platformi je dala prihvatljiv profil bezbednosti na bazi temperature, reakcija na mestu injekcije i kliničkih zapažanja. Formulacija 20% SLCD/10% SP-ulja je korišćena kao pozitivna ("nebezbedna") kontrola zbog istorijskih problema sa reakcijama na mestu injekcije zabeleženih od strane ove istraživačke grupe i ostalih.

Obrada tečnosti:

[0170] Sve vakcine su pripremljene sa inaktiviranim antigenom M. hyopneumoniae kao što je opisano pod "Fermentacija i inaktivacija" u Primeru 1. Cela masa antigena M.hyo je korišćena s obzirom na to da je bilo poznato da sadrži rastvorljive i nerastvorljive antigene M.hyo, pored imunoglobulina i imunoloških kompleksa koji bi bili uklonjeni posle tretmana proteinom A.

Racionalno je zaključiti da će uklanjanje nerastvorljivih ćelijskih ostataka i imunuoglobulina i imunoloških kompleksa samo dalje pojačati bezbednost formulacija vakcine. Namera ove studije da se stringentno testira bezbednost različitih formulacija ađuvansa koje sadrže antigen PCV2 i antigen M.hyo. Antigeni PCV2 i M.hyo su formulisani na maksimalnim nivoima oslobađanja da bi se dalje procenila bezbednost. Ove eksperimentalne formulacije su opisane u Tabeli 12 u daljem tekstu. IVP označava ispitivani veterinarski proizvod (IVP).

Tabela 12 Eksperimentalne formulacije vakcine PCV2/M.hyo korišćene za studiju bezbedosti

PCV1- Minimalna

IVP serija M Hyo* Ađuvans Ostalo

2 zapremina vakcine Ag Ag (mL) 87-244-DK NA Sterile NA

(Placebo) Saline

L0411RK15 10% SP ulju 200 L0411RK16 5% Amfigen 200

7.8 RP 13 RP 5% Amfigen 5% NA

L0611RK05 200

SLCD

20% SLCD 10%

L0611RK06 200

SP ulje

* antigen M hyo = iz globalne M hyo klice (cela masa antigena).

[0171] Parametri bezbednosti korišćeni u ovoj studiji bili su profil rektalne temperature i reakcija na mestu injekcije. Rezultati ove studije su pokazali da su svi kandidati platforme ađuvansa obezbedile prihvatljiv profil bezbednosti prema profilu rektalne temperature i kliničkim posmatranjima (rezultati nisu prikazani). Samo 20% SLCD 10% SP-ulje (tj., pozitivna kontrola) se značajno razlikovala od placebo vakcine i imala je određeni broj teških reakcija na mestu injekcije (rezultati nisu prikazani).

Primer 11: Priprema antigena M.hyo tretiranog Proteinom A za ključne studije

[0172] Slika 9 je dijagram koji prikazuje jedan primer izvođenja postupka proizvodnje korišćenog za pripremu PCV2 komaptibilnog antigena M.hyo tretiranog Proteinom A.

Inaktivirane cele kulture M.hyo su razbistrene od ćelija preko tangencijalne protočne filtracije. Ukratko, polietarski sulfon filter (GE Healthcare, part broj 56-4102-49) sa nominalnom veličinom pora od 0.45 mM je sanitiziran sa 0.5N rastvorom natrijum hidroksida, nakon čega je usledilo ekstenzivno ispiranje sterilnom USP vodom. Tečnost inaktivirane kulture mikoplazme je uvedena u aparat na stopi recirkulacije koja je usmerena na 11.0 L/minuti i transmembranskom pritisku od ~5 PSI. Razbistravanje je izvedeno na sobnoj temperaturi. Filterski permeat je sakupljen i čuvan na 2-8°C do dalje obrade.

[0173] Posle razbistravanja, tečnosti koje sadrže antigen su tretirane protein A smolom za redukovanje nivoa antitela. Ukratko, MAbSelect protein A smola (GE Healthcare) je pakovana u staklenu kolonu do visine od 12 cm. Smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone od 50 mM natrijum fosfata, 250 mM NaCl puferom (pH 7.0). Tečnost koja sadrži antigen, ekvivalentna 10 zapremina kolone, je sipana na smolu na linearnoj stopi protoka od 100 cm/čas. Protok kroz kolonu je sakupljen i filterski sterilizovan kroz 0.2 mikronski filter. Regeneracija kolona je postignuta proticanjem 3 zapremine kolone 25 mM acetatnog rastvora na pH 3.7, a zatim 4 zapremine kolone 1M rastvora sirćetne kiseline. Nivoi anti-PCV2 antitela i antigena M. hyopneumoniae su mereni u finalnoj tečnosti antigena preko PCV2 specifične ELISA antitela i kvantitativne ELISA p46 antigena, respektivno.

Primer 12: Procena virucidalne aktivnosti protiv PRRS virusa

[0174] Studija predstavljena u ovom primeru je dizajnirana za procenu efikasnosti himere PCV1-2, frakcije ubijenog virusa eksperimentalne kombinovane vakcine PCV2/M.hyo u 1 boci, primenjenoj na svinje starosti 21±3 dana i veštački inficirane virulentnim PCV2 izolatom na starosti od približno 6 nedelja.

[0175] Četiri eksperimentalne bivalentne vakcine PCV1-2/M.hyo na različitim, ali ravnotežnim, nivoima doze antigena i jedna eksperimentalna monovalentna vakcina M.hyo (negativna kontrola) su formulisane sa antigenom najvišeg pasaža. Kontrolna serija antigena M.hyo je pripremljena kao što je opisano u Primeru 11 u prethodnom tekstu. Antigen PCV2 je ubijeni antigen cPCV1-2 pripremljen kao što je opisano u Primeru 2 u prethodnom tekstu. Pre inaktivacije himernog virusa, serija antigena PCV2 je koncentrovana 20X i koncentrati su isprani ravnotežnim rastvorom soli. Finalnim eksperimentalnim formulacijama vakcine je dodat ađuvans 10% SP ulje. Ove eksperimentalne formulacije su opisane u daljem tekstu i u Tabeli 13, pri čemu je obezbeđena doza antigena (%serija antigena PCV2 i M.hyo).

[0176] T01: Eksperimentalni preparat (L1211RK11) antigena M.hyo (14.1%-visoki) bez himere PCVtipa 1-tipa 2, ubijene virusne frakcije (0%). Ovo odgovara negativnoj kontroli (monovalentan M.hyo).

[0177] T02: Eksperimentalni preparat (L1211RK09) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (1.375%- visok) i antigena M.hyo (14.1%-visok).

[0178] T03: Eksperimentalni preparat (L1211RK15) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (0.688%-srednji) i antigena M.hyo (9.4%-srednji).

[0179] T04: Eksperimentalni preparat (L0112RK03) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (0.344%-nizak) i antigena M.hyo (4.7%-nizal).

[0180] T05: Eksperimentalni preparat (L1211RK17) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (0.172%-veoma nizak) i antigena M.hyo (2.32%-veoma nizak).

Tabela 13 Eksperimentalni dizajn

Vakcinacija

Grupa N CP ili IPV<1>Serija/br. Doza antigena Put Ađuvans Doza

serije (PCV2/M hyo) primene T01 24 Placebo L1211RK11 Nijedna/visoka

T02 24 PCV2-M hyoL1211RK09Visoka/visoka

T03 24 PCV2-M hyoL1211RK15Srednja/srednja 10% SP IM, desni 2 mL

T04 24 PCV2-M hyo L0112RK03 Niska/niska ulje deo vrata Veoma

T05 24 PCV2-M hyo L1211RK17

niska/veoma niska

<1>IVP = Himera svinjskog cirkovirusa tipa 1 – tipa 2 (PCV2), vakcina od ubijenog virusa-Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) bakterijski ekstrakt

CP = Mycoplasma hyopneumoniae bakterijski ekstrakt sa ađuvansom SP-uljem 10% (bez frakcije himere svinjskog cirkovirusa tipa 1 – tipa 2)

IM = intramuskularno

[0181] Na dan 0 (3 nedelje starosti) jedna 2 mL doza dodeljene vakcine je primenjena preko IM injekcije u desni deo vrata svake svinje uključene u studiju. Posle vakcinacije nisu zabeleženi štetni događaji. Uzorak seruma je sakupljan iz svih svinja jednom nedeljno pre veštačke infekcije. Svaka svinja detektovana sa PCV2 viremijom pre veštačke infekcije je uklonjena iz studije. Na dan pre veštačke infekcije, sakupljeni su fekalni brisevi i uzorci seruma. Svinje su zatim veštački inficirane sa PCV2a virusom za veštačku infekciju. Veštačka infekcija je izvedena oko 3 nedelje posle vakcinacije (dan 21). Svaka svinja je inokulisana sa ukupno 3 mL PCV2a virusa za veštačku infekciju (izolat #40895, prethodno razblažen do 5.10 log10 FAID50/mL) sa 2 mL intranazlno i 1 mL intramuskularno u levi deo vrata. Rezervisana alikvota virusa za veštačku infekciju je titrirana posle veštačke infekcije za potvrdu stvarne doze za veštačku infekciju. Nerazblažena masa je prethodno rablažena 2-puta i rezultati povratne-titracije postigli su nivo veštačke infekcije od 5.10 log10FAID50/mL. Pre autopsije, jednom nedeljno u toku tronedeljne faze veštačke infekcije sakupljani su serum i fekalni brisevi. Tri nedelje posle veštačke infekcije sve svinje su eutanazirane i izvršena je autopsija. Uzorci seruma i fekalni brisevi su sakupljenizajedno sa 4 različita limfoidna tkiva. U toku autopsije, isečci tri limfna čvora (traheobronhijalni, mezenterički, ingvinalni), i krajnik su sakupljeni za svaku svinju i pojedinačno identifikovani i fiksirani u 10% puferisanom rastvoru formalina. Rezultati testiranja su obezbeđeni u daljem tekstu.

Testiranje potencije vakcine

[0182] Serija vakcine L1211RK15 PCV/M.hyo opisana gore smatrana je referentnim kandidatom. Posledično, relativna potencija za obe, frakciju M.hyo i frakciju PCV2 određivana je naspram ovog kandidata reference. Ovi rezultati su predstavljeni u Tabeli 14 u daljem tekstu. Serija L1211RK11 odgovara placebu (bez PCV2 frakcije).

Tabela 14 Rezultati potencije

Referenca L1211RK15

Serija

Potencija M. hyo Potencija PCV

L1211RK11 1.57 0.00

L1211RK09 2.08

L1211RK15 1.05

L0112RK03 0.56

L1211RK17 0.27

Rezultati prikazani za svaku seriju su srednje vredosti za sve testirane kopije.

Viremija PCV2

[0183] Posle veštačke infekcije, u poređenju sa placebo grupom, sve vakcinisane grupe su imale značajno smanjenje u procentu viremijskih svinja [P≤0.05], i tokom studije najmanje 47% svinja u tretiranim grupama (T02-T05) ostalo je negativno za PCV2 viremiju (Tabela 15 u daljem tekstu). Slično, sve vakcinisane grupe imale su značajno niži (P=0.0001) broj kopija DNK PCV2 od placebo grupe posle veštake infekcije (podaci nisu prikazani).

Tabela 15 qPCR kvalitativna viremija seruma – Procenat ikad pozitivnih i procena sprečene frakcije

Ikad pozitivni? Ukupna

Trt vakcina Pozitivni Negativni zapažanja P-vrednost # % # % Broj

T01 L1211RK11 23 95.8 1 4.2 24

T02 L1211RK09 2 8.3 22 91.7 24 <0.0001

T03 L1211RK15 7 31.8 15 68.2 22 0.0006

T04 L0112RK03 12 52.2 11 47.8 23 0.0063

T05 L1211RK17 7 29.2 17 70.8 24 0.0004

Fekalno praženjenje PCV2

[0184] Posle veštačke infekcije fekalni brisevi su otkrili da su 83.3% svinja iz placebo grupe (T01) bile pozitivne za PCV2 fekalno pražnjenje. Nasuprot tome, sve grupe koje su primale vakcine (T02-T05) imale su značajno smanjenje u procentu svinja PCR detektabilne izbačene PCV2 DNK (P≤0.0061). Ovi rezultati su predstavljeni u Tabeli 16 u daljem tekstu. Slično, sve grupe koje su primale vakcinu imale su značajno niže brojeve kopija DNK PCV2 od placebo grupe posle veštačke infekcije (podaci nisu prikazani).

Tabela 16 Fekalno pražnjenje prisutno ikada posle veštačke infekcije (dan>21) Ikad pozitivni? Ukupna

Trt vakcina Pozitivni Negativni<zapažanja>P-vrednost # % # % Broj

T01 L1211RK11 20 83.3 4 16.7 24

T02 L1211RK09 6 25.0 18 75.0 24 0.0002

T03 L1211RK15 9 40.9 13 59.1 22 0.0049

T04 L0112RK03 10 43.5 13 56.5 23 0.0061

T05 L1211RK17 6 25.0 18 75.0 24 0.0002

Odgovor antitela seruma

[0185] Sve svinje su bile PCV2 seronegativne pre vakcinacije. Svinje u placebo grupi su ostale seronegativne pre veštačke infekcije. Nasuprot tome, svinje u svim grupama koje su primale vakcine osim T05 grupe pokazale su značajna povećanja (P≤0.0287) titra antitela PCV2 na dan 20 posle vakcinacije u poređenju sa placebom, što ukazuje na aktivni imuni odgovor na PCV2 posle vakcinacije. ELISA titri antitela PCV2 su rezimirani u Tabeli 17 u daljem tekstu. Tirtri pre veštačke infekcije ukazali su na značajnu razliku (P ≤ .0393) u T02 i T03 grupama od T01 grupe na dane 7-20 i između T01 i T04 grupa na dan 20 (P ≤ .0287). Na dan 28 do 42, sve grupe koje su primale vakcinu imale su značajno više titre od T01 (P ≤ .0129; Tabela 17 u daljem tekstu).

Tabela 17 Poređenje ELISA S/P titara PCV2 tretmana prema danu studije Kontrast Dan -1 Dan 07 Dan 14 Dan 20 Dan 28 T01 vs T02 ns 0.0229 0.0005 0.0001 <0.0001 T01 vs T03 ns 0.0302 0.0393 0.0060 <0.0001 T01 vs T04 ns ns 0.0287 <0.0001 T01 vs T05 ns ns ns <0.0001 Kontrast Dan 35 Dan 42

T01 vs T02 <0.0001 0.0056

T01 vs T03 <0.0001 0.0024

T01 vs T04 <0.0001 0.0114

T01 vs T05 <0.0001 0.0129

*Kada je konstast značajan (≤0.05) zabeležena je P-vrednost, P-vrednosti > 0.5 su označene kao ns (nije značajna)

Limfoidne lezije i kolonizacija

[0186] U vreme autopsije, u poređenju sa placebo grupom, sve vakcinisane grupe su imale značajno smanjenje u ukupnoj količini antigena PCV2 detektovanog u tkivima. Podaci u vezi sa infekcijom PCV2 u limfoidnim tkivima (IHC ocene) su rezimirani u Tabeli 18 u daljem tekstu. Kao što je prikazano u Tabeli 18, sve grupe koje su primale vakcinu imale su značajno niže IHC ocene od T01 placebo grupe.

Tabela 18 PCV2 IHC ocene: ako su limfoidna tkiva ili tkiva krajnika ikada bila abnormalna

Tretman LSM P-vrednost u poređenju sa L12111RK11 L1211RK11 0.75

L1211RK09 0.15 0.0003

L1211RK15 0.30 0.0055

L0112RK03 0.34 0.0106

L1211RK17 0.41 0.0273

*Životinja je smatrana abnormalnom ako je ocena bila > 0 u bilo kom limfoidnom uzorku tkiva ili krajnika.

[0187] Sve vakcinisane grupe takođe su imale značajno smanjenje u PCV2 limfoidnoj depleciji kao što je prikazano u Tabeli 19 u daljem tekstu.

Tabela 19 PCV2 limfoidna deplecija: ako su limfoidna tkiva ili tkiva krajnika ikada bila abnormalna

Tretman LSM P-vrednost u poređenju sa L12111RK11 L1211RK11 0.48

L1211RK09 0.04 0.0053

L1211RK15 0.13 0.0181

L0112RK03 0.08 0.0069

L1211RK17 0.11 0.0116

*Životinja je smatrana abnormalnom ako je ocena bila > 0 u bilo kom limfoidnom uzorku tkiva ili krajnika.

[0188] Dodatno, sve vakcinisane grupe su imale značajno smanjenje u histiocitnoj zameni kao što je prikazana u Tabeli 20 u daljem tekstu.

Tabela 20 Histiocitna zamena PCV2; ako su limfoidna tkiva ili tkiva krajnika ikada abrnomalna

Tretman LSM** P-vrednost u poređenju sa L12111RK11 L1211RK11 ND

L1211RK09 ND 0.0006

L1211RK15 ND 0.0098

L0112RK03 ND 0.0098

L1211RK17 ND 0.0173

*Životinja je smatrana abnormalnom ako je ocena bila > 0 u bilo kom limfoidnom uzorku tkiva ili krajnika.

**Fisher-ov egzaktni test je korišćen zbog nekonvergencije, prema tome srednje vrednosti najmanjih kvadrata nisu određene (ND).

[0189] Podaci predstavljeni u ovom Primeru pokazuju da su vakcinisane grupe:

Značajno zaštićene i potpomognute u prevenciji PCV2 viremije posle veštačke infekcije; Značajno potpomognute u prevenciji fekalnog pražnjenja PCV2 posle veštačke infekcije kod svih vakcinisanih životinja;

Imale statistički značajan serološki odgovor 28 dana posle vakcinacije u grupama T02-T05. Pored toga, T02 i T03 su pokazale statistički značajan odgovor tako rano kao 7 dana posle vakcinacije u poređenju sa T01;

Imale su značajno smanjene mikroskopske lezije (limfoidna deplecija i histiocitna zamena) kod svih vakcinisanih životinja; i

sve vakcine su dokazane kao efikasne i serija vakcine L1211RK15 je izabrana kao referentni kandidat.

Primer 13: Efikasnost M.hyo frakcije posle intramuskularne primene kombinovane vakcine PCV2/M.hyo u 1 boci u 10% SP-ulju

[0190] Cilj studije predsatvljene u ovom primeru je bio procena efikasnosti frakcije Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) eksperimentalne himere svinjskog cirkovirusa (PCV) tipa 1 – tipa 2, ubijenog virusa -Mycoplasma Hyopneumoniae (M hyo) bakterijskog ekstrakta, primenjenih intramuskularno na svinje starosti 21 ± 3 dana i veštački inficirane virulentnim plućnim homogenatom M. hyopneumoniae 7 nedelja posle vakcinacije.

[0191] Formulisane su četiri eksperimentalne bivalentne vakcine PCV1-2/M.hyo na različitim, ali ravnotežnim, nivoima doze antigena i jedna eksperimentalna monovalentna vakcina PCV2 (negativna kontrola). Kontrolna serija antigena M.hyo je pripremljena kao što je opisano u Primeru 11 u prethodnom tekstu. Antigen PCV2 je ubijen antigen cPCV1-2 pripremljen kao što je opisano u Primeru 2 u prethodnom tekstu. Pre inaktivacije himernog virusa, serija antigena PCV2 je koncentrovana 20X i koncentrati su isprani ravnotežnim rastvorom soli. Finalnim eksperimentalnim formulacijama vakcine dodat je ađuvant 10% SP ulje. Ove eksperimentalne formulacije su opisane u daljem tekstu i u Tabeli 21 u daljem tekstu, gde je obezbeđena doza antigena (% serija antigena PCV2 i M.hyo).

[0192] T01: Eksperimentalni preparat (L1211RK10) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (1.375%-visok) bez M.hyo frakcije (0%). Ovo odgovara negativnoj kontroli (monovalentan PCV2).

[0193] T02: Eksperimentalni preparat (L1211RK09) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (1.375%-visok) i antigena M.hyo (14.1%-visok).

[0194] T03: Eksperimentalni preparat (L1211RK15) visokog pasaža himere PCV tipa 1-tipa 2, ubijenog virusa (0.688%-srednji) i antigena M.hyo (9.4%-srednji).

Tabela 21 Eksperimentalni dizajn

Vakcinacija

Doza antigena

Grupa N CP ili IPV<1>Serija/br. Put RP (PCV2/M Ađuvans Doza

serije primene hyo)

NTX 9 Sentinel NA Bez vakcinacije

T01 38 Placebo-PCV2L1211RK10Visoka/nijedna

10% SP IM, levi T02 38 PCV2-M hyoL1211RK09visoka/visoka 2 mL

ulje deo vrata T03 38 PCV2-M hyo L1211RK15 srednja/srednja

<1>IVP = Ispitivani veterinarski proizvod = Himera svinjskog cirkovirusa tipa 1 – tipa 2 (PCV2), vakcina od ubijenog virusa-Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo) bakterijski ekstrakt

CP = Kontrolni proizvod = Ubijena himerna frakcija PCV1-2 sa ađuvansom SP-uljem 10% (bez frakcije M. hyopneumoniae)

IM = intramuskularno

[0195] Na dan 0, 123 klinički zdravih, podložnih svinja je uključeno u ovu studiju starosti tri nedelje. Svinje su blokirane po leglu i po slučajnom izboru su dodeljene u sentinel (NTX) grupu ili jednu od tri grupe tretmana (T01-T03); na njih je intramuskularno primenjeno 2 mL jedne od eksperimentalne vakcine PCV1-2/M. hyopneumoniae vaccine na minimalnoj imunizujućoj dozi (MID), eksperimentalne vakcine PCV1-2/M. hyopneumoniae u dozi neznatno višoj od MID ili placeba koji sadrži PCV1-2 samo na MID. Sedam nedelja posle vakcinacije svinje koje su primale sentinel su eutanazirane i izvršena je njihova autopsija da bi se potvrdilo odsustvo M. hyopneumoniae i sve tretirane svinje su veštački inficirane dva puta (na dva uzastopna dana) sa živim, virulentnim M. hyopneumoniae plućnim homogenatom. Sve preostale svinje su eutanazirane i izvršena je njihova autopsija četiri nedelje posle veštačke infekcije. Prilikom autopsije plуća su ocenjivana za lezije tipične za M. hyopneumoniae. Posle veštačke infekcije lezije pluća su primarna promenljiva ishoda. Vakcinacija se smatra efikasnom ako je niži 95% interval poverenja ublažene frakcije bio >0.

Testiranje potencije vakcine

[0196] Serija vakcine L1211RK15 PCV/M.hyo opisana u prethodnom tekstu smatrana je referentnim kandidatom. Posledično, relativna potencija za obe, frakciju M.hyo i frakciju PCV2 korišćene u ovoj studiji efikasnosti M.hyo određena je naspram ovog referentnog kandidata. Ovi rezultati su predstavljeni u Tabeli 22 u daljem tekstu. Serija L1211RK10 odgovara placebu (bez frakcije M.hyo).

Tabela 22 Rezultati potencije

Serija Referenca L1211RK15

Potencija M. hyo<1>Potencija PCV<2>

L1211RK10 0.00 2.33

L1211RK09 1.48 2.20

L1211RK15 1.00 1.07

Rezultati prikazani za svaku seriju su srednje vrendosti svih testiranih kopija.

<1>Potencija M. hyopneumoniae testirana kod pet kopija.

<2>Potencija PCV testirana kod jedne kopije (L1211RK10) ili pet (L1211RK09, L1211RK15) kopija.

Serologija

[0197] Titri antitela M.hyo pokazali su da su sve svinje serološki M. hyopneumoniae negativne na dan 0 i ostale negativne pre veštačke infekcije. U svim vremenskim tačkama posle vakcinacije (dani 21, 47 i 75) T02 i T03 su imali značajno višu (P≤0.0004) geometrijsku sredinu najmanjih kvadrata titara antitela M. hyopneumoniae u poređenju sa T01 (podaci serologije nisu prikazani).

Procenat ukupnih pluća sa lezijama

[0198] Raspodele učestalosti ocena lezija pluća za svaki režanj pluća su izračunate prema tretmanu. Procenat ukupnih pluća sa lezijama je izračunat upotrebom sledeće formule: Procenat ukupnih pluća sa lezijama = {(0.10 x levi kranijalni) (0.10 x levi srednji) (0.25 x levi kaudalni) (0.10 x desni kranijalni) (0.10 x desni srednji) (0.25 x desni kaudalni) (0.10 x dodatni)}. Primenjena je arcus sinus kvadratni koren transformacija na procenat ukupnih pluća sa lezijama pre analize. Procenat ukupnih pluća sa lezijama je analiziran upotrebom mešanog linearnog modela. Parna poređenja su napravljena između grupa tretmana ako je efekat tretmana bio značajan. Povratno transformisane srednje vrednosti najmanjih kvadrata procenta ukupnih pluća sa lezijama, i njihovi 95% intervali poverenja su izračunati kao i minimumi i maksimumi. Lezije pluća su rezimirane sa stratifikovanom ublaženom frakcijom i granicama poverenja od 95%. Rezultati lezije pluća su predstavljeni u Tabeli 23 u daljem tekstu.

Tabela 23 Analiza procenta ukupnih pluća sa lezijom

Rezime srednjih vrednosti najmanjih kvadrata

% pluća sa

Grupa Serija N

lezijama<1>Opseg

Ublažena frakcija NTX 9 0.1 0.0 do 0.8

% pluća sa Konstrast vs

Grupa Serija N eg 05% CI<4>lezijama<1>Ops

T01

T01 L1211RK10 36 6.1<b>0.0 do 32.3

T02 L1211RK09 36 2.7<a>0.0 do 23.5 40.9 13.3 do 61.8 T03 L1211RK15 36 2.6<a>0.0 do 49.0 46.9 18.2 do 68.3<1>Povratno transformisana srednja vrednost najmanjih kvadrata

Grupe tretmana sa istim slovom nisu značajno različite na P-vrednosti 0.05.

[0199] Nekoliko lezija pluća makog procenta zabeleženo je u plućima svinja NTX što se pripisuje poznatoj incidenci Bordetella u ovom stadu. Bakterijska kultura na brisevima plućnog tkiva potvrdila je da su nekoliko svinja bile pozitivne na kulturu B. Bronchiseptica i kultura M. hyopneumoniae je potvrdila da su sve svinje NTX bile negativne na kulturu M. hyopneumoniae pre primene veštačke infekcije.

[0200] Protokl je ispunio kriterijume validnosti po tome što su srednje vrednosti LS lezija pluća za T01 bile >4%. Srednje vrednosti LS lezija pluća za T02 i T03 bile su značajno (P≤0.05) niže od T01 i oba su ispunila i kriterijume ublažene frakcije da je niži 95% interval poverenja bio >0. Validnost zahteva ove studije je ispunjen po tome što nije bilo dokaza za izlaganje M. Hyopneumoniae pre veštačke infekcije. Veštačka infekcija je bila validna po tome što je ocena povratno transformisane srednje vrednosti lezije pluća kod placebo svinja (T01) bila >4%.

[0201] U poređenju sa negativnom kontrolnom grupom (T01), grupe tretmana T02 i T03 su pokazale značajno smanjenje (P ≤ 0.05) u procentu pluća sa lezijom u poređenju sa T01. Ublažene frakcije za T02 i T03 u poređenju sa T01 ispunile su kriterijume protokola za efikasnost.

[0202] Pod uslovima ove studije, obe vakcine (T02 & T03) su pomogle u ublažavanju lezija pluća, primarnoj promenljivoj za efikasnost. Rezultati u predmetnom primeru pokazuju značajnu efikasnost M.hyo u eksperimentalnoj formulaciji PCV2/M.hyo u 1 boci.

Primer 14: Procena virucidalne aktivnosti protiv PRRS virusa

[0203] Studije predstavljene u ovom primeru su dizajnirane za procenu različitih platformi ađuvanata za virucidalnu aktivnost protiv PRRS virusa. Početni eksperimenti su bili fokusirani samo na ađuvansu (tj., formulacije nisu sadržale antigene PCV ili M.hyo). Procena ađuvansa za virucidalnu aktivnost PRRS je predstavljena na slici 10. Preliminarna virucidalna procena pokazala je da su 10% SP-ulje, 0.2% karbopol i 2.5% amfigen nevirucidalni u odnosu na PRRS virus. Nasuprot tome, 20% SLCD ađuvans izgleda da je virucidalan na PRRS virus.

[0204] Dodatne studije su izvedene za procenu da li su formulacije PCV/M.hyo koje su imale različite ađuvantne platforme bile nevirucidalne na PRRS virus. Ovi rezultati su predstavljeni u Tabeli 13 u daljem tekstu, gde simbol * označava one serije vakcina koje su virucidalne na PRRS virus.

Tabela 24 Rezultati virucidalne analize PRRS sa različitim formulacijama

Serija vakcine korišćena u studijama iz Potencija PRRS Primera 7, 8, 10 Virucidalni p46

PCV2

RP NVSL

(ru/ds

RP

Studija Opis Serijski # ) A B Primeri Sterilan fiziološki rastvor (0.9% 87-244-DK

7,8,10 natrijum hlorid) (Placebo)

cPCV (RP 1.6) M Hyo tretiran L0411RK08 7.1 1.29 -0.10 -0.13 Primeri

sa Prot A (RP 7.5) u 10% SP

7,8

ulju

cPCV (RP 1.6) M Hyo tretiran L0411RK09 7.3 1.33 -0.10 0.14 Primeri

sa Prot A (RP 7.5) u 5%

7,8

amfigenu

Primeri cPCV (RP 1.6) M Hyo tretiran<L0611RK03 6.9 1.15 -0.36 -0.33>7,8 sa Prot A (RP 7.5) u 5% amf.

5% SLCD

-cPCV (RP 1.6) monovalentan u

Primer 7 L0611RK04 1.50 1.86 -0.50

20% SLCD

* Primer 8 Istekla RespiSure jedna serija A827870 12.6

cPCV (RP 7.8) M Hyo cema L0411RK15 14 1.03 -0.32 -0.03 Primer 10

masa (RP 13.3) u 10% SP ulju

cPCV (RP 7.8) M Hyo Whole L0411RK16 15.5 1.12 -0.36 -0.53 Primer 10

Bulk (RP 13.3) in 5% Amphigen

cPCV (RP 7.8) M Hyo cela L0611RK05 17.5 1.50 -0.54 -0.33 Primer 10 masa (RP 13.3) u 5% amf. 5%

SLCD

cPCV (RP 7.8) M Hyo cela -Example -masa (RP 13.3) u 20% SLCD L0611RK06 15.9 1.13 1.93 10 0.99*

10% SP ulju *

*Označava Virucidalni (>0.7 log gibitka)

A – kontrola virucidalnog testa GMT ~5.53 log/mL

B – kontrola virucidalnog testa GMT ~6.42 log/mL

[0205] Rezultati predstavljeni u Tabeli 24 u prethodnom tekstu označavaju da je 10% SP-ulje nevirucidalno na PRRS virus.

[0206] Dodatne serije vakcine PCV/M.hyo su pripremljene upotrebom 10% SP-ulja kao ađuvansa (Tabela 25). Antigena potencija ovih serija vakcina je upoređivana sa referentnom serijom vakcine (L1211RK15) opisanoj u prethodnom tekstu. Rezultati prikazani u Tabeli 25 u daljem tekstu dalje pokazuju da je 10% SP-ulje nevirucidalno na PRRS virus. Vrednosti test uzorka u Tabeli 25 su svaka bile više (+ znak) od kontrole virucidalne analize, koja je imala geometrijsku sredinu titra (GMT) od oko 5.9±0.5 log/ml.

Tabela 25 Rezultati virucidalne analize sa različitim formulacijama PCV/M.hyo sa ađuvantom 10% SP-uljem

Korišćena serija PotencijaPRRSvakcine Virucidalni

p46 RP (ru/ds) PCV2 NVSL

Opis Serijski # Referenca Referenca log10

L1211RK15 L1211RK15 TCID50/mL Sterilni razblaživač

1949122 na na

(sterilna voda)

cPCV M Hyo L0912RK12 1.62 2.60 0.58 tretiran sa Prot A u

10% SP ulju

cPCV M Hyo L0912RK10 0.88 1.23 0.58 tretiran sa Prot A u

10% SP ulju

cPCV M Hyo L0912RK11 1.24 2.62 0.58 tretiran sa Prot A u

10% SP ulju

cPCV M Hyo L0912RK08 1.08 1.03 0.91 tretiran sa Prot A u

10% SP ulju

cPCV M Hyo L0912RK09 1.65 2.06 0.50 tretiran sa Prot A u

10% SP ulju

Kontrolna virucidalne analize GMT ~ 5.9 ± 0.5 log/ml

[0207] Rezultati predstavljeni u ovom primeru pokazuju da je 10% SP-ulje nevirucidalno na PRRS virus. Rezultati predstavljeni u ovom primeru dalje pokazuju da je formulacija PCV/M.hyo sa ađuvansom 10% SP-uljem bila među onim serijama vakcina koje su smatrane nevirucidalnim na PRRS virus (Tabela 24 i Tabela 25). U zaključku, formulacija PCV/M.hyo sa ađuvansom 10% SP-uljem smatrana je efikasnom platformom na kojoj bi trebalo zasnivati trovalentnu kombinaciju uključujući PCV, M.hyo i PRRS virus.

Primer 13: Priprema kombinovane vakcine PCV/M.hyo/PRRS

[0208] Formulacija PCV/M.hyo sa ađuvantnom platformom koja je nevirucidalna na PRRS virus (videti Tabele 24 i Tabelu 25 u prethodnom tekstu), je obezbeđena kao tečna kompozicija u jednoj boci koja je spremna za upotrebu. Ova formulacija PCV/M.hyo u 1 boci koristi supernatant M.hyo tretiran Proteinom A. Efikasnost oba, M.hyo i PCV2 je pokazana u takvim formulacijama PCV2/M.hyo korišćenjem supernatanta M.hyo tretiranog Proteinom A (videti Primere 7-9). U predmetnom primeru, ova dvovalentna formulacija PCV2/M.hyo je kombinovana sa monovalentnim PRRS virusnim antigenom.

[0209] U jednom primeru izvođenja, kombinacija PCV/M.hyo u 10% SP-ulju i koja odgovara jednoj od serija vakcina L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 i L0711RK14 u Tabeli 11 u prethodnom tekstu ili L1211RK09, L1211RK15, L0112RK15, L0112RK03 i L1211RK17 u Tabeli 13 u prethodnom tekstu je obezbeđena kao tečna kompozicija u jednoj boci koja je spremna za upotrebu. Rezultati predstavljeni u Primeru 14 u prethodnom tekstu pokazali su da je 10% SP-ulje nevirucidalno na PRRS virus. Primer 14 je takođe pokazao da su formulacije PCV2/M.hyo sa ađuvantom 10% SP-uljem među onim serijama vakcina koje su smatrane nevirucidalnim na PRRS virus. U predmetnom primeru, takva tečna kompozicija PCV2/M.hyo u 1 boci je korišćena za rehidrataciju kompozicije liofilizovanog genetički modifikovanog živog PRRS virusa sadržanoj u drugoj boci, tako da su svi antigeni sadržani u jednoj boci pre primene na svinju pogodne starosti (npr., starosti 3 nedelje ili starije).

[0210] U jednom primeru izvođenja, PRRS virus ina genomsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 16 ili njenu varijantu. U sledećem primeru izvođenja, PRRS virus korišćen u trovalentnoj kompoziciji je PRRS virusni izolat označen kao ISU-55, koji je deponovan u ATCC pod pristupnim brojem VR 2430. Pogodne količine odgovarajućih antigena su opisane ovde. Poželjno, svi antigeni su primenjeni u jednoj dozi na svinju.

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Multivalentna imunogena kompozicija koja sadrži supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); i antigen sivnjskog cirkovirusa tip 2 (PCV2), pri čemu je supernatant kulture M.hyo odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtracijom ili taloženjem i on je bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin.

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je supernatant kulture M.hyo tretiran proteinom-A ili proteinom-G pre dodavanja imunogenoj kompoziciji.

3. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačena time što je antigen PCV2 u obliku himernog tip-1-tip 2 cirkovirusa, pri čemu navedeni himerni virus sadrži inaktivirani rekombinantni svinjski cirkovirus tipa 1 koji eksprimira ORF2 protein svinjskog cirkovirusa tipa 2.

4. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što je antigen PCV2 u obliku rekombinantnog ORF2 proteina.

5. Kompozicija prema patentnom zahtevu 4, naznačena time što je rekombinantni ORF2 protein eksprimiran iz bakulovirusnog vektora.

6. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koja dalje sadrži najmanje jedan dodatni antigen koji daje zaštitu protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja, pri čemu je mikroorganizam izabran iz grupe koja se sastoji od virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjskog parvovirusa (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bakterije leptospire, Lawsonia intracellularis, virusa svinjske influence (SIV), antigena Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, svinjskog respiratornog koronavirusa, virusa svinjske epidemijske dijareje (PED), rotavirusa, Torque teno virusa (TTV), svinjskog citomegalovirusa, svinjskih enterovirusa, virusa encefalomiokarditisa, patogena koji je uzročnik Aujesky-eve bolesti, klasične svinjske groznice (CSF) i patogena koji je uzročnik svinjskog prenosivog gastroenteritisa ili njihovih kombinacija.

7. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time što kompozicija dalje sadrži ađuvans.

8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što je ađuvans izabran iz grupe koja se sastoji od ulje-u-vodi ađuvansa, polimernog i vodenog ađuvansa, voda-u-ulju ađuvansa, aluminijum hidroksid ađuvansa, vitamin E ađuvansa i njihovih kombinacija.

9. Kompozicija kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za upotrebu u imunizaciji svinje protiv Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) i PCV2 koja sadrži primenu na svinju kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.

10. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što se kompozicija primenjuje u jednoj dozi.

11. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, naznačena time što se kompozicija primenjuje na svinje koje imaju antitela poreklom od majke protiv najmanje jednog od M.hyo i PCV2, ili oba, M.hyo i PCV2.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 9 do 11, naznačena time što se kompozicija primenjuje na svinje starosti 3 nedelje ili starije.

13. Kompozicija vakcine koja sadrži imunogenu kompoziciju kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time što kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

14. Kompozicija vakcine prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u zaštiti svinja od enzootičke pneumonije i multisistemskog sindroma kržljavosti prasadi posle odlučenja (PMWS).

15. Komplet koji sadrži: bocu koja sadrži imunogenu kompoziciju ili kompoziciju vakcine uključujući oba, antigen PCV2 i supernatant kulture Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), pri čemu je supernatant bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, i izborno, dalje obuhvata uputstvo za upotrebu koje sadrži informacije za primenu imunogene kompozicije.

16. Postupak za pripremu imunogene kompozicije kao što je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, pri čemu postupak sadrži:

i) kultivisanje M.hyo u pogodnom medijumu tokom perioda u opsegu od 18-144 časova; ii) zatim inaktivaciju kulture M.hyo;

iii) sakupljanje tečnosti inaktivirane kulture, pri čemu tečnost inaktivirane kulture sadrži rastvorljivu tečnu frakciju i nerastvorljivi ćelijski materijal;

iv) odvajanje rastvorljive tečne frakcije od nerastvorljivog ćelijskog materijala filtracijom, centrifugiranjem ili taloženjem;

v) uklanjanje IgG i imunoloških kompleksa antigena/imunoglobulina iz odvojene rastvorljive tečne frakcije da bi se formirao supernatant kulture M. hyo bez (i) IgG i bez (ii) imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena vezanog za imunoglobulin; i

vi) zatim kombinovanje supernatanta sa antigenom PCV2.