RS59107B1 - Kompozicija za kontrolisanu stimulaciju jajnika - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na sastave i farmaceutske proizvode za tretman neplodnosti.

[0002] Tehnike tehnologije asistirane reprodukcije (ART) kao što je in vitro oplodnja (IVF) su dobro poznate. Ove ART tehnike generalno zahtevaju korak kontrolisane stimulacije jajnika (COS), gde se kohorta folikula stimuliše do pune zrelosti. Standardni COS režimi uključuju primenu gonadotrofina, kao što je hormon koji stimuliše folikule (FSH) sam ili u kombinaciji sa aktivnostima luteinizirajućeg hormona (LH) kako bi se stimulisao razvoj folikula, normalno sa primenom GnRH analoga pre i/ili tokom stimulacije kako bi se sprečio prevremeni LH rast. Farmaceutski sastavi koji se generalno koriste za COS uključuju rekombinantni hormon koji stimuliše folikule (rFSH), urinarni FSH, rekombinantne FSH LH preparate, urinarni menotrofin [ljudski menopauzalni gonadotrofin (hMG)] i visoko pročišćeni ljudski menopauzalni gonadotrofin (HP-hMG). IVF se može povezati sa rizikom od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS), koji u teškim slučajevima može biti opasan po život.

[0003] Sposobnost predviđanja potencijala odgovora žena na kontrolisanu stimulaciju jajnika (COS) može omogućiti razvoj individualnih COS protokola. Ovo bi, na primer, moglo smanjiti rizik od OHSS kod žena za koje se predviđa da imaju prekomerni odgovor na stimulaciju, i/ili poboljšati ishode trudnoće kod žena za koje se smatra da će loše reagovati. Serumska koncentracija antimilerijanskog hormona (AMH) sada je uspostavljena kao pouzdan marker jajne rezerve. Smanjenje AMH nivoa je u korelaciji sa smanjenim odgovorom jajnika na gonadotrofine tokom COS. Dalje, visoki nivoi AMH su dobar prediktor prekomernog odgovora jajnika i indikator rizika od OHSS.

[0004] U preliminarnoj studiji žena mlađih od 35 godina koje su podvrgnute ART, CONSORT algoritam doziranja (koji uključuje bazalni FSH, BMI, starost i AFC) je korišćen za predviđanje optimalne početne doze FSH za COS kod žena pod rizikom od razvoja OHSS (Olivennes i dr., 2009). Individualizacija doze dovela je do adekvatnog prinosa oocita i dobre stope trudnoće. Međutim, bilo je visokih stopa otkazivanja u grupi sa niskim dozama (75 IU FSH) zbog neadekvatnog odgovora, i OHSS se pojavio kod značajnog broja pacijentkinja.

[0005] Stoga postoji potreba za sastavom za upotrebu u individualnim COS protokolima koji pruža adekvatan odgovor na stimulaciju i/ili smanjen rizik od OHSS.

[0006] Kao što je gore navedeno, standardni COS protokoli mogu uključivati primenu FSH. FSH prirodno izlučuje prednja hipofiza i funkcioniše kao podrška folikularnom razvoju i ovulaciji. FSH sadrži alfa sub-jedinicu od 92 aminokiseline, takođe zajedničku za druge glikoproteinske hormone LH i CG, i beta podjedinicu od 111 amino kiselina koja je jedinstvena za FSH i koja primenjuje biološku specifičnost hormona (Pierce i Parsons, 1981). Svaka podjedinica je postranslaciono modifikovana dodavanjem kompleksnih ostataka ugljenih hidrata. Obe podjedinice nose 2 mesta za vezivanje N-vezanog glikana, alfa podjedinicu kod aminokiselina 52 i 78 i beta podjedinicu na aminokiselinskim ostacima 7 i 24 (Rathnam i Saxena, 1975, Saxena i Rathnam, 1976). FSH je tako glikozilovan do oko 30% mase (Dias i Van Roey.2001. Fox i dr.2001).

[0007] FSH pročišćen od post-menopauzalnog urina je korišćen dugi niz godina u tretmanu neplodnosti; kako bi promovisao ovulaciju u prirodnoj reprodukciji, ali i da pruži oocite za tehnologije asistirane reprodukcije. Trenutno odobreni proizvodi rekombinantnog FSH (rFSH) za stimulaciju jajnika, kao što su folitropin alfa (GONAL-F, Merck Serono/EMD Serono) i folitropin beta (PUREGON/FOLLISTIM, MSD/Schering-Plough), izvedeni su iz ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO). Trenutno, nijedan rFSH proizvod iz ljudske ćelijske linije nije komercijalno dostupan.

[0008] Postoji značajna heterogenost povezana sa preparatima FSH koji se odnose na razlike u količinama prisutnih različitih izoforma. Pojedinačne FSH izoforme pokazuju identične aminokiselinske sekvence, ali se razlikuju u stepenu u kome su post-translacijski modifikovane; određene izoforme karakteriše heterogenost struktura ugljenog hidrata i različite količine sijalinske kiseline (terminalni šećer), od kojih obe utiču na specifičnu bioaktivnost izoforma.

[0009] Glikozilacija prirodnog FSH je veoma kompleksna. Glikani u FSH hipofize prirodnog porekla mogu da sadrže širok spektar struktura koje mogu uključivati kombinacije mono-, bi-, tri- i tetra-antena glikana (Pierce i Parsons, 1981. Ryan i dr., 1987. Baenziger i Green, 1988). Glikani mogu da nose dalje modifikacije: fukozilaciju jezgro, bisecirajući glukozamin, lance proširene sa acetil laktozaminom, delimičnu ili potpuna sijalilacija, sijalilaciju sa α2,3 i α2,6 vezama, i sulfatni galaktozamin supstituisan za galaktozu (Dalpathado i dr., 2006). Pored toga, postoje razlike između raspodele struktura glikana na pojedinačnim lokacijama glikozilacije. Sličan nivo kompleksnosti glikana je otkriven u FSH izvedenom iz seruma pojedinaca i urina žena u postmenopauzi (Wide i dr., 2007).

[0010] Glikozilacija rekombinantnih FSH proizvoda odražava raspon glikozil-transferaza prisutnih u domaćinovoj ćelijskoj liniji. Komercijalno dostupni proizvodi rFSH su izvedeni iz projektovanih jajnih ćelija kineskog hrčka (CHO ćelije). Raspon modifikacija glikana u rFSH izvedeniom iz CHO ćelija je više ograničen od onog koji se nalazi na prirodnim proizvodima. Primeri redukovane heterogenosti glikana pronađene u rFSH izvedenom iz CHO ćelija uključuju nedostatak bisecirajućeg glukozamina i smanjeni sadržaj fukozilacije jezgra i ekstenzija acetil laktozamina (Hard i dr, 1990). Pored toga, CHO ćelije mogu da dodaju samo sijalinsku kiselinu koristeći α2,3 vezu (Kagawa i dr, 1988, Takeuchi i dr, 1988, Svensson i dr.,1990); rFSH izveden iz CHF ćelija uključuje samo α2,3-vezanu sijalinsku kiselinu i ne uključuje α2,6-vezanu sijalinsku kiselinu.

[0011] Prema tome, FSH izveden iz CHO ćelija je različit od prirodno proizvedenog FSH (npr. Ljudska hipofiza/serum/urinarni FSH) koji sadrži glikane sa smešom α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiselinom, gde prva preovlađuje.

[0012] Dalje, takođe je pokazano da se komercijalno dostupan rekombinantni preparat FSH razlikuje u količinama FSH sa izoelektričnom tačkom (pI) ispod 4 (smatra se kiselim izoformama) u poređenju sa FSH od hipofize, seruma ili post-menopauznog urina (Ulloa-Aguirre i dr. 1995). Količina kiselih izoformi u urinarnim preparatima bila je mnogo veća u poređenju sa rekombinantnim proizvodima izvedenih iz CHO ćelija, Gonal-f (Merck Serono) i Puregon (Schering Plough) (Andersen i dr. 2004). Ovo mora odražavati niži molarni sadržaj sijalinske kiseline u rekombinantnom FSH, pošto je sadržaj negativno naelektrisanog glikana modifikovanog sa sulfatom nizak u rekombinantnom FSH. Niži sadržaj sijalinske kiseline, u poređenju sa prirodnim FSH, je karakteristika oba komercijalno dostupna rekombinantna FSH proizvoda i može odražavati ograničenje u procesu proizvodnje.

[0013] Životni vek FSH u cirkulaciji je dokumentovan za materijale iz različitih izvora. Neki od ovih materijala su fragmentisani na osnovu ukupnog molekularnog naelektrisanja, što je karakterisano njihovim pI, gde više kiseline odgovara višem negativnom naelektrisanju. Kao što je ranije navedeno, glavni doprinos ukupnom molekulskom naelektrisanju je ukupni sijalinski sadržaj svakog FSH molekula. Na primer, rFSH (Organon) ima sadržaj sijalinske kiseline od oko 8 mol/mol, dok FSH dobijen iz urina ima veći sadržaj sijalinske kiseline (de Leeuw i dr.1996). Odgovarajuće stope klirensa plazme kod pacova su 0,34 i 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre i dr. 2003). U drugom primeru, gde je uzorak rekombinantnog FSH podeljen na fragmente visokog i niskog pl, in vivo potencija visokog pI (niži sadržaj sijalinske kiseline) je smanjena i imala je kraći polu-život u plazmi (D'Antonio i dr.1999). Takođe je prijavljeno da je više bazni FSH, koji cirkuliše u kasnijim fazama ciklusa ovulacije, posledica regulacije na dole α2,3 sijalil-transferaze u prednjoj hipofizi što je uzrokovano povećanjem nivoa estradiola (Damian-Matsumara i dr.1999. Ulloa-Aguirre i dr.2001). Rezultati za α2,6 sijaliltransferazu nisu prijavljeni.

[0014] Prema tome, kao što je gore navedeno, rekombinantni proteini eksprimirani upotrebom CHO sistema će se razlikovati od svojih prirodnih paralela po svom tipu terminalnih veza sijalinskih kiselina. Ovo je važno razmotriti u proizvodnji bioloških agenasa za farmaceutsku upotrebu, jer ugljenohidratni delovi mogu doprineti farmakološkim atributima molekula. Podnosioci predmetne prijave su razvili rekombinantni FSH izveden iz čoveka koji je predmet Međunarodne patentne prijave br. PCT/GB2009/000978, objavljeno kao WO2009/127826A. Rekombinantni FSH sa smešom i α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline je napravljen inženjeringom ljudske ćelijske linije za eksprimiranje i rFSH i α2,3 sijalil-transferaze.

Eksprimirani proizvod je visoko kiselinski i nosi mešavinu i α2,3- i α2,6-vezanih sijalinskih kiselina; druga je pružena endogenom aktivnošću sijalil transferaze. Otkriveno je da tip sijalinske kiseline, α2,3- ili α2,6-, može imati dramatičan uticaj na biološki klirens FSH.

Rekombinantni FSH sa mešavinom i α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline ima dve prednosti u odnosu na rFSH eksprimiran u konvencionalnim CHO ćelijama: najpre je materijal više sijalilovan zbog kombinovanih aktivnosti dve sijalil-transferaze; i zatim, materijal više liči prirodnom FSH. Ovo je verovatno više biološki odgovarajuće u poređenju sa rekombinantnim proizvodima CHO ćelija koji proizvode samo α2,3 sijalinsku kiselinu (Kagawa i dr,1988, Takeuchi i dr, 1988, Svensson i dr., 1990) i imaju smanjeni sadržaj sijalinske kiseline (Ulloa-Aguirre i dr. 1995., Andersen i dr.2004).

[0015] Proizvod rFSH opisan u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/GB2009/000978 sadrži razgranate glikanske ostatke. FSH sadrži glikane (vezane za FSH glikoproteine) i ovi glikani mogu da sadrže širok spektar struktura. Kao što je dobro poznato u struci, grananje (glikana) se može javiti tak oda rezultuje da glikan može imati 1, 2, 3, 4 ili više terminalnih ostataka šećera ili „antena“; glikani sa 1, 2, 3 ili 4 terminalna ostatka šećera ili „antene“ se odnose na mono-antene, di-antene, tri-antene ili tetra-antene. Glikani mogu imati prisustvo sijalilacije na mono-antenskim i/ili di-antenskim i/ili tri-antenskim i/ili tetra-antenskim strukturama. Primer rFSH obelodanjen u Međunarodnoj patentnoj prijavi br.

PCT/GB2009/000978 uključuje su mono-sijalilovane, di-sijalilovane, tri-sijalilovane i tetrasijalilovane strukture glikana sa relativnim količinama kako sledi: 9-15% mono-sijalilovani; 27 - 30% di-sijalilovan; 30 - 36% tri-sijalilovan i 25 - 29% tetra-sijalilovan. Kao što je dobro poznato, mono-sijalilovana struktura glikana nosi jedan ostatak sijalinske kiseline; disijalilovana struktura glikana nosi dva ostatka sijalinske kiseline; tri-sijalilovana struktura glikana nosi tri ostatka sijalinske kiseline; i tetra-sijalilovana struktura glikana nosi četiri ostatka sijalinske kiseline. Ovde, terminologija kao što je „X% mono-sijalilovan“, „X% disijalilovan“, „X% tri-sijalilovan“ ili „X% tetra-sijalilovan“ odnosi se na broj struktura glikana na FSH koje su mono-, di, tri ili tetra-sijalilovane (respektivno), izraženo kao procenat (X%) ukupnog broja struktura glikana na FSH koje su sijalilovani na bilo koji način (nose sijalinsku kiselinu). Prema tome, izraz „30 - 36% tri-sijalilovanih struktura glikana“ znači da, od ukupnog broja struktura glikana na FSH koje nose ostatke sijalinske kiseline (to jest, sijalilovane su), 30 do 36% ovih struktura glikana su tri sijalilovane (nose tri ostatka sijalinske kiseline). Podnosioci prijave su iznenađujuće otkrili da je FSH koji ima specifičnu količinu tetra-sijalilovanih struktura glikana (koja je različita od one iz primera rFSH proizvoda opisanog u gore navedenom PCT/GB2009/000978) izrazito snažniji od rekombinantnih FSH proizvoda koji su trenutno na tržištu. Aminokiselinska sekvenca proizvoda podnosioca prijave je prirodna sekvenca i identična je prirodnom ljudskom FSH i postojećim proizvodima rFSH izvedenim od CHO. Međutim, podnosioci predmetne prijave su otkrili da rekombinantni FSH proizvodi dobijeni ljudskim proizvodima (tj. rekombinantni FSH proizvedeni ili eksprimirani u ljudskoj ćelijskoj liniji, npr. napravljeni inženjeringom ljudske ćelijske linije) koji imaju mešavinu i α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline i/ili specifičnu količinu tetra-sijalilovanih struktura glikana, mogu biti posebno efikasni kada se koriste u (npr. individualnim) COS protokolima.

[0016] Prema pronalasku, u prvom aspektu, pružen je proizvod (npr. farmaceutski sastav) koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L (npr.0,05 pmol/L do 14,9 pmol/L), gde se proizvod primenjuje pri dozi, ili ekvivalentu, 11-13 µg (na primer 12 µg) rekombinantnog ljudskog FSH na dan, 12 do 16 dana nakon primene GnRH agonista.

[0017] Prema pronalasku, u daljem aspektu, pružen je proizvod (npr. farmaceutski sastav) koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 11-13 µg (na primer 12 µg) rekombinantnog ljudskog FSH na dan, zajedno sa GnRH antagonistom.

[0018] FSH je ljudski rekombinantni FSH („ljudski rFSH“ ili „ljudski recFSH“).

[0019] Doza pruža efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS. Poželjno, tretman neplodnosti obuhvata korak utvrđivanja (npr. merenja) AMH nivoa u serumu kod pacijentkinje i primene doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od <15 pmol/L (npr.

0,05 pmol/L do 14,9 pmol/L).

[0020] Gore navedene doze mogu biti za tretman neplodnosti u prvom protokolu stimulacije pacijentkinje (bolesnice). Treba imati na umu da se za dalje cikluse stimulacije, doze mogu podesiti prema stvarnom odgovoru jajnika u prvom ciklusu.

[0021] Podnosioci prijave su otkrili da je generalno neophodno dobiti red veličine devet oocita kako bi se omogućio izbor dva visoko kvalitetna oocita za transfer.

[0022] Podnosioci prijave su ustanovili da je za pacijentkinje koje imaju nizak AMH (AMH <15 pmol/L po litru) potrebna razumno visoka doza rekombinantnog FSH (na primer 12 µg) kako bi se to postiglo. U ovoj dozi, 8 do 14 oocita će biti dobijeno iz 60% ispitanika sa niskim AMH. Ovo je neočekivano i značajno poboljšanje u odnosu na tretman pacijentkinja sa niskim AMH koji su tretirani sa 150 IU Gonal-f, gde je 8 do 14 oocita dobijeno od samo 33% ispitanika. Podnosioci prijave su ustanovili da nema potrebe da se ova doza prilagođava u skladu sa telesnom težinom pacijentkinje.

[0023] Međutim, 60% populacije (i 80% žena mlađih od 30 godina tretiranih zbog neplodnosti) ima visok AMH (to jest, AMH od ≥15 pmol/L). Za ove pacijentkinje generalno je prilično jednostavno da se dobije srednja vrednost od 9 do 11 oocita; problem sa protokolima stimulacije je rizik od OHSS. Podnosioci prijave su otkrili da kod pacijentkinja koje su primali niske doze ljudskog rekombinantnog FSH postoji odnos između oocita i telesne težine pacijentkinje. To znači da postoji rizik povezan sa tretmanom sa fiksnom dozom FSH (što je uobičajeno u struci). Podnosioci predmetne prijave su uspostavili vezu između doze FSH i AMH nivoa i težine pacijentkinje, što pruža poboljšani sigurnosni profil (smanjeni rizik od OHSS) sa prihvatljivim ili poboljšanim dobijanjem oocita u poređenju sa poznatim protokolima tretmana (pogledati primer 10).

[0024] Prema pronalasku, u daljem aspektu, pružen je proizvod (npr. farmaceutski sastav) koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 0,09-0,19 µg (na primer 0,09 do 0,17 µg) rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno, 12 do 16 dana nakon primene GnRH agonista.

[0025] Prema pronalasku, u daljem aspektu, pružen je proizvod (npr. farmaceutski sastav) koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 0,09-0,19 µg (na primer 0,09 do 0,17 µg) rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno, zajedno sa GnRH antagonistom.

[0026] Poželjno tretman neplodnosti obuhvata korak utvrđivanja (npr. merenja) AMH nivoa u serumu kod pacijentkinje i primene doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od 15 pmol/L. U jednom otelotvorenju, proizvod je za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L, i proizvod se primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 0,14 do 0,19 µg ( poželjno 0,15 do 0,16 µg) rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno. U ovom otelotvorenju, tretman neplodnosti može da sadrži korak utvrđivanja (npr. merenja) AMH nivoa u serumu kod pacijentkinje i primene doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L. U još jednom otelotvorenju, proizvod je za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L, i proizvod se primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 0,11 do 0,14 µg (poželjno 0,12 do 0,13 µg) rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno. U ovom otelotvorenju, tretman neplodnosti može obuhvatiti korak određivanja (npr. merenja) AMH nivoa u serumu kod pacijentkinje i primene doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L. U još daljom otelotvorenju, proizvod je za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥35 pmol/L, i proizvod se treba primenjivati u dozi od, ili ekvivalentno, 0,10 do 0,11 µg ljudskog rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno. U ovom otelotvorenju, tretman neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) AMH nivoa u serumu kod pacijentkinje i primene doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od ≥35 pmol/L. Doze pružaju efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS.

[0027] Gore navedene doze mogu biti za tretman neplodnosti u prvom protokolu stimulacije pacijentkinje (bolesnika). Treba imati na umu da se za dalje cikluse stimulacije, doze mogu podesiti prema stvarnom odgovoru jajnika u prvom ciklusu.

[0028] Podrazumeva se da se ove doze mogu lako konvertovati za tretman pacijentkinja sa doziranjem prema njihovom BMI, koristeći konverzije koje su dobro poznate u struci.

[0029] Poželjno rekombinantni ljudski FSH uključuje α2,3- i α2,6-sijalilaciju. Rekombinantni ljudski FSH za upotrebu prema pronalasku može imati 1% do 99% od ukupne sijalilacije koja je α2,3-sijalilacija. Rekombinantni ljudski FSH prema pronalasku može imati 1% do 99% od ukupne sijalilacije koja je α2,6-sijalilacija. Poželjno, 50 do 70%, na primer 60 do 69%, na primer oko 65%, od ukupne sijalilacije je α2,3-sijalilacija. Poželjno je 25 do 50%, na primer 30 do 50%, na primer 31 do 38%, na primer oko 35% od ukupne sijalilacije je α2,6-sijalilacija.

[0030] Poželjno, rekombinantni ljudski FSH uključuje mono-, di-, tri- i tetra-sijalilovane strukture glikana, gde su 15-24%, na primer 17-23% sijalilovanih struktura glikana tetrasijalilovane strukture glikana (npr. kao što je prikazano WAX analizom naelektrisanih glikana, kao što je navedeno u primerima u nastavku). FSH sadrži glikane (vezane za glikoproteine FSH). Dobro je poznato da glikani u FSH mogu da sadrže širok spektar struktura. Oni mogu uključivati kombinacije mono, bi, tri i tetra-antenskih glikana. U ovom tekstu, terminologija kao što je „X% sijalilovanih struktura glikana su tetrasijalilovane strukture glikana“ odnosi se na broj struktura glikana na FSH koje su tetra sijalilovane, tj. nose četiri ostatka sijalinske kiseline, izražene kao procenat (X%) od ukupnog broja struktura glikana na FSH koje su sijalilovane na bilo koji način (nose sijalinsku kiselinu). Prema tome, izraz „15-24% sijalilovanih struktura glikana su tetrasijalilovane strukture glikana“ znači da, od ukupnog broja struktura glikana na FSH koje nose ostatke sijalinske kiseline (to jest, sijalilovane su), 15 do 24% ovih strukture glikana su tetrasijalilovane (nose četiri ostatka sijalinske kiseline).

[0031] Rekombinantni ljudski FSH može biti prisutan kao jedna izoforma ili kao smeša izoforma.

[0032] Podnosioci prijave su osmislili „individualne“ COS protokole u kojima se specifične doze rekombinantnog FSH koje imaju specifične karakteristike koriste za tretman pacijentkinja na osnovu njihovih specifičnih AMH nivoa, čime se povećava verovatnoća adekvatnog odgovora na stimulaciju (npr. kod pacijentkinja koje imaju nizak potencijal odgovora), i/ili smanjen rizik od OHSS (npr. kod pacijentkinja koje su klasifikovani da imaju visok ili prekomeran odgovor).

[0033] Nivo AMH u serumu može se odrediti (npr. meriti) bilo kojim postupkom poznatim u struci. Poželjno je da se nivo AMH u serumu kod meri pomoću AMH Gen-II enzimski vezanog imunosorbentnog testa, komplet (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može detektovati može detektovati koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikovanja od 1,1 pmol/L. Mogu se koristiti i drugi testovi.

1

[0034] Ovde se vrednosti AMH u serumu kod generalno navode u smislu pmol/L. One se mogu konvertovati u ng/mL korišćenjem konverzione jednačine 1ng/ml AMH = 7,1 pmol/L AMH.

[0035] Ovde se izrazi „pacijentkinja“ i „bolesnica“ koriste naizmenično.

[0036] Proizvod (npr. farmaceutski sastav) poželjno sadrži dnevnu dozu, ili dnevnu dozu ekvivalentnu, količinama rekombinantnog ljudskog FSH definisanog iznad, ovde i patentnim zahtevima. (Dnevna) doza može biti početna doza (tj. može se smanjiti, povećati ili održavati tokom tretmana).

[0037] Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za (dnevnu) primenu rekombinantnog ljudskog FSH počevši od prvog dana tretmana u trajanju od sedam do trinaest dana, na primer devet do trinaest dana, na primer 10 do 13 dana, na primer 10 do 11 dana. Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za primenu od 12 do 16, npr.13 do 15, npr.14 dana nakon primene (npr. nakon započinjanja primene, npr. nakon inicijacije dnevne primene) GnRH agonista (npr. Sinarel, Lupron, Decapeptil). Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za primenu sa GnRH agonistom. Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za primenu pre primene antGnRH agonista (npr. ganireliks, cetroreliks), na primer za primenu pet ili šest dana pre primene GnRH antagonista. Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za primenu sa GnRH antagonistom. Poželjno je da se proizvod (npr. farmaceutski sastav) primenjuje pre primene visoke (ovulatorne) doze hCG (na primer 4.000 do 11.000 IU hCG, npr. 5.000 IU hCG, 10.000 IU hCG itd.; ili 150 do 350 mikrogramski rekombinantni hCG, na primer 250 mikrogramski rekombinantnog hCG) kako bi se indukovalo konačno sazrevanje folikula.

[0038] Podrazumeva se da proizvod može biti za doziranje pri učestalosti više (ili manje) nego jednom dnevno, u kom slučaju će odgovarajuće doze biti ekvivalentne (dnevnim) dozama koje su ovde navedene.

[0039] Ovde izraz „tretman neplodnosti“ uključuje tretman neplodnosti kontrolisanom stimulacijom jajnika (COS) ili postupcima koji uključuju korak ili stadijum kontrolisane stimulacije jajnika (COS), na primer Intrauterina inseminacija (IUI), in vitro oplodnja (IVF), ili intracitoplazmatska injekcija sperme (ICSI). Izraz „tretman neplodnosti“ uključuje tretman neplodnosti indukcijom ovulacije (OI) ili postupcima koji uključuju korak ili stadijum indukcije ovulacije (OI). Izraz „tretman neplodnosti“ uključuje tretman neplodnosti kod pacijentkinje koja ima tubularnu ili neobjašnjenu neplodnost, uključujući tretman neplodnosti kod pacijentkinje koja ima endometriozu, na primer stadijum I ili II endometrioze, i/ili kod pacijentkinje koja ima anovulatornu neplodnost, na primer WHO tip II anovulatorne neplodnosti, i/ili pacijentkinje koja ima partnera sa muškim faktorom neplodnosti. Proizvod (ili sastav) može biti za (upotrebu u) tretmanu neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod pacijentkinje koja ima endometriozu, na primer kod pacijentkinje koja ima stadijum I ili II endometrioze, kako je definisano od strane The American Society for Reproductive Medicine (ASRM) klasifikacionog sistema za različite faze endometrioze, (IV faza najteža; I faza najteža) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817 821.].

[0040] Proizvod (sastav) može biti za (upotrebu u) tretmanu neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod pacijentkinje koja ima normalan nivo FSH u serumu od 1 do 16 IU/L, na primer 1 do 12 IU/L, u ranoj folikularnoj fazi.

[0041] Proizvod (sastav) može biti za (upotrebu u) tretmanu neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod pacijentkinje starog od 18 do 42 godine, na primer 25 do 37 godina. Proizvod može biti za (upotrebu) u tretmanu neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod pacijentkinje koja ima BMI> 1 i BMI <35 kg/m<2>, na primer, pacijentkinja koja ima BMI> 18 i BMI <25 kg/m<2>, na primer, pacijentkinja koja ima BMI> 20 i BMI <25 kg/m<2>.

[0042] Rekombinantni ljudski FSH može poželjno uključivati 27 - 33%, na primer 30 - 32%, tri-sijalilovanih struktura glikana. Rekombinantni ljudski FSH može poželjno uključivati 24 -33%, na primer 26 - 30%, di-sijalilovanih struktura glikana. Rekombinantni ljudski FSH može poželjno da sadrži 12 - 21%, na primer, 15 - 17% mono-sijalilovanih struktura glikana.

Rekombinantni ljudski FSH poželjno uključuje mono-sijalilovane, di-sijalilovane, trisijalilovane i tetra-sijalilovane strukture glikana sa relativnim količinama kako sledi: 15 do 17% mono-sijalilovanih; 26 - 30% di-sijalilovanih; 27 - 33% (npr.29 do 32%, npr.30-32%, npr. 30 do 31%) tri-sijalilovanih i 17 - 23% tetra-sijalilovanih (npr. kao što je prikazano WAX analizom naelektrisanih glikana, kako je navedeno u Primerima). Rekombinantni ljudski FSH može uključivati od 0 do 7%, na primer 0,1 do 7%, na primer 3 do 6%, na primer 5 do 6%, neutralne sijalilovane strukture. Rekombinantni ljudski FSH sadrži glikane (vezane za FSH glikoproteine). Ovde, terminologija kao što je „X% mono-sijalilovani“, „X% di-sijalilovani“, „X% tri-sijalilovani“ ili „X% tetra-sijalilovani“ odnosi se na broj struktura glikana na FSH koje su mono-, di, tri ili tetra sijalilovane (respektivno), izraženo kao procenat (X%) ukupnog broja struktura glikana na FSH koje su sijalilovane na bilo koji način (nose sijalinsku kiselinu). Prema tome, izraz „27 - 33% tri-sijalilovanih struktura glikana“ znači da, od ukupnog broja struktura glikana na FSH koje nose ostatke sijalinske kiseline (to jest, sijalilovane su), 27 do 33% ovih struktura glikana su tri sijalilovane (nose tri ostatka sijalinske kiseline).

[0043] Rekombinantni ljudski FSH može imati sadržaj sijalinske kiseline [izražen u odnosu odnosa molova sijalinske kiseline i molova proteina] od 6 mol/mol ili više, na primer između 6 mol/mol i 15 mol/mol, npr.8 mol/mol i 14 mol/mol, na primer između 10 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 11 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 12 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 12 mol/mol i 13 mol/mol. Rekombinantni ljudski FSH može biti proizveden ili eksprimiran u ljudskoj ćelijskoj liniji.

[0044] Rekombinantni ljudski FSH za upotrebu prema pronalasku može imati 1% do 99% od ukupne sijalilacije koja je α2,3-sijalilacija. rFSH može imati 10% ili više od ukupne sijalilacije koja je α2,3-sijalilacija. Na primer, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% ili više ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. rFSH može poželjno uključivati α2,3-sijalilaciju u količini koja je od 50 do 70% od ukupne sijalilacije, na primer od 60 do 69% od ukupne sijalilacije, na primer od 63 do 67%, na primer oko 65% ukupne sijalilacije. FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku može imati 1% do 99% od ukupne sijalilacije koja je α2,6-sijalilacija. rFSH (ili rFSH preparat) pronalaska može imati 5% ili više, na primer 5% do 99%, od ukupne sijalilacije koja je α2,6-sijalilacija. rFSH može imati 50% ili manje od ukupne sijalilacije koja je α2,6-sijalilacija. rFSH može poželjno uključivati α2,6-sijalilaciju u količini koja je od 25 do 50% od ukupne sijalilacije, na primer od 30 do 50% od ukupne sijalilacije, na primer od 31 do 38%, na primer oko 35% ukupne sijalilacije. Pod sijalilacijom se misli na količinu sijalinskih ostataka prisutnih na FSH ugljeno hidratnim strukturama. α2,3-

1

sijalilacija označava sijalilaciju na 2,3 položaju (kao što je dobro poznato u struci) i α2,6 sijalilacija na 2,6 položaju(takođe dobro poznat u struci). Prema tome, „% ukupne sijalilacije može biti α 2,3 sijalilacija“ odnosi se na % od ukupnog broja ostataka sijalinske kiseline prisutnih u FSH koji su sijalilovani na položaju 2,3. Izraz „% od ukupne sijalilacije može biti α2,6-sijalilacija“ odnosi se na % od ukupnog broja ostataka sijalinske kiseline prisutnih u FSH koji su sijalilovani na položaju 2,6.

[0045] Rekombinantni ljudski FSH može imati sadržaj sijalinske kiseline (količina sijalilacije po FSH molekulu) od (na osnovu mase proteina, pre nego mase proteina plus ugljenih hidrata) od 6% ili više (npr. između 6% i 15%, npr. između 7% i 13%, npr. između 8% i 12%, npr. između 11% i 15%, npr. između 12% i 14%) mase.

[0046] Rekombinantni ljudski FSH može biti rFSH ili rFSH preparat u kome 16% ili manje (npr. 0,1 do 16%) glikana sadrži (npr. nosi) bisecirajući N-acetilglukozamin (bisecirajući GlcNAc ili bisGlcNAc). Poželjno je da rFSH (ili rFSH preparat) bude rFSH ili rFSH preparat u kome 8 do 14,5% glikana sadrži (npr. nosi) bisecirajući N-acetilglukozamin (bisecirajući GlcNAc ili bisGlcNAc).

[0047] Podrazumeva se da FSH sadrži glikane vezane za FSH glikoproteine. Takođe će se podrazumevati da se 100% glikana odnosi na ili znači sve glikane vezane za FSH glikoproteine. Tako, ovde, terminologija „8 do 14,5% glikana sadrži (nosi) bisecirajući N-acetilglukozamin“ znači da 8 do 14,5% od ukupnog broja glikana vezanih za FSH glikoproteine uključuje/nosi bisecirajući N-acetilglukozamin; „16% ili manji broj glikana sadrži (nosi) bisecirajući N-acetilglukozamin“ znači da 16% ili manje od ukupnog broja glikana vezanih za FSH glikoproteine uključuje/nosi bisecirajući N-acetilglukozamin, i tako dalje.

[0048] Podnosioci prijave su otkrili da rekombinantni ljudski FSH u kome 16% ili manje (npr. 8 do 14,5%) glikana sadržanih u FSH glikoproteinima nose bisecirajući GlcNAc mogu imati povoljna farmakokinetička svojstva. Veruje se da korisna svojstva mogu nastati zato što je količina glikana koji nose bisecirajući GlcNAc slična onoj u Bravelle ljudskom proizvodu izvedenom iz urina, što je prilično manje nego kod drugih rekombinantnih FSH preparata kao što su oni opisani u WO2012/017058.

[0049] Rekombinantni ljudski FSH može biti rFSH ili rFSH preparat u kome 20% ili više glikana sadrži (npr. nosi) N-acetilgalaktozamin (GalNAc), na primer u kome 20% ili više glikana sadrži (npr. nosi) terminalni GalNAc. Poželjno, rFSH (ili rFSH preparat) je preparat FSH ili FSH u kome 40 do 55%, na primer 42% do 52%, glikana obuhvataju (npr. nose) GalNAc. Poželjno, rFSH (ili rFSH preparat) je preparat FSH ili FSH u kome 40 do 55%, na primer 42% do 52%, glikana obuhvataju (npr. nose) terminalni GalNAc.

[0050] Podrazumeva se da FSH sadrži glikane vezane za FSH glikoproteine. Takođe će se podrazumevati da se 100% glikana odnosi na ili znači sve glikane vezane za FSH glikoproteine. Tako, ovde, terminologija „gde 20% ili više glikana sadrži (npr. nosi) GalNAc“ znači da 20% ili više od ukupnog broja glikana vezanih za FSH glikoproteine uključuje/nosi N-acetilgalaktozamin (GalNAc); „40 do 55%, na primer 42% do 52%, glikana čine (npr. nose) terminalni GalNAc“ znači da je 40 do 55%, na primer 42% do 52%, od ukupnog broja glikana vezanih za FSH glikoproteini uključuju/nose terminalni GalNAc, i tako dalje.

[0051] Čini se da dostupnost α2,6-veze povećava broj tetrasijalilovanih struktura, u poređenju sa CHO ćelijama izvedenim proizvodima koji imaju samo α2,3-vezu. Podnosioci prijave su takođe otkrili da se njihov rekombinantni ljudski FSH razlikuje od drugih odobrenih proizvoda zbog sastava šećera: on uključuje, ili može uključivati, specifičnu količinu GalNac. Ovo može biti povezano sa tetrasijalilacijom i potencijom, jer je 2,6-sijalilacija povezana sa GalNac. Drugim rečima, podnosioci predmetne prijave su razvili rFSH proizvod koji uključuje specifične karakteristike (2,6-veznik mesta, GalNac) koji pružaju rFSH sa visokim stepenom sijalilacije, što izgleda da dovodi do poboljšane jačine in vivo.

[0052] Rekombinantni ljudski FSH može imati 16 do 24% glikana koji sadrže (npr. terminalno) 1 fukozu-lewis, na primer 16,5 do 18% glikana koji sadrže (npr. terminalno) 1 fukozu-lewis. Rekombinantni ljudski FSH može imati 1,5 do 4,5%, na primer 2 do 4%, na primer 3,7%, glikana koji sadrže (npr. terminalno) 2 fukozu-lewis. Sadržaj fukoza-lewis može uticati na potenciju.

[0053] Rekombinantni ljudski FSH može biti proizveden ili eksprimiran u ljudskoj ćelijskoj

1

liniji, na primer Per.C6 ćelijskoj liniji, HEK293 ćelijskoj liniji, HT1080 ćelijskoj liniji itd. Ovo može pojednostaviti (i učiniti efikasnijim) postupak proizvodnje zato što je manipulacija i kontrola, npr. medijuma za rast ćelija kako bi se se zadržala sijalilacija, mogu biti manje kritični nego kod poznatih procesa. Postupak može takođe biti efikasniji jer je proizvedeno malo osnovnog rFSH u poređenju sa proizvodnjom poznatih proizvoda rFSH; proizvodi se kiseliji rFSH i odvajanje/uklanjanje baznog FSH je manje problematično. Rekombinantni ljudski FSH može biti proizveden ili eksprimiran u PER.C6® ćelijskoj liniji, ćelijskoj liniji izvedenoj iz PER.C6® ili modifikovanoj PER.C6® ćelijskoj liniji. rFSH koji se proizvodi ili eksprimira u ljudskoj ćelijskoj liniji (npr. PER.C6® ćelijskoj liniji, HEK293 ćelijskoj liniji, HT1080 ćelijskoj liniji itd.) će uključivati neke α2,6-vezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) pružene endogenom aktivnošću sijalil transferaze [ćelijske linije] i uključiće neke α2,3-vezane sijalinske kiseline (α2,3 sijalilacija) pružene endogenom aktivnošću sijalil transferaze. Ćelijska linija može biti modifikovana korišćenjem α2,3-sijaliltransferaze.

Ćelijska linija može biti modifikovana korišćenjem α2,6-sijaliltransferaze. Alternativno ili dodatno, rFSH može uključivati α2,6-povezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) pružene endogenom aktivnošću sijalil transferaze [ćelijske linije]. Ovde, izraz „ljudski rekombinantni FSH“ označava rekombinantni FSH koji se proizvodi ili eksprimira u ljudskoj ćelijskoj liniji (npr. rekombinantni FSH napravljen inženjeringom ljudske ćelijske linije).

[0054] Rekombinantni ljudski FSH se može proizvesti upotrebom α2,3- i/ili α2,6-sijaliltransferaze. U jednom primeru, rFSH se proizvodi korišćenjem α2,3-sijaliltransferaze. Rekombinantni ljudski FSH može uključivati α2,6-vezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) pružene endogenom aktivnošću sijalil transferaze.

[0055] Proizvod može biti farmaceutski sastav. Farmaceutski sastav je za tretman neplodnosti. Tretman neplodnosti može uključivati tehnologije asistirane reprodukcije (ART), indukciju ovulacije ili intrauterinsku inseminaciju (IUI). Farmaceutski sastav se može koristiti, na primer, u medicinskim indikacijama gde se koriste poznati FSH preparati.

[0056] Proizvod ili sastav može biti formulisan u dobro poznate sastave za bilo koji put primene leka, npr. oralni, rektalni, parenteralni, transdermalni (npr. tehnologija flastera), intravenozni, intramuskularni, subkutani, intrasusternalni, intravaginalni, intraperitonealni, lokalni (prašci, masti ili kapi) put, ili kao bukalni ili nazalni sprej. Tipično sastav sadrži

1

farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je vodeni rastvor, neotrovne ekscipijente, uključujući soli i konzervanse, pufere i slično, kao što je opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences petnaesto izdanje (Matt Publishing Company, 1975), na stranicama 1405 do 1412 i 1461 - 87, i national formulary XIV četrnaesto izdanje (American Pharmaceutical Association, 1975), između ostalog.

[0057] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih farmaceutskih nosača, razblaživača, rastvarača ili vehikula uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično), karboksimetilcelulozu i njihove pogodne smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje) i injekcione organske estre kao što je etil oleat. Sastavi predmetnog pronalaska mogu takođe da sadrže aditive kao što su, ali nisu ograničeni na, konzervanse, agense za vlaženje, emulgatore, surfaktante i disperzione agense. Antibakterijski i antifungalni agensi mogu biti uključeni da spreče rast mikroba i uključuju, na primer, mkrezol, benzil alkohol, paraben, klorobutanol, fenol, sorbinsku kiselinu i slično. Ako je uključen konzervans, poželjni su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol; međutim, konzervans ni na koji način nije ograničen na ove primere. Pored toga, može biti poželjno uključiti izotonične agense kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Proizvod ili sastav može dalje da sadrži so koja sadrži farmaceutski prihvatljiv katjon alkalnog metala izabran iz grupe koja se sastoji od Na+- ili K+- soli, ili njihove kombinacije. Poželjno je da je so Na+- so, na primer NaCl ili Na2SO4.

[0058] Poželjno, proizvod ili sastav sadrži rekombinantni FSH i jedan ili više iz grupe koju čine polisorbat 20, L-metionin, fenol, dinatrijum sulfat i natrijum fosfatni pufer.

[0059] U nekim slučajevima, kako bi se izvršilo produženo dejstvo poželjno je usporiti apsorpciju FSH (i drugih aktivnih sastojaka, ako su prisutni) iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom rastvorljivošću u vodi. Brzina apsorpcije FSH zatim zavisi od brzine rastvaranja koja, sa svoje strane, može zavisiti od veličine kristala i oblika kristala. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjene FSH kombinacije se postiže rastvaranjem ili suspendovanjem FSH kombinacije u uljanom nosaču. Depo injekcioni oblici mogu biti napravljeni formiranjem matrica mikrokapsula FSH (i drugih agenasa, ako su prisutni) u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa FSH

1

prema polimeru i prirode određenog primenjenog polimera, može se kontrolisati brzina oslobađanja FSH. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju polivinilpirolidon, poli(ortoestere), poli(anhidride) itd. Depo injekcione formulacije se takođe pripremaju tako što se FSH uvode u liposome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

[0060] Injekcione formulacije mogu se sterilisati, na primer, filtracijom kroz filter za zadržavanje bakterija, ili ugradnjom sterilizacionih sredstava u obliku sterilnih čvrstih sastava koji se mogu rastvoriti ili raspršiti u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injekcionom medijumu neposredno pre upotrebe. Injekcione formulacije mogu se isporučiti u bilo kom pogodnom kontejneru, npr. bočici, napunjenom špricu, injekcionom kertridžu i slično.

[0061] Proizvod ili sastav mogu biti formulisani za jednokratnu upotrebu ili za višestruku upotrebu (višestruka doza). Ako je proizvod ili sastav formulisana za višestruku upotrebu, poželjno je da je konzervans uključen. Ako je konzervans uključen, poželjni su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol; međutim, konzervans ni na koji način nije ograničen na ove primere. Formulisani proizvod ili sastav za jednokratnu upotrebu ili višestruku upotrebu može dalje da sadrži so koja sadrži farmaceutski prihvatljiv katjon alkalnog metala izabran iz grupe koja se sastoji od Na<+>- ili K<+>- soli, ili njihove kombinacija. Poželjno je da je so Na+- so, na primer NaCl ili Na2SO4.

[0062] Proizvod ili sastav može biti uključena u kontejner kao što je bočica, prethodno napunjeni kertridž (npr. za jednokratnu primenu ili višestruku upotrebu) ili injekciona naprava kao što je „olovka“ za npr. primenu višestrukih doza.

[0063] Proizvod ili sastav može biti formulacija (npr. injekciona formulacija) uključujući rekombinantni ljudski FSH (opciono sa hCG, LH, LH aktivnost itd.) LH aktivnost, ako je prisutna, može poticati od LH ili ljudskog horionskog gonadotrofina, hCG. Ako postoji više od jednog aktivnog sastojka (tj. FSH i npr. HCG ili LH), oni mogu biti pogodni za primenu odvojeno ili zajedno. Ako se primenjuju odvojeno, primena može biti sekvencijalna. Proizvod se može isporučiti u odgovarajućem pakovanju. Na primer, proizvod može da sadrži broj kontejnera (npr. napunjene špriceve ili bočice) koji sadrže ili FSH ili hCG, ili kombinaciju (ili kombinaciju) i FSH i hCG. HCG može biti rekombinantni hCG ili urinarni hCG. Ako proizvod sadrži određeni broj kontejnera (npr. napunjene špriceve ili bočice) koji sadrže FSH,

1

npr. rekombinantni FSH, svaki kontejner može uključiti istu količinu FSH. Jedan ili više kontejnera mogu uključivati različite količine FSH. Špricevi ili bočice mogu biti upakovane u blister pakovanje ili na drugi način za održavanje sterilnosti. Bilo koji proizvod može opciono da sadrži instrukcije za upotrebu formulacija FSH (i npr. HCG ako su prisutne). pH i tačna koncentracija različitih komponenti farmaceutskog sastava se podešavaju u skladu sa rutinskom praksom u ovoj oblasti. Pogledati GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th ed. U poželjnom otelotvorenju, sastavi pronalaska se dobijaju kao sastavi za parenteralnu primenu. Opšti postupci za pripremu parenteralnih formulacija su poznati u struci i opisani su u REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, na stranama 780-820. Parenteralni sastavi se mogu isporučiti u tečnoj formulaciji ili kao čvrsta supstanca koja će biti pomešana sa sterilnim injekcionim medijumom neposredno pre primene. U naročito poželjnom otelotvorenju, parenteralni sastavi se isporučuju u jediničnom doznom obliku za laku primenu i uniformnost doziranja.

Detaljan opis pronalaska

[0064] Predmetni pronalazak će sada biti detaljnije opisan u vezi sa priloženim crtežima u kojima:

Slika 1 prikazuje plazmidnu mapu pFSHalfa/beta vektora eksprimiranja;

Slika 2 prikazuje vektor eksprimiranja α2,3-sijaliltransferaze (ST3GAL4);

Slika 3 prikazuje vektor eksprimiranja α2,6-sijaliltransferaze (ST6GAL1);

Slika 4 prikazuje raspodelu sijalinske kiseline u odnosu na količinu rekombinantnog FSH proizvedenog pomoću PER.C6® ćelija koje stabilno eksprimiraju FSH nakon inženjeringa sa α2,3-sijaliltransferazom;

Slika 5 prikazuje procenat gustine raspodele punjenja glikana u primerima rekombinantnog FSH proizvedenog pomoću PER.C6® ćelija koje stabilno eksprimiraju FSH nakon inženjeringa sa α2,3-sijaliltransferazom;

Slika 6 prikazuje poređenje koncentracije inhibina-B nakon primene 225IU Gonal f (donja linija, tačkasta linija) i 225 IU iz Primera (gornja linija, puna linija) pronalaska; Slika 7 prikazuje efekat telesne težine na oocite dobijene u grupi za tretman sa niskim AMH (Primer 10, 10A); i

Slika 8 prikazuje efekat telesne težine na oocite dobijene u grupi za tretman sa visokim AMH

1

Odabir sekvenci

Ljudski FSH

[0065] Kodirajući region gena za FSH alfa polipeptid je korišćen prema Fiddes i Goodman. (1981). Sekvenca je označena kao AH007338 i u vreme izgradnje nije bilo drugih varijanti ove proteinske sekvence. Sekvenca se ovde navodi kao SEQ ID NO: 1.

[0066] Kodirajući region gena za FSH beta polipeptid je korišćen prema Keene i dr (1989). Sekvenca je označena kao NM_000510 i u vreme izgradnje nije bilo drugih varijanti ove proteinske sekvence. Sekvenca se ovde navodi kao SEQ ID NO: 2

Sijaliltransferaza

[0067] α2,3-sijaliltransferaza - Kodirajući region gena za beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferazu 4 (α2,3-sijaliltransferaza, ST3GAL4) je korišćen prema Kitagawa i Paulson (1994). Sekvenca je označena kao L23767 i ovde se navodi kao SEQ ID NO: 3.

[0068] α2,6-sijaliltransferaza - Kodirajući region gena za beta-galaktosamid alfa-2,6-sijaliltransferazu 1 (α2,6-sijaliltransferaza, ST6GAL1) je korišćen prema Grundmann i dr. (1990). Sekvenca je označena kao NM_003032 i ovde se navodi kao SEQ ID NO: 4.

PRIMERI

Primer 1 Konstrukcija FSH vektora eksprimiranja

[0069] Kodirajuća sekvenca FSH alfa polipeptida (AH007338, SEQ ID NO: 1) i FSH beta polipeptida (NM_003032, SEQ ID NO: 2) je amplifikovana pomoću PCR koristeći kombinacije prajmera FSHa-fw i FSHa-rev i FSHb-fw i FSHb -rec respektivno.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (SEQ ID NO:9)

FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (SEQ ID NO:10) FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 11)

FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 12)

2

[0070] Dobijena amplifikovana FSH beta DNK je digestirana sa restrikcionim enzimima AscI i HpaI i umetnuta je na AscI i HpaI mesta na CMV usmerenom sisarskom vektoru eksprimiranja koji nosi selekcioni marker neomicina. Slično tome, FSH alfa DNK je digestirana sa BamHI and NheI i umetnuta je na BamHI i NheI mesta na vektoru eksprimiranja koji već sadrži FSH beta polipeptidnu DNK.

[0071] Vektorska DNK je korišćena za transformaciju DH5α soja E.coli. Kolonije su odabrane za amplifikaciju. Kolonije koje sadrže vektor koji sadrži i FSH alfa i beta su odabrane za sekvenciranje i sve su sadržale ispravne sekvence prema SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Plazmid pFSH A+B#17 je izabran za transfekciju (Slika 1).

Primer 2 Konstrukcija ST3 vektora eksprimiranja

[0072] Kodirajuća sekvenca beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferaze 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) je amplifikovana pomoću PCR koristeći kombinaciju prajmera 2,3STfw i 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 13)

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 14)

[0073] Dobijena amplifikovana ST3 DNK je digestirana sa restrikcionim enzimima BamHI and AflII i umetnuta je na BamHI and AflII mesta na CMV usmerenom sisarskom vektoru eksprimiranja koji nosi marker otpornosti na higromicin. Vektor je amplifikovan kao što je prethodno opisano i sekvencirano. Klon pST3#1 (Slika 2) sadrži ispravnu sekvencu prema SEQ ID NO: 3 i odabran je za transfekciju.

Primer 3 Konstrukcija ST6 vektora eksprimiranja

[0074] Kodirajuća sekvenca beta-galaktosamida alfa-2,6-sijaliltransferaze 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) je amplifikovana pomoću PCR koristeći kombinaciju prajmera 2,6STfw i 2,6STrev.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (SEQ ID NO: 15)

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 16)

[0075] Rezultujuća amplifikovana ST6 DNK je digestirana sa restrikcionim enzimima BamHI and AflII i umetnuta je na BamHI and AflII mesta na CMV usmerenom sisarskom vektoru eksprimiranja koji nosi marker otpornosti na higromicin. Vektor je amplifikovan kao što je prethodno opisano i sekvencirano. Klon pST6#11 (Slika 3) sadrži ispravnu sekvencu prema SEQ ID NO: 4 i izabran je za transfekciju.

Primer 4 Stabilno eksprimiranje pFSH α+β u PER.C6® ćelijama. Izolacija transfekcije i skrining klonova.

[0076] PER.C6® klonovi koji proizvode FSH su generisani eksprimiranjem oba polipeptidna lanca FSH iz jednog plazmida (pogledati Primer 1).

[0077] Kako bi se dobili stabilni klonovi, agens za transfekciju na bazi liposoma sa pFSH α+β konstruktom. Stabilni klonovi su odabrani u VPRO uz dodatak 10% FCS i sadrže G418. Tri nedelje nakon transfekcije klonovi otporni na G418 su porasli. Klonovi su odabrani za izolaciju. Izolovani klonovi su kultivisani u selekcionom medijumu do 70-80% konfluentnosti. Supernatanti su testirani na sadržaj FSH proteina korišćenjem FSH selektivne ELISA i na farmakološku aktivnost na FSH receptoru u kloniranoj ćelijskoj liniji, korišćenjem cAMP akumulacionog testa. Klonovi koji eksprimiraju funkcionalni protein su napredovali za ekspanziju kulture na 24 komorica, 6 komorica i T80 bocama.

[0078] Studije za određivanje produktivnosti i kvaliteta materijala iz sedam klonova započete su u T80 bocama kako bi se dobio dovoljan materijal. Ćelije su kultivisane u dopunjenom medijumu kao što je prethodno opisano za 7 dana i supernatant je sakupljen. Produktivnost je određena korišćenjem FSH selektivne ELISA. Izoelektrični profil materijala određen je izoelektričnim fokusiranjem (IEF), postupcima poznatim u struci. Klonovi sa dovoljnom produktivnošću i kvalitetom izabrani su za inžinjering sijaliltransferaze.

Primer 5 Nivo sijalilacije je povećan u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju α2,3-sijaliltransferazu. Stabilnu eksprimiranje pST3 u PER.C6® ćelijama koje eksprimiraju; Izolacija transfekcije i skrining klonova.

0079] PER.C6® klonovi koji proizvode visoko sijalilovani FSH su generisani eksprimiranjem α2,3 sijalil-transferaze iz odvojenih plazmida (Primer 2) u PER.C6® ćelijama koje već eksprimiraju oba polipeptidna lanca FSH (iz Primera 4). Klonovi proizvedeni iz PER.C6® ćelijmaa kako je prikazano u Primeru 4 su odabrani zbog svojih karakteristika uključujući produktivnost, dobar profil rasta, proizvodnju funkcionalnog proteina, i proizvedeni FSH koji je uključivao neku sijalilaciju. Stabilni klonovi su generisani kao što je prethodno opisano u Primeru 4. Klonovi su izolovani, ekspandirani i analizirani. Klonovi α2,3-sijaliltransferaze su prilagođeni medijumima bez seruma i uslovima suspenzije.

[0080] Kao i ranije, klonovi su testirani korišćenjem FSH selektivne ELISA, funkcionalni odgovor u FSH receptorskoj ćelijskoj liniji, IEF, brzini metaboličkog klirensa i Steelman Pohley analizi. Rezultati su upoređeni sa komercijalno dostupnim rekombinantnim FSH (Gonal-f, Serono) i roditeljskim FSH PER.C6® ćelijskim linijama. FSH proizveden od većine klonova je značajno poboljšao sijalilaciju (tj. u proseku više izoformi FSH sa visokim brojem sijalinskih kiselina) u poređenju sa FSH eksprimiranim bez α2,3-sijaliltransferaze. U zaključku, eksprimiranje FSH zajedno sa sijalil-transferazom u PER.C6® ćelijama rezultovalo je povećanim nivoima sijalilovanog FSH u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju samo FSH.

Primer 6 Pregled proizvodnje i prečišćavanja

[0081] Razvijena je procedura za proizvodnju FSH u PER.C6® ćelijama koje su kultivisane u suspenziji u medijumu bez seruma. Postupak je opisan u nastavku i primenjen je na nekoliko linija FSH koje proizvode PER.C6® ćelijske ćelije.

[0082] FSH iz α2,3-klona (Primer 5) je pripremljen upotrebom modifikacije postupka opisanog od strane od Lowry i dr. (1976).

[0083] Za proizvodnju PER.C6-FSH, ćelijske linije su prilagođene medijumu bez seruma, tj., Excell 525 (JRH Biosciences). Ćelije su prvo kultivisane kako bi se formiralo 70% -90% konfluentnog monosloja u T80 kultivacionoj posudi. Posle prolaza, ćelije su ponovo suspendovane u medijumu bez seruma, Excell 525 4 mM L-glutamin, do gustine ćelija od 0,3x10<6>ćelija/ml. Suspenzija ćelija od 25 ml je stavljena u posudu za mućkanje od 250 ml i mućkana na 100 o/min na 37°C pri 5% CO2. Nakon postizanja gustine ćelija> 1x10<6>ćelije/ml,

2

ćelije su subkultivisane do gustine ćelija od 0,2 ili 0,3x10<6>ćelija/ml i dalje kultivisane u posudama za mućkanje na 37°C, 5% CO2i 100 o/min.

[0084] Za proizvodnju FSH, ćelije su prebačene u proizvodni medijum bez seruma, tj. VPRO (JRH Biosciences), koji podržava rast PER.C6® ćelija do veoma visokih gustina ćelija (obično> 10<7>ćelija/ml u kulturi serije). Ćelije su prvo kultivisane do> 1x10<6>ćelija/ml u Excell 525, zatim centrifugirane tokom 5 min na 1000 o/min i zatim suspendovane u VPRO medijumu 6 mM L-glutamina do gustine od 1x10<6>ćelija/ml. Ćelije su zatim kultivisane u posudi za mućkanje 7-10 dana na 37°C, 5% CO2i 100 o/min. Tokom ovog perioda, ćelije su rasle do gustine > 10<7>ćelija/ml. Medijum za kulturu je sakupljen nakon što je vijabilnost ćelija počela da opada. Ćelije su centrifugirane 5 minuta na 1000 o/min i supernatant je korišćen za kvantifikaciju i prečišćavanje FSH. Koncentracija FSH je određena pomoću ELISA (DRG EIA 1288).

[0085] Nakon toga, prečišćavanje FSH je izvedeno korišćenjem modifikacije postupka opisane od strane Lowry i dr. (1976). Prečišćavanje upotrebom selektivne hromatografije je izvršeno kako bi se obogatili visoko sijalilovani oblici postupcima koji su dobro poznati u struci.

[0086] Tokom svih hromatografskih postupaka, obogaćivanje sijalilovanih oblika FSH kako je ovde zahtevano potvrđeno je pomoću RIA (DRG EIA 1288) i/ili IEF.

Primer 7 Kvantifikacija relativnih količina α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline

[0087] Relativne procentualne količine α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline na prečišćenom rFSH (Primer 6) su merene korišćenjem poznatih tehnika.

[0088] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGaze F u denaturativnim uslovima i zatim obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Otpušteni oblici glikana su zatim razdvojeni i analizirani pomoću kolone razmene slabih anjona (Weak Anion Exchange - WAX) za određivanje raspodele naelektrisanja. Označeni glikani tretirani sa 2,3,6,8 sijalidazom za određivanje ukupne sijalinske kiseline i 2,3 sijalidazom za određivanje 2,3 sijalinske kiseline, dalje su analizirani wax kolonom.

[0089] Relativni procenti naelektrisanih glikana su izračunati iz struktura prisutnih u nedigestiranim i digestiranim glikanskim bazenima i prikazane su na Slici 4 (za 8 uzoraka). Otkriveno je da su u rasponu 50% - 70% (npr. oko 60% ili 65%) za α2,3 sijalilaciju i 28 do 50%, uglavnom 30 do 35% (npr. oko 31% ili 35%), za α2,6 sijalilaciju.

Primer 8: Kvantifikacija relativnih količina mono, di, tri i tetrasijalilovanih struktura glikana

[0090] Relativne procentualne količine mono, di, tri i tetra sijalilovanih struktura na glikanima ekstrahovanim iz prečišćenog rFSH (Primer 6) merene su korišćenjem poznatih tehnika.

[0091] N Glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGaze F u denaturativnim uslovima i zatim su obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGaze F u denaturativnim uslovima i zatim obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Oslobođeni oblici glikana su zatim odvojeni i analizirani pomoću kolone razmene slabih anjona (Weak Anion Exchange - WAX) za određivanje distribucije sijalilacije. Relativne količine neutralnih, mono-sijalilovanih, di-sijalilovanih, tri-sijalilovanih i tetra-sijalilovanih struktura prikazane su na Slici 5 (za 8 uzoraka prikazanih na Slici 4).

[0092] rFSH uključuje neutralne, mono-sijalilovane, di-sijalilovane, tri-sijalilovane i tetrasijalilovane strukture glikana s relativnim količinama kako sledi: neutralne 5-6%; 15-17% mono-sijalilovane; 26-30% di-sijalilovane; 30-32% tri- sijalilovane i 17-23% tetrasijalilovane.

Primer 8a

[0093] Relativne procentualne količine α2,6 sijalinske kiseline na prečišćenom rFSH ekstrahovanom od devet uzoraka prečišćenog rFSH (proizvedenog postupcima iz Primera 6) merene su korišćenjem poznatih tehnika.

[0094] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGaze F u denaturativnim uslovima i zatim obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Otpušteni oblici glikana su zatim razdvojeni i analizirani pomoću kolone razmene slabih anjona (Weak Anion Exchange - WAX) za

2

određivanje raspodele naelektrisanja. Označeni glikani tretirani sa 2,3,6,8 sijalidazom za određivanje ukupne sijalinske kiseline i 2,3 sijalidazom za određivanje 2,3 sijalinske kiseline, dalje su analizirani wax kolonom (pogledati Primer 8). Analiza omogućava proračun α2,6 sijalinske kiseline.

[0095] Relativni procenti naelektrisanih glikana su izračunati iz struktura prisutnih u nedigestiranim i digestiranim glikanskim bazenima i prikazane su u sledećoj tabeli. Otkriveno je da su u rasponu od 25 do 50%, uglavnom 30 do 35% za α2,6 sijalilaciju.

[0096] Relativne procentualne količine bisecirajućih GlcNac, GalNac i 1-Fukoza Lewis na glikanima ekstrahovanim od devet uzoraka prečišćenog rFSH (proizvedenih postupcima iz Primera 6) su merene korišćenjem poznatih tehnika. N-glikani su oslobođeni iz glikoprotreina upotrebom PNGaze F i obeleženi sa 2-aminobenzamidom (2AB). Analiza je izvršena dvodimenzionalnom (2D) HPLC analizom u kombinaciji sa enzimskom degradacijom glikana. Za verifikaciju, glikani su analizirani pomoću MALDI-MS. Relativne količine alfa 2,6-sijalinske kiseline i terminalnih ostataka prikazane su u sledećoj tabeli, zajedno sa onim za Gonal F (rekombinantni FSH iz CHO ćelija) i Bravelle (ljudski) urinarni FSH).

2

[0097] Može se primetiti da količina GalNac u FSH pronalaska varira između oko 44,9 i 51%, u proseku oko 47,1%.

[0098] Može se primetiti da količina bisecirajućeg GlcNac u FSH pronalaska varira između 8,7 i 13,9%, prosečno približno 10,9%.

[0099] Može se primetiti da količina 1 Fukoze Lewis-a u FSH pronalaska varira između 16,1 i 23,3%, prosečno približno 19%.

[0100] Može se primetiti da količina 2 Fukoze Lewis-a u FSH pronalaska varira između 1,9 i 4,4%, prosečno približno 3,7%.

Primer 9 - Studija višestruke doze koja istražuje sigurnost, podnošljivost, farmakokinetiku, farmakodinamiku i imunogenost FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

Populacija studije

[0101] Ukupno 48 (24 za svaki lek) zdravih žena primalo je dnevne doze od 14,6 µg FE 999049 (sastav prema pronalasku, proizveden prema Primeru 6) ili 16,5 µg Gonal-F tokom sedam dana.

Sigurnosni rezultati

[0102] Primena višestrukih doza FE 999049 i GONAL-F bila je bezbedna i generalno dobro tolerisana prema proceni neželjenih događaja (AE), vitalnih znakova, EKG, kliničkih laboratorijskih merenja i fizičkog pregleda. Tokom studije nije bilo ozbiljnih neželjenih događaja ili smrti.

Farmakokinetički rezultati

[0103] Nakon primene FE 999049 i GONAL-F tokom 7 dana, vrednosti koncentracije FSH koje su procenjene neposredno pre sledeće injekcije su se povećale i činilo se da su dostigle stabilan nivo nakon 6-7 dana. Međutim, izloženost (AUC i Cmax) FE 999049 bila je 60% veća u odnosu na Gonal-F.

2

Farmakodinamički rezultati

[0104] Koncentracije inhibina-B (pogledati Sliku 6), estradiola i progesterona su se povećale nakon primene FE 999049 i GONAL-F, međutim u većoj meri nakon primene FE 999049 u poređenju sa GONAL-F. I broja i raspodela veličine folikula pokazali su veći odgovor na FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

[0105] Primer 9 pokazuje da FSH ima specifičnu količinu (17-23%) tetra-sijalilovanih struktura glikana i npr. specifične količine α2,3 sijalilacije i α2,6 sijalilacije su izrazito jače od rekombinantnih FSH proizvoda koji su trenutno na tržištu.

Primer 10 - Studija višestrukih doza koja istražuje FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

[0106] U nastavku je opisana randomizovana, kontrolisana, slepa, sa paralelnim grupama, multinacionalna, multicentrična studija koja procenjuje doza-odgovor odnos FE 999049 kod pacijentkinja koje su podvrgnuti kontrolisanoj stimulaciji jajnika za in vitro oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI). Populacija pacijentkinja bila je 265 IVF pacijentkinja u starosti od 18 do 37 godina, sa BMI 18,5 do 32,0 kg/m<2>.

Ispitivanje je osmišljeno kao ispitivanje doze-odgovora sa brojem oocita dobijenih kao primarna krajnja tačka. Sekundarne krajnje tačke će istražiti kvalitativni i kvantitativni uticaj različitih doza FE 999049 u odnosu na endokrini profil, razvoj folikula, oplodnju oocita, kvalitet embriona i efikasnost tretmana (tj. ukupnu potrošnju gonadotrofina i trajanje stimulacije). Ispitivanje je osmišljeno da proceni efikasnost FE 999049 kako bi se utvrdila trudnoća kada se koristi u kontrolisanoj stimulaciji jajnika za IVF/ICSI cikluse.

[0107] Pacijentkinje su procenjene u roku od 3 meseca pre randomizacije zbog usaglašenosti sa kriterijumima za uključivanje i isključivanje, uključujući procenu antimilerijanskog hormona (AMH) za povećanje homogenosti ispitivane populacije u odnosu na odgovor jajnika i minimizovanje broja potencijalno loših i hiper-odgovora na FE 999049 dozu i GONAL-F dozu koja se koristi u ispitivanju. AMH procena je merena korišćenjem AMH Gen-II enzimski vezanog imunosorbentnog test kompleta (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može detektovati koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikovanja od 1,1 pmol/L.

2

[0108] Na dan 2-3 menstrualnog ciklusa, pacijentkinje su randomizovane u modalitetu 1:1:1:1:1:1 na tretman sa ili 90 IU, 120 IU, 150 IU, 180 IU ili 210 IU FE 999049 ili 150 IU GONAL-F i stimulacija jajnika je otpočela. Randomizacija je stratifikovana prema nivou AMH pri skriningu [5,0-14,9 pmol/L (nizak AMH) i 15,0 do 44,9 pmol/L (visok AMH)).

[0109] Gonal-F se popunjava masom (FbM) po FDA zahtevu; stoga se odnosi na µg dozu. Oznaka Gonal-F ukazuje na 600 IU/44 µg, što ukazuje da je 150 IU 11 µg. Međutim, postoje neke varijacije i sertifikat serije za ovo ispitivanje je pokazao da je 11,3 µg Gonal-F ekvivalentno 150 IU. Doze FE999049 su prikazane sadržajem proteina (µg), pre nego biološkom aktivnošću. Tako su doze FE999049 bile 5,2 µg (90 IU), 6,9 µg (120 IU), 8,6 µg (150 IU), 10,3 µg (180 IU) ili 12,1 µg (210 IU).

[0110] Podela i raspodela doze su sledeći (podaci su broj pacijentkinja):

Tabela 1

[0111] Nivo dnevne FE 999049 ili GONAL-F doze je fiksiran tokom čitavog perioda stimulacije. Tokom stimulacije, pacijentkinje se prate na dan 1, 4 i 6 stimulacije, i kasnije najmanje svakog drugog dana. Kada se primete 3 folikule od ≥15 mm, posete se obavljaju svakodnevno. Pacijentkinje se tretiraju sa FE 999049 ili GONAL-F maksimalno 16 dana.

[0112] Kako bi se sprečio preuranjeni LH rast, GnRH antagonist (ganireliks acetat, ORGALUTRAN, MSD/Schering-Plough) može biti iniciran na dan stimulacije 6 u dnevnoj

2

dozi od 0,25 mg i nastavljen tokom perioda stimulacije. Pokretanje konačnog folikularnog sazrevanja vrši se na dan kada se primeti ≥3 folikula prečnika ≥17 mm. Ako postoji <25 folikula prečnika ≥12 mm, primenjuje se 250 µg rekombinantnog hCG (horiogonadotrofin alfa, OVITRELLE, Merck Serono/EMD Serono). Ako postoji 25-35 folikula prečnika ≥12 mm, primenjuje se 0,2 mg GnRH agonista (triptorelin acetat, DECAPEPTIL/GONAPEPTIL, Ferring Pharmaceuticals). U slučaju prevelikog odgovora jajnika, definisanog kao >35 folikula prečnika ≥12 mm, tretman se poništava. U slučaju lošeg odgovora jajnika, definisanog kao <3 folikula sa prečnikom> 10 mm posmatranim na dan stimulacije 10, ciklus se može poništiti.

[0113] Povlačenje oocita se odvija 36 sati (± 2 sata) nakon okidanja konačnog folikularnog sazrevanja i oocita oplođenih sa IVF i/ili ICSI. Oplodnja i razvoj embriona se procenjuju od preuzimanja oocita do dana prenosa. Za pacijentkinje koje su podvrgnuti završnom folikularnom sazrevanju sa hCG, jedan blastocist najboljeg dostupnog kvaliteta se prenosi na dan 5 nakon uzimanja oocita, dok se preostali blastocisti zamrzavaju. Za pacijentkinje koje se podvrgavaju završnom folikularnom sazrevanju sa agonistom GnRH, prenos embriona se ne odvija u svežem ciklusu i blastocisti se umesto toga zamrzavaju na dan 5. Vaginalne tablete progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 100 mg 3 puta dnevno se pružaju kao podrška od dana nakon preuzimanja oocita do dana posete usled kliničke trudnoće. Ispitivanje βhCG vrši se 13-15 dana nakon prenosa embriona i klinička trudnoća će se potvrditi transvaginalnim ultrazvukom (TVU) 5-6 nedelja nakon transfera embriona.

Rezultati

[0114] Broj dobijenih oocita (primarna krajnja tačka) je prikazan u sledećoj tabeli.

Tabela 2

[0115] Primarni cilj je ispunjen: utvrđen je značajan doza-odgovor odnos za FE 999049 u odnosu na broj dobijenih oocita. Ovaj nalaz je primećen ne samo za celokupnu ispitivanu populaciju, već i za svaki od dva nivoa AMH koji se koriste u randomizaciji.

[0116] Značajan doza-odgovor odnos za FE 999049 je pokazan za sve ključne objektivne farmakodinamičke parametre, npr. estradiol, inhibin B i inhibin A. Na sličnom mikrogramskom nivou doziranja, farmakodinamički odgovori sa FE 999049 bili su veći nego kod GONAL-F (ovi rezultati nisu prikazani).

[0117] Koncentracije FSH u serumu nakon izlaganja FE 999049 bile su značajno veće nego kod GONAL-F. Rezultati potvrđuju da se PK profil FE 999049 razlikuje od onog za GONAL-F. Stopa oplodnje, razvoj blastocista i stopa trudnoće kod pacijentkinja sa IVF/ICSI koji su tretirani FE 999049 bile su unutar očekivanja.

[0118] Nije bilo zabrinutosti u vezi sa upotrebom FE 999049. Dokazana je dobra lokalna podnošljivost.

Dalja analiza

[0119] Podnosioci predstavke su dalje analizirali podatke kako bi identifikovali dozu ili doze FE 999049 koje ispunjavaju sledeće kriterijume broja dobijenih oocita:

• Oociti dobijeni u rasponu 8-14

• Smanjenje udela pacijentkinja sa <8 oocita

• Smanjenje udela pacijentkinja sa ≥20 oocita

[0120] Podnosioci prijave su takođe istražili uticaj telesne težine. Ako je relevantno, doza se pretvara u µg/kg za prosečnu pacijentkinju. Ova vrednost od µg/kg i ± 0,01 µg/kg se procenjuje u modelu u odnosu na distribuciju oocita koje se dobijaju, kao i profil bezbednosti, i identifikuje se optimalna doza.

1

Nizak nivo AMH

[0121] Kao što se vidi u Tabeli 2, doza FE999049 koja je ispunila prvi kriterijum (oociti dobijeni u rasponu 8-14) bila je 12,1 µg (srednja vrednost 9,4 dobijenih oocita). Distribucija oocita je prikazana u Tabeli 3 u nastavku.

[0122] Kao što je prikazano zaokruženim okvirom i strelicom, doza od 12,1 µg FE999049 omogućava pronalaženje najpoželjnijeg broja oocita kod 60% ispitanika u grupi sa niskim AMH. Ovo je značajno poboljšanje u odnosu na Gonal-F (najpoželjniji broj oocita kod samo 33% pacijentkinja).

[0123] Tabela 4 pokazuje analizu znakova prekomernog odgovora pri niskim nivoima AMH (podaci su broj pacijentkinja). Može se primetiti da nije bilo indikacija za rani OHSS umerene ili teške prirode, i da nije bilo neophodnih preventivnih akcija; nema zabrinutosti u vezi sa dozom od 12,1 µg FE999049 kod pacijentkinje koja ima nizak AMH.

Tabela 4

2

[0124] Slika 7 prikazuje efekat telesne težine na dobijene oocite (za niske nivoe AMH), za različite doze. Strelice pokazuju broj oocita dobijenih od pacijentkinja telesne težine između 45 kg i 90 kg tretiranih pri dozi od 12,1 µg. Kao što se može pogledati (tekstualni okvir) varijacije između pacijentkinja telesne težine 45kg i onih od 90kg su manje od oko 0,5 oocita; drugim rečima, doziranje po telesnoj težini nije potrebno kod pacijentkinja sa niskim AMH kada je FE999049 doza najmanje 12 µg, jer pri ovoj dozi ne postoji značajna varijacija u dobijenim oocitima povezana sa telesnom težinom.

[0125] Podnosioci prijave su, stoga, otkrili da je doza od, ili ekvivalentna, 6 do 18 µg, na primer 9 do 14 µg, na primer 12 µg, rekombinantnog FSH izvedenog iz čoveka, pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu <15 pmol/L, na primer 0,05-14,9 pmol/L, na primer 5,0-14,9 pmol/L. Doza pruža efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS.

Visoki nivoi AMH

[0126] Kao što se vidi u Tabeli 2, tri doze FE999049 ispunile su prvi kriterijum (dobijeni oociti u rasponu 8-14): 6,9 µg (srednja vrednost je 9,1 dobijenih oocitaa), 8,6 µg (srednja vrednost je 10,6 dobijenih oocitaa) i 10,3 µg (srednja vrednost je 13,6 dobijenih oocitaa).

[0127] Slika 8 prikazuje efekat telesne težine na dobijene oocite (za visoke nivoe AMH), za različite doze. Strelice pokazuju broj oocita dobijenih od pacijentkinja telesne težine između 45 kg i 90 kg tretiranih pri dozama od 6,9 µg, 8,6 µg i 10,3 µg. Kao što se može pogledati (tekstualni okviri), varijacija je značajna: za dozu od 6,9 µg dobiće se 6 dodatnih oocita kod pacijentkinje od 45 kg u poređenju pacijentkinjom od 90 kg; za dozu od 8,6 µg dobiće se 4 dodatna oocita kod pacijentkinje od 45 kg u poređenju pacijentkinjom od 90 kg; i za dozu od 10,1 µg dobiće se 2,5 dodatnih oocita kod pacijentkinje od 45 kg u poređenju pacijentkinjom od 90 kg. Drugim rečima, doziranje po telesnoj težini utiče na pacijentkinje sa visokim AMH kada je doza FE999049 manja od 12 µg, jer pri ovoj dozi postoji značajna varijacija u dobijenim oocitima povezana sa telesnom težinom.

[0128] Tabela 5a ispod pokazuje dalju podelu oocita dobijenih (iz Tabele 2) od putem AMH. Ovo pokazuje doze koje su ispunile prvi kriterijum (dobijeni oociti u rasponu 8-14) za svaku podgrupu AMH (kutije).

Tabela 5a

[0129] Tabela 5 b prikazuje analizu pacijentkinja kod kojih je terapija otkazana zbog prekomernog odgovora ili aktiviranja agonista, za ove podgrupe. Na primer, jedna pacijentkinja pri AMH nivoima od 25-34 pmol/L otkazana je zbog prekomernog odgovora nakon doze od 10,3 µg i jedna pacijentkinja pri AMH nivoima od 25-34 pmol/L otkazana je zbog prekomernog odgovora nakon doze od 12,1 µg; jedna pacijentkinjapri AMH nivoima od 35-45 pmol/L otkazana je nakon aktiviranja agonista nakon doze od 10,3 µg; i jedna pacijentkinja pri AMH nivoima od 35-45 pmol/L otkazana je nakon aktiviranja agonista nakon doze od 6,9 µg.

Tabela 5b

4

[0130] Stoga se može primetiti da bi prilagođavanje doze telesnoj težini (Slika 8) i nivou AMH bilo korisno pri višim nivoima AMH, kako bi se minimalizovala otkazivanja i maksimizovalo dobijanje oocita.

[0131] Podnosioci prijave su ustanovili da sledeće doze pružaju efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS (kg je kg telesne težine pacijentkinje).

[0132] Sledeće je odgovarajuće ako doziranje po telesnoj težini nije poželjno.

[0133] Sledeće su odgovarajuće ako je potrebno manje kategorija AMH.

[0134] Sledeće je odgovarajuće ako doziranje po telesnoj težini nije poželjno.

[0135] Podnosioci prijave su, stoga, otkrili da je doza od, ili ekvivalentna, 9 do 14 µg, na primer 12 µg, rekombinantnog FSH izvedenog iz čoveka, pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima serumski AMH <15 pmol/L, na primer 0,05-14,9 pmol/L na primer 5,0-14,9 pmol/L. Doza pruža efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS.

[0136] Podnosioci prijave su otkrili da je doza od, ili ekvivalentna, 5 do 12,5 µg, na primer 6 do 10,5 µg, rekombinantnog FSH izvedenog iz čoveka, pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima serumski AMH> 15 pmol/L. Doza pruža efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS.

[0137] Podnosioci prijave su utvrdili da je (npr. dnevna) doza od, ili ekvivalentna, 0,09 do 0,19 µg rekombinantnog FSH ljudskog proizvoda po kg telesne težine pacijentkinje, pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥15 pmol/L. Podnosioci prijave su otkrili da je(npr. dnevna) doza od, ili ekvivalentna, 0,14 do 0,19 µg ljudskog rekombinantnog FSH (poželjno 0,15 do 0,16 µg ljudskog rekombinantnog FSH) po kg telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L. Podnosioci prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza od, ili ekvivalentna, 0,11 do 0,14 µg ljudskog rekombinantnog FSH (poželjno 0,12 do 0,13 µg ljudskog rekombinantnog FSH) po kg telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L. Podnosioci prijave su utvrdili da je (npr. dnevna) doza od, ili ekvivalentna, 0,10 do 0,11 µg rekombinantnog FSH ljudskog proizvoda po kg telesne težine pacijentkinje, pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥35 pmol/L. Ove doze pružaju efikasan odgovor uz minimizovanje rizika od OHSS.

[0138] Podnosioci prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza od, ili ekvivalentna, 0,15 do 0,21 µg (npr.0,16 µg) rekombinantnog FSH ljudskog proizvoda po kg telesne mase pacijentkinje, pogodna za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od <15 pmol/L, na primer za prvi ciklus stimulacije sa ljudskim rekombinantnim FSH.

Međutim, nije potrebno da se pacijenti doziraju po telesnoj težini pri ovom nivou AMH.

Primer 10 A - Individualni COS protokol (nizak AMH)

[0139] Odabrane pacijentkinje će se podvrgnuti COS za in vitro oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI) postupcima poznatim u struci. Protokol pre tretmana uključuje procenu/skrining AMH u serumu kod pacijentkinje korišćenjem AMH Gen-II enzimski vezanog imunosorbentnog test kompleta (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može detektovati koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikovanja od 1,1 pmol/L. AMH može da se meri korišćenjem drugih kompleta za testiranje (npr. dostupno od Roche).

[0140] COS protokol se odvija na uobičajen način, izuzev primene početne doze FE 999049 u skladu sa nivoom AMH kod skrininga. Pacijentkinji sa nivoom AMH <14,9 pmol/L bi se primenjivala početna dnevna doza od približno 12 µg FE 999049, koji je rekombinantni FSH proizvod izveden iz čoveka, proizveden prema postupku iz Primera 6. Pacijentkinja sa nivoom AMH od 15 do 24,9 pmol/L bi primila početnu dnevnu dozu od 0,15 do 0,19 µg rekombinantnog FSH izvedenog iz čoveka po kg telesne težine pacijentkinje. Pacijentkinja sa nivoom AMH od 25 do 34,9 pmol/L bi primila početnu dnevnu dozu od 0,11 do 0,13 µg rekombinantnog FSH izvedenog iz čoveka po kg telesne težine pacijentkinje. Pacijentkinja sa nivoom AMH od ≥35 pmol/L bi primila početnu dnevnu dozu od 0,10 do 0,11 µg rekombinantnog FSH izvedenog iz čoveka po kg telesne težine pacijentkinje.

Primer 11 - individualni COS protokoli.

[0141] Doze u ovom protokolu su manje poželjne nego Primer 10A.

[0142] Odabrane pacijentkinje će se podvrgnuti COS za in vitro oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI) postupcima poznatim u struci. Protokol pre tretmana uključuje procenu/skrining AMH u serumu kod pacijentkinje korišćenjem AMH Gen-II enzimski vezanog imunosorbentnog test kompleta (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može detektovati koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikovanja od 1,1 pmol/L.

[0143] COS protokol se odvija na uobičajeni način, izuzev primene početne doze FE 999049 u skladu sa nivoom AMH pri skriningu u skladu sa sledećom tabelom. Tako bi se pacijentkinji sa nivoom AMH od 5-14,8 pmol/L primenjivalo 180 IU FSH u obliku od približno 8-11 µg FE 999049, koji je rekombinantni FSH proizvod izveden iz čoveka proizveden prema postupku iz Primera 6. Pacijentkinji sa nivoom AMH od 30-44,9 pmol/L bi se primenjivalo 120 IU FSH u obliku od približno 4-7 µg FE 999049, koji je rekombinantni FSH proizvod izveden iz čoveka proizveden prema postupku iz Primera 6. Ako nivo AMH nije dostupan, pacijentkinji bi se primenjivalo 120-180 IU FSH u obliku od približno 6-11 µg FE 999049, koji je rekombinantni FSH proizvod izveden iz čoveka proizveden prema postupku iz Primera 6.

Reference

[0144]

Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236.

Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, and Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol.11(5), 517-526.

Baenziger JU and Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947(2), 287-306.

Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

Damián-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alpha2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol.23(2), 153-165. D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, and Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28), 8665-8673. No copy

Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6), 510-519

Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN and Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79, 756-760 Fox KM, Dias JA, and Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 378-89

Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, and Conradt HS. (1995).

Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GlcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GlcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25.

Green ED and Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44.

Grundmann,U., Nerlich,C., Rein,T. and Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18 (3), 667

Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2,172-191.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem.263(33), 17508-17515.

Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. and Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.

Kitagawa,H. and Paulson,J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem.269(2), 1394-1401.

4

Lee EU, Roth J, and Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of betagalactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.

de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Damm, J. and Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2, 361-369.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem.193(1), 265-75.

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol).

7, 16-21.

Olivennes F, Howles CM, Borini A, Germond M, Trew G, Wikland M, Zegers-Hochschild F, Saunders H (2009) Individualizing FSH dose for assisted reproduction using a novel algorithm: the CONSORT study. Reprod Biomed Online. 2009 Feb;18(2):195-204.

Pierce JG, and Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem.50, 465-495.

Pricer WE Jr, and Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem. 246(15), 4825-33.

Rathnam P, and Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of folliclestimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.;250(17):6735-6746.

Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, and Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta.541(3), 372-84.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO and Vutyavanich T. (1987). Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.;43,:383-429.

Saxena BB and Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem.251(4), 993Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.

Steer CJ, and Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem. 255(7), 3008-13.

Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the betagalactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem.263(8), 3657-3663.

Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, Gonzalez R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissue-type plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), 153-163.

Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Suárez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, and Ulloa-Aguirre A. (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol.165(2), 193-205.

Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. and Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod.3, 491-501.

Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Damiàn-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E and Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod.7, 23-30.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Folliclestimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damián-Matsumura P, and Timossi C (2001).

Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res.32(6), 520-532.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod.69(2), 379-389.

Van Lenten L, and Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem. 247(14), 4633-40.

Wide, L. and Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropinreleasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab.70, 271-276.

Wide, L. and Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, 885-889.

Wide L, Naessén T, Sundström-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol Metab.;92(11), 4410-4417.

Zambrano E, Zariñán T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine.

10(2), 113-121.

Zhang X, Lok SH, and Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta.1425(3), 441-452.

SEQ ID NO: 1

Alfa polipeptid hormona koji stimuliše folikule

Pristupni broj AH007338

Nukleotidna sekvenca od FSH alfa

4

Proteinska sekvenca od FSH alfa (SEQ ID NO: 5)

SEQ ID NO: 2

Beta polipeptid hormona koji stimuliše folikule Pristupni broj NM_000510

Nukleotidna sekvenca od FSH beta

Proteinska sekvenca od FSH beta (SEQ ID NO: 6)

SEQ ID NO: 3

Beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferaza 4 Pristupni broj L23767

Nukleotidna sekvenca od ST3GAL4

Proteinska sekvenca od ST3GAL4 (SEQ ID NO: 7)

SEQ ID NO: 4

Beta-glaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferaza 1 Pristupni broj NM_003032

Nukleotidna sekvenca od ST6GAL1

4

4

4

4

4

1

2

4

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Proizvod koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 11-13 µg rekombinantnog ljudskog FSH na dan, 12 do 16 dana nakon primene GnRH agonista.

2. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 12 µg rekombinantnog ljudskog FSH dnevno.

3. Proizvod koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, sa 0,09-0,19 µg rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno, 12 do 16 dana nakon primene GnRH agonista.

4. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 u tretmanu pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, od 0,14 do 0,19 µg rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno.

5. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 u tretmanu pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od 0,11 do 0,14 µg rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno.

6. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 u tretmanu pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥35 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 0,10 do 0,11 µg rekombinantnog ljudskog FSH izvedenog iz čoveka po kg telesne težine pacijentkinje dnevno.

7. Proizvod prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je rekombinantni ljudski FSH rekombinantni ljudski FSH koji uključuje α2,3- i α2,6-sijalilaciju.

8. Proizvod prema patentnom zahtevu 7, gde je od 1% do 50% ukupne sijalilacije α2,6-sijalilacija, i 50% do 99% od ukupne sijalilacije je α2,3-sijalilacija

9. Proizvod koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde proizvod dalje sadrži so koja sadrži farmaceutski prihvatljiv katjon alkalnog metala izabran iz grupe koja se sastoji od Na<+>- ili K<+>- soli, ili njihove kombinacije.

10. Proizvod koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 11 -13 µg rekombinantnog ljudskog FSH dnevno, zajedno sa GnRH antagonistom.

11. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, 12 µg rekombinantnog ljudskog FSH na dan.

12. Proizvod koji sadrži rekombinantni ljudski hormon koji stimuliše folikule (FSH) za upotrebu u tretmanu neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od ≥15 pmol/L, gde se proizvod primenjuje u dozi od, ili ekvivalentno, sa 0,09 -0,19 µg rekombinantnog ljudskog FSH po kg telesne težine pacijentkinje dnevno, zajedno sa GnRH antagonistom.

13. Proizvod za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde tretman neplodnosti obuhvata korak određivanja AMH nivoa u serumu kod pacijentkinje, i korak primene doze pacijentkinji koja ima određeni nivo AMH u serumu.