RS61843B1 - Sastav za kontrolisanu stimulaciju jajnika - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na sastave i farmaceutske proizvode za lečenje neplodnosti.

[0002] Asistirane reproduktivne tehnologije (ART) kao što je vantelesna oplodnja (IVF) su dobro poznate. Ove ART tehnike obično zahtevaju korak kontrolisane stimulacije jajnika (COS), u kojem se kohorta folikula stimuliše do pune zrelosti. Standardni COS režimi uključuju primenu gonadotropina, kao što je folikulostimulišući hormon (FSH) sam ili u kombinaciji sa aktivnošću luteinizirajućeg hormona (LH) za podsticanje folikularnog razvoja, obično uz primenu analoga GnRH pre i/ili tokom stimulacije radi sprečavanja prevremenog LH skoka. Farmaceutski sastavi koji se generalno koriste za COS uključuju rekombinantni folikulostimulišući hormon (rFSH), FSH izveden iz urina, rekombinantni preparati FSH LH, menotrofin izveden iz urina [humani menopauzni gonadotropin (hMG)] i visoko prečišćeni humani menopauzni gonadotropin (HP-hMG). IVF može biti povezan sa rizikom od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS), koji u teškim slučajevima može biti opasan po život.

[0003] Sposobnost predviđanja potencijala odziva žena na kontrolisanu stimulaciju jajnika (COS) može omogućiti razvoj individualizovanih COS protokola. Ovo bi, na primer, moglo smanjiti rizik od OHSS kod žena za koje se predviđa prekomerna reakcija na stimulaciju i/ili poboljšati ishode trudnoće kod žena koje su klasifikovane kao one koje su loše reagovale. Sada je utvrđena serumska koncentracija antimelerovskog hormona (AMH) kao pouzdanog markera jajničke rezerve. Smanjivanje nivoa AMH je u vezi sa smanjenim odgovorom jajnika na gonadotropin tokom COS. Dalje, visoki nivoi AMH dobar su prediktor prekomernog odgovora jajnika i pokazatelj rizika od OHSS.

[0004] U preliminarnom ispitivanju žena mlađih od 35 godina na ART, algoritam za doziranje CONSORT (koji uključuje bazalni FSH, BMI, starost i AFC) korišćen je za predviđanje optimalne početne doze FSH za COS kod žena sa rizikom od razvoja OHSS (Olivennes i dr., 2009). Individualizacija doze dovela je do odgovarajućeg prinosa oocita i dobre stope trudnoće. Međutim, postojale su visoke stope otkazivanja u grupi sa niskim dozama (75 IU FSH) zbog neadekvatnog odgovora, a OHSS se pojavio kod značajnog dela pacijenata.

[0005] Stoga postoji potreba za sastavom za upotrebu u individualizovanim COS protokolima koji pruža adekvatan odgovor na stimulaciju i/ili smanjen rizik od OHSS.

[0006] Kao što je iznad navedeno, standardni COS protokoli mogu da uključuju davanje FSH. FSH prirodno izlučuje prednja hipofiza i deluje kao podrška razvoju folikula i ovulaciji. FSH sadrži alfa podjedinicu sa 92 aminokiseline, takođe zajedničku ostalim glikoproteinskim hormonima LH i CG, i beta podjedinicu sa 111 aminokiselina jedinstvenu za FSH koja dodeljuje biološku specifičnost hormona (Pierce i Parsons, 1981). Svaka podjedinica je post translaciono modifikovana dodavanjem složenih ostataka ugljenih hidrata. Obe podjedinice nose 2 mesta za vezivanje N-vezanog glikana, alfa podjedinica na aminokiselinama 52 i 78 i beta podjedinica na aminokiselinskim ostacima 7 i 24 (Rathnam i Saxena, 1975, Saxena i Rathnam, 1976). FSH je tako glikoziliran na oko 30 mas.% (Dias and Van Roey.2001. Fox i dr. 2001).

[0007] FSH prečišćen iz urina čoveka nakon menopauze se već dugi niz godina koristi u lečenju neplodnosti; kako za promociju ovulacije u prirodnoj reprodukciji, tako i za obezbeđivanje oocita za tehnologije potpomognute reprodukcije. Trenutno odobreni rekombinantni FSH (rFSH) proizvodi za stimulaciju jajnika, kao što su folitropin alfa (GONAL-F, Merck Serono/EMD Serono) i folitropin beta (PUREGON/FOLLISTIM, MSD/Schering-Plough), izvedeni su iz ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO). Trenutno nijedan rFSH proizvod iz humane ćelijske linije nije komercijalno dostupan.

[0008] Postoji značajna heterogenost povezana sa preparatima FSH koja se odnosi na razlike u količinama različitih prisutnih izoformi. Pojedinačni izoformi FSH pokazuju identične sekvence aminokiselina, ali se razlikuju u meri u kojoj su post-translaciono modifikovani; pojedine izoforme karakterišu heterogenost razgranatih struktura ugljenih hidrata i različite količine ugradnje sijalne kiseline (krajnjeg šećera), a čini se da obe utiču na specifičnu bioaktivnost izoforme.

[0009] Glikozilacija prirodnog FSH je veoma složena. Glikani u prirodno izvedenom hipofiznim FSH mogu sadržati širok spektar struktura koje mogu uključivati kombinacije mono-, bi-, tri- i tetra-antenskih glikana (Pierce i Parsons, 1981. Ryan i dr., 1987. Baenziger and Green, 1988). Glikani mogu da nose dalje modifikacije: fukozilacija jezgra, raspoređivanje glukozamina, lanci produženi acetil-laktozaminom, delimična ili potpuna sijalilacija, sijalilacija sa α2,3 i α2,6 vezama i sulfatni galaktozamin supstituisan za galaktozu (Dalpathado i dr., 2006). Dalje, postoje razlike između raspodele glikanskih struktura na pojedinačnim mestima glikozilacije. Uporediv nivo složenosti glikana pronađen je u FSH dobijenom iz seruma pojedinaca i iz urina žena u nakon menopauze (Wide i dr., 2007).

[0010] Glikozilacija rekombinantnih proizvoda FSH odražava raspon glikozil-transferaza prisutnih u ćelijskoj liniji domaćina. Komercijalno dostupni proizvodi rFSH su izvedeni iz projektovanih ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije). Spektar modifikacija glikana u rFSH izvedenom iz ćelija CHO je ograničeniji od onih koji se nalaze u prirodnim proizvodima. Primeri smanjene heterogenosti glikana pronađene u rFSH izvedenom iz ćelija CHO uključuju nedostatak podeljenog glukozamina i smanjen sadržaj fukozilacije jezgra i nastavka acetil-laktozamina (Hard i dr., 1990). Pored toga, CHO ćelije su u stanju da dodaju sijalnu kiselinu samo koristeći α2,3 vezu (Kagawa i dr, 1988, Takeuchi i dr, 1988, Svensson i dr., 1990); RFSH izveden iz CHO ćelija uključuje samo sijalnu kiselinu povezanu sa α2,3 i ne uključuje sijalnu kiselinu povezanu sa α2,6.

[0011] Stoga se FSH izveden iz ćelija CHO razlikuje od prirodno proizvedenog FSH (npr., humani FSH iz hipofize/seruma/urina) koji sadrži glikane sa mešavinom sijalne kiseline α2,3 i α2,6-vezane, s prevlašću one prve.

[0012] Dalje, takođe je pokazano da se komercijalno dostupan rekombinantni preparat FSH razlikuje u količinama FSH sa izoelektričnom tačkom (pl) ispod 4 (smatra se kiselim izoformama) u poređenju sa FSH urina hipofize, seruma ili urina nakon menopauze (Ulloa) (Ulloa-Aguirre i dr. 1995). Količina kiselih izoformi u urinarnim preparatima bila je mnogo veća u poređenju sa rekombinantnim proizvodima dobijenim iz ćelija CHO, Gonal-f (Merck Serono) i Puregon (Schering Plough) (Andersen i dr.2004). Ovo mora odražavati niži molarni sadržaj sijalne kiseline u rekombinantnom FSH, jer je sadržaj negativno naelektrisanog glikana modifikovanog sulfatom nizak u rekombinantnom FSH. Niži sadržaj sijalne kiseline, u poređenju sa prirodnim FSH, karakteristika je komercijalno dostupnih rekombinantnih FSH proizvoda i može odražavati ograničenja u procesu proizvodnje.

[0013] Vreme cirkulacije FSH dokumentovano je za materijale iz različitih izvora. Neki od ovih materijala su frakcionisani na osnovu ukupnog molekularnog naelektrisanja, okarakterisanog njihovim pl, u kojem više kiseline odgovara većem negativnom naelektrisanju. Kao što je prethodno rečeno, glavni doprinos ukupnom molekularnom naelektrisanju je ukupan sijalni sadržaj svakog molekula FSH. Na primer, rFSH (Organon) ima sadržaj sijalne kiseline oko 8 mol/mol, dok FSH dobijen iz urina ima veći sadržaj sijalne kiseline (de Leeuw i dr.1996). Odgovarajuće brzine klirensa iz plazme kod pacova su 0,34 i 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre i dr.2003). U drugom primeru gde je uzorak rekombinantnog FSH podeljen na frakcije sa visokim i niskim pl, in vivo potentnost frakcije sa visokim pl (nižim sadržajem sijalne kiseline) je smanjena i imala je kraći polu-život u plazmi (D'Antonio i dr.1999). Takođe je zabeleženo da je bazičniji FSH koji cirkuliše tokom kasnijih faza ovulacionog ciklusa zbog smanjenja regulacije α2,3 sijalil-transferaze u prednjoj hipofizi koja je uzrokovana povećanjem nivoa estradiola (Damian-Matsumara i dr. 1999. Ulloa-Aguirre i dr. 2001). Rezultati za α2,6 sijalnu-transferazu nisu zabeleženi.

[0014] Prema tome, kao što je iznad rečeno, rekombinantni proteini eksprimirani pomoću CHO sistema razlikovaće se od svojih prirodnih kolega po svojoj vrsti krajnjih veza sijalne kiseline. Ovo je važno u proizvodnji bioloških sredstava za farmaceutsku upotrebu, jer ugljeni hidratni delovi mogu doprineti farmakološkim svojstvima molekula. Sadašnji podnosioci zahteva razvili su rekombinantni FSH dobijen od čoveka koji je predmet međunarodne patentne prijave br. PCT/GB2009/000978, objavljene kao WO2009/127826A. Rekombinantni FSH sa smešom i α2,3 i α2,6-povezane sijalne kiseline napravljen je inženjeringom humane ćelijske linije da eksprimira i rFSH i α2,3 sijaliltransferazu.

Eksprimiran proizvod je visoko kiseo i sadrži mešavinu sijalnih kiselina vezanih za α2,3- i α2,6; ovo poslednje obezbeđuje endogena aktivnost sijaliltransferaze. Otkriveno je da vrsta veze sijalne kiseline, α2,3- ili α2,6-, može imati dramatičan uticaj na biološki klirens FSH. Rekombinantni FSH sa smešom α2,3 i α2,6-povezane sijalne kiseline ima dve prednosti u odnosu na rFSH eksprimirane u konvencionalnim CHO ćelijama: prvo je materijal jače sijaliran zbog kombinovanih aktivnosti dve sijaliltransferaze; i drugo, materijal više liči na prirodni FSH. Ovo će verovatno biti biološki prikladnije u poređenju sa rekombinantnim proizvodima dobijenim iz ćelija CHO koji proizvode samo α2,3 vezane sijalne kiseline (Kagawa i dr., 1988, Takeuchi i dr., 1988, Svensson i dr., 1990) i imaju smanjeni sadržaj sijalne kiseline (Ulloa-Aguirre i dr.1995., Andersen i dr.2004).

[0015] Proizvod rFSH obelodanjen u međunarodnoj patentnoj prijavi br.

PCT/GB2009/000978 sadrži razgranate glikanske ostatke. FSH sadrži glikane (vezane za glikoproteine FSH) i ti glikani mogu sadržati širok spektar struktura. Kao što je dobro poznato u struci, može doći do razgranavanja (glikana) što rezultira time da glikan može imati 1, 2, 3, 4 ili više krajnjih ostataka šećera ili „antene“; glikani sa 1, 2, 3 ili 4 terminalna ostatka šećera ili "antene" nazivaju se mono-antenskim, di-antenskim, tri-antenskim ili tetraantenskim strukturama. Glikani mogu imati prisustvo sijalilacije na mono-antenskim i/ili dvo-antenskim i/ili tro-antenskim i/ili tetra-antenskim strukturama. Primer rFSH obelodanjen u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/GB2009/000978 obuhvatio je mono-sijalirane, disijalirane, tri-sijalirane i tetra-sijalirane glikanske strukture sa relativnim količinama kako sledi: 9-15% mono-sijalirane; 27 - 30% di-sijalirane; 30 - 36% tri-sijalirane i 25 - 29 % tetrasijalirane. Kao što je dobro poznato, mono-sijalirana glikanska struktura nosi jedan ostatak sijalne kiseline; di-sijalirana glikanska struktura nosi dva ostatka sijalne kiseline; tri-sijalirana glikanska struktura nosi tri ostatka sijalne kiseline; i tetra-sijalirana glikanska struktura nosi četiri ostatka sijalne kiseline. Ovde se terminologija kao što je "X% mono-sijalirana ", "X% di-sijalirana", "X% tri-sijalirana" ili "X% tetra-sijalirana" odnosi na broj glikanskih struktura na FSH koje su mono-, di, tri ili tetra-sijalirane (respektivno), izraženi u procentima (X%) od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje su na bilo koji način sijalirane (nose sijalnu kiselinu). Dakle, fraza „30 - 36% tri-sijaliranih glikanskih struktura“ znači da je od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje nose ostatke sijalne kiseline (odnosno su sijalirane), 30 do 36% ovih glikanskih struktura su tri sijalirane (nose tri ostatka sijalne kiseline).

Podnosioci zahteva su iznenađujuće otkrili da je FSH koji ima određenu količinu tetrasijaliranih glikanskih struktura (koja se razlikuje od primera rFSH proizvoda obelodanjenog u PCT/GB2009/000978 iznad pomenutom) znatno snažniji od rekombinantnih FSH proizvoda koji su trenutno u prodaji. Aminokiselinska sekvenca proizvoda podnosioca zahteva je izvorna sekvenca i identična je prirodnom humanom FSH i postojećim rFSH proizvodima dobijenim iz CHO. Međutim, sadašnji podnosioci zahteva otkrili su da rekombinantni FSH proizvodi izvedeni od čoveka (tj. rekombinantni FSH proizvedeni ili eksprimirani u ljudskoj ćelijskoj liniji, npr. napravljeni inženjeringom ljudske ćelijske linije) sadrže mešavinu sijalnih α2,3 i α2,6 povezanih sijalnih kiselina i/ili određena količina tetra-sijaliranih glikanskih struktura mogu biti naročito efikasne kada se koriste u (npr. individualizovanim) COS protokolima.

[0016] Prema predmetnom pronalasku u prvom aspektu obezbeđen je proizvod (npr., farmaceutski sastav) koji sadrži folikul stimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu 0.05 pmol/L ili većim, pri čemu je lečenje naznačeno time što se daje dnevna doza od 15 µg do 24 µg humanog rekombinantnog FSH. Poželjno, proizvod sadrži dnevnu dozu od 15 µg, 18 µg ili 24 µg ljudskog rekombinantnog FSH. Poželjno, lečenje neplodnosti obuhvata korak određivanja nivoa AMH u serumu pacijenta i korak davanja doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu od 0,05 pmol/L ili veći. Poželjno, humani derivat FSH uključuje α2, 3- i α2, 6-sialilaciju. Poželjno je da proizvod dalje sadrži hCG.

[0017] Podnosioci zahteva su utvrdili da je generalno neophodno doći do regiona od devet oocita kako bi se omogućio izbor dva visokokvalitetna oocita za prenos.

[0018] Podnosioci zahteva su otkrili da je za ispitanike sa niskim AMH (AMH <15 pmol/L po litru) potrebna dovoljna doza rekombinantnog FSH (na primer 12 µg) da bi se to postiglo. Pri ovoj dozi, 8 do 14 oocita će biti uzeto od 60% ispitanika sa niskim AMH. Ovo je neočekivano i značajno poboljšanje u odnosu na lečenje ispitanika sa niskim AMH lečenih sa 150 IU Gonal-f, gde se od samo 33% ispitanika uzima 8 do 14 oocita. Podnosioci zahteva su utvrdili da nema potrebe da se ova doza prilagođava telesnoj masi pacijenta. Tako su podnosioci zahteva pronašli proizvod (npr. farmaceutski sastav) koji sadrži folikul stimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu <15 pmol / L (npr.0,05 pmol/L do 14,9 pmol/L), pri čemu proizvod sadrži (npr. dnevnu) dozu ili dozu ekvivalentnu 9 do 14 ug, na primer 11 do 13 µg, na primer 12 µg ljudskog rekombinantnog FSH. Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH ("rFSH" ili "recFSH"). Poželjno je da je FSH rekombinantni FSH izveden iz humane ćelijske linije. Doza pruža efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS. Poželjno je lečenje neplodnosti koje obuhvata korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu pacijenta i davanje doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L (npr.0,05 pmol/L do 14,9 pmol/L).

[0019] Međutim, 60% populacije (i 80% žena mlađih od 30 godina lečenih od neplodnosti) ima visok AMH (to jest, AMH od ≥15 pmol/L). Za ove ispitanike je obično prilično jednostavno dobiti srednju vrednost od 9 do 11 oocita; problem sa protokolima stimulacije je rizik od OHSS. Podnosioci zahteva su otkrili da kod pacijenata kojima je dozirana mala doza humanog rekombinantnog FSH postoji veza između preuzetih oocita i telesne mase ispitanika. To znači da može postojati rizik povezan sa lečenjem fiksnom dozom FSH (što je uobičajeno u struci). Sadašnji podnosioci zahteva uspostavili su vezu između doze FSH i nivoa AMH i mase ispitanika koji pruža poboljšani sigurnosni profil (smanjeni rizik od OHSS) sa prihvatljivim ili poboljšanim pronalaženjem oocita u poređenju sa poznatim protokolima lečenja (videti primer 10). Podnosioci zahteva su otkrili proizvod (npr., farmaceutski sastav) koji sadrži folikulostimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu od ≥15 pmol/L, pri čemu je proizvod za davanje u (npr. dnevno) dozi od, ili ekvivalentnoj dozi od 0,09 do 0,19 µg (na primer 0,09 do 0,17 µg) izvedenog rekombinantnog humanog FSH po kg telesne mase pacijenta. Poželjno je lečenje neplodnosti koje obuhvata korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu pacijenta i davanje doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L. Proizvod se može koristiti za lečenje neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L, i za davanje (npr. dnevne doze) ili ekvivalentne doze od 0,14 do 0,19 µg izvedenog rekombinantnog humanog FSH (poželjno 0,15 do 0,16 µg rekombinantnog FSH dobijenog od čoveka) po kg telesne mase pacijenta. Lečenje neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu pacijenta i davanje doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L. Proizvod se može koristiti za lečenje neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L, a proizvod za davanje u (npr. dnevnoj) dozi ili ekvivalentnoj doziod 0,11 do 0,14 µg izvedenog rekombinantnog humanog FSH (poželjno 0,12 do 0,13 µg rekombinantnog FSH dobijenog od čoveka) po kg telesne mase pacijenta. Lečenje neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu pacijenta i davanje doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L.

Proizvod može da se koristi za lečenje neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu ≥ 35 pmol/L, a daje se u (npr. dnevnoj) dozi ili ekvivalentnoj dozi od 0,10 do 0,11 µg izvedenog rekombinantnog humanog FSH po kg telesne mase pacijenta. Lečenje neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu pacijenta i davanje doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu ≥ od 35 pmol/L. Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH ("rFSH" ili "recFSH"). Poželjno je da je FSH rekombinantni FSH izveden iz humane ćelijske linije. Doze pružaju efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS. Iznad navedene doze mogu biti za lečenje neplodnosti u prvom protokolu stimulacije pacijenta (ispitanika). Podrazumevaće se da se za dalje cikluse stimulacije doze mogu prilagoditi stvarnom odgovoru jajnika u prvom ciklusu.

[0020] Prema tome, prema predmetnom pronalasku u prvom aspektu dat je proizvod (npr. farmaceutski sastav) koji sadrži folikul stimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta koji ima nivo AMH u serumu od 0,05 pmol/L ili veći, pri čemu je lečenje naznačeno time što se daje dnevna doza od 15 µg do 24 µg izvedenog ljudskog rekombinantnog FSH. Poželjno je da proizvod sadrži dnevnu dozu od 15 µ, 18 µg ili 24 µg izvedenog ljudskog rekombinantnog FSH. Poželjno je da lečenje neplodnosti obuhvata korak određivanja nivoa AMH u serumu pacijenta i korak davanja doze pacijentu koji ima nivo AMH u serumu od 0,05 pmol/L ili veći. Poželjno, humani derivat FSH uključuje α2, 3- i α, 6-sialilaciju. Poželjno je da proizvod dalje sadrži hCG.

[0021] Poželjno je da rFSH (npr. rekombinantni FSH izveden iz humane ćelijske linije) uključuje α2,3- i α2,6-sijalilaciju. FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku može imati 1% do 99% ukupne sijalilacije koja je α2,3-sialilacija. FSH (rFSH) prema pronalasku može imati 1% do 99% ukupne sijalilacije koja je α2,6-sialilacija. Poželjno je da je 50 do 70%, na primer 60 do 69%, na primer oko 65%, ukupne sijalilacije α2,3-sijalilacije. Poželjno je 25 do 50%, na primer 30 do 50%, na primer 31 do 38%, na primer oko 35%, ukupne sijalilacije je a2,6-sialilacija.

[0022] Poželjno je da rFSH (npr. rekombinantni FSH izveden iz humane ćelijske linije) uključuje mono-, di-, tri- i tetra-sijalirane glikanske strukture, pri čemu su 15-24%, na primer 17-23% sijaliranih glikanskih struktura, tetra-sijalirane glikan strukture (npr. kako je prikazano WAX analizom naelektrisanih glikana, kako je prikazano u Primerima ispod). FSH sadrži glikane (vezane za FSH glikoproteine). Dobro je poznato da glikani u FSH mogu sadržati širok spektar struktura. To može uključivati kombinacije mono, bi, tri i tetraantenastih glikana. Ovde se terminologija kao što je „X% struktura sijaliranog glikana čine tetra-sijalirane glikanske strukture“ odnosi na broj glikanskih struktura na FSH koje su tetrasijalirane, odnosno nose četiri ostatka sijalne kiseline, izraženo u procentima (X%) ukupan broj glikanskih struktura na FSH koje su sijalirane na bilo koji način (nose sijalnu kiselinu). Prema tome, fraza „15-24% sijaliranih glikanskih struktura su tetra-sijalirane glikanske strukture“ znači da od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje nose ostatke sijalne kiseline (odnosno su sijalirane), 15 do 24% ovih glikanskih struktura su tetra-sijalirane (nose četiri ostatka sijalne kiseline).

[0023] rFSH može biti prisutan kao pojedinačna izoforma ili kao smeša izoformi.

[0024] Podnosioci zahteva su osmislili „individualizovane“ COS protokole u kojima se specifične doze rekombinantnog FSH specifičnih karakteristika koriste za lečenje pacijenata na osnovu njihovih specifičnih nivoa AMH, povećavajući time verovatnoću adekvatnog odgovora na stimulaciju (npr. kod pacijenata sa malim potencijalom odgovora), i/ili smanjeni rizik od OHSS (npr. kod pacijenata klasifikovanih kao odgovor sa visokim ili prekomernim odgovorima).

[0025] Nivo AMH u serumu može se odrediti (npr. merenjem) bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Poželjno je da se nivo AMH u serumu meri upotrebom testa imunosorbentom povezanog enzima AMH Gen-II, kompleta (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovim testom se može otkriti koncentracija AMH veća od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/L. Mogu se koristiti i drugi testovi.

[0026] Ovde se vrednosti AMH u serumu obično daju u terminima pmol/L. Ovo se može pretvoriti u ng/ml koristeći jednačinu konverzije 1ng/ml AMH = 7,1 pmol/L AMH.

[0027] Ovde se termini „pacijent“ i „ispitanik“ koriste naizmenično.

[0028] Proizvod (npr. farmaceutski sastav) poželjno sadrži dnevnu dozu ili dnevnu dozu ekvivalentnu količinama humanog derivata rFSH definisanih iznad, ovde i u patentnim zahtevima. (Dnevna) doza može biti početna doza (tj. može se smanjiti, povećati ili održavati tokom lečenja).

[0029] Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za (dnevno) davanje FSH počev od prvog dana lečenja i nastavljajući se sedam do trinaest dana, na primer devet do trinaest dana, na primer 10 do 13 dana, na primer 10 do 11 dana. Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za primenu od 12 do 16, npr.13 do 15, npr.14 dana nakon davanja (npr. nakon započinjanja davanja, npr. nakon započinjanja svakodnevnog davanja) GnRH agonista (npr. Sinarel, Lupron, Decapeptyl). Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za davanje sa GnRH agonistom. Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za davanje pre davanja antagonista GnRH (npr. ganireliks, cetroreliks), na primer za davanje pet ili šest dana pre

1

davanja antagonista GnRH. Proizvod (npr. farmaceutski sastav) može biti za davanje sa GnRH antagonistom. Poželjno je da je proizvod (npr. farmaceutski sastav) za davanje pre davanja visoke (ovulatorne) doze hCG (na primer 4000 do 11000 IU hCG, npr.5000 IU hCG, 10000 IU hCG itd.; ili 150 do 350 mikrograma rekombinantnog hCG, na primer 250 mikrograma rekombinantnog hCG) da bi se indukovalo konačno sazrevanje folikula.

[0030] Smatraće se da proizvod može biti za doziranje na frekvencijama većim (ili manjim) od dnevnih, u kom slučaju će odgovarajuće doze biti ekvivalentne ovde navedenim (dnevnim) dozama.

[0031] Ovdašnji termin "lečenje neplodnosti" uključuje lečenje neplodnosti kontrolisanom stimulacijom jajnika (COS) ili postupcima koje uključuju korak ili fazu kontrolisane stimulacije jajnika (COS), na primer intramaterična oplodnja (IUI), vantelesna oplodnja (IVF), ili intracitoplazmatska injekcija sperme (ICSI). Termin "lečenje neplodnosti" uključuje lečenje neplodnosti indukcijom ovulacije (OI) ili postupcima koji uključuju korak ili fazu indukcije ovulacije (OI). Termin "lečenje neplodnosti" uključuje lečenje neplodnosti kod ispitanika koji ima tubarnu ili neobjašnjivu neplodnost, uključujući lečenje neplodnosti kod ispitanika koji ima endometriozu, na primer endometrioze stadijuma I ili II, i/ili kod ispitanika koji ima anovulatornu neplodnost, za primer anovulatorna neplodnost tipa II SZO i/ili kod ispitanika sa partnerom sa neplodnošću muškog faktora. Proizvod (ili sastav) može biti za (upotrebu u) lečenju neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanika koji ima endometriozu, na primer kod ispitanika koji ima endometriozu stadijuma I ili II, kako je definisalo Društvo za reproduktivnu medicinu (ASRM) sistem klasifikacije za različite stadijume endometrioze (najteži stadijum IV; stadijum I najmanje težak) [Američko društvo za reproduktivnu medicinu. Revidirana klasifikacija endometrioze Američkog društva za reproduktivnu medicinu: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817821.].

[0032] Proizvod (sastav) može biti za (upotrebu u) lečenju neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanika koji ima normalan nivo FSH u serumu od 1 do 16 IU/L, na primer 1 do 12 IU/L, u ranoj folikularnoj fazi.

[0033] Proizvod (sastav) može biti za (upotrebu u) lečenju neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanika starosti od 18 do 42 godine, na primer od 25 do 37 godina. Proizvod može biti za (upotrebu u) lečenju neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanika koji ima BMI > 1 i BMI < 35 kg/m<2>, na primer ispitanika koji ima BMI > 18 i BMI < 25 kg/m<2>, na primer ispitanika koji ima BMI > 20 i BMI < 25 kg/m<2>.

[0034] RFSH može poželjno da sadrži 27 - 33%, na primer 30 - 32%, tri-sijalirane glikanske strukture. RFSH može poželjno da sadrži 24 - 33%, na primer 26 - 30%, di-sijalirane glikanske strukture. RFSH može poželjno da sadrži 12 - 21%, na primer 15 - 17%, monosijalirane glikanske strukture. RFSH poželjno uključuje mono-sijalirane, di-sijalirane, trisijalirane i tetra-sijalirane glikanske strukture sa relativnim količinama kako sledi: 15 do 17% mono-sijalirane; 26 - 30% di-sijalirane; 27 - 33% (npr.29 do 32%, npr.30-32%, npr.30 do 31%) tri-sijalirane i 17 - 23% tetra-sijalirane (npr. kako pokazuje WAX analiza naelektrisanih glikana, kako je navedeno u Primerima). RFSH može sadržati od 0 do 7%, na primer 0,1 do 7%, na primer 3 do 6%, na primer 5 do 6%, neutralne sijalirane strukture. FSH sadrži glikane (vezane za FSH glikoproteine). Ovde se terminologija kao što je "X% mono-sijalirana ", "X% di-sijalirana", "X% tri-sijalirana" ili "X% tetra-sijalirana" odnosi na broj glikanskih struktura na FSH koje su mono-, di, tri ili tetra-sijalirane (respektivno), izraženi u procentima (X%) od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje su na bilo koji način sijalirane (nose sijalnu kiselinu). Dakle, fraza „27 - 33% tri-sijaliranih glikanskih struktura“ znači da je od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje nose ostatke sijalne kiseline (odnosno su sijalirane), 27 do 33% ovih glikanskih struktura su tri sijalirane (nose tri ostatka sijalne kiseline).

[0035] rFSH može imati sadržaj sijalne kiseline [izraženu kroz odnos molova sijalne kiseline prema molovima proteina] od 6 mol/mol ili više, na primer između 6 mol/mol i 15 mol/mol, npr. između 8 mol/mol i 14 mol/mol, na primer između 10 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 11 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 12 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 12 mol/mol i 13 mol/mol. rFSH se može proizvesti ili eksprimirati u ljudskoj ćelijskoj liniji.

[0036] FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku može imati 1% do 99% ukupne sijalilacije koja je α2,3-sialilacija. rFSH može imati 10% ili više ukupne sijalilacije koja je α2,3-sijalilacija. Na primer, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% ili više ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. rFSH može poželjno da uključuje α2,3-sijalilaciju u količini koja je od 50 do 70% ukupne sijalilacije, na primer od 60 do 69% ukupne sijalilacije, na primer od 63 do 67%, na primer oko 65% ukupne sijalilacije. FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku može imati 1% do 99% ukupne sijalilacije koja je α2,6-sialilacija. rFSH (ili preparat rFSH) prema pronalasku može imati 5% ili više, na primer 5% do 99%, pri čemu ukupna sijalilacija predstavlja α2,6-sijalilaciju. rFSH može imati 50% ili manje ukupne sijalilacije koja je α2,6-sijalilacija. rFSH može poželjno da uključuje α2,6-sijalilaciju u količini koja je od 25 do 50% ukupne sijalilacije, na primer od 30 do 50% ukupne sijalilacije, na primer od 31 do 38%, na primer oko 35% ukupne sijalilacije. Pod sijalilacijom se podrazumeva količina sijalnih ostataka prisutnih na FSH ugljenohidratnim strukturama. α2,3-sijalilacija znači sijalilaciju na položaju 2,3 (kao što je dobro poznato u struci) i α2,6 sijalilacija na položaju 2,6 (takođe dobro poznato u tehnici). Prema tome, "% ukupne sijalilacije može biti α2,3 sijalilacija" odnosi se na % ukupnog broja ostataka sijalne kiseline prisutnih u FSH koji su sijalirani na položaju 2,3. Termin "% ukupne sijalilacije koja predstavlja α2,6-sijalilaciju" odnosi se na % ukupnog broja ostataka sijalne kiseline prisutnih u FSH koji su sijalirani u položaju 2,6.

[0037] rFSH može sadržati sadržaj sijalne kiseline (količina sijalilacije po molekulu FSH) od (na osnovu mase proteina, a ne mase proteina i ugljenih hidrata) od 6% ili više (npr. između 6% i 15%, npr. između 7% i 13%, npr. između 8% i 12%, npr. između 11% i 15%, npr. između 12% i 14%) po masi.

[0038] rFSH može biti rFSH ili preparat rFSH u kome 16% ili manje (npr.0,1 do 16%) glikana sadrži (npr. nošenje) N-acetilglukozamin koji deli dvosmerno (raspoređuje GlcNAc ili bisGlcNAc). Poželjno je da je rFSH (ili preparat rFSH) preparat rFSH ili rFSH u kome 8 do 14,5% glikana sadrži (npr. nosi) N-acetilglukozamin koji deli dvosmerno (deli GlcNAc ili bisGlcNAc).

[0039] Podrazumeva se da FSH sadrži glikane vezane za FSH glikoproteine. Takođe će se razumeti da se 100% glikana odnosi ili znači sve glikane vezane za FSH glikoproteine. Prema tome, ovde terminologija „8 do 14,5% glikana sadrži (nose) dvodelni N-acetilglukozamin“ znači da 8 do 14,5% od ukupnog broja glikana povezanih sa glikoproteinima FSH uključuje/nosi dvodelni N-acetilglukozamin; „16% ili manje glikana sadrži (nose) dvodelni N-acetilglukozamin“ znači da 16% ili manje od ukupnog broja glikana vezanih za glikoproteine FSH uključuje/nosi dvodelni N-acetilglukozamin, i tako dalje.

[0040] Podnosioci zahteva su utvrdili da je rekombinantni FSH (rFSH preparati; sastavi rFSH) u kojima 16% ili manje (npr.8 do 14,5%) glikana sadržanih u FSH glikoproteinima imaju podeljeni GlcNac mogu imati povoljna farmakokinetička svojstva. Veruje se da bi korisna svojstva mogla nastati zato što je količina glikana koji nose dvodelni GlcNac slična je

1

onoj u ljudskom proizvodu dobijenom iz urina Bravelle, što je prilično manje od broja ostalih rekombinantnih FSH preparata, poput onih koji su obelodanjeni u WO2012/017058.

[0041] rFSH (ili preparat rFSH) može biti preparat rFSH ili rFSH u kome 20% ili više glikana sadrži (npr. nosi) N-acetilgalaktozamin (GalNAc), na primer u kome sadrži 20% ili više glikana (npr. nosi) terminalni GalNAc. Poželjno je da rFSH (ili preparat rFSH) predstavlja FSH ili FSH preparat u kome 40 do 55%, na primer 42% do 52% glikana sadrži (npr. nosi) GalNAc. Poželjno je da rFSH (ili preparat rFSH) predstavlja FSH ili FSH preparat u kome 40 do 55%, na primer 42% do 52% glikana sadrži (npr. nosi) terminalni GalNAc.

[0042] Podrazumeva se da FSH sadrži glikane vezane za FSH glikoproteine. Takođe će se razumeti da se 100% glikana odnosi ili znači sve glikane vezane za FSH glikoproteine. Stoga, ovdašnja terminologija „gde 20% ili više glikana sadrži (npr. nosi) GalNAc“ znači da 20% ili više od ukupnog broja glikana vezanih za FSH glikoproteine uključuje/nosi N-acetilgalaktozamin (GalNAc); „40 do 55%, na primer 42% do 52%, glikana sadrži (npr. nosi) terminal GalNAc“ znači da 40 do 55%, na primer 42% do 52%, od ukupnog broja glikana povezanih sa FSH glikoproteini uključuju/nose terminal GalNAc, i tako dalje.

[0043] Čini se da dostupnost α2,6- veze povećava broj tetra-sijaliranih struktura, u poređenju sa proizvodima izvedenim iz CHO ćelija koji imaju na raspolaganju samo α2,3-vezu.

Podnosioci zahteva su takođe utvrdili da se njihov rFSH razlikuje od ostalih odobrenih proizvoda zbog sastava šećera: uključuje, ili može sadržati, određenu količinu GalNac. Ovo može biti povezano sa tetra-sijalilacijom i snagom, jer je 2,6-sijalilacija povezana sa GalNac. Drugim rečima, sadašnji podnosioci zahteva razvili su rFSH proizvod koji uključuje specifične karakteristike (2,6-linker mesta, GalNac) koji pružaju rFSH visok stepen sijalilacije, što izgleda da dovodi do poboljšane potencije in vivo.

[0044] rFSH (ili preparat rFSH) može imati 16 do 24% glikana koji sadrže (npr. terminalni) 1 fukoza Lewis, na primer 16,5 do 18% glikana koji sadrže (npr. terminalni) 1 fukoza Lewis. rFSH (ili preparat rFSH) može imati 1,5 do 4,5%, na primer 2 do 4%, na primer 3,7% glikana koji sadrže (npr. terminalni) 2 fukozni Lewis. Sadržaj fukoze Lewis može uticati na potenciju.

[0045] rFSH se može proizvesti ili eksprimirati u ljudskoj ćelijskoj liniji, na primer ćelijskoj liniji Per.C6, ćelijskoj liniji HEK293, ćelijskoj liniji HT1080 itd. Ovo može pojednostaviti (i učiniti efikasnijim) način proizvodnje jer manipulacija i kontrola npr. medijum za rast ćelija za zadržavanje sijalilacije može biti manje kritičan nego kod poznatih procesa. Postupak može biti i efikasniji jer se proizvodi malo osnovnog rFSH u poređenju sa proizvodnjom poznatih rFSH proizvoda; proizvodi se kiseliji rFSH i odvajanje/uklanjanje osnovnog FSH je manje problematično. rFSH se može proizvesti ili izraziti u ćelijskoj liniji PER.C6®, ćelijskoj liniji izvedenoj iz PER.C6® ili modifikovanoj ćelijskoj liniji PER.C6®. rFSH koji se proizvodi ili eksprimira u humanoj ćelijskoj liniji (npr. ćelijska linija PER.C6®, ćelijska linija HEK293, ćelijska linija HT1080 itd.) sadržaće neke α2,6-povezane sijalne kiseline (α2,6-sialilacija) koje obezbeđuje endogeni sijalil aktivnost transferaze [ćelijske linije] i obuhvatiće neke α2,3-povezane sijalne kiseline (α2,3 sijalilacija) koje pruža endogena aktivnost sijalil-transferaze. Ćelijska linija se može modifikovati upotrebom α2,3-sijaliltransferaze. Ćelijska linija se može modifikovati upotrebom α2,6-sijaliltransferaze. Alternativno ili dodatno, rFSH može da sadrži α2,6-povezane sijalne kiseline (α2,6-sijalilacija) obezbeđene endogenom aktivnošću sijaliltransferaze [ćelijske linije]. Ovdašnji termin "rekombinantni FSH izveden iz čoveka" označava rekombinantni FSH koji se proizvodi ili eksprimira u ljudskoj ćelijskoj liniji (npr. rekombinantni FSH napravljen inženjeringom humane ćelijske linije).

[0046] rFSH se može dobiti upotrebom α2,3- i/ili α2,6-sijaliltransferaze. U primeru, rFSH se proizvodi upotrebom α2,3-sijaliltransferaze. rFSH može da sadrži α2,6-povezane sijalne kiseline (α2,6-sijaliranje) koje pruža endogena aktivnost sijaliltransferaze.

[0047] Proizvod može biti farmaceutski sastav. Farmaceutski sastav je za lečenje neplodnosti. Lečenje neplodnosti može obuhvatati potpomognute reproduktivne tehnologije (ART), indukciju ovulacije ili intramateričnu oplodnju (IUI). Farmaceutski sastav se može koristiti, na primer, u medicinskim indikacijama gde se koriste poznati FSH preparati.

[0048] Proizvod ili sastav mogu se formulisati u dobro poznate sastave za bilo koji način davanja leka, npr. oralno, rektalno, parenteralno, transdermalno (npr. tehnologija flastera), intravenski, intramuskularno, potkožno, intracisternalno, intravaginalno, intraperitonealno, lokalno (praškovi, masti ili kapi) ili u obliku spreja za usta ili nosa. Tipičan sastav sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je vodeni rastvor, netoksične pomoćne supstance, uključujući soli i konzervanse, pufere i slično, kako je opisano u Remingtonovom

1

Farmaceutskom nauku petnaesto izdanje (Matt Publishing Company, 1975), na stranicama 1405 do 1412 i 1461 - 87, i nacionalni formular XIV četrnaesto izdanje (American Pharmaceutical Association, 1975), između ostalih.

[0049] Primeri pogodnih vodenih i ne-vodenih farmaceutskih nosača, razblaživača, rastvarača ili nosača uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično), karboksimetilceluloza i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje) i injektibilni organski estri kao što je etil oleat. Sastavi predmetnog pronalaska takođe mogu sadržati aditive kao što su, ali bez ograničenja, konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori, površinski aktivne materije i sredstva za dispergovanje. Antibakterijska i antifungalna sredstva mogu biti uključena da spreče rast mikroba i uključuju, na primer, m-krezol, benzil alkohol, paraben, hlorobutanol, fenol, sorbinsku kiselinu i slično. Ako je uključen konzervans, poželjni su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol; međutim, konzervans nikako nije ograničen na ove primere. Dalje, može biti poželjno uključiti izotonična sredstva kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Proizvod ili sastav mogu dalje sadržati so koja sadrži farmaceutski prihvatljiv katjon alkalnog metala odabran iz grupe koja se sastoji od soli Na<+>- ili K<+>- ili njihove kombinacije. Poželjno je da je so Na+ - so, na primer NaCl ili Na2SO4.

[0050] Poželjno je da proizvod ili sastav sadrži rekombinantni FSH i jedan ili više polisorbata 20, L-metionina, fenola, dinatrijum sulfata i natrijum fosfatnog pufera.

[0051] U nekim slučajevima, radi dejstva produženog delovanja, poželjno je usporiti apsorpciju FSH (i drugih aktivnih sastojaka, ako postoje) iz potkožne ili intramuskularne injekcije. Ovo se može ostvariti upotrebom tečnih suspenzija kristalnog ili amorfnog materijala sa niskom rastvorljivosti u vodi. Brzina upijanja FSH će onda zavisiti od brzine rastvaranja koja će, zauzvrat, zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno davanog oblika kombinacije FSH postiže se rastvaranjem ili suspendovanjem kombinacije FSH u uljanom nosaču. Depozitni oblici za injekcije mogu se napraviti formiranjem mikrokapsulnih matrica FSH (i drugih sredstava, ako postoje) u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa FSH prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, brzina oslobađanja FSH može se kontrolisati. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju polivinilpirolidon, poli (ortoester), poli (anhidridi) itd. depozitne formulacije za injekcije se takođe pripremaju

1

uvlačenjem FSH u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

[0052] Formulacije za ubrizgavanje mogu biti sterilisane, na primer, filtriranjem kroz filter koji zadržava baterije, ili uključivanjem sredstava za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih sastava koji se mogu rastvoriti u sterilisanoj vodi ili drugoj sterilisanoj podlozi za ubrizgavanje pre upotrebe. Formulacije za injekcije mogu se isporučiti u bilo kojoj pogodnoj posudi, npr. bočica, napunjeni špric, patrone za injekcije i slično.

[0053] Proizvod ili sastav mogu se formulisati za jednokratnu upotrebu ili za višestruku upotrebu (višestruka doza). Ako su proizvod ili sastav formulisani za višestruku upotrebu, poželjno je da je uključen konzervans. Ako je uključen konzervans, poželjni su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol; međutim, konzervans nikako nije ograničen na ove primere. Formulisani proizvod ili sastav za jednokratnu ili višestruku upotrebu može dalje sadržati sol koja sadrži farmaceutski prihvatljiv katjon alkalnog metala odabran iz grupe koja se sastoji iz soli Na<+>- ili K<+>- ili njihove kombinacije. Poželjno je da je so Na+ - so, na primer NaCl ili Na2SO4.

[0054] Proizvod ili sastav mogu biti uključeni u posudu kao što je bočica, prethodno napunjeni špric (npr. za jednokratno davanje ili višestruku upotrebu) ili uređaj za ubrizgavanje, kao što je „olovka“ za npr. davanje više doza.

[0055] Proizvod ili sastav mogu biti formulacije (npr. formulacija za injekcije) koja uključuje FSH (opciono sa hCG, LH, LH aktivnošću itd.) LH aktivnost, ako je prisutna, može poticati od LH ili humanog horionskog gonadotropina, hCG. Ako ima više od jednog aktivnog sastojaka (tj. FSH i npr. hCG ili LH) oni mogu biti pogodni za davanje odvojeno ili zajedno. Ako se daje zasebno, davanje može biti uzastopno. Proizvod se može isporučiti u bilo kom odgovarajućem pakovanju. Na primer, proizvod može da sadrži određeni broj kontejnera (npr. napunjene špriceve ili bočice) koji sadrže ili FSH ili hCG, ili kombinaciju (ili kombinaciju) i FSH i hCG. HCG može biti rekombinantni hCG ili urinarni hCG. Ako proizvod uključuje određeni broj ambalaža (npr. napunjene špriceve ili bočice) koji sadrže FSH, npr. rekombinantni FSH, svaka ambalaža može sadržati istu količinu FSH. Jedna ili više ambalaža mogu sadržavati različite količine FSH. Špricevi ili bočice mogu biti zapakovani u blister pakovanje ili na drugi način za održavanje sterilnosti. Bilo koji proizvod može opciono da sadrži uputstva za upotrebu formulacija FSH (i npr. HCG ako je prisutan).

1

PH i tačna koncentracija različitih komponenata farmaceutskog sastava podešavaju se u skladu sa rutinskom praksom u ovoj oblasti. Videti GOODMAN i GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th ed. U poželjnom otelotvorenju, sastavi prema pronalasku se isporučuju kao sastavi za parenteralno davanje. Opšti postupci za pripremu parenteralnih formulacija poznati su u tehnici i opisani su u REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, na stranama 780-820. Parenteralni sastavi se mogu isporučiti u tečnoj formulaciji ili u obliku čvrste supstance koja će se pomešati sa sterilnim injekcionim medijumom neposredno pre davanja. U posebno poželjnom otelotvorenju, parenteralni sastavi se isporučuju u jediničnom doznom obliku radi lakšeg davanja i uniformnosti doziranja.

Detaljni opis pronalaska

[0056] Predmetni pronalazak će sada biti detaljnije opisan u vezi sa priloženim crtežima u kojima:

Slika 1 prikazuje plazmidnu mapu pFSHalpha/beta vektora ekspresije;

Slika 2 prikazuje vektor ekspresije α2,3-sijaliltransferaze (ST3GAL4);

Slika 3 prikazuje vektor ekspresije α2,6-sijaliltransferaze (ST6GAL1);

Slika 4 prikazuje % raspodelu sijalne kiseline u obilju u primerima rekombinantnog FSH proizvedenog PER.C6® ćelijama koje stabilno eksprimiraju FSH nakon inženjeringa sa α2,3-sijaliltransferazom;

Slika 5 prikazuje % raspodelu glikanskog naelektrisanja u obilju u primerima rekombinantnog FSH proizvedenog PER.C6® ćelijama koje stabilno eksprimiraju FSH nakon inženjeringa sa α2,3-sijaliltransferazom;

Slika 6 prikazuje poređenje koncentracije inhibina-B nakon primene 225 IU Gonal f (donja linija, isprekidana linija) i 225 IU Primera (gornja linija, puna linija) pronalaska;

Slika 7 prikazuje efekat telesne mase na oocite pronađene u grupi sa niskim AMH (Primer 10, 10A); i

Slika 8 prikazuje efekat telesne mase na oocite pronađene u grupi koja je lečena visokim AMH

Izbor sekvence

Humani FSH

1

[0057] Kodirajući region gena za alfa polipeptid FSH korišćen je prema Fidesu i Gudmanu. (1981). Sekvenca je označena kao AH007338 i u vreme konstrukcije nije bilo drugih varijanti ove proteinske sekvence. Sekvenca se ovde naziva SEQ ID NO:1.

[0058] Kodirajući region gena za FSH beta polipeptid korišćen je prema Keene i dr (1989). Sekvenca je označena kao NM_000510 i u vreme konstrukcije nije bilo drugih varijanti ove proteinske sekvence. Sekvenca se ovde naziva SEQ ID NO: 2

Sijaliltransferaza

[0059] α2,3-sijaliltransferaza - Kodirajući region gena za beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferaza 4 (α2,3-sijaliltransferaza, ST3GAL4) korišćen je prema Kitagawa i Paulson (1994). Sekvenca je označena kao L23767 i ovde se naziva SEQ ID NO: 3.

[0060] α2,6-sijaliltransferaza - Kodirajući region gena za beta-galaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferaza 1 (α2,6-sijaliltransferaza, ST6GAL1) je korišćen prema Grundmann i dr. (1990). Sekvenca je označena kao NM_003032 i ovde se naziva SEQ ID NO: 4.

PRIMERI

Primer 1 Konstrukcija vektora ekspresije FSH

[0061] Kodirajuća sekvenca FSH alfa polipeptida (AH007338, SEQ ID NO: 1) i FSH beta polipeptid (NM_003032, SEQ ID NO: 2) su amplifikovani pomoću PCR koristeći kombinacije prajmera FSHa-fv i FSHa-rev i FSHb-fw i FSHb-rec.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (SEQ ID NO:9)

FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (SEQ ID NO:10) FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 11) FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 12)

[0062] Dobijena amplifikovana FSH beta DNK je svarena restrikcionim enzimima AscI i HpaI i ubačena u mesta AscI i HpaI na ekspresionom vektoru sisara koji je vođen CMV, noseći marker selekcije neomicina. Slično tome, FSH alfa DNK je digestiran sa BamHI i

1

NheI i umetnut u mesta BamHI i NheI na ekspresionom vektoru koji već sadrži FSH beta polipeptidnu DNK.

[0063] Vektorska DNK je korišćena za transformaciju DH5α soja E.coli. Kolonije su odabrane za pojačavanje. Kolonije koje sadrže vektor koji sadrži i FSH alfa i beta su odabrane za sekvenciranje i sve su sadržavale tačne sekvence prema SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Za transfekciju je izabran plazmid pFSH A+B#17 (Slika 1).

Primer 2 Konstrukcija vektora ekspresije ST3

[0064] Kodirajuća sekvenca beta-galaktozida alfa-2,3-sijaliltransferaze 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) je pojačan PCR-om primenom prajmer kombinacije 2,3STfw i 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 13)

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 14)

[0065] Dobijena amplifikovana ST3 DNK je svarena restrikcionim enzimima BamHI i AflII i ubačena u mesta BamHI i AflII na ekspresionom vektoru sisara koji je vođen CMV, noseći marker rezistencije na higromicin. Vektor je pojačan kako je prethodno opisano i sekvencirano. Klon pST3 # 1 (Slika 2) sadržao je tačnu sekvencu prema SEQ ID NO: 3 i odabran je za transfekciju.

Primer 3 Konstrukcija vektora ekspresije ST6

[0066] Kodirajuća sekvenca beta-galaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferaze 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) je pojačan PCR-om primenom prajmer kombinacije 2,6STfw i 2,6STrev.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (SEQ ID NO: 15)

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 16)

[0067] Dobijena amplifikovana ST6 DNK je svarena restrikcionim enzimima BamHI i AflII i ubačena u mesta BamHI i AflII na ekspresionom vektoru sisara koji je vođen CMV, noseći marker rezistencije na higromicin. Vektor je pojačan kako je prethodno opisano i sekvencirano. Klon pST6 # 11 (Slika 3) sadržao je tačnu sekvencu prema SEQ ID NO: 4 i

2

odabran je za transfekciju.

Primer 4 Stabilna ekspresija pFSH α+β u PER.C6® ćelijama. Transfekciona izolacija i skrining klonova.

[0068] PER.C6® klonovi koji proizvode FSH generisani su ekspresijom oba polipeptidna lanca FSH iz jednog plazmida (videti Primer 1).

[0069] Da bi se dobili stabilni klonovi, sredstvo za transfekciju na bazi lipozoma sa konstrukcijom pFSH α+β. Stabilni klonovi su odabrani u VPRO sa dodatkom 10% FCS i sadrže G418. Tri nedelje nakon transfekcije, izrasli su klonovi otporni na G418. Klonovi su izabrani za izolaciju. Izolovani klonovi su kultivisani u selekcionom medijumu do koncentracije 70-80%. Supernatanti su ispitivani na sadržaj FSH proteina korišćenjem FSH selektivne ELISA i farmakološke aktivnosti na FSH receptoru u kloniranoj ćelijskoj liniji, primenom testa akumulacije cAMP. Klonovi koji eksprimiraju funkcionalni protein napredovani su za ekspanziju kulture u 24 udubljenja, 6 udubljenja i T80 boce.

[0070] Ispitivanja za određivanje produktivnosti i kvaliteta materijala iz sedam klonova započete su u bocama T80 da bi se dobilo dovoljno materijala. Ćelije su kultivisane u dopunjenom medijumu kako je prethodno opisano tokom 7 dana i sakupljen je supernatant. Produktivnost je određena upotrebom FSH selektivnog ELISA. Izoelektrični profil materijala određen je izoelektričnim fokusiranjem (IEF), postupcima poznatim u struci. Klonovi sa dovoljnom produktivnošću i kvalitetom izabrani su za inženjering sijaltransferaze.

Primer 5 Povećan je nivo sijalilacije u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju α2,3-sialiltransferazu. Stabilna ekspresija pST3 u FSH koji eksprimira PER.C6® ćelije; Transfekciona izolacija i skrining klonova.

[0071] Klonovi PER.C6® koji proizvode visoko sijalizovani FSH generisani su ekspresijom α2,3 sijaliltransferaze iz odvojenih plazmida (Primer 2) u PER.C6® ćelijama koje već eksprimiraju oba polipeptidna lanca FSH (iz Primera 4). Klonovi proizvedeni iz PER.C6® ćelija, kako je prikazano u Primeru 4, izabrani su zbog njihovih karakteristika, uključujući produktivnost, dobar profil rasta, proizvodnju funkcionalnih proteina, i proizvedeni FSH koji je sadržavao određenu sijalilaciju. Stvoreni su stabilni klonovi kao što je prethodno opisano u Primeru 4. Klonovi su izolovani, prošireni i analizirani. Klonovi α2,3-sijaliltransferaze prilagođeni su medijumu bez seruma i uslovima suspenzije.

[0072] Kao i ranije, klonovi su ispitivani pomoću FSH selektivnog ELISA, funkcionalnog odgovora u ćelijskoj liniji receptora za FSH, IEF, brzine metaboličkog klirensa i Steelman Pohley analize. Rezultati su upoređeni sa komercijalno dostupnim rekombinantnim FSH (Gonal-f, Serono) i roditeljskim FSH PER.C6® ćelijskim linijama. FSH koji proizvodi većina klonova je značajno poboljšao sijalilaciju (tj. u proseku više izoformi FSH sa velikim brojem sijalnih kiselina) u poređenju sa FSH eksprimiranim bez α2,3-sijaliltransferaze. U zaključku, ekspresija FSH zajedno sa sijaliltransferazu u PER.C6® ćelijama rezultirala je povećanim nivoom sijaliranog FSH u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju samo FSH.

Primer 6 Pregled proizvodnje i prečišćavanja

[0073] Razvijen je postupak za proizvodnju FSH u PER.C6® ćelijama koje su kultivisane u suspenziji u medijumu bez seruma. Postupak je opisan u nastavku i primenjen je na nekoliko PER.C6® ćelijskih linija koje proizvode FSH.

[0074] FSH iz α2,3-klona (Primer 5) je pripremljen korišćenjem modifikacije postupka opisanog od Lowry i dr. (1976).

[0075] Za proizvodnju PER.C6®-FSH, ćelijske linije su prilagođene medijumu bez seruma, tj. Excell 525 (JRH Biosciences). Ćelije su prvo kultivisane da bi stvorile 70% -90% slivajući se jedan sloj u boci za kulturu T80. Nakon prolaska, ćelije su ponovo suspendovane u medijumu bez seruma, Excell 525 4 mM L-glutamina, do gustine ćelija od 0,3x10<6>ćelija/ml. Suspenzija ćelija od 25 ml je stavljena u tikvicu za mućkanje od 250 ml i mućkana na 100 o/min na 37°C na 5% CO2. Nakon postizanja gustine ćelija od > 1x10<6>ćelija/ml, ćelije su sub-kultivisane do ćelijske gustine od 0,2 ili 0,3x10<6>ćelija/ml i dalje kultivisane u flašicama za mućkanje na 37°C, 5% CO2i 100 o/min.

[0076] Za proizvodnju FSH, ćelije su premeštene u medijum za proizvodnju bez seruma, tj., VPRO (JRH Biosciences), koji podržava rast PER.C6® ćelija do vrlo visoke gustine ćelija (obično > 10<7>ćelija/ml u serijskoj kulturi). Ćelije su prvo kultivisane na > 1x10<6>ćelija/ml u Excell 525, zatim su okrenute 5 minuta pri 1000 obrtaja u minuti i potom suspendovane u VPRO medijumu 6 mM L-glutamina do gustine od 1x10<6>ćelija/ml. Ćelije su zatim kultivisane u flašici za mućkanje 7-10 dana na 37°C, 5% CO2i 100 o/min. Tokom ovog perioda, ćelije su porasle do gustine > 10<7>ćelija/ml. Medijum za kultivisanje je sakupljen nakon što je održivost ćelija počela da opada. Ćelije se vrte 5 minuta pri 1000 obrtaja u minuti i supernatant se koristi za kvantifikaciju i prečišćavanje FSH. Koncentracija FSH je određena pomoću ELISA (DRG EIA 1288).

[0077] Posle toga, prečišćavanje FSH je izvedeno modifikovanjem postupka opisanog od Lowry i dr. (1976). Prečišćavanje primenom selektivne hromatografije naelektrisanjem izvedeno je da bi se obogatili visoko sijalirani oblici postupcima dobro poznatim u tehnici.

[0078] Tokom svih hromatografskih postupaka, obogaćivanje sijalizovanih oblika FSH kako se ovde tvrdi potvrđeno je od strane RIA (DRG EIA 1288) i/ili IEF.

Primer 7 Kvantifikacija relativnih količina sijalne kiseline α2,3 i α2,6

[0079] Relativne procentualne količine α2,3 i α2,6 sijalne kiseline na prečišćenom rFSH (Primer 6) merene su upotrebom poznatih tehnika.

[0080] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGase F pod denaturacionim uslovima, a zatim obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Oslobođeni glikanski oblici su zatim odvojeni i analizirani u koloni razmene slabog anjona (WAX) za određivanje raspodele naelektrisanja. Označeni glikani tretirani sa 2,3,6,8 sijalidazom za određivanje ukupne sijalne kiseline i 2,3 sijalidazom za određivanje 2,3 sijalne kiseline, dalje su analizirani voštanom kolonom.

[0081] Relativni procenti naelektrisanih glikana izračunati su iz struktura prisutnih u nesvarenom i svarenom bazenu glikana i prikazani su na Slici 4 (za 8 uzoraka). Utvrđeno je da su oni u opsegu 50% - 70% (npr. oko 60% ili 65%) za α2,3 sijalilaciju i 28 do 50%, obično 30 do 35% (npr. oko 31% ili 35%), za α2,6 sijalilaciju.

Primer 8 Kvantifikacija relativnih količina mono, di, tri i tetra-sijaliranih glikanskih struktura

[0082] Relativne procentualne količine mono, di, tri i tetra-sijaliranih struktura na glikanima

2

ekstrahovanim iz prečišćenog rFSH (Primer 6) izmerene su upotrebom poznatih tehnika.

[0083] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGase F pod denaturacionim uslovima, a zatim su obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGase F pod denaturacionim uslovima, a zatim obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Oslobođeni glikanski oblici su zatim odvojeni i analizirani u koloni razmene slabog anjona (WAX) za određivanje raspodele sijalilacije. Relativne količine neutralnih, mono-sijaliranih, di-sijaliranih, tri-sijaliranih i tetra-sijaliranih struktura prikazane su na Slici 5 (za 8 uzoraka prikazanih na Slici 4).

[0084] RFSH uključuje neutralne, mono-sijalirane, di-sijalirane, tri-sijalirane i tetra-sijalirane glikanske strukture sa relativnim količinama kako sledi: neutralna 5-6 %; 15-17% monosijalirane; 26-30% di-sijalirane; 30-32% tri-sijalirane i 17-23 % tetra-sijalirane.

Primer 8a

[0085] Relativne procentualne količine α2,6 sijalne kiseline na prečišćenom rFSH ekstrahovanom iz devet uzoraka prečišćenog rFSH (proizvedenog postupcima iz Primera 6) izmerene su upotrebom poznatih tehnika.

[0086] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka upotrebom PNGase F pod denaturacionim uslovima, a zatim obeleženi sa 2-aminobenzamidom. Oslobođeni glikanski oblici su zatim odvojeni i analizirani u koloni razmene slabog anjona (WAX) za određivanje raspodele naelektrisanja. Označeni glikani tretirani sa 2,3,6,8 sijalidazom za određivanje ukupne sijalne kiseline i 2,3 sijalidazom za određivanje 2,3 sijalne kiseline, dalje su analizirani voštanom kolonom (videti Primer 8). Analiza omogućava izračunavanje α2,6 sijalne kiseline.

[0087] Relativni procenti naelektrisanih glikana izračunati su iz struktura prisutnih u nesvarenom i svarenom bazenu glikana i prikazani su na sledećoj Tabeli. Utvrđeno je da su oni u rasponu od 25 do 50%, obično 30 do 35% za α2,6 sijalilaciju.

[0088] Relativne procentualne količine razdvajanja GlcNac, GalNac i 1-Fukoza Lewis na glikanima ekstrahovanim iz devet uzoraka prečišćenog rFSH (proizvedenog postupcima iz Primera 6) izmerene su upotrebom poznatih tehnika. N-glikani su oslobođeni iz glikoproteina upotrebom PNGase F i obeleženi sa 2-aminobenzamidom (2AB). Analiza je rađena dvodimenzionalnom (2D) HPLC analizom u kombinaciji sa enzimskom razgradnjom glikana. Za verifikaciju, glikani su analizirani pomoću MALDI-MS. Relativne količine alfa 2,6-sijalne kiseline i terminalni ostaci prikazani su u sledećoj tabeli, zajedno sa onima za Gonal F (rekombinantni FSH koji potiče iz ćelija CHO) i Bravelle (humani) mokraćni FSH).

[0089] Može se videti da količina GalNac u FSH prema pronalasku varira između oko 44,9 i 51%, u proseku oko 47,1%.

[0090] Može se videti da količina podeljenog GlcNac u FSH prema pronalasku varira između 8,7 i 13,9%, u proseku približno 10,9%.

[0091] Može se videti da količina 1 fukoze Lewis u FSH prema pronalasku varira između 16,1 i 23,3%, u proseku oko 19%.

[0092] Može se videti da količina 2 fukoze Lewis u FSH prema pronalasku varira između 1,9 i 4,4%, u proseku oko 3,7%.

Primer 9 - Ispitivanje višestrukih doza koja istražuje sigurnost, podnošljivost,

2

farmakokinetiku, farmakodinamiku i imunogenost FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

Ispitivanje populacije

[0093] Ukupno 48 (24 za svaki lek) zdravih žena je tokom sedam dana dobijalo dnevne doze od 14,6 µg FE 999049 (sastav prema pronalasku, proizvedena prema Primeru 6) ili 16,5 µg Gonal-F.

Rezultati bezbednosti

[0094] Primena višestrukih doza FE 999049 i GONAL-F bila je sigurna i generalno se dobro podnosila prema proceni neželjenih događaja (AE), vitalnih znakova, EKG-a, kliničkih laboratorijskih merenja i fizičkog pregleda. Tokom ispitivanja nije došlo do ozbiljnih neželjenih događaja ili smrti.

Farmakokinetički rezultati

[0095] Nakon davanja FE 999049 i GONAL-F tokom 7 dana, vrednosti koncentracije FSH, procenjene neposredno pre sledeće injekcije, povećale su se i činilo se da dostižu nivo stabilnog stanja nakon 6-7 dana. Međutim, izloženost (AUC i Cmax) FE 999049 bila je 60% veća u poređenju sa Gonal-F.

Farmakodinamički rezultati

[0096] Koncentracije inhibina-B (videti Sliku 6), estradiola i progesterona povećale su se nakon davanja FE 999049 i GONAL-F, ali u većoj meri nakon davanja FE 999049 u poređenju sa GONAL-F. I raspored i broj folikula pokazali su veći odgovor na FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

[0097] Primer 9 pokazuje da FSH ima određenu količinu (17-23%) tetra-sijaliranih glikanskih struktura i npr. specifične količine α2,3 sijalilacije i α2,6 sijalilacije su znatno moćnije od rekombinantnih FSH proizvoda koji su trenutno na tržištu.

2

Primer 10 - Ispitivanje višestruke doze koja istražuje FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

[0098] Sledeće opisuje nasumično, kontrolisano, slepo od procenjivača, paralelno grupno multinacionalno multicentrično ispitivanje koje procenjuje odnos doze i odziva FE 999049 kod pacijenata koji su podvrgnuti kontrolisanoj stimulaciji jajnika za vantelesnu oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI). Populacija pacijenata bila je 265 vantelesnih oplodnih bolesnika starosti između 18 i 37 godina, sa BMI 18,5 do 32,0 kg/m<2>.

[0099] Ispitivanje je zamišljeno kao ispitivanje odgovora na dozu sa brojem oocita koji su dobijeni kao primarna krajnja tačka. Sekundarne krajnje tačke će istražiti kvalitativni i kvantitativni uticaj različitih doza FE 999049 na endokrini profil, folikularni razvoj, oplodnju jajnih ćelija, kvalitet embriona i efikasnost lečenja (tj. ukupnu potrošnju gonadotropina i trajanje stimulacije). Suđenje je dizajnirano da proceni efikasnost FE 999049 za utvrđivanje trudnoće kada se koristi u kontrolisanoj stimulaciji jajnika za IVF/ICSI cikluse.

[0100] Ispitanici su procenjeni u roku od 3 meseca pre nasumičnog postavljanja na usaglašenost sa kriterijumima za uključivanje i isključivanje, uključujući procenu antimilerovskog hormona (AMH) radi povećanja homogenosti ispitivane populacije u odnosu na odgovor jajnika i minimiziranja broja potencijalnih siromašnih i hiper-odgovora na doze FE 999049 i dozu GONAL-F korišćene u ispitivanju. Procena AMH merena je pomoću kompleta za analizu imunosorbentnih enzima AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Test može otkriti koncentraciju AMH veću od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/L.

[0101] Na dan 2-3 menstrualnog ciklusa, ispitanici su nasumično postavljeni na način 1:1:1:1:1:1 na tretman sa 90 IU, 120 IU, 150 IU, 180 IU ili 210 IE FE 999049 ili 150 IU GONAL-F i započeta je stimulacija jajnika. Nasumično postavljanje je stratifikovano prema nivou AMH pri skriningu [5,0-14,9 pmol/L (nizak AMH) i 15,0 do 44,9 pmol/L (visok AMH)).

[0102] Gonal-F se puni masom (FbM) na zahtev FDA; upućivanje na dozu µg je stoga prikladno. Oznaka Gonal -F označava 600 IU/44 µg, što znači da 150 IU iznosi 11 µg.

Međutim, postoje neke varijacije i sertifikat serije za ovo ispitivanje ukazuje da je 11,3 µg

2

Gonal-F ekvivalentno 150 IU. Doze FE999049 su predstavljene sadržajem proteina (µg), a ne biološkom aktivnošću. Tako su doze FE999049 bile 5.2µg (90 IU), 6.9µg (120 IU), 8.6µg (150 IU), 10.3µg (180 IU) ili 12.1µg (210 IU).

[0103] Raspodela ispitanika i doze data je na sledeći način (podaci su broj ispitanika):

Tabela 1

FE 999049 GONAL-F

5,2 6,9 8,6 10,3 12,1 11,3 (11) Ukupno

[0104] Dnevni nivo doze FE 999049 ili GONAL-F je fiksiran tokom čitavog perioda stimulacije. Tokom stimulacije, ispitanici se nadgledaju dan stimulacije 1, 4 i 6 i dalje, najmanje svakog drugog dana. Kada se primete 3 folikula od ≥15 mm, posete se obavljaju svakodnevno. Ispitanici se leče FE 999049 ili GONAL-F maksimalno 16 dana.

[0105] Da bi se sprečio prevremeni LH skok, GnRH antagonist (ganireliks acetat, ORGALUTRAN, MSD/Schering-Plough) može biti pokrenut 6. dana stimulacije u dnevnoj dozi od 0,25 mg i nastavljen tokom perioda stimulacije. Pokretanje konačnog sazrevanja folikula vrši se na dan kada se primete ≥3 folikula prečnika ≥17 mm. Ako postoji < 25 folikula prečnika ≥12 mm, daje se 250 µg rekombinantnog hCG (horiogonadotropin alfa, OVITRELLE, Merck Serono/EMD Serono). Ako postoji 25-35 folikula prečnika ≥12 mm, primenjuje se 0,2 mg GnRH agonista (triptorelin acetat, DECAPEPTYL/ GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals). U slučaju prekomernog odgovora jajnika, definisanog kao > 35 folikula prečnika ≥12 mm, lečenje se otkazuje. U slučaju lošeg odgovora jajnika, definisanog

2

kao < 3 folikula prečnika ≥ 10 mm, primećenih 10. dana stimulacije, ciklus bi mogao biti otkazan.

[0106] Vađenje jajnih ćelija vrši se 36h (± 2h) nakon pokretanja konačnog folikularnog sazrevanja i oocita osemenjenih sa IVF i/ili ICSI. Oplodnja i razvoj embriona procenjuju se od pronalaženja jajnih ćelija do dana prenosa. Za ispitanike koji su podvrgnuti pokretanju konačnog folikularnog sazrevanja hCG, jedna blastocista najboljeg dostupnog kvaliteta prenosi se 5. dana nakon vađenja oocita, dok su preostale blastociste zamrznute. Za ispitanike koji prolaze kroz aktiviranje konačnog folikularnog sazrevanja sa GnRH agonistom, prenos embriona se ne odvija u svežem ciklusu, a blastociste se 5. dan zamrzavaju. Vaginalne tablete progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 100 mg 3 puta dnevno pružaju se za podršku lateralnoj fazi od dana nakon vađenja oocita do dana kliničke posete trudnoći. Test bhCG se izvodi 13-15. dana nakon prenosa embriona, a klinička trudnoća biće potvrđena transvaginalnim ultrazvukom (TVU) 5-6 nedelja nakon prenosa embriona.

Rezultati

[0107] Broj preuzetih jajnih ćelija (primarna krajnja tačka) prikazan je u sledećoj Tabeli.

Tabela 2

2

[0108] Primarni cilj je ispunjen: uspostavljena je značajna veza doza-odgovor za FE 999049 u odnosu na broj preuzetih oocita. Ovo otkriće je primećeno ne samo za ukupnu populaciju ispitivanja, već i za svaki od dva sloja AMH koji su korišćeni u nasumičnom odabiru.

[0109] Pokazan je značajan odgovor doze za FE 999049 za sve ključne objektivne farmakodinamičke parametre, npr. estradiol, inhibin B i inhibin A. Na sličnom nivou doze mikrograma, farmakodinamički odgovori sa FE 999049 bili su veći nego sa GONAL-F (ovi rezultati nisu prikazani).

[0110] Koncentracije FSH u serumu nakon izlaganja FE 999049 bile su značajno veće nego u GONAL-F. Rezultati potvrđuju da se PK profil FE 999049 razlikuje od profila GONAL-F. Stope oplodnje, razvoj blastociste i stope trudnoće kod IVF/ICSI pacijenata lečenih FE 999049 bili su u okviru očekivanja.

[0111] Nije bilo zabrinutosti za sigurnost upotrebe FE 999049. Dokumentovana je dobra lokalna podnošljivost.

Dalja analiza

[0112] Podnosioci zahteva su dalje analizirali podatke kako bi identifikovali dozu (e) FE 999049 koje ispunjavaju sledeće kriterijume u pogledu broja preuzetih jajnih ćelija:

• Oociti pronađeni u opsegu 8-14

• Smanjiti udeo pacijenata sa <8 oocita

• Smanjiti udeo pacijenata sa ≥20 oocita

[0113] Podnosioci patentnih zahteva su takođe istraživali uticaj telesne mase. Ako je relevantno, doza se pretvara u µg/kg za prosečnog ispitanika. Ova vrednost od µg/kg i ± 0,01 µg/kg procenjuje se u modelu s obzirom na raspodelu preuzetih oocita, kao i na sigurnosni profil, i identifikuje se optimalna doza.

Niski AMH slojevi

[0114] Kao što se vidi u Tabeli 2, doza FE999049 koja je ispunila prvi kriterijum (oociti preuzeti u opsegu 8-14) iznosila je 12,1 µg (srednjih 9,4 preuzetih oocita). Raspodela oocita prikazana je u Tabeli 3 ispod.

Podaci su % ispitanika

[0115] Kao što pokazuju kutija i strelica, doza od 12,1 µg FE999049 obezbeđuje pronalaženje najpoželjnijeg broja jajnih ćelija kod 60% ispitanika u grupi sa niskim AMH. Ovo je značajno poboljšanje Gonal-F (najpoželjniji broj jajnih ćelija u samo 33% ispitanika).

[0116] Tabela 4 u nastavku prikazuje analizu znakova prekomernog odgovora u niskim slojevima AMH (podaci su broj ispitanika). Može se videti da nije bilo indikacija za rani OHSS umerene ili teške prirode i da nije bilo slučajeva potrebnih preventivnih mera; nema zabrinutosti povezanih sa dozom od 12,1 µg FE999049 kod pacijenta sa niskim AMH.

1

[0117] Slika 7 pokazuje efekat telesne mase na preuzete oocite (za niske slojeve AMH), za različite doze. Strelice pokazuju broj oocita uzetih kod ispitanika telesne mase između 45 kg i 90 kg koji su lečeni u dozi od 12,1 µg. Kao što se može videti (okvir za tekst), varijacija između pacijenata telesne mase 45 kg i onih od 90 kg je manja od oko 0,5 oocita; drugim rečima, doziranje telesne mase nije potrebno kod pacijenata sa niskim AMH kada je doza FE999049 najmanje 12 µg, jer u ovoj dozi ne postoje značajne razlike u oocitima preuzetim sa telesnom masom.

[0118] Stoga su podnosioci patentnih zahteva otkrili da je doza od, ili ekvivalentna dozi od 6 do 18 µg, na primer 9 do 14 µg, na primer 12 µg, rekombinantni FSH humanog porekla pogodan za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta koji ima serum AMH <15 pmol/L, na primer 0,05-14,9 pmol/L, na primer 5,0-14,9 pmol/L. Doza pruža efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS.

Visok AMH sloj

[0119] Kao što se vidi u Tabeli 2, tri doze FE999049 ispunile su prvi kriterijum (oociti pronađeni u opsegu 8-14): 6,9 µg (preuzeto 9,1 oocita), 8,6 µg (preuzeto 10,6 oocita) i 10,3 µg (preuzeto 13,6 oocita).

2

[0120] Slika 8 pokazuje efekat telesne mase na preuzete oocite (za visoke slojeve AMH), za različite doze. Strelice pokazuju broj oocita uzetih kod ispitanika telesne mase između 45 kg i 90 kg koji su tretirani u dozama od 6,9 µg, 8,6 µg i 10,3 µg. Kao što se može videti (okviri za tekst), varijacija je značajna: za dozu od 6,9 µg, 6 dodatnih jajnih ćelija će se uzeti od pacijenta od 45 kg u poređenju sa pacijentom od 90 kg; za dozu od 8,6 µg, 4 dodatnih jajnih ćelija će se uzeti od pacijenta od 45 kg u poređenju sa pacijentom od 90 kg; i za dozu od 10,1 µg, 2,5 dodatnih jajnih ćelija će se uzeti od pacijenta od 45 kg u poređenju sa pacijentom od 90 kg; Drugim rečima, doziranje telesne mase ima uticaja na pacijente sa visokim AMH kada je doza FE999049 manja od 12 µg, jer postoje značajne razlike u oocitima dobijenim sa telesnom masom, u ovim dozama.

[0121] Tabela 5a ispod prikazuje dalju razgradnju oocita koje je AMH preuzeo (iz Tabele 2). Ovo pokazuje doze koje su ispunile prvi kriterijum (oociti preuzeti u opsegu 8-14) za svaki podsloj AMH (kutije).

Tabela 5a

[0122] Tabela 5b ispod prikazuje analizu pacijenata kod kojih je lečenje otkazano zbog prekomernog odgovora ili aktiviranja agonista, za ove podgrupe. Na primer, jedan pacijent u slojevima od 25-34 pmol/L AMH otkazan je zbog prekomernog odgovora nakon doze od 10,3 µg i jedan pacijent u slojevima od 25-34 pmol/L AMH otkazan zbog prekomernog odgovora nakon doze od 12,1 µg ; jedan pacijent u slojevima 35-45 pmol/L AMH otkazan nakon aktiviranja agonista nakon doze od 10,3 µg; i jedan pacijent u slojevima 35-45 pmol/L AMH otkazan nakon aktiviranja agonista nakon doze od 6,9 µg;

Tabela 5b

[0123] Stoga se može videti da bi prilagođavanje doze prema telesnoj masi (Slika 8) i nivou AMH bilo korisno u visokim slojevima AMH, kako bi se smanjila otkazivanja i maksimizovalo preuzimanje oocita.

[0124] Podnosioci zahteva su otkrili da sledeće doze pružaju efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS (kg je kg telesne mase pacijenta).

[0125] Sledeće je prikladno ako doziranje telesne mase nije poželjno.

Serum AMH doza (Max doza)

4

[0126] Sledeće je prikladno ako je potrebno manje kategorija AMH.

[0127] Sledeće je prikladno ako doziranje telesne mase nije poželjno.

[0128] Stoga su podnosioci patentnih zahteva otkrili da je doza od, ili ekvivalentna dozi od 9 do 14 µg, na primer 12 µg, rekombinantni FSH humanog porekla pogodan za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta koji ima serum AMH <15 pmol/L, na primer 0,05-14,9 pmol/L, na primer 5,0-14,9 pmol/L. Doza pruža efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS.

[0129] Podnosioci patentnih zahteva su otkrili da je doza, ili doza ekvivalentna 5 do 12,5 µg, na primer 6 do 10,5 µg, rekombinantni FSH humanog porekla pogodan za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta koji ima AMH u serumu ≥ 15 pmol/l. Doza pruža efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS.

[0130] Podnosioci patentnih zahteva su otkrili da je (npr. dnevna) doza od 0,09 do 0,19 µg rekombinantnog FSH po kg telesne mase pacijenta, ili ekvivalentna doza, pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu ≥ 15 pmol/L.

Podnosioci patentnih zahteva su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza ekvivalentna 0,14 do 0,19 µg humanog rekombinantnog FSH (poželjno 0,15 do 0,16 µg humanog rekombinantnog FSH) po kg telesne mase pacijenta pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/L. Podnosioci patentnih zahteva su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza ekvivalentna 0,11 do 0,14 µg humanog rekombinantnog FSH (poželjno 0,12 do 0,13 µg humanog rekombinantnog FSH) po kg telesne mase pacijenta pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/L. Podnosioci patentnih zahteva su otkrili da je (npr. dnevna) doza od 0,10 do 0,11 µg rekombinantnog FSH po kg telesne mase pacijenta, ili ekvivalentna doza, pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu ≥ 35 pmol/L. Ove doze pružaju efikasan odgovor, istovremeno smanjujući rizik od OHSS.

[0131] Podnosioci patentnih zahteva su otkrili da je (npr. dnevna) doza od 0,15 do 0,21 µg (npr. 0,16 µg) humanog rekombinantnog FSH po kg telesne mase pacijenta pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta koji ima nivo AMH u serumu <15 pmol/L, na primer za prvi stimulativni ciklus sa rekombinantnim FSH dobijenim od čoveka. Međutim, nije potrebno da se pacijenti doziraju telesnom masom na ovom nivou AMH.

Primer 10 A - Individualizovani COS protokol (nizak AMH)

[0132] Odabrani pacijenti treba da se podvrgnu COS za vantelesnu oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI) postupcima poznatim u struci. Protokol pre lečenja uključuje procenu/skrining AMH pacijentovog seruma korišćenjem kompleta za analizu imunosorbentnih lekova AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovim testom se mogu otkriti koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/L. AMH se može meriti pomoću drugih kompleta za ispitivanje (npr. dostupno kod Roche).

[0133] COS protokol se odvija na uobičajeni način, osim davanja početne doze FE 999049 prema nivou AMH na skriningu. Pacijentu sa nivoom AMH <14,9 pmol/L primenila bi se početna dnevna doza od približno 12 µg FE 999049, rekombinantni proizvod FSH humanog porekla proizveden prema postupku iz Primera 6. Pacijent sa nivoom AMH od 15 do 24,9 pmol/L primio bi početnu dnevnu dozu od 0,15 do 0,19 µg humanog rekombinantnog FSH po kg telesne mase pacijenta. Pacijent sa nivoom AMH od 25 do 34,9 pmol/L primio bi početnu dnevnu dozu od 0,11 do 0,13 µg humanog rekombinantnog FSH po kg telesne mase pacijenta. Pacijent sa nivoom AMH od ≥ 35 pmol/L primio bi početnu dnevnu dozu od 0,10 do 0,11 µg humanog rekombinantnog FSH po kg telesne mase pacijenta.

Primer 11 - Individualizovani COS protokoli.

[0134] Doze u ovom protokolu su manje poželjne od Primera 10A.

[0135] Odabrani pacijenti treba da se podvrgnu COS za vantelesnu oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI) postupcima poznatim u struci. Protokol pre lečenja uključuje procenu/skrining AMH pacijentovog seruma korišćenjem kompleta za analizu imunosorbentnih lekova AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Test može otkriti koncentraciju AMH veću od 0,57 pmol/L sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/L.

[0136] COS protokol se odvija na uobičajeni način, osim davanja početne doze FE 999049 prema nivou AMH na skriningu u skladu sa sledećom tabelom. Tako bi se pacijentu sa nivoom AMH od 5-14,8 pmol/L davalo 180 IU FSH u obliku približno 8-11 µg FE 999049, rekombinantni FSH proizvod dobijen od čoveka, proizveden prema postupku iz Primera 6. Tako bi se pacijentu sa nivoom AMH od 30-44,9 pmol/L davalo 120 IU FSH u obliku približno 4-7 µg FE 999049, rekombinantni FSH proizvod dobijen od čoveka, proizveden prema postupku iz Primera 6. Ako nivo AMH nije dostupan, pacijentu se rekombinant daje 120-180 IU FSH u obliku približno 6-11 µg FE 999049, rekombinantni proizvod FSH humanog porekla proizveden prema postupku iz Primera 6.

Reference

[0137]

Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online.9(2), 231-236.

Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, and Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(5), 517-526.

Baenziger JU and Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947(2), 287-306.

Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

Damián-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alpha2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol.23(2), 153-165.

D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, and Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28), 8665-8673. No copy

Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res.32(6), 510-519

Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN and Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79, 756-760

Fox KM, Dias JA, and Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human folliclestimulating hormone. Mol Endocrinol.15(3), 378-89

Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, and Conradt HS. (1995). Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GlcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GlcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25.

Green ED and Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44. Grundmann,U., Nerlich,C., Rein,T. and Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18 (3), 667

Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2,172-191.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem.263(33), 17508-17515.

Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. and Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.

Kitagawa,H. and Paulson,J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem.269(2), 1394-1401.

Lee EU, Roth J, and Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.

de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Damm, J. and Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2, 361-369.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol).7, 16-21.

Olivennes F, Howles CM, Borini A, Germond M, Trew G, Wikland M, Zegers-Hochschild F, Saunders H (2009) Individualizing FSH dose for assisted reproduction using a novel algorithm: the CONSORT study. Reprod Biomed Online.2009 Feb;18(2):195-204.

Pierce JG, and Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 50, 465-495.

Pricer WE Jr, and Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem.246(15), 4825-33.

Rathnam P, and Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.;250(17):6735-6746. Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, and Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta.541(3), 372-84.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO and Vutyavanich T. (1987). Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.;43,:383-429.

Saxena BB and Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of folliclestimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem.251(4), 993-1005 Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology.53(6), 604-616.

Steer CJ, and Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for

4

asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem.

255(7), 3008-13.

Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem.265(34):20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem.

263(8), 3657-3663.

Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, Gonzalez R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissue-type plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), 153-163.

Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Suárez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, and Ulloa-Aguirre A. (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol.165(2), 193-205.

Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. and Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod.3, 491-501.

Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Damiàn-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E and Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod.7, 23-30.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Folliclestimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damián-Matsumura P, and Timossi C (2001). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res.32(6), 520-532.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod.69(2), 379-389.

Van Lenten L, and Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem.

247(14), 4633-40.

Wide, L. and Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropin-releasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab.70, 271-276.

Wide, L. and Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, 885-889.

Wide L, Naessén T, Sundström-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol Metab.;92(11), 4410-4417.

Zambrano E, Zariñán T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structurefunction relationship of the FSH variants. Endocrine. 10(2), 113-121.

Zhang X, Lok SH, and Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta.1425(3), 441-452.

SEQ ID NO: 1

Folikul stimulišući hormon alfa polipeptid

Pristupni broj AH007338

Nukleotidna sekvenca FSH alfa

Proteinska sekvenca FSH alfa (SEQ ID NO: 5)

SEQ ID NO: 2

Folikulostimulišući hormon beta polipeptid

Pristupni broj NM_000510

Nukleotidna sekvenca FSH beta

Proteinska sekvenca FSH beta (SEQ ID NO: 6)

SEQ ID NO: 3

Beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferaze 4 Pristupno broj L23767

Nukleotidna sekvenca ST3GAL4

Proteinska sekvenca ST3GAL4 (SEQ ID NO: 7)

4

SEQ ID NO: 4

Beta-galaktozid alfa-2,3- sijaliltransferaze 4 Pristupni broj NM_003032

Nukleotidna sekvenca ST6GAL1

Op-

Proteinska sekvenca ST6GAL1 (SEQ ID NO: 8)

4

4

4

4

4

1

2

4

Claims (1)

1. Patentni zahtevi

   1. Proizvod koji sadrži folikulo stimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenta sa nivoom AMH u serumu od 0,05 pmol/L ili većem, pri čemu je lečenje naznačeno time što se daje dnevna doza od 15 µg do 24 µg izvedenog humanog rekombinantnog FSH.

   2. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde proizvod sadrži dnevnu dozu od 15 µg, 18 µg ili 24 µg izvedenog rekombinantnog humanog FSH.

   4. Proizvod za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde izvedeni humani FSH uključuje α2, 3- i α2, 6-sialilaciju.

   5. Proizvod za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva gde proizvod dalje sadrži hCG.