RS59232B1 - Postupci za uklanjanje zagađivača koristeći hromatografiju membrane razmene jona sa razmeštanjem autohtonih proteina - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se uglavnom odnosi na prečišćavanje proteina. Pronalazak se posebno odnosi na postupke za uklanjanje zagađivača korišćenjem hromatografije membrane razmene jona sa razmeštanjem autohtonih proteina.

Stanje tehnike

[0002] Prečišćavanje proteina u velikoj ekonomičnoj razmeri sve je važniji problem za biotehnološku industriju. Uglavnom, proteini se proizvode pomoću ćelijske kulture, koristeći bilo eukariotske ili prokariotske ćelijske linije konstruisane za proizvodnju proteina od interesa ubacivanjem rekombinantnog plazmida koji sadrži gen za taj protein. Budući da su ćelije koje se obično koriste živi organizmi, moraju se hraniti složenim medijumom za rast, koji sadrži šećere, aminokiseline i faktore rasta, koji se obično dobijaju iz preparata životinjskog seruma. Odvajanje željenog proteina od smeše jedinjenja koja se hrane ćelijama i od nusproizvoda samih ćelija do čistoće dovoljne za upotrebu kao ljudski terapeutik predstavlja ozbiljan izazov.

[0003] Postupci prečišćavanja proteina od ćelijskih ostataka u početku zavise od mesta eksprimiranja proteina. Neki proteini mogu biti izazvani izlučivanjem direktno iz ćelije u okolni medijum za rast; drugi su izrađeni unutarćelijski. Za drugi tip proteina, prvi korak procesa prečišćavanja uključuje lizu ćelije, što se može obaviti različitim postupcima, uključujući mehaničko cepanje, osmotski šok ili enzimske tretmane. Takav poremećaj oslobađa celokupni sadržaj ćelije u homogenat, i osim toga stvara podćelijske fragmente koje je teško ukloniti zbog njihove male veličine. Obično se uklanjaju diferencijalnim centrifugiranjem ili filtracijom. Isti problem nastaje, mada u manjem obimu, sa direktno izlučenim proteinima usled prirodne smrti ćelija i oslobađanja proteina ćelija domaćina u toku proizvodnje proteina.

[0004] Jednom kada se dobije pročišćen rastvor koji sadrži protein od interesa, obično se pokušava njegovo razdvajanje od ostalih proteina koje proizvodi ćelija korišćenjem kombinacije različitih tehnika hromatografije. Ove tehnike razdvajaju smeše proteina na osnovu njihovog naelektrisanja, stepena hidrofobnosti ili veličine. Na raspolaganju je nekoliko različitih hromatografskih smola za svaku od ovih tehnika, što omogućava precizno prilagođavanje šema prečišćavanja određenom proteinu koji je uključen. Suština svakog od ovih postupaka odvajanja je da se mogu izazvati bilo da se proteini kreću različitim brzinama niz dugačku kolonu, postižući fizičko odvajanje koje se povećava kako prolaze dalje niz kolonu, ili da se selektivno lepe za medijum za razdvajanje, jer su eluirani različitim rastvaračima. U nekim slučajevima, željeni protein se odvaja od nečistoće kada se nečistoće posebno lepe na koloni, dok protein od interesa to ne čini, odnosno protein od interesa je prisutan u „protoku“.

[0005] Publikacije koje se tiču prečišćavanja proteina uključuju Fahrner i dr., Biotechnol 15 Genet Eng Rev. 2001;18:301-27.

[0006] Knudsen i dr., Journal of Chromatography A, 907 (2001), 145-154 opisuje hromatografiju membrane razmene jona za prečišćavanje antitela u razmeri. Ovo se odnosi na upotrebu membrana za katjonsku razmenu u režimu vezivanja i eluiranja i anjonskih membrana u protočnom režimu.

[0007] Goodall i dr., Journal of Dairy Science Vol. 91 No. 1, 2008 opisuje postupak za razdvajanje βlaktoglobulina, BSA i α-laktalbumina selektivno od pojedinačnih ili binarnih rastvora proteina ili sirišta pomoću membrana razmene anjona.

[0008] Tipičan proces prečišćavanja velikih razmera često se gradi oko upotrebe imobilisanog proteina A kao primarnog koraka hvatanja i prečišćavanja u kombinaciji sa drugim operacijama na koloni. Operacije na koloni Proteina A generalno omogućavaju čistoću koja se odnosi na proizvod preko 98%, i većina nečistoća procesa se ispira u fragmentu protoka. Zbog toga se smatra da su operativne jedinice koje slede u procesu koncentrisanja, prečišćavanja ili poliranja, odgovorne za odvajanje izomera koji se odnose na proizvod i uklanjanje preostalih količina proteina/DNK ćelije domaćina, izlučenog proteina A i virusa. Sažetak pronalaska

[0009] Ovde su obelodanjeni postupci za prečišćavanje polipeptida iz sastava koji sadrži polipeptid i najmanje jedan zagađivač, i koji obuhvataju sekvencijalne korake: (a) prenošenje sastava kroz membranu razmene jona, gde polipeptid i membrana imaju suprotno naelektrisanje, pri radnim uslovima koji se sastoje od pufera koji ima pH dovoljno različit od pI polipeptida da pojača naelektrisanje polipeptida i nisku jonsku snagu koja je efikasna za sprečavanje zaštite naelektrisanja puferskim jonima, zbog čega membrana vezuje polipeptid i najmanje jedan zagađivač i (b) obnavljanje prečišćenog polipeptida iz otpadne tečnosti. Ovde je opisano monoklonsko antitelo

[0010] U jednoj alternativi, ovde opisan je postupak za prečišćavanje monoklonskog antitela iz sastava koji sadrži monoklonsko antitelo i najmanje jedan zagađivač, gde postupak obuhvata sekvencijalne korake: (a) prenošenje smeše kroz membranu za razmenu katjona, gde monoklonsko antitelo i membrana imaju suprotno naelektrisanje, pri radnim uslovima koji se sastoje od pufera sa pH od oko 1 do oko 5 pH jedinica ispod pI polipeptida i provodnosti od ≤ oko 40 mS/cm, zbog čega membrana vezuje za monoklonsko antitelo i najmanje jedan zagađivač, i (b) obnavljanje pročišćenog monoklonskog antitela iz otpadnih tečnosti.

[0011] U drugoj alternativi, ovde je opisan postupak za prečišćavanje monoklonskog antitela iz sastava koji sadrži monoklonsko antitelo i najmanje jedan zagađivač, gde postupak sadrži sekvencijalne korake: (a) prenošenje smeše kroz membranu za razmenu anjona, gde monoklonsko antitelo i membrana imaju suprotno naelektrisanje, pri radnim uslovima koji se sastoje od pufera sa pH od oko 1 do oko 5 pH jedinica iznad pI monoklonskog antitela i provodnosti od ≤ oko 40 mS/cm, zbog čega se membrana vezuje za monoklonsko antitelo i najmanje jedan zagađivač, i (b) obnavljanje pročišćenog monoklonskog antitela iz otpadnih tečnosti.

[0012] U jednom aspektu, zagađivač je protein jajnika kineskog hrčka (CHOP). U drugom aspektu, polipeptid sadrži CH2/CH3 region.

[0013] U drugim aspektima, postupci dalje obuhvataju podvrgavanje sastava koji sadrži monoklonsko antitelo jednom ili više koraka daljeg prečišćavanja bilo pre, tokom ili nakon koraka a do b, gde je korak prečišćavanja, u jednoj alternativi, afinitetna hromatografija proteina A i, u drugoj alternativi, i hromatografiji razmene jona, koristeći kolonu ili membranu koja deluje u režimu vezivanja/eluiranja, protoka ili autohtonog pomeranja proteina.

[0014] Pored toga, ovde je opisano dobijanje farmaceutskog sastava kombinovanjem pročišćenog monoklonskog antitela sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Kratak opis crteža

[0015]

Slika 1: CHOP klirens za mAb 1 grupu razmene anjona pri pH 5,5, 6,0 mS/cm Mustang™ S (mala razmera, 0,18 mL MV, 667 MV/sat).

Slika 2: CHOP klirens za mAb 2 grupu razmene anjona pri pH 5,5, 6,4 mS/cm i pri pH 8,0 i 5,0 mS/cm, Mustang™ S (mala razmera, 0,18 mL MV, 667 MV/sat).

Slika 3: Prinos za mAb 2 mAb 2 grupu razmene anjona pri pH 5,5, 6,4 mS/cm i pri pH 8,0 i 5,0 mS/cm, Mustang™ S (mala razmera, 0,18 mL MV, 667 MV/sat).

Slika 4: CHOP klirens za mAb 1 Protein A grupu pri pH 5,5, 3,2 mS/cm Mustang™ S (mala razmera, 0,18 mL MV, 1333 MV/sat).

Slika 5: CHOP (stubići) i kapacitet vezivanja (linija) za mAb 3 pri pH 8,0, Mustang™ Q (mala razmera, 0,35 mL MV, 600 MV/sat).

Slika 6: Prinos za mAb 2 mAb 3 grupu razmene anjona pri pH 8,0, Mustang™ Q (mala razmera, 0,35 mL MV, 600 MV/sat).

Slika 7: CHOP nivoi za mAb 4 pri pH 8,0 i 4,0 mS/cm, Mustang™ Q (mala razmera, 0,18 mL MV, 1333 MV/sat) i zatim pH 5,5 i 6,1 mS/cm, Mustang™S (mala razmera, 0,18 mL MV, 1333 MV/sat) Slika 8: CHOP klirens za mAb 1 pri pH 8,0 i 4,7 mS/cm preko Q Sepharose kolone brzog protoka pokrenute u protočnom režimu pri 100 cm/sat (pruge) i zatim dalje pročišćeno preko Mustang™ S u režimu serija (dijamanti) i neprekidnom režimu (sivo) pri otprilike pH 5,5 i 6 mS/cm (mala razmera, 0,18 mL MV, 538 MV/sat).

Slika 9: CHOP klirens za mAb 1 pri pH 5,5, 6,0 mS/cm, Startobind™ S (mala razmera, 0,14 mL MV, 857 MV/sat).

Slika 10: CHOP klirens za mAb 1 pri pH 5,5, 6 mS/cm, Mustang™ S (mala razmera, 0,18 mL MV). Slika 11: CHOP klirens za mAb 1 pri pH 5,5, 6 mS/cm Mustang™S (pilot razmera, 10 mL MV, 546 MV/sat).

Slika 12. Pregled proizvodnje proteina u kojoj se hromatografija razmene katjona izvodi u režimu vezivanja/eluiranja.

Slika 13. Pregled proizvodnje proteina gde se hromatografija razmene katjona koja se izvodi u režimu vezivanja/eluiranja menja za izvođenjem membrane razmene kajtona u režimu razmeštanja autohtonog proteina

Detaljan opis poželjnog otelotvorenja

Definicije:

[0016] Ovde, numerički rasponi ili iznosi kojima prethodi izraz „otprilike“ naročito uključuju tačan raspon ili tačan brojčani iznos.

[0017] „Sastav“ koji se ovde prečišćava obuhvata polipeptid od interesa i jedan ili više zagađivača. Sastav može da bude „delimično prečišćen“ (tj., podvrgnut jednom ili više koraka prečišćavanja, poput hromatografije proteina A) ili se može dobiti direktno iz ćelije domaćina ili organizma koji proizvodi antitelo (npr., sastav može da sadrži prikupljenu tečnost ćelijske kulture).

[0018] Kako se ovde koristi, „polipeptid“ se generalno odnosi na peptide i proteine koji imaju više od desetak aminokiselina. Poželjno, polipeptid je sisarski protein, čiji primeri uključuju: renin; hormon rasta, uključujući ljudski hormon rasta i goveđi hormon rasta; faktor oslobađanja hormona rasta; paratiroidni hormon; tiroidno stimulišući hormon; lipoproteine; alfa-1-antitripsin; A-lanac insulina; B-lanac insulina; proinsulin; folikulno stimulišući hormon; kalcitonin; luteinizujući hormon; glukagon; faktore zgrušavanja poput faktora VIIIC, faktora IX, faktora tkiva i von Willebrands faktora; faktori protiv zgrušavanja, kao što je protein C; atrijski natriuretički faktor; surfaktant pluća; aktivator plazminogena, poput urokinaze ili ljudskog urina ili aktivator plazminogena tipa tkiva (t-PA); bombesin; trombin; hemopoetski faktor rasta; faktor nekroze tumora-alfa i -beta; enkefalinaza; RANTES (regulisano aktiviranjem normalno eksprimiranih i izlučenim T-ćelijama); ljudski makrofagni upalni protein (MIP-1-alfa); serumski albumin, kao što je ljudski serumski albumin; Milerijanska inhibitorna supstanca; A lanac relakina; B-lanac relakina; prorelaksin; mišji gonadotropin-povezani peptid; mikrobni protein, kao što je beta-laktamaza; DNaza; IgE; citotoksični antigen povezan sa T-limfocitima (CTLA), kao što je CTLA-4; inhibin; Aktivin; vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF); receptori za hormone ili faktore rasta; protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofični faktor, poput koštanog neurotrofičkog faktora (BDNF), neurotropin-3, -4, -5, ili -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ili NT-6), ili faktor rast nerava kao što je NGF-p; faktor rasta koji potiče iz trombocita (PDGF); faktor rasta fibroblasta kao što su aFGF i bFGF; faktor rasta epiderme (EGF); transformišući faktor rasta (TGF) kao što su TGF-alfa i TGF-beta, uključujući TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 ili TGF-β5; insulinski faktor rasta-I i -II (IGF-I i IGF-II); des(1-3)-IGF-I (moždani IGF-I), proteini koji vezuju insulinske faktore rasta (IGFBP); CD proteini kao što su CD3, CD4, CD8, CD19 i CD20; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; koštani morfogenetski protein (BMP); interferon kao što su interferon-alfa, -beta i - gama; faktori koji stimulišu kolonije (CSF), npr., M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukini (IL), npr., IL-1 do IL-10; superoksid dismutaza; T-ćelijski receptori; proteini površinske membrane; faktor ubrzavanja propadanja; virusni antigen, kao što je, na primer, deo AIDS omotača; transportni proteini; receptora za pronalaženje; adresini; regulatorni proteini; integrini kao što su CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 i VCAM; tumorski antigen kao što su HER2, HER3 ili HER4 receptori; i fragmenti i/ili varijante bilo kog od gore navedenih polipeptida kao i antitela, uključujući fragmente antitela, koji se vezuju za bilo koji od gore navedenih polipeptida.

[0019] „Zagađivač“ je materijal koji se razlikuje od željenog polipeptidnog proizvoda. Zagađivač uključuje, bez ograničenja: materijale ćelija domaćina, kao što su proteini jajnika kineskog hrčka (CHOP); lučeni protein A; nukleinske kiseline; varijanta, fragment, agregat, izomer ili derivat željenog polipeptida; drugi polipeptid; endotoksin; kontaminacija virusa; komponenta medijuma ćelijske kulture (npr., garamicin; GENTAMYCIN®) itd.

[0020] Ovde je polipeptid od interesa onaj koji sadrži CH2/CH3 i zbog toga je podložan prečišćavanju afinitetnom hromatografijom proteina A. Izraz „ CH2/CH3 region“ kada se ovde koristi odnosi se na one aminokiselinske ostatke u Fc regionu imunoglobulinskog molekula koji stupaju u interakciju sa proteinom A. U poželjnim otelotvorenjima, CH2/CH3 regija sadrži netaknut CH2 region, i zatim netaknut CH3 region, i najpoželjnije Fc region imunoglobulina. Primeri CH2/CH3 polipeptida koji sadrže region uključuju antitela, imunoadhezine i fuzione proteine koji sadrže polipeptid od interesa koji se fuzioniše sa ili konjuguje sa CH2/CH3 regionom.

[0021] U poželjnim otelotvorenjima pronalaska, antitelo koje se ovde prečišćava je rekombinantno antitelo. „Rekombinantno antitelo“ je ono koje je proizvedeno u ćeliji domaćinu koja je transformisana ili transficirana nukleinskom kiselinom koja kodira antitelo, ili proizvodi antitelo kao rezultat homologne rekombinacije. „Transformacija“ i „transfekcija“ koriste se naizmenično kako bi se odnosili na proces uvođenja nukleinske kiseline u ćeliju. Posle transformacije ili transfekcije, nukleinska kiselina može da se integriše u genom ćelije domaćina ili može postojati kao ekstrahromozomski element. „Ćelija domaćin“ uključuje ćeliju u in vitro ćelijskoj kulturi, kao i ćeliju unutar životinje domaćina. Postupci za rekombinantnu proizvodnju polipeptida su opisani u US Patent No.5,534,615,

[0022] Izraz „antitelo“ se koristi u najširem smislu i posebno obuhvata monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok zadržavaju ili su modifikovani tako da sadrže CH2/CH3 region kako je ovde definisano.

[0023] Antitelo ovde je usmereno protiv „antigena“ od interesa. Poželjno, antigen je biološki važan polipeptid i primena antitela sisaru koji pati od bolesti ili poremećaja može dovesti do terapeutske koristi kod tog sisara. Međutim, antitela usmerena protiv ne-polipeptidnih antigena (kao što su glikolipidni antigeni povezani sa tumorom; pogledati US Patent 5,091,178) takođe se razmatraju. Tamo gde je antigen polipeptid, to može biti transmembranski molekul (npr., receptor) ili ligand, kao što je faktor rasta. Primeri antigena uključuju one polipeptide koji su razmatrani iznad. Poželjni molekularni ciljevi za antitela obuhvaćena ovim pronalaskom uključuju CD polipeptide poput CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 i CD34; članove porodice HER receptora kao što su EGF receptor (HER1), HER2, HER3 ili HER4 receptor; molekule ćelijske adhezije kao što su LFA-1, Macl, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM i av/b3 integrin, uključujući njihove bilo a ili b podjedinice (npr., anti-CD11a, anti-CD18 ili anti-CDllb antitela); faktori rasta kao što su VEGF; IgE; antigeni krvne grupe; flk2/flt3 receptor; receptor za gojaznost (OB); mpl receptor; CTLA-4; polipeptid C itd. Rastvorljivi antigeni ili njihovi fragmenti, opciono konjugovani sa drugim molekulima, mogu se koristiti kao imunogeni za stvaranje antitela. Za transmembranske molekule, poput receptora, njihovi fragmenti (npr., vanćelijski domen receptora) mogu se koristiti kao imunogen. Alternativno, ćelije koje eksprimiraju transmembranski molekul mogu se koristiti kao imunogen. Takve ćelije mogu da se dobiju iz prirodnog izvora (npr., ćelijske linije raka) ili mogu biti ćelije koje su transformisane rekombinantnim tehnikama za eksprimiranje transmembranskih molekula.

[0024] Primeri antitela koja se ovde prečišćavaju uključuju, ali nisu ograničena na: HER2 antitela, uključujući trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), U.S. Patent No.5,725,856) i pertuzumab (OMNITARG™) (WO01/00245); CD20 antitela (pogledati niže); IL-8 antitela (St John i dr., Chest, 103:932 (1993), i International Publikatjon No. WO 95/23865); VEGF ili VEGF receptora antitela, uključujući humanizovana i/ili afinitetno sazrela VEGF antitela kao što su humanizovano VEGF antitelo huA4,6,1 bevacizumab (AVASTIN®) i ranibizumab (LUCENTIS®) (Kim i dr., Growth Factors, 7:53-64 (1992), International Publikatjon No. WO 96/30046, i WO 98/45331, objavljeno 15. oktobra 1998); PSCA antitela (WO01/40309); CD11a antitela, uključujući efalizumab (RAPTIVA®) (US Patent No. 5,622,700, WO 98/23761, Steppe i dr., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), i Hourmant i dr., Transplantation 58:377-380 (1994)); antitela koja vezuju IgE uključujući omalizumab (XOLAIR®) (Presta i dr., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), i International Publikatjon No. WO 95/19181;US Patent No. 5,714,338, objavljeno 3. februara 1998 ili US Patent No. 5,091,313, objavljeno 25. februara 1992, WO 93/04173 objavljeno 4. marta 1993, ili International Applikatjon No. PCT/US98/13410 podneseno 30. juna 1998, US Patent No. 5,714,338); CD18 antitela (US Patent No.

5,622,700, objavljeno 22. aprila 1997, ili kao u WO 97/26912, objavljeno 31. jula 1997); Apo-2 receptor antitelo antitela (WO 98/51793 objavljeno 19. novembra 1998); Antitela za tkivni faktor (TF) ( European Patent No. 0420 937 B1 odobreno 9, novembra 1994); α4-α7integrin antitela (WO 98/06248 objavljeno February 19, 1998); EGFR antitela (npr., himerisano ili humanizovano antitelo 225, cetuksimab, ERBUTIX® kao u WO 96/40210 objavljeno 19. decembra 1996); CD3 antitela kao što su OKT3 (US Patent No. 4,515,893 objavljeno 7. maja 1985); CD25 ili Tac antitela kao što su CHI-621 (SIMULECT®) i ZENAPAX® (pogledati US Patent No. 5,693,762 objavljen 2. decembra 1997); CD4 antitela kao što su cM-7412 antitelo Choy i dr., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); CD52 antitela kao što je CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann i dr., Nature 332:323-337 (1988)); Fc receptor antitela kao što je M22 antitelo usmereno protiv Fc(RI kao u Graziano i dr., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); karcinoembrionski antigen (CEA) antitela kao što su hMN-14 (Sharkey i dr., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); antitela usmerena protiv epitelnih ćelija dojke, uključujući huBrE-3, hu-Mc3 i CHL6 (Ceriani i dr., Cancer Res.55(23): 5852s-5856s (1995); i Richman i dr., Cancer Res.55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); antitela koja se vezuju za ćelije raka debelog creva kao što su C242 (Litton i dr., Eur J. Immunol.26(1):1-9 (1996)); CD38 antitela, npr., AT 13/5 (Ellis i dr., J. Immunol.155(2):925-937 (1995)); CD33 antitela kao što je Hu M195 (Jurcic i dr., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)) i CMA-676 ili CDP771; EpCAM antitela kao što je 17-1A (PANOREX®); GpIIb/IIIa antitela kao što je abciksimab ili c7E3 Fab (REOPRO®); RSV antitela kao što je MEDI-493 (SYNAGIS®); CMV antitela kao što je PROTOVIR®; HIV antitela kao što je PRO542; hepatitis antitela kao što je Hep B antitelo OSTAVIR®; CA 125 antitelo OvaRex; idiotipsko GD3 epitopsko antitelo BEC2; antitelo αvβ3 (npr., VITAXIN®; Medimmune); antitelo ljudskog bubrežnog raka kao što je ch-G250; ING-1; anti-ljudsko 17-1An antitelo (3622V94); antitela protiv ljudskog kolorektalnog tumora (A33); antitelo na ljudski melanom R24 usmereno protiv GD3 gangliozida; protiv ljudskog raka pločastih ćelija (SF-25); ljudski leukocitni antigen (HLA) antitelo kao što su Smart ID10 i onkolimam anti-HLA DR antitela (Lim-1); CD37 antitelo poput TRU 016 (Trubion); IL-21 antitelo (Zimogenetics/Novo Nordisk); antitelo protiv B ćelija (Impheron); MAb za ciljanje B ćelija (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosis/GPC); LymphoRad 131 (HGS); Lym-1 antitelo, kao što je Lim -1Y-90 (USC) ili anti-Lym-1 onkolim (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); BAFF antitelo (npr., WO 03/33658); Antitelo za BAFF receptor (pogledati npr., WO 02/24909); BR3 antitelo; Blys antitelo kao što je belimumab; LYMPHOSTAT -B™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); gomiliksima (Idec 152; Biogen Idec); Antitelo za IL-6 receptor, poput atlizumaba (ACTEMRA™; Chugai/Roche); IL-15 antitelo kao što je HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); antitelo za hemokinske receptore, kao što je CCR2 antitelo (npr., MLN1202; Millieneum); anti-komplement antitela, kao što je C5 antitelo (npr., ekulizumab, 5G1,1; Alexion); oralna formulacija ljudskog imunoglobulina (npr., IgPO; Protein Therapeutics); IL-12 antitelo kao što je ABT-874 (CAT/Abbott); Teneliksimab (BMS-224818; BMS); CD40 antitela, uključujući S2C6 i njegove humanizovane varijante (WO00/75348) i TNX 100 (Chiron/Tanox); TNF-α antitela, uključujući cA2 ili infliksimab (REMICADE®), CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA™), pegilovani fragment TNF-α antitela, kao što su CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), anti-TNF-α poliklonska antitela (npr., PassTNF; Verigen); CD22 antitela kao što su LL2 ili epratuzumab (LIMPHOCIDE®; Immunomedics), uključujući epratuzumab Y-90 i epratzumab I-131, Abiogen-ovo CD22 antitelo (Abiogen, Italija), CMC 544 (Wyeth/Celltech), kombotoks (UT Soutwestern), BL22 (NIH) i LympoScan Tc99 (Immunomedics).

[0025] Primeri CD20 antitela uključuju: „C2B8“, koji se sada naziva „ritukimab“ („RITUXAN®“) (US Patent No. 5,736,137); mišje antitelo obeleženo itrijumom-[90] označeno kao „Y2B8“ ili „Ibritumomab tiksetan“ (ZEVALIN®) komercijalno dostupno od strane IDEC Pharmaceuticals, Inc. (US Patent No.

5,736,137; 2B8 deponovano kod ATCC pod pristupnim br. HB11388, 22. juna 1993.); mišji IgG2a „B1“, takođe nazvan „Tositumomab“, koji je opciono označen sa<131>I kako bi generisao generisati antitelo „131I-B1“ ili „jod 1131 tositumomab“ (BEXXAR™) komercijalno dostupno od strane Corixa (pogledati, takođe, US Patent No. 5,595,721); mišje monoklonsko antitelo „1F5“ (Press i dr., Blood 69(2):584-591 (1987)) i njegove varijante, uključujući „zakrpljen okvir“ ili humanizovani 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC depozit HB-96450); mišje 2H7 i himerno 2H7 antitelo (US Patent No.5,677,180); humanizovani 2H7 (WO 2004/056312, Lowman i dr.,); 2F2 (HuMax-CD20), potpuno ljudsko antitelo visokog afiniteta usmereno na molekul CD20 u ćelijskoj membrani B-ćelija (Genmab, Danska; pogledati, na primer, Glennie i van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) i Cragg i dr., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319); ljudska monoklonska antitela data u WO 2004/035607 i US2004/0167319 (Teeling i dr.,); antitela koja imaju složene N-glikozidno vezane lance šećera vezane za Fc region opisan u US 2004/0093621 (Shitara i dr.,); monoklonska antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji se vezuju za CD20 (WO 2005/000901, Tedder i dr.,) kao što su HB20-3, HB20-4, HB20-25 i MB20-11; molekuli za vezivanje CD20, kao što je AME serija antitela, npr., AME 33 antitela kako je navedeno u WO 2004/103404 i US2005/0025764 (Watkins i dr., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); molekuli za vezivanje CD20, kao što su oni opisani u US 2005/0025764 (Watkins i dr.,); A20 antitelo ili njegove varijante, poput himernog ili humanizovanog A20 antitela (cA20, hA20, respektivno) ili IMMU-106 (US 2003/0219433, Imunomedicina); Antitela koja vezuju CD20, uključujući Leu-16, 1H4 ili 2B8 sa osiromašenim epitopom, opciono konjugovana sa IL-2, kao u US 2005/0069545A1 i WO 2005/16969 (Carr i dr.,); bispecifično antitelo koje se vezuje za CD22 i CD20, na primer, hLL2xhA20 (WO2005/14618, Chang i dr.,); monoklonska antitela L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ili NU-B2 dostupna od International Leukocyte Typing Workshop (Valentine i dr., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma i dr., Blood 92:184 (1998)); anti-CD20 auristatin E konjugata (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); anti-CD20 MAb terapija (EpiCyte); anti-CD20 antitelo TRU 015 (Trubion).

[0026] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u osnovi homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična, osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi, i koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su ka jednom antigenom mestu. Pored toga, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinanti na antigenu. Modifikator „monoklonski“ označava karakter antitela koje je dobijeno iz uglavnom homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti postupkom hibridoma koji je prvo opisao Kohler i dr., Nature 256: 495 (1975), ili se mogu napraviti rekombinantnim DNK postupcima (pogledati, npr., U.S. Patent No. 4,816,567). U sledećem otelotvorenju, „monoklonska antitela“ mogu biti izolovana iz biblioteka faga antitela generisanih korišćenjem tehnika opisanih u McCafferty i dr., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson i dr., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) opisuju izolaciju antitela kod miševa i ljudi, koristeći biblioteke faga. Sledeće publikacije opisuju proizvodnju ljudskih antitela visokog afiniteta (nM raspon) lančanim pomeranjem (Marks i dr., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), kao i kombinatornom infekcijom i in vivo rekombinacijom kao strategijom za izgradnju veoma velikih biblioteka faga (Waterhouse i dr., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Prema tome, ove tehnike su održiva alternativa tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonskih antitela za izolaciju monoklonskih antitela. Alternativno, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr., miševe) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvode kompletan repertoar ljudskih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotno brisanje gena za spajanje teškog lanca antitela (JH) u himernim i germlinijski mutiranim miševima rezultuje potpunom inhibicijom stvaranja endogenih antitela. Prenos gena ljudskog germlinijskog imunoglobulina u takvim germilinsjki mutiranim miševima će rezultovati proizvodnjom ljudskih antitela nakon izazivanja antigena. Pogledati, npr., Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann i dr., Year in Immuno., 7:33 (1993); and Duchosal i dr., Nature 355:258 (1992).

[0027] Monoklonska antitela ovde posebno uključuju „himerna“ antitela (imunoglobulini) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama antitela izvedenih iz određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No.

4,816,567; and Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

[0028] Izraz „hipervarijabilni region“ kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost“ ili „CDR“ (tj. ostaci 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31-35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Kabat i dr., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/ili one ostatke iz „hipervarijabilne petlje“ (tj. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (HI), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). „Okvirni“ ili „FR“ ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona kao što je ovde definisano.

[0029] „Humanizovani“ oblici ne-ljudskih (npr., mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz ne-ljudskog imunoglobulina. Najvećim delom humanizovana antitela su ljudski imunoglobulini (antitelo primaoc) u kojima se ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjuju ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-ljudske vrste (antitelo donor), poput miša, pacova, zeca ili primata koji nisu ljudi, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) ljudskog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim ne-ljudskim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu niti u antitelu donoru. Ove modifikacije su napravljene da poboljšaju performanse antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima od ne-ljudskog imunoglobulina, i svi ili suštinski svi FR regioni su oni iz ljudske imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično od ljudskog imunoglobulina.

[0030] Izbor ljudskih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji će se koristiti za pravljenje humanizovanih antitela je veoma važan za smanjenje antigeničnosti. Prema takozvanom postupku „najbolje prilagođenosti“, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara se pretražuje u odnosu na celokupnu biblioteku poznatih sekvenci ljudskog varijabilnog domena. Ljudska sekvenca koja je najbliži onoj kod glodara tada je prihvaćena kao ljudski okvir za humanizovano antitelo (Sims i dr., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia i dr., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

[0031] Drugi postupak koristi određeni okvir izveden iz konsenzus sekvence svih ljudskih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta i dr., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

[0032] Dalje je važno da antitela budu humanizovana uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i druga povoljna biološka svojstva. Kako bi se postigao ovaj cilj, u skladu sa poželjnim postupkom, humanizovana antitela se pripremaju postupkom analize roditeljske sekvence i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele roditeljske i humanizovane sekvence. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni i poznati su onima koji poznaju ovu struku. Dostupni su računarski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture izabranih imunoglobulinskih sekvenci kandidata. Uvid u ove prikaze omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju imunoglobulinske sekvence prikazuju, tj., analiza ostataka koji utiču na sposobnost imunoglobulina kandidata da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci se mogu odabrati i kombinovati iz prijemne i uvozne sekvence tako da se postigne željena karakteristika antitela, poput povećanog afiniteta za ciljani antigen. Generalno, CDR ostaci su direktno i u najvećoj meri uključeni u uticaj na vezivanje antigena.

[0033] „Fragmenti antitela“ sadrže deo antitela pune dužine, uglavnom njegovog antigen vezujućeg ili varijabilnog regiona. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab, F(ab')2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela. Različite tehnike su razvijene za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su dobijeni proteolitičkom varenjem netaknutih antitela (pogledati, npr., Morimoto i dr., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) i Brennan i dr., Science, 229:81 (1985)). Međutim, ovi fragmenti se sada mogu direktno proizvesti od rekombinantnih ćelija domaćina. Na primer, fragmenti antitela mogu se izolovati iz biblioteke faga antitela koje su gore navedene. Alternativno, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno izvući iz E. coli i hemijski veti da formiraju F(ab')2fragmente (Carter i dr., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). U drugem otelotvorenju, F(ab')2 je formiran korišćenjem leucinog zatvarača GCN4 za promociju sastavljanja molekula F(ab')2. Prema drugom pristupu, F(ab')2 fragmenti se mogu izolovati direktno iz rekombinantne kulture ćelija domaćina. Ostale tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnjaku.

[0034] U drugim otelotvorenjima, antitelo po izboru je jednolančani Fv fragment (scFv). Pogledati WO 93/16185. „Jednolančani Fv“ ili „sFv“ fragmenti antitela sadrže VH i VL domene antitela, gde su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni veznik između VH i VL domena što omogućava sFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled sFv pogledati Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

[0035] Izraz „dijatela“ odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta vezivanja antigena, gde ti fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH - VL). Korišćenjem linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena u istom lancu, domeni su primorani da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta koja vezuju antigen. Antitela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

[0036] Izraz „linearna antitela“ kada se koristi tokom ove prijave odnosi se na antitela opisana u Zapata i dr., Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Ukratko, ova antitela sadrže par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji formiraju par regiona za vezivanje antigena. Linearna antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična.

[0037] „Multispecifična antitela“ imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa, gde su epitopi obično iz različitih antigena. Dok takvi molekuli normalno vezuju samo dva antigena (tj. bispecifična antitela, BsAbs), antitela sa dodatnim specifičnostima, kao što su trispecifična antitela, obuhvaćena su ovim izrazom kada se ovde koristi. Primeri BsAbs uključuju one sa jednim krakom usmerenim protiv antigena tumorskih ćelija, i drugim krakom usmerenim protiv molekula citotoksičnog pokretača kao što su anti-FcyRI/anti-CD15, anti-p185<HER2>/FcγRIII (CD16),, anti-CD3/anti-maligna B-ćelija (1D10), anti-CD3/anti-p185<HER2>, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-renalni rak bubrega, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (rak debelog creva), anti-CD3/anti-analog melanocit stimulišućeg hormona, anti-EGF receptor/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-ahezioni molekul nervnih ćelija (NCAM)/anti-CD3, anti-folat vezujući protein (FBP)/anti-CD3, antiantigen povezan sa pan rakom (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs sa jednim krakom koji se specifično vezuje za antigen tumora i jednim krakom koji se vezuje za toksin kao što je anti-saporin/anti-Id-1, anti-CD22/antisaporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/anti-ricin A lanac, anti-interferon-a (IFN-a)/anti-hibridom idiotip, anti-CEA/anti-vinca alkaloid; BsAbs za pretvaranje prolekova aktiviranih enzimima, kao što je anti-CD30/antialkalna fosfataza (koja katalizuje pretvaranje proleka mitomicin fosfata u mitomicin alkohol); BsAbs koja se mogu koristiti kao fibrinolitički agensi kao što je anti-fibrin/anti-tkivni plazminogeni aktivator (tPA), anti-fibrin/anti-urokinaza tip plazminogenog aktivatora (uPA); BsAbs za ciljanje imunih kompleksa na ćelijske površinske receptore kao što su lipoprotein protiv niske gustine (LDL)/anti-Fc receptor (npr., FcyRI, ili FcyRIII); BsAbs za upotrebu u terapiji zaraznih bolesti kao što su anti-CD3/anti-herpes simpleks virus (HSV), anti-T-ćelijski receptor: CD3 kompleks/anti-influenca, anti-FciR/anti-HIV; BsAbs za otkrivanje tumora in vitro ili in vivo kao što su anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185HER2/ anti-hapten; BsAbs kao adjuvansi vakcine; i BsAbs kao dijagnostički alate kao što su anti-zečji IgG/anti-feritin, anti-ren peroksidaza(HRP)/anti-hormon, anti-somatostatin/antisupstanca P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-β-galaktozidaza. Primeri trispecifičnih antitela uključuju anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 i anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela (npr., F(ab')2 bispecifična antitela).

[0038] Razmatraju se antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt i dr., J. Immunol.147: 60 (1991)).

[0039] „Golo antitelo“ u smislu ovde je antitelo koje nije konjugovano sa citotoksičnom grupom ili radioobeležavanjem.

[0040] Ovde je „netaknuto antitelo“ ono koje sadrži dva regiona za vezivanje antigena i Fc region. Poželjno, netaknuto antitelo ima funkcionalnu Fc region.

[0041] „Tretman“ se odnosi i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je potreban tretman uključuju one koji već imaju poremećaj kao i one kod kojih će poremećaj biti sprečen.

[0042] „Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od tretmana pročišćenim antitelom kako je ovde opisano. Ovo uključuje i hronične i akutne poremećaje i bolesti i ona patološka stanja koja predisponiraju sisara na poremećaj.

[0043] Izraz „hromatografija razmene jona“ odnosi se na tehniku razdvajanja u kojoj su jedinjenja razdvojena na osnovu svog neto naelektrisanja. Molekuli su klasifikovani bilo kao anjoni (koji imaju negativano naelektrisanje) ili katjoni (koji imaju pozitivno naelektrisanje). Neki molekuli (npr., polipeptidi) mogu imati i anjonske i katjonske grupe.

[0044] Membrana za hromatografiju razmene jona će vezati jedinjenje sa ukupnim pozitivnim ili negativnim naelektrisanjem. Mreže vezivanja nalaze se duž pora adsorbera. Jedinjenje se transportuje na mesto vezivanja konvekcijom. Pozitivno naelektrisana membrana (anjonski izmenjivač) će vezati jedinjenje sa ukupnim negativnim naelektrisanjem. Suprotno tome, negativno naelektrisana membrana (katjonski izmenjivač) će vezati jedinjenje sa ukupnim pozitivnim naelektrisanjem.

[0045] Membrane razmene jona se mogu dalje kategorisati kao jake ili slabe. Membrane razmene snažnih jona naelektrisane su (jonizovane) u širokom rasponu pH nivoa. Membrane razmene slabih jona jonizuju se u uskom opsegu pH. Četiri najčešće hemije razmene jona su:

[0046] Uglavnom, membrane razmene jona imaju pore od 0,1 do 100 µm. Kao referenca, Sartobind Q (Sartorius AG) je membrana razmene snažnih anjona koja ima nominalnu veličinu pora od 3-5 µm i komercijalno je dostupna u jednoslojnom ili višeslojnom formatu, i Mustang Q (Pall Corporation) je membrana razmene snažnih anjona koja ima nominalnu veličinu pora od 0,8 µm i na takav način je komercijalno dostupna u jednoslojnom ili višeslojnom formatu. Kao dodatna referenca, Sartobind S (Sartorius AG) je membrana razmene snažnih katjona koja ima nominalnu veličinu pora od 3-5 µm i komercijalno je dostupna u jednoslojnom ili višeslojnom formatu, i Mustang S (Pall Corporation) je membrana razmene snažnih katjona koja ima nominalnu veličinu pora od 0,8 µm i na sličan je način dostupna u jednoslojnom ili višeslojnom formatu.

[0047] „Nominalna“ veličina pora opisuje sposobnost membrane da zadrži većinu čestica na 60 do 98% nominalne veličine pora.

[0048] „pH“ rastvora meri kiselost ili alkalnost u odnosu na jonizaciju uzorka vode. pH vode je neutralan, tj., 7. Većina očitavanja pH kreće se od 0 do 14. Rastvori sa većim [H+] od vode (pH manji od 7) su kiseli; rastvori sa nižim [H+] od vode (pH veći od 7) su bazni ili alkalni. pH se može meriti pomoću pH merača. pH pufera se može podesiti pomoću kiseline ili baze poput HCl ili NaOH.

[0049] „pI“ ili „izoelektrična tačka“ molekula, kao što je polipeptid, odnosi se na pH pri kom polipeptid sadrži jednak broj pozitivnih i negativnih naelektrisanja. pI se može izračunati od neto naelektrisanja aminokiselinskih ostataka polpeptida ili se može odrediti izoelektričnim fokusiranjem. Amfoternom prirodom polipeptida da imaju i anjonsku i katjonsku grupu može se manipulisati. pH polipeptida može biti spušten do tačke u kojoj se željeni polipeptid ponaša kao katjon (koji ima pozitivno naelektrisanje). Alternativno, pH polipeptida može biti povećan do tačke u kojoj se željeni polipeptid ponaša kao anjon (koji ima negativno naelektrisanje).

[0050] Izraz „provodnost“ odnosi se na sposobnost rastvora da provodi električnu struju između dve elektrode. Osnovna jedinica provodnosti je simens (S), ranije zvan mho. Provodnost se obično izražava u jedinicama mS/cm. Pošto naelektrisanje jona u rastvoru obezbeđuje provodnost električne struje, provodnost rastvora proporcionalna je koncentraciji jona. Oba ova merenja u jakoj su korelaciji sa snagom jona. Jonska jačina usko je povezana sa koncentracijom elektrolita i ukazuje koliko je efektivno naelektrisanje određenog jona zaštićeno ili stabilizovano drugim jonima u elektrolitu. Glavna razlika između snage jona i koncentracije elektrolita je ta što je prva veća ako su neki joni jače naelektrisani. Druga razlika između ova dva je u tome što jonska jačina odražava koncentraciju slobodnih jona, a ne samo koliko soli je dodato u rastvor. Provodnost se može meriti pomoću merača provodnosti, kao što su različiti modeli Orion merača provodnosti. Provodnost rastvora može se izmeniti promenom koncentracije jona u njemu. Na primer, koncentracija puferskog agensa i/ili koncentracija soli (npr., natrijum-hlorid, natrijum-acetat ili kalijum hlorid) u rastvoru mogu da se izmene kako bi se postigla željena provodnost. Poželjno, koncentracija soli različitih pufera je modifikovana kako bi se postigla željena provodnost.

[0051] Za membransku hromatografiju, brzina protoka se obično opisuje kao količina membrane u satu (MV/sat).

[0052] Za membransku hromatografiju, „gustina opterećenja“ se često izražava u gramima sastava koji se prerađuje po litru membrane.

[0053] „Pufer“ je rastvor koji odoleva promenama pH dejstvom svojih komponenati kiselina-baza konjugata. Različiti puferi koji se mogu koristiti u zavisnosti, na primer, od željenog pH pufera, opisani su u Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).

[0054] „Prečišćavanjem“ antitela iz sastava koji sadrži antitelo i jedan ili više zagađivača podrazumeva se povećanje stepena čistoće antitela u sastavu uklanjanjem (potpuno ili delimično) najmanje jednog zagađivača iz smeše. „Korak prečišćavanja“ može biti deo ukupnog procesa prečišćavanja što rezultuje „homogenim“ sastavom. „Homogeni“ se ovde koristi za označavanje smeše koja sadrži najmanje oko 70% težine antitela od interesa, na osnovu ukupne težine smeše, poželjno najmanje oko 80% težine, poželjnije najmanje oko 90% težine, još poželjnije najmanje oko 95% težine.

[0055] „Vezivanjem“ molekula na membranu razmene jona podrazumeva se izlaganje molekula membrani razmene jona u odgovarajućim uslovima (pH i/ili provodnost) tako da se molekul reverzibilno imobiliše u ili na membrani jona pomoću elektrostatičkih interakcija između molekula i naelektrisane grupe ili naelektrisanih grupa membrane razmene jona.

[0056] Pod „ispiranjem“ membrane razmene jona podrazumeva se prolazak odgovarajućeg pufera kroz ili preko membrane razmene jona.

[0057] „Eluiranjem“ molekula (npr., antitelo ili zagađivač) iz membrane razmene jona misli se na uklanjanje molekula iz nje.

[0058] U membrani za hromatografiju, „protok“ se odnosi na vezivanje nečistoća na membranu dok jedinjenje nije zadržano.

[0059] Izraz „mešoviti režim“ odnosi se na sorbent koji ima sposobnost odvajanja jedinjenja na osnovu dva različita mehanizma, npr. razdvajanje na osnovu na razlika hidrofilnosti/hidrofobnosti između polipeptida prekrivenih razdvajanjem na osnovu neto naelektrisanja. Ovo se često postiže korišćenjem multi-modalnog liganda koji može da stupa u interakciju sa ciljanim molekulom na nekoliko različitih načina, uključujući jonsku interakciju i vezivanje vodonika ili hidrofobnu interakciju. Sorbenti poput GE Healthcare Capto™ MMC i Capto™ Adhere su primeri hromatografskih smola „mešovitog režima“.

Načini otelotvorenja pronalazaka

[0060] Ovde su opisani postupci za prečišćavanje monoklonskog antitela iz sastava (npr. vodeni rastvor) koji sadrži monoklonsko antitelo i jedno ili više zagađivača. Sastav je uglavnom ona koja je rezultat rekombinantne proizvodnje monoklonskog antitela, ali može biti i ona koja nastaje proizvodnjom monoklonskog antitela sintezom peptida (ili drugim sintetičkim sredstvima) ili monoklonskim antitelom može da se očisti iz izvornog izvora polipeptida.

Rekombinantna proizvodnja antitela

[0061] Za rekombinantnu proizvodnju antitela, izolovana je nukleinska kiselina i ubačena u replikativni vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za eksprimiranje. DNK koja kodira antitelo se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teški i laki lanac antitela). Mnogi vektori su dostupni. Vektorske komponente obično uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više sledećeg: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, pojačivački element, promoter i sekvencu završavanja transkripcije (npr., kako je opisano u US Patent 5,534,615).

[0062] Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili eksprimiranje DNK u ovde navedenim vektorima su prokariote, kvasci ili više eukariotske ćelije. Pogodni prokarioti za tu svrhu uključuju eubakterije, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što su Escherichia, npr. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella typhimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacili kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41P obelodanjen u DD 266,710 objavljeno 12. aprila 1989), Pseudomonas kao što su P. aeruginosa, i Streptomyces. Jedan poželjni E. coli domaćin kloniranja je E. coli 294 (ATCC 31,446), mada su pogodni ostali sojevi poput E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su ilustrativni, i nisu ograničavajući.

[0063] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput vlaknastih gljiva ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili eksprimiranje vektora koji kodiraju antitelo. Saccharomyces cerevisiae, ili uobičajeni pekarski kvasac, najčešće se koristi od nižih eukariotskih mikroorganizama domaćina. Međutim, mnogi drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćini poput, npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, i K.

marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što su Schwanniomyces occidentalis; i vlaknaste gljive kao što su, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulani i A. niger.

[0064] Pogodne ćelije domaćina za eksprimiranje glikoziliranog antitela su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su mnogobrojni bakuloviralni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekata od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegipti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna muva), i Bombyx mori. Raznovrsni virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV i takvi virusi se mogu koristiti kao virus ovde prema predmetnom pronalasku, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelije. Biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana mogu se takođe koristiti kao domaćini.

[0065] Međutim, interesovanje je bilo najveće za ćelije kičmenjaka, i razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, CV1 ćelije bubrega majmuna transformisane sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ljudske embrionske ćelije bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham i dr., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); Jajne ćelije kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije ljudskog raka grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); pseće ćelije bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (V138, ATCC CCL 75); ljudske ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i ćelije ljudskog hepatoma (Hep G2). Često su CHO ćelije poželjne za eksprimiranje antitela i mogu se pogodno koristiti za proizvodnju antitela prečišćenih u skladu sa predstavljenim pronalaskom.

[0066] Ćelije domaćina transformišu se gore opisanim eksprimiranjem ili vektorima kloniranja za proizvodnju antitela i uzgajaju se u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim kako je pogodno za indukciju promotera, odabir transformatora ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

[0067] Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju antitela ovog pronalaska mogu se uzgajati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Ham-ov F10 (Sigma), Minimalni esencijalni medijum ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecc-ova modifikovana Eagle-ov medijum (DMEM), Sigma) pogodni su za kultivaciju ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji od medijuma opisanih u Ham i dr., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes i dr., Anal. Biochem,102:255 (1980), U.S. Pat. Nos.4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Patent Re. 30,985 može se koristiti kao medijum kulture za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), soli (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je garamicin; GENTAMYCIN®), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u krajnjim koncentracijama u mihromolarnom opsegu), i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Bilo koji drugi dodatak takođe može biti uključen u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za eksprimiranje i biće očigledni uobičajenom stručnjaku.

[0068] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti unutar ćelije, u periplazmatskom prostoru ili direktno izlučiti u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, krhotine čestica, ili ćelije domaćina ili lizirane ćelije (npr., koja je rezultat homogenizacije), uklanja se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih sistema eksprimiranja mogu se koncentrovati pomoću komercijalno dostupnog filtera za koncentraciju proteina, na primer, jedinica za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon.

Postupak hromatografije membrane razmene jona pronalaska

[0069] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, sastav koja će biti podvrgnuta ovom postupku prečišćavanja je rekombinantno proizvedeno antitelo, poželjno netaknuto antitelo, eksprimirano od strane kulture rekombinantih ćelija domaćina jajnika kineskog hrčka (CHO). Po izboru, sastav je podvrgnuta najmanje jednom koraku prečišćavanja pre hromatografije membrane razmene jona. Sastav sadrži antitelo od interesa i jedan ili više zagađivača, kao što su proteini jajnika kineskog hrčka (CHOP); lučeni protein A; nukleinske kiseline; varijanta, fragment, agregat ili derivat željenog antitela; drugi polipeptid; endotoksin; kontaminaciju virusa; komponentu medijuma ćelijske kulture (npr. garamicin; GENTAMYCIN®) itd.

[0070] Primeri dodatnih postupaka prečišćavanja koji se mogu izvesti pre, tokom ili posle postupka hromatografije membrane razmene jona uključuju fragmentisanje na hidrofobnoj hromatografiji za interakciju (npr., na PHENIL-SEPHAROSE™), taloženje etanolom, termalno taloženje, taloženje polietilen glikola (PEG), izoelektrično fokusiranje, HPLC reverzne faze, hromatografiju na silicijum dioksidu, hromatografiju na HEPARIN SEPHAROSE™, hromatografiju razmene anjona, hromatografiju razmene katjona, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, taloženje amonijum sulfata, hidroksiapatitnu hromatografija, gel elektroforeza, dijalizu, hidroficnu indukcionu hromatografiju, filtraciju tangencijalnog toka visokih performansi (HPTFF) i afinitetnu hromatografiju (npr., koristeći protein A, protein G, antitelo ili određeni supstrat, ligand ili antigen kao reagens za hvatanje).

[0071] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru ili direktno izlučiti u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili filtriranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, rekombinantne ćelije domaćina se mogu odvojiti od medijuma ćelijske kulture centrifugiranjem ili filtracijom, na primer.

[0072] Većina prečišćavanja se odvija tokom afinitetne hromatografije proteina A. Protein A je protein bakterijskog ćelijskog zida koji se specifično vezuje za Fc region antitela. Kada se imobiliše na hromatografski medijum, protein A pruža tehniku za prečišćavanje rekombinantnih antitela, jer može selektivno da veže antitela u složenim rastvorima, omogućavajući nečistoćama da teku kroz njih.

[0073] Osnovni protokol afinitetne kolone proteina je jednostavan: vezuje se na oko neutralnog pH i eluira sa kiselim pH. Protein A imobilizovan na čvrstoj fazi koristi se za prečišćavanje polipeptida koji sadrži CH2/CH3 region. Čvrsta faza je poželjno kolona koja sadrži staklo, silicijum-dioksid ili površinu agaroze za imobilizaciju proteina A. Poželjno, čvrsta faza je staklena kolona sa kontrolisanim porama, kolona silicijumske kiseline ili visoko povezana umrežena agarozna kolona. Kolona mAbelect SuRe™, komercijalno dostupna od strane GE Healthcare, je primer visoko umrežene kolone agaroznog proteina A, efikasne u prečišćavanju antitela. Ponekad je kolona obložena reagensom, poput glicerola, u pokušaju da se spreči nespecifično prijanjanje na kolonu. PrOSEP A™ kolona, komercijalno dostupna od strane Millipore Corporation, je primer protein A staklene kolone sa kontrolisanim porama koja je obložena glicerolom. Čvrsta faza za hromatografiju proteina A je izbalansirana odgovarajućim puferom.

[0074] Zagađivačeni preparat dobijen iz rekombinantnih ćelija domaćina se učitava na ravnotežnoj čvrstoj fazi koristeći pufer za punjenje koji može biti isti kao pufer za ravnotežu. Dok zagađeni preparat teče kroz čvrstu fazu, polipeptid se adsorbuje na imobilisani protein A, i ostali zagađivači (poput proteina jajnika kineskog hrčka, CHOP, gde se polipeptid proizvodi u CHO ćeliji) se nespecifično vezuju za čvrstu fazu.

[0075] Sledeći korak koji se izvodi podrazumeva uklanjanje zagađivača vezanih za čvrstu fazu ispiranjem čvrste faze rastvorom koji sadrži so, aminokiselinu i/ili hidrofobni rastvor elektrolita u međukoraku pranja. U poželjnim otelotvorenjima, so u ovom pranju je kalijum-fosfat, aminokiselina je arginin, i hidrofobni elektrolit je TEMAC i/ili TEAC. Iako u pranju može biti prisutan jedan rastvarač, u nekim otelotvorenjima se mogu koristiti dva ili više takvih rastvora. Rastvori se poželjno dodaju u rastvor sa puferom sa pH koji ima pH pri približno neutralnosti.

[0076] Nakon koraka međupranja iz prethodnog stava, polipeptid od interesa se oporavlja iz kolone. Ovo se obično postiže korišćenjem odgovarajućeg pufera za ispiranje. Polipeptid se, na primer, može eluirati iz kolone koristeći pufer za eluiranje koji ima nizak pH, npr., u opsegu od oko 2 do oko 5, i poželjno u opsegu od oko 2,5 do oko 3,5. Primeri pufera za eluiranje za ovu svrhu uključuju citratne ili acetatne pufere.

[0077] Hromatografija membrane razmene jona je izvedena kao što se ovde zahteva. Prvo se donosi odluka o tome da li se treba koristiti anjonska ili katjonska membrana. Iako je izoelektrična tačka (pI) nekih antitela u opsegu od približno 6,7 do 9,4, pI mnogih antitela je visok (često> 8, i ponekad i> 9). Uglavnom, membrana razmene katjona može se koristiti za antitela čija je pI veća od oko 8, i membrana razmene anjona može se koristiti za antitela sa pI manjim od oko 8.

[0078] Za hromatografiju membrane razmene jona koja se vrši u režimu razmeštanja autohtonih proteina, pH opterećenog materijala je podešen na oko 1 do oko 5 pH jedinica ispod pI antitela, provodnost opterećenog materijala je podešena na ≤ oko 40 mS/cm, zavisno od pH, i antitelo se zatim pumpa kroz membranu. U nekim otelotvorenjima, pH opterećenog materijala je podešen na oko 1 do oko 4 pH jedinice, oko 1 do oko 3 pH jedinice, oko 1 do oko 2 pH jedinice, ili oko 1 pH jedinice, ispod pI antitela. U drugim otelotvorenjima, provodnost opterećenog materijala je podešena na ≤ oko 20 mS/cm ili ≤ oko 10 mS/cm, zavisno od pH. Pošto je pH opterećenja manji od pI antitela, antitelo (koje je postalo pozitivno naelektrisano) u početku NEĆE teći. Umesto toga, antitelo će se elektrostatički povezati sa negativnim funkcionalnim grupama katjonskih izmenjivača. To je zato što antitelo (pozitivno) i membrana (negativno) imaju suprotno naelektrisanje. Pošto se pI mnogih zagađivača, npr., proteini ćelija domaćina, kao što je CHOP, koji se eluiraju sa antitelom tokom afinitetne hromatografija proteina A, neznatno razlikuje od pI antitela, to jest, pI se može razlikovati za samo oko 0,05 do oko 0,2 pI jedinica, i ovi zagađivači poput „osnovnih“ antitela će se takođe vezati za membranu. Bez namere da se veže teorijom, čini se da se za hromatografiju membrane razmene katjona koja se vrši u režimu razmeštanja autohtonih proteina, pri uslovima pH i provodnosti koji indukuju naelektrisanje sa minimalnom jonskim zaštitom, zagađivači se poželjno vezuju za membranu ili na neki drugi način efikasno „premeštaju“ antitelo iz membrane (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), omogućavajući antitelu da „eluira“ iz matrice ili teče kroz vezivanje i bude ponovo dobijeno u otpadnoj tečnosti.

[0079] Za hromatografiju membrane razmene anjona koja se vrši u režimu razmeštanja autohtonih proteina, pH opterećenog materijala se podešava na oko 1 do oko 5 pH jedinica iznad pI antitela, provodnost opterećenog materijala je podešena na ≤ oko 40 mS/cm, zavisno od pH, i antitelo se zatim pumpa kroz membranu. U nekim otelotvorenjima, pH opterećenog materijala je podešen na oko 1 do oko 4 pH jedinice, oko 1 do oko 3 pH jedinice, oko 1 do oko 2 pH jedinice, ili oko 1 pH jedinice, iznad pI antitela. U drugim otelotvorenjima, provodnost opterećenog materijala je podešena na ≤ oko 20 mS/cm ili ≤ oko 10 mS/cm, zavisno od pH. Pošto je pH opterećenja veći od pI antitela, antitelo (koje je postalo negativno naelektrisano) u početku NEĆE teći. Umesto toga, antitelo će biti elektrostatički vezano za pozitivne funkcionalne grupe anjonskog izmenjivača. To je zato što antitelo (negativno) i membrana (pozitivno) imaju suprotno naelektrisanje. Pošto se pI mnogih zagađivača, npr., proteini ćelija domaćina, kao što je CHOP, koji se eluiraju antitelom tokom afinitetne hromatografija proteina A, neznatno razlikuje od pI antitela, to jest, pI se mogu razlikovati za samo oko 0,05 do oko 0,2 pI jedinica, ova zagađivači, poput „kiselih“ antitela će se takođe vezati za membranu. Bez namere da se veže teorijom, čini se da za hromatografiju membrane razmene anjona koja se vrši u režimu razmeštanja proteina autoputa, pri uslovima pH i provodnosti koji indukuju naelektrisanje sa minimalnom jonskom zaštitom, zagađivači se preferencijalno vezuju za membranu ili na drugi način efikasno „premeštaju“ antitelo iz membrane (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), omogućavajući antitelo da „eluira“ iz matrice ili teče kroz vezivanje i bude ponovo dobijeno u otpadnoj tečnosti.

[0080] U jednom primeru, hromatografija membrane se koristi ili na standardnom sistemu hromatografije ili prilagođenom sistemu hromatografije poput AKTA™ Explorer (GE Healthcare) koji je opremljen manometrima, senzorima i pumpa plus regulatorima. U ovom primeru je membranski uređaj postavljen nizvodno od manometra. U pomenutom primeru, detektori pH i provodnosti su instalirani iza membranskog uređaja. Nastavljajući sa ovim primerom, sistem se pre instalacije membrane temeljno ispira vodom, i zatim uravnotežuje puferom. Nastavljajući dalje sa primerom, sistem sa membranom se ispira sa ravnotežnim puferom sve dok se pH i rastvor provodnosti ne poklapaju sa specifikacijom pufera za ravnotežu (oko pet zapremina membrane) i dok se ne primeti stabilna osnovica. Nastavljajući dalje sa ovim primerom, materijal za punjenje se puni pumpom brzinom 333 - 2667 MV/sat, pH 5,5 (za prečišćavanje hipotetičkog „baznog“ antitela) ili pH 8,0 (za prečišćavanje hipotetičkog „kiselog“ antitela) i provodnost od približno 4 mS/cm. Nastavljajući dalje sa ovim primerom, beleže se povratni pritisak rada, promene pH i provodnosti tokom rada. Konačno, u ovom primeru, polipeptid u membranskom otpadnoj tečnosti se sakuplja odmah kada trag apsorpcije ultraljubičastog (UV) na 280 nm bude 0,2 apsorpcione jedinice iznad osnovne linije, prikupljanje grupa se zaustavlja kada UV trag na 280 nm bude ispod 0,2 apsorpcione jedinice, i uzorci iz grupa u membranskoj fragmentu otpadnih tečnosti analiziraju se na koncentraciju polipeptida, dimer/agregaciju proteina, proteine ćelija domaćina, DNK i izlučeni protein A. Korak oporavka obično se izračunava korišćenjem opterećenog polipeptida i polipeptida u membranskoj otpadnoj tečnosti. Membrana je tradicionalno jednokratna.

[0081] Što se tiče analitičkih ispitivanja, sadržaj polipeptida (koncentracija antitela) može se odrediti apsorbancijom na 280 nm korišćenjem Beckmanovog spektrofotometra. Agregacija antitela može se odrediti hromatografijom za isključenje veličine. Protein ćelije domaćina, npr., CHOP, nivoi mogu da se analiziraju pomoću enzimski imunosorbentnog testa (ELISA). DNK domaćin-ćelija može se kvantifikovati upotrebom TakMAN PCR (lančana reakcija polimeraze). Izlučeni protein A može se izvesti korišćenjem imunohemijske postupka zasnovane na ELISA preporučeno od strane prodavca smole proteina A.

[0082] Sledeći puferi su hipotetski dizajnirani i testirani za upotrebu sa S membranom: (1) 89 mM sirćetne kiseline, 127 mM TRIS baza, 21 mM limunska kiselina, pH 5,5, 6,0 mS/cm, (2) 28 mM MES, 95 mM NaCl, pH 6,0, 11 mS/cm, (3) 200 mM NaOAc, pH 5,5, 12 mS/cm, (4) 100 mM NaOAc, pH 5,5, 6,4 mS/cm i (5) 96 mM sirćetne kiseline, 65 mM TRIS, pH 5,0, 3,6 mS/cm.

[0083] Sledeći puferi su hipotetski dizajnirani i testirani za upotrebu sa Q membranom: (1) 50 mM TRIS, 15 mM NaCl, pH 8,0, 4,3 mS/cm, (2) 25 mM TRIS, pH 8,0, 1,3 mS/cm, (3) 60 mM TRIS, 118 mM NaCl, pH 8,0, 15,7 mS/cm, (4) 50 mM TRIS, 50 mM NaOAc, pH 8,0, 7,0 mS/cm, (5) 25 mM HEPES, 85 mM NaOAc, pH 7,0, 6,5 mS/cm i (6) 91 mM sirćetne kiseline, 130 mM TRIS, pH 8,0, 5,0 mS/cm.

[0084] Pored toga, bilo koji sistem pufera može da se podesi na gore ili dole dodatkom sirćetne kiseline, limunske kiseline, HEPES, hlorovodonične kiseline, fosforne kiseline, natrijum hidroksida, TRIS ili drugih takvih kiselih i baznih pufera kako bi se postigao pogodan pH. Bilo koji sistem pufera takođe može da se podesi na gore ili dole pomoću prečišćene vode, vode za ubrizgavanje (WFI), natrijum-acetata, natrijumhlorida, kalijum-fosfata ili drugih takvih pufera koji sadrže nisku i visoku so kako bi se postigla odgovarajuća provodnost.

[0085] Razvoj koraka hromatografije membrane razmeštanja autohtonog proteina je pravolinijski. Materijal za opterećenje se pušta kroz membranu na različitim nivoima pH i provodnosti. Zadržavanje polipeptida, bilo antitela ili zagađivača, može se poboljšati kada molekul ima veliku elektrostatsku interakciju. Elektrostatičke interagmenti mogu se poboljšati pri radu u uslovima gde su polipeptidi visoko naelektrisani, tj. kada se koristi pufer koji ima pH dovoljno različit od pI polipeptida, pojačavajući naelektrisanje polipeptida i nisku jonsku snagu kako sprečilo štićenje naelektrisanja puferskim jonima. Suprotno tome, elektrostatičke interagmenti mogu biti smanjene kada rade u uslovima u kojima su polipeptidi slabo naelektrisani, tj. kada se koristi pufer koji ima pH dovoljno blizu pI polipeptida, smanjujući naelektrisanje polipeptida i visoku jonsku čvrstoću kako bi se omogućilo štićenje naelektrisanja puferskim jonima. Kao rezultat, polipeptidi koji imaju različita fizičko-hemijska svojstva mogu se odvojiti membranskom adsorpcijom optimizacijom puferskog rastvora. Neki molekuli se mogu zadržati na datoj membrani, dok se drugi odvijaju na osnovu odgovarajućeg izbora pH i jonske snage pufera.

[0086] Preparat za antitela dobijen shodno ovom postupku hromatografiju membrane razmene jona može se podvrgnuti dodatnim koracima prečišćavanja, ako je potrebno. Primeri daljnjih koraka prečišćavanja razmatrani su iznad.

[0087] Pozivajući se na Sliku 12, jedan primer uspešne šeme prečišćavanja je postupak oporavka koji podrazumeva početni korak fragmentisanja afinitetne hromatografije proteina A, prelazni korak prečišćavanja hromatografije katjonske razmene u režimu vezivanja/eluiranja i poslednji korak poliranja hromatografije razmene anjona se odvija u režimu protoka.

[0088] Pozivajući se na Sliku 13, jedan primer poboljšane šeme prečišćavanja je postupak oporavka koji podrazumeva početni korak fragmentisanja afinitetne hromatografije proteina A, ali zamenjujući hromatografiju razmene katjona koja se izvodi u režimu vezivanja/eluiranja sa katjonskom membranom koja se vrši u režimu razmeštanja autohtonih proteina. To bi bilo korisno iz više razloga, i jedan od razloga je što bi se međukoraci i koraci za poliranje mogli kombinovati u jednu kontinuiranu operaciju, odnosno u jedan korak.

[0089] Opciono, antitelo se konjuguje sa jednim ili više heterolognih molekula po želji. Heterologni molekul može, na primer, biti onaj koji povećava poluživot u serumu antitela (npr., polietilen glikol, PEG) ili može biti oznaka (npr., enzim, fluorescentna oznaka i/ili radionuklid), ili citotoksični molekul (npr., toksin, hemoterapijski lek ili radioaktivni izotop itd.).

[0090] Terapeutska formulacija koja sadrži antitelo, opciono konjugovano sa heterolognom molekulom, može se pripremiti mešanjem antitela koje imaju željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. „Farmaceutski prihvatljivi“ nosači, ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što je oktadecilldimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-cresol) polipeptid niske molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su albumin u serumu, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorske agense kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji stvaraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0091] Aktivni sastojci se takođe mogu ugraditi u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinskomikrokapsulom, mikrokapsulama poli-(metilmetacilata), u sistemima za davanje koloidnih lekova (na primer, lipozoma, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0092] Formulacija za koju se koristi in vivo primena mora biti sterilna. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne membrane za filtriranje.

[0093] Mogu se pripremiti preparati sa odloženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, i matriksi su u obliku oblikovanih predmeta, npr., filmovi ili mikrokapsule. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestere, hidrogelove (na primer, poli (2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polaktide (U.S. Pat. No. 3,773,919), kopolimerei L-glutaminske kiseline i i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradljivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injekcijske mikrosfere sastavljene od kopoimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i leuprolide acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksi-bute kiselina.

[0094] Antitelo prečišćeno kako je ovde obelodanjeno, ili sastav koja sadrži antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač se zatim koristi za različite dijagnostičke, terapeutske ili druge namene poznate za takva antitela i smeše. Na primer, antitelo se može koristiti za tretman poremećaja kod sisara primenom terapeutski efikasne količine antitela sisaru.

[0095] Sledeći primeri su ponuđeni kao ilustracija, i ne kao ograničenje.

Primeri

Uvod

[0096] Titri bioreaktora za monoklonska antitela (mAb) povećavaju se kako se uslovi kulture ćelije poboljšavaju. Veće serije mAb mogu se teško pročistiti korišćenjem tradicionalne kolonske hromatografije. Nove smole sa povećanim kapacitetom vezivanja možda nisu dovoljne da se izbegne potreba za paralelnim cikličnim menjanjem ili vođenjem više kolona. Nemogućnost efikasnog rukovanja sa većim serijama može negativno uticati na troškove robe i kapacitet postrojenja. Pored toga, industriji bioprocesuiranja su potrebni pogodniji, ekonomičniji alati kako bi se smanjili troškovi robe. Male poželjne tehnologije za prečišćavanje koje se mogu istovremeno smanjiti validaciju i troškove rada. Kako se industrija razvija, membrane razmene jona mogu postati povoljnije za obradu mAb.

[0097] Iako su postupci hromatografije na koloni robusni i pouzdani, uglavnom imaju malu propusnost mase, jer performanse odvajanja zavise od difuzije pora. Proizvod i nečistoće moraju se polako distribuirati u pore kako bi se pristupilo vezivnim mestima. Suprotno tome, membrane nisu ograničene difuzijom pora. Učinkovitost razdvajanja ne zavisi od brzine protoka i zato su membrane sposobne da postignu mnogo veće protoke u odnosu na smole. Membrane su takođe pogodnije od smola, jer ne zahtevaju tela kolona, pakovanje/raspakivanje kolona ili kvalifikaciju. Membrane u industrijskoj razmeni su dostupne u patroni ili samokapsuliranim formatima koji se mogu odložiti nakon jedne upotrebe, čime se eliminišu troškovi validacije povezani sa ponovnom upotrebom i skladištenjem. Membrane su takođe manje i znatno lakše od kolona napunjenih smolom, što olakšava rukovanje unutar proizvodnog pogona.

[0098] Membrane imaju neke nedostatke. U poređenju sa smolama, oni su relativno nova tehnologija koja tek treba da doživi široku integraciju na industrijskom nivou. Vrste komercijalno dostupnih membrana i izbor dobro okarakterisanih liganda su ograničeni. Membrane su takođe značajno skuplje od smola razmene jona. Pored toga, one nisu optimalni medijum za obavljanje hromatografije vezivanja i eluiranja u industrijskoj rezmeri. Membrane imaju relativno mali kapacitet vezivanja, koji je teško ekonomski nadoknaditi cikličnim menjanjem. Mnoga od ovih pitanja verovatno će biti rešena kako se razvijaju nove generacije membrana.

[0099] Uprkos nedostacima, membrane su uspostavile nišu u nizvodnom prečišćavanju. Membrane razmene jona pokazale su se uspešnim kao korak dalje u hvatanju protein A mAb. Membrane su u ovom položaju idealne, jer su nivoi nečistoća niski i kada se koristi u režimu protoka, kapacitet vezivanja više nije ograničavajući. Protočna hromatografija je definisana kao hromatografska operacija gde ciljani protein teče kroz sorbentni medijum bez vezivanja, i adekvatno naelektrisane nečistoće su adsorbovane. Proširena na membransku hromatografiju, to je tehnika koja iskorišćava odbojnu silu uspostavljenu između membrane i mAb tako da većina vezivnih mesta ostaje na raspolaganju za adsorpciju suprotno naelektrisanih CHOP vrsta.

[0100] Ova studija usredsređena je na prečišćavanje monoklonskih antitela korišćenjem membrana razmene jona u režimu zamene autohtonih proteina. Pristup se razlikuje od protočnog jer mAb se obrađuje kroz membranu pod uslovima pH i provodnosti koji izazivaju adsorpciju proizvoda. Ovo se postiže radom pri niskoj jonskoj snazi i pri pH iznad mAb pI tokom anjonske razmene i ispod mAb pI tokom katjonske razmene. U tim uslovima se uspostavlja privlačna sila između membrane i mAb što rezultuje adsorpcijom proizvoda. Učitavanje toka se nastavlja izvan probojnih kapaciteta, i membranski otpadni otpad se sakuplja u pročišćenom obliku. Eksperimentalni podaci za režim razmeštanja autohtonih proteina pokazuju visoko prečišćavanje i prinos, koji nisu bili očigledni s obzirom na snažnu elektrostatičku interakciju između membrane i mAb.

[0101] Četiri mAb dobijena rekombinantnim DNK odabrana su za analizu na osnovu svog raspona izoelektričnih tačaka (pI 6,7 - 9,3, izračunato na osnovu aminokiselinskog niza). Sva četiri mAb su proizvedena u CHO ćelijskim kulturama kompanije Genentech Inc. i delimično su prečišćena sa jednim ili više koraka hromatografije na koloni (Protein A ili Protein A i razmena jona). Tokovi sirovina su izabrani na osnovu preostalog nivoa proteina jajnika kineskog hrčka (CHOP).

[0102] Ova studija istražuje sposobnost membrana razmene jona Mustang™ S, Mustang™ Q i Sartobind™ S da očiste CHOP pri uslovima pH i provodnosti koji takođe izazivaju adsorpciju mAb. Prečišćavanje i prinosi CHOP su ispitivani kao funkcija pH, provodnosti, gustine opterećenja, brzine protoka i tipa membrane. Proučavano je i povećanje i regeneracija membrane i ispitivana je izvodljivost kontinuirane obrade.

Materijali i postupci

Tok sirovina

[0103] Tokovi sirovina su uzeti iz serija ćelijskih kultura industrijskih, pilot ili malih razmera (Genentech Inc., Južni San Francisco, California) u početku proizvedenih u komercijalne ili istraživačke svrhe. Svaki tok sirovina je delimično prečišćen, što znači da su ćelije razdvojene, i razčišćena tečnost je prečišćena tokom najmanje jednog koraka hromatografije na koloni (Protein A ili Protein A i razmena jona). Svaki tok sirovina sadrži ciljano terapijsko monoklonsko antitelo (IgG1 ili IgG4) i količinski procenjivu nečistoću ćelija domaćina. Sastav svakog toka sirovina varirao je u zavisnosti od pojedinačnog mAb procesa i nivoa prečišćavanja. Uglavnom, pH u ulaznom toku bio je 5,5 - 8,0, provodnost 3,2 - 9,0 mS/cm, i koncentracija proizvoda 3,5 - 6,9 mg/mL. Tabela 1 prikazuje karakteristike toka sirovina za svaki mAb korišćen u ovoj studiji.

Kvantifikacija mAb

[0104] Koncentracija mAb je određena korišćenjem UV-spektrofotometrijskog ispitivanja na 280 i 320 nm. Nivoi CHOP bili su preniski da bi imali značajan uticaj na apsorbanciju UV zraka. Uzorci koji sadrže mAb su razblaženi odgovarajućim ne interferencijskim razblaživačem u rasponu od 0,1 do 1,0 AU. Priprema uzoraka i očitavanja spec skeniranja izvedeni su u duplikatu i zabeležena je prosečna vrednost. Koeficijent apsorpcije za testirana mAb bio je 1,45 - 1,70 (mg/mL)<-1>cm<-1>. Apsorbancija pri 280 i 320 nm, faktor razblaživanja, dužina putanje (1 cm) i koeficijent apsorpcije korišćeni su za izračunavanje koncentracije mAb koristeći jednačinu poznatu kao Beer-Lambertov zakon.

Kvantifikacija CHO proteina ćelija domaćina (CHOP)

[0105] Enzimski imunosorbentni test (ELISA) korišćen je za kvantifikovanje nivoa CHOP. Kozja antitela prečišćena od afiniteta imobilizovana su na komoricama sa mikrotiterima. Razblaženja uzoraka koji sadrže CHOP, standarde i kontrole, inkubiraju se u komoricama, nakon čega sledi inkubacija sa kozjim anti-CHOP antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena. Enzimska aktivnost peroksidaze rena otkrivena je ofenilendiamin dihidrohloridom. CHOP je kvantifikovan apsorpcijom očitavanja pri 492 nm u čitaču mikrotiter ploča. Računarskni program prilagođavanja krivih korišćen je za generisanje standardne krive i automatski izračunavanje koncentracije uzorka. Raspon ispitivanja za ELISA tipično je bio od 5 ng/ml do 320 ng/ml. Za svaki uzorak testirana su 2-4 razblaženja i vrednosti su uprosečne. CHOP vrednosti podeljene su koncentracijom mAb, i rezultati su dati u jedinicama ppm (ng CHOP/mg mAb).

[0106] Uzorci filtrata koji pokazuju nivoe CHOP ispod granice kvantifikacije (LOQ) su potom koncentrovani kako bi se dobili merljivi rezultati. Uzorci su koncentrovani 10 puta koristeći Amicon® Ultra-15 centrifugalni 10 kD MWCO filter (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts) i Eppendorf 5810R centrifugu (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) pri 5 - 25°C i 3200 - 4000 o/min, u trajanju od 10 do 20 minuta.

Membrane

[0107] Ispitivane membrane su Mustang™ S i Q (Pall Corporation, East Hills, New York) i Sartobind™ S (Sartorius-Stedim Biotech S.A., Aubagne, France). Mustang™ S i Sartobind™ S su membrane razmene snažnih katjona, i Mustang™ Q je membrana razmene snažnih anjona. Mustang™ S i Sartobind™ S su modifikovani sa oblikom sulfonske kiseline, i Mustang™ Q je modifikovan sa oblikom kvartarnog amina. Mustang™ S i Q su napravljeni od polietersulfona (PES) sa porama od 0,8 µm, i Sartobind™ S je napravljen od regenerisane celuloze sa porama od 3-5 µm. Kako bi se povećao kapacitet vezivanja svaki proizvođač kombinuje više slojeva membrane u svaki uređaj. Ukupan broj slojeva i debljina variraju u zavisnosti od proizvođača i veličine uređaja koji se proizvodi. Zapremina membrane (MV) je fizička zapremina membrane (čvrste supstance i praznine) i meri se u jedinicama mL. U ovoj su studiji korišćeni različiti membranski uređaji koji predstavljaju višestruke razmere. Tabela 2 navodi relevantne specifikacije za svaku testiranu membranu.

Sistemi filtriranja

[0108] Ispitivanja manjih razmera izvedena su sa AKTA Explorer™ 100 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut), sistemom za prečišćavanje procesa koji se može programirati, koji uključuje integrisanu mernu pumpu, senzor pritiska i linijski pH, provodnost i UV senzor. Explorer sistem je programiran i kontrolisan preko računara na kome je pokrenut softver UNICORN™ v5.10 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut). Takođe su izvedeni mali testovi pomoću ručnog sistema koji se sastoji od Masterflex® L/S® digitalne ekonomične peristaltičke pumpe (Cole Parmer, Wernon Hills, Illinois), linijskog DTX™ Plus TNF-R senzora pritiska (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey), i AND I EK-1200i vage (A&D Company, Ltd., Tokio, Japan). Vaga je korišćena za fizičko nadgledanje protoka pumpe merenjem nakupljanja mase. Masa je pretvorena u zapreminu pretpostavljajući gustinu toka sirovina od 1,0 g/mL. Pritisak linijskih pretvarača i masa sa vage kontinuirano su praćeni pomoću NetDAQ™ 2640A/41A mrežnog sistema za prikupljanje podataka (Fluke, Everett, Washington) koji je povezan sa računarom koji koristi Trendlink™ verziju 3.1.1 (Canary Labs Inc., Martinsburg, Pennsylvania) i RsCom verziju 2.,40 (A&D Company, Ltd., Tokio, Japan) softvera za prikupljanje pritiska i mase. Ispitivanja razmere izvedena su korišćenjem AKTA Pilot™ (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut) koji ima UNICORN™ v5.10. Pilot je opremljen većom pumpom, ali je funkcionalno ekvivalentan Explorer-u.

Tehnike skupljanja uzoraka za filtriranje

[0109] Filtrat je sakupljen na tri različita načina. Uzorci i fragmenti bili su najčešći. Uzorak je mali trenutni alikvot filtrata uzet pri određenoj propusnosti. Fragmenti su veći uzorci filtrata i određuju se opsegom propusnosti. Filtrat je takođe sakupljen kao jedna velika grupa. Analiza grupa je efikasna, ali uzorci i fragmenti su uglavnom korisniji za nadgledanje nivoa mAb i CHOP jer se uzastopni uzorci mogu kombinovati kako bi se pokazali trendovi.

Eksperimentalno

[0110] Sirovine su uklonjene iz hladnjaka (2-8°C ili ≤ -70°C) i ostavljene su da se uravnoteže do sobne temperature. Tada su opciono pH i/ili provodnost podešeni od uslova prikazanih u Tabeli 1, koristeći odgovarajući agens za titriranje (tj. 1,5 M tris baze ili 1 M limunske kiseline) ili razblaživač (prečišćena voda ili 5 M natrijum hlorida). Zatim je filtrirano van mreže koristeći 0,2 µm Millipak-20 (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts), AcroPak™ 20 (Pall Corporation, East Hills, New York) ili 1000 ml vakuum filtera (Thermo Fisher Scientific, Rochester, New York) za uklonjanje taloga koji može nastati tokom hladnog skladištenja ili kondicioniranja.

[0111] Sistem filtriranja je pripremljen ispiranjem opterećenja i linija filtrata pomoću prečišćene vode ili odgovarajućeg pufera. Membrana je postavljena linijski nizvodno od pumpe za sirovinu i senzora za pritisak i zatim je isprana sa 50 - 500 MV prečišćene vode ili ravnotežnog pufera. Nakon ispiranja, sirovina je usmeren na membranu i promenljiva količina je punjena konstantnom brzinom protoka od 333 do 2667 MV/sat. Tokom faze opterećenja, filtrat je uzorkovan po potrebi. Zatim je membrana opciono tražena puferom kako bi sakupila bilo koji preostali proizvod. Kako bi se nečistoće zadržale na membrani, pufer (tj. pufer za pranje) je generalno sličan po pH i jednak ili niži po provodnosti u odnosu na sirovinu.

[0112] U nekim slučajevima membranski adsorber je eluiran. Eluiranje membrane je izvedeno samo pomoću Explorer-a ili Pilot-a, tako da je udruživanje moglo da se olakša pomoću ugrađenog UV senzora. Membrana je eluirana puferom visoke soli (20 mM natrijum acetata i 350 mM natrijum hlorida, pH 5,5 ili 25 mM tris i 250 mM natrijum hlorida, pH 8,0) sa konstantnom brzinom protoka od 333 - 2667 MV/sat i grupisana je od 0,5 - 0,5 OD.

Kontinuirana obrada

[0113] Eksperimenti kontinuirane obrade izvedeni su u AKTA Explorer-u. Tokom ovih eksperimenata protok Q kolone je prilagođavan pH linijski i odmah je nanet na Mustang™ S membranu. Q kolona je bila opremljena sa Q Sepharose Fast Flow smolom (prečnik x dužina: 1,1 cm x 20 cm). Izlaz kolone je pričvršćen na ulaz T-priključka i podešavanje pH je izvršeno linijskim usmeravanjem „B pumpe“ na suprotni ulaz T-priključka. T-veza je pružila adekvatno mešanje i rastvor sa prilagođenim pH je usmeren na ulaz Mustang™ S membrane. Brzina protoka kroz kolonu je održavana na 100 cm/sat (1,58 mL/min). Brzina protoka kroz membranu bila je neznatno veća (približno 2,2%) zbog dodate tečnosti iz linijskog podešavanja pH.

Rezultati

Performanse malih razmera membrane razmene katjona (CEX)

[0114] MAb 1 grupa razmene anjona pri pH 5,5 i 6,0 mS/cm obrađena je kroz malu razmeru 0,18 ml Mustang™ S membrane sa konstantnom brzinom protoka od 667 MV/sat. pH mAb 1 je bio 3,4 pH jedinice ispod pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Uzorci sirovine i filtrata analizirani su na nečistoće mAb i ćelije domaćina. Slika 1 prikazuje Mustang™ S inicijalno smanjen CHOP sa 38 na 4,3 ppm. CHOP je blago porastao na 5,7 ppm dok se gustina opterećenja povećala na 16,000 g/L. Rezultati takođe pokazuju visoki prinos koji je dostigao približno 100% nakon 5000 g/L.

[0115] Kako bi se identifikovale zavisnosti od mAb i naelektrisanja, mAb 2 grupa razmene anjona obrađena je preko Mustang™ S pri pH 5,5 i 8,0. MAb 2 tok sirovina je podeljen na jednake delove, prvi je održavan na pH 8,0 i 5,0 mS/cm, i drugi je podešen na pH 5,5 i 6,4 mS/cm koristeći 1M limunske kiseline. Oba toka su procesuirana kroz membranu Mustang™ S male veličine 0,18 ml, konstantnom brzinom protoka od 667 MV/sat. MAb 2 pri pH 5,5 i 8,0 bio je ispod pI i zbog toga se pozitivno naelektrisao. Uzorci sirovine i filtrata su analizirani, i rezultati za CHOP prikazani su na Slici 2. Pri pH 5,5 Mustang™ S je u početku smanjio CHOP sa 51 na 3,0 ppm, i slično kao mAb 1, nivoi su se povećavali sa gustoćom opterećenja. Performanse membrane su se značajno smanjile na pH 8,0, što jasno pokazuje da adsorpcija CHOP zavisi od pH. Slika 3 pokazuje da je prinos sličan u oba pH stanja, i ≥ 96% je dostižno nakon gustine opterećenja od oko 5000 g/L.

[0116] Kako bi se procenio učinak adsorbera na grubljem toku sirovina, mAb 1 Protein A grupa pri pH 5,5 i 3,2 mS/cm prerađen je kroz malu razmeru 0,18 ml Mustang™ S membrane konstantnom brzinom protoka od 1333 MV/sat. Opterećenje mAb 1 je bilo 3,4 jedinice ispod izračunatog pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Uzorci opterećenja, filtriranja i uzorci eluiranja su analizirani, i rezultati za CHOP prikazani su na Slici 4. Podaci pokazuju da je Mustang™ S u početku smanjio CHOP sa 438 na 109 ppm. CHOP se povećao na 318 ppm kada se gustina opterećenja približila 55,300 g/L. Membrana se eluira pomoću rastvora koji sadrži visoku so. Jon soli se koristi da se zaštite naelektrisanje, na taj način se prekidaju elektrostatičke interakcije i prouzrokuju desorbovanje proteina sa površine membrane i slobodno se kreću u pokretnu fazu. Analiza grupa za eluiranje pokazuje obogaćivanje nečistoća koje potvrđuju da se CHOP vezuje za membranu zahvaljujući elektrostatskim silama.

Performanse malih razmera membrane razmene anjona (AEX)

[0117] Radi poređenja, odabrano je MAb 3 za testiranje koristeći anjonsku membranu iznad izoelektrične tačke od 7,7. Proteini su skloni deamidizaciji i agregaciji pri visokom pH, pa slični testovi nisu izvedeni na mAb 1 i 2. Grupa razmene katjona pri pH 5,5 i 9 mS/cm je pH podešena na 8,0 koristeći 1,5 M tris baze. Sirovina je zatim podeljena u tri odvojene grupe i provodnost je podešena korišćenjem prečišćene vode.

Prva grupa je bila na 10 mS/cm, druga i treća grupa su podešene na 7 mS/cm i 4 mS/cm, respektivno. Sve tri grupe su održavane na pH 8,0. Svaki tok sirovine je zatim obrađen kroz malu razmeru 0,35 ml Mustang™ Q konstantnim protokom od 600 MV/sat. MAb 3 pri pH 8,0 je bio 0,3 pH jedinice iznad pI, pa je antitelo negativno naelektrisano. Grupe opterećenja i filtrata su analizirane, i rezultati za CHOP prikazani su na Slici 5. Podaci pokazuju da je na 4 mS/cm Mustang™ Q smanjio CHOP sa 180 na 0,6 ppm i da se klirens nečistoća smanjio pri većoj provodnosti, verovatno zbog jonskog štita. Slika 5 pokazuje da, iako je pH bio samo 0,3 jedinice iznad pI, naelektrisanje na mAb 3 bilo je dovoljno jako da omogući vezivanje > 10 mg/ml. Kao i CHOP klirens, i vezivanje mAb 3 se smanjilo pri većoj provodnosti. Slika 6 prikazuje prinos za mAb 3 koji se brzo povećavao, prelazeći 96% nakon približno 1000 g/L.

Proces kombinovanja membrana AEX i CEX

[0118] MAb 4 korišćen je za testiranje izvodljivosti upotrebe uzastopnih koraka razmeštanja autohtonih proteina korišćenjem membrana razmene anjona i katjona. MAb 4 je bio poželjan jer je njegov pI od 6,7 bio dovoljno nizak da omogući obradu pri pH uslovima i iznad i ispod izoelektrične tačke. Protein A grupa sa pH 5,0 i 3,5 mS/cm je podešena na pH 8,0 i 4 mS/cm koristeći 1,5 M tris baze. Sirovina je zatim obrađena kroz malu razmeru 0,18 mL Mustang™ Q membrane sa konstantnom brzinom protoka od 1333 MV/sat. MAb 4 pri pH 8,0 bio je 1,3 jedinice iznad pI, pa je antitelo negativno naelektrisano. Fragmenti Mustang™ Q filtrata su uzorkovani, i zatim rekombinovani i podešeni na pH 5,5 i 6,1 mS/cm koristeći 1 M limunske kiseline. Rekombinovana grupa je zatim obrađena kroz malu razmeru 0,18 mL Mustang™ S membrane sa konstantnom brzinom protoka od 1333 MV/sat. MAb 4 pri pH 5,5 je bio 1,2 pH jedinice ispod pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Fragmenti opterećenja i filtrata su analizirani, i rezultati CHOP za obe membrane prikazani su na Slici 7. Podaci pokazuju da je Mustang™ Q u početku smanjivao CHOP sa 1215 na 555 ppm, i nivoi su se neprestano povećavali na 726 ppm kako se gustina opterećenja približavala 1700 g/L. Rezultati takođe pokazuju da se CHOP smanjio na 375 ppm nakon što su rekombinovani Mustang™ Q fragmenti filtrata podešeni na pH 5,5. Tačan uzrok smanjenja CHOP nije poznat. Rezultati naknadnog testiranja upotrebom Mustang™ S pokazuju da su nivoi CHOP dalje smanjeni na 143 ppm, i ponovo su se neprestano povećavali na približno 168 ppm kada se gustina opterećenja približila 1500 g/L. Uopšteno, rezultati pokazuju da je moguće izvesti kombinovanje korake membrane kako bi se dodatno smanjile nečistoće ćelija domaćina.

Neprekidni proces koji kombinuje kolone i membrane

[0119] MAb 1 je korišćen za testiranje izvodljivosti korišćenjem kolonske hromatografije kontinuirano i u seriji sa membranama razmene jona, koje se izvode u režimu razmeštanja autohtonih proteina. Izvršena su dva ponavljanja. Za vreme Ponavljanja 1 kolona i membrana su analizirani odvojeno (režim serije), i tokom Ponavljanja 2 kolona i membrana su izvođeni istovremeno u nizu (kontinuirani režim). Serijske operacije za Ponavljanje 1 su kako sledi. Kondicionirana mAb 1 Protein A grupa (pH 8,0 i 4,7 mS/cm) je naneta na kolonu Q Sepharose Fast Flow. pH opterećenja Q Seph FF bio je 0,9 pH jedinica ispod pI, tako da je antitelo pozitivno naelektrisano, što rezultuje odbojnom silom između smole i mAb. Način rada može se okarakterisati kao tradicionalna hromatografija protočne kolona. Protočni uzorci su sakupljeni tokom čitavog trajanja. Kolona je napunjena do približno 136 g/L smole. Sakupljena je Q Seph FF grupa i pH je podešen na 5,5 i 6 mS/cm koristeći 1 M limunske kiseline. Zatim je prerađena preko manjeg 0,18 mL Mustang™ S membrane sa 538 MV/sat do gustoće opterećenja od približno 15.000 g/L membrane. pH opterećenja membrane bio je približno 3,4 jedinice ispod izračunatog pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Uzorci membranskih otpadnih tečnosti su sakupljani tokom čitavog trajanja. Korišćena Mustang™ S membrana je odbačena i Q Seph FF kolona je regenerisana korišćenjem 0,5M NaOH i zatim uskladištena u 0,1 N NaOH. Ponavljanje 2 je izvedeno na sličan način kao i Ponavljanje 1; međutim, protok Q Seph FF je linijski podešen za pH, i zatim je odmah postavljen na Mustang™ S membranu. Analizirani su uzorci opterećenja i kolone/membrane, i CHOP rezultati su sabrani za serijski (Ponavljanje 1) i kontinuirani (Ponavljanje 2) eksperiment na Slici 8. Podaci pokazuju da je CHOP u Protein A grupi smanjen sa 1450 ppm na približno 16,8 ppm preko Q Sepharose kolone. Treba napomenuti da je vrednost Q grupe od 16,8 ppm izračunata na osnovu rezultata uzoraka uzetih tokom čitavog ciklusa. Serijski i kontinuirani Mustang™ S rezultati (12,7 i 11,1 ppm) pokazuju dobar dogovor. Sveukupno, podaci pokazuju da je povezivanje koraka kolone i membrane u jedan kontinuirani proces moguće izvesti i daje rezultate koji su uporedivi sa tradicionalnim serijskim operacijama.

Poređenje proizvođača membrana

[0120] Sartobind™ S membrana je testirana korišćenjem mAb 1 kako bi se uporedile performanse između dobavljača membrane. mAb 1 grupa razmene anjona pri pH 5,5 i 6 mS/cm obrađena je kroz malu razmeru 0,14 mL Sartobind™ S membrane sa konstantnom brzinom protoka od 857 MV/sat. pH opterećenja mAb 1 bio je 3,4 pH jedinice ispod pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Fragmenti sirovine i filtrata analizirane su na CHOP, i rezultati su prikazani na Slici 9. Podaci pokazuju da je Sartobind™ S inicijalno smanjio CHOP sa 29 na 3,3 ppm, i nakon otprilike 11,500 g/L nivoi su blago porasli na 5,6 ppm. Podaci pokazuju da Sartobind™ S i Mustang™ S membrane imaju sličnu CHOP adsorpciju.

Uticaj stope protoka

[0121] Mustang™ S CHOP klirens je ispitivano pri 333 - 2667 MV/sat kako bi se ispitao uticaj brzine protoka. MAb 1 grupa razmene anjona pri pH 5,5 i 6 mS/cm obrađena je na četiri odvojene membrane od 0,18 ml Mustang™ S sa istog seta uređaja. Opterećenje mAb 1 je bilo 3,4 pH jedinice ispod pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Uzorci sirovine i filtrata analizirani su na CHOP, i rezultati su prikazani na slici 10. Podaci pokazuju da je Mustang™ S u početku smanjen CHOP sa 45 na približno 6,9 ppm. Nakon 16,000 g/L, CHOP se povećao na prosečno 8,7 ppm. Kao što se očekuje za membranski uređaj koji nije podložan ograničenjima difuzije pora, rezultati pokazuju da CHOP adsorpcija ne zavisi od brzine protoka.

Povećavanje razmere

[0122] Mustang™ S membrana pilot razmere korišćena je za verifikaciju CHOP klirensa i prinosa nakon povećanja razmere.10 mL uređaj sa 16 slojeva izabran je jer je bio najmanji potpuno reprezentativan uređaj na raspolaganju. Smatralo se u potpunosti reprezentativnim jer je broj slojeva membrana, nabora i sklopa uređaja bio sličan znatno većim industrijskim kapsulama. Uređaj od 10 mL imao je 55-puta povećanje veličine u odnosu na prethodno proučavani uređaj malih dimenzija. MAb 1 grupa za izmenu anjona pri pH 5,5 i 6 mS/cm je obrađen preko adsorbera pilot razmere pomoću AKTA Pilot™. Opterećenje mAb 1 je bilo 3,4 pH jedinice ispod pI, pa je antitelo pozitivno naelektrisano. Kako bi se dobio utisak o mogućnosti reprodukcije, opterećenje mAb 1 testirano je na istom uređaju od 10 mL dva puta. Između ciklusa membrana se eluira sa puferom visoke soli (20 mM natrijum acetata, 350 mM natrijum hlorida, pH 5,5) i regeneriše se koristeći 0,5 M NaOH. Brzina protoka za sve faze bila je 546 MV/sat. Uzorci sirovine i filtrata i baze za ispiranje analizirani su na CHOP, i rezultati su prikazani na Slici 11. Podaci pokazuju dobru reprodukciju između ciklusa, što ukazuje da Mustang™ S može biti regenerisan bar jednom. Analiza uzorka eluiranja pokazala je obogaćivanje nečistoća, potvrđujući po drugi put da se CHOP vezuje za membranu zahvaljujući elektrostatičnim silama. Poređenje sa prethodnim rezultatima male razmere za mAb 1 pokazuje dobar dogovor za CHOP i prinos. Podaci pokazuju da su uređaji malih razmera sposobni da prognoziraju performanse velikih razmera.

Zaključak

[0123] Pokazalo se da su membrane razmene jona efikasne u uklanjanju CHOP u režimu sličnom hromatografiji režimom protoka, ali pri uslovima pH i provodnosti koji uzrokuju vezivanje mAb. Tehnika je nazvana hromatografija membrana razmene jona sa razmeštanjem autohtonih proteina. Rezultati su pokazali da se ova tehnika može koristiti za CHOP klirens bez značajnog gubitka prinosa koji bi se verovatno dogodio kod tradicionalne kolone napunjene smolom povećane kako bi se održali prinos, čistoća i vreme procesa. Podaci su pokazali da se mAb koja su prethodno bili podvrgnuti delimičnom prečišćavanju korišćenjem Proteina A i hromatografije razmene jona mogu dalje očistiti do CHOP nivoa manjih od 10 ppm sa prinosima ≥ 96% korišćenjem Mustang™ S, Sartobind™ S i Mustang™ Q. Niski CHOP nivoi su održavani pri velikim gustinama opterećenja, i u nekim slučajevima su performanse održavane i do 16,000 g/L. Rezultati su pokazali da klirens nečistoće zavisi od pH opterećenja i Uglavnom se smanjuje s većom provodnosti. Pored toga, studije izvodljivosti pokazale su da se više membrana može koristiti u kombinaciji za dalje smanjenje nivoa nečistoće i da se kolone i koraci membrane mogu integrisati u jedan kontinuirani proces prečišćavanja. Poređenje između Mustang™ S i Sartobind™ S pokazalo je sličan klirens nečistoća. Iako su među membranama uočljive razlike, rezultati su bili slični i samim tim mehanizam uklanjanja nečistoće ne zavisi od membrane. Rezultati ispitivanja pri protoku od 333 do 2667 MV/sat bili su u skladu sa teorijom i literatura tvrdi da su performanse membrane nezavisne od brzine protoka. Konačno, eksperimentiranje sa posrednim uređajem koji predstavlja 55-puta povećanje veličine pokazalo je performanse slične membrani malih razmera. Podaci potvrđuju da su uređaji malih razmera sposobni da predviđaju performanse na nivou proizvodnje. Pored toga, čišćenje pilot-uređaja između duplih ciklusa natrijum-hloridom, praćeno natrijum-hidroksidom, pokazalo je da se adsorberi membrane mogu regenerisati i koristiti više puta bez smanjenja performansi.

[0124] Jasna je potreba za boljim tehnologijama prečišćavanja. Povećanje titra bioreaktora može preopteretiti platforme za prečišćavanje na bazi kolona, i izazov se ne može rešiti samo povećanjem kapaciteta vezivanja smole. Pored toga, industriji su potrebni povoljniji, ekonomičniji alati, kako bi smanjili troškove robe. Membranski adsorberi su mali i za jednokratnu upotrebu i mogu smanjiti troškove validacije i rada uz istovremeno povećanje mase protoka. Eksperimentalni rezultati membrana razmene jona, koje rade u režimu razmeštanja autohtonih proteina, pokazali su visok klirens nečistoća i prinos, što ovu tehniku čini atraktivnom opcijom za bioprocesuiranje.

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Postupak za prečišćavanje monoklonskog antitela iz sastava koji sadrži monoklonsko antitelo i najmanje jedan zagađivač, gde postupak sadrži naredne korake:

a. prolazak sastava kroz membranu razmene katojna, gde monoklonsko antitelo i membrana imaju suprotno naelektrisanje, pri operativnim uslovima koji se sastoje od pufera sa pH od oko 1 do oko 5 pH jedinica ispod pI monoklonskog antitela i provodnosti ≤ oko 40 mS/cm, zbog čega membrana vezuje monoklonsko antitelo i bar jedan zagađivač, i

b. povraćaj pročišćenog monoklonskog antitela iz otpadnih tečnosti.

2. Postupak za prečišćavanje monoklonskog antitela iz sastava koji sadrži monoklonsko antitelo i najmanje jedan zagađivač, gde postupak sadrži naredne korake:

a. prolazak sastava kroz membranu razmene anjona, gde monoklonsko antitelo i membrana imaju suprotno naelektrisanje, pri operativnim uslovima koji se sastoje od pufera sa pH od oko 1 do oko 5 pH jedinica iznad pI monoklonskog antitela i provodnosti ≤ oko 40 mS/cm, zbog čega membrana vezuje monoklonsko antitelo i bar jedan zagađivač, i

b. povraćaj pročišćenog monoklonskog antitela iz otpadnih tečnosti.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde membrana razmene jona ima veličinu pora od 0,1 do 100 µm.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde je pH

(i) oko 1 do oko 4 pH jedinice ispod pI monoklonskog antitela;

(ii) oko 1 do oko 3 pH jedinice ispod pI monoklonskog antitela;

(iii) oko 1 do oko 2 pH jedinice ispod pI monoklonskog antitela; ili

(iv) oko 1 pH jedinice ispod pI monoklonskog antitela.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je provodnost <20 mS/cm ili <10 mS/cm.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 2, gde je pH

(i) oko 1 do oko 4 pH jedinice iznad pI monoklonskog antitela;

(ii) oko 1 do oko 3 pH jedinice iznad pI monoklonskog antitela;

(iii) oko 1 do oko 2 pH jedinice iznad pI monoklonskog antitela; ili

(iv) oko 1 pH jedinice iznad pI monoklonskog antitela.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde je membrana adsorber u mešovitom režimu.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, koji dalje uključuje podvrgavanje sastava koji sadrži monoklonsko antitelo jednom ili više koraka daljeg prečišćavanja

(i) bilo pre, tokom ili posle koraka od a do b, gde je navedeni korak prečišćavanja afinitetna hromatografija proteina A;

(ii) bilo pre, tokom ili posle koraka od a do b, gde je navedeni postupak prečišćavanja hromatografija razmene jona; ili

(ii) izvođenje neprekidno tokom koraka od a do b, gde je navedeni postupak prečišćavanja hromatografija razmene jona.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, koji dalje sadrži pripremu farmaceutskog sastava kombinovanjem pročišćenog monoklonskog antitela sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, gde su monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen izabrani iz grupe koja se sastoji od HER2 antitela, EGFR antitela, CD20 antitela, CD22 antitela, VEGF antitela, VEGF receptor antitela, IgE antitela, Apo-2 receptor antitela i TNF-alfa antitela.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, gde je antitelo

(i) HER2 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od trastuzumaba i pertuzumaba; (ii) CD20 antitelo ritukimab;

(iii) VEGF antitelo bevacizumab; ili

(iv) IgE antitelo omalizumab.