RS60106B1 - Mnd promoterni himerni antigenski receptori - Google Patents

Description

POZADINA

Tehničko polje

Ovo otkriće odnosi se na poboljšane sastave i metode lečenja raka ili tumora. Posebno se odnosi na poboljšane vektore koji uključuju receptore himernih antigena (CAR), ćelije imunih efektora koje su genetski modifikovane tim vektorima u cilju iskazivanja ekspresije CAR-a i upotrebu tih sastava za efektivno tretiranje različitih vrsta raka ili tumora.

Opis naučnih metoda

Rak je značajan zdravstveni problem u svetu. Na osnovu podataka iz perioda od 2008. do 2010. godine, kod 40,76% današnjih muškaraca i žena u nekom trenutku života biće dijagnostikovan neki oblik raka. U poređenju sa 15,30% žena, 20,37% muškaraca razviće rak u periodu između pedesetog i sedamdesetog rođendana. U Sjedinjenim Američkim Državama 1. januara 2010. godine bilo je približno 13 027 914 živih pacijenata sa istorijom ove bolesti, od čega su 6 078 974 bili muškarci, a 6 948 940 žene. Procenjuje se da će u Sjedinjenim Američkim Državama u 2013. godini kod 1 660 290 ljudi (854 790 muškaraca i 805500 žena) biti dijagnostikovan rak na raznim organima, od kojeg će 580350 ljudi umreti. Howlader et al.2013.

SATIRO NAKAMURA DE OLIVEIRA et al: "Modifikacija hematopoetskih stem/praroditeljskih ćelija sa receptorima himernih antigena sa specifičnim CD 19 kao novi vid pristupa imunoterapiji raka", HUMAN GENE THERAPY, Vol. 24, br. 10, 1. oktobar 2013., str. 824-839, obrađuje transfer gena na hematopoetske stem/praroditeljske ćelije kao pristup isporuke CAR-a sa specifičnim CD 19.

Iako su načinjeni pomaci u otkrivanju, sprečavanju i lečenju raka, univerzalno uspešna terapeutska strategija tek treba da bude otkrivena. Odgovor različitih tipova lečenja raka je različit. Tradicionalni metodi lečenja raka, uključujući hemoterapiju i radioterapiju, imaju ograničenu upotrebnu vrednost zbog štetnih propratnih efekata. Imunoterapija terapijskim antitelima je tako đe dala ograničen uspeh, delom zbog siromašnih farmakokinetičkih profila, brze eliminacije antitela od strane serumske proteaze i filtracije u glomerulima i ograničenog prodiranja na lokaciju tumora i nivoa iskazivanja ekspresije ciljnog antigena na ćelije tumora. Pokušaji korišćenja genetski modifikovanih ćelija koje iskazuju ekspresiju receptora himernih antigena (CAR-ova) su takođe doživeli ograničen uspeh zbog siromašnog širenja CAR T ćelija in vivo, brzog nestanka ćelija nakon infuzije i razočaravajuće kliničke aktivnosti.

Zbog toga se u nauci zadržava potreba za klinički efektivnijim sastavima i metodima lečenja raka.

KRATAK PREGLED

Otkriće uopšteno predstavlja poboljšane sastave vektora za stvaranje terapeutskih T ćelija. U različitim primerima prikazan je polinukleotid koji obuhvata mijeloprolferativni poja čivač virusa sarkoma, uz izbrisanu regiju negativne kontrole, (MND) promotor sa zamenjenim lokacijom vezivanja prajmera dl587rev-a koji je operativno povezan sa receptorima himernih antigena (CAR).

U određenim primerima, CAR uključuje: vanćelijski domen koji vezuje antigen izabran iz grupe koja se sastoji od: receptora alfa folata, 5T4, # vβ6 integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, 11-UR# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova i VEGFR2; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8# ; CD4, CD28, CD45, PD1 i CD152; jedan ili više unutarćelijskih ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) i CD278 (ICOS); i CD3 primarni signalni domen.

U nekim primerima vanćelijski domen uključuje fragment vezivnog antigena ili antitela koje vezuje antigen.

U specifičnim primerima, vezivni fragment antitela ili antigena koji vezuje polipeptid kappa svetlosnog lanca izabran je iz grupe koja se sastoji od: a Camel Ig, Ig NAR, Fab fragmenata, Fab' fragmenata, F(ab)'2 fragmenata, F(ab)'3 fragmenata, Fv, Fv antitela s jednostrukim lancem ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minitela, dijatela, trijatela, tetratela, Fv proteina stabilizovanog disulfidom ("dsFv") i antitela jednostrukog domena (sdAb, nanotelo).

U dodatnim primerima, fragment vezivnog antitela ili antigena koji vezuje polipeptid kappa svetlosnog lanca je scFv.

U određenim primerima, antitelo je ljudsko, mišije ili humanizovano.

U otelotvorenjima, transmembranski domen se izvodi iz CD8# .

U specifičnim primerima, jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena izabran je iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134 i CD137.

U nekim primerima, CAR uključuje dva ili više ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD 134 i CD 137.

U nekim primerima, jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena je CD28.

U specifičnim primerima, jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena je CD 134.

U određenim primerima, jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena je CD 137.

U specifičnim primerima, CAR nadalje uključuje polipeptid zglobne regije.

U daljim primerima, polipeptid zglobne regije sadrži zglobnu regiju PD1, CD 152 ili CD8# . U daljim primerima, polipeptid zglobne regije sadrži zglobnu regiju PD1.

U daljim primerima, polipeptid zglobne regije sadrži zglobnu regiju CD 152.

U daljim primerima, polipeptid zglobne regije sadrži zglobnu regiju CD8# .

U nekim primerima CAR nadalje uključuje regiju odstojnika.

U dodatnim primerima, polipeptid regije odstojnika sadrži CH2 i CH3 regije IgGI.

U određenim primerima, CAR nadalje uključuje signalni pepetid.

U specifičnim primerima, signalni pepetid sadrži signalni polipeptid IgGl teškog lanca, signalni polipeptid CD8# ili ljudski alfa signalni peptid receptora GM-CSF.

U nekim primerima, polinukleotid kodira CAR kao što je pokazano u bilo kom od BR. ID. SEKV.:2do3.

U različitim primerima, prikazan je vektor koji uključuje polinukleotid koji šifruje CAR kao što je prikazano u bilo kom od prethodnih ili primera iznesenih u drugim delovima ovog rada.

U daljim primerima, vektor je vektor iskazivanja ekspresije.

U dodatnim primerima, vektor je viralni vektor.

U specifičnim primerima, vektor je retroviralni vektor.

U prvom aspektu pronalaska prikazan je lentiviralni vektor, definisan tvrdnjom 1.

U dodatnim otelotvorenjima lentiviralni vektor je izabran iz grupe koja se su štinski sastoji od ljudskog imunodeficijencijskog virusa (HIV), visna-maedi virusa (VMV), kozijeg artritis-encefalitis virusa (CAEV), konjskog virusa zarazne anemije (EIAV), mačijeg imunodeficijencijskog virusa (FIV), goveđeg imunodeficijencijskog virusa (BIV) i majmunskog imunodeficijencijskog virusa (SIV).

U određenim otelotvorenjima, CAR nadalje uključuje levi (5') retroviralni LTR, Psi (" ) signal pakovanja, poklopac centralnog polipurinskog trakta/DNA (cPPT/FLAP), retroviralni izvozni element, MND promoter operativno povezan sa CAR-om i desni (3') retroviralni LTR.

U dodatnim otelotvorenjima CAR nadalje uključuje heterolognu sekvencu poliadenilacije.

U dodatnim otelotvorenjima sekvenca poliadenilacije je sekvenca poliadenilacije gove đeg hormona rasta ili signalna sekvenca poliadenilacije zečijeg β-globina.

U specifičnim otelotvorenjima CAR dalje uključuje post-transkripcijski regulatorni element virusa hepatitis B (HPRE) ili post-transkripcijski regulatorni element mrmota (WPRE).

U nekim otelotvorenjima promotor 5' LTR zamenjen je heterolognim promotorom.

U određenim otelotvorenjima heterologni promotor je promotor citomegalovirusa (CMV), promoter virusa Rous Sarcoma (RSV) ili promotor majmunskog virusa 40 (SV40).

U daljim otelotvorenjima 5' LTR ili 3' LTR je lentivirus LTR.

U dodatnim otelotvorenjima 3' LTR uključuje jednu ili više modifikacija.

U specifičnim otelotvorenjima 3' LTR uključuje jedno ili više brisanja.

U određenim otelotvorenjima 3' LTR je samo-inaktivirajući (SIN) LTR.

U specifičnim otelotvorenjima polinukleotid koji kodira CAR uključuje optimizovanu Kozak sekvencu.

U raznim primerima prikazana je ćelija imunog efektora koja uključuje vektor kao što je opisano u bilo kom od prethodnih ili primera opisanih drugde u ovom radu.

U drugom aspektu pronalaska prikazana je ćelija imunog efektora koja uključuje lentiviralni vektor iz prvog aspekta, kao što je definisano tvrdnjom 9.

U nekom otelotvorenjima ćelija imunog efektora je T limfocit.

U različitim otelotvorenjima prikazan je sastav koji uključuje ćeliju imunog efektora kao što je razmatrano u bilo kom od prethodnih ili otelotvorenja razmatranih drugde u ovom radu, kao i fiziolo ški prihvatljiv pomoćni sastojak.

U različitim primerima prikazan je metod generisanja ćelije imunog efektora koja sadrži uvođenje vektora u nju kao što je ovde razmatrano, što stimuliše ćelije i indukuje njihovo razmnožavanje dovodeći ih u kontakt sa antitelima koja vezuju CD3, kao i onima koja vezuju CD28. Dakle prikazan je metod generisanja ćelije imunog efektora.

U daljim primerima ćelije imunog efektora su stimulisane i indukovane na razmnožavanje pre uvođenja vektora.

U specifičnim primerima ćelije imunog efektora sadrže T limfocite.

U različitim primerima prikazan je metod stvaranja ćelije imunog efektora koja uključuje prethodno razmatrani polinukleotid koji uključuje izolovanje ćelija CD34+ iz koštane srži, krvi iz pupkovine ili mobilizovane periferne krvi subjekta, te uvođenje prethodno razmatranog vektora u izolovane ćelije CD34+.

U dodatnim primerima ćelije CD34+ su prethodno stimulisane sa jednim ili više citokina izabranih iz grupe koja uključuje od FLT3 ligand, TPO, SCF, IL-3 i IL-6 pre uvođenja vektora na prethodno opisan način.

U različitim otelotvorenjima prikazano je ovde razmatrani sastav koje se koristi u metodu lečenja raka kod subjekta kome je to potrebno, a koji obuhvata primenu terapeutski efektivene količine navedenog sastava.

U određenim otelotvorenjima rak je izabran iz grupe koja se sastoji od Vilijamovog tumora, Juingovog sarkoma, neuroendokrinog tumora, glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, raka ko že, raka dojke, raka debelog creva, raka prostate, raka jetre, raka bubrega, raka gu šterače, raka pluća, raka žučne kese, raka materice, raka endometrijuma, raka jednjaka, raka želuca, raka glave i vrata, karcinoma medule tiroide, raka jajnika, glioma, limfoma, leukemije, mijeloma, akutne limfoblasti čne leukemije, akutne mijelogenozne leukemije, hronične leukemije limfocita, hronične mijelogenozne leukemije, Hodžkinsovog limfoma, ne-Hodžkinsovog limfoma i raka bešike.

U specifičnim otelotvorenjima rak je rak gušterače i vanćelijski vezni domen veže epitop PSCA ili MUC1.

U daljim otelotvorenjima rak je rak bešike i vanćelijski vezni domen veže epitop PSCA ili MUC1. U specifičnim otelotvorenjima rak je glioblastom multiforme i vanćelijski vezni domen veže epitop EPHA2, EGFRvIII ili CSPG4.

U specifičnim otelotvorenjima rak je rak pluća i vanćelijski vezni domen veže epitop PSCA ili GD2.

U određenim otelotvorenjima rak je rak dojke i vanćelijski vezni domen veže epitop CSPG4 ili HER2.

U nekim otelotvorenjima rak je melanom i vanćelijski vezni domen veže epitop CSPG4 ili GD2.

Kod različitih otelotvorenja ovde je prikazan sastav korišćen u metodu lečenja hematološkog maligniteta kod subjekta kome je to potrebno, a koji obuhvata primenu terapeutski efektivne koli čine navedenog sastava.

Kod daljih otelotvorenja hematološki malignitet je malignitet B ćelija izabran iz grupe koja se sastoji od: multiplog mijeloma (MM), hronične leukemije limfocita (HLL) ili ne-Hodžkinsovog limfoma (NHL).

Kod specifičnih otelotvorenja MM je izabran iz grupe koja se sastoji od: očiglednog multiplog mijeloma, tinjajućeg multiplog mijeloma, leukemije ćelijske plazme, ne-sekretornog mijeloma, IgD mijeloma, osteosklerotičnog mijeloma, usamljenog plazmacitoma kosti i ekstramedularnog plazmacitoma.

Kod određenih otelotvorenja NHL je izabran iz grupe koja se sastoji od: Burkitovog limfoma, hronične leukemije limfocita/male leukemije limfocita (HLL/MLL), difuznog velikog limfoma B ćelija, folikularnog limfoma, imunoblastičnog limfoma velikih ćelija, prekursorskog B-limfoblastičnog limfoma i limfoma plašta ćelije.

Prioritetna otelotvorenja pronalaska opisana su u nastavku teksta u svakom od svojih razli čitih aspekata ili kao što je definisano u pod-tvrdnjama.

KRATAK OPIS PONEKIHRAZMATRANJA CRTEŽA

Slika 1 prikazuje strukturu konstrukta pMND-CD19 CAR (A) i konstrukta pMND-kappaLC CAR (B).

Slika 2 prikazuje mapu vektora za pMND-CD19 CAR.

Slika 3 prikazuje mapu vektora za pMND-kappaLC CAR.

Slika 4 prikazuje broj kopija vektora (VCN) integrisanih lentiviralnih čestica pMND-kappaLC CAR. VCN bio je određen metodom q-PCR devet dana nakon transdukcije. Svaki krug predstavlja jedinstvenu kulturu načinjenu paralelno sa odgovarajućim nemodifikovanim (kvadrat) kulturama T ćelija. Prikazani podaci potiču od 12 jedinstvenih kultura sakupljenih od 6 donora. Aritmetička sredina i standardna devijacija predstavljene su linijskom trakom i trakom gre šaka.

Slika 5 prikazuje iskaz ekspresije kappaLC u T ćelijama transdukovanim sa pMND-kappaLC CAR-ovima. Iskazivanje ekspresije CAR-a na T ćelijama bilo je određeno citometrijom protoka šest do devet dana nakon transdukcije. Svaki krug predstavlja jedinstvenu kulturu načinjenu paralelno sa odgovarajućim nemodifikovanim (kvadrat) kulturama T ćelija. Prikazani podaci potiču od 12 jedinstvenih kultura sakupljenih od 6 donora. Aritmetička sredina i standardna devijacija predstavljene su linijskom trakom i trakom grešaka.

Slika 6 prikazuje uporedivu transdukciju i iskazivanje ekspresije CD 19 CAR-a na T ćelijama transdukovanim sa lentiviralnim vektorima pMND- ili pEFla-CD 19 CAR. Ti su vektori korišćeni za transdukovanje uparenih paralelnih kultura primarnih ljudskih T ćelija. Iskazivanje ekspresije CAR-a na T ćelijama bilo je određeno citometrijom protoka šest dana nakon transdukcije. Broj kopija vektora (VCN) integrisanih lentiviralnih čestica bio je određen metodom q-PCR devet dana nakon transdukcije.

Slika 7 prikazuje reaktivnost pMND-kappaLC T ćelija sa modifikovanim CAR-om specifičnu za tumor. Modifikovane T ćelije bile su kulturisane zajedno sa ćelijama kappa+ Daudi ili kappa-HDLM-2 tokom 24 časa. Oslobađanje IFN-y specifično za tumor analizirano je putem ELISA-e. Ovde prikazani podaci potiču iz 5 jedinstvenih kultura T ćelija pribavljenih od 4 donora.

Slika 8 prikazuje regresiju ustanovljenih Daudi tumora nakon adoptivnog transfera pMND-kappaLC CAR modifikovanih T ćelija. Modifikovane T ćelije iskorišćene su za tretiranje miševa sa ustanovljenim Daudi tumorima. U poređenju sa netretiranim kontrolnim životinjama tumorski teret nakon tretmana praćen je obradom slike in vivo. Podaci su bili reprezentativni u dva nezavisna eksperimenta.

Slika 9 prikazuje klirens tumora specifičan za antigen uz korišćenje CAR T ćelija koje iskazuju ekspresiju. (A). CAR T ćelije sa iskazivanjem ekspresije anti-BCMA ubile su ćelije tumora sa iskazivanjem BCMA obeležene karboksifluorescentnim sukcinimidil esterom (CFSE), a fluorescenca je merena FACS-om. (B). CAR T ćelije sa iskazivanjem ekspresije anti-BCMA bile su kulturisane zajedno sa ćelijama K562 i K562, genetski modifikovanim za iskazivanje ekspresije BCMA, a površinske rezidue bile su sakupljene 24 časa kasnije i analizirane na IFN-& otpuštanje pomoću ELISA-e. (n=3).

KRATAK OPIS IDENTIFIKATORA SEKVENCI

ID. BR. SEKV. 1 prikazuje polinukleotidsku sekvencu pojačivača virusa mijeloproliferativnog sarkoma, uz izbrisanu negativnu kontrolnu regiju, te (MND) promotor zamenjene dl587rev lokacije za vezivanje prajmera.

ID. BR. SEKV.2 prikazuje polinukleotidnu sekvencu MND promotora anti-CD 19 CAR konstrukta.

ID. BR. SEKV. 3 prikazuje polinukleotidnu sekvencu MND promotora anti-kappa lakog lanca CAR konstrukta.

DETALJAN OPIS

A. Pregled

Otkriće se generalno odnosi na poboljšane sastave i metode lečenja raka koji uključuju ali nisu ograničeni na tumore ili rakove jetre, gušterače, pluća, dojki, bešike, mozga, kostiju, tiroide, bubrega, kože i hematopoetičkog sistema. Otkriće se posebno odnosi na adoptivnu terapiju ćelija imunih efektora, genetski modifikovanih vektorima koji uključuju pojačivač virusa mijeloproliferativnog sarkoma, uz izbrisanu negativnu kontrolnu regiju, te (MND) promotor zamenjene dl587rev lokacije za vezivanje prajmera operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira receptor himernkih antigena.

Genetički pristupi nude potencijalna sredstva za pojačavanje imunog prepoznavanja i eliminacije ćelija raka. Jedna od obećavajućih strategija je genetski inženjering ćelija imunog efektora za izražavanje ekspresije receptora himernih antigena koji preusmeravaju citotoksi čnost ka ćelijama tumora. Međutim, postojećim imunoterapijama adoptivnih ćelija za tretiranje tumora ili rakova nedostaju istrajni nivoi dovoljnog iskazivanja ekspresije CAR-a u terapeutskim ćelijama. Prema tome, takve terapije nisu klinički poželjne i zbog toga u sklopu nauke ostaje potreba za efikasnijim terapijama maligniteta B-ćelija koje pošteđuju humoralni imunitet.

Poboljšani sastavi i metodi terapije adoptivnim ćelijama o kojima je ovde reč obezbeđuju genetski modifikovane ćelije imunih efektora koje spremno mogu da budu proširene, ispoljavaju dugoročnu postojanost in vivo i iskazuju postojanu i dovoljnu ekspresiju CAR polipeptida. Bez želje da se veže za bilo koju posebnu teoriju, ovaj rad delimično razmatra iznenađujuće otkriće da MND promotor usmerava postojano iskazivanje ekspresije polipeptida CAR-a aktiviranih, pro širenih i mirujućih T ćelija, pa je tako to iskazivanje ekspresije dovoljno da efikasno preusmeri ovde pominjane genetski modifikovane ćelije imunih efektora tako da izmame citotoksičnu aktivnost protiv ćelija tumora ili raka.

U jednom primeru polinukleotid uključuje MND promotor operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR, a CAR sadrži vanćelijski domen koji vezuje ciljni antigen, transmambranski domen, te jedan ili više unutarćelijskih signalnih domena.

U jednom primeru T ćelija je genetski modifikovana vektorom koji sadrži MND promotor koji je operativno povezan sa ovde razmatranim CAR-om. T ćelije koje iskazuju ekspresiju CAR-a ovde se nazivaju CAR T ćelijama ili CAR modifikovanim T ćelijama.

U različitim primerima, ovde pominjane genetski modifikovane CAR T ćelije date su pacijentu sa rakom ili tumorom.

Osim ako je specifično indikovano suprotno, praksa pronalaska će upotrebiti konvencionalne metode hemije, biohemije, organske hemije, molekularne biologije, mikrobiologije, tehnike rekombinovanja DNK, genetike, imunologije i ćelijske biologije koje se nalaze u okviru prakse, od kojih se mnoge u cilju ilustracije opisuju u daljem tekstu. Te su tehnike u potpunosti obja šnjene u literaturi. Videti npr. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izdanje, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. izdanje, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow i Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E.

Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach i W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; as well as monographs in journals such as Advances in Immunology.

B. Definicije

Osim ukoliko nije definisano drugačije, svi ovde korišćeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kao i ono koje se uobičajeno podrazumeva među naučnicima vičnim području u koje intervencija pripada. Iako bilo koji metodi ili materijali sli čni ili jednaki opisanima ovde mogu da se koriste u praksi ili pri testiranju ovde iznesene teme, prioritetni primeri sastava, metoda i materijala opisani su ovde. U svrhu trenutnog pronalaska u nastavku teksta definisani su sledeći termini.

Članovi "a," "an," i "the" ovde se koriste za određivanje jednog ili više (tj. najmanje jednog) gramatičkog objekta u članku. Kao primer, "element" znači jedan ili više elemenata.

Ovde korišćeni termini "oko" ili "aproksimativno" odnose se na količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, težinu ili dužinu koja varira između 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1% referentne količine, nivoa, vrednosti, broja, frekvencije, procenta, dimenzije, veličine, količine, težine ili dužine. U specifičnim primerima kada je procenat numerička vrednost, termini "oko" ili "aproksimativno" označavaju vrednost veću ili manju od opsega od 15%, 10%, 5% ili 1%.

Tokom ove specifikacije, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reči "uključivati", "uključuje" i "uključujući" treba da označavaju impliciranje inkluzije naznačenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata ali ne i isključivanje bilo kog drugog koraka, elementa ili grupe koraka ili elemenata. Pod frazom "sastoji se od" podrazumeva se uključivanje onoga što je sledi i ograničavanje na isto. Tako fraza "sastoji se od" označava da su nabrojani elementi zahtevani ili obavezni, te da nijedan drugi element ne može biti prisutan. Pod frazom "suštinski se sastoji od" podrazumeva se uključivanje svih elemenata nabrojanih nakon fraze i ograničavanje drugih elemenata koji se ne mešaju u aktivnost ili akciju naznačenu na kraju nabrojanih elemenata ili joj ne doprinose. Tako fraza "suštinski se sastoji od" naznačava da su nabrojani elementi zahtevani ili obavezni, ali da nijedan drugi element nije opcionalan i može ili ne mora biti prisutan u zavisnosti od toga da li utiče na aktivnost ili akciju nabrojanih elemenata.

U ovoj specifikaciji referisanje na "jedno otelotvorenje", "otelotvorenje", "specifi čno otelotvorenje", "povezano otelotvorenje", "određeno otelotvorenje", "dodatno otelotvorenje" ili "dalje otelotvorenje" ili njihova kombinacija znači da određeno svojstvo, struktura ili karakteristika opisana u vezi sa otelotvorenjem jeste uključena u najmanje jedno otelotvorenje ovog pronalaska. Tako pojava prethodnih fraza na različitim mestima ove specifikacije ne znači i njihovo neophodno odnošenje na isto otelotvorenje. Nadalje, kod jednog ili više otelotvorenja posebna svojstva, strukture ili karakteristike mogu biti kombinovane na bilo koji suptilan način.

C. Receptori himernih antigena

Ovde su otkrivene ćelije imunog efektora genetski inženjerisane vektorima dizajniranim za iskazivanje ekspresije receptora himernih antigena koji preusmeravaju citotoksi čnost ka ćelijama tumora. Ti genetski inženjerisani receptori ovde se pominju kao receptori himernih antigena (CAR-ovi). CAR-ovi su molekuli koji kombinuju specifičnost zasnovanu na antitelima za ciljni antigen (npr. antigen tumora) sa unutarćelijskim domenom aktivirajućih receptrora T ćelija kako bi stvorili himerni protein koji ispoljava specifičnu anti-tumorsku ćelijsku imunu aktivnost. Ovde korišćen termin "himerni" opisuje sastav od delova različitih proteina ili delova DNK različitog porekla.

Ovde razmatrani vektori uključuju i MND promotor i polinukleotid koji kodira CAR. Ovde razmatrani CAR-ovi uključuju vanćelijski domen koji se veže na specifični ciljni antigen (takođe poznat kao vezni domen ili vezni domen specifičan za antigen), transmembranski domen i unutarćelijski signalni domen. Angažman veznog domena specifičnog za antigen CAR-a sa ciljnim antigenom na površini ciljne ćelije rezultuje klasteriranjem CAR-a i polučuje aktivacijski stimulans na ćeliju koja ga sadrži. Glavna karakteristika CAR-ova je njihova sposobnost preusmeravanja specifi čnosti ćelije imunog efektora, čime otpočinje razmnožavanje, proizvodnja citokina, fagocitoza ili proizvodnja molekula koji mogu da posreduju pri ćelijskoj smrti ciljne ćelije koja iskazuje ekspresiju antigena na nezavisni način velike histokompatibilnosti (MHC), eksploatišući specifične ćelijske ciljne sposobnosti za monoklonska antitela, rastvorljive ligande ili ko-receptore specifične za ćeliju.

U specifičnim primerima, CAR uključuje vanćelijski vezni domen uključujući ali ne ograničavajući se na vezni fragment antitela ili antigena, vezani molekul ili van ćelijski domen koreceptora, koji specifično veže ciljani antigen izabran iz grupe koja se sastoji od: receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove i VEGFR2; jednog ili više zglobnih ili domena odstojnika; transmembranskog domena uključujući, ali ne i ograničavajući se na transmembranske domene iz CD8# , CD4, CD45, PD1 i CD 152; jednog ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnih domena uključujući ali ne i ograničavajući se na unutarćelijske ko-stimulatorne signalne domene iz CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), i CD278 (ICOS); i primarnog signalnog domena iz CD3 ili FcR & .

1. Vezni domen

U specifičnim primerima ovde razmatrani CAR-ovi uključuju vanćelijski vezni domen koji se specifično vezuje na ciljani polipeptid, npr. ciljani antigen sa iskazivanjem ekspresije na ćeliju tumora. Ovde korišćeni termini "vezni domen", "vanćelijski domen", "vanćelijski vezni domen", "vezni domen specifičan za antigen" i "vanćelijski vezni domen specifičan za antigen" koriste se zamenljivo i obezbeđuju sposobnost CAR-a da se specifično veže za ciljani antigen od interesa. Vezni domen može da sadrži bilo koji protein, polipeptid, oligopeptid ili peptid koji poseduje sposobnost specifi čnog prepoznavanja i vezivanja biološkog molekula (npr. receptora površine ćelije ili proteina tumora, lipida, polisaharida ili drugog ciljnog molekul površine ćelije ili njegove komponenete). Vezni domen uključuje bilo kog prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantno proizvedenog veznog partnera za biološki molekul od interesa.

Termini "specifična vezna sklonost" ili "specifično veže" ili "specifično vezan" ili "specifično vezivanje" ili "specifično targetira" ovde se koriste za opisivanje vezivanja jednog molekula za drugi sa većom veznom sklonošću od pozadinske vezne sklonosti. Vezni domen (ili CAR koji uključuje vezni domen ili fuzioni protein koji sadrži vezni domen) "specifično se veže" za ciljni molekul ako se veže ili se udružuje sa ciljnim molekulom sa sklonošću ili Ka (tj. konstantom asocijacije ekvilibrijuma određene vezne interakcije sa jedinicama od 1/M) koja je, na primer, ve ća od ili jednaka približno 10<5>M<-1>. Kod određenih otelotvorenja vezni domen (ili fuzioni protein) ve že se sa ciljem pri čemu je Ka veća od ili jednaka približno 10<6>M<-1>, 10<7>M<-1>, 10<8>M<-1>, 10<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>, 10<12>M<-1>ili 10<13>M<-1>. Vezni domeni "visoke sklonosti" (ili njihovi jednolančani fuzioni proteini ) odnose se na one vezne domene čija je Kanajmanje 10<7>M<-1>, najmanje 10<8>M<-1>, najmanje 10<9>M<-1>, najmanje 10<10>M<-1>, najmanje 10<11>M<-1>, najmanje 10<12>M<-1>, najmanje 10<13>M<-1>ili veća.

Alternativno, sklonost može da se definiše kao konstanta disocijacije ekvilibrijuma (Kd) određene vezne interakcije sa jedinicama od M (npr. 10<-5>M do 10<-13>M ili manje). Prema ovom radu sklonosti polipeptida veznog domena i proteina CAR-a mogu lako da se odrede uz pomo ć konvencionalnih tehnika, npr. uz pomoć kompetitivne ELISA-e (enzimski imunosorbentni test) ili uz pomoć veznog udruživanja, ili testa pomeranja koji koristi obeležene ligande, ili pomoću uređaja za površinsku plazmonsku rezonancu poput Biacore T100, koji je dostupan kod prodavca Biacore, Inc., Piskatavej, Nju Džerzi, ili tehnologijom optičkog biosenzora poput sistema EPIC ili EnSpire koji su dostupni kod prodavaca Corning i Perkin Elmer (videti takođe npr. Scatchard et al. (1949) Ann. Nju Jork Acad. Sci. 51:660; i patenti S.A.D.5,283,173; 5,468,614 ili ekvivalent).

Kod jednog otelotvorenja, sklonost specifičnog vezivanja je oko 2 puta veća od pozadinskog vezivanja, oko 5 puta veća od pozadinskog vezivanja, oko 10 puta veća od pozadinskog vezivanja, oko 20 puta veća od pozadinskog vezivanja, oko 20 puta veća od pozadinskog vezivanja, oko 50 puta veća od pozadinskog vezivanja, oko 100 puta veća od pozadinskog vezivanja ili oko 1000 puta veća od pozadinskog vezivanja ili više.

U specifičnim primerima, vanćelijski vezni domen CAR-a uključuje vezni fragment antitela ili antigena. Termin "antitelo" odnosi se na vezni agens koji je polipeptid koji se sastoji od promenljive regije imunoglobulina sa najmanje lakim ili teškim lancem koji specifično prepoznaje i veže epitop antigena, poput peptida, lipida, polisaharida ili nukleinske kiseline koji uklju čuje antigensku determinantu poput one koju prepoznaje imuna ćelija.

Termin "antigen (Ag)" odnosi se na jedinjenje, sredstvo ili supstancu koji mogu da stimuli šu proizvodnju antitela ili odgovor T ćelije kod životinje, uključujući sastave (poput onog koji uključuje protein specifičan za tumor) koje životinja apsorbuje ili se u nju injektiraju. Antigen reaguje sa proizvodima specifičnog humoralnog ili ćelijskog imuniteta, uključujući one indukovane heterolognim antigenima, poput otkrivenih antigena. "Ciljni antigen" ili "ciljni antigen od interesa" je antigen koji je dizajniran za vezivanje sa veznim domenom ili CAR-om na ovde razmatran na čin. Kod specifičnih otelotvorenja, ciljni antigen je epitop peptida, lipida, polisaharida ili nukleinske kiseline na koju se vezni domen specifično veže. Kod prioritetnih otelotvorenja antigen je epitop receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida.

Termin "epitop" ili "antigenska determinanta" odnosi se na regiju antigena na koju se ve že vezni agens. Epitopi mogu biti formirani od graničnih amino kiselina ili negraničnih amino kiselina jukstaponiranih tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani od grani čnih amino kiselina se tipično zadržavaju pri izloženosti denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube prilikom tretmana denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a obično i više, odnosno najmanje 5, oko 9 ili oko 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konfirmaciji.

Antitela uključuju vezne fragmente antigena poput Camel Ig, Ig NAR, fragmente Fab, fragmente Fab', fragmente F(ab)'2, fragmente F(ab)'3, Fv, Fv proteine jednostrukog lanca ("scFv"), bisscFv, (scFv)2, minitela, diatela, triatela, tetratela, Fv proteine stabilizovane disulfidom ("dsFv") i antitelo jednog domena (sdAb, nanotelo) i delove celovitih antitela odgovorne za vezivanje antigena. Termin takođe uključuje genetski inženjerisane oblike poput himernih antitela (na primer, humanizovana mišija antitela), heterokonjugovana antitela (poput biospecifi čnih antitela) i njihove vezne fragmente antigena. Videti takođe Pierce Catalog i Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3. izd., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.

Takođe se podrazumeva da naučnici razumeju da se kompletno antitelo sastoji od dva te ška lanca i dva laka lanca. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilne regije i prve, druge i treće konstantne regije, dok se svaki laki lanac sastoji od varijabilne i konstantne regije. Te ški lanci kod sisara klasifikovani su kao # , $ , % , & i , , a laki lanci kod sisara klasifikovani su kao ili ( .

Imunoglobilini koji uključuju # , $ , % , & i , , teški lanci su klasifikovani kao imunoglobulin (Ig)A, IgD, IgE, IgG i IgM. Oblik kompletnog antitela je "Y". Osnova "Y" sastoji se od druge i treće konstantne regije (a kod IgE i IgM od četvrte konstantne regije) i dva teška lanca vezana zajedno, kao a disulfidne veze (među lancima) se formiraju na zglobu. Konstantna regija te ških lanaca & , # i $ sastoji se od tri tandema lg domena (u liniji) i zglobne regije zbog dodatne fleksibilnosti; te ški lanci , i % poseduju konstantnu regiju koja uključuje četiri domena imunoglobulina. Druga i treća konstantna regija nazivaju se "domen CH2" i "domen CH3". Svaki krak "Y" uključuje varijabilnu regiju i prvu konstantnu regiju jednostrukog teškog lanca vezanog za varijabilne i konstantne regije jednostrukog lakog lanca. Varijabilne regije lakih i teških lanaca odgovorne su za vezivanje antigena.

Varijabilne regije lakih i teških lanaca sadrže regiju "okvira" koja je prekinuta sa tri hipervarijabilne regije koje se takođe nazivaju "komplementarno-definišuće regije" ili "CDR-ovi". CDR-ovi mogu da se definišu ili identifikuju konvencionalnim metodima, poput sekvence prema Kabat et al (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (vidi Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991), ili putem strukture prema Chothia et al (Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol, 196(4): 901-917 (1987), Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).

Sekvence regija okvira različitih lakih i teških lanaca su relativno očuvane unutar vrsta, poput ljudi. Regija okvira antitela, odnosno kombinovane regije okvira pripadaju ćih lakih i teških lanaca, služi za pozicioniranje i poravnavanje CDR-ova u trodimenzionalnom prostoru. CDR-ovi su primarno odgovorni za vezivanje epitopa antigena. CDR-ovi svakog lanca obično se nazivaju CDR1, CDR2 i CDR3, a brojevima su obeleženi uzastopno počevši od N-terminusa i takođe se obično definišu lancem u kom je određeni CDR lociran. Tako se CDR-ovi smešteni u verijabilnom domenu teškog lanca antitela označavaju kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3, dok se CDR-ovi smešteni u varijabilnom domenu lakog lanca antitela označavaju kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Antitela sa različitim specifičnostima (tj. različitim lokacijama za kombinovanje za različite antigene) imaju drugačije CDR-ove. Iako CDR-ovi variraju od antitela do antitela, samo je ograničen broj položaja amino kiselina unutar njih direktno uključen u vezivanje antigena. Ovi položaji unutar CDR-ova nazivaju se rezidue za ocenjivanje specifičnosti (SOR).

Reference na "Vh" ili "VH" odnose se na varijabilne regije te škog lanca imunoglobulina, uključujući i onaj kod antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab ili drugog fragmenta antitela kao što je ovde objašnjeno. Reference na "Vl" ili "VL" odnose se na varijabilne regije lakog lanca imunoglobulina, uključujući i onaj kod antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab ili drugog fragmenta antitela kao što je ovde objašnjeno.

"Monoklonsko antitelo" je antitelo koje proizvodi jednostruki klon B limfocita ili ćelija u koju su transfektovani geni lakih i teških lanaca jednog antitela. Monoklonska antitela proizvode se metodima poznatim stručnjacima, na primer stvaranjem hibridnih ćelija koje formiraju antitela iz fuzije ćelija mijeloma sa imunim ćelijama slezine. Monoklonska antitela uključuju humanizovana monoklonska antitela.

"Himerno antitelo" poseduje rezidue okvira od jedne vrste, poput ljudi, i CDR-ove (koji generalno daju antitela) od druge, kao što je miš. U određenim preferiranim primerima, prethodno razmatran CAR sadrži vezni domen specifičan za antigen koji je himerno antitelo ili njegov fragment koji veže antigen.

U određenim preferiranim primerima antitelo je humanizovano antitelo (poput humanizovanog monoklonskog tela) koje se specifično veže na površinski protein ćelije tumora. "Humanizovano" antitelo je imunoglobulin sa humanom regijom okvira i jednim ili vi še CDR-ova neljudskog (npr. mišijeg, pacovskog ili sintetičkog) imunoglobulina. Neljudski imunoglobulin koji daje CDR-ove naziva se "donorom", a humani imunoglobulin koji daje okvir naziva se "akceptorom". U jednom primeru svi CDR-ovi potiču od donorskog imunoglobulina u humanizovanom imunoglobulinu. Konstantne regije ne moraju da budu prisutne, ali ako jesu, moraju biti suštinski identične konstantnim regijama humanog imunoglobulina, tj. u najmanje oko 85-90%, poput identičnosti od 95% ili više. Stoga, svi delovi humanizovanog imunoglobulina, osim moguće CDR-ova, suštinski su jednaki odgovarajućim delovima sekvenci prirodnog ljudskog imunoglobulina. Humanizovana ili monoklonska antitela mogu da imaju dodatne konzervativne zamene za amino kiseline, koje suštinski nemaju efekta na vezivanje antigena ili druge funkcije imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu se konstruisati uz pomo ć sredstava genetskog inženjeringa (videti npr. patent S.A.D. br. 5,585,089).

U specifičnom primeru vanćelijski vezni domen CAR-a uključuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, uključujući ali ne i ograničavajući se na Camel Ig (antitelo kamelida (VHH)), Ig NAR, Fab fragmente, Fab' fragmente, F(ab)'2 fragmente, F(ab)'3 fragmente, Fv, Fv antitela jednostrukog lanca ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minitela, diatela, triatela, tetratela, Fv protein stabilizovan disulfidom ("dsFv") i antitelo jednog domena (sdAb, nanotelo).

Ovde korišćeni "kamel lg" ili "kamelidski VHH" odnosi se na najmanju poznatu jedinicu za vezivanje antigena antitela teškog lanca (Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "Antitelo teškog lanca" ili "antitelo kamelida" odnosi se na antitelo koje sadrži dva VH domena i nijedan laki lanac (Riechmann L. etal, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); WO94/04678; W094/25591; patent S.A.D br. 6,005,079).

"IgNAR" "novog antigen receptora za imunoglobulin" odnosi se na klasu antitela iz imunog repertoara ajkule koja se sastoji iz homodimera jednog varijabilnog domena novog antigen receptora (VNAR) i pet konstantnih domena novog antigen receptora (CNAR). IgNAR-ovi predstavljaju neke od najmanjih poznatih proteina na bazi imunoglobulina u obliku skele, te su veoma stabilni i poseduju efikasne karakteristike vezivanja. Inherentna stabilnost može da se pripiše (i) temeljnoj lg skeli, koja predstavlja značajan broj nabijenih i hidrofilnih površinskih ostataka u poređenju sa konvencionalnim VH i VL domenima antitela koji se mogu naći u antitelima miša; i (ii) stabilišućim strukturalnim karakteristikama u petljama područja koja određuju komplementarnost (CDR) uključujući inter-loop disulfidne mostove i obrasce intra-loop vodonikove veze.

Varenje papina antitela proizvodi dva identična fragmenta koji vežu antigen, a koji se nazivaju "Fab" fragmentima, od kojih svaki poseduje jednu lokaciju za vezivanje antigena i rezidualni "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost za spremno kristalizovanje. Lečenje pepsinom daje F(ab')2 fragment sa dva mesta za kombinovanje antigena, koji je jo š uvek je sposoban za unakrsno povezivanje antigena.

"Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletnu lokaciju za vezivanje antigena. U jednom primeru, Fv vrsta sa dva lanca sastoji se od dimera promenljivog domena jednog te škog i jednog lakog lancem u tesnoj, nekovalentnoj vezi. Kod Fv (scFv) vrsta sa jednostrukim lancem, jedan promenljivi domen teškog i jedan promeljivi domen lakog lanca mogu biti kovalentno povezani pomo ću fleksibilnog peptidnog linkera tako da se laki i teški lanci mogu povezati u "dimeričku" strukturu analognu onoj kod Fv vrsta sa dva lanca. U toj konfiguraciji tri hipervarijabilne regije (HVR-a) svakog promenljivog domena dolaze u interakciju kako bi definisale lokaciju za vezivanje antigena na povr šini VH-Vl dimera. Šest HVR-ova zajedno dele specifičnost za vezivanje antigena za antitelo. Međutim, čak i jedan promeljivi domen (ili polovina Fv-ova koji obuhvataju samo tri HVR-a specifi čna za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako u manjoj meri od čitave lokacije za vezivanje.

Fab fragment sadrži promenljive domene sa teškim i lakim lancima, kao i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CHI) teškog lanca. Fab' fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata po dodatku nekolicine rezidua na karboksi terminusu teškog lanca CHI domena koji uključuje jedan ili više cisteina iz zglobne regije antitela. U ovom radu Fab'-SH je oznaka za Fab' u kom rezidua cisteina konstantnih domena poseduje slobodnu grupu tiola. F(ab')2 fragmenti antitela bili su originalno proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata povezanih uzglobljenim cisteinima. Takođe su poznata i druga uparivanja fragmenata antitela.

Izraz "diatela" odnosi se na fragmente antitela sa dve lokacije za vezivanje antitela, čiji fragmenti uključuju promenljivi domen teškog lanca (VH) povezan sa promenljivim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem linkera koji je prekratak za povezivanje između dva domena u istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementalnim domenima iz drugog lanca i stvore dve lokacije za vezivanje antigena. Diatela mogu biti bivalentna ili bispecifi čna. Diatela su pobliže opisana u, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003).

"Antitelo jednog domen" ili "sdAb" ili "nanotelo" odnosi se na fragment antitela koji se sastoji od promenljive regije teškog lanca antitela (VH domen) ili promenljive regije lakog lanca antitela (VL domen) (Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).

"Fv sa jednostrukim lancem" ili "scFv" fragmenti antitela uključuju VH i VL domene antitela, pri čemu su ti domeni prisutni u jednostrukom polipeptidnom lancu i bilo koje su orijentacije ( e.g., VL-VH ili VH-VL). Uopšteno, scFv polipeptid dalje uključuju polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava scFv-u da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Pregled ove teme potražite npr.

u Pluckthiin, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore ur., (Springer-Verlag, New York, 1994), str.269-315.

Kod otelotvorenja, ovde razmatran CAR uključuje specifični domen za vezivanje antigena koji je scFv i može biti mišiji, ljudski ili humanizovani scFv. Antitela jednostrukog lanca mogu da se kloniraju iz gena V regije hibridoma specifičnog za željeni cilj. Proizvodnja takvih hibridoma postala je rutinska. Tehnika koja može da se koristi za kloniranje promenljive regije teškog lanca (VH) i promenljive regije lakog lanca (VL) opisana je, na primer u Orlandi et al, PNAS, 1989; 86: 3833-3837. Kod specifičnih otelotvorenja, specifični domen za vezivanje antigena koji je scFv veže ( ili polipeptid lakog lanca. Kod određenih otelotvorenja scFv veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs ili VEGFR2 polipeptide.

Ogledni humanizovani specifični domen za vezivanje antigena je promenljiva regija imunoglobulina specifična za antigen tumora koja uključuje najmanje jednu regiju ljudskog okvira. "Regija ljudskog okvira" odnosi se na divlji tip (tj. prirodnu) regiju okvira promenljive regije ljudskog imunoglobulina, izmenjenu regiju okvira promenljive regije ljudskog imunoglobulina sa manje od oko 50% (npr. po mogućnosti manje od oko 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ili 1%) amino kiselina u regiji izbrisanih ili zamenjenih (npr. jednom ili više rezidua amino kiselina iz regije okvira neljudskog imunoglobulina na odgovarajućim pozicijama), ili regiju izmenjenog okvira premenljive regije neljudskog imunoglobulina sa manje od oko 50% (npr. manje od 45%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ili 5%) amino kiselina u regiji koje su izbrisne ili zamenjene ( npr. na pozicijama izloženih rezidua i/ili su jednom ili više rezidua amino kiselina regije okvira ljudskog imunoglobulina na odgovarajućim pozicijama) pa je u jednom aspektu imunogenost smanjena.

Kod određenih otelotvorenja regija ljudskog okvira je regija okvira divljeg tipa promenljive regije ljudskog imunoglobina. Kod drugih određenih otelotvorenja regija ljudskog okvira je izmenjena regija okvira promenljive regije ljudskog imunoglobina, sa brisanjima ili zamenom amino kiselina na jednoj, dve, tri, četiri ili pet pozicija. Kod drugih otelotvorenja, regija ljudskog okvira je izmenjena regija okvira promenljive regije neljudskog imunoglobina sa brisanjima ili zamenom amino kiselina na jednoj, dve, tri, četiri ili pet pozicija.

U specifičnim otelotvorenjima vezni domen specifičan za antigen uključuje najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam regija ljudskog okvira (FR) izabranu iz ljudskog lakog lanca FR1, ljudskog teškog lanca FR1, ljudskog lakog lanca FR2, ljudskog teškog lanca FR2, ljudskog lakog lanca FR3, ljudskog teškog lanca FR3, ljudskog lakog lanca FR4 i ljudskog teškog lanca FR4.

Ljudski FR-ovi koji mogu da budu prisutni kod veznih domena specifičnih za antigen takođe uključuju varijante oglednih FR-ova predstavljenih u ovom radu, pri čemu su jedna ili dve amino kiseline oglednih FR-ova zamenjene ili izbrisane.

U određenim otelotvorenjima humanizovani vezni domen specifičan za antigen uključuje (a) humanizovanu promenljivu regiju lakog lanca koja obuhvata ljudski laki lanac FR1, ljudski laki lanac FR2, ljudski laki lanac FR3 i ljudski laki lanac FR4, i (b) humanizovanu promenljivu regiju te škog lanca koja obuhvata ljudski teški lanac FR1, ljudski teški lanac FR2, ljudski teški lanac FR3 i ljudski teški lanac FR4.

Ovde pomenuti vezni domeni specifični za antigen takođe uključuju jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-ova. Ti CDR-ovi mogu da budu neljudski CDR-ovi ili izmenjeni neljudski CDR-ovi izabrani između CDRL1, CDRL2 i CDRL3 iz lakog lanca i CDRH1, CDRH2 i CDRH3 iz teškog lanca. U određenim otelotvorenjima vezni domen specifičan za antigen uključuje (a) promenljivu regiju lakog lanca koja sadrži laki lanac CDRL1, laki lanac CDRL2 i laki lanac CDRL3, i (b) promenljivu regiju te škog lanca koja sadrži teški lanac CDRH1, teški lanac CDRH2 i teški lanac CDRH3.

2. Linkeri

U određenim otelotvorenjima ovede pominjani CAR-ovi mogu da uključuju rezidue linkera između različitih domena, npr. između domena VHi VL, koji su dodani zbog prikladnog razmeštanja i ustrojstva molekula. Ovde pominjani CAR-ovi mogu da sadrže jedan, dva, tri, četiri, pet ili više linkera. U specifičnim otelotvorenjima dužina linkera je oko 1 do oko 25 amino kiselina, oko 5 do oko 20 amino kiselina ili oko 10 do oko 20 amino kiselina ili bilo koje interventne dužine amino kiselina. U nekim otelotvorenjima linker je dug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više amino kiselina.

Ilustrativni primeri linkera uključuju polimere glicina (G)n; polimere glicin-serin (G1-5S1-5)n, pri čemu je n ceo broj jedan, dva, tri, četiri ili pet; polimere glicin-alanin; polimere alanin-serin i druge poznate fleksibilne linkere. Polimeri glicina i glicin-serina su relativno nestrukturisani i zato mogu da poslu že kao neutralan lanac između domena fuzije proteina poput ovde opisanih CAR-ova. Glicin pristupa značajno većoj količini phi-psi prostora čak i od alanina, te je mnogo manje ograničen od rezidua sa dužim postraničnim lancima (videti Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Obično obrazovan naučnik prepoznaće da dizajna CAR-a u pojedinim slučajevima može da uključuje linkere koji su u celosti ili delimično fleksibilni, tako da linker može da uključuje flekisbilni linker, kao i jedan ili više delova manje fleksibilne strukture kako bi se obezbedila željena strukture CAR-a.

Ostali ogledni linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće sekvence amino kiselina: GGG; DGGGS (BR. ID. SEKV.: 4); TGEKP (BR. ID. SEKV.: 5) (videti npr. Liu et al, PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (BR. ID. SEKV.: 6) (Pomerantz et al. 1995, iznad); (GGGGS)ngde je = 1, 2, 3, 4 ili 5 (BR. ID. SEKV.: 7) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (BR. ID. SEKV.:8) (Chaudhary et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. S.A.D. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (BR. ID. SEKV.:9) (Bird et al, 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (BR. ID. SEKV.: 10); LRQRDGERP (BR. ID. SEKV.:l 1); LRQKDGGGSERP (BR. ID. SEKV.: 12); LRQKd(GGGS)2 ERP (BR. ID. SEKV.: 13). Alternativno, fleksibilni likeri mogu racionalno da se dizajniraju uz pomoć računarskog programa koji je sposoban za modeliranje veznih lokacija DNK i samih peptida (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) ili metodima za prikazivanje faga.

U specifičnim otelotvorenjima CAR uključuje scFV koji dalje uključuje veznu sekvencu promenljive regije. "Vezna sekvenca promenljive regije" je sekvenca amino kiseline koja povezuje promenljivu regiju teškog lanca sa promenljivom regijom lakog lanca i obezbeđuje funkciju odstojnika kompatibilnog sa interakcijom dva pod-vezna domena tako da polipetid koji nastaje kao rezultat zadržava specifičnu sklonost vezivanja nekih ciljnih molekula kao što je antitelo koje uključuje iste promenljive regije lakog i teškog lanca. U jednom otelotvorenju sekvenca povezivanja promenljive regije duga je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više amino kiselina. U specifičnom otelotvorenju sekvenca povezivanja promenljive regije uključuje polimer a glicin-serin (G1-5S1-5)n, gde je n ceo broj i iznosi 1, 2, 3, 4 ili 5. U drugom otelotvorenju sekvenca povezivanja promenljive regije uključuje (G4S)3linker amino kiseline.

3. Domen odstojnika

U specifičnim otelotvorenjima iza veznog domena CAR-a sledi jedan ili vi še "domena odstojnika" koji predstavljaju regije koje odmiču domen vezivanja antigena od površine ćelije efektora kako bi omogućili pravilan kontakt ćelije sa ćelijom, te vezvanje i aktivaciju antigena (Patel et al, Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). Zglobni domen može biti izveden iz prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantnog izvora. U određenim otelotvorenjima domen odstojnika je deo imunoglobulina, koji uključuje ali nije ograničen na jednu ili više konstantnih regija teškog lanca, npr. CH2 i CH3. Domen odstojnika može da obuhvati sekvencu amino kiseline zglobne regije prirodnog imunoglobulina ili zglobne regije izmenjenog imunoglobulina.

U jednom otelotvorenju domen odstojnika uključuje CH2 i CH3 iz IgGi.

4. Zglobni domen

Iza veznog domena CAR-a obično sledi jedan ili više "zglobnih domena" koji igraju ulogu u odmicanju domena za vezivanje antigena od povr šine ćelije efektora kako bi se obezbedio pravilan kontakt ćelije sa ćelijom, te vezivanje i aktivacija antigena. CAR uop šteno uključuje jedan ili više zglobnih domena između veznog i transmembranskog domena (TM). Zglobni domen može biti izveden iz prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantnog izvora. Zglobni domen može da uključi sekvencu amino kiseline zglobne regije prirodnog imunoglobulina ili zglobne regije izmenjenog imunoglobulina.

"Izmenjena zglobna regija" odnosi se na (a) prirodnu zglobnu regiju sa do 30% promena amino kiselina (npr. do 25%, 20%, 15%, 10% ili 5% zamena ili brisanja amino kiselina), (b) deo prirodne zglobne regije koja je duga najmanje 10 amino kiselina (npr. najmanje 12, 13, 14 ili 15 amino kiselina) sa do 30% promena amino kiselina (npr. do 25%, 20%, 15%, 10% ili 5% zamena ili brisanja amino kiselina) ili (c) deo prirodne zglobne regije koja obuhvata zglobnu regiju jezgra (koja može biti duga 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15, ili najmanje 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 amino kiselina). U određenim primerima jedna ili više rezidua cisteina u zglobnoj regiji prirodnog imunoglobulina može biti zamenjena jednom ili većim brojem rezidua drugih amino kiselina (npr. jednom ili većim brojem rezidua serina). Zglobna regija izmenjenog imunoglobulina može alternativno ili dodatno da sadrži reziduu prolina iz zglobne regije imunoglobulina divljeg tipa, zamenjenu reziduom druge amino kiseline (npr. reziduom serina).

Drugi ilustrativni zglobni domeni prikladni za upotrebu u ovde opisanim CAR-ovima uklju čuju zglobne regije izvedene iz vanćelijskih regija proteina membrane tipa 1 poput CD8# , CD4, CD28 i CD7, koje mogu biti zglobne regije divljeg tipa iz tih molekula ili mogu biti izmenjene. U otelotvorenjima zglobni domen uključuje zglobnu regiju CD8# .

5. Transmembranski domen (TM)

"Transmembranski domen" je deo CAR-a koji spaja vanćelijski vezivni deo i unutarćelijski signalni domen i učvršćuje CAR u plazmu membrane ćelije imunog efektora. TM domen može biti izveden iz prirodnih, sintetičkih, polusintetičkih ili kombinovanih izvora. TM domen može biti izveden iz (tj. uključivati najmanje transmembranske regije) alfa, beta ili zeta lanca receptora T- ćelije, CD3 epsilon, CD3 zeta, CD4, CD5, CD9, CD 16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, PD-1 i CD 154. U posebnom primeru TM domen je sintetički i predominantno uključuje hidrofobne rezidue poput leucina i valina.

U otelotvorenjima ovde razmatrani CAR-ovi sadrže TM domen izveden iz CD8# . U drugom otelotvorenju ovde razmatran CAR uključuje TM domen izveden iz CD8# i kratki oligo- ili polipetidni linker, poželjne dužine između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kiselina koji povezuje TM domen i unutarćelijski signalni domen CAR-a. Glicin-erin linker pokazao se posebno prikladnim.

6. Unutarćelijski signalni domen

U određenim primerima ovde razmatrani CAR-ovi uključuju unutarćelijski signalni domen. "Unutarćelijski signalni domen" odnosi se na deo CAR-a koji učestvuje u pretvaranju poruke efektivnog vezivanja CAR-a na ciljni antigen u unutrašnjost ćelije imunog efektora u cilju podsticanja njenog funkcionisanja, npr. aktivacije, proizvodnje citokina, razmnožavanja i citotoksične aktivnosti, uključujući i oslobađanje citotoksičnih faktora u ciljnu ćeliju vezanu za CAR, ili drugog ćelijskog odgovora podstaknutog vezivanjem antigena za vanćelijski domen CAR -a.

Termin "funkcija efektora" odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije. Funkcija efektora T ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoć ili aktivnost koja uključuje sekreciju citokina. Tako se termin "unutarćelijski signalni domen" odnosi na deo proteina koji pretvara signal funkcije efektora i usmerava ćeliju da izvodi specijalizovanu funkciju. Dok obično može da se koristi ceo unutarćelijski signalni domen, u mnogim slučajevima to nije neophodno. U obimu u kom se koristi, okrnjen unutarćelijski signalni domen može da zameni čitav domen sve dok transdukuje signal funkcije efektora. Termin "unutarćelijski signalni domen" podrazumevano uključuje sve krnje delove unutarćelijskog signalnog domena koji su dovoljni za transdukovanje signala funkcije efektora.

Poznato je da signali generisani od strane samog TCR-a nisu dovoljni za punu aktivaciju T ćelije, te da se za to zahteva sekundarni ili ko-stimulativni signal. Tako se mo že reći da kod aktivacije T ćelije posreduju dve različite klase unutarćelijskih signalnih domena: primarni signalni domeni koji iniciraju primarnu aktivaciju koja zavisi od antigena putem TCR-a ( npr. TCR/CD3 kompleks) i kostimulativni signalni domeni koji deluju nezavisno od antigena i obezbeđuju sekundarni ili kostimulativni signal. U prioritetnim primerima ovde razmatran CAR uključuje unutarćelijski signalni domen koji obuhvata jedan ili više "ko-stimulativnih signalnih domena" i "primarni signalni domen".

Primarni signalni domeni regulišu primarnu aktivaciju TCR kompleksa na stimulativan ili na inhibirajući način. Primarni signalni domeni koji se ponašaju na stimulativan način mogu da sadrže signalne motive poznate kao aktivacioni motivi imunoreceptora na bazi tirozina ili ITAM-ovi.

Ilustrativni primeri IT AM-a koji sadrže primarne signalne domene sa posebnom upotrebom uključuju

Ovde razmatrani CAR-ovi uključuju jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena u cilju podsticanja efikasnosti i širenja T ćelija koje iskazuju ekspresiju CAR receptora. Ovde korišćen termin "ko-stimulativni signalni domen" ili "ko-stimulativni domen" odnosi sa na unutarćelijski signalni domen ko-stimulativnog molekula. Ko-stimulativni molekuli su molekuli sa površine ćelije koji nisu receptori antigena ili Fc receptori koji obezbeđuju drugi signal koji je potreban za efikasnu aktivaciju i funkcionisanje T limfocita nakon vezivanja na antigen. Ilustrativni primeri takvih ko-stimulativnih molekula obuhvataju CD27, CD28, 4-IBB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT i NKD2C i CD83. U jednom primeru CAR uključuje jedan ili više kostimulativnih signalnih domena koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od CD28, CD137 i CD 134, i

g

U određenim primerima ovde razmatrani CAR-ovi uključuju fragment koji veže antigen ili antitelo koji se specifično veže na receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid koji iskazuje ekspresiju na ćeliju tumora.

U jednom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-

A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-

13R# 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8# ; CD4, CD45, PD1 i CD 152; i jedan ili više unutarćelijskih ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD54, CD134, CD137, CD152, CD273, CD274 i CD278; i primarnog signalnog domena.

U drugom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R# 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen izabran iz grupe koja se sastoji od: IgGl zgloba/CH2/CH3 i CD8# , i CD8 # ; transmembranskog domena izvedenog iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8# ; CD4, CD45, PD1 i CD 152; i jedan ili vi še unutarćelijskih ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD 134 i primarnog signalnog domena.

U još jednom primeru CAR uključuje scFv, koji dalje uključuje linker, koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD 138, CD 171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen izabran iz grupe koja se sastoji od: IgGl zgloba/CH2/CH3 i CD8# , i CD8 # ; transmembranski domen uključuje TM domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8# ; CD4, CD45, PD1 i CD 152, i kratkog oligo- ili polipeptidnog linkera, po mogućnosti dugog između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kisleina koji povezuje TM domen sa unutarćelijskim signalnim domenom CAR-a; i jedan ili više unutarćelijskih ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD 134 i CD 137; i primarni signalni domen.

U posebnom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A 1+NY-ESO-l, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R# 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koji uključuje PD1 ili CD 152 zglobni polipeptid; PD1 ili CD 152 transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 amino kiseline; CD 137 unutarćelijski ko-stimulativni signalni domen; i primarni signalni domen.

U specifičnom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A 1+NY-ESO-l, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koji uključuje PD1 ili CD 152 zglobni polipeptid; PD1 ili CD 152 transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 amino kiseline; CD 134 unutarćelijski ko-stimulativni signalni domen; i primarni signalni domen.

U specifičnom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R# 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koju uključuje PD 1 ili CD 152 zglobni polipeptid; PD1 ili CD 152 transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 amino kiseline; CD28 unutarćelijski ko-stimulativni signalni domen; i primarni signalni domen.

U specifičnom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koji uključuje IgGl zglob/CH2/CH3 polipeptid i CD8# polipeptid; CD8 # transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 amino kiseline; CD 137 unutarćelijski ko-stimulativni signalni domen; i primarni signalni domen.

U specifičnom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetali AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A 1+NY-ESO-l, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koji uključuje CD8# polipeptid; CD8 # transmembranski domen koji uključuje polipeptini linker od oko 3 amino kiseline; CD 134 unutarćelijski ko-stimulativni signalni domen; i primarni signalni domen.

U specifičnom primeru CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A 1+NY-ESO-l, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koji uključuje CD8# polipeptid; CD8 # transmembranski domen koji uključuje polipetidni linker od oko 3 amino kiseline; CD28 unutarćelijski ko-stimulativni signalni domen; i primarni signalni domen.

Štaviše, dizajn ovde razmatranih vektora omogućava poboljšano širenje, dugoročnu izdržljivost i citotoksična svojstva T ćelija i istrajno iskazivanje ekspresije CAR-ova kroz život ćelija u poređenju sa nemodifikovanim T ćelijama ili T ćelijama modifikovanim drugim vektorima.

D. Polipeptidi

Ova rad delimično govori o CAR polipeptidima i njihovim fragmentima, ćelijama i sastavima koji ih čine, kao i vektorima koji poseduju iskazivanje ekspersije polipeptida. U preferiranim primerima polipeptid uključuje jedan ili više CAR-ova šifrovanih sekvencom polinukleotida kao što je prikazano u odeljku sa BR. ID SEKV: 2 i 3.

Termini "polipeptid," "fragment polipeptida," "peptid" i "protein" koriste se zamenski, osim ako nije naznačeno drugačije, te prema konvencionalnom značenju, tj. kao sekvence amino kiselina. Polipeptidi nisu ograničeni određenom dužinom, npr. mogu da uključuju celu sekvencu proteina ili njezin fragment, te post-tranzicione modifikacije polipeptida, npr. glikosilacije, acetilacije, fosforilacije i sl., kao i druge modifikacije poznate nauci, kako prirodne tako i neprirodne. U razli čitim primerima ovde razmatrani CAR polipeptidi uključuju signalnu ili (vodeću) sekvencu na kraju N-terminala proteina, koja ko-translatorno ili post-translatorno usmerava transfer proteina. Ilustrativni primeri prikladnih signalnih sekvenci (signalnih peptida) korisni u obja šnjavanju ovde razmatranih CAR-ova uključuju, ali nisu ograničeni na lgGI signalne polipeptide teškog lanca, CD8# signalne polipeptide ili humani GM-CSF signalni receptor alfa signalnog peptida. Polipeptidi mogu biti pripremljeni uz pomo ć mnoštva dobro poznatih kombinovanih ili sintetičkih tehnika. Ovde razmatrani polipeptidi posebno obuhvataju objašnjene CAR-ove ili sekvence koje sadrže brisanja, dodatke i/ili zamene jedne ili većeg broja amino kiselina CAR-a.

Ovde korišćeni termini "izolovani peptid" ili "izolovani polipeptid" i sl., odnose se na in vitro izolaciju i/ili purifikaciju molekula peptida ili polipeptida iz ćelijskog okruženja i prekidanje veza sa drugim komponentama ćelije, tj. oni nisu značajno povezani sa in vivo supstancama. Slično tome, termin "izolovana ćelija" odnosi se na ćeliju dobijenu iz in vivo tkiva ili organa koja je suštinski oslobođena od vanćelijskog matriksa.

Polipeptidi uključuju "varijante polipeptida". Varijante polipeptida mogu da se razlikuju od prirodnog polipeptida u jednoj ili više zamena, brisanja, dodataka i/ili umetaka. Takve varijante mogu da se javljaju prirodno ili mogu biti stvorene sintetički, na primer modifikovanjem jedne ili više prethodno spomenutih sekvenci polipeptida. Na primer, u pojedinim primerima, mo že biti poželjno poboljšati vezivnu sklonost i/ili druga biološka svojstva CAR-ova uvođenjem jedne ili više zamena, brisanja, dodataka i/ili umetaka u vezni domen, zglob, TM domen, ko-stimulativni signalni domen ili primarni signalni domen polipeptida CAR-a. Prioritetno, pomenuti polipeptidi uklju čuju polipeptide koji imaju identitet amino kiseline najmanje oko 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99%.

Polipeptidi uključuju "frgmente polipeptida". Fragmenti polipeptida odnose se na polipeptid koji može biti monomerni ili multimerni, koji poseduje brisanje amino-terminala, brisanje karboksilterminala i/ili namerno brisanje ili zamenu prirodnog polipeptida ili polipeptida proizvedenog kombinovanjem. U određenim primerima fragment polipeptida može da uključuje lanac amino kiseline koji je dugačak od najmanje 5 do oko 500 amino kiselina. Biće razumljivo da su u određenim primerima fragmenti dugi najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ili 450 amino kiselina. Posebno korisni fragmenti polipeptida obuhvataju funkcionalne domene, uklju čujući domene za vezivanje antigena ili fragmenata antitela. U slučaju anti-kappa ili anti-lambda antitela lakog lanca korisni fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na: CDR regiju, CDR3 regiju, regiju teškog ili lakog lanca, promenljivu regiju teškog ili lakog lanca, deo lanca antitela ili promenljive regije uključujući dva CDR-a i slično.

Polipeptid takođe može biti spojen unutar okvira ili sjedinjen sa linkerom ili drugom sekvencom radi olakšanja sinteze, čišćenja ili identifikacije polipeptida (npr. poli-His) ili u cilju pojačavanja vezivanja polipeptida za čvrstu podršku.

Kako je prethodno rečeno, ovde razmatrani polipeptidi mogu biti izmenjeni na razne na čine uključujući zamenu, brisanja, skraćivanje i umetanje amino kiselina. Metodi takvih manipulacija op šte su poznati u nauci. Na primer, varijante sekvenci amino kiseline referentnog peptida mogu da se pripreme mutacijom DNK. Metodi mutageneze i izmena sekvence nukleotida dobro su poznati u nauci. Vidi na primer, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. S.A.D. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), pat. S.A.D. br. 4,873,192, Watson, J. D. et al, (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif, 1987) i reference citirane u tom radu. Smernice za prikladnu zamenu amino kiselina koja ne utiče na biološku aktivnost proteina od interesa mogu da se pronađu u modelu autora Dayhoff et al, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

U nekim primerima varijanta će sadržati konzervativne zamene. "Konzervativna zamena" je ona u kojoj je amino kiselina zamenjena drugom sa sličnim svojstvima, tako da će stručnjak za oblast peptidne hemije očekivati suštinsko zadržavanje svojstava sekundarne strukture i hidropatske prirode polipeptida. U strukturi polinukleotida i polipeptida predstavljenih u radu mogu biti napravljene modifikacije, koje će i dalje zadržati funkcionalni molekul koji kodira varijantu ili derivat polipeptida sa poželjnim karakteristikama. Kada je promena sekvence amino kiseline polipepetida po željna u cilju kreiranja ekvivalentne ili čak poboljšanje varijante polipeptida, stručnjak npr. može da izmeni jedan ili više kodona šifrovane sekvence DNK, npr. kao što je opisano u Tabeli 1.

TABELA 1 - Kodoni amino kiselina

Uputstvo za određivanje koje rezidue amino kiselina mogu da budu zamenjene, umetnute ili izbrisane bez poništavanja biološke aktivnosti može da se pronađe uz pomoć stručnjacima poznatih računarskih programa poput softvera DNASTAR™. Poželjno je da ovde opisane promene amino kiselina u varijantama proteina budu konzervativne promene amino kiselina, tj. zamene slično izmenjenim ili neizmenjenim amino kiselinama. Konzervativna zamena amino kiseline uklju čuje zamenu jedne iz familije amino kiselina sa srodnim postraničnim lancima.

Prirodne amino kiseline se uopšteno dele na četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazične (lizin, arginin, histidin), ne-polarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i neizmenjene polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin). Fenilalanin, triptofan i tirozin se ponekad klasifikuju zajedno kao aromati čne amino kiseline. Odgovarajuće konzervativne zamene amino kiselina kod peptida ili proteina poznate su nau čnicima i mogu da se izvrše bez izmene biološke aktivnosti molekula. Naučnici prepoznaju da zamene jednostrukih amino kiselina u sporednim regijama polipeptida uop šteno suštinski ne menjaju biološku aktivnost (videti npr. Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4. izdanje, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., str.224). Primeri konzervativnih zamena opisani su u Privremenoj primeni patenata S.A.D. br.61/241,647.

Kod takvih promena u obzir treba uzeti hidropatski indeks amino kiselina. Va žnost hidropatskog indeksa amino kiseline u dodeljivanju interaktivne biolo ške funkcije na proteinu opšte je poznata u nauci (Kyte and Doolittle, 1982). Svakoj amino kiselini dodeljen je hidropatski indeks na osnovu njenih hidropatskih karakteristika i karakteristika naboja (Kyte and Doolittle, 1982). Te vrednosti su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistein (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9) i arginin (-4.5).

U nauci je poznato da određene amino kiseline mogu da budu zamenjene drugim amino kiselinama sa sličnim hidropatskim indeksom ili rezultatom, a da i dalje daju protein slične biološke aktivnosti, tj. i dalje daju protein ekvivalentne biološke funkcionalnosti. Pri pravljenju ovakvih promena, preferira se zamena amino kiselina čiji hidropatski indeksi spadaju u raspon od ±2, posebno se preferira zamena onih čiji hidropatski indeksi spadaju u raspon ±1, a najviše se preferira zamena onih sa rasponom od ±0,5. U nauci je takođe poznato da zamena sličnih amino kiselina može efikasno da se uradi na osnovu hidrofiličnosti.

Kao što je detaljno navedeno u patentu S.A.D. br. 4,554,101, sledeće hidrofilične vrednosti pripisane su reziduama amino kiselina: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ±1); glutamat (+3.0 ± 1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucine (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5); triptofan (-3.4). Razume se da amino kiselina može biti zamenjena drugom sa sličnom hidrofilnom vrednošću i da i dalje zadrži biološki ekvivalent, a posebno, imunološki ekvivalentan protein. Kod takvih promena preferira se zamena amino kiselina čiji hidrofilne vrednosti spadaju u raspon od ±2, posebno se preferira zamena onih čije hidrofilne vrednosti spadaju u raspon od ±1, a najviše se preferira zamena onih sa rasponom od ±0,5.

Kao što je prethodno istaknuto, zamene amino kiselina mogu da budu zasnovane na osnovu relativne sličnosti postraničnih lanaca zamenskih amino kiselina, na primer, hidrofobičnosti, hidrofilnosti, naboju, veličini i slično.

Varijante polipeptida dalje uključuju glikosilatne forme, agregativne konjugate sa drugim molekulima i kovalentne konjugate sa nepovezanim hemijskim delovima ( npr. pegiliranih molekula). Kovalentne varijante mogu biti pripremljene povezivanjem funkcionalnosti u grupe koje se nalaze u lancu amino kiselina ili na rezidualnom N- ili C-terminalu, što je poznato u nauci. Varijante takođe uključuju alelske varijante, varijante unutar vrste i muteine. U varijante tako đe spadaju i skraćenja ili brisanja regija koje ne utiču na funkcionalnu aktivnost proteina.

U jednom primeru gde je poželjno iskazivanje ekspresije jednog ili više polipeptida, polinukleotidna sekvenca koja ih kodira može da se odvoji od IRES sekvence kao što se razmatra druge u ovom radu. U drugom primeru, dva ili više peptida mogu posedovati iskazivanje ekspresije u obliku fuzijskog proteina koji uključuje jednu ili više samo-odcepljujućih polipeptidnih sekvenci.

Polipeptidi prisutni u ovom radu uključuju fuzijske polipeptide. U preferiranim primerima prikazani su fuzijski polipeptidi i polinukleotidi koji kodiraju fuzijske polipeptide, npr. CAR-ovi. Fuzijski polipeptidi i fuzijski proteini odnose se na polipeptide koji imaju najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset ili više polipeptidnih segmenata. Fuzijski polipeptidi su obično povezani vezom C-terminus - N-terminus, iako takođe mogu biti povezani vezom C-terminus - C-terminus, N-terminus - N-terminus ili N-terminus - C-terminus. Polipeptidi fuzijskih proteina mogu imati bilo koji ili specifičan redosled. Fuzijski polipeptidi ili fuzijski proteini takođe mogu da uključuju konzervativno modifikovane varijante, polimorfne varijante, alele, mutante, subsekvence, me đuvrsne homologne rekombinacije, sve dok je očuvana željena transkripciona aktivnost fuzijskog polipeptida. Fuzijski polipeptidi mogu biti proizvedeni hemijskim sintetičkim metodima ili hemijskim povezivanjem između dva dela ili mogu uopšteno biti pripremljeni pomoću standardnih tehnika.

Ligatirane DNK sekvence koje uključuju fuzijski polipeptid operativno su povezane sa prikladnim transkripcionim ili kontrolnim elementima kao što je objašnjeno drugde u ovom radu.

U jednom primeru fuzijski partner uključuje sekvencu koja pomaže u izražavanju ekspresije proteina (pojačivač izražavanja ekspresije) sa većim prinosima od nativnog rekombinantnog proteina. Ostali fuzijski partneri mogu biti izabrani tako da povećaju rastvorljivost proteina ili da omoguće targetiranje proteina u poželjnim unutarćelijskim odeljcima ili da olakšaju transport fuzijskog proteina kroz ćelijsku membranu.

Fuzijski polipeptidi mogu dalje uključivati signal za otcepljivanje polipetida između svakog od ovde opisanih polipeptidnih domena. Osim toga, lokacija polipeptida mo že da bude stavljena u bilo koju peptidnu sekvencu linkera. Uzorni signali za otcepljivanje polipeptida uklju čuju lokacije za prepoznavanje otcepljivanja polipeptida, lokacije za otcepljivanje jezgra ( npr. retke lokacije za ograničeno prepoznavanje enzima, lokacije za prepoznavanje samo-otcepljenja ribosoma) i samootcepljujuće viralne oligopeptide (videti deFelipe i Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).

Prikladne lokacije za otcepljivanje proteaze i samo-otcepljujućih peptida poznate su naučnicima (videti npr. u Ryan et al, 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Uzorne lokacije za otcepljivanje proteaze uključuju, ali nisu ograničenije na, lokacije za otcepljivanje proteaza NIa potivirusa ( npr. proetaze virusa duvanske jetke), proteaza HC potivirusa, proteaza virusa PI (P35), proteaza biovirusa NIa, proteaza kodiranog RNA-2 biovirusa, proteaza L aptovirusa, proteaza enterovirusa 2A, proteaza rinovirusa 2A, proteaza pikorna 3C, proteaza komovirusa 24K, proteaza nepovirusa 24K proteaza RTSV 3C (pirinčanog tungro sferičnog virusa), proteaza PYFV 3C (virusa peršinove žute fleke), heparina, trombina, faktora Xa i enterokinaze. Zbog te velike strogosti otcepljivanja, lokacije za otcepljivanje proteaza TEV (virusa duvanske jetke) preferirane su u jednom primeru, npr. EXXYXQ(G/S) (BR. ID. SEKV.: 14), na primer, ENLYFQG (BR. ID. SEKV.: 15) i ENLYFQS (BR. ID. SEKV.: 16), gde X predstavlja bilo koju amino kiselinu (otceplijvanje od strane TEV-a dešava se između Q i G ili Q i S).

U posebnim primerima, peptidi sa samo-otcepljivanjem uključuju one sekvence polipeptida dobijene iz pepetida potivirusa i kardiovirusa 2A, FMDV (virusa bolesti stopala i usta), A virusa konjskog rinitisa, virusa Thosea asigna i svinjskog teskovirusa.

U određenim primerima lokacija polipeptida sa samo-otcepljivanjem uključuje lokaciju 2A ili onu nalik 2A, sekvencu ili domen (Donnelly et al, 2001. J. Gen. Virol.82:1027-1041).

TABELA 2: Uzorne lokaci e 2A ukl uču u sledeće sekvence.

U preferiranim primerima ovde razmatrani polipeptid radi uključuje CAR polipeptid.

E. Polinukleotidi

U određenim otelotvorenjima prikazani su polinukleotidi koji uključuju MND promotor i polinukleotidno šifrovanje jednog ili više CAR-ova. U prioritetnim otelotvorenjima prikazan je polinukleotid koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidnim šifrovanjem jednog ili više CAR-ova kao što je prikazano u BR. ID. SEKV.: 2 i 3. Ovde korišćen termin "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" odnosi se na messenger RNK (mRNA), RNK, genomsku RNK (gRNA), RNK pozitivne niti (RNA(+)), RNK negativne niti (RNA(-)), genomsku DNK (gDNA), komplementarnu DNK (cDNA) ili rekombinantnu DNK. Polinukleotidi uključuju jednolančane i dvolančane polinukleotide. Poželjno, polinukleotidi iz ovog pronalaska uključuju polinukleotide ili varijante koji imaju identitet sekvence najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% u odnosu na ovde opisane referentne sekvence (videti e.g., Listu sekvenci), tipično u slučajevima gde varijanta zadržava najmanje jednu biološku aktivnost referentne sekvence. U različitim ilustrativnim primerima u ovom radu polinukleotidi uključuju vektore za iskazivanje ekspresije, viralne vektore i plazmide transfera, a sastavi i ćelije uključuju isto.

U određenim primerima polinukleotidi prikazani u ovom radu šifruju najmanje oko 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 ili 2000 ili više graničnih rezidua amino kiselina prisutnih polipeptida, kao i onih između. Spremno se podrazumeva da "dužine između" u ovom kontekstu znače bilo koju dužinu između citiranih vrednosti, kao što su 6, 7, 8, 9, itd., 101, 102, 103, itd.; 151, 152, 153, itd.; 201, 202, 203, itd.

Ovde korišćeni termini "polinukleotidna varijanta", "varijanta" i slični odnose se na polinukleotide koji pokazuju identitet suštinske sekvence uz referentnu sekvencu polinukleotida ili polinukleotide koji hibridizuju sa referentnom sekvencom u strogim uslovima definisanim u radu. Ovi termini uključuju polinukleotide u kojima je jedan ili više nukleotida dodan ili izbrisan, ili zamenjen različitim nukleotidima u poređenju sa referentnim polinukleotidom. U tom smislu u struci je jasno razumljivo da na referentnom polinukleotidu mogu biti načinjene određene alteracije koje uključuju mutacije, dodatke, brisanja ili zamene, pri čemu izmenjeni polinukleotid zadržava biološku funkciju ili aktivnost referentnog polinukleotida.

Izrazi "identitet sekvence" ili, npr. oni poput "sekvenca je 50% identična sa" odnose se na stepen u kom su u okviru komparacije sekvence identične na osnovu nukleotida-po-nukleotida ili amino kiseline-po-amino kiseline. Tako "procenat identiteta sekvence" mo že da se izračuna pomoću poređenja dvaju optimalno poravnatih sekvenci u okviru poređenja, što određuje broj položaja u kojima se identične baze nukleinske kiseline (npr. A, T, C, G, I) ili identične rezidue amino kiseline (npr. Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, He, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys i Met) pojavljuju u obe sekvence kako bi dale broj podudarnih položaja pomoću ukupnog broja položaja u okviru poređenja (tj. veličini okvira) i rezultat pomnožen brojem 100 kako bi se dobio postotak identiteta sekvence. Uključeni su nukleotidi i polipeptidi koji imaju najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa svakom od prethodno opisanih referentnih sekvenci, obično u slučaju kada peptidna varijanta zadržava najmanje jednu biološku aktivnost referentnog polipeptida.

Termini korišćeni za opisivanje odnosa sekvenci između dva ili više polinukleoptida ili polipeptida uključuju "referentnu sekvencu", "okvir poređenja", "identitet sekvence", "procenat identiteta sekvence" i "suštinski identitet". "Referentna sekvenca" dugačka je najmanje 12, ali često i 15 do 18, kao i najmanje 25 jedinica monomera, uključujući nukleotide i rezidue amino kiselina. Pošto dva polinukleotida mogu da pojedinačno čine (1) sekvencu (tj. samo deo kompletne sekvence polinukleotida) koja je slična kod oba polinukleotida, i (2) sekvencu koja se razlikuje kod oba polinukleotida, poređenja sekvenci između dva (ili više) polinukleotida obično se izvode poređenjem sekvenci dvaju polinukelotida u "okviru poređenja" kako bi se identifikovale i uporedile lokalne regije sličnosti sekvenci. "Okvir poređenja" odnosi se na konceptualni segment od najmanje 6 uzastopnih položaja, a obično od oko 50 do oko 100, a češće oko 100 do oko 150, u kojima se sekvenca nakon optimalnog poravnavanja daju sekvenci poredi sa referentnom sekvencom sa istim brojem uzastopnih položaja. U slučaju optimalnog poravnanja dvaju sekvenci okvir poređenja može da uključi dodatke ili brisanja tj. praznine) od oko 20% ili manje u poređenju sa referentnom sekvencom (što ne ugrožava dodatke ili brisanja). Optimalno poravnavanje sekvenci za poravnanje okvira pore đenja može da se izvede pomoću kompjuterizovane implementacije algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Izdanju softverskog paketa Wisconsin Genetics 7.0, Genetička računarska grupa, Science Drive 575, Madison, WI, S.A.D.) ili proverom najboljeg poravnanja (tj. onog koje rezultuje najvišim procentom homologije u okviru poređenja) stvorenom bilo kojom od različitih odabranih metoda. Može se dati i referenca na BLAST familiju programa kao što je učinjeno u primeru prikazanom u radu Altschul et al, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Detaljna rasprava o analizi sekvence može se pronaći u Odeljku 19.3 rada Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, poglavlje 15.

Ovde korišćen termin "izolovani polinukleotid" odnosi se na polinukleotid koji je očišćen od sekvenci koje mu se u prirodnom stanju nalaze bočno, npr. fragment DNK koji je uklonjen iz sekvenci koje su mu normalno susedne. "Izolovani polinukleotid" takođe se odnosi na komplementarnu DNK (cDNA), rekombinantnu DNK ili polinukleotid koji ne postoji u prirodi i načinjen je ljudskom rukom.

Termini koji opisuju orijentaciju polinukleotida uključuju: 5' (u normalnim slučajevima kraj polinukleotida ima grupu slobodnih fosfata) i 3' (u normalnim slučajevima kraj polinukleotida ima slobodnu hidroksilnu (OH) grupu). Sekvence polinukleoptida mogu se obeležiti u orijentaciji 5' do 3' ili 3' do 5'. Za DNK i mRNA, lanac 5' do 3' predstavlja lanac "sense", "plusa" ili "kodiranja" jer je njena sekvenca identična sekvenci premessengera (premRNA) [osim za uracil (U) u RNK, umesto timina (T) u DNK]. Za DNK i mRNA, komplementarni lanac 3' do 5', koji je prepisan od strane RNK polimeraze određen je kao lanac "obrasca", "antisense", "minusa" ili "ne-kodiranja". Kako se ovde koristi, termin "reverzna orijentacija" odnosi se na sekvencu 5' do 3' upisanu u 3' do 5' orijentaciju ili sekvencu 3' do 5' upisanu u 5' do 3' orijentaciju.

Termini "komplementaran" i "komplementarnost" odnose se na polinukleotide ( tj. sekvencu nukleotida) povezane pravilima uparivanja baza. Na primer, komplementarni lanac sekvence DNK 5' A G T C A T G 3' je 3' T C A G T A C 5'. Druga sekvenca se često piše kao reverzni komplement sa završetkom 5' na levoj i završetkom 3' na desnoj strani, 5'CATGACT3'. Sekvenca jednaka svom obrnutom komplementu je palindromska sekvenca. Komplementarnost može da bude "delimična", u kom slučaju su samo neke baze nukleinskih kiselina uparene prema pravilima uparivanja baza. Ili mo že biti "kompletna" ili "totalna" kompementarnost između nukleinskih kiselina.

Štaviše, naučnici će ceniti saznanje da, kao rezultat degeneracije genetskog koda, postoje mnoge sekvence nukleotida koje kodiraju polipeptid ili fragment njegove varijante, kao što je ovde opisano. Neki od tih polipeptida imaju minimalnu homolognost sa sekvencom nukleotida bilo kog nativnog gena. Uprkos tome, polinukleotidi koji variraju zbog razlika u upotrebi kodona su specifi čno raumatrani u ovom pronalasku, kao na primer polinukleoptidi optimizovani za ljudsku i/ili primatsku selekciju kodona. Dalje, takođe mogu da se upotrebe ovde izneseni aleli gena koji čine sekvence polinukleotida. Aleli su endogeni geni koji su pretrpeli izmene kao rezultat jedne ili vi še mutacija, poput brisanja, dodataka i/ili zamena nukleotida.

Ovde korišćen termin "kaseta nukleinske kiseline" odnosi se na genetske sekvence unutar vektora koji može da iskaže ekspresiju RNK, a posledično i proteina. Kaseta nukleinske kiseline sadrži protor i gen od interesa, npr. CAR. Kaseta nukleinske kiseline je poziciono i sekvenciono orijentisana unutar vektora na takav način da nukleinska kiselina u kaseti može biti transkribovana u RNK, a kada je to potrebno, translatirana u protein ili polipeptid, te izlo žena prikladnim post-tranzicionim modifikacijama koje zahteva aktivnost transformisane ćelije, kao i translocirana na prikladni komplement za biološku aktivnost pomoću targetiranja prikladnih unutarćelijskih odeljaka ili sekrecije u vanćelijske odeljke. Krajevi kasete 3' i 5' su poželjno prilagođeni za spremno umetanje u vektor, npr. ona na svakom kraju poseduje lokacije ograničenja endonukleaze. U prioritetnom otelotvorenju pronalaska, kaseta nukleinske kiseline sadrži ovde razmatranu sekvencu MND promotora i himerni receptor antigena. Kaseta se može ukloniti i umetnuti u plazmid ili viralni vektor kao jedinstvena jedinica.

U određenim primerima polinukleotidi uključuju najmanje jedan polinukleotid od interesa. Ovde kroišćen termin "polinukleotid od interesa" odnosi se na polinukleotid koji kodira polipeptid ( tj. polipeptid od interesa), umetnut u vektor iskazuje ekspresiju koji želi da se izrazi. Vektor može da uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 polinukleotida od interesa. U određenim primerima polinukleotid od interesa kodira polipeptid koji obezbeđuje terapijski efekat u tretiranju ili prevenciji bolesti ili poremećaja. Plinukleotidi od interesa i polipeptidi koji ih kodiraju uklju čuju polinukleotide koji kodiraju polipeptide divljeg tipa, kao i njihove funkcionalne varijante i fragmente. U odre đenim primerima funkcionalna varijanta ima najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% istovetnosti sa primerima koji odgovaraju referentnom polinukeotidu divljeg tipa ili sekvenci polipeptida. U određenim otelotvorenjima funkcionalna varijanta ili fragment ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% biološke aktivnosti odgovarajućeg polipeptida divljeg tipa.

U jednom primeru polinukleotid od interesa ne kodira polipeptid ali slu ži kao predložak za transkripciju miRNA, siRNA ili shRNA, ribosoma ili druge inhibitorne RNK. U različitim otelotvorenjima polinukleotid obuhvata polinukleotid od interesa koji kodira CAR i jedan ili vi še dodatnih polinukleotida od interesa uključujući ali ne i ograničavajući se na inhibitornu sekvencu nukleinske kiseline uključujući ali ne ograničavajući se na: siRNA, miRNA, shRNA i ribosom.

Ovde kroišćeni termini "siRNA" ili "kratka posredna RNA" odnose se na kratku sekvencu polinukleotida koja posreduje u procesu post-transkripcionog uti šavanja gena specifičnom za sekvencu, tranzicionoj inhibiciji, transkripcionoj inhibiciji ili epigenetskoj RNAi kod životinja (Zamore et al, 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al, 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al, 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al, 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; i Strauss, 1999, Science, 286, 886). U određenim otelotvorenjima siRNA uključuje prvi lanac i drugi lanac koji imaju isti broj nukleozida, međutim prvi i drugi lanac su protivteža na takav način da dva terminalna nukelotida na prvom i drugom lancu nisu uparena sa reziduom na komplementarnom lancu. U određenim slučajevima dva neuparena nukelozida su rezidue timidina. siRNA treba da uklju čuje regiju sa dovoljnom homologijom na ciljni gen, te da bude dovoljne dužine u nukleotidima, tako da siRNA ili njen fragment mogu da posreduju pri smanjenju regulacije ciljnog gena. Tako, siRNA uključuje regiju koja je barem delimično komplementarna ciljnoj RNK. Nije neophodno da postoji savr šena komplementarnost između siRNA i cilja, ali sličnost mora biti značajna kako bi se omogućilo da siRNA ili produkt njenog otcepljivanja usmere utišavanje specifično za sekvencu, kao što se dešava kod RNAi otcepljivanja ciljne RNK. Komplementarnost ili stepen homologije sa ciljnim lancem je najkriti čnija kod antisense lanca. Dok je savršena komplementarnost često poželjna posebno kod antisense lanca, neka otelotvorenja uključuju jednu ili više, ali poželjno je 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 ili manje neusklađenosti u odnosu na ciljnu RNK. Te neusklađenosti se najviše tolerišu u terminalnim regijama, te ako su prisutne poželjno se nalaze u terminalnoj regiji ili regijama, npr. unutar 6, 5, 4 ili 3 nukleotida terminusa 5' i/ili 3'. Kako bi održalo sveukupni karakter dvostrukog lanca molekula, sense lanac treba samo da bude dovoljno komplementaran sa antisense lancem

Pored toga, siRNA može da bude modifikovana ili da uključuje nukleozidne analoge. Regije jednostrukog lanca siRNA mogu da budu modifikovane ili da uključuju nukleozidne analoge, npr. neuparenu regiju ili regiju petlje za ukosnicu, npr. regiju koja povezuje dve komplementarne regije i može da sadrži modifikacije ili nukleozidne analoge. Takođe je korisna modifikacija za stabilizovanje jednog ili više terminusa 3'- ili 5'- siRNA, npr. protiv egzonukleaza ili favorizovanje ulaska agensa antisense siRNA u RISC. Modifikacije mogu da uključe C3 (ili C6, C7, C12) amino linkere, tiol linkere, karboksil linkere, ne-nukleotidske odstojnike (C3, C6, C9, C12, abazik, trietilen glikol, heksaetilen glikol), specijalni biotin ili reagense fluoresceina koji se javljaju u obliku fosforamidita i imaju drugu DMT-zaštićenu hidroksilnu grupu, što dozvoljava mnogostruka uparivanja tokom sinteze RNK. Svaki lanac siRNA dug je 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20 nukleotida ili manje. Poželjno je da su lanci dugi najmanje 19 nukleotida. Na primer, svaki lanac može biti dug između 21 i 25 nukelotida. Preferirana siRNA poseduje dupleks regiju od 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotidnih parova i jedan ili više previsa od 2-3 nukleotida, poželjno je jedan ili dva 3' previsa od 2-3 nukleotida.

Ovde kroišćeni termini "miRNA" ili "mikroRNA" odnose se na male nekodirajuće RNK-ove od 20-22 nukleotida, koje su obično isečene iz prekursorskih struktura RNK od -70 na sebi savijenih nukleotida, poznatih kao pre-miRNK-ovi. miRNK-ovi negativno reguli šu svoje ciljeve na jedan ili dva načina u zavisnosti od stepena komplementarnosti između miRNa i cilja. Prvo, miRNA koja se savija sa savršenom ili skoro savršenom komplementarnošću na sekvencu mRNA koja kodira protein indukuje RNK-posredujući put interference (RNAi). miRNA-ovi koji vrše regulatorne efekte vezivanjem na nesavršene komplementarne lokacije unutar 3' netranslatiranih regija (UTR-ova) u svojim mRNA ciljevima, post-transkripciono suzbijaju ekspresiju ciljnih gena, naizgled na nivou translacije, putem RISC kompleksa koji je sličan ili moguće je i jednak onome koji se koristi za RNAi put. Dosledno sa kontrolom translacije, miRNA-ovi koji koriste ovaj mehanizam smanjuju nivoe proetina svojih ciljnih gena, ali samo minimalno utiču na nivoe mRNA ovih gena. miRNA obuhvataju prirodne kao i ve štački dizajnirane miRNA-ove koji mogu specifično da targetiraju bilo koju sekvencu mRNA. Na primer, u jednom otelotvorenju stručnjak može da dizajnira kratke RNK konstrukte ukosnice koji izražavaju ekspresiju kao primarni transkripti ljudske miRNA (npr. miR-30 ili miR-21). Taj dizajn dodaje konstruktu ukosnice Drosha lokaciju obrade i pokazano je da uveliko povećava efikasnost obaranja (Pusch et at, 2004). Osnova ukosnice sastoji se od 22-nukleotidne dsRNA (npr. antisense ima savršenu komplementarnost sa željenim ciljem) i 15-19-nukleotidne petlje ljudske miR. Dodavanje miR petlje i miR30 bočne sekvence na jednu ili obe strane ukosnice rezultira desetostrukim povećanjem Drosha i Dicer obrade za ukosnice koje iskazuju ekspresiju u poređenju sa konvencionalnim dizajnovima shRNA bez microRNA. Povećanje Drosha i Dicer obrade translatira se u veću proizvodnju siRNA/miRNA i veću moć za ukosnice sa iskazivanjem ekspresije.

Ovde kroišćeni termini "shRNA" ili "RNA kratke ukosnice" odnose se na dvolančanu strukturu koja se formira od jednostrukog samo-komplementarnog lanca RNK. Kod inhibicije su preferirani shRNA konstrukti koji sadrže sekvencu nukleotida jednaku delu kodirajuće ili nekodirajuće sekvence ciljnog gena. Kod inhibicije su takođe efikasne sekvence RNK sa umecima, brisanjima i mutacijama jednog mesta relativnima u odnosu na ciljnu sekvencu. Između inhibitorne RNK i dela ciljnog gena preferiše se istovetnost sekvence veća od 90% ili jednaka 100%. U određenim prioritetnim otelotvorenjima dužina dela shRNA koji formira dupeks shRNA duga je najmanje 20, 21 i 22 nukleotida, npr. veličinom odgovara proizvodima RNK proizvedenim Dicer otcepljivanjima. U određenim otelotvorenjima konstrukt shRNA dug je najmanje 25, 50, 100, 200, 300 ili 400 baza. U određenim otelotvorenjima konstrukt shRNA dug je 400-800 baza. Konstrukti shRNA su veoma tolerantni na varijacije u sekvenci petlje i veli čini petlje A. Ovde korišćen termin "robosom" odnosi se na katalitički aktivan molekul RNK koji je sposoban za otcepljivanje specifične lokacije od ciljne mRNA. Opisano je nekoliko podtipova, npr. čekićasti ribosomi ili ribosomi ukosnice. Katalitička aktivnost i stabilnost ribosoma može se poboljšati zamenom deoksiribonukleotida ribonukleotidima na nekatalitičkim bazama. Dok se za uništavanje određenih mRNA-ova mogu koristiti ribosomi koji otcepljuju mRNA na sekvencama za prepoznavanje specifi čnim za lokaciju, preferira se upotreba čekićastih ribosoma. Čekićasti ribosomi otcepljuju mRNA-ove na lokacijama određenim bočnim regijama koje formiraju bazne parove komplementarne sa ciljnom mRNA. Jedini zahtev je da ciljna mRNA ima sledeću sekvencu od dve baze: 5'-UG-3'. Konstrukcija i proizvodnja čekićastih ribosoma dobro je poznata u nauci.

Preferirani metod isporuke polinukleotida od interesa koji uključuje siRNA, miRNA, shRNA ili ribosom uključuje jednu ili više regulatornih sekvenci poput, na primer, snažne konstruktivne polimeraze III, npr. ljudskog U6 snRNA promotora, mišijeg U6 snRNA promotora, ljudskog ili mišijeg HI RNA promotora i ljudskog tRNA-val promotora ili snažnog konstruktivnog promotora polimeraze II, kao što je opisano drugde u ovom radu.

Polinukleotidi ovog pronalaska, bez obzira na dužinu same kodne sekvence, mogu da se kombinuju sa drugim sekvencama DNK, poput protomera i/ili pojačivača, netranslatiranih regija (UTR-ova), Kozak sekvenci, signalima poliadenilacije, dodatnim lokacijama za ograni čavanje enzima, lokacijama mnogostrukog kloniranja, unutarnjim lokacijama za ulazak ribosoma (IRES), lokacijama za prepoznavanje rekombinaze (npr. LoxP, FRT i Att lokacijama), završnim kodonima, signalima za završavanje transkripcije i polinukleotidima koji kodiraju peptide za samootcepljivanje, oznakama epitopa, kao što je prikazano drugde u ovom radu ili poznato u nauci, pa njihova ukupna du žina može značajno da varira. Zato se smatra da je moguća upotreba fragmenta gotovo bilo koje dužine, dok je ukupna dužina preferirano ograničena lakoćom pripreme i upotrebom u nameravanom protokolu za rekombinaciju DNK.

Polinukleotidi mogu da budu pripremljeni, udešavani i/ili da iskazuju ekspresiju uz pomoć bilo koje od raznih dobro ustanovljenih tehnika poznatih i dostupnih nauci. U cilju iskazivanja ekspresije željenog polipeptida, moguće je u prikladan vektor umetnuti sekvencu nukleotida koja ga kodira. Primeri vektora su plazmidi, autonomne zamenske sekvence i prenosni elementi. Dodatni uzorni vektori bez izuzetka uključuju plazmide, fagemide, kozmide, veštačke hromozome poput veštačkog hromozoma kvasca (YAC), bakterijske veštačke hromozome (BAC) ili PI izvedene veštačke hromozome (PAC), bakteriofage poput lambda faga ili MI3 faga i životinjske viruse. Primeri kategorija životinjskih virusa koji se koriste kao vektori bez izuzetka uključuju retrovirus (uključujući i lentivirus), adenovirus, adeno povezani virus, virus herpesa (npr. virus herpes simpleksa), virus boginja, bakulovirus, virus papiloma i papovirus (npr. SV40). Primeri vektora iskazivanja ekspresije su pCleno vektori (Promega) za iskazivanje ekspresije u ćelijama sisara; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ i pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) za transfer gena sa posredovanjem lentivirusa i iskazivanje ekspresije u ćelijama sisra. U posebnim primerima kodna sekvenca ovde prikazanih himernih proteina mo že biti vezana u takve vektore iskazivanja ekspresije u cilju izražavanja himernog proteina u ćelijama sisara.

"Kontrolni elementi" ili "regulatorne sekvence" prisutne kod vektora iskazivanja ekspresije su one netranslatirane regije vektora - poreklo replikacije, kasete selekcije, promotori, poja čivači, introni signala početka prevođenja (Shine Dalgarno sekvenca ili Kozak sekvenca), sekvenca poliadenilacije, 5' i 3' netranslatirane regije - koji stupaju u interakciju sa ćelijskim proteinima domaćina kako bi sproveli transkripciju i translaciju. Takvi elementi mogu da se razlikuju u snazi i specifi čnosti. U zavisnosti od upotrebljenog sistema vektora i domaćina, može da se koristi bilo koji broj elemenata prikladnih transkripcija i translacija, uključujući sveprisutne i induktibilne promotore.

U posebnim primerima upotrebljeni vektor koji praktikuje otkrivenu temu koja uklju čuje ali nije ograničena na vektore iskazivanja ekspresije i viralne vektore, koja će uključivati egzogene, endogene ili heterologne kontrolne sekvence poput promotora i/ili poja čivača. "Endogena" kontrolna sekvenca je ona koja je prirodno vezana sa datim genom u genomu. "Egzogena" kontrolna sekvenca je ona smeštena u jukstapoziciju sa genom uz pomoć genetske manipulacije (tj. tehnike molekularne biologije) poput transkripcije onog gena koji je usmeren povezanim poja čivačem/promotorom. "Heterologna" kontrolna sekvenca je egzogena sekvenca koja pripada drugoj vrsti u odnosu na ćeliju podvrgnutu genetskoj manipulaciji.

Ovde korišćen termin "promotor" odnosi se na lokaciju prepoznavanja polinukleotida (DNK ili RNK) na koji se veže RNK polimeraza. RNK polimeraza pokreće i transkribuje polinukleotide koji su operativno povezani sa promotorom. U specifičnim otelotvorenjima promotori operativni u ćelijama sisara uključuju AT-bogatu regiju smeštenu približno 25 do 30 baza više od lokacije pokrenute transkripcije i/ili druge sekvence pronađene 70 do 80 baza više od početka transkripcije, CNCAAT regije u kojoj N može biti bilo koji nukleotid.

Termin "pojačivač" odnosi se na segment DNK koji sadrži sekvencu sposobnu za obezbeđivanje pojačane transkripcije i u nekim slučajevima može da funkcioniše nezavisno od svoje orijentacije u odnosu na drugu kontrolnu sekvencu. Pojačivač može da funkcioniše kooperatvno ili dodatno sa promotorima i/ili drugim elementima pojačavanja. Termin "promotor/pojačivač" odnosi se na segment DNK koji sadrži sekvencu sposobnu za obezbeđivanje funkcija promotora i pojačivača.

Termin "operativno povezan" odnosi se na jukstapoziciju u kojoj se opisane komponente nalaze u vezi koja dozvoljava funkcionisanje na nameravani način. U jednom otelotvorenju termin se odnosi na funkcionalno povezivanje između kontrolne sekvence izraza nukleinske kiseline (kao što je promotor i/ili pojačivač) i druge sekvence polinukleotida, npr. polinukleotida od interesa, pri čemu kontrolna sekvenca iskazivanja ekspresije usmerava transkripciju nukleinske kiseline koja odgovara drugoj sekvenci.

Ovde korišćen termin "kontrolna sekvenca konstitutivnog iskazivanja ekspresije" odnosi se na promotor, pojačivač ili promotor/pojačivač koji kontinualno ili neprekidno dozvoljava transkripciju operativno povezane sekvence. Kontrolna sekvenca konstitutivnog iskazivanja ekspresije mo že biti "sveprisutan" promotor, pojačivač ili promotor/pojačivač koji dozvoljava iskazivanje ekspresije kod velike raznolikosti tipova ćelija i tkiva ili promotor, pojačivač ili promotor/pojačivač koji je "specifičan za ćeliju", "specifičan za tip ćelije", "specifičan za soj ćelija" ili "specifičan za tkivo" koji dozvoljava iskazivanje ekspresije kod ograničene raznolikosti tipova ćelija ili tkiva.

Ilustrativne sveprisutne kontrolne sekvence iskazivanja ekspresije pogodne za primenu u pojedinim primerima uključuju ali nisu ograničene na trenutni rani promotor citomegalovirusa (CMV), viralni majmunski virus 40 (SV40) (npr. rani ili kasni), LTR promotor virusa Molony mišije leukemije (MoMLV), LTR virusa Rous sarkoma (RSV), promotor virusa herpesa simpleksa (HSV) (timidim kinaza), H5, P7,5 i Pl 1 promotore iz virusa vakcine, promotor elongativnog faktora 1-alpha (EFla), odgovor na rani rast 1 (EGR1), feritin H (FerH), feritin L (FerL), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH), faktor inicijacije eukariotkse translacije 4A1 (EIF4A1), protein 5 toplinskog šoka 70KDa (HSPA5), protien toplinskog šoka 90kDa beta, član 1 (HSP90B1), protein toplinskog šoka 70kDa (HSP70), β-kinezin (β-KTN), ljudski lokus ROSA 26 (Irions et ah, Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), sveprisutni C promotor (UBC), promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PKG), promotor pojačivača/pilećeg β-aktina citomegalovirusa (CAG), promotor β-aktina i pojačivač virusa mijeloproliferativnog sarkoma, izbrisane negativne kontrolne regije, (MND) promotor zamenjene dl587rev lokacije za vezivanje prajmera (Challita et al, J Virol.69(2):748-55 (1995)).

U posebnom primeru poželjno je iskazivanje ekspresije polinukleotida koji uključuje CAR iz promotora koji obezbeđuje stabilno ili dugoročno iskazivanje ekspresije CAR-a na T ćelije i na nivoima dovoljnim za preusmeravanje T ćelija na ćelije sa iskazivanjem ekspresije ciljnog antigena. U prioritetnom primeru promotor je MND promotor.

U jednom primeru vektor iz otkrića uključuje MND promotor koji uključuje jedan ili više nukleotidnih umetaka, brisanja, zamena ili modifikacija koje pove ćavaju, smanjuju ili stabilizuju aktivnost MND promotora.

Ovde kroišćen termin "kondicionalno iskazivanje ekspresije" može da se odnosi na bilo koji tip kondicionalnog iskazivanja ekspresije uključujući ali ne ograničavajući se na indukovano iskazivanje ekspresije, represivno iskazivanje ekspresije, iskazivanje ekspresije u ćelijama ili tkivima u određenom fiziološkom i biološkom stanju ili stanju bolesti, itd. Ova definicija nije namenjena isključivanju specifičnog iskazivanja ekspresije tipa ćelije ili tkiva. Određeni primeri obezbeđuju kondicionalno iskazivanje ekspresije polinukleotida od interesa, npr. iskazivanje ekspresije kontroliše podvrgnuta ćelija, tkivo, organizam, itd., u tretmanu ili stanju koje izaziva iskazivanje ekspresije polinukleotida ili uzrokuje povećanje ili smanje iskazivanja ekspresije polinukleotida kodiranog polinukeotidom od interesa.

Ilustrativni primeri induktibilnih promotora/sistema uključuju ali nisu ograničeni na steroidinduktivne promotore poput promotora gena koji kodiraju receptore glukokortikoida ili estrogena (induktibilne tretiranjem odgovarajućim hormonom), promotor matlotiorina (induktibilne tretiranjem različitim teškim metalima), promotor MX-1 (induktibilan interferonom), "GeneSwictch" sistem koji reguliše mifepriston (Sirin et al, 2003, Gene, 323:67), kumulativni induktibilni zamenjivač gena (WO 2002/088346), regulatorne sisteme zavisne od tetraciklina, itd.

Kondicionalno iskazivanje ekspresije može takođe da bude aktivirano uz pomoć DNK rekombinaze specifične za lokaciju. Prema određenim otelotvorenjima ovog pronalaska vektor uključuje barem jednu (obično dve) lokacije za rekombinovanje kod kojih posreduje određena rekombinaza. Ovde korišćeni termini "rekombinaza" ili "rekombinaza specifične lokacije" uključuju ekscizivne ili integrativne proteine, enzime, ko-faktore ili povezane proteine koji su uklju čeni u reakcije rekombinacije koje uključuju jednu ili više lokacija za rekombinaciju (npr. dve, tri, četiri, pet, sedam, deset, dvanaest, petnaest, dvadeset, trideset, pedeset, itd.) koji mogu biti proteini divljeg tipa (videti Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), ili mutanti, derivativi ( npr. fuzioni proteini koji sadrže sekvencu rekombinacije proteina ili njen fragment), fragmenti i njihove varijante. Ilustrativni primeri rekombinaza prikladnih za primenu u određenim otelotvorenjima u ovom pronalasku uključuju ali nisu ograničene na: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ! C31, Cin, Tn3 resolvase, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCEl i ParA.

Vektori mogu da uključuju jedanu ili više lokacija za rekombinaciju za bilo koju od široke lepeze rekombinaza specifičnih za lokaciju. Podrazumeva se ciljna lokacija za rekombinazu specifičnu za lokaciju predstavlja dodatak bilo kojoj lokaciji ili lokacijama zahtevanim za integraciju vektora, npr. retroviralnog ili lentiviralnog vektora. Ovde korišćeni termini "sekvenca rekombinacije", "lokacija rekombinacije" ili "lokacija rekombinacije specifična za lokaciju" odnose se na određenu sekvencu nukleinske kiseline koju rekombinaza prepoznaje i veže.

Na primer, jedna lokacija rekombinacije za Cre rekombinazu je loxP koja predstavlja sekvencu od 34 bazna para i uključuje obrnuta ponavljanja dva para od 13 baza (koja služe kao vezivne lokacije rekombinaze) flankirajući sekvencu jezgra od 8 baznih parova (vidi SL. 1 iz Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)). Ostale uzorne loxP lokacije uključuju ali nisu ograničene na: lox511 (Hoess et al, 1996; Bethke i Sauer, 1997), lox5171 (Lee i Saito, 1998), lox2272 (Lee i Saito, 1998), m2 (Langer et al, 2002), lox71 (Albert et al, 1995), i lox66 (Albertsal, 1995).

Prikladne lokacije za prepoznavanje FLP rekombinaze uključuju ali nisu ograničene na: FRT (McLeod, et al, 1996), F1, F2, F3(Schlake i Bode, 1994), F4, F5(Schlake i Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988).

Ostali primeri sekvenci za prepoznavanje su attB, attP, attL i attR sekvence, koje prepoznaje enzim rekombinaze integraza, npr. phi-c31.' C31 SSR posreduje pri rekombinaciji samo između heterotipičnih lokacija attB (dugih 34 bp) i attP (dugih 39 bp) (Groth et al, 2000). attB i attP, nazvani po lokacijama pripajanja integraze faga na genome bakterija i faga, sadr že nesavršena obrnuta ponavljanja na koja se najverovatnije vežu ' C31 homodimeri (Groth et al, 2000). Lokacije proizvoda attL i attR, su efektivno inertne na ' C31-posredovanu rekombinaciju (Belteki et al, 2003), što reakciju čini ireverzibilnom. U slučaju katalizatorskih umetaka pronađeno je da se attB-noseća DNK umeće na attP lokaciju genoma spremnije od umetanja attP lokacije u attB lokaciju genoma (Thyagarajan et al, 2001; Belteki et al, 2003). Tako tipične strategije homolognom rekombinacijom pozicioniraju attP-noseću "spojnu lokaciju" na definisano mesto, što je zatim propraćeno umetanjem attB-noseće dolazne sekvence.

Ovde korišćen termin "unutarnja lokacija za ulazak ribosoma" ili "IRES" odnosi se na element koji promoviše direktni unutarnji ulazak ribosoma u inicijacijski kodon, poput ATG-a, cistona (prepoznavanje završetka proteina), time dovodeći do cap-nezavisne translacije gena. Videti npr. Jackson et al, 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) i Jackson i Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. U određenim primerima vektori objašnjeni u ovom otkriću uključuju jedan ili više polinukleotida od interesa koji kodiraju jedan ili više polipeptida. U posebnim primerima sekvenca polinukleotida mo že biti razdvojena jednom ili više IRES sekvenci ili sekvenci polinukleotida koje kodiraju samootcepljujuće polipeptide, kako bi aktivirala translaciju svakog od mnogobrojnih polipeptida.

Ovde kroišćen termin "Kozak sekvenca" odnosi se na kratku sekvencu nukleotida koja uveliko olakšava inicijalno vezivanje mRNA na malu podjedinicu ribosoma i pove ćava translaciju. Konsenzusna Kozak sekvenca je (GCC)RCCATGG (BR. ID. SEKV.:27), gde R označava purin (A ili G) (Kozak, 1986. Cell.

44(2):283-92, i Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). U posebnim primerima vektori objašnjeni u ovom otkriću uključuju polinukleotide koji poseduju konsenzusnu Kozak sekvencu i kodiraju želeni polipeptid, npr. CAR.

U nekim otelotvorenjima pronalaska polinukleotid ili ćelija koja sadrži polinukleotid koristi samoubilački gen, uključujući induktivni samoubilački gen kako bi smanjila rizik od direktne toksičnosti i/ili nekontrolisanog širenja. U specifičnim aspektima samoubilački gen nije imunogen u slučaju domaćina koji sadrži polinukleotid ili ćeliju. Određeni primer samoubilačkog gena koji može da se koristi je caspase-9 ili caspase-8 ili citozin deaminaza. Caspase-9 može da se aktivira uz pomoć hemijskog induktora dimerizacije (CID).

U određenim otelotvorenjima vektori uključuju segmente gena koji uzrokuju prijemčivost ćelija imunog efektora iz pronalaska, npr. T ćelija, na negativnu selekciju in vivo. Pod terminom "negativna selekcija" podrazumeva se mogućnost eliminacije infuzne ćelije koja je rezultat promene u stanju individue in vivo. Negativni selektivni fenotip može da nastane kao rezultat umetanja gena koji deli osetljivost na primenjeni agnes, na primer, jedinjenje. Negativni selektivni geni poznati su u nauci i među ostalima uključuju i sledeće: gen tiamidin kinaze virusa herpes simpleks tipa I (HSV-I TK) (Wigler et ah, Cell 11:223, 1977) koji deli osetljivost na ganciklovir; gen ćelijskog hipoksantina fosfribosiltransferaze (HPRT), gen ćelijske adenin fosfribosiltransferaze (APRT) i bakterijsku citozin deaminazu (Mullen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. S.A.D. 89:33 (1992)).

U nekim otelotvorenjima genetski modifikovane ćelije imunog efektora poput T ćelija uključuju polinukleotid koji dalje uključuje marker koji omogućava selekciju ćelija za negativni selektivni fenotip in vitro. Pozitivni selektivni marker može da bude gen koji nakon uvođenja u ćeliju domaćina iskazuje ekspresiju dominantnog fenotipa dozvoljavajući pozitivnu selekciju ćelija koje nose gen. Geni ovog tipa poznati su u nauci i između ostalog uključuju gen higromicin-B fosfotransferaze (hph) koji deli otpornost na higromicin B, gen amino glikozid fosfotransferaze (neo ili aph) iz Tn5 koji kodira otpornost na antibiotik G418, gen dihidrofolat reduktaze (DHFR), gen adenozin deaminaze (ADA) i gen otpornosti na više lekova (MDR).

Preferirno, pozitivni selektivni marker i negativni selektivni element povezani su na takav na čin da je gubitak negativnog selektivnog elementa neophodno propraćen gubitkom pozitivnog selektivnog markera. Čak još više preferirano, pozitivni i negativni selektivni markeri fuzionisani su tako da gubitak jednog obavezno vodi gubitku drugog. Primer fuzionisanog polinukleotida koji daje iskazivanje ekspresije, polipeptid koji sadrži obe prethodno opisane željene pozitivne i negativne selektivne karakteristike je gen fuzije higromicin fosfotransferaze timidin kinaze (HyTK). Iskazivanje ekspresije ovog gena polučuje polipeptid koji sadrži otpornost na higromicin B za pozitivnu selekciju in vitro i osetljivost na ganciklovir za negativnu selekciju in vito. Videti Lupton S. D., et al, Mol. and Cell. Biology 1 1:3374- 3378, 1991. Osim toga, u prioritetnim primerima, polinukleotidi pominjani u ovom radu koji šifruju himerne receptore nalaze se u retroviralnim vektorima koji sadr že fuzionisani gen, posebeno oni koji dele otpornost na higromicin B za pozitivnu selekciju in vitro i osetljivost na ganciklovir za negativnu selekciju in vito, kao na primer HyTK retroviralni vektor opisan u radu Lupton, S. D. et al. (1991), iznad. Takođe videti publikacije WO/1992/008796 i WO/1994/028143, autora S. D. Luptona, koje opisuju upotrebu bifunkcionalnih selektabilnih fuzionisanih gena proisteklih iz fuzije dominantnih pozitivnih selektabilnih markera sa negativnim selektabilnim markerima.

Preferirani pozitivni seletabilni markeri su proistekli iz gena izabranih iz grupe koja se sastoji od hph, nco i gpt, a preferirani negativni selektabilni markeri proistekli su iz gena izabranih iz grupe koja se sastoji od citozin deaminaze, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT i gpt. Posebno preferirani markeri su bifunkcionalni selektabilni fuzionisani geni gde je pozitivni selektabilni marker proistekao iz hph ili neo, a negativni selektabilni marker iz citozin deaminaze ili TK gena ili selektabilnog markera.

F. Viralni vektori

U specifičnim primerima ćelija (npr. T ćelija) je transdukovana retroviralnim vektorom, npr. retroviralnim vektorom, koji kodira CAR. Na primer, vektor uključuje MND promotor i kodira CAR koji kombinira vezni domen specifičan za antigen antitela koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD 138, CD 171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid sa unutarćelijskim signalnim domenom CD28, 4-1BB, Ox40 ili bilo koje prethodne kombinacije. Tako, te transdukovane T ćelije mogu da izmame stabilan, dugoročan i istrajan odgovor T ćelije posredovan CAR-om.

Retrovirusi predstavljau uobičajeni alat za dobijanje gena (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). U specifičnim primerima retrovirus se koristi za dobijanje polinukleotida koji šifruje receptor himernog antigena (CAR) na ćeliju. Ovde korišćen termin "retrovirus" odnosi se na virus RNK koji obrnuto transkribuje njegovu genomsku RNK u linearnu kopiju DNK sa dva lanca i posledično kovalentno integriše svoju genomsku DNK u genom domaćina. Jednom kada je virus integrisan u domen domaćina, naziva se "provirus". Provirus služi kao obrazac za RNK polimerazu II i usmerava iskazivanje ekspresije molekula RNK koji kodiraju strukturalne proteine i enzime potrebne za proizvodnju novih viralnih čestica.

Ilustrativni retrovirusi prikladni za primenu u određenim primerima uključuju ali nisu ograničene na: mišiji Moloney virus leukemije (M-MuLV), mišiji Moloney virus sarkoma (MoMSV), mišiji Harvey virus sarkoma (HaMuSV), mišiji virus tumora dojke (MuMTV), virus leukemije majmuna gibona (GaLV), mačiji virus leukemije (FLV), spumavirus, mišiji Friend virus leukemije, mišiji virus stem ćelija (MSCV) i Rous virus sarkoma (RSV)) i lentivirus.

Ovde korišćen termin "lentivirus" odnosi se na grupu (ili genus) složenih retrovirusa. Ilustrativni lentivirusi uključuju ali nisu ograničeni na: HIV (humani virus imunodeficijencije; uključujući HIV tipa 1 i HIV tipa 2); visna-maedi virus (VMV) virus; koziji virus arthritisa-encefalitisa (CAEV); konjski virus infektivne anemije (EIAV); mačiji virus imunodeficiencije (FIV); goveđi virus imunodeficiencije (BIV) i majmunski virus imunodeficiencije (SIV). U jednom otelotvorenju preferiraju se oslonci HIV baziranog vektora (tj. HIV cis-delujući elementi sekvence). U posebnim otelotvorenjima lentivirus se koristi za dobijanje polinukleotida koji uključuje MND promotor i šifruje CAR na ćeliju.

Retroviralni vektori i posebno lentiviralni vektori mogu da se koriste u praktikovanju posebnih primera iz ovog rada. Prema tome, ovde korišćen termin "retrovirus" ili "retroviralni vektor" takođe treba da uključi i termin "lentivirus" i "lentiviralni vektor".

Ovde korišćen termin "vektor" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koja je sposobna za prenošenje ili transportovanje drugog molekula nukleinske kiseline. Prenesena nukleinska kiselina je obično povezana sa, npr. umetnuta u, vektorski molekul nukleinske kiseline. Vektor može da uključi sekvence koje usmeravaju autonomne replikacije u ćeliji ili može da sadrži sekvence dovoljne za dozvoljavanje integracije u DNK ćeliju domaćina. Korisni vektori uključuju, npr. plazmide (npr. plazmide DNK ili plazmide RNK), transposone, kosmide, bakterijske veštačke hromozome i viralne vektore. Korisni vektori uključuju npr. retroviruse defektne replikacije i lentiviruse.

Kao što je stručnjaku očigledno, termin "viralni vektor" se široko koristi u slučaju molekula nukleinske kiseline (npr. transfernog plazmida) koji uključuje elemente nukleinske kiseline potekle od virusa koji obično olakšavaju prenos molekula nukleinske kiseline ili integraciju u genom ćelije ili u viralnu česticu koja posreduje u prenosu nukleinske kiseline. Viralne čestice će tipično pored amino kiseline ili kiselina uključivati različite viralne komponente, a ponekad takođe komponente ćelije domaćina.

Termin "viralni vektor" može da se odnosi ili na virus ili viralnu česticu sposobnu za prenos nukleinske kiseline u ćeliju ili na samu prenesenu nukleinsku kiselinu. Viralni vektori i transferni plazmidi sadrže strukturalne i/ili funkcionalne genetske elemente koji se primarno dobijaju iz virusa. Termin "retroviralni vektor" odnosi se na viralni vektor ili plazmid koji sadrži strukturalne i funkcionalne genetske elemente ili njihove delove, koji se primarno dobijaju iz retrovirusa. Termin "lentiviralni vektor" odnosi se na viralni vektor ili plazmid koji sadrži strukturalne ili funkcionalne genetske elemente ili njihove delove, uključujući LTR-ove koji se primarno dobijaju iz lentivirusa. Termin "hibridni vektor" odnosi se na vektor, LTR ili drugu nukleinsku kiselinu koja sadrži retroviralne, npr. lentiviralne sekvence i ne-lentiviralne viralne sekvence. U jednom primeru hibridni vektor odnosi se ne vektor ili transferni plazmid koji uključuju retroviralne npr. lentiviralne sekvence za obrnutu transkripciju, replikaciju, integraciju i/ili pakovanje.

U određenim otelotvorenjima termini "lentiviralni vektor" i "vektor lentiviralnog iskazivanja ekspresije" mogu da se koriste u odnosu na lentiviralne transferne plazmide i/ili infektivne lentiviralne čestice. Na mestima u ovom radu na kojima se pozivamo na elemente poput lokacija za kloniranje, promotora, regulatornih elemenata, heterolognih nukleinskih kiselina, itd. valja razumeti da su sekvence tih elemenata prisutne u obliku RNK u lentiviralnim česticama i u obliku DNK u DNK plazmidima prikazanim u otkriću.

Na svakom kraju prethodno pomenutih nalaze se strukture pod nazivom "duga terminalna ponavljanja" ili "LTR-ovi". Termin "duga terminalna ponavljanja (LTR)" odnosi se na bazne parove smeštene na krajevima retroviralne DNK koji, u kontekstu svog prirodnog sleda, predstavljaju direktna ponavljanja i sadrže U3, R i U5 regije. LTR-ovi uopšteno obezbeđuju funkcije koje su fundamentalne za iskazivanje ekspresije retroviralnih gena (npr. promociju, inicijaciju i poliadenilaciju genskih transkripta) i za replikaciju virusa. LTR sadrži brojne regulatorne signale uključujući transkripcione kontrolne elemente, signale poliadenilacije i sekvence potrebne za replikaciju i integraciju viralnog genoma. Viralni LTR podeljen je na tri regije zvane U3, R i U5. Regija U3 sadr ži elemente pojačivača i promotora. Regija U5 je sekvenca između vezne lokacije prajmera i R regije, te sadrži sekvencu poliadenilacije. Regija R (regija ponavljanja) je flankirana regijama U3 i U5. LTR sastavljen od regija U3, R i U5 pojavljuje se na krajevima viralnog genoma 5' i 3'. Iza LTR 5' slede sekvence neophodne za obrnutu transkripciju genoma (vezna lokacija prajmera tRNA) i za efikasno pakovanje viralne RNK u čestice (Psi lokacija).

Ovde korišteni termini "signal za pakovanje" ili "sekvenca pakovanja" odnose se na sekvence smeštene unutar retroviralnog genoma koje se potrebne za umetanje viralne RNK u viralnu kapsidu ili česticu, videti npr. Clever et al, 1995. J. of Virology, Vol. 69, br. 4; str. 2101-2109. Nekolicina retroviralnih vektora koristi minimalni signal za pakovanje (takođe poznat kao psi [" ] sekvenca) potreban za enkapsidaciju viralnog genoma. Tako se ovde kori šćeni termini "sekvenca za pakovanje", "signal za pakovanje", "psi" i "" " odnose na ne-kodirajuće sekvence zahtevane za enkapsidaciju lanaca retroviralne RNK tokom formiranja viralne čestice.

U različitim otelotvorenjima vektori uključuju modifikovane 5' LTR-ove i/ili 3' LTR-ove. Jedan ili oba LTR-a mogu da uključuju jednu ili više modifikacija uključujući ali ne i ograničavajući se na jedno ili više brisanja, umetanja ili zamena. Modifikacije 3' LTR-a se često prave u cilju poboljšanja sigurnosti lentiviralnih ili retroviralnih sistema onesposobljavanja virusa za replikaciju. Ovde kori šćen termin "onesposobljen za replikaciju" odnosi se na virus koji nije sposoban za kompletnu, efikasnu replikaciju, pa se ne proizvode infektivni virioni (npr. onesposobljena replikacija lentiviralnog potomstva). Termin "sposoban za replikaciju" odnosi se na viruse divljeg tipa ili mutirane viruse koji su sposobni za replikaciju, tako da je viralna replikacija virusa sposobna za proizvodnju infektivnih viriona ( npr. osposobljena replikacija lentiviralnog potomstva).

Vektori "samo-inaktivacije" (SIN) se odnose na vektore onesposobljene za replikaciju, npr. retroviralne ili lentiviralne vektore, kod kojih je desna (3') LTR regija poja čivača-promotora, poznata kao U3 regija, modifikovana (npr. brisanjem ili zamenom) u cilju sprečavanja viralne transkripcije nakon prve runde replikacije virusa. To je zato što se tokom replikacije virusa desna (3') LTR U3 regija koristi kao obrazac za levu (5') LTR U3 regiju, pa tako viralni trakskript ne može biti napravljen bez U3 pojačivača-promotora. U daljim otelotvorenjima pronalaska 3' LTR je modifikovan tako da je U5 regija zamenjena, na primer, idealnom poli(A) sekvencom. Treba upamtiti da su modifikacije LTR-ova poput onih na 3' LTR, 5' LTR ili na oba takođe uključene u pronalazak.

Pojačanje dodatne sigurnosti postignuto je zamenom U3 regije 5' LTR-a heterolognim promotorom u cilju upravljanja transkripcijom viralnog genoma tokom proizvodnje viralnih čestica. Primeri heterolognih promotora koji se mogu koristiti uključuju npr. promotore (timidin kinaze) viralnog majmunskog virusa 40 (SV40) (npr. ranog ili kasnog), citomegalovirusa (CMV) (npr. neposrednog ranog), mišijeg Moloney virusa leukmije (MoMLV), Rous virusa sarkoma (RSV) i virusa herpes simpleksa (HSV). Tipični promotori su sposobni za upravljanje visokim nivoima transkripcije na Tat-nezavisan na čin. Ta zamena smanjuje mogućnost rekombinacije za generisanje virusa sposobnog za replikaciju usled nepostojanja kompletne sekvence U3 u sistemu produkcije virusa. U određenim otelotvorenjima heterologni promotor poseduje dodatne prednosti u kontrolisanju načina transkripcije viralnog genoma. Na primer, heterologni promotor može da bude induktibilan, pa će se transkripcija celog ili jednog dela viralnog genoma desiti samo kada su prisutni faktori indukcije. Faktori indukcije uklju čuju ali nisu ograničeni na jedno ili više hemijskih jedinjenja ili fiziološke uslove poput temperature ili pH vrednosti u kojima se gaje ćelije domaćina.

U nekim otelotvorenjima viralni vektori uključuju TAR element. Termin "TAR" odnosi se na genetski element "odgovora trans-aktivacije" smešten u R regiji lentiviralnih (npr. HIV) LTR-ova. U cilju pojačavanja replikacije virusa taj element stupa u interakciju sa lentiviralnim genetskim elementom trans-aktivacije (tat). Međutim, taj element se ne zahteva u otelotvorenjima u kojima je U3 regija 5' LTR-a zamenjena heterolognim promotorom.

"R regija" se odnosi na regiju sa retroviralnim LTR-ovima koji počinju na početku grupe za zatvaranje (tj. na početku transkripcije) i završavaju odmah pre početka poli A trakta. Regija R je takođe definisana kao regija flankirana regijama U3 i U5. R regija igra ulogu tokom obrnute transkripcije dozvoljavajući transfer nastajuće DNK sa jednog kraja genoma na drugi.

Ovde korišćen termin "FLAP element" odnosi se na nukleinsku kiselinu čija sekvenca uključuje centralni polipurinski trakt i centralne terminativne sekvence (cPPT i CTS) retrovirusa, npr. HIV-1 ili HIV-2. Prikladni FLAP elementi opisani su u patentu S.A.D. br. 6,682,907 i u Zennou, et al, 2000, Cell, 101:173. Tokom obrnute transkripcije virusa HIV-1, centralna inicijacija plus-lanca DNK u centralnom polipurinskom traktu (cPPT) i centralna terminacija u centralnoj terminativnoj sekvenci (CTS) dovode do stvaranja strukture DNK sa tri lanca: centralne DNK klapne virusa HIV-1. Nezavisno od bilo koje teorije, DNK klapna može da igra ulogu cis-aktivne determinante nuklearnog uvoza lentiviralnog genoma i/ili može da pojača titer virusa. U specifičnim primerima, oslonci retroviralnih ili lentiviralnih vektora uključuju jedan ili više FLAP elemenata više ili niže od heterolognih gena od interesa u vektorima. Na primer, u posebnim primerima transferni plazmid uključuje FLAP element. U jednom otelotvorenju vektor iz pronalaska uključuje FLAP element koji je izolovan iz virusa HIV-1.

U jednom primeru retroviralni ili lentiviralni transferni vektori uklju čuju jedan ili više izvoznih elemenata. Termin "izvozni element" odnosi se na cis-delujući post-transkripcioni regulativni element koji reguliše transport RNK transkripta od jezgra do citoplazme ćelije. Primeri izvoznih elemenata RNK uključuju ali nisu ograničeni na element reverzibilnog odgovora HIV-a (RRE) (videti npr. Cullen et al, 1991. J. Virol. 65: 1053; i Cullen et al, 1991. Cell 58: 423), i post-transkripcioni regulatorni element virusa hepatitis B (HPRE). Uopšteno, izvozni element RNK smešten je unutar 3' UTR-a gena i može da se umetne kao jedna ili više kopija.

U određenim otelotvorenjima, iskazivanje ekspresije homolognih sekvenci kod viralnih vektora povećano je uključivanjem post-transkripcionih regulatornih elemenata, efikasnih lokacija poliadenilacije i opciono signalima završetka transkripcije u vektorima. Razni post-transkripcioni regulatorni elementi mogu da povećaju iskazivanje ekspresije heterolognih nukleinskih kiselina u proteinu, npr. post-transkripcionog regulatornog elementa virusa hepatitisa kod mrmota (WPRE; Zufferey et al, 1999, J. Virol, 73:2886); post-transkripcionog regulatornog elementa virusa hepatitisa B (HPRE) (Huang et al, Mol. Cell. Biol, 5:3864); i slično (Liu et al, 1995, Genes Dev., 9:1766). U posebnim otelotvorenjima vektori iz pronalaska uključuju post-transkripcioni regulatorni element poput WPRE ili HPRE.

U određenim otelotvorenjima vektorima iz pronalasaka nedostaje ili oni ne sadr že posttranskripcioni regulatorni element poput WPRE ili HPRE jer u nekim slučajevima ti elementi povećavaju rizik od ćelijske transformacije i/ili suštinski ili značajno ne povećavaju količinu mRNA transkripta ili povećavaju stabilnost mRNA. Zato u nekim otelotvorenjima u cilju dodatne sigurnosne mere vektorima iz pronalaska nedostaju ili oni ne sadrže WPRE ili HPRE.

Elementi koji usmeravaju efikasnu transformaciju i poliadenilaciju heterolognih transkripta nukleinske kiseline povećavaju heterologno iskazivanje ekspresije gena. Signali završetka transkripcije mogu se uopšteno naći niže od signala poliadenilacije. U određenim otelotvorenjima vektori uključuju sekvencu poliadenilacije 3' polinukleotida koji kodira polipetid čije iskazivanje ekspresije treba da se desi. Termin "poliA lokacija" ili "poliA sekvenca" ovde se koristi za označavanje sekvence DNK koja usmerava završetak i poliadenilaciju transkripta nastajuće DNK uz pomoć RNK polimeraze II. Sekvenca poliadenilacije može da promoviše stabilnost mRNA dodavanjem poliA repa na kraj 3' sekvnce kodiranja i tako doprinese povećanoj translativnoj efikasnosti. Efikasna poliadenilacija rekombinantnog transkripta poželjna je pošto su transkripti kojima nedostaje poliA rep nestabilni i brzo degradirani. Ilustrativni primeri poliA signala koji mogu da se koriste u vektoru pronalaska uključuju idelanu poliA sekvencu (npr. AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), poliA sekvencu goveđeg hormona rasta (BGHpA), poliA sekvencu zečijeg β-globina (rβgpA) ili neku drugu prikladnu heterolognu ili endogenu poliA sekvencu koja je poznata u nauci.

U određenim primerima retroviralni ili lentiviralni vektor dalje uključuje jedan ili više izolatorskih elemenata. Izolatorski elementi mogu da doprinesu zaštiti lentivirusnih sekvenci koje iskazuju ekspresiju, npr. terapijskih polipeptida, od efekata integrativne lokacije koji mogu da budu posredovani cis-delujućim elementima prisutnim u genomskoj DNK i da dovedu do deregulisanog iskazivanja ekspresije transferisane sekvence (tj. efekat pozicije; videti npr. Burgess-Beusse et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., S.A.D., 99:16433; i Zhan et al, 2001, Hum. Genet., 109:471). U nekim otelotvorenjima transferni vektori uključuju jedan ili više izolatorskih elemenata 3' LTR-a i po integraciji provirusa u genom odmaćina, provirus uključuje jedan ili više izolatora na 5' LTR-u ili 3' LTR-u pomoću svojstva dupliciranja 3' LTR-a. Izolatori prikladni za korišćenje u intervenciji uključuju ali nisu ograničeni na izolator pilećeg β-globina (videti Chung et al, 1993. Cell 74:505; Chung et al, 1997. PNAS 94:575; i Bell et al, 1999. Cell 98:387). Primeri izolatorskih elemenata uključuju ali nisu ograničeni na izolator iz lokusa β-globina, poput pilećeg HS4.

Prema određenima specifičnim otelotvorenjima pronalaska, većina ili svi oslonci sekvenci viralnih vektora izvedeni su iz lentivirusa, npr. HIV-1. Međutim, valja razumeti da je moguće koristiti ili kombinovati mnoge različite izvore retroviralnih i/ili lentiviralnih sekvenci, a mnogobrojne zamene i alteracije u određenim lentiviralnim sekvencama mogu da se smeste bez smanjivanja sposobnosti transfernog vektora za izvođenje ovde opisanih funkcija. Štaviše, u nauci je poznato mnoštvo lentiviralnih vektora, videti Naldini et al, (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al, (1997); Dull et al, 1998, patenti S.A.D. br. 6,013,516 i 5,994,136, od kojih mnogi mogu biti prilagođeni za proizvodnju viralnih vektora ili transfernih plazmida prikazanih u pronalasku.

Vektori iz pronalaska uključuju promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira polipeptid CAR-a. Vektori mogu da imaju jedan ili vi še LTR-ova, pri čemu svaki LTR uključuje jednu ili više modifikacija, poput jedne ili više zamena, dodataka ili brisanja nukleotida. Vektori dalje mogu da uključuju jedan ili više dodatnih elemenata za povećavanje efikasnosti transdukcije (npr. cPPT/FLAP), viralno pakovanje (npr. Psi (" ) signal za pakovanje, RRE), i/ili druge elemente koji povećavaju terapeutsko iskazivanje ekspresije gena (npr. poli (A) sekvence), i mogu opciono da uključuju WPRE ili HPRE.

U specifičnom otelotvorenju transferni vektor iz pronalaska uključuje levi (5') retroviralni LTR, klapnu centralnog polipurinskiog trakta/DNK (cPPT/FLAP), retroviralni izvozni element, MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde pominjani CAR polipeptid i desni (3') retroviralni LTR, a opciono i WPRE ili HPRE.

U specifičnom otelotvorenju transferni vektor iz pronalaska uključuje levi (5') retroviralni LTR, retroviralni izvozni element, MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde pominjani CAR polipeptid, desni (3') retroviralni LTR i poli (A) sekvencu, a opciono i WPRE ili HPRE. U drugom specifičnom otelotvorenju pronalazak daje lentiviralni vektor koji uključuje levi (5') LTR, cPPT/FLAP, RRE, MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde pominjani CAR polipeptid, desni (3') LTR, sekvencu poliadenilacije, a opciono i WPRE ili HPRE.

U određenom otelotvorenju pronalazak daje lentiviralni vektor koji uključuje: levi (5') HIV-1 LTR, Psi (" ) signal za pakovanje, cPPT/FLAP, RRE, MND promotor operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde pominjani CAR, desni (3') samo-inaktiviraju ći (SIN) HIV-1 LTR i sekvencu poliadenilacije zečijeg β-globina, a opciono i WPRE ili HPRE.

U drugom otelotvorenju pronalazak daje vektor koji uključuje najmanje jedan LTR, centralni polipurinski trakt/DNK klapnu (cPPT/FLAP), retroviralni izvozni element, MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde razmatrani CAR polipeptid, a opciono i WPRE ili HPRE.

U određenom otelotvorenju pronalazak daje vektor koji uključuje najmanje jedan LTR, cPPT/FLAP, MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde razmatrani CAR polipeptid, sekvencu poliadenilacije, a opciono i WPRE ili HPRE.

U određenom otelotvorenju pronalazak daje najmanje jedan SIN HIV-1 LTR, Psi (" ) signal za pakovanje, cPPT/FLAP, RRE, MND promotor operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde razmatrani CAR i sekvencu poliadenilacije zečijeg β-globina, a opciono i WPRE ili HPRE.

Vešt naučnik ceniće činjenicu da mnoga od različitih otelotvorenja mogu biti kreirana iz postojećih otelotvorenja iz pronalaska. "Ćelija domaćina" uključuje ćelije koje su in vivo, ex vivo, ili in vitro transfektirane, infektirane ili transdukovane rekombinantnim vektorom ili polinukleotidom iz pronalaska. Ćelije domaćina mogu da uključuju ćelije za pakovanje, ćelije proizvođača i ćelije infektirane viralnim vektorima. U posebnim primerima ćelije domaćina infektirane viralnim vektorom iz pronalaska primenjene su na subjektu koji zahteva terapiju. U određenim primerima termin "ciljna ćelija" koristi se umesto termina ćelija domaćina i odnosi se na transfektirane, infektirane ili transdukovane ćelije željenog tipa. U preferiranim otelotvorenjima ciljna ćelija je T ćelija.

Za postizanje razložnog viralnog titera često je potrebna obilna proizvodnja viralnih vektora. Viralni vektori se proizvode transfekcijom transfernog vektora u ćeliju za pakovanje koja uključuje viralne strukturalne i/ili dodatne gene, npr. gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx ili nef gene ili druge retroviralne gene.

Ovde korišćen termin "vektor za pakovanje" odnosi se na vektor koji iskazuje ekspresiju ili viralni vektor kome nedostaje signal za pakovanje i uključuje jedan, dva, tri, četiri ili više viralnih strukturalnih i/ili dodatnih gena koji kodiraju polinukleotid. Vektori za pakovanje su tipi čno uključeni u ćeliju za pakovanje i u nju uvedeni transfekcijom, transdukcijom ili infekcijom. Metodi transfekcije, transdukcije ili infekcije su dobro poznati stručnjacima. Retroviralni/lentiviralni transferni vektor iz ovog rada može biti uveden i liniju ćelija za pakovanje pomoću transfekcije, transdukcije ili infekcije, kako bi stvorio ćeliju proizvođača ili liniju ćelija. Vektori za pakovanje iz ovog rada mogu biti uvedeni i ljudske ćelije ili linije ćelija pomoću standardnih metoda koji uključuju npr. transfekciju kalcijum fosfata, lipofekciju ili elektroporaciju. U nekim primerima vektori za pakovanje uvedeni su u ćelije zajedno sa dominantnim slektabilnim markerom poput neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidin kinaze, DHFR-a, Gin sinteaze ili ADA-e, iza čega sledi selekcija u prisustvu prikladnog leka i izolacija klonova. Gen slektabilnog markera može fizički biti povezan sa genima koje kodira vektor za pakovanje, npr. IRES ili samootcepljujući viralni peptidi.

Proteini viralne omotnice (env) određuju obim ćelija domaćina koje na posletku mogu da budu infektirane i transformisane rekombinantnim retrovirusima stvorenim iz linija ćelija. U slučaju lentivirusa, poput HIV-1, HTV-2, SIV, FIV i EIV, env proteini uključuju gp41 i gpl20. Preferirano, viralni env proteini sa iskazivanjem ekspresije od strane ćelija za pakovanje iz ovog rada šifruju se na posebnom vektoru od viralnih gag i pol gena, kao što je prethodno opisano. Ilustrativni primeri retroviralnih env gena koji se mogu upotrebiti u ovom radu uključuju ali nisu ograničeni na: MLV omotnice, 10A1 omotnicu, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ebola, Sendai, FPV (virus koko šije kuge) i omotnice virusa gripa. Slično tome, mogu da se koriste geni koji kodiraju omotnice iz RNK virusa ( npr. familije RNK virusa Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) kao i DNK virusa (familije Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae i Iridoviridae). Reprezentativni primeri uključuju FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, besnilo, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 i EIAV.

U drugim primerima proteini omotnice za pseudotipovanje virusa iz ovog rada uklju čuju ali nisu ograničeni na bilo koji od sledećih virusa: grip A poput H1N1, H1N2, H3N2 i H5N1 (ptičji grip), grip B, grip C, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, virus hepatitisa D, virus hepatitisa E, Rotavirus, bilo koji virus iz grupe virusa Norwalk, enteričke adenoviruse, parvovirus, virus Dengue groznice, majmunske boginje, mononegavirale, lyssavirus poput virusa besnila, virus Lagos slepog mi ša, Mokola virus, Duvenhage virus, virus evropskog slepog miša1 i 2 i virus australijskog slepog miša, efemerovirus, vezikulovirus, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), herpesviruse poput virusa herpes simpleksa tipa 1 i 2, varičela zoster, citomegalovirus, virus Epstein-Bar (EBV), ljudske herpesviruse (HHV), ljudski herpesvirus tipa 6 i 8, ljudski virus imunodeficiencije (HIV), virus papiloma, mi šiji gamaherpesvirus, arenaviruse poput virus argentinske hemoragične groznice, virus bolivijske hemoragične groznice, Sabia-povezan virus hemoragične groznice, virus venecuelanske hemoragične groznice, virus Lassa groznice, Machupo virus, virus limfocitskog koriomeningitisa (LCMV), Bunyaviridiae poput Crimean-Congo virusa hemoragičke groznice, hantavirus, virus hemoragične groznice koji uzrokuje renalni sindrom, virus Rift Valley groznice, filoviridae (filovirus) uključujući hemoragičnu groznicu Ebola i Marburg, flaviviridae uključujući virus bolesti Kaysanur Forest, virus Omsk hemoragične groznice, virus koji uzrokuje encefalitis a potiče od krpelja i paramyxoviridae poput Hendra virusa i Nipah virusa, velikih i malih boginja, alphaviruse poput venecuelenskog virusa konjskog encefalitisa, istočnog virusa konjskog encefalitisa, zapadnog virusa konjskog encefalitisa, koronavirusa povezanog sa SARS-om (SARS-CoV), virusa zapadnog Nila, bilo kog virusa koji uzrokuje encefalitis.

U jednom primeru u ovom radu daju se ćelije za pakovanje koje proizvode rekombinantne retroviruse npr. lentivirus, polipeptid sa VSV-G glikoproteinom.

Ovde korišćeni termini "pseudotip" ili "pseudotipovanje" odnose se na viruse čiji su proteini viralnih omotnica zamenjeni onima iz drugog virusa koji poseduje preferirane karakteristike. Na primer, HIV može biti pseudotipovan proteinima omotnice G-proteina virusa vaskularnog stomatitisa (VSV-G), što dozvoljava HIV-u da infektira velik obim ćelija jer proteini omotnice HIV-a (koje kodira env gen) normalno targetiraju virus na ćelije koje predstavljaju CD4+. U prioritetnom otelotvorenju pronalaska proteini lentiviralnih omotnica su pseudotipovani sa VSV-G-om. U jednom primeru, rad pru ža ćelije za pakovanje koje proizvode rekombinantni retrovirus, npr. lentivirus pseudotipovan sa glikoproteinom VSV-G omotnice.

Ovde korišćen termin "linije ćelija za pakovanje" koristi se u odnosu na linije ćelija koje ne sadrže signal za pakovanje, ali pokazuju stabilno ili trajno iskazivanje ekspresije viralnih strukturalnih proteina i replikativnih enzima (npr. gag, pol i env) koji su neophodni za ispravno pakovanje viralnih čestica. Za pripremu ćelija za pakovanje u ovom radu može da se koristi bilo koja prikladna ćelija. Ćelije obično pripadaju sisarima. U specifičnim primerima ćelije za proizvodnju ćelija za pakovanje su ljudske. Ćelije prikladne za upotrebu uključuju, na primer, CHO ćelije, BHK ćelije, MDCK ćelije, C3H 10T1/2 ćelije, FLY ćelije, Psi-2 ćelije, BOSC 23 ćelije, PA317 ćelije, WEHI ćelije, COS ćelije, BSC 1 ćelije, BSC 40 ćelije, BMT 10 ćelije, VERO ćelije, W138 ćelije, MRC5 ćelije, A549 ćelije, HT1080 ćelije, 293 ćelije, 293T ćelije, B-50 ćelije, 3T3 ćelije, NIH3T3 ćelije, HepG2 ćelije, Saos-2 ćelije, Huh7 ćelije, HeLa ćelije, W163 ćelije, 211 ćelije i 211A ćelije. U prioritetnim primerima ćelije za pakovanje su 293 ćelije, 293T ćelije ili A549 ćelije. U drugim prioritetnim primerima ćelije su A549 ćelije.

Ovde korišćen termin "linija ćelija proizvođača" odnosi se na liniju ćelija koja je sposobna za proizvodnju rekombinantnih retroviralnih čestica, uključujući liniju ćelija za pakovanje i konstrukt vektora za transfer koji uključuje signal za pakovanje. Proizvodnja infektivnih viralnih čestica i rastvora virusa može da se izvrši pomoću konvencionalnih tehnika. Metodi pripreme rastvora virusa poznati su u nauci i ilustrovani u npr. Y. Soneoka et al. (\995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, i N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Infektivne čestice virusa mogu da se pokupe iz ćelija za pakovanje uz pomoć konvencionalnih metoda. Na primer, infektivne čestice mogu da se pokupe pomoću lize ili sakupljanja površine ćelijske kulture, kao što je u nauci poznato. Opciono i ukoliko je to poželjno, sakupljene čestice virusa mogu da budu prečišćene. Naučnicima su dobro poznate prikladne tehnike čišćenja.

Isporuka gena ili drugih sekvenci polinukleotida uz pomoć retroviralnog ili lentiviralnog vektora pomoću viralne infekcije pre nego transfekcije naziva se "transdukcija". U jednom primeru retroviralni vektori su transdukovani u ćeliju pomoću infekcije i integracije provirusa. U određenim primerima ciljna ćelija, npr. T ćelija, "transdukovana" je ako uključuje gen ili drugu sekvencu polinukleotida isporučenu u ćeliju putem infekcije korišćenjem viralnog ili retroviralnog vekotra. U specifičnim primerima transdukovana ćelija uključuje jedan ili više gena ili sekvenci polinukleotida isporučenih od strane retroviralnog ili lentiviralnog vektora u njen ćelijski genom.

U specifičnim primerima ćelije domaćina transdukovane viralnim vektorom u ovom radu koje iskazuju ekspresiju jednog ili više polipeptida primenjene su na subjekat u cilju lečenja i/ili prevencije maligniteta B-ćelija. Ostali metodi vezani za upotrebu viralnih vektora u genetskoj terapiji, koji mogu da se koriste prema određenim primerima iz ovog rada, mogu se pronaći u npr. Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N.i Heard, J. M. (1998) HUM. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. i Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. NY. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. i Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; i Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.

G. Genetski modifikovane ćelije

U specifičnim primerima ovaj rad razmatra upotrebu ćelija koje su genetski modifikovane da iskažu ekspresiju pomenutih CAR-ova za lečenje raka. Ovde korišćen termin "genetski inženjerisano" ili "genetski modifikovano" odnosi se ne dodavanje posebnog genetskog materijala u obliku DNK ili RNK ukupnom genetskom materijalu ćelije. Termini "genetski modifikovane ćelije", "modifikovane ćelije" i "preusmerene ćelije" koriste se zamenski. Ovde korišćen termin "genetska terapija" odnosi se ne uvođenje posebnog genetskog materijala u obliku DNK ili RNK u ukupan genetski materijal ćelije, koje vraća, ispravlja ili modifikuje iskazivanje ekspresije gena, ili u svrhu postizanja iskazivanja ekspresije terapeutskog polipeptida, npr. CAR-a.

U specifičnim primerima vektori moji sadrže MND promotor i kodiraju CAR-ove iz ovog pronalaska uvedeni su u ćelije imunog efektora gde vrše iskazivanje ekspresije kako bi preusmerili svoju specifičnost na cilni antigen od interesa. "Ćelija imunog efektora" je bilo koja ćelija imunog sistema koja ima jednu ili više funkcija efektora (npr. aktivnost ubijanja citotoksičnih ćelija, sekreciju citokina, indukciju ADCC i/ili CDC).

Ćelije imunih efektora iz pronalaska mogu biti autologne/autogene ("self") ili neautologne ("non-self", npr. alogeneičke, singeneičke ili ksenogeneičke).

Ovde korišćen termin "autologne" odnosi se na ćelije koje potiču od istog subjekta.

Ovde korišćen termin "alogeneičke" odnosi se na ćelije iz iste vrste koje se genetski razlikuju od ćelije sa kojom se porede.

Ovde korišćen termin "singeneičke" odnosi se na ćelije koje potiču od različitog subjekta, a koje su genetski identične ćeliji sa kojom se porede.

Ovde korišćen termin "ksenogeneičke" odnosi se na ćelije iz različite vrste u odnosu na ćeliju sa kojom se porede. U preferiranim otelotvorenjima ćelije iz pronalaska su alogeneičke.

Ilustrativne ćelije imunih efektora korišćene sa vektorima koje uključuju ranije pomenute CAR-ove uključuju i T ćelije. Termini "T ćelija" ili "T limfocit" poznati su u nauci i uključuju timocite, nezrele T limfocite, zrele T limfocite, T limfocite u mirovanju ili aktivirane T limfocite. T ćelija može biti ćelija T pomagača (Th), na primer, ćelija T pomagača 1 (Th1) ili ćelija T pomagača 2 (Th2). T ćelija može biti pomoćna T ćelija (HTL; CD4<+>T ćelija) CD4+ T ćelija, citotoksična T ćelija (CTL; CD8<+>T ćelija), CD4<+>CD8<+>T ćelija, CD4CD8" T ćelija ili bilo koji drugi podskup T ćelija. Ostale ilustrativne populacije T ćelija prikladnih za upotrebu u posebnim otelotvorenjima uključuju naivne T ćelije i memorijske T ćelije. Stručnjaci razumeju da vektor koju uključuje MND promotor i kodira CAR može biti uveden u drugih ćelija koje takođe mogu da se koriste kao ćelije imunog efektora. Posebno, ćelije imunog efektora takođe uključuju NK ćelije, NKT ćelije, neutrofile i makrofage. Ćelije imunog efektora takođe uključuju praroditelje ćelija efektora gde takve ćelije praroditelja mogu da budu uključene zbog diferencijacije u ćelije imunih efektora in vivo ili in vitro. Tako, u specifičnim otelotvorenjima ćelija imunog efektora uključuje praroditelje ćelija imunih efektora poput hematopoietičnih stem ćelija (HSC-ova) sadržanih u CD34<+>populaciji ćelija izvedenih iz krvi iz pupkovine, koštane srži ili mobilisane periferne krvi koje se po davanju subjektu diferenciraju u zrele ćelije imunog efektora ili koje mogu biti indukovane in vitro kako bi se diferencirale u zrele ćelije imunog efektora.

Ovde korišćene ćelije imunog efektora koje su genetski inženjerisane tako da sadrže vektor koji uključuje MND promotor i kodiraju CAR specifičan za antigen mogu da se nazovu "preusmerene ćelije imunog efektora specifične za antigen".

Ovde korišćen termin "CD34<+>ćelija" odnosi se na ćeliju koja na svojoj površini iskazuje ekspresiju CD34 proteina. Ovde korišćen termina "CD34" odnosi se na glikoprotein sa ćelijske površine (npr. protein sialomucin) koji često deluje kao faktor adhezije među ćelijama i uključen je u ulazak T ćelije u limfne čvorove. Populacija ćelija CD34+ uključuje hematopoietske stem ćelije (HSC), koje se po davanju pacijentu diferenciraju i doprinose svim hematopoietskim rodovima, uklju čujući T ćelije, NK ćelije, NKT ćelije, neutrofile i ćelije rodove monocita/makrofaga.

Ovaj rad daje metode stvaranja ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju prethodno razmatranih CAR-ova. U jednom primeru metod uključuje transfer ili transdukciju ćelija imunog efektora izolovanih iz pojedinca na takav način da iskazuju ekspresiju jednog ili više CAR-ova na prthodno opisan način. U određenim primerima ćelije imunog efektora su izolovane iz pojedinca i genetski modifikovane bez dalje manipulacije in vitro. Takve se ćelije tada mogu direktno ponovo dati pojedincu. U daljim primerima, pre genetskog modifikovanja kako bi izrazile ekspresiju CAR-a, ćelije imunog efektora su prvo aktivirane i stimulisane na širenje in vitro. U tom smislu, ćelije imunog efektora mogu da budu uzgojene pre i/ili nakon genetske modifikacije ( tj. transdukovane ili transfektovane kako bi piskazale ekspresiju prethodno razmatranog CAR-a).

U specifičnim primerima, pre manipulacije in vitro ili genetske modifikacije ovde opisanih ćelija imunog efektora pribavlja se izvor ćelija pribavljenih od subjekta. U specifičnim primerima ćelije imunog efektora sa modifikacijom CAR-a uključuju T ćelije. T ćelije mogu da se pribave iz velikog broja izvora uključujući ali ne ograničavajući se na mononuklearne ćelije iz periferne krvi, koštane srži, tkiva limfnih čvorova, krvi iz pupkovine, tkiva timusa, tkiva sa mesta infekcije, ascitesa, pleuralnog izliva, tkiva slezine i tumora. U određenim primerima T ćelije mogu da se pribave iz jedinice krvi prikupljene od subjekta uz pomoć bilo kojih tehnika poznatih stručnjacima, poput sedimentacije, npr. FICOLL™ separacije.

U jednom primeru ćelije iz cirkulišuće krvi pojedinca pribavljene su aferezom. Proizvod afareze obično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge nukleirane bele krvne ćelije, crvene krvne ćelije i platelete. U jednom primeru ćelije prikupljene aferezom mogu biti oprane u cilju uklanjanja frakcije plazme i njihovog sme štanja u odgovarajući pufer ili medijum za dalju obradu. Ćelije mogu biti oprane PBS-om ili drugim prikladnim rastvorom kojem nedostaje kalcijum, magnezijum i većina, ako ne i svi ostali, divalentni kationi. Naučnici će ceniti informaciju da pranje može da se obavi putem njima poznatih metoda, poput upotrebe poluautomatske proto čne centrifuge. Na primer, procesorom za obradu ćelija Cobe 2991, Baxter Cytomatom ili slično. Nakon pranja ćelije mogu biti resuspendovane u mnoštvo biokompatibilnih pufera ili druge fiziološke rastvore sa ili bez pufera. U određenim primerima nepoželjne komponente uzorka afereze mogu se ukloniti u direktno resuspendovanom medijumu kulture ćelije.

U određenim primerima T ćelije su izolovane iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC-ova) lizijom crvenih krvnih ćelija i iscrpljivanjem monocita, na primer, centrifugiranjem kroz PERCOLL™ gradijent. Specifična podpopulacija T ćelija iskazuje ekspresiju jednog ili više sledećih markera: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO, te može biti dalje izolovana tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. U jednom primeru, specifična podopulacija T ćelija koja iskazuje ekspresiju CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO dalje se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, obogaćivanje populacije T ćelije negativnom selekcijom može se postići kombinacijom antitela usmerenom na površinske markere koji su jedinstveni za negativno selektovane ćelije. Jedan od ovde korišćenih metoda je sortiranje i/ili selekcija ćelija putem negativne magnetske imunološke adherencije ili citometrije protoka koja koristi koktel monoklonskih antitela usmeren na markere površine ćelije koji su prisutni na negativno selektovanim ćelijama. Na primer, za obogaćivanje CD4<+>ćelija negativnom selekcijom, koktel monoklonskih antitela obično uključuje antitela do CD14, CD20, CD1 lb, CD16, HLA-DR i CD8. Za upotrebu u ovom pronalasku takođe mogu da se koriste citometrija protoka i sortiranje ćelija za izolovanje populacija ćelija od interesa.

PBMC može biti direktno genetski modifikovan pomoću vektora koji uključuju MND promotor koji je operativno povezan kako bi iskazao ekspresiju polinukleotida koji kodira prethodno razmatrani CAR. U određenim primerima, nakon izolacije PBMC-a T limfociti se dalje izoluju, a u nekim primerima, citotoksični i T limfociti pomagači mogu se sortirati u naivne, memorijske i efektorske podpopulacije T ćelija, bilo pre ili posle genetske modifikacije i/ili ekspanzije.

CD8<+>ćelije mogu se pribaviti upotrebom standardnih metoda. U nekim primerima CD8<+>ćelije dalje se sortiraju u naivne, ćelije centralne memorijske i ćelije efektora identifikovanjem antigena sa površine ćelije koji su povezani sa svakim od ovih tipova CD8<+>ćelija.

U određenim primerima naivne CD8<+>T limfocite karakteriše iskazivanje ekspresije fenotipskih markera naivnih T ćelija uključujući CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 i CD45RA.

U specifičnim primerima memorijske T ćelije prisutne su u CD62L<+>i CD62L<+>podsetovima CD8<+>limfocita periferne krvi. Nakon bojenja anti-CD62L i anti-CC8 antitelima, PBMC-i se sortiraju u CD62L<+>CD8<+>i CD62L<+>CD8<+>frakcije. U nekim primerima iskazivanje ekspresije fenotipskih markera T ćelija centralne memorije uključuje CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 i CD 127 i negativni su za grancime B. U nekim primerima T ćelije centralne memorije su CD45RO<+>, CD62L<+>i CD8<+>.

U nekim primerima T ćelije efektora negativne su za CD62L, CCR7, CD28 i CD 127, a pozitivne za grancim B i perforin.

U određenim primerima CD4<+>T ćelije se dalje sortiraju u podpopulacije. Na primer, CD4<+>T ćelije pomagača mogu da se sortiraju u naivne, ćelije centralne memorije ili ćelije efektora identifikacijom ćelijskih populacija koje poseduju antigene na površini ćelije. CD4<+>limfociti mogu se pribaviti upotrebom standardnih metoda. U nekim primerima naivni CD4<+>T limfociti su CD45RO<+>, CD45RA<+>, CD62L<+>CD4<+>T ćelije. U nekim primerima ćelije centralne memorije CD4<+>su CD62L pozitivne i CD45RO pozitivne. U nekim primerima ćelije CD4<+>efektora su CD62L i CD45RO negativne.

Ćelije imunog efektora, poput T ćelija, mogu nakon izolacije biti genetski modifikovane uz pomoć poznatih metoda, ili mogu biti aktivirane i pro širene (ili u slučaju praroditelja diferencirane) in vitro pre genetske modifikacije. U specifičnim primerima, ćelije imunog efektora, poput T ćelija, su genetski modifikovane prethodno pominjanim himernim receptorima antigena ( npr. transdukovane viralnim vektorom koji uključuje MND promotor i nukleinsku kiselinu koja kodira CAR) i zatim aktivirane i proširene in vitro. U različitim primerima T ćelije mogu biti aktivirane i proširene pre ili posle genetske modifikacije kako bi iskazale ekspresiju CAR-a, uz pomoć metoda opisanih u, npr. patentima S.A.D. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7, 144,575; 7,067,318; 7, 172,869; 7,232,566; 7, 175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041 i publikaciji za aplikaciju patenata S.A.D. br. 20060121005.

Uopšteno, T ćelije se proširuju pomoću kontakta sa površinom za koju je pričvršćen antigen koji stimuliše CD3 TCR signal povezan sa kompleksom i ligand koji stimuliše ko-stimulativne molekule na površini T ćelije. Populacije T ćelija mogu biti stimulisane kontaktom sa anti-CD3 antitelom ili njenim fragmentom koji vezuje antigen, ili anti-CD2 antitelom imobilisanim na povr šini, ili kontaktom sa aktivatorom protein kinaze C (npr. briostatinom) u konjugaciji sa kalcijum ionoforom. Takođe se razmatra ko-stimulacija dodatnih molekula na površini T ćelija.

U specifičnim primerima PBMC-ovi ili izolovane T ćelije dolaze u kontakt sa stimulativnim ili kostimulativnim agensom, poput anti-CD3 i anti-CD28 antitela, koji je uop šteno pričvršćen za zrnce ili drugu površinu, u medijumu kulture sa prikladnim citokinima poput IL-2, IL-7 i/ili IL-15. Za stimulaciju širenja CD4<+>T ćelija ili CD8<+>T ćelija koriste se anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Primeri anti-CD28 antitela uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diasion, Bezankon, Francuska) i mogu da se koriste kao i drugi metodi poznati u nauci (Berg et al, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al, J. Exp. Med.

190(9): 13191328, 1999; Garland et al, J. Immunol Meth. 227 (1 -2):53-63, 1999). Anti-CD3 i anti-CD28 antitela pričvršćena za isto zrnce služe kao ćelije za prezentovanje "surogatnih" antigena (APC). U drugim primerima T ćelije mogu se aktivirati i stimulisati na širenje pomoću dovodnih ćelija i prikladnih antitela i citokina pomoću metoda opisanih u US6,040,177; US5,827,642 i WO2012129514.

U drugim primerima veštački APC (aAPC) napravljen je inženjeringom K562, U937, 721.221, T2 i C1R ćelija od različitih ko-stimulativnih molekula i citokina kako bi usmerio stabilno iskazivanje ekspresije i sekreciju. U specifičnom primeru K32 ili U32 aAPC-ovi koriste za usmeravanje prikaza jednog ili više stimulativnih molekula na bazi antitela na površini AAPC ćelije. Iskazivanje ekspresije različitih kombinacija gena na aAPC-u omogućava precizno determinisanje zahteva za aktivaciju ljudske T ćelije, poput toga da sAPC-ovi mogu da budu skrojeni za optimalno širenje podskupova T ćelija sa specifičnim zahtevima za rast i različitim funkcijama. Za razliku od korišćenja prirodnih APC-ova, aAPC-ovi podržavaju ex vivo rast i dugoročno širenje funkcionalnih ljudskih CD8 T ćelija bez zahtevanja dodatnih egzogenih citokina. Populacije T ćelija mogu da se prošire uz pomoć aAPC-a sa iskazivanjem ekspresije različitih ko-stimulativnih molekula uključujući ali ne ograničavajući se na CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L), i/ili CD80 ili CD86. Konačno, aAPC-ovi obezbeđuju efikasnu platformu za širenje genetski modifikovanih T ćelija i održavanje CD28 iskazivanja ekspresije na CD8 T ćelijama. aAPC-ovi su dati u WO 03/057171 i US2003/0147869 Al.

U jednom primeru CD34<+>ćelije su transdukovane konstruktom nukleinske kiseline u skladu sa ovim radom. U određenim primerima, nakon primene ne subjektu, uopšteno na subjektu od kojeg su ćelije originalno izolovane, transdukovane CD34+ ćelije diferenciraju se u ćelije imunog efektora in vivo. U drugom primeru CD34+ ćelije mogu da se stimulišu in vitro pre izlaganja genetskoj modifikaciji ili nakon nje pomoću ovde prethodno opisanog CAR-a, sa jednim ili više sledećih citokina: Flt-3 ligand (FLT3), faktor stem ćelija (SCF), faktor rasta i diferencijacije megakariocita (TPO), IL-3 i IL-6 prema prethodno opisanim metodima (Asheuer et al, 2004; Imren, et al, 2004).

Pronalazak obezbeđuje populaciju modifikovanih ćelija imunog efektora za lečenje raka, koje sadrže CAR prikazan u njemu. Na primer, populacije modifikovanih ćelija imunog efektora pripremaju se iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC-ova) dobijenih od pacijenta sa dijagnozom prethodno opisanog maligniteta B ćelija (autologni donori). PBMC-ovi iz heterogenih populacija T limfocita koji mogu biti CD4<+>, CD8<+>ili CD4<+>i CD8<+>.

PBMC-ovi takođe mogu da uključuju druge citotoksične limfocite poput NK ili NKT ćelija. Vektor iskazivanja ekspresije koji uključuje promotor, npr. MND promotor i prethodno pominjana kodna sekvenca CAR-a mogu biti uvedeni u populaciju T ćelija, NK ili NTK ćelija ljudskog donora,. Uspešno transdukovane T ćelije koje nose vektor iskazivanja ekspresije mogu da se sortiraju pomoću citometrije protoka kako bi se izolovale CD3 pozitivne T ćelije, a zatim dalje razmnožene kako bi se povećao broj tih T ćelija sa iskazivanjem ekspresije CAR proteina pored aktivacije ćelija pomoću anti-CD3 ili anti-CD28 antitela i IL-2 ili bilo kojih drugih ovde opisanih naučnih metoda. Za krioprezervaciju T ćelija sa iskazivanjem ekspresije T ćelija CAR proteina koriste se standardne procedure skladištenja i/ili pripreme za ljudski subjekt. U jednom primeru transdukcija in vitro, kultura i/ili širenje T ćelija izvedeni su u odsustvu ne-ljudskih proizvoda dobijenih od životinja poput seruma iz fetusa teleta i seruma iz fetusa goveda. Pošto je heterogena populacija PBMC-ova genetski modifikovana, rezultirajuće transdukovane ćelije su heterogena populacija modifikovanih ćelija koja uključuje ovde razmatrani ciljani CAR specifičan za antigen.

U daljem primeru, mešavina od npr. jednog, dva, tri, četiri, pet ili više različitih vektora iskazivanja ekspresije može da se koristi u genetskom modifikovanju ćelija imunog efektora populacije donora gde svaki vektor kodira različit CAR protien, kao što se ovde razmatra. Rezultirajuće modifikovane ćelije imunog efektora formiraju mešanu populaciju modifikovanih ćelija sa proporcijom modifikovanih ćelija koje iskazuju ekspresiju više od jednog različitog CAR proteina.

U jednom primeru ovaj rad pruža metod skladištenja genetski modifikovanih mišijih, ljudskih ili humanizovanih ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR proteina, uključujući citoprezervaciju ćelija imunog efektora tako da ćelije ostanu održive nakon odmrzavanja. Frakcija ćelija imunog efektora koje pokazuju ekspresiju CAR proteina može da bude citoprezerviran poznatim naučnim metodima kako bi obezbedio stalan izvor takvih ćelija za dalji tretman pacijenata zaraženih rakom. U slučaju potrebe citoprezervirane transformisane ćelije imunog efektora mogu da budu zamrznute, uzgajane ili proširene u cilju dobijanja većeg broja takvih ćelija.

Ovde korišćen termin "citoprezervacija" odnosi se na očuvanje ćelija hlađenjam na temperature ispod nule, obično na 77 K ili -196 °C (tačku ključanja tečnog azota). Citoprotektivni agensi se često koriste ne temperaturama ispod nule u cilju sprečavanja oštećenja čuvane ćelije tokom zamrzavanja na niskim temperaturama ili zagrejavanja na sobnoj temperaturi. Citoprezervativni agensi i optimalne brzine hlađenja mogu da zaštite ćeliju od oštećenja. Citoprotektivni agensi koji mogu da se koriste uključuju ali nisu ograničeni na dimetil sulfoksid (DMSO) (Lovelock i Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirolidin (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), i polietilen glikol (Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). Preferirana brzina hlađenja je 1 C° do 3 °C u minutu. Nakon najmanje dva sata T ćelije dostigle su temperaturu od -80 °C i mogu biti smeštene direktno u tečni azot (-196 °C) radi trajnog skladištenja poput onog u posudi za dugoročno kriogenetsko skladištenje.

H. Sastavi i formulacije

Ovde pominjani sastavi mogu da uključuju jedan ili više polipeptida, polinukleotida, vektora koji obuhvataju iste, genetski modifikovane ćelije imunog efektora, itd. Sastavi uključuju ali nisu ograničeni na farmaceutske sastave. Termin "farmaceutski sastav" odnosi se na sastav formulisan u farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim rastvorima koji služi za primenu na ćeliju ili životinju, bilo sam ili u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih modaliteta. Takođe se podrazumeva da sastavi u pronalasku mogu da se primene u kombinaciji sa drugim agensima poput npr. citokina, faktora rasta, hormona, malih molekula, lekova za hemoterapiju, pro-lekova, lekova, antitela ili drugim razli čitim farmaceutski aktivnim agensima. Praktično ne postoje granice broja drugih komponenata koje takođe mogu biti uključene u sastave, uz uslov da dodatni agensi ne utiču negativno na sposobnost sastava da posluži u nameravanoj terapiji.

Ovde korišćena fraza "farmaceutski prihvatljivo" odnosi ne na one oblike jedinjenja, materijala, sastava i/ili doza koji su, u okviru zdravog medicinskog prosuđivanja, prikladni za kontakt sa tkivima ljudskih bića i životinja bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijske reakcije ili nekog drugog problema ili komplikacije, proporcionalno razumnoj razmeri dobrobit/rizik.

Ovde korišćen termin "farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač ili pomoćni sastojak" bez ograničenja uključuje bilo koji katalizator, nosač, pomoćni sastojak, glidant, zaslađivač, razblaživač, sredstvo za očuvanje, boju, pojačivač ukusa, surfaktant, ovlaživač, sredstvo za raspršivanje, sredstvo za suspendiranje, izotonični agnes, rastvarač ili emulgator odobren od strane Administracije za hranu i lekove S.A.D. kao prihvatljiv za upotrebu kod ljudi i domaćih životinja. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju ali nisu ograničeni na šećere poput laktoze, glukoze i sukroze; skrobove poput kukuruznog i krompirovog skroba; celulozu i njene derivate poput natrijum karboksimetil celuloze, etil celuloze i celuloznog acetata; prirodne gume; slada; želatina; talka; kako putera; voskova; životinjskih i biljnih masti; parafina; silikona; bentonita; silicijumske kiseline; cikovog okisda; ulja poput ulja od kikirikija, ulja od pamuka, ulja šafranike, ulja od susama; maslinovog ulja; kukuruznog ulja ili ulja od soje; glikola poput propilen glikola; poliola poput glicerina, sorbitola, manitola i poelietilen glikola; stera poput etil oleata i etil laurata; puferske agense poput magnezijum hidroksida i aluminijum hidroksida; alginske kiseline; vode bez pirogena; izotoni čnog fiziološkog rastvora; Ringerovog rastvora; etil alkohola; rastvore fosfatnih pufera i bilo koje druge kompatibilne supstance korišćene u farmaceutskim formulacijama.

U određenim otelotvorenjima sastavi iz ovog pronalaska uključuju određenu količinu ćelija imunog efektora ovog pronalaska. Ovde korišćen termin "količina" odnosi se na genetski modifikovanu terapijsku ćeliju sa "efektivnom količinom" ili "efektivnu količinu" genetski modifikovane terapijske ćelije, npr. T ćelije, za postizanje delotvornog ili željenog profilaktičkog ili terapeutskog rezultata, uključujući kliničke rezultate.

Termin "profilaktički efektivna količina" odnosi se na količinu genetski modifikovane terapeutske ćelije koja efektivno postiže željeni profilaktički rezultat. Pošto se profilaktička doza kod subjekta koristi pre bolesti ili u njenoj ranoj fazi, profilaktička količina je tipično ali ne nužno manja od terapeutski efektivne količine.

"Terapeutski efektivna količina" genetski modifikovane terapeutske ćelije može da varira u zavisnosti od faktora poput faze u kojoj se bolest nalazi, životnog doba, pola i težine pojedinca, kao i od sposobnosti stem ćelija i ćelija praroditelja da kod njega izazovu željeni odgovor. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj su svi toksični ili štetni efekti virusa ili transdukovanih terapeutskih ćelija nadmašeni terapeutski blagotvornim efektima. Termin "terapeutski efektivna količina" uključuje količinu koja ima efekta na "tretiranje" subjekta (npr. pacijenta). Kada je terapeutska količina naznačena, preciznu količinu primenljivih sastava iz ovog pronalaska može da odredi doktor, uzevši u obzir individualne razlike u životnom dobu, težini, veličini tumora, stepenu infekcije ili metastaza i stanju pacijenta (subjekta). Uop šteno možemo da izjavimo da farmaceutski spoj koji uključuje ovde opisane T ćelije može da se primerni u dozi od 10<2>do 10<10>ćelija/kg telesne težine, preferirano 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne mase, uključujući sve celobrojne vrednosti u tim obimima. Broj i tip ovde pomenutih ćelija zavisiće od krajnje nameravane upotrebe sastava. Za ovde pomenute upotrebe ćelije se obično nalaze u volumenu od litra ili manje, što može da iznosi 500 ml ili manje, pa čak 250 ml ili 100 ml ili manje. Tako je gustina željenih ćelija tipično veća od 10<6>ćelija/ml i uopšteno veća od 10<7>ćelija/ml, odnosno 10<8>ćelija/ml ili veća. Klinički relevantan broj imunih ćelija može da se podeli u veći broj infuzija koje su kumulativno jednake ili premašuju 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>ili 10<12>ćelija. U nekim primerima, posebno pošto će sve ćelije date infuzijom biti preusmerene na određeni ciljni antigen (npr. ( ili laki lanac), može biti primenjen manji brij ćelija u obimu od 10<6>/kilogram (10<6>-10<11>po pacijentu). Sastavi sa ćelijama koje iskazuju ekspresiju CAR-a mogu da se primene više puta u dozama unutar pomenutog obima. U odnosu na terapiranog pacijenta ćelije mogu biti alogeneičke, singeneičke, ksenogeneičke ili autologne. Po želji i u cilju pospešivanja indukcije imunog odgovora, tretman takođe može da uključuje primenu ovde opisanih mitogena ( npr. PHA) ili limfokina, citokina i/ili hemokina (npr. IFN-& , IL-2, IL-12, TNF-alpha, IL-18, i TNF-beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MlPl # , itd.).

Uopšteno, sastavi koji uključuju ćelije koje su aktivirane i proširene na ovde opisan način mogu da se koriste u tretmanu i prevenciji bolesti koje se javljaju kod imuno-kompromitovanih pojedinaca. Sastavi koji uključuju ovde pominjane T ćelije sa modifikovanim CAR-om posebno se koriste u lečenju raka. T ćelije sa modifikovanim CAR-om iz ovog pronalaska mogu da se primenjuju same ili kao farmaceutski sastav u kombinaciji sa nosačima, razblaživačima, pomoćnim sastojcima i/ili drugim komponentama poput IL-2 ili drugim citokinima ili populacijama ćelija. U određenim otelotvorenjima ovde pomenuti farmaceutski sastavi uključuju određenu količinu genetski modifikovanih T ćelija u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski ili fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača ili pomoćnih sredstava.

Farmaceutski sastavi iz ovog pronalaska koji uključuju populacije ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a, poput T ćelija, mogu da uključuju pufere poput neutralnog puferskog rastvora, fosfatnog puferskog rastvora i sl.; ugljene hidrate poput glukoze, manoze, sukroze ili dekstana; manitol, proteine, polipeptide ili amino kiseline poput glicina; antioksidanse, helatne agense poput EDTA ili glutationa; katalizatore (npr. aluminijum hidroksid) i konzervanse. Sastavi iz ovog pronalaska se preferirano formulišu za parenteralnu primenu npr. intravaskularnu (intravenoznu ili intraarterijsku), intraperitonealnu ili intramuskularnu primenu.

Tečni farmaceutski sastavi, bilo da su u pitanju rastvori, suspenzije ili ostali slični oblici, mogu da uključuju jedno ili više od sledećeg: sterilne razblaživače poput vode za injekcije, rastvor soli preferirano fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, fiksna ulja poput sintetičkih mono ili diglicerida koji mogu da služe kao rastvarač ili suspenzija, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili ostale rastvarače; antibakterijske agense poput benzil alkohola ili metil parabena; antioksidante poput askorbinske kiseline ili natrijum bisulfita; helatne angense poput etilendijamintetraacetične kiseline; pufere poput acetata, citrata ili fosfata i agense za prilagođavanje toničnosti poput natrijum hlorida i dekstroze. Paraenteralna priprema mo že da bude priložena u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili bočicama sa više doza napravljenim od stakla ili plastike. Farmaceutski sastav za ubrizgavanje je poželjno sterilan.

U određenom otelotvorenjima ovde pominjani sastavi uključuju efektivnu količinu ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a, samu ili u kombinaciji sa jednim ili vi še terapeutskih agensa. Tako sastavi ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a mogu da se primenjuju sami ili u kombinaciji sa drugom terapijom za rak, poput terapije zračenjem, hemoterapije, transplantacije, imunoterapije, hormonske tarapije, fotodinamične terapije itd. Sastavi takođe mogu biti primenjeni u kombinaciji s antibioticima. Kako je ovde opisano, takvi terapeutski agensi mogu u nauci biti prihva ćeni kao standardni tretman za stanja određene bolesti, posebno raka. Primerni obrazloženi terapeutski agensi uključuju citokine, faktore rasta, steroide, NSAID-e, DMARD-e, protivupalna sredstva, hemoterapeutike, radioterapeutike, terapeutska antitela ili druge aktivne ili pomo ćne agense.

U određenim otelotvorenjima sastavi koji sadrže ovde pominjanje ćelije imunog efektora koji iskazuju ekspresiju CAR-a mogu biti primenjeni u konjugaciji sa bilo kojim brojem hemoterapeutskih agensa. Ilustrativni primer hemoterapeutskih agnesa uključuje alkilirajuće angense poput tiotepije i ciklofosfahamida (CYTOXAN™); alkil sulfonate poput busulfana, improsulfana i piposulfana; aziridine poput nebzodope, karbokuona, meturedope i uredope; etilenimine i metilamelamine uklju čujući rezime altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforaoramida i trimetilolomelamina; azotne iperite poput hlorambucila, hloranafazina, hlorofosfamida, estramustina, ifsfamida, mehloretamina, mehloretamin oksid hidrohlorida, melfalana, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil iperita; nitrozoureje poput karmustina, hlorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibiotike poput aklacinomizina, antinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, kaktinomicina, kaliheamicina, karabicina, karminomicina, karcinofilina, hromomicina, daktilomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-okso-L-norleucina, doksorubicina, epirubicina, ezorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina, mikofenolne kiseline, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potifromicina, puromicina, kvelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimeksa, zinostatina, zorubicina; antimetabolita poput metotreksata i 5-fluorouracila (5-FU); analoga folne kiseline poput denopterina, metotreksata, pteropterina, trimetreksata; purinskih analoga poput fludarabina, 6-merkaptopurina, tijamiprina, tijoguanina; analoga piramidina poput ancitabina, azacitdina, 6-azuridina, karmofura, citarabina, dideoksiuridina, doksifluridina, enocitabina, floksuridina, 5FU; androgena poput kalusterona, dromostanolon propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; antiadrenergici poput aminoglutetimida, mitotana, trilostana; sredstava za nadopunu folne kiseline poput frolinske kiseline; aceglatona; aldofosfamid glikozida; aminolevulinske kiseline; amsakrina; bestrabucila; bisantrena; edatraksata; defofamina; demekolcina; dijazikvona; elformitina; eliptin acetata; etoglucida; galijum nitrata; hidroksiureje; lentinana; lonidamina; mitoguazona; mitoksantrona; mopidamola; nitrakrina; pentostatina; fenamenta; pirarubicina; podofilinske kiseline; 2-etilhidrazida; prokarbazina; PSK®; razoksana; sizofirana; spirogermanijuma; tenauzonične kiseline; tijazikvona; 2,2',2"-trihlorotrietilamina; uretana; vindesina; dakarbazina; manomustina; mitobranitola; mitolaktola; pipobromana; gacitosina; arabinozida ("Ara-C"); ciklofosfamida; tiotepa; taksoida npr. pacilitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Prinston, Nju Džerzi) i doksataksela (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antoni, Francuska); hlorambucila; gemcitabina; 6-tijoguanina; merkaptopurina; metotreksata; nalaoga platine poput cisplatina i karboplatina; vinblastina; platine; etopozida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoksantrona; vinkristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipozida; dunomicina; aminopterina; kselode; ibandronata; CPT-11; inhibitora topoizomeraze RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivata retinoične kiseline poput Targretin™ (beksarotena), Panretin™ (alitretinoina); ONTAK™ (denileukin diftitoksa); esperamicina; kapecitabina i farmaceutski prihvatljivih soli, kiselina ili njihovih derivata. U ovu definiciju takođe su uključeni i anti-hormonski agensi koji regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore poput anti-estrogena uklju čujući npr. tamoksifen, raloksifen, 4(5)-imadazole koji inhibiraju aromataze, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston); i anti-androgene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i njihove derivate.

U konjugaciji sa ovde opisanim sastavima moguće je koristiti i druge različite terapeutske agenske. U jednom otelotvorenju sastav koji uključuje ćelije imunog efektora koji iskazuju ekspresiju CAR-a primenjuje se sa protivupalnim agensom. Protivupalni agensi ili lekovi uklju čuju ali nisu ograničeni na steroide i glukokortikoide (uključujući betametazon, budezonid, deksametazon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcinolon), nesteroidne protivupalne lekove (NSAIDS) uključujući aspirin, ibuprofen, naproksen, metotreksat, culfasalacin, leflunomid i anti-TNF lekove, ciklofosfamid i mikofenolat.

Drugi uzorni NSAID-ovi izabrani su iz grupe koja se sastoji od ibuprofena, naproksena, naproksen natrijuma, Cox-2 inhibitora poput VIOXX® (rofekoksib) i CELEBREX® (celekoksib), i sijalizata. Uzorni analgetici izabrani su iz grupe koja uključuje acetaminofen, oksikodin, tramadol i proporksifen hidrohlorid. Uzorni glukokortikoidi izabrani su iz grupe koja uključuje kortizon, deksametazon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon ili prednizon. Uzorni modifikatori biolo škog odgovora uključuju molekule usmerene protiv markera ćelijske površine (npr. CD4, CD5, itd.), inhibitore citokina poput TNF antagonista (npr. etanercepta (ENBREL®), adalimumaba (HUMIRA®) i infliksimaba (REMICADE®), hemokine inhibitore i inhibitore adhezivnih molekula. Modifikatori biolo škog odgovora uključuju monoklonska antitela kao i rekombinantne forme molekula. Uzorni DMARD-ovi uključuju azatioprin, ciklofosfamid, ciklosporin, metotreksat, penicilamin, leflunomid, sulfasalacin, hidroksihlorokin, zlato (oralno (auranofin) i intramuskularno) i minociklin.

Ilustrativni primeri terapeutskih antitela prikladnih za kombinovanje sa ovde razmatranim T ćelijama sa modifikovanim CAR-om uključuju ali nisu ograničeni na abagovomab, adekatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuksimab, anatumomab, arkitummab, bavituksimab, bektumomab, bevacizumab, bivatuzumab, bilinatumomab, brentuksimab, kantuzumab, katumaksomab, cetuksimab, citatuzumab, ciksutumumab, klivatuzumab, konatumumab, daratumumab, drizitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ekromeksimab, eltuzumab, ensituksimab, ertumaksomab, etaracizumab, faretuzumab, fiklatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuksimab, ganitumab, gemtuzumab, girentuksimab, glembatumumab, ibritumomab, igovmab, imgatuzumab, indatuksimab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, leksatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lukatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moksetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomab, okaratuzumab, ofatumumab, olaratumumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintomomab, pritumumab, rakotumomab, raderumab, rilotumumab, rituksimab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuksimab, simtuzumab, solitomab, takatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tukotuzumab, ublituksimab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49 i 3F8.

U određenim otelotvorenjima ovde opisani sastavi primenjuju se u konjunkciji sa citokinom. Ovde korišćen termin "citokin" označava generički izraz za proteine koje oslobađa jedna populacija ćelija koji deluju na drugu ćeliju kao međućelijskii medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini i tradicionalni polipeptidni hormoni. Među citokine spadaju hormoni rasta poput ljudskog hormona rasta, N-metionil ljudski hormon rasta i goveđi hormon rasta; paratiroidni hormon, tiroksin, insulin, proinsulin, relaksin, prorelaksin; glikoproteinski hormoni poput hormona koji stimuli še folikule (FSH), hormona koji stimuliše tiroidu (TSH) i luteinizirajućeg hormona (LH); faktor rasta hepatocita; faktor rasta fibroblasta, prolaktin, laktogen placente, antimilerijanski hormon alfa i beta faktora nekroze tumora, mišiji peptid vezan za gonadotropin, inhibin, aktivin, vaskulatorni endotelni faktor rasta, integrin, trombopojetin (TPO), faktori rasta nerava poput NGF-beta, faktor rasta koji poti če iz trombocita, transformišući faktori rasta (TGF-ovi) poput TGF-alfa i TGF-beta, faktor rasta slični insulinu I i II; eritropoietin (EPO); osteoinduktivni faktori, interferoni poput interferon-alfa, beta i -gama; faktori koji stimulišu kolonije (CSF-ovi) poput makrofag-CSF (M-CSF), granulocit-makrofag-CSF (GM-CSF) i granulocit-CSF (G-CSF); interleukini (IL-ovi) poput IL-1, IL-lalpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15; faktor nekroze tumora poput TNF-alfa ili TNF-beta i drugi polipeptidni faktoru uključujući i LIF i kit lingad (KL). Ovde korišćen termin "citokin" uključuje protiene iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture, te biološki aktivne ekvivalente citokina nativne sekvence.

I. Ciljne ćelije i antigeni

Ovaj rad delimično govori o genetski modifikovanim ćelijama imunog efektora preusmerenima na ciljnu ćeliju npr. ćeliju tumora ili raka, koje sadrže CAR-ove sa veznim domenom koji se veže na ciljne antigene na ćelijama. Ovde korišćen termin "rak" uopšteno se odnosi na klasu oboljenja ili stanja u kojima se abnormalne ćelije nekontrolisano dele i mogu da napadnu okolna tkiva. Ćelije raka takođe mogu da se prošire na druge delove tela putem sistema krvi i limfe. Postoji nekoliko glavnih tipova raka. Karcinom je rak koji počinje na koži ili u tkivima koja oblažu ili pokrivaju unutarnje organe. Sarkom je rak koji počinje u kosti, hrskavici, masti, mišiću, krvnim sudovima ili ostalim veznim ili potpornim tkivima. Leukemija je rak koji počinje u tkivima koja stvaraju krv poput koštane srži i uzrokuje produkciju velikog broja abnormalnih krvnih ćelija koje ulaze u krv. Limfom i višestruki mijelom su rakovi koji počinju u ćelijama imunog sistema. Rakovi centralnog nervnog sistema su rakovi koji počinju u tkivima mozga i kičmenog stuba.

Ovde korišćen termin "maligni" odnosi se na rak u kome grupa tumoroznih ćelija pokazuje jedan ili više oblika nekontrolisanog rasta (tj. deljenje izvan normalnih granica), invaziju (tj. napad i uništavanje susednih tkiva) i metastazu (tj. širenje na druge lokacije u telu putem limfe ili krvi). Ovde korišćen termin "metastazirati" odnosi se na širenje raka iz jednog dela tela u drugi. Tumor formiran od ćelija koje su se raširile naziva se "metastatički tumor" ili "metastaza". Matastatički tumor sadrži ćelije nalik onima u originalnom (primarnom) tumoru.

Ovde korišćen termin "benigni" ili "ne-maligni" odnosi se na tumore koji mogu da narastu ve ći ali se ne šire na druge delove tela. Benigni tumori su samoograničeni i obično ne napadaju i ne metastaziraju.

Termin "ćelija raka" ili "ćelija tumora" odnosi se na pojedinačnu ćeliju kanceroznog rasta ili tkiva. Tumor se generalno odnosi na otok ili leziju koja nastaje abnormalnim rastom ćelija, a koja može biti benigna, pre-maligna ili maligna. Većina rakova formira tumore ali neki npr. leukemija, to neophodno ne čine. U slučajevima onih rakova koji formiraju tumore, termini "ćelija raka" ili "ćelija tumora" se koriste zamenski. Količina tumora kod pojedinca naziva se "tumorsko opterećenje" i može se meriti brojem, zapreminom ili težinom tumora.

U jednom otelotvorenju ciljna ćelija izražava ekspresiju antigena, npr. ciljnog antigena koji se suštinski ne nalazi na površini normalne (poželjne) ćelije. U jednom otelotvorenju ciljna ćelija je ćelija parenhima gušterače, ćelija kanala gušterače, ćelija jetre, ćelija srčanog mišića, ćelija skeletnog mišića, osteoblast, skeletni mioblast, neuron, vaskularna endotelna ćelija, ćelija pigmenta, ćelija glatkog mišića, glijalna ćelija, ćelija masti, koštana ćelija, hondrocit, ćelija otoka gušterače, ćelija CNS-a, ćelija PNS-a, ćelija jetre, adipozna ćelija, ćelija bubrega, ćelija pluća, ćelija kože, ćelija jajnika, folikularna ćelija, epitelna ćelija, imuna ćelija ili endotelna ćelija.

U određenim otelotvorenjima ciljna ćelija je deo tkiva gušterače, neuralnog tkiva, srčanog tkiva, koštane srži, mišićnog tkiva, koštanog tkiva, tkiva kože, tkiva jetre, folikula kose, vaskularnog tkiva, adipoznog tkiva, tkiva pluća i tkiva bubrega.

U određenom otelotvorenju ciljna ćelija je ćelija tumora. U drugom specifičnom otelotvorenju ciljna ćelija je ćelija raka, poput ćelije kod pacijenta sa rakom. Uzorne ćelije koje mogu biti ubijene prikazanim metodima uključuju ćelije sledećih tumora: tumore tečnosti poput leukemije uključujući i akutnu leukemiju (poput akutne limfocitske leukemije, akutne mijelocitske leukemije i mijeloblastičke, promijelocitičke, mijelomonocitičke, monocitičke i eritroleukemije), hroničnih oblika leukemije (poput hronične mijelocitičke (granulocitičke) leukemije i hronične leukemije limfocita), policitemiju vera, limfome, Hodžkinsovu bolest, ne-Hodžkinsov limfom, multiple mijelome, Valdenštromovu makroglobulinemiju, bolest teškog lanca.

U drugom otelotvorenju ćelija je ćelija čvrstog tumora poput sarkoma i karcinoma, fibrosarkoma, miksosarkoma, liposrakoma, hondrosarkoma, osteogeničkog sarkoma i ostalih, sinovioma, mezotelioma, Juingovog tumora, leiomiosarkoma, rabdomiosarkoma, karcinoma debelog creva, raka gušterače, raka dojke, raka jajnika, raka prostate, hepatocelularnog karcinoma, raka plu ća, kolorektalnog raka, karcinoma skvamoznih ćelija, karcinoma bazalnih ćelija, adenokarcinoma (npr. adenokarcinoma gušterače, debelog creva, jajnika, pluća, dojke, stomaka, prostate, grlića materice ili jednjaka), karcinoma znojnih žlezda, karcinoma lojnih žlezda, papilarnog karcinoma, papilarnog adenokarcinoma, karcinoma moždine, bronhogeničnog karcinoma, karcinoma bubrežnih ćelija, hepatoma, karcinoma žučne kese, horiokarcinoma, Vilmovog tumora, raka grlića materice, tumora testisa, karcinoma bešike, tumora CNS-a (poput glioma, astrocitoma, meduloblastoma, kraniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, akusti čnog neuroma, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma i retinoblastoma).

U jednom otelotvorenju rak je izabran iz grupe koja uključuje: Vilmov tumor, Juingov sarkom, nuroendokrini tumor, glioblastom, neuroblastom, melanom, rak kože, rak dojke, rak debelog creva, rak rektuma, rak prostate, rak jetre, rak bubrega, rak gušterače, rak pluća, rak žučne kese, rak grlića materice, rak endometrija, rak jednjaka, rak želuca, rak glave i vrata, medularni karcinom štitne žlezde, rak jajnika, gliom, limfom, leukemiju, hroničnu limfocitsku leukemiju, akutnu mijelogenoznu leukemiju, Hodžkinsov limfom, ne-Hodžkinsov limfom i rak bešike.

U jednom otelotvorenju ciljna ćelija je maligna ćelija jetre, gušterače, pluća, doke, bešike, mozga, kosti, štitne žlezde, bubrega, kože i hematopoetskog sistema. U drugom otelotvorenju ciljna ćelija je ćelija u raku jetre, raka gušterače, raka pluća, raka dojke, raka bešike, raka mozga, raka kosti, raka štitne žlezde, raka bubrega, raka kože ili hematološkog raka.

U jednom otelotvorenju ciljni antigen je epitop receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida.

J. Terapeutski metodi

Ovde pominjane genetski modifikovane T ćelije obezbeđuju poboljšane metode adoptivne imunoterapije za upotrebu u tretiranju različitih tumora i rakova. U određenim otelotvorenjima specifičnost primarne T ćelije je preusmerena na ćelije tumora ili raka uz pomoć genetske modifikacije primarne T ćelije prethodno razmatranim CAR-om. U različitim primerima viralni vektor se koristi za genetsko modifikovanje ćelije imunog efektora sa polinukleotidom koji uključuje MND promotor i kodira CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen, transmembranski domen koji uključuje TM domen dobijen iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8# ; CD4, CD45, PD1 i CD 152, i kratkog oligo- ili polipeptidnog linkera, po mogućnosti dugog između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kisleina koji povezuje TM domen sa unutarćelijskim signalnim domenom CAR-a; i jedan ili više unutarćelijskih ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137; i CD3C, primarno signalnog domena.

U jednom primeru ovaj rad uključuje tip ćelijske terapije gde su T ćelije genetski modifikovane da izraze ekspresiju CAR-a koji targetira ćelije raka koje izražavaju ekspresiju ciljnog antigena, pa se CAR T ćelija infuzijom daje pacijentu kojem je potrebna. Ta ćelija sposobna je za ubijanje ćelija tumora kod primaoca. Za razliku od terapija antitelima, CAR T ćelije sposobne su za replikaciju in vivo što za rezultat ima dugotrajnu istrajnost koja može dovesti do održive terapije raka.

U jednom primeru CAR T ćelije ovog pronalaska mogu da prođu snažnu in vivo ekspanziju T ćelija, te da opstanu tokom produženog vremenskog perioda. U drugom primeru CAR T ćelije ovog pronalaska evoluiraju u T ćelije sa specifičnom memorijom koje mogu da se reaktiviraju kako bi inhibirale svako dodatno formiranje tumora ili njegov rast.

U posebnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruije CAR koriste se u lečenju čvrstih tumora ili rakova koji bez ograničenja uključuju rak jetre, rak gušterače, rak pluća, rak dojke, rak bešike, rak mozga, rak kosti, rak štitne žlezde, rak bubrega ili rak kože.

U specifičnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop PSCA ili MUC1 koriste se za lečenje raka gušterače.

U specifičnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop EPHA2, EGFRvIII ili CSPG4 koriste se za lečenje glioblastoma multiforme.

U posebnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop PSCA ili MUC1 koriste se za lečenje raka bešike.

U specifičnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop PSCA ili GD2 koriste se za lečenje raka pluća.

U specifičnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop CSPG4 ili HER2 koriste se za lečenje raka dojke, npr. trostruko negativnog raka dojke.

U specifičnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop GD2 ili CSPG4 koriste se za lečenje melanoma.

U specifičnim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora genetski modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno vezan za polinukleotid koji šifruje CAR koriste se za lečenje tumora tečnosti, uključujući leukemiju, akutnu leukemiju (npr. ALL, AML i mijeloblaste, promijelocitičku, mijelomonocitičku, monocitičku i eritroleukemiju), hronične oblike leukemije (npr. CLL, SLL, CML, HCL), policitemiju vera, limfom, Hodžkinsovu bolest, ne-Hodžkinsov limfom, multipli mijelom, Valdenštromovu makroglobulinemiju i bolesti teškog lanca.

U određenim primerima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora modifikovanu vektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koriste se za lečenje maligniteta B-ćelija, uključujući ali ne ograničavajući se na multipli mijelom (MM), ne-Hodžkinsov limfom (NHL) i hroničnu leukemiju limfocita (CLL).

Multipli mijelom je malignitet B-ćelija morfologije zrelih ćelija plazme koji karakteriše neoplastična transformacija jednostrukog klona ovog tipa ćelija. Te ćelije plazme razmnožavaju se u BM-u i mogu da napadnu okolnu kost, a ponekad i krv. Varijante multiplog mijeloma uklju čuju otvoreni mulpli mijelom, tinjajući multipli mijelom, leukemiju ćelija plazme, ne-sekretorni mijelom, IgD mijelom, osteosklerotični mijelom, usamljeni plazmacitom kosti i ekstramedularni plazmacitom (videti npr. Braunwald, et al. (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15. izdanje (McGraw-Hill 2001)).

Ne-Hodžkinsov limfom obuhvata veliku grupu rakova limfocita (belih krvnih ćelija). Ne-Hodžkinsovi limfomi mogu da se pojave u bilo kom dobu i često su obeleženi limfnim čvorovima koji su veći od normale, groznicom i gubitkom telesne težine. Postoji mnogo različitih tipova ne-Hodžkinsovog limfoma. Na primer, ne-Hodžkinsov limfom može da se podeli na agresivni (brzorastući) i indolentni (spororastući) tip. Iako se ne-Hodžkinsovi limfomi mogu izvesti iz B-ćelija i T-ćelija, kao što je ovde naznačeno, termini "ne-Hodžkinsov limfom" i "ne-Hodžkinsov limfom B-ćelija" se koriste zamenski. Ne-Hodžkinsov limfom B-ćelija (NHL) uključuje Burkitov limfom, hroničnu limfocitičku leukemiju/mali limfocitički limfom (CLL/SLL), difuzni limfom velikih B-ćelija, folikularni limfom, imunoblastični limfom velikih ćelija, prekursorski B-limfoblastični limfom i limfom plašta ćelije. Limfomi koji se pojavljuju nakon transplantacije koštane srži ili stem ćelija su obično limfomi B-ćelija ili ne-Hodžkinsovi limfomi.

Hronična leukemija limfocita (CLL) je indolentan (spororastući) rak koji uzrokuje sporo povećanje broja nezrelih belih krvnih ćelija zvanih B limfociti ili B ćelije. Ćelije raka šire se putem krvi i koštane srži, a takođe mogu da utiču na limfne čvorove ili druge organe poput jetre i slezine. CLL na posletku uzrokuje prestanak funkcionisanja koštane moždine. Ponekad, u kasnijim fazama bolesti, ona se naziva malim limfocitičnim limfomom.

U specifičnim primerima dati su metodi koji uključuju primenu terapeutski efektivne količine ovde razmatranih ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a ili sastava koji ih sadrži, kod pacijenta koji za njima ima potrebu, bilo samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili vi še terapeutskih agensa. U određenim otelotvorenjima ćelije iz ovog pronalaska koriste se za lečenje pacijenata koji spadaju u rizičnu grupu za razvijanje raka. Tako ovaj rad pruža metode za lečenje ili prevenciju raka, uključujući primenu na subjektu koji za tim ima potrebu terapeutski efektivne koli čine T ćelija sa modifikovanim CAR-om iz ovog pronalaska.

Ovde korišćeni termini "pojedinac" i "subjekt" se često koriste zamenski i odnose se na bilo koju životinju koja pokazuje simptom raka koji je moguće tretirati vektorima genetske terapije, terapeuticima zasnovanim na ćelijama i ovde opisanim metodima. Prikladni subjekti (npr. pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (poput miša, pacova, zeca ili morskog praseta), životinje sa farme i domaće životinje ili ljubimce (poput mačke ili psa). U prikladne subjekte takođe su uključeni ne-ljudski primati i poželjno je ljudski pacijenti. Tipični subjekti uključuju pacijente obolele od raka, one kojima je rak dijagnostikovan ili koji spadaju u rizičnu grupu.

Ovde korišćeni termini "pacijent" odnosi se na subjekta kom je dijagnostikovan određeni rak koji je moguće tretirati vektorima genetske terapije, terapeuticima zasnovanim na ćelijama i ovde razmatranim metodima.

Ovde korišćeni termini "tretman" ili "tretiranje" uključuju svaki blagotvorni ili poželjni efekat na simptome ili patologiju bolesti ili fiziološko stanje, i mogu da obuhvataju čak i minimalne reakcije jednog ili više merljivih markera tretirane bolesti ili stanja, npr. raka. Tretman može opciono da uključuje smanjenje ili poboljšanje simptoma bolesti ili stanja, ili odlaganje napredovanja bolesti ili stanja. Termin "tretman" neophodno ne označava potpuno iskorenjivanje ili izlečenje bolesti ili stanja, kao ni njihovih simptoma.

Ovde korišćen termin "sprečiti" i slične reči poput "sprečeno", "sprečavanje" itd. označavaju pristup za sprečavanje, inhibiranje ili smanjenje verovatnosti pojave ili ponovne pojave bolesti ili stanja, npr. raka. Takođe se odnosi na odlaganje početka ili ponovne pojave bolesti ili stanja ili odlaganje pojave ili ponovne pojave simptoma bolesti ili stanja. Ovde kori šćen termin "prevencija" i slične reči uključuju smanjenje intenziteta, efekata, simptoma i/ili optere ćenja bolesti ili stanja pre početka ili ponovne pojave bolesti ili stanja.

Termini "poboljšati" ili "promovisati" ili "pojačati" ili "proširiti" uopšteno se odnose na sposobnost ovde razmatranih sastava npr. genetski modifikovanih T ćelija ili vektora koji kodira CAR da proizvedu, izazovu ili uzrokuju veći fiziološki odgovor (tj. opadajući efekat) u poređenju sa odgovorom koji je posledica sredstva ili kontrolne molekule/sastava. Između ostalih očiglednih ovde opisanih značenja i značenja poznatih nauci, merljiv fiziološki odgovor može da uključi pojačano širenje, aktivaciju, održivost T ćelija i/ili povećanje sposobnosti ubijanja ćelija raka. "Povećana" ili "pojačana" količina je obično "statistički značajna" količina i može da uključi povećanje od 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr. 500, 1000 puta) (uključujući sve cele i decimalne brojeve između, kao i iznad 1, npr. 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, itd.) odgovora koji izaziva sredstvo ili kontrolni sastav.

Pod "smanjenjem" ili "snižavanjem" ili "umanjenjem", "redukcijom" ili "snižavanjem" uopšteno se podrazumeva sposobnost ovde razmatranog sastava da proizvede, izmami ili izazove manji fiziolo ški odgovor (npr. opadajuće efekte) u poređenju sa odgovorom izazvanim sredstvom ili kontrolnom molekulom/sastavom. "Smanjena" ili "redukovana" količina je obično "statistički značajna" količina i može da uključi smanjenje od 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr. 500, 1000 puta) (uključujući sve cele i decimalne brojeve između, kao i iznad 1, npr. 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, itd.) odgovora (referentnog odgovora) koji proizvodi sredstvo, kontrolni sastav, ili odgovora u posebnoj liniji ćelija.

Pod "održavanjem" ili "očuvanjem" ili izrazima "bez promene" ili "bez suštinske promene" ili "bez suštinskog smanjenja" uopšteno se podrazumeva sposobnost ovde razmatranog sastava da proizvede, izmami ili izazove manji fiziološki odgovor (npr. opadajuće efekte) u ćeliji u poređenju sa odgovorom izazvanim sredstvom ili kontrolnom molekulom/sastavom, ili odgovorom u posebnoj liniji ćelija. Komparabilan odgovor je onaj koji se značajno ili merljivo ne razlikuje od referentnog odgovora.

U jednom primeru metod tretiranja raka kod subjekta kome je to potrebno uklju čuje primenu efektivne količine, npr. terapeutski efektivne količine, sastava koji uključuje ovde razmatrane genetski modifikovane ćelije imunog efektora. Količina i frekvencija primene biće određena faktorima poput stanja pacijenta i tipa i ozbiljnosti bolesti, iako se prikladne doze mogu utvrditi klini čkim opitima.

U određenim primerima može biti poželjna primena aktiviranih T ćelija kod subjekta i posledično povlačenje krvi (ili izvođenje apereze), aktiviranje T ćelija iz nje i njeno ponovno davanje pacijentu zajedno sa aktiviranim i proširenim T ćelijama. Ovaj proces može da se sprovede nekoliko puta svakih nekoliko nedelja. U određenim primerima T ćelije mogu biti aktivirane iz količine od 10cc do 400cc povučene krvi. U određenim primerima T ćelije su aktivirane iz količina od 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc ili 400cc ili više povučene krvi. Nezavisno od bilo koje teorije, protokol mnogostrukog povlačenja krvi/mnogostruke reinfuzije može da služi za selektovanje određenih populacija T ćelija.

Primena ovde razmatranih sastava može da se sprovede na bilo koji prikladan način, uključujući inhalaciju aeroslola, injekcije, gutanje, transfuziju, implantaciju ili transplantaciju. U prioritetnim primerima sastavi se primenjuju paraenteralno. Ovde kri šćene fraze "paraenteralna primena" ili "paraenteralno primenjeno" odnose se na načine primene koji isključuju enteralnu i topičku primenu, provode se obično injektiranjem, te bez ograničenja uključuju intravaskularne, intravenozne, intramuskularne, intraarterijske, intrateklane, intrakapsularne, intraorbitalne, intratumorske, intrakardijalne, intradermalne, intraperitonealne, transtrahealne, subkutane, subkutikularne, intraartikularne, subkapsularne, subarahnoidne, intraspinalne i intrasternalne injekcije i infuzije. U jednom primeru ovde razmatrani sastavi se kod subjekta primenjuju direktnim injektiranjem u tumor, limfni čvor ili zaraženo mesto.

U jednom primeru kod subjekta je primenjena efektivna količina sastava u cilju povećanja ćelijskog imunog odgovora na rak. Imuni odgovor može da uključi ćelijske imune odgovore kod kojih posreduju odgovori citotoksičnih T ćelije sposobnih za ubijanje zaraženih ćelija, regulatornih T ćelija ili T ćelija pomoćnika. Takođe mogu da budu uključeni humoralni imuni odgovori kod kojih primarno posreduju T ćelije pomoćnici sposobne za aktiviranje B ćelija, što dovodi do proizvodnje antitela. Za analizu imunih odgovora izazvanih sastavima iz ovog pronalaska mogu da se koriste razne tehnike koje su u nauci dobro opisane, npr. Current Protocols in Immunology, urednici: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, NY.

U slučaju ubijanja kod kojeg posreduju T ćelije, vezivanje liganda CAR-a pokreće signalizovanje CAR-a T ćeliji, što za rezultat ima aktivaciju različitih signalnih puteva T ćelija koji kod njih izazivaju proizvodnju ili oslobađanje proteina sposobnih za izazivanje apoptoze ciljnih ćelija putem različitih mehanizama. Ti mehanizmi kod kojih posreduju T ćelije uključuju (ali nisu ograničeni na) prenos unutarćelijskih citotoksičnih granula iz T ćelije u ciljnu ćeliju, sekreciju pro-zapaljivih citokina iz T ćelije koji mogu da izazovu direktno ubistvo ciljne ćelije (ili njeno indirektno ubistvo putem regrutovanja drugih ćelija efektora za ubijanje) i uzlaznu regulaciju linganda receptora smrti (npr. FasL) na površini T ćelije koji izazivaju apoptozu ciljne ćelije koja sledi iza vezivanja njima srodnog receptora smrti (npr. Fas) na ciljnu ćeliju.

U jednom primeru ovaj rad prikazuje metod lečenja subjekta sa dijagnozom raka koji uključuje uklanjanje ćelija imunog efektora iz njega, njihovo genetsko modifikovanje ovde razmatranim vektorom koji uključuje nukleinsku kiselinu koja šifruje CAR, čime se proizvodi populacija modifikovanih ćelija imunog efektora koje se zatim primenjuju na isti subjekat. U prioritetnim primerima ćelije imunog efektora uključuju T ćelije.

U određenim primerima ovaj rad takođe prikazuje metode stimulisanja odgovora imunog modulatora kod koga posreduju ćelije imunog efektora na populaciju ciljnih ćelija kod subjekta, a koje uključuju korake primene populacije ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju konstrukta nukleinske kiseline koja šifruje molekul CAR-a.

Ovde opisani metodi primene ćelijskih sastava uključuju svaki metod koji efektivno rezultuje ponovnim uvođenjem ex vivo genetski modifikovanih ćelija imunog efektora koje ili direktno iskazuju ekspresiju CAR-a iz pronalaska kod subjekta ili na ponovno uvođenje genetski modifikovanih praroditelja ćelija imunog efektora koji se po primeni na subjekat diferenciraju u zrele ćelije imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a. Jedan metod uključuje transdukciju T ćelija iz periferne krvi ex vivo sa konstruktom nukleinske kiseline u skladu sa pronalaskom i vraćanje transdukovanih ćelija u subjekat.

U određenim primerima receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-I, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligandi, NY-ESO-I, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ovi ili VEGFR2 polinukelotidi, polipetidi, fragmenti polipeptida ili njihova antitela predstavljaju deo metoda prateće dijagnostike, obično zbog procene da li će subjekat ili populacija subjekata povoljno odgovoriti na poseban medicinski tretman.

Ovde korišćen termin "prateća dijagnostika" odnosi se na dijagnostički test povezan sa terapijom posebnim CAR-om ili genetski modifikovanom ćelijom imunog efektora. U određenom primeru dijagnostički metodi i oprema uključuju detekciju nivoa iskazivanja ekspresije receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida ili polinukleotida u biološkom uzorku, što dozvoljava brzu identifikaciju pacijenata koji su pogodni za tretman u skladu sa ovim radom.

Na primer, dati terapeutski agens za rak (npr. ovde razmatrani CAR ili genetski modifikovane ćelije imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a ) mogu da se identifikuju kao prikladne za subjekat ili određenu populaciju subjekata na osnovu toga da li subjekat ili subjekti poseduju jedan ili više izabranih biomarkera za datu bolest ili stanje. Primeri biomarkera uklju čuju markere seruma/tkiva, kao i markere koji mogu da se identifikuju tehnikama medicinskog snimanja. U određenim primerima receptor alfa folata, 5T4, #vβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligandi, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ovi ili VEGFR2 fragmenti polipeptida (ili njima odgovarajućih polinukleotida) sami mogu da daju serum i/ili biomarker tkiva koji može da se upotrebi za merenje ishoda leka ili procenu poželjnosti leka korišćenog kod određenog subjekta ili specifične populacije subjekata. U određenom aspektima identifikacija indikacije pogodne za lečenje koja iskazuje ekspresiju receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 referentne sekvence polipeptida ili polinukleotida može da uključi karakterizacije diferencijalnih izražaja ekspresije te sekvence, bilo kod izabranog subjekta, izabranog tkiva ili druga čije, kao što je ovde opisano i poznato u nauci.

U određenom primeru ovde razmatrani metodi uključuju merenje ili kvantifikovanje nivoa premRNA, mRNA ili iskazivanje ekspresije receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R# 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida u raku subjekta. U jednom primeru subjekt je identifikovan na osnovu određenog raka pogodnog za tretiranje ovde razmatranim sastavom ako je iskazivanje ekspresije markera u biološkom uzorku 10, 25, 50, 100 ili 1000 puta veće od iskazivanja ekspresije markera u kontrolnom uzorku ili poznatom standardu. U specifi čnom primeru subjekt je identifikovan na osnovu indikacije pogodne za tretiranje ako je iskazivanje ekspresije biomarkera u biološkom uzorku otkriveno, a iskazivanje ekspresije markera u kontrolnom uzorku ili poznatom standardu koji isti metod koristi nalazi se ispod nivoa otkrivanja.

Prisustvo, odsustvo ili relativni nivoi iskazivanja ekspresije proteina biomarkera u potencijalnom raku može se analizirati putem npr. histohemijskih tehnika, imunolo ških tehnika, elektrofosforeze, Vestern blot analize, FASC analize, citometrije protoka i sl. Pored toga mo že da se otkrije prisustvo, odsustvo ili relativni nivoi iskazivanja ekspresije biomarkera RNK npr. pomo ću PCR tehnika, Nordern blot analize, upotrebom prikladnih oligonukleotidnih proba i sl.

Iako je gorepomenuti pronalazak detaljno opisan ilustrovanjem i primerom u svrhu jasnog razumevanja, u svetlu učenja iz njega naučniku će biti očigledno da se u mogu napraviti određene izmene i modifikacije. Sledeći primeri dati su samo ilustrativno. Naučnici će spremno prepoznati razne nekritičke parametre koji mogu biti izmenjeni ili modifikovani u cilju pružanja suštinski istih rezultata. PRIMERI PRIMER 1:

Konstruisanje CAR-ova

1. CD19 specifični CAR (pMND-CD19 CAR)

CD 19 specifični CAR-ovi dizajnirani su tako da sadrže MND promotor koji je operativno povezan sa anti--CD 19 scFv-om, zglobnim domenom ili transmembranskim domenom CD8# i CD 137 kostimulativnim domenom, propraćenim unutarćelijskim signalnim domenom lanca CD3# . Slika 1A. CD 19 CAR uključuje sekvencu CD8# jednostrukog peptida (SP) za površinsko iskazivanje ekspresije na ćelijama imunog efektora. Polinukleotidna sekvence pMND-CD19 CAR-a prikazana je pod BR. ID. SEKV.: 2, a vektorska mapa prikazana je na Slici 2. Tabela 3 prikazuje Identitet, Referencu banke gena, Ime izvora i Citat za različite segmente nukleotida lentiviralnog vektora pMND-CD19 CAR-a.

Tabela 3.

2. CAR specifičan za Kappa laki lanac (kappaLC) (pMND-kappa CAR)

CAR-ovi specifični za Kappa laki lanac dizajnirani su tako da sadrže MND promotor koji je operativno povezan sa scFv-om anti-kappa lakog lanca, zglobnim domenom ili transmembranskim domenom iz ko-stimulativniih domena CD8# i CD 137, propraćenim unutarćelijskim signalnim domenom lanca CD3# . Slika 1B. KappaLCCAR uključuje sekvencu CD8# jednostrukog peptida (SP) za površinsko iskazivanje ekspresije na ćelijama imunog efektora. Polinukleotidna sekvence pMND-kappaLCCAR-a prikazana je pod BR. ID. SEKV.: 3, a vektorska mapa prikazana je na Slici 3. Tabela 4 prikazuje Identitet, Referencu banke gena, Ime izvora i Citat za različite segmente nukleotida lentiviralnog vektora pMND-kappa lakog lanca CAR-a.

Tabela 4.

PRIMER 2:

TRANSDUKCIJA ĆELIJA

Površinske rezidue lentiviralnog vektora (LV) proizvode se u HEK 293T ćelijama kao što je opisano u literaturi (Naldini et al, 1996, Dull et al, 1998 i Zufferey et al, 1998). Prelazna transfekcija 5-plazmida (HPV 275 koji šifruju HIV gag pol, * /N 15 koji šifruje VSV-G protein omotnice, p633 koji šifruje HIV rev protein, HPV601 koji šifruje HIV tat protein i vektor koji iskazuje ekspresiju CAR-a) koriste se prema opisu u PCT Publ. br. WO2012/170911. Površinske rezidue LV se zatim koncentriraju bilo ultracentrifugiranjem ili kolonom za razmenu iona iza koje sledi tangencijalna filtracija protoka (TFF), formulišu u SCGN medijum (CellGenix Inc., Nemačka) i citporezerviraju na <-70°C u kriobočicama za jednokratnu upotrebu. Infektivni titeri određuju se citometrijskom analizom protoka transdukovanih ćelija ljudskih osteosarkoma (HOS) (Kutner et al, 2009, Nature Protocols 4:495-505). Za transdukovanje ljudskih T limfocita, primarne humane T ćelije izoluju se od zdravih donora volontera iza čega sledi leukapereza po negativnoj selekciji pomoću RosetteSep opreme (tehnologija stem ćelija). T ćelije se gaje u RPMI 1640 dopunjenom sa 10% FCS-a, 100 U/ml penicilina, 100 g/ml streptomicin sulfata, 10 mM Hepesa i stimulisanom sa magnetnim zrncima prekrivenim anti-CD3/anti-CD28 antitelima u razmeri ćelija i zrnaca 1:3. Za CD8 T ćelije, finalnoj koncentraciji od 30 IU/ml svakog drugog dana dodaje se ljudski IL-2 (Hiron). Približno 24 h nakon aktivacije T ćelije se transdukuju lentiviralnim vektorima pri MOI od 5. Evaluacija trandsdukcije T ćelija obavlja se reakcijom lanca polimeraze uz korišćenje prajmera specifičnih za viralni vektor i citometrijom protoka koje slede 7 do 10 dana nakon transdukcije.

PRIMER 3

VCN CAR TRANSDUKOVANIH ĆELIJA

Određen je broj vektorskih kopija za transdukciju primarnih ljudskih T ćelija sa pMND-kappaLc CAR lentivirusom. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifičnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljene bez tretmana. Kulture su održavane tako da dozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširile približno 2 loga.

Broj kopija vektora (VCN) integrisanih lentiviralnih čestica bio je određen metodom q-PCR devet dana nakon transdukcije. Aritmetička sredina VCN-a za 12 jedinstvenih kultura od 6 donora iznosila je 3,1. Slika 4.

PRIMER 4

ISKAZIVANJE EKSPANZIJE CAR-a U TRANSDUKOVANIM T ĆELIJAMA

Na primarnim ljudskim T ćelijama određeno je iskazivanje ekspresije površine ćelije za CAR-ove specifične za kappa ekspresiju iz MND promotora (pMND-kappaLcCAR). Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifi čnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljene bez tretmana. Kulture su odr žavane tako da dozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširile približno 2 loga.

Iskazivanje ekspresije KappaLcbilo je određeno citometrijom protoka korišćenjem antitela specifičnih za lg miša (BD Biosciences) koja su isključivo prisutna na pMND- kappaLcT ćelijama sa modifikovanim CAR-om. Citometrija protoka obavljena je šest do devet dana nakon transdukcije. Nivo iskazivanja ekspresije aritmetičke sredine kappaLciz 12 jedinstvenih kultura od 6 donora iznosio je 35,6%. Slika 5.

PRIMER 5

MND PROMOTOR POKREĆE IZRAŽAVANJE EKSPRESIJE CAR-a U T ĆELIJAMA UPOREDIV SA EFIA PROMOTOROM CD 19 CAR ekspresija pokrenuta MND promotorom na modifikovanim T ćeijama bila je uporediva sa CD 19 CAR ekspresijom pokrenutom EFI# promotorom. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifi čnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljene bez tretmana. Kulture su odr žavane tako da dozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširile približno 2 loga. Na kraju kulture transdukcija T ćelija bila je ispitana kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze (qPCR) uz pomoć prajmera specifičnih za viralne čestice. Iskazivanje ekspresije CD 19 CAR-a bilo je određeno šest dana nakon transdukcije citometrijom protoka uz pomoć korišćenja antitela specifičnih za lg miša (BD Biosciences) koja su isključivo prisutna na CD 19 T ćelijama sa modifikovanim CAR-om. Iskazivanje ekspresije CD19 CAR-a i VCN različitih konstrukata bili su uporedivi. Slika 6.

PRIMER 6

REAKTIVNOST SPECIFIČNA ZA ANTIGEN T ĆELIJA CAR-a

Utvrđena je reaktivnost specifična za antigen pMND kappaLcCAR T ćelija. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifičnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljene bez tretmana. Kulture su održavane tako da dozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširile približno 2 loga.

Na kraju kulture reaktivnost tumora bila je ispitana uz pomoć interferon-gama otpuštanja (IFNy). T ćelije modifikovane pMND- kappaLcCAR-om luče IFN& nakon ko-kulturisanja sa ćelijama kappa<+>Daudi (iskazuju ekspresiju kappaLc). Za razliku od toga, ko-kulture T ćelija modifikovanih pMND-kappaLcCAR-om sa kappa-negativnim HDLM-2 ćelijama rezultovale su oslobađanjem IFN& uporedivog sa količinom primećenom kada su T ćelije bile uzgajane same. Oslobađanje IFN& bilo je utvrđeno korišćenjem ELISA opreme nakon 24 časa ko-kulturisanja sa kappa-pozitivnim Daudi ili kappanegativnim HDLM-2 ćelijama. Slika 7.

PRIMER 7

ANTI-TUMORSKA FUNKCIJA T ĆELIJA CAR-a

Određena je anti-tumorska funkcija T ćelija CAR-a inženjerisanih za iskazivanje ekspresije pMND- kappaLcCAR-a. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifičnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljene bez tretmana. Kulture su održavane tako da dozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširile približno 2 loga.

2 x 10<6>Daudi ćelije obeležene genom luciferaze svica ustanovljene su pomoću intravenozne injekcije kod NOD scid IL-2 receptora gama lanca nokaut miševa (NSG). Tri, šest i devet dana po injektiranju ćelija tumora u miševe, 1x10<7>pMND- kappaLcT ćelije sa modifikovanim CAR-om bile su usvojeno prenesene na miševe, a rast tumora praćen je bioluminiscencijom uz pomoć Xenogen-IVIS sistema za snimanje. Tumorsko opterećenje kod miševa koji su primili T ćelije sa modifikovanim CAR-om bilo je smanjeno u poređenju sa tumorskim opterećenjem netretiranih miševa. Slika 8.

PRIMER 8

STVARANJE FUNKCIONALNOG CAR T LEKA

Anti-BCMA T ćelije koje iskazuju ekspresiju CAR-a proizvedene su kao što je opisano u Primeru 1, iznad. Ove T ćelije sa ekspresijom CAR-a pokazale se klirens specifičnog tumora. Anti-BCMA T ćelije koje iskazuju ekspresiju CAR-a su ko-kulturisane 4 časa sa K562 ćelijama ili K562 ćelijama modifikovanim tako da iskažu ekspresiju CAR-a. Ćelije tumora koje su iskazivale ekspresiju antigena bile su obeležene karboksiflureoscein cukcimidril esterom (CFSE) i fluoresecenca je merena uz pomo ć FASC-a. Anti-BCMA T ćelije koje iskazuju ekspresiju CAR-a ubile su K562 ćelije koje iskazuju BCMA (Slika 9A) i oslobodile IFN-& (Slika 9B). (n=3).

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Lentiviralni vektor koji sadrži polinukleotid koji uključuje mijeloprolferativni pojačivač virusa sarkoma, uz izbrisanu regiju negativne kontrole, (MND) promoter zamenje dl587rev lokacije za vezivanje prajmera -a koji je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja šifruje receptor himernih antigena (CAR), gde CAR uključuje:

2.

Lentiviralni vektor prema patentnom zahtevu 1, gde scFv antigen izabran iz grupe koja se

sastoji od: receptora alfa folata, 5T4, #vβ6integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FR# , GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11R# , IL-13R # 2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelina, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida.

3. Kod lentiviralnog vektora prema patentnim zahtevima 1 i 2 CAR dalje uključuje polipeptid zglobne regije, regiju odstojnika ili signalni peptid.

4. Lentiviralni vektor prema patentnom zahtevu 1 gde polinukleotid šifruje CAR prikazan je bod bilo kojim BR. ID. SEKV.: 2-3.

5. Lentiviralni vektor prema patentnom zahtevu 1 gde:

je lentiviralni vektor izabran iz grupe koja se sastoji od: HIV (ludski virus imunodeficijencije), visna-maedi virusa (VMV), kozijeg virusa arthritisa-encefalitisa (CAEV), konjskog virusa infektivne anemije (EIAV), mačijeg virusa imunodeficiencije (FIV), goveđeg virusa imunodeficiencije (BIV) i majmunskog virusa imunodeficiencije (SIV).

6. Lentiviralni vektor prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5 uklju čuje levi (5') retroviralni LTR, a Psi (* ) signal za pakovanje, klapnu centralnog polipurinskog trakta/DNK (cPPT/FLAP), retroviralni izvozni element, MND promotor koji je operativno povezan sa CAR-om iz tvrdnje 1 desni (3') retroviralni LTR.

7. Lentiviralni vektor prema patentnom zahtevu 6 dalje uključuje:

a) heterolognu sekvencu poliadenilacije;

b) hereolognu sekvencu poliadenilacije koja je sekvenca poliadenilacije goveđeg hormona rasta ili signalna sekvenca poliadenliacije zečijeg β-globina; ili

c) post-transkripcioni regulativni element virusa hepatitisa B (HPRE) or post-transkripcioni regulativni element mrmota (WPRE).

8. Lentiviralni vektor prema patentnom zahtevu 6 ili 7 gde je

(a) promotor 5' LTR-a zamenjen heterolognim promotorom;

(b) promotor 5' LTR-a zamenjen promotorom citomegalovirusa (CMV), a promotorom virusa Rous Sarcoma (RSV) ili promotorom majmunskog virusa 40 (SV40);

(c) su 5' LTR ili 3' LTR lentivirus LTR-ovi;

(d) 3' LTR uključuje jednu ili više modifikacija;

(e) 3' LTR uključuje jedno ili više brisanja; ili

(f) je 3' LTR samo-inaktivirajući (SIN) LTR.

9. Ćelija imunog efektora koja uključuje lentiviralni vektor je bilo koja prema patentnim zahtevima od 1 do 8.

10. Ćelija imunog efektora prema patentnom zahtevu 9 gde je ćelija imunog efektora T limfocita.

11. Sastav koji uključuje ćeliju imunog efektora prema patentnom zahtevu 9 ili 10 i fiziolo ški prihvatljiv pomoćni sastojak.

12. Za korišćenje u metodu za tretiranje raka kod subjekta potreban je sastav prema patentnom zahtevu 11.

13. Za korišćenje u metodu za tretiranje hematološkog maligniteta kod subjekta potreban je sastav prema patentnom zahtevu 11.