Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS62733B1 - Mnd promoter himernih antigenskih receptora - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS62733B1 - Mnd promoter himernih antigenskih receptora - Google Patents

Mnd promoter himernih antigenskih receptora

Info

Publication number
RS62733B1
RS62733B1 RS20211468A RSP20211468A RS62733B1 RS 62733 B1 RS62733 B1 RS 62733B1 RS 20211468 A RS20211468 A RS 20211468A RS P20211468 A RSP20211468 A RS P20211468A RS 62733 B1 RS62733 B1 RS 62733B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
car
sequence
hla
Prior art date
Application number
RS20211468A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Morgan
Kevin Friedman
Byoung Ryu
Original Assignee
2Seventy Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54333432&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62733(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 2Seventy Bio Inc filed Critical 2Seventy Bio Inc
Publication of RS62733B1 publication Critical patent/RS62733B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

[0001]Ovaprimenazahtevabeneficijepo35U.S.C.§119(e)PrivremeneprimeneSAD-abr.61/984,561, podnete25.aprila2014.godine,kojajeovdeuključenareferencomucelosti.
IZJAVAUVEZILISTESEKVENCI
[0002]Listasekvencipovezanasaovomprimenomjeobezbeđenautekstualnomformatuumestokopije na papiru i ovim je uključena referencom u specifikaciju. Ime tekstualne datoteke koja sadrži listu sekvenci jeBLBD_027_01VO_ST25.txt. Tekstualnadatotekaveličine27KB, kreirana je24.aprila2015. godineidostavljaseelektronskiputemEFS-Web-a,istovremenosapodnošenjemspecifikacije.
POZADINA
Tehničkopolje
[0003]Ovajpronalazakodnosi senapoboljšane sastave imetode lečenja raka ili tumora.Posebno se odnosinapoboljšanevektorekojiuključuju receptorehimernihantigena (CAR), ćelije imunihefektora kojesugenetskimodifikovanetimvektorimauciljuiskazivanjaekspresijeCAR-aiupotrebutihsastavaza efektivnotretiranjerazličitihvrstarakailitumora.
Opisnaučnihmetoda
[0004] Rakjeznačajanzdravstveniproblemusvetu.Naosnovupodatakaizperiodaod2008.do2010. godine,kod40,76%današnjihmuškaracaiženaunekomtrenutkuživotabićedijagnostikovannekioblik raka. U poređenju sa 15,30% žena, 20,37% muškaraca razviće rak u periodu između pedesetog i sedamdesetogrođendana.USjedinjenimAmeričkimDržavama1.januara2010.godinebilojepribližno 13027914živihpacijenatasaistorijomovebolesti,odčegasu6078974bilimuškarci,a6948940žene. Procenjuje se da će u Sjedinjenim AmeričkimDržavama u 2013. godini kod 1660290 ljudi (854790 muškaracai805500žena)bitidijagnostikovanraknaraznimorganima,odkojegće580350ljudiumreti. Howlader et al. 2013. SATIRO NAKAMURA DE OLIVEIRA et al: "Modifikacija hematopoetskih stem/praroditeljskihćelijasareceptorimahimernihantigenasaspecifičnimCD19kaonovividpristupa imunoterapiji raka",HUMANGENE THERAPY, Vol.24, br.10, 1. oktobar 2013. (2013-10-01), str.824-839,otkrivahimerneantigenskereceptoreprotivCD19koristećiMNDpromotor lentivirusnogvektora, CD28transmembranskidomeniCD28iCD3ζsignalnedomene.Konstruktsadržizglobnuregiju,kaošto je prikazano na slici 1, strana 825. Ljudske hematopoetske matične/progenitorske ćelije (HSPC) su modifikovane da eksprimiraju anti-CD19 CAR i procenjene in vitro nakon diferencijacije kultura u mijeloidne ili NK ćelije. Sprovedeni su i funkcionalni testovi kako bi se procenila specifična liza CD19-pozitivnihmeta.Slika1prikazujeSINdugaterminalnaponavljanjasapoboljšanimbrisanjemprikazana kaosivekutijenasvakomkrajuelemenataHIV-1osnove,uključujućisignalzapakovanjeψ.
[0005] Iako su načinjeni pomaci u otkrivanju, sprečavanju i lečenju raka, univerzalno uspešna terapeutska strategija tek treba da bude otkrivena. Odgovor različitih tipova lečenja raka je različit. Tradicionalnimetodilečenjaraka,uključujućihemoterapijuiradioterapiju,imajuograničenuupotrebnu vrednostzbogštetnihpropratnihefekata.Imunoterapijaterapijskimantitelimajetakođedalaograničen uspeh, delom zbog siromašnih farmakokinetičkih profila, brze eliminacije antitela od strane serumske proteaze i filtracije u glomerulima i ograničenog prodiranja na lokaciju tumora i nivoa iskazivanja ekspresije ciljnog antigena na ćelije tumora. Pokušaji korišćenja genetski modifikovanih ćelija koje iskazuju ekspresiju receptora himernih antigena (CAR-ova) su takođe doživeli ograničen uspeh zbog siromašnog širenja CAR T ćelija in vivo, brzog nestanka ćelija nakon infuzije i razočaravajuće kliničke aktivnosti.
[0006]Zbogtogaseunaucizadržavapotrebazakliničkiefektivnijimsastavimaimetodimalečenjaraka. KRATAKPREGLED
[0007]PronalazakuopštenopredstavljapoboljšanesastavevektorazastvaranjeterapeutskihTćelija.
[0008] Urazličitimotelotvorenjimaprikazanjepolinukleotidkojiobuhvatamijeloprolferativnipojačivač virusa sarkoma, uz izbrisanu regiju negativne kontrole, (MND) promotor sa zamenjenim lokacijom vezivanjaprajmeradl587rev-akojijeoperativnopovezansareceptorimahimernihantigena(CAR).
[0009] Uodređenimotelotvorenjima, CARuključuje: vanćelijski domen koji vezuje antigen izabran iz grupekoja se sastojiod: receptoraalfa folata,5T4,αvβ6 integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19, CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138,CD171,CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, 11-URα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y,Kappa,Mezotelina,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dliganda,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova i VEGFR2; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD28, CD45, PD1 i CD152; jedan ili više unutarćelijskih kostimulativnihsignalnihdomenaizabranihizgrupekojasesastojiod:CD28,CD54(ICAM),CD134(OX40), CD137(41BB),CD152(CTLA4),CD273(PD-L2),CD274(PD-L1) iCD278(ICOS); iCD3 ξprimarnisignalni domen.
[0010]Unekimotelotvorenjimavanćelijskidomenuključujefragmentvezivnogantigenailiantitelakoje vezujeantigen.
[0011]Uspecifičnimotelotvorenjima,vezivnifragmentantitelailiantigenakojivezujepolipeptidkappa svetlosnog lanca izabran je iz grupe koja se sastoji od: a Camel Ig, Ig NAR, Fab fragmenata, Fab' fragmenata,F(ab)'2fragmenata,F(ab)'3fragmenata,Fv,Fvantitelasjednostrukimlancem("scFv"),bisscFv, (scFv)2, minitela, dijatela, trijatela, tetratela, Fv proteina stabilizovanog disulfidom ("dsFv") i antitelajednostrukogdomena(sdAb,nanotelo).
[0012]Udodatnimotelotvorenjima,fragmentvezivnogantitelailiantigenakojivezujepolipeptidkappa svetlosnoglancajescFv.
[0013]Uodređenimotelotvorenjima,antitelojeljudsko,mišijeilihumanizovano.
[0014]Uspecifičnimotelotvorenjima,transmembranskidomenseizvodiizCD8α.
[0015] U specifičnim otelotvorenjima, jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena izabran je iz grupekojasesastojiod:CD28,CD134iCD137.
[0016] Unekimotelotvorenjima,CARuključujedvailivišeko-stimulativnihsignalnihdomenaizabranih izgrupekojasesastojiod:CD28,CD134iCD137.
[0017] Unekimotelotvorenjima,jedanilivišeko-stimulativnihsignalnihdomenajeCD28.
[0018]Uspecifičnimotelotvorenjima,jedanilivišeko-stimulativnihsignalnihdomenajeCD134.
[0019]Uodređenimotelotvorenjima,jedanilivišeko-stimulativnihsignalnihdomenajeCD137.
[0020]Uspecifičnimotelotvorenjima,CARnadaljeuključujepolipeptidzglobneregije.
[0021] Udaljimotelotvorenjima,polipeptidzglobneregijesadržizglobnuregijuPD1,CD152iliCD8α.
[0022] Udaljimotelotvorenjima,polipeptidzglobneregijesadržizglobnuregijuPD1.
[0023] Udaljimotelotvorenjima,polipeptidzglobneregijesadržizglobnuregijuCD152.
[0024] Udaljimotelotvorenjima,polipeptidzglobneregijesadržizglobnuregijuCD8α.
[0025] UnekimotelotvorenjimaCARnadalje uključuje regijuodstojnika.
[0026] Udodatnimotelotvorenjima,polipeptidregijeodstojnikasadržiCH2iCH3regijeIgGI.
[0027] Uodređenimotelotvorenjima,CAR nadaljeuključuje signalnipepetid.
[0028] U specifičnim otelotvorenjima, signalni pepetid sadrži signalni polipeptid IgGl teškog lanca, signalnipolipeptidCD8αililjudskialfasignalnipeptidreceptoraGM-CSF.
[0029] U nekim otelotvorenjima, polinukleotid kodira CAR kao što je pokazano u bilo kom od BR. ID. SEKV.:2do3.
[0030] U različitim otelotvorenjima, prikazan je vektor koji uključuje polinukleotid koji šifruje CAR kao štoje prikazanoubilokomodprethodnihiliotelotvorenjimaiznesenihudrugimdelovimaovograda.
[0031]Udaljimotelotvorenjima,vektorjevektoriskazivanjaekspresije.
[0032]Udodatnimotelotvorenjima,vektorjeviralnivektor.
[0033]Uspecifičnimotelotvorenjima,vektorjeretroviralnivektor.
[0034]Uspecifičnimotelotvorenjimavektorjelentiviralnivektor.
[0035] U dodatnim otelotvorenjima lentiviralni vektor je izabran iz grupe koja se suštinski sastoji od ljudskog imunodeficijencijskog virusa (HIV), visna-maedi virusa (VMV), kozijeg artritis-encefalitis virusa (CAEV), konjskog virusa zarazne anemije (EIAV), mačijeg imunodeficijencijskog virusa (FIV), goveđeg imunodeficijencijskogvirusa(BIV)imajmunskogimunodeficijencijskogvirusa(SIV).
[0036] U određenim otelotvorenjima, CAR nadalje uključuje levi (5') retroviralni LTR, Psi (Ψ) signal pakovanja, poklopac centralnog polipurinskog trakta/DNA (cPPT/FLAP), retroviralni izvozni element, MND promoter operativno povezan sa CAR-om prema bilo kojoj tvrdnji od 1 do 19; i desni (3') retroviralniLTR.
[0037] UdodatnimotelotvorenjimaCARnadalje uključuje heterolognusekvencupoliadenilacije.
[0038] U dodatnim otelotvorenjima sekvenca poliadenilacije je sekvenca poliadenilacije goveđeg hormonarastailisignalnasekvencapoliadenilacijezečijegβ-globina.
[0039]UspecifičnimotelotvorenjimaCARdaljeuključujepost-transkripcijskiregulatornielementvirusa hepatitisB(HPRE)ilipost-transkripcijskiregulatornielementmrmota(WPRE).
[0040]Unekimotelotvorenjimapromotor5'LTRzamenjenjeheterolognimpromotorom.
[0041] U određenim otelotvorenjima heterologni promotor je promotor citomegalovirusa (CMV), promotervirusaRousSarcoma(RSV)ilipromotormajmunskogvirusa40(SV40).
[0042]Udaljimotelotvorenjima5'LTRili3'LTRjelentivirusLTR.
[0043]Udodatnimotelotvorenjima3'LTRuključujejednuilivišemodifikacija.
[0044]Uspecifičnimotelotvorenjima3'LTRuključujejednoilivišebrisanja.
[0045]Uodređenimotelotvorenjima3'LTRjesamo-inaktivirajući(SIN)LTR.
[0046] U specifičnim otelotvorenjima polinukleotid koji kodira CAR uključuje optimizovanu Kozak sekvencu.
[0047]U raznim otelotvorenjima prikazana je ćelija imunog efektora koja uključuje vektor kao što je opisanoubilokomodprethodnihiliotelotvorenjimaopisanihdrugdeuovomradu.
[0048]UnekomotelotvorenjimaćelijaimunogefektorajeTlimfocit.
[0049]U različitim otelotvorenjima prikazan je sastav koji uključuje ćeliju imunog efektora kao što je razmatranoubilokomodprethodnihiliotelotvorenjarazmatranihdrugdeuovomradu,kaoifiziološki prihvatljivpomoćnisastojak.
[0050]U različitim otelotvorenjima prikazan je metod generisanja ćelije imunog efektora koja sadrži uvođenjevektoraunjukaoštojeovderazmatrano,štostimulišećelijeiindukujenjihovorazmnožavanje dovodeći ihu kontakt saantitelimakoja vezujuCD3, kao i onimakoja vezujuCD28.Dakleprikazan je metodgenerisanjaćelijeimunogefektora.
[0051]Udaljimotelotvorenjimaćelije imunogefektorasustimulisane i indukovanenarazmnožavanje preuvođenjavektora.
[0052]UspecifičnimotelotvorenjimaćelijeimunogefektorasadržeTlimfocite.
[0053]U različitim otelotvorenjima prikazan jemetod stvaranja ćelije imunog efektora koja uključuje prethodno razmatrani polinukleotid koji uključuje izolovanje ćelija CD34+ iz koštane srži, krvi iz pupkovine ili mobilizovane periferne krvi subjekta, te uvođenje prethodno razmatranog vektora u izolovanećelijeCD34+.
[0054]U dodatnim otelotvorenjima ćelije CD34+ su prethodno stimulisane sa jednim ili više citokina izabranih izgrupekojauključujeodFLT3 ligand,TPO,SCF, IL-3 i IL-6preuvođenjavektorapremabilo kojojtvrdnjiod20do36.
[0055]Urazličitimotelotvorenjimaobezbeđenjemetodlečenjarakakodsubjektakomejetopotrebno, akojiobuhvataprimenuterapeutskiefektivenekoličineovderazmatranogsastava.
[0056] U određenim otelotvorenjima rak je izabran iz grupe koja se sastoji od Vilijamovog tumora, Juingovogsarkoma,neuroendokrinogtumora,glioblastoma,neuroblastoma,melanoma,rakakože,raka dojke,rakadebelogcreva,rakaprostate,rakajetre,rakabubrega,rakagušterače,rakapluća,rakažučne kese, raka materice, raka endometrijuma, raka jednjaka, raka želuca, raka glave i vrata, karcinoma medule tiroide, raka jajnika, glioma, limfoma, leukemije, mijeloma, akutne limfoblastične leukemije, akutne mijelogenozne leukemije, hronične leukemije limfocita, hronične mijelogenozne leukemije, Hodžkinsovoglimfoma,ne-Hodžkinsovoglimfomairakabešike.
[0057]UspecifičnimotelotvorenjimarakjerakgušteračeivanćelijskiveznidomenvežeepitopPSCAili MUC1.
[0058]UdaljimotelotvorenjimarakjerakbešikeivanćelijskiveznidomenvežeepitopPSCAiliMUC1.
[0059] U specifičnim otelotvorenjima rak je glioblastom multiforme i vanćelijski vezni domen veže epitopEPHA2,EGFRvIIIiliCSPG4.
[0060]UspecifičnimotelotvorenjimarakjerakplućaivanćelijskiveznidomenvežeepitopPSCAiliGD2.
[0061]U određenim otelotvorenjima rak je rak dojke i vanćelijski vezni domen veže epitop CSPG4 ili HER2.
[0062]UnekimotelotvorenjimarakjemelanomivanćelijskiveznidomenvežeepitopCSPG4iliGD2.
[0063]Urazličitimotelotvorenjimaobezbeđenjemetodlečenjahematološkogmalignitetakodsubjekta kome je to potrebno, a koji obuhvata primenu terapeutski efektivene količine ovde razmatranog sastava.
[0064] Kod daljih otelotvorenja hematološki malignitet jemalignitet B ćelija izabran iz grupe koja se sastoji od:multiplogmijeloma (MM), hronične leukemije limfocita (HLL) ili ne-Hodžkinsovog limfoma (NHL).
[0065] Kod specifičnih otelotvorenjaMM je izabran iz grupe koja se sastoji od: očiglednogmultiplog mijeloma, tinjajućeg multiplog mijeloma, leukemije ćelijske plazme, ne-sekretornog mijeloma, IgD mijeloma, osteosklerotičnog mijeloma, usamljenog plazmacitoma kosti i ekstramedularnog plazmacitoma.
[0066] Kod određenih otelotvorenja NHL je izabran iz grupe koja se sastoji od: Burkitovog limfoma, hronične leukemije limfocita/male leukemije limfocita (HLL/MLL), difuznog velikog limfoma B ćelija, folikularnoglimfoma,imunoblastičnoglimfomavelikihćelija,prekursorskogB-limfoblastičnoglimfomai limfomaplaštaćelije.
KRATAKOPISPONEKIHRAZMATRANJACRTEŽA
[0067]
Slika1prikazujestrukturukonstruktapMND-CD19CAR(A)ikonstruktapMND-kappaLCCAR(B). Slika2prikazujemapuvektorazapMND-CD19CAR.
Slika3prikazujemapuvektorazapMND-kappaLCCAR.
Slika4prikazujebrojkopijavektora(VCN)integrisanihlentiviralnihčesticapMND-kappaLCCAR. VCN bio je određen metodom q-PCR devet dana nakon transdukcije. Svaki krug predstavlja jedinstvenukulturunačinjenuparalelnosaodgovarajućimnemodifikovanim(kvadrat)kulturama Tćelija.Prikazanipodacipotičuod12jedinstvenihkulturasakupljenihod6donora.Aritmetička sredinaistandardnadevijacijapredstavljenesulinijskomtrakomitrakomgrešaka.
Slika5prikazujeiskazekspresijekappaLCuTćelijamatransdukovanimsapMND-kappaLCCAR-ovima.IskazivanjeekspresijeCAR-anaTćelijamabilojeodređenocitometrijomprotokašestdo devetdananakon transdukcije. Svaki krugpredstavlja jedinstvenukulturunačinjenuparalelno saodgovarajućimnemodifikovanim(kvadrat)kulturamaTćelija.Prikazanipodacipotičuod12 jedinstvenih kultura sakupljenih od 6 donora. Aritmetička sredina i standardna devijacija predstavljenesulinijskomtrakomitrakomgrešaka.
Slika 6 prikazuje uporedivu transdukciju i iskazivanje ekspresije CD 19 CAR-a na T ćelijama transdukovanimsalentiviralnimvektorimapMND-ilipEFla-CD19CAR.Tisuvektorikorišćeniza transdukovanje uparenih paralelnih kultura primarnih ljudskih T ćelija. Iskazivanje ekspresije CAR-anaTćelijamabilo jeodređenocitometrijomprotokašestdananakontransdukcije.Broj kopijavektora(VCN)integrisanihlentiviralnihčesticabiojeodređenmetodomq-PCRdevetdana nakontransdukcije.
Slika 7 prikazuje reaktivnost pMND-kappaLC T ćelija sa modifikovanim CAR-om specifičnu za tumor. Modifikovane T ćelije bile su kulturisane zajedno sa ćelijama kappa+ Daudi ili kappa-HDLM-2 tokom 24 časa. Oslobađanje IFN-y specifično za tumor analizirano je putem ELISA-e. Ovdeprikazanipodacipotičuiz5jedinstvenihkulturaTćelijapribavljenihod4donora.
Slika 8 prikazuje regresiju ustanovljenih Daudi tumora nakon adoptivnog transfera pMND-kappaLCCARmodifikovanihTćelija.ModifikovaneTćelijeiskorišćenesuzatretiranjemiševasa ustanovljenimDaudi tumorima.Upoređenju sa netretiranim kontrolnim životinjama tumorski teret nakon tretmana praćen je obradom slike in vivo. Podaci su bili reprezentativni u dva nezavisnaeksperimenta.
Slika 9 prikazuje klirens tumora specifičan za antigen uz korišćenje CAR T ćelija koje iskazuju ekspresiju. (A). CAR T ćelije sa iskazivanjem ekspresije anti-BCMA ubile su ćelije tumora sa iskazivanjem BCMA obeležene karboksifluorescentnim sukcinimidil esterom (CFSE), a fluorescencajemerenaFACS-om.(B).CARTćelijesaiskazivanjemekspresijeanti-BCMAbilesu kulturisane zajedno sa ćelijama K562 i K562, genetskimodifikovanim za iskazivanje ekspresije BCMA,apovršinskereziduebilesusakupljene24časakasnijeianaliziranenaIFN-γotpuštanje pomoćuELISA-e.(n=3).
KRATAKOPISIDENTIFIKATORASEKVENCI
[0068]
ID. BR. SEKV. 1 prikazuje polinukleotidsku sekvencu pojačivača virusa mijeloproliferativnog sarkoma, uz izbrisanu negativnu kontrolnu regiju, te (MND) promotor zamenjene dl587rev lokacijezavezivanjeprajmera.
ID.BR.SEKV.2prikazujepolinukleotidnusekvencuMNDpromotoraanti-CD19CARkonstrukta. ID.BR.SEKV.3prikazujepolinukleotidnusekvencuMNDpromotoraanti-kappalakoglancaCAR konstrukta.
DETALJANOPIS
A.Pregled
[0069]Pronalazaksegeneralnoodnosinapoboljšanesastaveimetodelečenjarakakojiuključujualinisu ograničeni na tumore ili rakove jetre, gušterače, pluća, dojki, bešike,mozga, kostiju, tiroide, bubrega, kože i hematopoetičkog sistema. Pronalazak se posebno odnosi na adoptivnu terapiju ćelija imunih efektora, genetski modifikovanih vektorima koji uključuju pojačivač virusa mijeloproliferativnog sarkoma, uz izbrisanunegativnu kontrolnu regiju, te (MND)promotor zamenjenedl587rev lokacije za vezivanjeprajmeraoperativnopovezansapolinukleotidomkojikodirareceptorhimernkihantigena.
[0070]Genetičkipristupinudepotencijalnasredstvazapojačavanjeimunogprepoznavanjaieliminacije ćelijaraka.Jednaodobećavajućihstrategijajegenetskiinženjeringćelijaimunogefektorazaizražavanje ekspresijereceptorahimernihantigenakojipreusmeravajucitotoksičnostkaćelijamatumora.Međutim, postojećim imunoterapijama adoptivnih ćelija za tretiranje tumora ili rakova nedostaju istrajni nivoi dovoljnogiskazivanjaekspresijeCAR-auterapeutskimćelijama.Prematome,takveterapijenisuklinički poželjne i zbog togau sklopunaukeostajepotreba za efikasnijim terapijamamalignitetaB-ćelija koje pošteđujuhumoralniimunitet.
[0071] Poboljšani sastavi i metodi terapije adoptivnim ćelijama o kojima je ovde reč obezbeđuju genetski modifikovane ćelije imunih efektora koje spremno mogu da budu proširene, ispoljavaju dugoročnupostojanostinvivoiiskazujupostojanuidovoljnuekspresijuCARpolipeptida.Bezželjedase veže za bilo koju posebnu teoriju, ovaj pronalazak delimično razmatra iznenađujuće otkriće daMND promotorusmeravapostojanoiskazivanjeekspresijepolipeptidaCAR-aaktiviranih,proširenihimirujućih T ćelija, pa je tako to iskazivanje ekspresije dovoljno da efikasno preusmeri ovde pominjane genetski modifikovanećelijeimunihefektoratakodaizmamecitotoksičnuaktivnostprotivćelijatumorailiraka.
[0072] U jednom otelotvorenju polinukleotid uključuje MND promotor operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR, a CAR sadrži vanćelijski domen koji vezuje ciljni antigen, transmambranskidomen,tejedanilivišeunutarćelijskihsignalnihdomena.
[0073]U jednomotelotvorenju T ćelija je genetskimodifikovana vektoromkoji sadržiMNDpromotor kojijeoperativnopovezansaovderazmatranimCAR-om.TćelijekojeiskazujuekspresijuCAR-aovdese nazivajuCARTćelijamailiCARmodifikovanimTćelijama.
[0074] U različitim otelotvorenjima, ovde pominjane genetski modifikovane CAR T ćelije date su pacijentusarakomilitumorom.
[0075]Osim ako je specifično indikovano suprotno, praksa pronalaska će upotrebiti konvencionalne metode hemije, biohemije, organske hemije, molekularne biologije, mikrobiologije, tehnike rekombinovanjaDNK,genetike,imunologijeićelijskebiologijekojesenalazeuokviruprakse,odkojihse mnoge u cilju ilustracije opisuju u daljem tekstu. Te su tehnike u potpunosti objašnjene u literaturi. Videtinpr.Sambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual (3. izdanje,2001);Sambrook,et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2. izdanje, 1989);Maniatis et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual(1982);Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWileyandSons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current ProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience;Glover,DNACloning:A PracticalApproach,vol.I&II(IRLPress,Oxford,1985);Anand,TechniquesfortheAnalysisofComplex Genomes,(AcademicPress,NewYork,1992);TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide toMolecular Cloning (1984); Harlow i Lane, Antibodies, (Cold Spring HarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1998)CurrentProtocolsinImmunologyQ.E.Coligan, A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.ShevachiW.Strober,eds.,1991);AnnualReviewofImmunology; aswellasmonographsinjournalssuchasAdvancesinImmunology.
B.Definicije
[0076]Osim ukoliko nije definisano drugačije, svi ovde korišćeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kao i ono koje se uobičajeno podrazumeva među naučnicima vičnim području u koje intervencija pripada. Iako bilo koji metodi ili materijali slični ili jednaki opisanima ovde mogu da se koristeupraksiilipritestiranjuovogpronalaska,prioritetniprimerisastava,metodaimaterijalaopisani suovde.Usvrhutrenutnogpronalaskaunastavkutekstadefinisanisusledećitermini.
[0077] Članovi "a," "an," i "the" ovde se koriste za određivanje jednog ili više (tj. najmanje jednog) gramatičkogobjektaučlanku.Kaoprimer,"element"značijedanilivišeelemenata.
[0078]Ovde korišćeni termini "oko" ili "aproksimativno" odnose se na količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju,procenat,dimenziju,veličinu,količinu,težinuilidužinukojavariraizmeđu30,25,20,25,10, 9,8,7,6,5,4,3,2 ili1%referentnekoličine,nivoa,vrednosti,broja, frekvencije,procenta,dimenzije, veličine,količine,težineilidužine.Uspecifičnimotelotvorenjimakadajeprocenatnumeričkavrednost, termini"oko"ili"aproksimativno"označavajuvrednostvećuilimanjuodopsegaod15%,10%,5%ili1%.
[0079] Tokom ove specifikacije, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reči "uključivati", "uključuje" i "uključujući" trebadaoznačavaju impliciranje inkluzijenaznačenogkoraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata ali ne i isključivanje bilo kog drugog koraka, elementa ili grupe koraka ili elemenata.Podfrazom"sastojiseod"podrazumevaseuključivanjeonogaštojeslediiograničavanjena isto.Takofraza"sastojiseod"označavadasunabrojanielementizahtevani iliobavezni, tedanijedan drugielementnemožebitiprisutan.Podfrazom"suštinskisesastojiod"podrazumevaseuključivanje svihelemenatanabrojanihnakonfrazeiograničavanjedrugihelemenatakojisenemešajuuaktivnostili akcijunaznačenunakrajunabrojanihelemenatailijojnedoprinose.Takofraza"suštinskisesastojiod" naznačavadasunabrojanielementizahtevaniiliobavezni,alidanijedandrugielementnijeopcionalani možeilinemorabitiprisutanuzavisnostiodtogadaliutičenaaktivnostiliakcijunabrojanihelemenata.
[0080] U ovoj specifikaciji referisanje na "jedno otelotvorenje", "otelotvorenje", "specifično otelotvorenje","povezanootelotvorenje","određenootelotvorenje","dodatnootelotvorenje"ili"dalje otelotvorenje" ilinjihovakombinacijaznačidaodređenosvojstvo,struktura ilikarakteristikaopisanau vezi sa otelotvorenjem jeste uključena u najmanje jedno otelotvorenje ovog pronalaska. Tako pojava prethodnihfrazanarazličitimmestimaovespecifikacijeneznačiinjihovoneophodnoodnošenjenaisto otelotvorenje. Nadalje, kod jednog ili više otelotvorenja posebna svojstva, strukture ili karakteristike mogubitikombinovanenabilokojisuptilannačin.
C.Receptorihimernihantigena
[0081] U različitim otelotvorenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje ćelije imunog efektora genetski inženjerisane vektorima dizajniranim za iskazivanje ekspresije receptora himernih antigena koji preusmeravaju citotoksičnost ka ćelijama tumora. Ti genetski inženjerisani receptori ovde se pominju kao receptorihimernihantigena (CAR-ovi).CAR-ovi sumolekuli koji kombinuju specifičnost zasnovanu na antitelima za ciljni antigen (npr. antigen tumora) sa unutarćelijskim domenom aktivirajućih receptroraTćelijakakobistvorilihimerniproteinkojiispoljavaspecifičnuanti-tumorskućelijskuimunu aktivnost. Ovde korišćen termin "himerni" opisuje sastav od delova različitih proteina ili delova DNK različitogporekla.
[0082] Ovde razmatrani vektori uključuju i MND promotor i polinukleotid koji kodira CAR. Ovde razmatraniCAR-oviuključuju vanćelijski domenkoji se vežena specifični ciljni antigen (takođepoznat kaoveznidomeniliveznidomenspecifičanzaantigen),transmembranskidomeniunutarćelijskisignalni domen.AngažmanveznogdomenaspecifičnogzaantigenCAR-asaciljnimantigenomnapovršiniciljne ćelije rezultuje klasteriranjem CAR-a i polučuje aktivacijski stimulans na ćeliju koja ga sadrži. Glavna karakteristikaCAR-ovajenjihovasposobnostpreusmeravanjaspecifičnostićelijeimunogefektora,čime otpočinje razmnožavanje, proizvodnja citokina, fagocitoza ili proizvodnja molekula koji mogu da posreduju pri ćelijskoj smrti ciljne ćelije koja iskazuje ekspresiju antigena na nezavisni način velike histokompatibilnosti(MHC),eksploatišućispecifičnećelijskeciljnesposobnostizamonoklonskaantitela, rastvorljiveligandeiliko-receptorespecifičnezaćeliju.
[0083] U specifičnim otelotvorenjima, CAR uključuje vanćelijski vezni domen uključujući ali ne ograničavajući se na vezni fragment antitela ili antigena, vezani molekul ili vanćelijski domen koreceptora, koji specifičnovežeciljaniantigen izabran izgrupekoja se sastojiod: receptoraalfa folata, 5T4, αvβ6 integrina, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD 19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3(GPC3),HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mesotelin,Mucl,Mucl6,NCAM, NKG2Dligande,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-oveiVEGFR2;jednog ilivišezglobnihilidomenaodstojnika;transmembranskogdomenauključujući,alineiograničavajućise na transmembranske domene iz CD8α, CD4, CD45, PD1 i CD 152; jednog ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnihdomenauključujućialine iograničavajući senaunutarćelijskeko-stimulatorne signalnedomene izCD28,CD54 (ICAM),CD134 (OX40),CD137 (41BB),CD152 (CTLA4),CD273 (PD-L2), CD274(PD-L1),iCD278(ICOS);iprimarnogsignalnogdomenaizCD3ξiliFcRγ.
1.Veznidomen
[0084]UspecifičnimotelotvorenjimaovderazmatraniCAR-oviuključujuvanćelijskiveznidomenkojise specifično vezujena ciljani polipeptid, npr. ciljani antigen sa iskazivanjemekspresije na ćeliju tumora. Ovde korišćeni termini "vezni domen", "vanćelijski domen", "vanćelijski vezni domen", "vezni domen specifičan za antigen" i "vanćelijski vezni domen specifičan za antigen" koriste se zamenljivo i obezbeđujusposobnostCAR-adasespecifičnovežezaciljaniantigenodinteresa.Veznidomenmožeda sadrži bilo koji protein, polipeptid, oligopeptid ili peptid koji poseduje sposobnost specifičnog prepoznavanjaivezivanjabiološkogmolekula(npr.receptorapovršinećelijeiliproteinatumora,lipida, polisaharidailidrugogciljnogmolekulpovršinećelijeilinjegovekomponenete).Veznidomenuključuje bilo kog prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantno proizvedenog veznog partnera za biološkimolekulodinteresa.
[0085] Termini "specifična vezna sklonost" ili "specifično veže" ili "specifično vezan" ili "specifično vezivanje" ili "specifičnotargetira"ovdesekoristezaopisivanjevezivanja jednogmolekulazadrugi sa većom veznom sklonošću od pozadinske vezne sklonosti. Vezni domen (ili CAR koji uključuje vezni domenilifuzioniproteinkojisadrživeznidomen)"specifičnoseveže"zaciljnimolekulakosevežeilise udružuje sa ciljnim molekulom sa sklonošću ili Ka (tj. konstantom asocijacije ekvilibrijuma određene vezne interakcijesa jedinicamaod1/M)koja je,naprimer,većaod ili jednakapribližno105M-1.Kod određenih otelotvorenja vezni domen (ili fuzioni protein) veže se sa ciljem pri čemu je Ka veća od ili jednakapribližno106M-1,107M-1,108M-1,109M-1,1010M-1,1011M-1,1012M-1 ili1013M-1. Vezni domeni "visoke sklonosti" (ili njihovi jednolančani fuzioni proteini ) odnose se na one vezne domene čija je Ka najmanje 107 M-1, najmanje 108 M-1, najmanje 109 M-1, najmanje 1010 M-1, najmanje1011M-1,najmanje1012M-1,najmanje1013M-1iliveća.
[0086]Alternativno,sklonostmožedasedefinišekaokonstantadisocijacijeekvilibrijuma(Kd)određene vezne interakcije sa jedinicamaodM (npr.10-5Mdo10-13M ilimanje).Premaovomradusklonosti polipeptida veznog domena i proteina CAR-a mogu lako da se odrede uz pomoć konvencionalnih tehnika, npr. uz pomoć kompetitivne ELISA-e (enzimski imunosorbentni test) ili uz pomoć veznog udruživanja, ili testa pomeranja koji koristi obeležene ligande, ili pomoću uređaja za površinsku plazmonskurezonancupoputBiacoreT100,kojijedostupankodprodavcaBiacore,Inc.,Piskatavej,Nju Džerzi, ili tehnologijom optičkog biosenzora poput sistema EPIC ili EnSpire koji su dostupni kod prodavaca Corning i Perkin Elmer (videti takođe npr. Scatchard et al. (1949) Ann. Nju Jork Acad. Sci.
51:660;ipatentiS.A.D.5,283,173;5,468,614iliekvivalent).
[0087] Kod jednog otelotvorenja, sklonost specifičnog vezivanja je oko 2 puta veća od pozadinskog vezivanja,oko5putavećaodpozadinskogvezivanja,oko10putavećaodpozadinskogvezivanja,oko20 putavećaodpozadinskogvezivanja,oko20putavećaodpozadinskogvezivanja,oko50putavećaod pozadinskog vezivanja, oko 100 puta veća od pozadinskog vezivanja ili oko 1000 puta veća od pozadinskogvezivanjailiviše.
[0088]Uspecifičnimotelotvorenjima,vanćelijskiveznidomenCAR-auključujeveznifragmentantitelaili antigena. Termin "antitelo" odnosi se na vezni agens koji je polipeptid koji se sastoji od promenljive regije imunoglobulina sa najmanje lakim ili teškim lancem koji specifično prepoznaje i veže epitop antigena, poput peptida, lipida, polisaharida ili nukleinske kiseline koji uključuje antigensku determinantupoputonekojuprepoznajeimunaćelija.
[0089] Termin "antigen (Ag)" odnosi se na jedinjenje, sredstvo ili supstancu koji mogu da stimulišu proizvodnju antitela ili odgovor T ćelije kod životinje, uključujući sastave (poput onog koji uključuje protein specifičan za tumor) koje životinja apsorbuje ili se u nju injektiraju. Antigen reaguje sa proizvodima specifičnog humoralnog ili ćelijskog imuniteta, uključujući one indukovane heterolognim antigenima,poputotkrivenihantigena. "Ciljni antigen" ili "ciljni antigenod interesa" je antigenkoji je dizajniran za vezivanje sa veznim domenom ili CAR-om na ovde razmatran način. Kod specifičnih otelotvorenja,ciljniantigenjeepitoppeptida,lipida,polisaharidailinukleinskekiselinenakojusevezni domenspecifičnoveže.Kodprioritetnihotelotvorenjaantigenjeepitopreceptoraalfafolata,5T4,αvβ6 integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII,EGP2,EGP40,EPCAM,EphA2,EpCAM,FAP,fetalnogAchR,FRα,GD2,GD3,'Glypican-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kappa,Mezotelina,Mucl,Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-ovailiVEGFR2polipeptida.
[0090]Termin"epitop"ili"antigenskadeterminanta"odnosisenaregijuantigenanakojuseveževezni agens. Epitopi mogu biti formirani od graničnih amino kiselina ili negraničnih amino kiselina jukstaponiranihtercijarnimsavijanjemproteina.Epitopiformiraniodgraničnihaminokiselinasetipično zadržavaju pri izloženosti denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube prilikom tretmana denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a obično i više, odnosno najmanje 5, oko 9 ili oko 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konfirmaciji.
[0091]AntitelauključujuveznefragmenteantigenapoputCamelIg, IgNAR,fragmenteFab,fragmente Fab',fragmenteF(ab)'2,fragmenteF(ab)'3,Fv,Fvproteinejednostrukoglanca("scFv"),bis-scFv,(scFv)2, minitela, diatela, triatela, tetratela, Fv proteine stabilizovane disulfidom ("dsFv") i antitelo jednog domena (sdAb, nanotelo) i delove celovitih antitela odgovorne za vezivanje antigena. Termin takođe uključuje genetski inženjerisane oblike poput himernih antitela (na primer, humanizovana mišija antitela),heterokonjugovanaantitela(poputbiospecifičnihantitela)injihoveveznefragmenteantigena. Videti takođe Pierce Catalog i Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology,3.izd.,W.H.Freeman&Co.,NewYork,1997.
[0092] Takođe se podrazumeva da naučnici razumeju da se kompletno antitelo sastoji od dva teška lanca idva laka lanca.Svaki teški lanac sastoji seodvarijabilne regije iprve,druge i trećekonstantne regije,doksesvakilakilanacsastojiodvarijabilneikonstantneregije.Teškilancikodsisaraklasifikovani sukaoα, δ,ε,γiµ,alakilancikodsisaraklasifikovanisukao λiliκ.Imunoglobilinikojiuključujuα, δ,ε, γiµ,teškilancisuklasifikovanikaoimunoglobulin(Ig)A,IgD,IgE,IgGiIgM.Oblikkompletnogantitelaje "Y". Osnova "Y" sastoji se od druge i treće konstantne regije (a kod IgE i IgM od četvrte konstantne regije) idva teška lancavezanazajedno,kaoadisulfidneveze (među lancima)se formirajunazglobu. Konstantnaregijateškihlanacaγ,αiδsastojiseodtritandemalgdomena(uliniji)izglobneregijezbog dodatne fleksibilnosti; teški lanci µ i ε poseduju konstantnu regiju koja uključuje četiri domena imunoglobulina.Drugaitrećakonstantnaregijanazivajuse"domenCH2"i"domenCH3".Svakikrak"Y" uključuje varijabilnu regiju i prvu konstantnu regiju jednostrukog teškog lanca vezanog za varijabilne i konstantne regije jednostrukog lakog lanca. Varijabilne regije lakih i teških lanaca odgovorne su za vezivanjeantigena.
[0093] Varijabilne regije lakih i teških lanaca sadrže regiju "okvira" koja je prekinuta sa tri hipervarijabilneregijekojesetakođenazivaju"komplementarno-definišućeregije"ili"CDR-ovi".CDR-ovi mogudasedefinišuiliidentifikujukonvencionalnimmetodima,poputsekvencepremaKabatetal(Wu, TTandKabat,E.A.,JExpMed.132(2):211-50,(1970);Borden,P.andKabatE.A.,PNAS,84:2440-2443 (1987); (vidi Kabat et al, Sequencesof Proteins of Immunological Interest,U.S.DepartmentofHealth andHumanServices,1991,koji jeovimuključenreferencom), iliputemstrukturepremaChothiaetal (Choithia,C.andLesk,A.M.,JMol.Biol,196(4):901-917(1987),Choithia,C.etal,Nature,342:877-883 (1989)).
[0094] Sekvence regija okvira različitih lakih i teških lanaca su relativno očuvane unutar vrsta, poput ljudi.Regijaokviraantitela,odnosnokombinovaneregijeokvirapripadajućihlakihiteškihlanaca,služiza pozicioniranje iporavnavanjeCDR-ovau trodimenzionalnomprostoru.CDR-ovi suprimarnoodgovorni zavezivanjeepitopaantigena.CDR-ovisvakoglancaobičnosenazivajuCDR1,CDR2iCDR3,abrojevima suobeleženiuzastopnopočevšiodN-terminusa i takođeseobičnodefinišu lancemukomjeodređeni CDR lociran. Tako se CDR-ovi smešteni u verijabilnom domenu teškog lanca antitela označavaju kao CDRH1,CDRH2iCDRH3,dokseCDR-ovismešteniuvarijabilnomdomenulakoglancaantitelaoznačavaju kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Antitela sa različitim specifičnostima (tj. različitim lokacijama za kombinovanje za različite antigene) imaju drugačije CDR-ove. Iako CDR-ovi variraju od antitela do antitela, samo je ograničen broj položaja amino kiselina unutar njih direktno uključen u vezivanje antigena.OvipoložajiunutarCDR-ovanazivajusereziduezaocenjivanjespecifičnosti(SOR).
[0095] Reference na "Vh" ili "VH" odnose se na varijabilne regije teškog lanca imunoglobulina, uključujući i onaj kod antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab ili drugog fragmenta antitela kao što je ovde objašnjeno. Reference na "Vl" ili "VL" odnose se na varijabilne regije lakog lanca imunoglobulina, uključujući i onaj kod antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab ili drugog fragmenta antitela kao što je ovde objašnjeno.
[0096]"Monoklonskoantitelo" jeantitelokojeproizvodi jednostrukiklonB limfocita ilićelijaukojusu transfektovanigeni lakih i teških lanaca jednogantitela.Monoklonskaantitelaproizvodesemetodima poznatim stručnjacima, na primer stvaranjem hibridnih ćelija koje formiraju antitela iz fuzije ćelija mijeloma sa imunim ćelijama slezine. Monoklonska antitela uključuju humanizovana monoklonska antitela.
[0097]"Himernoantitelo"posedujerezidueokviraodjednevrste,poputljudi,iCDR-ove(kojigeneralno dajuantitela)oddruge,kaoštojemiš.Uodređenimpreferiranimotelotvorenjima,prethodnorazmatran CAR sadrži vezni domen specifičan za antigen koji je himerno antitelo ili njegov fragment koji veže antigen.
[0098] U određenim preferiranim otelotvorenjima antitelo je humanizovano antitelo (poput humanizovanog monoklonskog tela) koje se specifično veže na površinski protein ćelije tumora. "Humanizovano" antitelo je imunoglobulin sa humanom regijom okvira i jednim ili više CDR-ova neljudskog (npr. mišijeg, pacovskog ili sintetičkog) imunoglobulina. Neljudski imunoglobulin koji daje CDR-ove naziva se "donorom", a humani imunoglobulin koji daje okvir naziva se "akceptorom". U jednom otelotvorenjusvi CDR-ovi potiču od donorskog imunoglobulina u humanizovanom imunoglobulinu. Konstantne regije ne moraju da budu prisutne, ali ako jesu, moraju biti suštinski identične konstantnim regijama humanog imunoglobulina, tj. u najmanje oko 85-90%, poput identičnosti od 95% ili više. Stoga, svi delovi humanizovanog imunoglobulina, osimmoguće CDR-ova, suštinski su jednaki odgovarajućim delovima sekvenci prirodnog ljudskog imunoglobulina. Humanizovana ili monoklonska antitela mogu da imaju dodatne konzervativne zamene za amino kiseline, koje suštinski nemaju efekta na vezivanje antigena ili druge funkcije imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu se konstruisati uz pomoć sredstava genetskog inženjeringa (videti npr. patentS.A.D.br.5,585,089).
[0099]UspecifičnomotelotvorenjuvanćelijskiveznidomenCAR-auključujeantiteloilinjegovfragment kojivezujeantigen,uključujućialineiograničavajućisenaCamelIg(antitelokamelida(VHH)), IgNAR, Fabfragmente,Fab'fragmente,F(ab)'2fragmente,F(ab)'3fragmente,Fv,Fvantitelajednostrukoglanca ("scFv"),bis-scFv,(scFv)2,minitela,diatela,triatela,tetratela,Fvproteinstabilizovandisulfidom("dsFv") iantitelojednogdomena(sdAb,nanotelo).
[0100] Ovde korišćeni "kamel lg" ili "kamelidski VHH" odnosi se na najmanju poznatu jedinicu za vezivanje antigena antitela teškog lanca (Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "Antitelo teškoglanca"ili"antitelokamelida"odnosisenaantitelokojesadržidvaVHdomenainijedanlakilanac (RiechmannL.etal,J.Immunol.Methods231:25-38(1999);WO94/04678;W094/25591;patentS.A.Dbr.
6,005,079).
[0101] "IgNAR" "novog antigen receptora za imunoglobulin" odnosi se na klasu antitela iz imunog repertoara ajkule koja se sastoji iz homodimera jednog varijabilnog domena novog antigen receptora (VNAR) i pet konstantnih domena novog antigen receptora (CNAR). IgNAR-ovi predstavljaju neke od najmanjih poznatih proteina na bazi imunoglobulina u obliku skele, te su veoma stabilni i poseduju efikasne karakteristike vezivanja. Inherentna stabilnost može da se pripiše (i) temeljnoj lg skeli, koja predstavljaznačajanbrojnabijenihihidrofilnihpovršinskihostatakaupoređenjusakonvencionalnimVH i VL domenima antitela koji se mogu naći u antitelima miša; i (ii) stabilišućim strukturalnim karakteristikama u petljama područja koja određuju komplementarnost (CDR) uključujući inter-loop disulfidnemostoveiobrasceintra-loopvodonikoveveze.
[0102]Varenjepapina antitela proizvodi dva identična fragmenta koji vežu antigen, a koji senazivaju "Fab" fragmentima, od kojih svaki poseduje jednu lokaciju za vezivanje antigena i rezidualni "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost za spremno kristalizovanje. Lečenje pepsinom daje F(ab')2 fragment sa dva mesta za kombinovanje antigena, koji je još uvek je sposoban za unakrsno povezivanjeantigena.
[0103] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletnu lokaciju za vezivanje antigena. U jednomotelotvorenju,Fvvrstasadvalancasastojiseoddimerapromenljivogdomenajednogteškogi jednog lakog lancem u tesnoj, nekovalentnoj vezi. Kod Fv (scFv) vrsta sa jednostrukim lancem, jedan promenljividomenteškogijedanpromeljividomenlakoglancamogubitikovalentnopovezanipomoću fleksibilnog peptidnog linkera tako da se laki i teški lanci mogu povezati u "dimeričku" strukturu analognu onoj kod Fv vrsta sa dva lanca. U toj konfiguraciji tri hipervarijabilne regije (HVR-a) svakog promenljivogdomenadolazeu interakcijukakobidefinisale lokaciju zavezivanjeantigenanapovršini VH-Vldimera.ŠestHVR-ovazajednodelespecifičnostzavezivanjeantigenazaantitelo.Međutim,čaki jedanpromeljividomen (ili polovinaFv-ovakojiobuhvataju samo triHVR-a specifična zaantigen) ima sposobnostprepoznavanjaivezivanjaantigena,iakoumanjojmeriodčitavelokacijezavezivanje.
[0104]Fabfragmentsadržipromenljivedomenesateškimilakimlancima,kaoikonstantnidomenlakog lanca i prvi konstantni domen (CHI) teškog lanca. Fab' fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata po dodatkunekolicinereziduanakarboksiterminusuteškoglancaCHIdomenakojiuključujejedaniliviše cisteina iz zglobne regije antitela. U ovom radu Fab'-SH je oznaka za Fab' u kom rezidua cisteina konstantnih domena poseduje slobodnu grupu tiola. F(ab')2 fragmenti antitela bili su originalno proizvedenikaoparoviFab' fragmenatapovezanihuzglobljenimcisteinima.Takođesupoznata idruga uparivanjafragmenataantitela.
[0105]Izraz"diatela"odnosisenafragmenteantitelasadvelokacijezavezivanjeantitela,čijifragmenti uključujupromenljivi domen teškog lanca (VH)povezan sapromenljivimdomenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem linkera koji je prekratak za povezivanje između dva domena u istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementalnim domenima iz drugog lancaistvoredvelokacijezavezivanjeantigena.Diatelamogubitibivalentnailibispecifična.Diatelasu pobližeopisanau,naprimer,EP404,097;WO1993/01161;Hudsonetal,Nat.Med.9:129-134(2003);i Hollingeretal,PNASUSA90:6444-6448 (1993).Triatela i tetratelasu takođeopisanauHudsonetal, Nat.Med.9:129-134(2003).
[0106]"Antitelojednogdomen"ili"sdAb"ili"nanotelo"odnosisenafragmentantitelakojisesastojiod promenljive regije teškog lanca antitela (VH domen) ili promenljive regije lakog lanca antitela (VL domen)(Holt,L.,etal,TrendsinBiotechnology,21(11):484-490).
[0107]"Fvsa jednostrukimlancem" ili"scFv"fragmentiantitelauključujuVH iVLdomeneantitela,pri čemusutidomeniprisutniujednostrukompolipeptidnomlancuibilokojesuorijentacije(e.g.,VL-VHili VH-VL). Uopšteno, scFv polipeptid dalje uključuju polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućavascFv-udaformiraželjenustrukturuzavezivanjeantigena.Pregledovetemepotražitenpr.u Pluckthiin, inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg iMooreur., (Springer-Verlag,NewYork,1994),str.269-315.
[0108] Kod preferiranih otelotvorenja, ovde razmatran CAR uključuje specifični domen za vezivanje antigenakojijescFvimožebitimišiji,ljudskiilihumanizovaniscFv.Antitelajednostrukoglancamoguda seklonirajuizgenaVregijehibridomaspecifičnogzaželjenicilj.Proizvodnjatakvihhibridomapostalaje rutinska.Tehnikakojamožedasekoristizakloniranjepromenljiveregijeteškoglanca(VH)ipromenljive regijelakoglanca(VL)opisanaje,naprimeruOrlandietal,PNAS,1989;86:3833-3837.Kodspecifičnih otelotvorenja,specifičnidomenzavezivanjeantigenakojijescFvvežeκiliλpolipeptidlakoglanca.Kod određenihotelotvorenjascFvvežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX, CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138,CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM,FAP, fetalniAchR,FRα,GD2,GD3, 'Glypican-3 (GPC3),HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1, SSX,Survivin,TAG72,TEMsiliVEGFR2polipeptide.
[0109] Ogledni humanizovani specifični domen za vezivanje antigena je promenljiva regija imunoglobulina specifična za antigen tumora koja uključuje najmanje jednu regiju ljudskog okvira. "Regija ljudskog okvira" odnosi se na divlji tip (tj. prirodnu) regiju okvira promenljive regije ljudskog imunoglobulina, izmenjenu regiju okvira promenljive regije ljudskog imunoglobulina samanje od oko 50%(npr.pomogućnostimanjeodoko45%,40%,30%,25%,20%,15%,10%,5%ili1%)aminokiselinau regiji izbrisanih ili zamenjenih (npr. jednom ili više rezidua amino kiselina iz regije okvira neljudskog imunoglobulinanaodgovarajućimpozicijama),iliregijuizmenjenogokvirapremenljiveregijeneljudskog imunoglobulinasamanjeodoko50%(npr.manjeod45%,40%,30%,25%,20%,15%,10%ili5%)amino kiselinauregijikojesuizbrisneilizamenjene(npr.napozicijamaizloženihreziduai/ilisujednomiliviše rezidua amino kiselina regije okvira ljudskog imunoglobulina na odgovarajućim pozicijama) pa je u jednomaspektuimunogenostsmanjena.
[0110]Kododređenihotelotvorenjaregijaljudskogokvirajeregijaokviradivljegtipapromenljiveregije ljudskog imunoglobina. Kod drugih određenih otelotvorenja regija ljudskog okvira je izmenjena regija okvira promenljive regije ljudskog imunoglobina, sa brisanjima ili zamenom amino kiselina na jednoj, dve,tri,četiri ilipetpozicija.Koddrugihotelotvorenja,regijaljudskogokvirajeizmenjenaregijaokvira promenljiveregijeneljudskogimunoglobinasabrisanjimailizamenomaminokiselinanajednoj,dve,tri, četiriilipetpozicija.
[0111]Uspecifičnimotelotvorenjimaveznidomenspecifičanzaantigenuključujenajmanjejednu,dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam regija ljudskog okvira (FR) izabranu iz ljudskog lakog lanca FR1, ljudskogteškoglancaFR1,ljudskoglakoglancaFR2,ljudskogteškoglancaFR2,ljudskoglakoglancaFR3, ljudskogteškoglancaFR3,ljudskoglakoglancaFR4iljudskogteškoglancaFR4.
[0112] Ljudski FR-ovi koji mogu da budu prisutni kod veznih domena specifičnih za antigen takođe uključujuvarijanteoglednihFR-ovapredstavljenihuovomradu,pričemusujednailidveaminokiseline oglednihFR-ovazamenjeneiliizbrisane.
[0113] U određenim otelotvorenjima humanizovani vezni domen specifičan za antigen uključuje (a) humanizovanupromenljivuregijulakoglancakojaobuhvataljudskilakilanacFR1,ljudskilakilanacFR2, ljudski laki lanac FR3 i ljudski laki lanac FR4, i (b) humanizovanu promenljivu regiju teškog lanca koja obuhvataljudskiteškilanacFR1,ljudskiteškilanacFR2,ljudskiteškilanacFR3iljudskiteškilanacFR4.
[0114]Ovdepomenutiveznidomenispecifičnizaantigentakođeuključujujedan,dva,tri,četiri,pet ili šestCDR-ova.TiCDR-ovimogudabuduneljudskiCDR-oviiliizmenjenineljudskiCDR-oviizabraniizmeđu CDRL1, CDRL2 i CDRL3 iz lakog lanca i CDRH1, CDRH2 i CDRH3 iz teškog lanca. U određenim otelotvorenjima vezni domen specifičan za antigen uključuje (a) promenljivu regiju lakog lanca koja sadrži laki lanacCDRL1, laki lanacCDRL2 i laki lanacCDRL3, i (b) promenljivu regiju teškog lanca koja sadržiteškilanacCDRH1,teškilanacCDRH2iteškilanacCDRH3.
2.Linkeri
[0115] U određenim otelotvorenjima ovede pominjani CAR-ovi mogu da uključuju rezidue linkera između različitih domena, npr. izmeđudomenaVH i VL, koji su dodani zbogprikladnog razmeštanja i ustrojstvamolekula.OvdepominjaniCAR-ovimogudasadržejedan,dva,tri,četiri,petilivišelinkera.U specifičnimotelotvorenjimadužina linkera jeoko1dooko25aminokiselina,oko5dooko20amino kiselina ili oko 10 do oko 20 amino kiselina ili bilo koje interventne dužine amino kiselina. U nekim otelotvorenjimalinkerjedug1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25ilivišeaminokiselina.
[0116] Ilustrativniprimeri linkerauključujupolimereglicina (G)n;polimereglicin-serin (G1-5S1-5)n,pri čemu je n ceo broj jedan, dva, tri, četiri ili pet; polimere glicin-alanin; polimere alanin-serin i druge poznate fleksibilne linkere. Polimeri glicina i glicin-serina su relativno nestrukturisani i zato mogu da posluže kao neutralan lanac između domena fuzije proteina poput ovde opisanih CAR-ova. Glicin pristupa značajno većoj količini phi-psi prostora čak i od alanina, te je mnogo manje ograničen od reziduasadužimpostraničnimlancima(videtiScheraga,Rev.ComputationalChem.11173-142(1992)). Obično obrazovan naučnik prepoznaće da dizajna CAR-a u pojedinim slučajevima može da uključuje linkerekoji suucelosti ilidelimičnofleksibilni, takoda linkermožedauključuje flekisbilni linker,kao i jedanilivišedelovamanjefleksibilnestrukturekakobiseobezbedilaželjenastruktureCAR-a.
[0117]Ostali ogledni linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće sekvence amino kiselina: GGG; DGGGS(BR.ID.SEKV.:4);TGEKP(BR.ID.SEKV.:5)(videtinpr.Liuetal,PNAS5525-5530(1997));GGRR (BR.ID.SEKV.:6)(Pomerantzetal.1995,iznad);(GGGGS)ngdeje=1,2,3,4ili5(BR.ID.SEKV.:7)(Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (BR. ID. SEKV.:8) (Chaudhary et al, 1990, Proc. Natl.Acad.Sci.S.A.D.87:1066-1070);KESGSVSSEQLAQFRSLD(BR.ID.SEKV.:9)(Birdetal,1988,Science 242:423-426),GGRRGGGS (BR. ID.SEKV.:10); LRQRDGERP (BR. ID.SEKV.:l1); LRQKDGGGSERP (BR. ID. SEKV.:12);LRQKd(GGGS)2ERP(BR.ID.SEKV.:13).Alternativno,fleksibilni likerimoguracionalnodase dizajnirajuuzpomoćračunarskogprogramakojijesposobanzamodeliranjeveznihlokacijaDNKisamih peptida (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) ilimetodima za prikazivanjefaga.
[0118]UspecifičnimotelotvorenjimaCARuključujescFVkojidaljeuključujeveznusekvencupromenljive regije."Veznasekvencapromenljiveregije"jesekvencaaminokiselinekojapovezujepromenljivuregiju teškog lanca sa promenljivom regijom lakog lanca i obezbeđuje funkciju odstojnika kompatibilnog sa interakcijom dva pod-vezna domena tako da polipetid koji nastaje kao rezultat zadržava specifičnu sklonostvezivanjanekihciljnihmolekulakaoštojeantitelokojeuključujeistepromenljiveregijelakogi teškoglanca.Ujednomotelotvorenjusekvencapovezivanjapromenljiveregijedugaje1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 ili višeaminokiselina.Uspecifičnom otelotvorenjusekvencapovezivanjapromenljiveregijeuključujepolimeraglicin-serin(G1-5S1-5)n,gde je n ceo broj i iznosi 1, 2, 3, 4 ili 5.U drugomotelotvorenju sekvenca povezivanja promenljive regije uključuje(G4S)3linkeraminokiseline.
3.Domenodstojnika
[0119]UspecifičnimotelotvorenjimaizaveznogdomenaCAR-asledijedaniliviše"domenaodstojnika" koji predstavljaju regije koje odmiču domen vezivanja antigena od površine ćelije efektora kako bi omogućilipravilankontaktćelijesaćelijom,tevezvanjeiaktivacijuantigena(Pateletal,GeneTherapy, 1999; 6: 412-419). Zglobni domen može biti izveden iz prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantnog izvora. U određenim otelotvorenjima domen odstojnika je deo imunoglobulina, koji uključuje ali nije ograničen na jednu ili više konstantnih regija teškog lanca, npr. CH2 i CH3. Domen odstojnika može da obuhvati sekvencu amino kiseline zglobne regije prirodnog imunoglobulina ili zglobneregijeizmenjenogimunoglobulina.
[0120]UjednomotelotvorenjudomenodstojnikauključujeCH2iCH3izIgGi.
4.Zglobnidomen
[0121] Iza veznog domena CAR-a obično sledi jedan ili više "zglobnih domena" koji igraju ulogu u odmicanju domena za vezivanje antigena od površine ćelije efektora kako bi se obezbedio pravilan kontaktćelijesaćelijom,tevezivanjeiaktivacijaantigena.CARuopštenouključujejedanilivišezglobnih domena između veznog i transmembranskog domena (TM). Zglobni domen može biti izveden iz prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantnog izvora. Zglobni domen može da uključi sekvencu amino kiseline zglobne regije prirodnog imunoglobulina ili zglobne regije izmenjenog imunoglobulina.
[0122]"Izmenjenazglobnaregija"odnosisena (a)prirodnuzglobnuregijusado30%promenaamino kiselina(npr.do25%,20%,15%,10%ili5%zamenailibrisanjaaminokiselina),(b)deoprirodnezglobne regijekojajeduganajmanje10aminokiselina(npr.najmanje12,13,14ili15aminokiselina)sado30% promenaaminokiselina(npr.do25%,20%,15%,10%ili5%zamenailibrisanjaaminokiselina)ili(c)deo prirodnezglobneregijekojaobuhvatazglobnuregijujezgra(kojamožebitiduga4,5,6,7,8,9,10,11, 12, 13, 14 ili 15, ili najmanje 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 amino kiselina). U određenim otelotvorenjima jedna ili više rezidua cisteina u zglobnoj regiji prirodnog imunoglobulina može biti zamenjenajednomilivećimbrojemreziduadrugihaminokiselina(npr.jednomilivećimbrojemrezidua serina). Zglobna regija izmenjenog imunoglobulina može alternativno ili dodatno da sadrži reziduu prolina iz zglobne regije imunoglobulina divljeg tipa, zamenjenu reziduom druge amino kiseline (npr. reziduomserina).
[0123]Drugi ilustrativni zglobni domeni prikladni za upotrebu u ovde opisanim CAR-ovima uključuju zglobneregije izvedene izvanćelijskihregijaproteinamembranetipa1poputCD8α,CD4,CD28 iCD7, kojemogubitizglobneregijedivljegtipaiztihmolekulailimogubitiizmenjene.Udrugomotelotvorenju zglobnidomenuključujezglobnuregijuCD8α.
5.Transmembranskidomen(TM)
[0124]"Transmembranskidomen"jedeoCAR-akojispajavanćelijskivezivnideoiunutarćelijskisignalni domen i učvršćuje CAR u plazmumembrane ćelije imunog efektora. TM domenmože biti izveden iz prirodnih, sintetičkih, polusintetičkih ili kombinovanih izvora. TM domen može biti izveden iz (tj. uključivati najmanje transmembranske regije) alfa, beta ili zeta lanca receptora T-ćelije, CD3 epsilon, CD3zeta,CD4,CD5,CD9,CD16,CD22,CD28,CD33,CD37,CD45,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,PD-1 i CD 154.U posebnomotelotvorenju TMdomen je sintetički i predominantno uključuje hidrofobne reziduepoputleucinaivalina.
[0125]UjednomotelotvorenjuovderazmatraniCAR-ovisadržeTMdomenizvedenizCD8α.Udrugom otelotvorenju ovde razmatran CAR uključuje TM domen izveden iz CD8α i kratki oligo- ili polipetidni linker, poželjne dužine između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kiselina koji povezuje TMdomen i unutarćelijskisignalnidomenCAR-a.Glicin-erinlinkerpokazaoseposebnoprikladnim.
6.Unutarćelijskisignalnidomen
[0126]UodređenimotelotvorenjimaovderazmatraniCAR-oviuključujuunutarćelijski signalnidomen. "Unutarćelijskisignalnidomen"odnosisenadeoCAR-akojiučestvujeupretvaranjuporukeefektivnog vezivanja CAR-a na ciljni antigen u unutrašnjost ćelije imunog efektora u cilju podsticanja njenog funkcionisanja,npr.aktivacije,proizvodnjecitokina,razmnožavanjaicitotoksičneaktivnosti,uključujućii oslobađanje citotoksičnih faktora u ciljnu ćeliju vezanu za CAR, ili drugog ćelijskog odgovora podstaknutogvezivanjemantigenazavanćelijskidomenCAR-a.
[0127]Termin"funkcijaefektora"odnosisenaspecijalizovanufunkcijućelije.FunkcijaefektoraTćelije, naprimer,možebiticitolitičkaaktivnostilipomoćiliaktivnostkojauključujesekrecijucitokina.Takose termin "unutarćelijski signalni domen" odnosi na deo proteina koji pretvara signal funkcije efektora i usmerava ćeliju da izvodi specijalizovanu funkciju. Dok obično može da se koristi ceo unutarćelijski signalni domen, u mnogim slučajevima to nije neophodno. U obimu u kom se koristi, okrnjen unutarćelijskisignalnidomenmožedazameničitavdomensvedoktransdukujesignalfunkcijeefektora. Termin "unutarćelijski signalni domen" podrazumevano uključuje sve krnje delove unutarćelijskog signalnogdomenakojisudovoljnizatransdukovanjesignalafunkcijeefektora.
[0128]PoznatojedasignaligenerisaniodstranesamogTCR-anisudovoljnizapunuaktivacijuTćelije,te da se za to zahteva sekundarni ili ko-stimulativni signal. Tako semože reći da kod aktivacije T ćelije posreduju dve različite klase unutarćelijskih signalnih domena: primarni signalni domeni koji iniciraju primarnu aktivaciju koja zavisi od antigena putem TCR-a (npr. TCR/CD3 kompleks) i ko-stimulativni signalnidomenikojidelujunezavisnoodantigena iobezbeđujusekundarni ili ko-stimulativni signal.U prioritetnimotelotvorenjimaovderazmatranCARuključujeunutarćelijskisignalnidomenkojiobuhvata jedaniliviše"ko-stimulativnihsignalnihdomena"i"primarnisignalnidomen".
[0129] Primarni signalni domeni regulišu primarnu aktivaciju TCR kompleksa na stimulativan ili na inhibirajući način. Primarni signalni domeni koji se ponašaju na stimulativan način mogu da sadrže signalnemotivepoznatekaoaktivacionimotiviimunoreceptoranabazitirozinailiITAM-ovi.
[0130] Ilustrativni primeri IT AM-a koji sadrže primarne signalne domene sa posebnomupotrebomu pronalaskuuključujuoneizvedeneizTCRξ,FcRγ,FcRβ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD3ξ,CD22,CD79a,CD79bi CD66d.UposebnimprioritetnimotelotvorenjimaCARuključujeCD3ξprimarnisignalnidomenijedanili višeko-stimulativnihsignalnihdomena.Unutarćelijskiprimarnisignalniiko-stimulativnisignalnidomeni mogu da se bilo kojim redosledom povežu u tandem na karboksilni terminal transmembranskog domena.
[0131] Ovde razmatrani CAR-ovi uključuju jedan ili više ko-stimulativnih signalnih domena u cilju podsticanja efikasnosti i širenja T ćelija koje iskazuju ekspresiju CAR receptora. Ovde korišćen termin "ko-stimulativnisignalnidomen"ili"ko-stimulativnidomen"odnosisanaunutarćelijskisignalnidomen ko-stimulativnog molekula. Ko-stimulativni molekuli su molekuli sa površine ćelije koji nisu receptori antigena ili Fc receptori koji obezbeđuju drugi signal koji je potreban za efikasnu aktivaciju i funkcionisanje T limfocita nakon vezivanja na antigen. Ilustrativni primeri takvih ko-stimulativnih molekula obuhvataju CD27, CD28, 4-IBB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), CTLA4,LFA-1,CD2,CD7,LIGHTiNKD2CiCD83.UjednomotelotvorenjuCARuključujejedanilivišekostimulativnihsignalnihdomenakojisuizabraniizgrupekojasesastojiodCD28,CD137iCD134,iCD3ξ primarnogsignalnogdomena.
[0132]Udrugomotelotvorenju,CARuključujeCD28 iCD137ko-stimulativnesignalnedomene iCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0133]UjošjednomotelotvorenjuCARuključujeCD28iCD134ko-stimulativnesignalnedomeneiCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0134]UjednomotelotvorenjuCARuključujeCD137iCD134ko-stimulativnesignalnedomeneiCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0135]U jednomotelotvorenju CAR uključuje CD 137 ko-stimulativni signalni domen i CD3ξ primarni signalnidomen.
[0136]U jednomotelotvorenju CAR uključuje CD 134 ko-stimulativni signalni domen i CD3ξ primarni signalnidomen.
[0137] U jednom otelotvorenju CAR uključuje CD28 ko-stimulativni signalni domen i CD3ξ primarni signalnidomen.
[0138]Uodređenimotelotvorenjimaovde razmatraniCAR-ovi uključuju fragment koji vežeantigen ili antitelokojisespecifičnoveženareceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6,CALX, CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138,CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM,FAP, fetalniAchR,FRα,GD2,GD3, 'Glypican-3 (GPC3),HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1, SSX,Survivin,TAG72,TEM-oveiliVEGFR2polipeptidkojiiskazujeekspresijunaćelijutumora.
[0139]U jednomotelotvorenjuCARuključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4,αvβ6 integrina, BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1,IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-ove iliVEGFR2polipeptid; transmembranski domen izveden izpolipeptida izabranog izgrupekoja se sastojiod:CD8α;CD4,CD45,PD1 iCD152; i jedan ili više unutarćelijskih ko-stimulativnih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28,CD54,CD134,CD137,CD152,CD273,CD274iCD278;iCD3ξprimarnogsignalnogdomena.
[0140]U drugom otelotvorenju CAR uključuje scFv koji veže receptor alfa folata, 5T4,αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1,IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen izabran iz grupe koja se sastoji od: IgGl zgloba/CH2/CH3 i CD8α, i CD8α; transmembranskog domena izvedenogizpolipeptidaizabranogizgrupekojasesastojiod:CD8α;CD4,CD45,PD1iCD152;ijedanili višeunutarćelijskihko-stimulativnihsignalnihdomenaizabranihizgrupekojasesastojiod:CD28,CD134 iCD137;iCDξprimarnogsignalnogdomena.
[0141]UjošjednomotelotvorenjuCARuključujescFv,kojidaljeuključujelinker,kojivežereceptoralfa folata,5T4,αvβ6integrin,BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6, CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138,CD171,CEA,CSPG4,EGFR,EGFR familijuuključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3),HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM, NKG2D ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen izabran iz grupe koja se sastoji od: IgGl zgloba/CH2/CH3 i CD8α, i CD8α; transmembranskidomenuključujeTMdomen izveden izpolipeptida izabranog izgrupekojasesastoji od: CD8α; CD4, CD45, PD1 i CD 152, i kratkog oligo- ili polipeptidnog linkera, po mogućnosti dugog između1,2,3,4,5,6,7,8,9ili10aminokisleinakojipovezujeTMdomensaunutarćelijskimsignalnim domenomCAR-a;ijedanilivišeunutarćelijskihko-stimulativnihsignalnihdomenaizabranihizgrupekoja sesastojiod:CD28,CD134iCD137;iCD3ξprimarnisignalnidomen.
[0142]UposebnomotelotvorenjuCARuključujescFvkojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-l,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2polipeptid; zglobni domen koji uključuje PD1 ili CD 152 zglobni polipeptid; PD1 ili CD 152 transmembranski domen koji uključuje polipeptidnilinkerodoko3aminokiseline;CD137unutarćelijskiko-stimulativnisignalnidomen;iCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0143]UspecifičnomotelotvorenjuCARuključujescFvkojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-l,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2polipeptid; zglobni domen koji uključuje PD1 ili CD 152 zglobni polipeptid; PD1 ili CD 152 transmembranski domen koji uključuje polipeptidnilinkerodoko3aminokiseline;CD134unutarćelijskiko-stimulativnisignalnidomen;iCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0144]UspecifičnomotelotvorenjuCARuključujescFvkojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-ove iliVEGFR2polipeptid; zglobnidomenkoju uključuje PD 1 ili CD 152 zglobni polipeptid; PD1 ili CD 152 transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linkerodoko3aminokiseline;CD28unutarćelijskiko-stimulativnisignalnidomen; iCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0145]UspecifičnomotelotvorenjuCARuključujescFvkojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2polipeptid; zglobni domen koji uključujeIgGlzglob/CH2/CH3polipeptidiCD8αpolipeptid;CD8αtransmembranskidomenkojiuključuje polipeptidnilinkerodoko3aminokiseline;CD137unutarćelijskiko-stimulativnisignalnidomen;iCD3ξ primarnisignalnidomen.
[0146]UspecifičnomotelotvorenjuCARuključujescFvkojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetali AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-l,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2polipeptid; zglobni domen koji uključuje CD8α polipeptid; CD8α transmembranski domen koji uključuje polipeptini linker od oko 3 aminokiseline;CD134unutarćelijskiko-stimulativnisignalnidomen;iCD3ξprimarnisignalnidomen.
[0147]UspecifičnomotelotvorenjuCARuključujescFvkojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-l,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2polipeptid; zglobni domen koji uključuje CD8α polipeptid; CD8α transmembranski domen koji uključuje polipetidni linker od oko 3 aminokiseline;CD28unutarćelijskiko-stimulativnisignalnidomen;iCD3ξprimarnisignalnidomen.
[0148]Štaviše,dizajnovderazmatranihvektoraomogućavapoboljšanoširenje,dugoročnuizdržljivosti citotoksična svojstva T ćelija i istrajno iskazivanje ekspresije CAR-ova kroz život ćelija u poređenju sa nemodifikovanimTćelijamailiTćelijamamodifikovanimdrugimvektorima.
D.Polipeptidi
[0149] Ovaj pronalazak delimično govori o CAR polipeptidima i njihovim fragmentima, ćelijama i sastavimakoji ihčine,kao i vektorimakojiposeduju iskazivanjeekspersijepolipeptida.Upreferiranim otelotvorenjimapolipeptiduključujejedanilivišeCAR-ovašifrovanihsekvencompolinukleotidakaošto jeprikazanouodeljkusaBR.IDSEKV:2i3.
[0150]Termini"polipeptid,""fragmentpolipeptida,""peptid"i"protein"koristesezamenski,osimako nije naznačeno drugačije, te prema konvencionalnom značenju, tj. kao sekvence amino kiselina. Polipeptidinisuograničeniodređenomdužinom,npr.mogudauključujucelusekvencuproteinailinjezin fragment,tepost-tranzicionemodifikacijepolipeptida,npr.glikosilacije,acetilacije,fosforilacijeisl.,kao idrugemodifikacijepoznatenauci,kakoprirodnetako ineprirodne.Urazličitimotelotvorenjimaovde razmatraniCARpolipeptidiuključujusignalnuili (vodeću)sekvencunakrajuN-terminalaproteina,koja ko-translatornoilipost-translatornousmeravatransferproteina.Ilustrativniprimeriprikladnihsignalnih sekvenci (signalnih peptida) korisni u objašnjavanju ovde razmatranih CAR-ova uključuju, ali nisu ograničeni na lgGI signalne polipeptide teškog lanca, CD8α signalne polipeptide ili humani GM-CSF signalni receptor alfa signalnog peptida. Polipeptidi mogu biti pripremljeni uz pomoćmnoštva dobro poznatih kombinovanih ili sintetičkih tehnika. Ovde razmatrani polipeptidi posebno obuhvataju objašnjeneCAR-ove ili sekvencekojesadržebrisanja,dodatke i/ili zamene jedne ili većegbrojaamino kiselinaCAR-a.
[0151]Ovde korišćeni termini "izolovani peptid" ili "izolovani polipeptid" i sl., odnose se na in vitro izolaciju i/ili purifikaciju molekula peptida ili polipeptida iz ćelijskog okruženja i prekidanje veza sa drugimkomponentamaćelije,tj.oninisuznačajnopovezanisainvivosupstancama.Sličnotome,termin "izolovanaćelija"odnosisenaćelijudobijenuiz invivotkiva iliorganakoja jesuštinskioslobođenaod vanćelijskogmatriksa.
[0152] Polipeptidi uključuju "varijante polipeptida". Varijante polipeptida mogu da se razlikuju od prirodnogpolipeptidaujednojilivišezamena,brisanja,dodatakai/iliumetaka.Takvevarijantemoguda sejavljajuprirodnoilimogubitistvorenesintetički,naprimermodifikovanjemjedneilivišeprethodno spomenutihsekvencipolipeptida.Naprimer,upojedinimotelotvorenjima,možebitipoželjnopoboljšati vezivnu sklonost i/ili druga biološka svojstva CAR-ova uvođenjem jedne ili više zamena, brisanja, dodataka i/ili umetaka u vezni domen, zglob, TM domen, ko-stimulativni signalni domen ili primarni signalni domen polipeptida CAR-a. Prioritetno, pomenuti polipeptidi uključuju polipeptide koji imaju identitetaminokiselinenajmanjeoko65%,70%,75%,85%,90%,95%,98%ili99%.
[0153] Polipeptidiuključuju"frgmentepolipeptida".Fragmentipolipeptidaodnosesenapolipeptidkoji može biti monomerni ili multimerni, koji poseduje brisanje amino-terminala, brisanje karboksilterminala i/ili namerno brisanje ili zamenu prirodnog polipeptida ili polipeptida proizvedenog kombinovanjem. U određenim otelotvorenjima fragment polipeptida može da uključuje lanac amino kiseline koji jedugačakodnajmanje5dooko500aminokiselina.Biće razumljivoda suuodređenim otelotvorenjimafragmentiduginajmanje5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ili 450 amino kiselina. Posebno korisni fragmenti polipeptida obuhvataju funkcionalne domene, uključujući domene za vezivanje antigena ili fragmenata antitela. U slučaju anti-kappa ili anti-lambda antitela lakog lanca korisni fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na: CDR regiju, CDR3 regiju, regiju teškog ili lakog lanca, promenljivuregijuteškogililakoglanca,deolancaantitelailipromenljiveregijeuključujućidvaCDR-ai slično.
[0154]Polipeptidtakođemožebitispojenunutarokvirailisjedinjensalinkeromilidrugomsekvencom radiolakšanjasinteze,čišćenjailiidentifikacijepolipeptida(npr.poli-His)iliuciljupojačavanjavezivanja polipeptidazačvrstupodršku.
[0155] Kako je prethodno rečeno, ovde razmatrani polipeptidi mogu biti izmenjeni na razne načine uključujućizamenu,brisanja,skraćivanjeiumetanjeaminokiselina.Metoditakvihmanipulacijaopštesu poznatiunauci.Naprimer,varijantesekvenciaminokiselinereferentnogpeptidamogudasepripreme mutacijomDNK.Metodimutageneze i izmena sekvence nukleotida dobro su poznati u nauci. Vidi na primer, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. S.A.D.82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol,154:367-382),pat.S.A.D.br.4,873,192,Watson, J.D.etal, (MolecularBiologyof theGene, FourthEdition,Benjamin/Cummings,MenloPark,Calif,1987)ireferencecitiraneutomradu.Smernice zaprikladnuzamenuaminokiselinakojaneutičenabiološkuaktivnostproteinaodinteresamogudase pronađuumodeluautoraDayhoffetal,(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(Natl.Biomed. Res.Found.,Washington,D.C.).
[0156]Unekimotelotvorenjimavarijantaćesadržatikonzervativnezamene."Konzervativnazamena"je onau kojoj je amino kiselina zamenjenadrugomsa sličnim svojstvima, takoda će stručnjak zaoblast peptidne hemije očekivati suštinsko zadržavanje svojstava sekundarne strukture i hidropatske prirode polipeptida.Ustrukturipolinukleotidaipolipeptidaovogpronalskamogubitinapravljenemodifikacije, koje će i dalje zadržati funkcionalni molekul koji kodira varijantu ili derivat polipeptida sa poželjnim karakteristikama. Kada je promena sekvence amino kiseline polipepetida poželjna u cilju kreiranja ekvivalentne ili čak poboljšanje varijante polipeptida ovog pronalaska, stručnjak npr.može da izmeni jedanilivišekodonašifrovanesekvenceDNK,npr.kaoštojeopisanouTabeli1.
TABELA1-Kodoniaminokiselina
[0157] Uputstvo za određivanje koje rezidue amino kiselina mogu da budu zamenjene, umetnute ili izbrisane bez poništavanja biološke aktivnosti može da se pronađe uz pomoć stručnjacima poznatih računarskihprogramapoputsoftveraDNASTAR™.Poželjnojedaovdeopisanepromeneaminokiselinau varijantama proteina budu konzervativne promene amino kiselina, tj. zamene slično izmenjenim ili neizmenjenim amino kiselinama. Konzervativna zamena amino kiseline uključuje zamenu jedne iz familijeaminokiselina sa srodnimpostraničnim lancima.Prirodneaminokiseline seuopštenodelena četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazične (lizin, arginin, histidin), ne-polarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i neizmenjene polarne (glicin, asparagin, glutamin,cistein,serin,treonin,tirozin).Fenilalanin,triptofanitirozinseponekadklasifikujuzajednokao aromatičneaminokiseline.Odgovarajućekonzervativnezameneaminokiselinakodpeptidailiproteina poznatesunaučnicimaimogudaseizvršebezizmenebiološkeaktivnostimolekula.Naučniciprepoznaju dazamenejednostrukihaminokiselinausporednimregijamapolipeptidauopštenosuštinskinemenjaju biološku aktivnost (videti npr. Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4. izdanje, 1987, The Benjamin/CummingsPub.Co.,str.224).PrimerikonzervativnihzamenaopisanisuuPrivremenojprimeni patenataS.A.D.br.61/241,647,čijejeotkrivanjeovdeuključenoreferencom.
[0158]Kodtakvihpromenauobzirtrebauzetihidropatskiindeksaminokiselina.Važnosthidropatskog indeksaaminokiselineudodeljivanjuinteraktivnebiološkefunkcijenaproteinuopštejepoznataunauci (Kyte and Doolittle, 1982, uključeno ovde referencom). Svakoj amino kiselini dodeljen je hidropatski indeksnaosnovunjenihhidropatskihkarakteristikaikarakteristikanaboja(KyteandDoolittle,1982).Te vrednostisu:izoleucin(+4.5);valin(+4.2);leucin(+3.8);fenilalanin(+2.8);cistein/cistein(+2.5);metionin (+1.9);alanin (+1.8);glicin (-0.4); treonin (-0.7);serin (-0.8); triptofan(-0.9); tirozin (-1.3);prolin (-1.6); histidin(-3.2);glutamat(-3.5);glutamin(-3.5);aspartat(-3.5);asparagin(-3.5);lizin(-3.9)iarginin(-4.5).
[0159] U nauci je poznato da određene amino kiseline mogu da budu zamenjene drugim amino kiselinama sa sličnim hidropatskim indeksom ili rezultatom, a da i dalje daju protein slične biološke aktivnosti,tj.idaljedajuproteinekvivalentnebiološkefunkcionalnosti.Pripravljenjuovakvihpromena, preferirasezamenaaminokiselinačijihidropatskiindeksispadajuurasponod±2,posebnosepreferira zamena onih čiji hidropatski indeksi spadaju u raspon ±1, a najviše se preferira zamena onih sa rasponomod ±0,5. U nauci je takođe poznato da zamena sličnih amino kiselinamože efikasno da se uradinaosnovuhidrofiličnosti.
[0160] Kao što je detaljno navedeno u patentu S.A.D. br.4,554,101, sledeće hidrofilične vrednosti pripisanesureziduamaaminokiselina:arginin(+3.0);lizin(+3.0);aspartat(+3.0±1);glutamat(+3.0±1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucine (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin(-2.5);triptofan(-3.4).Razumesedaaminokiselinamožebitizamenjenadrugomsasličnom hidrofilnomvrednošćuidaidaljezadržibiološkiekvivalent,aposebno,imunološkiekvivalentanprotein. Kodtakvihpromenapreferirasezamenaaminokiselinačijihidrofilnevrednostispadajuurasponod±2, posebnosepreferirazamenaonihčijehidrofilnevrednostispadajuurasponod±1,anajvišesepreferira zamenaonihsarasponomod±0,5.
[0161] Kao što je prethodno istaknuto, zamene amino kiselina mogu da budu zasnovane na osnovu relativne sličnosti postraničnih lanaca zamenskih amino kiselina, na primer, hidrofobičnosti, hidrofilnosti,naboju,veličiniislično.
[0162] Varijante polipeptida dalje uključuju glikosilatne forme, agregativne konjugate sa drugim molekulima i kovalentne konjugate sa nepovezanim hemijskim delovima (npr. pegiliranih molekula). Kovalentne varijante mogu biti pripremljene povezivanjem funkcionalnosti u grupe koje se nalaze u lancu amino kiselina ili na rezidualnom N- ili C-terminalu, što je poznato u nauci. Varijante takođe uključuju alelske varijante, varijante unutar vrste imuteine.U varijante takođe spadaju i skraćenja ili brisanjaregijakojeneutičunafunkcionalnuaktivnostproteina.
[0163] U jednom otelotvorenju gde je poželjno iskazivanje ekspresije jednog ili više polipeptida, polinukleotidnasekvencakojaihkodiramožedaseodvojiodIRESsekvencekaoštoserazmatradrugeu ovomradu.Udrugomotelotvorenju,dvailivišepeptidamoguposedovatiiskazivanjeekspresijeuobliku fuzijskogproteinakojiuključujejednuilivišesamo-odcepljujućihpolipeptidnihsekvenci.
[0164] Polipeptidi prisutni u ovom pronalasku uključuju fuzijske polipeptide. U preferiranim otelotvorenjim prikazani su fuzijski polipeptidi i polinukleotidi koji kodiraju fuzijske polipeptide, npr. CAR-ovi. Fuzijski polipeptidi i fuzijski proteini odnose se na polipeptide koji imaju najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset ili više polipeptidnih segmenata. Fuzijski polipeptidi su običnopovezanivezomC-terminus-N-terminus,iakotakođemogubitipovezanivezomC-terminus-C-terminus,N-terminus-N-terminusiliN-terminus-C-terminus.Polipeptidifuzijskihproteinamoguimati bilo koji ili specifičan redosled. Fuzijski polipeptidi ili fuzijski proteini takođe mogu da uključuju konzervativnomodifikovane varijante, polimorfne varijante, alele, mutante, subsekvence, međuvrsne homologne rekombinacije, sve dok je očuvana željena transkripciona aktivnost fuzijskog polipeptida. Fuzijski polipeptidimogu biti proizvedeni hemijskim sintetičkimmetodima ili hemijskim povezivanjem između dva dela ili mogu uopšteno biti pripremljeni pomoću standardnih tehnika. Ligatirane DNK sekvence koje uključuju fuzijski polipeptid operativno su povezane sa prikladnim transripcionim ili kontrolnimelementimakaoštojeobjašnjenodrugdeuovomradu.
[0165]Ujednomotelotvorenjufuzijskipartneruključujesekvencukojapomažeuizražavanjuekspresije proteina (pojačivač izražavanja ekspresije) sa većim prinosima od nativnog rekombinantnog proteina. Ostali fuzijski partneri mogu biti izabrani tako da povećaju rastvorljivost proteina ili da omoguće targetiranjeproteinaupoželjnimunutarćelijskimodeljcima ili daolakšaju transport fuzijskogproteina krozćelijskumembranu.
[0166] Fuzijski polipeptidi mogu dalje uključivati signal za otcepljivanje polipetida između svakog od ovdeopisanihpolipeptidnihdomena.Osimtoga,lokacijapolipeptidamožedabudestavljenaubilokoju peptidnusekvenculinkera.Uzornisignalizaotcepljivanjepolipeptidauključujulokacijezaprepoznavanje otcepljivanja polipeptida, lokacije za otcepljivanje jezgra (npr. retke lokacije za ograničeno prepoznavanje enzima, lokacije za prepoznavanje samo-otcepljenja ribosoma) i samo-otcepljujuće viralneoligopeptide(videtideFelipeiRyan,2004.Traffic,5(8);616-26).
[0167]Prikladnelokacijezaotcepljivanjeproteaze isamo-otcepljujućihpeptidapoznatesunaučnicima (videtinpr.uRyanetal,1997.J.Gener.Virol.78,699-722;Scymczaketal.(2004)NatureBiotech.5,589-594). Uzorne lokacije za otcepljivanje proteaze uključuju, ali nisu ograničenije na, lokacije za otcepljivanje proteaza NIa potivirusa (npr. proetaze virusa duvanske jetke), proteaza HC potivirusa, proteaza virusa PI (P35), proteaza biovirusa NIa, proteaza kodiranog RNA-2 biovirusa, proteaza L aptovirusa,proteazaenterovirusa2A,proteazarinovirusa2A,proteazapikorna3C,proteazakomovirusa 24K,proteazanepovirusa24KproteazaRTSV3C(pirinčanogtungrosferičnogvirusa),proteazaPYFV3C (virusa peršinove žute fleke), heparina, trombina, faktora Xa i enterokinaze. Zbog te velike strogosti otcepljivanja, lokacije za otcepljivanje proteaza TEV (virusa duvanske jetke) preferirane su u jednom otelotvorenju,npr.EXXYXQ(G/S)(BR. ID.SEKV.:14),naprimer,ENLYFQG(BR. ID.SEKV.:15) iENLYFQS (BR. ID.SEKV.:16),gdeXpredstavljabilokojuaminokiselinu(otceplijvanjeodstraneTEV-adešavase izmeđuQiGiliQiS).
[0168]Uposebnimotelotvorenjima,peptidisasamo-otcepljivanjemuključujuonesekvencepolipeptida dobijeneizpepetidapotivirusaikardiovirusa2A,FMDV(virusabolestistopalaiusta),Avirusakonjskog rinitisa,virusaThoseaasignaisvinjskogteskovirusa.
[0169]Uodređenimotelotvorenjimalokacijapolipeptidasasamo-otcepljivanjemuključujelokaciju2Aili onunalik2A,sekvencuilidomen(Donnellyetal,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041).
TABELA2:Uzornelokacije2Auključujusledećesekvence.
[0170]UpreferiranimotelotvorenjimaovderazmatranipolipeptidradiuključujeCARpolipeptid.
E.Polinukleotidi
[0171] U određenim otelotvorenjima prikazani su polinukleotidi koji uključuju MND promotor i polinukleotidno šifrovanje jednog ili više CAR-ova. U prioritetnim otelotvorenjima prikazan je polinukleotidkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidnimšifrovanjem jednogilivišeCAR-ovakaoštojeprikazanouBR.ID.SEKV.:2i3.Ovdekorišćentermin"polinukleotid"ili "nukleinskakiselina"odnosisenamessengerRNK(mRNA),RNK,genomskuRNK(gRNA),RNKpozitivne niti (RNA(+)), RNK negativne niti (RNA(-)), genomsku DNK (gDNA), komplementarnu DNK (cDNA) ili rekombinantnu DNK. Polinukleotidi uključuju jednolančane i dvolančane polinukleotide. Poželjno, polinukleotidi iz ovog pronalaska uključuju polinukleotide ili varijante koji imaju identitet sekvence najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%u odnosu na ovde opisane referentne sekvence (videti e.g., Listu sekvenci), tipično u slučajevima gde varijanta zadržava najmanje jednu biološku aktivnost referentne sekvence. U različitim ilustrativnim otelotvorenjimaovajpronalazakdelomičnorazmatrapolinukleotidekojiuključujuvektorezaiskazivanje ekspresije,viralnevektoreiplazmidetransfera,asastaviićelijeuključujuisto.
[0172]Uodređenimotelotvorenjimapolinukleotidiprikazaniuovompronalaskušifrujunajmanjeoko5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 ili 2000 ili više graničnih reziduaamino kiselinaprisutnihpolipeptida, kao i onih između. Spremno sepodrazumevada "dužine između"uovomkontekstuznačebilokojudužinuizmeđucitiranihvrednosti,kaoštosu6,7,8,9,itd., 101,102,103,itd.;151,152,153,itd.;201,202,203,itd.
[0173]Ovdekorišćenitermini"polinukleotidnavarijanta","varijanta"isličniodnosesenapolinukleotide kojipokazuju identitetsuštinskesekvenceuzreferentnusekvencupolinukleotida ilipolinukleotidekoji hibridizuju sa referentnom sekvencom u strogim uslovima definisanim u radu. Ovi termini uključuju polinukleotideukojimajejedanilivišenukleotidadodaniliizbrisan,ilizamenjenrazličitimnukleotidima u poređenju sa referentnim polinukleotidom. U tom smislu u struci je jasno razumljivo da na referentnompolinukleotidumogubitinačinjeneodređenealteracije kojeuključujumutacije,dodatke, brisanjailizamene,pričemuizmenjenipolinukleotidzadržavabiološkufunkcijuiliaktivnostreferentnog polinukleotida.
[0174]Izrazi"identitetsekvence"ili,npr.onipoput"sekvencaje50%identičnasa"odnosesenastepen u kom su u okviru komparacije sekvence identične na osnovu nukleotida-po-nukleotida ili amino kiseline-po-aminokiseline.Tako"procenatidentitetasekvence"možedaseizračunapomoćupoređenja dvaju optimalno poravnatih sekvenci u okviru poređenja, što određuje broj položaja u kojima se identičnebazenukleinskekiseline (npr.A,T,C,G, I) ili identičnerezidueaminokiseline (npr.Ala,Pro, Ser, Thr,Gly,Val, Leu,He, Phe, Tyr, Trp, Lys,Arg,His,Asp,Glu,Asn,Gin, Cys iMet) pojavljujuuobe sekvencekakobidalebrojpodudarnihpoložajapomoćuukupnogbrojapoložajauokvirupoređenja(tj. veličiniokvira)irezultatpomnoženbrojem100kakobisedobiopostotakidentitetasekvence.Uključeni sunukleotidiipolipeptidikojiimajunajmanjeoko50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa svakom od prethodno opisanih referentnih sekvenci, obično u slučaju kada peptidna varijanta zadržava najmanje jednu biološku aktivnost referentnogpolipeptida.
[0175]Terminikorišćenizaopisivanjeodnosasekvenciizmeđudvailivišepolinukleoptidailipolipeptida uključuju "referentnu sekvencu", "okvir poređenja", "identitet sekvence", "procenat identiteta sekvence"i"suštinskiidentitet"."Referentnasekvenca"dugačkajenajmanje12,aličestoi15do18,kao i najmanje 25 jedinica monomera, uključujući nukleotide i rezidue amino kiselina. Pošto dva polinukleotida mogu da pojedinačno čine (1) sekvencu (tj. samo deo kompletne sekvence polinukleotida) koja je slična kod oba polinukleotida, i (2) sekvencu koja se razlikuje kod oba polinukleotida, poređenja sekvenci između dva (ili više) polinukleotida obično se izvode poređenjem sekvenci dvaju polinukelotidau "okviru poređenja" kakobi se identifikovale i uporedile lokalne regije sličnosti sekvenci. "Okvir poređenja" odnosi se na konceptualni segment od najmanje 6 uzastopnih položaja, a obično od oko 50 do oko 100, a češće oko 100 do oko 150, u kojima se sekvenca nakon optimalnogporavnavanjadajusekvenciporedi sa referentnomsekvencomsa istimbrojemuzastopnih položaja.U slučajuoptimalnogporavnanjadvaju sekvenciokvirpoređenjamožedauključi dodatke ili brisanja tj. praznine) od oko 20% ilimanje u poređenju sa referentnom sekvencom (što ne ugrožava dodatke ili brisanja). Optimalno poravnavanje sekvenci za poravnanje okvira poređenja može da se izvedepomoćukompjuterizovaneimplementacijealgoritama(GAP,BESTFIT,FASTA, iTFASTAuIzdanju softverskog paketaWisconsin Genetics 7.0, Genetička računarska grupa, Science Drive 575,Madison, WI,S.A.D.) iliproveromnajboljegporavnanja(tj.onogkojerezultujenajvišimprocentomhomologijeu okviru poređenja) stvorenombilo kojom od različitih odabranihmetoda.Može se dati i referenca na BLAST familiju programa kao što je učinjeno u primeru prikazanomu raduAltschul et al, 1997,Nucl.
AcidsRes.25:3389.DetaljnaraspravaoanalizisekvencemožesepronaćiuOdeljku19.3radaAusubelet al,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonsInc,1994-1998,poglavlje15.
[0176] Ovde korišćen termin "izolovani polinukleotid" odnosi se na polinukleotid koji je očišćen od sekvenci kojemu seuprirodnomstanjunalazebočno,npr. fragmentDNKkoji jeuklonjen iz sekvenci koje su mu normalno susedne. "Izolovani polinukleotid" takođe se odnosi na komplementarnu DNK (cDNA),rekombinantnuDNKilipolinukleotidkojinepostojiuprirodiinačinjenjeljudskomrukom.
[0177] Termini koji opisuju orijentaciju polinukleotida uključuju: 5' (u normalnim slučajevima kraj polinukleotida ima grupu slobodnih fosfata) i 3' (u normalnim slučajevima kraj polinukleotida ima slobodnuhidroksilnu(OH)grupu).Sekvencepolinukleoptidamoguseobeležitiuorijentaciji5'do3'ili3' do 5'. Za DNK i mRNA, lanac 5' do 3' predstavlja lanac "sense", "plusa" ili "kodiranja" jer je njena sekvenca identičnasekvencipremessengera(premRNA)[osimzauracil (U)uRNK,umestotimina(T)u DNK]. Za DNK i mRNA, komplementarni lanac 3' do 5', koji je prepisan od strane RNK polimeraze određen je kao lanac "obrasca", "antisense", "minusa" ili "ne-kodiranja". Kako se ovde koristi, termin "reverznaorijentacija"odnosisenasekvencu5'do3'upisanuu3'do5'orijentacijuilisekvencu3'do5' upisanuu5'do3'orijentaciju.
[0178] Termini "komplementaran" i "komplementarnost" odnose se na polinukleotide (tj. sekvencu nukleotida)povezanepravilimauparivanjabaza.Naprimer,komplementarnilanacsekvenceDNK5'AG TCATG3'je3'TCAGTAC5'.Drugasekvencasečestopišekaoreverznikomplementsazavršetkom 5' na levoj i završetkom 3' na desnoj strani, 5'CATGACT3'. Sekvenca jednaka svom obrnutom komplementujepalindromskasekvenca.Komplementarnostmožedabude"delimična",ukomslučaju su samo neke baze nukleinskih kiselina uparene prema pravilima uparivanja baza. Ili može biti "kompletna"ili"totalna"kompementarnostizmeđunukleinskihkiselina.
[0179]Štaviše,naučnicićecenitisaznanjeda,kaorezultatdegeneracijegenetskogkoda,postojemnoge sekvence nukleotida koje kodiraju polipeptid ili fragment njegove varijante, kao što je ovde opisano. Nekiodtihpolipeptidaimajuminimalnuhomolognostsasekvencomnukleotidabilokognativnoggena. Uprkos tome, polinukleotidi koji variraju zbog razlika u upotrebi kodona su specifično raumatrani u ovompronalasku,kaonaprimerpolinukleoptidioptimizovanizaljudskui/iliprimatskuselekcijukodona. Dalje, takođemogudaseupotrebeovde iznesenialeligenakojičinesekvencepolinukleotida.Aleli su endogenigenikojisupretrpeliizmenekaorezultatjedneilivišemutacija,poputbrisanja,dodatakai/ili zamenanukleotida.
[0180] Ovde korišćen termin "kaseta nukleinske kiseline" odnosi se na genetske sekvence unutar vektora kojimože da iskaže ekspresiju RNK, a posledično i proteina. Kaseta nukleinske kiseline sadrži protor i gen od interesa, npr. CAR. Kaseta nukleinske kiseline je poziciono i sekvenciono orijentisana unutarvektoranatakavnačindanukleinskakiselinaukasetimožebititranskribovanauRNK,akadaje to potrebno, translatirana u protein ili polipeptid, te izložena prikladnim post-tranzicionim modifikacijama koje zahteva aktivnost transformisane ćelije, kao i translocirana na prikladni komplementzabiološkuaktivnostpomoćutargetiranjaprikladnihunutarćelijskihodeljakailisekrecijeu vanćelijskeodeljke.Krajevikasete3'i5'supoželjnoprilagođenizaspremnoumetanjeuvektor,npr.ona nasvakomkrajuposedujelokacijeograničenjaendonukleaze.Uprioritetnomotelotvorenjupronalaska, kaseta nukleinske kiseline sadrži ovde razmatranu sekvencu MND promotora i himerni receptor antigena.Kasetasemožeuklonitiiumetnutiuplazmidiliviralnivektorkaojedinstvenajedinica.
[0181]Uodređenimotelotvorenjimapolinukleotidiuključujunajmanjejedanpolinukleotidodinteresa. Ovde kroišćen termin "polinukleotidod interesa"odnosi senapolinukleotid koji kodirapolipeptid (tj. polipeptid od interesa), umetnut u vektor iskazuje ekspresiju koji želi da se izrazi. Vektor može da uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 polinukleotida od interesa. U određenim otelotvorenjima polinukleotid od interesa kodira polipeptid koji obezbeđuje terapijski efekat u tretiranju ili prevenciji bolestiiliporemećaja.Plinukleotidiodinteresaipolipeptidikojiihkodirajuuključujupolinukleotidekoji kodiraju polipeptide divljeg tipa, kao i njihove funkcionalne varijante i fragmente. U određenim otelotvorenjima funkcionalna varijanta ima najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% istovetnosti sa odgovarajućim referentnimpolinukeotidomdivljeg tipa ili sekvenci polipeptida.U određenim otelotvorenjima funkcionalna varijanta ili fragment ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% biološke aktivnosti odgovarajućeg polipeptida divljeg tipa.
[0182]Ujednomotelotvorenjupolinukleotidodinteresanekodirapolipeptidalislužikaopredložakza transkripciju miRNA, siRNA ili shRNA, ribosoma ili druge inhibitorne RNK. U različitim drugim otelotvorenjimapolinukleotidobuhvatapolinukleotidodinteresakojikodiraCARijedanilivišedodatnih polinukleotida od interesa uključujući ali ne i ograničavajući se na inhibitornu sekvencu nukleinske kiselineuključujućialineograničavajućisena:siRNA,miRNA,shRNAiribosom.
[0183] Ovde kroišćeni termini "siRNA" ili "kratka posredna RNA" odnose se na kratku sekvencu polinukleotidakojaposredujeuprocesupost-transkripcionogutišavanjagenaspecifičnomzasekvencu, tranzicionoj inhibiciji, transkripcionoj inhibiciji ili epigenetskoj RNAi kod životinja (Zamore et al, 2000, Cell,101,25-33;Fireetal,1998,Nature,391,806;Hamiltonetal,1999,Science,286,950-951;Linetal, 1999,Nature,402,128-129;Sharp,1999,Genes&Dev.,13,139-141;iStrauss,1999,Science,286,886). U određenim otelotvorenjima siRNA uključuje prvi lanac i drugi lanac koji imaju isti broj nukleozida, međutimprviidrugilanacsuprotivtežanatakavnačindadvaterminalnanukelotidanaprvomidrugom lancunisuuparenasareziduomnakomplementarnomlancu.Uodređenimslučajevimadvaneuparena nukelozidasureziduetimidina.siRNAtrebadauključujeregijusadovoljnomhomologijomnaciljnigen, te da bude dovoljne dužine u nukleotidima, tako da siRNA ili njen fragment mogu da posreduju pri smanjenjuregulacijeciljnoggena.Tako,siRNAuključujeregijukojajebaremdelimičnokomplementarna ciljnoj RNK. Nije neophodno da postoji savršena komplementarnost između siRNA i cilja, ali sličnost mora biti značajna kako bi se omogućilo da siRNA ili produkt njenog otcepljivanja usmere utišavanje specifično za sekvencu, kao što se dešava kod RNAi otcepljivanja ciljne RNK. Komplementarnost ili stepen homologije sa ciljnim lancem je najkritičnija kod antisense lanca. Dok je savršena komplementarnost čestopoželjnaposebnokodantisense lanca,nekaotelotvorenjauključuju jednu ili više,alipoželjnoje10,8,6,5,4,3,2ilimanjeneusklađenostiuodnosunaciljnuRNK.Teneusklađenosti senajvišetolerišuuterminalnimregijama,teakosuprisutnepoželjnosenalazeuterminalnojregiji ili regijama, npr. unutar 6, 5, 4 ili 3 nukleotida terminusa 5' i/ili 3'. Kako bi održalo sveukupni karakter dvostrukog lancamolekula, sense lanac treba samo da bude dovoljno komplementaran sa antisense lancem
[0184] Pored toga, siRNA može da bude modifikovana ili da uključuje nukleozidne analoge. Regije jednostrukog lanca siRNA mogu da budu modifikovane ili da uključuju nukleozidne analoge, npr. neuparenu regiju ili regiju petlje za ukosnicu, npr. regiju koja povezuje dve komplementarne regije i može da sadrži modifikacije ili nukleozidne analoge. Takođe je korisna modifikacija za stabilizovanje jednog ili više terminusa 3'- ili 5'- siRNA, npr. protiv egzonukleaza ili favorizovanje ulaska agensa antisense siRNA u RISC.Modifikacijemogu da uključe C3 (ili C6, C7, C12) amino linkere, tiol linkere, karboksillinkere,ne-nukleotidskeodstojnike(C3,C6,C9,C12,abazik,trietilenglikol,heksaetilenglikol), specijalni biotin ili reagense fluoresceina koji se javljaju u obliku fosforamidita i imaju drugu DMT-zaštićenu hidroksilnu grupu, što dozvoljava mnogostruka uparivanja tokom sinteze RNK. Svaki lanac siRNAdug je 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20nukleotida ilimanje. Poželjno je da su lanci dugi najmanje 19 nukleotida.Naprimer,svakilanacmožebitidugizmeđu21i25nukelotida.PreferiranasiRNAposeduje dupleksregijuod17,18,19,29,21,22,23,24 ili25nukleotidnihparova i jedanilivišeprevisaod2-3 nukleotida,poželjnojejedanilidva3'previsaod2-3nukleotida.
[0185]Ovdekroišćenitermini"miRNA"ili"mikroRNA"odnosesenamalenekodirajućeRNK-oveod20-22nukleotida,kojesuobičnoisečeneizprekursorskihstrukturaRNKod-70nasebisavijenihnukleotida, poznatih kao pre-miRNK-ovi. miRNK-ovi negativno regulišu svoje ciljeve na jedan ili dva načina u zavisnostiodstepenakomplementarnostiizmeđumiRNaicilja.Prvo,miRNAkojasesavijasasavršenom ili skoro savršenom komplementarnošću na sekvencu mRNA koja kodira protein indukuje RNK-posredujućiput interference (RNAi).miRNA-ovikojivršeregulatorneefektevezivanjemnanesavršene komplementarne lokacije unutar 3' netranslatiranih regija (UTR-ova) u svojim mRNA ciljevima, posttranskripcionosuzbijajuekspresijuciljnihgena,naizglednanivoutranslacije,putemRISCkompleksakoji je sličan ilimoguće je i jednak onome koji se koristi za RNAi put. Dosledno sa kontrolom translacije, miRNA-ovikojikoristeovajmehanizamsmanjujunivoeproetinasvojihciljnihgena,alisamominimalno utičunanivoemRNAovihgena.miRNAobuhvatajuprirodnekao iveštačkidizajniranemiRNA-ovekoji moguspecifičnodatargetirajubilokojusekvencumRNA.Naprimer,u jednomotelotvorenjustručnjak može da dizajnira kratke RNK konstrukte ukosnice koji izražavaju ekspresiju kao primarni transkripti ljudskemiRNA(npr.miR-30 ilimiR-21).TajdizajndodajekonstruktuukosniceDrosha lokacijuobrade i pokazanojedauvelikopovećavaefikasnostobaranja(Puschetat,2004).Osnovaukosnicesastojiseod 22-nukleotidne dsRNA (npr. antisense ima savršenu komplementarnost sa željenim ciljem) i 15-19-nukleotidnepetlje ljudskemiR.DodavanjemiRpetlje imiR30bočne sekvencena jednu ili obe strane ukosnicerezultiradesetostrukimpovećanjemDroshaiDicerobradezaukosnicekojeiskazujuekspresiju u poređenju sa konvencionalnim dizajnovima shRNA bezmicroRNA. Povećanje Drosha i Dicer obrade translatiraseuvećuproizvodnjusiRNA/miRNAivećumoćzaukosnicesaiskazivanjemekspresije.
[0186]Ovdekroišćenitermini"shRNA"ili"RNAkratkeukosnice"odnosesenadvolančanustrukturukoja se formira od jednostrukog samo-komplementarnog lanca RNK. Kod inhibicije su preferirani shRNA konstrukti koji sadrže sekvencu nukleotida jednaku delu kodirajuće ili nekodirajuće sekvence ciljnog gena. Kod inhibicije su takođe efikasne sekvence RNK sa umecima, brisanjima i mutacijama jednog mestarelativnimauodnosunaciljnusekvencu.IzmeđuinhibitorneRNKidelaciljnoggenapreferišese istovetnost sekvencevećaod90% ili jednaka100%.Uodređenimprioritetnimotelotvorenjimadužina delashRNAkojiformiradupeksshRNAdugajenajmanje20,21i22nukleotida,npr.veličinomodgovara proizvodima RNK proizvedenim Dicer otcepljivanjima. U određenim otelotvorenjima konstrukt shRNA dugjenajmanje25,50,100,200,300ili400baza.UodređenimotelotvorenjimakonstruktshRNAdugje 400-800baza.KonstruktishRNAsuveomatolerantninavarijacijeusekvencipetljeiveličinipetljeA.
[0187]Ovdekorišćentermin"robosom"odnosisenakatalitičkiaktivanmolekulRNKkojijesposobanza otcepljivanjespecifičnelokacijeodciljnemRNA.Opisanojenekolikopodtipova,npr.čekićastiribosomi ili ribosomi ukosnice. Katalitička aktivnost i stabilnost ribosoma može se poboljšati zamenom deoksiribonukleotida ribonukleotidima na nekatalitičkim bazama. Dok se za uništavanje određenih mRNA-ovamogukoristitiribosomikojiotcepljujumRNAnasekvencamazaprepoznavanjespecifičnimza lokaciju, preferira se upotreba čekićastih ribosoma. Čekićasti ribosomi otcepljuju mRNA-ove na lokacijamaodređenimbočnimregijamakojeformirajubazneparovekomplementarnesaciljnommRNA. JedinizahtevjedaciljnamRNAimasledećusekvencuoddvebaze:5'-UG-3'.Konstrukcijaiproizvodnja čekićastihribosomadobrojepoznataunauci.
[0188] Preferirani metod isporuke polinukleotida od interesa koji uključuje siRNA, miRNA, shRNA ili ribosomuključujejednuilivišeregulatornihsekvencipoput,naprimer,snažnekonstruktivnepolimeraze III, npr. ljudskog U6 snRNA promotora, mišijeg U6 snRNA promotora, ljudskog ili mišijeg HI RNA promotorailjudskogtRNA-valpromotorailisnažnogkonstruktivnogpromotorapolimerazeII,kaoštoje opisanodrugdeuovomradu.
[0189] Polinukleotidi ovog pronalaska, bez obzira na dužinu same kodne sekvence, mogu da se kombinuju sadrugim sekvencamaDNK,poputprotomera i/ili pojačivača,netranslatiranih regija (UTR-ova), Kozak sekvenci, signalima poliadenilacije, dodatnim lokacijama za ograničavanje enzima, lokacijama mnogostrukog kloniranja, unutarnjim lokacijama za ulazak ribosoma (IRES), lokacijama za prepoznavanje rekombinaze (npr. LoxP, FRT i Att lokacijama), završnim kodonima, signalima za završavanje transkripcije i polinukleotidima koji kodiraju peptide za samootcepljivanje, oznakama epitopa,kaošto jeprikazanodrugdeuovomradu ilipoznatounauci,panjihovaukupnadužinamože značajnoda varira. Zato se smatra da jemogućaupotreba fragmenta gotovobilo koje dužine, dok je ukupna dužina preferirano ograničena lakoćom pripreme i upotrebom u nameravanom protokolu za rekombinacijuDNK.
[0190]Polinukleotidimogu da budu pripremljeni, udešavani i/ili da iskazuju ekspresiju uz pomoć bilo koje od raznih dobro ustanovljenih tehnika poznatih i dostupnih nauci. U cilju iskazivanja ekspresije željenogpolipeptida,mogućejeuprikladanvektorumetnutisekvencunukleotidakojagakodira.Primeri vektora su plazmidi, autonomne zamenske sekvence i prenosni elementi. Dodatni uzorni vektori bez izuzetka uključuju plazmide, fagemide, kozmide, veštačke hromozome poput veštačkog hromozoma kvasca (YAC), bakterijske veštačke hromozome (BAC) ili PI izvedene veštačke hromozome (PAC), bakteriofagepoputlambdafagailiMI3fagaiživotinjskeviruse.Primerikategorijaživotinjskihvirusakoji se koriste kao vektori bez izuzetka uključuju retrovirus (uključujući i lentivirus), adenovirus, adeno povezanivirus,virusherpesa (npr.virusherpessimpleksa),virusboginja,bakulovirus,viruspapiloma i papovirus(npr.SV40).PrimerivektoraiskazivanjaekspresijesupClenovektori(Promega)zaiskazivanje ekspresijeućelijamasisara;pLenti4/V5-DEST™,pLenti6/V5-DEST™ ipLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) za transfer gena sa posredovanjem lentivirusa i iskazivanje ekspresije u ćelijama sisra. U posebnim otelotvorenjima kodna sekvencaovdeprikazanih himernih proteinamožebiti vezanau takve vektore iskazivanjaekspresijeuciljuizražavanjahimernogproteinaućelijamasisara.
[0191]"Kontrolnielementi"ili"regulatornesekvence"prisutnekodvektoraiskazivanjaekspresijesuone netranslatiraneregijevektora-porekloreplikacije,kaseteselekcije,promotori,pojačivači,intronisignala početka prevođenja (Shine Dalgarno sekvenca ili Kozak sekvenca), sekvenca poliadenilacije, 5' i 3' netranslatirane regije - koji stupaju u interakciju sa ćelijskim proteinima domaćina kako bi sproveli transkripciju i translaciju. Takvi elementi mogu da se razlikuju u snazi i specifičnosti. U zavisnosti od upotrebljenog sistema vektora i domaćina, može da se koristi bilo koji broj elemenata prikladnih transkripcijaitranslacija,uključujućisveprisutneiinduktibilnepromotore.
[0192] U posebnim otelotvorenjima vektor za upotrebu u primeni pronalaska koji uključuje ali nije ograničen na vektore iskazivanja ekspresije i viralne vektore, će uključivati egzogene, endogene ili heterologne kontrolne sekvence poput promotora i/ili pojačivača. "Endogena" kontrolna sekvenca je onakojajeprirodnovezanasadatimgenomugenomu."Egzogena"kontrolnasekvencajeonasmeštena u jukstapoziciju sa genom uz pomoć genetske manipulacije (tj. tehnike molekularne biologije) poput transkripcijeonoggenakojijeusmerenpovezanimpojačivačem/promotorom."Heterologna"kontrolna sekvenca je egzogena sekvenca koja pripada drugoj vrsti u odnosu na ćeliju podvrgnutu genetskoj manipulaciji.
[0193]Ovde korišćen termin "promotor" odnosi se na lokaciju prepoznavanja polinukleotida (DNK ili RNK) na koji se veže RNK polimeraza. RNK polimeraza pokreće i transkribuje polinukleotide koji su operativno povezani sa promotorom. U specifičnim otelotvorenjima promotori operativni u ćelijama sisara uključuju AT-bogatu regiju smeštenu približno 25 do 30 baza više od lokacije pokrenute transkripcijei/ilidrugesekvencepronađene70do80bazavišeodpočetkatranskripcije,CNCAATregije ukojojNmožebitibilokojinukleotid.
[0194]Termin"pojačivač"odnosisenasegmentDNKkoji sadržisekvencusposobnuzaobezbeđivanje pojačane transkripcije i u nekim slučajevima može da funkcioniše nezavisno od svoje orijentacije u odnosu na drugu kontrolnu sekvencu. Pojačivač može da funkcioniše kooperatvno ili dodatno sa promotorimai/ilidrugimelementimapojačavanja.Termin"promotor/pojačivač"odnosisenasegment DNKkojisadržisekvencusposobnuzaobezbeđivanjefunkcijapromotoraipojačivača.
[0195]Termin"operativnopovezan"odnosisenajukstapozicijuukojojseopisanekomponentenalazeu vezikojadozvoljava funkcionisanjenanameravaninačin.U jednomotelotvorenjuterminseodnosina funkcionalnopovezivanjeizmeđukontrolnesekvenceizrazanukleinskekiseline(kaoštojepromotori/ili pojačivač)idrugesekvencepolinukleotida,npr.polinukleotidaodinteresa,pričemukontrolnasekvenca iskazivanjaekspresijeusmeravatranskripcijunukleinskekiselinekojaodgovaradrugojsekvenci.
[0196]Ovde korišćen termin "kontrolna sekvenca konstitutivnog iskazivanja ekspresije" odnosi se na promotor, pojačivač ili promotor/pojačivač koji kontinualno ili neprekidno dozvoljava transkripciju operativno povezane sekvence. Kontrolna sekvenca konstitutivnog iskazivanja ekspresije može biti "sveprisutan" promotor, pojačivač ili promotor/pojačivač koji dozvoljava iskazivanje ekspresije kod velikeraznolikostitipovaćelijaitkivailipromotor,pojačivačilipromotor/pojačivačkojije"specifičanza ćeliju", "specifičan za tip ćelije", "specifičan za soj ćelija" ili "specifičan za tkivo" koji dozvoljava iskazivanjeekspresijekodograničeneraznolikostitipovaćelijailitkiva.
[0197] Ilustrativne sveprisutne kontrolne sekvence iskazivanja ekspresije pogodne za primenu u pojedinim otelotvorenjima ovog pronalaska uključuju ali nisu ograničene na trenutni rani promotor citomegalovirusa (CMV), viralni majmunski virus 40 (SV40) (npr. rani ili kasni), LTR promotor virusa Molonymišijeleukemije(MoMLV),LTRvirusaRoussarkoma(RSV),promotorvirusaherpesasimpleksa (HSV) (timidim kinaza), H5, P7,5 i Pl 1 promotore iz virusa vakcine, promotor elongativnog faktora 1-alpha (EFla), odgovor na rani rast 1 (EGR1), feritin H (FerH), feritin L (FerL), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu(GAPDH),faktorinicijacijeeukariotksetranslacije4A1(EIF4A1),protein5toplinskogšoka 70KDa (HSPA5),protien toplinskog šoka90kDabeta, član1 (HSP90B1),protein toplinskog šoka70kDa (HSP70), β-kinezin (β-KTN), ljudski lokusROSA26 (Irionset ah,NatureBiotechnology25, 1477 - 1482 (2007)), sveprisutni C promotor (UBC), promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PKG), promotor pojačivača/pilećeg β-aktina citomegalovirusa (CAG), promotor β-aktina i pojačivač virusa mijeloproliferativnog sarkoma, izbrisane negativne kontrolne regije, (MND) promotor zamenjene dl587revlokacijezavezivanjeprajmera(Challitaetal,JVirol.69(2):748-55(1995)).
[0198]UposebnomotelotvorenjupoželjnojeiskazivanjeekspresijepolinukleotidakojiuključujeCARiz promotorakojiobezbeđujestabilno ilidugoročno iskazivanjeekspresijeCAR-anaTćelije inanivoima dovoljnim za preusmeravanje T ćelija na ćelije sa iskazivanjem ekspresije ciljnog antigena. U prioritetnomotelotvorenjupromotorjeMNDpromotor.
[0199]UjednomotelotvorenjuvektorizpronalaskauključujeMNDpromotorkojiuključujejedaniliviše nukleotidnihumetaka,brisanja,zamenailimodifikacijakojepovećavaju,smanjujuilistabilizujuaktivnost MNDpromotora.
[0200]Ovdekroišćen termin "kondicionalno iskazivanjeekspresije"možeda seodnosinabilo koji tip kondicionalnog iskazivanja ekspresije uključujući ali ne ograničavajući se na indukovano iskazivanje ekspresije, represivno iskazivanje ekspresije, iskazivanje ekspresije u ćelijama ili tkivimau određenom fiziološkom i biološkom stanju ili stanju bolesti, itd. Ova definicija nije namenjena isključivanju specifičnog iskazivanja ekspresije tipa ćelije ili tkiva. Određena otelotvorenja ovog pronalaskaobezbeđujukondicionalno iskazivanjeekspresijepolinukleotidaod interesa,npr. iskazivanje ekspresije kontroliše podvrgnuta ćelija, tkivo, organizam, itd., u tretmanu ili stanju koje izaziva iskazivanje ekspresije polinukleotida ili uzrokuje povećanje ili smanje iskazivanja ekspresije polinukleotidakodiranogpolinukeotidomodinteresa.
[0201] Ilustrativni primeri induktibilnih promotora/sistema uključuju ali nisu ograničeni na steroidinduktivne promotore poput promotora gena koji kodiraju receptore glukokortikoida ili estrogena (induktibilne tretiranjem odgovarajućim hormonom), promotor matlotiorina (induktibilne tretiranjem različitim teškim metalima), promotor MX-1 (induktibilan interferonom), "GeneSwictch" sistem koji reguliše mifepriston (Sirin et al, 2003, Gene, 323:67), kumulativni induktibilni zamenjivač gena (WO 2002/088346),regulatornesistemezavisneodtetraciklina,itd.
[0202] Kondicionalno iskazivanje ekspresije može takođe da bude aktivirano uz pomoć DNK rekombinazespecifičnezalokaciju.Premaodređenimotelotvorenjimaovogpronalaskavektoruključuje baremjednu(običnodve)lokacijezarekombinovanjekodkojihposredujeodređenarekombinaza.Ovde korišćenitermini"rekombinaza"ili"rekombinazaspecifičnelokacije"uključujuekscizivneiliintegrativne proteine, enzime, ko-faktore ili povezane proteine koji su uključeni u reakcije rekombinacije koje uključuju jednu ili više lokacija za rekombinaciju (npr. dve, tri, četiri, pet, sedam, deset, dvanaest, petnaest, dvadeset, trideset, pedeset, itd.) koji mogu biti proteini divljeg tipa (videti Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), ili mutanti, derivativi (npr. fuzioni proteini koji sadrže sekvencu rekombinacije proteina ili njen fragment), fragmenti i njihove varijante. Ilustrativni primeri rekombinazaprikladnihzaprimenuuodređenimotelotvorenjimauovompronalaskuuključujualinisu ograničenena:Cre,Int,IHF,Xis,Flp,Fis,Hin,Gin, ΦC31,Cin,Tn3resolvase,TndX,XerC,XerD,TnpX,Hjc, Gin,SpCCEliParA.
[0203]Vektorimogudauključujujedanuilivišelokacijazarekombinacijuzabilokojuodširokelepeze rekombinazaspecifičnihzalokaciju.Podrazumevaseciljnalokacijazarekombinazuspecifičnuzalokaciju predstavljadodatakbilokojojlokacijiililokacijamazahtevanimzaintegracijuvektora,npr.retroviralnog ili lentiviralnog vektora. Ovde korišćeni termini "sekvenca rekombinacije", "lokacija rekombinacije" ili "lokacijarekombinacijespecifičnazalokaciju"odnosesenaodređenusekvencunukleinskekiselinekoju rekombinazaprepoznajeiveže.
[0204]Naprimer,jednalokacijarekombinacijezaCrerekombinazujeloxPkojapredstavljasekvencuod 34 bazna para i uključuje obrnuta ponavljanja dva para od 13 baza (koja služe kao vezivne lokacije rekombinaze)flankirajućisekvencujezgraod8baznihparova(vidiSL.1izSauer,B.,CurrentOpinionin Biotechnology 5:521-527 (1994)). Ostale uzorne loxP lokacije uključuju ali nisu ograničene na: lox511 (Hoesset al, 1996;Bethke i Sauer, 1997), lox5171 (Lee i Saito, 1998), lox2272 (Lee i Saito, 1998),m2 (Langeretal,2002),lox71(Albertetal,1995),ilox66(Albertsal,1995).
[0205] Prikladne lokacije za prepoznavanje FLP rekombinaze uključuju ali nisu ograničene na: FRT (McLeod,etal,1996),F1,F2,F3(SchlakeiBode,1994),F4,F5(SchlakeiBode,1994),FRT(LE)(Senecoff etal.,1988),FRT(RE)(Senecoffetal.,1988).
[0206]Ostali primeri sekvenci za prepoznavanje su attB, attP, attL i attR sekvence, koje prepoznaje enzim rekombinaze λ integraza, npr. phi-c31.ϕC31 SSR posreduje pri rekombinaciji samo između heterotipičnihlokacijaattB(dugih34bp)iattP(dugih39bp)(Grothetal,2000).attBiattP,nazvanipo lokacijamapripajanjaintegrazefaganagenomebakterijaifaga,sadrženesavršenaobrnutaponavljanja nakojasenajverovatnijevežuϕC31homodimeri (Grothetal,2000).LokacijeproizvodaattL iattR,su efektivno inertne na ϕC31-posredovanu rekombinaciju (Belteki et al, 2003), što reakciju čini ireverzibilnom.U slučajukatalizatorskihumetakapronađeno jeda seattB-nosećaDNKumećenaattP lokacijugenomaspremnijeodumetanjaattP lokacijeuattB lokacijugenoma(Thyagarajanetal,2001; Belteki et al, 2003). Tako tipične strategije homolognom rekombinacijom pozicioniraju attP-noseću "spojnu lokaciju" na definisano mesto, što je zatim propraćeno umetanjem attB-noseće dolazne sekvence.
[0207]Ovdekorišćentermin"unutarnjalokacijazaulazakribosoma"ili"IRES"odnosisenaelementkoji promovišedirektniunutarnjiulazakribosomauinicijacijskikodon,poputATG-a,cistona(prepoznavanje završetka proteina), time dovodeći do cap-nezavisne translacije gena. Videti npr. Jackson et al, 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) i Jackson i Kaminski.1995. RNA 1(10):985-1000. U određenim otelotvorenjimavektoriobjašnjeniuovompronalaskuuključujujedanilivišepolinukleotidaodinteresa koji kodiraju jedan ili višepolipeptida.Uposebnimotelotvorenjima sekvencapolinukleotidamožebiti razdvojena jednom ili više IRES sekvenci ili sekvenci polinukleotida koje kodiraju samootcepljujuće polipeptide,kakobiaktiviralatranslacijusvakogodmnogobrojnihpolipeptida.
[0208]Ovde kroišćen termin "Kozak sekvenca" odnosi se na kratku sekvencu nukleotida koja uveliko olakšava inicijalnovezivanjemRNAnamalupodjedinicu ribosoma ipovećava translaciju.Konsenzusna Kozaksekvenca je (GCC)RCCATGG(BR. ID.SEKV.:27),gdeRoznačavapurin (A iliG) (Kozak,1986.Cell.
44(2):283-92, i Kozak, 1987. Nucleic Acids Res.15(20):8125-48). U posebnim otelotvorenjima vektori objašnjeni u ovom pronalasku uključuju polinukleotide koji poseduju konsenzusnu Kozak sekvencu i kodirajuželenipolipeptid,npr.CAR.
[0209] U nekim otelotvorenjima pronalaska polinukleotid ili ćelija koja sadrži polinukleotid koristi samoubilačkigen,uključujući induktivnisamoubilačkigenkakobismanjila rizikoddirektnetoksičnosti i/ili nekontrolisanog širenja. U specifičnim aspektima samoubilački gen nije imunogen u slučaju domaćinakojisadržipolinukleotidilićeliju.Određeniprimersamoubilačkoggenakojimožedasekoristi je caspase-9 ili caspase-8 ili citozin deaminaza. Caspase-9 može da se aktivira uz pomoć hemijskog induktoradimerizacije(CID).
[0210]Uodređenimotelotvorenjimavektoriuključujusegmentegenakojiuzrokujuprijemčivostćelija imunog efektora iz pronalaska, npr. T ćelija, na negativnu selekciju in vivo. Pod terminom "negativna selekcija" podrazumeva se mogućnost eliminacije infuzne ćelije koja je rezultat promene u stanju individue in vivo. Negativni selektivni fenotip može da nastane kao rezultat umetanja gena koji deli osetljivostnaprimenjeniagnes,naprimer,jedinjenje.Negativniselektivnigenipoznatisuunauciimeđu ostalimauključuju isledeće:gentiamidinkinazevirusaherpessimplekstipa I (HSV-ITK)(Wigleretah, Cell 11:223, 1977) koji deli osetljivost na ganciklovir; gen ćelijskog hipoksantina fosfribosiltransferaze (HPRT), gen ćelijske adenin fosfribosiltransferaze (APRT) i bakterijsku citozindeaminazu (Mullen et al, Proc.Natl.Acad.Sci.S.A.D.89:33(1992)).
[0211]Unekimotelotvorenjimagenetskimodifikovanećelije imunogefektorapoputTćelijauključuju polinukleotidkojidaljeuključujemarkerkojiomogućavaselekcijućelijazanegativniselektivnifenotipin vitro. Pozitivni selektivni marker može da bude gen koji nakon uvođenja u ćeliju domaćina iskazuje ekspresijudominantnogfenotipadozvoljavajućipozitivnuselekcijućelijakojenosegen.Geniovogtipa poznatisuunauciiizmeđuostaloguključujugenhigromicin-Bfosfotransferaze(hph)kojideliotpornost na higromicin B, gen amino glikozid fosfotransferaze (neo ili aph) iz Tn5 koji kodira otpornost na antibiotikG418,gendihidrofolatreduktaze(DHFR),genadenozindeaminaze(ADA)igenotpornostina višelekova(MDR).
[0212]Preferirno,pozitivniselektivnimarker inegativniselektivnielementpovezanisunatakavnačin da jegubitaknegativnogselektivnogelementaneophodnopropraćengubitkompozitivnogselektivnog markera.Čak jošvišepreferirano,pozitivni inegativniselektivnimarkerifuzionisanisutakodagubitak jednog obavezno vodi gubitku drugog. Primer fuzionisanog polinukleotida koji daje iskazivanje ekspresije, polipeptid koji sadrži obe prethodno opisane željene pozitivne i negativne selektivne karakteristikejegenfuzijehigromicinfosfotransferazetimidinkinaze(HyTK).Iskazivanjeekspresijeovog genapolučujepolipeptidkojisadržiotpornostnahigromicinBzapozitivnuselekcijuinvitroiosetljivost naganciklovirzanegativnuselekciju invito.VidetiLuptonS.D.,etal,Mol.andCell.Biology11:3374-3378, 1991. Osim toga, u prioritetnim otelotvorenjima, polinukleotidi ovog pronalaskakoji šifruju himerne receptore nalaze se u retroviralnim vektorima koji sadrže fuzionisani gen, posebeno oni koji dele otpornost na higromicin B za pozitivnu selekciju in vitro i osetljivost na ganciklovir za negativnu selekcijuinvito,kaonaprimerHyTKretroviralnivektoropisanuraduLupton,S.D.etal.(1991),iznad. Takođe videti publikacije PCT US91/08442 i PCT/US94/05601, autora S. D. Luptona, koje opisuju upotrebu bifunkcionalnih selektabilnih fuzionisanih gena proisteklih iz fuzije dominantnih pozitivnih selektabilnihmarkerasanegativnimselektabilnimmarkerima.
[0213]Preferiranipozitivniseletabilnimarkerisuproistekli izgenaizabranihizgrupekojasesastojiod hph,ncoigpt,apreferiraninegativniselektabilnimarkeriproisteklisuizgenaizabranihizgrupekojase sastoji od citozin deaminaze, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT i gpt. Posebno preferirani markeri su bifunkcionalniselektabilnifuzionisanigenigdejepozitivniselektabilnimarkerproistekaoizhphilineo,a negativniselektabilnimarkerizcitozindeaminazeiliTKgenailiselektabilnogmarkera.
F.Viralnivektori
[0214]Uspecifičnimotelotvorenjimaćelija(npr.Tćelija)jetransdukovanaretroviralnimvektorom,npr. retroviralnimvektorom,koji kodiraCAR.Naprimer, vektoruključujeMNDpromotor i kodiraCARkoji kombiniraveznidomenspecifičanzaantigenantitelakojivežereceptoralfafolata,5T4,αvβ6integrin, BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a, CD79b, CD123, CD 138, CD 171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ove ili VEGFR2 polipeptid sa unutarćelijskim signalnim domenom CD3ξ, CD28, 4-1BB, Ox40 ili bilo koje prethodne kombinacije. Tako, te transdukovaneTćelijemogudaizmamestabilan,dugoročaniistrajanodgovorTćelijeposredovanCAR-om.
[0215]Retrovirusipredstavljauuobičajenialatzadobijanjegena(Miller,2000,Nature.357:455-460).U specifičnim otelotvorenjima retrovirus se koristi za dobijanje polinukleotida koji šifruje receptor himernog antigena (CAR) na ćeliju. Ovde korišćen termin "retrovirus" odnosi se na virus RNK koji obrnutotranskribujenjegovugenomskuRNKulinearnukopijuDNKsadvalancaiposledičnokovalentno integrišesvojugenomskuDNKugenomdomaćina.Jednomkadajevirusintegrisanudomendomaćina, naziva se "provirus".Provirus služi kaoobrazac zaRNKpolimerazu II iusmerava iskazivanjeekspresije molekula RNK koji kodiraju strukturalne proteine i enzime potrebne za proizvodnju novih viralnih čestica.
[0216] Ilustrativni retrovirusi prikladni za primenu u određenim otelotvorenjima uključuju ali nisu ograničenena:mišijiMoloneyvirusleukemije(M-MuLV),mišijiMoloneyvirussarkoma(MoMSV),mišiji Harveyvirus sarkoma (HaMuSV),mišiji virus tumoradojke (MuMTV),virus leukemijemajmunagibona (GaLV), mačiji virus leukemije (FLV), spumavirus, mišiji Friend virus leukemije, mišiji virus stem ćelija (MSCV)iRousvirussarkoma(RSV))ilentivirus.
[0217]Ovdekorišćentermin"lentivirus"odnosisenagrupu(iligenus)složenihretrovirusa. Ilustrativni lentivirusiuključujualinisuograničenina:HIV(humanivirusimunodeficijencije;uključujućiHIVtipa1i HIV tipa 2); visna-maedi virus (VMV) virus; koziji virus arthritisa-encefalitisa (CAEV); konjski virus infektivne anemije (EIAV); mačiji virus imunodeficiencije (FIV); goveđi virus imunodeficiencije (BIV) i majmunski virus imunodeficiencije (SIV). U jednomotelotvorenju preferiraju se oslonci HIV baziranog vektora (tj. HIV cis-delujući elementi sekvence). U posebnim otelotvorenjima lentivirus se koristi za dobijanjepolinukleotidakojiuključujeMNDpromotorišifrujeCARnaćeliju.
[0218]Retroviralni vektori i posebno lentiviralni vektorimoguda se koriste u praktikovanjuposebnih otelotvorenjima iz ovog pronalaska. Prema tome, ovde korišćen termin "retrovirus" ili "retroviralni vektor"takođetrebadauključiitermin"lentivirus"i"lentiviralnivektor".
[0219]Ovde korišćen termin "vektor" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koja je sposobna za prenošenje ili transportovanje drugog molekula nukleinske kiseline. Prenesena nukleinska kiselina je obično povezana sa, npr. umetnuta u, vektorski molekul nukleinske kiseline. Vektor može da uključi sekvence koje usmeravaju autonomne replikacije u ćeliji ili može da sadrži sekvence dovoljne za dozvoljavanjeintegracijeuDNKćelijudomaćina.Korisnivektoriuključuju,npr.plazmide(npr.plazmide DNKiliplazmideRNK),transposone,kosmide,bakterijskeveštačkehromozomeiviralnevektore.Korisni vektoriuključujunpr.retrovirusedefektnereplikacijeilentiviruse.
[0220] Kao što je stručnjaku očigledno, termin "viralni vektor" se široko koristi u slučaju molekula nukleinske kiseline (npr. transfernog plazmida) koji uključuje elemente nukleinske kiseline potekle od virusa koji obično olakšavaju prenos molekula nukleinske kiseline ili integraciju u genom ćelije ili u viralnu česticu koja posreduje u prenosu nukleinske kiseline. Viralne čestice će tipično pored amino kiseline ili kiselina uključivati različite viralne komponente, a ponekad takođe komponente ćelije domaćina.
[0221] Termin "viralni vektor" može da se odnosi ili na virus ili viralnu česticu sposobnu za prenos nukleinskekiselineućelijuilinasamuprenesenunukleinskukiselinu.Viralnivektoriitransferniplazmidi sadrže strukturalne i/ili funkcionalne genetske elemente koji se primarno dobijaju iz virusa. Termin "retroviralni vektor" odnosi se na viralni vektor ili plazmid koji sadrži strukturalne i funkcionalne genetskeelementeilinjihovedelove,kojiseprimarnodobijajuizretrovirusa.Termin"lentiviralnivektor" odnosi se na viralni vektor ili plazmid koji sadrži strukturalne ili funkcionalne genetske elemente ili njihove delove, uključujući LTR-ove koji se primarno dobijaju iz lentivirusa. Termin "hibridni vektor" odnosisenavektor,LTRilidrugunukleinskukiselinukojasadržiretroviralne,npr.lentiviralnesekvencei ne-lentiviralne viralne sekvence. U jednom otelotvorenju hibridni vektor odnosi se ne vektor ili transferni plazmid koji uključuju retroviralne npr. lentiviralne sekvence za obrnutu transkripciju, replikaciju,integracijui/ilipakovanje.
[0222] U određenim otelotvorenjima termini "lentiviralni vektor" i "vektor lentiviralnog iskazivanja ekspresije"mogudasekoristeuodnosuna lentiviralnetransferneplazmide i/ili infektivne lentiviralne čestice. Na mestima u ovom radu na kojima se pozivamo na elemente poput lokacija za kloniranje, promotora,regulatornihelemenata,heterolognihnukleinskihkiselina,itd.valjarazumetidasusekvence tih elemenata prisutne u obliku RNK u lentiviralnim česticama i u obliku DNK u DNK plazmidima prikazanimupronalasku.
[0223] Na svakom kraju prethodno pomenutih nalaze se strukture pod nazivom "duga terminalna ponavljanja" ili "LTR-ovi". Termin "duga terminalna ponavljanja (LTR)" odnosi se na bazne parove smeštenenakrajevimaretroviralneDNKkoji,ukontekstusvogprirodnogsleda,predstavljajudirektna ponavljanjaisadržeU3,RiU5regije.LTR-oviuopštenoobezbeđujufunkcijekojesufundamentalneza iskazivanjeekspresijeretroviralnihgena(npr.promociju,inicijacijuipoliadenilacijugenskihtranskripta)i za replikaciju virusa. LTR sadrži brojne regulatorne signale uključujući transkripcione kontrolne elemente,signalepoliadenilacijeisekvencepotrebnezareplikacijuiintegracijuviralnoggenoma.Viralni LTRpodeljenjenatriregijezvaneU3,RiU5.RegijaU3sadržielementepojačivačaipromotora.Regija U5 je sekvenca između vezne lokacije prajmera i R regije, te sadrži sekvencu poliadenilacije. Regija R (regijaponavljanja) je flankirana regijamaU3 iU5. LTRsastavljenod regijaU3,R iU5pojavljuje sena krajevimaviralnoggenoma5'i3'.IzaLTR5'sledesekvenceneophodnezaobrnututranskripcijugenoma (veznalokacijaprajmeratRNA)izaefikasnopakovanjeviralneRNKučestice(Psilokacija).
[0224]Ovde korišteni termini "signal za pakovanje" ili "sekvenca pakovanja" odnose se na sekvence smešteneunutar retroviralnoggenomakojesepotrebnezaumetanjeviralneRNKuviralnukapsidu ili česticu,videtinpr.Cleveretal,1995.J.ofVirology,Vol.69,br.4;str.2101-2109.Nekolicinaretroviralnih vektora koristi minimalni signal za pakovanje (takođe poznat kao psi [Ψ] sekvenca) potreban za enkapsidaciju viralnog genoma. Tako se ovde korišćeni termini "sekvenca za pakovanje", "signal za pakovanje", "psi" i "Ψ" odnose na ne-kodirajuće sekvence zahtevane za enkapsidaciju lanaca retroviralneRNKtokomformiranjaviralnečestice.
[0225]U različitimotelotvorenjimavektoriuključujumodifikovane5' LTR-ove i/ili 3' LTR-ove. Jedan ili obaLTR-amogudauključujujednuilivišemodifikacijauključujućialineiograničavajućisenajednoili više brisanja, umetanja ili zamena.Modifikacije 3' LTR-a se često prave u cilju poboljšanja sigurnosti lentiviralnih ili retroviralnih sistema onesposobljavanja virusa za replikaciju. Ovde korišćen termin "onesposobljenzareplikaciju"odnosisenaviruskojinijesposobanzakompletnu,efikasnureplikaciju, pa se ne proizvode infektivni virioni (npr. onesposobljena replikacija lentiviralnog potomstva). Termin "sposoban za replikaciju" odnosi se na viruse divljeg tipa ili mutirane viruse koji su sposobni za replikaciju, tako da je viralna replikacija virusa sposobna za proizvodnju infektivnih viriona (npr. osposobljenareplikacijalentiviralnogpotomstva).
[0226] Vektori "samo-inaktivacije" (SIN) se odnose na vektore onesposobljene za replikaciju, npr. retroviralneililentiviralnevektore,kodkojihjedesna(3')LTRregijapojačivača-promotora,poznatakao U3regija,modifikovana(npr.brisanjemilizamenom)uciljusprečavanjaviralnetranskripcijenakonprve runde replikacije virusa. To je zato što se tokom replikacije virusadesna (3') LTRU3 regija koristi kao obrazaczalevu(5')LTRU3regiju,patakoviralnitrakskriptnemožebitinapravljenbezU3pojačivačapromotora.Udaljimotelotvorenjimapronalaska3'LTRjemodifikovantakodajeU5regijazamenjena, naprimer,idealnompoli(A)sekvencom.TrebaupamtitidasumodifikacijeLTR-ovapoputonihna3'LTR, 5'LTRilinaobatakođeuključeneupronalazak.
[0227] Pojačanje dodatne sigurnosti postignuto je zamenom U3 regije 5' LTR-a heterolognim promotorom u cilju upravljanja transkripcijom viralnog genoma tokom proizvodnje viralnih čestica. Primeriheterolognihpromotorakojisemogukoristitiuključujunpr.promotore(timidinkinaze)viralnog majmunskogvirusa40(SV40)(npr.ranogilikasnog),citomegalovirusa(CMV)(npr.neposrednogranog), mišijegMoloneyvirusa leukmije (MoMLV),Rousvirusasarkoma(RSV) ivirusaherpessimpleksa(HSV). Tipični promotori su sposobni za upravljanje visokim nivoima transkripcije na Tat-nezavisan način. Ta zamena smanjuje mogućnost rekombinacije za generisanje virusa sposobnog za replikaciju usled nepostojanja kompletne sekvence U3 u sistemu produkcije virusa. U određenim otelotvorenjima heterolognipromotorposedujedodatneprednostiukontrolisanjunačinatranskripcijeviralnoggenoma. Naprimer,heterolognipromotormožedabudeinduktibilan,paćesetranskripcijacelogilijednogdela viralnog genoma desiti samo kada su prisutni faktori indukcije. Faktori indukcije uključuju ali nisu ograničeninajednoilivišehemijskihjedinjenjailifiziološkeuslovepoputtemperatureilipHvrednostiu kojimasegajećelijedomaćina.
[0228] U nekim otelotvorenjima viralni vektori uključuju TAR element. Termin "TAR" odnosi se na genetskielement"odgovoratrans-aktivacije"smeštenuRregiji lentiviralnih(npr.HIV)LTR-ova.Ucilju pojačavanja replikacije virusa taj element stupa u interakciju sa lentiviralnim genetskim elementom trans-aktivacije(tat).Međutim,tajelementsenezahtevauotelotvorenjimaukojimajeU3regija5'LTR-azamenjenaheterolognimpromotorom.
[0229] R regija" se odnosi na regiju sa retroviralnim LTR-ovima koji počinju na početku grupe za zatvaranje(tj.napočetkutranskripcije)izavršavajuodmahprepočetkapoliAtrakta.RegijaRjetakođe definisana kao regija flankirana regijama U3 i U5. R regija igra ulogu tokom obrnute transkripcije dozvoljavajućitransfernastajućeDNKsajednogkrajagenomanadrugi.
[0230]Ovde korišćen termin "FLAP element" odnosi se na nukleinsku kiselinu čija sekvenca uključuje centralnipolipurinskitrakticentralneterminativnesekvence(cPPTiCTS)retrovirusa,npr.HIV-1iliHIV-2. Prikladni FLAP elementi opisani su u patentu S.A.D. br.6,682,907 i u Zennou, et al, 2000, Cell, 101:173. Tokom obrnute transkripcije virusa HIV-1, centralna inicijacija plus-lanca DNK u centralnom polipurinskomtraktu(cPPT)icentralnaterminacijaucentralnojterminativnojsekvenci(CTS)dovodedo stvaranjastruktureDNKsatri lanca:centralneDNKklapnevirusaHIV-1.Nezavisnoodbilokojeteorije, DNK klapnamože da igra ulogu cis-aktivne determinante nuklearnog uvoza lentiviralnog genoma i/ili možedapojačatitervirusa.Uspecifičnimotelotvorenjima,oslonciretroviralnih ili lentiviralnihvektora uključuju jedan ili više FLAPelemenata više ili nižeodheterolognih genaod interesau vektorima.Na primer,uposebnimotelotvorenjimatransferniplazmiduključujeFLAPelement.Ujednomotelotvorenju vektorizpronalaskauključujeFLAPelementkojijeizolovanizvirusaHIV-1.
[0231] U jednom otelotvorenju retroviralni ili lentiviralni transferni vektori uključuju jedan ili više izvoznih elemenata. Termin "izvozni element" odnosi se na cis-delujući post-transkripcioni regulativni element koji reguliše transport RNK transkripta od jezgra do citoplazme ćelije. Primeri izvoznih elemenataRNKuključujualinisuograničeninaelementreverzibilnogodgovoraHIV-a(RRE)(videtinpr. Cullenetal,1991.J.Virol.65:1053; iCullenetal,1991.Cell58:423), ipost-transkripcioniregulatorni element virusa hepatitis B (HPRE).Uopšteno, izvozni elementRNK smešten je unutar 3'UTR-a gena i možedaseumetnekaojednailivišekopija.
[0232]Uodređenimotelotvorenjima, iskazivanje ekspresije homolognih sekvenci kod viralnih vektora povećanojeuključivanjempost-transkripcionihregulatornihelemenata,efikasnihlokacijapoliadenilacije i opciono signalima završetka transkripcije u vektorima. Razni post-transkripcioni regulatorni elementi mogu da povećaju iskazivanje ekspresije heterolognih nukleinskih kiselina u proteinu, npr. posttranskripcionog regulatornog elementa virusa hepatitisa kod mrmota (WPRE; Zufferey et al, 1999, J. Virol, 73:2886); post-transkripcionog regulatornog elementa virusa hepatitisa B (HPRE) (Huang et al, Mol.Cell.Biol,5:3864);islično(Liuetal,1995,GenesDev.,9:1766).Uposebnimotelotvorenjimavektori izpronalaskauključujupost-transkripcioniregulatornielementpoputWPREiliHPRE.
[0233] U određenim otelotvorenjima vektorima iz pronalasaka nedostaje ili oni ne sadrže posttranskripcioniregulatornielementpoputWPREiliHPREjerunekimslučajevimatielementipovećavaju rizik od ćelijske transformacije i/ili suštinski ili značajno ne povećavaju količinu mRNA transkripta ili povećavajustabilnostmRNA.Zatounekimotelotvorenjimauciljudodatnesigurnosnemerevektorima izpronalaskanedostajuilioninesadržeWPREiliHPRE.
[0234] Elementi koji usmeravaju efikasnu transformaciju i poliadenilaciju heterolognih transkripta nukleinske kiseline povećavaju heterologno iskazivanje ekspresije gena. Signali završetka transkripcije moguseuopštenonaćinižeod signalapoliadenilacije.Uodređenimotelotvorenjimavektoriuključuju sekvencu poliadenilacije 3' polinukleotida koji kodira polipetid čije iskazivanje ekspresije treba da se desi. Termin "poliA lokacija" ili "poliA sekvenca" ovde se koristi za označavanje sekvence DNK koja usmerava završetak ipoliadenilaciju transkriptanastajućeDNKuzpomoćRNKpolimeraze II. Sekvenca poliadenilacijemožedapromovišestabilnostmRNAdodavanjempoliArepanakraj3'sekvncekodiranja itakodoprinesepovećanojtranslativnojefikasnosti.Efikasnapoliadenilacijarekombinantnogtranskripta poželjna je pošto su transkripti kojima nedostaje poliA rep nestabilni i brzo degradirani. Ilustrativni primeripoliAsignalakojimogudasekoristeuvektorupronalaskauključujuidelanupoliAsekvencu(npr. AATAAA,ATTAAA,AGTAAA),poliAsekvencugoveđeghormonarasta(BGHpA),poliAsekvencuzečijegβglobina (rβgpA) ili neku drugu prikladnu heterolognu ili endogenu poliA sekvencu koja je poznata u nauci.
[0235] U određenim otelotvorenjimaretroviralni ili lentiviralni vektor dalje uključuje jedan ili više izolatorskih elemenata. Izolatorski elementi mogu da doprinesu zaštiti lentivirusnih sekvenci koje iskazuju ekspresiju, npr. terapijskih polipeptida, od efekata integrativne lokacije koji mogu da budu posredovani cis-delujućim elementima prisutnim u genomskoj DNK i da dovedu do deregulisanog iskazivanjaekspresijetransferisanesekvence(tj.efekatpozicije;videtinpr.Burgess-Beusseetal,2002, Proc. Natl. Acad. Sci., S.A.D., 99:16433; i Zhan et al, 2001, Hum. Genet., 109:471). U nekim otelotvorenjimatransfernivektoriuključujujedanilivišeizolatorskihelemenata3'LTR-aipointegraciji provirusaugenomodmaćina,provirusuključuje jedan iliviše izolatorana5'LTR-u ili3'LTR-upomoću svojstvadupliciranja3'LTR-a.Izolatoriprikladnizakorišćenjeuintervencijiuključujualinisuograničeni naizolatorpilećegβ-globina(videtiChungetal,1993.Cell74:505;Chungetal,1997.PNAS94:575;iBell et al, 1999.Cell 98:387,uključenoovde referencom).Primeri izolatorskihelemenatauključujuali nisu ograničeninaizolatorizlokusaβ-globina,poputpilećegHS4.
[0236]Premaodređenimaspecifičnimotelotvorenjimapronalaska,većinailisviosloncisekvenciviralnih vektora izvedeni su iz lentivirusa, npr. HIV-1. Međutim, valja razumeti da je moguće koristiti ili kombinovati mnoge različite izvore retroviralnih i/ili lentiviralnih sekvenci, a mnogobrojne zamene i alteracije u određenim lentiviralnim sekvencama mogu da se smeste bez smanjivanja sposobnosti transfernog vektora za izvođenje ovde opisanih funkcija. Štaviše, u nauci je poznato mnoštvo lentiviralnih vektora, videti Naldini et al, (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al, (1997); Dull et al, 1998, patenti S.A.D. br.6,013,516 i 5,994,136, od kojih mnogi mogu biti prilagođeni za proizvodnju viralnihvektorailitransfernihplazmidaprikazanihupronalasku.
[0237]Urazličitimotelotvorenjimavektoriizpronalaskauključujupromotorkojijeoperativnopovezan sapolinukleotidomkojikodirapolipeptidCAR-a.VektorimogudaimajujedanilivišeLTR-ova,pričemu svaki LTR uključuje jednu ili više modifikacija, poput jedne ili više zamena, dodataka ili brisanja nukleotida.Vektoridaljemogudauključujujedanilivišedodatnihelemenatazapovećavanjeefikasnosti transdukcije (npr. cPPT/FLAP), viralno pakovanje (npr. Psi (Ψ) signal za pakovanje, RRE), i/ili druge elemente koji povećavaju terapeutsko iskazivanje ekspresije gena (npr. poli (A) sekvence), i mogu opcionodauključujuWPREiliHPRE.
[0238]U specifičnom otelotvorenju transferni vektor iz pronalaska uključuje levi (5') retroviralni LTR, klapnucentralnogpolipurinskiog trakta/DNK (cPPT/FLAP), retroviralni izvoznielement,MNDpromotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde pominjani CAR polipeptid i desni (3') retroviralniLTR,aopcionoiWPREiliHPRE.
[0239]U specifičnom otelotvorenju transferni vektor iz pronalaska uključuje levi (5') retroviralni LTR, retroviralni izvoznielement,MNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji kodira ovdepominjaniCARpolipeptid,desni(3')retroviralniLTRipoli(A)sekvencu,aopcionoiWPREiliHPRE. U drugom specifičnom otelotvorenju pronalazak daje lentiviralni vektor koji uključuje levi (5') LTR, cPPT/FLAP, RRE, MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde pominjaniCARpolipeptid,desni(3')LTR,sekvencupoliadenilacije,aopcionoiWPREiliHPRE.
[0240]Uodređenomotelotvorenjupronalazakdajelentiviralnivektorkojiuključuje:levi(5')HIV-1LTR, Psi(Ψ)signalzapakovanje,cPPT/FLAP,RRE,MNDpromotoroperativnopovezansapolinukleotidomkoji kodira ovde pominjani CAR, desni (3') samo-inaktivirajući (SIN) HIV-1 LTR i sekvencu poliadenilacije zečijegβ-globina,aopcionoiWPREiliHPRE.
[0241] U drugom otelotvorenju pronalazak daje vektor koji uključuje najmanje jedan LTR, centralni polipurinski trakt/DNK klapnu (cPPT/FLAP), retroviralni izvozni element, MND promotor koji je operativnopovezansapolinukleotidomkojikodiraovderazmatraniCARpolipeptid,aopcionoiWPREili HPRE.
[0242] U određenom otelotvorenju pronalazak daje vektor koji uključuje najmanje jedan LTR, cPPT/FLAP,MNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkojikodiraovderazmatrani CARpolipeptid,sekvencupoliadenilacije,aopcionoiWPREiliHPRE.
[0243]U određenom otelotvorenju pronalazak daje najmanje jedan SIN HIV-1 LTR, Psi (Ψ) signal za pakovanje, cPPT/FLAP, RRE,MND promotor operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira ovde razmatraniCARisekvencupoliadenilacijezečijegβ-globina,aopcionoiWPREiliHPRE.
[0244] Vešt naučnik ceniće činjenicu da mnoga od različitih otelotvorenja mogu biti kreirana iz postojećihotelotvorenjaizpronalaska.
[0245]"Ćelijadomaćina"uključujećelijekojesuinvivo,exvivo,iliinvitrotransfektirane,infektiraneili transdukovane rekombinantnim vektorom ili polinukleotidom iz pronalaska. Ćelije domaćinamoguda uključuju ćelije za pakovanje, ćelije proizvođača i ćelije infektirane viralnim vektorima. U posebnim otelotvorenjimaćelijedomaćinainfektiraneviralnimvektoromizpronalaskaprimenjenesunasubjektu kojizahtevaterapiju.Uodređenimotelotvorenjimatermin"ciljnaćelija"koristiseumestoterminaćelija domaćinaiodnosisenatransfektirane,infektiraneilitransdukovanećeliježeljenogtipa.Upreferiranim otelotvorenjimaciljnaćelijajeTćelija.
[0246] Za postizanje razložnog viralnog titera često je potrebna obilna proizvodnja viralnih vektora. Viralni vektori se proizvode transfekcijom transfernog vektora u ćeliju za pakovanje koja uključuje viralnestrukturalnei/ilidodatnegene,npr.gag,pol,env,tat,rev,vif,vpr,vpu,vpxilinefgeneilidruge retroviralnegene.
[0247]Ovdekorišćentermin"vektorzapakovanje"odnosisenavektorkojiiskazujeekspresijuiliviralni vektorkomenedostajesignalzapakovanjeiuključujejedan,dva,tri,četiriiliviševiralnihstrukturalnih i/ili dodatnih gena koji kodiraju polinukleotid. Vektori za pakovanje su tipično uključeni u ćeliju za pakovanje iunjuuvedenitransfekcijom,transdukcijomili infekcijom.Metoditransfekcije,transdukcije ili infekcije su dobro poznati stručnjacima. Retroviralni/lentiviralni transferni vektor iz ovog pronalaskamože biti uveden i liniju ćelija za pakovanje pomoću transfekcije, transdukcije ili infekcije, kako bi stvorio ćeliju proizvođača ili liniju ćelija. Vektori za pakovanje iz ovog pronalaska mogu biti uvedeni i ljudske ćelije ili linije ćelija pomoću standardnih metoda koji uključuju npr. transfekciju kalcijumfosfata,lipofekcijuilielektroporaciju.Unekimotelotvorenjimavektorizapakovanjeuvedenisu u ćelije zajedno sa dominantnim slektabilnim markerom poput neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina,zeocina,timidinkinaze,DHFR-a,Ginsinteaze iliADA-e, izačegaslediselekcijauprisustvu prikladnog leka i izolacija klonova.Gen slektabilnogmarkeramože fizički biti povezan sa genima koje kodiravektorzapakovanje,npr.IRESilisamootcepljujućiviralnipeptidi.
[0248]Proteiniviralneomotnice(env)određujuobimćelijadomaćinakojenaposletkumogudabudu infektirane i transformisane rekombinantnim retrovirusima stvorenim iz linija ćelija. U slučaju lentivirusa,poputHIV-1,HTV-2,SIV,FIViEIV,envproteiniuključujugp41igpl20.Preferirano,viralnienv proteini sa iskazivanjem ekspresije od strane ćelija za pakovanje iz ovog pronalaska šifruju se na posebnomvektoruodviralnihgagipolgena,kaoštojeprethodnoopisano.
[0249]Ilustrativniprimeriretroviralnihenvgenakojisemoguupotrebitiuovompronalaskuuključujuali nisuograničenina:MLVomotnice,10A1omotnicu,BAEV,FeLV-B,RD114,SSAV,Ebola,Sendai,FPV(virus kokošije kuge) iomotnicevirusagripa. Slično tome,moguda sekoristegeni koji kodirajuomotnice iz RNKvirusa (npr. familijeRNKvirusaPicornaviridae,Calciviridae,Astroviridae,Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) kao i DNK virusa (familije Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae i Iridoviridae). ReprezentativniprimeriuključujuFeLV,VEE,HFVW,WDSV,SFV,besnilo,ALV,BIV,BLV,EBV,CAEV,SNV, ChTLV,STLV,MPMV,SMRV,RAV,FuSV,MH2,AEV,AMV,CT10iEIAV.
[0250] U drugim otelotvorenjima proteini omotnice za pseudotipovanje virusa iz ovog pronalaska uključujualinisuograničeninabilokojiodsledećihvirusa:gripApoputH1N1,H1N2,H3N2iH5N1(ptičji grip), grip B, grip C, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, virus hepatitisa D, virus hepatitisaE,Rotavirus,bilokojivirus izgrupevirusaNorwalk,enteričkeadenoviruse,parvovirus,virus Dengue groznice, majmunske boginje, mononegavirale, lyssavirus poput virusa besnila, virus Lagos slepogmiša,Mokolavirus,Duvenhagevirus,virusevropskogslepogmiša1i2ivirusaustralijskogslepog miša,efemerovirus,vezikulovirus,virusvezikularnogstomatitisa(VSV),herpesvirusepoputvirusaherpes simpleksatipa1i2,varičelazoster,citomegalovirus,virusEpstein-Bar(EBV),ljudskeherpesviruse(HHV), ljudski herpesvirus tipa 6 i 8, ljudski virus imunodeficiencije (HIV), virus papiloma, mišiji gamaherpesvirus, arenaviruse poput virus argentinske hemoragične groznice, virus bolivijske hemoragične groznice, Sabia-povezan virus hemoragične groznice, virus venecuelanske hemoragične groznice,virusLassagroznice,Machupovirus,viruslimfocitskogkoriomeningitisa(LCMV),Bunyaviridiae poputCrimean-Congovirusahemoragičkegroznice,hantavirus,virushemoragičnegroznicekojiuzrokuje renalnisindrom,virusRiftValleygroznice,filoviridae(filovirus)uključujućihemoragičnugroznicuEbolai Marburg, flaviviridaeuključujućivirusbolestiKaysanurForest,virusOmskhemoragičnegroznice,virus kojiuzrokujeencefalitisapotičeodkrpeljaiparamyxoviridaepoputHendravirusaiNipahvirusa,velikih imalihboginja,alphavirusepoputvenecuelenskogvirusakonjskogencefalitisa,istočnogvirusakonjskog encefalitisa, zapadnog virusa konjskog encefalitisa, koronavirusa povezanog sa SARS-om (SARS-CoV), virusazapadnogNila,bilokogvirusakojiuzrokujeencefalitis.
[0251] U jednom otelotvorenju u ovom pronalasku daju se ćelije za pakovanje koje proizvode rekombinantneretrovirusenpr.lentivirus,polipeptidsaVSV-Gglikoproteinom.
[0252]Ovde korišćeni termini "pseudotip" ili "pseudotipovanje" odnose se na viruse čiji su proteini viralnihomotnicazamenjenionimaizdrugogvirusakojiposedujepreferiranekarakteristike.Naprimer, HIVmožebiti pseudotipovanproteinimaomotniceG-proteina virusa vaskularnog stomatitisa (VSV-G), što dozvoljava HIV-u da infektira velik obim ćelija jer proteini omotnice HIV-a (koje kodira env gen) normalno targetiraju virus na ćelije koje predstavljaju CD4+.U prioritetnomotelotvorenju pronalaska proteini lentiviralnihomotnicasupseudotipovanisaVSV-G-om.U jednomotelotvorenjima,pronalazak pruža ćelije za pakovanje koje proizvode rekombinantni retrovirus, npr. lentivirus pseudotipovan sa glikoproteinomVSV-Gomotnice.
[0253]Ovdekorišćentermin"linijećelijazapakovanje"koristiseuodnosunalinijećelijakojenesadrže signalzapakovanje,alipokazujustabilnoilitrajnoiskazivanjeekspresijeviralnihstrukturalnihproteinai replikativnih enzima (npr. gag, pol i env) koji su neophodni za ispravno pakovanje viralnih čestica. Za pripremu ćelija za pakovanje u ovom pronalasku može da se koristi bilo koja prikladna ćelija. Ćelije obično pripadaju sisarima. U specifičnim otelotvorenjima ćelije za proizvodnju ćelija za pakovanje su ljudske. Ćelije prikladne za upotrebu uključuju, na primer, CHO ćelije, BHK ćelije, MDCK ćelije, C3H 10T1/2ćelije,FLYćelije,Psi-2ćelije,BOSC23ćelije,PA317ćelije,WEHIćelije,COSćelije,BSC1ćelije,BSC 40 ćelije, BMT 10 ćelije, VERO ćelije,W138 ćelije,MRC5 ćelije, A549 ćelije, HT1080 ćelije, 293 ćelije, 293T ćelije, B-50 ćelije, 3T3 ćelije, NIH3T3 ćelije, HepG2 ćelije, Saos-2 ćelije, Huh7 ćelije, HeLa ćelije, W163 ćelije, 211 ćelije i 211A ćelije. U prioritetnimotelotvorenjima ćelije za pakovanje su 293 ćelije, 293TćelijeiliA549ćelije.UdrugimprioritetnimotelotvorenjimaćelijesuA549ćelije.
[0254]Ovde korišćen termin "linija ćelija proizvođača" odnosi se na liniju ćelija koja je sposobna za proizvodnju rekombinantnih retroviralnih čestica, uključujući liniju ćelija za pakovanje i konstrukt vektoraza transferkojiuključujesignalzapakovanje.Proizvodnja infektivnihviralnihčestica i rastvora virusamožedaseizvršipomoćukonvencionalnihtehnika.Metodipripremerastvoravirusapoznatisuu nauciiilustrovaniunpr.Y.Soneokaetal.(\995)Nucl.AcidsRes.23:628-633,iN.R.Landauetal.(1992) J. Virol.66:5110-5113. Infektivne čestice virusa mogu da se pokupe iz ćelija za pakovanje uz pomoć konvencionalnihmetoda.Naprimer, infektivnečesticemogudasepokupepomoću lize ili sakupljanja površinećelijskekulture,kaoštojeunaucipoznato.Opcionoiukolikojetopoželjno,sakupljenečestice virusamogudabuduprečišćene.Naučnicimasudobropoznateprikladnetehnikečišćenja.
[0255] Isporukagena ilidrugihsekvencipolinukleotidauzpomoćretroviralnog ili lentiviralnogvektora pomoću viralne infekcije pre nego transfekcije naziva se "transdukcija". U jednom otelotvorenju retroviralni vektori su transdukovani u ćeliju pomoću infekcije i integracije provirusa. U određenim otelotvorenjima ciljna ćelija, npr. T ćelija, "transdukovana" je ako uključuje gen ili drugu sekvencu polinukleotida isporučenu u ćeliju putem infekcije korišćenjem viralnog ili retroviralnog vekotra. U specifičnimotelotvorenjimatransdukovanaćelijauključujejedanilivišegenailisekvencipolinukleotida isporučenihodstraneretroviralnogililentiviralnogvektoraunjenćelijskigenom.
[0256] U specifičnim otelotvorenjima ćelije domaćina transdukovane viralnim vektorom u ovom pronalaskukojeiskazujuekspresijujednogilivišepolipeptidaprimenjenesunasubjekatucilju lečenja i/iliprevencijemalignitetaB-ćelija.Ostalimetodivezanizaupotrebuviralnihvektoraugenetskojterapiji, kojimogudasekoristepremaodređenimotelotvorenjimaizovogpronalaska,mogusepronaćiunpr. Kay,M.A.(1997)Chest111(6Supp.):138S-142S;Ferry,N.iHeard,J.M.(1998)HUM.GeneTher.9:1975-81;Shiratory,Y.etal.(1999)Liver19:265-74;Oka,K.etal.(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86;Thule, P.M.iLiu,J.M.(2000)GeneTher.7:1744-52;Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56;Alt,M. (1995) J. Hepatol.23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. NY. Acad. Sci.716:90-101; Strayer,D. S. (1999)ExpertOpin. Investig.Drugs8:2159-2172;Smith-Arica, J.R. iBartlett, J. S. (2001) Curr.Cardiol.Rep.3:43-49;iLee,H.C.etal.(2000)Nature408:483-8.
G.Genetskimodifikovanećelije
[0257] U specifičnim otelotvorenjima ovaj pronalazak razmatra upotrebu ćelija koje su genetski modifikovanedaiskažuekspresijupomenutihCAR-ovazalečenjeraka.Ovdekorišćentermin"genetski inženjerisano" ili "genetski modifikovano" odnosi se ne dodavanje posebnog genetskog materijala u obliku DNK ili RNK ukupnom genetskom materijalu ćelije. Termini "genetski modifikovane ćelije", "modifikovane ćelije" i "preusmerene ćelije" koriste se zamenski. Ovde korišćen termin "genetska terapija"odnosiseneuvođenjeposebnoggenetskogmaterijalauoblikuDNKiliRNKuukupangenetski materijal ćelije, koje vraća, ispravlja ili modifikuje iskazivanje ekspresije gena, ili u svrhu postizanja iskazivanjaekspresijeterapeutskogpolipeptida,npr.CAR-a.
[0258]UspecifičnimprimerimavektorimojisadržeMNDpromotorikodirajuovderazmatraneCAR-ove uvedenisuućelijeimunogefektoragdevršeiskazivanjeekspresijekakobipreusmerilisvojuspecifičnost nacilniantigenodinteresa."Ćelijaimunogefektora"jebilokojaćelijaimunogsistemakojaimajednuili višefunkcijaefektora(npr.aktivnostubijanjacitotoksičnihćelija,sekrecijucitokina, indukcijuADCCi/ili CDC).
[0259]Ćelijeimunihefektoraizpronalaskamogubitiautologne/autogene("self")iline-autologne("nonself",npr.alogeneičke,singeneičkeiliksenogeneičke).
[0260]Ovdekorišćentermin"autologne"odnosisenaćelijekojepotičuodistogsubjekta.
[0261]Ovdekorišćentermin"alogeneičke"odnosisenaćelijeizistevrstekojesegenetskirazlikujuod ćelijesakojomseporede.
[0262]Ovdekorišćentermin"singeneičke"odnosisenaćelijekojepotičuodrazličitogsubjekta,akoje sugenetskiidentičnećelijisakojomseporede.
[0263]Ovdekorišćentermin"ksenogeneičke"odnosisenaćelijeizrazličitevrsteuodnosunaćelijusa kojomseporede.Upreferiranimotelotvorenjimaćelijeizpronalaskasualogeneičke.
[0264] Ilustrativne ćelije imunihefektora korišćene sa vektorimakojeuključuju ranijepomenuteCAR-oveuključujuiTćelije.Termini"Tćelija"ili"Tlimfocit"poznatisuunauciiuključujutimocite,nezreleT limfocite, zrele T limfocite, T limfocite umirovanju ili aktivirane T limfocite. T ćelijamože biti ćelija T pomagača (Th), na primer, ćelija T pomagača 1 (Th1) ili ćelija T pomagača 2 (Th2). T ćelijamože biti pomoćnaTćelija(HTL;CD4+Tćelija)CD4+Tćelija,citotoksičnaTćelija(CTL;CD8+Tćelija),CD4+CD8+T ćelija,CD4CD8"TćelijailibilokojidrugipodskupTćelija.OstaleilustrativnepopulacijeTćelijaprikladnih zaupotrebuuposebnimotelotvorenjimauključujunaivneTćelijeimemorijskeTćelije.
[0265] Stručnjaci razumeju da vektor koju uključujeMND promotor i kodira CARmože biti uveden u drugihćelijakojetakođemogudasekoristekaoćelijeimunogefektora.Posebno,ćelijeimunogefektora takođeuključujuNKćelije,NKTćelije,neutrofile imakrofage.Ćelije imunogefektora takođeuključuju praroditeljećelijaefektoragdetakvećelijepraroditeljamogudabuduuključenezbogdiferencijacijeu ćelije imunih efektora in vivo ili in vitro. Tako, u specifičnim otelotvorenjima ćelija imunog efektora uključujepraroditeljećelija imunihefektorapoputhematopoietičnihstemćelija (HSC-ova)sadržanihu CD34+populacijićelijaizvedenihizkrviizpupkovine,koštanesržiilimobilisaneperifernekrvikojesepo davanjusubjektudiferencirajuuzrelećelijeimunogefektorailikojemogubitiindukovaneinvitrokako bisediferenciraleuzrelećelijeimunogefektora.
[0266]Ovdekorišćenećelije imunogefektorakojesugenetski inženjerisanetakodasadrževektorkoji uključujeMNDpromotor i kodirajuCARspecifičanzaantigenmogudasenazovu"preusmerenećelije imunogefektoraspecifičnezaantigen".
[0267]Ovdekorišćentermin"CD34+ćelija"odnosisenaćelijukojanasvojojpovršiniiskazujeekspresiju CD34 proteina. Ovde korišćen termina "CD34" odnosi se na glikoprotein sa ćelijske površine (npr.
proteinsialomucin)kojičestodelujekaofaktoradhezijemeđućelijamaiuključenjeuulazakTćelijeu limfnečvorove.PopulacijaćelijaCD34+uključujehematopoietskestemćelije(HSC),kojesepodavanju pacijentudiferenciraju idoprinosesvimhematopoietskimrodovima,uključujućiTćelije,NKćelije,NKT ćelije,neutrofileićelijerodovemonocita/makrofaga.
[0268]Ovajpronalazakdajemetodestvaranjaćelijaimunogefektorakojeiskazujuekspresijuprethodno razmatranih CAR-ova. U jednom otelotvorenjumetod uključuje transfer ili transdukciju ćelija imunog efektora izolovanih iz pojedinca na takav način da iskazuju ekspresiju jednog ili više CAR-ova na prthodnoopisannačin.Uodređenimotelotvorenjimaćelijeimunogefektorasuizolovaneizpojedincai genetskimodifikovanebezdaljemanipulacije invitro.Takvesećelije tadamogudirektnoponovodati pojedincu. U daljim otelotvorenjima, pre genetskog modifikovanja kako bi izrazile ekspresiju CAR-a, ćelije imunogefektora suprvoaktivirane i stimulisanena širenje invitro.U tomsmislu, ćelije imunog efektora mogu da budu uzgojene pre i/ili nakon genetske modifikacije (tj. transdukovane ili transfektovanekakobipiskazaleekspresijuprethodnorazmatranogCAR-a).
[0269]Uspecifičnimotelotvorenjima,premanipulacije invitro ili genetskemodifikacijeovdeopisanih ćelija imunogefektorapribavlja se izvor ćelija pribavljenihod subjekta.U specifičnimotelotvorenjima ćelije imunogefektorasamodifikacijomCAR-auključujuTćelije.Tćelijemogudasepribave izvelikog broja izvorauključujućialineograničavajućisenamononuklearnećelije izperifernekrvi,koštanesrži, tkivalimfnihčvorova,krviizpupkovine,tkivatimusa,tkivasamestainfekcije,ascitesa,pleuralnogizliva, tkiva slezine i tumora. U određenim otelotvorenjima T ćelije mogu da se pribave iz jedinice krvi prikupljeneod subjekta uz pomoćbilo kojih tehnika poznatih stručnjacima, poput sedimentacije, npr. FICOLL™separacije.Ujednomotelotvorenjućelijeizcirkulišućekrvipojedincapribavljenesuaferezom. Proizvod afareze obično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge nukleiranebele krvne ćelije, crvene krvne ćelije i platelete.U jednomotelotvorenju ćelije prikupljene aferezommogubitiopraneuciljuuklanjanjafrakcijeplazmeinjihovogsmeštanjauodgovarajućipuferili medijum za dalju obradu. Ćelije mogu biti oprane PBS-om ili drugim prikladnim rastvorom kojem nedostaje kalcijum, magnezijum i većina, ako ne i svi ostali, divalentni kationi. Naučnici će ceniti informacijudapranjemožedaseobaviputemnjimapoznatihmetoda,poputupotrebepoluautomatske protočne centrifuge.Naprimer,procesoromzaobradu ćelijaCobe2991,BaxterCytomatom ili slično. Nakon pranja ćelijemogu biti resuspendovane umnoštvo biokompatibilnih pufera ili druge fiziološke rastvoresa ilibezpufera.Uodređenimotelotvorenjimanepoželjnekomponenteuzorkaaferezemogu seuklonitiudirektnoresuspendovanommedijumukulturećelije.
[0270]UodređenimotelotvorenjimaTćelijesuizolovaneizmononuklearnihćelijaperifernekrvi(PBMC-ova) lizijomcrvenihkrvnihćelija i iscrpljivanjemmonocita,naprimer,centrifugiranjemkrozPERCOLL™ gradijent. Specifična podpopulacija T ćelija iskazuje ekspresiju jednog ili više sledećih markera: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO, te može biti dalje izolovana tehnikama pozitivne ili negativne selekcije.U jednomotelotvorenju, specifičnapodopulacija T ćelija koja iskazujeekspresijuCD3,CD28, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO dalje se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, obogaćivanje populacije T ćelije negativnom selekcijom može se postići kombinacijom antitela usmerenomnapovršinskemarkere koji su jedinstveni zanegativno selektovane ćelije. Jedanodovde korišćenihmetodajesortiranjei/iliselekcijaćelijaputemnegativnemagnetskeimunološkeadherencije ilicitometrijeprotokakojakoristikoktelmonoklonskihantitelausmerennamarkerepovršinećelijekoji su prisutni na negativno selektovanim ćelijama. Na primer, za obogaćivanje CD4+ ćelija negativnom selekcijom,koktelmonoklonskihantitelaobičnouključujeantiteladoCD14,CD20,CD1lb,CD16,HLA-DR iCD8.Zaupotrebuuovompronalaskutakođemogudasekoristecitometrijaprotokaisortiranjećelija zaizolovanjepopulacijaćelijaodinteresa.
[0271]PBMCmože biti direktno genetskimodifikovan pomoću vektora koji uključujuMND promotor koji je operativnopovezan kakobi iskazaoekspresiju polinukleotida koji kodira prethodno razmatrani CAR. U određenim otelotvorenjima, nakon izolacije PBMC-a T limfociti se dalje izoluju, a u nekim otelotvorenjima,citotoksični iT limfocitipomagačimogusesortiratiunaivne,memorijskeiefektorske podpopulacijeTćelija,bilopreiliposlegenetskemodifikacijei/iliekspanzije.
[0272]CD8+ ćelijemogu se pribaviti upotrebom standardnihmetoda.U nekimotelotvorenjimaCD8+ ćelijedaljesesortirajuunaivne,ćelijecentralnememorijskeićelijeefektoraidentifikovanjemantigena sapovršinećelijekojisupovezanisasvakimodovihtipovaCD8+ćelija.
[0273] U određenim otelotvorenjima naivne CD8+ T limfocite karakteriše iskazivanje ekspresije fenotipskihmarkeranaivnihTćelijauključujućiCD62L,CCR7,CD28,CD3,CD127iCD45RA.
[0274]UspecifičnimotelotvorenjimamemorijskeTćelijeprisutnesuuCD62L+ iCD62L+podsetovima CD8+ limfocita periferne krvi. Nakon bojenja anti-CD62L i anti-CC8 antitelima, PBMC-i se sortiraju u CD62L+CD8+iCD62L+CD8+frakcije.Unekimotelotvorenjimaiskazivanjeekspresijefenotipskihmarkera T ćelija centralne memorije uključuje CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 i CD 127 i negativni su za grancimeB.UnekimotelotvorenjimaTćelijecentralnememorijesuCD45RO+,CD62L+iCD8+.
[0275] U nekim otelotvorenjima T ćelije efektora negativne su za CD62L, CCR7, CD28 i CD 127, a pozitivnezagrancimBiperforin.
[0276]UodređenimotelotvorenjimaCD4+Tćelijesedaljesortirajuupodpopulacije.Naprimer,CD4+T ćelije pomagača mogu da se sortiraju u naivne, ćelije centralne memorije ili ćelije efektora identifikacijom ćelijskih populacija koje poseduju antigene na površini ćelije. CD4+ limfociti mogu se pribavitiupotrebomstandardnihmetoda.UnekimotelotvorenjimanaivniCD4+TlimfocitisuCD45RO+, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T ćelije. U nekim otelotvorenjima ćelije centralne memorije CD4+ su CD62L pozitivne i CD45RO pozitivne. U nekim otelotvorenjima ćelije CD4+ efektora su CD62L i CD45RO negativne.
[0277]Ćelijeimunogefektora,poputTćelija,mogunakonizolacijebitigenetskimodifikovaneuzpomoć poznatihmetoda,ilimogubitiaktiviraneiproširene(iliuslučajupraroditeljadiferencirane)invitropre genetskemodifikacije.Uspecifičnimotelotvorenjima,ćelijeimunogefektora,poputTćelija,sugenetski modifikovane prethodno pominjanim himernim receptorima antigena (npr. transdukovane viralnim vektorom koji uključuje MND promotor i nukleinsku kiselinu koja kodira CAR) i zatim aktivirane i proširene in vitro. U različitim otelotvorenjima T ćelije mogu biti aktivirane i proširene pre ili posle genetskemodifikacije kakobi iskazaleekspresijuCAR-a,uzpomoćmetodaopisanihu,npr.patentima S.A.D. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7, 144,575; 7,067,318;7,172,869;7,232,566;7,175,843;5,883,223;6,905,874;6,797,514;6,867,041ipublikacijiza aplikacijupatenataS.A.D.br.20060121005.
[0278]Uopšteno,Tćelijeseproširujupomoćukontaktasapovršinomzakojujepričvršćenantigenkoji stimuliše CD3 TCR signal povezan sa kompleksom i ligand koji stimuliše ko-stimulativnemolekule na površini T ćelije. Populacije T ćelijamogu biti stimulisane kontaktom sa anti-CD3 antitelom ili njenim fragmentom koji vezuje antigen, ili anti-CD2 antitelom imobilisanim na površini, ili kontaktom sa aktivatorom protein kinaze C (npr. briostatinom) u konjugaciji sa kalcijum ionoforom. Takođe se razmatrako-stimulacijadodatnihmolekulanapovršiniTćelija.
[0279]UspecifičnimotelotvorenjimaPBMC-oviiliizolovaneTćelijedolazeukontaktsastimulativnimili ko-stimulativnimagensom,poputanti-CD3 ianti-CD28antitela,koji jeuopštenopričvršćenzazrnce ili drugupovršinu,umedijumukulture saprikladnimcitokinimapoput IL-2, IL-7 i/ili IL-15. Za stimulaciju širenjaCD4+TćelijailiCD8+Tćelijakoristeseanti-CD3antiteloianti-CD28antitelo.Primerianti-CD28 antitela uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diasion, Bezankon, Francuska) imogu da se koriste kao i drugi metodipoznatiunauci(Bergetal,TransplantProc.30(8):3975-3977,1998;Haanenetal, J.Exp.Med.
190(9):13191328,1999;Garlandetal,J. ImmunolMeth.227(1-2):53-63,1999).Anti-CD3ianti-CD28 antitelapričvršćenazaistozrnceslužekaoćelijezaprezentovanje"surogatnih"antigena(APC).Udrugim otelotvorenjimaT ćelijemogu se aktivirati i stimulisati na širenje pomoćudovodnih ćelija i prikladnih antitelaicitokinapomoćumetodaopisanihuUS6,040,177;US5,827,642iWO2012129514.
[0280]UdrugimotelotvorenjimaveštačkiAPC(aAPC)napravljenjeinženjeringomK562,U937,721.221, T2 i C1R ćelija od različitih ko-stimulativnih molekula i citokina kako bi usmerio stabilno iskazivanje ekspresije isekreciju.UspecifičnomotelotvorenjuK32iliU32aAPC-ovikoristezausmeravanjeprikaza jednog ili više stimulativnih molekula na bazi antitela na površini AAPC ćelije. Iskazivanje ekspresije različitihkombinacijagenanaaAPC-uomogućavapreciznodeterminisanjezahtevazaaktivacijuljudskeT ćelije, poput toga da sAPC-ovi mogu da budu skrojeni za optimalno širenje podskupova T ćelija sa specifičnimzahtevimazarast i različitimfunkcijama.ZarazlikuodkorišćenjaprirodnihAPC-ova,aAPC-ovi podržavaju ex vivo rast i dugoročno širenje funkcionalnih ljudskih CD8 T ćelija bez zahtevanja dodatnihegzogenih citokina.Populacije T ćelijamoguda seprošireuzpomoćaAPC-a sa iskazivanjem ekspresije različitih ko-stimulativnihmolekula uključujući ali ne ograničavajući se na CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L), i/ili CD80 ili CD86. Konačno, aAPC-ovi obezbeđuju efikasnu platformu za širenje genetskimodifikovanihTćelijaiodržavanjeCD28iskazivanjaekspresijenaCD8Tćelijama.aAPC-ovidati uWO03/057171iUS2003/0147869Alsuovdeucelostiuključenireferencom.
[0281]UjednomotelotvorenjuCD34+ćelijesutransdukovanekonstruktomnukleinskekiselineuskladu saovimpronalaskom.Uodređenimotelotvorenjima,nakonprimenenesubjektu,uopštenonasubjektu od kojeg su ćelije originalno izolovane, transdukovane CD34+ ćelije diferenciraju se u ćelije imunog efektora in vivo. U drugom otelotvorenjuCD34+ ćelije mogu da se stimulišu in vitro pre izlaganja genetskojmodifikaciji ilinakonnjepomoćuovdeprethodnoopisanogCAR-a,sajednimilivišesledećih citokina:Flt-3ligand(FLT3),faktorstemćelija(SCF),faktorrastaidiferencijacijemegakariocita(TPO),IL-3iIL-6premaprethodnoopisanimmetodima(Asheueretal,2004;Imren,etal,2004).
[0282] Pronalazak obezbeđuje populaciju modifikovanih ćelija imunog efektora za lečenje raka, koje sadrže CAR kao što je ovde otkriveno. Na primer, populacije modifikovanih ćelija imunog efektora pripremajuseizmononuklearnihćelijaperifernekrvi(PBMC-ova)dobijenihodpacijentasadijagnozom prethodno opisanog maligniteta B ćelija (autologni donori). PBMC-ovi iz heterogenih populacija T limfocitakojimogubitiCD4+,CD8+iliCD4+iCD8+.
[0283]PBMC-ovitakođemogudauključujudrugecitotoksičnelimfocitepoputNKiliNKTćelija.Vektor iskazivanja ekspresije koji uključuje promotor, npr. MND promotor i prethodno pominjana kodna sekvenca CAR-a mogu biti uvedeni u populaciju T ćelija, NK ili NTK ćelija ljudskog donora,. Uspešno transdukovaneTćelijekojenosevektoriskazivanjaekspresijemogudasesortirajupomoćucitometrije protokakakobiseizolovaleCD3pozitivneTćelije,azatimdaljerazmnoženekakobisepovećaobrojtih T ćelija sa iskazivanjem ekspresije CAR proteina pored aktivacije ćelija pomoću anti-CD3 ili anti-CD28 antitela i IL-2 ili bilo kojih drugih ovde opisanih naučnih metoda. Za krioprezervaciju T ćelija sa iskazivanjemekspresijeTćelijaCARproteinakoristesestandardneprocedureskladištenjai/ilipripreme zaljudskisubjekt.Ujednomotelotvorenjutransdukcijainvitro,kulturai/iliširenjeTćelijaizvedenisuu odsustvune-ljudskihproizvodadobijenihod životinjapoput seruma iz fetusa teleta i seruma iz fetusa goveda.Pošto jeheterogenapopulacijaPBMC-ovagenetskimodifikovana, rezultirajućetransdukovane ćelijesuheterogenapopulacijamodifikovanihćelijakojauključujeovderazmatraniciljaniCARspecifičan zaantigen.
[0284]U daljem otelotvorenju, mešavina od npr. jednog, dva, tri, četiri, pet ili više različitih vektora iskazivanjaekspresijemožedasekoristiugenetskommodifikovanjućelija imunogefektorapopulacije donora gde svaki vektor kodira različit CAR protien, kao što se ovde razmatra. Rezultirajuće modifikovanećelije imunogefektora formirajumešanupopulacijumodifikovanihćelija saproporcijom modifikovanihćelijakojeiskazujuekspresijuvišeodjednograzličitogCARproteina.
[0285]Ujednomotelotvorenjuovajpronalazakpružametodskladištenjagenetskimodifikovanihmišijih, ljudskih ili humanizovanih ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR proteina, uključujući citoprezervacijućelijaimunogefektoratakodaćelijeostanuodrživenakonodmrzavanja.Frakcijaćelija imunog efektora koje pokazuju ekspresiju CAR proteina može da bude citoprezerviran poznatim naučnimmetodima kako bi obezbedio stalan izvor takvih ćelija za dalji tretman pacijenata zaraženih rakom. U slučaju potrebe citoprezervirane transformisane ćelije imunog efektora mogu da budu zamrznute,uzgajaneiliprošireneuciljudobijanjavećegbrojatakvihćelija.
[0286]Ovdekorišćentermin"citoprezervacija"odnosisenaočuvanjećelijahlađenjamnatemperature ispod nule, obično na 77 K ili -196 °C (tačku ključanja tečnog azota). Citoprotektivni agensi se često koristenetemperaturamaispodnuleuciljusprečavanjaoštećenjačuvanećelijetokomzamrzavanjana niskim temperaturama ili zagrejavanja na sobnoj temperaturi. Citoprezervativni agensi i optimalne brzine hlađenja mogu da zaštite ćeliju od oštećenja. Citoprotektivni agensi koji mogu da se koriste uključuju ali nisuograničeni nadimetil sulfoksid (DMSO) (Lovelock i Bishop,Nature, 1959; 183: 1394-1395;Ashwood-Smith,Nature,1961;190:1204-1205),glicerol,polivinilpirolidin(Rinfret,Ann.N.Y.Acad. Sci., 1960; 85: 576), i polietilen glikol (Sloviter and Ravdin,Nature, 1962; 196: 48). Preferirana brzina hlađenjaje1C°do3°Cuminutu.NakonnajmanjedvasataTćelijedostiglesutemperaturuod-80°Ci mogu biti smeštene direktno u tečni azot (-196 °C) radi trajnog skladištenja poput onog u posudi za dugoročnokriogenetskoskladištenje.
H.Sastaviiformulacije
[0287]Ovdepominjanisastavimogudauključujujedanilivišepolipeptida,polinukleotida,vektorakoji obuhvataju iste,genetskimodifikovanećelije imunogefektora, itd.Sastaviuključujualinisuograničeni nafarmaceutskesastave.Termin"farmaceutskisastav"odnosisenasastavformulisanufarmaceutskiili fiziološkiprihvatljivimrastvorimakojislužizaprimenunaćelijuiliživotinju,bilosamiliukombinacijisa jednim ili više terapeutskihmodaliteta. Takođe se podrazumeva da sastavi u pronalaskumogu da se primeneukombinacijisadrugimagensimapoputnpr.citokina,faktorarasta,hormona,malihmolekula, lekova za hemoterapiju, pro-lekova, lekova, antitela ili drugim različitim farmaceutski aktivnim agensima. Praktičnonepostoje granicebrojadrugih komponenata koje takođemogubiti uključeneu sastave,uzuslovdadodatniagensineutičunegativnonasposobnostsastavadaposlužiunameravanoj terapiji.
[0288]Ovdekorišćena fraza"farmaceutskiprihvatljivo"odnosinenaoneoblike jedinjenja,materijala, sastava i/ili doza koji su, u okviru zdravogmedicinskog prosuđivanja, prikladni za kontakt sa tkivima ljudskihbićaiživotinjabezpreteranetoksičnosti, iritacije,alergijskereakcijeilinekogdrugogproblema ilikomplikacije,proporcionalnorazumnojrazmeridobrobit/rizik.
[0289] Ovde korišćen termin "farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač ili pomoćni sastojak" bez ograničenja uključuje bilo koji katalizator, nosač, pomoćni sastojak, glidant, zaslađivač, razblaživač, sredstvozaočuvanje,boju,pojačivačukusa,surfaktant,ovlaživač,sredstvozaraspršivanje,sredstvoza suspendiranje, izotonični agnes, rastvarač ili emulgator odobren od strane Administracije za hranu i lekoveS.A.D.kaoprihvatljivzaupotrebukodljudiidomaćihživotinja.Primerifarmaceutskiprihvatljivih nosača uključuju ali nisu ograničeni na šećere poput laktoze, glukoze i sukroze; skrobove poput kukuruznog ikrompirovogskroba;celulozu injenederivatepoputnatrijumkarboksimetilceluloze,etil celuloze iceluloznogacetata;prirodnegume;slada;želatina;talka;kakoputera;voskova;životinjskih i biljnih masti; parafina; silikona; bentonita; silicijumske kiseline; cikovog okisda; ulja poput ulja od kikirikija,uljaodpamuka,uljašafranike,uljaodsusama;maslinovogulja;kukuruznoguljailiuljaodsoje; glikolapoputpropilenglikola;poliolapoputglicerina,sorbitola,manitolaipoelietilenglikola;sterapoput etiloleataietillaurata;puferskeagensepoputmagnezijumhidroksidaialuminijumhidroksida;alginske kiseline;vodebezpirogena;izotoničnogfiziološkograstvora;Ringerovograstvora;etilalkohola;rastvore fosfatnihpuferaibilokojedrugekompatibilnesupstancekorišćeneufarmaceutskimformulacijama.
[0290] U određenim otelotvorenjima sastavi iz ovog pronalaska uključuju određenu količinu ćelija imunog efektora koja se ovde razmatra. Ovde korišćen termin "količina" odnosi se na genetski modifikovanuterapijskućelijusa"efektivnomkoličinom" ili"efektivnukoličinu"genetskimodifikovane terapijske ćelije, npr. T ćelije, za postizanje delotvornog ili željenog profilaktičkog ili terapeutskog rezultata,uključujućikliničkerezultate.
[0291]Termin"profilaktičkiefektivnakoličina"odnosisenakoličinugenetskimodifikovaneterapeutske ćelijekojaefektivnopostižeželjeniprofilaktičkirezultat.Poštoseprofilaktičkadozakodsubjektakoristi pre bolesti ili u njenoj ranoj fazi, profilaktička količina je tipično ali ne nužno manja od terapeutski efektivnekoličine.
[0292] "Terapeutski efektivna količina" genetski modifikovane terapeutske ćelije može da varira u zavisnostiodfaktorapoputfazeukojojsebolestnalazi,životnogdoba,polaitežinepojedinca,kaoiod sposobnostistemćelija ićelijapraroditeljadakodnjegaizazovuželjeniodgovor.Terapeutskiefektivna količinajetakođeonaukojojsusvitoksičniilištetniefektivirusailitransdukovanihterapeutskihćelija nadmašeniterapeutskiblagotvornimefektima.Termin"terapeutskiefektivnakoličina"uključujekoličinu koja ima efekta na "tretiranje" subjekta (npr. pacijenta). Kada je terapeutska količina naznačena, preciznu količinu primenljivih sastava iz ovog pronalaska može da odredi doktor, uzevši u obzir individualne razlike u životnom dobu, težini, veličini tumora, stepenu infekcije ili metastaza i stanju pacijenta(subjekta).UopštenomožemodaizjavimodafarmaceutskispojkojiuključujeovdeopisaneT ćelije može da se primerni u dozi od 102 do 1010 ćelija/kg telesne težine, preferirano 105 do 106 ćelija/kg telesnemase,uključujući sve celobrojnevrednostiu timobimima.Broj i tipovdepomenutih ćelija zavisiće od krajnje nameravane upotrebe sastava. Za ovde pomenute upotrebe ćelije se obično nalazeu volumenuod litra ilimanje, štomožeda iznosi 500ml ilimanje, pa čak250ml ili 100ml ili manje. Tako je gustina željenih ćelija tipično veća od 106 ćelija/ml i uopšteno veća od 107 ćelija/ml, odnosno108ćelija/mliliveća.Kliničkirelevantanbrojimunihćelijamožedasepodeliuvećibrojinfuzija kojesukumulativnojednakeilipremašuju105,106,107,108,109,1010,1011ili1012ćelija.Unekim aspektimaovogpronalaska,posebnopošto će sve ćelijedate infuzijombiti preusmerenenaodređeni ciljniantigen(npr.κiliλlakilanac),možebitiprimenjenmanjibrijćelijauobimuod106/kilogram(106-1011popacijentu).Sastavisaćelijamakoje iskazujuekspresijuCAR-amogudaseprimenevišeputau dozama unutar pomenutog obima. U odnosu na terapiranog pacijenta ćelije mogu biti alogeneičke, singeneičke, ksenogeneičke ili autologne. Po želji i u cilju pospešivanja indukcije imunog odgovora, tretmantakođemožedauključujeprimenuovdeopisanihmitogena(npr.PHA)ililimfokina,citokinai/ili hemokina(npr.IFN-γ,IL-2,IL-12,TNF-alpha,IL-18,iTNF-beta,GM-CSF,IL-4,IL-13,Flt3-L,RANTES,MlPlα, itd.).
[0293]Uopšteno,sastavikojiuključujućelijekojesuaktiviraneiproširenenaovdeopisannačinmoguda se koriste u tretmanu i prevenciji bolesti koje se javljaju kod imuno-kompromitovanih pojedinaca. Sastavi koji uključujuovdepominjaneT ćelije samodifikovanimCAR-omposebno sekoristeu lečenju raka. T ćelije sa modifikovanim CAR-om iz ovog pronalaska mogu da se primenjuju same ili kao farmaceutski sastav u kombinaciji sa nosačima, razblaživačima, pomoćnim sastojcima i/ili drugim komponentama poput IL-2 ili drugim citokinima ili populacijama ćelija. U određenim otelotvorenjima ovde pomenuti farmaceutski sastavi uključuju određenu količinu genetski modifikovanih T ćelija u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski ili fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača ili pomoćnih sredstava.
[0294] Farmaceutski sastavi iz ovog pronalaska koji uključuju populacije ćelija imunog efektora koje iskazujuekspresijuCAR-a,poputTćelija,mogudauključujupuferepoputneutralnogpuferskograstvora, fosfatnogpuferskograstvoraisl.;ugljenehidratepoputglukoze,manoze,sukrozeilidekstana;manitol, proteine, polipeptide ili amino kiseline poput glicina; antioksidanse, helatne agense poput EDTA ili glutationa; katalizatore (npr. aluminijum hidroksid) i konzervanse. Sastavi iz ovog pronalaska se preferirano formulišu za parenteralnu primenu npr. intravaskularnu (intravenoznu ili intraarterijsku), intraperitonealnuiliintramuskularnuprimenu.
[0295]Tečnifarmaceutskisastavi,bilodasuupitanjurastvori,suspenzijeiliostalisličnioblici,moguda uključujujednoilivišeodsledećeg:sterilnerazblaživačepoputvodezainjekcije,rastvorsolipreferirano fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, fiksna ulja poput sintetičkih mono ili diglicerida kojimogu da služe kao rastvarač ili suspenzija, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili ostale rastvarače;antibakterijskeagensepoputbenzilalkohola ilimetilparabena;antioksidantepoput askorbinske kiseline ili natrijum bisulfita; helatne angense poput etilendijamintetraacetične kiseline; pufere poput acetata, citrata ili fosfata i agense za prilagođavanje toničnosti poput natrijumhlorida i dekstroze. Paraenteralna priprema može da bude priložena u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili bočicama sa više doza napravljenim od stakla ili plastike. Farmaceutski sastav za ubrizgavanjejepoželjnosterilan.
[0296]Uodređenomotelotvorenjimaovdepominjanisastaviuključujuefektivnukoličinućelijaimunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a, samu ili u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih agensa. Tako sastavi ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju CAR-a mogu da se primenjuju sami ili u kombinaciji sa drugom terapijom za rak, poput terapije zračenjem, hemoterapije, transplantacije, imunoterapije, hormonske tarapije, fotodinamične terapije itd. Sastavi takođemogubiti primenjeni u kombinacijisantibioticima.Kakojeovdeopisano,takviterapeutskiagensimoguunaucibitiprihvaćeni kao standardni tretman za stanja određene bolesti, posebno raka. Primerni obrazloženi terapeutski agensi uključuju citokine, faktore rasta, steroide, NSAID-e, DMARD-e, protivupalna sredstva, hemoterapeutike,radioterapeutike,terapeutskaantitelailidruge aktivneilipomoćneagense.
[0297] U određenim otelotvorenjima sastavi koji sadrže ovde pominjanje ćelije imunog efektora koji iskazuju ekspresiju CAR-a mogu biti primenjeni u konjugaciji sa bilo kojim brojem hemoterapeutskih agensa. Ilustrativni primer hemoterapeutskih agnesa uključuje alkilirajuće angense poput tiotepije i ciklofosfahamida (CYTOXAN™); alkil sulfonate poput busulfana, improsulfana i piposulfana; aziridine poput nebzodope, karbokuona, meturedope i uredope; etilenimine i metilamelamine uključujući rezime altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforaoramida i trimetilolomelamina; azotne iperite poput hlorambucila, hloranafazina, hlorofosfamida, estramustina, ifsfamida, mehloretamina, mehloretamin oksid hidrohlorida, melfalana, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil iperita; nitrozoureje poput karmustina, hlorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibiotike poput aklacinomizina, antinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, kaktinomicina, kaliheamicina, karabicina, karminomicina, karcinofilina, hromomicina, daktilomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-okso-L-norleucina, doksorubicina, epirubicina, ezorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina, mikofenolne kiseline, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potifromicina, puromicina, kvelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina,ubenimeksa,zinostatina,zorubicina;antimetabolitapoputmetotreksatai5-fluorouracila(5-FU); analoga folne kiseline poput denopterina, metotreksata, pteropterina, trimetreksata; purinskih analoga poput fludarabina, 6-merkaptopurina, tijamiprina, tijoguanina; analoga piramidina poput ancitabina, azacitdina, 6-azuridina, karmofura, citarabina, dideoksiuridina, doksifluridina, enocitabina, floksuridina, 5FU; androgena poput kalusterona, dromostanolon propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; antiadrenergici poput aminoglutetimida, mitotana, trilostana; sredstava za nadopunu folne kiseline poput frolinske kiseline; aceglatona; aldofosfamid glikozida; aminolevulinske kiseline; amsakrina; bestrabucila; bisantrena; edatraksata; defofamina; demekolcina; dijazikvona; elformitina; eliptin acetata; etoglucida; galijum nitrata; hidroksiureje; lentinana; lonidamina; mitoguazona; mitoksantrona; mopidamola; nitrakrina; pentostatina; fenamenta; pirarubicina; podofilinske kiseline; 2-etilhidrazida; prokarbazina; PSK®; razoksana; sizofirana; spirogermanijuma; tenauzonične kiseline; tijazikvona; 2,2',2"-trihlorotrietilamina; uretana; vindesina; dakarbazina; manomustina; mitobranitola; mitolaktola; pipobromana; gacitosina; arabinozida ("Ara-C"); ciklofosfamida; tiotepa; taksoida npr. pacilitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Prinston, Nju Džerzi) i doksataksela (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antoni, Francuska); hlorambucila; gemcitabina; 6-tijoguanina; merkaptopurina; metotreksata; nalaoga platine poput cisplatina i karboplatina; vinblastina; platine; etopozida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoksantrona; vinkristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipozida; dunomicina; aminopterina; kselode; ibandronata; CPT-11; inhibitora topoizomeraze RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivata retinoične kiseline poput Targretin™ (beksarotena), Panretin™ (alitretinoina); ONTAK™ (denileukin diftitoksa); esperamicina; kapecitabina i farmaceutski prihvatljivih soli, kiselina ili njihovih derivata. U ovu definiciju takođe su uključeni i anti-hormonski agensi koji regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore poput anti-estrogena uključujući npr. tamoksifen, raloksifen, 4(5)-imadazole koji inhibiraju aromataze, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston); i anti-androgene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; i farmaceutski prihvatljivesoli,kiselineinjihovederivate.
[0298] U konjugaciji sa ovde opisanim sastavima moguće je koristiti i druge različite terapeutske agenske. U jednom otelotvorenju sastav koji uključuje ćelije imunog efektora koji iskazuju ekspresiju CAR-aprimenjujesesaprotivupalnimagensom.Protivupalniagensiililekoviuključujualinisuograničeni nasteroideiglukokortikoide(uključujućibetametazon,budezonid,deksametazon,hidrokortizonacetat, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcinolon), ne-steroidne protivupalne lekove (NSAIDS) uključujući aspirin, ibuprofen, naproksen,metotreksat, culfasalacin, leflunomid i anti-TNFlekove,ciklofosfamidimikofenolat.
[0299]DrugiuzorniNSAID-oviizabranisuizgrupekojasesastojiodibuprofena,naproksena,naproksen natrijuma, Cox-2 inhibitora poput VIOXX® (rofekoksib) i CELEBREX® (celekoksib), i sijalizata. Uzorni analgetici izabrani su iz grupe koja uključuje acetaminofen, oksikodin, tramadol i proporksifen hidrohlorid. Uzorni glukokortikoidi izabrani su iz grupe koja uključuje kortizon, deksametazon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon ili prednizon. Uzorni modifikatori biološkog odgovora uključujumolekuleusmereneprotivmarkeraćelijskepovršine (npr.CD4,CD5, itd.), inhibitorecitokina poput TNF antagonista (npr. etanercepta (ENBREL®), adalimumaba (HUMIRA®) i infliksimaba (REMICADE®), hemokine inhibitore i inhibitore adhezivnihmolekula.Modifikatori biološkog odgovora uključuju monoklonska antitela kao i rekombinantne forme molekula. Uzorni DMARD-ovi uključuju azatioprin, ciklofosfamid, ciklosporin, metotreksat, penicilamin, leflunomid, sulfasalacin, hidroksihlorokin,zlato(oralno(auranofin)iintramuskularno)iminociklin.
[0300] Ilustrativni primeri terapeutskih antitela prikladnih za kombinovanje sa ovde razmatranim T ćelijama sa modifikovanim CAR-om uključuju ali nisu ograničeni na abagovomab, adekatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuksimab, anatumomab, arkitummab, bavituksimab, bektumomab,bevacizumab,bivatuzumab,bilinatumomab,brentuksimab,kantuzumab,katumaksomab, cetuksimab, citatuzumab, ciksutumumab, klivatuzumab, konatumumab, daratumumab, drizitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ekromeksimab, eltuzumab, ensituksimab, ertumaksomab, etaracizumab, faretuzumab, fiklatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuksimab, ganitumab, gemtuzumab, girentuksimab, glembatumumab, ibritumomab, igovmab, imgatuzumab, indatuksimab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, leksatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lukatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moksetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomab, okaratuzumab, ofatumumab, olaratumumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintomomab, pritumumab, rakotumomab, raderumab, rilotumumab, rituksimab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuksimab, simtuzumab, solitomab, takatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tukotuzumab, ublituksimab, veltuzumab,vorsetuzumab,votumumab,zalutumumab,CC49i3F8.
[0301]Uodređenimotelotvorenjimaovdeopisanisastaviprimenjujuseukonjunkcijisacitokinom.Ovde korišćentermin"citokin"označavageneričkiizrazzaproteinekojeoslobađajednapopulacijaćelijakoji deluju na drugu ćeliju kao međućelijskii medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini i tradicionalnipolipeptidnihormoni.Međucitokinespadajuhormonirastapoputljudskoghormonarasta, N-metionilljudskihormonrastaigoveđihormonrasta;paratiroidnihormon,tiroksin,insulin,proinsulin, relaksin,prorelaksin;glikoproteinskihormonipoputhormonakojistimulišefolikule(FSH),hormonakoji stimulišetiroidu(TSH) i luteinizirajućeghormona(LH); faktorrastahepatocita; faktorrastafibroblasta, prolaktin, laktogenplacente, antimilerijanski hormonalfa i beta faktoranekroze tumora,mišiji peptid vezan za gonadotropin, inhibin, aktivin, vaskulatorni endotelni faktor rasta, integrin, trombopojetin (TPO),faktorirastaneravapoputNGF-beta,faktorrastakojipotičeiztrombocita,transformišućifaktori rasta (TGF-ovi) poput TGF-alfa i TGF-beta, faktor rasta slični insulinu I i II; eritropoietin (EPO); osteoinduktivni faktori, interferoni poput interferon-alfa, beta i -gama; faktori koji stimulišu kolonije (CSF-ovi) poput makrofag-CSF (M-CSF), granulocit-makrofag-CSF (GM-CSF) i granulocit-CSF (G-CSF); interleukini(IL-ovi)poputIL-1,IL-lalpha,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12;IL-15; faktornekrozetumorapoputTNF-alfailiTNF-betaidrugipolipeptidnifaktoruuključujućiiLIFikitlingad (KL).Ovdekorišćen termin "citokin"uključujeprotiene izprirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture,tebiološkiaktivneekvivalentecitokinanativnesekvence.
I.Ciljnećelijeiantigeni
[0302]Ovajraddelimičnogovoriogenetskimodifikovanimćelijamaimunogefektorapreusmerenimana ciljnućelijunpr. ćeliju tumora ili raka, koje sadržeCAR-ovesaveznimdomenomkoji seveženaciljne antigene na ćelijama. Ovde korišćen termin "rak" uopšteno se odnosi na klasu oboljenja ili stanja u kojima se abnormalne ćelije nekontrolisano dele imogu da napadnu okolna tkiva. Ćelije raka takođe mogudaseproširenadrugedelovetelaputemsistemakrviilimfe.Postojinekolikoglavnihtipovaraka. Karcinomjerakkojipočinjenakožiiliutkivimakojaoblažuilipokrivajuunutarnjeorgane.Sarkomjerak koji počinjeu kosti, hrskavici,masti,mišiću, krvnimsudovima ili ostalimveznim ili potpornim tkivima. Leukemijajerakkojipočinjeutkivimakojastvarajukrvpoputkoštanesržiiuzrokujeprodukcijuvelikog broja abnormalnih krvnih ćelija koje ulaze u krv. Limfom i višestrukimijelom su rakovi koji počinju u ćelijama imunog sistema. Rakovi centralnog nervnog sistema su rakovi koji počinju u tkivimamozga i kičmenogstuba.
[0303]Ovdekorišćentermin"maligni"odnosisenarakukomegrupatumoroznihćelijapokazujejedan ilivišeoblikanekontrolisanograsta(tj.deljenjeizvannormalnihgranica),invaziju(tj.napadiuništavanje susednihtkiva)imetastazu(tj.širenjenadrugelokacijeuteluputemlimfeilikrvi).Ovdekorišćentermin "metastazirati"odnosisenaširenjerakaizjednogdelatelaudrugi.Tumorformiranodćelijakojesuse raširile naziva se "metastatički tumor" ili "metastaza".Matastatički tumor sadrži ćelije nalik onima u originalnom(primarnom)tumoru.
[0304]Ovdekorišćentermin"benigni"ili"ne-maligni"odnosisenatumorekojimogudanarastuvećiali se ne šire na druge delove tela. Benigni tumori su samoograničeni i obično ne napadaju i ne metastaziraju.
[0305]Termin"ćelijaraka"ili"ćelijatumora"odnosisenapojedinačnućelijukanceroznograstailitkiva. Tumor se generalnoodnosinaotok ili leziju kojanastajeabnormalnim rastomćelija, a kojamožebiti benigna,pre-malignailimaligna.Većinarakovaformiratumorealinekinpr.leukemija,toneophodnone čine.Uslučajevimaonihrakovakojiformirajutumore,termini"ćelijaraka"ili"ćelijatumora"sekoriste zamenski. Količina tumora kod pojedinca naziva se "tumorsko opterećenje" imože semeriti brojem, zapreminomilitežinomtumora.
[0306]U jednom otelotvorenju ciljna ćelija izražava ekspresiju antigena, npr. ciljnog antigena koji se suštinski nenalazi napovršini normalne (poželjne) ćelije.U jednomotelotvorenju ciljna ćelija je ćelija parenhimagušterače,ćelijakanalagušterače,ćelija jetre,ćelijasrčanogmišića,ćelijaskeletnogmišića, osteoblast,skeletnimioblast,neuron,vaskularnaendotelnaćelija,ćelijapigmenta,ćelijaglatkogmišića, glijalna ćelija, ćelijamasti, koštana ćelija, hondrocit, ćelija otoka gušterače, ćelija CNS-a, ćelija PNS-a, ćelija jetre, adipozna ćelija, ćelija bubrega, ćelija pluća, ćelija kože, ćelija jajnika, folikularna ćelija, epitelnaćelija,imunaćelijailiendotelnaćelija.
[0307]Uodređenimotelotvorenjimaciljnaćelijajedeotkivagušterače,neuralnogtkiva,srčanogtkiva, koštane srži, mišićnog tkiva, koštanog tkiva, tkiva kože, tkiva jetre, folikula kose, vaskularnog tkiva, adipoznogtkiva,tkivaplućaitkivabubrega.
[0308]Uodređenomotelotvorenju ciljna ćelija je ćelija tumora.U drugom specifičnomotelotvorenju ciljna ćelija je ćelija raka, poput ćelije kod pacijenta sa rakom. Uzorne ćelije koje mogu biti ubijene prikazanimmetodima uključuju ćelije sledećih tumora: tumore tečnosti poput leukemije uključujući i akutnu leukemiju (poputakutne limfocitske leukemije,akutnemijelocitske leukemije imijeloblastičke, promijelocitičke,mijelomonocitičke,monocitičke i eritroleukemije), hroničnih oblika leukemije (poput hronične mijelocitičke (granulocitičke) leukemije i hronične leukemije limfocita), policitemiju vera, limfome, Hodžkinsovu bolest, ne-Hodžkinsov limfom, multiple mijelome, Valdenštromovu makroglobulinemiju,bolestteškoglanca.
[0309]Udrugomotelotvorenjućelijajećelijačvrstogtumorapoputsarkomaikarcinoma,fibrosarkoma, miksosarkoma,liposrakoma,hondrosarkoma,osteogeničkogsarkomaiostalih,sinovioma,mezotelioma, Juingovog tumora, leiomiosarkoma, rabdomiosarkoma, karcinomadebelog creva, rakagušterače, raka dojke, raka jajnika, raka prostate, hepatocelularnog karcinoma, raka pluća, kolorektalnog raka, karcinoma skvamoznih ćelija, karcinoma bazalnih ćelija, adenokarcinoma (npr. adenokarcinoma gušterače, debelog creva, jajnika, pluća, dojke, stomaka, prostate, grlića materice ili jednjaka), karcinomaznojnih žlezda,karcinoma lojnih žlezda,papilarnogkarcinoma,papilarnogadenokarcinoma, karcinoma moždine, bronhogeničnog karcinoma, karcinoma bubrežnih ćelija, hepatoma, karcinoma žučnekese,horiokarcinoma,Vilmovogtumora, rakagrlićamaterice, tumoratestisa,karcinomabešike, tumora CNS-a (poput glioma, astrocitoma, meduloblastoma, kraniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, akustičnog neuroma, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastomairetinoblastoma).
[0310]U jednom otelotvorenju rak je izabran iz grupe koja uključuje: metod iz tvrdnje 1 gde je rak izabran iz skupine koju čine: Vilmov tumor, Juingov sarkom, nuroendokrini tumor, glioblastom, neuroblastom,melanom,rakkože,rakdojke,rakdebelogcreva,rakrektuma,rakprostate,rakjetre,rak bubrega,rakgušterače,rakpluća,rakžučnekese,rakgrlićamaterice,rakendometrija,rakjednjaka,rak želuca, rak glave i vrata, medularni karcinom štitne žlezde, rak jajnika, gliom, limfom, leukemiju, hroničnu limfocitsku leukemiju, akutnu mijelogenoznu leukemiju, Hodžkinsov limfom, ne-Hodžkinsov limfomirakbešike.
[0311]Ujednomotelotvorenjuciljnaćelijajemalignaćelijajetre,gušterače,pluća,doke,bešike,mozga, kosti, štitne žlezde, bubrega, kože i hematopoetskog sistema. U drugom otelotvorenju ciljna ćelija je ćelijaurakujetre,rakagušterače,rakapluća,rakadojke,rakabešike,rakamozga,rakakosti,rakaštitne žlezde,rakabubrega,rakakožeilihematološkograka.
[0312]Ujednomotelotvorenjuciljniantigenjeepitopreceptoraalfafolata,5T4,αvβ6integrina,BCMA, B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kappa,Mezotelina,Mucl,Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-ovailiVEGFR2polipeptida.
J.Terapeutskimetodi
[0313] Ovde pominjane genetski modifikovane T ćelije obezbeđuju poboljšane metode adoptivne imunoterapije za upotrebu u tretiranju različitih tumora i rakova. U određenim otelotvorenjima specifičnostprimarneTćelije jepreusmerenanaćelijetumorailirakauzpomoćgenetskemodifikacije primarneTćelijeprethodnorazmatranimCAR-om.Urazličitimotelotvorenjimaviralnivektorsekoristi za genetskomodifikovanje ćelije imunog efektora sa polinukleotidom koji uključujeMND promotor i kodira CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže receptor alfa folata, 5T4,αvβ6 integrin,BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familiju uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII,EGP2,EGP40,EPCAM,EphA2,EpCAM,FAP, fetalniAchR,FRα,GD2,GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1,IL-11Rα,IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2Dligande,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-oveiliVEGFR2polipeptid;zglobnidomen, transmembranski domen koji uključuje TM domen dobijen iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD45, PD1 i CD 152, i kratkog oligo- ili polipeptidnog linkera, pomogućnosti dugog između1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10aminokisleinakojipovezujeTMdomen saunutarćelijskim signalnimdomenomCAR-a;ijedanilivišeunutarćelijskihko-stimulativnihsignalnihdomenaizabranihiz grupekojasesastojiod:CD28,CD134,iCD137;iCD3C,primarnosignalnogdomena.
[0314]U jednom otelotvorenju ovaj pronalazak uključuje tip ćelijske terapije gde su T ćelije genetski modifikovane da izraze ekspresiju CAR-a koji targetira ćelije raka koje izražavaju ekspresiju ciljnog antigena,paseCARTćelijainfuzijomdajepacijentukojemjepotrebna.Taćelijasposobnajezaubijanje ćelijatumorakodprimaoca.Zarazlikuodterapijaantitelima,CARTćelijesposobnesuzareplikacijuin vivoštozarezultatimadugotrajnuistrajnostkojamožedovestidoodrživeterapijeraka.
[0315]UjednomotelotvorenjuCARTćelijeovogpronalaskamogudaprođusnažnuinvivoekspanzijuT ćelija,tedaopstanutokomproduženogvremenskogperioda.UdrugomotelotvorenjuCARTćelijeovog pronalaska evoluiraju u T ćelije sa specifičnom memorijom koje mogu da se reaktiviraju kako bi inhibiralesvakododatnoformiranjetumorailinjegovrast.
[0316]Uposebnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkojišifruijeCAR koristeseulečenjučvrstihtumorailirakovakojibezograničenjauključujurakjetre,rakgušterače,rak pluća,rakdojke,rakbešike,rakmozga,rakkosti,rakštitnežlezde,rakbubregailirakkože.
[0317]Uspecifičnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji šifrujeCAR kojiuključujeveznidomenspecifičanzaantigenkojivežeepitopPSCAiliMUC1koristesezalečenjeraka gušterače.
[0318]Uspecifičnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji šifrujeCAR kojiuključujeveznidomenspecifičanzaantigenkojivežeepitopEPHA2,EGFRvIIIiliCSPG4koristeseza lečenjeglioblastomamultiforme.
[0319]Uposebnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoramodifikovanuvektorom koji uključuje MND promotor koji je operativno povezan sa polinukleotidom koji šifruje CAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji vežeepitopPSCA iliMUC1koriste se za lečenje raka bešike.
[0320]Uspecifičnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji šifrujeCAR kojiuključujeveznidomenspecifičanzaantigenkojivežeepitopPSCAiliGD2koristesezalečenjeraka pluća.
[0321]Uspecifičnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji šifrujeCAR kojiuključujeveznidomenspecifičanzaantigenkojivežeepitopCSPG4iliHER2koristesezalečenjeraka dojke,npr.trostrukonegativnograkadojke.
[0322]Uspecifičnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji šifrujeCAR koji uključuje vezni domen specifičan za antigen koji veže epitop GD2 ili CSPG4 koriste se za lečenje melanoma.
[0323]Uspecifičnimotelotvorenjimasastavikojiuključujućelijuimunogefektoragenetskimodifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkojijeoperativnovezanzapolinukleotidkojišifrujeCARkoriste se za lečenje tumora tečnosti, uključujući leukemiju, akutnu leukemiju (npr. ALL, AML i mijeloblaste, promijelocitičku,mijelomonocitičku,monocitičkuieritroleukemiju),hroničneoblikeleukemije(npr.CLL, SLL,CML,HCL),policitemijuvera,limfom,Hodžkinsovubolest,ne-Hodžkinsovlimfom,multiplimijelom, Valdenštromovumakroglobulinemijuibolestiteškoglanca.
[0324] U određenim otelotvorenjima sastavi koji uključuju ćeliju imunog efektora modifikovanu vektoromkojiuključujeMNDpromotorkoji jeoperativnopovezansapolinukleotidomkoji šifrujeCAR koristeseza lečenjemalignitetaB-ćelija,uključujućialineograničavajućisenamultiplimijelom(MM), ne-Hodžkinsovlimfom(NHL)ihroničnuleukemijulimfocita(CLL).
[0325] Multipli mijelom je malignitet B-ćelija morfologije zrelih ćelija plazme koji karakteriše neoplastičnatransformacijajednostrukogklonaovogtipaćelija.TećelijeplazmerazmnožavajuseuBM-u i mogu da napadnu okolnu kost, a ponekad i krv. Varijante multiplog mijeloma uključuju otvoreni mulplimijelom,tinjajućimultiplimijelom,leukemijućelijaplazme,ne-sekretornimijelom,IgDmijelom, osteosklerotični mijelom, usamljeni plazmacitom kosti i ekstramedularni plazmacitom (videti npr. Braunwald,etal.(eds),Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine,15.izdanje(McGraw-Hill2001)).
[0326] Ne-Hodžkinsov limfom obuhvata veliku grupu rakova limfocita (belih krvnih ćelija). Ne-Hodžkinsovilimfomimogudasepojaveubilokomdobuičestosuobeleženilimfnimčvorovimakojisu većiodnormale,groznicomigubitkomtelesnetežine.Postojimnogorazličitihtipovane-Hodžkinsovog limfoma. Na primer, ne-Hodžkinsov limfommože da se podeli na agresivni (brzorastući) i indolentni (spororastući) tip. Iako se ne-Hodžkinsovi limfomi mogu izvesti iz B-ćelija i T-ćelija, kao što je ovde naznačeno,termini"ne-Hodžkinsovlimfom"i"ne-HodžkinsovlimfomB-ćelija"sekoristezamenski.NeHodžkinsov limfom B-ćelija (NHL) uključuje Burkitov limfom, hroničnu limfocitičku leukemiju/mali limfocitički limfom (CLL/SLL), difuzni limfom velikih B-ćelija, folikularni limfom, imunoblastični limfom velikihćelija,prekursorskiB-limfoblastičnilimfomilimfomplaštaćelije.Limfomikojisepojavljujunakon transplantacijekoštanesržiilistemćelijasuobičnolimfomiB-ćelijailine-Hodžkinsovilimfomi.
[0327]Hroničnaleukemijalimfocita(CLL)jeindolentan(spororastući)rakkojiuzrokujesporopovećanje brojanezrelihbelihkrvnihćelijazvanihBlimfocitiiliBćelije.Ćelijerakašireseputemkrviikoštanesrži, atakođemogudautičunalimfnečvoroveilidrugeorganepoputjetreislezine.CLLnaposletkuuzrokuje prestanak funkcionisanja koštanemoždine. Ponekad, u kasnijim fazama bolesti, ona se nazivamalim limfocitičnimlimfomom.
[0328] U specifičnim otelotvorenjima dati su metodi koji uključuju primenu terapeutski efektivne količineovderazmatranihćelijaimunogefektorakojeiskazujuekspresijuCAR-ailisastavakojiihsadrži, kodpacijentakojizanjimaimapotrebu,bilosamostalnoiliukombinacijisajednimilivišeterapeutskih agensa. U određenim otelotvorenjima ćelije iz ovog pronalaska koriste se za lečenje pacijenata koji spadajuurizičnugrupuzarazvijanjeraka.Takoovajpronalazakpružametodeza lečenje iliprevenciju raka,uključujućiprimenunasubjektukoji za tim imapotrebuterapeutskiefektivnekoličineTćelijasa modifikovanimCAR-omizovogpronalaska.
[0329]Ovdekorišćenitermini"pojedinac"i"subjekt"sečestokoristezamenskiiodnosesenabilokoju životinjukojapokazujesimptomrakakojijemogućetretirativektorimagenetsketerapije,terapeuticima zasnovanim na ćelijama i ovde opisanim metodima. Prikladni subjekti (npr. pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (poput miša, pacova, zeca ili morskog praseta), životinje sa farme i domaće životinjeili ljubimce(poputmačkeilipsa).Uprikladnesubjektetakođesuuključenine-ljudskiprimati i poželjno je ljudski pacijenti. Tipični subjekti uključuju pacijente obolele od raka, one kojima je rak dijagnostikovanilikojispadajuurizičnugrupu.
[0330]Ovdekorišćenitermini"pacijent"odnosisenasubjektakomjedijagnostikovanodređenirakkoji je moguće tretirati vektorima genetske terapije, terapeuticima zasnovanim na ćelijama i ovde razmatranimmetodima.
[0331]Ovdekorišćenitermini"tretman"ili"tretiranje"uključujusvakiblagotvorni ilipoželjniefekatna simptomeilipatologijubolestiilifiziološkostanje,imogudaobuhvatajučakiminimalnereakcijejednog ili više merljivih markera tretirane bolesti ili stanja, npr. raka. Tretman može opciono da uključuje smanjenjeilipoboljšanjesimptomabolestiilistanja,iliodlaganjenapredovanjabolestiilistanja.Termin "tretman"neophodnoneoznačavapotpunoiskorenjivanje ili izlečenjebolesti ilistanja,kaoninjihovih simptoma.
[0332] Ovde korišćen termin "sprečiti" i slične reči poput "sprečeno", "sprečavanje" itd. označavaju pristupzasprečavanje,inhibiranjeilismanjenjeverovatnostipojaveiliponovnepojavebolestiilistanja, npr.raka.Takođeseodnosinaodlaganjepočetkailiponovnepojavebolestiilistanjailiodlaganjepojave iliponovnepojavesimptomabolesti ilistanja.Ovdekorišćentermin"prevencija" isličnerečiuključuju smanjenje intenziteta, efekata, simptoma i/ili opterećenja bolesti ili stanja pre početka ili ponovne pojavebolestiilistanja.
[0333] Termini "poboljšati" ili "promovisati" ili "pojačati" ili "proširiti" uopšteno se odnose na sposobnostovderazmatranihsastavanpr.genetskimodifikovanihTćelijailivektorakojikodiraCARda proizvedu, izazovu iliuzrokujuveći fiziološkiodgovor (tj.opadajućiefekat)upoređenjusaodgovorom koji je posledica sredstva ili kontrolne molekule/sastava. Između ostalih očiglednih ovde opisanih značenja i značenja poznatih nauci, merljiv fiziološki odgovor može da uključi pojačano širenje, aktivaciju, održivost T ćelija i/ili povećanje sposobnosti ubijanja ćelija raka. "Povećana" ili "pojačana" količinajeobično"statističkiznačajna"količinaimožedauključipovećanjeod1,1,1,2,1,5,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,15,20,30ilivišeputa(npr.500,1000puta)(uključujućisveceleidecimalnebrojeveizmeđu, kaoiiznad1,npr.1,5,1,6,1,7.1,8,itd.)odgovorakojiizazivasredstvoilikontrolnisastav.
[0334]Pod"smanjenjem"ili"snižavanjem"ili"umanjenjem","redukcijom"ili"snižavanjem"uopštenose podrazumeva sposobnost ovde razmatranog sastava da proizvede, izmami ili izazove manji fiziološki odgovor (npr. opadajuće efekte) u poređenju sa odgovorom izazvanim sredstvom ili kontrolnom molekulom/sastavom. "Smanjena" ili "redukovana" količina je obično "statistički značajna" količina i možedauključismanjenjeod1,1,1,2,1,5,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30ilivišeputa(npr.500,1000 puta)(uključujućisveceleidecimalnebrojeveizmeđu,kaoiiznad1,npr.1,5,1,6,1,7.1,8,itd.)odgovora (referentnogodgovora)kojiproizvodisredstvo,kontrolnisastav,iliodgovorauposebnojlinijićelija.
[0335]Pod"održavanjem"ili"očuvanjem"iliizrazima"bezpromene"ili"bezsuštinskepromene"ili"bez suštinskog smanjenja"uopštenosepodrazumevasposobnostovde razmatranog sastavadaproizvede, izmami ili izazovemanji fiziološki odgovor (npr. opadajuće efekte) u ćeliji u poređenju sa odgovorom izazvanim sredstvom ili kontrolnom molekulom/sastavom, ili odgovorom u posebnoj liniji ćelija. Komparabilanodgovorjeonajkojiseznačajnoilimerljivonerazlikujeodreferentnogodgovora.
[0336] U jednom otelotvorenju metod tretiranja raka kod subjekta kome je to potrebno uključuje primenuefektivnekoličine,npr. terapeutski efektivnekoličine, sastavakojiuključujeovde razmatrane genetskimodifikovane ćelije imunog efektora. Količina i frekvencija primenebiće određena faktorima poputstanjapacijentaitipaiozbiljnostibolesti,iakoseprikladnedozemoguutvrditikliničkimopitima.
[0337] U određenim otelotvorenjima može biti poželjna primena aktiviranih T ćelija kod subjekta i posledično povlačenje krvi (ili izvođenje apereze), aktiviranje T ćelija iz nje prema ovom pronalasku i njenoponovnodavanjepacijentuzajednosaaktiviranimiproširenimTćelijama.Ovajprocesmožedase sprovede nekoliko puta svakih nekoliko nedelja. U određenim otelotvorenjima T ćelije mogu biti aktiviraneizkoličineod10ccdo400ccpovučenekrvi.UodređenimotelotvorenjimaTćelijesuaktivirane izkoličinaod20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,100cc,150cc,200cc,250cc,300cc,350ccili 400cc ili više povučene krvi. Nezavisno od bilo koje teorije, protokol mnogostrukog povlačenja krvi/mnogostrukereinfuzijemožedaslužizaselektovanjeodređenihpopulacijaTćelija.
[0338]Primenaovderazmatranihsastavamožedasesprovedenabilokojiprikladannačin,uključujući inhalaciju aeroslola, injekcije, gutanje, transfuziju, implantaciju ili transplantaciju. U prioritetnim otelotvorenjima sastavi se primenjuju paraenteralno. Ovde krišćene fraze "paraenteralna primena" ili "paraenteralnoprimenjeno"odnose senanačineprimenekoji isključujuenteralnu i topičkuprimenu, provode se obično injektiranjem, te bez ograničenja uključuju intravaskularne, intravenozne, intramuskularne, intraarterijske, intrateklane, intrakapsularne, intraorbitalne, intratumorske, intrakardijalne, intradermalne, intraperitonealne, transtrahealne, subkutane, subkutikularne, intraartikularne, subkapsularne, subarahnoidne, intraspinalne i intrasternalne injekcije i infuzije. U jednom otelotvorenju ovde razmatrani sastavi se kod subjekta primenjuju direktnim injektiranjem u tumor,limfničvorilizaraženomesto.
[0339]Ujednomotelotvorenjukodsubjekta jeprimenjenaefektivnakoličinasastavauciljupovećanja ćelijskog imunog odgovora na rak. Imuni odgovormože da uključi ćelijske imune odgovore kod kojih posredujuodgovoricitotoksičnihTćelijesposobnihzaubijanjezaraženihćelija,regulatornihTćelijailiT ćelija pomoćnika. Takođe mogu da budu uključeni humoralni imuni odgovori kod kojih primarno posreduju T ćelije pomoćnici sposobne za aktiviranje B ćelija, što dovodi do proizvodnje antitela. Za analizuimunihodgovoraizazvanihsastavimaizovogpronalaskamogudasekoristeraznetehnikekoje su u nauci dobro opisane, npr. Current Protocols in Immunology, urednici: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek,DavidH.Margulies,EthanM.Shevach,WarrenStrober(2001)JohnWiley&Sons,NY,NY.
[0340]Uslučajuubijanja kodkojegposredujuT ćelije, vezivanje ligandaCAR-apokreće signalizovanje CAR-a T ćeliji, što za rezultat ima aktivaciju različitih signalnih puteva T ćelija koji kod njih izazivaju proizvodnju ili oslobađanje proteina sposobnih za izazivanje apoptoze ciljnih ćelija putem različitih mehanizama. Ti mehanizmi kod kojih posreduju T ćelije uključuju (ali nisu ograničeni na) prenos unutarćelijskihcitotoksičnihgranula izTćelijeuciljnućeliju, sekrecijupro-zapaljivihcitokina izTćelije koji mogu da izazovu direktno ubistvo ciljne ćelije (ili njeno indirektno ubistvo putem regrutovanja drugihćelijaefektorazaubijanje)iuzlaznuregulacijulingandareceptorasmrti(npr.FasL)napovršiniT ćelijekojiizazivajuapoptozuciljnećelijekojaslediizavezivanjanjimasrodnogreceptorasmrti(npr.Fas) naciljnućeliju.
[0341]U jednomotelotvorenju ovaj pronalazak prikazujemetod lečenja subjekta sa dijagnozom raka koji uključuje uklanjanje ćelija imunog efektora iz njega, njihovo genetsko modifikovanje ovde razmatranimvektoromkojiuključujenukleinskukiselinukojašifrujeCAR,čimeseproizvodipopulacija modifikovanih ćelija imunog efektora koje se zatim primenjuju na isti subjekat. U prioritetnim otelotvorenjimaćelijeimunogefektorauključujuTćelije.
[0342]Uodređenim otelotvorenjima ovaj pronalazak takođe prikazujemetode stimulisanja odgovora imunogmodulatorakodkogaposredujućelijeimunogefektoranapopulacijuciljnihćelijakodsubjekta, a koje uključuju korake primenepopulacije ćelija imunog efektora koje iskazuju ekspresiju konstrukta nukleinskekiselinekojašifrujemolekulCAR-a.
[0343] Ovde opisani metodi primene ćelijskih sastava uključuju svaki metod koji efektivno rezultuje ponovnim uvođenjem ex vivo genetskimodifikovanih ćelija imunog efektora koje ili direktno iskazuju ekspresijuCAR-aizpronalaskakodsubjektailinaponovnouvođenjegenetskimodifikovanihpraroditelja ćelija imunogefektorakoji sepoprimeninasubjekatdiferencirajuuzrelećelije imunogefektorakoje iskazuju ekspresiju CAR-a. Jedan metod uključuje transdukciju T ćelija iz periferne krvi ex vivo sa konstruktomnukleinskekiselineuskladusapronalaskomivraćanjetransdukovanihćelijausubjekat.
[0344] U određenim otelotvorenjima receptor alfa folata, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnog AchR, FRα, GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-I, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mezotelin, Mucl, Mucl6, NCAM, NKG2D ligandi, NY-ESO-I, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ovi ili VEGFR2 polinukelotidi, polipetidi, fragmenti polipeptidailinjihovaantitelapredstavljajudeometodapratećedijagnostike,običnozbogprocenedali ćesubjekatilipopulacijasubjekatapovoljnoodgovoritinaposebanmedicinskitretman.
[0345]Ovdekorišćentermin"pratećadijagnostika"odnosisenadijagnostičkitestpovezansaterapijom posebnim CAR-om ili genetski modifikovanom ćelijom imunog efektora. U određenom otelotvorenju dijagnostičkimetodiiopremauključujudetekcijunivoaiskazivanjaekspresijereceptoraalfafolata,5T4, αvβ6 integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8, CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138,CD171,CEA,CSPG4,EGFR,EGFRfamilijeuključujućiErbB2(HER2), EGFRvIII,EGP2,EGP40,EPCAM,EphA2,EpCAM,FAP,fetalnogAchR,FRα,GD2,GD3,'Glypican-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1,HLA-A3+MAGE1,HLA-A1+NY-ESO-1,HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kappa,Mezotelina,Mucl,Mucl6, NCAM, NKG2D liganda, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida ili polinukleotida u biološkom uzorku, što dozvoljava brzu identifikaciju pacijenata koji su pogodni za tretmanuskladusaovimpronalaskom.
[0346]Na primer, dati terapeutski agens za rak (npr. ovde razmatrani CAR ili genetski modifikovane ćelijeimunogefektorakojeiskazujuekspresijuCAR-a)mogudaseidentifikujukaoprikladnezasubjekat ili određenu populaciju subjekata na osnovu toga da li subjekat ili subjekti poseduju jedan ili više izabranihbiomarkerazadatubolestilistanje.Primeribiomarkerauključujumarkereseruma/tkiva,kaoi markere kojimoguda se identifikuju tehnikamamedicinskog snimanja.Uodređenim otelotvorenjima receptor alfa folata, 5T4,αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD79a,CD79b,CD123,CD138,CD171,CEA,CSPG4,EGFR,EGFRfamilija uključujućiErbB2(HER2),EGFRvIII,EGP2,EGP40,EPCAM,EphA2,EpCAM,FAP,fetalniAchR,FRα,GD2, GD3, 'Glypican-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1,HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2,Lambda,Lewis-Y,Kappa,Mezotelin,Mucl,Mucl6, NCAM,NKG2Dligandi,NY-ESO-1,PRAME,PSCA,PSMA,ROR1,SSX,Survivin,TAG72,TEM-oviiliVEGFR2 fragmentipolipeptida(ilinjimaodgovarajućihpolinukleotida)samimogudadajuserumi/ilibiomarker tkiva koji može da se upotrebi za merenje ishoda leka ili procenu poželjnosti leka korišćenog kod određenogsubjektailispecifičnepopulacijesubjekata.Uodređenomaspektimaidentifikacijaindikacije pogodnezalečenjekojaiskazujeekspresijureceptoraalfafolata,5T4,αvβ6integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM,EphA2,EpCAM,FAP,fetalnogAchR,FRα,GD2,GD3,'Glypican-3(GPC3),HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1, HLA-A3 MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kappa,Mezotelina,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2D liganda,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 referentne sekvence polipeptida ili polinukleotidamože da uključi karakterizacije diferencijalnih izražaja ekspresije te sekvence, bilo kod izabranogsubjekta,izabranogtkivailidrugačije,kaoštojeovdeopisanoipoznatounauci.
[0347]Uodređenomotelotvorenjuovderazmatranimetodiuključujumerenje ilikvantifikovanjenivoa pre-mRNA,mRNAiliiskazivanjeekspresijereceptoraalfafolata,5T4,αvβ6integrina,BCMA,B7-H3,B7-H6, CALX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familije uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM,EphA2,EpCAM,FAP,fetalnogAchR,FRα,GD2,GD3,'Glypican-3(GPC3),HLA-A1+MAGE1,HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kappa,Mezotelina,Mucl,Mucl6,NCAM,NKG2D liganda,NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEM-ova ili VEGFR2 polipeptida u raku subjekta. U jednom otelotvorenju subjekt je identifikovan na osnovu određenog raka pogodnog za tretiranje ovde razmatranimsastavomakojeiskazivanjeekspresijemarkeraubiološkomuzorku10,25,50,100ili1000 putavećeodiskazivanjaekspresijemarkeraukontrolnomuzorkuilipoznatomstandardu.Uspecifičnom otelotvorenju subjekt je identifikovan na osnovu indikacije pogodne za tretiranje ako je iskazivanje ekspresije biomarkera u biološkom uzorku otkriveno, a iskazivanje ekspresije markera u kontrolnom uzorkuilipoznatomstandardukojiistimetodkoristinalaziseispodnivoaotkrivanja.
[0348]Prisustvo,odsustvoilirelativninivoi iskazivanjaekspresijeproteinabiomarkeraupotencijalnom raku može se analizirati putem npr. histohemijskih tehnika, imunoloških tehnika, elektrofosforeze, Vestern blot analize, FASC analize, citometrije protoka i sl. Pored toga može da se otkrije prisustvo, odsustvoilirelativninivoiiskazivanjaekspresijebiomarkeraRNKnpr.pomoćuPCRtehnika,Nordernblot analize,upotrebomprikladniholigonukleotidnihprobaisl.
[0349]Svepublikacije,prijavepatenataiizdatipatenticitiraniuovojspecifikacijisuovdeuključenikao referenca kao da je za svaku pojedinačnu publikaciju, prijavu patenta ili izdati patent posebno i pojedinačnonaznačenodabuduuključenireferencom.
[0350] Iako je gorepomenuti pronalazak detaljno opisan ilustrovanjem i primerom u svrhu jasnog razumevanja,usvetluučenjaiznjeganaučnikućebitiočiglednodasemogunapravitiodređeneizmenei modifikacije bez odstupanja od duha ili obima priloženih tvrdnji. Sledeći primeri dati su samo ilustrativno,anekaoograničenje.Naučnicićespremnoprepoznatiraznenekritičkeparametrekojimogu bitiizmenjeniilimodifikovaniuciljupružanjasuštinskiistihrezultata.
PRIMERI
PRIMER1:
KonstruisanjeCAR-ova
1.CD19specifičniCAR(pMND-CD19CAR)
[0351]CD19specifičniCAR-ovidizajniranisutakodasadržeMNDpromotorkojijeoperativnopovezan sa anti--CD 19 scFv-om, zglobnim domenom ili transmembranskim domenom CD8α i CD 137 kostimulativnimdomenom,propraćenimunutarćelijskimsignalnimdomenomlancaCD3α.Slika1A.CD19 CARuključujesekvencuCD8αjednostrukogpeptida(SP)zapovršinskoiskazivanjeekspresijenaćelijama imunog efektora. Polinukleotidna sekvence pMND-CD19 CAR-a prikazana je pod BR. ID. SEKV.: 2, a vektorskamapaprikazanajenaSlici2.Tabela3prikazujeIdentitet,Referencubankegena,Imeizvorai CitatzarazličitesegmentenukleotidalentiviralnogvektorapMND-CD19CAR-a.
Tabela3.
2.CARspecifičanzaKappalakilanac(kappaLC)(pMND-kappaCAR)
[0352] CAR-ovi specifični za Kappa laki lanac dizajnirani su tako da sadrže MND promotor koji je operativno povezan sa scFv-om anti-kappa lakog lanca, zglobnim domenom ili transmembranskim domenomizko-stimulativniihdomenaCD8αiCD137,propraćenimunutarćelijskimsignalnimdomenom lancaCD3α. Slika 1B. KappaLCCARuključuje sekvencuCD8α jednostrukogpeptida (SP) za površinsko iskazivanje ekspresije na ćelijama imunog efektora. Polinukleotidna sekvence pMND-kappaLC CAR-a prikazanajepodBR.ID.SEKV.:3,avektorskamapaprikazanajenaSlici3.Tabela4prikazujeIdentitet, Referencubankegena, Ime izvora iCitatzarazličitesegmentenukleotida lentiviralnogvektorapMND-kappalakoglancaCAR-a.
Tabela4.
PRIMER2:
TRANSDUKCIJAĆELIJA
[0353]Površinskereziduelentiviralnogvektora(LV)proizvodeseuHEK293Tćelijamakaoštojeopisano uliteraturi(Naldinietal,1996,Dulletal,1998iZuffereyetal,1998).Prelaznatransfekcija5-plazmida (HPV275kojišifrujuHIVgagpol, ψ/N15kojišifrujeVSV-Gproteinomotnice,p633kojišifrujeHIVrev protein,HPV601kojišifrujeHIVtatproteinivektorkojiiskazujeekspresijuCAR-a)koristesepremaopisu uPCTPubl.br.WO2012/170911.PovršinskerezidueLVsezatimkoncentrirajubiloultracentrifugiranjem ili kolonom za razmenu iona iza koje sledi tangencijalna filtracija protoka (TFF), formulišu u SCGN medijum (CellGenix Inc., Nemačka) i citporezerviraju na <-70°C u krio-bočicama za jednokratnu upotrebu. Infektivni titeri određuju se citometrijskomanalizomprotoka transdukovanih ćelija ljudskih osteosarkoma (HOS) (Kutner et al, 2009, Nature Protocols 4:495-505). Za transdukovanje ljudskih T limfocita,primarnehumaneTćelijeizolujuseodzdravihdonoravolonteraizačegasledileukaperezapo negativnojselekcijipomoćuRosetteSepopreme(tehnologijastemćelija).TćelijesegajeuRPMI1640 dopunjenom sa 10% FCS-a, 100 U/ml penicilina, 100 g/ml streptomicin sulfata, 10 mM Hepesa i stimulisanomsamagnetnimzrncimaprekrivenimanti-CD3/anti-CD28antitelimaurazmerićelijaizrnaca 1:3.ZaCD8Tćelije,finalnojkoncentracijiod30IU/mlsvakogdrugogdanadodajeseljudskiIL-2(Hiron). Približno24hnakonaktivacijeTćelijese transdukuju lentiviralnimvektorimapriMOIod5.Evaluacija trandsdukcijeTćelijaobavljasereakcijomlancapolimerazeuzkorišćenjeprajmeraspecifičnihzaviralni vektoricitometrijomprotokakojeslede7do10dananakontransdukcije.
PRIMER3
VCNCARTRANSDUKOVANIHĆELIJA
[0354]Određen je broj vektorskih kopija za transdukciju primarnih ljudskih T ćelija sapMND-kappaLc CAR lentivirusom. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktiviranekulturisanjemsaantitelimaspecifičnimzaCD3iCD28(MiltenyiBiotec)umedijumukojisadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljenebez tretmana.Kulture suodržavane takodadozvoleporast i širenjeT ćelija (7-10dana).U vremežetve,kulturekojesusadržavaleTćelijesuseproširilepribližno2loga.
[0355]Brojkopijavektora(VCN)integrisanihlentiviralnihčesticabiojeodređenmetodomq-PCRdevet dananakon transdukcije.AritmetičkasredinaVCN-aza12 jedinstvenihkulturaod6donora iznosila je 3,1.Slika4.
PRIMER4
ISKAZIVANJEEKSPANZIJECAR-aUTRANSDUKOVANIMTĆELIJAMA
[0356]Naprimarnim ljudskimTćelijamaodređeno je iskazivanjeekspresijepovršinećelijezaCAR-ove specifične za kappa ekspresiju iz MND promotora (pMND-kappaLc CAR). Mononuklearne ćelije iz perifernekrvi(PBMC)uzetesuodnormalnihdonoraiaktiviranekulturisanjemsaantitelimaspecifičnim zaCD3iCD28(MiltenyiBiotec)umedijumukojisadržiIL-2(CellGenix).Nakonaktivacije,PBMCkulture bilesutransdukovanelentiviralnimvektorimailiostavljenebeztretmana.Kulturesuodržavanetakoda dozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširilepribližno2loga.
[0357] Iskazivanje ekspresije KappaLc bilo je određeno citometrijom protoka korišćenjem antitela specifičnih za lg miša (BD Biosciences) koja su isključivo prisutna na pMND- kappaLcT ćelijama sa modifikovanimCAR-om.Citometrijaprotokaobavljena je šestdodevetdananakon transdukcije.Nivo iskazivanja ekspresije aritmetičke sredine kappaLc iz 12 jedinstvenih kultura od 6 donora iznosio je 35,6%.Slika5.
PRIMER5
MND PROMOTOR POKREĆE IZRAŽAVANJE EKSPRESIJE CAR-a U T ĆELIJAMA UPOREDIV SA EFIA PROMOTOROM
[0358]CD19CARekspresijapokrenutaMNDpromotoromnamodifikovanimTćeijamabilajeuporediva saCD19CARekspresijompokrenutomEFIαpromotorom.Mononuklearnećelijeizperifernekrvi(PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifičnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovanelentiviralnimvektorimailiostavljenebeztretmana.Kulturesuodržavanetakodadozvole porast i širenje T ćelija (7-10 dana). U vreme žetve, kulture koje su sadržavale T ćelije su se proširile približno2loga.NakrajukulturetransdukcijaTćelijabilajeispitanakvantitativnomlančanomreakcijom polimeraze(qPCR)uzpomoćprajmeraspecifičnihzaviralnečestice.IskazivanjeekspresijeCD19CAR-a bilo je određeno šest dana nakon transdukcije citometrijom protoka uz pomoć korišćenja antitela specifičnihzalgmiša(BDBiosciences)kojasuisključivoprisutnanaCD19Tćelijamasamodifikovanim CAR-om.IskazivanjeekspresijeCD19CAR-aiVCNrazličitihkonstrukatabilisuuporedivi.Slika6.
PRIMER6
REAKTIVNOSTSPECIFIČNAZAANTIGENTĆELIJACAR-a [0359]UtvrđenajereaktivnostspecifičnazaantigenpMNDkappaLcCARTćelija.Mononuklearnećelije iz periferne krvi (PBMC) uzete su od normalnih donora i aktivirane kulturisanjem sa antitelima specifičnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) umedijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix). Nakon aktivacije, PBMC kulture bile su transdukovane lentiviralnim vektorima ili ostavljene bez tretmana. Kulture su održavanetakodadozvoleporastiširenjeTćelija(7-10dana).Uvremežetve,kulturekojesusadržavale Tćelijesuseproširilepribližno2loga.
[0360]Nakrajukulturereaktivnosttumorabilajeispitanauzpomoćinterferon-gamaotpuštanja(IFNy). TćelijemodifikovanepMND-kappaLcCAR-omlučeIFNγnakonko-kulturisanjasaćelijamakappa+Daudi (iskazujuekspresijukappaLc).Zarazlikuodtoga,ko-kultureTćelijamodifikovanihpMND-kappaLcCAR-om sa kappa-negativnimHDLM-2 ćelijama rezultovale su oslobađanjem IFNγ uporedivog sa količinom primećenomkadasuTćelijebileuzgajanesame.Oslobađanje IFNγbilo jeutvrđenokorišćenjemELISA opremenakon24časako-kulturisanjasakappa-pozitivnimDaudiilikappa-negativnimHDLM-2ćelijama. Slika7.
PRIMER7
ANTI-TUMORSKAFUNKCIJATĆELIJACAR-a
[0361]Određenajeanti-tumorskafunkcijaTćelijaCAR-ainženjerisanihzaiskazivanjeekspresijepMND-kappaLcCAR-a.Mononuklearnećelijeizperifernekrvi(PBMC)uzetesuodnormalnihdonoraiaktivirane kulturisanjem sa antitelima specifičnim za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix).Nakonaktivacije,PBMCkulturebilesutransdukovanelentiviralnimvektorimailiostavljene beztretmana.KulturesuodržavanetakodadozvoleporastiširenjeTćelija(7-10dana).Uvremežetve, kulturekojesusadržavaleTćelijesuseproširilepribližno2loga.
[0362] 2 x 106 Daudi ćelije obeležene genom luciferaze svica ustanovljene su pomoću intravenozne injekcije kod NOD scid IL-2 receptora gama lanca nokaut miševa (NSG). Tri, šest i devet dana po injektiranju ćelija tumora umiševe, 1x107 pMND- kappaLc T ćelije samodifikovanim CAR-om bile su usvojeno prenesene na miševe, a rast tumora praćen je bioluminiscencijom uz pomoć Xenogen-IVIS sistemazasnimanje.TumorskoopterećenjekodmiševakojisuprimiliTćelijesamodifikovanimCAR-om bilojesmanjenoupoređenjusatumorskimopterećenjemnetretiranihmiševa.Slika8.
PRIMER8
STVARANJEFUNKCIONALNOGCARTLEKA
[0363]Anti-BCMATćelijekojeiskazujuekspresijuCAR-aproizvedenesukaoštojeopisanouPrimeru1, iznad.OveTćelijesaekspresijomCAR-apokazaleseklirensspecifičnogtumora.Anti-BCMATćelijekoje iskazujuekspresijuCAR-asuko-kulturisane4časasaK562ćelijamailiK562ćelijamamodifikovanimtako da iskažu ekspresiju CAR-a. Ćelije tumora koje su iskazivale ekspresiju antigena bile su obeležene karboksiflureosceincukcimidrilesterom(CFSE)ifluoresecencajemerenauzpomoćFASC-a.Anti-BCMAT ćelijekojeiskazujuekspresijuCAR-aubilesuK562ćelijekojeiskazujuBCMA(Slika9A)ioslobodileIFN-γ (Slika9B).(n=3).

Claims (15)

  1. PATENTNIZAHTEVI 1.Lentiviralnivektorkojisadržipolinukleotidkojiuključujemijeloprolferativnipojačivačvirusasarkoma, uzizbrisanuregijunegativnekontrole,(MND)promoterzamenjedl587revlokacijezavezivanjeprajmera -akoji jeoperativnopovezan sanukleinskomkiselinomkoja šifruje receptorhimernihantigena (CAR), gdeCARuključuje:
    (a)scFvkojivežeantigensazrevanjaB-ćelija(BCMA);
    (b)CD8αzblobnuregiju;
    (c)CD8αtransmembranskidomen;
    (d)CD137ko-stimulativnisignalnidomen;i
    (e)CD3ξprimarnisignalnidomen.
  2. 2.Lentiviralnivektorizpatentnogzahteva1pričemuCARdaljesadržisignalnipeptid.
  3. 3.Lentiviralnivektorizpatentnogzahteva1pričemujelentivirusizabranizgrupekojasesastojiod:HIV (ljudskivirusimunodeficijencije),iHIV-2.
  4. 4.Premabilokojemodpatentnihzahtevaod1do3lentiviralnivektoruključujelevi(5')lentiviralniLTR, a Psi (ψ) signal za pakovanje, klapnu centralnog polipurinskog trakta/DNK (cPPT/FLAP), retroviralni izvoznielement,MNDpromotorkojijeoperativnopovezansaCAR-omizpatentnogzahteva1desni(3') lentiviralniLTR.
  5. 5.Lentiviralnivektorizpatentnogzahteva4daljeuključuje:
    a)heterolognusekvencupoliadenilacije; b)hereolognusekvencupoliadenilacijekojajesekvencapoliadenilacijegoveđeghormonarasta ilisignalnasekvencapoliadenliacijezečijegβ-globina;ili
    c) post-transkripcioni regulativni element virusa hepatitisa B (HPRE) or post-transkripcioni regulativnielementmrmota(WPRE).
  6. 6.Lentiviralnivektorizpatentnogzahteva4ili5pričemuje
    (a)promotor5'LTR-azamenjenheterolognimpromotorom;
    (b) promotor 5' LTR-a zamenjen promotorom citomegalovirusa (CMV), a promotorom virusa RousSarcoma(RSV)ilipromotorommajmunskogvirusa40(SV40);
    (c)3'LTRuključujejednuilivišemodifikacija;
    (d)3'LTRuključujejednoilivišebrisanja;ili
    (e)je3'LTRsamo-inaktivirajući(SIN)LTR.
  7. 7.Ćelijaimunogefektorakojauključujelentiviralnivektorizbilokojegpatentnogzahtevaod1do6.
  8. 8.Ćelijaimunogefektoraizpatentnogzahteva7pričemujećelijaimunogefektoraTlimfocit.
  9. 9.Ćelijaimunogefektorapremapatentnomzahtevu7,pričemujećelijaimunogefektoraprirodnaćelija ubica(NK).
  10. 10. Kompozicija obuhvata ćeliju imunog efektora iz patentnog zahteva 8 ili 9 i fiziološki prihvatljiv pomoćnisastojak.
  11. 11.Kompozicijapremapatentnomzahtevu10zaupotrebuupostupkulečenjarakakodsubjektakome jetopotrebno.
  12. 12. Kompozicija prema patentnom zahtevu 11 za upotrebu u postupku lečenja hematološkog malignitetakodsubjektakomejetopotrebno.
  13. 13. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je hematološki malignitet malignitetB-ćelija.
  14. 14.Kompozicijazaupotrebupremapatentnomzahtevu13,pričemu jemalignitetB-stanica izabran iz grupe koju čine: multipli mijelom (MM), ne-Hodžkinov limfom (NHL) i hronična limfocitna leukemija (HLL).
  15. 15.Kompozicijazaupotrebupremapatentnomzahtevu14,pričemujeMMizabranizgrupekojučine: simptomatskimultiplimijelom,tinjajućimultiplimijelom,leukemijaplazmaćelija,nesekretornimijelom, IgDmijelom,osteosklerotskimijelom,solitarniplazmacitomkostiiekstramedularniplazmacitom.
RS20211468A 2014-04-25 2015-04-24 Mnd promoter himernih antigenskih receptora RS62733B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461984561P 2014-04-25 2014-04-25
EP19218258.2A EP3689899B8 (en) 2014-04-25 2015-04-24 Mnd promoter chimeric antigen receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62733B1 true RS62733B1 (sr) 2022-01-31

Family

ID=54333432

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211468A RS62733B1 (sr) 2014-04-25 2015-04-24 Mnd promoter himernih antigenskih receptora
RS20200339A RS60106B1 (sr) 2014-04-25 2015-04-24 Mnd promoterni himerni antigenski receptori

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200339A RS60106B1 (sr) 2014-04-25 2015-04-24 Mnd promoterni himerni antigenski receptori

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10774343B2 (sr)
EP (3) EP3689899B8 (sr)
JP (2) JP6538716B2 (sr)
KR (2) KR102021982B1 (sr)
CN (2) CN110938655A (sr)
AU (4) AU2015249390B2 (sr)
BR (1) BR112016024481A2 (sr)
CA (1) CA2946585C (sr)
CY (2) CY1122831T1 (sr)
DK (2) DK3134432T3 (sr)
ES (2) ES2781073T3 (sr)
HR (2) HRP20200483T1 (sr)
HU (2) HUE056735T2 (sr)
IL (3) IL296691B2 (sr)
LT (2) LT3689899T (sr)
MX (2) MX382565B (sr)
NZ (1) NZ725169A (sr)
PL (2) PL3134432T3 (sr)
PT (2) PT3134432T (sr)
RS (2) RS62733B1 (sr)
RU (1) RU2708311C2 (sr)
SG (2) SG11201608754SA (sr)
SI (2) SI3689899T1 (sr)
SM (2) SMT202000203T1 (sr)
WO (1) WO2015164759A2 (sr)
ZA (2) ZA201607174B (sr)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
CN109554350B (zh) 2012-11-27 2022-09-23 儿童医疗中心有限公司 用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向bcl11a远端调控元件
EP2948544A4 (en) 2013-01-28 2016-08-03 St Jude Childrens Res Hospital CHIMERIC RECEPTOR WITH NKG2D SPECIFICITY FOR CELL THERAPY AGAINST CANCER AND INFECTION DISEASES
PL3134432T3 (pl) 2014-04-25 2020-10-19 Bluebird Bio, Inc. Promotor mnd chimeryczne receptory antygenowe
MX375592B (es) 2014-04-25 2025-03-06 The Children´S Medical Center Corp Composiciones y su uso para tratar hemoglobinopatias.
HUE049514T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc Javított eljárások adoptív sejtterápiák kialakítására
DK3143134T3 (da) 2014-05-15 2021-01-04 Nat Univ Singapore Modificerede, naturlige dræberceller og anvendelser deraf
SI3151672T1 (sl) 2014-06-06 2021-03-31 Bluebird Bio, Inc. Izboljšani T-celični sestavki
ES2878449T3 (es) 2014-07-24 2021-11-18 2Seventy Bio Inc Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
EP3189073B2 (en) 2014-09-04 2025-06-11 Cellectis Trophoblast glycoprotein (5t4, tpbg) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
HRP20191873T1 (hr) 2014-12-12 2020-01-24 Bluebird Bio, Inc. Kimerni antigenski receptori
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
US11572543B2 (en) 2015-05-08 2023-02-07 The Children's Medical Center. Corporation Targeting BCL11A enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
PL3298033T5 (pl) 2015-05-18 2023-10-30 TCR2 Therapeutics Inc. Kompozycje i zastosowania medyczne do reprogramowania TCR z zastosowaniem białek fuzyjnych
EP3319631A4 (en) 2015-07-08 2019-01-09 American Gene Technologies International Inc. HIV PREMUNICATION AND IMMUNOTHERAPY
WO2018028647A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 Legend Biotech Usa Inc. Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
EP3368672B1 (en) * 2015-10-27 2020-11-25 Celltheon Corporation Chimeric post-transcriptional regulatory element
JP7221049B2 (ja) * 2015-11-19 2023-02-13 ノバルティス アーゲー レンチウイルス調製物の安定化のための緩衝液
FI3380620T3 (fi) 2015-11-23 2024-08-01 Novartis Ag Optimoituja lentiviruksen siirtovektoreita ja niiden käyttötapoja
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
CN116064678A (zh) * 2016-01-15 2023-05-05 美国基因技术国际有限公司 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
CN107034193B (zh) * 2016-02-03 2020-06-05 北京马力喏生物科技有限公司 治疗b细胞白血病及b细胞淋巴瘤的治疗组合物
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy
JP2019509275A (ja) * 2016-02-23 2019-04-04 イミューン デザイン コーポレイション マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物ならびにそれらを産生および使用するための方法およびシステム
WO2017156311A2 (en) 2016-03-09 2017-09-14 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
EP3468617A4 (en) 2016-06-08 2020-01-22 American Gene Technologies International Inc. SYSTEM FOR THE NON-INTEGRAL VIRAL ISSUE AND PROCEDURE RELATING TO IT
CN105907790A (zh) * 2016-06-21 2016-08-31 林志国 特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法
AU2017292582C1 (en) 2016-07-08 2021-11-11 American Gene Technologies International Inc. HIV pre-immunization and immunotherapy
EP3487507A4 (en) 2016-07-21 2020-04-08 American Gene Technologies International, Inc. VIRAL VECTORS FOR THE TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE
MA45996A (fr) 2016-08-16 2021-06-02 Bluebird Bio Inc Variants d'endonucléase de homing du récepteur alpha de l'il-10, compositions et méthodes d'utilisation associées
JP6698854B2 (ja) * 2016-09-16 2020-05-27 キッセイ薬品工業株式会社 遺伝子改変細胞及びその作製方法
WO2018085690A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car t cell compositions
CA3043768A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
EP3548055A4 (en) 2016-12-02 2020-08-19 University of Southern California SYNTHETIC IMMUNE RECEPTORS AND THEIR PROCESSES FOR USE
EP3568474A1 (en) * 2017-01-10 2019-11-20 Intrexon Corporation Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
CA3048648A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 The General Hospital Corporation T cells expressing a chimeric antigen receptor
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
US10404635B2 (en) 2017-03-21 2019-09-03 Bank Of America Corporation Optimizing data replication across multiple data centers
CA3056591A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
BR112019019917A2 (pt) 2017-03-27 2020-04-22 Nat Univ Singapore receptores quiméricos nkg2d truncados e seus usos em imunoterapia de células exterminadoras naturais
US11261441B2 (en) 2017-03-29 2022-03-01 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
JP7228523B2 (ja) * 2017-03-29 2023-02-24 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド ヘモグロビン異常症を治療するためのベクターおよび組成物
US11820999B2 (en) 2017-04-03 2023-11-21 American Gene Technologies International Inc. Compositions and methods for treating phenylketonuria
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
EP3635099A4 (en) * 2017-06-07 2021-02-24 The General Hospital Corporation T-CELLS WITH EXPRESSION OF A CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR
JP2020524996A (ja) 2017-06-16 2020-08-27 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド ヒトガンマデルタｔ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物
AU2018351050B2 (en) 2017-10-18 2025-09-18 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
CN111787938A (zh) 2017-11-15 2020-10-16 诺华股份有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体、靶向cd19的嵌合抗原受体及组合疗法
US20200371091A1 (en) 2017-11-30 2020-11-26 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
CN109609533B (zh) * 2017-12-27 2020-07-10 赛德特生物科技开发有限公司 基于人源化cd276抗体的car慢病毒表达载体构建及其应用
CN109608547B (zh) * 2017-12-29 2022-03-15 郑州大学第一附属医院 表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
US12539308B2 (en) 2018-01-08 2026-02-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immune-enhancing RNAs for combination with chimeric antigen receptor therapy
JP7566628B2 (ja) * 2018-01-10 2024-10-15 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞
CA3087481A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-18 Pfizer Inc. Methods of administering chimeric antigen receptor immunotherapy in combination with 4-1bb agonist
AU2019215031C1 (en) 2018-01-31 2026-02-26 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3749685A4 (en) 2018-02-09 2021-12-22 National University of Singapore ACTIVATOR CHEMERIC RECEPTORS AND THEIR USES IN NATURAL KILLING CELL IMMUNOTHERAPY
US20200399383A1 (en) 2018-02-13 2020-12-24 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN108384760B (zh) * 2018-03-16 2020-07-07 北京多赢时代转化医学研究院 携带cd20/cd19双特异性嵌合抗原受体的人t淋巴细胞及制备方法和应用
JP7334985B2 (ja) 2018-04-02 2023-08-29 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール 免疫細胞で発現される膜結合抗サイトカイン非シグナル伝達バインダーによるヒトサイトカインの中和
WO2019213273A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Enhanced bcl11a rnp / crispr delivery & editing using a 3xnls-cas9
WO2019213013A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
GB201807870D0 (en) * 2018-05-15 2018-06-27 Autolus Ltd A CD79-specific chimeric antigen receptor
DK3806903T5 (da) * 2018-06-14 2024-08-19 2Seventy Bio Inc Cd79a kimæriske antigenreceptorer
US20220177524A1 (en) * 2018-07-26 2022-06-09 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Nef-containing t cells and methods of producing thereof
EP3844186A4 (en) 2018-08-29 2022-08-17 National University of Singapore METHOD OF SPECIFIC STIMULATION OF SURVIVAL AND EXPANSION OF GENETICALLY MODIFIED IMMUNE CELLS
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP4635978A2 (en) 2018-08-31 2025-10-22 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US11352646B2 (en) 2018-11-05 2022-06-07 American Gene Technologies International Inc. Vector system for expressing regulatory RNA
CA3120563A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Nkarta, Inc. Methods for the simultaneous expansion of multiple immune cell types, related compositions and uses of same in cancer immunotherapy
WO2020124021A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting cd79b and cd19
EP3897745A1 (en) 2018-12-23 2021-10-27 CSL Behring LLC Haematopoietic stem cell-gene therapy for wiskott-aldrich syndrome
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3773918A4 (en) 2019-03-05 2022-01-05 Nkarta, Inc. CD19 DIRECTED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR USES IN IMMUNOTHERAPY
CN109721659B (zh) * 2019-03-11 2020-06-23 浙江玉安康瑞生物科技有限公司 一种靶向cd19的新型嵌合抗原受体（car）及其应用
EP3941490A4 (en) * 2019-03-20 2023-01-04 2seventy bio, Inc. ADOPTIVE CELLULAR THERAPY
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
WO2020252110A1 (en) * 2019-06-14 2020-12-17 Bluebird Bio, Inc. Compositions and methods for treating cancer
IL293215A (en) 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors that bind bcma and cd19 and their uses
CN112980886B (zh) * 2019-12-02 2022-02-22 河北森朗生物科技有限公司 一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN115397460A (zh) 2020-02-27 2022-11-25 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
WO2021189008A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Lyell Immunopharma, Inc. Novel recombinant cell surface markers
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
WO2022006105A2 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 Avrobio, Inc. Compositions and methods for treating neurocognitive disorders
US20220033383A1 (en) 2020-07-20 2022-02-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Functionalized peptides as antiviral agents
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
KR102751788B1 (ko) * 2020-08-27 2025-01-13 주식회사 하울바이오 키메라 항원 수용체 단백질 및 이의 용도
US11352363B1 (en) 2020-11-23 2022-06-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
KR20230124583A (ko) 2020-11-23 2023-08-25 이난타 파마슈티칼스, 인코포레이티드 신규한 스피로피롤리딘 유래 항바이러스제
US11384090B2 (en) 2020-11-23 2022-07-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US12540141B2 (en) 2020-11-23 2026-02-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
WO2022180586A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Senthil Natesan Car t-cell product and method of preparation thereof
US12144827B2 (en) 2021-02-25 2024-11-19 Lyell Immunopharma, Inc. ROR1 targeting chimeric antigen receptor
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
US11319325B1 (en) 2021-05-11 2022-05-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11325916B1 (en) 2021-07-29 2022-05-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11339170B1 (en) 2021-07-23 2022-05-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
CA3228773A1 (en) * 2021-08-12 2023-02-16 Gaurav KHARYA Chimeric antigen receptors (car) for b cell malignancies
EP4388000A1 (en) 2021-08-20 2024-06-26 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
CN116178562A (zh) * 2021-11-29 2023-05-30 四川大学华西医院 基于efna1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
JP2025504398A (ja) * 2022-01-10 2025-02-12 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６キメラ抗原受容体
WO2023230524A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of secretory and/or catalytic cells and methods using the same
WO2024073111A2 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Adicet Therapeutics, Inc. Affinity binding entities directed to b7h6 and methods of use thereof
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
EP4612306A2 (en) * 2022-11-02 2025-09-10 CSL Behring LLC A screening method

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
ATE86967T1 (de) 1988-01-09 1993-04-15 Asta Medica Ag 1,2-bis(aminomethyl)cyclobutan-platin-komplexe.
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU7154891A (en) 1989-12-01 1991-06-26 Randall Kevin Mitchell Photoelectric joystick displacement detector
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
DE4415263C1 (de) 1994-04-15 1995-11-30 Asta Medica Ag Cis-[trans-1,2-Cyclobutanbis(methylamin)-N,N']-[(2S)-lactato-O·1·, O·2·]-platin(II)-trihydrat (Lobaplatin-Trihydrat), seine Herstellung und arzneiliche Verwendung
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
CA2247131A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Targeted Genetics Corporation Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes
US20020177125A1 (en) 1997-03-04 2002-11-28 Kamb Carl Alexander Human rhinovirus assays, and compositions therefrom
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2002088346A2 (en) 2001-05-01 2002-11-07 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
DE10132502A1 (de) 2001-07-05 2003-01-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Angriff auf Tumorzellen mit fehlender, niedriger oder anormaler MHC-Expression durch kombinieren von nicht MHC-Restringierten T-Zellen/NK-Zellen und MHC-Restringierten Zellen
WO2003057171A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
GB0224442D0 (en) 2002-10-21 2002-11-27 Molmed Spa A delivery system
TW200502391A (en) 2003-05-08 2005-01-16 Xcyte Therapies Inc Generation and isolation of antigen-specific t cells
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
US7260418B2 (en) 2004-09-29 2007-08-21 California Institute Of Technology Multi-element phased array transmitter with LO phase shifting and integrated power amplifier
GB0503936D0 (en) 2005-02-25 2005-04-06 San Raffaele Centro Fond Method
JP2008539796A (ja) 2005-05-20 2008-11-20 バイレクシス コーポレイション 初代細胞の形質導入
WO2007018318A1 (ja) 2005-08-10 2007-02-15 National University Corporation Kanazawa University 小脳星状細胞及び／又は籠細胞特異的な遺伝子発現方法
EP2094837B1 (en) 2006-12-14 2012-04-25 Medical Research Council Use of pi3k, m-tor and akt inhibitors to induce foxp3 expression and generate regulatory t cells
WO2008153742A2 (en) 2007-05-23 2008-12-18 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increased transgene expression
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
RS53782B1 (sr) 2008-10-01 2015-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Preparati tumor-asociranih peptida i odgovarajuća antikancerska vakcina za tretman glioblastoma (gbm) i drugih kancera
MX341884B (es) 2009-03-10 2016-09-07 Biogen Ma Inc Anticuerpos anti-antigeno de maduracion de celulas b (bcma).
WO2011057124A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Transtarget, Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
GB201004200D0 (en) 2010-03-15 2010-04-28 Univ Basel Spirocyclic compounds and their use as therapeutic agents and diagnostic probes
WO2012033885A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
KR20140004174A (ko) 2011-01-18 2014-01-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암 치료를 위한 조성물 및 방법
US9987308B2 (en) 2011-03-23 2018-06-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
KR20150029756A (ko) 2011-06-10 2015-03-18 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증을 위한 유전자 요법 벡터
WO2013070468A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
CA3285826A1 (en) 2012-02-22 2026-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
RU2766608C2 (ru) * 2012-04-11 2022-03-15 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания b-клеток
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
AU2013204923A1 (en) * 2012-06-21 2014-01-16 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
JP6482461B2 (ja) 2012-07-13 2019-03-13 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 投与に関する形質導入ｔ細胞の適合性の評価方法
BR122020002986A8 (pt) * 2012-08-20 2023-04-18 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapia celular
MX367730B (es) 2012-09-04 2019-09-04 Cellectis Receptor de antigeno quimerico multi-cadena y usos del mismo.
EP2711418B1 (en) 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
MX370148B (es) 2012-10-02 2019-12-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Composiciones y su uso para inmunoterapia.
WO2014055771A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
AU2013329186B2 (en) 2012-10-10 2019-02-14 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
CN104781789B (zh) 2012-12-20 2018-06-05 三菱电机株式会社 车载装置
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
US10934346B2 (en) 2014-02-14 2021-03-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified T cell comprising a polynucleotide encoding an inducible stimulating molecule comprising MyD88, CD40 and FKBP12
EP3131927B8 (en) 2014-04-14 2020-12-23 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
PL3134432T3 (pl) 2014-04-25 2020-10-19 Bluebird Bio, Inc. Promotor mnd chimeryczne receptory antygenowe
HUE049514T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc Javított eljárások adoptív sejtterápiák kialakítására
US20170049819A1 (en) 2014-04-25 2017-02-23 Bluebird Bio, Inc. Kappa/lambda chimeric antigen receptors
SI3151672T1 (sl) 2014-06-06 2021-03-31 Bluebird Bio, Inc. Izboljšani T-celični sestavki
ES2878449T3 (es) 2014-07-24 2021-11-18 2Seventy Bio Inc Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
HRP20191873T1 (hr) 2014-12-12 2020-01-24 Bluebird Bio, Inc. Kimerni antigenski receptori
WO2016164408A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The General Hospital Corporation Anti-cspg4 reagents and methods of treating cancer
WO2016187216A1 (en) * 2015-05-18 2016-11-24 Bluebird Bio, Inc. Anti-ror1 chimeric antigen receptors
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
CN112980886B (zh) * 2019-12-02 2022-02-22 河北森朗生物科技有限公司 一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
PL3134432T3 (pl) 2020-10-19
US20240401080A1 (en) 2024-12-05
ZA201900944B (en) 2020-10-28
CN106536549B (zh) 2020-01-17
HRP20211910T1 (hr) 2022-03-18
LT3134432T (lt) 2020-04-10
IL248348B (en) 2021-06-30
EP3998278A1 (en) 2022-05-18
IL248348A0 (en) 2016-11-30
CA2946585C (en) 2023-09-19
NZ725169A (en) 2018-02-23
HRP20200483T1 (hr) 2020-06-26
JP6606210B2 (ja) 2019-11-13
IL283828B2 (en) 2023-02-01
AU2022203195A1 (en) 2022-06-02
SG11201608754SA (en) 2016-11-29
PL3689899T3 (pl) 2022-01-31
KR102021982B1 (ko) 2019-09-18
EP3134432A4 (en) 2017-12-13
ES2899608T3 (es) 2022-03-14
EP3134432B1 (en) 2019-12-25
ZA201607174B (en) 2019-05-29
JP2018086030A (ja) 2018-06-07
DK3134432T3 (da) 2020-03-30
JP6538716B2 (ja) 2019-07-03
CY1125032T1 (el) 2023-03-24
PT3689899T (pt) 2021-11-30
PT3134432T (pt) 2020-04-01
DK3689899T3 (da) 2021-11-22
KR102135006B1 (ko) 2020-07-17
SG10201809379UA (en) 2018-11-29
EP3689899A1 (en) 2020-08-05
IL296691B2 (en) 2023-11-01
IL296691B1 (en) 2023-07-01
CN106536549A (zh) 2017-03-22
SI3134432T1 (sl) 2021-01-29
AU2022203195B2 (en) 2025-02-20
CN110938655A (zh) 2020-03-31
SMT202000203T1 (it) 2020-05-08
BR112016024481A2 (pt) 2017-10-10
KR20190105677A (ko) 2019-09-17
EP3689899B8 (en) 2021-11-24
LT3689899T (lt) 2021-12-10
MX382565B (es) 2025-03-13
JP2017517249A (ja) 2017-06-29
RU2016145958A3 (sr) 2018-08-06
WO2015164759A3 (en) 2015-12-23
AU2019261783B2 (en) 2022-06-02
CA2946585A1 (en) 2015-10-29
HUE048898T2 (hu) 2020-09-28
AU2015249390B2 (en) 2019-08-15
EP3689899B1 (en) 2021-10-13
KR20160147929A (ko) 2016-12-23
RU2708311C2 (ru) 2019-12-05
US20210032658A1 (en) 2021-02-04
AU2015249390A1 (en) 2016-11-03
MX2016013964A (es) 2017-04-06
AU2019261783A1 (en) 2019-11-28
HUE056735T2 (hu) 2022-03-28
RS60106B1 (sr) 2020-05-29
AU2025203679A1 (en) 2025-06-12
US10774343B2 (en) 2020-09-15
ES2781073T3 (es) 2020-08-28
IL283828A (en) 2021-07-29
RU2016145958A (ru) 2018-05-25
EP3134432A2 (en) 2017-03-01
RU2019134212A (ru) 2020-02-20
AU2019261783C1 (en) 2022-09-22
IL283828B (en) 2022-10-01
MX2021005490A (es) 2021-06-18
CY1122831T1 (el) 2021-05-05
SMT202100700T1 (it) 2022-01-10
WO2015164759A2 (en) 2015-10-29
US20170051308A1 (en) 2017-02-23
IL296691A (en) 2022-11-01
SI3689899T1 (sl) 2022-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240401080A1 (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
KR102523934B1 (ko) Bcma 키메릭 항원 수용체
ES2800906T3 (es) Métodos mejorados para producir terapias celulares adoptivas
US20170049819A1 (en) Kappa/lambda chimeric antigen receptors
US20250082756A1 (en) Muc16 chimeric antigen receptors
HK40074895A (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
HK40034106B (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
HK40034106A (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
BR122024006834A2 (pt) Polinucleotídeo, vetor que compreende o polinucleotídeo, célula efetora imune que compreende o vetor, composição compreendendo a célula, e usos da composição para tratar câncer e uma malignidade hematológica
HK1234075A1 (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
HK1234075B (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
BR112017001498B1 (pt) Receptor de antígeno quimérico (car) anti-bcma, polinucleotídeo que codifica o dito car, vetor, composição e uso da mesma para tratar uma condição relacionada à célula b