Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS60647B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji za epitelijalni karcinom jajnika i druge maligne tumore - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS60647B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji za epitelijalni karcinom jajnika i druge maligne tumore - Google Patents

Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji za epitelijalni karcinom jajnika i druge maligne tumore

Info

Publication number
RS60647B1
RS60647B1 RS20200937A RSP20200937A RS60647B1 RS 60647 B1 RS60647 B1 RS 60647B1 RS 20200937 A RS20200937 A RS 20200937A RS P20200937 A RSP20200937 A RS P20200937A RS 60647 B1 RS60647 B1 RS 60647B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
cell
cells
cancer
tumor
Prior art date
Application number
RS20200937A
Other languages
English (en)
Inventor
Heiko Schuster
Janet Peper
Philipp Wagner
Hans-Georg Rammensee
Original Assignee
Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immatics Biotechnologies Gmbh filed Critical Immatics Biotechnologies Gmbh
Publication of RS60647B1 publication Critical patent/RS60647B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K40/4255—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4256—Tumor associated carbohydrates
    • A61K40/4257—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidni epitop tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumorasociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.
Predmetni pronalazak odnosi se na peptidnu sekvencu dobijenu iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koja može da se koristi u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.
OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU
Epitelijalni karcinom jajnika (EOC) ostaje vodeći uzrok smrti zbog ginekoloških maligniteta i peti vodeći uzrok smrti povezane sa rakom u zapadnom svetu, koji je doveo do procenjenih 22.000 novih dijagnoza i 14.000 smrti u SAD u 2014. godini(1). Jedina dostupna opcija kurativnog lečenja je kompletno hirurško uklanjanje tumora u ranom stadijumu bez metastaza. Ipak, kod većine pacijentkinja (>70%) se dijagnoza postavlja u III ili IV stadijumu bolesti zbog nedostatka specifičnih ranih simptoma. Uprkos napredovanju režima hemioterapije i nedavnom odobrenju leka bevacizumab za terapiju prve linije, većina pacijentkinja doživi relaps u roku od nekoliko meseci ili godina nakon inicijalnog lečenja (2, 3).
Imajući u vidu teška neželjena dejstva i trošak lečenja raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno raka jajnika.
Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumorasociranih antigena. Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:
a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.
b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate.
c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.
d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.
e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični.
f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.
Tokom poslednje dve dekade, EOC je prepoznat kao visoko imunogen tumor, na osnovu raznih kliničkih nalaza. Pokazujući čestu infiltraciju imunskim ćelijama EOC je bio među prvim malignim tumorima za koje je ustanovljena definitivna povezanost T-ćelijske infiltracije i kliničke prognoze. Unutar ove infiltrišuće T-ćelijske populacije identifikovane su tumor-reaktivne i antigen-specifične T ćelije. Za razliku od toga tumor-rezidentne regulatorne T ćelije (Treg) su u negativnoj korelaciji sa kliničkim ishodom. Dalje, dokazano je da imunostimulišući citokini indukuju ubedljive tumorske odgovore kod individualnih pacijenata.
Efikasnost imunoterapijskih pristupa za terapiju maligniteta je ilustrovana nedavnim razvojem i odobrenjem inhibitora imunske kontrolne tačke koja je pokazana u lečenju melanoma. Osim toga, antigen-specifična vakcinacija peptidima i adoptivni transfer T ćelija počinju da pokazuju uspeh u melanomu i drugim imunogenim tumorima, npr. karcinom bubrežnih ćelija. Personalizovana imunoterapija čak ima kurativni potencijal i predstavljeni su zadivljujuću rezultati za individualne pacijente.
Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumorasociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.
Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.
MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.
Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.
CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).
U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).
Elongirani (duži) peptidi mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.
T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.
Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferonagama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).
Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.
Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji se vezuju za MHC klasa I su obično dužine 8–12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.
U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).
Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumorspecifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.
U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.
Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju pronalaska je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).
Peruzzi i sar. (u: Peruzzi, D., et al., MMP11: A Novel Target Antigen for Cancer Immunotherapy. Clin Cancer Res June 152009 (15) (12) 4104-4113) iznose peptid tumor-asociranog antigena (TAA) (TUMAP) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu 237-YTFRYPLSL-245, dobijenu iz MMP-11 (stromelisin-3).
U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR) i antitela u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 82, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
U sledećim tabelama prikazani su ovde predstavljeni peptidi, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) geni za ove peptide. ID BR. SEKV 82 je u skladu sa pronalaskom. Svi peptidi u tabeli 1 i tabeli 2 vezuju se za HLA-A*02. Peptidi u tabeli 2 objavljeni su ranije u velikim spiskovima kao rezultati visoko propusnih skrininga sa velikim stopama greške ili su izračunati pomoću algoritama, ali nisu nikada ranije bili povezani sa malignim tumorom. Peptidi u tabeli 3 su dodatni peptidi koji mogu biti korisni u kombinaciji sa drugim ovde predstavljenim peptidima. Peptidi u tabeli 4 su pored toga korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju različitih drugih maligniteta, koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.
Tabela 1: Predstavljeni peptidi; X = S, R ili G
1
Tabela 2: Dodatni predstavljeni peptidi, X = S, R ili G
1
1
Tabela 3: Dodatni peptidi korisni za terapije malignih tumora, X = S, R ili G
1
1
1
Tabela 4: Dodatni peptidi korisni za terapije malignih tumora, X = S, R ili G
1
2
Predmetni pronalazak se dalje uopšteno odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, rak jajnika, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, rak bubrega, rak mozga, rak kolona ili rektuma, rak želuca, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jednjaka, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese, rak žučnih puteva i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid u skladu sa ID BR. SEKV 82, konkretno rak jajnika.
Predmetni pronalazak se pored toga odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na (ili u sekvencu) antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom ili kompleksa navedenih peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom sa MHC i metode za pravljenje istih.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.
Antitela i TCR-ovi su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa prikazanim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na navedeni metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor
2
ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 82.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, aktiviranog T limfocita, T-ćelijskog receptora ili antitela ili drugih molekula koji vezuju peptid i/ili peptid-MHC u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka.
Poželjno, lek je aktivan protiv raka.
Poželjno, navedeni lek je za ćelijsku terapiju, vakcinu ili protein zasnovan na solubilnom TCR ili antitelu.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije raka jajnika, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog karcinoma pluća, raka bubrega, raka mozga, raka kolona ili rektuma, raka želuca, raka jetre, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, raka jednjaka, raka mokraćne bešike, raka materice, raka žučne kese i raka žučnih puteva, a poželjno ćelije raka jajnika.
Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC.
Opciono antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.
I terapijske i dijagnostičke primene protiv dodatnih malignih bolesti predstavljene su u sledećem detaljnijem opisu osnovnih proizvoda ekspresije (polipeptida) peptida u skladu sa pronalaskom.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.
Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze kako je opisano u nastavku.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na antitelo (ili u sekvencu antitela), kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije, tj. vezuje se za dendritične ćelije.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira, i/ili prezentuje nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
2
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela opisana dalje u nastavku, kao i metode njihove proizvodnje. Poželjna su antitela koja su specifična za peptide predmetnog pronalaska, i/ili za peptide predmetnog pronalaska kada su vezani za svoje MHC. Poželjna antitela mogu biti monoklonalna.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR), konkretno solubilne TCR (sTCR) koji ciljaju peptid u skladu sa pronalaskom i/ili njegove komplekse peptid-MHC, kao i metode njihove proizvodnje.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela koja ciljaju peptid u skladu sa pronalaskom i/ili njegove komplekse peptid-MHC, kao i metode njihove proizvodnje.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je antigen-prezentujuća ćelija dendritična ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz ćelije domaćina i/ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen najmanje jedan peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.
2
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 82.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, koje selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktivirane T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni lek vakcina, ćelija, ćelijska populacija, kao, na primer, ćelijska linija, sTCR-ovi i monoklonalna antitela.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je lek aktivan protiv malignog tumora.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije raka jajnika.
Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.
Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje
2
infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).
Ogroman napredak na polju imunoterapije raka tokom poslednjih godina doveo je do njenog velikog uvažavanja (31, 32) kao potencijalno kurativnog dodatka (33) ili alternative standardnim hemioterapijskim pristupima. U nekoliko radova pokazan je značaj HLA-prezentovanih mutiranih i divljeg tipa tumor-asociranih antigena kao vrednih antigena odbacivanja tumora. Zato, opsežna identifikacija HLA-prezentovanih tumorskih antigena specifičnih za tumor dodaje drugi važan deo slagalice našeg razumevanja kako imunski sistem identifikuje i prepoznaje ćelije tumora.
U predmetnom pronalasku pronalazači su se fokusirali na epitelijalni karcinom jajnika (EOC) sa ciljem da sveobuhvatno okarakterišu imunopeptidom EOC-a i procene HLA-prezentovane antigene za njihovu korisnost u kliničkim primenama. Do sada je identifikovano samo nekoliko HLA-prezentovanih antigena za EOC a većina kliničkih studija se oslanjalo na pretpostavljene ili ustanovljene karcinom-testis antigene koji nisu nužno često prezentovani i od strane EOC, što je činjenica koju smo mogli da potvrdimo našom analizom.
Pronalazači prikazuju doslednu i visoku ekspresiju HLA molekula klase I na ćelijama tumora jajnika koja je u skladu sa prethodno objavljenim podacima. Pored toga, pronalazači pokazuju na nivou jedne ćelije da EOC takođe prikazuje snažnu ekspresiju HLA-DR molekula. Ova snažna ekspresija je dalje istaknuta našom identifikacijom velikih količina MHC klasa II liganada koji proističu iz tumora jajnika kao i iz visoko obogaćenih frakcija tumorskih ćelija.
Profiliranje imunopeptidoma 34 tumora jajnika u poređenju sa više od 85 benignih izvora različitog porekla otkrilo je nekoliko stotina EOC-asociranih antigena. Među TOP100 HLA klasa I EOC antigena koji nisu prezentovani na bilo kojem od tkiva u našoj benignoj bazi podataka MUC16 je bio jasno najizuzetniji. Uzimajući u obzir i broj identifikovanih HLA liganada (> 80) i učestalost prezentacije u kohorti pacijenata
2
(⁓80%) ovo je bez presedana za bilo koji drugi tumorski antigen i vrstu tumora koju su pronalazači do sada ispitivali. Sem toga, pronalazači su mogli da ustanove da je više od 70% HLA liganada dobijenih iz MUC16 imunogeno i u stanju da prajmuje T ćelije kod zdravih pojedinaca čineći mucin 16 prvoklasnim antigenom za imunoterapiju EOC bez premca. Profiliranje imunopeptidoma dalje obezbeđuje prikaz za jasne mehanističke uvide u EOS koji se ogledaju u HLA ligandomu HLA liganada i klase I i klase II. HLA ligandi iz važnih kinaza i fosfataza (DDR1, EYA2), faktora transkripcije (SOX9, SOX17), proteina povezanih sa imunosupresijom (IDO1, Galectin 1) kao i ustanovljenih i suspektnih molekulskih markera za EOC (MUC1, KLK10, FOLR1) samo su neki koje treba pomenuti. Posebno za HLA klase II, mezotelin koji je ustanovljen ligand MUC16 je identifikovan kao TOP1 tumorasocirani antigen. Nekoliko studija je pokazalo centralnu ulogu MUC16/MSLN ose za ćelijsku invaziju i metastaze u EOC kao i u drugim tumorima kao što su rak pankreasa ili mezoteliom, što ukazuje na to da bi T-ćelijski epitopi ovih antigena trebalo dodatno da se testiraju u drugim malignitetima. Pronalazači su mogli da pokažu da je bojenje MSLN direktno povezano sa bojenjem MUC16 a visoka ekspresija MSLN obrazuje negativan prognostički faktor u EOC.
Po prvi put je korišćeno nekoliko različitih benignih tkiva i vrsta ćelija (PBMC, kostna srž, jetra, bubreg, kolon, jajnik) za ovu vrstu selektivnog profiliranja imunopeptidoma. Zbog ograničenja u broju različitih tkiva koja su dostupna za istraživanje, pronalazači nisu mogli u potpunosti da isključe da pojedinačni antigeni nisu takođe prezentovani od strane HLA molekula u drugim organima. Ipak, ustanovljena fukcionalna relevantnost tih antigena za EOC i naročito imunogenost dotičnih peptida kod zdravih pojedinaca čini prezentaciju ovih antigena u drugim tkivima malo verovatnom.
Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.
Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i
2
karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, kao i dužine 10, 11 ili 12, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante predstavljenih peptida) oni mogu biti dužine od 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.
Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Neophodno je napomenuti da se soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.
Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.
Termin „peptidi predmetnog pronalaska“ će takođe obuhvatati peptid koji se sastoji od peptida kako je definisan ranije u skladu sa ID BR. SEKV: 82.
Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.
Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.
T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8–14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.
Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.
Tabela 5: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori et al., 1997) primenom Hardi-Vajnbergove formule F = 1 - (1-Gf)<2>. Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (Chanock et al., 2004).
1
Peptid pronalaska, poželjno kada je uključen u vakcinu pronalaska kako je ovde
2
opisana, vezuje se za različite vrste HLA. Vakcina može takođe da uključuje svevezujuće MHC klasa II peptide i peptide koji se vezuju za druge alele, što će biti korisno za personalizovane lekove. Stoga, ovde predstavljena vakcina može da se koristi za lečenje malignog tumora kod pacijenata koji su A*02 pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.
U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.
Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.
Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.
Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.
Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.
Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.
Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).
Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.
Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.
Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.
Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.
Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.
Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin
4
„prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je predstavljen.
Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1 % po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1 %, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku.
Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.
U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli: procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]
gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što
(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i
(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i
(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i (iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;
a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.
Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.
Kako je ranije navedeno, predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 82.
U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.
Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje.
U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „li“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi predmetnog pronalaska mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije kako su opisane u ovom dokumentu.
Pored toga, peptid može biti dalje modifikovan da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje nepeptidnih veza.
Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, - COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.
Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili tbutiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.
Peptid, naznačen time što peptid sadrži nepeptidne veze, poželjno je otelotvorenje pronalaska. Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Lukas et al., 1981) i referenci koje su tamo citirane. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksil-karbodiimid/1 hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (rad Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).
Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).
Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.
Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.
Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2015) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995).
Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprejjonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih TUMAP zabeleženog iz uzoraka raka jajnika sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog tumora dobijenom od pacijentkinja sa rakom jajnika.
Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.
Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.
Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tkiva raka jajnika su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog raka jajnika čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom raku jajnika.
TUMAP identifikovani na multiplim malignim tumorima jajnika i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.
Predmetni pronalazak obezbeđuje peptid koji je koristan u lečenju raka / tumora, poželjno raka jajnika koji prekomerno ili isključivo prezentuje peptid pronalaska. Za peptid je pokazano masenom spektrometrijom da ga prirodno prezentuju HLA molekuli na humanim uzorcima primarnog raka jajnika.
Dokazano je da su mnogi izvorni geni/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u raku u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu
4
ovog pronalaska će označavati ili zdrave ćelije tkiva jajnika ili druge normalne ćelije tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena. Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ovog pronalaska će označavati uzorak od pacijentkinje koja boluje od raka jajnika, ali ne na normalnim tkivima.
HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije raka jajnika koje prezentuju dobijene peptide.
Za peptid predmetnog pronalaska je dokazano da je sposoban da stimuliše T-ćelijske odgovore i/ili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, kao što su solubilini TCR-ovi, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako je peptid predmetnog pronalaska koristan za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.
Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.
Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.
U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.
U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I.
Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.
U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.
TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetnog pronalaska obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.
Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.
Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.
Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.
TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.
U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.
U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR i/ili beta lancu TCR ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks inventivni peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk od afiniteta vezivanja TCR koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR i/ili nemutirani beta lanac TCR. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na
4
opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za inventivni peptid može da se pojača pomoću metoda koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti.
Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/ peptid, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.
Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRαꞵ genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa peptidom, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.
U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-alfa i/ili TCR-beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigena specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.
U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR-alfa i/ili TCR-beta lanaca.
Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTRs), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), ꞵ-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.
Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).
Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.
Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR-alfa i TCR-beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR-alfa i TCR-beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR-alfa i TCR-beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR-alfa i TCR-beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR-alfa i TCR-beta lanaca. (Schmitt et al.2009).
Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog
4
koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni“ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR-alfa i TCR-beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR-alfa i TCR-beta gena (Scholten et al., 2006).
Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).
Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR-alfa i TCR-beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR-alfa i u TCR-beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR-alfa i TCR-beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR-alfa i TCR-beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).
U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.
„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).
4
Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu -NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, ptoluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.
U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).
Poželjno, lek predmetnog pronalaska je imunoterapeutik, kao što je vakcina. On se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (eng. keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe
4
može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.
U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 82 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.
Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.
Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.
Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.
4
Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.
DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.
DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.
Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.
Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.
4
Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.
Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.
Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.
Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže prepro-tripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica.
Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.
U drugom otelotvorenju dva ili više peptida pronalaska su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti mogu takođe da se koriste za antitumorsku terapiju i mogu indukovati imunske odgovore koji uključuju i MHC I i MHC II.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.
Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste
1
korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen et al. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012). Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.
Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.
Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.
U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog raka prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
2
U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).
Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.
Lek pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CD8-pozitivnim T ćelijama i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema su opisani ranije (Allison i Krummel, 1995). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).
Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1 ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1 indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006).
4
Patent US 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigenspecifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.
Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, Celebrex-a, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.
Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.
U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.
U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.
Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.
Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristiti „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „skela“ odnosi se na molekul koji se specifično vezuje za (npr. antigenu) determinantu. U jednom otelotvorenju, skela je u stanju da usmeri jedinicu za koju je zakačena (npr. (drugo) jedinjenje koje vezuje antigen) na ciljno mesto, na primer specifičnu vrstu tumorske ćelije ili stromu tumora koja nosi antigenu determinantu (npr. kompleks peptida sa MHC-om, u skladu sa predmetnom prijavom). U drugom otelotvorenju skela je u stanju da aktivira signalizaciju kroz njen ciljni antigen, na primer T-ćelijski receptor kompleksni antigen. Skele obuhvataju ali nisu i ograničene na antitela i njihove fragmente, antigenvezujuće domene antitela, koji sadrže varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela, vezujuće proteine koji sadrže najmanje jedan ponovljeni motiv ankirina i antigen-vezujuće molekule sa jednim domenom (SDAB), aptamere, (solubilne) TCR-ove i (modifikovane) ćelije kao što su alogene ili autologne T ćelije. Radi procene da li je molekul skela koja se vezuje za cilj, mogu se izvršiti testovi vezivanja.
„Specifično“ vezivanje znači da skela vezuje kompleks peptid-MHC od interesa bolje nego druge komplekse peptid-MHC koji se prirodno javljaju, do te mere da skela koja je naoružana aktivnim molekulom koji je u stanju da ubije ćeliju koja nosi specifičan cilj nije u stanju da ubije drugu ćeliju bez specifičnog cilja ali koja prezentuje drugi/-e kompleks/-e peptid-MHC. Vezivanje za druge komplekse peptid-MHC je nebitno ako se peptid unakrsno reaktivnog peptid-MHC ne javlja u prirodi, tj. nije dobijen uz humanog HLA-peptidoma. Testovi za procenu ubijanja ciljne ćelije dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Oni bi trebalo da se izvrše primenom ciljnih ćelija (primarnih ćelija ili ćelijskih linija) sa neizmenjenom prezentacijom peptid-MHC-a, ili ćelija u koje su ubačeni peptidi tako da se postižu prirodno javljajući nivoi peptid-MHC-a.
Svaka skela može da sadrži oznaku koja omogućava da vezana skela može da se detektuje određivanjem prisustva ili odsustva signala koji daje oznaka. Na primer, skela može da se obeleži fluorescentnom bojom ili bilo kojim drugim primenjivim ćelijskim markerskim molekulom. Takvi markerski molekuli su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Na primer fluorescentno obeležavanje, na primer koje obezbeđuje fluorescentna boja, može da obezbedi vizuelizaciju vezanog aptamera pomoću fluorescentne ili laserske skenirajuće mikroskopije ili protočne citometrije.
Svaka skela može da se konjuguje sa drugim aktivnim molekulom kao što su na primer IL-21, anti-CD3, anti-CD28.
Za dodatne informacije o polipeptidnim skelama vidite na primer uvodni odeljak patenta WO 2014/071978A1 i reference koje su citirane u dokumentu.
Aptameri (vidite na primer WO 2014/191359 i tamo citiranu literaturu) su kratki jednolančani molekuli nukleinske kiseline koji mogu da se presaviju u definisane trodimenzionalne strukture i prepoznaju specifične ciljne strukture. Ispostavilo se da su pogodne alternative za razvoj ciljanih terapija. Pokazalo se da se aptameri selektivno vezuju za raznolike kompleksne ciljeve sa visokim afinitetom i specifičnošću.
U poslednjoj dekadi su identifikovani aptameri koji prepoznaju molekule koji se nalaze na površini ćelije i obezbeđuju načine za razvoj dijagnostičkih i terapeutskih pristupa. Budući da se pokazalo da aptameri praktično nemaju toksičnost i imunogenost oni su obećavajući kandidati za biomedicinske primene. Aptameri su zaista, na primer aptameri koji prepoznaju membranski antigen specifičan za prostatu, uspešno upotrebljeni za ciljane terapije i pokazalo se da su funkcionalni u in vivo modelima ksenografta. Pored toga, identifikovani su aptameri koji prepoznaju specifične tumorske ćelijske linije.
Mogu da se izaberu DNK aptameri kako bi se otkrila svojstva prepoznavanja širokog spektra za različite ćelije malignih tumora, a naročito one dobijene iz solidnih tumora, dok se netumorogene i primarne zdrave ćelije ne prepoznaju. Ako identifikovani aptameri prepoznaju ne samo specifični podtip tumora već interaguju sa nizom tumora, ovo čini aptamere primenjivim kao takozvana dijagnostička i terapeutska sredstva širokog spektra.
Nadalje, ispitivanje ponašanja ćelijskog vezivanja pomoću protočne citometrije pokazalo je da aptameri pokazuju veoma dobre jasne afinitete koji su u nanomolarnom opsegu.
Aptameri su korisni za dijagnostičke i terapeutske svrhe. Pored toga, moglo je da se pokaže da neke od aptamera preuzimaju tumorske ćelije i tako mogu da imaju funkciju kao prenosioci molekula za ciljano dostavljanje antitumorskih agenasa kao što je siRNK u tumorske ćelije.
Mogu da se izaberu aptameri protiv kompleksnih ciljeva kao što su ćelije i tkiva i kompleksi peptida koji sadrže, poželjno sastoje se od, sekvence u skladu sa ID BR. SEKV 82 u skladu sa prikazanim pronalaskom sa MHC molekulom, koristeći tehniku cell-SELEX (sistematska evolucija liganada pomoću eksponencijalnog obogaćivanja).
Peptid predmetnog pronalaska može da se koristi za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.
Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.
Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.
Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).
Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska smatra „specifičnim“.
Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 82.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul klase I ili II humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što peptid sadrži nepeptidne veze.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što je peptid deo fuzionog proteina, konkretno koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii), ili naznačene time što je peptid fuziran na (ili u) antitelo, kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.
Drugo otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na peptid koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV: 82 i koji je sintetički proizveden (npr. sintetisan) u vidu farmaceutski prihvatljive soli. Metodi sintetičke proizvodnje peptida dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno se razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi stvoreni in vivo nisu soli. Peptid u obliku neprirodne soli posreduje u rastvorljivosti peptida, konkretno u kontekstu farmaceutskih smeša koje sadrže peptide, npr. peptidne vakcine predstavljene u ovom dokumentu. Neophodna je dovoljna i barem značajna rastvorljivost peptida da bi se ispitaniku koji se leči efikasno obezbedili peptidi. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida. Ove soli u skladu sa pronalaskom obuhvataju alkalne i zemnoalkalne soli kao što su soli Hofmeister serije koja sadrži kao anjone PO4<3->, SO4<2->, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN<->i kao katjone NH4<+>, Rb<+>, K<+>, Na<+>, Cs<+>, Li<+>, Zn<2+>, Mg<2+>, Ca<2+>, Mn<2+>, Cu<2+>i Ba<2+>. Soli su konkretno izabrane od (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2i Ba(SCN)2. Naročito poželjne su NH acetat, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl i CaCl2, kao, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.
Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Lukas et al., 1981) i referenci koje su tamo citirane. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N,N-dicikloheksilkarbodiimid/1 hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (rad Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).
1
Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).
Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju raka jajnika.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačen time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.
2
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačen time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 82.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačene time što navedene T ćelije selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom u medicini. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek vakcina.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije raka jajnika ili ćelije drugih solidnih ili hematoloških tumora kao što su karcinom pankreasa, maligni tumor mozga, karcinom bubrega, karcinom kolona ili rektuma, leukemija.
Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog polipeptida raka jajnika, isporučivanje toksina ćeliji raka jajnika koja eksprimira markerski gen za karcinom u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida raka jajnika) u skladu sa pronalaskom.
Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za rak jajnika kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.
Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV 82, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za rak jajnika koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.
Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora pluća fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.
Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca)
4
identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).
Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.
Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).
Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.
Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.
Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.
Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.
U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira spojni region teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultuje kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.
Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.
Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.
Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje raka jajnika, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora pluća kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje raka pluća.
Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhu odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.
Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetnog pronalaska mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.
Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.
Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.
Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.
Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.
Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).
Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.
U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.
Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV 82.
Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Piebanski i sar. (Piebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.
Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga, mogu se koristiti biljni virusi (vidite, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa kravljeg graška kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.
Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.
Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV 82.
Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.
In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).
T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.
Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od
1
nivoa prisutnog u normalnom tkivu.
T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.
Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: Gattioni et al. i Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
Drugi aspekt predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu peptida koji su u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.
Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).
Zato što su osnovni polipeptidi ovde prikazanih peptida i pomenutih u tabelama iznad visoko eksprimirani u raku jajnika i eksprimirani u veoma do izuzetno niskim nivoima u normalnim ćelijama, ciljni peptidi dobijeni od proteinskih proizvoda sledećih gena mogu poželjno biti integrisani u terapijsku strategiju:
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, posebno raka jajnika i drugih maligniteta.
Predmetni pronalazak je dalje usmeren na komplet koji se sastoji od:
(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;
(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i
(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.
Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica,
2
brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.
Kompleti predmetnog pronalaska se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži(e) uputstva o ili u vezi sa posudom koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.
Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).
Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.
Kompleti predmetnog pronalaska mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.
Poželjno, kompleti pronalaska obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.
Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente predmetnog kompleta.
Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.
Budući da je peptid pronalaska izolovan iz raka jajnika, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje raka jajnika.
Poželjno, peptidi uključeni u vakcinu identifikovani su pomoću metoda koji se sastoji od: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; (b) upoređivanja peptida identifikovanih u tački (a) sa skladištem (bazom podataka) peptida kako je opisano ranije; i (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta (baze podataka) koji korelira sa tumor-asociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta. Na primer, TUMAP-ovi koje prezentuje uzorak tumora identifikuju se pomoću: (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC klasa I i/ili klasa II molekule u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Poželjno, sekvence MHC liganada se identifikuju eluiranjem vezanih peptida sa MHC molekula izolovanih iz uzorka tumora, i sekvenciranjem eluiranih liganada. Poželjno, uzorak tumora i normalno tkivo se dobijaju od istog pacijenta.
4
TUMAP-ovi mogu biti identifikovani kod pacijenta de novo, a zatim uključeni u vakcinu. Kao jedan primer, kandidati za TUMAP mogu da se identifikuju kod pacijenta pomoću (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora, kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC molekule klase I i/ili klase II u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Kao drugi primer, mogu biti identifikovani proteini koji sadrže mutacije koje su jedinstvene za uzorak tumora u odnosu na normalno istovetno tkivo od pojedinačnog pacijenta, te mogu biti identifikovani TUMAP-ovi koji specifično ciljaju mutaciju. Na primer, genom tumora i istovetnog normalnog tkiva može da se sekvencira pomoću sekvenciranja celog genoma: Za otkrivanje nesinonimnih mutacija u regionima gena koji kodiraju protein, iz tumorskih tkiva se ekstrahuju genomska DNK i RNK, a normalna nemutirana genomska DNK germinativne linije se ekstrahuje iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Primenjeni NGS pristup ograničen je na resekvenciranje regiona koji kodiraju protein (resekvenciranje egzoma). U ovu svrhu, egzonska DNK iz uzoraka ljudskog porekla se sakuplja pomoću kompleta za obogaćivanje cilja koje dostavlja dobavljač, nakon čega sledi sekvenciranje pomoću npr. HiSeq2000 (Illumina). Dodatno, tumorska iRNK se sekvencira radi direktne kvantifikacije genske ekspresije i potvrde da su mutirani geni eksprimirani u tumorima pacijenata. Nastali milioni očitanih sekvenci se obrađuju kroz algoritme softvera. Izlazna lista sadrži mutacije i ekspresiju gena. Tumorspecifične somatske mutacije se utvrđuju upoređivanjem sa germinativnim varijacijama dobijenim iz PBMC i daje im se prioritet. De novo identifikovani peptidi zatim mogu da se testiraju u pogledu imunogenosti kako je opisano ranije za skladište, a kandidati za TUMAP-ove koji poseduju prikladnu imunogenost se biraju za uključivanje u vakcinu.
U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; i (b) biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo u tački (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.
Vakcina je poželjno tečna formulacija koja sadrži pojedinačne peptide rastvorene u između 20–40% DMSO, poželjno oko 30–35% DMSO, kao što je oko 33% DMSO.
Svaki peptid koji će biti uključen u proizvod se rastvara u DMSO. Koncentracija rastvora pojedinačnih peptida treba da se izabere u zavisnosti od broja peptida koji će biti uključeni u proizvod. Rastvori pojedinačan peptid-DMSO se mešaju u jednakim delovima kako bi se dobio rastvor koji sadrži sve peptide koji treba da budu uključeni u proizvod sa koncentracijom od ~2,5 mg/ml po peptidu. Pomešani rastvor se zatim razblažuje u odnosu 1:3 sa vodom za injekcije kako bi se dobila koncentracija od 0,826 mg/ml po peptidu u 33% DMSO. Razblaženi rastvor se filtrira kroz sterilni filter veličine 0,22 µm. Dobijen je konačan ukupni rastvor.
Konačni ukupni rastvor se puni u bočice i čuva na -20 °C do upotrebe. Jedna bočica sadrži 700 µl rastvora koji sadrži 0,578 mg svakog peptida. Od toga će 500 µl (oko 400 µg po peptidu) biti primenjeno za intradermalnu injekciju.
Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.
SLIKE
Na slici 1 prikazana je ekspresija HLA-A,B,C (a) i HLA-DR (b) različitih podskupova ćelija u okviru tkiva raka jajnika i benignog tkiva jajnika. Za sliku 1 je korišćen dvostrani, neupareni Student-ov t-test sa Welch-ovom korekcijom zbog nejednake varijanse između dve grupe poređenja. Ekspresiju HLA klase I (A) i HLA-DR (B) na različitim vrstama ćelija u okviru EOC i benignih tkiva jajnika nakon enzimske disocijacije karakterišu osobiti ćelijski površinski markeri (odeljci leukocita: CD45+, tumorske ćelije/odeljci epitelijalnih ćelija: CD45-EpCam+, odeljci endotelijanih ćelija: CD45-CD31+). Svaka tačka podataka predstavlja srednju vrednost eksperimenata u triplikatu izvršenih za svaki uzorak. Radi testiranja za značajnost korišćeni su dvostrani t-testovi (*p<0,05; ** p<0,01).
Na slikama 2A do D je prikazano komparativno profiliranje imunopeptidoma EOC u odnosu na benigna tkiva. (A) Komparativno profiliranje izvornih proteina HLA klasa I liganada reprezentovanih u EOC (n=34) i benignim tkivima. Učestalost HLA-restrikovane prezentacije izvornih proteina naznačena je na y osi zasebno za EOC (iznad x ose) i benigne izvore (ispod x ose). Izvorni proteini su rangirani (s leva na desno) prema njihovoj učestalosti EOC-specifične prezentacije. Okvir sa leve strane ističe izvorne proteine TOP100 HLA liganada koje ekskluzivno prezentuje EOC. (B) Oblak reči izvornih proteina TOP 100 EOC-specifičnih HLA klasa I liganada (ime gena preporučeno na osnovu baze UniProt). Veličina slova (5-26) korelira sa apsolutnim brojem pacijenata sa rakom koji prezentuje HLA ligande dotičnih izvornih proteina. (C) Komparativno profiliranje izvornih proteina HLA klasa II liganada reprezentovanih u EOC (n=22) i benignim tkivima. (D) Oblak reči izvornih proteina TOP 100 EOC-specifičnih HLA klasa II liganada (ime gena preporučeno na osnovu baze UniProt). Veličina slova (3-11) korelira sa apsolutnim brojem pacijenata sa rakom koji prezentuje HLA ligande dotičnih izvornih proteina.
Na slici 3 je prikazano ćelijsko poreklo TOP100 EOC-asociranih HLA klasa I liganada. Dijagrami rasipanja relativne zastupljenosti HLA liganada u imunopeptidomu klase I obogaćenih ćelijskih populacija OvCa 84 analiziranih pomoću kvantifikacije bez obeležavanja. Paneli pokazuju sa leve strane (A) tumorinfiltrišuće leukocite (CD45+) u odnosu na tumorske ćelije (CD45- Epcam+) a sa desne strane (B) ćelije strome (CD45-EpCam-) u odnosu na tumorske ćelije. Horizontalna isprekidana linija označava prag značajnosti (p < 0,05). Istaknuto je TOP100 EOC-ekskluzivnih liganada (MUC16 (crveno), DDR1, EYA2, SOX9, TLR7, OASL) kao i ligandi dobijeni iz antigena asociranih sa leukocitima (CD132, CD8, LSP1) i antigena asociranih sa stromom (endotelne ćelije) (vWF).
Na slici 4 je prikazano imunohistohemijsko bojenje i nivoi u serumu za surogat markere za prezentaciju liganada. Imunohistohemijsko bojenje seroznih karcinoma jajnika visokog gradusa za MUC16 (CA-125) sa niskim (IRS4), umerenim (IRS6) i visokim (IRS12) rezultatom za imunoreaktivnost (A). Imunohistohemijsko bojenje za mezotelin (desno, IRS8) i IDO1 (levo, IRS 12; sve na uveličanju od 200 puta) (B). Korelacija prezentacije HLA liganda i ekspresije izvornog proteina izabranih TOP100 EOC-asociranih antigena. Ekspresija MUC16 (n=23), IDO1 (n=23) i MSLN (n=16) analizirana je imunohistohemijskim bojenjem (C) ili analizom serumskih markera CA-125 (n=30) na dan operacije (D). Za MSLN su uključeni samo slučajevi za koje su bili dostupni podaci za HLA klasa II imunopeptidom. Radi testiranja za statističku značajnost primenjen je neparametarski Mann-Whitney test (p<0,05 se smatralo značajnim).
Na slici 5 prikazana je prognostička značajnost MUC16 i MSLN. Imunohistohemijska bojenja su izvršena na TMA sa 71 uzorkom seroznog EOC visokog gradusa od pacijenata sa dokumentovanom optimalnom citoredukcijom tumora. (A) Kaplan Majerova kriva koja prikazuje uticaj ekspresije MUC16 (levi panel, nizak rezultat ekspresije < 7, n=41; visok rezultat ekspresije > 7, n=30) i ekspresije MSLN (desni panel, niska ekspresija < 6, n=15; visoka ekspresija > 6 , n=52) na sveukupno preživljavanje. (B) Uticaj CD3 T-ćelijske infiltracije u intraepitelijalni odeljak (levi panel CD3E, niska infiltracija < 7 ćelija/HPF (vidno polje velikog uvećanja), n=13; visoka infiltracija > 7, n=57) ili fibrovaskularnu stromu (desni panel, CD3S, niska infiltracija < 7 ćelija/HPF, n=40; visoka infiltracija > 7, n=30) na sveukupno preživljavanje pacijenata. (C) Analiza podgrupe kombinovanog bojenja CD3 i MLN (sve granične vrednosti za ocenjivanje kao i iznad) za intraepitelijalne CD3 T ćelije (gornji panel, nizak MSLN/visok CD3E, n=11; nizak MSLN/nizak CD3E, n=40; visok MSLN/nizak CD3E, n=14; visok MSLN/visok CD3E, n=1) ili fibrovaskularne CD3 T ćelije (donji panel, nizak MSLN/visok CD3S, n=30; visok MSLN/nizak CD3S, n=7; nizak MSLN/nizak CD3S, n=21; visok MSLN/visok CD3S, n=8).
Na slici 6 je prikazana analiza protočnom citometrijom EOC i benignog tkiva jajnika. Primerna prezentacija strategije gejtovanja za OvCa 48 pokazuje selekciju CD45+ leukocita, CD45-CD31+ endotelijalnih ćelija i CD45-EpCam+ tumorskih ili epitelijalnih ćelija.
Slika 7 prikazuje analizu zasićenja identifikacija izvornih proteina HLA liganada za EOC. Analiza zasićenja za identifikacije izvornih proteina prikazana je zasebno za proteine HLA klasa I (A) i HLA klasa II (B) liganada. Srednji broj jedinstvenih izvornih proteina izračunat je za svaki izvorni obračun pomoću 1000 nasumičnih uzorkovanja iz 34 izvora EOC. Eksponencijalna regresija je korišćena da se utvrdi izračunata maksimalno dostižna pokrivenost pristupnosti izvornom proteinu (isprekidane linije) za EOC.
Na slici 8 je prikazana učestalost i broj prezentacije HLA liganda među uzorcima EOC. HLA prezentacija izabranih EOC-asociranih antigena kao i broj različitih HLA-prezentovanih peptida (šifriranje bojom) vizuelno je predstavljeno za svaki pojedinačan EOC (broj pacijentkinje na vrhu svake kolone) i za klasa I (gornji) i klasa II (donji) antigene.
PRIMERI
Materijali i metode
Uzorci tkiva
Svi uzorci tkiva su prikupljeni u Univerzitetskoj bolnici u Tibingenu nakon pribavljanja informisanog pristanka pacijentkinje u skladu sa principima Helsinške deklaracije. Svi protokoli studije odobreni su od strane lokalnog nadzornog odbora ustanove. Ako nije navedeno drugačije svi uzorci su čuvani na -80 °C do dalje upotrebe. Dvocifrena HLA tipizacija je izvršena pomoću PCR prajmera specifičnog za sekvencu (SSP) primenom sistema HLA-Ready Gene System (Innotrain, Kronberg, Nemačka) i evaluirana pomoću softvera SCORE (Olerup, Stokholm, Švedska) na Odeljenju za transfuzionu medicinu Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Četvorocifrena HLA tipizacija visoke rezolucije izvršena je pomoću sekvenciranja naredne generacije na aparatu GS Junior Sequencer primenom kompleta GS GType HLA Primer Sets (oba Roche, Bazel, Švajcarska). Normalna tkiva dobijena su od kompanije Bio-Options Inc, CA, SAD; BioServe, Beltsville, MD, SAD; Capital BioScience Inc, Rockville, MD, SAD; Geneticist Inc., Glendale, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Ženevi; Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu; Univerzitetske bolnice u Minhenu; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.
Disocijacija tkiva
Tkiva EOC kao i benigna tkiva jajnika i jajovoda sveže su prikupljena od pacijentkinja koje se podvrgavaju resekciji/citoredukciji tumora ili salpingo-ooforektomiji. Tkiva su izmlevena u male deliće < 2 mm<3>i prebačena u rastvor za enzimsku disocijaciju koji sadrži 400 J/ml kolagenaze tipa IV, 5 J/ml dispaze (oba od life technologies, Carlsbad, CA) i 0,1mg/ml DNk-aze (Roche, Bazel, Švajcarska) u DMEM (life technologies) sa 10% fetalnog telećeg seruma (Lonza, Bazel, Švajcarska). Disocijacija je vršena na rotacionom šejkeru (Infors HT, Bazel, Švajcarska) tokom 3 sata na 37 °C. Preostali fragmenti tkiva (tipično < 1% inicijalne težine) uklonjeni su pomoću cediljke ćelija od 100 µm (BD, Franklin Lakes, NJ). Pojedinačne suspenzije ćelija su oprane dva puta sa PBS a eritrociti su lizirani pomoću amonijum hloridnog pufera za lizu.
Kvantifikacija HLA površinskog molekula
Površinska ekspresija HLA utvrđena je pomoću QIFIKIT eseja za kvantitativnu protočnu citometriju (Dako, Glostrup, Danska) prema uputstvima proizvođača. Ćelije su obojene sa ili pan-HLA klasa I specifičnog monoklonalnog antitela W6/32, HLA-DR specifičnog L243 ili dotične izotipne kontrole. Diskriminacija vrsta ćelija bila je zasnovana na bojenju površinskog markera sa fluorescentno obeleženim antitelima usmerenim protiv CD45 (AmCyan klon 2D1, BD), CD31 (PeCy7, klon WM59, Biolegend, San Diego, CA), EpCam (APC, klon HEA125, Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Nemačka) i CD34 (APCCy7, klon 581, Biolegend). 7-AAD (BioLegend) je dodat kao marker vijabilnosti neposredno pre analize na instrumentu LSR SORP Fortessa (BD). Za svaki uzorak su zabeleženi triplikati pri čemu su srednji intenziteti fluorescencije korišćeni za izračunavanje ekspresije površinskog molekula.
Odvajanje ćelija:
Odvajanje ćelija izvršeno je pomoću dva uzastopna protokola magnetski aktiviranog odvajanja ćelija (MACS) prema uputstvima proizvođača (Miltenyi). Odvajanja su izvršena primenom XS kolona i superMACS separatora (oba Miltenyi). Prvo odvajanje imalo je za cilj pozitivnu selekciju CD45<+>leukocita. Negativna frakcija je naknadno obogaćena za EpCam<+>tumorske ćelije. Pretpostavljalo se da preostala CD45' EpCam’ frakcija predstavlja frakciju ćelija strome.
Izolacija HLA liganada
HLA molekuli klase I i II izolovani su pomoću standardnog imunoafinitetnog prečišćavanja kako je ranije opisano<42>. Pan-HLA klasa I-specifično mAt W6/32 je upotrebljeno za izolaciju HLA klase I a pan-HLA klasa II mAt Tü39 kao i HLA-DR-specifično mAt L243 su korišćena za izolaciju HLA klase II.
Analiza imunopeptidoma pomoću LC-MS/MS
Analiza imunopeptidoma izvršena je na LTQ OrbitrapXL masenom spektrometru (Thermo Fisher, Waltham, MA) opremljenom sa nanoelektronskim sprej jonskim izvorom i spregnutom sa sistemom Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC System (Dionex, Sunnyvale, CA). Uzorci peptida napunjeni su sa 3% rastvaračem B (20% H2O, 80% acetonitril i 0,04% mravlja kiselina) na PepMap 100 C18 Nanotrap koloni od 2 cm (Dionex) pri brzini protoka od 4 µl/min tokom 10 min. Odvajanje je izvršeno na PepMap C18 koloni od 50 cm sa veličinom čestica od 2 µm (Dionex) postavljenih u pećnicu za kolone koja je radila na 50 °C. Primenjeni gradijent kretao se u rasponu od 3 do 30% rastvarača B u okviru 140 min pri brzini protoka od 175 nil/min.
(Rastvarač A: 99% H2O, 1% ACN i 0,1% mravlja kiselina; Rastvarač B: 20% H2O, 80% ACN i 0,1% mravlja kiselina). Maseno spektrometrijska analiza izvršena je u režimu akvizicije zavisnom od podataka koji je primenjivao metod najvećih pet (tj. tokom svakog istražnog skena za fragmentaciju je izabrano pet najobilnijih prekursorskih jona). Istražni skenovi zabeleženi su u Orbitrap pri rezoluciji od 60.000. MS/MS analiza izvršena je pomoću disocijacije indukovane kolizijom (CID, normalizovana energija kolizije 35%, vreme aktivacije 30 ms, širina izolacije 1,3 m/z) sa naknadnom analizom u kvadrupolnoj linearnoj klopci (LTQ). Maseni opseg za HLA klasa I ligande je bio ograničen na 400-650 m/z sa mogućim stanjima naelektrisanja 2+ i 3+ izabranim za fragmentaciju. Za HLA klase II maseni opseg je postavljen na 300-1500 m/z što dozvoljava fragmentaciju sa stanjima pozitivnog naelektrisanja ≥ 2.
Uzorci HLA klase I bili su analizirani u 5 tehničkih replikata dok su za uzorke HLA klase II tipično uzeta 3 tehnička replikata. Inicijalne obrade su izvršene bez dinamičkog isključivanja, dok je za naredne obrade omogućeno dinamičko isključivanje od 5s.
Obrada i analiza podataka masene spektrometrije
Analiza MS podataka izvršena je pomoću softvera Proteome discoverer 1.3 (ThermoFisher). Vršne liste su pretraživane u odnosu na humani preoteom koji je sačinjen u bazi podataka Swiss-Prot (www.uniprot.org, objavljenoj 27. septembra 2013; koja obuhvata 20.279 pregledanih sekvenci proteina) primenom Mascot pretraživača (Mascot 2.2.04, Matrix Science, Boston, MA). Tolerancija za masu za obradu iznosila je 5 ppm za prekursorske jone i 0,5 Da za fragmentne jone. Nije bila izabrana nikakva specifičnost za cepanje a jedina dozvoljena dinamička modifikacija bila je oksidovani metionin. Pouzdanost peptida utvrđena je pomoću filterskog algoritma sa ciljnom vrednošću od q≤0,05 (5% FDR). Dodatni filteri nakon obrade bili su Mascot jonski skor ≥ 20, rang pretraživača = 1 i dužina peptida od 8-12 aminokiselina za HLA klasa I ligande i 12-25 aminokiselina za HLA klasa II ligande. Grupisanje proteina je bilo onemogućeno kako bi se osigurala višestruka beleženja peptida, ako se sekvence mapiraju u više proteina usled konzervacije. Beleženje HLA izvršeno je pomoću HLA predikcionih algoritama koji su hostovani na SYFPEITHI (www.syfpeithi.de) i NETMHC 3.4
1
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/). U slučaju dvosmislenih rezultata pomenuto je više alela. Za komparativno profiliranje, „čuda sa jednim pogotkom“ tj. peptidi koji su prezentovani samo na jednom izvoru sa PSM iznosom ≤ 5 uklonjeni su iz oba skupa podataka.
Kvantifikacija peptida bez obeležavanja na tumoru u odnosu na CD45<+>i tumoru u odnosu na ćelije strome izvršeno je pomoću Sieve 2.1 (Thermo Fisher). Najmanje 3 replikata neobrađenih MS datoteka za svaku frakciju obogaćenu ćelijama kao i rezultati iz precipitacija MHC iz celog tkiva poravnati su zajedno sa pomakom maksimalnog vremena zadržavanja (RT) od 2,5 min. Okviri su generisani na osnovu događaja MS<2>skena sa maksimalnom širinom RT od 3,5 min i tolerancijom za masu od 5 ppm. Identifikacije su uvezene iz Proteome discoverer primenom rezultata Mascot pretraživanja (vidite ranije). Normalizacija hromatograma ukupne jonske struje korišćena je da se izmire razlike u intenzitetima uzorka.
Analiza imunogenosti HLA klasa I liganada
Prajming peptid-specifičnih citotoksičnih limfocita (CTL-ova) sproveden je primenom ustanovljenog protokola koji obuhvata veštačke antigen-prezentujuće ćelije (aAPĆ) (30). aAPĆ sastojale su se od polistirenskih perli obloženih streptavidinom (prečnika 5,6 µm; Bangs Laboratories, Fishers, IN). Perle su resuspendovane do 2x10<6>čestica po ml i inkubirane sa 10 nmol/l biotiniliranih peptid-MHC kompleksa i 10 nmol/l stimulatornog anti-CD28 antitela (klon 9.3 dobijen od ATCC, Manassas, VA) svaka tokom 30 min na temperaturi ambijenta. T ćelije su izolovane iz pune krvi zdravih donora pomoću CD8 kompleta za magnetsku izolaciju ćelija (Miltenyi). Jedan milion T ćelija po mestu je kultivirano u mikropločama sa 96 mesta (Corning, Corning, NY, SAD) i stimulisano sa istim brojem ubačenih aAPĆ u prisustvu 5 ng/ml IL-12 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka). T ćelije su stimulisane ukupno 3 puta sa nedeljnim intervalom stimulacije. Dva dana nakon svake stimulacije dodato je 40 J/ml IL-2. Prajming T ćelija ocenjen je pomoću bojenja MHC multimera jednu nedelju nakon poslednje ture stimulacije.
Pravljenje tkivnih mikročipova (TMA)
Uzastopni uzorci tumora ukalupljeni u parafin od pacijentkinja sa seroznim karcinomom jajnika ili jajovoda (EOC) visokog gradusa sa najmanje FIGO stadijumom II-III i koje su operisane u Univerzitetskoj bolnici za žene u Tibingenu
2
između 1999. i 2008. godine dobijeni su iz arhive Instituta za patologiju. Nakon potvrde histološkog podtipa i stadijuma u skladu sa objavljenim kriterijumima (43).
154 slučajeva je inicijalno uključeno u studiju. Tkivni mikročip (TMA) je konstruisan kako je ranije opisano (44). Koristili smo šest jezgra prečnika 0,6 mm od svake pacijentkinje (maksimalno po tri jezgra sa dva različita mesta primarnih tumora – najmanje dva zasebna jezgra). Pored toga napravili smo TMA koristeći tkivo ukalupljeno u parafin od primarnih tumora prospektivno prikupljenih slučajeva za analizu ligandoma. Isečeni su isečci debljine 3 µm, rehidrirani u podvrgnuti specifičnom pretretmanu za imunohistohemiju. Ukupno 23 slučaja je moglo da se oceni za imunoskoring i korelaciju sa podacima imunopeptidoma.
Imunohistohemija
Za imunohistohemiju korišćena su sledeća primarna antitela i razblaženja: CD3 (1:100, pacovsko monoklonalno SP7, DCS, Hamburg, Nemačka), CD8 (1:200, mišje monoklonalno C8/144B, DAKO), MUC16 (1:450, mišje monoklonalno M11, DAKO, Glostrup, Danska), IDO1 (1:25, mišje monoklonalno, ABCAM, Cambridge, UK) i MSLN (1:100, mišje monoklonalno SPM143, GeneTex, Irvine, CA, SAD). Isečci tkiva su prethodno tretirani rastvorom EDTA-pufer (pH 8,6) na 95 °C tokom 36 min. Imunohistohemijsko bojenje izvršeno je na automatizovanom aparatu za imunobojenje prema uputstvima proizvođača primenom iView DAB kompleta za detekciju (oba od Ventana, Tucson, AZ, SAD).
Imunoskoring
Kvantifikacija TIL-ova izvršena je prvo procenom prosečnog broja imunoobojenih ćelija po vidnom polju velikog uvećanja (HPF=400x) brojanjem najmanje 2 HPF za svako jezgro. U drugom koraku, izračunat je prosečan broj limfocita po HPF za levi i desni set trostrukih jezgara i za sva jezgra zajedno. Ovaj bilateralni prosečan iznos korišćen je za dalja izračunavanja. Fibrovaskularna stroma tumora (CD3S i CD8S) i intraepitelijalni odeljak tumora (CD3E i CD8E) ocenjivani su zasebno.
Za ekspresiju CA 125, IDO1 i MSLN intenzitet bojenja je ocenjivan od 0 do 3, pomnožen sa rezultatom od 1 do 4 za procenat tumorskih ćelija (1: 0-10%; 2: 10-50%; 3: 50-80%; 4: 80-100%). Za sve parametre slučajevi su podeljeni u kvartile a najbolje odvajanje između dva kvartila definisano je kao granična vrednost između visoke i niske ekspresije. Od 154 slučaja na TMA 71 pacijentkinja bila je podvrgnuta dokumentovanoj optimalnoj citoredukciji tumora (< 1 cm rezidualne tumorske mase) i moglo je da se uspešno proceni za TIL-ove i ekspresiju proteina. Imunoskoring i analizu kliničkih podataka izvršili su nezavisni istraživači.
Statistička analiza / vizuelizacija
Ako nije pomenuto drugačije sve slike i statističke analize generisane su primenom programa Graphpad Prism 6.0 (Graphpad software, La Jolla, CA, SAD) ili Microsoft Office 2010 (Microsoft). Oblaci reči kreirani su pomoću onlajn aplikacije (www.wordle.net). Kaplan-Majerova analiza izvršena je primenom statističkog softvera SPSS (verzija 21, IBM Corp., Armonk, NY, SAD). Ako nije drugačije navedeno izvršen je dvostrani, neupareni Student-ov t-test. P vrednosti manje od 0,05 smatrale su se statistički značajnim. Omnibus test D’Agostino-Pearson korišćen je da se potvrdi normalnost a F-test je korišćen da se potvrdi jednaka varijansa. Za sliku 1 je korišćen dvostrani, neupareni Student-ov t-test sa Welch-ovom korekcijom zbog nejednake varijanse između dve grupe poređenja. Za sliku 4 je korišćen neparametarski Mann-Whitney test zato što normalna distribucija nije mogla da se proceni u svim slučajevima zbog malih veličina uzoraka. Spirmanova korelacija korišćena je za koreliranje IHC rezultata MSLN i MUC16 jer skupovi podataka nisu pokazivali normalnu distribuciju. P vrednosti koje upoređuju dve Kaplan-Majerove krive preživljavanja na slici 5 izračunate su pomoću log-rank (Mantel-Cox) testa u programu Graphpad Prism.
Primer 1: HLA broj na površini ćelije i HLA tipizacija
Glavni preduslov za razvoj imunoterapija posredovanih T ćelijama je ekspresija MHC molekula na površini tumorskih ćelija. Zato su pronalazači analizirali i kvantifikovali broj HLA-A, B, C kao i HLA-DR molekula pomoću protočne citometrije na različitim podskupovima ćelija tumora jajnika (n=11) kao i benignim tkivima iz jajnika i jajovoda (n=8) dobijenih enzimskom disocijacijom. Analiza je imala za cilj odvojenu kvantifikaciju HLA ekspresije specifične za vrstu ćelija za leukocite (CD45<+>), tumorske/epitelijalne ćelije (Epcam<+>) i endotelne ćelije (CD31<+>; drugo samo u podskupu od 7 tumora jajnika). Za kompletnu strategiju gejtovanja vidite sliku 6. Srednji broj HLA molekula po ćeliji bio je heterogen i među različitim vrstama ćelija i pojedinačnim pacijentkinjama, krećući se u rasponu od ~5.000 do 150.000 HLA klasa I i ~500 do 330.000 HLA-DR molekula. Broj HLA-A, B i C molekula bio je značajno veći (p = 0,0205) na leukocitima izolovanim iz tumora u odnosu na benigno tkivo što
4
ukazuje na aktuelnu zapaljensku reakciju u tumoru. Snažne razlike u ekspresiji HLA klase I takođe su opažene prilikom upoređivanja tumorskih ćelija sa epitelijalnim ćelijama dobijenim iz benignih tkiva. Ekspresija HLA molekula klase I bila je značajno (p = 0,0021) veća na tumorskim ćelijama (~75.000 molekula/ćeliji) ali je ostala u opsegu ostalih ćelija strome kao što su endotelijalne ćelije (~95.000 molekula/ćeliji). Iznenađujuće pronalazači su evidentirali jaku (~105.000 molekula/ćeliji) do određene mere izvanredno visoku ekspresiju HLA-DR na ćelijama EOC (>300.000 molekula/ćeliji) dok su benigne epitelijalne ćelije bile praktično negativne za HLA-DR (p=0,0108). Sveukupno, pronalazači su mogli da opaze povećanu ekspresiju MHC klase I i klase II u okviru tumora.
Analiza HLA ligandoma i komparativno profiliranje otkrivaju EOC-specifičnu prezentaciju antigena. Da bi mapirali repertoar HLA liganada EOC pronalazači su izolovali HLA molekule iz ukupnog tumorskog tkiva i izvršili masenu spektrometriju da bi okarakterisali HLA ligandom za ukupno 34 EOC-a (za karakteristike pacijentkinja i HLA tipizaciju vidite tabelu 7).
Tabela 7
Za MHC klase I pronalazači su mogli da identifikuju 22.920 jedinstvenih peptida (srednja vrednost 1.263/uzorku) koji proističu iz 9.136 različitih izvornih proteina (srednja vrednost 1.239/uzorku) što dostiže >90% procenjene maksimalno dostižne pokrivenosti (vidite sliku 7a).
Primer 2, identifikacija glavnih HLA liganada asociranih sa rakom
U cilju da izvuku najspecifičnije HLA ligande za EOC iz ovog opsežnog kataloga podataka pronalazači su uporedili izvorne proteine HLA liganada sa internom bazom podataka benignih izvora („baza podataka HLA benignog ligandoma“) koja sadrži uzorke iz PBMC (n=30), kostne srži (n=10), jetre (n=15), kolona (n=12), jajnika (n=4) i bubrega (n=16). Baza podataka HLA benignog ligandoma sadrži 31.032 peptida koji predstavljaju 10.012 izvornih proteina i dobro je ustanovljena primenom krvi ili kostne srži zdravih donora kao i histopatološki procenjenih normalnih tkiva, a svi su analizirani pomoći potpuno iste linije koja je korišćena za EOC. Za komparativno profiliranje, „čuda sa jednim pogotkom“ (tj. peptidi koji su prezentovani samo na jednom izvoru sa niskim PSM iznosom) uklonjena su iz oba skupa podataka da bi se uvrstila lažno pozitivna poklapanja. Komparativna analiza dva dotična skupa podataka (vidite sliku 2A) otkrila je da je 379 izvornih proteina MHC klase I prezentovano isključivo od strane EOC kod najmanje tri od testiranih pacijentkinja, čime se ističe EOC-specifičan repertoar HLA peptida. TOP100 EOC-specifičnih izvornih proteina rangiranih prema njihovoj učestalosti prezentacije vizuelno su prikazani na slici 2B. Najvažniji EOC-specifični izvorni protein HLA liganda koji je iznedrila ova analiza bio je mucin 16 (MUC16) koji je takođe poznat kao karcinomski antigen 125 (CA-125). Sveukupno, više od 80 različitih HLA liganada dobijenih od MUC16 (vidite tabelu 8) bilo je prezentovano kod skoro 80% pacijentkinja (26/34).
Tabela 8
1
2
Ti podaci ističu čestu obradu i prezentaciju MUC16 od strane mnogih različitih HLA alotipova koja ne može da se poredi ni sa jednim drugim EOC-specifičnim antigenom i koju imaju samo još često (>95%) prezentovani konstitutivni proteini kao što je beta aktin (ukupno je identifikovano 149 različitih peptida). Među TOP100 EOC-specifičnih izvornih proteina identifikovani su i drugi dobro ustanovljeni tumor-asocirani antigeni kao što su MUC1 ili KLK10 kao i antigeni sa dobro dokumentovanim funkcijama izbegavanja imunskog sistema poput indoleamin-2,3- dioksigenaze (IDO1) ili galektina 1 (LGALS1).
Zahvaljujući snazi CD4 T ćelija u podršci ili upravljanju antitumorskog imunskog odgovora pronalazači su koristili isti pristup za dalju analizu MHC klasa II prezentovanih peptida u EOC (n=22) što je proizvelo 9.162 peptida (srednja vrednost 598/uzorku) koji predstavljaju 2.330 izvornih proteina (srednja vrednost 319/uzorku) čime se dostiglo > 80% dostižne pokrivenosti (vidite sliku 7B). Skup podataka HLA benignih liganada za MHC klase II sadržao je 7.267 peptida koji su predstavljali 1.719 izvornih proteina dobijenih iz kostne srži (n=5), PBMC (n=13), kolona (n=2), jetre (n=7) i bubrega (n=17). Analiza TOP100 MHC klasa II prezentovanih antigena otkrila je heterogeniju i kompleksniju sliku (slika 2C). Značajno, MHC prezentovani peptidi mezotelina (MSLN) ustanovljenog liganda MUC16, mogli su da se identifikuju kod skoro 50% pacijentkinja (10/22; slika 2D). Sam MUC16 nije bio među TOP100 antigena klase II ali odgovarajući ligandi su ipak mogli da se detektuju kod četiri pacijentkinje.
Pored TOP100 EOC-specifičnih izvornih proteina HLA liganada, pronalazači su dalje tražili ustanovljene karcinom-testis i tumor-asocirane antigene koji su ranije korišćeni za kliničke primene kako bi potvrdili njihovu obilnost (Her2neu, WT1, NY-ESO-1, hTert i p53). Iako su pronalazači mogli da identifikuju HLA-prezentovane peptide za sve antigene izuzev za NY-ESO-1, nijedan od njih nije bio ekskluzivno prezentovan na EOC (tabela 9). Jedini ligandi koji pokazuju EOC-specifičnu prezentaciju, iako sa niskom učestalošću (3/34), bili su ligandi HLA klase I (ali ne HLA klase II) od Her2neu.
Tabela 9
4
Primer 3: Ćelijsko poreklo EOC-asociranih HLA-prezentovanih peptida
Budući da EOC otelotvorava ne samo ćelije raka već pre predstavlja heterogenu mešavinu različitih vrsta ćelija, pronalazači su se pitali da li ćelije raka zaista originalno prezentuju MHC klasa I TOP100 antigene. U tu svrhu pronalazači su izvršili digestiju EOC i odvojili CD45<+>leukocite, EpCam<+>tumorske ćelije kao i ćelije strome negativne za dva markera (za efikasnosti obogaćivanja vidite tabelu 10) a naknadno su pronalazači izvršili HLA ligandomiku pojedinačno za svaki od podskupova.
Tabela 10: Efikasnosti ćelijskog obogaćivanja:
Procenti ćelija su navedeni u svakoj frakciji pre (PreSort) i nakon MAC sortiranja
Pronalazači su koristili kvantifikaciju bez obeležavanja da bi utvrdili izvor svakog identifikovanog HLA liganda u ukupno 5 EOC (za reprezentativni primer vidite sliku 3). Kako se i očekivalo, nađeno je da su HLA ligandi dobijeni od MUC16, identifikovani na (4/5) uzoraka EOC, uvek prekomerno prezentovani na obogaćenim ćelijama raka sa srednjom petostrukom prekomernom prezentacijom (opseg 1,8-135 puta) u zavisnosti od efikasnosti obogaćivanja.
Ispostavilo se da je isto tačno i za nekoliko drugih često prezentovanih TOP100 antigena kao što su DDR1, SOX9, CRABP1/2, EYA2, LAMC2, MUC1 ili KLK10. Ipak za određeni broj drugih antigena naročito onih za koje je poznato da su ushodno regulisani interferonom kao što su toll like receptori (TLR3, TLR7) ili 2'-5'-oligoadenilat sintetazi-sličan protein sintetaza (OASL) nije moglo nedvosmisleno da se pokaže da su prezentovani od strane tumorskih ćelija već su pre prikazivali snažnu prekomernu prezentaciju na CD45+ leukocitima i/ili ćelijama strome. Pored tumor-asociranih antigena pronalazači su takođe prepoznali ligande iz izvornih proteina sa ekspresijom specifičnom za vrstu ćelija. Na primer otkriveno je da su ligandi dobijeni od CD8, CD132 ili proteina 1 specifičnog za limfocit (LSP1) visoko prekomerno prezentovani na CD45+ ćelijama a nađeno je da je fon Vilebrandov faktor (vWF) kojeg najverovatnije eksprimiraju endotelijalne ćelije strome visoko prekomerno prezentovan u okviru stromalnog podskupa što naglašava snagu ovog pristupa specifičnog za vrstu ćelije.
Primer 4: Analiza imunogenosti liganada dobijenih od MUC16
Imunogenost je glavni imperativ za primenjivost peptidnih vakcina. Da bi procenili imunogeni potencijal identifikovanih HLA liganada pronalazači su koristili protokol prajmovanja T ćelija koji obuhvata veštačke antigen-prezentujuće ćelije i T ćelije izolovane iz krvi zdravih donora. Rezultati ove analize za broj jedan EOC-asocirani antigen MUC16 prikazani su u tabeli 11. Među 23 različita peptida testirana do sad, za 18 je pokazano da su imunogeni kod najmanje 1/3 donora. Ovaj procenat prepoznavanja od skoro 80% potvrđuje prisustvo naivnih T ćelija koje prepoznaju MUC16 u humanoj populaciji. Slični rezultati su dobijeni za ostale TOP100 antigene (npr. DO1, LGALS1).
Tabela 11: Analiza imunogenosti EOC-prezentovanih HLA liganada iz MUC16 /CA-125
Primer 5: Biomarkeri za prezentaciju HLA liganada
Antigen-specifična imunoterapija raka (npr. peptidna vakcinacija, adoptivni transfer T ćelija) iziskuje strog izbor antigena kandidata u kratkom vremenskom roku. Međutim, analiza HLA ligandoma nije uvek moguća zbog nedostatka odgovarajućeg materijala. Izvodljiva alternativa bi bila upotreba biomarkera da se predvidi prisustvo HLA liganada na tumorskim ćelijama. Da bi se procenilo da li ekspresija proteina analizirana imunohistohemijom (skor imunoreaktivnosti, IRS) može da posluži kao surogat marker za prezentaciju HLA liganda, pronalazači su analizirali TOP100 MHC klasa I antigene MUC16 i IDO1 kao i TOP100 MHC klasa II antigen MSLN pomoću imunohistohemije i izvršili korelaciju intenziteta bojenja (slika 4A) sa prisustvom ili odsustvom HLA liganada na istim tumorima. I za MUC16 i za MSLN rezultati bojenja su bili značajno veći na tumorima koji su prezentovali HLA ligande dotičnih izvornih proteina (slika 4C). Isto je važilo i za nivoe CA-125 u serumu utvrđene na dan operacije (slika 4D) što ukazuje na to da bi ovi parametri mogli da se koriste za pravilan izbor kandidatskih antigena za vakcinaciju peptidima. Nasuprot tome, IDO1 nije pokazao značajnu povezanost sa prezentacijom liganda.
Primer 6: Prognostički značaj ose MUC16/MSLN
Zbog njihovog značaja kao ciljeva za imunoterapiju pronalazači su želeli da procene da li MSLN i MUC16 takođe imaju prognostički značaj kod pacijenata koji su slični našem kolektivu imunopeptidoma. U ovu svrhu pronalazači su analizirali ekspresiju oba antigena kao i stepen T-ćelijske infiltracije pomoću imunohistohemije u tkivnom mikročipu (TMA) seroznih karcinoma jajnika visokog gradusa (FIGO stadijum II-III). Da bi se izbegle prognostički relevantne zbunjujuće varijable pronalazači su ograničili našu analizu na 71 pacijentkinju sa optimalno citoredukovanim tumorima (rezidualna masa manja od 1 cm).
Iako pronalazači nisu opazili nijedan prognostički efekat za bojenje MUC16, snažno bojenje MSLN je bilo povezano sa primetnim granično značajnim (p=0,0572) smanjenjem srednjeg ukupnog preživljavanja sa 50 na 28 meseci (slika 5 A). Uprkos njihovom različitom prognostičkom značaju, rezultati bojenja za MUC16 i MSLN pokazali su direktnu i visoko značajnu korelaciju (Spirmanov koeficijent korelacije r = 0,5237; 95% IP = 0,3159-0,6835, dvostrana značajnost p < 0,001).
Za evaluaciju T-ćelijske infiltracije pronalazači su procenili broj CD3 T ćelija u intraepitelijalnom odeljku tumora (CD3E) i fibrovaskularnoj stromi (CD3S) zasebno. Značajno samo broj intraepitelijalnih T ćelija pokazao je značajan (p<0,0063) prognostički uticaj, dok samo infiltracija okolne strome nije imala prognostički značaj (slika 5B). Samo u analizi podgrupe koja je kombinovala bojenje MSLN i CD3 mogla je da se opazi značajna prognostička korist za tumore sa niskim MSLN i visokom T-ćelijskom infiltracijom (slika 5C) i za CD3E (p < 0,001) i za CD3S (p < 0,0049). Najupečatljivije, kombinacija visoke intratumorske T-ćelijske infiltracije (CD3E) i niskog bojenja MSLN definisala je podskup osoba koje dugoročno prežive rak (10/11 pacijentkinja sa potvrđenim preživljavanjem dužim od 3 godine).
Citirane reference
Allison, J. P. et al., Science 270 (1995)
Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc.7 (2012)
Appay, V. et al., Eur.J Immunol.36 (2006)
Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001)
Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001)
Beggs, J. D., Nature 275 (1978)
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995)
Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003)
Braumuller, H. et al., Nature (2013)
Brossart, P. et al., Blood 90 (1997)
Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol.5 (2004)
Card, K. F. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004)
Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol.65 (2004)
Cohen, C. J. et al., J Mol.Recognit.16 (2003a)
Cohen, C. J. et al., J Immunol.170 (2003b)
Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972)
Coligan JE et al., (1995)
Colombetti, S. et al., J Immunol.176 (2006)
Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006) Denkberg, G. et al., J Immunol.171 (2003)
Falk, K. et al., Nature 351 (1991)
Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001) Gabrilovich, D. I. et al., Nat.Med 2 (1996)
Gattinoni, L. et al., Nat.Rev.Immunol.6 (2006) Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003) Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997)
Green MR et al., 4th, (2012)
Greenfield EA, 2nd, (2014)
Hwang, M. L. et al., J Immunol.179 (2007)
Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987) Kibbe AH, rd, (2000)
Krieg, A. M., Nat.Rev.Drug Discov. 5 (2006)
Liddy, N. et al., Nat.Med. 18 (2012)
Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med 162 (1985) Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993) Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981) Lundblad RL, 3rd, (2004)
Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997)
Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006)
Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997)
Mortara, L. et al., Clin Cancer Res.12 (2006) Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res.7 (2008) Mueller, L. N. et al., Proteomics.7 (2007)
Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999) Pinheiro J et al., (2015)
Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995)
Porta, C. et al., Virology 202 (1994)
Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999) Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006)
Rock, K. L. et al., Science 249 (1990)
Rodenko, B. et al., Nat.Protoc. 1 (2006)
Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988)
Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999)
Sherman F et al., (1986)
Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004)
Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006)
Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics.9 (2008)
Teufel, R. et al., Cell Mol.Life Sci.62 (2005)
Tran, E. et al., Science 344 (2014)
Walter, S. et al., J.Immunol.171 (2003)
Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012)
Willcox, B. E. et al., Protein Sci.8 (1999)
Zaremba, S. et al., Cancer Res.57 (1997)
Siegel, R., Ma, J., Zou, Z. & Jemal, CA Cancer J. Clin.64, 9-29 (2014).
Coleman, R.L.et al Nat. Rev. Clin. Oncol.10, 211-224 (2013).
Herzog, T.J. & Pothuri, B.. Nat. Clin. Pract. Oncol. 3, 604-611 (2006).
Kandalaft, L.E., Powell, D.J., Jr., Singh, N. & Coukos, G. J. Clin. Oncol.29, 925-933 (2011).
Zhang, L., et al. N. Engl. J. Med.348, 203-213 (2003).
Schlienger, K., et al. Clin. Cancer Res.9, 1517-1527 (2003).
Matsuzaki, J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.107, 7875-7880 (2010).
Fisk, B., Blevins, T.L., Wharton, J.T. & Ioannides, C.G. J. Exp. Med. 181, 2109-2117 (1995).
Curiel, T.J., et al. Nat. Med.10, 942-949 (2004).
Vlad, A.M., et al. Cancer Immunol. Immunother.59, 293-301 (2010).
Hodi, F.S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.105, 3005-3010 (2008).
Robert, C., et al. Lancet 384, 1109-1117 (2014).
Wolchok, J.D., et al. N. Engl. J. Med.369, 122-133 (2013).
Rosenberg, S.A., et al.. Clin. Cancer Res.17, 4550-4557 (2011).
Walter, S., et al. Nat. Med.18, 1254-1261 (2012).
Rosenberg, S.A. Sci. Transl. Med. 4, 127ps128 (2012).
Tran, E., et al.. Science 344, 641-645 (2014).
Mantia-Smaldone, G.M., Corr, B. & Chu, C.S. Hum. Vaccin. Immunother.8, 1179-1191 (2012).
1
Haridas, D., et al. FASEB J.28, 4183-4199 (2014).
Deng, J., et al. Cancer Metastasis Rev.32, 535-551 (2013).
Luo, L.Y., et al. Cancer Res.63, 807-811 (2003).
Uyttenhove, C., et al. Nat. Med.9, 1269-1274 (2003).
Sorensen, R.B., et al.. PLoS One 4, e6910 (2009).
van den Brule, F., et al. Lab. Invest. 83, 377-386 (2003).
Rubinstein, N., et al. Cancer Cell 5, 241-251 (2004).
Perez-Diez, A., et al. Blood 109, 5346-5354 (2007).
Braumuller, H., et al. Nature 494, 361-365 (2013).
Hassan, R. & Ho, M. Eur. J. Cancer 44, 46-53 (2008).
Schoggins, J.W., et al. Nature 472, 481-485 (2011).
Walter, S., et al. J. Immunol.171, 4974-4978 (2003).
Couzin-Frankel, J. Cancer immunotherapy. Science 342, 1432-1433 (2013). Mellman, I., Coukos, G. & Dranoff, G. Nature 480, 480-489 (2011).
Perez, S.A., et al. Cancer 116, 2071-2080 (2010).
Matsushita, H., et al. Nature 482, 400-404 (2012).
Robbins, P.F., et al. Nat. Med. 19, 747-752 (2013).
Gubin, M.M., et al. Nature 515, 577-581 (2014).
Andersen, R.S., et al. Cancer Res.72, 1642-1650 (2012).
Lu, Y.C., et al. Clin. Cancer Res.20, 3401-3410 (2014).
Rolland, P., Deen, S., Scott, I., Durrant, L. & Spendlove, I. Clin. Cancer Res.13, 3591-3596 (2007).
Cheng, W.F., et al. Br. J. Cancer 100, 1144-1153 (2009).
Berlin, C., et al. Leukemia (2014).
Blaustein, A. & Kurman, R.J. Blaustein's pathology of the female genital tract, (Springer, New York, NY, 2011).
Pham, D.L., et al. Int. J. Gynecol. Pathol.32, 358-367 (2013).
1 1
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 82.
2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.
3. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačen time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, naročito koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).
4. T-ćelijski receptor, poželjno rekombinantni, solubilni ili vezan za membranu T-ćelijski receptor koji je reaktivan sa HLA ligandom, naznačeno time što navedeni ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 82.
5. Antitelo, konkretno solubilno ili antitelo vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, poželjno peptid u skladu sa bilo kojim od patentnog zahteva 1 kada je vezan za MHC molekul.
6. Nukleinska kiselina koja kodira za peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3 ili za TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, opciono povezana sa heterolognom promoterskom sekvencom, ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.
7. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 3, ili nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačena time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritična ćelija, ili naznačena time što je navedena ćelija domaćin poželjno T ćelija ili NK ćelija.
8. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, ili za proizvodnju T-ćelijskog receptora u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili antitela u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 7 koja prezentuje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, i izolovanja peptida ili TCR-a ili antitela iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
2
9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1.
10. Aktivirani T limfocit, proizveden pomoću metoda u skladu sa patentnim zahtevom 9, koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u patentnom zahtevu 1.
11. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, dodatne farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.
12. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4 za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka.
13. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4 za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačenog time što je navedeni rak izabran iz grupe koju čine rak jajnika, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, rak bubrega, rak mozga, rak kolona ili rektuma, rak želuca, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jednjaka, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese, rak žučnih puteva i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid u skladu sa ID BR. SEKV 82, konkretno rak jajnika.
14. Komplet koji se sastoji od:
a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 3, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćeliju u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, u rastvoru ili u liofiliziranom obliku; b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;
c) opciono, najmanje još jednog peptida odabranog iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV 1 do 81 i 83 do 549, i
d) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije, i
e) opciono dalje sadrži jedan ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica.
RS20200937A 2015-07-15 2016-07-14 Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji za epitelijalni karcinom jajnika i druge maligne tumore RS60647B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562192670P 2015-07-15 2015-07-15
GBGB1512369.8A GB201512369D0 (en) 2015-07-15 2015-07-15 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
PCT/EP2016/066706 WO2017009400A1 (en) 2015-07-15 2016-07-14 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
EP16739102.8A EP3322717B1 (en) 2015-07-15 2016-07-14 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60647B1 true RS60647B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=54013984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200937A RS60647B1 (sr) 2015-07-15 2016-07-14 Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji za epitelijalni karcinom jajnika i druge maligne tumore

Country Status (36)

Country Link
US (22) US9889159B2 (sr)
EP (2) EP3705491A1 (sr)
JP (10) JP6862411B2 (sr)
KR (2) KR20220075451A (sr)
CN (2) CN107922469A (sr)
AU (4) AU2016293047B9 (sr)
BR (2) BR122023024959A2 (sr)
CA (2) CA3221097A1 (sr)
CL (5) CL2018000124A1 (sr)
CO (1) CO2018000252A2 (sr)
CR (4) CR20180027A (sr)
CY (1) CY1123505T1 (sr)
DK (1) DK3322717T3 (sr)
EA (1) EA201890027A1 (sr)
ES (1) ES2807832T3 (sr)
GB (1) GB201512369D0 (sr)
HR (1) HRP20201281T1 (sr)
HU (1) HUE049937T2 (sr)
IL (3) IL292131A (sr)
LT (1) LT3322717T (sr)
MA (3) MA42441B1 (sr)
MD (1) MD3322717T2 (sr)
ME (1) ME03808B (sr)
MX (2) MX2018000543A (sr)
MY (1) MY189596A (sr)
NZ (1) NZ739128A (sr)
PE (2) PE20180693A1 (sr)
PH (1) PH12018500005A1 (sr)
PL (1) PL3322717T3 (sr)
PT (1) PT3322717T (sr)
RS (1) RS60647B1 (sr)
SG (7) SG10202100294WA (sr)
SI (1) SI3322717T1 (sr)
UA (1) UA124875C2 (sr)
WO (1) WO2017009400A1 (sr)
ZA (1) ZA201800129B (sr)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS58514B1 (sr) 2012-06-13 2019-04-30 Incyte Holdings Corp Supstituisana triciklična jedinjenja kao inhibitori fgfr
PH12015502383B1 (en) 2013-04-19 2023-02-03 Incyte Holdings Corp Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
TWI712601B (zh) 2015-02-20 2020-12-11 美商英塞特公司 作為fgfr抑制劑之雙環雜環
GB201507030D0 (en) * 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
MY189596A (en) 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
PH12022551111A1 (en) 2015-10-05 2023-08-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
JP7075125B2 (ja) 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
GB201609193D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
KR102379955B1 (ko) 2016-12-08 2022-03-29 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 짝짓기가 향상된 t 세포 수용체
WO2018138257A1 (en) * 2017-01-27 2018-08-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
US10738100B2 (en) 2017-01-27 2020-08-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
SI3573647T1 (sl) 2017-01-27 2023-07-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidi in kombinacija peptidov za uporabo v imunoterapiji proti raku jajčnikov in drugim oblikam raka
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
LT3428194T (lt) 2017-07-14 2021-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Pagerinta dvejopo savitumo polipeptido molekulė
EP4576103A3 (en) 2017-10-10 2025-08-27 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
DE102017127984B4 (de) 2017-11-27 2019-12-05 Immatics US, Inc. Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen
BR112020016176A2 (pt) 2018-02-09 2022-02-22 Immatics Us Inc Métodos de transdução de uma célula t, célula t transduzida geneticamente, composição farmacêutica, métodos de preparação de uma população de células t e uso da célula t
DE102018108612A1 (de) 2018-03-21 2019-09-26 Immatics US, Inc. Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen
AU2019262579B2 (en) 2018-05-04 2024-09-12 Incyte Corporation Salts of an FGFR inhibitor
HRP20241288T1 (hr) 2018-05-04 2024-12-06 Incyte Corporation Čvrsti oblici fgfr inhibitora i postupci za njihovu proizvodnju
CN110531077B (zh) * 2018-05-25 2023-07-07 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 间皮素免疫组化检测试剂盒
WO2020028562A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Loma Linda University Snail sirna-loaded mesoporous silica nanoparticles
US11628162B2 (en) 2019-03-08 2023-04-18 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an FGFR inhibitor
DE102019108125B4 (de) * 2019-03-28 2022-02-03 Immatics US, Inc. Cd28 t-zellkulturen, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
US20200297768A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Immatics US, Inc. Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
WO2020243134A1 (en) 2019-05-27 2020-12-03 Immatics US, Inc. Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
US12011459B2 (en) 2019-06-06 2024-06-18 Immatics US, Inc. Methods for manufacturing T cells by direct sorting and compositions thereof
BR112021025943A2 (pt) * 2019-06-25 2022-02-08 Univ Montreal Antígenos específicos de tumor inovadores para câncer de ovário e usos dos mesmos
US11591329B2 (en) 2019-07-09 2023-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
JP2022543687A (ja) * 2019-08-09 2022-10-13 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． ペプチド質量分析断片化を予測するための方法
WO2021067374A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
CA3157361A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
WO2021076728A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
CA3163875A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
JP7832891B2 (ja) 2019-12-04 2026-03-18 インサイト・コーポレイション Ｆｇｆｒ阻害剤の誘導体
US12012409B2 (en) 2020-01-15 2024-06-18 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CA3168729A1 (en) 2020-02-24 2021-09-02 Melinda MATA Methods for expanding t cells for the treatment of cancer and related malignancies
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE102020106710A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
US11977057B2 (en) * 2020-06-13 2024-05-07 Complete Omics International Inc. Method and system for neoantigen analysis
US20220056411A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Immatics US, Inc. Methods for isolating cd8+ selected t cells
TW202241938A (zh) 2020-12-31 2022-11-01 美商英麥提克斯股份有限公司 Ｃｄ８多肽、組合物及其使用方法
WO2022221170A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Incyte Corporation Combination therapy comprising an fgfr inhibitor and a nectin-4 targeting agent
EP4326858A4 (en) * 2021-04-23 2025-03-12 VLP Therapeutics, Inc. GALECTIN-TARGETED IMMUNOTHERAPY
IL308258A (en) 2021-05-05 2024-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Bma031 antigen binding polypeptides
CN113241177B (zh) * 2021-05-19 2024-05-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种评估免疫力水平的方法、装置、设备及存储介质
US11939331B2 (en) 2021-06-09 2024-03-26 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CA3220155A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
JP2024534825A (ja) * 2021-08-24 2024-09-26 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． 条件付きリガンド交換により産生されたペプチドｍｈｃ複合体を使用する免疫細胞の選択
TW202332765A (zh) 2021-09-20 2023-08-16 美商英麥提克斯股份有限公司 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡
WO2023056240A2 (en) 2021-09-28 2023-04-06 Frontaim Biomedicines, Inc. Multiple formats of molecular complexes
EP4448108A1 (en) 2021-11-08 2024-10-23 Immatics Biotechnologies GmbH Adoptive cell therapy combination treatment and compositions thereof
EP4514821A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
US20230348561A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
EP4514829A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
WO2023215825A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
CN114657158B (zh) * 2022-05-25 2022-10-21 深圳吉诺因生物科技有限公司 Ido1相关疫苗及其应用
GB202302709D0 (en) * 2023-02-24 2023-04-12 Genome Res Ltd Method of identifying t cell recpetors of interest
WO2025096649A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2492160A1 (en) 2002-07-12 2004-01-22 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
AU2003299643A1 (en) * 2002-12-04 2004-06-23 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to colon specific genes and proteins
DE102004026135A1 (de) * 2004-05-25 2006-01-05 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
US20110177079A1 (en) * 2004-09-08 2011-07-21 Ludwig Institute For Cancer Research Cancer-testis antigens
JP4987698B2 (ja) * 2005-03-31 2012-07-25 中外製薬株式会社 癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用
SI1806358T1 (sl) 2005-09-05 2010-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh S tumorjem povezani peptidi ki se promiskuitetnovežejo na molekule humanega levkocitnega antigena HLA razreda II
EP1760089B1 (en) * 2005-09-05 2009-08-19 Immatics Biotechnologies GmbH Tumor-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules and related anti-cancer vaccine
JP5543207B2 (ja) 2006-10-04 2014-07-09 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 不活性化された人工抗原提示細胞の調製および細胞治療におけるそれらの使用
US8097242B2 (en) 2006-10-05 2012-01-17 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Target CA125 peptides for cancer immunotherapy
CN103864893B (zh) * 2007-07-27 2017-01-04 伊玛提克斯生物技术有限公司 免疫疗法的免疫抗原表位
HRP20150820T1 (xx) * 2007-07-27 2015-09-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapija protiv neuronskih tumora i tumora mozga
WO2009032224A2 (en) * 2007-08-29 2009-03-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inhibiting squamous cell carcinoma
ES2532896T5 (es) * 2008-05-14 2018-03-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Péptidos del MHC de clase II novedosos y potentes derivados de survivina y neurocan
RS53782B1 (sr) * 2008-10-01 2015-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Preparati tumor-asociranih peptida i odgovarajuća antikancerska vakcina za tretman glioblastoma (gbm) i drugih kancera
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201006360D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
WO2014011465A2 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Aptamer-targeted antigen delivery
SG11201507883SA (en) * 2013-03-29 2015-10-29 Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd Wt1-antigen peptide conjugate vaccine
TWI636065B (zh) * 2013-08-05 2018-09-21 伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物
GB201319446D0 (en) * 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201505305D0 (en) * 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
LT3388075T (lt) * 2015-03-27 2023-11-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Nauji peptidai ir peptidų deriniai, skirti naudoti imunoterapijai prieš įvairius navikus (seq id 25 - mrax5-003)
GB201507030D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
MY189596A (en) * 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Also Published As

Publication number Publication date
US11278571B2 (en) 2022-03-22
SG10202100297QA (en) 2021-02-25
CL2018000124A1 (es) 2018-05-18
US20230086100A1 (en) 2023-03-23
US20200316125A1 (en) 2020-10-08
MD3322717T2 (ro) 2020-11-30
GB201512369D0 (en) 2015-08-19
US10463696B2 (en) 2019-11-05
JP7239993B2 (ja) 2023-03-15
AU2016293047A1 (en) 2018-02-08
US20210252066A1 (en) 2021-08-19
JP2021000078A (ja) 2021-01-07
IL292131A (en) 2022-06-01
PH12018500005A1 (en) 2018-07-09
US11246889B2 (en) 2022-02-15
US10869897B2 (en) 2020-12-22
US20230241107A1 (en) 2023-08-03
JP2020191862A (ja) 2020-12-03
IL256697B (en) 2022-05-01
HUE049937T2 (hu) 2020-11-30
BR112017028558A2 (pt) 2018-09-04
SG10202100295RA (en) 2021-02-25
AU2022200745A1 (en) 2022-02-24
US10888587B2 (en) 2021-01-12
EA201890027A1 (ru) 2018-06-29
US20200000850A1 (en) 2020-01-02
US20210260122A1 (en) 2021-08-26
CY1123505T1 (el) 2022-03-24
CR20200408A (es) 2020-10-08
US10568909B2 (en) 2020-02-25
KR20180030506A (ko) 2018-03-23
AU2016293047A2 (en) 2018-03-15
EP3705491A1 (en) 2020-09-09
JP7239992B2 (ja) 2023-03-15
US10639332B2 (en) 2020-05-05
US11071756B2 (en) 2021-07-27
ZA201800129B (en) 2018-12-19
JP2020182451A (ja) 2020-11-12
US9889159B2 (en) 2018-02-13
JP2020167995A (ja) 2020-10-15
CL2019003311A1 (es) 2020-03-13
AU2022200745B2 (en) 2024-01-18
AU2016293047B9 (en) 2020-10-29
US20230285458A1 (en) 2023-09-14
SG10202100294WA (en) 2021-02-25
MY189596A (en) 2022-02-18
JP7074370B2 (ja) 2022-05-24
CR20200409A (es) 2020-10-16
CN114163501A (zh) 2022-03-11
EP3322717A1 (en) 2018-05-23
US20230201259A1 (en) 2023-06-29
CN107922469A (zh) 2018-04-17
US10722538B2 (en) 2020-07-28
SG10202100298SA (en) 2021-02-25
ES2807832T3 (es) 2021-02-24
US20170035807A1 (en) 2017-02-09
SG10202100291XA (en) 2021-02-25
AU2020203971A1 (en) 2020-07-02
JP6862411B2 (ja) 2021-04-21
CO2018000252A2 (es) 2018-05-31
HRP20201281T1 (hr) 2020-11-13
CL2019003312A1 (es) 2020-03-13
US20200000849A1 (en) 2020-01-02
MX2023014146A (es) 2023-12-13
ME03808B (me) 2021-04-20
CR20200410A (es) 2020-10-12
US10639331B2 (en) 2020-05-05
AU2020256318A1 (en) 2020-11-12
UA124875C2 (uk) 2021-12-08
US20230190813A1 (en) 2023-06-22
MA42441B1 (fr) 2020-07-29
JP2020182458A (ja) 2020-11-12
HK1253574A1 (en) 2019-06-21
JP2020171283A (ja) 2020-10-22
CA2992506A1 (en) 2017-01-19
IL308200A (en) 2024-01-01
PT3322717T (pt) 2020-07-27
NZ739128A (en) 2022-04-29
JP2020156480A (ja) 2020-10-01
PE20180693A1 (es) 2018-04-23
WO2017009400A1 (en) 2017-01-19
US11819518B2 (en) 2023-11-21
US20210106623A1 (en) 2021-04-15
MX2018000543A (es) 2018-05-22
EP3322717B1 (en) 2020-06-10
JP7074367B2 (ja) 2022-05-24
US20200316126A1 (en) 2020-10-08
US10881690B2 (en) 2021-01-05
US20200155603A1 (en) 2020-05-21
US20210252064A1 (en) 2021-08-19
MA50542A (fr) 2020-09-09
LT3322717T (lt) 2020-08-25
BR122023024959A2 (pt) 2024-01-16
US20200316127A1 (en) 2020-10-08
US20180117085A1 (en) 2018-05-03
CL2019003310A1 (es) 2020-04-24
CR20180027A (es) 2018-07-23
MA41717A1 (fr) 2019-05-31
SG10202100296PA (en) 2021-02-25
US20210252065A1 (en) 2021-08-19
IL256697A (en) 2018-03-29
JP2018531581A (ja) 2018-11-01
PL3322717T3 (pl) 2020-11-16
JP7074369B2 (ja) 2022-05-24
US20210106624A1 (en) 2021-04-15
JP2020127401A (ja) 2020-08-27
AU2020203971B2 (en) 2021-11-25
PE20240645A1 (es) 2024-04-04
JP7205919B2 (ja) 2023-01-17
US20230241106A1 (en) 2023-08-03
US11806366B2 (en) 2023-11-07
SI3322717T1 (sl) 2020-09-30
KR20220075451A (ko) 2022-06-08
CA3221097A1 (en) 2017-01-19
DK3322717T3 (da) 2020-08-10
CL2019003313A1 (es) 2020-03-13
US20210260123A1 (en) 2021-08-26
JP2020198875A (ja) 2020-12-17
AU2016293047B2 (en) 2020-09-17
SG10202100292VA (en) 2021-02-25
US20190381103A1 (en) 2019-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7205919B2 (ja) 上皮性卵巣がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
RS61713B1 (sr) Peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka prostate i drugih malignih tumora
RS61787B1 (sr) Peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka dojke i drugih malignih tumora
RS60592B1 (sr) Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, posebno hronične limfocitne leukemije (hll)
CA3108578A1 (en) B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods
CA3068852A1 (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against lung cancer, including nsclc, sclc and other cancers
KR20210104674A (ko) B*08 제약 펩티드 및 펩티드의 조합에 의한 암에 대한 면역요법 및 관련 방법들
HK40026447A (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
HK1253574B (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers