RS61787B1 - Peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka dojke i drugih malignih tumora - Google Patents

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumorasociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.

Predmetni pronalazak odnosi se na peptidnu sekvencu dobijenu iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koja može da se koristi u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.

OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU

Rak dojke je ubedljivo najčešće dijagnostikovan rak i uzrok smrti zbog raka kod žena. U 2012. godini bilo je procenjenih 1,7 miliona novih slučajeva (25% svih malignih tumora kod žena) i 0,5 miliona smrti zbog raka (15% svih smrti zbog raka kod žena). Godišnja incidencija u industrijskim zemljama je 70–90 novih slučajeva na 100.000 žena, što je 2 puta više u poređenju sa zemljama kategorizovanim kao zemlje na niskom stepenu razvoja.

Uzrasno-standardizovane stope incidencije su najviše u Zapadnoj Evropi a najniže u Istočnoj Aziji. Stope mortaliteta se razlikuju oko 2–5 puta širom sveta; stopa fatalnosti je niža u zemljama na višem stepenu razvoja. Oko 43% procenjenih novih slučajeva i 34% smrti zbog raka dogodilo se u Evropi i Severnoj Americi.

Dok se incidencija uopšteno povećava u većini regija sveta, u više visoko razvijenih zemalja ona je dostigla maksimum i opada u toku poslednje decenije. Stope mortaliteta opadaju u više visoko razvijenih zemalja od kraja osamdesetih godina prošlog veka i početka devedesetih godina prošlog veka, kao posledica kombinacije poboljšanog otkrivanja i ranog postavljanja dijagnoze (pomoću skrininga populacije) i efikasnijih terapijskih režima (World Cancer Report, 2014).

Faktori rizika za rak dojke koji su dobro okarakterisani obuhvataju uzrast, porodičnu anamnezu, reproduktivne faktore uključujući nuliparitet, prvi porođaj nakon 30. godine, denzitet na mamografiji i atipiju u ranijoj benignoj biopsiji dojke. Agensi koji izazivaju rak dojke obuhvataju konzumiranje alkohola, upotrebu kombinovanih estrogenskih-progestogenskih kontraceptiva i terapije za menopauzu, izlaganje X ili γ zračenju i faktore u vezi sa stilom života poput visokokalorijske ishrane i nedostatka vežbanja. Fizička aktivnost je povezana sa smanjenjem rizika za rak dojke od 25–30% zbog smanjenja endogenih estrogena, masnog tkiva, insulinske rezistencije, leptina i zapaljenja, koji su svi nezavisno povezani sa povećanim rizikom za rak dojke (Winzer et al., 2011).

Mala proporcija rakova dojke nastaje zbog nasleđenih mutacija u visoko penetrantnim genima podložnosti za rak dojke (BRCA1 i BRCA2).

Nekoliko niže penetrantnih gena je otkriveno pomoću tehnologije sekvenciranja naredne generacije koja je primenjena da bi se ispitali genomi 100 rakova dojke za somatske promene broja kopija i mutacije u kodirajućim egzonima gena koji kodiraju proteine (Stephens et al., 2012). Broj somatskih mutacija se primetno razlikovao među pojedinačnim tumorima. Bile su evidentne snažne korelacije između broja mutacija, uzrasta u kojem je rak dijagnostikovan i histološkog gradusa raka, a zapaženo je više mutacionih potpisa, uključujući jedan, prisutan u oko 10% tumora, kojeg karakterišu brojne mutacije citozina u TpC dinukleotidima. Pokretačke mutacije su identifikovane u nekoliko novih gena raka, uključujući AKT2, ARID1B, CASP8, CDKN1B, MAP3K1, MAP3K13, NCOR1, SMARCD1 i TBX3. Među navedenih 100 tumora, postojale su pokretačke mutacije u najmanje 40 gena raka i 73 različite kombinacije mutiranih gena raka. Celokupno, jedan od gena koji najviše doprinosi razvoju raka dojke, TP53, je bez obzira na to verovatno uključen u samo 25% rakova, iako je njegova uloga u podskupu rakova dojke, kao što su trostruko negativni/nalik bazalnom, mnogo veća. Čini se da je u malom procentu tumora uključen veliki broj gena, te će ovo predstavljati dodatan izazov za ostvarivanje sna o ciljanoj i personalizovanoj medicinskog intervenciji specifičnoj za pacijenta.

Rak dojke nije jedna bolest već je i klinički i morfološki heterogena. Važeća klasifikacija tumora dojke SZO (4. izdanje) prepoznaje više od 20 različitih podtipova. Većina rakova dojke nastaje iz epitelijalnih ćelija (karcinomi); ovi tumori su dalje podeljeni na in situ i invazivne lezije. In situ karcinomi su preinvazivne lezije i dalje su podeljeni na duktalni karcinom in situ (DCIS) i lobularni karcinom in situ (LCIS). Razlika između DCIS i LCIS nije posledica mikroanatomskog mesta porekla (duktusi ili lobulusi) već razlike u arhitektonskim i citološkim karakteristikama ćelija. DCIS i LCIS se takođe razlikuju po svojoj distribuciji unutar dojke, kao i po svom riziku rekurencije i progresije u invazivni karcinom.

Invazivni karcinom koji se karakteriše kao „nijedan poseban tip“, takođe poznat kao duktalni karcinom, nijedan poseban tip ili invazivni duktalni karcinom, čini najveći podskup invazivnog karcinoma dojke. Ova oznaka identifikuje heterogenu grupu koju čine tumori koji ne mogu lako da se kategorišu na osnovu specifičnih morfoloških karakteristika koje karakterišu „posebne podtipove“. Stoga, to je podrazumevana dijagnoza za sve one tumore (približno 70%) kojima ne može da se dodeli naziv „posebnog podtipa“. Najčešći od posebnih podtipova uključuju lobularni karcinom, tubularni karcinom, mucinozni karcinom, karcinom sa medularnim i apokrinim karakteristikama, mikropapilarne i papilarne karcinome i metaplastične karcinome.

Histološki gradus je mera toga koliko tumor nalikuje tkivu iz kojeg potiče i integralni je deo patološkog izveštaja. Važeći sistem određivanja gradusa procenjuje stepen tri parametara arhitektonske diferencijacije, jedarnog pleomorfizma i proliferacije tumora. Iako ovaj semikvantitativni pristup uprosečava intratumorsku heterogenost koja postoji kod mnogih tumora, on ostaje snažan indikator pacijentove prognoze. Histološki gradus je takođe snažno povezan sa histološkim tipom i obrascima molekulskih promena, kao što je ekspresiija estrogenskog receptora (ER) i progesteronskog receptora (PR) i prekomerna ekspresija proteina receptora 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2) i amplifikacijom gena.

Nedavne molekularne i genetske studije su istakle da je rak dojke visoko heterogena grupa bolesti koje se razlikuju po svojoj prognozi i odgovoru na terapiju. Poboljšano razumevanje molekulskih puteva i genetskih promena koje leže u osnovi različitih podtipova raka dojke dovodi do ciljanijeg i personalizovanijeg pristupu lečenju raka dojke.

Standardna terapija za pacijente sa rakom dojke zavisi od različitih parametara: stadijuma tumora, statusa hormonskog receptora i obrasca ekspresije HER2. Standardno lečenje podrazumeva kompletnu hiruršku resekciju tumora nakon koje sledi zračna terapija. Hemioterapija uglavnom antraciklinima i taksanima može da se započne pre ili nakon resekcije. U uznapredovalim stadijumima, dodatni hemioterapeutici kao što su alkilirajući agensi, fluoropirimidini, analozi platine itd. mogu da se primene u vidu mono- ili kombinovane terapije. Pacijenti sa HER2-pozitivnim tumorima dobijaju anti-HER2 antitelo trastuzumab u dodatku hemioterapeutika. Inhibitor vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) bevacizumab sinergistički deluje sa monoterapijom paklitakselom ili kapecitabinom. Hemioterapija je tipično manje efikasna kod pacijenata sa tumorima pozitivnim na estrogenski ili progesteronski receptor. Za ove pacijente, standardni režim se sastoji od endokrinološke terapije tamoksifenom (prva linija) ili inhibitorima aromataze (druga linija) nakon inicijalne hemioterapije (S3-Leitlinie Mammakarzinom, 2012).

Više od decenije se primenjuje profiliranje genske ekspresije kako bi se definisali molekulski fenotipovi raka dojke i pronađeno je da su podtipovi luminalni A i nalik bazalnom dva glavna podtipa od pet koji su identifikovani. Ovaj tip analize ne samo da je potvrdio dva velika podskupa raka dojke – ER-pozitivan i ER-negativan – već je izneo u prvi plan razlike u okviru ER kategorija.

Korišćenjem ovih podataka o ekspresiji gena, sve je više moguće da se klasifikuje rak dojke, razviju potpisi za „dobru“ naspram „loše“ prognoze i identifikuju tumori koji će možda odreagovati na određenu terapiju ili neće (van de Vijver et al., 2002). Znanje koje se brzo razvija o molekulskim događajima i signalnim putevima koji leže u osnovi razvoja i progresije raka dojke takođe je dovelo do identifikacije sve većeg broja novih terapijskih ciljeva i razvoja lekova protiv ovih ciljeva. Trenutno se širom sveta sprovode mnoga klinička ispitivanja radi procene uloge ovih novih ciljanih terapija u lečenju pacijenata sa rakom dojke. Novije ciljane terapije koje su bile procenjivane ili se procenjuju, pojedinačno ili u međusobnoj kombinaciji i u kombinaciji sa tradicionalnim citotoksičnim agensima, uključuju inhibitore angiogeneze, inhibitore tirozin kinaze, inhibitore sisarskog cilja rapamicina (mTOR), inhibitore poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP1), inhibitore receptora insulinu-sličnog faktora rasta 1 (IGF-1R), inhibitore proteazoma, inhibitore fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i druge (Perez and Spano, 2012). Krajnji cilj ovog istraživanja je da se bude u stanju da se napravi terapija za rak dojke za individualne pacijente na osnovu konkretnih molekulskih karakteristika tumora. Molekulske analize su takođe relevantne za preživljavanje. Jedna studija koristila je modeliranje informacione RNK (iRNK), promenu broja kopija, mikroRNK i metilaciju (Kristensen et al., 2012). Za sve rakove dojke, najsnažniji prediktor dobrog ishoda bila je akvizicija genskog potpisa koji je favorizovao visok odgovor T-pomoćničkim tip 1(Th1)/citotoksičnim T limfocitima na uštrb Th2-vođene imunosti.

Ovi podaci odražavaju da je rak dojke imunogeni tumorski entitet i da različite vrste infiltrirajućih imunskih ćelija u primarnim tumorima pokazuju osoben prognostički i prediktivni značaj. Veliki broj ispitivanja imunoterapije u ranoj fazi je sprovedeno kod pacijenata sa rakom dojke. Većina završenih studija vakcinacije ciljalo je HER2 i ugljenohidratne antigene kao što je MUC-1 i otkrile su prilično razočaravajuće rezultate. Klinički podaci o efektima modulacije imunske kontrolne tačke pomoću ipilimumaba i drugih antitela koja aktiviraju T ćelije kod pacijenata sa rakom dojke su u razvoju (Emens, 2012).

Imajući u vidu teška neželjena dejstva i trošak lečenja raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno raka dojke. Takođe postoji potreba da se identifikuju faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za rak dojke, koji bi doveli do boljeg dijagnostikovanja raka, bolje procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumorasociranih antigena.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični. f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumorasociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.

MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.

Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).

Elongirani (duži) peptidi pronalaska mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.

T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferona-gama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji vezuju MHC klasa I su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželj-

1

no da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektni tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju pronalaska je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR) i antitela ili drugih vezujućih molekula (skele) u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.

Patent WO 02/16939 A2 iznosi da peptidi dobijeni od BCR4 stimulišu imunsku reakciju protiv tumora te su tako korisni za imunoterapiju raka dojke. Patent WO 02/16939 A2 takođe iznosi nukleinske kiseline koje kodiraju peptide, rekombinantne ćelije domaćine, antitela, farmaceutske smeše, komplete i upotrebu za lečenje raka.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 42; ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

U sledećim tabelama prikazani su ovde predstavljeni peptidi, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) geni za ove peptide. Svi peptidi u tabeli 1 i tabeli 2 vezuju se za HLA-A*02. Peptidi u tabeli 2 objavljeni su ranije u velikim spiskovima kao rezultati visoko propusnih skrininga sa velikim stopama greške ili su izračunati pomoću algoritama, ali nisu nikada ranije bili povezani sa malignim tumorom. Peptidi u tabeli 3 su dodatni peptidi koji mogu biti korisni u kombinaciji sa drugim ovde predstavljenim peptidima. Peptidi u tabeli 4 su pored toga korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju različitih drugih maligniteta, koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.

Tabela 1: Izneti peptidi.

J = fosfoserin U = fosfotreonin

Tabela 2: Dodatni predstavljeni peptidi bez prethodno poznate povezanosti sa malignim tumorima. ID BR. SEKV: 42 je u skladu sa predmetnim pronalaskom.

J – fosfoserin U – fosfotreonin

Tabela 3: Pe tidi korisni za n r. ersonalizovane antitumorske tera ie.

1

Predmetni pronalazak se dalje uopšteno odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, akutna mijelogena leukemija, rak žučnih puteva, rak mozga, hronična limfocitna leukemija, kolorektalni karcinom, rak jednjaka, rak žučne kese, rak želuca, hepatocelularni karcinom, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, non-Hodžkinov limfom, nesitnoćelijski karcinom pluća, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, karcinom bubrežnih ćelija, sitnoćelijski karcinom pluća, rak mokraćne bešike i rak materice.

Obezbeđen je peptid – samostalno ili u kombinaciji – u skladu sa predmetnim pronalaskom prema ID BR. SEKV: 42.

Kako je prikazano u sledećim tabelama 4A i B, mnogi od predstavljenih peptida se takođe nalaze i na drugim vrstama tumora, te se stoga mogu koristiti i u imunoterapiji drugih indikacija. Takođe pogledajte slike 1 i primer 1.

Tabela 4A: Predstavljeni peptidi i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, posebno u drugim malignim bolestima. U tabeli je prikazano, za izabrane peptide, na kojim dodatnim vrstama tumora su pronađeni i bilo da su prekomerno prezentovani na više od 5% izmerenih uzoraka tumora ili prezentovani na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana su bila: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, ćelije krvi, krvni sud, kostna srž, mozak, hrskavica, jednak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, debelo crevo, jetra, pluća, limfni čvor, nerv, pankreas, paraštitasta žlezda, peritoneum, hipofiza, pleura, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, timus, štitasta žlezda, traheja, ureter i mokraćna bešika.

1

1

1

NSCLC = nesitnoćelijski rak pluća, SCLC = sitnoćelijski rak pluća, RCC = rak bubrega, CRC = rak kolona ili rektuma, GC = rak želuca, HCC = rak jetre, PC = rak pankreasa, PrC = rak prostate, leukemija, BRCA = rak dojke, MCC = karcinom Merkelovih ćelija

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom prema ID BR. SEKV: 42 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovanu – lečenje NHL.

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom prema ID BR. SEKV: 42 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovanu – lečenje melanoma.

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom prema ID BR. SEKV: 42 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovanu – lečenje raka mokraćne bešike.

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom prema ID BR. SEKV: 42 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovanu – lečenje CLL.

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom za – poželjno kombinovanu – lečenje proliferativne bolesti izabrane iz grupe koju čine rak dojke, akutna mijelogena leukemija, rak žučnih puteva, rak mozga, hronična limfocitna leukemija, kolorektalni karcinom, rak jednjaka, rak žučne kese, rak želuca, hepatocelularni karcinom, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, non-Hodžkinov limfom, nesitnoćelijski karcinom pluća, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, karcinom bubrežnih ćelija, sitnoćelijski karcinom pluća, rak mokraćne bešike i rak materice.

1

Tabela 1B: Predstavljeni peptidi i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, posebno u drugim malignim bolestima. U tabeli je prikazano, kao tabeli 4A, za izabrane peptide, na kojim dodatnim vrstama tumora je pronađeno da pokazuju prekomernu prezentaciju (uključujući specifičnu prezentaciju) na više od 5% izmerenih uzoraka tumora, ili prezentaciju na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana su bila: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, ćelije krvi, krvni sud, kostna srž, mozak, jednjak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, debelo crevo, jetra, pluća, limfni čvor, nerv, pankreas, paraštitasta žlezda, peritoneum, hipofiza, pleura, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, štitasta žlezda, traheja, ureter, mokraćna bešika.

1

NSCLC = nesitnoćelijski rak pluća, SCLC = sitnoćelijski rak pluća, RCC = rak bubrega, CRC = rak kolona ili rektuma, GC = rak želuca, HCC = rak jetre, PC = rak pankreasa, PrC = rak prostate, leukemija, BRCA = rak dojke, MCC = karcinom Merkelovih ćelija, OC = rak jajnika, NHL = non-Hodžkinov limfom, AML = akutna mijeloidna leukemija, CLL = hronična limfocitna leukemija.

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom prema bilo kojoj ID BR. SEKV: 42 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovanu – lečenje HNSCC.

Predmetni pronalazak se zatim odnosi na predstavljene peptide koji imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili – u produženom obliku, kao što je varijanta dužine – MHC klase II.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom naznačen time što navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu prema ID BR. SEKV: 42.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

2

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv kompleksa navedenih peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom sa MHC i metode za pravljenje istih.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.

Antitela i TCR su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa prikazanim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na navedeni metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 42.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, aktiviranog T limfocita, T-ćelijskog receptora ili antitela ili drugog peptida – i/ili molekula koji vezuju peptid-MHC u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, navedeni lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je ćelijska terapija, vakcina ili protein zasnovan na solubilnom TCR ili antitelu.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije raka dojke, akutne mijelogene leukemije, raka žučnih puteva, raka mozga, hronične limfocitne leukemije, kolorektalnog karcinoma, raka jednjaka, raka žučne kese, raka želuca, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, non-Hodžkinovog limfoma, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, raka jajnika, raka pankreasa, raka prostate, karcinoma bubrežnih ćelija, sitnoćelijskog karcinoma pluća, raka mokraćne bešike i raka materice, i poželjno ćelije raka dojke.

Predstavljeni su biomarkeri zasnovani na peptidima u skladu sa predmetnim pronalaskom, u ovom dokumentu nazvani „ciljevi“, koji mogu da se koriste u dijagnostikovanju raka, poželjno raka dojke. Marker može da bude prekomerna prezentacija samog(ih) peptida odnosno prekomerna ekspresija odgovarajućeg(ih) gena. Markeri se takođe mogu koristiti za predviđanje verovatnoće uspeha terapije, poželjno imunoterapije, te najpoželjnije imunoterapije čiji je cilj isti kao onaj koji se identifikuje biomarkerom. Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC.

Opciono, antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

I terapijske i dijagnostičke primene protiv dodatnih malignih bolesti predstavljene su u sledećem detaljnijem opisu osnovnih proizvoda ekspresije (polipeptida) peptida u skladu sa pronalaskom.

Pokazano je da SLC39A6 ima presudnu ulogu u metastaziranju raka dojke inaktiviranjem GSK-3beta (kinaza glikogen sintetaze 3beta) putem Akt, što dovodi do aktivacije Snail (Hogstrand et al., 2013). Pored raka dojke, pronađeno je da je SLC39A6 takođe prekomerno eksprimiran u melanomu, skvamocelularnom karcinomu jednjaka (ESCC), raku prostate, jajnika, pankreasa i materice (Unno et al., 2014; Sussman et al., 2014; Cui et al., 2015). Indukovana nishodna regulacija SLC39A6 u hepatocelularnom karcinomu dovela je do smanjene ekspresije SLC39A6 i posledično nishodno regulisane ekspresije SNAIL i ushodno regulisane ekspresije E-kadherina (Shen et al., 2013; Lian et al., 2016).

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

2

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, i duži sa dužinom od 10 ili 11 aminokiselina ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante peptida pronalaska) oni mogu biti dužine od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Napomenuto je da se soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Termin „polipeptid kompletne dužine“ označava kompletan protein (lanac aminokiselina) ili kompletnu podjedinicu (lanac aminokiselina) multimernog proteina.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 5: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori et al., 1997) primenom Hardi-Vajnbergove formule F = 1 – (1-Gf)². Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu

2

na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (Chanock et al., 2004).

2

Peptid pronalaska, poželjno kada je uključen u vakcinu pronalaska kako je ovde opisana, vezuje se za A*02. Vakcina može takođe da uključuje sve-vezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina pronalaska može da se koristi za lečenje malignog tumora kod pacijenata koji su A*02 pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.

Ako se A*02 peptidi pronalaska kombinuju sa peptidima koji se vezuju za drugi alel, na primer A*24, veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva alela samog može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina koja sadrži HLA-A*24 i HLA-A*02 epitope može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).

U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

2

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

2

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može

2

obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i

(iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Kako je ranije navedeno, predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 42, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Peptid pronalaska ima sposobnost da se vezuje za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj.

1

peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. Tako će osoba stručna u predmetnoj oblasti moći da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u ID BR. SEKV: 42, zadržavanjem poznatih sidrenih ostataka, i biće u stanju da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost vezivanja za MHC molekule klase I ili II. Predstavljene varijante zadržavaju sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija, koje naknadno mogu unakrsno reagovati sa i ubiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska.

Originalni (nemodifikovani) peptidi kako su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, te supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili

2

slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima predstavljenim ovde. Pored toga, nestandardne aminokiseline (tj. koje nisu uobičajene proteinogene aminokiseline koje se javljaju u prirodi) mogu se takođe koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi predstavljeni ovde.

Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

Peptid koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu može imati zamenjenu jednu ili dve nesidrene aminokiseline (vidite u nastavku u pogledu sidrenog motiva) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom. U drugom otelotvorenju, u peptidu koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu, jedna ili dve aminokiseline mogu biti zamenjene njihovim partnerima za konzervativnu zamenu (vidite u nastavku dokumenta) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom.

Aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugim aminokiselinama čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, ovde predstavljeni peptid može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili njihovu varijantu kako je naznačeno.

Peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Poželjno, kada se T ćelije specifične za peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l.

4

Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

Pored toga, peptid ili varijanta mogu biti dalje modifikovani da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje nepeptidnih veza.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptid naznačen time što peptid sadrži nepeptidne veze je poželjno otelotvorenje pronalaska.

Drugo otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na peptid koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV: 42 i koji je sintetički proizveden (npr. sintetisan) u vidu farmaceutski prihvatljive soli. Metodi sintetičke proizvodnje peptida dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno se razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi stvoreni in vivo nisu soli. Peptid u obliku neprirodne soli posreduje u rastvorljivosti peptida, konkretno u kontekstu farmaceutskih smeša koje sadrže peptide, npr. peptidne vakcine predstavljene u ovom dokumentu. Neophodna je dovoljna i barem značajna rastvorljivost peptida da bi se ispitaniku koji se leči efikasno obezbedili peptidi. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida. Ove soli u skladu sa pronalaskom obuhvataju alkalne i zemnoalkalne soli kao što su soli Hofmeister serije koja sadrži kao anjone PO4<3->, SO4<2->, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN<->i kao katjone NH4<+>, Rb<+>, K<+>, Na<+>, Cs<+>, Li<+>, Zn<2+>, Mg<2+>, Ca<2+>, Mn<2+>, Cu<2+>i Ba<2+>. Soli su konkretno izabrane od (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2i Ba(SCN)2. Naročito poželjne su NH acetat, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl i CaCl2, kao, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.

Uopšteno, peptidi i varijante (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas i sar. (Lukas et al., 1981) i u tamo citiranim referencama. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksilkarbodiimid/1hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija prema veličini, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2015) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995) (uporedite primer 1, slike 1).

Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprej-jonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) zabeleženog iz uzoraka raka dojke (N = 17 A*02-pozitivna uzorka) sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog malignog tumora dobijenog od 17 pacijenta sa rakom dojke.

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016 koji je ovde u celosti uključen putem reference) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tkiva raka dojke su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP-ovi koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog raka dojke čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom raku dojke.

TUMAP-ovi identifikovani na multiplim tkivima raka dojke i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.

Pored prekomerne prezentacije peptida, testirana je i iRNK ekspresija osnovnog gena. Podaci iRNK dobijeni su putem RNKSeq analiza normalnih tkiva i tkiva raka (uporedite primer 2, slike 2). Dodatni izvor podataka normalnog tkiva je bila baza podataka javno dostupnih podataka ekspresije RNK od oko 3000 uzoraka normalnog tkiva (Lonsdale, 2013). Peptidi koji su dobijeni iz proteina čija je kodirajuća iRNK visoko eksprimirana u tkivu raka, ali vrlo nisko ili je odsutna u vitalnim normalnim tkivima, su poželjno uključeni u predmetni pronalazak.

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju raka / tumora, poželjno raka dojke koji prekomerno ili isključivo prezentuju peptide pronalaska. Za ove peptide je pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na uzorcima primarnog humanog raka dojke.

Dokazano je da su mnogi izvorni geni/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u raku u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ovog pronalaska označavaju ili zdrave ćelije dojke ili normalne ćelije drugih tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (vidite primer 2). Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ovog pronalaska označava uzorak od pacijenta koji boluje od raka dojke, ali ne na normalnim tkivima (vidite primer 1).

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije kraka dojke koje prezentuju dobijene peptide.

Za peptide predmetnog pronalaska je dokazano da su sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore i/ili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, kao što su solubilni TCR-ovi, u skladu sa predmetnim pronalaskom (vidite primer 3 i primer 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako su peptidi predmetnog pronalaska korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Takođe su obezbeđeni peptidi u skladu sa pronalaskom koji su sposobni da se vezuju za TCR-ove i antitela kada ih prezentuje MHC molekul. Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.

4

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I.

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetnog pronalaska obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR i/ili beta lancu TCR ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk od afiniteta vezivanja/poluživota vezivanja TCR koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR i/ili nemutirani beta lanac TCR. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za peptide može da se pojača pomoću metoda koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/peptidni monomeri, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRαꞵ genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa peptidom, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur.

4

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-alfa i/ili TCR-beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigena specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR-alfa i/ili TCR-beta lanaca.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTRs), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), ꞵ-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.

Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR-alfa i TCR-beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR-alfa i TCR-beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR-alfa i TCR-beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR-alfa i TCR-beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR-alfa i TCR-beta lanaca. (Schmitt et al.2009).

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni“ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR-alfa i TCR-beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR-alfa i TCR-beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR-alfa i TCR-beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR-alfa i u TCR-beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR-alfa i

4

TCR-beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR-alfa i TCR-beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

4

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je imunoterapeutik, kao što je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transfektovane tako da ko-eksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 42 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid ili varijantu peptida pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK,

4

cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK i sar. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901,

4

4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

4

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže pre-pro-tripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

U drugom otelotvorenju dva ili više predstavljenih peptida su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti mogu takođe da se koriste za antitumorsku terapiju i mogu indukovati imunske odgovore koji uključuju i MHC I i MHC II.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen i sar. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012) . Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman i sar. (Sherman et al., 1986) . Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u

1

predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju, ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog karcinoma prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125

2

µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel i sar. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Lek pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CD8-pozitivnim T ćelijama i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil, ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema opisani su ranije (Allison and Krummel, 1995). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Tolllike receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1 ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1 indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent US 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske

4

smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, celebreksa, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.

Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda ili rezikvimoda. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču.

Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, razblaživača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz priručnika A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga, napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristi „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptidi predmetnog pronalaska mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inženjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003), koji su svi za potrebe ovog pronalaska ovde u celosti izričito uključeni putem reference.

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska takođe smatra „specifičnim“.

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence ID BR. SEKV: 42, ili njenu farmaceutsku prihvatljivu so.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, naznačen time što peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju raka dojke.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačen time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 42 ili navedenu varijantu aminokiselinske sekvence.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačene time što navedene T ćelije selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije raka dojke ili drugog solidnog ili hematološkog tumora kao što su akutna mijelogena leukemija, rak žučnih puteva, rak mozga, hronična limfocitna leukemija, kolorektalni karcinom, rak jednjaka, rak žučne kese, rak želuca, hepatocelularni karcinom, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, non-Hodžkinov limfom, nesitnoćelijski karcinom pluća, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, karcinom bubrežnih ćelija, sitnoćelijski karcinom pluća, rak mokraćne bešike i rak materice.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovanih verzija molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog (poli)peptida raka dojke, isporučivanje toksina ćeliji raka dojke koja eksprimira markerski gen za rak u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida raka dojke) u skladu sa pronalaskom.

Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za rak dojke kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 42 polipeptid može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za rak dojke koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd.; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patenti-

1

ma WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će

2

takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje raka dojke, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhe odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti pove-

4

zan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetnog pronalaska mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.

Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren i sar. (Ljunggren and Karre, 1985).

Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 42.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Plebanski i sar. (Plebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili niskoaviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga, takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga mogu da se koriste i virusi biljaka (pogledajte, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) u kom je opisan razvoj mozaičkog virusa crnog pasulja kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV 42.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa nivoima ekspresije u normalnim tkivima, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih. Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: radu Gattioni i sar. i Morgan i sar. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Predstavljena je upotreba peptida koji su u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato, svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Predmetni pronalazak je dalje usmeren na komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Kompleti predmetnog pronalaska se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži(e) uputstva na posudi ili uz nju koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr.2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Kompleti predmetnog pronalaska mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, kompleti pronalaska obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd.) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente predmetnog kompleta.

Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.

Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz raka dojke, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje raka dojke.

TUMAP-ovi mogu biti identifikovani kod pacijenta de novo, a zatim uključeni u vakcinu.

Kao jedan primer, kandidati za TUMAP mogu da se identifikuju kod pacijenta pomoću (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora, kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC molekule klase I i/ili klase II u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira.

1

Kao drugi primer, mogu biti identifikovani proteini koji sadrže mutacije koje su jedinstvene za uzorak tumora u odnosu na normalno istovetno tkivo od pojedinačnog pacijenta, te mogu biti identifikovani TUMAP-ovi koji specifično ciljaju mutaciju. Na primer, genom tumora i istovetnog normalnog tkiva može da se sekvencira pomoću sekvenciranja celog genoma: Za otkrivanje nesinonimnih mutacija u regionima gena koji kodiraju protein, iz tumorskih tkiva se ekstrahuju genomska DNK i RNK, a normalna nemutirana genomska DNK germinativne linije se ekstrahuje iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Primenjeni NGS pristup ograničen je na resekvenciranje regiona koji kodiraju protein (resekvenciranje egzoma). U ovu svrhu, egzonska DNK iz uzoraka ljudskog porekla se sakuplja pomoću kompleta za obogaćivanje cilja koje dostavlja dobavljač, nakon čega sledi sekvenciranje pomoću npr. HiSeq2000 (Illumina). Dodatno, tumorska iRNK se sekvencira radi direktne kvantifikacije genske ekspresije i potvrde da su mutirani geni eksprimirani u tumorima pacijenata. Nastali milioni očitanih sekvenci se obrađuju kroz algoritme softvera. Izlazna lista sadrži mutacije i ekspresiju gena. Tumor-specifične somatske mutacije se utvrđuju upoređivanjem sa germinativnim varijacijama dobijenim iz PBMC i daje im se prioritet. De novo identifikovani peptidi zatim mogu da se testiraju u pogledu imunogenosti kako je opisano ranije za skladište, a kandidati za TUMAP-ove koji poseduju prikladnu imunogenost se biraju za uključivanje u vakcinu.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) koje prezentuje uzorak tumora pojedinačnog pacijenta pomoću ranije opisanog metoda; (b) upoređivanja peptida identifikovanih pod tačkom a) sa skladištem peptida koji su prethodno ispitani za imunogenost i prekomernu prezentaciju u tumorima u poređenju sa odgovarajućim normalnim tkivom; (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta koji korelira sa tumor-asociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta; i (d) opciono, biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo pod tačkom (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; i (b) biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo u tački (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

2

Vakcina se proizvodi kada se izaberu peptidi za personalizovanu vakcinu zasnovanu na peptidima. Vakcina je poželjno tečna formulacija koja sadrži pojedinačne peptide rastvorene u između 20–40% DMSO, poželjno oko 30–35% DMSO, kao što je oko 33% DMSO.

Svaki peptid koji će biti uključen u proizvod se rastvara u DMSO. Koncentracija rastvora pojedinačnih peptida treba da se izabere u zavisnosti od broja peptida koji će biti uključeni u proizvod. Rastvori pojedinačan peptid-DMSO se mešaju u jednakim delovima kako bi se dobio rastvor koji sadrži sve peptide koji treba da budu uključeni u proizvod sa koncentracijom od ~2,5 mg/ml po peptidu. Pomešani rastvor se zatim razblažuje u odnosu 1:3 sa vodom za injekcije kako bi se dobila koncentracija od 0,826 mg/ml po peptidu u 33% DMSO. Razblaženi rastvor se filtrira kroz sterilni filter veličine 0,22 µm. Dobijen je konačan ukupni rastvor.

Konačni ukupni rastvor se puni u bočice i čuva na -20 °C do upotrebe. Jedna bočica sadrži 700 µl rastvora koji sadrži 0,578 mg svakog peptida. Od toga će 500 µl (pribl.

400 μg po peptidu) biti primenjeno za intradermalnu injekciju.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, i uz upućivanje na pridružene slike, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

SLIKE

Slike 1A do N pokazuju prekomernu prezentaciju različitih peptida u normalnim tkivima (beli stupci) i raku dojke (crni stupci). Slika 1A – CILP, peptid: KMPEHISTV (ID BR. SEKV: 1), tkiva sleva nadesno: 2 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 4 ćelije krvi, 10 krvnih sudova, 9 kostnih srži, 7 mozgova, 6 dojki, 2 hrskavice, 2 oka, 3 žučne kese, 6 srca, 14 bubrega, 19 debelih creva, 20 jetri, 45 pluća, 8 limfnih čvorova, 7 nerava, 3 jajnika, 10 pankreasa, 3 paraštitaste žlezde, 1 peritoneum, 5 hipofiza, 6 placenti, 3 pleure, 3 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 5 skeletnih mišića, 6 koža, 4 tanka creva, 11 slezina, 5 želudaca, 6 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 9 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 4 materice, 6 jednjaka, 22 uzoraka raka dojke. Peptid je dodatno detektovan na 1/19 rakova pankreasa i 2/89 nesitnoćelijskih karcinoma pluća. Slika 1B – TFAP2B, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, peptid: SLVEGEAVHLA (ID BR. SEKV: 4), tkiva sleva nadesno: 2 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 4 ćelije krvi, 10 krvnih sudova, 9 kostnih srži, 7 mozgova, 6 dojki, 2 hrskavice, 2 oka, 3 žučne kese, 6 srca, 14 bubrega, 19 debelih creva, 20 jetri, 45 pluća, 8 limfnih čvorova, 7 nerava, 3 jajnika, 10 pankreasa, 3 paraštitaste žlezde, 1 peritoneum, 5 hipofiza, 6 placenti, 3 pleure, 3 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 5 skeletnih mišića, 6 koža, 4 tanka creva, 11 slezina, 5 želudaca, 6 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 9 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 4 materice, 6 jednjaka, 22 uzoraka raka dojke. Peptid je dodatno detektovan na 1/6 rakova žučne kese i žučnih puteva, 1/20 rakova jajnika, 1/18 rakova jednjaka i 1/89 nesitnoćelijskih karcinoma pluća. Slika 1C – DUSP4, peptid: FSFPVSVGV (ID BR. SEKV: 20), tkiva sleva nadesno: 2 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 4 ćelije krvi, 10 krvnih sudova, 9 kostnih srži, 7 mozgova, 6 dojki, 2 hrskavice, 2 oka, 3 žučne kese, 6 srca, 14 bubrega, 19 debelih creva, 20 jetri, 45 pluća, 8 limfnih čvorova, 7 nerava, 3 jajnika, 10 pankreasa, 3 paraštitaste žlezde, 1 peritoneum, 5 hipofiza, 6 placenti, 3 pleure, 3 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 5 skeletnih mišića, 6 koža, 4 tanka creva, 11 slezina, 5 želudaca, 6 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 9 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 4 materice, 6 jednjaka, 22 uzoraka raka dojke. Peptid je dodatno pronađen na 2/6 rakova žučne kese i žučnih puteva, 8/12 melanoma, 10/20 uzoraka non-Hodžkinovog limfoma, 2/20 rakova jajnika, 2/19 rakova pankreasa, 7/47 rakova želuca, 23/89 nesitnoćelijskih karcinoma pluća, 2/18 karcinoma bubrežnih ćelija, 2/17 sitnoćelijskih karcinoma pluća, 6/15 rakova mokraćne bešike i 2/15 rakova materice. Slika 1D) – MAGED1, peptid: GLLGFQAEA (ID BR. SEKV: 24), tkiva sleva nadesno: 2 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 4 ćelije krvi, 10 krvnih sudova, 9 kostnih srži, 7 mozgova, 6 dojki, 2 hrskavice, 2 oka, 3 žučne kese, 6 srca, 14 bubrega, 19 debelih creva, 20 jetri, 45 pluća, 8 limfnih čvorova, 7 nerava, 3 jajnika, 10 pankreasa, 3 paraštitaste žlezde, 1 peritoneum, 5 hipofiza, 6 placenti, 3 pleure, 3 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 5 skeletnih mišića, 6 koža, 4 tanka creva, 11 slezina, 5 želudaca, 6 testisa, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 9 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 4 materice, 6 jednjaka, 22 uzoraka raka dojke. Peptid je dodatno pronađen na 4/21 akutne mijeloidne leukemije, 2/48 rakova prostate, 1/17 hroničnih limfocitnih leukemija, 2/27 kolorektalnih karcinoma, 1/6 rakova žučne kese i žučnih puteva, 3/18 hepatocelularnih karcinoma, 3/12 melanoma, 6/20 non-Hodžkinovih limfoma, 7/20 rakova jajnika, 3/18 rakova jednjaka, 1/19 rakova pankreasa, 6/31 raka mozga, 3/47 rakova želuca, 12/89 nesitnoćelijskih karcinoma pluća,

4

2/18 karcinoma bubrežnih ćelija i 3/15 rakova materice. Odstupanja u pogledu liste tipova tumora između slike 1D i tabele 4 mogu biti usled strožijih kriterijuma za izbor primenjenih u tabeli 4 (za detalje vidite tabelu 4). Slika 1E) Gen: CNTD2, peptid: ALAGSSPQV (ID BR. SEKV: 2). Uzorci sleva nadesno: 5 tkiva raka (3 raka dojke, 1 rak kolona, 1 rak jetre). Slika 1F) Gen: LRRC8E, peptid: GLHSLPPEV (ID BR. SEKV: 10). Uzorci sleva nadesno: 2 tkiva raka (1 rak dojke, 1 rak glave i vrata). Slika 1G) Gen: NAIP, peptid: KAFPFYNTV (ID BR. SEKV: 12). Uzorci sleva nadesno: 2 tkiva raka (1 rak dojke, 1 rak želuca). Slika 1H) Gen: MUC6, peptid: KQLELELEV (ID BR. SEKV: 14). Uzorci sleva nadesno: 2 tkiva raka (1 rak dojke, 1 rak pankreasa). Slika 1I) Gen: PLEC, peptid: SLFPSLVVV (ID BR. SEKV: 15). Uzorci sleva nadesno: 8 tkiva raka (1 rak žučnih puteva, 1 rak dojke, 1 rak kolona, 1 rak žučne kese, 1 rak glave i vrata, 1 rak leukocitne leukemije, 1 rak limfnog čvora, 1 rak kože). Slika 1J) Gen: CREB3L4, peptid: YIDGLESRV (ID BR. SEKV: 22). Uzorci sleva nadesno: 1 primarna kultura, 2 benigne neoplazme, 5 normalnih tkiva (2 kolona, 1 slezina, 1 želudac, 1 traheja), 47 tkiva raka (2 raka kostne srži, 4 raka dojke, 1 rak jednjaka, 1 rak žučne kese, 8 rakova leukocitne leukemije, 4 raka pluća, 3 raka limfnih čvorova, 1 rak mijeloidnih ćelija, 2 raka jajnika, 1 rak pankreasa, 13 rakova prostate, 2 raka rektuma, 1 rak želuca, 1 rak mokraćne bešike, 3 raka materice). Slika 1K) Gen: THADA, peptid: SAFPEVRSL (ID BR. SEKV: 34). Uzorci sleva nadesno: 6 ćelijskih linija, 4 normalna tkiva (1 uzorak leukocita, 1 limfni čvor, 1 uzorak limfocita, 1 placenta), 9 tkiva raka (3 raka dojke, 1 rak žučne kese, 2 raka leukocitne leukemije, 1 rak jetre, 1 rak jajnika, 1 rak kože). Slika 1L) Gen: KDM5B, peptid: VLAHITADI (ID BR. SEKV: 37). Uzorci sleva nadesno: 1 ćelijska linija, 1 primarna kultura, 31 tkivo raka (3 raka kostne srži, 1 rak dojke, 2 raka kolona, 2 raka jednjaka, 1 rak glave i vrata, 5 rakova leukocitne leukemije, 5 rakova pluća, 2 raka limfnog čvora, 2 raka mijeloidnih ćelija, 1 rak jajnika, 3 raka mokraćne bešike, 4 raka materice). Slika 1M) Gen: PCNXL3, peptid: LLMUVAGLKL (ID BR. SEKV: 38). Uzorci sleva nadesno: 2 ćelijske linije, 1 normalno tkivo (1 limfni čvor), 16 tkiva raka (1 rak žučnih puteva, 2 raka kolona, 1 rak glave i vrata, 5 rakova pluća, 2 raka limfnog čvora, 1 rak mijeloidnih ćelija, 1 rak jajnika, 1 rak rektuma, 1 rak kože, 1 rak mokraćne bešike). Slika 1N) Gen: MCM8, peptid: SLNDQGYLL (ID BR. SEKV: 41). Uzorci sleva nadesno: 1 ćelijska linija, 1 normalno tkivo (1 tanko crevo), 9 tkiva raka (1 rak dojke, 1 rak pluća, 4 raka limfnog čvora, 1 rak mijeloidnih ćelija, 1 rak jajnika, 1 rak kože).

Na slikama 2A do C prikazani su primerni profili ekspresije predstavljenih izvornih gena koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u raku dojke u panelu normalnih tkiva (beli stupci) i 10 uzoraka raka dojke (crni stupci). Tkiva sleva nadesno: 6 arterija, 2 krvne ćelije, 2 mozga, 2 srca, 2 jetre, 3 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 6 kostnih srži, 1 hrskavica, 1 kolon, 1 jednjak, 2 oka, 2 žučne kese, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 5 pankreasa, 2 periferna nerva, 2 hipofize, 1 rektum, 2 pljuvačne žlezde, 2 skeletna mišića, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 štitasta žlezda, 7 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 5 jajnika, 5 placenti, 1 prostata, 1 testis, 1 timus, 1 materica, 10 uzoraka raka dojke. Slika 2A) simbol gena: ESR1; Slika 2B) simbol gena: ABCC11; Slika 2C) simbol gena: SLC39A6.

Na slici 3A do D prikazani su primerni podaci imunogenosti: rezultati protočne citometrije nakon bojenja peptid-specifičnog multimera. Prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 1 (B, levi panel), peptidom ID br. sekv. 22 (C, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 24 (D, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ID br. sekv.1 (B), A*02/ID br. sekv. 22 (C) ili A*02/ID br. sekv. 24 (D). Desni paneli (B, C i D) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

PRIMERI

PRIMER 1

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tkiva tumora pacijenata dobijena su od: Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Tissue Solutions Ltd (Glazgov, UK); i Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Hajdelberg, Nemačka)

Normalna tkiva su dobijena od Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (Brea, CA, SAD); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Prefekturalnog medicinskog univerziteta u Kjotou (KPUM) (Kjoto, Japan); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); Tissue Solutions Ltd (Glazgov, UK); Univerzitetske bolnice u Ženevi (Ženeva, Švajcarska); Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Hajdelberg, Nemačka); Univerzitetske bolnice u Minhenu (Minhen, Nemačka); i Univerzitetske bolnice u Tibingenu (Tibingen, Nemačka)

Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u orbitrap (R = 30 000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al., 2007). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću slabljenja naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako, svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid, izračunat je profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke raka dojke sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na slici 1. Rezultati prezentacije za primerne peptide prikazani su u tabeli 8.

Tabela 8: Rezultati prezentacije. U tabeli su navedeni peptidi koji su veoma visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Panel normalnih tkiva za koji se smatralo da je relevantan za poređenje sa tumorima činili su: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, ćelije krvi, krvni sud, kostna srž, mozak, hrskavica, jednjak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, debelo crevo, jetra, pluća, limfni čvor, nerv, pankreas, paraštitasta žlezda, peritoneum, hipofiza, pleura, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, timus, štitasta žlezda, traheja, ureter i mokraćna bešika.

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju ovde predstavljene peptide

Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva za eksperimente sekvenciranja RNK dobijena je od:

Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); BioCat GmbH (Hajdelberg, Nemačka); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“ (Napulj, Italija); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); i Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Hajdelberg, Nemačka)

Ukupna RNK iz tumorskih tkiva za eksperimente sekvenciranja RNK dobijena je od: Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); BioServe (Beltsville, MD, SAD); i Tissue Solutions Ltd (Glazgov, UK)

Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

Eksperimenti sekvenciranja RNK

Analiza ekspresije gena uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je sekvenciranjem naredne generacije (RNAseq) pomoću CeGaT (Tibingen, Nemačka). Ukratko, biblioteke za sekvenciranje su pripremljene primenom kompleta reagensa Illumina HiSeq v4 prema protokolu dobavljača (Illumina Inc, San Diego, CA, SAD), koji obuhvata fragmentaciju RNK, konverziju cDNK i dodavanje adaptera za sekvenciranje. Biblioteke dobijene od multiplih uzoraka se mešaju ekvimolarno i sekvenciraju na Illumina HiSeq 2500 sekvenceru prema uputstvima proizvođača, stvarajući jednostrana očitavanja veličine 50 bp. Obrađena očitavanja se mapiraju na humanom genomu (GRCh38) pomoću softvera STAR. Podaci o ekspresiji se obezbeđuju na nivou transkripta u vidu RPKM (očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja, koji generiše softver Cufflinks) i na nivou egzona (ukupna očitavanja, generiše softver Bedtools), na osnovu beleški ensembl baze podataka sekvenci (Ensembl77). Očitavanja egzona se normalizuju za dužinu egzona i veličinu poravnanja kako bi se dobile RPKM vrednosti.

1

Primerni profili ekspresije izvornih gena predmetnog pronalaska koji su veoma prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u raku dojke prikazani su na slici 2. Rezultati ekspresije za dalje primerne gene prikazani su u tabeli 9.

Tabela 9: Rezultati ekspresije. U tabeli su navedeni peptidi iz gena koji su veoma visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Početna vrednost za ovaj rezultat izračunata je iz merenja sledećih relevantnih normalnih tkiva: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, arterija, ćelije krvi, kostna srž, mozak, hrskavica, kolon, jednjak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluća, limfni čvor, pankreas, periferni nerv, hipofiza, rektum, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, štitasta žlezda, štitasta žlezda, traheja, mokraćna bešika, vena. U slučaju da su bili dostupni podaci o ekspresiji za nekoliko uzoraka tkiva iste vrste, za izračunavanje je korišćena aritmetička srednja vrednost za sve dotične uzorke.

PRIMER 3

2

In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti predstavljenih TUMAP-ova, pronalazači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za HLA-A*0201-restrikovane TUMAP-ove pronalaska, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (tabela 10).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih od Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.

PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Keln, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Hajdelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nirnberg, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 72) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV.73).

800.000 perli/200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Hajdelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost za peptide raka dojke

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za jedan peptid pronalaska prikazani su na

4

slici 3 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama. Rezultati za tri peptida iz pronalaska sumirani su u tabeli 10A, a za dodatne peptide u tabeli 10B.

Tabela 10A: in vitro imunogenost predstavljenih HLA klasa I peptida

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca za ovde predstavljene peptide. <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69%= ++; >= 70% = +++

Tabela 10B: In vitro imunogenost predstavljenih HLA klasa I peptida

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti za ovde predstavljene HLA-A*02-restrikovane peptide. Rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti su naznačeni. Procenat pozitivnih mesta i donora (među procenjivim) su sumirani kako je naznačeno <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69% = ++; >= 70% = +++

PRIMER 4

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama >50%. Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.

PRIMER 5

Testovi vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama kako su predstavljeni su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC su proizvedeni pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptidreceptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko i sar. (Rodenko et al., 2006).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS-u na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*02:01/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15–500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Tabela 11: Rezultati vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*02:01 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

Lista referenci Akbari, M. E. et al., Breast Cancer (2015) Albulescu, R., Biomark.Med.7 (2013): 203 Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933 Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc.7 (2012): 891-902 Andres, S. A. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 326 Andres, S. A. et al., Breast 23 (2014): 226-233 Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Arafat, H. et al., Surgery 150 (2011): 306-315

Ariga, N. et al., Int J Cancer 95 (2001): 67-72

Aylon, Y. et al., Mol.Oncol 5 (2011): 315-323

Balko, J. M. et al., Nat Med 18 (2012): 1052-1059

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Band, A. M. et al., J Mammary.Gland.Biol Neoplasia.16 (2011): 109-115

Bausch, D. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 302-309

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Berger, C. et al., Curr.Mol.Med.13 (2013): 1229-1240

Bogush, T. A. et al., Antibiot.Khimioter.54 (2009): 41-49

Borel, F. et al., Hepatology 55 (2012): 821-832

Bornstein, S. et al., BMC.Genomics 17 (2016): 38

Bouameur, J. E. et al., J Invest Dermatol.134 (2014): 885-894

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Buranrat, B. et al., Oncol Rep.34 (2015): 2790-2796

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Chang, H. Y. et al., PLoS.One. 8 (2013): e54117

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223

Chekhun, V. F. et al., Int.J Oncol 43 (2013): 1481-1486

Chen, L. C. et al., Mod.Pathol. 24 (2011): 175-184

Cheng, I. et al., Gut 60 (2011): 1703-1711

Cheng, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015): 27

Cheriyath, V. et al., Oncogene 31 (2012): 2222-2236

Choi, J. et al., Cell Stress.Chaperones. 19 (2014): 439-446

Chung, F. Y. et al., J Surg.Oncol 102 (2010): 148-153

Ciruelos Gil, E. M., Cancer Treat.Rev 40 (2014): 862-871

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. J. et al., Pancreas 37 (2008): 154-158

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114 Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995) Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Cui, X. B. et al., J Transl.Med 13 (2015): 321

Delaval, B. et al., J Cell Biol.188 (2010): 181-190

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170 Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Ding, K. et al., Med.Hypotheses 83 (2014): 359-364

Drazkowska, K. et al., Nucleic Acids Res 41 (2013): 3845-3858 Du, L. et al., Tumori 101 (2015): 384-389

Egloff, A. M. et al., Cancer Res 66 (2006): 6-9

Emens, L. A., Expert.Rev.Anticancer Ther.12 (2012): 1597-1611 Fagin, J. A., Mol.Endocrinol. 16 (2002): 903-911

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fang, Y. et al., Cancer Biol Ther. 15 (2014): 1268-1279

Feng, Y. et al., J Biol.Chem. 289 (2014): 2072-2083

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814 Frasor, J. et al., Mol.Cell Endocrinol.418 Pt 3 (2015): 235-239 Fry, A. M. et al., J Cell Sci.125 (2012): 4423-4433

Fu, L. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 89

Fuqua, S. A. et al., Breast Cancer Res Treat.144 (2014): 11-19 Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med.2 (1996): 1096-1103

Ganly, I. et al., J Clin Endocrinol.Metab 98 (2013): E962-E972 Gardina, P. J. et al., BMC.Genomics 7 (2006): 325

Garg, M. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014): E62-E72 Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393 Gershenwald, J. E. et al., Oncogene 20 (2001): 3363-3375

Gilkes, D. M. et al., Mol Cancer Res 11 (2013): 456-466

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867 Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Grady, W. M., Cancer Metastasis Rev 23 (2004): 11-27

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012) Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014) Gumireddy, K. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1334-1343

Guo, Y. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 1762-1769

Harvey, H. et al., Int.J Cancer 136 (2015): 1579-1588

Hayashi, S. I. et al., Endocr.Relat Cancer 10 (2003): 193-202 Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hlavata, I. et al., Mutagenesis 27 (2012): 187-196

Hoei-Hansen, C. E. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 8521-8530 Hogstrand, C. et al., Biochem.J 455 (2013): 229-237

Honorat, M. et al., BMC.Struct.Biol 13 (2013): 7

Hu, P. et al., Biosci.Rep.35 (2015a)

Hu, P. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015b): 2638-2648

Hu, Z. Y. et al., Biochim.Biophys.Acta 1862 (2016): 1172-1181 Huang, C. C. et al., PLoS.One. 8 (2013): e76421

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

Jacob, M. et al., Curr.Mol Med.12 (2012): 1220-1243 Januchowski, R. et al., Biomed.Res Int 2014 (2014): 365867 Jezequel, P. et al., Int.J Cancer 131 (2012): 426-437

Jia, M. et al., Cancer Res (2016)

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615 Jung, H. J. et al., J Mol Med.(Berl) 91 (2013): 1117-1128

Kang, C. Y. et al., J Gastrointest.Surg. 18 (2014): 7-15 Karagiannis, G. S. et al., Oncotarget.3 (2012): 267-285

Karess, R. E. et al., Int.Rev Cell Mol.Biol 306 (2013): 223-273 Karvonen, U. et al., J Mol Biol.382 (2008): 585-600

Kashyap, M. K. et al., Cancer Biol.Ther 8 (2009): 36-46

Katada, K. et al., J Proteomics. 75 (2012): 1803-1815

Kevans, D. et al., Int J Surg.Pathol.19 (2011): 751-760

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000) Kim, H. C. et al., Cell Mol.Life Sci.67 (2010): 3499-3510

Kim, S. Z. et al., J Inherit.Metab Dis.23 (2000): 791-804

Klinke, O. K. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0130149

Koppen, A. et al., Eur.J Cancer 43 (2007): 2413-2422

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov.5 (2006): 471-484

Kristensen, V. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 2802-2807 Lai, Y. H. et al., Carcinogenesis 34 (2013): 1069-1080

Langnaese, K. et al., Cytogenet.Cell Genet. 94 (2001): 233-240 Lascorz, J. et al., BMC.Med.Genet. 13 (2012): 31

Lee, K. Y. et al., J Med.35 (2004): 141-149

Leiszter, K. et al., PLoS.One. 8 (2013): e74140

Leivo, I. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 156 (2005): 104-113

Li, G. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.14 (2013a): 4943-4952

Li, H. et al., Neoplasia.8 (2006): 568-577

Li, K. C. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 172

Li, M. et al., Int.J Oncol.24 (2004): 305-312

Li, X. et al., Genes Chromosomes.Cancer 49 (2010): 819-830

Li, X. H. et al., J BUON.20 (2015): 1223-1228

Li, Y. et al., PLoS.One.8 (2013b): e84489

Li, Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.12 (2011): 2405-2409

Lian, J. et al., Oncotarget.7 (2016): 2672-2683

Liddy, N. et al., Nat Med.18 (2012): 980-987

Lin, C. S. et al., Cancer Lett.368 (2015): 36-45

Lin, Y. C. et al., J Cell Sci.127 (2014): 85-100

Liu, Q. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.15 (2014): 8623-8629

Liu, Z. et al., Carcinogenesis 32 (2011): 1668-1674

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med.162 (1985): 1745-1759 Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci.690 (1993): 276-291 Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lu, X. et al., Mol.Cancer Ther. 3 (2004): 861-872

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795 Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004) Mahomed, F., Oral Oncol 47 (2011): 797-803

Malumbres, M. et al., Curr.Opin.Genet.Dev.17 (2007): 60-65 Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res.43 (2015): 3180-3196 Mehta, A. et al., Breast 23 (2014): 2-9

Mentlein, R. et al., Biol.Chem. 392 (2011): 199-207

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Milne, R. L. et al., Hum.Mol.Genet. 23 (2014): 6096-6111 Mitchell, D. C. et al., J Biol Chem 281 (2006): 51-58

Miyoshi, Y. et al., Med.Mol.Morphol. 43 (2010): 193-196

Mo, Q. Q. et al., Acta Pharmacol.Sin. 34 (2013): 541-548

Moniz, L. S. et al., Mol.Cell Biol 31 (2011): 30-42

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443 Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

1

Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480

Mukhopadhyay, P. et al., Biochim.Biophys.Acta 1815 (2011): 224-240

Mulligan, A. M. et al., Breast Cancer Res 13 (2011): R110

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Na, C. H. et al., Mol.Cells 38 (2015): 624-629

Oji, Y. et al., Int.J Oncol 44 (2014): 1461-1469

Onken, M. D. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 2873-2884

Ono, A. et al., Hum.Pathol. 40 (2009): 41-49

Orentas, R. J. et al., Front Oncol 2 (2012): 194

Papageorgio, C. et al., Int.J Oncol. 31 (2007): 1205-1211

Park, S. H. et al., Clin Cancer Res. 13 (2007): 858-867

Park, S. J. et al., Oncology 88 (2015): 122-132

Parris, T. Z. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 324

Pei, L. et al., Mol.Med Rep.4 (2011): 817-823

Perez, E. A. et al., Cancer 118 (2012): 3014-3025

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Pornour, M. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.15 (2014): 10339-10343

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Qi, H. et al., Cancer Res 62 (2002): 721-733

Qu, Y. et al., J Gastroenterol.49 (2014): 408-418

Quyun, C. et al., Recent Pat DNA Gene Seq.4 (2010): 86-93

Rammensee, H. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Rao, C. V. et al., Carcinogenesis 30 (2009): 1469-1474

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Resende, C. et al., Helicobacter.15 Suppl 1 (2010): 34-39

Resende, C. et al., Helicobacter.16 Suppl 1 (2011): 38-44

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rippe, V. et al., Oncogene 22 (2003): 6111-6114

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Roth, U. et al., Proteomics. 10 (2010): 194-202

S3-Leitlinie Mammakarzinom, 032-045OL, (2012)

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Sakurai, Y. et al., Mol.Pharm.11 (2014): 2713-2719

2

Saleem, M. et al., Chem Biol Drug Des 82 (2013): 243-251

Schmid, C. A. et al., J Exp.Med 212 (2015): 775-792

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Shen, R. et al., PLoS.One.8 (2013): e56542

Shen, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 7133-7142

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986) Sherman-Baust, C. A. et al., Cancer Cell 3 (2003): 377-386

Shi, D. et al., Oncotarget.6 (2015): 5005-5021

Shi, D. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 7 (2014): 266-277

Shi, Y. et al., Genomics Proteomics.Bioinformatics. 2 (2004): 47-54

Shi, Y. W. et al., Chin Med J (Engl.) 120 (2007): 1659-1665

Shimizu, D. et al., Oncol Lett.11 (2016): 1847-1854

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195 Skandalis, S. S. et al., Matrix Biol 35 (2014): 182-193

Skrzypczak, M. et al., Gynecol.Endocrinol. 29 (2013): 1031-1035

Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006): 3089-3094

Smith, M. J. et al., Br.J Cancer 100 (2009): 1452-1464

Song, Q. et al., Oncol Rep.33 (2015): 1956-1964

Stefanska, B. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 3118-3132

Stephens, P. J. et al., Nature 486 (2012): 400-404

Stone, B. et al., Gene 267 (2001): 173-182

Strekalova, E. et al., Clin.Cancer Res. (2015)

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163

Sun, H. et al., J BUON.20 (2015): 296-308

Sun, J. et al., Technol.Cancer Res Treat.15 (2016): 285-295

Sussman, D. et al., Mol.Cancer Ther.13 (2014): 2991-3000

Tahara E Jr et al., Cancer Immunol.Immunother. 54 (2005): 729-740 Takashima, S. et al., Tumour.Biol.35 (2014): 4257-4265

Tan, M. K. et al., Mol Cell Biol.31 (2011): 3687-3699

Tang, B. et al., Oncotarget. 6 (2015): 12723-12739

Tanguay, R. M. et al., Acta Biochim.Pol.43 (1996): 209-216

Tasker, P. N. et al., Osteoporos.Int. 17 (2006): 1078-1085

Terabayashi, T. et al., PLoS.One.7 (2012): e39714

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci.62 (2005): 1755-1762

Thorsen, K. et al., Mol Cell Proteomics.7 (2008): 1214-1224

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Trojani, A. et al., Cancer Biomark. 11 (2011): 15-28 Tsuchiya, T. et al., Chemotherapy 61 (2016): 77-86

Turner, B. C. et al., Cancer Res 58 (1998): 5466-5472 Uemura, T. et al., Cancer Sci.101 (2010): 2404-2410 Unland, R. et al., J Neurooncol. 116 (2014): 237-249

Unno, J. et al., Scand.J Gastroenterol. 49 (2014): 215-221

van de Vijver, M. J. et al., N.Engl.J Med. 347 (2002): 1999-2009 Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012): 1254-1261

Wang, G. H. et al., Oncol Lett.5 (2013a): 544-548

Wang, J. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015): 13

Wang, Q. et al., PLoS.One. 8 (2013b): e61640

Wang, X. et al., Cancer Genet.Cytogenet.196 (2010): 64-67 Wikberg, M. L. et al., Tumour.Biol. 34 (2013): 1013-1020 Willcox, B. E. et al., Protein Sci.8 (1999): 2418-2423 Winzer, B. M. et al., Cancer Causes Control 22 (2011): 811-826 World Cancer Report, (2014)

Wu, F. L. et al., Cancer Lett.363 (2015): 7-16

Wu, T. et al., PLoS.One. 11 (2016): e0149361

Wu, X. et al., Am.J Clin Exp.Urol.2 (2014): 111-120

Xie, X. et al., Oncol Lett.7 (2014): 1537-1543

Xiong, D. et al., Carcinogenesis 33 (2012): 1797-1805

Xu, L. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi.14 (2011): 727-732 Xu, X. et al., Int.J Mol.Med 36 (2015): 1630-1638

Xu, Y. et al., PLoS.One.8 (2013): e64973

Xue, H. et al., Autophagy. 12 (2016a): 1129-1152

Xue, H. et al., Int.J Oncol 49 (2016b): 519-528

Yakimchuk, K. et al., Mol.Cell Endocrinol.375 (2013): 121-129 Yamada, A. et al., Breast Cancer Res Treat.137 (2013): 773-782 Yang, Q. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1643-1651

Yang, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1772 (2007): 1033-1040 Ye, H. et al., BMC.Genomics 9 (2008): 69

Yu, J. et al., Gut 64 (2015): 636-645

Yuan, D. et al., J Surg.Oncol 108 (2013): 157-162 Zanaruddin, S. N. et al., Hum.Pathol. 44 (2013): 417-426 Zaravinos, A. et al., PLoS.One.6 (2011): e18135

4

Zaremba, S. et al., Cancer Res.57 (1997): 4570-4577 Zhang, G. et al., Tumour.Biol (2016)

Zhang, J. et al., PLoS.One. 9 (2014a): e109318

Zhang, Y. et al., Cancer Lett.303 (2011): 47-55

Zhang, Z. M. et al., J Cancer Res Clin Oncol 140 (2014b): 2119-2127 Zhao, F. et al., Oncol Res Treat.37 (2014): 106-110

Zhao, L. H. et al., Genet.Mol.Res 14 (2015): 5417-5426

Zhao, Y. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013): e532

Zhen, X. et al., Mol.Pharmacol. 60 (2001): 857-864

Zhou, H. et al., Tumour.Biol 37 (2016): 8741-8752

Zhu, H. et al., Cell Stress.Chaperones. (2014)

Zou, T. T. et al., Oncogene 21 (2002): 4855-4862

1

11

12

1

14

1

1

1

1

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV. 42; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

3. T-ćelijski receptor (TCR), poželjno rekombinantni, solubilni ili T-ćelijski receptor vezan za membranu koji je reaktivan sa HLA ligandom, naznačeno time što je navedeni ligand najmanje 88% identičan sa aminokiselinskom sekvencom u skladu sa ID BR. SEKV 42, i poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 42.

4. Antitelo, konkretno solubilno ili antitelo vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, poželjno peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2 kada je vezan za MHC molekul.

5. Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2 ili TCR u skladu sa patentnim zahtevom 3 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4, opciono povezana sa heterolognom promoterskom sekvencom, ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.

6. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, ili nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigenprezentujuća ćelija kao što je dendritična ćelija ili naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno T ćelija ili NK ćelija.

7. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, ili za proizvodnju T-ćelijskog receptora u skladu sa patentnim zahtevom 3, ili antitela u skladu sa patentnim zahtevom 4, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 6 koja prezentuje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 do 3, ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, i izolovanja peptida ili njegove varijante ili TCR-a ili antitela iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

8. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2.

9. Aktivirani T limfocit, proizveden metodom u skladu sa patentnim zahtevom 8 koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2.

10. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 9 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, dodatne farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

11. Peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 9 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3 za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka, ili za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka.

12. Peptid u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1 ili 2, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 6, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 9 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3 za upotrebu za dijagnostikovanje i/ili lečenje raka ili za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačenog time što je navedeni rak izabran iz grupe koju čine rak pluća, rak mozga, rak želuca, kolorektalni karcinom, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, melanom, rak jajnika i rak jednjaka i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid ID BR. SEKV 42.

13. Komplet koji se sastoji od:

a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži peptid u skladu sa bilo kojim

11

od patentnih zahteva 1 ili 2, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 5, ćeliju u skladu sa patentnim zahtevom 6, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 9 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3, u rastvoru ili u liofiliziranom obliku;

b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;

c) opciono, najmanje još jednog peptida odabranog iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV 1 do 41 i 43

d) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije, i

e) opciono dalje sadrži jedan ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica.