Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS60762B1 - Oligonukleotidna jedinjenja za ciljane irnk hantingtina - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS60762B1 - Oligonukleotidna jedinjenja za ciljane irnk hantingtina - Google Patents

Oligonukleotidna jedinjenja za ciljane irnk hantingtina

Info

Publication number
RS60762B1
RS60762B1 RS20200929A RSP20200929A RS60762B1 RS 60762 B1 RS60762 B1 RS 60762B1 RS 20200929 A RS20200929 A RS 20200929A RS P20200929 A RSP20200929 A RS P20200929A RS 60762 B1 RS60762 B1 RS 60762B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
gene
nucleotide
mrna
rna molecule
Prior art date
Application number
RS20200929A
Other languages
English (en)
Inventor
Anastasia Khvorova
Neil Aronin
Julia Alterman
Original Assignee
Univ Massachusetts
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Massachusetts filed Critical Univ Massachusetts
Publication of RS60762B1 publication Critical patent/RS60762B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/52—Physical structure branched
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovo obelodanjivanje se odnosi na nove ciljeve hantingtina i nove oligonukleotide za tretiranje Hantingtonove bolesti.
Pozadina
[0002] Neurološki poremećaji uključujući Hantingtonovu bolest, Parkinsonovu bolest i Alchajmerovu bolest predstavljaju veliku nezadovoljenu medicinsku potrebu. U nekim slučajevima, ove bolesti su monogene, što ih čini idealnim ciljevima za oligonukleotidnu terapeutsku intervenciju, npr., RNK interferenciju (RNKi). RNKi je fundamentalni mehanizam koji obuhvata kratke dvolančane RNK fragmente koji se mogu koristiti za reprogramiranje ćelijskog mehanizma i za utišavanje i degradiranje ciljane iRNK po potrebi. Ova tehnologija je klinički napredna i izvršila je revoluciju u oblasti ljudske funkcionalne genetike.
[0003] Više različitih tehnologija je ispitivano za obaranje iRNK i kao terapija i kao alat za funkcionalna ispitivanja, uključujući virusnu isporuku kratkih RNK petlja ukosnica (shRNK), antismisao oligonukleotida (ASO) i golih ili blago modifikovanih siRNK (Sah, D. W. Y. & Aronin, N. Oligonucleotide therapeutic approaches for Huntington disease. J. Clin. Invest. 121, 500-507 (2011); DiFiglia, M. i dr. Terapeutsko utišavanje mutiranog hantingtina sa siRNK oslabljuje striatalnu i kortikoidnu neuropatiju i deficite pri ponašanju. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 17204-17209 (2007)).
[0004] Pokazano je da ASO takođe imaju pristup koji obećava. Ova tehnologija suzbija efikasnu isporuku ćelijama bez vehikuluma i daje se u mozak radi tretiranja Hantingtonove bolesti za uspešno obaranje u mozgu i kod glodara i kod primata koji nisu ljudi (Mantha, N., Das, S. K. & Das, N. G. RNAi-based therapies for Huntington's disease: delivery challenges and opportunities. Therapeutic delivery 3, 1061-1076 (2012); Kordasiewicz, H. B. i dr.
Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. NEURON 74, 1031-1044 (2012)). Nažalost, trenutna ispitivanja pokazuju da je kumulativna doza od 700 µg koja se daje u toku od dve nedelje neophodna da bi se videlo utišavanje samo od 50% (Kordasiewicz, iznad).
[0005] Dongbo i dr. (2012) Cell, 150(5):895-908, Rodriguez-Lebron i dr (2005) Molecular Therapy, 12(4):618-633; WO 2007/051045; i Difiglia i dr. (2007) PNAS, 104(43):17204-17209 opisuju ciljanje siRNK kod iRNK hantingtina (HTT).
[0006] WO 2012/005898 opisuje transkriptom jajnika kineskog hrčka (CHO) ciljanje siRNK kod hantingtina hrčka.
[0007] WO 2012/118911 opisuje oligonukleotidne modulatore puta toličnih receptora.
[0008] Nemodifikovana siRNK („gola siRNK“) se u prošlosti teško isporučivala osetljivijim ćelijskim linijama i in vivo u tkivo. Iako se transfekcijski reagensi kao što je Lipofektamin mogu koristiti, postoji veoma uzak opseg unutar koga je efikasan i nije toksičan, i mora se optimizovati nezavisno za različite serije neurona kako bi se odredili odnosi siRNK i lipida koji su neophodni za uporedive nivoe utišavanja (Bell, H., Kimber, W. L., Li, M. & Whittle, I. R. Liposomal transfection efficiency and toxicity on glioma cell lines: in vitro and in vivo studies. NeuroReport 9, 793-798 (1998); Dass, C. R. Cytotoxicity issues pertinent to lipoplexmediated gene therapy in-vivo. Journal of Pharmacy and Pharmacology 1-9 (2010); Masotti, A. i dr. Comparison of different commercially available cationic liposome-DNA lipoplexes: Parameters influencing toxicity and transfection efficiency. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces 68, 136-144 (2009); Zou, L. L. i dr. Liposome-mediated NGF gene transfection following neuronal injury: potential therapeutic applications. Gene Ther 6, 994-1005 (1999)). Hidrofobne modifikovane siRNK su takođe korišćene kao alternativa za isporuku u ćelije i mozak (Sah, iznad; Soutschek, J. i dr. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173-178 (2004); Cheng, K., Ye, Z., Guntaka, R. V. & Mahato, R. I. Enhanced hepatic uptake and bioactivity of type alpha1(I) collagen gene promoter-specific triplex-forming oligonucleotides after conjugation with cholesterol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 317, 797-805 (2006); Byrne, M. i dr. Novel Hydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds (sd-rxRNA) Demonstrate Robust Efficacy in the Eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics 29, 855-864 (2013)), i neka od ovih jedinjenja su našla čak i kliničku upotrebu, ali osiguravanje hemijske stabilnosti i minimalne toksičnosti dok se maksimizuje isporuka preostaje težak zadatak. Trenutke prepreke u tehnologiji RNKi ograničavanju njihovu sposobnost da se koriste i kod funkcionalnih genomskih ispitivanja i u terapijama, što pruža mogućnost za poboljšanje njihovog dizajna kako se primenjuje na oblast neuronauke i in vitro i in vivo.
Rezime
[0009] Prema tome, ovde su date nove sekvence za ciljanje hantingtina. Takođe su ovde dati novi RNK molekuli (npr., siRNK) koji ciljaju nove sekvence za ciljanje hantingtina. Navedeni novi RNK molekuli (npr., siRNK) pokazuju efikasnost kod primarnih neurona i in vitro i in vivo u mozgu miševa nakon jedne injekcije sa malom dozom.
[0010] U jednom aspektu, dat je RNK molekul koji je dužine između 15 i 30 baza ili dužine između 15 i 35 baza, koji sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1) za terapeutsku upotrebu pri suzbijanju ispoljavanja Hantingtin (HTT) gena u organizmu.
[0011] U jednom aspektu, dat je RNK molekul koji je dužine između 15 i 30 baza ili dužine između 15 i 35 baza, koji sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1) za suzbijanje ispoljavanja Hantingtin (HTT) gena u ćeliji in vitro.
[0012] U određenim otelotvorenjima, RNK molekul je jednolančana (ss) RNK ili dvolančana (ds) RNK. U određenim otelotvorenjima, dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac gde antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1).
[0013] U određenim otelotvorenjima, dsRNK je tupa na kraju. U određenim otelotvorenjima, dsRNK sadrži bar jedan jednolančani nukleotidni viseći deo. U određenim otelotvorenjima, dsRNK sadrži prirodne nukleotide.
[0014] U određenim otelotvorenjima, dsRNK sadrži bar jedan modifikovani nukleotid. U određenim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid je izabran iz grupe koju čine: 2'-O-metil modifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži 5'fosforotioat grupu i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat ili bisdecilamid grupu dodekanoinske kiseline. U određenim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid je izabran iz grupe koju čine: 2'-dezoksi-2'-fluoro modifikovani nukleotid, 2'-dezoksi modifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid, 2'-amino-modifikovani nukleotid, 2'-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat i baze koje nisu prirodne i sadrže nukleotid. U određenim otelotvorenjima, dsRNK sadrži bar jedan 2'-O-metil modifikovani nukleotid i bar jedan nukleotid koji sadrži 5'5'fosforotioat grupu.
[0015] u određenim otelotvorenjima, RNK molekul sadrži 5' kraj, 3' kraj i ima komplementarnost sa ciljem, gde: (1) RNK molekul sadrži naizmenične 2'-metoksiribonukleotide i 2'-fluoro-ribonukleotide; (2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 5' kraju nisu 2'-metoksi-ribonukleotide; (3) su nukleotidi povezani fosfodiester ili fosforoditioat vezama; i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 na 3' kraju, ili pozicijama 1-7 sa 3' kraja, su povezani sa susednim nukleotidima fosforoditioat vezama.
[0016] U određenim otelotvorenjima, dsRNK ima 5' kraj, 3' kraj i ima komplementarnost sa ciljem i sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, gde: (1) prvi oligonukleotid sadrži sekvencu iznetu kao SEQ ID NO:1; (2) deo prvog oligonukleotida je komplementaran sa delom drugog oligonukleotida; (3) drugi oligonukleotid sadrži naizmenične 2'-metoksiribonukleotide i 2'-fluoro-ribonukleotide; (4) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 3' kraja drugog oligonukleotida su 2'-metoksi ribonukleotidi; i (5) nukleotidi drugog oligonukleotida su povezani fosfodiester ili fosforoditioat vezama.
[0017] U određenim otelotvorenjima, drugi oligonukleotid je povezan za hidrofobni molekul na 3' kraju drugog oligonukleotida. U određenim otelotvorenjima, veza između drugog oligonukleotida i hidrofobnog molekula sadrži polietilen glikol ili trietilen glikol. U određenim otelotvorenjima, nukleotidi na pozicijama 1 i 2 na 3' kraju drugog oligonukleotida su povezani sa susednim nukleotidima fosforoditioat vezama. U određenim otelotvorenjima, nukleotidi na pozicijama 1 i 2 na 3' kraju drugog oligonukleotida, i nukleotidi na pozicijama 1 i 2 na 5' kraju drugog oligonukleotida, su povezani za susedne ribonukleotide fosforoditioat vezama.
[0018] U određenim aspektima, dat je farmaceutski sastav za terapeutsku upotrebu pri suzbijanju ispoljavanja HTT gena u organizmu, koji sadrži dsRNK i farmaceutski prihvatljiv nosač. dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac. dsRNK je dužine između 15 i 35 baznih parova i antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1).
[0019] U određenim otelotvorenjima, dsRNK sadrži holesterol grupu.
[0020] Takođe je ovde obelodanjena metoda za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji. Metoda obuhvata korake uvođenja dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) u ćeliju koja sadrži smisao lanac i antismisao lanac, dsRNK je dužine između 15 i 35 baznih parova i antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), i održavanja ćelije proizvedene u koraku (a) za vremenski period koji je dovoljan da se dobije degradacija iRNK transkripta HTT gena, što time suzbija ispoljavanje HTT gena u ćeliji.
[0021] Takođe je ovde obelodanjena metoda za tretiranje ili upravljanje Hantingtonove bolesti koja obuhvata davanje pacijentu koji ima potrebu za takvim tretiranjem ili upravljanjem terapeutski delotvorne količine dsRNK. dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac i dužine je između 15 i 35 baznih parova i antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1).
[0022] Takođe je ovde opisano da se dsRNK daje u mozak pacijenta. Takođe je ovde opisano da se dsRNK daje bilo čime od intrastriatalno, intracerebroventrikularno i/ili intratekalnom infuzijom i/ili pumpom. Takođe je ovde opisano da davanje dsRNK u mozak izaziva smanjenje iRNK HTT gena u striatumu. Takođe je ovde opisano da davanje dsRNK u mozak izaziva smanjenje iRNK HTT gena u korteksu.
[0023] U određenim aspektima, dat je vektor za terapeutsku upotrebu pri suzbijanju ispoljavanja HTT gena u ćeliji. Vektor koji sadrži regulatornu sekvencu koja je operativno spojena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK molekul potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), gde je navedeni RNK molekul dužine između 15 i 35 baza i gde navedeni RNK molekul, nakon dovođenja u kontakt sa ćelijom ispoljava navedeni HTT gen, suzbija ispoljavanje navedenog HTT gena za bar 20%.
[0024] Takođe je ovde opisana ćelija koja sadrži vektor za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji. Vektor koji sadrži regulatornu sekvencu koja je operativno spojena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK molekul potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), gde je navedeni RNK molekul dužine između 15 i 35 baza i gde navedeni RNK molekul, nakon dovođenja u kontakt sa ćelijom ispoljava navedeni HTT gen, suzbija ispoljavanje navedenog HTT gena za bar 20%.
[0025] Takođe je ovde opisan RNK molekul koji je dužine između 15 i 35 baza, koji sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3).
[0026] U određenim instancama, dsRNK je tupa na kraju. U određenim instancama, dsRNK sadrži bar jedan jednolančani nukleotidni viseći deo. U određenim instancama, dsRNK sadrži prirodne nukleotide.
[0027] U određenim instancama, dsRNK sadrži bar jedan modifikovani nukleotid. U određenim instancama, modifikovani nukleotid je izabran iz grupe koju čine: 2'-O-metil modifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži 5'fosforotioat grupu i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat ili bisdecilamid grupu dodekanoinske kiseline. U određenim instancama, modifikovani nukleotid je izabran iz grupe koju čine: 2'-dezoksi-2'-fluoro modifikovani nukleotid, 2'-dezoksi modifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid, 2'-amino-modifikovani nukleotid, 2'-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat i baze koje nisu prirodne i sadrže nukleotid. U određenim instancama, dsRNK sadrži bar jedan 2'-O-metil modifikovani nukleotid i bar jedan nukleotid koji sadrži 5'5'fosforotioat grupu.
[0028] U određenim instancama, RNK molekul sadrži 5' kraj, 3' kraj i ima komplementarnost sa ciljem, gde: (1) RNK molekul sadrži naizmenične 2'-metoksi-ribonukleotide i 2'-fluororibonukleotide; (2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 5' kraju nisu 2'-metoksi-ribonukleotide; (3) su nukleotidi povezani fosfodiester ili fosforoditioat vezama; i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 na 3' kraju, ili pozicijama 1-7 sa 3' kraja, su povezani sa susednim nukleotidima fosforoditioat vezama.
[0029] U određenim instancama, drugi oligonukleotid je povezan za hidrofobni molekul na 3' kraju drugog oligonukleotida. U određenim instancama, veza između drugog oligonukleotida i hidrofobnog molekula sadrži polietilen glikol ili trietilen glikol. U određenim instancama, nukleotidi na pozicijama 1 i 2 na 3' kraju drugog oligonukleotida su povezani sa susednim nukleotidima fosforoditioat vezama. U određenim instancama, nukleotidi na pozicijama 1 i 2 na 3' kraju drugog oligonukleotida, i nukleotidi na pozicijama 1 i 2 na 5' kraju drugog oligonukleotida, su povezani za susedne ribonukleotide fosforoditioat vezama.
[0030] Takođe je ovde opisan farmaceutski sastav za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u organizmu, koji sadrži dsRNK i farmaceutski prihvatljiv nosač. dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac. dsRNK je dužine između 15 i 35 baznih parova i antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3).
[0031] U određenim instancama, dsRNK sadrži holesterol deo.
[0032] Takođe je ovde obelodanjena metoda za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji. Metoda obuhvata korake uvođenja dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNK) u ćeliju koja sadrži smisao lanac i antismisao lanac, dsRNK je dužine između 15 i 35 baznih parova i antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3), i održavanja ćelije proizvedene u koraku (a) za vremenski period koji je dovoljan da se dobije degradacija iRNK transkripta HTT gena, što time suzbija ispoljavanje HTT gena u ćeliji.
[0033] Takođe je ovde obelodanjena metoda za tretiranje ili upravljanje Hantingtonovom bolešću koja obuhvata davanje pacijentu koji ima potrebu za takvim tretiranjem ili upravljanjem terapeutski delotvorne količine dsRNK. dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac i dužine je između 15 i 35 baznih parova i antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3).
[0034] Takođe je ovde opisano da se dsRNK daje u mozak pacijenta. Takođe je ovde opisano da se dsRNK daje intrastriatalnom infuzijom. Takođe je ovde opisano da davanje dsRNK u mozak izaziva smanjenje iRNK HTT gena u striatumu. Takođe je ovde opisano da davanje dsRNK u mozak izaziva smanjenje iRNK HTT gena u korteksu.
[0035] Takođe je ovde obelodanjen vektor za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji.
Vektor koji sadrži regulatornu sekvencu koja je operativno spojena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK molekul suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3), gde je navedeni RNK molekul dužine između 15 i 35 baza i gde navedeni RNK molekul, nakon dovođenja u kontakt sa ćelijom ispoljava navedeni HTT gen, suzbija ispoljavanje navedenog HTT gena za bar 20%.
[0036] Takođe je ovde opisano da je RNK molekul ssRNK ili dsRNK. Takođe je ovde opisano da dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac, gde antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3).
[0037] Takođe je ovde opisana ćelija koja sadrži vektor za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji. Vektor koji sadrži regulatornu sekvencu koja je operativno spojena sa nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK molekul suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3), gde je navedeni RNK molekul dužine između 15 i 35 baza i gde navedeni RNK molekul, nakon dovođenja u kontakt sa ćelijom ispoljava navedeni HTT gen, suzbija ispoljavanje navedenog HTT gena za bar 20%.
[0038] Takođe je ovde opisano da je RNK molekul ssRNK ili dsRNK. Takođe je ovde opisano da dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac, gde antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3).
[0039] Takođe je ovde opisan RNK molekul koji je dužine između 15 i 35 baza. RNK molekul sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3), i RNK molekul cilja 3' neprevedeni region (UTR) kratke iRNK HTT gena.
[0040] 3' UTR kratke iRNK HTT gena je kao što sledi:
[0041] Takođe je ovde opisano da je RNK molekul ssRNK ili dsRNK. Takođe je ovde opisano da dsRNK sadrži smisao lanac i antismisao lanac, gde antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3).
[0042] Takođe je ovde opisano da RNK molekul koji je dužine između 15 i 35 baza, sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3), gde RNK molekul cilja iRNK HTT i sadrži bar jedan modifikovani nukleotid. Takođe je ovde opisano da je modifikovani nukleotid terminalni nukleotid povezan za fosfatidilholin derivat.
[0043] Takođe je ovde opisano da dvostruko razgranato RNK jedinjenje sadrži dva RNK molekula koja su dužine između 15 i 35 baza, koje sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1), 5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2) ili 5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3), gde su dva RNK molekula međusobno povezana jednom ili više grupa nezavisno izabranih iz veznika, razdelnika i tačke grananja.
[0044] U bilo kom od ovde opisanih aspekata, RNK molekul je antismisao molekul (npr.,
1
ASO) ili GAPMER molekul. U određenim instancama, antismisao molekul pojačava degradaciju regiona komplementarnosti. U određenim instancama, degradacija je degradacija nukleaze (npr., RNaza H).
Kratak opis slika
[0045] Gore navedena i druga svojstva i prednosti predmetnog pronalaska će se potpunije razumeti iz sledećih detaljnih opisa ilustrativnih otelotvorenja zajedno uz priložene slike. Datoteka patenta ili patentne prijave sadrži bar jednu sliku izvedenu u boji. Kopije ovog patenta ili patentne prijave sa slikama u boji će biti pružene od strane kancelarije nakon zahteva i plaćanja neophodne naknade.
Slike 1A-B prikazuju strukturni i hemijski sastav hidrofobne siRNK i efikasnu internalizaciju kod primarni kortikalnih neurona. A) Šematski prikaz hidrofobno modifikovanih i stabilizovanih siRNK (hsiRNK) B) Cy3-HTT10150 hsiRNK (crveno), 0,5 µm, je dodato primarnim kortikalnim neuronima. Slike su napravljene na Zeiss konfokalnom mikroskopu, 63X, nukleus obeležen Hoechst bojom (plavo).
Slike 2A-C prikazuju sistematski skrining neformulisanih hsiRNK koje ciljanju iRNK hantingtina prikazan kao linijski dijagram (A) ili kao stubičasti dijagrami (B) i (C). Panel od 94 hsiRNK je dodat u HeLa ćelije pri 1,5 µm. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) nakon 72 sata normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /-SD). UNT - netretirane ćelije, NTC - kontrola koja nije za ciljanje. Aktivna jedinjenja (crveno) su izabrana za sledeću analizu.
Slike 3A-C prikazuju utišavanje iRNK hantingtina zavisno od koncentracije sa HTT10150, i kod pasivne (A) i isporuke posredovane lipidima (B). Hemijske modifikacije omogućavaju pasivnu apsorpciju bez negativnog uticaja na ulaz siRNK RISC (kompleks za utišavanje izazvano sa RNK). HeLa ćelije su inkubirane sa modifikovanim (koji sadrže i hidrofobne i bazne hemijske modifikacije) ili nemodifikovanim HTT10150 pri koncentracijama prikazanim u odsustvu (A) i prisustvu (B) RNAIMAX. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) nakon 72 sata normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /-SD). UNT - netretirane ćelije. Izračunate IC50 vrednosti su ovde opisane. (C) je tabela koja prikazuje sumu rezultata.
Slike 4A-B grafički prikazuju utišavanje iRNK i proteina hantingtina zavisno od koncentracije sa HTT10150 u primarnim neuronima (pasivna apsorpcija). Primarni neuroni su inkubirani sa HTT10150 pri prikazanim koncentracijama. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /- SD). UNT - netretirane ćelije. A) U primarnim kortikalnim i striatalnim neuronima, 1 nedelja. B) Nivoi proteina hantingtina nakon inkubacije od 1 nedelje sa HTT10150 su detektovani Western blot analizom i normalizovani do β-Tubulina.
Slike 5A-H prikazuju jednu intrastriatalnu injekciju HTT10150 koja je lokalizovana do neurona i tkivne sisteme ipsilateralno mestu injekcije nakon 24 sata. 1 nmol CY3-HTT10150 (crveno) je unilateralno injektirano u striatum WT (FVBNj) miševa. Mozgovi su sakupljeni nakon 24 sata, stavljeni u parafin i podeljeni i secirani. (A) Slika u pločama koronarnog dela mozga (16X). Većina HTT10150 je lokalizovano na mestu injekcije sa strmi gradijentom difuzije. (B) Slika u pločama sagitalnog dela mozga (16X), ubrizgana strana. (C) Slika koronarnog dela mozga (40X), strana koja nije ubrizgana. (D) Slika u koronarnog dela mozga (40X), ubrizgana strana. (E, G) NueN obeleženi neuroni sa strane koja nije ubrizgana (60X). (F, H) NueN obeleženi neuroni sa strane koja je ubrizgana (60X).
Slika 6 grafički prikazuje procenjivanje efikasnosti HTT10150 in vivo. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa (2 µl). Miševi su žrtvovani nakon 120 sati. Mozgovi su isečeni na delove od 300 µm i šest - 2 mm udarnih biopsija striatuma je sakupljeno i sa ipsilateralne i kontralateralne strane. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=24, srednja vrednost /- SEM, 8 životinja, 3 biopsije po regionu).
Slike 7A-E prikazuju da HTT10150 ne pokazuje toksičnost u DARPP-32 pozitivnim neuronima oko mesta injektiranja. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa. Mozgovi su sakupljeni nakon 5 dana, fiksirani, secirani i obeleženi antitelima protiv DARPP-32 (A-D). Reprezentativna slika striatuma nakon injekcije ACSF, sken celog mozga i uvećanje od 60X (A, B) ili 12,5 µg HTT10150, sken celog mozga i 60X uvećanje (C, D). Kvantifikacija DARPP-32 pozitivnih neurona (E) (n=3 životinje, srednja vrednost /- SD). Slika 8 prikazuje ciljane sekvence, modifikovane oligonukleotide i njihovu efikasnost.
Slika 9 prikazuje efikasnu apsorpciju i internalizaciju hsiRNK kod primarnih kortikalnih neurona u vremenu. Cy3-HTT10150 hsiRNK (crveno), 0,5 µm, je dodato u primarne kortikalne neurone. Slike su napravljene na Zeiss konfokalnom mikroskopu, 63X, nukleus obeležen Hoechst bojom (plavo).
Slike 10A-B grafički prikazuju utišavanje iRNK hantingtina zavisno od koncentracije sa HTT10150 u HeLA ćelijama. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) nakon 72 sata normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /- SD). UNT -netretirane ćelije, NTC - kontrola koja nije za ciljanje. A) Odgovor na dozu 16 aktivnih sekvenci pri pasivnoj apsorpciji (bez formulacije). B) Odgovor na dozu osam izabranih sekvenci pri apsorpciji posredovanoj lipidima (upotrebom Invitrogen LIPOFECTAMINE RNAIMAX transfekcionog reagensa). Podaci odgovora na dozu su podešeni upotrebom GraphPad Prism 6.03.
Slike 11A-B grafički prikazuju nivoe iRNK hantingtina. A) Održivost ćelija je testirana upotrebom ALAMAR BLUE (Life Technologies) nakon inkubacije HTT10150 i NTC sa primarnim kortikalnim neuronima u trajanju od 72 sata i jedne nedelje. B) Primarni kortikalni neuroni su inkubirani sa tri HTT hsiRNK sekvence HTT10150, HTT10146, i HTT1215 pri prikazanim koncentracijama. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /- SD). UNT - netretirane ćelije. Slike 12A-B grafički prikazuju utišavanje iRNK i proteina hantingtina zavisno od koncentracije sa HTT10150 u primarnim neuronima (pasivna apsorpcija). Primarni neuroni su inkubirani sa HTT10150 pri prikazanim koncentracijama. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /- SD). UNT - netretirane ćelije. A) U trajanju od 72 sata i 1 nedelje. B) U trajanju od 1, 2 i 3 nedelje.
Slika 13 grafički prikazuje efikasnost hsiRNK protiv ciklofilina B (PPIB) u primarnim kortikalnim neuronima. Primarni neuroni su inkubirani sa hsiRNK koji ciljaju PPIB pri prikazanim koncentracijama. Nivo PPIB iRNK je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, HTT (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=3, srednja vrednost /- SD). UNT - netretirane ćelije u trajanju od 1 nedelje.
Slika 14 prikazuje reprezentativne rezultate Western blot analize za redukciju Htt u primarnim kortikalnim neuronima. Primarni kortikalni neuroni su kultivisani od pet pojedinačnih štenaca (#1-5) i inkubirani sa HTT10150 pri koncentracijama prikazanim za jednu nedelju. Nivoi proteina hantingtina su detektovani Western blot analizom upotrebom antitela AB1.
Slike 15A-B grafički prikazuju procenjivanje efikasnosti HTT10150 in vivo. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa (2 µl). Miševi su žrtvovani nakon 120
1
sati. Mozgovi su isečeni na delove od 300 µm i šest - 2 mm udarnih biopsija striatuma je sakupljeno i sa ipsilateralne i kontralateralne strane. Nivo iRNK hantingtina je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=8, srednja vrednost /- SD). B) Kvantifikacija utišavanja proteina hantingtina Western blot analizom.
Slika 16 grafički prikazuje procenjivanje citotoksičnosti HTT10150 in vivo. DARPP32 neuronski marker je minimalno pogođen HTT10150 injekcijom, što ne ukazuje na veći uticaj na zdravlje neurona. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum (FVB) miševa divljeg tipa pri prikazanim dozama. Miševi su žrtvovani nakon 120 sati. Mozgovi su isečeni na delove od 300 µm i šest udarnih biopsija ()2 mm striatuma je sakupljeno i sa ipsilateralne i kontralateralne strane. Nivo DARPP32 iRNK je meren sa QUANTIGENE (Affymetrix) normalizovan do gena koji održava domaćinstvo, PPIB (ciklofilin B) i prikazan kao procenat netretirane kontrole (n=24, srednja vrednost /- SD).
Slike 17A-C prikazuju da je HTT10150 pokazao dva puta veće povećanje mikroglijalne aktivnosti na mestu injektiranja. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa. Mozgovi su sakupljeni nakon 6 sati (b) i 5 dana (a i c), fiksirani, secirani i obeleženi antitelima protiv IBA-1. (A) Reprezentativne slike aktiviranog (crna strelica) i stanja odmaranja (otvorena strelica) nakon injektiranja 1 nmol HTT10150 i ACSF 5 dana nakon injekcije. 40X uvećanje. (B) Kvantifikacija mikroglija u aktiviranom i stanju odmaranje 6 sati nakon injekcije ACSF (n=6) i 1 nmol HTT10150 (n=3). (c) Kvantifikacija mikroglija u aktiviranom i stanju odmaranje 5 dana nakon injekcije ACSF (n=4) i 1 nmol HTT10150 (n=3).
Slike 18A-C prikazuju da je HTT10150 pokazao ograničenu toksičnost na mestu injektiranja pri dozi od 25 µg. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa.
Mozgovi su sakupljeni nakon 5 dana, fiksirani, secirani i obeleženi antitelima protiv DARPP-32. Reprezentativne slike striatuma nakon injekcije od 25 µg, sken celog mozga (A) i 10X uvećanje na mestu injektiranja (B), 20X uvećanje na mestu injektiranja (C) i 60X uvećanje.
Slika 19 prikazuje da HTT10150 ne pokazuje toksičnost u Darpp32 pozitivnim neuronima pri nižim koncentracijama. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa. Mozgovi su sakupljeni nakon 5 dana, fiksirani, secirani i obeleženi antitelima protiv DARPP-32. Reprezentativna slika striatuma nakon injekcije od 25 µg, 12,5 µg i ACSF (20X uvećanje) ipsilateralno i kontralateralno mestu injektiranja.
Slike 20A-B prikazuju da je HTT10150 izazvao blago povećanje ukupnih mikroglija u stanju odmaranja 5 dana nakon injekcije. HTT10150 je unilateralno injektiran u striatum WT (FVB) miševa. Mozgovi su sakupljeni nakon 6 sati i 5 dana, fiksirani, secirani i obeleženi antitelima protiv IBA-1. Kvantifikacija ukupnih mikroglija 6 sati (A) i 5 dana (B) nakon injektiranja ACSF (n=6, A) (n=4, B) i 12,5 µg HTT10150 (n=3, A, B).
Slika 21 prikazuje dodatne ciljane sekvence zajedno sa hemijskim modifikacijama i strukturnim skeletima.
Slika 22 prikazuje efikasnost hsiRNK<HTT>kod primarnih kortikalnih neurona (održivost ćelija) nakon jedne nedelje upotrebom QUANTIGENE i ALAMAR BLUE. NTC - kontrola koja nije za ciljanje.
Slika 23 prikazuje efikasnost HTT hsiRNK primarnih striatalnih neurona divljeg tipa i primarnih kortikalnih neurona nakon jedne nedelje QUANTIGENE. NTC - kontrola koja nije za ciljanje.
Slika 24 prikazuje efikasnost HTT hsiRNK kod primarnih neurona (trajanje dejstva) jednu do tri nedelje nakon tretiranja pasivnom apsorpcijom. Ispoljavanje HTT je normalizovano do PPIB. Podaci su prikazani kao približno procenti kontrole koja nije za ciljanje. UNT= netretirano.
Slika 25 grafički prikazuje da hsiRNK<HTT>ali ne i LNA-GAPMER ispoljava sloj utišavanja kod kortikalnih neurona nakon 72 sata upotrebom QUANTIGENE. N = 3.
Slika 26 prikazuje unutarćelijsku lokalizaciju htt i ppib kod primarnih kortikalnih neurona upotrebom RNA-SCOPE. Htt iRNK, crveno; ppib iRNK, zeleno; nukleus (DAPI), plavo. Slika 27 validira u neuronima htt set detekcionih sondi, potvrđujući specifičnost.
Slika 28 validira u neuronima htt set detekcionih sondi, pokazujući da signal nije intronspecifičan (validirano za intron 60-61).
Slika 29 prikazuje da je htt iRNK nuklearna lokalizacija specifična samo za neurone. Desni panel prikazuje primarne neurone; ppib iRNK, zeleno; htt iRNK, crveno, nukleus, plavo. Slika 30 prikazuje da hsiRNK<HTT>tretiranje kortikalnih neurona poželjno eliminiše citoplazmatsku htt iRNK. Ppib iRNK, zeleno; htt iRNK, crveno; nukleus, plavo. Gornji panel: netretirano. Donju panel, tretirano sa 1,5 µm hsiRNK<HTT>u trajanju od tri dana.
Slika 31 prikazuje da hsiRNK<HTT>tretiranje kortikalnih neurona poželjno eliminiše citoplazmatsku htt iRNK.
Slika 32 prikazuje Western blot analizu koja pokazuje utišavanje HTT proteina kod primarnih kortikalnih neurona divljeg tipa. hsiRNK htt-10150; NTC = kontrola koja nije za ciljanje, 1 nedelja.
Slika 33 grafički prikazuje rezultate HTT10150 direktne injekcije. Nisu primećeni uticaji na održivost neurona.
1
Slika 34 prikazuje toksičnost susedno mestu injektiranja nakon davanja holesterol-hsiRNK.
Slike 35A-C prikazuju da delimično modifikovane hsiRNK pokazuju kratko vreme trajanja dejstva i ne pokazuju sistemsko izlaganje.
Slike 36A-C prikazuju potpunu metaboličku stabilizaciju hsiRNK.
Slike 37A-C pokazuju da potpuna metabolička stabilizacija ne utiče na RISC ulazak hsiRNK.
Slike 38A-38E prikazuju pojačanje potpuno metabolički stabilizovane hsiRNK (FM-hsiRNK) lokalne isporuke i distribucije.
Slika 39A-B prikazuje pojačanu potentnost i trajanje dejstva posredovano sa FM-hsiRNK. Slika 40 karakteriše neuroaktivne, prirodne lipide kao hsiRNK biokonjugate.
Slika 41 prikazuje da je hidrofobnost hsiRNK u direktnoj korelaciji sa distribucijom i retenzijom u mozgu. Intrastriatalna injekcija, 12,5 µg (0,5 mg/kg), t = 24 sati, FVB/NJ miševa (n = 2).
Slika 42 prikazuje sintezu dokozaheksaenoinske kiseline (DHA) hsiRNK.
Slika 43 prikazuje internalizaciju DHA-hsiRNK i chol-hsiRNK u primarne kortikalne neurone. Apsorpcija: 0,5 µm Cy3-DHA-hsiRNK (crveno), DAPI (plavo).
Slika 44 prikazuje ko-lokalizaciju DHA-hsiRNK sa neuronima i astrocitima. Intrastriatalna injekcija, 12,5 µg (0,5 mg/kg), t = 24 sati, FVB/NJ miševa (n = 2).
Slika 45 prikazuje lokalizaciju DHA-hsiRNK u regionu upravnom na striatalne neurone, dok se chol-hsiRNK ne može detektovati. Intrastriatalna injekcija, 12,5 µg (0,5 mg/kg), t = 24 sati, FVB/NJ miševa (n = 2).
Slika 46 prikazuje ko-lokalizaciju DHA-hsiRNK sa neuronima i astrocitima u korteksu nakon jedne intrastriatalne injekcije. Intrastriatalna injekcija, 12,5 µg (0,5 mg/kg), t = 24 sati, FVB/NJ miševa (n = 2).
Slika 47 prikazuje lokalizaciju DHA-hsiRNK u regionu upravnom na kortikalne neurone, dok se chol-hsiRNK ne može detektovati.
Slika 48 prikazuje robusno utišavanje efikasnosti DHA-hsiRNK u striatumu i korteksu.
Intrastriatalna injekcija, 6-25 µg (0,25-1 mg/kg), t = 5 dana, FVB/NJ miševi (n = 8).
Slika 49 prikazuje trajanje dejstva i oporavak u striatumu nakon jedne intrastriatalne doze DHA-hsiRNK.
Slika 50 prikazuje bezbednosno pilot istraživanje koje pokazuje da DHA-siRNK ne utiče na integritet striatalnih neurona za dozu efikasniju više od 20 puta.
Slika 51 prikazuje bezbednosno pilot istraživanje koje pokazuje da DHA-siRNK izaziva minimalno mikroglijalno aktiviranje u striatumu pri doze efikasnijoj za više od 20 puta.
Slika 52 prikazuje perinuklearnu lokalizaciju izazvanu oligonukleotidnom hemijom.
1
Slika 53 prikazuje intra-nuklearne žarišta distribucije izazvana oligonukleotidnom hemijom.
Slika 54 pokazuje da je stepen striatalnog utišavanja htt iRNK pogođen oligonukleotidnom ćelijskom lokalizacijom.
Slika 55 prikazuje ciljanu glijalnu isporuku.
Slika 56 prikazuje ciljanu neuronski isporuku.
Slika 57 prikazuje da se DHA-hsiRNK efikasno distribuira kroz mozak i utišava gene i u striatumu i u korteksu. Intrastriatalna injekcija, 12,5 µg (0,5 mg/kg), t = 24 sati, FVB/NJ miševa (n = 2).
Slika 58 prikazuje hsiRNK efikasnost kod primarnih hipokampalnih neurona divljeg tipa i Q140 primarnih hipokampalnih neurona.16% gel.
Slika 59 grafički prikazuje hsiRNK efikasnost kod primarnih hipokampalnih neurona divljeg tipa i Q140 primarnih hipokampalnih neurona.
Slika 60 prikazuje hsiRNK efikasnost kod primarnih hipokampalnih neurona divljeg tipa i Q140 primarnih hipokampalnih neurona.7,5% gel.
Slika 61 pokazuje da svaki od PC-DHA-hsiRNK i chol-hsiRNK utišava mutiranu i divljeg tipa htt iRNK.
Slika 62 opisuje tri klase hsiRNK hemija: DHA-hsiRNK, PC-DHA-hsiRNK i chol-hsiRNK.
Slike 63A-B grafički prikazuju pojačanu potentnost PC-DHA-hsiRNK relativno u odnosu na DHA-hsiRNK kod kortikalnih primarnih neurona. 1 nedelja, analizirano sa QUANTIGENE, podaci normalizovani do PPIB.
Slika 64 ilustruje da chol-hsiRNK ima efikasniju hemiju za moduliranje gena kod primarnih kortikalnih neurona relativno u odnosu na PC-DHA-hsiRNK i DHA-hsiRNK. 1 nedelja, analizirano sa QUANTIGENE, podaci normalizovani do PPIB.
Slika 65 pokazuje da PC-DHA-hsiRNK pokazuje bolje zadržavanje u mozgu i širu distribuciju od DHA-hsiRNK. Intrastriatalne injekcije ili pri 2 ili 10 nmol, N = 2, mozgovi su sakupljeni nakon 48 sati.
Slika 66 pokazuje približno 80% utišavanje u striatumu miša nakon jedne IS injekcije PC-DHA-hsiRNK.
Slika 67 pokazuje približno 60% utišavanje u striatumu miša nakon jedne IS injekcije PC-DHA-hsiRNK.
Slika 68 prikazuje di-hsiRNK distribuciju u mozgu nakon CSF bolusne injekcije (250 µg), 48 sati.
Slika 69 prikazuje distribuciju di-hsiRNK nakon jedne IS injekcije.
Slika 70 prikazuje dejstvo grananja distribucije u mozgu.
1
Slika 71 prikazuje dizajn ispitivanja za procenjivanje in vivo utišavanja gena nakon jedne IS injekcije di-hsiRNK.
Slika 72 prikazuje neuronsku isporuku di-hsiRNK.
Slika 73 prikazuje efikasnost di-hsiRNK u striatumu i korteksu. IS injekcija, 2 nmol dihsiRNK, 1 nedelja, QuantiGene 2.0.
Slika 74 prikazuje uniformnu distribuciju di-hsiRNK u kičmenoj moždini.
Slika 75 prikazuje htt iRNK utišavanje u kičmenoj moždini nakon davanja di-hsiRNK<HTT>bolusa. IT, 3 nmol, jedna nedelja, QuantiGene.
Slika 76 prikazuje di-hsiRNK-posredovano in vitro utišavanje u HeLa ćelijama i primarnim kortikalnim neuronima.
Slika 77 prikazuje biodistribuciju di-hsiRNK. Intrastriatalna injekcija od 2 nmol Di-siRNK oligo (4 nmol odgovarajućeg antismisao lanca). N=2 miševa po konjugatu. Mozgovi su sakupljeni nakon 48 sati kasnije i obeleženi sa DAPI (nukleus, plavo) i NeuN (neuronski marker, zeleno). Slika je reprezentativna. Crveno-oligo.
Slika 78 prikazuje biodistribuciju di-hsiRNK. Intrastriatalna injekcija od 2 nmol Di-siRNK oligo (4 nmol odgovarajućeg antismisao lanca). N=2 miševa po konjugatu. Mozgovi su sakupljeni nakon 48 sati kasnije i obeleženi sa DAPI (nukleus, plavo) i NeuN (neuronski marker, zeleno). Slika je reprezentativna. Crveno-oligo.
Slika 79 prikazuje distribuciju di-hsiRNK u mozgu, TEG-azid, TEG i vitamin D nakon 48 sati. 2 nmola injektirano IS, N=2 miša po konjugatu, mozgovi su sakupljeni 48 sati kasnije. Slika 80 prikazuje efikasnost sinteze vitamina D na htt iRNK ispoljavanje.
Slika 81 prikazuje hemijsku Formulu jedinjenja koje je ovde dato.
Slika 82 prikazuje primere internukleotidnih veza R<3>.
Slika 83 prikazuje otelotvorenje hemijske Formule sa Slike 81.
Slika 84 prikazuje hemijsku Formulu jedinjenja koje je ovde dato.
Slika 85 prikazuje hemijsku Formulu jedinjenja koje je ovde dato.
Slika 86 prikazuje otelotvorenje Y dela sa Slike 84 ili Slike 85.
Slika 87 prikazuje hemijsku Formulu jedinjenja koje je ovde dato.
Slika 88 prikazuje otelotvorenje hemijske Formule sa Slike 87.
Slika 89 prikazuje hemijsku Formulu jedinjenja koje je ovde dato.
Slika 90 prikazuje otelotvorenje hemijske Formule sa Slike 89.
Slike 91A-D prikazuju razvoj potpuno metabolički stabilizovane hsiRNK (FM-hsiRNK). (A) Šema delimično i potpuno modifikovanih hsiRNK. (B) hsiRNK i FM-hsiRNK imaju jednaku sposobnost da uđu u RISC (HeLa, 72 sata). (C) Metabolički stabilni 5'-E-VP je aktivan kao 5'-
1
P. (D) 5'-E-VP omogućava stalnu isporuku udaljenom tkivu (7 dana nakon injekcije, PNA analiza).
Slika 92 prikazuje je evolucija hemije omogućila široku distribuciju hsiRNK u mozgu miševa nakon bolusne CSF (ICV) infuzije. Slike sagitalnih delova (levi panel) 48 sati nakon ICV injekcije sa 250 µg Cy3-označenim hsiRNK varijantama (desni panel). Slike su napravljene sa Leica mikroskopom sa nizom pločica pri 10× i pri identičnom intenzitetu lasera. Nukleus (plavo); Cy3-hsiRNK (crveno). Chol-hsiRNK su glavnom preostale oko injektiranih ventrikula sa marginalnom distribucijom u distalnim delovima mozga. DHA-hsiRNK pokazuje bolju distribuciju. PC-DHA i Di-hsiRNK pokazuju najrašireniju distribuciju sa jasnom isporukom u korteks, striatum i čak mali mozak. Razmera stuba = 900 µm.
Slika 93 prikazuje sintetski protokol za PC-DHA funkcionalizovanu čvrstu podlogu.
Slika 94 prikazuje sintetski protokol za DI-funkcionalizovanu čvrstu podlogu.
Slike 95A-C prikazuju di-hsiRNK otkriće. (A) Hemijski sastav četiri bi-proizvoda iz kalciferol-hsiRNK sinteze (analitička HPLC sirove sinteze). (B) Efikasnost bi-proizvoda u HeLa ćelijama, 72 sata, QuantiGene®. Sva jedinjenja su bila jednako aktivna. (C) Jedna, unilateralna intrastriatalna injekcija (25 µg) svakog Cy3-hsiRNK bi-proizvoda, 48 sati. Samo su di-hsiRNK pokazale široku distribuciju sa preferencijalnom neuronskom apsorpcijom. Slika 96 prikazuje hsiANTIDOTE antismisao oligonukleotid koji nosi modifikaciju sa visokim afinitetom (LNA) dizajniranu da bude potpuno komplementarna sa regionom zasejavanja antismisao lanca hsiRNK.
Slika 97 prikazuje holesterol i endocitni peptid (proton sunđer) konjugovanu hsiRNK.
Slika 98 prikazuje fazu rastvaranja sintetskog protokola za MG1-konjugovanu hsiRNK. Slika 99 prikazuje hemijske strukture za DHA-konjugate (g1DHA) i PC-DHA hsiRNK konjugate (g2DHA).
Slika 100 prikazuje čvrstu fazu sintetskog protokola za PC-DHA hsiRNK konjugate.
Slika 101 prikazuje fazu rastvaranja sintetskog protokola za PC-DHA hsiRNK konjugate. Slike 102A-D prikazuju da je stabilizacija celog metabolizma suštinska za konjugat posredovanu siRNK isporuku i trajanje dejstva in vivo. (A, B) U poređenju sa hsiRNK (A), FM-hsiRNK (B) je pokazala značajno pojačanu distribuciju i zadržavanje u tkivu nakon intravenskog (IV) i CSF (ICV) davanja. Trudni miševi divljeg tipa (E15) su injektirani sa 10 mg/kg IV ili 60 µg, ICV. Slike tkiva su napravljene pri 10× na Leica mikroskopu sa nizom ploča pri identičnom intenzitetu lasera. HsiRNK (crveno); nukleus (plavo). Razmera stuba = 900 µm. (C) Nepromenjeni lanac za navođenje u tkivu kvantifikovan 5 dana nakon IV injekcije (n=3, srednja vrednost ± SEM). (D) Utišavanje FM-hsiRNK Htt iRNK u striatumu
1
miša jedan mesec nakon injektiranja (12 µg, intrastriatalno). Delimično modifikovano utišavanje hsiRNK u trajanju manjem od dve nedelje.
Slike 103A-C prikazuju efikasnost i bezbednost PC-DHA-hsiRNK u mozgu miša in vivo. (A) Htt iRNK nivoi u striatumu i korteksu 1 nedelju nakon injektiranja 25 ili 50 µg DHA-hsiRNK. ***P < 0,0001 relativno i za CSF i NTC. (B) Nije detektovano javljanje urođene imune aktivacije pri nivoima doza koji su 20 puta veći od efikasne doze (podaci su prikazani za ukupne mikroglije za DHA-hsiRNK). (C) Normalna neuronska održivost zasnovana na DARP32 nivoima. Primetiti toksičnu dozu (crveni stub) za chol-hsiRNK.
Slike 104A-C pokazuju da di-hsiRNK ispoljava široku distribuciju i efikasnost u mozgu miša. (A) Robusna i uniformna distribucija Cy3-Di-hsiRNK kroz mozak, vizuelno i histološki, sa jasnom neuronskom apsorpcijom 48 sati nakon ICV injekcije (250 µg, CSF, obe strane), razmera stuba = 100 µm. (B) Htt iRNK utišavanje u korteksu i striatumu 7 dana nakon jedne intrastriatalne injekcije (25 µg). (C) hsiRNK akumulacija u tikvu 7 dana nakon injekcije (PNA analiza).
Slike 105A-B pokazuju da dihsiRNK ispoljava široku distribuciju i efikasnost u kičmenoj moždini miša nakon bolusne lumbalne intratekalane injekcije. (A) Chol-hsiRNK su pokazale strmi gradijent difuzije od spoljašnjosti ka unutrašnjosti kičmene moždine, ali su hsiRNK distribuirale široko kroz kičmenu moždinu. Životinje su injektirane intratekalno sa 75 µg Cy3-Chol-hsiRNK ili Cy3-Di-hsiRNK. Razmera stuba = 100 µm. (B) Robusno Htt iRNK utišavanje je primećeno u svim regionima kičmene moždine (7 dana nakon injekcije, n=6). Slika 106 prikazuje PNA (peptidna nukleinska kiselina)-baziranu analizu za detekciju hsiRNK lanca za navođenje u tkivu miševa. Izvršena je liza tkiva, talog je odvojen taloženjem i PNA dupleks lanca za navođenje je prečišćen HPLC (DNAPac P100, 50% voda 50% acetonitril, gradijent soli 0-1M NaClO4).
Slika 107 prikazuje ciljanje bubrega sa PC-DHA-hsiRNK.
Slika 108 prikazuje GM1-hsiRNK internalizaciju i GM1-hsiRNK-posredovano htt iRNK utišavanje.
Slika 109 prikazuje distribuciju GM1-hsiRNK u mozgu.
Slike 110A-G pokazuju da sistemski date potpuno modifikovane (FM) hsiRNK pokazuju dramatično pojačanu distribuciju u tkivu i efikasnost in vivo. (a) Distribucija Cy3-hsiRNK i Cy3-FM-hsiRNKsFLT1 (crveno) u tkivu 10 mg/kg IV injekcija. Nukleus je obeležen sa DAPI (plavo). Sve slike su dobijene uz identična podešavanja. (b-e) Kvantifikacija lanca za navođenje sa analizom baziranom na PNA hibridizaciji (b) 10 mg/kg, IV, 24 sata (c) 10 mg/kg, SC, 24 sata (d) 2x20 mg/kg, IV, 120 sati , (n= 7) (e) 2x15 mg/kg, IV, 120 sati, (n=12).
2
(f, g) Kvantifikacija sFLT1 iRNK utišavanja nakon (f) 2x20 mg/kg, C57B6 miševi, (n=3, PBS; n=7, FM-hsiRNKsFLT), (g) 2x15 mg/kg, CD1 miševi. (n=12, za PBS; n=6, NTC; n=12, FM-hsiRNKsFLT1). Nivoi iRNK su izmereni 120 sati nakon injektiranja sa QuantiGene® (Affymetrix) analizom, normalizovan do gena koji održava domaćinstvo FLT1 i predstavljeni kao procenat PBS tretirane kontrole. Sve trage grešaka predstavljaju srednju vrednost ± SD. ***, P<0,001; ****, P<0,0001.
Slika 111A-G prikazuju da su potpuno modifikovane hsiRNK široko distribuirane kroz mozak i pokazuju višu potentnost i duže vreme trajanja utišavanja nakon lokalnog davanja. Prikazane su hsiRNKHTT (a) i FM-hsiRNKHTT(b, c, d, e) koje su injektirane ICV, distribuirane kroz sagitalni deo mozga nakon 48 sati. Nukleus je obeležen sa DAPI (plavo). Cy3-hsiRNK (crveno). (f, g) hsiRNKHTT i FM-hsiRNKHTT su unilateralno injektirane u striatum i nivoi HTT iRNK su izmereni upotrebom QuantiGene® (Affymetrix) nakon (f) 5 dana ili (g) 7, 14 i 28 dana, normalizovani do gena koji održava domaćinstvo, PPIB i predstavljeni kao procenat netretirane kontrole (n=8 miševa, srednja vrednost ± SD). NTC = kontrola koja nije za ciljanje. CSF = veštačka cerebrospinalna tečnost Sve trake grešaka predstavljaju srednju vrednost ± SD. ** , P<0,01; ***, P<0,001; ****, P<0,0001.
Detaljni opis određenih primernih otelotvorenja
[0046] Date su nove sekvence za ciljanje hantingtina. Takođe su date nove siRNK koje ciljaju nove sekvence za ciljanje hantingtina.
[0047] Uopšteno, nomenklatura koja se koristi u vezi sa ćelijskom i tkivnom kulturom, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom i proteinima i hemijskom nukleinskih kiselina i hibridizacijom koja je ovde opisana je ona koja je dobro poznata i uopšteno korišćena u struci. Metode i tehnike koje su ovde date se uopšteno vrše u skladu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u struci i kao što je opisano u različitim opštim i naročitim referencama koje su citirane i razmatrane kroz predmetnu specifikaciju ukoliko nije drugačije ukazano. Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvršene u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što se obično vrši u struci ili kao što je ovde opisano. Nomenklatura koja se koristi u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su dobro poznate i obično se koriste u struci. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije i za isporuku i tretiranje pacijenata.
[0048] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini koji se ovde koriste imaju značenja koja su uopšteno prihvaćena od strane stručnjaka u ovoj oblasti. U slučaju bilo kakve latentne nejasnoće, definicije koje su ovde date imaju prednost nad bilo kojim rečnikom ili drugom definicijom. Ukoliko nije drugačije zahtevano kontekstom, termini u jednini će obuhvatati množinu a termini u množini će obuhvatati jedninu. Upotreba „ili“ označava „i/ili“ ukoliko nije drugačije navedeno. Upotreba termina „obuhvatati“ kao i drugih oblika, kao što su „obuhvata“ i „obuhvaćeno“ nije ograničavajuća.
[0049] Kako bi se predmetno obelodanjivanje moglo lakše shvatiti, prvo su definisani određeni termini.
[0050] Termin „nukleozid“ se odnosi na molekul koji ima purin ili pirimidin bazu kovalentno povezanu sa riboza ili dezoksiriboza šećerom. Primerni nukleozidi obuhvataju adenozin, gvanozin, citidin, uridin i timidin. Dodatni primerni nukleozidi obuhvataju inozin, 1-metil inozin, pseudouridin, 5,6-dihidrouridin, ribotimidin, 2N-metilgvanozin i 2,2N-N-dimetilgvanozin (takođe se ovde nazivaju „retkim“ nukleozidima). Termin „nukleotid“ se odnosi na nukleozid koji ima jednu ili više fosfatnih grupa spojenih u esterne veze sa šećerom. Primerni nukleotidi obuhvataju nukleozid monofosfate, difosfate i trifosfate.
Termini „polinukleotid“ i „molekul nukleinske kiseline“ se ovde koriste se naizmenično i odnose se na polimer nukleotida koji je spojen fosfodiester ili fosforotioat vezom između 5' i 3' atoma ugljenika.
[0051] Termin „RNK“ ili „RNK molekul“ ili „molekul ribonukleinske kiseline“ se odnosi na polimer ribonukleotida (npr., 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ili više ribonukleotida). Termin „DNK“ ili „DNK molekul“ ili „molekul dezoksiribonukleinske kiseline“ se odnosi na polimer dezoksiribonukleotida. DNK i RNK se mogu sintetisati prirodno (npr., DNK replikacijom ili transkripcijom DNK, respektivno). RNK se može post-transkripciono modifikovati. DNK i RNK se mogu hemijski sintetisati. DNK i RNK mogu biti jednolančane (tj., ssRNK i ssDNK, respektivno) ili višelančane (npr., dvolančane, tj., dsRNK i dsDNK, respektivno). „iRNK“ ili „informaciona RNK“ je jednolančana RNK koja vrši specifikaciju aminokiselinske sekvence jednog ili više polipeptidnih lanaca. Ova informacija se prevodi za vreme proteinske sinteze kada se ribozomi vezuju za iRNK.
[0052] Kako se ovde koristi, termin „mala interferirajuća RNK“ („siRNK“) (takođe se u struci naziva kao „kratka interferirajuća RNK“) se odnosi na RNK (ili RNK analog) koja sadrži između 10-50 nukleotida (ili nukleotidnih analoga) koji su u stanju da usmeravaju ili posreduju RNK interferenciju. Poželjno, siRNK sadrži između 15-30 nukleotida ili nukleotidnih analoga, poželjnije između 16-25 nukleotida (ili nukleotidnih analoga), čak još poželjnije između 18-23 nukleotida (ili nukleotidnih analoga) a čak još poželjnije između 19-22 nukleotida (ili nukleotidnih analoga) (npr., 19, 20, 21 ili 22 nukleotida ili nukleotidnih analoga). Termin „kratka“ siRNK se odnosi na siRNK koja sadrži oko 21 nukleotid (ili nukleotidni analog), na primer, 19, 20, 21 ili 22 nukleotida. Termin „dugačka“ siRNK se odnosi na siRNK koja sadrži oko 24-25 nukleotida, na primer 23, 24, 25 ili 26 nukleotida. Kratke siRNK mogu, u nekim primerima, obuhvatati manje od 19 nukleotida, npr., 16, 17 ili 18 nukleotida, uz to da kraće siRNK zadržavaju sposobnost da posreduju RNKi. Slično tome, dugačke siRNK mogu, u nekim primerima, obuhvatati više od 26 nukleotida, uz to da duže siRNK zadržavaju sposobnost da posreduju RNKi dalje procesiranje, npr., enzimsko procesiranje, kratkoj siRNK.
[0053] Termin „nukleotidni analog“ ili „izmenjeni nukleotid“ ili „modifikovani nukleotid“ se odnosi na ne-standardni nukleotid koji obuhvata ribonukleotide ili dezoksiribonukleotide koji se ne javljaju u prirodi. Primerni nukleotidni analozi su modifikovani na bilo kojoj poziciji tako da se menjaju hemijska svojstva nukleotida ali se zadržava sposobnost nukleotidnog analoga za vrši svoju namenjenu funkciju. Primeri pozicija nukleotida koji se mogu derivatizovati obuhvataju 5 poziciju, npr., 5-(2-amino)propil uridin, 5-bromo uridin, 5-propin uridin, 5-propienil uridin, itd.; 6 poziciju, npr., 6-(2-amino)propil uridin; 8-poziciju za adenozin i/ili gvanozin, npr., 8-bromo gvanozin, 8 hloro gvanozin, 8-fluorogvanozin, itd. Nukleotidni analozi takođe obuhvataju deaza nukleotide, npr., 7-deaza-adenozin; O- i N-modifikovane (npr., alkilisani, npr., N6-metil adenozin, ili na drugi način poznate u struci) nukleotide; i druge heterociklično modifikovane nukleotidne analoge kao što su oni opisani u Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug.10(4):297-310.
[0054] Nukleotidni analozi takođe mogu obuhvatati modifikacije dela šećera nukleotida. Na primer, 2' OH-grupa može biti zamenjena grupom izabranom iz H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR, ili OR, gde je R supstituisani ili nesupstituisani C1-C6alkil, alkenil, alkinil, aril, itd. Druge moguće modifikacije obuhvataju one opisane u pat. SAD br.
5,858,988 i 6,291,438.
2
[0055] Fosfatna grupa nukleotida takođe može biti modifikovana, npr., supstituisanjem jednog ili više kiseonika fosfatne grupe sa sumporom (npr., fosforotioati), ili vršenjem drugih supstitucija koje omogućavaju da nukleotid vrši svoju namenjenu funkciju kao što je opisano u, na primer, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000 Apr.10(2):117-21, Rusckowski i dr. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000 Oct.10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2001 Oct.11(5): 317-25, Vorobjev i dr. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2001 Apr. 11(2):77-85, i pat. SAD br.5.684.143. Određene iznad navedene modifikacije (npr., modifikacije fosfatne grupe) poželjno smanjuju brzinu hidrolize, na primer, polinukleotida koji sadrže navedene analoge in vivo ili in vitro.
[0056] Termin „oligonukleotid“ se odnosi na kratki polimer nukleotida i/ili nukleotidne analoge. Termin „RNK analog“ se odnosi na polinukleotid (npr., hemijski sintetisani polinukleotid) koji ima bar jedan izmenjeni ili modifikovani nukleotid u poređenju sa odgovarajućim neizmenjenom ili nemodifikovanom RNK ali koja zadržava istu ili sličnu prirodu ili funkciju kao odgovarajuća neizmenjena ili nemodifikovana RNK. Kao što je razmatrano iznad, oligonukleotidi mogu biti povezani vezama koje su rezultat niže stope hidrolize RNK analoga u poređenju sa RNK molekulom sa fosfodiester vezama. Na primer, nukleotidi ili analog mogu sadržati metilendiol, etilen diol, oksimetiltio, oksietiltio, oksikarboniloksi, fosforodiamidat, fosforoamidat i/ili fosforotioat veze. Poželjni RNK analozi obuhvataju ribonukleotide i/ili dezoksiribonukleotide sa modifikovanim šećerom i/ili glavnim lancem. Takve izmene ili modifikacije mogu dalje obuhvatati dodatni materijal koji nije nije nukleotidni, kao što je na krajevima RNK ili interno (na jednom ili više nukleotida RNK). RNK analog je potrebno da bude samo ono sličan prirodnoj RNK tako da ima sposobnost da posreduje RNK interferenciju.
[0057] Kako se ovde koristi, termin „RNK interferencija“ („RNKi“) se odnosi na selektivnu unutarćelijsku degradaciju RNK. RNKi se javlja u ćelijama prirodno kako bi se uklonila strana RNK (npr., virusna RNK). Prirodna RNKi počinje od fragmenata podeljenih od slobodne dsRNK što usmerava mehanizam degradaciju sličnih RNK sekvenci. Alternativno, RNKi se može započeti rukom čoveka, na primer, kako bi se utišalo ispoljavanje ciljanih gena.
[0058] RNKi sredstvo, npr., RNK sredstvo za utišavanje, koje ima lanac čija je „sekvenca dovoljno komplementarna sa sekvencom ciljane iRNK kako bi se usmerila RNK interferencija (RNKi) specifična za cilj“ predstavlja da lanac ima sekvencu koja je dovoljna da izazove uništavanje ciljane iRNK mehanizmom ili procesom RNKi.
[0059] Kako se ovde koristi, termin „izolovana RNK“ (npr., izolovana siRNK“ ili izolovani siRNK prekursor“) se odnosi na RNK molekule koji suštinski ne sadrže drugi ćelijski materijal ili sredinu za kultivisanje kada se proizvode rekombinantnim tehnikama, ili suštinski ne sadrže hemijske prekursore ili druge hemikalije kada se hemijski sintetišu.
[0060] Kako se ovde koristi, termin „utišavanje RNK“ se odnosi na grupu regulatornih mehanizama koji su specifični za grupu sekvenci (npr., RNK interferencija (RNKi), utišavanje transkripcionog gena (TGS), post-transkripciono utišavanje gena (PTGS), gušenje, ko-supresija, i translatorna represija) koji su posredovani RNK molekulima što za rezultat daje suzbijanje ili „utišavanje“ ispoljavanja odgovarajućeg gena koji kodira protein.
Utišavanje RNK je primećeno kod dosta tipova organizama, uključujući biljke, životinje i gljive.
[0061] Termin „diskriminatorno utišavanje RNK“ se odnosi na sposobnost RNK molekula da suštinski suzbije ispoljavanje „prve“ ili „ciljane“ polinukleotidne sekvence dok suštinski ne suzbija ispoljavanje „druge“ ili „one koja nije ciljana“ polinukleotidne sekvence, npr., kada su obe polinukleotidne sekvence prisutne u istoj ćeliji. U određenim otelotvorenjima, ciljana polinukleotidna sekvenca odgovara ciljanom genu, dok polinukleotidna sekvenca koja nije ciljana odgovara genu koji nije ciljan. U drugim otelotvorenjima, ciljana polinukleotidna sekvenca odgovara ciljanom alelu, dok polinukleotidna sekvenca koja nije ciljana odgovara alelu koji nije ciljan. Takođe je ovde opisana, da je ciljana polinukleotidna sekvenca DNK sekvenca koja kodira regulatorni region (npr., elementi promotera ili pojačivača) ciljanog gena. Takođe je ovde opisano da ciljana polinukleotidna sekvenca cilja iRNK kodiranu od strane ciljanog gena.
[0062] Termin „in vitro“ ima svoje značenje prepoznato u struci, npr., uključivanje prečišćenih reagenasa ili ekstrakta, npr., ćelijskih ekstrakta. Termin „in vivo“ ima svoje značenje prepoznato u struci, npr., uključivanje živih ćelija, npr., imortalizovanih ćelija, primarnih ćelija, ćelijskih linija i/ili ćelija u organizmu.
2
[0063] Kako se ovde koristi, termin „transgen“ se odnosi na bilo koji molekul nukleinske kiseline, koji je lukavo uveden u ćeliju i postaje deo genoma organizma koji se razvija iz ćelije. Takav transgen može obuhvatati gen koji je delimično ili potpuno heterologan (tj., stran) transgenom organizmu, ili može predstavljati gen koji je homologan endogenom genu organizma. Termin „transgen“ takođe znači da se molekul nukleinske kiseline koji obuhvata jednu ili više izabranih sekvenci nukleinske kiseline, npr., DNK, koje kodiraju jedan ili više modifikovani RNK prekursor, ispoljava u transgenom organizmu, npr., životinji, koji je delom ili potpuno heterologan, tj., stran transgenoj životinji ili je homologan endogenom genu transgene životinje, ali je dizajniran da se uvede u genom životinje na lokaciji koja se razlikuje od one u prirodnom genu. Transgen obuhvata jedan ili više promotera i bilo koju drugu DNK, kao što su introni, neophodni za ispoljavanje izabrane sekvence nukleinske kiseline, koji su svi operativno povezani za izabranu sekvencu i mogu obuhvatati sekvencu pojačivača.
[0064] Gen „uključen“ u bolest ili poremećaj obuhvata gen, normalno ili aberantno ispoljavanje ili funkciju koja utiče na ili izaziva bolest ili poremećaj ili bar jedan simptom navedene bolest ili poremećaja.
[0065] Termin „mutacija dobitka funkcije“ kako se ovde koristi, se odnosi na mutaciju u genu gde protein kodiran od strane navedenog gena (tj., mutirani protein) stiče funkciju koja obično nije povezana sa proteinom (tj., proteinom divljeg tipa) i izaziva ili doprinosi bolesti ili poremećaju. Mutacija dobitka funkcije može biti brisanje, dodavanje ili supstituisanje nukleotida ili više nukleotida u genu što daje povećanje ili izmenu funkcije kodiranog proteina. Takođe je ovde opisano da mutacija dobitka funkcije menja funkciju mutiranog proteina ili izaziva interakciju sa drugim proteinima. Takođe je ovde opisano da mutacija dobitka funkcije izaziva smanjenje ili uklanjanje normalnog proteina divljeg tipa, na primer, interakcijom izmenjenog, mutiranog proteina sa navedenim normalnim, proteinom divljeg tipa.
[0066] Kako se ovde koristi, termin „ciljani gen“ je gen čije se ispoljavanje suštinski suzbija ili „utišava“. Utišavanje se može postići utišavanjem RNK, npr., deljenjem iRNK ciljanog gena ili translatornom represijom ciljanog gena. Termin „gen koji nije ciljan“ je gen čije se ispoljavanje suštinski ne utišava. U jednom otelotvorenju, polinukleotidna sekvenca ciljanog i gena koji nije ciljan (npr., iRNK kodirana ciljanim i genima koji nisu ciljani) se može
2
razlikovati u jednom ili više polinukleotida. U drugom otelotvorenju, ciljani i geni koji nisu ciljani se mogu razlikovati u jednom ili više polimorfizmu (npr., jednonukleotidni polimorfizmi ili SNP). U drugom otelotvorenju, ciljani i geni koji nisu ciljani mogu deliti manje od 100% identičnosti sekvence. U drugom otelotvorenju, gen koji nije ciljan može biti homolog (npr., ortolog ili paralog) ciljanog gena.
[0067] „Ciljani alel“ je alel (npr., SNP alel) čije se ispoljavanje selektivno suzbija ili „utišava“. Utišavanje se može postići utišavanjem RNK, npr., deljenjem iRNK ciljanog gena ili ciljanog alela sa siRNK. Termin „alel koji nije ciljan“ je alel čije se ispoljavanje suštinski ne utišava. U određenim otelotvorenjima, ciljani i aleli koji nisu ciljani mogu odgovarati istom ciljanom genu. U drugim otelotvorenjima, ciljani alel odgovara, ili je povezan sa ciljanim genom i alel koji nije ciljan odgovara, ili je povezan sa genom koji nije ciljan. U jednom otelotvorenju, polinukleotidna sekvenca ciljanog i alela koji nije ciljan se može razlikovati u jednom ili više nukleotida. U drugom otelotvorenju, ciljani i alel koji nije ciljan se mogu razlikovati u jednom ili više polimorfizama alela (npr., jedan ili više SNP). U drugom otelotvorenju, ciljani i aleli koji nisu ciljani mogu deliti manje od 100% identičnosti sekvence.
[0068] Termin „polimorfizam“ kako se ovde koristi se odnosi na varijaciju (npr., jedno ili više brisanja, uvođenja ili supstitucija) u sekvenci gena koja je identifikovana ili detektovana kada se ista sekvenca gena iz različitih izvora ili ispitanika (ali od istog organizma) uporede. Na primer, polimorfizam može biti identifikovan kada se ista sekvenca gena iz različitih ispitanika uporede. Identifikacija takvih polimorfizama je rutinska u struci, metodologije su slične onima koje se koriste za detekciju, na primer tačkastih mutacija kod raka dojke.
Identifikacija se može izvršiti, na primer, iz DNK dobijene iz limfocita ispitanika, nakon čega sledi pojačavanje polimorfnih regiona upotrebom specifičnih prajmera za taj polimorfni region. Alternativno, polimorfizam se može identifikovati kada se dva alela istog gena uporede. N naročitim otelotvorenjima, polimorfizam je jednonukleotidni polimorfizmi ili (SNP).
[0069] Varijacija u sekvenci između dva alela istog gena bez organizma se ovde naziva kao „alelični polimorfizam“. U određenim otelotvorenjima, alelični polimorfizam odgovara SNP alelu. Na primer, alelični polimorfizam može sadržati jednonukleotidnu varijaciju između dva alela SNP. Polimorfizam može biti na nukleotidu u regionu kodiranja ali zbog degradacije
2
genetskog koga, izmena aminokiselinske sekvence se ne kodira. Alternativno, polimorfne sekvence mogu kodirati različite amino kiseline na naročitim pozicijama, ali izmena amino kiseline ne utiče na funkciju proteina. Polimorfni regioni se takođe mogu pronaći u nekodirajućim regionima gena. U primernim otelotvorenjima, polimorfizam se pronalazi u regionu kodiranja gena ili netransliranom regionu (npr., 5' UTR ili 3' UTR) gena.
[0070] Kako se ovde koristi, termin „alelična frekvencija“ je mera (npr., proporcija ili procenat) relativne frekvencije alela (npr., SNP alel) u jednom lokusu u populaciji pojedinaca. Na primer, kada populacija pojedinaca nosi n lokusa naročito hromozomalnog lokusa (i gena koji zauzima lokus) u svakoj od svojih somatskih ćelija, onda je alelična frekvencija alela udeo ili procenat lokusa koje alel zauzima unutar populacije. U naročitim otelotvorenjima, alelična frekvencija alela (npr., SNP alela) je bar 10% (npr., bar 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ili više) u uzorku populacije.
[0071] Kako se ovde koristi, termin „uzorak populacije“ se odnosi na populaciju pojedinaca koja predstavlja statistički značajan broj pojedinaca. Na primer, uzorak populacije može sadržati 50, 75, 100, 200, 500, 1000 ili više pojedinaca. U naročitim otelotvorenjima, uzorak populacije može sadržati pojedince koji dele bar jedan zajednički fenotip bolesti (npr., poremećaj dobitka funkcije) ili mutacije (npr., mutacija dobitka funkcije).
[0072] Kako se ovde koristi, termin „heterozigotnost“ se odnosi na udeo pojedinaca unutar populacije koji su heterozigotni (npr., sadrže dva ili više različita alela) na naročitom lokusu (npr., SNP). Heterozigotnost se može izračunati za uzorak populacije metodama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.
[0073] Termin „poliglutamin domen“ kako se ovde koristi se odnosi na segment ili domen proteina koji se sastoji od uzastopnih glutamin ostataka povezani peptidnim vezama. U jednom otelotvorenju uzastopni region obuhvata bar 5 glutamin ostataka.
[0074] Termin „prošireni poliglutamin domen“ ili „produženi poliglutamin segment“ kako se ovde koristi se odnosi na segment ili domen proteina koji obuhvata bar 35 uzastopnih glutamin ostataka povezanih peptidnim vezama. Takvi prošireni segmenti se nalaze kod svih ispitanika pogođenih poliglutaminskom bolešću, kao što je ovde opisano, bilo da ispitanik pokazuje ili ne pokazuje simptome.
2
[0075] Termin „trinukleotidno ponavljanje“ ili „region trinukleotidnog ponavljanja“ kako se ovde koristi se odnosi na segment sekvence nukleinske kiseline npr.,) koji se sastoji od uzastopnih ponavljanja naročite trinukleotidne sekvence. U jednom otelotvorenju, trinukleotidno ponavljanje obuhvata bar 5 uzastopnih trinukleotidnih sekvenci. Primerne trinukleotidne sekvence obuhvataju, ali nisu ograničene na, CAG, CGG, GCC, GAA, CTG i/ili CGG.
[0076] Termin „bolesti trinukleotidnog ponavljanja“ kako se ovde koristi, se odnosi na bilo koju bolest ili poremećaj okarakterisan proširenim regionom trinukleotidnog ponavljanja koji se nalazi u genu, gde je region trinukleotidnog ponavljanja izazivač bolesti ili poremećaja. Primeri bolesti trinukleotidnog ponavljanja obuhvataju ali nisu ograničene na spinocerebralnu ataksiju tipa 12, spino-cerebralnu ataksiju tipa 8, sindrom fragilnog X, mentalnu retardaciju - fragilni XE, Fridrajhovu ataksiju i miotoničnu distrofiju. Primerne bolesti trinukleotidnog ponavljanja za tretiranje su one okarakterisane ili izazvane proširenim regionom trinukleotidnog ponavljanja na 5' kraju regiona kodiranja gena, gena koji kodira mutirani protein koji izaziva ili je uzrok bolesti ili poremećaja. Određene trinukleotidne bolesti, na primer, sindrom fragilnog X, gde mutacija nije povezana sa regionom kodiranja možda nisu pogodne za tretiranje prema metodologijama koje su ovde opisano, kako ne postoji pogodna iRNK da se cilja od strane RNKi. Suprotno tome, bolest kao što je Fridrajhova ataksija može biti pogodna za tretiranje u skladu sa metodologijama kao što je ovde opisano zato što, iako mutacija koja je uzrok nije u regionu kodiranja (tj., leži u intronu), ona može biti u, na primer, iRNK prekursoru (npr., pre-splajsovani iRNK prekursor).
[0077] Termin „poliglutaminski poremećaj“ kako se ovde koristi, se odnosi na bilo koju bolest ili poremećaj okarakterisan proširenim (CAG)n ponavljanjima na 5' kraju regiona kodiranja (time kodirajući prošireni poliglutaminski region u kodiranom proteinu). U jednom otelotvorenju, poliglutaminski poremećaji su okarakterisani progresivnom degeneracijom nervnih ćelija. Primeri poliglutaminskih poremećaja obuhvataju ali nisu ograničeni na:
Hantingtonovu bolest, spino-cerebralnu ataksiju tip 1, spino-cerebralnu ataksiju tip 2, spinocerebralnu ataksiju tip 3 (takođe poznata kao Machado-Joseph bolest) i spino-cerebralnu ataksiju tip 6, spino-cerebralnu ataksiju tip 7 i dentatorubralnu-pallidoluisievu atrofiju.
[0078] Fraza „ispitivanje funkcije gena u ćeliji ili organizmu“ se odnosi na proveravanje ili
2
ispitivanje ispoljavanja, aktivnosti, funkcije ili fenotipa koji se odatle javlja.
[0079] Kako se ovde koristi, termin „sredstvo za utišavanje RNK“ se odnosi na RNK koja je u stanju da suzbije ili „utiša“ ispoljavanje ciljanog gena. U određenim otelotvorenjima, sredstvo za utišavanje RNK može sprečiti kompletno procesiranje (npr., puna translacija i/ili ispoljavanje) iRNK molekula kroz post-transkripcioni mehanizam utišavanja. Sredstva za utišavanje RNK obuhvataju male (<50 b.p.) nekodirajuće RNK molekule, na primer RNK duplekse koji sadrže uparene lance, kao i prekursor RNK iz kojih se takve male nekodirajuće RNK mogu generisati. Primerna sredstva za utišavanje RNK obuhvataju siRNK, miRNK, siRNK-nalik duplekse, antismisao oligonukleotide, GAPMER molekule i dvostrukofunkcionalne oligonukleotide kao i njihove prekursore. U jednom otelotvorenju, sredstvo za utišavanje RNK može izazvati RNK interferenciju. U drugom otelotvorenju, sredstvo za utišavanje RNK može posredovati translatornu represiju.
[0080] Kako se ovde koristi, termin „retki nukleotid“ se odnosi na prirodni nukleotid koji se ne javlja često, uključujući prirodne dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide koji se ne javljaju često, npr., prirodni ribonukleotid koji nije gvanozin, adenozin, citozin ili uridin. Primeri retkih nukleotida obuhvataju, ali nisu ograničeni na, inozin, 1-metil inozin, pseudouridin, 5,6-dihidrouridin, ribotimidin,<2>N-metilgvanozin i<2,2>N,N-dimetilgvanozin.
[0081] Termin „modifikovani“ kao kod modifikovanog RNK prekursora, ili modifikovanog molekula nukleinske kiseline, ukazuje da se prekursor ili molekul ne javljaju prirodno, u tome da je ceo ili deo sekvence nukleinske kiseline prekursora ili molekula stvoren ili izabran od strane čoveka. Kada se stvori ili izabere, sekvenca se može replikovati, translirati, transkribovati ili na drugačiji način obraditi mehanizmima u ćeliji. Zbog toga, RNK prekursor proizveden u ćeliji formira transgen koji obuhvata modifikovani molekul nukleinske kiseline je modifikovani RNK prekursor.
[0082] Kako se ovde koristi, termin „mikroRNK“ (miRNK), takođe se u struci naziva kao „male temporalne RNK“ („stRNK“) se odnosi na malu (10-50 nukleotida) RNK koja je uopšteno kodirana (npr., virusno, od strane sisara ili genoma biljaka) i može usmeravati ili posredovati RNK utišavanje. „miRNK poremećaj“ će se odnositi na bolest ili poremećaj okarakterisan aberantnim ispoljavanjem ili aktivnošću miRNK.
[0083] Kako se ovde koristi, termin „dvostruko funkcionalni oligonukleotid“ se odnosi na sredstvo za utišavanje RNK koje ima formulu T-L-µ, gde je T grupa za ciljanje iRNK, L je vezujuća grupa a µ je grupa za regrutovanje miRNK. Kako se ovde koristi, termini „grupa za ciljanje iRNK“, „grupa za ciljanje“, „deo za ciljanje iRNK“ ili „deo za ciljanje“ se odnose na domen, deo ili region dvostruko funkcionalnog oligonukleotida koji ima dovoljnu veličinu i dovoljnu komplementarnost na delu ili regionu iRNK koji je izabran iz ciljan za utišavanje (tj., grupa ima sekvencu koja je dovoljna da se uhvati ciljana iRNK). Kako se ovde koristi, termin „vezujuća grupa“ ili „vezujući deo“ se odnosi na domen, deo ili region sredstva za utišavanje RNK koji se kovalentno spaja ili povezuje sa iRNK.
[0084] Kako se ovde koristi, termin „antismisao lanac“ sredstva za utišavanje RNK, npr., siRNK ili sredstva za utišavanje RNK, se odnosi na lanac koji je suštinski komplementaran sa delom od 10-50 nukleotida, npr., oko 15-30, 16-25, 18-23 ili 19-22 nukleotida iRNK gena ciljanog za utišavanje. Antismisao lanac ili prvi lanac ima sekvencu koja je dovoljno komplementarna sa sekvencom željene ciljane iRNK kako bi se usmeravalo utišavanje specifično za cilj, npr., dovoljno komplementarna da bi se započelo uništavanje željene ciljane iRNK od strane RNKi mehanizma ili procesa (RNKi interferencija) ili dovoljno komplementarna da započne translatornu represiju željene ciljane iRNK.
[0085] Termin „smisao lanac“ ili „drugi lanac“ sredstva za utišavanje RNK, npr., siRNK ili sredstva za utišavanje RNK, se odnosi na lanac koji je komplementaran sa antismisao lancem ili prvim lancem. Antismisao i smisao lanci se mogu nazivati kao prvi ili drugi lanac, gde prvi ili drugi lanac imaju komplementarnost sa ciljanom sekvencom i respektivni drugi ili prvi lanac ima komplementarnost sa navedenim prvim ili drugim lancem. miRNK dupleks posreduje ili siRNK-nalik dupleksi obuhvataju miRNK lanac koji ima dovoljnu komplementarnost za deo od 10-50 nukleotida iRNK gena ciljanog za utišavanje i miRNK * lanac ima dovoljnu komplementarnost kako bi se formirao dupleks sa miRNK lancem.
[0086] Kako se ovde koristi, termin „lanac za navođenje“ se odnosi na lanac sredstva za utišavanje RNK, npr., antismisao lanac siRNK dupleksa ili siRNK sekvence koji ulazi u RISC kompleks i usmerava deljenje ciljane iRNK.
[0087] Kako se ovde koristi, termin „asimetrija“ kao što je asimetrija dupleks regiona sredstva za utišavanje RNK (npr., osnova shRNK), se odnosi na nejednakost jačine veze ili jačine
1
sparivanja baza između terminusa sredstva za utišavanje RNK (npr., između nukleotida na prvom lancu ili delu osnove i terminalnim nukleotidima na suprotnom drugom lancu ili delu osnove), tako da je 5' kraj jednog od dupleksa u prolazno neuparenom, npr., jednolančanom stanju češće od 5' kraja komplementarnog lanca. Ova strukturna razlika određuje da je jedan lanac dupleksa poželjno uključen u RISC kompleks. Lanac čiji je 5' kraj uže spojen sa komplementarnim lancem će poželjno biti uključen u RISC i posredovati RNKi.
[0088] Kako se ovde koristi, termin „jačina veze“ ili 2“ jačina sparivanja baza“ se odnosi na jačinu interakcije između parova nukleotida (ili nukleotidnih analoga) na suprotnim lancima oligonukleotidnog dupleksa (npr., siRNK dupleks), primarno usled H-vezivanja, van der Valsovih interakcija i sličnog između navedenih nukleotida (ili nukleotidnih analoga).
[0089] Kako se ovde koristi, „5' kraj“ kao što je u 5' kraj antismisao lanca se odnosi na 5' terminalne nukleotide, npr., između jednog i oko 5 nukleotida na 5' terminusu antismisao lanca. Kako se ovde koristi, „ 3' kraj“ kao što je u 3' kraj smisao lanca se odnosi na region, npr., region između jednog i oko 5 nukleotida, koji je komplementaran sa nukleotidima na 5' kraju komplementarnog antismisao lanca.
[0090] Kako se ovde koristi, termin „nukleotid koji vrši destabilizaciju“ se odnosi na prvi nukleotid ili nukleotidni analog koji može formirati bazni par sa drugim nukleotidom ili nukleotidnim analogom tako da bazni par ima manju jačinu veze od konvencionalnog baznog para (tj., Watson-Crick bazni par). U određenim otelotvorenjima, nukleotid koji vrši destabilizaciju može formirati neusklađeni bazni par sa drugim nukleotidom. U drugim otelotvorenjima, nukleotid koji vrši destabilizaciju može formirati klimavi bazni par sa drugim nukleotidom. U još drugih otelotvorenja, nukleotid koji vrši destabilizaciju može formirati dvoznačni bazni par sa drugim nukleotidom.
[0091] Kako se ovde koristi, termin „bazni par“ se odnosi na interakciju između parova nukleotida (ili nukleotidnih analoga) na suprotnim lancima oligonukleotidnog dupleksa (npr., dupleksa formiranog lancem sredstva za utišavanje RNK i ciljane iRNK sekvence), primarno usled H-vezivanja, van der Valsovih interakcija i sličnog između navedenih nukleotida (ili nukleotidnih analoga). Kako se ovde koristi, termin „jačina veze“ ili „jačina sparivanja baza“ se odnosi na jačinu baznog para.
2
[0092] Kako se ovde koristi, termin „neusklađeni bazni par“ se odnosi na bazni par koji se sastoji od nekomplementarnih ili ne-Watson-Crick baznih parova, na primer, bazni parovi G:C, A:T ili A:U koji nisu obično komplementarni. Kako se ovde koristi, termin „dvoznačni bazni par“ (takođe poznat kao ne-diskriminatorni bazni par) se odnosi na bazni par formiran univerzalnim nukleotidom.
[0093] Kako se ovde koristi, termin „univerzalni nukleotid“ (takođe poznat kao „neutralni nukleotid“) obuhvata one nukleotide (npr., određene nukleotide koji vrše destabilizaciju) koji ima bazu („univerzalnu bazu“ ili „neutralnu bazu“) koja ne diskriminiše značajno između baza na komplementarnom polinukleotidu kada se formira bazni par. Univerzalni nukleotidi su prevashodno hidrofobni molekuli koji mogu efikasnosti ući u antiparalelne dupleks nukleinske kiseline (npr., dvolančana DNK ili RNK) zbog nagomilavanja interakcija. Bazni deo univerzalnih nukleotida obično sadrži aromatičnu heterocikličnu grupu koja sadrži azot.
[0094] Kako se ovde koristi, termini „dovoljna komplementarnost“ ili „dovoljan stepen komplementarnosti“ predstavlja da sredstvo za utišavanje RNK ima sekvencu (npr., u antismisao lancu, iRNK grupi za ciljanje ili miRNK grupi za regrutovanje) koja je dovoljna da veže željenu RNK, respektivno i da izazove utišavanje RNK ciljane iRNK.
[0095] Kako se ovde koristi, termin „translatorna represija“ se odnosi na selektivno suzbijanje iRNK translacije. Prirodna translatorna represija nastaje od miRNK podeljenih od shRNK prekursora. I RNKi i translatorna represija su posredovane sa RISC. I RNKi i translatorna represija se javljaju prirodno ili se mogu započeti od strane čove, na primer, kako bi se utišalo ispoljavanje ciljanih gena.
[0096] Razne metodologije kao što je ovde opisano obuhvataju korak koji uključuje upoređivanje vrednosti, nivoa, svojstava, karakteristika, svojstava, itd. sa „pogodnom kontrolom“, koja se ovde naizmenično naziva kao "odgovarajuća kontrola". „Pogodna kontrola“ ili „odgovarajuća kontrola“ je bilo koja kontrola ili standard koji je poznat stručnjaku u ovoj oblasti za svrhe poređenja. U jednom otelotvorenju, „pogodna kontrola“ ili odgovarajuća kontrola“ je vrednost, nivo, svojstvo, karakteristika, svojstvo, itd. određeno pre vršenja RNKi metodologije, kao što je ovde opisano. Na primer, brzina transkripcije, nivo iRNK, brzina translacije, nivo proteina, biološka aktivnost, ćelijska karakteristika ili svojstvo, genotip, fenotip itd., se mogu odrediti pre uvođenja sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano u ćeliju ili organizam. U drugom otelotvorenju, „pogodna kontrola“ ili odgovarajuća kontrola“ je vrednost, nivo, svojstvo, karakteristika, svojstva itd., određeno u ćeliji organizma, npr., kontrolne ili normalne ćelije ili organizma, koji pokazuje, na primer, normalne osobine. U drugom otelotvorenju, „pogodna kontrola“ ili odgovarajuća kontrola“ je prethodno definisana vrednost, nivo, svojstvo, karakteristika, svojstvo itd.
[0097] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je uobičajeno prihvaćeno od strane stručnjaka u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, odgovarajuće metode i materijali su opisani u daljem tekstu. U slučaju, konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, ima kontrolu. Dodatno, materijali, metode i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.
[0098] Različiti aspekti su opisani detaljnije u sledećim delovima
I. Poliglutaminski poremećaji
[0099] Poliglutaminski poremećaji su klasa bolesti ili poremećaja okarakterisana zajedničkom genetskom mutacijom. Naročito, bolest ili poremećaji su okarakterisani proširenim ponavljanjem trinukleotida CAG koji povećava, u kodiranom proteinu, proširenje glutaminskih ostataka. Poliglutaminski poremećaji su slični u tome što se bolesti karakterišu progresivnom degeneracijom nervnih ćelija. Uprkos njihovim sličnostima, poliglutaminski poremećaji se javljaju na različitim hromozomima i zbog toga se javljaju na potpuno drugačijim segmentima DNK. Primeri poliglutaminskih poremećaja obuhvataju Hantingtonovu bolest, dentatorubralnu-palidoluisiansku atrofiju, spinobulbarnu muskularnu atrofiju, spinocerebralnu ataksiju tipa 1, spinocerebralnu ataksiju tipa 2, spinocerebralnu ataksiju tipa 3, spinocerebralnu ataksiju tipa 6 i spinocerebralnu ataksiju tipa 7.
[0100] Poliglutaminski poremećaji kao što je ovde opisano su okarakterisani, npr., domenima koji imaju između oko 30 do 35 glutaminskih ostataka, između oko 35 do 40 glutaminskih ostataka, između oko 40 do 45 glutaminskih ostataka ili imaju oko 45 ili više glutaminskih ostataka. Poliglutaminski domen obično sadrži uzastopne glutaminske ostatke (Q n>36).
II. Hantingtonova bolest
4
[0101] Sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano mogu biti dizajnirana da ciljaju polimorfizme (npr., jednonukleotidne polimorfizme) u mutiranom ljudskom hantingtin proteinu (htt) za tretiranje Hantingtonove bolesti.
[0102] Hantingtonova bolest, nasleđena kao autosomalno dominantna bolest, izaziva bolest neusklađene kognicije i motorike. Pacijent može živeti više od deset godina sa ozbiljnom oslabljenjem, do preuranjene smrti od gladi ili infekcije. Bolest počinje u četvrtoj ili petoj desetici kod većine slučajeva, ali deo pacijenata manifestuje bolest za vreme puberteta.
Genetska mutacija za Hantingtonovu bolest je izduženo CAG ponavljanje u hantingtin genu. CAG ponavljanja se razlikuju od 8 do 35 kod normalnih pojedinaca (Kremer i dr., 1994). Genetska mutacija, npr., povećanje dužine CAG ponavljanja u odnosu na normalno stanje (manje od 35 u hantingtin genu do više od 36 kod bolesti) je povezano sa sintezom mutiranog hantingtin proteina, koji ima više od 36 poliglutamata (Aronin i dr., 1995). Uopšteno, pojedinci sa 36 ili više CAG ponavljanja će razviti Hantingtonovu bolest. Prototipično za čak dvadeset drugih bolesti sa produženim CAG kao osnovnom mutacijom, Huntingtonova bolest još uvek nema efikasnu terapiju. Razne intervencije, poput prekida apoptotskih puteva, dodavanja reagenasa za povećanje efikasnosti mitohondrija i blokade NMDA receptora, pokazale su se obećavajuće u ćelijskim kulturama i mišjem modelu Hantingtonove bolesti. Međutim, u najboljem slučaju ovi pristupi su otkrili kratko prolongiranje ćelijskog ili životinjskog preživljavanja.
[0103] Hantingtonova bolest je u skladu sa centralnom dogmom genetike: mutirani gen služi kao obrazac za proizvodnju mutirane iRNK; mutirana iRNK zatim usmerava sintezu mutiranog proteina (Aronin i dr, 1995; DiFiglia i dr., 1997). Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, smatra se da se mutirani hantingtin protein akumulira u selektivnim neuronima u striatumu i korteksu i prekida već određene ćelijske aktivnosti i izaziva neuronsku disfunkciju i smrt (Aronin i dr., 1999; Laforet i dr., 2001). Budući da je jedna kopija mutiranog gena dovoljna da izazove Hantingtonovu bolest, najizrazitije tretiranje bi učinio mutirani gen neefikasnim. Teoretski pristupi mogu obuhvatati zaustavljanje transkripcije mutiranog hantingtina, uništavanje mutirane iRNK i blokiranje translacije. Svaki ima sledeći ishod: gubitak mutiranog hantingtina.
III. Hantingtin gen
[0104] Gen bolesti povezan sa Hantingtonovom bolešću se naziva hantingtin ili (htt). Lokus hantingtina je veliki, zauzima 180 kb i sastoji se od 67 egzona. Hantingtin gen se široko ispoljava i zahteva normalan razvoj. Ispoljen je kao 2 alternativno poliadenilisane forme koje pokazuju različitu relativnu obilnost u različitim fetalnom ili zrelom tkivu. Veći transkript je približno 13,7 kb i prevashodno se ispoljava kod mozgu odraslih i fetusa dok je manji transkript približno 10,3 kb i šire je ispoljen. Dva transkripta se razlikuju u pogledu njihovih 3’ netransliranih regiona (Lin i dr., 1993). Obe informacije su predviđene da kodiraju 348 kilodaltona proteina koji sadrži 3144 amino kiselina. Veruje se da genetski poremećaj koji dovodi do Hantingtonove bolesti dodeljuje novo svojstva iRNK ili menja funkciju proteina.
[0105] Predmetni pronalazak cilja hantingtin (npr., hantingtin divljeg tipa ili mutirani) upotrebom RNK interferencije (Hutvagner i dr., 2002). Jedan lanac dvolančane RNK (siRNK) komplementira ciljanu sekvencu sa iRNK hantingtina. Nakon uvođenja siRNK u neurone, siRNK se delom razmotava, vezuje za polimorfni region u iRNK hantingtina na način koji je specifičan za mesto i aktivira iRNK nukleazu. Ova nukleaza deli iRNK hantingtina i time zaustavlja translaciju hantingtina (npr., hantingtina divljeg tipa ili mutiranog). Ćelije se oslobađaju delimično razgrađene iRNK, čime se isključuje translacija, ili ćelije razgrađuju delimično prevedene proteine. U određenim otelotvorenjima, neuroni preživljavaju na hantingtinu divljeg tipa iz normalnog alela, sprečavajući oštećenje mutiranog hantingtina eliminišući njegovu proizvodnju.
[0106] Takođe su ovde obelodanjena sredstva za utišavanje RNK koja mogu ciljati jednu ili više sekvenci za ciljanje koje su date na Slici 8. Takođe su ovde opisana sredstva za utišavanje RNK koja se mogu koristiti za tretiranje jedne ili više sekvenci za ciljanje na jednoj ili više datih genskih pozicija sekvenci za ciljanje izabrana iz grupe koju čine 1214, 1218, 1219, 1257, 1894, 1907, 2866, 4041, 4049, 5301, 6016, 6579, 8603, 10125, 10146, 10150, 424, 456, 522, 527, 878, 879, 908, 1024, 1165, 1207, 1212, 1217, 1220, 1223, 1227, 1229, 1260, 1403, 1470, 1901, 1903, 2411, 2412, 2865, 3801, 4040, 4048, 4052, 4055, 4083, 4275, 4372, 4374, 4376, 4425, 4562, 4692, 4721, 5200, 5443, 5515, 8609, 10130, 10134, 10142, 10169, 10182, 10186, 10809, 11116, 11129, 11134, 11147, 11412, 11426, 11443, 11659, 11666, 11677, 11863, 11890, 11927, 11947, 12163, 12218, 12223, 12235, 12279, 12282, 12297, 12309, 12313, 12331, 13136, 13398, 13403, 13423, 13428 ljudskog htt gena (kao što je izneto na Slici 8). Takođe su ovde opisana sredstva za utišavanje RNK koja se mogu koristiti za ciljanje jedne ili više sekvenci za ciljanje na na jednoj ili više datih genskih pozicija sekvenci za ciljanje izabrana iz grupe koju čine 5301, 10125, 10146, 10150, 424, 878, 879, 4083, 4275, 4562, 4721, 5200, 10130, 10134, 10142, 11116, 11129, 11134, 11147, 11412, 11426, 11443, 11659, 11666, 11677, 11863, 11890, 11927, 11947, 12163, 12218, 12223, 12235, 12279, 12282, 12297, 12331, 13136, 13423 i 13428 ljudskog htt gena (kao što je izneto na Slici 8). Naročito primerne sekvence za ciljanje ljudskog htt gena se mogu pronaći na pozicijama 10150 (5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1)), 10146 (5' AUAUCAGUAAAGAGA 3' (SEQ ID NO:2)) i 10125 (5' CUCAGGAUUUAAAAU 3' (SEQ ID NO:3)). Genomske sekvence za svaku od sekvenci za ciljanje se mogu pronaći, na primer, u jadno dostupnim bazama podataka održavanim od strane NCBI.
[0107] Takođe su ovde opisana sredstva za utišavanje RNK koja mogu ciljati jednu ili više ciljanih sekvenci na jednoj ili više ciljanih sekvenci koje su date u Tabeli 1 ispod i na Slici 21 (koja takođe obuhvata primerne modifikacije).
Tabela 1. Dodatne ciljane sekvence su takođe ovde opisane.
4
IV. Dizajn siRNK
[0108] Takođe je ovde obelodanjeno da su siRNK dizajnirane kao što sledi. Prvo, deo ciljanog gena (npr., htt gena), npr., jedna ili više sekvenci za ciljanje koje su date na Slici 8 se biraju, npr., 10150, 10146 i/ili 101125 iz 5' netransliranog regiona ciljanog gena. Deljenje iRNK na ovim mestima bi trebalo da eliminiše translaciju odgovarajućeg mutiranog proteina. Smisao lanci su dizajnirani na osnovu sekvence za ciljanje. (Videti Sliku 8.) Poželjno, deo (i odgovarajući smisao lanac) obuhvataju oko 19 do 25 nukleotida, npr., 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotida. Poželjnije, deo (i odgovarajući smisao lanac) obuhvataju 21, 22 ili 23 nukleotida. Stručnjak u ovoj oblasti će uvažiti da, međutim, siRNK koje imaju dužinu manju od 19 nukleotida ili veću od 25 nukleotida takođe mogu posredovati RNKi. U skladu sa time, siRNK takve dužine su takođe ovde opisane uz to da zadržavaju sposobnost posredovanja RNKi. Pokazano je da duža RNKi sredstva izazivaju interferenciju ili PKR odgovor na određene ćelije sisara koje mogu biti nepoželjne. Poželjno, RNKi sredstva kao što je ovde opisano ne izazivaju PKR odgovor (npr., imaju dovoljno malu dužinu). Međutim, duža RNKi sredstva mogu biti od koristi, na primer, kod tipova ćelija koji ne mogu stvarati PKR odgovor ili u situacijama gde je PKR odgovor regulisan na dole ili prigušen alternativnim sredstvima.
[0109] Sekvenca smisao lanca je dizajnirana tako da su sekvence za ciljanje suštinski u sredini lanca. Pomeranje ciljane sekvence van pozicije centra može, u nekim slučajevima, smanjiti efikasnost deljenja siRNK. Takvi sastavi, tj., manje efikasni sastavi mogu biti poželjni za upotrebu ukoliko je utišavanje iRNK divljeg tipa van cilja detektovano.
[0110] Antismisao lanac je rutinski iste dužine kao i smisao lanac i obuhvata komplementarne nukleotide. U jednom otelotvorenju, lanci su potpuno komplementarni, tj., lanci su tupi na
4
kraju kada se poklope ili poravnaju. U drugom otelotvorenju, lanci sadrže poklapanje ili poravnanje tako da se stvaraju 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- ili 7-nukleotidni viseći završeci, tj., 3' kraj smisao lanca se produžuje 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 nukleotida dalje od 5' kraja antismisao lanca i/ili 3' kraj antismisao lanac se prostire 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 nukleotida dalje od 5' kraja smisao lanca. Viseći završeci mogu sadržati (ili se sastojati od) nukleotida koji odgovaraju sekvenci gena za ciljanje (ili njenom komplementu). Alternativno, viseći završeci mogu sadržati (ili se sastojati od) dezoksiribonukleotida, na primer dT, ili nukleotidnih analoga ili drugog pogodnog ne-nukleotidnog materijala.
[0111] Kako bi se olakšao ulazak antismisao lanca u RISC (i time povećala ili poboljšala efikasnost ciljanog deljenja ili utišavanja), jačina baznog para između 5' kraja smisao lanca i 3' kraja antismisao lanca se može izmeniti, npr., smanjiti ili redukovati kao što je opisano detaljno u patenti SAD br.7,459,547, 7,772,203 i 7,732,593, pod nazivom „Methods and Compositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing“ (podnet 2. juna 2003.) i patenti SAD br.8,309,704, 7,750,144, 8,304,530, 8,329,892 i 8,309,705, pod nazivom „Methods and Compositions for Enhancing the Efficacy and Specificity of RNAi“ (podnet 2. juna 2003.). Takođe je ove opisano da je jačina baznog para manja zbog manje G:C baznih parova između 5' kraja prvog antismisao lanca i 3' kraja drugog ili smisao lanca između 3' kraja prvog ili antismisao lanca i 5' kraja drugog ili smisao lanca. Takođe je ovde opisano da je jačina baznog para manja zbog bar jednog neusklađenog baznog para između 5' kraja prvog ili antismisao lanca i 3' kraja drugog ili smisao lanca. Takođe je ovde opisano da je neusklađeni bazni par izabran izabran iz grupe koju čine G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C i U:U. Takođe je ovde opisano da je jačina baznog para manja zbog bar jednog klimavog baznog para između 5' kraja prvog ili antismisao lanca i 3' kraja drugog ili smisao lanca. Takođe je ovde opisano da je jačina baznog para manja zbog bar jednog baznog para koji sadrži retki nukleotid, npr., inozin (I). Takođe je ovde opisano da je bazni par izabran iz grupe koju čine I:A, I:U i I:C. Takođe je ovde opisano da je jačina baznog para manja zbog bar jednog baznog para koji sadrži modifikovani nukleotid. U određenim primernim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid je izabran iz grupe koju čine 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G i 2,6-diamino-A.
[0112] Dizajn siRNK koje su pogodne za ciljanje htt sekvenci za ciljanje su date na Slici 8 je opisan detaljno ispod. siRNK se može dizajnirati u skladu sa iznad opisanim učenjem za bilo koje druge ciljane sekvence koje se nalaze u htt genu. Pored toga, tehnologija se može primeniti na ciljanje bilo kojih drugih sekvenci za ciljanje, npr., sekvence za ciljanje koje ne izazivaju bolest.
[0113] Kako bi se potvrdila delotvornost kojom siRNK uništavaju iRNK (npr., iRNK hantingtina), siRNK se može inkubirati sa cDNK (npr., cDNK hantingtina) u Drosophilabaziranom in vitro sistemu ispoljavanja iRNK. Radiooznačene sa<32>P, novo sintetisane iRNK (npr., iRNK hantingtina) se detektuju autoradiografski na agaroza gelu. Prisustvo podeljenih iRNk ukazuje na aktivnost nukleaze iRNK. Pogodne kontrole obuhvataju izostavljanje siRNK. Alternativno, kontrole siRNK su izabrane tako da imaju isti nukleotidni sastav kao izabrana siRNK, ali bez značajne komplementarnosti sekvence sa odgovarajućim ciljanim genom. Takve negativne kontrole se mogu dizajnirati nasumičnim preuređivanjem nukleotidnih sekvenci izabrane siRNK; homologno pretraživanje se može izvršiti kako bi se osiguralo da negativna kontrola nema homologiju sa bilo kojim drugim genom u odgovarajućem genomu. Dodatno, siRNK negativne kontrole se može dizajnirati uvođenjem jedne ili više baznih neusklađenosti u sekvencu.
[0114] Mesta siRNK-iRNK komplementacije su izabrana što za rezultat daje optimalnu iRNK specifičnost i maksimalno iRNk deljenje.
[0115] Dok se trenutni pronalazak prevashodno odnosi na ciljanje specifičnih sekvenci za ciljanje gena (npr., htt) različitih od proširenih mutacija CAG regiona, stručnjak će uvažiti da ciljanje mutiranog regiona može biti primenljivo kao terapeutska strategija u određenim situacijama. Ciljanje mutiranog regiona se može ostvariti upotrebom siRNK koje komplementiraju CAG u serijama. siRNK<cag>bi se vezala za iRNK sa CAG komplementacijom, ali se može očekivati da ima veću mogućnost da se veže za prošireni CAG niz. Više siRNK<cag>bi se vezalo za mutiranu iRNK hantingtina (u suprotnosti sa manje za iRNK hantingtina divljeg tipa); zbog toga mutirana iRNK hantingtina ima veću verovatnoću da bude podeljena. Uspešna deaktivacija iRNK ovim pristupom bi takođe eliminisala normalnu ili iRNK hantingtina divljeg tipa. Takođe, barem do neke mere, deaktivirani mogu biti i drugi normalni geni (otprilike 70) koji takođe imaju CAG ponavljanja, pri čemu bi njihove iRNK mogle da stupaju u interakciju sa siRNK. Ovaj pristup bi se prema tome oslanjao na strategiju umora--uništeno bi bilo više iRNK mutiranog hantingtina, nego iRNK hantingtina divljeg tipa ili ostalih približno 69 iRNK koje kodiraju poliglutamine.
4
V. RNKi sredstva
[0116] Takođe su ovde opisani siRNK molekuli dizajnirani, na primer, kao što je opisano iznad. siRNK molekuli kao što je ovde opisano se mogu hemijski sintetisati ili se mogu transkribovati in vitro iz DNK obrasca ili in vivo iz npr., shRNK, ili upotrebom rekombinantnog ljudskog DICER enzima, kako bi se podelili in vitro transkribovani dsRNK obrasci na grupe od 20-, 21- ili 23-bp dupleks RNK koje posreduju RNKi. siRNK molekuli se mogu dizajnirati bilo kojom metodom poznatom u struci.
[0117] Takođe je ovde opisano, umesto da RNKi sredstvo bude interferirajuća ribonukleinska kiselina, npr., siRNK ili shRNK kao što je opisano iznad, RNKi sredstvo može kodirati interferirajuću ribonukleinsku kiselinu, npr., shRNK, kao što je opisano iznad. Drugim rečima RNKi sredstvo može biti transkripcioni obrazac interferirajuće ribonukleinske kiseline. Zbog toga, RNKi sredstva kao što je ovde opisano mogu obuhvatati kratke RNK petlje ukosnice (shRNK) i ekspresione konstrukte modifikovane da ispoljavaju shRNK. Transkripcija shRNK se započinje na promoteru polimeraze III (pol III) i smatra se da se završava na poziciji 24-5 timin mestu završetka transkripcije. Nakon ispoljavanja, shRNK se smatra da se savija u strukturu nalik petlji sa 3’ UU visećim završecima; posle toga, krajevi ovih shRNK se obrađuju, pretvarajući shRNK u siRNK-nalik molekule od oko 21-23 nukleotida (Brummelkamp i dr., 2002; Lee i dr., 2002, iznad; Miyagishi i dr., 2002; Paddison i dr., 2002, iznad; Paul i dr., 2002, iznad; Sui i dr., 2002 iznad; Yu i dr., 2002, iznad. Više informacija o shRNK dizajnu i upotrebi se može pronaći na internetu na sledećim adresama: katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf i katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR-strategy1.pdf).
[0118] Ekspresioni konstrukti kao što je ovde opisano obuhvataju bilo koji konstrukt koji je pogodan za upotrebu u odgovarajućem ekspresionom sistemu i obuhvataju ali nisu ograničeni na, retrovirusne vektore, kasete linearnog ispoljavanja, plazmide i virusne ili vektore dobijene od virusa, kao što je poznato u struci. Takvi ekspresioni konstrukti mogu obuhvatati jedan ili više inducibilnih promotera, RNK Pol III promoterske sisteme kao što su U6 snRNK promoteri ili HI RNK polimeraza III promoteri ili drugi promoteri poznati u struci. Konstrukti mogu obuhvatati jedan ili više lanaca siRNK. Ekspresioni konstrukti koji ispoljavaju oba lanca mogu takođe obuhvatati petlje koje povezuju oba lanca ili svaki lanac može biti odvojeno transkribovan od odvojenog promotera u istom konstruktu. Svaki lanac može biti
4
transkribovan od odvojenog ekspresionog konstrukta. (Tuschl, T., 2002, iznad).
[0119] Sintetičke siRNK se mogu isporučiti u ćelije metodama poznatim u struci, uključujući katjonsku lipozomsku transfekciju i elektroporaciju. Kako bi se dobilo dugoročno suzbijanje ciljanih gena (tj., htt gena) i olakšala isporuka pod određenim okolnostima, jedna ili više siRNK se može ispoljiti sa ćelijama iz rekombinantnih DNK konstrukata. Takve metode za ispoljavanje siRNK dupleksa u ćelijama iz rekombinantnih DNK konstrukata kako bi se omogućilo dugoročno suzbijanje ciljanog gena su poznate u struci, uključujući promoterske sisteme Pol III kod sisara (npr., H1 ili U6/snRNK promoterske sisteme (Tuschl, T., 2002, iznad) koji mogu ispoljavati funkcionalne dvolančane siRNK; (Bagella i dr., 1998; Lee i dr., 2002, iznad; Miyagishi i dr., 2002, iznad; Paul i dr., 2002, iznad; Yu i dr., 2002), iznad; Sui i dr., 2002, iznad). Transkripciona terminacija od strane RNK Pol III se javlja kod pokretanja četiri uzastopna T ostatka u DNK obrascu, pružajući mehanizam za završavanje siRNK transkripcije na specifičnoj sekvenci. siRNK je komplementarna sa sekvencom ciljanog gena u 5'-3' i 3'-5' orijentacijama i dva lanca siRNK se mogu ispoljiti u istom konstruktu ili u odvojenim konstruktima. siRNK petlje ukosnice, vođeni sa HI ili U6 snRNK promoterom i ispoljene u ćelijama, mogu suzbiti ispoljavanje ciljanog gena (Bagella i dr., 1998; Lee i dr., 2002, iznad; Miyagishi i dr., 2002, iznad; Paul i dr., 2002, iznad; Yu i dr., 2002), iznad; Sui i dr., 2002, iznad). Konstrukti koji sadrži siRNK sekvencu pod kontrolom T7 promotera takođe čine funkcionalne siRNK kada se ko-transfektuju u ćelije sa vektorom koji ispoljava T7 RNK polimerazu (Jacque i dr., 2002, iznad). Jedan konstrukt može sadržati više sekvenci za kodiranje siRNK, kao što je više regiona gena koji kodiraju htt, ciljajući isti gen ili više gena i može se voditi, na primer, odvojenim PolIII mestima promotera.
[0120] Ćelije životinja ispoljavaju opseg nekodirajućih RNK od približno 22 nukleotida koji se nazivaju mikro RNK (miRNK) koje mogu regulisati ispoljavanje gena na post transkripcionom ili translatornom nivou za vreme razvoja životinje. Jedno zajedničko svojstvo miRNK je da su izvedene iz prekursor RNK petlje sa približno 70 nukleotida, poželjno sa Dicer, RNaza III-tip enzimom ili njegovih homologom. Zamenjivanjem osnovne sekvence miRNK prekursora sa sekvencom komplementarnom sa ciljanom iRNK, vektorski konstrukt koji ispoljava modifikovani prekursor će se koristiti za proizvodnju siRNK kako bi se započela RNKi protiv specifičnih iRNK ciljeva kod ćelija sisara (Zeng i dr., 2002, iznad). Kada se ispoljava od strane DNK vektora koji sadrži promotere polimeraze II, mikro-RNK označene petlje ukosnice mogu utišati ispoljavanje gena (McManus i dr., 2002, iznad).
4
MikroRNK koje ciljaju polimorfizme se takođe mogu koristiti za blokiranje translacije mutiranih proteina u odsustvu siRNK-posredovanog utišavanja gena. Takve primene mogu biti od koristi u situacijama, na primer, kada je dizajnirana siRNK izazvala utišavanje proteina divljeg tipa van cilja.
[0121] Virusno posredovani mehanizmi isporuke se takođe mogu koristiti za izazivanje specifičnog utišavanja ciljanih gena kroz ispoljavanje siRNK, na primer, stvaranjem rekombinantnih adenovirusa koji nose siRNK pod RNK Pol II promoter transkripcionom kontrolom (Xia i dr., 2002, iznad). Infekcija HeLa ćelija ovim rekombinantnim adenovirusima omogućava smanjeno endogeno ispoljavanje ciljanog gena. Injekcija rekombinantih adenovirusnih vektora u transgene miševe koji ispoljavaju ciljane gene siRNK za rezultat daje in vivo redukciju ispoljavanja ciljanog gena. Id. U modelu životinja, elektroporacija celog embriona može efikasno isporučiti sintetičku siRNK u post-implantacione embrione miševa (Calegari i dr., 2002). Kod odraslih miševa, efikasna isporuka siRNK se može uspostaviti tehnikom isporuke „pod visokim pritiskom“, brzom injekcijom (u trajanju od 5 sekundi) velike zapremine siRNK koja sadrži rastvor u životinju u repnu venu (Liu i dr., 1999, iznad; McCaffrey i dr., 2002, iznad; Lewis i dr., 2002. Nanočestice i lipozomi se takođe mogu koristiti za isporuku siRNK životinjama. U određenim primernim otelotvorenjima, rekombinantni adeno-povezani virusi (rAAV) i njihovi povezani vektori se mogu koristiti za isporuku jedne ili više siRNK u ćelije, npr., prirodne ćelije (npr., moždane ćelije) (patentne prijave SAD 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 i 2005/0220766).
[0122] Sastavi nukleinskih kiselina kao što je ovde opisano obuhvataju i nemodifikovane siRNK i modifikovane siRNK kao što je poznato u struci, kao što su unakrsno povezani siRNK derivati ili derivati koji imaju ne-nukleotidne grupe povezane, na primer, sa svojim 3' ili 5' krajevima. Modifikovanje siRNK derivata na ovaj način poboljšava ćelijsku apsorpciju ili pojačava aktivnosti ćelijskog ciljanja dobijenog siRNK derivata u poređenju sa odgovarajućom siRNK, što je od koristi za praćenje siRNK derivata u ćeliji, ili poboljšanje stabilnosti siRNK derivata u poređenju sa odgovarajućom siRNK.
[0123] Modifikovani RNK prekursori, uvedeni u ćelije ili cele organizme kao što je ovde opisano, će dovesti do proizvodnje željenog siRNK molekula. Takvi siRNK molekuli će zatim biti povezani sa endogenim proteinskim komponentama RNKi puta kako bi se vezali za i ciljali specifične iRNK sekvence za deljenje i uništavanje. Na ovaj način, iRNK koja se cilja
4
od strane siRNK stvorene iz modifikovanog RNK prekursora će biti uklonjena iz ćelije ili organizma, što dovodi do smanjenja koncentracije proteina kodiranog od strane iRNK u ćeliji ili organizmu. RNK prekursori su obično molekuli nukleinske kiseline koji pojedinačno kodiraju ili jedan lanac dsRNK ili kodiraju celu nukleotidnu sekvencu strukture RNK petlje ukosnice.
[0124] Sastavi nukleinske kiseline kao što je ovde opisano mogu biti nekonjugovani ili mogu biti konjugovani za drugu grupu, kao što je nanočestica, kako bi se poboljšalo svojstvo sastava, npr., farmakokinetički parametar kao što je apsorpcija, efikasnost, bioraspoloživost i/ili poluraspad. Konjugovanje se može uspostaviti metodama poznatim u struci, npr., upotrebom metoda od Lambert i dr., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (opisuje nukleinske kiseline stavljene u poliakrilcijanoakrilat (PACA) nanočestice); Fattal i dr., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (opisuje nukleinske kiseline vezane za nanočestice); Schwab i dr., Ann. Oncol. 5 Suppl.4:55-8 (1994) (opisuje nukleinske kiseline povezane sa interkaliranim sredstvima, hidrofobnim grupama, polikatjonima ili PACA nanočesticama; i Godard i dr., Eur. J. Biochem.232(2):404-10 (1995) (opisuje nukleinske kiseline povezane za nanočestice).
[0125] Molekuli nukleinske kiseline kao što je ovde opisano se mogu označiti bilo kojom metodom poznatom u struci. Na primer, sastavi nukleinske kiseline se mogu označiti sa fluoroforom, npr., Cy3 fluoresceinom ili rodaminom. Označavanje se može izvršiti upotrebom ko pleta, npr., SILENCER™™ komplet za označavanje siRNK (Ambion).
Dodatno, siRNK se može radio označiti, npr., upotrebom<3>H,<32>P ili drugog odgovarajućeg izotopa.
[0126] Pored toga, zato što se veruje da RNKi napreduje pomoću bar jednog jednolančanog RNK posrednika, stručnjak će uvažiti da se ss-siRNK (npr., antismisao lanac ds-siRNK) takođe mogu dizajnirati (npr., za hemijsku sintezu) stvoriti (npr., enzimski stvoriti) ili ispoljiti (npr., iz vektora ili plazmida) kao što je ovde opisano i iskoristiti u skladu sa zahtevanim metodologijama. Pored toga, kod beskičmenjaka, RNKi se može izazvati efikasno dugim dsRNK (npr., dsRNK dužine od oko 100-1000 nukleotida, poželjno dužine od oko 200-500, na primer, oko 250, 300, 350, 400 ili 450 nukleotida) koje deluju kao efektori za RNKi.
(Brondani i dr., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Dec.4; 98(25):14428-33. Epub 2001 Nov. 27.)
4
VI. Sredstva protiv utišavanja RNK Htt
[0127] Predmetni pronalazak obuhvata anti-hantingtin RNK sredstva za utišavanje (npr., siRNK i shRNK), metode za pravljenje navedenih sredstava za utišavanje RNK, i metode (npr., istraživačke i/ili terapeutske metode) za korišćenje navedenih sredstava za utišavanje RNK (ili njihovih delova) za utišavanje RNK hantingtin proteina (npr., mutiranog hantingtin proteina). Sredstva za utišavanje RNK obuhvataju antismisao lanac (ili njegov deo), gde antismisao lanac ima dovoljnu komplementarnost sa heterozigotnim jednonukleotidnim polimorfizmom kako bi se posredovao mehanizam RNK-posredovanog utišavanja (npr., RNKi).
[0128] U određenim otelotvorenjima, siRNK jedinjenja su data koja imaju jednu ili više kombinacija sledećih svojstava: (1) potpuna hemijska stabilnost (tj., bez modifikovanih 2’-OH ostataka); (2) asimetrija; (3) 11-16 dupleksa baznih parova; (4) naizmenični obrazac hemijski modifikovanih nukleotida (npr., 2'-fluoro i 2'-metoksi modifikacije); i (5) jednolančani, potpuno fosforoditioat repovi od 5-8 baza. Broj fosforoditioat modifikacija je ključna. Ovaj broj varira od 6 do 17 u različitim otelotvorenjima.
[0129] U određenim otelotvorenjima, siRNK jedinjenja koja su ovde opisana se mogu konjugovati sa različitim ciljanim antigenima, uključujući, ali bez ograničenja, holesterol, DHA, feniltrofane, kortizol, vitamin A, vitamin D, GalNac i gangliozide. Holesterolmodifikovana verzija je pokazala 5-10 puta veće poboljšanje efikasnosti in vitro u poređenju sa prethodno korišćenim obrascima za hemijsku stabilizaciju (npr., gde su svi purini ali ne i purimidini modifikovani) u širokom opsegu ćelijskih tipova (npr., HeLa, neuroni, hepatociti, trofoblasti).
[0130] Određena jedinjenja kao što je ovde opisano imaju strukturna svojstva opisana iznad i mogu se ovde nazivati kao „hsiRNK-ASP“ (hidrofobno-modifikovane male interferirajuće RNK, koje imaju napredni obrazac stabilizacije). Dodatno, ovaj hsiRNK-ASP obrazac je pokazao dramatično poboljšanu distribuciju u mozgu, kičmenoj moždini, isporuku u jetru, placentu, bubreg, slezinu i nekoliko drugih tkiva, što ga čini pogodnim za terapeutsku intervenciju.
[0131] U jetri se hsiRNK-ASP isporučuje specijalnim endotelijalnim i kupferovim ćelijama, ali ne i u hepatocitima, što čini ovaj obrazac hemijske modifikacije komplementarnom pre nego kompetetivnom tehnologijom za GalNac konjugate.
[0132] Jedinjena kao što je ovde opisano se mogu opisati u sledećim aspektima i otelotvorenjima.
[0133] U prvom aspektu, ovde je dat oligonukleotid od bar 16 konjugovanih nukleotida, navedeni oligonukleotid ima 5' kraj, 3' kraj i komplementarnost za ciljem, gde: (1) drugi oligonukleotid sadrži naizmenične 2'-metoksi-ribonukleotide i 2'-fluoro-ribonukleotide; (2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 5' kraju nisu 2'-metoksi-ribonukleotide; (3) su nukleotidi povezani fosfodiester ili fosforoditioat vezama; i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 na 3' kraju, ili pozicijama 1-7 sa 3' kraja, su povezani sa susednim nukleotidima fosforoditioat vezama.
[0134] U drugom aspektu, ovde je data dvolančana, hemijski modifikovana nukleinska kiselina, koja sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, gde: (1) je prvi oligonukleotid oligonukleotid kao što je ovde opisano (npr., sadrži SEQ ID NO:1, 2, 3 ili 4); (2) deo prvog oligonukleotida je komplementaran sa delom drugog oligonukleotida; (3) drugi oligonukleotid sadrži naizmenične 2'-metoksi-ribonukleotide i 2'-fluoro-ribonukleotide; (4) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 3' kraja drugog oligonukleotida su 2'-metoksi ribonukleotidi; i (5) nukleotidi drugog oligonukleotida su povezani fosfodiester ili fosforoditioat vezama.
[0135] U trećem aspektu, ovde je dat oligonukleotid koji ima strukturu:
X-A(-L-B-L-A)j(-S-B-S-A)r(-S-B)t-OR
gde: X predstavlja 5' fosfatnu grupu; A, pri svakom javljaju, nezavisno predstavlja 2'-metoksiribonukleotid; B, pri svakom javljaju, nezavisno predstavlja 2'- fluoro-ribonukleotid; L pri svakom javljanju, nezavisno predstavlja fosfodiester ili fosforotioat veznik; S predstavlja fosforotioat veznik; i R je izabran iz vodonika i kape (npr., acil kao što je acetil); j je 4, 5, 6 ili 7; r je 2 ili 3; i t je 0 ili 1.
[0136] U četvrtom aspektu, ovde je data dvolančana, hemijski modifikovana nukleinska kiselina, koja sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, gde: (1) je prvi oligonukleotid izabran iz oligonukleotida trećeg aspekta; (2) deo prvog oligonukleotida je komplementaran
1
sa delom drugog oligonukleotida; i (3)
drugi oligonukleotid ima strukturu:
C-L-B(-S-A-S-B)m'(-P-A-P-B)n'(-P-A-S-B)q'(-S-A)r'(-S-B)t'-OR
gde: C predstavlja hidrofobni molekul; A, pri svakom javljaju, nezavisno predstavlja 2'-metoksi-ribonukleotid; B, pri svakom javljaju, nezavisno predstavlja 2'- fluoro-ribonukleotid; L predstavlja veznik gde je jedna ili više grupa izabrana iz grupe koju čine: 0-4 jedinice ponavljanja etilenglikola, fosfodiester i fosforotioat; S predstavlja fosforotioat veznik; P predstavlja fosfodiester veznik; R je izabran iz vodonika i kape (npr., acil kao što je acetil); m' je 0 ili 1; n' je 4, 5 ili 6; q' je 0 ili 1; r' je 0 ili 1; i t' je 0 ili 1.
a) Dizajn anti-Htt siRNK molekula
[0137] siRNK molekul kao što je ovde opisano je dupleks koji se sastoji od smisao lanca i komplementarnog antismisao lanca, antismisao lanac ima dovoljnu komplementarnost sa iRNK htt kako bi se posredovala RNKi. Poželjno, siRNK molekul je dužine od oko 10-50 ili više nukleotida, tj., svaki lanac sadrži 10-50 nukleotida (ili nukleotidnih analoga). Poželjnije, siRNK molekul je dužine od oko 16-30, npr., 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida u svakom lancu, gde je jedan od lanaca dovoljno komplementaran sa ciljanim regionom. Poželjno, lanci su poravnati tako da postoje bar 1, 2 ili 3 baze na kraju lanaca koje nisu poravnate (tj., za koje ne javljaju komplementarne baze na suprotnim lancima) tako da se viseći završetak od 1, 2 ili 3 ostatka javlja na oba kraja dupleksa kada se lanci poklope. Poželjno, siRNK molekul je dužine od oko 10-50 ili više nukleotida, tj., svaki lanac sadrži 10-50 nukleotida (ili nukleotidnih analoga). Poželjnije, siRNK molekul je dužine od oko 16-30, npr., 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida u svakom lancu, gde je jedan od lanaca suštinski komplementaran sa sekvencom za ciljanje a drugi lanac je identičan ili suštinski identičan sa prvim lancem.
[0138] Uopšteno, siRNK se mogu dizajnirati bilo kojom metodom koja je poznata u struci, na primer, praćenjem sledećeg protokola:
1. SiRNK bi trebalo da bude specifična za sekvencu za ciljanje, npr., sekvencu za ciljanje iznetu na Slici 8. Takođe je ovde opisano, sekvenca za ciljanje se nalazi u alelu mutiranog hantingtina (htt) ali ne i u alelu hantingtina divljeg tipa. Takođe je ovde opisano, sekvenca za ciljanje se nalazi u alelu mutiranog hantingtina (htt) i u alelu hantingtina divljeg tipa.
2
Takođe je ovde opisano, sekvenca za ciljanje se nalazi u alelu hantingtina divljeg tipa. Prvi lanac bi trebalo da bude komplementaran sa sekvencom za ciljanje a drugi lanac je suštinski komplementaran sa prvim lancem. (Videti Sliku 8 za primerne smisao i antismisao lance). Takođe je ovde opisano, sekvenca za ciljanje je van proširenog CAG ponavljanja alela mutiranog hantingtina (htt). Takođe je ovde opisano, sekvenca za ciljanje je van regiona kodiranja ciljanog gena. Primerne sekvence za ciljanje je izabrana iz 5' netransliranog regiona (5'-UTR) ciljanog gena. Deljenje iRNK na ovim mestima bi trebalo da eliminiše translaciju odgovarajućeg mutiranog proteina. Sekvence za ciljanje iz drugih regiona htt gena su takođe pogodne za ciljanje. Smisao lanac je dizajniran na osnovu sekvence za ciljanje. Dalje, siRNK sa nižim G/C sadržajem (35-55%) može biti aktivnija od onih sa G/C sadržajem većim od 55%. Takođe su ovde opisani molekuli nukleinske kiseline koji imaju sadržaj G/C od 35-55%.
2. Smisao lanac siRNK je dizajniran na osnovu sekvence izabranog mesta za ciljanje. Poželjno, smisao lanac obuhvata oko 19 do 25 nukleotida, npr., 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotida. Poželjnije, smisao lanac obuhvata 21, 22 ili 23 nukleotida. Stručnjak u ovoj oblasti će uvažiti da, međutim, siRNK koje imaju dužinu manju od 19 nukleotida ili veću od 25 nukleotida takođe mogu posredovati RNKi. U skladu sa time, siRNK takve dužine su takođe ovde opisane uz to da zadržavaju sposobnost posredovanja RNKi. Pokazano je da duža sredstva za utišavanje RNK izazivaju interferon ili proteinsku kinazu R (PKR) odgovor na određene ćelije sisara koje mogu biti nepoželjne. Poželjno, sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano ne izazivaju PKR odgovor (tj., imaju dovoljno malu dužinu). Međutim, duža sredstva za utišavanje RNK mogu biti od koristi, na primer, kod tipova ćelija koji ne mogu stvarati PRK odgovor ili u situacijama gde je PKR odgovor regulisan na dole ili prigušen alternativnim sredstvima.
siRNK molekuli kao što je ovde opisano imaju dovoljnu komplementarnost sa sekvencom za ciljanje kao što su siRNK koje posreduju RNKi. Uopšteno, siRNK koja sadrži nukleotidne sekvence koje su dovoljno identične sa delom ciljane sekvence ciljanog gena kako bi se uticalo na RISC-posredovano deljenje ciljanog gena je poželjna. Prema tome, takođe je ovde opisano da je smisao lanac siRNK dizajniran da ima sekvencu dovoljno identičnu sa delom cilja. Na primer, smisao lanac može imati 100% identičnost sa ciljanim mestom. Međutim, 100% identičnost nije zahtevana. Više od 80% identičnosti, npr., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili čak 100% identičnosti, između smisao lanca i ciljane RNK sekvence je poželjna. kao što je ovde opisano je prednost zato što je u stanju da se tolerišu određene varijacije sekvence kako bi se poboljšala efikasnost i specifičnost RNKi. Takođe je ovde opisano da smisao lanac ima 4, 3, 2, 1 ili 0 neusklađenih nukleotida sa ciljanim regionom, kao što je ciljani region koji se razlikuje za bar jedan bazni par između alela divljeg tipa i mutiranog alela, npr., ciljani region koji sadrži mutaciju dobitka funkcije i drugi lanac je identičan ili suštinski identičan sa prvim lancem. Pored toga, siRNK sekvence sa malim uvođenjem ili brisanjem 1 ili 2 nukleotida mogu biti efikasne za posredovanje RNKi. Alternativno, siRNK sekvence sa supstitucijama nukleotidnog analoga ili uvođenjima mogu biti efikasne za suzbijanje.
Identičnost sekvence se može odrediti poređenjem sekvence i poravnanjem algoritama poznatih u struci. Za određivanje procenta identičnosti dve sekvence nukleinske kiseline (ili dve aminokiselinske sekvence), sekvence su poravnate u svrhe optimalnog poređenja (npr., praznine se mogu uvesti u prvu sekvencu ili drugu sekvencu za optimalno poravnanje) Nukleotidi (ili aminokiselinski ostaci) na odgovarajućim nukleotidnim (ili aminokiselinskim) pozicijama su zatim poređeni. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim ostatkom kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija deljenih od strane sekvenci (tj., % homologije = broj identičnih pozicija / ukupan broj pozicija x 100), opciono uz smanjenje ocene za broj uvedenih praznina i/ili dužinu uvedenih praznina.
Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može uspostaviti matematičkim algoritmima. U jednom otelotvorenju, poravnanje stvoreno preko određenog dela sekvence poravnate koja ima dovoljnu identičnost ali ne preko delova koji imaju nizak stepen identičnosti (tj., lokalno poravnanje). Poželjni neograničavajući primer lokalo poravnatog algoritma koji je korišćen za poređenje sekvenci je algoritam od Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modifikovan kao u Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Takav algoritam je uključen u BLAST programe (verzija 2.0) od Altschul, i dr. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10.
Takođe je ovde opisano da je poravnanje optimizovano uvođenjem odgovarajućih praznina i procenat identičnosti je određen preko dužine poravnatih sekvenci (tj., poravnanje sa prazninama). Kako bi se dobila poravnanja sa prazninama za svrhe poređenja, BLAST sa prazninama se može koristiti kao što je opisano u Altschul i dr., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Takođe je ovde opisano da je poravnanje optimizovano uvođenjem odgovarajućih praznina i procenat identičnosti je određen preko
4
cele dužine poravnatih sekvenci (tj., globalno poravnanje). Poželjni neograničavajući primer matematičkog algoritma koji je korišćen za globalne poređenje sekvenci je algoritam od Myers i Miller, CABIOS (1989). Takvi algoritmi su uključeni u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo GCG softverskog paketa za poravnanje sekvenci. Kada se koristi ALIGN program za poređenje aminokiselinskih sekvenci, PAM120 tabela masenih ostataka, smanjenje za dužinu praznine od 12 i smanjenje za prazninu od 4 se mogu koristiti.
3. Antismisao ili lanac za navođenje siRNK je rutinski iste dužine kao i smisao lanac i obuhvata komplementarne nukleotide. U jednom otelotvorenju, lanac za navođenje i smisao lanac su potpuno komplementarni, tj., lanci su tupi na kraju kada se poklope i poravnaju. U jednom otelotvorenju, lanci siRNK se mogu spariti na takav način da imaju 3’ viseći završetak od 1 do 7 (npr., 2, 3, 4, 5, 6 ili 7) ili 1 do 4, npr., 2, 3 ili 4 nukleotida. Viseći završeci mogu sadržati (ili se sastojati od) nukleotida koji odgovaraju sekvenci gena za ciljanje (ili njenom komplementu). Alternativno, viseći završeci mogu sadržati (ili se sastojati od) dezoksiribonukleotida, na primer dT, ili nukleotidnih analoga ili drugog pogodnog ne-nukleotidnog materijala. Zbog toga u drugom otelotvorenju, molekuli nukleinske kiseline mogu imati 3' viseći završetak od 2 nukleotida, kao što je TT.
Nukleotidi visećeg završetka mogu biti ili RNK ili DNK. Kao što je navedeno iznad, poželjno je izabrati ciljani region gde je nepodudaranje mutant:divlji tip purin:purin nepodudaranje.
4. Upotreba bilo koje poznate metode u strci, poređenje potencijalnih ciljeva sa odgovarajućom genomskom bazom podataka (za ljude, miševe, pacove, itd.) i eliminisanje bilo kojih sekvenci za ciljanje sa značajnom homologijom sa drugim kodirajućim sekvencama. Jedna takva metoda za takvu pretragu homologije sekvenci je poznata kao BLAST, i dostupna je na sajtu Nacionalnog centra za biotehnološke informacije.
5. Odabir jedne ili više sekvenci koje zadovoljavaju Vaš kriterijum evaluacije.
[0139] Dalje opšte informacije o dizajnu i upotrebu siRNK se mogu pronaći u „The siRNA User Guide“, što je dostupno na sajtu The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie.
[0140] Alternativno, siRNK se može definisati funkcionalno kao nukleotidna sekvenca (ili oligonukleotidna sekvenca) koja se može hibridizovati sa ciljanom sekvencom (npr., 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50 °C za 70 °C hibridizaciju u trajanju od 12-16 sati; praćeno ispiranjem). Dodatni poželjni uslovi hibridizacije obuhvataju hibridizaciju pri 70 °C u 1xSSC ili 50 °C u 1xSSC, 50% formamidu što je praćeno ispiranjem pri 70 °C u 0,3xSSC ili hibridizacijom pri 70 °C u 4xSSC ili 50 °C u 4xSSC, 50% formamidu što je praćeno ispiranjem pri 67 °C u 1xSSC. Temperatura hibridizacije za hibride za koje se očekuje da imaju dužinu manju od 50 baznih parova bi trebalo da bude 5-10 °C manja od temperature topljenja (Tm) hibrida, gde je Tm određena na osnovu sledećih jednačina. Za hibride dužine manje od 18 baznih parova, Tm(°C)=2(# A+T baze)+4(# G+C baze). Za hibride dužine između 18 i 49 baznih parova, Tm(°C)=81,5+16,6(log 10[Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), gde je N broj baza u hibridu a [Na+] je koncentracija natrijumovih jona u puferu za hibridizaciju ([Na+] za 1xSSC=0,165 M). Dodatni primeri strogih uslova za polinukleotidnu hibridizaciju su dati u Sambrook, J., E. F. Fritsch, i T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., poglavlja 9 i 11, i Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel i dr., ured., John Wiley & Sons, Inc., odeljci 2.10 i 6.3-6.4.
[0141] siRNK negativne kontrole bi trebalo da imaju isti nukleotidni sastav kao izabrana siRNK ali bez značajne komplementarnosti sekvence sa odgovarajućim genomom. Takve negativne kontrole se mogu dizajnirati nasumičnim preuređivanjem nukleotidne sekvence izabrane siRNK. Homologno pretraživanje se može izvršiti kako bi se osiguralo da negativna kontrola nema homologiju sa bilo kojim drugim genom u odgovarajućem genomu. Dodatno, siRNK negativne kontrole se mogu dizajnirati uvođenjem jedne ili više baznih neusklađenosti u sekvencu.
[0142] 6. Kako bi se potvrdila delotvornost kojom siRNK uništavaju ciljanu iRNK (npr., iRNK divljeg tipa ili mutiranog hantingtina), siRNK se može inkubirati sa cDNK (npr., cDNK hantingtina) u Drosophila-baziranom in vitro sistemu ispoljavanja iRNK.
Radiooznačene sa<32>P, novo sintetisane ciljane iRNK (npr., iRNK hantingtina) se detektuju autoradiografski na agaroza gelu. Prisustvo podeljenih ciljanih iRNk ukazuje na aktivnost nukleaze iRNK. Pogodne kontrole obuhvataju izostavljanje siRNK i upotrebu cDNK koja nije ciljana. Alternativno, kontrole siRNK su izabrane tako da imaju isti nukleotidni sastav kao izabrana siRNK, ali bez značajne komplementarnosti sekvence sa odgovarajućim ciljanim genom. Takve negativne kontrole se mogu dizajnirati nasumičnim preuređivanjem nukleotidnih sekvenci izabrane siRNK. Homologno pretraživanje se može izvršiti kako bi se osiguralo da negativna kontrola nema homologiju sa bilo kojim drugim genom u odgovarajućem genomu. Dodatno, siRNK negativne kontrole se može dizajnirati uvođenjem jedne ili više baznih neusklađenosti u sekvencu.
[0143] Anti-htt siRNK se može dizajnirati da cilja bilo koju od sekvenci za ciljanje opisanu iznad. Navedene siRNK sadrže antismisao lanac koji je dovoljno komplementaran sa sekvencom za ciljanje kako bi se posredovalo utišavanje ciljane sekvence. U određenim otelotvorenjima, sredstvo za utišavanje RNK je siRNK.
[0144] Takođe je ovde opisano da siRNK sadrži smisao lanac koji sadrži sekvencu iznetu na Slici 8 i antismisao lanac koji sadrži sekvencu iznetu na Slici 8.
[0145] Mesta siRNK-iRNK komplementacije su izabrana što za rezultat daje optimalnu iRNK specifičnost i maksimalno iRNk deljenje.
b) siRNK-nalik molekuli
[0146] siRNK-nalik molekuli kao što je ovde opisano imaju sekvencu (tj., imaju lanac koji ima sekvencu) koja je „dovoljno komplementarna“ sa sekvencom za ciljanje htt iRNK za direktno utišavanje gena ili sa RNKi ili translatornom represijom. siRNK-nalik molekuli su dizajnirani na isti način kao siRNK molekuli, ali stepen identičnost sekvence između smisao lanca i ciljane RNK aproksimira onu koja je osmotrena između miRNK i cilja. Uopšteno, stepen identičnost sekvence između miRNK sekvence i odgovarajuće sekvence ciljanog gena je smanjen, tendencija za posredovanjem post-transkripcionog utišavanja gena translatornom represijom pre nego RNKi se povećava. Prema tome, u alternativnom otelotvorenju, gde je post-translatorno utišavanje gena translacionom represijom ciljanog gena poželjno, miRNK sekvenca ima delimičnu komplementarnost sa sekvencom ciljanog gena. U određenim otelotvorenjima, miRNK sekvenca ima delimičnu komplementarnost sa jednom ili više kratkih sekvenci (mesta komplementarnosti) rasprostranjenih u ciljanoj iRNK (npr., unutar 3'-UTR ciljane iRNA) (Hutvagner i Zamore, Science, 2002; Zeng i dr., Mol. Cell, 2002; Zeng i dr., RNA, 2003; Doench i dr., Genes & Dev., 2003). Kako je mehanizam translacione represije kooperativna, više mesta komplementarnosti (npr., 2, 3, 4, 5 ili 6) se može ciljati u određenim otelotvorenjima.
[0147] Sposobnost siRNK-nalik dupleksa da posreduje RNKi ili translacionu represiju se može predvideti distribucijom nukleotida koji nisu identični između sekvence ciljanog gena i nukleotidne sekvence sredstva za utišavanje na mestu komplementarnosti. U jednom otelotvorenju, gde je utišavanje gena translacionom represijom poželjno, bar jedan nukleotid koji nije identičan je prisutan u centralnom delu mesta komplementarnosti tako da se formira dupleks sa miRNK lancem za navođenje i ciljana iRNK sadrži centralno „ispupčenje“ (Doench J G i dr., Genes & Dev., 2003). Takođe je ovde opisano da je 2, 3, 4, 5 ili 6 susednih ili nesusednih nukleotida koji nisu identični uvedeno. Nukleotidi koji nisu identični se mogu koristiti tako da formiraju klimavi bazni par (npr., G:U) ili neusklađeni bazni par (G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C, U:U). U sledećem poželjnom otelotvorenju, ispupčenje“ je centrirano na nukleotidnim pozicijama 12 i 13 na 5' kraju miRNK molekula.
c) Molekuli kratkih RNK petlje ukosnice (shRNK)
[0148] Takođe su ovde opisane shRNK koje mogu posredovati utišavanje RNK htt sekvence za ciljanje sa pojačanom selektivnošću. U kontrastu sa siRNK, shRNK oponaša prirodne prekursore mikro RNK (miRNK) i ulazi na vrhu puta za utišavanje gena. Iz tog razloga, veruje se da shRNK posreduju utišavanje gena efikasnije tako što se dovode kroz ceo prirodni put utišavanja gena.
[0149] miRNK su nekodirajuće RNK od približno 22 nukleotida koje mogu regulisati ispoljavanje gena na post transkripcionom ili translatornom nivou za vreme razvoja biljke i životinje. Jedno zajedničko svojstvo miRNK je da su izvedene iz prekursor RNK petlje sa približno 70 nukleotida koja se naziva pre-miRNK, poželjno sa Dicer, RNaza III-tip enzimom ili njegovim homologom. Prirodni miRNK prekursori (pre-miRNK) imaju jedan lanac koji formira dupleks osnovu uključujući dva dela koja su generalno komplementarna, i petlju koja povezuje dva dela osnove. Obično kod pre-miRNK, osnova obuhvata jedno ili više ispupčenja, npr., dodatne nukleotide koji stvaraju jednu nukleotidnu „petlju“ u jednom delu osnove, i/ili jedan ili više neuparenih nukleotida koji međusobno stvaraju prazninu u hibridizaciji dva dela osnove. Kratke RNK petlje ukosnice ili modifikovani RNK prekursori kao što je ovde opisano su veštački konstrukti bazirani na ovim prirodnim pre-miRNK ali koje su modifikovane da isporuče željena sredstva za utišavanje RNK (npr., siRNK kao što je ovde opisano). Zamenjivanjem sekvenci osnove pre-miRNK sa sekvencom komplementarnom sa ciljanom iRNK, formira se shRNK. shRNK se procesira celim putem utišavanja gena, što time efikasno posreduje RNKi.
[0150] Potrebni elementi shRNK molekula obuhvataju prvi deo i drugi deo, imaju dovoljnu komplementarnost da se pretvore ili hibridizuju u oblik dupleksa ili dvolančanog dela osnove. Dva dela ne moraju biti potpuno ili savršeno komplementarni. Delovi prve i druge „osnove“ su povezani delom koji ima sekvencu koja ima nedovoljnu komplementarnost sekvence kako bi se pretvorili ili hibridizovali u druge delove shRNK. Ovaj drugi deo se naziva kao deo „petlje“ u shRNK molekulu. shRNK molekuli su procesirani kako bi se stvorile siRNK. shRNK takođe mogu obuhvatati jedno ili više ispupčenja, tj., dodatne nukleotide koji stvaraju malu nukleotidnu „petlju“ u delu osnove, na primer, petlju sa jednim, dva ili tri nukleotida. Delovi osnove mogu biti iste dužine ili jedan deo može obuhvatati viseći završetak od, na primer, 1-5 nukleotida. Nukleotidi visećeg završetka mogu obuhvatati, na primer, uracile (U), npr., sve U. Takvi U su značajnije kodirani od strane timidina (T) u shRNK-kodirajućoj DNK koja signalizira prekidanje transkripcije.
[0151] Kod shRNK (ili modifikovane prekursor RNK) kao što je ovde opisano, jedan deo dupleks osnove je sekvence nukleinske kiseline koja je komplementarna (ili anti smisao) sa htt sekvencom za ciljanje. Poželjno, jedan lanac dela osnove shRNK je dovoljno komplementaran (npr., antismisao) sa sekvencom ciljane RNK (npr., iRNK) kako bi se posredovala degradacija navedenog cilja RNK pomoću RNK interferencije (RNKi). Zbog toga, modifikovani RNK prekursori obuhvataju dupleks osnovu sa dva dela i petljom koja povezuje dva dela osnove. Antismisao deo može biti na 5' ili 3' kraju osnove. Delovi osnove shRNK su poželjno dužine oko 15 do 50 nukleotida. Poželjno, dva dela osnove su dužine oko 18 ili 19 do oko 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 37, 38, 39 ili 40 ili više nukleotida. U poželjnim otelotvorenjima, dužina delova osnove bi trebalo da bude 21 nukleotid ili više. Kada se koristi kod ćelija sisara, dužina delova osnove bi trebalo da bude manja od oko 30 nukleotida kako bi se izbeglo provociranje nespecifičnih odgovora nalik interferon puta. Kod ćelija koje nisu od sisara, osnova može biti duža od 30 nukleotida. Zapravo, osnova može obuhvatati mnogo veće delove komplementarnost sa ciljanom iRNK (do, i uključujući celu iRNK). Zapravo, deo osnove može obuhvatati mnogo veće delove komplementarnost sa ciljanom iRNK (do, i uključujući celu iRNK).
[0152] Dva dela dupleks osnove moraju biti dovoljno komplementarni da bi se hibridizovali kako bi se formirala dupleks osnova. Zbog toga, dva dela mogu biti, ali ne moraju biti, potpuno ili savršeno komplementarna. Dodatno, dva dela osnove mogu biti iste dužine ili jedan deo može obuhvatati viseći završetak od 1, 2, 3 ili 4 nukleotida. Nukleotidi visećeg završetka mogu obuhvatati, na primer, uracile (U), npr., sve U. Petlja shRNK ili modifikovani RNK prekursori se mogu razlikovati od prirodnih pre-miRNK sekvenci modifikovanjem sekvence petlje kako bi se povećao ili smanjio broj sparenih nukleotida, ili zamenjivanjem cele ili dela sekvence petlje sa tetrapetljom ili drugim sekvencama petlje. Zbog toga, petlja u shRNK ili modifikovanim RNK prekursorima može biti dužine 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više, npr., 15 ili 20 ili više nukleotida.
[0153] Petlja shRNK ili modifikovani RNK prekursori se mogu razlikovati od prirodnih premiRNK sekvenci modifikovanjem sekvence petlje kako bi se povećao ili smanjio broj sparenih nukleotida, ili zamenjivanjem cele ili dela sekvence petlje sa tetrapetljom ili drugim sekvencama petlje. Zbog toga, deo petlje u shRNK može biti dužine od oko 2 do oko 20 nukleotida, tj., oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više, npr., 15 ili 20, ili više nukleotida. Poželjna petlja se sastoji od ili sadrži sekvence „tetrapetlje“. Primerne sekvence tetrapetlje obuhvataju ali nisu ograničene na sekvence GNRA, gde je N bilo koji nukleotid i R je purin nukleotid, GGGG i UUUU.
[0154] Takođe je ovde opisano da shRNK obuhvataju sekvence željenog siRNK molekula koji je opisan iznad. Takođe je ovde opisano da se sekvenca antismisao dela shRNK može dizajnirati suštinski kao što je opisano iznad ili uopšteno odabirom 18, 19, 20, 21 nukleotidne ili duže sekvence iz ciljane RNK (npr., htt iRNK), na primer, iz regiona od 100 do 200 ili 300 nukleotida uzvodno ili nizvodno od početne translacije. Uopšteno, sekvenca se može izabrati iz bilo kog dela ciljane RNK (npr., iRNK) uključujući 5’ UTR (netranslirani region), kodirajuću sekvencu ili 3’UTR uz to da je navedeni deo udaljen od mesta mutacije dobitka funkcije. Ova sekvenca može opciono slediti odmah nakon regiona ciljanog gena koji sadrži sva susedna AA nukleotida. Poslednja dva nukleotida nukleotidne sekvence mogu biti izabrani da budu UU. Ova sekvenca od 21 ili slično nukleotida se koristi za stvaranje jednog dela dupleksa osnove u shRNK. Ova sekvenca može zameniti deo osnove pre-miRNK sekvence divljeg tipa, npr., enzimski ili je uključena u kompletnoj sekvenci koja se sintetisana. Na primer, mogu se sintetisati DNK oligonukleotidi koji kodiraju celi modifikovani prekursor RNK petlje ukosnice ili koji kodiraju samo deo koji se uvodi u dupleks osnove prekursora i upotrebom restrikcionih enzima kako bi se izgradio modifikovani RNK prekursor konstrukt, npr., iz pre-miRNK divljeg tipa.
[0155] Modifikovani RNK prekursori obuhvataju u dupleks osnovi sekvencu od 21-22 ili slično nukleotida siRNK ili siRNK-nalik dupleksa koji se poželjno proizvodi in vivo. Zbog toga, deo osnove modifikovanog RNK prekursora obuhvata bar 18 ili 19 nukleotidnih parova koji odgovaraju sekvenci egzonskog dela gena čije se ispoljavanje smanjuje ili suzbija. Dva 3' nukleotida koji su sa bočne strane regiona osnove su izabrani tako da maksimizuju proizvodnju siRNK iz modifikovanog RNK prekursora i da maksimizuju efikasnost dobijene siRNK pri ciljanju odgovarajuće iRNK za translatornu represiju ili uništavanje RNKi in vivo i in vitro.
[0156] U određenim otelotvorenjima, shRNK kao što je ovde opisano obuhvataju miRNK sekvence, opciono miRNK sekvence modifikovane na kraju, kako bi se pojačao ulazak u RISC. miRNK sekvenca može biti slična ili identična onoj koja se prirodno javlja kod bilo koje miRNK (videti npr., The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004). Preko hiljadu prirodnih miRNK je identifikovano do danas i zajedno se smatraju da čine oko 1% svih predviđenih gena u genomu. Mnoge prirodne miRNK su međusobno grupisane u introne pre-iRNK i mogu se identifikovati in silico upotrebom pretraživanja baziranog na homologiji (Pasquinelli i dr., 2000; Lagos-Quintana i dr., 2001; Lau i dr., 2001; Lee and Ambros, 2001) ili na računarskim algoritmima (npr. MiRScan, MiRSeeker) koji predviđaju sposobnost kandidata miRNK gena da formira strukturu petlje osnove pri-iRNK (Grad i dr., Mol. Cell., 2003; Lim i dr., Genes Dev., 2003; Lim i dr., Science, 2003; Lai E C i dr., Genome Bio., 2003). Online registar pruža pretraživu bazu podataka svih objavljenih miRNK sekvenci (miRNK registar na sajtu Sanger instituta; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004). Primerne, prirodne miRNK obuhvataju lin-4, let-7, miR-10, mirR-15, miR-16, miR-168, miR-175, miR-196 i njihove homologe kao i druge prirodne miRNK od ljudi i određene modele organizama uključujući Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, ribu zebricu, Arabidopsis thalania, Mus musculus, i Rattus norvegicus kao što je opisano u međunarodnoj PCT objavi br. WO 03/029459.
[0157] Prirodne miRNK su ispoljene endogenim genima in vivo i procesirane su iz prekursora petlje ukosnice ili petlje osnove (pre-miRNK ili pri-miRNK) sa Dicer ili drugim RNAzama (Lagos-Quintana i dr., Science, 2001; Lau i dr., Science, 2001; Lee i Ambros, Science, 2001; Lagos-Quintana i dr., Curr. Biol., 2002; Mourelatos i dr., Genes Dev., 2002; Reinhart i dr., Science, 2002; Ambros i dr., Curr. Biol., 2003; Brennecke i dr., 2003; Lagos-Quintana i dr., RNA, 2003; Lim i dr., Genes Dev., 2003; Lim i dr., Science, 2003). miRNK mogu postojati tranzitno in vivo kao dvolančani dupleks ali samo se jedan lanac uzima od strane RISC kompleksa za direktno utišavanje gena. Određene miRNK, npr., miRNK biljaka imaju
1
savršenu ili skoro savršenu komplementarnost sa svojim ciljanim iRNK i zbog toga usmeravaju deljenje ciljane iRNK. Druge miRNK imaju manje savršenu komplementarnost sa svojim ciljanim iRNK i zbog toga usmeravaju translatornu represiju ciljane iRNK. Stepen komplementarnosti između miRNK i njene ciljane iRNk se veruje da određuje svoj mehanizam delovanja. Na primer, savršena ili skoro savršena komplementarnost između miRNK i njene ciljane iRNK ukazuje na mehanizam deljenja (Yekta i dr., Science, 2004), gde komplementarnost manja od savršene ukazuje na mehanizma translatorne represije. U naročitim otelotvorenjima, miRNK sekvenca je od prirodne miRNK sekvenca, aberantnog ispoljavanja ili aktivnosti koja je povezana sa miRNK poremećajem.
d) Dvostruko funkcionalni oligonukleotidni teteri.
[0158] U drugim otelotvorenjima, sredstva za utišavanje RNK obuhvataju dvostruko funkcionalne oligonukleotidne tetere koji su od koristi za unutarćelijsko regrutovanje miRNK. Ćelije životinja ispoljavaju opseg miRNK, nekodirajućih RNK od približno 22 nukleotida koje mogu regulisati ispoljavanje gena na post transkripcionom ili translatornom nivou.
Vezivanje miRNK vezane za RISC i regrutovanje do ciljane iRNK, dvostruko funkcionalni oligonukleotidni teter može potisnuti suzbijanje gena uključenih u, npr., procesu arterioskleroze. Upotreba oligonukleotidnih tetera nudi nekoliko prednosti u poređenju sa postojećim tehnikama za potiskivanje ispoljavanja naročitog gena. Prvo, metode koje su ovde opisane omogućavaju endogeni molekul (često obilno prisutan), miRNK za posredovanje utišavanja RNK. Prema tome, ovde opisane metode uklanjaju potrebu za uvođenjem stranih molekula (npr., siRNK) kako bi se posredovalo RNK utišavanje. Drugo, sredstva za utišavanje RNK i, naročito, grupa za vezivanje (npr., oligonukleotidi kao što je 2’-O-metil oligonukleotid) se mogu napraviti stabilnim i otpornim na aktivnost nukleaze. Kao rezultat, teteri kao što je ovde opisano se mogu dizajnirati za direktnu isporuku, uklanjajući potrebu za indirektnom isporukom (npr., virusno) prekursor molekula ili plazmida dizajniranog da čini željeno sredstvo u ćeliji. Treće, teteri i njihove respektivne grupe se mogu dizajnirati da budu u skladu sa specifičnim iRNk mestima i specifičnim miRNK. Dizajn može biti specifičan za ćeliju i genski proizvod. Četvrto, ovde obelodanjene metode ostavljaju iRNK nepromenjenom, što omogućava stručnjaku da blokira proteinsku sintezu u kratkim pulsevima samim ćelijskim mehanizmom. Kao rezultat, ove metode RNK utišavanja su veoma regulatorne.
[0159] Dvostruka funkcija oligonukleotidnih tetera („teteri“) kao što je ovde opisano je
2
dizajnirana na taj način da regrutuju miRNK (npr., endogena ćelijska miRNK) kako bi se ciljala iRNK tako da se izaziva modulacija gena od interesa. U poželjnom otelotvorenju, teteri imaju formulu T-L-µ, gde je T grupa koja cilja iRNK, L je grupa za vezivanje a µ je grupa za regrutovanje miRNK. Bilo koja ili više grupa mogu biti dvolančane. Poželjno je, međutim, da je svaka grupa jednolančana.
[0160] Grupe u teterima mogu biti postavljene ili povezane (u smeru od 5' do 3') kao što je prikazano u formuli T-L-µ (tj., 3' kraj grupe za ciljanje povezan za 5' kraj grupe za vezivanje i 3' kraj grupe za vezivanje povezan za 5' kraj grupe za regrutovanje miRNK). Alternativno, grupe se mogu postaviti ili povezati u teterima kao što sledi: µ-T-L (tj., 3' kraj grupe za regrutovanje miRNK povezan za 5' kraj grupe za vezivanje i 3' kraj grupe za vezivanje povezan za 5' kraj grupe za ciljanje).
[0161] Grupa za ciljanje iRNK, kao što je opisano iznad, može zatvoriti specifičnu ciljanu iRNK. Prema pronalasku, ispoljavanje ciljane iRNK nije poželjno i zbog toga je poželjna translatorna represija iRNK. Grupa za ciljanje iRNk može biti dovoljne veličine kako bi se efikasno vezala za ciljanu iRNK. Dužina ciljane grupe će u velikom varirati u zavisnosti od, delimično, dužine ciljane iRNK i stepena komplementarnosti između ciljane iRNK i grupe za ciljanje. Takođe je ovde opisano da je grupa za ciljanje dužine manje od oko 200, 100, 50, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, ili 5 nukleotida. Takođe je ovde opisano da je grupa za ciljanje dužine od oko 15 do oko 25 nukleotida.
[0162] Grupa za regrutovanje miRNK, kao što je opisano iznad, se može povezati sa miRNK. Prema pronalasku, miRNK može biti bilo koja miRNK koja može vršiti represiju ciljane iRNK. Zabeleženo je da sisari imaju preko 250 endogenih miRNK (Lagos-Quintana i dr. (2002) Current Biol.12:735-739; Lagos-Quintana i dr. (2001) Science 294:858-862; i Lim i dr. (2003) Science 299:1540). U različitim otelotvorenjima, miRNK može biti bilo koja miRNK prepoznata u struci.
[0163] Grupa za vezivanje je bilo koje sredstvo koje se može vezati za ciljane grupe tako da aktivnost ciljanih grupa ostane održana. Grupe za vezivanje su poželjno oligonukleotidne grupe koje sadrže dovoljan broj nukleotida tako da sredstva za ciljanje mogu imati dovoljnu interakciju sa njihovim respektivnim ciljevima. Grupe za vezivanje imaju malo ili nemaju homologiju sekvence sa ćelijskom iRNK ili miRNK sekvencama. Primeri grupa za vezivanje obuhvataju jedan ili više 2'-O-metilnukleotida, npr., 2'-β-metiladenozin, 2'-O-metiltimidin, 2'-O-metilgvanozin ili 2'-O-metiluridin.
e) Oligonukleotidi za utišavanje gena
[0164] U određenim primernim otelotvorenjima, ispoljavanje gena (tj., ispoljavanje htt gena) se može modulirati upotrebom oligonukleotidno-baziranih jedinjenja koja sadrže dva ili više jednolančana antismisao oligonukleotida koji su povezani preko svojih 5'-krajeva što dozvoljava prisustvo dva ili više pristupna 3'-kraja za efikasno suzbijanje ili smanjenje ispoljavanja htt gena. Takvi oligonukleotidi su takođe poznati kao oligonukleotidi koji utišavaju gene (GSO). (Videti, npr., US 8,431,544 na ime Idera Pharmaceuticals, Inc..)
[0165] Veza na 5' kraju GSO je nezavisna od drugih oligonukleotidnih veza i može biti direktno preko 5', 3' ili 2' hidroksil grupa ili indirektno, preko ne-nukleotidnog veznika ili nukleozida, uz upotrebu ili 2' ili 3' hidroksil pozicija nukleozida. Veze takođe mogu koristiti funkcionalizovani šećer ili nukleobazu na 5' terminalnom nukleotidu.
[0166] GSO mogu sadržati dve identične ili različite sekvence konjugovane na svojim 5'-5' krajevima preko fosfodiestera, fosforotioata ili ne-nukleozidnog veznika. Takva jedinjenja mogu sadržati od 15 do 27 nukleotida koji su komplementarni za specifične delove iRNK ciljeva od interesa za antismisao regulaciju na dole genskog proizvoda. GSO koji sadrže identične sekvence se mogu vezati za specifične iRNK Watson-Crick vodoničnom vezom i suzbiti proteinsko ispoljavanje. GSO koji sadrže različite sekvence se mogu vezati za dva ili više različita regiona jednog ili više iRNK cilja i suzbiti proteinsko ispoljavanje. Takva jedinjenja se nalaze u heteronukleotidnim sekvencama komplementarnim sa ciljanom iRNK i formiraju stabilne dupleks strukture preko Watson-Crick vodonično vezivanje. Pod određenim uslovima, GSO koji sadrže dva slobodna 3'-kraja (5'-5'-povezani antismisao) mogu biti potentniji inhibitori suzbijanja gena od onih koji sadrže jedan slobodni 3'-kraj ili ne sadrže slobodni 3'-kraj.
[0167] U nekim otelotvorenjima, ne-nukleotidni veznik je glicerol ili glicerol homolog formule HO--(CH2)o--CH(OH)--(CH2)p--OH, gde su o i p nezavisno celi brojevi od 1 do oko 6, od 1 do oko 4 ili od 1 do oko 3. U nekim drugim otelotvorenjima, ne-nukleotidni veznik je derivat 1,3-diamino-2-hidroksipropan. Neki takvi derivati imaju formulu HO--(CH2)m--C(O)NH--CH2--CH(OH)--CH2-NHC(O)--(CH2)m--OH, gde je m ceo broj od 0 do oko 10, od
4
0 do oko 6, od 2 do oko 6 ili od 22 do oko 4.
[0168] Neki ne-nukleotidni veznici dozvoljavaju povezivanje više od jedne GSO komponente. Na primer, ne-nukleotidni veznik glicerol ima tri hidroksil grupe za koje GSO komponente mogu biti kovalentno povezane. Neka oligonukleotidno-bazirana jedinjenja kao što je ovde opisano, prema tome, sadrže dva ili više oligonukleotida povezana za nukleotidni ili nenukleotidni veznik. Takvi oligonukleotidi kao što je ovde opisano se nazivaju „razgranatim“.
[0169] U određenim otelotvorenjima, GSO su dužine od bar 14 nukleotida. U određenim primernim otelotvorenjima, GSO su dužine od 15 do 40 nukleotida ili od 20 do 30 nukleotida. Prema tome, komponenta oligonukleotida GSO može nezavisno biti dužine 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 nukleotida.
[0170] Ovi oligonukleotidi se mogu pripremiti metodama poznatim u struci kao što su hemija fosforamidata ili H-fosfonata što se može izvršiti ručno ili automatskim uređajem za sintezu. Ovi oligonukleotidi takođe mogu biti modifikovani na više različitih načina tako da ne sadrže svoju sposobnost da hibridizuju iRNK. Takve modifikacije mogu obuhvatati bar jednu internukleotidnu vezu oligonukleotida koji je alkilfosfonat, fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, fosfat estar, alkilfosfonotioat, fosforamidat, karbamat, karbonat, fosfat hidroksil, acetamidat ili karboksimetil estar ili njihova kombinacija sa drugim internukleotidnim vezama između 5' kraja jednog nukleotida i 3' kraja drugog nukleotida gde je 5' nukleotidna fosfodiester veza zamenjena sa bilo kojim brojem hemijskih grupa.
VII. Modifikovana sredstva za utišavanje anti-Htt RNK
[0171] U određenim aspektima pronalaska, sredstvo za utišavanje RNK (ili bilo koji njegov deo) kao što je opisano iznad se može modifikovati tako da se aktivnost sredstva dodatno poboljša. Na primer, sredstva za utišavanje RNK kao što je opisano u Odeljku II iznad se mogu modifikovati bilo kojom modifikacijom koja je opisana ispod. Modifikacije mogu, delom, služiti da dodatno pojačaju diskriminaciju cilja, da poboljšaju stabilnost sredstva (npr., da spreče degradaciju), da promovišu ćelijsku apsorpciju, da pojačaju ciljanu efikasnost, da poboljšaju efikasnost vezivanja (npr., za ciljeve), da poboljšaju toleranciju pacijenta na sredstvo i/ili da smanje toksičnost.
1) Modifikacije za pojačavanje diskriminacije cilja
[0172] U određenim otelotvorenjima, sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se mogu supstituisati sa nukleotidom za destabilizaciju kako bi se pojačala diskriminacija jednog ciljanog nukleotida (videti patentnu prijavu ser. br.11/698,689, podnetu 25. jan.2007. i provizornu patentnu prijavu SAD br.60/762,225 podnetu 25. jan.2006). Takve modifikacije mogu biti dovoljne da ukinu specifičnost sredstva za utišavanje RNK za iRNK koja nije cilj (npr., iRNK divljeg tipa), bez primetnog uticanja na specifičnost RNK sredstva za utišavanje za ciljanu iRNK (npr., mutirana iRNK za dobitak funkcije).
[0173] U poželjnim otelotvorenjima, sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano su modifikovana uvođenjem bar jednog univerzalnog nukleotida u njegov antismisao lanac. Univerzalni nukleotidi sadrže bazne delove koji se neselektivno mogu bazno spariti sa bilo kojom od četiri konvencionalne nukleotidne baze (npr., A, G, C, U). Univerzalni nukleotid je poželjan zato što ima relativno mali uticaj na stabilnost RNK dupleksa ili dupleksa formiranog lancem za navođenje sredstva za utišavanje RNK i ciljane iRNK. Primerni univerzalni nukleotid obuhvata one koji imaju deo inozin baze ili deo inozin analog baze izabran iz grupe koju čine dezoksiinozin (npr., 2'-dezoksiinozin), 7-deaza-2'-dezoksiinozin, 2'-aza-2'-dezoksiinozin, PNA-inozin, morfolino-inozin, LNA-inozin, fosforamidat-inozin, 2'-O-metoksietil-inozin i 2'-OMe-inozin. U naročito poželjnom otelotvorenju, univerzalni nukleotid je inozin ostatak ili njegov prirodni analog.
[0174] U određenim otelotvorenjima, sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano su modifikovana uvođenjem bar jednog nukleotida za destabilizaciju sa 5 nukleotida iz nukleotida koji određuje specifičnost (tj., nukleotida koji prepoznaje polimorfizam povezan sa bolesti). Na primer, nukleotid za destabilizaciju se može uvesti na poziciji koja je 5, 4, 3, 2 ili 1 nukleotid od nukleotida koji određuje specifičnost. U primernim otelotvorenjima, nukleotid za destabilizaciju je nukleotid uveden na poziciji koja je 3 nukleotida od nukleotida koji određuje specifičnost (tj., tako da postoje 2 nukleotida za stabilizaciju između nukleotida za destabilizaciju i nukleotida koji određuje specifičnost). Kod sredstava za utišavanje RNK koja imaju dva lanca ili dela lanca (npr., siRNK i shRNK), nukleotid za destabilizaciju se može uvesti u lanac ili deo lanca koji ne sadrži nukleotid koji određuje specifičnost. U poželjnim otelotvorenjima, nukleotid za destabilizaciju je uveden u isti lanac ili deo lanca koji sadrži nukleotid koji određuje specifičnost.
2) Modifikacije za pojačavanje efikasnosti i specifičnosti
[0175] U određenim otelotvorenjima, sredstva za utišavanje RNK kako je ovde opisano se mogu izmeniti kako bi se olakšala poboljšana efikasnost i specifičnost posredovanja RNKi u skladu sa pravilima dizajna asimetrije (videti pat. SAD br.8,309,704, 7,750,144, 8,304,530, 8,329,892 i 8,309,705). Takve izmene olakšavaju ulazak antismisao lanca siRNK (npr., siRNK dizajnirane upotrebom metoda kao što je ovde opisano ili siRNK proizvedene od shRNK) u RISC u korist smisao lanca, tako da antismisao lanac poželjno navodi deljenje ili translatornu represiju ciljane iRNK, i prema tome povećava ili poboljšava efikasnost ciljanog deljenja ili utišavanja. Poželjno, asimetrija sredstva za utišavanje RNK je pojačana smanjenjem jačine baznog para između 5' kraja (AS 5') antismisao lanca i 3' kraja (S 3') smisao lanca sredstva za utišavanje RNK relativno u odnosu na jačinu veze ili jačinu baznog para između 3' kraja (AS 3') antismisao lanca i 5' kraja (S 5') smisao lanca navedenog sredstva za utišavanje RNK.
[0176] U jednom otelotvorenju, asimetrija sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može poboljšati tako da postoji manje G:C baznih parova između 5' kraja prvog ili antismisao lanca i 3’ kraja dela smisao lanca nego između 3' kraja prvog ili antismisao lanca i 5' kraja dela smisao lanca. U drugom otelotvorenju, asimetrija sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može poboljšati tako da postoji bar jedan neusklađeni bazni par između 5' kraja prvog ili antismisao lanca i 3' kraja dela smisao lanca. Poželjno, neusklađeni bazni par je izabran izabran iz grupe koju čine G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C i U:U. U drugom otelotvorenju, asimetrija sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može poboljšati tako da postoji bar jedan klimavi bazni par, npr., G:U, između 5' kraja prvog ili antismisao lanca i 3' kraja dela smisao lanca. U drugom otelotvorenju, asimetrija sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može poboljšati tako da postoji bar jedan bazni par koji sadrži retki nukleotid, npr., inozin (I). Poželjno, bazni par je izabran iz grupe koju čine I:A, I:U i I:C. U još jednom otelotvorenju, asimetrija sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može poboljšati tako da postoji bar jedan bazni par koji sadrži modifikovani nukleotid. U poželjnim otelotvorenjima, modifikovani nukleotid je izabran iz grupe koju čine 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G i 2,6-diamino-A.
3) Sredstva za utišavanje RNK sa pojačanom stabilnosti
[0177] Sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se mogu modifikovati tako da poboljšaju stabilnost u serumu i u okruženju za razvoj ćelijske kulture. Kako bi se poboljšala stabilnost, 3'-ostaci se mogu stabilizovati protiv degradacije, npr., mogu se izabrati tako da se sastoje od purin nukleotida, naročito adenozin ili gvanozin nukleotida. Alternativno, supstitucija pirimidin nukleotida modifikovanim analozima, npr., supstitucija uridina sa 2’-dezoksitimidina se toleriše i ne utiče samo na efikasnost RNK interferencije.
[0178] Takođe su ovde opisana sredstva za utišavanje RNK koja obuhvataju prvi i drugi lanac gde su drugi lanac i/ili prvi lanac modifikovani supstitucijom unutrašnjih nukleotida sa modifikovanim nukleotidima, tako da je in vivo stabilnost pojačana u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim sredstvom za utišavanje RNK. Kao što je ovde definisano, „unutrašnji“ nukleotid je onaj koji se javlja na bilo kojoj poziciji koja nije 5' kraj ili 3' kraj molekula nukleinske kiseline, polinukleotida ili oligonukleotida. Unutrašnji nukleotid može biti unutar jednolančanog molekula ili unutar lanca dupleksa ili dvolančanog molekula. U jednom otelotvorenju, smisao lanac i/ili antismisao lanac su modifikovani supstituisanjem bar jednog unutrašnjeg nukleotida. U drugom otelotvorenju, smisao lanac i/ili antismisao lanac su modifikovani supstituisanjem bar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više unutrašnjih nukleotida. U drugom otelotvorenju, smisao lanac i/ili antismisao lanac su modifikovani supstituisanjem bar 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više unutrašnjih nukleotida. U drugom otelotvorenju, smisao lanac i/ili antismisao lanac je modifikovan supstituisanjem svih unutrašnjih nukleotida.
[0179] U poželjnom otelotvorenju predmetnog pronalaska, sredstva za utišavanje RNK mogu sadržati bar jedan modifikovani nukleotidni analog. Nukleotidni analozi mogu biti locirani na pozicijama gde aktivnost specifična za cilj, npr., aktivnost koja posreduje RNKi ili aktivnost translatorne represije nije dovoljno pogođena, npr., u regionu na 5'-kraju i/ili 3'-kraju siRNK molekula. Naročito, krajevi se mogu stabilizovati uključivanjem modifikovanih nukleotidnih analoga.
[0180] Primerni nukleotidni analozi obuhvataju ribonukleotide modifikovane na šećeru ili glavnom lancu (tj., obuhvataju modifikacije na fosfat-šećer glavnom lancu. Na primer, fosfodiester veze prirodne RNK se mogu modifikovati da obuhvataju bar jedan azot ili sumpor heteroatom. U primernim ribonukleotidima sa modifikovanim glavnim lancem, fosfoester grupa koja povezuje susedne ribonukleotide je zamenjena modifikovanom grupom, npr., fosfotioat grupom. U primernim ribonukleotidima sa modifikovanim šećerom, 2' OHgrupa je zamenjena sa grupom izabranom iz H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2ili ON, gde je R C1-C6alkil, alkenil ili alkinil a halo je F, Cl, Br ili I.
[0181] U naročitim otelotvorenjima, modifikacije su 2'-fluoro, 2'-amino i/ili 2'-tio modifikacije. Naročito poželjne modifikacije obuhvataju 2'-fluoro-citidin, 2'-fluoro-uridin, 2'-fluoro-adenozin, 2'-fluoro-gvanozin, 2'-amino-citidin, 2'-amino-uridin, 2'-amino-adenozin, 2'-amino-gvanozin, 2,6-diaminopurin, 4-tio-uridin, i/ili 5-amino-alil-uridin. U naročitom otelotvorenju, 2'-fluoro ribonukleotidi su svaki uridin i citidin. Dodatne primerne modifikacije obuhvataju 5-bromo-uridin, 5-jodo-uridin, 5-metil-citidin, ribo-timidin, 2-aminopurin, 2'-amino-butiril-piren-uridin, 5-fluoro-citidin, i 5-fluoro-uridin. 2'-dezoksi nukleotidi i 2'-Ome nukleotidi se takođe mogu koristiti sa modifikovanim grupama sredstava za utišavanje RNK kao što je ovde opisano. Dodatni modifikovani ostaci obuhvataju, dezoksi-abazni, inozin, N3-metil-uridin, N6,N6-dimetil-adenozin, pseudouridin, purin ribonukleozid i ribavirin. U naročito poželjnom otelotvorenju, 2' grupa je metil grupa tako da je vezujuća grupa 2'-O-metil oligonukleotid.
[0182] U primernom otelotvorenju, sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano sadrži zaključane nukleinske kiseline (LNA). LNA sadrže nukleotide sa modifikovanim šećerom koji pružaju otpor aktivnostima nukleaze (visoko su stabilni) i poseduju jednonukleotidnu diskriminaciju za iRNK (Elmen i dr., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch i dr. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen i dr. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81). Ovi molekuli imaju 2'-O,4'-C-etilen-premošćene nukleotidne kiseline, sa mogućim modifikacijama 2'-dezoksi-2"-fluorouridin. Pored toga, LNA povećava specifičnost oligonukleotida zadržavanjem grupe šećera u 3’-endo konformaciji, što time prethodno organizuje nukleotid za bazno sparivanje i povećanje temperature topljenja oligonukleotida za do 10 °C po bazi.
[0183] U drugom primernom otelotvorenju, sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano sadrži peptidne nukleinske kiseline (ANA). PNA sadrže modifikovane nukleotide u kojima je šećer-fosfat deo nukleotida zamenjen sa neutralnom 2-amino etilglicin grupom koja može formirati poliamidni glavni lanac koji je veoma otporan na razgradnju nukleaze i utiče na poboljšanu specifičnost vezivanja za molekul (Nielsen, i dr., Science, (2001), 254: 1497-1500).
[0184] Takođe su poželjni ribonukleotidi sa modifikovanom nukleobazom, tj., ribonukleotidi koji sadrže bar jedan nukleotid koji se je javlja prirodno umesto prirodne nukleobaze. Baze se mogu modifikovati tako da blokiraju aktivnost adenozin deaminaze. Primeri modifikovanih nukleobaza obuhvataju, ali nisu ograničeni na, uridin i/ili citidin modifikovan na 5-poziciji, npr., 5-(2-amino)propil uridin, 5-bromo uridin; adenozin i gvanozin modifikovan na 8 poziciji, npr., 8-bromo gvanozin; deaza nukleotide, npr., 7-deaza-adenozin; O- i N-alkilisan nukleotide, npr., N6-metil adenozin je pogodan. Potrebno je napomenuti da se modifikacije od iznad mogu kombinovati.
[0185] U drugim otelotvorenjima, unakrsno povezivanje se može iskoristiti za menjanje farmakokinetike sredstva za utišavanje RNK, na primer, za povećavanje polu raspada u telu. Takođe, ovde su opisana sredstva za utišavanje RNK koja imaju dva komplementarna lanca nukleinske kiseline, gde su dva lanca unakrsno povezana. Takođe su ovde opisana sredstva za utišavanje RNK koja su konjugovana ili nisu konjugovana (npr., na svom 3’ terminusu) sa drugom grupom (npr., grupa koja nije nukleinska kiselina kao što je peptid), ili organskim jedinjenjem (npr., boja) ili slično). Modifikovanje siRNK derivata na ovaj način poboljšava ćelijsku apsorpciju ili pojačava aktivnosti ćelijskog ciljanja dobijenog siRNK derivata u poređenju sa odgovarajućom siRNK, što je od koristi za praćenje siRNK derivata u ćeliji, ili poboljšanje stabilnosti siRNK derivata u poređenju sa odgovarajućom siRNK.
[0186] Druge primerne modifikacije obuhvataju: (a) 2' modifikaciju, npr., pružanje 2' OMe grupe na U u smisao ili antismisao lancu, ali naročito na smisao lancu, ili pružanje 2' OMe grupe na 3' visećem završetku, npr., na 3' terminusu (3' terminus znači na 3' atomu molekula ili na većini 3' grupe, npr., na većini 3' P ili 2' pozicije, kao što je ukazano kontekstom); (b) modifikaciju glavnog lanca, npr., zamenjivanje 0 sa S, u fosfatnom glavnom lancu, npr., pružanje fosforotioat modifikacije na U ili A ili kod oba, naročito na antismisao lancu; npr., sa zamenjivanjem O sa S; (c) zamenjivanje U sa C5 amino veznikom; (d) zamenjivanje A sa G (poželjno je da se izmene sekvence nalaze na smisao lancu a ne na antismisao lancu); i (d) modifikaciju na 2', 6', 7', ili 8' poziciji. Primerna otelotvorenja su ona u kojima je jedna ili više modifikacija prisutno na smisao ali ne i na antismisao lancu, ili ona otelotvorenja gde antismisao lanac ima manje takvih modifikacija. Druge primerne modifikacije obuhvataju upotrebu metilisanog P na 3' visećem završetku, npr., na 3' terminusu; kombinaciju 2' modifikacije, npr., pružanje 2' O Me grupe i modifikacije glavnog lanca , npr., sa zamenjivanjem O sa S, npr., pružanje fosforotioat modifikacije ili upotreba metilisanog P na 3' visećem završetku, npr., na 3' terminusu; modifikaciju sa 3' alkilom; modifikaciju sa abaznim pirolidonom na 3' visećem završetku, npr., 3' terminusu; modifikaciju naproksena, ibuprofena, ili drugih grupa koje pokazuju degradaciju na 3' terminusu.
4) Modifikacije za pojačavanje ćelijske apsorpcije
[0187] U drugim otelotvorenjima, sredstva za utišavanje RNK mogu biti modifikovana sa hemijskim grupama, na primer, kako bi se pojačala ćelijska apsorpcija od strane ciljanih ćelija (npr., neuronske ćelije). Prema tome, takođe su ovde opisana sredstva za utišavanje RNK koja su konjugovana ili nisu konjugovana (npr., na svom 3’ terminusu) sa drugom grupom (npr., grupom koja nije nukleinska kiselina kao što je peptid), ili organskim jedinjenjem (npr., boja) ili slično. Konjugovanje se može uspostaviti metodama poznatim u struci, npr., upotrebom metoda od Lambert i dr., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (opisuje nukleinske kiseline stavljene u poliakrilcijanoakrilat (PACA) nanočestice); Fattal i dr., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (opisuje nukleinske kiseline vezane za nanočestice); Schwab i dr., Ann. Oncol. 5 Suppl.4:55-8 (1994) (opisuje nukleinske kiseline povezane sa interkaliranim sredstvima, hidrofobnim grupama, polikatjonima ili PACA nanočesticama; i Godard i dr., Eur. J. Biochem.232(2):404-10 (1995) (opisuje nukleinske kiseline povezane za nanočestice).
[0188] U naročitom otelotvorenju, sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano je konjugovano sa lipofilnom grupom. U jednom delu, lipofilna grupa je ligand koji obuhvata katjonsku grupu. U drugom otelotvorenju, lipofilna grupa je povezana za jedan ili oba lanca siRNK. U primernom otelotvorenju, lipofilna grupa je povezana za jedan kraj smisao lanca siRNK. U drugom primernom otelotvorenju, lipofilna grupa je povezana za 3' kraj smisao lanca. U određenim otelotvorenjima, lipofilna grupa je izabrana iz grupe koju čine holesterol, vitamin E, vitamin K, vitamin A, folna kiselina ili katjonska boja (npr., Cy3). U primernom otelotvorenju, lipofilna grupa je holesterol. Druge lipofilne grupe obuhvataju holnu kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-Bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupu, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupu, palmitinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, O3-(oleoil)litoholnu kiselinu, O3-(oleoil)holensku kiselinu, dimetoksitritil ili fenoksazin.
5) Teterisani ligandi
[0189] Drugi entiteti se mogu teterisati u sredstvo za utišavanje RNK. Na primer, ligand teterisan do sredstva za utišavanje RNK koji poboljšava stabilnost, termodinamiku
1
hibridizacije sa ciljanom nukleinskom kiselinom, koji cilja naročito tkivo ili tip ćelije, ili ćelijsku permeabilnost, npr., mehanizmom zavisnim ili nezavisnim od endocitoze. Ligandi i povezane modifikacije takođe mogu povećati specifičnost sekvence i kao posledicu toga smanjiti ciljanje van mesta. Teterisani ligandi mogu obuhvatati jednu ili više modifikovanih baza ili šećera koji mogu delovati kao interkalatori. Oni se poželjno nalaze u unutrašnjem regionu, kao što je u ispupčenom sredstvom za utišavanje RNK/ciljanog dupleksa.
Interkalator može biti aromatično, npr., policiklično ili heterociklično aromatično jedinjenje. Policiklični interkalator može imati sposobnost nagomilavanja i može obuhvatati sisteme sa 2, 3 ili 4 spojena prstena. Univerzalne baze koje su ovde opisane mogu biti obuhvaćene u ligandu. U jednom otelotvorenju, ligand može obuhvatati grupu za deljenje koja doprinosi suzbijanju ciljanog gena deljenjem ciljane nukleinske kiseline. Grupa za deljenje može biti, na primer, bleomicin (npr., bleomicin-A5, bleomicin-A2 ili bleomicin-B2), piren, fenantrolin (npr., O-fenantrolin), poliamin, tripeptid (npr., lys-tyr-lys tripeptid) ili grupa koja helira metalni jon. Grupa koja helira metalni jon može obuhvatati npr., Lu(III) ili EU(III) makrociklični kompleks, Zn(II) 2,9-dimetilfenantrolin derivat, Cu(II) terpiridin ili akridin, koji mogu promovisati selektivno ciljanje RNK na mestu ispupčenja od strane slobodnih metalnih jona, kao što je Lu(III). U nekim otelotvorenjima, peptidni ligand se može teterisati do sredstva za utišavanje RNK kako bi se promovisalo deljenje ciljane RNK, npr., u regionu ispupčenja. Na primer, 1,8-dimetil-1,3,6,8,10,13-heksaazaciklotetradekan (ciklam) se može konjugovati do peptida (npr., aminokiselinskim derivatom) kako bi se promovisalo deljenje RNK. Teterisani ligand može biti aminoglikozid ligand koji može izazvati da sredstvo za utišavanje RNK ima poboljšana svojstva hibridizacije ili poboljšanu specifičnost sekvence. Primerni aminoglikozidi obuhvataju glikozilisani polilizin, galaktosilizani polilizin, neomicin B, tobramicin, kanamicin A i akridin konjugate aminoglikozida, kao što su Neo-N-akridin, Neo-S-akridin, Neo-C-akridin, Tobra-N-akridin i KanaA-N-akridin. Upotreba akridin analoga može povećati specifičnost sekvence. Na primer, neomicin B ima visok afinitet za RNK u poređenju sa DNK ali manju specifičnost sekvence. Akridin analog, neo-5-akridin ima povećani afinitet za HIV Rev-element odgovora (RRE). U nekim otelotvorenjima, guanidin analog (guanidinoglikozid) aminoglikozidnog liganda je teterisan do sredstva za utišavanje RNK. U guanidinoglikozidu, amin grupa na amino kiselini je zamenjena sa guanidin grupom. Povezivanje guanidin analoga može pojačati ćelijsku permeabilnost sredstva za utišavanje RNK. Teterisani ligand može biti poli-arginin peptid, peptoid ili peptidomimetik koji može poboljšati ćelijsku apsorpciju oligonukleotidnog sredstva.
2
[0190] Primerni ligandi su spojeni, poželjno kovalentno, ili direktno ili indirektno pomoću intervenišućeg tetra, do nosača konjugovanog ligandom. U primernim otelotvorenjima, ligand je povezan za nosač intervenišućim teterom. U primernim otelotvorenjima, ligand menja distribuciju, ciljanje ili vreme poluraspada sredstva za utišavanje RNK koje je uključeno. U primernim otelotvorenjima, ligand pruža pojačani afinitet za izabrani gen, npr., molekul, ćeliju ili tip ćelije, deo, npr., deo ćelije ili organa, tkivo, organ ili region tela kao što je npr., u poređenju sa vrstama koje nemaju takav ligand.
[0191] Primerni ligandi mogu obuhvatati transport, hibridizaciju i svojstva specifičnosti i takođe mogu poboljšati otpornost na nukleazu dobijenih prirodnih ili modifikovanih sredstava za utišavanje DNK ili polimerni molekul koji sadrži bilo koju kombinaciju monomera koji su ovde opisani i/ili prirodne ili modifikovane ribonukleotide. Ligandi uopšteno mogu obuhvatati terapetuske modifikatore, npr., za pojačavanje apsorpcije; dijagnostička jedinjenja ili reporter grupe, npr., za praćenje distribucije; unakrsno povezujuća sredstva; grupe koje dodeljuju otpornost na nukleazu; i prirodne ili neuobičajene nukleobaze. Opšti primeri obuhvataju lipofile, lipide, steroide (npr., uvaol, hecigenin, diosgenin), terpene (npr., triterpene, npr., sarsasapogenin, Friedilin, epifriedelanol dobijenu litoholnu kiselinu), vitamine (npr., folna kiselina, vitamin A, biotin, piridoksal), ugljene hidrate, proteine, sredstva za vezivanje proteina, integrin ciljajuće molekule, polikatjonike, peptide, poliamine i peptidne mimetike. Ligandi mogu obuhvatati prirodne supstance (npr., ljudski serum albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL) ili globulin); ugljene hidrate (npr., dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronsku kiselinu) amino kiselinu ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul kao što je sintetički polimer, npr., sintetička poliamino kiselina. Primer poliamino kiselina obuhvataju poliamino kiselinu koja je polilizin (PLL), poli L-asparaginska kiselina, poli L-glutaminska kiselina, anhidrid kopolimer stiren-maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolied) kopolimer, anhidrid kopolimer divinil etar-maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamid polimeri ili polifosfazin. Primeri poliamina obuhvataju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetik poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvarternarna so poliamina, ili alfa helični peptid.
[0192] Ligandi takođe mogu obuhvatati ciljajuće grupe, npr., sredstvo koje cilja ćeliju ili tkivo, npr., lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr., antitelo koje se vezuje za specijalni tip ćelije kao što je ćelija bubrega. Ciljajuće grupe mogu biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktant protein A, mucin ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin, multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilisane poliamino kiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin ili RGD peptid ili RGD peptid mimetik. Drugi primeri liganda obuhvataju boje, interkalirajuća sredstva (npr., akridini i supstituisani akridini), unakrsni-veznici (npr., psoralen, mitomicin C) porfirini (TPPC4, teksafirin, sapfirin), polIkrilne aromatične ugljene hidrate (npr:, fenazin, dihidrofenazin, fenantrolin, pirene), lys-tyr-lys tripeptid, aminoglikozide, guanidin aminoglikoide, veštačke endonukleaze (npr., EDTA), lipofilne molekule, npr., holesterol (i njegove tio analoge), holnu kiselinu, holansku kiselinu, litoholnu kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, glicerol (npr., esteri (npr., esteri mono, bis, ili tris masne kiseline, npr., C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, or C20masne kiseline) i njihovi etri npr., C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, ili C20alkil; npr., 1,3-bis-O(heksadecil)glicerol, 1,3-bis-O(oktadecil)glicerol), geraniloksiheksil grupa, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupa, palmitinska kiselina, stearinska kiselina (npr., gliceril distearat), oleinska kiselina, miristinska kiselina, O3-(oleoil)litoholatna kiselina, O3-(oleoil)holenska kiselina, dimetoksitritil ili fenoksazin) i peptidne konjugate (npr., antenapedija peptid, Tat peptid), sredstva za alkilaciju, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioobeležene oznake, enzime, haptene (npr., biotin), sredstva za olakšavanje transporta/apsorpcije (npr., aspirin, naproksen, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol klasteri, akridinimidazol konjugati, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikla), dinitrofenil, HRP ili AP.
[0193] Ligandi mogu biti proteini, npr., glikoproteini ili peptidi, npr., molekuli koji imaju specifični afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr., antitelo koje se vezuje za specifični tip ćelije kao što je ćelija raka, endotelijalna ćelija ili koštana ćelija. Ligandi takođe mogu obuhvatati hormone i hormonske receptore. Takođe mogu obuhvatati ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin multivalentna manoza ili multivalentna fukoza. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze, ili aktivator NF-κB.
4
[0194] Ligand može biti supstanca, npr., lek, koji može povećati apsorpciju sredstva za utišavanje RNK u ćeliji, na primer, prekidanjem citoskeleta ćelija, npr., prekidanjem mikrotubula, mikrofilamenata i/ili međufilamenata ćelije. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin. Ligand može povećati apsorpciju sredstva za utišavanje u ćelijama aktiviranjem inflamatornog odgovora, na primer. Primerni ligandi koji bi imali takvo dejstvo unutar faktora nekroze tumora alfa (TNFα), interleukin-1 beta ili gama interferona. U jednom aspektu, ligand je lipid ili lipidno-bazirani molekul. Takav lipid ili lipidno-bazirani molekul koji poželjno vezuje protein seruma, npr., ljudski serum albumin (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata za ciljano tkivo, npr., ciljano tkivo tela koje nije bubreg. Na primer, ciljano tkivo može biti jetra, uključujući parenhimalne ćelije jetre. Drugi molekuli koji mogu vezati HSA se takođe koriste kao ligandi. Na primer, neproksin ili aspirin se mogu koristiti. Lipid ili lipidno-bazirani ligand može (a) povećati otpornost na degradaciju konjugata, (b) povećati ciljanje ili transport u ciljanu ćeliju ili ćelijsku membranu, i/ili (c) može se koristiti za podešavanje vezivanja za protein seruma, npr., HSA. Lipidno bazirani ligand se može modulirati, npr., kontrolisati vezivanje konjugata za ciljano tkivo. Na primer, lipid ili lipidno-bazirani ligand koji se vezuje za HSA jače će imati manju verovatnoću da bude ciljan do bubrega i prema tome će imati manju verovatnoću da se pročisti iz tela. Lipid ili lipidno-baziran ligand koji se vezuje za HSA slabije se može koristiti za ciljanje konjugata do bubrega. U poželjnom otelotvorenju, lipidno bazirani ligand se vezuje za HSA. Lipidnobazirani ligand može vezati HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u tkivo van bubrega. Međutim, poželjno je da afinitet ne bude tako jak da se HSA-ligand vezivanje ne može povratiti. U drugom poželjnom otelotvorenju, lipidno bazirani ligand se vezuje za HSA slabo ili se uopšte ne vezuje, tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u bubreg. Druge grupe koje ciljaju ćelije bubrega se takođe mogu koristiti umesto ili dodatno lipidno baziranom ligandu.
[0195] U drugom aspektu, ligand je grupa, npr., vitamin, koji se uzima od strane ciljane ćelije, npr., ćelije koja vrši proliferaciju. Oni su naročito koristi pri tretiranju poremećaja okarakterisanih neželjenom ćelijskom proliferacijom, npr., malignih ili ne-malignih, npr., ćelija raka. Primerni vitamini obuhvataju vitamin A, E i K. Drugi primerni vitamini su B vitamin, npr., folna kiselina, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili drugi vitamini ili nutrijenti koji se uzimaju od strane ćelija raka. Takođe su obuhvaćeni HSA i lipoprotein niske gustine (LDL).
[0196] U drugom aspektu, ligand je sredstvo za probijanje ćelije, poželjno helikoidno sredstvo za probijanje ćelije. Poželjno, sredstvo je amfipatično. Primerno sredstvo je peptid kao što je tat ili antenopedija. Ukoliko je sredstvo peptid, može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik, invertomere, ne-peptidne ili pseudo-peptidne veze i upotrebu D-amino kiselina. Helikoidno sredstvo je poželjno alfa-helikoidno sredstvo, koje poželjno ima lipofilnu ili lipofobnu fazu.
[0197] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (takođe se ovde naziva kao oligopeptidomimetik) je molekul koji se može saviti u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Povezivanje peptida i peptidomimetika za oligonukleotidno sredstvo može uticati na farmakokinetsku distribuciju sredstva za utišavanje RNK, kao što je pojačavanje ćelijskog prepoznavanja i apsorpcije. Peptid ili peptidomimetik grupa mogu biti dužine oko 5-50 amino kiselina, npr., oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 amino kiselina. Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid ćelijskog probijanja, katjonski peptid, amfipatični peptid ili hidrofobni peptid (npr., koji se primarno sastoji od Tyr, Trp ili Phe). Peptidna grupa može biti dendrimerni peptid, zadržani peptid ili unakrsno povezani peptid. Peptidna grupa može biti L-peptid ili D-peptid. U drugoj alternativi, peptidna grupa može obuhvatati sekvencu translokacije hidrofobne membrane (MTS). Peptid ili peptidomimetik se može kodirati nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke prikaza faga ili kombinatorne biblioteke jedno-zrno-jednojedinjenje (OBOC) (Lam i dr., Nature 354:82-84, 1991). U primernim otelotvorenjima, peptid ili peptidomimetik teterisan do sredstva za utišavanje RNK inkorporiranom monomernom jedinicom je peptid koji cilja ćeliju kao što je arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD)-peptid ili RGD mimetik. Peptidna grupa može biti opseg dužine od oko 5 amino kiselina do oko 40 amino kiselina. Peptidne grupe mogu imati strukturnu modifikaciju, kao što je povećavanje stabilnosti ili direktna konformaciona svojstva. Bilo koja od ispod opisanih strukturnih modifikacija se može upotrebiti.
6) Jedinjenja
[0198] U jednom aspektu, ovde je dato jedinjenje Formule prikazane na Slici 81, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za terapeutsku upotrebu pri suzbijanju ispoljavanja Hantingtin (HTT) gena u organizmu ili upotreba jedinjenja Formule prikazanog na Slici 81, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za suzbijanje ispoljavanja Hantingtin (HTT) gena u ćeliji in vitro, gde
R<1>je izabran izabran iz grupe koju čine:
R<3>je nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine internukleotidni veznik kao što je prikazano na Slici 82; i
L je veznik koji povezuje dve grupe, gde je veznik izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac, peptid, RNK, DNK,
ili kombinacija navedenog.
[0199] U jednom otelotvorenju, R<1>je izabran iz grupe koju čine
[0200] U drugom otelotvorenju, R<1>je
[0201] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran pri svakom javljanju iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilenfosfonat, fosfotriester i boranofosfat.
[0202] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat i boranofosfat.
[0203] U drugom otelotvorenju, R<3>je fosforotioat.
[0204] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac i peptid.
[0205] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz etilen glikol lanca ili peptida.
[0206] U drugom otelotvorenju, L je
[0207] U drugom otelotvorenju, L je
[0208] U drugom otelotvorenju, L je
[0209] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 81 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 83.
[0210] U drugom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 81 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 83 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
i
[0211] U drugom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 81 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 83 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
[0212] U drugom aspektu, ovde je dato jedinjenje Formule prikazane na Slici 84 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
R<1>je izabran iz grupe koju čine
R<3>je nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine internukleotidni veznik kao što je prikazano na Slici 82;
L je veznik koji povezuje dve grupe, gde je veznik izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac, peptid, RNK, DNK,
ili kombinacija navedenog; i
B je tačka grananja između dva ili više veznika, gde je tačka grananja izabrana iz grupe koju čine glikol, amino kiselina ili polivalentna organska vrsta.
[0213] U jednom otelotvorenju, R<1>je izabran iz grupe koju čine
1
[0214] U drugom otelotvorenju, R<1>je
[0215] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran pri svakom javljanju iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilenfosfonat, fosfotriester i boranofosfat.
[0216] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat i boranofosfat.
[0217] U drugom otelotvorenju, R<3>je fosforotioat.
[0218] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac i peptid.
2
[0219] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz etilen glikol lanca ili peptida.
[0220] U drugom otelotvorenju, L je
[0221] U drugom otelotvorenju, L je
[0222] U drugom otelotvorenju, L je
[0223] U jednom otelotvorenju, B je tačka grananja između dva ili više veznika, gde je tačka grananja izabrana iz glikola ili amino kiseline. U drugom otelotvorenju tačka grananja je glikol. U drugom otelotvorenju tačka grananja je amino kiselina.
[0224] U drugom otelotvorenju jedinjenja Formule prikazane na Slici 84, Y je definisano kao što je prikazano na Slici 86.
[0225] U drugom aspektu, ovde je dato jedinjenje Formule prikazane na Slici 85 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
R<1>je izabran iz grupe koju čine
R<3>je nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine internukleotidni veznik kao što je prikazano na Slici 82;
L je veznik koji povezuje dve grupe, gde je veznik izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac, peptid, RNK, DNK,
ili kombinacija navedenog; i
B je tačka grananja između dva ili više veznika, gde je tačka grananja izabrana iz grupe koju čine glikol, amino kiselina ili bilo koja polivalentna organska vrsta.
4
[0226] U jednom otelotvorenju, R<1>je izabran iz grupe koju čine
i
tvorenju, R<1>je
[0228] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran pri svakom javljanju iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilenfosfonat, fosfotriester i boranofosfat.
[0229] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat i boranofosfat.
[0230] U drugom otelotvorenju, R<3>je fosforotioat.
[0231] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac i peptid.
[0232] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz etilen glikol lanca ili peptida.
[0233] U drugom otelotvorenju, L je
[0234] U drugom otelotvorenju, L je
[0235] U drugom otelotvorenju, L je
[0236] U jednom otelotvorenju, B je tačka grananja između dva ili više veznika, gde je tačka grananja izabrana iz glikola ili amino kiseline. U drugom otelotvorenju tačka grananja je glikol. U drugom otelotvorenju tačka grananja je amino kiselina.
[0237] U jednom otelotvorenju jedinjenja Formule prikazane na Slici 85, Y je definisano kao što je prikazano na Slici 86.
[0238] U drugom aspektu, ovde je dato jedinjenje Formule prikazane na Slici 87 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
R<1>je izabran iz grupe koju čine
R<3>je nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine internukleotidni veznik kao što je prikazano na Slici 82;
L je veznik koji povezuje dve grupe, gde je veznik izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac, peptid, RNK, DNK,
ili kombinacija navedenog; i
R<2>je izabran iz grupe koju čine (npr., C1-6, C1-10, C1-20, C1-30ili C1-40), vitamin, ligand, peptid, bioaktivni konjugat (uključujući, ali bez ograničenja glikosfingolipide, polinezasićene masne kiseline, sekosteroide, steroidne hormone ili sterol lipide),
[0239] U jednom otelotvorenju, R<1>je izabran iz grupe koju čine
[0240] U drugom otelotvorenju, R<1>je
[0241] U drugom otelotvorenju, R<2>je izabran iz grupe koju čine
[0242] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran pri svakom javljanju iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilenfosfonat, fosfotriester i boranofosfat.
[0243] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat i boranofosfat.
[0244] U drugom otelotvorenju, R<3>je fosforotioat.
[0245] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz grupe koju čine etilen glikol lanac, alkil lanac i peptid.
[0246] U drugom otelotvorenju, L je izabran iz etilen glikol lanca ili peptida.
[0247] U drugom otelotvorenju, L je
1
[0248] U drugom otelotvorenju, L je
[0249] U drugom otelotvorenju, L je
[0250] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 87 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 88.
[0251] U drugom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 87 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 88 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
[0252] U drugom aspektu, ovde je dato jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
R<1>je izabran iz grupe koju čine
2
R<3>je nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine internukleotidni veznik kao što je prikazano na Slici 82; i
R<2>je izabran iz grupe koju čine (npr., C1-6, C1-10, C1-20, C1-30ili C1-40), vitamin, ligand, peptid, bioaktivni konjugat (uključujući, ali bez ograničenja glikosfingolipide, polinezasićene masne kiseline, sekosteroide, steroidne hormone ili sterol lipide),
�
[0253] U jednom otelotvorenju, R<1>je izabran iz grupe koju čine
[0254] U drugom otelotvorenju, R<1>je
[0255] U drugom otelotvorenju, R<2>je izabran iz grupe koju čine
[0256] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran pri svakom javljanju iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilenfosfonat, fosfotriester i boranofosfat.
[0257] U drugom otelotvorenju, R<3>je internukleotidni veznik nezavisno izabran iz svakog javljanja iz grupe koju čine fosforotioat, fosforoditioat i boranofosfat.
[0258] U drugom otelotvorenju, R<3>je fosforotioat.
[0259] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90.
[0260] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
i
R<2>je
[0261] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
[0262] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
[0263] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
[0264] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
[0265] U jednom otelotvorenju, jedinjenje Formule prikazane na Slici 89 je jedinjenje Formule prikazane na Slici 90 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde
VIII. Metode za uvođenje nukleinskih kiselina, vektora i ćelija domaćina
[0266] Sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se mogu direktno uvesti u ćeliju (npr., nervnu ćeliju) (tj., unutarćelijski); ili se mogu uvesti vanćelijski u šupljinu, intestinalni prostor, u cirkulaciju organizma, uvesti oralno ili se mogu uvesti potapanjem ćelije ili organizma u rastvor koji sadrži nukleinsku kiselinu. Vaskularna ili ekstravaskularna cirkulacija, krv ili limfni sistem i moždano-moždinska tečnost su mesta gde se nukleinska kiselina može uvesti.
[0267] Sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se mogu uvesti upotrebom metoda za isporuku nukleinske kiseline koje su poznate u struci koje obuhvataju injektiranje rastvora koji sadrži nukleinsku kiselinu, bombardovanje česticama pokrivenim nukleinskom kiselinom, potapanje ćelije ili organizma u rastvor nukleinske kiseline ili elektroporaciju ćelijskih membrana u prisustvu nukleinske kiseline. Druge metode poznate u struci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije se mogu koristiti, kao što je lipidno-posredovan transport nosača, hemijski-posredovan transport i katjonska lipozomska transfekcija kao što je kalcijum fosfat i slično. Nukleinska kiselina se može uvesti zajedno sa drugim komponentama koje vrše jednu ili više od sledećih aktivnosti: pojačavanje apsorpcije nukleinske kiseline od
1
strane ćelije ili povećavanje suzbijanja ciljanog gena na drugi način.
[0268] Fizičke metode uvođenja nukleinskih kiselina obuhvataju injektiranje rastvora koji sadrži RNK, bombardovanje česticama pokrivenim sa RNK, potapanje ćelije ili organizma u rastvor RNK ili elektroporaciju ćelijskih membrana u prisustvu RNK. Virusni konstrukt stavljen u virusnu česticu bi postigao i efikasno uvođenje ekspresionog konstrukta u ćeliju i transkripciju RNK kodirane ekspresionim konstruktom. Druge metode poznate u struci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije se mogu koristiti, kao što je lipidno-posredovan transport nosača, hemijski-posredovan transport kao što je kalcijum fosfat i slično. Prema tome, RNK se može uvesti zajedno sa komponentama koje vrše jednu ili više od sledećih aktivnosti: pojačavanje apsorpcije RNK od strane ćelije, suzbijanje pretvaranja pojedinačnih lanaca, stabilizovanje pojedinačnih lanaca ili povećanje suzbijanja ciljanog gena na drugi način.
[0269] RNK se može direktno uvesti u ćeliju (tj., unutarćelijski); ili se može uvesti vanćelijski u šupljinu, intestinalni prostor, u cirkulaciju organizma, uvesti oralno ili se mogu uvesti potapanjem ćelije ili organizma u rastvor koji sadrži RNK. Vaskularna ili ekstravaskularna cirkulacija, krv ili limfni sistem i moždano-moždinska tečnost su mesta gde se RNK može uvesti.
[0270] Ćelija koja ima ciljani gen može biti od germinalne linije ili somatska, totipotentna ili pluripotentna, ona koja deli ili ne deli, parenhimalna ili epitelna, imortalizovana ili transformisana ili slično. Ćelija može biti matična ćelija ili diferencirana ćelija. Tipovi ćelija koji su diferencirani obuhvataju adipocite, fibroblaste, miocite, kardiomiocite, egzokrine žlezde, neurone, glijalne ćelije, krvne ćelije, megakariocite, limfocite, makrofage, neutrofile, eozinofile, bazofile, mastocite, leukocite, granulocite, keratinocite, hondrocite, osteoblaste, osteoklaste, hepatocite i ćelije endokrinih ili egzokrinih žlezda.
[0271] U zavisnosti od naročitog ciljanog gena i doze materijala isporučene dvolančane RNK, ovaj proces može pružiti delimičan ili kompletan gubitak funkcije ciljanog gena. Smanjenje ili gubitak ispoljavanja gena od bar 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% ili više ciljanih ćelija je primeran. Suzbijanje ispoljavanja gena se odnosi na odsustvo (ili primetno smanjenje) nivoa proteina i/ili iRNK proizvoda u ciljanom genu. Specifičnost se odnosi na sposobnost da se suzbije ciljani gen bez manifestovanja dejstva na druge gene ćelije.
1 1
Posledice suzbijanja se mogu potvrditi ispitivanjem spoljašnjih svojstava ćelije ili organizam (kao što je predstavljeno ispod u primerima) ili biohemijskim tehnikama kao što su hibridizacija RNK rastvora, protekcija nukleaze, Northern hibridizacija, reverzna transkripcija, praćenje ispoljavanja gena na mikronizu, vezivanje antitela, imunoenzimske analize (ELISA), Western blot analiza, radioimunološka analiza (RIA), druge imunološke analize i sortiranje fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS).
[0272] Za RNK-posredovano suzbijanje u ćelijskoj liniji ili celom organizmu, ispoljavanje gena se konvencionalno procenjuje upotrebom reporter ili gena za otpornost na lek čiji se proteinski proizvod lako procenjuje. Takvi reporter geni obuhvataju acetohidroksikiselu sintazu (AHAS), alkalnu fosfatazu (AP), beta galaktosidazu (LacZ), beta glukoronidazu (GUS), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), zeleni fluorescentni protein (GFP), peroksidazu rena (HRP), luciferazu (Luc), nopalin sintazu (NOS), oktopin sintazu (OCS) i njihove derivate. Više markera koji se mogu izabrati su dostupni i dodeljuju otpornost na ampicilin, bleomicin, hloramfenikol, gentamicin, higromicin, kanamicin, linkomicin, metotreksat, fosfinotricin, puromicin i tetraciklin. U zavisnosti od analize, kvantifikacija količine ispoljavanja gena omogućava određivanje stepena suzbijanja koji je veći od 10%, 33%, 50%, 90%, 95% ili 99% u poređenju sa ćelijom koja nije tretirana prema predmetnom pronalasku. Niže doze injektiranog materijala i duža vremena nakon davanja RNKi sredstva za rezultat mogu dat suzbijanje ćelija u manjim frakcijama (npr., bar 10%, 20%, 50%, 75%, 90% ili 95% ciljanih ćelija). Kvantizacija ispoljavanja gena u ćeliji može pokazati slične količine suzbijanja pri nivou akumulacije ciljane iRNK ili translacije ciljanog proteina. Kao primer, efikasnost suzbijanja se može odrediti procenjivanjem količine genskog proizvoda u ćeliji; iRNK se može detektovati sondom za hibridizaciju koja ima nukleotidnu sekvencu van regiona koji se koristi za inhibitornu dvolančanu RNK, ili se translirani polipeptid može detektovati antitelom dobijenim protiv polipeptidne sekvence tog regiona.
[0273] RNK se može uvesti u količini koja omogućava isporuku bar jedne kopije po ćeliji. Veće doze (npr., bar 5, 10, 100, 500 ili 1000 kopija po ćeliji) materijala mogu dati efikasnije suzbijanje; niže doze takođe mogu biti od koristi za specifične primene.
[0274] U primernom aspektu, efikasnost RNKi sredstva kao što je ovde opisano (npr., siRNK koja cilja htt ciljanu sekvencu) je testirana za svoju sposobnost da specifično degradira mutiranu iRNK (npr., htt iRNK i/ili proizvodnju hantingtin proteina) u ćelijama, naročito u
1 2
neuronima (npr., striatalnim ili kortikalnim neuronskim klonskim linijama i/ili primarnim neuronima. Takođe su dostupne za validacione analize bazirane na ćeliji druge ćelije koje se mogu lako transfektovati, na primer, HeLa ćelije ili COS ćelije, Ćelije su transfektovane u ljudsku divlju ili mutiranu cDNK (npr., ljudska cDNK divljeg ili mutiranog hantingtina). Standardna siRNK, modifikovana siRNK ili vektori koji mogu proizvesti siRNK iz iRNK sa U-petljom su ko-transfektovane. Selektivna redukcija u ciljanoj iRNK (npr., iRNK hantingtina) i/ili ciljanim proteinima (npr., hantingtin protein) je merena. Redukcija ciljane iRNK ili proteina se može porediti sa nivoima ciljane iRNK ili proteina u odsustvu RNKi sredstva ili u prisustvu RNKi sredstva koje ne cilja htt iRNK. Egzogeno-uvedena iRNK ili protein (ili endogena iRNK ili protein) se mogu testirati u svrhe poređenja. Kada se koriste neuronske ćelije, za koje je poznato da su donekle otporne na standardne tehnike transfekcije, može biti poželjno uvesti RNKi sredstva (npr., siRNK) pasivnom apsorpcijom.
Rekombinantni adeno-povezani virusi i vektori
[0275] Kao što je ovde opisano, rekombinantni adeno-povezani virusi (rAAV) i njihovi povezani vektori se mogu koristiti za isporuku jedne ili više siRNK u ćelije, npr., nervne ćelije (npr., moždane ćelije). AAV može inficirati više različitih tipova ćelija, iako efikasnost infekcije zavisi od serotipa, koji je određen sekvencom kapsid proteina. Nekoliko nativnih AAV serotipova je identifikovano, gde su serotipovi 1-9 najčešće korišćeni za rekombinantni AAV. Serotip AAV-2 je najizučeniji i ima najviše publikacija. AAV-DJ sistem obuhvata serotipove AAV-DJ i AAV-DJ/8. Ovi serotipovi su stvoreni mešanjem DNK od više AAV serotipova kako bi se proizveo AAV sa hibridnim kapsidima koji imaju poboljšane efikasnosti transdukcije in vitro (AAV-DJ) i in vivo (AAV-DJ/8) u različitim ćelijama i tkivu.
[0276] Kao što je ovde opisano, široko raspoređena isporuka centralnog nervnog sistema (CNS) se može postići intravaskularnom isporukom rekombinantnog adeno-povezanog virusa 7 (rAAV7), RAAV9 i rAAV10 ili drugih pogodnih rAAV (Zhang i dr. (2011) Mol. Ther. 19(8):1440-8. doi: 10.1038/mt.2011.98. Epub 24. maj 2011.). rAAV i njihovi povezani vektori su dobro poznati u struci i opisane su u patentnim prijavama SAD 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 i 2005/0220766.
[0277] rAAV se mogu isporučiti ispitaniku u sastavima u skladu sa bilo kojom pogodnom metodom poznatom u struci. rAAV se može suspendovati u fiziološki kompatibilnom nosaču (tj., u sastavu), i može se dati ispitaniku, tj., životinji koja je domaćin, na primer, čovek, miš,
1
pacov, mačka, pas, ovca, zec, konj, krava, koza, svinja, zamorče, hrčak, kokoška, ćurka, ili primatu koji nije čovek (npr., makaki) i slično. U određenim otelotvorenjima, životinja koja je domaćin je životinja koja nije čovek.
[0278] Isporuka jednog ili više rAAV ispitaniku koji je sisar se može izvršiti, na primer, intramuskularnom injekcijom ili davanjem u krvotok ispitanika koji nije sisar. Davanje u krvotok može biti injekcijom u venu, arteriju ili bilo koji drugi vaskularni sprovodnik. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više rAAV se daju u krvotok putem izolovane perfuzije uda, tehnika koja je dobro poznata kod operacija, metoda koja suštinski omogućava stručnjaku da izoluje ud iz sistemske cirkulacije pre davanja rAAV virona. Varijanta tehnike izolovane perfuzije uda, koja je opisana u pat. SAD br.6,177,403, se može upotrebiti od strane stručnjaka za davanje virona u vaskulaturu izolovanog uda kako bi se potencijalno pojačala transdukcija u ćelije mišića ili tkiva. Pored toga, u određenim primerima, može biti poželjno isporučiti virone u centralni nervni sistem (CNS) ispitanika. Pod „CNS“ podrazumevaju se sve ćelije i tkivo u mozgu i kičmenoj moždini kičmenjaka. Prema tome, termin obuhvata, ali nije ograničen na, nervne ćelije, glijalne ćelije, astrocite, moždanomoždinsku tečnost (CSF), intestinalni prostor, kost, hrskavicu i slično. Rekombinantni AAV se mogu isporučiti direktno u CNS ili mozak injektiranjem, npr., u ventrikularni region, kao i u striatum (npr., repato jedro ili putamen striatuma), kičmenu moždinu i neuromuskularnu spojnicu, ili cerebralnu lobulu, sa iglom, kateterom ili sličnim uređajem, upotrebom tehnike neurohirurgije poznate u struci kao što je stereotaktička injekcija (videti, npr., Stein i dr., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson i dr., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson i dr., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; i Alisky i Davidson, Hum. Gene Ther.11:2315-2329, 2000).
[0279] Sastavi kao što je ovde opisano mogu sadržati samo rAAV ili biti u kombinaciji sa jednim ili više virusa (npr., drugo rAAV kodiranje koje ima jedan ili više različitih transgena). U određenim otelotvorenjima, sastav sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više različitih rAAV gde svaki ima jedan ili više različitih transgena.
[0280] Delotvorna količina rAAV je količina koja je dovoljna da inficira životinju, ciljajući željeno tkivo. U nekim otelotvorenjima, delotvorna količina rAAV je količina koja je dovoljna da proizvede stabilni somatski transgeni životinjski model. Delotvorna količina će prevashodno zavisiti od faktora kao što su vrste, starost, težina, zdravlje ispitanika i tkivo koje se cilja i prema tome može varirati u zavisnosti od životinje i vrste. Na primer, delotvorna
1 4
količina jednog ili više rAAV je uopšteno u opsegu od oko 1 ml do oko 100 ml rastvora koji sadrži od oko 10<9>do 10<16>genomskih kopija. U nekim slučajevima, doza sa između oko 10<11>do 10<12>rAAV genomskih kopija je odgovarajuća. U određenim otelotvorenjima, 10<12>rAAV genomske kopije su efikasne da ciljaju tkivo srca, jetre i pankreasa. U nekim slučajevima, stabilne transgene životinje su proizvedene sa više doza rAAV.
[0281] U nekim otelotvorenjima, rAAV sastavi su formulisani da redukuju agregaciju AAV čestica u sastavu, naročito kada su visoke koncentracije rAAV prisutne (npr., oko 10<13>genomskih kopija/mL ili više). Metode za redukciju agregacije rAAV su dobro poznate u struci i obuhvataju, na primer, dodavanje surfaktanata, podešavanje pH, podešavanje koncentracije soli, itd. (Videti, npr., Wright i dr. (2005) Molecular Therapy 12:171-178)
[0282] „Rekombinantni AAV (rAAV) vektori“ obuhvataju, minimalno, transgen i njegove regulatorne sekvence i 5' i 3' AAV invertovana terminalna ponavljanja (ITR). Ovaj rekombinantni AAV vektor je postavljen u kapsid protein i isporučen u izabranu ciljanu ćeliju. U nekim otelotvorenjima, transgen je sekvence nukleinske kiseline, heterologna sa sekvencama vektora, koje kodiraju polipeptid, protein, funkcionalni RNK molekul (npr., siRNK) ili drugi genski proizvod od interesa. Sekvenca koja kodira nukleinsku kiselinu je operativno povezana sa regulatorne komponente na način koji dozvoljava transgenu transkripciju, translaciju i/ili ispoljavanje u ćeliji ciljanog tkiva.
[0283] AAV sekvence vektora obično sadrže sekvence cis-delujućeg 5' i 3' invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) (Videti, npr., B. J. Carter, u „Handbook of Parvoviruses“, ured., P. Tijsser, CRC Press, str.155 168 (1990)). ITR sekvence su obično dužine oko 145 baznih parova. U određenim otelotvorenjima, suštinski cele sekvence koje kodiraju ITR se koriste u molekulu, iako se određeni stepen manje modifikacije ovih sekvenci dozvoljava. Sposobnost modifikovanja ovih ITR sekvenci je poznata u struci. (Videti, npr., tekstove kao što su Sambrook i dr, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); i K. Fisher i dr., J Virol., 70:520532 (1996)). Primer takvog molekula koji je korišćen u predmetnom pronalasku je „cis-delujući“ plazmid koji sadrži transgen, gde je su izabrane transgene sekvence i povezani regulatorni elementi između 5' i 3' AAV ITR sekvenci. AAV ITR sekvence se mogu dobiti iz bilo kog poznatog AAV, uključujući AAV tipove koji su ovde opisani u nastavku.
1
IX. Metode za tretiranje
[0284] Takođe su ovde opisane i profilaktičke i terapeutske metode za tretiranje ispitanika koji ima rizik (ili je podložan) od bolesti ili poremećaja koji je izazvan, u celosti ili delom, od mutiranog proteina dobitka funkcije. Bolest ili poremećaj može biti bolest ili poremećaj ponavljanja trinukleotida. Bolest ili poremećaj može biti poliglutaminski poremećaj. Prema pronalasku, bolest ili poremećaj povezan sa ispoljavanjem hantingtina i gde menjanje hantingtina, naročito pojačavanje CAG broja ponavljanja, dovodi do defekta hantingtin gena (strukture ili funkcije) ili hantingtin proteina (strukture ili funkcije ili ispoljavanja), tako da kliničke manifestacije obuhvataju one koje se mogu videti kod pacijenata sa Hantingtonovom bolesti.
[0285] „Tretiranje“ ili „za tretiranje“ kako se ovde koristi je definisano kao primena ili davanje terapeutskog sredstva (npr., RNK sredstva ili vektora ili transgena koji kodira isti) pacijentu, ili primena ili davanje terapeutskog sredstva u izolovano tkivo ili ćelijsku liniju od pacijenta, koji ima bolest ili poremećaj, simptom bolesti ili poremećaja ili predispoziciju prema bolesti ili poremećaju, sa svrhom da se izleči, leči, ublaži, olakša, izmeni, oslabi, poboljša, popravi ili utiče na bolest ili poremećaj, simptome bolesti ili poremećaja ili predispoziciju prema bolesti.
[0286] Takođe je ovde opisana metoda za sprečavanje bolesti ili poremećaja kod ispitanika kao što je opisano iznad, davanjem ispitaniku terapeutskog sredstva (npr., RNKi sredstvo ili vektor ili transgen koji kodira isto). Ispitanici pri riziku za bolest se mogu identifikovati, na primer, bilo kojom ili kombinacijom dijagnostičkih ili prognostičkih analiza kao što je ovde opisano. Davanje profilaktičkog sredstva se može javiti pre manifestacije simptoma karakterističnih za bolest ili poremećaj, tako da se bolest ili poremećaj sprečava ili alternativno, prolongira u pogledu napredovanja.
[0287] Takođe su ovde opisane metode za tretiranje ispitanika terapeutski, tj., menjanje nastupanja simptoma bolesti ili poremećaja. Modulatorna metoda kao što je ovde opisano može obuhvatati dovođenje ćelije koja ispoljava mutant dobitka funkcije u kontakt sa terapeutskim sredstvom (npr., RNKi sredstvom ili vektorom ili transgenom koji kodira isti) koja je specifična za ciljanu sekvencu unutar gena (npr., SEQ ID NO: 1, 2 ili 3) tako da se postiže interferencija specifična za sekvencu u genu. Ove metode se mogu izvršiti in vitro (npr., kultivisanjem ćelije sa sredstvom) ili alternativno, in vivo (npr., davanjem sredstva
1
ispitaniku).
[0288] U pogledu i sa profilaktičkim i terapeutskim metodama tretiranja, takva tretiranja se mogu specijalno usmeriti ili modifikovati, na osnovu znanja dobijenog iz oblasti farmakogenomike. „Farmakogenomika“ kako se ovde koristi se odnosi na primenu tehnologije genoma kao što je sekvenciranje gena, statistička genetika i analiza ispoljavanja gena na lekove u kliničkom razvoju i na tržištu. Preciznije, termin se odnosi na ispitivanje kako geni pacijenta određuju njegov ili njen odgovor na lek (npr., „fenotip odgovora na lek“ ili „genotip odgovora na lek“ pacijenta). Prema tome, takođe su ovde obelodanjene metode za usmeravanje profilaktičko ili terapeutsko tretiranje pojedinca ili sa molekulima ciljanog gena kao što je ovde opisano ili modulatorima ciljanog gena na osnovu genotipa odgovora na lek za pojedinca. Farmakogenomika omogućava kliničaru ili lekaru da cilja profilaktička ili terapeutska tretiranja kod pacijenata koji će imati najveću korist od tretiranja i kako bi se izbeglo tretiranje pacijenata koji će imati toksična neželjena dejstva povezana sa lekom.
[0289] Terapeutska sredstva se mogu testirati u odgovarajućem životinjskom modelu. Na primer, RNKi sredstva (ili ekspresioni vektor ili transgen koji kodira isto) kao što je ovde opisano se mogu koristiti u životinjskom modelu za određivanje efikasnosti, toksičnost ili neželjenih dejstava tretiranja navedenog sredstva. Alternativno, terapeutsko sredstvo se može koristiti u životinjskom modelu za određivanje mehanizma delovanja takvog sredstva. Na primer, sredstvo se može koristiti u životinjskom modelu za određivanje efikasnosti, toksičnost ili neželjenih dejstava tretiranja sa navedenim sredstvom. Alternativno, sredstvo se može koristiti u životinjskom modelu za određivanje mehanizma delovanja takvog sredstva.
[0290] Farmaceutski sastav koji sadrži sredstvo za utišavanje RNK se može davati bilo kom pacijentu koji je dijagnostikovan da ima ili je pri riziku od razvijanja neurološkog poremećaja, kao što je Hantingtonova bolest. Takođe je ovde opisano da je pacijent dijagnostikovan da ima neurološki poremećaj, i da je pacijent u suprotnom u dobrom zdravstvenom stanju. Na primer, pacijent nije terminalno bolestan i pacijent ima verovatnoću da živi bar 2, 3, 5 ili više godina nakon dijagnoze. Pacijent se može tretirati odmah nakon dijagnoze, ili se tretiranje može odložiti dok pacijent ne iskusi oslabljujuće simptome, kao što su motorne fluktuacije i diskineza kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću. Takođe je ovde opisano da pacijent nije postigao naprednu fazu bolesti.
1
[0291] Sredstvo za utišavanje RNK modifikovano da pojača apsorpciju u nervne ćelije se može davati pri jediničnoj dozi koja je manja od 1,4 mg po kg telesne mase, ili manja od 0, 5, 2, 1, 0.5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ili 0,00001 mg kg telesne mase ili manja od 200 nmol RNK sredstva (npr., oko 4,4 x 10<16>kopija) po kg telesne mase ili manje od 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 nmol sredstva za utišavanje RNK po kg telesne mase. Jedinična doza, na primer, može biti data injekcijom (npr., intravenski ili intramuskularno, intratekalno ili direktno u mozak), inhalacionom dozom ili topikalnom primenom. Naročito poželjne doze su manje od 2, 1 ili 0,1 mg/kg telesne mase.
[0292] Isporuka sredstva za utišavanje RNK direktno u organ (npr., direktno u mozak) može biti pri dozi reda veličine od oko 0,00001 mg do oko 3 mg po organu, ili poželjno od oko 0,0001-0,001 mg po organu, oko 0,3-3,0 mg po organu, oko 0,1-3,0 mg po oku ili oko 0,3-3,0 mg po organu. Doza može biti količina koja je delotvorna da tretira ili sprečava neurološku bolest ili poremećaj, npr., Hantingtonovu bolest. Jedinična doza se može dati ređe nego jednom dnevno, npr., ređene nego svaka 2, 4, 8 ili 30 dana. Jedinična doza se ne mora dati učestalo (npr., učestalost koja nije regularna). Na primer, jedinična doza se može dati jednom. Delotvorna doza se može dati sa drugim tradicionalnim terapeutskim modalitetima.
[0293] Takođe je ovde opisano da ispitanik prima početnu dozu i jednu ili više doza za održavanje sredstva za utišavanje RNK. Doza za održavanje ili doze su generalno manje od početne doze, npr., duplo manje od početne doze. Režim održavanja može obuhvatati tretiranje ispitanika sa dozom ili dozama u opsegu od 0,01 µg do 1,4 mg/kg telesne mase na dan, npr., 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 ili 0,00001 mg po kg telesne mase na dan. Doze za održavanje se poželjno daju ne više nego jednom svakih 5, 10 ili 30 dana. U nastavku, režim tretiranja može trajati u toku vremenskog perioda koji je zavisiti od prirode naročite bolesti, njene ozbiljnosti i opšteg stanja pacijenta. Doza se može isporučiti ne više od jednom dnevno, npr., ne više od jednom svaka 24, 36, 48 ili više sati, npr., ne više nego jednom svakih 5 ili 8 dana. Nakon tretiranja, mogu se pratiti promene stanja pacijenta za ublažavanje simptoma stanja bolesti. Doza jedinjenja se može ili povećati pri događaju kada pacijent ne reaguje značajno na trenutne nivoe doze ili se doza može smanjiti ukoliko se primeti ublažavanje simptoma stanja bolesti, ukoliko se bolest ukloni ili neželjena dejstva primete.
[0294] Delotvorna doza se može davati kao jedna doza ili kao dve ili više doza, po želji ili
1
kako se smatra pogodnim pod specifičnim okolnostima. Ukoliko je želja da se olakšaju ponovljene ili učestale infuzije, implantacija uređaja za isporuku, npr., pumpe, polupermanentnog stenta (npr., intravenski, intraperitonealno, intracisternalno ili intrakapsularno) ili rezervoara se preporučuje. U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav obuhvata više vrsta sredstava za utišavanje RNK. U drugom otelotvorenju, vrste sredstva za utišavanje RNK imaju sekvence koje se ne preklapaju i nisu susedne sa drugim vrstama u pogledu prirodne sekvence za ciljanje. U drugom otelotvorenju, više vrsta sredstava za utišavanje RNK je specifično za različite prirodne ciljane gene. U drugom otelotvorenju, sredstvo za utišavanje RNK je specifično za alel. U drugom otelotvorenju, više vrsta sredstava za utišavanje RNK ciljaju dve ili više ciljanih sekvenci (npr., dve, tri, četiri, pet, šest ili više ciljanih sekvenci).
[0295] Nakon uspešnog tretiranja, može biti poželjno da pacijent prođe kroz terapiju održavanja kako bi se sprečilo ponovno javljanje stanja bolesti, gde se jedinjenje kao što je ovde opisano daje u dozama za održavanje u opsegu od 0,01 µg do 100 g po kg telesne mase (videti pat. SAD br.6,107,094).
[0296] Koncentracija sastava sredstva za utišavanje RNK je količina koja je dovoljna da bude efikasna pri tretiranju ili sprečavanju poremećaja ili da reguliše fiziološko stanje kod ljudi. Koncentracija ili količina sredstva za utišavanje RNK će zavisiti od parametara određenih za sredstvo i metode davanja, npr., nazalno, bukalno ili plućno. Na primer, nazalne formulacije teže da imaju zahtevaju mnogo manje koncentracije nekih sastojaka kako bi se izbegle iritacije ili opekotine nazalnih puteva. Ponekada je poželjno razblažiti oralnu formulaciju do 10-100 puta kako bi se pružila pogodna nazalna formulacija.
[0297] Određeni faktori mogu uticati na dozu koja je potrebna da se efikasno tretira ispitanik, uključujući ali bez ograničenja ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodno tretiranje, opšte zdravstveno stanje i/ili starost ispitanika i druge prisutne bolesti. Međutim, tretiranje ispitanika sa terapeutski delotvornom količinom sredstva za utišavanje RNK može obuhvatati jedno tretiranje ili poželjno, može obuhvatati niz tretiranja. Takođe će biti uvaženo da se delotvorna doza sredstva za utišavanje RNK za tretiranje može povećati ili smanjiti u toku trajanja naročitog tretiranja. Izmene u dozi mogu biti rezultat i postati očigledne iz rezultata dijagnostičkih analiza kao što je ovde opisano. Na primer, ispitanik se može pratiti nakon davanja sastava sredstva za utišavanje RNK. Na osnovu informacije o praćenju, dodatna količina sastava sredstva za utišavanje RNK se može dati.
1
[0298] Doziranje zavisi od ozbiljnosti i responzivnosti stanja bolesti koje se tretira gde trajanje tretiranja traje od nekoliko dana do nekoliko meseci, ili dok se ne postigne izlečenje ili ne postigne smanjenje stanja bolesti. Optimalni raspored za doziranje se može izračunati na osnovu merenja akumulacije leka u telu pacijenta. Stručne osobe mogu lako odrediti optimalne doze, metodologije za doziranje i stope ponavljanja. Optimalne doze mogu varirati u zavisnosti od relativne potentnosti pojedinačnih jedinjenja i generalno se mogu proceniti na osnovu EC50 za koje je pronađeno da su efikasne u in vitro i in vivo životinjskim modelima. Takođe je ovde opisano da životinjski modeli obuhvataju transgene životinje koje ispoljavaju ljudski gen, npr., gen koji proizvodi ciljanu RNK, npr., RNK koja se ispoljava u nervnoj ćeliji. Transgene životinje mogu biti deficitne za odgovarajuću endogenu RNK. U drugom otelotvorenju, sastav za testiranje obuhvata sredstvo za utišavanje RNK koje je komplementarno, bar u unutrašnjem regionu sa sekvencom koja je konzervisana između ciljane RNK u životinjskom modelu i ciljane RNK kod čoveka.
X. Farmaceutski sastavi i metode davanja
[0299] Pronalazak se odnosi na upotrebu iznad opisanih sredstava za profilaktičko i/ili terapeutsko tretiranje kao što je opisano iznad. Prema tome, modulatori (npr., RNKi sredstva) kao što je ovde opisano se mogu inkorporirati u farmaceutske sastave pogodne za davanje. Takvi sastavi obično sadrže molekul nukleinske kiseline, protein, antitelo, ili modulatorno jedinjenje i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ je namenjen da obuhvati bilo koji i sve rastvarače, disperzione sredine, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično, koja su u skladu sa farmaceutskim davanjem. Upotreba takvih sredina i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Osim u slučaju da je bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nespojivo sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba. Dopunska aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporirati u sastavima.
[0300] Farmaceutski sastav kao što je ovde opisano je formulisan da bude u skladu sa svojim namenjenim načinom davanja. Primeri načina davanja su parenteralno, npr., intravensko, intradermalno, subkutano, intraperitonealno, intramuskularno, oralno (npr., inhalaciono), transdermalno (topikalno) i transmukozno davanje. Farmaceutski sastav kao što je ovde opisano se može isporučiti u moždano-moždinsku tečnost (CSF) načinom davanja koji obuhvata, ali nije ograničen na, intrastriatalno (IS) davanje, intracerebroventrikularno (ICV)
11
davanje i intratekalno (IT) davanje (npr., pumpom, infuzijom ili slično). Rastvori ili suspenzije koje se koriste za parenteralno, intradermalno ili subkutano davanje mogu obuhvatati sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekciju, slani rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol i druge sintetičke rastvarače; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; sredstva za heliranje kao što je etilen-diaminotetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti sa kiselinama ili bazama, kao što su hidrohlorna kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralne preparacije se mogu zatvoriti u ampule, jednokratne špriceve ili epruvete za više doza napravljene od stakla ili plastike.
[0301] Farmaceutski sastavi pogodni za injektiranje obuhvataju sterilne vodene rastvore (rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensko, IS, ICV i/ili IT davanje, pogodni nosači obuhvataju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatno puferisani slani rastvor (PBS). U svim slučajevima, sastav mora biti sterilan i trebalo bi da bude tečnost do granice da je lako korišćenje u špricu moguće. Mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti zaštićen od kontaminiranja od strane mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperziona podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol i slično) i pogodne mešavine navedenog. Odgovarajuća protočnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što su lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama se može obezbediti različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogo slučajeva, može biti pogodno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, poli-alkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u sastavu. Prolongirana apsorpcija sastava za ubrizgavanje može biti dovedena uključivanjem u sastav sredstva koje produžava apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0302] Sterilni sastavi za injektiranje mogu biti pripremljeni uključivanjem aktivnog jedinjenja u željenoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih iznad, po potrebi, što je praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom. Uopšteno, disperzije su pripremljene uključivanjem aktivnog sastojka u sterilno sredstvo za prenošenje koje sadrži osnovnu disperzionu podlogu i zahteva druge sastojke pored onih navedenih iznad. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih rastvora za injektiranje, neke metode za pripremanje uključuju vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem kako bi se dobio prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni sastojak iz prethodnog sterilnofiltriranog rastvora navedenog.
[0303] Oralni sastavi generalno obuhvataju inertni rastvarač ili jestivi nosač. Takođe mogu biti zatvoreni u želatinske kapsule ili kompresovani u tablete. U svrhe oralnog terapeutskog davanja, aktivno jedinjenje se može inkorporirati sa ekscipijensima i koristiti u obliku tableta, pastila ili kapsula. Oralni sastavi se takođe mogu pripremiti upotrebom tečnog nosača za upotrebu kao sredstvo za ispiranje usta, gde se jedinjenje u tečnom nosaču nanosi oralno ili ispira i izbacuje ili guta. Farmaceutski kompatibilna sredstva i/ili adjuvansni materijali se mogu uključiti kao deo sastava. Tablete, pilule, kapsule, pastile i slično mogu sadržati bilo koji od sledećih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: veznik kao što je mikrokristalna celuloza, guma tragakant ili želatin; ekscipijens kao što je skrob ili laktoza, sredstvo za razlaganje kao što je alginska kiselina, Primogel ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat ili Steroti; glidant kao što je koloidni silikon dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili sredstvo za poboljšanje ukusa kao što je pepermint, metil salicilat ili aroma pomorandže.
[0304] Za inhalaciono davanje, jedinjenja se isporučuju u obliku aerosol spreja iz ambalaže pod pritiskom ili uređaja za raspršivanje koji sadrži pogodni propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid ili nebulizator.
[0305] Sistemsko davanje takođe može biti transmukozno ili transdermalno. Za transmukozno ili transdermalno davanje, koriste se pogodna sredstva za penetraciju prepreke u formulaciji. Takva sredstva za penetraciju su uopšteno poznata u struci i obuhvataju, na primer, za transmukozno davanje, deterdžente, žučne soli, i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozno davanje se može uspostaviti upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalno davanje, aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove ili kreme kao što je uopšteno poznato u struci.
[0306] Jedinjenja se takođe mogu pripremiti u obliku supozitorija (npr., sa konvencionalnim supozitornim bazama kao što je kakao maslac i drugi gliceridi) ili retenzioni klistiri za rektalnu isporuku.
[0307] Sredstva za utišavanje RNK se takođe mogu dati transfekciono ili infekciono metodama poznatim u struci, uključujući ali bez ograničenja metode opisane u McCaffrey i dr. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (hidrodinamička transfekcija); Xia i dr. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (virusno posredovana isporuka); ili Putnam (1996), Am. J.
Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, eratum kod Am. J. Health Syst. Pharm.53(3), 325 (1996).
[0308] Sredstva za utišavanje RNK se takođe mogu davati bilo kojom metodom pogodnom za davanje sredstava nukleinske kiseline, kao što je DNK vakcina. Ove metode mogu obuhvatati genske pištolje, bio injekcije i flastere za kožu kao i metode bez igala kao što je tehnologija mikročestične DNK vakcine obelodanjena u pat. SAD br.6,194,389, i transdermalna vakcinacija bez igle za sisare sa vakcinom u obliku praška obelodanjena u pat. SAD br.
6.168.587. Dodatno, intranazalna isporuka je moguća, kao što je opisano u, između ostalog, Hamajima i dr. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. Liposomes (npr., kao što je opisano u pat. SAD br.6,472,375) i mikrokapsulacija se takođe može koristiti.
Biorazgradive ciljajući mikročestični sistemi isporuke se takođe mogu koristiti (npr., kao što je opisano u pat. SAD br.6,471,996).
[0309] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje je pripremljeno sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje protiv brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i mikrokaspulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Metode za pripremanje takvih formulacija će biti očigledne stručnjacima u ovoj oblasti. Materijali se takođe mogu dobiti komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomne suspenzije (uključujući lipozome ciljane da inficiraju ćelije sa monoklonalnim antitelima do virusnih antigena) se takođe mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. One se mogu pripremiti u skladu sa metodama koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti, na primer, kao što je pisano u pat. SAD br.4.522.811.
[0310] Naročito je pogodno formulisati oralne ili parenteralne sastave u jediničnim oblicima
11
za doziranje radi jednostavnosti davanja i uniformnosti doziranja. Jedinični oblik za doziranje kako se ovde koristi se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne kao unitarne doze za ispitanika koji se tretira; gde svaka jedinica koja sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatog da proizvodi željeno terapeutsko dejstvo u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične oblike doziranja kao što je ovde opisano zavisi od i direktno je zavisna od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i naročitog terapeutskog dejstva koje se postiže i ograničenja inherentna u struci pravljenja takvog aktivnog jedinjenja za tretiranje pojedinaca.
[0311] Toksičnost i terapeutska delotvornost takvih jedinjenja se može odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50 (doza letalna kod 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski delotvorna kod 50% populacije. Odnos doze između toksičnih i terapeutskih dejstava je terapeutski indeks i može se ispoljiti kao odnos LD50/ED50. Jedinjenja koja pokazuju velike terapeutske indekse su poželjna. Iako se jedinjenja koja pokazuju toksična neželjena dejstva mogu koristiti, potrebno je obratiti pažnju na dizajn sistema za isporuku koji cilja takva jedinjenja na mesto pogođenog tkiva kako bi se minimizovalo potencijalno oštećenje neinficiranih ćelija i time smanjila neželjena dejstva.
[0312] Podaci dobijeni iz analiza ćelijske kulture i životinjskih ispitivanja se mogu koristiti pri formulisanju opsega doze za upotrebu kod ljudi. Doza takvih jedinjenja poželjno leži u opsegu cirkulišućih koncentracija koje obuhvataju ED50 sa malo ili bez toksičnosti. Doza može varirati unutar ovog opsega u zavisnosti od oblika doziranja koji se koristi i načina davanja. Za bilo koje jedinjenje korišćeno u metodi pronalaska, terapeutski delotvorna doza se može proceniti inicijalno na osnovu analize ćelijske kulture. Doza može biti formulisana u životinjskim modelima kako bi se postigao opseg koncentracije cirkulišuće plazme koji obuhvata EC50 (tj., koncentracija test jedinjenja koja postiže polu-maksimalni odgovor) kao što je određeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije se mogu koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivo u plazmi se može izmeriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0313] Farmaceutski sastav mogu biti u ambalaži, pakovanju ili raspršivaču zajedno sa optimalnim uputstvima za upotrebu.
[0314] Kao što je ovde definisano, terapeutski delotvorna količina sredstva za utišavanje RNK (tj., delotvorna doza) zavisi od izabranog sredstvom za utišavanje RNK. Na primer, ukoliko se izabere plazmid koji kodira shRNK, količine pojedinačne doze u opsegu od 1 µg do 1000 mg se mogu davati; 10, 30, 100 ili 1000 µg se mogu davati.1-5 g sastava se može davati. Sastav se može davati u jednom obliku jednom ili više puta na dan do jednom ili više puta nedeljino; uključujući jednom svakog drugog dana. Stručnjak će uvažiti da određeni faktori mogu uticati na dozu koja je potrebna da se efikasno tretira ispitanik, uključujući ali bez ograničenja ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodno tretiranje, opšte zdravstveno stanje i/ili starost ispitanika i druge prisutne bolesti. Međutim, tretiranje ispitanika sa terapeutski delotvornom količinom proteina, polipeptida ili antitela može obuhvatati jedno tretiranje ili poželjno, može obuhvatati niz tretiranja.
[0315] Molekuli nukleinske kiseline kao što je ovde opisano se mogu uvesti u ekspresione konstrukte, npr., virusne vektore, retrovirusne vektore, ekspresione kasete ili plazmidne virusne vektore, npr., upotrebom metoda poznatih u struci, uključujući ali bez ograničenja one opisane u Xia i dr., (2002), iznad. Ekspresioni konstrukti mogu biti isporučeni ispitaniku, na primer, inhalaciono, oralno, intravenskom injekcijom, lokalnim davanjem (videti pat. SAD br.
5,328,470) ili stereotaktičkom injekcijom (videti, npr., Chen i dr. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 91, 3054-3057). Farmaceutska preparacija za isporuku vektora može obuhvatati vektor u prihvatljivom rastvaraču ili može obuhvatati matricu za sporo oslobađanje u kojoj je obuhvaćeno sredstvo za isporuku. Alternativno, kada se ceo vektor za isporuku može proizvesti nepromenjen od rekombinantnih ćelija, npr., retrovirusnih vektora, farmaceutska preparacija može obuhvatati jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.
[0316] Molekuli nukleinske kiseline kao što je ovde opisano mogu obuhvatati kratke RNK petlje ukosnice (shRNK) i ekspresione konstrukte modifikovane da ispoljavaju shRNK.
Transkripcija shRNK se započinje na promoteru polimeraze III (pol III) i smatra se da se završava na poziciji 24-5 timin mestu završetka transkripcije. Nakon ispoljavanja, shRNK se smatra da se savija u strukturu nalik petlji sa 3’ UU visećim završecima; posle toga, krajevi ovih shRNK se obrađuju, pretvarajući shRNK u siRNK-nalik molekule od oko 21-23 nukleotida. Brummelkamp i dr. (2002), Science, 296, 550-553; Lee i dr, (2002). iznad;
Miyagishi i Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison i dr. (2002), iznad; Paul (2002), iznad; Sui (2002) iznad; Yu i dr. (2002), iznad.
11
[0317] Ekspresioni konstrukti pogodni za upotrebu u odgovarajućem ekspresionom sistemu i obuhvataju ali nisu ograničeni na, retrovirusne vektore, kasete linearnog ispoljavanja, plazmide i virusne ili vektore dobijene od virusa, kao što je poznato u struci. Takvi ekspresioni konstrukti mogu obuhvatati jedan ili više inducibilnih promotera, RNK Pol III promoterske sisteme kao što su U6 snRNK promoteri ili HI RNK polimeraza III promoteri ili drugi promoteri poznati u struci. Konstrukti mogu obuhvatati jedan ili više lanaca siRNK. Ekspresioni konstrukti koji ispoljavaju oba lanca mogu takođe obuhvatati petlje koje povezuju oba lanca ili svaki lanac može biti odvojeno transkribovan od odvojenog promotera u istom konstruktu. Svaki lanac može biti transkribovan od odvojenog ekspresionog konstrukta, Tuschl (2002), iznad.
[0318] Sastav koji obuhvata sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može isporučiti u nervni sistem ispitanika na nekoliko načina. Primerni načini obuhvataju intratekalnu, parenhimalnu (npr., u mozak), nazalnu i okularnu isporuku. Sastav se takođe može isporučiti sistemski, npr., intravenskom, subkutanom ili intramuskularnom injekcijom, što je naročito korisno za isporuku sredstava za utišavanje RNK u perfierne neurone. Poželjan način davanja je direktno u mozak, npr., u ventrikule ili hipotalamus mozga, ili u lateralne ili dorzalne regione mozga. Sredstva za utišavanje RNK za isporuku nervnih ćelija se mogu inkorporirati u farmaceutske sastave pogodne za davanje.
[0319] Na primer, sastavi mogu obuhvatati jednu ili više vrsta sredstava za utišavanje RNK i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski sastavi kao što je ovde opisano se mogu davati na više načina u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko tretiranje i od regiona koji se tretira. Davanje može biti topikalno (uključujući oftalmološko, intranazalno, transdermalno), oralno ili parenteralno. Parenteralno davanje obuhvata intravensko kapanje, subkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju, intratekalno ili intraventrikularno (npr., intracerebroventrikularno) davanje. Sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može isporučiti preko krv-mozak barijere (BBB) koja vodi više pogodnih sastava i metoda koje su ovde opisane.
[0320] Način isporuke može biti zavistan od poremećaja pacijenta. Na primer, ispitanik dijagnostikovan sa Hantingtonovom bolesti može primiti anti-htt sredstvo za utišavanje RNK direktno u mozak (npr., u bledo jedro ili u korpus striatum bazalne ganglije i blizu srednjih bodljikavih neurona korpus striatuma). Pored sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde
11
opisano, pacijent može dobiti drugu terapiju, npr., palijativnu terapiju i/ili terapiju specifičnu za bolest. Sekundarna terapija može biti, na primer, simptomatska (npr., za ublažavanje simptoma), neuroprotekvina (npr., za usporavanje ili zaustavljanje progresa bolesti) ili restorativna (npr., za vraćanje toka bolesti). Za tretiranje Hantingtonove bolesti, na primer, simptomatske terapije mogu obuhvatati lekove haloperidol, karbamazepin ili valproat. Druge terapije mogu obuhvatati psihoterapiju, fizioterapiju, terapiju govora, komunikativna i memorijska pomagala, usluge socijalne podrške i savetovanje o ishrani.
[0321] Sredstvo za utišavanje RNK se može isporučiti u nervne ćelije mozga. Metode isporuke koje ne zahtevaju prolazak sastava kroz krv-mozak barijeru se mogu koristiti. Na primer, farmaceutski sastav koji sadrži sredstvo za utišavanje RNK se može isporučiti pacijentu injekcijom direktno u oblast koja sadrži ćelije pogođene bolešću. Na primer, farmaceutski sastav se može isporučiti injekcijom direktno u mozak. Injekcija može biti stereotaktička injekcija u naročiti region mozga (npr., supstancija nigra, korteks, hipokampus, striatum ili bledo jedro). Sredstvo za utišavanje RNK se može isporučiti u više regiona centralnog nervnog sistema (npr., u više regiona mozga i/ili u kičmenu moždinu). Sredstvo za utišavanje RNK se može isporučiti u difuzne regione mozga (npr., difuzna isporuka u korteks mozga).
[0322] Sredstvo za utišavanje RNK se može isporučiti pomoću kanile ili drugog uređaja za isporuku koji ima jedan kraj implantiran u tkivo, npr., mozak, npr., supstanciju nigru, korteks, hipokampus, striatum ili bledo jedro mozga. Kanila se može povezati za rezervoar sredstva za utišavanje RNK. Tok ili isporuka se može posredovati pumpom, npr., osmotskom pumpom ili minipumpom, kao što je Alzet pumpa (Durect, Cupertino, CA). Pumpa i rezervoar se mogu implantirati u region udaljen od tkiva, npr., abdomen i isporuka se vrši od strane provodnika iz pumpe ili rezervoara do mesta oslobađanja. Uređaji za isporuku u mozak su opisani, na primer, u pat. SAD br.6,093,180 i 5,814,014.
[0323] Sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može dalje modifikovati tako da bude u stanju da prođe kroz krv-mozak barijeru. Na primer, sredstvo za utišavanje RNK se može konjugovati do molekula koji omogućava sredstvu da prođe kroz barijeru. Takva modifikovana sredstva za utišavanje RNK se mogu dati bilo kojom poželjnom metodom, kao što je intraventrikularna ili intramuskularna injekcija ili pulmonarnom isporukom, na primer.
11
[0324] Egzozomi se mogu koristiti za isporuku sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano. Egzozomi mogu preći BBB i isporučiti siRNK, antismisao oligonukleotide, hemoterapeutska sredstva i proteine specifične za neurone nakon sistemske injekcije (Videti, Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol.2011 Apr;29(4):341-5. doi: 10.1038/nbt.1807; El-Andaloussi S, Lee Y, Lakhal-Littleton S, Li J, Seow Y, Gardiner C, Alvarez-Erviti L, Sargent IL, Wood MJ.(2011). Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc.2012 Dec;7(12):2112-26. doi:
10.1038/nprot.2012.131; EL Andaloussi S, Mäger I, Breakefield XO, Wood MJ. (2013). Vanćelijski vezikule: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov.
2013 May;12(5):347-57. doi: 10.1038/nrd3978; El Andaloussi S, Lakhal S, Mäger I, Wood MJ. (2013). Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Mar;65(3):391-7. doi: 10.1016/j.addr.2012.08.008).
[0325] Jedan ili više lipofilnih molekula se može koristiti za isporuku sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano kroz BBB (Alvarez-Ervit (2011)). Sredstvo za utišavanje RNK bi zatim bilo aktivirano, npr., degradacijom enzima sa lipofilnom maskom kako bi se lek oslobodio u svom aktivnom obliku.
[0326] Jedno ili više jedinjenja za prolazak posredovanih receptorom se može koristiti za povećanje permeabilnosti BBB kako bi se omogućila isporuka sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano. Ovi lekovi povećavaju permeabilnost BBB privremeno povećavanjem osmotskog pritiska u krvi što oslabljuje uske spojeve između endotelijalnih ćelija ((El-Andaloussi (2012)). Oslabljivanjem uskih spojeva normalna intravenska injekcija sredstva za utišavanje RNK se može izvršiti.
[0327] Nanočestično bazirani sistemi isporuke se mogu koristiti za isporuku sredstva za utišavanje RNK kao što je ovde opisano kroz BBB. Kako se ovde koristi, „nanočestice“ se odnose na polimerne nanočestice koje su obično čvrsti, biorazgradivi, koloidni sistemi koji su široko istraživani kao nosač za lek ili gen (S. P. Egusquiaguirre, M. Igartua, R. M. Hernandez, i J. L. Pedraz, „Nanoparticle delivery systems for cancer therapy: advances in clinical and preclinical research,“ Clinical and Translational Oncology, tom 14, br.2, str.83-93, 2012). Polimerne nanočestice su klasifikovane u dve glavne kategorije, prirodne polimere i veštačke polimere. Prirodni polimeri za siRNK isporuku obuhvataju ali nisu ograničeni na
11
ciklodekstrin, hitozan i atelokolaken (Y. Wang, Z. Li, Y. Han, L. H. Liang, i A. Ji, „Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo,“ Current Drug Metabolism, tom 11, br.2, str.182-196, 2010). Sintetički polimeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na polietilenimin (PEI), poli(dl-laktid-ko-glikolid) (PLGA) i dendrimere koji su intenzivno istraživani (X. Yuan, S. Naguib, i Z. Wu, „Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles,“ Expert Opinion on Drug Delivery, tom 8, br.4, str.521-536, 2011). Za razmatranje nanočestica i druge pogodne sisteme za isporuku, Videti Jong-Min Lee, Tae-Jong Yoon, i Young-Seok Cho, „Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy,“ BioMed Research International, tom 2013, Članak ID 782041, 10 strana, 2013. doi:10.1155/2013/782041.
[0328] Sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može davati okularno, kao što je za tretiranje bubrežnog poremećaja, npr., retinopatije. Na primer, farmaceutski sastavi se mogu primeniti na površini oka ili bliskog tkiva, npr., unutar kapka. Mogu se primeniti topikalno, npr., sprejom, kapima ili kao sredstvo za ispiranje očiju ili mast. Masti ili tečnosti za kapi se mogu isporučiti sistemima za okularnu isporuku koji su u struci poznati kao aplikatori ili kapi za oči. Takvi sastavi mogu obuhvatati mukomimetike kao što su hijaluronska kiselina, hondroitin sulfat, hidroksipropil metilceluloza ili poli(vinil alkohol), konzervansi kao što je sorbinska kiselina, EDTA ili benzilhronijum hlorid i uobičajene količine razblaživača i/ili nosača. Farmaceutski sastav se takođe može davati u unutrašnjost oka i može se uvesti iglom ili uređajem za isporuku koji ga može uvesti u izabrani region ili strukturu. Sastav koji sadrži sredstvo za utišavanje RNK se takođe može primeniti okularnim flasterom.
[0329] Uopšteno, sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može davati bilo kojom pogodnom metodom. Kao što je ovde opisano, topikalna isporuka se može odnositi na direktnu primenu sredstva za utišavanje RNK na bilo koju površinu na telu, uključujući oko, mukoznu membranu, površine telesnih šupljina ili bilo koju unutrašnju površinu. Formulacije za topikalno davanje mogu obuhvatati transdermalne flastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, sprejeve i tečnosti. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, zgušnjivači i slično mogu biti neophodni ili poželjni. Topikalno davanje se takođe može koristiti kao sredstvo selektivne isporuke sredstva za utišavanje RNK u epidermis ili dermis ispitanika, ili na njegov specifični sloj ili tkivo ispod njega.
11
[0330] Sastavi za intratekalno ili intraventrikularno (npr., intracerebroventrikularno) davanje mogu obuhvatati sterilne vodene rastvore koji takođe mogu sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Sastavi za intratekalno ili intraventrikularno davanje poželjno ne sadrži transfekcioni reagens ili dodatne lipofilne grupe pored, na primer, lipofilne grupe povezane za sredstvo za utišavanje RNK.
[0331] Formulacije za parenteralno davanje mogu obuhvatati sterilne vodene rastvore koji takođe mogu sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Intraventrikularna injekcija može biti pomognuta intraventrikularnim kateterom, na primer, povezanim za rezervoar. Za intravensku upotrebu, ukupna koncentracija rastvorene supstance bi trebalo da se kontroliše kako bi se preparacija pokazala izotoničnom.
[0332] Sredstvo za utišavanje RNK kao što je ovde opisano se može davati ispitaniku pulmonarnom isporukom. Sastavi za pulmonarnu isporuku se mogu isporučiti inhalacijom ili disperzijom tako da sastav u disperziji može doći do pluća gde se može lako apsorbovati kroz alveolarni region direktno u krvotok. Pulmonarna isporuka može biti efikasna za sistemsku isporuku i za lokalizovanu isporuku za tretiranje bolesti pluća. Sredstvo za utišavanje RNK dato pulmonarno se može modifikovati tako da bude u stanju da prođe kroz krv-mozak barijeru.
[0333] Pulmonarna isporuka se može postići različitim pristupima, uključujući upotrebu raspršenih, aerosolnih, micelarnih i suvih praškastih formulacija. Isporuka se može postići tečnim nebulizatorima, inhalatorima baziranim na aerosolima, i uređajima za raspršivanje suvog praška. Uređaji sa merenjem doze su poželjni. Jedna od koristi upotrebe atomizatora ili inhalatora je da se potencijal kontaminacije minimizuje zato što su uređaji samostalni. Uređaji za raspršivanje suvog praška, na primer, isporučuju lek koji se može lako formulisati kao suvi prašak. Sredstvo za utišavanje RNK se može stabilno čuvati kao liofilizovani ili sprejom osušeni prašak samostalno ili u kombinaciji sa pogodnim praškastim nosačem. Isporuka sastava za inhalaciju se može posredovati elementom za merenje trajanja doziranja koji može merač, brojač doza, uređaj za merenje vremena ili indikator vremena koji je inkorporiran u uređaj koji omogućava praćenje doza, praćenje, i/ili uređaj za davanje doze pacijentu za vreme davanja aerosolnog medikamenta.
[0334] Tipovi farmaceutskih ekscipijenasa koji su od koristi kao nosači obuhvataju
12
stabilizatore kao što je ljudski serum albumin (HSA), sredstva za zapreminu kao što su ugljeni hidrati, amino kiseline i polipeptidi; sredstva za podešavanje pH ili puferi; soli kao što je natrijum hlorid; i slično. Ovi nosači mogu biti u kristalnom ili amorfnom obliku ili mogu biti smeša dva.
[0335] Sredstva za zapreminu koja su naročito vredna obuhvataju kompatibilne ugljene hidrate, polipeptide, amino kiseline ili njihove kombinacije. Pogodni ugljeni hidrati obuhvataju monosaharide kao što su galaktoza, D-manoza, sorboza i slično; disaharide, kao što je laktoza, trehaloza i slično; ciklodekstrine, kao što su 2-hidroksipropil-.beta. ciklodekstrin; i polisaharide, kao što su rafinoza, maltodekstrini, dekstrani i slično; alditole, kao što su manitol, ksilitol, i slično. Poželjna grupa ugljenih hidrata obuhvata laktozu, trehalozu, rafinozu, maltodekstrine i manitol. Pogodni polipeptidi obuhvataju aspartam.
Amino kiseline obuhvataju alanin i glicin, gde je glicin poželjan.
[0336] Pogodna sredstva za podešavanje pH ili puferi obuhvataju organske soli dobijene od organskih kiselina i baza, kao što je natrijum citrat, natrijum askorbat i slično; poželjna je natrijum citrat.
[0337] Sredstvo za utišavanje RNK se može dati oralnom ili nazalnom isporukom. Na primer, lekovi dati kroz ove membrane imaju brzo nastupajuće delovanje, pružaju terapeutske nivoe u plazmi, izbegavaju prvi efekat prolaza hepatičkog metabolizma, i izbegavaju izlaganje leka štetnom gastrointestinalnom (GI) okruženju. dodatne prednosti obuhvataju lako pristupanje membrane tako da se lek može primeniti, lokalizovati i lako ukloniti. Sredstvo za utišavanje RNK, dato oralnom ili nazalnom isporukom se može modifikovati tako da bude u stanju da prođe kroz krv-mozak barijeru.
[0338] Jedinične doze ili izmerene doze sastava koji obuhvata sredstva za utišavanje RNK se mogu isporučiti implantiranim uređajem. Uređaj može obuhvatati senzor koji prati parametar u ispitaniku. na primer, uređaj može obuhvatati pumpu, kao što je osmotska pumpa i, opciono, povezanu elektroniku.
[0339] Sredstvo za utišavanje RNK se može obuhvatiti u virusnom prirodnom kapsidu ili u hemijski ili enzimski obrađenom veštačkom kapsidu ili strukturi dobijenoj iz njega.
XI. Kompleti
[0340] Takođe su ovde opisani kompleti koji obuhvataju pogodnu ambalažu koja sadrži farmaceutsku formulaciju sredstva za utišavanje RNK, npr., dvolančano sredstvo za utišavanje RNK, ili sRNK sredstvo (npr., prekursor, npr., veće sredstvom za utišavanje RNK koje se može procesirati u sRNK sredstvo, ili DNK koja kodira sredstvo za utišavanje RNK, npr., dvolančano sredstvo za utišavanje RNK, ili sRNK sredstvo ili prekursor navedenog). Pojedinačne komponente farmaceutske formulacije se mogu dati u jednoj ambalaži.
Alternativno, može biti poželjno pružiti komponente farmaceutske formulacije odvojeno u dve ili više ambalaža, npr., jedna ambalaža za pripremanje sredstva za utišavanje RNK i bar jedna druga za jedinjenje nosača. Komplet može biti zapakovan u više različitih konfiguracija kao što je jedna ili više ambalaža u jednoj kutiji. Različite komponente se mogu kombinovati, npr., u skladu sa uputstvima datim u kompletu. Komponente se mogu kombinovati u skladu sa ovde opisanim metodama, npr., za pripremanje i davanje farmaceutskog sastava. Komplet može takođe obuhvatati uređaj za isporuku.
[0341] Pošto je sada detaljno opisan predmetni pronalazak, isto će biti jasnije shvaćeno na osnovu sledećih primera, koji su ovde obuhvaćeni samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni da ograniče pronalazak.
PRIMERI
Primer 1. Redukcija Hantingtina i kod primarnih neurona i u mišijem mozgu sa neformulisanom, stabilizovanom, hidrofobnom siRNK
[0342] Upotreba hidrofobno modifikovanih ASO-siRNK hibrida, koji imaju potencijal da ponude i bolju efikasnost i distribuciju in vivo i obaranje kod primarnih neurona in vitro, je istražena. Hantingtin gen je korišćen kao cilj za obaranje iRNK. Hantingtonova bolest je monogena (Mangiarini, L. i dr. Exon 1 of the HTT gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 87, 493-506 (1996)) sa više ćelijskih mehanizama dovodi do patologije bolesti (Zuccato, C., Valenza, M. & Cattaneo, E. Molecular Mechanisms and Potential Therapeutical Targets in Huntington's Disease. Physiological Reviews 90, 905-981 (2010)) što je čini odličnim kandidatom za moguća buduća oligonukleotidna terapeutska sredstva.
[0343] Razvijen je panel hidrofobno modifikovanih siRNK koje ciljaju Hantingtin gen.
Efikasnost i potentnost su primećeni i kod primarnih neurona in vitro, i in vivo u mozgu miša nakon jedne male doze injekcije bez formulacije za isporuku. Ova jedinjenja kombinuju više različitih hemijskih i strukturnih modifikacija koje su pronađene i kod ranijih modela siRNK i hsiRNK, kao i kod ASO. Ova svojstva, koja obuhvataju stabilizovanje baznih modifikacija, konjugovanje holesterola i potpuno fosforotioatisani jednolančani rep, čine ove hsiRNK odličnim alatima za ispitivanje funkcije gena kod teško ciljanih primarnih ćelija i organa koji se mogu adaptirati za upotrebu kod više različitih biološki relevantnih sistema.
1.1 hsiRNK - hidrofobno modifikovani siRNK/antismisao hibridi su efikasno internalizovani od strane primarnih neurona
[0344] hsiRNK su asimetrična jedinjenja, sa kratkim dupleks regionom (15 baznih parova) i jednolančanim potpuno fosforotioatisanim repom. Svi pirimidini u ovim jedinjenjima su 2'-Fluoro i 2'-O-Metil modifikovani (pružajući stabilizaciju), i 3' kraj prolaznog lanca je konjugovan za TEG-Holesterol (Slika 1A, Slika 8) 13. Holesterol konjugat je omogućio brzo povezivanje membrane, dok je jednolančani fosforotioatisani rep bio neophodan za ćelijsku internalizaciju mehanizmom koji je sličan onom koji je korišćen od strane konvencionalnih antismisao oligonukleotida. Dodavanje Cy3-označenih hsiRNK u primarne kortikalne neurone je za rezultat dalo među (u roku od nekoliko minuta) ćelijsku asocijaciju (Slika 1B). Zanimljivo, apsorpcija je prvo primećena preferencijalno kod dendrita, što je praćeno relokalizacijom u ćelijsko telo (Slika 9). Apsorpcija je bila uniformna kod svih ćelija u sudu, što potvrđuje efikasnu internalizaciju.
1.2 Identifikacija hsiRNK koje ciljaju hantingtin
[0345] Panel od 94 hsiRNK jedinjenja (Slika 8) za ciljanje iRNK hantingtina je dizajniran i sintetisan. Ove sekvence su obuhvatale gen i izabrane su da budu u skladu sa standardnim siRNK parametrima za dizajn (Birmingham, A. i dr. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nat Protoc 2, 2068-2078 (2007)) uključujući procenjivanje sadržaja GC, specifičnosti i niske učestalosti komplementa semena (Anderson, E. M. i dr. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. RNA 14, 853-861 (2008)), eliminaciju sekvenci koje sadrže miRNK semena, i ispitivanje termodinamičke greške (Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S. D. Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand Bias. Cell 115, 209-216 (2003); Schwarz, D. S. i dr. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199-208 (2003)). Više od 50% baza je hemijski modifikovano, kako bi se pružila in vivo stabilnost i minimizovao imuni odgovor (Judge, A., Bola, G., Lee, A. & MacLachlan, I. Design of Noninflammatory
12
Synthetic siRNA Mediating Potent Gene Silencing in Vivo. Molecular Therapy 13, 494-505 (2006)). Modifikacije su nametnule dodatna ograničenja na prostor sekvence, smanjujući broj udara. Uticaj na ispoljavanje iRNK Hantingtina je izmeren 72 sata nakon ispoljavanje 1,5 µM hsiRNK (pasivna apsorpcija, bez formulacije) u HeLa ćelijama sa QUANTIGENE analizom (Slika 2), gde je 7% sekvenci pokazalo utišavanje veće od 70%. Funkcionalna mesta za ciljanje su raširena duž gena sa izuzetkom na distalnom delu 3'UTR, što je kasnije objašnjeno preferencijalnim ispoljavanjem kraće htt izoforme u HeLa ćelijama (Li, S. H. i dr.
Huntington's disease gene (IT15) is widely expressed in human and rat tissues. NEURON 11, 985-993 (1993)). IC50 vrednosti su identifikovane kod šesnaest aktivnih sekvenci, izabranih na osnovu primarne aktivnosti pri skriningu i na osnovu konzervacije unakrsnih vrsta (Slika 10). IC50 vrednosti su bile u opsegu od 90 do 766 nM kod pasivne apsorpcije (bez formulacije)i od 4 do 91 pM kod lipidno-posredovane apsorpcije (Slika 8). Potpuno hemijskioptimizovana aktivna jedinjenja su lako identifikovana, što ukazuje da bi mnogo manja biblioteka trebalo da bude dovoljna kod budućeg skrininga za druge gene, iako broj udara verovatno zavisi od cilja do cilja. hsiRNK ciljajuća pozicija 10150 (HTT10150 (tj., 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1))) je korišćena za dalje ispitivanje. Kako bi se osiguralo da hemijski skelet hsiRNK nije negativno uticao na efikasnost i potentnost HTT10150, modifikovane i nemodifikovane verzije jedinjenja su testirane i kod analiza pasivne i lipidno-posredovane apsorpcije (Slika 3). Kao što je očekivano, samo su modifikovane sekvence bile uspešne pri ćelijskoj isporuci i Htt utišavanju pasivnom apsorpcijom (IC50 ) 82,2 nM) dok su i modifikovana i nemodifikovana jedinjenja pokazala slične vrednosti IC50 kod lipidno posredovane isporuke (4 pM i 13 pM respektivno) što predlaže da modifikacija skeleta hsiRNK nije uticala na dodavanje RNK indukovanog kompleksa za utišavanje (RISC).
1.3 Potentno i utišavanje specifičnog gena sa neformulisanim hsiRNK kod primarnih neurona.
[0346] HTT10150 je dalje testirano za utišavanje iRNK kod primarnih neurona izolovanih iz FVBN miševa. Efikasnost je primećena i 72 sata i jednu nedelju nakon dodavanja jednostavnog neformulisanog jedinjenja u kortikalne neurone (Slika 4A) gde je maksimalno utišavanje (70%) primećeno pri koncentraciji od 1,25 µM. HTT10150 je takođe pokazao slično utišavanje kod primarnih striatalnih neurona (Slika 4B). Nivoi proteina su izmereni nakon jedne nedelje Western blot analizom (Slika 14), što je potvrdilo iRNK podatke sa 85% smanjenjem proteina nakon tretiranja sa 1,25 µM jedinjenja (Slika 4C). Geni održavanja domaćinstva (PPIB, GAPDH) i opšta ćelijska održivost, izmerena ALAMARBLUE analizom (Slike 11B i 14) nisu pogođeni pri ovim koncentracijama. U drugim eksperimentima, blagi uticaj na ćelijsku održivost je primećen pri 3 µM.
[0347] Kako bi se procenilo trajanje dejstva nakon jednog HTT10150 tretiranja, utišavanje iz izmereno u intervalima od jedne nedelje, dve nedelje i tri nedelje (Slika 4D). Polu raspad dodatog RISC kompleksa je trajao nedeljama (Song, E. i dr. Sustained Small Interfering RNA-Mediated Human Immunodeficiency Virus Type 1 Inhibition in Primary Macrophages. Journal of Virology 77, 7174-7181 (2003)), i utišavanje je očekivano da bude dugotrajno kod ćelija koje se ne dele. Zaista, jedno tretiranje sa hsiRNK je bilo dovoljno da indukuje utišavanje htt pri svim testiranim vremenima. Tri nedelje je bilo najduže koliko su primarni neuroni mogli da se održavaju u kulturi. Drugi sistemi će se koristiti za dugoročnije eksperimente.
[0348] Za Demonstriranje opšte primenljivosti hsiRNK kao alat za utišavanje nervnih gena i za potvrđivanje ovog hemijskog skeleta kao validnog za neuronsku isporuku, izvršeni su slični eksperimenti sa nekoliko drugih hsiRNK koje ciljaju HTT i sa jednom koja cilja gen koji održava domaćinstvo PPIB (Ciklofilin B) (Slike 11A i 13). Utišavanje čak i do 70 i 90% je postignuto sa HTT i PPIB, respektivno.
[0349] Ukratko, ovi podaci pokazuju da je hidrofobno modifikovana siRNK jednostavan i direktan pristup za utišavanje gena kod primarnih neurona i može se adaptirati za više genskih ciljeva.
1.4 Distribucija hsiRNK in vivo u mozgu miša nakon jedne injekcije
[0350] HsiRNK su efikasno internalizovane različitim tipovima neurona in vitro. Izabrane hsiRNK, HTT10150 je dalje procenjena za svoj potencijal za utišavanje ispoljavanja gena u mozgu in vivo. Kako bi se odredio distribucioni profil HTT10150 nakon in vivo davanja, 12,5 µg Cy3 označene hsiRNK (videti Sliku 8 za sekvencu) je injektirano intrastriatalno i, nakon 24 sata, izvršena je perfuzija mozga, seciran je i distribucija oligonukleotida je vizualizovana fluorescentnom mikroskopijom (Leica DM5500 - DFC365FX). Veštački CSF injektirani uzorci procesirani konkurentno su korišćeni za podešavanje mikroskopskog pravljenja slika kako bi se kontrolisala epifluorescencija tkiva u pozadini.
12
[0351] Većina jedinjenja je pokazalo strmi gradijent difuzije van mesta injektiranja, dok je većina ipsilateralnog striatuma pokrivena. (Slika 5A, 5B). Zanimljivo, hsiRNK su detektovane sa strane mozga koja nije injektirana (kontralateralna) (i korteks i striatum), iako su relativne koncentracije bile veoma manje. Slike pri većem uveličanju su pokazale značajnu vezu između hsiRNK i vlaknastih traka, najverovatnije zbog prisustva hidrofobne modifikacije. Ovaj aspekt hsiRNK je može činiti korisnom za označavanje reagensa za vizualizovanje arhitekture signaliziranja u mozgu (Slika 5C, 5D). Pored vlaknastih traka i neuritskog označavanja, hsiRNK bi se mogla detektovati kao tačkasta oznaka u perinuklearnom prostoru različitih tipova ćelija, uključujući neurone, kao što je evidentno iz ko-lokalizacije sa NeuN (neuronski marker) označenim ćelijama (Slika 5E) samo 24 sata nakon injekcije.
[0352] Efekat vitamina D na hsiRNK distribuciju je prikazan na Slikama 79 i 80.
1.5 hsiRNK efikasnost in vivo u mozgu miša nakon jedne injekcije
[0353] Za određivanje HTT10150 efikasnosti in vivo, FVBN miševi divljeg tipa su dozirani intrastriatalno sa jednom dozom od između 3 i 25 µg (0,1-0,9 mg/kg) jedinjenja i utišavanje iRNK je ispitivano i na ispilateralnom i kontralateralnom mestu. Osam životinja je dozirano po grupi za tretiranje i tri individualne punkcije su uzete sa svake strane striatuma za kvantifikaciju iRNK i proteina. Nivo ispoljavanja hantingtina je izmeren QUANTIGENE analizom i normalizovan do gena za održavanje domaćinstva (detaljni u Onlajn metodama).
[0354] Statistička analiza je izvršena jednostranim ANOVA poređenjem u odnosu na CSF ili PBS kontrolom sa Bonferroni korekcijama za ponavljanja izmerena upotrebom GraphPad Prism (Onlajn metode za detalje). Sve grupe su izazvale utišavanje koje je bilo značajno protiv CSF, PBS i za kontrolno tretirane životinje koje nisu za ciljanje. Neobrađeni podaci od 24 individualne punkcije po grupi za tretiranje (8 životinja, 3 punkcije po životinji) se mogu videti na Slici 15. Na mestu davanja (ipsilateralna strana) utišavanje zavisno od doze koje dostiže statistički značaj je primećeno pri svim koncentracijama. Tretiranje sa 25 µg je izazvalo utišavanje od 77% (p>0,0001) a tretiranje sa 12,5 µg je ponovljeno kod dve grupe životinja na različite dane i pokazalo je statistički značajno utišavanje od 66% i 42% (Slika 6).
[0355] Dok su istraživanja inicijalne distribucije pokazala strmi gradijent difuzije od mesta injektiranja sa minimalnom količinom jedinjenja koja migrira ka kontralateralnoj strani,
12
tretiranje sa većim dozama od 25 µg i 12,5 µg je za rezultat dalo statistički značajnije utišavanje (p<0,0001) sa strane koja nije injektirana. Međutim, nivo utišavanja je bio značajno manji (samo 36% za grupu od 25 µg) nego sa tretirane strane mozga.
[0356] Ukratko, ovi podaci pokazuju da je jedna intrastriatalna injekcija hsiRNK dovoljna da izazove potentno utišavanje gena oko mesta davanja. Ovaj efekat se mogao reprodukovati i na drugim grupama za tretiranje i nezavisnim eksperimentima.
1.6 Održivost neurona nakon jedne hsiRNK injekcije u mozak miša
[0357] Modifikacija holesterola nemodifikovane, gole siRNK je prethodno korišćena za poboljšanje distribucije siRNK u mozgu gde je toksičnost pri velikim dozama identifikovana kao potencijalno ograničenje. Za procenjivanje stepena dejstava povezanih sa nespecifičnom hemijom na mozak, istraživano je DARPP32 ispoljavanje, uspostavljeni marker za ispoljavanje dopamin receptora na srednje bodljikave neurone u striatumu i reprezentativan je za održivost neurona. Dodatno, potencijalna indukcija imunog odgovora je izvršena procenjivanjem stepena aktivacije mikroglija nakon hsiRNK injekcije.
[0358] Nije primećen značajni uticaj na ispoljavanje DARPP32 za doze do 12,5 µg što ukazuje na upornu održivost neurona (Slika 7A, 7B i 16). Slično, minimalna aktivacija mikroglija je vizualizovana pri dozi od 12,5 µg (Slika 7C, 7D) što je indikativno za ograničeni imuni odgovor u prisustvu modifikovane hsiRNK. Doza od 25 µg nije izazvala redukciju DARPP32 samo oko mesta injektiranja što je indikativno za toksičnost i uspostavljanje maksimalnih nivoa doza za ovaj hemijski skelet nakon ukazanog načina davanja. Jedno davanje hsiRNK od 10-12,5 µg je efikasno utišalo iRNK HTT u tri, dobro snabdevena, nezavisna ispitivanja sa robusnim utišavanjem od 62, 42 i 52% bez toksičnosti. Ovi podaci su indikativni da se ova tehnologija može široko koristiti za funkcionalna ispitivanja drugih neurološki značajnih ciljeva.
1.7 Dalja karakterizacija kod neurona
[0359] Zadržano utišavanje je postignuto za 21 dan kod terminalno-diferenciranih neurona (Slika 24). Plato za utišavanje je primećen kod RNKi (citoplazmatska) ali ne i kod RNazaH (prevashodno nuklearna) jedinjenja (Slika 25). Primećeni plato je bio specifičan za htt gen. Približno 60% iRNK htt se nalazi u jezgrima (Slika 26).
12
[0360] Kompleti sondi su validirani u neuronima (Slika 27). Većina detektovanog signala je bila specifična za iRNK htt. Veliki udeo žutih (ko-lokalizovano obeležavanje) površina je primećen. Bez namere za ograničavanjem o naučnu teoriju, visok stepen crvenog signala može biti povezan sa nejednakim koncentracijama dva kompleta sondi.
[0361] Dodatni kompleti sondi su validirani za intron 60-61 u neuronima (Slika 28). Sonde specifične za intron su pokazale jednu do dve tačke u jezgrima specifičnim za transkripciona mesta. Sonde specifične za egzon su pokazale visok stepen preklapanja.
[0362] Htt iRNK nuklearna lokalizacija je specifična za neurona a ne za fibroblaste (Slika 29). HsiRNK<HTT>tretiranje kortikalnih neurona je poželjno eliminisalo citoplazmatsku htt iRNK (Slike 30 i 31).
[0363] Skoro kompletno utišavanje HTT proteina je primećeno kod primarnih kortikalnih neurona (Slika 32).
[0364] Direktna injekcija HTT10150 nije izazvala detektabilne promene broja neurona (Slika 33). Holesterol hsiRNK je pokazao malu površinu toksičnosti susedno mestu injekcije (Slika 34).
[0365] Slike 58-60 obelodanjuju efikasnost hsiRNK kod divljeg tipa i Q140 primarnih neurona hipokampusa.
1.8 Diskusija
[0366] Ovo ispitivanje demonstrira da je upotreba hidrofobno modifikovane siRNK za isporuku u primarne ćelije vredan alat za omogućavanje funkcionalnih i genomskih ispitivanja neuronskih puteva i neuroloških poremećaja.
[0367] Mogućnost da se izazove utišavanje gena kod primarnih neurona bez upotrebe toksične formulacije ima značajni uticaj na neuronaučno istraživanje, što olakšava dublja ispitivanja neuroloških poremećaja u kontekstu primarnih ćelijskih linija i, na kraju, pruža relevantnije shvatanje in vivo funkcije i patologije. Većina neuroloških ispitivanja se vrši u stabilnim ćelijskim linijama zbog lakoće isporuke i ćelijskog održavanja, ali upotreba veštačkih ćelijskih sistema može dovesti do artefakta u podacima koji se mogu pripisati
12
manipulaciji ovih ćelijskih linija (što je problem koji se može izbeći upotrebom primarnih ćelija (Cheung, Y.-T. i dr. Efekti sve-trans retionske kiseline na ljudski SH-SY5Y neuroblastom kao u in vitro modelu u istraživanju neurotoksičnosti. NeuroToxicology 30, 127-135 (2009); Gilany, K. i dr. The proteome of the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y: An enlarged proteome. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1784, 983-985 (2008); Lopes, F. M. i dr. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies. Brain Research 1337, 85-94 (2010); Zhang, W. i dr. Cyclohexane 1,3-diones and their inhibition of mutant SOD1-dependent protein aggregation and toxicity in PC12 cells. BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY 1-17 (2011). doi:10.1016/j.bmc.2011.11.039). Trenutne metode za isporuku siRNK u primarne neurone obuhvataju upotrebu lentivirusnih vektora, adenopovezanih virusa (AAV) ili Lipofectamine™ posredovane transfekcije (Karra, D. & Dahm, R. Transfection Techniques for Neuronal Cells. Journal of Neuroscience 30, 6171-6177 (2010)). Konjugovanjem hidrofobne grupe kao što je holesterol direktno u siRNK samu i korišćenjem dodatnog jednolančanog fosforotioatisanog repa za pojačanu apsorpciju je ovde demonstrirano da se, ne samo siRNK može isporučiti efikasno u primarne neurone in vitro sa minimalnom toksičnošću, već da takođe ostaje potencijalno sredstvo za utišavanje iRNK.
[0368] Bez namere za vezivanjem za naučnu teoriju, jedna od glavnih prednosti RNKi u odnosu na antismisao tehnologiju je da se očekuje da dodatni RISC ostaje aktivan duže vremenske periode u ćelijama koje se ne dele (Bartlett, D. W. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging.
Nucleic Acids Research 34, 322-333 (2006)). Dodatno, ograničeni broj dodatih RISC je dovoljan za indukovanje RNKi posredovang utišavanja (Stalder, L. i dr. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMBO Journal 32, 1115-1127 (2013)). Ovde prikazani podaci demonstriraju utišavanje u trajanju do tri nedelje in vitro kod primarnih kortikalnih neurona nakon jednog tretiranja sa hsiRNK, što podržava predstavu da RNKi posredovano utišavanje može biti i efikasno i dugotrajno. Ovde prikazani podaci takođe pokazuju da se ova jedinjenja mogu koristiti za ciljanje više regiona u dva različita gena, što demonstrira adaptibilnost hsiRNK za ispitivanje alternativnih neuroloških puteva i bolesti.
[0369] Dok je jedna intrastriatalna injekcija hsiRNK za rezultat dala potentno utišavanje gena blizu mesta injektiranja in vivo efekat nije podjednako raširen u mozgu. Iako je ograničeno,
12
širenje na druge regione mozga (demonstrirano sa in vivo ispitivanjima efikasnosti) se može desiti pomoću više mehanizama. Oni obuhvataju kretanje u CSF, širenje vlaknastim trakama za koje je pokazano da imaju veliku vizualnu gustinu Cy3-označenih hsiRNK u ispitivanjima distribucije, ili moguće preko retrogradnog transporta (Stewart, G. R. & Sah, D. Retrograde Transport of siRNA and Therapeutic Uses to Treat Neurological Disorders. Objava patentne prijave Sjedinjenih Američkih Država US 2008/0039415 A1, 1-18 (2008)), iako će dalja ispitivanja biti sprovedena kako bi se odredio stvarni mehanizam.
[0370] Ovde predstavljena tehnologija je od koristi za razumevanje funkcionalne genomike naročitih regiona u mozgu, kao i za ispitivanje veza između regiona u mozgu. Dodatno, ispitivanje nekih neuroloških poremećaja (na primer poremećaja memorije (Samuelson, K. W. Post-traumatic stress disorder and declarative memory functioning: a review. Dialogues in Clinical Neuroscience 13, 346-351 (2011))) može imati koristi od ograničene i regionalno ciljane distribucije i utišavanja. Međutim, zbog svog distribucionog modela, hsiRNK kako trenutno postoji nije održivo terapeutsko sredstvo za opšte neurološke poremećaje kao što je Hantingtonova bolest. Više injekcija može delovati da poveća opšte utišavanje kod malih glodara, ali kako bi se ova tehnologija prilagodila za upotrebu kod mozgova većih životinja i ljudi, i kako bi se postigla jednaka i široko rasprostranjena distribucija, druge hemijske modifikacije i terapeutske metode isporuke se mogu upotrebiti. Postoji više načina kojima se može pristupiti. Prvo, hemijska podešavanja samog hsiRNK sastava se mogu izvršiti. Ona obuhvataju konjugovanje za različit lipid, što dopunjuje glavni lanac sa dodatnim fosforotioat grupama ili dodavanje hidrofobnih grupa samim nukleotidima (Vaught, J. D., Dewey, T. & Eaton, B. E. T7 RNA Polymerase Transcription with 5-Position Modified UTP Derivatives. J. Am. Chem. Soc.126, 11231-11237 (2004)). Sve od ovih modifikacija mogu podržati opseg hidrofobiciteta što bi omogućilo poboljšanu distribuciji na većoj distanci. Povećana bioraspoloživost se takođe može postići različitim režimima injekcije kao što je u CSF umesto intrastriatalno, povećavajući verovatnoću izlaganja celog mozga. Međutim, isporuka CSF bi mogla da pomogne lokalizaciju hsiRNK u regione mozga koji nisu striatum što je čini manje idealnom metodom za isporuku za tretiranje Hantingtonove bolesti. Druga mogućnost je formulisana isporuka pakovanjem ovih hidrofobno modifikovanih siRNK u egzozome i lipozome (manje toksično od trenutnih Lipofectamine™ formulacija) i upotreba ovih prirodnih i sintetičkih nanonosača za isporuku tereta na način koji je jednako distribuiran (Alvarez-Erviti, L. i dr Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol 1-7 (2011). doi:10.1038/nbt.1807; Marcus, M. & Leonard,
1
J. FedExosomes: Engineering Therapeutic Biological Nanoparticles that Truly Deliver.
Pharmaceuticals 6, 659-680 (2013)). Međutim, potentnost i efikasnost isporučene hsiRNK se i dalje moraju potvrditi ovim metodama.
[0371] Kao zaključak, HTT10150 je bio efikasan za ciljanje iRNK hantingtina kod primarnih neurona in vitro i lokalno u mozgu miša in vivo. Ovo jedinjenje nije zahtevalo formulaciju za isporuku u primarne ćelije i omogućilo je funkcionalna ispitivanja gena za hantingtina kao i za druge ciljeve, što ga čini veoma korisnim alatom za ispitivanje neuroloških poremećaja. Potencijalne prednosti ove tehnologije bi trebalo da omoguće da hsiRNK funkcioniše kao terapeutsko tretiranje za Hantingtonovu bolest kao i za druge neurološke bolesti u budućnosti.
1.9 Metode
Ćelijska kultura
[0372] HeLa ćelije su održavane u DMEM (Corning Cellgro) dopunjenim sa 10% goveđim fetalnim serumom (Gibco) i 100 U / mL penicilina / streptomicina (Invitrogen) i gajene su pri 37 °C i 5% CO2. Ćelije su podeljene na svakih 2-5 dana sve do prolaska 15 i zatim su uklonjene.
Ćelijska kultura za pasivnu apsorpciju
[0373] Ćelije su postavljene u DMEM sa 6% FBS pri 10.000 ćelija / udubljenju u pločama sa 96 udubljenja tretiranih sa tkivnom kulturom. hsiRNK su razblažene u OptiMEM (Gibco) do 2X krajnje koncentracije i 50 µL razblažene hsiRNK je dodato u 50 µL ćelija za 3% FBS na kraju. Ćelije su inkubirane u trajanju od 72 sata pri 37 °C i 5%2.
Ćelijska kultura za lipidno posredovanu apsorpciju
[0374] Ćelije su postavljene u DMEM sa 6% FBS pri 10.000 ćelija / udubljenju u pločama sa 96 udubljenja tretiranih sa tkivnom kulturom. hsiRNK su razblažene u OptiMEM do 4X krajnje koncentracije. LIPOFECTAMINE RNAIMAX transfekcioni reagens (Invitrogen #13778150) je razblažen do 4X krajnje koncentracije (na kraju = 0,3 µL/25 µL /udubljenju). RNAIMAX i hsiRNK su pomešane 1:1 i 50 µL je dodato u 50 µL ćelija za 3% FBS na kraju. Ćelije su inkubirane u trajanju od 72 sata pri 37 °C i 5%2.
Pripremanje primarnih neurona
[0375] Primarni kortikalni neuroni su dobijeni od E15.5 embriona miševa od WT (FVBN) miševa. Trudne ženke su anestezirane sa IP injekcijom Avertina (250 mg/kg mase) što je
1 1
praćeno cervikalnom dislokacijom. Embrioni su uklonjeni i preneti u Petri sud sa ledeno hladnom DMEM/F12 sredinom (Invitrogen). Mozgovi su uklonjeni i meningeje su pažljivo uklonjene. Korteksi su izolovani i preneti u epruvetu od 1,5 ml sa prethodno zagrejani papain rastvorom u trajanju od 25 min pri 37 °C i 5% CO2kako bi se rastvorilo tkivo. Papain rastvor je pripremljen kao što sledi: papain (Worthington #54N15251) je rastvoren u 2 mL HibernateE (Brainbits) i 1 mL EBSS (Worthington). Odvojeno, DNaza (Worthington #54M15168) je resuspendovana u 0,5 mL HibernateE. Zatim, 0,25 mL resuspendovane DNaze je preneto u resuspendovani papain za krajnji rastvor. Nakon inkubacije od 25 minuta, papain rastvor je uklonjen i 1 mL NbActiv4 (Brainbits) dopunjenog sa 2,5% FBS je dodato u tkivo. Korteksi su zatim odvojeni pipetiranjem na gore i dole sa vatrom poliranom, staklenom Pasteru pipetom. Kortikalni neuroni su izbrojani i postavljeni u ploče pri 1x10<6>ćelija / ml. Za ispitivanja pravljenja slika živih ćelija, ploče sa kulturom su prethodno obložene sa poli-L-lizinom (Sigma #P4707) i 2x10<5>ćelije su dodate u stakleni centar za svaki sud. Za analize utišavanja, neuroni su postavljeni u ploče na poli-L-lizinom prethodno obložene ploče sa 96 udubljenja (BD BIOCOAT #356515) pri 1x10<5>ćelija po udubljenju. Nakon inkubiranja preko noći pri 37 °C i 5% CO2jednaka zapremina NbActiv4 (Brainbits) dopunjenog sa antimitoticima, 0,484 µL/mL 5'UtP (Sigma #U6625) i 0,2402 µL/mL of 5'FdU (Sigma #F3503), kako bi se sprečio rast ćelija koje nisu neuronske, je dodat u neuronske kulture. Polovina zapremina sredine je zamenjena svakih 48 sati (sa novim NbActiv4 sa anti-mitoticima) dok su se neuroni tretirali sa siRNK. Kada su ćelije tretirane, sredina nije uklonjena već samo dodata. Svako sledeće dodavanje sredine je sadržali anti-mitotike.
Kvantifikacija iRNK
[0376] iRNK je kvantifikovana upotrebom QuantiGene 2.0 analize (Affymetrix #QS0011). Ćelije su lizirane u 250 µL razblažene smeše za lizu (Affymetrix #13228), 1 deo smeša za lizu, 2 dela H2O, sa 0,167 µg / µL proteinaze K (Affymetrix #QS0103) u trajanju od 30 minuta pri 55 °C. Ćelijski lizati su dobro pomešani i 40 µL (približno 8000 ćelija) lizata je dodato kako bi se zahvatile ploče zajedno sa 40 µL dodatno razblažene smeše za lizu bez proteinaze K. Kompleti sondi su razblaženi kao što je naznačeno u Affymetrix protokolu. Za HeLa ćelije, 20 µL ljudskog HTT ili PPIB kompleta sondi (Affymetrix #SA-50339, #SA-10003) je dodato u odgovarajuća udubljenja za krajnju zapreminu od 100 µL. Za primarne neurone, 20 µL mišijeg HTT ili PPIB kompleta sondi (Affymetrix #SB-14150, #SB-10002) je korišćeno.
1 2
[0377] Tkiva su tretirana slično, upotrebom 300 µL pufera za homogenizovanje (Affymetrix #10642) sa 2 µg/µL proteinaze K za 5 mg punkciju tkiva. Tkivo je zatim homogenizovano u ploči formata sa 96 udubljenja na QIAGEN TissueLyser II i 40 µL je dodato kako bi se zahvatila ploča. Kompleti sondi su razblaženi kao što je naznačeno u Affymetrix protokolu i 60 µL ili HTT ili PPIB kompleta sondi (Affymetrix #SB-14150, #SB-10002) je dodato u svako udubljenje zahvaćene ploče za krajnju koncentraciju od 100 µL. Za kvantifikaciju DARPP32, samo 10 µL uzorka tkiva i 30 µL pufera za homogenizaciju je dodato u svako udubljenje sa 60 µL mišijeg Ppp1r1b kompleta sondi (Affymetrix #SB-21622). Signal je pojačan u skladu sa Affymetrix protokolom. Luminescencija je detektovana ili na Veritas luminometru ili Tecan M 1000.
Obeležavanje živih ćelija
[0378] Za praćenje apsorpcije hsiRNK kod živih ćelija, ćelije su postavljene u ploče od 2x10<5>ćelija u sud sa staklenim dnom debljine 35 mm kao što je opisano u pripremanju primarnih neurona iznad. Pre pravljenja slika, ćelijska jezgra su obeležena fenol bez crvene NbActiv4 upotrebom NUCBLUE (Molecular Probes by Life Technologies #R37605) kao što je ukazano od strane proizvođača. Pravljenje slika je izvršeno u fenol bez crvene NbActiv4. Ćelije su tretirane sa 0,5 µM Cy3-označenoj hsiRNK, i pravljenje slika živih ćelija je izvršeno vremenom. Sve konfokalne slike živih ćelija su dobijene sa Zeiss konfokalnim mikroskopom i slike su obrađene upotrebom ImageJ (1.47v) softvera.
Imm unohistohemija/imunofluorescencija
[0379] Za ispitivanja distribucije, mozgovi su injektirani sa 1 nmol (12,5 µg) Cy3-označene hsiRNK. Nakon 24 sata, miševi su žrtvovani i mozgovi su uklonjeni i poslati u DERC Morphology Core na UMASS Medical School kako bi se sačuvali u parafinu i secirali na delove od 4 µm i postavili na staklene slajdove. Delovi su uklonjeni iz parafina u trajanju od 8 minuta u ksilenu dva puta. Delovi su zatim rehidrirani sa serijskim etanol razblaživanjem (100%, 95%, 80%) u trajanju od 4 minuta, zatim su isprani dva puta u trajanju od dva minuta sa PBS. Za NueN obeležavanje, slajdovi su dovedeni do ključanja u trajanju od 5 minuta u puferu za otkrivanje antigena i zatim su ostavljeni da stoje na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 minuta, što je praćeno 5-minutnim ispiranjem sa PBS. Slajdovi su zatim blokirani sa 5% normalnim kozjim serumom u PBS 0,05% Tween20 u trajanju od 1 sata i isprani jednom sa PBS 0,05% Tween20 u trajanju od 5 minuta. Primarna antitela (1:1000 razblaženje u PBS 0,05% Tween20) su dodata u slajdove u trajanju inkubacije od 1 sata što je praćeno sa tri 5-
1
minutna ispiranja sa PBS 0,05% Tween20. Sekundarna antitela (1:1000 razblaženje u PBS 0,05% Tween20) si dodata u slajdove u trajanju inkubacije od 30 minuta što je praćeno sa tri 5-minutna ispiranja sa PBS 0,05% Tween20. Slajdovi su zatim obeleženi sa DAPI (Molecular Probes od Life Technologies #D3571), razblaženi do 250 ng/mL u PBS, u trajanju od jednog minuta što je dalje praćeno sa tri 1-minutna ispiranja sa PBS. Sredina za postavljanje i prekrivači su postavljeni na slajdove i ostavljeni su da se osuše preko noći pre nego što su napravljene slike na Leica DM5500 - DFC365FX mikroskopu pri ukazanom uvećanju.
[0380] Ispitivanja aktiviranja toksičnosti i mikroalgija ekstrahovani, perfuzirani mozgovi su isečeni na delove od 40 µm na Leica 2000T Vibratome u ledeno hladnom PBS.
Imunohistohemija je izvršena na svakom 6-om delu u odnosu na DARPP32 (Millipore, 1:10.000 razblaženje) i IBA-1 (Millipore, 1:500 razblaženje). Delovi su postavljeni i vizualizovani svetlosnom mikroskopijom. Četiri slike su napravljene pri 20X u striatumu i sa injektirane i sa neinjektirane strane svakog dela. Broj DARP32 pozitivnih neurona je kvantifikovan upotrebom ImageJ. Aktivirane mikroglije su kvantifikovane morfologijom obeleženih ćelija za IBA-1.
Životinje, stereotaksične injekcije
[0381] Miševi divljeg tipa (FVBN) su primili mikroinjekcije sterotaksičkim postavljanjem u desni striatum (koordinate (relativno bregma) su bile 1,0 mm anteriorno, 2,0 mm lateralno i 3,0 mm ventralno). Životinje su duboko anestezirane pre injekcije sa 1,2% Avertinom. I za ispitivanja toksičnosti (DARPP32) i efikasnosti, miševi su primili injekcije ili sa PBS ili veštačkom moždano-moždinskom tečnošću (2 µL po striatumu, N = 8 miševa), 12,5 µg NTC hsiRNK (2 µL 500 µM štok rastvora po striatumu, N = 8 miševa), 25 µg HTT10150 hsiRNK (2 µL 1 mM štok rastvora po striatumu, N = 8 miševa), 12,5 µg HTT10150 hsiRNK (2 µL 500 µM štok rastvora po striatumu, N = 16 miševa ukupno, dva kompleta od 8 miševa na dva različita dana), 6,3 µg HTT10150 hsiRNK (2 µL 250 µM štok rastvora po striatumu, N = 8 miševa) ili 3,1 µg HTT10150 hsiRNK (2 µL 125 µM štok rastvora po striatumu, N = 8 miševa) i eutanazirani su 5 dana kasnije. Mozgovi su sakupljeni i tri 300 µm kortikalna dela su napravljena. Jedna punkcija od 2 mm je napravljena sa obe strane (injektirane i neinjektirane) za svaki deo i postavljena na RNAlater (Ambion #AM7020) u trajanju od 24 sata pri 4 °C. Svaka punkcija je procesirana kao pojedinačni uzorak za QuantiGen analizu. Sve životinjske procedure su odobrene od strane University of Massachusetts Medical School
1 4
Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocol number A-2411).
Statistička analiza
[0382] Analiza podataka je izvršena upotrebom softvera GraphPad Prism 6 verzije 6.04 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Za krivu zavisnosti od koncentracije IC50, kriva je podudarena upotrebom log(inhibitor) u odnosu na odgovor - varijabilni nagib (četiri parametra). Donji deo krive je postavljen da ne bude manji od nule a gornji deo krive je postavljen da ne bude veći od 100. Za svaki nezavisni eksperiment kod miševa, nivo obaranja pri svakoj dozi je normalizovan do srednje vrednosti kontrolne grupe, što je bilo na strani koja nije injektirana za OBS ili veštačke CSF grupe, tako da su svi podaci izraženi proporcionalno u odnosu na kontrolu. In vivo podaci su analiziranu upotrebom Kruskal-Wallis testa (jednostrane ANOVA) sa Bonferroni korekcijama za više komparacija. Razlike u svim poređenjima su smatrane značajnim pri P-vrednosti većom od 0,05.
Ćelijska kultura za pasivnu apsorpciju (primarni skrining i odgovor na dozu).
[0383] Ćelije su postavljene u DMEM (Gibco) sa 6% FBS (Gibco) pri 10.000 ćelija / udubljenju u pločama sa 96 udubljenja tretiranih sa tkivnom kulturom. HsiRNK je razblažena na OptiMEM (Gibco) do 2X krajnje koncentracije i 50 uL razblažene hsiRNK je dodato u 50 µL ćelija za 3% FBS na kraju. Ćelije su inkubirane u trajanju od 72 sata pri 37 °C i 5%2.
Ćelijska kultura za lipidno posredovanu apsorpciju
[0384] Ćelije su postavljene u DMEM (Gibco) sa 6% FBS (Gibco) pri 10.000 ćelija / udubljenju u pločama sa 96 udubljenja tretiranih sa tkivnom kulturom. HsiRNK je razblažena u OptiMEM (GIbco) do 4X krajnje koncentracije. LIPOFECTAMINE RNAIMAX transfekcioni reagens (Invitrogen CAT#13778150) je razblažen do 4X krajnje koncentracije (na kraju = 0,3 µL / 25 µL / udubljenju). RNAIMAX i hsiRNK su pomešane 1:1 i 50 µL je dodato u 50 µL ćelija za 3% FBS na kraju. Ćelije su inkubirane u trajanju od 72 sata pri 37 °C i 5%2.
Kvantifikacija iRNK
[0385] iRNK je kvantifikovana upotrebom QuantiGene 2.0 analize (Affymetrix QS0011). Izvršena je liza ćelija u 250 µL razblaženoj smeši za lizu, 1 deo smeša za lizu, 2 dela H2O sa 0,167 µg / µL proteinaze K (Affymetrix QS0103) u trajanju od 30 minuta pri 55 C. Ćelijski lizati su dobro pomešani i 40 µL (~8000 ćelija) lizata je dodato kako bi se zahvatile ploče
1
zajedno sa 40 µL dodatno razblažene smeše za lizu bez proteinaze K. Tkiva su tretirana slično, upotrebom 300 µL pufera za homogenizaciju (Affymetrix) sa 2 µg / µL proteinaze K za punkciju tkiva od 5 mg. Tkivo je zatim homogenizovano u ploči formata sa 96 udubljenja na Qaigen TissueLyser II i 40 µL je dodato kako bi se zahvatila ploča. Kompleti sondi su razblaženi kao što je naznačeno u Affymetrix protokolu i 20 µL ili HTT ili PPIB sondi (Affymetrix: SA-50339, SA-10003) je dodato u svako udubljenje zahvaćene ploče za krajnju koncentraciju od 100 µL. Singal je pojača u skladu sa protokolom proizvođača.
Luminescencija je detektovana ili na Veritas luminometru ili Tecan M 1000.
Obeležavanje živih ćelija i imunoobeležavanje delova mozga
[0386] Za praćenje apsorpcije živih ćelija, ćelije su postavljene u ploče pri gustini od 2x10<5>ćelija u sud sa staklenim dnom debljine 35 mm i gajene su preko noći. Pre pravljenja slika, ćelijske organele su obeležene u HBSS (Gibco) upotrebom reagenasa za obeležavanje kupljenih od Life Technologies osim ukoliko nije naznačeno: ćelijska jezgra, endoplazmatski retikulum i lizozomi su respektivno obeleženi upotrebom NUCBLUE Live READYPROBE, ER-TRACKER zelenog (Bodipy FL Glibenclamide) i LYSOTRACKER tamno crvenog reagensa kao što je ukazano od strane proizvođača. Pravljenje slika je izvršeno u nedopunjenom DMEM bez fenol crvene (Invitrogen). Ćelije su tretirane sa 0,5 µM Cy3-označenoj hsiRNK, i pravljenje slika živih ćelija je izvršeno vremenom.
Konfokalno pravljenje slika
[0387] Sve konfokalne slike su dobijene sa CSU10B glavom za skeniranje konfokalnog sistema sa rotirajućim diskom (Solamere Technology Group) koji je postavljen na TE-200E2 inverzni mikroskop (Nikon) sa 60x Plan/APO uljanim sočivima i Coolsnap HQ2 kamerom (Roper). Slike su procesirane upotrebom ImageJ (1.47v) softvera. Broj neurona sa ili bez hsiRNK je izbrojan upotrebom ImageJ softvera. Slike delova mozga su dobijene sa razmakom z-ose od 1 µm.
Primer 2. hsiRNK retenzija i distribucija su direktno povezane sa hidrofobnosti [0388] Iako su FM-hsiRNK pokazale poboljšanu retenziju i akumulaciju u mozgu i kičmenoj moždini i izazivaju maksimalno utišavanje pri 10 puta manjim dozama u odnosu na delimično stabilizovane hsiRNK, uveliko su zadržane blizu mesta injektiranja (Slika 102; CholhsiRNK). Postavljena je hipoteza da bi ograničena distribucija hsiRNK mogla biti rezultat preferencijalnog vezivanja hsiRNK za lipidno-obogaćene mijelinske i mijelinisane strukture
1
zbog jake hidrofobnosti holesterol konjugata, i takvo podešavanje hidrofobnosti hsiRNK konjugata bi moglo da poboljša distribuciju u kičmenoj moždini i mozgu. Kako bi se testirala ideja, izvršen je skrining panela prirodnih, hidrofobnih molekula koji mogu aktivirati neuronsko saobraćanje uključujući: (i) neuroaktivne steroide, tj., endogene steroide koji prolaze kroz krv-mozak barijeru i vezuju se za različite gejtovane-jonske kanale i neuronski ispoljene receptore (Rupprecht R. Neuroactive steroids: mechanisms of action and neuropsychopharmacological properties. Psychoneuroendocrinology. 2003; 28:139-68.
PMID: 12510009), uključujući GABA (Lan NC, Gee KW. Neuroactive steroid actions at the GABAA receptor. Hormones and behavior.1994; 28:537-44. PMID: 7729823); (ii) ganglioside-neuroprotektivne glikolipide koji su ključni za neuronsku plastičnost i popravljanje (Aureli M, Mauri L, Ciampa MG, Prinetti A, Toffano G, Secchieri C, Sonnino S. GM1 Ganglioside: Past Studies and Future Potential. Molecular neurobiology.2015. PMID: 25762012); i (iii) endokanabioid-nalik dugolančane polinezasićene masne kiselineneuromodulatorni lipidi prepoznati od strane receptora uključenih u apetitu, bolu, raspoloženju i memoriji (Dyall SC. Long-chain omega-3 fatty acids and the brain: a review of the independent and shared effects of EPA, DPA and DHA. Frontiers in aging neuroscience.
2015; 7:52. PMID: 25954194; PMCID: PMC4404917; Janssen CI, Kiliaan AJ. Long-chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFA) from genesis to senescence: the influence of LCPUFA on neural development, aging, and neurodegeneration. Progress in lipid research.2014; 53:1-17. PMID: 24334113; Figueroa JD, De Leon M. Neurorestorative targets of dietary longchain omega-3 fatty acids in neurological injury. Molecular neurobiology. 2014; 50:197-213. PMID: 24740740; PMCID: PMC4183712).
[0389] Najrobusniji pristup za sintezu oligonukleotidnih konjugata je bio da se poveže aktivirani konjugat za amino-modifikovanu podršku. Struktura i dužina veznika je varirala (npr., granata) i podloga je funkcionalizovana gde god je bilo moguće. Varijacije sintetičkih pristupa navedene na Slikama 93 i 94 su korišćene za sintetisanje hsiRNK konjugovanih sa kortizolom, dokozaheksaenoinskom kiselinom (DHA), kalciferolom, holesterolom i GM1 ganglozidom (Slike 98 i 99). Sva jedinjenja su HPLC-prečišćena i njihovi identiteti su potvrđeni masenom spektrometrijom. Kalciferol-funkcionalizovana podloga je bila nestabilna, što je za rezultat dalo smešu nekoliko varijanti koje su bile testirane in vivo (opisano ispod).
[0390] Kao što je očekivano, jedinjenja su pokazala različite stepene hidrofobnosti na osnovu vremena zadržavanja u toku reverzne faze hromatografije. Injektiranje Cy3-označenih
1
hsiRNK konjugata u striatum ili ICV (Slika 92) miševa divljeg tipa je otkrilo različite stepene hsiRNK distribucije i retenziju koja je visoko povezana za hidrofobnosti. Nekonjugovane ili samo vezničke hsiRNK su pokazale minimalnu retenziju u mozgu (slično onoj za antismisao oligonukleotide) i većina hidrofobnih jedinjenja, holesterol i GM1 su primarno zadržani na mestu injektiranja. Optimalna retenzija/distribucija je postignuta sa DHA i kalciferol konjugatima (iznad), koji imaju hidrofobne međuprofile. DHA-hsiRNK je ispitivana detaljno i pokazala je odličnu efikasnost i neprikosnovenu bezbednost (terapeutski indeks > 20 puta) (Nikan i dr., 2016; Molecular Therapy, in revision, see Appendix). Ukratko, ovde predstavljeni podaci pokazuju da je podešavanje hidrofobnosti konjugata validna strategija za identifikovanje konjugata koji podržavaju optimalnu retenziju, distribuciju i bezbednost tkiva mozga.
[0391] GM1-hsiRNK je efikasno internalizovana i izazvala je utišavanje iRNK hantingtina kod primarnih kortikalnih neurona (Slika 108). GM1-hsiRNK je pokazala ograničenu distribuciju u mozgu miša nakon intrastriatalne injekcije (Slika 109).
Primer 3. DHA-hsiRNK
[0392] Delimično modifikovane hsiRNK su pokazale kraće trajanje dejstva i nisu pokazale sistemsko ispoljavanje (Slike 35A-C). Metabolička stabilizacija je dalje istraživana (Slika 36). Potpuna metabolička stabilizacija se nije mešala sa RISC ulazom hsiRNK (Slika 37). Potpuno metabolički stabilizovane hsiRNK (FM-hsiRNK) su pojačale lokalnu isporuku i distribuciju i omogućile duže trajanje dejstva (Slike 38, 39A-B, 91, 110 i 111 Termin „nukleozid“).
[0393] Prirodni lipidi (tj., glikosfingolipidi, polinezasićene masne kiseline, sekosteroidi, steroidni hormoni i sterolni lipidi) su ispitivani kao hsiRNK biokonjugati (Slika 40). Lipidni biokonjugati su imali izraženi efekat na hidrofobnost smisao lanca hsiRNK<HTT>.
[0394] Ispitivanje je dizajnirano da istraži in vivo distribuciju hsiRNK konjugata. Izvršena je intrastriatalna unilateralna injekcija (2 nml / 2 µl) kod FVBN WT miševa sa P2-stabilizovanim siRNK CY3 konjugatima u aCSF.48 sati nakon injektiranja, životinjama je izvršena perfuzija sa PBS i 10% formalinom. Njihovi mozgovi su uklonjeni i nakon toga fiksirani u trajanju od 48 sati.4 µm koronalna i sagitalna isečka su pripremljena i obeležena sa DAPI. Pravljenje slika je izvršeno na Leica DM 5500 fluorescentnom mikroskopu (CY3 i DAPI). Određeno je da je hsiRNK hidrofobnost direktno povezana sa distribucijom i
1
retenzijom u mozgu (Slika 41). Ključno svojstvo je balansiranje između distribucije i retenzije.
[0395] Dokozaheksaenoinska kiselina (DHA) - hsiRNK su sintetisani (Slika 42). DHA je omega-3 masna kiselina koja je primarna komponenta ljudskog mozga (70%). DHA prelazi moždanu barijeru (BBB) i aktivno se internalizuje od strane neurona i drugih tipova ćelija. To je netoksični suplement klinički pokazan da poboljšava kognitivnu funkciju kod HD i ALS pacijenata. DHA je značajno manje hidrofobna od holesterola.
[0396] DHA-hsiRNK i chol-hsiRNK su pokazane da se internalizuju u primarne kortikalne neurone (SLika 43). DHA.hsiRNK je ko-lokalizovana sa neuronima i astrocitima (Slika 44)i lokalizovana je do perinuklearnog regiona striatalnih neurona (chol-hsiRNK nije detektabilna u striatalnim neuronima) (Slika 45). DHA-hsiRNK je ko-lokalizovana sa neuronima i astrocitima u korteksu nakon jedne intrastriatalne injekcije (Slika 46). DHA-hsiRNK je lokalizovana u perinuklearnom regionu u kortikalnim neuronima, dok chol-hsiRNK nije detektabilna (Slika 47). DHA-hsiRNK je efikasno distribuirana u mozgu i utišava gene i u striatumu i u korteksu (Slika 57).
[0397] DHA-hsiRNK je pokazala robusnu efikasnost u striatumu i korteksu (Slike 48 i 49). Do 200 µg DHA-hsiRNK nije imalo dejstvo na DARPP-32 nivoima, ukazujući na bezbednost jedinjenja (Slika 50). U suprotnosti, 25 µg (1 mg/kg) je maksimalno tolerisana intrastriatalna doza chol-hsiRNK. Do 200 µg DHA-hsiRNK nije izazvalo značajno povećanje aktiviranih mikroglija, ukazujući na minimalnu stimulaciju imunog sistema (Slika 51).
[0398] hsiRNK omogućava jednostavno i efikasno utišavanje gena u primarnim neuronima in vivo u mozgu. Oligonukleotidna hidrofobnost definiše retenziju i distribuciju u tkivu mozga. Pokazano je da oligonukleotidna hemija ima uticaj na ćelijsku isporuku i distribuciju (Slike 52-56). DHA-hsiRNK konjugati predstavljaju novu klasu oligonukleotida sa širokom in vivo efikasnošću i širokim terapeutskim indeksom.
Primer 4. PC-DHA-hsiRNK (PC-DHA-hsiRNK)
[0399] Ohrabreni širokim terapeutskim indeksom DAH-hsiRNK, DHA i povezani konjugati su detaljnije istraživani. Cirkulišuća DHA je najviše prisutna kao lizofosfatidilholin estar, koji je jedini oblik koji aktivno saobraća kroz krv-mozak barijeru pomoću specifičnog
1
transporteda Mfsd2a (Nguyen LN, Ma D, Shui G, Wong P, Cazenave-Gassiot A, Zhang X, Wenk MR, Goh EL, Silver DL. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature.2014; 509:503-6. PMID: 24828044).
[0400] Lizofosfatidilholin estar DHA nije stabilan, tako da se lizofosfatidilholin (PC) amid DHA sintetiše (Slike 93, 94, 100 i 101). PC-DHA je metabolički stabilan analog koji je kompatibilan sa oligonukleotidnom sintezom čvrste faze. Njegov identitet je potvrđen sa NMR i masenom spektrometrijom. Testiranjem ideje da bi lizofosfatidilholin trebalo da poboljša saobraćanje DHA-hsiRNK, je određeno da su PC-DHA-hsiRNK pokazale širu distribuciju i povećanu efikasnost u tkivu mozga od DHA-hsiRNK (Slika 92 i 103). Značajno, kao klasa, DHA konjugati su pokazali širok terapeutski indeks bez očigledne urođene imune aktivacije neuronske degeneracije pri koncentracijama 20 puta većim od minimalne efektivne doze (Slika 92). Komparativno, chol-hsiRNK je pokazala značajnu toksičnost pri injekcijama od 25 µg (Slika 92C). Na kraju, bolusna CSF (ICV) infuzija je podržala široku distribuciju u mozgu, pretvarajući striatum, korteks i čak dostižući posteriorne i ventralne regione mozga (Slika 92). Zbog izvanrednih karakteristika, PC-DHA-hsiRNK je izabrana kao vodeća hemija za ispitivanje.
[0401] PC-DHA je metabolički aktivni analog DHA (Slika 62). PC-DHA-hsiRNK demonstrira pojačano neuronsko utišavanje in vitro, pojačavajući distribuciju u mozgu i pojačavajući in vivo potentnost (bez znakova toksičnosti) relativno u odnosu na DHA-hsiRNK.
[0402] PC-DHA-hsiRNK i chol-hsiRNK su pokazale da efikasno utišavaju iRNK i mutiranog i divljeg tipa htt (Slika 61). Chol-hsiRNK je demonstrirala toksičnost (3 od 6 životinja je umrlo). Preživele životinje su demonstrirale veoma nisko (3 puta u pozadini) ispoljavanje ljudskog htt.
[0403] PC-DHA-hsiRNK, kada se isporuči u primarne neurone, pokazuje pojačanu potentnost relativno DHA-hsiRNK (Slika 63). Iako je chol-hsiRNK efikasnija pri smanjenju ispoljavanja htt gena u primarnim neuronima (Slika 64), PC-DHA-hsiRNK je pokazala superiorniju retenziju u mozgu i širu distribuciju (Slika 65).
[0404] PC-DHA-hsiRNK je pokazala približno 80% utišavanje u striatumu miša nakon jedne
14
intrastriatalne (IS) injekcije (Slika 66) i pokazala je približno 60% utišavanje u korteksu miša nakon jedne SI injekcije (Slika 67). Nije postojalo indikacija o toksičnosti. Utišavanje je ograničeno na injektiranu stranu mozga.
[0405] Bubreg je glavni cilj PC-DHA-hsiRNK (Slika 107). PC-DHA-hsiRNK se akumulirala u proksimalnim tubulama moždanih vijuga.
Primer 5:Primer 5. Otkriće Di-hsiRNK
[0406] Granati oligonukleotidi predstavljaju novu klasu oligonukleotidnih terapeutskih sredstava. Dva do osam oligonukleotida je međusobno povezano preko hidrofobnog veznika, gde je poželjno da 2-3 oligonukleotida budu međusobno povezana. Suštinska hemijska stabilizacija je obično korišćena (gde je bar 40% baza modifikovano, poželjno potpuno modifikovano. Jednolančani fosforotioatisani rep od 2-20 je obično korišćen (poželjno 8-10).
[0407] Otkriće jedinjenja di-razgranate hsiRNK (di-hsiRNK) je bilo isključivo na sreću. Kalciferol se lako oksiduje i dokazano je da je čvrsta podloga nestabilna, što komplikuje QC i prečišćavanje. Grupa od četiri glavna nusproizvoda je injektirana u striatum miševa divljeg tipa. Imalo je bolje performanse od bilo kog drugog jedinjenja koje je prethodno injektirano u CNS. Proizvodi su pokazali široku difuziju, dobru retenziju i preferencijalnu apsorpciju u neurone u korteksu, striatumu i kičmenoj moždini, što je skoro idealni profil. Detalja karakterizacija sa HPLC i masena spektrometrija su identifikovale nusproizvode prisutne u sirovoj smešu: željeni kalciferol-hsiRNK konjugat, hsiRNK sa kapom trietil glikol veznikom (TEG) i dve hsiRNK povezane TEG veznikom. Kasnije jedinjenje je rezultat podeljenog kalciferola za vreme dodavanja podloge, ostavljajući dve aktivne grupe na kojima će putnička lanca hsiRNK da rastu (Slika 95A). Nakon prečišćavanja svakog nusproizvoda određeno je da bi svaki mogao efikasno da uđe u RISC in vitro (Slika 95B), ali su samo Di-hsiRNK pokazale široku distribuciju i preferencijalnu neuronsku apsorpciju (Slika 95C). Put za direktno sintetisanje Di-hsiRNK sa prinosom > 70% (Slike 93 i 94), potvrđen masenom spektrometrijom, je osmišljen (Slika 100 i 101).
[0408] Određeno je da bolusna ICV infuzija Di-hsiRNK podržane isporuke kroz moždana Dirazgranata hsiRNK (di-hsiRNK) jedinjenja podržava široku distribuciju u mozgu (Slike 68, 69 i 104A). Potrebno je zapamtiti da je mozak injektiran sa Cy3 Di-hsiRNK na slici 104A ceo roze boje. Jedna injekcija di-siRNK je detektovana i ipsilateralno i kontralateralno mestu injektiranja što ukazuje da širenje nije ograničeno na injektiranu hemisferu već da se takođe javlja duž srednje linije u neinjektiranu stranu. Manji stepen di-siRNK akumulacije sa kontralateralne strane, iako je značajan, može zahtevati bilateralne injekcije za potpuno utišavanje u mozgu. Alternativne metode za injektiranje koje obuhvataju intracerebralnoventrikularne mogu takođe olakšati bilateralnu distribuciju samo sa jednom injekcijom.
[0409] Grananje je određeno kao esencijalno za pojačanu distribuciju u mozgu (Slika 70). DihsiRNK se distribuirala kroz injektiranu hemisferu mozga miša nakon intrastriatalne injekcije. Dok pojedinačna nekonjugovana hsiRNK može utišati iRNK u primarnim neuronima, dihsiRNK struktura je bila suštinska za pojačanu distribuciju u tkivu i retenziju u tkivu modifikovanih oligonukleotida. Drugi konjugati kao što je holesterol, iako se zadržava, pokazuje strmi gradijent difuzije od mesta injektiranja. Blaga hidrofobnost dva jednolančana fosforotioatisana repa su podržala retenziju dok je i dalje omogućeno širenje i uniformna distribucija kroz ipsilateralnu hemisferu injektiranog mozga.
[0410] In vivo utišavanje gena nakon jedne IS injekcije di-hsiRNK je ispitivano (Slika 71). Jedna injekcija di-siRNK je izazvala robusno utišavanje i u striatumu i u korteksu mozga miša (Slike 72 i 73). Ovaj nivo efikasnosti prethodno nikad nije bio demonstriran za nekonjugovane siRNK. Iako di-hsiRNK deluje vizuelno povezana sa vlaknastim traka u striatumu, primećena efikasnost jasno ukazuje da su striatalni neuroni internalizovali disiRNK do značajnog stepena.
[0411] Di-hsiRNK takođe podržavaju uniformnu distribuciju u kičmenoj moždini (Slika 74). Di-hsiRNK bolusna IT injekcija je podržala utišavanje htt u kičmenim moždinama (Slika 75). Di-hsiRNK je pokazala robusno i jednako utišavanje u kičmenoj moždini nakon intratekalne injekcije. Jedna injekcija di-hsiRNK u lumbarnom regionu kičmene moždine je utišala iRNK do istog stepena u cervikalnom, torakalnom i lumbarnom regionu što ukazuje na jednaku i dugoročnu distribuciju. Ova prihvaćena metoda isporuke leka će omogućiti tretiranje neurodegenerativne bolesti koje pogađaju neurone u kičmenoj moždini.
[0412] Di siRNK pokazuju veoma jedinstvenu ćelijsku distribuciju kada se injektiranju intrastriatalnu mozak (Slika 76). Fluorescentno obeležene di-siRNK deluju da se lokalizuju preferencijalno sa neuronima u korteksu. Ovo selektivno svojstvo je bilo specifično za ona jedinjenja i nije bilo istinito za druge siRNK konjugate, kao što je holesterol, što nije pokazalo preferenciju za tip ćelije.
[0413] Di-siRNK je pokazala lokalizaciju za vlaknaste trake u striatumu ali je prisutna u telima neuronskih ćelija u korteksu (Slika 77). Bez namere za ograničavanjem sa naučnom teorijom, pokretanje korteksa može biti preko difuzije ili može biti rezultat retrogradnog transporta striatalnim vlaknastim trakama. Teorija da je retrogradni transport delimično odgovoran je podržana činjenicom da su neke oblasti korteksa pokazale potpunu neuronsku penetraciju dok neuroni u susednim oblastima nisu pokazali vezu sa di-hsiRNK.
[0414] Intratekalna injekcija di-hsiRNK je proizvela slično impresivne rezultate za kičmenu moždinu (Slika 105A). Dok je chol-hsiRNK (originalno konjugovana hsiRNK) pokazala strmi gradijent distribucije sa relativno malim količinama koje dostižu sivu masu i motorne neurone, di-hsiRNK se uniformno distribuirala kroz kičmenu moždinu i ko-lokalizovala sa motornim neuronima (uvećano na Slici 105A).
[0415] Široka distribucija di-hsiRNK nakon jedne injekcije je povezana sa utišavanjem većim od 85% u striatumu, utišavanjem većim od 70% u korteksu (Slika 104B) i utišavanjem približno od 50% u kičmenoj moždini (Slika 105B). Dok su se značajne količine si-hsiRNK akumulirale vremenom u striatumu, korteks, jetra i bubrezi (Slika 104C), dokaz o inflamaciji ili neuronskoj degeneraciji nije detektovan pri najvećim testiranim dozama (tj., 400 µg ICV i 150 µg IT), što je prevazišlo minimalnu delotvornu dozu. Pri ovim nivoima, chol-hsiRNK je toksična. Na osnovu ovih podataka, di-hsiRNK je izabrana kao druga klasa hemije za detaljnu karakterizaciju, optimizaciju i validaciju. Detaljna karakterizacija di-hsiRNK će biti izvršena za određivanje odgovora na dozu, maksimalne tolerisane doze i terapeutskog indeksa.
Ćelijske, molekularne i biohemijske analize će se koristiti za dalje merenje in vivo distribucije i akumulacije jedinjenja i stepena regulacije ciljanog gena.
Primer 6. Dokaz da aksonski transport doprinosi Di-hsiRNK distribuciji u mozgu [0416] Preferencijalna isporuka di-hsiRNK u neurone, naročito distalno mestu injektiranja, je bila ohrabrujuća. Kod miševa intrastriatalno injektiranih sa Cy3-di-hsiRNK (Slika 95), smo detektovali Di-hsiRNK kod svake NeuN pozitivne ćelije (neuroni) korteksa ali ne i u drugim tipovima ćelijama koje nisu neuronske (npr., glijalnim). Jedna interpretacija ove opservacije je da su di-hsiRNK preferencijalno transportovane duž aksona do distalnih neurona. Zašto bi razgranati oligonukleotidi imali tako duboko dejstvo na njihovu distribuciju? Postavljena je
14
hipoteza da je uloga za kooperativno vezivanje, gde se jedna hsiRNK slabo vezuje za receptor a drugi nezavisni vezujući događaj promoviše internalizaciju (Alves ID, Ciano KA, Boguslavski V, Varga E, Salamon Z, Yamamura HI, Hruby VJ, Tollin G. Selectivity, cooperativity, and reciprocity in the interactions between the delta-opioid receptor, its ligands, and G-proteins. The Journal of biological chemistry. 2004; 279:44673-82. PMID: 15317820). Kooperativno vezivanje kovalentno povezanih hsiRNK može dramatično pojačati brzinu ćelijske apsorpcije i kao posledicu toga retenziju u tkivu. Ove i druge hipoteze će biti testirane i detaljna ispitivanja veze između strukture i aktivnosti di-hsiRNK će se izvršiti.
Primer 7. Dokazi PC-DHA i Di-hsiRNK konjugata: dve nove klase CNS aktivnih oligonukleotida.
[0417] Kao što je opisano u podacima od iznad, dva nova, hemijski udaljene klase terapeutskih siRNK, PC-DHA-hsiRNK i Di-hsiRNK, su dizajnirane da podrže široku distribuciju i potentno utišavanje gena u CNS tkivu nakon CSF infuzije. Di-hsiRNK deluje obećavajuće ali trenutno nema dovoljno podataka o bezbednosti i terapeutskom indeksu. PC-DHA-hsiRNK ima širok terapeutski prozor (Slika 103). Ovo je značajno zato što antismisao oligonukleotidi u hemijskim ispitivanjima za CNS indikacije imaju uzak terapeutski indeks.
[0418] Za smanjenje potencijalnog rizika, obe klase jedinjenja će biti detaljno procenjene. Cilj je da se postigne utišavanje gena veće od 70% pri dozi manjoj od 200 µg/injekciji, terapeutski indeks veći od 10 puta, i trajanje dejstva od 1 meseca do 3 meseca sa bolusnom injekcijom preko CSF. Razvoj jednostavne tehnološke platforme koja omogućava direktno i dugotrajno utišavanje u mozgu i kičmenoj moždini male životinje će značajno unaprediti oblast istraživanja neuronauke. Omogući će direktnu funkcionalnu analizu opsega novih ciljeva sa pretpostavljenim uključenjem u biologiji mozga i progresom neurodegenerativne bolesti. Ovde opisani podaci demonstriraju da hemija definiše distribuciju, efikasnost i bezbednost oligonukleotida. Hemijske varijante PC-DHA-hsiRNK i di-hsiRNK će se proceniti za identifikovanje skeleta sa većom efikasnošću i širim terapeutskim indeksima, svojstva koja su suštinska za buduće prevođenje ove tehnološke platforme na ljudska terapeutska sredstva. Na kraju, performanse nekoliko jedinjenja će biti validirane u uspostavljenim životinjskim modelima neurodegenerativnih bolesti, utišavanjem HTT u HD.
Primer 8. Karakterizacija PC-DHA i Di-hsiRNK distribucije, efikasnosti i bezbednosti u mozgu i kičmenoj moždini
Oligonukleotidna sinteza
[0419] HsiRNK i Di-hsiRNK će se sintetisati (0,2 grama, /- Cy3) i HPLC-prečistiti kao potpuno metabolički stabilne hsiRNK (uključujući 5'-E-VP kao terminalni fosfatni analog), što je praćeno karakterizacijom sa masenom spektrometrijom. Izvršen je skrining različitih veznika i optimalni skeleti za PC-DHA i di-hsiRNK konjugaciju su identifikovani.
Funkcionalizovane podloge će biti sintetisane kao što je prikazano na Slikama 93 i 94.
Koristiće se sledeća jedinjenja: HTT-10150 (HD) i PPIB-437 (kontrola održavanja domaćinstva). Brojevi označavaju poziciju ljudske iRNK ciljane od strane 5' nukleotida vodećeg lanca. Sva jedinjenja su prethodno identifikovana upotrebom optimizovanih bioinformatičkih parametara (Birmingham A, Anderson E, Sullivan K, Reynolds A, Boese Q, Leake D, Karpilow J, Khvorova A. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature protocols.2007; 2:2068-78. PMID: 17853862) i opsežnog eksperimentalnog skrininga. Svaki siRNK cilja i utišava odgovarajuću iRNK čoveka, miša i majmuna, što će olakšati budući klinički razvoj.
[0420] Dodatno standardnim sistemima oligonukleotidne sinteze, tj., Mermaid12 i Expedite, sposobnost RNK-sinteze srednje razmere (fundirano preko S10 grant programa), uključujući OligoPilot 100, preparativna HPLC i LC-MS visoke rezolucije su uspostavljene. Velike serije novih jedinjenja potrebnih za in vivo ispitivanja koja su predložena ispod će biti sintetisana.
Optimizacija načina davanja
[0421] Nekoliko načina davanja je poređeno i određeno je da bolusna infuzija preko CSF (ICV i IT infuzija) podržava najbolji stepen retenzije i distribucije jedinjenja u CNS tkivu. CSF isporuka ovim putevima je analogna lumbalnoj punkciji, klinički prihvatljivim načinom davanja. Uporedno poređenje retenzije u tkivu i efikasnosti je izvršeno kada su ekvivalentne doze isporučene bolusnom injekcijom ili sa ALZET pumpom u periodu od jedne nedelje. Značajno bolja retenzija u tkivu i efikasnost su primećeni sa bolusnim injekcijama sa podacima zabeleženim za ASO (Rigo F, Chun SJ, Norris DA, Hung G, Lee S, Matson J, Fey RA, Gaus H, Hua Y, Grundy JS, Krainer AR, Henry SP, Bennett CF. Pharmacology of a central nervous system delivered 2'-O-methoxyethyl-modified survival of motor neuron splicing oligonucleotide in mice and nonhuman primates. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2014; 350:46-55. PMID: 24784568; PMCID: PMC4056267). Bez namere za ograničavanjem sa naučnom teorijom, bolje performanse bolusnog davanja u odnosu na davanje pumpom bi moglo da bude povezano sa mehanizmom oligonukleotidne
14
apsorpcije. Na primer, neproduktivna oligonukleotidna padanja mogu biti zasićena brže sa bolusnom nego sa pumpnom infuzijom, što time omogućava da se višak oligonukleotida brže transportuje.
[0422] Za direktno kvantifikovanje nepromenjenog vodećeg lanca u tkivu, razvili smo i implementirali novu i kvantitativnu analizu hibridizacije peptidne nukleinske kiseline (PNA) (Slika 106). Analiza je bila veoma osetljiva, gde je granica detekcije bila manja od 10 fmola hsiRNK po gramu tkiva. HsiRNK metaboliti sa 5'-fosforilisaim i 5'-defosforilisanim pune dužine i delimično degradiranim vodećim lancem se mogu brzo kvantifikovati kao odvojeni maksimumi ili ramena na HPLC tragu. Upotrebom ove analize, kinetika retenzije vodećeg lanca u biopsijama punkcije od 2 mm uzetim iz regiona kičmene moždine i mozga će biti kvantifikovana.
[0423] Na osnovu prethodnog iskustva, akumulacija 1 do 5 µg oligonukleotida po gramu tkiva jednu nedelju nakon injekcije je obično dovoljna za podržavanje produktivnog utišavanje cilja (Slike 104B, 104C). Fluorescencija i PNA analize omogućavaju mapiranje distribucije i količine isporučene konjugovane hsiRNK. Ova ispitivanja će upotpuniti funkcionalne analize i uspostaviti osnovu za ispitivanja efikasnosti utišavanja.
Identifikovanje maksimalne tolerisane doze
[0424] U probnim ispitivanjima, 200 µg DHA-hsiRNK i di-hsiRNK je uspostavljeno kao bezbedna doza za intrastriatalnu injekciju (podaci za DHA su predstavljeni na Slikama 103B i 103C), 150 µg je uspostavljeno kao bezbedna doza za intratekalnu injekciju a 400 µg je uspostavljeno kao bezbedna doza za intracerebroventrikularnu injekciju. Počevši pri ovim nivoima, doza će se povećati u inkrementima od dva puta sve dok životinje pokazuju bilo kakve indikacije toksičnosti ili dok se granice rastvorljivosti od približno 20 nM za PC-DHA-hsiRNK i približno 50 nM za Di-hsiRNK ne dostignu. Tri nedelje nakon injektiranja (optimalno vreme potrebno da se vidi oligonukleotidna toksičnost), moždano tkivo će se sakupiti i broj i održivost neurona će se proceniti obeležavanjem neuronskih markera NeuN i DARPP-32 (Mullen RJ, Buck CR, Smith AM. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development (Cambridge, England).1992; 116:201-11. PMID: 1483388; Weyer A, Schilling K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. Journal of neuroscience research.2003; 73:400-9. PMID:
12868073; Ouimet CC, Miller PE, Hemmings HC, Jr., Walaas SI, Greengard P. DARPP-32, a
14
dopamine- and adenosine 3':5'-monophosphate-regulated phosphoprotein enriched in dopamine-innervated brain regions. III. Immunocytochemical localization. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 1984; 4:111-24. PMID: 6319625). Aktiviranje mikroalgija (urođena aktivacija imunog sistema) će se takođe proceniti obeležavanjem za IBA1 (Judge AD, Bola G, Lee AC, MacLachlan I. Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2006; 13:494-505. PMID: 16343994; Marques JT, Williams BR. Activation of the mammalian immune system by siRNAs. Nature biotechnology. 2005; 23:1399-405. PMID: 16273073). Za testiranje da li jedinjenja izazivaju povrati kratkotrajni inflamatorni odgovor, miševi će biti injektirani sa maksimalnom dozom koja se može tolerisati i aktivacija glija će biti ispitivana 6 sati nakon davanja. Završetak ovog ispitivanja će stvoriti podatke o maksimalnoj dozi koja se može tolerisati za dve nove klase terapeutskih hsiRNK koje su ovde opisane.
Procenjeni PC-DHA i Di-hsiRNK profili klirensa
[0425] Vreme zadržavanja RNK u CSF i krvi će se odrediti. Ponovljivo povlačenje CSF kod miševa nije izvodljivo, i zbog toga će se ispitivanja klirensa CSF vršiti na pacovima, podešavanjem doze u skladu sa time. 10 µl CSF će se uzeti 1, 6, 12 i 24 sata i 1 nedelju nakon davanja PC-DHA- i Di-hsiRNK upotrebom preklapajućih grupa životinja. Slično, 20 µL krvi će se sakupiti 5 i 30 min i 1, 4, 12, 24, 48, 72 i 96 nakon injektiranja. Za minimiziranje brige povezane za ponovljivo uzimanje krvi u kratkim vremenskim periodima i za minimiziranje broja životinja potrebnih za dobijanje preciznih podataka, koristiće se kateterizacija vratne vene.
[0426] Na osnovu prethodnih farmakokinetičkih ispitivanja sa povezanim siRNK jedinjenjima, očekuje se da će se primetiti kinetika dvofaznog klirensa, gde se brza faza završava u roku od četiri do šest sati. Na osnovu probnih ispitivanja, bilo bi potrebno nekoliko meseci za potpuni klirens leka. Međutim, jednonedeljno probno ispitivanje je dovoljno za procenjivanje profila klirensa. Završetak ovog ispitivanja će stvoriti podatke o profilima klirensa za dve nove klase terapeutskih hsiRNK koje su ovde opisane.
Uspostavljanje odgovora na dozu
[0427] Ispitivanja odgovora na dozu će se izvršiti kako bi se odredila optimalna doza za utišavanje u regionima mozga koji pokazuju značajnu oligonukleotidnu akumulaciju.
14
Eksperimenti će se izvršiti slično onima predstavljenim na Slikama 103, 104 i 105. Biopsije sa punkcijom od 3 mm će se uzeti iz mozga i kičme miševa injektiranih sa povećavajućim dozama PC-DHA i Di-hsiRNK, nivoi HTT ili kontrolne iRNK će se meriti upotrebom QUANTIGENE® analize.
[0428] QUANTIGENE® je visoko osetljiva analiza bazirana na 96 udubljenja koja koristi amplifikaciju kako bi se direktno detektovala iRNK u tkivu ili ćelijskim lizatima. Protokol koji opisuje automatizovanu visoko-propusnu (sa 96 udubljenja) verziju analize koji direktno povezuje TissueLyser i QUANTIGENE ® je nedavno objavljen (Coles AH, Osborn MF, Alterman JF, Turanov AA, Godinho BM, Kennington L, Chase K, Aronin N, Khvorova A. A High-Throughput Method for Direct Detection of Therapeutic Oligonucleotide-Induced Gene Silencing In Vivo. Nucleic acid therapeutics.2015. PMID: 26595721). Zbog toga, simultana kvantifikacija HTT i iRNK za održavanje domaćinstva se može izvršiti za mnogo tkiva i/ili životinja. U probnim ispitivanjima, određeno da je osam miševa po grupu dovoljno za detektovanje 40% redukcije ispoljavanja ciljanog gena sa 80% pouzdanošću. Id.
[0429] Nivoi iRNK HTT će biti normalizovani do kontrole iRNK za održavanje domaćinstva. Veštačke CSF i kontrole koje nisu za ciljanje (NTC) istog hemijskog sastava će se koristiti za kontrolisanje događaja koji nisu specifični za sekvencu. NTC hsiRNK će se injektirati samo pri najvišim netoksičnim koncentracijama kako bi se ograničio broj korišćenih životinja. Iako je NTC bolja negativna kontrola, druga ciljajuća hsiRNK (npr., PPIB-ciljanje) će pružiti podatke o utišavanje za dva različita cilja sa istim brojem životinja. Potvrđivanje utišavanja pri nivou proteina je od suštinskog značaja pre prelaska na životinjske modele bolesti, tako da će se Western blot analiza izvršiti na sličan način kao što je izvršeno za chol-hsiRNK (Alterman JF, Hall LM, Coles AH, Hassler MR, Didiot MC, Chase K, Abraham J, Sottosanti E, Johnson E, Sapp E, Osborn MF, Difiglia M, Aronin N, Khvorova A. Hydrophobically Modified siRNAs Silence Huntingtin mRNA in Primary Neurons and Mouse Brain.
Molecular therapy Nucleic acids.2015; 4:e266. PMID: 26623938). Završetak ovog ispitivanja bi trebalo da identifikuje doze koje omogućavaju utišavanje funkcionalnog gena u različitim regionima CNS za dve nove klase terapeutske hsiRNK koje su ovde opisane.
PC-DHA i Di-hsiRNK trajanje utišavanja nakon jednog davanja
[0430] Većina neurodegenerativnih poremećaja i modela bolesti predstavljaju kasno nastupanje simptoma (npr., 3 do 9 meseci kod miševa). Trajanje utišavanja od jedne injekcije
14
i broj injekcija koji će biti potreban za podržavanje 6 do 9 meseci utišavanje će biti određeni. Uopšteno, siRNK indukovano utišavanje kod ćelija koje se ne dele se očekuje da će trajati mesecima. Polu raspad dodatog RISC kompleksa je nekoliko nedelja (Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews Drug discovery. 2009; 8:129-38. PMID: 19180106) i manje od 1.000 dodatih RISC molekula po ćeliji je dovoljno da indukuje utišavanje (Stalder L, Heusermann W, Sokol L, Trojer D, Wirz J, Hean J, Fritzsche A, Aeschimann F, Pfanzagl V, Basselet P, Weiler J, Hintersteiner M, Morrissey DV, Meisner-Kober NC. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMBO journal.2013; 32:1115-27. PMID:
23511973; PMCID: 3630355; Pei Y, Hancock PJ, Zhang H, Bartz R, Cherrin C, Innocent N, Pomerantz CJ, Seitzer J, Koser ML, Abrams MT, Xu Y, Kuklin NA, Burke PA, Sachs AB, Sepp-Lorenzino L, Barnett SF. Quantitative evaluation of siRNA delivery in vivo. Rna. 2010; 16:2553-63. PMID: 20940339; PMCID: 2995415).
[0431] Pored toga, FM-hsiRNK mogu pružiti druge pogodnosti. Ćelija obično zauzima milione hsiRNK ali velika većina je zarobljena u lizozomima. Konvencionalno, delimično modifikovane hsiRNK zarobljene u lizozomima su degradirane, ali FM-hsiRNK nisu. Kao rezultat, FM-hsiRNK tranzitno zarobljena u lizozomima formira unutarćelijski „depo“ koji polako oslobađa FM-hsiRNK, što ih čini dostupnim za RISC dodavanje. Podaci od Alnylam GalNAc probe ukazuje da optimizovana isporuka u jetru pruža efikasnost do šest meseci od jedne subkutane injekcije. Ovde predstavljeni podaci su u skladu sa ovom opservacijom; jedna FM-hsiRNK injekcija pruža maksimalno utišavanje u trajanju od bar jednog meseca (Slika 2D).
[0432] Za merenje retenzije hsiRNK i trajanja utišavanja, tri miša će biti injektirana sa najvećom dozom PC-DHA- ili di-hsiRNK koja se može tolerisati i nivoi nepromenjenog vodećeg lanca u tkivima će biti izmereni za 1, 2 i 4 nedelje i 2, 3, 4 i 6 meseci upotrebom PNA analize (Slika 106). Čim nivoi nepromenjenih vodećih lanaca padnu ispod 1 µg hsiRNK po gramu tkiva, ispitivanje će se završiti. Nivoi iRNK HTT će biti izmereni u vremenskim tačkama gde je koncentracija vodećeg lanca iznad jednog µg po gramu tkiva u odvojenom ispitivanju sprovedenom (n=8) da pouzdano detektuje efekte utišavanja. Iako se očekuje da će trajanje utišavanje biti bar tri meseca, eksperimentalna validacija je poželjna.
Ispitivanje mehanizama ćelijske apsorpcije i saobraćanje Di-hsiRNK
14
[0433] Di-razgranate hsiRNK su pokazale značajno pojačanu retenziju i distribuciju u CNS tkivima u poređenju sa jednakom dozom pojedinačne veznikom vezane siRNK, što ukazuje da kooperativno vezivanje kovalentno povezanim siRNK ili receptor dimerizacijom navodi ćelijsku apsorpciju (Slika 95C). Diferencijalna apsorpcija će biti vizualizovana i okarakterisana upotrebom kombinacije TESM mikroskopije (vremenski određena epifluorescentna strukturna mikroskopija) i masene spektrometrije.
Razvijanje „antidota“ za HTT jedinjenje
[0434] Pristupi genske terapije (tj., permanentno utišavanje gena) se trenutno razmatraju za tretiranje neurodegenerativnih poremećaja, tako da trajanje utišavanja od 1 do 6 meseci deluje relativno bezbedno. Bez obzira, „antidoti“ za vraćanje utišavanja bi zadovoljili bezbednosne brige. „Antidoti“ su takođe odličan alat za ispitivanje funkcije gena in vivo, što omogućava testiranje potrebnog trajanja koliko dugo se gen mora regulisati na dole kako bi se proizveli povezani fenotipovi.
[0435] Baveći se istim pitanjima od FDA, Alnylam je razvio tehnologiju koja se naziva „REVERSIR®“, koja omogućava vraćanje toka dugoročnog utišavanja. Koncept obuhvata razvijanje visoko-afinitetnog antismisao (LNA i 2'-O-metil/dezoksi) MIXMER® koji je potpuno komplementaran sa regionom zasejavanja funkcionalne hsiRNK. WA panel hsiANTIDOTE koji cilja HTT10150 (i na kraju druga jedinjenja) će biti dizajniran i sintetisan i njihova sposobnost da vrate tok utišavanja in vitro i in vivo će biti procenjen (Slika 96). Antidoti će biti sintetisani u kontekstu PC-DHA konjugata kako bi se omogućila slična distribuciona svojstva kao i kod PC-DHA-hsiRNK. Završetak ovog ispitivanja će stvoriti antidote protiv glavnih hsiRNK jedinjenja kako bi se omogućilo vraćanje toka njihove in vivo aktivnosti, ukoliko je to poželjno.
Alternativni pristup: testiranje da li PC-DHA konjugacija i Di-razgranata struktura poboljšavanju antismisao-posredovano utišavanje u mozgu
[0436] Antismisao oligonukleotidi za tretiranje neurodegenerativnih poremećaja su u klinički naprednim fazama razvoja (Evers MM, Toonen LJ, van Roon-Mom WM. Antisense oligonucleotides in therapy for neurodegenerative disorders. Advanced drug delivery reviews.
2015. PMID: 25797014; Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS, Hung G, Bennett CF, Cleveland DW. Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transient repression
1
of huntingtin synthesis. Neuron.2012; 74:1031-44. PMID: 22726834; PMCID: PMC3383626). IONIS-HTTRxje generacija 2.5 antismisao hemije u vlasništvu Ionis i generalno nije dostupna akademskoj zajednici.
[0437] Visoko potentna zaključana nukleinska kiselina (LNA) GamperR ciljanje HTT je razvijeno, međutim. Za testiranje da li PC-DHA konjugacija i/ili di-grananje može poboljšati distribuciju i retenziju antismisao oligonukleotida u tkivu mozga i redukovati njihove efektivne doze, PC-DHA. i di-LNA GapmeRs ciljanje HTT će biti sintetisano.
[0438] Završavanje ovog primera će rezultovati u potpunoj karakterizaciji dva nova oligonukleotidna konjugata (tj., PC-DHA i di-hsiRNK) koji su ovde opisani u CNS (mozak i kičmena moždina), uključujući optimalni put isporuke, klirens leka i retenziju, bezbednost, odgovor na dozu i trajanje dejstva. Ovde opisana eksperimentacija će omogućiti upotrebu ovih hemikalija za utišavanje gena i ispitivanje validacije cilja u CNS in vivo kao i za pružanje čvrste podloge prema razvoju novih terapija za HD.
Primer 9. Sinteza i karakterizacija panela PC-DHA i Di-hsiRNK hemijskih varijanti za poboljšanje distribucije i terapeutskog indeksa
[0439] Ovde predstavljeni podaci (Slike 92, 103, 104 i 105) ukazuju da će PC-DHA- i dihsiRNK hemija biti dovoljna da dostigne cilj trajanja dejstva od 1 meseca do 3 meseca u kičmenoj moždini, striatumu i korteksu, što je dovoljno za funkcionalna ispitivanja genomike in vivo. Ovo samo je dovoljno dostignuće, ali buduća translacija platforme ove tehnologije prema ljudskim terapeutskim sredstvima predstavlja drugi nivo kompleksnosti. Pre nego što prevedemo tehnologiju, optimizovaćemo hemiju za (i) najširi mogući terapeutski indeks i (ii) pojačanu distribuciju za podržavanje isporuke u velike mozgove.
[0440] Blage promene u hemijskom skeletu konjugata mogu duboko uticati na distribuciju u tkivu kao što je demonstrirano funkcionalizovanjem DHA sa fosfatidilholinom (Slika 92). Kapitalizacija na ovim sintetičkim platformama, panel PC-DHA- i di-hsiRNK varijanti će biti sintetisan kako bi se dalje optimizovao terapeutski indeks i šira distribucija u tkivu.
PC-DHA optimizacija
[0441] Postoje dve suštinske komponente za PC-DHA strukturu: fosfatidilholin i DHA (videti strukturu na Slici 92). Ovde opisati pristup sinteze (Slike 93 i 94) će omogućiti ovim
1 1
hemijama da se nezavisno menjaju. Postoji malo ili ni malo informacija u literaturi o vezi između strukture i funkcije oligonukleotidnih konjugata, ali velika količina informacija postoji o opisivanju kako polimerne strukture i lipidna jedinjenja utiču na formiranje lipidnih čestica<48>. Ispitivanja ukazuju da dužina lipida ima glavni uticaj na ukupnu efikasnost formulacije.
[0442] Polinezasićene veze su suštinske za pojačanu hsiRNK distribuciju u CNS tkivu.
Konjugacija DCA, potpuno zasićenog analoga DHA, ne promoviše široku distribuciju u CNS. Konjugacija EPA, koji je dva ugljenika kraći od DHA, dovodi do zanimljivog profila distribucije, ali efikasnost još uvek nije testirana. Panel fosfatidilholin-modifikovanih polinezasićenih varijanti masnih kiselina, koji menja dužinu lipidnog repa od 10 do 22 ugljenika i broj polinezasićenih veza od 0 do 4 će biti sintetisan. Prekursori za ove reakcije sinteze su svi komercijalno dostupni. Ova jedinjenja će otkriti kako dužina lipidnog repa i broj polinezasićenih veza utiče na oligonukleotidnu distribuciju u CNS.
[0443] Drugo, sistematsko zamenjivanje holin entiteta će se izvršiti za opseg modifikacija, većinom u korist prirodnih hemijskih skeleta, npr., fosfatidilserina, fosfatidilinozitola i fosfatidil amina. Većina sinteze se može izvršiti paralelno, stvarajući biblioteku jedinjenja sa sastavom fiksiranog lipidnog repa i različitim glavnim grupama. Ova biblioteka će se koristiti za definisanje značaja glavnih grupa na in vivo performanse hsiRNK konjugata.
[0444] Dobro je poznato da, bez obzira na prirodu hemije ili formulacija za isporuku, velika većina internalizovanih oligonukleotida nije biološki dostupna. Endosomolitički, peptidnomodifikovani polimeri su korišćeni od strane Arrowhead Research Corporation (Wong SC, Klein JJ, Hamilton HL, Chu Q, Frey CL, Trubetskoy VS, Hegge J, Wakefield D, Rozema DB, Lewis DL. Co-injection of a targeted, reversibly masked endosomolytic polymer dramatically improves the efficacy of cholesterol-conjugated small interfering RNAs in vivo. Nucleic acid therapeutics. 2012; 22:380-90. PMID: 23181701) za pojačavanje sistemske efikasnosti zajedno datih holesterol-modifikovanih siRNK jedinjenja. Nastavljajući se na ovaj koncept, biblioteka veznika sa različitim brojevima i sastavima endosomolitičkih peptida je sintetisana. Većina varijanti nije imala uticaj na chol-hsiRNK efikasnost, ali najbolje vodeće (Slika 97A) pojačano utišavanje nakon pasivne apsorpcije je veće od 10 puta (Slika 97B). Bez namere za vezivanjem za naučnu teoriju, pojačana aktivnost je verovatno rezultat od povećane bioraspoloživnosti internalizovane chol-hsiRNK, kako modifikovani veznik ne povećava
1 2
efikasnost lipidno-modifikovane apsorpcije (Slika 97B) ili ukupnu količinu internalizovanog oligonukleotida. Ovaj veznik će biti kombinovan sa najoptimalnijom kombinacijom dužine lipida i glavne grupe.
Di-hsiRNK optimizacija
[0445] Dve hsiRNK u di-hsiRNK jedinjenju su asimetrično povezane: jedna sa fosfatnom vezom a druga sa fosforoamidat vezom (Slike 93, 94 i 103A). Uspostavljanje da li je fosforoamidat veza neophodna, di-razgranato jedinjenje u kome su hsiRNK povezana za veznik preko fosfata se trenutno testira (modifikovana šema sinteze bazirana na onoj sa Slika 93 i 94). Pokazujući da fosforamidat veza nije suštinska bi pojednostavilo ispitivanje veze struktura-aktivnost, kako se može koristiti veliki broj komercijalno dostupnih prekursora. Bez obzira na to, potrebe za fosfoamid vezom bi bile interesantne zato što je fosfoamid mnogo nestabilniji u kiselim uslovima i očekuje se da promoviše oslobađanje jedinjenja iz endozoma.
[0446] Panel varijanti će biti sintetisan, testiranjem sledećih parametara: broja hsiRNK (2, 3, 4 ili 6, upotrebom razdelnika sa dve ili tri grane koji je dostupan od Glen Research); i hemijske prirode veznika koji povezuje oligonukleotide (TEG, zasićeni i nezasićeni alkil lanac, naelektrisani, nenaelektrisani, dužine od 3 do 30 ugljenika i protonske sunđere).
Minimalni broj fosforotiat veza koji je potreban za apsorpciju će takođe biti identifikovan. Već je određeno da su fosforotiat veze suštinske za pasivnu apsorpciju i efikasnost hsiRNK; tako da se sumnja da kooperativno vezivanje dva fosforotiat repa navodi pojačanu distribuciju i apsorpciju Di-hsiRNK. Međutim, fosforotioat veze takođe navode toksičnost antismisao oligonukleotida (Geary RS, Norris D, Yu R, Bennett CF. Pharmacokinetics, biodistribution and cell uptake of antisense oligonucleotides. Advanced drug delivery reviews.2015;87:46-51). Zbog toga, optimizacija i redukcija broja fosforotioata je razuman put prema pojačavanja terapeutskog indeksa.
Procenjivanje efikasnosti PC-DHA- i Di-hsiRNK varijanti
[0447] Eksperimenti kulture tkiva će se koristiti za potvrđivanje bezbednosti i efikasnog uvođenja u RISC kompleks. Svako jedinjenje će zatim biti injektirano sa ICV pri minimalno efikasnoj i maksimalno tolerisanoj dozi uspostavljenoj kao što je ovde opisano. Jedinjenja koja su efikasna pri nižim koncentracijama i/ili koja nisu toksična pri višim koncentracijama će biti izabrana za detaljna ispitivanja. Na kraju, sposobnost jedinjenja koja najviše obećavaju da se distribuiraju u velikom mozgu (npr., od ovce) će se proceniti. Model ovce će biti
1
dizajniran za procenjivanje distribucije AAV-htt vektora. PNA analiza koja je ovde opisana će se koristiti za merenje nivoa jedinjenja u biopsijama iz različitih regiona mozga ovce nakon bolusne ICV infuzije.
[0448] Završetak ovog primera se očekuje da: (i) da informacije o hemijskim strukturama koje definišu in vivo efikasnost PC-DHA- i Di-hsiRNK; i (ii) stvori verzije ovih jedinjenja sa poboljšanom distribucijom, efikasnošću i terapeutskim indeksom.
Primer 10. Razvijanje kandidata predkliničkih jedinjenja za modele Hantingtonove bolest
Procenjivanje novih konjugata za hsiRNK HTT10150 u životinjskim modelima Hantingtonove bolesti
[0449] Hiperfunkcionalna, FM-hsiRNK za Htt , HTT-10150, je ovde opisana. Više HD životinjskih modela je aktuelno u laboratoriji (Chang R, Liu X, Li S, Li XJ. Transgenic animal models for study of the pathogenesis of Huntington's disease and therapy. Drug design, development and therapy.2015; 9:2179-88. PMID: 25931812; PMCID:
PMC4404937), uključujući YAC128 (Hodgson JG, Agopyan N, Gutekunst CA, Leavitt BR, LePiane F, Singaraja R, Smith DJ, Bissada N, McCutcheon K, Nasir J, Jamot L, Li XJ, Stevens ME, Rosemond E, Roder JC, Phillips AG, Rubin EM, Hersch SM, Hayden MR. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron.1999; 23:181-92. PMID:
10402204), BACHD (Hult S, Soylu R, Bjorklund T, Belgardt BF, Mauer J, Bruning JC, Kirik D, Petersen A. Mutant huntingtin causes metabolic imbalance by disruption of hypothalamic neurocircuits. Cell metabolism.2011;13:428-39. PMID: 21459327; Hult Lundh S, Nilsson N, Soylu R, Kirik D, Petersen A. Hypothalamic expression of mutant huntingtin contributes to the development of depressive-like behavior in the BAC transgenic mouse model of Huntington's disease. Human molecular genetics. 2013; 22:3485-97. PMID: 23697793; Gray M, Shirasaki DI, Cepeda C, Andre VM, Wilburn B, Lu XH, Tao J, Yamazaki I, Li SH, Sun YE, Li XJ, Levine MS, Yang XW. Full-length human mutant huntingtin with a stable polyglutamine repeat can elicit progressive and selective neuropathogenesis in BACHD mice. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience.2008;
28:6182-95. PMID: 18550760; PMCID: PMC2630800), i nedavno uspostavljeni nizovi alela uključujući Q140 (veb sajt: chdifoundation.org), će se koristiti.
1 4
[0450] Na osnovu optimalnih parametara identifikovanih kao što je ovde opisano, bolusna ICV injekcija HTT-10150 će se dati svakom mišijem modelu Hantingtonove bolesti i miševi će biti analizirani za utišavanje Htt, ponašanje Hantingtonove bolesti i/ili nastupanje fenotipova povezanih sa Hantingtonovom bolešću i validirane histološke parametre. Komplet validiranih analiza će biti dizajniran da detektuje diferencijalno ispoljavanje YAC128 i Q140 mutirane iRNK i iRNK Htt divljeg tipa. Panel analiza ponašanja je dizajniran za procenjivanje motornih funkcija, uključujući rotarod, povišenu platformu, i analize otvorenog polja (Sah DW, Aronin N. Oligonucleotide therapeutic approaches for Huntington disease. The Journal of clinical investigation. 2011; 121:500-7. PMID: 21285523; PMCID: 3026739;
Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS, Hung G, Bennett CF, Cleveland DW. Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron. 2012; 74:1031-44. PMID: 22726834; PMCID: PMC3383626). Jedna grupa miševa će se tretirati pri starosti od tri meseca kako bi se procenila prevencija bolesti a druga grupa miševa će se tretirati pri starosti od šest meseci kako bi se procenilo vraćanje toka bolesti. HTT agregati će biti procenjeni imunohistohemiskim obeležavanjem upotrebom komercijalno dostupnih anti-poliglutaminskih antitela (3B5H10). HTT10150 hsiRNK konjugati će biti ponovo dati ukoliko je neophodno. Kontrolne grupe će obuhvatati miševe injektirane sa PBS i kontrolna jedinjenja koja nisu ciljana koja imaju identičnu hemiju kao HTT-10150 hsiRNK konjugat. Najbolji pravac će biti ponovno testiranje nezavisno sa drugom grupom u nekoliko modela ponašanja Hantingtonove bolesti.
[0451] Završetak ovog primera, zajedno sa ispitivanjima efikasnosti, bezbednosti i trajanja dejstva, će stvoriti niz podataka koji je dovoljan da pokrene optimizovanu hsiRNK-10150 u predklinički razvoj. Trenutno, najbolji dostupni program za oligonukleotidno-bazirano tretiranje Hantingtonove bolesti je 2'-O-metoksietil GapmeR (Id.), što će se koristiti kao reper. IONIS-HTTRxjedinjenje je nedavno započelo fazu 1 kliničkih ispitivanja gde su pacijenti primili bolusnu kičmenu injekciju i redukcija nivoa HTT u CSF služi kao biomarker za dokazivanje koncepta. Ovo uspostavlja klinički put ka napred pri razvoju oligonukleotidnih terapeutskih sredstava za Hantingtonovu bolesti. Inicijalno, planirano je da se utišaju i mutirani i divljeg tipa Htt, slično IONIS pristupu. Ovde opisani skelet će se takođe koristiti za stvaranje jedinjenja koja selektivno utišavaju mutirani HTT diskriminacijom SNP. Zaista, pet SNP alela je povezano za toksično CAG proširenje kod 75% pacijenata sa mutacijama Hantingtonove bolesti (Pfister EL, Kennington L, Straubhaar J, Wagh S, Liu W, DiFiglia M,
1
Landwehrmeyer B, Vonsattel JP, Zamore PD, Aronin N. Five siRNAs targeting three SNPs may provide therapy for three-quarters of Huntington's disease patients. Current biology : CB.
2009;19:774-8. PMID: 19361997; PMCID: PMC2746439).
[0452] Obelodanjivanje će koristiti, ukoliko nije drugačije ukazano, konvencionalne tehnike imunologije, molekularne biologije i ćelijske biologije, koje su dobro poznate u struci.
[0453] Predmetno obelodanjivanje se takođe odnosi na tehnike koje su dobro poznate u oblasti molekularne biologije i isporuci leka. Ove tehnike obuhvataju ali nisu ograničene na, tehnike koje su opisane u sledećim publikacijama:
Atwell i dr. J. Mol. Biol.1997, 270: 26-35;
Ausubel i dr. (ured.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley &Sons, NY (1993);
Ausubel, F.M. i dr. ured., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X);
CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen i Ball (ured.), Wiley, New York (1984);
Giege, R. i Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, a Practical Approach, 2. izd., str.20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);
Goodson, u MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, tom 2, str.115-138 (1984);
Hammerling, i dr., u: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981;
Harlow i dr. , ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.1988);
Kabat i dr., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) i (1991);
Kabat, E.A., i dr. (1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikacija br. 91-3242;
Kontermann i Dubel ured., ANTIBODY ENGINEERING (2001) Springer-Verlag. New York. 790 str. (ISBN 3-540-41354-5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);
1
Lu i Weiner ured., CLONING AND EXPRESSION VECTORS FOR GENE FUNCTION ANALYSIS (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA.298 str. (ISBN 1-881299-21-X).
MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer i Wise (ured.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974);
Old, R.W. & S.B. Primrose, PRINCIPLES OF GENE MANIPULATION: AN INTRODUCTION TO GENETIC ENGINEERING (3. izd.1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 str. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J. i dr. ured., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2. izd.
1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Tomovi.1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J.R.
Robinson, ured., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
Winnacker, E.L. FROM GENES TO CLONES: INTRODUCTION TO GENE TECHNOLOGY (1987) VCH Publishers, NY (prevedeno od strane Horst Ibelgaufts). 634 str. (ISBN 0-89573-614-4).
1

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. RNK molekul koji je dužine između 15 i 35 baza, koji sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1) za upotrebu u terapiju za suzbijanje ispoljavanja Hantingtin (HTT) gena.
2. Upotreba RNK molekula koji je dužine između 15 i 35 baza, koji sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1) za suzbijanje ispoljavanja Hantingtin (HTT) gena u ćeliji in vitro.
3. RNK molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili upotreba RNK molekula prema patentnom zahtevu 2, gde je navedeni molekul jednolančana (ss) RNK ili dvolančana (ds) RNK.
4. RNK molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili upotreba RNK molekula prema patentnom zahtevu 2, gde je navedeni RNK molekul dsRNK koji sadrži smisao lanac i antismisao lanac, gde antismisao lanac sadrži region komplementarnosti koji je potpuno komplementaran sa 5' CAGUAAAGAGAUUAA 3' (SEQ ID NO:1).
5. RNK molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili upotreba RNK molekula prema patentnom zahtevu 2, gde je navedeni RNK molekul dsRNK i gde je navedena dsRNK dužine između 30 i 35 baznih parova.
6. RNK molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili upotreba RNK molekula prema patentnom zahtevu 2, gde je navedeni RNK molekul dsRNK i gde navedena dsRNK sadrži bar jedan modifikovani nukleotid.
7. Vektor za upotrebu u terapiji za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji in vivo, gde navedeni vektor sadrži regulatornu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK molekul kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6 i gde navedeni RNK molekul, nakon dolaska u kontakt sa ćelijom koja ispoljava navedeni HTT gen, suzbija ispoljavanje navedenog HTT gena za bar 20%.
8. Upotreba vektora za suzbijanje ispoljavanja HTT gena u ćeliji in vitro, gde navedeni vektor sadrži regulatornu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK molekul kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, gde navedeni RNK molekul, nakon dolaska u kontakt sa ćelijom koja ispoljava navedeni HTT gen, suzbija ispoljavanje navedenog HTT gena za bar 20%.
9. Vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili upotreba vektora prema patentnom zahtevu 8, gde je navedeni vektor rekombinantni adeno asocirani virusni vektor.
10. Rekombinantni adeno asocirani virus (rAAV) za upotrebu u terapiji za suzbijanje ispoljavanja HTT gena, koji sadrži RNK molekul ili vektor kao što je definisano u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
11. Farmaceutski sastav za upotrebu u terapiji za suzbijanje ispoljavanja HTT gena, koji sadrži dsRNK kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva od 3 do 6, vektor kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 7 ili 9 ili rAAV kao što je definisano u patentnom zahtevu 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. RNK molekul za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 9 ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, koji se daju u mozak pacijenta.
13. RNK molekul, vektor ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, koji se daju intrastriatalnom infuzijom.
14. RNK molekul, vektor ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, gde davanje u mozak izaziva smanjenje iRNK HTT gena u striatumu.
15. RNK molekul, vektor ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, gde davanje u mozak izaziva smanjenje iRNK HTT gena u korteksu.
1
RS20200929A 2015-04-03 2016-04-01 Oligonukleotidna jedinjenja za ciljane irnk hantingtina RS60762B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562142731P 2015-04-03 2015-04-03
US201662289274P 2016-01-31 2016-01-31
PCT/US2016/025722 WO2016161374A1 (en) 2015-04-03 2016-04-01 Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna
EP16716412.8A EP3277814B1 (en) 2015-04-03 2016-04-01 Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60762B1 true RS60762B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=55752785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200929A RS60762B1 (sr) 2015-04-03 2016-04-01 Oligonukleotidna jedinjenja za ciljane irnk hantingtina

Country Status (18)

Country Link
US (5) US9809817B2 (sr)
EP (2) EP3766973A1 (sr)
JP (5) JP7009356B2 (sr)
CN (2) CN107980062B (sr)
AU (4) AU2016244027B2 (sr)
CA (1) CA2980337A1 (sr)
CY (1) CY1123289T1 (sr)
DK (1) DK3277814T3 (sr)
ES (1) ES2808750T3 (sr)
HR (1) HRP20201200T1 (sr)
HU (1) HUE050441T2 (sr)
LT (1) LT3277814T (sr)
PL (1) PL3277814T3 (sr)
PT (1) PT3277814T (sr)
RS (1) RS60762B1 (sr)
SI (1) SI3277814T1 (sr)
SM (1) SMT202000454T1 (sr)
WO (1) WO2016161374A1 (sr)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2715289C (en) 2008-02-11 2019-12-24 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified rnai polynucleotides and uses thereof
EP2342340A1 (en) 2008-09-22 2011-07-13 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
WO2010059226A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of map4k4 through rnai
CN102282155B (zh) 2008-12-02 2017-06-09 日本波涛生命科学公司 磷原子修饰的核酸的合成方法
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
RU2612521C2 (ru) 2009-07-06 2017-03-09 Онтории, Инк. Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
CN103200945B (zh) 2010-03-24 2016-07-06 雷克西制药公司 眼部症候中的rna干扰
EP3560503B1 (en) 2010-03-24 2021-11-17 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in dermal and fibrotic indications
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
CN103796657B (zh) 2011-07-19 2017-07-11 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
CA2879066C (en) 2012-07-13 2019-08-13 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
PL2872485T3 (pl) 2012-07-13 2021-05-31 Wave Life Sciences Ltd. Asymetryczna grupa pomocnicza
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
CN106061488B (zh) 2013-12-02 2021-04-09 菲奥医药公司 癌症的免疫治疗
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
BR112016016400A2 (pt) 2014-01-16 2017-10-03 Wave Life Sciences Ltd Composições de oligonucleotídeos quiralmente controlados, seu uso, sua composição farmacêutica, e métodos
WO2015168108A2 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating cancer using nucleic targeting mdm2 or mycn
US10900039B2 (en) 2014-09-05 2021-01-26 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting Tyr or MMP1
KR20230145206A (ko) 2014-11-14 2023-10-17 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
PL3277814T3 (pl) 2015-04-03 2020-11-30 University Of Massachusetts Związki oligonukleotydowe ukierunkowane na mrna huntingtyny
RS62672B1 (sr) 2015-04-03 2021-12-31 Univ Massachusetts Oligonukleotidna jedinjenja za tretman preeklampsije i drugih angiogenskih poremećaja
US20160319278A1 (en) 2015-04-03 2016-11-03 University Of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
US10808247B2 (en) 2015-07-06 2020-10-20 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
EP3862005A1 (en) 2015-07-06 2021-08-11 Phio Pharmaceuticals Corp. Nucleic acid molecules targeting superoxide dismutase 1 (sod1)
IL320434A (en) 2015-07-22 2025-06-01 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide preparations and methods
WO2017030973A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
WO2017070151A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
US10478503B2 (en) * 2016-01-31 2019-11-19 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides
JP2019513371A (ja) 2016-04-01 2019-05-30 アビディティー バイオサイエンシーズ エルエルシー 核酸ポリペプチド組成物とその使用
EP3452596A4 (en) 2016-05-04 2020-03-18 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
KR102427379B1 (ko) * 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US11299733B2 (en) 2016-07-15 2022-04-12 University Of Massachusetts Process of delivering small RNAs to sperm
CA3033368A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
ES2912270T3 (es) * 2016-11-23 2022-05-25 Mayo Found Medical Education & Res Transporte de productos biológicos por medio de partículas
CN110121558B (zh) * 2016-11-28 2023-06-13 日商那帕洁制药股份有限公司 化学修饰siRNA
DK3607069T3 (da) * 2017-04-05 2022-11-21 Silence Therapeutics Gmbh Produkter og sammensætninger
US12544344B2 (en) 2017-04-19 2026-02-10 Phio Pharmaceuticals Corp. Topical delivery of nucleic acid compounds
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
JP2020518259A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ハンチントン病治療組成物および方法
CA3065523A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
JP2020522510A (ja) * 2017-06-02 2020-07-30 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法
JP7406793B2 (ja) * 2017-06-23 2023-12-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法
EP3691657A4 (en) 2017-10-04 2021-07-21 Avidity Biosciences, Inc. NUCLEIC ACID POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF
TW202413649A (zh) 2017-10-16 2024-04-01 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP3735252A4 (en) * 2018-01-04 2021-10-06 Avidity Biosciences, Inc. HETERODUPLEX NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF
CN111954548A (zh) * 2018-02-21 2020-11-17 亚克安娜生命科学有限公司 流体递送系统和方法
EP3769769A4 (en) * 2018-03-19 2022-05-04 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University NUCLEIC ACID WITH REDUCED TOXICITY
SG11202009877XA (en) 2018-04-12 2020-11-27 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
EP3781677A4 (en) 2018-04-16 2022-01-19 University of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED GENE EDITTING
US12391942B2 (en) 2018-05-11 2025-08-19 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
WO2020033899A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 University Of Massachusetts Modified oligonucleotides targeting snps
US11279930B2 (en) 2018-08-23 2022-03-22 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
CN113614232A (zh) 2019-01-18 2021-11-05 马萨诸塞大学 动态药代动力学修饰锚
CN113924364A (zh) * 2019-03-08 2022-01-11 罗格斯新泽西州立大学 治疗亨廷顿病的组合物和方法
US11820985B2 (en) * 2019-03-26 2023-11-21 University Of Massachusetts Modified oligonucleotides with increased stability
US11629347B2 (en) * 2019-05-06 2023-04-18 University Of Massachusetts Anti-C9ORF72 oligonucleotides and related methods
US12006499B2 (en) 2019-06-06 2024-06-11 Avidity Biosciences, Inc. Una amidites and uses thereof
CN114375296A (zh) 2019-06-06 2022-04-19 艾维迪提生物科学公司 核酸多肽组合物及其用途
EP3983077A4 (en) * 2019-06-17 2023-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. DELIVERY OF OLIGONUCLEOTIDES TO THE STRIATUM
US20220348912A1 (en) 2019-06-20 2022-11-03 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved gene editing
KR20220047989A (ko) 2019-08-09 2022-04-19 유니버시티 오브 매사추세츠 Snp를 표적화하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드
US12365894B2 (en) 2019-09-16 2025-07-22 University Of Massachusetts Branched lipid conjugates of siRNA for specific tissue delivery
EP4051795A1 (en) * 2019-11-01 2022-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
CN112980837B (zh) * 2019-12-13 2023-07-04 深圳艾码生物科技有限公司 一种抑制HTT基因表达的siRNA及其前体和应用
US20210363524A1 (en) * 2020-03-18 2021-11-25 University Of Massachusetts Oligonucleotides for snca modulation
JP7837560B2 (ja) 2020-03-26 2026-03-31 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 安定性の向上を有する修飾オリゴヌクレオチドの合成
US20210355491A1 (en) * 2020-04-20 2021-11-18 University Of Massachusetts Oligonucleotides for msh3 modulation
WO2021242883A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 University Of Massachusetts Synthetic oligonucleotides having regions of block and cluster modifications
WO2022031591A2 (en) * 2020-08-03 2022-02-10 University Of Massachusetts Oligonucleotides for htt-1a modulation
US20240200063A1 (en) * 2021-03-24 2024-06-20 Atalanta Therapeutics, Inc. Microglial gene silencing using double-stranded sirna
EP4314296A2 (en) 2021-03-29 2024-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
CN117677699A (zh) 2021-06-23 2024-03-08 马萨诸塞大学 用于治疗先兆子痫和其他血管生成病症的优化抗flt1寡核苷酸化合物
US20230340475A1 (en) * 2021-12-17 2023-10-26 University Of Massachusetts Oligonucleotides for mlh1 modulation
AU2023354001A1 (en) * 2022-09-28 2025-04-17 Atalanta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of huntington's disease
IL325355A (en) * 2023-06-30 2026-02-01 Spark Therapeutics Inc RNA inhibitor targeting huntingtin expression
WO2025073871A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligand complexes specific for tfr1
WO2025160434A1 (en) * 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting huntington's disease
WO2025265013A2 (en) * 2024-06-20 2025-12-26 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents for inhibiting expression of huntingtin (htt), compositions thereof, and methods of use

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
ES2113371T3 (es) 1989-11-16 1998-05-01 Univ Duke Transformacion de celulas epidermicas de tejidos animales con la ayuda de particulas.
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5587308A (en) * 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6291438B1 (en) 1993-02-24 2001-09-18 Jui H. Wang Antiviral anticancer poly-substituted phenyl derivatized oligoribonucleotides and methods for their use
US5858988A (en) 1993-02-24 1999-01-12 Wang; Jui H. Poly-substituted-phenyl-oligoribo nucleotides having enhanced stability and membrane permeability and methods of use
TW360548B (en) 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
WO1996033761A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Medtronic, Inc. Intraparenchymal infusion catheter system
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US5735814A (en) 1996-04-30 1998-04-07 Medtronic, Inc. Techniques of treating neurodegenerative disorders by brain infusion
US20080119427A1 (en) 1996-06-06 2008-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6177403B1 (en) 1996-10-21 2001-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods, and apparatus for delivery of a macromolecular assembly to an extravascular tissue of an animal
US6042820A (en) 1996-12-20 2000-03-28 Connaught Laboratories Limited Biodegradable copolymer containing α-hydroxy acid and α-amino acid units
US6472375B1 (en) 1998-04-16 2002-10-29 John Wayne Cancer Institute DNA vaccine and methods for its use
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
EP2447370B1 (en) 2001-09-28 2018-07-18 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. MicroRNA molecules
US20050096284A1 (en) 2002-02-20 2005-05-05 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
US7858367B2 (en) 2002-04-30 2010-12-28 Duke University Viral vectors and methods for producing and using the same
KR101215701B1 (ko) 2002-07-19 2012-12-26 베스 이스라엘 데코니스 메디칼 센터 자간전증 또는 자간의 진단 및 치료 방법
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
AU2003295600A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
PT1633767T (pt) 2003-06-02 2019-02-27 Univ Massachusetts Métodos e composições para controlar a eficácia do silenciamento de arn
EP1633890B2 (en) 2003-06-02 2020-11-18 University of Massachusetts METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE EFFICACY AND SPECIFICITY OF FNAi
WO2008005562A2 (en) 2006-07-07 2008-01-10 University Of Massachusetts Rna silencing compositions and methods for the treatment of huntington's disease
EP1709195B1 (en) 2003-12-19 2014-01-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Cell transfecting formulations of small interfering rna, related compositions and methods of making and use
WO2005077333A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Gel-based delivery of recombinant adeno-associated virus vectors
ES2423060T3 (es) 2004-03-12 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF
US20060014289A1 (en) 2004-04-20 2006-01-19 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Methods and compositions for enhancing delivery of double-stranded RNA or a double-stranded hybrid nucleic acid to regulate gene expression in mammalian cells
WO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
JP5136766B2 (ja) 2004-12-15 2013-02-06 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル キメラベクター
EP1937066A4 (en) 2005-08-18 2008-12-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF NERVOUS DISEASES
JP5111385B2 (ja) * 2005-10-28 2013-01-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ハンチンチン遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法
US20070259827A1 (en) 2006-01-25 2007-11-08 University Of Massachusetts Compositions and methods for enhancing discriminatory RNA interference
US9198981B2 (en) 2006-02-01 2015-12-01 The University Of Kentucky Modulation of angiogenesis
WO2007094218A1 (ja) 2006-02-16 2007-08-23 Gifu University 修飾オリゴヌクレオチド
US20090306178A1 (en) 2006-03-27 2009-12-10 Balkrishen Bhat Conjugated double strand compositions for use in gene modulation
US20080039415A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Gregory Robert Stewart Retrograde transport of sirna and therapeutic uses to treat neurologic disorders
WO2008154482A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Sirnaomics, Inc. Sirna compositions and methods of use in treatment of ocular diseases
CN101199858A (zh) 2007-10-18 2008-06-18 广州拓谱基因技术有限公司 治疗眼科疾病的多靶点小干扰rna鸡尾酒制剂及制备方法
TW200927177A (en) 2007-10-24 2009-07-01 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect
WO2009099991A2 (en) * 2008-01-31 2009-08-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of cancer
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
EP2342340A1 (en) 2008-09-22 2011-07-13 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
WO2012005898A2 (en) 2010-06-15 2012-01-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chinese hamster ovary (cho) cell transcriptome, corresponding sirnas and uses thereof
CA2828544A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
US20140275211A1 (en) * 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
KR101567576B1 (ko) 2012-05-22 2015-11-10 올릭스 주식회사 세포 내 관통능을 가지고 ｒｎａ 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
US9480752B2 (en) 2012-07-10 2016-11-01 Baseclick Gmbh Anandamide-modified nucleic acid molecules
US20150247141A1 (en) 2012-09-14 2015-09-03 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
CN104837996A (zh) 2012-11-15 2015-08-12 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 抗apob反义缀合物化合物
US10513710B2 (en) * 2014-04-18 2019-12-24 University Of Massachusetts Exosomal loading using hydrophobically modified oligonucleotides
RS62672B1 (sr) 2015-04-03 2021-12-31 Univ Massachusetts Oligonukleotidna jedinjenja za tretman preeklampsije i drugih angiogenskih poremećaja
PL3277814T3 (pl) 2015-04-03 2020-11-30 University Of Massachusetts Związki oligonukleotydowe ukierunkowane na mrna huntingtyny
US20160319278A1 (en) 2015-04-03 2016-11-03 University Of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
IL320434A (en) 2015-07-22 2025-06-01 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide preparations and methods
WO2017030973A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
US10478503B2 (en) 2016-01-31 2019-11-19 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
CN107980062A (zh) 2018-05-01
JP7504482B2 (ja) 2024-06-24
DK3277814T3 (da) 2020-08-24
CA2980337A1 (en) 2016-10-06
JP2022064900A (ja) 2022-04-26
JP2024152725A (ja) 2024-10-25
US20200308584A1 (en) 2020-10-01
US9809817B2 (en) 2017-11-07
AU2025204686A1 (en) 2025-07-24
US20220251554A1 (en) 2022-08-11
HUE050441T2 (hu) 2020-12-28
JP2024028909A (ja) 2024-03-05
ES2808750T3 (es) 2021-03-01
EP3766973A1 (en) 2021-01-20
CN116004624A (zh) 2023-04-25
JP2018516091A (ja) 2018-06-21
LT3277814T (lt) 2020-10-26
SI3277814T1 (sl) 2020-12-31
US20190225965A1 (en) 2019-07-25
AU2022204722A1 (en) 2022-07-21
EP3277814B1 (en) 2020-06-03
WO2016161374A1 (en) 2016-10-06
JP2022062038A (ja) 2022-04-19
US20160355808A1 (en) 2016-12-08
US11230713B2 (en) 2022-01-25
US20180094263A1 (en) 2018-04-05
AU2016244027B2 (en) 2022-04-28
HRP20201200T1 (hr) 2020-11-13
AU2016244027A1 (en) 2017-10-12
PT3277814T (pt) 2020-07-28
US10774327B2 (en) 2020-09-15
CY1123289T1 (el) 2021-12-31
CN107980062B (zh) 2022-11-25
EP3277814A1 (en) 2018-02-07
JP7009356B2 (ja) 2022-01-25
SMT202000454T1 (it) 2020-11-10
PL3277814T3 (pl) 2020-11-30
AU2022204719A1 (en) 2022-07-21
US10435688B2 (en) 2019-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7504482B2 (ja) ハンチンチンｍＲＮＡをターゲティングするオリゴヌクレオチド化合物
JP7420391B2 (ja) 十分に安定化された非対称ｓｉｒｎａ
JP2025156319A (ja) 組織特異的なａｐｏｅ調節のためのオリゴヌクレオチド
JP2022528487A (ja) Ｃ９ｏｒｆ７２のオリゴヌクレオチドベースの調節
HK40042570A (en) Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna
US20240360444A1 (en) Dendritic conjugates for the brain delivery of therapeutic oligonucleotides
HK1250242A1 (en) Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna
HK1250242B (en) Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna