RS62672B1 - Oligonukleotidna jedinjenja za tretman preeklampsije i drugih angiogenskih poremećaja - Google Patents

Description

Ovaj pronalazak je ostvaren uz podršku vlade pod dodeljenim grantom broj OPP1086170 od strane Nacionalne naučne fondacije (National Science Foundation). Vlada ima određena prava na ovaj pronalazak.

Tehnička oblast pronalaska

Ovo otkriće se odnosi na nove angiogenske ciljeve i nova oligonukleotidna jedinjenja za tretman angiogenskih poremećaja (npr., preeklampsija).

Stanje tehnike

Komplikujući 5-8% svih trudnoća, preeklampsija (PE) je jedna od tri glavna uzroka prevremenog porođaja. Najzapaženije karakteristike PE su hipertenzija, edema i višak proteina u urinu (proteinurija) nakon 20-te nedelje trudnoće. Konsekvence za fetus mogu biti teške, u rasponu od male-za-gestacijsku-starost bebe do hipoksije-izazvane neurološkom povredom (npr., cerebralna paraliza) pa sve do smrtnog ishoda. Materinske komplikacije uključuju pad rada bubrega, HELLP sindrom (Hemoliza, Povišeni enzimi u jetri, i Niski trombociti), stanja oduzetosti, šlog i smrtni ishod. PE i povezani hipersenzitivni poremećaji se konzervativno procenjuju da izazovu smrtni ishod kod 76.000 majki i 500.000 novorođenčadi globalno svake godine. (Videti preeclampsia [dot] org. U Sjedinjenim Američkim Državama, PE je odgovorna za 100.000 prevremenih porođaja i 10.500 smrtnih ishoda kod novorođenčadi svake godine uz cenu za zdravstveni sistem od grubo procenjeno sedam milijardi dolara (tri milijardi dolara za materinsku invalidnost i četiri milijarde dolara u vezi sa morbiditetom novorođenčadi) svake godine. Širom sveta, PE i potonja eklampsia su glavni doprinosioci materinskom i fetusnom i neonatalnom morbiditetu i mortalitetu. Tako, PE predstavlja vrlo značajno neispunjenje potrebe javnog zdravstva.

lako se koreni uzroka PE tek treba u potpunosti da shvate, u ovom trenutku je dobro utvrđeno da su materinski znakovi i simptomi hipertenzije, edema i proteinurije izazvani viškom anti-angiogenskih proteina u majčinom krvotoku. Glavni među njima su rastvorljivi fms-slični tirozin kinaza 1 (sFLT1s) proteini. sFLT1s su krnji oblici receptora FLT1 (takođe poznati kao VEGFR1) vezani za membranu vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF). Normalno funkcionišu kao pufer VEGF signaliziranja. Ipak, kada su sFLT1s abnormalno visoki u majčinom cirkulacionom sistemu, mogu ometati njenu sopstvenu sposobnost da odgovori na VEGF. Između ostalih funkcija, VEGF su neophodni za održavanje hepatične sinusoidne vaskulature i ostalih fenestriranih vaskularnih ležaja u telu (Kamba, T. et al.VEGF-dependent plasticity offenestrated capillaries in the normal adult microvasculature. Americ journal of physiology. Heart and circulatory physiology 290, H560-576 (2006)). Prekid ovih struktura pogoršava materinsku funkciju bubrega, dovodeći do hipertenzije, proteinurije i cerebralnog edema koji su klasične karakteristike PE i eklampsije (Young, B.C., Levine, R.J. & Karumanchi, S.A. Pathogenesis of preeclampsia. Annual review of pathology 5, 173-192 (2010); Eremina, V. et al., Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of clinical investigation 111, 707-716 (2003); Eremina, V. et al. VEGF inhibition and renal thrombotic microangiopathy, The New England journal of medicine 358,1129-1136(2008)).

Pilot studije upotrebe vantelesnog uređaja da se ukloni sFLT1 iz krvotoka ozbiljno preeklampsične žene demonstrira da snižavanje sFLT1 proteina samo za 30-40% u materinskoj plazmi može da produži PE trudnoće za dve nedelje bez škodljivih posledica za bebu (Thadhani, R. et al. Pilot study of extracorporeal removal of soluble fms-like tyrosine kinase 1 in preeclampsia. Circulation 124, 940-950 (2011)). Štaviše, studije na životinjama podržavaju hipotezu da ciljanje sFLT1 u PE može takođe da smanji rizik od neonatalnih respiratornih problema i bronhopulmonalne displazije, glavnih komplikacija za nedonošče (Tang, J.R., Karumanchi, S.A., Seedorf, G., Markham, N. & Abman, S.H. Excess soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 in amniotic fluid impairs lung growth in rats: linking preeclampsia with bronchopulmonary dysplasia. American journal of physiology. Lung celular and molecular physiology 302, L36-46 (2012)). Ipak, dok je afereza (pranje krvi) krajnje obećavajuća, malo je verovatno da će biti primen jljiva na sve pacijente u svim situacijama. Posebno u uslovima niske postavke resursa, isplativiji pristup sa nižim medicinskim i generalno infrastrukturnim zahtevima je očajnički potreban. RNK stišavanje putem RNAi je jedan od takvih pristupa.

široki raspon humanih bolesti, uključujući kancer, infekciju i neurodegeneraciju, može biti tretiran putem stišavanja specifičnih gena korišćenjem malih oligonukleotida. ONT-ovi (OligoNukleotidni Terapeutici) su nova klasa lekova, koji se izdvajaju ciljanjem RNK ili DNK direktno, tako ometajući gen koji izaziva bolest u njegovom korenu, pre nego što može da proizvede protein odgovoran za fenotip bolesti. Prednosti ONT-ova nad konvencionalnim lekovima uključuju lak dizajn leka zasnovan isključivo na pravilima sparivanja baze, sposobnost da pristupi ciljevima koji su prethodno smatrani ,,nelečljivim“ i njihovo obećanje specifičnosti bez presedana, i trajanje dejstva. Dodatno tome, farmakokinetika, famakodinamika i bezbednost ONT-ova je uglavnom definisana hemijskim modifikacijama/formulacijom i vrlo su slični među jedinjenjima koja ciljaju različite gene, omogućavajući multi-gensko stišavanje jednostavan razvoj lekova koji ciljaju isto tkivo (Videira, M., Arranja, A., Rafael, D. & Gaspar, R. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems. Nanomedicine: nanotechnology, biology, and medicine 10, 689-702 (2014); H. Younis et al., in A Comprehensive Guide to Toxicology in Preclinical Drug Development. (ed. A.S. Faqi) 647-664 (Academic Press, 2013)). Značajan napor u poslednoj deceniji rezultirao je razvojem nekoliko tipova kako hemijski-modifikovanih tako i formulisanih oligonukleotida sa jasnom kliničkom efikasnošću (Whitehead, K.A., Langer, R. & Anderson, D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews, Drug discovery 8, 129-138 (2009). Tako ONT-ovi predstavljaju novu i potencijalno transformativnu terapeutsku paradigmu. Uprkos tome, njihovo kliničko iskorišćavanje je otežano ograničenom distribucijom u tkiva. Sistemsko davanje je do sada generalno ograničeno na hepatocite jetre, dok ostala tkiva zahtevaju lokalno davanje (de Fougerolles, A., Vornlocher, H.P., Maraganore, J. & Lieberman, J. Interfering with disease: a progres report on siRNA-based therapeutics. Nature reviews. Drug discovery 6, 443-453 (2007)).

Jedna klasa ONT-ova su siRNK, mali dvolančani oligonukleotidi koji se sastoje od putnika (sens) i vodiča (antisens) lanaca. Nakon ćelijskog unosa, lanac vodič se puni u sa RNK izazvani Kompleks Stišavanja (RISC) sposoban da cepa svoju komplementarnu ciljanu RNK. Broj napunjenih RlSC-ova po ćeliji dovoljan da izazove efikasno i dugotrajno stišavanje gena ili RNK ometanje (RNAi) je procenjen na otprilike 25-100 in vitro (Stalder, L. et al. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMPO journal 32, 1115-1127 (2013)) a otprilike na 400 in vivo (Pei, Y. et al. Ouantitative evaluation of siRNA delivery in vivo. Rna 16, 2553-2563 (2010)). Tipično, 10-100 ng / gram oligonukleotida isporučenog ciljanom tkivu (Overhoff, M., Wunsche, W. & Sczakiel, G. Quantitative detection of siRNA and single-stranded oligonucleotides. Relationship between uptake and biological activity of SiRNA. Nucleic acids research 32, e170 (2004)) je adekvatno da se generiše dovoljan broj aktivnih RISC kompleksa i izazove stišavanje. Napunjeni RlSC-ovi ima nedeljama dugotrajnu stabilnost, rezultirajući u produženom stišavanju gena (3-6 nedelja) samo jednim davanjem (Whitehead, K.A., Langer, R. & Anderson, D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews. Drug discovery 8, 129-138 (2009)).

Luo et al. (2013) eL,ife, 2:e00324 opisuje da je avaskularnost fotoreceptora ukinuta između ostalog sa RNAi posredovanim potiskivanjem sFLT-1. US 2007/1911273 opisuje moduliranje angiogeneze, između ostalog sa RNAi posredovanim potiskivanjem VEGF. CN 101 199 858 opisuje višestruku ciljanu tačku male interferencije RNK koktel sredstva za tretiranje oftalmološke bolesti. WO 2008/154482 opisuje siRNK kompozicije i postupke upotrebe u tretmanu očnih bolesti.

Behlke (2008), Oligonucleotides, 18:305-320 opisuje hemijsku modifikaciju siRNK za upotrebu in vivo.

Suština pronalaska

Sadašnji pronalazak se zasniva delom na otkriću da mRNK izoforme koje kodiraju sFLT1 proteine sadrže sekvence koje nisu pronađene u mRNK koja kodira pune dužine FLT1 (fl-FLT1) protein koji može biti ciljan radi degradacije, npr., da se tretira PE, postporođajna PE, eklampsija i/ili HELLP sindrom. Ovde su obezbeđene nove oligonukleotidne sekvence (npr., male ometajuće RNK (siRNKs)) koje su projektovane da selektivno smanje nivoe sFLT1 bez uticaja na fl-FLT1 vezivanjem jedne ili više sekvenci koje nisu prisutne u fl-FLT1, npr., jedan ili više intronskih regiona mRNK koja kodira jedan ili više sFLT1 proteina. Otkriveno je da se nove siRNK koje su ovde opisane preferencijalno isporučuju u placentne trofoblaste (ćelijski tip odgovoran za višak sFLT1 proizvodnju) korišćenjem sistemske (odnosno, intravenozne ili potkožne) isporuke majci bez isporuke fetusu.

Takođe su obezbeđena terapeutska jedinjenja i postupci za tretiranje jednog ili više simptoma PE i/ili postporođajne PE i/ili eklampsije i/ili HELLP sindroma.

U jednom aspektu, obezbeđeno je jedinjenje koje se vezuje za intronski region mRNK koji kodira sFLT1 protein, pri čemu jedinjenje selektivno inhibira ekspresiju sFLT1 proteina u ćeliju ili organizam; navedeno jedinjenje se sastoji od dsRNK koja ima sens lanac i antisens lanac od bar 16 susednih nukleotida,

pri čemu je deo antisens lanca komplementaran sa delom sens lanca,

pri čemu je antisens lanac u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:1;

(1) antisens lanac se sastoji od naizmeničnih 2’-metoksi-ribonukleotida i 2’-fluororibonukleotida;

(2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 iz 5’ kraja antisens lanca nisu 2’-metoksi-ribonukleotidi; (3) nukleotidi antisens lanca su spojeni putem fosfodiestar ili fosforotioat veza; i

(4) nukleotidi na pozicijama 1-6 3’ kraja, ili pozicijama 1-7 3’ kraja, antisens lanca su spojeni za susedne nukleotide putem fosforotioat veza;

pri čemu je sens lanac povezan za hidrofobni molekul na 3’ kraju sens lanca.

Ovde je takođe opisana dsRNK koja ima sens lanac i antisens lanac, pri čemu se antisens lanac sastoji od regiona komplementarnosti ili je suštinski komplementarna sa 5’

CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3’ (SEQ ID NO:1), 5’ CATCATAGCTACCATTTATT 3’

(SEQ ID NO:2), 5’ ATTGTACCACACAAAGTAAT 3’ (SEQ ID NO:3) ili 5’ GAGCCAAGACAATCATAACA 3’ (SEQ ID NO: 4). U jednom primeru, region komplementarnosti je komplementaran sa bar 15, 16, 17 ili 18 susednih nukleotida iz SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 4. U jednom primeru, region komplementarnosti sadrže ne više od 3 neusklađenosti sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4. U jednom primeru, region komplementarnosti je potpuno komplementaran sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:4.

U jednoj realizaciji, dsRNK se krnje-završava. U jednoj realizaciji, dsRNK sadrži bar jedno nadvišenje jednolančanog nukleotida. U jednoj realizaciji, dsRNK sadrži prirodno nastale nukleotide.

Takođe je ovde opisana dsRNK koja sadrži bar jedan modifikovan nukleotid. U jednom primeru, modifikovani nukleotid je odabran od grupe: 2’-0-metil modifikovani nukleotid, 2’-fluoro modifikovan nukleotid, nukleotid koji sadrži 5’-fosforotioat grupu, i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat. U jednom primeru, modifikovani nukleotid je odabran od grupe: 2’-deoksi-2’-fluoro modifikovani nukleotid, 2’-deoksi-modifikovani nukleotid, zaključan nukleotid, abazni nukleotid, 2’-amino-modifikovani nukleotid, 2’-alkilmodifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, i ne-prirodna baza koja sadrži nukleotid. U jednom primeru, dsRNK sadrži bar jedan 2’-O-metil modifikovani nukleotid, bar jedan 2’-fluoro modifikovani nukleotid, bar jedan nukleotid koji sadrži 5’fosforotioat grupu i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat.

Takođe je ovde opisana dsRNK koja ima 5’ kraj, 3’ kraj i komplementarnost prema cilju, i koja sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, pri čemu: (1) prvi oligonukleotid sadrži sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4; (2) deo prvog oligonukleotida je komplementaran sa delom drugog oligonukleotida; (3) drugi oligonukleotid sadrži naizmenično 2’-metoksi-ribonukleotide i 2’-fluoro-ribonukleotide; (4) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 3’ kraja drugog oligonukleotida su 2’-metoksi-ribonukleotidi; i (5) nukleotidi drugog oligonukleotida su spojeni putem fosfodiestar i fosforotioat veza.

Prema ovom pronalasku, drugi oligonukleotid je povezan za hidrofobni molekul na 3’ kraju drugog oligonukleotida, npr., omega-3 masna kiselina U realizaciji, hidrofobni molekul je dokozankiselina (DCA), dokozaheksanoična kiselina (DHA), lizofosfatidilholin esterifikovana DHA (g2-DHA, takođe poznata kao PC-DHA) ili eikozapentaenoična kiselina (EPA).

U jednoj realizaciji, veza između drugog oligonukleotida i hidrofobnog molekula sadrži polietilen glikol ili trietilen glikol.

U jednoj realizaciji, nukleotidi na pozicijama 1 i 2 sa 3’ kraja drugog oligonukleotida su spojeni sa susednim nukleotidima putem fosforotioat veza.

U jednoj realizaciji, nukleotidi na pozicijama 1 i 2 sa 3’ kraj drugog oligonukleotida, i nukleotidi na pozicijama 1 i 2 sa 5’ kraj drugog oligonukleotida, su spojeni za susedne ribonukleotide putem fosforotioat veza.

U jednoj realizaciji, exspresija sFLT1 proteina u ćeliji ili organizmu je smanjena od oko 30% do oko 50%. U jednoj realizaciji, ekspresija sFLT1 proteina u ćeliji ili organizmu je smanjena od oko 30% do oko 40%.

Takođe je ovde opisan postupak koji je obezbeđen radi inhibiranja ekspresije jednog ili više sFLT1 proteina u ćeliji. Postupak uključuje korake (a) uvođenja u ćeliju jednog ili više jedinjenja koja se vezuju za intronski region jednog ili više mRNK-ova koji kodiraju jedan ili više sFLT1 proteina, i (b) održavanja ćelije proizvedene u koraku (a) tokom vremenskog perioda dovoljnog da inhibira ekspresiju jednog ili više sFLT1 proteina u ćeliji.

U jednom primeru, jedno ili više jedinjenja su jedna ili više dsRNK koja posreduje degradaciju jedne ili više mRNK. U jednom primeru, jedinjenje je dsRNK koja ima sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, i/ili SEQ ID NO:4. U jednom primeru, jedna ili više dsRNK su svaka između 15 i 30 parova baza po dužini.

U jednoj realizaciji, ekspresija jednog ili više sFLT1 proteina je smanjena od oko 30% do oko 50%. U jednoj realizaciji, ekspresija jednog ili više sFLT1 proteina je smanjena od oko 30% do oko 40%.

Takođe je ovde opisan RNK molekul koji je između 15 i 30 baza po dužini koji sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:1, pri čemu RNK molekul cilja jedan ili oba intronski region sFLT-i13 kratki i intronski region sFLT-i13 dugi.

U jednom primeru, RNK je dsRNK koja ima sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti.

Takođe je ovde opisan RNK molekul koji je između 15 i 30 baza po dužini koji sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2, pri čemu RNK molekul cilja jedan ili oba intronski region sFLT-i15a (takođe poznat kao sFLT-e15a).

U jednom primeru, RNK je dsRNK koja ima sens lanac i antisen lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti.

U jednom aspektu, obezbeđeno je terapeutsko jedinjenje koje se vezuje za intronski region jedne ili više mRNK koja kodira jedan ili više sFLT1 proteina, pri čemu ovo terapeutsko jedinjenje selektivno smanjuje ekspresiju jednog ili više sFLT1 proteina, i pri čemu ovo terapeutsko jedinjenje smanjuje jedan ili više simptoma PE, postporođajne PE, eklampsije ili HELLP sindroma kada se daje subjektu kome je neophodno, pri čemu ovo jedinjenje sadrži dsRNK prema ovom pronalasku.

U jednoj realizaciji, jedan ili više sFLT1 proteina su odabrani od grupe koja se sastoji od sFLT1-i13 kratki, sFLT1-i13 dugi i sFLT1-i15a.

U jednoj realizaciji, terapeutsko jedinjenje sadrži prvu i drugu oligonukleotid sekvencu, pri čemu prva oligonukleotid sekvenca vezuje intronski region jednog ili oba sFLT1-i13 kratki i sFLT1-i13 dugi, a druga oligonukleotid sekvenca vezuje intronski region sFLT1-i15a. U jednoj realizaciji, prva i druga oligonukleotid sekvenca su dvolančana RNK (dsRNK).

Takođe je ovde opisano terapeutsko jedinjenje koje sadržii prvu dsRNK koja se sastoji od prvog sens lanca i prvog antisens lanca i drugu dsRNK koja se sastoji od drugog sens lanca i drugog antisens lanca, pri čemu prvi antisens lanac sadrži prvi region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:1 a drugi antisens lanac sadrži drugi region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2. U jednom primeru, svaka dsRNK je između 15 i 30 parova baza u dužini. U jednom primeru, prvi region komplementarnosti je komplementaran sa bar 15 susednih nukleotida iz SEQ ID NO:1, a drugi region komplementarnosti je komplementaran sa bar 15 susednih nukleotida iz SEQ ID NO:2. U jednom primeru, prvi region komplementarnosti sadrže ne više od 3 neusklađenosti sa SEQ ID NO:1, a drugi region komplementarnosti sadrži ne više od 3 neusklađenosti sa SEQ ID NO:2. U jednom primeru, prvi region komplementarnosti je u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:1, a drugi region komplementarnosti je u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:2.

U jednoj realizaciji, svaka dsRNK sadrži bar jedno nadvišenje jednolančanog nukleotida.

U jednoj realizaciji, svaka dsRNK sadrži bar jedan modifikovan nukleotid. U jednoj realizaciji, modifikovani nukleotid je odabran od grupe: 2’-O-metil modifikovani nukleotid, 2’-fluoro modifikovan nukleotid, nukleotid koji sadrži 5’-fosforotioat grupu, i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat. U jednoj realizaciji, modifikovani nukleotid je odabran od grupe: 2’-deoksi-2’-fluoro modifikovani nukleotid, 2’-deoksi-modifikovani nukleotid, zaključan nukleotid, abazni nukleotid, 2’-amino-modifikovani nukleotid, 2’-alkilmodifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, i ne-prirodna baza koja sadrži nukleotid. U jednoj realizaciji, dsRNK sadrži bar jedan 2’-O-metil modifikovani nukleotid, bar jedan 2’-fluoro modifikovani nukleotid, bar jedan nukleotid koji sadrži 5’fosforotioat grupu i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat.

U jednoj realizaciji, svaka dsRNK sadrži 5’ kraj, 3’ kraj i komplementarnost prema cilju, pri čemu: (1) oligonukleotid sadrži naizmenično 2’-metoksi-ribonukleotide i 2’-fluororibonukleotide; (2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 5’ nisu 2’-metoksi-ribonukleotidi; (3) nukleotidi su spojeni putem fosfodiestar i fosforotioat veza, i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 sa 3’ kraja, ili pozicijama 1-7 sa 3’ kraja su spojeni sa susednim nukleotidima putem fosforotioat veza.

U jednom aspektu, obezbeđenja je farmaceutska kompozicija. Ova kompozicija uključuje prvu dsRNK prema ovom pronalasku; drugu dsRNK koja sadrži drugi sens lanac i drugi antisens lanac, pri čemu drugi antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2, i pri čemu drugi antisens lanac selektivno cilja intronski region sFLT-i15a; i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Takođe je ovde opisan postupak tretiranja ili upravljanja PE, eklampsije ili HELLP sindroma koji se sastoji od davanja subjektu kome je neophodan takav tretman ili upravljanje terapeutski efektivne količine farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana. U jednom primeru, farmaceutska kompozicija se daje intravenozno ili potkožno. U jednom primeru, ekspresija sFLT1 proteina je smanjena kod subjekta za oko 30% do oko 50%. U jednom primeru, ekspresija sFLT1 proteina je smanjena kod subjekta za oko 30% do oko 40%.

1

Takođe je ovde opisan postupak tretiranja jednog ili više simptoma PE, eklampsije ili HELLP sindroma kod subjekta kome je on neophodan. Ovaj postupak uključuje davanje subjektu terapeutskog jedinjenja koje se vezuje za intronski region jedne ili više mRNK koja kodira jedan ili više sFLT1 proteina, pri čemu terapeutsko jedinjenje smanjuje ekspresiju jednog ili više sFLT1 proteina.

U jednom primeru, jedan ili više sFLT1 proteina se odabire od grupe koja se sastoji od sFL1-i13 kratki, sFLT1-i13 dugi i sFLT1-i15a.

U jednom primeru, terapeutsko jedinjenje sadrži prvu i drugu oligonukleotid sekvencu, pri čemu prva oligonukleotid sekvenca vezuje intronski region jednog ili oba sFLT1-i13 kratki i sFLT1-i13 dug, a druga oligonukleotid sekvenca vezuje intronski region sFLT-i15a. U jednom primeru, prva i druga oligonukleotid sekvenca su ssRNK ili dsRNK.

Takođe je ovde opisano terapeutsko jedinjenje koje se sastoji od prve dsRNK koja sadrži prvi sens lanac i prvi antisens lanac i druge dsRNK koja sadrži drugi sens lanac i drugi antisens lanac, pri čemu prvi antisens lanac sadrži prvi region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:1 a drugi antisens lanac sadrži drugi region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2. U jednoj realizaciji, svaka dsRNK je između 15 i 30 parova baza dugačka. U jednom primeru, prvi region komplmentarnosti je komplementaran sa bar 15 susednih nukleotida iz SEQ ID NO:1, a drugi region komplementarnosti je komplementaran sa bar 15 susednih nukleotida iz SEQ ID NO:2. U jednom primeru, prvi region komplementarnosti sadrži ne više od 3 neusklađenosti sa SEQ ID NO:1, a drugi region komplementarnosti sadrže ne više od 3 neusklađenosti sa SEQ ID NO:2. U jednom primeru, prvi region komplementarnosti je u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:1, a drugi region komplementarnosti je u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:2.

U jednom primeru, svaka dsRNK sadrži bar jedno nadvišenje jednolančanog nukleotida.

U jednom primeru, svaka dsRNK sadrži bar jedan modifikovani nukleotid. U jednoj realizaciji, modifikovani nukleotid je odabran iz grupe: 2’-O-metil modifikovani nukleotid, 2’-fluoro modifikovan nukleotid, nukleotid koji sadrži 5’-fosforotioat grupu, i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat. U jednom primeru, modifikovani nukleotid je odabran od grupe: 2’-deoksi-2’-fluoro modifikovani nukleotid, 2’-deoksi-modifikovani nukleotid, zaključan nukleotid, abazni nukleotid, 2’-amino-modifikovani nukleotid, 2’-alkilmodifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, i ne-prirodna baza koja sadrži nukleotid. U jednom primeru, dsRNK sadrži bar jedan 2’-O-metil modifikovani nukleotid, bar jedan 2’-fluoro modifikovani nukleotid, bar jedan nukleotid koji sadrži 5’fosforotioat grupu i terminalni nukleotid povezan za holesteril derivat.

Takođe je ovde opisana farmaceutska kompozicija. Ova farmaceutska kompozicija uključuje prvu dsRNK koja sadrži prvi sens lanac i prvi antisens lanac, pri čemu prvi antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:1, i pri čemu prvi antisens lanac cilja jedan ili oba intronski region sFLT-i13 kratki i intronski region sFLT-i13 dugi, i drugu dsRNK koja sadrži drugi sens lanac i drugi antisens lanac, pri čemu drugi antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2, i pri čemu drugi antisens lanac cilja intronski region sFLT-i15a, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Takođe je ovde opisan postupak tretiranja ili upravljanja PE, eklampsije ili HELLP sindroma koji se sastoji od davanja subjektu kome je neophodan takav tretman ili upravljanja terapeutski efektivnom količinom farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana.

U jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija se daje intravenozno ili potkožno.

U jednoj realizaciji, ekspresija sFLT1 proteina je smanjena kod subjekta za oko 30% do oko 50%. U jednoj realizacijji, ekspresija sFLT1 proteina je smanjena kod subjekta za oko 30% do oko 40%.

Takođe je ovde opisan postupak tretiranja jednog ili više simptoma angiogenskog poremećaja kod subjekta kome je neophodan, koji se sastoji od davanja subjektu bilo kog jedinjenja koje je ovde opisano.

Takođe je ovde opisan postupak tretiranja jednog ili više simptoma PE, eklampsije ili HELLP sindroma kod subjekta kome je neophodan, koji se sastoji od davanja subjektu bilo kog jedinjenja koje je ovde opisano.

Kratak opis slika

Prethodno i druge karakteristike i prednosti sadašnjeg pronalaska će biti potpunije shvaćeni iz sledećeg detaljnog opisa ilustrativnih realizacija uzetih povezano sa pridruženim slikama.

Slike 1A-C opisiju analizu PoliAdenilacionog Položaja Sekvenciranja (PAS-Seq) ekspresije sFLT1 izoforme u preeklamptičnim i normalnim placentama. (A) Šematski opisuje Receptor Tirozin Kinaze (RTK) koji signalizira modulaciju putem rastvorljivih mamaca, koji mogu biti generisani poliadenilacijom u intronu uzvodno od TransMembrane (TM) i kinaza domena. (Adaptirano iz Vorlova, S. et al. Induction of antagonistic soluble decoy receptor tyrosine kinases by intronic polyA activation. Molecular cell 43, 927-939 2011)). (B) PAS-Seq identifikuje alternativne FLT1 položaje poliadenilacije. (C) Oba i13 i i15 izoforme se prekomerno ekspresuju u preeklampsiji. Ukupna RNK je prečišćena i analizirana sa PAS-Seq (Неуег, E.E., Ozadam, H., Ricci, E.P., Cenik, C. & Moore, M.J: An optimized kit-free method for makon strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Res 43, e2 (2015)) iz pet normalnih i šest preeklamptičnih humanih placenti. Primetiti da sFLT1-i14 upućuje na sFLT1-i15a.

Slika 2 opisuje rezultate ogleda zasnovanog na Peptid Nukleinskoj Kiselini (PNA) radi detekcije sFLT1-i13-2283 u tkivu miša. Tkiva su lizovana, ostaci uklonjeni taloženjem, PNA-vodič lanac dupleks je prečišćen Tečnom hromatografijom Visoke Performance (HPLC) (DNK Pac P100, 50% voda 50% acetonitril i gradijent soli je 0 tolM NaCIO4) i obavlja se sistemski skrining neformulisanih hsiRNK koje ciljaju sFLT1 mRNK.

Slike 3A-D opisuju hidrofobnu siRNK strukturalnu/hemijsku kompoziciju, uzimanje i efikasnost u primarnim humanim citotrofoblastima (CTBs). (A) Šematski opisuje hidrofobno modifikovane i stabilizovane siRNK (hsiRNKs) prema određenim realizacijama. sFLT1-i13-2283 hsiRNK i podudaran NTC se dodaju CTB-ovima pri prikazanoj koncentraciji. (B) Nivo sFLT1 proteina se meri sa ELISA (#MVR100, R&D systems) u kontinuiranom medijumu kulture nakon 72 h tretmana. (C) opisuje sFLT-i13 mRNK nivoe, i (D) opisuje Flt-FL mRNK nivoe koji se mere korišćenjem QuantiGene® (Affymetrix) u 72 sata, (n=3, srednja vrednost /-SD). UNT-netretirane ćelije, NTC-ne-ciljana kontrola sa podudarnom hemijom.

1

Slike 4A-B opisuju hsiRNK efikasnost isporuke jetri, bubregu i placenti. (A) divljeg-tipa trudnom mišu (E15) se ubrizga Cy3-sFLT1-2283-P2 (crveno) (10 mg/kg; IV putem repne vene). Tkiva se fiksiraju nakon 24 sata, procesuiraju i slikaju sa 10x i 63x na Leica fluorescentnom mikroskopu sa stavljanjem pločica; jezgra su obojena sa DAPI (plavo). (B) Prikazuje distribuciju tkiva sFLT1-2283 (40 mg/kg) 5 dana nakon ubrizgavanja analizirano PNA ogledom (n=7, srednja vrednost SEM).

Slika 5 opisuje histološku evaluaciju hsiRNK distribucije u placenti miša. Divljeg-tipa trudnom mišu (E15) se ubrizga Cy3-sFLT1-2283-P2 (crveno) (10 mg/kg; IV putem repne vene). Tkiva se fiksiraju nakon 24 sata, procesuiraju i boje sa HE, a onda slikaju pri 20Х na Leica fluorescentnom mikroskopu. Fm - fetusna membrana, mV - materinski sud, L -lavirint; Jz - spojna zona; D - decidua.

Slike 6A-C opisuju identifikaciju i validaciju funkcionalnih hsiRNK jedinjenja koja ciljaju i13 i i15 sFlt1 izoformi. (A) Sematski prikazuje ekson-intron strukturu sFLT1 i13 i i15 izoformi. (B) Opisuje sFLT1 i13 i i5 mRNK sekvenci. Naznačene su lokacije vodećih hsiRNK udara (crvene linije). Kodoni zaustavljanja su prikazani crvenom bojom. (C) opisuje hsiRNK koja cilja sFLT1-i13 i sFLT1-i15a. Hemijske modifikacije su kako sledi: P — 5’ - fosfat; f-2’fluoro; m - 2’0-metil; #-fosforotioat. Primetiti da sFLT1-i14 upućuje na sFLT1- i15a.

Slike 7A-C opisuju efikasnu placentnu isporuku i stišavanje sFLT1 u modelu divljeg-tipa trudnoće miša. (A) divljeg-tipa trudnom mišu (E15) se ubrizgava Cy3-sFLT1-2283-P2 (crveno) (10 mg/kg; IV putem repne vene). Fetusi i njihove placente se fiksiraju nakon 24 sata, procesuiraju, i slikaju na Leica fluorescentnom mikroskopu sa postavljenim pločicama; jezgra se boje sa DAPI (plavo). (B) Opisuje nivo ekspresije sFlt1-i13 u tkiva miša 5 dana nakon sFLT1-2283-P2 ubrizgavanja (2 X 20 mg/kg). sFLT1-i13 mRNK se meri korišćenjem QuantiGene® (Affymetrix), normalizovano do fl-FLT 1 i predstavljeno kao procenta netretiranih kontrola [n=3 (PBS); n=7 (sFLT1-i13-2283), srednja vrednost ± SEM]. (C) Opisuje in vivo validaciju sFLT1_2283/2519 (sFLT1-miks, 151111); CD1 miševi putem IV sa 20 mg/kg, n = 8).

Slike 8A-C opisuje uticaj hsiRNK hemije i puta davanja na placentnu akumulaciju i distribuciju. (A) divljeg-tipa trudnom mišu (E15) se ubrizga Cy3-sFLT1-2283 (crveno) (10 mg/kg; IV putem repne vene). Placente se fiksiraju nakon 24 sata, procesuiraju, i slikaju na Leica fluorescentnom mikroskopu sa postavljenim pločicama; (B) Opisuje akumulaciju sFlt1-i13-2283 (10 mg/kg) nakon 24 sata i analizira putem PNA ogleda (n=3, srednja vrednost SEM). (C) Šematski predstavlja različite obrasce modifikacije sFLT-i13-2283 hsiRNK. P - 50-fosfat; Hol-teg - Holesterol-teg linker; bele sfere - RNK; crne sfere - 2’- O-metil; sive sfere - 2’-Fluoro; crvene sfere - fosforotioat. Primetiti da sFLT-i14 upućuje na sFLT1-i15a.

Slike 9A-B opisuje sFlt1 terapiju u miševima. (A) Prikazuje da sFlt1 terapije u miševima izaziva hipertenziju (mereno radiotelemetrijom kod svesnih miševa) i glomerularnu endoteliozu u bubregu (otečen glomerularne i kapilarne okluzije). (B) Opisuje studije Doppler ultrazvukom tokom normalne trudnože miše pri kasnoj gestaciji da se proceni pupčani protok. Talasna forma se dobija prikazivanjem Pika Sistolne Brzine (PSV).

Slika 10 opisuje kartu protoka koja prikazuje korake za razvoj terapeutika (npr., terapeutske RNKs) za tretman preekslampsije i/ili eklampsije.

Slika 11 šematski opisuje faktore povezane sa preeklampsijom.

Slike 12A-C opisuju slektivnu isporuku hsiRNK sloju sincicijskog trofoblasta lavirinta placente miša. (A) Opisuje šematski prema Maltepe et al. (J Clin Invest. (2010) 120(4):1016-1025. doi:10.1172/JCI41211). (B) Opisuje distribuciju trofoblasta nakon intravenoznog davanja hsiRNK (63Х uvećanje). (C) Opisuje distribuciju trofoblasta nakon potkožnog davanja hsiRNK (63Х uvećanje).

Slika 13 opisuje listu svih udara sa efikasnošću u različitim hemijskim skelama i jedinstvenim sekvencama 113 kratka, 113 duga i 115a izoformama, koje se ciljaju kako je dalje ovde opisano.

Slika 14 daje sumarno prihvatljive i idealne profile ciljanog proizvoda i komentare potencijala za adresiranje ovih potreba prema određenim primernim realizacijama.

Slika 15 opisuje histološku evaluaciju hsiRNK distribucije u placentnim tkivima miša nakon potkožnog (SC) i post-intravenskog (IV) davanja.

1

Slike 16A-E opisuju efikasno stišavanje sFLT1 sa hsiRNK u trudnim miševima (CD1). (А) Opisije vremensku liniju eksperimenta. (B) Opisuje ekspresiju sFLT1-113 mRNK u jetri, bubregu i placenti. (C) Opisuje nivoe sFLT1 proteina kao funkciju vremena. (D) Opisuje procenat sFLT1-2283 ubrizgane doze koja je prisutna u tkivima jetre, bubrega, placente, slezine i fetusne jetre pet dana nakon ubrizgavanja. (E) Opisuje μg/g sFLT1-2283 prisutan u tkivima jetre, bubrega, placente, slezine i fetusne jetre pet dana nakon ubrizgavanja.

Slike 17A-D opisuju efikasno stišavanje sFLT1 putem hsiRNK u trudnim miševima (CD1). (A) Opisuje vremensku liniju eksperimenta. (B) Opisuje nivoe sFlt1-1 proteina detektovanih u plazmi kao funkciju dana u trudnoći. (C) Tabela je sa podacima dobijanja telesne težine majke miša i težine mladunčeta i podacima o mortalitetu. (D) Opisuje grafikone koji prikazuju AST i ALT nivoe na dan 19.

Slike 18A-B opisuju hsiRNK stabilnost in vivo. IV spram SC, sFLT_2283P2 (150403). (A) Opisuje vremensku liniju eksperimenta. (B) Opisuje nivoe hsiRNK u jetri post-IV i post-SC davanja.

Slika 19 opisuje hsiRNK stabilnost in vivo. (A) Opisuje vremensku liniju eksperimenta. (B) Opisuje hsiRNK na dva sata, 24 sata i 120 sati post-IV davanja. sFLT1_2283P2 (#150624).

Slika 20 opisuje distribuciju tkiva u jetri DFIA-hsiRNK i g2 DHA-hsiRNK konjugata. 10Х uvećanje. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1:2283P2-g2DHA). Plavo, jezgro (DAPI); crveno, hsiRNK (Су3). Miš E15, IV (repna vena) ubrizgavanje, hsiRNK se daju 10 mg/kg, 24 sata. LEICA DM5500B.

Slika 21 opisuje distribuciju tkiva u jetri DHA-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK konjugata. 63Х uvećanje. (SFLT1_2283P2-DHA, sFLT1:2283P2-g2DHA). Plavo, jezgro (DAPI); crveno, hsiRNK (Су3). Miš E15, IV (repna vena) ubrizgavanje, hsiRNK se daju 10 mg/kg, 24 sata. LEICA DM5500B.

Slika 22 opisuje distribuciju tkiva u bubregu DHA-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK konjugata. 10Х uvećanje. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1:2283P2-g2DHA). Plavo, jezgro (DAPI); crveno, hsiRNK (Су3). Miš E15, IV (repna vena) ubrizgavanje, hsiRNK se daju 10 mg/kg, 24 sata. LEICA DM5500B.

1

Slika 23 opisuje distribuciju tkiva u bubregu DHA-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK konjugata.63Х uvećanje. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1:2283P2-g2DHA). Plavo, jezgro (DAPI); crveno, hsiRNK (СуЗ). Miš E15, IV (repna vena) ubrizgavanje, hsiRNK se daju 10 mg/kg, 24 sata. LEICA DM5500B.

Slika 24 opisuje distribuciju tkiva u placenti DHA-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK konjugata.10Х uvećanje. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1:2283P2-g2DHA). Plavo, jezgro (DAPI); crveno, hsiRNK (Су3). Miš E15, IV (repna vena) ubrizgavanje, hsiRNK se daju 10 mg/kg, 24 sata. LEICA DM5500B.

Slika 25 opisuje distribuciju tkiva u placenti DHA-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK konjugata.63Х uvećanje. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1:2283P2-g2DHA). Plavo, jezgro (DAPI); crveno, hsiRNK (Су3). Miš E15, IV (repna vena) ubrizgavanje, hsiRNK se daju 10 mg/kg, 24 sata. LEICA DM5500B.

Slika 26 opisuje sFLT1 stišavanje posredovano sa DHA-hsiRNK u trudnim miševima (CD1) kako je detektovano u tkivima jetre, bubrega i placente. sFLT1_2283P2-g2DHA (150813).

Slike 27A-D opisuju in vitro validaciju sFLT1_2283/2519 (sFLT1-miks, 1510025). (A) Opisuje odgovor na dozu kandidata siRNK koje ciljaju sFLt1i13 prikazano mRNK nivoima ekspresije. (B) Opisuje odgovor na dozu kandidata siRNK koje ciljaju sFLt1 e15a prikazano mRNK nivoima ekspresije. (C) Opisuje aFLT1 i1З mRNK nivoe ekspresije u prisustvu 2283 (krugovi) ili 2283/2519 (blokovi). (D) Opisuje aFLT1 e15a mRNK nivoe ekspresije u prisustvu 2519 (krugovi) ili 2283/2519 (blokovi).

Slike 28A-D opisuju in vitro validaciju sFLT1_2283/2519 (sFLT1-miks, 151111). (A) Opisuje odgovor na dozu kandidata siRNK koje ciljaju sFLt1i13 prikazano mRNK nivoima ekspresije. (B) Opisuje odgovor na dozu kandidata siRNK koje ciljaju sFLt1 e15a prikazano mRNK nivoima ekspresije. (C) Opisuje aFLT1 i13 mRNK nivoe ekspresije u prisustvu 2283 (krugovi), 2283/2519 LS (blokovi) ili 2283/2519 (dijamanti). (D) Opisuje aFLT1 e 15a mRNK nivoe ekspresije u prisustvu 2519 (krugovi), 2283/2519 LS (blokovi) ili 2283/2519 (dijamanti).

1

Slika 29 opisuje modulaciju rastvorljivog sFLT1 proteina kod trudnih miševa korišćenjem jednog ubrizgavanja sFLT12283/2519 (10 mg/kg svaki). sFLT1 nivoi proteina na dan 15 / dan 17 su prikazani na levom grafikonu. Nivoi sFLT1 proteina u serumu kao funkcija dana trudnoće su prikazani na desnom grafikonu.

Slika 30 opisuje šematiku PE modela babuna (Papio hamadrysas) radi proučavanja sFLT1_i13_2283Р2 / sFLT1_e15a_2519P2 efikasnosti i bezbednosti korišćenjem divljegtipa babuna sa PE izazvanom putem uteroplacentalneishemije (UPI).

Slika 31 opisuje pasivan unos FM-hsiRNK<sFLT1>u primarnim trofoblastima efektivan za smanjenje sFLT1 i1З mRNK ekspresiju.

Slika 32 opisuje sistemsku isporuku FM-hsiRNK<sFLT1>(dve desne kolone) u odnosu na nepotpuno modifikovani FM-hsiRNK<sFLT1>(dve leve kolone) u tkivima jetre, bubrega i slezine.

Slika 33 opisuje sistemsku isporuku FMhsiRNK u tivima jetre, bubrega, slezine, kože i masnom tkivu nakon potkožnog (SC) ubrizgavanja.

Slika 34 opisuje PNA-zasnovan ogled za vodič kvantifikacije lanca in vivo.

Slike 35A-F opisuju robustnu FM-hsiRNKs<FLT1>isporuku i efikasnost u tkivima jetre, bubrega i slezine in vivo nakon IV ili SC davanja. (A) Opisuje ng/mg hsiRNK nivoe po tkivu post-IV davanja od 10 mg/kg na t = 24 sati. (B) Opisuje ng/mg hsiRNK nivoe po tkivu post-SC davanja od 10 mg/kg na t = 24 sati. (C) Opisuje ng/mg hsiRNK nivoe po tkivu post-IV davanja od 2x20 mg/kg na t =120 sati. (D) Opisuje ng/mg hsiRNK nivoe po tkivu post-IV davanja od 2x15 mg/kg na t =120 sati. (E) Opisuje sFLT1 mRNK ekspresiju post-IV davanja od 2x20 mg/kg na t =120 sati. (F) Opisuje sFLT1 mRNK ekspresiju post-IV davanja 2x20 mg/kg na t = 120 sati.

Slika 36 opisuje sFLT_2283/2519 hsiRNK miks u skladu sa posebno poželjnim realizacijama ovog pronalaska. Vrste opisane na ovoj slici mogu biti farmaceutski prihvatljiva so, kako će P-OH i P-SH biti deprotonirani.

1

Slika 37 opisuje podatke iz PE modela kod babuna koji prikazuju stabilizaciju krvnog pritiska kod životinje.

Slika 38 opisuje podatke iz PE modela kod babuna koji prikazuju smanjenje krvnog pritiska kod životinje.

Slika 39 opisuje primerne sFLT1-2283/2519 dsRNK konjugovane za holesterol. R1=5’-E-VP-mU, C12H18N2O9P2S, Molekularna masa: 428,29, R2=3’-holesterol, C27H46O, Molekularna masa: 386,66, spojeno linkerom koji je definisan kao L. R1 =A=A-A-U-U-U-G-G-A-G-A-U-C=C=G=A=G=A=G (SEQ ID NO:8), R<2>-A=U=U-U-A-A-A-C-C-U-C-U-A=G=G (SEQ ID NO:9), R<1>=A=U-A-A-A-U-G-G-U-A-G-C-U=A=U=G=A=U=G (SEQ ID NO:10), R<2>-A=U= A -U-U-U-A -C-C-A-U-C-G=A=U (SEQ ID NO:11).

Slika 40 opisuje primerne sFLT1-2283/2519 dsRNK konjugovane za fosfatidilholin derivat DHA (PC-DHA). R<1>=5’-E-VP-mU, C12H18N2O9P2S, Molekularna masa: 428,29. R2=3’-PC-DHA, С38Н66Н3O8Р+, Molekularna masa: 723,93, spojeno linkerom definisanim kao L..R<1>=A=A-A-U-U-U-G-G-A-G-A-U-C=C=G=A=G=A=G (SEQ ID NO:12), R<2>-A=U=U-U-A-A-A-C-C-U-C-U-A=G=G (SEQ ID NO:13), R<1>=A=U-A-A-A-U-G-G-U-A-G-C-U=A=U=G=A=U=G (SEQ ID NO:14), R<2>-A=U=A-U-U-U-A-C-C-A-U-C-G=A=U (SEQ ID NO:15).

Slika 41 opisuje primere internukleotidnih veza R<3>. R<3>je internukleotid veza između prva dva nukleotida na 5’ i 3’ krajevima bilo kog datog oligonukleotid lanca koja može biti stabilizovana sa ostacima opisanim na ovoj slici.

Slika 42 opisuje primere internukleidne veze L<2>.

Slika 43 opisuje primere nukleozida X<1>, X<2>, X<3>i X<4>.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Opisani su novi angiogenski ciljevi (npr., ciljane sekvence PE, npr., intron sekvence sFLT1 mRNK). Takođe su obezbeđeni novi siRNK koje selektivno ciljaju intronske regione mRNK

1

kodirajući aniogenske ciljeve (npr., sFLT1 proteini). Takođe su opisani, postupci tretiranja angiogenskih poremećaja, npr., PE, postporođajne PE, eklampsije i/ili HELLP.

Generalno, nomenklatura koja se koristi u vezi sa kulturom ćelije i tkiva, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom, i hemija proteina i nukleinske kiseline i hibridizacija koja je ovde opisana su one dobro poznate i uobičajeno se koriste u nauci. Postupci i tehnike koje su ovde obezbeđene se generalno obavljaju prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u nauci i kako je opisano u različitim generalnim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmatrane kroz sadašnju specifikaciju osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se obavljaju prema proizvođačkim specifikacijama, kako se uobičajeno ostvaruju u nauci ili kako je to ovde opisano. Nomenklatura koja se koristi u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su oni dobro poznate i koje se uobičajeno koriste u nauci. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutski preparat, formulaciju i isporuku i tretman pacijenata.

Osim ukoliko nije drugačije ovde definisano, naučni i tehnički pojmovi koji se ovde koriste imaju značenja kako se uobičajeno razumeju od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke. U slučaju bilo koje latentne dvosmislenosti, definicije koje su ovde obezbeđenje imaju prednost nad bilo kojom rečničkom ili spoljnom definicijom. Osim ukoliko drugačije na zahteva kontekst, pojmovi u jednini će uključiti i množinu a pojmovi u množini će uključiti jedninu. Upotreba ,,ili“ znači ,,i/ili“ osim ukoliko nije navedeno drugačije. Upotreba pojma „uključujući , kako i drugi oblici, kao što su „uključuje" i „uključivao" nisu ograničavajući.

Take da ovaj pronalazak možda bude lakše razumljiv, prvo se definišu određeni pojmovi.

Pod pojmom „alteracija" se misli na promenu (povećanje ili smanjenje) u nivoima ekspresije gena, mRNK ili polipeptida kako se to detektuje standardnim poznatim postupcima kakvi su oni koji su ovde opisani. Kako se to ovde koristi, povećanje ili smanjenje uključuje 10% promenu u nivoima ekspresije, 25% promenu, 40% promenu ili 50% promenu ili veću promenu u nivoima ekspresije. U određenim realizacijama, povećanje ili smanjenje je promena u nivoima ekspresije između oko 30% i oko 50% ili između oko 30% i oko 40%. ,,Alteracija“ može takođe da ukazuje na promenu (povećanje ili smanjenje) u biološkoj aktivnosti bilo koje mRNK ili polipeptida ovog pronalaska (npr.,

2

sFlt1 (npr., sFlt1-i13 kratki, sFlt1-i13 dugi i/ili sFlt1-i15a (takođe poznat kao sFlt1-e15a)). Primeri biološke aktivnosti za sFlt-1 uključuju jedan ili više kliničkih simptoma PE ili eklampsije. Kako se to ovde koristi, povećanje ili smanjenje uključuje 10% promenu u biološkoj aktivnosti, poželjno 25% promenu, još poželjnije 40% promenu, i najpoželjnije 50% ili veću promenu u biološkoj aktivnosti. U određenim poželjnim realizacijama, povećanje ili smanjenje u promeni nivoa ekspresije od između oko 30% i oko 50% ili između oko 30% i oko 40%.

Određene realizacije ovog pronalaska su usmerene na jedinjenja za upotrebu u tretmanu jednog ili više angiogenskih poremećaja. Pod pojmom „tretman angiogenskog poremećaja" se misli na upotrebu oligonukleotida (npr., siRNK) ovog pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji za tretman bolesti koji uključuje fiziološke i patološke postupke neovaskularizacije, vaskulogeneze i/ili angiogeneze. Kao takve, ove farmaceutske kompozicije su korisne za tretiranje bolesti, stanja i poremećaja koji zahtevaju inhibiciju neovaskularizacije, vaskulogeneze ili angiogeneze, uključujući ali ne ograničavajući na rast i metastazu kancer tumora, neoplazmu, okularnu neovaskularizaciju (uključujući makularnu degeneraciju, dijabetičku retinopatiju, ishemičnu retinopatiju, retinopatiju nedonoščeta, horoidnu neovaskularizaciju), reumatoidni artritis, osteoartritis, hroničnu astmu, septički šok, inflamatorne bolesti, sinovitis, destrukciju kosti i hrskavice, rast panusa, formaciju osteofita, osteomijelitis, psorijazu, gojaznost, hemangiom, Kaposi-jev sarkom, aterosklerozu (uključujući aterosklerotičnu rupturu plaka), endometriozu, bradavice, višak rasta kose, keloide ožiljaka, alergijski edem, disfunkcionalno krvarenje materice, folikularne ciste, jajničku hiperstimulaciju, endometriozu, osteomijelitis, inflamatorne i infektivne procese (hepatitis, pneumonija, glumerulonefritis), astmu, nazalne polipe, transplantaciju, regeneraciju jetre, leukomalaciju, tiroiditis, tiroidno uvećanje, limfoproliferativne poremećaje, hematologne malignosti, vaskularne malformacije, pre- eklampsiju, eklampsiju i/ili HELLP sindrom.

Pod pojmom ,,preeklampsija“ (,,PE“) se misli na multi-sistemski poremećaj koji se karakteriše hipertenzijom sa proteinurijom ili edemom, ili sa oba, i jedna ili više glomerularnih disfunkcija, edem mozga, edem jetre, ili koagulacija abnormalnosti zbog trudnoće iii uticaja nedavne trudnoće. PE se generalno pojavljuje nakon 20-te nedelje gestacije. PE se generalno definiše kao neka kombinacije sledećih simptoma: (1) sistolni krvni pritisak (BP) > 140 mgHg a diastolni BP > 90 mmHg nakon 20 nedelja gestacije (generalno se meri dva puta, 1-168 sati razdvojeno), (2) novi početak proteinurije (1 merna štapić prilikom urinalize, > 300 mg proteina u 24-satnom sakupljanju urina, ili jedan nasumičan uzorak urina koji ima protein/kreatinin odnos > v0,3), i (3) rezolucija hipertenzije i proteinurije do 12 nedelje nakon porođaja.

Ozbiljna PE se generalno definiše kao (1) diastolni BP > 110 mmHg (generalno mereno dva puta, 4-168 sati odvojeno) ili (2) preoteinurija karakterisana merenjem 3,5 g ili više proteina u 24-satnom sakupljanju dva nasumice izabrana uzorka urina sa bar 3+ proteinom po mernoj šipki. U PE, hipertenzija i proteinurija se generalno pojavljuju u razmaku od ne više od sedam dana jedna od druge. Kod ozbiljne PE, ozbiljna hipertenzija, ozbiljna proteinurija i HELLP sindrom (hemoliza, povećani enzimi jetre, nizak broj trombocita) ili eklampsija mogu da se pojave simultano ili nekada samo po jedan simptom.

Povremeno, ozbiljna PE može da dovede do razvoja napada oduzetosti. Na ovaj ozbiljan oblik sindroma se upućuje kao na „eklampsiju". Eklampsija može takođe da uključi disfunkciju ili oštećenje nekoliko organa ili tkiva kao što su jetra (npr., hepatocelularno oštećenje, periportalna nekroza) i centralni nervni sistem (npr., cerabralni edem ili cerebralno krvarenje). Etiologija ovih napada oduzetosti se smatra da je sekundarna za razvoj cerabralnog edema i fokalnog spazma malih krvnih sudova u bubregu.

Pod pojmom „HELLP" sindrom se misli na grupu simptoma koji se pojavljuju kod trudnice karakterisanu hemolizom, povišenim enzimima jetre i niskim brojm trombocita. HELLP sindrom se smatra da je varijanta PE, ali može biti entitet sam po sebi.

U određenim aspektima, PE uključuje postporođajnu PE. Postporođajna PE je retko stanje koje se pojavljuje kada žena ima visok krvni pritisak i višak proteina u svom urinu nakon rođenje deteta. Postporođajna PE tipično se razvija u roku od 48 sati nakon porođaja. Ipak, postporođajna PE se nekada razvija do šest nedelja nakon porođaja, što je poznato kao kasna postporođajna PE. Znaci i simptomi postporođajne PE i kasne postporođajne PE su tipično slični onim kod PE koja se pojavljuje tokom trudnoće i mogu uključiti kombinaciju sledećeg: visok krvni pritisak (odnosno, 140/90 mmHg ili više; proteinurija, jake glavobolje; promene u vidu, uključujući privremeni gubitak vida, zamagljen vid ili osetljivost na svetlo; oticanje lica i udova; gornji abdominalni bol, uobičajeno ispod rebara na desnoj strani; mučnina ili povraćanje; i smanjeno uriniranje; iznenadni gubitak telesne težine, tipično više od 2 funte (0,9 kilograma) za nedelju dana.

Pod pojmom „degradacija intrauterinskog rasta (IUGR)“ se misli na sindrom koji rezultira u porođajnoj težini koja je manja za 10 posto od predviđene fetusne težine za gestacionu starost fetusa. Trenutni kriterijum Svetske zdravstvene organizacije za nisku porođajnu težinu je težina manja od 2.500 grama (5 funci, 8 unci) ili ispod 10-tog procenta gestacione starosti prema U.S. tabelama porođajne težine za gestacionu starost po rasi, paritetu i polu novorođenčeta (Zhang and Bowes, Obstet. Gynecol. 86:200-208, 1995). Na ove niske porođajne težine beba se takođe upućuje kao na „malo za gestacionu starost (SGA)“. PE je stanje koje je poznato da je povezano sa IUGR ili SGA.

Ovde je takođe opisan tretman jednog ili više bubrežnih poremećaja. Pod pojmom „tretman bubrežnog poremećaja“ je misli na upotrebu oligonukleotida (npr., siRNK) ovog pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji za tretman bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa bubregom. Bolesti, stanja i poremećaji povezani sa bubregom uključuju, ali nisu ograničeni na, hroničnu bubrežnu bolest (CKD) (faze 1 - 5 sa fazom 1 koja je najblaža i uobičajeno izaziva nekoliko simptoma i fazom 5 koja je ozbiljna bolest sa slabim očekivanim životnim vekom ukoliko se ne tretira (faza 5 CKD se često naziva krajnja faza renalne bolesti, krajnja faza renalne insuficijencije, ili krajnja faza bubrežne bolesti, hronična bubrežna insuficijencija ili hronična renalna insuficijencija), i aukutnu renalnu insuficijenciju (ARF) (izazvana traumatskom povredom sa gubitkom krvi, iznenadnim smanjenjem protoka krvi u bubrege, oštećenjem bubrega usled sepse, opstrukcijom protoka urina, oštećenjem od određenih lekova ili toksina, komplikacijama u trudnoći (npr., eklampsija, PE i/ili HELLP sindrom) i slično).

Takođe je ovde opisan tretman jednog ili više poremećaja jetre. Pod pojmom „tretman poremećaja jetre“ se misli na upotrebu oligonukleotida (npr., siRNK) ovog pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji za tretman bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa jetrom. Bolesti, stanja ili poremećaji povezani sa jetrom uključuju, ali nisu ograničeni na, fascioliaza, hepatitis (npr., viralni hepatitis, alkoholni hepatitis, autoimuni hepatitis, nasledni hepatitis i slično), alkoholna bolest jetre (uključujući alkoholna bolest masne jetre, alkoholni hepatitis i alkoholna ciroza), ne-alkoholna bolest masne jetre, stetohepatitis, ne- alkoholna ciroza, primarni kancer jetre (npr., hepatocelularni karcinom, holangiokarcinom, angiosarkom, eamangiosarkom i slično), primarna bilijarna ciroza, primarno skleroziranje, centrilobularna nekroza, Budd-Chiari sindrom, hemohromatoza, Wilson-ova bolest, alfa 1- antitripsin nedostatak, bolest skladištenja glikogena tip II , sa transtiretinom-povezana

2

nasledna amiloidoza, Gilber-ov sindrom, bilijarna atrezija, alfa-1 antitripsin nedostatak, Alagille sindrom, progresivna porodična intrahepatična holestaza, i slično.

Pod pojmom „terapeutska količina" se misli na količinu koja je kada se daje pacijentu koji pati od PE ili eklampsije dovoljna da izazove kvalitativno i kvantitativno smanjenje simptoma PE ili eklampsije kako je ovde opisano. „Terapeutska količina“ može takođe da znači količina koja je kada se da pacijentu ili subjektu koji pati od PE ili eklampsije dovoljan da izazove smanjenje u nivoima ekspresije jednog ili više sFLT1 proteina (npr., jedan ili više FLT1-i13 kratki, sFLT1-i13 dugi i sFlt1-i15a) izmereno putem jednog ili više ogleda koji su ovde opisani.

Pod pojmom „subjekt" se misli na sisara, uključujući, ali ne ograničavajući na, humanog ili ne-humanog sisara, kao što su ne-humani primati ili druge životinje kao što su, npr., goveda, konji, psi, ovce, mačke, miševi (glodari) i slično. U ovu definiciju su uključeni trudni, post-porođajni i ne-trudni sisari.

Pod pojmom „rastvorljiv FLT1 (sFLT1)“ (takođe poznat kao sVEGF-R1) se misli na rastvorljivi oblik FLT1 receptora koji ima sFLT1 biološku aktivnost (npr., sFlt1-i13 kratki, sFlt1-i13 dugi i/ili sFlt1-i15a (takođe poznat kao sFlt1-e15a)). Biološka aktivnost sFLT1 polipeptida može se biti podvrgnuta ogledu korišćenjem standardnog postupka, na primer, ogledanje na jedan ili više kliničkih simptoma PE, postporođajne PE, eklampsije i/ili HELLP, ogledanjem nivoa sFLT1 mRNK i/ili proteina, rađenjem ogleda na sFLT1 vezivanje za VEGF i slično. sFLT1 proteinima nedostaje domen transmembrane i citoplazmični tirozin kinaza domen FLT1 receptora. sFLT1 proteini mogu da se vezuju za VEGF i PIGF vezujući se sa visokim afinitetom, ali ne mogu da izazovu proliferaciju ili angiogenezu pa su stoga funkcionalno različiti od Flt-1 i KDR receptora. sFLT1 se inicijalno prečišćava iz humanih pupčanih endotelijalnih ćelija a kasnije pokazuju da se proizvode trofoblast ćelijama in vivo. Kako se to ovde koristi, sFlt-1 uključuje bilo koju sFlt- 1 član ili izoformu familije, npr., sFLT1-i13 (npr., FLT1-i13 kratki i/ili sFLT1-i13 dugi (sFLT1v1), sFlt1-i15a (sFLT1 _v2), sFLT1-e15a, sFLT1_v3, sFLT1_vr i slično.

Sekvenca sFLT1-i13 kratke izoforme je:

GTGAGCACTGCAAСAAAAAGGСTGTTTTСTСТСGGАTCTССA

AATTTAAAAGCACAAGGAATGATTGTACCACACAAAGTAATGTAAAACAT TAAAGGACTCATTAAAAAGTAA (SEQ ID NO:5).

�

utvrđuju merenjem količine slobnodnog PIGF i slobodnog VEGF (odnosno, nevezanog za sFLT1). Jedna primerna metrika je [sFLT1/(VEGF+PIGF)], na koju se takođe upućuje kao na PE anti-angiogenski indeks (PAAI).

Pod pojmom „anti-angiogenski indeks (PAAI) pre-eklampsije“ se misli na odnos sFLT1 / VEGF PIGF koji se koristi kao indikator anti-angiogenske aktivnosti. PAAI veći od 20 se smatra indikativnim za PE ili rizik od PE.

Pod pojmom „ vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF)“ se misli na sisarski faktor rasta koji je homolog sa faktorom rasta definisanom u U.S. Pat. br. 5,332,671; 5,240,848; 5,194,596; i Chamock-Jones et al. (Biol. Reproduction, 48: 1120-1128, 1993), i ima VEGF biološku aktivnost. VEGF egsistira kao glikolizovani homodimer i uključuje bar četiri različito alternativno spojenih izoformi. Biološka aktivnost urođenog VEGF uključuje promociju selektivnog rasta vaskularnih endotelijalnih ćelija ili endotelijalnih ćelija pupčane vene i izazivanje angiogeneze. Kako se ovde koristi, VEGF uključuje bilo koji član ili izoforma familije VEGF (npr., VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165 ili VEGF 121). U određenim realizacijama, VEGF je VEGF121 ili VEGF 165 izoforma (Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947-11954, 1991; Neufed et al. Cancer Metastasis 15:153-158, 1996), što je opisano u U.S. Pat. br. 6,447,768; 5,219,739; i 5,194,596). Takođe su uključene mutant forme VEGF kao što su KDR-selektivni VEGF i Flt-selektivni VEGF opisan kod Gille et al. (J. Biol. Chem. 276:3222-3230, 2001). VEGF uključuje humane forme i može da uključi druge životinjske forme VEGF (npr., miša, pacova, psa, kokoške ili slično).

Pod pojmom „placentni faktor rasta (PIGF)“ se misli na sisarski faktor rasta koji je homolog proteinu definisanom od strane GenBank pristupnog broja P49763 i koji ima PIGF biološku aktivnost. PIGF je glikozilovan homodimer koji pripada VEGF familiji i može biti pronađen u dve različite izoforme kroz alternativne mehanizme spajanja. PIGF expresovan od strane cito- i sincitiotrofoblasta u placenti i PIGF biološke aktivnosti uključuju izazivanje proliferacije, migracije i aktivacije endotelijalnih ćelija, posebno trofoblast ćelija.

Pod pojmom „trofoblast" se misli na mezektodermalni ćelijski sloj koji pokriva blastocistu koji erodira materičnu mukozu i kroz koji embrion prima hranjenje od majke. Trofoblast ćelije doprinose formiranju placente.

2

Pojam „nukleozid" upućuje na molekul koji ima purin ili pirimidin bazu kovalentno vezanu za ribozni ili deoksiribozni šećer. Primerni nukleozidi uključuju adenozin, guanozin, citidin, uridin i timidin. Dodatni primerni nukleozidi uključuju inozin, 1-metil inozin, pseudouridin, 5,6-dihidrouridin, ribotimidin, 2N-metil-guanozin i 2,2N,N-dimetilguanozin (takođe se na njih upućuje kao na ,,retke“ nukleozide). Pojam ,,nukleotid“ upućuje na nukleozid koji ima jednu ili više fosfatnu grupu spojenu u estar vezan za ostatak šećera. Primerni nukleotidi uključuju nukleozid monofosfate, difosfate i trifosfate. Pojam „polinukleotid" i „molekul nukleinske kiseline“ se ovde upotrebljavaju međusobno izmenjivo i upućuju na polimer nukleotida spojen zajedno putem fosfodiestar veze između 5’ i 30 atoma ugljenika.

Pojam ,,RNK“ ili ,,RNK molekul“ ili „molekul ribonukleinske kiseline“ upućuje na polimer ribonukleotida (npr., 2, 3, 4, 5,10, 15, 20, 25, 30 ili više ribonukleotida). Pojam ,,DNK“ ili ,,DNK molekul“ ili „molekul dezoksiribonukleinske kiseline" upućuje na polimer dezoksiribonukleotida. DNK i RNK mogu biti sintetizovani prirodno (npr., putem DNK replikacije ili transkripcije DNK, svaka posebno). RNK može biti post-transkripciono modifikovana. DNK i RNK takođe mogu biti hemijski sintetizovane. DNK i RNK mogu biti jednolančane (odnosno, ssRNK i ssDNK, svaka posebno) ili višelančane (npr., dvolančane, odnosno, dsRNK i dsDNK, svaka posebno). ,,mRNK“ ili „mesindžer RNK“ je jednolančana RNK koja specifikuje sekvencu amino kiseline jednog ili više polipeptidnih lanaca. Ova informacija se prevodi tokom sinteze proteina kada se ribozomi vezuju za mRNK.

Kako se to ovde koristi, pojam „mala interferirajuća RNK“ (,,siRNK“) (takođe se upućuje u nauci kao na „male interferirajuće RNK“) upućuje na RNK (ili RNK analog) koji sadrži između 10-50 nukleotida (ili nukleotid analoga) koja je sposobna da usmeri ili posreduje RNK interferenciju. Poželjno, siRNK sadrži između oko 15-30 nukelotida ili nukleotid analoga, još poželjnije oko 16-25 nukleotida (ili nukleotid analoga), čak još poželjnije između oko 18-23 nukleotida (ili nukleotid analoga), i čak još poželjnije između oko 19-22 nukleotida (ili nukleotid analozi) (npr., 19, 20, 21 ili 22 nukleotida ili nukleotid analoga). Pojam ,,kratka“ siRNK upućuje na siRNK koja sadrži oko 21 nukleotida (ili nukleotid analoga), na primer, 19, 20, 21 ili 22 nukleotida. Pojam ,,duga“ siRNK upućuje na siRNK koja sadrži oko 24-25 nukleotida, na primer, 23, 24, 25 ili 26 nukleotida. Kratke siRNK mogu, u nekim instancama, ukjučivati manje od 19 nukleotida, npr., 16, 17 ili 18 nukleotida, pod uslovom da kraća siRNK zadržava sposobnost da posreduje RNKi. Na isti način, duge siRNK mogu, u nekim instancama, uključivati više od 26 nukleotida, pod

2

uslovom da duža siRNK zadržava sposobnost da posreduje RNKi bez daljeg procesuiranja, npr., enzimskog procesuiranja, ka kratkoj siRNK.

Pojam „nukleotid analog" ili „izmenjeni nukleotid" ili „modifikovani nukleotid" upućuje na nestandardni nukleotid, uključući i ne-prirodno nastale ribonukleotide i deoksiribonukleotide. Primerni nukleotid analozi su modifikovani na bilo kojoj poziciji tako da menjaju određene hemijske osobine nukleotida ali da ipak zadržavaju sposobnost nukleotid analoga da obavlja svoju nameravanu funkciju. Primeri pozicija nukleotida koji mogu biti derivatizovani uključuju 5 poziciju, npr., 5-(2-amino)propil uridin, 5-bromo uridin, 5-propin uridin, 5-propenil uridin, itd.; 6 poziciju, npr., 6-(2-amino)propil uridin; 8-poziciju za adenozin i/ili guanozine, npr., 8-brom guanozin, 8-hloro guanozin, 8-fluorguanozin, itd. Nukleotid analozi takože uključuju deaza nukleotide, npr., 7-deaza-adenozin; O- i N-modifikovane (npr., alkilovane, npr., N6-metil adenozin, ili kako je to inače poznato u nauci) nukleotide; i druge heterociklično modifikovane nukleotid analoge kao što su oni opisani kod Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug.10(4):297-310.

Nukleotid analozi mogu takođe da sadrže modifikacije na delu šećera nukleotida. Na primer 2’ OH-grupa može biti zamenjena grupom odabranom od H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR ili OR, pri čemu je R supstituisan ili nesupstituisan C1-C6 alkil, alkenil, alkinil, aril, itd. Druge moguće modifikacije uključuju one opisane u U.S. Pat. br.

5,858,988 i 6,291,438.

Fosfat grupa nukleotida može takođe biti modifikovana, npr., supstituisanjem jednog ili više kiseonika fosfat grupe sa sumporom (npr., fosforotioati), ili pravljenjem drugih supstitucija koje dopuštaju nukleotidu da obavlja svoju nameravanu funkciju kao što je to opisano kod, na primer, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117- 21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Anisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85, i U.S. Pat. br. 5,684,143. Određene modifikacije na koje se u gornjem tekstu poziva (npr., modifikacije fosfat grupe) poželjno smanjuju brzinu hidrolize, na primer, polinukleotida koji sadrže navedene analoge in vivo ili in vitro.

Pojam „oligonukleotid" upućuje na kratki polimer nukleotida i/ili nukleotid analoga. Pojam „RNK analog" upućuje na polinukleotid (npr., hemijski sintetizovan polinukleotid) koji ima

2

bar jedan izmenjen ili modifikovan nukleotid upoređeno sa korespondirajućom neizmenjenom ili nemodifikovanom RNK. Kao što je u gornjem tekstu razmatrano, oligonukleotidi mogu biti povezani vezama koje rezultiraju u nižoj brzini hidrolize RNK analoga upoređeno sa RNK molekulom sa fosfodiestar vezama. Na primer, nukleotidi analoga mogu da sadrže metilendiol, etilen diol, oksimetiltio, oksietiltio, oksikarboniloksi, fosforodiamidat, fosforoamidat, i/ili fosforotioat veze. Poželjni RNK analozi uključuju šećeri/ili kičmu-modifikovanih ribonukleotida i/ili deoksiribonukleotida. Takve izmene ili modifikacije mogu dalje da uključuju dodavanje ne-nukleotidnog materijala, kao što je to na kraju(evima) RNK ili interno (na jednom ili više nukleotida RNK). RNK analog treba samo da bude dovoljno sličan prirodnoj RNK koja ima sposobnost da posreduje (posreduju) RNK interferenciju.

Kao što se to ovde koristi, pojam ,,RNK interferencija“ (,,RNKi“) upućuje na selektivnu intracelularnu degradaciju RNK. RNKi se pojavljuje u ćelijama prirodno da ukloni strane RNK (npr., viralne RNK). Prirodna RNKi postupa putem fragmenata koji su rascepani od slobnodne dsRNK koja usmerava degradativne mehanizme na drugim sličnim RNK sekvencama. Alternativno, RNKi može biti inicirana ručno od strane čoveka, na primer, da se stiša ekspresija ciljanih gena.

RNKi sredstvo, npr., RNK sredstvo za stišavanje, koje ima lanac koji je „sekvenca dovoljno komplementarna da cilja mRNK sekvencu da usmeri ciljno-specifičnu RNK interferenciju (RNKi)“ znači lanac koji ima sekvencu dovoljnu da pokrene destrukciju ciljane mRNK putem RNKi mašinerije i procesa.

Kako se ovde koristi, pojam „izolovana RNK“ (npr., „izolovana siRNK" ili „izolovani siRNK prekursor") upućuje na RNK molekule koji su suštinski slobodni od drugog ćelijskog materijala, ili medijuma kulture kada su proizvedeni rekombinantnim tehnikama, ili suštinski slobodni od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada su hemijski sintetizovani.

Kako se ovde koristi, pojam „RNK stišavanje” upućuje na grupu sekvencom-specifičnih regulatornih mehanizama (npr., RNK interferencija (RNKi), transkripciono stišavanje gena (TGS), post-transkripciono stišavanje gena (PTGS), gušenje, ko-supresija (kopotiskivanje), i translaciona represija) posredovanih RNK molekulima što rezultira u

2

inhibiciji ili „stišavanju" ekspresije korespondirajućeg protein-kodirajućeg gena. RNK stišavanje je primećeno u mnogim tipovima organizama, uključujući biljke, životinje i gljive.

Pojam „diskriminatorno RNK stišavanje" upućuje na sposobnost RNK molekula da suštinski inhibira ekspresiju ,,prve“ ili ,,ciljane“ polinukleotidne sekvence dokse suštinski ne inhibira ekspresija ,,druge“ ili ,,ne-ciljane polinukleotidne sekvence", npr., kada su obe polinukleotidne sekvence prisutne u istoj ćeliji. U određenim realizacijama, ciljana polinukleotidna sekvenca korespondira sa ciljanim genom, dok ne-ciljana polinukleotidna sekvenca korespondira sa ne-ciljanim genom. U drugim realizacijama, ciljana polinukleotidna sekvenca korespondira za ciljanom alelom, dok ne-ciljana polinukleotidna sekvenca korespondira sa ne-ciljanom alelom. U određenim realizacijama, ciljana polinukleotidna sekvenca je DNK sekvenca koja kodira regulatorni region (npr., promoter ili pojačivač elemente) ciljanog gena. U drugim realizacijama, ciljana polinukleotidna sekvenca je ciljana mRNK koja je kodirana putem ciljanog gena.

Pojam „in vitro“ ima svoje priznato značenje u nauci, npr., uključivanje prečišćenih reagensa ili ekstrakta, npr., ćelijskih ekstrakta. Pojam „in vivo“ takođe ima svoje priznato značenje u nauci, npr., uključivanje živih ćelija, npr., imortalizovane (besmrtne) ćelije, primarne ćelije, ćelijske linije i/ili ćelije u organizmu.

Kako se ovde koristi, pojam ,,transgen“ upućuje na bilo koji molekul nukleinske kiseline, koji je umetnut veštački u ćeliju, i postaje deo genoma organizma koji se razvija iz ćelije. Takav transgen može da uključi gen koji je delimično ili u potpunosti heterolog (npr., strani) za transgenski organizam, ili može predstavljati gen homolog za endogeni gen organizma. Pojam „transgen" takođe znači molekul nukleinske kiseline koji uključuje jednu ili više odabranih sekvenci nukleinske kiseline, npr., DNK, koje kodiraju jedan ili više modifikovanih manipulacijom RNK prekursora, da budu ekspresovani u transgenski organizam, npr., životinju, koji je delimično ili u potpunosti homolog, odnosno, strani, za transgensku životinju, ili homolog za endogeni gen transgenske životinje, ali koji je dizajniran da bude umetnut u životinjski genom na lokaciji koja se razlikuje od prirodnog gena. Transgen uključuje jedan ili više promotera i bilo koju drugu DNK, kao što su introni, neophodni za ekspresiju ciljane sekvence nukleinske kiseline, sve operativno povezano za odabranu sekvencu, i može uključiti pojačivač sekvencu.

Gen „uključen" u bolest ili poremećaj uključuje gen, normalnu ili aberantnu ekspresiju ili funkciju koja daje dejstvo ili izaziva bolest ili poremećaj ili bar jedan simptom navedene bolesti ili poremećaja.

Pojam „dobijanje-funkcije mutacija“ kako se ovde koristi, upućuje na bilo koju mutaciju u genu u kojoj protein kodiran navedenim genom (odnosno, mutant protein) stiče funkciju koja nije normalno povezana sa proteinom (odnosno, divlji tip proteina) pa izaziva ili doprinosi bolesti ili poremećaju. Dobijanje-funkcije mutacija može biti uklanjanje, dodavanje ili supstitucija nukleotida ili više nukleotida u genu koji dovode do promene u funkciji kodiranog proteina. U jednoj realizaciji, dobijanje-funkcije mutacija menja funkciju mutant proteina (npr., izaziva proizvodnju jednog ili više sFLT1 proteina) ili izaziva interakcije sa drugim proteinima. U drugoj realizaciji, dobijanje-funkcije mutacija izaziva smanjenje ili ukljanjanje normalnog divljeg-tipa proteina, na primer, interakcijom izmenjenog, mutant proteina sa navedenim normalnim, divljeg-tipa proteinom.

Kako se to ovde koristi, pojam „ciljani gen“ je gen čija se ekspresija ima suštinski inhibirati ili „stišati“. Ovo stišavanje može biti postignuto RNK stišavanjem, npr., cepanjem mRNK ciljanog gena ili translacionom represijom ciljanog gena. Pojam „ne-ciljani gen“ je gen čija se ekspresija neće suštinski stišati. U jednoj realizaciji, polinukleotidne sekvence ciljanog i ne-ciljanog gena (npr., mRNK kodirana putem ciljanih (sFLT1) i ne-ciljanih (flFLT1) gena) mogu da se razlikuju sa jednim ili više nukleotida, npr, u intronskom regionu. U još jednoj realizaciji, ciljani i ne-ciljani geni mogu da se razlikuju po jednom ili više polimorfizama (npr, polimorfizmi pojedinačnih nukleotida ili SNP-ovi). U još jednoj realizaciji, ciljani i ne- ciljani geni mogu da dele manje od 100% identitet sekvence. U još jednoj realizaciji, ne- ciljani gen može biti homolog (npr., ortolog ili paralog) ciljanog gena.

„Ciljana alela“ je alela (npr., SNP alela) čija se ekspresija ima selektivno inhibirati ili „stišati“. Ovo stišavanje može biti postignuto RNK stišavanjem, npr., cepanjem mRNK ciljanog gena ili ciljane alele sa siRNK. Pojam ,,ne-ciljana alela" je alela čija se ekspresija suštinski ne stišava. U određenim realizacijama, cilanje i ne-ciljane alele mogu da korespondiraju sa istim ciljanim genom. U drugim realizacijama, ciljana alela korespondira sa, ili je povezana sa, ciljanim genom, a ne-ciljana alela korespondira, ili je povezana sa, ne-ciljanim genom. U jednoj realizaciji, polinukleotidna sekvenca ciljanih i ne-ciijanih alela može da se razlikuje po jednom ili više nukleotida. U još jednoj realizaciji, ciljane i neciljane alele mogu da se razlikuju po jednom ili više alelskih polimorfizama (npr, jednom ili

1

više SNP-ova). U još jednoj realizaciji, ciljane i ne-ciljane alele mogu da dele manje od 100% identiteta sekvence.

Pojam ,,polimorfizam“ kako se ovde koristi, upućuje na varijaciju (npr., jedno ili više uklanjanje, umetanja ili supstitucija) u sekvenci gena koja se identifikuje ili detektuje kada se uporedi ista sekvenca gena iz različitih izvora ili subjekata (ali iz istog organizma). Na primer, polimorfizam može biti identifikovan kada se uporedi ista sekvenca gena iz različitih subjekata. Identifikacija takvog polimorfizma je rutina u nauci a metodologije su slične onima koje se koriste da se detektuje, na primer, tačka mutacija kancera dojke. Identifikacija može biti učinjena, na primer, iz DNK ekstrakovane iz subjektovih iimfocita, praćeno pojačavanjem (amplifikacijom) polimorfnih regiona korišćenjem specifičnih prajmera za navedeni polimorfni region. Alternativno, polimorfizam može biti identifikovan kada se uporede dve alele istog gena. U posebnim realizacijama, polimorfizam je polimorfizam jednog nukleotida (SNP).

Na varijaciju sekvence između dve alele istog gena u okviru organizma se ovde upućuje kao na „alelni polimorfizam“. U određenim realizacijama, alelni polimorfizam korespondira sa SNP alele. Na primer, alelni polimorfizam može sadržati varijaciju jednog nukleotida između dve alele SNP-a. Polimorfizam može biti na nukleotidu u okviru regiona kodiranja ali, zbog degeneracije genetskog koda, nije kodirana promena u sekvenci amino kiseline. Alternativno, polimorfne sekvence mogu da kodiraju različitu amino kiselinu na određenoj poziciji, ali promena u amino kiseline ne utiče na funkciju proteina. Polimorfni region mogu takođe biti pronađeni u ne-kodirajućim regionima gena. U primernim realizacijama, polimorfizam se pronalazi u kodiranom regionu gena ili u neprevedenom regionu (npr., 5’ UTR ili 3’ UTR) gena.

Kako se to ovde koristi, pojam „alelska frekvencija'<1>je mera (npr., proporcija ili procenat) relativne frekvencije alele (npr., SNP alele) na jednom lokusu (poziciji) u populaciji pojedinaca. Na primer, gde populacija pojedinaca nosi n lokalitet određenog hromozomskog lokusa (i gen zauzima taj lokus) u svakoj od njihovih somatskih ćelija, tada je alelska frekvencija alele frakcija ili procenat lokaliteta koji alela zauzima u okviru populacije. U posebnim realizacijama, alelska frekevencija alele (npr., SNP alela) je bar 10% (npr., bar 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ili više) u istoj populaciji.

2

Kako se to ovde koristi, pojam „uzorak populacije" upućuje na populaciju pojedinaca koja se sastoji od značajnog broja pojedinaca. Na primer, uzorak populacije može da se sastoji od 50, 75, 100, 200, 500, 1000 ili više pojedinaca. U posebnim realizacijama, uzorak populacije može da se sastoji od pojedinaca koji dele bar uobičajeni fenotip bolesti (npr., dobija-funkciju poremećaj) ili mutaciju (npr., dobija-funkciju mutacija).

Kako se to ovde koristi, pojam „heterozigotnost" upućuje na frakciju pojedinca sa populacijom koja je heterozigotna (npr., sadrže dve ili više različite alele) na određenoj lokaciji (npr., na SNP). Heterozigotnost može bit izračunate za uzorak populaciju korišćenjem postupaka koji su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti nauke.

Fraza „ispitivanje funkcije gena u ćeliji ili organizmu“ upućuje na ispitivanje ili proučavanje ekspresije, funkcije ili fenotipa koji iz toga proističe.

Kako se ovde koristi, pojam ,,RNK sredstvo za stišavanje“ upućuje na RNK koja je sposobna da vrši inhibiciju ili „stišavanje" ekspresije ciljanog gena. U određenim realizacijama, RNK sredstvo za stišavanje je sposobno da vrši sprečavanje potpunog procesuiranja (npr., puna translacija i/li ekspresija) mRNK molekula kroz mehanizme posttranskripcionog stišavanja. RNK sredstvo za stišavanje uključuje male (< 50 b.p.), nekodirajuće RNK molekule, na primer RNK duplekse koji sadrže sparene lance, kao i prekusor RNK iz koje tako male ne-kodirajuće RNK mogu da generišu. Primerna RNK sredstva za stišavanje uključuju siRNK, miRNK, siRNK-slični dupleksi, i oligonukleotidi sa dualnom funkcijom kao i njihovi prekursori. U jednoj realizaciji, RNK sredstvo za stišavanje je sposobno da izazove RNK interferenciju. U sledećoj realizaciji, RNK sredstvo za stišavanje je sposobno da posreduje translacionu represiju.

Kako se ovde koristi, pojam „retki nukleotid" upućuje na prirodno nastali nukleotid koji nastaje retko, uključujući prirodno nastale deoksiribonukleotide ili ribonukleotide koji nastaju retko, npr., prirodno nastali ribonukleotid koji nije guanozin, adenozin, citozin, ili uridin. Primeri retkih nukleotida uključuju, ali nisu ograničeni na, inozin, 1-metil inozin, pseudouridin, 5,6-dihidrouridin, ribotimidin,<2>N-metilguanozin i<2,2>N,N-dimetilguanozin.

Pojam „modifikovani manipulacijom (engineered)" je modifikovan manipulacijom RNK prekursor, ili modifikovan manipulacijom molekul nukleinske kiseline, koji ukazuje da prekursor ili molekul nisu pronađeni u prirodi, tako što su sve ili deo sekvence nukleinske kiseline prekursora ili molekula kreirane ili odabrane od strane čoveka. Kada je jedanput kreirana ili odabrana, sekvenca može biti replicirana, prevedena, transkribovana, ili na neki drugi način procesuirana putem mehanizama u okviru ćelije. Tako, RNK prekursor proizveden u okviru ćelije iz transgena koji uključuje modifikovan manipulacijom molekul nukleinske kiseline je modifikovan manipulacijom RNK prekursor.

Kako se ovde koristi, pojam „mikroRNK" (,,miRNK“), tna koji se takođe upućuje u nauci kao na „male temporalne RNK" („stRNK"), upućuje na malu (10-50 nukleotida) RNK koje su genetski kodirane (npr., putem viralnih, sisarskih ili biljnih genoma) i sposobne su da usmeravaju ili posreduju u RNK stišavanju. „miRNK poremećaj" će upućivati na bolest ili poremećaj karakterisan aberantnom ekspresijom ili aktivnošću miRNK.

Kako se ovde koristi, pojam „dualno funkcionalni oligonukleotid“ upućuje na RNK sredstvo za stišavanje koje ima formulu T-L-μ, pri čemu T predstavlja mRNK ciljajući ostatak, L predstavlja vezujući ostatak, a μ predstavlja miRNK regrutujući ostatak. Kako se ovde koriisti, pojmovi „mRNK ciljajući ostatak“, „ciljajući ostatak", „mRNK ciljajući deo“ ili „ciljajući deo“ upućuje na domen, deo ili region dualnog funkcionalnog oligonukleotida koji ima dovoljnu veličinu i dovoljnu komplementarnost prema delu ili regionu mRNK izabrane ili ciljane za stišavanje (odnosno, ostatak ima sekvencu dovoljnu da zarobi ciljnu mRNK). Kako se ovde koristi, pojam „vezujući ostatak" ili „vezujući deo“ upućuje na domen, deo ili region RNK sredstva za stišavanje koje se kovalentno spaja ili vezuje za mRNK.

Kako se ovde koristi, pojam „antisens lanac“ RNK sredstva za stišavanje, npr., siRNK ili RNK sredstvo za stišavanje, upućuje na lanac koji je suštinski komplementaran delu od oko 10-50 nukleotida, npr., oko 15-30, 16-25, 18-23 ili 19-22 nukleotida mRNK gena ciljanog za stišavanje. Antisens lanac ili prvi lanac ima sekvencu dovoljno komplementarnu sa željenom ciljnom mRNK sekvencom kako bi usmerio ciljno-specifično stišavanje, npr., kompiementarnost dovoljna da pokrene destrukciju željene ciljne mRNK putem RNKi mašinerije ili procesa (RNKi interferencija) ili komplementarnost dovoljna da pokrene translacionu represiju željene ciljne mRNK.

Pojam „sens lanac“ ili „drugi lanac“ RNK sredstva za stišavanje, npr., siRNK ili RNK sredstvo za stišavanje, upućuje na lanac koji je komplementaran sa antisens lancem ili prvim lancem. Na antisens i sens lance se može upućivati kao na prve ili druge lance, gde prvi ili drugi lanac ima komplementarnost sa ciljnom sekvencom i odnosni drugi ili prvi

4

lanac ima komplementarnost sa navedenim prvim ili drugim lancem. miRNK dupleks služi kao intermedijar ili siRNK-slični dupleksi uključuju miRNK lanac koji ima dovoljnu komplementarnost prema delu od oko 10-50 nukleotida mRNK gena ciljanog za stišavanje i miRNK* lanac kojiima dovoljnu komplementarnost da formira dupleks sa miRNK lancem.

Kako se ovde koristi, pojam „vodič lanac“ upućuje na lanac RNK sredstva za stišavanje, npr., antisens lanac siRNK dupleksa ili siRNK sekvence, koji ulazi u RISC kompleks i usmerava cepanje ciljne mRNK.

Kako se ovde koristi, pojam ,,asimetrija“, kao u asimetriji dupleks regiona RNK sredstva za stišavanje (npr., stem shRNK), upućuje na nejednakost snage veze ili snage sparivanja baze između krajeva RNK sredstva za stišavanje (npr., između krajnjih nukieotida na prvom lancu ili stem delu i krajnih nukleotida na suprotnom drugom lancu ili stem delu), tako da je 5’ kraj jednog lanca dupleksa češći u prolazno nesparenom, npr., jednolančanom, stanju od 5’ kraja komplementarnog lanca. Strukturalna razlika određuje da je jedan lanac dupleksa poželjno inkorporisan u RISC kompleks. Lanac čiji je 5’ kraj manje čvrsto sparen za komplementarni lanac će poželjno biti inkorporisan u RISC i posredovaće RNKi.

Kako se ovde koristi, pojam „snaga veze“ ili „snaga para baze“ upućuje na snagu interakcije između parova nukleotida (ili nukleotid analoga) na suprotnim lancima oligonukleotidnog dupleksa (npr., siRNK dupleks), primarno zbog H-vezivanja, van der Waals interakcija, ili slično između nukleotida (ili nukleotid analoga).

Kako se ovde koristi, „5’ kraj“, kao na 5’ kraju antisens lanca, upućuje na 5’ krajnje nukleotide, npr., između jednog i oko 5 nukleotida na 5’ kraju antisens lanca. Kako se ovde koristi, „3’ kraj“, kao na 3’ kraju sens lanca, upućuje na region, npr., region između jednog i oko 5 nukleotida, koji je komplementaran sa nukleotidima na 5’ kraju komplementarnog antisens lanca.

Kako se ovde koristi pojam „destabilizujući nukleotid“ upućuje na prvi nukleotid ili nukleotid analog sposoban da formira bazni par sa drugim nukleotidom ili nukleotid analogom tako da je bazni par niže snage veze nego kod konvencionalnog baznog para (odnosno, Watson-Crick bazni par). U određenim realizacijama, destabilizujući nukleotid je sposoban da formira nepodudaran bazni par sa drugim nukleotidom. U drugim realizacijama, destabilizujući nukleotid se sposoban da formira klimav bazni par sa drugim nukleotidom. U još nekim realizacijama, destabilizujući nukleotid je sposoban da formira nesiguran bazni par sa drugim nukleotidom.

Kako se ovde koristi „bazni par“ upućuje na interakciju između parova nukleotida (i li nukleotid analoga) na suprotnim lancima oligonukleotidnog dupleksa (npr., dupleks formiran lance RNK sredstva za stišavanje i ciljnom mRNK sekvencom), primarno zbog H-vezivanja, van der Waals interakcija, i slično između navedenih nukleotida (ili nukleotid analoga). Kako se ovde koristi, pojam „snaga veze" ili „snaga baznog para“ upućuje na snagu baznog para.

Kako se ovde koristi, pojam „neusklađen bazni par“ upućuje na bazni par koji sadrži nekomplementarne ili ne-Watson-Crick bazne parove, na primer, ne normalno komplementarni G:C, A:T ili A:U bazni parovi. Kako se ovde koristi pojam „nesiguran bazni par“ (takođe poznat kao ne-diskriminatorni bazni par) upućuje na bazni par formiran od strane univerzalnog nukleotida.

Kako se ovde koristi, pojam „univerzalni nukleotid<11>(takođe poznat kao „neutralni nukleotid") uključuje one nukleotide (npr. određene destabilizujuće nukleotide) koji imaju bazu („univerzalnu bazu“ ili „neutralnu bazu“) koje ne diskriminuje značajno između baza na komplementarnom polinukleotidu kada se formira bazni par. Univerzalni nukleotidi su predominantno hidrofobni molekuli koji mogu da uviju efikasno u antiparalelne dupleks nukleinske kiseline (npr., dvolančana DNK ili RNK) zbog interakcija slaganja. Delovi baze univerzalnih nukleotida tipično sadrže aromatični heterociklični ostatak koji sadrži azot.

Kako se ovde koristi, pojmovi „dovoljna komplementarnost“ ili „dovoljan stepen komplementarnosti“ znači da RNK sredstvo za stišavanje ima sekvencu (npr. u antisens lancu, mRNK ciljajućem ostatku ili miRNK ostatku za regrutovanje) koje je dovoljno da vezuje željenu ciljnu RNK, redom, i da pokrene RNK stišavanje ciljne mRNK.

Kako se ovde koristi, pojam „translaciona represija“ upućuje na selektivnu inhibiciju mRNK translacije. Neutralna translaciona represija se nastavlja putem miRNK cepanih iz shRNK prekursora. I RNKi i translaciona represija su posredovani putem RISC. I RNKi i translaciona represiju sa pojavljuju prirodno ili mogu biti inicirani čovečijom rukom, na primer, stišavanje ekspresije ciljnih gena.

Različite metodologije ovog pronalaska uključuju korak koji povlači sa sobom upoređivanje vrednosti, nivoa, odlike, karakteristike, osobine, itd. prema „pogodnoj kontroli“, gde se ovde međusobno izmenjivo upućuje i na kao „odgovarajuću kontrolu“. „Pogodna kontrola“ ili „odgovarajuća kontrola“ je bilo koja kontrola ili standard koji je blizak stručnjaku iz ove oblasti nauke a koristan u svrhe upoređenja. U jednoj realizaciji, „pogodna kontrola“ ili „odgovarajuća kontrola“ je vrednost, nivo , odlika, karakteristika, osobina, itd. utvrđena pre obavljanja RNKi metodologije, kako je to ovde opisano. Na primer, brzina transkripcije, mRNK nivo, brzina translacije, nivo proteina, biološka aktivnost, ćelijska karakteristika ili osobina, genotip, fenotip, itd. mogu biti određeni pre unošenja RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska u ćeliju ili organizam. U sledećoj realizaciji, „pogodna kontrola“ ili „odgovarajuća kontrola“ je vrednost, nivo, odlika, karakteristika, osobine, itd. određena u ćeliji ili organizmu, npr., kontrola ili normalna ćelija ili organizam, koji prikazuje, na primer, normalna svojstva. U još jednoj realizaciji, „pogodna kontrola“ ili „odgovarajuća kontrola“ je prethodno definisana vrednost, nivo, odlika, karakteristika, osobina, itd.

Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kako se uobičajeno podrazumevaju od strane stručnjaka iz ove oblasti nauke kojoj ovaj pronalazak pripada. lako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni u praksi ili testiranju sadašnjeg pronalaska, pogodni postupci i materijali su niže opisani. U slučaju konflikta sadašnja specifikacija, uključujući definicije, će imati kontrolu. Dodatno tome, materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska su dizajnirana da ciljaju intronske regione mRNK molekula koji kodiraju jedan ili više sFLT1 proteina.

Sadašnji pronalazak cilja jedan ili više sFL1 mRNK i njihove korespondirajuće proteine. Jedan lanac dvolančane RNK (siRNK) je komplementaran sa ciljnom sekvencom u okviru sFLT1 mRNK. Nakon uvođenja siRNK u subjekt ili ćeliju, siRNK delimično odmotava, vezuje se za intronski ciljni region u okviru sFLT1 mRNk na položajno-specifičan način, i aktivira mRNK nukleazu. Ova nukleaza cepa sFLT1 mRNK, pri čemu zaustavlja translaciju sFLT1 proteina. Ćelije se oslobađaju od delimično svarene mRNK, tako isključujući translaciju, ili ćelije vare delimično prevedene proteine. U određenim realizacijama, ekspresija sFLTI proteina se smanjuje u subjektu ili ćeliji sa oko 30% do 50%, ili za oko 30% do 40%.

Takođe su ovde opisana RNK sredstva za stišavanje sposobna da ciljaju jednu ili više ciljnih sekvenci datih na Slici 13. U određenim primerima, RNK sredstva za stišavanje su sposobna da ciljaju jednu ili više ciljnih sekvenci na jednoj ili više ciljnih sekvenci navedenih na genskim pozicijama odabranim od grupe koja se sastoji od 2247, 2252, 2253, 2256, 2279, 2280, 2283, 2284, 2286, 2293, 2294, 2295, 2304, 2313, 2318, 2321, 2322, 2324, 2326, 2332, 2333, 2339, 2343, 2351, 2353,2362, 2471, 2474, 2477, 2508, 2510, 2513, 2518, 2519, 2525, 2528, 2556, 2561, 2572, 2574, 2576,2577, 2580, 2582, 2585, 2588 i 2590 humanog flt1 gena (kako je dat napred na Slici 13 i u donjoj Tabeli).

Naročito primerne ciljne sekvence humanog flt1 gena mogu biti pronađene na pozicijama 2283 (5’ CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3’ (SEQ ID NO:1)), 2519 (5’ CATCATAGCTACCATTTATT 3’ (SEQ ID NO:2)), 2318 (5’ ATTGTACCACACAAAGTAAT 3’ (SEQ ID NO:3)), i 2585 (5’ GAGCCAAGACAATCATAACA 3’ (SEQ ID NO:4)). (Videti Slike 6 i 13). Genomska sekvenca za svaku ciljnu sekvencu može biti pronađena u, na primer, javno dostopnoj bazi podataka koja se održava od strane NCBI.

� Različiti aspekti se opisuju detaljnije u sledećim pododeljcima.

I. siRNK Dizajn

U nekim primerima, siRNK su dizajnirane kako sledi. Prvo, deo ciljnog gena (npr., flt1 gen), npr., jedna ili više ciljnih sekvenci ovde iznetih na Slici 6, se odabiru, npr., jedna ili bilo koja kombinacija SFL1-i13-2283, sFlt1-i15a-2519, sFLT1-i13-2318, sFlt1-i15a-2585 iz izotronskog regiona ciljnog gena. Cepanje mRNK na ovim položajima treba da eliminiše translaciju korespondirajućeg rastvorljivog proteina. Sens lanci se dizajniraju na bazu ciljne sekvence. (Videti Sliku 13). Poželjno, deo (i korespondirajući sens lanac) uključuju oko 30 do 35 nukleotida, npr., 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 nukleotida. Poželjnije, deo (i korespondirajući sens lanac) uključuju 21, 22 ili 23 nukleotida. Vešt stručnjak će ipak ceniti da siRNK koje imaju dužinu od manje od 19 nukleotida ili veću od 25 nukleotida mogu takođe da funkcionišu u posredovanju RNKi, U skladu sa tim, siRNK takve dužine su takođe u okviru ovog pronalaska pod uslovom da zadržavaju sposobnost da posreduju RNKi. Za duža RNKi sredstva je demonstrirano da izmamljuju interferon ili PKR odgovor kod određenih sisarskih ćelija koje mogu biti nepoželjne. Poželjno RNKi sredstva ovog pronalaska ne izmamljuju PKR odgovor (odnosno, dovoljno su kratke dužine). Ipak, duža RNKi sredstva mogu biti korisna, na primer, u ćelijskim tipovima nesposobnim da generišu PKR odgovor ili u situacijama gde je PKR odgovor regulisan naniže ili prigušen alternativnim sredstvima.

Ovaj sens lanac sekvence je dizajniran tako da je ciljna sekvenca esencijalno u sredini lanca. Pomeranje ciljne sekvence na poziciju van centra može, u nekim instancama, smanjiti efikasnost cepanja od strane siRNK. Takve kompozicije, odnosno, manje efikasne kompozicije, mogu biti poželjne za upotrebu ukoliko je isključivanje-stišavanja divljeg-tipa mRNK primećeno.

Antisens lanac je rutinski iste dužine kao sens lanac i uključuje komplementarne nukleotide. U jednoj realizaciji, lanci su u potpunosti komplementarni, odnosno, lanci su krnje-završeni kada su poravnati ili rekombinovani. U sledećoj realizaciji, lanci sadrže poravnanje ili rekombinovanje tako da se generišu 1-, 2- ili 3-nukleotidna ispupčenja, odnosno, 3 kraj sens lanca se pruža 1, 2 ili 3 nukleotida dalje od 5’ kraja lanca antisens lanca i/ili se 3’ kraj antisens lanca pruža 1, 2 III 3 nukleotida dalje od 5’ kraja sens lanca.

Ispupčenja mogu da sadrže (ili da se sastoje od) nukleotida koji korespondiraju sa ciljnom sekvencom gena (ili njenim komplementom). Alternativno, ispupčenja mogu da sadrže (ili da se sastoje od) deoksiribonukleotida, na primer dTs, ili nukleotid analoga, ili drugog pogodnog ne-nukleotidnog materijala.

Kako bi se olakšao ulazak antisens lanca u RISC (i tako povećala ili poboljšala efikasnost ciljnog cepanja i stišavanja), snaga baznog para između 5’ kraja sens lanca i 3’ kraja antisens lanca može biti izmenjena, npr., smanjena ili redukovana, kako je opisano detaljno u U.S. Patent br. 7,459,547, 7,772,203 i 7,732,593, pod naslovom „Methods and Compositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing" (podneseno 2. juna 2003. god.) i U.S. Patent br.. 8,309,704, 7,750,144, 8,304,530, 8,329,892 i 8,309,705, pod naslovom „Methods and Compositions for Engancing the Effficacy and Specificity of RNAi“ (podneseno 2. juna 2003. god). U jednoj realizaciji ovih aspekata pronalaska, snaga baznog para je manje zbog manjeg broja G:C baznih parova između 5’ kraja prvog ili antisens lanca i 3’ kraja drugog ili sens lanca nego između 3’ kraj prvog ili antisens lanca i 5’ kraja drugog ili sens lanca. U sledećoj realizaciji, snaga baznog para je manja zbog bar jednog neusklađenog baznog para između 5’ kraja prvog ili antisens lanca i 3’ kraja drugog ili sens lanca. U određenim primernim realizacijama, neusklađena bazni par je odabran od grupe koja se sastoji od G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C i U:U. U sledećoj realizaciji, snaga baznog para je manje zbog bar jednog klimavog baznog para, npr., G:U, između 5’ kraja prvog ili antisens lanca i 3’ kraja drugog ili sens lanca. U sledećoj realizaciji, snaga baznog para je manja zbog bar jednog baznog para koji sadrži retki nukleotid, npr., inozin (I). U određenim primernim realizacijama, bazni par je odabran od grupe koja se sastoji od l:A, l:U i l:C. U još jednoj realizaciji, snaga baznog para je manja zbog bar jednog baznog para koji sadrži modifikovani nukleotid. U određenim primernim realizacijama, modifikovani nukleotid je odabran od grupe koja se sastoji od 2-amino-G, 2- amino-A, 2,6-diamino-G i 2,6-diamino-A.

Dizajn siRNK koje su pogodne za ciljanje sFlt1 ciljnih sekvenci kako su iznete na Slici 6 je opisan detaljno niže u tekstu. siRNK mogu biti dizajnirane prema gornjim primernim učenjima za bilo koju od ciljnih sekvenci pronađenih u flt1 genu. Štaviše, tehnologija je primenjljiva na ciljanje bilo kojih drugih ciljnih sekvenci, npr., ciljnih sekvenci koje ne izazivaju bolest.

Da se validira efektivnost kojom siRNK uništavaju mRNK (npr, sFLT1 mRNK), siRNK može biti inkubirana sa cDNK (npr., Flt1 cDNK) u Drosophila-baziranom in vitro mRNK sistemu ekspresije. Radiooznačeni sa<32>P, novije sintetizovane mRNK (npr., FltlmRNK) se detektuju autoradiografski na agaroznom gelu. Prisustvo cepane mRNK ukazuje na mRNK aktivnost nukleaze. Pogodne kontrole uključuju izostavljanje siRNK. Alternativno, kontrolne RNK se odabiru da imaju istu kompoziciju nukleotida kao odabrana siRNK, ali bez značanje komplementarnosti sekvence za odgovarajući ciljni gen. Takve negativne kontrole mogu biti dizajnirane nasumičnim šifriranjem sekvence nukleotida odabrane siRNK; pretraga homologije može biti obavljena da se obezbedi da negativnoj kontroli nedostaje homologija sa bilo kojim drugim genom u odgovarajućem genomu. Dodatno tome, negativna kontrola siRNK može biti dizajnirana uvođenjem jedne ili više neusklađenih baza u sekvencu.

Položaji siRNK-mRNK komplementacije su odabrani tako da rezultiraju u optimalnoj mRNK specifičnosti i maksimalnom mRNK cepanju.

II. RNKi sredstva

Sadašnji pronalazak uključuje siRNK molekule dizajnirane, na primer, kako je u gornjem tekstu opisano. siRNK molekuli ovog pronalaska mogu biti hemijski sintetizovani, ili mogu biti transkribovani in vitro iz DNK obrasca, ili in vivo iz npr., shRNK, ili korišćenjem rekombinantnog humanog DICER enzima, da cepaju in vitro transkribovane dsRNK obrasce u grupe od 20-, 21- ili 23-bp dupleks RNK koje posreduju RNKi. siRNK molekuli mogu biti dizajnirani korišćenjem bilo kog postupka poznatog u nauci.

Takođe je ovde opisano, umesto da RNKi bude sredstvo koje vrši interferenciju ribonukleinske kiseline, npr., siRNK ili shRNK kako je u gornjem tekstu opisano, RNAi sredstvo može da kodira interferirajuću ribonukleinsku kiselinu, npr., shRNK, kako je u gornjem tekstu opisano. Drugim rečima, RNKi sredstvo može biti transkripcioni obrazac interferirajuće ribonukleinske kiseline. Tako, RNKi sredstva kako su ovde opisana mogu takođe da uključe male petlje RNK (shRNK), i konstrukte ekspresije modifikovane manipulacijom da ekspresuju shRNK. Transkripcija shRNK se inicira na polimeraza III (pol III) promoteru, i misli se da će biti ukinuta na poziciji 2 od 4-5-timin položaja ukidanja transkripcije. Nakon ekspresije, za shRNK se misli da se savijaju u strukturu stem-petlje sa 3’ UU-ispupčenjima; potom, krajevi ovih shRNK se procesuiraju, konvertuju shRNK u

4

siRNK-slične molekule od oko 21-23 nukleotida (Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002, Supra; Miyagishi et al„ 2002; Paddison et al„ 2002, supra; Paul et al„ 2002, supra; Sui et al„ 2002 supra; Yu et al„ 2002, supra). Više informacija o shRNK dizajnu i korišćenju može biti pronađeno na internetu na sledećim adresama: katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI-Strategy.pdf i katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR-strategy1.pdf).

Ekspresija konstrukta kako je ovde opisano uključuje konstrukt pogodan za korišćenje u odgovarajućem sistemu ekspresije i uključuje, ali nije ograničen na, retroviralne vektore, linearne kasete ekspresije, plazmide i viralne ili viralno-izvedene vektore, kako je to poznato u nauci. Takvi konstrukti ekspresije mogu da uključe jedan ili više promotera koji se mogu izazvati, RNK Pol III promoter sisteme kao što su U6 snRNK promoteri ili Hl RNK polimeraza III promoteri, ili druge promotere poznate u nauci. Ovi konstrukti mogu takođe uključiti jedan ili oba lanca siRNK. Konstrukti ekspresije koje ekspresuju oba lanca mogu takođe da uključe petlja strukture koje povezuju oba lanca, ili svaki lanac može biti odvojeno transkribovan iz odvojeni promotera u okviru istog konstrukta. Svaki lanac može takođe biti transkribovan iz odvojenog konstrukta ekspresije. (Tuschl, T„ 2002, Supra).

Sintetičke siRNK mogu biti isporučene u ćelije postupcima poznatim u nauci, uključujući katjonsku lipozomsku transfekciju i elektroporaciju. Da se dobije duže trajanje supresije ciljnih gena (npr., flt1 geni) i da se olakša isporuka pod određenim okolnostima, jedna ili više siRNK može biti ekspresovana u okviru ćelija iz rekombinantnih DNK konstrukata. Takvi postupci za ekspresiju siRNK dupleksa u okviru ćelija iz rekombinantnih DNK konstrukata da se dopusti duže trajanje supresije ciljnog gena u ćelijama su poznati u nauci, uključujući sisarske Pol III promoter sisteme (npr., Hl ili U6/snRNK promoter sistemi (Tuschl, T., 2002, supra) sposobne da ekspresuju funkcionalne dvolančanje siRNK; (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, supra; Miyagishi et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Yu et al., 2002), supra; Sui et al., 2002, supra). Transkripciono ukidanje od strane RNK Pol III nastaje prilikom rada četiri uzastopna T ostatka u DNK obrascu, obezbeđujući mehanizam da se savrši siRNK transkript na specifičnoj sekvenci. siRNK je komplementarna sa sekvencom ciljnog nega u 5’-3’ i 3’-5’ orijentacijama, i dva lance siRNK mogu biti ekspresovana u istom konstruktu ili odvojenim konstruktima. Petlja siRNK, vođena sa Hl ili U6 snRNK promoterom i ekspresovana u ćelije, može inhibirati ekspresiju ciljnog gena (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, supra; Miyagishi et al., 2002, supra; Paul et al., 2002, supra; Yu et al., 2002), supra; Sui et al., 2002, supra). Konstrukti koji sadrže siRNK sekvencu pod kontrolom T7 promotera takođe čine funkcionalnim siRNK kada se ko-transfektuju u ćelije sa vektorom koji ekspresuje T7 RNK polimerazu (Jacque et al., 2002, supra). Jedan konstrukt može da sadrži više sekvenci koje kodiraju za siRNK, kao što su više regioni gena koji kodira sFit1, ciljajući isti gen ili više gena, i može biti vođen, na primer, odvojenim položajima Pol III promotera.

Životinjske ćelije ekspresuju raspon nekodirajućih RNK od otprilike 22 nukleotida koje se nazivaju mikro RNK (miRNK) koje mogu regulisati ekspresiju gena na post transkripcionom i translacionom nivou tokom razvoja životinje. Jedna zajednička odlika miRNK je da su one sve izrezane od otprilike 70 nukleotid prekursor RNK stem-petiji, verovatno od strane Dicer-a, RNaza lll-tip enzima, ili njihovih homologa. Supstitucijom stem sekvenci miRNK prekursora sa sekvencom komplementarnom sa ciljnom mRNK, vektor konstrukt koji ekspresuje modifikovan manipulacijom prekursor može biti upotrebljen da se proizvedu siRNK da bi inicirale RNKi spram specifičnih mRNK ciljeva u sisarskim ćelijama (Zeng et al., 2002, supra). Kada se ekspresuju od strane DNK vektora koji sadrže polimeraza III promotere, mikro-RNK dizajnirane petlje mogu da stišaju ekspresiju gena (McManus et al., 2002, supra). MikroRNK koje ciljaju polimorfizme mogu takođe biti korisne za blokiranje translacije mutant proteina, u odsustvu sa siRNK- posredovanog stišavanja gena. Takve primene mogu biti korisne u situacijama, na primer, gde dizajnirana siRNK izaziva stišavanje van-mete divljeg tipa proteina.

Viralno-posredovani mehanizmi isporuke mogu biti takoše upotrebljeni da se izazove specifično stišavanje ciljanih gena kroz ekspresiju siRNK, na primer, generisanjem rekombinantnog adenovirusa koji skriva siRNK pod RNK Pol II promoter transkripcionom kontrolom (Xia et al., 2002, supra). Infekcija HeLa ćelija ovim rekombinantnim adenovirusima dopušta umanjenu ekspresiju endogenog ciljnog gena. Ubrizgavanje rekombinantnih adenovirus vektora u transgenske miševe vršeći ekspresiju ciljnih gena siRNK rezultira u in vivo smanjenju ekspresije ciljnog gena. Id. U životinjskom modelu, cela-embrio elektroporacija može efikasno da isporuči sintetičku siRNK u embrione miša nakon implantacije (Calegari et al., 2002). Kod odraslih miševa, efikasna isporuka siRNK može biti postignuta tehnikom isporuke „visokog pritiska“, brzim ubrizgavanjem (u roku od 5 sekundi) u životinju velike zapremine siRNK koja sadrži rastvor putem repne vene (Liu et al., 1999, supra; McCaffrey et al., 2002, supra; Lewis et al., 2002). Nanočestice i lipozomi mogu takođe biti upotrebljeni da se isporuči siRNK u životinje. U određenim primernim realizacijama, rekombinantni adeno-povezani virusi (rAAVs) i njihovi povezani vektori

4

mogu se upotrebiti da se isporuči jedna ili više siRNK u ćelije, npr., neuronske ćelije (npr., ćelije mozga) (US patentne prijave 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 i 2005/0220766).

Kompozicije nukleinske kiseline ovog pronalaska uključuju i nemodifikovane siRNK i modifikovane siRNK kao što su poznate u nauci, kao što su ukršteno vezani siRNK derivati ili derivati koji imaju povezane ne nukleotidne ostatke, na primer za njihove 3’ i 5’ krajeve. Modifikovanje siRNK derivat na ovaj način može poboljšati ćelijski unos ili pojačati aktivnosti ćelijskog ciljanja rezultirajućeg siRNK derivata upoređeno sa korespondirajućom siRNK, i korisni su za praćenje tragova siRNK derivata u ćeliji, ili poboljšavaju stabilnost siRNK derivata upoređeno sa korespondirajućom siRNK.

Modifikovani manipulacijom RNK prekursori, uvedeni u ćelije ili cele organizme kako je to ovde opisano, će voditi do proizvodnje željenog siRNK molekula. Takav siRNK molekul će biti onda povezan sa komponentama endogenog proteina RNKi putanje da se vezuje za ciljnu specifičnu mRNK sekvencu radi cepanja i destrukcije. Na ovaj način, mRNK koja se ima ciljati sa siRNK generisanom iz modifikovanog manipulacijom RNK prekursora će biti potrošena iz ćelije ili organizma, dovodeći do smajenja koncentracije proteina kodiranog tom mRNK u ćeliji ili organizmu. RNK prekursori su tipično molekuli nukleinske kiseline koji poojedinačno kodiraju bilo jedan lanac dsRNK ili kodiraju celu nukleotidnu sekvencu RNK petlja strukture.

Kompozicije nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu bit nekonjugovane ili mogu biti konjugovane sa drugim ostatkom, kao što je nanočestica, da pojačaju osobinu kompozicija, npr., farmakokinetički parametar kao što je apsorpcija, efikasnost, biodostupnost i/ili poluživot. Konjugacija može biti postignuta postupcima poznatim u nauci, .pr., korišćenjem postupaka iz Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (opisuje nukleinske kiseline napunjene na polialkilcijanoakrilat (PACA) nanočestice); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3): 137-43 (1998) (opisijue nukleinske kiseline vezane za nanočestice); Schvvab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994) (opisuje nukleinske kiseline povezane za interkalatirajuća sredstva, hidrofobne grupe, polikatjone ili PACA nanočestice); i Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (opisuje nukleinske kiseline vezane za nanočestice).

4

Molekuli nukleinske kiseline sadašnjeg pronalaska mogu takođe biti označeni korišćenjem postupka poznatog u nauci. Na primer, kompozicije nukleinske kiseline mogu biti označene sa fluoroforom, npr., Су3, fluorescin, ili rodamin. Označavanje može biti obavljeno upotebom pribora, npr., SILENCER™ siRNA labeling kit (Ambion). Dodatno tome, siRNK može biti radiooznačena, npr., korišćenjem<3>H,<32>P ili drugih odgovarajućih izotopa.

Štaviše, zato što se za RNKi veruje da napreduje putem bar jednog jednolančanog RNK intermedijara, vešt naučnik će ceniti da ss-siRN (npr., antisens lanac ds-siRNK) može takođe biti dizajniran (npr., za hemijsku sintezu), generisan (npr., enzimski generisan) ili ekspresovan (npr., iz vektora ili plazmida) kako je to ovde opisano i iskorišćen u skladu sa metodologijama za koje se traži zaštita. Štaviše, kod beskičmenjaka, RNKi može biti pokrenuta efektivno putem dugih dsRNK (npr, dsRNK oko 100-1000 nukleotida po dužini, poželjno oko 200-500, na primer, oko 250, 300, 350, 400 ili 450 nukleotida po dužini) koje se rade kao efektori RNKi. (Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 4. dec.2001.; 98(25): 14428-33, Epub 27. nov.2001.god.).

III. Anti-sFltL RNK sredstva za stišavanje

Ovde su opisani anti-sFltl RNK sredstva za stišavanje (npr., siRNK i shRNK), postupci pravljenja navedenih RNK sredstava za stišavanje, i postupci (npr., istraživanje i/ili terapeutki postupci) za korišćenje navedenih poboljšanih RNK sredstava za stišavanje (ili njihovih delova) za RNK stišavanje jednog ili više sFLT-1 proteina. RNK sredstva za stišavanje sadrže antisens lanac (ili njegove delove), pri čemu ovaj antisens lanac ima dovoljnu komplementarnost prema heterozigotnom pojedinačnom nukleotidnom polimorfizmu da posreduje sa RNK-posredovane mehanizme stišavanja (npr., RNKi).

a) Dizajn Anti-sFftl siRNK molekula

siRNK molekul kako je ovde opisan je dupleks koji sadrži sens lanac i komplementarnog antisen lanca, antisens lanac koji ima dovoljnu komplementarnosti prema sFlt1 mRNK da posreduje RNKi. Poželjno, siRNK molekul ima dužinu od oko 10-50 nukleotida, odnosno, svaki lanac se sastoji od 10-50 nukleotida (ili nukleotid analoga). Poželjnije, siRNK molekul ima dužinu od oko 16-30, npr., 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida u svakom lancu, pri čemu je jedan od lanaca dovoljno komplementaran

4

u odnosu na ciljni region. Poželjno, lanci su poravnati tako da postoje bar 1, 2 ili 3 baze na krajevima lanaca koje se ne podudaraju (odnosno, za koje se ne pojavljuju komplementarne baze u suprotnom lancu) tako da se ispupčenje 1, 2 ili 3 ostatka pojavljuje na jednom ili oba kraja dupleksa kada se lanci užare. Poželjno, siRNK molekul ima dužinu od oko 10-50 ili više nukleotida, odnosno, svaki lanac sadrži 10-50 nukleotida (ili nukleotid analoga). Poželjnije, siRNK molekul ima dužinu od oko 16-30, npr., 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida u svakom lancu, pri čemu je jedan od lanaca suštinski komplementaran u odnosu na ciljnu sekvencu, a drugi lanac je identičan ili suštinski identičan prvom lancu.

Generalno, siRNK mogu biti dizajnirane korišćenjem bilo kog postupka poznatog u nauci, na primer, korišćenjem sledećeg protokola:

1. siRNK treba da bude specifična za ciljnu sekvencu, npr., ciljna sekvenca data na Slikama 6 ili 13. U jednom primeru, ciljna sekvenca se nalazi u rastvorljivoj Flt1 mRNK, ali ne i u Flt mRNK pune dužine. U sledećem primeru, ciljna sekvenca se nalazi i u rastvorljivoj Flt1 mRNK i u Flt mRNK pune dužine. U sledećem primeru, ciljna sekvenca se nalazi u Flt mRNK pune dužine. Prvi lanac treba da bude komplementaran u odnosu na ciljnu sekvencu, a drugi lanac je suštinski komplementaran u odnosu na prvi lanac. (Videti Sliku 6 za primerne sens i antisens lance). U jednom primeru, ciljna sekvenca je kodirana u intronskom regionu jedne ili više rastvorljive Flt mRNK sekvence. Primerne ciljne sekvence korespondiraju sa jednim ili više intronskih regiona ciljnog gena. Cepanje mRNK na ovim položajima treba da eliminiše translaciju korespondirajućeg rastvorljivog proteina ali ne i proteina pune dužine. Ciljne sekvence sa drugih region flt gena su takođe pogodne za ciljanje. Sens lanac je dizajniran na osnovu ciljne sekvence. Dalje, siRNK sa nižim G/C sadržajem (35-55%) mogu biti aktivnije od onih sa G/C sadržajem većim od 55%. Tako u jednom primeru, otkriveni su molekuli nukleinske kiseline koji imaju 35-55% G/C sadržaja.

2. Sens lanac siRNK je dizajniran zasnovano na sekvenci odabranog ciljnog položaja. Poželjno sens lanac uključuje oko 19 do 25 nukleotida, npr., 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotida. Poželjnije, sens lanac uključuje 21, 22 ili 23 nukleotida. Vešt stručnjak će ipak ceniti da siRNK koje imaju dužinu manju od 19 nukleotida ili veću od 25 nukleotida mogu takođe funkcionisati da posreduju RNKi. U skladu sa tim, otkrivene su siRNK takve dužine, pod uslovom da zadržavaju sposobnost da posreduju RNKi. Za duža RNK sredstva za stišavanje je demonstrirano da pobuđuju interferon ili Protein Kinaza R (PKR) odgovor u

4

određenim sisarskim ćelijama koje mogu biti nepoželjne. Poželjno RNK sredstva za stišavanje prema pronalasku ne pobuđuju PKR odgovor (odnosno, dovoljno su kratke dužine). Međutim, duža RNK sredstva za stišavanje mogu biti korisna, na primer, u ćelijskim tipovima koji nisu sposobni da generišu PRK odgovor ili u situacijama gde je PKR odgovor regulisan naniže ili odbačen alternativnim sredstvima.

Ovde opisani siRNK molekuli imaju dovoljnu komplementarnost sa ciljnom sekvencom tako da siRNK može da posreduje RNKi. Generalno, poželjne su siRNK koje sadrže nukleotidne sekvence dovoljno identične u odnosu na deo ciljne sekvence ciljnog gena kako bi izazvale dejstvo sa RlSC-posredovanog cepanja ciljnog gena. U skladu sa tim, u poželjnom primeru, sens lanac siRNK je dizajniran da mora da ima sekvencu dovoljno identičnu u odnosu na ceo cilj. Na primer, sens lanac može imati 100% identičnost u odnosu na ciljni položaj. Ipak, 100% identičnost se ne zahteva. Poželjna je veća od 80% identičnost, npr., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili čak 100% identičnost, između sens lanca i ciljne RNK sekvence. Takođe je ovde opisana prednost da se bude sposoban tolerisati određene varijacije sekvence kako bi se pojačala efikasnosti i specifičnost RNKi U jednom primeru, sens lanac ima 4, 3, 2, 1, ili 0 neusklađenih nukleotid(a) sa ciljnim regionom, tako da ciljni region koji se razlikuje bar po jednom baznom paru između rastvoljive flt1 i pune dužin fltl alele, npr., ciljni region koji sadrži dobijanje-funkcije mutaciju, a drugi lanac je identičan ili suštinski identičan sa prvim lancem. Štaviše, siRNK sekvence sa malim umetcima ili brisanjima 1 ili 2 nukleotida mogu biti efektivne za posredovanje RNKi. Alternativno, siRNK sekvence sa supstitucijama ili umetcima nukleotid analoga mogu biti efektivne za inhibiciju.

Identičnost sekvence može biti određena algoritmima poređenja i poravnanja poznatim u nauci. Da se utvrdi procenat identičnosti dve sekvence nukleinske kiseline (ili dve sekvence amino kiseline), sekvence se poravnavaju radi optimalnih svrha poređenja (npr., međuprostori mogu biti uvedeni u prvu sekvencu ili drugu sekvencu radi optimalnog poravnanja). Nukleotidi (ili ostaci amino kiseline) na korespondirajućim pozicijama nukleotida (ili amino kiseline) se onda upoređuju. Kada je pozicija prve sekvence zauzeta istim ostatkom kao na korespondirajućoj poziciji u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje se dele od strane sekvenci (odnosno, % homologije = broj

4

identičnih pozicija / ukupan broj pozicija х 100), opciono kažnjavajući rezultat za broj uvedenih međuprostora i/ili dužinu uvedenih međuprostora.

Poređenje sekvenci i utvrđivanje procenta identičnosti između dve sekvence može biti postignuto korišćenjem matematičkog algoritma. U jednoj realizaciji, poravnanje se generiše preko određenog dela poravnate sekvence koje ima ima dovoljnu identičnost ali ne i preko delova koji imaju nizak stepen identičnosti (odnosno, lokalno poravnanje). Poželjan, ne-ograničavajući primer algoritma lokalnog pravnanja iskorištenog za poređenje sekvenci je algoritam od Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modifikovan kao kod Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Takav algoritam je inkorporisan u BLAST programe (verzija 2.0) od Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10.

U sledećoj realizaciji, poravnanje je optimizovano uvođenjem odgovarajućih međuprostora i procenat identičnosti se utvrđuje preko dužine poravnatih sekvenci (odnosno, međuprostorno poravnanje). Da se dobiju međuprostorna poravnanja u svrhe poređenja, Gapped (Međuprostorni) BLAST može biti iskorišćen kako je opisano kod Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. U sledećoj realizaciji, poravnanje je optimizovano uveođenjem odgovarajućih međuprostora i procenat identičnosti se utvrđuje pune dužine poravnatih sekvenci (odnosno, globalno poravnanje). Poželjan, neograničavajući primer matematičkog algoritma iskorišćenog za globalno poređenje sekvenci je algoritam od Myers and Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa poravnanja GCG sekvvence. Kada se iskorišćava ALIGN program za poređenje sekvenci amino kiseline, mogu se koristiti PAM120 tabela ostatka težine, kazna dužine međuprostora 12, i kazna dužine međuprostora 4.

3. Antisens ili vodič lanac siRNK je rutinski iste dužine kao sens lanac i uključuje komplementarne nukleotide. U jednoj realizaciji, vodič i sens lanci su u potpunosti komplementarni, odnosno, bez nesparenih baza (blunt-ended) kada se poravnaju i užare. U sledećoj realizaciji, lanci siRNK mogu biti spareni na takav način da imaju 3’ ispupčenje °d 1 do 4, npr., 2 nukleotida. Ispupčenja mogu da sadrže (ili se sastoje od) nukleotida koji korespondiraju sa sekvencom ciljnog gena (ili njenim komplementom). Alternativno, ispupčenja mogu da sadrže (ili da se sastoje od) dioksiribonukleotida, na primer dTs, ili nukleotid analoga, ili drugog pogodnog ne-nukleotidnog materijala. Tako u sledećoj realizaciji, molekuli nukleinske kiseline mogu imati 3’ ispupčenja od 2 nukleotida, kao što su TT. Ovi nadvisujuća ispupčenja nukleotida mogu biti bilo RNK ili DNK. Kao što je u gornjem tekstu primećeno, poželjno je izabrati ciljni region gde mutant:divlji tip nepodudaranje predstavlja purin:purin nepodudaranje.

4. Upotrebom postupka poznatog u nauci, uporediti potencijalne ciljeve u odnosu na odgovarajuću bazu podataka genoma (humana, mišja, pacova, itd.) i eliminisati iz razmatranja bilo koje ciljne sekvence sa značajnom homologijom prema drugim kodirajućim sekvencama. Jedan takav postupak za takva pretraživanja homologije je poznat kao BLAST, koji je dostupan na vebsajtu Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information).

5. Odabrati jednu ili više sekvenci koje ispunjavaju vaše kriterijume evaluacije.

Dalje generalne informacije o dizajnu i upotrebi siRNK mogu biti pronađene u „The siRNK User Guide" („Uputstvo za upotrebu siRNK“), dostupno na vebsajtu Max-Plank-lnstituta za Biofizičku Hemiju.

Alternativno, siRNK može biti definisana funkcionalno kao nukleotidna sekvenca (ili oligonukleotidna sekvenca) koja je sposobna da hibridizuje sa ciljnom sekvencom (npr., 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C hibridizacija tokom 12-16 sati; praćeno pranjem). Dodatno poželjni uslovi hibridizacije uključuju hibridizaciju na 70°C u 1xSSC ili 50°C u 1xSSC, 50% formamid praćeno pranjem na 70°C u 0,3xSSC ili hibridizacija na 70°C u 4xSSC ili 50°C u 4xSSC, 50% formamid praćeno pranjem na 67°C u 1xSSC. Temperatura hibridizacije za predviđene hibride koji će biti sa manje od 50 baznih parova po dužini treba da bude 5-10°C manja od temperature topljenja (Tm) hibrida, pri čemu se Tm utvrđuje prema sledećim jednačinama. Za hibride sa manje od 18 baznih parova po dužini, Tm(°C)=2(# A+T baza)+4(# G+C baza). Za hibride između 18 i 49 baznih parova po dužini, Tm(°C)=81,5+16,6(log 10[Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), pri čemu N predstavlja broj baza u hibridu, a [Na+] je koncentracija natrijum jona u hibridizacionom puferu ([Na+] za 1xSSC=0,165 M). Dodatni primeri strogosti uslova za hibridizaciju polinukleotida su dati kod Sambrook, J., E.F.Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, i Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4.

1

Nekativna kontrola siRNK treba da ima istu nukleotidnu kompoziciju kao što je odabrana sirNK, ali bez značajne komplementarnosti sekvence u odnosu na odgovarajući genom. Takve negativne kontrole mogu biti dizajnirane nasumičnim biranjem nukleotidne sekvence odabrane siRNK. Pretraživanje homologije može biti obavljeno da se obezbedi da negativnoj kontroli nedostaje homologija prema bilo kom drugom genu u odgovarajućem genomu. Dodatno tome, negativna kontrola siRNK može biti dizajnirana uvođenjem jedne ili više neusklađene baze u sekvenci.

6. Kako bi se validirala efrektivnost kojom siRNK uništavaju ciljne mRNK (npr., sFlt1 mRNK koja korespondira sa rastvorljivim FLT1), siRNK može biti inkubirana sa ciljno cDNK (npr., flt1 cDNK) u Drosophila-zasnovanom in vitro mRNK sistemu ekspresije. Radiooznačene sa<32>P, novo sintetizovane ciljne mRNK (npr., sFltl mRNK) se detektuju autoradiografski na agaroza gelu. Prisustvo ciljne mRNK ukazuje aktivnost mRNK nukleaze. Pogodne kontrole uključuju izostavljanje siRNK i upotrebu ne-ciljne cDNK. Alternativno, kontrola siRNK se odabire imajući istu nukleotidnu kompoziciju kao odabrana siRNK, ali bez značajne komplementarnosti sekvence u odnosu na odgovarajući ciljni gen. Takve negativne kontrole mogu biti dizajnirane nasumičnim odabirom nukleotidne sekvence odabrane siRNK. Pretraživanje homologije može biti obavljeno da se obezbedi da negativnoj kontroli nedostaje homologija prema bilo kom drugom genu u odgovarajućem genomu. Dodatno tome, negativna kontrola siRNK može biti dizajnirana uvođenjem jedne ili više neusklađene baze u sekvenci.

Anti-sfltl siRNK mogu biti dizajnirane da ciljaju bilo koje ciljne sekvence prethodno opisane. Navedene siRNK se sastoje od antisens lanca koji je dovoljno komplementaran sa ciljnom sekvencom da posreduje stišavanje ciljne sekvence. U određenim realizacijama, RNK sredstvo za stišavanje je siRNK.

U određenim realizacijama, siRNK se sastoji od sens lanca koji sadrži sekvencu datu na Slici 6, i antisens lanca koji sadrži sekvencu datu na Slici 6.

Položaji siRNK-mRNK komplementacije se odabiru tako da rezultiraju u optimalnoj mRNK specifičnsoti i maksimalnom mRNK cepanju.

b) siRNK-slični molekuli

2

siRNK-slični molekuli kako su ovde opisani imaju sekvencu (odnosno, imaju lanac koji ima sekvencu) koja je „dovoljno komplementarna" u odnosu na ciljnu sekvencu sfltl mRNK kako bi usmerila stišavanje gena bilo putem RNKi ili translacione represije. siRNK-slični molekuli su dizajnirani na isti način kao siRNK molekuli, ali stepen identičnosti sekvence između sens lanca i ciljne RNK je približan onom primećenom između miRNK i njenog cilja. Generalno, kako se stepen identičnosti sekvence između miRNK sekvence i korespondirajuće ciljne sekvence gena smanjuje, tendencija da se posreduje u posttranskripcionom stišavanju gena putem translacione represije pre nego putem RNKi se povećava. Prema tome, u alternativnom primeru, gde je post-transkripciono stišavanje gena putem translacione represije ciljnog gena poželjno, miRNK sekvenca ima delimičnu komplementarnost sa ciljnom sekvencom gena. U određenim primerima, miRNK sekvenca ima delimičnu komplementarnost sa jednom ili više kratkih sekvenci (položaji komplementarnosti) rasutih u ciljnoj mRNK (npr., u okviru 3’-UTR ciljne mRNK) (Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al„ RNA, 2003; Doench et al„ Genes & Dev„ 2003). Pošto je mehanizam translacione represije kooperativan, više položaja komplementarnosti (npr., 2, 3, 4, 5 ili 6) može biti ciljano u određenim realizacijama.

Kapacitet siRNK-sličnog dupleksa da posreduje RNKi ili translacionu represiju može biti predviđen distribucijom ne-identičnih nukleotida između ciljne sekvence gena i nukleotida sekvence sredstva za stišavanja na položaju komplementarnosti. U jednom primeru, kada je stišavanje gena translacionom represijom poželjno, bar jedan ne-identičan nukleotid je prisutan u centralnom delu položaja komplementarnosti tako da formirani dupleks putem miRNK vodič lanca i ciljna mRNK sadrže centralno ,,ispupčenje“ (Doench J G et al., Genes & Dev., 2003). U sledećem primeru, uvode se 2, 3, 4, 5 ili 6 susedna ili ne-susedna neidentična nukleotida. Ne-identičan nukleotid može biti izabran tako da on formira klimavi bazni par (npr., G:U) ili nepodudaran bazni par (G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C, U:U). U deljem poželjnom pirmeru, „ispupčenje" je centrirano na pozicijama 12 i 13 nukleotida od 5’ kraja miRNK molekula.

c) Molekuli kratke ukosnice RNK (shRNK)

U određenim istaknutim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje shRNK sposobne da posreduju RNK stišavanje sFlt1 ciljne sekvence sa pojačanom selektivnošću. Za razliku od siRNK, shRNK oponašaju prirodne prekursore mikro RNK (miRNK) i ulaze u vrh putanje stišavanja gena. Iz ovog razloga, za shRNK se veruje da posreduju u stišavanju gena efikasnije tako što se pune kroz celokupnu putanju stišavanja prirodnog gena.

miRNK su nekodirajuće RNK od otprilike 22 nukleotida koji mogu da regulišu ekspresiju gena na post transkripcionom i translacionom nivou tokom razvoja biljke ili životinje. Jedna zajednička odlika miRNK je da se one sve pobuđuju iz prekursora stem-petlje RNK od otprilike 70 nukleotida koja se naziva pre-miRNK, verovatno putem Dicer-a, RNase III- tipa enzima, ili njihovog homologa. Prirodno-nastali miRNK prekursori (pre-miRNK) imaju jedan lanac koji formira dupleks stem uključujući dva dela koja su generalno komplementarna, i petlju, koja spaja dva dela stema. U tipičnim pre-miRNK, stem uključuje jedno ili više ispupčenja, npr., ekstra nukleotide koji kreiraju jednu nukleotidnu ,,petlju“ u jednom delu stema, i/ili jedan ili više nesparenih nukleotida koji kreiraju međuprostor u hibridizaciji dva dela stema jedan prema drugom. Kratka ukosnica RNK, ili modifikovani manipulacijom RNK prekursori, ovog pronalaska su veštački konstrukti zasnovani na ovim prirodno nastalim pre-miRNK, aali koji su modifikovani manipulacijom da isporuče željena RNK sredstva za stišavanje (npr., siRNK ovog pronalaska). Supstituisanjem stem sekvenci premiRNK sa sekvencom komplementarnom ciljnoj mRNK, formira se shRNK. shRNK se procesuira duž čitave putanje stišavanja gena ćelije, time efikasno posredujući RNKi.

Neophodni elementi shRNK molekula uključuju prvi deo i drugi deo, koji imaju dovoljnu komplementarnost da se užare ili hibridizuju kako bi formirali dupleks ili dvolančani stem deo. Dva dela ne moraju biti u potpunosti ili perfektno komplementarna. Prvi i drugi „stem“ delovi su povezani putem dela koji ima sekvencu koja ima nedovoljnu komplementarnost sekvence da uđari ili hibridizuje u odnosu na druge delove shRNK. Na ovaj potonji deo se upućuje kao na „petlja" deo u shRNK molekulu. shRNK molekuli se procesuiraju da generišu siRNK. shRNK miogu takođe uključivati jedno ili više ispupčenja, odnosno, ekstra nukleotida koji kreiraju malu nukleotidnu „petlju" u delu stema, na primer, petlja sa jednim-, dva- ili tri-nukleotida. Stem delovi mogu biti iste dužine ili jedan deo može da uključi ispupčenje od, na primer, 1-5 nukleotida. Ispupčenja nukleotida mogu da uključe, na primer, uracile (Us), npr., sve Us. Takvi Us su primetno kodirani timidinima (Ts) u shRNK-kodirajućoj DNK koja daje signal kraja transkripcije.

U shRNK (ili modifikovanom prekursoru RNK) ovog pronalaska, jedan deo dupleks stema је sekvenca nukleinske kiseline koja je komplementarna ( ili anti-sens) u odnosu na sFlt1

4

ciljnu sekvencu. Poželjno, jedan lanac stem dela shRNK je dovoljno komplementaran (npr., antisens) da cilja RNK (npr., mRNK) sekvencu kako bi posredovao degradaciju ili cepanje navedene ciljne RNK putem RNK interferencije (RNAi). Tako, modifikovani manipulacijom RNK prekursori uključuju dupleks stem sa dva dela i petljom koja povezuje dva stem dela. Antisens deo može na 5’ ili 3’ kraju stema. Delovi stema shRNK su poželjno oko 15 do oko 50 nukleotida po dužini Poželjno dva dela stema su oko 18 ili 19 do oko 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 37, 38, 39 ili 40 ili više nukleotida po dužini. U poželjnim realizacijama, dužina delova stema treba da bude 21 nukleotid ili veća. Kada se koriste sisarske ćelije, dužina delova stema treba da bude manji od oko 30 nukleotida kako bi se izbeglo provociranje nespecifičnih odgovora kao što je putanja interferona. U ne-sisarskim ćelijama, stem može biti duži od 30 nukleotida. U stvari, stem može da uključi veće delove komplementarnosti u odnosu na ciljnu mRNK (do, i uključujući celokupnu mRNK). U stvari, stem deo može da uključi mnogo veće delove komplementarnosti u odnosu na ciljnu mRNK (do, i uključujući celokupnu mRNK).

Dva dela dupleks stema moraju biti dovoljno komplementarna da hibridizuju kako bi formirali dupleks stem. Tako, dva dela mogu biti, ali ne moraju biti, u potpunosti ili perfektno komplementarni. Dodatno tome, dva dela stema mogu biti iste dužine, ili jedan deo može da uključi ispupčenje od 1, 2, 3 ili 4 nukleotida. Ispupčenja nukleotida mogu da uključe, na primer, uracile (Us), npr., sve Us. Petlja u shRNK ili modifikovanim manipulacijom RNK prekursorima može se razlikovati od prirodnih pre-miRNK sekvenci putem modifikovanja sekvence petlje da se poveća ili smanji broj sparenih nukleotida, zamenjivanja cele ili dela sekvence petlje sa tetrapetljom ili drugim petlja sekvencama. Tako, petlja u shRNK ili modifikovanim manipulacijom RNK prekursorima može biti 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više, npr., 15 ili 20 ili više nukleotida po dužini.

Petlja shRNK ili modifikovani manipulacijom RNK prekursori mogu da se razlikuju od prirodnih pre-miRNK sekvenci modifikacijom sekvence petlje da se poveća ili smanji broj sparenih nukleotida, ili zamenjivanjem svih ili dela sekvence petlje sa tetrapetljom ili drugim sekvencama petlje. Tako, deo petlje u shRNK može biti oko 2 do oko 20 nukleotida po dužini, odnosno, oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više, npr., 15 ili 20, ili više nukleotida po dužini. Poželjna petlja se sastoji od ili sadrži „tetrapetlja“ sekvence. Primeri tetrapetlji sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence GNRA, gde je N bilo koji nukleotid a R je purin nukleotid, GGGG, i UUUU.

U određenim realizacijama, shRNK ovog pronalaska uključuju sekvence željenog siRNK prethodno opisanog molekula. U drugim realizacijama, sekvenca antisens dela shRNK može biti u osnovi dizajnirana kako je opisano u gornjem tekstu ili generalno odabiranjem 18, 19, 20, 21 nukleotida, ili više sekvence iz ciljne RNK (npr., sfltl mRNK), na primer, iz regiona 100 do 200 ili 300 nukleotida naviše ili naniže od početka translacije. Generalno, sekvenca može biti odabrana od bilo kog dela ciljne RNK (npr., mRNK) uključujući i intronski region, 5’ UTR (neprevedeni region), kodirajuću sekvencu, ili 3’ UTR, pod uslovom da je navedeni deo udaljen od položaja dobijanje-funkcije mutacije. Ova sekvenca može opciono slediti odmah nakon regiona ciljnog gena koji sadrži dva susedna AA nukleotida. Poslednja dva nukleotida nukleotidne sekvence mogu biti odabrana da budu UU This 21 ili se takva nukleotidna sekvenca koristi da se kreira jedan deo dupleks stema u shRNK. Ova sekvenca može zameniti deo stama divljeg-tipa pre-miRNK sekvence, npr., enzimski, ili je uključena u kompletnu sekvencu koja se sintetizuje. Na primer, neko može sintetizovati DNK oligonukleotide koji kodiraju celokupnu stem-petlju modifikovanog manipulacijom RNK prekursora, ili koji kodiraju samo deo koji se ima umetnuti u dupleks stem prekursora, i korišćenjem restrikcije enzima time da izgradi modifikovan manipulacijom RNK prekursor konstrukt, npr., iz divljeg tipa pre-miRNK.

Modifikovani manipulacijom RNK prekursori uključuju u dupleks stemu 21-22 ili slično nukleotidnih sekvenci siRNK ili siRNK-sličnog dupleksa koje se žele da budu proizvedene in vivo. Tako, stem deo modifikovanog manipulacijom RNK prekursora uključuje bar 18 ili 19 nukleotidnih parova koji korespondiraju sa sekvencom eksonskog dela gena čija se ekspresija ima smanjiti ili inhibirati. Dva 3’ nukleotida koja flankiraju ovaj region stema se odabiru tako da maksimizuju proizvodnju siRNK iz modifikovanog manipulacijom RNK prekursora i da maksimizuju efikasnost rezultirajuće siRNK u ciljanju korespondirajuće mRNK radi translacione represije ili destrukcije putem RNKi in vivo i in vitro.

U određenim realizacijama, shRNK ovog pronalaska uključuju miRNK sekvence, opciono na kraju-modifikovane miRNK sekvence, da se pojača ulazak u RISC. miRNK sekvenca može biti slična ili identična onoj bilo koje prirodno nastale miRNK (videti npr., The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004). Preko hiljadu prirodnih miRNK su identifikovane do danas i zajedno se za njih smatra da se sastoje od oko 1% svih predviđenih gena u genomu. Mnoge prirodno nastale miRNK su u klasteru zajedno u intronima pre-miRNK i mogu biti identifikovani in silico korišćenjem na homologiji zasnovanih pretraživanja (Pasguinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001, Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001) ili kompjuterskih algoritama (npr., MiRScan, MiRSeeker) koji predviđaju sposobnost kandidata miRNK gena da formira stem petlja strukturu pri- mRNK (Grad et al., Mol. Cell., 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003; Lai E C et al., Genome Bio„ 2003). Onlajn registar obezbeđuje pretražive baze podataka svih publikovanih miRNK sekvenci (The miRNK Registry at the Sanger Institute vebsajtu; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res„ 2004). Primerne, prirodne miRNK uključuju lin-4, let-7, miR-10, mirR-15, miR-16, miR-168, miR-175, miR-196 i njihove homologe, kao i drugie prirodne miRNK iz himanih ili određenih modela ogranizama uključujući Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, zebrice, Arabidopsis thalania, Mus musculus i Rattus norvegicus kako je opisano u međunarodnoj PCT publikaciji br. WO 03/029459.

Prirodno-nastale miRNK se ekspresuju endogenim genima in vivo i procesuiraju se iz uskosnica ili stem-petlji prekursora (pre-miRNK ili primiRNK) putem Dicer-a ili drugih RNKza (Lagos-Ouintana et al., Scient, 2001; au et al., Science, 2001; Lee and Ambros, Science, 2001; Lagos-Ouintana et al., Curr. Biol., 2002; Mourelatos et al., Genes Cev., 2002; Reinhart et al., Science, 2002; Ambros et al., Curr. Biol., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., RNA, 2003; Lim et al., Genes Dev. 2003; Lim et al., Science, 2003). miRNK mogu da postoje in vivo prolazno kao dvolančani dupleks, ali samo jedan lanac se uvodu putem RISC kompleksa da usmeri stišavanje gena. Određene miRNK, npr, biljne miRNK, imaju perfektnu ili blizu-perfektne komplementarnost u odnosu na njihove ciljne mRNK i, stoga, usmeravaju cepanje ciljnih mRNK. Druge miRNK imaju manje od perfektne komplementarnosti u odnosu na ciljne mRNK i, stoga, usmeravaju translacionu represiju ciljnih mRNK. Za stepen komplementarnosti između miRNK i njene ciljne mRNK se veruje da utvrđuje svoj mehanizam dejstva. Na primer, perfektna ili blizu- perfektne komplementarnost između miRNK i njene ciljne mRNK je predikativna mehanizmu cepanja (Yekta et al„ Science, 2004), dok je manje od perfektne komplementarnosti predikativno mehanizmu translacione represije. U posebnim realizacijama, miRNK sekvenca je ona od prirodno-nastale miRNK sekvence, čija je aberantna ekspresija ili aktivnost u korelaciji sa miRNK poremećajem.

d) Dvostruko funkcionalne oligonukleotidne omče

U drugim realizacijama, RNK sredstva za stišavanje sadašnjeg pronalaska uključuju dvostruko funkcionalne oligonukleotidne omče koirsne za intercelularno regrutovanje miRNK. Životinjske ćelije ekspresuju opseg miRNK, nekodirajućih RNK od otprilike 22 nukleotida koje mogu regulisati ekspresiju gena na post transkripcionom ili translacionom nivou. Vezivanjem miRNK veze za RISC i njegovim regrutovanjem prema ciljnoj mRNK, dvostruko funkcionalna oligonukleotidna omča može da suzbije ekspresiju gena koji su uključeni npr., kod arteriosklerotičnog procesa. Upotreba oligonukleotidnih omči nudi nekoliko prednosti nad postojećim tehnikama da se potisne ekspresija određenog gena. Prvo, postupci koji su ovde opisani dopuštaju endogeni molekul (često prisutan kao izobilje), miRNK, da posreduje RNK stišavanje. U skladu sa tim, postupci koji su ovde opisani zaobilaze potrebu da se uvedu strani molekuli (npr., siRNK) da posreduju RNK stišavanje. Drugo, RNK-sredstva za stišavanje i, naročito, vezujući ostatk (npr., oligonukleotidi kakav je 2’-O-metil oligonukleotid), mogu biti učinjeni stabilnima i otpornim na aktivnost nukleaze. Kao rezultat, omče sadašnjeg pronalaska mogu biti dizajnirane radi direktne isporuke, zaobilazeći potrebu za indirektnom isporukom (npr., viralnom) prekursor molekula ili plazmida dizajniranog da napravi željeno sredstvo u okviru ćelije. Treće, omče i drugi posebni ostaci, mogu biti dizajnirani da se prilagode specifičnim mRNK položajima i specifičnim miRNK. Dizajni mogu biti ćelijski genski produkt specifični. Četvrto, postupci koji su ovde otkriveni ostalvljaju mRNK netaknutu, dopuštajući stručnjaku iz ove oblasti nauke da blokira sintezu proteina u kratkim pulsevima korišćenjem sopstvene ćelijske mašinerije. Kao rezultat, ovi postupci RNK stišavanja se krajnje mogu regulisati.

Dvostruko funkcionalne oligonukleotidne omče („tethers“) ovog pronaiaska su dizajnirane tako da one regrutuju miRNK (npr., endogene ćelijske miRNK) prema ciljnoj mRNK tako da izazovu modulaciju gena od interesa. U poželjnim realizacijama, omče imaju formulu T- L-μ, gde T predstavlja mRNK ciljajući ostatak, L je vezujući ostatak a μ predstavlja miRNK regrutujući ostatak. Bilo koji ili više ostataka mogu biti dvolančani. Poželjno, ipak, svaki ostatak je jednolančan.

Ostaci u okviru omči mogu biti raspoređeni ili povezani (u 5’ ka 3’ pravcu) kako je opisano u formuli T-L-μ (odnosno 3’ kraj ciljajućeg ostatka povezan ka 5’ kraju ostatka vezujućeg ostatka i 3’ kraj vezujućeg ostatka povezan za 5’ kraj miRNK regrutujućeg ostatka). Alternativno, ostati mogu biti raspoređeni ili povezani u omče kako sledi: μ-T-L (odnosno, 3’ kraj miRNK regrutujućeg ostatka povezan za 5’ krajem vezujućeg ostatka i 3’ kraj vezujućeg ostatka povezan sa 5’ krajem ciljajućeg ostatka).

mRNK ciljajući ostatak, kako je u gornjem tekstu opisan, je sposoban za hvatanje specifične ciijne mRNK. Prema ovom pronalasku, ekspresija ciljne mRNK je nepoželjna, pa je tako poželjna translaciona represija mRNK. mRNK ciljajući ostatak treba da bude dovoljne veličine da efektivno vezuje ciljnu mRNK. Dužina ciljajućeg ostatka će varirati u mnogome u zavisnosti, delimično, od dužine ciljne mRNK i stepena komplementarnosti između ciljne mRNK i ciljajućeg ostatka. U različitim realizacijama, ciljajući ostatak je manje od oko 200, 100, 50, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 nukleotida po dužini. U posebnoj realizaciji, ciljajući ostatak je oko 15 do oko 25 nukleotida po dužini.

miRNK regrutujući ostatak, kako je u gornjem tekstu opisan, je sposoban da se povezuje sa miRNK. U skladu sa ovom pronalaskom, miRNK može biti bilo koja miRNK sposobna da vrši represiju ciljne mRNK (npr., jedan ili više sfltl mRNK). Za sisare se beleži da imaju preko 250 endogenih miRNK (Lagos-Quintana et al.. (2002) Current Biol. 12:735-739; Lagos-Quintana et al., (2001) Science 294:858-862; i Lim et al. (2003) Science 299:1540). U različitim realizacijama, miRNK može biti bilo koja u nauci prepoznata miRNK.

Vezujući ostatak je bilo koje sredstvo sposobno da vezuje ciljajuće ostatke tako da se održava aktivnost ciljajućih ostataka. Vezujući ostaci su poželjno oligonukleotidni ostaci koji se sastoje od dovoljnog broja nukleotida tako da ciljajuća sredstva mogu dovoljno da vrše interakciju sa njihovim posebnim ciljevima. Vezujući ostaci imaju malo ili nemaju homologiju sekvence sa čelijskom mRNK ili sekvencama miRNK. Primerni vezujući ostaci uključuju jedan ili više 2’-O-metilnukleotida, npr., 2’-β-metiladenozin, 2’-O-metiltimidin, 2’-O-metilguanozin ili 2’-O-metiluridin.

e) Gensko stišavanje oligonukleotida

U određenim primernim realizacijama, genska ekspresija (odnosno, sflt1 genska ekspresija) može biti modulirana korišćenjem na oligonukleotidu-bazirana jedinjenja koja sadrže dva ili više jednolančana antisens oligonukleotida koji su povezani kroz njihove 5’-krajeve koja dopuštaju prisustvo dva ili više 3’-kraja kojima se može pristupiti da se efektivno inhibira ili smanji iflt1 genska ekspresija. Takvi povezani oligonukleotidi su takođe poznati kao Oligonukleotidi koji stišavaju gen (GSO-vi). (Videti, npr., US 8,431,544 dodeljeni Idera Pharmaceuticals, Inc.).

Povezivanje 5’ krajeva GSO-va je nezavisno od drugih povezivanja oligonukleotida i mogu biti direktno putem 5,3 ili 2 hidroksilne grupe, ili indirektno, putem ne-nukleotidnog linkera (veznika) nukleozida, iskorišćavajući bilo 2’ ili 3’ hidroksil pozicije nukleozida. Povezivanja mogu takođe iskoristiti funkcionalizovan šećer ili nukleobazu 5’ krajnjeg nukleotida.

GSO-vi mogu da sadrže dve identične ili različite sekvence konjugovane na njihovim 5’-5’ krajvima putem fosfodiestra, fosforotioata ili ne-nukleozidnog linkera. Takva jedinjenja mogu da sadrže 15 do 27 nukleotida koji su komplementarni u odnosu na specifične delove mRNK ciijeva od interesa za antisens naniže regulaciju genskog produkta. GSO-vi koji sadrže identične sekvence mogu da se vezuju za specifičnu mRNK putem Watson-Crick interakcija vezivanja vodonika i inhibirati ekspresiju proteina. GSO-vi koji sadrže različite sekvence su sposobne da se vezuju za dva ili više različita regiona jednog ili više mRNK cilja i inhibiraju ekspresiju proteina. Takva jedinjenja se sastoje od heteronukleotidnih sekvenci komplementarnih sa ciljnom mRNK i formiraju stabilne dupleks strukture preko Watson-Crick vezivanja vodonika. Pod određenim uslovima, GSO- vi koji sadrže dva slobodna 3’-kraja (5’-5’-prikačeni antisens) mogu biti potentniji inhibitori ekspresije gena neko oni koji sadrže jedan slobodan 3’-kraj ili su bezslobodnog 3’-kraja.

U nekim realizacijama, ne-nukleotidni linker je glicerin ili glicerin homolog formule HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH, pri čemu su o i p nezavisno celi brojevi od 1 do oko 6, od 1 do oko 4 od 1 do oko 3. U nekim drugim realizacijama, ne-nukleotidni linker je derivat 1,3-diamino-2-hidroksipropana Neki takvi derivati imaju formulu HO--(CH2)m-C(O)NH-CH2--CH(OH)--CH2--NHC(O)--(CH2)m--OH, pri čemu m predstavlja ceo broj od 0 do oko 10, od 0 do oko 6, od 2 do oko 6 ili od 2 do oko 4.

Neki ne-nukleotidni linkeri dopuštaju kačenje više od dve GSO komponente. Na primer, nenukleotidni linker glicerin ima tri hidroksilne grupe za koje GSO komponente mogu biti kovalentno prikačene. Neka na oligonukleotidu-bazirana jedinjenja ovog pronalaska, prema tome, sadrže dva ili više oligonukleotida ovezna za nukleotid ili ne-nukleotidni linker. Na takve oligonukleotide u skladu sa ovim pronalaskom se upućuje kao na one koji su „račvasti".

U određenim realizacijama, GSO-vi su bar 14 nukleotida po dužini. U određenim primernim realizacijama, GSO-vi su 15 do 40 nukleotida dugački ili 20 do 30 nukleotida po dužini. Tako, komponenta oligonukleotida GSO-va može nezavisno biti 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 nukleotida po dužini.

Ovi oligonukleotidi mogu biti pripremljeni putem naučno priznatih postupaka kao što su fosforoamidat ili H-fosfonat hemija koji mogu biti obavljeni manualno ili putem automatizovanog sintetizera. Ovi oligonukleotidi mogu takođe biti modifikovani brojnim načinima bez kompromitovanja njihove sposobnosti da hibridizuju za mRNK. Takve modifikacije mogu uključiti bar jedno internukleotidno povezivanje oligonukleotida koji je alkilfosfonat, fosforotioat, fosforoditioan, metilfosfonat, fosfat estar, alkilfosfonotioat, fosforamidat, karbamat, karbonat, fosfat hidroksil, acetamidat ili karboksimetil estar ili kombinacija ovih i drugih internukleotidnih povezivanja između 5’ kraja nukleotida i 3’ kraj drugog nukleotida u kome je 5’ nukleotid fosfodiestar povezivanje zamenjeno sa bilo kojim brojem hemijskih grupa.

IV. Modifikovana Anti-sFltl RNK sredstva za stišavanje

U određenim aspektima ovog pronalaska, RNK sredstvo za stišavanje (ili bilo koji njegov deo) ovog pronalaska kako je prethodno opisano može biti modifikovano tako da se aktivnost tog sredstva dalje poboljšava. Na primer, ovde opisana RNK sredstva za stišavanje mogu biti modifikovana bilo kojim niže opisanim modifikacijama. Modifikacije mogu, delimično, služiti za dalje pojačavanje diskriminacije cilja, da se pojača stabilnost sredstva (npr., da se spreči degradacija), da se promoviše ćelijski unos, da se pojača ciljna efikasnost, da se poboljša efikasnost vezivanja (npr, za ciljeve), da se poboljša pacijentovo tolerisanje sredstva, i/ili da se smanji toksičnost.

U određenim realizacijama, siRNK jedinjenja su obezbeđeno kao ona koja imaju jednu ili više kombinacija sledećih osobina: (1) potpuno hemijski-stabilizovana (odnosno, ne nemodifikovani 2’-OH ostaci); (2) asimetrija; (3) 11-16 dupleksa baznih parova; (4) naizmenični obrazac hemijski-modifikovanih nukleotida (npr., 2’-fluoro i 2’-metoksi modifikacije); i (5) jednolančani, potpuno fosforotioatovani repovi 5-8 baza. Broj

1

fosforotioat modifikacija je kritičan. Ovaj broj varira od 6 do 17 ukupno u različitim realizacijama.

U određenim realizacijama, ovde opisana siRNK jedinjena mogu biti konjugovana za različita ciljajuća sredstva, uključujući, ali ne ograničavajući na, holesterol, DHA, feniitropane, kortizol, vitamin A, vitamin D, GalNac, i gangliozide. Holesterol-modifikovana verzija prikazuje 5-10 puta poboljšanje u efikasnosti in vitro spram prethodno korišćenih obrazaca hemijske stabilizacije (npr., gde je sav purin ali ne pirimidini modifikovan) u širokom opsegu ćelijskih tipova (npr., HeLa, neuroni, hepatociti, trofoblasti).

Određena jedinjenja ovog pronalaska imaju gore i ovde opisane strukturne osobine i na njih se može upućivati kao na ,,hsiRNK-ASP“ (hidrofobnomodifikovane, male interferirajuće RNK, koje prikazuju napredni obrazac stabilizacije). Dodatno tome, hsiRNK-ASP obrazac prikazuje dramatično poboljšanu distribuciju kroz mozak, kičmenu moždinu, isporuku jetri, placenti, bubregu, slezini i u još nekoliko drugih tkiva, čineći ih pristupačnim za terapeutsku intervenciju.

U jetri hsiRNK-ASP isporuka specifično ka endotelijalnim ćelijama i kupfer ćelijama, ali ne ka hepatocitima, čini ovaj obrazac hemijske modifikacije komplementarnim pre nego kompetetivna tehnologij ka GalNac konjugatima.

U aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje koje se vezuje za intronski region mRNK kodirajući sFLT1 protein, pri čemu ovo jedinjenje selektivno inhibira ekspresiju sFLT1 proteina u ćeliju ili organizam; navedeno jedinjenje sadrži dsRNK koja ima sens lanac i antisens lanac od bar 16 susednih nukleotida,

pri čemu je deo antisens lanca komplementaran sa delom sens lanca,

pri čemu je antisens lanac potpuno kompiementaran sa SEQ ID N0:1;

(1) antisens lanac sadrži naizmenično 2’-metoksi-ribonukleotide i 2’-fluoro-ribonukleotide; (2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 od 5’ kraja antisens lanca nisu 2’-metoksi-ribonukleotidi; (3) nukleotidi antisens lanca su spojeni putem fosfodiestra ili fosforotioat povezivanja; i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 sa 3’ kraja, antisens lanca su spojeni za susedne nukleotide putem fosforotioat povezivanja;

pri čemu je sens lanac povezan za hidrofobni molekul na 3’ kraju sens lanca.

2

Takođe je ovde opisan oligonukleotid od bar 16 susednih nukleotida, pri čemu navedeni oligonukleotid ima 5’ kraj, 3’ kraj i komplementarnost sa ciljem, pri čemu: (1) oligonukleotid sadrži naizmenične 2’-metoksi-ribonukleotide i 2’-fluoro-ribonukleotide; (2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 5 kraja nisu 2’-metoksi-ribonukleotidi; (3) nukleotidi su spojeni putem fosfodiestar ili fosforotioat povezivanja; i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 sa 3’ kraja, ili pozicijama 1-7 sa 3’ kraja, su spojeni za susedne nukleotide putem fosforotioat povezivanja.

Takođe je ovde opisana dvolančana, hemijski-modifikovana nukleinska kiselina, koja sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, pri čemu: (1) prvi oligonukleotid je ovde opisan oligonukleotid (npr., koji sadrži SEQ ID Nos: 1, 2, 3 ili 4); (2) deo prvog oligonukleotida je komplementaran sa delom drugog oligonukleotida; (3) drugi oligonukleotid sadrže naizmenično 2’-metoksi-ribonukleotide i 2’-fluro-ribonukleotide; (4) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 sa 3’ kraja drugog oligonukleotida su 2’-metoksi- ribonukleotidi; i (5) nukleotidi drugog oligonukleotida su spojeni putem fosfodiestar ili fosforotioat povezivanja.

Ovde je takođe opisan oligonukleotid koji ma strukturu:

X-A(-L-B-L-A)j(-S-B-S-A)r(-S-B)t-OR

pri čemu: X je 5’ fosfat grupa; A, za svako pojavljivanje, je nezavisno 2’-metoksiribonukleotid; B, za svako pojavljivanje, je nezavisno 2’-fluororibonukleotid; L, za svako pojavljivanje, je nezavisno fosfodiestar li fosforotioat linker; S je posforotioat linker; i R je odabran od vodonika i grupe za zatvaranje (npr., acil tako što je acetil); j predstavlja 4,5, 6 ili 7; r predstavlja 2 ili 3; i t predstavlja 0 ili 1.

Takođe je ovde opisana dvolančana, hemijski-modifikovana nukleinska kiselina koja sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, pri čemu je:

(1) prvi oligonukleotid odabran od oligonukleotida trećeg aspekta;

(2) deo prvog oligonukleotida je komplementaran sa delom drugog oligonukleotida; i

(3) drugi oligonukleotid ima strukturu:

C-L-B(-S-A-S-B)m’(-P-A-P-B)n’(-P-A-S-B)q’(-S-A)r’(-S-B)t’-OR

pri čemu: C je hidrofobni molekul; A, za svako pojavljivanje, je nezavisno 2’-metoksiribonukleotid; B, za svako pojavljivanje, je nezavisno 2’-fluororibonukleotid; L je linker koji sadrži jedan ili više ostatak odabranod od grupe koja se sastoji od: 0-4 ponovljenih jedinica etilenglikola, foasfodiestar, i fosforotioat; S je fosforotioat linker; P je foasfodiestar linker; R je odabran od vodonika i grupe za zatvaranje (npr., acil kao što je acetil; m’ predstavlja 0 ili 1; n’ predstavlja 4, 5 ili 6; q’ predstavlja 0 ili 1; r’ predstavlja 0 ili 1; i t’ predstavlja 0 ili 1.

1) Modifikacije kako bi se pojačala diskriminacija cilja

U određenim realizacijama, RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska mogu biti supstituisana sa destabilizujućim nukleotidom kako bi se pojačala pojedina nukleotidna diskriminacija cilja (videti U.S. prijavi Ser. br. 11/698,689, podnesene 25. januara 2007. god. i U.S. provizorna prijava br. 60/762,225 podnesena 25. januara 2006. god.). Takva modifikacija može biti dovoljna da se ukine specifičnost RNK sredstva za stišavanja za neciljnu mRNK (npr., divljeg-tipa RNK), bez primetnog uticanja na specifičnost RNK sredstva za stišavanje za ciljnu mRNK (npr., dobijanje-funkcije mutant mRNK).

U poželjnim realizacijama, RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska su modifikovana uvođenjem bar jednog univerzalnog nukleotida u njihov antisens lanac. Univerzalni nukleotidi sadrže delove baze koji su sposobni da nediskriminatorno vrše sparivanje baza sa bilo kojom od četiri konvencionalne nukleotidne baze (npr., A, G, C, U). Univerzalni nukleotid je poželjan zato što ima relativno malo dejstvo na stabilnost RNK dupleksa ili dupleksa formiranog od strane vodič lanca RNK sredstva za stišavanje i ciljne mRNK. Primerni univerzalni nukleotidi uključuju one koji imaju inozin deo baze ili inozin analog deo baze odabran od grupe koja se sastoji od deoksiinozina (npr., 2’-deoksiinozin), 7- deaza-2’-deoksiinozina, 2’-aza-2’-deoksiinozina, PNA-inozina, morfolino-inozina, LNA- inozina, fosforoamidat-inozina, 2’-O-metoksietil-inozina, i 2’-OMe-inozina. U naročito poželjnim realizacijama, univerzalni nukleotid je inozin ostatak ili njegov prirodno nastali analog.

U određenim realizacijama, RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska su modifikovana uvođenjem bar jednog destabilizujućeg nukleotida unutar 5 nukleotida od nukleotida koji

4

utvrđuje specifičnost (odnosno, nukleotid koji prepoznaje sa bolešću-povezan polimorfizam). Na primer, destabilizujući nukleotid može biti uveden na poziciju koja je unutar 5, 4, 3, 2, ili 1 nukleotida od nukleotida koji utvrđuje specifičnost. U primernim realizacijama, destabilizujući nukleotid se uvodi na poziciju koja je 3 nukleotida od nukleotida koji utvrđuje specifičnost (odnosno, tako da postoje 2 stabilizujuća nukleotida između destabilizujućeg nukleotida i nukleotida koji utvrđuje specifičnost). U RNK sredstvima za stišavanje koji imaju dva lanca ili delova lanca (npr., siRNK i shRNK), destabilizujući nukleotid može biti uveden u lanac ili deo lanca koji ne sadrži nukleotid koji utvrđuje specifičnost. U poželjnim realizacijama, destabilizujući nukleotid se uvodi u isti lanac ili deo lanca koji sadrži nukleotid koji utvrđuje specifičnost.

2) Modifikacije radi pojačavanja efikasnosti i specifičnosti

U određenim realizacijama, RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska mogu biti izmenjena da se olakša pojačana efikasnost i specifičnost u posredovanju RNKi prema pravilima asimetričnog dizajna (videti U.S. Patent br. 8,309,704, 7,750,144, 8,304,530, 8,329,892 i 8,309,705). Takve izmene olakšavaju ulazak antisens lanca siRNK (npr, siRNK dizajniran korišćenjem postupaka ovog pronalaska ili siRNK proizvedena iz shRNK) u RISC u korist sens lanca, tako da antisens lanac poželjno vodi cepanje ili translacionu represiju ciljne mRNK, i tako povećava ili poboljšava efikasnost ciljnog cepanja i stišavanja. Poželjno asimetrija RNK sredstva za stišavanje je pojačana smanjenjem snage baznog para između 5’ kraja antisens lanca (AS 5’) i 3’ kraja sens lanca (AS 3’) RNK sredstva za stišavanje u odnosu na snagu veze ili snagu baznog para između 3’ kraja antisens lanca (AS 3’) i 5’ kraja sens lanca (s 5’) navedenog RNK sredstva za stišavanje.

U jednoj realizaciji, asimetrija RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska može biti pojačana tako da postoji manje G:C baznih parova između 5’ kraja prvog ili antisens lanca i 3’ kraja dela sens lanca nego između 3’ kraja prvog ili antisens lanca i 5’ kraja dela sens lanca. U sledećoj realizaciji, asimetrija RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska može biti pojačana tako da postoji bar jedan neusklađeni bazni par između 5’ kraja prvog ili antisens lanca i 3’ kraja dela sens lanca. Poželjno, neusklađeni bazni par je odabran od grupe koja se sastoji od G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C i U:U. U sledećoj realizaciji, asimetrija RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska može biti pojačana tako da postoji bar jedan klimavi bazni par, npr., G:U, između 5’ kraja prvog ili antisens lanca i 3’ kraja dela sens lanca. U sledećoj realizaciji, asimetrija RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska može biti pojačana tako da postoji bar jedan bazni par koji sadrži retki nukleotid, npr., inozin (I). Poželjno, bazni par je odabran od grupe koja se sastoji od l:A, 1:11 i l:C. U još jednoj realizaciji, asimetrija RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska može biti pojačana tako da postoji bar jedan bazni par koji sadrži modifikovan nukleotid. U požeijnim realizacijama, modifikovani nukleotid je odabran od grupe koja se sastoji od 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G, i 2,6-diamino-A.

3) RNK sredstva za stišavanje sa pojačanom stabilnošću

RNK sredstva za stišavanje sadašnjeg pronalaska mogu biti modifikovana da se poboljša stabilnost u serumu ili medijumu rasta za ćelijske kulture. Da bi se pojačala stabilnost, 3’-ostaci mogu biti stabilizovani protiv degradacije, npr., mogu biti odabrani tako da sadrže purin nukleotide, naročito adenozin i guanozin nukleotide. Alternativno, supstitucija pirimidin nukleotida modifikovanim analozima, npr., supstitucija uridina sa 2’-deoksitimidinom se toleriše i ne utiče na efikasnost RNK interferencije.

Ovaj pronalazak prikazuje RNK sredstva za stišavanje koja uključuju prve i druge lance pri čemu su drugi lanac i prvi lanac modifikovani supstitucijom internih nukleotida sa modifikovanim nukleotidima, tako da je in vivo stabilnost pojačana upoređeno sa korespondirajućim nemodifikovanim RNK sredstvom za stišavanje. Kako je ovde definisano, ,,interni“ nukleotid je onaj koji se pojavljuje na bilo kojoj poziciji osim na 5’ kraju ili 3’ kraju molekula nukleinske kiseline, polinukleotid ili oligonukleotid. Interni nukleotid može biti unutar jednolančanaog molekula ili unutar lanca dupleks ili dvolančanog molekula. U jednoj realizaciji, sens lanac i/ili antisens lanac je modifikovan supstitucijom bar jednog internog nukleotida. U sledećoj realizaciji, sens lanac i/ili antisens lanac je modifikovan supstitucijom bar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ili više internih nukleotida. U sledećoj realizaciji, sens lanac i/ili antisens lanac je modifikovan supstitucijom bar 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više internih nukleotida. U još jednoj realizaciji, sens lanac i/ili antisens lanac je modifikovan supstitucijom svih internih nukleotida.

RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska sadrže bar jedan modifikovani nukleotid analog. Jedan ili više nukleotid analoga mogu biti locirani na pozicijama gde se suštinski ne utiče na ciljno-specifičnu aktivnost stišavanja, npr., RNKi aktivnost posredovanja ili aktivnost translacione represije, npr., u regiona na 5’-kraju i/ili 3’-kraju siRNK molekula. Naročito, krajevi mogu biti stabilizovani inkorporisanjem modifikovanih nukleotid analoga.

Primerni nukleotid analozi uključuju šećer- i/ili kičma-modifikovane ribonukleotide (odnosno, uključuju modifikacije na fosfat-šećer kičmu). Na primer, fosfodiestar povezivanja prirodne RNK mogu biti modifikovana da uključe bar jedan azot ili sumpor heteroatom. U primernim kičma-modifikovanim ribonukleotidima, fosfoestar grupa koja je spojena za susedne ribonukleotide se menja modifikovanom grupom, npr., fosfotioat grupom. U primernim šećer-modifikovanim ribonukleotidima, 2’ OH-grupa se menja grupom odabranom od H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 ili ON, pri čemu R predstavlja Ci-C6 alkil, alkenil ili alkinil a halo predstavlja F, Cl, Br ili I.

U posebnim realizacijama, modifikacije su 2’-fluoro, 2’-amino i/ili 2’-tio modifikacije. Naričito poželjne modifikacije uključuju 2’-fluoro-citidin, 2’-fluoro-uridin, 2’-fluoro-adenozin, 2’-fluoroguanozin, 2’-aminocitidin, 2’-amino-uridin, 2’-amino-adenozin, 2’-amino-guanozin, 2,6-diaminopurin, 4-tio-uridin, i/ili 5-amino-alil-uridin. U posebnoj realizaciji, 2’-fluoro ribonukleotidi su svaki uridin i citidin. Dodatne primerne modifikacije uključuju 5-bromouridin, 5-jodo-uridin, 5-metil-citidin, ribo-timidin, 2-aminopurin, 2’-amino-butiril-piren-uridin, 5-fluoro-citidin, i 5-fluoro-uridin. 2’-deoksi-nukleotidi i 2’-Ome nukleotidi mogu takođe biti korišćeni unutar modifikovanih ostataka RNK-sredstava za stišavanje ovog pronalaska. Dodatno modifikovani ostaci uključuju, deoksi-abazni, inozin, N3-metil-uridin, N6,N6-dimetil-adenozin, pseudouridin, purin ribonukleozid i ribavirin. U naročito poželjnoj realizaciji, 2’ ostatak je metil grupa takva da je ostatak povezivanja 2’-0-metil oligonukleotid.

U primernoj realizaciji, RNK sredstvo stišavanja ovog pronalaska sadrži Zaključane nukleinske kiseline (Locked Nucleic Acids) (LNAs). LNAs sadrže šećer-modifikovane nukleotide koji su otporni na aktivnosti nukleaze (krajnje su stabilni) i poseduju osobinu diskriminacije jednog nukleotida za mRNK (Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al„ (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81). Ovi molekuli imaju 2’-0,4’-C-etilen-premošćene nukleinske kiseline, sa mogućim modifikacijama kao što je 2’-deoksi-2”-fluorouridin. Štaviše, LNAs povećavaju specifičnost oligonukleotida ograničavajući šećerni ostatak u 3’-endo konformaciji, time prethodno-organizujući nukleotid za bazno sparivanje i povećanje tačke topljenja oligonukleotida za čak 10°C po bazi.

U sledećoj primernoj realizaciji, RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska sadrži Peptid nukleinske kiseline (PNAs). PNAs sadrže modifikovane nukleotide u kojima je šećer-fosfat deo nukleotida zamenjen sa neutralnim 2-amino etilclicin ostatkom sposobnim da formira poliamid kičmu koja je krajnje otporna na varenje nukleaze i daje poboljšanu specifičnost vezivanja za molekul (Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500).

Takođe su poželjni nukleobaza-modifikovani ribonukleotidi, odnosno, ribonukleotidi, koji sadrže bar jednu ne-prirodno nastalu nukleobazu imesto prirodno nastale nukleobaze. Baze mogu biti modifikovane da blokiraju aktivnost adenozin deaminaze. Pogodne su primerne modifikovane nukleobaze koje uključuju, ali nisu ograničene na, uridin i/ili citidin modifikovan na 5-poziciji, npr., 5-(2-amino)propil uridin, 5-bromo-uridin; adenozin i/ili guanozin modifikovan na poziciji 8, npr., 8-bromo guanozin; deaza nukleotide, npr., 7-deaza-adnozin; O- i N-alkilovane nukleotide, npr., N6-metil adenozin. Treba primetiti da gornje modifikacije mogu biti kombinovane.

U drugim realizacijama, ukršteno-povezivanje može biti uposleno da se izmeni farmakokinetika RNK sredstva za stišavanje, na primer, da se poveća polu-život u telu. Tako, ovaj pronalazak uključuje RNK sredstva za stišavanje koja imaju dva komplementarna lanca nukleinske kiseline, pri čemu su ova dva lanca ukršteno povezana. Ovaj pronalazak takođe uključuje RNK sredstva za stišavanje koja su konjugovana ili nekonjugovana (npr., na svojim 3’ završecima) za drugi ostatak (npr., ostatak koji nije nukleinska kiselina kao što je peptid), organsko jedinjenje (npr., boju), ili slično). Modifikovanje siRNK derivata na ovaj način može poboljšati ćelijski unos ili pojačati aktivnost ćelijskog ciljanja rezultirajućeg siRNK derivata upoređeno sa korespondirajućom siRNK, i korisni su za praćenje siRNK derivata u ćeliji, ili poboljšavaju stabilnost siRNK derivata upoređeno sa korespondirajućom siRNK.

Druge primerne modifikacije uključuju: (a) 2’ modifikacija, npr., obezbeđivanje 2’ OMe ostatka na U u sens ili antisen lancu, ali posebno na sens lancu, i/ili 2’ F ostatka na U u sens ili antisens lancu, ali posebno na sens lancu, i/ili 2’ OMe ostatak u 3’ produženju, npr., na 3’ kraju (3’ kraj znači na 3’ atomu molekula ili na najviše 3’ ostatka, npr., najviša 3’P ili 2’ pozicija, kako je naznačeno kontekstom) i/ili 2’ F ostatku; (b) modifikacija kičme, npr., sa zamenom O sa S, u fosfat kičmi, npr., obezbeđivanje foasforotioat modifikacije, na U ili A ili oba, posebno na antisens lancu, ; npr., sa zamenom P sa S; (c) zamena U sa C5 amino linkerom; (d) zamena A sa G (promena sekvence je poželjna da bi se locirao na sens lancu a ne na antisens lancu); i (d) modifikacija na 2’, 6’, 7’ i 8’ poziciji. Primerne realizacije su one u kojima je prisutna jedna ili više ovih modifikacija na sens a ne na antisens lancu, ili realizacije gde antisens lanac ima manje takvih modifikacija. Ipak druge primerne realizacije uključuju korišćenje metilovanog P u 3’ produženju, npr., na 3’ kraju; kombinaciju 2’ modifikacije, npr., obezbeđivanje 2’ O Me ostatka i modifikacije kičme, npr, sa zamenom P sa S, npr., obezbeđivanje foaforotioat modifikacije, ili korišćenje metilovanog P, u 3’ produženju, npr., na 3’ kraju; modifikaciju sa naproksenom, ibuprofenom, ili drugim ostacima koji inhibiraju degradaciju 3’ kraja.

4) Modifikacije da se pojača ćelijski unos

U drugim realizacijama, RNK sredstva za stišavanje mogu biti modifikovana sa hemijskim ostacima, na primer, da se pojača ćelijski unos od strane ciljnih ćelija (npr., neuronske ćelije). Tako, pronalazak uključuje RNK sredstva za stišavanje koja su konjugovana ili nekonjugovana (npr., na svojim 3’ krajevima) za drugi ostatak (npr., ostatak koji nije nukleinska kiselina kao što je peptid), organsko jedinjenje (npr., boja), ili slično. Konjugacija može biti postignuta postupcima poznatim u nauci, npr., korišćenjem postupaka od Lambert et al„ Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (opisuje nukleinske kiseline napunjene na polialkil-cijanoakrilat (PACA) nanočestice); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3): 137-43 (1998) (opisuje nukleinske kiseline vezane za nanočestice); Schwab et al„ Ann. Oncol. 5 Suppl.4:55-8 (1994) (opisuje nukleinske kiseline povezane za interkaliriajuća sredstva, hidrofobne grupe, polikatjone ili PACA nanočestice); i Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (opisuje nukleinske kiseline povezane za nanočestice).

Prema ovom pronalasku, RNK sredstvo za stišavanje pronalaska je konjugovano za lipofilni ostatak. U jednoj realizaciji, lipofilni ostatak je ligand koji uključuje katjonsku grupu. U sledećoj realizaciji, lipofilni ostatak je zakačen za jedan ili oba lanca siRNK. U primernoj realizaciji, lipofilni ostatak je zakačen za jedan kraj sens lanca siRNK. U sledećoj primernoj realizaciji, lipofilni ostatak je zakačen za 3’ kraj sens lanca. U određenim realizacijama, lipofilni ostatak je odabran od grupe koja sadrži holesterol, vitamin E, vitamin K, vitamin A, folnu kiselinu, ili katjonsku boju (npr., Су3). U primernoj realizaciji, lipofilni ostatak je holesterol. Drugi lipofilni ostaci uključuju holeinsku kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-Bis-0(heksadecil)glicerin, geranuloksiheksil grupu, heksadecilglicerin, borneol, mentol, 1,3-propendiol, heptadecil grupu, palmitinsku kiselini, miristinsku kiselinu, 03-(oleoil)litoholeinsku kiselinu, O3-(oleoil)holnsku kiselinu, dimetoksitritil, ili fenoksazin.

5) Privezani (omča) ligandi

Drugi entiteti mogu biti privezani za RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska. Na primer, privezani ligand za RNK sredstvo za stišavanje da se poboljša stabilnost, termodinamika hibridizacije sa ciljnom nukleionskom kiselinom, ciljanj posebnog tkiva ili ćelijskog-tipa, ili propustljivost ćelije, npr., putem od endocitoze-zavisnog ili -nezavisnog mehanizma Ligandi i povezane modifikacije mogu takođe povećati specifičnost sekvence i shodno tome smanjiti ciljanje van-mete. Privezani ligand može da uključi jednu ili više modifikovanih baza ili šećera koji mogu da funkcionišu kao interkalatori. Ove su poželjno locirane u internom reginu, kao što je u ispupčenju RNK sredstva za stišavanje/ciljnog dupleksa. Interkalator može biti aromatičan, npr., policiklično aromatično ili heterociklično aromatično jedinjenje. Policiklični interkalator može da ima sposobnosti slaganja, i može da uključi sisteme sa 2, 3, ili 4 spojene prstenove. Univerzalne baze koje su ovde opisane mogu biti uključene na ligand, U jednoj realizaciji, ligand može da uključi cepajuću grupu koja doprinosi inhibiciji ciljnog gena cepanjem ciljne nukleinske kiseline. Cepajuća grupa može biti, na primer, bleomicin (npr., bleomicin-A5, bleomicin-A2, ili bleomicin-B2), piren, fenantrolin (npr., O-fenantrolin), poliamin, tripeptid (npr., Iys-tyr-lys tripeptid), ili metal jon helatujuća grupa. Metal jon helatujuća grupa može da uključi, npr., Lu(lll) ili E(lll) makrociklični kompleks, Zn(ll) 2,9-dimetilfenantrolin derivat, Cu(ll) terpiridin, ili akridin, koja može promovisati selektivno cepanje ciljne RNK na položaju ispupčenja od strane slobodnih metalnih jona, kao što je Lu(lll). U nekim realizacijama, peptid ligand može biti privezan za RNK sredstvo za stišavanje da promoviše cepanje ciljne RNK, npr., u regionu ispupčenja. Na primer, 1,8-dimetil-1,3,6,8,10,13-heksaazaciklotetradekan (ciklam) može biti konjugovan za peptid (npr., putem derivata amino kiseline) da promoviše cepanje ciljne RNK. Privezani ligand može biti aminoglikozid ligand, koji može izazvati RNK sredstvo za stišavanje da ima poboljšane osobine hibridizacije ili poboljšanu specifičnost sekvence. Primerni aminogukozidi uključuju glikozilovani polilizin, galaktozilovan polilizin, neomicin B, tobramicin, kanamicin A, i akridin konjugate aminoglukozida, kao što su Neo-N-akridin, Neo-S-akridin, Neo-C-akridin, Tobra-N-akridin, i KanaA-N-akridin. Korišćenje akridin analoga može da poveća specifičnost sekvence Na primer, neomicin B ima visok afinitet za RNK upoređeno sa DNK, ali nisku specifičnost sekvence. Akridin analog, neo-5-akridin ima povećani afinitet za HIV element Rev-odgovora (RRE). U nekim realizacijama guanidin analog (guanidinglukozid) aminoglikozid liganda je privezan za RNK sredstvo za stišavanje. U guanidinglukozidu, amin grupa na amino kiseline je razmenjena za guanidin grupu. Kačenje guanidin analoga može pojačati ćelijsku propustljivost RNK sredstva za stišavanje. Privezani ligand može biti poli-arginin peptid, peptoid ili peptidomimetik, koji može pojačati ćelijski unos oligonukleotidnog sredstva.

Primerni ligandi su spareni, poželjno kovalentno, bilo direktno ili indirektno putem intervenišuće omče, za ligand-konjugovani nosač. U primernim realizacijama, ligand je zakačen za nosač putem intervenišuće omče. U primernim realizacijama, ligand menja distribuciju, ciljanje ili životni vek RNK sredstva za stišavanje u koji je inkorporisan. U primernim realizacijama, ligand obezbeđuje pojačan afinitet za odabrani cilj, npr., molekul, ćelija ili ćelijski tip, odeljak, npr., ćelijski odeljak ili odeljak organa, organ ili region tela, kako je, npr., upoređeno sa vrstama koje nemaju takav ligand.

Primerni ligandi mogu da poboljšaju transport, hibridizaciju, i osobine specifičnosti i mogu takođe da poboljšaju otpornost nukleaze rezultirajućeg prirodnog ili modifikovanog RNK sredstva za stišavanje, ili polimernog molekula koji sadrži bilo koju kombinaciju monomera koji su ovde opisani i/ili prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida. Ligandi generalno mogu da uključuju terapeutske modifikatore, npr., za povećanje unosa; dijagnostička jedinjenja ili reporter grupe, npr., za praćenje distribucije; ukršteno-povezana sredstva; dodeljivanje ostataka koji imaju nukleaza-otpornost; i prirodne ili neobične nukleobaze. Generalni primeri uključuju lipofile, lipide, steroide (npr., uvaol, hecigenin, diosgenin), terpene (npr., triterpeni, npr., sarsasapogenin, Friedelin, epifriedelanol derivatizovana litoholeinska kiselina), vitamine (npr., folna kiselina, vitamin A, biotin, piridoksal), ugljene hidrate, proteine, sredstva za vezivanje proteina, integrin ciljajuće molekule, polikatjonike, peptide, poliamine i peptid mimike. Ligandi mogu da uključe prirodno nastalu supstancu, (npr., humani serum albumin (HSA), lipoprotein niske-gustine (LDL), ili globulin); ugljene hidrate (npr., dekstran, pululan, hitin, hitosan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronsku kiselinu); amino kiselinu ili lipid. Ligand može takođe biti rekombinantan ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr., sintetička poliamino kiselina. Primeri poliamino kiselina uključuju poliamino kiselinu da je polilizin (PLL), poli L-aspartanska kiselina, poli L-glutaminska kiselina, anhidrid stiren-maleinske kiseline kopolimer, poli(L-laktid-ko-glikolovan) kopolimer, anhidrid divinil etar-maleinske kiseline kopolimer, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil aikohol

1

(PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamid polimeri, ili polifosfain. Primeri poliamina uključuju: polietilenamin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, petidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarna so poliamina, ili alfa helični peptid.

Ligandi mogu takođe da uključe ciljajuće grupe, npr., ciljajuće sredstvo ćelije ili tkiva, npr., lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr., antitelo, koje se vezuje za specifični ćelijski tip kao što je ćelija placente, ćelija bubrega i/ili ćelija jetre. Ciljajuća grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, protein A kao površinsko sredstvo, mucin uljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetilglukozamin, multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliamino kiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, ili RGD peptid ili RGD peptid mimetik. Drugi primeri liganda uključuju boje, interkalirajuća sredstva (npr., akridini i supstituisani akridini), ukrštene linkere (npr, psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, Sapfirin), policiklične aromatične ugljene hidrate (npr., fenazin, dihidrofenazin, fenantroline, pireni), lys-tyr-lys tripeptid, aminoglukozide, gvanidium aminoglukozide, veštačke endonukleaze (npr., EDTA), lipofilne molekule, npr., holesterol (i njegovi tio analozi), holeinska kiselina, holanska kiselina, litoholeinska kiselina, adamantan sirćetna kiselina, 1-piren buterna kiselina, dihidrotestosteron, glicerin (npr., njegovi estri (npr., mono, bis ili tris estri masne kiseline, npr., C10, С11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, ili C20 masne kiseline) i etri, npr., C10, С11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, ili C20 alkil; npr., 1,3-bis-O(heksadecil)glicerin, 1,3-bis-0(oktadecil)glicerin), geranuioksiheksil grupa, heksadecilglicerin, borneol, mentol, 1,3-propandiol, hepatodecil grupa, palmitinska kiselina, stearinska kiselina (npr., glicerin distearat), oleinska kiselina, miristinska kiselina, O3-(oleoil)litoholeinska kiselina, O3-(oleoil)holenska kiselina, dimetoksitritil, ili fenoksazin) i peptid konjugate (npr., antenapedia peptid, Tat peptid), srestva za alkilovanje, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radio-označeni markeri, enzimi, hapteni (npr. biotin), transport/apsorpcija facilitatori (npr., aspirin, naproksen, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol klasteri, akridin-imidazol konjugati, Eu3+ kompleksi tetraazamakrociklova), dinitrofenil, HRP ili AP.

Ligandi mogu biti proteini, npr., glikoproteini ili peptidi, npr., molekuli koji imaju specifičan afinitet za co-ligand, ili antitela, npr., antitelo koje se vezuje za specifični ćelijski tip kao što

2

је ćelija kancera, endotelijalna ćelija, ili ćelija kosti. Ligandi mogu takođe uključiti hormone i hormon receptore. Oni mogu takođe uključiti ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetil-glukozamin, multivalentna manoza, ili multivalentna fukoza Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze, ili aktivator NF-KB.

Ligand može biti supstanca, npr., lek, koja povećava unos RNK sredstva za stišavanje u ćeliju, na primer, prekidajući ćelijski citoskelet, npr., prekidanjem ćelijskih mikrotubula, mikrofilamenta (mikrovlakana), i/ili intermedijarnih filamenta. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunculin A, faloidin, svinholid A, indanocin, ili mioservin. Ligand može povećati unos RNK sredstva za stišavanje u ćeliju aktiviranjem inflamatornog odgovora, na primer. Primerni iigandi koji bi imali tako dejstvo uključuju tumor nekroza faktor alfa (TNFα), interleukin-1 beta, ili gama interferon. U jednom aspektu, ligand je lipid ili na lipidu-baziran molekul. Takav lipid ili na lipidu-baziran molekul poželjno vezuje serum protein, npr., humani serum albumin (HSA). HSA vezujući ligand dopušta distribuciju konjugata ka ciljnom tkivu. Na primer, ciljno tkivo može biti placenta, bubreg ili jetra. Drugi molekuli koji mogu da vezuju HSA takođe mogu biti upotrebljeni kao ligandi. Na primer, mogu se upotrebiti neproksin ili aspirin. Lipid ili na lipidu-bazirani ligand mogu (a) povećati otpor degradaciji konjugata, (b) povećati ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu, i/ili (c) mogu biti upotrebljeni da se podesi vezivanje za serum protein, npr., HSA. Na lipidu zasnovani ligand može biti upotrebljen da modulira, npr., kontroliše vezivanje konjugata za ciljno tkivo. Na primer, lipid ili na lipidubazirani ligand koji se vezuje za HSA snažnije će imati manju verovatnoću da bude ciljan ka placenti, jetri i/ili bubregu i prema tome manje verovatno će biti iščišćen iz tela. Lipid ili na lipidu-bazirani ligand koji se vezuje za HSA manje snažno može biti upotrebljen da cilja konjugate placente, jetre i/ili bubrega. Drugi ostaci koji ciljaju ćelije placente, jetre i/ili bubrega mogu takođe biti korišćeni umesto ili dodatno na lipidu-baziranom ligandu.

U sledećem aspektu, ligand je ostatak, npr., vitamin, koji se uzima od strane ciljne ćelije, npr., proliferativne ćelije. One su posebno korisne za tretiranje poremećaja karakterisanim neželjnom ćelijskom proliferacijom, npr., malignog ili nemalignog tipa, npr., ćelije kancera. Primerni vitamini uključuju vitamin A, E, i K. Drugi primerni vitamini uključuju vitamin B, npr., folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili drugi vitamine ili haranljiva sredstva uzeta od strane ćelija kancera. Takođe su uključeni HSA i lipoprotein male gustine (LDL).

U sledećem aspektu, ligand je sredstvo za ćelijsku-propustljivost, poželjno helično sredstvo za ćelijsku-propustljivost. Poželjno sredstvo je amfipatično. Primerno sredstvo je peptid kao što je tat ili antenopedia. Ukoliko je sredstvo peptid, može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik, invertomere, ne-peptidna ili pseudo-peptidna vezivanja, i korišćenje D-amino kiselina. Helično sredstvo je poželjno alfa-helično sredstvo, koje je poželjno ima lipofilnu i lipofobičnu fazu.

Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (na njega se ovde takođe upućuje kao na oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se uvije u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Kačenje peptida i peptidomimetika za oligonukleotidna sredstva može da utiče na farmakokinetičku distribuciju RNK sredstva za stišavanje, kao što je to putem pojačavanja ćelijskog prepoznavanja i apsorpcije. Peptid ili peptidomimetik ostatak može biti oko 5-50 amino kiselina dug, npr., oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 amino kiselina dug. Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid ćelijske propustljivosti, katjonski peptid, amfipatični peptid, ili hidrofobni peptid (npr., koji se sastoji primarno od Туr, Trp ili Phe). Peptid ostatak može biti dendrimer peptid, ograničen peptid, ili ukršteno-povezan peptid. Peptid ostatak može biti L-peptid ili D-peptid. U sledećoj alternativi, peptid ostatak može da uključi sekvencu translokacije hidrofobne membrane (MTS). Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran nasumičnom sekvencom DNK, takav peptid identifikovan iz faga-prikaz biblioteke, ili jedno-zrno-jednojedinjenje (OBOC) kombinatorne biblioteke (Lam et al., Nature 354:82-84, 1991). U primernim realizacijama, peptid ili peptidomimetik su privezani za RNK sredstvo za stišavanje putem inkorporisane monomer jedinice je peptid koji cilja ćeliju kao što je to arginin-glicin-aspartinska kiselina (RGD)-peptid, ili RGD mimik. Peptid ostatak može biti u rasponu dužine od oko 5 amino kiselina do oko 40 amino kiselina. Peptid ostaci mogu imati strukturalnu modifikaciju, kao što je to da bi se povećala stabilnost ili direktne konformacione osobine. Bilo koja od strukturnih modifikacija koje su niže opisane može biti iskorišćena.

6) Kombinacije

Ovde je takođe opisana kombinacija koja se sastoji od:

oligonukleotida Formule (I):

(5-3’)

4

L<2>je nezavisno odabran na svakom pojavljivanju iz grupe koja se sastoji od oligonukleotidnih povezivanja kako je prikazano na Slici 42; i

X<1>, X<2>, X<3>, i X<4>su svaki nezavisno odabrani na svakom pojavljivanju od grupe koja se sastoji od nukleozida kako su prikazani na Slici 43, pri čemu je nukleozid baza odabrana od grupe koja se sastoji od adenina, guanina, uracila, citozina, 5-metilcitozina, hipakantina, i timina, pri čemu je nukleozid baza opciono dalje modifikovana sa jednim ili više hidrofobnih ostataka odabranih od naftila ili izobutila.

U jednom primer, R<1>je odabran od grupe koja se sastoji od

U sledećem primeru, R<3>je internukleotid linker nezavisno odabran pri svakom pojavljivanju od grupe koja sadrži fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilenfosfonat, fosfotriestar, i boranofosfat.

U sledećem primeru, R<3>je internukleotid linker nezavisno odabaran pri svakom pojavljivanju od grupe koja sadrži fosforotioat, fosforoditioat, i boranofosfat.

U sledećem primeru, R<3>je fosforotioat.

1

U jednom primeru, L<2>je nezavisno odabran pri svakom pojavljivanju od fosfodiestra i fosforotioata.

U jednom primeru, X<1>, X<2>, X<3>, i X<4>su svaki nezavisno odabrani pri svakom pojavljivanju od grupe koja se sastoji od nukleozida kako su prikazani na Slici 43, pri čemu je nukleozid baza odabrana od grupe koja se sastoji od adenina, guanina, uracila, citozina, 5-metilcitozina, hipakantina, i timina.

2

�

RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska mogu biti direktno uvedena u ćeliju (npr, neuronska ćelija) (odnosno, intraćelijski); ili uvedeni ekstraćelijski u šupljinu, interstitijalni prostor, u cirkulaciju organizma, uvedena oralno, ili mogu biti uvedena kupanjem ćelije ili organizma u rastvoru koji sadrži nukleinsku kiselinu. Vaskularna i ekstravaskularna cirkulacija, krvni i limfni sistem, i cerebrospinalni fluid su položaji gde nukleinska kiselina može biti uvedena.

RNK sredstva za stišavanje ovog pronalaska mogu biti uvedena upotrebom postupaka isporuke nukleinske kiseline poznate u nauci uključujući ubrizgavanje rastvora koji sadrži nukleinsku kiselinu, bombardovanje česticama koje su pokrivene nukleinskom kiselinom, potapanjem ćelije ili organizma u rastvor nukleinske kiseline, ili elektroporacijom ćelijskih membrana u prisustvu nukleinske kiseline. Mogu biti upotrebljeni drugi postupci poznati u nauci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, kao što su lipidom-posredovan transport nosača, hemijski-posredovani transport, i katjonska lipozom transfekcija kao što je kalcijum fosfat, i slično. Nukleinska kiselina može biit uvedena zajedno sa drugim komponentama koje obavljaju jednu ili više od sledećih aktivnosti. Pojačavanje unosa nukleinske kiseline od strane ćelije ili na drugi način povećanje inhibicije ciljnog gena.

Fizički postupci uvođenja nukleinskih kiselina uključuju ubrizgavanje rastvora koji sadrži RNK, bombardovanje česticama koje su prekrivene sa RNK, potapanje ćelije ili organizma u rastvor RNK, ili elektroporacija ćelijskih membrana u prisustvu RNK. Viralni konstrukt spakovan u viralnu česticu će postići i efikasno uvođenje konstrukta ekspresije u ćeliju i transkripciju RNK kodirane konstruktom ekspresije. Mogu se upotrebiti drugi postupci poznati u nauci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije, kao što je lipidom-posredovan transport nosača, hemijski-posredovan transport, kao što je kalcijum fosfat, i slično. Tako RNK može biti uvedena zajeno sa komponentama koje obavljaju jednu ili više od sledećih aktivnosti: pojačavaju RNK unos od strane ćelije, inhibiraju žarenje pojedinačnih lanaca, stabilizuju pojedinačne lance, ili na drugi način povećavaju inhibiciju ciljnog gena.

RNK može biti direktno uvedena u ćeliju (odnosno, intraćelijski); ili uvedena ekstraćelijski u šupljinu, interstitijalni prostor, u cirkulaciju organizma, uvedena oralno, ili može biti uvedena kupanjem ćelije ili organizma u rastvoru koji sadrži RNK. Vaskularna i ekstravaskularna cirkulacija, krvni i limfni sistem, i cerebrospinalni fluid su položaji gde RNK može biti uvedena.

Ćelija koja ima ciljni gen može biti iz linije mikroba ili somatska, totipotentna ili pluripotentna, deljiva ili nedeljiva, parenhima ili epitelijuma, besmrtna ili transformisana, ili slično. Ćelija može biti stem ćelija ili diferencirana ćelija. Ćelijski tipovi koji su diferencirani uključuju adipocite, fibroblaste, miocite, kardiomiocite, endotelijum, neurone, glijalne ćelije, krvne ćelije, megakariociti, limfociti, makrofage, neutrofili, esionofili, bazofili, mast ćelije, leukociti, granulociti, keratinociti, hondrociti, osteoblasti, osteoklasti, hepatociti i ćelije endokrinih ili eksokrinih žlezdi.

U zavisnosti od posebnog ciljnog gena i doze isporučenog dvolančanog RNK materijala, ovaj proces može obezbediti delimičan ili potpun gubitak funkcije za ciljni gen. Primerno je smanjenje ili gubitak genske ekspresije u bar 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% ili više ciljanih ćelija. Inhibicija genske ekspresije upućuje na odsustvo (ili primetljivo smanjenje) u nivou proteina i/ili mRNK proizvodu iz ciljnog gena. Specifičnost upućuje na sposobnost da se inhibira ciljni gen bez manifestacionih dejstava na druge gene ćelije. Posledice inhibicije mogu biti potvrđene ispitivanjem spoljnih osobina ćelije ili organizma (kako je prezentovano niže u primerima) ili biohemijskim tehnikama kao što su hibridizacija RNK rastvora, zaštita nukleaze, Northern (severna) hibridizacija, povratna transkripcija, praćenje genske ekspresije sa mikronizovima, vezivanje antitela, Enzimski vezan imunosorbent ogled (ELISA), Western (zapadno) mrljanje, Radioimunološki ogled (RIA), drugi imunoogledi, i Fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS).

Sa RNK-posredovana inhibicija u ćelijskoj liniji ili celom organizmu, genska ekspresije se pogodno ogleda korišćenjem reporter gena ili gena otpornog na lek čiji se protein proizvod lako ogleda. Takvi reporter geni uključuju sintazu acetohidroksikiseline (AHAS), alkalnu fosfatazu (AP), beta galaktozidazu (LacZ), beta glukoronidazu (GUS), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), zeleni fluorescentni protein (GFP), ren peroksidazu (HRP), luciferazu (Luc), nopalin sintazu (NOS), oktopin sintazu (OCS), i njihove derivate. Višestruki markeri koji se mogu odabrati su dostupni koji pružaju otpor ampicilinu, bleomicinu, hloramfenikolu, gentarnicinu, higromicinu, kanamicinu, linkomicinu, metotreksatu, fosfinotricinu, puromicinu, i tetraciklinu. U zavisnosti od ogleda, kvantizacija količine genske ekspresije dopušta da se utvrdi stepen inhibicije koji je veći od 10%, 33%, 50%, 90%, 95% ili 99% upoređeno sa ćelijom koja nije tretirana u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Niže doze ubrizganog materijala i duži vremenski periodi nakon davanja RNKi sredstva mogu rezultirati u inhibiciji manje frakcije ćelija (npr., bar 10%, 20%, 50%, 75%, 90%, ili 95% ciljanih ćelija). Kvantizacija genske ekspresije u ćeliji može prikazati slične količine inhibicije na nivou akumulacije ciljne mRNK ili translacije ciljnog proteina. Kao primer, efikasnost inhibicije može biti utvrđena procenjivanjem količine genskog proizvoda u ćeliji; mRNK može biti detektovana sa probom hibridizacije koja ima nukleotidnu sekvencu van regiona upotrebljenu za inhbito rnu dvolančanu RNK, ili prevedeni polipeptid može biti detektovan sa antitelom podignutim spram polipeptidne sekvence tog regiona.

RNK može biti uvedena u količini koja dopušta isporuku bar jedne kopije po ćeliji. Više doze (npr., bar 5, 10, 100, 500 ili 1000 kopija po ćeliji) materijala može dati prinos efektivnije inhibicije; niže doze mogu biti korisne za specifične primene.

U primernom aspektu, efikasnost RNKi sredstva ovog pronalaska (npr., siRNK koja cilja fltl intronsku ciljnu sekvencu) se testira na svoju sposobnost da specifično degradira mutant mRNK (npr., sfltl mRNK i/ili proizvodnja sFlt1 proteina) u ćelijama, naročito, u ćelijama placente (npr., lavirint ćelije, trofoblasti (npr., sincitiotrofoblasti i/ili citotrofoblasti), mezenhimske ćelije, mezenhimski-izvedene makrofage (Hofbauer-ove ćelije), fibroblasti, fetusne vaksularne ćelije (npr., ćelije glatkih mišića, perivaskularne ćelije (periciti), i endotelijaine ćelije)), ćelije jetre i/ili ćelije bubrega. Takođe pogodne za oglede ćelijskibazirane validacije su druge ćelije spremne za transfekciju, na primer, trofoblast ćelije, HeLa ćelije ili COS ćelije. Ćelije se transfektuju sa humanom divijeg tipa ili mutant cDNK (npr., humane divljeg tipa ili izlučene fltl cDNK). Standardna siRNK, modifikovana siRNK ili vektori sposobni da proizvedu siRNK iz U-petlja mRNK su ko-transfektovane. Meri se selektivno smanjenje u ciljnoj mRNK (npr., sfltl mRNK) i/ili ciljnom proteinu (npr., sFlt1 protein). Smanjenje ciljne mRNK ili proteina mođe biti upoređeno sa nivoima mRNK ili proteina u odsustvu RNKi sredstva ili u prisustvu RNKi sredstva koje ne cilja sFlt1 mRNK. Egzogeno-uvedena mRNK ili protein (ili endogena mRNK ili protein) mogu bit ogledani u svrhe poređenja. Kada se iskorišćavaju neuronske ćelije, za koje je poznato da su donekle otporne na standardne tehnike transfekcije, može biti poželjno da se uvedu RNKi sredstva (npr., siRNK) pasivnim unosom.

6) Rekombinantni adeno-povezani virusi i vektori

U određenim primernim realizacijama, rekombinantni adeno-povezani virusi (rAAVs) i njihovi povezani vektori mogu biti upotrebljeni da se isporuči jedna ili više siRNK u ćelije, npr., ćelije placente, ćelije bubrega i/ili ćelije jetre. AAV je sposoban da inficira mnoge različite tipove ćelija, iako efikasnost infekcije varira na osnovu serotipa, što se utvrđuje sekvencom kapsid proteina. Identifikovano je nekoliko urođenih AAV serotipova, sa serotipovima 1-9 koji su najuobočajenije koristi za rekombinantni AAV. AAV-2 je najbolje proučen i objavljen serotip. AAV-DJ sistem uključuje serotipove AAV-DJ i AAV-DJ/8. Ovi serotipovi su kreirani kroz DNK mešanje višestrukih AAV serotipova da se proizvede AAV sa hibridnim kapsidima koji imaju poboljšane efikasnosti transdukcije in vitro (AAV-DJ) i in vivo (AAV-DJ/8) u različitim ćeljama i tkivima.

U posebnim realizacijama, široko rasprostranjena isporuka u centralni nervni sistem (CNS) može biti postignuta intravaskularnom isporukom rekombinantnog adeno-povezanog virusa 7 (rAAV7), RAAV9 i rAAVIO, ili drugih pogodnih rAAVs (Zhang et al., (2011) Mol. Ther.19(8):1440-8. doi: 10.1038/mt.2011.98 Epub 2011 Мау 24). rAAVs i njihovi povezani vektori su dobro poznati u nauci i opisani u US patentnim prijavama 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 i 2005/0220766.

rAAVs mogu biti isporučeni subjektu u kompoziciji u skladu sa bilo kojim odgovarajućim postupkom poznatom u nauci. rAAV može biti suspendovan u fiziološki kompatibilnom nosaču (odnosno, u kompoziciji), i može biti dat subjektu, odnosno, životinji domaćinu, kao što su čovek, miš, pacov, mačka, pas, ovca, zec, konj, krava, svinja, zamorčić, hrčak, kokoška, ćurka, ne-humani primat (npr., babun) ili slično. U određenim realizacijama, životinja domaćin je ne-humana životinja domaćin.

Isporuka jednog ili više rAAVs sisaru kao subjektu može biti obavljena, na primer, intramuskularnim ubrizgavanjem ili davanjem u krvotok sisaru kao subjektu. Davanje u krvotok može biti ubrizgavanje u venu, arteriju, ili bilo koji drugi vaskularni provodnik. U određenim realizacijama, jedan ili više rAAVs se daju u krvotok putem izolovane perfuzije ekstremiteta, tehnikom dobro poznatom u hirurškoj nauci, postupak koji u osnovi omogućava stručnjaku da izoluje ekstremitet iz sistemske cirkulacije pre davanja rAAV virione. Varijanta tehnike perfuzije izolovanog ekstremiteta, opisana u U.S. Pat. br.

6,177,403, može takođe biti primenjena od stručnjaka da bi dao virione u vaskulaturu izolovanog ekstremiteta kako bi potencijalno pojačao transdukciju u mišićne ćelije ili tkivo. Štaviše, u određenim instancama, može biti poželjno isporučiti virione placenti, jetri i/ili bubrege subjekta. Rekombinantni AAVs mogu biti isporučeni direktno u placentu, jetru i/ili bubreg sa iglom, kateterom ili povezanim uređajem, korišćenjem neurohirurških tehnika poznatih u nauci, kao što je to putem stereotaktičnog ubrizgavanja (videti, npr., Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; i Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000).

Kompozicije ovog pronalaska mogu da sadrže samo rAAV, ili da budu u kombinaciji sa jednim ili više drugih virusa (npr., drugi rAAV koji kodira i ima jedan ili više različitih transgena). U određenim realizacijama, kompozicija sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više različitih rAAVs gde svaki ima jedan ili više različitih transgena.

Efektivna količina rAAV je količina dovoljna cilja infekciju životinje, cilja željeno tkivo. U nekim realizacijama, efektivna količina rAAV je količina dovoljna da proizvede stabilni somatske transgeni životinjski model. Efektivna količina će zavisiti primarno od faktora kakvi su vrste, starost, telesna težina, zdravstveno stanje subjekta, i tkivo koje se ima ciljati, i može tako varirati među životinjama i tkivima. Na primer, efektivna količina jednog ili više rAAVs je generalno u rasponu od oko 1 ml do oko 100 ml rastvora koji sadrži od oko 10<9>do 10<16>kopija genoma. U nekim slučajevima, odgovarajuća je doza između oko 10<11>do 10<12>rAAV kopija genoma. U određenim realizacijama, 10<12>rAAV kopija genoma su efektivne da ciljaju tkiva srca, jetre i pankreasa. U nekim slučajevima, stabilne transgenske životinje se proizvode višestrukim dozama rAAV.

U nekim realizacijama, rAAV kompozicije se formulišu da smanje agregaciju AAV čestica u kompoziciji, posebno gde su prisutne visoke rAAV koncentracije (npr., oko 10<13>kopija genoma/mL ili više). Postupci za smanjenje agregacije rAAVs su dobro poznati u nauci i uključuju, na primer, dodavanje površinskih sredstava, pH podešavanje, podešavanje koncentracije soli, itd. (Videti, npr., Wright et al., (2005) Molecular Therapy 12:171-178).

„Rekombinantni AAV (rAAV) vektori" sadrže, minimalno, transgen i njegove regulatorne sekvence, i 5 i 3 AAV obrnuta krajnja ponavljanja (ITRs). To je ovaj rekombinantni AAV vektor koji je spakovan u kapsid protein i isporučen odbranoj ciljnoj ćeliji. U nekim realizacijama, transgen je sekvenca nukleinske kiseline, hetrologa prema sekvencama vektora, koja kodira polipeptid, protein, funkcionalni RNK molekul (npr., siRNK) ili druge genske proizvode od interesa. Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline je radno povežana za regulatorne komponente na način koji dopušta transkripciju transgena, translaciju, i/ili ekspresiju u ćeliji ciljnog tkiva.

AAV sekvence vektora tipično sadrži cis-ponašajući 5’ i 3’ obrnuto krajnje ponavljanje (ITR) sekvence (Videti, npr., B.J. Carter, u „Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). ITR sekvence su uobičajeno 145 baznih parova po dužini. U određenim realizacijama, u osnovi celokupne sekvence koje kodiraju ITRs se upotrebljavaju u molekulu, iako je dopušten neki stepen manje modifikacije ovih sekvenci. Sposobnost da modifikuje ITR sekvence je u okviru veštine tehnike. (Videti, npr., tekstove kao što su Sambrook et al, „Molecular Cloning. A Laboratory Manual“, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); i K. Fisher et al„ J Virol., 70:520532 (1996)). Primer tako uposlenog molekula u sadašnjem pronalasku je ,,cis-ponašajući“ plazmid koji sadrži transgen, u kome su sekvenca odabranog transgena i povezanih regulatornih elemenata flankirane 5’ i 3’ AAV ITR sekvencama. AAV ITR sekvence mogu biti dobijene iz bilo kog poznatog AAV, uključujući sisarske AAV tipove ovde dalje opisane.

VI. Postupci tretmana

Takođe su ovde opisani i frofilaktički i terapeutski postupci tretiranja subjekta pod rizikom od (ili podložnog) bolesti ili poremećaja izazvanih, u celini ili delimično, izlučenim Flt1 proteinom. U jednom primeru, bolest ili poremećaj je bolest ili poremećaj jetre. U sledećem primeru, bolest ili poremećaj predstavlja bolest ili poremećaj bubrega. U jednom primeru, bolest ili poremećaj predstavljaju placentnu bolest ili poremećaj. U jednom primeru, bolest ili poremećaj je sa trudnoćom-povezana bolest ili poremećaj. U poželjnom primeru, bolest ili poremećaj predstavlja poremećaj povezan sa ekspresijom rastvorljivog Flt1 proteina u kome pojačana ekspresije rastvorljivog Flt1 proteina vodi do kliničkih manifestacija PE, postporođajne PE, eklampsije i/ili HELLP.

„Tretman ili ,,tretiranje“, kako se ovde upotrebljava, je definisan kao primena ili davanje terapeutskog sredstva (npr., RNK sredstvo ili vektor ili transgen koji kodiraju isto) pacijentu, ili primena ili davanje terapeutskog sredstva izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji iz pacijenta, koji ima bolest ili poremećaj, simptom bolesti ili poremećaja ili predispoziciju prema bolesti ili poremećaju, u svrhu da leči, zaleči, ublaži, olakša, prepravi, popravi, poboljša, unapredi ili utiče na bolest ili poremećaj, simptome boelsti ili poremećaja, ili predispoziciju prema bolesti.

Takođe je ovde opisan postupak za sprečavanje u subjektu, bolesti ili poremećaja kako je u gornjem tekstu opisano, davanjem subjektu terapetskog sredstva (npr. RNKi sredstvo ili vektor ili transgen koji kodiraju isto). Subjekt sa rizikom za bolest može biti identifikovan putem, na primer, bilo koje kombinacije dijagnostičkih i prognostičkih ogleda kako je ovde opisano. Do davanja profilaktičkog sredstva može da dođe pre manifestacije simptoma

1

karakterističnih za bolest ili poremećaj, tako da se bolest ili poremećaj sprečavaju ili, alternativno, odlaže njihova progresija.

Takođe su ovde opisani postupci tretiranja subjekata terapeutski, odnosno, izmenom početka simptoma bolesti ili poremećaja. U primeru, modulatorni postupak uključuje kontaktiranje ćelije koja ekspresuje dobiti-funkciju mutant sa terapeutskim sredstvom (npr., RNKi sredstvo ili vektor ili transgen koji kodiraju isto) koje je specifično za jednu ili više ciljnih sekvenci u okviru gena (npr., SEQ ID NOs: 1, 2, 3, ili 4 ili bilo koja njihova kombinacija), tako da se postigne specifična interferencija sekvence sa genom. Ovi postupci mogu biti obavljeni in vitro (npr., kultivisanjem ćelije sa sredstvom) ili, alternativno, in vivo (npr., davanjem sredstva subjektu).

U pogledu i profilaktičkih i terapeutskih postupaka tretmana, takvi tretmani mogu biti specifično skrojeni ili modifikovani, zasnovano na znanju stečenom iz polja farmakogenomike. „Farmakogenomika“ , kako se ovde upotrebljava, upućuje na primenu tehnologija genomike kao što je sekvenciranje gena, statistička genetika, i analiza genske ekspresije na lekove u kliničkom razvoju i na tržištu. Specifičnije, pojam upućuje na proučavanje kako pacijentovi geni određuju negov ili njen odgovor na lek (npr., pacijentov „fenotip odgovora na lek“, ili „genotip odgovora na lek“). Tako su takođe ovde opisani postupci za krojenje profilaktičkog ili terapeutskog tretmana pojedinca sa bilo molekulima ciljnog gena kako su ovde opisani ili modulatorima ciljnog gena u skladu sa genotipom odgovora na lek tog pojedinca. Farmakogenomika dopušta kliničaru ili lekaru da cilja profilatkičke ili terapeutske tretmana za pacijente koji će imati najviše koristi iz tog tretmana a da bi se izbegao tretman pacijenata koji će iskusiti toksične sa lekom- povezane sporedne efekte.

Terapeutska sredstva mogu biti testirana u odgovarajućem životinjskom modelu. Na primer, RNKi sredstvo (ili vektor ekspresije ili transgen koji kodiraju isto) kako je ovde opisano može biti upotrebljeno u životinjskom modelu da se utvrdi efikasnost, toksičnost, ili sporedni efekti tretmana sa navedenim sredstvom. Alternativno, terapeutsko sredstvo se može upotrebiti u životinjskom modelu da se utvrdi mehanizam dejstva takvog sredstva. Na primer, sredstvo može biti upotrebljeno u životinjskom modelu da se utvrdi efikasnost, toksičnost, ili sporedni efekti tretmana sa takvim sredstvom. Alternativno, sredstvo može biti upotrebljeno u životinjskom modelu da se utvrdi mehanizam dejstva takvog sredstva.

2

Farmaceutska kompozicija koja sadrži RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska može biti dato bilo kom pacijentu dijagnostikovanom da ima ili da je pod rizikom da razvije poremećaj u trudnoći, jetre i/ili bubrega, kao što je PE i/ili eklampsija. U jednoj realizaciji, pacijent je dijagnostikovan da ima PE i/ili eklampsiju, a pacijent je inače generalno dobrog zdravstvenog stanja. Na primer, pacijent nije smrtno bolestan, i verovatno će živeti bar 2, 3, 5 ili više godina nakon dijagnoze. Pacijent može biti tretiran trenutno nakon dijagnoze, ili tretman može biti odložen sve dok pacijent ne doživi simptome iscrpljujuće u većoj meri, kao što su dva ili više simptoma PE ili jedan ili više simptoma eklampsije. U sledećoj realizaciji, pacijent ne dostiže odmaklu fazu bolesti.

RNK sredstvo za stišavanje modifikovano za pojačanje unosa u neuronske ćelije može biti dato pri jediničnoj dozi manjoj od oko 1,4 mg po kg telesne težine, ili menje od 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ili 0,00001 mg po kg telesne težine, i manje od 200 nmola RNK sredstva (npr., oko 4,4 х 10<16>kopija) po kg telesne težine, ili manje od 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 nmola RNK sredstva za stišavanje po kg telesne težine. Jedinična doza, na primer, može biti data ubrizgavanjem (npr., intravenozno ili intramuskularno, intratekalno, ili direktno u mozgu), kao inhalirana doza, ili mesnom primenom. Posebno poželjne doze su manje od 2, 1, ili 0,1 mg/kg telesne težine.

Isporuka RNK sredstva za stišavanje direktno u organ (npr., direktno u placentu, jetru i/ili bubrege) može biti pri dozi po nalogu od oko 0,00001 mg do oko 3 mg po organu, ili poželjno oko 0,0001-0,001 mg po organu, oko 0,03-3,0 mg po organu, oko 0,1-3,0 mg po oku li oko 0,3-3,0 mg po organu. Doza može biti količina efektivna da se tretira ili spreči bolest ili poremećaj povezani sa jetrom, bubregom ili trudnoćom, npr., PE, postporođajna PE, eklampsija i/ili HELLP. U jednoj realizaciji, jedinična doza se daje manje često od jedanput na dan, npr., manje nego svakog 2, 4, 8 ili 30 dana. U sledećoj realizaciji, jedinična doza se ne daje sa učestalošću (npr., ne regularna učestalost). Na primer, jedinična doza može biti dati jedanput. U jednoj realizaciji, efektivna doza se daje sa drugim tradicionalnim terapeutskim modalitetima.

U jednoj realizaciji, subjektu se ima dati inicijalna doza, i jedna ili više doza održavanja RNK sredstva za stišavanje. Doza ili doze za održavanje su generalno niže od inicijalne doze, npr., upola manje od inicijalne doze. Režim održavanje može da uključi tretiranje subjekta sa dozom ili dozama u opsegu od 0,01 μg do 1,4 mg/kg telesne težine dnevno, npr., 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, ili 0,00001 mg po kg telesne težine dnevno. Doze za održavanje se poželjno daju ne više od jedanput svakih 5, 10, ili 30 dana. Dalje, režim tretmana može trajati tokom vremenskog perioda koji će varirati u zavisnosti od prirode posebne bolesti, njene ozbiljnosti i sveukupnog stanja pacijenta. U poželjnim realizacijama doza može biti isporučena ne više od jedanput na dan, npr., ne više od svaka 24, 36, 48 ili više sati, npr., ne više od svakih 5 ili 8 dana. Nakon tretmana, pacijent može biti praćen u vezi promena u njegovom stanju i u vezi ublažavanje stanja simptoma bolesti. Doza jedinjenja može biti bilo povećana u slučaju da pacijent ne odgovara značajno na trenutno nivoe doze, ili doza može biti smanjena ukoliko je primenjeno ublažavanje stanja simptoma bolesti, ukoliko je stanje bolesti uklonjeno, Iii ukoliko su primećeni sporedni efekti.

Efektivna doza može biti data u jednoj dozi ili u dve ili više doza, kako se želi ili smatra odgovarajućim pod specifičnim okolnostima. Ukoliko se žele olakšati ponovljene ili česte infuzije, implantacija uređaja za isporuku, npr., pumpa, polu-trajni stent (npr., intravenozni, intraperitonelni, intracisternalni ili intrakapsularni), ili rezervoar mogu biti preporučljivi. U jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija uključuje mnoštvo vrsta RNK sredstava za stišavanje. U sledećoj realizaciji, vrsta RNK sredstva za stišavanje ima sekvence koje su ne-preklapajuće i ne-susedne sa drugom vrstom u pogledu prirodno nastale ciljne sekvence. U sledećoj realizaciji, mnoštvo vrsta RNK sredstva za stišavanje je specifično za različito nastale ciljne gene. U sledećoj realizaciji, RNK sredstvo za stišavanje je alela specifično. U sledećoj realizaciji, RNK sredstva za stišavanje je mnoštvo vrsta cilja dve ili više ciljne sekvence (npr., dve, tri, četiri, pet, šest, ili više ciljnih sekvenci).

Nakon uspešnog tretmana, može biti poželjno da se pacijent podvrgne terapiji održavanja da se spreči ponovno pojavljivanje stanja bolesti, pir čemu se jedinjenje ovog pronalaska daje u dozama za održavanje, u rasponu od 0,01 μg do 100 g po kg telesne težine (videti U.S. Pat. br.6,107,094).

Koncentracija kompozicije RNK sredstva za stišavanje je u količini koja je dovoljna da bude efektivna u tretiranju ili sprečavanju poremećaja ili da reguliše fiziološko stanje kod ljudi. Koncentracija ili količina datog RNK sredstva za stišavanje će zavisiti od parametara utvrđenih za sredstvo i postupak davanja, npr., nazalno, bukalno, ili pulmonalno. Na primer, nazalne formulacije imaju tendenciju da zahtevaju mnogo manje koncentracije nekih sastojaka kako bi se izbegla iritacije ili gorenje nazalnih prolaza. Ponekad je

4

poželjno razblažiti oralnu formulaciju do 10-100 puta kako bi se obezbedila pogodna nazalna formulacija.

Određeni faktori mogu uticati na dozu koja se zahteva da se efektivno tretira subjekt, uključujući ali ne ograničavajući na ozbiljnost bolesti, prethodne tretmane, generalno zdravstveno stanje i/ili starost subjekta, i drugi prisutne bolesti. Štaviše, tretman subjekta sa terapeutski efektivnom količinom RNK sredstva za stišavanje može da uključi jedan tretman ili, poželjno, može da uključi seriju tretmana. Takođe će se ceniti da se efektivna doza RNK sredstva za stišavanje radi tretmana može povećati ili smanjiti tokom trajanja određenog tretmana. Promene u dozi mogu rezultirati i postati očigledne iz rezultata dijagnostičkih ogleda kako je ovde opisano. Na primer, subjekt može biti praćen nakon davanje kompozicije RNK sredstva za stišavanje. Na osnovu informacija iz praćenja, može se dati dodatna količina kompozicije RNK sredstva za stišavanje.

Doziranje zavisi od ozbiljnosti i odazivanja stanja bolesti koja se imaju tretirati, sa tokom tretmana koji traje od nekoliko dana do nekoliko meseci, ili dok lek ne dejstvuje ili se ne postigne umanjenje stanja bolesti. Optimalni rasporedi doziranja mogu se izračunati iz merenja akumulacije leka u telu pacijenta. Lica uobičajene veštine mogu lako utvrditi optimum doze, metodologije doziranja i stope ponavljanja. Optimalne doze mogu da variraju u zavisnosti od relativne potencije pojedinačnih jedinjenja, i mogu generalni biti procenjene na osnovu EC50s koji za koje je pronađeno da su efektivne in vitro i in vivo u životinjskim modelima. U nekim realizacijama, životinjski modeli uključuju transgenske životinje koje espresuju humani gen, npr., gen koji proizvodi ciljnu RNK, npr., RNK ekspresovanu u ćeliju jetre, bubrega i/ili placente. Transgenska životinja može biti sa manjkom korespondirajuće endogene RNK. U sledećoj realizaciji, kompozicija za testiranje uključuje RNK sredstvo za stišavanje koje komplementarno, bar u internom regionu, sa sekvencom koja se konzervira između ciljne RNK u životinjskom modelu i ciljne RNK u čoveku.

VII. Farmaceutske kompozicije i postupci davanja

Ovaj pronalazak se odnosi na gore-opisana sredstva za profilaktičku i/ili terapeutsku upotrebu kako je niže opisano. U skladu sa tim, modulatori (npr., RNKi sredstva) sadašnjeg pronalaska mogu biti inkorporisani u farmaceutske kompozicije pogodne za davanje. Takve kompozicije tipično sadrže molekul nukleinske kiseline, protein, antitelo, ili modulatorno jedinjenje i farmaceutski prihvatljivi nosač. Kako se ovde koristi jezik „farmaceutski prihvatijiv nosač“ je namenjen da uključi bilo koje i sve rastvarače, medije disperzije, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilna sa farmaceutskim davanjem. Upotreba takvog medija i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznato u nauci. Osim ukoliko je konvencionalan medij ili sredstvo inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihovo korišćenje u kompozicijama. Dodatna aktivna jedinjenje takođe mogu biti inkorporisana u kompozicije.

Farmaceuska kompozicija ovog pronalaska je formulisana da bude kompatibilna sa nameravanim putem davanja. Primeri puteva davanja uključuju parenteralano, npr., intravenozno (IV), intradermalno, potkožno (SC ili SQ), intraperitonelno, intramuskularno, oralno (npr., inhalacija), transdermalno (mesni), i transmukozno davanje. Rastvori i suspenzije koje se koriste za parenteralnu, intradermalnu ili potkožnu primenu mogu da uključe sledeće komponente: sterilni razblaživač kakav je voda za ubrizgavanje, slani rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante kao što askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; sredstva za helatovanje kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina; puferi kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. Vrednost pH može biti podešena sa kiselinama ili bazama, kao što hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može biti priložen u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili bočicama sa višestrukom dozom napravljenim od stakla ili plastike.

Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu ubrizgavanjem uključuju sterilne vodene rastvore (gde je rastvorljivo u vodi) ili disperzije i sterilni praškovi za ekstemporalno pripremanje sterilnih ubrizgavajućih rastvora ili disperzije. Za intravenozno davanje, pogodni nosači uključuju fiziološki slani rastvor, bakteriostatička voda, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J) ili fosfatom puferovani slani rastvor (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i treba da bude fluidna u meri da postoji lako korišćenje šprica. Mora biti stabilna pod proizvođačkim uslovima i skladištena i mora biti sačuvana spram kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzija medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerin, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Pravilna fluidnost može biti održavana, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanje zahtevane veličine čestice u slučaju disperzije i korišćenjem površinskih sredstava. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može biti postignuto različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal, i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što je manit, sorbit, natrijum hlorid u kompoziciji. Produžena apsorpcija ubrizgavajućih kompozicija može biti dovedena uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat ili želatin.

Sterilni ubrizgavajući rastvori mogu biti pripremljeni inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u zatevanoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka koji su gore nabrojani, kako se zahteva, praćeno filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni tečni nosač koji sadrži bazni medijum disperzije i zahtevane druge sastojke od onih koji su gore nabrojani. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih ubrizgavajućih rastvora, poželjni postupci pripremanja su vakumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem koji daju prinos praška aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog prethodno sterilno- filtriranog rastvora.

Oralne kompozicije generalno uključuju intertni razblaživač i jestivi nosač. Oni mogu biti zatvoreni u želatin kapsulama ili kompresovani u tablete. U svrhu oralnog terapeutskog davanja, aktivno jedinjenje može biti inkorporisano sa inertnim puniocima i upotrebljeno u obliku tableta, pilula, ili kapsula. Oralne kompozicije mogu takođe biti pripremljene korišćenjem fluidnog nosača za upotrebu kao sredstvo za pranje usta, pri čemu se jedinjenje u fluidnom nosaču aplicira oralno i promućka i ispljune ili proguta Farmaceutski kompatibilna vezivna sredstva i/ili adjuvant materijali mogu biti uključeni kao deo ove kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, trohe i slično mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivno sredstvo kao što je mikrokristalna celuloza, guma tragakant ili želatin; inertni punilac kao što je skrob ili laktoza, sredstvo za dezintegraciju kao što je alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; glidant kao što koloidni silikon dioksid; sredstva za zaslađivanje kao što je saharoza ili saharin; ili sredstva za davanje arome kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.

Za davanje putem inhalacije, jedinjenja se imaju isporučiti u obliku aerosol spreja iz kontejnera pod pritiskom ili dozatora koji sadrži odgovarajuće pogonsko gorivo, npr., gas kao što je ugljen dioksid, ili raspršivača.

Sistemsko davanje može biti takođe putem transmukoznih ili transdermalnih sredstava. Za transmukozno ili transdermalno davanje, koriste se u formulaciji odgovarajuća sredstva za penetraciju u barijeru koja se ima prožeti. Takva sredstva za penetraciju su generalno pozanta u nauci, i uključuju, na primer, za transmukozno davanje, deterdžente, žučne soli, derivate fusiditne kiseline. Transmukozno davanje može biti postignuto kro upotrebu nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalno davanje, aktivna jedinjenja su formulisana kao masti, melemi, gelovi ili kreme kako je to generalno poznato u nauci.

Jedinjenja mogu takođe biti pripremljena u obliku supozitorija (npr., sa konvencionalnim osnovama za supozitorije kao što je kakao puter i drugi gliceridi) ili retencioni klistiri za rektalnu isporuku.

RNK sredstva za stišavanje mogu takođe biti data transfekcijom ili infekcijom upotrebom postupaka poznati u nauci, uključujući ali ne ograničavajući na postupke opisane kod McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (hydrodynamic transfection); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (viral-mediated delivery); ili Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325(1996).

RNK sredstva za stišavanje mogu takođe biti data bilo kojim postupkom koji je podoban za davanje sredstava nukleinske kiseline, kao što je DNK vakcina. Ovi postupci uključuju genske pištolje, bio-ubrizgače, i zakrpe na koži kao i postupke bez igle kao što su tehnologija mikro-čestica DNK vakcine otkrivene u U.S. Pat. br.6,194,389, i transdermalnu bez igle vakcinaciju kod sisara sa vakcinom praškastog oblika otkrivenu u U.S. Pat. No.

6,168,587. Dodatno tome, moguća je intranazalna isporuka, kako je opisano, između ostaloga kod Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. Mogu takođe biti korišćeni lipozomi (npr., kako je opisano u U.S. Pat. No. 6,472,375) i mikroinkapsulacija. Sistemi isporuke biodegradibilnih ciljanih mikročestica mogu se takođe koristiti (npr., kako je opisano u U.S. Pat. No„ 6,471,996).

U jednoj realizaciji, aktivna jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme isporuke. Mogu se koristiti biodegradibilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, ili polimlečna kiselina. Postupci pripremanja takvih formulacija će biti očigledni stručnjacima iz ove oblasti nauke. Materijali se takođe mogu dobiti komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Takođe se mogu koristiti lipozomske suspenzije (uključujući lipozome cljane da inficiraju ćelije sa monoklonalnim antitelima ka viralnim antigenima) kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Ovo može biti pripremljeno prema postupcima poznatim stručnjacima iz ove oblasti nauke, na primer, kako je opisano u U.S. Pat. br.4,522,811.

Posebno je povoljno formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u jediničnom obliku doze radi lakog davanja i uniformnosti doze. Jedinični oblik doze kako se ovde koristi upućuje na fizički odvojene jedinice skrojene kao unitarne doze za subjekta koji se ima tretirati; svaka jedinica sadrži prethodno utvrđenu količinu aktivnog jedinjenja izračunate da proizvede željeno terapeutsko dejstvo povezano sa neophodnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija jediničnih oblika doze ovog pronalaska je diktirana sa i direktno zavisna od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapeutskog dejstva koje se ima postići, i ograničenja inherentna u nauci za sastavljanje jedinjenja kakvo je jedinjenje za tretman pojedinaca.

Toksičnost i terapeutska efikasnost takvih jedinjenja mogu biti utvrđeni standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za utvrđivanje LD50 (letalna (smrtonosna) doza do 50% od populacije) i ED50 (terapeutski efektivna doza u 50% populacije). Odnos doze između toksičnog i terapeutskog dejstva je terapeutski indeks i on može biti izražen kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja prikazuju velike indekse. lako jedinjenja koja prikazuju toksične sporedne efekte mogu biti korišćena, treba obratiti pažnju na dizajn sistema isporuke koji cilja takva jedinjenja na položaju zahvaćenog tkiva kako bi se minimizovala potencijalna šteta neinficiranim ćelijama i, time, smanjili sporedni efekti.

Dobijeni podaci iz ogleda ćelijske kulture i životinjskih studija mogu se upotrebiti u formulisanju opsega doze za korišćenje kod Ijudi. Doza takvih jedinjenja leži poželjno u opsegu cikrulacionih koncentracije koje uključuju ED50 sa malo ili bez toksičnosti. Doza može varirati u okviru ovog opsega u zavisnosti od oblika doze koji se upošljava i puta davanja koji se iskorišćava. Za svako jedinjenje upotrebljeno u postupku ovog pronalaska, terapeutski efektivna doza može biti procenjena inicijalno iz ogleda ćelijske kulture. Doza može biti formulisana u životinjskim modelima da se postigne cirkulaciona koncentracija u plazmi u opsegu koji uključuje EC50 (odnosno, koncentracije testiranog jedinjenja koja postiže polu-maksimalan odgovor) kako je utvrđeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu biti upotrebljene da se tačnije utvrde korisne doze kod ljudi. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.

Farmaceutske kompozicije mogu biti uključene u kontejner, pakovanje, dozator zajedno sa opcionim instrukcijama za davanje.

Kako je to ovde definisano, terapeutski efektivna količina RNK sredstva za stišavanje (odnosno, efektivna doza) zavisi od odabranog RNK sredstva za stišavanje. Na primer, ukoliko je odabran plazmid koji kodira shRNK, pojedinačne količine doze u opsegu od otprilike 1 μg do 1000 mg mogu biti date; u nekim realizacijama, 10, 30, 100 ili 1000 μg mogu biti date. U nekim realizacijama, 1-5g kompozicija može biti dato. Kompozicije mogu biti date nekom od jedanput do više puta na dan do jedanput do više puta nedeljno; uključujući jedanput svaki drugi dan. Vešt stručnjak će ceniti da određeni faktori mogu uticati na dozu i podešavanje vremena neophodno da efektivno tretira subjekta, uključujući ali ne ograničavajući na ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravstveno stanje i/ili starost subjekta, i druge prisutne bolesti. Štaviše, tretman subjekta sa terapeutski efektivnom količinom proteina, polipeptida ili antital može da uključi jedan tretman ili, poželjno, može da uključi seriju tretmana.

Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti umetnuti u konstrukte ekspresije, npr., viralne vektore, retroviralne vektore, ekspresione kasete ili plazmid viralne vektore, npr., korišćenjem postupaka poznatih u nauci, uključujući ali ne ograničavajuće one koji su opisani u Xia et al., (2002), prethodno pomenuto. Konstrukti ekspresije mogu biti isporučeni subjektu putem, na primer, inhalacije, oralno, intravenoznim ubrizgavanjem, lokalnim davanjem (videti U.S. Pat. br., 5,328,470) ili putem stereotaktičkog ubrizgavanja (videti npr., Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057). Farmaceutski preparat vektora isporuke može da uključi bektor u prihvatljivom razblaživaču, ili može da sadrži matricu za sporo oslobađanje u koji je nosač isporuke ugrađen. Alternativno, tamo gde kompletan vektor isporuke može biti proizveden netaknut od rekombinantnih ćelija,

1

npr., retroviralni vektori, farmaceutski preparat može da uključi jednu ili više ćelija koje proizvode sistem isporuke gena.

Takođe su ovde opisane male ukosnica RNK (shRNK), i ekspresioni konstrukti modifikovani manipulacijom da ekspresuju shRNK. Transkripcija shRNK se inicira na polimeraza III (pol III) promoteru, i smatra se ukinutim na poziciji 2 od 4-5-timin transkripcionog položaja ukidanja. Nakon ekspresije, za shRNK se misli da se savijaju u stem-petlja strukturu sa 3’ UU-ispupčenjima; potom, se krajevi ovih shRNK procesuiraju, konvertujući shRNK u siRNK-slične molekule od oko 21-og nukleotida. Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553; Lee et al., (2002), prethodno pomenuto; Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. (2002), prethodno pomenuto; Paul (2002), prethodno pomenuto; Sui (2002) prethodno pomenuto; Yu et al., (2002), prethodno pomenuto.

Konstrukti ekspresije mogu biti bilo koji konstrukt pogodan za upotrebu u odgovarajućem sistemu ekspresije i uključuju, ali nisu ograničeni na retroviralne vektore, linearne kasete ekspresije, plazmide i viralne ili viralno-izvedene vektore, kako je poznato u nauci. Takvi konstrukti ekspresije mogu uključiti jedan ili više promotera koji se mogu indukovati RNK Pol III promoter sisteme kao što su U6 snRNK promoteri ili Hl RNK polimeraza III promoteri, ili drugi promoteri poznati u nauci. Konstrukti mogu da uključe jedan ili oba lanca siRNK. Konstrukti ekspresije koji ekspresuju oba lanca mogu takođe da uključe petlja strukture koje povezuju oba lanca, ili svaki lanac može biti odvojeno transkribovan iz separatnog promotera u okviru istog konstrukta. Svaki lanac može takođe biti transkribovan iz separatnog konstrukta ekspresije, Tuschl (2002), prethodno pomenuto.

Put isporuke može biti zavistan od poremećaja pacijenta. U određenim primernim realizacijama, subjektu dijagnostikovanom sa PE, postporođajnom PE, eklampsijom i/ili HELLP može se dati anti-sFltl RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska putem IV ili SC davanja. Dodatno RNK sredstvu za stišavanje ovog pronalaska, pacijentu se može dati druga terapija, npr., palijativna terapija i/ili za bolest-specifična terapija. Sekundarna terapija može biti, na primer, simptomatična (npr., za ublažavanje simptoma), zaštitna (npr., za usporavanje ili zaustavljanje progresije bolesti), ili obnovljiva (npr., za preokretanje procesa bolesti). Za tretman PE, postporođajne PE, eklampsije i/ili HELLP, na primer, simptomatične terapije mogu dalje da uključe lekove Atenolol, Hidralazin, Labetalol, magnezijum sulfat, Metildopa, Nikardipin, Nifedipin, natrijum nitroprusid i slično.

1 1

Generalno, RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska može biti dato bilo kojim pogodnim postupkom. Kako se to ovde koristi, mesna isporuka može da upućuju na direktnu primenu RNK sredstva za stišavanje na bilo koju površinu tela, uključujući oko, mukoznu membranu, površine telesne šupljne, ili na bili koju internu površinu. Formulacije za mesno davanje mogu da uključe transdermalne fiastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, sprejove i tečnosti. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, sredstva za zgrušavanje i slično mogu biti neophodni ili poželjni. Mesno davanje može takođe biti upotrebljeno kao sredstvo za selektivnu isporuku RNK sredstva za stišavanje na epidermis ili dermis subjekta, ili na njihove specifične slojeve, ili na tkivo koje leži ispod.

Kompozicije za intratekalno davanje mogu da uključe sterilne vodene rastvore koji mogu takođe da sadrže pufere, razblaživače i drugi pogodne aditive. Intaventikularno ubrizgavanje može bit olakšano intraventikularnim kateterom, na primer, zakačen na rezervoar. Za intravenoznu upotrebu, ukupna koncentracija rastvorenih supstanci treba da bude kontrolisana da učini preparat izotoničnim.

RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska može biti dato subjektu pulmonalnom isporukom. Pulmonalna isporuka kompozicija može biti isporučena inhalacijom ili dispersijom tako da kompozicija u disperziji može da stigne do pluća gde može spremno biti apsorbovana kroz alveolni region direktno u cirkulaciju krvi. Pulmonalna isporuka može biti efektivna kako za sistemsku isporuku tako i za lokalizovanu isporuku da se tretiraju bolesti u plućima.

Pulmonalna isporuka može biti postignuta različitim pristupima, uključujući upotrebu formulacija u obliku za raspršivanje, aerosola, micelarnom ili na suvom prašku-bazirane. Isporuka može biti postignuta sa tečnim raspršivačima, na aerosolu-baziranim inhalatorima, i uređajima za disperziju suvog praška. Poželjnu su uređaji sa dozatorom. Jedna od koristi upotrebe raspršivača ili inhalatora je da je potencijalna kontaminacija minimizovana zbog toga što su uređaji samodovoljni. Uređaji disperzije suvog praška, na primer, isporučuju lekove koji mogu biti spremno formulisani kao suvi praškovi. Kompozicija RNK sredstva za stišavanje može biti stabilno uskladištena kao liofilisani li sprejom-osušeni praškovi sami ili u kobinaciji sa pogodnim nosačima praška. Isporuka kompozicije za inhalaciju može biti posredovana vremenskim elementom doziranja koji

1 2

može da uključi tajmer, brojač doze, uređaj za merenje vremena, ili indikator vremena koji kada je inkoroporisan u uređaj omogućuje praćenje doze, praćenje usklađenosti, i/ili pokretanje doza pacijentu tokom davanja aerosol medikamenta.

Tipovi farmaceutskih intertnih punilaca koji su korisni kao nosači uključuju stabilizatore kao što su humani serum albumin (HSA), sredstva za punjenje kao što su ugljeni hidrati, amino kiseline i polipeptidi; pH podešivači ili puferi; soli kao što je natrijum hlorid; i slično. Ovi nosači mogu biti u kristalnom ili amorfnom obliku ili mogu biti smeša ova dva.

Sredstva za punjenje koja su posebno vredna uključuju kompatibilne ugljene hidrate, polipeptide, amino kiseline ili njihove kombinacije. Pogodni ugljeni hidrati uključuju monosaharide kao što je galaktoza, D-manosa, sorboza i slično; disaharidi, kao što je laktoza, trehaloza, i slično; ciklodekstrini, kao što je 2-hidroksipropil-(3-ciklodekstrin; i polisaharidi, kao što su rafinoza, maltodekstrini, dekstrani, i slično; alditoli, kao što je manit, ksilitol, i slično. Poželjna grupa ugljenih hidrata uključuje laktozu, trehalozu, rafinozu, maltodekstrine i manit. Pogodni polipeptidi su aspartam. Amino kiseline uključuju alanin i glicin, sa glicinom koji je poželjan.

Pogodni pH podešivači ili puferi uključuju organske soli pripremljene iz organskih kiselina i baza, kao što je natrijum citrat, natrijum askorbat i slično; poželjan je natrijum citrat.

RNK sredstvo za stišavanje ovog pronalaska može biti dato oralnom ili nazalnom isporukom. Na primer, lekovi dati kroz ove membrane imaju brz početak dejstva, obezbeđuju terapeutske nivoe u plazmi, izbagavaju dejstvo prvog prolaza hepatičkog metabolizma, i izbegavanju izlaganje leka neprijateljskom gastrointestinalnom (Gl) okruženju. Dodatne prednosti uključuju lak pristup položajima membrane tako da lek može biti lako primenjen, lokalizovan i uklonjen. U jednoj realizaciji, RNK sredstvo za stišavanje dato oralnom ili nazalnom isporukom je modifikovano da bude sposobno da prelazi krvmozak barijeru.

U jednoj realizaciji, jedinice doze ili izmerene doze kompozicije koja uključuje RNK sredstvo za stišavanje se disperguju implantiranim uređajem. Ovaj uređaj može da uključi senzor koji prati parametre u subjektu. Na primer, uređaj može da uključuju pumpu, kao što osmotska pumpa i, opciono, povezana elektronika.

1

RNK sredstvo za stišavanje može biti spakovano u viralni prirodni kapsid ili u hemijski ili enzimski proizvedeni veštački kapsid ili strukturu koja je iz toga izvedena.

VIII. Pribori

Takođe su ovde opisani pribori koji uključuju pogodni kontejner koji sadrži farmaceutsku formulaciju RNK sredstva za stišavanje, npr., dvolančano RNK sredstvo za stišavanje, ili sRNK sredstvo, (npr., prekursor, npr., veće RNK sredstvo za stišavanje koje može biti procesuirano u sRNK sredstvo, ili DNK koja kodira RNK sredstvo za stišavanje, npr., dvolančano RNK sredstvo za stišavanje, ili sRNK, ili njihov prekursor). U određenim primerima pojedinačne komponente farmaceutske formulacije mogu biti date u jednom kontejneru. Alternativno, može biti poželjno da se obezbede komponente farmaceutske formulacije odvojeno u dva ili više kontejnera, npr., jedan kontejner za preparat RNK sredstva za stišavanje, i bar još jedan za jedinjenje nosač. Pribor može biti spakovan u brojnim različitim konfiguracijama kao što su jedan ili više kontejnera u jednoj kutiji. Različite komponente se mogu kombinovati, npr., u skladu sa instrukcijama datim u priboru. Komponente mogu biti kombinovane u skladu sa postupkom koji je ovde opisan, npr., da se pripremi i da farmaceutska kompozicija. Pribor takođe može da uključi uređaj za isporuku.

PRIMERI

Primer 1. Pozadina i značaj preeklampsije (PE)

Ogromni dokazi iz epidemioloških i eksperimentalnih studija sada ukazuju da je PE izazvana povišenim nivoima „rastvorljivog mamac“ proteina (rastvorljivi FLTIs (sFLT1s) iz FIt1 gena (VEGFR1) u majčinom krvotoku (Young, B.C., Levine, R.J. & Karumanchi, S.A., Pathogenesis of preeclampsia. Annual revievv of pathology 5, 173-192 (2010); Maynard, S.E., et al. Višak placentalno rastvorljive tirozin kinaze slične fms 1 (sFlt1) može doprineti endotelijalnoj disfunkciji, hipertenziji, i proteinuriji u preeklampsiji. The Journal of clinical investigation 111, 649-658 (2003); Levine, R.J. et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia. The New England journal of medicine 350, 672-683 (2004); Heydarian, M. Et al., Nove varijante spajanja sFlt1 su povećane kod preeklampsije. Placenta 30, 250-255 (2009)). FLT1 je receptor tirozin kinaze (RTK) predominantno ekspresovan u placenti. Generalni mehanizam RTK modulacije je proizvodnja krnjih,

1 4

izlučenih oblika receptora koji rade kao dominantni negativni regulatori sveukupne signalne putanje (Slika 1A). Sekvestracija liganda takvim rastvorljivim mamcima inhibira intracelularno signaliziranje od strane receptora pune-dužine, time desentizirajući sistem prema koncentraciji liganda (Vorlova, S. et al. Induction of antagonistic soluble decoy receptor tyrosine kinases by intronic polyA activation. Molecular cell 43, 927-939 (2011).). U slučaju FLT1, rastvorljivi mamci su ekspresovani sa krnjih mRNK generisano poliadenilacijom u okviru dva introna (i13 i i15) na gore od eksona koji kodira fl-FLT1 transmembranu (TM) i domene kinaze (Slika 1B).

Kod sisara, FLT1 se predominantno ekspresuje u placentu, sa humanim placentnim FLt1 mRNK nivoima koji su 10-100 puta viši od onih primećenih u drugim tkivima odraslih (Cerdeira, A.S. & Karumanchi, S.A. Angiogenic factors in preeclampsia and related disorders. Cold Spring Harbor persepectives in medicine 2 (2012)). Dok pune dužine izoforma predominanira u svim tkivima kod ne-trudnih odrasiih žena (ld.), placentna ekspresija je dominirana sa tri kranje izoforme, sFlt1-i13 kratki, sFlt1-i13 dugi i sFlt1-i15a, gde svi kodiraju sFLT1 proteine (Slika 1B). Ovaj isti obrazac visokog FLt1 u placenti i niske ekspresije u drugim ne-trudnim tkivima odraslih je primećen kod glodara. Ipak, pošto glodarima nedostaje intron 14 položaj poliadenilacije, oni samo ekspresuju jedan oblik rastvorljivog mamca: sFlt1-i13. U PE, oba i pune-dužine (fl-Flt1) i krnji FLt1 mRNK akumuliraju više nivoe u placenti nego kod normalnih trudnoća, sa krnjim izoformama koje su čak više izraženje (Slika 1B). Ove promene na mRNK nivou verovatno objašnjavaju značajan porast u sFLT1 proteina u majčinom krvotoku tokom PE.

1.1 Primenjivost siRNK za tretman PE

Terapeutici bazirani na siRNK su dizajnirani za tretman PE. I preklinički i klinički podaci podržavaju snižavanje sFLT1 kao validnu terapeutsku strategiju za produženje PE trudnoća (Thadhani, R. Et al. Pilot study of extracorporeal removal of soluble fms-like tirosine kinase 1 in preeclampsia. Circulation 124, 940-950 (2011)). Dalje, jedinstveni region specifičan za svaki sFLT1 protein je vrlo mali, sa samo nekoliko jedinstvenih amino kiselina prikačenih za svaki C-završetak. Ova mala veličina cilja ometa razvoj konvencionalnih lekova (npr., mali molekuli i antitela) koji ciljaju samo sFLT1s a ne fl-FLT1. Sa druge strane, prozor cilja na RNK nivou je znatno veći, sa i1З i i15 mRNK izoformama koje imaju 435 i 567 jedinstvenih baza, svaka posebno, od kojih nijedna nije prisutna u fl-Fltl mRNK. Pošto RNKi zahteva veličinu cilja od samo 19-22 nukleotida, za

1

ovo se utvrdilo da je više nego dovoljan nukleotidni prostor u kome se dizajniraju višestruke izoforma-selektivne siRNK. Iz kliničke perspektive, mogućnost da će jedna doza koja se isporuči potkožno biti dovoljna da spreči bekstvo sFLT1 ekspresije na nekoliko nedelje može da učini tretman jednostavnim i pristupačnim.

Novi hemijski-modifikovani oligonukleotidi poznati kao samo-isporučive hidrofobno modifikovane siRNK (hsiRNKs) (Slika 2A) mogu da obezbede najznačajniju prednost za troškovno isplativ terapeutik. Dok je njihova trenutna cena hemijske sinteze ($200 po gramu, sa otprilike $20 po dozi pri 1mg / kg nivoima doze) je ralativno visoka, očekuje se da cena padne dramatično (10-50 puta) sa podignutim kg-nivoom. Dalje, hsiRNK mogu biti u potpunosti sintetizovani korišćenjem hemije čvrste podrške u manje od 10 sati. Kao ostali oligonukleotidi, osušene hsiRNK su krajnje stabilne, mogu biti skladištene ekstenzivni vremenski period (odnosno, godine) na ambijentalnoj temperaturi, i mogu biti dovedene u rastvor neposredno pre ubrizgavanja. Dalje, hsiRNK polu-život in vivo je dovoljnog trajanja da je jedna intravenozna doza odgovarajuća sa dve do šest nedelja inhibiciju sFLt1 proizvodnju.

ONT-ovi koji neutralizuju sFlt1 ovde opisani su prva nova terapija preeklampsije bazirana na mehanističkom razumevanju bolesti, i mogu isplativo i lako biti dati širom sveta.

1.2 Profil ciljanja pilot proizvoda za RNKi-bazirani tretman PE

Tabel na Slici 14 daje sumarno trenutan pogled na prihvatljive i idealne profile ciljnog proizvoda u skladu sa poželjnim realizacijama. Niže u tekstu se diskutuju specijalna razmatranja RNKi-baziranog tretmana za PE.

1.3 Višestruke sFLT1 mRNK izoforme

Obavljanje poliadenilacije položaja sekvenciranja (PAS-Seq (Неуег, E.E., Ozadam, H., Ricci, E.P., Cenik, C. & Moore, M.J. An optimized kit-free method for making strandspecific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Res 43, e2 (2015)) na ukupnoj RNK iz višestrukih normalnih i PE placenti, utvrđeno je da PE placente prekomerno ekspresuju i13 i i15 sFLT1 varijanti sa, i15 odgovornim za 55% čitanja a i13 odgovoran za otprilike 45% čitanja (Slika 1C). Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, unutrašnja varijabilnost odnosu izoforme u različitim uzorcima ukazuje da ciljanje

1

obe izoforme može biti najbolja opcija da se pokrije najveći broj PE pacijenata. Tako, kandidat lek proizvod se definiše kao ekvimolarna smeša dve hsi-RNK: jedne koja cilja i kratki i dugi sFLTi-i13 i druga koja cilja sFlt1-i15a (Slika 3). FDA je već dopustila siRNK smešu da bude definisana kao jedan lek entitet kada je komponenta siRNKs identično formulisana ili hemijski modifikovana i njihovi PK / PD profili su vrlo slični (npr., multisiRNK formulacije koje ciljaju VEGF-A/KSP (Tabemero, J. et al. First-in-humans trial of an RNK interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement. Cancer discovery 3, 406-417 (2013)); HBV (Wooddell, C.l. et al. Hepatocytetargeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 973-985 (2013)), Arrowhead, etc.). lako korišćenje smeša dodaje kompleksnost CMC (hemija, proizvodnja i kontrole), preteže prednost da će smeša dopustiti tretman šire PE populacije nezavisno od odnosa prekomerne ekspresije izoformne varijante. U određenim realizacijama, smeša dva kandidata sе daje potkožno (5C) u slanom rastvoru kao inertnom puniocu.

U određenim realizacijama, željene nivo sFLT1 stišavanja je samo 30-40%, pošto viši stepen stišavanja može biti nepovoljan. Preliminarni podaci ukazuju da 10-20 mg / kg doze proizvodi > 50% stišavanja kod miševa, tako da manje stišavanje može jednostavno biti postignuto sa nižim doziranjem. Pošto je profil željenog proizvoda jednokratno ubrizgavanje, ipak, više doze mogu biti zahtevane da se produži trajanje dejstva. Tako, u određenim realizacijama, i13 ili i15 mogu biti korišteni samostalno kao klinički kandidati.

1.4 Razmatranja sveukupne bezbednosti i toksičnosti

Sa ONT-povezana toksičnost može biti zbog ciljno-specifičnih efekata (npr., isuviše stišavanja sFlt1 izoformi), ciljno-nezavisnih efekata (odnosno, nenamerno stišavanje neciljnih mRNK) ili sa klasom povezanih hemijski-specifičnih događaja. Sposobnost da se ciljaju i13 i i15 varijante odvojeno dramatično smanjuje šanse za bilo koju veliku ciljnopovezanu toksičnost. Dalje, i13 i i15 varijante su placenta- i trudnoća-specifične, sa niskom ili nedetektovanom ekspresijom u drugim tkivima odraslih. Prema tome, klinički limitirana toksičnost će najverovatnij biti ciljno-nezavisna. Ovi tipovi dejstava uključuju siRNK van-mete, RNK-baziranu indukciju urođenog imunog odgovora, i generalna toksičnost povezana sa izabranim načinom isporuke (npr., hidrofobne modifikacije u kombinaciji sa fosforotioatima). Najnaprednija bioinformatika se upošljava unap red da se

1

optimizuje dizajn oligonukleotida kako bi se minimizovao potencijal događaja van-mete (Uchida, S. et al., An integrated approach for the systematic identification i characterization of heart-enriched genes with unknown functions. BMC genomics 10, 100 (2009)). Dalje, sve riboze u seme sekvenci (odnosno, nukleotidi 2-8 vodič lanca) su 2’-F i 2’-O-metil modifikovane, čije su modifikacije između njih samih vrlo dobro utvrđene da minimizuju događaje van-mete (Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces ,,off-target“ transcript silencing. Rna 12, 1197-1205 (2006); Anderson, E., Boese, Q., Khvorova, A. & Karpilow, J. Identifying siRNA-induced off-targets by microarray analysis. Methods in molecular biology 442, 45-63 (2008); Anderson, E.M. et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. Rna 14, 853-861 (2008); Birmingham, A. Et al., 3’ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods 3, 199-204 (2006); Fedorov, У. et al. Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype. Rna 12, 1188-1196 (2006)), pošto je preklapanje između potpisa siRNK van-mete u tkivu kulture/životinjskom modelu i kod Ijudi generalno minimalno (Burchard, J. et al., MicroRNA-like off-target transcript regulation by siRNAs is species specific. Rna 15, 308- 315 (2009)), pa je vrednost takvih studija upitna. Za svaku sFLT1 izoformu, dve različite sekvence se odabiru za in vivo evaluaciju (jedna vodeća i druga rezervna) (Slika 3). Ukoliko vodeća ne uspe zbog van-mete-izazvane toksičnosti, druga sekvenca će se upotrebiti kao rezerva (Jackson, A.L. & Linsley, P.S. Recognizing and avoiding siRNA off- target effects for target identification and therapeutic application. Nature reviews. Drug discovery 9, 57-67 (2010)). Pošto ne postoji trenutno formalno uputstvo specifično za siRNK terapeutike, standardna preporuka za NCE (novi hemijski entitet) razvoj, uključujući demonstriranje bezbednosti u dva životinjska modela (Hughes m, I.J., Kurtz A, et al. (ed. C.N.-Sittampalam GS, Nelson H, et al„ editors) (Eli Lilly & Сompanу and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD); 2012)), će biti praćena.

Vodeća jedinjenja su u potpunosti hemijski-modifikovana (znači da su ne nemodifikovane riboze ostale) korišćenjem naizmenično 2’-0-metil/2'-F obrasca. Za kombinaciju 2’ OMe/2’-F je poznato da blokira aktiviranje urođenog imunog odgovora (Nair, J.K. et al., Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing.Journal of the American Chemical Society (2014)). Nedostatak aktivacije putanje interferona je potvrđeno sa in vitro ogledom aktivacije citokina cele krvi gledajući u IL-I(B, IL-1RA, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12(p70), IP-10, G-CSF, IFN- у, MCP-1, MIP-1a, MIP-I(3, i TNF-а (Bio-Plex Pro Magnetic Cytokine Assay; BioRad

1

Laboratories) i in vivo (nakon ubrizgavanja u miševe) gledajući u G-CSF, TNF, IL-6, IP-10, KC, i MCP-1 (Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel; Millipore) (Kumar, V. et al. Shielding of Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery: Impact on Physicochemical Properties, Cytokine induction, and Efficacy. Molecular therapy. Nucleic acids 3, e210 (2014)).

Bez namere da bude vezano naučnom teorijom, na osnovu podatak iz drugih hemija oligonukleotida (Wooddell, C.l. et al. Hepatocyte-targeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Molecular therapy ; the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 973-985 (2013); Coelho, T. et al. Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis. The New England journal of medicine 369, 819-829 (2013)), dozno ograničavajuća toksičnost će najverovatnije biti povezana sa funkcijom jetre. Preliminarne studije utvrđuju da se do 50% ubrizgane doze hsiRNKs akumulira u jetri, sa isporukom koja je specifična za endotelijalne, kupffer-ove ćelije i zvezdaste ćelije, ne hepatocite (Slika 4A). Sa drugim oligonukleotidima koji sadrže fosforotiot, blago preokrenuto povećanje enzima jetre i blage preokrenute reakcije sa strane ubrizgavanja su primećene kao sporedni efekti (Frazier, K.S. Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist’s Perspective. Toxicologic pathology 43, 78-89 (2015)), ali uobičajeno ovo povišenje enzima jetre je samo primećeno nakon dugotrajnog kontinuiranog doziranja sa visokim nivoima doze. Pošto je ovaj tretman neophodan kratkotrajno (samo jedno ili dva ubrizgavanja tokom period od jednog ili dva meseca) i pošto ne cilja hepatocite, toksičnost jetre možda ne mora da bude problem. Uprkos tome, ove brige će biti proučavane detaljno.

Razvoj bilo kog terapeutika koji cilja trudnu ženu donosi dodatnu zabrinutost za bezbednost. Glavna briga je potencijalni transfer hsiRNKs u fetus i moguća toksičnost koju ovo može izazvati. U preliminarnim studijama nuje primećen oligonukleotidni transfer fetusu koji se može detektovati korišćenjem fluorescentne mikroskopije (Slika 6A), ili korišćenjem krajnje osetljivog na PNA (peptid nukleinska kiselina)-baziranog kvantitativnog ogleda (Slika 4B). Nisu primećeni bilo kakvi efekti na rast fetusa, broj pobačaja, histologiju placente ili druge teratogenske efekte.

1

1.5 Uspostavljeni sistemi ogleda radi evaluacije vodećih jedinjenja.

Ogledi i modeli koji su do sada razvijeni, su kako sledi.

Procena fluoroscentnom mikroskopijom in situ distribucije tkiva

Varijante hsiRNk sa Су3 ili Cy5.5 (niža auto-fluorescencija) boje zakačene preko nedegradirajućeg linker za 5’ kraj sens (putnik) lanac se sintetišu. Ovo jedinjenje je biološki stabilno sa Су3 cepanjem koje se ne može detektovati tokom 24 sata. Fluorescentni sens lanac hibridizovan za svoj komplementarni vodič lanac (tako formirajući dvolančanu hsiRNK) se daje životinjama i ispituju se obrasci distribucije oligonukleotida u 4 pm sekcijama tkiva takođe zamrljanih sa DAPI ili/i selektivnim antitelima ćelijskog tipa. Paralelne sekcije mogu biti zamrljane sa standardnim histološkim markerima omogućavajući detaljno mapiranje histologije. Zato što su hsiRNK veš jako hidrofobno modifikovane, dodavanje boje ima malo dejstvo na sveukupnu hidrofobnost i prema tome minimalni uticaj na distribuciju oligonukleotida. Ogled dopušta brzu evaluaciju distribucije tkiva i ćelijskog-tipa i mokplementarno je sa PNA-bazoranim kvantitativnim ogledom za direktnu detekciju vodič lanca.

PNA hibridizacija za kvantitativnu detekciju vodič lanca u lizatima tkiva

Da se omogući kvantifikacija netaknutog vodič lanca u tkivima, razvijen je i implementiran novi ogled gde se vodič lanac hibridizuje sa potpuno komplementarno Cy3-označenim PNA (peptid nukleinska kiselina) oligonukleotidom, i korespondirajući dupleks se odvaja iz viša jednolančanog PNA putem HPLC (Slika 2). Pošto je PNA nenapunjen i poseduje ekstremno čvrsto vezivanje za vodič lanac, nadmašuje i hsiRNK sens lanac i bilo koje endogene ciljne sekvence. Fluorescentna detekcija Су3-PNA: hibrid vodič pruža direktno merenje zastupljenosti vodič lanca u lizatima tkiva. U vezi sa HPLC auto ubrizgačem, ovaj ogled omogućava kvantifikaciju vodič lanac u stotinama uzoraka preko noći. Ovaj ogled je jako osetljiv, sa ograničenjem detekcije manjim od 10 fmol/gram, i hibridi koji sadrže punedužine, delimično degradiran, 5’-fosforilatovan i 5’-defosforilatovan vodič lanac mogu svi biti kvantifikovani kao odvojeni pikovi i ramena HPLC traga. Pošto ovaj ogled može detektovati i označena i neoznačena jedinjenja, može biti direktno prenesen na buduće CRO-ove radi kliničke analize uzorka.

11

QuanitGene® (Affymetrix) ogled za direktnu detekciju Flt1 mRNK varijanti u ćelijama i tkivu

QuanitGene® je jako osetljiv ogleda zasnovan na 96-bazenčića u kome se mRNK direktno detektuje preko pojačavanja signala direkt no iz lizata tkiva i/ili ćelija. Povezivanjem ovog ogleda direktne detekcije sa automatskim TissueLyser-om sa 192 bazenčića, razvija se jaka-propusna verzija koja omogućava procesuiranje više tuceta uzoraka po životinji. Tako se generišu kvantitativni podaci ekspresije ciljanih i očuvanih gena u mnogim životinjama odmah. U pilot studijama, n=8 je dovoljno da detektuje 40% modulacije sFlt1 mRNK ekspresije izoforme sa 80% pouzdanosti. Ogledi bDNK su opisani kod Coles et al. Nucleic Acid Ther. (2015) Nov 23, PMID: 26595721.

ELISA (#MVR100, R&D Systems) za detekciiu sFLT1 proteina u uslovlienim mediiima i krvi

Ovaj ogled baziran na 96-bazenčića zahteva samo 10 μL biološkog fluida po uzorku. Ovaj ogled je optimizovan tokom mnogih godina kako za in vitro tako i za in vivo proučavanja. Klinički je kompatibilan i dopušta evaluaciju cirkulišućih sFLT1 nivoa proteina bez žrtvovanja životinje, i biće posebno koristan za proučavanja ne-humanih primata.

Model normalne mišje trudnoće

Varijante sFlt1-i13 se ekspresuju tokom mišje trudnoće sa i13 nivoima koji se eksponencijalno povećavaju od dana 14-19. Perfektna homologija između sFLT1-i13-2283 jedinjenja i i13 mišje varijante dopušta proučavanje kako efikasnosti tako i bezbednosti u ovom jednostavnom modelu glodara.

Modeli preeklampsije

Model redukovanog materičnog perfuzionog pritiska (RUPP) ishemije placente i model hipoksije preeklampsije se koristi kako je opisano dalje u tekstu.

Model divljeg-tipa trudnoće babuna

Varijanta sFlt1-i15a nije ekspresovana u glodarima tokom trudnoće, tako da će sveukupna kombinacija efikasnosti i bezbednosti biti procenjena u divljeg-tipa trudnoći babuna korišćenjem ELISA, neinvazivnog ogleda kao čitanje efikasnosti.

Preliminarni podaci

Razvijen je jednostavan i isplativ PE terapeutik korišćenjem RNKi da se ograniči višak ekspresije sFLT1 proteina u placenti. Za ovaj posao, postignuti su sledeći ciljevi: (1) odgovarajući siRNK ciljni položaji u sFlt1 mRNKs su identifikovani; (2) utvrđeno je da li je RNK stišavanje moguće u placenti upotrebom generalizovane (odnosno, intravenozne ili potkožne) isporuke; (3) razvijene su nove siRNK hemije koje omogućavaju poželjnu isporuku trofoblastima placente, ćelijskom tipu odgovornom za višak sFLT1 proizvodnje.

Upotrebom dostupnih podataka o tkivno-specifičnim RNK-Sekvencama iz Humanog atlas proteina (videti proteinatlas [dot] org) i PAS-Seq podatke iz višestrukim normalnih i PE humanih placenti (Slike 1B-C), utvrđeno je da, dok pune dužine (fl) izoforma predominira u svim tkivima ne-trudnih odraslih Ijudi, ekspresija u placenti je dominantna sa tri krnje izoforme, sFlt1-i13-kratka, sFlt1-i13-duga i sFlt1-i15a, generisana sa poliadenilacijom u okviru introna 13 i 15, svakog posebno. Ciljanje intronskih regiona sa hsiRNK omogućava selektivno stišavanje krnjih izoformi bez interferencije sa fl-Fltl mRNK zastupljenošću.

Novi tip siRNK hemije je razvijen tako da omogućavaj efikasnu isporuku endotelijalnim ćelijama i demonstrira selektivni pristup lavirint regionu placente (odnosno, trofoblastima, ćelijskom tipu odgovornom za sFLT1 ekspresiju). Bez bilo koje dodatne formulacije, do 12% od ubrizgane doze se akumulira u placenti sa transferom u fetus koji se ne može detektovati. Ova tehnologije je prva demonstracija selektivnog ciljanja lavirinta od strane bilo kog ONT-a, omogućavajući stišavanje sFLT 1 proteina na njegovom glavnom položaju ekspresije (Slika 6A).

Preko 50 siRNK varijanti je dizajnirano i provereno (videti Sliku 13). Za hiperfunkcionalne, potpuno hemijski modifikovane hsiRNK je identifikovano da selektivno ciljaju i13 i i15 izoforme bez mešanja sa fl-FLT1 ekspresijom (Slika 3). Korišćenjem ovih hsiRNK, demonstrirano je efikasno stišavanje i13 i i15 u primarno humanim trofoblastima bez aktivne formulacije (odnosno, hemijske neasistirane internalizacije / unosa bez potrebe za lipidom) (Slika 2B). Kombinacija sFLT1-i13-2283 i sFLT-i15a-2519 hsiRNK je odabrana kao vodeći kandidat za tretman PE (Slika 3).

Utvrđeno je da koncentracije jedinjenja u tkivu kod trudnih miševa mogu dostići 100 pg / gram sa jednim potkožnim (SC) ili intravenoznim (IV) ubrizgavanjem, proizvodeći više od 50-80% redukcije u sFlt1-i13 mRNK (Slike 6 i 4, svaka posebno). Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, sa ovim nivoom isporuke, stišavanje se očekuje da se održi nedeljama kod Ijudi, tako limitirajući broj ubrizgavanja koji će biti neophodan. Naravno, samo jedno SC ubrizgavanje može biti dovoljno da se stiša sFLT1 tokom nekoliko nedelja, rezultirajući u značajnom produženju PE trudnoće.

Primer 2. Hidrofobno modifikovane siRNK (hsiRNK): potpuno hemijski-modifikovani siRNK/antisens hibridi

Panel hemija i formulacija su uzete u obzir kao potencijalni pristupi isporuke placenti. Oni uključuju LNA antisens, LNPs, holkonjugati / DPC GalNacs i hsiRNK. hsiRNK daleko premašuju druge hemije u isporuci placenti (dalje razmatrano niže u tekstu) i odabrani su za dalje istraživanje. Procenjuje se efikasnost hsiRNK unosa u trofoblaste. Primećen je efikasan unos od strane svih ćelija nakon dodavanja sa Су3-označenog jedinjenja mediju (Slika 2B). hsiRNK su asimetrična jedinjenja, sa kratkim dupleks regionom (15 baznihparova) i jednolančanim u potpunosti fosforotioatovanim repom, gde su sve baze u potpunosti modifikovane korišćenjem naizmeničnog 2’-F/2’-O-metil obrasca (obezbeđuje stabilizaciju i izbegava PKR odgovor), a 3’ kraj putnik lanca je konjugovan za TEG-Holesterol (Slika ЗА). Holesterol omogućava brzu asocijaciju membrane, dok je jednolančani fosforotioatovani rep esencijalan za ćelijsku internalizacija putem mehanizma sličnog onom koji se koristi od strane konvencionalnih antisens oligonukleotida (D.M. Navaroli, J.C., L. Pandarinathan, K. Fogarty, C., Standley, L.L., K. Bellve, M. Prot, A. Khvorova and & Corvera, S. Self-delivering therapeutic siRNA internalization through a distinct class of early endosomes. PNAS, under review, second resubmission (2015)). Dodavanje sa Су3-označene hsiRNK bilo kom kultivisanom ćelijskom tipu prikazuje brzu i efikasnu internalizaciju kroz EE1 povezani deo putanje endocitoze. Prethodna verzija ove tehnologije (Вуrnе, M. Et al. Novel Hydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds (sd-rxRNA) Demonstrate Robust Efficacy in the Еуе. Journal of ocular pharmacology and therapeutics : the official journal of the Association for Ocular

11

Pharmacology and Therapeutics (2013)), gde je samo 50% baza 2’F/2’-O-metil modifikovano, je u Fazi II kliničkih proba za dermalnu fibrozu.

Obrazac hemijske modifikacije se ne ometa razvijeni primarni RISC uiazak. Širok opseg hemijskih varijacija je generisan i naizmenični 2’F/2’-O-metil obrazac je identifikovan da optimalno konfiguriše vodič lanac da usvoji geometriju koja blisko oponaša onu koju ima pojedinačni lanac u A-oblik RNK dupleksu. A-oblik RNK dupleksa je prepoznat od strane RISC kompleksa i podržava pravilno pozicioniranje ciljen mRNK u okviru položaja cepanja (Ameres, S.L., Martinez, J. & Schroeder, R. Molecular basis for target RNA recognition and cleavage by human RISC. Cell 130, 101-112 (2007); Schirle, N.T., Sheu-Gruttadauria, J. & MacRae, I.J. Gene regulation. Structural basis for microRNA targeting. Science 346, 608-613 (2014)). Započinjanjem naizmeničnog obrasca sa 5’-fosforilatovane 2’-O-metil riboze (5’ fosfat je neophodan za PIWI domen interakcije), 2’F modifikacije se postavljaju u označene parnim brojem pozicije 2-14. Za pozicije 2 i 14 je prethodno pokazano da su netolerantne na glomaznije modifikacije 2’-riboze (Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces ,,off-target“ transcript silencing. Rna 12, 1197-1205 (2006); Kenski, D.M. et al. siRNA-optimized Modifications for Enhanced In Vivo Activity. Molecular therapy. Nucleic acids 1, e5 (2012)).

Ova potpuno hemijski stabilizovana jedinjenja su bar efektivnije nego gola siRNK prilikom RISC ulaza i predstavljaju prvi obrazac potpune hemijske modifikacije bez negativnog uticaja na RISC funkciju. Ovo otkriće je transformativno za PE projekat, pošto je potpuna hemijska stabilizacija apsolutno esencijalna za akumulaciju u tkivu nakon sistemskog davanja. Slika 8 prikazuje da nije bilo pune-dužine jedinjenja koje se moglo detektovati u placentama miša 24 sati nakon davanja verzije gde je 40% riboza bilo i dalje 2’-OH (P0 hemija). Kao poređenje, obe potpuno 2’-F / 2’-O-metil modifikovane verzije (Pl i P2 hemije) akumuliraju do preko terapeutski efikasnih nivoa (Slika 8). Sledeća korist ne-RNK koja sadrži siRNK je lakoća proizvodnje - njihova DNK-slična hemija bez potrebe za zaštitom ortogonalne riboze skraćuje procedure deprotekcije i povećava efikasnosti sparivanja. Konačno, potpuno eliminisanje svih 2’-OH grupa pomaže kod izbegavanja urođenog imunog odgovora, koji se oslanja uglavnom na 2’-OH interakcije (Alexopoulou, L., Hoit, A.C., Medzhitov, R. & Flavell, R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413, 732-738 (2001); Choe, J., Kelker, M.S. & Wilson, I.A. Crystal structure of human toll-like receptor 3 (TLR3) ectodomain. Science 309, 581-585 (2005)).

Za FM-hsiRNK je utvrđeno da su potentnije u pasivnom unosu nego ne-potpuno modifikovane hsiRNK u primarnim trofoblastima (Slika 31). Za potpunu metaboličku stabilizaciju je utvrđeno da su esencijalne za sistemsku isporuku nakon intravenoznog davanja (Slika 32). Za FM-hsiRNK je takože utvrđeno da su esencijalne za sistemsku isporuku nakon potkožnog davanja (Slika 33).

Za PNA-bazirani ogled je razvijeno da kvantifikuje distribuciju vodič lanca in vivo (Slika 34). Upotrebom ovog ogleda, primećene su robusna isporuka i efikasnost za tkiva jetre i bubrega in vivo nakon davanja FM-hsiRNK (Slike 35A-35F).

In vivo stabilnost u tkivima jetre nakon IV ili SC davanja se ogleda na 120 sati nakon IV i nakon SC davanja (Slike 18A-B). Ogledaju se hsiRNK nivoi in vivo na dva sata, 24 sata i 120 sati nakon IV davanja (Slika 19).

Primer 3. hsiRNK omogućavaju selektivnu isporuku placentnom lavirintu trofoblasta bez fetusnog transfera koji se može detektovati

Da se proceni hsiRNK distribucija in vivo, normalnim trudnim miševima (dan 15) se ubrizga sa Су3-označena sFlt-i13-2283 hsiRNK i ispituje se distribucija putem dva nezavisna ogleda. Gross mikroskopija fluorescencije tkiva otkriva da je najviše oligonukleotida akumulirano u tri tkiva; endotelijum jetre, endotelijum bubrega i lavirint placente (Slika 4). Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, profil distribucije je najverovatnije definisan kombinacijom krvotok / brzina filtriranja i koncentracija holesterol receptora na ćelijskim površinama. Korišćenjem novog FDA-usklađenog ogleda PNA- hibridizacije koji je gore opisan, demonstrirano je da sveukupna koncentracija leka u placenti prevazilazi nivoe efikasnosti (otprilike 100 ng / gram) po redosledu veličina nakon jednog ubrizgavanja 10 mg / kg (Slika 8). Ovaj nivo isporuke u tkivo je ugrubo isti za IV i SC davanje, sa otprilike 50%, 10% i 12% jedinjenja distribuiranog u jetru, bubreg i placentu, svaku posebno, 24 sata nakon ubrizgavanja (Slika 4). Interesantno, samo polovina njih je iščišćena iz jetre (malo više u bubregu) nakon pet dana, ukazujući da jedno davanje može biti dovoljno da izazove dugotrajno stišavanje.

Slika 7A prikazuje distribuciju oligonukleotida u 4 μM sagitalnom rezu načinjenom kroz fetus i njegovu prikačenu placentu. Zapanjujuće je i krajnje zadovoljavajuće primetiti

11

efikasnu isporuku lavirintu placente sa esencijalno oligonukleotidnim transferom fetusu koji se ne može detektovati, uključujući tu i fetusnu jetru. Ovi podaci su nezavisno potvrđeni PNA ogledom koji je detektovao da nema hsiRNK u fetusnoj jetri (Slika 4B) (osetljivost ogleda je otprilike 10 fmol / gram). Slika 5 opisuje histološku analizu placente i potvrđuje specifičnu isporuku hsiRNK trofoblastima u lavirintu placente, glavnom tipu ćelije odgovornom za sFLT1 ekspresiju. Značajno je da skoro nije detektovan Су3 u drugim slojevima (npr., spojnom i decidua), dalje podržavajući specifičnost ovog novog obrasca hemijske modifikacije za isporuku trofoblastima lavirinta.

Dodatno upoređenju uticaja potpune 2’-F / 2’-O-metil modifikacije na PK (farmakokinetiku), fosforotioat (PS) sadržaj je blago izmenjen. Dok Р1 hemija ima PS povezivanja na 3’-krajevima oba lanca (za ukupno 8), P2 hemija inkorporiše još dva PS-a na 5’ kraju svakog lanca (za ukupno 12). Krajnja PS povezivanja obezbeđuju odbranu spram eksonukleaza, tako da esencijalne za dugotrajnu stabilnost u ekstremno agresivnom okruženju nukleaze. Sveukupno, ove dve hemije su uporedive u nivoima isporuke oligonukleotida nakon 24 sata (Slika 8), ali bi mogle da imaju različite profile degradacije nakon dugotrajnoj izlaganja tkiva, time utičući na trajanje dejstva stišavanja. One takođe imaju blago različite jetra:placenta odnose distribucije, što može unakoliko uticati na put davanja (Slika 8).

3.1. Odabir i identifikacija vodećih kandidata: i 13/i 15 miks i efikasnost u primarnim trofoblastima

i13 i i15 FLt1 mRNK izoforme sadrže 435 i 567 jedinstvenih nukleotida, svaka posebno, koji nisu prisutni u fl-Fltl mRNK. Nažalost, velika većina prostora ovih sekvenci je pod dominacijom homo-polimernih ponavljanja i regiona sa visokim GC sadržajem, od kojih nijedan nije moguće ciljati sa RNAi. Uprkos ovim preprekama, panel više od 50 shiRNK je dizajniran spram bilo koje izvodljive sekvence koja se može ciljati upotrebom standardnih parametara siRNK dizajna (Birmingham, A. et al. A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nature protocols 2, 2068-2078 (2007)) uključujući procenu GC sadržaja, specifičnosti niske učestalosti komplementa semena (Anderson, E.M. et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity. Rna 14, 853-861 (2008)), eliminaciju sekvenci koje sadrže miRNK semenje, i ispitivanje termodinamičkih sklonosti (Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S.D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-216 (2003); Schwarz, D.S. et al. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115,

11

199-208 (2003)). Slika 6B prikazuje pozicije ciljanja hsiRNK identifikovanih da su krajnje funkcionalne.

U kriterijumu dizajna, favorizovani su ciljani položaji sa perfektnom homologijom u drugim primatima kako bi se pojednostavila proučavanja formalne i toksikologije i efikasnosti kod ne-humanih primata i PE modela babuna kako je niže opisano. Miš ekspresuje samo ИЗ varijantu. Na sreću, za najefikasniju hsiRNK, sFLT1-i13-2283, se dogodilo da ima perfektnu komplementarnost sa mišjom i13 izoformom, omogućavajući direktnu in vivo procenu efikasnosti i toksičnosti ovog jednjenja kako kod modela normalne tako i kod PE mišje trudnoće. Slika 6C prikazuje tabelu sa položajima ciljanja i IC50 vrednostima najboljih jedinjenja koja su identifikovana da efikasno stišavaju i1З i i15 izoforme. IC50 vrednosti za efikasna jedinjenja je u opsegu između 40-100 nM kako za HeLa ćelije tako i za humane trofoblaste.

Slika ЗС prikazuje odgovor na dozu sFLT1-i13-2283 u primarnim humanim trofobiastima korišćenim za izračunavanje IC50 vrednosti. Važno je naglasiti da je stišavanje sa hsiRNK postignuto nakon dodavanja neformulisanog jedinjenja medijumima trofoblasta. Nivo obaranja mRNK je utvrđen na 72 sata korišćenjem gore opisanog OuantiGene ogleda. Kontrola za bilo koje potencijalne ne-specifične efekte, i13 ili i15 nivoi su uvek normalizovani prema genu domaćinu. Ne-ciljajuća-kontrola (NTC) identične hemije se koristi u svim eksperimentima da se kontrolišu hemijski efekti klase. Na nivoe pune dužine Flt1 mRNK se ne utiče (Slika 3D). Da se proceni stišavanje na nivou proteina, sFLT1 koncentracija u uslovljenom medijumu se meri korišćenjem ELISA (Quantikine® FLT1, MVR100, R&D Systems) (Slika ЗВ).

Da se krene dalje, dva hsiRNK para se odabiru: SFLT1413-2283 (5’ CTCTCGGATCT CCAAATTTA 3’) (SEQ ID NO:1) /sFLT-i15a-2519 (5' CATCATAGCTACCATTTATT 3’) (SEQ ID NO:2) i sFLT1-i13-2318 (5’ ATTGTACCACACAAAGTAAT 3’) (SEQ ID NO:3) / sFLT-i15a-2585 (5’ GAGCCAAGACAATCATAACA 3) (SEQ ID N0:4) (Slika ЗС). Prvi par je vodeći kandidat za lek i koristi se u svim studijama. Drugi par je rezervni. Dok je malo verovatno da će za sekvencu-specifična toksičnost biti problem, poželjna je rezervna kombinacija jedinjenja koja je dostupna u slučaju da se pojavi bilo kakva od sekvence-zavisna toksičnost. Kao zaključak, identifikovane su funkcionalne hidrofobni modifikovane siRNK koje selektivno

11

ciljaju sFlt1-i13 i sFlt-i15a izoforme. Efikasna internalizacija i stišavanje korespondirajućih meta u primarno humanim trofoblastima je utvrđena na nivou kako mRNK tako i proteina.

In vitro validacija sFLT1_2283/2519 (sFLT1-miks; 151005 ili 151111) pokazuje odgovore na dozu za ciljanje sFLT1 i1З i sFLT1 e15a (Slike 27A-D i 28A-D).

3.2. Varijanta sFLT1-i13 stišavanja in vivo nakon sistemskog davanja normalnim trudnim miševima

Slika 7B prikazuje pilot podatke koji demonstriraju efikasno stišavanje sFlt1 mRNK u bubregu, jetri i placenti nakon dva 20 mg / kg IV ubrizgavanja. 12 trudnih miševa se dozira sa 20 mg / kg sFLT-13-2283 jedinjenjem IV tokom dva dana, i utvrđuje se nivo sF!t1-i13 ekspresije (normalizovan prema genu domaćinu i fl-FLT 1) 5 dana kasnije u majčinoj jetri, bubregu i placenti, kao i u fetusnim jetrama. Postignuto je statistički značajno stišavanje (50-60%) u svim majčinim tkivima i placenti, dok su nivoi sFLT1 ekspresije u fetusnoj jetri nisu promenjeni. Nedostatak stišavanja u fetusnoj jetri je konzistentno sa nedostatkom oligonukleotida koji se mogu detektovati u ovom tkivu (Slika 4B). Koncentracija hsiRNK u placenti je oko 20-40 μg / gram. Ovo daleko premašuje neophodnu koncentraciju za produktivno stišavanje, koje se uobičajeno primećuje sa toliko niskim koncentracijama jedinjenja kao što je 100 ng / gram. Upotrebljena doza je tako jasno mnogo veća nego što je neophodno. Odgovor na dozi u dužina trajanja dejstva se proučavaju detaljno, i NOEAL i MTD nivoi doze se definišu za ovo jedinjenje. Dodatno tome, prate se majčina težina, težina piacente i broj i težina fetusa, i utvrđeno je da na svaku od njih nema uticaja 10 mg / kg ubrizgavanje a blago utiče (prosek od 6 spram 7 fetusa) 20 mg / kg nivoi ubrizgavanja bez ikakvih drugih primetljivih promena. Ohrabrujuće je da, čak i pri ovoj prekomerno visokoj dozi, nije primećen transfer hsiRNK u fetus. Na osnovu postignutih koncentracija leka u placenti, efektivna doza bi trebalo da bude bar jedan red veličine niža.

Obavlja se histološka evaluacija hsiRNK distribucije kod mišjih tkiva placente (Slika 15). Efikasno stišavanje sFLT1 putem hsiRNK se primećuje u tkivima jetre, bubrega i placente trudnih CD1 miševa (Slike 16A-16E, Slike 17A-D).

Modulacija rastvorljivog sFLT1 proteina je primećena u serumu trudnih miševa nakon jednog IV ubrizgavanja (10 mg/kg) sFLT1_2283/2519 na dane 14, 15, 17 i 19 (Slika 29).

11

Nije bilo nikakvih primetljivih negativnih efekata, niti je bilo bilo kakvih primetljivih devijacija u težini, ALT vrednostima, AST vrednostima ili broju štenića po trudnom mišu.

Kao zaključak, ovi podaci ukazuju da je razvijena nova siRNK hemija koja omogućuje efikasnu isporuku trofoblastima placente, primarnom položaju prekomerne ekspresije sFLT1 tokom PE, i dopušta moćno stišavanje i cirkulaciju sFLT1 nakon sistemskog davanja.

Primer 4. Hemija i optimalno doziranje, pilot PK/PD, i trajanje dejstva 2283 u modelu divljeg-tipa trudnom mišu

4.1 Optimizacija hemije

lako obrasci modifikacije prikazuju efikasnu isporuku citotrofoblastima u okviru lavirinta placente (Slike 4, 5, 7 i 8), na dva dodatna pitanja u vezi sa hemijom će se obratiti pažnja: 1) dalja optimizacija fosforotioat (PS) sadržaja i 2) dalja stabilizacija 5’-krajnjeg fosfata vodič lanca.

Fosforotioat (PS) sadržaj

Dok PS povezivanja dodeljuju veću in vivo siRNK stabilnost, ekstenzivna fosforotioacija može da izazove veću za klasu specifičnu toksičnost (iako samo nakon produženog davanja pri visokoj dozi) (Frazier, K.S. Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist’s Perspective. Toxicologic pathology 43, 78-89 (2015)). lako se od P2 hemije (Slika 8) očekuje da bude daleko više stabilna tokom dugih vremenskih perioda (odnosno, nedelje, kako je prikazano za GalNac konjugate (Nair, J.K. et al. Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing. Journal of the American Chemical Society (2014)) od Pl, pilot studije pokazuju da nema značajne razlike između sFLT1-2283-P2 i sFLT1-2283-P1 u pogledu akumulacije u placenti nakon 24 sata (Slika 8). Zbog toga se sumnja da optimalan PS sadržaj (dovoljan da održi stabilnost i e fikasnosti ali minimizuje toksičnost) leži negde između Р1 i P2. Planira se sinteza nekoliko dodatnih varijanti. Biće utvrđene koncentracije pune -dužine vrsta u placentama 24 sata i 5 dana nakon davanja, i relativne distribucije na položaju ubrizgavanja u jetri, bubregu i placenti, i maksimalno tolerisana doza (MTD) nakon jednog davanja će biti

11

ustanovljena. Na osnovu ovih podataka, PS obrazac će biti odabran i korišćen za sva potonja proučavanja.

Stabilizacija 5’-terminalnog fosfata

Drugo pitanje je kako najbolje optimizovati stabilizaciju 5’-krajnjeg fosfata vodič lanca, lanca koji je neophodan za RISC punjenje. Na PNA-bazirani ogled hibridizacije koji se koristi dopušta efikasno odvajanje fosforilovanih i defosforilovanih vodič lanaca, i otkriva da je više od 70% sFLT1-2283-P2 vodič lanca koji se mogu detektovati u jetri 5 dana nakon ubrizgavanja defosforilovano. Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, verovatno je da će uvođenjem metabolički stabilnog 5’-(E)-vinilfosfonata (5’-VP) (Lima, W.F. et al. Single-stranded siRNAs activate RNAi in animals. Cell 150, 883-894 (2012)) ili 5’(R)Me-P, obe hemije sa konformacijom i stereoelektronskim osobinama sličnim prirodnom fosfatu, umesto 5’fosfata moži potencijalno da smanje efektivnu dozu (i tako cenu koštanja leka i bilo koji za klasu ograničavajuću toksičnost) više od tri puta. sFLT1-2283 će biti sintetizovani sa 5’-VP i 5’(R)Me-P na vodič lancu (rutinski urađeno u Dr Khvorova laboratoriji) i proceniće se njihov uticaj na efikasnost oligonukleotida, isporuku u placenti i bezbednost. Profili toksičnosti 2’-O-metil, 2’-fiuoro, holesterola i PS se vrlo dobro razumeju. Obavljanje ove analize treba da finalizuje hemijsku konfiguraciju (РХ) prekliničkih kandidat oligonukleotida za tretman PE.

4.2. Sinteza oligonukleotida srednje veličine

Korišćenjem hemije odabrane u Aim 1.1, sFLT-i13-2283-РХ će biti sintetizovan, HPLC prečišćen i biti pod kontrolom kvaliteta (QC’ed) putem masene spektrometrije. Za sve in vivo studije, iz jedinjenja će biti odstranjene soli, u kompleksu sa natrijum kontrajonom, i proverena da obezbede da su nivoi endotoksina prihvatljivi. Oligonukleotidi se prethodno sintetizuju korišćenjem Expedite and Mermaid 8 sistema i prečista putem Agilent srednje veličine HPLC. Trenutni kapacitet sinteze je 40 μmol jedinjenja nedeljno, razultirajući u 0,2 grama nakon HPLC prečišćavanja. Ovaj opseg je dovoljan da se obave sve planirane studije na miševima (kao referenca, 10 mg/kg doza korespondira sa 0,4 mg/miš/ubrizgavanje za 40 grama trudne životinje). Anticipirajući potrebu povećanog kapaciteta sinteze za ne-humane studije na primatima, biće iskorišteni srednje veličine OligoPilot sintetizer i visoke rezolucije LC-MS, što će takođe smanjiti troškove sinteze oligonukleotida.

12

4.3. Pilot farmakokinetika (PK), farmakodinamika (PD), nije primećen nivo štetnih efekata (NOAEL), i maksimalno tolerisana doza (MTD) kod merenja za sFLT-i13-2283

Sve životinjske studije će biti obavljene prema IACUC protokolima. U dizajnu svih eksperimenata, biće praćeni preporučeni standardi od strane Landis-a (Landis, S.C. et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature 490, 187-191 (2012)), uključujući pravilnu nasumičnost grupe, vezivanje i proučavanje napajanja. Razvoj na PNA baziranog hromatografskog ogleda omogućava sposobnost da se kvantitativno proceni distribucija oligonukleotida i definiše pilot PK. Za studije pilot PK, n-3 je dovoljan. Radi efikasnosti i trajanja efekta studija gde je iščitano smanjenje u sFLT1 varijantam mRNK i nivoima proteina, n-8 je minimalno neophodan broj da se omogući studiji da detektuje 40% modulaciju sa 80% sigurnosti.

Za pilot PK analizu, istražiće se dinamika koncentracije krvi. 20 μL uzoraka krvi će biti sakupljeno na 5, 30, i 60 minuta, 4, 12, 24, 48, 72 i 96 sati nakon ubrizgavanja. Kratke vremenske tačke će biti dobijene kateterizacijom jugularne vene, eliminišući IACUC zabrinutost u vezi ponovljenih vađenja krvi tkom kratkih vremenskih perioda i minimiziranja broja životinja koje se zahtevaju da bi se dobili čvrsti podaci. Na osnovu prethodnih PK studija sa povezanim jedinjenjima, očekuje se da će biti primećena kinetika bifaznog čišćenja, sa ispunjenom brzom fazo za 1 i 4-6 sati za IV i SC davanje, svko posebno. Na osnovu pilot studija koje pokazuju da je > 50% od originalno isporučene doze ostalo u tkivima čak 5 dana nakon ubrizgavanja, može uzeti čitav mesec da se potpuno obavi čišćenje od leka, ali nedelju dana dugačka studija bi trebalo da bude dovoljna da generiše pilot podatke koji dopuštaju procenu profila čišćenja.

Dodatno tome, NOAEL i MTD će biti ustanovljeni za vodeće jedinjenje. Do sada, davanje 10 mg / kg i 20 mg / kg sFLT1-2283-P2 trudnim miševima nije imalo primetljiv negativan uticaj osim blagog smanjenja u broju fetusa na 40 mg / kg. Kako otprilike 50% ubrizgane doze (Slika 4B) odlazi u endotelijum jetre i kupfer ćelije, razumno je očekivati modulaciju enzima jetre sa ALT i AST iskorištenim kao standardnim iščitavanjem. ALT/AST nivoi mogu biti izmereni (ogledi se nalaze kao deo suštini brige o životinjama) pri različitim sFLT1-2283-PX koncentracijama i u različita vremene nakon ubrizgavanja. Ovaj ogled može lako biti kombinovan sa studijama efikasnosti odgovora na dozu pošto je neinvazivan i zahteva samo 10 μL krvi.

MTD će biti utvrđen i u trudnim i u ne-trudnim miševima, pilot studije ukazuju da je sFLT1-2283-P2 MTD opseg očekivan da bude viši od 100 mg/kg. Kod trudnih miševa, ipak, NOAEL nivo doze može biti niži. Očekuje se da će NOAEL doza biti mnogo viša od očekivane efikasne doze od 1 mg / kg zasnovano na nivoima leka koji se može postići u placenti. 1 mg / kg je u liniji sa koncentracijom koja se koristi za ALN-TTR2 jedinjenje koje je u fazi II kliničkih proba.

Sa oligonukleotidom-povezana toksičnost može bit zbog ciljno-specifičnih efekata (sFlt1 povezano) ili ciljno-nezavisnih efekata (povezano sa siRNK sekvencom ili formulacijom). Ciljno specifični efekti će biti evaluirani kod miševa kojima je dato vodeće jedinjenje tokom 3-ćeg tromesečja procenom fetusnog broja, težine i rasta kao i učestalosti pobačaja. Histologija placente će proceniti gustinu trofoblasta i vaskularnu gustinu. Protoci u materičnoj arteriji i pupčanoj arteriji će biti procenjeni korišćenjem neinvazivnih Doppler studija (Zhang, J.H. & Сrоу, B.A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med 59, 527-533 (2009)). Dodatno tome, miševima tretiranim sa NOAEL i MTD dozom će biti dopušteno da rode i štenci će biti praćeni dve generacije da se proceni potencijalni uticaj na sveukupno zdravstveno stanje i reproduktivnu funkciju.

Za PD studije, studija odgovora na dozu će biti obavljena sa dozama u opsegu od 0,5 do 10 mg/kg. Nivoi sFLT1 proteina će biti mereni sa ELISA (kinetika krvi) a SFIt1 i fl-Fltl mRNK nivoi će biti mereni sa QuantiGene u placenti, jetri i bubregu. Preliminarne studije pokazuju da je jedno davanja sFLT1-i13-2283-P2 dovoljno da izazove stišavanje sFLT1 u ciljanim tkivima (Slika 7B) bez efekta na jetre embriona. In vivo validacija sFLT1_2283/2519 je prikazana na Slici 7C. Dejstvo trajanja će biti analizirano kako za najvišu NOAEL tako i za najnižu efikasnu dozu. Na žalost, miševi možda ne mogu biti optimalni model za ova proučavanja, pošto sFLT1 jedva da se ekspresuje u ne-trudnim mievima i trudni miševi ne dopuštaju PD evaluacije nakon vremena dužeg od 2 nedelje. Da se proceni potencijal za studije dužeg trajanja, biće iskorišćene hsiRNK koje dele tačno istu hemiju koji ima ciljna TEK tirozin kinaza (Tie2) mRNK, endotelijalno specifična meta. Tie2 stišavanje će se ispitati u endotelijum jetre 1, 2, 3, 4 nedelje nakon jednog ubrizgavanja. Ukoliko stišavanje ne opstane više od 3 nedelje, višestruko doziranje će se ispitati za rešavanje problema. Dok PK/PD ponašanje različitih sekvenci nije identično, slično je (H. Younis et al. In A Comprehensive Guide to Toxicology in Preclinical Drug Development. (ed. A.S. Faqi) 647-664 (Academic Press, 2013)) i podaci o trajanju dejstva sa Tie2 jedinjenjima mogu biti informativni da se dizajniraju NHP studije efikasnosti.

Ova studija će rezuitirati u finalizaciji hemijske konfiguracije i utvrđivanju odgovora na dozu, pilot PK, NOAEL i MTD za sFLT1-2283 kod ne-trudnih i normalno trudnih miševa. Ove informacije će biti kritične za dalje planiranje IND-omogućavajućih studija toksikologije.

4.4 Pilot bezbednost i toksičnost i 13/i15 kombinacije

Trenutni pre-klinički kandidat je definisan kao smeša hsiRNK koje ciljaju sve i13 i i15 varijante. Oba jedinjenja mogu biti re-sintetizovana na sonovu najoptimalnije hemijske kompozicije koja je gore identifikovana. Ukoliko su jedinjenja re-sintetizovana, biće esencijalno demonstrirati da i13/i 15 smeša ima sličan profil bezbednosti kao ciljanje samo i13 varijante. Eksperimenti da se utvrdi NOAEL i MTD za smešu jedinjenja će biti ponovljeni korišćenjem AST/ALT iščitavanja kao mera toksičnosti. Dodatno tome, sličnost u PK ponašanju će biti potvrđena za i15 i i13 jedinjenja korišćenjem i13 i i15 ciljajućih PNA-baziranih proba. Nemoguće je proceniti PD i15 u modelu miša pošto se i15 varijante tamo ne ekspresuju. Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, veruje se da će posedovanje slične in vitro (odnosno, trofoblast) efikasnosti u kombinaciji sa sličnim PK profilima biti dovoljno da se predvidi slična efikasnost. Ovo će biti potvrđeno u modelu trudnoće babuna gde se obe i i1З i i15 varijante ekspresuju.

4.5 Kvantitativna procena hsiRNK transfera (ukoliko ga ima) u fetus

Glavna bezbednosna zabrinutost u razvoju bilo kog terapeutika za tretman trudnih žena je bezbednost fetusa i potencijalni negativni uticaj na razvoj embriona. U preliminarnim podacima koji šu ovde prezentovani, primećeno je da nema transfera sFLT1-2283-P2 u fetus koji se može detektovati (Slike 6A i 4B) bilo fluorescentnom mikroskopijom ili PNA hibridizacijom. Nije primećeno ni bilo kakvih promena u fetusnoj sFLT1 ekspresiji u grupi životinja koje su tretirane lekom. Pri dozama do 20 mg / kg, nije primećen uticaj na težinu i broj fetusa, i nije primećen uticaj na sveukupnu histologiju placente. Blago smanjenje broja fetusa (od prosečno 7 na 6) je primećeno pri maksimalnoj dozi od 40 mg / kg. Uprkos ovim ohrabrujućim podacima koji čine projekat tako obećavajućim, važno je kvantitativno analizirati bilo koji potencijalni transfer leka i detaljan uticaj na placentu i fetus. Da bi se to

12

učinilo, koristiće se ogled PNA hibridizacije da se detektuju oligonukleotidi u različitim tkivima embriona. Kao što je gore pomenuto, osetljivost ogleda je otprilike 10 fmola / gram, niža od biološki efikasnih koncentracija. Nivo potencijalnog transfera oligonukleotida će biti meren nakon davanja različitih koncentracija oligonukleotida do MTD. Ovi eksperimenti će takođe biti ponovljeni korišćenjem PE modela, pošto integritet i zdravlje placente može uticati na sposobnost barijere.

Naročita zabrinutost za siRNK terapeutike je potencijal da čak mala količina transferisanog oligonukleotida ometa miRNK homeostazu. miRNK profili se menjaju brzo tokom razvoua embriona i esencijalni su za propisno izvršenje programa razvoja. Prethodno, izmenjeni miRNK profili su višeni samo nakon mesecima duge virusno-bazirane prekomerne ekspresije posebne siRNK (Grimm, D. et al. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441, 537-541 (2006)). Ćelijskispecifični miRNK potpisi su krajnje dinamični tokom embrionskog razvoja, pa tako potencijalno osetljiviji od tkiva odraslih prema eskternim RISC punjenjem supstrata. Da se ispita ova mogućnost, RNK će biti prečišćenja iz celih fetusa, mozga fetusa i jetre fetusa iz netretiranih MTD-doziranih trudnih miševa i obaviće se mala RNK-Sekv. Ovo će omogućiti: (1) evaluaciju broja čitanja koja korespondiraju sa hsiRNK u ovim tkivima i (2) evaluacija uticaja (ukoliko ga uopšte ima) na endogene miRNK profile.

Primer 5. Dodatni PE modeli

5.1 Demonstracija efikasnosti sFLT1 oligonukleotida u dva modela preeklampsije

Dok smanjenje u sFLT1 nivoima podržava mehanističku efikasnost vodeće jedinjenja, bilo bi poželjno demonstrirati da sFLT1 smanjenje ima uticaj na ,,preekslampsiji-sličan“ fenotip. Dok postoje opisi nekoliko životinjskih modela preeklampsije u literaturi, nema nijednog modela koji rekapitulira sve aspekte kliničkog sindroma, i nijedan od njih precizno ne modelira progresiju bolesti iz preeklampsije u ozbiljnje komplikacije kakav je HELLP sindrom ili ekslampsija (Aubuchon, M. Schulz, L.C. & Schust, D.J. Preeclamsia: animal models for human cure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stats of America 108, 1197-1198 (2011)). Tako, nema još perfektnog modela za humanu bolest. Pošto miševi i pacovi imaju relativno plitku placentaciju, modeli glodara nisu optimalni za proučavanje uzvodnih uzroka siromašne trofoblast invazije. Sa druge strane, ova karakteristika ih čini idealnim za procenu nizvodne patofiziologije i etiologije majčinskog odgovora na plitku placentaciju, utvrđeni upravljač humane preeklampsije (Powe, C.E., Levine, R.J. & Karumanchi, S.A. Preeclampsia, a disease of maternal endothelium: the role of anti-angiogenic factors and implications for later cardiovascular disease. Circulation 123, 2856-2869 (2011)). Pošto je sveukupni cilj ovog pronalaska da obori sFlt1 u humanim trudnoćama, odabrani su mišji modeli (materična ishemija i ishemija cele životinje) o kojima je izvešteno da imaju povećanu cirkulaciju sFlt1. Za obe, relativnu hipoksiju i ishemiju je izvešteno da izazivaju sFlt1 proizvodnju u humanim placentnim kulturama in vitro i u različitim životinjskim modelima (Nagamatsu, T. et al. Cytotrophoblasts up-regulate soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression under reduced охуgen: an implication for the placental vascular development and the pathophysiology of preeclampsia. Endocrinology 145, 4838-4845 (2004); Makris, A. et al. Uteroplacental ishemia results in proteinuric hypertension and elevated sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007); Gilbert, J.S., Babcock, S.A. & Granger, J.P. Hipertenzija uzrokovana smanjenom perfuzijom materice kod trudnih pacova povezana je sa povećanom ekspresijom rastvorljive tirozin kinaze-1 slične fms. Hypertension 50, 1142-1147 (2007)).

5.2 Telemetrijska hirurgija

Ženski CD1 trudni miševi težine 20-25 grama će biti kupljeni od Charles River Laboratories. Pojava minijaturizovanih, hirurški implanabilnih radiotelemetrijskih proba pogodnih za hronično hemodinamičko praćenje male laboratorije životinja je značajno unapredila fiziološko istraživanje i važna je u istraživanju preeklampsije pošto tehnika dopušta da se meri krvni pritisak tokom gestacije (Burke, S.D. et al. Remodeliranje spiralne arterije nije neophodno za normalnu regulaciju krvnog pritiska kod trudnih miševa. Hypertension 55, 729-737 (2010)). Ukratko, ženski CD-1 miševi težine preko 20g će biti anestezirani korišćenjem inhaliranog izoflurana. 1 cm rez po sredini je učinjen na trbušnoj površini od grudnog zaseka rostralno. Leva zajednička karotidna arterija se izoluje i začepi korišćenjem šavova. Arterija se ureže sa 26 igli merača i telemetrijski kateter (DSI, St. Paul, Ml) se uvodi u arteriju; vrh se postavi samo unutar luka aorte. Kateter se zašije na mesto, permanentno začepljujući arteriju. Telo transmitera se postavi u potkožni džep na desnom boku miša. Rana se zašije i miš se prati dok se ne oporavi. Životinjama će se pružiti analgezija tokom 48 sati nakon-operacije i pratiće se 1 nedelju. Dve nedelje nako oporavka, životinje se pare sa muškim miševima istog porekla da se proučavaju fenotipovi trudnoće kako je niže opisano.

12

5.3 Model smanjenog materičnog perfuzionog pritiska (RUPP) placentne ishemije

Koristiće se RUPP model placentne ishemije kod trudnih CD1 miševa koji je pionirski poduhvat Barbara Alexander Laboratory at University of Mississippi (Intapad, S. et al. Smanjeni perfuzioni pritisak materice izaziva hipertenziju kod trudnog miša. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology 307, R1353-1357 (2014)). Ovaj životinjski model preeklampsije uključuje postavljanje srebrnih stezaljki na abdominalnu aortu i iznad materičnih arterija da se umanji materični perfuzioni pritisak na gestacioni dan 14, kreirajući placentnu insuficijenciju. Životinjama će se dati bilo sFLT1 oligonukleotid lek (korišćenjem nivoa doze i puta davanja kako je definisano prethodno u tekstu) ili kontrola (PBS i/ili NTC) na gestacioni dan 16 putem ubrizavanja u repnu venu. Krvni pritisak će biti meren kontinuirano korišćenjem telemetrije od gestacinog dana 15-19 i životinje će biti žrtvovane na gestacioni dan 19. Dodatno tome, uzorci urina će biti sakupljeni postavljanjem miševa u metabolične kaveze 12 sati pre žrtvovanja.

5.4 Model hipoksije kod preeklampsije

Takođe će biti korišćen model hipoksije koji je koji je pionirski poduhvat Surendra Sharma Laboratory at Brovvn University. Id. U ovom modelu, trudni CD1 miševi kojima je implantiran telemetar će biti izloženi hipoksiji (9,5% kiseonik, izloženi 10 dana) u hipobaričnoj komori od gestacionig dana 9-19. Životinjama će biit dat ili terapeutski sFLT1 oligonukleotid rastvoren u PBS (2 doze) ili nosač (PBS) na gestacioni dan 16 putem ubrizgavanja u repnu venu. Krvni pritisci će biti mereni kontinuirano korišćenjem telemetrije od gestacionog dana 15-19 i životinje će biti žrtvovane na gestacioni dan 19. Uzorci urina će biti sakupljeni kako je gore opisano.

Fenotipovi preeklampsije

Merenja krvnog pritiska će biti obavljena u svesnim miševima korišćenjem telemetrijske probe implantirane u karotidnu arteriju (DSL, St. Paul, MN). (Videti pilot studije na Slici 9A). Renalno tkivo će biti ispitano histološki radi kvantifikacije glomerularne endotelioze kako je opisano (Li, Z. et al. Rekombinantni vaskularni endotelni faktor rasta 121 ublažava hipertenziju i poboljšava oštećenje bubrega kod pacova modela preeklampsije. Hypertension 50, 686-692 (2007)). Tkivo će biti fiksirano u 10% puferovanom formalinu, ugrađeno u parafin, rezrezano, i zamrljano sa H&E, PAS, i Masson-ovom trihrom mrljom.

12

Serum i urinarni kreatin (mereno kalorimetrijom pikrinske kiseline) i urinarni protein (mereno sa ELISA) tokom trudnoće (gestacioni dan 18-19) će biti mereni da se proceni proteinurija. Dodatno tome, hematokrit i broj trombocita će biti mereni na gestacioni dan 18-19. Periferni brisevi će biti obavljeni uzimanjem cele krvi dobijene iz ovih pacova da se pronađe dokaz hemolize. Serum AST i ALT će biti mereni kinetičkim UV postupkom (lnfinity Liquid, Thermo Electron Corp). Plazma nivoi sFlt1 će biti mereni komercijalno dostupnom ELISA (R & D Systems, MN).

Studije placente/fetusa

Doppler ultrazvuk će biti korišćen da se procene materični i pupčani protoci na gestacioni dan 18-19 kako je drugde opisano (Khankin, E.V., Hacker, M.R., Zelop, C.M., Karumanchi, S.A. & Rana, S. Intravitalna visokofrekventna ultrasonografija za procenu kardiovaskularnog i uteroplacentarnog krvotoka u trudnoći miševa. Рregnancy hypertension 2, 84-92 (2012)). Miševi se anesteziraju korišćenjem lzofluran/2 smeše date preciznim isparivačem. Miševi će biti postavljeni u ležeći položaj u zagrejanoj fazi Vevo 2100 ultrasonografskog aparata (Visual Sonics Inc. Toronto, Ontario, CA) i rektalna temperaturna proba će biti umetnuta da se prati temperatura jezgra tokom procedure. Abdominalni organi će biti skenirani i biće identifiovana materična arterija. Kada se pozicija verifikuje, talasni Doppler će biti korišćen da se vizuelizuje obrazac protoka krvi i meri brzina protoka u materičnoj arteriji. Ultrazvučna evaluacija će biti urađena na bar 4 embriona pro životinji: dva u svaki horn. Merenja koja će biti preduzeta uključuju fetusni puls (FHR), Doppler pupčane arterije (UA Doppler), Doppler materične arterije (Ut. A Doppler) i abdominalna cirkumferencija (AC) (Slika 9B). Veličina okota i resorpcije će biti ocenjivani kada se životinje žrtvuju na gestacioni dan 19. Težine pri rođenju će biti zabeležene radi dokaza restrikcije rasta fetusa. Položaji implantacije sa placentama će biti fiksirani u 4% paraformaldehidu i biše ispitane histopatološki radi dokaza abnormalnog remodeliranja spiralne arterije, što je karakteristika abnormalne placentacije (Cui, Y. et al. Role of corin in trophoblast invasion and uterina spiral artery remodelling in рregnancу. Nature 484, 246-250 (2012)).

Veličina uzorka i statistička upoređenja

Za svaku od predloženih studija, biće korišćeno otprilike 10 životinja po g rupi: kontrola, niska doza sFlt1 oligonukleotida i visoka doza oligonukleotida. Obaviće se standardne

12

statističke analize svih podataka o životinjama. Pojedinačne vrednosti će biti sravnjene kao srednje vrednosti /- S.E.M. Upoređenja među višestrukim grupama će biti učinjena inicijalnom analizom variranja, i biće upotrebljen Studentski t-test da se procene razlike između pojedinačnih grupa. Hemodinamički podaci će biti analizirani upotrebom 24 časovnih srednjih vrednosti iz podataka pojedinačnih životinja, što će biti upoređeno korišćenjem dvosmernih ponovljenih mera ANOVA. Gde je ukazano na značajne razlike (p<0,05), biće upotrebljen Bonferroni-jev post-hoc test da se procene razlike između pojedinačnih grupa.

5.5 Interpretacija, zamke i alternative

Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, očekuje se da će sFLT1 oligonukleotidna terapija voditi do otpriiike 50% smanjenja u cirkulaciji sFLT1 nivoa, što će biti povezano sa poboljšanjem fenotipa preeklampsije kao što je rešavanje hipertenzije i poboljšanje renalne patologije.

Ne očekuje se da će biti bilo kakvih štetnih posledica u rastu fetusa ili placentaciji. Genetičke studije obaranja od strane Rossant-ove grupe sugeriše da placentni sFlt1 nije kritičan za održavanje trudnoće (Hirashima, M., Lu, Y., Byers, L. & Rossant, J. Ekspresija trofoblasta tirozin kinaze 1 slične fms nije potrebna za uspostavljanje interfejsa majke i fetusa u placenti miša. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 15637-15642 (2003)). Ipak, pošto će sFlt1 biti oboren sistemski, moguće je da tu može biti štetnih posledica, kao što je smanjene u rastu fetusa povezano sa značajnim padom krvnih pritisaka. Ukoliko je veći od 20 mm pad u krvnim pritiscima nije primećene, ove studije efikasnosti će biti ponovljene sa nišom dozom sFLT1 oligonukleotida. Štaviše, sa neinvazivnim Doppler ultrazvukom, mogu biti zabeležene čak suptilne promene u protoku krvi ka fetusu. Ukoliko nije primećena robustna ekspresija endogenih sFlt1 nivoa u odgovoru na hipoksiju tkom 3-ćeg tromesečja, studije mogu biti ponovljene u miševima sa nedostatkom IL-10 koje su prikazane od strane Sharma-ine grupe da se reguliše na gore sFlt1 tokom trećeg tromesečja vrlo dramatično (Intapad, S. et al. Smanjen perfuzioni pritisak materice izaziva hipertenziju kod trudnog miša. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology 307, R1353-1357 (2014)). Ispunjenje ovog cilja će proceniti efikasnost i bezbednost RNKi-bazirane sFLT1 redukcije u dva modela PE.

12

Primer 6. Evaluacija PK i efikasnost i bezbednost kod trudnih babuna tokom kasne gestacije u pilot studiji

6.1 Obrazloženje

Pošto miševi samo ekspresuju jednu od izoformi sFlt1, važno je proceniti in vivo efikasnost sFlt1 oligonukleotid(a) u ne-humanim primatima koji ekspresuju sve sFlt1 izoforme (Makris, A. et al. Uteroplacentarna ishemija rezultira proteinurskom hipertenzijom i povišenim sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007); Thomas, C.P. et al. Nedavno evoluirana nova varijanta tirozin kinaze-1 obogaćena trofoblastom je pojačano regulisana kod hipoksije i preeklampsije. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 94, 2524-2530 (2009)). Babuni su izabrani ispred ostalih ne-humanih primata zato što pristupaju dobro karakterisanom modelu preeklampsije koja je bila pionirski rad D. Annemarie Hennessy (Makris, A. et al., Uteroplacentarna ishemija rezultira proteinurskom hipertenzijom i povišenim sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007)).

6.2 Model trudnoće babuna

Zbog etičkih ograničenja da se minimizuje broj životinja kao subjekata, biće korišćeno šest trudnih babuna (2 grupe х 3 životinje). Na 20 nedelja od gestacije, (ekvivalentno sa gestacionim vremenom u kome se pojavljuje humana PE), svih šest životinja će biti podvrgnuto telemetrijskoj hirurgiji da se meri intra-arterijski krvni pritisak kako je prethodno opisano. id. Ukratko, ingvinalni rez je učinjen na koži da se izloži profunda femoris, malu granu glavne arterije koja snabdeva nogu, putem tupog sekciranja. Kateter komponenta telemetra (Data Sciences Ltd, Minnesota, USA) se umeće u pritoku femoralne arterije na odabranoj strani i postavlja na utvrđenoj razdaljini u srednju-abdominalnu aortu i obezbeđuje se krvni sud. Post-hirurški oporavak se procenjuje ocenjivanjem broja različitih fizičkih i bihevioralnih znakova, i obavlja se i beleža dnevno tokom tri dana pre započinjanja beleženja krvnog pritiska. Za anesteziju, životinjama će se dati kiseonik putem maske za lice i anestetišu se infuzijom ketamina, i metoklopramid da se spreči povraćanje. Na 22 nedelje gestacije, životinjama će biti ubrizgano intravenozno 4 mg / kg telesne težine jedna doza sFLT1 oligonukleotida u fosfat puferovanom slanom rastvoru (N=3) ili samo sa fosfat puferovanim slanim rastvorom (N=3) pod anestezijom.

12

Razvija se PE model babuna (Slika 30). PE model babuna će biti korišćen za efikasnost testa (PK) i generalnu bezbednost davanja sFLT1-ciljanja hsiRNK. Obaviće se pilot evaluacija jedne doze ubrizgavanja sFLT1-i13/e15a koja cilja hsiRNK na sFLT1 nivoima krvi i sFLT1 mRNK nivoe i placentna tkiva. Telemetar će biti umetnut na dan 143. Ishemija placente će biti izazvana i hsiRNK će biti ubrzgana na dan 150. Uklanjanje telemetra će se dogoditia na dan 164.

Prvom babunu dobija ubrizganje na dan prvi korišćenjem 20 mg/kg hsiRNK<sFLT1m>. Zabeleženi su neprimetljivi toksični i škodljivi efekti tokom prve dve nedelje. Inicijalni ALT/AST nivoi i citokin paneli su normalni, i krvni pritisci se normalizuju. Stabilizacija krvnog pritiska (BP) se primećuje nakon hsiRNK ubrizavanja (dvonedeljna studija) (Slika 37). Primećena je pozitivna dinamika za BP i HR kako u uslovima budnosti tako i spavanja. Smanjenje BP je primećeno nakon jednog IV hsiRNK ubrizgavanja (dvonedeljna studija) (Slika 38).

Babuni dva i tri su raspoređeni za ubrizgavanje jedan do dva meseca nakon što je prvi babun primio inicijalno ubrizganje.

6.3 Plazma sFlt1 nivoi i drugi fiziološki parametri

Osnovni nivoi sFlt1 će biti dobijeni iz plvazme sakupljene na dan umetanja telemetra i nedeljno, nakon isporuke na 26 nedelja. Uzorci urina će biti sakupljeni na isti dana kada se vadi krv. Osnovni krvni pritisak će biti kontinuirano beležen putem telemetrije od gestacione nedelje 21 pa do isporuke. Životinje će biti praćene korišćenjem fetusnih ultrazvukova (HDI 3000 instrument i C7-4 proba, ili slično) nedeljno radi utvrđivanja meteričnih i pupčanih protoka krvi, zdavlja fetusa (puls fetusa) i merenja rasta (obim glave, biparietalni prečnik, abdominalni obim, dužina femura) do isporuke. Pri isporuci, krv iz pupčane vrpce će biti sakupljena da se proceni transfer sFLT1 oligonukleotida u celom fetusu. Pri isporuci, procene rasta će biti učinjene merenjima obima glave i grudi, abdominalni opseg, dužina od vrha glave-do-kraja zadnjice i dužina femura. Ova merenja će biti upoređenja spram onih dobijenih sa novorođenčićima životinja tretiranih samo slanim rastvorom.

1

6.4 Interpretacija, zamke i alternative

U ovim pilot studijama, cilj nije pronaći optimalnu terapeutsku dozu za tretman preeklampsije, već da se jednostavno potvrdi da sFLT1 oligonukleotidna terapija inhibira druge izoforme sFLT1 koje se ne ekspresuju u miševima. Bez namere da se bude vezano naučnom teorijom, očekuje se da je jedna IV doza sFLT1 oligonukleotida smanjiti cirkulisanje sFLT1 za 50% u roku od nedelju dana i da će ti efekti trajati 2 nedelje ili duže. Očekuje se da će smanjenje u cirkulaciji sFLT1 biti povezano sa skromnim smanjenjem krvnog pritiska. Ipak ovo neće pogoršati materični arterijski protok krvi. Ukolike se primete smanjenaj u rastu fetusa, Imanjenje doze sFLT1 oligonukleotidne terapije može biti razmatrano. Alternativno, može biti razmatrana isporuka terapije kao jedne doze SQ (što može izazvati manje akutne efekte na materični arterijski protok krvi). Ukoliko se sakupe ohrabrujući podaci iz miša i inicijalnih PK studija sa babunima, formalne dokaz-koncepta in vivo studije efikasnosti će biti obavljene u babun modelu preeklampsije koji je karakterisan od strane Dr. Annemarie Hennessy u Australiji (Makris, A. et al. Uteroplacentarna ishemija rezultira proteinurskom hipertenzijom i povišenim sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007)). U ovoj studiji, biće specifično procenjene različite doze i višestruke doze sFlt1 oligonukleotidne terapije neophodne i dovoljne da se poboljšaju znaci i simptomi preekslampsije. lako Ijudski sFlt1 ELISA ogledi ukršteno-reaguju sa babun sFlt1, ogledi za PIGF i VEGF babuna ne postoje. Imunoogledi koji reaguju na PIGF/VEGF babuna se trenutno procenjuju i, ukoliko budu uspešni, meriće se slobnodne koncentracije PIGF i VEGF nivoa u krvi i urinu koje se mogu podići kako se cirkulišući sFlt1 nivoi smanjuju kao surogat biološkoj efikasnosti.

6.5 Rezime

Kompozicije i postupci koji su ovde opisani će dovesti do razvoja novog, isplativog tretmana preeklampsije kroz moduliranje sFLT1 nivoa. Dodatno tome, kao što je istina za ONT-ove, ode razvijena tehnologija treba da bude primenjljiva za stišavanje drugih gena placente, omogućavajući široki opseg novih funkcionalnih studija genomike in vivo za druge sa trudnoćom-povezane bolesti.

1 1

Primer 6.6. DHA-hsiRNK konjugati i g2DHA-hsiRNK konjugati

DHA je omega-3 masna kiselina koja je primarno komponenta humanog mozga (70%) koja prelazi krv mozak barijeru (BBB) i aktivno je internizovana od strane neurona i drugih ćelijskih tipova. g2DHA (na koji se takođe upućuje ovde kao na PC-DHA) je matabolički aktivni analog DHA.

Sintetišu se dokozaheksaenojska kiselina (DHA)-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK (na koji se ovde upućuje kao na PC-DHA-hsiRNK). Distribucija tkiva DHA-hsiRNK i g2DHA-hsiRNK nakon IV davanja (putem mišjih repnih vena) se utvrđuje u tkivima jetre (Slike 20 i 21), bubrega (Slike 22 i 23) i placente (Slike 24 i 25).

sFLT1 stišavanje sa g2DHA-shiRNK se primećuje kod trudnih miševa korišćenjem 15 mg/kg IV-datog sFLT1_2283P2-g2DHA (150813) u tkivima jetre, bubrega i placente (Slika 26).

Posebno poželjan sFLT_2283/2519 miks je prikazan na Slici 36.

1 2

Claims (11)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Jedinjenje koje se vezuje za intronski region mRNK koji kodira sFLT1 protein, naznačeno time, što jediinjenje selektivno inhibira ekspresiju sFLT1 proteina u ćeliji ili organizmu; navedeno jedinjenje sadrži dsRNK koja ima sens lanac i antisens lanac od bar 16 susednih nukleotida,

pri čemu je deo antisens lanca komplementaran sa delom sens lanca, pri čemu je antisens lanac u potpunosti komplementaran sa SEQ ID NO:1;

(1) antisens lanac se sastoji od naizmeničnih 2’-metoksi-ribonukleotida i 2’-fluororibonukleotida;

(2) nukleotidi na pozicijama 2 i 14 iz 5’ kraja antisens lanca nisu 2’-metoksi-ribonukleotidi; (3) nukleotidi antisens lanca su spojeni putem fosfodiestar ili fosforotioat povezivanja; i (4) nukleotidi na pozicijama 1-6 od 3’ kraja, ili pozicijama 1-7 od 3’ kraja, antisens lanca su spojeni za susedne nukleotide putem fosforotioat povezivanja;

pri čemu je sens lanac povezan za lipofilni molekul na 3’ kraju sens lanca.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što je navedena dsRNK dalje karakterisana time da:

je krnje-završena;

sadrži bar jedno jednolančano nukleotidno ispupčenje;

sadrži prirodno nastale nukleotide;

smanjuje ekspresiju sFLT1 proteina u ćeliji ili organizmu od oko 30% do oko 50%; ili smanjuje ekspresiju sFLT1 proteina u ćeliji ili organizmu od oko 30% do oko 40%.

3. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što navedena dsRNK sadrži krajnji nukleotid povezan za holesteril derivat.

4. Terapeutsko jedinjenje koje se vezuje za intronski region mRNK koji kodira sFLT1 protein, naznačeno time, što terapeutsko jedinjenje selektivno smanjuje ekspresiju sFLT1 proteina, i smanjuje terapeutsko jedinjenje jedan iii više simptoma preeklampsije (PE), postporođajne PE, eklampsije ili Hemoliza/Povećani enzimi jetre/Nizak broj trombocita (HELLP) sindrom kada se daje subjektu kome je neophodno, pri čemu je sFLT1 protein opciono odabran iz grupe koja se sastoji od jednog ili kombinacije sFLT1-i13 kratki, sFLT1-i13 dugi i sFlt1-i15a, gde navedeno jedinjenje sadrži dsRNK kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 3.

5. Terapeutsko jedinjenje prema zahtevu 4, naznačeno time, što sadrži prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid, pri čemu prvi oligonukleotid vezuje intronski region jednog ili oba sFLT-i13 kratki i sFLT-i13 dugi, a drugi oligonukleotid vezuje intronski region sFlt1-i15a, i pri čemu su prvi oligonukleotid i drugi oligonukleotid dvolančana RNK (dsRNK).

6. Terapeutsko jedinjenje prema zahtevu 4, naznačeno time, što sadrži prvu dsRNK koja sadrži prvi sens lanac i prvi antisens lanac kako je definisano bilo kojim od zahteva 1 do 5 a druga dsRNK sadrži drugi sens lanac i drugi antisens lanac, pri čemu drugi antisens lanac sadrži drugi region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2, opciono gde je:

svaka dsRNK između 15 i 35 baznih parova po dužini;

navedeni drugi region komplementarnosti je komplementaran za bar 15, 16, 17 ili 18 susednih nukleotida SEQ ID NO:2;

navedeni drugi region komplementarnosti sadrži ne više od 3 nepodudaranja sa SEQ ID NO:2;

navedeni drugi region komplementarnosti je potpuno komplementaran sa SEQ ID NO:2; svaka dsRNK sadrži bar jedno jednolančano nukleotidno ispupčenje; i/ili svaka dsRNK sadrži bar jedan modifikovani nukleotid, poželjno gde je:

navedeni modifikovani nukleotid odabran od grupe koja se sastoji od: 2-0-metil modifikovanog nukleotida, 2-fluoro modifikovanog nukleotida, nukleotida koji sadrži 5'-fosforotioat grupu, i krajnjeg nukleotida povezanog za holesteril derivat; navedeni modifikovani nukleotid odabran od grupe koja sadrži: 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovani nukleotid, 2'-deoksi-modifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid, 2'-amino-modifikovani nukleotid, 2’-alkil-modifikovani nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, i ne-prirodnu bazu koja sadrži nukleotid; i/ili svaka dsRNK sadrži bar jedan 2-O-metil modifikovani nukleotid, bar jedan 2'-fluoro modifikovan nukleotid, bar jedan nukleotid koji sadrži 5'fosforotioat grupu i krajnji nukleotid povezan za holesteril derivat.

1 4

7. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži:

prvu dsRNK koja sadrži prvi sens lanac i prvi antisens lanac kako je definisano bilo kojim od zahteva 1 do 3;

drugu dsRNK koja sadrži drugi sens lanac i drugi antisens lanac, pri čemu drugi antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji suštinski komplementaran sa SEQ ID NO:2, i pri čemu drugi antisens lanac selektivno cilja intronski region sFLT-И 5a; i farmaceutski prihvatljiv nosač.

8. Farmaceuska kompozicija prema zahtevu 7, naznačena time, što služi za upotrebu u tretiranju ili upravljanju PE, postporođajne PE, eklampsije ili HELLP sindroma.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, naznačena time, što se farmaceutska kompozicija daje intravenozno ili potkožno, opciono pri čemu je:

ekspresija sFLT1 proteina smanjena kod subjekta za oko 30% do oko 50%; ili ekspresija sFLT1 proteina smanjena kod subjekta za oko 30% do oko 40%.

10. Terapeutsko jedinjenje prema zahtevu 6, naznačeno time, što služi za upotrebu u tretiranju jednog ili više simptoma PE, postporođajne PE, eklampsije ili HELLP sindroma.

11. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što služi za upotrebu u tretiranju jednog ili više simptoma angiogenskog poremećaja, opciono angiogenskog poremećaja odabranog od grupe koja se sastoji od PE, postporođajne PE, eklampsije i HELLP sindroma.

1