RS61399B1

RS61399B1 - Vezne belančevine slične antitelu sa dva varijabilna regiona koje imaju ukrštenu orijentaciju veznog regiona

Info

Publication number: RS61399B1
Application number: RS20210133A
Authority: RS
Inventors: Nicolas Baurin; Christian Beil; Carsten Corvey; Christian Lange; Danxi Li; Vincent Mikol; Anke Steinmetz; Rao Ercole
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2021-02-26
Also published as: CL2018001827A1; CN103562221A; TW201940510A; EP2691416A1; KR101974901B1; JP2023100752A; CN110256569A; US20160200811A1; AU2012236603B2; CN110256569B; WO2012135345A1; JP2014511684A; IL261673A; JP6023172B2; MX2013011176A; BR122022004041B1; NZ616174A; US20210189011A1; IL261673B; US20120251541A1

Description

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na belančevine slične antitelima koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu svaki par polipeptida, koji formiraju veznu belančevinu koja sliči antitelu, poseduje dvojne varijabilne domene koji imaju ukrštenu orijentaciju. Pronalazak se takođe odnosi na postupke za proizvodnju takvih veznih belančevina sličnih antitelima.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Prirodna IgG antitela su bivalentna i monospecifična. Bispecifična antitela koja imaju vezne specifičnosti za dva različita antigena mogu da se proizvedu uz pomoć rekombinantnih tehnologija, a uobičajeno imaju široku kliničku primenu. Dobro je poznato da kompletni molekuli IgG antitela imaju Y-formu pri čemu sadrže četiri polipeptidna lanca: dva teška lanca i dva laka lanca. Svaki laki lanac se sastoji od dva domena, N-terminalni domen koji je poznat kao varijabilni ili VLdomen (ili region) i C-terminalni domen koji je poznat kao konstantni (ili CL) domen (konstantni kapa (Cκ) ili konstantni lambda (Cλ) domen). Svaki teški lanac se sastoji od četiri ili pet domena, u zavisnosti o klasi antitela. N-terminalni domen je poznat kao varijabilni (ili VH) domen (ili region), kojeg sledi prvi konstantni (ili CH1) domen, region drške, a tada i drugi i treći konstantni (ili CH2i CH3) domen. U sklopljenom antitelu, VLi VHdomeni se spajaju kako bi formirali mesto za vezanje antigena. Takođe, CLi CH1domeni se spajaju zajedno kako bi omogućavali da teški lanac bude spojen na jedan laki lanac. Dva heterodimera teški-laki lanac se spajaju preko interakcije CH2i CH3domena i preko interakcije između regiona sa drškama oba teška lanca.

[0003] Poznato je da proteolitičko cepanje (digestija) nekog antitela može da dovede do nastanka fragmenata antitela (Fab i Fab2). Takvi fragmenti celog antitela mogu da poseduju sposobnost vezanja antigena. Fragmenti antitela takođe mogu da se proizvedu rekombinantno. Mogu da se dobiju Fv fragmenti koji se sastoje samo od varijabilnih domena teških i lakih lanaca koji su međusobno spojeni. Ovi Fv fragmenti su monovalentni šta se tiče vezanja antigena. Manji fragmenti poput pojedinačnih varijabilnih domena (domen-antitela ili dAB; Ward et al., 1989, Nature 341(6242): 544-46), i pojedinačni regioni koji određuju komplementarnost ili CDR (Williams et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(14): 5537-41) takođe zadržavaju vezne karakteristike parentnog antitela, mada većina prirodnih antitela generalno zahteva oba lanca, VHi VL, kako bi zadržala svoj vezni potencijal.

[0004] Konstrukti sa pojedinačnim lancem varijabilnog fragmenta (scFv) sadrže VHi VLdomene koji se nalaze u jednom polipeptidnom lancu u kojem su pomenuti domeni odvojeni uz pomoć fleksibilnog linkera dovoljne dužine (više od 12 amino-kiselinskih ostataka), koji omogućava intramolekularnu interakciju, dozvoljavajući spontano sklapanje oba domena u vezno mesto za neki funkcionalni epitop (Bird et al., 1988, Science 242(4877): 423-26). Ove male belančevine (MW ~25,000 Da) generalno zadržavaju specifičnost i afinitet za svoje antigene u pojedinačnom polipeptidu i mogu da obezbede prikladan vezni blok za veće, antigen-specifične molekule.

[0005] Prednost korišćenja fragmenata antitela umesto celih antitela u dijagnozi i terapiji se skriva u njihovoj smanjenoj veličini. Oni su manje imunogeni u odnosu na cela antitela i mogu da se lakše probiju kroz tkiva. Nedostatak povezan sa primenom takvih fragmenata je taj šta pomenuti sadrže samo jedno vezno mesto za antigen šta smanjuje aviditet. Osim toga, zbog njihove smanjene veličine, pomenuti brzo nestaju iz seruma, pa prema tome imaju kratak poluživot.

[0006] Od interesa je da se proizvedu bispecifična antitela (BsAbs) koja spajaju vezna mesta za antigen iz dva antitela u jedna molekul, zbog čega će biti sposobna da vežu dva različita antigena istovremeno. Osim primene u dijagnostici, takvi molekuli otvaraju put novim terapeutskim aplikacijama, na primer, uz pomoć usmeravana potentnih efektorskih sistema u željene delove (gde tumorske ćelije često razvijaju mehanizme kako bi suprimirali normalne imuno-odgovore koje potiču monoklonska antitela, poput antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) ili komplement-zavisne citotoksičnosti (CDC)), ili uz pomoć povećavanja neutralizujućih ili stimulacionih delovanja antitela. Ovaj potencijal je bio rano prepoznat što je omogućilo brojne pristupe za dobijanje takvih bispecifičnih antitela. Početni pokušaji da se spoje vezne specifičnosti dva cela antitela protiv različitih ciljanih antigena za terapeutske ciljeve su koristili hemijski fuzionisane hetero-konjugovane molekule (Staerz et al., 1985, Nature 314(6012): 628-31).

[0007] Bispecifična antitela su originalno načinjena uz pomoć fuzionisanja dva hibridoma, od kojih je svaki spodoban za proizvede različiti imunoglobulin (Milstein et al., 1983, Nature 305(5934):537-40), ali je složenost vrsta (do deset različitih vrsta) proizvedenih u ćelijskoj kulturi otežavala i poskupljivala prečišćavanje (George et al., 1997, THE ANTIBODIES 4:99-141 (Capra et al., ur., Harwood Academic Publishers)). Uz pomoć ovog formata, IgG2a iz miša i IgG2b iz pacova su proizvedeni zajedno u istoj ćeliji (na primer, kao četvorostruku fuziju dva hibridoma, ili u projektovanim CHO ćelijama). Zbog toga šta su laki lanci svakog antitela bili preferirano spojeni sa teškim lancima svojih srodnih vrsta, sklopile su se tri glave vrste antitela: oba parentalna antitela, i heterodimer oba pomenuta antitela koji je sadržavao jedan par teški/laki lanac iz svakog antitela koji su bili spojeni preko njihovih Fc delova. Željeni heterodimer može da se prečisti iz ove smeše zbog toga šta su njegove vezne karakteristike prema Belančevini A različite od onih iz parentalnih antitela: IgG2b iz pacova se ne veže za Belančevinu A, dok se mišji IgG2a veže. Kao posledica, heterodumer miš-pacov se veže za Belančevinu A, ali se oslobađa kod većeg pH u odnosu na IgG2a homodimer, koje čini selektivno prečišćavanje bispecifičnog heterodimera mogućim (Lindhofer et al., 1995, J. Immunol. 155(1): 219-25). Nastao bispecifičan heterodimer je potpuno ne-humani, pa prema tome je veoma imunogen, koje može da dovede do pojave štetnih nus-pojava (na primer, "HAMA" ili "HARA" reakcije), i/ili neutralizuje terapeutski efekat. Tako je preostala potreba za projektovanim bispecifičnim antitelima sa superiornim karakteristikama koja mogu da se lako proizvedu uz veliki prinos iz kulture ćelija sisara.

[0008] Unatoč obećavajućih rezultata, koji su dobiveni primenom hetero-konjugata ili bispecifičnih antitela proizvedenih iz ćelijskih fuzija kao šta je malopre opisano, nekoliko faktora ih čini nepraktičnima za masovnu terapeutsku primenu. Ti faktori uključuju: brz nestanak hetero-konjugata in vivo, potrebu za primenom intenzivnih laboratorijskih tehnika za proizvodnju oba tipa molekula, potrebu za opsežnim prečišćavanjem (odvajanjem) heterokonjugata od homo-konjugata ili mono-specifičnih antitela, i generalno niski prinosi.

[0009] Genetičko inženjerstvo se ubrzano koristi za dizajn, modifikovanje, i proizvodnju antitela ili derivata antitela sa željenim setom veznih karakteristika i efektorskih funkcija. Brojni rekombinantni postupci su razvijeni za efikasnu proizvodnju BsAbs u formi fragmenata antitela (Carter et al., 1995, J. Hematother. 4(5): 463-70; Pluckthun et al., 1997, Immunotechnology 3(2): 83-105; Todorovska et al., 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 47-66) i IgG formata cele dužine (Carter, 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15).

[0010] Spajanje dva različita scFvs daje BsAb formate sa minimalnom molekularnom masom, koji su poznati kao sc-BsAbs ili Ta-scFvs (Mack et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15): 7021-25; Mallender et al., 1994, J. Biol. Chem.269(1): 199-206). BsAbs je konstruiran uz pomoć genetičkog fuzionisanja dva scFvs do dimerizacijske funkcionalnosti poput leucinskog rajsferšlusa (Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148(5): 1547-53; de Kruif et al., 1996, J. Biol. Chem.271(13): 7630-34).

[0011] Diatela su mali bivalentni i bispecifični fragmenti antitela. Ovi fragmenti obuhvataju VHkoji je spojen na VLiz istog polipeptidnog lanca uz pomoć linkera koji je dovoljno kratak (kraći od 12 amino-kiselinskih ostataka) da dozvoljava sparivanje između dva domena na istom lancu. Ovi domeni su prisiljeni da se sparuju inter-molekularno sa komplementarnim domenima iz drugog lanca stvarajući dva mesta za vezanje antigena. Ovi dimerni fragmenti antitela, ili "diatela", su bivalentni i bispecifični (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-48). Diatela su slična u veličini sa Fab fragmentom. Polipeptidni lanci VHi VLdomena spojenih sa linkerom između 3. i 12. amino-kiselinskog ostatka predominantno daju dimere (diatela), dok spajanje sa linkerom između 0. i 2. amino-kiselinskog ostatka predominantno daje trimere (triatela) i tetramere (tetratela). Osim dužine linkera, tačan obrazac oligomerizacije se čini da zavisi o sastavu kao i o orijentaciji varijabilnih domena (Hudson et al., 1999, J. Immunol. Methods 231(1-2): 177-89). Predvidljivost finalne strukture molekula diatela je veoma slaba.

[0012] Mada konstrukti na bazi sc-BsAb i diatela pokazuju interesantan klinički potencijal, bilo je pokazano da su takvi ne-kovalentno spojeni molekuli dovoljno stabilni u fiziološkim uslovima. Ukupna stabilnost scFv fragmenta zavisi o urođenoj stabilnosti VLi VHdomena kao i o stabilnosti domenskog interfejsa. Nedovoljna stabilnost VH-VLinterfejsa iz scFv fragmenata je često sugerisana kao glavni razlog nepovratnog inaktivisanja scFv, jer prolazno otvaranje interfejsa, koje bi bilo omogućeno uz pomoć peptidnog linkera, izlaže hidrofobne delove koji favorizuju agregaciju pa prema tome dovode do nestabilnosti i slabog proizvodnog prinosa (Wörn et al., 2001, J. Mol. Biol.305(5): 989-1010).

[0013] Alternativni postupak za proizvodnju bispecifičnih bivalentnih belančevina iz VHi VLdomena koji vežu antigen je opisan u U.S. patentu br. 5,989,830. Takve dualne Fv konfiguracije sa dvostrukim glavama se dobijaju uz pomoć ekspirmiranja bicistronskog vektora, koji kodira dva polipeptidna lanca. U dualnoj-Fv konfiguraciji, varijabilni domeni iz dva različita antitela se eksprimiraju u tandemskoj orijentaciji na dva različita lanca (jedan teški lanac i jedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac sadrži dva VHu serijama odvojenim sa peptidnim linkerom (VH1-linker-VH2), a drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih VLdomena spojenih u serijama uz pomoć peptidnog linkera (VL1-linker-VL2). Kod konfiguracije ukrštene dvostruke glave, varijabilni domeni iz dva različita antitela se eksprimiraju u tandemskoj orijentaciji na dva različita polipeptidna lanca (jedan teški lanac i jedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac sadrži dva VHu serijama odvojenima sa peptidnim linkerom (VH1-linker-VH2), a drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih VLdomena spojenih u serijama uz pomoć peptidnog linkera u suprotnoj orijentaciji (VL2-linker-VL1). Molekularno modeliranje ovih konstrukata sugeriše da veličina linkera treba da bude dovoljno duga da prekrije 30-40 Å (15-20 amino-kiselinskih ostataka).

[0014] Povećavanje valencije nekog antitela je važno jer pojačava funkcionalni afinitet pomenutog antitela usled efekta aviditeta. Kompleksi sa polivalentnim belančevinama (PPC) sa povećanom valencijom su opisani u U.S. patentnoj prijavi br. US 2005/0003403 A1. PPC obuhvata dva polipeptidna lanca koja su generalno aranžirana lateralno (jedan u odnosu na drugog). Svaki polipeptidni lanac tipično sadrži tri do četiri "v-regiona", koji obuhvataju amino-kiselinske sekvence koje su sposobne da formiraju vezno mesto za antigen kada se spoje sa odgovarajućim v-regionom iz suprotnog polipeptidnog lanca. Na svakom polipeptidnom lancu može da se koristi do šest "v-regiona". V-regioni iz svakog polipeptidnog lanca su međusobno spojeni linearno i mogu da budu spojeni preko isprekidanih veznih regiona. Kada su aranžirani u formi PPC, v-regioni sa svakog polipeptidnog lanca formiraju pojedinačna vezna mesta za antigen. Kompleks može da sadrži jednu ili više veznih specifičnosti.

[0015] Jedna strategija je bila predložena od strane Carter et al. (Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7): 617-21; Carter, 2011, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15) u svrhu proizvodnje Fc heterodimera primenom mutacija "čvor-u-rupi" u CH3domenu iz Fc. Ove mutacije omogućavaju promenu rezidualne komplementarnosti pakovanja između interfejsa iz CH3domena sa strukturno konzerviranim hidrofobnim središnjim regionom tako da je nastanak heterodimera favorizovan u odnosu na homodimere, koje omogućava dobru ekspresiju heterodimera u kulturi ćelija sisara. Mada ova strategija omogućava veći prinos heterodimera, pojava homodimera nije potpuno suprimirana (Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol.16(7): 677-81.

[0016] Gunasekaran et al. su istraživali mogućnost zadržavanja integriteta hidrofobnog središnjeg regiona uz poticanje nastanka Fc heterodimera uz pomoć promene komplementarnosti naboja u interfejsu iz CH3domena (Gunasekaran et al., 2010, J. Biol. Chem.

285(25): 19637-46). Koristeći se sa elektrostatičkim upravljačkim mehanizmom, ovi konstrukti pokazuju efikasnu promociju nastanka Fc heterodimera uz minimalnu kontaminaciju sa homodimerima preko mutacije dva para periferno lociranih nabijenih ostataka. Suprotno od dizajna „čvor-u-rupi“, homodimeri su podjednako suprimirani zbog prirode mehanizma elektrostatičkog odbijanja, ali ne može ih se izbeči potpuno.

[0017] Davis et al. opisuju pristup projektovanog antitela sa ciljem konvertovanja Fc homodimera u heterodimere uz pomoć internog isprepletanja segmenata β-plohe iz CH3domena iz humanog IgG i IgA, ali bez uvođenja inter-lančanih disulfidnih veza (Davis et al., 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 195-202). Ekspresija SEEDtelo (Sb) fuzionisanih belančevina u ćelijama sisara daje Sb heterodimere u visokom prinosu koji mogu lako da se prečiste kako bi se eliminisali retki nus-produkti.

[0018] U.S. patentna prijava br. US 2010/331527 A1 opisuje bispecifično antitelo na bazi heterodimerizacije CH3domena uz pomoć uvođenja mutacija H95R i Y96F u CH3domenu u jednom teškom lancu. Ove amino-kiselinske supstitucije potiču iz CH3domena iz IgG3 podtipa i mogu da heterodimerizuju sa osovinom IgG1. Uobičajeni laki lanac, koji ima tendenciju da se sparuje sa svakim teškim lancem, je osnovni uslov za sve formate na bazi heterodimerizacije preko CH3domena. Prema tome, nastaje ukupno tri tipa antitela: 50% imaju čistu IgG1osovinu, jedna-trećina ima čistu H95R i Y96F mutiranu osovinu, a jedna-trećina ima dva različita teška lanca (bispecifično). Željeni heterodimer može da se prečisti iz ove smeše zbog toga šta su njegove vezne karakteristike prema Belančevini A različite od onih koje imaju parentalna antitela: IgG3-izvedeni CH3domeni se ne vežu na Belančevinu A, dok IgG1 se vežu. Kao posledica, heterodimer se veže na Belančevinu A, ali može da se eluira na višem pH u odnosu na čisti IgG1 homodimer, koje selektivno prečišćavanje bispecifičnog heterodimera čini mogućim.

[0019] U.S. patentni br.7,612,181 opisuje Dvostruki-Varijabilni-Domen IgG (DVD-IgG) koje je bispecifično antitelo na bazi Dvostrukog-Fv formata koji je opisan u U.S. patentu br.

5,989,830. Sličan bispecifičan format je takođe opisan u U.S. patentnoj prijavi br. US 2010/0226923 A1. Dodavanje konstantnih domena odgovarajućim lancima iz Dvostrukog-Fv (CH1-Fc na teški lanac, a kapa ili lambda konstantni domen na laki lanac) daje funkcionalna bispecifična antitela bez potrebe dodatnih modifikovanja (tj, očitog dodavanja konstantnih domena kako bi se pojačala stabilnost). Neka od antitela koja su eksprimirana u DVD-Ig/TBTI formatu pokazuju pozicioni efekt na drugoj (ili unutrašnji-most) poziciji za vezanje antigena (Fv2). U zavisnosti o sekvenci i prirodi antigena kojeg prepoznaje Fv2 pozicija, ovaj domen pokazuje smanjeni afinitet prema svojim antigenom (tj., gubitak on-rate konstante u odnosu na parentalno antitelo). Jedno moguće objašnjenje za ovaj nalaz je to da se linker između VL1i VL2proteže u CDR region iz Fv2, koje čini Fv2 da nekako bude nedostupan za veće antigene.

[0020] Druga konfiguracija nekog fragmenta za bispecifično antitelo, koja je opisana u U.S. patentu br. 5,989,830, je ukrštena dvoglava (CODH), koja poseduje sledeće orijentacije varijabilnih domena eksprimiranih na dva lanca:

VL1-linker-VL2, za laki lanac, i

VH2-linker-VH1, za teški lanac.

Patent '830 opisuje da bispecifičan ukršteni dvoglavi fragment za antitelo (konstrukt GOSA.E) zadržava višu veznu aktivnost u odnosu na Dvostruki-Fv (vidi stranicu 20, linije 20-50 iz patenta '830), i dodatno opisuje da je ovaj format manje pod uticajem linkera koji se koriste između varijabilnih domena (vidi stranice 20-21 iz patenta '830).

SAŽETAK PRONALASKA

[0021] Ovaj pronalazak obezbeđuje vezne belančevine slične antitelima koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen sposobna da specifično vežu jedan ili više ciljanih antigena, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

a dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region ručke, a CH2, CH3su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri, gde

dužina L4je najmanje dvostruka dužina L2; i

dužina L3je najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1i VH1i za uparivanje VL2i VH2, a polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.

[0022] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje veznu belančevinu sličnu antitelu koja obuhvata dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen sposobna da specifično vežu jedan ili više ciljanih antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri; gde

dužina L4je najmanje dvostruka dužina L2; i

dužina L3je najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1i VH1i za uparivanje VL2i VH2, a prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.

[0023] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju vezne belančevina slične antitelu koja obuhvata četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu pomenuti postupak obuhvata

a) identifikovanje varijabilnog domena iz prvog antitela koji veže prvi ciljani antigen i varijabilnog domena iz drugog antitela koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu oba sadrže VLi VH;

b) pripisivanje lakog lancu kao lanca za kalup;

c) pripisivanje VLiz varijabilnog domena iz prvog antitela ili iz varijabilnog domena iz drugog antitela funkciju VL1;

d) pripisivanje funkcija VL2, VH1, i VH2u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:

e) određivanje maksimalnih i minimalnih dužina L1, L2, L3, i L4;

f) generisanje polipeptidnih struktura sa formulama I i II;

g) izbor polipeptidnih struktura sa formulama I i II koji vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada se spoje sa ciljem da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region ručke, a CH2, CH3su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4 najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3 najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1 i VH1 i za uparivanje VL2 i VH2, a polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.

1

[0024] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju vezne belančevine slične antitelu, koja sadrži četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu pomenuti postupak obuhvata

a) identifikovanje varijabilnog domena iz prvog antitela koji veže prvi ciljani antigen i varijabilnog domena iz drugog antitela koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu svaki sadrži VLi VH;

b) pripisivanje lakog lancu kao lanca za kalup;

d) pripisivanje funkcija VL2, VH1,i VH2u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:

e) određivanje maksimalnih i minimalnih dužina za L1, L2, L3, i L4;

f) generisanje polipeptidnih struktura sa formulama I i II;

g) izbiranje polipeptidnih struktura sa formulama I i II koje vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada se spoje sa ciljem da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu; gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4 najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3 najmanje dvostruka dužina L1;

[0025] Dalji aspekti pronalaska će postati vidljive iz sledećeg detaljnijeg opisa i iz zahteva.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1. Shematski prikaz domena Fv1 i Fv2 koji vežu antigen kod konfiguracije dvostrukog V regiona i aranžmana njihovih odgovarajućih peptidnih linkera LLi LHu TBTI formatu.

Slika 2. Shematski dijagram (2D) domena Fv1 (anti-IL4) i Fv2 (anti-IL13), koji vežu antigen u ukrštenoj dvostrukoj varijabilnoj (CODV) konfiguraciji, i aranžmana njihovih odgovarajućih peptidnih linkera.

Slika 3. Shematski prikaz Fv anti-IL4 i Fab anti-IL13 koji pokazuje jedan mogući prostorni aranžman dobiven uz pomoć pristajanja belančevina-belančevina Fv iz anti-IL4 i Fv iz anti-IL13.

Slika 4. Procena tetravalentne i bispecifične vezne sposobnosti CODV belančevine u ogledu BIACORE uz pomoć uzastopnog ili simultanog injektiranja dva antigena u čipa koji je prekriven sa DVD-Ig belančevinom. Maksimalni primećeni signal uz pomoć uzastopnog injektiranja može da se dobije uz pomoć ko-injekcije oba antigena, pokazujući zasićenje svih veznih mesta.

Slika 5. Shematski dijagram (2D) domena koji vežu antigen u CODV konfiguraciji i aranžmana njihovih odgovarajućih peptidnih linkera LL(L1i L2) i LH(L3i L4). U panelu A, laki lanac je raspoređen u "linearnom ili kalup" ravnanju, dok je teški lanac raspoređen u "unakrsnoj" konfiguraciji. U panelu B, teški lanac je raspoređen u "linearnom ili kalup" ravnanju, a laki lanac je raspoređen u "unakrsnoj" konfiguraciji.

Slika 6. Shematski prikaz CODV-Ig dizajna na bazi toga da li se laki lanac ili teški lanac koristi kao "kalup".

Slika 7. Uporedba TBTI/DVD-Ig ili CODV-Ig molekula koje nose anti-IL4 i anti-IL13 sekvence.

Slika 8. Uporedba CODV-Fab i B-Fab formata u citotoksičnom ogledu sa NALM-6 ćelijama.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0027] Ovaj pronalazak obezbeđuje vezne belančevine slične antitelu, kao što je gore opisano u Sažetku pronalaska. Pronalazak takođe daje postupke za proizvodnju takvih veznih belančevina sličnih antigenu.

[0028] Kompjutersko modeliranje predviđa da će unakrsni dvoglavi (CODH) dizajn iz U.S. patenta br. 5,989,830 dati kompleks u kojem su oba vezna mesta okrenuta u suprotnim smerovima, ali bez ograničenja koje sugeriše Dvostruka-Fv konfiguracija iz U.S. patenta br.

7,612,181. Specifično, kompjutersko modeliranje pokazuje da dužina amino-kiselinskih linkera između varijabilnih domena nije kritična za CODH dizajn, ali je važna za omogućavanje punog pristupa prema oba vezna mesta za antigen u Dvostrukom-Fv dizajnu. Kao i kod DVD-Ig/TBTI formata, konstrukti vezne belančevine slične antitelu su pripremljeni tako da su konstantni domeni spojeni sa CODH konfiguracijom kako bi formirali vezne belančevine slične antitelu koje sadrže četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu svaki par polipeptida koji formira veznu belančevinu sličnu antitelu poseduje dvostruke varijabilne domene u unakrsnoj orijentaciji (tj., CODH-Ig). CODH-Ig molekuli se očekuje da poseduju značajno poboljšanu stabilnost u odnosu na CODH molekule (jer DVD-Ig/TBTI poseduju poboljšanu stabilnost u odnosu na Dvostruke-Fv molekule).

[0029] Sa ciljem da se testira malopre pomenuta hipoteza, CODH-Ig molekul je pripremljen uz pomoć anti-IL4 i anti-IL13 sekvenca iz antitela opisanih u U.S. patentnoj prijavi br. US 2010/0226923 A1. CODH-Ig molekul se razlikovao od CODH molekula iz dokumenta US 2010/0226923 u veličini amino-kiselinskih linkera koji odvajaju varijabilne domene na odgovarajućim polipeptidnim lancima. CODH-Ig molekuli su eksprimirani u ćelijama nakon prolazne transfekcije, a tada su prečišćeni uz pomoć hromatografije na Belančevini A. Mada su njihovi profili, na osnovu hromatografske veličine (SEC), pokazivali nivoe agregacije od 5-10%, niti jedan od CODH-Ig molekula nije bio funkcionalan, pa tako niti jedan CODH-Ig molekul nije bio sposoban da se veže na svoje ciljne antigene. Nedostatak vezne aktivnosti možda je bio posledica izmenjene dimerizacije Fv-regiona teških i lakih lanaca zbog neprikladnih dužina linkera koje je kompromitovalo pravilno formiranje paratopa. Kao rezultat je razvijen protokol sa ciljem da se identifikuju prikladni amino-kiselinski linkeri za inserciju između dva varijabilni domena i između drugog varijabilnog domena i konstantnog domena na teškom i lakom polipeptidnom lancu iz vezne belančevine slične antitelu. Ovaj protokol se bazira na pristajanju belančevina-belančevina i uzima u obzir eksperimentalne modele FvIL4 i FvIL13 regiona, kao i uključivanje Fc1 domena u model, i konstrukciju prikladnih linkera između FvIL4 i FvIL13 regiona i između Fv i konstantnog Fc1 regiona.

[0030] Standardna metodologija rekombinantne DNA je korišćena kako bi se konstruirali polinukleotidi koji kodiraju polipeptide koji formiraju vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska, ugradili pomenuti polinukleotidi u rekombinantne ekspresione vektore, i pomenuti vektori uveli u ćelije domaćine. Vidi na primer Sambrook et al., 2001, MOLECULAR

1

CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. izd.). Encimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se provedu u skladu sa instrukcijama proizvođača, kao šta je uobičajeno poznato stanju tehnike, ili na način kako je ovde opisano. Osim ako su navedene specifične definicije, korišćena nomenklatura, i laboratorijske procedure i tehnike, analitička hemija, hemija za organsku sintezu, i medicinska i farmaceutska hemija, koji su ovde opisani, su dobro poznati stručnjacima iz ove tehničke oblasti. Slično, konvencionalne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, dostavu, i za tretman pacijenata.

1. Opšte definicije

[0031] Korišćeni u skladu sa ovim opisom, sledeći termini, osim ako je drugačije navedeno, treba da se razumeju kao da imaju sledeća značenja. Osima ako kontekst zahteva drugačije, termini u jednini uključuju i množinu, a termini u množini uključuju i jedninu.

[0032] Termin "polinukleotid", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedno-lančane ili dvolančane polimere nukleinske kiseline od najmanje 10 nukleotida u dužini. U nekim izvedbama, nukleotidi koji čine polinukleotid mogu da budu ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovana forma bilo kojeg tipa nukleotida. Takve modifikacije uključuju modifikacije poput bromuridina, modifikacije riboze poput arabinozida i 2',3'-dideoksiriboze, i modifikacije internukleotidnih veza (spajanja) poput fosforotioata, fosforoditioata, fosforoselenoata, fosforodiselenoata, fosforoanilotioata, fosforaniladata i fosforoamidata. Termin "polinukleotid" specifično uključuje jedno-lančane i dvo-lančane forme DNA.

[0033] "Izolovani polinukleotid" je polinukleotid genomskog porekla, cDNA, ili sintetski ili neka njihova kombinacija, koji je izolovani polinukleotid upravo zbog svojeg porekla: (1) nije spojen sa, potpuno ili delomično, polinukleotidom u kojem se pomenuti izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, (2) je spojen na polinukleotid na koji nije spojen u prirodi, ili (3) se ne pojavljuje u prirodi kao deo neke veće sekvence.

[0034] "Izolovani polipeptid" je takav polipeptid koji: (1) je očišćen od barem nekih drugih polipeptida koji ga uobičajeno pridružuju u prirodi, (2) je značajno očišćen od drugih polipeptida iz istog izvora, na primer, iste vrste, (3) se eksprimira u ćeliji iz druge vrste, (4) je očišćen od najmanje oko 50% polinukleotida, lipida, ugljohidrata, ili drugih materijala koji ga pridružuju u prirodi, (5) nije povezan (kovalentnom ili ne-kovalentnom interakcijom) sa delovima nekog polipeptida koji pomenutog "izolovanog polipeptida" pridružuje u prirodi, (6) je operativno povezan (kovalentnom ili ne-kovalentnom interakcijom) sa nekim polipeptidom koji ga pridružuje u prirodi, ili (7) se ne pojavljuje u prirodi. Takav izolovani polipeptid može da bude kodiran sa genomskom DNA, cDNA, mRNA ili drugom RNA, ili može da bude sintetskog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija. Preferirano, izolovani polipeptid je značajno očišćen od polipeptida ili drugih kontaminanata koji ga pridružuju u njegovoj prirodnoj sredini, a koji bi uticali na njegovu primenu (terapeutsku, dijagnostičku, profilaktičku, istraživačku ili neku drugu).

[0035] Termin "humano antitelo", kao šta se ovde koristi, uključuje antitela koja sadrže varijabilni i konstantni region koji se značajno podudara sa humanim imunoglobulinskim sekvencama iz germinativne linije. U nekim izvedbama, humana antitela se proizvode u nehumanim sisarima, uključujući, ali bez ograničenja, glodare, poput miševa i pacova, i dvojezupce, poput zečeva. U drugim izvedbama, humana antitela se proizvode u hibridom ćelijama. U drugim izvedbama, humana antitela se proizvode rekombinantno.

[0036] Prirodna antitela tipično su tetramer. Svaki takav tetramer se tipično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par sadrži jedan "laki" lanac pune dužine (tipično sa molekularnom masom od oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac pune dužine (tipično sa molekularnom masom od oko 50-70 kDa). Termini "teški lanac" i "laki lanac", kao šta se ovde koriste, se odnose na bilo koji imunoglobulinski polipeptid koji sadrži dovoljno specifičan varijabilni domen koji bi bio sposoban da prepozna ciljani antigen. Amino-terminalni deo svakog lakog i teškog lanca tipično uključuje varijabilni domen od oko 100 do 110 ili više amino-kiselina koje su tipično odgovorne ua prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca tipično definiše konstantni domen koji je odgovoran za efektorsku funkciju. Tako, kod prirodnih antitela, teški lanac imunoglobulinskog polipeptida pune dužine uključuje varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2, i CH3), pri čemu se VHdomen nalazi na amino-terminusu pomenutog polipeptida, a CH3domen na karboksil-terminusu, dok laki lanac imunoglobulinskog polipeptida pune dužine uključuje varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL), pri čemu se VLdomen nalazi na amino-terminusu pomenutog polipeptida, a CLdomen na karboksil-terminusu.

[0037] Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci, a humani teški lanci su tipično klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, pri čemu pomenuti definišu

1

izotipove antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE. IgG obuhvata nekoliko podklasa, uključujući, ali bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM obuhvata podklase koje uključuju, ali bez ograničenja, IgM1 i IgM2. IgA je slično podeljen u podklase koje uključuju, ali bez ograničenja, IgA1 i IgA2. U lakim i teškim lancima pune duljine, varijabilni i konstantni domeni tipično su spojeni uz pomoć "J" regiona od oko 12 ili više amino-kiselina, pro čemu teški lanac takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više amino-kiselina. Vidi, na primer, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ur., Raven Press, 2. izd., 1989). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično formira mesto za vezanje antigena. Varijabilni domeni prirodnih antitela tipično imaju istu opštu strukturu relativno konzervisanih okvirnih regiona (FR) spojenih preko tri hipervarijabilna regiona, takođe poznati kao regioni koji određuju komplementarnost ili CDR. CDR iz oba lanca svakog para tipično su poravnani uz pomoć okvirnih regiona, koje omogućava vezanje na neki specifični epitop. Od aminoterminusa do karboksil-terminusa, varijabilni domeni iz lakog i teškog lanca tipično obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.

[0038] Termin "nativni Fc", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul koji obuhvata sekvencu fragmenta koji ne veže antigen koji je produkt digestije nekog antitela ili je proizveden na neki drugi način, bez razlike da li je u monomernoj ili multimernoj formi, i može da sadrži region ručke. Originalni imunoglobulin nativnog Fc preferirano ima humano poreklo i može da bude bilo koji imunoglobulin, mada su IgG 1 i IgG2 preferirani. Nativni Fc molekuli su načinjeni od monomernih polipeptida koji mogu da se povežu u dimerne ili multimerne forme preko kovalentne (tj., disulfidni mostovi) i ne-kovalentne veze. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih podjedinica nativnih Fc molekula se kreće u rasponu od 1 do 4 u zavisnosti o klasi (na primer, IgG, IgA, i IgE) ili podklasi (na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, i IgGA2). Jedan primer za nativni Fc je disulfidno-povezan dimer koji je produkt cepanja IgG sa papainom. Termin "nativni Fc", kao šta se ovde koristi, je generički naziv za monomernu, dimernu, i multimernu formu.

[0039] Termin "Fc varijanta", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul ili sekvencu koja je modifikovani nativni Fc, koji još uvek poseduje vezno mesto za salvage-receptor, FcRn (neonatalni Fc receptor). Primeri za Fc varijante i njihovu interakciju sa salvage-receptorom su poznati stanju tehnike. Tako, termin "Fc varijanta" može da obuhvata molekul ili sekvencu koja je humanizovani ne-humani nativni Fc. Nadalje, nativni Fc obuhvata regione koji mogu da se odstrane zbog toga šta obezbeđuju strukturalne karakteristike ili biološku aktivnost koji

1

nisu potrebni veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska. Tako, termin "Fc varijanta" obuhvata molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedan ili više nativnih Fc mesta ili ostataka, ili u kojoj su jedno ili više Fc mesta ili ostataka modifikovani, pri čemu pomenuta obuhvata ili je uključena u: (1) nastanku disulfidne veze, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćina, (3) N-terminalnu heterogenost nakon ekspresije u izabranoj ćeliji domaćina, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezanju na Fc receptor koji nije salvagereceptor, ili (7) antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC).

[0040] Termin "Fc domen", kao šta se ovde koristi, obuhvata nativne Fc i Fc varijante i sekvence kao šta je definisano iznad. Kao i sa Fc varijantama i nativni Fc molekuli, termin "Fc domen" uključuje molekule u monomernoj ili multimernoj formi, bez razlike da li su dizajnirani iz celog antitela ili proizvedeni na drugi način.

[0041] Termin "vezna belančevina slična antitelu", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neprirodni (li rekombinantni) molekul koji specifično veže najmanje jedan ciljani antigen, a koji obuhvata četiri polipeptidna lanca koji formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu pomenuta dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

i dva polipeptidna lanca koji imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region drške, a CH2, CH3su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanacteški lanac. Termin "vezna belančevina slična antitelu", kao šta se ovde koristi, takođe se odnosi na ne-prirodni (ili rekombinantni) molekul koji specifično veže najmanje jedan ciljani

1

antigen, i koji obuhvata dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac. "Rekombinantni" molekul je takav molekul koji je bio konstruiran, eksprimiran, kreiran, ili izolovan uz pomoć rekombinantne tehnologije.

[0042] Jedna izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje vezne belančevine slične antitelu, kao šta je definisano u Sažetku pronalaska, koje imaju biološku i imunološku specifičnost za između jednog i četiri ciljana antigena. Druga izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju vezne belančevine slične antitelu. Druga izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje ekspresione vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju pomenute vezne belančevine slične antitelu. Još jedna izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje ćelije domaćine koje eksprimiraju pomenute vezne belančevine slične antitelu (tj., koje sadrže molekule nukleinske kiseline ili vektore koji kodiraju polipeptidne lance koji formiraju pomenute vezne belančevine slične antitelu).

[0043] Termin "razmenljivost", kao šta se ovde koristi, se odnosi na međusobnu razmenljivost varijabilnih domena u CODV formatu uz zadržavanje sklapanja i krajnjeg veznog afiniteta. "Puna razmenljivost " se odnosi na sposobnost da se zameni redosled VH1i VH2domena, pa prema tome i redosled VL1i VL2domena u CODV-Ig (tj., da se ostvari obrnuti redosled) ili CODV-Fab uz zadržavanje pune funkcionalnosti veznih belančevina sličnih antitelu kao šta

1

može da se potvrdi uz pomoć zadržavanja veznog afiniteta. Nadalje, treba da se primeti da oznake VHi VLu određenim CODV-Ig ili CODV-Fab se odnose samo na lokaciju pojedinog domena u pojedinom proteinskom lancu u finalnom formatu. Na primer, VH1i VH2mogu da se izvedu iz VL1i VL2domena iz parentnog antitela i da se premeste na VH1i VH2pozicije vezne belančevine slične antitelu. Na isti načine, VL1i VL2mogu da se izvedu iz VH1i VH2domena iz parentnog antitela i da se premeste na VH1i VH2pozicije u veznoj belančevini sličnoj antitelu. Tako, oznake VHi VLse odnose na sadašnju lokaciju, a ne na originalnu lokaciju u parentnom antitelu. VHi VLdomeni su, prema tome, "razmenljivi".

[0044] "Izolovana" vezna belančevina slična antitelu je takva belančevina koja je bila identifikovana i odvojena i/ili obnovljena iz neke komponente iz njene prirodne sredine. Kontaminirajuće komponente iz njene prirodne sredine su materijali koji će interferirati sa dijagnostičkom ili terapeutskom primenom vezne belančevine slične antitelu, a mogu da uključuju encime, hormone, i druge proteinske i ne-proteinske rastvorene materije. U preferiranim izvedbama, pomenuta vezna belančevina slična antitelu će biti prečišćena: (1) do čistoće koja je veća od 95 težinskih procenata antitela utvrđeno uz pomoć Lowry-evog postupka, a najbolje veća od 99 težinskih procenata, (2) do stepena čistoće koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne amino-kiselinske sekvence primenom spinning cup sekvenatora, ili (3) do homogenosti koja se dobija uz pomoć SDS-PAGE u reducirajućim i ne-reducirajućim uslovima uz pomoć bojanja sa Coomassie-plavim ili, preferirano, srebrom. Izolovane vezne belančevine slične antitelu uključuju veznu belančevinu sličnu antitelu in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta iz prirodne sredine pomenute vezne belančevine slične antitelu neće biti prisutna.

[0045] Termini "bitno čist" ili "bitno prečišćen", kao šta se ovde koriste, se odnose na jedinjenje ili vrste čija prisutnost dominira (tj., na molarnoj bazi je više zastupljena u odnosu na bilo koju drugu pojedinačnu vrstu u kompoziciji). U nekim izvedbama, bitno prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj je pomenuta vrsta zastupljena najmanje oko 50% (na molarnoj bazi) u odnosu na sve ostale prisutne makromolekularne vrste. U drugim izvedbama, bitno čista kompozicija sadrži vrstu koja je više od 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% zastupljenija u odnosu na ostale makromolarne vrste prisutne u kompoziciji. U još drugim izvedbama, pomenuta vrsta je prečišćena do esencijalne homogenosti (kontaminirajuće vrste ne mogu da se detektuju u kompoziciji uz pomoć konvencionalnih postupaka za detekciju) pri čemu se pomenuta kompozicija sastoji uglavnom od pojedinačnih makromolekularnih vrsta.

1

[0046] Termin "antigen" ili "ciljni antigen", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul ili deo nekog molekula koji može da bude vezan od strane neke vezne belančevine slične antitelu, a dodatno može da se koristi u nekoj životinji sa ciljem da se proizvedu antitela koja su sposobna da se vežu na neki epitop iz pomenutog antigena. Ciljani antigen može da poseduje jedan ili više epitopa. U odnosu na svaki ciljani antigen koji može da bude prepoznat od strane neke vezne belančevine slične antitelu, pomenuta vezna belančevina slična antitelu je sposobna da se takmiči sa nekim intaktnim antitelom koje prepoznaje pomenuti ciljani antigen. "Bivalentna" vezna belančevina slična antitelu, koja nije "multispecifična" ili "multifunkcionalna" vezna belančevina slična antitelu, se podrazumeva da obuhvata mesta za vezanje antigena koja imaju identičnu antigenu specifičnost.

[0047] Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo tipično je veštačko hibridno antitelo koje sadrži dva različita para teški lanac/laki lanac i dva različita vezna mesta ili epitopa. Bispecifično antitelo može da se proizvede uz pomoć brojnih postupaka uključujući, ali bez ograničenja, fuziju hibridoma ili spajanje F(ab') fragmenata.

[0048] F(ab) fragment tipično uključuje jedan laki lanac i VHi CH1domene iz jednog teškog lanca, pri čemu VH-CH1deo iz teškog lanca iz F(ab) fragmenta ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim polipeptidom teškog lanca. Kao šta se ovde koristi, F(ab) fragment takođe može da uključuje jedan laki lanac koji sadrži dva varijabilna domena koji su odvojeni sa aminokiselinskim linkerom i jedan teški lanac koji sadrži dva varijabilna domena koji su odvojeni sa amino-kiselinskim linkerom i CH1domenom.

[0049] F(ab') fragment tipično uključuje jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži veći deo konstantnog regiona (između CH1i CH2domena), na takav način da može da se formira inter-lančana disulfidna veza između oba teška lanca kako bi nastao F(ab')2molekul.

[0050] Fraze "biološko svojstvo", "biološka karakteristika", i termin "aktivnost" u odnosu na veznu belančevinu sličnu antitelu iz ovoga pronalaska se koriste kao sinonimi i uključuju, ali bez ograničenja, afinitet i specifičnost prema epitopu, sposobnost da se antagonizuje aktivnost ciljanog antigena (ili ciljanog polipeptida), in vivo stabilnost vezne belančevine slične antitelu, i imunogene karakteristike pomenute vezne belančevine slične antitelu. Druga biološka svojstva i karakteristike, koje mogu da se identifikuju, a koje opisuju pomenutu veznu

2

belančevinu sličnu antitelu uključuju, na primer, unakrsnu-reaktivnost, (tj., uopšteno sa nehumanim homolozima ciljanog antigena, ili sa drugim ciljanim antigenima ili tkivima), i sposobnost da se sačuvaju visoki nivoi ekspresije belančevina u ćelijama sisara. Malopre pomenuta svojstva i karakteristike mogu da se primete ili izmere uz pomoć tehnika koje su poznate stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja, ELISA, kompetitivna ELISA, analiza površinske rezonance plazmona, in vitro i in vivo ogledi neutralizovanja, i imunohistohemiju tkivnih preseka iz različitih izvora uključujući čoveka, primate, ili bilo koji drugi izvor prema potrebi.

[0051] Termin "imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki polipeptidni fragment koji sadrži najmanje CDR iz imunoglobulinskih teških ili lakih lanaca iz koji je izveden pomenuti polipeptidni fragment. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment je sposoban da veže ciljani antigen.

[0052] "Neutralizovanje" vezne belančevine slične antitelu, kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki molekul koji je sposoban da blokira ili značajno smanji efektorsku funkciju ciljanog antigena na kojeg se veže. Kao šta se ovde koristi, "značajno smanjuje" označava najmanje oko 60%, preferirano najmanje oko 70%, još bolje najmanje oko 75%, još bolje najmanje oko 80%, još bolje najmanje oko 85%, a najbolje oko 90% smanjivanje efektorske funkcije ciljanog antigena.

[0053] Termin "epitop" uključuje bilo koji determinant, preferirano polipeptidni determinant, sposoban da specifično veže imunoglobulin ili receptor iz T-ćelije. U nekim izvedbama, epitopdeterminanti uključuju hemijski aktivno površinsko grupiranje molekula poput amino-kiselina, lanaca bočnih šećera, fosforilne grupe, ili sulfonilne grupe, i, u nekim izvedbama, mogu da imaju specifične tri-dimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naboja. Epitop je region nekog antigena koji je vezan od strane nekog antitela ili vezne belančevine slične antitelu. U nekim izvedbama, vezna belančevina slična antitelu se specifično veže na neki antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši belančevina i/ili makromolekula. U preferiranim izvedbama, neka vezna belančevina slična antitelu se specifično veže na neki antigen kada ravnotežna konstanta disocijacije iznosi ≤ 10<-8>M, bolje kada ravnotežna konstantna disocijacije iznosi ≤ 10<-9>M, a najbolje kada konstantna disocijacije iznosi ≤ 10<-10>M.

[0054] Pomenuta konstantna disocijacije (KD) neke vezne belančevine slične antitelu može da se odredi, na primer, uz pomoć površinske rezonance plazmona. Uopšteno, analiza površinske rezonancije plazmona prati (meri) vezne interakcije između liganda (ciljani antigen na biosenzorskoj matrici) i analita (vezna belančevina slična antitelu u rastvoru) u realnom vremenu uz pomoć površinske rezonancije plazmona (SPR) primenom sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). Površinska analiza plazmona takođe može da se provede uz pomoć imobiliziranja analita (vezna belančevina slična antitelu na biosenzorskoj matrici) i prezentacije (izlaganja) liganda (ciljani antigen). Termin "KD", kao šta se ovde koristi, se odnosi na disocijacijsku konstantnu interakcije između određene vezne belančevine slične antitelu i ciljnog antigena.

[0055] Termin "specifično veže", kao šta se ovde koristi, se odnosi na sposobnost neke belančevine slične antitelu ili nekog fragmenta koji veže antigen da veže antigen koji sadrži epitop sa Kd od najmanje oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, 1 x 10<-12>M, ili više, i/ili da veže epitop sa afinitetom koji je najmanje dva-puta veći od njegovog afiniteta za neki ne-specifični antigen.

[0056] Termin "linker", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više amino-kiselinskih ostataka ugrađenih između imunoglobulinskih domena kako bi omogućili dovoljnu mobilnost domena lakih i teških lanaca sa ciljem da se unakrsno zamotaju oko imunoglobulina sa dvojnim varijabilnim regionom. Linker je ugrađen na prelazu između varijabilnih domena ili između varijabilnog i konstantnog domena, na nivou sekvence. Prelaz između domena može da se identifikuje zbog toga šta je približna veličina imunoglobulinskih domena dobro poznata. Precizna lokacija prelaza domena može da se odredi uz pomoć lociranja peptidnih isečaka koji ne formiraju sekundarne strukturne elemente poput beta-ploha ili alfa-heliksa kao šta je pokazano uz pomoć eksperimentalnih podataka ili kao šta može da se predvidi uz pomoć tehnika modeliranja ili predviđanja sekundarnih struktura. Ovde opisani linkeri se označavaju kao L1, koji je lociran na lakom lancu između N-terminalnih VL1i VL2domena; L2, koji se takođe nalazi na lakom lancu je lociran između VL2i C-terminalnih CLdomena. Linkeri iz teškog lanca su poznati kao L3, koji je lociran između N-terminalnih VH2i VH1domena; i L4, koji je lociran između VH1i CH1-Fc domena. Linkeri L1, L2, L3, i L4su nezavisni, ali u nekim slučajevima mogu da imaju istu sekvencu i/ili dužinu.

[0057] Termin "vektor", kao šta se ovde koristi, se odnosi na bilo koji molekul (na primer, nukleinska kiselina, plazmid, ili virus) koji se koristi da se prenese kodirana informacija u ćeliju domaćin. Termin "vektor" uključuje neki molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu na koju je spojen. Jedan tip vektora je "plazmid", koji se odnosi na cirkularni dvo-lančani DNA molekul u kojeg su ugrađeni dodatni DNA segmenti. Drugi tip vektora je neki viralni vektor, pri čemu dodatni DNA segmenti mogu da budu ugrađeni u viralni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (na primer, bakterijski vektori koji imaju bakterijski početak replikacije i episomalni vektori za ćelije sisara). Drugi vektori (na primer, ne-episomalni vektori za ćelije sisara) mogu da se ugrade u genom ćelije domaćina nakon ulaska u nju, pa se prema tome repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Osim toga, određeni vektori su sposobni da diriguju ekspresiju gena na koje su operativno spojeni. Takvi vektori se ovde nazivaju "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Uopšteno, ekspresioni vektori koji se primenjuju u tehnikama rekombinantne DNA su često u formi plazmida. Termini "plazmid" i "vektor" ovde mogu da se koriste kao sinonimi, jer je plazmid najčešća korišćena forma vektora. Međutim, ovaj pronalazak ima za cilj da obuhvati i druge forme ekspresionih vektora, poput viralnih vektora (na primer, retorvirusi koji se ne repliciraju, adenovirusi, i adeno-slični virusi), koji služe predviđenoj nameni podjednako dobro.

[0058] Termin "operativno spojen" ovde se koristi sa ciljem da se opiše aranžman susednih (bočnih) sekvenca pri čemu su pomenute bočne sekvence konfigurisane ili sklopljene tako da mogu da obavljaju svoje uobičajene funkcije. Tako, bočna sekvenca koja je operativno spojena na kodirajuću sekvencu može da bude sposobna da potakne replikaciju, transkripciju, i/ili translaciju kodirajuće sekvence. Na primer, neka kodirajuća sekvenca je operativno spojena na neki promotor kada je pomenuti promotor sposoban da potakne transkripciju pomenute kodirajuće sekvence. Bočna sekvenca ne mora da bude susedna kodirajućoj sekvenci sve dok ispravno funkcionira. Tako, na primer, interventne ne-translatirane sekvence koje se transkribiraju mogu da budu prisutne između sekvence promotora i kodirajuće sekvence, pri čemu se sekvenca promotora još uvek smatra "operativno spojenom" na pomenutu kodirajuću sekvencu.

[0059] Fraza "rekombinantna ćelija domaćin" (ili "ćelija domaćin"), kao šta se ovde koristi, se odnosi na neku ćeliju u koju je uveden neki rekombinantni ekspresioni vektor. Predviđeno je

2

da rekombinantna ćelija domaćin ili ćelija domaćin obuhvata ne samo određenu ćeliju subjekt, već takođe i potomke takve ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu pojaviti u budućim generacijama usled mutacija ili okolišnih uticaja, takvi potomci ne moraju, u stvari, da budu identični sa parentnom ćelijom, ali su takve ćelije još uvek obuhvaćene okvirima termina "ćelija domaćin", na način kao šta se ovde koristi. Brojni ekspresioni sistemi u ćeliji domaćinu mogu da se koriste sa ciljem da se eksprimiraju vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska, uključujući bakterijske, kvašćeve, bakuloviralne, i sisteme za ekspresiju u ćelijama sisara (kao i ekspresioni sistemi za izlaganje faga). Jedan primer za prikladan bakterijski ekspresioni vektor je pUC19. Sa ciljem da se neka vezna belančevina slična antitelu eksprimira rekombinantno, ćelija domaćin se transformira ili transfektira sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose DNA fragmente koji kodiraju polipeptidne lance pomenute vezne belančevine slične antitelu na način da se pomenuti polipeptidni lanci eksprimiraju u ćeliji domaćina, a, preferirano, da se izlučuju u medijumu u kojem se ćelije domaćini uzgajaju, iz kojeg medijuma pomenuta vezna belančevina slična antitelu može da se obnovi.

[0060] Termin "transformacija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na promenu ćelijskih genetičkih karakteristika, a ćelija je transformirana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNA. Na primer, ćelija je transformisana kada je genetički modifikovana tako da je promenjeno njeno prirodno stanje. Nakon transformacije, transformirajuća DNA može da rekombinira sa genomom ćelije tako da se fizički ugradi u hromosom pomenute ćelije, ili može da se privremeno održava u formi episomalnog elementa bez da se replicira, ili može da se replicira nezavisno kao plazmid. Ćelija se smatra stabilno transformiranom kada se DNA replicira zajedno sa deobom ćelije. Termin "transfekcija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na unos strane ili egozogene DNA u neku ćeliju, pri čemu je ćelija "transfektovana" kada se egzogena DNA uvede u ćeliju. Stanju tehnike su poznate brojne tehnike transfekcije. Takve tehnike mogu da se koriste da se uvede jedan ili više egzogenih DNA molekula u neku prikladnu ćeliju domaćin.

[0061] Termin "pojavljuje se prirodno" kada se koristi i primenjuje na neki predmet se odnosi na činjenicu da se pomenuti predmet može naći u prirodi i da nije manipulisan od strane čoveka. Na primer, neki polinukleotid ili polipeptid koji je prisutan u nekom organizmu (uključujući i viruse), koji može da se izoluje iz nekog prirodnog izvora i koji nije bio ciljano modifikovan od strane čoveka je prirodan. Slično, "ne-prirodno", kao šta se ovde koristi, se odnosi na neki predmet koji ne može da se pronađe u prirodi ili koji je strukturno modifikovan ili sintetizovan od strane čoveka.

[0062] Kao šta se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih kiselina i njihove skraćenice se primenjuju na uobičajeni način. Stereoizomeri (na primer, D-amino-kiseline) dvadeset konvencionalnih amino-kiselina; neprirodnih amino-kiselina poput α-, α-disupstituisanih amino-kiselina, N-alkil amino-kiselina, mlečna kiselina, i druge ne-konvencionalne aminokiseline mogu takođe da budu prikladne komponente za polipeptidne lance veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska. Primeri za ne-konvencionalne amino-kiseline uključuju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične amino-kiseline i imino-kiseline (na primer, 4-hidroksiprolin). Šta se tiče polipeptidne notacije koja se ovde koristi, levi smer je amino-terminalni smer, a desni smer je karboksil-terminalni smer, u skladu sa standardima i konvencijama.

[0063] Prirodni ostaci mogu da se podele u klase na bazi karakteristika običnog bočnog lanca:

(1) hidrofobno: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2) polarno hidrofilno: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr ;

(3) alifatsko: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4) alifatsko hidrofobno: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5) neutralno hidrofilno: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6) kiselo: Asp, Glu;

(7) bazno: His, Lys, Arg;

(8) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(9) aromatsko: His, Tip, Tyr, Phe; i

(10) aromatsko hidrofobno: Phe, Trp, Tyr.

[0064] Konzervativne amino-kiselinske supstitucije mogu da uključuju izmenu nekog člana iz jedne klase sa drugim članom iz iste klase. Konzervativne amino-kiselinske supstitucije mogu da obuhvataju ne-prirodne amino-kiselinske ostatke, koji se tipično ugrađuju uz pomoć hemijske sinteze peptida pre no sintezom u biološkom sistemu. Pomenuto uključuje peptidomimetike i druge reverzne ili invertne forme amino-kiselinskih ostataka. Nekonzervativne supstitucije mogu da uključuju izmenu jednog člana iz jedne klase sa članom iz neke druge klase.

2

[0065] Stručnjak je sposoban da odredi prikladne varijante polipeptidnih lanaca veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska primenom dobro poznatih tehnika. Na primer, stručnjak može da identifikuje prikladne delove u polipeptidnom lancu koji mogu da se promene bez da se uništi aktivnost uz pomoć ciljanja regiona za koje se veruje da nisu važni za aktivnost. Alternativno, stručnjak može da identifikuje ostatke i delove molekula koji su konzervisani između sličnih polipeptida. Osim toga, čak i delovi koji su važni za biološku aktivnost ili za strukturu mogu da se podvrgnu konzervativnim amino-kiselinskim supstitucijama bez da se uništi biološka aktivnost ili bez štetnih efekata koji bi uticali na polipeptidnu strukturu.

[0066] Termin "pacijent", kao šta se ovde koristi, uključuje humane i životinjske subjekte.

[0067] "Poremećaj" je bilo koje stanje koje bi imalo korist od tretmana sa veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska. "Poremećaj" i "stanje" se ovde koriste kao sinonimi i uključuju hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja prema kojima pacijent ima sklonosti.

[0068] Termini "tretman" ili "tretiranje", kao šta se ovde koriste, se odnose na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Pacijenti koji trebaju takav tretman uključuju one koji boluju od pomenutog poremećaja kao i one koji imaju sklonost da razviju pomenuti poremećaj ili one kod kojih se pomenuti poremećaj treba sprečiti.

[0069] Termini "farmaceutska kompozicija" ili "terapeutska kompozicija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedinjenje ili kompoziciju koja je sposobna da uzrokuje željeni terapeutski efekt kada se pravilno administrira nekom pacijentu.

[0070] Termin "farmaceutski prihvatljivi nosilac" ili "fiziološki prihvatljivi nosilac", kao šta se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više materijala za formulaciju koji su prikladni za postizanje ili pojačavanje dostave veznih belančevina sličnih antitelu.

[0071] Termini "efektivna količina" i "terapeutski efektivna količina" kada se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jednu ili više veznih belančevina sličnih antitelu podrazumeva količinu ili dozu koja je dovoljna da se proizvede željeni terapeutski rezultat. Još

2

specifičnije, terapeutski efektivna količina je ona količina vezne belančevine slične antitelu koja je dovoljna da inhibira, tokom određenog vremenskog perioda, jedan ili više kliničkih definisanih patoloških procesa povezanih sa stanjem koje se tretira. Efektivna količina može da varira u zavisnosti o specifičnoj veznoj belančevini sličnoj antitelu koja se koristi, a takođe zavisi o brojnim faktorima i stanjima povezanim sa pacijentom koji prima tretman i sa snagom samog poremećaja. Na primer, ako se pomenuta vezna belančevina slična antitelu treba administrirati in vivo, faktori poput starosti, težine, i zdravlja pacijenta kao i kriva odgovora na dozu i podaci o toksičnosti, dobiveni uz pomoć pred-kliničkih istraživanja na životinjama, spadaju u faktore koji su važni za razmatranje. Određivanje efektivne količine ili terapeutski efektivne količine određene farmaceutske kompozicije spada u uobičajenu ekspertizu stručnjaka.

[0072] Jedna izvedba ovoga pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata neki farmaceutski prihvatljivi nosilac i terapeutski efektivnu količinu neke vezne belančevine slične antitelu.

2. Vezne belančevine slične antitelu

[0073] U jednoj izvedbi ovoga pronalaska, pomenute vezne belančevine slične antitelu obuhvataju četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri mesta za vezanje antigena podobna da specifično vežu jedan ili više ciljanih antigena, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

a dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

gde:

VL1je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region drške, a CH2i CH3su konstantni domeni imunoglobulinskog teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri; gde

2

je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

[0074] U drugoj izvedbi ovoga pronalaska, pomenute vezne belančevine slične antitelu obuhvataju dva polipeptidna lanca koja formiraju da su mesta za vezanje antigena podobna da specifično vežu jedan ili više ciljanih antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

gde:

VL1je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri; gde

je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1i VH1i za uparivanje VL2i VH2, i gde prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.

[0075] Pomenute belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska mogu da se pripreme primenom domena ili sekvenca koji su dobiveni ili izvedeni iz bilo kojeg humanog ili nehumanog antitela, uključujući, na primer, humana, mišja, ili humanizovana antitela.

[0076] Kod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska, L1sadrži 1 do 3 amino-kiselinska ostatka, L2sadrži 1 do 4 amino-kiselinska ostatka, L3sadrži 2 do 15 aminokiselinskih ostataka, a L4sadrži 2 do 15 amino-kiselinskih ostataka. Kod drugih veznih belančevina sličnih antitelu, L1sadrži 1 do 2 amino-kiselinska ostatka, L2sadrži 1 do 2 amino-

2

kiselinska ostatka, L3sadrži 4 do 12 amino-kiselinskih ostataka, a L4sadrži 2 do 12 aminokiselinskih ostataka. Kod preferirane vezne belančevine slične antitelu, L1sadrži 1 aminokiselinski ostatak, L2sadrži 2 amino-kiselinska ostatka, L3sadrži 7 amino-kiselinskih ostataka, a L4sadrži 5 amino-kiselinskih ostataka.

[0077] U nekim veznim belančevima sličnih antitelu pronalaska L1može biti jednako nuli. Međutim, kod veznih belančevina sličnih antitelu gde je L1jednak nuli, odgovarajući prelazni linker između varijabilnog regiona i konstantnog regiona ili između dvostrukih varijabilnih domena na drugom lancu ne mogu da budu nula. U nekim izvedbama, L1je jednak nuli, a L3sadrži 2 ili više amino-kiselinskih ostataka.

[0078] Kod nekih veznih belančevina sličnih antitelu iz ovoga pronalaska, najmanje jedan od linkera, koji je izabran iz grupe koja obuhvata L1, L2, L3, i L4, sadrži najmanje jedan cisteinski ostatak.

[0079] Primeri za prikladne linkere uključuju pojedinačni glicinski (Gly) ostatak; diglicinski peptid (Gly-Gly); tripeptid (Gly-Gly-Gly); peptid sa četiri glicinska ostatka (Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID BR: 25); peptid sa pet glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID BR: 26); peptid sa šest glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID BR: 27); peptid sa sedam glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID BR: 28); peptid sa osam glicinskih ostataka (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID BR: 29). Druge kombinacije amino-kiselinskih ostataka mogu da se koriste kao peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID BR: 30) i peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID BR: 31). Drugi prikladni linkeri uključuju pojedinačni Ser, i Val ostatak; dipeptid Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, i Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID BR: 52), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID BR: 53), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID BR: 54), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID BR: 55); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID BR: 48), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID BR: 49), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID BR: 50), i His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID BR: 51). Navedeni primeri ne ograničavaju okrive ovoga pronalaska na bilo koji način, a linkeri koji sadrže nasumično odabranih amino-kiselina izabranih iz grupe koja sadrži valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, lizin, arginin, histidin, aspartat, glutamat, asparagin, glutamin, glicin, i prolin su se pokazali prikladnima za vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska (vidi Primer 12).

2

[0080] Identitet i sekvenca amino-kiselinskih ostataka u linkeru mogu da zavise o tipu sekundarnog strukturnog elementa koji je neophodan za izgradnju linkera. Na primer, glicin, serin, i alanin su najbolji za linkere koji poseduju maksimalnu fleksibilnost. Neke kombinacije glicina, prolina, treonina, i serina su korisne ako je potreban rigidniji i izduženiji linker. Bilo koji amino-kiselinski ostatak može da se smatra linkerom u kombinaciji sa drugim aminokiselinskim ostacima sa ciljem da se konstruišu veći peptidni linkeri koji neophodno zavise o željenim karakteristikama.

[0081] U nekim veznim belančevinama sličnim antitelu iz ovoga pronalaska, VL1obuhvata amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 1; VL2obuhvata amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 3; VH1obuhvata amino-kiselinu sekvencu SEQ ID BR: 2; a VH2obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 4.

[0082] U nekim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da se specifično veže na jedan ili više ciljanih antigena. U preferiranim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da se specifično veže na najmanje jedan ciljani antigen izabran iz grupe koja obuhvata B7.1, B7.2, BAFF, BlyS, C3, C5, CCL11 (eotaksin), CCL15 (MIP-1d), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MPIF-2/eotaksin-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaksin-3), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (E-kaderin), hitinazu, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXCL12 (SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL415, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (b4 integrin), LEP (leptin), MHC iz klase II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNF-a, TNFSF4 (OX40 ligand), TNFSF5 (CD40 ligand), Toll-like receptore, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1 (GPR5/CCXCR1), DNGR-1(CLEC91), i HMGB1. U drugim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da inhibira delovanje jednog ili više ciljanih antigena.

[0083] U nekim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je bispecifična i sposobna da veže dva različita ciljana antigena ili epitopa. U jednoj preferiranoj izvedbi ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu je bispecifična pri čemu je svaki par laki lanacteški lanac sposoban da veže dva različita ciljana antigena ili epitopa. U još jednoj preferiranoj izvedbi, vezna belančevina slična antitelu je sposobna da veže dva različita ciljna antigena koja su izabrana iz grupe koja obuhvata IL4 i IL13, IGF1R i HER2, IGF1R i EGFR, EGFR i HER2, BK i IL13, PDL-1 i CTLA-4, CTLA4 i MHC iz klase II, IL-12 i IL-18, IL-1α i IL-1β, TNFα i IL12/23, TNFα i IL-12p40, TNFα i IL-1β, TNFα i IL-23, i IL17 i IL23. U još jednoj preferiranoj izvedbi, pomenuta vezna belančevina slična antitelu je sposobna da veže ciljane antigene IL4 i IL13.

[0084] U nekim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu specifično veže IL4 sa on-rate konstantom od 2.97 E+07 i off-rate konstantom od 3.30 E-04 i specifično veže IL13 sa on-rate konstantom od 1.39 E+06 i off-rate konstantom od 1.63 E-04. U drugim izvedbama ovoga pronalaska, vezna belančevina slična antitelu specifično veže IL4 sa on-rate konstantom od 3.16 E+07 i off-rate konstantom od 2.89 E-04 i specifično veže IL13 sa on-rate konstantom od 1.20 E+06 i off-rate konstantom od 1.12 E-04.

[0085] U jednoj izvedbi pronalaska vezna belančevina slična antitelu, koja obuhvata četiri polipeptidna lanaca koja formiraju četiri mesta za vezanje antigena, se priprema uz pomoć a) identifikovanja varijabilnog domena iz prvog antitela, koji veže prvi ciljani antigen, i varijabilnog domena iz drugog antitela, koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu svaki sadrži VL, i VH;

b) pripisivanja lakom lancu ili teškom lancu oznaku lanac kalup;

c) pripisivanja VLiz varijabilnog domena iz prvog antitela ili iz varijabilnog domena iz drugog antitela oznaku VL1;

d) označavanja VL2, VH1,i VH2u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:

e) određivanja maksimalnih i minimalnih dužina za L1, L2, L3, i L4;

f) generisanja polipeptidnih struktura sa formulama I i II;

g) izbora polipeptidnih struktura sa formulama I i II koje vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada su spojeni tako da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

1

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region drške, a CH2, CH3su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1i VH1i za uparivanje VL2i VH2, a polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni para laki lanac-teški lanac.

[0086] U drugom izvedbama pronalaska vezna belančevina slična antitelu, koja obuhvata četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, priprema uz pomoć a) identifikovanja varijabilnog domena iz prvog antitela, koji veže prvi ciljani antigen, i varijabilnog domena iz drugog antitela, koji veže drugi ciljani antigen, pri čemu oba sadrže VL, i VH;

b) pripisivanja lakom lancu ili teškom lancu oznaku lanac kalup;

d) označavanja VL2, VH1,i VH2u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:

e) određivanja maksimalnih i minimalnih dužina za L1, L2, L3, i L4;

f) generisanja polipeptidnih struktura sa formulama I i II;

g) izbora polipeptidnih struktura sa formulama I i II koje se vežu na prvi ciljani antigen i na drugi ciljani antigen kada su spojeni tako da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu; gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL1je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

2

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

i gde polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanacteški lanac.

[0087] U drugim izvedbama pronalaska se priprema vezna belančevina slična antitelu u kojoj su varijabilni domen iz prvog antitela i varijabilni domen iz drugog antitela isti.

[0088] Jedna izvedba pronalaska obezbeđuje postupak za proizvodnju vezne belančevine slične antitelu koji obuhvata eksprimiranje (u ćeliji) jednog ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji imaju strukture predstavljene sa formulama [I] i [II] ispod:

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2;i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

[0089] Druga izvedba pronalaska obezbeđuje postupak za proizvodnju vezne belančevine slične antitelu koji obuhvata eksprimiranje (u ćeliji) jednog ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji imaju strukture koje su predstavljene sa formulama [I] i [II] ispod:

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL1je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1i VH1i za uparivanje VL2i VH2, a polipeptid sa formulom I i polipeptid sa formulom II formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.

3. Primene veznih belančevina sličnih antitelu

[0090] Vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska mogu da se primene u bilo kojem poznatom ogledu, poput ogleda kompetetivnog vezanja, direktnih i indirektnih sendvič-ogleda, i ogleda imunoprecipitacije sa ciljem detektovanja i kvantifikovanja jednog ili više ciljanih antigena. Vezne belančevine slične antitelu će se vezati na jedan ili više ciljanih antigena sa afinitetom koji je prikladan za primenjeni ogled.

[0091] Za dijagnostičke primene, u nekim izvedbama, vezne belančevine slične antitelu mogu da se označe uz pomoć ostatka koji može da se detektuje. Pomenuti ostatak koji može da se detektuje može da bude bilo koji ostatak koji može da proizvede, direktno ili indirektno, signal koji može da se detektuje. Na primer, ostatak koji može da se detektuje može da bude neki radioizotop, poput<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<125>I,<99>Tc,<111>In, ili<67>Ga; neko fluorescentno ili hemiluminescentno jedinjenje, poput fluorescein izotiocijanata, rodamina, ili luciferina; ili neki encim, poput alkalne fosfataze, β-galaktozidaze, ili peroksidaze iz hrena.

[0092] Vezne belančevine slične antitelu iz ovoga pronalaska su takođe korisne za in vivo snimanja. Vezna belančevina slična antitelu koja je označena sa nekim ostatkom koji može da

4

se detektuje može da se administrira nekoj životinji, preferirano u krvotok, a tada se analizira prisustvo i lokacija označenog antitela. Vezna belančevina slična antitelu može da bude označena sa bilo kojim ostatkom koji može da se detektuje u nekoj životinji uz pomoć nuklearne magnetne rezonance, radiologije, ili uz pomoć drugih načina detektovanja koji su poznati stanju tehnike.

[0093] Pronalazak se takođe odnosi na komplet koji sadrži veznu belančevinu sličnu antitelu pronalaska i druge reagense korisne za detektovanje nivoa ciljnog antigena u biološkim primercima. Takvi reagensi uključuju oznaku koja može da se detektuje, serum za blokiranje, primerke za pozitivnu i negativnu kontrolu, i reagense za detektovanje.

4. Terapeutske kompozicije sa veznom belančevinom sličnom antitelu i njihovo administriranje

[0094] Terapeutske ili farmaceutske kompozicije koje sadrže vezne belančevine slične antitelu pronalaska, spadaju u okvire ovoga pronalaska. Takve terapeutske ili farmaceutske kompozicije mogu da sadrže terapeutski efektivnu količinu neke vezne belančevine slične antitelu, lekoviti konjugat vezne belančevine slične antitelu u smeši sa nekom farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim agensom za formulisanje koji je izabran tako da bude prikladan sa modusom za administriranje.

[0095] Prihvatljivi materijali za formulisanje su netoksični za recipijente u dozama i koncentracijama u kojima se primenjuju.

[0096] Pomenuta farmaceutska kompozicija može da sadrži materijale za formulisanje koji služe modifikovanju, održavanju, ili konzervisanju, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, stope raspadanja ili oslobađanja, apsorpcije, ili penetracije same kompozicije. Prikladni materijali za formulisanje uključuju, ali bez ograničenja, amino-kiseline (poput glicina, glutamina, asparagina, arginina, ili lizina), sredstva protiv mikroorganizama, antioksidanse (poput askorbinske kiseline, natrijum sulfita, ili natrijum hidrogen-sulfita), pufere (poput borata, bikarbonata, Tris-HCI, raznih citrata, fosfata, ili drugih organskih kiselina), agense za bubrenje (poput manitola ili glicina), agense za heliranje (poput etilendiamin tetraoctene kiseline (EDTA)), agense za kompleksovanje (poput kofeina, polivinilpirolidona, beta-ciklodekstrina, ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrina), filere, monosaharide, disaharide, i druge ugljohidrate (poput glikoze, manoze, ili dekstrina), belančevine (poput albumina iz seruma, želatina, ili raznih imunoglobulina), agense za boju, ukus i za razblaživanje, agense za emulziju, hidrofilne polimere (poput polivinilpirolidona), polipeptide niske molekularne mase, kontra-jone koji formiraju soli (poput natrijuma), konzervanse (poput benzalkonijum hlorida, benzojeve kiseline, salicilne kiseline, timerosala, fenetil alkohola, metilparabena, propilparabena, hlorheksidina, sorbinske kiseline, ili hidrogen peroksida), rastvarače (poput glicerina, propilen glikola, ili polietilen glikola), šećerne alkohole (poput manitola ili sorbitola), agense za suspendovanje, surfaktante ili agense za vlaženje (poput pluronika; PEG; sorbitan estera; polisorbata kao polisorbat 20 ili polisorbat 80; tritona; trometamina; lecitina; holesterola ili tiloksapala), agense koji pojačavaju stabilnost (poput saharoze ili sorbitola), agense koji pojačavaju tonicitet (poput alkalo-metalnih halida – preferirano natrijum ili kalijum hlorid – ili manitol sorbitola), prenosnike za dostavu, razblaživaće, ekscipijente i/ili farmaceutske dodatke (vidi, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18. izd., A.R. Gennaro, ur., Mack Publishing Company 1990), i novija izdanja pomenutog naslova).

[0097] Optimalnu farmaceutsku kompoziciju određuje stručnjak u zavisnosti o, na primer, predviđene rute za administriranje, formata za dostavu, i željene doze. Takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, stopu otpuštanja in vivo, i stopu čišćenja in vivo pomenute vezne belančevine slične antitelu.

[0098] Primarni prenosnik ili nosilac u nekoj farmaceutskoj kompoziciji može da bude tečan ili ne-tečan po prirodi. Na primer, neki prikladni prenosnik ili nosilac za injekciju može da bude voda, fiziološki salini rastvor, ili veštačka cerebrospinalna tečnost, moguće obogaćena sa drugim materijalima koji su uobičajeni kod kompozicija namenjenih za parenteralno administriranje. Prirodno puferovana slanica ili slanica pomešana sa albuminom iz seruma su dodatni primeri za prenosnike. Drugi primeri za farmaceutske kompozicije obuhvataju Trispufer (pH od oko 7.0-8.5), ili acetatni pufer (pH od oko 4.0-5.5), koji dodatno može da uključuje sorbitol ili neku prikladnu zamenu. U jednom apsektu pronalaska vezne belančevine slične antitelu mogu da se pripreme za skladištenje na način da se pomeša izabrana kompozicija, koja ima željenu stepen čistoće, sa opcionim agensima za formulisanje u formi liofilizovanog kolača ili nekog vodenog rastvora. Nadalje, pomenuta vezna belančevina slična antitelu može da se formuliše kao liofilizat primenom odgovarajućih ekscipijenata poput saharoze.

[0099] Farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da budu namenjene za parenteralnu dostavu. Alternativno, pomenute kompozicije mogu da budu namenjene za inhalaciju ili za dostavu preko digestivnog trakta, na primer oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je poznata stručnjacima.

[0100] Komponente pomenute formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto administriranja. Na primer, puferi se koriste sa ciljem da se u kompoziciji održava fiziološki pH ili blago niži pH, tipično u pH rasponu od oko 5 do oko 8.

[0101] Kada se govori o parenteralnom administriranju, pomenute terapeutske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu da budu u formi vodenog rastvora koji ne sadrži pirogen, koji je parenteralno prihvatljiv, i koji sadrži željenu veznu belančevinu sličnu antitelu u nekom farmaceutski prihvatljivom prenosniku. Posebno prikladan prenosnik za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je formulisana vezna belančevina slična antitelu u formi sterilnog, izotoničnog rastvora, koji je propisno konzervisan. Jedan drugi preparat može da uključuje formulaciju željenog molekula sa nekim agensom, poput mikro-sfera za injektiranje, čestica za bio-eroziju, polimernih jedinjenja (poput poli-mlečne kiseline ili poliglikolne kiseline), kuglica, ili liposoma, koje obezbeđuje kontrolisano ili zadržano oslobađanje produkta koji može da se dostavi preko depo-injekcije. Hijaluronska kiselina takođe može da se koristi, a to može da obezbedi efekt održivog trajanja tokom cirkulisanja. Drugi prikladni načini uvođenja željenog molekula uključuju dostavu leka preko naprave za implantiranje.

[0102] U jednoj izvedbi, farmaceutska kompozicija može da se formuliše kao preparat za inhalaciju. Na primer, vezna belančevina slična antitelu može da se formuliše kao suvi prah za inhalaciju. Rastvori za inhalaciju vezne belančevine slične antitelu takođe mogu da se formulišu uz pomoć propelanta za dostavu aerosola. U još jednoj izvedbi, pomenuti rastvori mogu da budu nebulizovani.

[0103] Takođe je predviđeno da se određene formulacije administriraju oralno. U jednom aspektu pronalaska, vezne belančevine slične antitelu koje se administriraju na ovaj način mogu da se formulišu sa ili bez onih nosioca koji se uobičajeno koriste kod pripreme čvrstih doznih forma poput tableta i kapsula. Na primer, kapsula može da se dizajnira tako da oslobađa aktivni deo formulacije u tačno određenoj tačci gastrointestinalnog trakta gde je bio-dostupnost maksimalna, a pre-sistemska degradacija minimalna. Dodatni agensi mogu da se dodaju sa ciljem da se ubrza apsorpcija vezne belančevine slične antitelu. Razređivači, agensi za ukus, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, agensi za suspendovanja, agensi za raspadanje tablete, i veznici takođe mogu da se primene.

[0104] Druga farmaceutska kompozicija može da sadrži efektivnu količinu veznih belančevina sličnih antitelu u smeši ne-toksičnih ekscipijenata koji su prikladni za proizvodnju tableta. Uz pomoć rastvaranja tableta u sterilnoj vodi, ili u drugom prikladnom prenosniku, mogu da se pripreme rastvori u formi pojedinačnih doza. Prikladni ekscipijenti uključuju, ali bez ograničenja, inertne razblaživaće, poput kalcijum karbonata, natrijum karbonata ili bikarbonata, laktoze, ili kalcijum fosfata; ili vezne agense, poput skroba, želatina, ili akcije; ili lubrikante poput magnezijum stearata, stearinske kiseline, ili talka.

[0105] Dodatne farmaceutske kompozicije pronalaska će biti evidentne stručnjacima, uključujući formulacije koje sadrže vezne belančevine slične antitelu koje su formulisane u preparatima za zadržanu- ili kontrolisanu-dostavu. Stručnjacima su poznate brojne tehnike za formulisanje preparata za zadržanu- ili kontrolisanu-dostavu, poput liposomalnih nosioca, mikročestica za bio-eroziju ili poroznih kuglica i depo-injekcija. Dodatni primeri za preparate za zadržano otpuštanje uključuju polu-propustljive polimerne matrice u formi oblikovanih artikala, na primer, filmova, ili mikrokapsula. Matrice za zadržano otpuštanje mogu da uključuju poliestere, hidrogelove, polilaktide, kopolimer L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat, poli(2-hidroksietilmetakrilat), etilen vinil acetat, ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Kompozicije za zadržano otpuštanje takođe mogu da uključuju liposome, koji mogu da se pripreme na više načina koji su poznat stanju tehnike.

[0106] Farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za in vivo administriranje, pri čemu tipično moraju da budu sterilne. To može da se postigne uz pomoć filtriranja kroz sterilnih membrana za filtriranje. Kada je pomenuta kompozicija liofilizovana, sterilizacija može da se primeni pre, ili nakon, liofilizovanja i obnavljanja. Kompozicija za parenteralno administriranje može da se skladišti u liofilizovanoj formi ili u formi rastvora. Osim toga, parenteralne kompozicije se uobičajeno smeštaju u kontejner koji ima sterilni otvor za, na primer, intravenoznu vrećicu ili posudu koja sadrži zatvarač koji može da se probije uz pomoć igle za hipodermičku injekciju.

[0107] Jednom kada se farmaceutska kompozicija formuliše, može da se skladišti u sterilnim posudama u formi rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste materije, ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu da se skladište u formi preparata „gotov-zaupotrebu“ ili u formi preparata (na primer, liofilizovan) koji zahteva obnovu neposredno pre administriranja.

[0108] Pronalazak takođe obuhvata komplete hemikalija za proizvodnju pojedinačnih doznih jedinica. Pomenuti kompleti hemikalija mogu da obuhvataju prvi kontejner koji sadrži osušenu belančevinu i drugi kontejner koji sadrži vodenu formulaciju. Takođe su obuhvaćeni obimom pronalaska kompleti hemikalija koji sadrže pojedinačne i višestruke špriceve koji su od pre ispunjeni sa formulacijom (na primer, tečni špricevi i liošpricevi).

[0109] Efektivna količina farmaceutske kompozicije sa veznim belančevinama sličnim antitelu, koja se primenjuje terapeutski, zavisi, na primer, o terapeutskom kontekstu i ciljevima. Stručnjak razume da će odgovarajući nivoi za tretman zavisiti, delomično, o molekulu koji se dostavlja, o indikaciji za koju se primenjuje vezna belančevina slična antitelu, ruti za administriranje, i veličini (telesnoj težini, telesnoj površini, ili veličini organa) i stanju (starosti i opšteg zdravstvenog stanja) pacijenta. Prema tome, kliničar može da titrira dozu i da modifikuje rutu za administriranje kako bi postigao optimalni terapeutski efekt. Tipična doza može da se kreće u rasponu od oko 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti o ovde pomenutim faktorima. U drugim izvedbama, pomenuta doza može da se kreće u rasponu od 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 µg/kg, 10 µg/kg, 15 µg/kg, 20 µg/kg, 25 µg/kg, 30 µg/kg, 35 µg/kg, 40 µg/kg, 45 µg/kg, 50 µg/kg, 55 µg/kg, 60 µg/kg, 65 µg/kg, 70 µg/kg, 75 µg/kg, do oko 100 mg/kg.

[0110] Frekvencija doziranja zavisi o farmakokinetičkim parametrima vezne belančevine slične antitelu iz formulacije koja se primenjuje. Tipično, kliničar administrira kompoziciju do postizanja doze koja postiže željeni efekt. Pomenuta kompozicija, prema tome, može da se administrira kao pojedinačna doza, kao dve ili više doza (koje mogu, ali ne moraju, da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuiranu infuzija preko implantirane naprave ili katetera. Dodatno podešavanje odgovarajuće doze je rutinsko znanje i veština stručnjaka. Odgovarajuće doze mogu da se utvrde uz pomoć primene odgovarajućih podataka koji proizlaze iz odgovora na dozu.

[0111] Ruta za administriranje pomenute farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, na primer, oralno; preko injekcije kroz intravenozne, intraperitonealne, intracerebralne (intraparenhimalne), intracerebroventrikularne, intramuskularne, intraokularne, intraarterijalne, intraportalne, ili intralezionalne rute; uz pomoć sistema za zadržano otpuštanje; ili uz pomoć naprava za implantiranje. Ako je poželjno, pomenute kompozicije mogu da se administriraju uz pomoć bolus-injekcije ili kontinuirano preko infuzije, ili uz pomoć implantirane naprave.

[0112] Pomenuta kompozicija može da se administrira lokalno preko implantiranja membrane, sunđera, ili nekog drugog odgovarajućeg materijala u kojem je poželjni molekul bio apsorbiran ili enkapsuliran. Kada se koristi implantirana naprava, pomenuta može da se implantira u neko odgovarajuće tkivo ili organ, a dostava željenog molekula može da se ostvari uz pomoć difuzije, bolusa koji se oslobađa tokom vremena, ili uz pomoć kontinuiranog administriranja.

5. Primeri

[0113] Primeri služe samo kao ilustracija i ne treba da ih se shvati kao da ograničavaju okvire ovoga pronalaska na bilo koji način.

Primer 1. Dizajn i projektovanje bispecifičnih veznih belančevina sličnih antitelu sa ukrštenim dvojnim varijabilnim regionom

[0114] Ukršteni dvojni varijabilni region u Fv formatu je opisan u U.S. patentu br.5,989,830, a navodi se kao ukrštena dvoglava (CODH) konfiguracija. Molekularno modeliranje predviđa da ukršteni dvoglavi (CODH) dizajn dovodi do kompleksa u kojem su oba vezna mesta usmerena u suprotnim smerovima, bez ograničenja koja su sugerisana za Dvostruku-Fv konfiguraciju. CODH Fv format je ispitan sa ciljem da se utvrdi da li može da se konvertuje u kompletne molekule slične antitelu uz pomoć dodavanja CLdomena lakom lancu i Fc regiona teškom lancu. Slična konverzija je uspešna za odgovarajuće dvojne varijabilne domene (DVD-Ig) i TBTI kao šta je opisano u U.S. patentu br. 7,612,181 i Internacionalnoj prijavi br. WO 2009/052081. Raspored varijabilnih regiona u CODH formatu je prikazan u strukturama ispod koje ukazuju na orijentaciju peptidnih lanaca u smeru amino-prema-karboksilu:

(a) laki lanac: NH2-VL1-Linker-VL2-COOH

(b) teški lanac: NH2-VH2-Linker-VH1-COOH.

4

[0115] Pomenuti amino-prema-karboksilu terminalni aranžman varijabilnih regiona u (a) i (b) iznad može da se razlikuje od aranžmana u Dvostrukoj-Fv konfiguraciji koja je prikazana pod (c) i (d) ispod:

(c) laki lanac: NH2-VL1-Linker-VL2-COOH

(d) teški lanac: NH2-VH1-Linker-VH2-COOH.

[0116] Glavna razlika, koja treba da se primeti, je različiti raspored odgovarajućih varijabilnih regiona iz lakog lanca i teškog lanca (VH1/VL1i VH2/VL2), jedan prema drugomu, u konfiguracijama sa dva dvostruka varijabilna regiona. Odgovarajući VL1i VH1domeni se nalaze na N-terminusu lakog i teškog lanca u konfiguraciji sa dvostrukim varijabilnim regionom. Suprotno, u ukrštenoj konfiguraciji, jedna polovina jednog para varijabilnog regiona antitela je prostorno odvojena sa proteinskim lancem u ukrštenoj konfiguraciji. Kod ukrštene konfiguracije, VL1domen se nalazi na N-terminusu proteinskog lakog lanca, ali domen VH1za sparivanje se nalazi na C-terminusu teškog lanca iz ukrštene konfiguracije. Prostorni odnos između VL1i VH1, koji se nalazi u konfiguraciji sa dvostrukim varijabilnim regionom, je aranžman koji je prisutan u prirodnim antitelima.

[0117] Jedan potencijalan nedostatak dvostruke-Fv konfiguracije je taj da linker LL, koji odvaja dva varijabilna regiona, strči u mesto za vezanje antigena iz Fv2 domena (vidi Sliku 1). Ova protruzija može da interferira sa mestom za vezanje antigena i da dovede do narušene pristupačnosti Antigena 2 prema Fv2. Ovakva narušena pristupačnost ili interferencija može da spreči vezanje antigena. Osim toga, ova interferencija može da bude izraženija kada je veličina Antigena 2 veća. Uistinu, već je pokazano u U.S. patentu br.7,612,181 da vezni afinitet i sposobnost neutralizovanja DVD-Ig molekula zavisi o tome koja je antigena specifičnost predstavljena na N-terminusu ili C-terminusu. Vidi U.S. patent br.7,612,181, Primer 2.

[0118] Prema tome, kako bi se kreirale stabilnije vezne belančevine slične antitelu, koje neće gubiti afinitet prema antigenu u odnosu na parentalno antitelo, projektovani su i konstruirani ukršteni molekuli sa dvostrukim varijabilnim regionom koji sadrže CLdomen u lakom lancu i Fc region u teškom lancu. Polipeptidi koji formiraju pomenute belančevine slične antitelu imaju strukture koje su prikazane ispod, a u kojima je prikazana amino-prema-karboksilu terminalna orijentacija polipeptidnih lanaca:

(e) laki lanac: NH2-VL1-Linker-VL2-CL-COOH

(f) teški lanac: NH2-VH2-Linker-VH1-CH1-Fc-COOH.

[0119] Sa ciljem da se proceni da li će ovako dizajnirana bispecifična belančevina slična antitelu vezati dva različita antigena, korišćena su dva prethodno generisana i humanizovana varijabilna regiona iz antitela koja su bila specifična za IL4 (parentalno humanizovano anti-IL4 antitelo) i za IL13 (parentalno humanizovano anti-IL13 antitelo) kako bi se konstruirali bispecifični molekuli slični antitelu koji su prikazani u Tabeli 1. Sekvenciranje mišjeg antitela i proces njegovog humanizovanja su opisani u Internacionalnoj prijavi br. WO 2009/052081 (TBTI). Ukratko, amino-kiselinske sekvence varijabilnih teških i lakih lanaca iz mišjeg anti-IL13 klona B-B13 i mišjeg anti-IL4 klona 8D4-8 su određene uz pomoć sekvenciranja aminokiselinske sekvence. Mišje sekvence su bile humanizovane, a tada ponovo prevedene u nukleotidne sekvence kao šta je opisano u Primeru 5 iz Internacionalne prijave br. WO 2009/052081. Sekvence VHi VLiz parentalnog humanizovanog anti-IL4 antitela, i VHi VLsekvence iz parentalnog humanizovanog anti-IL13 antitela su kombinovane i aranžirane kao šta je prikazano u Tabeli 1. Skraćene oznake u prvom stupcu iz Tabele 1 su kreirane radi pojednostavljenja rasprave o ovim veznim belančevinama sličnim antitelu. Pomenute vezne belančevine slične antitelu se razlikuju u veličini linkera koji je ugrađen između dva varijabilna regiona kao šta je prikazano u Tabeli 1. DNA molekuli koji kodiraju polipeptide prikazane u Tabeli 1 su generisani iz translatovanih parentalnih anti-IL4 i anti-IL13 antitela. CH1, CL, i Fc domeni su dobiveni iz IGHG1 (GenBank pristupni br.569F4) i IGKC (GenBank pristupni br. Q502W4).

Tabela 1. Ukršteni dvoglavi imunoglobulini

[0120] Kombinacije belančevina prikazane u Tabeli 2 su eksprimirane uz pomoć prolazne transfekcije i prečišćene uz pomoć hromatografije na Belančevini A. U svakom slučaju, hromatografija koja razdvaja na osnovu veličine je pokazala manje od 12% agregacije, a najčešće manje od 7% agregacije; ali niti jedan od ukrštenih dvoglavih imunoglobulina nije mogao da veže IL4 ili IL13. Međutim, funkcionalno vezanje slično vezanju antitela nije moglo da se detektuje, a razlozi za ovakav nedostatak aktivnosti nisu bili otkriveni. Prethodno je bilo predviđeno da će ovakav aranžman pokazati superiornu stabilnost u odnosu na antitela sa dvostrukim varijabilnim regionom koja su opisana u U.S. patentu br. 7,612,181 i u Internacionalnoj publikaciji br. WO 2009/052081.

Tabela 2. Vezanje CODH-Ig na IL4 i IL13

4

Primer 2. Dizajniranje CODV-Ig belančevina uz pomoć molekularnog modeliranja

[0121] Sa ciljem da se dobiju potpuno funkcionalne belančevine slične antitelu primenom ukrštene dvoglave konfiguracije, koje mogu da prime Fc i CL1domene, razvijen je protokol za molekularno modeliranje koji je korišćen za ugradnju i procenu različitih linkera između konstantnih i varijabilnih domena i između dvostrukih varijabilnih domena na teškom i lakom lancu. Pitanje je bilo da li će dodavanje pojedinačnih linkera u svakom interfejsu između konstantnog i varijabilnog domen i između dva interfejsa varijabilni/varijabilni domen na teškom i lakom lancu omogućiti pravilno sklapanje belančevine tako da se dobiju funkcionalni molekuli slični antitelu u ukrštenoj konfiguraciji sa dvostrukim varijabilnim regionom (vidi Sliku 2). Drugim rečima, ukupno su procenjena četiri nezavisna i jedinstvena linkera (vidi Sliku 2). Ovakav protokol molekularnog modeliranja se bazira na pristajanje belančevinabelančevina iz modela homologija i eksperimentalnih modela za FvIL4i FvIL13regione, u kombinaciji sa odgovarajućim linkerima između FvIL4i FvIL13regiona i između Fv i konstantnih ili Fc regiona.

[0122] Nezavisni linkeri su dobili jedinstvene oznake kako sledi: L1se odnosi na linker između N-terminalnog VLi C-terminalnog VLu lakom lancu; L2se odnosi na linker između C-terminalnog VLi CLu lakom lancu; L3se odnosi na linker između N-terminalnog VHi C-terminalnog VHu teškom lancu; L4se odnosi na linker između C-terminalnog VHi CH1(i Fc) u teškom lancu. Treba da se primeti da se oznake VHi VLodnose na lokaciju domena u određenom proteinskom lancu u finalnom formatu. Na primer, VH1i VH2mogu da se izvedu iz VL1i VL2domena iz parentnog antitela i da se smeste na VH1i VH2pozicije u CODV-Ig. Slično, VL1i VL2mogu da se izvedu iz VH1i VH2domena iz parentnog antitela i da se smeste na VH1i VH2pozicije u CODV-Ig. Tako, oznake VHi VLse odnose na sadašnju lokaciju, a ne na originalnu lokaciju u parentnom antitelu.

[0123] Detaljnije, model homologije FvIL4je konstruisan na PDB unosima 1YLD (laki lanac) i 1IQW (teški lanac). FvIL4dimer je prekomponovan na jednoj in-house kristalnoj strukturi kompleksa IL13/anti-IL13 FabIL13pa je optimizovan. Sa ciljem da se napravi procena volumena kojeg zahvata IL4 kada je vezan na FvIL4, kristalna struktura IL4 (1RCB.pdb) je pridodana modelu homologije FvIL4. Sledeće, generisana su dvadeset i dva pretpostavljena modela pomenutog kompleksa koje je zahtevalo dodatna razmatranja.

[0124] Paralelno, model pristajanja homologije za FvIL4je pridodan FvIL13koji je ekstrahiran iz in-house kristalne strukture kompleksa IL13/FabIL13. Pronađeno je jedno superiorno rešenje koje je dozvolilo konstrukciju relativno kratkih linkera koji ne stvaraju steričku interferenciju kod vezanja antigena i postavljanja konstantnih domena koje se događa kod imunoglobulina sa dvostrukim varijabilnim regionom (vidi Sliku 3). U ovom aranžmanu FvIL4(VL1) je postavljen na N-terminusu lakog lanca, a nakon njega se nalaze FVIL13(VL2) i Fc (CL1) na C-terminusu lakog lanca. U teškom lancu, FVIL13(VH2) je postavljen N-terminalno, a nakon njega sledi FvIL4(VH1) i konstantni regioni (CH1-CH2-CH3).

[0125] Kao šta je prikazano u Tabeli 3, modeli lakog lanca sugerišu da linker L1između VL1i VL2domena i linker L2između VL2i CL1domena treba da bude dugačak između jednog i tri i nula i dva glicinska ostatka. Modeli teškog lanca sugerišu da linker L3između VH2i VH1domena i linker L4između VH1i CH1domena treba da bude dugačak između dva i šest i četiri i sedam glicinska ostatka (vidi Tabelu 3 i Sliku 2). U ovom primeru, glicin se koristi kao prototipična amino-kiselina za linkere, ali takođe i drugi amino-kiselinski ostaci mogu da posluže kao linkeri. Strukturna stabilnost predloženih modela je verifikovana uz pomoć optimizacije linkerskih konformacija, minimizovanja, i izračuna molekularnih dinamika. Sistematsko kombinovanje konstrukata od između četiri laka lanca i šest teških lanaca je dalo 24 moguće anti-IL4 i anti-IL13 bispecifične vezne belančevine slične antitelu koje sadrže ukrštene dvostruke varijabilne regione (vidi Tabelu 4).

Tabela 3. Predložene dužine linkera

4

Tabela 4. CODV-Ig za ekspresiju

*kratka oznaka je osmišljena sa ciljem da predstavlja odgovarajuće strukture. Oznake koje počinju sa HC predstavljaju susedni teški lanac, a oznake koje počinju sa LC predstavljaju susedne lake lance.

[0126] U Tabeli 4, prefiks "anti" nije uključen, ali namenjen je da pokazuje da se IL13 odnosi na anti-IL13, a IL4 na anti-IL4.

Primer 3. Generisanje CODV-Ig ekspresionih plazmida

[0127] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilne teške i lake lance između onih šest teških lanaca i četiri laka lanca, opisanih u Tabeli 4, su generisani uz pomoć sinteze gena

4

na aparatu Geneart (Regensburg, Nemačka). Varijabilni domeni iz lakog lanca su fuzionisani na konstantni domen iz lakog lanca (IGKC, GenBank pristupni br. Q502W4) uz pomoć digestije sa restrikcionim endonukleazama ApaL I i BsiW I, a naknadno ligirani u mesta ApaL I/BsiW I u episomalnom ekspresionom vektoru pFF, koji je analogon pTT vektoru koji je opisan od autora Durocher et al., (2002, Nucl. Acids Res.30(2): E9), koje dovodi do kreiranja plazmida za ekspresiju lakih lanaca u ćelijama sisara.

[0128] Varijabilni domeni uz teškog lanca su fuzionisani na "Ted" varijantu humanog konstantnog domena iz teškog lanca (IGHG1, GenBank pristupni br.569F4), ili alternativno, na CH1domen sa priveskom od 6x His iz humanog konstantnog IGHG1 sa ciljem da se kreira bispecifični Fab. Sledeće, VHdomen je pocepan sa restrikcionim endonukleazama ApaL I i Apa I, a tada je fuzionisan na IGHG1 ili na CH1domen sa His-priveskom uz pomoć ligiranja u ApaL I/Apa I mesta iz episomalnog ekspresionog vektora pFF pri čemu nastaju plazmidi za ekspresiju teških lanaca u ćeliji sisara (IgG1 ili Fab).

Primer 4. Eksprimiranje CODV-Ig

[0129] Ekspresioni plazmidi koji kodiraju teški i laki lanac iz odgovarajućih konstrukata su propagirani u ćelijama E. coli (DH5a). Plazmidi koji su korišćeni za transfekciju su pripremljeni iz E. coli primenom kompleta hemikalija Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit.

[0130] HEK 293-FS ćelije koje rastu u medijumu Freestyle (Invitrogen) su transfektovane sa navedenim LC i HC plazmidima koji kodiraju teške lance i lake lance prikazane u Tabeli 4 primenom 293fektina (Invitrogen) (reagens za transfektovanje) sledeći instrukcije proizvođača. Nakon 7 dana, ćelije su odstranjene uz pomoć centrifugovanja, a supernatant je propušten kroz filter (0.22 µm) sa ciljem da se odstrane čestice.

[0131] Konstrukti CODV-IgG1 su prečišćeni uz pomoć afinitetne hromatografije na koloni od Belančevine A (kolone HiTrap Protein A HP, GE Life Sciences). Nakon elucije iz kolone uz pomoć acetatnog pufera (100 mM; pH 3.5) i NaCl (100 mM), konstrukti CODV-IgG1 su odsoljeni uz pomoć kolona HiPrep 26/10, formulisani u PBS u koncentraciji od 1 mg/mL i filtrirani kroz membranu (0.22 µm).

[0132] Bispecifični CODV Fab konstrukti su prečišćeni uz pomoć IMAC na kolonama HiTrap IMAC HP (GE Life Sciences). Nakon elucije iz kolone uz pomoć linearnog gradijenta (pufer

4

za eluciju: 20 mM natrijum fosfat, 0.5 M NaCl, 50-500 mM imidazol, pH 7.4), frakcije koje sadrže belančevinu su sakupljene i odsoljene uz pomoć kolona HiPrep 26/10, formulisane u PBS u koncentraciji od 1 mg/mL i filtrirane kroz membranu (0.22 µm).

[0133] Koncentracija belančevine je određena uz pomoć merenja apsorbancije kod 280 nm. Svaka serija je analizirana uz pomoć SDS-PAGE u uslovima redukcije ili bez redukcije kako bi se odredila čistoća i molekularna masa svake podjedinice i monomera.

[0134] Pločica F96-MaxiSorp-Immuno je obložena sa kozjim anti-humanim IgG (Fc specifičnim) [NatuTec A80-104A]. Antitelo je razređeno do 10 µg/ml u karbonatnom puferu za oblaganje (50 mM natrijum karbonat, pH 9.6) i dodano u rupice (po 50 µL u svaku). Pločica je zatvorena sa trakom za prianjanje, pa je ostavljena na 4° C preko noći. Pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje (PBS, pH 7.4 i 0.1% Tween20). U svaku rupicu je dodano po 150 µL rastvora za blokiranje (1% BSA/PBS) sa ciljem da se prekrije pločica. Nakon 1 h na sobnoj temperaturi, pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje. Dodano je po 100 µL primerka ili standarda (u rasponu od 1500 ng/ml do 120 ng/ml), a pločica je ostavljena da stoji tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje. Dodano je po 100 µL konjugata kozji anti-humani IgG-FC-HRP [NatuTec A80-104P-60] koji je bio razređen 1:10.000 uz pomoć rastvora za inkubaciju (0.1% BSA, PBS, pH 7.4, i 0.05% Tween20). Nakon 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi, pločica je isprana tri puta sa puferom za ispiranje. Dodano je po 100 µL ABTS supstrata (tableta ABTS od 10 mg (Pierce 34026) u 0.1 M Na2HPO4, 0.05 M rastvora limunske kiseline, pH 5.0). U svaku rupicu je dodano po 10 µL 30% H2O2/10 ml supstrata, a smeša je ostavljena da razvije boju. Nakon pojave boje (približno 10 do 15 min) je dodano 50 µL 1% SDS rastvora sa ciljem da se zaustavi reakcija. Pločica je očitana kod A405.

Primer 5. Karakterizovanje varijanata CODV-Ig

[0135] Sa ciljem da se odredi da li se teški i laki lanci iz CODV-Ig belančevine slične antitelu sparuju i ispravno sklapaju, nivo agregacije je izmeren uz pomoć analitičke hromatografije osetljive na veličinu (SEC). Analitička SEC je provedena na sklopljenim parovima uz pomoć aparata AKTA explorer 10 (GE Healthcare) koji je bio opremljen sa kolonom TSKgel G3000SWXL (7.8 mm x 30 cm) i kolonom TSKgel SWXL guard (Tosoh Bioscience). Analiza je provedena stopom od 1 ml/min primenom 250 mM NaCl, 100 mM Na-fosfata, pH 6.7, pri čemu je detektovanje provedeno kod 280 nm.30 µL primerka sa belančevinom (0.5-1 mg/ml) je naneseno na kolonu. Za procenu molekularne veličine, kolona je kalibrirana uz pomoć

4

standardne smeše za gel-filtraciju (MWGF-1000, SIGMA Aldrich). Procena podataka je provedena uz pomoć programa UNICORN v5.11.

[0136] Tabela 5 prikazuje rezultate prve grupe od 24 različitih CODV-Ig molekula koji su dobiveni uz pomoć kombinovanja anti-IL4 i anti-IL13 varijabilnih regiona iz Tabele 4. Oznake iz Tabele 4 predstavljaju susedne strukture prikazane u Tabeli 4. Za parove lakog lanca sa teškim lancima koji su formirali belančevinu, nivoi agregacije su izmereni primenom SEC. Rezultati su prikazani u Tabeli 5 pri čemu LC4 (L1= 1; L2= 2) je najuspešniji u sparivanju sa svih šest teških lanaca. LC4 odgovara strukturi IL4 VL-(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1sa linkerom L1koji je jednak 1, pri čemu jedan amino-kiselinski ostatak odvaja dva VLdomena dvostrukog varijabilnog regiona iz lakog lanca. Osim toga, LC4 ima L2koji je jednak 2, koji sadrže Gly-Gly dipeptidni linker između centralnog VLi C-terminalnog CH1.

Tabela 5. Nivoi agregacije između parova teških i lakih lanaca

[0137] Tamo gde su se pojavili CODV-Ig molekuli je proveden eksperiment pojedinačnekoncentracije BIACORE kod interminedijarnih koncentracija IL13 i IL4 sa ciljem da se potvrdi vezanje ciljanih antigena. CODV-Ig molekuli slični antitelu koji odgovaraju kombinacijama LC4:HC4 i LC4:HC6, opisanima u Tabeli 4, su izabrani za provođenje pune konetičke analize primenom površinske rezonance plazmona.

[0138] Kao šta je prikazano u Tabeli 5, najveći deo CODV-Ig molekula ne može da se proizvede uopšte ili nastaje samo u formi agregata (do 90%). Kombinacije teški lanac/laki lanac koje daju prihvatljive nivoe agregacije (5-10%) nakon jednog hromatografskog koraka su one u kojima je kombinovan laki lanac IL4 VL-(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1. Laki lanac je najbiraniji lanac bez ove CODV-Ig varijante i služi kao platforma koja prihvata različite teške lance sa različitim kompozicijama linkera.

4

1. Kinetička analiza

[0139] Dva para teških i lakih lanaca su izabrana za punu kinetičku analizu. Rekombinantni humani IL13 i IL4 su nabavljeni od Chemicon (USA). Kinetičko karakterizovanje prečišćenih antitela je provedeno uz pomoć površinske rezonance plazmona na aparatu BIACORE 3000 (GE Healthcare). Primenjen je ogled zarobljavanja koji koristi specifično antitelo (na primer, humano-Fc specifično MAB 1302, Chemicon) za zarobljavanje i orijentaciju ispitivanog antitela. Zarobljeno antitelo je imobilizirano preko primarnih aminskih grupa (11000 RU) na čipu za istraživanje CM5 (GE Life Sciences) uz pomoć standardnih procedura. Analizirano antitelo je zarobljeno kod stope protoka od 10 µL/min sa podešenom RU vrednosti koje obezbeđuje maksimalno vezanje analita od 30 RU. Kinetike vezanja su izmerene u odnosu na rekombinantni humani IL4 i IL13 preko raspona koncentracije između 0 i 25 nM u HBS EP (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, i 0.005% surfaktant P20) kod stope protoka od 30 µl/min. Površine čipa su regenerisane sa 10 mM glicinom (pH 2.5). Kinetički parametri su analizirani i izračunati uz pomoć programskog paketa BIAevaluation v4.1 u odnosu na protok ćelija bez zarobljenog antitela (referenca).

[0140] Tabela 6 ispod prikazuje uporedbu kinetika parentalnih BB13 (anti-IL13) i 8D4 (anti-IL4) antitela (eksprimirani kao IgG) pri čemu se odgovarajući domeni nalaze u CODV-Ig formatu (Tabela 4, oznake LC4:HC4 i LC4:HC6). Kao šta je prikazano u Tabeli 6, konstrukti CODV-Ig ne pokazuju karakteristike smanjenog vezanja odgovarajućih antigena, kada se uporede sa parentalnim anti-IL13 i anti-IL4 antitelima. Gubitak on-rate konstante, koji je primećen u DVD-Ig/TBTI formatu primenom istih Fv sekvenca, ne nastupa sa CODV-Ig konfiguracijom. Vezna mesta koja su okrenuta u suprotnim smerovima se očekuje da omoguće vezanje većih antigena ili premošćivanje različitih ćelija uz pomoć bispecifične konfiguracije slične antitelu, koja je takođe prikladna za opsežniju selekciju parentalnog antitela. Dodatna prednost CODV-Ig je ta da linkerski ostaci ne strče u mesta koja vežu antigen čime bi smanjivali pristupačnost antigena.

Tabela 6. Kinetička analiza LC4:HC4 i LC4:HC6

2. Ko-injekcija IL4 i IL13 sa ciljem demonstracije aditivnog vezanja antigena uz pomoć CODV-Ig

[0141] Sa ciljem da se istraži aditivno vezanje oba antigen je primenjen uz pomoć automatskog ko-ubrizgavanja pri čemu je prvo injektiran jedan antigen, a odmah nakon toga je injektiran i drugi nakon lag-perioda (IL4, a tada IL13 i obrnuto). Nastao vezni nivo može da se uporedi sa onim koji je postignut uz pomoć smeše oba antigena (1:1) u istoj koncentraciji. Sa ciljem da se dokaže aditivno vezanje oba antigena, IL4 i IL13, od strane CODV-Ig molekula, proveden je BIACORE eksperiment uz pomoć CODV-Ig kombinacije [HC4:LC4] pri čemu su koinjektirana oba antigena u tri odvojena analitička ciklusa (vidi Sliku 4). Ko-injektiranje je provedeno sa 3.125 nM IL4/25 nM IL13 (i obrnuto) i sa smešom 3.125 nM ILA i 25 nM IL13 (1:1). Ko-injekcija HBS-EP pufera je provedena kao referenca. U vremenskoj tačci od 800 s je postignut identičan vezni nivo od 63 RU nakon injektiranja smeše antigena ili ko-injektiranja antigena, bez razlike na ko-injektiranu sekvencu. Kada je CODV-Ig belančevina bila zasićena sa prvim antigenom (IL4), injektriran je drugi antigen (IL13) nakon čega je primećen drugi vezni signal. Ova opservacija je reprodukovana i kada je redosled injektiranih antigena bio promenjen. To pokazuje da je vezanje oba antigena uz pomoć CODV-Ig aditivno i nije inhibirano. Prema tome, CODV-Ig konstrukt je sposoban da veže oba antigena istovremeno (tj., pokazuje bispecifičnost) pri čemu su zasićena sva vezna mesta (tj., pokazuje tetravalenciju).

Primer 6. Tolerancija linkerskih dužina kod CODV-Ig

[0142] Tolerancija različitih dužina linkera je procenjena uz pomoć konstruisanja CODV-Ig molekula koji sadrže različite kombinacije linkera L1i L2na lakom lancu i L3i L4na teškom lancu (linkeri su bili različitih dužina). CODV-Ig konstrukti su generisani tako da na teškom lancu imaju linkere L3i L4čija dužina varira između 1 i 8 ostataka za L3i 0 ili 1 ostatak za L4. Teški lanac je sadržavao anti-IL4 kao N-terminalni vezni domen i anti-IL13 kao C-terminalni vezni domen nakon kojeg se nalazio CH1-Fc. Dužine linkera L1i L2iz lakog lanca su varirale

1

od 3 do 12 ostataka za L1i od 3 do 14 ostataka za L2. Laki lanac je sadržavao anti-IL13 kao N-terminalni vezni domen i anti-IL4 kao C-terminalni vezni domen nakon kojeg se nalazio CL1.

1. Karakterizovanje varijanata CODV-Ig

[0143] Određivanje nivoa agregacije je provedeno uz pomoć analitičke hromatografije osetljive na veličinu (SEC). Analitička SEC je provedena uz pomoć aparata ÄKTA explorer 10 (GE Healthcare) koji je bio opremljen sa kolonom TSKgel G3000SWXL (7.8 mm x 30 cm) i kolonom TSKgel SWXL guard (Tosoh Bioscience). Analiza je provedena kod stope od 1 ml/min primenom 250 mM NaCl, 100 mM Na-fosfata, pH 6.7, pri čemu je detektovanje provedeno na 280 nm. U kolonu je dodano 30 µL primerka sa belančevinom (0.5-1 mg/ml). Za procenu molekularne mase, kolona je kalibrirana uz pomoć sta standardne smeše za gelfiltraciju (MWGF-1000, SIGMA Aldrich). Procena podataka je provedena uz pomoć programa UNICORN v5.11.

[0144] Rekombinantni humani IL13 i IL4 su nabavljeni od Chemicon (SAD). Rekombinantni humani TNF-α je nabavljen od Sigma Aldrich (H8916-10µg), rekombinantni humani IL-1β (201-LB/CF), rekombinantni humani IL-23 (1290-IL/CF), rekombinantni humani EGFR (344 ER), i rekombinantni humani HER2 (1129-ER-50) su nabavljeni od R&D Systems.

[0145] Analiza kinetike vezanja uz pomoć pristupa Biacore je provedena kako sledi. Tehnologija površinske rezonance plazmona na aparatu Biacore 3000 (GE Healthcare) je korišćena za detaljno kinetičko karakterizovanje prečišćenog antitela. Korišćen je ogled zarobljavanja sa specifičnim antitelom (na primer, humano-Fc specifično MAB 1302, Chemicon) za zarobljavanje i orijentaciju ispitivanog antitela. Za određivanje veznih kinetika IL4 i IL13, odgovarajući CODV Fab kao u Primeru 10 i Tabeli 12 su zarobljeni uz pomoć kompleta hemikalija za zarobljavanje sa anti-humanim Fab (GE Healthcare). Zarobljeno antitelo je imobilizirano preko primarnih aminskih grupa (11000 RU) na istraživačkom čipu CM5 (GE Life Sciences) uz pomoć standardnih procedura. Analizirano antitelo je zarobljeno kod stope protoka od 10 µL/min sa podešenom RU vrednosti koja obezbeđuje maksimalno vezanje analita od 30 RU. Vezne kinetike su izmerene u odnosu na rekombinantni humani IL4 i IL13 preko raspona koncentracije od između 0 i 25 nM u HBS EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfaktant P20) kod stope protoka od 30 µL/min. Površine čipa su regenerisane uz pomoć 10 mM glicina (pH 2.5). Kinetički parametri su

2

analizirani i izračunati uz pomoć programskog paketa BIAevaluation v4.1 primenom protoka ćelija bez zarobljenog antitela (referenca).

[0146] Vezni afiniteti CODV-Ig, CODV-Fab, i TBTI za EGFR i HER2 su izmereni uz pomoć sistema Proteon XPR36 protein interaction array (Biorad). Antigeni su imobilizirani uz pomoć reaktivnog kuplovanja amina na čipovima GLC sensor (Biorad). Serije razblaživanja varijanata bispecifičnog antitela u puferu PBSET (Biorad) su analizirane paralelno u modusu one-shot kinetike uz pomoć dvostruke reference. Podaci su analizirani uz pomoć programa Proteon Manager Software v3.0 (Biorad) primenom modela Langmuir 1:1 sa prenosom mase ili modela bivalentnog analita.

[0147] Tabela 7 prikazuje rezultate za prinos, agregaciju (izmerene uz pomoć hromatografije osetljive na veličinu), vezni afinitet za CODV-Ig koji je sadržavao linkere različitih veličina. Rezultati su pokazali da se CODV-Ig molekuli, kod kojih je L2iznosio nula, ne mogu proizvesti, ili kada je belančevina bila proizvedena, postojao je visoki nivo agregacije (vidi Serije br. 101, 102, 106-111, i 132-137 u Tabeli 7). Prema tome, suprotno od predviđanja molekularnog modeliranja iz Primera 2, gde se L2jednak nuli nalazio u prihvatljivom rasponu, ovi rezultati pokazuju da VL2-CLtranzicija (ili L2) zahteva linker od najmanje jednog ostatka (vidi Tabelu 7).

Tabela 7. Optimizovanje linkerskih veličina za CODV-Ig

4

[0148] Osim toga, malopre opisane dužine CODV-Ig linkera su osetljivije na povećanje od 1 amino-kiselinskog ostatka nego na povećanje od 2 amino-kiselinska ostatka. Na primer, dok se Serije br.103 i 104 razlikuju za 1 amino-kiselinski ostatak u L2, Serija br.103 pokazuje 6-puta povećanu agregaciju, a Serija br. 104 pokazuje manji stepen agregacije i dvostruko povećani prinos. Suprotno, Serije br. 104 i 105, koje se razlikuju za dva ostatka u L2, pokazuju slične profile u odnosu na prinos, agregaciju, i vezanje.

Primer 7. Teški lanac kao lanac kalup za CODV-Ig

[0149] U primerima 1 do 5, optimalne veličine kratkog linkera na lakom lancu sugerišu da je pomenuti laki lanac služio kao kalup ostajući u linearnom rasporedu i da su potrebni veći linkeri na teškom lancu kako bi se pomenuti teški lanac ispravno sklapao u ukrštenu konfiguraciju kako bi se podesio prema lakom lancu koji je kalup (vidi Sliku 5, Panel A). Sledeće je bilo procenjeno da li su kratki linkeri, koji su specifično postavljeni na teškom lancu sa ciljem da održavaju lineran raspored u njemu, omogućili pomenutom teškom lancu da postane lanac "kalup" i da li će se takav obrazac ponoviti, a veći linkeri biti potrebni kako bi se lanac koji nije kalup ispravno sklopio i prilagodio novom teškom lancu koji služi kao kalup (vidi Sliku 5, Panel B).

[0150] Slika 6 pokazuje pomenute principe kod dizajna CODV-Ig na bazi toga da kao lanac „kalup“ služi laki lanac ili teški lanac. Sa ciljem da se evaluira generička priroda ovog koncepta, CODV-Ig konstrukti su generisani tako da poseduju linkere L3i L4na teškom lancu čija dužina varira između 1 i 8 ostataka za L3i 0 ili 1 ostatak za L4. Teški lanac je sadržavao anti-IL4 kao N-terminalni vezni domen i anti-IL13 kao C-terminalni vezni domen nakon kojeg slede CH1-Fc. Linkeri na lakom lancu, L1i L2, imaju dužine koje variraju između 3 i 12 ostataka za L1i od 3 do 14 ostataka za L2. Laki lanac je sadržavao anti-IL13 kao N-terminalni vezni domen i anti-IL4 kao C-terminalni vezni domen, nakon kojeg sledi CL1.

[0151] Tabela 8 prikazuje rezultate za prinos, agregaciju (izmerenu uz pomoć hromatografije koja je osetljiva na veličinu), i vezni afinitet za CODV-Ig koji sadrži linkere različitih dužina pri čemu se teški lanac održava u linearnom aranžmanu kao lanac kalup, a lakom lancu je omogućeno da se sklopi u ukrštenu konfiguraciju. Rezultati su otkrili da CODV-Ig molekuli kod kojih L4je nula generalno ne mogu da se proizvedu, ili kada je belančevina proizvedena, primećen je visoki nivo agregacije (slično molekulima kod kojih L2je jednak nuli) (vidi Serije br. 207-209, 211-212, 219-224, 231-236, 243-252, i 263-266 u Tabeli 8). Jedna iznimka je Serija br. 210, u kojoj L1je 7, L2je 5, L3je 2, a L4je nula. Ovakav raspored omogućava proizvodnju dovoljne količine belančevine i ima prihvatljivi nivo agregacije i vezanja, koje sugeriše da može da se pronađe kombinacija linkerskih veličina koja može da kompenzira za dužinu nula linkera L4u nekim situacijama.

Tabela 8. Optimizovanje linkerskih dužina kada teški lanac služi kao kalup

[0152] Rezultati iz Tabela 7 i 8 jasno pokazuju da su linkeri potrebni između varijabilnih i konstantnih domena kako bi se omogućilo ispravno sklapanje. Samo je u retkim aranžmanima linker dužine nula tolerisan (vidi Serije br.103-105, u kojima L1(LC) je nula, i Seriju br.210, u kojoj L4je nula). Međutim, u svakom slučaju, odgovarajući prelazni linker između varijabilnog regiona i konstantnog regiona na drugom lancu može da bude nula.

[0153] Ovi rezultati pokazuju da kombinacije L1=7, L2=5, L3=1, i L4=2 su dobra početna tačka za optimizovanje novog CODV-Ig u kojem teški lanac služi kao kalup. Rasponi u Tabeli 9 su se pokazali kao razumni rasponi za uspešno projektovanje novog CODV-Ig iz dva parentna antitela.

Tabela 9. Rasponi linkerskih veličina kada LC ili HC služe kao kalup

Primer 8. Univerzalna primena CODV-Ig formata

[0154] Sa ciljem da se proceni prikladnost CODV-Ig formata za projektovanje nove vezne belančevine slične antitelu, varijabilni regioni iz brojnih postojećih humanih i humanizovanih antitela koja imaju specifičnost za receptor faktora rasta 1 koji je sličan insulinu (IGF1R(1)), drugo antitelo protiv receptora faktora rasta 1 sličnog insulinu (IGF1R(2)), humanog receptora 2 za epidermalni faktor rasta (HER2), receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR), alfa faktora nekroze tumora (TNF α), interleukina 12 i 23 (IL-12/23) i interleukina 1beta (IL-1β) su ugrađeni u CODV-Ig format (vidi Tabelu 10).

Tabela 10. Deskriptivne oznake za teške i lake lance korišćene u bispecifičnom CODV-Ig

[0155] Varijabilni regioni iz humanog ili humanizovanog antitela se koriste da se testira univerzalna primena CODV-Ig formata u dizajniraju bispecifičnih veznih belančevina sličnih antitelu. Osim toga, ispitana je i mogućnost pozicionih efekata u odnosu na položaj određenih varijabilnih regiona na N-terminusu ili C-terminusu na teškom lancu ili na lakom lancu. Na bazi dizajna CODV-Ig molekula koji imaju linkersku kompoziciju L1=7, L2=5, L3=1, i L4=2, različite sekvence antitela su uvedene u CODV-Ig format.

[0156] Aktivnosti bispecifičnih antitela ili derivata protiv IL1β i TNFα su određene uz pomoć komercijalno dostupnih HEK-Blue TNFα/IL1β reporter ćelija (InvivoGen). Sa ciljem da se odredi aktivnost antitela protiv TNFα i IL1β, citokini su pre-inkubirani tokom 1 h sa antitelom u različitim koncentracijama pa su dodani u 50000 ćelija soja HEK Blue TNFα/IL1β. Indukcija SEAP posredovana sa citokinom je izmerena nakon 24 h u supernatantu kulture primenom ogleda QUANTI-Blue (InvivoGen).

[0157] Kao šta je prikazano u Tabeli 11, svi konstrukti su pokazali dobar do izvrsan prinos belančevina i prihvatljive nivoe agregacije (vidi, posebno Serije br. 301 i 302 u Tabeli 11). Izmereni afinitet za svaki varijabilni domen se nalazio unutar objavljenih ili očekivanih vrednosti. U slučajevima kada je afinitet procenjen, pozicioni efekti nisu primećeni. Sve zajedno, kao šta je prikazano u sledećim tabelama, pozicioni efekti nisu bili primećeni za bilo koji varijabilni domen koji je korišćen na bilo kojem lancu antitela.

1

Primer 9. Retencija afiniteta parentalnog antitela u CODV-Ig formatu

[0158] Identične sekvence za anti-IL4 i anti-IL13 su ugrađene u TBTI/DVD-Ig ili CODV-Ig formate za direktnu uporedbu pomenutih konfiguracija, pozicija linkera, i afiniteta nastalih molekula. Kao šta je prikazano na Slici 7, parentalni afinitet svakog antitela se održava u CODV formatu. Kao šta je prikazano u gornjem panelu Slike 7, kada su varijabilni regioni smešteni u TBTI/DVD-Ig format, pad afiniteta IL4 antitela koje zauzima unutarnju Fv2 poziciju se manifestuje kao smanjivanje on-rate konstante vezanja antitela na antigen. Suprotno, gubitak afiniteta za CODV-Ig format nije nastupio ako se uporedi sa parentalnim antitelom (vidi Sliku 7, donji panel).

Primer 10. Adaptabilnost CODV-Ig na Fab format

[0159] Sledeće je procenjena sposobnost CODV-Ig formata da obezbedi fragmente poput Fab fragmenata. Različiti varijabilni regioni iz teških lanaca su fuzionisani jedan sa drugim preko linkera L3i C-terminalno produženi preko linkera L4. Ovaj VHkompleks je tada fuzionisan na CH1domen iz IGHG1 (GenBank pristupni br. Q569F4) koji na C-terminalu ima pet aminokiselinskih sekvenca DKTHT (SEQ ID BR: 60), od regiona ručke na kojeg se nastavlja šest histidinskih ostataka. Dva različita varijabilna regiona iz lakih lanaca su fuzionisana jedan sa drugim u unakrsnu konfiguraciju sa odgovarajućim teškim lancem preko linkera L1i C-terminalno produženi preko linkera L2, nakon čega su fuzionisani na konstantni region iz kapa lanca (IGKC, GenBank pristupni br. Q502W4).

[0160] Fab fragmenti su eksprimirani preko prolazne transfekcije kao šta je ranije opisano. Sedam dana nakon transfekcije, ćelije su odstranjene uz pomoć centrifugovanja, nakon čega je dodano 10% vol/vol 1M Tris-HCl (pH 8.0), a supernatant je propušten kroz filter (0.22 µm) sa ciljem da se odstrane čestice. Fab belančevine su zarobljene uz pomoć kolona HisTrap High Performance (GE Healthcare), a elucija je provedena uz pomoć gradijenta imidazola. Frakcije koje sadrže belančevinu su sakupljene i odsoljene uz pomoć kolona PD-10 ili Sephadex. Rastvori sa belančevinom su koncentrovani i sterilizirani uz pomoć filtracije (0.22 µm), koncentracija je podešena na 1 mg/ml, a smeše su čuvane na 4° C do upotrebe.

[0161] Neposredne koristi proizlaze zbog toga šta molekuli slični Fab-u u CODV orijentaciji pokazuju tendenciju da agregiraju i zadržavaju afinitete parentalnih antitela (vidi Tabelu 12). Konstrukti veznih belančevina iz Serija br.401-421 su direktno upoređivali belančevine slične antitelu u kojima su varijabilni regioni bili aranžirani kao kod CODV-Ig molekula gde teški lanac sliži kao kalup (401, 402, 406, i 407), fragmente CODV slične Fab-u (402, 408, 413, 418, i 421), molekule sa četiri domena slične antitelu u TBTI/DVD-Ig formatu (404, 409, 414, i 419), i CODV-Ig bez linkera (405, 410, 415, i 420). Kao šta je prikazano u Tabeli 12, rezultati ove uporedbe pokazuju da je verovatnije da će nastupiti gubitak afiniteta u odnosu na parentna antitela kada je varijabilni region ugrađen kao TBTI ili DVD-Ig format. Suprotno, formati CODV-Ig i CODV-Ig sličan Fab-u su bili sposobni da održavaju parentalne afinitete. Rezultati dodatno potvrđuju da CODV-Ig molekuli zahtevaju linkere između varijabilnih regiona i između varijabilnih regiona i konstantnih domena (vidi Tabelu 12).

4

u

Fab-

čne sli

ente

frag za ata

forg -I V D

C

reba pot

12.Uela ab T

Primer 11. Supstitucija varijabilnih domena unutar CODV-Ig i CODV-Fab

[0162] Sa ciljem da se karakterizuje CODV format kroz pristup koji koristi T-ćelije, bispecifične vezne belančevine CODV slične Fab-u (CODV-Fab), koje imaju TCR vezno mesto (CD3epsilon) i CD19 vezno mesto, su generisani i upoređeni sa bispecifičnim Fab koji je dobiven iz TBTI/DVD-Ig formata (B-Fab). Sa ciljem da se istraži važnost orijentacije veznih mesta (TCR x CD19 naspram CD19 x TCR), obe orijentacije su procenjene za svaku veznu belančevinu.

[0163] Vezne belančevine su karakterizovane u citotoksičnom ogledu primenom NALM-6 ćelija (koje eksprimiraju CD19), koje su korišćene kao ciljne ćelije, i primarnih humanih T-ćelija, koje su korišćene kao efektorske ćelije. CD3 pozitivne ćelije su izolovane iz sveže pripremljenih humanih PBMC. Efektorske i ciljne ćelije su pomešane u omeru 10:1 pa su inkubirane tokom 20 h sa bispecifičnim veznim belančevinama sa navedenim koncentracijama (vidi Sliku 8). Apoptotične ciljane ćelije su određene uz pomoć ogleda na bazi FACS bojanja sa 7-aminoaktinomicinom.

[0164] B-Fab format u konfiguraciji CD3-CD19 (1060) se pokazao aktivnim u indukovanju citotoksičnosti prema NALM-6 ćelijama, koja je posredovana sa T-ćelijama, sa konstantom EC50od 3.7 ng/ml. Slična visoka aktivnost je primećena za CD19-CD3 CODV-Fab (1109) sa konstantom EC50od 3.2 ng/ml (vidi Sliku 8).

[0165] Razmena konfiguracije u B-Fab molekulu (Fab iz TBTI/DVD-Ig formata) sa CD19-CD3 orijentacijom dovodi do značajnog gubitka aktivnosti (vidi Sliku 8). Razmenjeni B-Fab molekul ne pokazuje aktivnost kod koncentracija koje su bile maksimalne za obe orijentacije CODV-Ig Fab i drugu orijentaciju B-Fab. Za brojne CODV-Ig Fab i jednu orijentaciju B-Fab je primećen maksimalni odgovor (u rasponu od između 1 i 100 ng/ml). Za CD19-CD3 orijentaciju B-Fab, čak i kod maksimalne koncentracije (30 µg/ml), optimalni citotoksični odgovor nije postignut. Suprotno, promena orijentacije domena u CODV-Fab prema CD3-CD19 (1108) obezbeđuje molekul sa značajnom aktivnosti u ovom ogledu (vidi Sliku 8). Mada razmena domena u CODV-Fab takođe smanjuje indukciju citotoksičnosti posredovane sa T-ćelijama (povećanje EC50za faktor od 100), ovaj efekt je manje izražen od onog koji je primećen kod B-Fab formata, a molekul je bio sposoban da indukuje maksimalnu citotoksičnost. Podaci su bili reprezentativni i dobiveni iz tri nezavisna eksperimenta.

Primer 12. Uticaj identiteta amino-kiselinske sekvence na CODV-Ig linkere

[0166] Optimizovani konstrukt koji odgovara Seriji br.204 (vidi Primer 7 i Tabelu 8) je izabran sa ciljem da se ispita uticaj linkerskog sastava na linkere L1do L4. Dužine linkera su podešene na 7, 5, 1, i 2 ostatka za L1, L2, L3, i L4(vidi Tabelu 13). Testirane sekvence su izvedene iz prirodnih linkera na prelazu između VHi CH1domena iz prirodnog antitela ili između Fv i CLdomena iz kapa ili lambda lakih lanaca. Sekvence kandidati su ASTKGPS (SEQ ID BR: 48), koja je izvedena iz prelaza između VHi CH1domena, RTVAAPS (SEQ ID BR: 49) i GQPKAAP (SEQ ID BR: 50), koje su izvedene iz prelaza između Fv i CLdomena iz kapa i lambda lakih lanaca. Nadalje, jedan konstrukt je generisan sa arbitrarnim sastavom linkera sa ciljem da se pokaže da bilo koja sekvenca može potencijalno da se koristi u linkerima L1do L4. Ovaj linkerski sastav je dobiven nasumičnim rasporedom amino-kiselina valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, lizin, arginin, histidin, aspartat, glutamat, asparagin, glutamin, glicin, i prolin na 15 pozicija u četiri pomenuta linkera. Aromatske amino-kiseline fenilalanin, tirozin, i triptofan, kao i amino-kiseline metionin i cistein su namerno izostavljene sa ciljem da se izbegne potencijalni porast agregacije.

[0167] Tri-dimenzionalni model konstrukta za Seriju br. 204 je generisan sa ciljem da se obezbedi prikladnost ili da se rafinira izbor linkerskog sastava. Tako, serin je izabran za linker L3jer su u tri-dimenzionalnom modelu primećeni pozitivno i negativno nabijeni ostaci u susedstvu. Ostaci u linkeru L4su izabrani tako da budu kompatibilni sa rastvaračem kojem su izloženi kao šta sugeriše sam model. Slično, problemi nisu anticipirani ili predviđeni za linkerske sastave za L1i L2. Konstruisani su tri-dimenzionalni modeli za izabrane predloge za linkersku kompoziciju.

[0168] Kao šta je prikazano u Tabeli 12, linkerski sastav može da ima dramatični uticaj na prinos. Sekvence koje su izvedene iz lambda lanca na L1(uporedbom Serija br. 505-507 sa Serijama br. 501-503) su generatori produktivnijih belančevina (porast od 8-puta). Uistinu, linkeri na bazi nasumičnog generisanja takođe stvaraju dobre prinose, kao šta je pokazano u Tabeli 13, Serija br.508. Prema tome, linkerski sastav treba da bude jedan od parametara koji treba da se uzmu u obzir kod optimizovanja CODV-Ig.

-Ig V D

C na a av sast ogersk ink ktle Ef13.ela ab T

[0169] Aktivnosti bispecifičnih antitela ili derivata protiv citokina IL4 i IL13 su određene sa komercijalno dostupnim reporter ćelijama HEK-Blue IL-4/IL-13 (InvivoGen). HEK-Blue IL-4/IL-13 ćelije su dizajnirane sa ciljem da se prati aktiviranje STAT6 puta uz pomoć IL-4 ili IL13. Stimulacija ćelija sa bilo kojim citokinom dovodi do proizvodnje embrionske alkalne fosfataze (reporter gen, SEAP), čija prisutnost može da se izmeri u supernatantu kulture uz pomoć testa QUANTI-Blue. Sa ciljem da se testira delovanje antitela protiv IL4 ili IL13, citokini su pre-inkubirani tokom 1 h sa antitelom u različitim koncentracijama pa su dodani u 50000 ćelija HEK-Blue IL-4/IL-13. Indukcija SEAP posredovana citokinom je izmerena nakon i 24-časovne inkubacije u supernatantu ćelijske kulture uz pomoć testa QUANTI-Blue (InvivoGen).

Primer 13. Uvođenje cisteina u CODV-Ig linkere

[0170] Objavljeni podaci sugerišu da se stabilnost antitela i veznih belančevina izvedenih iz antitela može povećati uz pomoć uvođenja ne-prirodnih disulfidnih mostova (vidi Wozniak-Knopp et al., 2012, "Stabilisation of the Fc Fragment of Human IgG1 by Engineered Intradomain Disulfide Bonds," PLoS ONE 7(1): e30083). Sa ciljem da se ispita da li ekvivalentni Fc fragment, koji je izveden iz humanog IgG1 antitela i projektovan u CODV-Ig molekul, može da se stabilizuje uz pomoć uvođenja inter- i intra-lančanih disulfidnih mostova ekvivalentne Fc pozicije CODV-Ig konstrukta iz Serije br. 204 (iz Primera 7) su mutirane u cisteinske ostatke, a mutirane belančevine su proizvedene, prečišćene, i karakterizovane (vidi Tabelu 14).

[0171] Kao šta je prikazano u Tabeli 14, svaki mutirani CODV-Ig molekul, koji sadrži dodatne cisteinske ostatke, je imao iste temperature topljenja kao i temperature topljenja CODV-Ig konstrukta iz Serije br.204.

[0172] Osim toga, dva simultana cisteina su bila uvedena u Kabat poziciju 100 u lakom lancu i 44 u teškom lancu u svakom varijabilnom domenu kao šta je opisano od strane autora Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7538-42. Ove pozicije su strukturno konzervisane unutar nabora antitela, pa zbog toga tolerišu cisteinske supstitucije bez da utiču na integritet pojedinačnih domena.

[0173] Kao šta je prikazano u Tabeli 15, CODV i CODV-Ig konstrukti u kojima su cisteinski ostaci uvedeni u Kabat poziciju 100 u lakom lancu i 44 u teškom lancu u svakom varijabilnom domenu imaju veće temperature topljenja u odnosu na CODV i CODV-Ig konstrukte u kojima cisteinski ostaci nisu uvedeni u pomenute pozicije (vidi, na primer, Serije br.704 i 706 i Serije br. 713 i 714).

1. Merenja termostabilnosti varijanata CODV i TBTI

[0174] Tačke topljenja (Tm) varijanata CODV i TBTI su određene uz pomoć diferencijalne skening fluorimetrije (DSF). Primerci su razblaženi u D-PBS puferu (Invitrogen) do konačne koncentracije od 0.2 µg/µl pa su dodani u 2 µl 40x koncentrovanog rastvora SYPRO-narandžaste boje (Invitrogen) u D-PBS u belim semi-skirt pločicama sa 96-rupica. Sva merenja su provedena u duplikatu uz pomoć instrumenta MyiQ2 real time PCR (Biorad). Tm vrednosti su ekstrahirane iz negativnog prvog derivata kriva topljenja primenom programa iQ5 v2.1.

[0175] Sledeće je ispitan efekt uvođenja cisteinskih ostataka direktno u linkere ili u varijabilni region. U ovom primeru, Serija br. 204 (iz Primera 7 i Tabele 8) je korišćena kao model za CODV-Ig veznu belančevinu, a cistein je zamenjen sa glicinom u L1, L3, ili u varijabilnom regionu na bazi tri-dimenzionalnog modela. Kao šta je prikazano u Tabeli 16 ispod, rezultati pokazuju da uvođenje cisteinskih parova utiče na prinos i agregaciju. Predviđene mutacije su bile modelirane sa ciljem da se konstatuje da li se disulfidne veze ispravno formiraju, pri čemu je korektna geometrija je održavana u linkerima i njihovoj sredini u modelima. Bez razlike na to, Serija br.808 je dala dobar prinos, niski nivo agregacije, koje sugeriše da ispravan cisteinski most može da se formira.

1

osta g dno ulfidis ćo

po uz -Ig V D

C e acij iliz tab ktsEfe 14.ela ba T

a ost

noglfidisu d oć

po uz -Ig V D

C e ij izacbil

tstafek

15.E laeab T

osta

ogidn sulf dićo

po uz -Ig V D

Cjeci liza biat kts

.Efe

16Aela ab T

ta osgoidn ulf dis oć po uz g -I V D

Cje aciilizstab kt .Efe 6B 1ela ab T

1

�

1

2

4

1

11

��

1

��

1

�

1

�

11

12

��

12

��

12

��

12

1

11

12

�

14

�

1

�

1

��

14

��

14

��

1

11

12

1

14

Claims

Patentni zahtevi

1. Vezna belančevina slična antitelu koja sadrži četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen sposobna da specifično vežu jedan ili više ciljanih antigena, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

a dva polipeptidna lanca imaju strukturu koja je predstavljena sa formulom:

VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region drške, a CH2i CH3su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

pri čemu:

dužina L4je najmanje dvostruka dužina L2; i

dužina L3je najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1 i VH1 i za uparivanje VL2 i VH2, a polipeptidi sa formulom I i polipeptidi sa formulom II formiraju ukršteni para laki lanac-teški lanac.

2. Vezna belančevina slična antitelu, naznačena time, što obuhvata dva polipeptidna lanca koja formiraju dva vezna mesta za antigen sposobna da specifično vežu jedan ili više ciljanih antigena,, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

a drugi polipeptidni lanac ima strukturu koja je predstavljena sa formulom:

VH2-L3-VH1-L4-CH1[II]

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

pri čemu:

dužina L4je najmanje dvostruka dužina L2; i

dužina L3je najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1 i VH1 i za uparivanje VL2 i VH2, a prvi i drugi polipeptid formiraju ukršteni par laki lanac-teški lanac.

3. Vezna belančevina slična antitelu iz zahteva 1-2, gde jedan ili više ciljanih antigena su izabrani iz grupe koja obuhvata B7.1, B7.2, BAFF, BlyS, C3, C5, CCL11 (eotaksin), CCL15 (MIP-ld), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MPIF-2/eotaksin-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaksin-3), CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (E-kaderin), hitinazu, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXCL12 (SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (b 4 integrin), LEP (leptin), MHC klase II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNFα, TNFSF4 (OX40 ligand), TNFSF5 (CD40 ligand), Toll-like receptore, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1 (GPR5/CCXCR1), DNGR-1(CLEC91), i HMGB1.

4. Vezujući protein nalik antitelu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde je vezujući protein bispecifičan i sposoban da veže dve različite antigenske mete, poželjno IL-4 i IL-13.

5. Vezujući protein nalik antitelu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde su dva različita ciljana antigena izabrana iz grupe koja se sastoji od IL4 i IL13, IGF1R i HER2, IGF1R i EGFR, EGFR i HER2, BK i IL13, PDL 1 i CTLA-4, CTLA4 i MHC klase II,

1

IL-12 i IL-18, IL-1a i IL-1β, TNFα i IL12/23, TNFα i IL-12p40, TNFα i IL1β, TNFα i IL-23, i IL17 i IL23.

6. Vezujući protein nalik na antitelo prema bilo kom od zahteva 1-5, gde je vezivni protein sposoban da inhibira funkciju jednog ili više ciljeva antigena.

7. Vezujući protein nalik na antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6, gde najmanje jedan od linkera odabranih iz grupe koja se sastoji od L1, L2, L3i L4sadrži najmanje jedan ostatak cisteina.

8. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira vezujući protein nalik antitelu, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.

9. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 8.

10. Izolovana ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 8 ili ekspresioni vektor iz zahteva 9, pri čemu je ćelija domaćin poželjno ćelija sisara ili ćelija insekta.

11. Farmaceutski kompozicija koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač i terapeutski efektivnu količinu vezne belančevine slične antitelu iz bilo kojeg od zahteva 1-7.

12. Postupak proizvodnje antitela sličnog vezujućem proteinu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3 do 7, koji sadrži ekspresiju u ćeliji jednog ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji imaju strukture predstavljene donjim formulama [I] i [II]:

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

1

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri,

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

13. Postupak proizvodnje antitela sličnog vezujućem proteinu prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 7, koji sadrži ekspresiju u ćeliji jednog ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji imaju strukture predstavljene donjim formulama [I] i [II]:

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

VH2-L3-VH1-L4-CH1[II]

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL1je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

i gde linkeri pružaju dovoljnu pokretljivost za uparivanje VL1i VH1i za uparivanje VL2i VH2, a polipeptid sa formulom I i polipeptid sa formulom I formira ukršteni par laki lanac-teški lanac.

14. Postupak proizvodnje antitela sličnog vezujućem proteinu koji obuhvata četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, pri čemu pomenuti postupak obuhvata:

1

b) pripisivanje lakog lancu kao lanca za kalup;

d) pripisivanje funkcija VL2, VH1, i VH2u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

VH1-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]

e) određivanje maksimalnih i minimalnih dužina L1, L2, L3, i L4;

f) generisanje polipeptidnih struktura sa formulama I i II;

g) izbor polipeptidnih struktura sa formulama I i II koji vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada se spoje sa ciljem da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu; gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca;

Fc je imunoglobulinski region ručke, a CH2, CH3su konstantni domeni iz imunoglobulinskog teškog lanca; i

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

15. Postupak proizvodnje antitela sličnog vezujućem proteinu koji sadrži četiri polipeptidna lanca koja formiraju četiri vezna mesta za antigen, koji sadrži

1

b) pripisivanje lakog lancu kao lanca za kalup;

d) pripisivanje funkcija VL2, VH1,i VH2u skladu sa formulama [I] i [II] ispod:

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

VH1-L3-VH1-L4-CH1[II]

e) određivanje maksimalnih i minimalnih dužina za L1, L2, L3, i L4;

f) generisanje polipeptidnih struktura sa formulama I i II;

g) izbiranje polipeptidnih struktura sa formulama I i II koje vežu prvi ciljani antigen i drugi ciljani antigen kada se spoje sa ciljem da formiraju veznu belančevinu sličnu antitelu;

gde:

VL1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog lakog lanca;

VL2je varijabilni domen iz drugog imunoglobulinskog lakog lanca;

VH1je varijabilni domen iz prvog imunoglobulinskog teškog lanca;

VH2je varijabilni domen drugog imunoglobulinskog teškog lanca;

CLje konstantni domen iz imunoglobulinskog lakog lanca;

CH1je konstantni domen iz imunoglobulinskog CH1teškog lanca; a

L1, L2, L3, i L4su amino-kiselinski linkeri;

gde je dužina L4najmanje dvostruka dužina L2; i

gde je dužina L3najmanje dvostruka dužina L1;

16. Postupak prema zahtevu 14 ili 15 gde su prvi promenljivi domen antitela i drugi varijabilni domen antitela isti.

1