RS62519B1 - Metode upotrebe trisupstituisanih derivata benzotriazola kao inhibitora dihidroorotat oksigenaze - Google Patents

Description

POZADINA PRONALASKA

Polje pronalasaka

[0001] Predstavljeni pronalazak se odnosi na nove trisupstituisane derivate benzotriazola formule (I) koji su inhibitori dihidroorotat oksigenaze. Posebno, pronalazak se odnosi na nova jedinjenja, koja inhibiraju aktivnost DHODH enzima, na njihov proces proizvodnje i farmaceutskih kompozicije koje ih sadrže, i na njihovu upotrebu za lečenje i prevenciju bolesti ili poremećaja, posebno za njihovu upotrebu kod bolesti i poremećaja gde imaju prednost u inhibiranju DHODH.

Opis srodnih članaka

[0002] DHODH je protein koji katalizuje jedan od koraka u de novo biosintetskom putu pirimidin nukleotida (Greene i saradnici, Biochem Pharmacol 1995, 50:861-7; Davis J.P. i saradnici, Faseb J 1996, 10(6): Abst C23). Ove katalize su samo oksidaciono-redukcione reakcije na tom putu, koji je korak pretvaranja DHO (dihidroorotata) u orotat pomoću kofaktora flavina i elektron akceptora. Utvrđeno je da inhibitori dihidroorotat dehidrogenaze imaju širu primenu kao hemoterapeutski agensi (Kensler i saradnici, 1989.u: Design of Enzyme Inhibitors as Drugs; Sandler, M., and Smith, H. J. Eds., pp 379-401 Oxford Univ Press, Oxford England; Cody i saradnici, Am. J. Clin. Oncol. 16, 526-528 (1993)).

[0003] Kao primer DHODH inhibitora, kvinolinski derivat Brekvinara (6-fluoro-2- fluoro[1,1’-bifenil]- 4-yl)-3-metil-4-kvinolinkarboksilna kiselina) pokazuje aktivnost protiv karcinoma kod L1210 mišje leukemije (Andreson LW. i saradnici, Cancer Commun. 1989; 1(6), 381-7; Chen SF. i saradnici, Cancer Res. 1986 Oct; 46(10): 5014-9). Takođe je prikazano da Brekvinar pospešuje antikarcinomsko delovanje 5-fluoracila u mišjem modelu 38 kancera tkiva debelog creva, specifičnom izmenom skladišta nukleotida uridina (G. Pizzorno i saradnici Cancer Res. 1992 Apr 1; 52:1660-5).

[0004] Inhibitori DHODH takođe mogu biti korisni u lečenju virusno posredovanih bolesti (pogledati US 6,841,561). Dalje, poznato je da inhibicija DHODH obećavajući cilj u lelčenju odbacivanja transplanta, reumatoidnog artritisa, psorijaza, kao i autoimunih bolesti (Kovarik, J. M. i saradnici, Expert Opin. Emerg. Drugs 2003, 8, 47; Allison, A.C. Transplantation Proc. (1993) 25(3) Suppl. 2, 8-18); Makowka, L., Immunolog Rev. (1993) 136, 51-70; Davis J.P i saradnici, Biochemistry 1996, 35: 1270-3).

[0005] Leflunomid, dobro poznati DHODH inhibitor, je sintetski lek koji se trenutno prodaje, lek niske molekularne mase iz klase izoksazola (pogledati EP0527736, JP1993506425, JP1999322700, JP1999343285, US5494911, US5532259, WO19991017748) i koristio se u lečenju reumatoidnog artritisa i procenjuje se takođe i njegovo korišćenje u lečenju upalnih bolesti creva o hroničnog odbacivanja alografta.

[0006] In vivo, leflunomid se brzo transformiše u njegov aktivni oblik teriflunomid koji ispoljava njegove antiupalno, antiproliferativno i imunosupresorsko dejstvo pomo ću mehanizma koji nije u potpunosti razjašnjen. Teriflunomid nije samo mogući inhibitor proteina tirozin kinaze in vivo već je 100-1000 puta bolji inhibitor DHODH (Davis J.P i saradnici, FASEB J 1996, 10(6): Abst C23; Davis J.P et al. Biochemistry 1996, 35:1270-3).

[0007] WO2014/128669 otkriva “trisupstiruisane derivate benzotriazola kao jedinjenja formule (I) inhibitore dihidroorotat oksigenaze, koja mogu biti terapeutski korisna kao inhibitori DHODH. (I) gde R1, R2 i R3 imaju značenja navedena u specifikaciji, i njihove farmaceutski prihvatljive soli koje su korisne u lečenju i prevenciji bolesti i poremećaja, naručito njihova upotreba kod bolesti i poremećaja gde postoji prednost u inhibiciji DHODH.

[0008] Sa porastom broja pacijenata sa autoimunim i srodnim bolestima, postoji nezadovoljena potreba za novim lekovima koji mogu efikasnije da leče takve bolesti. I dalje postoji ključna potreba za imunosupresivnim agensima koji dalje mogu biti korisni za širok spektar autoimunih i hroničnih upalnih bolesti, uključujući sistemski eritematozni lupus, hronični reumatoidni artritis, multiple sklerozu, dijabetes melitus tip I, upalne bolesti creva, bilijarnu cirozu, uveitis i druge poremećaje kao što su Kronova bolest, ulcerozni kolitis, bulozni pemfigoid, sarkoidoza, psoriaza, autoimuni mijelitis, Vegenerova granulomatoza, ihtioza, Grajvsova oftalmopatija, atropijski dermatitis i astma. Oni takođe mogu biti korisni kao deo hemoterapeutskih rezima za tretman karcinoma, limfoma i leukemija, sami ili u kombinaciji sa antitumorskim jedinjenjima dobro poznatim stručnjacima.

SAŽETAK PRONALASKA

[0009] Predstavljeni pronalazak se odnosi na jedinjenja za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije, multiple mijeloma, B-prolimfocitne leukemije, ne-Hodgkinskovog limfoma, difuzijonog limfoma velikih B ćelija, anaplastičnog limfoma velikih ćelija, mantle ćelijskog limfoma, trostruko negativnog kancera dojke, melanoma, karcinoma prostate ili karcinoma jednjaka, pri čemu se jedinjenje odabira od:

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0010] Otkriven je, ali nije deo pronalaska, postupak inhibiranja rasta i/ili metastaza tumornih ćelija kod subjekta. Postupak sadrži korak primene na subjekat, jedan ili više puta, terapeutski efikasne količine najmanje jednog jedinjenja formule (I):

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U strukturi tri tačke […] u prstenu predstavljaju potencijalnu vezu koja može biti prisutna u bilo kojoj stabilnoj kombinaciji. R1može biti vodonik ili alkil. R2može biti -A-R4. A može biti arilen ili tetrasupstituisani arilen gde je substituent halogen. R3može biti hidroksi ili amino. R4može biti potencijalno substituisan aril i potencijalno substituisan heteroaril. Potencijalni substituenti mogu biti jedan ili vi še R5. R5može biti alkil ili -(CH2)nN(Ra)Rb. Rai Rbmogu biti nezavisno vodonik, alkil i -C(O)alkil, ili alternativno, Rai Rbmogu biti uzeti zajedno sa atomom azota na koji su vezani kako bi formirali opcijono supstituisani 4-6 člani heterociklil koji sadrži 0-2 dodatna heteroatoma, nezavisno odabrana između kiseonika i azota, gde je opciono suptituent alkkil i “n” moće biti ceo broj 0 i 1.

[0011] Takođe je otkriven postupak za inhibiciju aktivnost i enzima dihidrooratat oksigenaze u ćelijama tumora. Metoda sadrži korak kontakta ćelija tumora, jednom ili više puta sa terapeutski efikasne količine najmanje jednog jedinjenja formule (I):

1

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U strukturi tri tačke […] u prstenu predstavljaju potencijalnu vezu koja može biti prisutna u bilo kojoj stabilnoj kombinaciji. R1može biti vodonik ili alkil. R2može biti -A-R4. A može biti arilen ili tetrasupstituisani arilen gde je substituent halogen. R3može biti hidroksi ili amino. R4može biti potencijalno substituisan aril i potencijalno substituisan heteroaril. Potencijalni substituenti mogu biti jedan ili vi še R5. R5može biti alkil ili -(CH2)nN(Ra)Rb. Rai Rbmogu biti nezavisno vodonik, alkil i -C(O)alkil, ili alternativno, Rai Rbmogu biti uzeti zajedno sa atomom azota na koji su vezani kako bi formirali opcijono supstituisani 4-6 člani heterociklil koji sadrži 0-2 dodatna heteroatoma, nezavisno odabrana između kiseonika i azota, gde je opciono suptituent alkkil i “n” moće biti ceo broj 0 i 1.

KRATAK OPIS NACRTA

[0012]

Slika 1 prikazuje osetljivost panela od ~ 400 humanih liniija karcinoma hematopoetskog i karcinoma nehematopoetskog porekla prema rastu inhibicije Jedinjenja 1 ovog pronalaska. Sivi krugovi predstavljaju ćelijske linije ocenjene kao osetljive (pokazuju ≥75% maksimalnog rasta inhibicije i GI50 vrednost <1.5 µM).

Slika 2 prikazuje osetljivost dodatnih panela humanih linija hema kancera prema rastu inhibicije Jedinjenja 1 ovog pronalaska.

Slika 3 prikazuje fiziološku sposobnost (5 µM) i suprafiziološku koncentraciju (25 µM, 100 µM) egzogenog uridina da spreči citotoksične efekte 10 mM jedinjenja na naznačene linije kancera.

Slika 4A prikazuje relativni stepen rasta u odnosu na koncentraciju osetljivosti profila MV411, Kasumi-1, THP-1, DB, Toledo i WSU-DLCL2 linija ćelija naspram različitih koncentracija Jedinjenja 1.

Slika 4B prikazuje relativni stepen rasta u odnosu na koncentraciju osetljivosti profila MV411, Kasumi-1, THP-1, DB, Toledo i WSU-DLCL2 linija ćelija naspram različitih koncentracija citarabina.

Slika 4C prikazuje relativni stepen rasta u odnosu na koncentraciju osetljivosti profila MV411, Kasumi-1, THP-1, DB, Toledo i WSU-DLCL2 linija ćelija naspram različitih koncentracija doksorubicina.

Slika 5A prikazuje krivu rasta MOLM-13 tumora kod CB17 SCID miševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 10 mg/kg Jedinjenja 1, dva puta dnevno (BID), mereno tokom 14 dana.

Slika 5B prikazuje farmakokinetički profil Jedinjenja 1 (doza 100 mg/kg, BID) u plazmi CB17 SCID miša i u implantiranim MOLM-13 tumorima u naznačenim vremenskim tačkama nakon poslednje doze na kraju istraživanja.

Slika 5C prikazuje nivoe DHO u nelečenim (nosač) MOLM-13 tumorima i tumorima lečenim Jedinjenjem 1, mereno tokom 12 sati nakon poslednje doze u istraživanju.

Slika 5D prikazuje nivo urinida u nelečenim (nosač) MOLM-13 tumorima i tumorima lečenim Jedinjenjem 1, mereno tokom 12 sati nakon poslednje doze u istraživanju.

Slika 6A prikazuje krive rasta AML_1 tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID miševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Slika 6B prikazuje krive rasta AML_2 tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID mi ševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Slika 6C prikazuje krive rasta AML_3 tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID mi ševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Slika 6D prikazuje krive rasta AML_4 tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID miševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Slika 6E prikazuje krive rasta AML_5 tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID mi ševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Slika 7A prikazuje krive rasta DLBCL_1 (modela sa trostrukim pogotkom) tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID miševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Slika 7B prikazuje krive rasta DLBCL_2 (modela sa trostrukim pogotkom) tumora dobijenog od pacijenata, kod CB17 SCID miševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID.

Na slici 8 je kriva koje prikazuje relativni stepen rasta OCILY18, SC-1 i CARNAVAL dvostruko pogođenih ćelijskih linija difuzionih limfoma velike B ćelije lečenih sa različitim koncentracijama Jedinjenja 1 tokom 96 sati.

Slika 9A prikazuje krive rasta OCILY-19 tumora dvostruko pogođenih difuzionim limfomom velike B ćelije (DLBCL) kod CB17 SCID miševa kada se ne leči (nosač) ili leči sa 10 mg/kg Jedinjenja 1, BID; 30 mg/kg Jedinjenja 1, BID; 100 mg/kg Jedinjenja 1, BID; i 200 mg/kg Jedinjenja 1, jednom dnevno (QD) sve mereno tokom 14 dana.

Slika 9B prikazuje farmakokinetički profil Jedinjenja 1, primenjenih doza opisanih na slici 9A, u plazmu CB17 SCID miševa, u naznačenim vremenskim tačkama nakon poslednje primenjene doze u istraživanju.

Slika 9C prikazuje nivoe DHO u nelečenim (nosač) OCILY-19 tumorima i tumorima lečenim Jedinjenjem 1 u naznašenim dozama, mereno tokom 12 sati nakon poslednje doze u istraživanju.

Slika 9D prikazuje nivoe uridina u nelečenim (nosač) OCILY-19 tumorima i tumorima lečenim Jedinjenjem 1 u naznašenim dozama, mereno tokom 12 sati nakon poslednje doze u istraživanju.

Na slici 10 je kriva koje prikazuje relativni stepen rasta DU4475 trostruko negativne linije kancera dojke lečenog sa različitim koncentracijama Jedinjenja 1 tokom 96 sati.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0013] Otkriveni su trisupstituisani derivati benzotriazola kao inhibitori dihidroorotat oksigenaza.

[0014] Ovi derivati su korisni kao lekovi u lečenju autoimunih i zapaljenskih poremećaja poput multiple skleroze, reumatoidnog artritisa i bolesti poput kancera.

[0015] Ovde su otkrivena jedinjenja formule (I),

Ili njene farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutski prhvatljivog regio izomera pri čemu:

tri tačke […] u prstenu predstavljaju opcionu vezu koja može biti prisutna u svakoj stabilnoj kombinaciji;

R1je izabran između vodonika i alkila;

R2je -A-R4;

A je arilen ili tetrasubstituisani arilen; pri čemu je substituent halogen;

R3je izabran između hidroksi i amino grupe;

R4je izabran između opciono substituisanog arila i opciono supstituisanog heteroarila; pri čemu su opcioni supstituenti izabrani između jednog ili više R5;

R5je izabran između alkil i -(CH2)nN(Ra)Rbgrupe;

Rai Rbmogu biti zajedno uzeti sa atomom azota na koji su vezani radi formiranja opcionog supstituisanog 4-6 članog heterocikla koji sadrži 0-2 dodatna heteroatoma nezavisno izabrana ozmeđi kiseonika i azota; pri čemu je opcioni supstituent akril; i

“N” je ceo broj izabran između 0 i 1.

[0016] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je R1akril; posebno akril je metil.

[0017] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je R2-A-R4; gde je -A- izabran između arilena i tetrasubstituisanog arilena.

[0018] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je R2izabran između

[0019] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je R4izabran između opciono supstituisanog fenila; u kom su opcioni supstituenti izabrani između metil, acetilamin, izopropilaminometil, metilaminometil, dimetilaminometil grupe

1

[0020] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je R4izabran između 2,4-dimetil-1H-pirol grupe;

[0021] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je R3izabran između -OH i-NH2grupe.

[0022] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je jedinjenje formule (Ia)

pri čemu su crtice [- - -], R1, R3i R4iste kao što je opisano u formuli (I).

[0023] Takođe su otrivena jedinjenja formule (I) u kojoj je jedinjenje formule (Ib)

pri čemu su crtice [- - -], R1, R3i R4iste kao što je opisano u formuli (I).

[0024] Takođe su otriven postupak pripreme trisupstituisanih derivata benzotiazola formule (I).

[0025] Postupak za jedinjenja formule (I) je detaljno opisan u daljem tekstu, korak po korak uključujući i opštu sintezu različitih intramedijera uključenih u proces proizvodnje jedinjenja prema predstavljenom pronalasku.

[0026] Konkretnije, otkrivena je upotreba jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili regio-izomera, uključujući smeše svega pomenutog u odnosima kao lek, inhibiranjem aktivnosti enzima dihidroorotat oksigenaze u lečenju poremećaja poput multiple skleroze i drugih poremećaja kao što su zapaljenski poremećaji, reumatoidni artritis i kancer.

[0027] Trisupstituisani derivati benzotiazola formule (I) ovog pronalaska imaju terapeutsku ulogu inhibiranja enzima dihidroorotat dehidrogenaze (DHODH ili DHOD). Jedinjenja formule (I) mogu biti korisna u lečenju i/ili prevenciji, ali nisu ograničena na, autoimune i hronične zapaljenske bolesti, uključujući sistemski eritematozni lupus, hronični reumatoidni artritis, multiple sklerozu, dijabetes melitus tipa I, zapaljenske bolesti creva, bilijarnu cirozu, uveitis i druge poreme ćaje kao što su Kronova bolest, ulcerozni kolitis, bulozni pemfigoid, sarkoidoza, psorijaza, autoimuni miozitis, Vegenerova granulomatoza, ihtioza, Gravisova oftalmopatia, atropijski dermatitis i astma. Jedinjenja formule (I) i srodnih formula takođe mogu biti korisna kao deo hemoterapeutskog rezima lečenja kancera, limfoma i leukemija, sami ili u kombinaciji sa klasičnim antitumorskim jedinjenima dobro poznatim stručnjacima.

[0028] Sledeće definicije su date kako bi se stručnjacima u ovoj oblasti pomoglo da razumeju detaljan opis ovog pronalaska.

[0029] “Alkil” se odnosi na ugljovodonični lanac koji može biti linearan ili razgranat, koji sadrži naznačen broj ugljenikovih atoma, na ptimer, C1-C6 alkil grupa može imati u sebi od 1 do 6 (uključujući) ugljenikovih atoma. Primeri C1-C4i C1-6alkil grupa uključuje, ali ne ograničava se na, metil, etil, propil, butil, pentil, heksil, izopropil, izobutil, sec-butil, tert-butil, izopentil, neopentil i izoheksil. Alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više pogodnih grupa.

[0030] “Amino” se odnosi -N- grupu, atom azota u pomenutoj grupi je vezan za vodonik, alkil, cikloalkil, aril, heterociklil ili bilo koju pogodnu grupu. Reprezentativni primeri amino grupe uključuju, ali ne ograničavaju se na -NH2, -NHCH3i -NH-ciklopropil. Amino grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više pogodnih grupa.

[0031] “Aril” se odnosi na opciono supstituisani moniciklični, biciklični ili policiklični aromatični ugljovodonični prsten sa oko 6 do 14 ugljenikovih atoma. Primeri C6-C14aril grupe uključuju, ali ne ograničavaju se na fenil, naftil, bifenil, antil, tetrahidronaftil, fluorenil, indanil, bifenilenil i acenaftil. Aril grupa koja može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili vi še pogodnih grupa.

[0032] “Arilen” označava dvovalentni monociklični ili biciklični, zasićeni, nezasičeni ili aromatični ugljovodonični prsten koji ima od 6 do 14 atoma ugljenika koji mogu biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više pogodnih grupa.

[0033] “Halogen” ili “halo” uključuje fluor, hlor, brom ili jod.

[0034] “Hidroksi” se odnosi na -OH grupu.

[0035] Pojam “heterocikl” uključuje definicije “heterocikloalkila” i “heteroarila”. Pojam “heterocikl” se odnosi na biaromatični, supstituisani ili delimično supstituisani, monociklični ili policiklični prsten sa od 3 do 10 članova gde je najmanje jedan heteroatom ili heterogrupa izabrana između O, N, S, S(O), S(O)2, NH i C(O). Reprezentativna heterocikloakril grupa uključuje piperdinil, piperazinil, morfolinil, triomorfolinil, 1,3-dioksoanil, 1,4-dioksoanil i slične. Heterocikloakril grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više pogodnih grupa.

[0036] “Heteroaril” se odnosi na nesupstituisani, monociklični,biciklični ili policiklični aromatični prsten koji sadrži najmanje jedan heteroatom izabran između kiseonika, sumpora i azota. Primeri C5-C10heteroaril grupa uključuju furan, triofen, indol, azaindol, oksazol, triazol, triadiazol, izokazol, izotriazol, imidazol, N-metilimifazol, piridin, pirimidin, pirazinm pirol, N-metilpirol, pirazol, N-metilpirazol, 1,3,4-oksadazol, 1,2,4-tiazol, 1-metil-1,2,4-triazol, 1H-tetrazol, 1-

1

metiltetrazol, benzoksazol, benzotiazol, benzofuran, benzizooksazol, idazol, kvinazolin, kvinolin i izokvinolin. Biciklične hetroaril grupe uključuju one u kojima su spojeni fenil, piridin, pirimidin i piradizin prsten, sa 5- ili 6-članim monocikličnim heterocikličnim prstenom koji ima jedan ili dva azotova atoma u prstenu, jedan azotov atom zajedno sa jednim kiseonikom ili jednim atomom sumpora u prstenu ili jedan O ili S atom u prstenu. Heteroaril grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više pogodnih grupa.

[0037]“Heteroatom” se odnosi na atom sumpora, azota ili kiseonika.

[0038] “Ociono supstituisan ili supstituisan” kako se ovde koristi, znači da je najmanje jedan vodonikov atom opciono supstituisane grupe zamenjen sa pogodnim supstituentom kao primeri, ali bez ograničenja na halogen, hitro, cijano, hidroksi, okso (=O), tio (=S), -N(C1-C3alkil)C(O)(C1-C6alkil), -NHC(O)(C1-C6alkil), -NHC(O)(cikloalkil), -NHC(O)(aril), - NHC(O)(heterocikl), -NHC(O) (heteroaril), -NHC(O)H, -C(O)NH2, -C(O)NH(C1-C6 alkil), -C(O)NH(cikloalkil), -C(O)NH(heterocikl), -C(O)NH(heteroaril), -C(O)N(C1-C6alkil)(C1-C6alkil), -S(O)NH(C1-C6alkil),-S(O)2NH(C1-C6alkil), -S(O)NH(cikloalkil), - S(O)2NH(cikloalkil), karboksi, -C(O)O(C1-C6alkil), -C(O)(C1-C6alkil), =N- OH, supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani haloalkil, supstituisani ili nesupstituisani alkoksi, supstituisani ili nesupstituisani haloalkoksi, supstituisani ili nesupstituisani alkenil, supstituisani ili nesupstituisani alkinil, supstituisani ili nesupstituisani aril, supstituisani ili nesupstituisani arilalkil, supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil, supstituisani ili nesupstituisani cikloalkenilalkil, supstituisani ili nesupstituisani cikloalkenil, supstituisana ili nesupstituisana amino, supstituisani ili nesupstituisani hetoroaril, supstituisani ili nesupstituisani hetorociklil, supstituisani ili nesupstituisani heteroarylalkil, supstituisani ili nesupstituisani heterocikli čni prsten.

[0039] Određena jedinjenja ovog pronalaska bez odstupanja od opsega definicija datih pod jedninjenima formule (I) i određena jedinjenja koja su priozašla iz formule (I) su sumirana u narednoj tabeli, koja obuhvata celokupan opseg jedinjenja unutar jedinjenja formule (I).

1

1

Ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili njihovi farmaceutski prihvatljivi regio izomeri.

[0040] Takođe su otkrivena jedinjenja formule (I) za upotrebu u lečenju zapaljenskih poremećaja i autoimunih bolesti ili preteranog imunog odgovora. Takođe su otkrivena jedinjenja formule (I) za upotrebu u lečenju multiple skleroze, reumatoidnog artritisa i odbacivanja transplanta.

[0041] Takođe su otkrivena jedinjenja formule (I) ili njihovi farmaceutski prihvatljivi derivati, soli i regio izomeri, uključujući njihove smeše u svim odnosima kao lek.

[0042] Upotreba prethodno pomenutih jedinjenja i njihovih farmaceutski upotrebljivih derivata, soli i regio izomera, uključuju’i i njihove smeše u svim odnosima,za pripremu leka za lečenje i/ili profilaksu poremećaja povezanog sa dihidroorotat dehidrogenazom.

[0043] Upotreba prethodno pomenutih jedinjenja gde je, poreme ćaja povezan sa dihidroorotat dehidrogenazom, autoimuni poremećaj ili stanje povezano sa prejakim imunim odgovorom.

[0044] Upotreba prethodno pomenutih jedinjenjai njihovih farmaceutski upotrebljivih derivata, soli i regio-izomera, uključuju’č i njihove smeše u svim odnosima, za pripremu leka za lečenje i/ili profilaksu imunoregulatorne abnormalnosti.

[0045] Upotreba prethodno pomenutih jedinjenja gde je imunoregulatorna abnormalnost multiple skleroza ili reumatoidni artritis.

[0046] Upotreba prethodno pomenutih jedinjenja za pripremu leka za lečenje i/ili profilaksu bolesti kancera, zapaljenskih bolesti creva ili reumatoidnog artritisa.

[0047] Takođe je otkrivena farmaceutska formulacija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje prema formuli (I) i/ili njihovih farmaceutski upotrebljivih derivata, soli i regio izomera, uklju čuju’č i njihove smeše u svim odnosima, i najmanje jedan dodatni aktivni sastojak.

[0048] Takođe je otkrivena farmaceutska formulacija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje prema formuli (I) i/ili njihovih farmaceutski upotrebljivih derivata, soli i regio-izomera, uključujći i njihove smeše u svim odnosima, eventualno jedan dodatni aktivni sastojak i najmanje jedanu pomoćnu supstancu.

[0049] Izraz “farmaceutski prihvatljivaso” ili “farmaceutski prihvatljivi derivati” podrazumeva aktivni sastojak koji sadrži jedinjenje formule (I) u obliku jedne od njegovih soli, naručito ukoliko ovaj oblik soli poboljšava farmakokinetičke osobine aktivnog sastojka u poređenju sa njegovim slobodnim oblikom ili bilo kojim oblikom soli aktivnog sastojka koji je ranije upotrebljan. Farmaceutski prihvatljivi oblik soli aktivnog sastojka takođe može ovom aktivnom sastojku obezbediti, po prvi put, željena farmakokinetička svojstva koja ranije nije imao i čak imati pozitivan uticaj na farmakodinamiku ovog aktivnog sastojka u pogledu terapeutske efikasnosti u telu.

[0050] Izraz “regio-izomer” ili “regio-izomeri” se odnosi na pozicione izomere, koji spadaju u kategoriju strukturnih izomera pri čemu je položaj ili promenjen položaj supstituenta na osnovnoj

1

strukturi. Ovde izraz regio-izomer, bez odstupanja od opsega jedinjenja formule (I) su štinski uključuje sve regio-izomere, bilo kao čist regio-izomer ili smešu dva ili više njegova izomera. Pošto se farmaceutska aktivnost regioizomera jedinjenja ovog pronalaska može razlikovati, može biti korisno upotrebljavati regio-izomere. U Tim slučajevima regio-izomeri mogu biti odvojeni u bilo kojoj mogućoj fazi ili kao međuproizvod ili kao krajnji proizvod, postupkom dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, ili se čak kao takav upotrebljavati u sintezi. Regio-izomeri jedinjenja formule (I) se odnose na sledeće strukture

Regio-izomer 1 Regio-izomer 2 Regio-izomer 3

[0051] Farmaceutska formulacija može biti adaptirana za primenu bilo kojim odgovarajućim metodom, na primer oralnu (uključujući bukalnu ili subligvalnu), rektalnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu, subligvalnu ili transdermalnu), vaginalnu ili parenteralna (uključujući potkožnu, intramuskularnu, intravenoznu ili intradermalnu) metodu. Takve formulacije se mogu pripremiti korišćenjem svih postupaka poznatih u farmaceutskoj struci, na primer, kombinovanje, aktivnih sastojaka sa ekscipijentom ili pomoćnom supstancom.

[0052] Farmaceutske formulacije prilagođena za oralnu primenu mogu se davati kao zasebna doza, kao što su, na primer, kapsule ili tablete; praškovi ili granule; rastvori ili suspenzije u vodenim ili nevodenim tečnostima; jestive pene ili hrana od pene; ili tečne emulzije ulje u vodi ili tečne emulzije voda u uju.

[0053] Na primer, u slučaju oralne primene kao što su tablete ili kapsule, komponenta aktivnog sastojka može biti kombinovana sa oralnim, netoksičnim i farmaceutski prihvatljivom inertnom pomoćnom supstancom, kao što su na primer etanol, glicerol, voda i slično. Praškovi se pripremaju usitnjavanjem jedinjenja do odgovarajuće veličine cestica i mešanjem sa farmaceutskim pomoćnim materijalom, koji je usitnjen na sličan način, kao na primer jestivi ugljeni hidrat, kao što je na primer skrob ili manitol. Aroma, konzervans, dispergent i boja takođe mogu biti prisutnji.

[0054] Kapsule su napravljane pripremom mešavine praška kako je već opisano u prethodnom tekstu i šunjenjem oblikovanih želatinskih omotaća time. Klizna sredstva i lubrikanti kao što su na primer visoko dispergovana salicilna kiselina, talk, magnezijum stearat, calcijum stearat ili polietilen glikol u čvrstom obliku može biti dodat u miks praška pre postupka punjena. Dezintegrant ili rastvarač, kao što su na primer agar-agar, kalcijum karbonat ili natrijum karbonat, mo že se takođe dodati da bi se poboljšala dostupnost leka nakon uzimanja kapsule.

[0055] Dodatno, ukoliko postoji želja ili je neophodno, pogodna vezivna sredstva, lubriknti i dezintegranti, kao i boje, se mogu dodati u smešu. Pogodna vezivna sredstva uključuju, skrob, želatin, prirodne šećere, kao što su glukoza ili beta lakotoza, zaslađivače napravljene od kukuruza, prirodne i sintetičke gume, kao što su na primer bagrem, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetilceluloza, polietilen glikol, voskovi i slično. Lubrikanti koji se koriste u ovim oblicuma doza uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. Dezintegranti uključuju, bez ograničenja, skrob, metilcelulozu, agar, bentonit, ksantan gumu i slično. Tablete su napravljene, na primer, pripremom praškaste smeše, granuliranjem i suvim presovanjem smeše, dodavanjem lubrikanta i dezintegranta i presovanjem cele smeše kako bi se dobile tablete. Praškasta smeša je pripremljena mešanjem

1

jedinjenja usitnjenog na odgovarajući način sa razblaživačem ili bazom, kao što je prethodno opisano, i opcioniono sa vezivnim sredstvom poput, na primer, karboksimetilceluloze, alginata, želatina ili polivinilpirolidina, sredstva koje usporava rastvaranje poput, na primer, parafina, sredstva koje ubrzava absorpciju poput, na primer, kvatenernih soli, i/ili absorbanta poput, na primer, bentonita, kaolina ili dikalijum fosfata. Praškasta smeša može biti granulisana kvašenjem sa vezivnim sredstvom poput, na primer, sirupa, skrobne paste, sluzi bagrema ili rastvora celuloze ili polimernih materijala, i presovanjem kroz sito. Kao alternativa granulaciji, pra škasta smeša može biti propuštena kroz mainu za tabletiranje, pri čemu se dobijaju grudviče neujednačenog oblik koje se razbijaju kako bi se formirale granule. Granule se mogu podmazati dodavanjem stearinske kiseline, stearat soli, talka ili mineralnog ulja, za slučaj prevencije lepljenja tablete na liveni kalup. Podmazana smeša se zatim pritiska da bi se dobile tablete. Aktivni sastojci takođe mogu biti kombinovani sa inertnom pomoćnom supstancom slobodnog protoka i nda direktno presovani da bi se dobile tablete bez izvođenja koraka granuliranja i suvog presovanja. Prozirni ili neprozirni zaštitni sloj koji se sastoji od šelak zaptivnog sloja, sloja šećera ili polimernog materijala i može biti prisutan sjajni sloj voska. Boje se mogu dodati u ove premaze kako bi se razlikovale razli čite jedinice doze.

[0056] Oralne tečnosti poput, na primer, rastvora, sirupa i eliksira, mogu se pripremati u obliku jedinica za doziranje tako da data količina sadrži unapred određenu količinu jedinjenja. Sirupi se mogu pripremati rastvaranjem jedinjenja u vodenom rastvoru sa odgovaraju ćom aromom, dokmse eliksiri pripremaju korišćenjem netoksičnih alkoholnih nosača. Suspenzije mogu biti napravljene disperzijom jedinjenja u netoksičnom nosaču. Rastvarači i emulgatori poput, na primer, etoksilovani izostearil alkoholi i poliksoetilen sorbitol etari, konzervansi, aditivi ukusa, poput, na primer, pepermint ulja ili prirodni zaslađivači ili saharin, ili drugi veštački zaslađivači i slično, takođe mogu biti dodati.

[0057] Formulacije doznih jedinica za oralnu upotrebu mogu, po želji, biti inkapsulirane u mikro kapsule. Formulacija takođe može biti pripremljena na takav način da se oslobađanje produži ili uspori, poput, na primer, premazivanja ili ugrađivanja čestica u polimere, vosak i slično.

[0058] Novi trisupstituisani derivati benzotiazola formule (I) i njegove farmaceutski prihvatljive soli i njihovi fiziološki funkcionalni derivati i druge aktivne supstance takođe mogu biti primenjene u obliku sistema za isporuku lipozoma poput, na primer, malih jednoslojnih vezikula, velikih jednoslojnih vezikula i multislojnih vezikula. Lipozomi mogu da se formiraju od odgovarajućih lipida ili fosfolipida ili oba, poput na primer, holesterola, stearilamina ili fosfatidilholina i sli čnih.

[0059] Farmaceutske formulacije prilagođene za transdermalnu primenu mogu se primenjivati kao nezavisni flasteri za produženi, bliski kontakt sa epidermisom primaoca. Tako na primer, aktivni sastojak možr biti isporučen sa flastera putem jonotopforeze, kako je opisano u generalnim principima u Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).

[0060] Farmaceutska jedinjenja prilagođene za topikalnu primenu mogu se napraviti kao masti, kreme, suspenzije, losioni, puderi, rastvori, paste, gelovi, spejevi, aerosoli ili ulja.

[0061] Za lečenje oka ili drugih spoljašnjih tkiva, na primer usta i kože, formulacije koje su poželjne za primenu su lokalne masti ili kreme. U slučaju da je formulacija data kao mast, može se koristiti aktivni sastojak na bazi parafina ili kreme koja se me ša sa vodom. Alternativno, aktivni sastojak se može formiati tako da daje kremu na bazi ulje-voda kreme ili na bazi voda-ulje.

[0062] Farmaceutske formulacije prilagođene za topikalnu primenu na oku uključuju kapi za oči, u kojima je aktivni sastojak rastvoren ili suspendovan u odgovarajućem nosaču, posebno u vodenom nosaču.

[0063] Farmaceutske formulacije prilagođene za topikalnu primenu u usta obuhvataju lozenge, pastile i tečnosti za ispiranje usta.

2

[0064] Farmaceutska jedinjenja prilagođene za rektalnu primenu mogu se primeniti u obliku supozitorija ili klistira.

[0065] Farmaceutska jedinjenja prilagođene za nazalnu primenu u kojima je noseća supstanca čvrsta i sadrži grubi prašak koji ima veličinu čestica, na primer, u opsegu od 20-50 mikrona, koji se primenjuje na način u kojem se uzima, npr. brzom inhalacijom kroz nazalne prolaze iz posude sa praškom koja je blizu nosa. Pogodne formulacije za primenu kao nazalni spej ili kapi za nos sa tečnošću kao nosačem supstance, obuhvataju rastvore aktivnih sastojaka u vodi ili ulju.

[0066] Farmaceutska jedinjenja prilagođene za primenu inhalacijom obuhvataju fine čestice prašine ili magle koje mogu biti napravljene različitim vrstama dozatora pod pritiskom sa aerosolima, rasprašovačima ili insuflamatorima.

[0067] Farmaceutske formulacije prilagođene za vaginalnu primenu se mogu primeniti kao pesari, tamponi, lreme, gelovi, paste, pene i sprej formulacije. Farmaceutske formulacije prilago đene za parenteralnu primenu uključuju vodene i nevodene sterilne injekcione rastvore koji sadr že antioksidanse, pufere, bakteriostatike i rastvore pomoću kojih formulacije izotonizuju sa krvlju primaoca koji se leči; i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu sadržati suspenzione medije ili sredstva za zgušnjavanje. Formulacije mogu biti primenjene u pojedina čnim dozama ili multidoznim posudama, na primer zaptivenim ampulama ili vialama, i skladi štene u suvo zamrznutom (liofilizovanom) stanju, tako da je samo potrebno dodati sterilni te čbi nosač, na primer vodu za injekcije, neposredno pre upotrebe.

[0068] Injekcioni rastvori i suspenzije su pripremljene prema receptu, mogu biti pripremljene od sterilnih praškova, granula i tableta.

[0069] Podrazumeva se da, pored prethodno posebno navedenih sastojaka, formulacije mogu takođe sadržati i druge agense uobičajene u struci, u zavisnosti od određenog tipa formulacije; tako na primer, formulacije koje su prilagođene za oralnu primenu mogu sadržati arome.

[0070] Terapeutski efikasna količina jedinjenja formule (I) i drugih aktivnih sastojaka zav isi od brojnih faktora, na primer, starosti i težine životinje, tačnog stanja bolesti koja zahteva lečenje i njene težine, prirode formulacije i načina primene, koju na kraju određuje doktor ili veterinar. Međutim, efikasna količina jedinjenja je generalno u opsegu od 0,1 do 100 mg/kg telesne mase primaoca (sisara) na dan, i posebno tipični opseg od 1 do 100 mg/kg telesne mase dnevno. Tako da je stvarna dnevna količina za odraslog sisara težine 70 kg, obično između 70 i 700 mg, pri čemu ova količina može biti primenjena kao pojedinačna dnevna doza ili obično u serijama delova doze (kao što su, na primer, dve, tri, četiri, pet ili šest) dnevno, tako da je ukupna dnevna doza ista. Efikasna količina soli ili solvata ili njegovog fiziološki funkcionalnog derivata se moze odrediti kao frakcija efikasne količine jedinjenja samog po sebi.

[0071] Takođe je otkriven postupak lečenja karcinoma kod subjekta koji ima potrebu za takvim lečenjem koji obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine bar jednog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ovde otkrivene, jednom ili vi še puta na subjekat.

[0072] Takođe je otkriven postupak inhibicije rasta i/ili metastaziranja tumora ćelija subjekta koji obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine bar jednog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ovde otkrivene, jednom ili više puta na subjekat.

[0073] Takođe je otkriven postupak inhibicije aktivnosti enzima dihidroorotat oksigenaze u ćelijama tumora koji obuhvata korak kontakta ćelije tumora, jednom ili više puta, sa terapeutski efikasne količine bar jednog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ovde otkrivene. U ovom izvođenju ćelije tumora su u kontaktu in vivo, ex vivo ili in vitro.

[0074] Jedinjenja, njihove farmaceutki prihvatljive soli i farmaceutske formulacije i kompozicije ovde otkrivene su korisne u lečenju karcinoma kod subjekata kojima je takvo lečenje potrebno. Istovremeno, rast ćelija tumora i/ili metastaze ili aktivnost enzima dihidroorotat oksigenaze njima može biti inhibiran. Jedinjenja i farmaceutska kompozicija se mogu primeniti jednom ili vi še puta kako bi se postigao terapeutski efekat. Kako je poznato u struci, stručna osoba je u stanju da odredi dozu, režim doziranja i način primene u zavisnosti od stanja koje se leči i toga kakvo lečenje subjekat zahteva. Reprezentativni primeri karcinoma uključuju hematološke malignitete kao što su, ali nisu ograničeni na, akutna mijeloidna leukemija, multiple mijelom, leukemija B-prolimfocita, akutna limfoblastična leukemija i hronična limfoblastična leukemija. Reprezentativni primeri kancera uključuju limfome, kao što su, ali nisu ograničeni na, Hodgkinsova bolest, ne-Hodgkinsova bolest limfoma, folikularni limfom, difuzni limfom belikih B ćelija, anaplastični limfom velikih ćelija i limfom mantle ćelija. Reprezentativni primeri karcinoma uključuju “čvrstih” karcinoma, kao što su, ali nisu ograničeni na, karcinom pluća, karcinom dojke, triputa negativni karcinom dojke, melanom, glioblastom, karcinom prostate, karcinom debelog creva, karcinom pankreasa, karcinom kostiju, karcinom glave ili vrata, karcinom kože, kožni ili intraokularni maligni endometrijum, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom vulve, karcinom jednjaka, karcinom tankog creva, karcinom štitste žlezde, karcinom paraštitaste žlezde, karcinom nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, karcinom uretre, karcinom penisa, “čvrsti” tumori u detinjstvu, karcinom limfocitnih limfoma bešike, karcinom bubrega i uretera, karcinom bubrežne karlice, naoplazm centralnog nervnog sistema (CNS), limfom primarnog CNS, angiogenozni tumor, tumor kičmenog stuba, gliom mozdanog stabla, adenom hipofize, Kaposijev sarkom, epidermoidni karcinom, karcinom plaočastih ćelija, limfom T-ćelija, karcinomi izazvani okruženjem uključujući one izazvane azbestom, i karcinomi PTEN mutanti.

[0075] Takođe je otkriven postupak pripreme derivata trisupstituisanog benzotiazola formule (I).

[0076] Inhibitori dihidroorotat dehidrogenaze prema formuli (I) mogu se pripremiti iz lako dostupnih polaznih materijala korišćenjem narednih opštih metoda i postupaka. Biće cenjeno tamo gde su dati tipični ili željeni eksperimentalni uslovi (npr. temperatura reakcije, vreme, moli reagensa, rastvarača itd.), drugi eksperimentalni uslovi se takođe mogu koristiti iako ovde nije naznačeno. Optimalni reakcioni uslovi mogu biti različiti u zavisnosti od određenih reaktanata ili rastvarača koji se koriste, ali takve uslove može odrediti stručnjak koristeći rutisku organizaciju postupka. Šta više, primenom detaljno opisanog postupka, jedan prosečan stručnjak može pripremiti dodatna jedinjenja ovog pronalaska koja se ovde zahtevaju. Sve temperature su stepenima Celzijusa ( ̊C) ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0077] U daljim aspektima, jedinjenja ovog pronalaska takođe mogu sadržati neprirodne proporcije atoma izotopa, jednog ili više atoma koji čine takva jedinjenja. Na primer, predstavljeni pronalazak takođe obuhvata izotopski obeležene varijante ovog pronalaska koje su identične onim ovde navedenim, ali zbog činjenice da su jedan ili više atoma jedinjenja zamenjeni atomom koji ima drugačiju atomsku masu ili maseni broj od dominantne atomske mase ili masenog broj koji se uobičajeno nalazi u prirodi. Svi izotopi bilo kog određenog atoma ili elementa su obuhvaćeni sveukupnim jedinjenjima pronalaska i njihovom upotrebom. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja pronalasa uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, sumpora, fluora, hlora i joda, kao što su 2H ("D"), 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O,17O,18O, 32P, 33P, 35S, 18F, 36Cl 123I and 125I. Izotopski označena jedinjenja ovog pronalaska generalno se mogu pripremiti praćenjem postupka analogno sa onim koji je predstavljen i Šemama i/ili u Primerima, u narednom telstu; zamenom izotopskih obeleženih reagenasa sa izotopskih neobeleženim reagensima.

[0078] Sledeće skraćenice se odnose na definicije navedene u daljem tekstu:

AcOH (sirćena kiselina), ACN (acetonitril), ATP (adenosid trifosfat), BSA (Bovine Serum Albumin), CHCl3(hloroform), Cs2CO3(cezijum karbonat), DCM (Dichlormetan), DIPEA (di-iszopropil etilamin), DMSO (dimetil sulfoksid), DMF (N,N-dimetilformamid), EDCI.HCl (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid),Et3N (trietilamin), EtOAc (etil acetate), EtOH (etanol), HOBT (hidroksibenzotriazole), HCl (hlorovodonična kiselina), K2CO3(kalijum karbonat), KOAc (kalijum acetat), min (minut), MeOH (metanol), MeI (metil jodid), MgSO4(magnezijum sulfat), NH4Cl (amonijum hlorid), NH4(CO3)2(amonijum karbonat), Pd(dppf)2Cl2([1,1-bis(difenilfosfino)-ferocen]dihloropaladijum (II)), NaH (natrijum hidrid), NaNO2(natrijum nitrit), NaHCO3(natrijum bikarbonat), PetEther (petroleum etar), PBS (fosfatni pufer fizioloskog rastvora), RT-sobna temperatura (25°C-35°C), TEA (trietil amin), TFA (trifluoroacetatna kiselina), THF (tetrahidrofuran), t-BuOK (kalijum tert-butoksid), TMSI (trimetilsilil jodid), TLC (tankoslojna hromatografija), H2O - voda; mL - mililitar; hr/h - sat; N - normalitet; M - molaritet; s- singlet; d -dublet; t - triplet; m- multiplet; 1HNMR - proton nuklearna mgnetna rezonanca; MS - masena spektrometrija; LC - tečna hromatografija; HPLC - tečna hromatografija visokih preformansi, J -Coupling Constant; 1H - Proton; MHz - Mega Hertz (frequency); Hz - Hertz; ppm - Parts per million; bs - široki singlet; ES - elektro sprej; Conc.- koncentrovan; g - gram; mmol or mM – millimolari; µM – mikro molarni; nM - nano molarni; UV - ultraviolet; °C – stepen Celsijusa, M+-molekulari jon, % - procenat; µ - mikron; i δ - delta; anh. - anhidrovani; pH - potencijal vodonika; Metode korisne za dobijanje jedinjenja formule (I) navedene su u narednim Primerima i generalizovani u Šemi-I. Jedan stručnjak u oblasti će prepoznati da Šema-I može biti prilagođena za proizvodnju jedinjenja formule (I) i farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja formule (I) prema ovom pronalasku. Pri čemu svi simboli/varijable su prethodno definisani, osim ako nije drugačije naznačeno. Postupak je prikazan pomoću Šeme-I:

[0079] Jedinjenja pronalaska se mogu pripremiti korišćenjem sintetskih transformacija prikazanih na Šemi-I. Početni materijali su komercijalno dostupni, mogu biti pripremljeni postupcima ovde opisanim, postupcima iz literature ili postupcima koji bi bili dobro pozati stru čnjacima iz oblasti organske hemije. Početni materijal 5-supstituisani metil 2,3-diamino-benzoat je pripremljen postupkom koji je opisan u WO 2010115736A2.

[0080] Korak-a: Jedinjenje-I reaguje sa natrijum-nitritom u kiseloj sredini pomo ću Opšte procedure-A za dobijanje jedinjenja-II.

[0081] Korak-b: Jedinjenje-II je dalje podvrgnuto N-alkilaciji kori šćenjem metil-jodida u osnovnim uslovima kao što su oni opisani u Opštoj proceduri-B za dobijanje jedinjenja-III.

[0082] Korak-c: Jedinjenje-III reaguje sa bispinakolat-diboranom u osnovnom medijumu u prisustvu odgovaajućeg paladijum katalizatora primenom Opšte procedure-C za dobijanje jedinjenja-IV.

[0083] Korak-d: Jedinjenje-IV je tretirano supstituisanim aril halidom u prisustvu odgovaraju ćeg paladijum katalizatora primenom uslova koji su opisani u Opštoj proceduri-D za dobijanje jedinjenja-V.

[0084] Korak-e: Alternativno, jedinjenje formule-V može biti pripremljeno od jedinjenja formule-III korišćenjem odgovarajuće borne kiseline u pogodnim uslovima kao što su oni opisani u Opštoj proceduri-D.

[0085] Korak-f: dobijena jedinjenja formule-V estarskom hidrolizom pri osnovnim uslovima, kao što su oni opisani u Opštoj proceduri-F za dobijanje jedinjenja formule (I) (gde je R3=OH).

2

[0086] Korak-g: karboksilne kiseline formule (I) su tretirane amonijum-hloridom pod uslovima koji su opisani u Opštoj proceduri-G za dobijanje odgovarajućeg jedinjenja formule (I) (gde je R3=NH2).

[0087] Ako pomenuti set generalnih metoda za sintetisanje nije primenljiv za dobijanje jedinjenja prema formuli (I) i/ili potrebnih intermedijera za sinteze jedinjenja formule (I), trebalo bi da se iskoriste pogodne metode pripreme poznate stručnjaku. Generalno, putevi sinteze za bilo koje jedinjenje formule (I) će zavisiti od specifičnih supstituenata svakog molekula i od raspoloživosti neophodnih intermedijera; ponovo su takvi faktori cenjeni od strane obi čnih stručnjaka.

[0088] Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti izolovana zajedno sa molekulima rastvarača, kristalizacijom isparavanja odgovarajućeg rastvarača. Farmaceutski prihvatljive adicione soli kiselina jedinjenja formule (I), koje sadrže bazni centar, mogu se pripremiti na konvencionalan način. Na primer, rastvor slobodne baze može biti tretiran sa odgovarajućom kiselinom, bilo čistom ili u odgovarajućem rastvaraču, i dobijena so se izoluje ili filtriranjem ili uparavanjem pod vakuumom reakcionog rastvarača. Farmaceutski prihvatljive adicione soli baza se mogu dobiti analognom putem, tretiranjem jedinjenja formule (I) odgovaraju ćom bazom. Obe vrste soli mogu se formirati ili međusobno konvertovati korišćenjem tehnika jono izmenjivačkih smola.

PRIMERI

Opšte:

[0089] MS podaci dobijeni u primerima opisanim u narednom tekstu su dobijeni na slede ći način: Maseni spektar: LC/MS Waters ZMD (ESI) ili Waters Acquity SQD (ESI).

[0090] NMR podaci dobijeni u primerima opisanim u narednom tekstu su dobijeni na slede ći način:<1>H-NMR: Bruker DPX-300MHz ili Bruker DPX 400 MHz.

[0091] HPLC podaci dobijeni u primerima opisanim u narednom tekstu su dobijeni na slede ći način.

[0092] Uslovi A: Kolona Waters XbridgeTM C8 50 mm x 4.6 mm sa protokom od 2 mL/min; 8 min gradijentom od 0.1 % TFA u H2O do 0.07 % TFA u CH3CN.

[0093] Uslovi B: C18 BDS (4.6X250) mm, SC\244 sa protokom 0.7 mL/min; 10 min gradijentom od 0.1 % TFA u H2O do CH3CN.

[0094] Pripremni HPLC uslovi: kolona - Zorbax Eclipse XDB C18 PrepHT (150x21.2mm, 5µ); mobilna faza:(A) 0.01% TFA or 0.1% TFA; (B) ACN ili ACN: MeOH (1:1); protok: 20ml/min.

[0095] Pripremni HPLC prećiščavanja se izvode sa usmerenim masenim autoprečišćavanjem Fractionlynx od Waters opremljenim sa Sunfire Prep C18 OBD kolonom 19x100 mm 5 µm, ukoliko drugačije nije naznačeno. Sva HPLC prečišćavanja se izvode sa gradijentom ACN/H2O ili ACN/H2O/HCOOH (0.1%).

[0096] Jedinjenja pronalaska si imenovana prema standardima kori šćenim u programu ACD/Name Barch od "Advanced Chemistry Development Inc., ACD/Labs (Izdanje 7.00)". Verzija proizvoda: 7.10 build: 15 Sep 2003.

[0097] Postupak za jedinjenja formule (I) je detaljno opisan u narednom tekstu, u op štim procedurama uključujući i opšte sinteze različitih intermedijera uključenih u proces dobijanja jedinjenja prema ovom pronalasku.

Opšti postupak-A: priprema supstituisanih [1,2,3] benzoiazola

[0098] 6-supstituisani ili supstituisani diamino estar (1-3 ekvivalenta) u sirćetnoj kiselini, koji se nalazi u tikvici, se meša 10-20 minuta, poželjno 10 minuta, nakon čega se dodaje (natrijum-nitrit, kalijum-nitrit, poželjno natrijum-nitrit)(2,5-3,5, poželjno 2,5 ekvivalenata) u vodi. Reakciona smeša se meša 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Odvojena čvrsta supstanca se skuplja filtracijom i sušenjem pod vakuumom do dobijanja željenog produkta.

Ilustrativni primer opšteg postupka-A:

Priprema # A.1: Sinteza metil-6-bromo-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-4-karboksilata:

[0099]

[0100] Rastvor metil 2,3-diamino-5-bromobenzoata (1,0 g, 4,08 mmol) (Ref:WO2010/115736 A2) u sirćetnoj kiselini (15 ml) se meša 10 min na RT. Natrijum-nitrit (0,309 g, 4,48 mmol) u vodi (2 ml) se dodaje i reakciona smeša se meša 30 min na RT. Talog se izfliltrira, ispere vodom i osuši pod vakuumom kako bi se dobio željeni proizvod (0,8 g, 77%);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 16,19 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 3.99

(s, 3H) i LC-MS m/z: 258 (M+H)<+>.

Opšti postupak-B: N-alkilacija supstituisanih benzoiazola

[0101] Mešanom rastvoru supstituisanog derivata benzotiazol-karboksilata (1 ekvivalent) u organskom rastvaraču (kao što je DMF, THF, dioksan, poželjno DMF) je dodata pogodna baza (kao što je K2CO3, CS2CO3, NaH itd.,poželjno K2CO3, 2 do 5 ekvivalenata,poželjno 2 ekvivalenta), nakon čega je dodat alkil halid (2 do 5 ekvivalenata,poželjno 3 ekvivalenta). Reakciona smeša je mešana na RT od oko 1 do 10 h (poželjno 3 h). Reakciona smeša je sipana u ledeno hladnu vodu i izdvojena čvrsta supstanca je skupljena filtriranjem i sušenjem pod vakuumom. Regio-izomeri su razdvojeni na hromatografskoj koloni da bi se dobili željeni proizvodi.

Ilustrativni primer opšteg postupka-B:

[0102] Priprema # B.1: Sinteza metil 5-bromo-1-metil-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilata, metil 6-bromo-2-metil-2H-benzo[d][1,2,3]triazol-4-karboksilatai metil 6-bromo-1-metil-1H-benzo[d][1,2,3] triazol-4-karboksilata

[0103] U mešani rastvor metil 6-bromo-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-4-karboksilate (4,5 g, 17,5 mmol, priprema # A.1) u DMF (25 mL) je didat kalijum karbonat (4,85 g, 35,15 mmol), a zatim i metil jodid (7,48 g, 52,73 mmol). Reakciona smeša je mešana na RT 1 h. Reakciona smeša je ohlađena u ledeno hladnu vodu i izdvojena čvrsta supstanca je skupljena filtriranjem i sušenjem pod vakuumom. Dobijeno sirovo jedinjenje je prečišćeno na hromatografskoj koloni punjenoj silika gelom (100-200 mesh-a) korišćenjem 10% etil acetata u heksanu da bi se dobio Izomer-I (B.1.a) (1,9 g); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,40 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 4.57 (s, 3H), 4,01 (s, 3H) i LC-MS m/z: 272 (M+2)+; 15-20% etil acetat u heksanuda bi se dobio Izomer-II (B.1.b) (1,4 g);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,26 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 4,58 (s, 3H), 4,04 (s, 3H) i LC-MS m/z: 272.0 (M+2)+; 20-25% etil

2

acetat u heksanu da bi se dobio Izomer-III (B.1.c) (1,0 g);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,67 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 4,45 (s, 3H), 3,96 (s, 3H) i LC-MS m/z: 272.0 (M+2)+.

Opšti postupak-C: priprema bornog estra

[0104] Mešavina aril halo derivata (1,0 do 3,0 ekvivalenata, poželjno 1,0 ekvivalent), pogodne neorganske baze (kao što je KOAC ili Na2CO3ili K2CO3ili Cs2CO3, poželjno KOAC), bispinakolat diborana 1,0 do 3,0 ekvivalenata, poželjno 1,1 ekvivalent) u dioksanu se degazira azotom oko 10 do 15 minuta i dodaje [1,1-bis (difeniifosfino)-ferocen] dihloropaladium (II) (0.001 do 0.010 ekvivalenata, poželjno 0.05 ekvivalenata). Reakciona smeša se meša na refluks temperaturi pod azotom oko 3 do 12 h (poželjno oko 6 h). Reakciona smeša je ohlađena na RT i uparena do suvog pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u EtAc, ispran uzastopno sa vodom i rastvorom soli. Organski rastvor je osušen sa Na2SO4, profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Proizvod je prečišćen kristalizacijom ili trituracijom iz odgovarajućeg rastvarača ili odgovarajućih rastvarača ili preparativnim HPLC-om ili fleš hromatografijom.

Ilustrativni primer opšteg postupka-C:

Priprema #C.1: Sinteza metil1-metil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-yl)-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilata

[0105]

[0106] Smeša metil 5-bromo-1-metil-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilata (1,0 g, 3,7 mmol, priprema # B.1.a), kalijum acetata (0,627 g, 5,92 mmol), bispinakolat diborana (0,93 g, 3,7 mmol) u dioksanu (60 ml) je degasirana sa azotom oko 15 min i dodat je (difenilfosfino)-ferocen]dihloropaladium(II) (0,151 g, 0,018 mmol). Reakciona smeša je mešana na refluks temperaturi pod azotom oko 6 h. Reakciona smeša je ohlađena na RT i uparena do suva pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc, ispran uzastopno sa vodom i rastvorom soli i koncetrovan. Dobijeno sirovo jedinjenje je prečišćeno na hromatografskoj koloni punjenoj silika gelom (60-120 mesh-a) korišćenjem 30% etil acetata u heksanu da bi se dobio željeni proizvod (0,9 g, 77%);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,46 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 4,59 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 1,35 (s, 12H) i LC- MS m/z = 318.2 (M+H)+.

[0107] Druga jedinjenja sintetisana korišćenjem Opšte procedure C su opisana u Tabeli C.1.

Opšti postupak-D: Suzuki reakcija

[0108] Smeša acetonitrila i vode (8:2) je degasirana sa azotom oko 10 do 15 min i dodata je pogodna baza (kao što je Na2CO3ili K2CO3ili Cs2CO3, poželjno Na2CO3) zatim je dodat aril bromo derivat (1,0 do 3,0 ekvivalenata, poželjno 1,0 ekvivalent) i pogodna borna kiselina (1,0 do 3,0 ekvivalenata, poželjno 1,5 ekvivalent). Reakciona smeša je ponovo degasirana 15 min i na kraju je dodat [1,1-bis(difenilfosfino)-ferocen] dihloropaladium(II) (0,001 do 0,010 ekvivalenta, po željno 0,05 ekvivalenta). Reakciona smeša je mešana na refluks temperaturi pod azotom oko 3 do 12 h (poželjno oko 4 h). Reakciona smeša je ohlađena na RT i uparena do suva pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc, ispran uzastopno sa vodom i rastvorom soli. Organski rastvor je osušen sa Na2SO4, profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Proizvod je

2

prečišćen kristalizacijom ili trituracijom iz odgovarajućeg rastvarača ili odgovarajućih rastvarača ili preparativnim HPLC-om ili fleš hromatografijom.

Ilustrativni primer opšteg postupka-D:

Priprema # D.1: Sinteza metil 1-metil-5- metil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1H-benzo[d][1,2,3] triazol-7- karboksilata

[0109]

[0110] Smeša acetonitrila (80 ml) i vode (15 ml) je degasirana sa azotom 10 min. Dodat je natrijumkarbonat (2,74 g, 25,9 mmol), a zatim metil 5-bromo-1-metil-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilat (3,5 g, 12,9 mmol) i 4,4,5,5-tetrametil-2-(2’-metil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1,3,2-dioksaborolan (3,81 g, 12,0 mmol) (C.1.5). Reakciona smeša je ponovo degasirana 15 min. Na kraju je dodat [1,1-bis(difenilfosfino)-ferocen]dihloropaladium(II) (0,526 g, 0,64 mmol). Reakciona sme ša je mešana na refluks temperaturi pod azotom 5 h. Reakciona smeša je ohlađena na RT i uparena do suva pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc, ispran uzastopno sa vodom i rastvorom soli i koncentrovan. Dobijeno sirovo jedinjenje je pre čišćeno na hromatografskoj koloni punjenoj silika gelom (60-120 mesh-a) korišćenjem 30% etil acetata u heksanu da bi se dobio željeni proizvod (3,6 g, 77%);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8,52 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,76-7,74 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,48-7,46 (d, J=7.6, 2H), 7,31-7,28 (m, 4H), 4,63 (s, 3H), 4,08 (s, 3H), 2,34 (s, 3H) i LC-MS m/z = 358.2 (M+H)+.

[0111] Druga jedinjenja sintetisana korišćenjem Opšte procedure D su opisana u Tabeli D.1.

Opšti postupak-E: Redukciona aminacija

[0112] Smeša odgovarajućeg aldehida i amina u organskom rastvaraču (kao što su DCM, THF, ACN, DMF, DCE ili dioksan) su mešani na sobnoj temperaturi od 30 min do 4 h. Dobijena reakciona sme ša je ohlađena na 0° C i u malim porcijama je dodat redukcioni agens kao sto je natrijum triacetoksiborohidrid, nakon čega je dodata katalitička količina sirćetne kiseline. Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2-4 h. Napredovanje reakcije je pra ćeno TLC i reakciona smeša je ugašena sa vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata. Zatim je ekstrahovano sa etil acetatom, kombinovani organski slojevi su osušeni natrijum sulfatom i koncentrovani pod vakuumom kako bi se dobilo željeno jedinjenje. Opciono, željeno jedinjenje se može prečistiti kristalizacijom ili trituracijom iz odgovarajućeg rastvarača ili odgovarjućih rastvarača ili preparativnom HPLC ili fleš hromatografijom.

Ilustrativni primer opšteg postupka-E:

Priprema # E.1: Sinteza metil 1-metil-5- (morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1H-benzo[d]

[1,2,3]triazol-7-karboksilata

[0113]

2

[0114] Rastvor metil 5-(2’-formil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1-metil-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilata (0,300 g, 0,8 mmol, D.1.8) i morfolina (0,070 g, 0,8 mmol) u DCE (15 mL) je mešan na sobnoj temperaturi 30 min. Reakciona smeša je ohlađena na 0° C, dodat je natrijum triacetoksiborohidrid (0,342 g, 1,6 mmol), nakon čega je dodata sirćetna kiselina (0,2 ml). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Reakciona smeša je ugašena sa vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (50 ml). Ekstrahovano je sa etil acetatat (3x50 ml), kombinovani organski slojevi su osušeni natrijum-sulfatom i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Dobijeno sirovo jedinjenje je preneseno u sledeći korak bez prečišćavanja (0,200 g);1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,69 (s, 1H), 8,696 (s, 1H), 8,424-8,422 (d, J=8 Hz, 2H), 7,912-7,891 (d, J=8 Hz, 2H), 7,607 (m, 1H), 7,531-7,324 (m, 3H), 4,50 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 3,560 (m, 4H), 3,55 (s, 2H), 3,308 (m, 4H) i LC-MS m/z = 443.3 (M+H)+.

Opšti postupak-F: Hidroliza estra

[0115] U tikvicu koja sadrži alkil estar u vodenom organskom rastvaraču (kao što je THF ili metanol, 1,4-dioksin, poželjno 1,4-dioksin) je dodat 1,5 ekvivalent vodenog rastvora natrijum-hidroksida i reakciona smeša je refluksovana 1-8 h (poželjno 4 h). Završetak reakcije je praćen TCL-om. Višak rastvarača je uklonjen pod vakuumom i rastor je zakišeljen sa 10% rastvorom HCl-a. Odvojena čvrsta čestica je skupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio željeni derivat karboksilne kiseline. Opciono, željeno jedinjenje se može prečistiti kristalizacijom ili trituracijom iz odgovarajućeg rastvarača ili odgovarjućih rastvarača ili preparativnom HPLC ili fleš hromatografijom.

Ilustrativni primer opšteg postupka-F:

Priprema # F.1: Sinteza 1-metil-5- metil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilnakiselina (Jedinjenja-1)

[0116]

2

[0117] U mešani rastvor metil 1-metil-5-(2’-metil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilata (1,2 g, 3,361 mmol, D.1) u 1,4-dioksan (15 ml) je dodat vodeni 2N NaOH (15 ml). Reakciona smeša je refluksovana 4 h. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je ohlađena na sobnoj temperaturi, višak rastvora je uklonjen pod sniženim pritiskom i rastvor je zakišeljen sa 10% rastvorom HCl-a (pH∼ 2). Odvojena čvrsta supstanca je skupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenja kao prljavo bela čvrsta supstanca (1,1 g, 95%);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13,35 (bs, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,89-7,87 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,51-7,49 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,32-7,25 (m, 4H), 4,58 (s, 3H) 2,30 (s, 3H) i LC-MS m/z = 344.1 (M+H) .

Opšti postupak-G: Formiranje amida

[0118] U tikvicu koja sadrži derivat karboksilne kiseline (1,0 ekvivalent) u organskom rastvaraču (kao što su DMF, THF ili CH2Cl2) je dodata EDCl.HCl (1,5 ekvivalent), HOBT (1,5 ekvivalent) i N-etil-N-isopropilpropan-2-amin (3 ekvivalent). Nakon mešanja od oko 10 min na približno 25°C, odgovarajući amin (1,5 ekvivalent) je dodat i reakciona smeša je mešana dodatno 8-12 h (poželjno 12 h). Odvojena čvrsta supstanca je skupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobio derivat amida. Opciono, željeno jedinjenje se može prečistiti kristalizacijom ili trituracijom iz odgovarajućeg rastvarača ili odgovarjućih rastvarača ili preparativnom HPLC ili fleš hromatografijom.

Ilustrativni primer opšteg postupka-G:

Priprema # G.1: Sinteza 1-metil-5-(2’-metil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksamid (Jedinjenje-2)

[0119]

[0120] U tikvicu koja sadrži 1-metil-5-(2’-metil-[1,1’-bifenil]-4-yl)-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-7-karboksilnakiselina (0,150 g, 0,43 mmol, Jedinjenja-1) u DMF (3 ml) jedodata EDCI.HCl (0,100 g, 0,52 mmol), HOBT (0,070 g, 0,52 mmol) i N-etil-N-isopropilpropan-2-amin (0,168 g, 1,31 mmol). Smeša je mešana na oko 25°C približno 10 min i dodat je amonijum-hlorid (0.070 g, 1.31 mmol). Reakcijona smeša je onda mešana još dodatnih 12 h i ugašena sa vodom (50 ml). Odvojena čvrsta supstanca je skupljena filtracijom i osušena pod vakuumom da bi se dobilo naslovljeno jedinjenja kao prljavo bela čvrsta supstanca (0,08 g, 53%);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,47 (s, 1H), 8,37 (s,

2

1H),8,05 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,90-7,88 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,51-7,49 (d, J=7,6 Hz, 2H), 7,35-7,27 (m, 4H), 4,61 (s, 3H), 2,30 (s, 3H) i LC-MS m/z = 343.2 (M+H)+.

[0121] Intermedijeri navedeni u narednom tekstu su pripremani prema proceduri sli čnoj onoj koja je opisana u Opštoj proceduri-C sa odgovarajućim varijacijama u reaktantima, količinama reagensa i reakcionim uslovima. Fizičko-hemijske karakteristike jedinjenja su sumirane ovde u Tabeli C.1.

[0122] Intermedijeri navedeni u narednom tekstu su pripremani prema proceduri sli čnoj onoj koja je opisana u Opštoj proceduri-D sa odgovarajućim varijacijama u reaktantima, količinama reagensa i reakcionim uslovima. Fizičko-hemijske karakteristike jedinjenja su sumirane ovde u Tabeli D.1.

�

�

[0123] Intermedijeri navedeni u narednom tekstu su pripremani prema proceduri sli čnoj onoj koja je opisana u Opštoj procedurama-E, F i G sa odgovarajućim varijacijama u reaktantima, količinama reagensa i reakcionim uslovima. Fizičko-hemijske karakteristike jedinjenja su sumirane ovde u narednoj Tabeli.

4

FARMAKOLOŠKA AKTIVNNOST

Merenje aktivnosti DHODH inhibitornih enzima (in vitro testovi)

[0124] Test aktivnosti DHODH je test povezanih enzima u kom oksidacija DHO i naknadna redukcija ubikvinona je stehiometrijski ekvivalent redukciji DCIP (2,6-dihlorofenol). Redukciju DCIP prati smanjenje absorbance na 610 nm.

[0125] Priprema rastvora/reagenasa:

Priprema pufera: 50 mM tris HCl, 150 mM KCl i pH 8,0, 0,8% triton

20 mM osnovni rastvor L-dihidrooronatne kiseline u puferu

20 mM osnovni rastvor natrijumove soli 2, 6-dihloroindofenol hidrata u puferu

4

20 mM osnovni rastvor decilubikvinona u puferu.

DMSO je korišćen kao nosač.

Postupak

[0126] 5 ml dimetil sulfoksida ili jedinjenja formule (I) u rastvoru DMSO je dodato u bunariće na mikrotitar pločici sa 96 mesta. Jedinjenja formule (I) su merena na 10 µM.

[0127] Zajedno sa puferom dodat je protein, tako da je totalna zapremina uklju čujući i DMSO bila 87 µl. Jedinjenje i protein su nakon mešanja inkubirani pola sata na sobnoj temperaturi. 5 µl 20 mM rastvora L-dihidroorotatne kiseline, 5 µl of 2 mM rastvora decilubikvinoni 3 µl 2 mM rastvora natrijumove soli 2, 6-dihloroindofenol hidratajedodato u pomenuti rastvor (ukupna zapremina testa je bila 100 µl). Smeša je mešana 2 min i beležena je absorbanca svakih 10 min na 610 nanometara. Procenat inhibicije se izračunava na sledeči način:

Reakcija koja sadrži jedinjenje ima jedinjenje, pufer, enzim i supstrat

Pozitivna kontrola sadrži DMSO, pufer, enzim i supstrat

Reakcija bez reakcije enzima sadrži DMSO, pufer i supstrat

Određivanje IC50

[0128] Pripremljen je 2 mM osnovni rastvor DMSO izabranog trisupstituisanog benzoimidazola i derivata benzotiazola sa formulom (I), ovog pronalaska, koji treba ispitai. Napravljena si naknadna 1/3 razblaženja.

[0129] 5 µl svakog osnovnog rastvora jedinjenja formule (I) je korišćeno za svaki test od 100 µl. Zbog toga, 5 µl 2 mM osnovnog rastvora je dalo 100 µl 100 mM rastvora formule (I) kada je napravljen sa puferom, proteinom i supstratom. Pogledati takođe: Ulrich i saradnici (2001) Eur. J. Biochem.268, 1861-1868.

[0130] Vrednost IC50odabranog jedinjenja ovog pronalaska je dato u narednoj tabeli. Jedinjenja koja pokazuju IC50vrednost ≤ 0.1 µM su grupisana kao “a”, jedinjenja koja pokazuju IC50vrednost u opsegu od 0,101 µM do 1,0 µM su grupisana kao “b” i jedinjenja koja pokazuju IC50vrednost >1.0 µM su grupisana kao “c”.

Tabela: Inhibicija aktivnosti DHODH određenih jedinjenja

ĆELIJSKA AKTIVNOST

Test Ramos proliferacije (In vitro test)

[0131] Test ćielijske proliferacije je osetljiva metoda za kvantifikaciju odr živih ćelija u testu cititoksičnosti ili proliferacije. XTT (2,3-bis[2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolijum-5-karboksianilid cviter jon) je sistem za merenje aktivnosti živih ćelija putem mitohondrijalnih dehidrogenaza. Mitohondrijalne dehidrogenaze održivih ćelija cepaju tetrazolijumov prsten XTT-a, dajući narandzaste kristale formazona koji su rastvorljivi u vodenim rastvorima. XTT rastvor se potencira dodatkom agensa za sprezanje elektrona, fenazin metosulfat (PMS) u reakciju. Dobijena narandzasta boja je spektrofotometrijski merena na 450 nm. Povećanje ili sniženje broja ćelija istovremeno dovodi do promene u količini formiranog formazona što ukazuje na stepen citotoksičnosti izazvane test materijalom.

Priprema rastvora/reagenasa

Priprema media

[0132] Rastvoriti 17,7 g IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) Praha, 1,5 g natrijumbikarbonata pH 7,2-7,4 u 1 L MiliQ vode, dodati 1% penicilin/streptomicin i 10% FBS.

[0133] Rastvoriti 10,6 g Hemovog F12 praha, 1,5 g natrijum-bikarbonata pH 7,2-7,4 u 1 L MiliQ vode, dodati 1% penicilin/streptomicin.

[0134] DMSO je korišćen kao nosač.

[0135] 1 X PBS (fiziološki rastvor puferisan fosfatom): rastvoriti 5 tableta PBS (Sigma: Cat#P4417) u 1 L MiliQ vode.

Postupak (određivanje IC50)

[0136] Ramos ćelije su ponovo suspendovane do gustine od 1x10<5>ćelija/ml u kompletnom IMDM medijumu. 95 µl suspenzije ovih ćelija je dodato u mikrotitar pločice sa 96 mesta da bi se zasejalo ∼ 10,000 ćelija po bunariću. Cela poločica je inkubirano oko 1 h na 37 °C u vlažnoj atmosferi 5% CO2pre nego što je dodato jedinjenje.

[0137] Test jedinjenja (pogledati Tabelu 1) je rastvoren u 100% DMSO kako bi se dobio 2/6/10/20 mM osnovni rastvor. Koncentracija 200X potrebnih konačnih koncentracija je pripremljena u DMSO.

10 µL svake koncentracije (200X) je zatim razblaženo u Hamovom F12 medijumu bez seruma kako bi se dobila srednja koncentracija od 20X u medijumu. Koncentracija DMSO u ovom koraku je 10% (intermedijarno razblaženje. 5 µL svakog intermedijarnog razblaženja je onda dodato u triplikatu na prethodno zasejanu titarpločicu sa 96 bunarića. Konačna koncentracija DMSO u eksperimentalnim bunarićima je bila 0,5 %. Ćelije tretirane sa 0,5 % DMSO su služile kao pozitivna kontrola. 100 µL kompletnog IMDM medijuma je služilo kao blank medijuma za analizu podataka.

200 µL 1X PBS je dodato u sve ugaone bunariće ispitivane titarpločice. Onda su mikrotitar pločice inkubirani 72 sata u inkubatoru sa 5% CO2na 37 °C.

[0138] Na dan završetka, 100 µL rastvora XTT (1 mg/ml XTT dopunjenog sa 25 mM PMS u Hamsovom F12 medijumu) je dodato u svaki bunarić. Mikrotitar pločice su inkubbirani 2 h. Količina dobijenog formazona je određena očitavanjem absorbance mikrotitar pločice korišćenjem VICTOR X5 multilabel čitača, na talasnoj dužini od 450 nm. IC50vrednost je određena kao koncentracije koje su smanjile održivost ćelija za 50% i kriva je iscrtana pomoću GraphPad Prism 6.0. Procenti inhibicije su prepačunati na sledeći način:

Procenat (%) inhibicije je preracunat normalizacijom kontrolnih vrednosti DMSO na 100% koriste ći formulu:

Test jedinjenje sadrži ćelije, test jedinjenje, IMDM medijum i 0,5 % DMSO. Pozitivna kontrola sadrži ćelije, IMDM medijum i 0,5 % DMSO.

Blant sadrži IMDM medijum.

4

In vitro rast inhibicije humanih više ćelijskih linija karcinoma pomoći Jedinjenja 1

[0139] Urađen je panelni pregled linije tumornih ćelija sa ciljem da se identifikuje podskupina ćelija tumora koje su bile posebno osetljive na inhibiciju DHODH sa Jedinjenjem 1.

Ove ćelije su tretirane Jedinjenjem 1 ukupno 73 sata.

[0140] Procena stepena rasta tumora posle 72 sata tretmana, kao što je prikazano na Slici 1 i u Tabeli 1, otkrili su poseban podskup linija ćelija (prikazan sivin tačkama na Slici 1) koji je osetljiv na Jedinjenje 1. Većina linija ćelija koja pokazuje visoku osetljivost na Jedinjenje 1 su hematopoetskog porekla, mada su i neki “čvrsti” tumori takođe pokazali visoku osetljivosr (Tabela 1). Za potrebe pravljena Tabele 1, osetljivost linija ćelija su definisane tako da pokazuju maksimalni rast inhibicije ≥75% i imaju vrednost GI50<1.5 µM. Tabela 1 je lista nekih linija ćelije osetljivih na Jedinjenje 1, zajedno sa GI50vrednošću i maksimalnim rastem odgovora. Maksimalna inhibicija od 100 predstavlja potpunu inhibiciju rasta; maksimalna vrednost inhibicije >100 predstavlja ubijanje ćelija.

[0141] Kontrolno praćenje je urađeno na proširenom panelu linija hema ćelija u testu rasta koji je trajao 4 dana. Rast je procenjen pomoću Cell-Titer Glo meranja od dana 0 do dana 4. Kao što je prikazano na Slici 2, 2,25% praćenih hema linija (20/80) pokazalo je osetljivist na Jedinjenje 1, od kojih su linije difuznog limfom velikih B ćelija (DLBCL) bile posebno osetljive (8/11 ili 73%). Podskup hema linija koje su bile srednje osetljive (definisane kao >50% i <75% rasta stepena inhibicije) ili neosetljive (definisane kao >50% rasta stepena inhibicije) na Jedinjenje 1 u ovom kontrolnom praćenju su podvrgnute produženom testu rasta kako bi se procenilo da li produženo vreme tretmana menja njihove profile osetljivosti. Konkretno, ove hema linije su prethodno tretirane Jedinjenjem 1 3 dana u naznačenim koncentracijama i onda ponovo postavljene za standardni test rasta od 4 dana na svež medij/lek. Većina ponovo testiranih hema linija je pokazala jaku osetljivost na Jedinjenje 1, nakon 7 dana tretmana sa Jedinjenjem 1 (Tabela 2).

Tabela 1. GI50i maksimalni rast inhibicije različitih linija ćelija tretiranih Jedinjenjem 1

4

Tabela 2. 4-dnevna i 7-dnevna osetljivost rarazličitih linija ćelija tretiranih Jedinjenjem 1

Inhibicija rasta ćelija raka Jedinjenjem 1 pripisuje se inhibiciji DHODH

[0142] DHODH katalizuje četvrti korak u de novo sintezi pirimidina, oksidujući dihidroorotat do orotata u unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani. Orotat se onda kombinuje sa fosforibozil pirofosfatom (PRPP) kako bi dao orotidin-5’-monofosfat (OMP). Uridin monofosfate (UMP) se na kraju dobija iz OMP u u citosolu gde se koristi za formiranje pirimidina za RNK/DNK biosinteze, kao i za druge bitne biosintetske funkcije kao što su glikozilacija protein/lipid i proizvodnju fosfolipida za biosintezu membrane.

4

[0143] Da bi se potvrdio efekat Jedinjenja 1 u smanjenju ćelijskog rasta/održivosti nastali zbog specifične inhibicije DHODH, izvršeni su testovi rasta ćelija sa različitim količinama uridina u dopunjenom medijumu. Dopunjeni medijum sa koncentracijama urinida bliskim fiziolo škim (5µM) delimično je ublažio efekat Jedinjenja 1, dok su suprafiziološke koncentracije (25 Μm i 100 µM) potpuno ublažile efekat na rast do 10 µM Jedinjenja 1. Ovi rezultati ukazuju da su efekti Jedinjenja 1 na rast ciljani (Slika 3).

Poređenje profila osetljivosti Jedinjenja 1 naspram profila osetljivosti citarabina i doksorubicina

[0144] Profil osetljivosti Jedinjenja 1 na podskup hema linija je poređeno sa profilima osetljivosti drugih agenasa koji se koriste kao standardna nega (SOC) hema maligniteta. U skladu sa razli čitim mehanizmom delovanja, Jedinjenje 1 je pokazalo profil osetljivosti (Slika 4A) koji se razlikuje od profila osetljivosti citarabina (Slika 4B) i doksorubicina (Slika 4C).

Jedinjenje 1 efikasno inhibira DHODH in vivo i blokira rast tumora u AML ksenograft modelu

[0145] In vivo studije efikasnosti Jedinjenja 1 su rađene kako bi se procenio prelaz efekta sa in vitro u in vivo na blokadu DHODH i inhibiciju ćelija tumora. 1x10<6>MOLM-13 ćelija je primenjeno potkožno na CB17 SCID miševima. Miševi (n= 15/grupi) su tretirani sa nosačem ili Jedinjenjem 1 u dozi od 100 mg/kg oralno dva puta dnevno onog momenta kada tumori dostignu prosečno -150 mm<3>. Na kraju studije, tkiva su skupljena u naznačenim vremenskim tačkama posle poslednje primenjene doze za farmakokinetičku (PK) analizu i analizu puta biomarkera.

[0146] Jedinjenje 1 primenjeno u dozi od 100 mg/kg dva puta dnevno se dobro podnosilo i rezultiralo je brzom skoro potpunom inhibicijom rasta tumora (TGI) MOLM-13 akutne mijeloidne leukemije (AML) ksenograft modela (Slika 5A). Farmakokinetički profil je meren u plazmi i tumor je pokazao pad koncentracije leka za 12 sati, što podržava režim doziranja dva puta dnevno (Slika 5B). Jasan dokaz ciljanog angažovanja primećen je drastičnim povećanjem nivoa tumora dihidroorotata (DHO), DHODH supstrata (Slika 5C). Bazna linija DHO nivoa bila je ispod granice kvantifikacije (BQL <120 ng/g). Skupovi tumora uridina su istovremeno smanjenji za -60% u zavisnosti od procenjenje vremenske tačke (Slika 5D).

Jedinjenje 1 efikasno inhibira DHODH in vivo i blokira rast tumora u AML i DLBCL ksenograft modelima izvedenim kod pacijenata

[0147] Sledeće što je urađeno je skrining korišćenja malog broja miševa/grupi za procenu efikasnosti Jedinjenja 1 kod AML i DLBCL modela ksenografta dobijenih od pacijenata. Mi ševi koji se nosioci tumora (n=3/grupi) su tretirani nosačem ili Jedinjenjem 1 u dozama od 100 mg/kg dva puta dnevno, oralno.

[0148] Kako je prikazano na Slikama 6A-6E i 7A-7B, anti tumorska aktivnost Jedinjenja 1 je primećena na svim testiranim modelima, sa 60% TGI u dva od pet AML modela (npr., AML_2 i AML_5) i u jednom od dva DLBCL modela (DLBCL_1). DLBCL_1 model je okarakterisan kao trostruki DLBCL model.

In vitro inhibicija rasta dvostruko pogođenih ćelijskih linija humanog difuzionog limfoma velikih B ćelija Jedinjenjem 1

[0149] Tri ćelijske linije DBLCL limfoma dobijene od pacijenata su klasifikovane kao dvostruko pogođeni DLBCL, OCILY18, SC-1 i CARNAVAL, i utvrđena je visoka osetljivost na inhibiciju Jedinjenjem 1 u testu rasta koji je trajao 96 sati (Slika 8).

Jedinjenje 1 efikasno blokira rast timora u DLBCL ksenograft modelima dobijenim od pacijenata

[0150] Snažan blok in vivo rasta tumora je praćen sa Jedinjenjem 1 kod ksenograft modela OCILY-19 difuznog limfoma velikih ćelija (DLBCL). 7x10<6>OCILY-19 ćelija je implementirano potkožno

4

miševima CB17 SCID. Miševi (n=15-18/grupi) su tretirani nosačem ili Jedinjenjem 1, naznačenom dozom/učestalosti u momentu kada tumori dostignu prosečno -150 mm3. Tkiva su skupljena u naznačenim vremenskim tačkama nakon poslednje doze za PK i biomarker analizu.

[0151] Pokazalo se da je stepen modulacije puta i inhibicije rasta tumora zavisi od doze i rasporeda (Slika 9A). Režim doziranja 100 mg/kg dva puta dnevno rezultira superiornom efikasnošću u poređenju sa dozama 10 i 30 mg/kg dva puta dnevno i što je povezano sa veliki povećanjem DHO tumora (Slika 9C), kao i smanjenjem ukupnih skladišta tumora uridina (Slika 9D). Režim doziranja 200 mg/kg jednom dnevno je bio manje efikasan od režima doziranja 100 mg/kg dva puta dnevno zbog kratkog polu života Jedinjenja 1 u miševima, što je dovelo do nižih koncentracija leka kod doziranja jednom dnevno (pogledati Sliku 9B).

In vitro inhibicija rasta više ćelijskih linijatrostrukih humanih karcinoma grudi Jedinjenjem 1

[0152] Paneli sa ćelijskim linijama trostruko negativnih karcinoma (TNCB) su praćeni radi procene da li bi podskup TNBC potencijalno mogao imati koristi od tretmana Jedinjenjem 1 kao jedinim agensom. Tretman Jedinjenjem 1 u periodu od 96 sata jako je oslabilo odr živost/rast ćelija kod DU4475 u uporedivom stepenu kao što je primećeno kod ćelijskih linija hema porekla (pogledati Sliku 10), dok su četiri ostale TNBC linije (HCC1143, HCC38, BTS49 i HCC1806) bile neosetljive pod datim uslovima.

4

Claims (15)

1. Patentni zahtevi: 1.Jedinjenje za primenu u tretmanu akutne mijeloidne leukemije, multiple mijeloma,B-prolimfocitne leukemije, ne-Hodgkinsovog limfoma, difuzionog limfoma velikih B ćelija, anaplastičnoglimfoma velikih ćelija,limfoma mantle ćelija, trostruko negativnog karcinoma grudi, melanoma, karcinoma prostate, ilikarcinoma jednjaka, pri čemu je jedinjenje odabrano između:

   4

   �

   �

   �

   Ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
2. 2. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu akutne mijeloidne leukemije.
3. 3. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu multiple mijeloma.
4. 4. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu B-prolimfocitne leukemije.
5. 5. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu ne-Hodgkinsovog limfoma.
6. 6. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu difuznog limfoma velikih B ćelija.
7. 7. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu anaplsatičnog limfoma velikih ćelija.
8. 8. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu limfoma mantle ćelija.
9. 9. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu trostruko negativnog karcinoma grudi.
10. 10. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu melanoma.
11. 11. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu karcinoma prostate.
12. 12. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 u tretmanu karcinoma jednjaka.
13. 13. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom zahtevu od 1 do 12, pri čemu je jedinjenje

    Ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
14. 14. Jedinjenje za uppotrebu prema bilo kom zahtevu od 1 do 12, pri čemu je jedinjenje

    Ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
15. 15. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom zahtevu od 1 do 12, pri čemu je jedinjenje: a)

    c)

    ili

    Ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 1