RS63220B1 - Genetski modifikovani miševi sa ekspresijom himernih molekula klase ii glavnog kompleksa histokompatibilnosti (mhc) - Google Patents

Description

OPIS

Oblast pronalaska pronalazak

[0001] Ovde obelodanjene metode se odnose na glodara (npr. miša ili pacova) koji je genetski projektovan u cilju eksprimovanja humanizovanog MHC II proteina. Pronalazak se dalje odnosi na metode proizvodnje genetski modifikovanog glodara sa ekspresijom II klase proteina humanizovanog MHC. Ovde su takođe navedene metode za korišćenje glodara, ćelija i tkiva sa ekspresijom klase II proteina MHC za identifikovanje peptida koji aktiviraju limfocite i pokreću T ćelije i za razvijanje ljudskih vakcina u drugih terapija.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] Kod adaptivnog imunog odgovora, strani antigeni se prepoznaju pomoću molekula receptora na B limfocitima (npr. imunoglobulini) i T limfocita (npr. receptori T ćelija ili TCR). Ove strane antigene na površinu ćelija u obliku fragmenata peptida donose specijalizovani proteini koji se generički nazivaju molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Molekuli MHC su enkodirani višestrukim lokusima koji su prisutni u obliku povezanog klastera gena koji se prostiru na oko 4 Mb. Kod miševa, MHC geni se nalaze na hromozomu 17, a iz istorijskih razloga nazivaju se geni histokompatibilnosti 2 (H-2). Kod ljudi, ovi geni se nalaze na hromozomu 6 i nazivaju se geni ljudskog sistema leukocitnih (engl. HLA) antigena. Lokusi kod miševa i ljudi su poligeni; oni sadrže tri visoko polimorfne klase MHC gena (klasa I, II i III) koje ispoljavaju sličnu organizaciju kod ljudskog i mišjeg genoma (pogledati sl.2, odnosno sl.3).

[0003] MHC lokusi ispoljavaju najviši polimorfizam u genomu; neki geni sadrže >300 alela (npr. ljudski HLA-DRβ i ljudski HLA-B). Svi MHC geni klase I II mogu da prezentuju fragmente peptida, ali svaki gen ima ekspresiju proteina sa različitim karakteristikama vezivanja, odražavajući polimorfizme i alelne varijante. Svaki pojedinac ima jedinstven opseg fragmenata peptida koji se mogu prezentovati na površini B i T ćelija tokom imunog odgovora.

[0004] I ljudi i miševi poseduju MHC gene klase II (pogledati sl. 2 i 3). Kod ljudi, klasični MHC II geni se obeležavaju oznakama HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR, dok se kod miševa obeležavaju oznakama H-2A i H-2E (često skraćenim oblikom I-A, odnosno I-E). Dodatni proteini koji su enkodirani genima u MHC II lokusu, HLA-DM i HLA-DO kod ljudi, odnosno H-2M i H-2O kod miševa, se ne nalaze na površini ćelija, već u endocitnom odeljku i osiguravaju ispravno punjenje MHC II molekula peptidima. Molekuli klase II se sastoje od dva lanca polipeptida: α lanac i β lanac. Ekstracelularni deo α lanca sadrži dva ekstracelularna domena, α1 i α2, a ekstracelularni deo β lanca takođe sadrži dva ekstracelularna domena, β1 i β2 (pogledati sl. 1). α i β lanci nisu kovalentno povezani jedan s drugim.

[0005] MHC molekuli klase II su eksprimovani na antigen prezentujućim ćelijama (engl. APC), npr. B ćelije, makrofagi, dendritične ćelije, entotelijalne ćelije tokom zapaljenja, itd. MHC molekuli klase II eksprimovani na površini APC-ova obično prezentuju antigene generisane u intracelularnim vezikulama na CD4+ T ćelijama. Kako bi učestvovao u pokretanju CD4+ T ćelija, MHC kompleks klase II sa odgovarajućim antigenom mora da bude dovoljno stabilan da bi preživeo dovoljno dugo za pokretanje CD4+ T ćelije. Kada se CD4+ pomoćna ćelija aktivira stranim peptidom / MHC II kompleksom na površini APC-a, T ćelija se aktivira tako da otpušta citokine koji pomažu u imunom odgovoru na napadača.

[0006] Neće svi antigeni dovesti do aktiviranja T ćelije zbog mehanizama tolerancije. Međutim, kod nekih oboljenja (npr. karcinoma, autoimunih oboljenja) peptidi izvedeni iz samoproteina postaju meta celularne komponente imunog sistema, što dovodi do uništavanja ćelija koje prezentuju te peptide. Došlo je do značajnog napretka u prepoznavanju antigena koji su klinički značajni (npr. antigeni povezani sa različitim vrstama karcinoma). Međutim, da bi se poboljšala identifikacija i selekcija peptida koji će aktivirati adekvatan odgovor kod ljudskih T ćelija, a naročito peptida klinički značajnih antigena, i dalje postoji potreba za in vivo i in vitro sistemima koji oponašaju aspekte ljudskog imunog sistema. Stoga, postoji potreba za biološkim sistemima (npr. genetski modifikovane glodare i ćelije) koji mogu da iskažu komponente ljudskog imunog sistema.

Kratak opis pronalaska

[0007] Obelodanjen je biološki sistem za generisanje ili identifikaciju peptida koji se povezuju sa humanim MHC proteinima klase II i njihovim himerama i vezuje za CD4+ T ćelije. Obelodanjeni su glodari koji sadrže ćelije glodara sa ekspresijom humanizovanih molekula koji funkcionišu u okviru celularnog imunog odgovora. Takođe su obelodanjeni humanizovani lokusi glodara koji enkodiraju humanizovane MHC II proteine. Takođe su obelodanjene ćelije glodara koje eksprimuju humanizovane MHC molekule. Obelodanjeni su in vivo i in vitro sistemi koji sadrže humanizovane ćelije glodara, gde ćelije glodara eksprimuju jedan ili viđe humanizovanih molekula imunog sistema.

[0008] Ovde je obelodanjen glodar (npr. miš ili pacov) koji u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira humanizovani MHC II kompleks, kod koga ljudski deo humanizovanog MHC II kompleksa sadrži ekstracelularni domen humanizovanog MHC II kompleksa, npr. humanizovane MHC II alpha1 i alpha2 domene i humanizovane MHC II β beta1 i beta2 domene.

[0009] U jednom aspektu, ovde je dat glodar koji u endogenom lokusu MHC II α gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru, ljudski deo takvog himernog MHC II α polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži ljudski MHC II α ekstracelularni domen. U jednom primeru glodar eksprimuje funkcionalni MHC II kompleks na površini ćelije glodara. U jednom primeru dok ljudski MC II α ekstracelularni domen kod glodara sadrži ljudske MHC II α1 i α2 domene; u jednom primeru, deo glodara himernog ljudskog/glodarskog -MHC II polipeptida sadrži transmembranu i citoplazmatske domene endogenog MHC II polipeptida glodara. U jednoj primeni, nukleotidna sekvenca koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara se eksprimuje pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II α promotera porekla od glodara i regulatornih elemenata. U jednom primeru, ljudski deo himernog polipeptida se izvodi iz ljudskog HLA proteina klase II koji je izabran iz grupe koja se sastoji od HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP proteina, npr., ljudski deo se izvodi iz proteina HLA-DR4. Glodar može biti miš. U jednom otelotvorenju, glodar koji u endogenom lokusu MHC II α gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara dalje u endogenom lokusu MHC II β gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. Ovde je takođe obelodanjena metoda proizvodnje genetski modifikovanog glodara koji u endogenom lokusu MHC II α gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni ljudski MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. Takva metoda može da se sastoji od zamene nukleotidne sekvence u endogenom lokusu MHC II α gena koja enkodira endogeni MHC II α polipeptid porekla glodara nukleotidnom sekvencom koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara.

[0010] Ovde je takođe obelodanjen genetski modifikovani glodar koji u endogenom lokusu MHC II β gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru, ljudski deo takvog himernog MHC II β polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži ljudski MHC II β ekstracelularni domen. U jednom primeru, glodar eksprimuje funkcionalni MHC II kompleks na površini ćelije glodara. U jednom primeru, humani MHC II β ekstracelularni domeni u glodaru sadrži MHC II β1 i β2 domene; U jednoj primeni, deo porekla od glodara himernog MHC II β polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži transmembranski i citoplazmni domen endogenog MHC II β polipeptida porekla od glodara. U jednoj primeni, nukleotidna sekvenca koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara se eksprimuje pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II β promotera porekla od glodara i regulatornih elemenata. U jednom primeru, ljudski deo himernog polipeptida se izvodi iz ljudskog HLA proteina klase II koji je izabran iz grupe koja se sastoji od HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP proteina, npr., ljudski deo se izvodi iz proteina HLA-DR4. Glodar može biti miš. U jednom otelotvorenju, glodar koji u endogenom lokusu MHC II β gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara dalje u endogenom lokusu MHC II α gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. Ovde je obelodanjena navedena metoda proizvodnje genetski modifikovanog glodara koji u endogenom lokusu MHC II β gena sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. Takva metoda može da se sastoji od zamene nukleotidne sekvence u endogenom lokusu MHC II β gena koja enkodira endogeni MHC II β polipeptid porekla od glodara nukleotidnom sekvencom koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara.

[0011] U jednom primeru, obelodanjen je glodar koji na endogenom lokusu MHC II gena sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara i drugu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara, gde ljudski deo himernog MHC II α polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži ljudski MHC II α ekstracelularni domen, a ljudski deo himernog MHC II β polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži ljudski MHC II β ekstracelularni domen, pri čemu ljudski MHC II α ekstracelularni domen sadrži ljudske α1 i α2 domene ljudskog MHC II, a ljudski MHC II β ekstracelularni domen sadrži ljudske β1 i β2 domene ljudskog MHC II. Himerni MHC II α i β polipeptidi ljudskog porekla i porekla od glodara formiraju funkcionalni himerni MHC II kompleks (npr. MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara) na površini ćelije. U različitim aspektima, prva nukleotidna sekvenca se eksprimuje pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II α promotera porekla od glodara i regulatornih elemenata. U različitim aspektima, druga nukleotidna sekvenca se eksprimuje pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II β promotera porekla od glodara i regulatornih elemenata. U nekim primerima, deo porekla od glodara himernog MHC II α polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži transmembranski i citoplazmni domen endogenog MHC II α polipeptida porekla od glodara. U nekim primerima, deo porekla od glodara himernog MHC II β polipeptida ljudskog porekla ili porekla glodara sadrži transmembranski i citoplazmni domen endogenog MHC II β polipeptida porekla od glodara.

[0012] U različitim primerima, ljudski delovi himernog MHC II α i β polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrže ljudske sekvence izvedene iz HLA proteina klase II izabranih iz grupe koja se sastoji od HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP proteina. U nekim primenama pronalazaka, ljudski delovi himernih MHC II α i β sekvenci ljudskog porekla ili porekla od glodara izvedeni su iz sekvence ljudskog HLA-DR4; stoga, nukleotidna sekvenca koja enkodira MHC II α ekstracelularni domen izvodi se iz sekvence gena HLA-DRα*01, a nukleotidna sekvenca koja enkodira MHC II β ekstracelularni domen se izvodi iz sekvence koja enkodira gen HLA-DRβ1*0.

[0013] U različitim obelodanjivanjima, prva i druga nukleotidna sekvenca se nalaze na istom hromozomu. U nekim primerima, glodar se sastoji od dve kopije MHC lokusa koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu, dok se u drugim aspektima glodar sastoji od jedne kopije MHC II lokusa koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu. Prema tome, glodar može biti homozigotna ili heterozigotna za MHC II lokus koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu.

[0014] U nekim primerima, himerni MHC II α polipeptid i/ili himerni MHC II β polipeptid se operativno povezuje sa liderskom sekvencom glodara.

[0015] U jednom primeru, glodar je izabran iz grupe koja se sastoji od miša i pacova. Stoga, u nekim primerima, sekvence himernih MHC II α i β gena izvedene su iz nukleotidnih sekvenci koje enkodiraju mišji MHC II protein, npr. protein H-2E. U jednoj primeni, glodar (npr., miš ili pacov) prema pronalasku ne eksprimuje funkcionalne endogene MHC II polipeptide iz svojih endogenih lokusa. U jednoj primeni, u slučajevima kada je glodar miš, miš ne eksprimuje funkcionalne endogene H-2E i H-2A polipeptide iz svojih endogenih lokusa.

[0016] Tako, u nekim primerima, obezbeđen je miš koji na endogenom mišjem lokusu MHC II sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog/mišjeg porekla, a druga nukleotidna sekvenca enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog/mišjeg porekla, pri čemu ljudski deo himernog MHC II α polipeptida sadrži ekstracelularni domen izveden iz α polipeptida ljudskog proteina HLA-DR4, a ljudski deo himernog MHC II β polipeptida ljudskog/mišjeg porekla sadrži ekstracelularni domen izveden iz β polipeptida ljudskog proteina HLA-DR4, gde mišji deo himernog MHC II α polipeptida sadrži transmembranu i citoplazmne domene mišjeg H-2E α lanca, dok mišji deo himernog MHC II β polipeptida sadrži transmembranu i citoplazmne domene mišjeg H-2E β lanca, a miš eksprimuje funkcionalni himerni HLA-DR4/H-2E MHC II kompleks. U nekim primerima, ekstracelularni domen himernog MHC II α polipeptida sadrži ljudski α1 i α2 domen; u nekim primerima, ekstracelularni domen himernog MHC II β polipeptida sadrži ljudski β1 i β2 domen. U nekim primenama, prva nukleotidna sekvenca je eksprimovana pod regulatornom kontrolom endogenog mišjeg MHC II α promotera i regulatornih elemenata, a druga nukleotidna sekvenca se eksprimuje pod regulatornom kontrolom endogenog mišjeg MHC II β promotera i regulatornih elemenata. U različitim primenama, miš ne eksprimuje funkcionalne endogene MHC II polipeptide, npr. H-2E i H-2A polipeptide, iz svojih endogenih lokusa. U nekim primerima, miš se sastoji od dve kopije MHC II lokusa koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu, dok u drugim primerima, miš se sastoji od jedne kopije MHC II lokusa koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu.

[0017] Takođe su priložene metode proizvodnje genetski izmenjenih glodara, npr. miševa ili pacova, kao što je ovde opisano. U različitim primerima, glodari, npr. miševi ili pacovi u okviru pronalazaka se dobijaju zamenom endogenih MHC II sekvenci nukleotidnim sekvencama koje enkodiraju himerne MHC II α i β polipeptide ljudskog porekla ili porekla od glodara (npr. ljudski/mišji). Takođe je obelodanjena metoda izmene MHC II lokusa glodara (npr. miš ili pacov) u cilju eksprimovanja himernog MHC II kompleksa ljudskog porekla ili porekla od glodara koji se sastoji od zamene na endogenom lokusu mišjeg MHC II nukleotidne sekvence koja enkodira MHC II kompleks porekla od glodara nukleotidnom sekvencom koja enkodira himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru metode, nukleotidna sekvenca kojom se enkodira himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja enkodira ekstracelularni domen ljudskog MHC II α lanca i transmembranski i citoplazmni domen MHC II α lanca porekla od glodara i sadrži drugu nukleotidnu sekvencu koja enkodira ekstracelularni domen ljudskog MHC II β lanca i transmembranski i citoplazmni domen MHC II β lanca porekla od glodara. U nekim primerima, deo himernog MHC II kompleksa porekla od glodara je izveden iz mišjeg proteina H-2E, dok je ljudski deo izveden iz ljudskog proteina HLA-DR4. U nekim obelodanjivanjima, zamena endogenog lokusa MHC II koja je ovde opisana se obavlja u jednoj embrionskoj matičnoj (ES) ćeliji, a jedna ES ćelija se uvodi u embrion glodara (npr. miša ili pacova) da bi se dobio genetski modifikovan glodar (npr. miš ili pacov).

[0018] Ovde su takođe opisane ćelije, npr. izolovane antigen prezentujuće ćelije, izvedene iz glodara, npr. iz miševa ili pacova koji su ovde opisani. Tkiva i embrioni koji su izvedeni iz glodara koji su opisani ovde su takođe obelodanjeni.

[0019] Sve primene i aspekti koji su ovde opisani mogu da se koriste zajedno jedan s drugim, osim ako drugačije nije navedeno i ako to nije očigledno iz konteksta. Druge primene iz pregleda koji sadrži naredni detaljan opis će biti očigledne za korisnike sa uobičajenim veštinama i znanjem u ovoj oblasti. Sledeći detaljan opis sadrži prikaze primera raznih primena koji ne ograničavaju pronalazak u skladu sa tvrdnjama. Prateće slike predstavljaju deo ove specifikacije i, zajedno sa opisom, služe samo za ilustraciju primena i ne ograničavaju pronalazak.

Kratak opis crteža

[0020]

Sl. 1 je šematski prikaz molekula MHC klase II eksprimovanog na površini antigen prezentujuće ćelije (APC), koja sadrži četiri domena: α1, α2, β1 i β2. Sivi krug predstavlja peptid koji je vezan u rascepu za vezivanje peptida.

Sl. 2 je šematski prikaz (nije u razmeri) relativne genomske strukture ljudskog HLA, gde su prikazani geni klase I, II i III.

Sl. 3 je šematski prikaz (nije u razmeri) relativne genomske strukture mišjeg MHC, gde su prikazani geni klase I, II i III.

Sl. 4 (A-D) je šematski prikaz (nije u razmeri) strategije za generisanje vektora za ciljanje koji se sastoji od humanizovanog I-E β i I-E α (tj. himera H-2Eβ/HLA-DRβ1*04, odnosno H-2Eα/HLA-DRα*01). Na sl. 4C finalna humanizovana MHC II sekvenca sa sl. 4B se povezuje između restrikcionih lokacija PI-SceI i I-CeuI finalne konstrukcije sa sl.4A kako bi se dobila konstrukcija koja se sastoji od humanizovanog MHC II i eksona 1 I-Eα od BALB/c. Pg = pseudogen; BHR = bakterijska homologna rekombinacija; CM = hloramfenikol; spec = spektinomicin; hyg = higromicin; neo = neomicin; EP = elektroporacija. Trouglovi predstavljaju eksone, ispunjeni trouglovi predstavljaju eksone miševa iz miša C57BL/6 (sa izuzetkom isprekidanih trouglova, koji predstavljaju ekson 1 I-Eα iz miša BALB/c), a otvoreni trouglovi predstavljaju ljudske eksone.

Sl. 5 prikazuje šematsku ilustraciju (nije u razmeri) MHC I-E i I-A gena klase II, prikazujući izbacivanje lokusa miša koristeći kasetu higromicina, nakon čega sledi uvođenje vektora koji se sastoji od humanizovanog I-E β i I-E α (tj. himera H-2Eβ/HLA-DRβ1*04, odnosno H-2Eα/HLA-DRα*01). Otvoreni trouglovi predstavljaju ljudske eksone; ispunjeni trouglovi predstavljaju mišje eksone. Sonde korišćene za genotipizaciju su zaokružene.

Sl. 6 prikazuje šematsku ilustraciju (nije u razmeri) uklanjanja kasete neomicina posredstvom „Cre”-a sa sl.5. Otvoreni trouglovi predstavljaju ljudske eksone; ispunjeni trouglovi predstavljaju mišje eksone. Dve gornje strune predstavljaju MHC II lokuse u humanizovanom MHC II heterozigotnom mišu koji nosi selekcionu kasetu neomicina, a donje dve strune predstavljaju MHC II lokuse u humanizovanom MHC II heterozigotnom mišu sa uklonjenom kasetom neomicina.

Sl. 7 prikazuje šematsku poredbenu ilustraciju (nije u razmeri) lokusa klase II miša i čoveka. Geni klase II su predstavljeni okvirima, a prazni okviri predstavljaju pseudogene. Prikazane su relativne veličine (kb) različitih fragmenata nukleinske kiseline.

Sl. 8, na levom panelu, predstavlja šematsku ilustraciju (nije u razmeri) strategije humanizacije za MHC II α lanac; slika naročito prikazuje zamenu α1 i α2 domena, enkodiranih eksonima 2 i 3 iz MHC II α gena, dok se zadržava mišja transmembranska i citoplazmna repna sekvenca. Kod humanizovanog lokusa, MHC II α lider sekvenca je izvedena iz mišjeg soja BALB/c. Na desnom panelu je ilustrovana humanizacija MHC II β lanca; slika naročito prikazuje zamenu β1 i β2 domena, enkodiranih eksonima 2 i 3 iz MHC II β gena, dok se zadržava mišji lider i mišja transmembranska i citoplazmna repna sekvenca. U gornjem redu su sve ljudske sekvence; u srednjem redu su sve mišje sekvence; u donjem redu su sve humanizovane sekvence, sa eksonima 2 i 3 izvedenim iz ljudskih HLA-DR gena.

Sl. 9 prikazuje FACS analizu sa antitelom za anti-HLA-DR za B ćelije iz miša koji je heterozigotni za himerni HLA-DR4 (kaseta neomicina uklonjena) u prisustvu (1681HET poli(I:C) ili odsustvu (1681HET) poli(I:C) i miš divlje vrste (WT miš).

Detaljan opis pronalaska

Definicije

[0021] Obelodanjeni su genetski modifikovani glodari (npr., miševi, pacovi, zečevi, itd.) koji eksprimuju humani ili humanizovani MHC II polipeptid; embrione, ćelije i tkiva koja sadrže isti; kao i metode za njihovu proizvodnju. Osim ako nije drugačije definisano, svi termini i fraze koji se ovde koriste imaju isto značenje kao i termini i fraze u ovoj oblasti, osim ako suprotno nije jasno naznačeno ili jasno očigledno iz konteksta u kojoj se termin ili fraza koriste.

[0022] Termin „konzervativno”, kada se koristi za opisivanje konzervativne supstitucije aminokiselina, obuhvata supstituciju ostatka aminokiseline drugim ostatkom aminokiseline čija R grupa bočnog lanca ima slična hemijska svojstva (npr. napon ili hidrofobnost). Konzervativne supstitucije aminokiselina mogu da se postignu izmenom nukleotidne sekvence kako bi se uvela nukleotidna promena koja će enkodirati konzervativnu supstituciju. Uopšteno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva od interesa u vezi sa proteinom, na primer, mogućnost MHC II da prezentuje peptid od interesa. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju alifatske bočne lance, kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatsko-hidroksilne bočne lance, kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amide, kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance, kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovne bočne lance, kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance, kao što su asparaginska i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor, kao što su cistein i metionin. Grupe za konzervativnu supstituciju aminokiselina obuhvataju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. Konzervativna supstitucija aminokiselina može da bude supstitucija bilo kog izvornog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što se koristi, na primer, kod mutageneze za alanin-skeniranje. Konzervativna supstitucija sme biti napravljena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici logaritma verovatnoće i koja je navedena u literaturi Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim primenama, supstitucija je umereno konzervativna, pri čemu supstitucija nema negativnu vrednost u PAM250 matrici logaritma verovatnoće.

[0023] Stoga, takođe je obelodanjena genetski modifikovana životinja glodar čiji se genom sastoji od nukleotidne sekvence koja enkodira ljudski ili humanizovani MHC II polipeptid, gde se polipeptid sastoji od konzervativnih supstitucija aminokiselina u sekvenci aminokiselina koja je ovde opisana.

[0024] Osoba sa uobičajenim veštinama i znanjem u ovoj oblasti bi razumela da pored ostataka nukleinske kiselina koja enkodira ljudski ili humanizovani MHC II polipeptid koji je ovde opisan, zbog degenerativnosti genetskog koda, druga nukleinska kiselina može da enkodira polipeptid otkrivanja. Tako je pored genetski modifikovanog glodara koji u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira MHC II polipeptid sa konzervativnim supstitucijama aminokiselina takođe obezbeđen glodar čiji se genom sastoji od nukleotidne sekvence koji se razlikuje od sekvence koja je ovde data zbog degenerativnosti genetskog koda.

[0025] Termin „identitet” kada se koristi u vezi sa sekvencom koja obuhvata identitet koji se određuje brojnim različitim algoritmima koji su poznati u ovoj oblasti može da se koristi za merenje identiteta nukleotidne sekvence ili sekvence aminokiseline. U nekim primenama koje su ovde opisane, identiteti se određuju koristeći ClustalW v. 1.83 (sporo) usklađivanje koje koristi penal za zazor od 10,0, prošireni penal za zazor od 0,1 i Gonnet matricu sličnosti (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identitetom sekvenci zavisiće od određenih sekvenci. U različitim primenama, identitet se određuje poređenjem sekvence zrelog proteina iz njegovog N-terminala do njegovog C-terminala. U različitim primenama prilikom poređenja himerne sekvence ljudskog porekla ili porekla od glodara sa ljudskom sekvencom, ljudski deo sekvence ljudskog porekla ili porekla od glodara (ali ne deo glodara) se koristi za poređenje u svrhu utvrđivanja nivoa identiteta između ljudske sekvence i ljudskog dela himerne sekvence ljudskog porekla ili porekla od glodara (npr. poređenje ljudskog ektodomena himernog proteina ljudskog/mišjeg proteina sa ljudskim ektodomenom ljudskog proteina).

[0026] Termini „homologija” ili „homologno” u vezi sa sekvencama, npr. nukleotidna sekvenca ili sekvenca aminokiselina, označava dve sekvence koje su nakon optimalnog usklađivanja poređenja identične kod najmanje 75 % nukleotida ili aminokiselina, najmanje oko 80 % nukleotida ili aminokiselina, najmanje 90–95 % nukleotida ili aminokiselina, npr. više od 97 % nukleotida ili aminokiselina. Osoba sa uobičajenim veštinama i znanjem u ovoj oblasti bi razumela da, za optimalno ciljanje gena, konstrukcija za ciljanje treba da sadrži krakove koji su homologni endogenim sekvencama DNK (tj. „homologne krakove”), zbog čega homologna rekombinacija može da se javi između konstrukcije za ciljanje i ciljane endogene sekvence.

[0027] Termin „operativno povezano” se odnosi na jukstapoziciju gde su komponente koje su tako opisane u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđen način. Kao takva, sekvenca nukleinske kiseline koja enkodira protein može da se operativno poveže sa regulatornim sekvencama (npr. promoter, poboljšivač, sekvenca utišavanja, itd.) da bi se održala ispravna transkripcijska regulacija. Pored toga, različiti delovi himernog ili humanizovanog proteina mogu da se operativno povežu kako bi se zadržalo odgovarajuće savijanje, obrada, ciljanje, eksprimovanje i druga funkcijska svojstva proteina u ćeliji. Osim ako nije drugačije navedeno, različiti domeni himernog ili humanizovanog proteina koji su ovde opisani su operativno međusobno povezani.

[0028] Termini „MHC II kompleks”, „MHC II protein” ili slično, kao što se ovde koriste, obuhvataju kompleks između MHC II α polipeptida i MHC II β polipeptida. Termin „MHC II α polipeptid” ili „MHC II β polipeptid” (ili slično), kao što se ovde koristi, sadrži samo MHC I α polipeptid, odnosno samo MHC II β polipeptid. Slično tome, termini „HLA-DR4 kompleks”, „HLA-DR4 protein”, „H-2E kompleks”, „H-2E” protein” ili slično se odnose na kompleks između α i β polipeptida. Uobičajeno, termini „ljudski MHC” i „HLA” se koriste kao sinonimi.

[0029] Termin „zamena” u vezi sa zamenom gena se odnosi na postavljanje egzogenog genetskog materijala u endogeni genetski lokus, čime se zamenjuje celokupni endogeni gen ili njegov deo ortolognom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. Kao što je prikazano u primerima u nastavku, sekvenca nukleinske kiseline endogenog MHC II lokusa je bila zamenjena nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od sekvenci koje enkodiraju delove ljudskih MHC II α i β polipeptida; detaljnije, enkodiranje ekstracelularnih delova MHC II α i β polipeptida.

[0030] Termin „funkcionalni”, kao što se ovde koristi, npr. u vezi sa funkcionalnim polipeptidom, se odnosi na polipeptid koji zadržava najmanje jednu biološku aktivnost koja je normalno povezana sa izvornim proteinom. Na primer, kod nekih primena pronalazaka, zamena u endogenom lokusu (npr. zamena kod endogenog neljudskog MHC II lokusa) dovodi do toga da lokus ne eksprimuje funkcionalni endogeni polipeptid.

Genetski modifikovane MHC II životinje

[0031] Ovde su obelodanjeni genetski modifikovani glodari koji u svom genomu sadrže nukleotidnu sekvencu koja enkodira humani ili humanizovani MHC II kompleks; stoga, glodari eksprimuju humani ili humanizovani MHC II kompleks (npr., MHC II α i β polipeptidi).

[0032] MHC geni su podeljeni u tri klase: klasa I, klasa II i klasa III, od kojih su sve enkodirane ili na ljudskom hromozomu 6 ili mišjem hromozomu 17. Šema relativne organizacije ljudskih i mišjih MHC klasa je predstavljena na slikama 2, odnosno 3. Većina MHC gena su polimorfni, zapravo su to najpolimorfniji geni mišjeg i ljudskog genoma. Smatra se da su MHC polimorfizmi važni kod pružanja evolucione prednosti; promene u sekvenci mogu da dovedu do razlika u spajanju peptida, što omogućava bolju prezentaciju antigena. Jedini izuzetak je ljudski lanac HLA-DRα i njegov mišji homolog, Eα (tj., H-2Ea), koji su monomorfni.

[0033] MHC kompleks klase II se sastoji od dva nekovalentno povezana domena: α lanac i β lanac, koji se ovde takođe nazivaju α polipeptid i β polipeptid (sl.1). Protein se rasprostire preko membrane plazme; stoga on sadrži ekstracelularni domen, transmembranski domen i citoplazmni domen. Ekstracelularni domen α lanca obuhvata α1 i α2 domene, a ekstracelularni domen β lanca obuhvata β1 i β2 domene. α1 i β1 domeni formiraju rascep za vezivanje peptida na površini ćelije. Zbog trodimenzionalne potvrde rascepa za vezivanje peptida MHC II kompleksa, teorijski ne postoji gornja granica dužine za vezani antigen, ali uobičajeno peptidi koje prezentuje MHC II imaju dužinu između 13 i 17 aminokiselina.

[0034] Pored njegove interakcije sa antigenskim peptidima, rascep za vezivanje peptida na MHC II molekulu vrši interakciju sa invarijantnim lancem (Ii) tokom procesa formiranja MHC II kompleksa i akvizicije peptida. Dimeri α/β MHC II se sastavljaju u endoplazmatičnom retikulumu i povezuju sa Ii lancem koji je odgovoran za kontrolu vezivanja peptida i ciljanja MHC II u endocitnu putanju. U endozomu, Ii prolazi proteolizu, a mali fragment Ii, peptid invarijantnog lanca povezan sa klasom II (CLIP), ostaje na rascepu za vezivanje peptida. U endozomu pod kontrolom HLA-DM (kod ljudi), CLIP se zamenjuje antigenim peptidima.

[0035] MHC II vrši interakciju sa koreceptorom CD4 T ćelija u hidrofobnom useku na spoju domena α2 i β2. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49. Kada CD4 i receptor T ćelije vezuju isti MHC II molekul koji pravi kompleks sa peptidom, osetljivost T ćelije na antigen je povećana i zahteva stostruko manje antigena za aktivaciju. Pogledati, Janeway’s Immunobiology, 7<th>Ed., Murphy et al. eds., Garland Science, 2008.

[0036] Brojne funkcije su predložene za transmembranski i citoplazmni domen MHC II. U slučaju citoplazmnog domena, pokazano je da je važan za intracelularno signaliziranje, usmeravanje do membrane plazme i na kraju prezentovanja antigena. Na primer, pokazano je da hibridomi T ćelije loše reaguju na antigen prezentujuće ćelije (APC) transfektovane MHC II β lancima koji su skraćeni u domenu citoplazmnom domenu, a indukcija diferencijacije B ćelija je otežana. Pogledati, npr., Smiley et al. (1996) Truncation of the class II β-chain cytoplasmic domain influences the level of class II/invariant chain-derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:241-44. Čini se da skraćivanje molekula klase II pogoršava proizvodnju cAMP. Uzima se kao istinito da brisanje citoplazmnog repa MHC II utiče na intracelularno usmeravanje, čime se sprečava da kompleks naiđe na relevantne antigene u endocitnoj putanji. Smiley i drugi autori (iznad) su pokazali da skraćivanje molekula klase II u citoplazmnom domenu dovodi do smanjivanja broja CLIP / klase II kompleksa, na osnovu čega se zaključuje da to utiče na mogućnost da CLIP efektivno reguliše prezentaciju antigena.

[0037] Postoji hipoteza da s obzirom na to da je stvaranje klastera MHC II važno za aktiviranje receptora na T ćelijama (TCR), ako se spreči da se MHC molekuli koji su skraćeni u citoplazmnom domenu vežu za citoskelet i zbog toga dođe do agregacije, to će uticati na prezentaciju antigena T ćelijama. Ostrand-Rosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22. Zapravo, nedavno je pokazano da HLA-DR skraćen u citoplazmnom domenu nije uspeo da se poveže sa citoskeletom nakon oligomerizacije. El Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLA-DR

Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80. Ono što je važno je to da aktinski citoskelet predstavlja mesto aktivnosti transdukcije lokalizovanog signala koji može da utiče na prezentaciju antigena. Pored povezivanja sa citoskeletom, nedavne studije su takođe pokazale da do 20 % svih HLA-DR molekula konstitutivno ostaju na lipidnim splavovima APC-a, koji su mikrodomeni bogati holesterolom i glikosfingolipidima, i da je takva lokalizacija važna za prezentaciju antigena, formiranje imune sinapse i signaliziranje posredstvom MHC II. Pogledati, npr., Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14. Dolan i drugi autori predlažu da skraćivanje citoplazmnog domena MHC II smanjuje konstitutivnu lokalizaciju MHC II na lipidne splavove.

[0038] Pored toga, citoplazmni domen MHC II, naročito β lanac, sadrži ostatak leucina koji podleže ubikvitinaciji izazvanoj ubikvintin ligazom, RING-CH I (MARCH I) povezanim sa membranom, koji kontroliše endocitno usmeravanje, internalizaciju i degradaciju MHC II, i pokazano je da ubikvintinacija posredstvom MARCH-a prestaje nakon sazrevanja dendritičnih ćelija, što dovodi do povećanja nivoa MHC II u membrani plazme. Shin et al. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18; De Gassart et al. (2008) MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96.

[0039] Transmembranski domeni α i β lanaca MHC II vrše međusobnu interakciju i ova je interakcija važna za ispravno sklapanje kompleksa MHC klase II. Cosson and Bonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659-62. Zapravo, molekuli MHC II kod kojih su transmembranski domeni α i β lanaca zamenjeni α lancem receptora IL-2 su zadržani u ER i bilo je veoma teško detektovati ih na površini ćelije. Id. Putem studija mutageneze je ustanovljeno da su konzervirani ostaci glicina na α i β transmembranskim domenima odgovorni za sklapanje MHC II na površini ćelije. Id. Stoga su transmembranski i citoplazmni domeni od kritične važnosti za ispravno funkcionisanje MHC II kompleksa.

[0040] U različitim primerima, pronalazak pruža genetski modifikovanog glodara (na primer, miša, pacova, zeca itd.) koji u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira ljudski ili humanizovani MHC II kompleks, npr. ljudski ili humanizovani MHC II α i/ili β polipeptid. Glodar životinja može u svom genomu da sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira MHC II kompleks koji je delimično ljudski i delimično od glodara, npr. glodar koji eksprimuje himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara (npr. glodar koji eksprimuje MHC II α i β polipeptide ljudskog porekla ili porekla od glodara). U jednom primeru, glodar eksprimuje samo ljudski ili humanizovani MHC II kompleks, npr. himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara, ali ne eksprimuje endogeni MHC II kompleks glodara iz endogenog MHC II lokusa. U nekim primenama, životinja ne može da eksprimuje nijedan endogeni MHC II kompleks glodara iz endogenog MHC II lokusa, već eksprimuje samo ljudski ili humanizovani MHC II kompleks. U nekim primerima, genetski modifikovani glodar (na primer, miš, pacov, itd.) u svom genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira ljudski ili humanizovani MHC II kompleks, npr. ljudski ili humanizovani MHC II α i/ili β polipeptid.

[0041] U jednom primeru, ovde je obelodanjen himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru, himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara i himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru, ljudski deo himernog MHC II α polipeptida i/ili ljudski deo himernog MHC II β polipeptida se sastoji od domena za vezivanje peptida ljudskog MHC II α polipeptida, odnosno ljudskog MHC II β polipeptida. U jednom primeru, ljudski deo himernog MHC II α i/ili β polipeptida se sastoji od ekstracelularnog domena ljudskog MHC II α polipeptida, odnosno β polipeptida. U jednom primeru, ljudski deo himernog MHC II α polipeptida se sastoji od α1 domena ljudskog MHC II α polipeptida; u drugom primeru, ljudski deo himernog MHC II α polipeptida se sastoji od α1 i α2 domena ljudskog MHC II α polipeptida. U dodatnom primeru, ljudski deo himernog MHC II β polipeptida se sastoji od β1 domena ljudskog MHC II β polipeptida; u drugom slučaju, ljudski deo himernog MHC II β polipeptida se sastoji od β1 i β2 domena ljudskog MHC II β polipeptida.

[0042] Ljudski deo MHC II α i β polipeptida koji je ovde opisan može da se enkodira bilo kojim lokusima HLA-DP, -DQ i -DR. Lista uobičajeno korišćenih HLA antigena i alela je opisana u literaturi Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet.4(2):91-103). Shankarkumar i drugi autori su takođe predstavili kratko objašnjenje HLA nomenklature koja se koristi u ovoj oblasti. Dodatne informacije o HLA nomenklaturi i različitim HLA alelama mogu se pronaći u literaturi Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and –DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, i u nedavno ažuriranoj verziji autora Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455, oba. Stog se ljudski ili humanizovani MHC II polipeptid može izvesti iz bilo kojih funkcionalnih ljudskih HLA molekula koji su opisani u navedenoj literaturi.

[0043] U jednom specifičnom primeru, ljudski delovi humanizovanog MHC II kompleksa koji su ovde opisani se izvode iz ljudskog HLA-DR, npr. HLA-DR4. Uobičajeno, HLA-DR α lanci su monomorfni, npr. gen HLA-DRA enkodira α lanac HLA-DR kompleksa (npr. gen HLA-DRα*01). S druge strane, HLA-DR β lanac je polimorfan. Tako se HLA-DR4 sastoji od α lanca koga enkodira gen HLA-DRA i β lanca koga enkodira gen HLA-DRB1 (npr. gen HLA-DRβ1*04). Kao što je u nastavku opisano, poznato je da se HLA-DR4 povezuje sa pojavom brojnih autoimunih oboljenja, npr. reumatoidni artritis, dijabetes tipa I, multipla skleroza, itd. U jednom primeru HLA-DRA alela je HLA-DRα*01 alela, npr. HLA-DRα*01:01:01:01. U drugom primeru HLADRB alela je HLA-DRβ1*04, npr. HLA-DRβ1*04:01:01. Iako ovi primeri opisuju ove određene HLA sekvence, sve pogodne HLA-DR sekvence su ovde obuhvaćene, npr. polimorfne varijante koje se ispoljavaju u ljudskoj populaciji, sekvence sa jednim ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija aminokiselina, sekvence nukleinske kiseline koje se razlikuju od sekvenci koje su ovde opisane zbog degeneracije genetskog koda, itd.

[0044] Ljudski delovi humanizovanog MHC II kompleksa mogu da se enkodiraju nukleotidnim sekvencama HLA alela za koje je poznato da se povezuju sa uobičajenim ljudskim oboljenjima. Te HLA alele obuhvataju, bez ograničenja, HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, DQB1*0201, DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 i njihove kombinacije. Za sažetak veza između HLA alela i oboljenja pogledati Bakker et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 i dodatne informacije.

[0045] U jednom primeru, deo porekla od glodara himernog MHC II kompleksa ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži transmembranski i citoplazmni domen endogenog MHC II kompleksa porekla od glodara, npr., miša, pacova, itd.). Stoga, deo poreklom od glodara himernog MHC II α polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara može da sadrži transmembranski i/ili citoplazmni domen endogenog MHC II α polipeptida glodara. Deo poreklom od glodara himernog MHC II β polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara može da sadrži transmembranski i/ili citoplazmni domen endogenog MHC II β polipeptida poreklom od glodara. U jednom primeru, životinja je miš, a delovi glodara himernog α i β polipeptida se izvode iz mišjeg proteina H-2E. Tako delovi glodara himernog α i β polipeptida mogu da sadrže transmembranski i citoplazmni domen izveden iz mišjeg proteina H-2E. Iako se određene H-2E sekvence razmatraju u primerima, sve pogodne sekvence, npr. polimorfne varijante, konzervativne/nekonzervativne supstitucije aminokiselina, itd. su ovde obuhvaćene.

[0046] U različitim primerima pronalaska, sekvenca/-e koja enkodira himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara se nalazi u endogenom MHC II lokusu porekla od glodara (npr. mišji H-2A i/ili H-2E lokus). U jednom primeru, to dovodi do zamene endogenih MHC II gena ili njihovih delova nukleotidnim sekvencama koje enkodiraju ljudski ili humanizovani MHC II protein, npr. himerni gen koji enkodira himerni glodarski MHC II protein ljudskog porekla ili porekla od glodara koji je ovde opisan. S obzirom na to da se nukleotidne sekvence koje enkodiraju MHC II α i β polipeptide nalaze u međusobnoj blizini na hromozomu, zamena se može projektovati tako da cilja dva gena nezavisno ili zajedno; obe ove mogućnosti su ovde obuhvaćene. U jednom primeru, zamena obuhvata zamenu endogene nukleotidne sekvence koja enkodira MHC II α i β polipeptide nukleotidnom sekvencom koja enkodira himerni MHC α polipeptid ljudskog/neljudskog porekla ili porekla od glodara i himerni MHC β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru, zamena obuhvata zamenu nukleotidnih sekvenci koje predstavljaju jedan ili više (npr. dva) endogena MHC II gena. Shodno tome, glodar sadrži himernu nukleotidnu sekvencu ljudskog porekla ili porekla od glodara u endogenom MHC II lokusu i eksprimuje himerni MHC II protein ljudskog porekla ili porekla od glodara iz endogenog lokusa glodara.

[0047] Stoga je ovde obelodanjen glodar koji na endogenom lokusu MHC II gena sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara i drugu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara, gde ljudski deo himernog MHC II α polipeptida ljudskog porekla ili porekla od glodara sadrži ljudski MHC II α ekstracelularni domen, a ljudski deo himernog MHC II β polipeptida ljudskog/glodarskog porekla sadrži ljudski MHC II β ekstracelularni domen, pri čemu ljudski/glodarski MHC II α i ljudski/neljudski MHC II β polipeptidi formiraju funkcionalni MHC II kompleks na površini ćelije.

[0048] Himerni ljudski/glodarski polipeptid može biti takav da obuhvata ljudsku ili glodarski lider (signalnu) sekvencu. U jednom obelodanjivanju, himerni MHC II α polipeptid sadrži lider sekvencu glodara endogenog MHC II α polipeptida. U jednom primeru, himerni MHC II β polipeptid sadrži lider sekvencu glodara endogenog MHC II β polipeptida. U alternativnom obelodanjivanju, himerni MHC II α i/ili MHC II β polipeptid sadrži lider sekvencu glodara MHC II α, odnosno MHC II β polipeptida drugog glodara ili miša istog soja. Stoga se nukleotidna sekvenca koja enkodira himerni MHC II α i/ili MHC II β polipeptid može operativno povezati sa nukleotidnom sekvencom koja enkodira MHC II α, odnosno MHC II β lider sekvencu poreklom od glodara. U još jednom obelodanjivanju, himerni MHC II α i/ili MHC II β polipeptid sadrži ljudsku lider sekvencu ljudskog MHC II α, odnosno ljudskog MHC II β polipeptida (npr. lider sekvencu ljudskog HLA-DRA, odnosno ljudskog HLADRβ1*04).

[0049] Himerni MHC II α i/ili MHC II β polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara može u svom ljudskom delu da sadrži kompletan ili suštinski kompletan ekstracelularni domen ljudskog MHC II α, odnosno ljudskog MHC II β polipeptida. Tako ljudski deo može da sadrži najmanje 80 %, poželjno najmanje 85 %, još poželjnije najmanje 90 %, npr. 95 % ili više aminokiselina koje enkodiraju ekstracelularni domen ljudskog MHC II α i/ili ljudskog MHC II β polipeptida (npr. ljudski HLA-DRA i/ili ljudski HLA-DRβ1*04). U jednom primeru, suštinski kompletan ekstracelularni domen ljudskog MHC II α i/ili ljudskog MHC II β polipeptida ne sadrži ljudsku lider sekvencu. U drugom primeru, himerni MHC II α polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara i/ili himerni MHC II β polipeptid ljudskog/neljudskog porekla sadrži ljudsku lider sekvencu.

[0050] Pored toga, himerni MHC II α i/ili MHC II β polipeptid može da se eksprimuje pod kontrolom endogenog promotera porekla od glodara i regulatornih elemenata, npr. mišji MHC II α, odnosno MHC II β regulatorni elementi. Takav sklop će pojednostaviti ispravno eksprimovanje himernih MHC II polipeptida kod glodara, npr. tokom imunog odgovora kod glodara.

1

[0051] Genetski modifikovana glodar može biti izabran iz grupe koja se sastoji iz miša ili pacova U slučaju glodara kod kojih pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu već bile dostupne, korišćene su druge metode za proizvodnju glodara koji sadrže genetsku modifikaciju. Takve metode obuhvataju, npr. izmenu genoma u ćelijama koje nisu ES (npr. fibroblast ili indukovana pluripotentna ćelija) i korišćenje nuklearnog prenosa za prenos modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. oocit i gestiranje modifikovane ćelije (npr. modifikovani oocit) kod glodara pod pogodnim uslovima za formiranje embriona.

[0052] U jednoj primeni, glodar je izabran između miša, pacova i hrčka. U jednoj primeni, glodar je izabran iz superporodice Muroidea. U jednoj primeni, genetski modifikovana životinja potiče iz porodice izabrane iz Calomyscidae (npr. hrčci nalik miševima), Cricetidae (npr. hrčak, miševi i pacovi novog sveta, voluharice), Muridae (pravi miševi i pacovi, skočimiš, ježasti miš, lophiomys imhausi), Nesomyidae (penjući miš, kameni miš, pacovi sa repom, madagaskarski pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr. Platacanthomys lasiurus) i Spalacidae (krtice, bambus pacovi i zokori). U određenoj primeni, genetski modifikovani glodar se bira između pravog miša ili pacova (porodica Muridae), skočimiša, ježastog miša i lophiomys imhausi. U jednoj primeni, genetski modifikovani miš potiče od člana porodice Muridae. U jednoj primeni, životinja je glodar. U određenoj primeni, glodar se bira između miša i pacova.

[0053] U određenoj primeni, glodar koji je miš soja C57BL izabran je iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U drugoj primeni, miš je soja 129, izabran iz grupe sojeva koja obuhvata 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (pogledati, npr., Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, takođe pogledati, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U određenoj primeni, genetski modifikovani miš je mešavina gore navedenog soja 129 i gore navedenog soja C57BL/6. U drugoj određenoj primeni, miš je mešavina gore navedenih sojeva 129 ili mešavina gore navedenih sojeva BL/6. U određenoj primeni, soj 129 je mešavina soja 129S6 (129/SvEvTac). U drugoj primeni, miš je iz soja BALB, npr. soj BALB/c. U još jednoj drugoj primeni, miš je iz mešavine soja BALB i drugog gore navedenog soja.

[0054] U jednoj primeni, glodar je pacov. U jednoj primeni, pacov je izabran između pacova Wistar, soja LEA, soja Sparague Dawley, soja Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. U jednoj primeni, soj pacova je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koja se sastoji od Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.

[0055] Stoga, u jednoj primeni, pronalazak se odnosi na genetski modifikovanog miša koji u svoj genomu sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II kompleks, npr. ljudski/mišji MHC II α i β polipeptid. U jednom primeru, ljudski deo himernog ljudskog/mišjeg MHC II α polipeptida sadrži ljudski MHC II α polipeptid sa domenom za vezivanje ili ekstracelularnim domenom, a ljudski deo himernog ljudskog/mišjeg MHC II β polipeptida sadrži ljudski MHC II β peptid sa domenom za vezivanje ili ekstracelularnim domenom. U nekim primerima, miš ne eksprimuje domen za vezivanje peptida ili ekstracelularni domen endogenog mišjeg α i/ili β polipeptida iz endogenog mišjeg lokusa (npr. H-2A i/ili H-2E lokus). U nekim primerima, miš sadrži genom kojem nedostaje gen koji enkodira funkcionalni MHC molekul klase II koji sadrži H2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea i njihovu kombinaciju. Domen za vezivanje peptida kod ljudskog MHC II α polipeptida može da sadrži α1 domen, a domen za vezivanje peptida kod ljudskog MHC II β polipeptida može da sadrži β1 domen; stoga, domen za vezivanje peptida himernog MHC II kompleksa može da sadrži ljudske domene α1 i β1. Ekstracelularni domen kod ljudskog MHC II α polipeptida može da sadrži α1 i α2 domen, a ekstracelularni domen kod ljudskog MHC II β polipeptida može da sadrži β1 i β2 domen; stoga, ekstracelularni domen himernog MHC II kompleksa može da sadrži ljudske domene α1, α2, β1 i β2. U jednom primeru, mišji deo himernog MHC II kompleksa sadrži transmembranski i citosolni domen mišjeg MHC II, npr. mišji H-2E (npr. transmembranski i citosolni domeni mišjeg H-2E α i β lanca).

[0056] Stoga, u jednom primeru, genetski modifikovani miš je obelodanjen tako da miš sadrži na endogenom mišjem lokusu MHC II prvu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II α polipeptid ljudskog/mišjeg porekla, a druga nukleotidna sekvenca enkodira himerni MHC II β polipeptid ljudskog/mišjeg porekla, pri čemu ljudski deo himernog MHC II α polipeptida sadrži ekstracelularni domen izveden iz α polipeptida ljudskog proteina HLA-DR4, a ljudski deo himernog MHC II β polipeptida sadrži ekstracelularni domen izveden iz β polipeptida ljudskog proteina HLA-DR4, gde mišji deo himernog MHC II α polipeptida sadrži transmembranu i citoplazme domene mišjeg H-2E α lanca, a mišji deo himernog MHC II β polipeptida sadrži transmembranu i citoplazmne domene mišjeg H-2E β lanca, i gde miš eksprimuje funkcionalni himerni HLADR4/H-2E MHC II kompleks. U jednoj primeni, himerni kompleks HLA-DR4/H-2E MHC II sadrži MHC II α lanac koji obuhvata ekstracelularne domene (npr. α1 i α2 domene) izvedene iz HLA-DR4 proteina (HLA-DRA α1 i α2 domeni) i transmembranske i citoplazmne domene iz mišjeg H-2E α lanca, kao i MHC II β lanac koji sadrži ekstracelularne domene (npr. β1 i β2 domene) izvedene iz HLA-DR4 (HLA-DRβ1*04 β1 i β2 domena) i transmembranske i citoplazmne domene iz mišjeg H-2E β lanca. U jednom primeru, miš ne eksprimuje funkcionalne endogene H-2A i H-2E polipeptide iz endogenih mišjih lokusa (npr. miš ne eksprimuje H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea polipeptide). U različitim primerima, eksprimovanje prve i druge nukleotidne sekvence je pod kontrolom odgovarajućih endogenih mišjih promotera i regulatornih elemenata. U različitim primenama pronalazaka, prva i druga nukleotidna sekvenca se nalaze na istom hromozomu. U nekim primerima, miš se sastoji od dve kopije himernog MHC lokusa koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu, dok se u drugim primerima miš sastoji od jedne kopije MHC II lokusa koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu. Prema tome, miš može biti homozigotni ili heterozigotni za himerni MHC II lokus koji sadrži prvu i drugu nukleotidnu sekvencu. U različitim primenama, prva i druga nukleotidna sekvenca su sadržane u istom genomu miša.

[0057] U nekim ovde opisanim primerima, obezbeđen je miš koji sadrži himerni MHC II lokus kod endogenog mišjeg MHC II lokusa, npr. putem zamene endogenih mišjih gena H-2A i H-2E. U nekim primerima, himerni lokus sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira ekstracelularni domen ljudskog HLA-DRA i transmembranski i citoplazmni domen mišjeg H-2E α lanca, kao i ekstracelularni domen ljudskog HLA-DRβ1*04 i transmembranskog i citoplazmnog domena mišjeg H-2E β lanca. Različiti domeni himernog lokusa su povezani tako da lokus eksprimira funkcionalni himerni ljudski/mišji MHC II kompleks.

[0058] U različitim primerima, glodar, npr. miš ili pacov koji eksprimuje funkcionalni himerni MHC II protein iz himernog MHC II lokusa, kao što je ovde opisano, prikazuje himerni protein na površini ćelije. U jednoj primeni, glodar eksprimuje himerni MHC II protein na površini ćelije u celularnoj distribuciji koja je ista kao kod čoveka. U jednom primeru, ćelija prikazuje fragment peptida (fragment antigena) koji je vezan za ekstracelularni deo (npr. ekstracelularni deo ljudskog HLA-DR4) himernog MHC II proteina.

[0059] U različitim primerima, ćelija koja prikazuje himerni MHC II protein, npr. protein HLADR4/H-2E, predstavlja antigen prezentujuću ćeliju (APC) npr. makrofag, dendritičku ćeliju ili B ćeliju. Kod nekih primera se fragment peptida prezentovan himernim proteinom izvodi iz tumora. U drugim primerima se fragment peptida prezentovan himernim MHC II proteinom izvodi iz patogena, npr. bakterija, virusa ili parazita.

[0060] Himerni MHC II protein koji je ovde opisan može da vrši interakciju sa drugim proteinima na površini iste ćelije ili na drugoj ćeliji. U nekim primerima, himerni MHC II protein vrši interakciju sa endogenim glodarskim proteinima na površini navedene ćelije. Himerni MHC II protein takođe može da vrši interakciju sa ljudskim ili humanizovanim proteinima na površini iste ćelije ili na drugoj ćeliji. U nekim primerima, druga ćelija je T ćelija, a himerni MHC II protein vrši interakciju sa receptorom T ćelije (TCR) i njenim koreceptorom CD4. U nekim primerima, T ćelija je endogena mišja T ćelija. U drugim primerima T ćelija je ljudska T ćelija. U nekim primerima, TCR je ljudski ili humanizovani TCR. U dodatnim primerima CD4 je ljudski ili humanizovani CD4. U drugim primerima, jedan ili oba TCR i CD4 su neljudski, npr. od miša ili pacova.

[0061] U jednom primeru obezbeđen je genetski modifikovani glodar kod kog ne dolazi do razvoja tumora u većoj stopi nego kod divljih životinja kojima nedostaje himerni MHC II gen. U nekim primenama, kod životinje se ne razvijaju hematološki maligniteti, npr. različiti limfomi T i B ćelija, leukemije, kompozitni limfomi (npr. Hodžkinova bolest), u većoj stopi nego u poređenju sa divljim životinjama.

[0062] Pored genetski projektovanog glodara, embrion glodara npr., embrion miša ili embrion pacova je takođe obelodanjen, tako da se embrion sastoji od donorske ES ćelije koja je izvedena iz glodara, npr. miša ili pacova, kao što je obelodanjeno. U jednom primeru, embrion se sastoji od ES donorske ćelije koja sadrži himerni MHC II gen i domaćinskih ćelija embriona.

[0063] Ovde je takođe opisano tkivo, tako da se tkivo izvodi iz glodara, npr. miša ili pacova, eksprimuje himerni MHC II protein (npr. HLA-DR4/H-2E protein).

[0064] Pored toga, obelodanjena je ćelija glodara izolovana iz glodara. U jednom primeru, ćelija je ES ćelija. U jednom primeru, ćelija je antigen prezentujuća ćelija, npr. dendritička ćelija, makrofag, B ćelija. U jednom primeru, ćelija je imuna ćelija. U jednom primeru, imuna ćelija je limfocit.

[0065] Ovde je takođe navedena ćelija glodara koja sadrži hromozom ili njegov fragment glodara. U jednom primeru, ćelija glodara sadrži nukleus glodara, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija glodara sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat nuklearnog prenosa.

[0066] U jednom primeru, obelodanjena je pluripotentna ćelija indukovana u glodaru koja sadrži gen koji enkodira himerni MHC II protein (npr. HLA-DR4/H-2E protein). U jednom primeru, indukovana pluripotentna ćelija je izvedena iz glodara, kao što je ovde opisano.

[0067] U jednom primeru, obezbeđeni su hibridom ili kvadrom izvedeni iz ćelije glodara, kao što je ovde obelodanjeno. U jednom primeri, glodar je miš ili pacov.

[0068] U jednom primeru, in vitro preparat je obezbeđen koji sadrži prvu ćeliju koja nosi himerni MHC II površinski protein ljudskog porekla ili porekla od glodara i koji sadrži vezani peptid tako da se formira kompleks himernog MHC II ljudskog porekla ili porekla od glodara i peptida, kao i drugu ćeliju koja se vezuje za kompleks himernog MHC II ljudskog porekla ili porekla od glodara i peptida. U jednom primeru, druga ćelija sadrži receptor ljudske ili humanizovane T ćelije, a u jednom otelotvorenju dalje sadrži humani ili humanizovani CD4. U jednom primeru, druga ćelija je ćelija glodara (npr. miša ili pacova) koja sadrži receptor humane ili humanizovane T ćelije i humani ili humanizovani CD4 protein. U jednom primeru, druga ćelija je ljudska ćelija.

[0069] Takođe je obelodanjena metoda za proizvodnju genetski projektovanih glodara, npr. miša ili pacova koji su ovde opisani. Ova metoda za proizvodnju genetski projektovanih glodara daje životinje čiji genom sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni MHC II protein (npr. himerni MHC II α i β polipeptidi). U jednom primeru, metoda pruža genetski projektovanog miša čiji genom sadrži u endogenom MHC II lokusu nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II protein, gde ljudski deo himernog MHC II proteina sadrži ekstracelularni domen ljudskog HLA-DR4, a mišji deo sadrži transmembranski i citoplazmni domen mišjeg H-2E. U nekim primerima, metoda koristi konstrukciju za ciljanje izrađenu uz pomoć tehnologije VELOCIGENE®, čime se konstrukcija uvodi u ES ćelije, a klonovi ciljanjih ES ćelija u embrion miša koristeći tehnologiju VELOCIMOUSE®, kao što je opisano u primerima. U jednom primeru, ES ćelije predstavljaju mešavinu mišjih sojeva 129 i C57BL/6; u jednom primeru, ES ćelije predstavljaju mešavinu mišjih sojeva BALB/c i 129.

[0070] Nukleotidna konstrukcija koja se koristi za generisanje genetski projektovanih glodara takođe je obelodanjena. U jednom primeru, nukleotidna konstrukcija sadrži: 5’ i 3’ glodarske homologne krakove, fragment DNK koji sadrži sekvence ljudskog HLA-DR α i β lanca i izvor kasete flankiran lokacijama za rekombinaciju. U jednom primeru, sekvence ljudskog HLA-DR α i β lanca su genomske sekvence koje sadrže introne i eksone gena ljudskog HLA-DR α i β lanca. U jednom primeru, glodarski homologni krakovi su homologni neljudskoj genomskoj sekvenci MHC II.

[0071] U jednom primeru, sekvenca HLA-DR α i β lanca sadrži sekvencu kodiranja α1 i α2 domena. U određenom otelotvorenju on sadrži od 5’ do 3’: α1 ekson (ekson 2), α1/α2 intron (intron 2) i α2 ekson (ekson 3). U jednom primeru sekvenca HLA-DR β i β lanca sadrži sekvencu kodiranja β1 i β2 domena. U određenom primeru on sadrži od 5’ do 3’: β1 ekson (ekson 2), β1/β2 intron (intron 2) i β2 ekson (ekson 3).

[0072] Kaseta za selekciju je nukleotidna sekvenca koja je umetnuta u konstrukciju za ciljanje da bi se pojednostavio izbor ćelija (npr. ES ćelija) koje imaju integrisanu konstrukciju od interesa. U ovoj oblasti su poznate brojne prikladne kasete za selekciju. Uobičajeno, kaseta za selekciju omogućava pozitivnu selekciju u prisustvu određenog antibiotika (npr. Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, itd.). Pored toga, kaseta za selekciju može da bude flankirana lokacijama za rekombinaciju, što omogućava brisanje kasete za selekciju nakon terapije enzimima rekombinaze. Uobičajeno korišćene lokacije za rekombinaciju su loxP i Frt koje se prepoznaju prema enzimima Cre, odnosno Flp, ali i druge lokacije su poznate u ovoj oblasti. Kaseta za selekciju se može nalaziti bilo gde u konstrukciji izvan regiona kodiranja. U jednom primeru, kaseta za selekciju se nalazi na intronu na lancu β, npr. intron β2/transmembranski domen (intron 3).

[0073] U jednom primeru, 5’ i 3’ homologni krakovi sadrže genomsku sekvencu na lokacijama 5’ i 3’ endogenog glodarskog MHC II lokusa. U jednom primeru, 5’ homologni krak sadrži genomsku sekvencu uzvodno od mišjeg H-2Ab1 gena, a 3’ homologni krak sadrži genomsku sekvencu nizvodno od mišjeg H-2Ea gena. U ovom primeru, konstrukcija omogućava zamenu mišjih gena H-2E i H-2A.

[0074] Stoga, u jednom primeru, ovde se opisuje nukleotidna konstrukcija koja sadrži od 5’ do 3’: 5’ homologni krak koji sadrži mišju genomsku sekvencu uzvodno od mišjeg H-2Ab1 gena, prvu nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II β lanac, drugu nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II α lanac i 3’ homologni krak koji sadrži mišju genomsku sekvencu nizvodno od mišjeg gena H2Ea. U određenom primeru, prva nukleotidna sekvenca koja sadrži sekvencu koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II β lanac sadrži ljudski β1 ekson, β1/β2 intron, β2 ekson,

1

kasetu za selekciju flankiranu lokacijama za rekombinaciju u intronskom regionu između sekvence ljudskog β2 eksona i sekvence mišjeg eksona transmembranskog domena. U određenom primeru druga sekvenca nukleotida koja sadrži sekvencu koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II α lanac sadrži ljudski α1 ekson, α1/α2 intron i ljudski α2 ekson. Primer konstrukcije je prikazan na sl.5 (MAID 1680).

[0075] Po završetku ciljanja gena, ES ćelije ili genetski modifikovani glodari se procenjuju da bi se potvrdila uspešna inkorporacija egzogene nukleotidne sekvence od interesa ili eksprimovanje egzogenog polipeptida. Brojne tehnike su poznate osobama koje imaju uobičajene veštine i znanje u ovoj oblasti i one obuhvataju (ali bez ograničenja) južno blotovanje, dugi PCR, kvantitativni PCT (npr. PCR u realnom vremenu uz upotrebu TAQMAN®), fluorescenciju in situ hibridizacije, severno blotovanje, citometriju protoka, zapadnu analizu, imunocitohemiju, imunohistohemiju, itd. U jednom primeru, glodari (npr. miševi) koji nose genetske modifikacije od interesa mogu da se identifikuju procenom za gubitak mišje alele i/ili dobitak ljudske alele koristeći modifikaciju testa za alele koja je opisana u literaturi Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.

21(6):652-659. Drugi testovi koji identifikuju specifični nukleotid ili sekvencu aminokiseline kod genetski modifikovanih životinja su poznate osobama koje imaju uobičajene veštine i znanje u ovoj oblasti.

[0076] Takođe je obelodanjena metoda za modifikaciju MHC II lokusa glodara tako da se eksprimuje himerni MHC II kompleks ljudskog porekla ili porekla od glodara. U jednom primeru, metoda izmene MHC II lokusa miša u cilju eksprimovanja himernog ljudskog/mišjeg MHC II kompleksa koji se sastoji od zamene na endogenom lokusu mišjeg MHC II nukleotidne sekvence koja enkodira mišji MHC II kompleks nukleotidnom sekvencom koja enkodira himerni ljudski/mišji MHC II kompleks, je obelodanjena. U određenom primeru, nukleotidna sekvenca kojom se enkodira ljudski/mišji himerni MHC II kompleks sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja enkodira ekstracelularni domen ljudskog MHC II α (npr. HLA-DR4 α lanac) lanca i transmembranski i citoplazmni domen MHC II α lanca (npr. H-2E α lanac) porekla od glodara i sadrži drugu nukleotidnu sekvencu koja enkodira ekstracelularni domen ljudskog MHC II β lanca (npr. HLA-DR4 β lanac) i transmembranski i citoplazmni domen mišjeg MHC II β lanca (npr. H-2E β lanac, npr. H-2Eb1 lanac). U nekim primerima, modifikovani mišji MHC II lokus eksprimuje himerni HLADR4/H-2E protein.

[0077] U jednom primeru, ovde je obelodanjena metoda za proizvodnju himernog ljudskog HLA molekula klase II / MHC molekula klase II porekla od glodara i sadrži eksprimovanje u jednoj ćeliji himernog proteina HLA-DR4/H-2E od nukleotidne konstrukcije, kao što je opisano. U jednom primeru, nukleotidna konstrukcija je virusni vektor; u određenom primeru, virusni vektor je lentivirusni vektor. U jednom primeru ćelija se bira između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije mrežnjače sa eksprimovanjem sekvence virusne nukleidne kiseline (npr., ćelija PERC.6™).

[0078] U jednom primeru, ovde je obelodanjena ćelija koja sadrži himerni protein HLA-DR4/H-2E. U jednom primeru, ćelija sadrži vektor eksprimovanja koji sadrži himernu MHC sekvencu klase II, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija se bira između CHO, COS, 293, HeLa i ćelije mrežnjače sa eksprimovanjem sekvence virusne nukleidne kiseline (npr., ćelija PERC.6™).

[0079] Himerni MHC molekul klase II dobijen iz glodara, takođe je ovde obelodanjen, pri čemu himerni MHC molekul klase II sadrži α1, α2, β1 i β2 domene iz ljudskog proteina MHC II, npr. protein HLA-DR4 i transmembranski i citoplazmni domen iz MHC II proteina glodara, npr. mišji H-2E protein. Himerni MHC II kompleks koji sadrži ekstracelularni domen HLA-DR4 opisan ovde je možda detektovan pomoću anti-HLA-DR antitela. Stoga, ćelija koja sadrži himerni MHC II polipeptid ljudskog porekla ili porekla od glodara može da se detektuje i/ili izabere koristeći anti-HLA-DR antitelo.

[0080] Iako primeri koji slede opisuju genetski projektovanog glodara čiji genom sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja enkodira mišje proteine H-2A i H-2E sa nukleotidnom sekvencom koja enkodira himerni ljudski/mišji protein HLA-DR4/H-2E, osoba sa uobičajenim veštinama i znanjem u ovoj oblasti bi razumela da se slična strategija može koristiti za uvođenje himera koji sadrže druge ljudske MHC II gene (HLA-DP i HLA-DQ). Stoga dodatni primer obelodanjuje ka genetski projektovanoj životinji čiji genom sadrži nukleotidnu sekvencu koja enkodira himerni HLADQ/H-2A protein. U jednom primeru, nukleotidna sekvenca enkodira himerni protein HLA-DQ2.5/H2A. U drugom primeru, nukleotidna sekvenca enkodira himerni protein HLA-DQ8/H-2A. Pored toga, uvođenje višestrukih humanizovanih MHC II molekula (npr. himernih HLA-DR/H-2E i HLA-DQ/H-2A) se takođe razmatra.

Upotreba genetski modifikovanih životinja

[0081] U različitim primerima, genetski modifikovani glodari koji su ovde opisani proizvode APC-ove sa ljudskim ili humanizovanim MHC II na površini ćelije i zbog toga prezentuju peptide izvedene iz citosolnih proteina kao epitope za T ćelije na sličan način kao kod ljudi zbog toga što su, suštinski, sve komponente kompleksa ljudske ili humanizovane. Genetski glodari iz pronalazaka mogu da se koriste za izučavanje funkcije ljudskog imunog sistema u humanizovanoj životinji; za identifikaciju antigena i antigen epitopa koji pokreću imuni odgovor (npr. epitopi T ćelija, jedinstveni ljudski epitopi karcinoma), kao npr. za upotrebu kod razvoja vakcina; za procenu kandidata vakcina i drugih strategija za vakcine; za proučavanje autoimuniteta kod ljudi; za ispitivanje ljudskih infektivnih bolesti; i drugačije za izvođenje boljih terapijskih strategija zasnovanih na eksprimovanju ljudskog MHC.

[0082] MHC II kompleks vezuje peptide izvedene iz ekstracelularnih proteina, npr. ekstracelularne bakterije, susednih ćelija ili polipeptida vezanih receptorima B ćelija i internalizovanih u B ćeliju. Kada ekstracelularni proteini uđu u endocitnu putanju, oni se razlažu na peptide, a peptidi se vezuju i prezentuju koristeći MHC II. Kada CD4+ T ćelije prepoznaju peptid koga prezentuje MHC II, T ćelije se aktiviraju, razmnožavaju, diferenciraju u različite podvrste T pomoćnika (npr. TH1, TH2) i dovode do brojnih događaja, uključujući i aktivaciju ubijanja patogena posredstvom makrofaga, umnožavanje B ćelija i proizvodnju antitela. Zbog uloge MHC u imunom odgovoru, razumevanje prezentacije MHC II peptida je važno za razvoj terapija za patologije kod ljudi. Međutim, prezentacija antigena u kontekstu mišjeg MHC II je samo donekle relevantna za ljudsko oboljenje zbog toga što ljudski i mišji MHC kompleksi drugačije prepoznaju antigene, npr. mišji MHC II možda neće prepoznati iste antigene ili može da prezentuje različite epitope u poređenju sa ljudskim MHC II. Stoga se najrelevantniji podaci za ljudske patologije dobijaju kroz proučavanje prezentacije antigen epitopa pomoću ljudskog MHC II.

[0083] Tako su, u različitim primerima, genetski projektovani glodari obelodanjeni ovde korisni, između ostalog, kod procene kapaciteta antigena da pokrene imuni odgovor kod ljudi i za generisanje različitih antigena i identifikaciju određenog antigena koji se može koristiti za razvoj vakcine za ljude.

[0084] U jednom primeru, metoda za određivanje antigenosti kod ljudi za sekvencu peptida je ovde data i sadrži izlaganje genetski modifikovanog glodara, kao što je opisano, molekulu koji sadrži sekvencu peptida, čime se glodaru omogućava da uspostavi imuni odgovor i detekciju ćelije kod glodara koja vezuje sekvencu peptida prezentovanih humanizovanim MHC II kompleksom koji je ovde opisan.

[0085] U jednom primeru, ovde se navodi metoda za utvrđivanje da li će peptid aktivirati imuni odgovor kod čoveka i ona sadrži izlaganje genetski modifikovanog glodara, kao što je opisano, peptidu, što glodaru omogućava da uspostavi imuni odgovor i detekciju ćelije kod glodara koja vezuje sekvencu peptida koristeći himerni ljudski/glodarski molekul MHC klase II, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, glodarska životinja nakon izlaganja sadrži CD4+ T ćeliju ograničenu MHC-om klase II koja vezuje peptid.

[0086] U jednom primeru, metoda za identifikaciju epitopa ljudske CD4+ T ćelije je ovde obezbeđena. Ona sadrži izlaganje glodara, kao što je opisano, antigenu koji sadrži pretpostavljeni epitop T ćelije, čime se glodaru omogućava da pokrene imuni odgovor i čime se omogućava identifikacija epitopa koji je vezan CD4+ T ćelijom ograničenom MHC-om klase II.

[0087] U jednom primeru, ovde se obezbeđuje metoda za identifikaciju antigena koji generiše odgovor CD4+ T ćelije kod ljudi i ona sadrži izlaganje pretpostavljenog antigena mišu, kao što je opisano, što omogućava da miš generiše imuni odgovor, čime se detektuje odgovor CD4+ T ćelije koji je specifičan za antigen u kontekstu ljudskog MHC II molekula (npr. HLA-DR molekul) i identifikuje antigen vezan molekulom ograničenim ljudskim MHC II (npr., molekul ograničen ljudskim HLA-DR).

[0088] U jednom otelotvorenju, antigen sadrži bakterijski protein. U jednom otelotvorenju, antigen sadrži ljudski antigen za ćeliju tumora. U jednom otelotvorenju, antigen sadrži pretpostavljenu vakcinu za upotrebu kod ljudi ili drugi biofarmaceutik. U jednom otelotvorenju, antigen sadrži ljudski epitop koji generiše antitela kod čoveka. U još jednom otelotvorenju, antigen sadrži antigen za ćelije kvasca ili gljivica. U još jednom otelotvorenju antigen se izvodi iz ljudskog parazita.

[0089] U jednom primeru, ovde se obezbeđuje metoda za određivanje da li pretpostavljeni antigen sadrži epitop koji će nakon izlaganja ljudskom imunom sistemu generisati imuni odgovor ograničen HLA-DR-om (npr. odgovor ograničen HLA-DR4), koji sadrži izlaganje miša, kao što je opisano, pretpostavljenom antigenu i merenje imunog odgovora specifičnog za antigen i ograničenog HLADR-om (npr. ograničen HLA-DR4) kod miša. U drugom primeru, ovde se obelodanjuje metoda za određivanje, pri čemu pretpostavljeni antigen sadrži epitop koji će nakon izlaganja imunom sistemu čoveka generisati odgovor ograničen HLA-DQ-om.

[0090] Ovde je takođe obelodanjena metoda za generisanje antitela za antigen, npr. antigen izveden iz

1

bakterije, parazita, itd., koja se prezentuje u kontekstu ljudskog MHC II kompleksa i koja sadrži izlaganje ovde opisanog miša antigenu, što omogućava da se uspostavi imuni odgovor kod miša, pri čemu imuni odgovor sadrži proizvodnju antitela i izolovanje antitela koje prepoznaje antigen koji je prezentovan u kontekstu ljudskog MHC II kompleksa. U jednom primeru, da bi se generisala antitela na peptid-MHC II, MHC II humanizovani miš se imunizuje imunogenom peptid-MHC II.

[0091] U jednom aspektu, metoda za identifikaciju promenljivog domena receptora T ćelije koji prepoznaje antigen prezentovan u kontekstu MHC II (npr. ljudski antigen na tumor, vakcina, itd.) sadrži izlaganje miša koji sadrži ovde opisan humanizovani MHC II kompleks antigenu, što omogućava mišu da generiše imuni odgovor i izolovanje sekvence nukleinske kiseline iz miša koja enkodira promenljivi domen receptora T ćelije koji vezuje antigen ograničen MHC II. Antigen se prezentuje u kontekstu humanizovanog MHC II (npr. ljudski HLA II ektodomen / mišji MHC II transmembranski i/ili citoplazmni domen).

[0092] Posledica interakcije između T ćelije i APC-a sa peptidom u kontekstu MHC II (npr. ljudski HLA II ektodomen / mišji MHC II transmembranski i/ili citoplazmni domen) može da se izmeri brojnim tehnikama poznatim u ovoj oblasti, npr. procenama umnožavanja T ćelija, procenama otpuštanja citokina, itd.

[0093] Pored mogućnosti identifikovanja antigena i njihovih epitopa T ćelija iz patogena ili neoplazmi, genetski modifikovane glodare obelodanjene ovde mogu da se koriste za identifikaciju autoantigena od značaja za ljudske autoimune bolesti ili za proučavanje progresije ljudske autoimune bolesti. Poznato je da polimorfizmi unutar HLA lokusa imaju ulogu u predispoziciji za ljudsko autoimuno oboljenje. Štaviše, identifikovani su određeni polimorfizmi u HLA-DR i HLA-DQ lokusima koji su povezani sa razvojem reumatoidnog artritisa, dijabetesa tipa I, Hašimotovog tireoiditisa, multiple skleroze, mijastenije gravis, Gravesove bolesti, sistemskog eritematoznog lupusa, celijakije, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa i drugih autoimunih poremećaja. Pogledati npr. Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest.101:921-26; Bakker et al. (2006), iznad; and International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85.

[0094] Stoga, metode za proizvodnju glodara sa humanizovanim MHC II kompleksom koje su ovde opisane mogu da se koriste za uvođenje MHC II molekula za koje se smatra da su povezani sa određenim ljudskim autoimunim oboljenjima, te se može proučavati progresija ljudske autoimune bolesti. Pored toga, glodari koji su ovde opisani mogu da se koriste za razvoj životinjskih modela ljudske autoimune bolesti. U skladu sa pronalazakom, miševi koji sadrže humanizovane MHC II proteine koji su ovde opisani mogu da se koriste za identifikaciju potencijalnih autoantigena, za mapiranje epitopa uključenih u progresiju oboljenja i za projektovanje strategija za modulaciju autoimunog oboljenja.

[0095] Pored toga, genetski modifikovani glodari koji su ovde opisani mogu da se koriste u studiji ljudskog alergijskog odgovora. S obzirom na to da se čini da su alergijski odgovori povezani sa MHC II alelima, genetski modifikovani glodari koji su ovde opisani mogu da se koriste za određivanje HLA ograničenja odgovora T ćelije specifične za alergen i za razvoj strategija za borbu protiv alergijskog odgovora.

PRIMERI

[0096] Pronalazak će dalje biti ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Ovi primeri su namenjeni da pomognu u razumevanju pronalazaka, ali nisu namenjeni i ne treba ih tumačiti tako da ograničavaju njegov opseg na bilo koji način. Primeri ne obuhvataju detaljne opise standardnih metoda koje bi bile dobro poznate osobama sa uobičajenim veštinama i znanjem u ovoj oblasti (tehnike molekularnog kloniranja, itd.). Osim ako nije drugačije navedeno, delovi su delovi težine, molekularna težina je prosečna molekularna težina, temperatura je data u stepenima Celzijusove skale, a pritisak je jednak ili sličan atmosferskom.

Primer 1. Brisanje endogenih lokusa H-2A i H-2E MHC klase II.

[0097] Vektor za ciljanje za uvođenje brisanja endogenih gena H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea MHC klase II je proizveden uz pomoć tehnologije za genetski inženjering VELOCIGENE® (pogledati npr., US Pat. No.6.586.251 i literaturu Valenzuela et al., iznad). DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) RP23-458i22 (Invitrogen) je modifikovana da bi se izbrisali endogeni geni H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea MHC klase II.

[0098] Ukratko, uzvodni i nizvodni homologni krakovi su izvedeni pomoću PCR-a iz mišje BAC DNK sa lokacija 5’ gena H-2Ab1, odnosno 3’ gena H-2Ea. Kao što je prikazano na sl. 5, ovi homologni krakovi su

1

korišćeni za proizvodnju kasete koja je izbrisala ~79 kb RP23-458i22 koji sadrži gene H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea lokusa MHC klase II putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR). Ovaj region je zamenjen kasetom higromicina koja je flankirana lokacijama lox66 i lox71. Završni vektor za ciljanje od 5’ do 3’ je sadržao homologni krak od 34 kb koji je sadržao mišju genomsku sekvencu 5’ do gena H-2Ab1 endogenog lokusa MHC klase II, 5’ lox66 lokaciju, kasetu higromicina, 3’ lox71 lokaciju i homologni krak od 63 kb koji je sadržao mišju genomsku sekvencu 3’ do gena H-2Ea endogenog lokusa MHC klase II (MAID 5111, pogledati sl.5).

[0099] Vektor za ciljanje BAC DNK (opisan iznad) je korišćen za elektroporaciju mišjih ES ćelija za kreiranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže brisanje endogenog lokusa MHC klase II. Pozitivne ES ćelije koje sadrže izbrisani endogeni lokus MHC klase II su identifikovane kvantitativnom procenom PCR uz pomoć sonde TAQMAN™ (Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Uzvodni region izbrisanog lokusa je potvrđen pomoću PCR-a, korišćenjem prajmera 5111U F (CAGAACGCCAGGCTGTAAC; SEQ ID NO:1) i 5111U R (GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; SEQ ID NO:2) i sonde 5111U P (CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; SEQ ID NO:3), dok je nizvodni region izbrisanog lokusa potvrđen korišćenjem prajmera 5111D F (GTGGGCACCATCTTCATCATTC; SEQ ID NO:4) i 5111D R (CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; SEQ ID NO:5) i sonde 5111D P (AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; SEQ ID NO:6). Prisustvo kasete higromicina iz vektora za ciljanje je potvrđeno korišćenjem prajmera HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) i HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) i sonde HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9). Nukleotidna sekvenca preko uzvodne tačke brisanja (SEQ ID NO:10) je obuhvatala sledeće, što naznačava endogenu mišju sekvencu uzvodno od tačke brisanja (sadržanu unutar zagrada u nastavku), susedno povezanu sa sekvencom kasete koja se nalazi na tački brisanja: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke brisanja (SEQ ID NO:11) je obuhvatala sledeće, što naznačava sekvencu kasete pored endogene mišje sekvence nizvodno od tačke brisanja (sadržane u zagradama u nastavku): CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju u ženke miševa uz pomoć metode VELOCIMOUSE® (opisane u nastavku) za stvaranje legla mladunaca koji sadrže brisanje endogenog lokusa MHC klase II.

[0100] Ciljane ES ćelije koje su opisane iznad su korišćene kao donorske ES ćelije i uvedene u mišji embrion u fazi sa 8 ćelija korišćenjem metode VELOCIMOUSE® (pogledati, npr., US Pat. No.7.294.754 i literaturu Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). Miševi koji sadrže brisanje gena H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea u endogenom lokusu MHC klase II su bili identifikovani pomoću genotipizacije korišćenjem modifikacije procene alela (Valenzuela et al., iznad), koja je detektovala prisustvo kasete higromicina i potvrdila odsustvo endogenih sekvenci MHC klase II.

[0101] Miševi koji sadrže brisanje gena H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea u endogenom lokusu MHC klase II mogu da se uzgajaju do mišjeg soja Cre sa bisa (pogledati, npr., International Patent Application Publication No. WO 2009/114400) kako bi se uklonile sve lox-ovane kasete higromicina koje su uvedene preko vektora za ciljanje koji nije uklonjen, npr. u fazi ES ćelije ili u embrionu. Opciono, kaseta higromicina se zadržava u mišu.

Primer 2. Stvaranje velikog vektora za ciljanje (engl. LTVEC) koji sadrži humanizovane gene H-2Eb1 i H-2Ea

[0102] Vektor za ciljanje za uvođenje humanizovanih sekvenci MHC II je projektovan onako kako je prikazano na sl. 4. Korišćenjem tehnologije VELOCIGENE® za genetski inženjering, DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) RP23-458i22 je izmenjena u različitim koracima iz sledećih razloga: (1) da bi se dobio vektor koji sadrži funkcionalni I-E α ekson 1 iz BALB/c H-2Ea gena (sl.4A); (2) da bi se kreirao vektor koji sadrži zamenu eksona 2 i 3 mišjeg gena I-E β sa eksonima ljudskog DRβ1*04 i zamenu eksona 2 i 3 mišjeg I-E α eksonima ljudskog DRα1*01 (sl.4B); (3) da bi se kreirao vektor koji nosi eksone 2 i 3 ljudskog DRα1*04 među preostalim mišjim eksonima I-E β, i eksone 2 i 3 ljudskog DRβ1*01 među preostalim mišjim eksonima I-E α, uključujući funkcionalni I-E α ekson 1 iz miša BALB/c (korak (1) (sl.4C); i (4) da bi se uklonila kriptična splajs lokacija na vektoru generisana u (3) (sl.4D).

1

[0103] Naročito zbog toga što je kod miša C57Bl/6 gen I-E α pseudogen zbog prisustva nefunkcionalnog eksona 1, prvo je kreiran vektor koji sadrži funkcionalni I-E α ekson 1 iz gena BALB/c H-2Ea (sl.4A). RP23-458i22 BAC je modifikovan bakterijskom homolognom rekombinacijom (1.BHR) u cilju zamene gena za otpornost na hloramfenikol genom spektromicina. Dobijeni vektor je dodatno modifikovan BHR-om da bi se zamenio celokupni region enkodiranja I-A i I-E kasetom neomicina flankiranom lokacijama za rekombinaciju (2.BHR). Još jedan krug BHR-a (3. BHR) sa konstrukcijom koja sadrži ekson koji enkodira BALB/c I-Eα lidera (ekson 1) i gen hloramfenikola koji je flankiran lokacijama ograničenja PISceI i I-CeuI je doveo do vektora koji sadrži funkcionalni BALB/c H-2Ea ekson 1.

[0104] Nezavisno od toga, da bi se dobio vektor koji sadrži zamenu eksona 2 i 3 mišjeg gena I-E β sa eksonima ljudskog DRβ1*04 i zamenu eksona 2 i 3 mišjeg I-E α eksonima ljudskog DRα1*01, modifikovan je RP23-458i22 BAC pomoću nekoliko koraka homologne rekombinacije, 4. BHR – 8. BHR (sl. 4B). Dobijena sekvenca nukleinske kiseline je flankirana lokacijama za ograničenje PI-SceI/I-CeuI kako bi se omogućilo vezivanje u konstrukciji koja nosi BALB/c I-Eα ekson 1, kao što je navedeno iznad (sl.4C).

[0105] Sekvenca finalne konstrukcije prikazana na sl. 4C je sadržala kriptičnu splajs lokaciju na kraju 3’ introna BALB/c. Nekoliko koraka BHR-a (11. BHR–12. BHR) nakon čega je usledio korak brisanja je obavljeno da bi se dobio završni vektor za ciljanje (MAID 1680) koji je korišćen za elektroporaciju u ES ćelije (sl. 4D).

[0106] Detaljnije, završni vektor za ciljanje (MAID 1680), od 5’ do 3’, je sadržao 5’ mišji homologni krak koji je sadržao ~26 kb mišje genomske sekvence koja se završavala neposredno uzvodno od gena H-2Ab1 endogenog lokusa MHC klase II; ~59 kb umetka koji je sadržao gen humanizovanog MHC II β lanca (humanizovani H-2Eb1 gen) i gen humanizovanog MHC II α lanca (humanizovani H-2Ea gen) i floksovanu kasetu neomicina; i 3’ mišji homologni krak koji je sadržao ~57 kb mišje genomske sekvence koja počinje neposredno nizvodno od gena H-2Ea endogenog lokusa MHC klase II. Nukleotidna sekvenca preko spoja između 5’ kraka i umetka (SEQ ID NO:12) je obuhvatala sledeće: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, gde je sekvenca napisana kurzivom jedinstvena lokacija PI-SceI, a mišja genomska sekvenca u 5’ homolognom kraku se nalazi između zagrada. Nukleotidna sekvenca preko spoja između umetka i 3’ kraka (SEQ ID NO:13) je obuhvatala sledeće: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), gde je mišja genomska sekvenca u 3’ homolognom kraku između zagrada.

[0107] U okviru umetka od ~59 kb, gen H-2Eb1 je modifikovan na sledeći način: 5136 bp region gena H-2Eb1, uključujući poslednjih 153 bp introna 1, eksona 2, introna 2 i eksona 3 i prvih 122 bp introna 3 je zamenjeno korišćenjem 3111 bp homolognog regiona ljudskog gena HLA-DRB1*04, uključujući poslednja 148 bp introna 1, eksona 2, introna 2 i eksona 3 i prva 132 bp introna 3. Na spoju između ljudske i mišje sekvence introna 3 je umetnuta kaseta koja se sastoji od 5’ lox2372 lokacije, UbC promotera, gena za otpornost na neomicin i 3’ lox2372 lokacije. Dobijeni gen je enkodirao himerni HLA-DRB1*04/H-2Eb1 protein koji se sastojao od mišjeg lidera H-2Eb1, ljudskog β1 i β2 domena iz DRB1*04 i mišjeg transmembranskog domena i citoplazmnog repa. Nukleotidna sekvenca preko mišjeg/ljudskog spoja na intronu 1 (SEQ ID NO:14) je obuhvatala sledeće: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, gde je sekvenca napisana kurzivom višestruka lokacija za kloniranje uvedena tokom koraka kloniranja, a mišje intron 1 sekvence se nalaze između zagrada. Nukleotidna sekvenca preko spoja između ljudskog introna 3 i kasete neomicina (SEQ ID NO:15) je obuhvatala sledeće: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, gde je 5’ lox2372 lokacija napisana kurzivom, a ljudska intron 3 sekvenca se nalazi između zagrada. Nukleotidna sekvenca preko spoja između kasete neomicina i mišjeg introna 3 (SEQ ID NO:16) je obuhvatala sledeće: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), gde je 3’ lox2372 lokacija napisana kurzivom, a mišja intron 3 sekvenca se nalazi između zagrada.

[0108] Takođe u okviru umetka od ~59 kb, gen H-2Ea je modifikovan na sledeći način: 1185 bp region gena H-2Ea, uključujući poslednjih 101 bp introna 1, eksona 2, introna 2 i eksona 3 i prvih 66 bp introna 3 je zamenjen korišćenjem 1189 bp homolognog regiona ljudskog gena HLADRA1*01, uključujući poslednja 104 bp introna 1, eksona 2, introna 2 i eksona 3 i prvih 66 bp introna 3. Kao što je iznad opisano, zbog toga što

1

ekson 1 alele C57BL/6 u H-2Ea sadrži brisanje, što čini da gen bude nefunkcionalan, H-2Ea ekson 1 i ostatak introna 1 su zamenjeni ekvivalentnim 2616 bp regiona iz alele BALB/c u H-2Ea koji je funkcionalan. Dobijeni gen je enkodirao himerni H-2Ea/HLA-DRA1*01 protein koji se sastojao od mišjeg lidera H-2Ea BALB/c, ljudskog α1 i α2 domena iz DRA1*01 i mišjeg transmembranskog domena i citoplazmnog repa. Nukleotidna sekvenca preko mišjeg/ljudskog spoja na intronu 1 (SEQ ID NO:17) je obuhvatala sledeće: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, gde je sekvenca napisana kurzivom lokacija enzima ograničenja koji je uveden tokom koraka kloniranja, a sekvence BALB/c introna 1 se nalaze između zagrada. Nukleotidna sekvenca preko ljudskog/mišjeg spoja na intronu 3 (SEQ ID NO:18) je obuhvatala sledeće: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), gde je sekvenca napisana kurzivom lokacija enzima ograničenja koji je uveden tokom koraka kloniranja, a sekvence mišjeg introna 3 se nalaze između zagrada. Nukleotidna sekvenca preko C57BL/6-BALB/c spoja 5’ eksona 1 (SEQ ID NO:19) je obuhvatala sledeće: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, gde su sekvence specifične za C57BL/6 prikazane između zagrada. Nukleotidna sekvenca preko BALB/c-C57BL/63’ eksona 1 (SEQ ID NO:20) je obuhvatala sledeće: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGACGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), gde je SacII lokacija ograničenja prikazana kurzivom, a sekvence C57BL/6 su navedene između zagrada.

Primer 3. Stvaranje humanizovanih MHC II miševa

[0109] Pojednostavljeni dijagrami strategije za generisanje humanizovanih MHC II miševa korišćenjem vektora iz primera 2 su navedeni na slikama 5 i 8.

[0110] Naročito, MAID1680 BAC DNK (opisana iznad) je korišćena za elektroporaciju MAID5111 ES ćelija u cilju kreiranja modifikovanih ES ćelija koje sadrže zamenu endogenih mišjih I-A i I-E lokusa sa genomskim fragmentom koji sadrži himerni ljudski DR4 / mišji I-E lokus. Pozitivne ES ćelije koje sadrže izbrisane endogene I-A i I-E lokuse zamenjene genomskim fragmentom koji sadrži himerni ljudski DR4 / mišji I-E lokus su identifikovane kvantitativnom PCR procenom pomoću sonde TAQMAN™ (Lie i Petropoulos, iznad). Umetanje ljudskih sekvenci DRα je potvrđeno pomoću PCR-a korišćenjem prajmera hDRA1F (CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; SEQ ID NO:21), hDRA1R (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; SEQ ID NO:22) i sonde hDRA1P (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; SEQ ID NO:23). Umetanje ljudskih sekvenci DRβ potvrđeno je pomoću PCR-a korišćenjem prajmera hDRB1F (AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; SEQ ID NO:24), hDRB1R (GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; SEQ ID NO:25) i sonde hDRB1P (CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; SEQ ID NO:26). Gubitak kasete higromicina iz vektora za ciljanje je potvrđeno prajmerima HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) i HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) i sondom HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9).

[0111] Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju u ženke miševa uz pomoć metode VELOCIMOUSE® (iznad) za stvaranje legla mladunaca koji sadrže zamenu endogenih lokusa I-A i I-E sa himernim ljudskim DR4 / mišjim I-E lokusom. Ciljane ES ćelije koje su opisane iznad su korišćene kao donorske ES ćelije i uvedene u mišji embrion u fazi sa 8 ćelija korišćenjem metode VELOCIMOUSE®. Miševi koji nose himerni ljudski DR4 / mišji I-E lokus su identifikovani pomoću genotipizacije korišćenjem modifikacije procene alela (Valenzuela et al., iznad), koja je detektovala prisustvo himernog ljudskog DR4 / mišjeg I-E lokusa.

[0112] Miš koji sadrži himerni ljudski DR4 / mišji I-E lokus može da se uzgaja do mišjeg soja Cre sa bisa (pogledati, npr., International Patent Application Publication No. WO 2009/114400) kako bi se uklonile sve lox-ovane kasete neomicina koje su uvedene preko vektora za ciljanje koji nije uklonjen, npr. u fazi ES ćelije ili u embrionu (pogledati sl.6).

Primer 4. Ekspresija himernog HLA-DR4 kod genetski modifikovanih miševa

[0113] Slezine iz WT ili heterozigotnih miševa sa humanizovanim HLA-DR4 („1681 HET”) su perfudirani korišćenjem Collagenase D (Roche Bioscience), a liza eritrocita je obavljena ACK puferom za lizu. Splenociti su kultivisani dva dana korišćenjem 25 mikrograma/ml poli(I:C) kako bi se simulisala ekspresija gena MHC-II. Ekspresija površine ćelije ljudskog HLA-DR4 je analizirana korišćenjem FACS pomoću anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-CD11c (N418), anti-F480 (BM8), anti-I-A/I-E (M15) i anti-HLADR (L243), koji su konjugovani fluorohromom. Citometrija protoka je obavljena pomoću BD-LSRII. Ekspresija ljudskog HLA-DR4 se jasno mogla detektovati na površini CD19+ B ćelija i bila je značajno regulisana naviše nakon

1

stimulacije agonistom TLR-a poli(I:C) (pogledati sl.9).

2

2

Claims (10)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Metoda za identifikaciju antigena koji generiše CD4+ T-ćelijski odgovor kod čoveka koji obuhvata

izlaganje glodara pretpostavljenom antigenu,

omogućavajući glodaru da stvori imuni odgovor,

otkrivanje odgovora CD4+ T ćelija koji je specifičan za antigen; i

identifikaciju antigena,

pri čemu glodar obuhvata

(i) na endogenom lokusu MHC II α gena nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ljudski/glodarski MHC II a polipeptid i

(ii) na endogenom lokusu MHC II β gena nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ljudski/glodarski MHC II β polipeptid,

pri čemu ljudski deo himernog humanog/glodarskog MHC II α polipeptida sadrži humane MHC II α1 i α2 domene i ljudski deo himernog polipeptida MHC II β čoveka/glodara sadrži humane MHC II β1 i β2 domene,

pri čemu glodar eksprimira funkcionalni himerni MHC II kompleks koji sadrži himerni ljudski/glodarski MHC II α polipeptid i himerni ljudski/glodarski MHC II β polipeptid na površini ćelije glodara.

2. Metoda za identifikaciju varijabilnog domena receptora T ćelija koji prepoznaje antigen predstavljen u kontekstu humanog MHC II koji obuhvata

izlaganje glodara antigenu,

omogućavajući glodaru da generiše imuni odgovor, i

izolovanje od glodarske sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen T ćelijskog receptora koji vezuje antigen ograničen na MHC II,

pri čemu glodar obuhvata

(i) na endogenom lokusu MHC II α gena nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ljudski/glodarski MHC II polipeptid i

(ii) na endogenom lokusu MHC II β gena nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ljudski /glodarski MHC II β polipeptid,

pri čemu ljudski deo himernog ljudskog/glodarskog MHC II α polipeptida sadrži humane MHC II α1 i α2 domene i ljudski deo himernog polipeptida MHC II β čoveka/glodara sadrži humane MHC II β1 i β2 domene,

pri čemu glodar eksprimira funkcionalni himerni MHC II kompleks koji sadrži himerni ljudski/glodarski MHC II α polipeptid i himerni ljudski/glodar MHC II β polipeptid na površini ćelije glodara.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je nukleotidna sekvenca koja kodira himerni ljudski/glodarski MHC II polipeptid eksprimirana pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II α promotera i regulatornih elemenata i nukleotidna sekvenca koja kodira himerni ljudski/glodarski MHC II β polipeptid se eksprimira pod regulatornom kontrolom endogenog MHC II β promotera i regulatornih elemenata.

2

4. Metoda prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde deo glodara himernog ljudskog/glodarskog MHC II α polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II α polipeptida glodara i deo himernog polipeptida MHC II α čoveka/glodara obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene endogenog MHC II β polipeptida glodara.

5. Metoda prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je ljudski deo himernog polipeptida MHC II α čoveka/glodara kodiran genom lanca HLA klase II α koji je izabran iz grupe koju čine gen HLA-DR α lanca, Gen HLA-DQ α lanca, i gen HLA-DP lanca i ljudski deo himernog ljudskog/glodarskog MHC II β polipeptida je kodiran humanim HLA genom klase II odabranim iz grupe koju čini HLA-DR β lanac gen, gen HLA-DQ β lanca i gen HLA-DP β lanca.

6. Metoda prema patentnom zahtevu 5, gde je ljudski deo himernog polipeptida MHC II α čoveka/glodara kodiran humanim HLA-DR4 lančanim genom, a ljudski deo himernog polipeptida MHC II β čoveka/glodara je kodiran pomoću gena ljudskog HLA-DR4 β lanca.

7. Metoda prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je glodar miš.

8. Metoda prema patentnom zahtevu 7, gde je glodar miš i delovi glodara himernih MHC II α i β polipeptida su kodirani mišjim H-2E α i β genima.

9. Metoda prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je glodar miš koji sadrži na endogenom mišjem MHC II lokusu prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ljudski/miš MHC II polipeptid i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni ljudski/mišji MHC II b polipeptid,

pri čemu ljudski deo himernog MHC II α polipeptida sadrži α1 i α2 domene kodirane humanim HLA-DR4 lančanim genom i ljudski deo himernog MHC II β polipeptida sadrži β1 i β2 domene koje kodira ljudski HLA-DR4 β lančani gen,

pri čemu mišji deo himernog MHC II α polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2E α lanca i mišji deo himernog MHC II β polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatske domene mišjeg H-2E β lanca,

i pri čemu miš eksprimira funkcionalni himerni HLA-DR4/H-2E MHC II kompleks koji sadrži himerni human/miš MHC II polipeptid i himerni human/miš MHC II β polipeptid na površini ćelije miša.

10. Metoda prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde glodar ne eksprimira na površini ćelije funkcionalne endogene MHC II polipeptide iz njihovih endogenih MHC II lokusa glodara.