RS63371B1

RS63371B1 - T ćelijski receptori

Info

Publication number: RS63371B1
Application number: RS20220652A
Authority: RS
Inventors: Conor Hayes; Linda Hibbert; Nathaniel Liddy; Tara Mahon; Marine Raman
Original assignee: Immunocore Ltd
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2022-08-31
Also published as: US11505590B2; RU2018135248A; US12606607B2; CN109563148A; EP4023668A1; PH12018502158A1; MX2018012318A; KR102473964B1; WO2017175006A1; IL262144A; IL308831A; BR112018070741A2; AU2017246693A1; MA44608A; KR20180132844A; CY1125331T1; US20230322895A1; JP2019516357A; CR20180531A; SMT202200306T1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na T ćelijske receptore (TCR) koji vezuju HLA-A*02 ograničeni peptid GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) izveden iz antigena kancera klicine linije MAGE A4. Navedeni TCR sadrže neprirodne mutacije unutar alfa i/ili beta varijabilnih domena u odnosu na nativni MAGE A4 TCR. TCR prema pronalasku su posebno pogodni za upotrebu kao novi imunoterapeutski reagensi za lečenje malignih bolesti. Bilo koje pozivanje na postupke za lečenje ljudskog ili životinjskog tela operacijom ili terapijom treba tumačiti kao pozivanje na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja.

Osnova pronalaska

[0002] T ćelijski receptori (TCR) su prirodno eksprimirane CD4<+>i CD8<+>T ćelije. TCR su dizajnirani da prepoznaju kratke peptidne antigene koji se prikazuju na površini ćelija koje predstavljaju antigen u kompleksu sa molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) (kod ljudi, MHC molekuli su takođe poznati kao humani leukocitni antigeni ili HLA) (Davis, et al., (1998), Annu Rev Immunol 16: 523-544.). CD8<+>T ćelije, koje se takođe nazivaju citotoksične T ćelije, specifično prepoznaju peptide vezane za MHC klasu I i generalno su odgovorne za pronalaženje i posredovanje u uništavanju obolelih ćelija. CD8<+>T ćelije su u stanju da unište kancerogene, kao i ćelije inficirane virusom; međutim, afinitet TCR eksprimiranih od strane T ćelija specifičnim za kancer u prirodnom repertoaru je obično nizak kao rezultat selekcije timusa, što znači da ćelije kancera često izbegavaju otkrivanje i uništenje. Novi imunoterapeutski pristupi koji imaju za cilj stimulaciju prepoznavanja kancera od strane T ćelija nude veoma obećavajuću strategiju za razvoj efikasnih tretmana protiv kancera.

[0003] MAGE A4 pripada porodici MAGE antigena kancera kodiranih klicinom linijom (De Plaen, et al., (1994), Immunogenetics 40(5): 360-369) i ima Uniprot pristupni broj P43358. Utvrđeno je da se takvi antigeni često eksprimiraju u različitim vrstama kancera, dok je njihova ekspresija u normalnim tkivima ograničena na testise odraslih i druga imunološki privilegovana mesta uključujući placentu. Specifična priroda ovih gena za kancer čini ih idealnim ciljnim mestima za terapiju protiv kancera. Precizna funkcija MAGE A4 ostaje nepoznata, ali se veruje da igra ulogu u razvoju embriona. Visok nivo ekspresije MAGE A4 je zabeležen u tumorima nekoliko tipova uključujući melanom, karcinome jednjaka, glave i vrata, pluća, dojke i bešike (Bergeron, (2009), Int J Cancer 125(6): 1365-1371; Cabezon, et al., (2013), Mol Cell Proteomics 12(2): 381-394; Cuffel, et al., (2011), Int J Cancer 128(11): 2625-2634; Forghanifard, et al., (2011), Cancer Biol Ther 12(3): 191-197; Karimi, et al., (2012), Clin Lung Cancer 13(3): 214-219; Svobodova, et al., (2011), Eur J Cancer 47(3): 460-469).10-merni peptid GVYDGREHTV (SEQ ID NO 1) odgovara aminokiselinama 230-239 pune dužine MAGE A4 proteina. Ovaj peptid se vezuje za HLA-A*02 i pokazalo se da kompleks peptid-HLA stimuliše citotoksične T ćelije što dovodi do lize MAGE A4 pozitivnih, HLA-A*02 pozitivnih, tumorskih ćelija (Duffour, et al., (1999), Eur J Immunol 29(10): 3329-3337 i WO2000020445). Kompleks GVYDGREHTV HLA-A*02 stoga pruža koristan ciljni antigen za imunoterapeutsku intervenciju.

[0004] Identifikacija određenih TCR sekvenci koje se vezuju za GVYDGREHTV HLA-A*02 kompleks sa visokom specifičnošću je korisna za razvoj novih imunoterapija. Terapeutski TCR se mogu koristiti, na primer, kao rastvorljivi agensi za ciljno delovanje u svrhu isporuke citotoksičnih ili imunoloških efektorskih agenasa u tumor (Lissin et al. (2013). "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707-711; Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987), ili alternativno mogu se koristiti za konstrukciju T ćelija za adaptivnu terapiju (June, et al., (2014), Cancer Immunol Immunother 63(9): 969-975). Međutim, takve TCR sekvence nisu poznate u tehnici, a postupci za identifikaciju TCR sa specifičnim karakteristikama koje su podložne terapijskoj upotrebi imaju visoku stopu trošenja i stoga stručnjaku ne pružaju razumno očekivanje uspeha.

[0005] U prvom slučaju, stručnjak treba da identifikuje odgovarajuću početnu sekvencu ili skafold. Obično se takve sekvence dobijaju iz prirodnih izvora, npr. iz T ćelija koje reaguju na antigen ekstrahovane iz krvi donora. S obzirom na retkost T ćelija specifičnih za kancer u prirodnom repertoaru, često je potrebno pregledati mnoge donatore, na primer 20 ili više, pre nego što se pronađe T ćelija koja reaguje. Postupak skrininga može potrajati nekoliko nedelja ili meseci, pa čak i kada se pronađe T ćelija koja reaguje, ona može biti neprikladna za imunoterapeutsku upotrebu. Na primer, odgovor može biti preslab i/ili možda neće biti specifičan za ciljni antigen, alternativno možda neće biti moguće stvoriti klonsku populaciju T ćelija, niti proširiti ili održavati datu T ćelijsku liniju da bi proizvela dovoljno materijala za identifikaciju ispravne sekvence TCR lanca. Pored toga, pošto su TCR degenerisani i predviđeno je da mogu da vežu oko milion različitih HLA-peptida (Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177)) izuzetno je teško čak i za kvalifikovane praktičare da odrede da li određeni TCR ima profil specifičnosti koji bi ga učinio podobnim za inženjering za terapeutsku upotrebu.

[0006] TCR sekvence koje su pogodne kao početne ili skafold sekvence treba da imaju dobar afinitet za ciljni peptid-HLA kompleks, na primer 200 µM ili jače, pokazuju visok nivo ciljne specifičnosti, npr. relativno slabo ili nikakvo vezivanje za alternativne komplekse peptid-HLA, može se koristiti u bibliotekama za prikaz, kao što je prikaz faga, i može se ponovo savijati i prečišćavati uz visok prinos.

[0007] TCR, kakvi postoje u prirodi, imaju slab afinitet za ciljni antigen (nizak mikromolarni opseg) u poređenju sa antitelima, a TCR protiv antigena kancera obično imaju slabije prepoznavanje antigena od virusno specifičnih TCR (Aleksić et al. (2012). Eu J Immunol., 42(12), 3174-3179). Ovaj slab afinitet u kombinaciji sa smanjenjem HLA na ćelijama kancera znači da terapeutski TCR za imunoterapiju kancera zahtevaju inženjering kako bi povećali njihov afinitet za ciljni antigen i tako stvorili snažniji odgovor. Afiniteti vezivanja TCR antigena u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu, sa poluživotom vezivanja od nekoliko sati, poželjni su za rastvorljiva ciljana sredstva zasnovana na TCR. Poboljšana potencija generisana prepoznavanjem antigena visokog afiniteta pri malom broju epitopa je prikazana na slikama 1e i 1f Liddy et al. (Liddy, et al. (2012), Nat Med, 18(6), 980-987). Sazrevanje afiniteta, obično uključuje kvalifikovanu osobu koja mora da identifikuje specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije, insercije i/ili delecije, koje se mogu izvršiti na početnoj TCR sekvenci kako bi se povećala snaga prepoznavanja antigena. Postupci za identifikaciju mutacija datog TCR koje daju poboljšanje afiniteta su poznate u tehnici, na primer korišćenje biblioteka prikaza (Li et al., (2005) Nat Biotechnol. 23(3):349-354; Holler et al., (2000). Proc Natl Acad Sci U S A; 97(10):5387-5392). Međutim, da bi se proizvelo značajno povećanje afiniteta datog TCR prema datom ciljnom mestu, potrebno je da stručnjak izabere specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija iz velikog skupa mogućih alternativa. Specifične mutacije i/ili kombinacije mutacija koje proizvode značajno povećanje afiniteta nisu predvidljive i postoji visoka stopa trošenja. U mnogim slučajevima možda neće biti moguće postići značajno povećanje afiniteta sa datom TCR početnom sekvencom.

[0008] Proces sazrevanja afiniteta takođe mora da uzme u obzir neophodnost održavanja specifičnosti TCR antigena. Povećanje afiniteta TCR za njegov ciljni antigen donosi značajan rizik od otkrivanja unakrsne reaktivnosti sa drugim neželjenim ciljnim mestima kao rezultat inherentne degeneracije prepoznavanja TCR antigena (Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177; Wilson, et al., (2004), Mol Immunol 40(14-15): 1047-1055; Zhao et al., (2007) J. Immunol, 179; 9, 5845-5854). Na prirodnom nivou afiniteta, prepoznavanje unakrsno reaktivnog antigena može biti prenisko da bi proizvelo odgovor. Ako se unakrsno reaktivni antigen prikaže na normalnim zdravim ćelijama, postoji velika mogućnost vezivanja van cilja in vivo što se može manifestovati u kliničkoj toksičnosti. Stoga, pored povećanja snage vezivanja antigena, stručnjak takođe mora da izabere mutacije i/ili kombinacije mutacija koje omogućavaju da TCR zadrži visoku specifičnost za ciljni antigen i pokaže dobar bezbednosni profil u pretkliničkom testiranju. Opet takve mutacije i/ili kombinacije mutacija nisu predvidljive. Stopa trošenja u ovoj fazi je još veća i u mnogim slučajevima možda uopšte nije moguća iz date TCR početne sekvence.

[0009] Mutacije potrebne za visok afinitet i visoku specifičnost takođe bi trebalo da proizvedu TCR koji može da se ekspresuje, ponovo savija i prečisti sa razumnim prinosom i koji je visoko stabilan u prečišćenom obliku.

[0010] Uprkos gore opisanim poteškoćama u identifikaciji TCR sekvenci sa odgovarajućim karakteristikama za terapeutsku upotrebu, pronalazači su iznenađujuće pronašli TCR sekvencu koja obezbeđuje idealnu početnu tačku, ili skafold, za proizvodnju terapeutskih TCR. Štaviše, pronalazači su neočekivano identifikovali pogodne mutacije koje se mogu uvesti u alfa i beta varijabilne domene skele da bi se proizvele TCR sekvence sa idealnim karakteristikama za ciljanu imunoterapiju raka koji eksprimiraju MAGE A4 zasnovanu na TCR.

Suština pronalaska

[0011] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) u kompleksu sa HLA-A*02 i koji sadrži varijabilni domen TCR alfa lanca i TCR beta varijabilni domen lanca,

(a) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28;

(b) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25;

(c) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28;

(d) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28;

(e) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(f) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27;

(g) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(h) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(i) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(j) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(k) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(l) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(m) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(n) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;

(o) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;

(p) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;

(q) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;

(r) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;

(s) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;

(t) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;

(u) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(v) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(w) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(x) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(y) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(z) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(aa) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(bb) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(cc) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26;

(dd) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;

(ee) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;

(ff) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;

(gg) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74;

(hh) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75;

(ii) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76;

(jj) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77;

(kk) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78; ili

(ll) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79.

[0012] Poželjne karakteristike aspekata pronalaska su navedene u zavisnim zahtevima ovde.

[0013] Ovde je otkriven TCR koji se vezuje za GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks sa afinitetom većim od 200 µM, pri čemu: CDR regioni alfa lanca 1, 2 i 3 sadrže SEQ ID NOs 6, 7 i 8 respektivno, i/ili CDR regioni beta lanca 1, 2 i 3 sadrže SEQ ID NOs 11, 12 i 13 respektivno; i/ili najmanje jedan od CDR regiona sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija u odnosu na SEQ ID NO: 6 do 8 i 11 do 13; i/ili najmanje jedan od CDR regiona sadrži do tri tolerisane supstitucije u odnosu na SEQ ID NO: 6 do 8 i 11 do 13.

[0014] Afinitet TCR pronalaska za GVYDGREHTV HLA-A*02 kompleks može biti u opsegu od 200 µM do 1 pM. Poželjno je da pomenute supstitucije ne menjaju afinitet vezivanja za više od /- 50%, ili još poželjnije za ne više od /- 20%, u odnosu na nesupstituisani TCR. Poželjno je da pomenute supstitucije ne povećavaju afinitet vezivanja za alternativne komplekse peptid-HLA.

[0015] Skafold TCR ima sledeću upotrebu alfa i beta varijabilnog lanca:

Alfa lanac: TRAV10*01/TRAJ6*01

Beta lanac: TRBV28*01/TRBD1*01/TRBJ2-7*01/

(Napomena, termin '*01' ukazuje na alelsku varijantu za ovu sekvencu, kako je označeno IMGT nomenklaturom)

i sledeće CDR3 sekvence alfa i beta lanca:

Alfa lanac: WNHSGGSYIPTF (SEQ ID NO: 8)

Beta lanac: ASSFLMTSGDPYEQYF (SEQ ID NO: 13)

[0016] Termin „skafold TCR“ ili „početni TCR“ se u ovoj aplikaciji koristi kao sinonim sa terminima „divlji tip TCR“ ili „WT TCR“ ili „nemutirani TCR“ ili „prirodni TCR“, ili „roditeljski TCR“ koji znači TCR koji ima varijabilan alfa lanac koja sadrži ostatke 1-113 SEQ ID NO: 2 i varijabilnog domen beta lanca koji sadrži ostatke 1-116 SEQ ID NO: 3. Konstantni domen WT TCR može biti pune dužine, ili može biti skraćeni i/ili mutirani da bi proizveli rastvorljivi TCR. U svakom slučaju, cisteinske supstitucije se mogu uvesti u TRAC i TRBC regione tako da se može formirati ne-nativna međulančana disulfidna veza. Pogodne pozicije za lokaciju navedenih cisteinskih supstitucija su opisane u WO03020763. Slika 2 pratećih crteža prikazuje ekstracelularne sekvence TCR alfa i beta lanaca divljeg tipa, u rastvorljivom formatu. SEQ ID NO: 4 je identična ekstracelularnoj sekvenci prirodnog alfa lanca SEQ ID NO: 2 osim što je cistein na poziciji 48 konstantnog domena zamenjen treoninom. Isto tako SEQ ID NO: 5 je identična ekstracelularnoj sekvenci prirodnog beta lanca SEQ ID NO: 3 osim što je cistein na poziciji 57 konstantnog domena zamenjen serinom, cistein na poziciji 75 konstantnog domena je zamenjen alaninom, a asparagin na poziciji 89 konstantnog domena je zamenjen asparaginskom kiselinom. Rastvorljivi TCR divljeg tipa može da se koristi da obezbedi referencu sa kojom se može uporediti profil vezivanja mutiranih TCR prema pronalasku.

[0017] TCR sekvence definisane ovde su opisane u vezi sa IMGT nomenklaturom koja je široko poznata i dostupna onima koji rade u oblasti TCR. Na primer, pogledati: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011 (6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol appendix 1: Appendix 10O; i Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. Ukratko, αβ TCR se sastoje od dva disulfidno povezana lanca. Svaki lanac (alfa i beta) se generalno smatra da ima dva domena, naime promenljivi i konstantni domen. Kratki spojni region povezuje promenljive i konstantne domene i obično se smatra delom alfa varijabilnog regiona. Pored toga, beta lanac obično sadrži region kratke raznolikosti pored spojnog regiona, koji se takođe tipično smatra delom beta varijabilnog regiona.

[0018] Varijabilni domen svakog lanca je lociran N-terminalno i obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) ugrađena u okvirnu sekvencu. CDR regioni obuhvataju mesto prepoznavanja za vezivanje peptida-MHC. Postoji nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione alfa lanca (Vα) i nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione beta lanca (Vβ), koji se razlikuju po svom okviru, CDR1 i CDR2 sekvencama i delimično definisanom CDR3 sekvencom. Geni Vα i Vβ se u IMGT nomenklaturi pominju prefiksom TRAV i TRBV (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Slično, postoji nekoliko spajajućih ili J gena, nazvanih TRAJ ili TRBJ, za alfa i beta lanac respektivno, a za beta lanac, gen za raznolikost ili D koji se naziva TRBD (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Ogromna raznolikost lanaca receptora T ćelija rezultat je kombinatornih preuređivanja između različitih V, J i D gena, koji uključuju alelske varijante, i različitosti spojeva (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107). Konstantni, ili C, regioni TCR alfa i beta lanaca se nazivaju TRAC i TRBC respektivno (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O).

[0019] Varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22, i varijabilni domen beta lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 i varijabilni domen beta lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 i varijabilni domen beta lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen beta lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i varijabilni domen beta lanca može da sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 29.

[0020] TCR pronalaska može biti alfa-beta heterodimer, koji ima sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2.

[0021] TCR pronalaska može biti u jednolančanom formatu uključujući, ali ne ograničavajući se na Vα,-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, Vα-Cα-L -Vβ-Cβ, gde su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno, a L je sekvenca linkera.

[0022] TCR pronalaska može biti povezan sa obeleživačem koji se može detektovati, terapeutskim agensom ili ostatkom koji modifikuje PK.

[0023] TCR pronalaska može da sadrži anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR. Beta lanac može biti vezan za sekvencu anti-CD3 antitela preko linkerske sekvence; sekvenca povezivača može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO: 30), GGGSG (SEQ ID NO: 31), GGSGG (SEQ ID NO: 32), GSGGG (SEQ ID NO: 33), GSGGGP (SEQ ID NO: 33). ID BR: 34), GGEPS (SEQ ID NO: 35), GGEGGGP (SEQ ID NO: 36) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 37).

[0024] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje TCR-anti-CD3 fuzioni molekul gde:

1

(dd) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i TCR beta lanac varijabilni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;

(ll) varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79, i

pri čemu je anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za N-terminus ili C-terminus TCR beta lanca preko linker sekvence odabrane od SEQ ID NO: 30-37.

[0025] TCR pronalaska može biti uključen u biblioteku čestica. Za takve svrhe, TCR može biti prikazan na površini bakteriofaga, ćelije kvasca, ćelije sisara ili ribozoma, na primer. TCR može biti izolovan, bez ćelija i/ili rastvorljiv, tj. ne može biti TCR koji se javlja u svom prirodnom stanju unutar T-ćelije unutar ljudskog tela.

[0026] TCR prema pronalasku mogu biti neprirodni i/ili prečišćeni i/ili konstruisani.

[0027] Ovde su otkriveni TCR koji mogu imati više od jedne mutacije prisutne u varijabilnom domenu alfa lanca i/ili varijabilnom domenu beta lanca u odnosu na nativni MAGE A4 TCR. Varijabilni domen alfa lanca može imati mutaciju na najmanje jednoj od sledećih pozicija u odnosu na numerisanje ostataka 1-113 SEQ ID NO: 2: M50, T51, F52, S53, E54, H94, S95, G96, S98. Mutacije se mogu izabrati između sledećih amino kiselina u odnosu na numerisanje ostataka 1-113 SEQ ID NO: 2:

(Tabela 1)

[0028] Dodatno ili alternativno, varijabilni domen beta lanca može imati mutaciju na najmanje jednoj od sledećih pozicija u odnosu na numerisanje ostataka 1-116 SEQ ID NO: 3: M27; D28; H29, E30, N31, Y50, D51, V52, K53, M54, F95, L96, M97, T98. Mutacije se mogu izabrati između sledećih amino kiselina u odnosu na numerisanje ostataka 1-116 SEQ ID NO: 3:

(Tabela 2)

1

[0029] Varijabilni domen alfa lanca može imati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 mutacija prikazanih u tabeli 1 i/ili varijabilni domen beta lanca može imati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija prikazanih u tabeli 2

[0030] Varijabilni domen alfa lanca može imati najmanje jednu od sledećih grupa mutacija:

Grupa 1: M50L, T51D, F52Y, S53A, E54I

Grupa 2: H94S, S95A, G96N, S98L

Grupa 3: H94R S95A, G96D, S98L

Grupa 4: M50L, T51D, F52Y, S53A, E54I, H94R S95A, G96D, S98L

Grupa 5: M50L, H94S, S95A, G96S, S98L

Grupa 6: M50L, H94S, S95A, G96K, S98L

i/ili varijabilni domen beta lanca može imati najmanje jednu od sledećih grupa mutacija:

Grupa 1: M27A, D28P, H29L, E30S, N31K F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupa 2: Y50R, D51F, V52A, K53T, M54G, F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupa 3: F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupa 4: M27L, Y50R, D51F, V52A, K53T, M54G, F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupa 5: M27A, D28P, H29L, E30S, N31K, M54L, F95S, L96D, M97Q, T98N

[0031] Na primer, varijabilni domen alfa lanca može imati mutacije Grupe 4, a varijabilni domen beta lanca može imati mutacije Grupe 1; varijabilni domen alfa lanca može imati mutacije Grupe 4, a varijabilni domen beta lanca može imati mutacije Grupe 5; varijabilni domen alfa lanca može imati mutacije Grupe 2, a varijabilni domen beta lanca može imati mutacije Grupe 2; varijabilni domen alfa lanca može imati mutacije Grupe 6, a varijabilni domen beta lanca može imati mutacije Grupe 4; varijabilni domen alfa lanca može imati mutacije Grupe 5, a varijabilni domen beta lanca može imati mutacije Grupe 4.

[0032] Mutacije se mogu dodatno ili alternativno napraviti van CDR regiona; takve mutacije mogu poboljšati vezivanje, i/ili specifičnost, i/ili stabilnost, i/ili prinos prečišćenog rastvorljivog oblika TCR. Na primer, TCR može dodatno ili alternativno da sadrži varijabilni domen alfa lanca koji ima sledeće mutacije u vezi sa numerisanjem ostataka 1-113 SEQ ID NO: 2:

(Tabela 3)

[0033] U varijabilnom domenu alfa lanca sekvenca aminokiselinskih ostataka 27 - 32, 50 - 56 i 91 - 103 može se izabrati između sledećeg:

(Tabela 4)

[0034] Varijabilni domen TCR alfa lanca može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnost sa bilo kojim od SEQ ID NO: 16 -24 ili 46 - 64.

[0035] U varijabilnom domenu beta lanca sekvenca aminokiselinskih ostataka 27 - 31, 49 - 54 i 92 - 107 može se izabrati od sledećih:

1

(Tabela 5)

[0036] Varijabilni domen TCR beta lanca može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO.: 25 - 29 ili 65 - 81.

[0037] Sekvenca varijabilnog domena alfa lanca aminokiselinskih ostataka 27-32, 50-56 i 91-103 i sekvenca varijabilnog domena beta lanca aminokiselinskih ostataka 27-31, 49-54 i 92-107 mogu se izabrati od sledećih

(Tabela 6)

[0038] Varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 16 do 24 ili 46 - 64 i/ili varijabilni domen beta lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 25 do 29 ili 65 -81.

[0039] TCR može da sadrži region okvira 2 (FR2) alfa lanca i region okvira alfa lanca 3 (FR3), pri čemu regioni FR2 i FR3 sadrže SEQ ID NO: 9 i 10 respektivno, i/ili sadrže jedan ili više, npr. jednu, dve ili tri, konzervativne supstitucije i/ili do tri tolerisane supstitucije. TCR može da sadrži FR2 region beta lanca i FR3 region beta lanca, pri čemu regioni FR2 i FR3 sadrže SEQ ID

1

NO: 14 i 15 respektivno, i/ili sadrže jednu ili više, na primer jednu, dve ili tri, konzervativne supstitucije i/ili do tri tolerisane supstitucije. TCR može da sadrži aminokiseline 1-113 SEQ ID NO: 2 i/ili aminokiseline 1-116 SEQ ID NO: 3, od kojih svaka može sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija i/ili do tri tolerisane mutacije i/ili jednu ili više mutacija navedenih u tabelama 1, 2 i 3.

[0040] "Inženjerski TCR" i "mutantni TCR" se ovde koriste kao sinonimi za označavanje TCR koji ima jednu ili više uvedenih mutacija u odnosu na nativni MAGE A4 TCR, posebno u njegovom varijabilnom domenu alfa lanca i/ili varijabilnom domenu beta lanca. Mutacija(e) tipično poboljšavaju afinitet vezivanja TCR za GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks, ali mogu dodatno ili alternativno dati druge prednosti kao što su poboljšana stabilnost u izolovanom obliku i poboljšana specifičnost. Mutacije na jednoj ili više pozicija mogu dodatno ili alternativno uticati na interakciju susedne pozicije sa srodnim pMHC kompleksom, na primer omogućavanjem povoljnijeg ugla za interakciju. Da bi se poboljšalo vezivanje TCR za kompleks GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02, mutacije se poželjno prave unutar jednog ili više CDR regiona.

[0041] Može postojati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 mutacija u CDR regionima alfa lanca, na primer 4, 5 ili 9 mutacija, i/ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mutacija u CDR regionima beta lanca, na primer 4, 9 ili 10 mutacija.

[0042] Varijabilni domen α lanca TCR koji je ovde otkriven može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa sekvencom aminokiselinskih ostataka 1-113 SEQ ID NO: 2, pod uslovom da varijabilni domen α lanca ima najmanje jednu od navedenih mutacija navedenih u prethodnom tekstu, na primer u Tabeli 1 ili Tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, varijabilni domen β lanca TCR pronalaska može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, na najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnost sa sekvencom aminokiselinskih ostataka 1-116 SEQ ID NO: 3, pod uslovom da varijabilni domen β lanca ima najmanje jednu od mutacija navedenih u prethodnom tekstu, na primer u tabeli 2.

[0043] Mutacije na roditeljski (ili divlji tip) TCR mogu uključivati one koje su u stanju da povećaju afinitet vezivanja (kDi/ili poluvreme vezivanja) TCR za GVYDGREHTV. Mutacije mogu uključivati one koje su u stanju da smanje količinu nespecifičnog vezivanja, tj. smanje vezivanje za antigene pored vezivanja za GVYDGREHTV. Mutacije mogu uključivati one koje povećavaju efikasnost savijanja i/ili proizvodnje. Neke mutacije mogu doprineti svakoj od ovih karakteristika, druge mogu doprineti afinitetu, ali ne specifičnosti, na primer, ili specifičnosti ali

1

ne afinitetu itd.

[0044] Fenotipski tihe varijante bilo kog TCR pronalaska su ovde otkrivene. Kako se ovde koristi, termin "fenotipski tihe varijante" podrazumeva se da se odnosi na TCR koji uključuje jednu ili više dodatnih promena aminokiselina, uključujući supstitucije, insercije i delecije, pored onih koje su gore navedene, a TCR ima sličan fenotip kao odgovarajući TCR bez pomenutih promena(a). Za potrebe ove prijave, TCR fenotip obuhvata afinitet vezivanja antigena (KDi/ili poluživot vezivanja) i specifičnost antigena. Fenotipski tiha varijanta može imati KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks HLA-A*02 GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) unutar 50%, ili još poželjnije unutar 20% izmerenog KDi/ili polu-život vezivanja odgovarajućeg TCR bez pomenute promene(a), kada se meri pod identičnim uslovima (na primer na 25°C i/ili na istom SPR čipu). Pogodni uslovi su dalje dati u Primeru 3. Specifičnost antigena je dalje definisana u nastavku. Kao što je stručnjacima poznato, može biti moguće proizvesti TCR koji uključuju promene u svojim varijabilnim domenima u poređenju sa onima koji su detaljno opisani iznad bez promene afiniteta interakcije sa GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A *02 kompleksom. Posebno, takve tihe mutacije mogu biti ugrađene u delove sekvence za koje se zna da nisu direktno uključeni u vezivanje antigena (npr. CDR regioni, ili delovi CDR koji ne dolaze u kontakt sa peptidnim antigenom).

[0045] Fenotipski tihe varijante mogu sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija i/ili jednu ili više tolerisanih supstitucija. Tolerisane i konzervativne supstitucije mogu dovesti do promene u KDi/ili poluživotu vezivanja za kompleks HLA-A*02 GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) unutar 50%, ili još poželjnije unutar 20%, još poželjnije unutar 10% od izmerenog KDi/ili poluživota vezivanja odgovarajućeg TCR bez pomenutih konzervativnih i/ili tolerisanih supstitucija (jedne ili više), kada se meri pod identičnim uslovima (na primer na 25°C i/ili istom SPR čipu), pod uslovom da promena KDne rezultira da je afinitet manji od (tj. slabiji od) 200 µm. Pod tolerisanim supstitucijama podrazumevaju se one supstitucije koje ne potpadaju pod definiciju konzervativnih kao što je dato u nastavku, ali su ipak fenotipski tihe.

[0046] TCR mogu uključivati jednu ili više konzervativnih supstitucija koje imaju sličnu sekvencu aminokiselina i/ili koje zadržavaju istu funkciju (tj. fenotipski su tihe kao što je gore definisano). Stručnjak je svestan da različite aminokiseline imaju slična svojstva i stoga su 'konzervativne'. Jedna ili više takvih aminokiselina proteina, polipeptida ili peptida često mogu biti supstituisane sa jednom ili više drugih takvih aminokiselina bez eliminisanja željene aktivnosti tog proteina, polipeptida ili peptida.

[0047] Tako se aminokiseline glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin često mogu zameniti jedna drugom (aminokiseline koje imaju alifatične bočne lance). Od ovih mogućih supstitucija, poželjno je da se glicin i alanin koriste da zamene jedna drugu (pošto imaju relativno kratke

1

bočne lance) i da se valin, leucin i izoleucin koriste da zamene jedni druge (pošto imaju veće alifatske bočne lance koji su hidrofobni). Druge aminokiseline koje se često mogu zameniti jedna drugom uključuju: fenilalanin, tirozin i triptofan (amino kiseline koje imaju aromatične bočne lance); lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju osnovne bočne lance); aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance); asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju bočne lance amida); i cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor). Treba imati na umu da se zamene aminokiselina mogu napraviti korišćenjem aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili koje se ne pojavljuju u prirodi. Na primer, ovde se razmatra da metil grupa na alaninu može biti zamenjena etil grupom, i/ili da se manje promene mogu izvršiti na peptidnoj kičmi. Bez obzira da li se koriste prirodne ili sintetičke aminokiseline ili ne, poželjno je da su prisutne samo L-aminokiseline.

[0048] Supstitucije ove prirode se često nazivaju "konzervativnim" ili "polukonzervativnim" supstitucijama aminokiselina. Ovde je otkriven TCR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu gore, ali sa jednom ili više konzervativnih supstitucija i ili jednom ili više tolerisanih supstitucija u sekvenci, tako da sekvenca aminokiselina TCR ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa TCR koji sadrži aminokiseline 1-113 SEQ ID NOs: 2, 16- 24 ili 46 - 64, i/ili aminokiseline 1-116 SEQ ID NO: 3, 25-29 ili 65-81.

[0049] "Identičnost" kao što je poznato u tehnici je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identitet takođe označava stepen srodnosti sekvenci između polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, što je određeno podudarnošću između nizova takvih sekvenci. Iako postoji veliki broj postupaka za merenje identičnosti između dva polipeptida ili dve polinukleotidne sekvence, postupci koji se obično koriste za određivanje identičnosti su kodifikovani u kompjuterskim programima. Poželjni kompjuterski programi za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket (Devereux, et al., Nucleic Acid Research, 12, 387 (1984.), BLASTP, BLASTN i FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol.215, 403 (1990)).

[0050] Može se koristiti program kao što je CLUSTAL program za upoređivanje sekvenci aminokiselina. Ovaj program upoređuje sekvence aminokiselina i pronalazi optimalno poravnanje umetanjem razmaka u bilo koju sekvencu prema potrebi. Moguće je izračunati identičnost ili sličnost aminokiselina (identičnost plus očuvanje tipa aminokiseline) za optimalno poravnanje. Program kao što je BLASTx će poravnati najduži deo sličnih sekvenci i dodeliti vrednost uklapanju. Stoga je moguće dobiti poređenje gde se nalazi nekoliko regiona sličnosti, od kojih svaki ima drugačiji rezultat. Oba tipa analize identičnosti su razmatrana u ovom

1

pronalasku.

[0051] Procenat identičnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinskih kiselina se određuje poravnavanjem sekvenci radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u prvu sekvencu radi najboljeg usklađivanja sa sekvencom) i poređenjem aminokiselinskih ostataka ili nukleotida na odgovarajućim pozicijama. „Najbolje poravnanje“ je poravnanje dve sekvence koje rezultira najvećim procentom identičnosti. Procenat identičnosti je određen brojem identičnih aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvencama koje se porede (tj. % identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija × 100).

[0052] Određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma poznatog stručnjacima u ovoj oblasti. Primer matematičkog algoritma za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, izmenjen kao u Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. NBLAST i XBLAST programi Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 ugradili takav algoritam. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti pomoću NBLAST programa, rezultat = 100, dužina reči = 12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti pomoću programa XBLAST, rezultat = 50, dužina reči = 3 da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinskim molekulima za upotrebu u pronalasku. Da biste dobili razmaknuta poravnanja u svrhu poređenja, „Gapped“ BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res.

25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast se može koristiti za obavljanje iterirane pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (Id.). Kada koristite programe BLAST, „Gapped“ BLAST i PSI-Blast, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. XBLAST i NBLAST). Pogledajte http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Sledeći primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam od Myers i Miller, CABIOS (1989). Program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje sekvenci CGC ugradio je takav algoritam. Drugi algoritmi za analizu sekvenci poznati u tehnici uključuju ADVANCE i ADAM kao što je opisano u Torellis i Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; i FASTA opisan u Pearson i Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. U okviru FASTA, ktup je kontrolna opcija koja postavlja osetljivost i brzinu pretrage.

[0053] Mutacije, uključujući konzervaciju i tolerisane supstitucije, insercije i delecije, mogu se uvesti u sekvence koje su obezbeđene korišćenjem bilo koje odgovarajuće metode uključujući, ali ne ograničavajući se na, one postupke zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze (PCR), kloniranje zasnovano na restrikcionim enzimima ili kloniranje nezavisno od ligacije (LIC). Ove metode su detaljno opisane u mnogim standardnim tekstovima o molekularnoj biologiji. Za više detalja u vezi sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i kloniranjem zasnovanim na

2

restrikcionim enzimima, videti Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (3rded.) CSHL Press. Dodatne informacije o postupcima nezavisnog kloniranja (LIC) mogu se naći u Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6. TCR sekvence obezbeđene pronalaskom mogu se dobiti sintezom u čvrstom stanju ili bilo kojim drugim odgovarajućim postupkom poznatim u tehnici.

[0054] TCR prema pronalasku imaju svojstvo vezivanja kompleksa GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02. Utvrđeno je da TCR prema pronalasku snažno prepoznaju ovaj epitop u odnosu na druge, irelevantne epitope, i stoga su posebno pogodni kao ciljni vektori za isporuku terapeutskih agenasa ili detektabilnih oznaka u ćelije i tkiva koja pokazuju te epitope. Specifičnost u kontekstu TCR pronalaska se odnosi na njihovu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su pozitivne na antigen, dok imaju minimalnu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su antigen negativne.

[0055] Specifičnost se može meriti in vitro, na primer, u ćelijskim testovima kao što su oni opisani u Primeru 6. Da bi se testirala specifičnost, TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i/ili mogu biti fuzionisani sa imunim efektorom, i/ili mogu biti eksprimirani na površini ćelija, kao što su T ćelije. Prepoznavanje se može odrediti merenjem nivoa aktivacije T ćelija u prisustvu TCR pronalaska i ciljnih ćelija. Minimalno prepoznavanje ciljnih ćelija negativnih na antigen je definisano kao nivo aktivacije T ćelija manji od 20%, poželjno manji od 10%, poželjno manji od 5%, a poželjnije manji od 1% nivoa proizvedenog u prisustvu antigen pozitivne ciljne ćelije, kada se mere pod istim uslovima i pri terapijski relevantnoj koncentraciji TCR. Za rastvorljive TCR prema pronalasku terapeutski relevantna koncentracija se može definisati kao koncentracija TCR od 10<-9>M ili ispod, i/ili koncentracija do 100, poželjno do 1000, puta veća od odgovarajuće vrednosti EC50. Antigen pozitivne ćelije se mogu dobiti pulsiranjem peptida korišćenjem odgovarajuće koncentracije peptida da bi se dobio nivo prezentacije antigena uporediv sa ćelijama raka (npr. 10<-9>M peptid, kao što je opisano u Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840) ili, mogu prirodno da predstavljaju pomenuti peptid. Poželjno, i antigen pozitivne i antigen negativne ćelije su humane ćelije. Poželjno antigen pozitivne ćelije su humane ćelije kancera. Antigen negativne ćelije poželjno uključuju one izvedene iz zdravih humanih tkiva.

[0056] Specifičnost se može dodatno, ili alternativno, odnositi na sposobnost TCR da se veže za GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks, a ne za panel alternativnih kompleksa peptid-HLA. Ovo se, na primer, može odrediti Biacore metodom iz Primera 3. Navedena ploča može da sadrži najmanje 5, a poželjno najmanje 10 alternativnih kompleksa peptid-HLA-A*02. Alternativni peptidi mogu da dele nizak nivo identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1 i mogu biti prirodno predstavljeni. Alternativni peptidi mogu biti izvedeni iz proteina eksprimiranih u zdravim humanim tkivima. Vezivanje za GVYDGREHTV-HLA-A*02 kompleks može biti najmanje 2 puta veće nego za druge prirodno prisutne peptidne HLA komplekse, poželjnije najmanje 10 puta, ili najmanje 50 puta ili najmanje 100 puta veće, još poželjnije na najmanje 400 puta veći.

[0057] Alternativni ili dodatni pristup za određivanje specifičnosti TCR može biti da se identifikuje motiv prepoznavanja peptida TCR korišćenjem sekvencijalne mutageneze, npr. skeniranje alaninom. Ostaci koji čine deo vezivnog motiva su oni koji nisu dozvoljeni za supstituciju. Nijedna dozvoljena supstitucija se ne može definisati kao one peptidne pozicije u kojima je afinitet vezivanja TCR smanjen za najmanje 50%, ili poželjno najmanje 80% u odnosu na afinitet vezivanja za ne-mutirani peptid. Takav pristup je dalje opisan u Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5 (197): 197ra103 i WO2014096803. Specifičnost TCR u ovom slučaju se može odrediti identifikacijom peptida koji sadrže alternativni motiv, posebno peptida koji sadrže alternativni motiv u humanom proteomu, i testiranjem ovih peptida na vezivanje za TCR. Vezivanje TCR za jedan ili više alternativnih peptida može ukazivati na nedostatak specifičnosti. U ovom slučaju može biti potrebno dalje testiranje specifičnosti TCR putem ćelijskih testova.

[0058] Kao što je stručnjacima sa iskustvom u ovoj oblasti poznato, peptidi izvedeni iz članova porodice MAGE mogu deliti visok nivo identičnosti sekvence sa peptidima izvedenim od drugih članova porodice MAGE. Na primer, postoje peptidi izvedeni iz MAGE-A8 i MAGE-B2 koji se razlikuju za samo dva ostatka od SEQ ID NO 1 (GVYDGREHTV). Navedeni peptidi i ćelije koje eksprimiraju pomenute članove porodice MAGE mogu biti isključeni iz gore navedene definicije specifičnosti, posebno ako je poznato da su navedeni članovi porodice MAGE antigeni kancera, kao što su MAGE-A8 i MAGE-B2. TCR prema pronalasku stoga mogu prepoznati peptide sa visokim procentom identičnosti sekvence koji su izvedeni iz drugih članova porodice MAGE, uključujući MAGE-A8 i MAGE-B2 i prikazani u kontekstu HLA A*02. Prepoznavanje navedenih peptida od strane TCR pronalaska može biti na sličnom ili nižem nivou od prepoznavanja GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02.

[0059] Određeni TCR prema pronalasku mogu imati idealan bezbednosni profil za upotrebu kao terapeutski reagensi. U ovom slučaju TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i poželjno je da budu fuzionisani sa imunim efektorom. Idealan bezbednosni profil znači da pored demonstracije dobre specifičnosti, TCR prema pronalasku možda su prošli dalje prekliničke testove bezbednosti. Primeri takvih testova uključuju testove pune krvi da bi se potvrdilo minimalno oslobađanje citokina u prisustvu pune krvi i samim tim mali rizik od izazivanja sindroma potencijalnog oslobađanja citokina in vivo, i testovi aloreaktivnosti da bi se potvrdio nizak potencijal za prepoznavanje alternativnih tipova HLA.

[0060] Određeni rastvorljivi TCR prema pronalasku mogu biti podložni prečišćavanju visokog prinosa. Visok prinos znači veći od 1%, ili poželjnije veći od 10%, ili veći prinos.

[0061] TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks GVYDGREHTV-HLA-A*02 veći od (tj. jači od) 200 µM, na primer između 1 pM i 200 µM. Određeni TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks od oko 1 pM do oko 400 nM, od oko 1 pM do oko 200 pM, od oko 1 pM do oko 100 pM. Određeni TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks od oko 20-80 pM. TCR prema pronalasku mogu imati poluvreme vezivanja (T1⁄2) za kompleks u opsegu od oko 1 sekunde do oko 60 h, od 1 min do oko 60 h, od oko 20 min do oko 50 h, ili od oko 2 h do oko 35 h. Određeni TCR prema pronalasku mogu imati T1⁄2 za kompleks od oko 8 h do 35 h. TCR koji se koriste kao rastvorljivi terapeutici i/ili dijagnostici kada su spojeni sa detektabilnom oznakom ili terapeutskim agensom poželjno imaju KDza kompleks od oko 1 pM do oko 100 pM, ili od oko 20 pM do oko 80 pM, i/ili poluvreme vezivanja za kompleks od oko 2 h do 60 h, ili od oko 8 h do oko 35 č. Određeni TCR prema pronalasku mogu biti pogodni za adoptivne terapeutske primene; takvi TCR mogu imati KDza kompleks od oko 50 nM do oko 200 µM, ili od oko 100 nM do oko 1 µM i/ili poluživot vezivanja za kompleks od oko 3 sec do oko 12 min.

[0062] Određeni poželjni TCR su u stanju da generišu veoma moćan odgovor T ćelija in vitro protiv ćelija pozitivnih na antigen, posebno onih ćelija koje predstavljaju niske nivoe antigena tipične za ćelije kancera (tj. oko 50 antigena po ćeliji (Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840; Purbhoo et al., (2006). J Immunol 176(12): 7308-7316.)). Takvi TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i vezani za imuni efektor kao što je anti-CD3 antitelo. Odgovor T ćelija koji se meri može biti oslobađanje markera aktivacije T ćelija kao što je interferon γ ili Granzime B, ili ubijanje ćelija, ili druga mera aktivacije T ćelija. Poželjno je da je veoma moćan odgovor onaj sa EC50vrednošću u pM opsegu, na primer 100 pM ili niže.

[0063] Određeni poželjni TCR prema pronalasku imaju afinitet vezivanja i/ili poluvreme vezivanja za kompleks GVYDGREHTV-HLA-A*02 znatno veći od onog kod prirodnog TCR. Povećanje afiniteta vezivanja prirodnog TCR često smanjuje specifičnost TCR za njegov peptid-MHC ligand, a to je demonstrirano u Zhao et al., (2007) J. Immunol, 179:9, 5845-5854. Međutim, takvi TCR prema pronalasku ostaju specifični za kompleks GVYDGREHTV-HLA-A*02, uprkos tome što imaju znatno veći afinitet vezivanja od prirodnog TCR.

[0064] Afinitet vezivanja (obrnuto proporcionalan konstanti ravnoteže KD) i poluživot vezivanja (izražen kao T1⁄2) mogu se odrediti korišćenjem površinske plazmonske rezonance (BIAcore) i/ili oktet metode iz Primera 3 ovde. Biće cenjeno da udvostručavanje afiniteta TCR rezultira prepolovljenjem KD. T1⁄2 se izračunava kao In2 podeljen sa stopom disocijacije (koff). Prema tome, udvostručenje T1⁄2 dovodi do prepolovljenja koff. KDi koffvrednosti za TCR se obično mere za rastvorljive oblike TCR, tj. one oblike koji su skraćeni da bi se uklonili ostaci citoplazmatskog i transmembranskog domena. Poželjno je da se afinitet vezivanja ili poluživot vezivanja datog

2

TCR meri nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, korišćenjem istog protokola analize i uzima se prosek rezultata.

[0065] Za upotrebu kao ciljano sredstvo za isporuku terapeutskih sredstava u ćeliju koja predstavlja antigen, TCR može biti u rastvorljivom obliku (tj. bez transmembranskih ili citoplazmatskih domena). Radi stabilnosti, TCR prema pronalasku, i poželjno rastvorljivi αβ heterodimerni TCR, mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano, na primer, u WO 03/020763. Jedan ili oba ekstracelularna konstantna domena prisutna u αβ heterodimeru pronalaska mogu biti skraćena na C kraju ili C terminusu, na primer za do 15, ili do 10 ili do 8 ili manje aminokiselina. C kraj ekstracelularnog konstantnog domena alfa lanca može biti skraćen za 8 aminokiselina. Jedan ili oba ekstracelularna konstantna domena mogu sadržati jednu ili više mutacija. Ekstracelularna konstanta alfa lanca može imati ostatak asparagina (N) ili lizina (K) na poziciji 4 zbog prirodnog polimorfizma. Za upotrebu u adoptivnoj terapiji, αβ heterodimerni TCR može, na primer, biti transfektovan kao lanci pune dužine koji imaju i citoplazmatski i transmembranski domen. TCR za upotrebu u adoptivnoj terapiji mogu da sadrže disulfidnu vezu koja odgovara onoj koja se nalazi u prirodi između odgovarajućih alfa i beta konstantnih domena, dodatno ili alternativno može biti prisutna ne-nativna disulfidna veza.

[0066] TCR prema pronalasku mogu biti αβ heterodimeri. TCR pronalaska mogu biti u jednolančanom formatu. Jednolančani formati uključuju, ali nisu ograničeni na, αβ TCR polipeptide Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ ili Vα-Vα-L-Vβ-Cβ tipovi, pri čemu su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno, a L je sekvenca linkera (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). Jedan ili oba konstantna domena mogu biti pune dužine, ili mogu biti skraćeni kao što je gore opisano i/ili sadrže mutacije. Ekstracelularna konstanta alfa lanca može imati ostatak asparagina (N) ili lizina (K) na poziciji 4 zbog prirodnog polimorfizma. U određenim primerima izvođenja, jednolančani TCR prema pronalasku mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano u WO 2004/033685. Jednolančani TCR su dalje opisani u WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).

[0067] Kao što će biti očigledno stručnjacima u ovoj oblasti, može biti moguće skratiti sekvence obezbeđene na C-kraju i/ili njegovom N-kraju, za 1, 2, 3, 4, 5 ili više ostataka, bez suštinskog uticaja karakteristike vezivanja TCR.

[0068] Alfa-beta heterodimerni TCR pronalaska obično sadrže sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i/ili sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2. Sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca mogu biti modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 eksona 2 TRAC i Cys2 eksona 2 TRBC1 ili TRBC2. Sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca može biti modifikovana supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu navedeni cisteini formiraju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR. TRBC1 ili TRBC2 mogu dodatno uključiti mutaciju cisteina u alanin na poziciji 75 konstantnog domena i mutaciju asparagina u asparaginsku kiselinu na poziciji 89 konstantnog domena. Konstantni domen može dodatno ili alternativno da sadrži dalje mutacije, supstitucije ili delecije u odnosu na nativnu TRAC i/ili TRBC1/2 sekvencu. Termin TRAC i TRBC1/2 obuhvata prirodne polimofne varijante, na primer od N do K na poziciji 4 TRAC (Bragado et al Int Immunol.1994 Feb;6(2):223-30).

[0069] Ovde su takođe otkrivene varijante, fragmenti i derivati TCR obezbeđenih pronalaskom.

[0070] Ovde su otkrivene čestice koje pokazuju TCR prema pronalasku i uključivanje navedenih čestica u biblioteku čestica. Takve čestice uključuju ali nisu ograničene na fage, ribozome kvasca ili ćelije sisara. Postupci za proizvodnju takvih čestica i biblioteka su poznati u tehnici (na primer, videti WO2004/044004; WO01/48145, Chervin i dr. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184).

[0071] U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira TCR alfa lanac i TCR beta lanac TCR pronalaska i/ili TCR-anti-CD3 fuzionog molekula pronalaska.

[0072] U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je cDNK. Nukleinska kiselina može biti neprirodna i/ili prečišćena i/ili konstruisana. Sekvenca nukleinske kiseline može biti optimizovana kodonom, u skladu sa korišćenim ekspresionim sistemom.

[0073] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku.

[0074] Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju koja sadrži (a) ekspresioni vektor pronalaska, koji kodira alfa i beta lance u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira za čitanje; ili (b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR pronalaska, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR pronalaska. Takve ćelije su posebno korisne u adoptivnoj terapiji. Ćelije pronalaska mogu biti izolovane i/ili rekombinantne i/ili ne-prirodne i/ili projektovane.

[0075] Pošto TCR pronalaska imaju koristi u terapiji usvajanja, pronalazak uključuje ne-prirodnu i/ili prečišćenu i/ili konstruisanu ćeliju, posebno T-ćeliju, koja predstavlja TCR pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje proširenu populaciju T ćelija koje predstavljaju TCR pronalaska. Postoji veliki broj postupaka pogodnih za transfekciju T ćelija nukleinskom kiselinom (kao što

2

su DNK, cDNK ili RNK) koje kodiraju TCR prema pronalasku (videti npr. Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). T ćelije koje eksprimiraju TCR prema pronalasku biće pogodne za upotrebu u lečenju kancera zasnovanom na adoptivnoj terapiji. Kao što će biti poznato stručnjacima u ovoj oblasti, postoji niz pogodnih postupaka pomoću kojih se može sprovesti adoptivna terapija (videti npr. Rosenberg et at., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).

[0076] Rastvorljivi TCR prema pronalasku su korisni za isporuku detektabilnih obeleživača ili terapeutskih agenasa u ćelije koje predstavljaju antigen i tkiva koja sadrže ćelije koje predstavljaju antigen. Oni stoga mogu biti povezani (kovalentno ili na drugi način) sa obeleživačem koja se može detektovati (u dijagnostičke svrhe gde se TCR koristi za detekciju prisustva ćelija koje predstavljaju GVYDGREHTV-HLA-A*02 kompleks); terapeutsko sredstvo; ili deo koji modifikuje PK.

[0077] Primeri ostataka koji modifikuju PK uključuju, ali nisu ograničeni na, PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 i Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28), PASilaciju (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501), albumin (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43) i/ili nestrukturirane polipeptide (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90).

[0078] Obeleživači koje se mogu detektovati u dijagnostičke svrhe uključuju, na primer, fluorescentne obeleživače, radioaktivne obeleživače, enzime, nukleinsko kiselinske probe i kontrastne reagense.

[0079] Terapeutska sredstva koja mogu biti povezana sa TCR pronalaska uključuju imunomodulatore, radioaktivna jedinjenja, enzime (na primer perforin) ili hemoterapeutske agense (na primer, cis-platina). Da bi se osiguralo da se toksični efekti vrše na željenoj lokaciji, toksin bi mogao biti unutar lipozoma koji je povezan sa TCR tako da se jedinjenje polako oslobađa. Ovo će sprečiti štetne efekte tokom transporta u telu i obezbediti da toksin ima maksimalan efekat nakon vezivanja TCR za relevantne ćelije koje prikazuju antigen.

[0080] Drugi pogodni terapeutski agensi uključuju:

• citotoksične agense male molekule, odnosno jedinjenja sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara čija je molekulska težina manja od 700 daltona. Takva jedinjenja mogu takođe da sadrže toksične metale sposobne da imaju citotoksični efekat. Dalje, treba razumeti da ovi citotoksični agensi sa malim molekulima takođe uključuju prolekove, tj. jedinjenja koja se raspadaju ili se konvertuju u fiziološkim uslovima da bi oslobodila citotoksična sredstva. Primeri takvih agenasa obuhvataju cis-platin, derivate majtanzina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etopozid, gemcitabin, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, sorfimer natrijumfotofrin II, temozolomacin, topotekan, trimetreat 27arbour27at, auristatin E vinkristin i doksorubicin;

2

• peptidni citotoksini, tj. proteini ili njihovi fragmenti sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara. Na primer, ricin, toksin difterije, bakterijski egzotoksin A pseudomonasa, Dnaza i Rnaza; • radionuklidi, tj. nestabilni izotopi elemenata koji se raspadaju uz istovremenu emisiju jedne ili više α ili β čestica, ili γ zraka. Na primer, jod 131, renijum 186, indijum 111, itrijum 90, bizmut 210 i 213, aktinijum 225 i astatin 213; helatirajući agensi se mogu koristiti za olakšavanje povezivanja ovih radionuklida sa TCR visokog afiniteta ili njihovim multimerima;

• Imunostimulansi, odnosno imunološki efektorski molekuli koji stimulišu imuni odgovor. Na primer, citokini kao što su IL-2 i IFN-γ,

• Superantigeni i njihovi mutanti;

• TCR-HLA fuzije, npr. fuzija sa kompleksom peptid-HLA, pri čemu je navedeni peptid izveden iz uobičajenog humanog patogena, kao što je Epstein Barr virus (EBV);

• hemokini kao što su IL-8, trombocitni faktor 4, protein koji stimuliše rast melanoma, itd; • antitela ili njihove fragmente, uključujući anti-T ćelija ili NK ćelijska determinantna antitela (npr. anti-CD3, anti-CD28 ili anti-CD16);

• alternativne proteinske skafolde sa karakteristikama vezivanja poput antitela

• aktivatori komplementa;

• ksenogeni proteinski domeni, alogeni proteinski domeni, virusni/bakterijski proteinski domeni, virusni/bakterijski peptidi.

[0081] Jedab poželjan primer izvođenja je obezbeđen pomoću TCR pronalaska koji je povezan (obično fuzijom sa N- ili C-terminusom alfa ili beta lanca) sa anti-CD3 antitelom, ili funkcionalnim fragmentom ili varijantom pomenutog anti-CD3 antitela (takve TCR-anti-CD3 fuzije mogu se nazvati ImmTAC<™>molekulima). Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" obuhvata takve fragmente i varijante. Primeri anti-CD3 antitela uključuju, ali nisu ograničeni na OKT3, UCHT-1, BMA-031 i 12F6. Fragmenti antitela i varijante/analozi koji su pogodni za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisanim ovde uključuju minitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, dsFv i scFv fragmente, Nanobodies<™>(ovi konstrukti, koje prodaje Ablynx (Belgija), koje sadrže sintetički pojedinačni vatrijabilni teški domen imunoglobulina dobijen od antitela kamile (npr. kamile ili lame)) i antitela na domen (Domantis (Belgija), koja sadrže afinitetno sazreli pojedinačni varijabilni teški domen imunoglobulina ili varijabilni laki domen imunoglobulina) ili alternativne proteinske skafolde koje pokazuju karakteristike vezivanja poput antitela, kao što su „Affibodies“ (Affibody (Švedska), koji se sastoji od projektovanog proteina A skela) ili „Antiticalins“ (Pieris (Nemačka)), koji sadrže konstruisane antikaline), da spomenemo samo neke.

[0082] Veza TCR i anti-CD3 antitela može biti preko kovalentnog ili nekovalentnog vezivanja.

2

Kovalentno vezivanje može biti direktno ili indirektno preko linkerske sekvence. Linkerske sekvence su obično fleksibilne, jer su napravljene sastoje prvenstveno od aminokiselina kao što su glicin, alanin i serin koji nemaju glomazne bočne lance koji bi verovatno ograničavali fleksibilnost. Upotrebljive ili linkerske sekvence optimalne dužine se lako određuju. Često će linkerska sekvenca biti manja od oko 12, kao što je manja od 10, ili od 2-10 aminokiselina u dužini. Pogodni linkeri koji se mogu koristiti u TCR pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na: GGGGS (SEQ ID NO: 30), GGGSG (SEQ ID NO: 31), GGSGG (SEQ ID NO: 32), GSGGG (SEQ ID NO: 31). NO: 33), GSGGGP (SEK ID BR: 34), GGEPS (SEQ ID NO: 35), GGEGGGP (SEQ ID NO: 36) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 37) (kao što je opisano u WO2010/133828).

[0083] Određeni poželjni primeri izvođenja anti-CD3-TCR fuzionih konstrukata pronalaska su dati u nastavku:

(Tabela 7)

[0084] Svaki linker SEQ ID NO: 30-37 može se koristiti sa svakim ili bilo kojim od poželjnih primera izvođenja CD3-TCR fuzionih konstrukata. Na primer, fuzija TCR-CD3 koja sadrži alfa lanac SEQ ID NO: 24 i beta lanac SEQ ID NO: 29, pri čemu je beta lanac fuzionisan sa anti-CD3 scFv preko linkera bilo kojeg od SEQ ID NOs : 31-37 je uključen u pronalazak.

[0085] Za neke svrhe, TCR pronalaska mogu biti agregirani u kompleks koji sadrži nekoliko TCR da bi se formirao multivalentni TCR kompleks. Postoji veliki broj humanih proteina koji sadrže multimerizacioni domen koji se može koristiti u proizvodnji multivalentnih TCR kompleksa. Na primer, domen tetramerizacije p53 koji je korišćen za proizvodnju tetramera fragmenata scFv antitela koji su pokazali povećanu postojanost seruma i značajno smanjenu brzinu u poređenju sa monomernim scFv fragmentom (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem.276 (17) 14385-14392). Hemoglobin takođe ima domen tetramerizacije koji bi se mogao koristiti za ovu vrstu primene. Multivalentni TCR kompleks pronalaska može imati poboljšanu sposobnost

2

vezivanja za GVYDGREHTV-HLA-A*02 kompleks u poređenju sa nemultimernim heterodimerom divljeg tipa ili T ćelijskog receptora prema pronalasku. Takvi multivalentni TCR kompleksi prema pronalasku su posebno korisni za praćenje ili ciljanje ćelija koje predstavljaju određene antigene in vitro ili in vivo, i takođe su korisni kao intermedijeri za proizvodnju dodatnih multivalentnih TCR kompleksa koji imaju takvu upotrebu.

[0086] Kao što je dobro poznato u tehnici, TCR mogu biti podložni posttranslacionim modifikacijama. Glikozilacija je jedna takva modifikacija, koja obuhvata kovalentno vezivanje oligosaharidnih delova za definisane aminokiseline u TCR lancu. Na primer, ostaci asparagina, ili ostaci serina/treonina su dobro poznate lokacije za vezivanje oligosaharida. Status glikozilacije određenog proteina zavisi od brojnih faktora, uključujući sekvencu proteina, konformaciju proteina i dostupnost određenih enzima. Štaviše, status glikozilacije (tj. tip oligosaharida, kovalentna veza i ukupan broj veza) može uticati na funkciju proteina. Stoga, kada se proizvode rekombinantni proteini, kontrola glikozilacije je često poželjna. Kontrolisana glikozilacija je korišćena za poboljšanje terapije na bazi antitela. (Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.). Za rastvorljive TCR prema pronalasku glikozilacija se može kontrolisati in vivo, korišćenjem određenih ćelijskih linija na primer, ili in vitro, hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije su poželjne, pošto glikozilacija može poboljšati farmakokinetiku, smanjiti imunogenost i bolje oponašati prirodni humani protein (Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35).

[0087] Za primenu na pacijente, TCR pronalaska (poželjno povezani sa detektabilnim obeleživačem ili terapeutskim agensom ili eksprimirani na transfektovanoj T ćeliji), TCR-anti CD3 fuzioni molekuli, nukleinske kiseline, ekspresioni vektori ili ćelije pronalaska mogu biti obezbeđeni u farmaceutsku kompoziciju zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Terapeutski ili imadžing TCR ili ćelije, u skladu sa pronalaskom, obično će biti isporučeni kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja će normalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka primene na pacijenta). Može se obezbediti u obliku jedinične doze, generalno će biti obezbeđena u zapečaćenom kontejneru i može se obezbediti kao deo kompleta. Takav komplet bi obično (iako ne nužno) uključivao uputstva za upotrebu. Može uključivati veći broj navedenih jediničnih doznih oblika.

[0088] Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za primenu bilo kojim odgovarajućim putem, kao što je parenteralni (uključujući subkutani, intramuskularni ili intravenski), enteralni (uključujući oralni ili rektalni), inhalacioni ili intranazalni putevi. Takve kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u farmaciji, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem(ima) ili ekscipijentom(ima) u sterilnim uslovima.

2

[0089] Doze supstanci iz ovog pronalaska mogu da variraju između širokih granica, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se leči, starosti i stanja pojedinca koji se leči, itd. odgovarajući opsega doza za rastvorljiv TCR pronalaska povezan sa anti-CD3 antitelo može biti između 25 ng/kg i 50 µg/kg. Lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti.

[0090] TCR, farmaceutske kompozicije, vektori, nukleinske kiseline i ćelije pronalaska mogu se obezbediti u suštinski čistom obliku, na primer najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, na najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% čisti.

[0091] Pronalazak takođe obezbeđuje TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinsku kiselinu, farmaceutsku kompoziciju i/ili ćeliju pronalaska za upotrebu u leku, poželjno za upotrebu u postupku lečenja kancera ili tumora. Ovde je otkrivena formulacija za injektiranje za primenu na ljudskog subjekta koja sadrži TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinsku kiselinu, farmaceutsku kompoziciju ili ćeliju pronalaska.

[0092] Kancer može biti kancer dojke, jednjaka, glave i vrata, pluća, jajnika ili bešike. Tumor može da eksprimira MAGE A4 i/ili može biti solidan tumor. TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija ili ćelija pronalaska mogu se primenjivati injekcijom, kao što je intravenska ili direktna intratumoralna injekcija. Ljudski subjekt može biti podtip HLA-A*02.

[0093] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju TCR ili TCR-anti-CD3 fuzionog molekula pronalaska, koji sadrži a) održavanje ćelije prema pronalasku pod optimalnim uslovima za ekspresiju kiseline TCR lanaca i b) izolovanje TCR lanaca.

[0094] Poželjne karakteristike svakog aspekta pronalaska su kao i za svaki drugi aspekt mutatis mutandis.

Opis crteža

[0095]

Slika 1 - daje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnih regiona nativnog MAGE A4 TCR alfa i beta lanca.

Slika 2 - daje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnih regiona rastvorljivog prirodnog MAGE A4 TCR alfa i beta lanca.

Slika 3 - daje primere aminokiselinskih sekvenci mutiranih varijabilnih regiona MAGE A4 TCR alfa lanca.

Slika 4 - daje primere aminokiselinskih sekvenci mutiranih varijabilnih regiona MAGE A4 TCR beta lanca.

Slika 5 - daje primere aminokiselinskih sekvenci alfa lanca MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzionih molekula.

Slika 6 - daje primer aminokiselinskih sekvenci beta lanca MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzionih molekula.

Slika 7 - daje ćelijske podatke koji pokazuju potenciju i specifičnost MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzionih molekula.

Slika 8 - daje ćelijske podatke koji demonstriraju potenciju i specifičnost dodatnih MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzionih molekula.

Slika 9 - daje dodatne dokaze specifičnosti MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzionih molekula Slika 10 - daje dodatne podatke o specifičnosti za MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzione molekule Slika 11 - daje dokaz da MAGE A4 TCR-anti-CD3 fuzioni molekuli dovode do ubijanja ćelija kancera

[0096] Pronalazak je dalje opisan u sledećim neograničavajućim primerima.

Primeri

Primer 1 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje rastvorljivih TCR

Postupak

[0097] DNK sekvence koje kodiraju alfa i beta ekstracelularne regione rastvorljivih TCR prema pronalasku su klonirane odvojeno u ekspresione plazmide zasnovane na pGMT7 korišćenjem standardnih metoda (kao što je opisano u Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbour laboratory press). Ekspresioni plazmidi su odvojeno transformisani u E. coli soj Rosetta (BL21pLysS), a pojedinačne kolonije otporne na ampicilin su uzgajane na 37°C u TYP (+ ampicilin 100 µg/ml) medijumu do OD600od ~0,6-0,8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0,5 mM IPTG. Ćelije su sakupljene tri sata nakon indukcije centrifugiranjem. Ćelijski talozi su lizirani reagensom za ekstrakciju proteina BugBuster (Merck Millipore) prema uputstvima proizvođača. Talozi inkluzionog tela su dobijeni centrifugiranjem. Talozi su dva puta isprani u Triton puferu (50 mM Tris-HCl pH 8,1, 0,5% Triton-X100, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) i na kraju resuspendovani u puferu bez deterdženta (50 mM Tris-HCl pH 0,1, mM NaCl 0,1 10 mM NaEDTA). Prinos proteina inkluzionog tela je kvantifikovan rastvaranjem sa 6 M guanidin-HCl i merenjem OD280. Koncentracija proteina je zatim izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije. Čistoća inkluzionog tela je merena rastvaranjem sa 8M uree

1

i punjenjem ~2 µg na 4-20% SDS-PAGE pod redukcionim uslovima. Čistoća je zatim procenjena ili izračunata korišćenjem softvera za denzitometriju (Chemidoc, Biorad). Inkluziona tela su čuvana na 4°C za kratkotrajno skladištenje i na -20°C ili -70°C za dugotrajno skladištenje.

[0098] Za ponovno savijanje rastvorljivog TCR, inkluziona tela koja sadrže α i β lanac su prvo pomešana i razblažena u 10 ml pufera za solubilizaciju/denaturaciju (6 M guanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCI pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM DTT) nakon čega sledi inkubacija od 30 min na 37°C. Ponovno savijanje je zatim započeto daljim razblaživanjem u 1 L pufera za ponovno savijanje (100 mM Tris pH 8,1, 400 mM L-arginin HCL, 2 mM EDTA, 4 M uree, 10 mM cisteamin hidrohlorida i 2,5 mM cistamin dihidrohlorida) i rastvor je dobro pomešan. Ponovo savijena smeša je dijalizovana protiv 10 L H2O tokom 18-20 sati na 5°C ± 3°C. Posle ovog vremena, pufer za dijalizu je dva puta zamenjen sa 10 mM Tris pH 8,1 (10 L) i dijaliza je nastavljena još 15 sati. Smeša za ponovno savijanje je zatim filtrirana kroz celulozne filtere od 0,45 µm.

[0099] Prečišćavanje rastvorljivih TCR je započeto nanošenjem dijaliziranog ponovo savijenog proizvoda na POROS<®>50HQ anjonsko izmenjivačku kolonu i eluiranjem vezanog proteina sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM Tris pH 8,1 preko 50 zapremina kolone korišćenjem Akta<®>prečišćivača (GE Healthcare). Maksimalne TCR frakcije su identifikovane pomoću SDS PAGE pre nego što su objedinjene i koncentrovane. Koncentrovani uzorak je zatim nanet na Superdex<®>75HR kolonu za gel filtraciju (GE Healthcare) prethodno ekvilibrisanu u Dulbeccoovom PBS puferu. Maksimalne TCR frakcije su sakupljene i koncentrovane i izračunat je konačni prinos prečišćenog materijala.

Primer 2 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje ImmTAC molekula (rastvorljivi TCR-anti CD3 fuzioni molekuli)

Postupak

[0100] Priprema ImmTAC je izvedena kao što je opisano u Primeru 1, osim što je TCR beta lanac fuzionisan preko linkera sa anti-CD3 jednolančanim antitelom. Pored toga, izveden je korak izmene katjona tokom prečišćavanja nakon izmene anjona. U ovom slučaju frakcije pikova iz anjonske razmene su razblažene 20 puta u 20mM MES (pH6,5) i nanete na POROS<®>50HS kolonu za izmenu katjona. Vezani protein je eluiran sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM MES. Maksimalne ImmTAC frakcije su sakupljene i podešene na 50 mM Tris pH 8,1, pre nego što su koncentrovane i nanete direktno na matricu za gel filtraciju kao što je opisano u Primeru 1.

2

Primer 3 - Karakterizacija vezivanja

[0101] Analiza vezivanja prečišćenih rastvorljivih TCR i ImmTAC molekula za relevantni kompleks peptid-HLA sprovedena je površinskom plazmonskom rezonancom, korišćenjem BIAcore 3000 ili BIAcore T200 instrumenta, ili interferometrijom biosloja, korišćenjem ForteBio Octet instrumenta). Biotinilovani molekuli HLA-A*02 klase I su ponovo presavijeni sa peptidom od interesa i prečišćeni korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). Sva merenja su obavljena na 25°C u Dulbeccovom PBS puferu, dopunjenim sa 0,005% P20.

BIAcore metoda

[0102] Biotinilovani peptid-HLA monomeri su imobilisani na CM-5 senzorskim čipovima spojenim sa streptavidinom. Konstante ravnoteže vezivanja su određene korišćenjem serijskih razblaženja rastvorljivog TCR / ImmTAC injektiranih pri konstantnoj brzini protoka od 30 µl min<-1>preko protočne ćelije obložene sa ~200 jedinica odgovora (RU) kompleksa peptid-HLA-A*02. Ravnotežni odgovori su normalizovani za svaku koncentraciju TCR oduzimanjem puferskog odgovora na kontrolnoj protočnoj ćeliji koja sadrži irelevantan peptid-HLA. KDvrednost je dobijena aproksimacijom nelinearne krive korišćenjem softvera Prism i Langmuirove izoterme vezivanja, vezano = C*Max/(C KD), gde je „vezano“ ravnotežno vezivanje u RU pri injektiranoj koncentraciji TCR C, a Max je maksimalno vezivanje.

[0103] Za interakcije visokog afiniteta, parametri vezivanja su određeni analizom kinetike jednog ciklusa. Pet različitih koncentracija rastvorljivog TCR/ImmTAC je ubrizgano preko protočne ćelije obložene sa ~100 - 200 RU kompleksa peptid-HLA koristeći brzinu protoka od 50-60 µl min<-1>. Tipično, 60-120 µl rastvorljivog TCR/ImmTAC je ubrizgano u najvišoj koncentraciji od 100-200 nM, uz uzastopna 2-struka razblaženja koja su korišćena za ostale četiri injekcije. Prvo je ubrizgana najniža koncentracija. Da bi se izmerila faza disocijacije, pufer je zatim ubrizgavan dok se ne dogodi ≥ 10% disocijacije, obično posle 1 - 3 sata. Kinetički parametri su izračunati korišćenjem BIAevaluation<®>softvera. Faza disocijacije je prilagođena jednoj eksponencijalnoj jednačini raspada koja omogućava izračunavanje vremena poluraspada. Konstanta ravnoteže KDizračunata je iz koff/kon.

Metod okteta

[0104] Biotinilovani peptid-HLA monomeri su uhvaćeni na 1 nm na (SA) streptavidin biosenzore (Pall ForteBio) prethodno imobilizovane sa streptavidinom. Senzori su blokirani slobodnim biotinom (2 µM) tokom 2 minuta. Konstante ravnoteže vezivanja su određene uranjanjem napunjenih biosenzora u rastvorljiv TCR/ImmTAC serijski razblažen u ploči za uzorke sa 96 ili 384 bunarića. Mućkanje ploče je podešeno na 1000 obrtaja u minuti. Za interakcije niskog afiniteta (opseg µM) korišćeno je kratko vreme povezivanja (~2 minuta) i kratko vreme disocijacije (~2 minuta). Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem referentnih biosenzora napunjenih irelevantnim pHLA koristeći Octet Data Analisis Software (Pall ForteBio). Odgovori (nm) u ravnoteži su korišćeni za procenu KDvrednost iz dijagrama stabilnog stanja prilagođenih jednačini Odgovor = Rmax*konc/(KD konc), gde je "odgovor" ravnotežno vezivanje u nm pri svakoj koncentraciji TCR (konc) i Rmax je maksimalni odgovor vezivanja pri pHLA zasićenju.

[0105] Za interakcije visokog afiniteta (opseg nM - pM), kinetički parametri su određeni iz krivih vezivanja pri ≥ 3 koncentracijama TCR/ImmTAC tipično 10 nM, 5 nM i 2,5 nM. Vreme povezivanja je bilo 30 minuta, a vreme disocijacije 1-2 sata. Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem referentnih biosenzora napunjenih irelevantnim pHLA i blokiranih biotinom. Kinetički parametri koni koffizračunati su globalnim uklapanjem direktno na krive vezivanja korišćenjem Octet Data Analisis Software (Pall ForteBio). KDizračunato je iz koff/koni polu-život disocijacije je izračunat iz t1/2= 0,693/koff.

Primer 4 - Karakterizacija vezivanja nativnog TCR

[0106] Rastvorljivi prirodni TCR je pripremljen prema postupcima opisanim u Primeru 1, a vezivanje za pHLA je analizirano u skladu sa Primerom 3. Aminokiselinske sekvence alfa i beta lanaca su odgovarale onima prikazanim na Slici 2. Rastvorljivi biotinilovani HLA-A*02 je pripremljen sa MAGE A4 peptidom GVYDGREHTV i imobilisan na BIAcore senzorski čip.

Rezultati

[0107] Vezivanje je određeno pri različitim koncentracijama i KDvrednost za interakciju je određena na 142 µM. Unakrsna reaktivnost (specifičnost) je procenjena u odnosu na panel od 15 irelevantnih peptidnih HLA-A*02 kompleksa korišćenjem ravnotežne BIAcore metode iz Primera 3.15 irelevantnih pHLA je spojeno u tri grupe i stavljeno na jednu od tri protočne ćelije, da bi se dobilo približno 1000 RU svake pHLA po protočnoj ćeliji. 20 µL rastvorljivog divljeg

4

tipa TCR je ubrizgano u koncentracijama od 73 µM preko svih protočnih ćelija brzinom od 20 µL/min. Ni u jednoj koncentraciji nije otkriveno značajno vezivanje, što ukazuje da je nativni TCR specifičan za kompleks GVYDGREHTV-HLA-A*02.

[0108] Ovi podaci ukazuju da se ovaj TCR vezuje za ciljno mesto sa odgovarajućim afinitetom i specifičnošću i stoga obezbeđuje korisnu početnu sekvencu za terapeutske TCR.

Primer 5 - Karakterizacija vezivanja rastvorljivih mutiranih TCR i ImmTAC molekula pronalaska

[0109] Rastvorljivi mutirani TCR i ImmTAC molekuli su proizvedeni na osnovu sekvenci datih na Slici 2. Uzorci su pripremljeni kako je opisano u Primerima 1 i 2, a karakteristike vezivanja su određene prema Primeru 3.

Rezultati

[0110] Utvrđeno je da jedna tačka mutacije cisteina i valina na poziciji 19 alfa lanca (SEQ ID NO: 6) poboljšava ponovno savijanje i prinos prečišćavanja bez uticaja na afinitet ili specifičnost (KDjer je zabeleženo kao 145 µM i nije primećena unakrsna reaktivnost na istom panelu od 15 alternativnih peptidnih HLA kompleksa koji su testirani sa WT).

[0111] Identifikovani su TCR alfa i/ili beta lanci koji sadrže mutacije u najmanje jednom CDR regionu u odnosu na CDR sekvence prikazane na Slici 2 (SEQ ID NO: 4 i 5). Ove TCR sekvence su prepoznale GVYDGREHTV HLA-A*02 kompleks sa posebno pogodnim afinitetom i/ili poluživotom. U nekim slučajevima identifikovane su dalje mutacije koje su poboljšale stabilnost i/ili prinos TCR, uključujući mutaciju alfa lanca K1A (sa referencom na numerisanje SEQ ID NO: 4). Aminokiselinske sekvence određenih mutiranih TCR alfa i beta lanaca varijabilnih regiona pronalaska su date na slikama 4 i 5 respektivno. Tabela ispod daje karakteristike vezivanja za rastvorljive TCR ili ImmTAC molekule (rastvorljive TCR anti-CD3 fuzione molekule) koje sadrže naznačene alfa i beta varijabilne regione.

(Tabela 9)

nd = nije utvrđeno

<a>Odgovara ImmTAC3 iz primera 6, pune sekvence alfa i beta lanca date su pomoću SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 44 respektivno. Vrednosti zasnovane na proseku iz 7 nezavisnih merenja

[0112] Dodatne kombinacije alfa i beta varijabilnih regiona koje sadrže mutacije pronalaska su testirane na vezivanje za GVYDGREHTV HLA-A*02 kompleks. Podaci predstavljeni u tabeli ispod su dobijeni korišćenjem Biacore, kao što je gore opisano. Navedene sekvence alfa i beta varijabilnog domena su pripremljene kao ImmTAC molekuli. Sledeće kombinacije odgovarajućih alfa i beta lanaca varijabilnih domena nisu u okviru pronalaska: (i) SEQ ID NO:62; i SEQ ID NO:5; (ii) SEQ ID NO:63; i SEQ ID NO:5; (iii) SEQ ID NO:64; i SEQ ID NO:5; (iv) SEQ ID NO:61; i SEQ ID NO:80; i (v) SEQ ID NO:61; i SEQ ID NO:81.

(Tabela 10)

[0113] Podaci predstavljeni u tabelama 9 i 10 ukazuju na to da određene TCR varijabilne sekvence pronalaska imaju visok afinitet vezivanja i dug polu-život za GVYDGREHTV HLA-A*02 kompleks, i stoga su posebno pogodne za upotrebu kao rastvorljivi terapeutski reagensi.

[0114] Pored vezivanja srodnog GVYDGREHTV HLA-A*02 kompleksa, TCR pronalaska su takođe procenjeni na vezivanje za slične peptide izvedene iz MAGE A8 i MAGE B2 i predstavljene sa HLA-A*02. Brojevi u tabeli ispod daju podatke o vezivanju Biacore za tri ImmTAC molekula koji sadrže naznačene sekvence alfa i beta varijabilnog domena. Sva tri ImmTAC molekula prepoznaju peptid MAGE-A8 na sličnom nivou kao srodni peptid i MAGE-B2 peptid na slabijem nivou.

(Tabela 11)

Primer 6 - Snažno i specifično preusmeravanje T ćelija pomoću ImmTAC molekula

[0115] ImmTAC molekuli koji sadrže mutirane sekvence alfa i beta varijabilnog lanca sa posebno visokim afinitetom za ciljni antigen testirani su na njihovu sposobnost da posreduju u snažnom i specifičnom preusmeravanju CD3+ T ćelija ELISPOT testom, koristeći izlučivanje interferona-γ (IFN-γ) kao očitavanje za aktivaciju T ćelija.

[0116] U ovom primeru, sekvenca varijabilnog regiona alfa lanca je izabrana od SEQ ID NOs: 20-24, a sekvenca varijabilnog regiona beta lanca je izabrana od SEQ ID NOs: 26-29. Sekvence varijabilnog domena su fuzionisane za odgovarajuće alfa ili beta sekvence ekstracelularnog konstantnog domena i sadržale su ne-nativnu disulfidnu vezu. U svakom slučaju, beta lanac je fuzionisan preko linkera sa anti-CD3 scFv; linker je izabran od SEQ ID NOs: 30-37. Pune sekvence testiranih ImmTAC molekula obezbeđene su pomoću SEQ ID NOs navedenim u sledećoj tabeli:

(Tabela 12)

Postupak

[0117] Testovi su izvedeni korišćenjem humanog IFN-γ ELISPOT kompleta (BD Biosciences). Ciljne ćelije su pripremljene u gustini od 1 × 10<6>/ml u medijumu za ispitivanje (RPMI 1640 koji sadrži 10% toplotno inaktivirani FBS i 1% penicilin-streptomicin-L-glutamin) i naneti na 50000 ćelija po otvoru u zapremini od 50 µl. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), izolovane iz sveže donorske krvi, korišćene su kao efektorske ćelije i postavljene u 10000 - 50000 ćelija po bunarčiću u zapremini od 50 µl (tačan broj ćelija korišćenih za svaki eksperiment zavisi od donora i može biti prilagođen da proizvede odgovor u okviru odgovarajućeg opsega za test). Korišćene su različite koncentracije ImmTAC, koje obuhvataju očekivani klinički relevantan opseg, i dodavane su u bunarčić u zapremini od 50 µl.

[0118] Ploče su pripremljene prema uputstvima proizvođača. Ciljne ćelije, efektorske ćelije i ImmTAC molekuli su dodati u relevantne bunarčiće i dopunjeni do konačne zapremine od 200 µl sa medijumom za ispitivanje. Sve reakcije su izvedene u tri primerka. Kontrolni bunarčići su takođe pripremljeni bez ImmTAC, efektorskih ćelija ili ciljnih ćelija. Ploče su zatim inkubirane preko noći (37°C/5% CO2). Sledećeg dana ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje (1 x PBS kesica, koja sadrži 0,05% P20, pripremljena u dejonizovanoj vodi). Primarno detekciono antitelo je zatim dodato u svaki bunarčić u zapremini od 50 µl. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 2 sata pre nego što su ponovo isprane tri puta. Sekundarna detekcija je izvedena dodavanjem 50 µl razblaženog streptavidina-HRP u svaki bazenčić i inkubacijom na sobnoj temperaturi 1 sat i korak ispiranja je ponovljen. Ne više od 15 minuta pre upotrebe, jedna kap (20

4

µl) AEC hromogena je dodata u svakih 1 ml AEC supstrata i izmešana i dodato je 50 µl u svaki bunarčić. Razvoj mrlja je redovno praćen i ploče su isprane u vodi iz slavine da bi se prekinula razvoj reakcije. Ploče su zatim ostavljene da se osuše na sobnoj temperaturi najmanje 2 sata pre brojanja tačaka korišćenjem CTL analizatora sa softverom Immunospot (Cellular Technology Limited).

Rezultati

[0119] Podaci predstavljeni na slikama 7 i 8, gornji paneli, pokazuju da su ImmTAC molekuli 1-2 i 3-5 u stanju da posreduju snažno (tj. EC50manje od 100 pM) preusmeravanje T ćelija protiv ćelija kancera koje eksprimiraju ciljni antigen (NCI-H1703 - ćelijska linija humanog kancera pluća). Nije otkrivena aktivacija T ćelija protiv antigen-negativnih ćelija kancera (ćelijska linija humanog papilarnog adenokarcinoma NCI-H441 za ImmTAC molekule 1-2 i CAMA-1 ćelijska linija humanog kancera dojke za ImmTAC molekule 3-5), u okviru klinički relevantnog opsega koncentracija (≤ 1 nM), što pokazuje da je odgovor specifičan.

[0120] ImmTAC molekuli su testirani na specifičnost korišćenjem ćelija dobijenih iz normalnih zdravih humanih tkiva kao ciljnih ćelija. Donji panel na slici 7 pokazuje da ImmTAC molekuli 1-2 imaju minimalnu reaktivnost u klinički relevantnoj koncentraciji prema vaskularnim ćelijama humane kože. Slično, donji paneli na Slici 8 pokazuju da ImmTAC molekuli 3-5 imaju minimalnu reaktivnost u klinički relevantnoj koncentraciji protiv vaskularnih ćelija ljudske kože i humanih bubrežnih ćelija.

[0121] ImmTAC molekuli 1 i 3 su dalje testirani na specifičnost protiv panela humanih ćelija izvedenih iz normalnih zdravih tkiva korišćenjem iste ELISPOT metodologije opisane gore. Podaci predstavljeni na Slici 9 pokazuju ograničenu aktivaciju T ćelija, unutar klinički relevantnog opsega koncentracija (≤ 1 nM), za zdrava tkiva uključujući kožne vaskularne, srčane, skeletne, jetre i pluća.

[0122] ImmTAC molekuli 1 i 4 su dodatno testirani na reaktivnost prema proširenom panelu od >10 normalnih tipova ćelija, koristeći istu ELISPOT metodologiju opisanu gore i sa finijim opsegom ImmTAC koncentracija (0,01 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,3 nM, 0,5 nM i 1 nM). Slika 10 prikazuje reprezentativne podatke dobijene iz skeletnih, srčanih i bubrežnih ćelija. U svakom slučaju, antigen pozitivne ćelije (NCI-H1703) i antigen negativne ćelije (NCI-H441) su uključene kao kontrole. Podaci pokazuju zanemarljivu reaktivnost prema normalnim ćelijama, u odnosu na ćelije pozitivne na antigen, unutar klinički relevantnog opsega koncentracija (≤ 1 nM).

[0123] Ovi podaci pokazuju da ovi ImmTAC molekuli pokazuju visok nivo potencije i specifičnosti i stoga su posebno pogodni za terapeutsku upotrebu.

Primer 7 - Snažno ubijanje tumorskih ćelija pomoću ImmTAC preusmerenih T ćelija

[0124] Sposobnost ImmTAC molekula pronalaska da posreduju u snažnom preusmerenom T ćelijskom ubijanju antigen-pozitivnih tumorskih ćelija je ispitana korišćenjem IncuCite platforme (Essen BioScience). Ovaj test omogućava detekciju u realnom vremenu mikroskopijom oslobađanja kaspaze-3/7, markera za apoptozu.

Metod

[0125] Testovi su izvedeni korišćenjem kompleta za analizu apoptoze Caspase-3/7 sa 96 bunarčića CellPlayer (Essen BioScience, kat. br. 4440) i sprovedeni prema protokolu proizvođača. Ukratko, ciljne ćelije (NCI-H1703 - antigen<+ve>HLA A*02<+ve>i NCI-H441 -antigen<-ve>HLA A*02<+ve>) su postavljene u 5000 ćelija po bunarčiću i inkubirane preko noći da bi im se omogućilo da prianjaju. ImmTAC rastvori su pripremljeni u koncentracijama između 0,5 nM do 0,01 nM, i 25 µl svake koncentracije je dodato u relevantni bunarčić. Efektorske ćelije su korišćene u odnosu efektorskih ciljnih ćelija od 10:1 (50000 ćelija po bunarčiću). Takođe je pripremljen kontrolni uzorak bez ImmTAC. NucView reagens za analizu je napravljen na 30 µM i 25 µl je dodato u svaki bunar i konačna zapremina je dovedena do 150 µl (dajući 5 µM konačne konc.). Ploča je stavljena u instrument IncuCite i slike su snimane svaka 2 sata (1 slika po otvoru) tokom 3 dana. Broj apoptotičkih ćelija na svakoj slici je određen i zabeležen kao apoptotičke ćelije po mm<2>. Testovi su izvedeni u tri primerka.

Rezultati

[0126] Podaci predstavljeni na slici 11 pokazuju ubijanje tumorskih ćelija u realnom vremenu od strane ImmTAC preusmerenih T ćelija. Rezultati su predstavljeni za ImmTAC1 i ImmTAC4. Oba ImmTAC molekula pokazuju preusmereno ubijanje T ćelija pozitivnih na antigen tumorskih ćelija u koncentraciji od 0,01 nM. Nije primećeno ubijanje antigen negativnih ćelija čak ni pri najvišoj koncentraciji (0,5 nM).

[0127] Ovi podaci potvrđuju da ImmTAC1 i immTAC4 posreduju u snažnom preusmerenom T ćelijskom ubijanju antigen-pozitivnih tumorskih ćelija.

Claims

Patentni zahtevi

1. T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks i koji sadrži varijabilni domen TCR alfa lanca i varijabilni domen TCR beta lanca, pri čemu:

4

2. TCR prema zahtevu 1, naznačen time što varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24 i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29.

3. TCR prema zahtevu 1, naznačen time što varijabilni domen TCR alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22 i varijabilni domen TCR beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26.

4. TCR prema zahtevu 1, koji je

(a) alfa-beta heterodimer, koji ima sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2, ili

(b) u formatu jednog lanca tipa Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ,

pri čemu su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno, a L je sekvenca linkera.

5. TCR prema zahtevu 4, koji je alfa-beta heterodimer, pri čemu su sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 od TRAC i Cys2 egzona 2 od TRBC1 ili TRBC2, i/ili izborno, sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca su modifikovani supstitucijom

4

cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu navedeni cisteini formiraju ne-nativnu disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.

6. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu koji je povezan sa obeleživačem koji se može detektovati, terapeutskim agensom ili grupom koja modifikuje PK, izborno pri čemu je anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR, izborno pri čemu je anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za C- ili N-terminus beta lanca TCR preko linkerske sekvence, izborno pri čemu je linkerska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO: 30), GGGSG (SEQ ID NO: 31), GGSGG (SEQ ID NO: 32), GSGGG (SEQ ID NO: 33), GSGGGP (SEQ ID NO: 34), GGEPS (SEQ ID NO: 35), GGEGGGP (SEK ID BR: 36), i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 37).

7. TCR-anti-CD3 fuzioni molekul u kome:

4

pri čemu je anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za N-terminus ili C-terminus TCR beta lanca preko linkerske sekvence odabrane od SEQ ID NO: 30-37.

8. TCR-anti CD3 fuzioni molekul prema zahtevu 7, koji sadrži

(a) aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 38 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 42;

(b) aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 38 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 43;

(c) aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 39 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 44;

(d) aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 40 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 45; ili

(e) aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 41 i aminokiselinsku

4

sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 45.

9. TCR-anti CD3 fuzioni molekul prema zahtevu 7, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 40 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 45.

10. TCR-anti CD3 fuzioni molekul prema zahtevu 7, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu alfa lanca koja odgovara SEQ ID NO: 38 i aminokiselinsku sekvencu beta lanca koja odgovara SEQ ID NO: 42.

11. Nukleinska kiselina koja kodira TCR alfa lanac i TCR beta lanac prema bilo kom od prethodnih zahteva.

12. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 11.

13. Ekspresioni vektor prema zahtevu 12, naznačen time što vektor sadrži prvi otvoreni okvir čitanja koji kodira TCR alfa lanac i drugi otvoreni okvir čitanja koji kodira TCR beta lanac.

14. Ćelija u kojoj se nalazi

(a) ekspresioni vektor prema zahtevu 12 ili 13 koji kodira TCR alfa i beta lance prema bilo kom od zahteva 1 do 10, u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja; ili

(b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 10, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR prema bilo kom od zahteva od zahteva 1 do 10.

15. Ćelija koja se ne pojavljuje u prirodi, posebno T-ćelija, koja prikazuje TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 6.

16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži TCR prema bilo kom od zahteva 1-6, TCR-anti CD3 fuzioni molekul prema zahtevima 7-10, nukleinsku kiselinu prema zahtevu 11, i/ili ćeliju prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.

4

17. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 6, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul prema zahtevima 7-10, nukleinska kiselina prema zahtevu 11, farmaceutska kompozicija prema zahtevu 16 i/ili ćelija prema zahtevu 14 ili 15, za upotrebu u leku.

18. TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija i/ili ćelija za upotrebu prema zahtevu 17, pri čemu je TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija ili ćelija za upotrebu u postupku lečenja kancera ili tumora, poželjno kod humanog subjekta.

19. TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija i/ili ćelija za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu (i) humani subjekat ima tumor koji eksprimira MAGE A4, (ii) tumor je solidni tumor, (iii) humani subjekat je podtipa HLA-A*02 i/ili (iv) TCR, TCR-anti-CD3 fuzioni molekul, nukleinska kiselina, farmaceutska kompozicija ili ćelija se primenjuju injekcijom, kao što je intravenska ili direktna intratumoralna injekcija.

20. Postupak za proizvodnju TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 6, ili TCR-anti-CD3 fuzionog molekula prema bilo kom od zahteva 7 do 10, koji sadrži a) održavanje ćelije prema zahtevu 14 pod optimalnim uslovima za ekspresiju TCR lanaca i b) izolovanje TCR lanaca.