RS63501B1

RS63501B1 - T ćelijski receptori specifični za kompleks tumorskog antigena ny-eso-1 sa hla-a*02

Info

Publication number: RS63501B1
Application number: RS20220770A
Authority: RS
Inventors: Fiona Chester; Andrew Alexander Knox; Jonathan Patrick Lowther; Viren Vinubhai Patel; Emma Elizabeth Baston; Ruth Martinez Hague
Original assignee: Immunocore Ltd
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2022-09-30
Also published as: ES2923026T3; MY196179A; AU2016375994B2; US20190002523A1; SI3394094T1; PT3394094T; PL3394094T3; RU2018122795A; HRP20221021T1; US11639374B2; CN109476723A; EP3394094B1; DK3394094T3; KR20180090374A; GB201522592D0; SMT202200336T1; HUE059484T2; IL260151A; JP6985274B2; LT3394094T

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na T ćelijske receptore (TCR) koji vezuju HLA-A*02 restriktivni peptid SLLM-WITQC izveden iz antigena kancera NY-ESO-1. Navedeni TCR mogu da sadrže mutacije unutar alfa i/ili beta varijabilnih domena u odnosu na nativni NY-ESO-1 TCR. TCR prema pronalasku su posebno pogodni za upotrebu kao novi imunoterapeutski reagensi za lečenje malignih bolesti.

Osnova pronalaska

[0002] T ćelijski receptori (TCR) su prirodno eksprimirani od strane CD4<+>i CD8<+>T ćelija. TCR su dizajnirani da prepoznaju kratke peptidne antigene koji se prikazuju na površini ćelija koje predstavljaju antigen u kompleksu sa molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) (kod ljudi, MHC molekuli su takođe poznati kao humani leukocitni antigeni ili HLA) (Davis, et al., (1998), Annu Rev Immunol 16: 523-544). CD8<+>T ćelije, koje se takođe nazivaju citotoksične T ćelije, specifično prepoznaju peptide vezane za MHC klasu I i generalno su odgovorne za pronalaženje i posredovanje u uništavanju inficiranih ili kancerogenih ćelija.

[0003] NY-ESO-1 pripada porodici antigena kancera kodiranih klicinom linijom (Chen, et al., (1997), Citogenet Cell Genet 79(3-4): 237-240: WO9814464) i ima Uniprot pristupni broj P78358. Utvrđeno je da se takvi antigeni klicine linije često eksprimiraju u različitim vrstama karcinoma, dok je njihova ekspresija u normalnim tkivima ograničena na odrasle testise i druga privilegovana imunološka mesta. Specifična priroda ovih antigena za kancer čini ih idealnim ciljnim mestima za terapiju protiv kancera. Precizna funkcija NY-ESO-1 ostaje nepoznata, ali je njegova ekspresija prijavljena u fetalnim i odraslim testisima (Satie, et al., (2002), Lab Invest 82(6): 775-780), jajnicima i miometrijumu materice, kao i kod širokog spektra kancera uključujući mijelom (Andrade, et al., (2008), Cancer Immun 8: 2), kanceru jajnika (Odunsi, et al., (2003), Cancer Res 63(18): 6076-6083), nesitnoćelijskom kanceru pluća (Konishi, et al., (2004), Oncol Rep 11(5): 1063-1067) i melanomu (Barrov, et al., (2006), Clin Cancer Res 12 (3 Pt 1): 764-771). 9-merni peptid SLLMWITQC (SEQ ID NO 1) odgovara aminokiselinama 157-165 pune dužine NY-ESO-1 proteina. Isti peptid se takođe nalazi u LAGE-1A (pristupni br. O75638-2), alternativnom antigenu kancera (Lethe, et al., (1998), Int J Cancer 76(6): 903-908).

Ovaj peptid se vezuje za HLA-A*02 i kompleks peptid-HLA je u stanju da stimuliše citotoksične T ćelije koje dovode do lize NY-ESO-1<+>, HLA-A*02<+>, tumorskih ćelija (Duffour, et al., (1999), Eur J Immunol 29(10): 3329-3337 i WO2000020445). Kompleks SLLMWITQC HLA-A*02 stoga pruža koristan ciljni antigen za imunoterapeutsku intervenciju.

[0004] Identifikacija određenih TCR sekvenci koje se vezuju za SLLMWITQC HLA-A*02 kompleks je korisna za razvoj novih imunoterapija. Takvi terapeutski TCR se mogu koristiti, na primer, kao rastvorljivi agensi za ciljno delovanje u svrhu isporuke citotoksičnih ili imunoloških efektorskih agenasa u tumor (Lissin, et al., (2013). "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707-711; Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987), ili alternativno mogu se koristiti za konstruisanje T ćelija za adaptivnu terapiju (June, et al., (2014), Cancer Immunol Immunother 63(9): 969-975). Poželjno je da TCR za imunoterapeutsku upotrebu budu u stanju da snažno prepoznaju ciljni antigen, čime se podrazumeva da TCR treba da poseduje visok afinitet i/ili dugo vreme polu-života vezivanja za ciljni antigen kako bi izvršio snažan odgovor. TCR kakvi postoje u prirodi obično imaju nizak afinitet za ciljni antigen (nizak mikromolarni opseg), tako da je često potrebno identifikovati mutacije, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije, insercije i/ili delecije, koje se mogu napraviti datoj TCR sekvenci u cilju poboljšanja vezivanja antigena. Za upotrebu kao rastvorljivih ciljanih agenasa, poželjniji su afiniteti vezivanja TCR antigena u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu i sa poluživotom vezivanja od nekoliko sati. Takođe je poželjno da terapeutski TCR pokažu visok nivo specifičnosti za ciljni antigen da bi se ublažio rizik od toksičnosti u kliničkim primenama kao rezultat vezivanja van ciljnog mesta. Ovakva visoka specifičnost može biti posebno izazovna za postizanje s obzirom na prirodnu degeneraciju prepoznavanja TCR antigena (Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177; Wilson, et al., (2004), Mol Immunol 40(14-15): 1047-1055). Konačno, poželjno je da terapeutski TCR mogu da se eksprimiraju i prečiste u visoko stabilnom obliku.

[0005] Ovde definisane TCR sekvence su opisane sa referencom na IMGT nomenklaturu koja je široko poznata i dostupna onima koji rade u oblasti TCR. Na primer, videti: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011 (6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O; i Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. αβ TCR se sastoje od dva disulfidno povezana lanca. Svaki lanac (alfa i beta) se generalno smatra da ima dva domena, naime varijabilni i konstantni domen. Kratki spojni region povezuje promenljive i konstantne domene i obično se smatra delom promenljivog regiona. Pored toga, beta lanac obično sadrži kratak region raznolikosti između varijabilnog i spojnog regiona.

[0006] Varijabilni domen svakog lanca nalazi se na N-terminusu i sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) ugrađena u okvirnu sekvencu. CDR regioni sadrže mesto prepoznavanja za vezivanje peptida-MHC. Postoji nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione alfa lanca (Vα) i nekoliko gena koji kodiraju varijabilne regione beta lanca (Vβ). Ovi geni se razlikuju po svom okviru, CDR1 i CDR2 sekvencama i delimično definisanom CDR3 sekvencom. Geni Vα i Vβ se u IMGT nomenklaturi pominju prefiksima 'TRAV' i 'TRBV' respektivno (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Slično, postoji nekoliko spajajućih ili J gena, nazvanih 'TRAJ' ili 'TRBJ', za alfa i beta lanac respektivno, a za beta lanac, gen za raznolikost ili D nazvan 'TRBD' (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Ogromna raznolikost sekvenci alfa i beta varijabilnih regiona rezultat je kombinatornih preuređivanja između različitih V, J i D gena, koji uključuju alelne varijante, i dodatne spojne raznolikosti (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107). Konstantni, ili C, regioni TCR alfa i beta lanaca se nazivaju 'TRAC' i 'TRBC' respektivno (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Dodatak 1O).

[0007] U ovoj specifikaciji i zahtevima, termin "TCR alfa (ili α) varijabilni domen" odnosi se na spajanje TRAV i TRAJ regiona; samo TRAV region; ili TRAV i delimični TRAJ region, a termin TCR alfa (ili α) konstantni domen se odnosi na ekstracelularni TRAC region, ili na skraćenu C-terminalnu ili TRAC sekvencu pune dužine. Slično, termin "TCR beta (ili β) varijabilni domen" može se odnositi na spajanje TRBV i TRBD/TRBJ regiona; samo za regione TRBV i TRBD; samo za regione TRBV i TRBJ; ili na TRBV i delimične TRBD i/ili TRBJ regione, a termin TCR beta (ili β) konstantni domen se odnosi na ekstracelularni TRBC region, ili na C-terminalnu skraćenu ili TRBC sekvencu pune dužine.

[0008] TCR koji ciljno deluju na NI-ESO-1 su ranije prijavljeni (WO05113595; WO08039818; McCormack, et al., (2013), Cancer Immunol Immunother 62(4): 773-785).

[0009] Pronalazači su identifikovali alternativne TCR alfa i beta sekvence varijabilnog domena koje se vezuju za NI-ESO-1 HLA-A*02 kompleks. Takve sekvence su posebno pogodne za upotrebu kao terapeutski TCR za ciljanu imunoterapiju kancera koji predstavljaju SLLMWITQC HLA-A*02 kompleks.

[0010] Pronalazači su identifikovali izvorni TCR koji sadrži sledeće upotrebe lanca:

Alfa lanac: TRAV3*01/TRAJ28*01

Beta lanac: TRBV29-1*01/TRBD2*01/TRBJ2-3*01

(Napomena, termin '*01' ukazuje na alelnu varijantu za ovu sekvencu, kako je označeno IMGT nomenklaturom)

Ovaj prirodni TCR je korišćen kao šablon iz kojeg su izvedene mutirane sekvence pronalaska.

Rezime pronalaska

[0011] Ovaj pronalazak kao prvi aspekt obezbeđuje T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo specifičnog vezivanja za SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks i koji sadrži varijabilni domen alfa lanca TCR i varijabli domen beta lanca TCR, pri čemu

varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa SEQ ID NO: 12,

varijabilni domen beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa SEQ ID NO: 15, i

sekvenca varijabilnog domena alfa lanca aminokiselinskih ostataka 27-32 (CDR1), 50-57 (CDR2) i 91-107 (CDR3) i sekvenca varijabilnog domena beta lanca aminokiselinskih ostataka 27-31 (CDR1), 49- 55 (CDR2) i 93-106 (CDR3) su izabrane od sledećih:

[0012] TCR se može vezati za SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks sa afinitetom većim od 50 µM, kao što je od 50 uM do 1 pM.

[0013] Varijabilni domen alfa lanca i varijabilni domen beta lanca mogu se izabrati od aminokiselinskih sekvenci:

[0014] TCR pronalaska može biti alfa-beta heterodimer, koji ima sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2.

[0015] Sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca mogu biti modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2 i/ili sekvenca (sekvence) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca može biti modifikovana supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu navedeni cisteini formiraju ne-nativnu disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.

[0016] TCR pronalaska može biti u jednolančanom formatu tipa Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, pri čemu su Vα i Vβ TCR α i β varijabilni regioni, respektivno, Cα i Cβ su TCR α i β konstantni regioni respektivno i L je sekvenca linkera.

[0017] TCR pronalaska može biti povezan sa obeleživačem koji se može detektovati, terapeutskim agensom ili PK modifikujućim delom.

[0018] Pronalazak takođe obezbeđuje TCR anti-CD3 fuziju koja sadrži TCR pronalaska i anti-CD3 antitelo kovalentno povezano sa C- ili N-terminusom alfa ili beta lanca TCR i takva TCR anti-CD3 fuzija može sadrže varijabilni domen alfa lanca izabran iz bilo koje od SEQ ID NO: 6-12 ili 51 i varijabilni domen beta lanca izabran iz bilo koje od SEQ ID NO: 13-23 ili 52. Beta lanac može biti vezan za sekvencu anti-CD3 antitela preko sekvence linkera; sekvenca linkera može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 26). ID BR: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31).

[0019] TCR anti-CD3 fuzija pronalaska može da sadrži sekvencu aminokiselina alfa lanca i uparivanje sekvenci aminokiselina beta lanca koji imaju najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnost, sa parovima aminokiselinskih sekvenci kao što su navedeni u tabeli ispod.

[0020] Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira TCR ili TCR anti-CD3 fuziju pronalaska.

[0021] Takođe je obezbeđena ne-prirodna i/ili prečišćena i/ili konstruisana ćelija koja predstavlja TCR ili TCR anti-CD3 fuziju pronalaska i ćeliju koja sadrži (a) TCR ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja koji kodiraju alfa lanac i beta lanac; ili (b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR ili TCR anti-CD3 fuzije pronalaska, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR ili TCR anti-CD3 fuzije pronalaska.

[0022] Ćelija koja predstavlja TCR ili TCR anti-CD3 fuziju ili ćelija koja sadrži vektor(e) ekspresije može biti T-ćelija.

[0023] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži TCR ili TCR anti-CD3 fuziju pronalaska ili ćeliju pronalaska, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.

[0024] Takođe je obezbeđena TCR, TCR anti-CD3 fuzija ili nukleinska kiselina ili ćelija pronalaska za upotrebu u medicini. TCR, TCR anti-CD3 fuzija, ćelija ili nukleinska kiselina mogu biti za upotrebu u postupku lečenja kancera kod humanog subjekta.

[0025] Humani subjekt može imati tumor koji eksprimira NY-ESO-1 i/ili LAGE-1A, a tumor može biti solidan tumor i biti izabran od sinovijalnog sarkoma, nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), tumora bešike, tumora želuca, tumor prostate, kolorektalnog tumora, tumora dojke, tumora jajnika, tumora jednjaka, melanoma, multiplog mijeloma, hepatocelularnog karcinoma i tumora glave i vrata. Humani subjekat može biti subjekat podtipa HLA-A*02. Pronalazak takođe obezbeđuje formulaciju za injekcije pogodnu za primenu na humanog subjekta koja sadrži TCR, TCR anti-CD3 fuziju, nukleinsku kiselinu, ćeliju ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska i takvu formulaciju za injekcije za upotrebu u medicini, i može se primeniti injekcijom, kao što je intravenska ili direktna intratumoralna injekcija.

[0026] Dalje je obezbeđen postupak za proizvodnju TCR ili TCR anti-CD3 fuzije pronalaska, koji sadrži a) održavanje ćelije domaćina prema zahtevu 20 pod optimalnim uslovima za ekspresiju nukleinske kiseline i b) izolovanje TCR ili TCR anti- CD3 fuzije kodirane nukleinskom kiselinom.

[0027] Konačno, obezbeđen je TCR, TCR anti-CD3 fuzija, nukleinska kiselina ili ćelija pronalaska za upotrebu prema pronalasku u kombinaciji sa anti-neoplatisčnim agensom.

Detaljan opis pronalaska

[0028] U prvom aspektu pronalazak obezbeđuje

[0029] T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo specifičnog vezivanja za SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks i koji sadrži varijabilni domen TCR alfa lanca i varijabilni domen TCR beta lanca, pri čemu

[0030] Afinitet TCR za kompleks SLLMWITQC HLA-A*02 može biti u opsegu od 50 uM do 100 nM, ili od 5 uM do 1 pM.

[0031] Za proizvodnju stabilnih, rastvorljivih TCR prema pronalasku, rastvorljiva verzija nativnog TCR je korišćena kao početna sekvenca koja ima sekvencu prikazanu na slici 2. U tu svrhu se uvode supstitucije cisteina u TRAC i TRBC regione tako da može biti formirana nenativna interlančana disulfidna veza. Pogodne pozicije za lokaciju navedenih cisteinskih supstitucija su opisane u WO03020763. Slika 2 prikazuje ekstracelularne sekvence divljeg tipa TCR alfa i beta lanaca, u rastvorljivom formatu. SEQ ID NO: 4 je identična ekstracelularnoj sekvenci prirodnog alfa lanca SEQ ID NO: 2 osim što je Thr48 TRAC zamenjen sa Cys. Slično SEQ ID NO: 5 je identična ekstracelularnoj sekvenci prirodnog beta lanca SEQ ID NO: 3 osim što je Ser57 TRBC zamenjen sa Cys, Cys75 je zamenjen sa Ala i Asn201 je zamenjen sa Asp. Rastvorljivi TCR divljeg tipa opisan gore može se koristiti da obezbedi referencu sa kojom se može uporediti profil vezivanja mutiranih TCR pronalaska. TCR prvog aspekta može takođe biti TCR drugog aspekta.

[0032] TCR prema pronalasku mogu biti neprirodni i/ili prečišćeni i/ili konstruisani. TCR prema pronalasku mogu imati više od jedne mutacije prisutne u varijabilnom domenu alfa lanca i/ili varijabilnom domenu beta lanca u odnosu na nativni NY-ESO-1 TCR.

[0033] „Konstruisani TCR“ i „mutantni TCR“ se ovde koriste kao sinonimi i generalno označavaju TCR koji ima jednu ili više mutacija uvedenih u odnosu na divlji tip NY-ESO-1 TCR, posebno u varijabilnom domenu alfa lanca i/ili njihov varijabilni domen beta lanca. Poželjno je da se mutacije prave unutar CDR regiona. Ove mutacije obično poboljšavaju afinitet vezivanja TCR za kompleks SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02. Varijabilni domen alfa lanca može imati najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest od sledećih mutacija u odnosu na numerisanje SEQ ID NO: 2:

i/ili varijabilni domen beta lanca može imati najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili devet od sledećih mutacija u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 3:

(tabela 2)

[0034] Varijabilni domen alfa lanca može imati najmanje jednu od sledećih mutacija u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 2:

(tabela 3)

[0035] I/ili varijabilni domen beta lanca može imati najmanje jednu od sledećih mutacija u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 3:

1

(tabela 4)

[0036] Varijabilni domen alfa lanca ima najmanje jednu od sledećih grupa mutacija

Grupa 1: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A

Grupa 2: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D

Grupa 3: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R

Grupa 4: I96S, N97D, S98Q, G99H

Grupa 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H

Grupa 6: I51L, G53D

i/ili varijabilni domen beta lanca ima najmanje jednu od sledećih grupa mutacija

Grupa 1: N50W, Q51T, S53G

Grupa 2: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G

Grupa 3: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A

Grupa 4: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T

Grupa 5: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G

Grupa 6: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G, G100A

Grupa 7: S27K, Q28R, V29L, T30A, M3IL, N50W, Q51T

Grupa 8: T30A, N50W, G100A

[0037] Otkrivene su posebne kombinacije grupa mutacija koje mogu biti kao što su navedene u tabeli ispod:

[0038] Otkrivene su posebne kombinacije mutacija koje mogu biti prisutne u TCR pronalaska kao što su navedene u tabelama ispod:

Alfa lanac

(tabela 6)

Beta lanac

(tabela 7)

[0039] Naročito, varijabilni domeni alfa i beta lanca obuhvataju sledeće kombinacije aminokiselinskih sekvenci:

[0040] U skladu sa otkrićem, može postojati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 mutacija u CDR regionima alfa lanca, na primer 2 do 6 mutacija, i/ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 mutacija u CDR regionima beta lanca, na primer 3 do 9 mutacija. U otkriću, varijabilni domen α lanca TCR pronalaska može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa sekvencom aminokiselinskih ostataka 1-117 SEQ ID NO: 2, pod uslovom da varijabilni domen α lanca ima najmanje jednu od gore navedenih mutacija. U otkriću, varijabilni domen β lanca TCR pronalaska može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa sekvencom aminokiselinskih ostataka 1-115 SEQ ID NO: 3, pod uslovom da varijabilni domen β lanca ima najmanje jednu od gore navedenih mutacija. Varijabilni domen alfa lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 6-12 ili 51. Varijabilni domen beta lanca može da sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 13-23 ili 52.

[0041] Mutacije se takođe mogu napraviti izvan CDR regiona, takve mutacije mogu poboljšati

1

vezivanje, ali poželjno poboljšati prinos i stabilnost prečišćavanja. Primeri takvih mutacija u varijabilnom domenu alfa lanca, u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 2 mogu biti:

(tabela 9)

i/ili u varijabilnom domenu beta lanca može biti najmanje jedna od sledećih mutacija u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 3:

(tabela 10)

[0042] Mutacije na roditeljski TCR mogu uključivati one koje su u stanju da povećaju afinitet vezivanja (kDi/ili poluvreme vezivanja) TCR za SLLMWITQC. Mutacije mogu uključivati one koje su u stanju da smanje količinu nespecifičnog vezivanja, tj. da smanje vezivanje za antigene pored vezivanja za SLLMWITQC, ili da povećaju specifičnost TCR vezivanja za SLLMWITQC. Mutacije mogu uključivati one koje povećavaju efikasnost savijanja i/ili proizvodnje. Neke mutacije mogu doprineti svakoj od ovih karakteristika, druge mogu doprineti afinitetu, ali ne specifičnosti, na primer, ili specifičnosti ali ne afinitetu itd.

[0043] U okviru ovog pronalaska su fenotipski tihe varijante bilo kog TCR pronalaska koji su ovde otkriveni. Kako se ovde koristi, termin "fenotipski tihe varijante" podrazumeva se da se odnosi na TCR koji uključuje jednu ili više dodatnih promena aminokiselina pored onih gore navedenih u kojima TCR ima sličan fenotip kao odgovarajući TCR bez pomenutih promena. Za potrebe ove prijave, fenotip TCR sadrži afinitet vezivanja antigena (KDi/ili poluživot vezivanja) i specifičnost antigena. Fenotipski tiha varijanta može imati KDi/ili poluživot vezivanja za kompleks SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 unutar 20% izmerenog KDi/ili polu-život vezivanja odgovarajućeg TCR bez pomenute promene (promena), kada se meri pod identičnim uslovima (na primer na 25°C i na istom SPR čipu). Pogodni uslovi su dalje definisani u Primeru 3. Specifičnost antigena je dalje definisana u nastavku. Kao što je stručnjacima poznato, može biti moguće proizvesti TCR koji uključuju promene u svojim varijabilnim domenima u poređenju sa onima koji su detaljno opisani iznad bez promene afiniteta interakcije sa SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A *02 kompleksom. Posebno, takve tihe mutacije mogu biti ugrađene u delove sekvence za koje se zna da nisu direktno uključene u vezivanje antigena (npr. izvan CDR regiona ili delova CDR regiona koji ne dolaze u kontakt sa peptidnim antigenom). Takve trivijalne varijante su uključene u obim ovog pronalaska. Oni TCR u kojima je napravljena jedna ili više konzervativnih i/ili tolerisanih supstitucija takođe čine deo ovog pronalaska. Tolerisane supstitucije su takođe fenotipski tihe, ali možda nisu konzervativne, kao što je definisano u nastavku. Tolerisane supstitucije mogu dovesti do smanjenja afiniteta za SLLMWITQC HLA-A*02 kompleks u poređenju sa TCR koji nema tolerantnu supstituciju. Smanjenje afiniteta može biti 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% ili 50% TCR bez tolerisane supstitucije. Smanjenje afiniteta ne dovodi do toga da afinitet bude manji od (tj. slabiji od) 50 µm.

[0044] TCR ovog pronalaska mogu takođe uključiti jednu ili više konzervativnih supstitucija koje imaju sličnu aminokiselinsku sekvencu i/ili koje zadržavaju istu funkciju. Stručnjak je svestan da različite aminokiseline imaju slična svojstva i stoga su 'konzervativne'. Jedna ili više takvih aminokiselina proteina, polipeptida ili peptida često mogu biti supstituisane sa jednom ili više drugih takvih aminokiselina bez eliminisanja željene aktivnosti tog proteina, polipeptida ili peptida.

[0045] Tako se aminokiseline glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin često mogu supstituisati jedna drugom (aminokiseline koje imaju alifatične bočne lance). Od ovih mogućih supstitucija, poželjno je da se glicin i alanin koriste da supstituišu jedna drugu (pošto imaju relativno kratke bočne lance) i da se valin, leucin i izoleucin koriste da supstituišu jedna drugu (pošto imaju veće alifatične bočne lance koji su hidrofobni). Druge aminokiseline koje se često mogu supstituisati jedna drugom uključuju: fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance); lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju bazne bočne lance); aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance); asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju bočne lance amida); i cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor).

[0046] Supstitucije ove prirode se često nazivaju "konzervativnim" ili "polukonzervativnim" supstitucijama aminokiselina. Ovo otkriće uključuje TCR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu gore, ali sa jednom ili više konzervativnih supstitucija u sekvenci, tako da sekvenca aminokiselina TCR ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa TCR koji sadrži aminokiseline 1-117 SEQ ID NO: 2, 6-12 ili 51 i/ili aminokiseline 1-115 SEQ ID NO: 3, 13-23 ili 52.

[0047] Posebne kombinacije varijabilnog domena alfa lanca i varijabilnog domena beta lanca

1

mogu biti:

[0048] Promene aminokiselina u odnosu na sekvence date gore mogu se izvršiti korišćenjem bilo koje pogodne tehnike, npr. korišćenjem mutageneze usmerene na mesto ili sinteze u čvrstom stanju.

[0049] Treba imati na umu da se supstitucije aminokiselina u okviru ovog pronalaska mogu napraviti korišćenjem aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili koje se ne nalaze u prirodi. Na primer, ovde se razmatra da metil grupa na alaninu može biti zamenjena etil grupom, i/ili da se manje promene mogu izvršiti na peptidnoj kičmi. Bez obzira da li se koriste prirodne ili sintetičke aminokiseline ili ne, poželjno je da su prisutne samo L-aminokiseline.

[0050] "Identičnost" kao što je poznato u tehnici je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identičnost takođe označava stepen srodnosti sekvenci između polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, što je određeno podudarnošću između nizova takvih sekvenci. Iako postoji veliki broj postupaka za merenje identičnosti između dva polipeptida ili dve polinukleotidne sekvence, postupci koji se obično koriste za određivanje identičnosti su kodifikovani u kompjuterskim programima. Poželjni kompjuterski programi za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket (Devereux, et al., Nucleic Acid Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN i FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol.215, 403 (1990)).

[0051] Može se koristiti program kao što je CLUSTAL program za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci. Ovaj program upoređuje aminokiselinske sekvence i pronalazi optimalno poravnanje umetanjem razmaka u bilo koju sekvencu prema potrebi. Moguće je izračunati identičnost ili sličnost aminokiselina (identičnost plus očuvanje tipa aminokiseline) za optimalno poravnanje. Program kao što je BLASTx će poravnati najduži deo sličnih sekvenci i dodeliti vrednost uklapanju. Stoga je moguće dobiti poređenje gde se nalazi nekoliko regiona

1

sličnosti, od kojih svaki ima drugačiji rezultat. Oba tipa analize identičnosti su razmatrana u ovom pronalasku.

[0052] Procenat identičnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinskih kiselina se određuje poravnavanjem sekvenci radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u prvu sekvencu radi najboljeg usklađivanja sa sekvencom) i poređenjem aminokiselinskih ostataka ili nukleotida na odgovarajućim pozicijama. „Najbolje poravnanje“ je poravnanje dve sekvence koje rezultira najvećim procentom identičnosti. Procenat identičnosti je određen brojem identičnih aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvencama koje se porede (tj. % identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija x 100).

[0053] Određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma poznatog stručnjacima u ovoj oblasti. Primer matematičkog algoritma za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, izmenjeno kao u Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. NBLAST i XBLAST programi Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 ugradili takav algoritam. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti pomoću NBLAST programa, rezultat = 100, dužina reči = 12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti pomoću programa XBLAST, rezultat = 50, dužina reči = 3 da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinskim molekulima za upotrebu u pronalasku. Da biste dobili razmaknuta poravnanja u svrhu poređenja, „Gapped“ BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res.

25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast se može koristiti za obavljanje iterirane pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (Id.). Kada koristite programe BLAST, „Gapped“ BLAST i PSI-Blast, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. XBLAST i NBLAST). Videti http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Još jedan primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam Miersa i Millera, CABIOS (1989). Program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje sekvenci CGC ugradio je takav algoritam. Drugi algoritmi za analizu sekvenci poznati u tehnici uključuju ADVANCE i ADAM kao što je opisano u Torellis i Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; i FASTA opisan u Pirson i Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. U okviru FASTA, ktup je kontrolna opcija koja postavlja osetljivost i brzinu pretrage.

[0054] Mutacije se mogu izvesti korišćenjem bilo koje odgovarajućeg postupka uključujući, ali ne ograničavajući se na, one zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze (PCR), kloniranju zasnovanom na restrikcionim enzimima ili postupcima kloniranja nezavisnim od ligacije (LIC). Ovi postupci su detaljno opisani u mnogim standardnim tekstovima o molekularnoj biologiji. Za više detalja u vezi sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i kloniranjem zasnovanim na

1

restrikcionim enzimima, pogledajte Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press. Dodatne informacije o postupcima nezavisnog kloniranja (LIC) mogu se naći u Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6.

[0055] TCR pronalaska može da sadrži region okvira alfa lanca 2 (FM2) i region okvira alfa lanca 3 (FM3), pri čemu FM2 i FM3 regioni sadrže SEQ ID NO: 47 i 48 respektivno, i/ili sadrže jedbu ili više konzervativnih supstitucija i/ili do tri tolerisane supstitucije.

[0056] TCR drugog aspekta može da sadrži FM2 region beta lanca i FM3 region beta lanca, pri čemu FM2 i FM3 regioni sadrže SEQ ID NO: 49 i 50 respektivno, i/ili sadrže jednu ili više konzervativnih supstitucija i/ili do tri tolerisane supstitucije.

[0057] TCR prema otkriću može da sadrži aminokiseline 1-117 SEQ ID NO: 2 i/ili aminokiseline 1-115 SEQ ID NO: 3, od kojih svaka može sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija i/ili do tri tolerisane mutacije i/ili jednu ili više mutacija definisanih u tabeli 1 ili tabeli 2.

[0058] TCR prema pronalasku imaju svojstvo vezivanja kompleksa SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02. Utvrđeno je da su TCR prema pronalasku visoko specifični za ovaj epitop u odnosu na druge, irelevantne epitope, i stoga su posebno pogodni kao ciljni vektori za isporuku terapeutskih agenasa ili detektabilnih obeleživača u ćelije i tkiva koja pokazuju te epitope. Specifičnost u kontekstu TCR pronalaska se odnosi na njihovu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su pozitivne na peptid SLLMWITQC, dok imaju minimalnu sposobnost da prepoznaju HLA-A*02 ciljne ćelije koje su negativne za peptid. Da bi se testirala specifičnost, TCR mogu biti u rastvorljivom obliku i/ili mogu biti eksprimirani na površini T ćelija. Prepoznavanje se može odrediti merenjem nivoa aktivacije T ćelija u prisustvu TCR i ciljnih ćelija. U ovom slučaju, minimalno prepoznavanje peptidno negativnih ciljnih ćelija je definisano kao nivo aktivacije T ćelija manji od 20%, poželjno manji od 10%, a poželjnije manji od 5%, nivoa proizvedenog u prisustvu peptidno ciljnih ćelija, kada se meri pod istim uslovima. Za rastvorljive TCR prema pronalasku, specifičnost se može odrediti na terapeutski relevantnoj koncentraciji TCR. Terapeutski relevantna koncentracija može se definisati kao TCR koncentracija od 10<-9>M ili ispod, i/ili koncentracija do 100, ili do 1000, puta veća od odgovarajuće vrednosti EC50. Peptid pozitivne ćelije se mogu dobiti pulsiranjem peptida ili, poželjnije, mogu prirodno da predstavljaju navedeni peptid. Poželjno, i peptidno pozitivne i peptidno negativne ćelije su ljudske ćelije. Specifičnost se može meriti, na primer, u ćelijskim testovima kao što su oni opisani u Primerima 6-8. Specifičnost se može dodatno odnositi na sposobnost vezivanja za NY-ESO-1-HLA-A*02 kompleks, a ne na više prirodno prisutnih peptidnih HLA kompleksa, kao što je odredio Biacore, na primer. Poželjno, vezivanje za NY-ESO-1-HLA-A*02 kompleks je najmanje 400 puta veće nego za druge prirodno prisutne

1

peptidne HLA komplekse.

[0059] TCR pronalaska mogu imati KDza NY-ESO-1-HLA-A*02 kompleks veći od (tj. jači od) 50 µM, na primer između 50 µM i 1 pM. Određeni TCR pronalaska mogu imati KDza kompleks od oko 1 pM do oko 50 nM, od oko 1 pM do oko 400 pM, od oko 20 pM do oko 200 pM. TCR prema pronalasku mogu imati poluvreme vezivanja (T1⁄2) za kompleks u opsegu od oko 1 sekunde do oko 60 sati ili više, od oko 30 minuta do oko 60 sati ili više, ili od oko 6 sati do oko 60 h ili više. TCR koji se koriste kao rastvorljivi terapeutici i/ili dijagnostici kada su spojeni sa detektabilnim obeleživačem, ili terapeutskim agensom poželjno imaju KDza kompleks od oko 1 pM do oko 200 pM, ili od oko 20 pM do oko 100 pM, kako je određeno korišćenjem BIAcore metode iz Primera 3, i/ili poluživot vezivanja za kompleks od oko 2 h do 60 h ili više, ili od oko 20 h do oko 60 h ili više, kao što je određeno korišćenjem BIAcore metode iz Primera 3. Određeni TCR pronalaska mogu biti pogodni za primenu u adoptivnoj terapiji; takvi TCR mogu imati KDza kompleks od oko 50 nM do oko 50 uM, ili od oko 100 nM do oko 1 uM i/ili poluživot vezivanja za kompleks od oko 3 sec do oko 12 min.

[0060] Određeni TCR prema pronalasku imaju afinitet vezivanja za, i/ili poluvreme vezivanja za kompleks SLLMWITQC-HLA-A*02, znatno veći od onog kod prirodnog TCR. Povećanje afiniteta vezivanja prirodnog TCR često smanjuje specifičnost TCR za njegov peptid-MHC ligand, a to je demonstrirano u Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No.9, 1 november 2007, 5845-5854. Međutim, TCR prema pronalasku mogu ostati specifični za kompleks SLLMWITQC-HLA-A*02, uprkos tome što imaju znatno veći afinitet vezivanja od prirodnog TCR.

[0061] Afinitet vezivanja (obrnuto proporcionalan konstanti ravnoteže KD) i poluživot vezivanja (izražen kao T1⁄2) mogu se odrediti korišćenjem površinske plazmon rezonance (BIAcore) i/ili oktet metode iz Primera 3 ovde. Biće jasno da udvostručavanje afiniteta TCR rezultira prepolovljenjem KD. T1⁄2 se izračunava kao In2 podeljen sa stopom disocijacije (koff). Prema tome, udvostručenje T1⁄2 dovodi do prepolovljenja koff. KDi koffvrednosti za TCR se obično mere za rastvorljive oblike TCR, tj. one oblike koji su skraćeni da bi se uklonili ostaci citoplazmatičnog i transmembranskog domena. Poželjno je da se afinitet vezivanja ili poluživot vezivanja datog TCR meri nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, korišćenjem istog protokola analize i uzima se prosek rezultata.

[0062] Za upotrebu kao ciljani agens za isporuku terapeutskih sredstava u ćeliju koja prikazuje antigen, TCR može biti u rastvorljivom obliku (tj. bez transmembranskih ili citoplazmatičnih domena). Radi stabilnosti, TCR prema pronalasku, i poželjno rastvorljivi αβ heterodimerni TCR, mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano, na primer, u WO 03/020763. Jedan ili oba konstantna domena prisutna u αβ

1

heterodimeru pronalaska mogu biti skraćeni na C kraju ili C terminusu, na primer za do 15, ili do 10 ili do 8 ili manje aminokiselina. C kraj ekstracelularnog konstantnog regiona alfa lanca može biti skraćen za 8 aminokiselina. Za upotrebu u adoptivnoj terapiji, αβ heterodimerni TCR može, na primer, biti transfektovan kao lanci pune dužine koji imaju i citoplazmatični i transmembranski domen. TCR za upotrebu u adoptivnoj terapiji mogu da sadrže disulfidnu vezu koja odgovara onoj koja se nalazi u prirodi između odgovarajućih alfa i beta konstantnih domena, dodatno ili alternativno može biti prisutna ne-nativna disulfidna veza.

[0063] TCR prema pronalasku mogu biti αβ heterodimeri ili mogu biti u jednolančanom formatu. Jednolančani formati uključuju αβ TCR polipeptide tipa Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ ili Vα-L-Vβ-Cβ, pri čemu su Vα i Vβ su α i β varijabilni regioni TCR respektivno , Cα i Cβ su α i β konstantni regioni TCR respektivno, a L je sekvenca linkera. U određenim primerima izvođenja, jednolančani TCR prema pronalasku mogu imati uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano u WO 2004/033685. Jednolančani TCR su dalje opisani u WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).

[0064] Kao što će biti očigledno stručnjacima u ovoj oblasti, može biti moguće skratiti sekvence obezbeđene na njihovom C-kraju i/ili N-kraju, za 1, 2, 3, 4, 5 ili više ostataka, bez suštinskog uticaja na karakteristike vezivanja TCR. Sve takve trivijalne varijante su obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0065] Alfa-beta heterodimerni TCR pronalaska obično sadrže sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i/ili sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2. Sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca mogu biti modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2. Sekvenca(e) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca takođe može biti modifikovana supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu navedeni cisteini formiraju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.

[0066] U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira TCR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je cDNK. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen α lanca TCR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen β lanca TCR pronalaska. Nukleinska kiselina može biti neprirodna i/ili prečišćena i/ili konstruisana.

[0067] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku. Poželjno, vektor je vektor ekspresije TCR.

2

[0068] Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju koja sadrži vektor pronalaska, poželjno TCR ekspresioni vektor. Vektor može da sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska koja kodira u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja, alfa lanac i beta lanac, respektivno. Sledeći aspekt obezbeđuje ćeliju koja sadrži prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR pronalaska, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR pronalaska. Takve ćelije su posebno korisne u adoptivnoj terapiji. Ćelije pronalaska mogu biti izolovane i/ili rekombinantne i/ili ne-prirodne i/ili konstruisane.

[0069] Pošto TCR pronalaska imaju koristi u adoptivnoj terapiji, pronalazak uključuje neprirodnu i/ili prečišćenu i/ili konstruisanu ćeliju, posebno T-ćeliju, koja predstavlja TCR pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje proširenu populaciju T ćelija koje predstavljaju TCR pronalaska. Postoji veliki broj postupaka pogodnih za transfekciju T ćelija nukleinskom kiselinom (kao što su DNK, cDNK ili RNK) koje kodiraju TCR prema pronalasku (videti npr. Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). T ćelije koje eksprimiraju TCR prema pronalasku biće pogodne za upotrebu u lečenju kancera zasnovanom na usvajanju terapije. Kao što će stručnjacima biti poznato, postoji niz pogodnih postupaka pomoću kojih se može sprovesti adoptivna terapija (videti npr. Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).

[0070] Rastvorljivi TCR prema pronalasku su korisni za isporuku detektabilnih obeleživača ili terapeutskih agenasa u ćelije koje prikazuju antigen i tkiva koja sadrže ćelije koje prikazuju antigen. Oni stoga mogu biti povezani (kovalentno ili na drugi način) sa obeleživačem koji se može detektovati (u dijagnostičke svrhe gde se TCR koristi za otkrivanje prisustva ćelija koje predstavljaju SLLMWITQC-HLA-A<*>02 kompleks); terapeutski agens; ili PK modifikujući ostatak (na primer PEGilacijom).

[0071] Detektabilni obeleživači u dijagnostičke svrhe uključuju, na primer, fluorescentne obeleživače, radioaktivne obeleživače, enzime, probe nukleinske kiseline i kontrastne reagense.

[0072] Terapeutski agensi koji mogu biti povezani sa TCR pronalaska uključuju imunomodulatore, radioaktivna jedinjenja, enzime (na primer perforin) ili hemoterapeutske agense (na primer, cis-platina). Da bi se osiguralo da se toksični efekti vrše na željenoj lokaciji, toksin bi mogao biti unutar lipozoma koji je povezan sa TCR tako da se jedinjenje polako oslobađa. Ovo će sprečiti štetne efekte tokom transporta u telu i obezbediti da toksin ima maksimalan efekat nakon vezivanja TCR za relevantne ćelije koje prikazuju antigen.

[0073] Ostali pogodni terapeutski agensi uključuju:

• citotoksični agensi malih molekula, odnosno jedinjenja sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara čija je molekulska težina manja od 700 daltona. Takva jedinjenja mogu takođe da sadrže toksične metale sposobne da imaju citotoksični efekat. Dalje, treba razumeti da ovi citotoksični agensi sa malim molekulima takođe uključuju prolekove, tj. jedinjenja koja se raspadaju ili se konvertuju u fiziološkim uslovima da bi oslobodila citotoksična sredstva. Primeri takvih agenasa obuhvataju cis-platin, derivate majtanzina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etopozid, gemcitabin, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, sorfimer natrijumfotofrin II, temozolomid, topotekan, trimetreat glukuronat, auristatin E vinkristin i doksorubicin;

• peptidni citotoksini, tj. proteini ili njihovi fragmenti sa sposobnošću da ubijaju ćelije sisara. Na primer, ricin, toksin difterije, pseudomonas bakterijski egzotoksin A, DNaza i RNKaza;

• radionuklidi, tj. nestabilni izotopi elemenata koji se raspadaju uz istovremenu emisiju jedne ili više α ili β čestica, ili γ zraka. Na primer, jod 131, renijum 186, indijum 111, itrijum 90, bizmut 210 i 213, aktinijum 225 i astatin 213; helatirajući agensi se mogu koristiti za olakšavanje povezivanja ovih radionuklida sa TCR visokog afiniteta ili njihovim multimerima;

• imunostimulansi, tj., imuni efektorski molekuli koji stimulišu imuni odgovor. Na primer, citokini kao što su IL-2 i IFN-γ,

• Superantigeni i njihovi mutanti;

• TCR-HLA fuzije, npr. fuzija sa kompleksom peptid-HLA, pri čemu je navedeni peptid izveden iz uobičajenog humanog patogena, kao što je Epstein Barr virus (EBV);

• hemokini kao što je IL-8, trombocitni faktor 4, protein koji stimuliše rast melanoma, itd; • antitela ili njihove fragmente, uključujući antitela anti-T ćelijska ili NK ćelijska determinantna antitela (npr. anti-CD3, anti-CD28 ili anti-CD16);

• alternativne proteinske skele sa karakteristikama vezivanja poput antitela

• aktivatori komplementa;

• ksenogeni proteinski domeni, alogeni proteinski domeni, virusni/bakterijski proteinski domeni, virusni/bakterijski peptidi.

[0074] Jedan poželjan primer izvođenja je obezbeđen TCR anti-CD3 fuzijom koja sadrži TCR pronalaska povezan (obično fuzijom na N- ili C-kraj alfa ili beta lanca) sa anti-CD3 antitelom, ili funkcionalnim fragmentom ili varijantom pomenutog anti-CD3 antitela. (Takve TCR-anti-CD3 fuzije mogu se nazvati ImmTAC<™>molekuli). Kako se ovde koristi, termin TCR obuhvata TCR-fuzije, kao što je TCR anti-CD3 fuzija. Kako se ovde koristi, termin "antitelo" obuhvata takve fragmente i varijante. Primeri anti-CD3 antitela uključuju, ali nisu ograničeni na OKT3, UCHT-1, BMA-031 i 12F6. Fragmenti antitela i varijante/analozi koji su pogodni za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisanim ovde uključuju minitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, dsFv i scFv fragmente, Nanobodies<™>(ovi konstrukti, koje prodaje Ablynx (Belgija), sastoje se od sintetičkog pojedinačnog imunoglobulinskog varijabilnog teškog domena dobijenog od antitela kamile (npr. kamile ili lame)) i domen antitela (Domantis (Belgija), koja sadrže afinitetno sazreli pojedinačan varijabilni teški domen imunoglobuilina ili varijabilni laki domen imunoglobulina) ili alternativne proteinske skele koje pokazuju karakteristike vezivanja poput antitela, kao što su „Affibodies“ („Affibody“ (Švedska), koji sadrži konstruisani protein A skele) ili antitikalini (Pieris (Nemačka)), koji sadrži konstruisane antitikaline), da spomenemo samo neke.

[0075] Veza TCR i anti-CD3 antitela može biti direktna ili indirektna preko sekvence linkera. Sekvence linkera su obično fleksibilne, jer su prvenstveno napravljene od aminokiselina kao što su glicin, alanin i serin koji nemaju glomazne bočne lance koji bi verovatno ograničavali fleksibilnost. Upotrebljive ili optimalne dužine sekvenci linkera se lako određuju. Često će sekvenca linkera biti manja od oko 12, kao što je manja od 10, ili od 5-10 aminokiselina u dužini. Pogodni linkeri koji se mogu koristiti u TCR anti-CD3 fuzijama pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na: GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31) (kao što je opisano u WO2010/133828).

[0076] Specifični primeri izvođenja anti-CD3-TCR fuzionih konstrukata pronalaska uključuju one alfa i beta parove lanaca prikazane u tabeli ispod.

(tabela 7)

[0077] Posebno poželjna anti-CD3-TCR fuzija obuhvata alfa lanac SEQ ID NO: 37 i beta lanac SEQ ID NO: 38.

[0078] Za neke svrhe, TCR pronalaska mogu biti agregirani u kompleks koji sadrži nekoliko TCR da bi se formirao multivalentni TCR kompleks. Postoji veliki broj humanih proteina koji sadrže multimerizacioni domen koji se može koristiti u proizvodnji multivalentnih TCR kompleksa. Na primer, domen tetramerizacije p53 koji je korišćen za proizvodnju tetramera

2

fragmenata scFv antitela koji su pokazali povećanu postojanost seruma i značajno smanjenu brzinu u poređenju sa monomernim scFv fragmentom (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem.276 (17) 14385-14392). Hemoglobin takođe ima domen tetramerizacije koji bi se mogao koristiti za ovu vrstu primene. Multivalentni TCR kompleks pronalaska može imati poboljšanu sposobnost vezivanja za kompleks SLLMWITQC-HLA-A*02 u poređenju sa nemultimernim heterodimerom divljeg tipa ili T ćelijskog receptora prema pronalasku. Prema tome, multivalentni kompleksi TCR prema pronalasku su takođe uključeni u pronalazak. Takvi multivalentni TCR kompleksi prema pronalasku su posebno korisni za praćenje ili ciljno delovanje na ćelije koje prikazuju određene antigene in vitro ili in vivo, i takođe su korisni kao intermedijeri za proizvodnju dodatnih multivalentnih TCR kompleksa koji imaju takve upotrebe.

[0079] Kao što je dobro poznato u tehnici, TCR mogu biti podložni posttranslacionim modifikacijama. Glikozilacija je jedna takva modifikacija, koja obuhvata kovalentno vezivanje oligosaharidnih delova za definisane aminokiseline u TCR lancu. Na primer, ostaci asparagina, ili ostaci serina/treonina su dobro poznate lokacije za vezivanje oligosaharida. Status glikozilacije određenog proteina zavisi od brojnih faktora, uključujući sekvencu proteina, konformaciju proteina i dostupnost određenih enzima. Štaviše, status glikozilacije (tj. tip oligosaharida, kovalentna veza i ukupan broj veza) može uticati na funkciju proteina. Stoga, kada se proizvode rekombinantni proteini, kontrola glikozilacije je često poželjna. Kontrolisana glikozilacija je korišćena za poboljšanje terapije na bazi antitela. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34). Za rastvorljive TCR prema pronalasku glikozilacija se može kontrolisati in vivo, korišćenjem određenih ćelijskih linija, na primer, ili in vitro, hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije su poželjne, pošto glikozilacija može poboljšati farmakokinetiku, smanjiti imunogenost i bolje oponašati prirodni ljudski protein (Sinclair AM i Elliott S., Pharm Sci.2005 Aug; 94(8):1626-35).

[0080] Za primenu na pacijente, TCR ili TCR anti-CD3 fuzije pronalaska (poželjno povezane sa detektabilnim obeleživačem ili terapeutskim agensom ili eksprimirane na transfektovanoj T ćeliji) ili ćelije pronalaska mogu biti obezbeđene u farmaceutskoj kompoziciji zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivijih nosača ili ekscipijenasa. Terapeutski ili imadžing TCR, TCR fuzije ili ćelije, u skladu sa pronalaskom, obično će biti isporučeni kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja će normalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka primene na pacijenta). Može se obezbediti u obliku jedinične doze, generalno će biti obezbeđeno u zapečaćenom kontejneru i može se obezbediti kao deo kompleta. Takav komplet bi obično (iako ne nužno) uključivao uputstva za upotrebu. Može uključiti mnoštvo navedenih jediničnih doznih oblika.

[0081] Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za primenu bilo kojim odgovarajućim putem, kao što je parenteralni (uključujući subkutani, intramuskularni ili intravenski), enteralni (uključujući oralni ili rektalni), inhalacioni ili intranazalni putevi. Takve kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u farmaciji, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem(ima) ili ekscipijensom(ima) u sterilnim uslovima.

[0082] Doze supstanci iz ovog pronalaska mogu da variraju između širokih granica, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se leči, starosti i stanja individue koja se leči, itd. Odgovarajućeg opseg doza za rastvorljiv TCR prema pronalasku povezanog sa anti-CD3 antitelom može biti između 25 ng/kg i 50 µg/kg. Lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti.

[0083] TCR, farmaceutske kompozicije, vektori, nukleinske kiseline i ćelije pronalaska mogu se obezbediti u suštinski čistom obliku, na primer najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, na najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% čist.

[0084] Pronalaskom su takođe obezbeđeni:

• TCR, TCR anti-CD3 fuzija, nukleinska kiselina ili ćelija pronalaska za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u postupku lečenja kancera; i

• upotreba TCR, TCR anti-CD3 fuzije, nukleinske kiseline ili ćelije pronalaska u proizvodnji leka za lečenje kancera.

[0085] Kancer koji se leči može biti sinovijalni sarkom, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), tumor bešike, tumor želuca, tumor prostate, kolorektalni tumor, tumor dojke, tumor jajnika, tumor jednjaka, melanom, multipli mijelom, hepatocelularni karcinom i tumor glave i vrata.

[0086] Pronalazak je opisan u nastavku u vezi sa sledećim neograničavajućim slikama i primerima, u kojima:

Slika 1 daje aminokiselinske sekvence ekstracelularnih regiona nativnih varijabilnih domena alfa i beta lanaca pronalaska;

Slika 2 daje aminokiselinske sekvence rastvorljivih ekstracelularnih regiona nativnih alfa i beta lanaca pronalaska;

Slika 3 daje aminokiselinske sekvence mutiranih varijabilnih regiona alfa lanca TCR pronalaska; Slika 4 daje aminokiselinske sekvence mutiranih varijabilnih regiona beta lanca TCR pronalaska; Slika 5 daje aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže TCR sekvence pronalaska;

Slika 6 daje aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže TCR sekvence

2

pronalaska;

Slika 7 daje aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže TCR sekvence pronalaska;

Slika 8 daje aminokiselinske sekvence ImmTAC molekula koje sadrže TCR sekvence pronalaska;

Slika 9 prikazuje snažno i specifično vezivanje ImmTAC molekula pronalaska;

Slika 10 prikazuje dalje testiranje potencije za 2 ImmTAC molekula pronalaska;

Slika 11 prikazuje dalje testiranje specifičnosti za 3 ImmTAC molekula pronalaska; i

Slika 12 prikazuje ubijanje tumorskih ćelija ImmTAC preusmerenim T ćelijama.

Primeri

Primer 1 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje rastvorljivih TCR

[0087] DNK sekvence koje kodiraju alfa i beta ekstracelularne regione rastvorljivih TCR prema pronalasku su klonirane odvojeno u ekspresione plazmide zasnovane na pGMT7 korišćenjem standardnih metoda (kao što je opisano u Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbor laboratory press). Ekspresioni plazmidi su odvojeno transformisani u E. coli soj Rosetta (BL21pLysS), a pojedinačne kolonije otporne na ampicilin su uzgajane na 37°C u TYP (+ ampicilin 100 µg/ml) medijumu do OD600od ~0,6-0,8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0,5 mM IPTG. Ćelije su sakupljene tri sata nakon indukcije centrifugiranjem. Ćelijski talozi su lizirani reagensom za ekstrakciju proteina BugBuster (Merck Millipore) prema uputstvima proizvođača. Talozi inkluzijskog tela su dobijeni centrifugiranjem. Talozi su dva puta isprani u Triton puferu (50 mM Tris-HCl pH 8,1, 0,5% Triton-X100, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) i na kraju resuspendovane u puferu bez deterdženta (50 mM Tris-HCl pH 0,1, mM NaCl 0,1 10 mM NaEDTA). Prinos proteina inkluzijskog tela je kvantitativno određen rastvaranjem sa 6 M guanidina-HCl i merenjem OD280. Koncentracija proteina je zatim izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije. Čistoća inkluzionog tela je merena rastvaranjem sa 8M uree i punjenjem ~2 µg na 4-20% SDS-PAGE pod uslovima redukcije. Čistoća je zatim procenjena ili izračunata korišćenjem softvera za denzitometriju (Chemidoc, Biorad). Inkluziona tela su čuvana na 4°C za kratkotrajno skladištenje i na -20°C ili -70°C za dugotrajno skladištenje.

[0088] Za ponovno savijanje rastvorljivog TCR, inkluziona tela koja sadrže α i β lanac su prvo pomešana i razblažena u 10 ml pufera za solubilizaciju/denaturaciju (6 M guanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCI pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM 20 EDTA M DTT ) nakon čega sledi inkubacija

2

od 30 min na 37°C. Ponovno savijanje je zatim započeto daljim razblaživanjem u 1 L ponovno savijenog pufera (100 mM Tris pH 8,1, 400 mM L-arginin HCL, 2 mM EDTA, 4 M uree, 10 mM cisteamin hidrohlorida i 2,5 mM cistamin dihidrohlorida) i rastvor je dobro izmešan. Ponovno savijena smeša je dijalizovana protiv 10 L H2O tokom 18-20 sati na 5 °C ± 3 °C. Posle ovog vremena, pufer za dijalizu je dva puta zamenjen sa 10 mM Tris pH 8,1 (10 L) i dijaliza je nastavljena još 15 sati. Smeša za ponovno savijanje je zatim filtrirana kroz celulozne filtere od 0,45 µm.

[0089] Prečišćavanje rastvorljivih TCR je započeto nanošenjem dijaliziranog ponovno savijenog TCR na POROS<®>50HQ kolonu za anjonsku izmenu i eluiranje vezanog proteina sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM Tris pH 8,1 preko 50 zapremina kolone korišćenjem Akta<®>prečistača (GE Healthcare). Maksimalne TCR frakcije su identifikovane pomoću SDS PAGE pre nego što su objedinjene i koncentrisane. Koncentrovani uzorak je zatim primenjen na Superdex<®>75HR kolonu za gel filtraciju (GE Healthcare) prethodno ekvilibrisanu u Dulbecco-ovom PBS puferu. Maksimalne TCR frakcije su sakupljene i koncentrovane i izračunat je konačni prinos prečišćenog materijala.

Primer 2 - Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje ImmTAC molekula (rastvorljivi TCR-anti CD3 fuzioni proteini)

[0090] Priprema ImmTAC je izvedena kao što je opisano u Primeru 1, osim što je TCR beta lanac fuzionisan preko linkera sa anti-CD3 jednolančanim antitelom. Pored toga, izveden je korak izmene katjona tokom prečišćavanja nakon izmene anjona. U ovom slučaju frakcije pikova iz anjonske razmene su razblažene 20 puta u 20mM MES (pH6,5) i nanete na POROS<®>50HS kolonu za izmenu katjona. Vezani protein je eluiran sa gradijentom od 0-500 mM NaCl u 20 mM MES. Maksimalne ImmTAC frakcije su sakupljene i podešene na 50 mM Tris pH 8,1, pre nego što su koncentrovane i nanete direktno na matricu za gel filtraciju kao što je opisano u Primeru 1.

Primer 3 - Karakterizacija vezivanja

[0091] Analiza vezivanja prečišćenih rastvorljivih TCR i ImmTAC molekula za relevantni kompleks peptid-HLA sprovedena je površinskom plazmon rezonancom, korišćenjem BIAcore 3000 ili BIAcore T200 instrumenta, ili bioslojnom interferometrijom, korišćenjem ForteBio Octet instrumenta). Biotinilovani molekuli HLA-A*02 klase I su ponovo presavijeni sa peptidom od interesa i prečišćeni korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433).

2

Sva merenja su obavljena na 25°C u Dulbeccovom PBS puferu, dopunjenom sa 0,005% P20.

BIAcore

[0092] Biotinilovani peptid-HLA monomeri su imobilisani na CM-5 senzorskim čipovima spojenim sa streptavidinom. Konstante ravnoteže vezivanja su određene korišćenjem serijskih razblaženja rastvorljivog TCR / ImmTAC injektiranih pri konstantnoj brzini protoka od 30 µl min.<-1>preko protočne ćelije obložene sa ~200 jedinica odgovora (RU) kompleksa peptid-HLA-A*02. Ravnotežni odgovori su normalizovani za svaku TCR koncentraciju oduzimanjem puferskog odgovora na kontrolnoj protočnoj ćeliji koja sadrži irelevantan peptid-HLA.Dvrednost je dobijena prilagođavanjem nelinearne krive korišćenjem softvera Prism i Langmuirove izoterme vezivanja, vezana = C*Max/(C KD), gde je „vezano“ ravnotežno vezivanje u RU pri ubrizganoj TCR koncentraciji C, a Max je maksimum vezivanje.

[0093] Za interakcije visokog afiniteta, parametri vezivanja su određeni analizom kinetike jednog ciklusa. Pet različitih koncentracija rastvorljivog TCR / ImmTAC je ubrizgano preko protočne ćelije obložene sa ~100 - 200 RU kompleksa peptid-HLA koristeći brzinu protoka od 50-60 µl min.<-1>. Tipično, 60-120 µl rastvorljivog TCR / ImmTAC je ubrizgano u najvišoj koncentraciji od 100-200 nM, uz uzastopna 2 puta razblaženja koja su korišćena za ostale četiri injekcije. Prvo je ubrizgana najniža koncentracija. Da bi se izmerila faza disocijacije, pufer je zatim ubrizgavan dok se ne dogodi ≥ 10% disocijacije, obično posle 1 - 3 sata. Kinetički parametri su izračunati korišćenjem BIAevaluation<®>softvera. Faza disocijacije je prilagođena jednoj eksponencijalnoj jednačini raspada koja omogućava izračunavanje vremena poluraspada. Konstanta ravnoteže KDizračunata je od koff/kon.

Oktet

[0094] Biotinilovani peptid-HLA monomeri su uhvaćeni do 1 nm na (SA) streptavidin biosenzore (Pall ForteBio) prethodno imobilizovane sa streptavidinom. Senzori su blokirani slobodnim biotinom (2 µM) tokom 2 minuta. Konstante ravnoteže vezivanja su određene uranjanjem napunjenih biosenzora u rastvorljiv TCR / ImmTAC serijski razblažen u ploči za uzorke sa 96 ili 384 bunarića. Mućkanje ploče je podešeno na 1000 obrtaja u minuti. Za interakcije niskog afiniteta (opseg µM) korišćeno je kratko povezivanje (~2 minuta) i kratko vreme disocijacije (~2 minuta). Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem referentnih biosenzora napunjenih irelevantnim pHLA koristeći Octet Data Analysis Software (Pall ForteBio). Odgovori (nm) u ravnoteži su korišćeni za procenu KD

2

vrednost iz dijagrama stabilnog stanja prilagođenih jednačini Odgovor= Rmax*konc/(KD konc), gde je "odgovor" ravnotežno vezivanje u nm pri svakoj koncentraciji TCR (konc) i Rmax je maksimalni odgovor vezivanja pri pHLA zasićenju.

[0095] Za interakcije visokog afiniteta (opseg nM - pM), kinetički parametri su određeni iz krivih vezivanja pri ≥ 3 TCR / ImmTAC koncentracijama tipično 10 nM, 5 nM i 2,5 nM. Vreme povezivanja je bilo 30 minuta, a vreme disocijacije 1-2 sata. Krive vezivanja su obrađene dvostrukim referentnim oduzimanjem referentnih biosenzora napunjenih irelevantnim pHLA i blokiranih biotinom. Kinetički parametri koni koffizračunati su globalnim uklapanjem direktno na krive vezivanja korišćenjem Octet Data Analysis Software (Pall ForteBio). KDizračunato je od koff/koni vreme poluraspada disocijacije je izračunato iz t1/2= 0,693/koff.

Primer 4 - Karakterizacija vezivanja rastvorljivog ne-mutiranog TCR pronalaska

[0096] Rastvorljivi TCR divljeg tipa je pripremljen prema postupcima opisanim u Primeru 1, a vezivanje za pHLA analizirano prema Primeru 3. Aminokiselinske sekvence alfa i beta lanaca su odgovarale onima prikazanim na Slici 2. Rastvorljivi biotinilovani HLA-A* 02 je pripremljen ili sa divljim tipom (SLLMWITQC) ili heteroklitičnim NY-ESO-1 peptidom (SLLMWITQV SEQ ID NO: 34), i imobilisan na BIAcore senzorski čip. KDvrednosti su određene na 5,2 µM i 4,3 µM respektivno. Nije otkriveno značajno vezivanje protiv 15 irelevantnih peptidnih HLA-A*02 kompleksa.

[0097] Ovi podaci ukazuju da se TCR vezuje za cilj sa odgovarajućim afinitetom i specifičnošću. Ovi TCR lanci stoga obezbeđuju korisnu skelu za identifikaciju daljih TCR pronalaska.

Primer 5 - Karakterizacija vezivanja rastvorljivih TCR visokog afiniteta i ImmTAC molekula pronalaska

[0098] Rastvorljivi mutirani TCR i ImmTAC molekuli su pripremljeni kako je opisano u Primerima 1 i 2, a karakteristike vezivanja su određene prema Primeru 3. TCR alfa i ili beta lanci su sadržali mutacije u najmanje jednom CDR regionu u odnosu na CDR sekvence prikazane na Slici 2 ( SEQ ID NO: 41 do 46). Aminokiselinske sekvence određenih mutiranih TCR alfa i beta lanaca varijabilnih regiona pronalaska su date na slikama 4 i 5 respektivno. Tabela ispod daje karakteristike vezivanja za rastvorljive TCR i/ili ImmTAC molekule koji sadrže naznačene alfa i beta varijabilne regione. Vezivanje je mereno korišćenjem heteroklitičnog NY-ESO-1 peptida (SLLMWITQV).

2

nd = nije utvrđeno

<1>Odgovara ImmTAC1 iz Primera 6, pune sekvence alfa i beta lanca su date na slici 5

<2>Odgovara ImmTAC2 iz Primera 6, pune sekvence alfa i beta lanca su date na slici 6

<3>Odgovara ImmTAC3 iz Primera 6, pune sekvence alfa i beta lanca su date na slici 7

<4>Odgovara ImmTAC4 iz Primera 6, pune sekvence alfa i beta lanca su date na slici 8

[0099] Ovi podaci pokazuju da sekvence TCR alfa i beta lanca pronalaska proizvode rastvorljive TCR i ImmTAC molekule sa karakteristikama vezivanja pogodnim za razvoj imunoterapeutskih reagensa.

Primer 6 - Snažno i specifično preusmeravanje T ćelija pomoću ImmTAC molekula pronalaska

[0100] ImmTAC molekuli koji sadrže alfa i beta sekvence varijabilnog lanca pronalaska su

1

testirani na njihovu sposobnost da posreduju u snažnom i specifičnom preusmeravanju CD3+ T ćelija ELISPOT testom, koristeći sekreciju interferona-γ (IFN-γ) kao očitavanje za aktivaciju T ćelija.

[0101] Sekvence alfa i beta lanaca četiri testirana ImmTAC molekula date su na slikama 5-8.

[0102] Testovi su izvedeni korišćenjem humanog IFN-γ ELISPOT kompleta (BD Biosciences). Ciljne ćelije su pripremljene u gustini od 1 × 10<6>/ ml u medijumu za ispitivanje (RPMI 1640 koji sadrži 10% toplotno inaktivirani FBS i 1% penicilin-streptomicin-L-glutamin) i naneti na 50.000 ćelija po bunarčiću u zapremini od 50 µl. Sledeće ciljne ćelijske linije su korišćene u ovom primeru:

• NCI-H1755 (NY-ESO-1<+ve>; HLA-A*02<+ve>) ćelijska linija humanog kancera pluća (isporučuje ATCC, kat. br.: CRL-5892)

• HAo5 (NY-ESO-1<-ve>; HLA-A*02<+ve>) humane srčane ćelije (isporučuje Promocell, kat. broj: C-12271)

[0103] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), izolovane iz sveže donorske krvi, korišćene su kao efektorske ćelije i postavljene u koncentraciji od 40.000 ćelija po bunarčiću u zapremini od 50 µl. Korišćene su različite koncentracije ImmTAC, koje obuhvataju očekivani klinički relevantan opseg, i dodavane su u bunarčić u zapremini od 50 µl.

[0104] Ploče su pripremljene prema uputstvu proizvođača. Ciljne ćelije, efektorske ćelije i ImmTAC molekuli su dodati u relevantne bunarčiće i dopunjeni do konačne zapremine od 200 µl sa medijumom za ispitivanje. Sve reakcije su izvedene u tri primerka. Kontrolni bunarčići su takođe pripremljeni bez ImmTAC, efektorskih ćelija ili ciljnih ćelija. Ploče su zatim inkubirane preko noći (37°C / 5% CO2). Sledećeg dana ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje (1 x PBS kesica, koja sadrži 0,05% P20, pripremljena u dejonizovanoj vodi). Primarno detekciono antitelo je zatim dodato u svaki bunarčić u zapremini od 50 µl. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 2 sata pre nego što su ponovo isprane tri puta. Sekundarna detekcija je izvedena dodavanjem 50 µl razblaženog streptavidina-HRP u svaki bunarčić i inkubacijom na sobnoj temperaturi 1 sat i korak ispiranja je ponovljen. Ploče su zatim isprane dva puta sa 200 µl PBS (pH 7,4). Ne više od 15 minuta pre upotrebe, jedna kap (20 µl) AEC hromogena je dodata u svaki 1 ml AEC supstrata i izmešana i dodato je 50 µl u svaki bunar. Razvoj mrlja je redovno praćen i ploče su isprane u vodi iz slavine da bi se prekinula reakcija razvoja. Ploče su zatim ostavljene da se osuše na sobnoj temperaturi najmanje 2 sata pre brojanja tačaka korišćenjem CTL analizatora sa softverom Immunospot (Cellular Technology Limited).

[0105] Podaci predstavljeni na slici 9 pokazuju da ImmTAC molekuli koji sadrže alfa i beta sekvence varijabilnog lanca pronalaska mogu da posreduju u snažnom preusmeravanju T ćelija

2

protiv HLA-A*02<+ve>ćelija kancera koje eksprimiraju ciljni antigen. Nije primećena aktivnost protiv HLA-A*02<+ve>antigen negativne ćelije. Ovi podaci ukazuju da su ImmTAC molekuli specifični za ciljnu ćeliju unutar klinički relevantnog opsega koncentracija (≤ 1 nM).

[0106] Dalja procena potencije je izvršena za ImmTAC molekule 3 i 4 da bi se odredile vrednosti EC50. ELISpot testovi su izvedeni kao što je gore opisano sa ImmTAC koncentracijama u rasponu od 10<-13>M do 10<-8>M. Podaci su analizirani korišćenjem softvera Prism 5.0 (GraphPad) za izračunavanje vrednosti EC50. Vrednosti su određene kao 95 pM i 121 pM za ImmTAC molekule 3 i 4 (Slika 10). Ovi podaci potvrđuju sposobnost ovih ImmTAC molekula da posreduju u snažnom preusmerenom T ćelijskom odgovoru.

Primer 7 - Dalje testiranje specifičnosti ImmTAC molekula pronalaska

[0107] Dalje testiranje specifičnosti ImmTAC molekula je sprovedeno na panelu normalnih ćelija. ImmTAC molekuli 2-4 (Slike 6-8) se koriste u ovom primeru. Sekrecija interferona-i (IFN-γ) je korišćena kao očitavanje za aktivaciju T ćelija.

[0108] Testovi su izvedeni korišćenjem IFN-γ DuoSet ELISA kompleta (R&D Sistems, kat br: DI285) i sprovedeni prema uputstvima proizvođača. Ukratko, IFN-γ je razblažen do 10,000 pg/ml i napravljena su 2 puta razblaženja da bi se dobila standardna kriva. Ciljne ćelije su izbrojane i postavljene na 10.000 ćelija po bunarčiću u 10 ul u medijumu za ispitivanje. ImmTAC molekuli su razblaženi da bi se dobile konačne koncentracije od 2 nM i 1 nM u 10 ul po bunarčiću. Takođe je pripremljen kontrolni uzorak bez ImmTAC. Efektorski PBMC su odmrznuti i postavljeni na 10.000 ćelija/bunariću u 10 ul. Ploče su inkubirane 48 h pre nego što su razvijene i očitane.

[0109] U ovom primeru, NCI-H1755 ćelije su korišćene kao antigen pozitivna kontrola, a HTC-116 ćelije su korišćene kao antigen negativna kontrola. Ćelijski panel je uključivao kardiomiocite (CM12, CM5 i CM10), endotelne ćelije aorte (HAo5), epitelne ćelije disajnih puteva (HCAEC2 i HCAEC5), mioblaste skeletnih mišića (HSkMM3) i ćelije HPF9. Sve ćelijske linije su bile HLA-A*02<+ve>. Testovi su izvedeni u tri primerka.

[0110] Podaci predstavljeni na Slici 11 pokazuju minimalnu proizvodnju IFN-γ u prisustvu ćelijskih linija izvedenih iz normalnih tkiva, u odnosu na antigen pozitivne ćelijske linije kancera, unutar terapeutski relevantnog opsega koncentracija ImmTAC. Ovi podaci ukazuju da ImmTAC molekuli pronalaska imaju visok nivo specifičnosti i stoga su posebno pogodni za terapeutsku upotrebu.

Primer 8 - Snažno ubijanje tumorskih ćelija ImmTAC preusmerenim T ćelijama

[0111] Sposobnost ImmTAC molekula pronalaska da posreduju u snažnom preusmerenom ubijanju T ćelija tumorskih ćelija pozitivnih na antigen ispitana je korišćenjem IncuCite platforme (Essen BioScience). Ovaj test omogućava detekciju u realnom vremenu mikroskopijom oslobađanja kaspaze-3/7, markera za apoptozu.

[0112] Testovi su izvedeni korišćenjem kompleta za analizu apoptoze kaspaze-3/7 sa 96 bunarčića CellPlaier (Essen BioScience, Kat. br. 4440) i sprovedeni prema protokolu proizvođača. Ukratko, ciljne ćelije (NCI-H1755 - NYESO<+ve>HLA A*02<+ve>ili HCT-116 -NYESO<-ve>HLA A*02<+ve>) su postavljene na 5000 ćelija po bunarčiću i inkubirane preko noći da bi im se omogućilo da prianjaju. ImmTAC rastvori su pripremljeni u koncentracijama između 2,16 nM i 8,8 pM. 25 ul svake koncentracije je dodato u odgovarajući bunarčić. PBMC su korišćene kao efektorske ćelije i postavljene na 50.000 po bunarčiću u 50 ul. Takođe je pripremljen kontrolni uzorak bez ImmTAC. NucView reagens za analizu je napravljen na 30 uM i 25 uM dodato u svaki bunarčić (dajući 5 uM konačne koncentracije). Ploča je stavljena u instrument IncuCite i slike su snimane svaka 2 sata (1 slika po otvoru) tokom 3 dana. Broj apoptotičkih ćelija na svakoj slici je određen i zabeležen kao br. predmeta po mm<2>. Testovi su izvedeni u tri primerka.

[0113] Podaci predstavljeni na slici 12 pokazuju ubijanje tumorskih ćelija u realnom vremenu od strane ImmTAC preusmerenih T ćelija. Rezultati su predstavljeni za ImmTAC3 i ImmTAC4. Oba ImmTAC molekula pokazuju preusmereno ubijanje T ćelija pozitivnih na antigen tumorskih ćelija pri koncentracijama od čak 26 pM. ImmTAC3 pokazuje preusmereno ubijanje T ćelija ispod 10 pM. Niski nivo ubijanja antigen negativnih ćelija je primećen samo pri najvišoj koncentraciji (2,16 nM).

[0114] Ovi podaci potvrđuju da ImmTAC3 i immTAC4 posreduju snažno preusmereno ubijanje T ćelija tumorskih ćelija pozitivnih na antigen unutar terapeutski relevantnog opsega koncentracija.

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi 1. T ćelijski receptor (TCR) koji ima svojstvo specifičnog vezivanja za SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks i koji sadrži varijabilni domen alfa lanca TCR i varijabilni domen beta lanca TCR, naznačen time što varijabilni domen alfa lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa SEQ ID NO: 12, varijabilni domen beta lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa SEQ ID NO: 15, i sekvenca varijabilnog domena alfa lanca aminokiselinskih ostataka 27-32 (CDR1), 50-57 (CDR2) i 91-107 (CDR3) i sekvenca varijabilnog domena beta lanca aminokiselinskih ostataka 27-31 (CDR1), 49- 55 (CDR2) i 93-106 (CDR3) su izabrane od sledećih:
2. TCR prema zahtevu 1 koji se vezuje za SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) HLA-A*02 kompleks sa afinitetom većim od 50 µM, izborno sa afinitetom od 1 pM do 50 nM.
3. TCR prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što su varijabilni domen alfa lanca i varijabilni domen beta lanca izabrani od aminokiselinskih sekvenci od:
4. TCR prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji je alfa-beta heterodimer, koji ima sekvencu konstantnog domena alfa lanca TRAC i sekvencu konstantnog domena beta lanca TRBC1 ili TRBC2.
5. TCR prema zahtevu 4, naznačen time što su sekvence konstantnog domena alfa i beta lanca modifikovane skraćivanjem ili supstitucijom da bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.
6. TCR prema zahtevu 4 ili zahtevu 5, naznačent ime što je(su) sekvenca(sekvence) konstantnog domena alfa i/ili beta lanca modifikovane supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu navedeni cisteini formiraju ne-nativnu disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR.
7. TCR prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji je u formatu jednog lanca tipa Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, pri čemu, Vα i Vβ su α i β varijabilni regioni TCR respektivno, Cα i Cβ su α i β konstantni regioni TCR respektivno i L je sekvenca linkera.
8. TCR prema bilo kom od prethodnih zahteva, povezan sa detektabilnim obeleživačem, terapeutskim agensom ili PK modifikujućim ostatkom.
9. TCR anti-CD3 fuzija koja sadrži TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu i anti-CD3 antitelo kovalentno vezano za C- ili N-terminus alfa ili beta lanca TCR.
10. TCR anti-CD3 fuzija prema zahtevu 9, koja sadrži varijabilni domen alfa lanca izabran od SEQ ID NO: 7 i 12 i koja sadrži varijabilni domen beta lanca izabran od SEQ ID NO: 15 i 18.
11. TCR anti-CD3 fuzija prema zahtevu 10, naznačena time što je beta lanac vezan za sekvencu anti-CD3 antitela preko sekvence linkera, izborno pri čemu je sekvenca linkera izabrana iz grupe koja se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30) i GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31).
12. TCR anti-CD3 fuzija prema zahtevu 11, koja sadrži alfa i beta lanac koji ima najmanje 90% identičnosti, kao što je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti, sa aminokiselinskim sekvencama kao što su navedene u tabeli ispod:
13. TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 12, koja sadrži varijabilni domen alfa lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen beta lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15 i pri čemu je beta lanac vezan za anti-CD3 antitelo preko sekvence linkera, izborno pri čemu je beta lanac vezan za anti-CD3 antitelo preko sekvence linkera SEQ ID NO: 24 ili gde je alfa lanac vezan za anti-CD3 antitelo preko sekvence linkera.
14. TCR anti-CD3 fuzija prema zahtevu 13, koja ima alfa lanac SEQ ID NO: 32 i beta lanac SEQ ID NO: 33, ili alfa lanac SEQ ID NO: 37 i beta lanac SEQ ID NO: 38.
15. Nukleinska kiselina koja kodira TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili TCR anti-CD3 fuziju prema bilo kom od zahteva 9 do 14.
16. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 15.
17. Neprirodna i/ili prečišćena i/ili konstruisana ćelija, kao što je T-ćelija, koja predstavlja TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 14.
18. Ćelija, kao što je T-ćelija, koja sadrži (a) TCR ekspresioni vektor prema zahtevu 16 u jednom otvorenom okviru čitanja, ili dva različita otvorena okvira čitanja koja kodiraju alfa lanac i beta lanac respektivno; ili (b) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili TCR anti-CD3 fuziju prema bilo kom od zahteva 9 do 14, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili TCR anti-CD3 fuziju prema bilo kom od zahteva 9 do 14.
19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili TCR anti-CD3 fuziju prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinsku kiselinu prema zahtevu 15 ili ćeliju prema zahtevu 17 ili 18, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.
20. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinska kiselina prema zahtevu 15 ili ćelija prema zahtevu 17 ili 18 za upotrebu u medicini, kod humanog subjekta.
21. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinska kiselina prema zahtevu 15 ili ćelija prema zahtevu 17 ili 18 za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta.
22. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinska kiselina prema zahtevu 15 ili ćelija prema zahtevu 17 ili 18 za upotrebu u tretmanu solidnog tumora koji eksprimira NYESO-1 ili LAGE-1A kod humanog subjekta, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) kod humanog subjekta, tumora bešike kod humanog subjekta, melanoma kod humanog subjekta ili sinovijalnog sarkoma kod humanog subjekta.
23. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinska kiselina prema zahtevu 15 ili ćelija prema zahtevu 17 ili 18 za upotrebu prema zahtevu 22, naznačeni time što humani subjekat je subjekat HLA-A*02 podtipa.
24. Formulacija za injekcije pogodna za primenu na humanog subjekta koja sadrži TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, TCR anti-CD3 fuziju prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinsku kiselinu prema zahtevu 15, ćeliju prema zahtevu 17 ili 18 ili farmaceutsku kompoziciju prema zahtevu 19.
25. Formulacija za injekcije prema zahtevu 24, za upotrebu u medicini.
26. Formulacija za injekciju za upotrebu prema zahtevu 25, koja se primenjuje injekcijom, kao što je intravenska ili direktna intratumoralna injekcija.
27. Postupak za proizvodnju TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili TCR anti-CD3 fuzije prema bilo kom od zahteva 9 do 14, koji sadrži a) održavanje ćelije domaćina prema zahtevu 18 pod optimalnim uslovima za ekspresiju nukleinske kiseline i b) izolovanje TCR ili TCR anti-CD3 fuzije kodirane nukleinskom kiselinom.
28. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 8, TCR anti-CD3 fuzija prema bilo kom od zahteva 9 do 14, nukleinska kiselina prema zahtevu 15 ili ćelija prema zahtevu 17 ili 18 za upotrebu prema zahtevu 22 ili 23, u kombinaciji sa anti-neoplatičnim agensom.