JP6985274B2

JP6985274B2 - Ｎｙ−ｅｓｏ−１腫瘍抗原−ｈｌａ−ａ＊０２複合体に特異的なｔ細胞レセプター

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Publication number: JP6985274B2
Application number: JP2018532590A
Authority: JP
Inventors: チェスター，フィオナ; アレクサンダーノックス，アンドリュー; パトリックローサー，ジョナサン; バイナブハイパテル，ヴィレン; エリザベスバストン，エマ; マルティネスハーグ，ルース
Original assignee: イムノコアリミテッド
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2021-12-22
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: ES2923026T3; MY196179A; AU2016375994B2; US20190002523A1; SI3394094T1; PT3394094T; PL3394094T3; RU2018122795A; HRP20221021T1; US11639374B2; CN109476723A; EP3394094B1; DK3394094T3; KR20180090374A; GB201522592D0; SMT202200336T1; HUE059484T2; IL260151A; LT3394094T; RU2018122795A3

Description

本発明は、ガン抗原NY-ESO-1に由来するHLA-A^*02制限ペプチドSLLMWITQCに結合するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。前記TCRは、α及び/又はβ可変ドメイン内に、天然型NY-ESO-1 TCRに関する変異を含んでなり得る。本発明のTCRは、悪性疾患治療用の新規免疫治療剤としての使用に特に適切である。

発明の背景
Ｔ細胞レセプター(TCR)は、CD4⁺及びCD8⁺ Ｔ細胞により天然に発現される。TCRは、主要組織適合性複合体(MHC)分子(ヒトでは、MHC分子はヒト白血球抗原又はHLAとしても知られる)との複合体で、抗原提示細胞の表面にディスプレイされる短いペプチド抗原を認識するように設計されている(Davisら(1998), Annu Rev Immunol 16：523-544)。CD8⁺ Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれ、MHCクラスＩに結合するペプチドを特異的に認識し、一般には、感染細胞又はガン細胞の発見及びその破壊の仲介を担っている。

NY-ESO-1は、生殖細胞系列にコードされるガン抗原のファミリーに属し(Chenら(1997), Cytogenet Cell Genet 79(3-4)：237-240：WO9814464)、Uniprotアクセッション番号P78358を有する。この生殖細胞系列の抗原は、種々のガンにおいて頻繁に発現することが見出されている一方、正常組織における発現は成人の精巣その他の免疫特権部位に制限されている。そのガン特異的性質により、これら抗原は抗ガン剤の理想的な標的となっている。NY-ESO-1の正確な機能は未知のままであるが、その発現は、胎児及び成人の精巣(Satieら(2002), Lab Invest 82(6)：775-780)、卵巣及び子宮筋層、並びにミエローマ(Andradeら(2008), Cancer Immun 8：2)、卵巣ガン(Odunsiら(2003), Cancer Res 63(18)：6076-6083)、非小細胞肺ガン(Konishiら(2004), Oncol Rep 11(5)：1063-1067)及びメラノーマ(Barrowら(2006), Clin Cancer Res 12(3 Pt 1)：764-771)を含む種々の広範なガンにおいて報告されている。９マーペプチドSLLMWITQC(配列番号１)は、全長NY-ESO-1タンパク質のアミノ酸157〜165に相当する。同じペプチドが、別のガン抗原であるLAGE-1A(Acc. No. O75638-2)にも見出される(Letheら(1998), Int J Cancer 76(6)：903-908)。このペプチドはHLA-A^*02に結合し、ペプチド-HLA複合体は細胞傷害性Ｔ細胞を刺激して、NY-ESO-1⁺, HLA-A^*02⁺腫瘍細胞の溶解を導くことができる(Duffourら(1999), Eur J Immunol 29(10)：3329-3337及びWO2000020445)。したがって、SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体は、免疫療法的介入の有用な標的抗原を提供する。

SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体に結合する特定のTCR配列の同定は、新規免疫治療剤の開発に有利である。このような治療用TCRは、例えば、細胞傷害性薬剤又は免疫エフェクター薬剤を腫瘍に送達するための可溶性標的化剤として使用し得(Lissinら(2013)，「High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals：Applications and Challenges」 S. R. Schmidt, Wiley；Boulterら(2003), Protein Eng 16(9)：707-711；Liddyら(2012), Nat Med 8：980-987)、或いは養子療法用にＴ細胞を遺伝子操作するために用い得る(Juneら(2014), Cancer Immunol Immunother 63(9)：969-975)。免疫療法用TCRは、標的抗原を強力に認識することができることが望ましく、このことは、TCRが、有力な応答を発揮するように、標的抗原に関して高い親和性及び/又は長い結合半減期を有するべきことを意味する。TCRは、天然に存在するままでは、代表的には、標的抗原に関して低い親和性を有し(数マイクロモル範囲)、そのため、所与のTCR配列に対してなし得る、抗原結合を改善する変異(置換、挿入及び/又は欠失を含むがこれらに限定されない)を同定することが必要となる場合が多い。可溶性標的化剤としての利用のためには、ナノモル〜ピコモル範囲の抗原結合親和性及び数時間の結合半減期を有するTCRが好ましい。治療用TCRは標的抗原に関して高レベルの特異性を示し、臨床適用においてオフターゲット結合に起因する毒性リスクを低減することも望ましい。TCRの抗原認識における天然の縮重を考慮すれば、このような高特異性は、特に困難であり得る(Wooldridgeら(2012), J Biol Chem 287(2)：1168-1177；Wilsonら(2004), Mol Immunol 40(14-15)：1047-1055)。最後に、治療用TCRは高度に安定な形態で発現し、精製され得ることが望ましい。

本明細書に記載するTCR配列は、TCRの分野の当業者に広く知られアクセス可能であるIMGT命名法を参照して記載される。例えば、LeFranc及びLeFranc(2001)，「T cell Receptor Factsbook」, Academic Press；Lefranc(2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6)：595-603；Lefranc(2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1：Appendix 1O；並びにLefranc(2003), Leukemia 17(1)：260-266を参照。αβTCRは２つのジスルフィド連結鎖からなる。各鎖(α及びβ)は、一般に、２つのドメイン、すなわち、可変ドメイン及び定常ドメインを有すると考えられる。短い連結領域が可変ドメインと定常ドメインとを連結し、この連結領域は、代表的には、可変領域の一部とみなされている。加えて、β鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域を含有する。

各鎖の可変ドメインはＮ末端側に位置し、フレームワーク配列に埋め込まれた３つの相補性決定領域(CDR)を含んでなる。CDRはペプチド-MHC結合のための認識部位を含む。α鎖可変(Vα)領域をコードする幾つかの遺伝子及びβ鎖可変(Vβ)領域をコードする幾つかの遺伝子が存在する。これら遺伝子は、フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により区別される。Vα及びVβ遺伝子は、IMGT命名法では、それぞれ接頭語「TRAV」及び「TRBV」を用いて称呼される(Folch及びLefranc(2000), Exp Clin Immunogenet 17(1)：42-54；Scaviner及びLefranc(2000), Exp Clin Immunogenet 17(2)：83-96；LeFranc及びLeFranc(2001), 「T cell Receptor Factsbook」, Academic Press)。同様に、α鎖及びβ鎖について、それぞれ「TRAJ」又は「TRBJ」と呼ばれる幾つかの連結又はＪ遺伝子が存在し、β鎖については「TRBD」と呼ばれる多様性又はＤ遺伝子が存在する(Folch及びLefranc(2000), Exp Clin Immunogenet 17(2)：107-114；Scaviner及びLefranc(2000), Exp Clin Immunogenet 17(2)：97-106；LeFranc及びLeFranc(2001), 「T cell Receptor Factsbook」, Academic Press)。α及びβ可変領域配列の非常に大きな多様性は、種々のＶ、Ｊ及びＤ遺伝子(対立遺伝子バリアントを含む)の間での再配置の組合せ、更には連結多様性に起因する(Arstilaら(1999), Science 286(5441)：958-961；Robinsら(2009), Blood 114(19)：4099-4107)。TCR α鎖及びβ鎖の定常又はＣ領域は、それぞれ「TRAC」及び「TRBC」と呼ばれる(Lefranc(2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1：Appendix 1O)。

本願の明細書及び特許請求の範囲において、用語「TCRアルファ(又はα)可変ドメイン」は、TRAV領域とTRAJ領域との連鎖；TRAV領域のみ；又はTRAV領域及びTRAJ領域の一部をいい、用語「TCRアルファ(又はα)定常ドメイン」はTRAC細胞外領域又はＣ末端短縮型若しくは全長のTRAC配列をいう。同様に、用語「TCRベータ(又はβ)可変ドメイン」は、TRBV領域とTRBD/TRBJ領域との連鎖；TRBV領域及びTRBD領域のみ；TRBV領域及びTRBJ領域のみ；又はTRBV領域並びにTRBD領域及び/又はTRBJ領域の一部をいい、用語「TCRベータ(又はβ)定常ドメイン」は、TRBC細胞外領域又はＣ末端短縮型若しくは全長のTRBC配列をいう。
NY-ESO-1を標的するTCRは、以前に報告されている(WO05113595；WO08039818；McCormackら(2013), Cancer Immunol Immunother 62(4)：773-785)。

本発明者らは、NY-ESO-1 HLA-A^*02複合体に結合する代替のTCR α及びβ可変ドメイン配列を同定した。この配列は、SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体を提示するガンの標的化免疫療法のための治療用TCRとしての使用に特に適切である。
本発明者らは、下記の鎖を含んでなる天然型TCRを同定した：
α鎖：TRAV3^*01/TRAJ28^*01
β鎖：TRBV29-1^*01/TRBD2^*01/TRBJ2-3^*01
(注記：用語「^*01」は、IMGT命名法により指定されているように、この配列についての対立遺伝子バリアントを示す。)
この天然型TCRは、本発明の変異配列を誘導する鋳型として用いられた。

発明の要旨
本発明は、第１の観点として、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に対する結合性を有し、TCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなり、
α鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸１〜117と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び/又は
β鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸１〜115と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
Ｔ細胞レセプター(TCR)を提供する。

第２の観点として、本発明は、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に50μMより大きい親和性で結合し、ここで：α鎖のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号41、42及び43を含み、及び/又はβ鎖のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号44、45及び46を含み；及び/又は前記CDRの少なくとも１つが配列番号41〜46に関して１又は２以上の保存的置換を含有し；及び/又は前記CDRの少なくとも１つが配列番号41〜46に関して３つまでの寛容される置換を含有する、TCRを提供する。

第１又は第２の観点のα鎖可変ドメインは配列番号２の番号付けを参照して次の変異：

の少なくとも１つを有していてもよく、及び/又は第１又は第２の観点のβ鎖可変ドメインは配列番号３の番号付けを参照して次の変異：

の少なくとも１つを有していてもよい。

α鎖可変ドメインは配列番号２の番号付けを参照して次の変異：

の少なくとも１つを有していてもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインは配列番号３の番号付けを参照して次の変異：

の少なくとも１つを有していてもよい。

の２〜６つを有していてもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインは配列番号３を参照して次の変異：

の３〜９つを有していてもよい。

α鎖可変ドメインは次の変異群：
群１：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A
群２：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97D
群３：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97R
群４：I96S、N97D、S98Q、G99H
群５：D95S、I96S、N97R、S98Q、G99H
群６：I51L、G53D
の少なくとも１つを有していてもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインは次の変異群：
群１：N50W、Q51T、S53G
群２：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G
群３：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G、G100A
群４：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T
群５：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G
群６：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G、G100A
群７：S27K、Q28R、V29L、T30A、M3IL、N50W、Q51T
群８：T30A、N50W、G100A
の少なくとも１つを有していてもよい。

α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインはそれぞれ次の変異群：

を有していてもよい。

本発明のTCRは、配列番号２の番号付けを参照して次の変異：

を有するα鎖可変ドメインを含んでなってもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインは配列番号３の番号付けを参照して次の変異：

の少なくとも１つを有していてもよい。

α鎖可変ドメインにおいて、アミノ酸残基27〜32、50〜57及び91〜107の配列は次：

から選択される。
TCR α鎖可変ドメインは配列番号12と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

β鎖可変ドメインにおいて、アミノ酸残基27〜31、49〜55及び93〜106の配列は次：

から選択される。
TCR β鎖可変ドメインは配列番号15と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

α鎖可変ドメインは、下記表から選択されるアミノ酸残基27〜32、50〜57及び91〜107の配列を有していてもよく、β鎖可変ドメインは、下記表から選択されるアミノ酸残基27〜31、49〜55及び93〜106の配列を有していてもよい：

α鎖可変ドメインは配列番号12と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、β鎖可変ドメインは配列番号15と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
α鎖可変ドメインは配列番号６〜12又は51のアミノ酸配列から選択されてもよく、β鎖可変ドメインは配列番号13〜23又は52のアミノ酸配列から選択されてもよい。

α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインは次：

のアミノ酸配列から選択されてもよい。
本発明のTCRは、α鎖TRAC定常ドメイン配列及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列を有するα-βヘテロダイマーであってもよい。

α鎖及びβ鎖の定常ドメイン配列はTRACのエキソン２のCys4と、TRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮化又は置換により改変されていてもよく、及び/又は、α鎖及び/又はβ鎖の定常ドメイン配列はTRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57からシステイン残基への置換により改変されており、該システイン同士はTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインと間で非天然型ジスルフィド結合を形成していてもよい。
本発明のTCRは、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型(式中、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)の単鎖形式であってもよい。

本発明のTCRは、検出可能な標識、治療剤又はPK調整成分と結合していてもよい。
本発明また、本発明のTCRと、該TCRのα鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に共有結合した抗CD3抗体とを含んでなるTCR-抗CD3融合体を提供し、このTCR-抗CD3融合体は、配列番号６〜12又は51から選択されるα鎖可変ドメイン及び配列番号13〜23又は52から選択されるβ鎖可変ドメインを含んでなっていてもよい。β鎖は抗CD3抗体配列にリンカー配列を介して連結されていてもよく；リンカー配列は、GGGGS(配列番号24)、GGGSG(配列番号25)、GGSGG(配列番号26)、GSGGG(配列番号27)、GSGGGP(配列番号28)、GGEPS(配列番号29)、GGEGGGP(配列番号30)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号31)からなる群より選択されてもよい。

本発明のTCR-抗CD3融合体は、下記の表：

に記載のアミノ酸配列の対と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するα鎖アミノ酸配列とβ鎖アミノ酸配列との対を含んでなってもよい。
本発明はまた、本発明のTCR又はTCR-抗CD3融合体をコードする核酸を提供する。

本発明のTCR又はTCR-抗CD3融合体を提示する天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作された細胞、(ａ)本発明のTCR発現ベクターを、単一オープンリーディングフレーム中又はα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする２つの別個のオープンリーディングフレーム中に有するか；又は(ｂ)本発明のTCR又はTCR-抗CD3融合体のα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクターと、本発明のTCR又はTCR-抗CD3融合体のβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターとを有する細胞もまた提供する。
TCR若しくはTCR-抗CD3融合体を提示する細胞又は発現ベクターを有する細胞は、Ｔ細胞であってもよい。

本発明はまた、本発明のTCR若しくはTCR-抗CD3融合体又は本発明の細胞を、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤と共に含んでなる医薬組成物を提供する。
医薬に用いるための、本発明のTCR、TCR-抗CD3融合体、核酸又は細胞もまた提供される。TCR、TCR-抗CD3融合体、細胞又は核酸は、ヒト対象におけるガン治療法に用いられるものであってもよい。
ヒト対象はNY-ESO-1及び/又はLAGE-1Aを発現する腫瘍を有していてもよく、腫瘍は固形/充実腫瘍であってもよく、滑膜肉腫、非小細胞肺ガン(NSCLC)、膀胱の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、直腸結腸の腫瘍、乳房の腫瘍、卵巣の腫瘍、食道の腫瘍、メラノーマ、多発性骨髄腫、肝細胞ガン及び頭部頸部の腫瘍から選択されてもよい。ヒト対象は、HLA-A^*02サブタイプの対象であってもよい。

発明の詳細な説明
第１の観点において、本発明は、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に対する結合性を有し、TCR α鎖可変ドメイン及び/又はTCR β鎖可変ドメインを含んでなり、α鎖可変ドメインが配列番号２のアミノ酸１〜117と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び/又は、β鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸１〜115と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞レセプター(TCR)を提供する。TCRは、単離され、細胞フリーであり及び/又は可溶性であってもよい。すなわち、TCRは、人体においてＴ細胞内に天然の状態で生じるTCRでなくてもよい。

本発明はまた、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に50μMより大きい親和性で結合し、ここで：α鎖のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号41、42及び43を含み、及び/又はβ鎖のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号44、45及び46を含み；及び/又は前記CDRの少なくとも１つが配列番号41〜46に関して１又は２以上の保存的置換を含有し；及び/又は前記CDRの少なくとも１つが配列番号41〜46に関して３つまでの寛容される置換を含有する、TCRを提供する。SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体に関するTCRの親和性は、50μM〜100nMの範囲であってもよい。好ましくは、前記置換は、結合親和性を、非置換TCRと比較して、±50％を超えて、より好ましくは±20％を超えて変化させないものである。

本発明の安定な可溶性TCRの作製には、図２に示す配列を有する可溶性型の天然型TCRを出発配列として用いた。この目的のため、非天然型鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となるように、TRAC領域及びTRBC領域にシステイン置換を導入する。前記システイン置換の場所の適切な位置はWO03020763に記載されている。図２は、可溶形式の野生型TCRのα鎖及びβ鎖の細胞外配列をそれぞれ示す。配列番号４は、TRACのThr48がCysで置換されていることを除き、配列番号２の天然型α鎖細胞外配列と同一である。同様に、配列番号５は、TRBCのSer57がCysで置換され、Cys75がAlaで置換され、Asn201がAspで置換されていることを除き、配列番号３の天然型β鎖細胞外配列と同一である。上記の可溶性野生型TCRは、本発明の変異TCRの結合プロフィールと比較され得る参照/基準を提供するために用いることができる。第１の観点のTCRは第２の観点のTCRであってもよい。

本発明のいずれか又は両方の観点のTCRは、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作されたものであってもよい。本発明のTCRは、天然型NY-ESO-1 TCRと比較して、α鎖可変ドメイン及び/又はβ鎖可変ドメインに存在する１又は２以上の変異を有していてもよい。

「工学的に操作されたTCR」及び「変異TCR」は、本明細書では同義に用いられ、概して、野生型NY-ESO-1 TCRに関して１又は２以上の変異が、特にα鎖可変ドメイン及び/又はβ鎖可変ドメインに導入されているTCRを意味する。変異は、好ましくは、CDR領域内になされる。これら変異は、代表的には、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に対するTCRの結合親和性を向上させる。α鎖可変ドメインは配列番号２の番号付けを参照して次の変異：

(表１)
の少なくとも１、２、３、４、５又は６つを有していてもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインは配列番号３の番号付けを参照して次の変異：

(表２)
の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９つを有していてもよい。

(表３)
の少なくとも１つを有していてもよく、及び/又はβ鎖可変ドメインは配列番号３の番号付けを参照して次の変異：

(表４)
の少なくとも１つを有していてもよい。

α鎖可変ドメインは次の変異群：
群１：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A
群２：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97D
群３：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97R
群４：I96S、N97D、S98Q、G99H
群５：D95S、I96S、N97R、S98Q、G99H
群６：I51L、G53D
の少なくとも１つを有し、及び/又はβ鎖可変ドメインは次の変異群：
群１：N50W、Q51T、S53G
群２：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G
群３：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G、G100A
群４：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T
群５：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G
群６：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G、G100A
群７：S27K、Q28R、V29L、T30A、M3IL、N50W、Q51T
群８：T30A、N50W、G100A
の少なくとも１つを有する。

変異群の特定の組合せは下記の表：

(表５)
に記載されるものであってもよい。

変異の特定の組合せは下記の表：

(表６)

(表７)
に記載されるように本発明のTCRに存在してもよい。

特に、α鎖及びβ鎖可変ドメインは次のアミノ酸配列の組合せ：

(表８)
を含んでなってもよい。

特定の実施形態において、α鎖CDRには１、２、３、４、５、６、７又は８つの変異、例えば２〜６つの変異が存在し、及び/又はβ鎖CDRには１、２、３、４、５、６、７、８又は９つの変異、例えば３〜９つの変異が存在する。幾つかの実施形態において、本発明のTCRのα鎖可変ドメインは、上記の変異の少なくとも１つを有するという条件で、配列番号２のアミノ酸残基１〜117の配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインは、上記の変異の少なくとも１つを有するという条件で、配列番号３のアミノ酸残基１〜115の配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。α鎖可変ドメインは、配列番号６〜12又は51のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいてもよい。β鎖可変ドメインは、配列番号13〜23又は52のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなってもよい。

変異はCDRの外側になされてもよく、この変異は結合を改善してもよいが、好ましくは精製収率及び安定性を向上させる。このような変異の例は、α鎖可変ドメイン中では、配列番号２の番号付けを参照して：

(表９)
であってもよく、及び/又はβ鎖可変ドメイン中では、配列番号３の番号付けを参照して次の変異：

(表10)
の少なくとも１つであってもよい。

親TCRに対する変異は、SLLMWITQCに対するTCRの結合親和性(k_D及び/又は結合半減期)を増大させることができるものを含んでいてもよい。変異は、非特異的結合の量を低減させることができるもの、すなわち、SLLMWITQCに対する結合に加えて、抗原に対する結合も低減させることができるもの又はSLLMWITQCに対するTCR結合の特異性を増大させることができるものを含んでいてもよい。変異は、フォールディング及び/又は製造の効率を増大させるものを含んでいてもよい。これら特性の各々に寄与する変異もあれば、例えば、親和性に寄与するが特異性には寄与しない変異、又は特異性に寄与するが親和性には寄与しない変異などもあってよい。

本明細書に開示するいずれの本発明のTCRの表現型上サイレントなバリアントも、本発明の範囲内である。本明細書で用いる場合、用語「表現型上サイレントなバリアント」は、上記の変異に加えて、１又は２以上の更なるアミノ酸変化が組み込まれたTCR(前記変化のない対応するTCRに類似する表現型を有するもの)をいうと理解される。本願の目的のためには、TCR表現型は、抗原結合親和性(K_D及び/又は結合半減期)及び抗原特異性を含む。表現型上サイレントなバリアントは、同一条件下(例えば25℃にて同じSPRチップ上)で測定したとき、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に関して、前記変化を有しない対応するTCRの測定されたK_D及び/又は結合半減期の20％以内のK_D及び/又は結合半減期を有していてもよい。適切な条件は実施例３で更に記載される。抗原特異性は下記で更に記載される。当業者に公知であるように、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体との相互作用の親和性を変更することなく、可変ドメインに、上記のものからの変化が組み込まれたTCRを作製することは可能であり得る。具体的には、このようなサイレント変異は、抗原結合に直接関与しないことが知られている配列の部分(例えば、CDRの外側又はCDRのペプチド抗原と接触しない部分)に組み込まれてもよい。このような特段の意味のないバリアントも本発明の範囲に含まれる。１又は２以上の保存的及び/又は寛容される置換がなされたTCRも本発明の一部を構成する。許容される置換は、下記のとおり、表現型上サイレントであるが、保存的でないことがあり得るものである。寛容される置換は、寛容される置換を有しないTCRと比較して、SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体に関する親和性の減少を生じてもよい。親和性の減少は、寛容される置換を有しないTCRの５％、10％、15％、20％、25％、30％、40％又は50％であってもよい。親和性の減少は、50μM未満の(すなわち、50μMより弱い)親和性をもたらさない。

本発明のTCRは、類似するアミノ酸配列を有し及び/又は同じ機能を保持する１又は２以上の保存的置換を含んでいてもよい。当業者は、種々のアミノ酸が類似する特性を有し、よって「保存的」であることを理解する。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのそのような１又は２以上のアミノ酸は、該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの所望の活性を消失させない１又は２以上の他のそのようなアミノ酸で置換し得る場合が多い。

よって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン(脂肪族側鎖を有するアミノ酸)は、互いに置換し得る場合が多い。これら可能な置換のうち、(相対的に短い側鎖を有するので)グリシン及びアラニンを互いの置換に用い、(疎水性である、より長い脂肪族側鎖を有するので)バリン、ロイシン及びイソロイシンを互いの置換に用いることが好ましい。互いに置換し得る場合が多い他のアミノ酸として：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)；リジン、アルギニン及びヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン酸及びグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン及びグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)；並びにシステイン及びメチオニン(イオウ含有側鎖を有するアミノ酸)が挙げられる。

この性質の置換は、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれる場合が多い。したがって、本発明は、上記アミノ酸配列に１又は２以上の保存的置換を有するアミノ酸配列を含んでなり、その結果、アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸１〜117、配列番号６〜12若しくは51及び/又は配列番号３のアミノ酸１〜115、配列番号13〜23若しくは52を含んでなるTCRと少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するTCRの使用にまで拡張される。

α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインの特定の組合せは：

(表11)
であってもよい。

上記配列に対するアミノ酸変化は、任意の適切な技法を用いて、例えば部位特異的変異誘発又は固相合成により作製することができる。
本発明の範囲内のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を用いて行い得ることを理解すべきである。例えば、本明細書では、アラニンのメチル基はエチル基で置換されてもよく及び/又は軽微な変化がペプチド骨格になされてもよい。天然又は合成のアミノ酸が用いられているか否かにかかわらず、L-アミノ酸のみが存在することが好ましい。

「同一性」は、当該分野において公知のように、２若しくは３以上のポリペプチド配列間又は２若しくは３以上のポリヌクレオチド配列間での配列比較により決定される両配列間の関係である。当該分野において、同一性はまた、妥当な場合、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の、配列の並びの一致性によって決定される配列関連性の程度を意味する。２つのポリペプチド配列間又は２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する方法は幾つか存在するが、同一性の決定に一般に用いられる方法は、コンピュータプログラム化されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラムとしては、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら，Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)、BLASTP、BLASTN及びFASTA (Atschulら，J. Molec. Biol. 215, 403 (1990))が挙げられるが、これに限定されない。

CLUSTALプログラムのようなプログラムを用いてアミノ酸配列を比較することができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、必要な場合にはいずれかの配列にスペースを挿入して最適な整列を見出す。最適な整列についてアミノ酸の同一性又は類似性(同一性＋アミノ酸タイプの保存)を算出することができる。BLASTxのようなプログラムは、類似する配列を最も長く整列させ、そのフィッティングに対して値を割り当てる。よって、各々が異なるスコアを有する幾つかの類似領域が見出される比較を行うことができる。いずれのタイプの同一性分析も本発明において企図されている。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適な比較目的のために配列を整列させ(例えば、最良整列のために第１の配列にギャップを導入することができる)、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することにより決定する。「最良整列」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列の整列である。パーセント同一性は、比較する配列中の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数により決定する(すなわち、％同一性 = 同一位置の数/位置の総数×100)。

２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較する数学的アルゴリズムの例は、Karlin及びAltschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877に記載されるように改変されたKarlin及びAltschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264-2268のアルゴリズムである。Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215：403-410のNBLAST及びXBLASTプログラムには、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。BLASTヌクレオチドサーチは、核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTプログラム、スコア = 100、ワード長 = 12を用いて行うことができる。BLASTタンパク質サーチは、本発明に用いるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためには、XBLASTプログラム、スコア = 50、ワード長 = ３を用いて行うことができる。比較目的でギャップを有する整列を得るためには、Altschulら(1997) Nucleic Acids Res. 25：3389-3402に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。或いは、PSI-Blastを用いて、分子間の遠い関連性を検出する累次サーチを行うことができる(前出)。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる(例えば、XBLAST及びNBLAST)。http：//www.ncbi.nlm.nih.govを参照。配列比較に利用される数学的アルゴリズム別の例は、Myers及びMiller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。CGC配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。当該分野において公知の他の配列分析アルゴリズムとしては、Torellis及びRobotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 ：3-5に記載されるADVANCE及びADAM；並びにPearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85：2444-8に記載されるFASTAが挙げられる。FASTAにおいて、ktupは、サーチの感度及び速度を設定するコントロールオプションである。

変異は、任意の適切な方法を用いて行うことができる。このような方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにする方法、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順が挙げられるが、これらに限定されない。これら方法は、多くの標準的な分子生物学の教科書に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素ベースのクローニングに関する更なる詳細については、Sambrook及びRussell(2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995) Curr Opin Biotechnol 6(1)：30-6に見出すことができる。

第２の観点のTCRは、α鎖フレームワーク２(FM2)領域及びα鎖フレームワーク３(FM3)領域を含んでなってもよく、前記FM2領域及びFM3領域はそれぞれ配列番号47及び48を含み並びに/又は１若しくは２以上の保存的置換及び/若しくは３つまでの寛容される置換を含有する。
第２の観点のTCRは、β鎖FM2領域及びβ鎖FM3領域を含んでなってもよく、前記FM2領域及びFM3領域はそれぞれ配列番号49及び50を含み並びに/又は１若しくは２以上の保存的置換及び/若しくは３つまでの寛容される置換を含有する。
第２の観点のTCRは、配列番号２のアミノ酸１〜117及び/又は配列番号３のアミノ酸１〜115を含んでなってもよく、前記アミノ酸の各々は１若しくは２以上の保存的置換及び/若しくは３つまでの寛容される変異並びに/又は表１若しくは表２に規定される変異の１若しくは２以上を含有してもよい。

本発明のTCRは、SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に対する結合性を有する。本発明のTCRは、このエピトープに関して、他の無関係なエピトープと比較して、高度に特異的であることが見出されており、よってこのエピトープをディスプレイする細胞及び組織への治療剤又は検出可能な標識の送達用ターゲッティングベクターとして特に適切である。特異性は、本発明のTCRに関して、ペプチドSLLMWITQCについてポジティブなHLA-A^*02標的細胞を認識できる一方で、当該ペプチドについてネガティブなHLA-A^*02標的細胞を認識する能力が極めて小さいことに関する。特異性を試験するため、TCRは可溶形態であってもよく及び/又はＴ細胞表面に発現されていてもよい。認識は、TCR及び標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化レベルを測定することによって決定してもよい。この場合、ペプチドネガティブ標的細胞の極めて小さい認識は、同一条件下で測定したとき、ペプチドポジティブ標的細胞の存在下で生じるＴ細胞活性化レベルの20％未満、好ましくは10％未満、より好ましくは５％未満のレベルとして規定される。本発明の可溶性TCRについて、特異性は治療上妥当なTCR濃度で決定されてもよい。治療上妥当な濃度は、10^-9Ｍ以下のTCR濃度及び/又は対応するEC50値より100倍まで又は1000倍まで大きい濃度と規定されてもよい。ペプチドポジティブ細胞は、ペプチド-パルスにより得られてもよく、より好ましくは天然に当該ペプチドを提示してもよい。好ましくは、ペプチドポジティブ細胞及びペプチドネガティブ細胞は共にヒト細胞である。特異性は、例えば、細胞アッセイ、例えば実施例６〜８に記載される細胞アッセイにおいて測定することができる。特異性は、加えて、例えばBiacoreにより測定した場合に、NY-ESO-1-HLA-A^*02複合体に結合し、複数の天然に提示されるペプチドHLA複合体には結合しない能力に関してもよい。好ましくは、NY-ESO-1-HLA-A^*02複合体に対する結合は、他の天然に提示されるペプチドHLA複合体に対する結合より少なくとも400倍大きい。

本発明のTCRは、NY-ESO-1-HLA-A^*02複合体に関して、50μMより大きい(すなわち、50μMより強力な)、例えば50μM〜１pMの間のK_Dを有していてもよい。本発明の特定のTCRは、該複合体に関して、約１pM〜約50nM、約１pM〜約400pM、約20pM〜約200pMのK_Dを有していてもよい。本発明のTCRは、該複合体に関して、約１秒〜約60時間若しくはそれ以上、約30分〜約60時間若しくはそれ以上又は約６時間〜約60時間若しくはそれ以上の範囲の結合半減期(T1/2)を有していてもよい。可溶性治療剤及び/又は診断剤として用いるTCRは、検出可能な標識又は治療剤と結合したときに、好ましくは、該複合体に関して、実施例３のBIAcore法を用いて測定した場合、約１pM〜約200pM若しくは約20pM〜約100pMのK_Dを有し及び/又は実施例３のBIAcore法を用いて測定した場合、該複合体に関して、約２時間〜60時間若しくはそれ以上若しくは約20時間〜約60時間若しくはそれ以上の結合半減期を有する。本発明の特定のTCRは、養子療法適用に適切であってもよい；このようなTCRは、該複合体に関して約50nM〜約50μM若しくは約100nM〜約１μMのK_D及び/又は該複合体に関して約３秒〜約12分の結合半減期を有していてもよい。

本発明の特定のTCRは、SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体複合体に関して、天然型TCRのものより実質的に高い結合親和性及び/又は結合半減期を有する。天然型TCRの結合親和性を増大させると、そのペプチド-MHCリガンドに関するTCRの特異性は低減することが多く、このことは、Zhao Yangbingら, The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No.9, 1 November 2007, 5845-5854において証明されている。しかし、本発明のTCRは、天然型TCRより実質的に高い結合親和性を有するにもかかわらず、SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体について特異的なままであり得る。
結合親和性(平衡定数K_Dに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表す)は、本願実施例３の表面プラズモン共鳴(BIAcore)及び/又はOctet法を用いて決定することができる。TCRの親和性が二倍になればK_Dは1/2になると理解される。T1/2はln2/解離速度(k_off)として算出される。したがって、T1/2が二倍になればk_offは1/2になる。TCRのK_D値及びk_off値は、通常、可溶形態のTCR(すなわち、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの残基を除去するように短縮された形態のもの)について測定する。好ましくは、所与のTCRの結合親和性又は結合半減期は、同じアッセイプロトコルを用いて数回、例えば３回又は４回以上測定し、その結果の平均をとる。

抗原提示細胞への治療剤の送達用ターゲティング剤としての使用のためには、TCRは可溶形態(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形態)であってもよい。安定性のために、本発明のTCR、好ましくは可溶性αβヘテロダイマーTCRは、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。本発明のαβヘテロダイマーに存在する定常ドメインの一方又は両方は、一方又は両方のＣ末端で、例えば15まで又は10まで又は８まで又は７以下のアミノ酸が欠失されていてもよい(短縮化)。α鎖細胞外定常領域のＣ末端は、８アミノ酸が欠失されていてもよい。養子療法での使用のためには、αβヘテロダイマーTCRは、例えば、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされてもよい。養子療法に用いるTCRは、α定常ドメインとβ定常ドメインとの間に天然に見出されるものに相当するジスルフィド結合を含有していてもよく、追加的に又は代替的に、非天然型ジスルフィド結合が存在してもよい。

本発明のTCRはαβヘテロダイマーであってもよく、又は単鎖形式であってもよい。
単鎖形式としては、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ又はVα-L-Vβ-Cβタイプ(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)のαβ TCRポリペプチドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明の単鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有してもよい。単鎖TCRは、WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanzら(1998) J Immunol Methods 221(1-2)：59-76；Hooら(1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10)：4759-4763；Schodin(1996) Mol Immunol 33(9)：819-829)に更に記載されている。

当業者に自明なように、提供される配列は、TCRの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく、そのＣ末端及び/又はＮ末端で１、２、３、４、５又は６以上の残基を切り取ることも可能であり得る。このような特段の意味のないバリアントも全て本発明に包含される。
本発明のα-βヘテロダイマーTCRは、通常、α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなる。α及びβ鎖の定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合が欠失するように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α鎖及び/又はβ鎖の定常ドメイン配列も、TRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57からシステイン残基への置換により改変され、該システインがTCRのαβ定常ドメインとβ定常ドメインと間のジスルフィド結合を形成していてもよい。

更なる１つの観点において、本発明は、本発明の第１及び/又は第２の観点のTCRをコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態において、核酸はcDNAである。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのα鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。核酸は、天然に存在しないもの及び/又は精製されたもの及び/又は工学的に操作されたものであってもよい。
別の１つの観点において、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。好ましくは、ベクターはTCR発現ベクターである。

本発明はまた、本発明のベクター、好ましくはTCR発現ベクターを有する細胞を提供する。ベクターは、単一オープンリーディングフレームにα鎖及びβ鎖をコードする本発明の核酸を含んでなるか、又は２つの別個のオープンリーディングフレームにそれぞれα鎖及びβ鎖をコードする本発明の核酸を含んでなってもよい。別の１つの観点は、本発明のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクター及び本発明のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。このような細胞は養子療法に特に有用である。本発明の細胞は、単離されたもの及び/又は組換えのもの及び/又は天然に存在しないもの及び/又は工学的に操作されたものであってもよい。

本発明のTCRは養子療法に有用であるので、本発明は、本発明のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作された細胞、特にＴ細胞を包含する。本発明はまた、本発明のTCRを提示するＴ細胞の拡大された集団を提供する。本発明のTCRをコードする核酸(例えば、DNA、cDNA又はRNA)でのＴ細胞のトランスフェクションに適切な幾つかの方法が存在する(例えば、Robbinsら(2008) J Immunol. 180：6116-6131を参照)。本発明のTCRを発現するＴ細胞は、養子療法ベースのガン治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法の実施を可能にする適切な幾つかの方法が存在する(例えば、Rosenbergら(2008) Nat Rev Cancer 8(4)：299-308参照)。
本発明の可溶性TCRは、検出可能な標識又は治療剤の、抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織への送達に有用である。したがって、これらは、検出可能な標識(TCRを用いてSLLMWITQC-HLA-A^*02複合体を提示する細胞の存在を検出する診断目的のため)；治療剤；又は(例えばPEG化による)PK調整成分と(共有結合又はその他の様式で)結合していてもよい。

診断目的の検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤が挙げられる。
本発明のTCRと結合され得る治療剤としては、免疫調整剤、放射性化合物、酵素(例えば、パーフォリン)又は化学療法剤(例えば、シスプラチン)が挙げられる。毒性効果が確実に所望の位置で発揮されるために、毒物は、緩徐に放出されるようにTCRに連結されたリポソームの内部に存在し得る。このことにより、人体における輸送の間の損傷効果が防止され、該当する抗原提示細胞へのTCRの結合後に、毒物が最大効果を有することが保証される。

他の適切な治療剤として、以下のものが挙げられる：
・小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。更に、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、グルクロナート、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
・放射性核種、すなわち、１以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213；高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を容易にするために、キレート化剤が使用されてもよい；
・免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・スーパー抗原及びその変異体；
・TCR-HLA融合体、例えば、ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタインバーウイルス(EBV)に由来するペプチド-HLA複合体への融合体；
・ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント。抗Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗CD3、抗CD28又は抗CD16)が挙げられる；
・抗体様結合特性を有するオルターナティブタンパク質足場
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。

１つの好適な実施形態は、抗CD3抗体又は該抗CD3抗体の機能的フラグメント若しくはバリアントと(通常、α鎖又はβ鎖のＮ末端又はＣ末端への融合により)結合した本発明のTCRを含んでなるTCR-抗CD3融合体により提供される(このTCR-抗CD3融合体はImmTAC^TM分子とも呼ぶ)。本明細書で用いる場合、用語TCRはTCR-融合体、例えばTCR-抗CD3融合体を包含する。本明細書で用いる場合、用語「抗体」は前記のようなフラグメント及びバリアントを包含する。抗CD3抗体の例としては、OKT3、UCHT-1、BMA-031及び12F6が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適切な抗体フラグメント及びバリアント/アナログとしては、数例挙げるとすれば、ミニボディ、Fabフラグメント、F(ab')₂フラグメント、dsFv及びscFvフラグメント、ナノボディ^TM(Ablynx (Belgium)から市販されており、これら構築物はラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)抗体に由来する合成の単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含んでなる)及びドメイン抗体(Domantis (Belgium)；これは、親和性成熟単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含んでなる)又は抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、例えばアフィボディ(Affibody (Sweden)；これは工学的に操作されたプロテインＡ足場を含んでなる)若しくはアンチカリン(Anticalins)(Pieris (Germany))；これは工学的に操作されたアンチカリンを含んでなる)が挙げられる。

TCRと抗CD3抗体との連結は、直接的であっても、リンカー配列を介して間接的であってもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を制限する蓋然性が大きい嵩高い側鎖を有しないグリシン、アラニン及びセリンのようなアミノ酸から主に作製されるという点で可撓性である。使用に適した又は最適なリンカー配列の長さは容易に決定される。リンカー配列は約12アミノ酸長未満、例えば10アミノ酸長未満、又は５〜10アミノ酸長であることが多い。本発明のTCR-抗CD3融合体に使用し得る適切なリンカーとしては、(WO2010/133828に記載されるような)GGGGS(配列番号24)、GGGSG(配列番号25)、GGSGG(配列番号26)、GSGGG(配列番号27)、GSGGGP(配列番号28)、GGEPS(配列番号29)、GGEGGGP(配列番号30)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号31)が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗CD3-TCR融合体構築物の具体的実施形態としては、下記の表に示すα鎖及びβ鎖の対のものが挙げられる：

(表７)
特に好適な抗CD3-TCR融合体は配列番号37のα鎖及び配列番号38のβ鎖を含んでなる。

幾つかの目的のために、本発明のTCRは、幾つかのTCRを含んでなる複合体に凝集して、多価TCR複合体を形成していてもよい。多価TCR複合体の製造に使用し得る多量体化ドメインを含むヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して増大した血清残留性及び顕著に低減した解離速度を示す四量体のscFv抗体フラグメントを作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用に使用することができる四量体化ドメインを有する。本発明の多価TCR複合体は、非多量体野生型又は本発明のＴ細胞レセプターヘテロダイマーと比較して、SLLMWITQC-HLA-A^*02複合体に関する結合能力が増強されていてもよい。よって、本発明のTCRの多価複合体もまた本発明に含まれる。本発明に従うこのような多価TCR複合体は、インビトロ又はインビボにおける、特定の抗原を提示する細胞の追跡又は標的化に特に有用であり、また、そのような用途を有する更なる多価TCR複合体の製造用の中間体としても有用である。

当該分野において周知であるように、TCRは翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR鎖中の規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付加位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。更に、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付加の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療薬を改善するために使用されている(Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar；8(3)：226-34)。本発明の可溶性TCRについて、グリコシル化は、例えば特定の細胞株を用いることにより、インビボで制御されてもよく、又は化学的修飾によりインビボで制御されてもよい。このような修飾は、グリコシル化が薬物動態を改善し、免疫原性を低減させ及び天然型ヒトタンパク質をより厳密に模擬することができるので、望ましい(Sinclair AM及びElliott S., Pharm Sci. 2005 Aug；94(8)：1626-35)。

患者への投与のために、本発明のTCR若しくはTCR-抗CD3融合体(好ましくは、検出可能な標識若しくは治療剤と結合しているか、又はトランスフェクトされたＴ細胞に発現しているもの)又は本発明の細胞は、医薬組成物中で、医薬的に許容可能な１又は２以上の担体又は賦形剤と共に提供されてもよい。本発明に従う治療用又は造影用のTCR、TCR融合体又は細胞は、通常、医薬的に許容可能な担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器中で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含んでいてもよい。

医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば非経口経路(皮下、筋内又は静脈内経路を含む])、経腸(経口又は直腸経路を含む)、吸入又は鼻内経路による投与に適合されていてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分を担体又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は異常、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して広範囲に変化し得る。抗CD3抗体に結合した本発明の可溶性TCRに適切な用量範囲は、25ng/kg〜50μg/kgであり得る。最終的には医師が使用すべき適切な投薬量を決定する。
本発明のTCR、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。

本発明はまた、以下のものを提供する：
・医薬における使用のため、好ましくはガン治療法における使用のための、本発明のTCR、TCR-抗CD3融合体、核酸又は細胞
・ガン治療用医薬の製造における、本発明のTCR、TCR-抗CD3融合体、核酸又は細胞の使用；
・本発明のTCR、TCR-抗CD3融合体、核酸又は細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるガンの治療法。

治療すべきガンは、滑膜肉腫、非小細胞肺ガン(NSCLC)、膀胱の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、乳房の腫瘍、卵巣の腫瘍、食道の腫瘍、メラノーマ、多発性骨髄腫、肝細胞ガン及び頭部頸部の腫瘍であってもよい。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についてのとおりである(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した先行技術文献は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。
下記では、本発明を以下の非限定的な図面及び実施例を参照して説明する。

図１は、本発明の天然型α鎖及びβ鎖可変ドメインの細胞外領域のアミノ酸配列を提供する。図２は、本発明の天然型α鎖及びβ鎖可溶性細胞外領域のアミノ酸配列を提供する。図３は、本発明の変異TCR α鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。図４は、本発明の変異TCR β鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。図４は、本発明の変異TCR β鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。図５は、本発明のTCR配列を含んでなるImmTAC分子のアミノ酸配列を提供する。図６は、本発明のTCR配列を含んでなるImmTAC分子のアミノ酸配列を提供する。図７は、本発明のTCR配列を含んでなるImmTAC分子のアミノ酸配列を提供する。図８は、本発明のTCR配列を含んでなるImmTAC分子のアミノ酸配列を提供する。図９は、本発明のImmTAC分子の強力で特異的な結合を示す。図10は、２つの本発明のImmTAC分子についての更なる効力試験を示す。図11は、３つの本発明のImmTAC分子についての更なる特異性試験を示す。図11は、３つの本発明のImmTAC分子についての更なる特異性試験を示す。図12は、ImmTAC制限Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷を示す。図12は、ImmTAC制限Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷を示す。

実施例
実施例１−可溶性TCRの発現、リフォールディング及び精製
本発明の可溶性TCRのα及びβ細胞外領域をコードするDNA配列を、(Sambrookら，Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York：Cold spring harbor laboratory pressに記載のような)標準的方法を用いて、別々にpGMT7ベースの発現プラスミドにクローニングした。発現プラスミドを別々にE. coli株Rosetta(BL21pLysS)に形質転換し、単一アンピシリン抵抗性コロニーを、TYP(＋アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃にて、約0.6〜0.8のOD₆₀₀まで増殖させた後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導の３時間後に細胞を遠心分離により採集した。BugBusterタンパク質抽出試薬(Merck Millipore)を製造業者の指示に従って用いて細胞ペレットを溶解させた。封入体ペレットを遠心分離により回収した。ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、0.5％ Triton-X100、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中で２回洗浄し、最後に界面活性剤フリーの緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM NaEDTA)中に再懸濁した。６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、OD₂₈₀を測定することによって、封入体タンパク質収量を定量した。次いで、消光係数を用いてタンパク質濃度を算出した。８Ｍ尿素で可溶化し、約２μgを還元条件下の４〜20％ SDS-PAGEにロードして封入体の純度を測定した。次いで、デンシトメトリーソフトウェア(Chemidoc, Biorad)を用いて純度を推定又は算出した。封入体を、短期保存については＋４℃にて、長期保存については−20℃又は−70℃にて保存した。

可溶性TCRのリフォールディングについては、α鎖及びβ鎖含有封入体を先ず混合し、10mlの可溶化/変性緩衝液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、20mM DTT)中に希釈し、続いて30分間37℃にてインキュベートした。次いで、１Ｌのリフォールド緩衝液(100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニンHCL、２mM EDTA、４Ｍ尿素、10mMシステアミン塩酸及び2.5mMシスタミン二塩酸)中に更に希釈し、溶液を十分に混合することによりリフォールディングを開始した。リフォールドした混合物を10ＬのH₂Oに対して18〜20時間５℃±３℃にて透析した。その後、透析緩衝液を10mM Tris pH8.1(10Ｌ)と２回交換し、透析を更に15時間継続した。次いで、リフォールド混合物を0.4μmセルロースフィルターで濾過した。
透析したリフォールド物をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムに適用し、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて50カラム容量にわたり20mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより可溶性TCRの精製を開始した。ピークTCR画分をSDS PAGEにより同定した後、プールし、濃縮した。次いで、濃縮サンプルを、ダルベッコのPBS緩衝液で予め平衡化させたSuperdex(登録商標) 75HRゲル濾過カラム(GE Healthcare)に適用した。ピークTCR画分をプールし、濃縮し、精製物質の最終収量を計算した。

実施例２−ImmTAC分子(可溶性TCR-抗CD3融合体タンパク質)の発現、リフォールディング及び精製
ImmTACの調製は、TCR β鎖を、抗CD3単鎖抗体にリンカーを介して融合させたこと以外は、実施例１の記載のとおりに行った。加えて、カチオン交換工程を、アニオン交換後の精製の間に行った。この場合、アニオン交換からのピーク画分を20mM MES(pH6.5)中で20倍希釈し、POROS(登録商標) 50HSカチオン交換カラムに適用した。結合タンパク質を、20mM MES中０〜500mM NaClのグラジエントで溶出させた。ピークImmTAC画分をプールし、50mM Tris pH8.1に調整した後、濃縮し、実施例１に記載のとおりにゲル濾過マトリクスに直接適用した。

実施例３−結合特性決定
精製した可溶性TCR及びImmTAC分子の該当のペプチド-HLA複合体に対する結合の分析を、BIAcore 3000若しくはBIAcore T200装置を用いる表面プラズモン共鳴又はForteBio Octet装置を用いる二重層干渉分光法により行った。ビオチン化クラスＩ HLA-A^*02分子を、目的のペプチドと共にリフォールディングし、当業者に公知の方法を用いて精製した(O'Callaghanら(1999)，Anal Biochem 266(1)：9-15；Garbocziら(1992)，Proc Natl Acad Sci USA 89(8)：3429-3433)。全ての測定は、0.005％ P20を補充したダルベッコのPBS緩衝液中で25℃にて行った。

BIAcore
ビオチン化ペプチド-HLAモノマーをストレプトアビジン共役CM-5センサチップに固定した。平衡結合定数は、約200応答単位(RU)のペプチド-HLA-A^*02複合体を被覆したフローセル上に30μl/分の定流速で注入した可溶性TCR/ImmTACの系列希釈物を用いて決定した。平衡応答は、各TCR濃度について、無関係のペプチド-HLAを含有するコントロールフローセルでのバルク緩衝液応答を減算することにより規格化した。K_D値は、Prismソフトウェア及びLangmuir結合等温式結合 = Ｃ×Max/(Ｃ+K_D) (式中、「結合」は注入したTCR濃度Ｃでの平衡結合(RU)であり、Maxは最大結合である)を用いる非線形曲線フィッティングにより得た。
高親和性相互作用については、結合パラメータは、単一サイクル速度論分析により決定した。５つの異なる濃度の可溶性TCR/ImmTACを、約100〜200RUのペプチド-HLA複合体を被覆したフローセル上に、50〜60μl/分の流速で注入した。代表的には、60〜120μlの可溶性TCR/ImmTACを100〜200nMの最高濃度で注入し、他の４回の注入については２倍系列希釈物を用いた。最低濃度を先ず注入した。解離相を測定するため、その後、≧10％の解離が生じるまで、代表的には１〜３時間後まで、緩衝液を注入した。速度論パラメータはBIAevaluation(登録商標)ソフトウェアを用いて算出した。半減期の算出が可能とするため、解離相を一次指数関数的減衰式にフィッティングした。平衡定数K_Dはk_off/k_onから算出した。

Octet
ビオチン化ペプチド-HLAモノマーを、ストレプトアビジンを予め固定した(SA)ストレプトアビジンバイオセンサ(Pall ForteBio)に１nmに捕捉した。センサを遊離ビオチン(２μM)で２分間ブロックした。平衡結合定数は、ロードしたバイオセンサを、96ウェル又は384ウェルサンプルプレート内で系列希釈した可溶性TCR/ImmTAC中に浸漬することにより決定した。プレート振盪は1000rpmに設定した。低親和性相互作用(μM範囲)については、短い結合時間(約２分間)及び短い解離時間(約２分間)を用いた。Octetデータ分析ソフトウェア(Pall ForteBio)を用いて無関係のpHLAをロードした参照バイオセンサの二重参照減算により結合曲線を加工処理した。平衡時の応答(nm)を用いて、等式応答 = Rmax×conc/(K_D + conc) (式中、「応答」は各TCR濃度(conc)での平衡結合(nm)であり、RmaxはpHLA飽和時の最大結合応答である)にフィッティングさせた定常状態のプロットからK_D値を推定した。
高親和性相互作用(nM〜pM範囲)については、速度論パラメータは、≧３ TCR/ImmTAC濃度のとき、代表的には10nM、５nM及び2.5nMの結合曲線から決定した。結合時間は30分であり、解離時間は１〜２時間であった。無関係のpHLAをロードし、ビオチンでブロックした参照バイオセンサの二重参照減算により結合曲線を加工処理した。速度論パラメータk_on及びk_offは、Octetデータ分析ソフトウェア(Pall ForteBio)を用いて、結合曲線への直接の全体フィッティングにより算出した。K_Dはk_off/k_onから算出し、解離半減期はt_1/2 = 0.693/k_offから算出した。

実施例４−本発明の可溶性非変異TCRの結合特性決定
可溶性野生型TCRを、実施例１に記載の方法に従って調製し、pHLAに対する結合を実施例３に従って分析した。α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列は、図２に示したものに対応するものであった。可溶性ビオチン化HLA-A^*02を、野生型NY-ESO-1ペプチド(SLLMWITQC)又はヘテロクリティック(heteroclitic)NY-ESO-1ペプチド(SLLMWITQV：配列番号34)のいずれかを用いて調製し、BIAcoreセンサチップに固定した。K_D値はそれぞれ5.2μM及び4.3μMと決定された。15の無関係なペプチド-HLA-A^*02複合体に対して有意な結合は検出されなかった。
これらデータは、TCRが標的に適切な親和性及び特異性で結合することを示している。したがって、これらTCR鎖は、本発明の更なるTCRの同定に有用な足場を提供する。

実施例５−本発明の可溶性高親和性TCR及びImmTAC分子の結合特性決定
可溶性変異TCR及びImmTAC分子を実施例１及び２に記載のように調製し、結合特性を実施例３に従って決定した。TCR α鎖及び/又はβ鎖は、少なくとも１つのCDR領域に、図２に示したCDR配列に対する変異を含有していた(配列番号41〜46)。本発明の特定の変異TCR α鎖及びβ鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ図４及び５に示す。下記の表は、示したα及びβ可変領域を含んでなる可溶性TCR及び/又はImmTAC分子の結合特性を提供する。結合は、ヘテロクリティックNY-ESO-1ペプチド(SLLMWITQV)を用いて測定した。

これらデータは、本発明のTCR α鎖及びβ鎖配列が免疫治療剤の開発に適切な結合特性を有する可溶性TCR及びImmTAC分子を生じることを証明する。

実施例６−本発明のImmTAC分子による強力で特異的なＴ細胞の再指向化
本発明のα及びβ可変鎖配列を含有するImmTAC分子を、CD3+ Ｔ細胞の強力で特異的な再指向化を仲介する能力について、Ｔ細胞活性化の指標としてインターフェロン-γ(IFN-γ)分泌を利用するELISPOTアッセイにより試験した。
試験した４つのImmTAC分子のα鎖及びβ鎖の配列を図５〜８に示す。
アッセイはヒトIFN-γ ELISPOTキット(BD Biosciences)を用いて行った。標的細胞をアッセイ培地(10％熱不活化FBS及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミンを含むRPMI 1640)中に１×10⁶/mlの密度で準備し、50,000細胞/ウェルにて50μl容量でプレートした。本実施例では次の標的細胞株を用いた：
・NCI-H1755(NY-ESO-1^+ve；HLA-A^*02^+ve)ヒト肺ガン細胞株(ATCCから供給；cat. no：CRL-5892)
・HAo5(NY-ESO-1^-ve；HLA-A^*02^+ve)ヒト心臓細胞(Promocellから供給；cat. no：C-12271)

新鮮なドナー血液から単離した末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として用いて、40,000細胞/ウェルの濃度にて50μl容量でプレートした。予測される臨床的に妥当な範囲にわたる種々の濃度のImmTACを用い、50μl容量でウェルに添加した。
プレートを製造業者の指示に従って準備した。標的細胞、エフェクター細胞及びImmTAC分子を該当するウェルに加え、アッセイ培地で最終容量を200μlとした。全ての反応を三連で行った。ImmTAC、エフェクター細胞又は標的細胞のいずれかを省略したコントロールウェルも準備した。次いで、プレートを一晩インキュベートした(37℃/５％CO₂)。翌日、プレートを洗浄緩衝液(脱イオン水中に作製した0.05％ P20を含む１×PBS)で３回洗浄した。次いで、一次検出抗体を各ウェルに容量50μlで加えた。プレートを室温にて２時間インキュベートした後、再び３回洗浄した。二次検出は、50μlの希釈ストレプトアビジン-HRPを各ウェルに加え、室温にて１時間インキュベートし、洗浄工程を繰り返すことにより行った。次いで、プレートを200μlのPBS(pH7.4)で２回洗浄した。使用前15分以内に１滴(20μl)のAEC色原体を各１mlのAEC基質に加えて混合し、50μlを各ウェルに加えた。スポット発色を定期的にモニターし、プレートを水道水で洗浄して発色反応を停止させた。次いで、プレートを室温にて少なくとも２時間乾燥させた後、Immunospotソフトウェアを備えたCTL分析装置(Cellular Technology Limited)を用いてスポットを計数した。

図９に示したデータは、本発明のα及びβ可変鎖配列を含有するImmTAC分子が、標的抗原を発現するHLA-A^*02^+veガン細胞に対するＴ細胞の強力な再指向化を仲介する能力を有することを証明する。HLA-A^*02^+ve抗原ネガティブ細胞に対する活性は観察されなかった。これらデータは、ImmTAC分子が、臨床的に妥当な濃度範囲(≦１nM)内で、標的細胞に特異的であることを示している。
ImmTAC分子３及び４について効力の更なる評価を行い、EC50値を決定した。ELISpotアッセイを、10^-13Ｍ〜10^-8Ｍの範囲のImmTAC濃度で、上記のとおりに行った。Prism 5.0ソフトウェア(GraphPad)を用いてデータを分析し、EC50値を算出した。その値は、ImmTAC分子３及び４についてそれぞれ95pM及び121pMと決定された(図10)。このデータから、これらImmTAC分子が強力な再指向化Ｔ細胞応答を仲介する能力が確証される。

実施例７−本発明のImmTAC分子の更なる特異性試験
ImmTAC分子の更なる特異性試験を、正常細胞のパネルに対して行った。本実施例ではImmTAC分子２〜４(図６〜８)を用いた。インターフェロン-γ(IFN-γ)分泌をＴ細胞活性化の指標として用いた。
アッセイは、IFN-γ DuoSet ELISAキット(R&D Systems, Cat No：DY285)を用いて行い、製造業者の指示のとおりに行った。簡潔には、IFN-γを10,000pg/mlに希釈し、２倍希釈物を作製して標準曲線を作成した。標的細胞を計数し、アッセイ培地に10μl中10,000細胞/ウェルでプレートした。ImmTAC分子を、10μl/ウェルで最終濃度が２nM及び１nMとなるように希釈した。ImmTACを含まないコントロールサンプルも準備した。エフェクターPBMCを解凍し、10μl中10,000細胞/ウェルでプレートした。プレートを48時間インキュベートした後、発色させて読み取った。

本実施例では、NCI-H1755細胞を抗原ポジティブコントロールとして用い、HTC-116細胞を抗原ネガティブコントロールとして用いた。細胞パネルは、心筋細胞(CM12、CM5及びCM10)、大動脈内皮細胞(HAo5)、気道上皮細胞(HCAEC2及びHCAEC5)、骨格筋筋細胞(HSkMM3)及びHPF9細胞を含んでいた。全ての細胞株がHLA-A^*02^+veであった。アッセイは３連で行った。
図11に示すデータは、治療上妥当なImmTAC濃度範囲内で、正常組織に由来する細胞株の存在下でのIFN-γ産生は、抗原ポジティブガン細胞株の存在下と比して、極めて低いことを証明する。このデータは、本発明のImmTAC分子が高レベルの特異性を有し、したがって治療用途に特に適切であることを示している。

実施例８−ImmTAC再指向化Ｔ細胞による腫瘍細胞の強力な殺傷
本発明のImmTAC分子が再指向化Ｔ細胞による抗原ポジティブ腫瘍細胞の強力な殺傷を仲介する能力を、IncuCyteプラットフォーム(Essen BioScience)を用いて調べた。このアッセイは、アポトーシスのマーカーであるカスパーゼ-３/７の放出の顕微鏡観察によるリアルタイム検出を可能とする。
アッセイは、CellPlayer 96ウェルカスパーゼ-３/７アポトーシスアッセイキット(Essen BioScience, Cat. No.4440)を用いて行い、製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔には、標的細胞(NCI-H1755 - NYESO^+ve HLA A^*02^+ve又はHCT-116 - NYESO^-ve HLA A^*02^+ve)を5000細胞/ウェルでプレートし、一晩インキュベートして細胞を接着させた。ImmTAC溶液を2.16nM〜8.8pMの濃度で調製した。25μlの各濃度溶液を該当するウェルに加えた。PBMCをエフェクター細胞として用い、50μl中50,000/ウェルでプレートした。ImmTACを含まないコントロールサンプルも調製した。NucViewアッセイ試薬を30μMで作製し、25μlを各ウェルに加えた(最終濃度５μM)。プレートをIncuCyte装置内に配置し、２時間ごとに(ウェルあたり１画像)３日間にわたって撮像した。各画像中のアポトーシス細胞の数を決定し、mm²あたりの対象物の数として記録した。アッセイは３連で行った。

図12に提示したデータは、ImmTAC再指向化Ｔ細胞によるリアルタイムの腫瘍細胞殺傷を示す。ImmTAC3及びImmTAC4についての結果を示す。両ImmTAC分子とも、26pM程度の低濃度で、再指向化Ｔ細胞による抗原ポジティブ腫瘍細胞の殺傷を示す。ImmTAC3は、10pM以下で、再指向化Ｔ細胞による殺傷を示す。最高濃度(2.16nM)でのみ、抗原ネガティブ細胞の低レベルの殺傷が観察された。
このデータから、ImmTAC3及びimmTAC4が、治療上妥当な濃度範囲で、再指向化Ｔ細胞による抗原ポジティブ腫瘍細胞の強力な殺傷を仲介することが確証される。

Claims

SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に対する結合性を有し、TCR α鎖可変ドメイン及びTCR β鎖可変ドメインを含んでなり、
α鎖可変ドメインが配列番号12のアミノ酸１〜117と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
β鎖可変ドメインが配列番号15のアミノ酸１〜115と少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基27〜32、50〜57及び91〜107のα鎖可変ドメイン配列並びにアミノ酸残基27〜31、49〜55及び93〜106のβ鎖可変ドメイン配列が次の表：

の各行に示される配列の組合せから選択される、
Ｔ細胞レセプター(TCR)。
SLLMWITQC(配列番号１)-HLA-A^*02複合体に50μMより大きい親和性で結合する請求項１に記載のTCR。
α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインが次の表：

の各行に示されるアミノ酸配列の組合せから選択される、請求項１又は２に記載のTCR。
α鎖TRAC定常ドメイン配列及びβ鎖TRBC1又はTRBC2定常ドメイン配列を有するα-βヘテロダイマーである請求項１〜３のいずれか１項に記載のTCR。
α鎖及びβ鎖の定常ドメイン配列がTRACのエキソン２のCys4と、TRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合が欠失するように短縮化又は置換により改変されている、請求項４に記載のTCR。
α鎖及び/又はβ鎖の定常ドメイン配列がTRACのThr 48及びTRBC1又はTRBC2のSer 57からシステイン残基への置換により改変されており、該システイン同士がTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインと間で非天然型ジスルフィド結合を形成している、請求項４又は５に記載のTCR。
Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型(式中、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)の単鎖形式である請求項１〜６のいずれか１項に記載のTCR。
検出可能な標識、治療剤又はPK調整成分と結合した請求項１〜７のいずれか１項に記載のTCR。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCRと、該TCRのα鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に共有結合した抗CD3抗体とを含んでなるTCR-抗CD3融合体。
配列番号６〜12又は51から選択されるα鎖可変ドメイン及び配列番号13〜23又は52から選択されるβ鎖可変ドメインを含んでなる請求項９に記載のTCR-抗CD3融合体。
β鎖が抗CD3抗体配列にリンカー配列を介して連結されている、請求項１０に記載のTCR-抗CD3融合体。
リンカー配列が、GGGGS(配列番号24)、GGGSG(配列番号25)、GGSGG(配列番号26)、GSGGG(配列番号27)、GSGGGP(配列番号28)、GGEPS(配列番号29)、GGEGGGP(配列番号30)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号31)からなる群より選択される、請求項１１に記載のTCR-抗CD3融合体。
下記の表：

のいずれかの行に記載のα鎖及びβ鎖アミノ酸配列の組合せに対してそれぞれ少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有するα鎖及びβ鎖を含んでなる請求項１２に記載のTCR-抗CD3融合体。
配列番号37からなるα鎖及び配列番号38からなるβ鎖を含んでなる請求項１３に記載のTCR-抗CD3融合体。
配列番号32からなるα鎖及び配列番号33からなるβ鎖を含んでなる請求項１３に記載のTCR-抗CD3融合体。
配列番号12のアミノ酸配列からなるα鎖可変ドメイン及び配列番号15のアミノ酸配列からなるβ鎖可変ドメインを含んでなり、ここで、β鎖が抗CD3抗体にリンカー配列を介して連結されている、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体。
配列番号12のアミノ酸配列からなるα鎖可変ドメイン及び配列番号15のアミノ酸配列からなるβ鎖可変ドメインを含んでなり、ここで、α鎖が抗CD3抗体にリンカー配列を介して連結されている、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体。
α鎖可変ドメインが配列番号12のアミノ酸配列からなり、β鎖可変ドメインが配列番号15のアミノ酸配列からなり、ここで、β鎖が抗CD3抗体に配列番号24のリンカー配列を介して連結されている、請求項１７に記載のTCR-抗CD3融合体。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR又は請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体をコードする核酸。
請求項１９に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR又は請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体を提示する天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は工学的に操作された細胞。
(ａ)請求項２０に記載のTCR発現ベクターを、単一オープンリーディングフレーム中又はα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする２つの別個のオープンリーディングフレーム中に有するか；又は
(ｂ)請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR又は請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体のα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクターと、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR又は請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体のβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターとを有する、
細胞。
Ｔ細胞である請求項２１又は２２に記載の細胞。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸又は請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞を、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤と共に含んでなる医薬組成物。
ヒト対象における医薬に用いるための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸又は請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞。
ヒト対象におけるガン治療法に用いるための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物。
ヒト対象がNY-ESO-1及び/又はLAGE-1Aを発現する腫瘍を有する、請求項２６に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物。
腫瘍が固形腫瘍である、請求項２７に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物。
腫瘍が、滑膜肉腫、非小細胞肺ガン(NSCLC)、膀胱の腫瘍、胃の腫瘍、前立腺の腫瘍、直腸結腸の腫瘍、乳房の腫瘍、卵巣の腫瘍、食道の腫瘍、メラノーマ、多発性骨髄腫、肝細胞ガン及び頭部頸部の腫瘍から選択される、請求項２７又は２８に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物。
ヒト対象がHLA-A^*02サブタイプの対象である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物。
抗腫瘍剤と別々に、組み合わせて又は逐次に投与することに用いる請求項２４に記載の医薬組成物。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物を含んでなる、ヒト対象投与用の注射可能な製剤。
TCR、TCR-抗CD3融合体、核酸、細胞又は医薬組成物が注射により、例えば静脈内注射又は腫瘍内直接注射により投与される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体、請求項１９に記載の核酸、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞又は請求項２４に記載の医薬組成物。
ａ)請求項２２に記載の宿主細胞を、核酸の発現に最適な条件下に維持し、ｂ)核酸によりコードされるTCR又はTCR-抗CD3融合体を単離することを含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR又は請求項９〜１８のいずれか１項に記載のTCR-抗CD3融合体の製造方法。