RS63738B1 - Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera - Google Patents

Description

Opis

[0001] Kancer pankreasa je jedan od najsmrtonosnijih kancera. Smrtnost se približava 100% zbog sklonosti ka ranom širenju metastaza i zbog toga što je bolest veoma otporna na zračenje i hemoterapiju. S obzirom da se svake godine dijagnostikuje 27000 novih slučajeva u Severnoj Americi i 68000 u Evropi, postoji hitna potreba da se razviju nove strategije lečenja za smanjenje smrtnosti pacijenata sa rakom pankreasa.

[0002] Molekul čvrste veze Klaudin 18, varijante 2 nastale alternativnim splajsovanjem, (Klaudin 18.2 (CLDN18.2)) je član klaudinske familije proteina čvrste veze. CLDN18.2 je transmembranski protein od 27.8 kDa koji sadrži četiri domena koja prolaze kroz membranu sa dve male ekstracelularne petlje. U normalnim tkivima ne postoji ekspresija CLDN18.2 koja može da se detektuje pomoću RT-PCR metode, sa izuzetkom želuca. Imunohistohemija sa antitelima specifičnim za CLDN18.2 otkriva želudac kao jedino pozitivno tkivo. CLDN18.2 je visoko selektivni antigen želudačne linije koji se eksprimira isključivo na kratkoživećim diferenciranim ćelijama želudačnog epitela. CLDN18.2 se održava tokom maligne transformacije i stoga je često prikazan na površini humanih ćelija kancera želuca. Dodatno, ovaj pan-tumorski antigen se ektopično aktivira na značajnim nivoima u ezofagealnim, pankreasnim i plućnim adenokarcinomima.

[0003] Himerno IgG1 antitelo IMAB362 koje je usmereno protiv CLDN18.2 razvila je kompanija Ganymed Pharmaceuticals AG. Antitelo IMAB362 je detaljno opisano u dokumentima stanja tehnike WO2007/059997 i WO2008/145338. IMAB362 prepoznaje prvi ekstracelularni domen (ECD1) CLDN18.2 sa visokim afinitetom i specifičnošću. IMAB362 se ne vezuje ni za kog drugog člana klaudinske familije, uključujući blisko srodnu varijantu 1 Klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (CLDN18.1). IMAB362 pokazuje preciznu specifičnost za ćelije tumora i povezuje četiri nezavisna veoma potentna mehanizma dejstva. Nakon vezivanja sa ciljnom strukturom IMAB362 posreduje u ubijanju ćelija putem ADCC, CDC i indukcije apoptoze izazvane unakrsnim vezivanjem ciljne strukture na površini ćelije tumora i direktne inhibicije proliferacije. Stoga, IMAB362 efikasno lizira CLDN18.2-pozitivne ćelije, uključujući humane ćelijske linije kancera želuca in vitro i in vivo.

[0004] Toksičnost i PK/TK profil IMAB362 detaljno su ispitivani kod miševa i makaki majmuna uključujući studije pronalaženja doznog opsega, studije toksičnosti sa 28-dnevnim ponavljanjem doze kod makaki majmuna i studije toksičnosti sa 3-mesečnim ponovljenim dozama kod miševa.

I kod miševa (najduže trajanje tretmana nedeljna primena u toku 3 meseca, najviši nivoi doze 400 mg/kg) i makaki majmuna (do 5 nedeljnih primena do 100 mg/kg) ponovljene doze IMAB362 i.v. su dobro podnošene. Nisu indukovani znaci sistemske ili lokalne toksičnosti. Specifično, nije uočena toksičnost po želudac u bilo kojoj studiji toksičnosti. IMAB362 ne indukuje imunu aktivaciju i oslobađanje citokina. Nisu zabeleženi štetni efekti na reproduktivne organe mužjaka ili ženki. IMAB362 se ne vezuje za tkiva kojima nedostaje ciljna struktura. Studije biološke raspodele kod miševa ukazuju na to da je razlog izostanka gastrične toksičnosti vrlo verovatno kompartmentalizacija čvrstih veza na lumenskoj strani u zdravom gastričnom epitelu, što izgleda da suštinski onemogućava pristup IMAB362 epitopu.

[0005] IMAB362 je u ranoj fazi kliničkog ispitivanja. Faza I kliničke studije je izvedena kod ljudi. 5 doznih kohorti (33 mg/m<2>, 100 mg/m<2>, 300 mg/m<2>, 600 mg/m<2>, 1000 mg/m<2>), od po 3 pacijenta svaka, primile su pojedinačnu intravensku dozu IMAB362 i posmatrane su 28 dana. IMAB362 je veoma dobro tolerisan, bez značajnih bezbednosnih opservacija kod pacijenata. Kod jednog pacijenta svi mereni tumor markeri su se značajno smanjili u okviru od 4 nedelje nakon tretmana. U tekućoj fazi IIa kliničke studije IMAB362 se primenjuje ponovljeno.

[0006] Kancer pankreasa slabo reaguje na većinu hemoterapijskih agenasa (Vincent et al. 2011). Lečenje kancera pankreasa gemcitabinom opisano je na primer u dokumentu stanja tehnike Vincent et al. 2011. Dokument iz prethodnog stanja tehnike Cartwright et al. 2008. opisuje kombinovanu terapiju kancera pankreasa gemcitabinom i npr. cetuksimabom, monoklonskim antitelom usmerenim na receptor humanog epiderminalnog faktora rasta ili bevacizumabom, monoklonskim antitelom usmerenim na vaskularni endotelni faktor rasta. Cartwright et al.2008. pominje neuspeh da se pokaže klinički značajna prednost kombinovane terapije cetuksimabom u odnosu na monoterapiju gemcitabinom. Cartwright et al. 2008. dalje pominje nedostatak poboljšanja u preživljavanju pacijenata nakon kombinovane terapije bevacizumabom u odnosu na monoterapiju gemcitabinom.

[0007] U ovom dokumentu podnosioci prijave predstavljaju podatke koji pokazuju da hemoterapijski agensi mogu da stabilizuju ili povećaju ekspresiju CLDN18.2 na površini ćelija kancera pankreasa što rezultuje u poboljšanoj mogućnosti za primenu anti-CLDN18.2 antitela kao što je IMAB362, kao leka na CLDN18.2. Uočen je sinergistički efekat anti-CLDN18.2 antitela kao što je IMAB362 sa određenim hemoterapijskim režimima, naročito hemoterapijskim režimima koji se upotrebljavaju za lečenje kancera pankreasa. Humane ćelije kancera prethodno tretirane hemoterapijom su osetljivije na antitelom-indukovano ciljno-specifično ubijanje. U modelima mišjeg tumora, kontrola tumora anti-CLDN18.2 antitelom zajedno sa hemoterapijom bolja je od kontrole anti-CLDN18.2 antitelom kao jedinim agensom.

REZIME

[0008] Predmetni navodi generalno obezbeđuju kombinovanu terapiju za efikasno lečenje i/ili prevenciju bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, uključujući bolesti kancera kao što je kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave-vrata, i kancer žučne kese i njihove metastaze, naročito metastaze kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealna metastaza i metastaza limfnog čvora. Naročito poželjne bolesti kancera su kancer pankreasa i njegove metastaze.

[0009] U jednom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za lečenje ili prevenciju kancera pankreasa kod pacijenta koji obuhvata primenu kod pacijenta (i) antitela koje ima sposobnost da se veže za CLDN18.2 i (ii) agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju, tj., nivo, CLDN18.2. Ekspresija CLDN18.2 je poželjno na površini ćelije kancera. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da se primeni pre, istovremeno ili nakon primene antitela koje ima sposobnost da se veže za CLDN18.2, ili njihove kombinacije.

[0010] Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da bude citotoksični i/ili citostatski agens. U jednom primeru izvođenja, agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 sadrži agens koji indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa ili akumulaciju ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa, poželjno u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa različitoj od G1-faze kao što je S-faza, G2-faza, ili njihova kombinacija ili kombinacija S-faze ili G2-faze sa G1-fazom. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od analoga nukleozida, jedinjenja platine, analoga kamptotecina i taksana, njihovih prolekova, njihovih soli i njihovih kombinacija. Analog nukleozida može biti izabran iz grupe koja se sastoji od gemcitabina, 5-fluorouracila, njihovih prolekova i njihovih soli. Jedinjenje platine može se izabrati iz grupe koja se sastoji od oksaliplatina, cisplatina, njegovih prolekova i njihovih soli. Analog kamptotecina može biti izabran iz grupe koja se sastoji od irinotekana, topotekana, njihovih prolekova i njihovih soli. Taksan može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od paklitaksela, docetaksela, njihovih prolekova i njihovih soli. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od gemcitabina, 5-fluorouracila, oksaliplatina, irinotekana, paklitaksela, njihovih prolekova, njihovih soli i njihovih kombinacija. Agens za stabilizaciju ili povećanje ekspresije CLDN18.2 može da sadrži kombinaciju oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju cisplatina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju najmanje jednog taksana i oksaliplatina, kombinaciju najmanje jednog taksana i cisplatina, kombinaciju najmanje jednog taksana i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, ili kombinaciju najmanje jednog analoga kamptotecina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova. Agens za stabilizaciju ili povećanje ekspresije CLDN18.2 može da sadrži kombinaciju gemcitabina i oksaliplatina, kombinaciju gemcitabina i cisplatina, kombinaciju gemcitabina i karboplatina ili kombinaciju oksaliplatina, 5-fluorouracila ili njihovih prolekova i irinotekana. Shodno tome, postupak prema navodima može da obuhvata primenu kombinacije gemcitabina i oksaliplatina, kombinacije gemcitabina i cisplatina, kombinacije gemcitabina i karboplatina ili kombinacije oksaliplatina, 5-fluorouracila ili njihovih prolekova i irinotekana. U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima obuhvata primenu folinske kiseline, 5-fluorouracila ili njegovih prolekova, irinotekana i oksaliplatina. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da sadrži agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt. Agens koji izaziva imunogenu ćelijsku smrt može da sadrži oksaliplatin.

[0011] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak lečenja ili prevencije kancera kod pacijenta koji obuhvata primenu kod pacijenta (i) antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i (ii) gemcitabina. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glave-vrata, kancera žučne kese i njihovih metastaza. Bolest kancera može da bude Krukenbergov tumor, peritonealna metastaza i/ili metastaza u limfnim čvorovima. U jednom primeru izvođenja, kancer je adenokarcinom, posebno uznapredovali adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer pankreasa.

[0012] U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima dodatno sadrži primenu agensa koji stimuliše γδ T ćelije. U jednom primeru izvođenja, yδ T ćelije su Vγ9Vδ2 T ćelije. U jednom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije je bisfosfonat kao što je bisfosfonat koji sadrži azot (aminobisfosfonat). U jednom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije izabran je iz grupe koja se sastoji od zoledronske kiseline, klodronske kiseline, ibandronske kiseline, pamidronske kiseline, rizedronske kiseline, minodronske kiseline, olpadronske kiseline, alendronske kiseline, inkadronske kiseline i njihovih soli. U jednom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije primenjuje se u kombinaciji sa interleukinom-2.

[0013] Postupak prema navodima može dodatno da obuhvata primenu najmanje još jednog dodatnog hemoterapijskog agensa koji može da bude citotoksični agens.

[0014] Antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 može se vezivati za nativne epitope na CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 vezuje se za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 posreduje u ubijanju ćelija jednim ili većim brojem mehanizama od: lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), indukcije apoptoze i inhibicije proliferacije. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo posreduje u ubijanju ćelija kada je vezano za ćelijski CLDN18.2, posebno za CLDN18.2 koji ćelije eksprimiraju na svojoj površini, pri čemu su ćelije poželjno ćelije kancera, kao što su ćelije ovde opisanih kancera. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela koje je proizvedeno i/ili koje se može dobiti iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, ili DSM ACC2810, (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitela koje sadrži antigen-vezujući deo ili mesto vezivanja antigena, naročito varijabilni region, antitela pod (i) i poželjno ima specifičnost antitela pod (i). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa terapijskim agensom kao što je toksin, radioizotop, lek ili citotoksični agens.

[0015] U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima obuhvata primenu antitela koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 u dozi sve do 1000 mg/m<2>. U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima obuhvata primenu antitela koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 ponovljeno u dozi od 300 do 600 mg/m<2>.

[0016] Prema navodima, CLDN18.2 poželjno ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1.

[0017] U jednom primeru izvođenja, ovde opisani kancer je pozitivan na CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, kancerske ćelije ovde opisanog kancera su pozitivne na CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, kancerske ćelije ovde opisanog kancera eksprimiraju CLDN18.2 na svojoj površini.

[0018] U jednom primeru izvođenja, kancer pankreasa koji je ovde opisan obuhvata primarni kancer, uznapredovali kancer ili metastatski kancer, ili njihovu kombinaciju, kao što je kombinacija primarnog kancera pankreasa i metastatskog kancera. U jednom primeru izvođenja, postupci prema navodima su za istovremeno lečenje primarnog kancera i metastatskog kancera, kao što je primarni kancer pankreasa i metastatski kancer pankreasa. U jednom primeru izvođenja, metastatski kancer obuhvata metastazu na limfne čvorove, jajnike, jetru ili pluća, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, kancer pankreasa obuhvata kancer pankreasnog kanala. U jednom primeru izvođenja, kancer pankreasa obuhvata adenokarcinom ili karcinom, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, kancer pankreasa obuhvata duktalni adenokarcinom, mucinozni adenokarcinom, neuroendokrini karcinom ili karcinom acinarnih ćelija, ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, kancer pankreasa je delimično ili potpuno refraktoran na lečenje gemcitabinom kao što je monoterapija gemcitabinom. U jednom primeru izvođenja, prevencija kancera pankreasa obuhvata prevenciju pojave recidiva kancera pankreasa.

[0019] U jednom primeru izvođenja, pacijent koji se leči prema navodima imao je hiruršku intervenciju zbog kancera pankreasa. U jednom primeru izvođenja, pacijent ima prekanceroznu pankreasnu leziju, konkretno, prekanceroznu pankreasnu leziju koja sadrži početnu malignu histološku promenu u kanalima pankreasa. U ovim primerima izvođenja, postupci prema navodima poželjno imaju za cilj sprečavanje razvoja malignog kancera pankreasa.

[0020] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju medicinski preparat za lečenje ili prevenciju kancera pankreasa koji sadrži (i) antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 i (ii) agens za stabilizaciju ili povećanje ekspresije CLDN18.2. Medicinski preparat prema predmetnim navodima može dodatno da sadrži agens koji stimuliše γδ T ćelije. Antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 i agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, i izborno agens koji stimuliše γδ T ćelije, mogu da budu prisutni u medicinskom preparatu u smeši ili međusobno odvojeno. Medicinski preparat može da bude predstavljen kompletom koji sadrži prvu posudu koja uključuje antitelo koje ima sposobnost vezivanja CLDN18.2 i drugu posudu koja uključuje agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, i izborno posudu koja uključuje agens koji stimuliše γδ T ćelije. Medicinski preparat može dodatno uključivati štampana uputstva za upotrebu preparata za lečenje ili prevenciju kancera pankreasa, naročito za upotrebu preparata u postupku prema navodima. Različiti primeri izvođenja medicinskog preparata, i, naročito, antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 i agensa koji stimuliše γδ T ćelije prethodno su opisani iznad za postupke prema navodima.

[0021] U posebnom aspektu, ovo učenje obezbeđuje medicinski preparat koji sadrži (i) antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, i (ii) gemcitabin. Medicinski preparat ovog učenja može dalje da sadrži agens koji stimuliše γδ T ćelije. Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i gemcitabin, i opciono agens koji stimuliše γδ T ćelije, mogu da budu prisutni u medicinskom preparatu u smeši ili odvojeno jedno od drugog. Medicinski preparat može biti za lečenje ili prevenciju kancera kao što je kancer pankreasa. Medicinski preparat može da bude predstavljen u obliku kompleta koji sadrži prvu posudu koja sadrži antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i drugu posudu koja sadrži gemcitabin, i opciono posudu koja sadrži agens koji stimuliše γδ T ćelije. Medicinski preparat može dalje da sadrži štampana uputstva za upotrebu preparata za lečenje ili prevenciju kancera kao što je kancer pankreasa, posebno za upotrebu preparata u postupcima prema navodima. Različiti primeri izvođenja medicinskog preparata, a posebno, antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 i agensa koji stimuliše γδ T ćelije su kao što je gore opisano za postupke prema navodima.

[0022] Predmetni navodi takođe obezbeđuju ovde opisane agense, kao što je antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 i/ili agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 za upotrebu u ovde opisanim postupcima. Na primer, predmetni navodi takođe obezbeđuju antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 za primenu zajedno sa agensom koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, kao što je gemcitabin, i izborno agensom koji stimuliše γδ T ćelije.

[0023] Druge karakteristike i prednosti predmetnih navoda biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0024]

Slika 1. Lentivirusni vektor upotrebljen za transdukciju ćelijskih linija kancera pankreasa humanim CLDN18.2 kloniran je nishodno od promotora EF1α. Ekspresiona kaseta je ubačena između dugačkih terminal ponovaka (5’ i 3’-LTR) koji omogućavaju pakovanje i reverznu transkripciju virusne iRNK. RSV: rouz sarkoma virus omogućava proizvodnju virusne iRNK nezavisnu od Tat. Amp: Gen za rezistenciju na ampicilin. PGKp: Promotor blasticidina. WPRE: posttranskripcioni regulatorni element mrmota; pojačava ekspresiju transgena. LTR: dugački terminalni ponovci, omogućavaju pakovanje virusa. SV40A omogućava terminaciju transkripcije i poliadenilaciju iRNK. pUC: nosač bakterijskog vektora. Bla: promotor ampicilina.

Slika 2. Analiza metastaze ćelija pankreasa u plućima miša. Šema disekcije pluća miša nakon i.v. injekcije ćelija kancera pankreasa u miša.

Slika 3. Ekspresija CLDN18.2 u normalnom i kanceroznom tkivu pankreasa. Bojenje normalnog tkiva pankreasa (A) fiksiranog formalinom i obloženog (FFPE) i tkiva adenokarcinoma pankreasa (B) monoklonskim mišjim antitelom 35-22A (0.2 µg/ml). Kontrastno bojenje hematoksilinom (2:00 min). Uvećanje 200x.

Slika 4. Ekspresija CLDN18.2 u normalnom i prekanceroznom tkivu pankreasa. 43-14A bojenje različitih prekanceroznih struktura (A) normalne i PanIN1; (B) PanIN2; (C) PanIN3. Uvećanje 200x.

Slika 5. Pilot studija - Korelacija između intenziteta signala CLDN18.2 i količine pozitivnih tumorskih ćelija za analizirane primarne tumore pankreasa. Svaka tačka predstavlja primarni slučaj kancera pankreasa analiziran bojenjem FFPE preseka korišćenjem monoklonskog, mišjeg 35-22A antitela (0.2 µg/ml). Isprekidana linija označava vrednost od 10%.

Slika 6. Pilot studija - Ekspresija CLDN18.2 u primarnom i metastatskom tumorskom tkivu pankreasa. Bojenje preseka tkiva FFPE (3 µm) korišćenjem mišjeg, monoklonskog 35-22A antitela (A) primarnog tumora adenokarcinoma i (B) metastaza u limfnim čvorovima. Kontrastno bojenje hematoksilinom (Mayers).

Slika 7. Glavna studija: Korelacija između intenziteta signala CLDN18.2 i količine pozitivnih tumorskih ćelija za analizirane primarne tumore pankreasa. Svaka tačka predstavlja primarni tumor duktalnog adenokarcinoma pankreasa (popunjen krug) ili neuroendokrini primarni tumor (prazni krug) analiziran bojenjem FFPE preseka korišćenjem monoklonskog mišjeg 43-14A antitela (0.2 µg/ml).

Slika 8. Korelacija između intenziteta signala CLDN18.2 i količine pozitivnih tumorskih ćelija za analizirane metastaze pankreasa. Svaka tačka predstavlja slučaj metastaze u limfnom čvoru pankreasa (popunjen krug) ili u jetri (prazni krug) analiziran bojenjem FFPE preseka korišćenjem monoklonskog, mišjeg 43-14A antitela (0.2 µg/ml). Isprekidana linija označava vrednost od 10%.

Slika 9. Ekspresija CLDN18.2 u primarnom i metastatskom tumorskom tkivu pankreasa. Bojenje preseka tkiva FFPE (3 µm) korišćenjem mišjeg, monoklonskog 43-14A antitela na (A, C, E) primarnom tumoru adenokarcinoma i (B, D, F) metastazama u limfnim čvorovima. Isečci su kontrastno obojeni pomoću Mayers hematoksilina.

Slika 10. Grafička analiza - Ekspresija CLDN18.2 u podudarnom primarnom tumoru pankreasa i metastatskim tkivima limfnih čvorova.

Slika 11. Ekspresija CLDN18.2 u podudarnom primarnom tumoru pankreasa i metastatskim tkivima. Bojenje preseka tkiva FFPE (3 µm) (A) primarnog adenokarcinoma, (B) metastaza u jetri i (C) metastaza u limfnim čvorovima, korišćenjem mišjeg, monoklonskog 43-14A antitela. Isečci su kontrastno obojeni pomoću Mayers hematoksilina. 200x uvećanje.

Slika 12. Nivoi iRNK CLDN18.2 u ćelijskim linijama karcinoma pankreasa. (A) Q-PCR analize ekspresije različitih ćelijskih linija CA pankreasa, lentivirusno transdukovanih (LVT) ćelijskih linija (sivi stubići), ćelijskih linija kancera želuca KATO-III (pozitivna kontrola) i ćelijskih linija kancera dojke SKBR-3 (negativna kontrola). Transkripti CLDN18.2 su amplifikovani korišćenjem genski specifičnih prajmera. Endogene ćelijske linije koje pokazuju relativni nivo ekspresije iznad 1x10<5>su ocenjene kao pozitivne na CLDN18.2 (šrafirane trake). NTC: kontrolni uzorak H2O. Pokazatelj greške: Srednja vrednost SD. (B-D) Analize ekspresije CLDN18.2 zavisne od pasaže u Patu8988S (B), Panc05.04 (C) i naznačenim ćelijskim linijama LVT (D). Broj pasaže je naznačen ispod svakog stubića.

Slika 13. Nivoi proteina CLDN18.2 u ćelijskim lizatima ćelijskih linija karcinoma pankreasa. Proteini su odvojeni na 12.5% SDS-PAGE. Western blot analiza je izvedena korišćenjem antitela protiv CLDN18 koje detektuje C-kraj CLDN18.1 i CLDN18.2 (Zymed-MID) i korišćenjem antitela za kontrolu nanošenja koje detektuje β-aktin. Korišćena su vremena ekspozicije od 140 sekundi (Pierce SuperSignal West Dura), odnosno 20 sekundi (Pierce SuperSignal West Pico). (A) Detekcija CLDN18 u lizatima ćelijske linije pankreasa, ćelijskim lizatima pozitivne kontrole (HEK293-p740) i negativne kontrole (SKBR-3). (B) Ekspresija CLDN18.2 upoređena između lizata netransdukovanih parentalnih ćelija i lizata lentivirusno transdukovanih (LVT) ćelijskih linija. Patu8988S i SKBR-3 su dodati kao pozitivna, odnosno negativna kontrola.

Slika 14. Detekcija i ćelijska lokalizacija ekspresije CLDN18 u ćelijskim linijama kancera pankreasa. Bojenje ćelijskih linija kancera pankreasa uzgajanih na pokrovnim staklima. Antitelo: 35-22A (20x uvećanje, vreme ekspozicije je naznačeno ispod svake slike) DAPI je korišćen za bojenje jedara (plavo).(A: AsPC1; B: BxPC3; C: CFPAC; D: DANG; E: HPAF- II; F: HUP-T3; G: HUP-T4; H: KCI-MOH; I: Panel; J: Panc05.04; K: Panc02.04; L: Panc04.03; M: Patu8902; N: Patu8988S; O: Su86.86: P: Suit-2; P: SW-1990; R: YAPC; S: kontrolna ćelijska linija kancera želuca KATO-III).

Slika 15. Detekcija i ćelijska lokalizacija ekspresije CLDN18 u CLDN18.2 transdukovanim ćelijskim linijama kancera pankreasa. Detekcija CLDN18 u lentivirusno transdukovanim (LVT) ćelijskim linijama kancera pankreasa korišćenjem 35-22A antitela nakon fiksacije i permeabilizacije. Za detekciju su korišćena sekundarna antitela obeležena pomoću Alexa488 ili Alexa555. A: BxPC3-LVT; B: CAPAN1-LVT; C: DANG-LVT; D: HPAC-LVT; E: MiaPaCa2-LVT; F: Patu8902-LVT; G: Suit-2-LVT; H: YAPC-LVT.

Slika 16. Vezivanje IMAB362 za ćelijsku površinu CLDN18.2-pozitivnih ćelijskih linija CA pankreasa (farmakodinamika). IF analiza ćelijskih linija kancera pankreasa (A,B,D,E), lentivirusno transdukovanih ćelijskih linija pankreasa (G-L) i kontrolnih ćelija kancera želuca KATO-III (C, F) koje eksprimiraju CLDN18.2. Ćelije su obojene sa IMAB362 u prirodnim uslovima (D-E) i za poređenje sa 35-22A nakon fiksacije i permeabilizacije ćelija (A-C). DAPI je korišćen za bojenje jedara. Vremena ekspozicije su navedena na svakom panelu. G: BxPC3-LVT; H: CAPAN1-LVT; I: DANG-LVT; J: MiaPaCa2-LVT; K: Patu8902-LVT; L: Suit2-LVT.

Slika 17. Ekspresija CLDN18.2 u ksenotransplantatima tumora različitih ćelijskih linija. Ekspresija CLDN18.2 u ksenotransplantatima tumora CAPAN1-LVT (A,B), BxPC3-LVT (C,D), PATU8988S-LVT (E,F), MiaPaCa2-LVT (G,H), YAPC-LVT (J,K) i DANG-LVT (L,M). Bojenje tkiva je izvedeno pomoću Zymed-MID antitela. Sočivo za uvećanje 10x (A,C,E,G,J,L) i 20x (B,D,F,H,K,M).

Slika 18. Provera implantiranja ćelijskih linija kancera pankreasa Suit-2 i MiaPaCa2. Ćelije su ubrizgane u repnu venu golih miševa. Životinje su žrtvovane 45 (A), 52 (B), 59 (C) dana nakon primene Suit-2 (A-C) ili 59 (D), 66 (E), 73 (F) dana nakon ubrizgavanja MiaPaCa2 (D-F). Pluća su pripremljena i obojena antitelima protiv MHC klase I (antihumani MHC I, klon EPR1394Y) da bi se otkrile humane ćelije u tkivima miša.

Slika 19. Analiza implantiranja metastaze Patu8988S. Nu/Nu miševima je i.v. ubrizgano 1x10<6>ili 2x10<6>ćelija Patu8988S, i pluća (A) i jetre (B) miševa su izolovani u različitim vremenskim tačkama kao što je naznačeno ispod x-ose. Da bi se izračunao procenat humane DNK prisutne u svakom preparatu tkiva, pripremljena je standardna kriva mešanjem DNK čoveka i miša i pripremanje 7x 5-strukih razblaženja što je rezultiralo 100% (1) – 0.0064% (7) humane DNK.

Slika 20. IHC analiza metastaza Patu8988S u tkivima pluća miša. Miševi kojima su u repne vene ubrizgane Patu8988S ćelije su žrtvovane u različitim vremenskim tačkama (A-D = 70 dana, E-H = 86 dana), a tkiva pluća su izolovana i obojena antitelom protiv MHC-I (EPR1394Y) (A, B, E, F ) razblaženim 1:1000 ili sa anti-klaudin18 (Zymed-Mid) antitelom (C, D, G, H) pri 0.2 µg/ml. Uvećanja: A, C, E, G = 10x i B, D, F, H = 20x.

Slika 21. IMAB362-posredovana apoptoza ćelija tumora pankreasa tretiranih gemcitabinom. Apoptoza indukovana unakrsnim povezivanjem CLDN18.2 na BxPC3~CLDN18 posle 48 časova. BxPC3~CLDN18 su kultivisane u medijumu ili medijumu 100 ng/ml gemcitabina. Frakcija apoptotskih ćelija mononuklearnih ćelija je pomerena. Slični pomaci su dobijeni inkubacijom tumorskih ćelija sa kamptotecinom.

Slika 22. Jačina delovanja ADCC aktivnosti izazvane IMAB362 na ćelije kancera pankreasa. (A) ADCC izvedena sa CLDN18.2-pozitivnim ćelijskim linijama kancera pankreasa upotrebom PBMC različitih davalaca. (B-F) ADCC izvedena na LVT ćelijskim linijama pankreasa koje ektopično eksprimiraju CLDN18.2 i odgovarajućim parentalnim ćelijama. (G) Tačkasti dijagram

Slika 23. Jačina delovanja CDC aktivnosti izazvane IMAB362 na ćelije kancera pankreasa. (A) CDC izvedena sa pulom seruma zdravih ljudi kao izvorom komplementa, IMAB362 i CLDN18.2-pozitivnim kontrolnim ćelijama pankreasa CDOK1-p740 u 4 nezavisna eksperimenta (B) CDC izvedena sa CLDN18.2-pozitivnim (Patu8988S, DANG, Panc05.04) i CLDN18.2-negativnim (CAPAN1, Suit2, BxPC3, YAPC) ćelijskim linijama pankreasa (C) CDC sa ektopično eksprimirajućim LVT ćelijskim linijama (D) Tačkasti dijagram koji prikazuje koncentraciju IMAB362 koja uzrokuje polovinu maksimalne stope lize (EC50) na ćelijskim linijama kancera pankreasa. (E) Maksimalne stope ubijanja ćelija dobijene sa IMAB362 na ćelijskim linijama kancera pankreasa.

Slika 24. Dejstvo tretmana sa IMAB362 na subkutane ksenotransplantate MiaPaCa2-LVT. Ksenotransplantati tumora MiaPaCa2-LVT inokulisani su subkutanim ubrizgavanjem 1e7 ćelija MiaPaCa2-LVT u bok 15 ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu za svaku tretmansku grupu. Trećeg dana nakon injekcije tumorskih ćelija, tretman je započet sa 200 µg IMAB362 ili kontrolama, respektivno. Tretman je nastavljen dva puta nedeljno sa naizmeničnim i.p. i i.v. injekcijama dok životinje nisu žrtvovane. (A) Dejstvo tretmana sa IMAB362 na rast tumora. Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM). (B) Kaplan-Meier-ovi dijagrami preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada tumor dostigne zapreminu od 1400 mm<3>ili tumor postane ulcerozan.

Slika 25. Tretman subkutanih ksenotransplantata BxPC3-LVT sa IMAB362. Ksenotransplantati tumora BxPC3-LVT inokulisani su subkutanim ubrizgavanjem 1e7 ćelija BxPC3-LVT u bok 15 ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu za svaku tretmansku grupu. Trećeg dana nakon injekcije tumorskih ćelija, tretman je započet sa 200 µg IMAB362 ili kontrolama, respektivno. Tretman je nastavljen dva puta nedeljno sa naizmeničnim i.p. i i.v. injekcijama dok životinje nisu žrtvovane. (A) Dejstvo tretmana sa IMAB362 na rast tumora. Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM, * p<0.05). (B) Kaplan-Meier-ovi dijagrami preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada tumor dostigne zapreminu od 1400 mm<3>ili tumor postane ulcerozan.

Slika 26. Dejstvo tretmana sa IMAB362 na rast metastaza pankreasa Suit2-LVT. U repnu venu 12 ženki Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu miševa po tretmanskoj grupi intravenski je ubrizgano 2x10<6>Suit2-LVT tumorskih ćelija. Trećeg dana nakon ubrizgavanja tumorskih ćelija, tretmani su započeti sa 200 µg IMAB362, 200 µg kontrole izotipa ili jednakom zapreminom PBS. Životinje su žrtvovane 42. dana nakon transplantacije. (A) qPCR analiza (srednja vrednost 2-4 reakcije po uzorku) koja određuje procenat humane DNK prisutne u uzorcima pluća miša. (B) Procenat humanih ćelija koje pokrivaju površinu pluća miša određen je planimetrijom. Humane ćelije su imunohistohemijski obojene u isečcima tkiva antitelima protiv humanog MHC-klase I. * p<0.05 (Kruskal-Wallis-ov test). Stubići greške: srednja vrednost ± SD.

Slika 27. Q-PCR i IHC analiza metastaza u plućima Patu8988S. Ubrizgano je 2x10<6>ćelija Patu8988S po mišu. Životinje su žrtvovane nakon 65 dana. Prazni krugovi: miševi žrtvovani nakon 63 dana. (A) Miševi su tretirani sa 200 µg IMAB362 dva puta nedeljno ili kontrolom fiziološkog rastvora. Količina humane DNK (ng) detektovana Q-PCR metodom, koja je izračunata iz vrednosti Ct. (B) Q-PCR eksperiment ponovljen kao što je opisano u A. Ovde je procenat humane DNK prisutne u DNK miša izračunat iz Ct vrednosti. (C) Miševi su tretirani sa IMAB362 i kontrolnim izotipskim antitelom (rituksimabom). Procenat humane DNK prisutne u plućima miša izračunat je iz vrednosti Ct. Za grupu IMAB362, otkrivena je jedna atipična vrednost (prazni trougao). Značajnost je naznačena uključivanjem ili isključivanjem atipičnih vrednosti. (D/E) isti eksperiment kao u C. Ovde je površina metastaze određena korišćenjem programa Image J. Tačkasti dijagrami pokazuju značaj inhibicije IMAB362 uključujući (D) ili isključujući (E) atipičnu vrednost. P-vrednost: neupareni t-test. Stubići greške ±SD

Slika 28. Krive doza-odgovor za gemcitabin. Ćelijske linije kancera pankreasa pokazuju veoma različitu osetljivost na gemcitabin. Ćelijske linije su bile izložene tokom 4 dana različitim koncentracijama gemcitabina i inhibicija proliferacije je analizirana putem testa vijabilnosti.

Slika 29. Krive doza-odgovor za oksaliplatin. Ćelijske linije kancera pankreasa pokazuju veoma različitu osetljivost na oksaliplatin. Ćelijske linije su bile izložene tokom 4 dana različitim koncentracijama oksaliplatina i inhibicija proliferacije je analizirana putem testa vijabilnosti.

Slika 30. Dejstvo tretmana hemoterapijskim agensima na ekspresiju CLDN18.2 (RNK). RNK netretiranih, Gem (1 ng/ml) ili GemOx (Gem 1 ng/ml Ox 10 ng/ml) prethodno tretiranih ćelija DANG (2 dana) (A) ili ćelija Patu8988S (B) prethodno tretiranih tokom3 dana sa Gem (10 ng/) ml ili GemOx (Gem 10 ng/ml Ox 100 ng/ml). RNK je konvertovana u cDNK i nivo transkripta CLDN18.2 je analiziran kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Rezultati su prikazani kao relativne jedinice u poređenju sa nivoom transkripta konstitutivno eksprimiranog gena HPRT.

Slika 31. Dejstvo hemoterapije na nivo proteina CLDN18.2 u ćelijama karcinoma pankreasa. Proteini iz ukupnih ćelijskih lizata netretiranih (med), Gem (1 ng/ml) ili GemOx (Gem 1 ng/ml Ox 10 ng/ml) prethodno tretiranih ćelija DANG (A) ili Patu8988S (B) analizirani su na ekspresiju CLDN18.2 detektovanu poliklonalnim antiserumom Zymed C-term. Aktin je korišćen da pokaže jednako nanošenje proteina.

Slika 32. FACS analiza ekspresije CLDN18.2 na površini ćelija. Ekspresija CLDN18 (ispunjen histogram) ćelija Patu8988S kultivisanih u medijumu (levo) i tretiranih sa Gem (desno) prikazana je u preklapanju u poređenju sa izotipskom kontrolom. Ćelije Patu8988S su tretirane gemcitabinom (10 ng/ml)) tokom 3 dana.

Slika 33. Analiza ćelijskog ciklusa DANG ćelija, tretiranih ili ne, gemcitabinom (Gem; 2ng/ml) ili gemcitabinom+oksaliplatinom (GemOx; 1ng/ml+10ng/ml) tokom dva dana. (A) Tretman gemcitabinom dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa ćelija u S-fazi. Površina svakog stubića je podeljena da bi se označio procenat ćelija u G0/G1, S i G2 fazi. (B) Western blot analize su pokazale ushodnu regulaciju CLDN18 nakon tretmana sa Gem.

Slika 34. Uticaj gemcitabina na ćelijski ciklus (A) i ekspresiju CLDN18.2 (B, C) u ćelijama Patu8988S. Patu8988S ćelije nisu bile tretirane, ili su tretirane gemcitabinom (10 ng/ml) tokom 2 dana. (A) Površina svakog stubića je podeljena da bi se označio procenat ćelija u G0/G1, S i G2 fazi. Gustina CLDN18.2 (x-osa) je ucrtana u odnosu na broj ćelija (y-osa). (B) Ucrtana je ekspresija CLDN18.2 u netretiranim (isprekidana linija) u odnosu na ćelije tretirane sa Gem (puna linija). (C) Prikazana je ekspresija CLDN18.2 u Patu8988S ćelijama tretiranim sa Gem u G0/G1 fazi (isprekidana linija) u odnosu na ćelije u S fazi (puna linija).

Slika 35. Dejstvo hemoterapije na ćelije kancera želuca. Kultivisanje KatoIII ćelija tokom 96 časova dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa u G0/G1-fazi (a) i nishodne regulacije CLDN18.2 (c). Citostatska jedinjenja koja rezultuju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa u različitim fazama ćelijskog ciklusa stabilizuju ekspresiju CLDN18.2 (c).

Slika 36. Dejstvo hemoterapije na ćelije kancera želuca. Citostatska jedinjenja rezultuju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa u različitim fazama ćelijskog ciklusa (S/G2-faza (Irinotekan) ili G2-faza (Docetaksel)). Površina svakog stubića je podeljena da bi se označio procenat ćelija u G0/G1, S i G2 fazi.

Slika 37. Krive doza-odgovor za IMAB362-posredovanu ADCC nakon hemoterapijskog tretmana ćelija DANG. (A) Krive doza-odgovor jednog reprezentativnog davaoca nakon prethodnog tretmana DANG ćelija kancera pankreasa sa Gem ili GemOx tokom 40 časova. (B) EC50 vrednosti (srednja vrednost) za IMAB362-posredovanu ADCC. P-vrednosti: neupareni t-test.

Slika 38. Dejstvo hemoterapije na ćelije kancera želuca. a: Ćelije tretirane irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom pokazuju niži nivo vijabilnih ćelija u poređenju sa ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu. b: Ekspresija CLDN18.2 u ćelijama tretiranim irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom je povećana u poređenju sa ćelijama kultivisanim u medijumu. c/d: Tretman ćelija irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom poboljšava jačinu delovanja IMAB362 u indukovanju ADCC.

Slika 39. Uticaj hemoterapijskih agenasa na IMAB362- posredovanu CDC ćelija MiaPaCa2-LVT. Krive doza-odgovor za 2 nezavisna testa. MiaPaCa2-LVT su kultivisane u medijumu, Gem (10 ng/ml) ili GemOx (10 ng/ml Gem 100 ng/ml Ox) tokom 70 časova.

Slika 40. Dejstva hemoterapije na IMAB362-indukovanu CDC

Slika 41. Dejstvo tretmana sa IMAB362 u kombinaciji sa Gem ili GemOx na ksenotransplantate BxPC3-LVT. Ksenotransplantati tumora BxPC3-LVT su inokulisani subkutanim ubrizgavanjem 8.5e6 ćelija BxPC3-LVT u bok 10 ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu za svaku tretmansku grupu. Trećeg dana nakon ubrizgavanja tumorskih ćelija, tretman je započet hemoterapijom (50 mg/kg gemcitabina i.p., odnosno 50 mg/kg gemcitabina i 5 mg/kg oksaliplatina i.p.) i nastavljen je nedeljno tokom šest nedelja. 24 časa nakon ubrizgavanja hemoterapijskih agenasa, 800 µg IMAB362 ili kontrole je primenjeno intravenski u repnu venu. Tretman sa IMAB362 je nastavljen svake nedelje sve dok miševi nisu žrtvovani. (A) Krive rasta subkutanih ksenotransplantata BxPC3-LVT. Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM). (B) Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu od 1400 mm3 ili tumori postali ulcerozni.

Slika 42. Povećanje antitumorske efikasnosti kombinacijom režima gemcitabina sa IMAB362. Ksenotransplantati tumora BxPC3-LVT su inokulisani subkutanim ubrizgavanjem 8.5e6 ćelija BxPC3-LVT u bok 10 ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu za svaku tretmansku grupu. Trećeg dana nakon ubrizgavanja tumorskih ćelija, tretmani su započeti hemoterapijom (100 mg/kg gemcitabina i.p., ili 100 mg/kg gemcitabina i 5 mg/kg oksaliplatina i.p.) i nastavljeni su nedeljno tokom šest nedelja. 24 sata nakon injekcije hemoterapijskih agenasa, 200 µg (1/2 doze) ili 400 µg (cela doza) IMAB362 je primenjeno intravenski u repnu venu. Tretman sa IMAB362 je nastavljen dva puta nedeljno i.p. i i.v. injekcijama naizmenično sve dok miševi nisu žrtvovani. (A) Krive rasta subkutanih BxPC3-LVT ksenotransplantata. Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM). (B) Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu od 1400 mm<3>ili tumori postali ulcerozni.

Slika 43. Dejstvo tretmana sa IMAB362 u kombinaciji sa gemcitabinom na ksenotransplantate MiaPaCa2-LVT. Ksenotransplantati tumora MiaPaCa2-LVT su inokulisani subkutanim ubrizgavanjem 5e6 ćelija MiaPaCa2-LVT u bok 10 ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu za svaku tretmansku grupu. 4 dana nakon ubrizgavanja tumorskih ćelija, tretman je započet hemoterapijom (50 mg/kg gemcitabina i.p) i nastavljen je nedeljno tokom šest nedelja. 24 h nakon injekcije hemoterapijskih agenasa, 200 µg IMAB362 ili kontrole je primenjeno intravenski u repnu venu. Tretman sa IMAB362 je nastavljen dva puta nedeljno i.p. i i.v. injekcijama naizmenično sve dok miševi nisu žrtvovani. (A) Rast subkutanih ksenotransplantata. Veličina tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM). (B) Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu od 1400 mm<3>ili tumori postali ulcerozni.

Slika 44. Dejstvo tretmana sa IMAB362 u kombinaciji sa gemcitabinom na uspostavljene ksenotransplantate tumora MiaPaCa2-LVT. Ksenotransplantati tumora MiaPaCa2-LVT inokulisani su subkutanim ubrizgavanjem 1e7 ćelija MiaPaCa2-LVT u bok ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxn1<nu>. 9 dana nakon subkutane inokulacije tumora, miševi sa tumorom su preraspoređeni u homogene tretmanske grupe od po 8 životinja po grupi i tretman je započet. Miševi su tretirani sa 150 mg/kg gemcitabina dva puta nedeljno tokom 4 nedelje i.p. 24 časa nakon injekcije gemcitabina, 200 µg IMAB362 ili kontrole je primenjeno intravenski u repnu venu. Tretman sa 200 µg IMAB362 je nastavljen dva puta nedeljno naizmeničnim i.p. i i.v. injekcijama sve dok miševi nisu žrtvovani. (A) Veličina subkutanih tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM; **=p<0.01). (B) Kaplan-Meier-ove krive preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu od 1400 mm<3>ili tumori postali ulcerozni (Log-rank (Mantel-Cox) test; **=p<0.01).

Slika 45. Dejstvo IMAB362 u kombinaciji sa gemcitabinom na metastaze u plućima u modelu ksenotransplantata Patu8988S. 2x10<6>tumorskih ćelija Patu8988S je intravenski ubrizgano u repnu venu 12 ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxn1<nu>po tretmanskoj grupi. Dve nedelje nakon intravenskog ubrizgavanja tumorskih ćelija, započet je tretman tretmanom održavanja od 200 µg IMAB362 dva puta nedeljno (i.v./i.p.) u kombinaciji sa primenom 100 mg/kg gemcitabina i.p. dva puta nedeljno tokom 4 nedelje. Kontrolna grupa je tretirana sa 200 µg kontrolnog izotipskog antitela u kombinaciji sa 100 mg/kg gemcitabina dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane 70. dana nakon transplantacije. (A) Kvantitativna PCR analiza (srednja vrednost 3 reakcije po uzorku) humane DNK u uzorcima pluća miševa tretiranih sa IMAB362 i izotipskim antitelom. Značajna razlika (P = 0.0035, Mann Whitney test) u odnosu na izotipsku kontrolu (B) Procenat obojenih humanih ćelija koje pokrivaju površinu pluća miša određen je kompjuterskom analizom. Imunohistološko bojenje je izvedeno pomoću anti-humanog MHC-I antitela (klon EPR1394Y) na tkivima pluća obloženim parafinom (srednja vrednost ± SEM; P = 0.0003, Mann Whitney test). C i D: Primeri imunohistološkog bojenja sa anti MHC-I antitelom metastaza na plućima Patu8988s kod miševa tretiranih sa IMAB362 gemcitabinom (C) ili izotipskim antitelom gemcitabinom (D).

DETALJAN OPIS

[0025] Iako su predmetni navodi u nastavku detaljno opisani, podrazumeva se da ovi navodi nisu ograničeni na određene metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe se podrazumeva da ovde korišćena terminologija služi samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograničava obim predmetnog navoda koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja koja uobičajeno podrazumeva stručnjak u ovoj oblasti.

[0026] U nastavku dokumenta, biće opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su nabrojani sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, podrazumeva se da mogu da budu kombinovani na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različito opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetne navode samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti tako da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem opisanih i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim u opisu ove prijave osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.

[0027] Poželjno, ovde korišćeni termini su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

[0028] Izvođenje predmetnih navoda koristiće, ukoliko nije naznačeno drugačije, konvencionalne postupke hemije, biohemije, biologije ćelije, imunologije i tehnika rekombinantne DNK koje su opisane u literaturi iz ove oblasti (videti, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0029] Kroz ovu specifikaciju i patentne zahteve koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrže", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takvi drugi članovi, celi brojevi ili koraci ili grupe članova, celih brojeva ili koraka mogu da budu isključeni, tj. predmet se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Treba shvatiti da navođenje termina u jednini upotrebljeno u kontekstu opisa navoda (naročito u kontekstu patentnih zahteva) obuhvata i jedninu i množinu, ukoliko nije ovde naznačeno drugačije ili jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Predviđeno je da nabrajanje opsega vrednosti ovde služi samo kao skraćeni postupak za pojedinačno označavanje svake zasebne vrednosti koja se nalazi unutar opsega. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili na drugi način jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Upotreba bilo kog ili svih primera, ili jezički označenog primera (npr., "kao što je"), koja je ovde data, predviđena je samo da bolje ilustruje navode i ne predstavlja ograničenje obima navoda za koje se inače traži zaštita. Nikakvi jezički termini u specifikaciji ne treba da budu shvaćeni kao da naznačuju element za koji nije tražena zaštita koji je esencijalan za izvođenje navoda.

[0030] Termin "CLDN18" odnosi se na klaudin 18 i uključuje bilo koje varijante, uključujući varijantu 1 klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (klaudin 18.1 (CLDN18.1)) i varijantu 2 klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (klaudin 18.2 (CLDN18.2)).

[0031] Termin "CLDN18.2" poželjno se odnosi na humani CLDN18.2, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0032] Termin "CLDN18.1" se poželjno odnosi na humani CLDN18.1, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.

[0033] Termin "varijanta" prema navodima se odnosi, naročito, na mutante, varijante nastale alternativnim splajsovanjem, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Potpuno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline poreklom od vrste drugačije od one od koje potiče data sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline. Termin "varijanta" obuhvataće bilo koje posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.

[0034] Prema navodima, termin "CLDN18.2-pozitivni kancer" označava kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, poželjno na površini pomenutih ćelija kancera.

[0035] "Ćelijska površina" je korišćena u skladu sa njenim normalnim značenjem u tehnici, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula. Na primer, transmembranski protein koji ima jedan ili više ekstracelularnih delova smatra se eksprimiranim na ćelijskoj površini.

[0036] CLDN18.2 je eksprimiran na površini ćelija ukoliko je lociran na površini pomenutih ćelija i dostupan je za vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima koja su dodata ćelijama.

[0037] Prema navodima, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije niži od ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca. Poželjno, nivo ekspresije je niži od 10%, poželjno niži od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ili 0.05% ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca, ili čak niži. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko nivo ekspresije ne prelazi nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu različitom od želuca za više od 2 puta, poželjno 1,5 put, i poželjno ne prelazi nivo ekspresije u pomenutom ne-kanceroznom tkivu. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije suviše nizak da bi omogućio vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama.

[0038] Prema navodima, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko nivo ekspresije prelazi nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu različitom od želuca, poželjno za više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta, ili 10000 puta. Poželjno, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama. Poželjno, CLDN18.2 eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen na površini pomenute ćelije.

[0039] Prema navodima, termin "bolest" odnosi se na bilo koje patološko stanje, uključujući kancer, naročito one oblike kancera opisane ovde. Bilo koja referenca ovde na kancer ili naročite oblike kancera takođe uključuje njegove metastaze. U poželjnom primeru izvođenja, bolest koja se tretira prema predmetnom pronalasku uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0040] "Bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2" ili slični izrazi označavaju prema navodima da je CLDN18.2 eksprimiran u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 u ćelijama bolesnog tkiva ili organa je povećana u odnosu na stanje u zdravom tkivu ili organu. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se javlja samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u odgovarajućem zdravom tkivu sprečena. Na primer, CLDN18.2 se eksprimira u kanceroznom tkivu pankreasa, dok ekspresija u nekanceroznom tkivu pankreasa ne može da se detektuje. Prema navodima, bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 uključuju bolesti kancera. Dodatno, prema navodima, bolesti kancera su poželjno one gde ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2.

[0041] Kako se ovde koristi, "bolest kancera" ili "kancer" uključuje bolest karakterisanu aberantno regulisanim ćelijskim rastom, proliferacijom, diferencijacijom, adhezijom, i/ili migracijom. Pod "ćelijom kancera" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što prestaje stimulus koji je izazvao novi rast. Poželjno, "bolest kancera" karakteriše se ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 i ćelija kancera eksprimira CLDN18.2. Ćelija koja eksprimira CLDN18.2 poželjno je ćelija kancera, poželjno kancera koji su ovde opisani.

[0042] Prema navodima, "karcinom" je maligni tumor koji potiče iz epitelnih ćelija.

[0043] "Adenokarcinom" je kancer koji je poreklom iz žlezdanog tkiva. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznatog kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i različito drugo tkivo koje oivičava šupljine i organe tela. Epitel vodi embrionalno poreklo iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi bile klasifikovane kao adenokarcinom, ćelije ne moraju obavezno da budu deo žlezde, sve dok imaju sekretorne osobine. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi teže sličnosti sa žlezdanim tkivom iz koga potiču, dok slabo diferencirani ne moraju. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela usled sveprisutnosti žlezda u telu. Iako svaka žlezda ne mora izlučivati istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija ćelije, smatra se žlezdanom i stoga je njen maligni oblik nazvan adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju drugih tkiva i često metastaziraju ukoliko im je dato dovoljno vremena.

[0044] Pankreas, organ endodermalnog porekla, je ključni regulator varenja proteina i ugljenih hidrata i homeostaze glukoze. Egzokrini pankreas (80% tkivne mase organa) je sačinjen od razgranate mreže acinarnih ćelija i duktalnih ćelija koje proizvode i isporučuju digestivne enzime u gastrointestinalni trakt. Acinarne ćelije, koje su organizovane u funkcionalne jedinice duž mreže kanala, sintetišu i luče enzime u lumen dukta kao odgovor na signale iz želuca i duodenuma. Unutar acinarnih jedinica u blizini kanala nalaze se centroacinarne ćelije. Endokrini pankreas, koji reguliše metabolizam i homeostazu glukoze lučenjem hormona u krvotok, sačinjen je od četiri specijalizovana tipa endokrinih ćelija okupljenih u klastere zvane Langerhansova ostrva.

[0045] Kancer pankreasa je maligna neoplazma koja potiče od transformisanih ćelija koje nastaju u tkivima koje formiraju pankreas. Kancer pankreasa je četvrti najčešći uzrok smrti od kancera u Sjedinjenim Državama i osmi u svetu. Rani kancer pankreasa često ne izaziva simptome, a kasniji simptomi su obično nespecifični i raznovrsni. Zbog toga se kancer pankreasa često ne dijagnostikuje dok ne uznapreduje. Kancer pankreasa ima lošu prognozu: za sve stadijume zajedno, relativne stope preživljavanja od 1 i 5 godina su 25%, odnosno 6%. Za bolest lokalnog tipa, 5-godišnje preživljavanje je približno 20%, dok je medijana preživljavanja za lokalno uznapredovalu bolest i za metastatsku bolest, koje zajedno obuhvataju preko 80% pojedinaca, oko 10, odnosno 6 meseci.

[0046] Kancer pankreasa uključuje adenokarcinome (tumore koji pokazuju žlezdanu arhitekturu) koji nastaju unutar egzokrine komponente pankreasa i neuroendokrine karcinome koji nastaju iz ćelija ostrvaca.

[0047] Najčešći oblik kancera pankreasa, duktalni adenokarcinom, tipično se karakteriše umereno do slabo diferenciranim strukturama žlezda na mikroskopskom pregledu. Duktalni adenokarcinom pankreasa (PDAC) obično nastaje u glavi pankreasa sa infiltracijom u okolna tkiva uključujući limfna tkiva, slezinu i peritonealnu šupljinu, i sa metastazama u jetru i pluća.

PDAC prvenstveno pokazuje žlezdani obrazac sa strukturama nalik na kanale i različitim stepenom ćelijske atipije i diferencijacije. Manje uobičajeni podtipovi PDAC uključuju koloidnu, adenoskvamoznu ili sarkomatoidnu histologiju. Često unutar pojedinačnog tumora postoje regionalne razlike u histologiji, stepenu tumora i stepenu diferencijacije. Čak i najmanje primarne lezije obično pokazuju perineuralnu i limfovaskularnu invaziju, što ukazuje na sklonost ka ranom rasprostiranju.

[0048] Drugi najčešći tip egzokrinog kancera pankreasa je mucinozan. Mucinozni adenokarcinom proizvodi veliku količinu mucina što mu daje cistični izgled prilikom ispitivanja snimanjem.

[0049] Neuroendokrini tumori pankreasa formiraju se u ćelijama koje prave hormone (ćelije ostrvaca) pankreasa. Neoplazme acinarnih ćelija nastaju iz acinarnih ćelija pankreasa.

[0050] Prema navodima, termin "kancer" takođe uključuje metastaze kancera primarnog tumora kao što je primarni kancer pankreasa. Dakle, ako se pominje, na primer, kancer pankreasa, to takođe uključuje metastaze kancera pankreasa, na primer metastaze na pluća, jetru i/ili limfne čvorove.

[0051] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje ćelija kancera sa njihovog originalnog mesta u drugi deo tela. Formiranje metastaze je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, penetracije endotelnih bazalnih membrana da bi ćelije ušle u telesne šupljine i sudove, i zatim, nakon transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaze tumora se često dešavaju čak i nakon uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu da ostanu i razviju metastazni potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema navodima odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema navodima se odnosi na metastaze limfnih čvorova. Jedan naročiti oblik metastaze koji može da se leči terapijom prema navodima je metastaza poreklom od kancera pankreasa kao primarnog mesta. U poželjnim primerima izvođenja takva metastaza kancera pankreasa je metastaza na limfne čvorove, metastaza na pluća i/ili metastaza na jetru.

[0052] Krukenbergov tumor je neuobičajeni metastazirani tumor jajnika koji čini 1% do 2% svih tumora jajnika. Krukenbergov tumor je metastazni adenokarcinom ćelija tipa pečatnog prstena jajnika. Želudac je u većini slučajeva primarno mesto Krukenbergovog tumora (70%). Karcinomi debelog creva, slepog creva i dojke (uglavnom invazivni lobularni karcinom) su sledeća najčešća primarna mesta. Registrovani su retki slučajevi Krukenbergovog tumora poreklom od karcinoma žučne kese, žučnog kanala, pankreasa, tankog creva, ampule Vateri, grlića materice i mokraćne bešike/urahusa.

[0053] Refraktorni kancer je malignitet za koji je određeni tretman neefikasan, koji ili inicijalno ne reaguje na lečenje, ili koji postaje neresponsivan tokom vremena.

[0054] Pod "tretiranjem/lečenjem" podrazumeva se primena jedinjenja ili kompozicije ili kombinacije jedinjenja ili kompozicija kod subjekta da bi se sprečila ili eliminisala bolest, uključujući smanjenje veličine tumora ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanje ili usporavanje bolesti kod subjekta; inhibicija ili usporavanje razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenje učestalosti ili težine simptoma i/ili ponovnog pojavljivanja kod subjekta koji trenutno ima ili koji je prethodno imao bolest; i/ili produžavanje, tj. povećanje dužine života subjekta.

[0055] Konkretno, termin "tretman/lečenje bolesti" uključuje lečenje, skraćivanje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiciju napredovanja ili pogoršanja, ili sprečavanje ili odlaganje pojave bolesti ili njenih simptoma.

[0056] Termin "pacijent" označava prema navodima subjekta za tretman, naročito obolelog subjekta, uključujući ljudska bića, ne-humane primate ili druge životinje, naročito sisare kao što su krave, konji, svinje, ovce, koze, psi mačke ili glodari kao što su miševi i pacovi. U naročito poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće.

[0057] Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" odnosi se na agens ili kombinaciju agenasa čije obezbeđivanje ćelijama rezultuje u povećanim nivoima RNK i/ili proteina CLDN18.2 u navedenim ćelijama, poželjno u povećanim nivoima proteina CLDN18.2 na ćelijskoj površini, u poređenju sa situacijom gde ćelijama nije obezbeđen agens ili kombinacija agenasa. Poželjno, ćelije su ćelije kancera, naročito ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, i stoga predstavljaju ciljno mesto delovanja za antitela koja se vezuju za CLDN18.2, kao što su ćelije ovde opisanih tipova kancera, posebno kancera pankreasa. Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" odnosi se na, naročito, agens ili kombinaciju agenasa čije obezbeđivanje ćelijama rezultuje u povećanoj gustini CLDN18.2 na površini pomenutih ćelija u poređenju sa situacijom gde ćelijama nije obezbeđen agens ili kombinacija agenasa. "Stabilizacija ekspresije CLDN18.2" uključuje, konkretno, situaciju gde agens ili kombinacija agenasa sprečava smanjenje ili redukuje smanjenje ekspresije CLDN18.2, npr. ekspresija CLDN18.2 bi se smanjila bez obezbeđivanja agensa ili kombinacije agenasa, i obezbeđivanje agensa ili kombinacije agenasa sprečava pomenuto smanjenje ili redukuje pomenuto smanjenje ekspresije CLDN18.2. "Povećanje ekspresije CLDN18.2" uključuje, konkretno, situaciju gde agens ili kombinacija agenasa povećava ekspresiju CLDN18.2, npr. ekspresija CLDN18.2 bi se smanjila, ostala suštinski konstantna ili bi se povećala bez obezbeđivanja agensa ili kombinacije agenasa, i obezbeđivanje agensa ili kombinacije agenasa povećava ekspresiju CLDN18.2 u poređenju sa situacijom gde nije obezbeđen agens ili kombinacija agenasa, tako da je rezultujuća ekspresija veća u poređenju sa situacijom kada bi se ekspresija CLDN18.2 smanjila, ostala suštinski konstantna ili se povećala, bez obezbeđivanja agensa ili kombinacije agenasa.

[0058] Prema navodima, termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" uključuje hemoterapijske agense ili kombinacije hemoterapijskih agenasa kao što su citostatski agensi. Hemoterapijski agensi mogu da utiču na ćelije na jedan od sledećih načina: (1) oštećivanje DNK ćelija tako da više ne mogu da se reprodukuju, (2) inhibicija sinteze novih DNK lanaca tako da nije moguća replikacija ćelije, (3) zaustavljanje mitotičkih procesa u ćelijama, tako da ćelije ne mogu da se podele na dve ćelije.

[0059] Prema navodima, termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" poželjno se odnosi na agens ili kombinaciju agenasa kao što je citostatsko jedinjenje ili kombinacija citostatskih jedinjenja čije obezbeđivanje ćelijama, naročito ćelijama kancera, rezultuje u zaustavljanju ili akumulaciji ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa, poželjno u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa različitoj od G1- i G0-faze, poželjno različitom od G1-faze, poželjno u jednoj ili više od G2- ili S-faza ćelijskog ciklusa kao što je G1/G2-, S/G2-, G2- ili S-faza ćelijskog ciklusa. Termin "ćelije zaustavljene ili akumulirane u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa" označava da se procenat ćelija koje su u pomenutoj jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa povećava. Svaka ćelija prolazi kroz ciklus koji se sastoji od četiri faze da bi se replicirala. Prva faza nazvana G1 je kada se ćelija priprema da replicira svoje hromozome. Drugi stadijum je nazvan S, i u ovoj fazi se odigrava sinteza DNK i DNK se udvaja. Sledeća faza je G2 faza, kada se udvajaju RNK i proteini. Finalni stadijum je M stadijum, koji predstavlja stadijum same ćelijske deobe. U ovom finalnom stadijumu, udvojena DNK i RNK se razdvajaju i odlaze na suprotne krajeve ćelije, i ćelija se zaista deli u dve identične, funkcionalne ćelije. Hemoterapijski agensi koji oštećuju DNK obično rezultuju u akumulaciji ćelija u G1 i/ili G2 fazi. Hemoterapijski agensi koji blokiraju rast ćelije preko ometanja sinteze DNK kao što su antimetaboliti obično rezultuju u akumulaciji ćelija u S-fazi. Primeri ovih lekova su gemcitabin, 6-merkaptopurin i 5-fluorouracil.

[0060] Prema navodima, termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" uključuje nukleozidne analoge kao što su gemcitabin, 5-fluorouracil ili njihovi prolekovi, jedinjenja platine kao što su oksaliplatin i cisplatin, taksane kao što je paklitaksel i docetaksel, i analoge kamptotecina kao što su irinotekan i topotekan, i kombinacije lekova kao što su kombinacije lekova koje sadrže jedno ili više od gemcitabina, oksaliplatina i 5-fluorouracila, kao što je kombinacija lekova koja sadrži gemcitabin i oksaliplatin, gemcitabin i 5-fluorouracil, oksaliplatin i 5-fluorouracil ili druge ovde opisane kombinacije lekova. Prema navodima, pozivanje na agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, kao što je pozivanje na analog nukleozida, jedinjenje platine, analog kamptotecina ili taksan, na primer, pozivanje na gemcitabin, 5-fluorouracil, oksaliplatin, irinotekan ili paklitaksel uključuje bilo koji prolek kao što je estar, so ili derivat kao što je konjugat pomenutog agensa. Primeri su konjugati pomenutog agensa sa supstancom nosača, npr. paklitaksel vezan za protein, kao što je paklitaksel vezan za albumin. Poželjno, soli pomenutog agensa su farmaceutski prihvatljive.

[0061] U jednom poželjnom primeru izvođenja, "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" je, ili sadrži, "agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt".

[0062] U specifičnim okolnostima, ćelije kancera mogu ući u put letalnog stresa povezan sa emitovanjem prostorno-vremenski definisane kombinacije signala koje imuni sistem dekodira da bi aktivirao tumor-specifične imunološke odgovore (Zitvogel L. et al. (2010) Cell 140: 798-804). U takvom scenariju ćelije kancera se stimulišu da emituju signale koje detektuju urođeni efektori kao što su dendritske ćelije za stimulaciju srodnog imunog odgovora koji uključuje CD8+ T ćelije i IFN-γ signalizaciju tako da smrt ćelije tumora može izazvati produktivni antikancerski imuni odgovor. Ovi signali uključuju pre-apoptotsko izlaganje šaperona kalretikulina (CRT) endoplazmatičnog retikuluma (ER) na ćelijskoj površini, pre-apoptotsku sekreciju ATP, i postapoptotsko oslobađanje jedarnog proteina HMGB1. Zajedno, ovi procesi čine molekularne determinante imunogene ćelijske smrti (ICD). Antraciklini, oksaliplatin, i γ zračenje su sposobni da indukuju sve signale koji definišu ICD, dok cisplatin, na primer, koji je deficijentan u indukciji CRT translokacije iz ER na površinu umirućih ćelija – procesa koji zahteva stres ER – zahteva dodavanje tapsigargina, induktora ER stresa.

[0063] Prema navodima, termin "agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt" odnosi se na agens ili kombinaciju agenasa koji su, kada su obezbeđeni ćelijama, naročito ćelijama kancera, sposobni da indukuju ćelije da uđu u put letalnog stresa koji konačno rezultuje u tumorspecifičnim imunološkim odgovorima. Naročito, agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt kada je obezbeđen ćelijama indukuje ćelije da emituju prostorno-vremenski definisanu kombinaciju signala, uključujući, naročito, pre-apoptotsko izlaganje šaperona kalretikulina (CRT) endoplazmatičnog retikuluma (ER) na ćelijskoj površini, pre-apoptotsku sekreciju ATP, i post-apoptotsko oslobađanje jedarnog proteina HMGB1.

[0064] Prema navodima, termin "agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt" uključuje antracikline i oksaliplatin.

[0065] Termin "nukleozidni analog" se odnosi na strukturni analog nukleozida, kategorije koja uključuje i purinske analoge i pirimidinske analoge.

[0066] Termin "gemcitabin" je jedinjenje koje predstavlja nukleozidni analog sledeće formule:

[0067] Konkretno, termin se odnosi na jedinjenje 4-amino-1-(2-deoksi-2,2-difluoro-β-D-eritropentofuranozil)pirimidin-2(1H)-on ili 4-amino-1-[(2R,4R,5R)-3,3-difluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)oksolan-2-il]-1,2-dihidropirimidin-2-on.

[0068] Prema navodima, gemcitabin se poželjno primenjuje intravenskim putem. Poželjno, gemcitabin se primenjuje u rasponima doza od 0.5 do 2 g/m<2>, poželjno 0.8 do 1.5 g/m<2>, poželjnije 1 do 1.2 g/m<2>površine tela. Na primer, gemcitabin može da se daje u dozi od 1000 mg po kvadratnom metru nedeljno tokom 7 od 8 nedelja, a zatim nedeljno tokom 3 od 4 nedelje.

[0069] Termin "nukleozidni analog" uključuje fluoropirimidinske derivate, kao što su fluorouracil i njihove prolekove. Termin "fluorouracil" ili "5-fluorouracil" (5-FU ili f5U) (prodaje se pod zaštićenim imenima Adrucil, Carac, Efudix, Efudex i Fluoroplex) je jedinjenje koje je pirimidinski analog sledeće formule:

[0070] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-dion.

[0071] Termin "kapecitabin" (Xeloda, Roche) odnosi se na hemoterapijski agens koji je prolek koji se konvertuje u 5-FU u tkivima. Kapecitabin koji se može oralno primeniti ima sledeću formulu:

[0072] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje pentil [1-(3,4-dihidroksi-5-metiltetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-2-okso-1 H-pirimidin-4-il]karbamat.

[0073] Prema navodima, termin "jedinjenje platine" odnosi se na jedinjenja koja sadrže platinu u svojoj strukturi kao što su kompleksi platine i uključuju jedinjenja kao što su cisplatin, karboplatin i oksaliplatin.

[0074] Termin "cisplatin" ili "cisplatina" odnosi se na jedinjenje cis-diamindihloroplatina(II) (CDDP) sledeće formule:

[0075] Termin "karboplatin" se odnosi na jedinjenje cis-diamin(1,1-ciklobutandikarboksilato)platina(II) sledeće formule:

[0076] Termin "oksaliplatin" se odnosi na jedinjenje koje je jedinjenje platine u kompleksu sa ligandom diaminocikloheksanskim nosačem sledeće formule:

[0077] Naročito, termin "oksaliplatin" se odnosi na jedinjenje [(1R,2R)-cikloheksan-1,2-diamin](etandioato-O,O’)platina(II). Oksaliplatin za injekciju se takođe prodaje pod zaštićenim imenom Eloxatine.

[0078] Taksani su klasa diterpenoidnih jedinjenja koja su prvi put dobijena iz prirodnih izvora kao što su biljke iz roda Taxus, ali su neki veštački sintetisani. Glavni mehanizam dejstva klase lekova taksana je narušavanje funkcije mikrotubula, čime se inhibira proces ćelijske deobe. Taksani uključuju docetaksel (Taxotere) i paklitaksel (Taxol).

[0079] Prema navodima, termin "docetaksel" se odnosi na jedinjenje koje ima sledeću formulu:

[0080] Konkretno, termin "docetaksel" se odnosi na jedinjenje 1,7β,10β-trihidroksi-9-okso-5β,20-epoksitaks-11-en-2α,4,13α-triil 4-acetat 2-benzoat 13-{(2R,3S)-3-[(terc-butoksikarbonil)-amino]-2-hidroksi-3 -fenilpropanoat}.

[0081] Prema navodima, termin "paklitaksel" se odnosi na jedinjenje koje ima sledeću formulu:

[0082] Konkretno, termin "paklitaksel" se odnosi na jedinjenje (2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-bis-(acetiloksi)-13-{[(2R,3S)-3-(benzoilamino)-2-hidroksi-3-fenilpropanoil]oksi}- 1,7-dihidroksi-9-okso-5,20-epoksitaks-11-en-2-il benzoat.

[0083] Prema navodima, termin "analog kamptotecina" odnosi se na derivate jedinjenja kamptotecin (CPT; (S)-4-etil-4-hidroksi-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b] hinolin-3,14-(4H,12H)-dion). Poželjno, termin "analog kamptotecina" odnosi se na jedinjenja koja sadrže sledeću strukturu:

[0084] Prema navodima, poželjni analozi kamptotecina su inhibitori DNK enzima topoizomeraze I (topo I). Poželjni analozi kamptotecina prema navodima su irinotekan i topotekan.

[0085] Irinotekan je lek koji sprečava odvijanje DNK inhibicijom topoizomeraze I. U hemijskom smislu, to je polusintetički analog prirodnog alkaloida kamptotecina koji ima sledeću formulu:

[0086] Konkretno, termin "irinotekan" odnosi se na jedinjenje (S)-4,11-dietil-3,4,12,14-tetrahidro-4-hidroksi-3,14-diokso-1H-pirano[3’,4’:6,7]-indolizino[1,2-b]hinolin-9-il-[1,4’bipiperidin]-1’-karboksilat.

[0087] Topotekan je inhibitor topoizomeraze formule:

[0088] Konkretno, termin "topotekan" se odnosi na jedinjenje (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-dihidroksi-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-3,14(4H,12H)-dion monohidrohlorid.

[0089] Antraciklini su klasa lekova uobičajeno korišćenih u hemoterapiji kancera koji su takođe antibiotici. Strukturno, svi antraciklini dele zajedničku 7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-hinonsku strukturu od četiri prstena i obično zahtevaju glikozilaciju na određenim mestima.

[0090] Antraciklini poželjno imaju jedan ili više sledećih mehanizama dejstva: 1. inhibiciju DNK i RNK sinteze umetanjem između baznih parova DNK/RNK lanca, čime sprečavaju replikaciju brzo rastućih ćelija kancera. 2. inhibiciju enzima topoizomeraze II, čime sprečavaju relaksaciju superzavijene DNK i time blokiraju transkripciju i replikaciju DNK. 3. stvaranje gvožđem posredovanih slobodnih kiseoničnih radikala koji oštećuju DNK i ćelijske membrane.

[0091] Prema navodima, termin "antraciklin" poželjno se odnosi na agens, poželjno agens protiv kancera za indukciju apoptoze, poželjno inhibicijom ponovnog vezivanja DNK u topoizomerazi II.

[0092] Poželjno, prema navodima, termin "antraciklin" se generalno odnosi na klasu jedinjenja koja imaju sledeću strukturu prstena

uključujući njegove analoge i derivate, farmaceutske soli, hidrate, estre, konjugate i prolekove.

[0093] Primeri antraciklina i analoga antraciklina uključuju, ali nisu ograničeni na, daunorubicin (daunomcin), doksorubicin (adriamicin), epirubicin, idarubicin, rodomicin, pirarubicin, valrubicin, N-trifluoro-acetil doksorubicin-14-valerat, aklacinomicin, morfolinodoksorubicin (morfolino-DOX), cijanomorfolino-doksorubicin (cijanomorfolino-DOX), 2-pirolinodoksorubicin (2-PDOX), 5-iminodaunomicin, mitoksantron i aklacinomicin A (aklarubicin). Mitoksantron je član klase antracendionskih jedinjenja koji su analozi antraciklina kojima nedostaje šećerni deo antraciklina, ali zadržavaju planarnu strukturu policikličnog aromatičnog prstena koja omogućava interkalaciju u DNK.

[0094] Naročito poželjan kao antraciklin prema navodima je jedinjenje sledeće formule:

gde

R1je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH, R2je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OMe, R3je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH, i R4je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH.

[0095] U jednom primeru izvođenja, R1je H, R2je OMe, R3je H, i R4je OH. U sledećem primeru izvođenja, R1je OH, R2je OMe, R3je H, i R4je OH. U sledećem primeru izvođenja, R1je OH, R2je OMe, R3je OH, i R4je H. U sledećem primeru izvođenja, R1je H, R2je H, R3je H, i R4je OH.

[0096] Specifično predviđen kao antraciklin u kontekstu predmetnih navoda je epirubicin. Epirubicin je antraciklinski lek koji ima sledeću formulu:

i prodaje se pod zaštićenim imenom Ellence u SAD i Pharmorubicin ili Epirubicin Ebewe na drugim mestima. Naročito, termin "epirubicin" se odnosi na jedinjenje (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hidroksi-6-metil-oksan-2-il]oksi-6,11-dihidroksi-8-(2-hidroksiacetil)-1-metoksi-8-metil-9,10-dihidro-7H-tetracen-5,12-dion. Epirubicin je poželjniji od doksorubicina, najpopularnijeg antraciklina, u nekim hemoterapijskim režimima jer izgleda da izaziva manje sporednih efekata.

[0097] Prema navodima, agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da bude hemoterapijski agens, naročito hemoterapijski agens ustanovljen u tretmanu kancera i može da bude deo kombinacije lekova kao što je kombinacija lekova ustanovljena za upotrebu u lečenju kancera. Takve kombinacije lekova mogu da budu kombinacije lekova korišćene u hemoterapiji, i mogu da budu kombinacije lekova kao što su one, korišćene u hemoterapijskom režimu FOLFIRINOX.

[0098] Kombinacija lekova korišćena u hemoterapiji FOLFIRINOX sačinjena je od leukovorina, fluorouracila, irinotekana (kao što je irinotekan hidrohlorid) i oksaliplatina. Oksaliplatin se može davati u dozi od 85 mg po kvadratnom metru površine tela; irinotekan pri 180 mg po kvadratnom metru; leucovorin pri 400 mg po kvadratnom metru; i fluorouracil pri 400 mg po kvadratnom metru dat kao bolus, praćen 5-fluorouracilom pri 2400 mg po kvadratnom metru koji se daje kao kontinuirana infuzija poželjno 46 sati, poželjno svake 2 nedelje).

[0099] Termin "folinska kiselina" ili "leukovorin" odnosi se na jedinjenje korisno u sinergističkoj kombinaciji sa hemoterapijskim agensom 5-fluorouracilom. Prema tome, ovde se poziva na primenu 5-fluorouracila ili njegovog proleka, gde pomenuta primena u jednom primeru izvođenja može da obuhvata primenu zajedno sa folinskom kiselinom. Folinska kiselina ima sledeću formulu:

[0100] Konkretno, termin se odnosi na jedinjenje (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formil-4-okso-5,6,7,8-tetrahidro-1H-pteridin-6-il)metilamino]benzoil]amino}glutarna kiselina.

[0101] γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju mali podskup T ćelija koje poseduju posebni T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Većina T ćelija ima TCR sastavljen od dva glikoproteinska lanca nazvana α- i β-TCR lanci. Nasuprot tome, kod γδ T ćelija, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je obično mnogo manje uobičajena od αβ T ćelija. Humane γδ T ćelije imaju važnu ulogu u odgovorima nadzora nad stresom kao što su infektivne bolesti i autoimunitet. Takođe je sugerisano da transformacijom-indukovane promene u tumorima izazivaju odgovore vezane za nadzor nad stresom posredovane γδ T ćelijama i poboljšavaju antitumorski imunitet. Važno je da nakon vezivanja antigena aktivirane γδ T ćelije na mestima lezija obezbeđuju citokine (npr. INFγ, TNFα) i/ili hemokine koji posreduju u regrutaciji drugih efektorskih ćelija i pokazuju neposredne efektorske funkcije kao što je citotoksičnost (preko puteva receptora smrti i citolitičkih granula) i ADCC.

[0102] Većina γδ T ćelija u perifernoj krvi eksprimira Vγ9Vδ2 T-ćelijski receptor (TCRγδ). Vγ9Vδ2 T ćelije su jedinstvene za ljude i primate i smatra se da imaju ranu i esencijalnu ulogu u registrovanju "opasnosti" od strane invazionih patogena jer se dramatično povećavaju u mnogim akutnim infekcijama i mogu prevazići sve druge limfocite u roku od nekoliko dana, npr. kod tuberkuloze, salmoneloze, erlihioze, bruceloze, tularemije, listerioze, toksoplazmoze i malarije.

[0103] γδ T ćelije odgovaraju na male ne-peptidne fosforilisane antigene (fosfoantigene) kao što su pirofosfati sintetisani u bakterijama i izopentenil pirofosfat (IPP) proizveden u ćelijama sisara posredstvom mevalonatnog puta. Dok proizvodnja IPP u normalnim ćelijama nije dovoljna za aktivaciju γδ T ćelija, deregulacija mevalonatnog puta u tumorskim ćelijama dovodi do akumulacije IPP i aktivacije γδ T ćelija. IPP se takođe mogu terapijski povećati aminobisfosfonatima, koji inhibiraju enzim mevalonatnog puta farnezil pirofosfat sintazu (FPPS). Između ostalih, zoledronska kiselina (ZA, zoledronat, Zometa™, Novartis) predstavlja takav aminobifosfonat, koji se već klinički primenjuje kod pacijenata za lečenje osteoporoze i metastazirajućih bolesti kostiju. Nakon tretmana PBMC in vitro, ZA preuzimaju posebno monociti. IPP se akumulira u monocitima i oni se diferenciraju u antigen-prezentujuće ćelije koje stimulišu razvoj γδ T ćelija. U ovom okruženju, poželjno je dodavanje interleukina-2 (IL-2) kao faktora rasta i preživljavanja aktiviranih γδ T ćelija. Konačno, opisano je da određeni alkilovani amini aktiviraju Vγ9Vδ2 T ćelije in vitro, međutim samo u milimolarnim koncentracijama.

[0104] Prema navodima, termin "agens koji stimuliše γδ T ćelije" odnosi se na jedinjenje koje stimuliše razviće γδ T ćelija, naročito Vγ9Vδ2 T ćelija, in vitro i/ili in vivo, naročito indukcijom aktivacije i ekspanzije γδ T ćelija. Poželjno, termin se odnosi na jedinjenja koja in vitro i/ili in vivo povećavaju izopentenil pirofosfat (IPP) proizveden u sisarskim ćelijama, poželjno inhibicijom enzima mevalonatnog puta farnezil pirofosfat sintaze (FPPS).

[0105] Jedna naročita grupa jedinjenja koja stimuliše γδ T ćelije su bisfosfonati, naročito bisfosfonati koji sadrže azot (N-bisfosfonati; aminobisfosfonati).

[0106] Na primer, pogodni bisfosfonati za upotrebu u navodima mogu uključivati jedno ili više sledećih jedinjenja uključujući njihove analoge i derivate, farmaceutske soli, hidrate, estre, konjugate i prolekove:

[1-hidroksi-2-(1H-imidazol-1-il)etan-1,1-diil]bis(fosforasta kiselina), zoledronska kiselina, npr. zoledronat;

(dihloro-fosfono-metil)fosforasta kiselina, npr. klodronat

{1-hidroksi-3-[metil(pentil)amino]propan-1,1-diil}bis(fosforasta kiselina), ibandronska kiselina, npr. ibandronat

(3-amino-1-hidroksipropan-1,1-diil)bis (fosforasta kiselina), pamidronska kiselina, npr. pamidronat;

(1-hidroksi-1-fosfono-2-piridin-3-il-etil)fosforasta kiselina, rizedronska kiselina, npr. rizedronat;

(1-Hidroksi-2-imidazo[1,2-a]piridin-3-il-1-fosfonoetil)fosforasta kiselina, minodronska kiselina;

[3-(dimetilamino)-1-hidroksipropan-1,1-diil]bis(fosforasta kiselina), olpadronska kiselina.

[4-amino-1-hidroksi-1-(hidroksi-oksido-fosforil)-butil]fosforasta kiselina, alendronska kiselina, npr. alendronat;

[(Cikloheptilamino)metilen]bis(fosforasta kiselina), inkadronska kiselina;

(1-hidroksietan-1,1-diil)bis(fosforasta kiselina), etidronska kiselina, npr. etidronat; i {[(4-hlorofenil)tio]metilen}bis(fosforasta kiselina), tiludronska kiselina.

[0107] Prema navodima, zoledronska kiselina (INN) ili zoledronat (prodavan od strane Novartis pod zaštićenim imenima Zometa, Zomera, Aclasta i Reclast) je naročito poželjan bisfosfonat. Zometa je korišćena da se spreče frakture skeleta kod pacijenata sa kancerima kao što je multipli mijelom i kancer prostate, kao i za lečenje osteoporoze. Takođe se može koristiti za lečenje hiperkalcemije maligniteta i može pomoći u lečenju bola kod metastaze kostiju.

[0108] U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije prema navodima primenjuje se u kombinaciji sa IL-2. Pokazano je da je takva kombinacija naročito efikasna u posredovanju širenja i aktivacije γ9δ2 T ćelija.

[0109] Interleukin-2 (IL-2) je interleukin, tip citokin signalnog molekula u imunom sistemu. To je protein i privlači limfocite i deo je prirodnog odgovora tela na mikrobnu infekciju, i u razlikovanju između stranog (ne-sopstvenog) i sopstvenog. IL-2 posreduje svojim efektima vezivanjem za IL-2 receptore, koje eksprimiraju limfociti.

[0110] IL-2 koji se koristi prema navodima može da bude IL-2 koji podržava ili omogućava stimulaciju γδ T ćelija i može da potiče iz bilo koje vrste, poželjno čoveka. IL-2 može da bude izolovan, rekombinantno proizveden ili sintetički IL-2, i može da bude prirodni ili modifikovani IL-2.

[0111] Termin "antigen" odnosi se na agens kao što je protein ili peptid koji sadrži epitop protiv koga je usmeren imuni odgovor i/ili treba da bude usmeren. U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa tumorom, kao što je CLDN18.2, tj., konstituent ćelija kancera koji može da potiče iz citoplazme, površine ćelije i jedra ćelije, naročito antigeni koji su proizvedeni, poželjno u velikim količinama, intracelularno ili kao antigeni na ćelijama kancera.

[0112] U kontekstu predmetnih navoda, termin "antigen povezan sa tumorom" poželjno se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, i eksprimirani su, ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U kontekstu predmetnih navoda, antigen povezan sa tumorom je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima.

[0113] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantu u molekulu, tj., na deo u molekulu koji je prepoznat od strane imunog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane antitela. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja su prepoznata od strane imunog sistema. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i ne-konformacioni epitopi razlikuju se po tome što je vezivanje za prvo pomenuti, ali ne za poslednje navedeni, izgubljeno u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop proteina kao što je CLDN18.2 poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na primer, epitop može da bude poželjno 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina dužine.

[0114] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, i uključuju bilo koji molekul koji sadrži njegov deo za vezivanje antigena. Termin "antitelo" uključuje monoklonska antitela i fragmente ili derivate antitela, uključujući, bez ograničenja, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, jednolančana antitela, npr., scFv i antigen-vezujući fragmenti antitela kao što su Fab i Fab’ fragmenti i takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, npr., antitela eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela, i bilo koje antigen-vezujuće fragmente i derivate antitela kao što su ovde opisani. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde označen skraćenicom VH) i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde označen skraćenicom VL) i konstantni region lakog lanca. VH i VL regioni mogu se dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), naizmenično poređane sa regionima koji su više konzervisani, označenim kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR regiona, raspoređena od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa.

[0115] Ovde opisana antitela mogu da budu humana antitela. Predviđeno je da termin "humana antitela", kako je ovde korišćen, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione poreklom iz sekvenci imunoglobulina humane klicine linije. Ovde opisana humana antitela mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr., mutacije introdukovane mutagenezom po principu slučajnosti ili specifičnom za mesto in vitro ili sa somatskom mutacijom in vivo).

[0116] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na molekul koji ima mesto vezivanja antigena koje suštinski potiče od imunoglobulina ne-humanih vrsta, pri čemu je preostala struktura imunoglobulinskog molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može da sadrži ili kompletne varijabilne regione fuzionisane sa konstantnim domenima ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) kalemljene na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen-vezujuća mesta mogu da budu divljeg tipa ili modifikovana jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela imaju očuvane CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR iz mišjeg antitela). Drugi oblici imaju jedan ili više CDR koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.

[0117] Termin "himerno antitelo" odnosi se na ona antitela u kojima je jedan deo svake od aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homolog odgovarajućim sekvencama antitela poreklom iz određenih vrsta ili koje pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homolog odgovarajućim sekvencama u drugoj. Tipično, varijabilni region lakih, kao i teških lanaca imitira varijabilne regione antitela poreklom iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sekvencama antitela poreklom iz druge. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora korišćenjem lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima poreklom iz, na primer, preparata humanih ćelija. Dok varijabilni region ima prednost lakoće pripreme i na specifičnost ne utiče izvor, manje je verovatno da će humani konstantni region izazvati imuni odgovor humanog subjekta kada se antitela ubrizgaju, nego što bi to bio slučaj kod konstantnog regiona iz ne-humanog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj posebni primer.

[0118] Termini "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "antigenvezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment"), ili slični termini odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da specifično vezuju antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jedne ručice antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR koji se izborno mogu spojiti sintetičkim linkerom. Dodatno, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani zasebnim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji omogućava da se naprave kao jedan lanac proteina u kojem su VL i VH regioni upareni da bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Predviđeno je da takva jednolančana antitela takođe budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući fragment" antitela. Dodatni primer je vezujući domen imunoglobulinskih fuzionih proteina koji sadrži (i) vezujući domen polipeptida koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Vezujući domen polipeptida može da bude varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini sa vezujućim domenom imunoglobulina su dodatno opisani u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima, i izvršen je skrining fragmenata za upotrebu na isti način kao kod intaktnih antitela.

[0119] Predviđeno je da termin "bispecifični molekul" uključuje bilo koji agens, npr., protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa (a) antigenom na površini ćelije, i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Predviđeno je da termin "multispecifični molekul" ili "heterospecifični molekul" uključi bilo koji agens, npr., protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima više od dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa a) antigenom na površini ćelije, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije, i (c) najmanje jednom različitom komponentom. Shodno tome, navodi uključuju, ali nisu ograničeni na, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule koji su usmereni na CLDN18.2, i na druge ciljne strukture, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama. Termin "bispecifična antitela" takođe uključuje diatela. Diatela su bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koriste linker koji je prekratak da bi dozvolio uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se prisiljavaju domeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca čime se stvaraju dva antigen vezujuća mesta (videti npr., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

[0120] Antitelo može da bude konjugovano sa terapijskim delom ili agensom, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresiv) ili radioizotop. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za, i naročito, koji ubija ćelije. Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, i njihove analoge ili homologe. Pogodni terapijski agensi za formiranje konjugata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilirajuće agense (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (prethodno daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (prethodno aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC), i anti-mitotičke agense (npr., vinkristin i vinblastin). U poželjnom primeru izvođenja, terapijski agens je citotoksični agens ili radiotoksični agens. U sledećem primeru izvođenja, terapijski agens je imunosupresiv. U sledećem primeru izvođenja, terapijski agens je GM-CSF. U poželjnom primeru izvođenja, terapijski agens je doksorubicin, cisplatin, bleomicin, sulfat, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid ili ricin A.

[0121] Antitela takođe mogu da budu konjugovana sa radioizotopom, npr., jodom-131, itrijumom-90 ili indijumom-111, da bi se stvorili citotoksični radiofarmaceutici.

[0122] Konjugati antitela prema navodima mogu se koristiti da modifikuju dati biološki odgovor, i deo sa lekom ne treba shvatiti ograničenim na klasične hemijske terapijske agense. Na primer, deo sa lekom može da bude protein ili polipeptid koji poseduje poželjnu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, enzimski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili, modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), stimulišući faktor kolonije granulocita makrofaga ("GM-CSF"), stimulišući faktor kolonije granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.

[0123] Tehnike za konjugovanje takvih terapijskih delova sa antitelima su dobro poznate, videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

[0124] Kako se ovde koristi, antitelo je "poreklom iz" određene sekvence klicine linije ukoliko je antitelo dobijeno iz sistema imunizacijom životinja ili skriningom biblioteke imunoglobulinskih gena, i gde je izabrano antitelo najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, čak poželjnije najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom klicine linije. Tipično, antitelo koje potiče iz određene sekvence klicine linije prikazaće razliku koja nije veća od razlike u 10 aminokiselina, poželjnije, ne više od razlike u 5, ili čak još poželjnije, ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline od aminokiselinske sekvence kodirane imunoglobulinskim genom klicine linije.

[0125] Kako se ovde koristi, termin "heteroantitela" odnosi se na dva ili više antitela, njihove derivate, ili antigen vezujuće regione vezane zajedno, od kojih najmanje dva imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti uključuju vezujuću specifičnost za Fc receptor na efektorskoj ćeliji, i vezujuću specifičnost za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji.

[0126] Ovde opisana antitela mogu da budu monoklonska antitela. Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na pripremu molekula antitela jedne molekularne kompozicije. Monoklonsko antitelo prikazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela su proizvedena u hibridomu koji uključuje B ćeliju dobijenu iz ne-humane životinje, npr., miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.

[0127] Ovde opisana antitela mogu da budu rekombinantna antitela. Termin "rekombinantno antitelo", kako se ovde koristi, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgena ili transhromozomalna u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridom pripremljen od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane tako da eksprimira antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinima koji uključuju splajsovanje sekvenci imunoglobulinskih gena sa drugim DNK sekvencama.

[0128] Ovde pisana antitela mogu da potiču iz različitih vrsta, uključujući, ali se ne ograničavajući na miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka.

[0129] Ovde pisana antitela uključuju poliklonska i monoklonska antitela i uključuju IgA kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, specifičnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).

[0130] Termin "transfektom", kako se ovde koristi, uključuje rekombinantne eukariotske ćelijedomaćine koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, ćelije biljaka, ili gljiva, uključujući ćelije kvasca.

[0131] Kako se ovde koristi, "heterologo antitelo" je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj u organizmu koji se ne sastoji od transgenog organizma, i generalno potiče iz vrsta različitih od transgenog organizma.

[0132] Kako se ovde koristi, "heterohibridno antitelo" odnosi se na antitelo koje ima lake i teške lance poreklom od različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa lakim lancem miša je heterohibridno antitelo.

[0133] Navodi obuhvataju sva antitela i derivate antitela, kao što je ovde opisano, koja su u svrhu navoda obuhvaćena terminom "antitelo". Termin "derivati antitela" označava bilo koji modifikovani oblik antitela, npr., konjugat antitela i drugi agens ili antitelo, ili fragment antitela.

[0134] Antitela koja su ovde opisana su poželjno izolovana. "Izolovano antitelo" kako se ovde koristi, namenjeno je da označava antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CLDN18.2 je suštinski bez antitela koja specifično vezuju antigene drugačije od CLDN18.2). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLDN18.2 može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, npr., iz drugih vrsta (npr., homolozi vrste CLDN18.2). Pored toga, izolovano antitelo može da bude suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja navoda, kombinacija "izolovanih" monoklonskih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanoj kompoziciji ili smeši.

[0135] Termin "vezivanje" prema navodima se poželjno odnosi na specifično vezivanje.

[0136] Prema predmetnim navodima antitelo je sposobno da se vezuje za unapred određeno ciljno mesto ako ima značajan afinitet za navedeno unapred određeno ciljno mesto i vezuje se za navedeno unapred određeno ciljno mesto u standardnim analizama. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" se često meri pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Poželjno, termin "značajan afinitet" označava vezivanje za unapred određeno ciljno mesto sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili niže, 10<-6>M ili niže, 10<-7>M ili niže, 10<-8>M ili niže, 10<-9>M ili niže, 10<-10>M ili niže, 10<-11>M ili niže ili 10<-12>M ili niže.

[0137] Antitelo nije (značajno) sposobno za vezivanje za ciljno mesto ako nema značajan afinitet za navedeno ciljno mesto i ne vezuje se značajno, konkretno, ne vezuje se detektabilno, za navedeno ciljno mesto u standardnim analizama. Poželjno, antitelo se ne vezuje detektabilno za navedeno ciljno mesto ako je prisutno u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, naročito 50 ili 100 µg/ml ili više. Poželjno, antitelo nema značajan afinitet za ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta viša od KDza vezivanje za unapred određeno ciljno mesto za koje je antitelo sposobno da se vezuje. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela za ciljno mesto za koje je antitelo sposobno da se vezuje jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje antitelo nema značajan afinitet bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M ili 10<-1>M.

[0138] Antitelo je specifično za unapred određeno ciljno mesto ako je sposobno da se vezuje za navedeno unapred određeno ciljno mesto, dok nije sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta, tj. nema značajan afinitet za druga ciljna mesta i ne vezuje se značajno za druga ciljna mesta u standardnim analizama. Prema navodima, antitelo je specifično za CLDN18.2 ako je sposobno da se vezuje za CLDN18.2, ali nije (značajno) sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta. Poželjno, antitelo je specifično za CLDN18.2 ako afinitet za vezivanje za takva druga ciljna mesta značajno ne prevazilazi afinitet za ili vezivanje za CLDN18.2-nesrodne proteine kao što su goveđi serum albumin (BSA), kazein, humani serum albumin (HSA), ili ne-klaudinske transmembranske proteine kao što su MHC molekuli ili receptor za transferin ili bilo koji drugi naznačeni polipeptid. Poželjno, antitelo je specifično za unapred određeno ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta niža od KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela za ciljno mesto za koje je specifično jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.

[0139] Vezivanje antitela za ciljno mesto može da bude određeno eksperimentalno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupcima opisanim ovde. Afiniteti mogu da budu lako određeni upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je pomoću ravnotežne dijalize; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih postupaka navedenih od strane proizvođača; pomoću radioimunološke analize upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili pomoću drugog postupka poznatog stručnjaku iz date oblasti tehnike. Podaci o afinitetu mogu da budu analizirani, na primer, pomoću postupka opisanog kod Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako je meren pod različitim uslovima, npr., koncentracija soli, pH. Prema tome, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara, npr., KD, IC50, poželjno se izvode upotrebom standardizovanih rastvora antitela i antigena, i standardizovanog pufera.

[0140] Kako se ovde koristi, "izotip" označava klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca.

[0141] Kako se ovde koristi, "promena izotipa" označava fenomen pomoću koga se klasa, ili izotip, antitela menja iz jedne Ig klase u neku od drugih Ig klasa.

[0142] Termin "prirodan", kako se ovde koristi, primenjen na objekat označava činjenicu da objekat može da bude nađen u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može da bude izolovana iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je prirodna.

[0143] Termin "preuređena" kako se ovde koristi označava konfiguraciju lokusa teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina gde je V segment postavljen neposredno pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira esencijalno kompletan VH ili VL domen, respektivno. Preuređeni genski lokus imunoglobulina (antitela) može da bude identifikovan poređenjem sa DNK klicine linije; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamerni/nonamerni element homologije.

[0144] Termin "nepreuređena" ili "konfiguracija klicine linije" kako se ovde koristi u vezi sa V segmentom označava konfiguraciju u kojoj V segment nije rekombinovan tako da bude neposredno pored D ili J segmenta.

[0145] Prema navodima antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za epitop prisutan u CLDN18.2, poželjno epitop lociran unutar ekstracelularnih domena CLDN18.2, naročito prvi ekstracelularni domen, poželjno za aminokiselinske položaje 29 do 78 u CLDN18.2. U posebnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za (i) epitop na CLDN18.2 koji nije prisutan na CLDN18.1, poželjno SEQ ID NO: 3, 4 i 5, (ii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 1, poželjno SEQ ID NO: 8, (iii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 2, poželjno SEQ ID NO: 10, (iv) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 11, (v) epitop, koji obuhvata CLDN18.2-petlju 1 i CLDN18.2-petlju D3, ili (vi) neglikozilovani epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 9.

[0146] Prema navodima antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, ali ne za CLDN18.1. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za CLDN18.2. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 eksprimiran na ćelijskoj površini. U naročito poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za jedan ili više peptida izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za gore navedene proteine, peptide ili imunogene fragmente ili njihove derivate. Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 može da bude dobijeno pomoću postupka koji sadrži korak imunizacije životinje sa proteinom ili peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćinom koja eksprimira navedeni protein ili peptid. Poželjno, antitelo se vezuje za ćelije kancera, naročito ćelije tipova kancera navedenih u prethodnom tekstu i, poželjno, ne vezuje se značajno za ne-kancerozne ćelije.

[0147] Poželjno, vezivanje antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 za ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 indukuje ili posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 su poželjno ćelije kancera i naročito su izabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija tumorogenog kancera želuca, kancera jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave-vrata, i žučne kese. Poželjno, antitelo indukuje ili posreduje u ubijanju ćelija indukcijom jednog ili više mehanizama od lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), apoptoze i inhibicije proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno, liza ćelija posredovana pomoću ADCC odigrava se u prisustvu efektorskih ćelija, koje su u određenim primerima izvođenja izabrane iz grupe koja se sastoji od monocita, mononuklearnih ćelija, NK ćelija i PMN. Inhibicija proliferacije ćelija može da bude merena in vitro određivanjem proliferacije ćelija u analizi upotrebom bromodeoksiuridina (5-bromo-2-deoksiuridin, BrdU). BrdU je sintetički nukleozid koji je analog timidina i može da bude ugrađen u novosintetisanu DNK replicirajućih ćelija (u toku S faze ćelijskog ciklusa), supstitucijom za timidin u toku replikacije DNK. Detekcija ugrađene hemikalije upotrebom, na primer, antitela specifičnih za BrdU označava ćelije koje su aktivno replicirale svoju DNK.

[0148] U poželjnim primerima izvođenja, antitela koja su ovde opisana mogu da budu okarakterisana jednom ili više od sledećih osobina:

a) specifičnost za CLDN18.2;

b) vezujući afinitet za CLDN18.2 od oko 100 nM ili manje, poželjno, oko 5-10 nM ili manje i, poželjnije, oko 1-3 nM ili manje,

c) sposobnost da se indukuje ili posreduje CDC usmerena na CLDN18.2-pozitivne ćelije; d) sposobnost da se indukuje ili posreduje ADCC usmerena na CLDN18.2-pozitivne ćelije; e) sposobnost da se inhibira rast CLDN18.2-pozitivnih ćelija;

f) sposobnost da se indukuje apoptoza CLDN18.2-pozitivnih ćelija.

[0149] U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je proizvedeno pomoću hibridoma deponovanog kod DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Nemačka; nova adresa: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Nemačka) i ima sledeću oznaku i pristupni broj:

a. 182-D1106-055, pristupni br. DSM ACC2737, deponovan 19.10.2005.

b. 182-D1106-056, pristupni br. DSM ACC2738, deponovan 19.10.2005.

c. 182-D1106-057, pristupni br. DSM ACC2739, deponovan 19.10.2005.

d. 182-D1106-058, pristupni br. DSM ACC2740, deponovan 19.10.2005.

e. 182-D1106-059, pristupni br. DSM ACC2741, deponovan 19.10.2005.

f. 182-D1106-062, pristupni br. DSM ACC2742, deponovan 19.10.2005.,

g. 182-D1106-067, pristupni br. DSM ACC2743, deponovan 19.10.2005.

h. 182-D758-035, pristupni br. DSM ACC2745, deponovan 17.11.2005.

i. 182-D758-036, pristupni br. DSM ACC2746, deponovan 17.11.2005.

j. 182-D758-040, pristupni br. DSM ACC2747, deponovan 17.11.2005.

k. 182-D1106-061, pristupni br. DSM ACC2748, deponovan 17.11.2005.

l. 182-D1106-279, pristupni br. DSM ACC2808, deponovan 26.10.2006.

m. 182-D1106-294, pristupni br. DSM ACC2809, deponovan 26.10.2006,

n. 182-D1106-362, pristupni br. DSM ACC2810, deponovan 26.10.2006.

[0150] Poželjna antitela prema navodima su ona proizvedena pomoću, i koja se mogu dobiti od, prethodno opisanih hibridoma; tj. 37G11 u slučaju 182-D1106-055, 37H8 u slučaju 182-D1106-056, 38G5 u slučaju 182-D1106-057, 38H3 u slučaju 182-D1106-058, 39F11 u slučaju 182-D1106-059, 43A11 u slučaju 182-D1106-062, 61C2 u slučaju 182-D1106-067, 26B5 u slučaju 182-D758-035, 26D12 u slučaju 182-D758-036, 28D10 u slučaju 182-D758-040, 42E12 u slučaju 182-D1106-061, 125E1 u slučaju 182-D1106-279, 163E12 u slučaju 182-D1106-294 i 175D10 u slučaju 182-D1106-362; i njihovi himerizovani i humanizovani oblici.

[0151] Poželjna himerizovana antitela i njihove sekvence su prikazane u sledećoj tabeli.

gK SEQ ID NO:36 SEQ

gK SEQ ID NO:35 SEQ

gK SEQ ID NO:37 SEQ

gK SEQ ID NO:40 SEQ

gK SEQ ID NO:39 SEQ

gK SEQ ID NO:38 SEQ

gK SEQ ID NO:41 SEQ

gK SEQ ID NO:42 SEQ

gK SEQ ID NO:43 SEQ

[0152] U poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region teškog lanca (CH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog teškog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 13 ili njen fragment. U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region lakog lanca (CL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog lakog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 12 ili njen fragment. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CH kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 13 ili njen fragment i koji sadrži CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CL kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 12 ili njen fragment.

[0153] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je himerno mišje/humano IgG1 monoklonsko antitelo koje sadrži kapa mišji varijabilni laki lanac, konstantni region humanog kapa lakog lanca alotip Km(3), mišji varijabilni region teškog lanca, humani IgG1 konstantni region, alotip G1m(3).

[0154] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, i njihovog fragmenta i/ili koja sadrže laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 i njihovog fragmenta.

[0155] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže kombinaciju teških lanaca i lakih lanaca izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 14 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 21 ili njen fragment,

(ii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 15 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 20 ili njen fragment,

(iii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 16 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 22 ili njen fragment,

(iv) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 18 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 25 ili njen fragment,

(v) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 17 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 24 ili njen fragment,

(vi) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 23 ili njen fragment,

(vii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 26 ili njen fragment,

(viii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 27 ili njen fragment, i

(ix) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 28 ili njen fragment.

[0156] "Fragment" ili "fragment aminokiselinske sekvence", kako se ovde koristi, označava deo sekvence antitela, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu antitela skraćenu na N-i/ili C-kraju, koja kada menja navedenu sekvencu antitela u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što su ovde opisane, npr. CDC-posredovana liza ili ADCC-posredovana liza. Poželjno, fragment aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% aminokiselinskih ostataka iz navedene aminokiselinske sekvence. Fragment aminokiselinske sekvence izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 i 28 poželjno se odnosi na navedenu sekvencu gde je uklonjeno 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 aminokiselina na N-kraju.

[0157] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33, 34, i njenog fragmenta.

[0158] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, i njenog fragmenta.

[0159] U određenim poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sledećih mogućnosti (i) do (ix):

(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 29 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 36 ili njen fragment,

(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 30 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 35 ili njen fragment,

(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 31 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 37 ili njen fragment,

(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 33 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 40 ili njen fragment,

(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 39 ili njen fragment,

(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 38 ili njen fragment,

(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 41 ili njen fragment,

(viii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 42 ili njen fragment,

(ix) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 43 ili njen fragment.

[0160] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži VH koji sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (vi):

(i) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 sekvence SEQ ID NO: 14,

(ii) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 15,

(iii) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 sekvence SEQ ID NO: 16,

(iv) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 17,

(v) CDR1: položaji 44-51 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 sekvence SEQ ID NO: 18 i

(vi) CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19.

[0161] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sadrži VL koji sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 20,

(ii) CDR1: položaji 49-53 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 sekvence SEQ ID NO: 21,

(iii) CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 22,

(iv) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 23,

(v) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 24,

(vi) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 sekvence SEQ ID NO: 25,

(vii) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 26,

(viii) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 27, i

(ix) CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 28.

[0162] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3, izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):

(i) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 sekvence SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: položaji 49-53 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 sekvence SEQ ID NO: 21,

(ii) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 20,

(iii) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 sekvence SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 22,

(iv) VH: CDR1: položaji 44-51 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 sekvence SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 sekvence SEQ ID NO: 25,

(v) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 24,

(vi) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 23,

(vii) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 26,

(viii) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 27, i

(ix) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 28.

[0163] U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 koje je ovde opisano, i poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) koji su ovde opisani. U jednom primeru izvođenja navedeni jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) su izabrani iz grupe regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 koji su ovde opisani. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 opisanog ovde, i poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) koji su ovde opisani.

[0164] U jednom primeru izvođenja antitelo koje sadrži jedan ili više CDR, grupu CDR ili kombinaciju grupa CDR kao što je ovde opisano, sadrži navedene CDR zajedno sa njihovim umetnutim okvirnim regionima. Poželjno, deo će takođe da obuhvata najmanje oko 50% bilo kog, ili oba, od prvog i četvrtog okvirnog regiona, pri čemu tih 50% predstavlja C-terminalnih 50% prvog okvirnog regiona i N-terminalnih 50% četvrtog okvirnog regiona. Konstrukcija antitela napravljenih pomoću tehnika rekombinantne DNK može da rezultuje u uvođenju ostataka N- ili C-terminalno u odnosu na varijabilne regione kodirane linkerima uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge korake manipulacije, uključujući uvođenje linkera da bi se spojili varijabilni regioni prema navodima sa dodatnim proteinskim sekvencama, uključujući teške lance imunoglobulina, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji diatela) ili proteinske obeleživače.

[0165] U jednom primeru izvođenja antitelo koje sadrži jedan ili više CDR, grupu CDR ili kombinaciju grupa CDR, kao što je ovde opisano, sadrži navedene CDR u okvirnom regionu humanog antitela.

[0166] Pozivanje u ovom dokumentu na antitelo koje sadrži, u odnosu na njegov teški lanac, određeni lanac, ili određeni region ili sekvencu, poželjno se odnosi na situaciju u kojoj svi teški lanci navedenog antitela sadrže navedeni određeni lanac, region ili sekvencu. Ovo, na analogni način, važi za laki lanac antitela.

[0167] Termin "nukleinska kiselina", kako se ovde koristi, namenjen je da obuhvata DNK i RNK. Nukleinska kiselina može da bude jednolančana ili dvolančana, ali je poželjno dvolančana DNK.

[0168] Prema navodima, termin "ekspresija" koristi se u najuopštenijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK, ili RNK i proteina/peptida. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može da bude izvedena prolazno ili stabilno.

[0169] Navodi koji su ovde dati u vezi sa specifičnim aminokiselinskim sekvencama, npr. onim prikazanim u listingu sekvenci, trebalo bi da se tumače tako da se takođe odnose na varijante navedenih specifičnih varijanti koje rezultuju u sekvencama koje su funkcionalno ekvivalente sa navedenim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinskim sekvencama koje ispoljavaju osobine identične ili slične onima kod specifičnih aminokiselinskih sekvenci. Jedna važna osobina je zadržavanje vezivanja antitela za njegovo ciljno mesto ili održavanje efektorskih funkcija antitela. Poželjno, sekvenca koja je varijanta u odnosu na specifičnu sekvencu, kada menja specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što je ovde opisano, npr. CDC-posredovanu lizu ili ADCC-posredovanu lizu.

[0170] Stručnjacima iz date oblasti tehnike biće jasno da naročito sekvence CDR, hipervarijabilnih i varijabilnih regiona mogu da budu modifikovane bez gubitka sposobnosti da se vežu za CLDN18.2. Na primer, CDR regioni biće ili identični ili visoko homologi sa regionima ovde naznačenih antitela. "Visoko homologi" označava da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3, ili 1 ili 2 supstitucije mogu da budu uvedene u CDR regione. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu da budu modifikovani tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima antitela koji su ovde specifično navedeni.

[0171] U svrhu predmetnih navoda, "varijante" aminokiselinske sekvence sadrže aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante. Aminokiselinske delecione varijante koje sadrže deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina su takođe označene N-terminalne i/ili C-terminalne skraćene varijante.

[0172] Aminokiselinske insercione varijante sadrže insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenoj aminokiselinskoj sekvenci. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su umetnuti na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je takođe moguća slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom rezultirajućeg proizvoda.

[0173] Aminokiselinske adicione varijante sadrže amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina.

[0174] Aminokiselinske delecione varijante su okarakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu da budu u bilo kom položaju proteina.

[0175] Aminokiselinske supstutucione varijante su okarakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom koji je inseriran na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koji nisu konzervativni između homologih proteina ili peptida, i/ili zameni aminokiselina drugim koje imaju slične osobine. Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna aminokiselinska promena obuhvata supstituciju jedne iz familije aminokiselina koje su srodne po njihovim bočnim lancima. Prirodne aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaleketrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin su nekada klasifikovani zajedno kao aromatične aminokiseline.

[0176] Poželjno, stepen sličnosti, poželjno identičnosti, između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta navedene aminokiselinske sekvence biće najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti je poželjno dat za aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% cele dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnosti sekvenci može se izvesti pomoću alata poznatih u tehnici, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, upotrebom Align, upotrebom standardnih postavki, poželjno EMBOSS::needle, Matrix:Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

[0177] "Sličnost sekvenci" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvenci" dve aminokiselinske sekvence ukazuje na procenat aminokiselina koje su identične u tim sekvencama.

[0178] Termin "procenat identičnosti" je određen tako da označava procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični kod dve sekvence koje se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspoređene slučajno i duž cele dužine. Poređenja sekvenci dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnanja, pri čemu je navedeno poređenje izvedeno pomoću segmenta ili pomoću "prozora poređenja" u cilju identifikacije i poređenja lokalnih regiona sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se dobije, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije autora Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije autora Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, pomoću postupka traženja sličnosti autora Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0179] Procenat identičnosti je izračunavan određivanjem broja identičnih položaja kod dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem položaja koji se porede i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti ove dve sekvence.

[0180] Termin "transgena životinja" označava životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgena teškog i/ili lakog lanca, ili transhromozoma (bilo integrisanih ili neintegrisanih u prirodnu genomsku DNK životinje) i koja je poželjno sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može imati transgen humanog lakog lanca i transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-CLDN18.2 antitela kada je imunizovan CLDN18.2 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Transgen humanog teškog lanca može da bude integrisan u hromozomalnu DNK miša, kao u slučaju transgenih miševa, npr., HuMAb miševa, kao što su HCo7 ili HCo12 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može da bude održavan eksrahromozomalno, kao u slučaju transhromozomalnih (npr., KM) miševa kao što je opisano u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi mogu da budu sposobni da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela za CLDN18.2 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i promeni izotipa.

[0181] "Redukovati", "smanjiti" ili "inhibirati", kako se ovde koristi, označava ukupno smanjenje ili sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više, nivoa, npr. nivoa ekspresije ili nivoa proliferacije ćelija.

[0182] Termini kao što su "povećanje" ili "pojačanje" poželjno se odnose na povećanje ili pojačanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, čak poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više.

Mehanizmi delovanja mAb

[0183] Iako su u nastavku data razmatranja koja se tiču mehanizma u osnovi terapijske efikasnosti antitela prema navodima, ne treba ih smatrati ograničavajućim za navode na bilo koji način.

[0184] Antitela koja su ovde opisana poželjno interaguju sa komponentama imunog sistema, poželjno preko ADCC ili CDC. Antitela koja su ovde opisana takođe mogu da budu korišćena da usmere opterećenje lekom (npr., radioizotopi, lekovi ili toksini) da direktno ubije ćelije tumora, ili mogu da budu korišćena sinergistički sa tradicionalnim hemoterapijskim agensima, napadajući tumore preko komplementarnih mehanizama delovanja koji mogu da obuhvataju antitumorske imune odgovore koji su možda kompromitovani zbog citotoksičnih sporednih efekata hemoterapeutika na T limfocite. Međutim, ovde opisana antitela takođe mogu da ispoljavaju efekat jednostavnim vezivanjem za CLDN18.2 na ćelijskoj površini, na taj način, npr. blokirajući proliferaciju ćelija.

Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela

[0185] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija da ubijaju ćelije kao što je ovde opisano, naročito limfocita, koji poželjno zahtevaju da ciljna ćelija bude označena antitelom.

[0186] ADCC se poželjno javlja kada se antitela vezuju za antigene na ćelijama tumora i Fc domeni antitela zauzimaju Fc receptore (FcR) na površini imunih efektorskih ćelija. Identifikovano je nekoliko familija Fc receptora, i specifične ćelijske populacije karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC se može posmatrati kao mehanizam za direktno indukovanje varijabilnog stepena neposredne destrukcije tumora koja dovodi do prikaza antigena i indukcije T-ćelijskih odgovora usmerenih na tumor. Poželjno, in vivo indukcija ADCC će dovesti do T-ćelijskih odgovora usmerenih na tumor i odgovora antitela poreklom od domaćina.

Citotoksičnost zavisna od komplementa

[0187] CDC je drugi postupak za ubijanje ćelija koji može da bude usmeren pomoću antitela. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su takođe oba veoma efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo rezultuje u otkrivanju višestrukih C1q vezujućih mesta u neposrednoj blizini na CH2 domenima molekula antitela koja učestvuju, kao što su molekuli IgG (C1q je jedna od tri subkomponente komplementa C1). Poželjno ova otkrivena C1q vezujuća mesta prevode ovu nisko-afinitetnu C1q-IgG interakciju u interakciju visokog aviditeta, koja pokreće kaskadu događaja koji uključuju seriju drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja hemotaktičnih/aktivirajućih agenasa C3a i C5a efektorske ćelije. Poželjno, kaskada komplementa završava formiranjem kompleksa koji napada membranu, koji stvara pore u ćelijskoj membrani koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvorenih supstanci u, i izvan ćelije.

Proizvodnja i ispitivanje antitela

[0188] Antitela koja su ovde opisana mogu da budu proizvedena različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskog antitela, npr., standardne tehnike hibridizacije somatske ćelije autora Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su postupci hibridizacije somatske ćelije poželjni, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike fagnog prikaza upotrebom biblioteka gena antitela.

[0189] Poželjan životinjski sistem za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro ustanovljeni postupak. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su dobro poznati u stanju tehnike. Fuzioni partneri (npr., ćelije mišjeg mijeloma) i fuzioni postupci su takođe poznati.

[0190] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisan u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

[0191] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela mogu da budu generisana upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema umesto mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomalni miševi obuhvataju miševe poznate kao HuMAb miševi i KM miševi, respektivno, i zajednički su označeni ovde kao "transgeni miševi". Proizvodnja humanih antitela u takvim transgenim miševima može da bude izvedena kao što je detaljno opisano za CD20 u WO2004035607.

[0192] Sledeća strategija za generisanje monoklonskih antitela je direktna izolacija gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode antitela definisane specifičnosti npr. videti Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Za detalje o inženjeringu rekombinantnog antitela takođe videti Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

[0193] Da bi se generisala antitela, miševi mogu da budu imunizovani peptidima konjugovanim sa nosačem poreklom od sekvence antigena, tj. sekvence protiv koje su usmerena antitela, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog antigena ili njegovih fragmenata i/ili ćelijama koje eksprimiraju antigen, kao što je opisano. Alternativno, miševi mogu da budu imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njegove fragmente. U slučaju da imunizacije koje koriste prečišćeni ili obogaćeni preparat antigena ne rezultiraju u antitelima, miševi takođe mogu da budu imunizovani ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr., ćelijskom linijom, za stimulaciju imunih odgovora.

[0194] Imuni odgovor može da bude praćen tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji su dobijeni iz krvi repne vene ili retroorbitalnog vađenja krvi. Miševi sa dovoljnim titrovima imunoglobulina mogu da budu korišćeni za fuzije. Može se izvršiti busterizacija miševa intraperitonealno ili intravenski ćelijama koje eksprimiraju antigen, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine, kako bi se povećala stopa hibridoma koji izlučuju specifično antitelo.

[0195] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, splenociti i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu da budu izolovani i fuzionisani sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. U rezultirajućim hibridomima može zatim da se ispita proizvodnja antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarčići mogu zatim da budu ispitivani pomoću ELISA testa za hibridome koji izlučuju antitelo. Pomoću imunofluorescencije i FACS analize upotrebom ćelija koje eksprimiraju antigen, mogu da budu identifikovana antitela sa specifičnošću za antigen. Hibridomi koji izlučuju antitelo mogu da budu ponovo zasejani na ploču, ponovo ispitivani, i ako su još uvek pozitivni na monoklonska antitela mogu da budu subklonirani metodom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi zatim mogu da budu kultivisani in vitro da bi se generisalo antitelo u medijumu za kulturu tkiva za karakterizaciju.

[0196] Antitela takođe mogu da budu proizvedena u transfektomu ćelije-domaćina upotrebom, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena kao što je dobro poznato u tehnici (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0197] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen(i) od interesa, npr., geni antitela, mogu da budu vezani u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid, kakav je korišćen u GS genskom ekspresionom sistemu opisanom u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338841 ili drugim ekspresionim sistemima dobro poznatim u tehnici. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima za antitelo može da bude uveden u eukariotske ćelije domaćine kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili alternativno druge eukariotske ćelije, kao što su ćelije poreklom od biljaka, ćelije gljiva ili ćelije kvasca. Postupak koji se koristi za uvođenje ovih gena može da predstavlja postupke opisane u tehnici kao što su elektroporacija, lipofektin, lipofektamin ili drugi. Posle uvođenja ovih gena antitela u ćelije-domaćine, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu da budu identifikovane i selektovane.

[0198] Ove ćelije predstavljaju transfektome koji mogu zatim da budu amplifikovani u odnosu na njihov ekspresioni nivo i proizvedeni u većem obimu za proizvodnju antitela. Rekombinantna antitela mogu da budu izolovana i prečišćena iz ovih supernatanata kulture i/ili ćelija.

[0199] Alternativno, klonirani geni antitela mogu da budu eksprimirani u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli. Pored toga, antitela mogu da budu proizvedena u transgenim ne-humanim životinjama, kao što je u mleku ovaca i zečeva ili jajima kokošaka, ili u transgenim biljkama; videti npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Himerizacija

[0200] Mišja monoklonska antitela mogu da budu korišćena kao terapijska antitela kod ljudi kada su obeležena toksinima ili radioaktivnim izotopima. Neobeležena mišja antitela su visoko imunogena kod čoveka kada se ponovljeno primenjuju, što dovodi do smanjenja terapijskog efekta. Glavna imunogenost je posredovana konstantnim regionima teškog lanca. Imunogenost mišjih antitela kod čoveka može da bude smanjena ili potpuno izbegnuta ako su odgovarajuća antitela himerizovana ili humanizovana. Himerna antitela su antitela, čiji su različiti delovi poreklom od različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilni region poreklom od mišjeg antitela i konstantni region humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela je postignuta spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjeg antitela sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (npr. kao što su opisali Kraus et al., u Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom primeru izvođenja himerna antitela su generisana spajanjem konstantnog regiona humanog kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. U takođe poželjnom primeru izvođenja himerna antitela mogu da budu generisana spajanjem konstantnog regiona humanog lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.

Humanizacija

[0201] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji su locirani u šest regiona koji određuju komplementarnost teškog i lakog lanca (CDR). Iz ovog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDR su raznovrsnije između pojedinačnih antitela od sekvenci izvan CDR. Kako su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitela konstrukcijom ekspresionih vektora koji obuhvataju CDR sekvence iz specifičnog prirodnog antitela kalemljenog na okvirne sekvence iz drugačijeg antitela sa drugačijim osobinama (videti, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.86: 10029-10033). Takve okvirne sekvence mogu da budu dobijene iz javnih baza podataka DNK koje obuhvataju genske sekvence antitela klicine linije. Ove sekvence klicine linije će se razlikovati od zrelih genskih sekvenci antitela zbog toga što neće obuhvatati potpuno sklopljene varijabilne gene, koji se formiraju pomoću V (D) J spajanja u toku sazrevanja B ćelija. Genske sekvence klicine linije će se takođe razlikovati od sekvenci sekundarnog repertoara antitela visokog afiniteta kod pojedinca ravnomerno duž varijabilnog regiona.

[0202] Sposobnost antitela da vežu antigen može da bude određena upotrebom standardnih analiza vezivanja (npr., ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i analiza protočne citometrije).

[0203] Da bi se antitela prečistila, izabrani hibridomi mogu da budu gajeni u dvolitarskim spiner bocama za prečišćavanje monoklonskog antitela. Alternativno, antitela mogu da budu proizvedena u bioreaktorima na bazi dijalize. Supernatanti mogu da budu filtrirani i, ako je neophodno, koncentrovani pre afinitetne hromatografije sa protein G-sefarozom ili protein A-sefarozom. Eluirani IgG može da bude proveren pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visokog učinka da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da bude zamenjen PBS-om, i koncentracija može da bude određena pomoću OD280 upotrebom koeficijenta ekstinkcije od 1.43. Monoklonska antitela mogu da budu podeljena u alikvote i čuvana na -80°C.

[0204] Da bi se odredilo da li se izabrana monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, može se koristiti mutageneza usmerena na mesto ili mutageneza usmerena na više mesta.

[0205] Da bi se odredio izotip antitela, mogu da budu izvedeni ELISA testovi izotipa pomoću različitih komercijalnih kompleta (npr. Zymed, Roche Diagnostics). Bunarčići mikrotitarskih ploča mogu da budu obloženi anti-mišjim Ig. Posle blokiranja, ploče reaguju sa monoklonskim antitelima ili prečišćenim kontrolama izotipa, na temperaturi sredine u trajanju od dva časa. Bunarčići zatim mogu da reaguju sa mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA ili mišjim IgM-specifičnom peroksidazom-konjugovanim probama. Posle ispiranja, ploče mogu da budu razvijene sa ABTS supstratom (1 mg/ml) i analizirane na OD 405-650. Alternativno, može da bude korišćen komplet IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, kat. br.

1493027), kao što je opisao proizvođač.

[0206] Za demonstriranje prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa, ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može da se koristi protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju antigen prirodno, ili posle transfekcije, i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena (gajene pod standardnim uslovima gajenja) mogu da budu pomešane sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u supernatantima hibridoma ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu da budu inkubirane na 4°C u trajanju od 30 min. Posle ispiranja, APC- ili Alexa647-obeleženo anti-IgG antitelo može da se veže za antigenvezano monoklonsko antitelo pod istim uslovima kao za bojenje primarnim antitelom. Uzorci mogu da budu analizirani protočnom citometrijom pomoću FACS instrumenta upotrebom upravnog rasejanja i bočnog rasejanja svetlosti da bi se izdvojile pojedinačne žive ćelije. Da bi se razlikovala antigen-specifična monoklonska antitela od nespecifičnih vezujućih agenasa u jednom merenju, može da bude korišćen postupak ko-transfekcije. Ćelije prolazno transficirane plazmidima koji kodiraju antigen i fluorescentnim markerom mogu da budu obojene kao što je opisano u prethodnom tekstu. Transficirane ćelije mogu da budu detektovane u različitom fluorescentnom kanalu u odnosu na ćelije obojene antitelom. Kako većina transficiranih ćelija eksprimira oba transgena, antigen-specifična monoklonska antitela se vezuju pretežno za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se nespecifična antitela vezuju u sličnom odnosu za netransficirane ćelije. Alternativna analiza koja koristi fluorescentnu mikroskopiju može da bude korišćena uz, ili umesto analize protočne citometrije. Ćelije mogu da budu obojene tačno kao što je opisano u prethodnom tekstu i ispitane fluorescentnom mikroskopijom.

[0207] U cilju demonstriranja prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može se koristiti analiza imunofluorescentne mikroskopije. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju antigen bilo spontano, ili posle transfekcije, i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena gaje se u pločama sa bunarčićima pod standardnim uslovima rasta u DMEM/F12 medijumu, sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije zatim mogu da budu fiksirane metanolom ili paraformaldehidom ili ostavljene netretirane. Ćelije zatim mogu da reaguju sa monoklonskim antitelima protiv antigena u trajanju od 30 min. na 25°C. Posle ispiranja, ćelije mogu da reaguju sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pod istim uslovima. Ćelije zatim mogu da budu ispitivane pomoću fluorescentne mikroskopije.

[0208] Ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju antigen i odgovarajućih negativnih kontrola mogu da budu pripremljeni i podvrgnuti natrijum dodecil sulfatnoj (SDS) poliakrilamid gel elektroforezi. Posle elektroforeze, odvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani i dovedeni u kontakt sa monoklonskim antitelima koja treba da se ispitaju. Vezivanje IgG može da bude detektovano upotrebom anti-mišjeg IgG konjugovanog sa peroksidazom i razvijeno sa ECL supstratom.

[0209] Reaktivnost antitela sa antigenom može da bude dodatno ispitana pomoću imunohistohemije na način koji je dobro poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike, npr. upotrebom krioisečaka fiksiranih u paraformaldehidu ili acetonu ili isečaka tkiva ukalupljenih u parafin fiksiranih paraformaldehidom iz uzoraka ne-kanceroznog tkiva ili tkiva kancera dobijenih od pacijenata u toku rutinskih hirurških procedura ili iz miševa koji nose ksenotransplantirane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju antigen spontano ili posle transfekcije. Za imunološko bojenje, antitela reaktivna na antigen mogu da budu inkubirana, a zatim kozja anti-mišja antitela konjugovana sa peroksidazom rena ili kozja antizečja antitela (DAKO) prema uputstvima dobavljača.

[0210] Sposobnost antitela da posreduju u fagocitozi i ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 može da se ispita. Ispitivanje aktivnosti monoklonskih antitela in vitro obezbediće početan skrining pre ispitivanja u in vivo modelima.

Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)

[0211] Ukratko, polimorfonuklearne ćelije (PMN), NK ćelije, monociti, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije, poreklom od zdravih davalaca mogu da budu prečišćene pomoću centrifugiranja na gradijentu gustine Ficoll Hypaque, nakon čega sledi liza primesa eritrocita. Isprane efektorske ćelije mogu da budu suspendovane u RPMI sa dodatkom 10% toplotominaktivisanog fetalnog telećeg seruma ili, alternativno sa 5% toplotom-inaktivisanog humanog seruma i mešane sa<51>Cr-obeleženim ciljnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, u različitim odnosima efektorskih ćelija prema ciljnim ćelijama. Alternativno, ciljne ćelije mogu da budu obeležene ligandom koji pojačava fluorescenciju (BATDA). Visoko fluorescentni helat europijuma sa pojačavajućim ligandom koji se oslobađa iz mrtvih ćelija može da bude meren fluorometrom. Sledeća alternativna tehnika može da koristi transfekciju ciljnih ćelija luciferazom. Dodata lucifer žuta može zatim da bude oksidovana isključivo pomoću vijabilnih ćelija. Prečišćeni anti-CLDN18.2 IgG mogu nakon toga da se dodaju u različitim koncentracijama. Irelevantni humani IgG može da bude korišćen kao negativna kontrola. Analize mogu da budu izvedene za 4 do 20 časova na 37°C u zavisnosti od tipa korišćene efektorske ćelije. U uzorcima može da bude analizirana citoliza merenjem oslobađanja<51>Cr ili prisustva helata EuTDA u supernatantu kulture. Alternativno, luminescencija koja je rezultat oksidacije lucifer žute može da predstavlja meru vijabilnih ćelija. Anti-CLDN18.2 monoklonska antitela takođe mogu da budu ispitana u različitim kombinacijama da bi se odredilo da li je citoliza pojačana sa višestrukim monoklonskim antitelima.

Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC)

[0212] Sposobnost monoklonskih anti-CLDN18.2 antitela da posreduju u CDC može da bude ispitana upotrebom različitih poznatih tehnika. Na primer, serum za komplement može da bude dobijen iz krvi na način poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike. Da bi se odredila CDC aktivnost mAbs, mogu se koristiti različiti postupci. Na primer, može da se meri oslobađanje<51>Cr ili može da se proceni povećana propustljivost membrane upotrebom analize isključenja propidijum jodida (PI). Ukratko, ciljne ćelije mogu da budu isprane i 5 x 10<5>/ml može da bude inkubirano sa različitim koncentracijama mAb u trajanju od 10-30 min. na sobnoj temperaturi ili na 37°C. Serum ili plazma zatim mogu da se dodaju u krajnjoj koncentraciji od 20% (zapr./zapr.) i ćelije inkubiraju na 37°C u trajanju od 20-30 min. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu da budu dodate u PI rastvor u FACS epruveti. Smeša zatim može da bude analizirana neposredno pomoću analize protočne citometrije upotrebom metode FACSArray.

[0213] U alternativnoj analizi, indukcija CDC može da se odredi na adheriranim ćelijama. U jednom primeru izvođenja ove analize, ćelije se zaseju 24 časa pre analize pri gustini od 3 x 10<4>ćelija/bunarčiću u mikrotitarske ploče za kulturu tkiva sa ravnim dnom. Sledećeg dana medijum za rast se ukloni i ćelije se inkubiraju sa antitelima u triplikatu. Kontrolne ćelije se inkubiraju sa medijumom za rast ili medijumom za rast koji sadrži 0.2% saponina za određivanje pozadinske lize i maksimalne lize, redom. Posle inkubacije od 20 min. na sobnoj temperaturi supernatant se uklanja i 20% (zapr./zapr.) humane plazme ili seruma u DMEM (prethodno zagrejanog do 37°C) se dodaje u ćelije i inkubira još 20 min. na 37°C. Sve ćelije iz svakog uzorka se dodaju u rastvor propidijum jodida (10 µg/ml). Zatim, supernatanti se zamenjuju PBS-om koji sadrži 2.5 µg/ml etidijum bromida i emisija fluorescencije posle ekscitacije na 520 nm se meri na 600 nm upotrebom Tecan Safire. Procenat specifične lize se izračunava na sledeći način: % specifične lize = (fluorescencija uzorka – fluorescencija pozadine)/ (fluorescencija maksimalne lize – fluorescencija pozadine) x 100.

Indukcija apoptoze i inhibicija ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela

[0214] Da bi se ispitala njihova sposobnost za započinjanje apoptoze, monoklonska anti-CLDN18.2 antitela mogu, na primer, da budu inkubirana sa CLDN18.2-pozitivnim ćelijama tumora, npr., SNU-16, DAN-G, KATO-III ili CLDN18.2 transficiranim ćelijama tumora na 37°C u trajanju od oko 20 časova. Ćelije mogu da budu sakupljene, isprane u Annexin-V vezujućem puferu (BD biosciences), i inkubirane sa proteinom Annexin V konjugovanim sa FITC ili APC (BD biosciences) u trajanju od 15 min. u mraku. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu da budu dodate u PI rastvor (10 µg/ml u PBS) u FACS epruveti i procenjene neposredno pomoću protočne citometrije (kao u prethodnom tekstu). Alternativno, opšta inhibicija ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela može da bude detektovana upotrebom komercijalno dostupnih kompleta. DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, kat. br. AD0200) je neizotopska imunološka analiza na bazi merenja ugradnje 5-bromo-2’-deoksiuridina (BrdU) u toku sinteze DNK proliferišućih ćelija u mikropločama. Ugradnja BrdU se detektuje upotrebom monoklonskog antitela obeleženog europijumom. Da bi se omogućila detekcija antitela, ćelije se fiksiraju i DNK se denaturiše upotrebom Fix rastvora. Nevezano antitelo se ispra i dodaje se DELFIA induktor da bi se disocirali joni europijuma sa obeleženog antitela u rastvor, gde oni formiraju visoko fluorescentne helate sa komponentama DELFIA induktora. Izmerena fluorescencija – upotrebom vremenski razložene fluorometrije u detekciji – proporcionalna je sintezi DNK u ćelijama svakog bunarčića.

Pretkliničke studije

[0215] Monoklonska antitela koja se vezuju za CLDN18.2 takođe mogu da budu testirana u in vivo modelu (npr. u imunodeficijentnim miševima koji nose ksenotransplantirane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju CLDN18.2, npr. DAN-G, SNU-16 ili KATO-III, ili posle transfekcije, npr. HEK293) da bi se odredila njihova efikasnost u kontroli rasta ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0216] In vivo studije posle ksenotransplantiranja ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2 u imunokompromitovane miševe ili druge životinje mogu da budu izvedene upotrebom antitela koja su ovde opisana. Antitela mogu da budu primenjivana kod miševa bez tumora nakon injekcije ćelija tumora kako bi se merili efekti antitela u sprečavanju formiranja tumora ili simptoma povezanih sa tumorom. Antitela mogu da budu primenjivana kod miševa koji nose tumor da bi se odredila terapijska efikasnost odgovarajućih antitela u smanjenju rasta tumora, metastaze ili simptoma povezanih sa tumorom. Primena antitela može da bude kombinovana sa primenom drugih supstanci, kao citostatskih lekova, inhibitora faktora rasta, blokatora ćelijskog ciklusa, inhibitora angiogeneze ili drugih antitela, za određivanje sinergističke efikasnosti i potencijalne toksičnosti kombinacija. Da bi se analizirali toksični sporedni efekti posredovani antitelima, životinje mogu da budu inokulisane antitelima ili kontrolnim reagensima, i simptomi koji mogu da budu povezani sa terapijom CLDN18.2-antitelom temeljno ispitani. Mogući sporedni efekti in vivo primene CLDN18.2 antitela naročito obuhvataju toksičnost na tkivima koja eksprimiraju CLDN18.2, uključujući želudac. Antitela koja prepoznaju CLDN18.2 kod čoveka i kod drugih vrsta, npr. miševa, su naročito korisna za predviđanje potencijalnih sporednih efekata posredovanih primenom monoklonskih CLDN18.2-antitela kod ljudi.

[0217] Mapiranje epitopa prepoznatih od strane antitela može da bude izvedeno kao što je detaljno opisano u "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) autora Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 autora Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

[0218] Jedinjenja i agensi koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.

[0219] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u jednačenom doznom obliku i mogu da budu pripremljene na način koji je sam po sebi poznat. Farmaceutska kompozicija može npr. da bude u obliku rastvora ili suspenzije.

[0220] Farmaceutska kompozicija može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa delovanjem aktivne komponente farmaceutske kompozicije.

[0221] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu da budu korišćene za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli i obuhvaćene su u navodima. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže na neograničavajući način one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, ćilibarne kiseline, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli takođe mogu da budu pripremljene kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma ili soli kalcijuma.

[0222] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.

[0223] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0224] Injektabilna formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što je Ringerov laktat.

[0225] Termin "nosač" označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetičku po prirodi, u kojoj je aktivna komponenta kombinovana u cilju olakšavanja, pojačavanja ili omogućavanja primene. Prema navodima, termin "nosač" takođe obuhvata jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su pogodne za primenu kod pacijenta.

[0226] Moguće supstance nosača za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringerov rastvor, Ringerov laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenisani naftaleni i, naročito, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid/glikolid kopolimeri ili polioksietilen/polioksi-propilen kopolimeri.

[0227] Termin "ekscipijens", kada se ovde koristi, namenjen je da označava sve supstance koje mogu da budu prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr., nosači, vezujući agensi, lubrikanti, agensi za zgušnjavanje, površinski aktivni agensi, konzervansi, emulgatori, puferi, agensi za poboljšanje ukusa ili boje.

[0228] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani bilo kojim konvencionalnim putem, kao parenteralnom primenom uključujući injekcije ili infuzije. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijska, subkutana, intradermalna ili intramuskularna.

[0229] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, uobičajeno se koriste sterilna, fiksna ulja kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje.

[0230] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani primenjuju se u efikasnim količinama. "Efikasna količina" označava količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat pojedinačno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo obuhvata usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekid ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja takođe može da bude odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja.

[0231] Efikasna količina agensa ili kompozicije koja je ovde opisana zavisiće od stanja koje se leči, težine bolesti, pojedinačnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje tretmana, tip prateće terapije (ako je prisutna), specifičan put primene i slične faktore. Prema tome, doze primenjenih agenasa opisane ovde mogu da zavise od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna pri početnoj dozi, mogu da se koriste veće doze (ili efikasno veće doze koje se postižu različitim, lokalizovanijim putem primene).

[0232] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani kod pacijenata, npr., in vivo, za lečenje ili prevenciju različitih poremećaja kao što su oni ovde opisani. Poželjni pacijenti obuhvataju humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu da budu korigovani ili poboljšani primenom agenasa i kompozicija koji su ovde opisani. Ovo obuhvata poremećaje koji uključuju ćelije koje se karakterišu izmenjenim obrascem ekspresije CLDN18.2.

[0233] Na primer, u jednom primeru izvođenja, antitela koja su ovde opisana mogu da budu korišćena za lečenje pacijenta obolelog od kancera, npr., bolesti kancera, kao što je ovde opisano, okarakterisane prisustvom ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0234] Farmaceutske kompozicije i postupci za lečenje opisani prema navodima takođe mogu da budu korišćeni za imunizaciju ili vakcinaciju za prevenciju bolesti koja je ovde opisana.

[0235] Predmetni navodi su dodatno ilustrovani sledećim primerima koje ne treba smatrati ograničavajućim za obim navoda.

PRIMERI

Primer 1: Materijal i metode

1. Antitela

Tabela 1: Upotrebljena antitela

2. Imunohistohemija (IHC)

[0237] Isečci tkiva (debljine 4 µm) čuvani su na 2-8 °C do upotrebe.

[0238] Pre postupka uklanjanja parafina, isečci su inkubirani na 58-60 °C u sušnici tokom 1 časa da bi se otopio parafin i kvantitativno uklonila voda, čime se poboljšava prianjanje tkiva na staklene pločice ("pečenje").

Deparafinizacija

[0239] Nakon topljenja i sušenja, pločice su podvrgnute deparafinizaciji upotrebom ksilola u dva koraka (5 minuta) i rehidrataciji korišćenjem opadajuće serije alkoholnih rastvora (na sobnoj temperaturi od 20-27 °C):

• 5 (±1) minuta u kupatilu sa ksilenom;

• ovaj korak je ponovljen jedanput u svežem kupatilu;

• višak tečnosti;

• 5 (±1) minuta u apsolutnom etanolu;

• ponoviti ovaj korak jedanput u svežem kupatilu;

• ukloniti višak tečnosti;

• 5 (±1) minuta u 96 % etanolu;

• ponoviti ovaj korak jedanput u svežem kupatilu;

• ukloniti višak tečnosti;

• 5 (±1) minuta u 80 % etanolu;

• ukloniti višak tečnosti;

• 5 (±1) minuta u 70 % etanolu;

• ukloniti višak tečnosti;

• 5 minuta u destilovanoj ili dejonizovanoj vodi;

Demaskiranje epitopa i gašenje

[0240] Nakon uklanjanja parafina, ciljni epitopi su demaskirani korišćenjem procedure za demaskiranje epitopa izazvano toplotom. Zbog toga su pločice stavljene u posude za bojenje napunjene sa 200 ml pufera za demaskiranje (10 mM citratni pufer; 0.05% Tween-20; pH 6) i inkubirane u posudi za kuvanje pod pritiskom (PASCAL, Dako) na 120 °C tokom 10 minuta. Nakon toga, posude su uklonjene iz posude za kuvanje pod pritiskom i ostavljene da se ohlade u rastvoru za demaskiranje epitopa 10 (±1) min na sobnoj temperaturi. Pločice su isprane u puferu za ispiranje (1x PBS).

[0241] Posle hlađenja isečci su premešteni u posude za bojenje napunjene sa 200 ml rastvora za gašenje (0.3% peroksidaze u 1x PBS) i inkubirani 15 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega su usledili koraci ispiranja od 2x5 minuta u svežem puferu za ispiranje.

Blokiranje i inkubacija antitela

[0242] Višak pufera za ispiranje je uklonjen, pločice su prekrivene sa 200 µl pufera za blokiranje (10% kozjeg seruma u 1x PBS) i inkubirane na RT 30 minuta. Pufer za blokiranje je uklonjen i zamenjen sa 200 µl razblaženog rastvora antitela (razblaženog u puferu za blokiranje). Pločice su inkubirane sa primarnim antitelom preko noći na 2-8 °C:

Tabela 2: Razblaživanje primarnih antitela za histološku analizu – koncentracija štoka i finalna koncentracija antitela korišćenih u histološkim testovima

[0243] Sledećeg dana rastvor primarnog antitela je uklonjen i isečci su ispirani 3x 5 min puferom za ispiranje. Potom je višak pufera za ispiranje uklonjen i dodato je 200 µl rastvora sekundarnog antitela spremnog za upotrebu (Power Vision HRP kozje-α-mišje; Immunologic; NL). Pločice su inkubirane 30 minuta na RT. Višak tečnosti je uklonjen i pločice su isprane 3x 5 min u svežem puferu za ispiranje.

Reakcija sa supstratom i kontrastno bojenje

[0244] Nakon uklanjanja viška pufera za ispiranje, isečci su prekriveni sa pribl.50-150 µL sveže pripremljenog rastvora supstrata i hromogena (VectorRed; Vector Labs) tokom 2 min. Višak supstrata je uklonjen i pločice su inkubirane u posudama sa dejonizovanom vodom 1-5 min.

[0245] Nakon toga, izvršeno je kontrastno bojenje tkiva uranjanjem isečaka u tegle koje sadrže 200 ml hematoksilina Mayer na 2 min. Nakon toga, isečci su stavljeni u česmensku vodu na 5-10 minuta da bi se razvila plava boja jedara.

Dehidratacija i pričvršćivanje

[0246] Nakon kontrastnog bojenja, isečci su dehidratisani upotrebom rastućeg niza rastvora alkohola:

• potapanje u 70% etanol (pribl.5-10 sek)

• potapanje u 80% etanol (pribl.5-10 sek)

• potapanje u 96% etanol (pribl.5-10 sek)

• potapanje u 96% etanol (pribl.5-10 sek)

• potapanje u apsolutni etanol (pribl.5-10 sek)

• 5 min u ksilenu

• 5 min u ksilenu

[0247] Za pričvršćivanje uzoraka upotrebljen je nevodeni medijum za pričvršćivanje (X-TRA-Kit, Medite). Slajdovi su pričvršćeni direktno iz poslednje posude napunjene ksilenom i osušeni na vazduhu na RT.

Tabela 3: Matrice tkiva za histološku analizu

3. Ćelijska kultura

[0248] Sve ćelijske linije kancera pankreasa i dodatne kontrolne ćelijske linije, korišćene za ovde predstavljene eksperimente, kultivisane su u medijumima u skladu sa podacima o poreklu i prema standardnim procedurama za kulturu tkiva. Uslovi su sumirani u Tabeli 4. U slučaju svih novodobijenih ćelijskih linija, ćelije su testirane na kontaminaciju mikoplazmom i pripremljena je glavna banka ćelija.

Tabela 4. Uslovi kultivacije ćelija za ćelijske linije humanog kancera pankreasa i kontrolne ćelijske linije

4. Transfekcija ćelijskih linija pankreasa luciferazom

[0249] Za ADCC testove, ćelijske linije kancera pankreasa su prolazno transfektovane sa RNK luciferaze. Ova RNK luciferaze (pST1-luc2mut-2hBgUTR-A121-EciI vektor (pST1-109)) je proizvedena sa ARCA kapom i rastvorena u H2O. RNK je čuvana u alikvotima od 22 µl na -80°C. Za sve ćelijske linije pankreasa su određeni optimalni uslovi elektroporacije koji su rezultovali najvišim stopama transfekcije i vijabilnošću ćelija. U svakom testu ćelije su odvojene od podloge pomoću PBS/5 mM EDTA i 2.5x10<6>ćelija rastvorenih u 250 µl X-Vivo je pomešano u ledeno hladnim kivetama sa 10 µg RNK. Ćelije su odmah podvrgnute elektroporaciji (GenePulser Xcell, Biorad) i resuspendovane u prethodno zagrejanom medijumu za test, uz podešavanje gustine ćelija na 5x10<5>ćelija/ml. Ispitani uslovi elektroporacije za sve ćelijske linije bili su:

EP1: 250 V, 475 µF

EP2: 200 V, 300 µF

EP3: 150 V, 300 µF

EP4: 200 V, 400 µF

EP5: 250 V, 950 µF

Kontrola: 0 V, 0 µF

[0250] Vijabilnost ćelija je određena direktno nakon elektroporacije korišćenjem CASY ili bojenjem ćelija Tripan plavim i određivanjem procenta mrtvih ćelija u komori Neubauer. Ćelije su zasejane u četiri primerka u bele ploče sa 96 bunarčića (2.5x10<4>ćelija/bunarčiću) i inkubirane 24 časa. Nakon toga, aktivnost luciferaze je merena u luminometru (Tecan Infinite200) nakon dodavanja smeše luciferina tokom 90 minuta. Transfekcija je bila uspešna i posledična ADCC merljiva, ako su dobijene vrednosti RLU >1000.

5. Kvantitativna PCR metoda u realnom vremenu (Q-PCR)

[0251] Za izolaciju RNK iz ćelijskih linija kancera pankreasa, ćelije su zasejane u posude od 10 cm i uzgajane 2-3 dana do 80% konfluentnosti. RNK je izolovana u skladu sa uputstvima priloženim uz RNeasy<®>Mini Kit (Qiagen). Priprema cDNK je obavljena prema uputstvima proizvođača koja su priložena uz SuperScript<®>III First Strand kit (Invitrogen). Uzorci RNK i cDNK su čuvani na -80°C.

[0252] Kvantitativna analiza transkripata CLDN18.2 je izvedena amplifikovanjem cDNK sa oligo(dT) prajmerom u PCR reakciji od 40 ciklusa korišćenjem PCR prajmera #5054s (5’-AGAGAGCTCTGGCTTCACCGAGTG-3’) i #5060as (5’-CCAGAAGTTAGTCACCAGCATGTTGG-3’) koji omogućavaju razlikovanje izoforme CLDN18.1 i CLDN18.2. Reakcija je pripremljena sa SYBR Green (QuantiTect SYBR Green PCR Kit, Qiagen), koji se interkalira u dvolančanu DNK. Reakcije i merenja su obavljeni korišćenjem instrumenta i softvera sistema za detektovanje sekvenci ABI-PRISM7900 (Applied Biosystems).

[0253] Relativni nivoi ekspresije transkripata CLDN18 su izračunati korišćenjem izračunavanja ΔΔCT u odnosu na konstitutivno eksprimirani gen HPRT.

6. Analiza metodom Western blot

[0254] Za izolaciju proteina ćelijskih linija kancera pankreasa, ćelije su zasejane u posude od 10 cm i uzgajane 2-3 dana do 80% konfluentnosti. Ćelije su lizirane dodavanjem 800 µl 4x SDS pufera za uzorke (34% glicin, 250 mM Tris pH6.8, 5% β-merkaptoetanol, 8.2% SDS). Da bi se dezintegrisala genomska DNK, uzorci proteina su sonifikovani pod sledećim uslovima: Kontrola izlaza: nivo 1, radni ciklus: 70% tokom 20-25 sekundi. Koncentracija proteina je merena spektrofotometrom (apsorpcija na 280nm) i uzorci su čuvani na -80°C do upotrebe. Da bi se detektovala ekspresija CLDN18.2 u Western blotovima, 12.5% poliakrilamidni gel za razdvajanje (za 2 mala gela 4.1 ml 29:1 akrilamid/bis-akrilamid, 100 µl 10% SDS, 2.5 ml Tris pH 8.8 ml, 3.2 ml H2O, 100 µl APS, 10 µl TEMED) pripremljen je između dve fiksne staklene ploče. Nakon polimerizacije, gel je prekriven gelom za slaganje (1.5 ml 29:1 akrilamid/bisakrilamid, 100 µl 10% SDS, 2.5 ml Tris pH 6.8, 5.8 ml H2O, 100 µl APS, 10 µl TEMED) i gel češalj stavljen je između staklenih ploča. Nakon polimerizacije, na gel je naneto 75 µg svakog uzorka proteina pripremljenog dodavanjem (1:20) 4x SDS pufera za uzorke (250 mM Tris-HCL, 34% glicerina, 8.2% SDS, pH 6.8) i 7.5 µl mešavine markera za veličinu (1.5 µl Magic Mark XP Western Standard pomešane sa 6 µl SeaBlue Plus2 Prestained Standard). Elektroforeza je pokrenuta na gelovima u 1x SDS puferu za elektroforezu (25 mM Tris, 0.192 M glicin, 0.1% SDS) na 80 V tokom 30 minuta i na 180 V tokom 60 minuta. Polu-suvo upijanje gela na nitroceluloznoj membrani je izvedeno tokom 90 minuta na 160 mA u 1x puferu za transfer (25 mM Tris, 0.192 mM glicin, 20% MeOH). Blotovi su prvo blokirani u 5% mleku u prahu/PBS i primarna antitela (0.25 µg/ml anti-klaudinl8 (C-term) ili 0.1 µg/ml anti-β-aktin antitelo) su dodata u rastvor 1% mleka u prahu/PBS. Blotovi su inkubirani preko noći na 4°C, isprani 3 puta po 10 minuta u 1x PBS/0.05% Tween20 i zatim inkubirani 1 h sa obeleženim sekundarnim antitelima na sobnoj temperaturi u 1% mleku u prahu/PBS (kozje anti-zečje IgG antitelo (FC) razblaženo 1:1000). Blotovi su ponovo isprani 3 puta po 10 minuta u 1x PBS/0.05% Tween20 i detekcija je izvršena dodavanjem 1-3 ml rastvora za detekciju (Pico and Dura Detection System (Pierce) u trajanju od 1 min i skeniranjem blotova u detektorskoj komori LAS-3000 (porast: 10 sekundi, vreme intervala: 10 sekundi, osetljivost: visoka) prema GA_056_Chemolumineszenzentwickler LAS3000.

7. Protočna citometrija (FACS)

[0255] Ćelije su sakupljene pomoću PBS/5 mM EDTA ili Tripsin/EDTA iz eksponencijalno rastuće kulture pri 70-85% konfluentnosti. Ćelije su izbrojane, centrifugirane 5 min (468 g) i talog je resuspendovan u FACS puferu (2% FCS, 0.1% natrijum azida u PBS) podešavanjem koncentracije na 2x10<6>/ml. Po 100 µl ćelija je zasejano u ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom i ponovo centrifugirano (5 min, 468 g). Antitelo IMAB362 (ili izotipska kontrola Rituksimab) je serijski razblaženo 0.1-200 µg/ml (11 koraka razblaživanja kontrola bez antitela) u 50 µl FACS-pufera i dodato ćelijama na 30 minuta na 4°C. Zatim je u svaki bunarčić dodato 200 µl FACS pufera i ploče su centrifugirane (5 min, 468 g). Supernatant je uklonjen i ispiranje je ponovljeno. Sekundarna kozja anti-humana antitela (FC specifična, F(ab')2 konjugovana sa APC (Dianova)) su razblažena (1:100) u FACS puferu i dodato je po 30 µl u svaki bunarčić. Ploče su inkubirane 30 minuta na 4°C. Nakon inkubacije ploče su ponovo isprane dva puta sa 200 µl FACS pufera i talog je finalno resuspendovan u 100 µl FACS pufera za merenje FACS Array Bioanalyzer (BD) prema GA_018_BD FACS Array bioanalyzer.

8. Lentivirusna transdukcija

[0256] Konstrukcija lentivirusnog vektora: Lentivirusi pripadaju RNK virusima, koji se stabilno integrišu u ljudsku genomsku DNK ćelija koje se dele, kao i ćelija koje se ne dele. Vektor pLenti6.4 (Invitrogen) je korišćen kao osnova. Sadrži gen za Blasticidin za selekciju pozitivno transdukovanih ćelija. U rekombinacioni region vektora kloniran je CLDN18.2 fuzionisan sa promotorom EF1α, čime je dobijen pL64B42E (EF1α-hCLaudin18.2)-Blasticidin (Slika 1).

[0257] Izbor ćelijskih linija: Ćelijske linije su odabrane prema literaturnim podacima, ili od ćelijskih linija koje su prethodno testirane in vivo. Kriterijumi selekcije uključivali su homogeni subkutani rast kod golih miševa i terapijski raspon od 20-100 dana. Integrisane su tri ćelijske linije (DANG, YAPC i BxPC3) koje su već pokazale slabu ekspresiju iRNK CLDN18.2 i tri (MiaPaCa-2, Patu8902 i Suit-2) koje su, prema literaturi, sposobne da metastaziraju. Dve druge ćelijske linije (za koje se zna da rastu kao homogeni subkutani tumori in vivo) su odabrane nasumično (HPAC, CAPAN1).

[0258] Određivanje uslova za selekciju blasticidinom: Za sve ćelijske linije, koncentracija blasticidina potrebna za selekciju ćelija posle lentivirusne transdukcije određena je pre nego što je transdukcija izvedena. Ćelije kancera pankreasa su zasejane u ploče sa 6 bunarčića pri visokoj gustini, što je rezultovalo u 80-90% konfluentnosti posle 24 časa. Blasticidin (štok: 10 mg/ml, Invitrogen) je dodat u bunarčiće u rastućim koncentracijama u rasponu od 0.5-12 µg/ml (5 koraka razblaživanja kontrola bez blasticidina). Medijum je menjan svaka 3-4 dana i ćelije su analizirane pod mikroskopom pre uklanjanja medijuma. Dokumentovana je količina mrtvih ćelija i stanje živih ćelija. Ćelije su kultivisane 14 dana. Najniža koncentracija blasticidina koja dovodi do 100% apoptotičnih ćelija posle 14 dana bila je poželjna za selekciju lentivirusno transdukovanih ćelija. Potrebne koncentracije blasticidina za svaku od uspostavljenih LVT ćelijskih linija su naznačene u Tabeli 4.

[0259] Izbor omotača: Za lentivirusnu transdukciju, GFP-lentivirusni kontrolni vektor pL64B42E-(EF1a-GFP)-blast je upakovan u različite čestice omotača (VSV-G, GALV, RD114, Mokola-G i Rabies-G). U zavisnosti od proteina prisutnih u omotaču i sastava ćelijske membrane, vezivanje za ciljne ćelije kancera je manje ili više efikasno. Kod svih ćelijskih linija kancera pankreasa, omotač VSV-G je pokazao najveću efikasnost transdukcije (68.5-91.2%) (Tabela 5). Shodno tome, ekspresioni vektor CLDN18.2 pL64B42E (EF1α-hCLaudin18.2)-Blasticidin je upakovan u omotače VSV-G. Ćelije-proizvođači su inficirane i virusi su izolovani iz medijuma u visokim titrovima (3.86x10<7>čestica/ml). Virusni supernatanti su čuvani na -80°C.

Tabela 5: Dobijanje ćelijskih linija kancera pankreasa koje prekomerno eksprimiraju CLDN18.2 lentivirusnom transdukcijom

<1>Efikasnosti dobijene pakovanjem vektor u čestice sa omotačem VSV-G, merena 2 dana nakon infekcije.

[0260] Lentivirusna transdukcija ćelijskih linija kancera pankreasa: Za infekciju ciljnih ćelijskih linija kancera pankreasa, ploča sa 24 bunarčića je obložena sa 200 µl 1x retronectin<®>(20 µg/ml, Takara Inc.) i ploča je zapečaćena parafilmom<®>i inkubirana 3-16 h na 4 °C. Ploče su isprane sa 200 ml PBS i blokirane sa PBS/2% BSA tokom 30 minuta na RT. Ploče su ponovo isprane i napunjene sa 300 µl virusnog supernatanta centrifugiranjem tokom 25 minuta na 2500 o/min na 15°C. Supernatant je uklonjen i punjenje je ponovljeno 3 puta. Ploče su na kraju jednom isprane sa PBS i u svaki bunarčić zasejane su ciljne ćelije na niskoj pasaži. Za sve ćelijske linije kancera pankreasa, zasejano je 5x10<5>-1x10<7>ćelija u 24 bunarčića. Ploče su inkubirane 2 dana na 37°C. Nakon toga, ćelije su odvojene od podloge i efikasnost transdukcije je određena pomoću FACS metode korišćenjem FITC-obeleženog antitela IMAB362. Ćelije su umnožene i pripremljena je glavna ćelijska banka za svaku ćelijsku liniju.

9. Test ADCC

[0261] Ciljne ćelije kancera pankreasa su zasejane dva dana unapred u flaskove da bi se dobilo 80-90% konfluentnih kultura na dan početka ADCC. Ćelije kancera pankreasa su transfektovane sa RNK luciferaze i zasejane u bele ploče sa 96 bunarčića pri gustini od 1x10<4>ćelija po bunarčiću u 50 µl medijuma za test (medijum za kulturu kao što je opisano u Tabeli 4 sa 20 mM HEPES). Ćelije NUGC-4 sub 10cH11 subE10 Luci#2 (8000 ćelija/bunarčiću) su dodatno zasejane kao pozitivna kontrola u svim testovima. Ćelije su kultivisane 4-6 h pre dodavanja antitela i prečišćenih PBMC.

[0262] PBMC su pripremljene iz svežeg sloja humanih leukocita i trombocita dobijenog od zdravih davalaca. Oko 3x 20-25 ml krvi je razblaženo (1:2) sa PBS-om i pažljivo naneto na 4x 15 ml Ficol-Paque Plus (GE Healthcare) u epruvetama Falcon od 50 ml. Gradijent je centrifugiran (25 min, 700 g). Nakon centrifugiranja, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su sakupljene iz interfaze, isprane u PBS/2 mM EDTA, centrifugirane (5 min, 468 g), ponovo resuspendovane u PBS/2 mM EDTA i centrifugirane (10 min, 208 g) za uklanjanje trombocita. Talozi su resuspendovani u 50 ml PBS/2 mM EDTA i ćelije su izbrojane. PBMC su centrifugirane (5 min, 468 g) i resuspendovane u medijumu za kulturu X-Vivo-15 u koncentraciji od 1.6x10<7>ćelija/ml za dodavanje ćelijama pankreasa i 1.28x10<7>ćelija/ml za dodavanje ćelijama NUGC-4 sub 10cH11 subE10 Luci #2.

[0263] Antitela (IMAB362 i kontrolno izotipsko antitelo ch78H11 1H6) su serijski razređena (4.5-struko) 10 puta, što je rezultovalo opsegom koncentracije od 200 µg/ml-0.26 ng/ml. Od svakog razblaženja 25 µl je dodato u četiri primerka u ciljne ćelije. PBS bez antitela je dodat u bunarčiće za kontrolu medijuma i lize. Nakon toga, 25 µl PBMC je dodato u svaki bunarčić (E:T odnos = 40:1) i ploče su inkubirane 24 h ± 1 h na 37°C, 5% CO2.

[0264] Sledećeg dana, 10 µl 8% rastvora Triton X100/PBS je dodato u kontrolne bunarčiće za lizu i 10 µl PBS u sve ostale bunarčiće. Na kraju, 50 µl sveže pripremljenog štok rastvora luciferina je dodato (160 mM HEPES, 1x PBS, 3.84 mg/ml D-Luciferin (BD Biosciences)) u svaki bunarčić i ploče su inkubirane 80 minuta na RT u mraku. Lumiscencija koja je rezultat oksidacije lucifer žute pomoću luciferaze živih ćelija merena je korišćenjem čitača mikroploče (Infinite200, Tecan, Švajcarska). Procenat ćelijske citotoksičnosti je izračunat korišćenjem sledeće formule:

Specifično ubijanje (%) = 100 - [(RLUuzorak- RLUtriton) / (RLUkontr. medijuma- RLUtriton) x 100]

10. CDC

[0265] CDC je izvedena kao što sledi.

[0266] Ciljne ćelije (CHO-K1 p740 MACS/FACS (24H5) p3151 Luci#2A5) su zasejane u 50 µl medijuma za test u bele test ploče sa 96 bunarčića (10000 ćelija/bunarčiću) i uzgajane 24h+20 min na 37°C, 7.5% CO2i 95% rH pre dodavanja uzoraka. Svaka ploča za analizu sa 96 bunarčića sadržala je ukupno 3 različite negativne kontrole (serum inaktiviran toplotom, serum sa i bez IMAB362 i serum sa kontrolnim izotipskim antitelom (rituksimab)) i pozitivnu kontrolu pula zdravog humanog seruma (serija br. 31032011) sa 500 ng/ml IMAB362. Dodatna pozitivna kontrola je generisana na kraju reakcije dodavanjem 0.8% Triton X100 u drugi bunarčić za kontrolu medijuma što je izazvalo potpunu lizu. Jedna od ploča za analizu sa 96 bunarčića je sadržala funkcionalnu pozitivnu kontrolu generisanu sa 7 serijskih 3.16-strukih razblaženja IMAB362 (10000 – 31.8 ng/ml). Ova kontrola je rezultovala sigmoidnom dozno-zavisnom lizom ciljnih ćelija. Svi uzorci su pripremljeni (svaki po 200 µl) u isto vreme u ploči za razblaživanje sa 96 dubokih bunarčića. Uzorci su uzeti 3 puta iz svakog bunarčića reverznim pipetiranjem da bi se generisali triplikati na pločama za analizu. Nakon dodavanja 50 µl svake ispitivane i kontrolne jedinice na ploče za analizu, ploče su inkubirane 80+5 min na 37°C, 7.5% CO2i 95% rH.

[0267] U svaki bunarčić je dodato 10 µl PBS, osim u kontrolne bunarčiće Triton-liza. U svaki kontrolni bunarčić Triton-liza dodato je 10 µl 0.8% rastvora Triton/PBS. Pripremljen je rastvor supstrata luciferina (6114 µl bidestil. voda, 2496 µl HEPES (1M), 1998 µl 1xDPBS, 4992 µl štok rastvora D-Luciferina (12 mg/ml)). U svaki bunarčić je dodato 50 µl rastvora supstrata luciferina. Ploče su inkubirane na 37°C, 7.5% CO2 i 95% rH tokom 45 min. Ploče će se meriti u čitaču mikroploče.

• Liza zavisna od komplementa je izračunata korišćenjem formule:

Specifična liza (%) = 100 - [(RLUuzorak - RLUtriton) / (RLUHSCM - RLUtriton) x 100]

[0268] Modifikacije za ispitivanje ćelijskih linija kancera pankreasa:

• Ćelije kancera pankreasa su transfektovane sa RNK luciferaze korišćenjem optimizovanih uslova. Za svaku testiranu ćelijsku liniju, zasejano je 1.5x104 ćelija po bunarčiću.

• Pošto je većinu ćelijskih linija kancera pankreasa teško odvojiti od podloge i razdvojiti pojedinačne ćelije, prvog dana je korišćen tripsin.

• Ćelije kancera pankreasa u pločama za analizu su kultivisane na 37°C, 5% CO2.

• Analize CDC sa ćelijama koje su prethodno tretirane hemoterapijskim agensima su rađene sa sledećim koncentracijama antitela IMAB362 ili ch78H11 1H6 kao kontrolnim izotipskim antitelom: 640000, 160000, 40000, 10000, 2500, 625, 156 i 39 ng/ml.

11. Inhibicija proliferacije

[0269] Da bi se analizirale krive doza-odgovor svakog hemoterapijskog agensa, urađen je test proliferacije.

Tabela 6: Ćelijske linije kancera pankreasa za analizu efikasnosti gemcitabina ili oksaliplatina

[0270] Ćelije su zasejane u ploče sa 96 bunarčića i nakon 4-6 časova dodat je gemcitabin ili oksaliplatin u sledećim koncentracijama: 1000, 500, 250, 100 i 20 ng/ml. Test proliferacije je inkubiran 4 dana na 37°C i 5% CO2. Dodato je 50 µl XTT kompletnog reagensa (50 delova XTT 1 deo mešanog kuplovanog reagensa) i inkubirano na 37°C. Merenje apsorpcije (ćelije i supernatant) je urađeno pomoću Tecan Safire posle 3 h i 4 h. Inhibicija proliferacije je izračunata u poređenju sa srednjim vrednostima postavljenim na 100%. EC50vrednosti za gemcitabin i oksaliplatin izračunate su u programu GraphPad Prism.

12. Kultivacija ćelijskih linija kancera pankreasa sa hemoterapijskim lekovima za ADCC ili CDC

[0271] Za DANG je zasejano 4 do 6E+06 ćelija i kultivisano 2 dana u medijumu ili medijumu 1 ng/ml gemcitabina ili 1 ng/ml gemcitabina 10 ng/ml oksaliplatina. Zasejano je 1-1.4E+07 ćelija Patu8988S i kultivisano bez ili sa 10 ng/ml gemcitabina ili 10 ng/ml gemcitabina u kombinaciji sa 100 ng/ml oksaliplatina.

[0272] Na dan početka ADCC, sledio se gore opisani protokol i ekspresija CLDN18 na površini ćelija je određena u FACS analizi kao što je gore opisano.

13. Analize ćelijskog ciklusa

[0273] Ćelije su zasejane u ploče sa šest bunarčića, a 5-6 časova kasnije dodavana su hemoterapijski agensi tokom 24 h, 48 h ili 3 dana. Ćelije koje plutaju u medijumu su kombinovane sa slojem adherentnih ćelija, koji je tripsinizovan. Ćelije su isprane. Analiza ćelijskog ciklusa je ili direktno započeta, ili je prethodno urađeno bojenje površine ćelija, kao što je gore opisano. Ćelije se resuspenduju u 1 ml PBS i dodaju u 3 ml 4% PFA. Posle 15 min fiksacije ćelija na sobnoj temperaturi ćelije se peletiraju i isperu. Za tretman enzimom RNAse ćelije su resuspendovane u 200 µl RNAse (10000 U/ml) sa 0.05% Triton X-100 i inkubirane 30 minuta na 37°C. Dodat je 1 ml PBS i uzorci su centrifugirani i resuspendovani u 200 µl PBS/PJ 50 µg/ml. Najmanje 30 minuta kasnije uzorci su bili spremni za analizu protočnom citometrijom. Raspodela fazna ćelijskog ciklusa je određena korišćenjem softvera FlowJo za analizu histograma sadržaja DNK.

14. Analiza apoptoze

[0274] Nakon naznačenih tretmana, apoptoza je merena vezivanjem aneksina V (komplet za detekciju I) ili analizom fragmentacije DNK (Apo-Direct) prema preporuci proizvođača (PharMingen, San Diego, CA). Ukratko, ćelije koje plutaju u supernatantu su kombinovane sa adherentnom frakcijom, koja je tripsinizovana i zatim isprana. Alikvot od 5E+05 ćelija je inkubiran sa aneksinom V-APC i PI tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Ćelije su odmah analizirane protočnom citometrijom. Vijabilne ćelije isključuju i aneksin V-APC i PI. Rane apoptotske ćelije su aneksin V-APC-pozitivne i PI-negativne, dok su ćelije koje više nisu vijabilne zbog apoptotske ili nekrotične ćelijske smrti pozitivno obojene i aneksinom V i PI. Procenat obojenih ćelija u svakom kvadrantu je kvantifikovan korišćenjem softvera FlowJo (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

[0275] Analiza apoptoze zasnovana na fragmentaciji DNK je izvedena na sledeći način. Tretirane ćelije (adherentne i plutajuće) su fiksirane u 70% ledeno hladnom EtOH preko noći. Nakon ispiranja, 10<6>fiksiranih ćelija je inkubirano sa enzimom terminalna dezoksinukleotidil transferaza (TdT) i FITC-dUTP tokom 90 minuta na 37 ° C da bi se obeležili prekidi DNK. Ćelije su isprane, inkubirane u RNase A/propidijum jodidu u mraku 30 minuta na sobnoj temperaturi da bi se obojila ukupna DNK, a zatim analizirane protočnom citometrijom. Ćelijski dubleti i slepljene ćelije su eliminisane iz analize selekcionisanjem populacije (eng. – gating).

15. In vivo studije

[0276] Svi in vivo eksperimenti su sprovedeni u skladu sa nacionalnim propisima i etičkim smernicama za eksperimentalne studije na životinjama.

15.1 Tretman ksenotransplantata

[0277] Tumori ksenotransplantata su inokulisani subkutanom injekcijom tumorskih ćelija u 200 µl PBS u bokove ženki miševa Hsd: Athymic Nude-Foxn1<nu>. Miševi koji nose tumor su tretirani sa 0 µg, 200 µg, 400 µg ili 800 µg antitela ubrizganim i.v. nedeljno ili naizmenično i.v./i.p. dva puta nedeljno. Hemoterapijski agensi su primenjivani i.p. nedeljno ili dva puta nedeljno. Veličina tumora i zdravlje životinja su praćeni dva puta nedeljno. Na kraju hemoterapijskog tretmana, primena antitela je nastavljena sve dok tumori ne dostignu zapreminu od >1400 mm<3>ili dok tumori ne postanu ulcerozni. Uzorci tumora su krio-konzervirani ili fiksirani u 4% formalinu za naknadnu analizu.

15.2 Analiza metastaze

[0278] Prvo je analizirana sposobnost različitih ćelijskih linija kancera pankreasa da formiraju metastaze nakon i.v. primene ćelija kod golih miševa. Za ove analize implantiranja, grupi od 5-10 miševa je ubrizgano 1x10<6>i/ili 2x10<6>ćelija, i pojedinačni miševi su žrtvovani u različitim vremenskim tačkama da bi se pronašla vremenska tačka implantiranja i rasta metastaza.

[0279] Tretmani metastaza su izvedeni sa 10-12 miševa Hsd: Athymic Nude-Foxn1<nu>po tretmanskoj grupi. Ubrizgano im je 2x10<6>ćelija (Patu8988S ili Suit2-LVT) intravenski. Svi miševi su žrtvovani u isto vreme, čim su se pojavili prvi simptomi metastazne bolesti (gubitak težine, slabost, otežano disanje), ili je prvi miš uginuo.

[0280] Priprema tkiva: Za studije implantiranja miševi su žrtvovani u različitim vremenskim tačkama, ili čim su miševi pokazali jasne fiziološke znake metastazne bolesti (gubitak težine, slabost, otežano disanje). Svi njihovi organi su makroskopski analizirani na metastaze. Samo za ćelije Patu8988S i Suit-2, pluća, odnosno pluća/jetra su pokazali makroskopski vidljive metastaze. Ovi organi su secirani u 4 jednaka dela, od kojih su dva (pluća: gornji desni i donji levi režanj) uskladištena za izolaciju genomske DNK. Druga dva dela su fiksirana formalinom i uskladištena za IHC analizu (Slika 2).

[0281] Priprema genomske DNK i strategija Q-PCR: Genomska DNK je ekstrahovana iz tkiva pluća ili jetre. Kao kontrole, genomska DNK je takođe izolovana iz humanih ćelija kancera pankreasa Patu8988S, kao i iz neinjektiranih miševa kao negativne kontrole.

[0282] Strategija Q-PCR se zasniva na amplifikaciji humane DNK prisutne u metastazama. Relativni nivo detekcije humane DNK u uzorku pluća miša direktno korelira sa količinom i/ili veličinom metastaza. Pošto na ovaj postupak utiče činjenica da se metastaze ne šire ravnomerno u plućima i da je ponekad jedan režanj više zahvaćen od drugog, dva različita regiona pluća su pomešana u jednom DNK preparatu (Slika 2).

[0283] Q-PCR reakcija je izvedena sa parom prajmera #5861 5’-GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG-3’ i #5862 5’-TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC-3’ koji specifično amplifikuju alfa-satelitsku DNK prisutnu u humanom hromozomu 17, ali ne i u mišjoj DNK. Da bi se napravila standardna kriva i kao pozitivna kontrola, DNK Patu8988S je pomešana sa mišjom DNK i pripremljena su 5-struka razblaženja, što je rezultovalo sa 100%, 20%, 4%, 0.8%, 0.16%, 0.032% i 0.0064% humane DNK u mišjoj DNK. Kriva je korišćena za izračunavanje (linearna regresija) količine DNK humane metastaze prisutne u mišjem plućnom tkivu. Q-PCR reakcije su izvedene u finalnoj zapremini od 50 µl koja se sastojala od 20 µl (200 ng) mišje DNK pluća, 25 µl Sybr Green (Qiagen), 1.6 µl sens prajmera (10 µM) i 1.6 µl anti-sens prajmera i 1.8 µl H2O.

Primer 2: Ekspresija CLDN18.2 u normalnom i neoplastičnom tkivu humanog pankreasa

[0284] Da bi se analizirao nivo i obrazac ekspresije CLDN18.2 u normalnom i tumorskom tkivu pankreasa, izvršeno je histološko bojenje FFPE isečaka sa dva reagensa na bazi mišjeg monoklonskog antitela (Slika 3).

[0285] Eksploratorni pilot eksperimenti su izvedeni korišćenjem prototipa antitela 35-22A na matricama tkiva (TMA). Glavni nedostatak TMA je promenljiv kvalitet i mala veličina tačaka tkiva i samim tim nereprezentativni karakter uzoraka. Ovo je, zajedno sa protokolom bojenja koji nije u potpunosti optimizovan, možda dovelo do potcenjivanja pozitivnih slučajeva.

[0286] Glavni eksperimenti su izvedeni sa antitelom 43-14A. Ova bojenja su sprovedena na isečcima tkiva, koji su (u poređenju sa TMA) bili veći i prethodno procenjeni na prisustvo tumorskih ćelija.

[0287] Prekancerozne lezije, koje potiču iz kanala pankreasa, mogu se rangirati prema međunarodnom sistemu intraepitelne neoplazije pankreasa (PanIN) (podtip PanIN-1A, -1B, -2, -3).

[0288] PanIN-1 lezije (Slika 4A) su ravne, sastavljene od visokih stubastih ćelija sa bazalno lociranim jedrima i obilnim supranuklearnim mucinom. Jedra su mala i okruglog do ovalnog oblika i orijentisana su okomito na bazalnu membranu. Postoji histološko preklapanje između ne-neoplastičnih ravnih hiperplastičnih lezija i ravnih neoplastičnih lezija bez atipije.

[0289] Lezije podtipa PanIN-1B imaju papilarnu, mikropapilarnu ili bazalno pseudostratifikovanu arhitekturu i inače su identične PanIN-1A. (Hruban et al. Am J Surg Pathol.

2001. May; 25(5):579-86.)

[0290] PanIN-2 lezije (Slika 4B) su ravne ili papilarne, imaju tipične jedarne abnormalnosti, uključujući izvestan gubitak polariteta, gomilanje jedara, uvećana jedra, pseudo-stratifikaciju i hiperhromatizam. Mitoze su retke, ali kada su prisutne one su neluminalne (nisu apikalne) i nisu atipične. (Hruban et al. Am J Surg Pathol.2001. May; 25(5):579-86.)

[0291] PanIN-3 lezije (Slika 4C) su obično papilarne ili mikropapilarne, međutim, retko mogu biti ravne. Na dijagnozu PanIN-3 upućuju pravi kribriformni izgled, pupljenje malih klastera epitelnih ćelija u lumen i luminalne nekroze. Lezije se karakterišu gubitkom jedarnog polariteta, distrofičnim peharastim ćelijama (peharaste ćelije sa jedrom orijentisanim ka lumenu i mucinoznom citoplazmom orijentisanom prema bazalnoj membrani), mitozama koje povremeno mogu biti abnormalne, jedarnim nepravilnostima i istaknutim (makro) nukleolusima. (Hruban et al. Am J Surg Pathol. 2001. May; 25(5):579-86.)

[0292] Ekspresija CLDN18.2 u prekanceroznim tkivima je analizirana pomoću antitela 43-14A korišćenjem uzoraka tkiva iz različitih izvora.

[0293] CLDN18.2 je često detektovan u PanIN strukturama podtipova PanIN-1, -2 i -3 pokazujući ranu ekspresiju CLDN18.2 u prekanceroznim lezijama (Slika 4), koja je sačuvana u kasnijim fazama. Nasuprot tome, nije primećena ekspresija u uzorcima normalnog tkiva pankreasa uključujući duktalne strukture pankreasa.

[0294] Zaključno, CLDN18.2 je rani marker početka malignih histoloških promena u kanalima pankreasa.

[0295] Izvedene su dve studije za procenu ekspresije CLDN18.2 kod primarnog kancera pankreasa. Za pilot studiju nekoliko TMA sa ukupno 141 slučajem primarnog kancera pankreasa obojeno je monoklonskim antitelom 35-22A specifičnim za CLDNA18.2. Ukupan kvalitet analiziranog TMA je bio nezadovoljavajući. Mnoge tačke su delimično izgubljene tokom otkrivanja epitopa, a nehomogeno kontrastno bojenje hematoksilinom je sugerisalo suboptimalnu tkivnu obradu FFPE tkiva.

[0296] Ukupno >48.9% obojenih slučajeva bilo je pozitivno na CLDN18.2, uključujući 49.2% (65/132) duktalnih adenokarcinoma, 50% (1/2) karcinoma acinarnih ćelija i 3 od 7 neuroendokrinih karcinoma (Tabela 7). Membrana tumorskih ćelija je obojena bez ikakvog fona na drugim tipovima ćelija (Slika 6).

[0297] Štaviše, podnosioci prijave su primetili korelaciju između intenziteta ekspresije CLDN18:2 i frakcije obojenih tumorskih ćelija unutar tumora (Tabela 8, Slika 5).

Tabela 7: Pilot studija: Broj CLDN18.2-pozitivnih slučajeva podeljenih na podtipove kancera pankreasa. Tkiva su obojena upotrebom monoklonskog mišjeg antitela 35-22A (0,2µg/ml) i pregledana za tumorske ćelije pozitivne na CLDN18.2.

Tabela 8: Pilot studija: Korelacija između intenziteta signala CLDN18.2 i količine pozitivnih tumorskih ćelija za analizirane primarne tumore pankreasa. Procenat pozitivnih slučajeva primarnog tumora korelirao je sa intenzitetom bojenja. Slučajevi su grupisani u šest frakcija u zavisnosti od količine pozitivnih tumorskih ćelija radi bolje vizualizacije.

Tabela 9: Pilot studija: Određivanje stepena slučajeva tumora pozitivnih na CLDN18.2.

Određivanje stepena tumorskih ćelija opisuje izgled ćelije i nivo diferencijacije ćelija. Pri tome stepen 1 opisuje dobro diferencirane ćelije; stepen 2 umereno diferencirane ćelije, a stepen 3 slabo diferencirane ćelije.

[0298] Druga studija je sprovedena sa optimizovanim protokolom bojenja sa visoko osetljivim antitelom 43-14A upotrebom isečaka tkiva kontrolisanog kvaliteta.

Tabela 10: Glavna studija – broj slučajeva pozitivnih na CLDN18.2 grupisanih u podtipove kancera pankreasa. Tkiva su obojena upotrebom mišjeg monoklonskog antitela 43-14A (0.2 µg/ml) i pregledana na tumorske ćelije pozitivne na CLDN18.2.

Tabela A

Tabela B

[0299] Analizirana su ukupno 42 uzorka primarnog duktalnog karcinoma pankreasa. Oko 90% (38 od 42 slučaja) njih je bilo pozitivno na CLDN18.2 (Tabela 10), od kojih je većina (>60%) pokazala jak intenzitet signala od ++ (Slika 7, Tabela 11). Takođe, ovde je primećena korelacija između nivoa ekspresije CLDN18.2 i frakcije pozitivnih tumorskih ćelija. Većina analiziranih slučajeva (62%) bili su tumori 3. stepena (Tabela 12).

Tabela 11: Glavna studija: Korelacija između intenziteta signala CLDN18.2 i količine pozitivnih tumorskih ćelija za analizirane primarne tumore pankreasa. Procenat pozitivnih slučajeva primarnog tumora korelirao je sa intenzitetom bojenja. Slučajevi su grupisani u šest frakcija u zavisnosti od količine pozitivnih tumorskih ćelija radi bolje vizualizacije.

Tabela 12: Glavna studija – Određivanje stepena slučajeva tumora pozitivnih na CLDN18.2. Za većinu analiziranih slučajeva tumora dostupan je bio rezultat određivanja stepena koje je sproveo odgovarajući patolog. Određivanje stepena tumorskih ćelija meri izgled ćelije i nivo diferencijacije ćelija. Pri tome, stepen 1 opisuje dobro diferencirane ćelije; stepen 2 umereno diferencirane ćelije, a stepen 3 slabo diferencirane ćelije.

[0300] Kancer pankreasa se kod većine pacijenata dijagnostikuje u poodmakloj fazi. Tumori pacijenata su već metastazirali na limfne čvorove i druge organe, posebno jetru. U glavnoj studiji 79 FFPE uzoraka tkiva metastaza na limfnim čvorovima i jetri kancera pankreasa analizirano je imunohistohemijskim testom, korišćenjem antitela 43-14A specifičnog za CLDN18.2. 70.5% metastaza na limfnim čvorovima (31/44 slučaja) i 68.6% udaljenih metastaza na jetri (24/35 slučajeva) pokazalo je jasno bojenje tumorskih ćelija za CLDN18.2 (Tabela 13). Obrazac bojenja pozitivnih tumorskih ćelija bio je membranski, u nekim slučajevima sa dodatnim slabijim citoplazmatskim signalima (Slika 9). U skladu sa rezultatima analize primarnog tumora, utvrđena je korelacija između nivoa ekspresije CLDN18.2 i frakcije tumorskih ćelija pozitivnih na CLDN18.2 u metastatskim uzorcima (Slika 8).

[0301] Nije pronađena korelacija između utvrđenog stepena analiziranih tumora i nivoa ekspresije CLDN18.2 ili frakcije pozitivnih tumorskih ćelija.

Tabela 13: Broj slučajeva metastaza pozitivnih na CLDN18.2 grupisanih prema ciljnom organu. Tkiva su obojena monoklonskim mišjim antitelom 43-14A (0.2 µg/ml) i pregledana za tumorske ćelije pozitivne na CLDN18.2.

[0302] Da bi ispitalo da li je ekspresija CLDN18.2 u pozitivnim slučajevima primarnog tumora očuvana u metastazama istog pacijenta, podudarni dubleti primarnog karcinoma/metastaza ne limfne čvorove su pregledani korišćenjem antitela 43-14A.

Tabela 14: Ekspresija CLDN18.2 u podudarnim uzorcima primarnog tumora pankreasa i metastatskih tumora limfnih čvorova - Podudarni uzorci primarnog adenokarcinoma i metastaza na limfnim čvorovima (LN) analizirani su na ekspresiju CLDN18.2 u tumorskim ćelijama.

[0303] U 25 (92.5%) od 27 analiziranih uparenih slučajeva u parovima primarnog tumora i limfnih čvorova oba su bila pozitivna na CLDN18.2. U jednom slučaju oba tkiva su bila negativna, a u jednom drugom slučaju primarni tumor je bio pozitivan na CLDN18.2, dok je metastaza bila negativna.

[0304] U 21 od 26 (80.7%) pozitivnih testiranih dubleta, intenzitet signala primarnih tumorskih i metastatskih tumorskih ćelija je bio identičan. U 5 slučajeva intenzitet signala je opao sa ++ na +. U 11 od 25 (44%) uparenih tkiva broj pozitivnih tumorskih ćelija bio je manji u metastazama u odnosu na primarni tumor (Tabela 14).

[0305] Ukratko, izgleda da je ekspresija CLDN18.2 očuvana kada primarne tumorske ćelije uznapreduju u metastatski stadijum. Ukupan intenzitet i udeo pozitivnih tumorskih ćelija u metastazama na limfnim čvorovima bio je samo nešto niži u poređenju sa primarnim tumorom (Slika 10).

[0306] Za mali broj pacijenata bili su dostupni uzorci tkiva dobijeni iz primarnog tumora, metastaze na limfnim čvorovima i metastaze na jetri. Ovi podudarni tripleti su obojeni da bi se ispitala očuvanost ekspresije CLDN18.2 u udaljenim metastazama. Šest podudarnih tripleta je analizirano pomoću antitela 43-14A.

Tabela 15: Ekspresija CLDN18.2 u podudarnim primarnim i metastatskim uzorcima tumora pankreasa - Podudarni uzorci primarnog adenokarcinoma, metastaza na jetri i metastaza na limfnim čvorovima (LN) analizirani su na ekspresiju CLDN18.2 u tumorskim ćelijama.

[0307] U 3 od 6 tripleta, sva tri uzorka tkiva bila su uporediva u pogledu njihove pozitivnosti za CLDN18.2 (Slika 11). U tri slučaja deo tumorskih ćelija bio je pozitivan na CLDN18.2 u primarnoj leziji, dok metastatske lezije nisu pokazale bojenje na CLDN18.2 (Tabela 15).

Primer 3: Ciljna ekspresija u humanim ćelijskim linijama kancera pankreasa koje se koriste za in vitro i in vivo modele i modele kancera pankreasa

Izvor ćelijskih linija

[0308] Primarni cilj ove pretkliničke evaluacione studije bio je da se analiziraju inhibitorni efekti tretmana sa IMAB362 u odgovarajućim model sistemima. Da bi se identifikovale CLDN18.2-pozitivne ćelijske linije koje se mogu koristiti za in vitro i in vivo karakterizaciju efekata IMAB362, skup od 26 komercijalno dostupnih ćelijskih linija kancera pankreasa je pregledan na ekspresiju CLDN18.2 i detaljno okarakterisan. Za svaku od ćelijskih linija, odmah po dolasku, pripremljena je ćelijska banka za eksperimentalnu upotrebu. One potiču iz primarnih adenokarcinoma pankreasa (10, od kojih su 6 mucinozni adenokarcinomi), primarnih karcinoma (4), metastaza adenokarcinoma pankreasa na jetri (5) ili slezini (1), ili su izolovane iz ascitesa (5) (videti Tabelu 16). Nekoliko od ovih ćelijskih linija (8) je lentivirusno transdukovano kako bi eksprimirale CLDN18.2.

. asa kre pan aij lin kihjs eli keć sti ri kte

kara esk lij i će lorek po nolje jav b

16: al abeT

Ekspresija transkripta CLDN18.2 u ćelijskim linijama humanog kancera pankreasa

[0309] Da bi se identifikovale ćelijske linije pankreasa koje eksprimiraju CLDN18.2, nivoi transkripta su određeni kvantitativnom PCR metodom u realnom vremenu (RT-PCR) korišćenjem direktnog prajmera koji se vezuje za egzon 1 u CLDN18.2 i reverznog prajmera koji se vezuje za egzon 3 u CLDN18. Ćelijska linija humanog karcinoma želuca KATO-III koja endogeno eksprimira CLDN18.2 i CLDN18.2-negativna ćelijska linija kancera dojke SKBR-3 uključene su kao pozitivna, odnosno negativna kontrola. RT-PCR je otkrio jasnu endogenu ekspresiju CLDN18.2 u ćelijskim linijama kancera pankreasa DANG, Panc03.27, Panc05.04, Patu8988S i YAPC sa relativnim nivoima koji prelaze 1x10<5>. Zanimljivo je da su ćelije Patu8988S pokazale nivoe ekspresije CLDN18.2 (~1x10<8>) uporedive sa ćelijama CA želuca KATO-III (Slika 12A). U zaključku, podnosioci prijave su otkrili robusnu ekspresiju CLDN18.2 u 5 od 22 ćelijske linije kancera pankreasa.

[0310] Pored endogenih ćelijskih linija, LVT ćelijske linije koje ektopično eksprimiraju CLDN18.2 su analizirane na nivou transkripta (Slika 12A). Za 6 od 8 LVT ćelijskih linija, otkriveni su relativni nivoi ekspresije CLDN18.2 veći od 1x10<8>. Samo u ćelijama HAPC-LVT i Suit2-LVT nivo ekspresije je bio iznad 1x10<5>.

[0311] Podnosioci prijave su ispitali da li je ekspresija CLDN18.2 stabilna tokom in vitro kultivacije. Ćelije Patu8988S, Panc05.04 i lentivirusno transdukovane ćelijske linije Suit2-LVT, MiaPaCa2-LVT i Patu8902-LVT su pasažirane do 15 puta i analiziran je transkript CLDN18.2 (Slika 12B-D). Zapažen je gubitak ekspresije CLDN18.2 i u endogenim i u transdukovanim ćelijama sa većim brojem pasaža. Gubitak ekspresije bio je najveći u transdukovanim ćelijama. Zbog toga su korišćene rane pasaže, gde god je to bilo moguće za eksperimente in vitro, a ekspresija CLDN18.2 u ksenotransplantatima tumora je verifikovana u dole navedenim eksperimentima implantiranja.

Ekspresija proteina CLDN18.2 u ćelijskim linijama humanog kancera pankreasa

Detekcija CLDN18.2 u ukupnim lizatima ćelija

[0312] Pored analize transkripta, ekspresija CLDN18.2 je analizirana na nivou proteina metodama Western blot i IF. Za Western blot analizu ćelijski lizati 26 ćelijskih linija kancera pankreasa su ispitani metodom Western blotting (WB) korišćenjem antitela specifičnog za CLDN18, anti-klaudinl8 (C-term). Lizati ćelija SKBR-3 su ponovo korišćeni kao negativna kontrola, dok su lizati ćelija HEK293 stabilno transfektovanih sa CLDN18.2 (HEK293-p740) korišćeni kao pozitivna kontrola. Ovde je otkrivena visoka ekspresija proteina u ćelijama Patu8988S, DANG i Panc05.04, što potvrđuje podatke o RNK. U lizatima ćelija Panc03.27 i BxPC3 mogle su da se detektuju nejasne trake. Ćelije YAPC, koje su identifikovane kao pozitivne na nivou RNK, pokazale su nejasnu traku manje veličine u western blotovima. Sve ostale ćelijske linije su bile negativne (Slika 13).

Ćelijska ekspresija CLDN18 u ćelijama kancera pankreasa

[0313] Da bi se dobili potvrdni podaci o ekspresiji proteina, ćelijske linije karcinoma pankreasa su ispitivane imunofluorescencijom (IF) nakon fiksacije i permeabilizacije ćelija i korišćenjem antitela 35-22A za detekciju. IF analize su potvrdile prethodne podatke o RNK i proteinima koji pokazuju da je većina ćelijskih linija kancera pankreasa negativna na bojenje na CLDN18.2 (Slika 14). U nekoliko ćelijskih linija (kao što su AsPCI, DANG, HUP-T3, HUP-T4, Panc01) primećene su nukleusne tačke, koje najverovatnije predstavljaju artefakte bojenja. Ćelije DANG, Panc03.27 i BxPC3 za koje je identifikovano da imaju nizak CLDN18.2 na nivou RNK i/ili proteina, bile su negativne u IF analizi, koja ima nižu osetljivost detekcije. Nasuprot tome, membrane i citoplazma Panc05.04, Patu8988S i kontrolnih ćelija karcinoma želuca KATO-III bojile su se snažno pozitivno na CLDN18.2. Intenzitet bojenja je bio različit za svaku ćeliju i takođe su otkrivene negativne ćelije unutar populacije (Slika 14J i N). U LVT ćelijskim linijama nađeno je snažno bojenje membrane kod više od 80% svih ćelija.

Potvrda ekspresije CLDN18.2 u ćelijama kancera pankreasa

[0314] Da bi se potvrdila ekspresija CLDN18.2 i procenila količina ovog ciljnog molekula na površini ćelije, endogene ćelijske linije Panc05.04 i Patu8988S, kao i LVT ćelijske linije, obojene su sa IMAB362 korišćenjem protokola nativnog bojenja. Iako je bojenje Patu8988S, Panc05.04 i kontrolnih ćelija kancera želuca KATO-III sa IMAB362 bilo manje intenzivno i procenat pozitivnih ćelija je smanjen u poređenju sa bojenjem ćelija sa 35-22A (Slika 16A-F), IF analiza je potvrdila da se CLDN18.2 eksprimira na površini ćelija kancera pankreasa. Za 8 LVT ćelijskih linija kancera pankreasa koje ektopično eksprimiraju CLDN18.2, uočeno je jasno bojenje membrane na skoro svim ćelijama (kao što je prikazano za 6 LVT ćelijskih linija na Slici 16G-L).

[0315] U zaključku, analize ekspresije CLDN18.2 su dovele do identifikacije endogeno eksprimirajućih ćelijskih linija kancera pankreasa Panc05.04 i Patu8988S i svih 8 lentivirusno transdukovanih ćelijskih linija BxPC3-LVT, CAPAN1-LVT, DANG-CLaPa-2-2- LVT, Suit-2-LVT, Patu8902-LVT i YAPC-LVT kao odgovarajućih CLDN18.2-pozitivnih sistema ćelijskih modela.

Razvoj modela ksenotransplantata i metastaza kancera pankreasa

Studije implantiranja za identifikaciju odgovarajućih modela tumora subkutanog kancera pankreasa

[0316] Urađeno je ukupno 37 studija implantiranja sa različitim ćelijskim linijama kancera pankreasa da bi se identifikovali pogodni modeli subkutanog ksenotransplantata za ispitivanje in vivo efikasnosti IMAB362. Od svih ispitanih ćelijskih linija, ćelijske linije BxPC3-LVT, CAPAN1-LVT, MiaPaCa-2-LVT, HPAC-LVT, DANG-LVT i YAPC-LVT sa ektopičnom ekspresijom CLDN18.2 su odabrane za modele subkutanog ksenotransplantata, pokazujući visoke stope implantiranja i homogeni rast tumora. Pored toga, za testiranje efikasnosti IMAB362 in vivo odabrani su modeli subkutanog ksenotransplantata sa ćelijskim linijama Patu8988S i DANG koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Subkutana injekcija ćelija Panc05.04 nije rezultovala stvaranjem subkutanih tumora.

Tabela 17: Sažet prikaz ispitanih uslova za implantiranje za razvoj modela subkutanih ksenotransplantata za kancer pankreasa.

Studije implantiranja za identifikaciju odgovarajućih modela metastaza

[0317] Da bi se proučavali efekti IMAB362 na formiranje metastaza, ustanovljeni su modeli metastatskog kancera kod golih miševa. Ćelijske linije kancera pankreasa su analizirane na njihovu sposobnost da metastaziraju pri i.v. primeni. Ćelije CAPAN1-LVT, MiaPaCa-2, Patu8988S, Patu8902 i Suit-2 su ubrizgane u repne vene golih miševa kao što su opisali Mohanty i Xu 2010. Da bi se odredila vremenska tačka implantiranja metastaze i brzina rasta, miševi su žrtvovani u različitim vremenskim tačkama (Tabela 18).

Tabela 18: Analiza implantiranja metastaze ćelijskih linija kancera pankreasa

Analiza implantiranja ćelija Patu8902 i CAPAN1-LVT nije bila izvodljiva, pošto je većina miševa uginula skoro trenutno. U plućima i jetri 5 preživelih miševa koji su bili izloženi ćelijama CAPAN-LVT nisu otkrivene makroskopski vidljive metastaze posle 72 dana. Injekcije ćelija Suit-2 i MiaPaCa2, nasuprot tome, bile su dobro tolerisane. Tkiva pluća ovih miševa su analizirana IHC analizom u različitim vremenskim tačkama nakon injekcije. Kod miševa izloženih ćelijama MiaPaCa-2 nisu otkrivene metastaze u plućima nakon do 73 dana, i stoga ova ćelijska linija nije izabrana kao model za tretman sa IMAB362. Kancerske ćelije Suit-2 metastazirale su u pluća miševa. U tkivu je otkriveno više žarišta. Stoga je ćelijska linija Suit-2-LVT koja je lentivirusno transdukovana sa CLDN18.2 odabrana kao model sistem za analizu efekata tretmana sa IMAB362 na formiranje metastaze.

[0318] Pored Suit-2, analizirana je i sposobnost ćelija Patu8988S koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 da formiraju metastaze. Provere implantiranja su izvršene i.v. ubrizgavanjem 2 različite količine ćelija (1x10<6>, 2x10<6>) po mišu. Pluća i jetra su izolovani u različitim vremenskim tačkama kao što je naznačeno u Tabeli 18. Prvo, različita dobijena tkiva su analizirana korišćenjem Q-PCR. Pluća i jetre dobijeni do 70. dana analizirani su amplifikacijom humane α-satelitske DNK hromozoma 17. Rezultati za pluća pokazuju jasno povećanje procenta humane DNK u mišjim plućima tokom vremena, koje nije zavisilo od broja ubrizganih ćelija. I.v. primenom 1x10<6>ili 2x10<6>ćelija može da se detektuje 5.8%, odnosno 3.7% humane DNK nakon 70 dana (Slika 19). U jetrama je retko koja humana DNK bila amplifikovana. Posle 70 dana procenat je blago povećan, ali je i dalje bio ispod 0.005%.

[0319] Da bi se potvrdila ekspresija CLDN18.2 u metastazi Patu8988S, tkiva pluća su imunohistohemijski obojena korišćenjem antitela protiv humanog MHC klase I za detekciju humanih ćelija u mišjem tkivu, kao i anti-klaudinl8 (Mid) antitela. Bojenje za MHC-I je pokazalo da su jasna žarišta metastaza mogla da se detektuju u isečcima tkiva pluća miša, ali ne i u isečcima jetre (Slika 20). Štaviše, membrane ćelija u ovim žarištima su obojene anti-klaudinl8 (Mid) antitelom što pokazuje jasnu ekspresiju ciljnog proteina IMAB362 u ovim ćelijama. Zbog toga je, pored modela Suit2-LVT, ovaj model endogene metastaze odabran za ispitivanje tretmana sa IMAB362.

Primer 4: Efekti ubijanja ćelija posredovanog IMAB362

Umrežavanje IMAB362 indukuje efikasnu apoptozu

[0320] Vezivanje antitela za ciljni molekul na površini ćelije može da pokrene aberantnu signalizaciju koja direktno rezultuje smrću ćelije. Takvi signalni događaji mogu da zavise od ciljnog epitopa, valence vezivanja i od toga da li je vezivanje povezano sa umrežavanjem ciljnog molekula. Kod nekoliko ćelijskih linija limfoma pozitivnih na CD20, na primer, indukcija apoptoze rituksimabom primećuje se samo u uslovima umrežavanja. Takvo umrežavanje može da se desi in vivo kada visokoafinitetne imunske ćelije pozitivne na Fc-receptor stupaju u interakciju sa tumorskim ćelijama obloženim antitelima.

[0321] Umrežavanje IMAB362 indukuje direktnu apoptozu u roku od 18-42 časa u ćelijama humanog kancera želuca NUGC-4 i KATO-III kao što je izmereno TUNEL testom. Veličina apoptoze korelira sa dozom antitela i nivoom ekspresije ciljnog molekula na ćeliji kancera. Tretman gemcitabinom dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa tumorskih ćelija praćenog apoptotskom smrću ćelija. Apoptoza tumorskih ćelija pankreasa tretiranih gemcitabinom prikazana je na Slici 21.

ADCC aktivnost protiv ćelija kancera pankreasa posredovana IMAB362

[0322] IMAB362 je veoma moćan u regrutovanju i aktiviranju imunskih efektorskih ćelija pozitivnih na Fcγ-receptor, kao što su ćelije prirodne ubice. Vezivanje IMAB362 za ciljne ćelije, indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) pomoću granzima i perforina koje luče efektorske ćelije nakon vezivanja njihovih Fcγ receptora za antitelo. Uticaj ovog mehanizma delovanja je ranije prikazan za luciferaza- i CLDN18.2-pozitivne ćelije CA želuca (kao što su NUGC-4 i KATO-III) inkubacijom sa IMAB362 tokom 24 časa u prisustvu mononuklearnih ćelija periferne krvi čoveka (PBMC) (odnos efektora i ciljnog molekula = 40:1). Primena do 200 µg/ml IMAB362 je rezultovala maksimalnim stopama lize od 80-100%.

[0323] Ovde, podnosioci prijave su odredili ADCC aktivnost IMAB362 protiv ćelijskih linija kancera pankreasa. Rastuće koncentracije IMAB362 su inkubirane sa različitim ćelijskim linijama u odnosu efektora i ciljnog molekula od 40:1. U svakom eksperimentu dodavani su PBMC različitih davalaca. Rezultati za sve ćelijske linije su sumirani u Tabeli 19. Od 5 prvobitno identifikovanih CLDN18.2-pozitivnih ćelijskih linija pankreasa, samo Patu8988S, Panc05.04 i DANG su efikasno ubijene dodavanjem IMAB362 i PBMC (Slika 22A). Iako površinska ekspresija CLDN18.2 nije bila detektabilna u FACS analizi kod Panc05.04 i DANG, nivo ekspresije je dovoljno značajan da izazove ubijanje zavisno od efektorskih ćelija (EC50: Patu8988S: 0.01-1.4 µg/ml, DANG/Pan05.04: 0.1 -38 µg/ml). Iz ovih podataka može se zaključiti da su samo ćelije koje eksprimiraju relativne nivoe RNK >5.5x10<5>efikasno lizirane.

[0324] Analize ADCC su takođe izvedene sa LVT ćelijskim linijama kancera pankreasa i njihovim odgovarajućim parentalnim ćelijskim linijama (Slika 22B-F). ADCC striktno zavisi od specifičnog vezivanja IMAB362 za ciljni molekul, budući da IMAB362 i PBMC ubijaju samo ciljne ćelije pozitivne na CLDN18.2. Polovina maksimalnog ubijanja i maksimalne stope ubijanja koje u humanim ćelijama kancera pankreasa indukuje IMAB362 varirale su među davaocima PBMC i takođe su zavisile od broja pasaže ćelija koji utiče na nivo ekspresije CLDN18.2.

[0325] Koncentracije IMAB362 koje izazivaju polovinu maksimalnih stopa ubijanja ciljnih ćelija, kao i maksimalne stope ubijanja prikazane su na Slici 22G-H. LVT ćelijske linije CA pankreasa su ubijene dodavanjem malih količina antitela pri visokim stopama, dok su za DANG i Panc05 najveće koncentracije antitela potrebne da bi se dostiglo ~50% maksimalne stope ubijanja ćelija. Za Panc05.04, rezultati dobijeni sa subklonom 15D3 (CLDN18.2-pozitivan klon selektovan graničnim razblaživanjem Panc05.04 i FACS analizom) koji su uključeni na slici prikazuju uporedive stope ADCC lize sa onom kod LVT ćelijskih linija. Nažalost, ekspresija CLDN18.2 u ovom klonu se brzo utišava in vitro nakon subkultivacije ćelija i stoga ovaj klon nije korišćen za dalje eksperimente.

CDC aktivnost protiv ćelija kancera pankreasa posredovana IMAB362

[0326] Ćelije kancera pankreasa, koje su ubijene sa IMAB362 u ADCC testovima, analizirane su na njihovu osetljivost na komplement-zavisnu litičku aktivnost IMAB362. Pored toga, LVT ćelijske linije i parentalni sojevi su ispitani na CDC.

[0327] CDC aktivnost se aktivira kompleksima antigena i IgM ili IgG antitela (klasični put) ili mikrobnim površinama (alternativni put). U klasičnom putu, komplement C5 se pretvara u C5b. Anafilotoksini C3a, C4a i C5b se oslobađaju i kompleks za napad na membranu (MAC) se formira sekvencijalnim vezivanjem C5b, C7, C8 i C9. Ovaj put inhibiraju rastvorljivi, ali i proteini vezani za membranu (npr. CR1, DAF, MCP, CD59, CD55, CD46) koji štite sopstvena tkiva.

[0328] Ćelije CHO-K1 koje su stabilno transfektovane sa CLDN18.2 (p740) i luciferazom korišćene su kao pozitivne kontrole u svakom testu (Slika 23A). Ćelijske linije DANG, BxPC3, YAPC, Patu8988S, Panc05.04, CAPAN1 i Suit2 nisu lizirane sa IMAB362 i dodatkom pula zdravog humanog seruma (Slika 23B). Iako su ćelije DANG, Patu8988S i Panc05.04 pozitivne na CLDN18.2, kao što je prikazano u svim prethodnim eksperimentima, ove ćelije nisu lizirane na način zavisan od komplementa. Ovo je najverovatnije zbog činjenice da neoplastične ćelije prekomerno eksprimiraju jedan ili više membranski vezanih inhibitornih proteina komplementa (npr. CD46, CD55 i CD59) (Geis et al., Curr Cancer Drug Targets, 2010. 10:922-931). Međutim, i dalje ostaje nejasno da li ekspresija ovih inhibitornih proteina na tumorskim ćelijama utiče na klinički ishod terapije antitelima (Dzietczenia et al. Med. Oncol. 2010, 27:743-6; Weng and Levy et al., Blood 200198:1352 -7).

[0329] Pored endogenih ćelijskih linija, sve LVT ćelijske linije su testirane u CDC testovima. Kao što je prikazano na Slici 23, dodavanje IMAB362 i seruma ćelijama MiaPaCa-2-LVT, Suit2-LVT i CAPAN1-LVT rezultovalo je dozno-zavisnom lizom sa vrednostima EC50u rasponu od 0.3 do 2.6 µg/ml.

Pregled ekspresije CLDN18.2 u humanim ćelijskim linijama kancera pankreasa

.sa

krea

pan

cera n ka

linijaih k ijsćelestik eritk

kara

vivo n i i o trvi in ne erInt19 la abeT

0] 33

[0

Primer 5: Efikasnost IMAB362 na modelima ksenotransplantata kancera pankreasa

[0331] Za ispitivanje efikasnosti IMAB362 in vivo izabrano je 10 od 41 testiranog modela ksenotransplantata kancera pankreasa. Na modelima ksenotransplantata pankreasa sa visokom ekspresijom CLDN18.2, tretman sa IMAB362 pokazao je visok antitumorski efekat. Ovo je ispitivano tretmanom miševa koji nose subkutane ksenotransplantate BxPC3-LVT ili MiaPaCa-2-LVT u levom boku. Tretman je započet 3 dana nakon inokulacije tumora, injekcijama od 200 µg IMAB362 dva puta nedeljno. Miševi tretirani sa IMAB362 pokazali su značajno inhibiran rast tumora u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim fiziološkim rastvorom. Pored toga, supresija rasta tumora kod miševa tretiranih sa IMAB362 rezultovala je produženom medijanom preživljavanja (Slika 24 i Slika 25). Efikasnost IMAB362 korelira sa trajanjem lečenja. Započinjanje tretmana sa IMAB362 u ranim vremenskim tačkama imalo je povećan efekat na inhibiciju rasta tumora u odnosu na kasne početke tretmana za ispitivanje efekta na ustanovljene tumore. Štaviše, antitumorski efekat IMAB362 zavisio je od količine ekspresije CLDN18.2 u ciljnim ćelijama. Inhibicija rasta tumora sa niskim ekspresijom CLDN18.2, kao što su ksenotransplantati DANG i Patu8988S, posredovana sa IMAB362 bila je smanjena u odnosu na inhibiciju rasta tumora pri korišćenju ksenotransplantata tumora sa visokom ekspresijom CLDN18.2.

Primer 6: Tretman modela pankreasne metastaze miša

[0332]

Tabela 20: Sažet prikaz tretmana za testiranje efikasnosti IMAB362 na metastazu kancera pankreasa

Model metastaze Suit2-LVT:

[0333] Miševima je intravenski ubrizgano 2x10<6>ćelija Suit2-LVT i tretirani su sa 200 µg IMAB362, kontrolnog izotipskog antitela (IMAB027), ili PBS-om, kao što je naznačeno u Tabeli 20. Posle 35 dana prvi miš (kontrolna izotipska grupa) je uginuo. Shodno tome, svi miševi su žrtvovani 42. dana, a pluća i jetre su uzeti za IHC i Q-PCR analize.

[0334] Q-PCR analiza humane DNK u plućima miševa je ponovljena najmanje dva puta u triplikatu. Izračunavanje procenta humane DNK sa dobijenim vrednostima Ct otkrilo je značajno smanjenje (P<0.05) Suit2-LVT metastaza otkrivenih u plućima, ako su miševi tretirani sa IMAB362 (Slika 26A) u poređenju sa PBS-om i kontrolnim izotipskim tretmanima. Da bi se potvrdili ovi rezultati, pripremljeni su isečci tkiva uzoraka pluća i obojeni korišćenjem antitela protiv MHC-I. Površina pozitivno obojenih ćelija u isečcima pluća izračunata je korišćenjem programa ImageJ. Kod tretmana sa IMAB362 primećena je značajna inhibicija (P<0.05) u poređenju sa tretmanom PBS-om, što potvrđuje rezultate dobijene Q-PCR metodom. Međutim, kod kontrolnog izotipskog antitela, razlike nisu bile značajne (Slika 26B). Ovo neslaganje je najverovatnije posledica razlika u obradi tkiva: obrada isečaka tkiva za IHC metodu pruža samo uvid u veoma mali deo pluća u poređenju sa Q-PCR analizom, za koju se genomska DNK ekstrahuje iz polovine tkiva.

[0335] Pored obrade tkiva, moguće je da rezultat predstavlja neočekivane inhibirajuće efekte kontrolnog izotipskog antitela koje ciljno deluje na CLDN6. Da bi se istražila ova opcija, ćelije Suit2-LVT su analizirane na ekspresiju CLDN6 i vezivanje IMAB027 u FACS. Dodavanje 200 µg/ml IMAB362 u ćelije Suit2-LVT potvrdilo je snažno vezivanje za ćelije, dok je dodavanje 200 µg/ml IMAB027 rezultovalo slabim vezivanjem antitela za ove ciljne ćelije, što ukazuje na to, da je CLDN6 zaista slabo eksprimiran na ovim ćelijama. Ovi rezultati sugerišu da su najmanje dva faktora (obrada tkiva i slaba inhibicija IMAB027) dovela do uočenih neslaganja sa kontrolnim izotipskim antitelom.

Model metastaze Patu8988S

[0336] Da bi se analizirao efekat tretmana sa IMAB362 na razvoj i rast metastaze Patu8988S in vivo, 10 miševa po grupi je primilo injekciju od 2x10<6>ćelija Patu8988S. Prvi eksperiment je izveden poređenjem tretmana sa IMAB362 sa miševima tretiranim PBS-om. U svakoj grupi 1 miš je uginuo odmah nakon ubrizgavanja ćelija. Kod ostalih 18 miševa, metastaza se razvila veoma brzo u poređenju sa eksperimentima implantiranja. Posle 63 dana, prva 2 miša u PBS grupi su žrtvovana zbog lošeg zdravstvenog stanja. Svi ostali miševi su žrtvovani nakon 65 dana. Optička analiza pluća otkrila je velike metastaze u tkivima pluća. Količina metastaza je analizirana u Q-PCR eksperimentima (Slika 27). Rezultati pokazuju da IMAB362 inhibira rast metastaze u plućnom tkivu.

[0337] Drugi eksperiment sa 11 miševa po grupi je izveden poređenjem tretmana sa IMAB362 sa kontrolnim tretmanom sa izotipskom kontrolom (Rituksimab). U ovom eksperimentu metastaze su se razvijale sporo, kao što je primećeno pri implantiranju. Ipak, radi uporedivosti, ovaj drugi eksperiment je okončan nakon 65 dana. Ponovo su tkiva pluća analizirana Q-PCR metodom i ponovo je IMAB362 smanjio rast metastaze. Jedan miš iz grupe IMAB362 je identifikovan kao nosilac atipične vrednosti i isključenje te atipične vrednosti je rezultovalo skoro značajnom (P=0.0588) inhibicijom. Ovi podaci su verifikovani IHC analizom površine, kao što je opisano za eksperiment metastaze Suit2-LVT. Ovde je mogla da se identifikuje ista atipična vrednost, a izostavljanjem ove vrednosti u t-testu, što je vrednost za istog miša, inhibicija IMAB362 je takođe na granici značajnosti (P=0.0691).

Primer 7: Primarna farmakodinamika IMAB362 u kombinaciji sa hemoterapijom

Osetljivost ćelija karcinoma pankreasa na gemcitabin i oksaliplatin

[0338] Ćelijske linije kancera pankreasa koje konstitutivno eksprimiraju CLDN18.2 (DANG, Patu8988S) i ćelije stabilno transdukovane sa CLDN18.2 (MiaPaCa-2-LVT, BxPC3-LVT) korišćene su za istraživanje načina delovanja IMAB362 u kombinaciji sa hemoterapijskim agensima oksaliplatinom ili gemcitabinom.

[0339] Hemijski, gemcitabin (Gemzar, koji prodaje Eli Lilly&Co) je analog nukleozida. Kao i kod 5-fluorouracila (5-FU) i drugih analoga pirimidina, trifosfatni analog gemcitabina zamenjuje jedan od gradivnih blokova nukleinskih kiselina tokom replikacije DNK. Proces zaustavlja rast tumora, pošto samo jedan dodatni nukleozid može da bude vezan za "neispravan" nukleozid, što dovodi do apoptoze.

[0340] Oksaliplatin funkcioniše tako što formira i inter- i intra-lančane unakrsne veze u DNK. Unakrsne veze u DNK sprečavaju replikaciju i transkripciju DNK, što dovodi do smrti ćelije. (Graham, Joanne; Mushin, Mohamed; Kirkpatrick, Peter (January 2004). "Oxaliplatin". Nature Reviews Drug Discovery 3 (1): 11-2.)

[0341] Krive doza-odgovor gemcitabina i oksaliplatina pokazale su različite osetljivosti testiranih ćelijskih linija tumora pankreasa (Slika 28 i Slika 29).

Tabela 21: Vrednosti IC50 gemcitabina i oksaliplatina za ćelijske linije karcinoma pankreasa.

[0342] Da bi se inhibirala ćelijska proliferacija Patu8988S, neophodne su visoke koncentracije gemcitabina (IC50 > 100 ng/ml) ili oksaliplatina (IC50 > 500 ng/ml). DANG i BxPC3-LVT su veoma osetljive na gemcitabin, ali ne i na oksaliplatin. Ćelije MiaPaCa-2-LVT su najosetljivije na oksaliplatin, ali manje osetljive na tretman gemcitabinom (Slika 28, Slika 29 i Tabela 21).

Efekat hemoterapijskih agenasa na ekspresiju CLDN18.2 u ćelijskim linijama karcinoma pankreasa

[0343] Način delovanja koji pokreće vezivanje IMAB362 zavisi striktno od prisustva i gustine njegovog ciljnog molekula CLDN18.2 na površini ćelije. Predtretman ćelija DANG i Patu8988S gemcitabinom (Gem) kao i gemcitabinom u kombinaciji sa oksaliplatinom (GemOx) rezultovao je povećanjem nivoa iRNK i proteina CLDN18.2, što je pokazano RT-PCR (Slika 30) i Western blot analizom (Slika 31) netretiranih ćelija i ćelija koje su prethodno tretirane hemoterapijom. Shodno tome, količina proteina CLDN18.2 na koju može ciljno da deluje IMAB362 na površini ćelijskih linija kancera pankreasa, prethodno tretiranih sa Gem ili GemOx, je povećana, kao što je pokazano protočnom citometrijom (Slika 32).

[0344] Tretman ćelija DANG i Patu8988S gemcitabinom dovodi do ushodne regulacije CLDN18.2. Patu8988S pokazuje snažnu ushodnu regulaciju CLDN18.2 pri primeni Gem i nižu ushodnu regulaciju pri primeni GemOx.

Efekat hemoterapijskih jedinjenja na ćelijski ciklus i ekspresiju CLDN18.2

[0345] Progresija ćelijskog ciklusa se odnosi na redosled događaja u ćeliji između jedne mitotičke deobe i druge. Nakon faze mirovanja (G0/G1) sledi faza sinteze DNK (S), zatim faza uvećanja ćelije (G2), a replikacija DNK (M) je praćena podelom ćelije na dve potomačke ćelije. Bilo koje ometanje ćelijske mašinerije može da inhibira napredovanje čitavog ciklusa u bilo kojoj fazi ćelijskog ciklusa. Na primer, specifični hemoterapijski agensi mogu da blokiraju progresiju u G2 ili M, ili i u G2 i u M (G2/M).

[0346] Tretman DANG ili Patu8988S gemcitabinom dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa u S-fazi (Slika 33, Slika 34). Analizirane su ćelije Patu8988S kultivisane sa Gem. Tretman gemcitabinom ne samo da dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa, već i menja ekspresiju CLDN18.2 (Slika 34B). Promena gustine CLDN18.2 nakon tretmana gemcitabinom je još veća kada se porede proliferišuće ćelije u S fazi sa ćelijama u mirovanju u G0/G1 fazi (Slika 34C). U ćelijama Patu8988S, CLDN18.2 se eksprimira u svim fazama ćelijskog ciklusa. Nakon tretmana gemcitabinom, njegova ekspresija se čak povećava, pri čemu su najviši nivoi CLDN18.2 po ćeliji nađeni u ćelijskoj populaciji S faze.

[0347] Ovaj poremećaj fenotipa tumorske ćelije ima značajan uticaj na biološku efikasnost terapijskih antitela. ADCC i CDC su zavisni od doze i stoga povećanje ciljne strukture CLDN18.2 pruža sinergističku korist pri standardnim hemoterapijskim režimima.

[0348] Ćelije Kato III, ćelijska linija humanog tumora želuca, kultivisane su u medijumu RPMI 1640 (Invitrogen) koji sadrži 20% FCS (Perbio) i 2 mM Glutamax (Invitrogen) na 37°C i 5% CO2, sa ili bez citostatskih jedinjenja. 5-FU (Neofluor kompanije NeoCorp AG) je testiran u koncentraciji od 10 ili 100 ng/ml, a oksaliplatin (Hospira) u koncentraciji od 50 ili 500 ng/ml.

8x10<5>ćelija Kato III je kultivisano 96 časova bez promene medijuma, ili 72 časa nakon čega je usledila 24-časovna kultivacija u standardnom medijumu, kako bi se otklonio zastoj ćelijskog ciklusa, u ploči za kulturu tkiva sa 6 bunarčića na 37°C, 5% CO2. Ćelije su sakupljene pomoću EDTA/tripsina, isprane i analizirane.

[0349] Za ekstracelularnu detekciju CLDN18.2 ćelije su obojene monoklonskim anti-CLDN18.2 antitelom IMAB362 (Ganymed) ili kontrolnim antitelom sa odgovarajućim izotipom (Ganymed). Kao sekundarni reagens korišćeno je kozje-anti-huIgG-APC antitelo kompanije Dianova.

[0350] Faze ćelijskog ciklusa su određene na osnovu merenja sadržaja ćelijske DNK. Ovo omogućava da se napravi razlika između ćelija u G1-, S- ili G2-fazi ćelijskog ciklusa. U S-fazi se javlja duplikacija DNK, dok u G2-fazi ćelije rastu i pripremaju se za mitozu. Analiza ćelijskog ciklusa je urađena korišćenjem kompleta CycleTEST PLUS DNA Reagent kompanije BD Biosciences prema protokolu proizvođača. Podaci protočne citometrije su dobijeni i analizirani korišćenjem sistema BD FACS CantoII (BD Biosciences) i softvera FlowJo (Tree Star).

[0351] Kolone na Slici 35a i b pokazuju odgovarajući procenat ćelija u G1-, S- ili G2-fazi ćelijskog ciklusa. Ćelije Kato III kultivisane u medijumu pokazuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa pretežno u G1-fazi. Ćelije tretirane sa 5-FU su blokirane pretežno u S-fazi. Ćelije Kato III tretirane oksaliplatinom pokazuju obogaćivanje ćelija pretežno u G1- i G2-fazi. Kao što se može videti na Slici 35c, zaustavljanje ćelijskog ciklusa u S-fazi ili G2-fazi dovodi do stabilizacije ili ushodne regulacije CLDN18.2. Čim se ćelije oslobode iz bilo koje faze ćelijskog ciklusa (Slika 35b), ekspresija CLDN18.2 na ćelijskoj površini Kato III ćelija postaje ushodno regulisana (Slika 35d).

[0352] Ćelije Kato III su prethodno tretirane 4 dana irinotekanom ili docetakselom i analizirane na ekspresiju CLDN18.2 i zaustavljanje ćelijskog ciklusa. Tretman ćelija irinotekanom je rezultovao dozno-zavisnom inhibicijom rasta ćelija i zaustavljanjem ćelijskog ciklusa u S/G2-fazi (Slika 36). Tretman ćelija docetakselom doveo je do dozno-zavisne inhibicije rasta ćelija i zaustavljanja ćelijskog ciklusa u G2-fazi (Slika 36).

Efekat hemoterapije na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) indukovanu pomoću IMAB362

[0353] Serija eksperimenata je izvedena sa ćelijskim linijama kancera pankreasa Patu8988S i DANG koje konstitutivno eksprimiraju CLDN18.2. Da bi se ispitali efekti gemcitabina (Gem) ili gemcitabina oksaliplatina (GemOx) na ADCC posredovan IMAB362. Krive doza-odgovor za ćelijsku lizu posredovanu IMAB362 prethodno tretiranih ćelija upoređene su sa onim kod ćelija kultivisanih u medijumu.

[0354] Krive doza-odgovor ćelija DANG prethodno tretiranih (2 dana) sa Gem (1 ng/ml) ili GemOx (Gem 1 ng/ml Ox 10 ng/ml) su pomerene nagore i nalevo u poređenju sa netretiranim ciljnim ćelijama (Slika 37A). Tretman tumorskih ćelija sa Gem ili GemOx dovodi do ushodne regulacije CLDN18.2 i veće osetljivosti na ADCC posredovanu antitelom IMAB362. Nakon tretmana hemoterapijskim agensima, moglo se primetiti smanjenje vrednosti EC50 i veća maksimalna ćelijska lizu pri ADCC posredovanoj antitelom IMAB362 (Slika 37B) u DANG ćelijama.

[0355] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) uključujući NK ćelije, monocite, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije zdravih humanih davalaca su prečišćene centrifugiranjem na gradijentu gustine Ficoll Hypaque. Oprane efektorske ćelije su zasejane u medijumu X-Vivo. Ćelije Kato III koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 i koje potiču iz želuca korišćene su kao ciljne ćelije u ovoj postavci. Ciljne ćelije su stabilno eksprimirale luciferazu, a lucifer žutu oksiduju samo žive ćelije. Prečišćeno anti-CLDN18.2 antitelo IMAB362 je dodato u različitim koncentracijama, a kao kontrolno izotipsko antitelo korišćeno je irelevantno himerno huIgG1 antitelo. Uzorci su analizirani na citolizu merenjem luminescencije koja je rezultat oksidacije lucifer žute, što predstavlja vrednost za količinu živih ćelija preostalih nakon citotoksičnosti indukovane pomoću IMAB362. Ćelije Kato III koje su prethodno tretirane 3 dana irinotekanom (1000 ng/ml), docetakselom (5 ng/ml) ili cisplatinom (2000 ng/ml) upoređene su sa netretiranim ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu i ADCC indukovana pomoću IMAB362 je kvantifikovana.

[0356] Ćelije Kato III prethodno tretirane 3 dana irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom pokazale su niži nivo vijabilnih ćelija u poređenju sa ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu (Slika 38a), a ekspresija klaudinl8.2 u ćelijama prethodno tretiranim irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom bila je povećana u poređenju sa ćelijama kultivisanim u medijumu (Slika 38b).

[0357] Štaviše, predtretman ćelija Kato III irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom povećao je potentnost IMAB362 u indukciji ADCC (Slika 38c, d).

Efekat hemoterapije na CDC indukovanu pomoću IMAB362

[0358] Efekat IMAB362 na CDC je okarakterisan inkubacijom sa ciljnim ćelijama u prisustvu humanog seruma kao izvora komplementa.

[0359] Ćelije MiaPaCa-2-LVT kultivisane u medijumu su pokazale EC50 vrednosti za IMAB362-specifičnu lizu od 7665 ng/ml. Tretman sa Gem doveo je do smanjenja EC50 na 4677 ng/ml u poređenju sa povećanjem maksimalne lize (Slika 39).

[0360] Efekti hemoterapijskih agenasa na CDC indukovanu pomoću IMAB362 su analizirani prethodnim tretmanom ćelija kancera želuca KATO III sa 10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina (5-FU OX) tokom 48 časova. Reprezentativne krive doza-odgovor za CDC indukovanu pomoću IMAB362 korišćenjem ćelija KATO III koje su prethodno tretirane hemoterapijom su prikazane na Slici 40. Predtretman tumorskih ćelija tokom 48 časova povećao je sposobnost IMAB362 da indukuje CDC, što je rezultovalo većom maksimalnom lizom prethodno tretiranih ćelija tumora u poređenju sa netretiranim ćelijama.

Primer 8: Efikasnost IMAB362 u kombinaciji sa hemoterapijom u modelima tumora miša

[0361] Antitumorska aktivnost IMAB362 u kombinaciji sa Gem ili GemOx ispitana je na modelima subkutanog ksenotransplantata karcinoma pankreasa, koji su ranije korišćeni za ispitivanje efikasnosti IMAB362 kao pojedinačnog agensa.

[0362] Goli miševi sa tumorom BxPC3-LVT ili MiaPaCa-2-LVT tretirani sa IMAB362 pokazali su značajno usporavanje rasta tumora u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim kontrolnim fiziološkim rastvorom. Hemoterapija sa do 100 mg/kg gemcitabina bez dodatnog tretmana sa IMAB362 nije pokazala značajan terapijski efekat na ksenotransplantate BxPC3-LVT ili MiaPaCa-2-LVT. Nasuprot tome, kombinovani tretman sa 50-100 mg/kg gemcitabina i IMAB362 je rezultovao značajno povećanom inhibicijom rasta tumora i produženim preživljavanjem miševa sa tumorom u poređenju sa miševima lečenim samo hemoterapijom (Slika 41, Slika 42, Slika 43). Ova zapažanja ukazuju na postojanje sinergističkih terapijskih efekata kombinacije gemcitabina i imunoterapije sa IMAB362.

[0363] Kada se koriste visoke doze gemcitabina od 2x 150 mg/kg nedeljno, uspostavljeni tumori ksenotransplantata MiaPaCa-2-LVT su snažno inhibirani u rastu tumora nezavisno od tretmana sa IMAB362 (Slika 44A). Međutim, miševi tretirani kombinovanom terapijom IMAB362 i gemcitabina pokazali su veoma značajno produženo preživljavanje u poređenju sa miševima tretiranim gemcitabinom kao pojedinačnim agensom (Slika 44B).

Primer 9: Tretman sa ZA/IL-2 dovodi do ekspanzije velikih količina Vγ9Vδ2 T-ćelija

[0364] PBMC su kultivisane 14 dana u medijumu RPMI sa dodatkom 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM zoledronske kiseline (ZA). Procenat Vγ9+Vδ2+ T ćelija u populaciji CD3+ limfocita i procenat CD16+ ćelija u populaciji CD3+Vγ9+Vδ2+ T ćelija određen je 0. i 14. dana multikolornom FACS metodom.

[0365] Dodatak IL-2 u kulture PBMC je neophodan za preživljavanje i rast limfocita. Oni se efikasno šire u kulturama obogaćenim sa 300 U/ml IL-2. FACS analiza korišćenjem antitela specifičnih za Vγ9 i Vδ2 otkriva da dodavanje ZA/IL-2 specifično indukuje akumulaciju Vγ9Vδ2 T ćelija. Posle 14 dana, populacija CD3+ limfocita može da sadrži do 80% Vγ9Vδ2 T ćelija. Deo Vγ9Vδ2 T ćelija eksprimira CD16, a obogaćivanje ovim ćelijama u populaciji CD3+ limfocita je 10-700 puta, u zavisnosti od davaoca. Obogaćivanje CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelijama u kulturama je 10-600 puta veće u poređenju sa kulturama uzgajanim bez ZA. Podnosioci prijave zaključuju da in vitro tretman PBMC sa ZA/IL-2 dovodi do ushodne regulacije FcγIII receptora CD16 koji posreduje u ADCC u značajnom udelu γδ T ćelija.

[0366] Slično NK ćelijama, Vγ9Vδ2 T ćelije ekspandirane pomoću ZA/IL-2 su pozitivne na CD16, FcγRIII receptor preko kojeg antitelo vezano za ćeliju pokreće ADCC. Da bi se procenilo da li su Vγ9Vδ2 T ćelije sposobne da indukuju snažnu ADCC u sprezi sa IMAB362, sproveden je niz eksperimenata.

[0367] PBMC dobijene od 2 različita davaoca (br. 1 i br. 2) su kultivisane u medijumu sa 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM ZA. Posle 14 dana ćelije su sakupljene i dodate sa rastućim koncentracijama (0.26 ng/ml - 200 µg/ml) IMAB362 ćelijama NUGC-4 koje eksprimiraju CLDN18.2. Specifično ubijanje ćelija je određeno u testovima sa luciferazom. ADCC testovi su izvedeni sa 27 davalaca ćelija koje su uzgajane u 300 U/ml IL-2 sa, ili bez, ZA gde su NUGC-4 služile kao ciljne ćelije. Za svakog davaoca, vrednosti EC50izračunate iz krivih doza-odgovor i maksimalna specifična stopa ubijanja pri dozi od 200 µg/ml IMAB362 su ocenjene na dijagramima rasipanja.

[0368] Uočena je jaka ADCC aktivnost zavisna od IMAB362 protiv CLDN18.2-pozitivnih ćelija NUGC-4 korišćenjem PBMC kultivisanih 14 dana sa ZA/IL-2. Pri korišćenju kultura PBMC tretiranih sa ZA/IL-2, ADCC zavisi od prisustva Vγ9Vδ2 T ćelija. Ako se ćelije uzgajaju bez ZA, aktivnost ADCC je smanjena za većinu davalaca. U ovim kulturama, rezidualna aktivnost ADCC zavisi od NK ćelija. Testiranjem više od 20 davalaca, ADCC testovi otkrivaju da tretman PBMC sa ZA/IL-2 poboljšava EC50i maksimalne specifične stope ubijanja u poređenju sa PBMC uzgajanim samo sa IL-2.

Primer 10: Efikasnost IMAB362 u kombinaciji sa gemcitabinom u modelu metastaze miša:

[0369] Da bi se analizirao efekat tretmana sa IMAB362 u kombinaciji sa gemcitabinom na metastaze Patu8988S na plućima in vivo, 12 miševa Hsd:Athymic Nude-Foxn1<nu>po grupi je primilo intravensku injekciju 2x10<6>ćelija Patu8988S u repnu venu. 14 dana nakon injekcije tumorskih ćelija miševi su primali 200 µg IMAB362 ili PBS kao kontrolu (i.v./i.p.) dva puta nedeljno i nedeljnu dozu od 100 mg/kg gemcitabina i.p. tokom 4 nedelje. Tretman sa IMAB362 ili PBS-om je nastavljen sve dok miševi nisu žrtvovani 70. dana nakon injekcije tumorskih ćelija. Opterećenje pluća ksenotransplantiranim tumorima analizirano je QPCR metodom za humanu DNK u preparatima pluća i optičkom analizom imunohistološkog bojenja anti-humanim MHC-I antitelom (klon EPR1394Y). Rezultati pokazuju da miševi tretirani sa IMAB362 i gemcitabinom imaju značajno smanjenu količinu humane DNK u plućima (Slika 45A) i da je površina isečaka pluća obojenih na humani MHC-I kompleks značajno manja nego u plućima miševa tretiranih irelevantnim antitelom i gemcitabinom (Slika 45B). Oba postupka su pokazala smanjenje tumorskog opterećenja ksenotransplantatom Patu8988s u plućima miševa tretiranih sa IMAB362 i gemcitabinom, što ukazuje na to da je kombinacija sa IMAB362 značajno bolja od monoterapije gemcitabinom.

12

��

12

1

11

12

1

��

1

�

1

�

1

��

14

14

��

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

Claims (21)

Patentni zahtevi

1. Antitelo za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju kancera pankreasa, naznačeno time, što ćelije kancera pankreasa eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu navedeni postupak sadrži davanje pacijentu (i) antitela i (ii) agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, gde

(a) antitelo se vezuje za CLDN18.2 i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu antitelo sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 32 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 39, i

(b) agens je hemoterapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od gemcitabina i njegovog proleka ili soli, pri čemu je prolek estar,

gde, opciono, postupak dodatno sadrži primenu najmanje jednog dodatnog hemoterapijskog agensa.

2. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu postupak sadrži primenu kombinacije gemcitabina i oksaliplatina, kombinacije gemcitabina i cisplatina, kombinacije gemcitabina i karboplatina ili kombinacije oksaliplatina, 5-fluorouracila i irinotekana.

3. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu postupak sadrži primenu folinske kiseline, oksaliplatina, 5-fluorouracila i irinotekana.

4. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde teški lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 17, a laki lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 24.

5. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde postupak dodatno sadrži primenu agensa koji stimuliše γδ T ćelije, pri čemu su γδ T ćelije poželjno Yγ9Vδ2 T ćelije, a navedeni agens koji stimuliše γδ T ćelije je poželjno bisfosfonat, i poželjnije bisfosfonat koji sadrži azot (aminobisfosfonat).

6. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde je agens koji stimuliše γδ T ćelije odabran iz grupe koja se sastoji od zoledronske kiseline, klodronske kiseline, ibandronske kiseline, pamidronske kiseline, risedronske kiseline, minodronske kiseline, olpadronske kiseline, alendronske kiseline, inkadronske kiseline i njihovih soli.

7. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 5 ili 6, gde se agens koji stimuliše γδ T ćelije primenjuje u kombinaciji sa interleukinom-2.

8. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde antitelo posreduje u ubijanju ćelija putem jednog ili više mehanizama od lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC) i lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC).

9. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, gde je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela koje je proizvedeno pomoću, i/ili može da se dobije iz, klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2810, (ii) antitela koje predstavlja himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), i (iii) antitela koje sadrži antigen-vezujući deo ili antigenvezujuće mesto, konkretno varijabilni region, antitela pod (i).

10. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu postupak sadrži primenu antitela u dozi do 1000 mg/m<2>ili ponovljeno, u dozi od 300 do 600 mg/m<2>.

11. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, gde kancer pankreasa sadrži primarni kancer, uznapredovali kancer ili metastatski kancer, ili njihovu kombinaciju, kao što je kombinacija primarnog kancera pankreasa i metastatskog kancera.

12. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde metastatski kancer sadrži metastazu na limfne čvorove, jajnik, jetru ili pluća, ili njihovu kombinaciju.

13. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, gde kancer pankreasa sadrži kancer pankreasnog kanala.

14. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, gde kancer pankreasa sadrži adenokarcinom ili karcinom, ili njihovu kombinaciju.

15. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, gde kancer pankreasa sadrži duktalni adenokarcinom, mucinozni adenokarcinom, neuroendokrini karcinom ili karcinom acinarnih ćelija, ili njihovu kombinaciju.

16. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, gde je kancer pankreasa delimično ili potpuno refraktoran na lečenje gemcitabinom, kao što je monoterapija gemcitabinom.

17. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, gde prevencija kancera pankreasa sadrži prevenciju pojave recidiva kancera pankreasa.

18. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17, gde je pacijent imao hiruršku intervenciju zbog kancera pankreasa.

19. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, gde pacijent ima prekanceroznu pankreasnu leziju, konkretno, prekanceroznu pankreasnu leziju koja sadrži početnu malignu histološku promenu u kanalima pankreasa.

20. Medicinski preparat za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera pankreasa, gde navedeni medicinski preparat sadrži (i) antitelo koje se vezuje za CLDN18.2 i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu antitelo sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 32 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 39 i (ii) gemcitabin.

21. Medicinski preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, koji je prisutan u obliku kompleta, koji sadrži prvu posudu koja uključuje antitelo i drugu posudu koja uključuje gemcitabin.