RS64074B1 - Kombinacije imetelstata i venetoklaksa za lečenje akutne mijeloidne leukemije - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetno otkriće odnosi se na lečenje hematoloških kancera korišćenjem kombinacije inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Pacijenti sa akutnom mijeloidnom leukemijom (AML) imaju ograničene mogućnosti lečenja prilikom postavljanja dijagnoze; lečenje obično ima oblik hemoterapije kako bi se brzo smanjilo opterećenje sa leukemijskim ćelijama. Postupci invazivne leukafereze za uklanjanje velikog broja leukocita (normalnih i bolesnih) mogu se primeniti paralelno sa hemoterapijom da bi se privremeno smanjilo opterećenje sa tumorskim ćelijama. Hemoterapija u induktivnoj fazi može biti uspešna, ali većina zdravih ćelija koje se nalaze u koštanoj srži pacijenta je takođe ubijena, što uzrokuje bolest i zahteva dodatnu palijativnu terapiju da bi se sprečila infekcija i povećao broj leukocita. Dodatne runde hemoterapije mogu se koristiti u pokušaju da se pacijenti održe u remisiji; ali recidiv je čest.

[0003] Telomeraza je prisutna u preko 90% tumora svih tipova kancera; i nema je u normalnim, zdravim tkivima. Imetelstat natrijum je novi, prvi u klasi inhibitor telomeraze koji je kovalentno lipidovan 13-merni oligonukleotid (prikazan dole) koji je komplementaran templejtu (hTR) regiona RNK telomeraze. Imetelstat natrijum ne funkcioniše kroz antisens mehanizam i stoga nema neželjene efekte koji se obično primećuju kod takvih terapija. Imetelstat natrijum je natrijumova so imetelstata (prikazano ispod):

[0004] Osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno iz konteksta, dole navedene reference na imetelstat takođe uključuju njegove soli. Kao što je gore pomenuto, imetelstat natrijum je naročito natrijumova so imetelstata.

[0005] ABT-199/venetoklaks (trgovački naziv Venclexta) je Bcl-2 inhibitor koji je odobrila FDA za upotrebu kod pacijenata sa hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL) sa del17p koji su relapsirani/refraktorni. ABT-199 je takođe poznat kao ABT 199, GDC0199, GDC-0199 ili RG7601. Hemijski naziv za ABT-199 je 4-[4-[[2-(4-hlorofenil)-4.4-dimetilcikloheksen-1-il]metil]piperazin-1-il]-N-[3-nitro-4-(oksan-4-ilmetilamino)fenil]sulfonil-2-(1H-pirolo[2.3-b]piridin-5-iloksi)benzamid (Cas No. 1257044-40-8). Osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno iz konteksta, dole navedene reference na ABT-199 takođe uključuju njegove farmaceutski prihvatljive soli. Međutim, konkretno u Primerima, ABT-199 je korišćen u obliku slobodne baze.

[0006] ABT-199, prikazan dole u obliku slobodne baze, veoma je specifičan za Bcl-2, za razliku od drugih inhibitora prve generacije koji pokazuju afinitet za srodne članove porodice Bcl i izazivaju veće neželjene efekte. Inhibicija Bcl-2 blokira pro-apoptotičke signale uzrokovane oštećenjem ili abnormalnostima unutar ćelijske DNK i na kraju dovodi do programirane ćelijske smrti u tretiranim ćelijama preko kaskade kaspaze i apoptoze kroz unutrašnji put.

ABT-199 (prikazano u slobodnom osnovnom obliku)

[0007] WO 2014/088785 opisuje upotrebu inhibitora telomeraze za lečenje mijeloproliferativnih poremećaja i mijeloproliferativnih neoplazmi. Fischer et al. Nature Genetics, 47, 1020-1029 (2015) navodi studiju o genomici i profilisanju lekova za fatalnu TCF3-HLF pozitivnu akutnu limfoblastnu leukemiju i razmatra terapijske opcije, uključujući upotrebu venetoklaksa (ABT-199).

REZIME PRONALASKA

[0008] Kombinovano doziranje imetelstat natrijuma i ABT-199 u AML ćelijama pruža novi tretman za hematološke kancere i posebno AML. Imetelstat natrijum se trenutno klinički istražuje kod mijeloidne fibroze (MF) i mijelodisplastičnog sindroma (MDS). ABT-199 je odobren od strane FDA u CLL i takođe se istražuje u AML.

[0009] Kada se daju u kombinaciji, ova dva agensa mogu promovisati apoptozu u ćelijama kancera. Kada se daju u kombinaciji, ova dva agensa mogu da leče kancer kod subjekta kome je to potrebno.

[0010] Aspekti za koje se traži zaštita su definisani u priloženim patentnim zahtevima.

[0011] Reference na postupke lečenja u rezimeu i detaljnom opisu pronalaska u ovom opisu treba tumačiti kao reference na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom.

[0012] Prema prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je imetelstat za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije (AML) kod pacijenata koji su podvrgnuti lečenju sa ABT-199 ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

[0013] Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je ABT-199 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije (AML) kod pacijenata koji su podvrgnuti lečenju imtelstatom.

[0014] Prema trećem aspektu pronalaska, postoji imetelstat za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje imetelstata i ABT-199 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. U skladu sa četvrtim aspektom pronalaska, obezbeđena je kombinacija koja sadrži imetelstat i ABT-199 ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje kombinacije subjektu kome je to potrebno.

[0015] U različitim aspektima pronalaska koji su gore opisani, imetelstat može biti imetelstat natrijum.

[0016] U skladu sa različitim aspektima pronalaska koji su gore opisani, imetelstat se može primeniti u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, pri čemu svaki ciklus doziranja obuhvata: (a) intravensku primenu 7-10 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje; (b) intravenska primena 7-10 mg/kg imetelstata jednom nedeljno tokom četiri nedelje; (c) intravenska primena 2.5-7 mg/kg imetelstata jednom u tri nedelje; ili (d) intravenska primena 0.5-9.4 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje. Imetelstat može biti imetelstat natrijum.

[0017] Prema različitim gore opisanim aspektima pronalaska, pri čemu ABT-199 može biti za primenu u dozi od: (a) 50-400 mg ABT-199 dnevno; (b) 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili (c) 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga.

[0018] U skladu sa različitim aspektima pronalaska koji su gore opisani, primena ABT-199 može biti jedan dan pre, jedan dan posle ili istog dana kada i davanje imetelstata.

[0019] Predmetni pronalazak takođe uključuje imetelstat natrijum za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML) prema trećem aspektu pronalaska, pri čemu postupak obuhvata davanje imetelstat natrijuma i ABT-199 u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. Predmetni pronalazak takođe uključuje ABT-199 za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML) prema drugom aspektu pronalaska, pri čemu postupak obuhvata davanje ABT-199 i imetelstat natrijuma u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. Predmetni pronalazak takođe uključuje kombinaciju koja sadrži imetelstat natrijum i ABT-199 za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML) prema četvrtom aspektu pronalaska, pri čemu postupak obuhvata davanje kombinacije subjektu kome je to potrebno.

[0020] U takvim aspektima pronalaska, imetelstat natrijum se može primeniti tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, pri čemu svaki ciklus doziranja sadrži: (a) intravensku primenu 7-10 mg/kg imetelstat natrijuma jednom u četiri nedelje; (b) intravensku primenu 7-10 mg/kg imetelstat natrijuma jednom nedeljno tokom četiri nedelje; (c) intravensku primenu 2.5-7 mg/kg imetelstat natrijuma jednom u tri nedelje; ili (d) intravenski davanje 0.5-9.4 mg/kg imetelstat natrijuma jednom svake četiri nedelje.

[0021] U takvim aspektima pronalaska, ABT-199 se može primeniti u dozi od:

(a) 50-400 mg ABT-199 dnevno; (b) 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili (c) 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga.

[0022] U takvim aspektima pronalaska, primena ABT-199 može biti jedan dan pre, jedan dan posle ili istog dana kao i primena imetelstat natrijuma.

[0023] U skladu sa petim aspektom pronalaska, obezbeđen je komplet za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), koji sadrži: (a) imetelstat; i (b) ABT-199 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. U takvim kompletima pronalaska, imetelstat može biti imetelstat natrijum.

[0024] U skladu sa šestim aspektom pronalaska, obezbeđen je in vitro postupak indukovanja apoptoze u ćeliji akutne mijeloidne leukemije (AML) koji obuhvata: dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom imetelstat natrijuma; i dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom ABT-199.

[0025] Prema sedmom aspektu pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži imetelstat i ABT-199. Imetelstat može biti imetelstat natrijum. Kompozicija može biti za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0026]

Sl. 1A i 1B pokazuju efekte tretmana KG-1 ćelija sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 tokom 48 časova. Sl. 1A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija KG-1 nakon 48-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl.1B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman KG-1 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 2A i 2B pokazuju efekte tretmana KG-1 ćelija sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 tokom 96 časova. Sl. 2A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija KG-1 nakon 96-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl.2B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 96-časovni tretman KG-1 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 3A i 3B pokazuju efekte tretmana KG-1 ćelija sa pogrešno uparenim ili nekomplementarnim oligonukleotidima i ABT-199 tokom 48 časova. Slika 3A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija KG-1 posle 48-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl. 3B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman KG-1 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida. Non-Comp se odnosi na nekomplementarni kontrolni oligonukleotid. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 4A i 4B pokazuju efekte tretmana KG-1 ćelija sa pogrešno uparenim ili nekomplementarnim oligonukleotidima i ABT-199 tokom 96 časova. Sl. 4A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija KG-1 posle 96-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl. 4B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman KG-1 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida. Non-Comp se odnosi na nekomplementarni kontrolni oligonukleotid. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 5A i 5B pokazuju efekte tretmana MOLM-13 ćelija sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 tokom 48 časova. Sl.5A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija MOLM-13 nakon 48-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl.5B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 6A i 6B pokazuju efekte tretmana MOLM-13 ćelija sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 tokom 48 časova. Sl.6A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija MOLM-13 nakon 96-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl.6B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 96-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 7A i 7B pokazuju efekte tretmana MOLM-13 ćelija različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnog oligonukleotida tokom 48 časova. Sl. 7A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija MOLM-13 nakon 48-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl. 7B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida. Non-Comp se odnosi na nekomplementarni kontrolni oligonukleotid. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 8A i 8B pokazuju efekte tretmana MOLM-13 ćelija različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida tokom 96 časova. Sl. 8A prikazuje tačkaste dijagrame ćelija MOLM-13 nakon 96-časovnog tretmana sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida i bojenja sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl. 8B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 96-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnih oligonukleotida. Non-Comp se odnosi na nekomplementarni kontrolni oligonukleotid. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 9 prikazuje nivoe transkripcije hTERT merene pomoću RT-qPCR posle tretmana sa imetelstat natrijumom, ABT-199 ili kombinacijom na 48 i 96 časova u ćelijama KG-1 ili MOLM-13.

Sl. 10 prikazuje nivoe aktivnosti enzima telomeraze merene pomoću qPCR TRAP posle tretmana sa imetelstat natrijumom, ABT-199 ili kombinacijom za 48 i 96 časova u ćelijama KG-1 ili MOLM-13.

Sl. 11 prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 12A i 12B prikazuju % apoptotičkih ćelija kao koncentraciju jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199, kontrolnim pogrešno uparenim oligonukleotidom i ne-komplementarnim oligonukleotidom. Sl.

12A prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnog pogrešno uparenog oligonukleotida "Mismatch". Sl. 12B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnog nekomplementarnog oligonukleotida "Non-comp". Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 13 prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 96-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 14A i 14B prikazuju % apoptotičkih ćelija kao koncentraciju jedinjenja za 48-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199, kontrolnim pogrešno uparenim oligonukleotidom i ne-komplementarnim oligonukleotidom. Sl.

14A prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 96-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnog pogrešno uparenog oligonukleotida "Mismatch". Sl. 14B prikazuje grafik % apoptotičkih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 96-časovni tretman MOLM-13 ćelija sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili kontrolnog nekomplementarnog oligonukleotida "Non-comp". Apoptotične ćelije su dvostruko obeležene aneksinom V i propidijum jodidom.

Sl. 15A-15D pokazuju srednje odgovore četiri uzorka PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi) prečišćene iz pune krvi pacijenata sa AML i izložene ex vivo tretmanu ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma u različitim koncentracijama tokom 16 i 40 časova, i analizirane na vitalnost ćelija pomoću testa protočne citometrije bojenjem sa Aneksinom V i propidijum jodidom. Sl.15A i Sl.15B prikazuju grafikone % vijabilnih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 16 časova tretmana pune krvi pacijenata sa AML PBMC prečišćenih Ficoll sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Sl. 15A prikazuje rezultate za CD45<+>leukocite. Sl. 15B prikazuje rezultate za CD45<+>/CD34<+>leukemijske matične ćelije. Sl.15C i Sl.15D prikazuju grafikone % vijabilnih ćelija kao koncentracije jedinjenja za 40 časova tretmana pune krvi pacijenata sa AML PBMC prečišćenih Ficoll sa različitim koncentracijama ABT-199 i/ili imetelstat natrijuma. Sl.15C prikazuje rezultate za CD45<+>leukocite. Sl.15D prikazuje rezultate za CD45<+>/CD34<+>leukemijske matične ćelije. Na Sl.15A-15D, trake grešaka predstavljaju standardna odstupanja. Vijabilne ćelije preostale nakon tretmana se ne obeležavaju ni sa Aneksinom V ni sa propidijum jodidom.

Sl. 16 pokazuje in vivo antitumorsku efikasnost i korist za preživljavanje imetelstat natrijuma ili ABT-1 kao monoterapije ili oba agensa u kombinaciji u modelu miša. Miševi su inokulisani sa MOLM-13 ćelijama (diseminovani model) i tretirani sa: vehikulumom, imetelstat natrijumom i/ili ABT-199, ili kontrolom pogrešno uparenog oligonukleotida plus ABT-199. Praćeno je preživljavanje miševa (n = 10 miševa/grupi na početku) nakon tretmana. Konkretno, Sl.16 prikazuje procenat preživljavanja miševa kao funkciju dana nakon implantacije ćelija tumora. Miševi su tretirani 31 dan sa: (i) vehikulumima (MM+PEG400/Phosal50/ETOH); (ii) imetelstat natrijumom (30 mg/kg), (iii) ABT-199 (100 mg/kg), (iv) MM (pogrešno upareni oligo) (30 mg/kg) i ABT-199 (100 mg/kg); i (v) imetelstat natrijum (30 mg/kg) i ABT-199 (100 mg/kg).

Sl. 17A i 17B prikazuju apoptotičke populacije 96 časova nakon tretmana jednom dozom natrijum-imetelstata za ćelije MOLM-13 i HL-60. Sl.17A prikazuje apoptotičku populaciju (dvostruko obeleženih) 96 časova nakon jednokratne doze tretmana sa imetelstat natrijumom za MOLM-13. Sl. 17B prikazuje apoptotičku populaciju (dvostruko obeleženih) 96 časova nakon jednokratne doze tretmana sa imetelstat natrijumom za AML ćelijsku liniju HL-60.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0027] Sledeći detaljan opis pronalaska biće bolje razumljiv kada se pročita zajedno sa priloženim slikama. Slike su date za ilustraciju određenih primera izvođenja pronalaska. Radi jasnoće otkrića, a ne zbog ograničenja, detaljan opis pronalaska je podeljen na pododeljke koji opisuju ili ilustruju određene karakteristike, primere izvođenja ili primene ovog pronalaska.

[0028] Ovo otkriće opisuje postupke lečenja hematoloških kancera kombinacijom inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2. Populacije ćelija otporne na lekove mogu dovesti do nepotpunog odgovora na lečenje ili relapsa bolesti. Ovo otkriće opisuje kombinaciju inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2 koji rade sinergistički da indukuju veće nivoe apoptoze u AML ćelijama nego što bilo koji lek može indukovati nezavisno. Ovo otkriće opisuje postupak indukovanja apoptoze u hematološkoj ćeliji kancera koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom inhibitora telomeraze i terapeutski efikasnom količinom inhibitora Bcl-2.

1

U nekim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze je imetelstat. U nekim primerima izvođenja, inhibitor Bcl-2 je ABT-199. U nekim primerima izvođenja, hematološki kancer je AML.

[0029] U određenim slučajevima, kombinacija obezbeđuje pojačani inhibibitorni efekat u odnosu na bilo koju komponentu zasebno; u nekim slučajevima, kombinacija obezbeđuje supraaditivni ili sinergistički efekat u odnosu na kombinovane ili aditivne efekte komponenti.

[0030] U nekim primerima izvođenja, ovaj postupak je postupak indukovanja apoptoze u hematološkoj ćeliji kancera. Predmetni postupak može uključiti dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom inhibitora telomeraze i dovođenje ćelije u kontakt sa terapeutski efikasnom količinom inhibitora Bcl-2. U određenim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze je imetelstat. U nekim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum. U nekim primerima izvođenja, inhibitor Bcl-2 je ABT-199. Kontaktiranje ćelije sa inhibitorom telomeraze može se izvesti pre, tokom i/ili posle kontakta ćelije sa Bcl-2 inhibitorom. Kontaktiranje ćelije sa inhibitorom telomeraze i inhibitorom Bcl-2 može se vršiti istovremeno ili uzastopno.

[0031] U jednom aspektu, inhibitor telomeraze je oligonukleotid sa aktivnošću inhibicije telomeraze, posebno oligonukleotid kako je definisano u WO 2005/023994 i/ili WO 2014/088785.

[0032] Generalno, mogu se koristiti različite kombinacije inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2, koje se koriste uzastopno ili istovremeno. Za višestruke doze, dva agensa mogu direktno da se smenjuju, ili dve ili više doza jednog agensa mogu da se smenjuju sa jednom dozom drugog agensa, npr., Istovremena primena oba agensa takođe može biti naizmenično ili na drugi način isprepletena dozama pojedinačnih agenasa. U nekim slučajevima, vreme između doza može biti u periodu od oko 1-6 časova, do oko 6-12 časova, do oko 12-24 časova, do oko 1-2 dana, do oko 1-2 nedelje ili duže nakon početka lečenja. Tokom trajanja lečenja, potreba za kompletiranjem planiranih doza može se ponovo proceniti.

[0033] Termin "apoptoza" se odnosi na proces programirane ćelijske smrti, sa pratećim ćelijskim morfološkim promenama i gubitkom vitalnosti ćelije. U jednom aspektu, postupak indukovanja apoptoze obezbeđuje postupak za lečenje neoplastičnog poremećaja u organizmu kičmenjaka.

[0034] U kontekstu ovog postupka, izraz „indukovanje“ označava direktnu ili indirektnu uzročnu vezu. Dakle, prisustvo i/ili održavanje određenog stanja uzrokuje ili dovodi do indukovanog rezultata.

[0035] Kako se ovde koristi, termin "oko" kada se odnosi na merljivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje i slično, podrazumeva varijacije između ± 20% i ± 0.1%, poželjno ± 20% ili ± 10 %, poželjnije ± 5%, još poželjnije ± 1%, i još poželjnije ± 0.1% od specificirane vrednosti, pošto su takve varijacije prikladne za izvođenje opisanih postupaka.

[0036] Kako se koristi u celom tekstu, "AML" se odnosi na akutnu mijeloidnu leukemiju.

A. Tretman

[0037] Kako se ovde koristi, i kao što je dobro shvaćeno u tehnici, "lečenje" je pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, umanjivanje ili ublažavanje jednog ili više simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovano (tj. bez pogoršanja) stanje bolesti, sprečavanje širenja bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisija (bilo delimična ili potpuna), bez obzira da li se može otkriti ili ne. „Lečenje“ takođe može značiti produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem ako se ne leči.

[0038] Ovo otkriće obezbeđuje tretman (za hematološke kancere kao što je akutna mijeloidna leukemija) koji se sastoji od kombinovanja primene inhibitora telomeraze imetelstat natrijum sa primenom Bcl-2 inhibitora ABT-199. Predmetni postupak lečenja može biti efikasniji i proizvesti veći odgovor na lečenje kod pacijenata sa AML nego što je primećeno upotrebom bilo kog leka zasebno. U jednom aspektu, postupak lečenja obuhvata davanje inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2 u kombinaciji subjektu kome je potrebno lečenje od hematološkog kancera. U drugom aspektu, hematološki kancer je AML. U drugom aspektu, inhibitor telomeraze je imetelstat. U određenim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum. U drugom aspektu, inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

[0039] U nekim primerima izvođenja, doza inhibitora telomeraze koja se daje subjektu je količina dovoljna za lečenje bolesti kada se njegov inhibitor telomeraze koristi zasebno. U određenim primerima izvođenja, doza inhibitora telomeraze koja se daje subjektu je manja od količine dovoljne za lečenje bolesti kada se inhibitor telomeraze koristi zasebno. U jednom aspektu, doza inhibitora telomeraze je smanjena kada se koristi u kombinaciji sa ABT-199 u lečenju subjekta kome je dijagnostikovan AML. U nekim primerima izvođenja inhibitor telomeraze je imetelstat. U nekim primerima izvođenja inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum. U nekim primerima izvođenja, doza inhibitora Bcl-2 koja se daje subjektu je količina dovoljna za lečenje bolesti kada se inhibitor Bcl-2 koristi zasebno. U određenim primerima izvođenja, doza inhibitora Bcl-2 koja se daje subjektu je manja od količine dovoljne za lečenje bolesti kada se inhibitor Bcl-2 koristi zasebno. U nekim primerima izvođenja inhibitor Bcl-2 je ABT-199. U drugom aspektu, doza Bcl-2 inhibitora se smanjuje kada se koristi u kombinaciji sa imetelstatom u lečenju subjekta kome je dijagnostikovan AML. U još jednom izvođenju, njegove doze imetelstata i ABT-199 se smanjuju kada se koriste u kombinaciji u lečenju subjekta kome je dijagnostikovana AML

[0040] U drugom aspektu, dužina lečenja inhibitorom telomeraze se smanjuje kada se koristi u kombinaciji sa Bcl-2 inhibitorom u lečenju subjekta koji ima hematološki kancer. U drugom aspektu, dužina lečenja sa imetelstatom se smanjuje kada se koristi u kombinaciji sa ABT-199 u lečenju subjekta sa hematološkim kancerom. U drugom aspektu, dužina lečenja sa ABT-199 se smanjuje kada se koristi u kombinaciji sa imetelstatom u lečenju subjekta kome je dijagnostikovan hematološki kancer. U drugom aspektu, dužina lečenja i sa imetelstatom i sa ABT-199 je smanjena kada se koristi u kombinaciji u lečenju subjekta kome je dijagnostikovan hematološki kancer. U nekim primerima izvođenja hematološki kancer je AML.

[0041] Ovde opisane kombinacije lekova mogu se davati subjektu kao kompozicija koja sadrži oba leka, ili odvojeno. Kombinacije lekova koje su ovde opisane mogu se davati u kompoziciji kombinovanog leka, npr. IV primenom, ili odvojeno.

B. Hematološki kancer

[0042] Postupci ovog pronalaska mogu se koristiti za lečenje bilo kog pogodnog hematološkog maligniteta. Hematološki maligniteti su oblici kancera koji počinju u ćelijama tkiva koje stvara krv, kao što je koštana srž, ili u ćelijama imunog sistema. Primeri hematoloških kancera su akutne i hronične leukemije, limfomi, multipli mijelom i mijelodisplastični sindromi. U nekim slučajevima, hematološki malignitet se naziva hematološki kancer. Mijeloproliferativne neoplazme, ili MPN, su hematološke neoplazme koje nastaju iz neoplastičnih hematopoetskih mijeloidnih progenitor ćelija u koštanoj srži, kao što su ćelije prekursora crvenih krvnih ćelija, trombocita i granulocita. Proliferacija neoplastičnih progenitornih ćelija dovodi do prekomerne proizvodnje bilo koje kombinacije belih krvnih ćelija, crvenih krvnih ćelija i/ili trombocita, u zavisnosti od bolesti. Ove prekomerno proizvedene ćelije takođe mogu biti abnormalne, što dovodi do dodatnih kliničkih komplikacija. Postoje različite vrste hroničnih mijeloproliferativnih poremećaja. U mijeloproliferativne neoplazme spadaju esencijalna

1

trombocitemija, policitemija vera, hronična mijelogena leukemija, mijelofibroza, hronična neutrofilna leukemija, hronična eozinofilna leukemija i akutna mijelogena leukemija. Mijelodisplastični sindrom (MDS) je grupa simptoma koja uključuje kancer krvi i koštane srži. MDS uključuje, ali ograničeno na, refraktornu anemiju, refraktornu anemiju sa viškom blasta, refraktornu citopeniju sa višelinijskom displazijom i hroničnu mijelomonocitnu leukemiju (CML).

[0043] Hematološki kanceri od interesa uključuju, ali ne ograničavajući se na, AML, esencijalnu trombocitemiju, policitemija vera, primarnu mijelofibrozu, sistemsku mastocitozu, hroničnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu neutrofilnu leukemiju, hroničnu eozinofilnu leukemiju, refraktornu anemiju sa prstenastim sideroblastima, refraktornu citopeniju sa multivinijskom displazijom, refraktornu anemiju sa viškom blasta, tip 1, refraktornu anemiju sa viškom blasta, tip 2, mijelodisplastični sindrom (MDS) sa izolovanim del (5q), MDS koji se ne može klasifikovati, hroničnu mijelomonocitnu leukemiju (CML), atipičnu hroničnu mijeloidnu leukemiju, juveniloprofilnu mijelomonocitnu leukemiju, mijeloproliferativni/mijelodisplastični sindromi-neklasifikovani, B limfoblastna leukemija/limfom, T limfoblastna leukemija/limfom, difuzni krupnoćelijski limfom B ćelija, primarni limfom centralnog nervnog sistema, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom, Burkit-ov limfom/leukemija, folikularni limfom, hronična limfocitna leukemija (CLL)/mali limfocitni limfom, B-ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom/Valdenstrom makroglobulinemija, limfom mantle ćelija, limfomi marginalne zone, limfoproliferativni poremećaji nakon transplantacije, limfomi povezani sa HIV-om, primarni efuzioni limfom, intravaskularni krupnoćelijski limfom B ćelija, primarni kožni limfom B ćelija, leukemija vlasatih ćelija, monoklonska gamopatija nepoznatog značaja, tinjajući multipli mijelom, i solitarni plazacitomi (solitary bone and extramedullary).

[0044] Određeni režimi lečenja iz ovog otkrića su posebno pogodni za lečenje AML. U određenim primerima izvođenja otkrića subjekt na koga se primenjuje lečenje ima AML. Od AML, AML otporni na hemoterapiju, kao što su AML otporni na lečenje citarabinom u kombinaciji sa daunorubicinom ili idarubicinom, mogu se lečiti korišćenjem postupaka koji su ovde otkriveni, npr. primenom imetelstata u kombinaciji sa ABT-199. Odgovor AML na lečenje je poznat u tehnici. Primer procene odgovora na AML prikazan je u tabeli 1.

Tabela 1. Procene odgovora na AML

1

[0045] Ovde opisane kombinacije lekova su pogodne za upotrebu u lečenju bilo koje od bolesti ili poremećaja pomenutih ovde, uključujući hematološki kancer (ili njegove podtipove). Lekovi se mogu davati istovremeno ili uzastopno.

[0046] Ovde opisane kombinacije lekova su pogodne za upotrebu u izazivanju apoptoze u hematološkim ćelijama kancera. Lekovi se mogu davati istovremeno ili uzastopno.

1

[0047] Takođe će biti jasno da su ovde opisane kompozicije pogodne za upotrebu u lečenju bilo koje od bolesti ili poremećaja pomenutih ovde, uključujući hematološki kancer (ili njegove podtipove).

C. Subjekt

[0048] Subjekt je sisar kome je potrebno lečenje od kancera. Generalno, subjekt je ljudski pacijent. U nekim primerima izvođenja otkrića, subjekt može biti sisar koji nije čovek kao što je primat koji nije čovek, životinjski model (npr. životinje kao što su miševi i pacovi koji se koriste u skriningu, karakterizaciji i proceni lekova) i drugi sisari. Kako se ovde koristi, termini pacijent, subjekt i pojedinac se koriste naizmenično.

D. Sredstva protiv kancera

[0049] Sledeći odeljak opisuje lekove koji se koriste u različitim primerima izvođenja ovog otkrića. Pošto su ovi lekovi dobro poznati, daju se samo kratke diskusije. Publikacije citirane u ovom odeljku imaju za cilj da ilustruju aspekte leka ya potrebe lekara; međutim, citiranje određene publikacije u ovom odeljku ili negde drugde u ovom otkriću nema nameru da ograniči ovaj pronalazak u bilo kom pogledu, uključujući doze, kombinacije i indikacije.

1. Inhibitori telomeraze

[0050] Primeri inhibitora telomeraze uključuju, bez ograničenja, imetelstat, posebno imetelstat natrijum. U nekim slučajevima, jedan ili više od jednog inhibitora telomeraze (npr. dva ili tri inhibitora telomeraze) se mogu primeniti na sisara za lečenje hematološkog maligniteta.

[0051] Imetelstat natrijum je natrijumova so imetelstata, koji je sintetički lipid konjugovan, 13-merni oligonukleotid N3'→P5'-tio-fosforamidat. Hemijski naziv za imetelstat natrijum je: DNK, d(3'-amino-3'-deoksi-P-tio) (T-A-G-G-G-T-T-A-G-A-C-A-A), 5'-[O-[2-hidroksi-3-(heksadekanoilamino)propil] fosforotioat], natrijumova so (1:13) (SEQ ID NO: 1). Imetelstat i imetelstat natrijum se mogu proizvesti, formulisati ili dobiti na način opisan na drugim mestima (Asai et al., Cancer Res., 63(14):3931-3939 (2003.)), Herbert et al., Oncogene, 24:5262-5268 (2005.), i Griaznov, Chem. Biodivers., 7:477-493 (2010.).)).

[0052] Imetelstat i imetelstat natrijum targetiraju RNK šablon telomeraze i pokazalo se da

1

inhibiraju aktivnost telomeraze i proliferaciju ćelija u različitim ćelijskim linijama kancera i tumorskim ksenograftama kod miševa. Studije faze 1 koje su uključivale pacijente sa kancerom dojke, sitnoćelijskim kancerom ćelija pluća i drugim solidnim tumorima, multiplim mijelomom ili hroničnom limfocitnom leukemijom pružile su informacije o farmakokinetici i farmakodinamici leka i pomogle da se ustanovi 9.4 mg po kilogramu telesne težine (dato kao 2-časovna intravenska infuzija). Sledeća studija faze 2 koja je uključivala pacijente sa esencijalnom trombocitemijom pokazala je aktivnost snižavanja trombocita praćenu značajnim smanjenjem opterećenja JAK2 V617F i CALR mutantnih alela. Imetelstat natrijum se rutinski primenjuje intravenski; smatra se da se u praksi ovog pronalaska mogu koristiti i drugi putevi primene, kao što je intratekalna primena, intratumoralna injekcija, oralna primena i drugi. Imetelstat natrijum se može primenjivati u dozama koje su uporedive sa onima koje se rutinski koriste klinički. U poželjnim primerima izvođenja, imetelstat natrijum se primenjuje kao što je opisano na ovde drugim mestima.

[0053] Posebna varijanta je prema bilo kojoj od drugih realizacija, pri čemu je imetelstat ograničen na imetelstat natrijum.

2. Bcl-2 Inhibitor ABT-199

[0054] ABT-199 (venetoklaks) predstavlja prvi u klasi, selektivni, oralni inhibitor BCL-2 koji štedi trombocite (Sl.1B). Pokazao je sub-nanomolarni afinitet prema BCL-2 (K i < 0.010 nM) sa antitumorskom aktivnošću protiv ne-Hodgkinovog limfoma (NHL) i CLL in vitro. In vivo studije ksenotransplantata miša pokazale su aktivnost protiv agresivnih (Mic+) limfoma, kao i protiv akutne leukemije. Ispitivanje faze Ia ABT-199 u R/R NHL koristilo je kontinuirano dnevno doziranje od 200-900 mg. Pojedinačna doza je primenjena 7. dana nakon čega je usledio uvodni period sa postupnom titracijom naviše tokom 2-3 nedelje. ABT-199 sa jednim agensom je takođe proučavan u fazi 2, otvorenog, multicentričnog ispitivanja kod pacijenata sa visokorizičnim R/R AML i kod nelečenih pacijenata koji nisu bili sposobni za intenzivnu hemoterapiju. Studija je dozvolila eskalaciju doze unutar pacijenta kada je pacijent primio 20 mg ABT-199 prve nedelje (Wk) prvog dana. Dnevna eskalacija je sprovedena da bi se ciljala konačna doza od 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga. Oni pacijenti bez potpunog odgovora (CR) ili CR sa nepotpunim hematološkim oporavkom (CRi) na prvoj planiranoj proceni (kraj 4. nedelje) mogli su da eskaliraju na 1200 mg. Preporučena doza faze 2 ABT-199 u kombinaciji sa rituksimabom je 400 mg dnevno.

1

E. Farmaceutske kompozicije

[0055] Ovo otkriće se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže inhibitor telomeraze (npr. imetelstat, posebno imetelstat natrijum) i inhibitor Bcl-2 (npr. ABT-199). U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži imetelstat, posebno imetelstat natrijum, i ABT-199. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži imetelstat, posebno, imetelstatnatrijum i ABT-199. Ovde opisane kombinacije lekova mogu se davati subjektu kao kompozicija koja sadrži oba leka.

[0056] Nosač ili razblaživač moraju biti "prihvatljivi" u smislu da su kompatibilni sa drugim sastojcima kompozicije i da nisu štetni za primaoce.

[0057] Radi lakše primene, kombinacije lekova koje su ovde opisane mogu se formulisati u različite farmaceutske oblike za svrhe primene. Kombinacije lekova koje su ovde opisane mogu se formulisati u različite farmaceutske oblike za svrhe primene. Kao odgovarajuće kompozicije mogu se navesti sve kompozicije koje se obično koriste za sistemsko davanje lekova.

[0058] Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku, efikasna količina kombinacije ovde opisanih lekova se kombinuje u bliskoj mešavini sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu nosač može imati širok spektar oblika u zavisnosti od oblika preparata koji se želi za primenu. Ove farmaceutske kompozicije su poželjne u jedinstvenom doznom obliku pogodnom, posebno, za oralno, rektalno, perkutano davanje, parenteralnom injekcijom ili inhalacijom. U nekim slučajevima, primena može biti putem intravenske injekcije. Na primer, u pripremanju kompozicija u oralnim doznim oblicima, može se koristiti bilo koji od uobičajenih farmaceutskih medija kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao što su suspenzije, sirupi, eliksiri, emulzije i rastvori; ili čvrsti nosači kao što su skrobovi, šećeri, kaolin, razblaživači, lubrikanti, veziva, agensi za dezintegraciju i slično u slučaju prahova, pilula, kapsula i tableta. Zbog njihove lakoće primene, tablete i kapsule predstavljaju najpovoljnije jedinične oblike oralne doze, u kom slučaju se očigledno koriste čvrsti farmaceutski nosači. Za parenteralne kompozicije, nosač će obično sadržati sterilnu vodu, barem u velikom delu, mada mogu biti uključeni i drugi sastojci, na primer, da bi se poboljšala rastvorljivost. Mogu se pripremiti rastvori za injekcije, na primer, u kojima nosač sadrži fiziološki rastvor, rastvor glukoze ili smešu fiziološkog rastvora i rastvora glukoze. Mogu se pripremiti rastvori za injekcije, na primer, u kojima nosač sadrži fiziološki rastvor, rastvor glukoze ili smešu fiziološkog rastvora i rastvora glukoze. Rastvori za injekcije

1

koji sadrže kombinaciju lekova opisanih ovde mogu biti formulisani u ulju za produženo dejstvo. Odgovarajuća ulja za ovu namenu su, na primer, kikirikijevo ulje, susamovo ulje, pamučno ulje, kukuruzno ulje, sojino ulje, sintetički glicerol estri dugolančanih masnih kiselina i mešavine ovih i drugih ulja. Suspenzije za injekcije se takođe mogu pripremiti u kom slučaju se mogu koristiti odgovarajući tečni nosači, sredstva za suspendovanje i slično. Takođe su uključeni preparati u čvrstom obliku koji su namenjeni da se neposredno pre upotrebe pretvore u preparate u tečnom obliku. U kompozicijama pogodnim za perkutanu primenu, nosač opciono sadrži sredstvo za poboljšanje penetracije i/ili pogodno sredstvo za vlaženje, opciono kombinovano sa pogodnim aditivima bilo koje prirode u manjim razmerama, pri čemu aditivi ne unose značajan štetan efekat na kožu. Navedeni aditivi mogu olakšati davanje na kožu i/ili mogu biti od pomoći za pripremu željenih kompozicija. Ove kompozicije se mogu primenjivati na različite načine, na primer, kao transdermalni flaster, kao spot-on, kao mast.

[0059] Posebno je korisno formulisati gore pomenute farmaceutske kompozicije u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Jedinični dozni oblik kako se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnih sastojaka izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Primeri takvih jediničnih doznih oblika su tablete (uključujući tablete sa zarezom ili obložene tablete), kapsule, pilule, paketići praha, vaferi, supozitorije, rastvori ili suspenzije za injekcije i slično, i njihovi odvojeni umnošci.

[0060] Da bi se poboljšala rastvorljivost i/ili stabilnost lekova u kombinacijama opisanim ovde u farmaceutskim kompozicijama, može biti korisno koristiti α-, β- ili γ-ciklodekstrine ili njihove derivate, posebno hidroksialkil supstituisane ciklodekstrine, npr. 2-hidroksipropil-βciklodekstrin ili sulfobutil-β-ciklodekstrin. Takođe, ko-rastvarači kao što su alkoholi mogu poboljšati rastvorljivost i/ili stabilnost jedinjenja prema opisu u farmaceutskim kompozicijama.

[0061] U zavisnosti od načina davanja, farmaceutska kompozicija će poželjno sadržati od 0.05 do 99% po težini, poželjnije od 0.1 do 70% po težini, još poželjnije od 0.1 do 50% po težini lekova u kombinacijama opisanim ovde, i od 1 do 99.95 mas. %, poželjnije od 30 do 99.9 mas. %, još poželjnije od 50 do 99.9 mas. % farmaceutski prihvatljivog nosača, pri čemu su svi procenti zasnovani na ukupnoj težini kompozicije.

[0062] Učestalost primene može biti bilo koja učestalost koja smanjuje težinu simptoma hematološkog maligniteta (npr., smanjuje ili preokreće fibrozu koštane srži) bez stvaranja značajne toksičnosti za sisara. Na primer, učestalost primene može biti od otprilike jednom u

2

dva meseca do otprilike jednom nedeljno, ili od otprilike jednom mesečno do otprilike dva puta mesečno, ili od otprilike jednom u šest nedelja do otprilike dva puta mesečno. Učestalost primene može ostati konstantna ili može biti promenljiva tokom trajanja lečenja. Tok tretmana sa kompozicijom koja sadrži jedan ili više inhibitora telomeraze može uključivati periode odmora. Na primer, kompozicija koja sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2 može se davati nedeljno tokom perioda od tri nedelje nakon čega sledi dvonedeljni period odmora, i takav režim se može ponoviti više puta. Kao i kod efektivne količine, različiti faktori mogu uticati na stvarnu učestalost primene koja se koristi za određenu primenu. Na primer, efikasna količina, trajanje lečenja, upotreba višestrukih agenasa za lečenje, način primene i ozbiljnost hematološkog maligniteta mogu zahtevati povećanje ili smanjenje učestalosti primene.

[0063] Efikasno trajanje za davanje kompozicije koja sadrži inhibitor telomeraze (npr., imetelstat ili imetelstat natrijum) i inhibitor Bcl-2 (npr., ABT-199) može biti bilo koje trajanje koje smanjuje ozbiljnost simptoma hematološkog maligniteta (npr. smanjuje ili preokreće fibrozu koštane srži) bez stvaranja značajne toksičnosti za sisara. Dakle, efektivno trajanje može varirati od jednog meseca do nekoliko meseci ili godina (npr., mesec do dve godine, mesec do godinu dana, tri meseca do dve godine, tri meseca do deset meseci ili tri meseca do 18 meseci). Generalno, efektivno trajanje lečenja hematološkog maligniteta može da traje od dva meseca do dvadeset meseci. U nekim slučajevima, efektivno trajanje može trajati sve dok je pojedinačni sisar živ. Više faktora može uticati na stvarno efektivno trajanje određenog tretmana. Na primer, efektivno trajanje može da varira u zavisnosti od učestalosti primene, efektivne količine, upotrebe višestrukih sredstava za lečenje, načina primene i težine hematološkog maligniteta.

[0064] U određenim slučajevima, može se pratiti tok lečenja i težina jednog ili više simptoma povezanih sa hematološkim malignitetom. Bilo koji postupak se može koristiti da se utvrdi da li je težina simptoma hematološkog maligniteta smanjena ili ne. Na primer, težina simptoma hematološkog maligniteta (npr. fibroza koštane srži) može se proceniti korišćenjem tehnika biopsije.

[0065] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja je prihvatljiva za davanje pacijentu, kao što je sisar (soli sa kontrajonima koje imaju prihvatljivu bezbednost za sisare za dati režim doziranja). Takve soli mogu biti izvedene iz farmaceutski prihvatljivih neorganskih ili organskih baza i iz farmaceutski prihvatljivih neorganskih ili organskih kiselina. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja, čije soli su izvedene iz raznih organskih i neorganskih kontrajona dobro poznatih u tehnici i uključuju, samo kao primer, natrijum i slično; i kada molekul sadrži baznu funkcionalnost, soli organskih ili neorganskih kiselina, kao što je hidrohlorid i slično. Farmaceutski prihvatljive soli od interesa uključuju, ali nisu ograničene na, aluminijum, amonijum, arginin, barijum, benzatin, kalcijum, holinat, etilendiamin, lizin, litijum, magnezijum, meglumin, prokain, kalijum, natrijum, trometamin, N-metilglukamin ,N'-dibenziletilen-diamin, hloroprokain, dietanolamin, etanolamin, piperazin, cink, diizopropilamin, diizopropiletilamin, trietilamin i trietanolamin soli.

[0066] Izraz "njihove soli" označava jedinjenje koje se formira kada je proton kiseline zamenjen katjonom, kao što je katjon metala ili organski katjon i slično. Poželjno, so je farmaceutski prihvatljiva so. Na primer, soli ovih jedinjenja uključuju one u kojima je jedinjenje protonovano neorganskom ili organskom kiselinom da bi se formirao katjon, sa konjugatom bazom neorganske ili organske kiseline kao anjonskom komponentom soli. Soli od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, aluminijum, amonijum, arginin, barijum, benzatin, kalcijum, cezijum, holinat, etilendiamin, litijum, magnezijum, meglumin, prokain, N-metilglukamin, piperazin, kalijum, natrijum, trometamin, cink, N,N' soli dibenziletilen-diamin, hloroprokain, dietanolamin, etanolamin, piperazin, diizopropilamin, diizopropiletilamin, trietilamin i trietanolamin soli. Podrazumeva se da za bilo koju od oligonukleotidnih struktura prikazanih ovde koje uključuju okosnicu od internukleozidne veze, takvi oligonukleotidi mogu takođe uključiti bilo koje pogodne oblike soli. U nekim primerima izvođenja, kiseli oblici internukleozidnih veza su prikazani radi jednostavnosti. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je monovalentna so katjona. U određenim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je dvovalentna so katjona. U nekim slučajevima, so predmetnog jedinjenja je trovalentna so katjona. "Solvat" se odnosi na kompleks formiran kombinacijom molekula rastvarača sa molekulima ili jonima rastvorene supstance. Rastvarač može biti organsko jedinjenje, neorgansko jedinjenje ili smeša oba. Neki primeri rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na, metanol, N,N-dimetilformamid, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i vodu. Kada je rastvarač voda, formirani solvat je hidrat.

[0067] "Stereoizomer" i "stereoizomeri" se odnose na jedinjenja koja imaju istu atomsku povezanost, ali različit atomski raspored u prostoru. Stereoizomeri uključuju na primer cis-trans izomere, E i Z izomere, enantiomere i diastereomere. Što se tiče bilo koje od ovde otkrivenih grupa koje sadrže jedan ili više supstituenata, podrazumeva se, naravno, da takve grupe ne sadrže nikakve supstitucije ili supstitucione obrasce koji su sterički nepraktični i/ili sintetički neizvodljivi. Svi stereoizomeri su namenjeni da budu uključeni u obim ovog otkrića.

[0068] Stručnjak u ovoj oblasti tehnike bi prepoznao da su mogući i drugi tautomerni aranžmani ovde opisanih grupa. Podrazumeva se da su svi tautomerni oblici predmetnog jedinjenja obuhvaćeni strukturom u kojoj je opisan jedan mogući tautomerni raspored grupa jedinjenja, čak i ako nije posebno naznačeno.

[0069] Namera je da se uključi solvat farmaceutski prihvatljive soli tautomera stereoizomera predmetnog jedinjenja. Oni su namenjeni da budu uključeni u obim ovog otkrića.

F. Primena i režimi primene

[0070] Za lečenje hematoloških kancera, inhibitori telomeraze (npr. imetelstat ili imetelstat natrijum) i inhibitori Bcl-2 (npr. ABT-199, ABT-263 i ABT-737) mogu se davati u kombinaciji subjektu kome je potrebno lečenje. Primer kancera koji se može lečiti ovim postupkom je akutna mijeloidna leukemija (AML), takođe nazvana akutna mijelocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija, akutna granulocitna leukemija ili akutna nelimfocitna leukemija. Kod akutne leukemije, ćelije leukemije su nezrele krvne ćelije (zvane blasti) koje brzo rastu i brzo se dele. Bez lečenja, većina pacijenata sa akutnom leukemijom živela bi samo nekoliko meseci.

[0071] Inhibitori telomeraze i inhibitori Bcl-2 kako se koriste u ovom pronalasku mogu se davati u bilo kojoj dozi koja je terapeutski efikasna, kao što su doze uporedive sa onima koje se rutinski koriste klinički. Specifični režimi doze za poznate i odobrene agense protiv kancera (npr., preporučena efektivna doza) su poznate lekarima i date su, na primer, u opisima proizvoda koji se nalaze u PHYSICIANS' DESK REFERENCE, 2003, 57th Ed., Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J.; Goodman & Gilman's THE FARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 2001, 10th Ed., McGraw-Hill, Nev York; i/ili su dostupni u Federal Drug Administration i/ili se o njima govori u medicinskoj literaturi.

[0072] U nekim aspektima, doza inhibitora telomeraze, imetelstat natrijum, primenjena na subjekta je oko 1.0 mg/kg do oko 13.0 mg/kg. U drugim aspektima, doza inhibitora telomeraze je oko 6.5 mg/kg do oko 11.7 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, doza inhibitora telomeraze uključuje najmanje bilo koje od 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg , 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg , 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg, 10 mg/kg, 10.1 mg/kg , 10.2 mg/kg, 10.3 mg/kg, 10.4 mg/kg, 10.5 mg/kg, 10.6 mg/kg, 10.7 mg/kg, 10.8 mg/kg, 10.9 mg/kg, 11 mg/kg, 11.1 mg/kg , 11.2 mg/kg, 11.3 mg/kg, 11.4 mg/kg, 11.5 mg/kg, 11.6 mg/kg, 11.7 mg/kg, 11.8

2

mg/kg, 11.9 mg/kg, 12 mg/kg, 12.1 mg/kg, 12.2 mg/kg, 12.3 mg/kg, 12.4 mg/kg, 12.5 mg/kg, 12.6 mg/kg, 12.7 mg/kg, 12.8 mg/kg, 12.9 mg/kg ili 13 mg/kg.

[0073] U nekim primerima izvođenja, efikasna količina inhibitora telomeraze koja se daje pojedincu uključuje najmanje bilo koju od 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.5 mg/kg, 5 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.5 mg/kg , 9.4 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg ili 20 mg/kg. U različitim primerima izvođenja, efikasna količina inhibitora telomeraze koja se daje pojedincu uključuje manje od bilo koje od 350 mg/kg, 300 mg/kg, 250 mg/kg, 200 mg/kg, 150 mg/kg, 100 mg/kg , 50 mg/kg, 30 mg/kg, 25 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg, 7.5 mg/kg, 6.5 mg/kg, 5 mg/kg, 3.5 mg/kg, 2.5 mg/kg 1 mg/kg ili 0.5 mg/kg inhibitora telomeraze.

[0074] Primeri učestalosti doziranja za farmaceutske kompozicije (npr. farmaceutske kompozicije uključujući inhibitor telomeraze, i/ili farmaceutske kompozicije koje uključuju inhibitor Bcl-2) uključuju, ali nisu ograničene na, dnevno; svaki drugi dan; dva puta nedeljno; tri puta nedeljno; nedeljno bez pauze; nedeljno, tri od četiri nedelje; jednom u tri nedelje; jednom u dve nedelje; nedeljno, dve od tri nedelje. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje otprilike jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje, jednom u 4 nedelje, jednom u 6 nedelja ili jednom u 8 nedelja. U nekim primerima izvođenja, kompozicija se primenjuje najmanje oko 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x ili 7x (tj. dnevno) nedeljno, ili tri puta dnevno, dva puta dnevno. U nekim primerima izvođenja, intervali između svake primene su manji od otprilike 6 meseci, 3 meseca, 1 mesec, 20 dana, 15 dana, 12 dana, 10 dana, 9 dana, 8 dana, 7 dana, 6 dana, 5 dana , 4 dana, 3 dana, 2 dana ili 1 dan. U nekim primerima izvođenja, intervali između svake primene su više od bilo kojeg od 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 8 meseci ili 12 meseci. U nekim primerima izvođenja, nema prekida u rasporedu doziranja. U nekim primerima izvođenja, interval između svake administracije nije duži od oko nedelju dana.

[0075] Inhibitori telomeraze kao što su imetelstat ili imetelstat natrijum mogu se davati bilo kojim odgovarajućim postupkom. Na primer, inhibitori telomeraze kao što su imetelstat ili imetelstat natrijum mogu se davati intravenski jednom svake 4 nedelje tokom određenog vremenskog perioda (npr., jedan, dva, tri, četiri ili pet časova). U jednom aspektu, imetelstat se primenjuje intravenski jednom nedeljno tokom perioda od oko 2 sata u dozi od 7 - 10 mg/kg. U drugom aspektu, imetelstat se primenjuje intravenski jednom svake 3 nedelje tokom perioda od oko 2 sata u dozi od 2.5 - 7 mg/kg. U još jednom izvođenju, imetelstat se primenjuje intravenski u periodu od oko 2 sata jednom svake 4 nedelje u dozi od 0.5 - 5 mg/kg. U drugom izvođenju, imetelstat se primenjuje intravenski jednom na svake 3 nedelje tokom perioda od oko 2 sata u dozi od oko 2.5 - 10 mg/kg. U još jednom izvođenju, imetelstat se primenjuje intravenski u periodu od oko 2 sata jednom svake 4 nedelje u dozi od oko 0.5 - 9.4 mg/kg.

[0076] U takvim slučajevima, kada se leči inhibitorom Bcl-2, ABT-199, doza ABT-199 može biti oko ili manja od 400 mg PO dnevno. Na primer, čovek koji je identifikovan kao hematološki malignitet može se lečiti sa ABT-199 u dozi koja je a) 20 mg PO dnevno, b) 50 mg PO dnevno, c) 100 mg PO dnevno, d) 200 mg PO dnevno ili e) 400 mg PO dnevno. U drugom aspektu, ABT-199 se primenjuje prema nedeljnom rasporedu povećanja tokom 5 nedelja do preporučene dnevne doze od 400 mg počevši od 20 mg PO dnevno u nedelji 1.50 mg PO dnevno u nedelji 2, 100 mg PO dnevno u nedelji 3, 200 mg PO dnevno u nedelji 4 i 400 mg PO dnevno u nedelji 5 i kasnije. U drugom izvođenju, ABT-199 se primenjuje u dozi od 400 mg PO dnevno. U drugom aspektu, doziranje se nastavlja do progresije bolesti ili do neprihvatljive toksičnosti.

[0077] Trebalo bi razumeti da lečenje kancera ponekad uključuje više „krugova“ ili „ciklusa“ primene leka, pri čemu svaki ciklus obuhvata davanje leka jednom ili više puta prema određenom rasporedu (npr. svake tri nedelje tokom tri uzastopna dana; jednom nedeljno, itd.). Na primer, lekovi protiv kancera mogu se davati od 1 do 8 ciklusa ili duže. Kada više od jednog leka (npr., dva·leka) se daje subjektu, svaki se može primeniti prema sopstvenom rasporedu (npr. nedeljno; jednom u tri nedelje, itd.). Biće jasno da se davanje lekova, čak i onih koji se primenjuju sa različitom periodičnošću, može koordinisati tako da se oba leka daju istog dana barem u određenom vremenskom periodu ili, alternativno, tako da se lekovi daju uzastopnim danima barem neko vreme.

[0078] U režimima lečenja u kojima inhibitor telomeraze (npr., imetelstat ili imetelstat natrijum) i inhibitor Bcl-2 (npr., ABT-199 ili Veneteklaks) se primenjuju u kombinaciji, mogu se davati bilo kojim redosledom. U određenim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze se primenjuje jedan dan pre, jedan dan posle ili istog dana kada se primenjuje Bcl-2 inhibitor. Podrazumeva se da se mogu koristiti i drugi rasporedi kako odredi lekar.

[0079] Kao što je shvaćeno u tehnici, lečenje lekovima za lečenje kancera može se privremeno obustaviti ako se primeti toksičnost, ili zbog pogodnosti pacijenta, bez odstupanja od obima pronalaska, a zatim nastavljeno.

G. Primena u kombinaciji

[0080] Dva ili tri leka se daju subjektu "u kombinaciji" kada se lekovi primenjuju kao deo istog toka terapije. Tok terapije se odnosi na davanje kombinacija lekova za koje lekar veruje da rade

2

zajedno aditivno, komplementarno, sinergistički ili na neki drugi način da bi proizveli povoljniji ishod od onog koji se predviđa za davanje jednog leka. Tok terapije može biti jedan ili nekoliko dana, ali se češće produžava na nekoliko nedelja.

[0081] Dakle, primer kombinovane primene je primena imetelstata jednom u 28 dana tokom 1 do 4 ciklusa, počevši od 1. dana, i primena ABT-199 jednom svakih 7 dana počevši od 1. dana tokom 4 ciklusa. U jednom rešenju primena ABT-199 počinje na dan 1, dan -1 ili dan 2 ili drugi dan unutar ciklusa. U jednom rešenju, primena u kombinaciji je primena imetelstata jednom svakih 28 dana tokom 1 do 4 ciklusa, počevši od 1. dana, i primena ABT-199 jednom dnevno tokom 28 dana počevši od 1. dana tokom 1 do 4 ciklusa.

[0082] Kada se dva leka daju u kombinaciji, mogu se koristiti različiti rasporedi. U jednom slučaju, na primer i bez ograničenja, lek 1 se prvo primenjuje pre primene leka 2, a tretman sa lekom 1 se nastavlja tokom primene leka 2; alternativno, lek 1 se primenjuje nakon početka ili završetka terapije lekom 2; alternativno, lek 1 se prvo primenjuje istovremeno sa započinjanjem druge terapije kancera. Kako se koristi u ovom kontekstu, "istovremeno" znači da se dva leka daju istog dana ili uzastopnih dana.

[0083] Iako se u principu određeni lekovi mogu ko-formulisati, generalno se primenjuju u odvojenim kompozicijama. Slično tome, iako se određeni lekovi mogu davati istovremeno, češće (posebno za lekove koji se primenjuju infuzijom) lekovi se daju u različito vreme istog dana, uzastopnih dana ili prema drugom rasporedu.

[0084] Ovo otkriće se takođe odnosi na kombinaciju koja sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2. Konkretno, inhibitor telomeraze je imetelstat, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199. Konkretno, inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

[0085] Ovo otkriće se takođe odnosi na kombinaciju koja sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2 za upotrebu kao lek. Konkretno, inhibitor telomeraze je imetelstat, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199. Konkretno, inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

H. Dijagnoza

[0086] Za dijagnozu AML, razmazi krvi i srži se morfološki ispituju korišćenjem May-Grunwald-Giemsa ili Wright-Giemsa bojenja. Preporučljivo je da se izbroji najmanje 200 leukocita na brisevima krvi i 500 ćelija sa jedrom na brisevima srži, pri čemu poslednji sadrže spikule. Za dijagnozu AML, potrebna je analiza koštane srži ili blastne slike od 20% ili više, osim za AML sa t(15;17), t(8;21), inv(16) ili t(16;16), i neki slučajevi eritroleukemije.

2

Mijeloblasti, monoblasti i megakarioblasti su uključeni u broj blasta. Kod AML sa monocitnom ili mijelomonocitnom diferencijacijom, monoblasti i promonociti, ali ne i abnormalni monociti, se računaju kao blastni ekvivalenti. Eritroblasti se ne računaju kao blasti osim u retkom slučaju čiste eritroidne leukemije.

I. Kompleti

[0087] Ovo otkriće se takođe odnosi na komplet koji sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2. Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2, za upotrebu u lečenju hematološkog kancera. Takva terapija u nekim slučajevima obuhvata primenu inhibitora Bcl-2 na subjekta, bilo pre, posle ili istovremeno sa primenom inhibitora telomeraze. U nekim slučajevima, inhibitor telomeraze je imetelstat.

[0088] U povezanom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži dozu inhibitora telomeraze u količini efikasnoj da inhibira proliferaciju ćelija kancera kod subjekta. Komplet u nekim slučajevima uključuje umetak sa uputstvima za primenu inhibitora telomeraze. Umetak može da pruži korisniku jedan set instrukcija za korišćenje inhibitora u kombinaciji sa Bcl-2 inhibitorom. U nekim slučajevima, inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

[0089] U nekim slučajevima, set uputstava za kombinovanu terapiju može preporučiti (i) nižu dozu inhibitora telomeraze, kada se koristi u kombinaciji sa inhibitorom Bcl-2, (ii) nižu dozu inhibitora Bcl-2, kada koristi se u kombinaciji sa inhibitorom telomeraze, i/ili (iii) drugačiji režim doziranja za jedan ili oba inhibitora nego što bi se normalno preporučilo.

[0090] Biće jasno da je u prethodnim paragrafima u nekim slučajevima inhibitor telomeraze imetelstat; u nekim slučajevima, inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum; u nekim slučajevima, inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

J. Primeri izvođenja

[0091] Jedan primer izvođenja ovog otkrića je postupak lečenja koji se sastoji od davanja inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2 u kombinaciji subjektu kome je potrebno lečenje od hematološkog kancera. U određenim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze je imetelstat. U alternativnim rešenjima, Bcl-2 inhibitor ABT-199, ABT-263 ili ABT-737. U još jednom izvođenju, inhibitor Bcl-2 je ABT-199. U jednom aspektu, inhibitor telomeraze je imetelstat, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

2

[0092] Hematološki kancer može biti AML, esencijalna trombocitemija, policitemija vera, primarna mijelofibroza, sistemska mastocitoza, hronična mijeloidna leukemija, hronična neutrofilna leukemija, hronična eozinofilna leukemija, refraktorna anemija sa prstenastim sideroblastima, refraktorna citopenija sa multilinjskom displazijom, refraktorna anemija sa viškom blasta, tip 1, refraktorna anemija sa viškom blasta, tip 2, mijelodisplastični sindrom (MDS) sa izolovanim del (5q), MDS koji se ne može klasifikovati, hronična mijelomonocitna leukemija (CML), atipična hronična mijeloidna leukemija, juvenilna mijelomonocitna leukemija, mijeloproliferativni/mijelodisplastični sindromi-neklasifikovani, B limfoblastna leukemija/limfom, T limfoblastna leukemija/limfom, difuzni krupnoćelijski B-ćelijski limfom, primarni limfom centralnog nervnog sistema, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom, Burkitov limfom/leukemija, folikularni limfom, hronična limfocitna leukemija (CLL)/sitnoćelijski limfocitni limfom, B-ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom/Waldenström makroglobulinemija, limfom mantle ćelija, limfomi marginalne zone, limfoproliferativni poremećaji nakon transplantacije, limfomi povezani sa HIV, primarni efuzioni limfom, intravaskularni krupnoćelijski B ćelijski limfom, primarni kožni B-ćelijski limfom, leukemija vlasastih ćelija, monoklonska gamopatija nepozbatog značaja, tinjajući multipli mijelom i solitarni plazmacitomi (solitarni i ekstramedularni). U jednom aspektu, hematološki kancer je AML.

[0093] U određenim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze imetelstat se primenjuje tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, svaki ciklus obuhvata: a) intravensku primenu od oko 7 - 10 mg/kg imetelstata od toga jednom svake četiri nedelje, b) intravenska primena oko 7 - 10 mg/kg imetelstata jednom nedeljno tokom četiri nedelje, c) intravenska primena oko 2.5 - 7 mg/kg imetelstata jednom u tri nedelje, ili d) intravenska primena oko 0.5 - 9.4 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje. Imetelstat može biti imetelstat natrijum.

[0094] U određenom izvođenju, ABT-199 se primenjuje u dozi od: a) oko 50 - 400 mg ABT-199 dnevno; b) oko 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od oko 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili c) 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od oko 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga. Primena ABT-199 može biti dan pre, jedan dan posle ili istog dana kada se primenjuje inhibitor telomeraze.

[0095] Drugi primer izvođenja otkrića je postupak indukovanja apoptoze u ćeliji hematološkog kancera koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom inhibitora telomeraze i dovođenje ćelije u kontakt sa terapeutski efikasnom količinom Bcl-2 inhibitora. Postupak se može primeniti in vitro ili in vivo. U jednom aspektu, inhibitor telomeraze je

2

imetelstat. U drugom aspektu, imetelstat je imetelstat natrijum. U ovom postupku, inhibitor Bcl-2 je ABT-199. U određenim primerima izvođenja, ćelija hematološkog kancera može biti ćelija iz sledećih tipova kancera: akutna mijeloidna leukemija (AML); esencijalna trombocitemija; policitemija vera; primarna mijelofibroza; sistemska mastocitoza; hronična mijeloidna leukemija; hronična neutrofilna leukemija; hronična eozinofilna leukemija; refraktorna anemija sa prstenastim sideroblastima; refraktorna citopenija sa višelinijskom displazijom; refraktorna anemija sa viškom blasta; tip 1; refraktorna anemija sa viškom blasta; tip 2; mijelodisplastični sindrom (MDS) sa izolovanim del (5q); MDS neklasifikovan; hronična mijelomonocitna leukemija (CML); atipična hronična mijeloidna leukemija; juvenilna mijelomonocitna leukemija; mijeloproliferativni/mijelodisplastični sindromi-neklasifikovani; B limfoblastna leukemija/limfom; T limfoblastna leukemija/limfom; difuzni krupnoćelijski B-ćelijski limfom; primarni limfom centralnog nervnog sistema; primarni medijastinalni B-ćelijski limfom; Burkitov limfom/leukemija; folikularni limfom; hronična limfocitna leukemija (CLL)/mali limfocitni limfom; B-ćelijska prolimfocitna leukemija; limfoplazmacitni limfom/Waldenström makroglobulinemija; limfom mantle ćelija; limfomi marginalne zone; limfoproliferativni poremećaji nakon transplantacije; limfomi povezani sa HIV; primarni efuzioni limfom; intravaskularni krupnoćelijski limfom B ćelija; primarni kožni B-ćelijski limfom; leukemija vlasastih ćelija; monoklonska gamopatija nepoznatog značaja; tinjajući multipli mijelom; i solitarni plazmocitomi (solitarni koštani i ekstramedularni). U jednom aspektu, hematološka ćelija kancera je ćelija akutne mijeloidne leukemije (AML).

[0096] Ovo otkriće takođe obezbeđuje komplete za kombinovanu terapiju. Shodno tome, jedan primer izvođenja otkrića je komplet koji sadrži: (a) dozu inhibitora telomeraze, u količini koja je efikasna, kada se primenjuje, da indukuje apoptozu u ćeliji hematološkog kancera; i (b) doza inhibitora Bcl-2, u količini efikasnoj, kada se primenjuje, da izazove apoptozu u ćeliji hematološkog kancera. U jednom aspektu ovog kompleta, inhibitor telomeraze je imetelstat, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199.

[0097] Jedan primer izvođenja ovog otkrića je farmaceutska kompozicija koja sadrži inhibitor telomeraze (npr., imetelstat/imetelstat natrijum) i inhibitor BCL-2 (npr., ABT-199) za upotrebu u lečenju hematološkog kancera. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži imetelstat/imetelstat natrijum i ABT-199.

[0098] Drugi primer izvođenja predmetnog otkrića je inhibitor telomeraze za upotrebu u postupku lečenja hematološkog kancera, pri čemu postupak obuhvata davanje inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2 u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. Još jedan primer

2

izvođenja ovog otkrića je inhibitor Bcl-2 za upotrebu u postupku lečenja hematološkog kancera, pri čemu postupak obuhvata primenu inhibitora Bcl-2 i inhibitora telomeraze u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. Alternativno izvođenje otkrića je kombinacija koja sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2 za upotrebu u postupku lečenja hematološkog kancera, pri čemu postupak obuhvata davanje kombinacije subjektu kome je to potrebno. U ovim primerima izvođenja, kombinacija inhibitora telomeraze i inhibitora Bcl-2 indukuje apoptozu hematoloških ćelija kancera. U ovim primerima izvođenja, inhibitor telomeraze može biti imetelstat. U jednom aspektu, imetelstat je imetelstat natrijum. Takođe u ovim primerima izvođenja, inhibitor Bcl-2 može biti ABT-199. Imetelstat može biti za primenu tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, svaki ciklus obuhvata: a) intravensku primenu od oko 7 - 10 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje , b) intravenska primena oko 7 - 10 mg/kg imetelstata jednom nedeljno tokom oko četiri nedelje, ili c) intravenska primena oko 2.5 - 7 mg/kg imetelstata jednom u tri nedelje, ili d) intravenska primena od oko 0.5 - 9.4 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje. ABT-199 može biti za primenu u dozi od: a) 50 - 400 mg ABT-199 dnevno; b) oko 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od oko 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili c) oko 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga. U određenim primerima izvođenja, primena ABT-199 je jedan dan pre, jedan dan posle, ili istog dana kao i davanje inhibitora telomeraze.

[0099] U primerima izvođenja inhibitora telomeraze, inhibitora Bcl-2 ili kombinacije, hematološki kancer može biti akutna mijeloidna leukemija (AML), esencijalna trombocitemija, policitemija vera, primarna mijelofibroza, sistemska mastocitoza, hronična mijeloidna leukemija, hronična neutrofilna leukemija, hronična leukemija refraktorna anemija sa prstenastim sideroblastima, refraktorna citopenija sa višelinijskom displazijom, refraktorna anemija sa viškom blasta, tip 1, refraktorna anemija sa viškom blasta, tip 2, mijelodisplastični sindrom (MDS) sa izolovanim del (5q), MDS neklasifikovani, hronična mijelomonocitna leukemija (CML), atipična hronična mijeloidna leukemija, juvenilna mijelomonocitna leukemija, mijeloproliferativni /mijelodisplastični sindromi-neklasifikovani, B limfoblastna leukemija/limfom, T limfoblastna leukemija/limfom, primarni centralni sistem B, difuzni krupnoćelijski limfom B-ćelija, primarni limfom centralnog nervnog sistema, Burkitov limfom/leukemija, folikularni limfom, hronična limfocitna leukemija (CLL)/mali limfocitni limfom, B-ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom/Waldenström makroglobulinemija, limfom mantle ćelija, limfomi marginalne zone, HIV-povezani limfomi, primarni efuzioni limfom, intravaskularni krupnoćelijski B-ćelijski limfom, primarni kožni B-ćelijski limfom, leukemija vlasastih ćelija, monoklonska gamopatija nepoznatog značaja, tinjajući multipli mijelom i solitarni plazmocitomi (solitarni koštani i ekstramedularni). U jednom aspektu, hematološki kancer je akutna mijeloidna leukemija (AML).

[0100] Alternativni primer izvođenja otkrića je in vitro postupak indukovanja apoptoze u ćeliji hematološkog kancera koji obuhvata: dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom inhibitora telomeraze; i dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom Bcl-2 inhibitora. U jednom aspektu, inhibitor telomeraze je imetelstat. Imetelstat može biti imetelstat natrijum. Bcl-2 inhibitor može biti ABT-199.

[0101] U određenim primerima izvođenja in vitro postupka, ćelija hematološkog kancera je ćelija iz sledećih vrsta kancera: akutna mijeloidna leukemija (AML); esencijalna trombocitemija; policitemija vera; primarna mijelofibroza; sistemska mastocitoza; hronična mijeloidna leukemija; hronična neutrofilna leukemija; hronična eozinofilna leukemija; refraktorna anemija sa prstenastim sideroblastima; refraktorna citopenija sa višelinijskom displazijom; refraktorna anemija sa viškom blasta; tip 1; refraktorna anemija sa viškom blasta; tip 2; mijelodisplastični sindrom (MDS) sa izolovanim del (5k); MDS neklasifikovani; hronična mijelomonocitna leukemija (CML); atipična hronična mijeloidna leukemija; juvenilna mijelomonocitna leukemija; mijeloproliferativni/mijelodisplastični sindromi-neklasifikovani; B limfoblastna leukemija/limfom; T limfoblastna leukemija/limfom; difuzni krupnoćelijski B-ćelijski limfom; primarni limfom centralnog nervnog sistema; primarni medijastinalni B-ćelijski limfom; Burkitov limfom/leukemija; folikularni limfom; hronična limfocitna leukemija (CLL)/mali limfocitni limfom; B-ćelijska prolimfocitna leukemija; limfoplazmacitni limfom/Waldenström makroglobulinemija; limfom ćelija plašta; limfomi marginalne zone; limfoproliferativni poremećaji nakon transplantacije; limfomi povezani sa HIV; primarni efuzioni limfom; intravaskularni krupnoćelijski B-ćelijski limfom; primarni kožni B-ćelijski limfom; leukemija vlasastih ćelija; monoklonska gamopatija nepoznatog značaja; tinjajući multipli mijelom; i solitarni plazmocitomi (solitarni koštani i ekstramedularni). U jednoj varijanti in vitro postupka, ćelija hematološkog kancera je ćelija akutne mijeloidne leukemije (AML).

[0102] Još jedan primer izvođenja predmetnopg otkrića je kombinacija koja sadrži inhibitor telomeraze i inhibitor Bcl-2. U jednom aspektu, inhibitor telomeraze je imetelstat, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199. U drugom aspektu, inhibitor telomeraze je imetelstat natrijum, a inhibitor Bcl-2 je ABT-199. Kombinacija se može koristiti kao lek.

1

[0103] Sledeći primer izvođenja otkrića je upotreba imetelstata ili imetelstat natrijuma za lečenje hematološkog kancera kod pacijenta koji je podvrgnut terapiji inhibicijom BCL. Alternativno izvođenje je upotreba ABT-199 za lečenje hematološkog kancera kod pacijenta koji je podvrgnut terapiji inhibicijom telomeraze. Sledeći primer izvođenja predmetnog otkrića je imetelstat natrijum za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje imetelstat natrijuma i ABT-199 u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. Dodatna realizacija je ABT-199 za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje ABT-199 i imetelstat natrijuma u kombinaciji subjektu kome je to potrebno. Sledeći primer izvođenja je kombinacija koja sadrži imetelstat natrijum i ABT-199 za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje kombinacije subjektu kome je to potrebno. Gde je primenjivo, u ovim primerima izvođenja, imetelstat natrijum može biti za primenu za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, pri čemu svaki ciklus sadrži: a) intravensku primenu od oko 7 - 10 mg/kg imetelstat natrijuma jednom svake četiri nedelje, b) intravensku primenu oko 7 - 10 mg/kg imetelstat natrijuma jednom nedeljno tokom četiri nedelje, ili c) intravensku primenu oko 2.5 - 7 mg/kg imetelstat natrijuma jednom u tri nedelje, ili d) intravensku primenu oko 0.5 - 9.4 mg/kg imetelstat natrijuma jednom svake četiri nedelje. Dodatno, u ovim primerima izvođenja, ABT-199 se može primeniti u dozi od: a) oko 50 - 400 mg ABT-199 dnevno; b) oko 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili c) oko 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga. U nekim od ovih izvođenja, primena ABT-199 je jedan dan pre, jedan dan posle ili istog dana kao i primena imetelstat natrijuma.

[0104] Sledeći primer izvođenja otkrića je in vitro postupak indukovanja apoptoze u ćeliji akutne mijeloidne leukemije (AML) koji obuhvata: dovođenje u kontakt ćelije sa terapeutski efikasnom količinom imetelstat natrijuma; i kontaktiranje ćelije sa terapeutski efikasnom količinom ABT-199.

[0105] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan, ali nije ograničen, sledećim primerima.

PRIMERI

Primer 1: Inhibitor telomeraze imetelstat natrijum u kombinaciji sa BCL-2 inhibitorom Venetoklaks pojačava apoptozu u AML ćelijskim linijama in vitro

2

[0106] AML tumorske ćelije KG-1 (ATCC #CCL-246) i MOLM-13 (DSMZ # ACC554) su postavljene na gustinu od ~20.000 ćelija po bunarčiću na pločice za kulturu tkiva sa 96 bunarčića od polistirena sa U-dnom (Corning catalog# 353777) u RPMI-1640 (ThermoFisher catalog# 11875-085) dopunjen sa 10% fetalnog goveđeg seruma (ThermoFisher catalog # 16140-089) i 1% antibiotskog koktela penicilin/streptomicina (ThermoFisher catalog 15140-122) i uzgajane u inkubatoru na 37°C pod vlažnom 5% CO2atmosferom. Ćelije su odmah tretirane sa imetelstat natrijumom (Janssen Biotech, Inc.) pripremljenim u RPMI-1640 sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i/ili ABT-199 (Selleckchem catalog # S8048) pripremljenog kao 1000x stok u DMSO, razblaženog 1:100 u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS, vehikulum; ThermoFisher catalog # 20012-027). U eksperimentima od 96 časova, druga doza jedinjenja je primenjena na 48 časova bez dodavanja svežeg medijuma pošto i ABT-199 i imetelstat natrijum imaju in vitro poluvreme manje od 48 časova (Shammas et al., Leukemia, 22(7): 1410-1418 (2008)). Imetelstat natrijum je testiran od 0-50 µM, a ABT-199 je testiran od 0-500 nM. Kontrolni ne-komplementarni i pogrešno upareni oligonukleotidi (US 7.998,938) prikazani u tabeli 2 korišćeni su u identičnim koncentracijama kao imetelstat natrijum da bi se pokazalo da su efekti specifični za kombinaciju imetelstat natrijuma i ABT-199.

Tabela 2: sekvenca koja targetira hTR

[0107] Na 48 i 96 časova, ćelije su merene u odnosu na zdravu, ranu apoptotičnu i apoptotičku populaciju sa aneksinom V (bojom unutrašnje ćelijske membrane) plus propidijum jodidom (PI, DNK vezujuća boja) kompletom za protočnu citometriju (BioLegend catalog 640914). Aneksin V otkriva eksternalizaciju fosfatidilserina u apoptotičnim ćelijama korišćenjem rekombinantnog aneksina V konjugovanog sa zeleno-fluorescentnom FITC bojom i mrtvih ćelija korišćenjem propidijum jodida (PI). Propidijum jodid boji nekrotične ćelije crvenom fluorescencijom. Nakon tretmana sa obe probe, rane apoptotičke ćelije pokazuju zelenu fluorescenciju, apoptotičke (mrtve) ćelije pokazuju crvenu i zelenu fluorescenciju, a žive ćelije pokazuju malu ili nikakvu fluorescenciju. Ukratko, ćelije su peletirane i isprane 2x sa PBS pre suspenzije u puferu za vezivanje Aneksina V koji sadrži 1:2 odnos anti-Annekin V-FITC i propidijum jodida, prema protokolu koji je predložio proizvođač. Ćelije su obojene 30 minuta na 4°C u mraku, nakon čega je usledilo 3x ispiranje sa PBS-om i suspenzijom u FACs Stain Buffer-u (BD catalog 554657) pre ispitivanja na BD FACs Canto protočnom citometru za prednje raspršivanje, bočno raspršivanje, FITC, i PE kanale. Ćelijske populacije su analizirane korišćenjem softvera Cytobank i upoređene sa netretiranim (bez imetelstat natrijuma ili ABT-199) uslovima da bi se ustanovile granice za gejtovanje održivih ćelija (neobojene u bilo kom kanalu; tj. dvostruko negativna populacija). Za sve eksperimente, tačkice podataka protočne citometrije pokazuju četiri kvadranta sa procentom živih ćelija u donjem levom kvadrantu, procentom ranih apoptotičkih ćelija (aneksin V+/PI-) u gornjem levom kvadrantu i procentom apoptotičkih (mrtvih) ćelije (dvostruko označene Aneksin V+/PI+) u gornjem desnom kvadrantu. Procenat apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) je korišćen za izračunavanje kombinovanih efekata korišćenjem modela najvišeg pojedinačnog agenta (HSA) i modela Bliss aditivnosti (J Tang et al. Frontiers in Pharmacology. 2015; 6 (181)).

[0108] Koristeći HSA model, citotoksični efekat kombinovanog stanja je upoređen sa efektom koji generiše svaka od kontrola pojedinačnog sredstva („A“ ili „B“) za odgovarajuću

4

dozu u kombinaciji:

Višak preko HSA = C-A (ako je A>B) ili C/B (ako je A<B)

[0109] Bliss model vrši slično poređenje, ali umesto najvećeg efekta pojedinačnog agenta, Bliss model oduzima od kombinacije vrednost jednaku zbiru svakog pojedinačnog agenta minus njihov proizvod:

Višak preko Bliss= C- [(A+B) – (A*B)]

[0110] Ovi modeli su u stanju da pokažu aditivnost ili slabu sinergiju u kombinaciji.

Rezultati tretmana AML ćelijske linije

[0111] Tačkasti grafikoni podataka protočne citometrije za ćelije KG-1 posle 48-časovnog tretmana sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 su prikazani na Sl. 1A sa grafikom % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeležene) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata prikazanih na Sl. 1B. KG-1 pokazuju manju osetljivost na ABT-199 posle 48 časova (~9% i ~14% na 100 nM i 500 nM respektivno) i minimalnu osetljivost na imetelstat natrijum. Međutim, kada se tretman 50 µM imetelstat natrijuma kombinuje sa 100 nM ili 500 nM ABT-199, primećuje se veći efekat na ćelijsku smrt pri (~27% na 100 nM i ~50% na 500 nM). Tabele 3 i 4 prikazuju proračune kombinovanog efekta korišćenjem HSA ili BLISS modela za tretman KG-1 ćelija na 48 časova. Negativne vrednosti ne ukazuju na antagonizam u ovim modelima, već samo na nedostatak interakcije.

[0112] Tačkasti grafikoni podataka protočne citometrije za ćelije KG-1 posle 96-časovnog tretmana sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 su prikazani na Sl. 2A sa grafikom % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata prikazanih na Sl.2B. KG-1 pokazuje manju osetljivost na ABT-199 nakon 96 časova (~6% i ~10% na 100 nM i 500 nM respektivno), a takođe je primećena određena osetljivost na imetelstat natrijum (5%, 9% i 16% na 10 µM, 20 µM i 50 µM respektivno). Međutim, kada se tretman sa 25 ili 50 µM imetelstat natrijuma kombinuje sa 20 do 500 nM ABT-199, primećuju se veći efekti na ćelijsku smrt pri svim koncentracijama. Tabele 5 i 6 prikazuju proračune kombinovanog efekta korišćenjem HSA ili BLISS modela na tretman KG-1 ćelija u 96 časova.

[0113] Tačkasti grafikoni podataka protočne citometrije za KG-1 ćelije su prikazani nakon tretmana 48 časova (Slika 3A) ili 96 časova (Slika 4A) sa pogrešno uparenim ili nekomplementarnim oligonukleotidima i ABT-199. Grafikoni % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama oligonukleotida prikazani su za 48 časova (Slika 3B) ili 96 časova (Slika 4B). Modeli viška u odnosu na najveći pojedinačni agens (Tabele 7 i 8) i višak u odnosu na Bliss (Tabele 9 i 10) potvrđuju da nema efekta kod kontrola oligonukleotida. Negativne vrednosti ne ukazuju na antagonizam u ovim modelima, već samo na nedostatak interakcije.

Tabela 7. Višak preko HSA u KG-1 ćelijama za 48 časova sa ne-komplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Tabela 8. Višak preko HSA u KG-1 ćelijama na 96 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Tabela 9. Višak preko BLISS u KG-1 ćelijama za 48 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Tabela 10. Višak preko BLISS u KG-1 ćelijama na 96 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

[0114] Tačkasti grafikoni podataka protočne citometrije za MOLM-13 ćelije nakon 48-časovnog tretmana sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 su prikazani na Sl.5A sa grafikom % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata prikazanih na Sl. 5B. MOLM-13 pokazuju određenu osetljivost na ABT-199 nakon 48 časova (~19% i ~30% na 100 nM i 500 nM respektivno) i određenu osetljivost na imetelstat natrijum (21.5% na 50 µM). Međutim, kada je 25 µM imetelstat natrijum kombinovan sa ABT-199, primećen je veći efekat na ćelijsku smrt (~32% i ~72% pri 100 nM i 500 nM respektivno). Najveći efekat na smrt ćelija primećen je sa 50 µM imetelstat natrijuma u kombinaciji sa ABT-199 pri 100 nM (62%) i 500 nM (88%). Iznenađujuće, u kombinaciji sa imetelstat natrijumom na 50 µM, uočen je efekat ABT-199 na ubijanje ćelija pri nižim koncentracijama od 5 nM i 20 nM. Tabele 11 i 12 prikazuju proračune kombinovanog efekta korišćenjem HSA ili BLISS modela za tretman MOLM-13 ćelija nakon 48 časova.

[0115] Tačkasti grafikoni podataka protočne citometrije za MOLM-13 ćelije posle 96-časovnog tretmana sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 su prikazani na Sl. 6A sa grafikom % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata prikazanih na Sl.6B. MOLM-13 ispoljavaju osetljivost na ABT-199 posle 96 časova (> 30% smrti ćelije na 5, 20, 100 i 500 nM) i osetljivost na imetelstat natrijum (≥ 30% pri 10, 25 i 50 µM). Pri svim koncentracijama kombinovanog tretmana ABT-199 plus imetelstat natrijum, dolazi do pojačanog uništavanja ćelija. Više od 90% ćelijske smrti je primećeno pri najnižoj koncentraciji imetelstat natrijuma (10 µM) kada se kombinuje sa najvišom koncentracijom ABT-199 (500 nM). Više od 90% ćelijske smrti je takođe primećeno pri koncentracijama ABT-199 od 100 nM i 500 nM kada su kombinovane. Pri najvišoj koncentraciji imetelstat natrijuma (50 µM) primećena je skoro potpuna ćelijska smrt pri koncentracijama ABT-199 od 5, 10, 20, 100 i 500 nM. Tabele 13 i 14 pokazuju proračune kombinovanog efekta korišćenjem HSA ili BLISS modela za tretman MOLM-13 ćelija na 96 časova.

4

[0116] Tačkasti grafikoni podataka protočne citometrije za MOLM-13 ćelije su prikazani nakon tretmana 48 časova (Slika 7A) ili 96 časova (Slika 8A) sa pogrešno uparenim ili nekomplementarnim oligonukleotidima i ABT-199. Grafikoni % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama oligonukleotida prikazani su za 48 časova (Slika 7B) ili 96 časova (Slika 8B). Modeli viška u odnosu na najveći pojedinačni agens (Tabele 15 i 17) i višak u odnosu na Bliss (Tabele 16 i 18) potvrđuju da nema efekta kod kontrola oligonukleotida. Negativne vrednosti ne ukazuju na antagonizam u ovim modelima, već samo na nedostatak interakcije.

Tabela 15. Višak u odnosu na HSA u MOLM-13 ćelijama na 48 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Tabela 16. Višak preko BLISS u MOLM-13 ćelijama na 48 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Tabela 17. Višak u odnosu na HSA u MOLM-13 ćelijama na 96 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Tabela 18. Višak preko BLISS u MOLM-13 ćelijama na 96 časova sa nekomplementarnim ili pogrešno uparenim kontrolama

Primer 2: Studije o mehanizmu interakcije između imetelstat natrijuma i ABT-199 u tretiranim ćelijama

[0117] Mehanički, imetelstat natrijum funkcioniše prvenstveno kroz inhibiciju aktivnog mesta kompleksa enzima telomeraze. Pri tome se krajevi telomera na koje enzim deluje ne izdužuju. Uz brzu i ponovljenu ćelijsku deobu tumorskih ćelija, vremenom one postaju ranjive na progresivno skraćivanje telomera. Sa blokiranim procesom obnove telomera, ćelije se progresivno približavaju krizi i na kraju pokreću apoptozu (Bruedigam et al., Cell Stem Cell., 15: 775-790 (2014)).

[0118] Bcl-2 i njegovi srodni članovi porodice igraju ulogu u isporuci anti-apoptotičkih signala tumorskim ćelijama. Bcl-2 deluje tako što inhibira Bak, koji je ključni posrednik u signaliziranju oslobađanja apoptotičkih faktora koji dovode do normalne programirane ćelijske smrti. Pod ovim signalima Bak se translocira u mitohondrije, pokrećući citohrom c i druge apoptotičke faktore koji dovode do aktivacije kaskade kaspaze i kulminiraju ćelijskom smrću preko unutrašnjeg (tj. nereceptorski posredovanog – TRAIL, TNFa itd.) puta. Prisustvo Bcl-2 dovodi do interferencije u ovim signalima jer Bcl-2 može direktno inhibirati Bak. Bez Bak, apoptotički faktori se ne oslobađaju i ćelije se oslobađaju apoptotičkih signala.

[0119] Ova dva puta konvergiraju jer primarna proteinska komponenta telomeraze, hTERT, takođe igra pomoćne uloge u unutrašnjem apoptotičkom putu koji se ukršta sa Bcl-2. Pored toga, poznato je da Bcl-2 takođe povećava ekspresiju hTERT i naknadnu aktivnost telomeraze, dodatno smanjujući apoptozu u tumorskim ćelijama. Pokazalo se da je hTERT u stanju da presretne Bak pre nego što stigne do mitohondrija i pokrene kaskadu apoptotičkih signala. Pored toga, unutar mitohondrija hTERT može pojačati inhibitorni efekat Bcl-2 na Bak. Da bi se dalje razjasnio mehanizam interakcije između imetelstat natrijuma i ABT-199 u tretiranim

4

ćelijama, merena je ekspresija hTERT procenom nivoa transkripcije korišćenjem RT-qPCR, a aktivnost telomeraze je procenjena korišćenjem proteina iz liziranih ćelija u TRAP testu zasnovanom na PCR.

Nivoi hTERT transkripta

[0120] Uzorci iz ćelijskih eksperimenata (i kontrola sa jednim agensom) su prikupljeni za molekularne analize da bi se procenili kombinovani efekti koji doprinose potencijalnim mehanizmima delovanja. AML ćelije su uzgajane u bocama Falcon T25 (Corning catalog 353135) u serijama od 8 miliona ćelija u 8 mL medijuma doziranog ili sa 50 µM imetelstat natrijuma, 20 nM ABT-199, 50 µM imetelstat natrijuma plus 20 nM ABT-199, ili bez leka tokom 48 i 96 časova slično prethodnim eksperimentima, a zatim sakupljeni kao ćelijski peleti za lizu i ekstrakciju nukleinske kiseline ili proteina. Nukleinske kiseline su prečišćene prvim liziranjem ćelija sa 350 µL RLT pufera (Qiagen catalog # 1030963) sa dodatkom 2-merkaptoetanola (Sigma catalog # 63689-100ML-F). RNK je prečišćena sa AllPrep RNA/DNA Mini Kit (Qiagen catalog # 80204) i reverzno transkribovana na cDNK korišćenjem kita za cDNK visokog kapaciteta (ThermoFisher catalog # 4368814) i prethodno amplifikovana pre analize sa TaqMan PreAmp Fisher Mix (catalog #Thermo 4384557B). Proizvodi su analizirani korišćenjem interno razvijenog Taq-Man RT-qPCR testa za merenje nivoa hTERT transkripcije (TaqMan Universal PCR Master Mix - ThermoFisher catalog # 4304437; sekvence prajmera i probe dati ispod) korišćenjem ViiA7 PCR sistema u realnom vremenu kompanije ThermoFisher:

hTERT pune dužine forward: 5'-TGTACTTTGTCAAGGTGGATGTGA-3' (SEQ ID NO:4) hTERT pune dužine reverse: 5'-GCTGGAGGTCTGTCAAGGTAGAG-3' (SEQ ID NO:5) hTERT FAM proba: FAM 5'-CGCGTACGACACCAT-3' MGBNFK (SEQ ID NO:6)

gde je FAM fluorescentni reporter, a MGBNFQ sredstvo za gašenje.

[0121] Bar grafikoni koji pokazuju ekspresiju hTERT posle 48 i 96 časova tretmana sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 su prikazani na Sl. 9. Nivoi ekspresije RNK mereni pomoću RT-qPCR prikazani su kao procenti netretiranih kontrola u isto vreme izlaganja. Rezultati pokazuju da ćelije KG-1 imaju minimalno smanjenje (90-95% u poređenju sa kontrolama u bilo kojoj vremenskoj tački) nivoa RNK hTERT sa tretmanom ABT-199, a ćelije MOLM-13 pokazuju samo blago smanjenje nivoa hTERT transkripcije nakon 96. časova doziranja (~69% u poređenju sa kontrolama). Tretman imetelstat natrijumom pokazuje veće smanjenje nivoa RNK za obe ćelijske linije, sa nižom ekspresijom u dužim vremenima tretmana (KG-1 ćelije od 72% kontrolne posle 48 časova i 47% kontrole za 96 časova; MOLM-13 ćelije od 39 % u 48 časova do nivoa nedetektabilnog testom u 96 časova). Za kombinaciju imetelstat natrijuma i ABT-199, ekspresija hTERT je bila nepromenjena u poređenju sa imetelstat natrijum pojedinačnim agensom u KG-1. Za MOLM-13 u obe vremenske tačke, hTERT nije bio detektovan.

hTERT enzimski nivoi

[0122] Uzorci iz prethodnog odeljka za analizu proteina su sakupljeni kao ćelijski peleti centrifugiranjem na 5 minuta na 1500K za lizu i ekstrakciju proteina. Proteinski lizati su analizirani korišćenjem modifikovanih postupaka kombinovanih iz dva primarna izvora (Hou, et al. (2001) 43(3) 519-524 i Nature Protocols (2006) 1 (3) 1583-1590). Lizati su generisani dodavanjem 80 µL 10 mM Tris-EDTA, 1% NP-40, 10% glicerola, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 250 µM natrijum deoksiholata, 100 µM AEBSF, 5 mM 2-merkaptoetanolni pufer i inkubacija na ledu 30 minuta. Lizati su centrifugirani 15 minuta pri maksimalnoj brzini i na 4°C da bi se peletirali ćelijski ostaci. Prinos proteina iz izbistrenih lizata je kvantifikovan korišćenjem BCA testa (ThermoFisher catalog 23252) i podvrgnut qPCR TRAP testu da bi se odredila relativna aktivnost telomeraze (Power SYBR Green PCR Master Mix - ThermoFisher # 4367659) korišćenjem ViiA7 sistema Real-Time PCR od ThermoFisher. U ovom testu, proteinski lizati su izloženi sintetičkim oligonukleotidima koji oponašaju sekvence telomera u prisustvu viška dNTP i SYBR Green boje. Što je veća aktivnost telomeraze, veća je ekstenzija sintetičkih prajmera, a samim tim i veće bojenje nukleinske kiseline i signala koji generiše SYBR boja. Ovaj signal se poredi sa standardnom krivom kontrolnog proteinskog lizata da bi se odredila relativna aktivnost telomeraze između uzoraka.

Forward prajmer: 5' - AACCGTCGAGCAGAGTT - 3' (SEQ ID NO:7)

Reverzni prajmer: 5' - GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC - 3' (SEQ ID NO:8)

4

Rezultati za molekularne interakcije

[0123] Bar grafikoni koji pokazuju aktivnost telomeraze posle 48 i 96 časova tretmana sa imetelstat natrijumom i/ili ABT-199 su prikazani na Sl. 10. Nakon 48 časova, ABT-199 ne pokazuje nikakav efekat na aktivnost telomeraze u ćelijama KG-1 i MOLM-13 kada se koristi kao pojedinačni agens. Nakon 96 časova tretmana ABT-199, aktivnost telomeraze je smanjena na ~80% u KG-1 i ~70% što ukazuje da ABT-199 ima mali uticaj na aktivnost telomeraze. Imetelstat natrijum je pokazao smanjenje aktivnosti telomeraze u ćelijskim linijama KG-1 i MOLM-13. U ćelijama MOLM-13, smanjenja u poređenju sa kontrolom su bila uporediva u obe vremenske tačke (37% za 48 časova, 44% za 96 časova). Međutim, KG-1 je pokazao veće redukcije aktivnosti telomeraze sa tretmanom natrijumom imetelstatom nakon 96 časova (64% tokom 48 časova, 16% tokom 96 časova). Sa kombinovanim tretmanom, KG-1 je pokazao minimalne razlike u odnosu na imetelstat natrijum kao pojedinačni agens, dok je kod MOLM-13 smanjenje aktivnosti telomeraze bilo skoro nedetektabilno PCR testom.

Primer 3: Razjašnjavanje sinergije kombinacije

[0124] Tretman modela AML tumorske ćelijske linije MOLM-13 je ponovljen u eksperimentalnom formatu opisanom u Primeru 1 sa sledećim promenama: imetelstat natrijum, kontrolna pogrešno uparena i kontrolna nekomplementarna jedinjenja su testirana na višim koncentracijama od 0 - 75 µM (ukupno sedam koncentracija) i ABT-199 je testiran od 20 pM - 1 µM (devet ukupnih koncentracija). Tretirane ćelije su analizirane protočnom citometrijom za bojenje aneksinom V i propidijum jodidom kao što je prethodno opisano. Događaji obuhvaćeni apoptotičnom populacijom (aneksin V+/propidijum jodid+) korišćeni su za određivanje sinergijskih rezultata za kombinacionu matricu. Analizu podataka kombinacije generisao je softver analizatora Horizon Chalice<™>(Horizon Discovery Group, Cambridge, UK). Dodatni in vitro eksperiment je izveden sa MOLM-13 kao i ćelijskom linijom HL-60 da bi se procenila sinergija imetelstat natrijuma plus ABT-199 nakon jednokratnog izlaganja kombinaciji (tj. bez ponovnog doziranja nakon 48 časova). Opsezi doza ABT-199 su neznatno izmenjeni (500 pM - 100 nM, pet ukupnih koncentracija) i upoređeni sa ekvivalentnim tačkama podataka u gore opisanom eksperimentu gde su ćelije dozirane drugi put nakon 48 časova. U ovom eksperimentu nisu korišćene pogrešno uparene i nekomplementarne kontrole.

[0125] Da bi se statistički kvalifikovali efekti uočeni u tretiranim MOLM-13 ćelijama, kombinacije doziranja su procenjene pomoću veb aplikacije Horizon's Chalice<™>Softver za analizator koja sumira neobrađene podatke izobolarne analize fiksnog doziranja prema

4

postupku Chou i Talalay (Chou TC, Talalay P., Adv Enzime Regul 1984; 22:27-55). Uslovi kombinacije se podvrgavaju izobolarnoj analizi da bi se generisao kombinovani indeks i grafički predstavili ponašanje kombinacije sa sinergističkim parovima koji padaju ispod izobolograma i antagonističkim koji padaju iznad njega (očekivalo bi se da će kombinacije aditiva pasti na liniju). Horizont Chalice<™>Softver Analyzer dodatno obezbeđuje sinergijski rezultat, sa vrednostima većim od 1 što ukazuje na sinergiju.

[0126] Grafikon % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata za 48-časovni tretman je prikazan na Sl. 11. Tabela 19 pokazuje proračune prekomerne aditivnosti (Loewe model) za svaku kombinaciju za MOLM-13 ćelije posle tretmana od 48 časova. Vrednosti veće od nule nalaze se u gornjem desnom kvadrantu tabele 19, gde su koncentracije ABT-199 veće ili jednake 20 nM, a koncentracije imetelstat natrijuma veće ili jednake 25 µM. Horizont Chalice<™>Softver Analyzer dodatno obezbeđuje sinergijski rezultat, sa vrednostima većim od 1 što ukazuje na sinergiju. Za ćelije tretirane imetelstat natrijumom, nakon 48 časova utvrđeno je da je sinergijski rezultat 5.12. Ovo se poredi sa rezultatima od 0.22 i 0.41 za pogrešno uparene i nekomplementarne kontrole (Tabela 20 i 21), respektivno. Grafikon % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata za 48-časovni tretman je prikazan na Sl. 12A i Sl. 12B za pogrešno obeležene i nekomplementarne kontrole, respektivno.

4

[0127] Grafikon % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijuma imetelstata za 96-časovni tretman je prikazan na Sl. 13. Tabela 22 prikazuje proračune prekoračenja aditivnosti (Loewe model) za svaku kombinaciju za MOLM-13 ćelije nakon 96-časovnog tretmana. Vrednosti veće od nule nalaze se u gornjoj desnoj dijagonali tabele 19. Iznenađujuće, čak i najniže koncentracije ABT-199 (0.04 nM i 0.2 nM) pokazuju sinergiju sa imetelstat natrijumom pri 50 µM odnosno 75 µM najnižoj koncentraciji imetelstat natrijuma, respektivno i najniže koncentracije imetelstat natrijuma (1 µM i 5 µM) pokazuju sinergiju sa ABT-199 na 500 nM i 100 nM respektivno. Horizont Chalice<™>Softver Analyzer dodatno obezbeđuje sinergijski rezultat, sa vrednostima većim od 1 što ukazuje na sinergiju. Za ćelije tretirane sa imetelstat natrijumom, nakon 96 časova utvrđen je sinergijski skor 11.33. Ovo se poredi sa rezultatima od 0.03 i 0.06 za pogrešno

4

uparene i nekomplementarne kontrole (Tabela 23 i 24), respektivno. Grafikon % apoptotičkih ćelija (dvostruko obeleženih) u odnosu na koncentraciju ABT-199 pri različitim koncentracijama natrijum imetelstata za 96-časovni tretman je prikazan na Sl.14A i Sl.14B za pogrešno uparene i nekomplementarne kontrole.

4

[0128] Apoptotična populacija (dvostruko obeleženih) 96 časova nakon pojedinačne doze tretmana prikazana je za MOLM-13 (Slika 17A) i AML ćelijsku liniju HL-60 (Slika 17B). Manji opseg doza ABT-199 je korišćen u ovom eksperimentu da bi se procenila efikasnost istovremenog tretmana imetelstat natrijumom. Tabela 25 prikazuje proračune pri višku aditivnosti (Loewe model) kako je izračunao softver analizatora Horizon Chalice<™>za svaku kombinaciju MOLM-13 dok tabela 26 to pokazuje za HL-60. Iako je sinergistički u obe linije, veća sinergija je primećena kod MOLM-13, što dokazuju i veći rezultat kao i pojačan efekat na apoptozu pri nižim (5 i 10 µM) koncentracijama imetelstat natrijuma. Kombinacija sa imetelstat natrijumom pokazuje potencijal sa koncentracijama ABT-199 do 1-5 nM doza.

[0129] Za poređenje, podaci prikazani na Sl.13 i korišćeni za generisanje tabele 22 ponovo su analizirani sa softverom analizatora Horizon Chalice<™>samo u dozama korišćenim na Sl.17A i tabeli 25. Kao što je naznačeno u tabeli 27, sinergijski rezultat je skoro prepolovljen (11.33 do 6.06) od uklanjanja gornjih nivoa ABT-199 krive titracije. Ovaj rezultat je otprilike dvostruki (6.06 naspram 3.24) u odnosu na 96-časovni uslov jednokratne doze (Tabela 25), što sugeriše da je veća sinergija kombinovanja ABT-199 sa imetelstat natrijumom izazvana kontinuiranom izloženošću.

Primer 4: Inhibitor telomeraze imetelstat natrijum u kombinaciji sa BCL-2 inhibitorom Venetoklaks pojačava apoptozu ex vivo u uzorcima AML pacijenata

[0130] Akutna mijeloidna leukemija (AML) je agresivan kancer sa ograničenim mogućnostima lečenja van hemoterapije, i stoga su lekovi potrebni da bi se ispunila ova nezadovoljena potreba. I hTERT, katalitička podjedinica telomeraze, i BCL-2, apoptotički regulator, su prekomerno izraženi u AML, što je u korelaciji sa ozbiljnošću bolesti i lošom prognozom. Imetelstat

1

natrijum je prvi u klasi kompetitivni inhibitor telomeraze sa kliničkom aktivnošću kod hematoloških maligniteta. Venetoklaks (ABT-199), odobreni inhibitor BCL-2 za CLL pacijente koji imaju deleciju 17p i koji su primili najmanje jednu prethodnu terapiju, pokazao je obećavajuću kliničku korist kod pacijenata sa AML. Studija u ovom primeru istraživala je efekat imetelstat natrijuma ili venetoklaksa samostalno ili u kombinaciji na AML ćelije in vitro.

[0131] AML ćelijske linije (vidi Primer 1) i uzorci mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) pacijenata sa AML, koji su dobijeni iz pune krvi pacijenata sa AML nakon prečišćavanja Ficoll, tretirani su samo imetelstat natrijumom ili venetoklaksom ili u kombinaciji, a održive i apoptotičke populacije ćelija su tretirane procenjeno protočnom citometrijom. Ispitivani su mehanizam delovanja telomeraze, ekspresija hTERT i mitohondrijalna disfunkcija. PBMC pacijenata sa AML su dozirani imetelstat natrijumom (0 µM, 25 µM i 50 µM), venetoklaksom (ABT-199) (0 nM, 20 nM i 100 nM) ili kombinacijom tokom 16 časova ili 40 časova. Apoptoza je merena bojenjem protočnom citometrijom za Aneksin V i propidijum jodid. Neobojene (tj. dvostruko negativne) ćelije čine žive ćelije preostale nakon tretmana.

[0132] Konkretno, puna krv pacijenata sa AML (n=4) je prečišćena korišćenjem Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare katalog # 17-1440-03) za prečišćavanje PBMC. Ficoll je stavljen u epruvete za centrifugiranje SepMate od 50 mL (StemCell Technologies katalog # 85450) i krv pacijenta je prethodno razblažena fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS; ThermoFisher catalog no.20012-027) sa dodatkom 2% fetalnog FBS seruma (FBS) sa HyClone FBS (ThermoFisher catalog # SH30070.02) 1:1 pre postavljanja na Ficoll. Krv je centrifugirana da se odvoje PBMC od crvenih krvnih ćelija, granulocita, itd., a preostali PBMC su isprani dva puta sa PBS+2% FBS. Ćelije su postavljene sa gustinom od ~300.000 ćelija po bunarčiću na pločice za kulturu tkiva sa 96 bunarčića od polistirena sa U dnom (Corning catalog # 353777) u RPMI-1640 (ThermoFisher catalog # 11875-085) dopunjen sa 10% HyClone FBS prethodno pomenutim i uzgajane u inkubatoru na 37°C pod vlažnim 5% CO2. Nisu korišćeni antibiotici sa ex vivo PBMC. Ćelije su odmah tretirane sa imetelstat natrijumom (Janssen Biotech, Inc.) pripremljenim u RPMI-1640 dopunjenom sa 10% FBS i/ili ABT-199 (Selleckchem katalog # S8048) pripremljenim kao 1000x stok u DMSO, razblaženom 1:100 u PBS (vehikulum). Imetelstat natrijum je testiran od 0 - 50 µM, a venetoklaks (ABT-199) je testiran od 0 - 100 nM.

[0133] Posle 16- i 40-časovnog tretmana, ćelije su merene u odnosu na zdravu, ranu apoptotičnu i apoptotičnu populaciju pomoću aneksina V (boja za unutrašnju ćelijsku membranu) plus propidijum jodid (PI, DNK vezujuća boja) kompleta za protočnu citometriju (BioLegend

2

catalog # 640914 ) kao što je opisano u Primeru 1. Pored toga, PBMC su obojeni za sledeće markere diferencijacije: CD45 (V500 konjugovan; BD catalog # 560777) i CD34 (konjugovan Pacific Blue; Biolegend katalog # 343512). Događaji su se prvo određivali za CD45 pozitivnost, a zatim za CD34 pre procene Aneksina V/propidijum jodida kao što je opisano u Primeru 1 iznad. Određene su srednje vrednosti i standardne devijacije za četiri pacijenta za CD45<+>(leukociti) i CD45<+>/CD34<+>(leukemijske matične ćelije) populacije.

Rezultati ex vivo tretmana

[0134] Sl. 15A do 15D ilustruju srednji odgovor četiri izložena PBMC uzorka pacijenata sa AML ex vivo na imetelstat natrijum i/ili venetoklaks (ABT-199). Grafikoni % vitalnih ćelija posle tretmana tokom 16 časova lečenja CD45<+>/CD34<+>leukocita i leukemijskih matičnih ćelija sa različitim koncentracijama venetoklaksa (ABT-199) i/ili imetelstat natrijuma pacijenta sa AML prikazane su na SI. 15A (CD45<+>leukociti) i 15B (CD45<+>/CD34<+>leukemijske matične ćelije). Grafikoni % vitalnih ćelija posle tretmana tokom 40 časova CD45<+>/CD34<+>leukocita i leukemijskih matičnih ćelija sa različitim koncentracijama venetoklaksa (ABT-199) i/ili imetelstat natrijuma pacijenta sa AML prikazane su na Sl. 15C (CD45<+>leukociti) i 15D (CD45<+>/CD34<+>leukemijske matične ćelije). Generalno, održivost CD45<+>leukocita dobijenih od pacijenata sa AML nisu bili pod uticajem samo tretmana natrijumom imetelstatom i samo umereno pod uticajem venetoklaksa kao pojedinačnog agensa nakon 16-časovne i 40-časovne izloženosti. Međutim, primećena je smanjena vitalnost ćelija kada je imetelstat natrijum korišćen u kombinaciji sa venetoklaksom. Slični rezultati su primećeni za CD45<+>/CD34<+>populacije leukemijskih matičnih ćelija; primećena je aktivnost zavisna od doze u smanjenju vitalnosti ćelija kada je imetelstat natrijum korišćen u kombinaciji sa venetoklaksom u obe vremenske tačke, i bila je najdrastičnija u 40 časova.

[0135] Sinergistička aktivnost zavisna od doze u izazivanju apoptoze primećena je u više AML ćelijskih linija kada se kombinuje imetelstat natrijum sa venetoklaksom (vidi Primer 1). Na primer, u ćelijskoj liniji MOLM-13, imetelstat natrijum i venetoklaks su imali skromnu apoptotičku aktivnost nakon 48 časova (22% i 30% respektivno), ali je kombinacija postigla 88% za 48 časova i skoro 100% za 96 časova. Slična pojačana apoptotička aktivnost je takođe primećena u 4 uzorka pacijenata sa AML. Molekularne analize su pokazale da kombinovanje natrijuma imetelstata sa venetoklaksom jače smanjuje ekspresiju hTERT i aktivnost telomeraze nego bilo koji od agenasa sam. Ovaj primer pokazuje da kombinacija imetelstat natrijuma sa venetoklaksom u AML ima sinergistički efekat na indukciju apoptoze u ćelijskim linijama i uzorcima pacijenata in vitro.

Primer 5: Inhibitor telomeraze imetelstat natrijum u kombinaciji sa BCL-2 inhibitorom Venetoklaks poboljšava preživljavanje in vivo kod akutne mijeloidne leukemije

[0136] Kao što je objašnjeno u Primeru 4, akutna mijeloidna leukemija (AML) je agresivan kancer sa ograničenim mogućnostima lečenja van hemoterapije, i stoga su potrebna lekovita sredstva. U Primeru 4, pokazano je da inhibitor telomeraze imetelstat natrijum u kombinaciji sa BCL-2 inhibitorom venetoklaks pojačava apoptozu in vitro. Studija u ovom primeru istraživala je efekat imetelstat natrijuma ili venetoklaksa samog, ili u kombinaciji u in vivo modelu akutne mijeloidne leukemije.

Postupci

[0137] In vivo studija na MOLM-13 AML diseminovanom mišjem modelu je sprovedena da bi se procenila efikasnost i preživljavanje. Konkretno, 0. dana studije, MOLM-13 AML tumorske ćelije su implantirane u miševe. Miševi su primili 31 dan tretmana: (i) vehikulume (MM+PEG400/Phosal50/ETOH); (ii) imetelstat natrijum (30 mg/kg); (iii) venetoklaks (ABT-199) (100 mg/kg); (iv) MM (kontrola pogrešno uparenih oligonukleotida) (30 mg/kg) i ABT-199 (100 mg/kg); i (v) imetelstat natrijum (30 mg/kg) i ABT-199 (100 mg/kg). Procenat preživljavanja miševa je procenjen kao funkcija vremena (dani nakon implantacije tumorskih ćelija). Studija je trajala ukupno 108 dana (77 dana nakon prekida terapije).

[0138] Pedeset ženki SCID-bež miševa (starih 6 nedelja, Jackson Laboratory) je intravenski ubrizgano sa 1 milion MOLM-13 ćelija i nasumično podeljeno u pet grupa. Prvog dana nakon injekcije, miševi su tretirani sa bilo kojim od pet terapijskih uslova kao što je navedeno u tabeli 28.

Tabela 28. Uslovi tretmana za SCID-bež miševe inokulirane MOLM-13 diseminovanim AML modelom.

4

[0139] Miševi su posmatrani svakodnevno, a telesna težina je merena dva puta nedeljno. Praćeno je preživljavanje miševa u svakoj grupi. Studija je prekinuta 108. dana, što je bilo 77 dana nakon poslednjeg tretmana. Povećani životni vek ("ILS") je procenjen za svaku grupu, a procenat ILS u odnosu na kontrolu vehikuluma je izračunat na sledeći način:

%ILS = 100x(T-C)/C

gde je T medijana preživljavanja tretirane grupe, a C medijana preživljavanja kontrolne grupe.

Rezultati in vivo studije

[0140] Kaplan-Meierova dijagram preživljavanja za AML diseminovani model MOLM-13 108. dana je prikazana na Sl. 16. Konkretno, Sl. Slika 16 prikazuje procenat preživljavanja miševa kao funkciju dana nakon implantacije ćelija tumora. Medijana preživljavanja i % produženog životnog veka ("ILS") izračunati za različite grupe tretmana prikazani su u Tabeli 29. Rezultati pokazuju da je srednje vreme preživljavanja za miševe tretirane imetelstat natrijumom kao jedinim agensom bilo 26.5 dana, što je prevedeno na 20.4% ILS (p=0.0009) u poređenju sa vehikulumom. Tretman sa venetoklaksom (ABT-199) kao jedinim agensom je rezultirao srednjim vremenom preživljavanja od 30 dana i 36.3% ILS (p≤0.0001). U kombinaciji sa neusklađenom (MM) oligo kontrolom, ABT-199 je dao slične efekte samog ABT-199: srednje vreme preživljavanja od 31 dan i 40.9% ILS (p≤0.0001). Kombinacija imetelstat natrijuma sa ABT-199 je rezultovala najboljim ishodom sa srednjim vremenom preživljavanja od 37 dana i značajnom efikasnošću od 68.1% ILS (p≤0.0001). Dodatno, četiri miša (40%) iz ove grupe kombinovanog tretmana su dugo živeli i preživeli su više od 108 dana, pokazujući povećani benefit za preživljavanje.

Tabela 29: Srednje vreme preživljavanja i procenat produženog životnog veka (%ILS; u poređenju sa kontrolom) MOLM-13 implantiranih miševa tretiranih imetelstat natrijumom i/ili venetoklaksom (ABT-199), ili MM (kontrola pogrešno uparenih oligonukleotida).

[0141] Svi miševi su tolerisali kombinaciju imetelstat natrijuma sa venetoklaksom i primećen je produženi životni vek u poređenju sa samo imetelstat natrijumom (39.6%, p=0.0011) ili samo venetoklaksom (23.3%, p=0.0001). U kombinovanoj grupi, 40% lečenih miševa je bilo živo 77 dana nakon prekida terapije, što je pokazalo značajnu korist za preživljavanje uz potencijalno izlečenje. Rezultati u ovom primeru, kao i u primeru 4, pokazuju da kombinacija imetelstat natrijuma sa venetoklaksom kod AML ima sinergistički efekat na indukciju apoptoze u ćelijskim linijama i uzorcima pacijenata. in vitro, što se prevodi u produženo preživljavanje i potencijalni lek u modelima ksenotransplantata.

Ekvivalenti

[0142] Iako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim primerima izvođenja, stručnjaci iz ove oblasti tehnike treba da razumeju da se mogu napraviti različite promene i da se ekvivalenti mogu supstituisati. Pored toga, mogu se napraviti mnoge modifikacije da bi se prilagodila određena situacija, materijal, sastav materije, proces, procesni korak ili koraci, da bi se postigle prednosti koje pruža ovaj pronalazak.

[0143] Citiranje publikacija i patentnih dokumenata nije zamišljeno kao indikacija da je bilo koji takav dokument relevantno prethodno stanje tehnike, niti predstavlja bilo kakvo priznanje sadržaja ili datuma istih.

Claims (21)

Patentni zahtevi

1. Imetelstat za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije (AML) kod pacijenata koji se leče sa ABT-199 ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

2. ABT-199 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije (AML) kod pacijenata koji su podvrgnuti lečenju imtelstatom.

3. Imetelstat za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje imetelstata i ABT-199 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u kombinaciji subjektu kome je to potrebno.

4. Kombinacija koja sadrži imetelstat i ABT-199 ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), pri čemu postupak obuhvata davanje kombinacije subjektu kome je to potrebno.

5. Imetelstat za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-3 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je imetelstat natrijum imetelstat.

6. Imetelstat za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-3 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu se imetelstat primenjuje za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, pri čemu svaki ciklus doziranja sadrži:

(a) intravensku primenu 7 - 10 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje;

(b) intravensku primenu 7 - 10 mg/kg imetelstata jednom nedeljno tokom četiri nedelje;

(c) intravensku primenu 2.5 - 7 mg/kg imetelstata jednom u tri nedelje; ili

(d) intravensku primenu 0.5 - 9.4 mg/kg imetelstata jednom u četiri nedelje.

7. Imetelstat za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili kombinacija za upotrebu prema zahtevu 6, gde je imetelstat natrijum imetelstat.

8. Imetelstat za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-3 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde je ABT-199 za primenu u dozi od:

(a) 50 - 400 mg ABT-199 dnevno;

(b) 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili

(c) 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga.

9. Imetelstat za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-3 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je primena ABT-199 jedan dan pre, jedan dan posle ili istog dana kada je primena imetelstata.

10. Imetelstat natrijum za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML) prema patentnom zahtevu 3, pri čemu postupak obuhvata davanje imetelstat natrijuma i ABT-199 u kombinaciji subjektu kome je to potrebno.

11. ABT-199 za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML) prema patentnom zahtevu 2, pri čemu postupak obuhvata davanje ABT-199 i imetelstat natrijuma u kombinaciji subjektu kome je to potrebno.

12. Kombinacija koja sadrži imetelstat natrijum i ABT-199 za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML) prema patentnom zahtevu 4, pri čemu postupak obuhvata davanje kombinacije subjektu kome je to potrebno.

13. Imetelstat natrijum za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, ABT-199 za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu se imetelstat natrijum primenjuje tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više od 8 ciklusa doziranja, pri čemu svaki ciklus doziranja sadrži:

(a) intravensku primenu 7 - 10 mg/kg imetelstat natrijuma jednom u četiri nedelje;

(b) intravensku primenu 7 - 10 mg/kg imetelstat natrijuma jednom nedeljno tokom četiri nedelje;

(c) intravensku primenu 2.5 - 7 mg/kg imetelstat natrijuma jednom u tri nedelje; ili

(d) intravensku primenu 0.5 - 9.4 mg/kg imetelstat natrijuma jednom svake četiri nedelje.

14. Imetelstat natrijum za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, ABT-199 za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu se ABT-199 primenjuje u dozi od:

(a) 50 - 400 mg ABT-199 dnevno;

(b) 2 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 800 mg 6. dana i dnevno nakon toga; ili

(c) 25 mg ABT-199 prvog dana sa dnevnom eskalacijom do konačne doze od 400 mg 5. dana i dnevno nakon toga.

15. Imetelstat natrijum za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, ABT-199 za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu se primena ABT-199 vrši jedan dan pre, jedan dan posle ili istog dana kada i primena imetelstat natrijuma.

16. Komplet za upotrebu u postupku lečenja akutne mijeloidne leukemije (AML), koji sadrži:

(a) imetelstat; i

(b) ABT-199 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

17. Komplet prema patentnom zahtevu 16, naznačen time da imetelstat je imetelstat natrijum.

18. In vitro postupak za izazivanje apoptoze u ćeliji akutne mijeloidne leukemije (AML) koji se sastoji od:

kontaktiranja ćelije sa terapeutski efikasnom količinom imetelstat natrijuma; i kontaktiranja ćelije sa terapeutski efikasnom količinom ABT-199.

19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži imetelstat i ABT-199.

20. Farmaceutska kompozicija prema patentnim zahtevu 19, naznačena time da imetelstat je imetelstat natrijum.

21. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 19, naznačena time da je kompozicija za upotrebu u lečenju akutne mijeloidne leukemije.