RS64299B1 - Isporuka adeno asociranog virusnog vektora mikrodistrofina specifičnog za mišiće za lečenje mišićne distrofije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak obezbeđuje adeno-asocirane virusne (AAV) vektore koji eksprimiraju minijaturizovani humani gen za mikro-distrofin i upotrebu ovih vektora u metodama za ekspresiju mikro-distrofina u skeletnim mišićima, uključujući dijafragmu i srčani mišić i za zaštitu mišićnih vlakana od povreda, povećanje mišićne snage i smanjenje i/ili sprečavanje fibroze kod ispitanika koji pate od mišićne distrofije.

STANJE TEHNIKE

[0002] Važnost mišićne mase i snage za svakodnevne aktivnosti, kao što su kretanje i disanje, i za metabolizam celog tela je nedvosmislena. Deficiti u mišićnoj funkciji proizvode mišićne distrofije (MD) koje karakterišu mišićna slabost i opadanje i imaju ozbiljan uticaj na kvalitet života. Najbolje okarakterisane MD rezultat su mutacija u genima koji kodiraju članove proteinskog kompleksa povezanog sa distrofinom (DAPC). Ove MD su rezultat krhkosti membrane povezane sa gubitkom sarkolemalno-citoskeletnog vezivanja od strane DAPC. Dišenova mišićna distrofija (DMD) je jedna od najrazornijih bolesti mišića koja pogađa 1 od 5000 novorođenih muškaraca.

[0003] DMD je uzrokovana mutacijama u genu DMD koje dovode do smanjenja iRNK i odsustva distrofina, sarkolemalnog proteina od 427 kD povezanog sa proteinskim kompleksom povezanim sa distrofinom (DAPC) (Hoffman et al., Cell 51(6):919-28, 1987). DAPC se sastoji od više proteina na mišićnoj sarkolemi koji formiraju strukturnu vezu između ekstracelularnog matriksa (ECM) i citoskeleta preko distrofina, proteina koji veže aktin, i alfa-distroglikana, proteina koji veže laminin. Ove strukturne veze deluju na stabilizaciju mišićne ćelijske membrane tokom kontrakcije i štite od oštećenja izazvanih kontrakcijama. Sa gubitkom distrofina, krhkost membrane rezultira sarkolemalnim kidanjem i prilivom kalcijuma, što pokreće proteaze aktivirane kalcijumom i segmentiranu nekrozu vlakana (Straub et al., Curr Opin. Neurol.10(2): 168-75, 1997). Ovaj nekontrolisani ciklus degeneracije i regeneracije mišića na kraju iscrpljuje populaciju matičnih ćelija mišića (Sacco et al., Cell, 2010.143(7): str.1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009.71: p. 37-57), što dovodi do progresivne slabosti mišića, zapaljenja endomizijuma i fibrotičnih ožiljaka.

[0004] Bez stabilizacije membrane od distrofina ili mikro-distrofina, DMD će manifestovati nekontrolisane cikluse povreda tkiva i na kraju zameniti izgubljena mišićna vlakna fibroznim ožiljnim tkivom kroz proliferaciju vezivnog tkiva. Fibrozu karakterišu prekomerne naslage proteina ECM matriksa, uključujući kolagen i elastin. ECM proteini se prvenstveno proizvode od citokina kao što je TGFβ koji se oslobađaju aktiviranim fibroblastima koji reaguju na stres i inflamaciju. Iako je primarna patološka karakteristika DMD degeneracija miofibera i nekroza, fibroza kao patološka posledica ima jednake posledice. Prekomerna proizvodnja fibrotičnog tkiva ograničava regeneraciju mišića i doprinosi progresivnoj slabosti mišića kod pacijenta sa DMD. U jednoj studiji, prisustvo fibroze na početnim DMD mišićnim biopsijama bilo je visoko povezano sa lošim ishodom motorike pri 10-godišnjem praćenju (Desguerreet al., J Neuropathol Exp Neurol, 2009.68(7): p.762-7). Ovi rezultati ukazuju na fibrozu kao glavni doprinos DMD disfunkciji mišića i naglašavaju potrebu za ranom intervencijom pre očite fibroze.

[0005] Adeno asocirani virus (AAV) je parvovirus sa nedostatkom replikacije, čiji je jednolančani DNK genom dužine oko 4,7 kb, uključujući 145 nukleotidnih terminalnih obrnutih ponavljanja (ITR). Postoji više serotipova AAV. Poznate su nukleotidne sekvence genoma AAV serotipova. Na primer, nukleotidna sekvenca genoma AAV serotipa 2 (AAV2) je predstavljena u Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) kako je ispravljeno u Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Kao i drugi primeri, kompletan genom AAV-1 dat je u GenBank Accession No. NC_002077; kompletan genom AAV-3 dat je u GenBank Accession No. NC_1829; kompletan genom AAV-4 dat je u GenBank Accession No.

NC_001829; AAV-5 genom je dat u GenBank Accession No. AF085716; kompletan genom AAV-6 dat je u GenBank Accession No. NC_001862; najmanje delovi AAV-7 i AAV-8 genoma su obezbeđeni u GenBank Accession Nos. AX753246, odnosno AX753249 (vidi takođe U.S. Patent No.7,282,199 i 7,790,449 koji se odnose na AAV-8); AAV-9 genom je dat u Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); AAV-10 genom je dat u Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); i AAV-11 genom je dat u Virology, 330(2): 375-383 (2004). Kloniranje AAVrh.74 serotipa je opisano u Rodino-Klapac., et al. Journal of translational medicine 5, 45 (2007). Cis-delujuće sekvence koje usmeravaju replikaciju virusne DNK (rep), enkapsidaciju/ pakovanje i integraciju ćelijskog hromozoma domaćina sadržane su u ITR. Tri AAV promotora (nazvana p5, p19 i p40 za njihove relativne lokacije na mapi) pokreću ekspresiju dva AAV unutrašnja otvorena okvira čitanja koji kodiraju rep i cap gene. Dva rep promotora (p5 i p19), zajedno sa diferencijalnim splajsovanjem pojedinačnog AAV introna (npr. na AAV2 nukleotidima 2107 i 2227), rezultiraju proizvodnjom četiri rep proteina (rep 78, rep 68, rep 52 i rep 40) iz rep gena. Rep proteini poseduju višestruka enzimska svojstva koja su na kraju odgovorna za replikaciju virusnog genoma. Cap gen je eksprimiran iz promotora p40 i kodira tri kapsidna proteina VP1, VP2 i VP3. Alternativno splajsovanje i početna mesta translacije bez konsenzusa odgovorna su za proizvodnju tri povezana kapsidna proteina.

Jedinstveno konsenzusno mesto poliadenilacije nalazi se na poziciji 95 mape AAV genoma. Životni ciklus i genetika AAV su izloženi u Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0006] AAV poseduje jedinstvene karakteristike koje ga čine privlačnim kao vektor za isporuku strane DNK ćelijama, na primer, u genskoj terapiji. AAV infekcija ćelija u kulturi je necitopatska, a prirodna infekcija ljudi i drugih životinja je tiha i asimptomatska. Štaviše, AAV inficira mnoge ćelije sisara omogućavajući mogućnost ciljanja mnogih različitih tkiva in vivo. Štaviše, AAV transdukuje ćelije koje se polako dele i koje se ne dele, i može da opstane u suštini tokom života tih ćelija kao transkripciono aktivni nuklearni epizom (ekstrahromozomski element). AAV provirusni genom je infektivan kao klonirana DNK u plazmidima, što čini izgradnju rekombinantnih genoma izvodljivom. Štaviše, pošto su signali koji usmeravaju replikaciju AAV, enkapsulaciju genoma i integraciju sadržani unutar ITR AAV genoma, neki ili svi od unutrašnjih genoma od približno 4,3 kb (koji kodiraju replikaciju i strukturne kapsidne proteine, rep-cap) mogu se zameniti stranom DNK kao što je kaseta gena koja sadrži promotor, DNK od interesa i poliadenilacioni signal. Rep i cap proteini mogu biti obezbeđeni u trans. Još jedna značajna karakteristika AAV je da je izuzetno stabilan i srčani virus. Lako podnosi uslove koji se koriste za inaktivaciju adenovirusa (56°C do 65°C tokom nekoliko sati), čineći hladno očuvanje AAV manje kritičnim. AAV može čak biti liofilizovan. Konačno, ćelije inficirane AAV-om nisu otporne na superinfekciju.

[0007] Više studija je pokazalo dugoročnu (> 1,5 godina) ekspresiju proteina posredovanu rekombinantnim AAV u mišićima. Vidi, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); i Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Vidi takođe, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) i Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Štaviše, pošto je mišić visoko vaskularizovan, transdukcija rekombinantnog AAV dovela je do pojave transgenskih proizvoda u sistemskoj cirkulaciji nakon intramuskularne injekcije kako je opisano u Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) i Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997).

Štaviše, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) pokazao je da skeletni miofibri poseduju neophodne ćelijske faktore za ispravnu glikozilaciju, preklapanje i sekreciju antitela, ukazujući da je mišić sposoban za stabilnu ekspresiju izlučenih proteinskih terapeutika.

[0008] Funkcionalno poboljšanje kod pacijenata koji pate od DMD i drugih mišićnih distrofija zahteva restauraciju gena u ranoj fazi bolesti. Postoji potreba za tretmanima koji povećavaju mišićnu snagu i štite od povreda mišića kod pacijenata koji pate od DMD.

SUŠTINA PRONALASKA

[0009] Predmetni pronalazak je usmeren na AAV vektore koji eksprimiraju gen za mikrodistrofin skeletnim mišićima, uključujući dijafragmu i srčani mišić, kako bi zaštitili mišićna vlakna od povreda, povećali mišićnu snagu i smanjili i/ili sprečili fibrozu.

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAVrh.74 vektor koji se sastoji od MHCK7 promotora/pojačivača specifičnog za mišiće koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1, pri čemu rekombinantni AAVrh.74 vektor obuhvata 5' AAV2 terminalno obrnuto ponavljanje (ITR), MHCK7 promotor/pojačivač specifičan za mišiće, SV40 intron, nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, signal sintetičke poliadenilacije (PolyA) i 3' AAV2 ITR.

[0011] Ovde su opisane terapije i pristupi za povećanje mišićne sile i/ili povećanje mišićne mase koristeći vektore genske terapije za isporuku mikro-distrofina za rešavanje defekta gena uočenog u DMD. Kao što je prikazano na primeru 2, lečenje mikro-distrofin genskom terapijom dovelo je do veće snage mišića in vivo. Dalje, isporuka mikro-distrofin genske terapije intramuskularno i sistemski pokazala je isporuku distrofina mišićima u modelima miševa in vivo.

[0012] Mikro-distrofin protein obezbeđuje stabilnost mišićne membrane tokom kontrakcije mišića, npr. mikro-distrofin deluje kao amortizer tokom kontrakcije mišića.

[0013] U jednom otelotvorenju, rAAV vektor je ne-replicirajući, rekombinantni adenoasocirani virus (AAV) nazvan rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin. Ovaj vektorski genom sadrži minimalne elemente potrebne za ekspresiju gena, uključujući AAV2 terminalno obrnuto ponavljanje (ITR), mikro-distrofin, SV40 intron (SD/SA) i signal sintetičke poliadenilaciie (Poly A), sve pod kontrolom MHCK7 promotora/pojačivača. Prikazana je šema vektorskog genoma i ekspresijske kasete. Serotip AAVrh74 se može koristiti za postizanje efikasnog prenosa gena u skeletnom i srčanom mišiću nakon IV primene.

[0014] Termin "strog" se koristi tako da se odnosi na uslove koji se u struci obično podrazumevaju kao strogi. Strogost hibridizacije je uglavnom određena temperaturom, jonskom jačinom i koncentracijom denaturacionih agenasa kao što je formamid. Primeri strogih uslova za hibridizaciju i ispiranje su 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat na 65-68°C ili 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015M natrijum citrat i 50% formamid na 42°C. Vidi Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y.1989). Mogu se koristiti i stroži uslovi (kao što su viša temperatura, niža jonska jačina, viši formamid ili drugo sredstvo za denaturisanje), međutim, to će uticati na brzinu hibridizacije. U slučajevima kada je u pitanju hibridizacija deoksioligonukleotida, dodatni uzorni strogi uslovi hibridizacije uključuju pranje u 6x SSC 0,05% natrijum pirofosfatu na 37°C (za 14-bazne oligonukleotide), 48°C (za 17-bazne oligonukleotide), 55°C (za 20-bazne oligonukleotide) i 60°C (za 23-bazne oligobukleotide).

[0015] Drugi agensi mogu biti uključeni u pufere za hibridizaciju i pranje u svrhu smanjenja nespecifične i/ili pozadinske hibridizacije. Primeri su 0,1% albumin goveđeg seruma, 0,1% polivinil-pirolidon, 0,1% natrijum pirofosfat, 0,1% natrijum dodecilsulfat, NaDodSO4, (SDS), fikol, Denhardt-ov rastvor, sonifikovana DNK sperme lososa (ili druga nekomplementarna DNK) i dekstran sulfat, iako se mogu koristiti i druga pogodna sredstva. Koncentracija i vrste ovih aditiva mogu se menjati bez značajnog uticaja na strogost uslova hibridizacije. Eksperimenti hibridizacije se obično izvode na pH 6,8-7,4, međutim, u tipičnim uslovima jonske jačine, brzina hibridizacije je skoro nezavisna od pH. Vidi Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch.4, IRL Press Limited (Oxford, England). Uslove hibridizacije može podesiti stručnjak u ovoj oblasti kako bi se prilagodile ove varijable i omogućilo da DNK različite srodnosti sekvenci formiraju hibride.

[0016] Termin "kontrolni element specifičan za mišiće" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja reguliše ekspresiju sekvence kodiranja koja je specifična za ekspresiju u mišićnom tkivu. Ovi kontrolni elementi uključuju pojačivače i promotore. Ovde su opisani konstrukti koji se sastoje od kontrolnih elemenata specifičnih za mišiće MCKH7 promotora, MCK promotora i MCK pojačivača.

[0017] Termin "operativno povezan" odnosi se na pozicioniranje nukleotidne sekvence regulatornog elementa, npr. nukleotidne sekvence promotora, kako bi se dobila ekspresija navedene nukleotidne sekvence navedenim regulatornim elementom.

[0018] Rekombinantni AAV vektori ovog pronalaska obuhvataju MHCK7 promotor/pojačivač specifičan za mišiće, koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1. Drugi kontrolni elementi specifični za mišiće uključuju humani skeletni aktin genski element, srčani aktin genski element, faktor vezivanja pojačivača specifičan za miocite (MEF), mišićnu kreatin kinazu (MCK), skraćeni MCK (tMCK), teški lanac miozina (MHC), hibridni pojačivač teškog lanca α-miozina -/MCK pojačivač-promotor (MHCK7), C5-12, element pojačivača mišje kreatin kreatinaze, skeletni brzo-prekidajući genski element troponina c, srčani sporo-prekidajući genski element troponina c, sporoprekidajući genski element troponina i, nuklearne faktore koji indukuju hipoksiju, element koji indukuje steroide ili element glukokortikoidnog odgovora (GRE).

[0019] Na primer, kontrolni element specifičan za mišić je nukleotidna sekvenca promotora MHCK7 SEQ ID NO: 2 ili kontrolni element specifičan za mišić je MCK nukleotidna sekvenca SEC ID NO: 4. Pored toga, u bilo kom od rAAV vektora pronalaska, sekvenca nukleotida kontrolnog elementa specifičnog za mišić je operativno povezana sa sekvencom nukleotida koja kodira protein mikro-distrofin. Na primer, nukleotidna sekvenca promotora MHCK7 (SEQ ID NO: 2) operativno je povezana sa sekvencom kodiranja humanog mikrodistrofina (SEQ ID NO: 1) kako je navedeno u konstruktu datom na Slici 1 ili Slici 10 (SEQ ID NO: 3). U drugom aspektu, pronalazak daje rAAV vektor pronalaska koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2.

[0020] U daljem aspektu, pronalazak daje rAAV vektor pronalaska koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO 3. Na primer, rAAVrh74.MHCK7.mikrodistrofin vektor obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 3 i prikazan je na slici 10. Ovaj rAAV vektor obuhvata MHCK7 promotor, himernu intronsku sekvencu, sekvencu kodiranja za humani mikro-distrofin gen, poli A, otpornost na ampicilin i pGEX plazmidnu okosnicu sa pBR322 poreklom ili replikacijom.

[0021] Pronalazak daje rekombinantni AAV vektor pronalaska koji se sastoji od humane mikro-distrofin nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i MHCK7 promotorske nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3. Ovaj rAAV vektor je AAV serotip AAVrh.74

[0022] Pronalazak takođe pruža rekombinantni AAV vektor pronalaska koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3. Ovaj rAAV vektor je AAV serotip AAVrh.74

[0023] Pronalazak takođe pruža farmaceutske sastave (ili se ovde ponekad nazivaju jednostavno "sastavi") koji sadrže bilo koji od rAAV vektora pronalaska.

[0024] Ovde su opisane metode proizvodnje čestice rAAV vektora koja se sastoji od kultivacije ćelije koja je transficirana bilo kojim rAAV vektorom pronalaska i oporavka rAAV čestica iz supernatanta transficiranih ćelija. Pronalazak takođe pruža virusne čestice koje sadrže bilo koji od rekombinantnih AAV vektora pronalaska.

[0025] Pronalazak pruža rekombinantni AAV vektor pronalaska za upotrebu u metodama lečenja mišićne distrofije koja se sastoji od primene terapeutski efikasne količine bilo kog od rekombinantnih AAV vektora pronalaska koji eksprimira humani mikro-distrofin.

[0026] Pronalazak pruža rekombinantni AAV vektor pronalaska za upotrebu u metodama lečenja mišićne distrofije koja se sastoji od primene terapeutski efikasne količine rekombinantnog AAV vektora pronalaska koji se sastoji od humane mikro-distrofinske nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2 MHCK7 promotora.

[0027] Pronalazak takođe pruža rekombinantni AAV vektor pronalaska za upotrebu u metodama lečenja mišićne distrofije koja se sastoji od primene terapeutski efikasne količine rekombinantnog AAV vektora pronalaska koji sadrži nukleotidnu sekvencu konstrukta pAAV.MHCK7.mikro-distrofin SEQ ID NO: 3.

[0028] "Fibroza" se odnosi na prekomerno ili neregulisano taloženje komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM) i nenormalne procese popravke u tkivima nakon povrede, uključujući skeletni mišić, srčani mišić, jetru, pluća, bubrege i pankreas. Deponovane komponente ECM uključuju fibronektin i kolagen, npr. kolagen 1, kolagen 2 ili kolagen 3.

[0029] Pronalazak takođe predviđa rekombinantni AAV vektor pronalaska za upotrebu u metodama smanjenja ili sprečavanja fibroze kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije, koje se sastoje od primene terapeutski efikasne količine bilo kog rekombinantnog AAV vektora pronalaska.

[0030] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža rekombinantni AAV vektor pronalaska za upotrebu u metodama sprečavanja fibroze kod ispitanika kome je potrebno, koje obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine rekombinantnog AAV vektora pronalaska. Na primer, bilo koji od rAAV vektora pronalaska može se primeniti na ispitanike koji pate od mišićne distrofije kako bi se sprečila fibroza, npr. rAAV pronalaska koji eksprimira humani mikrodistrofin protein koji se primenjuje pre nego što se fibroza primeti kod ispitanika. Pored toga, rAAV pronalaska koji eksprimira humani mikro-distrofin gen može se davati ispitaniku koji je izložen riziku od razvoja fibroze, kao što su oni koji pate ili im je dijagnostikovana mišićna distrofija, npr. DMD. rAAV pronalaska se može dati ispitaniku koji pati od mišićne distrofije kako bi se sprečila nova fibroza kod ovih ispitanika.

[0031] Pronalazak razmatra primenu bilo kog od AAV vektora pronalaska pre nego što se fibroza primeti kod ispitanika. Pored toga, rAAV pronalaska može se davati ispitaniku koji je izložen riziku od razvoja fibroze, kao što su oni koji pate ili im je dijagnostikovana mišićna distrofija, npr. DMD. rAAV pronalaska se može dati ispitaniku koji pati od mišićne distrofije i već ima razvijenu fibrozu, kako bi se sprečila nova fibroza kod ovih ispitanika.

[0032] Ovde su takođe opisane metode povećanja mišićne sile i/ili mišićne mase kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije, koje obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine rAAV vektora pronalaska koji eksprimira humani mikro-distrofin gen. Ove metode mogu dalje da obuhvate korak primene rAAV koji eksprimira mikro-distrofin.

[0033] Pronalazak razmatra upotrebu bilo kog od AAV vektora pronalaska za primenu pacijentima kojima je dijagnostikovana DMD pre nego što je fibroza primećena kod ispitanika ili pre nego što je mišićna sila smanjena ili pre nego što je mišićna masa smanjena.

[0034] Pronalazak takođe razmatra upotrebu AAV pronalaska za primenu na ispitaniku koji pati od mišićne distrofije, a koji već ima razvijenu fibrozu, kako bi se sprečila nova fibroza kod ovih ispitanika ili smanjila fibroza kod ovih pacijenata. Pronalazak takođe pruža upotrebu bilo kog rAAV pronalaska za primenu pacijentu koji pati od mišićne distrofije, a koji već ima smanjenu mišićnu silu ili ima smanjenu mišićnu masu, kako bi zaštitio mišić od daljeg oštećenja.

[0035] U bilo kojoj od metoda ispitanik može patiti od mišićne distrofije kao što je DMD ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom.

[0036] U bilo kojoj od metoda rAAV vektor ili sastav se može primeniti intramuskularnom injekcijom ili intravenskom injekcijom.

[0037] Pored toga, u bilo kojoj od metoda rAAV vektor ili sastav može se primeniti sistemski. Na primer, rAAV vektor ili sastav može biti parenteralna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.

[0038] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža sastav koji se sastoji od bilo kog od rAAV vektora pronalaska za upotrebu u smanjenju fibroze kod ispitanika kome je to potrebno.

[0039] Pored toga, pronalazak pruža sastav koji se sastoji od bilo kog od rekombinantnih AAV vektora pronalaska za upotrebu u prevenciji fibroze kod pacijenta koji pati od mišićne distrofije.

[0040] Pronalazak pruža sastave koje se sastoje od bilo kog od rekombinantnih AAV vektora pronalaska za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

[0041] Pronalazak pruža sastave koji se sastoje od rekombinantnog AAV vektora pronalaska, koji se sastoje od humane mikro-distrofinske nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i MHCK7 promotorske sekvence SEQ ID NO: 2 za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

[0042] Pronalazak pruža sastav koji se sastoji od rekombinantnog AAV vektora pronalaska koji sadrži pAAV.MHCK7.mikro-distrofin konstrukt koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3 za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

[0043] Ovde su takođe opisani sastavi koji sadrže bilo koji od rAAV vektora pronalaska za povećanje mišićne sile i/ili mišićne mase kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije. U daljem otelotvorenju, pronalazak predviđa sastave koji sadrže bilo koji od rAAV vektora pronalaska za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

[0044] Sastavi pronalaska mogu se formulisati za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Sastav pronalaska je takođe formulisan za sistemsku primenu, kao što je parenteralna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.

[0045] Pored toga, bilo koji od sastava se može formulisati za primenu na ispitaniku koji pati od mišićne distrofije kao što je DMD ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom.

[0046] U bilo kojoj upotrebi pronalaska, lek se može formulisati za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Pored toga, u bilo kojoj upotrebi pronalaska, lek se može formulisati za sistemsku primenu kao što je parenteralna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.

[0047] Bilo koji od lekova se može pripremiti za primenu na ispitaniku koji pati od mišićne distrofije, kao što je DMD ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0048]

Slika 1 ilustruje pAAV.MHCK7.mikro-distrofin konstrukt. U ovom konstruktu, cDNA ekspresijska kaseta je okružena sekvencama AAV2 terminalnog obrnutog ponavljanja (ITR). Konstrukt karakteriše unutarokvirna delecija štapičastog domena (R4-R23), dok šarke 1, 2 i 4 (Hi, H2 i H4) i domen bogat cisteinom i dalje proizvode protein 138 kDa. Ekspresija proteina mikro-distrofina (3579 bp) je vođena promotorom MHCK7 (795 bp). Intron i 5' UTR su izvedeni iz plazmida pCMVβ (Clontech). Kaseta mikro-distrofina je imala konsenzus Kozak neposredno ispred ATG starta i malog sintetičkog polyA signala od 53 bp za iRNA terminaciju. Humana kaseta mikro-distrofina sadržala je domene (R4-R23/Δ71-78) kao što su prethodno opisali Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)).

Slika 2 pokazuje ekspresiju distrofin proteina nakon intramuskularne isporuke AAVrh74. MHCK7 konstrukta. U mišić tibialis anterior mdx miševa ubrizgano je 1 × 10<11>vg (n=5 po grupi). Šest nedelja kasnije mišići su sakupljeni i obojeni za ekspresiju distrofina sa N-terminalnim antitelima za distrofin i bojenje hematoksilinom i eozinom.

Slike 3A-3C prikazuju merenje sile skeletnih mišića i kvantifikaciju ekspresije mikrodistrofina nakon intramuskularne injekcije AAVrh74.MHCK7 konstrukta. (A) U mišić tibialis anterior mdx miševa ubrizgano je 1 × 10<11>vg (n=5) sa AAVrh74.MHCK7 konstrukta. Šest nedelja kasnije tibijalni prednji mišići su sakupljeni i podvrgnuti merenjima sile in vivo.

Dozirana kohorta je imala značajno veću proizvodnju sile od netretiranih mdx kontrola.

Slike 4A-4C pokazuju široko rasprostranjenu transdukciju skeletnih, dijafragmalnih i srčanih mišićnih vlakana nakon sistemske primene AAVrh-a.74MHCK7.mikro-dis konstrukta. (A) Mdx miševi uzrasta 6 nedelja su sistematski tretirani preko repne vene sa 6×10<12>vg (2 × 10<14>vg/kg) AAVrh.74MHCK7.mikro-distrofin u sledećih 12 nedelja lečenja. (B) Bojenje za mikro-distrofin pokazuje kvantifikaciju procenta mišićnih vlakana koja eksprimiraju mikrodistrofin u svakom tkivu. (C) Pokazuje specifičnu silu izmerenu u dijafragmi pri niskoj i visokoj (planiranoj kliničkoj) dozi. Nije primećena značajna razlika pri niskoj dozi; međutim, došlo je do značajnog poboljšanja pri visokoj dozi.

Slika 5 prikazuje ekspresiju distrofins proteina nakon sistemske isporuke AAVrh.74MHCK7.mikro-distrofin konstrukta. Mdx miševi (n=5) su sistematski tretirani počev od 6 nedelja starosti preko repne vene sa 6 × 10<12>vg AAVrh.74MHCK7.mikrodistrofina. Nakon 12 nedelja lečenja, svi mišići su sakupljeni i obojeni na distrofin i obnovu DAPC komponenti (prikazan je beta-sarkoglikan).

Slike 6A-6D prikazuju toksikologiju/bezbednost AAVrh.74MHCK7. Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) izvršeno je na sledećim mišićnim tkivima radi analize toksičnosti: Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GAS), Quadriceps (QD), Psoas (PSO), Triceps (TRI) i Diaphragm (DIA) (Slika 6A). Toksičnost nije primećena. Kao pokazatelj efikasnosti, kvantifikovan je broj mišićnih vlakana sa centralno postavljenim nukleusima (CN) (slika 6B). CN ukazuju na cikluse degeneracije i regeneracije mišića i na taj način smanjenje CN pokazuje efekat lečenja. (Slika 6C) pokazuje da je ukupan broj vlakana nepromenjen tretmanom. Količina kreatin kinaze je data u (D) pokazujući poboljšanje pri visokoj dozi. Za lociranje razlika korišćeni su nezavisni t-testovi (p<.05); Podaci su prijavljeni kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 7 ilustruje pAAV.MCK.mikro-distrofin plazmidni konstrukt.

Slika 8 daje rezultate testa potentnosti rAAVrh74.MCK.mikro-distrofin (humani). U prednji mišić tibijalisa mdx miševa ubrizgano je 3 × 10<9>, 3 × 10<10>ili 1 × 10<11>vg (n=3 po grupi). Četiri nedelje kasnije mišići su sakupljeni i obojeni za ekspresiju distrofina sa N-terminalnim Dys3 antitelima. Postojala je linearna korelacija između ekspresije i doze sa veoma malom ekspresijom (nivo bez efekta) pri 3 × 10<9>vg i 89% ekspresije pri 1 × 10<11>vg.

Slike 9A-9C pokazuju da humani mikro-distrofin poboljšava stvaranje sile i zaštitu od povreda izazvanih ekscentričnom kontrakcijom. (A) Imunobojenje distrofinskog proteina u extensor digitorum longus (EDL) i TA pokazuje ekspresiju u mdx miofiberima nakon injektiranja rAAVrh.74-MCK-mikro-distrofin (humani) preko femoralne arterije. Lažnoinficirani mišići su obojeni na identičan način i izloženost se podudara sa vremenom. (B) rAAVrh.74-MCK-mikro-distrofin je značajno povećao normalizovanu specifičnu silu u odnosu na lažno tretirane mdx mišiće (P<0,05 naspram mdx). (C) mdx mišići inficirani sa rAAVrh.74-MCK-Mikro-dis(humani) su upoređeni sa lažno inficiranim kontralateralnim mdx EDL mišićima i DT (DT C57Bl/10) EDL mišićima za pad sile tokom ponavljajućih ekscentričnih kontrakcija u 12 nedelja nakon transfera gena. Tretman sa rAAVrh.74-MCK-mikrodistrofin (Micro-dys) značajno je zaštitio od gubitka sile u poređenju sa lažno tretiranim mdx mišićima (P< 0,001 naspram mdx). Greške su SEM.

Slika 10 daje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 3 rAAVrh74.MHCK7.mikrodistrofin.

Slika 11 daje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 5) rAA Vrh74.MCK.mikrodistrofin.

Slike 12A - 12B prikazuju imunološki odgovor na sistemsku isporuku AAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin u ne-humanom primatu. (A) ELISpot odgovor na AAV kapsidne i mikro-distrofinske peptidne grupe. ConA je pozitivna kontrola, a DMSO je negativna kontrola. Postojala su tri bazena za AAVrh74 i četiri peptidna bazena specifična za mikro-distrofin. (B) ELISA pozitivni titri cirkulišućih neutralizujućih antitela na vektorski kapsid. Serum je izolovan od primata svake dve nedelje i analiziran na titar antitela. Izveštaj o titru odgovara poslednjem razblaženju pri kome je odnos odgovora ≥2.

Slika 13A -B prikazuje sistemsku isporuku u rezus makaki sa AAVrh74.MHCK7.mikrodistrofinom. Bojenje anti-FLAG imunofluorescencije u mišićima leve strane pokazalo je robusnu ekspresiju mikro-distrofina.

Slika 14 prikazuje efekat sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom na ekspresiju transgena. Imunofluorescentno bojenje za mikro-distrofin pomoću N-terminalnog distrofinskog antitela u srcu, dijafragmi, psoasu i tibialis anterior (TA) pokazuje robusnu ekspresiju u srednjoj (6e12 vg; 2e14 vg/kg) i visokoj dozi (1.2e13 vg; 6e14 vg/kg) tretiranih životinja 3 meseca nakon injekcije. Prikazane su slike 20x.

Slika 15 prikazuje efekat sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom na ekspresiju transgena. Imunofluorescentno bojenje za mikro-distrofin korišćenjem N-terminalnog distrofinskog antitela u trbušastom mišiću lista, kvadricepsu, tricepsu i gluteusu pokazuje robusnu ekspresiju u srednjoj (6e12 vg; 2e14 vg/kg) i najvišoj dozi (1.2e13 vg; 6e14 vg/kg) tretiranih životinja 3 meseca nakon injekcije. Prikazane su slike 20x.

Slika 16 prikazuje efekat sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin na patologiji mišića. (A) H&E bojenje mišića dijafragme, tibialis anterior, gastrocnemius i kvadriceps iz tretiranih miševa sa C57BL/6 DT, mdx i rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin (Srednja doza-2e14vg/kg; visoka doza-6e14vg/kg), (B) Kvantifikacija prosečne veličine vlakana pokazala je normalizaciju veličine vlakana u celom tkivu. * ***p<0.001, jednosmerna ANOVA; Podaci su prijavljeni kao srednja vrednost ± SEM. Prikazane su slike 20x.

Slika 17 prikazuje efekat sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom na patologiju mišića. (A) H&E bojenje tricepsa, glutealnog i psoas mišića iz miševa tretiranih sa C57BL/6 DT, mdx i rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom (srednja doza-2e14vg/kg; visoka doza-6e14vg/kg), (B) Kvantifikacija prosečne veličine vlakana pokazala je veća vlakna na način koji zavisi od doze. ****p<0.001, jednosmerna ANOVA; Podaci su prijavljeni kao srednja vrednost ± SEM. Prikazane su slike 20x.

Slika 18 prikazuje efekat sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom na centralnu nukleaciju. Eskalacija doze ilustruje smanjenje centralne nukleacije u svim skeletnim mišićima i dijafragmi. Za lociranje razlika korišćena je dvosmerna ANOVA (p<0,05). Podaci su prijavljeni kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 19 prikazuje efekat sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom na taloženje kolagena. Eskalacija doze ilustruje smanjenje akumulacije kolagena (%) u dijafragmi. *p<0,05, jednosmerna ANOVA; podaci su prijavljeni kao srednja vrednost ± SEM. Prikazane su slike 20x.

Slika 20 prikazuje korekciju deficita sile u dijafragmi. Nakon 3 ili 6 meseci lečenja, trake mišića dijafragme su sakupljene kako bi se izmerila specifična sila (normalizovana na površinu poprečnog preseka). Tretman je povratio silu na nivo DT. Jednosmerna ANOVA je korišćena za određivanje razlika u odnosu na mdx-LR miševe.

Slika 21 prikazuje korekciju deficita sile u TA. (A) Nakon 3-6 meseci lečenja TA mišići su sakupljeni (i levo i desno) da bi se izmerila specifična sila (normalizovana na TA težinu). Tretman je povratio silu na DT nivo. (B) Tretman je oslobodio TA mišiće od zamora nakon rigoroznog protokola ekscentričnih kontrakcija. Jednosmerna ANOVA je korišćena za određivanje razlika u odnosu na mdx-LR miševe.

Slika 22 daje distribuciju prosečnih vg kopija u različitim tkivima od tri mdx miša nakon IV isporuke rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin.

Slika 23. Hemikalije seruma za ssAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin sistemski ubrizgane miševe i starosne odgovarajuće kontrolne grupe serumske hemije analizirane su od strane nezavisnog CRO (Charles River Laboratories) koji ukazuju na normalne vrednosti u svim analiziranim hemijskim grupama. Jedine nenormalne vrednosti su povišene AST i ALT zabeležene kod životinja tretiranih MDX vehikulumom [MDX-LR (laktatirani Ringerovi rastvori)] koje su normalizovane sa lečenjem. Poznato je da su AST i ALT povišeni u DMD. ALT = alanin aminotransferaza, ALP/K = alkalna fosfataza, AST = aspartat aminotransferaza, BUN = azot uree u krvi, B/C = odnos krvi i kreatinina, CREAT = kreatin, GLU = glukoza, TP= ukupni protein, TBIL = ukupni bilirubin, DBIL = direktni bilirubin

Slika 24 daje biodistribuciju Western blot na mišićima i organima iz mdx miševa sa sistemskim ubrizgavanjem rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina.

Slika 25 daje mapu pNLREP2-Caprh74 AAV plazmida pomagača.

Slika 26 daje Ad pomagač plazmid pHELP.

DETALJAN OPIS

[0049] Predmetni pronalazak pruža rAAV vektore koji prekomerno eksprimiraju humani mikro-distrofin i rAAV vektore za upotrebu u metodama smanjenja i sprečavanja fibroze kod pacijenata sa mišićnom distrofijom. Biopsija mišića uzeta u najranijoj dobi dijagnoze DMD otkriva istaknutu proliferaciju vezivnog tkiva. Fibroza mišića je štetna na više načina.

Smanjuje normalan tranzit endomizijskih hranljivih materija kroz barijere vezivnog tkiva, smanjuje protok krvi i lišava mišiće hranljivih sastojaka vaskularnog porekla, i funkcionalno doprinosi ranom gubitku ambulacije kroz kontrakcije udova. Vremenom, izazovi lečenja se množe kao rezultat izražene fibroze u mišićima. Ovo se može primetiti u biopsijama mišića upoređujući proliferaciju vezivnog tkiva u uzastopnim vremenskim tačkama. Proces se nastavlja pogoršavati što dovodi do gubitka ambulacije i ubrzavanja van kontrole, posebno kod pacijenata zavisnih od invalidskih kolica.

[0050] Bez ranog lečenja, uključujući paralelni pristup za smanjenje fibroze, malo je verovatno da se koristi od preskakanja egzona, čitanja stop-kodona ili terapije zamene gena ikada mogu u potpunosti postići. Čak i mali molekuli ili strategije zamene proteina će verovatno propasti bez pristupa za smanjenje fibroze mišića. Prethodni radovi na starijim mdx miševima sa postojećom fibrozom koji su tretirani sa AAV.mikro-distrofinom pokazali su da ne možemo postići potpunu funkcionalnu restauraciju (Liu, M., et al., Mol Ther 11, 245-256 (2005)). Takođe je poznato da je progresija DMD kardiomiopatije praćena ožiljkom i fibrozom u ventrikularnom zidu.

[0051] Kao što se ovde koristi, termin "AAV" je standardna skraćenica za adeno-asocirani virus. Adeno-asocirani virus je jednolančani DNK parvovirus koji raste samo u ćelijama u kojima određene funkcije pruža virus pomagač. Trenutno postoji trinaest serotipova AAV koji su karakterisani. Opšte informacije i pregledi AAV mogu se naći u, na primer, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol.1, pp.169-228, i Berns, 1990, Virology, pp.1743-1764, Raven Press, (New York). Međutim, u potpunosti se očekuje da će ovi isti principi biti primenljivi na dodatne AAV serotipove jer je dobro poznato da su različiti serotipovi prilično blisko povezani, kako strukturno tako i funkcionalno, čak i na genetskom nivou. (Vidi, na primer, Blacklowe, 1988, pp.165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Na primer, svi AAV serotipovi očigledno pokazuju veoma slične replikacione osobine posredovane homolognim rep genima; i svi nose tri srodna kapsidna proteina kao što su oni eksprimirani u AAV2. Stepen srodnosti dalje je sugerisan heterodupleks analizom koja otkriva opsežnu unakrsnu hibridizaciju između serotipova po dužini genoma; i prisustvo analognih segmenata samohibridizacije na terminusima koji odgovaraju "sekvencama terminalnog obrnutog ponavljanja" (ITR). Slični obrasci infektivnosti takođe sugerišu da su funkcije replikacije u svakom serotipu pod sličnom regulatornom kontrolom.

[0052] "AAV vektor" kao što se ovde koristi odnosi se na vektor koji se sastoji od jednog ili više polinukleotida od interesa (ili transgena) koji su okruženi sekvencama AAV terminalnog ponavljanja (ITR). Takvi AAV vektori se mogu replicirati i upakovati u infektivne virusne čestice kada su prisutni u ćeliji domaćinu koja je transficirana vektorom koji kodira i eksprimira proizvode rep i cap gena.

[0053] "AAV virion" ili "AAV virusna čestica" ili "AAV vektorska čestica" odnosi se na virusnu česticu koja se sastoji od najmanje jednog AAV kapsidnog proteina i inkapsidiranog polinukleotidnog AAV vektora. Ako čestica sadrži heterologni polinukleotid (tj. polinukleotid drugačijeg od divljeg tipa AAV genoma kao što je transgen koji se isporučuje u ćeliju sisara), obično se naziva "AAV vektorska čestica" ili jednostavno "AAV vektor". Dakle, proizvodnja AAV vektorske čestice nužno uključuje proizvodnju AAV vektora, jer je takav vektor sadržan u AAV vektorskoj čestici. AAV

[0054] Rekombinantni AAVrh.74 vektori pronalaska obuhvataju MHCK7 promotor/pojačivač specifičan za mišiće koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1, pri čemu rekombinantni AAVrh.74 vektor obuhvata 5' AAV2 terminalno obrnuto ponavljanje (ITR), MHCK7 promotor/pojačivač specifičan za mišiće, SV40 intron, nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, signal sintetičke poliadenilacije (PolyA) i 3' AAV2 ITR. AAV DNK u rAAV genomima može biti iz bilo kog AAV serotipa za koji se može izvesti rekombinantni virus, uključujući, ali ne ograničavajući se na AAV serotipove AAVrh.74, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 i AAV-13. Proizvodnja pseudotipiziranog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 01/83692.

Razmatraju se i druge vrste rAAV varijanti, na primer rAAV sa kapsidnim mutacijama. Vidi, na primer, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Kao što je navedeno u prethodnom odeljku Stanje tehnike, nukleotidne sekvence genoma različitih AAV serotipova su poznate u struci. Za promovisanje ekspresije specifične za skeletni mišić mogu se koristiti AAV1, AAV6, AAV8 ili AAVrh.74.

[0055] DNK plazmidi pronalaska obuhvataju rAAV genome pronalaska. DNK plazmidi se prenose u ćelije dozvoljene za infekciju virusom pomagačem AAV (npr. adenovirus, E1 deletirani adenovirus ili herpes virus) za asembliranje rAAV genoma u infektivne virusne čestice. Tehnike za proizvodnju rAAV čestica, u kojima se AAV genom koji se pakuje, rep i cap geni, i funkcije virusa pomagača pružaju ćeliji su standard u struci. Proizvodnja rAAV zahteva da su sledeće komponente prisutne unutar jedne ćelije (ovde označene kao ćelija za pakovanje): rAAV genom, AAV rep i cap geni odvojeni od (tj. ne u) rAAV genoma i funkcije virusa pomagača. AAV rep i cap geni mogu biti iz bilo kog AAV serotipa za koji se rekombinantni virus može izvesti i mogu biti iz drugačijeg AAV serotipa od rAAV genoma ITR, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 i AAV-13. Proizvodnja pseudotipiziranog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 01/83692.

[0056] Metoda generisanja ćelije pakovanja je stvaranje ćelijske linije koja stabilno eksprimira sve neophodne komponente za proizvodnju AAV čestica. Na primer, plazmid (ili višestruki plazmidi) koji se sastoji od rAAV genoma bez AAV rep i cap gena, AAV rep i cap gena odvojeno od rAAV genoma, i markera koji se može izabrati, kao što je gen otpornosti na neomicin, integrisani su u genom ćelije. AAV genomi su uvedeni u bakterijske plazmide procedurama kao što su GC izobličenje (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), dodavanje sintetičkih linkera koji sadrže restrikciona mesta za cepanje endonukleaze (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65 -73) ili direktnom ligacijom tupih krajeva (Senapathy& Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666). Linija ćelija pakovanja je zatim inficirana virusom pomagačem kao što je adenovirus. Prednosti ove metode su da se ćelije mogu izabrati i pogodne su za veliku proizvodnju rAAV. Drugi primeri pogodnih metoda koriste adenovirus ili baculovirus umesto plazmida za uvođenje rAAV genoma i/ili rep i cap gena u ćelije pakovanja.

[0057] Opšti principi proizvodnje rAAV preispituju se u, na primer, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; i Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Različiti pristupi su opisani u Ratschin et al., Mol. Cell. Biol.4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol.5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); i Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989); U.S. Patent No. 5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajući U.S. Patent No.5,658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al.Vaccine 13:1244-1250 (1995); Paul et al. Human Gene Therapy 4:609-615 (1993); Clark et al. Gene Therapy 3:1124-1132 (1996); U.S. Patent No.5,786,211; U.S. Patent No.5,871,982; i U.S. Patent. No.6,258,595.

[0058] Ovde su opisane ćelije pakovanja koje proizvode infektivni rAAV. Ćelije pakovanja mogu biti stabilno transformisane ćelije raka kao što su HeLa ćelije, 293 ćelije i PerC.6 ćelije (srodna 293 linija). Ćelije pakovanja mogu biti ćelije koje nisu transformisane ćelije raka, kao što su 293 ćelije niske pasaže (ćelije ljudskog fetalnog bubrega transformisane sa E1 adenovirusa), MRC-5 ćelije (humani fetalni fibroblasti), WI-38 ćelije (humani fetalni fibroblasti), Vero ćelije (ćelije majmunskog bubrega) i FRhL-2 ćelije (ćelije pluća rezus fetusa).

[0059] Rekombinantni AAV (tj., infektivne enkapsidirane rAAV čestice) pronalaska sadrže rAAV genom. U primernim otelovljenjima, genomima oba rAAV nedostaje AAV rep i cap DNK, odnosno ne postoji AAV rep ili cap DNK između ITR-ova genoma. Primeri rAAV koji mogu biti konstruisani tako da obuhvataju molekule nukleinske kiseline pronalaska navedeni su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352).

[0060] U primernom otelotvorenju, rekombinantni AAV vektor inveitona proizveden je metodom trostruke transfekcije (Xiao et al., J Virol 72, 2224-2232 (1998) koristeći AAV vektorske plazmide pAAV.MHCK7.mikro-distrofin, pNLRep2-Caprh74 i pHelp. pAAV sadrži kasetu ekspresije mikro-distrofin gena okruženu sekvencama AAV2 terminalnog obrnutog ponavljanja (ITR). To je sekvenca koja je enkapsulirana u AAVrh74 virione.

Plazmid sadrži sekvencu mikro-distrofina i MHCK7 pojačivača i osnovne elemente promotora mišićnog specifičnog promotora za pokretanje ekspresije gena. Ekspresijska kaseta takođe sadrži SV40 intron (SD/SA) za promovisanje ekspresije gena na visokom nivou i signal poliadenilacije goveđeg hormona rasta se koristi za efikasno okončanje transkripcije.

[0061] pNLREP2-Caprh74 je AAV pomagač plazmid koji kodira 4 AAV2 rep proteina divljeg tipa i 3 divlja tipa AAV VP kapsidnih proteina iz serotipa rh74. Šematska mapa plazmida pNLREP2-Caprh74 prikazana je na slici 25.

[0062] pHELP adenovirusni pomagač plazmid je 11.635 bp i dobijen je od Applied Viromics. Plazmid sadrži regione adenovirusnog genoma koji su važni za replikaciju AAV, naime E2A, E4ORF6 i VA RNK (funkcije adenovirusa E1 obezbeđuju 293 ćelije). Sekvence adenovirusa prisutne u ovom plazmidu predstavljaju samo ~40% genoma adenovirusa i ne sadrže cis elemente kritične za replikaciju kao što je ponavljanje terminala adenovirusa. Stoga se ne očekuje da će iz takvog proizvodnog sistema nastati infektivni adenovirus. Šematska mapa pHELP plazmida prikazana je na Slici 26.

[0063] rAAV se može prečišćavati metodama koje su standardne u struci, kao što su kolonska hromatografija ili gradijenti cezijum hlorida. Metode za prečišćavanje rAAV vektora iz virusa pomagača poznate su u struci i uključuju metode obelodanjene u, na primer, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69427-443 (2002); U.S. Patent No.6,566,118 i WO 98/09657.

[0064] U drugom otelotvorenju, pronalazak razmatra kompozicije koje sadrže rAAV predmetnog pronalaska. Kompozicije pronalaska obuhvataju rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kompozicije mogu da sadrže i druge sastojke kao što su razblaživači i adjuvansi. Prihvatljivi nosači, razblaživači i pomoćne supstance nisu toksični za primaoce i poželjno su inertni pri primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere i površinski aktivne supstance kao što su poloksameri.

[0065] Titri rAAV koji će se primenjivati u metodama će varirati u zavisnosti, na primer, od određenog rAAV, načina primene, cilja tretmana, pojedinca i tipa ćelije(a) koji se cilja, i mogu se odrediti metodama standardnim u struci. Titri rAAV mogu biti u rasponu od oko 1 ×10<6>, oko 1× 10<7>, oko 1×10<8>, oko 1×10<9>, oko 1×10<10>, oko 1×10<11>, oko 1×10<12>, oko 1 ×10<13>do oko 1 ×10<14>ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg).

[0066] Metode transdukcije ciljne ćelije sa rAAV, in vivo ili in vitro, opisane su ovde. Metode in vivo obuhvataju korak primene efikasne doze, ili efikasne višestruke doze, sastava koji se sastoji od rAAV pronalaska na životinji (uključujući i ljudsko biće) kojoj je to potrebno. Ako se doza daje pre razvoja poremećaja/bolesti, primena je profilaktička. Ako se doza daje nakon razvoja poremećaja/bolesti, primena je terapeutska. U otelotvorenjima pronalaska, efikasna doza je doza koja ublažava (eliminiše ili smanjuje) najmanje jedan simptom povezan sa stanjem poremećaja/bolesti koja se leči, koja usporava ili sprečava napredovanje u stanju poremećaja/bolesti, koja usporava ili sprečava napredovanje stanja poremećaja/bolesti, koja smanjuje obim bolesti, koja rezultira remisijom (delimičnom ili ukupnom) bolesti i/ili koja produžava preživljavanje. Primer bolesti koja se razmatra za prevenciju ili lečenje metodama pronalaska je DMD.

[0067] Pronalazak takođe razmatra kombinovanu terapiju. Kombinacija koja se ovde koristi uključuje i istovremeni tretman i sekvencijalne tretmane. Posebno se razmatraju kombinacije metoda pronalaska sa standardnim medicinskim tretmanima (npr. kortikosteroidi), kao i kombinacije sa novim terapijama.

[0068] Primena efikasne doze sastava može biti putem standardnih puteva u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intramuskularne, parenteralne, intravenske, oralne, bukalne, nazalne, pulmonarne, intrakranijalne, intraosne, intraokularne, rektalne ili vaginalne. Put(eve) primene i serotip(e) AAV komponenti rAAV (posebno, AAV ITR i kapsidni protein) pronalaska mogu izabrati i/ili uklopiti stručnjaci u ovoj oblasti uzimajući u obzir infekciju i/ili stanje bolesti koja se leči i ciljne ćelije/tkiva koje treba da eksprimiraju mikro-distrofinski protein.

[0069] Pronalazak predviđa lokalnu primenu i sistemsku primenu efikasne doze rAAV i sastava pronalaska. Na primer, sistemska primena je primena u cirkulacioni sistem tako da se utiče na celo telo. Sistemska primena uključuje enteralnu primenu kao što je apsorpcija kroz gastrointestinalni trakt i parenteralnu primenu putem injekcije, infuzije ili implantacije.

[0070] Konkretno, stvarna primena rAAV predmetnog pronalaska može se postići korišćenjem bilo koje fizičke metode koja će transportovati rAAV rekombinantni vektor u ciljno tkivo životinje. Primena prema pronalasku uključuje, ali nije ograničena na, ubrizgavanje u mišić i ubrizgavanje u krvotok. Dokazano je da je jednostavno resuspendovanje rAAV-a u fosfatnom puferisanom fiziološkom rastvoru dovoljno da obezbedi vehikulum koristan za ekspresiju mišićnog tkiva, i ne postoje poznata ograničenja za nosače ili druge komponente koje se mogu primeniti istovremeno sa rAAV-om (mada sastave koji razgrađuju DNK treba izbegavati na normalan način sa rAAV-om). Kapsidni proteini rAAV mogu biti modifikovani tako da je rAAV usmeren na određeno ciljano tkivo od interesa, kao što je mišić. Vidi, na primer, WO 02/053703. Farmaceutski sastavi se mogu pripremiti kao injekcione formulacije ili kao topikalne formulacije koje se isporučuju mišićima transdermalnim transportom. Brojne formulacije za intramuskularno ubrizgavanje i transdermalni transport su prethodno razvijene i mogu se koristiti u praksi pronalaska. rAAV se može koristiti sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem radi lakše primene i rukovanja.

[0071] Doza rAAV koji će se primenjivati u ovde obelodanjenim metodama će varirati u zavisnosti, na primer, od određenog rAAV, načina primene, cilja tretmana, pojedinca i tipa ćelije koja se cilja, i mogu se odrediti metodama standardnim u struci. Titri svakog primenjenog rAAV mogu biti u rasponu od oko 1 ×10<6>, oko 1× 10<7>, oko 1× 10<8>, oko 1× 10<9>, oko 1× 10<10>, oko 1 ×10<11>, oko 1 ×10<12>, oko 1 ×10<13>do oko 1 ×10<14>ili do oko 1 × 10<15>ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg) (tj.1 ×10<7>vg, 1 × 10<8>vg, 1 ×10<9>vg, 1 × 10<10>vg, 1 ×10<11>vg, 1 × 10<12>vg, 1 × 10<13>vg, 1 × 10<14>vg, odnosno 1 × 10<15>). Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg) po kilogramu (kg) telesne težine (tj., 1 × 10<10>vg/kg, 1 × 10<11>vg/kg, 1 × 10<12>vg/kg, 1 × 10<13>vg/kg, 1 × 10<14>vg/kg, 1 × 10<15>vg/kg). Metode titracije AAV opisane su u Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999).

[0072] Konkretno, stvarna primena rAAV predmetnog pronalaska može se postići korišćenjem bilo koje fizičke metode koja će transportovati rAAV rekombinantni vektor u ciljno tkivo životinje. Primena prema pronalasku uključuje, ali nije ograničena na, ubrizgavanje u mišić i ubrizgavanje u krvotok. Jednostavno resuspendovanje rAAV-a u fosfatnom puferisanom fiziološkom rastvoru je dokazano dovoljno da obezbedi vehikulum koristan za ekspresiju mišićnog tkiva, i ne postoje poznata ograničenja za nosače ili druge komponente koje se mogu primeniti istovremeno sa rAAV-om (mada sastave koji razgrađuju DNK treba izbegavati na normalan način sa rAAV-om). Kapsidni proteini rAAV mogu biti modifikovani tako da je rAAV usmeren na određeno ciljano tkivo od interesa, kao što je mišić. Vidi, na primer, WO 02/053703. Farmaceutski sastavi se mogu pripremiti kao injekcione formulacije ili kao topikalne formulacije koje se isporučuju mišićima transdermalnim transportom. Brojne formulacije za intramuskularno ubrizgavanje i transdermalni transport su prethodno razvijene i mogu se koristiti u praksi pronalaska. rAAV se može koristiti sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem radi lakše primene i rukovanja.

[0073] Za potrebe intramuskularnog ubrizgavanja mogu se koristiti rastvori u adjuvantu kao što je susamovo ili kikirikijevo ulje ili u vodenom propilen glikolu, kao i sterilni vodeni rastvori. Takvi vodeni rastvori mogu biti puferovani, po želji, a tečni razblaživač je prvo postao izotoničan sa fiziološkim rastvorom ili glukozom. Rastvori rAAV-a kao slobodne kiseline (DNK sadrži kisele fosfatne grupe) ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi koja je odgovarajuće pomešana sa površinski aktivnim sredstvom kao što je hidrokspropilceluloza. Disperzija rAAV se takođe može pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim mešavinama i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama. S tim u vezi, sterilni vodeni medijum koji se koristi lako se može dobiti standardnim tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0074] Farmaceutski nosači, razblaživači ili pomoćne materije pogodne za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan u meri u kojoj postoji laka sposobnost ubrizgavanja. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se čuvati od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i polietilen glikol i slično), njihove pogodne mešavine i biljna ulja. Podesna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za premazivanje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom površinski aktivnih materija.

Prevenciju delovanja mikroorganizama mogu da izazovu različiti antibakterijski i antifungalni agensi, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, benzil alkohol, sorbinska kiselina, tiomersal i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Dugotrajna apsorpcija sastava koji se ubrizgavaju može se postići upotrebom agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0075] Sterilni rastvori za ubrizgavanje pripremljeni su uključivanjem rAAV u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim gore navedenim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi filter sterilizacija. Generalno, disperzije su pripremljene ugradnjom aktivnog sastojka u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za ubrizgavanje, poželjni načini pripreme su tehnike vakuumskog sušenja i sušenja zamrzavanjem, koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0076] Transdukcija sa rAAV-om se takođe može izvršiti in vitro. U jednom otelotvorenju, željene ciljne mišićne ćelije su uklonjene iz ispitanika, transdukovane sa rAAV i ponovo unete u ispitanika. Alternativno, singenske ili ksenogenske mišićne ćelije se mogu koristiti tamo gde te ćelije neće generisati neprikladan imunski odgovor kod ispitanika.

[0077] Pogodne metode za transdukciju i ponovno uvođenje transdukovanih ćelija u ispitanika poznate su u struci. U jednom otelotvorenju, ćelije se mogu transdukovati in vitro kombinovanjem rAAV sa mišićnim ćelijama, npr. u odgovarajućim medijima, i skriningom za one ćelije koje sadrže DNK od interesa koristeći konvencionalne tehnike kao što su Southern blots i/ili PCR, ili korišćenjem selektabilnih markera. Transdukovane ćelije se zatim mogu formulisati u farmaceutske sastave, a sastav koji se uvodi u ispitanika različitim tehnikama, kao što su intramuskularna, intravenska, subkutana i intraperitonealna injekcija, ili injekcijom u glatki i srčani mišić, koristeći, npr., kateter.

[0078] Transdukcija ćelija sa rAAV pronalaska dovodi do održive ekspresije mikro-distrofin proteina. Tako su predviđene metode primene/isporuke rAAV koji eksprimira mikro-distrofin protein životinji, poželjno ljudskom biću. Ove metode uključuju transdukciju tkiva (uključujući, ali ne ograničavajući se na, tkiva kao što su mišići, organi kao što su jetra i mozak, i žlezde kao što su pljuvačne žlezde) sa jednim ili više rAAV predmetnog pronalaska. Transdukcija se može vršiti sa genskim kasetama koje sadrže kontrolne elemente specifične za tkivo. Na primer, ovde su opisane metode transdukcije mišićnih ćelija i mišićnih tkiva usmerene putem specifičnih kontrolnih elemenata mišića, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one izvedene iz porodica aktina i miozina, kao što su iz porodice gena myoD (vidi Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)), faktor vezivanja pojačivača specifičan za miocite MEF-2 (Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)), kontrolni elementi izvedeni iz gena humanog skeletnog aktina (Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)), gen srčanog aktina, elementi sekvence mišićne kreatin kinaze (vidi Johnson et al., Mol Cell Biol, 9: 3393-3399 (1989)) i element pojačivača mišje kreatin kinaze (mCK), kontrolni elementi izvedeni iz gena skeletnog brzo-prekidajućeg troponina C, gena srčanog sporo-prekidajućeg troponina C i gena sporo-prekidajućeg troponina I: nuklearni faktori koji indukuju hipoksiju (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementi koji se indukuju steroidima i promotori, uključujući element glukokortikoidnog odgovora (GRE) (vidi Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)) i drugi kontrolni elementi.

[0079] Mišićno tkivo je atraktivna meta za isporuku DNK in vivo, jer nije vitalni organ i lako je dostupan. Pronalazak razmatra kontinuiranu ekspresiju mikrodistrofina iz transdukovanih miofibera.

[0080] Pod "mišićna ćelija" ili "mišićno tkivo" podrazumeva se ćelija ili grupa ćelija izvedenih iz mišića bilo koje vrste (na primer, skeletni mišić i glatki mišić, npr. iz digestivnog trakta, mokraćne bešike, krvnih sudova ili srčanog tkiva). Takve mišićne ćelije mogu biti diferencirane ili nediferencirane, kao što su mioblasti, miociti, miotube, kardiomiociti i kardiomioblasti.

[0081] Termin "transdukcija" se koristi za primenu/isporuku regiona kodiranja mikrodistrofina u ćeliju primaoca bilo in vivo ili in vitro, putem replikaciono deficijentnog rAAV pronalaska što dovodi do ekspresije mikro-distrofina od strane ćelije primaoca.

[0082] Tako su predviđene metode primene efikasne doze (ili doze, primenjene u suštini istovremeno ili doze date u intervalima) rAAV-a koje kodiraju mikro-distrofin pacijentu kojem je to potrebno.

PRIMERI

Primer 1

Generisanje pAAV.MHCK7.mikro-distrofin konstrukta

[0083] Plazmid pAAV.MHCK7.mikro-distrofin sadrži kasetu za ekspresiju cDNK humanog mikrodistrofina okruženu sekvencama AAV2 terminalnog obrnutog ponavljanja (ITR) (vidi Sl. 1). Konstrukt mikro-distrofina karakteriše delecija u okviru štapa (R4-R23), dok šarke 1, 2 i 4 i domen bogat cisteinom ostaju da proizvode protein 138 kDa. Ekspresija mikro-distrofin proteina (3579 bp) je vođena promotorom MHCK7 (795 bp). Plazmid je konstruisan od pAAV.MCK.mikro-distrofin plazmida uklanjanjem MCK promotora i insercijom MHCK7 promotora. Nakon promotora jezgra, endogeni mišji MCK Exon1 od 53 bp (netransliran) je prisutan za efikasnu inicijaciju transkripcije, nakon čega slede SV40 kasni signali splajsovanja 16S/19S (97 bp) i mali 5'UTR (61 bp). Intron i 5' UTR su izvedeni iz plazmida pCMVβ (Clontech). Kaseta mikro-distrofina je imala konsenzus Kozak neposredno ispred ATG starta i mali sintetički polyA signal od 53 bp za prekid iRNK. Kaseta humanog mikrodistrofina sadržala je domene (R4-R23/Δ71-78) kao što su prethodno opisali Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)). Komplementarna DNK je kodon optimizovana za ljudsku upotrebu i sintetizovana putem GenScript (Piscataway, NJ) (Mol Ther 18, 109-117 (2010)). Jedine virusne sekvence uključene u ovaj vektor bile su obrnuta terminalna ponavljanja AAV2, koja su potrebna i za replikaciju virusne DNK i za pakovanje. Mikrodistrofinska kaseta ima mali 53 bp sintetički polyA signal od 53 bp za prekid iRNK.

[0084] Prethodne studije su potvrdile kardijalnu ekspresiju koristeći MHCK7 promotor (Salva et al. Mol Ther 15, 320-329 (2007) i AAVrh74 koji postiže ekspresiju skeletnog, dijafragmalnog i srčanog mišića (Sondergaard et al. Annals of clinical and Transl Neurology 2, 256-270 (2015)), Sekvenca konstrukta sa Sl.1 je enkapsidirana u AAVrh.74 virione.

Molekularni klon AAVrh-a.74 serotip je kloniran iz limfnog čvora rezus makaki majmuna i opisan je u Rodino-Klapac et al. Journal of Translational medicine 5, 45 (2007).

Tabela 1 prikazuje molekularne karakteristike plazmida pAAV.MHCK7.mikro-distrofin (SEQ ID NO: 3)

Primer 2

Studije intramuskularne ekspresije pomoću rAAV.MHCK7.mikro-distrofina [0085] Studije ekspresije su sprovedene sa humanim mikro-distrofin konstruktom (rAAVrh74.MHCK7. mikro-distrofin; opisan u Primeru 1) putem intramuskularne injekcije. U mišić tibialis anterior mdx miševa (spontani Dmd<mdx>mutant miševi koji ne eksprimiraju distrofin) ubrizgano je 1 × 10<11>vg kasete (n=5 po grupi). Šest nedelja kasnije mišići su sakupljeni i obojeni za ekspresiju distrofina (Dys3) sa N-terminalnim antitelima za distrofin i bojenje hematoksilinom i eozinom (HE). Slika 2 prikazuje difuznu ekspresiju gena i smanjenje centralno lociranih jezgara sa dozom od 1 × 10<11>vg u poređenju sa nelečenim mišićem. Pored toga, primećeno je smanjenje centralne nukleacije sa povećanjem prosečnih vlakana/okvira nakon tretmana sa mikro-distrofinskim konstruktom. Nivoi ekspresije rAAVrh74.MHCK7. mikro-distrofin konstrukta su kvantifikovani na oko 73%.

[0086] Pored merenja lokalizacije mikro-distrofina i nivoa ekspresije, snaga skeletnih mišića je izmerena nakon intramuskularne injekcije kasete. Intramuskularna ekspresija pAAV.MHCK7.mikro-distrofin konstrukta dovela je do značajno veće apsolutne i specifične proizvodnje sile u poređenju sa neobrađenim kontrolama (slike 3A i 3B).

Primer 3

Sistemska isporuka rAAVrh.74MHCK7.mikro-distrofina mdx miševima

[0087] Kohortama mdx miševa je ubrizgano preko repne vene bilo 2 × 10<12>vg (8 × 10<13>vg/kg) ili visoka doza (planirana klinička doza) 6 × 10<12>vg (2× 10<14>vg/kg) rAAVrh.74MHCK7.mikro-distrofin u dobi od 6 nedelja. Nakon 12 nedelja lečenja, svi mišići su sakupljeni i obojeni na distrofin i obnovu DAPC komponenti. Sistemski ubrizgani (repna vena) miševi su pokazali visok nivo bojenja distrofina u svim mišićima. Slika 4A predstavlja rasprostranjenu transdukciju skeletnih, dijafragmalnih i srčanih mišićnih vlakana nakon sistemske doze 6 ×10<12>vg (2 × 10<14>vg/kg). Slika 4B prikazuje kvantifikaciju procenta mišićnih vlakana koja eksprimiraju mikro-distrofin u svakom tkivu. Konačno, dijafragma je testirana na funkcionalno poboljšanje (slika 4C). Nije primećena značajna razlika pri niskoj dozi; međutim, došlo je do značajnog poboljšanja pri visokoj dozi. Važno je da Slika 5 pokazuje da su druge komponente DAPC potpuno obnovljene nakon isporuke mikrodistrofina. Prikazan je beta-sarkoglikan (B-SG).

[0088] Toksikologija/bezbednost AAVrh.74MHCK7.mikro-distrofina su procenjeni primenom vektora putem intravenske (i.v.) injekcije u repnu venu mdx miševa po Tabeli 2. Nije bilo dokaza toksičnosti ni u jednom analiziranom mišićnom tkivu, uključujući: Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GAS), Quadriceps (QD), Psoas (PSO), Triceps (TRI) i Diaphragma (DIA) (Slika 6A i 6B). Broj centralno postavljenih nukleusa je smanjen sa visokom dozom 6×10<12>vg (2 × 10<14>vg/kg). Istorijski gledano, centralna nukleacija skeletnih mišića kod nelečenih miševa podudarala se sa mdx miševima u proseku ~80%. Konačno, preliminarni podaci iz male veličine uzorka (n=3) pokazuju smanjeni nivo oslobađanja CK (U/L) u serumu miševa tretiranih visokim dozama (D). Za lociranje razlika korišćeni su nezavisni t-testovi (p<.05); Podaci su prijavljeni kao srednja vrednost ± SEM.

Tabela 2. Pregled toksikološke/bezbednosne studije rAAVrh.74MHCK7.mikrodistrofina.

Primer 4

Generisanje pAAV.MHCK7.mikro-distrofin konstrukta

[0089] Plazmid pAAV.MCK.mikro-distrofin je konstruisan insercijom MCK ekspresijske kasete koja pokreće kodonom optimizovanu sekvencu humanog mikro-distrofina cDNK u AAV vektoru kloniranja psub201 (Samulski et al., J. Virol.61(10): 3096-3101). Regulatorni element specifičan za mišiće bio je uključen u konstrukt kako bi pokrenuo ekspresiju gena specifičnih za mišiće. Ovaj regulatorni element je sadržao pojačivač mišjeg MCK jezgra (206 bp) fuzionisanog sa promotorom MCK jezgra (proksimalni) od 351 bp. Nakon promotora jezgra, konstrukt sadrži endogeni mišji MCK Exon1 (netranslirani) od 53 bp za efikasnu inicijaciju transkripcije, nakon čega slede SV40 kasni 16S/19S signali splajsovanja (97 bp) i mali 5'UTR (61 bp). Intron i 5' UTR su izvedeni iz plazmida pCMVβ (Clontech). Kaseta mikro-distrofina ima konsenzus Kozak neposredno ispred ATG starta i mali 53 bp sintetički polyA signal za iRNK terminaciju. Kaseta humanog mikro-distrofina sadržala je domene (R4-R23/Δ71-78), kao što su prethodno opisali Harper et al. Nat. Med. 8(3):253-61, 2002

[0090] Plazmid pAAV.MCK.mikro-distrofin sadržao je kasetu sa ekspresijom humanog mikro-distrofina cDNK okruženu sekvencama AAV2 terminalnog obrnutog ponavljanja (ITR) (vidi Sl.7). Ova sekvenca je enkapsulirana u AAVrh.74 virione. Molekularni klon AAVrh-a.74 serotip je kloniran iz limfnog čvora rezus makaki majmuna i opisan je u Rodino-Klapac et al. Journal of Tran. Med.45 (2007).

Primer 5

Analiza potentnosti i doze pomoću rAAV.MCK.mikro-distrofina

[0091] Studije ekspresije su sprovedene sa humanim mikro-distrofinskim konstruktom (rAAV.MCK.mikro-distrofin; opisano u primeru 1) intramuskularnom injekcijom. U tibialis anterior (TA) mišić mdx miševa (spontani Dmd<mdx>mutant miševi koji ne eksprimiraju distrofin) ubrizgano je 3 × 10<9>, 3 × 10<10>ili 1 × 10<11>vg (n=3 po grupi). Četiri nedelje kasnije mišići su sakupljeni i obojeni za ekspresiju distrofina koristeći antitelo specifično za N-terminalni Dys3 i bojenje hematoksilinom i eozinom (HE). Slika 8 pokazuje linearnu korelaciju između ekspresije i doze sa veoma malom ekspresijom (nivo bez efekta) pri 3 × 10<9>vg i 89% ekspresije pri 1 × 10<11>vg.

Primer 6

Vaskularna isporuka rAAV.MCK.mikro-distrofina u mdx miševe

[0092] Koristeći izolovani model perfuzije ekstremiteta (Rodino-Klapacet al., J. Trans. Med.

5(45): 1-11, 2007), mdx miševima (n=10) je ubrizgano 1 × 10<11>vg rAAVrh.74.MCK.mikrodistrofina preko femoralne arterije i izvršena je analiza ishoda. Tri meseca nakon prenosa gena, sakupljeni su mišići donjih ekstremiteta i studije efikasnosti pokazale su značajno poboljšanje i sile i otpornosti na povrede izazvane ekscentričnom kontrakcijom (Slika 9).

[0093] Imunobojenje distrofinskog proteina u mišiću extensor digitorum longus (EDL) i mišiću TA pokazuje ekspresiju u mdx miofibrima nakon tretmana sa rAAVrh.74-MCK-mikro-distrofinom (Sl. 9A). Lažno-inficirani mišići su obojeni na identičan način i izloženost se podudarala sa vremenom. Slika 9B pokazuje da rAAVrh.74-MCK-mikro-distrofin je značajno povećao normalizovanu specifičnu silu u odnosu na lažno tretirane mdx mišiće (P<0,05 naspram mdx). Pored toga, mdx mišići inficirani sa rAAVrh.74-MCK-Mikrodistrofin (humani) su upoređeni sa lažno inficiranim kontralateralnim mdx EDL mišićima (plavo) i EDL mišićima divljeg tipa (DT C57Bl/10) za pad sile tokom ponavljajućih ekscentričnih kontrakcija u 12 nedelja nakon transfera gena (Slika 9C). Pronađeno je da je tretman sa rAAVrh.74-MCK-mikrodistrofinom (Micro-dys) značajno zaštićen od gubitka sile u poređenju sa lažno tretiranim mdx mišićima (P< 0,001 naspram mdx).

Primer 7

Studije sa primatima

[0094] Da bi se pretklinički nalazi kod miševa primenili na kliničku paradigmu, sistemski je doziran primat koji nije čovek (NHP) kako bi se procenila bezbednost i efikasnost za buduća klinička ispitivanja. Efekat ukupne doze 2 × 10<14>vg AAVrh74.MHCK7.mikrodistrofin.FLAG isporučen intravenozno kroz glavnu venu proučavan je kod primata koji nije čovek. Ova doza je bila proporcionalna (prema težini životinje) sistemskoj dozi datoj miševima i odgovarala je srednjoj dozi (6,0 × 10<12>vg ukupne doze) datoj miševima.

[0095] Osnovne hemijske i imunološke studije, uključujući analizu enzimski vezanog imunosorbentnog spot testa (ELISpot), sprovedene su za merenje T ćelija prema titru AAVrh.74 kapsida i mikro-distrofina, kao i anti-AAV antitela. Tri peptidna bazena korišćena su za AAVrh.74 kapsidni protein (Genemed Synthesis, San Antonio, TX) koji sadrži 34-36 peptida, od kojih je svaki dugačak 18 aminokiselina i preklapa se sa 11 ostataka. Četiri peptidna bazena koji obuhvataju mikro-distrofin.FLAG protein (Genemed Synthesis) svaki dugačak 18 aminokiselina i preklapa se sa 11 ostataka. Concanavalin A (ConA) (Sigma, 1 µg/mL) služio je kao pozitivna kontrola i 0,25% dimetilsulfoksid (DMSO) kao negativna kontrola. Ove studije su se ponavljale svake dve nedelje tokom cele studije. 3 meseca nakon tretmana, životinje su eutanazirane kako bi se dobila potpuna nekropsija tkiva. Imunološki testovi nisu pokazali nikakve neočekivane reakcije na kapsid ili transgen pomoću ELISpot (Slika 12A) i nisu pokazali neočekivane reakcije antitela na AAVrh74 kapsid putem ELISA (Slika 12B).

[0096] Pored toga, kompletna krvna slika i hemijski paneli pokazali su blago povišenje jetrenih enzima koji su normalizovani na početnu vrednost bez intervencije ili tretmana, kao što je prikazano u tabeli 3 u nastavku.

Tabela 3.

[0097] Nije bilo drugih neočekivanih hemijskih vrednosti tokom trajanja studije. Konačno, potpuna analiza svih skeletnih mišića pokazala je rasprostranjenu ekspresiju u mišićnim vlaknima putem imunofluorescentnog bojenja sa antitelima specifičnim za FLAG i detekcijom western blot pomoću mišjeg monoklonskog antitela, na distrofin (slika 14A, B).

[0098] Podaci zajedno pokazuju da je sistemska isporuka AAVrh74.MHCK7.mikrodistrofin.FLAG uspostavila bezbednost i efikasnost sa rasprostranjenom ekspresijom na svim skeletnim mišićima kod primata koji nije čovek.

Primer 8

Pretklinička studija za demonstraciju efikasnosti

[0099] Sprovedena je pretklinička studija kako bi se pokazala efikasnost sistemske isporuke rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina u lečenju deficita skeletnih i srčanih mišića kod mdx miševa. Za ovu studiju korišćen je AAVrh74 vektor koji sadrži kodonom optimizovan transgen humanog mikro distrofina koji pokreće promotor specifičan za mišić i srce, MHCK7 kao što je opisano u Primeru 1.

[0100] Sistemske injekcije rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina preko repne vene kod mdx (bez distrofina) miševa korišćene su za ispitivanje odgovora na dozu. Rezultati ove studije pokazali su da su sistemske injekcije kod mdx miševa bile efikasne u normalizaciji histoloških i funkcionalnih ishoda izmerenih u udovima i dijafragmi na način koji zavisi od doze. Pored toga, nije prijavljena značajna toksičnost povezana sa vektorom nakon formalnog pregleda histopatologije od strane veterinarskog patologa sa sertifikatom odbora.

[0101] Vektor za ovu studiju proizvela je Nationwide Children's Hospital Viral Vector Core koristeći metodu trostruke transfekcije HEK293 ćelija, pod uslovima istraživačkog kvaliteta. Karakterizacija vektora nakon proizvodnje uključivala je određivanje titra pomoću qPCR sa supernamotanim standardom, određivanje nivoa endotoksina (EU/ml) i procenu sterilnosti. Proizvedeni vektor je analiziran putem SDS-PAGE kako bi se proverila konzistentnost trakastog šablona sa očekivanim rAAV. Vektor je proizveden korišćenjem plazmida koji sadrži mikrodistrofinski konstrukt, promotor MHCK7 specifičan za mišiće za pokretanje ekspresije, konsenzus Kozak sekvencu (CCACC), SV40 himerni intron, mesto sintetičke poliadenilacije (53 bp) (Slika 1). Kaseta ekspresije mikrodistrofina je klonirana između AAV2 ITR-a upakovanog u AAVrh74 vektor za poboljšanu transdukciju skeletnog i srčanog tkiva.

[0102] Određivanje potentnosti rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin proizvoda za testiranje je postignuto izvođenjem intramuskularnih injekcija vektora u mdx miševe. Miševi divljeg tipa služe kao pozitivna kontrola, a ubrizgavanje sterilnih laktiranih Ringerovih rastvora u mdx miševe služe kao negativna kontrola.

Tabela 4: Pregled studije rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin

IF: imunofluorescencija; H&E: bojenje hematoksilinom i eozinom; Diaph/TA Phys: merenja specifične sile u dijafragmi i TA mišiću; Put: formalna histopatologija; ’—’: neinjektiran;

Sve ubrizgane životinje tretirane su pri uzrastu od 4-5 nedelja i obdukovane 3 ili 6 meseci posle injektiranja. Obdukcija kontrolnih miševa izvršena je pri uzrastu 4 meseca i 7 meseci.

[0103] Životinje navedene u Tabeli 4 dozirane su u naznačenom uzrastu (4-5 nedelja starosti) injekcijom u repnu venu za sistemsku isporuku. Da bi se izvršilo precizno doziranje intramuskularnom injekcijom, životinje su nakratko anestezirane inhalacijom izoflurana. Doze su primenjene direktnom injekcijom u tibijalni prednji mišić donjeg zadnjeg ekstremiteta. Za precizno doziranje sa sistemskom isporukom nije bila potrebna anestezija. Doze su primenjene vaskulaturom kroz repnu venu. Posvećena je pažnja da se cela vektorska doza tačno deponuje u krvni sud. Nakon doziranja, životinje su stavljane na grejnu podlogu dok se spontano kretanje nije povratilo, a zatim su vraćene u kavez. Posmatranja svake životinje vršena su jednom nedeljno tokom celog trajanja studije.

[0104] U odgovarajućem uzrastu kako je navedeno u Tabeli 4, miševima je predozirana smeša ketamin/ksilazin (200mg/kg/20mg/kg). Krv je prikupljena punkcijom srca i puna krv je poslata na kompletnu analizu krvne slike (CBC), a serum je čuvan na -80 ° C do hemijske analize seruma u Charles Rivers Laboratory. Tkiva su zatim prikupljena i poslata na analizu nezavisnom veterinarskom histopatologu i kod kuće.

[0105] Intramuskularna isporuka rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina distrofin-nultim miševima pri ukupnoj dozi 1 × 10<11>vg rezultirala je sa ~70% ekspresije distrofina u injektiranim TA mišićima. Imunofluorescentno snimanje vektorski doziranog miša potvrdilo je ekspresiju mikro-distrofinskog gena.

Obnova ekspresije distrofina nakon sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikrodistrofinom.

[0106] Određivanje efikasnosti rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin proizvoda za testiranje je postignuto izvođenjem sistemskih injektiranja kod mdx miševa (genotip: C57BL/10ScSn-Dmd<mdx>/J) primenom eskalacije doze pri niskoj, srednjoj i visokoj dozi (2,0 ×10<12>vg ukupne doze ; 6,0 × 10<12>vg ukupne doze; 1,2 × 10<13>vg ukupne doze) za procenu ekspresije transgena i efikasnosti vektora kada se sistemski isporučuje u vremenskim tačkama od 3 i 6 meseci nakon injekcije. Miševi su ubrizgani u dobi od 4-5 nedelja, a potpuna nekropsija je izvršena i 3 i 6 meseci nakon ubrizgavanja. Na osnovu srednje težine životinja po grupi, ove doze su ekvivalentne: 8 ×10<13>vg/kg, 2 × 10<14>vg/kg i 6 × 10<14>vg/kg. Ubrizgavanje ekvivalentne zapremine laktiranih Ringerovih rastvora poslužilo je kao negativna kontrola. Ubrizgavanje ekvivalentne zapremine laktiranih Ringerovih rastvora u C57BL/6 miševe poslužilo je kao pozitivna kontrola. Bezbednost je utvrđena sistemskim ubrizgavanjem u DT (divlji tip) miševe u dozi od 6,0 ×10<12>vg ukupne doze (označeno kao grupa DT TX-srednje doze).

Imunofluorescentno bojenje skeletnih mišića tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GAS), kvadricepsa (QUAD), gluteusa (GLUT), psoasa, tricepsa (TRI), dijafragme (DIA) i srca je sprovedeno kako bi se utvrdila restauracija distrofina i osigurala efikasnost virusnog vektora rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin.

[0107] Skeletni mišići (TA, QUAD, GLUT, TRI) su ekstrahovani za analizu, zajedno sa srcem i dijafragmom. Organi su takođe uklonjeni za toksikološke i biodistributivne studije. Ekspresija transgena mikro-distrofina ostala je visoka od 3-6 meseci nakon tretmana. To je bilo praćeno poboljšanom histopatologijom mišića i poboljšanom funkcijom bez neželjenih efekata na neciljne organe

Preokret distrofičnog fenotipa u sistemski tretiranim mdx miševima sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom

[0108] Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) skeletnih mišića, dijafragme i srca je sprovedeno kako bi se utvrdilo preokretanje i poboljšanje distrofične patologije nakon sistemskog ubrizgavanja rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina u ukupnoj dozi od 2×10<12>vg (niska doza; n=1), 6 × 10<12>vg ukupne doze (srednja doza; n=8) i 1,2 ×10<13>vg ukupne doze (visoka doza; n=8) za svaku dozu sa eutanazijom 12 nedelja nakon injektiranja.24 nedelje nakon injektiranja, druga kohorta životinja lečenih srednjom dozom (ukupna doza 6 × 10<12>vg) procenjena je na preokret i poboljšanje patologije distrofina (n=5).

[0109] Za određivanje ekspresije transgena mikrodistrofina i na levoj i desnoj strani šest skeletnih mišića (TA, GAS, QUAD, GLUT, psoas, TRI), kao i dijafragme i srca kod svih distrofinski nultih miševa kojima je ubrizgan mikro-distrofinski vektor, korišćeno je imunofluorescentno bojenje za humani mikrodistrofin protein. Ovo je sprovedeno kako bi se utvrdila obnova distrofina i osigurala efikasnost virusnog vektora rAAVrh74.MHCK7.mikrodistrofina u ukupnoj dozi od 2 ×10<12>vg ukupne doze (niska doza; n=1), 6 × 10<12>vg ukupne doze (srednja doza; n=8) i 1,2 ×10<13>vg ukupne doze (visoka doza; n=8) za svaku dozu sa eutanazijom 12 nedelja nakon injektiranja.

[0110] Da bi se procenila efikasnost ekspresije i transdukcije, za kvantifikaciju su korišćene slike iz sve tri kohorte doziranja i leve i desne strane svakog mišića. Snimljene su četiri 20X slike svakog mišića i procenat mikro-distrofin pozitivnih vlakana je određen za svako snimanje što je rezultiralo prosečnom procentualnom transdukcijom za svaki mišić. Na slikama 14 i 15 prikazane su reprezentativne slike tretiranih miševa od srednje doze (6 × 10<12>vg; 2 × 10<14>vg/kg) i visoke doze (1,2 × 10<13>vg; 6 × 10<14>vg/kg). Za negativnu kontrolu uključeni su distrofin nulti miševi kojima su ubrizgani laktatni Ringerovi rastvori i koji su odgovarajuće starosti, a za pozitivne kontrole su uključeni miševi divljeg tipa kojima su ubrizgani laktatni Ringerovi rastvori. Srce je pokazalo ≥75% kod svih analiziranih životinja.

[0111] Mišići nelečenih životinja pokazali su široko rasprostranjenu miopatiju, uključujući masnu infiltraciju, centralnu nukleaciju, fibrozu i žarišne oblasti nekroze. H&E bojenje na slici 16 i slici 17 ilustruje ovaj distrofični fenotip kod miševa bez distrofina u poređenju sa normalnim DT miševima i poboljšanje patologije mišića nakon lečenja bilo srednjom dozom (6 × 10<12>vg; 2 × 10<14>vg/kg) ili visokom dozom (1,2 × 10<13>vg; 6× 10<14>vg/kg). Kvantifikacija histoloških parametara pokazala je smanjenje centralne nukleacije (Slika 18) i normalizaciju prosečnih prečnika vlakana (Slika 16 i 17) kod tretiranih miševa u svim mišićima na način koji zavisi od doze. Sirius Red bojenje pokazalo je smanjenje taloženja kolagena u dijafragmi u kohortama i srednjih i visokih doza u poređenju sa nelečenim (mdx LR) kohortama (Slika 19).

Funkcionalna procena sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom [0112] Da bi se utvrdilo da li je transfer gena za mikro-distrofin obezbedio funkcionalnu korist za bolesne mišiće, procenjena su funkcionalna svojstva i dijafragme i tibialis anterior od mdx miševa, DT miševa i vektorski doziranih miševa na tri nivoa doze. Eskalacija doze uključivala je nisku dozu (8 × 10<13>vg/kg), srednju dozu (2 × 10<14>vg/kg) i visoku dozu (6 × 10<14>vg/kg). Funkcionalna procena sistemskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin koristeći ex-vivo procenu specifične sile i smanjenje izlazne snage nakon ekscentričnih kontrakcija u TA je korišćen 24 nedelje nakon injektiranja kod životinja kojima je sistemski ubrizgan rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin pri 6 ×10<12>vg ukupne doze (srednja doza). Pored toga, specifična izlazna sila u dijafragmi je procenjena kod istih životinja.

[0113] Kao što je navedeno u prethodnim ciframa, histopatologija je pokazala normalizovanije okruženje sa poboljšanjima centralne nukleacije, taloženja kolagena i veličine vlakana u srednjim i visokim dozama. Isporuka u repnoj veni rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina je dovela do postepenog poboljšanja specifične izlazne sile u dijafragmi (176,9 mN/mm<2>u grupi srednjih doza naspram 227,78 mN/mm<2>u grupi visokih doza). Pored toga, dugotrajno tretirana kohorta predstavlja miševe 6 meseci nakon ubrizgavanja (srednja doza 2 × 10<14>vg/kg) i nije bilo odstupanja u dugotrajnom izlazu sile dijafragme (176,9 mN/mm<2>naspram 194,9 mN/mm<2>) (Slika 20).

[0114] Pored toga, uočeni su funkcionalni deficiti u prednjem mišiću tibijalisa kod mdx miševa u poređenju sa DT miševima. Mdx miševi su pokazali 50% smanjenje snage u poređenju sa DT miševima (171,3 mN/mm<2>naspram 291,65 mN/mm<2>) i veći gubitak sile nakon ekscentričnih kontrakcija (32% gubitak u mdx; 5% gubitak u DT). Sistemska isporuka srednjeg nivoa doze rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina rezultirala je sa 65,5% distrofina u prednjem mišiću tibijalis i obnovom specifične izlazne sile koja se poboljšala na 235,4 mN/mm<2>i zaštitila mišić od ponovljenog oštećenja ekscentrične kontrakcije sa samo 25% smanjenjem sile (Slika 21). Grupa DT srednje doze predstavlja divlji tip tretirane kohorte kako bi se pokazalo odsustvo toksičnosti i održavanje funkcionalnih mera ishoda nakon vektorskog tretmana.

Sažetak

[0115] Nakon početne demonstracije biopotentnosti intramuskularnom injekcijom, uporediva ili povećana obnova mikro-distrofina postignuta je vaskularnom isporukom dok su se transdukovali skeletni mišići, dijafragma i srce. Efikasnost je pokazala preokret distrofičnih karakteristika na način zavisan od doze smanjenjem inflamacije, manje degenerativnih vlakana i poboljšanim funkcionalnim oporavkom zaštitom od ekscentričnih kontrakcija u tibialis anterior i dijafragmi. Funkcionalne prednosti vektora uključuju postepeno poboljšanje nivoa divljeg tipa u generisanju sile dijafragme i TA.

Primer 9

Toksikologija i biodistribucija sistemskog tretmana sa rAAVrh74.MHCK7.mikrodistrofinom.

[0116] Organi i tkiva mdx miševa kojima je data sistemska injekcija rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina prikupljeni su za kvantitativni PCR u realnom vremenu radi detekcije specifičnih sekvenci vektorske DNK. Proteini ekstrahovani iz svih prikupljenih organa i tkiva su analizirani na Western blot kako bi se detektovao mikro-distrofin u organima koji nisu ciljani.

[0117] Proizvod za testiranje je dat u tri nivoa doze: niska (2 × 10<12>vg; 8 × 10<13>vg/kg), srednja (6 × 10<12>vg; 8 × 10<14>vg/kg) i visoka doza (1,2 × 10<13>vg; 6 ×10<14>vg/kg) intravenskim putem u dobi od 4-5 nedelja. Da bi se procenila bezbednost vektora, H&E bojenje je izvršeno na kriosekcijama mišićnog tkiva i svih glavnih organa sakupljenih iz istih kohorti miševa koji su prethodno opisani. Takođe su bili uključeni organi i mišići od C57BL6 DT miševa koji su sistemski tretirani vektorom pri srednjoj dozi. Mdx i DT miševi tretirani laktatom su takođe uključeni za histopatološku analizu. Ove sekcije je formalno pregledao na toksičnost treće lice, veterinarski patolog sa sertifikatom odbora i nisu otkriveni štetni efekti u bilo kom uzorku od bilo kog miša; rezultati su sumirani u nastavku.

[0118] Detalji grupe i dizajn studije prikazani su u nastavku 4.

Tabela 5: Projekat studije bezbednosti rAAVrh74. MHCK7.mikro-distrofina

Histopatološki pregled vektorski transdukovanog tkiva

[0119] IV injektiranje rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina nije izazvalo nikakve mikroskopske promene u miofibrima bilo kojih skeletnih mišića koji su ispitani. Pored toga, nisu uočene lezije povezane sa lečenjem ni u jednom od histološki procenjenih tkiva. Sve zabeležene promene su primećene i kod tretiranih i kod kontrolnih miševa i smatrane su slučajnim nalazima. Uzeto zajedno, ovi podaci ukazuju na to da su ispitanici dobro tolerisali ovaj proizvod za testiranje. Pored toga, u odnosu na referentne uzorke iz uzrasta podudarnih, netretiranih mdx miševa, primena rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina je smanjila atrofiju miofibera kod tretiranih mdx miševa, pokazujući tako da proizvod za testiranje može da ublaži stepen miopatije povezane sa deficijencijom mdx.

[0120] Pored pregleda obolelih mdx miševa sistematski tretiranih vektorom, rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin bio je sistemski isporučen u pet C57BL/6 DT miševa u dozi identičnoj minimalnoj efikasnoj dozi (MED) utvrđenoj u prethodno navedenim studijama kod mdx miševa, 6 × 10<12>vg ukupne doze (2 × 10<14>vg/kg). Ovo je omogućilo proučavanje intravenske isporuke proizvoda za testiranje kod zdravih DT miševa kako bi se definitivnije utvrdilo da li bilo kakvi neželjeni efekti nastaju isključivo zbog tretmana. Ovde su ponovo sakupljeni različiti skeletni mišići, uključujući dijafragmu, zajedno sa srcem, i još pet organa, a H&E sekcije svakog tkiva formalno je pregledao nezavisni veterinarski patolog.

Biodistribucija vektorskog genoma

[0121] Prisustvo DNK sekvenci specifičnih za proizvod za testiranje ispitano je korišćenjem kvantitativnog PCR testa (qPCR) u realnom vremenu. Analiza biodistribucije izvršena je na uzorcima tkiva prikupljenim od tri vektorski dozirane mdx životinje po nivou doze. Pozitivan signal je bilo šta što je jednako ili veće od 100 jednolančanih DNK kopija/µg dtektovane genomske DNK. Tkiva su sakupljena prilikom nekropsije i korišćeni su vektorski specifični setovi sondi specifični za sekvence promotora MHCK7. Na slici 22 i Tabeli 6 u nastavku prikazane su kopije vektorskog genoma detektovane u svakom uzorku tkiva iz miševa kojima je ubrizgavan rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofin.

Tabela 6: Brojevi kopija vektorskog genoma u organima i mišićima iz tri vektorski doziranih mdx miševa po nivou doze. Vrednosti su prikazane u vg/µg genomske DNK.

[0122] Transkript rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina detektovan je na različitim nivoima u svim prikupljenim tkivima. Kao što se očekivalo, najviši nivoi su viđeni u skeletnim mišićima i srcu. Najniži nivoi su detektovani u gonadi, plućima, bubrezima i slezini. Ovi podaci ukazuju na to da je proizvod za testiranje efikasno isporučen u sva istražena tkiva vektorski doziranih miševa.

[0123] Kao što prethodno navedeni qPCR rezultati ukazuju, intravenska isporuka rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofina dovela je do distribucije vektorskog transkripta na različitim nivoima u većini tkiva, sa najvišim nivoima koji se javljaju u mišićima jetre, srca i kvadricepsa (srednja doza) i mišićima jetre, srca i gastrocnemiusa (visoka doza). Stoga je cilj ovog dela studije bio da se utvrdi ekspresija proteina humanog transgena za mikro-distrofin u ovim tkivima kako bi se osigurala funkcionalnost promotora MHCK7 specifičnog za mišiće. Western blot je korišćen za detekciju ekspresije mikro-distrofina u uzorcima tkiva.

[0124] Ekspresija proteina i biodistribucija vektora takođe su procenjeni pomoću qPCR i Western blotting (Slika 23), a ovi podaci ukazuju na normalne nivoe vektora u neciljanim organima i minimalnu detekciju mikro-distrofinskog proteina u jetri tretiranoj visokim dozama. Ovi rezultati su korelisani sa odsustvom toksičnosti kako je utvrdio patolog u jetri. Pored toga, serumske hemikalije je analizirao nezavisni CRO (Charles River Laboratories) koji ukazuje na normalne vrednosti za sve analizirane hemikalije. Postojale su tri nenormalne vrednosti u jetrenom enzimu AST, od kojih su 2 pokazane u mdx-LR grupi i 1 u grupi srednjih doza (Slika 23). Podskup životinja je podvrgnut analizi kreatin kinaze (CK), međutim, uzorci su analizirani pre i posle fiziološke procene. Analiza seruma potvrđuje nedostatak toksičnosti nakon isporuke proizvoda za testiranje.

[0125] Ekspresija proteina mikro-distrofina zapažena je u različitim količinama u svim uzorcima skeletnih mišića, kao i uzorcima srca (Slika 24). Međutim, detektovan je minimalni protein u kohorti visokih doza u jetri. Veruje se da je ovo benigni rezultat i može biti da je prisustvo u jetri posledica ekspresije u glatkom mišiću jetre. Važno je da nije bilo štetnih histopatoloških efekata u jetri, označenih u nezavisnom patološkom izveštaju.

Sažetak

[0126] U histopatološkom pregledu je zaključeno da je mdx-LR kohorta pokazala rasprostranjenu miopatiju koja je uticala na svih sedam skeletnih mišića koji su procenjeni, kao i na desni ventrikularni zid srca. Glavni nalazi histopatološkog pregleda uključivali su izraženu i rasprostranjenu atrofiju miofibera (30-75% normalne veličine miofibera), minimalne do blage inflamacije mononuklearnih ćelija, povećan intersticijalni prostor i povećane citoplazmatske mineralne naslage. Dijafragma je pokazala najznačajnije promene u infiltraciji mononuklearnih ćelija i atrofiji miofibera. Srce je pokazalo nekoliko malih žarišta minimalne akumulacije mononuklearnih ćelija u ventrikularnom miokardu. Vektorski dozirane kohorte su značajno smanjile miopatiju u svim skeletnim tkivima i srcu. Smanjenje u histopatološkim nalazima bilo je u zavisnosti od doze, pri čemu je grupa visokih doza imala znatno manje degeneracije i inflamacije. Nije bilo neželjenih efekata usled vektorskog lečenja sa rAAVrh74.MHCK7.mikro-distrofinom kao što je dokumentovano u DT tretiranoj kohorti i vektorski doziranim mdx kohortama. Bilo je slučajnih nalaza u jetri i plućima mdx i DT miševa, bez obzira na tretman, u kojima su miševi pokazali blagu vakuolaciju citoplazme hepatocita. Stoga je proizvod za testiranje bio bezbedan, efikasan i zaštitni efekat je bio zavisan od doze.

REFERENCE

[0127]

1. Hoffman, E.P., Brown, R.H., Jr. & Kunkel, L.M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919-928 (1987).

2. Straub, V. & Campbell, K.P. Muscular dystrophies and the dystrophin-glycoprotein complex. Curr Opin Neurol 10, 168-175 (1997).

3. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell 143, 1059-1071 (2010).

4. Wallace, G.Q. & McNally, E.M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu Rev Physiol 71, 37-57 (2009).

5. Zhou, L. & Lu, H. Targeting fibrosis in Duchenne muscular dystrophy. J Neuropathol Exp Neurol 69, 771-776 (2010).

6. Desguerre, I., et al. Endomysial fibrosis in Duchenne muscular dystrophy: a marker of poor outcome associated with macrophage alternative activation. J Neuropathol Exp Neurol 68, 762-773 (2009).

7. DiPrimio, N., McPhee, S.W. & Samulski, R.J. Adeno-associated virus for the treatment of muscle diseases: toward clinical trials. Curr Opin Mol Ther 12, 553-560 (2010).

8. Mendell, J.R., et al. Sustained alpha-sarcoglycan gene expression after gene transfer in limb-girdle muscular dystrophy, type 2D. Ann Neurol 68, 629-638 (2010).

9. Mendell, J.R., et al. Limb-girdle muscular dystrophy type 2D gene therapy restores alpha-sarcoglycan and associated proteins. Ann Neurol 66, 290-297 (2009).

10. Mendell, J.R., et al. A phase 1/2a follistatin gene therapy trial for becker muscular dystrophy. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 192-201 (2015).

11. Carnwath, J.W. & Shotton, D.M. Muscular dystrophy in the mdx mouse: histopathology of the soleus and extensor digitorum longus muscles. J Neurol Sci 80, 39-54 (1987).

12. Coulton, G.R., Morgan, J.E., Partridge, T.A. & Sloper, J.C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.

Neuropathol Appl Neurobiol 14, 53-70 (1988).

13. Cullen, M.J. & Jaros, E. Ultrastructure of the skeletal muscle in the X chromosomelinked dystrophic (mdx) mouse. Comparison with Duchenne muscular dystrophy. Acta Neuropathol 77, 69-81 (1988).

14. Dupont-Versteegden, E.E. & McCarter, R.J. Differential expression of muscular dystrophy in diaphragm versus hindlimb muscles of mdx mice. Muscle Nerve 15, 1105-1110 (1992).

15. Stedman, H.H., et al. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352, 536-539 (1991).

16. Deconinck, A.E., et al. Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90, 717-727 (1997).

17. Grady, R.M., et al. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90, 729-738 (1997).

18. Love, D.R., et al. An autosomal transcript in skeletal muscle with homology to dystrophin. Nature 339, 55-58 (1989).

19. Tinsley, J.M., et al. Primary structure of dystrophin-related protein. Nature 360, 591-593 (1992).

20. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med 4, 1441-1444 (1998).

21. Squire, S., et al. Prevention of pathology in mdx mice by expression of utrophin: analysis using an inducible transgenic expression system. Hum Mol Genet 11, 3333-3344 (2002).

22. Rafael, J.A., Tinsley, J.M., Potter, A.C., Deconinck, A.E. & Davies, K.E. Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues utrophin-dystrophin deficient mice. Nat Genet 19, 79-82 (1998).

23. Zhou, L., et al. Haploinsufficiency of utrophin gene worsens skeletal muscle inflammation and fibrosis in mdx mice. J Neurol Sci 264, 106-111 (2008).

24. Gutpell, K.M., Hrinivich, W.T. & Hoffman, L.M. Skeletal Muscle Fibrosis in the mdx/utrn+/- Mouse Validates Its Suitability as a Murine Model of Duchenne Muscular Dystrophy. PloS one 10, e0117306 (2015).

25. Rodino-Klapac, L.R., et al. Mikro-distrofin and follistatin co-delivery restores muscle function in aged DMD model. Human molecular genetics 22, 4929-4937 (2013).

26. Nevo, Y., et al. The Ras antagonist, farnesylthiosalicylic acid (FTS), decreases fibrosis and improves muscle strength in dy/dy mouse model of muscular dystrophy. PloS one 6, e18049 (2011).

27. Rodino-Klapac, L.R., et al. A translational approach for limb vascular delivery of the mikro-distrofin gene without high volume or high pressure for treatment of Duchenne muscular dystrophy. J Transl Med 5, 45 (2007).

28. Mulieri, L.A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E.M. & Alpert, N.R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ Res 65, 1441-1449 (1989).

29. Rodino-Klapac, L.R., et al. Persistent expression of FLAG-tagged micro dystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vascular delivery. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 109-117 (2010).

30. Grose, W.E., et al. Homologous recombination mediates functional recovery of dysferlin deficiency following AAV5 gene transfer. PIoS one 7, e39233 (2012).

31. Liu, M., et al. Adeno-associated virus-mediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contraction-induced injury. Mol Ther 11, 245-256 (2005).

32. Harper, S.Q., et al. Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Nature medicine 8, 253-261 (2002).

33. Rodino-Klapac, L.R., et al. Persistent expression of FLAG-tagged micro dystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vascular delivery. Mol Ther 18, 109-117 (2010).

34. Salva, M.Z., et al. Design of tissue-specific regulatory cassettes for high-level rAAV-mediated expression in skeletal and cardiac muscle. Mol Ther 15, 320-329 (2007).

35. Sondergaard, P.C., et al. AAV.Dysferlin Overlap Vectors Restore Function in Dysferlinopathy Animal Models. Annals of clinical and translational neurology 2, 256-270 (2015).

36. De, B.P., et al. High levels of persistent expression of alpha1-antitrypsin mediated by the nonhuman primate serotype rh.10 adeno-associated virus despite preexisting immunity to common human adeno-associated viruses. Mol Ther 13, 67-76 (2006).

37. Rodino-Klapac, L.R., et al. A translational approach for limb vascular delivery of the mikro-distrofin gene without high volume or high pressure for treatment of Duchenne muscular dystrophy. Journal of translational medicine 5, 45 (2007).

38. Bulfield et al., X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc Natl Acad Sci USA.1984; 81(4): 1189-1192.

39. Sicinski et al., The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 1989 30;244(4912):1578-80

LISTA SEKVENCI

[0128]

<110> ISTRAŽIVAČKI INSTITUT U NACIONALNOJ DEČIJOJ BOLNICI

<120> ISPORUKA ADENO-ASOCIRANOG VIRUS VEKTORA MIKRO-DISTROFINA SPECIFIČNOG

ZA MIŠIĆE ZA LEČENJE MIŠIĆNE DISTROFIJE

<130> 28335/51475A PCT

<150> US 62/473,148

<151> 2017-03-17

<160> 5

<170> PatentIn verzija 3.5

<211> 3579

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 1

<211> 810

<212> DNK

<213> Adeno-asocirani virus <400> 2

<211> 8611

<212> DNK

<213> Adeno-asocirani virus <400> 3

<211> 564

<212> DNK

<213> Adeno-asocirani virus <400> 4

<210> 5

<211> 8409

<212> DNK

<213> Adeno-asocirani virus <400> 5

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni AAVrh.74 vektor koji sadrži MHCK7 promotor/pojačivač specifičan za mišiće koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1, pri čemu rekombinantni AAVrh.74 vektor obuhvata 5' AAV2 terminalno obrnuto ponavljanje (ITR), MHCK7 promotor/pojačivač specifičan za mišiće, SV40 intron, nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, signal sintetičke poliadenilacije (PolyA) i 3' AAV2 ITR.

2. Rekombinantni AAVrh.74 vektor iz zahteva 1, pri čemu vektor obuhvata nukleotidnu sekvencu postavljenu kao nukleotidi 7-5042 od SEQ ID NO: 3.

3. Sastav koji sadrži rekombinantni AAVrh.74 vektor iz zahteva 1 ili 2, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

4. Rekombinantni AAVrh.74 vektor iz zahteva 1 ili 2 ili sastav iz zahteva 3 za upotrebu u lečenju mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno.

5. Rekombinantni AAVrh.74 vektor iz zahteva 1 ili 2 ili sastav iz zahteva 3 za upotrebu u smanjenju ili sprečavanju fibroze kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije.

6. Rekombinantni AAVrh.74 vektor ili sastav za upotrebu prema zahtevu 4 ili 5, pri čemu ispitanik pati od Dišenove mišićne distrofije.

7. Rekombinantni AAVrh.74 vektor ili sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4-6, pri čemu rekombinantni AAVrh.74 vektor ili sastav se daje intramuskularnom injekcijom ili intravenskom injekcijom.

8. Rekombinantni AAVrh.74 vektor ili sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4-7, pri čemu se rekombinantni AAVrh.74 vektor ili sastav primenjuje sistemski.