RS65421B1 - Isporuka adeno-asociranog virusnog vektora alfa-sarkoglikana i lečenje mišićne distrofije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovde su opisani terapijski vektori kao što su AAV vektori koji eksprimiraju alfasarkoglikan i postupak korišćenja ovih vektora za lečenje mišićnih distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa kao što je LGMD2D.

OSNOVNE INFORMACIJE

[0002] Mišićne distrofije (MD) su grupa genetskih bolesti. Grupu karakteriše progresivna slabost i degeneracija skeletnih mišića koji kontrolišu kretanje. Neki oblici MD se razvijaju u detinjstvu ili ranom detinjstvu, dok se drugi možda neće pojaviti do srednjeg doba ili kasnije. Poremećaji se razlikuju u pogledu distribucije i obima mišićne slabosti (neki oblici MD takođe utiču na srčani mišić), starosti početka, brzine progresije i šeme nasleđivanja.

[0003] Jedna grupa MD je mišićna distrofija ekstremiteta (LGMD). LGMD su retka stanja i različito se manifestuju kod različitih ljudi u pogledu doba početka, područja mišićne slabosti, srčane i respiratorne uključenosti, brzine progresije i težine. LGMD mogu početi u detinjstvu, adolescenciji, mladoj odrasloj dobi ili čak kasnije. Oba pola su podjednako pogođena. LGMD uzrokuju slabost u ramenom i karličnom pojasu, pri čemu obližnji mišići u natkolenici i nadlaktici ponekad takođe vremenom slabe. Slabost nogu često se javlja pre slabosti ruku. Facijalni mišići su obično nepromenjeni. Kako stanje napreduje, ljudi mogu imati problema sa hodanjem i možda će morati da koriste invalidska kolica tokom vremena. Uključivanje mišića ramena i ruku može dovesti do poteškoća u podizanju ruku preko glave i podizanju predmeta. U nekim vrstama LGMD mogu biti uključeni srčani mišići i mišići disanja.

[0004] Specijalizovani testovi za LGMD sada su dostupni putem nacionalne šeme za dijagnozu, Nacionalne komisione grupe (National Commissioning Group - NCG).

[0005] LGMD podtip 2D (LGMD2D), koji se često naziva α-sarkoglikanopatija, je autozomno recesivni poremećaj izazvan mutacijama u alfa-sarkoglikan genu (SGCA; αsarkoglikan), što dovodi do potpunog ili smanjenog gubitka funkcionalnog proteina sa gubitkom drugih strukturnih komponenti proteinskog kompleksa povezanog sa distrofinom. Značajno, gubitak alfa-sarkoglikan proteina dovodi do progresivne mišićne distrofije sa pogoršanjem mišićne funkcije, sa početkom u dobi od 3 do 8. Simptomi uključuju: odloženu ambulaciju, slabost u proksimalnim mišićima uzrokovanu zamenom masti i fibrozom, povišenu kreatin kinazu, skoliozu i kontrakture zglobova. Oslabljujuća bolest često dovodi do zavisnosti od invalidskih kolica i smrti usled respiratorne insuficijencije. Dakle, ostaje potreba za tretmanima za LGMD2D.

[0006] WO 2013/078316 se odnosi na rAAV isporuku alfa-sarkoglikan gena u lečenju mišićnih distrofija ekstremiteta. Mendell et al., 2019, Human Gene Therapy, 30(7): 794-801 odnosi se na isporuku gena za mišićnu distrofiju ekstremiteta rameno-karličnog pojasa tipa 2D infuzijom izolovanog ekstremiteta. Mendell et al., 2012, Neuroscience Letters, 527(2): 90-99 se odnosi na gensku terapiju za mišićnu distrofiju. Mendell et al., 2010, Annals of Neurology, 68(5): 629-638 se odnosi na ekspresiju gena alfa-sarkoglikana nakon prenosa gena u mišićnoj distrofiji ekstremiteta, tip 2D.

SAŽETAK

[0007] U jednom aspektu, pronalazak pruža sastav za upotrebu u lečenju mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav sadrži rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA u dozi od 5 ×10<13>vg/kg do 2× 10<14>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije, i pri čemu je sastav formulisan za sistemski put primene, i dalje pri čemu rAAV sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 4 i navedena nukleotidna sekvenca kodira protein koji zadržava aktivnost alfa-sarkoglikana. Takođe je dat sastav za upotrebu u lečenju mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav obuhvata rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA u dozi od 1,0 × 10<13>vg/kg do 8,0 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije i pri čemu je sastav formulisan za sistemski put primene, i dalje pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 4, a navedena nukleotidna sekvenca kodira protein koji zadržava aktivnost alfa-sarkoglikana.

Takođe je obezbeđen sastav za smanjenje nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno, sastav koji sadrži scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4.

[0008] Ovde su opisani postupci za lečenje mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, koji obuhvataju korak primene rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA, pri čemu se rAAV primenjuje sistemskim putem primene i u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 5,0 × 10<15>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Obelodanjenje se odnosi na rAAV koji eksprimira gen alfasarkoglikana. Ovde su takođe opisani postupci isporuke alfa-sarkoglikana u mišić kako bi se smanjila i/ili sprečila fibroza; i/ili za povećanje mišićne sile i/ili za lečenje αsarkoglikanopatije kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije.

[0009] Ovde je opisan rekombinantni AAV (rAAV) koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira alfa-sarkoglikanski protein. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca obuhvata sekvencu od najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ili 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 99,5% identičnu nukleotidnoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 1 i kodira protein koji zadržava aktivnost alfa-sarkoglikana. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca se sastoji od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 1. U drugom otelotvorenju, polinukleotid kodira protein koji je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ili 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 99,5% identičan nukleotidnoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 2. U drugom otelotvorenju, polinukleotid kodira protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 2.

[0010] U nekim otelotvorenjima, rAAV se sastoji od nukleotidne sekvence koja sadrži tMCK promoter. Na primer, tMCK promoter se sastoji od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 3. Pored toga, rAAV se sastoji od 5' sekvence obrnutog terminalnog ponavljanja SEQ ID NO: 5 i/ili 3' sekvence obrnutog terminalnog ponavljanja SEQ ID NO: 6. U nekim otelotvorenjima, rAAV sadrži poli A sekvencu SEQ ID NO: 7.

[0011] U jednom otelotvorenju, polinukleotid se sastoji od nukleotidne sekvence koja je najmanje 99,5% identična sa SEQ ID NO: 4. U jednom otelotvorenju, polinukleotid se sastoji od nukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 4.

[0012] Ovde opisani postupci lečenja mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno obuhvataju korak primene bilo kog od rAAV koji je ovde obelodanjen, pri čemu se rAAV primenjuje sistemskim putem. Konkretno, u bilo kom od opisanih postupaka, rAAV je AAVrh74.tMCK.hSCGA, pri čemu se rAAV primenjuje sistemskim putem primene.

[0013] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, rAAV je primenjen u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 5,0 × 10<15>vg/kg na osnovu super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, rAAV je primenjen u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 2,0 × 10<15>vg/kg, oko 5 × 10<12>vg/kg do oko 1,0 × 10<15>vg/kg, oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg, oko 2,0 × 10<13>vg/kg do oko 3,0 × 10<14>vg/kg, ili oko 5 × 10<13>vg/kg do oko 2 × 10<14>vg/kg, ili se rAAV primenjuje u dozi od oko 5 × 10<13>vg/kg, oko 6 × 10<13>vg/kg, oko 7 × 10<13>vg/kg, oko 8 × 10<13>vg/kg, oko 9 × 10<13>vg/kg, oko 1 × 10<14>vg/kg, oko 2

× 10<14>vg/kg, oko 3 × 10<14>vg/kg, oko 4 × 10<14>vg/kg ili oko 5 × 10<14>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0014] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, rAAV je primenjen u dozi od oko 1,85 × 10<13>vg/kg ili 7,41 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, rAAV je primenjen u dozi od oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,5 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,6 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,2 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,4 × 10<13>vg/kg do oko 7,4 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, ili oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0015] Pored toga, u bilo kom od ovde opisanih postupaka, sistemski put primene je intravenski put. Na primer, rAAV se primenjuje injekcijom, infuzijom ili implantacijom. RAAV se može primeniti intravenskim putem kroz perifernu venu ekstremiteta.

[0016] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, mišićna distrofija je mišićna distrofija ekstremiteta i pojasa. Na primer, mišićna distrofija je mišićna distrofija ekstremiteta i ramenokarličnog pojasa tipa 2D (LGMD2D).

[0017] Postupci lečenja mišićne distrofije opisani u ovom dokumentu mogu da obuhvataju primenu rAAV kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa, a rAAV se primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od oko 5×10<13>vg/kg do oko 2×10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida kao kvantifikacionog standarda, i pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 scAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0018] Opisani su postupci lečenja mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, postupak koji se sastoji od koraka davanja rAAV-a ispitaniku pri čemu ispitanik pati od mišićne distrofije ekstremiteta i pojasa i pri čemu se rAAV primenjuje intravenskom infuzijom u dozi od oko 5×10<13>vg/kg do oko 2×10<14>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao kvantifikacionog standarda, i pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Na primer, u ovim postupcima, nivo ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika se povećava nakon primene rAAV u poređenju sa nivoom ekspresije alfa-sarkoglikan gena pre primene rAAV.

[0019] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, nivo ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika se povećava nakon primene rAAV u poređenju sa nivoom ekspresije alfasarkoglikan gena pre primene rAAV; i/ili pri čemu se nivo CK u serumu kod ispitanika smanjuje nakon primene rAAV u poređenju sa nivoom CK u serumu pre primene rAAV; i/ili pri čemu se povećava lokomotorna aktivnost i generisanje specifične sile; pri čemu se smanjuje fibroza; pri čemu se povećava otpornost na povredu izazvanu kontrakcijom u mišiću tibialis anterior; i/ili pri čemu se broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika povećava nakon primene rAAV u poređenju sa brojem alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana pre primene rAAV; ili pri čemu se fibroza smanjuje kod ispitanika nakon primene rAAV u poređenju sa istom pre primene rAAV; i/ili pri čemu se fibroza smanjuje kod ispitanika nakon primene rAAV u poređenju sa pre primene rAAV-a; i/ili pri čemu se specifična sila, veličina prečnika vlakana i/ili ekscentrična kontrakcija u mišiću ispitanika povećavaju nakon primene rAAV u poređenju sa istim pre primene rAAV.

[0020] U nekim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena se detektuje merenjem nivoa alfa-sarkoglikanskog proteina pomoću Western blot i/ili imunohistohemijom.

[0021] Opisane su i metode ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji koja se sastoji od primene na ispitaniku bilo kog od obelodanjenih rAAV. Na primer, opisan je postupak ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji koja se sastoji od primene ispitaniku nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Pored toga, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina putem Western blot u mišićnim biopsijama. Alternativno, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina imunohistohemijom u mišićnim biopsijama. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0022] Opisani su i postupci smanjenja nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno, postupak koji se sastoji od primene na ispitaniku bilo kog obelodanjenog rAAV. Na primer, opisani su postupci smanjenja nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno, a postupak se sastoji od primene na ispitaniku nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0023] Opisani su i postupci povećanja alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika koji obuhvataju primenu bilo kog od obelodanjenih rAAV. Na primer, opisan je postupak povećanja alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika kome je to potrebno, postupak koji se sastoji od primene na ispitaniku nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0024] Takođe su opisani postupci povećanja ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno, uključujući primenu na ispitaniku bilo kog od obelodanjenih rAAV. Na primer, opisani su postupci povećanja ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno, postupak koji se sastoji od primene nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Pored toga, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfasarkoglikan gena u ćeliji ispitanika je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blotu u mišićnim biopsijama. Alternativno, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina imunohistohemijom u mišićnim biopsijama. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfasarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0025] Obelodanjivanje predviđa sastave za lečenje mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav obuhvata bilo koji rAAV koji je ovde obelodanjen, pri čemu je sastav formulisan za primenu sistemskim putem. Konkretno, u bilo kom od sastava, rAAV je AAVrh74.tMCK.hSCGA.

[0026] Bilo koji od obelodanjenih sastava sadrži rAAV u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 5,0 × 10<15>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, rAAV se primenjuje u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 2,0 × 10<15>vg/kg, oko 5 × 10<12>vg/kg do oko 1,0 × 10<15>vg/kg, oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg, oko 2,0 × 10<13>vg/kg do oko 3,0 × 10<14>vg/kg, ili oko 5 × 10<13>vg/kg do oko 2 × 10<14>vg/kg, ili se rAAV primenjuje u dozi od oko 5 × 10<13>vg/kg, oko 6 × 10<13>vg/kg, oko 7 × 10<13>vg/kg, oko 8 × 10<13>vg/kg, oko 9 × 10<13>vg/kg, oko 1 × 10<14>vg/kg, oko 2 × 10<14>vg/kg, oko 3 × 10<14>vg/kg, oko 4 × 10<14>vg/kg ili oko 5 × 10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0027] U drugom otelotvorenju, u bilo kom od obelodanjenih sastava, rAAV je primenjen u dozi od oko 1,85 × 10<13>vg/kg ili oko 7,41 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, rAAV je primenjen u dozi od oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,5 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,6 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg. oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,2 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,4 × 10<13>vg/kg do oko 7,4 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, ili oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0028] Pored toga, bilo koji od obelodanjenih sastava formulisan je za primenu intravenskim putem, kao što su sastavi formulisani za primenu injekcijom, infuzijom ili implantacijom. U nekim otelotvorenjima, obelodanjeni sastavi su formulisani za primenu intravenskim putem kroz perifernu venu ekstremiteta.

[0029] Bilo koji od obelodanjenih sastava je za lečenje mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa, kao što je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tipa 2D (LGMD2D).

[0030] U primernom otelotvorenju, obelodanjivanje predviđa sastave za lečenje ispitanika koji pati od mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa, pri čemu sastav obuhvata dozu rAAV od oko 5×10<13>vg /kg do oko 2×10<14>vg /kg na osnovu super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije, i pri čemu je sastav formulisan za primenu intravenskom infuzijom, i pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 scAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0031] Pored toga, obelodanjivanje daje sastave za lečenje mišićne distrofije ekstremiteta i pojasa kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav obuhvata dozu rAAV od oko 5 × 10<13>vg/kg do oko 2 × 10<14>vg/kg na bazi super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije, a sastav je formulisan za primenu intravenskom infuzijom i pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Na primer, primena sastava povećava nivo ekspresije gena alfa-sarkoglikana u ćeliji ispitanika u poređenju sa nivoom ekspresije gena alfa-sarkoglikana pre primene sastava.

[0032] Pored toga, primena bilo kog od obelodanjenih sastava povećava nivo ekspresije gena alfa-sarkoglikana u ćeliji ispitanika u poređenju sa nivoom ekspresije gena alfa-sarkoglikana pre primene sastava; i/ili pri čemu primena obelodanjenog sastava smanjuje nivo CK u serumu kod ispitanika u poređenju sa nivoom CK u serumu pre primene sastava; i/ili pri čemu se povećava lokomotorna aktivnost i generisanje specifične sile; pri čemu se smanjuje fibroza; pri čemu se povećava otpornost na povredu izazvanu kontrakcijom u mišiću tibialis anterior; i/ili pri čemu primena sastava povećava broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika u poređenju sa brojem alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana pre primene sastava; i/ili pri čemu primena sastava smanjuje fibrozu kod ispitanika u poređenju sa istom pre primene rAAV; i/ili pri čemu sastav smanjuje fibrozu u poređenju sa istom pre primene sastava; ili pri čemu primena sastava povećava specifičnu silu, veličinu prečnika vlakana, i/ili ekscentričnu kontrakciju u mišiću ispitanika u poređenju sa istim pre primene sastava. U nekim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je detektovana merenjem nivoa alfasarkoglikan proteina putem Western blot, i/ili imunohistohemije.

[0033] U drugom aspektu, obelodanjivanje predviđa sastave za ekspresiju alfa-sarkoglikan gena u ćeliji, pri čemu sastav sadrži bilo koji od obelodanjenih rAAV. Na primer, obelodanjivanje pruža sastave za ekspresiju alfa-sarkoglikan gena u ćeliji koja sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Pored toga, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika detektovana je merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blotu u mišićnim biopsijama.

Alternativno, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina imunohistohemijom u mišićnim biopsijama. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektor genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0034] Obelodanjivanje pruža sastave za smanjenje nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno, sastav koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

[0035] U drugom aspektu, obelodanjivanje pruža sastav za povećanje alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika, pri čemu sastav obuhvata bilo koji od obelodanjenih rAAV. Na primer, obelodanjivanje predviđa sastave za povećanje alfasarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika, pri čemu sastav obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

[0036] Obelodanjivanje takođe pruža sastav za povećanje ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav sadrži bilo koji od obelodanjenih rAAV. Na primer, obelodanjivanje pruža sastave za povećanje ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Pored toga, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blotu u mišićnim biopsijama. Alternativno, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina imunohistohemijom u mišićnim biopsijama. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektor genoma po mikrogramu genomske DNK.

1

[0037] Takođe je opisana upotreba bilo kog od opisanih rAAV za pripremu leka za lečenje mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu je lek formulisan za primenu sistemskim putem. Opisana je upotreba AAVrh74.tMCK.hSCGA za pripremu leka za lečenje mišićne distrofije, pri čemu je lek formulisan za primenu sistemskim putem primene.

[0038] U bilo kojoj od ovde opisanih upotreba, lek sadrži rAAV u dozi od oko 1,0

× 10<12>vg/kg do oko 5,0 × 10<15>vg/kg na bazi super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, rAAV se primenjuje u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 2,0 × 10<15>vg/kg, oko 5 × 10<12>vg/kg do oko 1,0 × 10<15>vg/kg, oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg, oko 2,0 × 10<13>vg/kg do oko 3,0 × 10<14>vg/kg, ili oko 5 × 10<13>vg/kg do oko 2 × 10<14>vg/kg, ili se rAAV primenjuje u dozi od oko 5 × 10<13>vg/kg, oko 6 × 10<13>vg/kg, oko 7 × 10<13>vg/kg, oko 8 × 10<13>vg/kg, oko 9 × 10<13>vg/kg, oko 1 × 10<14>vg/kg, oko 2 × 10<14>vg/kg, oko 3 × 10<14>vg/kg, oko 4 × 10<14>vg/kg ili oko 5 × 10<14>vg/kg na bazi super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0039] U bilo kojoj od ovde opisanih upotreba, lek sadrži rAAV u dozi od oko

1,85 × 10<13>vg/kg ili 7,41 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, lek sadrži rAAV u dozi od oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,5 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,6 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg. oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,2 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,4 × 10<13>vg/kg do oko 7,4 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, ili oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0040] Pored toga, u bilo kojoj od opisanih upotreba, lek je formulisan za primenu intravenskim putem. Na primer, u bilo kojoj od opisanih upotreba, lek je formulisan za primenu injekcijom, infuzijom ili implantacijom. U nekim otelotvorenjima, lek je formulisan za primenu intravenskim putem kroz perifernu venu ekstremiteta.

[0041] U bilo kojoj od opisanih upotreba, lek je za lečenje mišićne distrofije ekstremiteta, kao što je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tipa 2D (LGMD2D).

[0042] Opisana je upotreba rAAV za pripremu leka za lečenje mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa, pri čemu je lek formulisan za primenu intravenskom infuzijom i rAAV je u dozi od oko 5×10<13>vg/ kg do oko 2×10<14>vg/ kg na bazi super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije., i pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Na primer, primena leka ispitaniku kome je potrebno dovodi do povećanja ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika u poređenju sa nivoom ekspresije alfa-sarkoglikan gena pre primene rAAV.

[0043] U bilo kojoj od opisanih upotreba, primena leka kod ispitanika kome je to potrebno dovodi do povećanja nivoa ekspresije gena alfa-sarkoglikana u ćeliji ispitanika u poređenju sa nivoom ekspresije gena alfa-sarkoglikana pre primene leka; i/ili primena leka kod ispitanika dovodi do smanjenja nivoa CK u serumu kod ispitanika u poređenju sa nivoom CK u serumu pre primene leka; i/ili pri čemu se povećava lokomotorna aktivnost i generisanje specifične sile; pri čemu je fibroza smanjena; pri čemu je povećana otpornost na povredu izazvanu kontrakcijom u mišiću tibialis anterior; i/ili primena leka ispitaniku dovodi do povećanja broja alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika u poređenju sa brojem alfasarkoglikan pozitivnih vlakana pre primene leka, i/ili primena leka ispitaniku u potrebi dovodi do smanjene fibroze kod ispitanika u poređenju sa istom pre primene leka; i/ili primena leka dovodi do povećanja specifične sile, veličine prečnika vlakana i/ili ekscentrične kontrakcije mišića ispitanika u poređenju sa istim pre primene leka. U nekim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena detektovana je merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina putem Western blot, i/ili imunohistohemije.

[0044] Takođe je opisana upotreba bilo kog obelodanjenog rAAV za pripremu leka za ekspresiju alfa-sarkoglikan gena u ćeliji kod ispitanika kome je to potrebno. Na primer, opisana je upotreba scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta za pripremu leka za ekspresiju alfa-sarkoglikan gena u ćeliji kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4. Pored toga, u bilo kojoj od upotreba, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blotu u mišićnim biopsijama. Alternativno, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina imunohistohemijom u mišićnim biopsijama. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0045] Ovde je opisana upotreba bilo kog od obelodanjenih rAAV za pripremu leka za smanjenje nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno. Na primer, opisana je upotreba scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta za pripremu leka za smanjenje nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4.

[0046] Ovde je opisana upotreba bilo kog od obelodanjenih rAAV za pripremu leka za povećanje alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika. Na primer, opisana je upotreba scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta za pripremu leka za povećanje alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika, pri čemu scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4.

[0047] Ovde je opisano korišćenje bilo kog od obelodanjenih rAAV za pripremu leka za povećanje ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno. Na primer, opisana je upotreba scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta za pripremu leka za povećanje ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4. Pored toga, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika je detektovana merenjem nivoa alfasarkoglikan proteina na Western blotu u mišićnim biopsijama. Alternativno, u bilo kom od postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfasarkoglikan proteina imunohistohemijom u mišićnim biopsijama. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0048] U bilo kom od obelodanjenih postupaka, sastava ili upotreba, ispitanik je ljudski ispitanik starosti od 4 do 15 godina, ili ljudski ispitanik starosti od 25 do 55 godina ili ljudski ispitanik starosti preko 50 godina.

[0049] U bilo kom od obelodanjenih postupaka, sastava ili upotreba, ispitanik je pedijatrijski ispitanik, adolescent ili mladi odrasli ispitanik. Alternativno, ispitanik je sredovečna odrasla osoba ili stariji ispitanik.

[0050] Na primer, u bilo kom od obelodanjenih postupaka, sastava ili primena, ispitanik je ljudski ispitanik starosti 4-15 godina, ima potvrđenu mutaciju alfa-sarkoglikana (SGCA) u

1

oba alela, bio je negativan na AAVrh74 antitela i/ili je imao test hoda na 100 metara >40% ili normalan.

[0051] Opisani su i postupci generisanja rAAV koji se primenjuju u postupku bilo kog od obelodanjenih postupaka, sastava ili primena, postupak koji se sastoji od transfera AAV vektorskog plazmida u ćeliju domaćina, pri čemu AAV vektorski plazmid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 8. Na primer, AAV vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim otelotvorenjima, vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1, 4 ili 8, ili vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, 4 ili 8.

[0052] U bilo kom od opisanih postupaka generisanja rAAV, postupak dalje obuhvata prenos plazmida za pakovanje i/ili virusa pomagača u ćeliju domaćina. Pored toga, u bilo kojoj od opisanih metoda generisanja rAAV, ćelija pakovanja sadrži stabilno integrisani AAV Cap gen i/ili sadrži ćeliju pakovanja koja obuhvata stabilno integrisani AAV rep gen.

[0053] Opisane su i ćelije domaćini koje sadrže AAV vektorski plazmid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1, 4 ili 8. Na primer, ćelija domaćina sadrži AAV vektorski plazmid koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, 4 ili 8.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0054]

Slika 1 prikazuje gensku kasetu scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

Slika 2 prikazuje ekspresiju transgena u studiji povećanja doze nakon sistemskog lečenja sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA. (A) alfa-sarkoglikansko imunofluorescentno bojenje više mišića miševa sistemski (intravenski) tretirano sa 1 × 10<12>vg, 3 × 10<12>vg i 6 × 10<12>vg ( ili 5 × 10<13>vg /kg, 1 × 10<14>vg /kg i 2 × 10<14>vg/kg, respektivno, na osnovu miša od 20 g ) (n=6 po grupi). Mišićna vlakna koja eksprimiraju alfasarkoglikan 12 nedelja nakon tretmana kretala su se u rasponu od 70%-93% u poređenju sa netretiranim kontrolama. (B) Western blot mišića od tretiranih sgca<-/->miševa potvrđuju ekspresiju proteina hSGCA. Skraćenice: TA, tibialis anterior; GAS, gastrocnemius; QD, kvadriceps; TRI, triceps; GLUT, gluteus; PSO, psoas major; DIA, dijafragma; HRT, srce; WT, divlji tip.

Slika 3 prikazuje poboljšanje morfologije mišića pomoću scAAVrh74.tMCK.hSGCA nezavisno od doze kod sgca-/-miševa. (A) Slike hematoksilina i eozina slike različitih mišića iz sgca-/- miševa tretiranih sa 1 × 10<12>vg, 3 × 10<12>vg i 6 × 10<12>vg (ili 5 × 10<13>vg/kg, 1 × 10<14>vg/kg i 2 × 10<14>vg/kg, respektivno, na osnovu miša od 20 g) scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Reprezentativne 20x slike pokazuju dramatično smanjenje centralizovanih jezgara i ukupnu normalizaciju veličine vlakana nezavisno od doze lečenja. (B) Kvantifikacija koja potvrđuje normalizaciju prečnika miofibera različitih mišića u tretiranim grupama u poređenju sa miševima koji su tretirani vehikulumom i kontrolama divljeg tipa (n=6 po grupi). (C) Kvantifikacija centralno lociranih jezgara u mišićima tretiranih miševa u poređenju sa netretiranim miševima i kontrolama divljeg tipa (n=6 po grupi). Skraćenice: TA, tibialis anterior; GAS, gastrocnemius; QD, kvadriceps; TRI, triceps; glut, gluteus; PSO, psoas major; DIA, dijafragma; HRT, srce; WT, divlji tip.

Slika 4 prikazuje smanjenje fibroze kod sgca<-/->miševa tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA. (A) "Picrosirius red" bojenje pokazuje smanjenu fibrozu kod miševa tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA, na šta ukazuje smanjenje taloženja kolagena u poređenju sa sgca<-/->miševima tretiranim sa vehikulumom u različitim mišićima. Prikazane su reprezentativne 20x slike. (B) Kvantifikacija nivoa kolagena u različitim mišićima potvrđuje smanjenje nivoa kolagena u sve tri tretirane grupe u poređenju sa netretiranim miševima i kontrolama divljeg tipa (n=6 po grupi). Skraćenice: PSO, psoas major; DIA, dijafragma; TRI, triceps; GLUT, gluteus.

Slika 5 prikazuje funkcionalne koristi za skeletni mišić nakon lečenja sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA. (A) Nakon 3 meseca lečenja, izvađeni su mišići tibialis anterior (TA) (i levi i desni) kako bi se izmerila specifična sila i otpornost na oštećenja izazvana kontrakcijom (normalizovana na težinu TA). Kvantifikacija specifične sile i ekscentrične kontrakcije povećana je u svim tretiranim grupama (sa minimalnom razlikom između doza) u poređenju sa netretiranim kontrolama (n=6 po grupi). (B) Trake mišića dijafragme su sakupljene za merenje specifične sile. Nakon 12 nedelja lečenja, sila je značajno povećana kod tretiranih miševa u poređenju sa netretiranim sgca<-/->miševima. (C) Nakon 12 nedelja lečenja, uočeno je poboljšanje u ambulaciji i vertikalnoj aktivnosti putem analize otvorenog polja kod tretiranih miševa u poređenju sa netretiranim kontrolama sgca<-/->(n=6 po grupi). (D) Nivoi kreatin kinaze u serumu su

1

smanjeni u svim terapijskim grupama u poređenju sa netretiranim kontrolama sgca<-/->. Podaci su analizirani pomoću jednosmerne ANOVA praćeno Tukeyevom "post hoc" analizom za višestruka poređenja. *= p <0,05, * * = p <0,01, * ** = p <0,001, * * **= p <0,0001 u poređenju sa sgca<-/->miševima koji su tretirani vehikulumom, osim ako nije navedeno. Skraćenice: TA, tibialis anterior; DIA, dijafragma; WT, divlji tip.

Slika 6 pokazuje da nema dokaza o toksičnosti putem hemije krvi nakon tretmana sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Jetreni enzimi (ALT, AST i ALP/K) i nivo glukoze u krvi (GLU) analizirani su na toksičnost (n=6 po grupi). Sve hemijske vrednosti tretiranih miševa bile su u normalnim/zdravim granicama miševa kao što je naznačeno isprekidanim linijama.

Slika 7A prikazuje analizu biodistribucije sistemskog scAAVrh74.tMCK.hSGCA histograma isporuke-distribucije srednjih vg kopija transkripta po mikrogramu DNK dodatih kvantitativnoj lančanoj reakciji polimeraze u različitim tkivima iz sgca<-/->miševa nakon intravenske isporuke scAAVrh74.tMCK.hSGCA pri 3 × 10<12>vg i 6× 10<12>vg (ili 1 × 10<14>vg/kg, odnosno 2×10<14>vg/kg, na bazi miša od 20 g ).

Slika 7B prikazuje Western blot ekspresije alfa-sarkoglikan proteina u jetri WT i sgca-</->miševa tretiranih ili sa vehikulumom (sgca<-/->LR (laktatni ringer)) ili scAArh74.tMCK.hSGCA pri 1,0 ×10<12>vg (Left Western blot) ili 6 × 10<12>vg (Right Western blot). Svaka traka predstavlja nezavisnog miša (M1: miš 1; M2: miš 2; M3: miš 3). Donji panel predstavlja vinkulin koji je korišćen kao kontrola punjenja.

Skraćenice: DIA, dijafragma; TA, tibialis anterior; TRI, triceps.

Slika 8 prikazuje ekspresiju scAAVrh74.tMCK.hSGCA u skeletnom mišiću 12-mesečnih sgca<-/->miševa pomoću imunofluorescentnog bojenja (slika 8A) i Western blot (slika 8B). Grafikon na slici 8C daje procenat pozitivnih mišićnih vlakana kod scAAVrh74.tMCK.hSGCA sgca<-/->miševa. Skraćenice: TA, tibialis anterior; GAS, gastrocnemius; QD, kvadriceps; GLUT, gluteus; TRI, triceps; PSOAS, psoas major, dijafragma; WT, divlji tip, LRS, laktirani Ringerov rastvor

Slika 9 prikazuje histološke rezultate primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA kod 12-mesečnih SGCA<-/->miševa. Slika 9a pokazuje poboljšanu patologiju mišića. Na slici 9b prikazano je smanjenje centralne nukleacije i povećanje prosečne veličine vlakana u mišićima gastrocnemius (GAS) i triceps (TRI). Na slici 9c prikazano je smanjenje nivoa fibroze u poređenju sa netretiranim kontrolama. Skraćenice: TA, tibialis anterior; GAS, gastrocnemius; QD, kvadriceps; GLUT, gluteus; PSO, psoas major; TRI, triceps; DIA, dijafragma; WT, divlji tip.

1

Slika 10 prikazuje funkcionalno poboljšanje kod starog miša nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

DETALJAN OPIS

[0055] Ovo obelodanjivanje se zasniva na otkriću da primena rAAV koji sadrži polinukleotid koji eksprimira alfa-sarkoglikan dovodi do smanjenja ili potpunog preokreta mišićne fibroze u životinjskom modelu mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa. Kao što je ovde prikazano u Primerima, primena rAAV opisanog ovde dovela je do preokreta distrofičnih karakteristika, uključujući smanjene nivoe CK, povećanu mišićnu silu, poboljšanu ambulaciju i vertikalnu aktivnost i druge motoričke funkcije.

[0056] Praksa predmetnog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke virologije, mikrobiologije, molekularne biologije i rekombinantne DNK tehnike u okviru struke. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Vidi, npr. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijssen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); Freshney Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, Third Edition); i Ausubel et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience, N.Y.).

Definicije

[0057] Kao što se ovde koristi, oblici jednine "neki", "jedan", i "ovaj" uključuju pozivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „ćeliju“ uključuje više takvih ćelija, a pozivanje na „kulturu“ uključuje pozivanje na jednu ili više kultura i njihove ekvivalente poznate stručnjacima u ovoj oblasti, i tako dalje. Pozivanje na "rekombinantni AAV" uključuje smešu dva ili više rAAV viriona i slično. Svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je uobičajeno shvaćeno za prosečnu stručnost u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada, osim ako nije jasno naznačeno drugačije.

1

[0058] Upotreba termina „ili“ u patentnim zahtevima se koristi za značenje „i/ili“, osim ako nije izričito naznačeno da se odnosi samo na alternative, ili su alternative međusobno isključive, iako obelodanjivanje podržava definiciju koja se odnosi samo na alternative i „i/ili“.

[0059] Tokom ove primene, termin "oko" se koristi da označi da vrednost uključuje statističku eksperimentalnu grešku (standardno odstupanje greške) za uređaj ili postupak koji se koristi za određivanje vrednosti.

[0060] Termin „vektor“ ili „ekspresijski vektor“ treba da bude bilo koji genetski element, kao što su plazmid, fag, transpozon, kosmid, hromozom, virus, virion, itd., koji je sposoban za replikaciju kada je povezan sa odgovarajućim kontrolnim elementima i koji može da prenese genske sekvence između ćelija. U jednom otelotvorenju, vektor je virusni vektor. Vektori ekspresije mogu da sadrže različite kontrolne sekvence, strukturne gene (npr. gene od interesa) i sekvence nukleinskih kiselina koje služe i drugim funkcijama.

[0061] Kao što se ovde koristi, termin "AAV" je standardna skraćenica za adeno-asocirani virus. Adeno-asocirani virus je jednolančani DNK parvovirus koji raste samo u ćelijama u kojima određene funkcije pruža ko-infektivni pomoćni virus. Trenutno postoji trinaest serotipova AAV koji su karakterisani. Opšte informacije i pregledi AAV mogu se naći u, na primer, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol.1, pp.169-228, i Berns, 1990, Virology, pp.1743-1764, Raven Press, (New York). Međutim, u potpunosti se očekuje da će ovi isti principi biti primenljivi na dodatne AAV serotipove jer je dobro poznato da su različiti serotipovi prilično blisko povezani, kako strukturno tako i funkcionalno, čak i na genetskom nivou. (Vidi, na primer, Blacklowe, 1988, pp.165-174 u Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Na primer, svi AAV serotipovi očigledno pokazuju veoma slične replikacione osobine posredovane homolognim rep genima; i svi nose tri srodna kapsidna proteina kao što su oni eksprimirani u AAV2.

Stepen srodnosti dalje se sugeriše heterodupleks analizom koja otkriva ekstenzivnu unakrsnu hibridizaciju između serotipova duž dužine genoma; i prisustvo analognih segmenata samohibridizacije na terminusima koji odgovaraju "sekvencama obrnutog terminalnog ponavljanja" (ITR). Slični obrasci infektivnosti takođe sugerišu da su funkcije replikacije u svakom serotipu pod sličnom regulatornom kontrolom.

1

[0062] Termin "AAV vektor" odnosi se na vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida od interesa (ili transgena) koji su okruženi AAV sekvencama terminalnog ponavljanja (ITR). Takvi AAV vektori se mogu replicirati i upakovati u infektivne virusne čestice kada su prisutni u ćeliji domaćinu koja je transficirana vektorom koji kodira i eksprimira rep i cap genske proizvode. U jednom otelotvorenju, AAV vektor je vektor izveden iz adenoasociranog virusnog serotipa, uključujući, bez ograničenja, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10 i AAV rh74. AAV vektori mogu imati jedan ili više AAV gena divljeg tipa izbrisanih u celini ili delimično, po mogućnosti rep i/ili cap gena, ali zadržavaju funkcionalne bočne ITR sekvence. Funkcionalne ITR sekvence su neophodne za očuvanje tkiva, replikaciju i pakovanje AAV viriona. Dakle, AAV vektor je ovde definisan tako da uključuje najmanje one sekvence koje su potrebne u cis za replikaciju i pakovanje (npr. funkcionalne ITR) virusa. IТR nе mоrајu biti nuklеоtidnе sеkvеncе divlјеg tipа i mоgu sе mеnjаti, npr. insercijom, dеlеciјоm ili supstituciјоm nuklеоtidа, svе dоk sеkvеncе pružајu funkciоnаlnо očuvanje tkiva, rеplikаciјu i pаkоvаnjе.

[0063] Termin "funkcije AAV pomagača" odnosi se na AAV izvedene sekvence kodiranja koje se mogu eksprimirati kako bi se obezbedili AAV genski proizvodi koji, zauzvrat, funkcionišu u trans za produktivnu AAV replikaciju. Dakle, funkcije AAV pomagača obuhvataju glavne AAV otvorene okvire čitanja (ORF), rep i cap. Pokazalo se da proizvodi ekspresije Rep poseduju mnoge funkcije, uključujući, između ostalog: prepoznavanje, vezivanje i uklanjanje AAV porekla replikacije DNK; aktivnost DNK helikaze; i modulaciju transkripcije iz AAV (ili drugih heterolognih) promotera. Proizvodi Cap ekspresije obezbeđuju neophodne funkcije pakovanja. AAV pomoćne funkcije se ovde koriste kao dopuna AAV funkcijama u trans koje nedostaju u AAV vektorima.

[0064] Pod „rekombinantnim virusom“ se podrazumeva virus koji je genetski izmenjen, npr. adicijom ili insercijom sekvence heterologne nukleinske kiseline u virusnu česticu.

[0065] "AAV virion" ili "AAV virusna čestica" ili "AAV vektorska čestica" odnosi se na virusnu česticu koja se sastoji od najmanje jednog AAV kapsidnog proteina i inkapsidiranog polinukleotidnog AAV vektora. AAV virion, u jednom otelotvorenju, obuhvata heterologni polinukleotid (tj. polinukleotid različit od AAV genoma divljeg tipa kao što je transgen koji se isporučuje u ćeliju sisara). Proizvodnja AAV virusnih čestica, u nekim otelotvorenjima,

1

uključuje proizvodnju AAV vektora, jer je takav vektor sadržan u AAV vektorskoj čestici. Ako čestica sadrži heterologni polinukleotid (tj. polinukleotid različit od divljeg tipa AAV genoma kao što je transgen koji se isporučuje u ćeliju sisara), obično se naziva "rAAV vektor" ili jednostavno "rAAV čestica". Dakle, proizvodnja AAV vektorske čestice nužno uključuje proizvodnju rAAV, jer je takav rAAV genom sadržan unutar rAAV vektorske čestice.

[0066] Na primer, AAV virusna čestica divljeg tipa (wt) koja sadrži linearni, jednolančani AAV genom nukleinske kiseline asociran sa AAV kapsidnim proteinskim premazom. AAV virion može biti ili jednolančani (ss) AAV ili samo-komplementarni (SC) AAV. U jednom otelotvorenju, jednolančani molekuli AAV nukleinske kiseline bilo komplementarnih sense, npr. "sense" ili "antisense" lanaca, mogu se upakovati u AAV virion i oba lanca su podjednako infektivna.

[0067] Termin „rekombinantni AAV“ ili „rAAV“ je ovde definisan kao infektivni virus sa defektom replikacije koji se sastoji od AAV proteinskog omotača, koji enkapsidira heterolognu nukleotidnu sekvencu od interesa koja je sa obe strane okružena sa AAV ITR. rAAV, u jednom otelotvorenju, proizveden je u odgovarajućoj ćeliji domaćinu koja ima AAV vektor, AAV pomoćne funkcije i dodatne funkcije uvedene u njih. Na ovaj način, ćelija domaćin je sposobna da kodira AAV polipeptide koji su potrebni za pakovanje AAV vektora (koji sadrži rekombinantnu nukleotidnu sekvencu od interesa) u infektivne rekombinantne čestice viriona za naknadnu isporuku gena.

[0068] Termin „transfekcija“ se odnosi na unos strane DNK od strane ćelije, a ćelija je „transficirana“ kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su dobro poznate u struci. Vidi, npr. Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197. Takve tehnike se mogu koristiti za uvođenje jednog ili više egzogenih delova DNK, kao što su vektor integracije nukleotida i drugi molekuli nukleinske kiseline, u odgovarajuće ćelije domaćina.

2

[0069] Termin „transdukcija“ označava isporuku DNK molekula u ćeliju primaoca bilo in vivo ili in vitro, putem virusnog vektora sa defektom replikacije, kao što je putem rekombinantnog AAV viriona.

[0070] Termin „ćelija domaćin“ označava, na primer, mikroorganizme, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara, koje mogu biti, ili su bile, korišćene kao primaoci AAV pomoćnog konstrukta, AAV vektorskog plazmida, vektora dodatne funkcije ili druge transferne DNK. Termin uključuje potomstvo originalne ćelije koja je transficirana. Dakle, "ćelija domaćin" koja se ovde koristi generalno se odnosi na ćeliju koja je transficirana egzogenom DNK sekvencom. Podrazumeva se da potomstvo jedne roditeljske ćelije ne mora nužno biti potpuno identično u morfologiji ili u genomskom ili ukupnom DNK komplementu kao originalni roditelj, zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije.

[0071] Termin „heterologni“ se odnosi na sekvence nukleinskih kiselina kao što su sekvence kodiranja i kontrolne sekvence, označava sekvence koje obično nisu povezane zajedno i/ili obično nisu asocirane sa određenom ćelijom. Dakle, "heterologni" region konstrukta nukleinske kiseline ili vektora je segment nukleinske kiseline unutar ili vezan za drugi molekul nukleinske kiseline koji se ne nalazi u asocijaciji sa drugim molekulom u prirodi. Na primer, heterologni region konstrukta nukleinske kiseline može uključivati sekvencu kodiranja okruženu sekvencama koje nisu pronađene u asocijaciji sa sekvencom kodiranja u prirodi. Drugi primer heterologne sekvence kodiranja je konstrukt gde se sama sekvenca kodiranja ne nalazi u prirodi (npr. sintetičke sekvence koje imaju kodone različite od izvornog gena). Slično tome, ćelija transformisana konstruktom koji obično nije prisutan u ćeliji smatrala bi se heterolognom za potrebe ovog pronalaska. Alelne varijacije ili prirodni mutacioni događaji ne dovode do heterologne DNK, kao što se ovde koristi.

[0072] "Sekvenca kodiranja" ili sekvenca koja "kodira" određeni protein je sekvenca nukleinske kiseline koja je transkribovana (u slučaju DNK) i translirana (u slučaju iRNK) u polipeptid in vitro ili in vivo kada je stavljena pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice sekvence kodiranja određene su start kodonom na 5' (amino) terminusu i translacionim stop kodonom na 3' (karboksi) terminusu. Sekvenca kodiranja može uključivati, ali nije ograničena na, cDNK iz prokariotske ili eukariotske iRNK, genomske DNK sekvence iz prokariotske ili eukariotske DNK, pa čak i sintetičke DNK sekvence. Sekvenca terminacije transkripcije će obično biti locirana 3' od sekvence kodiranja.

[0073] Sekvenca "nukleinske kiseline" se odnosi na DNK ili RNK sekvencu. Nukleinske kiseline uključuju bazne analoge DNK i RNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na 4-acetilcitozin, 8-hidroksi-N6-metiladenozin, aziridinilcitozin, pseudoizocitozin, 5-(karboksihidroksilmetil)uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetilaminometiluracil, dihidrouracil, inozin, N6-izopenteniladenin, 1-metiladenin, 1-metilpseudouracil, 1-metilgvanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilgvanin, 2-metiladenin, 2-metilgvanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-metiladenin, 7-metilgvanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manozilkveozin, 5'-metoksikarbonilmetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, metilestar uracil-5-oksisirćetne kiseline, uracil-5-oksisirćetna kiselina, oksibutoksozin, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metil estar uracil-5-oksisirćetne kiseline, uracil-5-oksisirćetna kiselina, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, i 2,6-diaminopurin.

[0074] Termin DNK „kontrolne sekvence“ odnosi se kolektivno na sekvence promotera, signale poliadenilacije, sekvence za terminaciju transkripcije, uzvodne regulatorne domene, poreklo replikacije, mesta unosa unutrašnjih ribozoma („IRES“), pojačivače i slično, koji kolektivno obezbeđuju replikaciju, transkripciju i translaciju sekvence kodiranja u ćeliji primaoca. Ne moraju sve ove kontrolne sekvence uvek biti prisutne sve dok se izabrana sekvenca kodiranja može replicirati, transkribovati i prevesti u odgovarajuću ćeliju domaćina.

[0075] Termin „promoter“ se ovde koristi u svom uobičajenom smislu da se odnosi na nukleotidni region koji sadrži regulatornu sekvencu DNK, pri čemu je regulatorna sekvenca izvedena iz gena koji je sposoban da veže RNK polimerazu i inicira transkripciju nizvodne (3'-direkcione) sekvence kodiranja. Promoteri transkripcije mogu uključivati „inducibilne promotere“ (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence operativno povezana sa promoterom indukovana analitom, kofaktorom, regulatornim proteinom, itd.), „represivne promotere“ (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence operativno povezana sa promoterom indukovana analitom, kofaktorom, regulatornim proteinom, itd.) i „konstitutivne promotere“. U jednom otelotvorenju, promoter je promoter specifičan za mišiće, koji uključuje, ali nije ograničen na, element humanog skeletnog aktin gena, element srčanog aktin gena, promoter dezmina, promoter skeletnog alfa-aktina (ASKA), promoter troponina I (TNNI2), element vezivanja miocit-specifičnog pojačivača faktora vezivanja mef, promoter mišićne kreatin kinaze (MCK), promoter skraćene MCK (tMCK), promoter miozinskog teškog lanca (MHC), hibridni promoter pojačivača teškog lanca a-miozina-/MCK pojačivač-promoter (MHCK7), promoter C5-12, element pojačivača mišje kreatin kinaze, element skeletnog brzog troponin c gena, element srčanog sporog troponin c gena, element sporog troponin i gena, element odgovora (HRE) nuklearnog faktora (HIF) indukovanog hipoksijom, element indukovan steroidom i element odgovora glukokortikoida (gre). U drugom otelotvorenju, promoter je MCK promoter, tMCK promoter ili MHCK7 promoter.

[0076] Termin „operativno povezan“ odnosi se na raspored elemenata pri čemu su tako opisane komponente konfigurisane tako da obavljaju svoju uobičajenu funkciju. Dakle, kontrolne sekvence operativno povezane sa sekvencom kodiranja mogu da utiču na ekspresiju sekvence kodiranja. Kontrolne sekvence ne moraju biti susedne sa sekvencom kodiranja, sve dok funkcionišu tako da usmeravaju njenu ekspresiju. Tako, na primer, intervenišuće netranslirane, ali transkribovane sekvence mogu biti prisutne između sekvence promotera i sekvence kodiranja, a sekvenca promotera se i dalje može smatrati "operativno povezanom" sa sekvencom kodiranja.

[0077] Promoter "usmerava transkripciju" sekvence kodiranja u ćeliji kada će RNK polimeraza vezati sekvencu promotera i transkribovati sekvencu kodiranja u mRNK, koja se zatim prevodi u polipeptid kodiran sekvencom kodiranja.

[0078] „Ekspresijska kaseta“ ili „ekspresijski konstrukt“ odnosi se na sklop koji je u stanju da usmeri ekspresiju sekvence ili gena od interesa. Ekspresijska kaseta uključuje kontrolne elemente, kao što je gore opisano, kao što je promoter koji je operativno povezan (tako da usmerava transkripciju) sa sekvencom (sekvencama) ili genom (genima) od interesa, a često uključuje i sekvencu poliadenilacije. U okviru određenih otelotvorenja pronalaska, ovde opisana ekspresijska kaseta može biti sadržana u konstruktu plazmida. Pored komponenti ekspresijske kasete, konstrukt plazmida može uključivati i jedan ili više selektivnih markera, signal koji omogućava da konstrukt plazmida egzistira kao jednolančana DNK, najmanje jedno mesto višestrukog kloniranja i „sisarsko“ poreklo replikacije (npr. SV40 ili adenovirusno poreklo replikacije).

[0079] Pod „izolovan“ kada se govori o nukleotidnoj sekvenci, podrazumeva se da je navedeni molekul prisutan u značajnom odsustvu drugih bioloških makromolekula kao što su

2

druge nukleotidne sekvence, hromatinski materijal itd. Dakle, "izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je u suštini bez drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju predmetni polipeptid; međutim, molekul može uključivati neke dodatne baze ili delove koji ne utiču štetno na osnovne karakteristike sastava.

[0080] U svrhu opisivanja relativnog položaja nukleotidnih sekvenci u određenom molekulu nukleinske kiseline tokom trenutne primene, kao što je slučaj kada je određena nukleotidna sekvenca opisana kao da se nalazi "uzvodno", "nizvodno", "3" ili "5" u odnosu na drugu sekvencu, treba razumeti da se radi o položaju sekvenci u "sens" (matričnom) ili "kodirajućem" lancu DNK molekula koji se naziva kako je uobičajeno u struci.

[0081] Termini „identičnost sekvence“, „ procentna identičnost sekvence“ ili „procenat identičan“ u kontekstu sekvenci nukleinske kiseline ili aminokiseline odnose se na rezidue u dve sekvence koje su iste kada su poravnate za maksimalnu korespondenciju. Dužina poređenja identičnosti sekvence može biti preko cele dužine genoma, poželjna je puna dužina sekvence kodiranja gena ili fragment od najmanje oko 500 do 5000 nukleotida. Međutim, takođe može biti poželjna identičnost između manjih fragmenata, npr. najmanje oko devet nukleotida, obično najmanje oko 20 do 24 nukleotida, najmanje oko 28 do 32 nukleotida, najmanje oko 36 ili više nukleotida. Procentualna identičnost sekvenci može se odrediti tehnikama poznatim u struci. Na primer, homologija se može odrediti direktnim poređenjem informacija o sekvenci između dva polipeptidna molekula poravnanjem informacija o sekvenci i korišćenjem lako dostupnih računarskih programa kao što su ALIGN, ClustalW2 i BLAST. U jednom otelotvorenju, kada se BLAST koristi kao alat za poravnanje, sledeći podrazumevani parametri: genetski kod=standard; filter=nijedan; lanac=oba; granična vrednost=60; očekivati=10; Matrica= BLOSUM62; Opisi=50 sekvenci; sortirati po=VISOKOM REZULTATU; Baze podataka= ne-redundantna, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+ Spupdate PTR.

[0082] Termin "ispitanik" se odnosi na bilo kog člana životinjskog carstva, koji uključuje, bez ograničenja, ljude i ne-humane primate kao što su šimpanze i druge vrste majmuna; domaće životinje kao što su goveda, ovce, svinje, koze i konji; domaće sisare kao što su psi i mačke; laboratorijske životinje uključujući glodare kao što su miševi, pacovi i zamorci i slično. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je čovek u rasponu starosti od rođenja do 2 godine, od 1 do 10 godina, ili u rasponu od 4 do 15 godina, ili u rasponu od 10 do 19 godina, ili od 20 do 40 godina, ili od 15 do 29 godina ili od 25-55 godina, ili u rasponu od 40 do 60 godina, ili preko 50 godina ili preko 60 godina ili preko 65 godina ili preko 70 godina. Na primer, ispitanik je dete čoveka (2 do 12 godina), adolescent (10 do 19 godina). U nekim otelotvorenjima, ispitanik je odrasla osoba (18 godina ili starija). Konkretno, ispitanik je mladi odrasli čovek (15 do 29 godina), sredovečni odrasli čovek (25 do 55 godina) ili stariji odrasli čovek (preko 50 godina) ili stariji ispitanik (preko 65 godina) ili gerijatrijski ispitanik (preko 70 godina).

[0083] Pod "terapijskim efektom" se podrazumeva svaka terapijska korist koja se ostvaruje lečenjem opisanim u ovom dokumentu. Na primer, takav efekat može biti održiva ekspresija, u odgovarajućem ciljnom tkivu, proteina ili enzima koji je deficitaran ili nedostaje u mišićnoj distrofiji od interesa. Pored toga, terapijski efekat može biti bilo kakvo smanjenje ili eliminacija jedne ili više kliničkih ili subkliničkih manifestacija bolesti ili poremećaja od interesa. Na primer, smanjenje nivoa CK, smanjenje fibroze je redukovano; povećanje otpornosti na povrede izazvane kontrakcijom u mišiću anterior tibialis; i/povećana specifična sila u mišiću, i poboljšana motorička funkcija pružaju terapijsku korist ispitaniku lečenom sa LGMD-2D.

[0084] Ovde opisani rekombinantni AAV vektor obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja kodira alfa-sarkoglikan, koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, ili protein zadržava aktivnost αsarkoglikana. U drugom otelotvorenju, alfa-sarkoglikan se sastoji od polipeptidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 2.

[0085] Ovde opisan je rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence koja kodira funkcionalni alfa-sarkoglikan koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje pod strogim uslovima sa sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1, ili njenim komplementom. U drugom otelotvorenju, rAAV se sastoji od nukleotidne sekvence sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 4. U drugom otelotvorenju, rAAV se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 4.

2

[0086] Termin "strog" se koristi da uputi na uslove koji se obično podrazumevaju u struci kao strogi. Strogost hibridizacije je uglavnom određena temperaturom, jonskom jačinom i koncentracijom denaturacionih agenasa kao što je formamid. Primeri strogih uslova za hibridizaciju i pranje su 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat na 65-68°C ili 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015M natrijum citrat i 50% formamid na 42°C.

Pogledajte Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y.1989). Mogu se koristiti i stroži uslovi (kao što su viša temperatura, niža jonska jačina, viši formamid ili drugo sredstvo za denaturaciju), međutim, to će uticati na brzinu hibridizacije. U slučajevima kada je u pitanju hibridizacija deoksioligonukleotida, dodatni primerni strogi uslovi hibridizacije uključuju pranje u 6x SSC 0,05% natrijum pirofosfata na 37°C (za 14-bazne oligonukleotide), 48°C (za 17-bazne oligonukleotide), 55°C (za 20-bazne oligonukleotide) i 60°C (za 23-bazne oligonukleotide).

[0087] Kada se opsezi ovde koriste za fizička svojstva, kao što su molekulska težina, koncentracija ili doza, u njih treba da budu uključene sve kombinacije i podkombinacije opsega i specifična otelotvorenja. Termin "oko", kada se odnosi na broj ili numerički opseg, znači da je broj ili numerički opseg na koji se odnosi aproksimacija u okviru eksperimentalne varijabilnosti (ili u okviru statističke eksperimentalne greške), pa stoga broj ili numerički opseg mogu varirati od, na primer, između 1% i 15% navedenog broja ili numeričkog opsega.

[0088] Drugi agensi mogu biti uključeni u pufere za hibridizaciju i pranje u svrhu smanjenja nespecifične i/ili pozadinske hibridizacije. Primeri su 0,1% albumin goveđeg seruma, 0,1% polivinil-pirolidon, 0,1% natrijum pirofosfat, 0,1% natrijum dodecilsulfat, NaDodSO4, (SDS), fikol, Denhardt-ov rastvor, DNK sonifikovane sperme lososa (ili druga nekomplementarna DNK) i dekstran sulfat, iako se mogu koristiti i druga pogodna sredstva. Koncentracija i vrste ovih aditiva mogu se menjati bez značajnog uticaja na strogost uslova hibridizacije.

Eksperimenti hibridizacije se obično izvode na pH 6,8-7,4, međutim, u tipičnim uslovima jonske jačine, brzina hibridizacije je skoro nezavisna od pH. Vidi Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch.4, IRL Press Limited (Oxford, England). Uslove hibridizacije može podesiti stručnjak u ovoj oblasti kako bi se prilagodile ove varijable i omogućile DNK različite srodnosti sekvenci da formiraju hibride.

[0089] Mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tipa 2D (LGMD2D) je progresivna mišićna distrofija koja se manifestuje slabošću mišića, respiratornim

2

abnormalnostima i u retkim slučajevima kardiomiopatijom. LGMD2D je uzrokovan mutacijama u genu alfa-sarkoglikana koje dovode do gubitka proteina i istovremenog gubitka kompleksa sarkoglikana i glikoproteina povezanog sa distrofinom. Sgca-null (sgca<-/->) miš rekapitulira klinički fenotip pacijenata sa LGMD2D, uključujući distrofične karakteristike kao što su mišićna nekroza i fibroza, povišena serumska kreatin kinaza (CK) i smanjenje generisanja apsolutne mišićne sile i lokomotorne aktivnosti. Dakle, sgca<-/->miševi pružaju relevantan model za testiranje bezbednosti i efikasnosti zamene gena. Ovim obelodanjenjem se obezbeđuje samokomplementarni AAVrh74 vektor koji sadrži kodonski optimizovan transgen pune dužine humanog SGCA (hSGCA) koji pokreće mišićno-specifični promoter, skraćena mišićna kreatin kinaza (tMCK). Efikasnost i bezbednost scAAVrh74.tMCK.hSGCA kod sgca<-/->miševa testirana je korišćenjem dizajna povećanja doze za procenu jedne sistemske injekcije od 1× 10<12>, 3 × 10<12>i 6 × 10<12>vg u poređenju sa miševima koji su tretirani vehikulumom i miševima divljeg tipa. Kod sgca<-/->miševa tretman sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA rezultirao je robusnom proteinskom ekspresijom α-SG na membrani sarkoleme u skeletnim mišićima pri svim testiranim dozama. Pored toga, scAAVrh74.tMCK.hSGCA je bio efikasan u poboljšanju histopatologije mišića ekstremiteta i dijafragme sgca<-/->miševa, što je pokazano smanjenjem fibroze i centralne nukleacije i normalizacijom veličine miofibera. Ove molekularne promene bile su istovremene sa značajnim povećanjem generisanja specifične sile u dijafragmi i mišiću anterior tibialis, zaštitom od gubitka ekscentrične sile i smanjenjem serumskog CK. Lokomotorna aktivnost je poboljšana pri svim dozama miševa tretiranih vektorom u poređenju sa sgca<-/->miševima tretiranim vehikulumom. Na kraju, nedostatak toksičnosti povezane sa vektorom detektovan je u panelu za hemiju seruma i grubom nekropsijom. Kolektivno, studija pruža podršku sistemskoj isporuci scAAVrh74.tMCK.hSGCA u kliničkom okruženju za lečenje LGMD2D.

[0090] Ovde opisani rekombinantni AAV vektori mogu biti operativno povezani sa kontrolnim elementom specifičnim za mišić. Na primer, promoter specifičan za mišiće sadrži jedan ili više od sledećeg: element humanog skeletnog aktin gena, element srčanog aktin gena, promoter dezmina, promoter skeletnog alfa-aktina (ASKA), promoter troponina I (TNNI2), element vezivanja miocit-specifičnog pojačivača faktora vezivanja mef, promoter mišićne kreatin kinaze (MCK), promoter skraćene MCK (tMCK), promoter miozinskog teškog lanca (MHC), hibridni promoter pojačivača teškog lanca α-miozina-/MCK pojačivačpromoter (MHCK7), promoter C5-12, element pojačivača mišje kreatin kinaze, element skeletnog brzog troponin c gena, element srčanog sporog troponin c gena, element sporog

2

troponin i gena, element odgovora (HRE) nuklearnog faktora (HIF) indukovanog hipoksijom, element indukovan steroidom i element odgovora glukokortikoida (gre).

[0091] U jednom otelotvorenju, promoter specifičan za mišiće je tMCK promoter, koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 3. Primer rAAV opisanog u ovom dokumentu je AAVrh74.tMCK.hSCGA koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca koja kodira AAVrh74.tMCK.hSCGA sadrži sekvencu od najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% identičnu sa nukleotidnom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 4, ili sa nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 1.

[0092] U drugom otelotvorenju, polinukleotidna sekvenca koja kodira AAVrh74.tMCK.hSCGA obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% identičnu nukleotidnoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidna sekvenca kodira protein koji zadržava aktivnost alfa-sarkoglikana.

[0093] U jednom otelotvorenju, rAAV se sastoji od 5' obrnute terminalne sekvence ponavljanja SEQ ID NO: 5. U drugom otelotvorenju, rAAV sadrži sekvencu 3' obrnutog terminalnog ponavljanja SEQ ID NO: 6. U nekim otelotvorenjima, rAAV sadrži poli A sekvencu SEQ ID NO: 7.

[0094] AAV može biti bilo koji serotip, na primer AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.10, AAV rh.74 ili njihove varijante i derivati. U ovom pronalasku rAAV je serotipa AAVrh.74.

Proizvodnja pseudotipizovanog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 2001/083692.

Razmatrane su i druge vrste rAAV varijanti, na primer rAAV sa kapsidnim mutacijama. Vidi, na primer, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014).

[0095] Razmatrani su i sastavi koji se sastoje od bilo kog ovde opisanog rAAV vektora.

2

[0096] Opisani su postupci lečenja mišićne distrofije kod ljudskog ispitanika kojem je to potrebno, koji se sastoje od koraka primene rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, pri čemu se rAAV primenjuje u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 5,0 × 10<15>vg/kg. Na primer, u bilo kojoj od opisanih metoda, doza primenjenog rAAV je između oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 2,0 × 10<15>vg/kg, oko 5 × 10<12>vg/kg do oko 1,0 × 10<15>vg/kg, oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg, oko 5 × 10<13>vg/kg do oko 2 × 10<14>vg/kg, ili oko 2,0 × 10<13>vg/kg do oko 3,0 × 10<14>vg/kg. U drugom otelotvorenju, doza je oko 5,0 × 10<13>vg/kg, 1,0 × 10<14>vg/kg, ili 2,0 × 10<14>vg/kg. U jednom otelotvorenju, rAAV se primenjuje sistemskim putem, koji se sastoji od intravenskog puta. U drugom otelotvorenju, rAAV se primenjuje intravenski u dozi od oko 5,0 × 10<13>vg/kg, 1,0 × 10<14>vg/kg ili 2,0 × 10<14>vg/kg. U jednom otelotvorenju, mišićna distrofija je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa.

[0097] Pored toga, doza primenjenog rAAV je oko 1,5 × 10<13>vg do oko 3,5 × 10<16>vg, ili 3 × 10<13>vg do 1 × 10<16>vg, ili oko 1,5 × 10<13>vg do oko 2 × 10<15>vg, ili oko 1,5 × 10<13>vg do oko 1 × 10<15>vg. Pored toga, u bilo kom od postupaka, doza rAAV se primenjuje u koncentraciji od oko 10 ml/kg. U jednom otelotvorenju, mišićna distrofija je mišićna distrofija ekstremiteta i pojasa. U jednom otelotvorenju, mišićna distrofija je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tipa 2D. Doze u ovom obelodanjenju, izražene u vg ili vg/kg, zasnivaju se na metodi kvalifikacije titracije pomoću kvantitativnog PCR (qPCR). Metoda titracije zasnovana na qPCR je poznata u struci.

[0098] Opisani su postupci lečenja mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, koji obuhvataju korak primene rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, pri čemu se rAAV primenjuje sistemskim putem primene i u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 2,0 × 10<15>vg/kg; pri čemu je nivo ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika povećan nakon primene rAAV u poređenju sa nivoom ekspresije alfasarkoglikan gena pre primene rAAV; pri čemu je nivo CK u serumu kod ispitanika smanjen nakon primene rAAV u poređenju sa nivoom CK u serumu pre primene rAAV; i/ili pri čemu je povećana lokomotorna aktivnost i generisanje specifične sile; pri čemu je smanjena fibroza; pri čemu je povećana otpornost na povrede izazvane kontrakcijom u mišiću tibialis anterior; i/ili pri čemu je povećan broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika nakon primene rAAV u poređenju sa brojem alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakna pre primene rAAV; pri čemu je veličina prečnika vlakana u mišićnom tkivu ispitanika povećana nakon

2

primene rAAV u poređenju sa brojem prečnika vlakana pre primene rAAV; ili pri čemu je centralna nukleacija u mišićnom tkivu ispitanika smanjena nakon primene rAAV u poređenju sa centralnom nukleacijom pre primene rAAV. Mišićna tkiva uključuju, ali nisu ograničena na triceps, tibialis anterior, soleus, gastrocnemius, biceps, trapezius, gluteus, psoas major, deltoide, kvadriceps i dijafragmu. U jednom otelotvorenju, mišićna tkiva obuhvataju tibialis anterior, gastrocnemius, gluteus, psoas major i triceps. Ekspresija alfa-sarkoglikana određuje se metodama poznatim prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. U jednom otelotvorenju, ekspresija je određena putem Western blot, imunohemije u mišićnim biopsijama i/ili detekcijom broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0099] Opisan je postupak lečenja mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, koji se sastoji od koraka primene rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, pri čemu je motorička funkcija dokazano poboljšana kod navedenog humanog ispitanika u poređenju sa motoričkom funkcijom navedenog humanog ispitanika pre primene rAAV.

[0100] Opisani su postupci povećanja alfa-sarkoglikana kod pacijenta kome je to potrebno, koji se sastoje od primene nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

[0101] U bilo kom od pruženih postupaka, upotreba i sastava za lečenje mišićne distrofije, ispitanik je star 4-15 godina, ima potvrđenu mutaciju alfa-sarkoglikana (SGCA) u oba alela, negativan je na AAVrh74 antitela i/ili je imao >40% ili normalan test hoda na 100 metara. U bilo kom od ponuđenih postupaka, upotreba i sastava za lečenje mišićne distrofije, ispitanik je pedijatrijski ispitanik. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je pedijatrijski ispitanik, kao što je ispitanik starosti od 1 do 21 godine. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je starosti 1 do 10 godina, ili 2 do 12 godina starosti, 4 do 15 godina starosti, ili 10 do 19 godina starosti.

Ispitanik je, u jednom otelotvorenju, adolescentski ispitanik, kao što je ispitanik starosti od 12 do 21 godine. Pored toga, ispitanik je, u jednom otelotvorenju, ispitanik mlađe odrasle dobi, kao što je ispitanik starosti od 15 do 29 godina ili od 18 do 39 godina. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je odrasla osoba srednjih godina ili stariji ispitanik, tako da odrasla osoba srednjih godina može biti u dobi od 25-55 godina, stariji odrasli ispitanik može biti u dobi iznad 50 godina, a stariji ispitanik može biti u dobi iznad 65 godina. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje injekcijom, infuzijom ili implantacijom. Na primer, rAAV se daje infuzijom tokom približno 1 do 2 sata. Pored toga, rAAV se primenjuje intravenskim putem kroz perifernu venu ekstremiteta.

[0102] Opisani su postupci lečenja mišićne distrofije kod humanog ispitanika kome je to potrebno, koji obuhvataju korak primene rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, pri čemu se rAAV primenjuje sistemskim putem primene i u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/ kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg , a rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu sa SEQ ID NO: 1. U drugom otelotvorenju, rAAV sadrži nukleotidnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1. U jednom otelotvorenju, rAAV kodira protein koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 2. U drugom otelotvorenju, rAAV sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji se sastoji od polipeptidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 2. Pored toga, bilo koji od obelodanjenih rAAV obuhvata promoter kao što je tMCK promoterska sekvenca SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, rAAV je serotipa AAVrh.74. Pored toga, rAAV sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 3 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. U jednom otelotvorenju, rAAV sadrži sekvencu 5' obrnutog terminalnog ponavljanja SEQ ID NO: 5. U drugom otelotvorenju, rAAV se sastoji od sekvence 3' obrnutog terminalnog ponavljanja SEQ ID NO: 6. U drugom otelotvorenju, rAAV sadrži poli A sekvencu SEQ ID NO: 7.

[0103] Doziranje AAV može se odrediti putem više metoda, koje uključuju, ali nisu ograničene na LISA, procenu aktivnosti reverzne transkriptaze, FACS, testove transdukcije Northern blotting (npr. polukvantitativni Northern), analizu Dot blot ili PCR (npr., qPCR). Poznato je da se doze AAV mogu odrediti merenjem AAV vektorskih genoma kvantitativnim PCR u realnom vremenu (qPCR). Takve qPCR metode prevazilaze nekonzistetnost ili proizvoljne rezultate iz konvencionalnih testova transdukcije. U jednom otelotvorenju određivanja doze PCR, kao standard kalibracije koristi se plazmidna DNK. Oblici plazmida mogu uticati na rezultate doziranja iz qPCR metoda. U jednom otelotvorenju, kružna ili super namotana DNK ili plazmidi se koriste kao standard kvantifikacije. U drugom otelotvorenju, kao standard kvantifikacije koristi se linearizovana DNK.

1

[0104] Termin „super namotana DNK“ ili „super namotani plazmid“ odnosi se na DNK ili plazmid koji ne sadrži slobodni kraj. Termin „linearizovana DNK“ ili "linearizovani plazmid“ odnosi se na DNK ili plazmid koji sadrži slobodni 5' kraj i slobodni 3' kraj, koji nisu međusobno povezani. U jednom otelotvorenju, linearizovana DNK ili plazmid je dobijen restrikcionim razlaganjem kružne DNK (npr. plazmidne DNK) ili restrikcionim razlaganjem dbDNK. U drugom otelotvorenju, restrikciono razlaganje se vrši pomoću enzima koji generišu najmanje jedan tupi (nekohezivni) kraj.

[0105] Postupci lečenja mišićne distrofije kod humanog ispitanika kome je to potrebno mogu se sastojati od koraka primene rekombinantnog adeno-asociranog virusa (rAAV) scAAVrh74. tMCK7.hSGCA, pri čemu se rAAV primenjuje sistemskim putem primene i u dozi od oko 1,0 × 10<12>vg/ kg do oko 5,0 × 10<14>vg/ kg, pri čemu humani ispitanik pati od mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa. U jednom otelotvorenju, rAAV se primenjuje intravenskom infuzijom tokom približno 1 do 2 sata u dozi od oko 5,0 × 10<13>vg/kg, 1,0 × 10<14>vg/kg ili 2,0 × 10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije, pri čemu rAAV obuhvata scAAVrh74. tMCK7.hSGCA konstrukt nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3. U drugom otelotvorenju, doza je oko 1,85 ×10<13>vg/kg ili 7,41 ×10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0106] Opisan je postupak povećanja ekspresije sarkoglikana u mišićnom tkivu ispitanika, koji se sastoji od primene na ispitaniku scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90% identična, najmanje 95% identična ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1, i/ili 4.

[0107] Opisan je postupak poboljšanja mišićne funkcije ispitanika koji se sastoji od primene na ispitaniku konstrukta koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90% identična, najmanje 95% identična ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1, i/ili 4.

[0108] U nekim aspektima, ispitanik pati od genetske mutacije u genu koji kodira sarkoglikanski protein ili mišićnu distrofiju. U nekim aspektima, ispitanik pati od genetske mutacije u genu koji kodira alfa-sarkoglikanski protein.

[0109] U bilo kom od opisanih postupaka, nivo ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika se povećava nakon primene scAAVrh74.tMCK 7.hSGCA konstrukta u poređenju

2

sa nivoom ekspresije alfa-sarkoglikan gena pre primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0110] Pored toga, u bilo kom od opisanih postupaka, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blot ili imunohistohemijom u biopsiji mišića pre i posle primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0111] U bilo kom od opisanih postupaka, nivo alfa-sarkoglikan proteina je povećan nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Na primer, nivo nivoa alfa-sarkoglikan proteina je povećan za najmanje 33% kao što je detektovano merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blot u biopsiji mišića pre i posle primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta, ili je nivo alfa-sarkoglikan proteina meren imunohistohemijom u biopsijama mišića i/ili detektovanjem broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK pre i posle primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0112] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, nivo CK u serumu kod ispitanika je smanjen nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta u poređenju sa nivoom CK u serumu pre primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0113] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika je povećan nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta u poređenju sa brojem alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana pre primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Na primer, broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana je detektovan merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina putem Western blot ili imunohistohemije na mišićnim biopsijama pre i posle primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Na primer, broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika se povećava nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0114] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, nivo alfa-sarkoglikana u ispitaniku je povećan nakon primene rAAV u poređenju sa nivoom alfa-sarkoglikana pre primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. Nivo alfa-sarkoglikana je detektovan merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina imunohistohemijom ili Western blot na biopsijama mišića pre i posle primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta.

[0115] Opisanu su i postupci ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji pacijenta, koji se sastoje od primene nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. U bilo kom od opisanih postupaka ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji pacijenta, ekspresija alfa-sarkoglikan gena u ćeliji pacijenta je detektovana merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina na Western blot ili imunohistohemijom u biopsijama mišića pre i posle primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukta. U jednom otelotvorenju alfa-sarkoglikan gen je meren kod pacijenta detekcijom više od jedne kopije vektorskog genoma rAAV po jezgru. U drugim otelotvorenjima, ekspresija alfa-sarkoglikan gena je merena kod ispitanika detekcijom broja vektorskog genoma po mikrogramu genomske DNK.

[0116] Opisani su i postupci smanjenja nivoa CK u serumu kod pacijenta kome je to potrebno, postupak koji se sastoji od primene nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA na ispitaniku.

[0117] Opisani su postupci povećanja alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu pacijenta, koji se sastoje od primene nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. U bilo kom od ovih postupaka, broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana je detektovan merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina putem Western blot ili imunohistohemijom na mišićnim biopsijama pre i posle primene rAAV.

[0118] Opisani su i postupci povećanja ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika kome je to potrebno, koji se sastoje od primene nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA. U bilo kom od ovih postupaka, nivo alfa-sarkoglikana je detektovan merenjem nivoa alfa-sarkoglikan proteina putem Western blot ili imunohistohemijom na mišićnim biopsijama pre i posle primene rAAV.

[0119] Opisanu su i postupci proizvodnje rekombinantne AAV vektorske čestice, koji se sastoje od kultivacije ćelije domaćina koja se prenosi sa bilo kojim rekombinantnim AAV vektorom opisanim u ovom dokumentu i oporavka rekombinantnih AAV čestica iz supernatanta transficiranih ćelija. Razmatrane su i virusne čestice koje se sastoje od bilo kog ovde opisanog rekombinantnog AAV vektora. U jednom otelotvorenju, postupak generisanja rAAV se sastoji od prenosa AAV vektorskog plazmida na ćeliju domaćina. U drugom otelotvorenju, rekombinantna AAV vektorska čestica i/ili AAV vektorski plazmid obuhvata

4

nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 81%, oko 82%, oko 83%, oko 84%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, ili oko 89%, tipičnije oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% ili više identična sa SEQ ID NO: 8. Opisana je ćelija domaćin koja se sastoji od AAV vektorskog plazmida koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim otelotvorenjima, AAV vektorski plazmid je stabilno eksprimiran u ćeliji domaćinu. Ćelija domaćin koja stabilno sadrži AAV vektorski plazmid može se koristiti za generisanje rAAV. U jednom otelotvorenju, AAV vektorski plazmid je pAAV.tMCK.hSGCA. KAN plazmid (SEQ ID NO: 8).

[0120] Opisani su i postupci smanjenja fibroze kod ispitanika sisara kome je to potrebno. U tom smislu, postupak se sastoji od primene terapeutski efikasne količine AAV vektora opisanog u ovom dokumentu (ili sastava koji sadrži AAV vektor opisan u ovom dokumentu) na ispitanike sisare. U nekim otelotvorenjima, ispitanik sisar pati od mišićne distrofije. U jednom otelotvorenju, mišićna distrofija je LGMD2D. U nekim otelotvorenjima, primena AAV vektora opisanog u ovom dokumentu (ili sastava koji se sastoji od AAV vektora opisanog u ovom dokumentu) smanjuje fibrozu u mišićnom tkivu ispitanika. U jednom otelotvorenju, mišićno tkivo obuhvata psoas major, dijafragmu, triceps i/ili gluteus.

[0121] Termin „mišićna distrofija“ koji se ovde koristi odnosi se na poremećaj u kojem snaga i mišićna masa postepeno opadaju. Neograničavajući primeri bolesti mišićne distrofije mogu uključivati Bekerovu mišićnu distrofiju, tibijalnu mišićnu distrofiju, Dišenovu mišićnu distrofiju, Emery-Dreifuss mišićnu distrofiju, facioskapulohumeralnu mišićnu distrofiju, sarkoglikanopatije, kongenitalnu mišićnu distrofiju kao što je kongenitalna mišićna distrofija usled delimične insuficijencije LAMA2, kongenitalnu mišićnu distrofiju sa nedostatkom merozina, kongenitalnu mišićnu distrofiju tip 1D, Fukujama kongenitalnu mišićnu distrofiju, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 1A, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2B, mišićnu distrofiju ekstremiteta i ramenokarličnog pojasa tip 2C, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2D, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2E, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2F, mišićnu distrofiju ekstremiteta i ramenokarličnog pojasa tip 2G, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2H, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2I, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip 2J, mišićnu distrofiju ekstremiteta i ramenokarličnog pojasa tip 2K, mišićnu distrofiju ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tip IC, rigidna spinalna mišićna distrofija sa buloznom epidermolizom simpleks, okulofaringealna mišićna distrofija, Ulrihova kongenitalna mišićna distrofija i Ulrihova skleroatonična mišićna distrofija. U nekim otelotvorenjima, ispitanik pati od mišićne distrofije ekstremiteta. U nekim otelotvorenjima, ispitanik pati od mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tipa 2D (LGMD2D).

[0122] Termin "fibroza" se odnosi na prekomerno ili neregulisano taloženje komponenti ekstracelularne matrice (ECM) i nenormalne procese reparacije u tkivima nakon povrede, uključujući skeletne mišiće, srčane mišiće, jetru, pluća, bubrege i pankreas. Deponovane komponente ECM uključuju kolagen, npr. kolagen 1, kolagen 2 ili kolagen 3 i fibronektin.

[0123] Ovde opisan je postupak povećanja alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu, veličine prečnika vlakana, ekscentrične kontrakcije u mišiću, mišićne sile i/ili ekspresije alfa-sarkoglikana kod ispitanika sisara, koji se sastoji od primene terapeutski efikasne količine AAV vektora opisanog ovde (ili sastava koji sadrži AAV vektor opisan ovde) kod ispitanika sisara. Ovde je takođe opisan postupak smanjenja fibroze, centralne nukleacije, nivoa CK i/ili taloženja kolagena kod ispitanika, koji se sastoji od primene terapeutski efikasne količine AAV vektora opisanog ovde (ili sastava koji sadrži AAV vektor opisan ovde) kod ispitanika.

[0124] Ispitanik može patiti od mišićne distrofije kao što je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom. U jednom otelotvorenju, mišićna distrofija je LGMD-2D.

[0125] Takođe je opisan postupak lečenja mišićne distrofije kod ispitanika sisara, koji se sastoji od primene terapeutski efikasne količine AAV vektora opisanog u ovom dokumentu (ili sastava koji sadrži AAV vektor opisan u ovom dokumentu) kod ispitanika sisara. U nekim otelotvorenjima, mišićna distrofija je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa.

[0126] RAAV se može primeniti intramuskularnom injekcijom ili intravenskom injekcijom. Pored toga, rAAV se može primeniti sistemski, kao što je parentelarna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.

[0127] Sastav pronalaska može se formulisati za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Pored toga, sastavi pronalaska su formulisani za sistemsku primenu, kao što je parenteralna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom.

[0128] Pored toga, bilo koji od sastava formulisanih za primenu na ispitaniku koji pati od mišićne distrofije (kao što je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom). U nekim otelotvorenjima, sastav može dalje da sadrži drugi rekombinantni AAV vektor koji eksprimira alfa-sarkoglikan ili drugi rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence navedene u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 4.

[0129] U bilo kojoj od ovde opisanih upotreba, lek je formulisan za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Pored toga, u bilo kojoj od ovde opisanih upotreba, lek je formulisan za sistemsku primenu, kao što je parenteralna primena injekcijom, infuzijom ili implantacijom. Pored toga, bilo koji od lekova može biti pripremljen za primenu kod ispitanika koji pati od mišićne distrofije (kao što je mišićna distrofija ekstremiteta i ramenokarličnog pojasa ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom). U nekim otelotvorenjima, sastav može dalje da sadrži drugi rekombinantni AAV vektor koji eksprimira alfa-sarkoglikan ili drugi rekombinantni AAV vektor koji se sastoji od polinukleotidne sekvence u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 4.

AAV

[0130] Rekombinantni AAV genomi opisani u ovom dokumentu obuhvataju molekul nukleinske kiseline opisan u ovom dokumentu i jedan ili više AAV ITR koji okružuju molekul nukleinske kiseline. AAV DNK u genomima rAAV može biti iz bilo kog AAV serotipa za koji rekombinantni virus može biti izveden, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 i AAVrh.74. Proizvodnja pseudotipiziranog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 01/83692. Razmatrane su i druge vrste rAAV varijanti, na primer rAAV sa kapsidnim mutacijama.

[0131] Ovde opisani DNK plazmidi sadrže rAAV genome. DNK plazmidi su transferisani u ćelije dozvoljene za infekciju virusom pomagačem AAV (npr. adenovirusom, adenovirusom sa delecijom E1 sekvenci ili herpes virusom) za nameštanje rAAV genoma u infektivne virusne čestice. Tehnike za proizvodnju rAAV čestica, u kojima se AAV genom treba upakovati, rep i cap geni, i funkcije virusa pomagača obezbeđene ćeliji su standard u struci. Proizvodnja rAAV zahteva da su sledeće komponente prisutne unutar jedne ćelije (ovde označene kao ćelija pakovanja): rAAV genom, AAV rep i Cap geni odvojeni od (tj. ne u) rAAV genoma i funkcije virusa pomagača. AAV rep i CAP geni mogu biti iz bilo kog AAV serotipa za koji se rekombinantni virus može izvesti i mogu biti iz drugačijeg AAV serotipa od rAAV genoma ITR, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10 i AAV rh.74. Proizvodnja pseudotipizovanog rAAV je obelodanjena u, na primer, WO 2001/083692.

[0132] Postupak generisanja ćelije pakovanja je stvaranje ćelijske linije koja stabilno eksprimira sve neophodne komponente za proizvodnju AAV čestica. Na primer, plazmid (ili višestruki plazmidi) koji sadrži rAAV genom bez AAV rep i Cap gena, AAV rep i Cap gene odvojene od rAAV genoma, i selektabilni marker, kao što je gen otpornosti na neomicin, integrisani su u genom ćelije. AAV genomi su uvedeni u bakterijske plazmide procedurama kao što su GC ’tailing’ (izobličenje na kraju signala) (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), adicija sintetičkih linkera koji sadrže restrikciona mesta za cepanje endonukleaze (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65 -73) ili direktnom, ligacijom sa tupim krajem (Senapathy& Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 4661-4666). Ćelijska linija pakovanja je zatim inficirana virusom pomagača kao što je adenovirus. Prednosti ovog postupka su da su ćelije selektabilne i pogodne su za veliku proizvodnju rAAV. Drugi primeri pogodnih postupaka koriste adenovirus ili bakulovirus umesto plazmida za uvođenje rAAV genoma i/ili rep i cap gena u ćelije pakovanja.

[0133] Pregled opštih principa proizvodnje rAAV dat je u, na primer, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; i Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Različiti pristupi opisani su u Ratschin et al., Mol. Cell. Biol.4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol.5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); i Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); U.S. Patent No.5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajući U.S. Patent No.5,658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO

97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; U.S. Patent. No.5,786,211; U.S. Patent No.5,871,982; i U.S. Patent. No.

6,258,595.

[0134] Ovde su opisane ćelije za pakovanje koje proizvode infektivni rAAV. U jednom otelotvorenju ćelije pakovanja mogu biti stabilno transformisane ćelije raka kao što su HeLa ćelije, 293 ćelije i PerC.6 ćelije (srodna linija 293). Ćelije pakovanja mogu biti ćelije koje nisu transformisane ćelije raka, kao što su 293 ćelije niske pasaže (bubrežne ćelije humanog fetusa transformisane sa E1 adenovirusa), MRC-5 ćelije (humani fetalni fibroblasti), WI-38 ćelije (humani fetalni fibroblasti), Vero ćelije (ćelije majmunskog bubrega) i FRhL-2 ćelije (ćelije pluća rezus fetusa).

[0135] Rekombinantni AAV (tj. infektivne enkapsidirane rAAV čestice) obuhvataju rAAV genom. Otelotvorenja uključuju, ali nisu ograničena na, rAAV nazvan pAAV.tMCK.hSCGA koji sadrži polinukleotidnu sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 3.

[0136] RAAV se može prečišćavati postupcima koji su standardni u struci, kao što su kolonska hromatografija ili gradijenti cezijum hlorida. Postupci za prečišćavanje rAAV vektora iz virusa pomagača poznate su u struci i uključuju postupke obelodanjene u, na primer, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69427-443 (2002); U.S. Patent No.6,566,118 i WO 98/09657.

[0137] U drugom otelotvorenju, pronalazak razmatra sastave koji sadrže ovde opisani rAAV. Ovde opisani sastavi sadrže rAAV u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Sastavi mogu da sadrže i druge sastojke kao što su razblaživači i adjuvansi. Prihvatljivi nosači, razblaživači i adjuvansi nisu toksični za primaoce i poželjno su inertni u primenjenim dozama i koncentracijama, a uključuju pufere kao što su fosfat, citrat ili druge organske kiseline; antioksidante kao što su askorbinska kiselina; polipeptide niske molekulske mase; proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; protivjone koji formiraju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween, pluronici ili polietilen glikol (PEG).

[0138] Titri rAAV koji će se primenjivati u postupcima opisanim ovde će varirati u zavisnosti, na primer, od određenog rAAV, načina primene, cilja tretmana, pojedinca i tipa ćelije koja se cilja, i mogu se odrediti metodama standardnim u struci. Titri rAAV mogu biti u rasponu od oko 1×10<6>, oko 1×10<7>, oko 1×10<8>, oko 1×10<9>, oko 1×10<10>, oko 1×10<11>, oko 1×10<12>, oko 1×10<13>do oko 1×10<14>ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg) kao što je mereno sa qPCR.

[0139] Razmatrani su postupci transdukcije ciljne ćelije sa rAAV, in vivo ili in vitro. Postupci in vivo obuhvataju korak primene efikasne doze, ili efikasne višestruke doze, sastava koji sadrži rAAV pronalaska opisan u ovom dokumentu, na životinji (uključujući i ljudsko biće) kojoj je to potrebno. Ako se doza daje pre razvoja poremećaja/bolesti, primena je profilaktička. Ako se doza daje nakon razvoja poremećaja/bolesti, primena je terapeutska. U otelotvorenjima pronalaska, efikasna doza je doza koja ublažava (eliminiše ili smanjuje) najmanje jedan simptom povezan sa poremećajem/stanjem bolesti koja se leči, koja usporava ili sprečava napredovanje u poremećaju/stanju bolesti, koja usporava ili sprečava napredovanje poremećaja/stanja bolesti, koja smanjuje obim bolesti, koja rezultira remisijom (delimičnom ili ukupnom) bolesti i/ili koja produžava preživljavanje. Primer bolesti koja je razmatrana za prevenciju ili lečenje ovde opisanim postupcima je mišićna distrofija, kao što je mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa. Dakle, opisana je metoda transdukcije ciljne ćelije sa rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA, koja sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4.

[0140] Opisan je postupak generisanja rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA koji obuhvata transfer AAV vektorskog plazmida u ćeliju domaćina. Postupci transfera DNK u ćeliju domaćina su dobro poznati u struci, koji uključuju, ali nisu ograničeni na transfekciju, infekciju, transformaciju, elektroporaciju i transdukciju. U jednom otelotvorenju, vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 81%, oko 82%, oko 83%, oko 84%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, ili oko 89%, tipičnije oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% ili više identična sa SEQ ID NO: 8. U drugom otelotvorenju, vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90%, 95% ili 99%

4

identična sa SEQ ID NO: 8. U drugom otelotvorenju, vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 8. Opisana je ćelija domaćin koja sadrži AAV vektorski plazmid koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim otelotvorenjima, AAV vektorski plazmid je stabilno eksprimiran u ćeliji domaćinu. Ćelija domaćin koja stabilno sadrži AAV vektorski plazmid može se koristiti za generisanje rAAV. U jednom otelotvorenju, AAV vektorski plazmid je pAAV.tMCK.hSGCA.KAN plazmid.

[0141] U jednom otelotvorenju, vektorski plazmid obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 81%, oko 82%, oko 83%, oko 84%, oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, ili oko 89%, tipičnije oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% ili više identična sa SEQ ID NO: 1, 4 ili 8.

[0142] U jednom otelotvorenju, vektorski plazmid sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 90%, 95% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1, 4 ili 8. U jednom otelotvorenju, vektorski plazmid sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, 4 ili 8. Postupak generisanja rAAV, u jednom otelotvorenju, dalje obuhvata transferisanje plazmida za pakovanje i/ili virusa pomagača u ćeliju domaćina. U plazmidu pakovanja, u nekim otelotvorenjima, sadrži AAV rep i/ili cap gen koji je operativno povezan sa promoterom. Promoter, u jednom otelotvorenju, je promoter transkripcije AAV. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćina je ćelija za pakovanje. U jednom otelotvorenju, ćelija za pakovanje sadrži stabilno integrisani AAV Cap gen. U drugom otelotvorenju, ćelija pakovanja sadrži stabilno integrisani AAV rep gen.

[0143] Kao što se ovde koristi, termin „ćelija domaćin“ se odnosi na ćeliju koja se može koristiti za ekspresiju egzogene DNK sekvence. Neograničavajući primeri ćelije domaćina obuhvataju mikroorganizam, ćeliju kvasca, ćeliju insekta i/ili ćeliju sisara. Ćelija domaćin se može koristiti kao primalac za AAV pomoćni konstrukt, plazmid za pakovanje, AAV vektorski plazmid, vektor dodatne funkcije ili drugu DNK. Termin koji se ovde koristi obuhvata potomstvo originalne ćelije nakon eksprimiranja egzogene DNK sekvence u originalnoj ćeliji domaćina. Neograničavajući primeri ćelija domaćina za proizvodnju AAV uključuju Sf9 ćelije insekata i HEK 293T ćelije. AAV vektorski plazmid se može uvesti u ćelije domaćina, npr. Sf9 ili 293T, infekcijom (virus ili bakulovirus), tranzijentnom transfekcijom pomoću reagenasa (npr. lipozomski, kalcijum fosfat) ili fizičkim sredstvima (npr. elektroporacijom) ili drugim sredstvima poznatim u struci. U drugom otelotvorenju, ćelijske linije domaćina su stabilno integrisane sa rAAV plazmidima u njihove genome.

Takve stabilne ćelijske linije mogu se uspostaviti ugradnjom markera selekcije u vektorski plazmid.

[0144] Ćelija domaćin može biti ćelija za pakovanje za proizvodnju AAV virusnih čestica. Dakle, opisana je ćelija domaćin koja sadrži AAV vektorski plazmid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 90%, 95% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 8. AAV vektorski plazmid može da sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 8. Ćelija domaćina može da sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, 4 ili 8.

[0145] Pronalazak takođe razmatra kombinovane terapije. Kombinacija koja se ovde koristi uključuje i istovremeni tretman ili sekvencijalne tretmane. Posebno su razmatrane kombinacije ovde opisanih metoda sa standardnim medicinskim tretmanima (npr., steroidi, kortikosteroidi i/ili glukokortikoidi, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više: prednizon, prednizolon i deflazakort), kao i kombinacije sa novim terapijama. U tom smislu, kombinacije uključuju primenu na ispitaniku jednog ili više steroida, kortikosteroida i/ili glukokortikoida, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više od: prednizon, prednizolon i deflazakort pre primene rAAV inventivnih metoda na ispitaniku, istovremeno sa primenom rAAV na ispitaniku ili nakon primene rAAV na ispitaniku.

[0146] U srodnim otelotvorenjima kombinovane terapije predviđene pronalaskom, glukokortikoid uključuje, ali nije ograničen na beklometazon, betametazon, budezonid, kortizon, deksametazon, hidrokortizon, metilprednizolon ili triamcinolon.

[0147] Prepoznato je da se može javiti odgovor T-ćelija specifičan za antigen kod ispitanika kome je primenjen rAAV vektor. Ovo je očekivani odgovor između 2-4 nedelje nakon transfera gena. Jedna od mogućih posledica takvih odgovora T-ćelija specifičnih za antigen je klirens transdukovanih ćelija i gubitak ekspresije transgena. Da bi se umanjio imunološki odgovor domaćina na terapiju zasnovanu na rAAV, pre terapije, na primer, dvadeset četiri sata pre procedure terapije, ispitanici mogu započeti sa približno 1 mg/kg/dan profilaktičkog prednizona ili uporedivog glukokortikoida oralno sa maksimalnom dozom od 60 mg/dan. Ako je potrebno, dozvoljena je i intravenska primena uporedivog glukokortikoida u približnoj dozi od 1 mg/kg/dan. Lečenje će trajati oko mesec dana. Protokol smanjivanja prednizona ili uporedivog glukokortikoida može se primeniti na osnovu imunološkog odgovora pojedinačnih ispitanika na transfer gena, procenjenog ELISpot testom, kao i praćenjem funkcije jetre sa GGT.

[0148] Terapijski efikasna količina rAAV vektora je doza rAAV u rasponu od oko 1,0 × 10<12>vg/ kg do oko 2,0 × 10<15>vg/ kg, oko 5 × 10<12>vg /kg do oko 1,0 × 10<15>vg /kg, oko 1,0 × 10<13>vg /kg do oko 5,0 × 10<14>vg /kg, oko 5 × 10<13>vg /kg do oko 2 × 10<14>vg/kg, ili oko 2,0 × 10<13>vg/kg do oko 3,0 × 10<14>vg/kg. U drugom otelotvorenju, doza je oko 5,0 × 10<13>vg/kg, 1,0 × 10<14>vg/kg, ili 2,0 × 10<14>vg/kg. U drugom otelotvorenju, doza je oko 5,0 × 10<13>vg/kg, 1,0 × 10<14>vg/kg, ili 2,0 × 10<14>vg/kg.

[0149] Doze se takođe mogu izraziti u jedinicama virusnih genoma (vg). Titri rAAV mogu biti određeni pomoću supernamotane DNK ili standardom kvantifikacije plazmida ili linearizovanim DNK ili standardom kvantifikacije plazmida. Titar ili doza AAV vektora mogu varirati u zavisnosti od fizičkih oblika plazmida ili DNK kao standarda kvantifikacije. Na primer, vrednost titra ili doze može varirati u zavisnosti od supernamotane standardne metode titriranja qPCR ili linearne standardne metode titriranja qPCR. U jednom otelotvorenju, doza u ovom obelodanjenju zasniva se na supernamotanoj DNK ili plazmidu kao standardu kvantifikacije. U drugom otelotvorenju, doza u ovom obelodanjivanju se zasniva na linearizovanoj DNK ili plazmidu kao standardu kvantifikacije. Stoga, terapijski efikasna količina rAAV vektora može biti doza rAAV u rasponu od oko 1,0 × 10<12>vg/ kg do oko 2,0 × 10<15>vg/ kg, oko 5 × 10<12>vg /kg do oko 1,0 × 10<15>vg /kg, oko 1,0 × 10<13>vg /kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg, oko 5 × 10<13>vg/kg do oko 2 × 10<14>vg/kg, ili oko 2,0 × 10<13>vg/kg do oko 3,0 × 10<14>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. U drugom otelotvorenju, doza je oko 5,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,0 × 10<14>vg/kg, ili oko 2,0 × 10<14>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. U drugom otelotvorenju, doza je 5,0 × 10<13>vg/kg, 1,0 × 10<14>vg/kg, ili 2,0 × 10<14>vg/kg na osnovu supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0150] U drugom otelotvorenju, terapeutski efikasna količina rAAV vektora je doza rAAV u rasponu od oko 1,0 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg /kg, oko 1,5 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,6 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg. oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg, oko 1,2 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5 × 10<13>vg/kg, oko 1,4 × 10<13>vg/kg do oko 7,4 × 10<13>vg/kg, oko 1,9 × 10<13>vg/kg do oko 7,5

4

× 10<13>vg/kg, ili oko 1,8 × 10<13>vg/kg do oko 8,0 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Na primer, terapijski efikasna količina rAAV vektora je doza od oko 1,85 × 10<13>vg/kg ili 7,41 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0151] U jednom otelotvorenju, doza od 5,0 × 10<13>vg/kg bazirana na super namotanoj DNK ili plazmidu kao standardu kvantifikacije je ekvivalentna dozi od 1,85 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. U drugom otelotvorenju, doza od 2,0 × 10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida je ekvivalentna 7,41 × 10<13>vg/kg na osnovu linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Stoga, u drugom otelotvorenju, doza je oko 1,85 × 10<13>vg/kg ili 7,41 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

[0152] Primena efikasne doze sastava može biti putem standardnih puteva u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intramuskularne, parenteralne, intravenske, oralne, bukalne, nazalne, pulmonalne, intrakranijalne, intraosealne, intraokularne, rektalne ili vaginalne. Put(eve) primene i serotip(e) AAV komponenti rAAV (posebno, AAV ITR i kapsidni protein) opisane u ovom dokumentu mogu izabrati i/ili upariti stručnjaci u ovoj oblasti uzimajući u obzir infekciju i/ili stanje bolesti koje se leči i ciljne ćelije/tkiva koji treba da eksprimiraju α-sarkoglikan.

[0153] Pronalazak pruža lokalnu primenu i sistemsku primenu efikasne doze rAAV i sastava pronalaska. Na primer, sistemska primena je primena u cirkulacioni sistem tako da se utiče na celo telo. Sistemska primena uključuje enteralnu primenu kao što je apsorpcija kroz gastrointestinalni trakt i parenteralnu primenu putem injekcije, infuzije ili implantacije.

[0154] Konkretno, aktuelna primena rAAV opisana u ovom dokumentu može se postići korišćenjem bilo koje fizičke metode koja će transportovati rAAV rekombinantni vektor u ciljno tkivo životinje. Primena prema pronalasku uključuje, ali nije ograničena na, ubrizgavanje u mišić, krvotok i/ili direktno u jetru. Jednostavno resuspendovanje rAAV u fosfatnom puferisanom fiziološkom rastvoru je dokazano dovoljno da obezbedi vehikulum koristan za ekspresiju mišićnog tkiva, i ne postoje poznata ograničenja za nosače ili druge komponente koje se mogu primeniti istovremeno sa rAAV (mada sastave koji razgrađuju DNK treba izbegavati na normalan način sa rAAV). Kapsidni proteini rAAV mogu biti modifikovani tako da je rAAV usmeren na određeno ciljano tkivo od interesa, kao što je mišić. Vidi, na primer, WO 02/053703.

[0155] Farmaceutski sastavi se mogu pripremiti kao injekcione formulacije ili kao topikalne formulacije koje se isporučuju mišićima transdermalnim transportom. Brojne formulacije za intramuskularno ubrizgavanje i za transdermalni transport su prethodno razvijene i mogu se koristiti u praksi pronalaska. RAAV se može koristiti sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem radi lakše primene i rukovanja. Dakle, u drugom aspektu, primena je usmerena na formulaciju koja sadrži rAAV koji sadrži kapsid izveden iz AAVrh74, puferski agens, agens jonske jačine i površinski aktivno sredstvo. U jednom otelotvorenju, rAAV je u koncentraciji od oko 1,0 × 10<12>vg/kg do oko 5,0 × 10<14>vg/kg. U drugom otelotvorenju, rAAV je u koncentraciji od oko 5,0 × 10<12>vg/kg do oko 1,0 × 10<14>vg/kg. U drugom otelotvorenju, rAAV je u koncentraciji od oko 5 × 10<13>vg/kg, oko 1 × 10<14>vg/kg, i/ili oko 2 × 10<14>vg/kg. U jednom otelotvorenju, doza je bazirana na supernamotanoj DNK ili plazmidu kao standardu kvantifikacije. U jednom otelotvorenju, rAAV je scAAVrh74. tMCK.hSGCA vektor. U jednom otelotvorenju, puferski agens sadrži jedan ili više iz grupe koju čine tris, tricin, bistricin, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES i CAPS. U drugom otelotvorenju, puferski agens sadrži tris sa pH 8,0 u koncentraciji od oko 5 mM do oko 40 mM. U jednom otelotvorenju, puferski agens sadrži tris sa pH 8,0 na oko 20 mM. U jednom otelotvorenju, agens jonske jačine sadrži jedan od više iz grupe koju čine kalijum hlorid (KCl), kalijum acetat, kalijum sulfat, amonijum sulfat, amonijumhlorid (NH4Cl), amonijum acetat, magnezijum hlorid (MgCl2), magnezijum acetat, magnezijum sulfat, mangan hlorid (MnCl2), mangan acetat, mangan sulfat, natrijum hlorid (NaCl), natrijum acetat, litijum hlorid (LiCl) i litijum acetat. U jednom otelotvorenju, agens jonske jačine sadrži MgCl2u koncentraciji od oko 0,2 mM do oko 4 mM. U drugom otelotvorenju, agens jonske jačine sadrži NaCl u koncentraciji od oko 50 mM do oko 500 mM. U drugom otelotvorenju, agens jonske jačine sadrži MgCl2u koncentraciji od oko 0,2 mM do oko 4 mM i NaCl u koncentraciji od oko 50 mM do oko 500 mM. U drugom otelotvorenju, agens jonske jačine sadrži MgCl2u koncentraciji od oko 1 mM i NaCl u koncentraciji od oko 200 mM. U jednom otelotvorenju, surfaktant se sastoji od jednog ili više iz grupe koju čine sulfonat, sulfat, fosfonat, fosfat, poloksamer i katjonski surfaktant. U jednom otelotvorenju, poloksamer sadrži jedan ili više iz grupe koju čine poloksamer 124, poloksamer 181, poloksamer 184, poloksamer 188, poloksamer 237, poloksamer 331, poloksamer 338 i poloksamer 407. U jednom otelotvorenju, površinski aktivno sredstvo sadrži poloksamer u koncentraciji od oko 0,00001% do oko 1%. U drugom

4

otelotvorenju, surfaktant sadrži poloksamer 188 u koncentraciji od oko 0,001%. Za potrebe intramuskularne injekcije, mogu se koristiti rastvori u adjuvantu kao što je ulje susama ili kikirikija ili u vodenom rastvoru propilen glikol, kao i sterilni vodeni rastvori. Takvi vodeni rastvori mogu biti puferovani, po želji, a tečni razblaživač je prvo postao izotoničan sa fiziološkim rastvorom ili glukozom. Rastvori rAAV kao slobodne kiseline (DNK sadrži kisele fosfatne grupe) ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi koja je odgovarajuće pomešana sa surfaktantom kao što je hidrokspropilceluloza. Disperzija rAAV se takođe može pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama. S tim u vezi, sterilni vodeni mediji koji se koriste lako se mogu dobiti standardnim tehnikama koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

[0156] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstempornu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti fluid u meri u kojoj postoji laka sposobnost špricanja. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora se čuvati od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol i slično), njihove pogodne smeše i biljna ulja. Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom površinski aktivnih materija. Prevenciju delovanja mikroorganizama mogu da izazovu različiti antibakterijski i antifungalni agensi, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerozal i slično. U mnogim slučajevima, biće razumno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Dugotrajna apsorpcija sastava koji se ubrizgavaju može se postići upotrebom agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostarata i želatina.

[0157] Sterilni rastvori za ubrizgavanje su pripremani inkorporiranjem rAAV u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim gore nabrojanim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtera. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporiranjem sterilizovanog aktivnog sastojka u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prašaka za pripremu sterilnih rastvora za ubrizgavanje, poželjni načini pripreme su vakuumsko

4

sušenje i sušenje zamrzavanjem koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0158] Transdukcija sa rAAV se takođe može izvršiti in vitro. U jednom otelotvorenju, željene ciljne mišićne ćelije su uklonjene iz ispitanika, transdukovane sa rAAV i ponovo uvedene u ispitanika. Alternativno, singene ili ksenogene mišićne ćelije se mogu koristiti tamo gde te ćelije neće generisati neprikladan imuni odgovor kod ispitanika.

[0159] Pogodne metode za transdukciju i ponovno uvođenje transdukovanih ćelija u ispitanika poznate su u struci. U jednom otelotvorenju, ćelije se mogu transdukovati in vitro kombinovanjem rAAV sa mišićnim ćelijama, npr. u odgovarajućim medijima, i skriningom za one ćelije koje sadrže DNK od interesa koristeći konvencionalne tehnike kao što su Southern blots i/ili PCR, ili korišćenjem selektabilnih markera. Transdukovane ćelije se zatim mogu formulisati u farmaceutske sastave, a sastav uveden u ispitanika različitim tehnikama, kao što je intramuskularna, intravenska, subkutana i intraperitonealna injekcija, ili injekcijom u glatki i srčani mišić, korišćenjem, na primer, katetera.

[0160] Transdukcija ćelija sa ovde opisanim rAAV rezultira održivom ekspresijom αsarkoglikana. Opisani su postupci primene/isporuke rAAV koji eksprimira alfa-sarkoglikan sisarskom ispitaniku, poželjno ljudskom biću. Ovi postupci uključuju transdukciju tkiva (uključujući, ali ne ograničavajući se na, tkiva kao što su mišići, organi kao što su jetra i mozak, i žlezde kao što su pljuvačne žlezde) sa jednim ili više rAAV opisanih u ovom dokumentu. Transdukcija se može vršiti sa genskim kasetama koje sadrže kontrolne elemente specifične za tkivo. Na primer, opisani su postupci transdukcije mišićnih ćelija i mišićnih tkiva usmerene od strane kontrolnih elemenata specifičnih za mišiće, uključujući, ali ne ograničavajući se na, one izvedene iz porodica gena aktina i miozina, kao što su iz porodice gena myoD [Videti Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], faktor vezivanja pojačivača specifičnog za miocite MEF-2 [Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], kontrolni elementi izvedeni iz humanog skeletnog aktin gena [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], srčani aktin gen, elementi sekvence mišićne kreatin kinaze [Vidi Johnson et al., Mol Cell Biol, 9: 3393-3399 (1989)] i element pojačivača mišje kreatin kinaze (mCK), kontrolni elementi izvedeni iz skeletnog brzog troponin C gena, srčani spori troponin C gen i spori troponin I gen: nuklearni faktori indukovani hipoksijom (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementi indukovani steroidima i

4

promoteri uključujući element glukokortikoidnog odgovora (GRE) (Vidi Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)) i drugi kontrolni elementi.

[0161] Mišićno tkivo je atraktivna meta za isporuku DNK in vivo, jer nije vitalni organ i lako je dostupan. Pronalazak razmatra kontinuiranu ekspresiju miRNK iz transdukovanih miofibera.

[0162] Pod "mišićna ćelija" ili "mišićno tkivo" podrazumeva se ćelija ili grupa ćelija izvedenih iz mišića bilo koje vrste (na primer, skeletni mišić i glatki mišić, npr. iz digestivnog trakta, mokraćne bešike, krvnih sudova ili srčanog tkiva). Takve mišićne ćelije mogu biti diferencirane ili nediferencirane, kao što su mioblasti, miociti, miotube, kardiomiociti i kardiomioblasti.

[0163] Termin „transdukcija“ se koristi za primenu/isporuku polinukleotida od interesa (npr. polinukleotidne sekvence koja kodira α-sarkoglikan) u ćeliju primaoca bilo in

vivo ili in vitro, putem opisanog rAAV sa nedostatkom replikacije koji rezultira ekspresijom alfa-sarkoglikana od strane ćelije primaoca.

[0164] Stoga su ovde opisani i postupci primene efikasne doze (ili doza, primenjenih u suštini istovremeno ili doza datih u intervalima) rAAV koji kodira alfa-sarkoglikan sisarskom ispitaniku kome je to potrebno.

[0165] U slučaju konflikta, predmetna primena, uključujući sve definicije u ovom dokumentu, imaće kontrolu. Opisani numerički opsezi uključuju svaku celobrojnu vrednost unutar svakog opsega i uključuju najniže i najviše navedene cele brojeve. Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji ne ograničavaju obim pronalaska opisan u patentnim zahtevima.

PRIMERI

[0166] Prekliničke studije koje koriste AAVrh74.tMCK.hSCGA opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2013/078316 i U.S. Patent br.9,434,928 i 10,105,453.

4

Primer 1

Materijali i metode

Životinjski modeli

[0167] Sve procedure je odobrio Istraživački institut pri Komitetu za institucionalnu negu i upotrebu životinja Nacionalne dečje bolnice. Nokaut (sgca<-/->) miševi su uzgajani i održavani kao homozigotne životinje pod standardizovanim uslovima u jezgru životinjskih resursa u Istraživačkom institutu u Nacionalnoj dečjoj bolnici. Miševi su održavani na 'Teklad Global Rodent' dijeti (3,8% vlakana, 18,8% proteina, 5% masti) sa 12:12-časovnim ciklusom mrak:svetlo. Sve životinje su bile smeštene u standardne kaveze za miševe sa hranom i vodom ad libitum.

Genotipizacija

[0168] DNK genotipizacija je korišćena za identifikaciju sgca<-/->miševa. DNK iz isečaka repa je izolovana i analizirana pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) korišćenjem OneTaq DNK polimeraze (New England Biolabs, Ipswich, MA). U PCR analizi korišćen je niz prajmera za određivanje α-SG nokaut statusa. Korišćeni su sledeći prajmeri i uslovi: Intron1 (CAGGGCTGGGGTTCTG; SEQ ID NO: 9); mutirani prajmer-intron 3 (CCCAGGGCCTTGATGCCT; SEQ ID NO: 10); i NEOTR (GCTATCAGGACATAGCGTTGCTA; SEQ ID NO: 11). Reakcije su izvedene na genomskoj DNK tokom 30 ciklusa pod sledećim uslovima: 94°C, 5 min; 94°C, 1 min; 64°C, 1 min; 72°C, 2,5 min; i 72°C, 7 min.

α-SG gen konstrukt

[0169] ScAAVrh74.tMCK.hSGCA transgen kaseta je napravljena korišćenjem vektorskog DNK plazmida pAAV.tMCK.aSG-neo adeno-asociranog virusa (AAV), insercijom tMCK ekspresijske kasete koja pokreće kodon-optimizovanu humanu α-SG cDNK sekvencu (humana cDNK, Genbank Accession # U08895) u samokomplementarnu vektorsku okosnicu pHpa7. Jedine virusne sekvence uključene u ovaj vektor bile su obrnuta terminalna ponavljanja AAV2, koja su potrebna i za replikaciju virusne DNK i za pakovanje rAAV vektorskog genoma. Jedno od obrnutih terminalnih ponavljanja (ITR) ima ciljanu deleciju mesta terminalne rezolucije (TRS) za restrikciju replikacije iz ovog ITR koji olakšava generisanje dimernog replikativnog oblika za samokomplementarno vektorsko pakovanje. Dokazano je da je virus AAVrh74 kod miševa, ne-humanih primata (NHP) i ljudi bezbedan i visoko efikasan u transdukciji mišića preko vaskularne barijere.

4

Proizvodnja vektora

[0170] Rekombinantni AAV, (sc) rAAVrh74.tMCK.hSGCA, napravljen je trostrukom transfekcijom. Metoda titracije na bazi qPCR korišćena je za određivanje inkapsuliranog vg titra korišćenjem detektorskog sistema Prism 7500 Fast Taqman (PE Applied Biosystems). Konstrukt sadrži himerni intron za promovisanje ekspresije na visokom nivou. Himerni intron se sastoji od 5' donorskog mesta iz prvog introna humanog gena β-globina i tačke grananja i 3' mesta akceptora spajanja iz introna koji se nalazi između lidera i tela varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulinskog gena. RAAV takođe sadrži signal poliadenilacije sintetičkog SV40 koji se koristi za efikasan završetak transkripcije. Šema ekspresijske kasete prikazana je u nastavku na Slici 1. Vektor je proizveden korišćenjem humanog alfa-sakroglikan (α-SG) gena okruženog sa AAV2 ITR sekvencama i enkapsidiran u AAVrh74 virione. Konstrukt sadrži tMCK neposredni rani promoter/pojačivač (GenBank Accession No. M21390) i koristi β-globin intron za ekspresiju na visokom nivou.

Isporuka gena

[0171] Sistemska isporuka kod miševa postignuta je ubrizgavanjem vektora u repnu venu sgca-/- miševa. Miševima je ubrizgana ukupna doza od 1 × 10<12>vg, 3 × 10<12>vg ili 6 × 10<12>vg (miševi u rasponu od 13-20 g; 5 × 10<13>vg/ kg, 1 × 10<14>vg/ kg i 2 × 10<14>vg/kg - doze zasnovane na super namotanoj DNK ili plazmidu kao standardu kvantifikacije - odnosno, zasnovane na mišu od 20 g) scAAVrh74.tMCK.hSGCA razblažene u laktiranom Ringerovom rastvoru u zapremini od 200-250 µL koristeći ultrafini insulinski špric kalibra 30. Svi tretirani miševi su ubrizgani u dobi od 4-5 nedelja i eutanazirani 12 nedelja nakon ubrizgavanja. U drugom otelotvorenju, doza je oko 1,85 × 10<13>vg/kg ili 7,41 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

Merenje kreatin kinaze u serumu

[0172] Nivoi kreatin kinaze su izmereni u serumima divljeg tipa C57BL/6 miševa (n = 6), sgca<-/->miševa (n = 6) tretiranih sa vehikulumom (laktirani Ringer rastvor) i sgca<-/->miševa (n = 6 po dozi) tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA, korišćenjem testa kreatin kinaze SL i odgovarajućeg protokola proizvođača (Sekisui Diagnostics; Charlottetown, PE, Canada) (kataloški br.326-10). Ukratko, 25 µL seruma je pomešano sa 1 ml radnih reagenasa i dodato u kivetu. Na spektrofotometru je postavljen kinetički test za merenje apsorbancije na 340 nm svakih 30 sekundi tokom 180 sekundi. Nivoi kreatin kinaze su izračunati korišćenjem očitavanja apsorbancije i jednačine navedene u nastavku:

Tetanusna kontrakcija dijafragme za funkcionalnu procenu

[0173] Miševi su eutanazirani i dijafragma (Dia) je secirana sa rebrastim dodacima i centralnom tetivom netaknutom i stavljena u K-H pufer. Izolovan je presek DIA širine 2-4 mm. DIA trake su čvrsto vezane pletenom hirurškom svilom (6/0; Surgical Specialties, Reading, PA) na centralnoj tetivi i zašivene kroz deo rebraste kosti pričvršćen na distalni kraj trake. Svaki mišić je prebačen u vodeno kupatilo ispunjeno oksigenovanim rastvorom K-H koji je održavan na 37°C. Mišići su poravnati horizontalno i vezani direktno između fiksne igle i dvofaznog pretvarača sile-servomotora (305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada). U kadi za organe postavljene su dve platinaste pločaste elektrode tako da okružuju dužinu mišića. Mišić je istegnut do optimalne dužine za merenje grčevitih kontrakcija, a zatim ostavljen da odstoji 10 minuta pre početka tetanusnog protokola. Kada je mišić stabilizovan, postavljen je na optimalnu dužinu od 1 g i podvrgnut zagrevanju, koje se sastojalo od tri 1-Hz trzaja svakih 30 sekundi, nakon čega slede tri 150-Hz trzaja svakog minuta. Nakon 3-minutnog perioda odmora, DIA je stimulisana na 20, 50, 80, 120, 150, 180 Hz, omogućavajući 2-minutni period odmora između svakog stimulusa, svaki u trajanju od 250 ms za određivanje maksimalne tetanusne sile. Izmerena je dužina i težina mišića. Sila je normalizovana za težinu i dužinu mišića.

Tetanusna kontrakcija Tibialis anterior (TA) za funkcionalnu procenu

[0174] Postupak procene TA sledio je protokol naveden u Hakim et al., Methods Mol Biol; 709:75-89 (2011). Miševi su anestezirani preko intraperitonealne šupljine koristeći smešu ketamin/ksilazin (100 mg/kg, odnosno 10 mg/kg). Pod opsegom seciranja, koža zadnjeg ekstremiteta je uklonjena kako bi se izložio TA mišić i patela. Dvostruki podvez je bio vezan oko tetive patele sa šavom 4-0. Zatim je secirana TA distalna tetiva i oko tetive vezan dvostruki podvezni čvor sa šavom 4-0 što bliže mišiću, a zatim je tetiva presečena. Izloženi mišić je stalno navlaživan fiziološkim rastvorom. Miševi su zatim prebačeni na termički kontrolisanu platformu i održavani na 37°C. Koleno je pričvršćeno za metalnu iglu sa šavom patelarne tetive i šavom distalne TA tetive za ravan krak pretvarača sile (Aurora Scientific, Aurora, Canada). U blizini išijatičnog nerva postavljena je elektroda za njegovu stimulaciju. Kada je mišić stabilizovan, napetost u mirovanju je postavljena na dužinu (optimalnu dužinu) gde su kontrakcije trzaja bile maksimalne. Nakon 3-minutnog odmora, TA je stimulisan na 50, 100, 150 i 200 Hz, omogućavajući 1-minutni odmor između svakog stimulusa. Nakon 5-

1

minutnog odmora, mišići su zatim podvrgnuti seriji od 10 izometrijskih kontrakcija, koje se javljaju u intervalima od 1 minuta sa procedurom rastezanja i produžavanja od 10%. Nakon ekscentričnih kontrakcija, miševi su zatim eutanazirani i TA mišić je seciran i zamrznut za histologiju.

Imunofluorescencija

[0175] Kriosekcije (debljine 12 µm) iz mišića TA, gastrocnemius (GAS), kvadriceps (QD), psoas major (PSOAS), gluteus (GLUT), triceps (TRI), DIA i srca (HRT) podvrgnute su imunofluorescentnom bojenju za hSGCA transgen. Sekcije su inkubirane sa zečjim monoklonskim α-SG primarnim antitelima (Abcam; Cambridge, UK; catalog no.ab189254) u razblaženju od 1:100. Četiri random slike od 20x koje pokrivaju četiri različita kvadranta mišićnog dela snimljene su koristeći Zeiss (Nemačka) AxioCam MRC5 kameru. Procenat vlakana pozitivnih na α-SG bojenje u poređenju sa kontrolama određen je za svaku sliku i uprosečen za svaki mišić. Pozitivna ekspresija vlakana α-SG definisana je kao da ima najmanje 30% svetlijeg obojenja vlakana od kontrola sgca-/- tretiranih vehikulumom.

Western Blot analiza

[0176] Za svaki Western blot korišćeni su uzorci miševa divljeg tipa C57BL/6, miševa sgca-/-tretiranih vehikulumom i sgca-/-miševa doziranih vektorom. Razblaženje 1 :10.000 zečjeg monoklonskog α-SG antitela (Abeam, kat. br.ab189254) i 1 :5.000 razblaženje mišjeg monoklonskog α-aktinin antitela (Sigma-Aldrich, kat. br. A7811) korišćeni su za hSGCA mrlje. Takođe je korišćeno 1:1.000 razblaženje zečjeg monoklonskog mišjeg vinkulin antitela (Invitrogen, kat. br.70062). Antimišja (Millipore, kat.br. AP308P) i antizečja (Life Technologies, kat. br.656120) sekundarna antitela peroksidaze rena korišćena su za pojačanu imunodetekciju hemiluminiscencije. Western blot kvantifikacija je izvršena denzitometrijom koristeći ImageQuantTL 1D 8.1.0 (GE Healthcare Life Sciences).

Morfometrijska analiza

[0177] Bojenje hematoksilina i eozina (H&E) za analizu izvršeno je na kriosekcijama mišića debljine 12 µm kod divljeg tipa C57BL/6 miševa starih 16-17 nedelja (n=6), sgca-/- miševa tretiranih vehikulumom (n=6) i sgca-/- miševa starih 16-17 nedelja tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA (n=6 po dozi). Procenat miofibera sa centralnim jezgrima određen je u mišićima TA, GAS, QD, GLUT, PSOAS i TRI. Pored toga, prečnici mišićnih vlakana su izmereni u TA, GAS, QD, TRI i PSOAS mišićima. Četiri random slike od 20x po mišiću po

2

životinji snimljene su kamerom Zeiss AxioCam MRC5. Centralno nukleirana vlakna su kvantifikovana pomoću softvera za snimanje Nacionalnog instituta za zdravlje, a prečnici vlakana su mereni pomoću softvera Zeiss Axiovision LE4.

Biodistributivna analiza kvantitativne lančane reakcije polimeraze (PCR)

[0178] Taqman kvantitativna PCR je izvršena kako bi se kvantifikovao broj kopija vektorskog genoma prisutnih u ciljanom i neciljanom kontralateralnom mišiću, kao i neciljanim organima, kao što je prethodno opisano. Komplet sonde prajmera specifičan za vektor korišćen je za amplifikaciju sekvence intronskog regiona direktno nizvodno od tMCK promotera koji je jedinstven i nalazi se unutar scAAVrh.74.tMCK.hSGCA transgen kasete. U ovoj studiji korišćeni su sledeći prajmeri i sonda: tMCK intron ushodni prajmer 5'-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3'; tMCK intron nishodni prajmer 5'-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3'; i tMCK intron sonda 5'-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C- IABkFQ-3' (Integrated DNA Technologies). Broj kopije je prijavljen kao vektorski genom po mikrogramu genomske DNK.

Picrosirius crveno bojenje i kvantifikacija kolagena

[0179] Picrosirius crveno bojenje je izvršeno kako bi se odredili nivoi taloženja kolagena u mišićnom tkivu. Bojenje je izvršeno na kriosekcijama od 12 µm mišića GLUT, PSOAS, TRI i DIA iz divljeg tipa C57BL/6 (n=6) starosti 16-17 nedelja, sgca-/- tretiranih vehikulumom (n=6) i sgca-/- starih 16-17 nedelja tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA (n=6 po dozi). Snimljene su četiri slike 20x po mišiću po mišu, a količina taloženja kolagena određena je softverskim programom. Srednji procenat kolagena za svaki mišić izračunat je za sve grupe.

Lasersko praćenje aktivnosti u kavezu na otvorenom polju

[0180] Za određivanje ukupne aktivnosti eksperimentalnih miševa korišćena je komora za aktivnost na otvorenom polju. Miševi u dobi od 16-17 nedelja od divljeg tipa C57BL/6 (n=6) i netretiranih sgca<-/->(n=6) kontrolnih grupa, zajedno sa sgca<-/->miševima starosti 16-17 nedelja tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA (n=6 po dozi) bili su podvrgnuti analizi. Svi miševi su testirani u isto doba dana, u rano jutro pred kraj noćnog ciklusa, kada su miševi najaktivniji. Svi miševi su testirani u izolovanoj prostoriji pod prigušenim svetlom i sa istim rukovaocem svaki put. Takođe, da bi se smanjila anksioznost i održale varijable ponašanja na minimumu koje bi potencijalno mogle uticati na normalnu aktivnost miševa, a samim tim i na rezultate testa, testirali smo miševe koji nisu bili pojedinačno smešteni. Aktivnost miša je praćena pomoću sistema aktivnosti Photobeam (San Diego Instruments, San Diego, CA). Ovaj sistem koristi mrežu nevidljivih infracrvenih svetlosnih zraka koji prelaze životinjsku komoru napred-nazad i sleva na desno kako bi pratili položaj i kretanje miša unutar x-y-z ravni. Aktivnost je zabeležena za 1-časovne cikluse u 5-minutnim intervalima. Miševi su aklimatizovani u prostoriji za testiranje aktivnosti na početnu jednosatnu sesiju nekoliko dana pre početka prikupljanja podataka. Miševi su testirani u pojedinačnim komorama u setovima od četiri. Oprema za testiranje je očišćena između svake upotrebe kako bi se smanjile reakcionarne varijable ponašanja miša koje bi mogle da promene rezultate. Podaci su konvertovani u Microsoft Excel radni list, a svi proračuni su urađeni u okviru Excel programa. Pojedinačni prekidi zraka za kretanje u x i y ravni su sabirani za svakog miša da predstavlja ukupnu ambulaciju, a prekidi zraka u z ravni su sabirani da bi se dobila vertikalna aktivnost u okviru vremenskog intervala od 1 sata.

Studije bezbednosti

Hematologija

[0181] Celokupna krv je uzeta iz srčane punkcije za hemijske analize krvi. Krv je prikupljena u epruveti za odvajanje seruma i centrifugirana 10 min na 15.000 o/min. Serum je prikupljen, zamrznut i poslat u Charles River Laboratories na hemijsko ispitivanje. U hematološkoj analizi dati su prioriteti hemiji jetrenih enzima i glukoze.

Histopatologija

[0182] Prilikom nekropsije, mišići su sveže zamrznuti u tečnom azotom hlađenom metilbutanu; svi ostali organi su sakupljeni i fiksirani u formalinu i ugrađeni u parafin. Nakon obrade, tkiva su obojena H&E, a slajdovi i sva tkiva su poslata u GEMPath, Inc, na formalni pregled od strane veterinarskog patologa.

Statistička analiza

[0183] Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM (trake grešaka) i analizirani korišćenjem jednosmerne ANOVA sa višestrukim poređenjima između grupa procenjenih Tukeyevim testom post-hoc analize korišćenjem GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA), osim ako nije drugačije navedeno.

4

Primer 2

Efikasnost sistemske isporuke scAAVrh74.tMCK.hSGCA

[0184] Pokrenuta je mala pilot studija kako bi se posmatrala efikasnost isporuke gena intravenskom injekcijom u lateralnu repnu venu sgca<-/->miševa u dozi od 1 × 10<12>vg ukupne doze (5 × 10<13>vg /kg na osnovu 20-g miša, n=4). Imunofluorescentna analiza je urađena na izvađenim mišićima 4 nedelje nakon transfera gena. Količina ekspresije hSGCA transgena u sedam različitih skeletnih mišića ekstremiteta: TA, GAS, GLUT, QD, PSOAS i TRI i DIA. Miševi sa nedostatkom α-SG pokazali su potpuno odsustvo proteina kada su analizirani imunofluorescencijom (Slika 2A; reprezentativne slike TA, GAS, TRI i DIA). Terapijska doza od 1 × 10<12>vg ukupne doze dala je srednju vrednost od 54± 23,81% transdukcije vektora kroz sve skeletne mišiće, uključujući DIA 4 nedelje nakon isporuke gena.

Studija povećanja doze scAAVrh74.tMCK.hSGCA sistemski dostavljena sgca<-/->miševima [0185] Da bi se odredila najbezbednija i najefikasnija doza, isporuka tri odvojene doze vektora proučavana je u studiji povećanja doze, gde je lateralna vena repa 4 nedelje starih sgca<-/->miševa tretirana sa 1 ×10<12>vg ukupne doze (5 × 10<13>vg/kg), 3 × 10<12>vg ukupne doze (1 × 10<14>vg/kg) ili 6 × 10<12>vg ukupne doze (2 × 10<14>vg/kg) scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Miševi su eutanazirani 12 nedelja nakon isporuke gena kako bi se procenila ekspresija hSGCA transgena u TA, GAS, QD, GLUT, PSOAS, TRI, DIA i HRT mišićima koristeći imunofluorescenciju. Srednja vrednost ekspresije hSGCA kod miševa lečenih najnižom dozom od 1 × 10<12>vg ukupne doze (5 × 10<13>vg/kg) bila je 70,07±3,71% ukupne ekspresije u skeletnim mišićima, uključujući DIA. Srednja vrednost ekspresije hSGCA kod miševa lečenih srednjom dozom od 3 × 10<12>vg ukupne doze (1 × 10<14>vg /kg) bila je 85,35±2,36% u svim skeletnim mišićima. Srednja vrednost ekspresije hSGCA kod miševa lečenih najvećom dozom od 6 × 10<12>vg ukupne doze (2 × 10<14>vg /kg) bila je 93,86±2,02% u svim skeletnim mišićima. Radi jasnoće, doze su izračunate na osnovu super namotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije. Ekspresija hSGCA u HRT mišiću ostala je na 75% nezavisno od doze.

Reprezentativne slike tkiva prikazane su na Slici 2A. Robusna ekspresija hSGCA pokazuje efikasnost isporuke gena u sve tri doze. Isporuka gena je bila usmerena na više mišića u prednjim i zadnjim ekstremitetima, pokazujući izuzetnu ekspresiju α-SG kod miševa u sve tri doze. Najvažnije, vitalni mišić dijafragme takođe je pokazao ekspresiju gena α-SG nakon isporuke. Western blotovi prikazani na Slici 2B potvrđuju ekspresiju proteina u svim mišićima sve tri dozirne kohorte tretiranih miševa. Srčani mišić kod miševa je takođe pokazao ekspresiju α-SG nakon tretmana.

[0186] Histopatološke karakteristike i ljudi i miševa lišenih proteina α-SG uključuju centralnu nukleaciju, nepravilnosti u distribuciji veličine vlakana, nekrozu i fibrozu. H&E bojenje je korišćeno za vizualizaciju morfologije mišića, uključujući veličinu vlakana i centralnu nukleaciju (Slika 3). Kao što je prikazano na Slikama 3A i 3B, normalizacija raspodele veličine vlakana, slična onoj koja je primećena kod kontrola divljeg tipa, primećena je u TA, QD i TRI iz sgca<-/->miševa tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA u poređenju sa kontrolama sgca<-/->tretiranih vehikulumom. Prosečna veličina prečnika vlakana je značajno povećana pri svim dozama u TA, QD i TRI mišićima u poređenju sa sgca<-l->kontrolnim miševima tretiranih vehikulumom (Tabela 1).

TABELA 1

[0187] Kod sgca<-/->miševa tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA, takođe je primećeno smanjenje centralne nukleacije. Skeletni mišići sgca<-/->miševa tretiranih vehikulumom imali su 68,72±3,01% vlakana sa centralno lociranim jezgrima. Nakon tretmana sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA, ukupna vrednost centralne nukleacije u svim mišićnim tkivima je smanjena sa najnižom dozom scAAVrh74.tMCK.hSGCA, što je rezultiralo sa 55,60±3,25% skeletnih mišićnih vlakana koja pokazuju centralno locirana jezgra (Tabela 2).

TABELA 2

[0188] Miševi tretirani srednjom dozom imali su 61,85±4,00% mišićnih vlakana sa centralizovanim jezgrima, dok je nukleacija mišićnih vlakana tretiranih najvećom dozom smanjena na 37,93±12,46% (Slika 3C).

[0189] Fibroza, gde u tkivu prevladava kolagen, često se javlja u mišićima pacijenata sa LGMD, što dovodi do formiranja ožiljnog tkiva. Fibroza je procenjena pomoću 'picrosirius red' bojenja za detekciju sadržaja kolagena I i III, kao markera fibroze. Kao što je prikazano na Slici 4, uočeno je snažno smanjenje crvenog obojenja kod sgca-/- miševa nakon tretmana sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Kvantifikacija je otkrila značajno smanjenje sadržaja kolagena u svim mišićima kod sgca-/- miševa tretiranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA u poređenju sa kontrolnim sgca<-/->miševima tretiranim vehikulumom (Slika 4B). Zajedno, ovi podaci pokazuju uspešnu sistemsku isporuku hSGCA transgena, na šta ukazuje robusna ekspresija u mišićnim tkivima i poboljšanje histopatoloških obeležja povezanih sa nedostatkom α-SG proteina kod sgca<-/->miševa.

Primer 3

scAAVrh74.tMCK.hSGCA rAAV poboljšava funkciju mišića dijafragme i tibialis anterior i povećava lokomotornu sposobnost

[0190] Pošto su slabost i gubitak funkcije proksimalnih mišića glavni simptomi LGMD2D i respiratorna insuficijencija je vodeći uzrok smrti kod LGMD2D, poboljšanje funkcionalnosti i snage TA i DIA je imperativ za povećanje dužine i kvaliteta života kod ispitanika sa LGMD2D. Za potvrdu korelacije između ekspresije hSGCA i mišićne snage korišćene su trake DIA i celi TA mišići. Kao što je prikazano na Slikama 5A i 5B, deficit u specifičnoj sili i otpornosti na povrede izazvane kontrakcijom identifikovan je u TA i specifičnoj sili u DIA mišićima sgca<-/->netretiranih miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa.

[0191] TA mišići sgca<-/->miševa pokazali su značajan funkcionalni deficit od 44% u smanjenju učinka specifične sile u poređenju sa miševima divljeg tipa (161,6 ±8,20 mN/mm<2>naspram 291,7 ±6,17 mN/mm<2>, respektivno; p <0,0001), kao i veći gubitak sile od one proizvedene nakon rigoroznog protokola ekscentrične kontrakcije (44,0±6,0% gubitak kod sgca<-/->miševa; 18,0±1,0% gubitak kod miševa divljeg tipa; p <0,0001) (Slika

5A). Dvanaest nedelja nakon isporuke u repnu venu, podnosilac zahteva je primetio dramatično poboljšanje nakon lečenja niskim, srednjim i visokim dozama scAAVrh74.tMCK.hSGCA u učinku specifične sile, koji se povećao na 218± 11,94 mN/mm<2>, 227±11,7 mN/mm<2>, odnosno 255±11,7 mN/mm<2>. Otpornost na povrede nakon protokola ekscentrične kontrakcije takođe se poboljšala u poređenju sa sgca<-/->miševima tretiranim vehikulumom, kod kojih su miševi tretirani niskom, srednjom i visokom dozom izgubili samo 22,0±4,0%, 22,0±3,0%, odnosno 12,0±1,0% (p <0,0001 u poređenju sa sgca<-/->miševima tretiranim vehikulumom) (Slika 5A).

[0192] U DIA sgca<- /->miševa tretiranih vehikulumom, generisana specifična sila pokazala je smanjenje snage od 41% u poređenju sa miševima divljeg tipa (131,5±12,07

mN/mm<2>naspram 223,8±15,85 mN/mm<2>). Uočeno je poboljšanje u sili nakon tretmana sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA u sve tri doze, gde se specifična sila DIA kod miševa sa niskim dozama povećala na 179,2±21,03 mN/mm<2>, kod miševa sa srednjim dozama povećala na 201,2±22,94 mN/mm<2>, a kod miševa sa visokim dozama povećala na 261,46 ±9,73 mN/mm<2>(Slika 65B). Ovi podaci pokazuju da TA i DIA mišići kod sgca<-/->miševa imaju deficit sile i brže se istroše od miševa divljeg tipa. Međutim, nakon isporuke scAAVrh74.tMCK.hSGCA, postignut je funkcionalni oporavak.

[0193] Dodatni simptomi LGMD2D uključuju netoleranciju na vežbanje i smanjenu aktivnost i ambulaciju, verovatno zbog oštećenja mišića, što dovodi do bola i umora mišića. Da bi se procenio nivo fizičke aktivnosti, sgca<-/->i miševi C57BL/6 divljeg tipa su podvrgnuti protokolu aktivnosti na otvorenom polju sličnom onom koji je korišćen u prethodnim izveštajima.

Aktivnosti miševa u vezi sa ambulacijom praćene su kako bi se utvrdilo da li nedostatak α-SG u sgca<-/->mišu dovodi do smanjenja ambulacije u poređenju sa miševima divljeg tipa.

Grafikoni na Slici 5C prikazuju smanjenje ambulacije i vertikalnog podizanja u modelu sgca<- /->miša u poređenju sa kontrolama divljeg tipa. Srednje vrednosti horizontalnih ambulatornih prekida zraka zabeležene kod sgca<-/->miševa iznosile su 2000±159 prekida zraka/h, što je smanjenje ambulacije od 77,5% u poređenju sa 8911±1193 prekida zraka/ h kod kontrola divljeg tipa. Srednja vrednost prekida zraka vertikalnog podizanja zabeležena kod sgca<-/->miševa bila je 24,75±11,47 prekida zraka/h, što je smanjenje vertikalnog podizanja za 97% u poređenju sa 803,3 ± 55,03 prekida zraka/h kod miševa divljeg tipa. Nakon tretmana sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA, aktivnosti ambulacije i vertikalnog podizanja miševa povećale su se 12 nedelja nakon isporuke gena. Srednja horizontalna ambulacija se povećala na 3595±55,03 prekida zraka/h kod miševa tretiranih sa 1× 10<12>vg ukupne doze, 5238± 861,9 prekida zraka/h kod miševa tretiranih sa 3× 10<12>vg ukupne doze i 6487± 467,9 prekida zraka/h kod miševa tretiranih sa 6× 10<12>vg ukupne doze. Srednja aktivnost vertikalnog podizanja povećala se na 377±146,1 prekida zraka/h kod miševa tretiranih sa 1 ×10<12>vg ukupne doze, 321±126,1 prekida zraka/h kod miševa tretiranih sa 3 ×10<12>vg ukupne doze i 448,8 ±53,43 prekida zraka/h kod miševa tretiranih sa 6 × 10<12>vg ukupne doze (Slika 5C). Fizičke aktivnosti tretiranih miševa pokazale su poboljšanje od 44%-69% u ambulaciji i 92%-94% u vertikalnom podizanju u poređenju sa miševima sgca<-/->tretiranih vehikulumom. Pored toga, nivoi kreatin kinaze u serumu bili su značajno smanjeni u svim tretiranim grupama u poređenju sa netretiranim miševima (Slika 5D). Zajedno, ovi podaci pokazuju da isporuka α-SG vraća fizičku aktivnost i štiti od sloma mišića kod sgca<-/->miševa.

Analiza bezbednosti i biodistribucije scAAVrh74.TMCK.hSGCA

[0194] Kao bezbednosna mera, izvršene su hemijske analize krvi i hematološke studije na sgca<-/->miševima sa vektorskim dozama i miševima divljeg tipa. Sve vrednosti su bile u normalnim referentnim opsezima za miševe (Slika 6). Dalje, sekcije tkiva svih mišića i organa obojenih sa H&E od sgca<-/->miševa doziranih sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA i miševa divljeg tipa poslati su veterinarskom patologu na formalni pregled. Nisu primećeni štetni efekti ni u jednom uzorku bilo kog od sgca<-/->miševa doziranih

sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA i miševa divljeg tipa. Pored efikasnosti, ovi podaci su pokazali da je sistemska isporuka sve tri doze scAAVrh74.tMCK.hSGCA bila dobro podnošljiva, bezbedna i netoksična za sgca<-/->i miševe divljeg tipa.

[0195] Da bi se testirali na potencijalne probleme toksičnosti ili bezbednosti od isporuke scAAVrh74.tMCK.hSGCA, izvršena je kvantitativna PCR biodistribucija vektora kako bi se kvantifikovalo prisustvo vektorskog genoma (Slika 7A). Kompleti sondi tMCK.hSGCA prajmera specifični za vektore korišćeni su za detekciju vektorskih genoma u svim testiranim mišićima i organima od sgca<-/->miševa doziranih sa scAAVrh74.tMCK/hSGCA. Očekivano, vektorski genomi su bili prisutni u testiranim tkivima, sa najvećim brojem kopija u jetri, a zatim u mišićima. Western blot alfa-sarkoglikan proteina u jetri WT i sgca<-/->miševa tretiranih bilo vehikulumom (sgca<-/->LR) ili sa scAArh74.tMCK.hSGCA prikazani su na Slici 7B.

[0196] Da bi se poboljšala efikasnost ekspresije α-SG, u jednom otelotvorenju, hSGCA cDNK sekvenca je upakovana u samo-komplementarni vektor. Samo-komplementarni AAV vektori sadrže genom obrnutog ponavljanja koji promoviše formiranje dsDNK, čime se omogućava replikacija i transkripcija bez potrebe za višestrukim vektorskim genomima za promovisanje ovih procesa. Kao takva, upotreba samo-komplementarnih vektora eliminiše korak ograničavanja brzine kako bi se omogućila brža ekspresija transgena. Podnosilac zahteva je pokazao da je intravaskularna isporuka scAAVrh74.tMCK.hSGCA kod pacijenata sa LGMD2D bila povezana sa povećanom ekspresijom α-SG 180 dana nakon prenosa gena u dozama od 1 × 10<12>i 3 × 10<12>.

[0197] Intravenska isporuka scAAVrh74.tMCK.hSGCA obezbeđuje mišićima povećanu snagu i otpornost na oštećenja izazvana kontrakcijom u mišićima tibialis anterior i dijafragme u sve tri kohorte tretirane vektorima u poređenju sa kontrolama tretiranim vehikulumom. Pored toga, lečenje sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA rezultiralo je značajnim smanjenjem CK. Štaviše, nakon tretmana sa scAAVrh74.tMCK.hSGCA, miševi su mogli da ambuliraju i zadrže se na zadnjim udovima češće nego miševi tretirani vehikulumom.

[0198] Istaknuta histopatologija, koja uključuje centralno locirana jezgra, široku varijabilnost u veličini vlakana, inflamaciju, nekrozu i fibrozu, obično se primećuje kroz biopsije mišića pacijenata sa LGMD2D. Nakon isporuke hSGCA, miševi su imali smanjenje CN, ravnomerniju raspodelu veličine miofibera i smanjenje sadržaja kolagena, pri čemu mišići imaju sveukupno zdraviji izgled u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom. Ukupno smanjenje histopatologije i ožiljnog tkiva bilo je istovremeno povezano sa poboljšanjem ukupne normalne funkcije i fiziologije mišića kod miševa lečenih vektorima.

[0199] Konačno, studije bezbednosti sprovedene kvantitativnom PCR, analizom hemije seruma i histopatologijom nisu pokazale znakove toksičnosti. Promoter tMCK je detektovan samo u ciljanim tkivima (svim mišićima) i nije bio prisutan u drugim (ne-mišićnim) organima, osim u jetri. Detekcija tMCK u jetri nije neuobičajena ili zabrinjavajuća jer je to organ za klirens. U histopatološkom pregledu svih tkiva (uključujući jetru) od strane sertifikovanog veterinara patologa zaključeno je da je sistemska isporuka scAAVrh74.tMCK.hSGCA ne samo bezbedna u svim tkivima, već i da je isporuka gena dramatično smanjila količinu distrofične patologije koja je nađena u skeletnim mišićima sgca<-/->miševa tretiranih vehikulumom. Hemijske analize uzoraka krvi miševa tretiranih vektorom takođe podržavaju odsustvo toksičnosti.

[0200] Studija povećanja doze, kao i u ovom obelodanjenju, pruža pretkliničke podatke koji podržavaju da je najniža doza sistemski testirana ovde, tj .1 × 10<12>vg ukupno ( 5 ×

10<13>vg/kg), dovoljna za smanjenje znakova i simptoma povezanih sa gubitkom proteina α-SG. Pri najnižoj dozi testirano je funkcionalno poboljšanje u svim mišićima, što je pokazano povećanjem snage i lokomotornog ponašanja (ambulacija i podizanje) kod vektorski tretiranih miševa. Studije bezbednosti ne pokazuju znake toksičnosti, čak ni pri najvišoj isporučenoj dozi od 6 ×10<12>vg ukupno (2 × 10<14>vg/kg).

Primer 4

Stariji pacijenti i trajnost

[0201] Zamena gena posredovana rAAVrh74.tMCK.hSGCA pokazala je pozitivne rezultate u lečenju LGMD-2D i drugih povezanih bolesti. Ova studija je dizajnirana da testira sposobnost rAAVrh74.tMCK.hSGCA da leči starije, teže pogođene mišiće i da odredi dugoročnu trajnost AAV virusnog vektora.

[0202] Sve procedure su sprovedene u skladu sa odobrenjem Istraživačkog instituta pri Komitetu za institucionalnu negu i upotrebu životinja Nacionalne dečije bolnice. Miševi su održavani u standardizovanim uslovima na 12:12-časovnom ciklusu svetlo:mrak, sa hranom i vodom obezbeđenom ad libitum. Prvo, rAAVrh74.tMCK.hSGCA je sistemski primenjen injekcijom u repnu venu kod 12-mesečnih sgca<- /->miševa (n=5) sa teškom histopatologijom mišića u tri doze (1,0 × 10<12>, 3,0 × 10<12>i 6,0 × 10<12>vg. Kontrole su uključivale laktirani Ringerov rastvor (LRS) ubrizgan sgca<-/->miševima (n=5) i LRS ubrizgan miševima BL6 divljeg tipa (n=4). Na 6-mesečnom ishodu nakon lečenja, mišići tretiranih miševa su

1

procenjeni na ekspresiju SCGA proteina, histološko očuvanje mikroanatomije tkiva i funkcionalno poboljšanje. Sve tri doze pokazale su robusnu proteinsku ekspresiju α-SG na sarkolemi, poboljšanu histopatologiju, povećanu lokomotornu aktivnost i generisanje specifične sile, zaštitu od gubitka ekscentrične sile i smanjeni serumski CK u poređenju sa kontrolama. Nije obelodanjena toksičnost vektora. Kod ostarelih miševa, lečenje je rezultiralo široko rasprostranjenom ekspresijom proteina visokog nivoa u analiziranim mišićima, smanjenom fibrozom i povećanom otpornošću na povrede izazvane kontrakcijom u mišiću tibialis anterior.

[0203] Konkretno, intravenska primena rAAVrh74.tMCK.hSGCA kod 12-mesečnih sgca<-/->miševa rezultirala je široko rasprostranjenom ekspresijom proteina visokog nivoa u mišićima širom mišića donjih ekstremiteta, gornjih ekstremiteta i proksimalnih mišića trupa, uključujući dijafragmu i srce (Slika 8).

[0204] Ukupno poboljšanje mišićne patologije (Slika 9a) i smanjenje centralne nukleacije primećeno je nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Pored toga, prosečna veličina vlakana povećana je na nivoe slične nivoima u WT vlaknima u mišićima gastrocnemius (GAS) i triceps (TRI) (Slika 9b) nakon primene.

[0205] Nivo taloženja kolagena je kvantifikovan kao mera fibroze. Primena scAAVrh74.tMCK.hSGCA rezultirala je smanjenjem nivoa fibroze u poređenju sa netretiranim kontrolama (Slika 9c). Funkcionalno poboljšanje nakon primene scAAVrh74.tMCK.hSGCA dokazano je poboljšanim učinkom sile (specifičnom silom) u mišiću tibialis anterior (TA) i dijafragme (DIA) i povećanom otpornošću na povrede izazvane kontrakcijom u TA mišiću (Slika 10).

[0206] Da bi se dodatno istražila dugoročna trajnost genske terapije, sgca<-/->miševima u dobi od 4 nedelje sistemski je primenjen rAAVrh74.tMCK.hSGCA. Više od 24 meseca nakon tretmana, brojevi kopija vektorskog genoma su detektovani pomoću qPCR u svim testiranim transdukovanim mišićima (TA, TRI, DIA, GLUT, PSOAS, GAS i QUAD). Ekspresija i lokalizacija proteina je proučavana imunofluorescentnim bojenjem tretiranog mišića.

2

SEQ ID NO:1

Optimizovana sekvenca SGCA cDNK kodona:

SEQ ID NO:2

Sekvenca humanog proteina SGCA:

SEQ ID NO:4 AAVrh74-tMCK-SGCA:

4

SEQ ID NO:6 3' ITR

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Sastav za upotrebu u lečenju mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav sadrži rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA u dozi od 5 × 10<13>vg/kg do 2 × 10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije, i pri čemu je sastav formulisan za sistemski put primene, i dalje pri čemu rAAV sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 4 i navedena nukleotidna sekvenca kodira protein koji zadržava aktivnost alfa-sarkoglikana.

2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je doza rAAV od 5 × 10<13>vg/kg, 1 × 10<14>vg/kg ili 2 × 10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

3. Sastav za upotrebu u lečenju mišićne distrofije kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu sastav obuhvata rekombinantni adeno-asocirani virus (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA u dozi od 1,0 × 10<13>vg/kg do 8,0 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije i pri čemu je sastav formulisan za sistemski put primene, i dalje pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu sa najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 4 i navedena nukleotidna sekvenca kodira protein koji zadržava aktivnost alfa-sarkoglikana.

4. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu sastav sadrži AAVrh74.tMCK.hSCGA u dozi od 1,85 × 10<13>vg/kg ili 7,41 × 10<13>vg/kg na bazi linearizovane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije.

5. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4.

6. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je nivo ekspresije alfa-sarkoglikan gena u ćeliji ispitanika povećan nakon primene sastava u poređenju sa nivoom ekspresije alfa-sarkoglikan gena pre primene sastava; ili pri čemu je nivo CK u serumu kod ispitanika smanjen nakon primene sastava u poređenju sa nivoom CK u serumu pre primene sastava; ili pri čemu je broj alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana u mišićnom tkivu ispitanika povećan nakon primene sastava u poređenju sa brojem alfa-sarkoglikan pozitivnih vlakana pre primene sastava.

7. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je sistemski put primene intravenski put.

8. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je sastav formulisan za primenu injekcijom, infuzijom ili implantacijom.

9. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je sastav formulisan za primenu infuzijom.

10. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je sastav formulisan za primenu intravenskim putem kroz perifernu venu ekstremiteta.

11. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu je mišićna distrofija mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa.

12. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu je mišićna distrofija mišićna distrofija ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa tipa 2D (LGMD2D).

13. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, pri čemu ispitanik pati od mišićne distrofije ekstremiteta i rameno-karličnog pojasa, a sastav je formulisan za primenu intravenskom infuzijom u dozi od 5 × 10<13>vg/kg do 2 × 10<14>vg/kg na bazi supernamotane DNK ili plazmida kao standarda kvantifikacije, i pri čemu rAAV obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4 konstrukta scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

14. Sastav za upotrebu u smanjenju nivoa CK u serumu kod ispitanika kome je to potrebno, sastav koji sadrži scAAVrh74.tMCK.hSGCA konstrukt koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 4.

1