Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS64690B1 - Konjugati biparatopskog anti-her2 antitela i leka i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS64690B1 - Konjugati biparatopskog anti-her2 antitela i leka i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Konjugati biparatopskog anti-her2 antitela i leka i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS64690B1
RS64690B1 RS20230943A RSP20230943A RS64690B1 RS 64690 B1 RS64690 B1 RS 64690B1 RS 20230943 A RS20230943 A RS 20230943A RS P20230943 A RSP20230943 A RS P20230943A RS 64690 B1 RS64690 B1 RS 64690B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
her2
antigen
binding
linker
Prior art date
Application number
RS20230943A
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Hamblett
Rupert H Davies
James R Rich
Gerald J Rowse
Vincent K C Fung
Stuart D Barnscher
Original Assignee
Zymeworks Bc Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymeworks Bc Inc filed Critical Zymeworks Bc Inc
Publication of RS64690B1 publication Critical patent/RS64690B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetno otkriće odnosi se na oblast terapeutika za kancer i, posebno, na konjugate antitela i leka koji sadrže biparatopsko anti-HER2 antitelo i analog auristatina.
OSNOV PRONALASKA
[0002] HER2 (ErbB2) je transmembranski površinski-vezani receptor tirozin kinaze koji je član ErbB porodice receptor tirozin kinaza i normalno je uključen u puteve transdukcije signala koji vode ka rastu i diferencijaciji ćelija. HER2 je obećavajuće ciljno mesto za lečenje kancera dojke budući da je utvrđeno da se prekomerno eksprimira kod oko jedne četvrtine obolelih od kancera dojke (Bange et al, Nature Medicine 7:548 (2001)).
[0003] Herceptin<®>(trastuzumab, SAD patent br. 5,821,337) je bio prvo monoklonsko antitelo razvijeno za lečenje HER2-pozitivnog kancera dojke i povećao je vreme preživljavanja kod pacijenata tako da je sada isto kao kod pacijenata sa HER2-negativnim kancerom dojke. Pertuzumab (Perjeta<®>, SAD patent br.7,862,817) je humanizovano monoklonsko antitelo, koje je dizajnirano specifično da spreči HER2 receptor da formira par (dimerizuje) sa drugim HER receptorima (EGFR/HER1, HER3 i HER4) na površini ćelija, što je proces za koji se veruje da igra ulogu u rastu i preživljavanju tumora. Smatra se da kombinacija lekova Perjeta, Herceptin i hemoterapije pruža sveobuhvatniju blokadu signalnih puteva HER. Pertuzumab se vezuje za domen II HER2, od suštinskog značaja za dimerizaciju, dok se trastuzumab vezuje za ekstracelularni domen IV HER2.
[0004] Li et al (Cancer Res., 73:6471-6483 (2013)) opisuje bispecifična, bivalentna antitela protiv HER2 koja su bazirana na nativnim sekvencama trastuzumaba i pertuzumaba i koja prevazilaze rezistenciju na trastuzumab. Opisana su i druga bispecifična anti-HER2 antitela (objava međunarodne patentne prijave br. WO 2015/077891 i WO 2016/179707; objava SAD patentne prijave br. 2014/0170148, 2015/0284463, 2017/0029529 i 2017/0291955; SAD patent br.
9.745.382). Opisan je i konjugat antitela i leka koji sadrži biparatopsko antitelo usmereno na HER2 koje je mesto-specifično konjugovano sa derivatom tubulizina (Li et al., Cancer Cell, 29:117-129 (2016)).
[0005] Auristatini su sintetički analozi dolastatina 10, koji je potentan inhibitor mikrotubula sa anti-kancerskom aktivnošću. Konjugati antitela i leka koji sadrže opterećenje auristatinom, kao što su monometil auristatin E (MMAE) ili monometil auristatin F (MMAF), su opisani (SAD patenti br. 7,498,298 i 7,659,241; objava međunarodne patentne prijave WO 2002/088172 i WO 2016/041082). Objava međunarodne patentne prijave WO 2106/041082 opisuje N-acil sulfonamid modifikovane auristatine i njihovu upotrebu kao opterećenja lekom za konjugate antitela i leka.
[0006] Ove informacije o osnovu pronalaska su date u svrhu iznošenja poznatih informacija za koje podnosilac zahteva veruje da su od mogućeg značaja za sadašnje otkriće. Ovo ne znači nužno nikakvo priznanje, niti ga tako treba tumačiti, da bilo koja od prethodnih informacija predstavlja prethodno stanje tehnike u odnosu na pronalazak za koji se traži zaštita.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0007] Ovde su opisani konjugati biparatopskog anti-HER2 antitela i leka i postupci za njihovu upotrebu. U jednom aspektu, sadašnje otkriće se odnosi na konjugat antitela i leka koji sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa analogom auristatina preko linkera (L) u niskom prosečnom odnosu leka i antitela (DAR), gde biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži prvi antigenvezujući polipeptidni konstrukt koji vezuje prvi HER2 epitop i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji vezuje drugi HER2 epitop, gde su prvi i drugi HER2 epitop različiti epitopi, i gde je nizak prosečni DAR prosečan DAR manji od 3.9.
[0008] U određenim primerima izvođenja konjugata antitela i leka analog auristatina-linker ima opštu Formulu (II):
gde:
X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-, ili je X odsutan;
R<1>je izabran od:
L je linker, i
predstavlja tačku vezivanja linkera-toksina za biparatopsko anti-HER2 antitelo; gde biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji vezuje prvi epitop HER2 i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji vezuje drugi epitop HER2, pri čemu su prvi i drugi epitop HER2 različiti epitopi, i
gde je nizak prosečni DAR prosečan DAR manji od 3.9.
[0009] U određenim primerima izvođenja, nizak prosečni DAR konjugata antitela i leka je između 0.5 i 3.5, odnosno između 0.5 i 2.5.
[0010] U određenim primerima izvođenja, konjugat antitela i leka sadrži 5% ili više vrsta DAR0 ili 15% ili više vrsta DAR0. U nekim primerima izvođenja konjugat antitela i leka sadrži između oko 5% i oko 50% vrsta DAR0, ili između oko 10% i oko 30% vrsta DAR0, ili između oko 10% i oko 25% vrsta DAR0, ili između oko 15% i oko 25% vrsta DAR0.
[0011] U određenim primerima izvođenja, konjugat antitela i leka sadrži 25% ili manje DAR6 ili većih vrsta, ili 15% ili manje DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja konjugat antitela i leka sadrži između 0% i oko 15% DAR6 ili većih vrsta, odnosno između oko 0% i oko 10% DAR6 ili većih vrsta.
[0012] Drugi aspekt predmetnog otkrića odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugat biparatopskog anti-HER2 antitela i leka kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
[0013] Sledeći aspekt se odnosi na postupak za inhibiciju rasta ćelije kancera koja eksprimira HER2, gde postupak obuhvata dovođenje u kontakt ćelije kancera sa efikasnom količinom konjugata biparatopskog anti-HER2 antitela i leka, kao što je ovde opisano.
[0014] Sledeći aspekt se odnosi na jedinjenja za upotrebu u postupku za lečenje kancera koji eksprimira HER2, a koji obuhvata davanje subjektu koji ima kancer koji eksprimira HER2 efikasne količine konjugata biparatopskog anti-HER2 antitela i leka kao što je ovde opisano.
[0015] Sledeći aspekt se odnosi na konjugat antitela i leka kao što je ovde opisano za upotrebu u terapiji.
[0016] Sledeći aspekt se odnosi na konjugat antitela i leka kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimira HER2 kod subjekta kome je to potrebno.
[0017] Sledeći aspekt se odnosi na upotrebu konjugata antitela i leka kao što je ovde opisano u proizvodnji leka za lečenje kancera koji eksprimira HER2.
[0018] Još jedan aspekt se odnosi na kompoziciju konjugata antitela i leka koja sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa analogom auristatina preko linkera (L), gde analog auristatinalinker ima opštu Formulu (II):
gde:
X je odsutan;
R<1>je izabran od:
L je linker, i
predstavlja tačku vezivanja analoga auristatina-linkera za biparatopsko anti-HER2 antitelo;
gde biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji vezuje prvi epitop HER2 na ECD4 u HER2 i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji vezuje drugi epitop HER2 na ECD2 u HER2, i
gde kompozicija konjugata antitela i leka ima prosečan DAR između 0.5 i 2.5 i sadrži između oko 10% i oko 30% vrsta DAR0 i između 0% i oko 15% DAR6 ili većih vrsta.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0019]
Slika 1 prikazuje neredukujuću i redukujuću SDS-PAGE za (A) v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR4) i (B) v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR2), svako u poređenju sa matičnim biparatopskim anti-HER2 antitelom (v10000).
Slika 2 prikazuje rezultate hromatografije sa hidrofobnim interakcijama (HIC) za (A) parentalno biparatopsko anti-HER2 antitelo v10000, (B) v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 koje pokazuje prosečan DAR od 3.92), i (C) v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 koje pokazuje prosečan DAR od 2.07). Pojedinačni doprinosi vrsta DAR0, DAR2, DAR4 i DAR6 prosečnom DAR prečišćenih ADC prikazani su na (D) i (E).
Slika 3 prikazuje rezultate ekskluzione hromatografije (SEC) za (A) parentalno biparatopsko anti-HER2 antitelo v10000, (B) v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR4), i (C) v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR2).
Slika 4 prikazuje rezultate testova vezivanja na bazi protočne citometrije na antigenpozitivnim ćelijama, poređenje vezivanja v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR4) i v10000 (parentalno biparatopsko anti-HER2 antitelo) za (A) ćelije karcinoma dojke JIMT-1 i (B) ćelije karcinoma bešike RT-112 i (C) poređenje vezivanja v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR2) i v10000 (parentalno biparatopsko anti-HER2 antitelo) za ćelije karcinoma dojke JIMT-1.
Slika 5 prikazuje rezultate lečenja ćelijskih linija karcinoma dojke BT-474 koje eksprimiraju HER2 (A), SK-BR-3 (B), HCC1954 (C), JIMT-1 (D) i ZR-75-1 (E) i HER2-negativnih ćelijskih linija MDA-MB-468 (F) pomoću v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR4) i v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR2).
Slika 6 prikazuje rezultate lečenja ćelijske linije karcinoma jajnika SK-OV-3 koja eksprimira HER2 (A), i ćelijske linije karcinoma dojke ZR-75-1 (B) i JIMT-1 (C) sa konjugatima antitela i leka koji sadrže v10000 konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri različitim prosečnim DAR. Pojedinačni doprinosi vrsta DAR0, DAR2, DAR4 i DAR6 prosečnom DAR ADC koji imaju prosečan DAR od 0.7; 2.2 i 3.9 prikazani su na (D). Slika 7 prikazuje rezultate lečenja q14d (jednom u 14 dana) x2 miševa sa ksenograftom poreklom od pacijenata sa kancerom dojke HBCx-13b naznačenim dozama (A) v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR4) i (B) v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR2). v15496 = vehikulum.
Slika 8 prikazuje rezultate lečenja qd (jednom dnevno) x1 miševa sa ksenograftom poreklom od pacijenata sa kancerom dojke ST-910 naznačenim dozama (A) v17597 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR4) i (B) v21252 (biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001 pri DAR2). v15496 = vehikulum.
Slika 9 prikazuje (A) profile srednje vrednosti (±SD) koncentracije v21252 u serumuvremena i (B) profile srednje vrednosti (±SD) ukupne koncentracije antitela u serumuvremena, nakon primene jedne doze v21252 kod ženki makaki (cynomolgus) majmuna (n=3) pri 9 mg/kg ili 12 mg/kg.
Slika 10 prikazuje profile srednje vrednosti (±SD) koncentracije v21252 u serumuvremena 1. dana (A) i 29. dana (B ) nakon infuzije v21252 na dve nedelje kod makaki majmuna (n=6) pri 12 mg/kg ili 9 mg/kg.
Slika 11 prikazuje profile srednje vrednosti (±SD) ukupne koncentracije antitela u serumuvremena 1. dana (A) i 29. dana (B ) nakon infuzije v21252 na dve nedelje kod makaki majmuna (n=6) pri 12 mg/kg ili 9 mg/kg.
Slika 12 prikazuje profile srednje vrednosti (±SD) koncentracije u serumu-vremena za v21252 i za ukupna antitela (konjugovana i nekonjugovana) nakon infuzije v21252 na dve nedelje kod makaki majmuna (n=6) pri 12 mg/kg ili 9 mg/kg.
Slika 13 prikazuje internalizaciju pHAb-konjugovanog v21252 u poređenju sa pHAbkonjugovanim Trastuzumabom-Linkerom-Toksinom 001 i negativnom kontrolom u (A) ćelijama SKBR3 i (B) ćelijama JIMT-1.
Slika 14 pokazuje internalizaciju pHAb-konjugovanog v21252 (A) u poređenju sa pHAbkonjugovanim Trastuzumabom-Linkerom-Toksinom 001 (B) u ćelijama SKBR3 u raznim vremenskim tačkama kao što je naznačeno. Nukleusi su prikazani u sivoj boji, a pHAb u beloj boji.
Slika 15 pokazuje komparativnu izloženost kod makaki majmuna i miševa tretiranih pomoću v21252 u naznačenim dozama: (A) izloženost kod makaki majmuna i miševa kojima je potkožno usađen tumor poreklom iz pacijenta sa visokim HER2 (HBCx-13b), (B) izloženost kod makaki majmuna i miševa kojima je potkožno usađen tumor poreklom iz pacijenta sa niskim HER2 (ST-910).
Slika 16 prikazuje rezultate lečenja miševa sa ksenograftom poreklom iz pacijenata sa kancerom jajnika LTL-654 qwk (jednom nedeljno) x4 sa 3 mg/kg vehikuluma ili v21252.
Slika 17 daje rezultate preživljavanja za miševe kojima su intrakranijalno implantirane ćelije BT-474 tumora dojke nakon nedeljne i.v. primene vehikuluma, kontrolnog konjugata (humanizovano antitelo protiv respiratornog sincicijalnog virusa konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR3.5) i v24029 (trastuzumab konjugovan pri DAR8 sa inhibitorom topoizomeraze I na bazi derivata egzatekana (DXd)), svaki pri 6 mg/kg nedeljno sa ukupno 12 injekcija.
Slika 18 daje rezultate preživljavanja za miševe kojima su intrakranijalno implantirane ćelije BT-474 tumora dojke nakon i.v. primene vehikuluma, kontrolnog konjugata (humanizovano antitelo protiv respiratornog sincicijalnog virusa konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001), ili v7155 (T-DM1, DAR3.5) pri 6 mg/kg nedeljno, sa ukupno 12 injekcija ili v21252 ili v24029 (trastuzumab konjugovan pri DAR8 sa inhibitorom topoizomeraze I na bazi derivata egzatekana (DXd)), svaki pri 6 mg/kg, na svake dve nedelje, sa ukupno 6 injekcija.
DETALJAN OPIS
[0020] Predmetno otkriće odnosi se na konjugate biparatopskog anti-HER2 antitela i leka (ADC) u kojima je lek analog auristatina i konjugovan je sa antitelom pri niskom prosečnom odnosu leka i antitela (DAR). ADC sa niskim prosečnim DAR (<3.9), kao što je ovde opisano, imaju poboljšanu podnošljivost i smanjenu toksičnost u poređenju sa odgovarajućim ADC koji ima DAR ≥3.9 kada se daje u istoj dozi toksina (analoga auristatina). Od posebnog interesa su ADC koji imaju prosečan DAR od oko 2.5 ili manje, kao što je između oko 1.8 i 2.5.
[0021] Predmetno otkriće takođe se odnosi na ADC koji su ovde opisani za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimira HER2.
Definicije
[0022] Osim ako nisu drugačije definisani, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ga obično razume stručnjak u ovoj oblasti.
[0023] Termin "subjekt", kao što se ovde koristi, odnosi se na životinju, u nekim primerima izvođenja sisara, koja je predmet lečenja, posmatranja ili eksperimenta. Životinja može da bude čovek, primat izuzev čoveka, životinja za pratnju (na primer pas, mačka, ili slično), životinja sa farme (na primer krava, ovca, svinja, konj ili slično) ili laboratorijska životinja (na primer pacov, miš, zamorče, primat izuzev čoveka, ili slično). U određenim primerima izvođenja, subjekt je čovek.
[0024] Termin "sisar", kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na ljude, primate izuzev čoveka, pse, mačke, miševe, goveda, konje i svinje. U određenim primerima izvođenja, sisar je čovek.
[0025] Kao što se ovde koristi, termin "oko" se odnosi na varijaciju od približno /-10% od date vrednosti. Treba razumeti da je takva varijacija uvek uključena u bilo koju datu vrednost koja je ovde prikazana, bez obzira na to da li se posebno poziva na to.
[0026] Upotreba pojma u jednini kada se ovde koristi zajedno sa terminom "koji sadrži" može da znači "jedan", ali je takođe u skladu sa određenim primerima izvođenja i značenje "jedan ili više", "najmanje jedan" ili "jedan ili više od jednog".
[0027] Kako se ovde koriste, termini "koji sadrži", "koji ima", "koji uključuje" i "koji obuhvata", kao i njihove gramatičke varijacije su inkluzivni ili otvoreni i ne isključuju dodatne, nenavedene elemente i/ili korake postupka. Termin "koji se u suštini sastoji od", kada se ovde koristi u vezi sa kompozicijom, upotrebom ili postupkom, označava da su možda prisutni dodatni elementi i/ili koraci postupka, ali da ovi dodaci ne utiču suštinski na način na koji navedena kompozicija, postupak ili upotreba funkcionišu. Termin "koji se sastoji od", kada se ovde koristi u vezi sa kompozicijom, upotrebom ili postupkom, isključuje prisustvo dodatnih elemenata i/ili koraka postupka. Kompozicija, upotreba ili postupak koji je ovde opisan kao takav da sadrži određene elemente i/ili korake takođe može, u određenim primerima izvođenja, da se suštinski sastoji od tih elemenata i/ili koraka, a u drugim primerima izvođenja da se sastoji od tih elemenata i/ili koraka, bez obzira da li se ti primeri izvođenja posebno pozivaju na njih.
[0028] Podrazumeva se da svaki primer izvođenja o kojem se ovde govori može da se sprovede u odnosu na bilo koji postupak, upotrebu ili kompoziciju koja je ovde obelodanjena.
[0029] Određena svojstva, strukture i/ili karakteristike opisane u vezi sa primerom izvođenja koji je ovde obelodanjen mogu da se kombinuju sa svojstvima, strukturama i/ili karakteristikama opisanim u vezi sa drugim primerom izvođenja koji je ovde obelodanjen na bilo koji pogodan način da bi se obezbedio jedan ili više dodatnih primera izvođenja.
[0030] Takođe treba shvatiti da pozitivno navođenje svojstva u jednom primeru izvođenja, služi kao osnova za isključivanje svojstva u alternativnom primeru izvođenja. Na primer, kada je lista opcija predstavljena za dati primer izvođenja ili patentni zahtev, treba razumeti da jedna ili više opcija mogu da budu izbrisane sa liste, a skraćena lista može da formira alternativni primer izvođenja, bez obzira na to da li se na takav alternativni primer izvođenja posebno poziva ili ne.
KONJUGATI BIPARATOPSKOG ANTI-HER2 ANTITELA I LEKA
[0031] Konjugati antitela i leka (ADC) predmetnog otkrića sadrže biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa toksinom preko linkera pri niskom prosečnom odnosu leka i antitela (DAR), pri čemu je toksin, toksin na bazi auristatina (ili "analog auristatina"). Primeri toksina na bazi auristatina poznati su u tehnici.
[0032] U određenim primerima izvođenja, analog auristatina je jedinjenje opšte Formule (I):
gde:
X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-, ili X je odsutan;
R<1>je izabran od:
i
R<2>je fenil.
[0033] "Nizak DAR", kao što se ovde koristi, definiše se kao prosečan DAR manji od 3.9, ali veći od 0.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je manji od 3.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je manji od 3.4, na primer, manji od 3.3, manji od 3.2 ili manji od 3.1. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je manji od 3.0. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je 2.9 ili manje, na primer, 2.8 ili manje, 2.7 ili manje, ili 2.6 ili manje. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je 2.5 ili manje, na primer, 2.4 ili manje, 2.3 ili manje, ili 2.2 ili manje. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je oko 2.0.
[0034] U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je između 0.5 i 3.8, na primer, između 0.5 i 3.5, ili između 0.5 i 2.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je između 0.7 i 3.8, na primer, između 0.7 i 3.5, između 0.7 i 3.0, ili između 0.7 i 2.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je između 1.0 i 3.8, na primer, između 1.0 i 3.5, između 1.0 i 3.0, ili između 1.0 i 2.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je između 1.5 i 3.8, na primer, između 1.5 i 3.5, između 1.5 i 3.0, ili između 1.5 i 2.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je između 1.6 i 3.8, na primer, između 1.6 i 3.5, između 1.6 i 3.0, ili između 1.6 i 2.5. U nekim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC je između 1.8 i 2.8, na primer, između 1.8 i 2.5.
[0035] Kao što je gore napomenuto, ADC sa niskim prosečnim DAR (<3.9), kao što je ovde opisano, imaju poboljšanu podnošljivost i smanjenu toksičnost u poređenju sa odgovarajućim ADC koji ima DAR ≥3.9 kada se daje u istoj dozi toksina. Kao što je poznato u tehnici, većina postupaka konjugacije daje kompoziciju ADC koja uključuje razne vrste DAR, pri čemu je navedeni DAR prosek pojedinačnih vrsta DAR. Bez ograničavanja bilo kakvom određenom teorijom, veća podnošljivost i smanjena toksičnost ADC sa niskim DAR mogu da budu posledica jednog ili oba elementa od smanjenja vrsta sa visokim DAR (6 ili više) u kompoziciji ADC i/ili povećanja vrste DAR0 u kompoziciji ADC.
[0036] U određenim primerima izvođenja, kompozicije ADC koje uključuju proporciju DAR0 vrsta iznad određenog praga mogu da predstavljaju prednost. U skladu sa tim, u nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži 5% ili više DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži 10% ili više DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži 15% ili više DAR0 vrsta, na primer, 20% ili više DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži između oko 5% i oko 50% DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži između oko 10% i oko 50% DAR0 vrsta, na primer, između oko 10% i oko 40%, između oko 10% i oko 30% DAR0 vrsta, ili između oko 10% i oko 25% DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži između oko 12% i oko 28% DAR0 vrsta, na primer, između oko 12% i oko 28% DAR0 vrsta, ili između oko 15% i oko 25% DAR0 vrsta.
[0037] U određenim primerima izvođenja, kompozicije ADC koje uključuju proporciju DAR6 ili većih vrsta ispod određenog praga mogu da predstavljaju prednost. U skladu sa tim, u nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži manje od oko 35% DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži 30% ili manje DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži 25% ili manje DAR6 ili većih vrsta, na primer, 20% ili manje, 15% ili manje, ili 10% ili manje DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži 9% ili manje DAR6 ili većih vrsta, na primer, 8% ili manje, 7% ili manje, 6% ili manje, ili 5% ili manje DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži između 0% i oko 35% DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži između 0% i oko 30% DAR6 ili većih vrsta, na primer, između 0% i oko 25%, ili između 0% i oko 20% DAR6 ili većih vrsta. U nekim primerima izvođenja, kompozicija ADC sa niskim DAR može da sadrži između 0% i oko 15% DAR6 ili većih vrsta, na primer, između oko 0% i oko 10%, između oko 0% i oko 8%, ili između 0% i oko 5% DAR6 ili većih vrsta.
[0038] Određeni primeri izvođenja odnose se na ADC koji sadrže biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa analogom auristatina preko linkera (L) pri niskom prosečnom odnosu leka i antitela (DAR), gde analog auristatina-linker ima opštu Formulu (II):
gde su X i R<1>definisani za opštu Formulu (I);
L je linker, i
predstavlja tačku vezivanja analoga auristatina-linkera za biparatopsko anti-HER2 antitelo.
[0039] Određeni primeri izvođenja se odnose na ADC koji ima opštu formulu (III):
gde su X i R<1>kao što je definisano za opštu Formulu (I);
L je linker;
n je prosečan odnos leka i antitela (DAR) i manji je od 3.9, i
Ab je biparatopsko anti-HER2 antitelo.
Biparatopska anti-HER2 antitela
[0040] ADC koji su ovde opisani sadrže biparatopsko anti-HER2 antitelo koje se vezuje za dva različita epitopa HER2.
[0041] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, uglavnom se odnosi na proteinski vezujući molekul sa funkcijama nalik imunoglobulinu. Tipični primeri antitela su imunoglobulini, kao i derivati ili njihovi funkcionalni fragmenti koji još uvek zadržavaju specifičnost vezivanja. Tehnike proizvodnje antitela su dobro poznate u ovoj oblasti. Termin "antitelo" takođe može da uključuje imunoglobuline različitih klasa (tj. IgA, IgG, IgM, IgD i IgE) i potklasa (kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2). Ilustrativni primeri antitela su cela antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, kao što su Fab fragmenti, F(ab')2, Fv fragmenti, jednolančani Fv fragmenti (scFv), dijatela, domenska antitela i njihove kombinacije. Domenska antitela domena mogu da budu jednodomenska antitela, antitela sa jednim varijabilnim domenom ili jedan varijabilni domen imunoglobulina koji ima samo jedan varijabilni domen, koji može da bude varijabilni domen teškog lanca ili varijabilni domen lakog lanca, koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od drugih varijabilnih regiona ili domena. Termin "antitelo" takođe uključuje primere izvođenja kao što su himerna, jednolančana i humanizovana antitela.
[0042] Tipično celo antitelo sadrži od najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac je sačinjen od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena: CH1, CH2 i CH3. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina poznati su kao α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) i μ (IgM). Svaki laki lanac je sačinjen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži samo jedan domen: CL. Laki lanci su klasifikovani ili kao kapa ili lambda. VH i VL regioni se mogu dodatno podeliti u regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), ispresecanim regionima koji su očuvaniji, označenim kao okvirni regioni (FW). Svaki VH i VL je sačinjen od tri CDR i četiri FW regiona, raspoređenih od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redosledom: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen (paratop) koji je u interakciji sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i C1q, što je komponenta sistema komplementa.
[0043] U određenim primerima izvođenja, biparatopska anti-HER2 antitela za uključivanje u ovde opisane ADC sadrže dva antigen-vezujuća polipeptida, od kojih se svaki vezuje za različit epitope HER2. "Antigen-vezujući polipeptidni konstrukt", kao što se ovde koristi, može da bude konstrukt zasnovan na imunoglobulinu, na primer, fragment antitela, ili da bude u formatu mimetika antitela koji nije imunoglobulin, kao što je antikalin, finomer, afimer, alfa-telo, DARPin ili avimer. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti sadržani u biparatopskom anti-HER2 antitelu mogu da budu konstrukti na bazi imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti sadržani u biparatopskom anti-HER2 antitelu mogu da budu delovi antitela.
[0044] U određenim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti sadržani u biparatopskom anti-HER2 antitelu mogu svaki nezavisno da budu Fab fragment, Fab' fragment, scFv ili sdAb. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti sadržani u biparatopskom anti-HER2 antitelu mogu da budu svaki nezavisno Fab fragment ili scFv. U nekim primerima izvođenja, jedan antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadržan u biparatopskom anti-HER2 antitelu može da bude Fab fragment, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt može da bude scFv.
[0045] U određenim primerima izvođenja, bar jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata sadržanih u biparatopskom anti-HER2 antitelu može da bude Fab fragment ili Fab' fragment. "Fab fragment" sadrži konstantni domen lakog lanca (CL) i prvi konstantni domen teškog lanca (CH1) zajedno sa varijabilnim domenima lakog i teškog lanca (VL, odnosno VH). Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodatku nekoliko aminokiselinskih ostataka na C-kraju CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab fragment može da bude i jednolančani Fab molekul, tj. Fab molekul u kome su laki lanac Fab i teški lanac Fab povezani peptidnim linkerom kako bi se formirao jedan peptidni lanac. Na primer, C-kraj lakog lanca Fab može da bude povezan sa N-krajem teškog lanca Fab u jednolančani molekul Fab.
[0046] U određenim primerima izvođenja, najmanje jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata sadržanih u biparatopskom anti-HER2 antitelu može da bude jednolančani Fv (scFv). "scFv" uključuje varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela u jednom polipeptidnom lancu. ScFv može opciono dalje da sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Na primer, scFv može da uključuje VL povezan preko njegovog C-kraja sa N-krajem VH polipeptidnim linkerom. Alternativno, scFv može da sadrži VH povezan preko njegovog C-kraja sa N-krajem VL polipeptidnim lancem ili linkerom (videti pregled u Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994)).
[0047] U određenim primerima izvođenja, najmanje jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata sadržanih u biparatopskom anti-HER2 antitelu može da bude u formatu jednodomenskog antitela (sdAb). SdAb format se odnosi na jedan imunoglobulinski domen. SdAb može da potiče, na primer, od kamelida. Antitela kamelida nemaju lake lance i njihova antigenvezujuća mesta se sastoje od jednog domena, koji se naziva "VHH". SdAb sadrži tri CDR/hipervarijabilne petlje koje čine antigen-vezujuće mesto: CDR1, CDR2 i CDR3. sdAb su prilično stabilni i lako se eksprimiraju, na primer, kao fuzija sa Fc lancem antitela (videti, na primer, Harmsen & De Haard, Appl. Mikrobiol Biotehnol.77(1): 13-22 (2007)).
Formati antitela
[0048] Biparatopska anti-HER2 antitela za uključivanje u ovde opisane ADC mogu da imaju različite formate. Minimalne komponente biparatopskog anti-HER2 antitela su prvi antigenvezujući polipeptidni konstrukt koji se vezuje za prvi HER2 epitop i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji se vezuje za drugi HER2 epitop, pri čemu su prvi i drugi HER2 epitop različiti. Antitelo koje sadrži dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta koja se vezuju za različite epitope HER2 može da se smatra bivalentnim, biparatopskim antitelom. Određeni primeri izvođenja odnose se na bivalentna, biparatopska anti-HER2 antitela. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži jedan ili više dodatnih antigenvezujućih polipeptidnih konstrukata, od kojih se svaki vezuje ili za prvi ili za drugi HER2 epitop. Na primer, u nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da bude trovalentno ili tetravalentno.
[0049] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo dalje sadrži linker koji povezuje prvi i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo dalje sadrži nosač (engl. - scaffold), a prvi i drugi antigenvezujući polipeptidni konstrukt je funkcionalno povezan sa nosačem. Termin "funkcionalno povezan", kao što se ovde koristi, znači da su opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na predviđeni način.
[0050] Prema tome, može se smatrati da biparatopska anti-HER2 antitela imaju modularnu arhitekturu koja uključuje dva modula antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta i opciono jedan ili oba modula linkera i modul nosača. Stručnjak će razumeti da ovi moduli mogu a se kombinuju na razne načine kako bi se obezbedila biparatopska anti-HER2 antitela koja imaju različite formate. Ovi formati su bazirani generalno na formatima antitela poznatim u tehnici (videti, na primer, recenziju Brinkmann & Kontermann, MABS, 9(2): 182-212 (2017), i Müller & Kontermann, "Bispecific Antibodies" in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)).
[0051] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži dva antigenvezujuća polipeptidna konstrukta, funkcionalno povezana sa nosačem. U nastavku su opisani odgovarajući nosači. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta funkcionalno povezana sa nosačem, a najmanje jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata je scFv. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta funkcionalno povezana sa nosačem, a najmanje jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata Fab.
[0052] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži tri ili četiri antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta i nosač. U ovom formatu, najmanje prvi i drugi antigenvezujući konstrukt su funkcionalno povezani sa nosačem. Treći i opciono četvrti antigen-vezujući polipeptidni konstrukt može da bude funkcionalno povezan sa nosačem ili sa prvim antigenvezujućim polipeptidnim konstruktom ili sa drugim antigen-vezujućim polipeptidnim konstruktom.
[0053] Biparatopska anti-HER2 antitela koja nemaju nosač obično sadrže dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta, funkcionalno povezana pomoću jednog ili više linkera. Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti mogu da budu u obliku scFv, Fab, sdAb ili njihova kombinacija. Na primer, korišćenjem scFv kao antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata mogu da se konstruišu formati kao što su tandem scFv ((scFv)2ili taFv), u kojima su scFv spojeni fleksibilnim linkerom. scFv mogu da se koriste i za konstruisanje formata dijatela, koje sadrži dva scFv povezana kratkim linkerom (obično dužine oko 5 aminokiselina). Ograničena dužina linkera rezultuje dimerizacijom scFv na način od glave ka repu. U bilo kom od prethodnih formata, scFv mogu da budu dodatno stabilizovani uključivanjem međudomenske disulfidne veze. Na primer, može se uvesti disulfidna veza između VL i VH kroz uvođenje dodatnih cisteinskih ostataka u svaki lanac (na primer, na poziciji 44 u VH i 100 u VL) (videti, na primer, Fitzgerald et al., Protein Engineering, 10: 1221-1225 (1997)), ili disulfidna veza može da se uvede između dva VH kako bi se dobio konstrukt koji ima DART format (videti, na primer, Johnson et al., J Mol. Biol., 399:436-449 (2010)).
[0054] Slično tome, u nekim primerima izvođenja mogu da se upotrebe formati koji sadrže dva sdAb, kao što su VH ili VHH, spojena preko odgovarajućeg linkera.
[0055] Ostali primeri anti-HER2 biparatopskih formata antitela koji nemaju nosač uključuju one zasnovane na Fab fragmentima, na primer, na formatima Fab2i F(ab')2, u kojima su Fab fragmenti povezani preko linkera ili zglobnog regiona IgG.
[0056] Kombinacije antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata u različitim oblicima takođe mogu da budu upotrebljene za generisanje alternativnih formata bez nosača. Na primer, scFv ili sdAb mogu da budu spojeni sa C-krajem bilo kog ili oba od lakog i teškog lanca Fab fragmenta čime nastaje bivalentni (Fab-scFv/sdAb) konstrukt.
[0057] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta i jedan ili više linkera, a da ne uključuje nosač. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta koji su scFv, Fab, sdAb ili njihova kombinacija, i jedan ili više linkera, a ne uključuje nosač.
Nosači
[0058] Biparatopska anti-HER2 antitela koja sadrže nosač mogu da budu konstruisana povezivanjem dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta sa odgovarajućim nosačem. Antigenvezujući polipeptidni konstrukti mogu da budu u jednom ili u kombinaciji gore opisanih oblika (na primer, scFv, Fab i/ili sdAb). Primeri odgovarajućih nosača opisani su detaljnije ispod i uključuju, ali nisu ograničeni na, Fc regione imunoglobulina, albumin, analoge i derivate albumina, heterodimerizujuće peptide (kao što su leucinski rajsferšlusi, peptidi "rajsferšlusa" koji obrazuju heterodimere poreklom od Jun i Fos, CH1 i CL domeni IgG ili barnaza-barstar toksini), citokine, hemokine ili faktore rasta. Drugi primeri uključuju antitela zasnovana na tehnologiji DOCK-AND-LOCK<™>(DNL<™>) koju su razvili IBC Pharmaceuticals, Inc. i Immunomedics, Inc. (videti, na primer, Chang, et al., Clin Cancer Res 13:5586s-5591s (2007)).
[0059] U nekim primerima izvođenja, biparatopska anti-HER2 antitela sadrže dva ili više antigenvezujućih polipeptidnih konstrukata i nosač. U određenim primerima izvođenja, biparatopska anti-HER2 antitela sadrže dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta, funkcionalno povezana sa nosačem.
[0060] Nosač može da bude peptid, polipeptid, polimer, nanočestica ili neki drugi hemijski entitet. Tamo gde je nosač polipeptid, svaki antigen-vezujući polipeptidni konstrukt biparatopskog anti-HER2 antitela može da bude povezan ili sa N- ili C-krajem polipeptidnog nosača. Biparatopska anti-HER2 antitela koja sadrže polipeptidne nosače u kojima je jedan ili više antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata povezano sa regionom koji nije N- ili C-kraj, na primer, preko bočnog lanca aminokiseline sa ili bez linkera, takođe se razmatraju u određenim primerima izvođenja.
[0061] U primerima izvođenja gde je nosač peptid ili polipeptid, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti mogu da budu povezani sa nosačem genetskom fuzijom ili hemijskom konjugacijom. Obično, kada je nosač peptid ili polipeptid, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti su povezani sa nosačem genetskom fuzijom. U nekim primerima izvođenja, gde je nosač polimer ili nanočestica, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti mogu da budu povezani sa nosačem hemijskom konjugacijom.
[0062] U tehnici su poznati brojni proteinski domeni koji čine selektivne parove dva različita polipeptida i mogu se koristiti za formiranje nosača. Primer su domeni leucinskog rajsferšlusa kao što su Fos i Jun koji se selektivno uparuju zajedno (Kostelny, et al., J Immunol, 148:1547-53 (1992); Wranik, et al., J. Biol. Chem., 287: 43331-43339 (2012)). Drugi parovi koji se selektivno uparuju uključuju, na primer, par barnaza-barstar (Deyev, et al., Nat Biotechnol, 21:1486-1492 (2003)), parove DNK lanca (Chaudri, et al., FEBS Letters, 450(1-2):23-26 (1999)) i podeljene fluorescentne proteinske parove (objava međunarodne patentne prijave br. WO 2011/135040).
[0063] Ostali primeri proteinskih nosača uključuju Fc regione imunoglobulina, albumin, analoge i derivate albumina, toksine, citokine, hemokine i faktore rasta. Upotreba proteinskih nosača u kombinaciji sa antigen-vezujućim fragmentima je opisana (videti, na primer, Müller et al., J Biol Chem, 282:12650-12660 (2007); McDonaugh et al., Mol Cancer Ther, 11:582-593 (2012); Vallera et al., Clin Cancer Res, 11:3879-3888 (2005); Song et al., Biotech Appl Biochem, 45:147-154 (2006), i objava SAD patentne prijave br.2009/0285816).
[0064] Na primer, pokazalo se da spajanje antigen-vezujućih fragmenata kao što su scFv, dijatela ili jednolančana dijatela sa albuminom poboljšava serumski poluživot antigen-vezujućih fragmenata (Müller et al., na istom mestu). Antigen-vezujući fragmenti mogu da budu spojeni na N- i/ili C-krajevima albumina, opciono preko linkera.
[0065] Opisani su derivati albumina u obliku heteromultimera koji sadrže dva transportna polipeptida dobijena segmentacijom proteina albumina tako da se transportni polipeptidi samostalno sklapaju kako bi formirali kvazi-nativni albumin (videti objavu međunarodne patentne prijave br. WO 2012/116453 i WO 2014/012082). Kao rezultat segmentacije albumina, heteromultimer uključuje četiri kraja i tako može da bude spojen sa do četiri različite antigenvezujuća fragmenta, opciono preko linkera.
[0066] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži proteinski nosač. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži proteinski nosač koji se zasniva na Fc regionu imunoglobulina, albuminu ili analogu ili derivatu albumina. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži proteinski nosač koji se zasniva na Fc regionu imunoglobulina, na primer, Fc regionu IgG.
[0067] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži proteinski nosač koji se zasniva na albuminu, na primer albuminu humanog seruma (HSA), ili analogu ili derivatu albumina. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži proteinski nosač koji se zasniva na derivatu albuma kao što je opisano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2012/116453 ili WO 2014/012082.
Fc regioni
[0068] Termini "Fc region", "Fc" ili "Fc domen", kako se ovde koriste, odnose se na C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bar deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativnu sekvencu Fc regiona i varijantne Fc regione. Osim ako nije drugačije navedeno ovde, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema sistemu numerisanja EU, nazvanom i EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
[0069] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koja se zasniva na Fc regionu imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, Fc region može da bude dimeran i sačinjen od dva Fc polipeptida. U nekim primerima izvođenja, Fc region može da bude sačinjen od jednog polipeptida.
[0070] "Fc polipeptid" dimernog Fc se odnosi na jedan od dva polipeptida koja formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži jedan ili više C-terminalnih konstantnih regiona teškog lanca imunoglobulina koji ima sposobnost stabilnog samo-povezivanja. Termini "prvi Fc polipeptid" i "drugi Fc polipeptid" mogu da se koriste zamenljivo pod uslovom da Fc region sadrži jedan prvi Fc polipeptid i jedan drugi Fc polipeptid.
[0071] Fc region sadrži CH3 domen, ili i CH3 i CH2 domen. Na primer, Fc polipeptid dimernog Fc regiona IgG sadrži sekvencu konstantnog domena CH2 IgG i CH3 IgG. CH3 domen sadrži dve CH3 sekvence, po jednu iz svakog od dva Fc polipeptida dimernog Fc regiona. CH2 domen sadrži dve CH2 sekvence, po jednu iz svakog od dva Fc polipeptida dimernog Fc regiona.
[0072] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na Fc regionu IgG. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na humanom Fc regionu. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na humanom Fc regionu IgG, na primer humanom Fc regionu IgG1.
[0073] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na Fc regionu IgG, koji je heterodimerni Fc region, koji sadrži prvi Fc polipeptid i drugi Fc polipeptid, od kojih svaki sadrži CH3 sekvencu, i opciono CH2 sekvencu.
[0074] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na Fc regionu koji sadrži prvi i drugi Fc polipeptid, i prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je funkcionalno povezan sa prvim Fc polipeptidom, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je funkcionalno povezan sa drugim Fc polipeptidom.
[0075] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na Fc regionu koji sadrži prvi i drugi Fc polipeptid, i prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je funkcionalno povezan sa prvim Fc polipeptidom, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je funkcionalno povezan sa drugim Fc polipeptidom, i u kome su prvi i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukti nezavisno Fab fragment ili scFv.
[0076] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na Fc regionu koji sadrži dve CH3 sekvence, od kojih bar jedna sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač koji se zasniva na Fc regionu koji sadrži dve CH3 sekvence i dve CH2 sekvence, gde bar jedna od CH2 sekvenci sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.
[0077] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži heterodimerni Fc region koji sadrži modifikovani CH3 domen, gde je modifikovani CH3 domen asimetrično modifikovani CH3 domen. Generalno, prvi Fc polipeptid heterodimernog Fc sadrži prvu CH3 sekvencu, a drugi Fc polipeptid sadrži drugu CH3 sekvencu.
[0078] Kao što se ovde koristi, "asimetrična aminokiselinska modifikacija" odnosi se na modifikaciju gde se aminokiselina na određenom položaju na prvoj CH3 sekvenci razlikuje od aminokiseline na drugoj CH3 sekvenci na istoj poziciji. Za CH3 sekvence koje sadrže asimetrične aminokiselinske modifikacije, prva i druga CH3 sekvenca će obično poželjno upariti da bi se formirao heterodimer, a ne homodimer. Ove asimetrične aminokiselinske modifikacije mogu da budu rezultat modifikacije samo jedne od dve aminokiseline na istom odgovarajućem položaju aminokiseline na svakoj sekvenci, ili različitih modifikacija obe aminokiseline na svakoj sekvenci na istoj odgovarajućoj poziciji na svakoj od prve i druge CH3 sekvence. Svaka od prve i druge CH3 sekvence heterodimernog Fc može da sadrži jednu ili više od jedne asimetričnih aminokiselinskih modifikacija.
[0079] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži nosač zasnovan na modifikovanom Fc regionu kao što je opisano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2012/058768 ili WO 2013/063702.
[0080] Tabela 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc sekvence humanog IgG1 (SEQ ID NO: 1), koja odgovara aminokiselinama 231 do 447 celog teškog lanca humanog IgG1. Sekvenca CH3 sadrži aminokiseline 341-447 celog teškog lanca humanog IgG1.
[0081] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc nosač koji sadrži modifikovani CH3 domen koji uključuje asimetrične aminokiselinske modifikacije koje podstiču formiranje heterodimernog Fc, umesto homodimernog Fc. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc nosač koji uključuje modifikacije na jednoj ili više sledećih pozicija: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 i/ili N390, kada se koristi EU numeracija.
[0082] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc koji sadrži modifikovani CH3 domen koji ima prvu polipeptidnu sekvencu koja sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407, i opciono dalje sadrži aminokiselinske modifikacije na poziciji L351, i drugu polipeptidnu sekvencu koja sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama T366 i T394, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji K392. U nekim primerima izvođenja, prva polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena može da sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji L351, a druga polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama T366 i T394, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji K392, a aminokiselinska modifikacija na poziciji F405 je F405A, F405I, F405M, F405S, F405T ili F405V; aminokiselinska modifikacija na poziciji Y407 je Y407I ili Y407V; aminokiselinska modifikacija na poziciji T366 je T366I, T366L ili T366M; aminokiselinska modifikacija na poziciji T394 je T394W; aminokiselinska modifikacija na poziciji L351 je L351Y, a aminokiselinska modifikacija na poziciji K392 je K392F, K392L ili K392M. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska modifikacija na poziciji F405 je F405A, F405S, F405T ili F405V.
[0083] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc koji sadrži modifikovani CH3 domen koji ima prvu Fc polipeptidnu sekvencu koja sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji L351, i drugu Fc polipeptidnu sekvencu koja sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama T366 i T394, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji K392, a aminokiselinska modifikacija na poziciji F405 je F405A, F405I, F405M, F405S, F405T ili F405V; aminokiselinska modifikacija na poziciji Y407 je Y407I ili Y407V; aminokiselinska modifikacija na poziciji T366 je T366I, T366L ili T366M; aminokiselinska modifikacija na poziciji T394 je T394W; aminokiselinska modifikacija na poziciji L351 je L351Y, a aminokiselinska modifikacija na poziciji K392 je K392F, K392L ili K392M, i jedna ili obe od prve i druge Fc polipeptidne sekvence dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju T350V. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska modifikacija na poziciji F405 je F405A, F405S, F405T ili F405V.
[0084] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc koji sadrži modifikovani CH3 domen kao što je gore opisano, u kome prva Fc polipeptidna sekvenca sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama F405 i Y407, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji L351, a druga Fc polipeptidna sekvenca sadrži aminokiselinske modifikacije na pozicijama T366 i T394, i opciono dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na poziciji K392, i u kome prva Fc polipeptidna sekvenca dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na jednoj ili obe pozicije S400 ili Q347 i/ili druga Fc polipeptidna sekvenca dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju na jednoj ili obe pozicije K360 ili N390, gde je aminokiselinska modifikacija na poziciji S400 S400E, S400D, S400R ili S400K; aminokiselinska modifikacija na poziciji Q347 je Q347R, Q347E ili Q347K; aminokiselinska modifikacija na poziciji K360 je K360D ili K360E, a aminokiselinska modifikacija na poziciji N390 je N390R, N390K ili N390D. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska modifikacija na poziciji F405 je F405A, F405S, F405T ili F405V.
[0085] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc nosač koji ima modifikovani CH3 domen koji sadrži modifikacije bilo koje od varijante 1, varijante 2, varijante 3, varijante 4 ili varijante 5, kao što je prikazano u tabeli 1.
Tabela 1: Fc sekvence IgG1
[0086] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc nosač koji ima modifikovani CH3 domen sa prvom CH3 sekvencom koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija izabranih od L351Y, F405A i Y407V, i drugom CH3 sekvencom koja sadrži aminokiselinske modifikacije T366L ili T366I; K392L ili K392M i T394W, i jedna ili obe od prve i druge CH3 sekvence mogu opciono dalje da sadrže aminokiselinsku modifikaciju T350V.
[0087] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc nosač koji ima modifikovani CH3 domen koji sadrži asimetrične aminokiselinske modifikacije, kao što je gore opisano, koje podstiču formiranje heterodimernog Fc u kome heterodimerni CH3 domen ima stabilnost koja se može uporediti sa homodimernim CH3 domenom divljeg tipa. Stabilnost CH3 domena može se proceniti merenjem temperature topljenja (Tm) CH3 domena, na primer diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). U nekim primerima izvođenja, jedna ili više asimetričnih aminokiselinskih modifikacija podstiču formiranje heterodimernog Fc domena u kojem CH3 domen ima stabilnost, praćenu preko temperature topljenja (Tm) u studiji diferencijalne skenirajuće kalorimetrije koja se nalazi unutar oko 8°C, na primer, unutar oko 7°C, oko 6°C, oko 5°C, ili oko 4°C, onoga što je primećeno za odgovarajući simetrični homodimerni CH3 domen divljeg tipa.
[0088] Heterodimerni Fc koji sadrži modifikovane CH3 sekvence može da bude formiran sa čistoćom od najmanje oko 75% u poređenju sa homodimernim Fc u eksprimiranom proizvodu. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži heterodimerni Fc nosač koji ima modifikovani CH3 domen koji sadrži asimetrične aminokiselinske modifikacije koje podstiču formiranje heterodimernog Fc sa čistoćom većom od oko 80%, većom od oko 85%, većom od oko 90%, većom od oko 95%, ili većom od oko 97%.
[0089] Dodatni postupci za modifikovanje monomernih Fc polipeptida za podsticanje formiranja heterodimernog Fc poznati su u tehnici i uključuju, na primer, one opisane u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 96/027011 (ispupčenja u udubljenjima); Gunasekaran et al. J Biol Chem, 285, 19637-46 (2010) (elektro-statički dizajn za postizanje selektivne heterodimerizacije); Davis et al., Prot Eng Des Sel, 23(4):195-202 (2010) (tehnologija domena konstruisanog izmenom lanaca (SEED)), i Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013) (izmena Fab-kraka).
[0090] U nekim primerima izvođenja, u kojima biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži heterodimerni Fc nosač, heterodimerni Fc takođe sadrži CH2 domen. U nekim primerima izvođenja, CH2 domen je modifikovani CH2 domen. Jedan od primera CH2 domena u Fc su aminokiseline 231-340 sekvence prikazane u tabeli 1. Nekoliko efektorskih funkcija su posredovane Fc receptorima (FcR), koji se vezuju za Fc antitela.
[0091] Fc receptori (FcR) uključuju receptore potklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. Termin FcR takođe može da uključuje u određenim primerima izvođenja neonatalni receptor, FcRn.
[0092] Modifikacije u CH2 domenu mogu da utiču na vezivanje FcR za Fc. Brojne aminokiselinske modifikacije u Fc regionu poznate su u tehnici po selektivnoj izmeni afiniteta Fc za različite Fcγ receptore. U nekim primerima izvođenja, u kojima biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži heterodimerni Fc nosač koji ima modifikovani CH2 domen, modifikovani CH2 domen može da sadrži jednu ili više modifikacija za podsticanje selektivnog vezivanja Fcγ receptora.
[0093] Neograničavajući primeri modifikacija koje menjaju vezivanje Fc od strane FcR uključuju S298A/E333A/K334A i S298A/E333A/K334A/K326A (Lu, et al., J Immunol Methods, 365(1-2):132-41 (2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L i F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen, et al., Cancer Res, 67(18):8882-90 (2007) i Nordstrom JL, et al., Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011)); F243L (Stewart, et al., Protein Eng Des Sel. 24(9):671-8 (2011)); S298A/E333A/K334A (Shields, et al., J Biol Chem, 276(9):6591-604 (2001)); S239D/I332E/A330L i S239D/I332E (Lazar, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005-10 (2006)); S239D/S267E i S267E/L328F (Chu, et al., Mol Immunol, 45(15):3926-33 (2008)). Dodatne modifikacije koje utiču na vezivanje Fc od strane FcR opisane su u Therapeutic Antibody Engineering (Strohl & Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1907568 37 9, Oct 2012, strana 283). Fc regioni koji sadrže asimetrične modifikacije koje utiču na vezivanje od strane FcR opisani su u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO 2014/190441.
[0094] Mogu se izvršiti dodatne modifikacije u Fc regionima kako bi se poboljšala njihova sposobnost posredovanja u efektorskoj funkciji. Takve modifikacije su poznate u tehnici i uključuju afukozilaciju, ili konstruisanje afiniteta Fc prema aktivirajućem receptoru, uglavnom FcγRIIIa za ADCC, i prema C1q za CDC. U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži Fc region modifikovan da poboljša njegovu sposobnost posredovanja u efektorskoj funkciji.
[0095] Postupci za proizvodnju antitela sa malo ili bez fukoze na glikozilacionom mestu u Fc (Asn 297, EU numeracija) bez menjanja aminokiselinske sekvence dobro su poznati u tehnici. Na primer, tehnologija GlymaX<®>(ProBioGen AG) (videti fon Horsten et al., Glycobiology, 20(12):1607-18 (2010) i SAD patent br. 8,409,572). U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži Fc region koji je aglikozilisan. U tom kontekstu, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da bude potpuno afukozilisano (tj. da ne sadrži detektabilnu fukozu) ili delimično afukozilisano, tako da biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrže manje od 95%, manje od 85%, manje od 75%, manje od 65%, manje od 55%, manje od 45%, manje od 35%, manje od 25%, manje od 15% ili manje od 5%, ili bilo koju količinu između navedenih, od količine fukoze koja se normalno detektuje kod sličnog konstrukta koji proizvodi ekspresioni sistem sisara.
[0096] Modifikacije Fc koje smanjuju FcγR i/ili vezivanje komplementa i/ili efektorsku funkciju poznate su u tehnici i uključuju one opisane iznad. Razne publikacije opisuju strategije koje su korišćene za konstruisanje antitela sa smanjenom ili utišanom efektorskom aktivnošću (videti, na primer, Strohl, Curr Opin Biotech 20:685-691 (2009) i Strohl & Strohl, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249). Ove strategije uključuju smanjenje efektorske funkcije kroz modifikaciju glikozilacije, upotrebu IgG2/IgG4 nosača ili uvođenje mutacija u zglobni ili CH2 region Fc (takođe pogledajte, SAD patentnu objavu br. 2011/0212087, međunarodnu patentnu objavu br. WO 2006/105338, SAD patentnu objavu br.2012/0225058, SAD patentnu objavu br.
2012/0251531 i Strop et al., J. Mol. Biol.420: 204-219 (2012)).
[0097] Specifični, neograničavajući primeri poznatih aminokiselinskih modifikacija za smanjenje vezivanja FcγR ili komplementa za Fc uključuju one identifikovane u tabeli 2.
Tabela 2: Modifikacije za smanjenje vezivanja FcγR ili komplementa za Fc
[0098] U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži Fc region koji sadrži modifikovani CH2 domen koji ima jednu ili više mutacija identifikovanih u tabeli 2. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži Fc region koji sadrži modifikovani CH2 domen koji ima aminokiselinske modifikacije na pozicijama L234, L235 i/ili D265. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo može da sadrži Fc region koji sadrži modifikovani CH2 domena koji ima aminokiselinske modifikacije L234A, L235A i D265S.
Epitopi HER2
[0099] Svaki od dva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo se vezuje za drugačiji epitop HER2, to jest, prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt se vezuje za prvi epitop HER2, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt se vezuje za drugi epitop HER2. U kontekstu predmetnog otkrića, svaki od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata se specifično vezuje za svoj ciljni epitop.
[0100] "Specifično vezuje" ili "specifično vezivanje" znači da je vezivanje selektivno za antigen i da može da se razlikuje od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta da se veže za specifični epitop može se izmeriti, na primer, pomoću enzimski-vezanog imunosorbentnog testa (ELISA), tehnika površinske rezonance plazmona (SPR) (analizirane na BIAcore instrumentu) (Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)) ili tradicionalni testova vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U nekim primerima izvođenja, smatra se da se antigen-vezujući polipeptidni konstrukt specifično vezuje za svoj ciljni epitop kada je stepen vezivanja antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta za nesrodni protein manji od oko 10% vezivanja antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta za njegov ciljni epitop mereno, na primer, pomoću SPR.
[0101] "HER2" (poznat i kao ErbB2) se odnosi na humani HER2 protein opisan, na primer, u Semba et al., PNAS (SAD), 82:6497-6501 (1985) i Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (GenBank pristupni broj X03363). Termini "erbB2" i "neu" se odnose na gen koji kodira humani HER2 protein. Termini p185 ili p185neu takođe mogu da se koriste za označavanje proteinskog proizvoda gena neu.
[0102] HER2 sadrži ekstracelularni domen, koji obično vezuje ligand HER, lipofilni transmembranski domen, očuvani intracelularni tirozin kinazni domen i karboksi-terminalni signalni domen koji ima nekoliko tirozinskih ostataka koji mogu da budu fosforilisani. Ekstracelularni (ekto) domen HER2 sadrži četiri domena, domene I-IV. Sekvenca HER2 je obezbeđena u tabeli 3 (SEQ ID NO:2). Granice ekstracelularnog domena (ECD) su: domen I -približno aminokiseline 1-165; domen II - približno aminokiseline 166-322; domen III - približno aminokiseline 323-488 i domen IV - približno aminokiseline 489-607.
Tabela 3: Aminokiselinska sekvenca humanog HER2 (SEQ ID NO:2)
[0103] "Epitop 2C4" je region u ekstracelularnom domenu HER2 za koji se vezuje antitelo 2C4 i sadrži ostatke iz domena II u ekstracelularnom domenu HER2 (naziva se i ECD2). 2C4 i Pertuzumab se vezuju za ekstracelularni domen HER2 na spoju domena I, II i III (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
[0104] "Epitop 4D5" je region u ekstracelularnom domenu HER2 za koji se vezuju antitela 4D5 (ATCC CRL 10463) i trastuzumab. Ovaj epitop je blizu transmembranskog domena HER2, a u okviru domena IV HER2 (naziva se i ECD4).
[0105] Uopšteno gledano, biparatopsko anti-HER2 antitelo predmetnog otkrića će se vezati za epitope unutar ekstracelularnih domena HER2. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi HER2 epitop vezani prvim i drugim antigen-vezujućim polipeptidnim konstruktom biparatopskog anti-HER2 antitela su epitopi koji se ne preklapaju. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi HER2 epitop vezani prvim i drugim antigen-vezujućim polipeptidnim konstruktom biparatopskog anti-HER2 antitela su na različitim ekstracelularnim domenima HER2. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt biparatopskog anti-HER2 antitela vezuje se za prvi HER2 epitop na prvom domenu HER2, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt vezuje se za drugi HER2 epitop na drugom domenu HER2. U nekim primerima izvođenja, prvi domen HER2 je ECD2, a drugi domen HER2 je ECD4.
[0106] U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo kompetira sa trastuzumabom za vezivanje za HER2. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo kompetira sa pertuzumabom za vezivanje za HER2. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo kompetira sa trastuzumabom za vezivanje za HER2, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji se vezuje za antigen kompetira sa pertuzumabom za vezivanje za HER2.
[0107] U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo je u Fab ili scFv formatu i kompetira sa trastuzumabom za vezivanje za HER2, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je u Fab ili scFv formatu i kompetira sa pertuzumabom za vezivanje za HER2. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo je u Fab formatu i kompetira sa trastuzumabom za vezivanje za HER2, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je u scFv formatu i kompetira sa pertuzumabom za vezivanje za HER2.
[0108] U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo vezuje se za isti epitop na HER2 kao trastuzumab. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo vezuje se za isti epitop na HER2 kao pertuzumab. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo vezuje se za isti epitop na HER2 kao trastuzumab, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt se vezuje za isti epitop na HER2 kao pertuzumab.
[0109] U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koje sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži CDR sekvence trastuzumaba ili njihovu varijantu koja sadrži jednu ili više mutacija za koje se zna da povećavaju vezivanje za HER2, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR pertuzumaba ili njihovu varijantu koja sadrži jednu ili više mutacija za koje se zna da povećavaju vezivanje za HER2. Literaturne mutacije za koje se zna da poboljšavaju vezivanje trastuzumaba ili pertuzumaba za HER2 uključuju one navedene u tabelama 4 i 5 ispod (HC = teški lanac; LC = laki lanac). Kombinacije ovih mutacija se takođe razmatraju.
Tabela 4: Mutacije trastuzumaba koje povećavaju vezivanje za HER2
Tabela 5: Mutacije pertuzumaba koje povećavaju vezivanje za HER2
[0110] Razna biparatopska anti-HER2 antitela su poznata u tehnici i mogu da budu pogodna antitela-kandidati za uključivanje u ovde opisane ADC. Primeri uključuju antitela opisana u objavama SAD patentne prijave br.2014/0170148; 2015/0284463; 2016/0289335; 2017/0029529; 2017/0291955 i 2018/0022820, i objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/179707.
[0111] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo je jedno od biparatopskih antitela opisanih u objavi SAD patentne prijave br. 2016/0289335. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo je jedno od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717 (videti tabele 6, 6A i 6B, i tabele sekvenci). U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VH sekvencu i VL sekvencu iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VH sekvencu i VL sekvencu iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, a drugi antigenvezujući polipeptidni konstrukt sadrži VH sekvencu i VL sekvencu iz ECD4-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717.
[0112] U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži CDR sekvence iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži CDR sekvence iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence iz ECD4-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717.
[0113] Stručnjak u ovoj oblasti će znati da se ograničen broj aminokiselinskih supstitucija može uvesti u CDR sekvence ili u VH ili VL sekvence poznatih antitela, a da antitelo ne izgubi sposobnost da se veže za svoj ciljni molekul. Kandidati za supstitucije aminokiselina mogu da se identifikuju kompjuterskim modeliranjem ili tehnikama poznatim u struci, kao što je alaninsko skeniranje, a dobijene varijante se testiraju na aktivnost vezivanja standardnim tehnikama. U skladu sa tim, u određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži skup CDR regiona (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca) koji imaju 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sekvence sa skupom CDR regiona iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD2. U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži varijantu ovih CDR sekvenci koja sadrži između 1 i 10 aminokiselinskih supstitucija duž šest CDR regiona (to jest, CDR mogu da budu modifikovani uključivanjem do 10 aminokiselinskih supstitucija sa bilo kojom kombinacijom CDR regiona koji su modifikovani), na primer, između 1 i 7 aminokiselinskih supstitucija, između 1 i 5 aminokiselinskih supstitucija, između 1 i 4 aminokiselinskih supstitucija, između 1 i 3 aminokiselinske supstitucije, između 1 i 2 aminokiselinske supstitucije, ili 1 aminokiselinska supstitucija, duž CDR regiona, pri čemu varijanta zadržava sposobnost vezivanja za ECD2. Obično će takve aminokiselinske supstitucije biti konzervativne aminokiselinske supstitucije. U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži skup CDR regiona (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca) koji imaju 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sekvence sa skupom CDR regiona iz ECD2-vezujućeg kraka v10000, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD2.
[0114] U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VH sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VH sekvenci iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD2. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VL sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VL sekvenci iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD2.
[0115] U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VH sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VH sekvenci iz ECD2-vezujućeg kraka v10000, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD2. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VL sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VL sekvenci iz ECD2-vezujućeg kraka v10000, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD2.
[0116] U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži skup CDR regiona (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca) koji ima 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sekvence sa skupom CDR regiona iz ECD4-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, gde antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD4. U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži varijantu ovih CDR sekvenci koja sadrži između 1 i 10 aminokiselinskih supstitucija duž šest CDR regiona (odnosno, CDR mogu da budu modifikovani uključivanjem do 10 aminokiselinskih supstitucija sa bilo kojom kombinacijom CDR regiona koji su modifikovani), na primer, između 1 i 7 aminokiselinskih supstitucija, između 1 i 5 aminokiselinskih supstitucija, između 1 i 4 aminokiselinske supstitucije, između 1 i 3 aminokiselinske supstitucije, između 1 i 2 aminokiselinske supstitucije, ili 1 aminokiselinska supstitucija, duž CDR regiona, pri čemu varijanta zadržava sposobnost vezivanja za ECD4. Obično će takve aminokiselinske supstitucije biti konzervativne aminokiselinske supstitucije. U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži skup CDR regiona (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca, i CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca) koji ima 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više, ili 100% identičnosti sekvence sa skupom CDR regiona iz ECD4-vezujućeg kraka v10000, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD4.
[0117] U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VH sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VH sekvenci iz ECD4-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD4. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog antiHER2 antitela sadrži VL sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VL sekvenci iz ECD4-vezujućeg kraka jednog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD4.
[0118] U određenim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VH sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VH sekvenci iz ECD4-vezujućeg kraka v10000, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD4. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži VL sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična VL sekvenci iz ECD4-vezujućeg kraka v10000, pri čemu antigen-vezujući polipeptidni konstrukt zadržava sposobnost vezivanja za ECD4.
Tabela 6: Ilustrativna biparatopska anti-HER2 antitela
* Numerisanje Fab ili varijabilnog domena prema Kabatu (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, p.647, 1991)
<§>Numerisanje CH3 prema EU indeksu kao u Kabat (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78-85)
Tabela 6A: CDR sekvence ECD2-vezujućeg kraka varijanti v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 i v6717
Tabela 6B: CDR sekvence ECD4-vezujućeg kraka varijanti v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 i v6717
[0119] U određenim primerima izvođenja, anti-HER2 biparatopsko antitelo je jedno od biparatopskih antitela opisanih u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/179707. Ova prijava opisuje visokoafinitetne varijante anti-HER2 antitela pertuzumab, uključujući biparatopska antitela koja sadrže sekvence iz visokoafinitetne varijante kao jedan antigen-vezujući domen. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo je jedno od v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ili v15085 (videti tabele 7 i 7A, i tabele sekvenci). U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata anti-HER2 biparatopskog antitela sadrži VH sekvencu i VL sekvencu iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ili v15085. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži CDR sekvence iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ili v15085. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata anti-HER2 biparatopskih antitela sadrži VH sekvencu i VL sekvencu iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ili v15085, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži VH sekvencu i VL sekvencu iz trastuzumaba. U nekim primerima izvođenja, jedan od antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata biparatopskog anti-HER2 antitela sadrži CDR sekvence iz ECD2-vezujućeg kraka jednog od v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ili v15085, a drugi antigenvezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence iz trastuzumaba.
Tabela 7: Dodatna ilustrativna biparatopska anti-HER2 antitela
* Numerisanje Fab ili varijabilnog domena prema Kabatu (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, p.647, 1991)
<§>Numerisanje CH3 prema EU indeksu kao u Kabat (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78-85)
Tabela 7A: CDR sekvence ECD2-vezujućeg kraka varijanti v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 i v15085
Svojstva biparatopskih anti-HER2 antitela
[0120] Konjugacija toksina pri niskom DAR je od posebne koristi za biparatopska anti-HER2 antitela koja pokazuju povećano vezivanje za HER2 i/ili veću internalizaciju u ćelije koje eksprimiraju HER2 u poređenju sa odgovarajućim bivalentnim monospecifičnim antitelom. Odgovarajuće bivalentno monospecifično antitelo može da sadrži dva prva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta, ili dva druga antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta koje čine biparatopsko antitelo.
[0121] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuju povećano vezivanje (tj. vezivanje sa većim afinitetom) za HER2 u poređenju sa odgovarajućim bivalentnim monospecifičnim antitelom. Povećano vezivanje može da bude pokazano, na primer, smanjenjem konstante disocijacije i/ili povećanjem maksimalnog vezivanja.
[0122] Konstanta disocijacije ili (KD) odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene ligand-proteinske interakcije, kao što su interakcije antitela i antigena. KDmeri sklonost dva proteina (npr. AB) da reverzibilno disociraju na manje komponente (A+B), i definiše se kao odnos brzine disocijacije (naziva se i "off-rate"; ili koff) i brzine asocijacije (naziva se i "on-rate"; ili kon). Tako je KDjednaka koff/koni izražena je kao molarna koncentracija (M). Iz toga sledi da što je manja KD, to je jači afinitet vezivanja. KDvrednosti za antitela mogu da se odrede metodama koje su dobro ustanovljene u tehnici. Primeri takvih metoda uključuju rezonancu površinskog plazmona (SPR), obično korišćenjem biosenzorskog sistema kao što je Biacore<®>sistem i kalorimetriju izotermalne titracije (ITC).
[0123] Prividna KD, ili prividna ravnotežna konstanta disocijacije predstavlja koncentraciju antitela na kojoj se zapaža pola maksimalnog vezivanja ćelija. Prividna KDzavisi od uslova eksperimenta vezivanja ćelija, kao što su različiti nivoi receptora eksprimiranih na ćelijama i uslovi inkubacije, pa se samim tim prividna KDgeneralno razlikuje od KDvrednosti utvrđenih iz molekularnih bešćelijskih eksperimenata, kao što su SPR i ITC. Međutim, generalno postoji dobro slaganje između različitih metoda.
[0124] Maksimalno vezivanje (ili "Bmax") odnosi se na maksimalni nivo vezivanja antitela na ćelijama pri zasićenim koncentracijama antitela. Ovaj parametar se može prikazati u proizvoljnoj jedinici MFI za relativna poređenja ili pretvoriti u apsolutnu vrednost koja odgovara broju antitela vezanih za ćeliju uz upotrebu standardne krive.
[0125] Bmax i prividna KDse mogu odrediti raznim tehnikama. Jedan od primera je merenje vezivanja za ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen pomoću protočne citometrije. Obično, u takvom eksperimentu, ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen se inkubiraju sa antitelima u različitim koncentracijama, peru, inkubiraju sa sekundarnim agensom za detekciju antitela, peru i analiziraju u protočnom citometru kako bi se izmerila medijana intenziteta fluorescencije (MFI) koja predstavlja jačinu signala detekcije na ćelijama, što je zauzvrat povezano sa brojem antitela vezanih za ćelije. Koncentracija antitela naspram podataka MFI se zatim uklapa u jednačinu vezivanja liganda do zasićenja, kako bi se dobili Bmax i prividna KD.
[0126] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo prikazuju povećanje Bmax za ciljnu ćeliju koja ispoljava HER2 u poređenju sa odgovarajućim referentnim antitelom. Za biparatopsko anti-HER2 antitelo koje sadrži prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt, kao što je opisano ovde, odgovarajuće referentno antitelo bilo bi bivalentno monospecifično antitelo koje sadrži dva prva antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta, ili dva druga antigen-vezujuća polipeptidna konstrukta. U određenim primerima izvođenja, Bmax određeno za biparatopsko anti-HER2 antitelo je najmanje oko 110% Bmax odgovarajućeg referentnog antitela. U nekim primerima izvođenja, Bmax određeno za biparatopsko anti-HER2 antitelo je najmanje oko 125% Bmax za odgovarajuće referentno antitelo, na primer, oko 150% Bmax odgovarajućeg referentnog antitela, ili najmanje oko 200% Bmax odgovarajućeg referentnog antitela.
[0127] U nekim primerima izvođenja, Bmax određeno za biparatopsko anti-HER2 antitelo je 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 ili 2.0 puta Bmax referentnog antitela.
[0128] U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuju veću internalizaciju u ćelije koje eksprimiraju HER2 od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela. Biparatopska anti-HER2 antitela se internalizuju u HER2+ ćelije putem vezivanja za receptor HER2. Biparatopska anti-HER2 antitela se tako mogu smatrati sposobnim da izazovu internalizaciju receptora u HER2+ ćelijama.
[0129] Internalizacija antitela može da se meri upotrebom metoda poznatih u tehnici, na primer, metodom direktne internalizacije prema protokolu detaljno opisanom u Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57: 1879–1890 (2008). Kao što je poznato u tehnici, ćelije kancera mogu da eksprimiraju HER2 na raznim nivoima. Jedna od metoda klasifikovanja ćelija koje eksprimiraju HER2 je kao HER2 1+, 2+ ili 3+ (nisko, srednje, odnosno visoko). U određenim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuju veću internalizaciju od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela u ćelijama koje eksprimiraju HER2 na 3+ nivou. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuju veću internalizaciju od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela u ćelijama koje eksprimiraju HER2 na 2+ nivou. U nekim primerima izvođenja, biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuju veću internalizaciju od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela u ćelijama koje eksprimiraju HER2 na 1+ nivou. Primeri ćelijskih linija koje eksprimiraju različite nivoe HER2 opisani su detaljnije u nastavku.
[0130] U kontekstu predmetnog otkrića, smatra se da biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuje veću internalizaciju u ćelije koje eksprimiraju HER2 od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela kada je količina biparatopskog anti-HER2 antitela internalizovana u ćelije koje eksprimiraju HER2 najmanje 1.2 puta veća od količine referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela internalizovanog u iste ćelije koje eksprimiraju HER2. U određenim primerima izvođenja, količina internalizovanog antitela se određuje metodom direktne internalizacije prema protokolu detaljno opisanom u Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008). U nekim primerima izvođenja, količina internalizovanog antitela se određuje u HER-2 eksprimirajućim ćelijama koje eksprimiraju HER2 na nivou od 2+.
[0131] U nekim primerima izvođenja, smatra se da biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuje veću internalizaciju u ćelije koje eksprimiraju HER2 od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela kada je količina biparatopskog anti-HER2 antitela internalizovana u ćelije koje eksprimiraju HER2 najmanje 1.3 puta veća od količine referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela internalizovanog u iste ćelije koje eksprimiraju HER2. U nekim primerima izvođenja, smatra se da biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuje veću internalizaciju u ćelije koje eksprimiraju HER2 od odgovarajućeg referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela kada je količina biparatopskog anti-HER2 antitela internalizovana u ćelije koje eksprimiraju HER2 najmanje 1.4 puta veća, na primer, najmanje 1.5 puta veća, 1.6 puta veća, 1.7 puta veća, 1.8 puta veća, 1.9 puta veća, ili 2.0 puta veća, od količine referentnog bivalentnog monospecifičnog antitela internalizovanog u iste ćelije koje eksprimiraju HER2. U određenim primerima izvođenja, količina internalizovanog antitela se određuje metodom direktne internalizacije prema protokolu detaljno opisanom u Schmidt, M. et al., Cancer Immunol Immunother, 57:1879-1890 (2008). U nekim primerima izvođenja, količina internalizovanog antitela se određuje u ćelijama koje eksprimiraju HER2 na nivou od 2+.
Analozi auristatina
[0132] Ovde opisani ADC sadrže toksin na bazi auristatina (ili "analog auristatina"). Razni analozi auristatina poznati su u stanju tehnike. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na, monometilauristatin F (MMAF), monometilauristatin E (MMAE), auristatin EB (AEB), auristatin EVB (AEVB) i auristatin F fenilendiamin (AFP). Sinteza i struktura različitih analoga auristatina opisani su u SAD patentu br.6.884.869; 7.098.308; 7.256.257 i 7.498.298.
[0133] U određenim primerima izvođenja, analog auristatina koji je uključen u ADC opisan ovde može da bude analog auristatina kao što je opisano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/041082. U određenim primerima izvođenja, analog auristatina uključen u ovde opisane ADC je jedinjenje opšte Formule (I):
gde:
X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-, ili X je odsutan;
R<1>je izabran od:
R<2>je fenil.
[0134] U određenim primerima izvođenja, u jedinjenjima opšte Formule (I), R<1>je izabran od:
[0135] U određenim primerima izvođenja, u jedinjenjima opšte Formule (I), X je odsutan.
[0136] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje opšte Formule (I) ima opštu Formulu (IV):
gde je R<1>kao što je definisano za opštu Formulu (I).
[0137] U određenim primerima izvođenja, u jedinjenjima Formule (IV), R<1>je izabran od:
[0138] U određenim primerima izvođenja, u jedinjenjima Formule (IV), R<1>je:
[0140] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje opšte Formule (I) ima opštu Formulu (V):
gde je R<1>kao što je definisano za opštu Formulu (I).
[0141] U određenim primerima izvođenja, u jedinjenjima Formule (V), R<1>je izabran od:
[0142] U određenim primerima izvođenja, u jedinjenjima Formule (V), R<1>je:
[0144] Jedinjenja opšte Formule (I) mogu da budu pripremljena standardnim sintetičkim protokolima organske hemije od komercijalno dostupnih polaznih materijala. Ilustrativni postupci su obezbeđeni u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/041082 i u odeljku Primeri ispod.
[0145] Podrazumeva se da upućivanje na jedinjenja opšte Formule (I) u ostatku ovog otkrića uključuje, u raznim primerima izvođenja, jedinjenja opšte Formule (IV) i (V), u istoj meri kao da su primeri izvođenja koji navode svaku od ovih formula pojedinačno posebno navedeni.
[0146] U određenim primerima izvođenja, ADC predmetnog otkrića sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa analogom auristatina (toksinom) putem linkera (L), u kojem linkertoksin ima opštu Formulu (II):
gde:
X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-, ili X je odsutan;
R<1>je izabran od:
R<2>je fenil;
L je linker, i
predstavlja tačku vezivanja linkera-toksina za biparatopsko anti-HER2 antitelo.
[0147] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (II), R<1>je izabran od:
[0148] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (II), X je odsutan.
[0149] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (II), L je otcepivi linker.
[0150] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (II), L je linker koji sadrži peptid.
[0151] U određenim primerima izvođenja, linker-toksin opšte Formule (II) ima opštu Formulu
gde su R<1>, L i kao što je gore definisano za opštu Formulu (II).
[0152] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (X), R<1>je izabran od:
[0153] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (X), R<1>is
[0155] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (X), L je otcepivi linker.
[0156] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (X), L je linker koji sadrži peptid.
[0157] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (X), L je proteazom otcepiv linker.
[0158] U određenim primerima izvođenja, linker-toksin opšte Formule (II) ima opštu Formulu (XI):
u kojoj su R<1>, L i kao što je gore definisano za opštu Formulu (II).
[0159] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (XI), R<1>je izabran od:
[0160] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (XI), R<1>je:
[0162] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (XI), L je otcepivi linker.
[0163] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (XI), L je linker koji sadrži peptid.
[0164] U nekim primerima izvođenja, u linkeru-toksinu opšte Formule (XI), L je proteazom otcepiv linker.
[0165] U ovom dokumentu razmatraju se i ADC koji sadrže biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa molekulom linker-toksin opšte Formule (II), Formule (X) ili Formule (XI), u kojoj linker ima opštu Formulu (VIII) ili (IX) kao što je prikazano ispod.
[0166] U određenim primerima izvođenja, ADC sadrži linker-toksin koji ima strukturu:
gde je A-S- tačka vezivanja za biparatopsko anti-HER2 antitelo.
[0167] U određenim primerima izvođenja, ADC predmetnog otkrića koji sadrži biparatopsko antiHER2 antitelo konjugovano sa analogom auristatina (toksinom) preko linkera (L) ima opštu Formulu (III):
gde su X i R<1>kao što je definisano za opštu Formulu (II);
L je linker;
n je prosečan odnos leka i antitela (DAR) i manji je od 3.9, i
Ab je biparatopsko anti-HER2 antitelo.
[0168] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte formule (III), R<1>je izabran od:
[0169] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), X je odsutan.
[0170] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), R<1>je:
i
X je odsutan.
[0171] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), R<1>je:
i
X je odsutan.
[0172] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-[0173] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), R<1>je:
i
X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-.
[0174] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), R<1>je:
i
X je -C(O)NHCH(CH2R<2>)-.
[0175] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), L je otcepivi linker.
[0176] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), L je linker koji sadrži peptid.
[0177] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), L je proteazom otcepiv linker.
[0178] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), n je između 0.5 i 3.8.
[0179] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), n je između 0.7 i 3.8, između 0.7 i 3.5, između 0.7 i 3.0, odnosno između 0.7 i 2.5.
[0180] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), n je između 1.0 i 3.8, između 1.0 i 3.5, između 1.0 i 3.0, odnosno između 1.0 i 2.5.
[0181] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), n je između 1.5 i 3.8, između 1.5 i 3.5, između 1.5 i 3.0, ili između 1.5 i 2.5.
[0182] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), n je između 1.6 i 3.8, između 1.6 i 3.5, između 1.6 i 3.0, ili između 1.6 i 2.5.
[0183] U nekim primerima izvođenja, u ADC opšte Formule (III), n je između 1.8 i 2.8, odnosno između 1.8 i 2.5.
[0184] Razmatraju se i sve kombinacije bilo kog od navedenih primera izvođenja za jedinjenja opšte Formule (III) i svaka kombinacija čini poseban primer izvođenja za potrebe predmetnog otkrića.
Linkeri
[0185] U ovde opisanim ADC, biparatopsko anti-HER2 antitelo je vezano za analog auristatina (toksin) pomoću linkera. Linkeri su bifunkcionalni ili multifunkcionalni fragmenti sposobni da povežu jedan ili više molekula toksina sa antitelom. Linker može da bude bifunkcionalan (ili monovalentan) tako da povezuje jedan lek sa jednim mestom na antitelu, ili može da bude multifunkcionalan (ili polivalentan) tako da povezuje više od jednog molekula toksina sa jednim mestom na antitelu. Linkeri sposobni da povežu jedan molekul toksina sa više od jednog mesta na antitelu takođe se mogu smatrati multifunkcionalnim.
[0186] Vezivanje linkera za antitelo može da se postigne na razne načine, kao što je preko površinskih lizina na antitelu, reduktivnim kuplovanjem sa oksidovanim ugljenim hidratima na antitelu, ili preko cisteinskih ostataka na antitela oslobođenih redukovanjem međumolekulskih disulfidnih veza. Alternativno, vezivanje linkera za antitelo može da se postigne modifikacijom antitela kako bi se uključili dodatni cisteinski ostaci (videti, na primer, SAD patent br.7,521,541; 8,455,622 i 9,000,130) ili neprirodne aminokiseline koje obezbeđuju reaktivne ručice, kao što su selenometionin, p-acetilfenilalanin, formilglicin ili p-azidometil-L-fenilalanin (videti, na primer, Hofer et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101-16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106:3000-3005 (2009); Zimerman et al., Bioconj. Chem., 25:351-361 (2014)), da bi se omogućila mesto-specifična konjugacija.
[0187] Linkeri uključuju funkcionalnu grupu sposobnu da reaguje sa ciljnom grupom ili grupama na antitelu, i jednu ili više funkcionalnih grupa sposobnih da reaguju sa ciljnom grupom na toksinu. Odgovarajuće funkcionalne grupe su poznate u tehnici i uključuju one opisane, na primer, u Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press).
[0188] Neograničavajući primeri funkcionalnih grupa za reakciju sa slobodnim cisteinima ili tiolima uključuju maleimid, haloacetamid, haloacetil, aktivirane estre kao što su sukcinimidni estri, 4-nitrofenil estri, pentafluorofenil estri, tetrafluorofenil estri, anhidridi, acil-hloridi, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocijanati. Takođe korisni u ovom kontekstu su "samo-stabilizujući" maleimidi kao što je opisano u Lyon et al., Nat. Biotechnol., 32:1059-1062 (2014).
[0189] Neograničavajući primeri funkcionalnih grupa za reakciju sa površinskim lizinima na antitelu i slobodnim aminima na toksinu uključuju aktivirane estre kao što su N-hidrokaisukcinamidni (NHS) estri, sulfo-NHS estri, imido estri kao što je Trautov reagens, izotiocijanati, aldehidi i acid-anhidridi kao što je anhidrid dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA). Među ostalim primerima su sukcinimido-1,1,3,3-tetra-metiluronijum tetrafluoroborat (TSTU) i benzotriazol-1-il-oksitripolidinofosfonijum heksafluorofosfat (PyBOP).
[0190] Neograničavajući primeri funkcionalnih grupa sposobnih da reaguju sa elektrofilnom grupom na antitelu ili toksinu (kao što su aldehid ili keton karbonil grupa) uključuju hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid.
[0191] Ostali linkeri uključuju one koji imaju funkcionalnu grupu koja omogućava premošćavanje dva međulančana cisteina na antitelu, kao što je ThioBridge<™>linker (Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25:1124-1136 (2014)), ditiomaleimidni (DTM) linker (Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986-3998 (2015)), linker na bazi ditioaril(TCEP)piridazindiona (Lee.et, Chem. Sci., 7:799-802 (2016)), linker na bazi dibromopiridazindiona (Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)) i drugi poznati u stanju tehnike.
[0192] Linker može da sadrži jednu ili više komponenti linkera. Linker će obično sadržati dve ili više komponenti linkera. Ilustrativne komponente linkera uključuju funkcionalne grupe za reakciju sa antitelom, funkcionalne grupe za reakciju sa toksinom, noseće jedinice, peptidne komponente, samouništavajuće grupe, samoeliminišuće grupe, hidrofilne fragmente, i slično. U tehnici su poznate razne komponente linkera, od kojih su neke opisane u nastavku.
[0193] Određene korisne komponente linkera mogu da se dobiju iz različitih komercijalnih izvora, kao što su Pierce Biotechnology, Inc. (sada Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Colo.), ili mogu da se sintetišu u skladu sa procedurama opisanim u tehnici (videti, na primer, Toki et al., J. Org. Chem., 67:1866-1872 (2002); Dubowchik, et al., Tetrahedron Letters, 38:5257-60 (1997); Walker, M. A., J. Org. Chem., 60:5352-5355 (1995); Frisch, et al., Bioconjugate Chem., 7:180-186 (1996); SAD patenti br. 6,214,345 i 7,553,816 i objavu međunarodne patentne prijave br. WO 02/088172).
[0194] Primeri komponenata linkera uključuju, ali nisu ograničeni na N-(β-maleimidopropilokai)-N-hidroksi sukcinimid estar (BMPS), N-(ε-maleimidokaproiloksi) sukcinimid estar (EMCS), N-[γ-maleimidobutiriloksi]sukcinimid estar (GMBS), 1,6-heksan-bis-vinilsulfon (HBVS), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat) (LC-SMCC), mmaleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), hidrazid 4-(4-N-maleimidofenil)buterne kiseline (MPBH), sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat (SBAP), sukcinimidil jodoacetat (SIA), sukcinimidil (4-jodoacetil)aminobenzoat (STAB), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), N-sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat (SMPB), sukcinimidil 6-[(β-maleimidopropionamido)heksanoat] (SMPH), iminotiolan (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB i sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat (SVSB).
[0195] Dodatni primeri uključuju bis-maleimidne reagense kao što su ditiobismaleimidoetan (DTME), bis-maleimido-trioksietilen glikol (BMPEO), 1,4-bismaleimidobutan (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroksibutan (BMDB), bismaleimidoheksan (BMH), bismaleimidoetan (BMOE), BM(PEG)2i BM(PEG)3; bifunkcionalne derivate imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivne estre (kao što su disukcinimidil suberat), aldehide (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što su bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bisdiazonijumske derivate (kao što su bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanate (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).
[0196] Odgovarajući linkeri su obično hemijski stabilniji u uslovima izvan ćelije nego u uslovima unutar ćelije, mada se manje stabilni linkeri mogu razmatrati u određenim situacijama, kao na primer kada je toksin selektivan ili usmeren i ima nisku toksičnost za normalne ćelije. Linkeri mogu da budu "otcepivi linkeri" ili "neotcepivi linkeri". Otcepivi linker je obično podložan cepanju pod intracelularnim uslovima, na primer, putem procesa u lizozomima. Primeri uključuju linkere koji su osetljivi na proteazu, osetljivi na kiselinu, osetljivi na redukciju ili fotolabilni. Nasuprot tome, neotcepivi linkeri se oslanjaju na razgradnju antitela u ćeliji, što obično rezultira oslobađanjem fragmenta aminokiselina-linker-toksin.
[0197] Odgovarajući otcepivi linkeri uključuju, na primer, linkere koji sadrže peptidnu komponentu koja uključuje dve ili više aminokiselina i koja je otcepiva intracelularnom proteazom, kao što je lizozomska proteaza ili endozomska proteaza. Peptidna komponenta može da sadrži aminokiselinske ostatke koji se javljaju prirodno i/ili manje zastupljene aminokiseline i/ili neprirodne analoge aminokiselina, kao što je citrulin. Peptidne komponente mogu da budu dizajnirane i optimizovane za enzimsko cepanje određenim enzimom, na primer, proteazom povezanom sa tumorom, katepsinom B, C ili D ili plazmin protezom.
[0198] U određenim primerima izvođenja, linker uključen u ADC može da bude linker koji sadrži dipeptid, kao što je linker koji sadrži valin-citrulin (Val-Cit) ili fenilalanin-lizin (Phe-Lys). Drugi primeri odgovarajućih dipeptida za uključivanje u linkere su Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, PhehomoLys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys i Met-(D)Lys. Otcepivi linkeri takođe mogu da sadrže duže peptidne komponente kao što su tripeptidi, tetrapeptidi ili pentapeptidi. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na tripeptide Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys i (D)Ala-Phe-Lys i tetrapeptide Gly-Phe-Leu-Gly i Ala-Leu-Ala-Leu.
[0199] Dodatni primeri otcepivih linkera uključuju linkere koji sadrže disulfide, kao što su, na primer, N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio) butanoat (SPBD) i N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoat (sulfo-SPBD). Linkeri koji sadrže disulfide mogu opciono da uključuju dodatne grupe koje će obezbediti sterno ometanje pored disulfidne veze kako bi se poboljšala ekstracelularna stabilnost linkera, kao što je uključivanje geminalne dimetil grupe. Drugi odgovarajući linkeri uključuju linkere hidrolizabilne na određenom pH ili unutar pH opsega, kao što su hidrazonski linkeri. Linkeri koji sadrže kombinacije ovih funkcionalnih grupa takođe mogu da budu korisni, na primer, linkeri koji sadrže i hidrazon i disulfid poznati su u tehnici.
[0200] Dalji primer otcepivog linkera je linker koji sadrži β-glukuronid, koji je otcepiv pomoću βglukuronidaze, enzima prisutnog u lizozomima i intersticijumu tumora (videti, na primer, De Graaf et al., Curr. Pharm. Des., 8: 1391-1403 (2002)).
[0201] Otcepivi linkeri mogu opciono dalje da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti kao što su samouništavajuće grupe i samoeliminišuće grupe, noseće jedinice ili hidrofilni fragmenti.
[0202] Samouništavajuće grupe i samoeliminišuće grupe koje pronalaze upotrebu u linkerima uključuju, na primer, p-aminobenziloksikarbonil (PABC) i p-aminobenzil etarske (PABE) grupe i metilovani etilen diamin (MED). Drugi primeri samouništavajućih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PABC ili PABE grupi kao što su heterociklični derivati, na primer 2-aminoimidazol-5-metanol derivati kao što je opisano u SAD patentu br.7,375,078. Drugi primeri uključuju grupe koje podležu ciklizaciji pri hidrolizi amidnih veza, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobuterne kiseline (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 2:223-227 (1995)) i amidi 2-aminofenilpropionske kiseline (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 55:5867-5877 (1990)).
[0203] Noseće jedinice koje nalaze upotrebu u linkerima za ADC uključuju, na primer, alkilen grupe i noseće jedinice na bazi alifatičnih kiselina, dikiselina, amina ili diamina, kao što su diglikolat, malonat, kaproat i kaproamid. Među ostalim nosećim jedinicama su, na primer, noseće jedinice na bazi glicina, polietilen glikolne (PEG) noseće jedinice i monometoksi polietilen glikolne (mPEG) noseće jedinice. PEG i mPEG noseće jedinice takođe funkcionišu kao hidrofilni fragmenti.
[0204] Primeri komponenti koje se obično nalaze u otcepivim linkerima koji mogu da pronađu upotrebu u ADC predmetnog otkrića u nekim primerima izvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na SPBD, sulfo-SPBD, hidrazon, Val-Cit, maleidokaproil (MC ili mc), mc-Val-Cit, mc-Val-Cit-PABC, Phe-Lys, mc-Phe-Lys, mc-Phe-Lys-PABC, maleimido trietilen glikolat (MT), MT-Val-Cit, MT-Phe-Lys i adipat (AD).
[0205] U određenim primerima izvođenja, linker koji je uključen u ADC predmetnog otkrića su linkeri zasnovani na peptidima koji imaju opštu Formulu (VI):
gde:
Z je funkcionalna grupa sposobna da reaguje sa ciljnom grupom na antitelu;
Str je noseća jedinica;
AA1i AA2su svaki nezavisno aminokiselina, gde AA1-[AA2]mformira mesto cepanja proteazom;
X je samouništavajuća grupa;
D je tačka vezivanja za analog auristatina;
s je 0 ili 1;
m je ceo broj između 1 i 4, i
o je 0, 1 ili 2.
[0206] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), Z je:
[0207] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), Str je izabran od
gde:
R je H ili C1-C6alkil;
p je ceo broj između 2 i 10, i
q je ceo broj između 1 i 10.
[0208] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), Str je:
gde su p i q kao što je definisano iznad.
[0209] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), Str je:
gde je p ceo broj između 2 i 6, i
q je ceo broj između 2 i 8.
[0210] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), AA1-[AA2]mse bira od Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly i Ala-Leu-Ala-Leu.
[0211] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), m je 1 (tj. AA1-[AA2]mje dipeptid).
[0212] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), AA1-[AA2]mje dipeptid izabran od Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit i Trp-Cit.
[0213] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), svaki X je nezavisno odabran od paminobenziloksikarbonila (PABC), p-aminobenzil etra (PABE) i metilovanog etilen diamina (MED).
[0214] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), m je 1, 2 ili 3.
[0215] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), s je 1.
[0216] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI), o je 0.
[0217] U nekim primerima izvođenja, u opštoj Formuli (VI):
gde je p ceo broj između 2 i 6, a q je ceo broj između 2 i 8;
m je 1, a AA1-[AA2]mje dipeptid izabran od Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit i Trp-Cit;
s je 1, i
o je 0.
[0218] U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji sadrži disulfid i ADC ima opštu Formulu
gde:
A je antitelo;
D je analog auristatina;
Y je -(CH2)p- ili -(CH2CH2O)q-, gde su p i q svaki nezavisno ceo broj između 1 i 10;
svaki R je nezavisno H ili C1-C6alkil;
r je 1, 2 ili 3, i
gde
predstavlja amidnu vezu formiranu između linkera i ε-amino grupe površinskog lizina na antitelu.
[0219] U nekim primerima izvođenja u opštoj Formuli (VII), p i q su svaki nezavisno ceo broj između 1 i 4.
[0220] U nekim primerima izvođenja u opštoj Formuli (VII), Y je -(CH2)p- i p je ceo broj između 1 i 4.
[0221] U nekim primerima izvođenja opšte Formule (VII), svako R je nezavisno H ili Me.
[0222] U nekim primerima izvođenja u opštoj Formuli (VII), r je 1 ili 2.
[0223] U tehnici su poznati razni neotcepivi linkeri za povezivanju lekova sa antitelima i oni mogu da budu korisni u ADC predmetnog otkrića u određenim primerima izvođenja. Primeri neotcepivih linkera uključuju linkere koji imaju N-sukcinimidil estar ili fragment N-sulfosukcinimidil estra za reakciju sa antitelom, kao i fragment na bazi maleimida ili haloacetila za reakciju sa toksinom, ili obrnuto. Primer takvog neotcepivog linkera zasnovan je na sulfosukcinimidil-4-[N-maleimidometil]cikloheksan-1-karboksilatu (sulfo-SMCC). Drugi neograničavajući primeri takvih linkera uključuju one zasnovane na N-sukcinimidil 4-(maleimidometil)cikloheksankarboksilatu (SMCC), N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproatu) ("dugolančani" SMCC ili LC-SMCC), N-sukcinimidil estru κ-maleimidoundekanoične kiseline (KMUA), N-sukcinimidil estru γ-maleimidobuterne kiseline (GMBS), N-hidroksisukcinimid estru ε-maleimidokaproične kiseline (EMCS), mmaleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estru (MBS), N-(α-maleimidoacetoksi)-sukcinimid estru (AMAS), sukcinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)heksanoatu (SMPH), N-sukcinimidil 4-(pmaleimidofenil)-butiratu (SMPB) i N-(p-maleimidofenil)izocijanatu (PMPI). Drugi primeri uključuju one koji sadrže funkcionalnu grupu zasnovanu na haloacetilu, kao što je N-suukcinimidil-4-(jodoacetil)-aminobenzoat (SIAB), N-sukcinimidil jodoacetat (SIA), N-sukcinimidil bromoacetat (SBA) i N-sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat (SBAP).
[0224] Drugi primeri neotcepivih linkera uključuju maleimidokarboksilne kiseline, kao što je maleimidokaproil (MC).
[0225] Stručnjak u ovoj oblasti može lako da izabere odgovarajući linker za dati ADC uzimajući u obzir relevantne faktore, kao što su mesto vezivanja antitela, bilo kakva strukturna ograničenja toksina i hidrofobnost toksina (videti, na primer, recenziju u Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer.
[0226] U određenim primerima izvođenja, linker uključen u ADC predmetnog otkrića ima opštu Formulu (VIII):
gde:
A-S- je tačka vezivanja za biparatopsko anti-HER2 antitelo;
Y je jedna ili više dodatnih komponenti linkera, ili je odsutan, i
D je tačka vezivanja za analog auristatina.
[0227] U određenim primerima izvođenja, linker uključen u ADC predmetnog otkrića ima opštu Formulu (IX):
gde:
A-S- je tačka vezivanja za biparatopsko anti-HER2 antitelo;
Y je jedna ili više dodatnih komponenti linkera, ili je odsutan, i
D je tačka vezivanja za analog auristatina.
Priprema konjugata lekova i antitela
[0228] ADC predmetnog otkrića mogu da se pripreme na jedan od nekoliko načina poznatih u tehnici, korišćenjem reakcija organske hemije, uslova i reagenasa poznatih stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press, i Primere date u ovom tekstu). Na primer, konjugacija se može postići (1) reakcijom nukleofilne grupe ili elektrofilne grupe antitela sa bifunkcionalnim linkerom za formiranje intermedijera antitelo-linker Ab-L, pomoću kovalentne veze, praćenom reakcijom sa aktiviranim analogom auristatina (D), ili (2) reakcijom nukleofilne grupe ili elektrofilne grupe analoga auristatina sa linkerom kako bi se formirao linker-toksin D-L, pomoću kovalentne veze, što je praćeno reakcijom sa nukleofilnom grupom ili elektrofilnom grupom antitela. Postupci konjugacije (1) i (2) mogu da se koriste sa raznim antitelima, nalozima auristatina i linkerima za pripremu ovde opisanih ADC.
[0229] Kao što je gore opisano, analog auristatina može da bude konjugovan preko odgovarajućeg linkera sa raznim grupama na antitelu kako bi se obezbedio ADC. Na primer, konjugacija može da se ostvari preko površinskih lizina, preko oksidovanih ugljenih hidrata ili preko cisteinskih ostataka koji su oslobođeni redukcijom jedne ili više međulančanih disulfidnih veza. Druga mogućnost je da antitela budu modifikovana tako da uključuju dodatne cisteinske ostatke ili neprirodne aminokiseline koje obezbeđuju reaktivne ručice, kao što su selenometionin, pacetilfenilalanin, formilglicin ili p-azidometil-L-fenilalanin. Takve modifikacije su dobro poznate u tehnici (videti, na primer, SAD patent br. 7,521,541; 8,455,622 i 9,000,130; Hofer et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109:16101-16106 (2012); Wu etal., PNAS, 106:3000-3005 (2009); Zimmerman etal., Bioconj. Chem., 25:351-361 (2014)).
[0230] U određenim primerima izvođenja, ADC predmetnog otkrića sadrže analog auristatina konjugovan preko odgovarajućeg linkera sa cisteinskim ostacima koji su oslobođeni redukcijom jedne ili više međulančanih disulfidnih veza.
[0231] U ADC opisanim ovde, biparatopsko anti-HER2 antitelo je konjugovano sa toksinom preko linkera pri niskom prosečnom odnosu leka i antitela (DAR), tačnije prosečnom DAR manjem od 3.9, ali većem od 0.5, na primer, između oko 1.5 i oko 2.5 u određenim primerima izvođenja.
[0232] Razni postupci su poznati u tehnici za pripremu ADC sa niskim prosečnim DAR (videti, na primer, recenziju McCombs and Owen, The AAPS Journal, 17(2):339-351 (2015) i reference u njoj; Boutureira & Bernardes, Chem. Rev., 115:2174-2195 (2015)).
[0233] Na primer, za konjugaciju sa cisteinskim ostacima, delimična redukcija međulančanih disulfidnih veza antitela može da se sprovede nakon konjugacije sa linkerom-toksinom. Delimična redukcija može da se postigne ograničavanjem količine redukcionog agensa koji se koristi u reakciji redukcije (videti, na primer, Lyon et al., Methods in Enzymology, 502:123-138 (2012) i primere u tom radu, i Primere koji su ovde navedeni). Odgovarajući redukcioni agensi su poznati u tehnici i uključuju, na primer, ditiotreitol (DTT), tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), 2-merkaptoetanol, cisteamin i izvestan broj fosfina rastvorljivih u vodi. Alternativno, ili dodatno, može da se upotrebi manje ekvivalenata linkera-toksina, kako bi se dobio nizak prosečni DAR.
[0234] Alternativno, može da se koristi konstruisano antitelo u kome se jedan ili više cisteinskih ostataka koji čine međulančane disulfidne veze zamenjuje serinskim ostatkom što rezultira manjim brojem cisteinskih ostataka koji su raspoloživi za konjugaciju (videti McDonagh et al., Protein Eng. Des. Sel. PEDS, 19(7):299-307). Konstruisana antitela zatim mogu da se tretiraju redukcionim agensom i konjuguju sa linkerom-toksinom.
[0235] Drugi pristup je korišćenje linkera bis-tiol koji premošćava dva cisteina koji inače čine međulančanu disulfidnu vezu. Upotreba linkera bis-tiol koji nosi samo jedan molekul toksina proizvela bi ADC sa maksimalnim DAR4 za antitela u punoj veličini, ako se sve četiri međulančane disulfidne veze redukuju i zamene linkerom bis-tiol. Delimična redukcija međulančanih disulfidnih veza i/ili manje ekvivalenata linkera mogu da se koriste zajedno sa linkerom bis-tiol kako bi se dodatno redukovao DAR. Razni linkeri bis-tiol su poznati u tehnici (videti, na primer, Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25(6):1124-1136 (2014); Behrens et al., Mol. Pharm., 12:3986-3998 (2015); Lee et al., Chem. Sci., 7:799-802 (2016); Maruani et al., Nat. Commun., 6:6645 (2015)).
[0236] Mogu da se koriste i pristupi konstruisanja cisteina u cilju generisanja ADC sa niskim prosečnim DAR. Takvi pristupi podrazumevaju konstruisanje cisteina pristupačnih rastvaračima u antitela kako bi se obezbedila mesto-specifična ručica za konjugaciju. Izvestan broj odgovarajućih mesta za uvođenje cisteinskog ostatka identifikovan je u strukturi IgG i obuhvata ona opisana u Junutula, et al., J. Immunol Methods, 332(1-2):41-52 (2008); Junutula, et al., Nat. Biotechnol., 26(8), 925-932 (2008), i SAD patentima br. 9,315,581; 9,000,130; 8.455.622; 8.507.654 i 7.521.541.
[0237] ADC sa niskim prosečnim DAR mogu da se pripreme i konjugacijom lizina korišćenjem ograničenih količina aktiviranog linkera-toksina. Selektivna reakcija na N-terminalnim aminokiselinama antitela takođe može da bude upotrebljena. Na primer, N-terminalni serin može da bude oksidovan u aldehid pomoću perjodata, a zatim da reaguje sa linkerom-toksinom (videti, na primer, Thompson, et al., Bioconjug). Chem., 26(10):2085-2096 (2015)). Slično tome, N-terminalni cisteinski ostaci mogu selektivno da reaguju sa aldehidima da bi se dobili tiazolidinoni (videti, na primer, Bernardes, et al., Nature Protocols, 8:2079-2089).
[0238] Dodatni pristupi uključuju konstruisanje antitela tako da uključuje jednu ili više neprirodnih aminokiselina, kao što su p-acetilfenilalanin (pAcPhe) ili selenocistein (Sec). Keto grupa u pAcPhe može da reaguje sa linkerom-toksinom koji sadrži terminalni alkoksiamin ili hidrazid za formiranje oksimske ili hidrazonske veze (videti, na primer, Axup, et al., PNAS USA, 109:16101-16106 (2012)). Antitela koja sadrže Sec mogu da reaguju sa maleimid- ili jodoacetamidom koji sadrži molekule linker-toksin da bi se formirao konjugat selenoetra (videti, na primer, Hofer, et al., Biochemistry, 48:12047-12057 (2009)).
[0239] Antitela takođe mogu da budu konstruisana tako da uključuju peptidne oznake koje prepoznaju određeni enzimi kako bi se omogućila konjugacija katalizovana enzimima. Na primer, sortaza-A (SortA) prepoznaje sekvencu LPXTG. Ovaj pentapeptid može da bude konstruisan u N-ili C-kraj antitela kako bi se omogućila konjugacija posredovana enzimom SortA (videti, na primer, objavu SAD patentne prijave br.2016/0136298; Komberger and Skerra, mAbs, 6(2):354-366 (2014)). Transglutaminaze su takođe korišćene za dobijanje ADC sa DAR2 korišćenjem antitela koja su deglikozilisana na poziciji N297 (što izlaže Q295 enzimskoj konjugaciji) ili konstruisanjem antitela tako da uključuju "glutaminsku oznaku" (LLQG) (Jeger, et al., Angew. Chem., 49:9995-9997 (2010); Strop, et al., Chem. Biol., 20(2):161-167 (2013)). U drugom pristupu, formilglicinski ostatak može da bude uveden u antitelo konstruisanjem odgovarajuće konsenzusne sekvence u antitelo i ko-eksprimiranjem konstruisanog antitela sa enzimom koji generiše formilglicin (FGE). Aldehidna funkcionalna grupa uvedenog formilglicina može zatim da se koristi kao ručica za konjugaciju toksina (videti, na primer, Drake, et al., Bioconjug). Chem., 25(7): 1331-1341 (2014)).
[0240] Još jedan pristup koji se koristi za generisanje ADC sa DAR2 je konjugacija linkera-toksina sa nativnim šećerima koji se nalaze na glikozilisanim antitelima. Konjugacija sa glikozilisanim antitelima može da se postigne, na primer, oksidacijom perjodatom terminalnih ostataka šećera da bi se dobili aldehidi, koji zatim mogu da se konjuguju sa odgovarajućim linkerom-toksinom, ili pristupima glikoinženjeringa u kojima se nativni šećeri modifikuju terminalnim ostacima sijalinske kiseline, koji zatim mogu da se oksiduju da bi se dobili aldehidi za konjugaciju sa linkerom-toksinom (Zhou, et al., Bioconjug Chem., 25(3):510-520 (2014)).
[0241] Takođe je zabeležena upotreba umrežavanja pomoću UV za konjugaciju aktivnih fragmenata sa antitelima. Ovaj postupak koristi nukleotidno vezujuće mesto (NBS) za mestospecifičnu kovalentnu funkcionalizaciju antitela sa reaktivnim hiolnim fragmentima. Verzija cisteina konjugovanog sa indol-3-buternom kiselinom (IBA) korišćena je za mesto-specifično foto-umrežavanje reaktivnog fragmenta tiola sa antitelima u NBS. Tiolni fragment tada može da se koristi za konjugaciju linkera-toksina koji ima reaktivnu grupu tiola (Alves, et al., Bioconjug. Chem., 25(7):1198-1202 (2014)).
[0242] Alternativno, ADC sa niskim prosečnim DAR mogu da budu izolovani iz preparata ADC koji sadrži mešavinu DAR vrsta korišćenjem tehnika hromatografskog razdvajanja, kao što je hromatografija hidrofobnih interakcija (videti, na primer, Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017); objavu SAD patentne prijave br.2014/0286968).
[0243] Preparati ADC sa niskim prosečnim DAR takođe mogu da budu dobijeni dodavanjem nekonjugovanog (tj. DAR0) antitela sa preparatima ADC koji imaju prosečan DAR ≥ 3.9. Kao što je poznato u tehnici, većina postupaka konjugacije daje preparat ADC koji uključuje razne vrste DAR, pri čemu je navedeni DAR prosečna vrednost pojedinačnih vrsta DAR. U određenim primerima izvođenja, mogu da budu pogodni preparati ADC koji uključuju udeo DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, preparat ADC koji ima prosečan DAR manji od 3.9 može da uključuje najmanje 5% DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, preparat ADC može da uključuje najmanje 10% DAR0 vrsta, na primer, najmanje 15% DAR0 vrsta ili najmanje 20% DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, preparat ADC može da uključuje između oko 5% i oko 50% DAR0 vrsta. U nekim primerima izvođenja, preparat ADC može da uključuje između oko 10% i oko 50% DAR0 vrsta, na primer, između oko 10% i oko 40%, ili između oko 10% i oko 30% DAR0 vrsta.
[0244] Prosečan DAR za ADC može da bude određen standardnim tehnikama kao što su UV/VIS spektroskopska analiza, tehnike zasnovane na ELISA, hromatografske tehnike, kao što su hromatografija hidrofobnih interakcija (HIC), masena spektrometrija UV-MALDI (MS) i MALDI-TOF MS. Pored toga, raspodela oblika vezanih sa lekom (na primer, frakcije vrsta DAR0, DAR1, DAR2, itd.) takođe može da bude analizirana različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti, uključujući MS (sa ili bez pratećeg koraka hromatografskog razdvajanja), hromatografiju hidrofobnih interakcija, reverzno-faznu HPLC ili elektroforezu na izoelektričnom fokusirajućem gelu (IEF) (videti, na primer, Sun et al., Bioconj Chem., 28:1371-81 (2017); Wakankar et al., mAbs, 3:161-172 (2011)).
[0245] U određenim primerima izvođenja, prosečan DAR kod ADC se određuje tehnikama hromatografije hidrofobnih interakcija (HIC).
[0246] Nakon konjugacije, ADC mogu da budu prečišćeni i odvojeni od nekonjugovanih reaktanata i/ili bilo kojih agregata konjugata postupcima prečišćavanja poznatim u tehnici. Takvi postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na, ekskluzionu hromatografiju (SEC), hromatografiju hidrofobnih interakcija (HIC), jonoizmenjivačku hromatografiju, hromatofokusiranje, ultrafiltraciju, centrifugalnu ultrafiltraciju i njihove kombinacije.
Testiranje
[0247] Antikancerska aktivnost ADC u kancerskim ćelijama koje eksprimiraju HER2 može da se ispita in vitro i/ili in vivo upotrebom standardnih tehnika.
[0248] Na primer, citotoksična aktivnost ADC može da se meri izlaganjem ćelija kancera koje eksprimiraju HER2 ADC u medijumu ćelijske kulture, kultivacijom ćelija tokom odgovarajućeg vremenskog perioda (na primer, oko 6 časova do oko 7 dana), a zatim merenjem vijabilnosti ćelija. Ćelije koje ne eksprimiraju HER2 mogu da budu uključene kao kontrola.
[0249] Mnoštvo ćelijskih linija kancera koje eksprimiraju HER2 na različitim nivoima, koje se mogu koristiti za testiranje ADC su poznate u tehnici i mnoge su komercijalno dostupne (na primer, iz Američke kolekcije tipova kultura, Manassas, VA; Addexbio Technologies, San Diego, CA; DSMZ, Braunschweig, Nemačka). Primeri uključuju ćelijske linije BT-474 (3+), SK-BR-3 (3+), HCC1954 (3+), JIMT-1 (2+) i ZR-75-1 (1+). Ovi i drugi primeri su rezimirani u tabeli 8.
Tabela 8: Relativni nivoi ekspresije HER2 u ćelijskim linijama od interesa
[0250] Sposobnost ADC da inhibiraju rast tumora in vivo može da se odredi u odgovarajućem životinjskom modelu upotrebom standardnih tehnika poznatih u ovoj oblasti (videti, na primer, Enna, et al., Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Generalno, aktuelni životinjski modeli za skrining anti-tumorskih jedinjenja su ksenograftski modeli, kod kojih je humani tumor implantiran u životinju, obično glodara.
[0251] Na primer, ADC mogu da budu ispitani in vivo na tumorima koji eksprimiraju HER2 korišćenjem miševa kojima su potkožno presađeni fragmenti tumora, ili implantiran odgovarajući broj ćelija kancera, 0. dana. Tumori se ostavljaju da se razviju do željene veličine, pri čemu se životinje koje imaju nedovoljno razvijene tumore eliminišu. Tretman pomoću ADC uglavnom počinje od 3 do 22 dana nakon implantacije, u zavisnosti od vrste tumora. ADC može da bude dat životinjama, na primer, intravenskom (i.v.) injekcijom. Tumori se mere ili nakon unapred određenog vremenskog perioda ili neprekidno (na primer, 2 ili 3 puta nedeljno) sve do unapred utvrđene krajnje tačke za studiju, na primer, kada tumor dostigne unapred utvrđenu veličinu ili težinu. U ksenograftskim modelima mogu da se koriste tumori koji eksprimiraju HER2 na raznim nivoima. Ksenografti (PDX) koji potiču od pacijenata su posebno korisni.
[0252] In vivo toksični efekti ADC mogu inicijalno da budu ocenjeni kod glodara, na primer miševa ili pacova, merenjem njihovog uticaja na težinu tela životinja tokom tretmana. Hematološki profili i analiza enzima jetre takođe se mogu izvršiti na uzorcima krvi uzetim od životinja.
[0253] In vivo toksičnost i farmakokinetika mogu dodatno da se analiziraju u odgovarajućim životinjskim modelima, na primer pacovima ili primatima koji nisu ljudi, prema standardnim protokolima. Makaki majmuni su posebno korisni u tom pogledu, budući da HER2 čoveka i makaki majmuna dele 98% homologije sekvence.
[0254] Ovde opisani ADC imaju poboljšanu podnošljivost i manju toksičnost u poređenju sa odgovarajućim ADC koji ima DAR ≥3.9 kada se daje pri istoj dozi toksina. U određenim primerima izvođenja, ADC pokazuju poboljšanje podnošljivosti veće od 2x od odgovarajućeg ADC koji ima DAR ≥3.9 kada se daje pri istoj dozi toksina. U nekim primerima izvođenja, ADC pokazuju poboljšanje podnošljivosti veće od 2.2x, na primer, 2.3x, 2.4x ili 2.5x, u odnosu na odgovarajući ADC koji ima DAR ≥3.9 kada se daje pri istoj dozi toksina. Poboljšanje podnošljivosti može da se utvrdi, na primer, poređenjem maksimalne tolerisane doze (MTD), nivoa bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL) ili najveće doze bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) za ADC predmetnog otkrića i za odgovarajući ADC koji ima DAR ≥3.9. MTD, NOAEL i/ili HNSTD mogu da se mere standardnim tehnikama u odgovarajućem životinjskom modelu, na primer, glodaru ili primatu koji nije čovek.
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
[0255] Za terapijsku upotrebu, ADC mogu da budu obezbeđeni u obliku kompozicija koje sadrže ADC i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Kompozicije mogu da se pripreme po poznatim procedurama korišćenjem dobro poznatih i lako dostupnih sastojaka.
[0256] Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane za davanje subjektu, na primer, oralnim (uključujući, na primer, bukalni ili sublingvalni), topikalnim, parenteralnim, rektalnim ili vaginalnim putem, ili inhaliranjem ili putem spreja. Termin "parenteralni", kao što se ovde koristi, uključuje potkožnu injekciju, i intradermalnu, intraartikularnu, intravensku, intramuskularnu, intravaskularnu, intrasternalnu, intratekalnu injekciju ili infuziju. Farmaceutska kompozicija će obično biti formulisana u formatu koji je pogodan za davanje subjektu, na primer, kao sirup, eliksir, tableta, troha, lozenga, tvrda ili meka kapsula, pilula, supozitorija, uljana ili vodena suspenzija, disperzabilni praha ili granula, emulzija, za injektovanje ili kao rastvor. Farmaceutske kompozicije mogu da budu obezbeđene kao formulacije jedinične doze.
[0257] U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje sadrže ADC su formulisane za parenteralnu primenu u obliku injektabilne jedinične doze, na primer kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori.
[0258] Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama. Primeri takvih nosača uključuju, ali se ne ograničavaju na pufere, kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse, kao što su askorbinska kiselina i metionin; konzervanse, kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil alkohol, benzil alkohol, alkilni parabeni (kao što su metil ili propil paraben), katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i mkrezol; niskomolekulske (manje od 10 ostataka) polipeptide; proteine, kao što su serum albumin ili želatin; hidrofilne polimere, kao što je polivinilfilolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, kao što su glukoza, manoza ili dekstrini; helirajuće agense, kao što je EDTA; šećere, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protiv-jone koji formiraju soli, kao što je natrijum; metalne komplekse, kao što su Zn-proteinski kompleksi i nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG).
[0259] U određenim primerima izvođenja, kompozicije koje sadrže ADC mogu da budu u obliku sterilnog injektabilnog vodenog ili uljanog rastvora ili suspenzije. Takve suspenzije mogu da budu formulisane pomoću odgovarajućih agenasa za dispergovanje ili vlaženje i/ili agensa za suspendovanja koji su poznati u tehnici. Sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija može da sadrži ADC u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili nosaču. Prihvatljivi razblaživači i nosači koji mogu da se koriste uključuju, na primer, 1,3-butandiol, vodu, Ringerov rastvor ili izotoničan rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja mogu da budu upotrebljena kao nosač. U tu svrhu mogu da se koriste razna blaga fiksna ulja, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, pronalaze upotrebu u pripremi injektabilnih supstanci. Adjuvansi, kao što su lokalni anestetici, konzervansi i/ili puferski agensi takođe mogu da budu uključeni u injektabilni rastvor ili suspenziju.
[0260] U određenim primerima izvođenja, kompozicija koja sadrži ADC može da bude formulisana za intravensku primenu kod ljudi. Obično su kompozicije za intravensku primenu rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je to neophodno, kompozicija može da sadrži i solubilizujući agens i/ili lokalni anestetik kao što je lignokain kako bi se ublažio bol na mestu ubrizgavanja. Generalno, sastojci se dostavljaju ili odvojeno ili pomešani u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi, kao što je ampula ili sašeta koja ukazuje na količinu aktivnog agensa. Kada kompozicija treba da se primeni infuzijom, može da se dostavi sa infuzionom bocom koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu ili fiziološki rastvor. Kada kompozicija treba da se primeni injekcijom, može da se obezbedi ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološkog rastvora, kako bi sastojci mogli da se pomešaju pre primene.
[0261] Ostale farmaceutske kompozicije i postupci za pripremu farmaceutskih kompozicija poznati su u tehnici i opisani su, na primer, u "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (ranije "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000).
POSTUPCI ZA UPOTREBU
[0262] Ovde opisani ADC mogu da se koriste u postupcima za inhibiranje rasta tumorskih ćelija koje eksprimiraju HER2. Ćelije mogu da budu in vitro ili in vivo. U određenim primerima izvođenja, ADC mogu da se koriste u postupcima za lečenje kancera ili tumora koji eksprimira HER2 kod subjekta.
[0263] Lečenje kancera koji eksprimira HER2 može da rezultuje ublažavanjem simptoma, smanjenjem veličine tumora, inhibiranjem rasta tumora, smanjenjem jedne ili više direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanjem metastaza, smanjenjem stope progresije bolesti, olakšavanjem ili palijacijom stanja bolesti, poboljšanjem preživljavanja, povećanjem preživljavanja bez progresije, remisijom i/ili poboljšanjem prognoze.
[0264] U određenim primerima izvođenja, lečenje kancera koji eksprimira HER2 pomoću ADC, kao što je ovde opisano, usporava napredovanje bolesti. U nekim primerima izvođenja, lečenje kancera koji eksprimira HER2 pomoću ADC, kao što je ovde opisano, rezultuje regresijom tumora. U nekim primerima izvođenja, lečenje kancera koji eksprimira HER2 pomoću ADC, kao što je ovde opisano, rezultuje inhibicijom rasta tumora.
[0265] Kanceri koji eksprimiraju HER2 su obično solidni tumori. Primeri solidnih tumora koji eksprimiraju HER2 uključuju, ali nisu ograničeni na kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća, kancer želuca, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, urotelijalni kancer, kancer pankreasa, kancer pljuvačne žlezde i kancer mozga. Kancer dojke koji eksprimira HER2 uključuje kancer dojke negativan na receptor za estrogen (ER-) i/ili negativan na receptor za progesteron (PR-) i trostruko negativne (ER-, PR-, nizak HER2) kancere dojke. Kanceri pluća koji eksprimiraju HER2 uključuju nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC) i sitnoćelijski kancer pluća.
[0266] U određenim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju kancera dojke, kancera jajnika, kancera pluća ili kancera želuca koji eksprimiraju HER2. U nekim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju kancera dojke koji eksprimira HER2. U nekim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju kancera dojke koji eksprimira HER2, koji je takođe negativan na receptor za estrogen i receptor za progesteron. U nekim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju trostruko negativnog kancera dojke koji eksprimira HER2 (TNBC). U nekim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju kancera dojke koji eksprimira HER2, koji je metastazirao na mozak. U nekim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju kancera jajnika koji eksprimira HER2.
[0267] Kao što je poznato u tehnici, kanceri koji eksprimira HER2 mogu da se okarakterišu nivoom HER2 koji eksprimiraju (tj. "HER2 statusom"). HER2 status se može proceniti, na primer, imunohistohemijom (IHC), fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) i hromogenom in situ hibridizacijom (CISH).
[0268] IHC identifikuje ekspresiju proteina HER2 na ćelijskoj membrani. Isečci tkiva obloženi parafinom iz tumorske biopsije mogu da budu podvrgnuti IHC testu i usklađeni sa kriterijumima intenziteta bojenja HER2 na sledeći način:
Ocena 0: nije zapaženo bojenje ili je bojenje membrane zapaženo u manje od 10% tumorskih ćelija; obično <20000 receptora/ćeliji.
Ocena 1+: slabašno/jedva primetno bojenje membrane se detektuje u više od 10% tumorskih ćelija. Ćelije su obojene samo u delu svoje membrane. Obično oko 100000 receptora/ćeliji.
Ocena 2+: slabo do umereno potpuno bojenje membrane se zapaža u više od 10% tumorskih ćelija; obično oko 500000 receptora/ćeliji.
Ocena 3+: umereno do jako potpuno bojenje membrane se zapaža u više od 10% tumorskih ćelija; obično oko 2000 000 receptora/ćeliji.
[0269] Tumori sa ocenama 0 ili 1+ za ekspresiju HER2 su okarakterisani kao HER2-negativni, dok su ti tumori sa ocenama 2+ ili 3+ okarakterisani kao HER2-pozitivni.
[0270] Primeri komercijalnih kompleta koje je odobrila FDA dostupni za detekciju HER2 pomoću IHC uključuju HercepTest<™>(Dako Denmark A/S); PATHWAY (Ventana Medical Systems, Inc.); InSite<™>HER2/NEU komplet (Biogenex Laboratories, Inc.) i Bond Oracle HER2 IHC System (Leica Biosystems.
[0271] ADC kao što je ovde opisano mogu da budu korisni u lečenju kancera koji eksprimiraju HER2 na različitim nivoima. U određenim primerima izvođenja, ADC mogu da se koriste u lečenju kancera koji eksprimiraju visoke nivoe HER2 (IHC 3+). U nekim primerima izvođenja, ADC mogu da se koriste u lečenju kancera koji eksprimiraju visok nivo HER2 (3+ IHC) ili umeren nivo HER2 (2+ IHC ili 2+/3+ IHC). U nekim primerima izvođenja, ADC mogu da se koriste u lečenju kancera koji eksprimiraju visoke nivoe HER2 (3+ IHC), umerene nivoe HER2 (2+ IHC ili 2+/3+ IHC), ili niske nivoe HER2 (1+ IHC ili 1+/2+ IHC). U nekim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste u lečenju kancera koji su IHC metodom ocenjeni kao HER2-negativni.
[0272] U određenim primerima izvođenja, nivoi HER2 kod kancera koji treba lečiti primenom ADC određeni su metodom IHC. U nekim primerima izvođenja, nivoi HER2 kod kancera koji treba lečiti primenom ADC određeni su metodom IHC koja se izvodi pomoću testa Herceptest<™>.
[0273] Kanceri koji eksprimiraju HER2 mogu da budu homogene prirode (tj. većina tumorskih ćelija eksprimira sličnu količinu HER2) ili mogu da budu heterogene prirode (tj. da sadrže različite populacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju različite nivoe HER2). Razmotrena je upotreba ADC za lečenje kancera koji eksprimiraju HER2, a koji su ili homogeni ili heterogeni u odnosu na nivo HER2.
[0274] U određenim primerima izvođenja, ADC pronalaze upotrebu u postupcima za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira HER2 koji je rezistentan, ili postaje rezistentan na druge terapije standardne nege. U nekim primerima izvođenja, ADC pronalaze upotrebu u postupcima za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira HER2, a koji ne reaguje na jednu ili više trenutnih terapija, kao što su trastuzumab (Herceptin<®>), pertuzumab (Perjeta<®>), T-DM1 (Kadcyla<®>ili trastuzumab emtansin) ili taksani (kao što su paklitaksel, docetaksel, kabazitaksel i slično). U nekim primerima izvođenja, ADC pronalaze upotrebu u postupcima za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira HER2, a koji je rezistentan na trastuzumab. U nekim primerima izvođenja, ADC pronalaze upotrebu u postupcima za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira HER2, a koji je rezistentan na pertuzumab. U nekim primerima izvođenja, ADC pronalaze upotrebu u postupcima za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira HER2, a koji je rezistentan na T-DM1. U nekim primerima izvođenja, ADC pronalaze upotrebu u lečenju metastatskog kancera kada je pacijent napredovao na prethodnoj anti-HER2 terapiji.
[0275] Kada se ADC koriste u lečenju subjekata koji imaju kancer koji eksprimira HER2 koji je rezistentan, refraktoran, i/ili je recidivirao nakon lečenja drugim terapijskim agensom, ADC mogu da budu deo terapije druge linije ili terapije treće ili četvrte linije, u zavisnosti od broja prethodnih tretmana kojima je subjekt bio podvrgnut.
[0276] U određenim primerima izvođenja, ovde opisani ADC mogu da se koriste zajedno sa dodatnim antitumorskim agensom u lečenju subjekata koji imaju kancer koji eksprimira HER2. Dodatni antitumorski agens može da bude terapijsko antitelo kao što su gore navedena, ili hemoterapijski agens. Hemoterapijski agensi koji se obično koriste za lečenje kancera koji eksprimiraju HER2 uključuju, na primer, cisplatin, karboplatin, paklitaksel, albumin-vezani paklitaksel Abraxane<®>), docetaksel, gemcitabin, vinorelbin, irinotekan, etopozid, vinblastin, pemetreksed, 5-fluorouracil (sa ili bez folne kiseline), kapecitabin, karboplatin, epirubicin, oksaliplatin, folfirinoks, ciklofosfamid i razne kombinacije ovih agenasa kao što je poznato u tehnici. Dodatni agens/agensi mogu da se daju subjektu uporedo sa ADC ili sekvencijalno.
[0277] U određenim primerima izvođenja, razmatra se upotreba ovde opisanih ADC za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira HER2 koji nije bio podvrgnut nikakvim prethodnim antikancerskim tretmanima (npr. ADC mogu da se koriste kao terapija prve linije).
[0278] U određenim primerima izvođenja, subjekt koji se leči pomoću ADC u gore navedenim postupcima može da bude čovek, primat koji nije čovek ili drugi sisar. U nekim primerima izvođenja, subjekt koji se leči pomoću ADC u gore navedenim postupcima je čovek.
[0279] Količina ADC koju treba dati subjektu razlikovaće se u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje koje treba lečiti, odabrani put primene, konkretno jedinjenje koje se daje, starost, težinu i odgovor pojedinačnog subjekta i ozbiljnost simptoma kod subjekta, ali je terapijski efikasna količina.
[0280] Termin "terapijski efikasna količina"; kao što se ovde koristi, odnosi se na količinu ADC koju je potrebno primeniti da bi se postigao cilj navedenog postupka, na primer, ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti koja se leči. Količina ovde opisanog ADC koja će biti efikasna u lečenju kancera koji eksprimira HER2 može da se odredi standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, opciono mogu da se koriste in vitro testovi za identifikaciju optimalnih opsega doza. Efikasne doze se ekstrapoliraju iz krivih zavisnosti odgovora od doze izvedenih iz sistema za testiranje in vitro ili na bazi životinjskih modela.
FARMACEUTSKI KOMPLETI
[0281] Određeni primeri izvođenja obezbeđuju farmaceutske komplete koji sadrže ADC kao što je ovde opisano.
[0282] Komplet će obično sadržati kontejner i nalepnicu i/ili prateće uputstvo na, ili zajedno sa kontejnerom. Nalepnica ili prateće uputstvo sadrži uputstva koja su obično uključena u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, pružajući informacije o indikacijama, korišćenju, dozi, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda. Nalepnica ili prateće uputstvo može dodatno da sadrži obaveštenje u obliku koji propisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, korišćenje ili prodaju farmaceutskih proizvoda ili bioloških proizvoda, što je odraz odobrenja agencije za proizvodnju, za upotrebu ili prodaju za primenu kod ljudi ili životinja. Nalepnica ili prateće uputstvo takođe označava da je ADC za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimira HER2. Kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži ADC i može u nekim primerima izvođenja da ima sterilni pristupni port (na primer, kontejner može da bude kesa za intravenski rastvor ili fiola koja ima zatvarač koji može da bude probijen hipodermičnom injekcionom iglom).
[0283] Pored kontejnera koji sadrži kompoziciju koja sadrži ADC, komplet može da sadrži i jedan ili više dodatnih kontejnera koji sadrže druge komponente kompleta. Na primer, farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatno puferisani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze; druge pufere ili razblaživače.
[0284] Odgovarajući kontejneri uključuju, na primer, boce, fiole, špriceve, kese za intravenski rastvor i slično. Kontejneri mogu da budu formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Ako je to prikladno, jedna ili više komponenti kompleta mogu da budu liofilizovane ili obezbeđene u suvom obliku, kao što su prah ili granule, a komplet može dodatno da sadrži odgovarajući rastvarač za rekonstituciju liofilizovanih ili suve/suvih komponenti.
[0285] Komplet dalje može da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalne ili korisničke tačke gledišta, kao što su filteri, igle i špricevi.
[0286] Sledeći Primeri su obezbeđeni u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da na bilo koji način ograniče obim pronalaska.
PRIMERI
PRIMER 1: SINTEZA LINKERA-TOKSINA
[0287] Sledeći primer opisuje pripremu ilustrativnog linkera-toksina (Linker-Toksin 001) koji sadrži sledeći analog auristatina (Jedinjenje 9):
[0288] Slični protokoli mogu da budu upotrebljeni za pripremu linkera-toksina koji sadrže druge analoge auristatina uključujući sledeća ilustrativna jedinjenja (videti i objavu međunarodne patentne prijave br. WO 2016/041082):
1.1 Etil (2R,3R)-3-metoksi-2-metil-3-((S)-pirolidin-2-il)propanoat (Jedinjenje 1)
[0289]
[0290] U mešani rastvor (2R,3R)-3-((S)-1-(terc-butoksikarbonil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanske kiseline (Boc-Dap-OH, 4.31 g, 15.0 mmol) u apsolutnom etanolu (27.0 mL) na 0°C dodat je tionil hlorid (3.0 mL) u kapima. Dobijeni rastvor je ostavljen da se zagreje do sobne temperature, a napredak je praćen metodom HPLC-MS. Posle 18h nije otkriven preostali polazni materijal i rastvor je koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom. Dobijeno ulje je suspendovano u toluenu (10 mL) i koncentrovano pod smanjenim pritiskom dva puta, zatim suspendovano u dietil etru (5 mL) i koncentrovano pod smanjenim pritiskom dva puta da bi se dobila bela čvrsta pena (3.78 g, kvantitativni prinos%). MS m/z zapaž. = 216.5 (M+1).
1.2 (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanska kiselina (Jedinjenje 3)
[0292] Jedinjenje 2 je pripremljeno kao što je opisano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/041082.
[0293] U mešani rastvor Jedinjenja 2 (6.965 g, 14.14 mmol) u dihlorometanu (20 mL) dodata je trifluorosirćetna kiselina (5.0 mL). Reakciju je praćena metodom HPLC-MS i posle 40h nije ostalo polaznog materijala. Reakcija je koncentrovana pod smanjenim pritiskom, ko-evaporisana sa toluenom (2 × 10 mL) i dihlorometanom (2 × 10 mL) da bi se dobila penasta bela čvrsta supstanca (6.2 g, kvantitativni prinos sa zaostacima TFA). Ovaj materijal je rastvoren u 200 mL toplog 1:3 EtOAc:heksana i ostavljen je da se ohladi do sobne temperature. Tokom hlađenja formirao se precipitat kao i nešto malih kristala. Dodato je 5 mL EtOAc i suspenzija je još jednom zagrejana kako bi se precipitat u potpunosti rastvorio. Formiralo se još kristala pri hlađenju do sobne temperature i boca je preko noći stavljena na -30°C. Sledećeg jutra matična tečnost je dekantovana, a kristali su ispirani sa 2 × 50 mL heksana i osušeni pod visokim vakuumom. Dobijeno je 5.67 g kristalnog proizvoda. MS m/z zapaž. = 405.7 (M+1).
1.3 Etil (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)-N,3dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoat (Jedinjenje 4)
[0294]
[0295] U mešani rastvor Jedinjenja 3 (6.711 g, 15.37 mmol, 1.025 ekviv.) u smeši dihlorometana (5.0 mL) i N,N-dimetilformamida (5.0 mL) na sobnoj temperaturi je dodat HATU (5.732 g, 15.07 mmol, 1.005 ekviv.) i N,N-diizopropiletilamin (7.84 mL, 3 ekviv.). Nakon mešanja 30 minuta na sobnoj temperaturi, rastvor Jedinjenja 1 (3.776 g, 15.00 mmol, 1.0 ekviv.) u smeši dihlorometana (1.0 mL) i N,N-dimetilformamida (1.0 mL) dodat je u kapima, ispran u rezidualnom Jedinjenju 1 sa dodatnih 3 mL 1:1 dihlorometana:N,N-dimetilformamida. Reakcija je praćena HPLC-MS metodom i posle 15 minuta nije primećeno preostalo Jedinjenje 1. Reakcija je koncentrovana pod smanjenim pritiskom, razblažena etil acetatom (~125 mL) i organska faza je ekstrahovana pomoću 1 M HCl (2 × 50 mL), 1 × dH2O (1 × 50mL), zasićenog NaHCO3(3 × 50 mL), slanog rastvora (25 mL). Kiseli i bazni vodeni slojevi su oprani sa 25 mL EtOAc. Sve organske faze su zatim spojene i osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane dajući crveno ulje. Ostatak je rastvoren u minimalnoj količini dihlorometana (~10 mL), nanet na Biotage<®>SNAP Ultra kolonu od 360 g silika gela (Isolera<™>Flash System; Biotage AB, Švedska) za prečišćavanje (20-100% EtOAc u heksanima sa 10 volumena kolone). Frakcije koje sadrže čist proizvod bili su spojene, čime je dobijeno 7.9 g penaste bele čvrste supstance. Frakcije koje nisu čiste podvrgnute su drugom prečišćavanju na Biotage<®>SNAP Ultra koloni silika gela od 100 g i spojene sa čistim proizvodom kako bi se dobila bela penasta čvrsta supstanca (8.390 g, 88.3 %). MS m/z zapaž. = 634.7 (M+1).
1.4 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)-N,3-dimetil butanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanska kiselina (Jedinjenje 5)
[0297] U mešani rastvor Jedinjenja 4 (8.390 g, 13.24mmol) u 1,4-dioksanu (158 mL) dodata je dH2O (39.7 ml) i litijum hidroksid monohidrat (1 M u H2O, 39.7 mL, 3 ekviv.). Reakcija je mešana na 4°C i HPLC-MS metodom je praćena potrošnja polaznog materijala, za šta je trebalo 3 dana, dok Jedinjenje 4 nije ostalo samo u tragu. Tokom reakcije, u malom procentu je formiran novi proizvod, koji odgovara gubitku metanola (β-eliminacija, <2%), pored željenog materijala. Reakcija je acidifikovana dodatkom 1 M vodenog rastvora HCl (50 mL) i koncentrovana pod smanjenim pritiskom za uklanjanje dioksana. Preostala reakciona smeša je ekstrahovana etil acetatom (4 × 50 mL) i organska faza je spojena, oprana slanim rastvorom (15 mL 2 mL 2 M HCl), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi dala svetlo obojeno ulje. Ulje je ponovo rastvoreno u dietil etru (~50 mL) i koncentrovano pod smanjenim pritiskom (3x) kako bi se olakšalo uklanjanje ostataka dioksana, dajući naslovni proizvod kao gusto ulje (7.81 g 97% prinosa sa nešto ostataka dioksana i Jedinjenja 4). MS m/z zapaž. = 606.7 (M+1).
1.5 Benzil ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (Jedinjenje 7)
[0299] Jedinjenje 6 je pripremljeno kao što je opisano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/041082).
[0300] U mešani rastvor Jedinjenja 5 (7.12 g, 11.754 mmol) u dihlorometanu (20 mL) dodat je 2,2,2-trifluoro-N-(4-sulfamoilfenil)acetamid (Jedinjenje 6, 4.095 g, 1.3 ekviv, rastvoren u 3 mL DMF), N,N-dimetilpiridin (1.867 g, 1.3 ekviv.) i N,N-dimetilformamid (1.5 mL) za dobijanje svetlo-žute suspenzije. Dalje dodavanje 5 mL DMF nije izbistrilo rastvor. N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (EDCI) (2.817 g, 1.25 ekviv.) je dodat u jednoj porciji i reakcija je praćena metodom HPLC-MS. Posle 48 časova, reakcija više nije napredovala i dodato je još 400 mg EDCI. Posle 18 časova, nije primećen preostali polazni materijal i reakcija je koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo žuto ulje. Ulje je rastvoreno u etil acetatu (~150 mL) i 1 M HCl (20 mL), a organska faza je oprana hladnom 2 M HCl (2 × 10 mL), zasićenim NAHCO3(1 × 10 mL), slanim rastvorom (20 mL 5 mL 2 M HCL). Kisele i bazne vodene frakcije su ekstrahovane pomoću EtOAc (1 × 20 mL), sve organske frakcije su spojene, osušene preko MgSO4i koncentrovane pod smanjenim pritiskom da bi se dobila uljana sirova čvrsta supstanca (13 g). Ostatak je rastvoren u dihlorometanu (~10 mL), nanet na Biotage<®>kolonu SNAP Ultra sa 360 g silika gela i prečišćen ispod 10-100% EtOAc (2% AcOH) u gradijentu heksana sa 12 zapremina kolona sa platoom na 3 zapremine kolone pri 50% EtOAc. Frakcije koje sadrže čist proizvod su spojene, koncentrovane pod smanjenim pritiskom, rastvorene i koncentrovane iz toluena (2 × 10 mL) i dietil etra (2 × 10 mL) kako bi se dobio željeni proizvod, 7.1 g bele penaste čvrste supstance. Frakcije koje nisu čiste podvrgnute su ponovljenom prečišćavanju pod uslovima gradijenta sa blažim nagibom pomoću Biotage<®>SNAP Ultra kolone sa 100 g silika gela na instrumentu Isolera<™>. Svi čiste frakcije su spojene da bi se izdvojio čist proizvod kao bela penasta čvrsta supstanca (8.60 g, 86%). MS m/z zapaž. = 856.7 (M+1).
1.6 (S)-2-amino-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid (Jedinjenje 7a)
[0302] Jedinjenje 7 (3.71 g, 4.33 mmol) je rastvoreno u 10% N,N-dimetilformamidu u etil acetatu (30 mL) u boci sa okruglim donom koja sadrži magnetnu mešalicu i zatvorena je 3-krakim adapterom za gasnu liniju. Posuda je dva puta evakuisana pod smanjenim pritiskom i napunjena azotnim gasom. Dodat je 10% paladijum na ugljeniku (0.461g, 0.1 ekviv.) u jednoj porciji, 3-kraki adapter je učvršćen na bocu, na adapter je pričvršćen balon sa vodonikom i posuda je dva puta evakuisana pod smanjenim pritiskom i napunjena vodonikom. Reakcija je ostavljena da se meša 2 dana, tokom kojih je balon vodonika povremeno dopunjavan. Nakon približno 48h, HPLC-MS analiza je pokazala da nema više polaznog materijala. Reakcija je razblažena metanolom (20 mL) i filtrirana kroz čep od celita. Celit je opran metanolom (2 × 50 mL). Svi filtrati su spojeni i koncentrovani pod smanjenim pritiskom i dobijeno ulje je rastvoreno i koncentrovano iz dihlorometana. Nakon sušenja pod smanjenim pritiskom, naslovno jedinjenje je izolovano kao bezbojni prah (3.10 g, 99%). MS m/z zapaž. = 722.6 (M+1).
1.7 (S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-metoksi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido) propil)pirolidin-1-il)-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamid (Jedinjenje 8)
[0304] U mešani rastvor N,N-(L)-dimetilvalina (1.696 g, 9.35 mmol) u N,N-dimetilformamidu (10 mL) je dodat HATU (3.216 g, 8.46 mmol) i di-izopropiletilamin (3.10 mL, 17.8 mmol). Posle 5 minuta nastao je bistar žuti rastvor. Mešanje je nastavljeno dodatnih 10 minuta, zatim je u jednoj porciji dodato Jedinjenje 7a (3.213 g, 4.45 mmol). Nakon dodatnog 1h mešanja, HPLC-MS je pokazala da su preostale količine Jedinjenja 7a u tragovima i reakcija je nastavljena još 16h. Reakcija je potom koncentrovana pod smanjenim pritiskom, razblažena etil acetatom (120 mL) i smešom 40 mL 1:1 NaHCO3(zas.): 5% LiCl i prebačena u levak za razdvajanje. Vodeni sloj je uklonjen i organska faza je oprana sa LiCl (1 × 20mL), NaHCO3(zas., 2 × 20 mL). Vodeni slojevi su spojeni i ekstrahovani pomoću EtOAc (3 × 50 mL). Organski slojevi su spojeni i oprani slanim rastvorom (1 × 20 mL), osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani čime je dobijeno ulje opterećeno sadržajem DMF, koje je koncentrovano pomoću rotacionog isparivača za uklanjanje rezidualnog DMF, dajući 7g sirovog ulja boje slame. Ulje je rastvoreno u minimalnoj količini od 10% metanola u dihlorometanu (~11mL) i naneto na Biotage<®>SNAP Ultra kolonu sa 360 g silika gela za prečišćavanje (2-20% MeOH u CH2Cl2pri 15 zapremina kolone, sa eluiranjem proizvoda na oko 10-13%). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bezbojna pena. Frakcije koje nisu čiste su kombinovane, evaporisane i podvrgnute ponovljenom prečišćavanju na Biotage<®>SNAP Ultra koloni sa 100 g silika gela na Instrumentu Isolera<™>i u kombinovane sa čistim proizvodom sa prve kolone da bi se dobila bezbojna penasta čvrsta supstanca (3.78 g). MS m/z zapaž. = 850.6 (M+1).
1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-aminofenil)sulfonamido)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamid (Jedinjenje 9)
[0306] U mešani rastvor Jedinjenja 8 (0.980 g, 1.154 mmol) u 1,4-dioksanima (15 mL) dodata je voda (3.5 mL) i 1 M litijum hidroksid monohidrata (3 ekviv., 3.46 mL). Rezultirajuća svetla suspenzija je ostavljena da se meša na 4°C i metodom HPLC-MS je praćena potrošnja polaznog materijala. Kada je konverzija završena (~5 dana), reakcija je neutralisana sa 3.46 mL 1 M HCl i koncentrovana pod smanjenim pritiskom da se ukloni dioksan. Rezultujuća vodena faza razblažena je sa 60 mL EtOAc i 5 mL slanog rastvora, a zatim ekstrahovana etil acetatom (2 × 30 mL). Organske frakcije su spojene, osušene preko Na2SO4, filtrirane i evaporisane da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao čvrsta supstanca žutomrke boje (0.930 g). Rf= 0.5 (8% MeOH u CH2Cl2). MS m/z zapaž. = 753.7 (M+1).
1.9 2,3,5,6-tetrafluorofenil 3-(2-(2-(2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etoksi)etoksi)etoksi) propanot (Jedinjenje 15)
[0308] U osušenoj konusnoj boci od 50 mL, 3-(2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)etoksi)propanska kiselina (Jedinjenje 14, 1.000 g, 4.52 mmol) i maleični anhidrid (0.443 g, 4.52 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom N,N-dimetilformamidu (5 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 6 časova pod N2, nakon čega je ohlađena na 0°C i ukapan je sin-kolidin (1.263 mL, 2.1 ekv.). U posebnoj osušenoj konusnoj boci od 50 mL, tetrafluorofenol (3.002 g, 4 ekv.) je rastvoren u anhidrovanom N,N-dimetilformamidu (10 mL). Boca je bila ohlađena na 0°C u ledenom kupatilu i ukapan je anhidrid trifluorosirćetne kiseline (2.548 mL, 4 ekv.). Boca je mešana 15 minuta, nakon čega je ukapan sin-kolidin (2.407 mL, 4 ekv.). Boca je ostavljena da se meša još 15 minuta, a zatim je sadržaj dodat u prvu bocu u kapima, pomoću šprica. Reakcija je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i mešanje je nastavljeno pod N2. Potrošnja polaznih materijala u reakciji praćena je HPLC-MS metodom. Posle 6 dana reakcija je bila završena, sa potpuno potrošenim Jedinjenjem 14, pri čemu je ostalo samo Jedinjenje 15 i mala količina (~5%) intermedijera amida bis-TFP maleične kiseline. Reakcija je prebačena na levak za razdvajanje, razblažena dietil etrom (75 ml) i oprana sa 5% LiCl (1 × 20 mL), 1 M HCl (2 × 20 mL), zas. NaHCO3(5 × 20 mL) i slanim rastvorom (1 × 20 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i evaporisan da bi se dobilo smeđe sirovo ulje sa zaostalim DMF. Sirovo ulje je rastvoreno u 8 mL 1:1 DMF:H2O 0.1% TFA, naneto 60 g Biotage<®>SNAP Ultra C18 kolone (Biotage AB, Upsala, Švedska) i prečišćeno pod linearnim gradijentom od 30-100% ACN/H2O 0.1% TFA pri 8 zapremina kolone. Čiste frakcije su spojene i razblažene slanim rastvorom (20 mL), zatim ekstrahovane sa 3 × 50 mL Et2O. Spojene organske faze su osušene preko MgSO4, filtrirane i evaporisane da bi se izdvojilo svetlo-žuto ulje (1.34 g, 66% prinosa).
1.10 Terc-butil ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)amino)-1-okso-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (Jedinjenje 12)
[0310] Jedinjenje 11 je pripremljeno kao što je opisano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2016/041082.
[0311] U praznu bocu u obliku kruške od 25 mL, dodato je Jedinjenje 11 (1.342 g, 3.58 mmol, 3.0 ekviv.), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodimid hidrohlorid (0.664 g, 3.46 mmol, 2.9 ekviv.) i 7-hidroksi-azabenzotriazol (HOAT) (0.472g, 3.46 mmol, 2.9 ekviv.). Ove čvrste supstance su rastvorene u smeši N,N-dimetilformamida (0.5 mL) i dihlorometana (4.5 mL) uz mešanje na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Odvojeno, Jedinjenje 9 (0.900 g, 1.20 mmol) je rastvoreno u smeši N,N-dimetilformamida (0.2 mL) i dihlorometana (1.8 mL) i dodato u bocu u obliku kruške, uz ispiranje dihlorometanom (1.0 mL). Brzina mešanja je povećana na 1000 o/min., proizvodeći vrtlog. U roku od 2 minuta od dodavanja Jedinjenja 9, dodat je bakar (II) hlorid (0.514 g, 3.83 mmol, 3.2 ekviv.) u jednoj porciji direktno u centar vrtloga kroz uski levak za prah. Početni svetložuti rastvor se pretvorio u tamnosmeđu suspenziju koja se tokom 10 minuta promenila u tamnozelenu suspenziju. Završetak reakcije je praćen metodom HPLC-MS i nije primećena promena napretka reakcije između uzoraka uzetih nakon 30 minuta i 1h (~95% završena reakcija). Reakcija je ostavljena da se meša preko noći na sobnoj temperaturi, zatim su u mešanu suspenziju dodati 2-(2-aminoetilamino)etanol (0.483 mL, 4.781 mmol, 4 ekviv.), EtOAc (10 mL) i dH2O (5 mL), čija se boja promenila u tamnoplavu. Suspenzija je energično mešana 4 časa, jer su se suspendovane čvrste supstance postepeno rastvarale u bifaznoj smeši. Ova smeša je prebačena u levak za razdvajanje i razblažena sa EtOAc (100 mL) i slanim rastvorom (10 mL), a vodeni sloj je ekstrahovan pomoću 10% IpOH/ EtOAc (4 × 50 mL). Organski slojevi su spojeni i oprani slanim rastvorom (10 mL), osušeni preko Na2SO4, i evaporisani da bi se dobila blago plava sirova čvrsta supstanca. Ova sirova čvrsta supstanca je rastvorena u smeši metanola (0.5 mL) i dihlorometana (6 mL) i prečišćena na Biotage<®>SNAP Ultra koloni sa 100 g silika gela (2-20% MeOH u CH2Cl2pri 10 zapremina kolone, što je praćeno platoom od 8 zapremina kolone na 20% MeOH). Proizvod je eluiran kao široki pik nakon 1-2 zapremine kolone na ~20% MeOH u CH2Cl2. Frakcije koje sadrže željeni materijal su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (1.105 g, 83%). MS m/z zapaž. = 555.9 ((M+2)/2), 1109.8 (M+1).
1.11 (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)-5-ureidopentanamid (Jedinjenje 13)
[0313] U rastvor Jedinjenja 12 (0.926 g, 0.834mmol) dodata je smeša dihlorometana (10 mL) i trifluorosirćetne kiseline (2.0 mL). Potrošnja polaznog materijala u reakciji praćena je HPLC-MS metodom (~45 minuta). Reakcija je ko-evaporisana sa acetonitrilom (2 × 10 mL) i dihlorometanom (2x 10 mL) pod smanjenim pritiskom da se ukloni višak trifluorosirćetne kiseline. Dobijeni ostatak je rastvoren u minimalnoj količini dihlorometana i metanola (3:1, zapr./zapr., ~2 mL), i dodati u mešani rastvor dietil etra (200 mL) i heksana (100 mL) u kapima pomoću pipete, proizvodeći suspenziju svetlo bele čvrste supstance. Čvrsta supstanca je filtrirana i osušena pod vakuumom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje u obliku belog praha, kao so trifluorosirćetne kiseline (1.04 g, kvantitativni prinos sa nekim rezidualnim rastvaračima). MS m/z zapaž. = 505.8 ((M+2)/2).
1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)-2-((S)-1-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-14-izopropil-12-okso-3,6,9-trioksa-13-azapentadekanamido)-5-ureidopentanamid (Linker-Toksin 001)
[0315] U mešani rastvor Jedinjenja 13 (0.722 g, 0.584 mmol) u N,N-dimetilformamidu (4 mL) je dodato Jedinjenje 15 (0.314 g, 1.2 ekviv.) i diizopropiletilamin (0.305 mL, 3.0 ekviv.). HPLC-MS analiza na 2h je pokazala da nema preostalog početnog materijala. Reakcija je acidifikovana sa TFA (300 μL), a zatim razblažena sa diH2O 0.1% TFA (9 mL). Dobijeni rastvor je nanet na kolonu od 120 g Biotage<®>SNAP Ultra C18 (Biotage, Upsala, Švedska) i prečišćen pod gradijentom ACN/H2O 0.1% TFA: 20-60% ACN pri 10 zapremina kolone, 60-100% ACN pri 5 zapremina kolone. Proizvod je eluiran blizu 40% ACN. Čiste frakcije identifikovane metodom LCMS su spojene i liofilizovane. Čvrsta supstanca u vidu belog praha je izvađena iz liofilizatora. Liofilizacija je ponovljena pri većoj koncentraciji (oko 50 mg/mL u 2:1 H2O/ACN) u bočici, kako bi se proizvela gušća, manje flokulantna liofilizovana čvrsta supstanca (754.2 mg, 91%). MS m/z zapaž. = 647.4 ((M+2)/2), 1292.8 (M+1).
PRIMER 2: KONJUGACIJA LINKERA-TOKSINA SA BIPARATOPSKIM ANTITELOM
[0316] Konjugati antitelo-lek (ADC) biparatopskog anti-HER2 mAb, v10000 i Linker-Toksin 001 su generisani delimičnom redukcijom međulančanih disulfidnih veza antitela, nakon čega je usledilo dodavanje kape na slobodne cisteinske ostatke reakcijom sa maleimidnom komponentom linkera-toksina. Variranjem količine TCEP koja se koristi za redukciju antitela, mogu se dobiti ADC sa prosečnim odnosom leka i antitela između 0 i 6. ADC su prečišćeni da bi se uklonili kontaminirajući mali molekuli i okarakterisani da bi se pokazali DAR, čistoća, monomerni sadržaj, nivoi endotoksina i vezivanje za antigen-pozitivne tumorske ćelije.
[0317] Priprema v10000 opisana je u objavi međunarodne patentne prijave br. WO 2015/077891. Detalji ovog antitela su navedeni u tabeli 9 ispod. Sekvence su obezbeđene u tabelama sekvenci.
Tabela 9
* Numerisanje Fab ili varijabilnog domena prema Kabatu (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, p.647, 1991)
<§>Numerisanje CH3 prema EU indeksu kao u Kabat (Edelman et al., 1969, PNAS USA, 63:78-85)
2.1 Konjugacija anti-HER2 antitela delimičnom redukcijom međulančanih disulfidnih veza (v17597; DAR 3.9)
[0318] Rastvor (138.9 mL) antitela v10000 (2.0 g) u 10 mM natrijum acetatu, 9% (tež./zapr.) saharoze, pH 4.5 je redukovan dodatkom sveže pripremljene smeše 200 mM Na2HPO4, pH 8.9 (15.4 mL), 5 mM rastvora DTPA (39.5 mL u PBS- u, pH 7.4) i 10 mM rastvora TCEP (3.68 mL, 2.3 ekv.). Nakon 90 minuta na 37°C, reakcija je ohlađena na ledu pre dodavanja viška Linkera-Toksina 001 (6.41 mL; 8 ekv.) iz štok rastvora od 20 mM DMSO. Reakcija konjugacije je ugašena posle 90 minuta dodavanjem viška 20 mM rastvora N-acetil cisteina (4.81 mL; 6 ekv.).
2.2 Konjugacija anti-HER2 antitela delimičnom redukcijom međulančanih disulfidnih veza (v21252; DAR 2.1)
[0319] Rastvoru (138.9 mL) antitela v10000 (2.0 g) u 10 mM natrijum acetatu, 9% (tež./zapr.) saharoze, pH 4.5, podešen je pH dodavanjem 200 mM Na2HPO4, pH 8.9 (15.4 mL). Nakon dodavanja rastvora DTPA (44 mL u PBS, pH 7.4, finalna koncentracija 1.0 mM), redukcija međulančanih disulfida je pokrenuta dodavanjem vodenog rastvora 10 mM TCEP (1.68 mL, 1.05 ekv.). Nakon 90 minuta na 37°C, reakcija je ohlađena na ledu pre dodavanja viška Linkera-Toksina 001 (4.81 mL; 6 ekv.) iz štok rastvora od 20 mM DMSO. Reakcija konjugacije je ugašena posle 90 minuta dodavanjem viška 20 mM rastvora N-acetil cisteina (4.81 mL; 6 ekv.).
2.3 Prečišćavanje konjugata antitela i leka v17597 i v21252
[0320] Ugašeni rastvori konjugata antitela i leka (ADC) prečišćeni su pomoću 9-15 dijavolumena 10 mM natrijum acetata, 9% (tež./zapr.) saharoze, pH 4.5 pomoću instrumenta za filtraciju tangencijalnog toka Millipore Labscale<™>upotrebom modula za ultrafiltraciju Pellicon<®>XL (Ultracel<®>30 kDa 0.005m<2>; Millipore Sigma). Eluirani ADC je bio sterilno filtriran (0.22 um). ADC proizvedeni u malom obimu proizvodnje prečišćeni su preko kolone sa graničnom vrednošću molekulske težine (MWCO) od 40 KDA Zeba<™>(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prekondicionirane ili rastvorom PBS ili 10 mM natrijum acetatom, 9% (tež./zapr.) saharoze, pH 4.5.
[0321] Nakon prečišćavanja, koncentracija ADC određena je BCA testom uz pozivanje na standardnu krivu generisanu iz v10000. Alternativno, koncentracije su procenjene merenjem apsorpcije na 280 nm (ε = 195065 M<-1>cm<-1>).
[0322] Uzorci ADC su procenjeni pomoću neredukujuće i redukujuće SDS-PAGE (videti sliku 1). Nisu primećene dodatne trake.
2.4 Hromatografija hidrofobnih interakcija
[0323] Antitelo i ADC su analizirani hromatografijom hidrofobnih interakcija (HIC) kako bi se procenio odnos leka i antitela (DAR). Hromatografija je izvedena na HIC etil koloni Proteomix<®>(7.8x50mm, 5μm) (Sepax Technologies Inc., Newark, DE) korišćenjem gradijenta od 80% MPA/20% MPB do 35% MPA/65% MPB u periodu od 13.5 minuta pri protoku od 1 mL/min (MPA = 1.5 M (NH4)2SO4, 25 mM NaxPO4i MPB = 75% 25 mM NaxPO4, 25% izopropanol).
[0324] Prosečan odnos leka i antitela (DAR) kod ADC može da varira u zavisnosti od broja disulfidnih veza oslobođenih tokom redukcije antitela. Jedna konjugaciona reakcija koja daje ADC sa određenim prosečnim DAR sadrži smešu vrsta. Za v17597 i v21252, generisana je smeša četiri vrste: nekonjugovano antitelo, ADC čiji je DAR 2, ADC čiji je DAR 4 i ADC čiji je DAR 6.
[0325] Rezultati HIC su prikazani na slici 2 i pokazuju da v17597 ima prosečan DAR od 3.92 (Slika 2A), a v21252 ima prosečan DAR od 2.07 (Slika 2B).
[0326] Pojedinačni doprinosi vrsta DAR0, DAR2, DAR4 i DAR6 prosečnom DAR prečišćenih ADC procenjeni su integracijom HPLC-HIC hromatograma. Svaki pik HIC hromatograma je izolovan preparativnom hromatografijom, a identitet pika je potvrđen metodom LC-MS. % sadržaja pojedinačnih DAR vrsta za svaku varijantu (određeno pomoću HIC) prikazan je u tabeli 10 i na slici 2D. Kao što se može videti iz tabele 10 i sa slike 2D, v17597 sadrži znatno više DAR6 vrsta nego v21252, a v21252 sadrži znatno više DAR0 vrsta nego v17597.
[0327] Slika 2E ilustruje promenu relativnih količina DAR 0, 2, 4 i 6 vrsta u okviru v10000-Linker Toksin 001 za seriju ADC preparata koji imaju prosečne DAR vrednosti u rasponu od 0.5 do 6.
Tabela 10: Raspodela DAR za v17597 i v21252
2.5 Ekskluziona hromatografija
[0328] Stepen agregacije antitela i ADC (~15 ug, injekciona zapremina 5 uL) procenjen je pomoću ekskluzione hromatografije (SEC) na koloni ACQUITY UPLC<®>Protein BEH SEC (200 angstrema, 1.7 μm, 4.6x150 mm) (Waters Corporation, Milford, MA) korišćenjem mobilne faze koja se sastoji od 150 mM fosfata, pH 6.8 i pri protoku od 400 uL/min. Detekcija je ostvarena pomoću apsorbance na 280 nm.
[0329] Rezultati su prikazani na slici 3 i rezimirani u tabeli 11. mAb v10000 je visoko monomerno prema analizi SEC. Nije primećen značajan porast agregacije po konjugaciji sa Linkerom-Toksinom 001. Poređenje v21252 i v17597 ukazuje na to da na obim agregacije ne utiče povećanje DAR sa 2 na 4.
Tabela 11: Rezime rezultata SEC
2.6 Kvantifikacija slobodnog toksina i linkera-toksina metodom LC-MS-MS
[0330] Rezidualne koncentracije slobodnog toksina (Jedinjenje 9), Linkera-Toksina 001 i ugašenog linkera leka N-acetil cistein-Linkera-Toksina 001 u formulacijama ADC procenjene su razdvajanjem tečnom hromatografijom (LC) i masenom detekcijom, uz pozivanje na standardne krive za svaki analit. Separacije su izvršene na koloni PolymerX<™>RP-1 (3 μm, 100 angstrema, 50x 4mm) (Phenomenex Inc., Torrance, CA) pri brzini protoka od 0.4 mL/min, temperaturi kolone od 30°C i gradijentu od 75% MPA/25% MPB do 60% MPA/40% MPB tokom 7.8 minuta (MPA = 0.1% vodeni rastvor mravlje kiseline, a MPB = 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Masena detekcija u pozitivnom režimu ESI-MRM urađena je pomoću tripl kvadripol masenog spektrometra Agilent 6470 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
[0331] Svi uzorci sadržali < 0.1 mol% analita u odnosu na ukupno konjugovano opterećenje.
2.7 Test vezivanja na antigen-pozitivnim ćelijama na bazi protočne citometrije
[0332] Vezivanje ADC za antigen-pozitivne tumorske ćelijske linije JIMT-1 (karcinom dojke, Addexbio Technologies, San Diego, CA) i RT-112/84 (karcinom bešike, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) upoređeno je sa vezivanjem parentalnog antitela (v10000) pomoću protočne citometrije. Ćelije su kultivisane prema uputstvima dobavljača. Ukratko, ćelije (50000 ćelija/bunarčiću) su inkubirane sa serijskim razblaženjima antitela ili ADC 90 minuta na ledu. Nakon ove inkubacije, ćelije su oprane dva puta, a zatim inkubirane sa AlexaFluor<®>647 konjugovanim anti-hIgG (Jackson ImmunoResearch Inc., Westgrove, PA) sekundarnim reagensom 60 minuta na ledu. Ćelije su potom dva puta oprane, i fluorescencija je analizirana protočnom citometrijom (protočni citometar LSRFortessa<™>X-20, BD, San Hoze, CA).
[0333] Rezultati su prikazani na slici 4 i pokazuju da konjugacija sa toksinom ne utiče na vezivanje v17597 i v21252 za antigen-pozitivne ćelije, pri čemu oba ADC pokazuju slično vezivanje kao parentalno antitelo v10000.
2.8 Testiranje endotoksina
[0334] Nivo endotoksina formulisanih ADC procenjen je korišćenjem testa krajnje tačke geliranja sa lizatom amebocita Limulusa (LAL) (Genscript ToxinSensor<™>Single Test Kit; GenScript, Piscataway, NJ) sa pragom od 0.125 EU/mL. Svi ADC korišćeni u in vivo eksperimentima (u nastavku teksta) dozirani su ispod 5 jedinica endotoksina po kilogramu telesne mase.
PRIMER 3: IN VITRO AKTIVNOST BIPARATOPSKIH ADC
[0335] In vitro potenca v17597 i v21252 merena je testom ćelijske proliferacije na antigenpozitivnim tumorskim ćelijama BT-474 (duktalni karcinom, ATCC, Manassas, VA (HTB-20)), SK-BR-3 (karcinom dojke, ATCC, Manassas, VA (HTB-30)), HCC-1954 (karcinom dojke, ATCC (CRL-2338)), JIMT-1 (karcinom dojke, Addexbio Technologies, San Diego, CA, (C0006005)), ZR-75-1 (karcinom dojke, ATCC (CRL-1500)) i antigen-negativnim tumorskim ćelijama MDA-MB-468 (karcinom dojke, Addexbio Technologies (C0006003)). Ćelije su kultivisane prema uputstvima dobavljača. Ukratko, dan pre dodavanja ADC, ćelije (50 uL/bunarčiću, 1000 ćelija/bunarčiću) su dodate u sterilne ploče sa 384 bunarčića obrađene za kulturu tkiva (TC) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) i inkubirane preko noći na 37°C/5% CO2da bi se ćelijama omogućilo da se zalepe za površinu ploče. Narednog dana, u sterilnoj ploči sa 96 bunarčića sa U dnom, ADC su razblaženi u kompletnom medijumu za rast do koncentracije koja je 4.3 puta veća od željene finalne maksimalne koncentracije i titrirani su 1:3 u istom medijumu, čime je dobijena titracija doza-odgovor u 10 tačaka. Kontrolni bunarčići bez ADC (samo medijum za rast) su uključeni na svakoj mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića. Po 15 uL iz titracije dozaodgovor u 10 tačaka dodato je u svaki bunarčić ploče od 384 bunarčića koja sadrži zasejane ćelije, u triplikatu, i ploče su inkubirane na 37°C/5% CO25 noći. Nakon petonoćne inkubacije, vijabilnost ćelija je kvantifikovana dodavanjem 20 uL/bunarčiću CellTiter-Glo<®>(Promega, Madison, WI) i inkubacijom na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 min. Luminiscencija je izmerena pomoću luminometra za mikroploče. Prikupljene relativne svetlosne jedinice (RLU) konvertovane su u % citotoksičnosti korišćenjem gore pomenute kontrole sa samim medijumom za rast (% Citotoksičnosti = 1- [RLU bunarčića/prosečna RLU kontrole samog medijuma]). Podaci su prilagođeni krivama korišćenjem metoda nelinearne regresije dostupnih sa softverom Prism<®>(GraphPad Software, La Jolla, CA).
[0336] Rezultati su prikazani na slici 5 i rezimirani u tabeli 12. Rezultati pokazuju da i v17597 i v21252 pokazuju selektivno ubijanje ćelija. Ćelijske linije BT-474, SK-BR-3, HCC1954, JIMT-1 i ZR-75-1 koje eksprimiraju HER2 (Slika 5A-E) bile su osetljive i na v17597 i na v21252. Oba antitela, i v17597 i v21252 su bila neefikasna protiv ćelija MDA-MB-468 (Slika 5F), koje su iz HER2-negativne ćelijske linije karcinoma dojke.
Tabela 12: In vitro aktivnost v17597 i v21252
PRIMER 4: IN VITRO TEST PROLIFERACIJE v10000-LINKER-TOKSIN 001 PRI RAZLIČITIM PROSEČNIM DAR
[0337] ADC sačinjeni od v10000 konjugovanog sa Linkerom-Toksinom 001 sa prosečnim DAR u rasponu od 0.7 do 3.9 pripremljeni su tako što su različite količine TCEP (0.5 do 10 molarnih ekvivalenata) korišćene u reakciji redukcije. Reakcija konjugacije je sprovedena u skladu sa procedurama navedenim u primeru 2 i dobijeni ADC su prečišćeni pomoću kolone od 40 kDa Zeba<™>, prethodno ekvilibrisane sa PBS pH 7.4.
[0338] In vitro potenca ADC je merena testom ćelijske proliferacije na antigen-pozitivnim tumorskim ćelijama SK-OV-3 (karcinom jajnika, ATCC, Manassas, VA (HTB-77)), JIMT-1 (karcinom dojke, DSMZ, Braunschweig, Nemačka (ACC 589)) i ZR-75-1 (karcinom dojke, ATCC (CRL-1500)). Ćelije su kultivisane prema uputstvima dobavljača. Ukratko, dan pre dodavanja ADC, ćelije (100 uL/bunarčiću, 2500 ćelija/bunarčiću) su dodate u sterilne, TC-obrađene, ploče sa 96 bunarčića neprozirnih zidova (Corning 3904) i inkubirane preko noći na 37°C/5% CO2kako bi se ćelijama omogućilo da se zalepe za površinu ploče. Narednog dana, ADC su razblaženi u kompletnom medijumu za rast (ploča sa 96 bunarčića sa U dnom) do koncentracije koja je 5 puta veća od željene finalne maksimalne koncentracije i titrani 1:3 u istom medijumu, u osam koraka (ukupno 9 tačaka titracije jedinjenja). Uključena je i kontrolna tačka titracije koja sadrži samo medijum za rast, čime je ukupno dobijena titracija doza-odgovor u 10 tačaka. Po 25 uL iz titracije doza-odgovor u 10 tačaka je dodato u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića koja sadrži zasejane ćelije, u triplikatu, i ploče su inkubirane na 37°C/5% CO25 noći. Nakon inkubacije, vijabilnost ćelija je kvantifikovana dodavanjem 25 uL/bunarčiću CellTiter-Glo<®>(Promega Corporation, Madison, WI) i inkubacijom na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 min. Luminiscencija je zatim izmerena pomoću luminometra za mikroploče i prikupljene relativne jedinice svetlosti (RLU) su pretvorene u % citotoksičnosti kao što je opisano u primeru 3.
[0339] Rezultati su prikazani na slici 6. ADC koji imaju prosečne DAR između 3.9 i 1.6 pokazali su uporedivu potencu u tri ćelijske linije, međutim, ADC sa prosečnim DAR0.7 je pokazao značajno smanjenje potence. Približne količine pojedinačnih vrsta DAR koje čine DAR0.7, DAR2.2 i DAR3.9 ADC prikazane su u tabeli 13 i na slici 6D. Može se videti da DAR0.7 ADC sadrži približno tri puta više DAR0 vrsta (približno 65% naspram približno 20%) od DAR1.9 ADC. DAR2.2 ADC zauzvrat sadrži znatno više DAR0 vrsta od DAR3.9 vrsta (oko 20% naspram <3%), međutim, DAR2.2 ADC je pokazao uporedivu in vitro potencu sa DAR3.9 ADC. Ovi rezultati sugerišu da možda postoji prag za udeo DAR0 vrsta koje preparat ADC može da sadrži pre nego što se uticaj na potencu ADC ispolji.
Tabela 13: Približna raspodela DAR za ADC
PRIMER 5: INTERNALIZACIJA BIPARATOPSKIH ADC U ĆELIJE KOJE EKSPRIMIRAJU HER2
[0340] Da bi se utvrdila internalizacija v21252, pHAb Dye (Promega Corporation, Madison, WI) je kuplovan sa aminskim ostacima v21252, trastuzumab-Linkerom-Toksinom 001 i negativnom kontrolom ADC prema preporučenim protokolima proizvođača. Negativna kontrola ADC bila je antitelo protiv Proteina F RSV konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001.
[0341] pHAb-konjugovana antitela mogu da se koriste za praćenje receptorom posredovane internalizacije antitela. Antitela konjugovana sa pHAb Dye vezana za antigen na ćelijskoj membrani ispoljavaju minimalnu fluorescenciju, ali nakon receptorom posredovane internalizacije i prenosa kroz endozomski i lizozomski sistem, konjugat antitelo-pHAb je izložen kiselijem pH, što dovodi do toga da konjugat antitelo-pHAb fluorescira.
[0342] Antitelo v21252 konjugovano sa pHAb, trastuzumab-Linker-Toksin 001 konjugovan sa pHAb i kontrola konjugovana sa pHAb su inkubirani sa ćelijskim linijama SKBR3 i JIMT-1 koje eksprimiraju HER2. Ukratko, SKBR3 i JIMT-1 HER2+ tumorske ćelije su zasejane u crnu ploču sa 384 bunarčića sa optičkim dnom (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) pri 5000 ćelija/bunarčiću u medijumu za test. Ploča je inkubirana preko noći na 37°C 5% CO2. Narednog dana, antitela konjugovana sa pHAb su dodata u ploče pri 10 ug/ml i 1 ug/mL finalno u medijumima za test. Mediji koji sadrže boju Vybrant<®>DyeCycle<™>Violet (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) dodati su pri 2uM finalne koncentracije za vizuelizaciju nukleusa. Ploča je inkubirana na 37°C 5% CO2 između vremenskih tačaka. Probni bunarčići su skenirani u različitim vremenskim tačkama na platformi CellInsight<™>CX5 High Content Screening (HCS) Platform (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Ploča je skenirana pomoću objektiva od 20x na SpotAnalysis Bioapplication sa 2 kanala. Kanal 1 (385nm, Vybrant Dye Cycle Violet) je korišćen kao fokus kanal, a kanal 2 (560nm, pHAb) je korišćen za dobijanje podataka o internalizaciji. Fluorescencija internalizovanih antitela konjugovanih sa pHAb izmerena je pomoću parametra "Srednji ukupni intenzitet signala".
[0343] Rezultati su prikazani na slikama 13 i 14 i pokazuju da se v21252 internalizuje i transportuje u lizozome u ćelijama koje eksprimiraju HER2 u većoj meri od monospecifičnog trastuzumab-Linkera-Toksina 001.
PRIMER 6: IN VIVO AKTIVNOST BIPARATOPSKIH ADC
6.1 ADC v17597 i v21252 inhibiraju rast ksenografta koji potiče od pacijenta sa kancerom dojke HBCx-13b
[0344] Ženkama atimičnih miševa (Envigo, Huntingdon, UK) potkožno su implantirani fragmenti tumora od 20 mm<3>(n=7 po grupi). Jednom kada su tumori dostigli veličinu od 75 do 200 mm<3>, životinje su bile raspodeljene u tretmanske grupe i v17597, v21252 ili vehikulum im je doziran intravenoznom injekcijom u ukupno 2 doze 1. dana i 15. dana (q14d x2) kao što je naznačeno na slici 7. Merenja tumora obavljana su na dve nedelje pomoću kalipera. Miševi su etički žrtvovani kada su tumori dostigli veličinu od 1764 mm<3>. Zapremine tumora su prikazane kao srednja vrednost ± SEM za svaku grupu.
[0345] Slika 7A daje rezultate za tumorski odgovor kod miševa kojima su potkožno implantirani fragmenti tumora HBCx-13b nakon i.v. primene vehikuluma ili v17597. Slika 7B daje rezultate za tumorski odgovor kod miševa kojima su potkožno implantirani fragmenti tumora HBCx-13b nakon i.v. primene vehikuluma ili v21252. Ovi rezultati pokazuju da lečenje miševa kojima je presađen HBCx-13b pomoću v17597 ili v21252 rezultuje smanjenjem zapremine tumora na dozno-zavisan način.
6.2 ADC v17597 i v21252 inhibiraju rast ksenografta koji potiče od pacijenta sa kancerom dojke ST-910
[0346] Ženkama atimičnih golih miševa (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) je potkožno implantiran fragment tumora od ~70 mg (n=6 po grupi). Kada su tumori dostigli veličinu od 125 do 250 mm<3>, životinje su bile raspodeljene u tretmanske grupe i v17597, v21252 ili vehikulum im je doziran jednom intravenskom injekcijom kao što je naznačeno na slici 8. Merenja tumora su obavljana na dve nedelje je digitalnim kaliperom. Miševi su etički žrtvovani kada su tumori dostigli veličinu od 2000 mm<3>. Zapremine tumora su prikazane kao srednja vrednost ± SEM za svaku grupu.
[0347] Slika 8A daje rezultate za tumorski odgovor kod miševa kojima su potkožno implantirani fragmenti tumora ST-910 nakon i.v. primene vehikuluma ili v17597. Slika 8B daje rezultate za tumorski odgovor kod miševa kojima su potkožno implantirani fragmenti tumora ST-910 nakon i.v. primene vehikuluma ili v21252. Ovi rezultati pokazuju da lečenje miševa kojima je presađen ST-910 pomoću v17597 ili v21252 rezultuje smanjenjem zapremine tumora na dozno-zavisan način.
[0348] ST-910 je ksenograft (PDX) poreklom od pacijenta, koji predstavlja HER2 1+ kancer dojke, dok je HBCx-13b (koristi se u primeru 6.1) PDX koji predstavlja HER23+ kancer dojke. Primeri 6.1 i 6.2 na taj način pokazuju da su i v17597 i v21252 aktivni i u HER2 3+ i HER21+ tumorima.
6.3 Farmakokinetička analiza
[0349] Za ksenografte HBCx-13b i ST-910 koji potiču od pacijenta, farmakokinetički uzorci za ukupno antitelo (nekonjugovano i konjugovano antitelo) prikupljeni su u unapred određenim vremenskim tačkama i kvantifikacija ukupnog antitela je urađena korišćenjem testa na bazi ELISA metode. Serumske koncentracije ukupnog antitela za v21252 ili v17597 analizirane su prvo oblaganjem ploča za ELISA test sa 384 bunarčića kozjim anti-humanim IgG Fc antitelom (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) u PBS pH 7.4 i inkubiranjem na 4°C preko noći. Narednog dana ploče su oprane i blokirane korišćenjem razblaživača za test i inkubirane 1 čas na RT. Nakon blokiranja, uzorci za standardnu krivu, kontrole i razblaženi uzorci seruma dodati su u ploče i inkubirani 1 čas na RT. Zatim su u ploče dodata antitela za detekciju, konjugat HRP-kozjeg antihumanog IgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch), i posle inkubacije od 1 časa na RT u ploče je dodat supstrat za HRP, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB). TMB je ugašen korišćenjem HCl i apsorbanca je izmerena na 450 nm pomoću čitača ploča. Slika 15 pokazuje serumsku koncentraciju ukupnih antitela - vremenski profil za HBCx-13b (A) i ST-910 (B).
PRIMER 7: STUDIJA FARMAKOKINETIKE/PODNOŠLJIVOSTI JEDNE DOZE v17597 i v21252 NA MAKAKI MAJMUNIMA
[0350] Cilj ove studije je bio da okarakteriše farmakokinetiku (PK) i podnošljivost v17597 i v21252 kod makaki majmuna nakon primene jedne intravenske (IV) infuzije. Makaki majmun je izabran za nekliničku procenu bezbednosti oba antitela, v17597 i v21252, na osnovu homologije sekvence i afiniteta vezivanja. HER2 čoveka i makaki majmuna dele 98% homologije sekvence, dok je homologija sekvence kod HER2 psa i miša/pacova 93% odnosno 88%. Pored toga, v17597 i v21252 se vezuju za HER2 makaki majmuna sa sličnim afinitetom kao za HER2 čoveka (KDmajmuna = 0.55×10<-9>; KDčoveka = 0.83×10<-9>) i ne vezuju se za HER2 psa, miša ili pacova.
[0351] Studija pokazuje da se jedna doza v17597 u dozama od 3, 6 ili 9 mg/kg dobro podnosi, kao i da se jedna doza v21252 u dozama od 9 ili 12 mg/kg dobro podnosi.
Materijali i metode
Podnošljivost
[0352] Jedna doza v17597 (3, 6 ili 9 mg/kg) ili v21252 (9 mg/kg ili 12 mg/kg) je primenjena IV infuzijom tokom 60 minuta kod ženki makaki majmuna (N=3). Opšta podnošljivost je procenjena na osnovu kliničkih zapažanja, telesne težine, konzumiranja hrane i kliničke patologije (hematologija i klinička hemija). Krv je prikupljena tokom studije za bioanalitičku analizu v17597 ili v21252, ukupno antitelo i slobodni toksin (Jedinjenje 9). Dizajn studije je sažet u tabeli 14.
Tabela 14: Dizajn studije farmakokinetike i opšte podnošljivosti jedne doze kod makaki majmuna
Bioanalitičke metode
[0353] v17597 i v21252: Serumske koncentracije v17597 ili v21252 (DAR od 1 ili više) analizirane su pomoću testa elektrohemiluminiscencije sa Mezo Scale Discovery platformom (ECL/MSD) (Mezo Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD) sa mišjim IgG protiv toksina kao agensom za hvatanje i anti-pertuzumab sulfo-TAG kao agensom za detekciju.
[0354] Ukupno antitelo: Bioanalitičkim testom za ukupno antitelo merena je komponenta antitela za v17597 ili v21252 bez obzira na to da li je komponenta antitela konjugovana sa toksinom (pri svim DAR) ili ne. Serumske koncentracije ukupnog antitela analizirane su pomoću testa elektrohemiluminiscencije sa Mezo Scale Discovery platformom (ECL/MSD) sa anti-pertuzumab antitelom kao agensom za hvatanje i anti-trastuzumab sulfo-TAG kao agensom za detekciju.
[0355] Toksin (Jedinjenje 9): Serumske koncentracije toksina analizirane su pomoću LC-MS/MS metode. Uzorci seruma su precipitirani acetonitriolom/ metanolom (50:50, zapr./zapr.) i analizirani su supernatanti. Upotrebljeni sistem za tečnu hromatografiju bio je reverzno-fazna kolona sa protokom gradijenta koji se sastoji od smeše voda/sirćetna kiselina (100/0.05, zapr./zapr.) i acetonitrila. Toksin i interni standard (toksin-d4; deuterisano Jedinjenje 9) detektovani su pomoću sistema tripl kvadripol masenog spektrometra opremljenog izvorom jonizacije elektrosprejom (ESI) koji radi u režimu pozitivnih jona.
Farmakokinetička analiza
[0356] Neprostorna analiza bioanalitičkih rezultata uzoraka seruma korišćena je za izvođenje PK parametara (maksimalna serumska koncentracija [Cmax], terminalni poluživot [T1/2], klirens [CL] i prividni volumen raspodele [Vss]).
Rezultati
Farmakokinetika
[0357] v17597: Izloženost v17597 je uglavnom bila dozno-proporcionalna između 3 i 9 mg/kg. Cmaxje postignuta na kraju 60-minutne infuzije (medijana Tmax) i povećavala se na doznoproporcionalan način. Sistemska izloženost (AUC0-∞) povećavala se na način nešto veći od doznoproporcionalnog načina. Preliminarni srednji terminalni poluživot (T1/2) uglavnom se povećavao sa porastom doze, klirens (CL) je uglavnom opadao sa porastom doze, a prividni volumen raspodele (Vss) se uglavnom nije menjao sa dozom.
[0358] v21252: Izloženost v21252 je uglavnom bila dozno-proporcionalna između 9 i 12 mg/kg. Cmaxje postignuta na kraju 60-minutne infuzije (medijana Tmax) i povećavala se na doznoproporcionalan način. Serumska koncentracija v21252 - vremenski profil je prikazan na slici 9A. Sistemska izloženost (AUC0-∞) povećavala se na način nešto veći od dozno-proporcionalnog načina. Preliminarni srednji terminalni poluživot (T1/2), klirens (CL) i prividni volumen raspodele (Vss) uglavnom se nisu menjali sa dozom.
[0359] Ukupno antitelo (konjugovano i nekonjugovano): Maksimalna serumska koncentracija ukupnog antitela (Cmax) postignuta je krajem 60-minutne infuzije (medijana Tmax). Serumska koncentracija ukupnog antitela - vremenski profil v21252 prikazan je na slici 9B. Za izvođenje PK parametara korišćen je neprostorni model. Cmaxse povećavala na dozno-proporcionalan način, dok se AUC0-∞povećavao na način nešto veći od dozno-proporcionalnog načina i za v17597 i za v21252. Srednji terminalni poluživot v17597 se povećao sa povećanjem doze, dok su se serumski klirens (CL) i ukupni prividni volumen distribucije (Vss) ukupnog antitela smanjivali sa porastom doze. Srednji terminalni poluživot i ukupni prividni volumen distribucije (Vss) v21252 se povećao sa povećanjem doze, dok se serumski klirens (CL) ukupnog antitela smanjivao sa porastom doze.
[0360] Toksin (Jedinjenje 9): Posle primene jedne doze v17597 (3, 6 ili 9 mg/kg) ili v21252 (9 mg/kg ili 12 mg/kg), sve serumske koncentracije toksina bile su ispod donje granice kvantifikacije (LLOQ, < 5.00 ng/mL).
Podnošljivost
[0361] Jedna doza v17597 (3, 6 ili 9 mg/kg) ili v21252 u dozama od 9 ili 12 mg/kg je dobro tolerisana. Nije bilo smrtnosti tokom studije. Nikakvi efekti vezani za lečenje nisu zabeleženi u kliničkim zapažanjima, konzumiranju hrane ili telesnoj težini.
[0362] Minimalne do blage promene u parametrima kliničke patologije koje su se smatrale povezanim sa lečenjem primećene su kod nekih životinja. Nije bilo efekata vezanih za ispitivanu supstancu među hematološkim krajnjim tačkama ni u jednoj tretmanskoj grupi. Smatra se da su sve fluktuacije u okviru očekivanih opsega za biološke i/ili fluktuacije vezane za proceduru, uprkos bilo kakvim očiglednim razlikama između pojedinačnih vrednosti.
PRIMER 8: NE-GLP STUDIJA TOKSIČNOSTI v17597 NA MAKAKI MAJMUNIMA
[0363] Sprovedena je ne-GLP (engl. Good laboratory practice - Dobra laboratorijska praksa) studija toksičnosti za istraživanje toksikokinetike i toksičnosti v17597 kod makaki majmuna. Studija je osmišljena na osnovu rezultata studije farmakokinetike/podnošljivosti jedne doze kod ženki makaki majmuna (Primer 6).
[0364] Studija je pokazala da primena v17597 jednom nedeljno u dozama od 2.25 i 4.5 mg/kg, i na dve nedelje u dozama od 4.5 i 9 mg/kg nema dobru podnošljivost kod mužjaka i ženki makaki majmuna. Smatra se da su nivo bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL) i najveća doza bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) za v17597 nakon primene jednom nedeljno ili primene na dve nedelje, ukupno 6 nedelja, manji od 2.25 mg/kg primenjenih jednom nedeljno ili 4.5 mg/kg primenjenih na dve nedelje.
Materijali i metode
[0365] Vehikulum ili v17597 su primenjivani IV infuzijom u trajanju od 1 časa jednom nedeljno, 1, 8, 15, 22, 29. i 36. dana u dozama od 0, 2.25 i 4.5 mg/kg, i jednom svake druge nedelje, 1, 15. i 29. dana u dozama od 4.5 i 9 mg/kg. Kod svih životinja procenjene su pomene u kliničkim znacima, konzumiranje hrane, telesna težina, krvni pritisak, EKG, frekvencija disanja (vizuelno), klinička patologija (hematologija, klinička hemija, koagulacija, analiza urina), težina organa i makroskopski/mikroskopski pregled tkiva. Prikupljena je krv za toksikokinetičku analizu i analizu antitela na lek (ADA). Životinje dozirane jednom nedeljno su žrtvovane 42. dana, a životinje dozirane svake druge nedelje su žrtvovane 36. dana. Dizajn studije je predstavljen u tabeli 15.
Tabela 15: Dizajn studije
Rezultati
[0366] Na osnovu telesne težine, kliničkih zapažanja i kliničkih patoloških nalaza, smatra se da je v17597 nepovoljan u svim dozama ispitanim u ovoj studiji. Životinje koje su primale dozu od 9 mg/kg/dozi (na dve nedelje) i jedna ženka koja je primala dozu od 4.5 mg/kg/dozi (na dve nedelje) su žrtvovane ranije i primile su samo doze 1. i 15. dana.
[0367] Na osnovu rezultata ove studije smatra se da su nivo bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL) i najveća doza bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) za v17597 nakon primene jednom nedeljno ili primene na dve nedelje, ukupno 6 nedelja, manji od 2.25 mg/kg primenjenih jednom nedeljno ili 4.5 mg/kg primenjenih na dve nedelje.
PRIMER 9: NE-GLP STUDIJA TOKSIČNOSTI v21252 NA MAKAKI MAJMUNIMA
[0368] Cilj ove studije bio je da dodatno okarakteriše toksikokinetiku i toksičnost v21252.
[0369] Studija je pokazala da primena v212521, 15. i 29. dana u dozama do 12 mg/kg klinički ima dobru podnošljivost kod mužjaka i ženki makaki majmuna. Nivo bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL) bio je 12 mg/kg, a najveća doza bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) bila je veća od 12 mg/kg.
Materijali i metode
[0370] U ovoj studiji, vehikulum ili v21252 su dati mužjacima i ženkama makaki majmunima IV infuzijom u trajanju od 1 časa jednom svake druge nedelje, 1, 15. i 29. dana u dozama od 0, 9 i 12 mg/kg (3 životinje po polu na svakom nivou doze). Kod svih životinja procenjene su pomene u kliničkim znacima, konzumiranje hrane, telesna težina, krvni pritisak, EKG, frekvencija disanja (vizuelno), klinička patologija (hematologija, klinička hemija, koagulacija, analiza urina), težina organa i makroskopski/mikroskopski pregled tkiva. Krv je prikupljena za toksikokinetičku (TK) analizu (v21252, ukupno antitelo i slobodni toksin (Jedinjenje 9)) i analizu antitela na lek (ADA) i životinje su žrtvovane 36. dana. Drugoj grupi životinja data je jedna doza od 12 mg/kg v21252 1. dana i žrtvovane su 4, 8. i 15. dana nakon davanja doze (n=2 po vremenskoj tački). Dizajn studije je sažet u tabeli 16.
Tabela 16: Dizajn ne-GLP studije toksičnosti
Rezultati
Farmakokinetika
[0371] v21252: Farmakokinetika je izračunata nakon ponovljene primene v21252. Cmaxje postignuta ili na kraju 60-minutne infuzije ili 60 minuta nakon završetka infuzije (medijana Tmax). Serumska koncentracija v21252 - vremenski profil je prikazan na slici 10.1. dana, Cmaxi sistemska izloženost (AUC0-168h) povećavale su se na način neznatno veći od dozno-proporcionalnog načina.
29. dana, Cmaxi AUC0-168hsu se povećavale na približno dozno-proporcionalni način. Izgleda da se sistemska izloženost i AUC0-168hnisu menjale i nisu pokazale nikakvu akumulaciju nakon ponovljene primene. Srednji poluživot eliminacije (T1/2) povećavao se od grupe sa dozom od 9 mg/kg ka grupi sa dozom od 12 mg/kg. Mehanizam klirensa pri zasićenju za v21252 može da bude uzrok razlike u T1/2i klirensu između grupa sa niskom (9 mg/kg) i visokom (12 mg/kg) dozom.
[0372] Ukupno antitelo (konjugovano i nekonjugovano): Ukupno antitelo je mereno kod makaki majmuna nakon ponovljenih primena v21252. Cmaxza ukupno antitelo postignuta je krajem 60-minutne infuzije (medijana Tmax). Serumska koncentracija ukupnog antitela - vremenski profil prikazan je na slici 11.1. dana, Cmaxi sistemska izloženost (AUC0-168h) povećavale su se na način neznatno veći od dozno-proporcionalnog načina.29. dana, Cmaxi AUC0-168hsu se povećavale na približno dozno-proporcionalni način. Sistemska izloženost AUC0-168hbila je nepromenjena i nije pokazala akumulaciju posle ponovljenih primena. Slično v21252, srednji poluživoti eliminacije (T1/2) za ukupno antitelo povećavali su se od grupe sa dozom od 9 mg/kg ka grupi sa dozom od 12 mg/kg.
[0373] Farmakokinetika v21252, kao što je naznačeno profilima serumska koncentracija-vreme za v21252 i ukupno antitelo, ukazuje na minimalni gubitak linkera-toksina iz v21252 in vivo (videti sliku 12).
[0374] Toksin (Jedinjenje 9): Slobodni toksin je izmeren kod makaki majmuna nakon ponovljenih primena v21252. Sve serumske koncentracije opterećenja (Jedinjenje 9) bile su ispod granice kvantifikacije (< 0.500 ng/mL) sa izuzetkom jedne ženke na 12 mg/kg 1. dana, jedne ženke na 9 mg/kg 29. dana i jednog mužjaka na 12 mg/kg 29. dana.
[0375] Antitela na lek (ADA): Urađen je skrining anti-v21252 antitela kod makaki majmuna posle ponovljenih primena v21252. ADA su detektovana u serumu jedne ženke u kohorti sa dozom od 9 mg/kg.
Toksičnost
[0376] Ukupno gledano, primena v21252 je klinički dobro tolerisana u svim ispitivanim dozama. Nisu primećene nikakve promene povezane sa lečenjem u analizama urina, EKG parametrima ili frekvenciji disanja.
[0377] Sporadični, minimalni efekti na pojedinačne telesne težine zabeleženi su kod životinja koje primaju ponovljene doze v21252 pri 12 mg/kg/dozi. Sve ove životinje su se delimično ili potpuno oporavile do 35. dana. Sve ostale životinje su ili održavale težinu ili su dobile na težini tokom studije.
[0378] Minimalne do blage promene kliničkih znakova, kliničke patologije, težine organa ili makroskopskog/mikroskopskog pregleda tkiva primećene su kod nekih životinja. Makroskopska zapažanja koja se smatraju vezanim za v21252 bila su ograničena na crvenu diskoloraciju primećenu na mestu infuzije kod svih životinja, uključujući kontrole. Promene težine organa vezane za ispitivanu supstancu bile su ograničene na slezinu. Kod životinja koje su žrtvovane 36. dana nakon 3 doze date na dve nedelje, mikroskopski efekti povezani sa lečenjem uključivali su promene u gastrointestinalnom traktu, jetri, slezini, limfnim čvorovima, pankreasu, koži i na mestima IV infuzije. Svi su klasifikovani kao minimalni ili blagi. Kod životinja koje su žrtvovane u raznim vremenskim trenucima nakon jedne doze od 12 mg/kg, primećeni su slični minimalni do blagi efekti povezani sa ispitivanom supstancom.
[0379] Analizom PK potvrđena je sistemska izloženost kod životinja tretiranih sa v21252 i da se srednja sistemska izloženost povećava sa povećanjem doze na dozno-proporcionalni način za v21252 i ukupno antitelo, dok je izloženost slobodnom toksinu (Jedinjenje 9) viđena samo na niskim nivoima kod nekoliko životinja.
[0380] Tabele 17-20 pokazuju poređenje rezultata iz studija PK/podnošljivosti i ne-GLP studija ponovljene doze za v17597 i v21252.
Tabela 17: Poređenje smrtnosti primećene u studijama jedne doze i ponovljene doze za v17597 i v21252 na makaki majmunima
Tabela 18: Poređenje NOAEL i HNSTD određenih u studijama ponovljene doze za v17597 i v21252 na makaki majmunima
Tabela 19: Bioanalitička analiza ADC
Tabela 20: Bioanalitička analiza ukupnog antitela
Zaključci
[0381] Pokazalo se da analozi auristatina opšte Formule (I) imaju dobru u vivo podnošljivosti kada se daju miševima. Konjugacija Jedinjenja 9 sa monospecifičnim anti-HER2 antitelom trastuzumab pri prosečnom DAR4 proizvela je ADC koji je pokazao odličnu podnošljivost kod makaki majmuna sa najvećom dozom bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) od 18 mg/kg. Nasuprot tome, ADC koji sadrži Jedinjenje 9 konjugovano sa anti-HER2 biparatopskim antitelom, v10000, pri prosečnom DAR4 (v17597) pokazao je znatno smanjenu podnošljivost sa HNSTD manjom od 4.5 mg/kg (Primer 8). Bez ograničavanja na neku konkretnu teoriju, predloženo je da smanjena podnošljivost primećena kod v17597 može da bude delimično posledica povećanog specifičnog vezivanja za ciljno mesto i internalizacije biparatopskog antitela u poređenju sa monospecifičnim trastuzumabom, što dovodi do povećane toksičnosti pri specifičnom delovanju na ciljno mesto, i/ili smanjenog udela DAR0 ili golih vrsta u prosečnom DAR4 (v17597) u poređenju sa prosečnim DAR2 (v21252) koji povećava toksičnost povezanu sa višim DAR vrstama (DAR2, DAR4 i DAR6), i/ili povećanog udela DAR6 vrsta u prosečnom DAR4 u poređenju sa prosečnim DAR2, što povećava toksičnost povezanu sa najvišom DAR vrstom.
[0382] Iznenađujuće, međutim, ADC koji sadrži Jedinjenje 9 konjugovano sa v10000 pri prosečnom DAR2 (v21252) pokazao je znatno poboljšanu podnošljivost sa HNSTD od 12 mg/kg (Primer 9). Ovaj rezultat je neočekivan jer je ranije pokazano da je toksičnost ADC koji sadrži bilo monometil auristatin E (MMAE) ili majtanzinoid direktno u korelaciji sa ukupnom količinom leka vezanog za antitelo, tj. odnos između DAR i maksimalne tolerisane doze je linearan za ADC (Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10:7063-7070 (2004); Sun, et al., Bioconj Chem., 28: 1371-81 (2017)). Konkretno, maksimalna tolerisana doza ADC sa 8 molekula leka po antitelu bila je 50 mg/kg, a maksimalna tolerisana doza ADC sa 4 molekula leka po antitelu (tj. polovina količine toksina) bila je 100 mg/kg (Hamblett, et al., na istom mestu). To jest, kada se primeni u istoj dozi antitela, ADC sa polovinom količine toksina u odnosu na DAR8 ADC pokazuje MTD koji je dvostruko veći nego kod DAR8 ADC.
[0383] v21252 ima DAR od 2 i samim tim polovinu količine toksina u odnosu na v17597 kada se daje u istoj dozi antitela. Na osnovu prethodnih studija sa v17597 očekivalo se da količina v21252 koja bi bila tolerisana bude manja od 9 mg/kg (tj. 2x maksimalna tolerisana doza za v17597). Međutim, kao što je prikazano u primeru 9, v21252 koji je davan makaki majmunima u dozama od 9 ili 12 mg/kg svake dve nedelje, ukupno tri doze, je tolerisan, a 12 mg/kg je označeno kao nivo bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL).
[0384] Bitno je da treba napomenuti da v21252 ispoljava manju toksičnost i veću podnošljivost u odnosu na v17597 kada se dozira na dve nedelje, iako pokazuje veću izloženost. Na osnovu ne-GLP toksikološke studije kod makaki majmuna (Primer 8), smatra se da v17597 ima nepovoljne nalaze kod obe doze date na dve nedelje, od 4.5 i 9 mg/kg. Međutim, u sličnoj ne-GLP studiji (Primer 9), ne smatra se da v21252 ima nepovoljne nalaze kod doza od 9 mg/kg i 12 mg/kg na dve nedelje, uprkos tome što pokazuje povećanje izloženosti (AUC0-336hnakon prve doze ili AUC0-168hposlednje doze) od približno 1.8 do 4.6 puta u poređenju sa 4.5 mg/kg v17597 (rezimirano u tabelama 19 i 20).
[0385] Pored toga, v21252 je pokazao in vivo efikasnost pri nivoima izloženosti za koje se pokazalo da se tolerišu kod makaki majmuna. Konkretno, kompletni odgovori su postignuti kod ksenograftskih modela koji potiču od pacijenta kako tumora sa visokim nivoom HER2, tako i tumora sa niskim nivoom HER2, pri izloženosti koja je podnošljiva za makaki majmune, kao što je sažeto u slici 15 (videti takođe, primer 6).
PRIMER 10: GLP STUDIJA TOKSIČNOSTI v21252 NA MAKAKI MAJMUNIMA
[0386] U naknadnoj GLP studiji toksičnosti, v21252 je davan makaki majmunima svake dve nedelje u dozama od 0, 6, 12 i 18 mg/kg, ukupno 4 doze, sa periodom oporavka od 6 nedelja. Utvrđeno je da najveća doza bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) iznosi 18 mg/kg. v21252 je dobro tolerisan u svim dozama. Nije bilo nepovoljnih kliničkih zapažanja i u ovoj GLP studiji nije primećena smrtnost. Jedino dosledno kliničko zapažanje bilo je povećana dijareja. Nikakva promena telesne težine nije primećena ni u jednoj dozi i nije bilo nepovoljnih kliničkih patoloških nalaza (funkcija jetre - aspartat transaminaza i alanin transaminaza i hematologija - neutrofili, trombociti, hemoglobin i limfociti). Izloženost (Cmaxi AUC0-168h) v21252 bila je praktično identična onoj kod v10000 (samo antitelo). Detalji studije su navedeni u nastavku.
[0387] Cilj ove GLP studije bio je da dodatno okarakteriše toksikokinetiku i toksičnost v21252 koji je primenjen 4 puta intravenski kod makaki majmuna.
[0388] U studiji GLP toksičnosti, v21252 je dat mužjacima i ženkama makaki majmuna 1, 15, 29. i 43. dana u dozama od 0, 6, 12 i 18 mg/kg, sa periodom oporavka od 6 nedelja. Nivo bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL) bio je 12 mg/kg, a najveća doza bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) bila je 18 mg/kg.
Materijali i metode
[0389] U ovoj studiji, vehikulum ili v21252 je dat mužjacima i ženkama makaki majmunima IV infuzijom od 1 časa, po jednom svake druge nedelje, 1, 15, 29. i 43. dana u dozama od 0, 6, 12 i 18 mg/kg (4 životinje po polu na svakom nivou doze i dodatne 2 životinje po polu sa 0, 12 i 18 mg/kg za procenu oporavka). Kod svih životinja procenjene su pomene u kliničkim znacima, konzumiranju hrane, telesnoj težini, krvnom pritisku, EKG, frekvenciji disanja (vizuelno), kliničkoj patologiji (hematologija, klinička hemija, koagulacija, analiza urina), težini organa i makroskopskom/mikroskopskom pregledu tkiva. Krv je prikupljena za toksikokinetičku (TK) analizu (v21252, ukupno antitelo i slobodni toksin (Jedinjenje 9)) i analizu antitela na lek (ADA) i životinje su žrtvovane 50. dana ili nakon oporavka od 6 nedelja, 92. dana. Dizajn studije je sažet u tabeli 21.
Tabela 21: Dizajn GLP studije toksičnosti
Grupa Doza v21252 (mg/kg) Životinje žrtvovane na dan (mužjak/ženka)
Rezultati
Farmakokinetika
[0390] v21252: Medijane maksimalnih serumskih koncentracija v21252 primećene su nakon 1 časa od početka infuzije (SOI) 1. i 43. dana. Nakon primene v21252 na dve nedelje, srednja vrednost Cmaxi AUC vrednosti za v21252 su se povećavale sa porastom doze. Povećanja Cmaxsu bila približno proporcionalna dozi 1. dana. Prvog dana, povećanje doze v21252 od 1:2:3 puta rezultovalo je povećanjem vrednosti Cmaxod približno 1:2.3:3.3, povećanjem srednje vrednosti AUC0-168hod približno 1:2.6:3.8 i povećanjem vrednosti AUC0-336hod približno 1:2.9:4.5. Cmaxi AUC0-168hsu bili približno proporcionalni dozi 43. dana. Povećanje doze v21252 od 1:2:3 puta 43. dana rezultovalo je povećanjem vrednosti Cmaxod približno 1:2.5:3.5 puta i povećanjem vrednosti AUC0-168hod približno 1:3.2:4.7. Sistemska izloženost v21252 se izgleda nije promenila nakon ponovljene IV infuzije 6 mg/kg na dve nedelje, međutim, generalno izgleda da se izloženost povećava nakon ponovljene IV infuzije 12 i 18 mg/kg na dve nedelje. Odnosi akumulacije leka za srednju vrednost AUC0-168hbili su 1.20, 1.47, odnosno 1.50 pri 6, 12, odnosno 18 mg/kg. Odnosi akumulacije leka za individualne AUC0-168hvarirali su od 1.01 do 1.64 pri 6 mg/kg, od 1.17 do 1.95 pri 12 mg/kg, i od 0.983 do 2.08 pri 18 mg/kg.
[0391] Ukupno antitelo (konjugovano i nekonjugovano): Medijane maksimalnih serumskih koncentracija ukupnog antitela zapažene su nakon 1 časa od SOI v21252, 1. i 43. dana. Nakon primene v21252 na dve nedelje, srednja vrednost Cmaxi vrednost AUC0-168hza ukupno antitelo su se povećavale sa povećanjem doze. Prvog dana, povećanje doze v21252 od 1:2:3 puta rezultovalo je povećanjem vrednosti Cmaxod približno 1:2.1:3.3, povećanjem vrednosti AUC0-168hod približno 1:2.4:3.8, i povećanjem srednje vrednosti AUC0-336hod približno 1:2.8:4.5. Povećanje doze v21252 od 1:2:3 puta 43. dana rezultovalo je povećanjem vrednosti Cmaxod približno 1:2.6:3.9 puta i povećanjem vrednosti AUC0-168hod približno 1:3.1:4.8 puta. Sistemska izloženost ukupnom antitelu se nije promenila nakon na dve nedelje ponovljene IV infuzije v21252 pri 6 mg/kg, ali se čini da se povećala nakon ponovljene IV infuzije v21252 na dve nedelje pri 12 i 18 mg/kg. Odnosi akumulacije leka za srednju vrednost AUC0-168hbili su 1.20, 1.47, odnosno 1.50 pri 6, 12, odnosno 18 mg/kg.
[0392] Toksin (Jedinjenje 9): Slobodni toksin je izmeren nakon ponovljenih primena v21252. Većina serumskih koncentracija toksina (Jedinjenje 9) bila je ispod granice kvantifikacije (< 0.500 ng/mL). Zabeleženi su sledeći izuzeci: jedna ženka na 12 mg/kg je 43. dana imala jednu kvantifikovanu koncentraciju toksina (Jedinjenje 9) (0.513 ng/ml na 72 časa posle davanja doze); jedan mužjak na 18 mg/kg je 29. dana imao jednu kvantifikovanu koncentraciju toksina (Jedinjenje 9) (0.532 ng/mL na 1 čas nakon SOI); dva mužjaka i dve ženke na 18 mg/kg su 43. dana imali svako po jednu kvantifikovanu koncentraciju toksina (Jedinjenje 9) (0.555, 0.505, 0.556 i 0.653 ng/mL, redom, na 24 časa nakon SOI); a jedan mužjak na 18 mg/kg je 43. dana imao četiri uzastopne kvantifikovane koncentracije toksina (Jedinjenje 9) sa vrednošću AUC0-168hod 125 h*ng/mL.
[0393] Antitela na lek (ADA): Ukupno 144 uzorka iz svih doznih kohorti je pregledano za ADA. Potvrđeno je da je sedam uzoraka pozitivno u konfirmacionom testu/testu imunodeplecije, uključujući jednu kontrolnu životinju i pred-ispitivani uzorak lečene životinje. Ocenjeno je da su ova poslednja dva uzorka posledica prethodno postojećih reaktivnih antitela i da nisu povezana sa izlaganjem v21252. Kod pet preostalih pozitivnih uzoraka, jedna ženka dozirana sa 18 mg/kg imala je detektabilan titar 43. dana, a preostale 4 životinje (2 ženke dozirane sa 12 mg/kg i jedan mužjak i jedna ženka dozirana sa 18 mg/kg) imale su detektabilne titrove 92. dana tačke oporavka. Iako ovi rezultati za anti-v21252 antitela ne nagoveštavaju snažan imunogeni odgovor kod većine životinja, cirkulišuća v21252 bi mogla da se vezuju sa anti-v21252 antitelima, ograničavajući detekciju antitela u ovom formatu testa. Međutim, malo je verovatno da su ADA značajno uticala na PK v21252 jer nisu primećene promene vremenskih podataka o serumskoj koncentraciji na 43. dan doziranja, u poređenju sa 1. danom doziranja.
Toksičnost
[0394] Primena ponovljene doze v21252 (svake druge nedelje x4) je generalno dobro tolerisana.
Nije bilo smrtnih slučajeva povezanih sa v21252 i nije bilo efekata zabeleženih u oftalmičkim i elektrokardiografskim procenama, vizuelnoj proceni frekvencije disanja, analizi urina ili proceni troponina I. Nije bilo promena povezanih sa v21252 u parametrima telesne težine zabeleženim tokom perioda lečenja ili oporavka nakon primene v21252.
[0395] Povećana učestalost mekih/vodenih izmeta zabeležena je kod životinja koje su primile ponovljene doze v21252 pri ≥ 6 mg/kg. Pored toga, sporadičan nedostatak apetita zabeležen je kod mužjaka i ženki pri 18 mg/kg i pogrbljeno držanje je sporadično zabeleženo kod ženki pri 18 mg/kg. Posle perioda oporavka, nedostatak apetita i pogrbljeno držanje su izostali, dok se učestalost mekih/vodenih izmeta smanjivala ili prestala, što ukazuje na poništavanje efekata povezanih sa v21252. Tokom studije, životinjama je obezbeđena suplementacija tečnošću/ishranom (zamrznuta Gatorade i PeptoPro<®>dijeta) zbog ponovljenih zapažanja mekih/tečnih izmeta. Ženke kod kojih je ponavljana primena v21252 dobijale su tečnost i/ili nutritivnu suplementaciju od 4. dana (6 i 18 mg/kg) ili 8. dana (12 mg/kg) do kraja perioda lečenja. Slično tome, mužjaci kod kojih je ponavljana primena v21252 su dobijali tečnost i/ili nutritivnu suplementaciju od 8. dana (12 mg/kg) ili 7. dana (18 mg/kg) do kraja perioda lečenja. Tokom oporavka nisu obezbeđene tečnosti ili suplementacija.
[0396] Klinički patološki nalazi nisu smatrani nepovoljnim zbog ograničene ozbiljnosti i reverzibilnosti nalaza. Hematološke promene povezane sa ispitivanom supstancom uključuju: povećanje broja monocita, morfološke izmene u neutrofilima, smanjenje broja retikulocita i mase crvenih krvnih ćelija (RBC, hemoglobin i hematokrit) sa istovremenim povećanjem širine raspodele crvenih krvnih ćelija. Bilo je minimalnih do blagih povećanja srednjih koncentracija fibrinogena u odnosu na početne srednje vrednosti od 8. do 50. dana kod mužjaka na 18 mg/kg i kod ženki na ≥ 12 mg/kg. Ove promene su povezane sa ispitivanom supstancom i ukazuju na imuni ili upalni stimulans. Ove promene su prestale 92. dana. Promene vezane za tretman primećene su u AST, fosforu, ukupnom proteinu, albuminu, globulinu i citrulinu.
[0397] Tabele 22-25 pokazuju poređenje rezultata iz ne-GLP studija ponovljene doze za v17597 i v21252 i GLP studije za v21252.
Tabela 22: Poređenje smrtnosti zapažene u studijama ponovljene doze svake druge nedelje za v17597 i v21252 kod makaki majmuna
Tabela 23: Poređenje NOAEL i HNSTD određenih u studijama ponovljene doze svake druge nedelje za v17597 i v21252 na makaki majmunima
Tabela 24: Poređenje PK parametara ADC za v17597 DAR4 i v21252 DAR2 (podudarne doze toksina)
Tabela 25: Poređenje PK parametara ukupnog antitela za v17597 DAR4 i v21252 DAR2 (podudarne doze toksina)
Zaključci
[0398] Utvrđeno je da je najveća doza bez ozbiljnog toksičnog dejstva (HNSTD) v21252 18 mg/kg. v21252 je dobro tolerisan u svim dozama. Nije bilo nepovoljnih kliničkih zapažanja i u ovoj GLP studiji nije primećena smrtnost. Jedino dosledno kliničko zapažanje bilo je povećana dijareja. Nikakva promena telesne težine nije primećena ni u jednoj dozi i nije bilo nepovoljnih kliničkih patoloških nalaza (funkcija jetre - aspartat transaminaza i alanin transaminaza i hematologija - neutrofili, trombociti, hemoglobin i limfociti). Ovi GLP toksikološki rezultati podržavaju kliničko doziranje iznad predviđenih efikasnih doza kod ljudi.
[0399] Iznenađujuće, ADC koji sadrži Jedinjenje 9 konjugovano sa v10000 pri prosečnom DAR2 (v21252) pokazao je poboljšanu podnošljivost u poređenju sa ADC sa prosečnim DAR4 (v17597) sa HNSTD od 18 mg/kg. Ovaj rezultat je neočekivan, jer je ranije pokazano da je toksin Jedinjenje 9 konjugovano sa v10000 pri prosečnom DAR4 (v17597), kada se daje u dozi toksina od 0.36 mg/kg, bio povezan sa smrtnošću, bilo da se dozira akutno (u jednoj dozi od 9 mg/kg) ili subhronično (u dve doze od 4.5 mg/kg razdvojene dve nedelje) (Primer 8). Nasuprot tome, kada je v21252 (DAR2) primenjen pri 0.36 mg/kg doze toksina (Jedinjenje 9) u četiri doze (kumulativna doza toksina od 1.44 mg/kg), nije bilo smrtnosti i znatno je smanjena toksičnost u poređenju sa v17597. Na primer, v21252 primenjen u kumulativnoj dozi od 0.96 mg/kg toksina (Jedinjenje 9) nije povezan ni sa kakvim nepovoljnim nalazima i označen je kao nivo bez zabeleženih neželjenih dejstava (NOAEL). Osim toga, 1.44 mg/kg kumulativne doze toksina (Jedinjenje 9) je primenjeno sa 18 mg/kg v21252 putem 4 doze i tolerisano je. Ovo je četvorostruko veća doza od doze v17597 koja je bila povezana sa smrtnošću (0.36 mg/kg).
[0400] Važno, v21252 ima manju toksičnost i veću podnošljivost u poređenju sa v17597 kada se dozira na svake dve nedelje, iako ima približno dva puta veću izloženost (AUC0-336hnakon prve doze) i dva puta duži poluživot nakon prve doze kada se uporedi sa dozama koje se podudaraju po toksinu (4.5 mg/kg v17597 naspram 9 mg/kg v21252 i 9 mg/kg v17597 naspram 18 mg/kg v21252) (rezimirano u tabelama 24 i 25).
PRIMER 11: v21252 INHIBIRA RAST KSENOGRAFTA POREKLOM OD PACIJENTA SA NISKIM HER2 IN VIVO
[0401] LTL-654 potiče od pacijenta sa metastazom seroznog karcinoma jajnika i ocenjen je imunohistohemijom (IHC) kao HER2-negativan. Ranija biopsija je pomoću IHC ocenjena kao HER2-ekvivokalna.
[0402] Ženkama NOD Rag gama (NRG) miševa su potkožno implantirana, preko kapsule bubrega, dva fragmenta tumora LTL-654, približno od po 15 mm<3>. Životinje su nasumično raspoređene u jednu od dve zaslepljene tretmanske grupe od po šest životinja kada su srednje zapremine tumora dostigle 70.3-77.8 mm<3>.
[0403] Životinje su tretirane ili vehikulumom ili sa 3 mg/kg v21252 primenjenog intravenski jednom nedeljno sa ukupno četiri injekcije (qwx4) (Tabela 21). Veličina tumora je izmerena pomoću Vevo<®>3100 sistema za obradu slika (FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Kanada) korišćenjem trodimenzionalnog (3D)-moda. Više slika (od 70 do 100 po tumoru) kroz ceo tumor zabeleženo je i analizirano pomoću Vevo<®>LAB softvera v2.1.0 (FUJIFILM VisualSonics, Inc.). Veličina tumora se merila jednom nedeljno nakon randomizacije do 24. dana. Miševi su etički žrtvovani kada su pojedinačni tumori dostigli veličinu od 1500 mm<3>. Zapremine tumora su prikazane kao srednja vrednost ± SEM za svaku grupu.
[0404] Slika 16 daje rezultate za odgovor tumora kod miševa kojima su potkožno implantirani fragmenti tumora LTL-654 nakon i.v. primene vehikuluma ili v21252, što pokazuje da je tretman miševa kojima je implantiran LTL-654 sa v21252 inhibirao brzinu rasta ksenografta tumora LTL-654.
[0405] Ovaj primer pokazuje da je v21252 efikasan kod ksenografta poreklom iz pacijenta u kojem je ekspresija HER2 dovoljno niska da bi pomoću IHC bio ocenjen kao HER2-negativan.
Tabela 21: Dizajn studije PDX modela kancera jajnika LTL-654
PRIMER 12: v21252 PRODUŽAVA PREŽIVLJAVANJE MIŠEVA KOJI NOSE INTRAKRANIJALNO IMPLANTIRANE HUMANE TUMORE DOJKE IN VIVO
[0406] Konstrukti korišćeni u ovom primeru bili su: kontrolni konjugat (humanizovano antitelo protiv respiratornog sincicijalnog virusa konjugovano sa Linkerom-Toksinom 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR3.5) i v24029 (trastuzumab konjugovan pri DAR8 sa inhibitorom topoizomeraze I na bazi derivata egzatekana (DXd)). Intrakranijalno implantirani humani tumori dojke BT-474 korišćeni u ovom primeru služe kao model metastaze HER2-pozitivnog kancera dojke.
[0407] Ženke Balb/c golih miševa (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) su ozračene izvorom γ zračenja (2 Gy,<60>Co, BioMep, Bretenières, Francuska). Anesteziranim miševima je stereotaktičkim navođenjem injecirano 1×10<5>ćelija BT-474 u 2 mikrolitra medijuma RPMI 1640 bez fenol crvenog. Životinje su nasumično raspoređene u tretmanske grupe i, počevši od 8. dana su intravenski primale vehikulum, kontrolni konjugat, v21252, v7155 ili v24029 pri 6 mg/kg svake nedelje, ukupno dvanaest injekcija (Tabela 26). Telesne težine su beležene dva puta nedeljno do 18. dana, a zatim svakodnevno. Miševi su etički žrtvovani kada je gubitak telesne težine dostigao ili premašio 20% za 3 uzastopna dana.
[0408] Slika 17 daje rezultate preživljavanja za miševe kojima su intrakranijalno implantirane tumorske ćelije BT-474 nakon i.v. primene vehikuluma, kontrolnog konjugata, v21252, v7155 ili v24029.
[0409] Dve dodatne kohorte životinja kojima su intrakranijalno implantirane ćelije BT-474 takođe su nasumično raspoređene u tretmanske grupe i, počev od 8. dana intravenski su primale v21252 ili v24029 pri 6 mg/kg na svake dve nedelje, ukupno šest injekcija. Telesne težine su beležene dva puta nedeljno do 18. dana, a zatim svakodnevno. Miševi su etički žrtvovani kada je gubitak telesne težine dostigao ili premašio 20% za 3 uzastopna dana.
[0410] Slika 18 daje rezultate preživljavanja za miševe kojima su intrakranijalno implantirane tumorske ćelije BT-474 nakon nedeljne (qw) i.v. primene vehikuluma, kontrolnog konjugata ili v7155, ili i.v. primene na svake dve nedelje (q2w) v21252 ili v24029.
[0411] Ovaj primer pokazuje da je v21252 efikasan u produženju preživljavanja miševa kojima su intrakranijalno implantirane tumorske ćelije dojke BT-474.
Tabela 26: Dizajn studije modela intrakranijalno implantiranog humanog kancera dojke BT-474
TABELE SEKVENCI
[0412]
Tabela A: Brojevi klona za varijante v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 i v6717
Tabela B: Sekvenca varijanti v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 i v6717 prema broju klona
SEQ ID NO Klon br. Opis Sekvenca (aminokiselina ili DNK) 34 5065, 720, H3 SRWGGDGFYAMDY
Tabela C: Sekvence VH i VL regiona varijanti v7133, v15082, v15085, v15083, v15080, v15079, v15084 i v15081

Claims (24)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat antitela i leka koji sadrži biparatopsko anti-HER2 antitelo konjugovano sa analogom auristatina preko linkera (L) pri niskom prosečnom odnosu leka i antitela (DAR), gde biparatopsko anti-HER2 antitelo sadrži prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji se vezuje za prvi epitop HER2 i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji se vezuje za drugi epitop HER2, pri čemu su prvi i drugi epitop HER2 na različitim domenima HER2, gde analog auristatina i linker imaju opštu Formulu (X):
  2. L je linker, i predstavlja tačku vezivanja linkera za biparatopsko anti-HER2 antitelo, i pri čemu je nizak prosečni DAR prosečan DAR između 1.5 i 2.5. 2. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1, gde je R<1>:
  3. 3. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je prosečan DAR između 1.8 i 2.5.
  4. 4. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je prosečan DAR oko 2.0.
  5. 5. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde konjugat sadrži između oko 10% i oko 30% DAR0 vrsta.
  6. 6. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde konjugat sadrži između oko 10% i oko 25% DAR0 vrsta.
  7. 7. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde konjugat sadrži između oko 15% i oko 25% DAR0 vrsta.
  8. 8. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde konjugat sadrži između 0% i oko 15% DAR6 ili većih vrsta, ili između oko 0% i oko 10% DAR6 ili većih vrsta.
  9. 9. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, gde je L otcepivi linker, opciono proteazom otcepiv linker.
  10. 10. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, gde L ima opštu Formulu
    u kojoj: Z je funkcionalna grupa sposobna da reaguje sa ciljnom grupom na biparatopskom anti-HER2 antitelu; Str je noseća jedinica; AA1i AA2su svaki nezavisno aminokiselina, gde AA1-[AA2]mformira mesto cepanja proteazom; X je samouništavajuća grupa; D je tačka vezivanja za analog auristatina; s je 0 ili 1; m je ceo broj između 1 i 4, i o je 0, 1 ili 2, pri čemu opciono s je 1, a o je 0.
  11. 11. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, gde L ima opštu Formulu (IX):
    u kojoj: A-S- je tačka vezivanja za biparatopsko anti-HER2 antitelo; Y je jedna ili više dodatnih komponenti linkera, ili je odsutan, i D je tačka vezivanja za analog auristatina.
  12. 12. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, gde analog auristatina i linker imaju strukturu:
    gde je A-S- tačka vezivanja za biparatopsko anti-HER2 antitelo.
  13. 13. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, gde se biparatopsko anti-HER2 antitelo vezuje za HER2 sa većim afinitetom u poređenju sa odgovarajućim bivalentnim monospecifičnim antitelom, i/ili gde biparatopsko anti-HER2 antitelo pokazuje veću internalizaciju u ćelije koje eksprimiraju HER2 u poređenju sa odgovarajućim bivalentnim monospecifičnim antitelom.
  14. 14. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, gde je prvi antigenvezujući polipeptidni konstrukt scFv, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je Fab.
  15. 15. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, gde je prvi epitop HER2 na ECD4 u HER2, a drugi epitop HER2 je na ECD2 u HER2, gde opciono prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt kompetira sa trastuzumabom za vezivanje za HER2, i/ili gde drugi antigenvezujući polipeptidni konstrukt kompetira sa pertuzumabom za vezivanje za HER2.
  16. 16. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, gde: (a) prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence iz ECD4-vezujućeg kraka bilo kog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 ili v6717, a drugi antigenvezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence iz ECD2-vezujućeg kraka bilo kog od v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, v6717, v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 ili v15085, ili (b) prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence iz ECD4-vezujućeg kraka v10000, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence iz ECD2-vezujućeg kraka v10000.
  17. 17. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, gde prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence prikazane u SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71 i 72, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži CDR sekvence prikazane u SEQ ID NO: 27, 28, 29, 39, 40 i 41.
  18. 18. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, gde prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži VH sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66 i VL sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 65, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži VH sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 38 i VL sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 26.
  19. 19. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, gde biparatopsko anti-HER2 antitelo dalje sadrži nosač koji je Fc region IgG, gde su prvi i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt funkcionalno vezani za nosač, i gde je Fc region IgG heterodimerni Fc region koji sadrži modifikovani CH3 domen.
  20. 20. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 19, gde modifikovani CH3 domen sadrži prvu polipeptidnu sekvencu i drugu polipeptidnu sekvencu, i gde: (a) prva polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V, a druga polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T366L, K392M i T394W; ili (b) prva polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije L351Y, F405A i Y407V, a druga polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T366L, K392L i T394W; ili (c) prva polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A i Y407V, a druga polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, T366L, K392M i T394W; ili (d) prva polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A i Y407V, a druga polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, T366L, K392L i T394W; ili (e) prva polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, L351Y, S400E, F405A i Y407V, a druga polipeptidna sekvenca modifikovanog CH3 domena sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, T366L, N390R, K392M i T394W.
  21. 21. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1, gde (a) prvi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt biparatopskog anti-HER2 antitela je scFv koji sadrži VH sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66 i VL sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 65, a drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt biparatopskog anti-HER2 antitela je Fab koji sadrži VH sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 38 i VL sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 26; (b) biparatopsko anti-HER2 antitelo dalje sadrži nosač koji je heterodimerni Fc region IgG koji sadrži modifikovani CH3 domen, gde su prvi i drugi antigen-vezujući polipeptidni konstrukt funkcionalno vezani za nosač, pri čemu modifikovani CH3 domen sadrži prvu polipeptidnu sekvencu i drugu polipeptidnu sekvencu, gde prva polipeptidna sekvenca sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, L351Y, F405A i Y407V, a druga polipeptidna sekvenca sadrži aminokiselinske modifikacije T350V, T366L, K392L i T394W; (c) analog auristatina i linker imaju strukturu:
    gde je A-S- tačka vezivanja za biparatopsko anti-HER2 antitelo; (d) prosečan DAR je između 1.8 i 2.5, i (e) konjugat sadrži između oko 10% i oko 25% DAR0 vrsta.
  22. 22. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 21 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
  23. 23. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 21 za upotrebu za lečenje kancera koji eksprimira HER2 kod subjekta kome je to potrebno.
  24. 24. Konjugat antitela i leka za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, gde je kancer koji eksprimira HER2 kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća ili kancer želuca.
RS20230943A 2018-03-13 2019-03-12 Konjugati biparatopskog anti-her2 antitela i leka i postupci za njihovu upotrebu RS64690B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862642483P 2018-03-13 2018-03-13
US201862658477P 2018-04-16 2018-04-16
US201862743884P 2018-10-10 2018-10-10
PCT/CA2019/050303 WO2019173911A1 (en) 2018-03-13 2019-03-12 Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
EP19766478.2A EP3765525B1 (en) 2018-03-13 2019-03-12 Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64690B1 true RS64690B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=67908692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230943A RS64690B1 (sr) 2018-03-13 2019-03-12 Konjugati biparatopskog anti-her2 antitela i leka i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (22)

Country Link
US (3) US20210260210A1 (sr)
EP (2) EP4253421A3 (sr)
JP (1) JP7547205B2 (sr)
KR (1) KR20200131840A (sr)
CN (1) CN112020519A (sr)
AU (1) AU2019235634A1 (sr)
BR (1) BR112020018618A2 (sr)
CA (1) CA3093477A1 (sr)
DK (1) DK3765525T5 (sr)
ES (1) ES2958933T3 (sr)
FI (1) FI3765525T3 (sr)
HR (1) HRP20231280T1 (sr)
HU (1) HUE063489T2 (sr)
IL (1) IL277049B2 (sr)
MX (1) MX2020009469A (sr)
NZ (1) NZ768561A (sr)
PL (1) PL3765525T3 (sr)
PT (1) PT3765525T (sr)
RS (1) RS64690B1 (sr)
SG (1) SG11202008770QA (sr)
TW (1) TWI822740B (sr)
WO (1) WO2019173911A1 (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016082044A1 (en) * 2014-11-27 2016-06-02 Zymeworks Inc. Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2
ES3057390T3 (en) 2015-05-13 2026-03-02 Zymeworks Bc Inc Antigen-binding constructs targeting her2
IL277049B2 (en) 2018-03-13 2024-02-01 Zymeworks Bc Inc Conjugates of biparatopic anti-HER2 antibody and drug and methods of use
WO2021030743A2 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 The Regents Of The University Of California Smart peptides and transformable nanoparticles for cancer immunotherapy
WO2021200840A1 (ja) * 2020-03-30 2021-10-07 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 エピトープ領域架橋型バイパラトピック抗体、及びそれを製造する方法
KR20240000575A (ko) * 2021-04-26 2024-01-02 수안주 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 이중특이성 항체약물접합체
WO2023141714A1 (en) * 2022-01-26 2023-08-03 Zymeworks Bc Inc. Methods of using anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates in the treatment of cancer
CN116003609B (zh) * 2022-07-04 2026-03-06 倍而达药业（苏州）有限公司 erb-B2双特异性抗体、药物组合物及其用途
WO2024230301A1 (zh) * 2023-05-09 2024-11-14 诺灵生物医药科技(北京)有限公司 一种抗体偶联药物及其用途
WO2025162287A1 (zh) * 2024-01-29 2025-08-07 正大天晴药业集团股份有限公司 抗her2抗体药物偶联物治疗肠癌的用途

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
WO2008061321A1 (en) * 2006-11-24 2008-05-29 Alinta Asset Management Pty Ltd Power supply monitoring system
PT2099823E (pt) 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
US8961967B2 (en) 2009-11-30 2015-02-24 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
JP2013514788A (ja) 2009-12-23 2013-05-02 アビペップ ピーティーワイ リミテッド イムノコンジュゲート及びその作製方法２
CN102884084B (zh) * 2010-03-04 2016-12-07 西福根有限公司 抗her2抗体及组合物
WO2011135040A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Fluorescent antibody fusion protein, its production and use
CA2799540A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
AU2012222833B2 (en) 2011-03-03 2017-03-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
US20140170148A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2
EP2702133B1 (en) * 2011-04-29 2017-08-23 Becton Dickinson and Company Cell sorter system and method
BR112014010580B1 (pt) * 2011-11-04 2021-01-12 Zymeworks, Inc. constructo de fc heteromultimérico isolado, composição, uso de um constructo de fc heteromultimérico isolado, composição de ácido nucléico e método para expressar o constructo de fc heteromultimérico isolado
EP2861261A2 (en) 2012-06-19 2015-04-22 Polytherics Limited Process for preparation of antibody conjugates and antibody conjugates
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
WO2014060365A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Universität Zürich Prorektorat Mnw Bispecific her2 ligands for cancer therapy
DK3199552T3 (da) 2012-11-20 2020-03-30 Sanofi Sa Anti-ceacam5-antistoffer og anvendelser heraf
EP2968589A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Antibody drug conjugate (adc) purification
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
WO2014182970A1 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
KR102332303B1 (ko) 2013-05-31 2021-11-26 자임워크스 인코포레이티드 감소되거나 침묵화된 효과기 기능을 갖는 이종다량체
US9877080B2 (en) * 2013-09-27 2018-01-23 Samsung Electronics Co., Ltd. Display apparatus and method for controlling thereof
KR101936697B1 (ko) 2013-11-19 2019-01-10 레메젠 리미티드 항-her2 항체 및 이의 접합체
AU2014357292B2 (en) 2013-11-27 2020-06-25 Zymeworks Bc Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
EP3083696B1 (en) 2013-12-20 2018-02-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
WO2015095953A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 The Centre For Drug Research And Development Sulfonamide-containing linkage systems for drug conjugates
RU2686085C2 (ru) 2014-01-10 2019-04-24 Синтон Байофармасьютикалс Б. В. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc) с дуокармицином, применяемые для лечения рака эндометрия
TWI701042B (zh) * 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
SG11201608192SA (en) 2014-04-11 2016-10-28 Medimmune Llc Bispecific her2 antibodies
SG11201609372UA (en) 2014-05-22 2016-12-29 Synthon Biopharmaceuticals Bv Site-specific conjugation of linker drugs to antibodies and resulting adcs
US9132096B1 (en) 2014-09-12 2015-09-15 Alkermes Pharma Ireland Limited Abuse resistant pharmaceutical compositions
ES2905569T3 (es) * 2014-09-17 2022-04-11 Zymeworks Inc Compuestos citotóxicos y antimitóticos y métodos para utilizarlos
WO2016082044A1 (en) 2014-11-27 2016-06-02 Zymeworks Inc. Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2
ES3057390T3 (en) 2015-05-13 2026-03-02 Zymeworks Bc Inc Antigen-binding constructs targeting her2
AU2016365114A1 (en) 2015-11-30 2018-05-17 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-huLRRC15 antibody drug conjugates and methods for their use
US20200297862A1 (en) 2016-04-25 2020-09-24 Zymeworks Inc. Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2
SI3626273T1 (sl) 2016-05-17 2021-04-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Konjugati protitelesa proti CMET in zdravila ter postopki za njihovo uporabo
US10377833B2 (en) 2016-07-22 2019-08-13 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Bispecific anti-HER2 antibody
CN107446045A (zh) * 2016-07-22 2017-12-08 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗her2的抗体、其药物组合物及用途
IL277049B2 (en) 2018-03-13 2024-02-01 Zymeworks Bc Inc Conjugates of biparatopic anti-HER2 antibody and drug and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021515793A (ja) 2021-06-24
TW202003585A (zh) 2020-01-16
ES2958933T3 (es) 2024-02-16
US20210346508A1 (en) 2021-11-11
DK3765525T5 (da) 2024-08-26
KR20200131840A (ko) 2020-11-24
IL277049B2 (en) 2024-02-01
FI3765525T3 (fi) 2023-10-16
SG11202008770QA (en) 2020-10-29
EP4253421A3 (en) 2024-01-03
HRP20231280T1 (hr) 2024-02-02
NZ768561A (en) 2025-09-26
EP3765525A4 (en) 2022-03-02
BR112020018618A2 (pt) 2020-12-29
HUE063489T2 (hu) 2024-01-28
US11000598B2 (en) 2021-05-11
EP3765525B1 (en) 2023-07-19
DK3765525T3 (da) 2023-10-16
IL277049B1 (en) 2023-10-01
US12357701B2 (en) 2025-07-15
MX2020009469A (es) 2021-01-29
CN112020519A (zh) 2020-12-01
EP4253421A2 (en) 2023-10-04
WO2019173911A1 (en) 2019-09-19
IL277049A (en) 2020-10-29
EP3765525A1 (en) 2021-01-20
US20200108152A1 (en) 2020-04-09
PL3765525T3 (pl) 2023-12-27
PT3765525T (pt) 2023-10-03
AU2019235634A1 (en) 2020-10-22
RU2020132555A (ru) 2022-04-13
JP7547205B2 (ja) 2024-09-09
TWI822740B (zh) 2023-11-21
CA3093477A1 (en) 2019-09-19
US20210260210A1 (en) 2021-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7547205B2 (ja) 抗ｈｅｒ２バイパラトピック抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
CN106456798B (zh) 具有高药物负载的抗体-药物缀合物
KR101529810B1 (ko) 항체-약물 접합체
EP3102244B1 (en) Antibody-drug conjugates and immunotoxins
JP6585600B2 (ja) Ｃ末端軽鎖ポリペプチド伸長を含有する抗体、ならびにその複合体及びその使用方法
TW202100557A (zh) 雙互補位ＦＲ-α抗體及免疫結合物
RS62157B1 (sr) Anti-her2 antitelo i njegov konjugat
RS60012B1 (sr) Antitela koja vezuju axl
KR20210125511A (ko) 항-cd228 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트
JP2025129192A (ja) 胆道癌の治療のための、ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合構築物の使用方法
JP2025109708A (ja) Ｂリンパ球特異的アマトキシン抗体コンジュゲート
WO2023141714A1 (en) Methods of using anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates in the treatment of cancer
RU2806049C9 (ru) Конъюгаты анти-her2 бипаратопных антител-лекарственных веществ и способы их применения
RU2806049C2 (ru) Конъюгаты анти-her2 бипаратопных антител-лекарственных веществ и способы их применения
HK40099999A (en) Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
HK40041667A (en) Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
HK40043130B (en) Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
HK40043130A (en) Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
TWI908142B (zh) Nectin-4抗體及抗體藥物結合物
WO2025184730A1 (en) Antibody constructs binding folate receptor alpha and napi2b, conjugates and methods of use
HK1233912A1 (en) Antibody-drug conjugates with high drug loading
HK1233912B (zh) 具有高药物负载的抗体-药物缀合物