Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS64812B1 - Irnk kompozicije za angiotenzinogen (agt) i postupci njihove upotrebe - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS64812B1 - Irnk kompozicije za angiotenzinogen (agt) i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Irnk kompozicije za angiotenzinogen (agt) i postupci njihove upotrebe

Info

Publication number
RS64812B1
RS64812B1 RS20231051A RSP20231051A RS64812B1 RS 64812 B1 RS64812 B1 RS 64812B1 RS 20231051 A RS20231051 A RS 20231051A RS P20231051 A RSP20231051 A RS P20231051A RS 64812 B1 RS64812 B1 RS 64812B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ome
nucleotides
modifications
hypertension
positions
Prior art date
Application number
RS20231051A
Other languages
English (en)
Inventor
Donald Foster
Gregory Hinkle
Mark K Schlegel
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=66770566&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64812(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS64812B1 publication Critical patent/RS64812B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis pronalaska
Srodne prijave
[0001] Ova prijava je srodna Privremenoj SAD prijavi br.62/671,094, podnetoj 14. maja 2018. godine, Privremenoj SAD prijavi br.62/727,141, podnetoj 5. septembra 2018. godine i Privremenoj SAD prijavi br. 62/816,996, podnetoj 12. marta 2019. godine.
Poznato stanje tehnike
[0002] Renin-angiotenzin-aldosteronski sistem (RAAS) ima ključnu ulogu u regulaciji krvnog pritiska. RAAS kaskada započinje oslobađanjem angiotenzinogena iz jetre i renina iz jukstaglomerulskih ćelija bubrega, u cirkulaciju. Sekreciju renina stimuliše nekoliko faktora, uključujući nakupljanje Na<+>u distalnim tubulama, β-simpatičku stimulaciju ili smanjenje bubrežne perfuzije. Aktivan renin u plazmi cepa angiotenzinogen (proizveden u jetri) do angiotenzina I, koji se zatim prevodi u angiotenzin II pod dejstvom konvertujućeg enzima angiotenzina I (ACE) koji se eksprimira lokalno i u cirkulaciji. Većina efekata angiotenzina II na RAAS ostvaruje se njegovim vezivanjem za receptore angiotenzina II tipa 1 (AT1R), što dovodi do arterijske vazokonstrikcije, efekata na tubule i glomerule, kao što su pojačana reapsorpcija Na<+>ili modulacija stope glomerularne filtracije. Dodatno, zajedno sa drugim stimulusima, kao što su adrenokortikotropin, antidiuretski hormon, kateholamini, endotelin, serotonin i nivoi Mg<2+>i K<+>, stimulacija AT1R dovodi do oslobađanja aldosterona koji, zauzvrat, podstiče izlučivanje Na<+>i K<+>u distalnim uvijenim tubulama bubrega.
[0003] Rezultat disregulacije RAAS koja dovodi do, na primer, prekomerne proizvodnje angiotenzina II, ili stimulacije AT1R, jeste hipertenzija koja može dovesti do, npr. povećanog oksidativnog stresa, pospešivanja inflamacije, hipertrofije i fibroze srca, bubrega i arterija, a što dalje dovodi do, npr. fibroze leve srčane komore, remodelovanja arterija i glomeruloskleroze.
[0004] Hipertenzija je najrasprostranjenija bolest koju je moguće kontrolisati u razvijenim zemljama, a koja pogađa 20-50% odrasle populacije. Hipertenzija je glavni faktor rizika za razne bolesti, poremećaje i stanja kao što su skraćeni životni vek, hronična bolest bubrega, moždani udar, infarkt miokarda, srčana insuficijencija, aneurizme (npr. aneurizma aorte), bolest perifernih arterija, oštećenje srca (npr. povećanje ili hipertrofija srca) i druge bolesti, poremećaji i stanja vezani za kardiovaskularni sistem. Dodatno, pokazano je da je hipertenzija važan faktor rizika za kardiovaskularni morbiditet i mortalitet, odnosno da čini ili doprinosi kod 62% od svih moždanih udara i 49% od svih slučajeva srčanih bolesti. U toku 2017. godine, uvedene su izmene u smernice za dijagnozu, prevenciju i lečenje hipertenzije, kada su kao ciljevi postavljeni još niži krvni pritisak, da bi se dodatno smanjio rizik od razvoja bolesti i poremećaja povezanih sa hipertenzijom (pogledati, npr. Reboussin i saradnici, Systematic Review for the 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. JAm Coll Cardiol.7. nov.2017. godine. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004; i Whelton i saradnici, (2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. JAm Coll Cardiol.7. nov.2017. godine. pii: S0735-1097(17)41519-1. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.006). WO 2015/179724 opisuje dvolančane RNK molekule koji inhibiraju ekspresiju angiotenzinogena.
[0005] Uprkos brojnim antihipertenzivnim lekovima koji su dostupni za lečenje hipertenzije, kod više od dve trećine pacijenata se kontrola bolesti ne može ostvariti sa jednim antihipertenzivnim agensom, tako da je neophodno uključivanje dva ili više antihipertenzivnih agenasa izabranih iz različitih klasa lekova. Navedeno dodatno smanjuje broj pacijenata sa kontrolisanim krvnim pritiskom, pošto se smanjuje njihovo pridržavanje propisanoj terapiji, a sa porastom brojeva medikamenata se povećavaju i sporedni efekti.
Kratko izlaganje suštine pronalaska
[0006] Predmetni pronalazak je definisan u pratećim patentnim zahtevima. Primeri izvođenja pronalaska su predstavljeni u sledećim numerisanim pasusima:
(1). Agens koji je dvolančana ribonukleinska kiselina (dsRNK), ili njegova so, za inhibiranje ekspresije angiotenzinogena (AGT), pri čemu dsRNK agens, ili njegova so, sadrži sens lanac i antisens lanac koji obrazuju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži nukleotidnu sekvencu 5’-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3’ (SEQ ID NO:482), a antisens lanac sadrži nukleotidnu sekvencu 5’-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3’ (SEQ ID NO:666),
gde a, g, c i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, G, C i U, tim redom; Af, Gf, Cf i Uf su 2'-fluoro A, G, C i U, tim redom; s je fosforotioatna veza; a (Tgn) je S-izomer timidin-glikolne nukleinske kiseline (GNA), i dalje sadrži ligand koji je derivat N-acetilgalaktozamina (GalNAc).
(2). dsRNK agens, ili njegova so, iz pasusa 1, gde je ligand:
(i) konjugovan na 3' kraj sens lanca dsRNK agensa ili njegove soli; i/ili
(ii) derivat N-acetilgalaktozamina (GalNAc) koji je
dalje opciono, pri čemu je dsRNK agens, ili njegova so, konjugovan sa ligandom kao što je prikazano sledećoj šemi
a, gde X je O ili S; ili
(iv) jedan ili više GalNAc derivata, vezanih preko monovalentnog, dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera.
(3). Izolovana ćelija koja sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, iz pasusa 1 ili 2.
(4). Farmaceutska kompozicija za inhibiranje ekspresije gena koji kodira AGT, koja sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, iz pasusa 1 ili 2.
(5). Farmaceutska kompozicija koja sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, iz pasusa 1 ili 2, i lipidnu formulaciju.
(6). In vitro postupak za inhibiranje ekspresije AGT gena u ćeliji, postupak koji obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom, ili njegovom soli, iz pasusa 1 ili 2, ili farmaceutskom kompozicijom iz pasusa 4 ili 5, čime se inhibira ekspresija AGT gena u ćeliji.
(7). dsRNK agens, ili njegova so, iz pasusa 1 ili 2, ili farmaceutska kompozicija iz pasusa 4 ili 5, za upotrebu u lečenju subjekta koji ima poremećaj povezan sa AGT.
(8). dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu iz pasusa 7, pri čemu je subjektu postavljena dijagnoza poremećaja povezan sa AGT,
opciono, pri čemu je poremećaj povezan sa AGT izabran iz grupe koju čine visok krvni pritisak, hipertenzija, granična hipertenzija, primarna hipertenzija, sekundarna hipertenzija, izolovana sistolna ili dijastolna hipertenzija, hipertenzija povezana sa trudnoćom, dijabetska hipertenzija, rezistentna hipertenzija, refraktorna hipertenzija, paroksizmalna hipertenzija, renovaskularna hipertenzija, Goldblatova hipertenzija, hipertenzija povezana sa niskom aktivnošću renina ili koncentracijom renina u plazmi, očna hipertenzija, glaukom, plućna hipertenzija, portalna hipertenzija, sistemska venska hipertenzija, sistolna hipertenzija, labilna hipertenzija; hipertenzivna bolest srca, hipertenzivna nefropatija, ateroskleroza, arterioskleroza, vaskulopatija, dijabetska nefropatija, dijabetska retinopatija, hronična srčana insuficijencija, kardiomiopatija, dijabetska kardiomiopatija, glomeruloskleroza, koarktacija aorte, aneurizma aorte, ventrikularna fibroza, insuficijencija srca, infarkt miokarda, angina, moždani udar, bubrežna bolest, bubrežna insuficijencija, sistemska skleroza, oraničenje intrauterinog rasta (IUGR), ograničenje rasta fetusa, gojaznost, steatoza jetre/masna jetra, nealkoholni steatohepatitis (NASH), bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD); intolerancija na glukozu, dijabetes tipa 2 (dijabetes nezavisan od insulina) i metabolički sindrom.
(9). dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu iz pasusa 7 ili 8, pri čemu dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom, ili njegovom soli, ili farmaceutskom kompozicijom, inhibira ekspresiju AGT za najmanje 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95%.
(10). dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu iz bilo kog od pasusa 7-9, pri čemu subjekat:
(i) ima sistolni krvni pritisak od najmanje 130 mm Hg ili dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg;
(ii) ima sistolni krvni pritisak od najmanje 140 mm Hg i dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg;
(iii) čovek je; i/ili
(iv) deo je grupe podložne osetljivosti na so, prekomerne je težine, gojazan je ili je u trudnoći.
(11). dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu iz bilo kog od pasusa 7-10, pri čemu se dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija, daju subjektu u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg, i/ili subkutano; i/ili
subjektu se daje dodatan terapijski agens za lečenje hipertenzije, opciono pri čemu dodatni terapijski agens:
(a) izabran iz grupe koju čine diuretik, inhibitor angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), antagonista receptora angiotenzina II, beta-blokator, vazodilatator, blokator kalcijumovih kanala, antagonista aldosterona, alfa2-agonista, inhibitor renina, alfa-blokator, adrenergički agens perifernog delovanja, selektivni delimičan agonista D1 receptora, neselektivni alfaadrenergički antagonista, sintetički, steroidni antimineralokortikoidni agens, inhibitori angiotenzinskog receptora-neprilizina (ARNi), Entresto<®>, sakubitril/valsartan; ili antagonista endotelinskog receptora (ERA), sitaksentan, ambrisentan, atrasentan, BQ-123, zibotentan, bosentan, macitentan i tezosentan; kombinacija bilo kojih od prethodno navedenih; i terapijski agens za hipertenziju formulisan kao kombinacija agenasa; ili
(b) sadrži antagonistu receptora angiotenzina II, dodatno opciono, pri čemu je antagonista receptora angiotenzina II izabran iz grupe koju čine losartan, valsartan, olmesartan, eprosartan i azilsartan.
(12). Komplet koji sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, iz pasusa 1 ili 2, ili farmaceutsku kompoziciju iz pasusa 4 ili 5.
[0007] Predmetni opis obezbeđuje IRNK (RNK interferirajuće) kompozicije koje utiču na cepanje RNK transkripata gena koji kodira angiotenzinogen (AGT) posredovano utišavajućim kompleksom koji se indukuje sa RNK (RISC). AGT može biti unutar ćelije, npr. ćelije unutar subjekta, kao što je humani subjekat.
[0008] Prema jednom aspektu, predmetni opis obezbeđuje agens koji je dvolančana ribonukleinska kiselina (dsRNK) za inhibiranje ekspresije angiotenzinogena (AGT), pri čemu dsRNK agens sadrži sens lanac i antisens lanac koji obrazuju dvolančani region, gde sens lanac sadrži najmanje 19 uzastopnih nukleotida iz nukleotidne sekvence bilo kog od nukleotida 635-658, 636-658, 642-667, 642-664, 645-667, 1248-1273, 1248-1272, 1248-1270, 1250-1272, 1251-1273, 1580-1602, 1584-1606, 1587-1609, 1601-1623, 1881-1903, 2074-2097, 2074-2096, 2075-2097, 2080-2102, 2272-2294, 2276-2298, 2281-2304, 2281-2303 ili 2282-2304 iz SEQ ID NO:1, a antisens lanac sadrži najmanje 19 uzastopnih nukleotida iz nukleotidne sekvence SEQ ID NO:2.
[0009] U određenim opcijama, sens lanac sadrži najmanje 21 uzastopni nukleotid od bilo kojih od nukleotida 635-658, 636-658, 642-667, 642-664, 645-667, 1248-1273, 1248-1272, 1248-1270, 1250-1272, 1251-1273, 1580-1602, 1584-1606, 1587-1609, 1601-1623, 1881-1903, 2074-2097, 2074-2096, 2075-2097, 2080-2102, 2272-2294, 2276-2298, 2281-2304, 2281-2303 ili 2282-2304 iz SEQ ID NO:1. U određenim opcijama, antisens lanac sadrži najmanje 21 uzastopni nukleotid iz nukleotidne sekvence SEQ ID NO:2.
[0010] U određenim opcijama, antisens lanac sadrži najmanje 19 uzastopnih nukleotida iz bilo koje od nukleotidnih sekvenci antisens lanca izabranih iz grupe koju čine AD-85481, AD-84701, AD84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD-133385. U određenim opcijama, sens lanac sadrži najmanje 19 uzastopnih nukleotida iz bilo koje od nukleotidnih sekvenci sens lanca dupleksa, izabranih iz grupe koju čine AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD133385. U određenim opcijama, sens i antisens lanci sadrže nukleotidne sekvence dupleksa izabrane iz grupe koju čine AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD133385.
[0011] U određenim opcijama, antisens lanac sadrži najmanje 19 uzastopnih nukleotida iz nukleotidne sekvence antisens lanca AD-85481 (5’-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3’ (SEQ ID NO: 9)). U određenim opcijama, sens lanac sadrži najmanje 19 uzastopnih nukleotida iz nukleotidnih sekvenci sens lanca AD-85481 (5’-GUCAUCCACAAUGAGAGUACA-3’ (SEQ ID NO: 10)). U određenim opcijama, sens i antisens lanci sadrže nukleotidne sekvence sens i antisens lanaca AD-85481 (5’-UGUACUCUCAUUGUGGAUGACGA-3’ (SEQ ID NO: 9) i 5’-GUCAUCCACAAUGAGAGUACA-3’ (SEQ ID NO: 10)).
[0012] U određenim opcijama, dsRNK agens sadrži najmanje jedan modifikovan nukleotid. U određenim opcijama, suštinski svi od nukleotida sens lanca i suštinski svi od nukleotida antisens lanca sadrže modifikaciju. U određenim opcijama, svi od nukleotida sens lanca i svi od nukleotida antisens lanca sadrže modifikaciju. U određenim opcijama, najmanje jedan od modifikovanih nukleotida je izabran iz grupe koju čine dezoksi-nukleotid, 3'-terminalni dezoksi-timinski (dT) nukleotid, 2'-O-metilom modifikovan nukleotid, 2'-fluoro modifikovan nukleotid, 2'-dezoksi-modifikovan nukleotid, „zaključan” (engl. locked) nukleotid, „otključan” (engl. unlocked) nukleotid, konformaciono ograničen nukleotid, krut etil nukleotid, abazičan nukleotid, 2'-aminom modifikovan nukleotid, 2’-O-alilom modifikovan nukleotid, 2'-C-alkilom modifikovan nukleotid, 2'-hidroksi modifikovan nukleotid, 2'-metoksietilom modifikovan nukleotid, 2'-O-alkilom modifikovan nukleotid, morfolino nukleotid, fosforamidat, nukleotid koji sadrži bazu koja se ne javlja u prirodi, tetrahidropiranom modifikovan nukleotid, 1,5-anhidroheksitolom modifikovan nukleotid, cikloheksenilom modifikovan nukleotid, nukleotid koji sadrži fosforotioatnu grupu, nukleotid koji sadrži metilfosfonatnu grupu, nukleotid koji sadrži 5'-fosfat, nukleotid koji sadrži imitaciju 5'-fosfata, termički destabilišući nukleotid, glikolom modifikovan nukleotid (GNA) i 2-O-(N-metilacetamidom) modifikovan nukleotid; i njihove kombinacije. U određenim opcijama, modifikacije na nukleotidima su izabrane iz grupe koju čine LNA, HNA, CeNA, 2’-metoksietil, 2'-O-alkil, 2'-O-alil, 2'-C- alil, 2'-fluoro, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil, GNA i njihove kombinacije. U određenim opcijama, modifikacije na nukleotidima su modifikacije sa 2'-O-metil ili 2'-fluoro grupama. U određenim opcijama, najmanje jedan od modifikovanih nukleotida je izabran iz grupe koju čine dezoksi-nukleotid, 2'-O-metilom modifikovan nukleotid, 2'-fluoro modifikovan nukleotid, 2'-dezoksi-modifikovan nukleotid, glikolom modifikovan nukleotid (GNA) i 2-O-(N-metilacetamidom) modifikovan nukleotid; i njihove kombinacije. U određenim opcijama, najmanje jedna od nukleotidnih modifikacija je termički destabilišuća nukleotidna modifikacija. U određenim opcijama, termički destabilišuća nukleotidna modifikacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od abazne modifikacije; pogrešnog sparivanja sa suprotnim nukleotidom u dupleksu; i destabilišuće modifikacija šećera, 2'-dezoksi modifikacije, aciklični nukleotidi, „otključane” nukleinske kiseline (UNA) i glicerolske nukleinske kiseline (GNA)
[0013] U određenim opcijama, dvolančani region je dužine od 19-21 nukleotida. U određenim opcijama, dvolančani region je dužine 21 nukleotid. U određenim opcijama, svaki lanac dsRNK agensa nezavisno nije dužine veće od 30 nukleotida. U određenim opcijama, najmanje jedan lanac dsRNK agensa sadrži 3' jednolančani kraj od najmanje 1 nukleotida ili najmanje 2 nukleotida.
[0014] U određenim opcijama, dsRNK agens dalje sadrži ligand. U određenim opcijama, ligand je konjugovan sa 3' krajem sens lanca dsRNK agensa. U određenim opcijama, ligand je derivat N-acetilgalaktozamina (GalNAc), npr. gde je ligand
[0015] U određenim opcijama, dsRNK agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano šemi koja sledi
a, gde X je O ili S, npr. gde je X O.
[0016] U određenim opcijama, opis obezbeđuje dsRNK agens, gde antisens lanac sadrži region komplementarnosti sa informacionom RNK (iRNK) koja kodira humani AGT, pri čemu region komplementarnosti sadrži najmanje 19 nukleotida iz jedne od sekvenci antisens lanca dupleksa, izabrane iz grupe koji se sastoji od AD-85481, AD84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD-133385. U određenim opcijama, antisens lanac sadrži region komplementarnosti sa iRNK koja kodira humani AGT, pri čemu region komplementarnosti sadrži bilo koju od sekvenci antisens lanca dupleksa, izabranu iz grupe koju čine AD-85481, AD84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD-133385. U određenim opcijama, region komplementarnosti se sastoji od bilo koje od sekvenci antisens lanca dupleksa, izabrane iz grupe koju čine AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD85444, AD-85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD85524, AD-85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD-133385.
[0017] U određenim opcijama, opis obezbeđuje dsRNK agens, gde antisens lanac sadrži hemijski modifikovanu nukleotidnu sekvencu dupleksa, izabranu iz grupe koju čine AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD-85432, AD-85434, AD85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD-85446, AD-85447, AD85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD-85622, AD-85623, AD85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD-126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD-133385.
[0018] U određenim opcijama, opis obezbeđuje dsRNK agens, gde antisens lanac sadrži hemijski modifikovanu nukleotidnu sekvencu dupleksa AD-85481 (5’-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3’ (SEQ ID NO: 11)) gde a c, g i u su 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, tim redom; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-O-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-O-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-O-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-O-fluoruridin-3'-fosfat, tim redom; dT je dezoksi-timin; s je fosforotioatna veza; a (Tgn) je S-izomer timidin-glikolne nukleinske kiseline (GNA).
[0019] U određenim opcijama, opis obezbeđuje dsRNK agens, gde antisens lanac i sens lanac sadrže hemijski modifikovane nukleotidne sekvence dupleksa, izabrane iz grupe koju čine AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD85637, AD-85655, AD-126306, AD-126307, AD126308, AD-126310, AD133360, AD-133361, AD-133362, AD-133374 i AD-133385.
[0020] U određenim opcijama, opis obezbeđuje dsRNK agens, gde antisens lanac i sens lanac sadrže hemijski modifikovane nukleotidne sekvence dupleksa AD-85481 (5’-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3’ (SEQ ID NO: 11) i 5’-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3’ (SEQ ID NO: 12)) gde a, c, g i u su 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, tim redom; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-O-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-O-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-O-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-O-fluoruridin-3'-fosfat, tim redom; dT je dezoksi-timin; s je fosforotioatna veza; a (Tgn) je S-izomer timidin-glikolne nukleinske kiseline (GNA); i pri čemu je 3'-kraj sens lanca opciono konjugovan sa N-[tris(GalNAc-alkil)-amidodekanoil)]-4-hidroksiprolinolskim (L96) ligandom.
[0021] U određenim opcijama, opis obezbeđuje dsRNK agens, gde se antisens lanac i sens lanac sastoje od hemijski modifikovanih nukleotidnih sekvenci dupleksa AD-85481 (5’-usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3’ (SEQ ID NO: 11) i 5’-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3’ (SEQ ID NO: 12)), pri čemu je 3'-kraj sens lanca konjugovan sa N-[tris(GalNAc-alkil)-amidodekanoil)]-4-hidroksiprolinolskim (L96) ligandom, gde a, c, g i u su 2'-O-metiladenozin-3'-fosfat, 2'-O-metilcitidin-3'-fosfat, 2'-O-metilguanozin-3'-fosfat, i 2'-O-metiluridin-3'-fosfat, tim redom; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-O-fluoroadenozin-3'-fosfat, 2'-O-fluorocitidin-3'-fosfat, 2'-O-fluoroguanozin-3'-fosfat i 2'-O-fluoruridin-3'-fosfat, tim redom; dT je dezoksi-timin; s je fosforotioatna veza; a (Tgn) je S-izomer timidin-glikolne nukleinske kiseline (GNA).
[0022] U određenim opcijama, dvolančani region dsRNK agensa je dužine od oko 19-30 nukleotidnih parova, dužine od oko 19-25 nukleotidnih parova, dužine od oko 23-27 nukleotidnih parova, dužine od oko 19-23 nukleotidnih parova, dužine od oko 21-23 nukleotidnih parova.
[0023] U određenim opcijama, svaki lanac dsRNK agensa je nezavisno dužine 19-30 nukleotida.
[0024] U određenim opcijama, ligand je jedan ili više od GalNAc derivata, vezanih preko jednovalentnog, dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera.
[0025] U određenim opcijama, dsRNK agens dalje sadrži najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu međunukleotidnu vezu. U određenim opcijama, fosforotioatna ili metilfosfonatna međunukleotidna veza je na 3’-kraju jednog lanca. U određenim opcijama, lanac je antisens lanac. U određenim opcijama, lanac je sens lanac. U određenim opcijama, fosforotioatna ili metilfosfonatna međunukleotidna veza je na 5'-kraju jednog lanca. U određenim opcijama, lanac je antisens lanac. U određenim opcijama, lanac je sens lanac. U određenim opcijama, fosforotioatna ili metilfosfonatna međunukleotidna veza je na oba od 5'- i 3'-krajeva jednog lanca. U određenim opcijama, lanac je antisens lanac.
[0026] U određenim opcijama, dsRNK agens na poziciji 15'-kraja antisens lanca dupleksa sadrži bazni par koji je AU bazni par.
[0027] U određenim opcijama, dsRNK agens sadrži sens lanac koji ima ukupno 21 nukleotid, a antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0028] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje ćeliju koja sadrži dsRNK agens opisa.
[0029] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za inhibiranje ekspresije gena koji kodira AGT, koja sadrži dsRNK agens opisa. U određenim opcijama, farmaceutska kompozicija sadrži dsRNK agens i lipidnu formulaciju.
[0030] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje postupak inhibiranja ekspresije AGTgena u ćeliji, postupak koji obuhvata:
(a) dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom ili farmaceutskom kompozicijom opisa; i (b) održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) tokom vremena dovoljnog da se ostvari degradacija iRNK transkripata AGT gena, čime se inhibira ekspresija AGT gena u ćeliji.
[0031] U određenim opcijama, ćelija je unutar subjekta. U određenim opcijama, subjekat je čovek. U određenim opcijama, subjektu je postavljena dijagnoza poremećaja povezanog sa AGT.
[0032] U određenim opcijama, poremećaj povezan sa AGT je izabran od visokog krvnog pritiska, hipertenzije, granične hipertenzije, primarne hipertenzije, sekundarne hipertenzije, izolovane sistolne ili dijastolne hipertenzije, hipertenzije povezane sa trudnoćom, dijabetske hipertenzije, rezistentne hipertenzije, refraktorne hipertenzije, paroksizmalne hipertenzije, renovaskularne hipertenzije, Goldblatove hipertenzije, očne hipertenzije, glaukoma, plućne hipertenzije, portalne hipertenzije, sistemske venske hipertenzije, sistolne hipertenzije, labilne hipertenzije; hipertenzivne bolesti srca, hipertenzivne nefropatije, ateroskleroze, arterioskleroze, vaskulopatije, dijabetske nefropatije, dijabetske retinopatije, hronične srčane insuficijencije, kardiomiopatije, dijabetske kardiomiopatije, glomeruloskleroze, koarktacije aorte, aneurizme aorte, ventrikularne fibroze, insuficijencije srca, infarkta miokarda, angine, moždanog udara, bubrežne bolesti, bubrežne insuficijencije, sistemske skleroze, oraničenja intrauterinog rasta (IUGR), ograničenja rasta fetusa, gojaznosti, steatoze jetre/masne jetre, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD); intolerancije na glukozu, dijabetesa tipa 2 (dijabetesa nezavisnog od insulina) i metaboličkog sindroma.
[0033] U određenim opcijama, subjekat ima sistolni krvni pritisak od najmanje 130 mm Hg ili dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg. U određenim opcijama, subjekat ima sistolni krvni pritisak od najmanje 140 mm Hg i dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg. U određenim opcijama, subjekat je deo grupe podložne osetljivosti na so, prekomerne je težine, gojazan je ili je u trudnoći.
[0034] U određenim opcijama, dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom inhibira ekspresiju AGT za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% (npr. u poređenju sa nivoom ekspresije AGT pre prvog kontakta ćelije sa dsRNK agensom; npr. pre davanja prve doze dsRNK agensa subjektu). U određenim opcijama, inhibiranje ekspresije AGT smanjuje nivo AGT proteina u uzorku(uzorcima) seruma subjekta za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95, npr. u poređenju sa nivoom ekspresije AGT pre prvog kontakta ćelije sa dsRNK agensom.
[0035] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje postupak lečenja poremećaja povezanog sa AGT kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu dsRNK agensa ili farmaceutske kompozicije opisa, čime se leči poremećaj povezan sa AGT kod subjekta. U određenim opcijama, subjekat ima sistolni krvni pritisak od najmanje 130 mm Hg ili dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg. U određenim opcijama, subjekat ima sistolni krvni pritisak od najmanje 140 mm Hg i dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg. U određenim opcijama, subjekat je čovek. U određenim opcijama, subjekat je deo grupe podložne osetljivosti na so, prekomerne je težine, gojazan je ili je u trudnoći.
[0036] U određenim opcijama opisa, dsRNK agens se primenjuje u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg. U određenim opcijama, dsRNK agens se daje subjektu subkutano. U određenim opcijama, nivo AGT u subjektu se meri. U određenim opcijama, nivo AGT kod subjekta je nivo AGT proteina u uzorku(uzorcima) krvi subjekta, uzorku(uzorcima) seruma ili uzorku(uzorcima) urina.
[0037] U određenim opcijama, subjektu se daje dodatni terapijski agens za lečenje hipertenzije. U određenim opcijama, dodatni terapijski agens je izabran iz grupe koju čine diuretik, inhibitor angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), antagonista receptora angiotenzina II, beta-blokator, vazodilatator, blokator kalcijumovih kanala, antagonista aldosterona, alfa2-agonista, inhibitor renina, alfa-blokator, adrenergički agens perifernog delovanja, selektivni delimičan agonista D1 receptora, neselektivni alfa-adrenergički antagonista, sintetički, steroidni antimineralokortikoidni agens; ili kombinacija bilo kojiih od prethodno navedenih; i terapijski agens za hipertenziju formulisan kao kombinacija agenasa. U određenim opcijama, dodatni terapijski agens sadrži antagonistu receptora za angiotenzin II, npr. losartan, valsartan, olmesartan, eprosartan i azilsartan. U određenim opcijama, dodatni terapijski agens je inhibitor angiotenzinskog receptora-neprilizina (ARNi), npr. Entresto<®>, sakubitril/valsartan; ili je antagonista endotelinskog receptora (ERA), npr. sitaksentan, ambrisentan, atrasentan, BQ-123, zibotentan, bosentan, macitentan i tezosentan.
[0038] Opis takođe obezbeđuje upotrebu dsRNK agenasa i farmaceutskih kompozicija koje su ovde obezbeđene, za lečenje poremećaja povezanih sa AGT. U određenim opcijama, upotrebe uključuju bilo koji od postupaka koji su obezbeđeni opisom.
[0039] Opis obezbeđuje komplete koji sadrže dsRNK agens opisa. U određenim opcijama, opis obezbeđuje komplete za praktikovanje postupaka opisa.
Kratak opis slika
[0040]
Slika 1A je grafik koji prikazuje nivoe AGT proteina u serumu cinomolgus majmuna (n = 3 po grupi) tretiranih jednom dozom naznačenih siRNK od 3 mg/kg. Nivoi AGT su prikazani kao procenat nivoa AGT pre tretmana.
Slika 1B je grafik koji prikazuje nivoe AGT proteina u serumu cinomolgus majmuna (n = 3 po grupi) tretiranih jednom dozom od 0,3 mg/kg, 1 mg/kg ili 3 mg/kg AD-85481 ili AD-67327, Dana 1. Nivoi AGT su prikazani kao procenat nivoa AGT pre tretmana.
Slika 1C je grafik koji prikazuje nivoe AGT proteina u serumu cinomolgus majmuna (n = 3 po grupi) kojima je data doza od 1 mg/kg AD-85481 ili AD-67327, jednom na svake četiri nedelje, a ukupno u tri doze. Nivoi AGT su prikazani kao procenat nivoa AGT pre tretmana.
Slike 2A-2G prikazuju rezultate raznih parametara iz studije sa spontano hipertenzivnim pacovima (n=9 po grupi) tretiranim nosačem, valsartanom (31 mg/kg/dan), AGT-siRNK specifičnom za pacove (10 mg/kg na 2 nedelje), kaptoprilom (100 mg/kg/dan), valsartanom i kaptoprilom ili valsartanom i sa AGT-siRNK.
Slika 2A prikazuje nivoe AGT u plazmi na početku (popunjeni stubići) i na kraju (šrafirani stubići) studije (u četvrtoj nedelji).
Slika 2B prikazuje dnevna očitavanja krvnog pritiska u poređenju sa bazalnim nivoom.
Slika 2C je grafik koji prikazuje odnose težine srca i dužine tibije.
Slika 2D je grafik koji prikazuje nivo aktivnosti renina u plazmi na početku (popunjeni stubići) i na kraju (šrafirani stubići) studije (u četvrtoj nedelji).
Slika 2E je grafik odnosa težine srca:dužine tibije u odnosu na srednji arterijski pritisak (MAP) u mm Hg.
Slika 2F je grafik veličine kardiomiocita.
Slika 2G je grafik nivoa N-terminalnog natriuretičkog peptida pro b-tipa (NT-proBNP).
Slika 3 je grafik koji prikazuje nivoe AGT u urinu, dobijene u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 4A je grafik koji prikazuje nivo Ang I u krvi, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 4B je grafik koji prikazuje nivo Ang II u krvi, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 4C je grafik koji prikazuje odnos Ang II u krvi prema Ang I u krvi, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 5A je grafik koji pokazuje nivo bubrežnog Ang I, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 5B je grafik koji prikazuje nivo bubrežnog Ang II, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 5C je grafik koji prikazuje odnos bubrežnog Ang II prema bubrežnom Ang I, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 6A je grafik koji prikazuje nivo angiotenzinskog receptora 1a u kori i meduli bubrega, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 6B je grafik koji prikazuje nivo angiotenzinskog receptora 1b u kori i meduli bubrega, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 6C je grafik koji prikazuje nivo ACE u kori i meduli bubrega, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 7 je grafik koji prikazuje zapreminu urina na početku i 4 nedelje nakon početka lečenja, dobijen u studiji sa spontano hipertenzivnim pacovima.
Slika 8A je grafik koji prikazuje prosečne telesne težine miševa kojima je indukovana gojaznost hranjenjem sa visoko masnom hranom (DIO), ili miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (n = 5 po grupi), tretiranih bilo sa AGT dsRNK agensom ili PBS-om.
Slika 8B je grafik koji prikazuje težinr jetre, masnog tkiva i mišića pri žrtvovanju (n = 5 po grupi) miševa kojima je indukovana gojaznost hranjenjem sa visoko masnom hranom (DIO), ili miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom, tretiranih bilo AGT dsRNK agensom ili PBS-om. Slika 9A je grafik koji pokazuje promene u nivoima glukoze u plazmi (mg/dL) kod miševa kojima je indukovana gojaznost hranjenjem sa visoko masnom hranom (DIO), ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (n = 5 po grupi), tretiranih bilo AGT dsRNK agensom ili PBS-om, u 0. nedelji, pre prvog davanja doze.
Slika 9B je grafik koji prikazuje nivoe glukoze u plazmi (mg/dL) kod miševa kojima je indukovana gojaznost hranjenjem sa visoko masnom hranom (DIO), ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (n = 5 po grupi), tretiranih bilo sa AGT dsRNK agensom ili PBS-omu, u 6. nedelji eksperimenta.
Slika 9C je grafik koji prikazuje nivoe glukoze u plazmi (mg/dL) kod miševa kojima je indukovana gojaznost hranjenjem sa visoko masnom hranom (DIO), ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (n = 5 po grupi), tretiranih bilo sa AGT dsRNK agensom ili PBS-omu, u 12. nedelji eksperimenta.
Slika 10A je grafik koji prikazuje prosečne telesne težine miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti i visokom fruktozom (HF HFr), tretiranih bilo AGT dsRNK agensom ili PBS-om, ili miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (LFD).
Slika 10B je grafik koji prikazuje prosečan kumulativni prirast telesne težine miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem fruktoze (HF HFr), tretiranih bilo AGT dsRNK agensom ili PBS-om, ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (LFD).
Slike 11A-11C su grafici koji prikazuju enzime jetre u serumu kod miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem fruktoze (HF HFr), tretiranih bilo AGT dsRNK agensom ili PBS-om, ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (LFD), u 20. nedelji eksperimenta.
Slika 11A je grafik koji prikazuje nivoe alanin transaminaze (ALT) kod miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem fruktoze (HF HFr), tretiranih bilo sa AGT dsRNK agensom ili PBS-om, ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (LFD).
Slika 11B je grafik koji prikazuje nivoe aspartat transaminaze (AST) kod miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem fruktoze (HF HFr), tretiranih bilo sa AGT dsRNK agensom ili PBS-om, ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (LFD).
Slika 11C je grafik koji prikazuje nivoe glutamat dehidrogenaze (GLDH) kod miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem fruktoze (HF HFr), tretiranih bilo sa AGT dsRNK agensom ili PBS-om, ili kod miševa hranjenih normalnom briketiranom hranom (LFD).
Detaljan opis pronalaska
[0041] Predmetni opis obezbeđuje IRNK kompozicije koje utiču na cepanje RNK transkripata AGT gena posredovano utišavajućim kompleksom koji se indukuje sa RNK (RISC). Gen može biti unutar ćelije, npr. ćelije unutar subjekta, kao što je čovek. Upotreba ovih IRNK omogućava ciljanu degradaciju iRNK odgovarajućeg gena (AGT gena) kod sisara.
[0042] IRNK opisa su dizajnirane tako da ciljano deluju na humani AGT gen, uključujući delove gena koji su evolutivno očuvani u AGT ortolozima iz drugih vrsta sisara. Bez namere da bude ograničeno teorijom, veruje se da kombinacija ili podkombinacija prethodno navedenih osobina i specifičnih ciljnih mesta ili specifičnih modifikacija u ovim IRNK obezbeđuju poboljšanu efikasnost, stabilnost, potenciju, izdržljivost i bezbednost za IRNK opisa.
[0043] Shodno navedenom, predmetni opis obezbeđuje postupke za lečenje i prevenciju poremećaja povezanih sa AGT, npr. hipertenzije, upotrebom IRNK kompozicija koje ostvajuju cepanje RNK transkripata AGT gena posredovano utišavajućim kompleksom koji se indukuje sa RNK (RISC).
[0044] IRNK opisa ukljuju RNK lanac (antisens lanac) koji ima region dužine do oko 30 nukleotida ili manje, npr. dužine od 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ili 21-22 nukleotida, što je region koji je suštinski komplementaran najmanje delu iRNK transkripta AGT gena.
[0045] U određenim opcijama, jedan ili oba lanca dvolančanih RNKi agenasa opisa su dužine do 66 nukleotida, npr. dužine su od 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nukleotida, sa regionom od najmanje 19 uzastopnih nukleotida koji je suštinski komplementaran najmanje delu iRNK transkripta AGT gena. U pojedinim opcijama, takvi RNKi agensi koji imaju antisens lanac veće dužine, poželjno mogu uključivati drugi RNK lanac (sens lanac) dužine od 20-60 nukleotida, pri čemu sens i antisens lanci obrazuju dupleks od 18-30 uzastopnih nukleotida.
[0046] Upotreba IRNK opisa omogućava ciljanu degradaciju iRNK odgovarajućeg gena (AGT gena) kod sisara. Upotrebom in vitro i in vivo testova, predmetni pronalazači su pokazali da IRNK koje ciljano deluju na AGT gen mogu posredovati RNKi, što rezultuje značajnom inhibicijom ekspresije AGT. Inhibicija ekspresije AGT kod takvog subjekta će sprečiti ili delovati na razvoj poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije. Prema tome, postupci i kompozicije koje uključuju ove IRNK su korisni za prevenciju i lečenje subjekta koji je podložan ili kome je postavljena dijagnoza poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije. Postupci i kompozicije koji su ovde opisani, korisni su za smanjivanje nivoa AGT kod subjekta.
[0047] Detaljan opis pronalaska koji sledi, opisuje kako napraviti i upotrebiti kompozicije koje sadrže IRNK za inhibiranje ekspresije AGT gena, kao i kompozicije, upotrebe i postupke za lečenje subjekata koji bi imali koristi od smanjenja ekspresije AGT gena, npr. subjekata podložnih ili kojima je postavljena dijagnoza poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije.
I. Definicije
[0048] Da bi se predmetni opis mogao lakše razumeti, najpre su definisani određeni termini. Dodatno, potrebno je napomenuti da kad god je navedena vrednost ili opseg vrednosti parametra, predviđeno je da su vrednosti i opsezi koji predstavljaju međuvrednosti u odnosu na navedene vrednosti, takođe deo ovog opisa.
[0049] Jednine pojmova se ove upotrebljavaju tako da se odnose na jedan ili više od jednog (tj. na najmanje jedan) gramatički objekat. Na primer, „element” označava jedan element ili više od jednog elementa, npr. mnoštvo elemenata.
[0050] Termin „uključujući” ovde se upotrebljava tako da označava, mada se i upotrebljava naizmenično sa, frazom „uključujući, ali bez ograničavanja na".
[0051] Termin „ili” ovde se upotrebljava tako da označava, mada se i upotrebljava naizmenično sa terminom „i/ili”, osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Na primer, „sens lanac ili antisens lanac” je potrebno tumačiti kao „sens lanac ili antisens lanac ili sens lanac i antisens lanac“.
[0052] Termin „oko” ovde se upotrebljava tako da označava vrednosti unutar uobičajenih opsega tolerancija u oblasti tehnike. Na primer, „oko” se može tumačiti kao standardno odstupanje od oko 2, od srednje vrednosti. U određenim opcijama, oko označava ±10%. U određenim opcijama, oko označava ±5%. Kada je oko prisutno ispred serije brojeva ili opsega, podrazumeva se da „oko” može modifikovati svaki od brojeva u seriji ili opsegu.
[0053] Podrazumeva se i da termin „najmanje”, pre broja ili serija brojeva, uključuje broj susedan terminu „najmanje”, kao i sve naredne brojeve ili cele brojeve koji bi logički mogli biti uključeni, a što je jasno iz konteksta. Na primer, broj nukleotida u molekulu nukleinske kiseline mora biti ceo broj. Na primer, „najmanje 19 nukleotida u molekulu nukleinske kiseline sa 21 nukleotidom” označava da 19, 20 ili 21 nukleotida ima naznačeno svojstvo. Kada je termin „najmanje” prisutan ispred serije brojeva ili opsega, podrazumeva se da „najmanje” može modifikovati svaki od brojeva iz serija ili opsega.
[0054] Kao što se ovde upotrebljava, „ne više od” ili „manje od” treba tumačiti kao vrednost koja je susedna vrednosti iz fraze ili logički nižim vrednostima ili celim brojevima, a koji su zapravo logiči iz konteksta, do nule. Na primer, dupleks sa jednolančanim krajem od „ne više od 2 nukleotida” ima jednolančani kraj koga čini 2, 1 ili 0 nukleotida. Kada je „ne više od” prisutno ispred serija brojeva ili opsega, podrazumeva se da „ne više od” može modifikovati svaki od brojeva iz serija ili opsega. Kao što se ovde upotrebljava, opsezi uključuju i gornju i donju graničnu vrednost.
[0055] U slučaju neslaganja između sekvence i njenog naznačenog mesta na transkriptu ili drugoj sekvenci, prednost ima nukleotidna sekvenca navedena u specifikaciji.
[0056] Kao što se ovde upotrebljava, „angiotenzinogen” se upotrebljava naizmenično sa terminom „AGT”, a odnosi se na dobro poznati gen i polipeptid, takođe poznat u oblasti tehnike kao serpinski peptidazni inhibitor, Klade A, član 8; Alfa-1 antiproteinaza; Antitripsin; SERPINA8; Angiotenzin I; Serpin A8; Angiotenzin II; Alfa-1 antiproteinazni angiotenzinogen; antitripsin; pre-angiotenzinogen2; ANHU; inhibitor serin proteinaze; i inhibitor cistein proteinaze.
[0057] Termin „AGT” uključuje humani AGT, čija se aminokiselinska i kompletna kodirajuća sekvenca mogu naći u, na primer, GenBank bazi podataka pod pristupnim br. GI: 188595658 (NM_000029.3; SEQ ID NO:1); AGT iz Macaca fascicularis, čija se aminokiselinska i kompletna kodirajuća sekvenca mogu naći u, na primer, GenBank bazi podataka pod pristupnim br. GI: 90075391 (AB170313.1: SEQ ID NO:3); AGT miša (Mus musculus), čija se aminokiselinska i kompletna kodirajuća sekvenca mogu naći u, na primer, GenBank bazi podataka pod pristupnim br. GI: 113461997 (NM_007428.3; SEQ ID NO:5); i AGT pacova (Rattus norvegicus) AGT, čija se aminokiselinska i kompletna kodirajuća sekvenca mogu naći u, na primer, GenBank bazi podataka pod pristupnim br. GI:51036672 (NM_134432; SEQ ID NO:7).
[0058] Dodatni primeri AGT iRNK sekvenci su lako dostupni u javno dostupnim bazama podataka, npr. na internet stranicama GenBank, UniProt, OMIM i Macaca genomskog projekta.
[0059] Termin „AGT”, kako se ovde upotrebljava, takođe odnosi se na varijacije DNK sekvence AGT gena koje se javljaju u prirodi, kao što je polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP) u AGT genu. SNP za primer se takođe mogu pronaći u dbSNP bazi podataka dostupnoj na www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp-_ref.cgi?geneld=183. Neograničavajući primeri varijacija sekvence unutar AGT gena uključuju, na primer, one opisane u SAD patentu br.5,589,584. Na primer, varijacije sekvence unutar AGT gena mogu uključivati kako C→T na poziciji -532 (u odnosu na mesto početka transkripcije); G→A na poziciji -386; G→A na poziciji -218; C→T na poziciji -18; G→A tako i A→C na poziciji -6 i -10; C→T na poziciji 10 (netranslatirajuća); C→T na poziciji 521 (T174M); T→C na poziciji 597 (P199P); T→C na poziciji 704 (M235T; pogledati takođe, npr. Reference SNP (refSNP) Cluster Report: rs699, dostupan na www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP); A→G na poziciji 743 (Y248C); C→T na poziciji 813 (N271N); G→A na poziciji 1017 (L339L); C→A na poziciji 1075 (L359M); i/ili G→A na poziciji 1162 (V388M).
[0060] Kao što se ovde upotrebljava, „ciljna sekvenca” odnosi se na uzastopni deo nukleotidne sekvence molekula iRNK koji je obrazovan tokom transkripcije AGT gena, uključujući iRNK koja je proizvod obrade RNK od primarnog proizvoda transkripcije. Ciljni deo sekvence će biti najmanje dužine koja je dovoljna da posluži kao supstrat za cepanje usmereno sa IRNK, na ili blizu tog dela nukleotidne sekvence molekula iRNK koji je obrazovan tokom transkripcije AGT gena. U jednoj opciji, ciljna sekvenca je unutar regiona koji kodira AGT protein.
[0061] Ciljna sekvenca može biti dužine od oko 19-36 nukleotida, npr. poželjno dužine od oko 19-30 nukleotida. Na primer, ciljna sekvenca može biti dužine od oko 19-30 nukleotida, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ili 21-22 nukleotida. Opsezi i dužine između prethodno navedenih opsega i dužina, takođe se smatraju delom opisa.
[0062] Kao što se ovde upotrebljava, termin „lanac koji sadrži sekvencu” odnosi se na oligonukleotid koji sadrži lanac nukleotida koji je opisan sekvencom na koju se poziva, upotrebom standardne nomenklature za nukleotide.
[0063] Svaki od „G”, „C”, „A”, „T” i „U” generalno označava nukleotid koji sadrži guanin, citozin, adenin, timidin i uracil kao bazu, tim redom. Ipak, podrazumeva se i da se termin „ribonukleotid” ili „nukleotid” takođe može odnositi na modifikovan nukleotid, kao što je detaljnije opisano u nastavku teksta, ili na surogatni ostatak za zamenu (pogledati, npr. Tabelu 2). Stručnjaku je dobro poznato da guanin, citozin, adenin i uracil mogu biti zamenjeni drugim ostacima bez suštinske izmene osobina uparivanja baza oligonukleotida koji sadrži nukleotid koji nosi takvav zamenjeni ostatak. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji sadrži inozin kao svoju bazu može biti uparen sa nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Nukleotidi koji sadrže uracil, guanin ili adenin mogu stoga biti zamenjeni u nukleotidnim sekvencama dsRNK koje su predstavljene u ovom opisu, sa nukleotidom koji sadrži, na primer, inozin. U drugom primeru, adenin i citozin bilo gde u oligonukleotidu mogu biti zamenjeni guaninom i uracilom, tim redom, da bi se obrazovalo G-U Voblovo uparivanje baza sa ciljnom iRNK. Sekvence koje sadrže takve zamenjene ostatke su pogodne za kompozicije i postupke predstavljene u ovom opisu.
[0064] Termini „IRNK”, „RNKi agens”, „RNKi agens”, „RNK interferirajući agens”, kako se ovde naizmenično upotrebljavaju, odnose se na agens koji sadrži RNK, kako je taj termin ovde i definisan, a koji posreduje u ciljanom cepanju RNK transkripta preko puta utišavajućeg kompleksa indukovanog sa RNK (RISC). IRNK usmerava degradaciju iRNK koja je specifična za sekvencu, putem procesa koji je poznat kao RNK interferencija (RNKi). IRNK moduliše, npr. inhibira ekspresiju AGT gena u ćeliji, npr. ćeliji unutar subjekta, kao što je sisarski subjekat.
[0065] U jednoj opciji, RNKi agens opisa uključuje jednolančanu RNK koja stupa u interakciju sa ciljnom RNK sekvencom, npr. AGT ciljnom iRNK sekvencom, da bi se usmerilo cepanje ciljne RNK. Bez želje da bude vezano za teoriju, veruje se da se dugačka dvolančana RNK uvedena u ćelije razlaže do siRNK dejstvom endonukleaze tipa III poznate kao Dajser (engl. Dicer; Sharp i saradnici (2001) Genes Dev.
15:485). Dajser, enzim sličan ribonukleazi-III, obrađuje dsRNK tako da nastaju kratke interferirajuće RNK od 19-23 bazna para, sa karakterističnim jednolančanim 3'-krajevima dužine od dve baze (Bernstein i saradnici (2001) Nature 409:363). Ove siRNK se zatim ugrađuju u utišavajući kompleks koji se indukuje sa RNK (RISC), gde jedna ili više helikaza odmotava siRNK dupleks, omogućavajući komplementarnom antisens lancu da vodi ciljno prepoznavanje (Nykanen i saradnici (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu iRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepa ciljni molekul, da bi se indukovalo utišavanje (Elbashir i saradnici (2001) Genes Dev.15:188). Prema jednom aspektu, opis se stoga odnosi na jednolančanu RNK (siRNK) generisanu unutar ćelije, a koja pospešuje obrazovanje RISC kompleksa da bi se ostvarilo utišavanje ciljnog gena, tj. AGT gena. Shodno tome, termin „siRNK” se ovde takođe upotrebljava da bi se naznačila IRNK koja je prethodno opisana.
[0066] U određenim opcijama, RNKi agens može biti jednolančana siRNK (ssRNKi) koja se uvodi u ćeliju ili organizam da bi se inhibirala ciljna iRNK. Jednolančani RNKi agensi se vezuju za RISC endonukleazu, Argonaut 2, koja zatim cepa ciljnu iRNK. Jednolančane siRNK su uglavnom sa 15-30 nukleotida i hemijski su modifikovane. Dizajn i ispitivanje jednolančanih siRNK su opisani u SAD patentu br.
8,101,348 i u publikaciji Lima i saradnika (2012) Cell 150:883-894. Bilo koja od ovde opisanih antisens nukleotidnih sekvenci može biti upotrebljena kao jednolančana siRNK, kao što je ovde opisano, ili kao hemijski modifikovana, postupcima koji opisani u Lima i saradnici (2012) Cell 150:883-894.
[0067] U određenim opcijama, „IRNK” za upotrebu u kompozicijama, upotrebama i postupcima opisa je dvolančana RNK i ovde se navodi kao „dvolančani RNK agens”, „dvolančani RNK (dsRNK) molekul,” „dsRNK agens” ili „dsRNK". Termin „dsRNK” odnosi se na kompleks molekula ribonukleinskih kiselina koje imaju strukturu dupleksa i sadrže dva antiparalelna i suštinski komplementarna lanca nukleinskih kiselina, označena kao lanci sa „sens” i „antisens” orijentacijom u pogledu ciljne RNK, tj. AGT gena. U pojedinim opcijama opisa, dvolančana RNK (dsRNK) pokreće degradaciju ciljne RNK, npr. iRNK, kroz post-transkripcioni mehanizam za utišavanje gena koji se ovde navodi kao RNK interferencija ili RNKi.
[0068] U principu, većina nukleotida svakog lanca dsRNK molekula su ribonukleotidi, ali kao što je ovde detaljno opisano, svaki ili oba lanca mogu takođe uključivati jedan ili više od nukleotida koji nisu ribonukleotidi, npr. dezoksiribonukleotide ili modifikovane nukleotide. Dodatno, kako se upotrebljava u ovoj specifikaciji, „IRNK” može uključivati ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; IRNK može uključivati značajne modifikacije na višestrukim nukleotidima. Kao što se ovde upotrebljava, termin „modifikovan nukleotid” odnosi se na nukleotid koji ima, nezavisno, modifikovan ostatak šećera, modifikovanu međunukleotidnu vezu ili modifikovanu nukleotidnu bazu, ili bilo koju od njihovih kombinacija. Termin modifikovan nukleotid stoga obuhvata supstitucije, dodatke ili uklanjanje, npr. funkcionalne grupe ili atoma, u okviru međunukleozidnih veza, ostataka šećera ili nukleobaza. Modifikacije pogodne za upotrebu u agensima opisa uključuju sve tipove modifikacija koje su ovde opisane ili su poznate u oblasti tehnike. Za potrebe ove specifikacije i patentnih zahteva, sve takve modifikacije koje se upotrebljavaju u molekulu tipa siRNK, obuhvaćene su terminima „ IRNK” ili „RNKi agens”.
[0069] Dupleksni region može biti bilo koje dužine koja dozvoljava specifičnu degradaciju željene ciljne RNK kroz RISC put, i može biti opsega dužina od oko 19 do 36 baznih parova, npr. dužine od oko 19-30 baznih parova, na primer, dužine od oko 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ili 36 baznih parova, kao što je dužina od 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ili 21-22 baznih parova. Opsezi i dužine između prethodno navedenih opsega i dužine takođe se smatraju delom opisa.
[0070] Dva lanca koji obrazuju strukturu dupleksa mogu biti različiti delovi jednog većeg molekula RNK, ili mogu biti odvojeni RNK molekuli. Kada su dva lanca deo jednog većeg molekula, odnosno kada su povezani neprekinutim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji obrazuju strukturu dupleksa, povezujući RNK lanac se označava „petlja strukture ukosnice“. Petlja strukture ukosnice može sadržavati najmanje jedan nespareni nukleotid. U pojedinim opcijama, petlja strukture ukosnice može sadržavati najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23 ili više nesparenih nukleotida. U pojedinim opcijama, petlja strukture ukosnice može imati 10 ili manje nukleotida. U pojedinim opcijama, petlja strukture ukosnice može imati 8 ili manje nesparenih nukleotida. U pojedinim opcijama, petlja strukture ukosnice može imati 4-10 nesparenih nukleotida. U pojedinim opcijama, petlja strukture ukosnice može imati 4-8 nukleotida.
[0071] Kada se dva suštinski komplementarna lanca dsRNK sastoje od razdvojenih RNK molekula, ti molekuli ne moraju, ali mogu biti kovalentno povezani. Kada su dva lanca kovalentno povezana na naičn koji je drugačiji od neprekinutog lanca nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji obrazuju strukturu dupleksa, povezujuća struktura se označava kao „linker”. RNK lanci mogu imati isti ili različit broj nukleotida. Maksimalan broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNK umanjen za sve jednolančane krajeve koji su prisutni u dupleksu. Pored strukture dupleksa, IRNK može sadržavati jedan ili više jednolančanih krajeva.
[0072] U određenim opcijama, RNKi agens opisa je dsRNK, čiji svaki lanac sadrži 19-23 nukleotida, a koji stupa u interakciju sa ciljnom RNK sekvencom, npr. AGT gena, da bi se usmerilo cepanje ciljne RNK.
[0073] U pojedinim opcijama, IRNK opisa je dsRNK od 24-30 nukleotida koji stupaju u interakciju sa ciljnom sekvencom RNK, npr. AGT ciljnom iRNK sekvencom, da bi se usmerilo cepanje ciljne RNK.
[0074] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „nukleotidni jednolančani kraj” (engl. overhang) odnosi se na najmanje jedan nespareni nukleotid koji se proteže u vidu ispusta izvan strukture dupleksa dvolančane IRNK. Na primer, kada se 3'-kraj jednog lanca dsRNK proteže dalje od 5'-kraja drugog lanca, ili obrnuto, postoji nukleotidni jednolančani kraj. dsRNK može sadržavati jednolančani kraj od najmanje jednog nukleotida; alternativno, jednolančani kraj može sadržavati najmanje dva nukleotida, najmanje tri nukleotida, najmanje četiri nukleotida, najmanje pet nukleotida ili više. Nukleotidni jednolančani kraj može sadržavati ili se sastojati od analoga nukleotida/nukleozida, uključujući dezoksinukleotid/nukleozid. Jednolančani kraj(evi) mogu biti na sens lancu, antisens lancu ili bilo predsavljati bilo koju od ovih kombinacija. Štaviše, nukleotid(i) jednolančanog kraja mogu biti prisutni na 5'-kraju, 3'-kraju ili na oba kraja bilo antisens ili sens lanca dsRNK.
[0075] U određenim opcijama, antisens lanac dsRNK ima jednolančani kraj od 1-10 nukleotida, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida, na 3'-kraju ili 5'-kraju. U određenim opcijama, jednolančani kraj na sens lancu ili antisens lancu, ili na oba, može uključivati produžene dužine, veće od 10 nukleotida, npr. dužine od 1-30 nukleotida, 2-30 nukleotida, 10-30 nukleotida, 10-25 nukleotida, 10-20 nukleotida ili 10-15 nukleotida. U određenim opcijama, produženi jednolančani kraj se nalazi na sens lancu dupleksa. U određenim opcijama, prošireni jednolančani kraj je prisutan na 3' kraju sens lanca dupleksa. U određenim opcijama, prošireni jednolančani kraj je prisutan na 5' kraju sens lanca dupleksa. U određenim opcijama, produženi jednolančani kraj je na antisens lancu dupleksa. U određenim opcijama, prošireni jednolančani kraj je prisutan na 3' kraju antisens lanca dupleksa. U određenim opcijama, prošireni jednolančani kraj je prisutan na 5' kraju antisens lanca dupleksa. U određenim opcijama, jedan ili više nukleotida u produženom jednolančanom kraju je zamenjeno nukleozidnim tiofosfatom. U određenim opcijama, jednolančani kraj uključuje delove koji su sami po sebi komplementarni, tako da je jednolančani kraj sposoban da obrazuju strukturu ukosnice koja je stabilna u fiziološkim uslovima.
[0076] „Ravan” ili „tupi kraj” označava da nema nesparenih nukleotida na tom kraju dvolančanog RNK agensa, tj. da nema jednolančanog nukleotidnog kraja. Dvolančani RNK agens sa „tupim krajevima” je dvolančan po celoj dužini, tj. nema jednolančani kraj ni na jednom kraju molekula. RNKi agensi opisa uključuju RNKi agense bez nukleotidnog jednolančanog kraja na jednom kraju (tj. agense sa jednim jednolančanim krajem i jednim tupim krajem) ili bez nukleotidnog jednolančanog kraja na oba kraja. Najčešće će takav molekul biti dvolančan celom svojom dužinom.
[0077] Termin „antisens lanac” ili „vodeći lanac” odnosi se na lanac IRNK, npr. dsRNK, koja uključuje region koji je suštinski komplementaran ciljnoj sekvenci, npr. AGT iRNK. Kao što se ovde upotrebljava, termin „region komplementarnosti” odnosi se na region na antisens lancu koji je suštinski komplementaran sekvenci, na primer ciljnoj sekvenci, npr. AGT nukleotidnoj sekvenci kao što je ovde definisano. Kada region komplementarnosti nije u potpunosti komplementaran ciljnoj sekvenci, nepodudarnosti mogu biti u unutrašnjim ili terminalnim regionima molekula. U principu, najviše se mogu tolerisati pogrešnja sparivanja u terminalnim regionima, npr. unutar 5, 4 ili 3 nukleotida od 5'-ili 3'-kraja IRNK. U pojedinim opcijama, dvolančani RNK agens opisa uključuje pogrešno sparene nukleotide u antisens lancu. U pojedinim opcijama, dvolančani RNK agens opisa uključuje pogrešno sparene nukleotide u u sens lancu. U pojedinim opcijama, pogrešno sparivanje nukleotida je, na primer, unutar 5, 4, 3 nukleotida od 3'-kraja IRNK. U drugoj opciji, pogrešno sparivanje nukleotida je, na primer, u 3'-terminalnom nukleotidu IRNK.
[0078] Termin „sens lanac” ili „nevodeći lanac”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na lanac IRNK koji uključuje region koji je suštinski komplementaran regionu antisens lanca, kao to je termin ovde i definisan.
[0079] Kao što se ovde upotrebljava, „suštinski svi od nukleotida su modifikovani” su u oni koji su velikoj meri, ali ne u potpunosti modifikovani, a koji mogu uključivati ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nemodifikovanih nukleotida.
[0080] Kao što se ovde upotrebljava, termin „region cepanja” odnosi se na region koji se nalazi neposredno uz mesto cepanja. Mesto cepanja je mesto na ciljnom molekulu na kome dolazi do cepanja. U pojedinim opcijama, region cepanja sadrži tri baze na bilo kom kraju od, odnosno neposredno pored mesta cepanja. U pojedinim opcijama, region cepanja sadrži dve baze na bilo kom kraju od, odnosno neposredno pored mesta cepanja. U pojedinim opcijama, mesto cepanja se specifično javlja na mestu vezanom za nukleotide 10 i 11 antisens lanca, a region cepanja sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0081] Kao što se ovde upotrebljava, i ukoliko nije drugačije naznačeno, termin „komplementaran”, kada se upotrebljava za opisivanje prve nukleotidne sekvence u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu, da hibridizuje i obrazuju strukturu dupleksa pod određenim uslovima, sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu nukleotidnu sekvencu, kao što će stručnjak i podrazumevati. Takvi uslovi mogu, na primer, biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu uključivati: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C tokom 12-16 sati, nakon čega sledi pranje (pogledati, npr. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i saradnici (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Mogu biti primenjeni i drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi koji se mogu sresti unutar organizma. Stručnjak će biti u stanju da odredi skup uslova koji su najprikladniji za ispitivanje komplementarnosti dve sekvence u skladu sa krajnjom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0082] Komplementarne sekvence unutar IRNK, npr. unutar dsRNK kao što je ovde opisano, uključuju uparivanje baza oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu, sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu nukleotidnu sekvencu, po celoj dužini jedne ili obe nukleotidne sekvence. Takve sekvence se ovde mogu označavati kao „potpuno komplementarne”, jedna u odnosu na drugu. Ipak, kada se ovde prva sekvenca navodi kao „suštinski komplementarna” u odnosu na drugu sekvencu, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili mogu obrazovati jednu ili više, ali uglavnom ne više od 5, 4, 3 ili 2 pogrešno sparena bazna para nakon hibridizacije dupleksa do 30 baznih parova, uz zadržavanje sposobnosti hibridizacije pod uslovima koji su najrelevantniji za njihovu krajnju primenu, npr. inhibiciju ekspresije gena preko RISC puta. Meutim, kada su dva oligonukleotida dizajnirana tako da obrazuju, nakon hibridizacije, jedan ili više jednolančanih ispusta, takvi jednolančane krajeve ne treba smatrati pogrešno uparenimm u pogledu određivanja komplementarnosti. Na primer, dsRNK koja sadrži jedan oligonukleotid dužine od 21 nukleotida i drugi oligonukleotid dužine od 23 nukleotida, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je u potpunosti komplementarna kraćem oligonukleotidu, može ipak biti označena kao „kompletan oligonukleotid” koji u svrhe koje su ovde opisane.
[0083] „Komplementarne” sekvence, kako se ovde upotrebljava, takođe mogu uključivati, ili biti u potpunosti obrazovane sparivanjem baza koje nije po Vatson-Krikovom principu ili baznim sparivanjem nukleotida koje se ne javljaju u prirodi i modikovani su, u meri u kojoj su ispunjeni prethodno navedeni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti da hibridizuju. Takva sparivanje baza koja nsu po Vatson-Krikovom principu uključuju, ali nisu ograničena na, G:U Voble ili Hugštajnovo sparivanje baza.
[0084] Termini „komplementaran”, „potpuno komplementaran” i „suštinski komplementaran” ovde mogu biti upotrebljeni tako da se odnose na podudaranje baza između sens lanca i antisens lanca dsRNK, ili između antisens lanca dvolančanog RNK agensa i ciljne sekvence, kao što će se razumeti iz konteksta njihove upotrebe.
[0085] Kao što se ovde upotrebljava, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran najmanje delu” informacione RNK (iRNK) odnosi se na polinukleotid koji je suštinski komplementaran kontinualnom delu iRNK od interesa (npr. iRNK koju kodira AGT gen). Na primer, polinukleotid je komplementaran najmanje delu AGT iRNK ukoliko je sekvenca suštinski komplementarna neprekinutom delu iRNK koju kodira AGT gen.
[0086] Shodno navedenom, u pojedinim opcijama, sens lanac polinukleotida i antisens polinukleotidi koji su ovde opisani potpuno su komplementarni ciljnoj AGT sekvenci. U drugim opcijama, sens lanac polinukleotida i antisens polinukleotidi koji su ovde opisani suštinski su komplementarni ciljnoj AGT sekvenci i sadrže kontinualnu nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% komplementarna, po celoj svojoj dužini, sa ekvivalentnim regionom bilo koje od nukleotidnih sekvenci SEQ ID NO: 1 i 2, ili fragmentu bilo koje od SEQ ID NO: 1 i 2, kao što je komplementarnost od najmanje 90% ili 95%; ili komplementarnost od 100%.
[0087] Shodno tome, u pojedinim opcijama, antisens lanac polinukleotida koji su ovde opisani potpuno su komplementarni ciljnoj AGT sekvenci. U drugim opcijama, antisens lanac polinukleotida koji su ovde opisani suštinski su komplementarni ciljnoj AGT sekvenci i sadrže neprekidnu nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 90% komplementarna, celom svojom dužinom, sa ekvivalentnim regionom nukleotidne sekvence SEQ ID NO:1 ili fragment SEQ ID NO:1, kao što je komplementarnost od oko 90%, ili oko 95%. U određenim opcijama, fragment SEQ ID NO: 1 je izabran iz grupe nukleotida 632-658, 635-658, 636-658, 1248-1273, 1248-1270, 1250-1272, 1251-1273, 1580-1602, 1584-1606, 1587-1609, 1601-1623, 1881-1903, 2074-2097, 2074-2096, 2075-2097, 2080-2102, 2272-2294, 2276-2298, 2281-2304, 2281-2303 ili 2282-2304 iz S SEQ ID NO: 1. U prioritetnim opcijama, dupleks se ne sastoji od sens lanca koji sadrži uscsucccAfcCfUfUfuucuucuaauL96 (SEQ ID NO: 13) i antisens lanca koji sadrži asUfsuagAfagaaaagGfuGfggagascsu (SEQ ID NO: 14).
[0088] U pojedinim opcijama, IRNK opisa uključuje antisens lanac koji je suštinski komplementaran ciljnoj AGT sekvenci i sadrži kontinualnu nukleotidnu sekvencu koja je, po svojoj celoj dužini, najmanje oko 90% komplementarna sa ekvivalentnim regionom nukleotidne sekvence bilo kog od sens lanaca u Tabeli 3, Tabeli 5 ili Tabeli 6 ili fragmentu bilo kog od sens lanaca u Tabeli 3, Tabeli 5 ili Tabeli 6, kao što je komplementarnost od oko 90%, 95% ili 100%.
[0089] U pojedinim opcijama, IRNK opisa uključuje sens lanac koji je suštinski komplementaran antisens polinukleotidu koji je, zauzvrat, komplementaran ciljnoj AGT sekvenci, a pri čemu polinukleotid sens lanca sadrži kontinualnu nukleotidnu sekvencu koja je, po svojoj celoj dužini, najmanje oko 90% komplementarna ekvivalentnom regionu nukleotidne sekvence bilo kog od antisens lanaca u Tabeli 3, 5 ili 6, ili fragmentu bilo kog od antisens lanaca u Tabeli 3 ili 5, kao što je oko 90%, 95% ili 100%.
[0090] U određenim opcijama, sens i antisens lanci u Tabeli 3 ili Tabeli 5 izbrani su od dupleksa AD-85481, AD-84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD- 85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD85442, AD-85443, AD-85444, AD85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637 i AD-85655.
[0091] U principu, „IRNK” uključuje ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama. Takve modifikacije mogu uključivati sve vrste modifikacija koje su ovde opisane ili poznate u oblasti tehnike. Za potrebe ove specifikacije i patentnih zahteva, sve takve modifikacije koje se upotrebljavaju u dsRNK molekulima, obuhvaćene su sa „IRNK”.
[0092] Prema aspektu opisa, agens za upotrebu u postupcima i kompozicijama pronalaska je jednolančani antisens oligonukleotidni molekul koji inhibira ciljnu iRNK preko mehanizam antisens inhibicije. Jednolančani antisens oligonukleotidni molekul je komplementaran sekvenci unutar ciljne iRNK. Jednolančani antisens oligonukleotidi mogu inhibirati translaciju na stehiometrijski način, tako što će se baze spariti sa iRNK i fizički ometati translacionu mašineriju, pogledati Dias N. i saradnici (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Jednolančani antisens oligonukleotidni molekul može biti dug oko 14 do oko 30 nukleotida i imati sekvencu koja je komplementarna ciljnoj sekvenci. Na primer, jednolančani antisens oligonukleotidni molekul može sadržavati sekvencu koja ima najmanje oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više uzastopnih nukleotida iz bilo koje od ovde opisanih antisens sekvenci.
[0093] Fraza „dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK”, kao što je dsRNK, kako se ovde upotrebljava, uključuje dovođenje ćelije u kontakt na bilo koji mogući način. Dovođenje ćelije u kontakt uključuje dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK in vitro ili dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK in vivo. Kontakt može biti direktan ili indirektan. Tako, na primer, IRNK može biti stavljena u fizički kontakt sa ćelijom od strane pojedinca koji sprovodi postupak, ili alternativno, IRNK može biti stavljena u situaciju koja će joj dozvoliti ili prouzrokovati da naknadno dođe u kontakt sa ćelijom.
[0094] Dovođenje ćelije u kontakt in vitro može biti urađeno, na primer, inkubacijom ćelije sa IRNK. Dovođenje ćelije u kontakt in vivo može biti urađeno, na primer, injeciranjem IRNK u ili blizu tkiva gde se ćelija nalazi, ili injeciranjem IRNK u drugu oblast, npr. krvotok ili potkožni prostor, tako da će agens naknadno doći do tkiva gde se nalazi ćelija sa kojom treba da stupi u kontakt. Na primer, IRNK može sadržavati ili biti kuplovana sa ligandom, npr. GalNAc, koji usmerava IRNK do mesto od interesa, npr. u jetru. Kombinacije in vitro i in vivo postupaka za dovođenje u kontakt su takođe moguće. Na primer, ćelija takođe može biti dovedena u kontakt sa IRNK in vitro i naknadno biti transplantirana u subjekta.
[0095] U određenim opcijama, dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK uključuje „uvođenje” ili „isporuku IRNK u ćeliju” olakšavanjem ili vršenjem preuzimanja ili apsorpcije u ćeliju. Apsorpcija ili preuzimanje IRNK se može odvijati putem olakšane difuzije ili aktivnih ćelijskih procesa, ili upotrebom pomoćnih agenasa ili uređaja. Uvođenje IRNK u ćeliju može biti in vitro ili in vivo. Na primer, za in vivo uvođenje, IRNK može biti injecirana u mesto u tkivu ili data sistemski. In vitro uvođenje u ćeliju uključuje postupke poznate u oblasti tehnike, kao što su elektroporacija i lipofekcija. Dalji pristupi su ovde opisani u nastavku teksta ili su poznati u oblasti tehnike.
[0096] Termin „lipidna nanočestica” ili „LNP” je vezikula koja sadrži lipidni sloj koji inkapsulira farmaceutski aktivan molekul, kao što je molekul nukleinske kiseline, npr. IRNK ili plazmid sa koga se IRNK transkribuje. LNP su opisani u npr. SAD patentima br. 6,858,225; 6,815,432; 8,158,601 i 8,058,069.
[0097] Kao što se ovde upotrebljava, „subjekat” je životinja, kao što je sisar, uključujući primata (kao što je čovek, primat koji nije čovek, npr. majmun i šimpanza), životinja koja nije primat (kao što su krava, svinja, konj, koza, zec, ovca, hrčak, zamorac, mačka, pas, pacov ili miš), ili ptica koja eksprimira ciljni gen, bilo endogeno ili heterologno. U opciji, subjekat je čovek, kao što je ljudsko biće koje se leči ili kod koga je procenjeno da bi smanjenje ekspresije AGT bilo od koristi u lečenju bolesti ili poremećaja; čovek sa rizikom da oboli od bolesti ili poremećaja, kod koga bi smanjenje ekspresije AGT bilo od koristi; čovek koji ima bolest ili poremećaj i koji bi imao koristi od smanjenja ekspresije AGT; ili ljudsko biće lečeno od bolesti ili poremećaja za koji bi smanjenje ekspresije AGT bilo od koristi, kao što je ovde opisano. Dijagnostički kriterijumi za poremećaj povezan sa AGT, npr. hipertenziju, obezbeđeni su u nastavku. U pojedinim opcijama, subjekat je žena. U drugim opcijama, subjekat je muškarac. U određenim opcijama, subjekat je deo grupe podložne osetljivosti na so, npr. crne rase ili starija odrasla osoba (≥65 godina). U određenim opcijama, subjekat je prekomerne težine ili gojazan, npr. subjekat koji pati od centralne gojaznosti. U određenim opcijama, subjekat vodi sedeći način života. U određenim opcijama, subjekat je u trudnoći.
[0098] Kao što se ovde upotrebljava, termini „lečenje” ili „tretman” odnose se na koristan ili željeni rezultat, kao što je smanjenje najmanje jednog znaka ili simptoma poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije kod subjekta. Tretman takođe uključuje smanjenje jednog ili više znakova ili simptoma povezanih sa neželjenom ekspresijom AGT, npr. aktivacije receptora angiotenzina II tipa 1 (AT1R) (npr. kod hipertenzije, hronične bolesti bubrega, moždanog udara, infarkta miokarda, srčane insuficijencije, aneurizama, bolesti perifernih arterija, bolesti srca, povećanog oksidativnog stresa, npr. povećanog stvaranja superoksida, inflamcije, vazokonstrikcija, zadržavanje natrijuma i vode, gubitka kalijuma i magnezijuma, supresije renina, hipertrofije miocita i glatkih mišića, povećane sinteza kolagena, stimulacije vaskularne, miokardne i bubrežne fibroze, povećane stope i snage srčanih kontrakcija, izmena pulsa, npr. povećanja aritmija, stimulacije inhibitora aktivatora plazminogena 1 (PAI1), aktivacije simpatičkog nervnog sistema i povećane sekrecije endotelina), simptoma hipertenzije povezane sa trudnoćom (npr. preeklampsije i eklampsije), uključujući, ali ne ograničavajući se na oraničenje intrauterinog rasta (IUGR) ili ograničenje rasta fetusa, simptoma povezanih sa malignom hipertenzijom, simptoma povezanih sa hiperaldosteronizmom; smanjenja obima neželjene aktivacije AT1R; stabilizacije (tj. odsustvo pogoršanja) stanja hronične aktivacije AT1R; umanjenja ili ublažavanja neželjene aktivacije AT1R (npr. kod hipertenzije, hronične bolesti bubrega, moždanog udara, infarkta miokarda, srčane insuficijencije, aneurizama, bolesti perifernih arterija, bolesti srca, povećanog oksidativnog stresa, npr. povećanog stvaranja superoksida, inflamcije, vazokonstrikcija, zadržavanje natrijuma i vode, gubitka kalijuma i magnezijuma, supresije renina, hipertrofije miocita i glatkih mišića, povećane sinteza kolagena, stimulacije vaskularne, miokardne i bubrežne fibroze, povećane stope i snage srčanih kontrakcija, izmena pulsa, npr. povećanja aritmija, stimulacije inhibitora aktivatora plazminogena 1 (PAI1), aktivacije simpatičkog nervnog sistema i povećane sekrecije endotelina), bilo da se ono može detektovati ili se ne može detektovati. Poremećaji povezani sa AGT takođe mogu uključivati gojaznost, steatozu jetre/masnu jetru, npr. nealkoholni steatohepatitis (NASH) i nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), netolerancija na glukozu, dijabetes tipa 2 (dijabetes nezavisan od insulina) i metabolički sindrom. U određenim opcijama, hipertenzija uključuje hipertenziju povezanu sa niskom aktivnošću renina u plazmi ili koncentracijom renina u plazmi. „Lečenje” takođe može označavati produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem u odsustvu lečenja.
[0099] Termin „niži”, u kontekstu nivoa ekspresije AGT gena ili proizvodnje agt proteina kod subjekta, ili markera bolesti ili simptoma, odnosi se na statistički značajno smanjenje tog nivoa. Smanjenje može biti, na primer, najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% ili ispod nivoa detekcije za postupke detekcije u relevantnoj ćeliji ili tkivu, npr. ćeliji jetre ili drugom uzorku subjekta, npr. krvi ili serumu dobijenom iz nje kao i iz urina.
[0100] Kao što se ovde upotrebljava, „prevencija” ili „sprečavanje”, kada se upotrebljava u odnosu na bolest ili poremećaj, za koje bi bilo od koristi smanjenje ekspresije AGT gena ili proizvodnje agt proteina, npr. kod subjekta koji je podložan poremećaju povezanom sa AGT usled, npr. starenja, genetičkih faktora, hormonskih promena, ishrane i sedećeg načina života. U određenim opcijama, bolest ili poremećaj je npr. simptom neželjene aktivacije AT1R, kao što je kod hipertenzije, hronične bolesti bubrega, moždanog udara, infarkta miokarda, srčane insuficijencije, aneurizama, bolesti perifernih arterija, bolesti srca, povećanog oksidativnog stresa, npr. povećanog stvaranja superoksida, inflamcije, vazokonstrikcija, zadržavanje natrijuma i vode, gubitka kalijuma i magnezijuma, supresije renina, hipertrofije miocita i glatkih mišića, povećane sinteza kolagena, stimulacije vaskularne, miokardne i bubrežne fibroze, povećane stope i snage srčanih kontrakcija, izmena pulsa, npr. povećanja aritmija, stimulacije inhibitora aktivatora plazminogena 1 (PAI1), aktivacije simpatičkog nervnog sistema i povećane sekrecije endotelina. Poremećaji povezani sa AGT takođe mogu uključivati gojaznost, steatozu jetre/masnu jetru, npr. nealkoholni steatohepatitis (NASH) i nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), netoleranciju na glukozu, dijabetes tipa 2 (dijabetes nezavisan od insulina) i metabolički sindrom. U određenim opcijama, hipertenzija uključuje hipertenziju povezanu sa niskom aktivnošću renina u plazmi ili sa koncentracijom renina u plazmi. Verovatnoća razvoja, npr. hipertenzija, smanjuje se, na primer, kada pojedinac koji ima jedan ili više faktora rizika za hipertenziju bilo ne uspe da razvije hipertenziju ili razvije hipertenziju manje ozbiljnosti u odnosu na populaciju koja ima iste faktore rizika i koja ne dobija lečenje koje je kao što je ovde opisano. Neuspeh u razvoju poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije, ili kašnjenje u vremenu razvoja hipertenzije mesecima ili godinama, smatra se efikasnom prevencijom. Prevencija može zahtevati primenu više od jedne doze ukoliko je RNKi agens.
[0101] Kao što se ovde upotrebljava, termin „bolest povezana sa angiotenzinogenom” ili „bolest povezana sa AGT” je bolest ili poremećaj koji je prouzrokovan ili je povezan sa aktivacijom reninangiotenzin-aldosteronskog sistema (RAAS), ili je bolest ili poremećaj čiji simptomi ili progresija reaguju na inaktivaciju RAAS. Termin „bolest povezana sa angiotenzinogenom” uključuje bolest, poremećaj ili stanje za koji bi smanjenja ekspresije AGT bilo od koristi. Takve bolesti su obično povezane sa visokim krvnim pritiskom. Neograničavajući primeri bolesti povezanih sa angiotenzinogenom uključuju hipertenziju, npr. graničnu hipertenziju (poznatu i kao prehipertenzija), primarnu hipertenziju (poznatu i kao esencijalna hipertenzija ili idiopatska hipertenzija), sekundarnu hipertenziju (poznatu i kao nesencijalna hipertenzija), izolovanu sistolnu ili dijastolnu hipertenziju, hipertenziju povezanu sa trudnoćom (npr. preeklampsiju, eklampsiju i postpartalnu preelampsiju), dijabetsku hipertenziju, rezistentnu hipertenziju, refraktornu hipertenziju, paroksizmalnu hipertenziju, renovaskularnu hipertenziju (poznatu i kao bubrežna hipertenzija), Goldblatovu hipertenziju, očnu hipertenziju, glaukom, plućnu hipertenziju, portalnu hipertenziju, sistemsku vensku hipertenziju, sistolnu hipertenziju, labilnu hipertenziju; hipertenzivnu srčanu bolest, hipertenzivnu nefropatiju, aterosklerozu, arteriosklerozu, vaskulopatiju (uključujući perifernu vaskularnu bolest, dijabetsku nefropatiju, dijabetsku retinopatiju, hroničnu srčanu insuficijenciju, kardiomiopatiju, dijabetsku srčanu miopatiju, glomerulosklerozu, koarktaciju aorte, aneurizme aorte, ventrikularnu fibrozu, apneu tokom spavanja, srčanu insuficijenciju (npr. sistolnu disfunkciju leve komore), infarkt miokarda, anginu, moždani udar, bolest bubrega npr. hroničnu bolest bubrega ili dijabetsku nefropatiju, opciono u kontekstu trudnoće, bubrežnu insuficijenciju, npr. hronična bubrežnu insuficijenciju i sistemsku sklerozu (npr. sklerodermu sa bubrežnom krizom). U određenim opcijama, bolest povezana sa AGT uključuje ograničenje intrauterinog rasta (IUGR) ili ograničenje rasta fetusa. U određenim opcijama, poremećaji povezani sa AGT takođe uključuju gojaznost, steatozu jetre/masnu jetru, npr. nealkoholni steatohepatitis (NASH) i nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), netolerancijg na glukozu, dijabetes tipa 2 (dijabetes nezavisan od insulina) i metabolički sindrom. U određenim opcijama, hipertenzija uključuje hipertenziju povezanu sa niskom aktivnošću renina u plazmi ili koncentracijom renina u plazmi.
[0102] Pragovi za visok krvni pritisak i stadijumi hipertenzije su detaljno razmotreni u nastavku teksta.
[0103] U jednoj opciji, bolest povezana sa angiotenzinogenom je primarna hipertenzija. „Primarna hipertenzija” je rezultat sredinskih ili genetičkih uzroka (npr. rezultat nema očiglednog osnovnog medicinskog uzroka).
[0104] U jednoj opciji, bolest povezana sa angiotenzinogenom je sekundarna hipertenzija. „Sekundarna hipertenzija” ima prepoznatljiv osnovni poremećaj koji može biti višestruke etiologije, uključujući bubrežne, vaskularne i endokrine uzroke, npr. bubrežnu parenhimsku bolest (npr. policistične bubrege, glomerularnu ili intersticijsku bolest), bubrežnu vaskularnu bolest (npr. stenozu bubrežne arterije, fibromuskularnu displaziju), endokrine poremećaje (npr. višak adrenokortikosteroida ili mineralokortikoida, feohromocitom, hipertireozu ili hipotireozu, višak hormona rasta, hiperparatiroidizam), koarktaciju aorte ili upotrebu oralnih kontraceptiva.
[0105] U jednoj opciji, bolest povezana sa angiotenzinogenom je hipertenzija povezana sa trudnoćom, npr. hronična hipertenzija u trudnoći, gestaciona hipertenzija, preeklampsija, eklampsija, preeklampsija prekrivena hroničnom hipertenzijom, HELLP sindrom i gestacijska hipertenzija (poznata i kao prolazna hipertenzija trudnoće, hronična hipertenzija identifikovana u drugoj polovini trudnoće i hipertenzija izazvana trudnoćom (PIH)). Dijagnostički kriterijumi za hipertenziju povezane sa trudnoćom su dati u nastavku.
[0106] U jednoj opciji, bolest povezana sa angiotenzinogenom je rezistentna hipertenzija. „Rezistentna hipertenzija” je krvni pritisak koji ostaje iznad praga (npr. sistolni pritisak iznad 130 mm Hg ili dijastolni iznad 90) uprkos istovremenoj upotrebi tri antihipertenziva različitih klasa, od kojih je jedan tiazidni diuretik. Subjekti čiji je krvni pritisak kontrolisan sa četiri ili više lekova takođe se smatraju kao subjekti sa rezistentnom hipertenzijom.
[0107] „Terapijski efektivna količina” ili „profilaktički efektivna količina” takođe uključuje količinu RNKi agensa koji proizvodi pojedine željene efekte sa razumnim odnosom koristi/rizika koji se primenjuje na bilo koji tretman. IRNK koja se upotrebljava u postupcima predmetnog opisa može biti primenjena u količini dovoljnoj da proizvede razuman odnos koristi/rizika koji je primenljiv na takav tretman.
[0108] Termin „farmaceutski prihvatljiv” se ovde koristi tako da odnosi se na ona jedinjenja, materijale, kompozicije ili dozne oblike koji su, u okviru dobre medicinske prakse, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik.
[0109] Fraza „farmaceutski prihvatljiv nosač”, kako se ovde upotrebljava, označava farmaceutski prihvatljiv materijal, kompoziciju ili nosač, kao što je tečan ili čvrst ispunjivač, razblaživač, ekscipijens, pomoćni agens (npr. lubrikans, talk magnezijuma, kalcijum ili cink stearat ili sterična kiselina), ili materijal za inkapsuliranje rastvarača, uključen u prenošenje ili transport predmetnog jedinjenja iz jednog organa, ili dela tela, do drugog organa ili dela tela. Svaki nosač mora biti „prihvatljiv” u smislu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima formulacije i da nije štetan za subjekta koji se leči. Takvi nosači su poznati u oblasti tehnike. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju nosače za primenu injeciranjem.
[0110] Termin „uzorak”, kako se ovde upotrebljava, uključuje kolekciju sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih iz subjekta, kao i tečnosti, ćelije ili tkiva prisutnih unutar subjekta. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serozne tečnosti, plazmu, cerebrospinalnu tečnost, očne tečnosti, limfu, urin, pljuvačku i slično. Uzorci tkiva mogu uključivati uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti dobijeni iz određenih organa, delova organa ili tečnosti ili ćelija unutar tih organa. U određenim opcijama, uzorci mogu biti dobijeni iz jetre (npr. uzorak može biti cela jetra ili određeni segmenti jetre ili određene vrste ćelija u jetri, kao što su npr. hepatociti). U pojedinim opcijama, „uzorak dobijen iz subjekta” odnosi se na urin dobijen iz subjekta. „Uzorak dobijen iz subjekta” se može odnositi na krv ili serum ili plazmu dobijenu iz krvi subjekta.
I. IRNK opisa
[0111] Predmetni opis obezbeđuje IRNK koje inhibiraju ekspresiju AGT gena. U poželjnim opcijama, IRNK uključuje dvolančane molekule ribonukleinske kiseline (dsRNK) za inhibiranje ekspresije AGT gena u ćeliji, kao što je ćelija unutar subjekta, npr. kod sisara, kao što je čovek podložan razvoju poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije. dsRNKi agens uključuje antisens lanac koji ima region komplementarnosti, komplementaran najmanje delu iRNK obrazovane tokom ekspresije AGT gena. Region komplementarnosti je dužine od oko 19-30 nukleotida (npr. dužine od oko 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 ili 19 nukleotida). Nakon kontakta sa ćelijom koja eksprimira AGT gen, IRNK inhibira ekspresiju AGT gena (npr. humanog, AGT gena primata, životinja različitih od primata ili pacova) za najmanje 50%, što se procenjuje, na primer, postupkom zasnovanim na PCR-u ili razgranatoj DNK (bDNK), ili postupkom zasnovanim na proteinima, kao što je imunofluorescentna anliza, upotrebom, na primer, imunoblot ili tehnike protočne citometrije. U poželjnim opcijama, inhibicija ekspresije se određuje qPCR postupkom koji je naveden u primerima, posebno u Primeru 2, sa siRNK u koncentraciji od 10 nM i u odgovarajućoj ćelijskoj liniji organizma koja je u istom primeru i obezbeđena. U poželjnim opcijama, inhibicija ekspresije in vivo određuje se genetičkim isključivenjem (engl. knock-down) humanog gena kod glodara koji eksprimira humani gen, npr. kod miša, ili miša inficiranog sa AAV koji eksprimira humani ciljni gen, npr. kada je davana jednokratna doza od 3 mg/kg tokom nadira ekspresije RNK. Ekspresija RNK u jetri je određivana upotrebom PCR postupaka obebzbeđenih u Primeru 2.
[0112] dsRNK uključuje dva RNK lanca koji su komplementarni i koji međusobno hibridizuju, da bi obrazovali dupleksnu strukturu pod uslovima u kojima će se dsRNK koristiti. Jedan lanac dsRNK (antisens lanac) uključuje region komplementarnosti koji je suštinski komplementaran, a uglavnom u potpunosti komplementaran, ciljnoj sekvenci. Ciljna sekvenca može biti izvedena iz sekvence iRNK koja se obrazuje tokom ekspresije AGT gena. Drugi lanac (sens lanac) uključuje region koji je komplementaran antisens lancu, tako da dva lanca hibridizuju i obrazuju strukturu dupleksa, kada se kombinuju pod pogodnim uslovima. Kao što je ovde opisano na drugom mestu, a kao i što je poznato u oblasti tehnike, komplementarne sekvence dsRNK mogu takođe predstavljati regione koji su međusobno komplementarni i sadržani u okviru jednog molekula nukleinske kiseline, za razliku od razdvojenih oligonukleotida.
[0113] U principu, dupleksna struktura je dužine od 19 do 30 baznih parova. Slično tome, region komplementarnosti sa ciljnom sekvencom je dužine od 19 do 30 nukleotida.
[0114] U pojedinim opcijama, dsRNK je dužine od oko 19 do oko 23 nukleotida, ili dužine od oko 25 do oko 30 nukleotida. U principu, dsRNK je dovoljne dužine da posluži kao supstrat za Dicer enzim. Na primer, u oblasti tehnike je dobro poznato da dsRNK duže od oko 21-23 nukleotida mogu poslužiti kao supstrati za Dicer. Kao što će prosečno iskusan stručnjak i prepoznati, region RNK na koji se ciljano deluje u svrhu cepanja, najčešće će biti deo većeg molekula RNK, često molekula iRNK. Tamo gde je to relevantno, „deo” iRNK na koga se ciljano deluje, kontinualna je sekvenca iRNK na koju se ciljano deluje, dovoljne dužine da joj bude omogućeno da bude supstrat za cepanje usmereno ka RNKi (tj. cepanje preko RISC puta).
[0115] Stručnjak iz oblasti tehnike takođe će prepoznati da je dupleksni region primarni funkcionalni deo dsRNK, npr. dupleksni region je od oko 19 do oko 30 baznih parova, npr. oko 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ili 21-22 baznih parova. Prema tome, u jednoj opciji, u meri u kojoj se obrađuje u funkcionalni dupleks, od npr.15-30 baznih parova, a koji ciljano deluje na na željenu RNK radi cepanja, molekul RNK ili kompleks molekula RNK koji imaju dupleksni region veći od 30 baznih parova je dsRNK. Prosečno iskusan stručnjak će stoga prepoznati da, u jednoj opciji, miRNK je dsRNK. U drugoj opciji, dsRNK nije miRNK koja se javlja u prirodi. U sledećoj opciji, RNKi agens koristan za ciljano delovanje na ekspresiju AGT gena, ne generiše se u ciljnoj ćeliji cepanjem veće dsRNK.
[0116] dsRNK koja je ove opisana, može dalje uključivati jedan ili više jednolančanih nukleotidnih „ispusta” npr. 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, 1, 2, 3 ili 4 nukleotida. dsRNK sa najmanje jednim jednolančanim krajem, mogu imati superiorne inhibitorne osobine u odnosu na svoje parnjake sa tupim krajevima. Nukleotidni jednolančani kraj može sadržavati ili se sastojati od analoga nukleotida/nukleozida, uključujući dezoksinukleotide/nukleozide. Jednolančani kraj(evi) mogu biti na sens lancu, antisens lancu ili bilo koja od ovih kombinacija. Štaviše, nukleotid(i) jednolančanog kraja mogu biti prisutni na 5'-kraju, 3'-kraju ili na oba kraja antisens ili sens lanca dsRNK.
[0117] dsRNK mogu biti sintetisane standardnim postupcima poznatim u oblasti tehnike. Dvolančana IRNK jedinjenja opisa mogu biti pripremana upotrebom postupka u dva koraka. Najpre, pojedinačni lanci dvolančanog RNK molekula se pripremaju odvojeno. Komponentni lanci se potom sparuju. Pojedinačni lanci siRNK jedinjenja mogu biti pripremani upotrebom organske sinteze u fazi rastvora ili na čvrstoj fazi ili sa oba. Organska sinteza nudi prednost u pogledu lake pripreme oligonukleotidnih lanaca koji sadrže neprirodne ili modifikovane nukleotide. Slično tome, jednolančani oligonukleotidi opisa mogu biti pripremani upotrebom organske sinteze u fazi rastvora ili na čvrstoj fazi ili sa oba postupka.
[0118] Prema jednom aspektu, dsRNK opisa uključuje najmanje dve nukleotidne sekvence, sens sekvencu i anti-sens sekvencu. Sens lanac je izabran iz grupe sekvenci obezbeđenih u Tabelama 3, 5 i 6, a odgovarajući antisens lanac za sens lanac, izabran je iz grupe sekvenci u Tabeli 3, 5 i 6. Prema ovom aspektu, jedna od dve sekvence je komplementarna drugoj od dve sekvence, pri čemu je jedna od sekvenci suštinski komplementarna sekvenci iRNK koja se generiše tokom ekspresije AGT gena. Kao takva, dsRNK će prema ovom aspektu uključivati dva oligonukleotida, pri čemu je jedan oligonukleotid opisan kao sens lanac u Tabeli 5, ili 6, dok je drugi oligonukleotid opisan kao odgovarajući antisens lanac za sens lanac u Tabeli 3, 5 ili 6. U određenim opcijama, suštinski komplementarne sekvence dsRNK se nalaze na odvojenim oligonukleotidima. U drugim opcijama, suštinski komplementarne sekvence dsRNK se nalaze na jednom oligonukleotidu. U određenim opcijama, sens ili antisens lanac iz Tabele 3 ili 5 je izabran od AD-85481, AD84701, AD-84703, AD-84704, AD-84705, AD-84707, AD-84715, AD-84716, AD-84739, AD-84741, AD-84746, AD85432, AD-85434, AD-85435, AD-85436, AD-85437, AD-85438, AD-85441, AD-85442, AD-85443, AD-85444, AD85446, AD-85447, AD-85482, AD-85485, AD-85493, AD-85496, AD-85504, AD-85517, AD-85519, AD-85524, AD85622, AD-85623, AD-85625, AD-85626, AD-85634, AD-85635, AD-85637 i AD-85655.
[0119] Mada sekvence u Tabeli 3 nisu opisane kao modifikovane ili konjugovane sekvence, podrazumeva se i da RNK za IRNK opisa, npr. dsRNK opisa, može sadržavati bilo koju od sekvenci navedenih u Tabeli 3, ili sekvence iz Tabele 5 ili 6 koje su modifikovane, ili sekvence iz Tabele 5 ili 6 koje su konjugovane. Drugim rečima, opis obuhvata dsRNK iz Tabele 3, 5 i 6 koje su nemodifikovane, nekonjugovane, modifikovane ili konjugovane, kao što je ovde opisano.
[0120] Stručnjaku je dobro poznato da se dsRNK koje imaju strukturu dupleksa od oko 20 do 23 bazna para, npr. 21 bazni par, smatraju posebno efektivnim u indukovanju RNK interferencije (Elbashir i saradnici, EMBO 2001, 20:6877-6888). Ipak, drugi su utvrdili i da kraće ili duže dupleksne strukture RNK takođe mogu biti efektivne (Chu i Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim i saradnici (2005) Nat Biotech 23:222-226). U prethodno opisanim opcijama, na osnovu prirode oligonukleotidnih sekvenci obezbeđenih u bilo kojoj od Tabela 3, 5 i 6, ovde opisane dsRNK mogu uključivati najmanje jedan lanac dužine od minimalno 21 nukleotid. Razumno je očekivati i da kraći dupleksi koji imaju jednu od sekvenci iz Tabele 3, 5 i 6, a kojima nedostaje samo nekoliko nukleotida na jednom ili oba kraja, mogu biti na sličan način efektivni u poređenju sa prethodno opisanim dsRNK. Tako, dsRNK koje imaju sekvencu od najmanje 19, 20 ili više uzastopnih nukleotida izvedenih iz jedne od sekvenci iz Tabele 3, 5 i 6, a koje se po svojoj sposobnosti da inhibiraju ekspresiju AGT gena razlikuju u inhibiciji za najviše oko 5, 10, 15, 20, 25 ili 30% u odnosu na dsRNK koja sadrži punu sekvencu, smatraju se onima koje su unutar obima predmetnog opisa.
[0121] Dodatno, RNK navedene u Tabeli 3, 5 i 6 identifikuju mesto(a) u AGT transkriptu koje je(koja su) podložno(a) cepanju posredovanom sa RISC. Kao takav, predmetni opis dalje sadrži IRNK koje ciljano deluju unutar jednog od ovih mesta. Kao što se ovde upotrebljava, za IRNK se navodi da ciljano deluje unutar određenog mesta RNK transkripta ukoliko IRNK pospešuje cepanje transkripta bilo gde unutar tog određenog mesta. Takva IRNK će generalno uključivati najmanje oko 19 uzastopnih nukleotida iz jedne od sekvenci datih u Tabeli 3, 5 i 6, a koja je kuplovana sa dodatnim nukleotidnim sekvencama uzetim iz regiona koji je u blizini izabrane sekvence u AGT genu.
II. Modifikovane IRNK opisa
[0122] U određenim opcijama, RNK iz IRNK opisa npr. dsRNK, nije modifikovana i ne sadrži, npr. hemijske modifikacije ili konjugacije poznate u oblasti tehnike i one koje su ovde opisane. U drugim opcijama, RNK iz IRNK opisa, npr. dsRNK, hemijski je modifikovana tako da se poboljša njena stabilnost ili druge korisne karakteristike. U određenim opcijama opisa, suštinski svi od nukleotida IRNK opisa su modifikovani. U drugim opcijama opisa, svi od nukleotida IRNK, ili suštinski svi od nukleotida IRNK, su modifikovani, tj. u lancu IRNK nije prisutno više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nemodifikovanih nukleotida.
[0123] Nukleinske kiseline predstavljene u opisu, mogu biti sintetisane ili modifikovane postupcima koji su dobro poznati u oblasti tehnike, kao što su oni opisani u „Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage S.L. i saradnici (ur.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, SAD. Modifikacije uključuju, na primer, modifikacije krajeva, npr. modifikacije 5'-kraja (fosforilaciju, konjugaciju, invertovane veze) ili modifikacije 3'-kraja (konjugaciju, DNK nukleotide, invertovane veze itd.); modifikacije baza, npr. zamenu sa stabilišućim bazama, destabilišućim bazama ili bazama koje se sparuju sa proširenim repertoarom partnera, uklanjanje baza (abazičnih nukleotida) ili konjugovanih baza; modifikacije šećera (npr. na 2'-poziciji ili 4'-poziciji) ili zamenu šećera; ili modifikacije okosnice, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiestarskih veza. Specifični primeri IRNK jedinjenja korisnih u opcijama koje su ovde opisane uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK koje sadrže modifikovane okosnice ili nemaju prirodne međunukleozidne veze. RNK koje imaju modifikovane okosnice uključuju, između ostalog, one koje nemaju atom fosfora u okosnici. Za potrebe ove specifikacije, a kao što se ponekad pominje i u oblasti tehnike, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u njihovoj internukleozidnoj okosnici, mogu se takođe smatrati oligonukleozidima. U pojedinim opcijama, modifikovana IRNK će imati atom fosfora u svojoj međunukleozidnoj okosnici.
[0124] Modifikovane okosnice RNK uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfosfosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate, uljučujući 3'-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, 2'-5'-vezane analoge istih ili one koje imaju obrnut polaritet, pri čemu su susedni parovi nukleozidnih jedinica povezani 3'-5' do 5'-3' ili 2'-5' do 5'-2'. Uključene su i razne soli, mešane soli i oblici slobodnih kiselina.
[0125] Reprezentativni SAD patenti u kojima je opisana priprema prethodno navedenih veza koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i SAD patent br. RE39464.
[0126] Modifikovane RNK okosnice u koje nije uključen atom fosfora, imaju okosnice obrazovane od kratkolančanih alkil ili cikloalkil međunukleozidnih veza, mešovitih heteroatomskih i alkil ili cikloalkil međunukleozidnih veza, ili jedne ili više od kratkolančanih heteroatomskih ili heterocikličnih međunukleozidnih veza. Navedeno uključuje one koje sadrže morfolino veze (obrazovane delom od dela šećera nukleozida); siloksanske okosnice; sulfidne, sulfoksidne i sulfonske okosnice; formacetilne i tioformacetilne okosnice; metilen formacetilne i tioformacetilne okosnice; okosnice koje sadrže alken; sulfamatne okosnice; metilenimino i metilenhidrazino okosnice; sulfonatne i sulfonamidne okosnice; amidne okosnice; i druge u kojima su izmešani N, O, S i CH2delovi komponenti.
[0127] Reprezentativni SAD patenti u kojima je opisana priprema prethnodno navednih oligonukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i 5,677,439.
[0128] Za upotrebu u IRNK koje su ovde obezbeđene, predviđeni su i pogodni RNK mimetici, u kojima su i šećer i međunukleozidna veza, tj. okosnica nukleotidnih jedinica, zamenjeni novim grupama. Bazne jedinice se zadržavaju zarad hibridizacije sa odgovarajućim ciljnim jedinjenjem tipa nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje u kome je prisutan RNK mimetik, za koga je pokazano da ima odlična osobina hibridizacije, označava se kao peptidna nukleinska kiselina (PNA). U PNA jedinjenjima, okosnica RNK sa šećerima se zamenjuju okosnicom koja sadrži amid, posebno aminoetilglicinskom okosnicom. Nukleobaze se zadržavaju i vezuju direktno ili indirektno za aza atome azota u amidnom delu okosnice. Reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremu PNA jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br. 5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dodatna PNA jedinjenja pogodna za upotrebu u IRNK opisa prijavljena su u, na primer, u Nielsen i saradnici, Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0129] Pojedine opcije predstavljene u opisu, uključuju RNK sa fosforotioatnim okosnicama i oligonukleozide sa heteroatomskim okosnicama, a posebno --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[poznatom kao metilen (metilimino) ili MMI okosnica], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2--[gde je nativna fosfodiestarska okosnica predstavljena kao --O--P--O--CH2--] iz prethodno navedenog SAD patenta br.5,489,677, i amidne okosnice iz prethodno navedenog SAD patenta br. 5,602,240. U pojedinim opcijama, RNK koje su ovde predstavljene imaju morfolino strukture okosnice iz prethodno navedenog SAD patenta br.5,034,506.
[0130] Modifikovane RNK takođe mogu sadržavati jedan ili više supstituisanih ostataka šećera. IRNK, npr. dsRNK, koje su ovde predstavljene, mogu uključivati jedan od sledećeg na 2'-poziciji: OH; F; O-, S-ili N-alkil; O-, S- ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, pri čemu alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Primeri pogodnih modifikacija uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugim opcijama, dsRNK uključuju jedno od sledećeg na poziciji 2': C1do C10niži alkil, supstituisan niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupu koja cepa RNK, reportersku grupu, interkalirajući agens, grupu za poboljšanje farmakokinetičkih osobina IRNK ili grupu za poboljšanje farmakodinamičkih osobina IRNK i druge supstituente koji imaju slične osobine. U pojedinim opcijama, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O-CH2CH2OCH3, poznat i kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin i saradnici, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj. alkoksi-alkoksi grupu. Druga modifikacija za primer je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj. O(CH2)2ON(CH3)2grupa, takođe poznata kao 2'-DMAOE, koja je kao što je opisano u primerima u nastavku, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznat u oblasti thenike kao 2'-0-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2. Dalje modifikacije za primer uključuju: 5'-Me-2'-F nukleotide, 5'-Me-2'-OMe nukleotide, 5'-Me-2'-dezoksinukleotide, (kako R, tako i S izomere u ove tri familije); 2'-alkoksialkil; i 2'-NMA (N-metilacetamid).
[0131] Druge modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluoro (2'-F). Slične modifikacije se takođe mogu uvesti na drugim pozicijama na RNK u okviru IRNK, posebno na 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanim dsRNK, kao i na 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. IRNK takođe mogu imati mimetike šećera kao što su ciklobutilni ostaci umesto pentofuranozilnih šećera. Reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremu takvih modifikovanih struktura šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br.4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920, od kojih su pojedini u zajedničkom vlasništvu sa predmetnim podnosiocima.
[0132] IRNK takođe može uključivati modifikacije ili supstitucije nukleobaza (koje se u oblasti tehnike često nazivaju jednostavno „bazama"). Kao što se ovde upotrebljava, „nemodifikovane” ili „prirodne” nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su dezoksi-timin (dT), 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksi i ostali 8-supstituisani adenini i guanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-daazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze uključuju one opisane u SAD pat. br. 3,687,808, one opisane u Modified Nucleosides u Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn P., izd. Wiley-VCH, 2008; one opisane u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, strane 858-859, Kroschwitz J. L, izd. John Wiley & Sons, 1990, one opisane od strane Englisch i saradnici, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 i one opisane od strane Sanghvi Y S., poglavlje 15, dsRNA Research and Applications, strane 289-302, Crooke S. T. i Lebleu, B., izd., CRC Press, 1993. Određene od ovih nukleobaza su posebno korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja predstavljenih u opisu. Navedeno uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Pokazano je takođe da supstitucije 5-metilcitozina povećavaju stabilnost dupleksa nukleinskih kiselina za 0,6-1,2°C (Sanghvi Y. S., Crooke S. T. i Lebleu B., ur., dsRNK Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, str. 276-278) i predstavljaju bazne supstitucije za primer, još preciznije kada se kombinuju sa 2'-O-metoksietil modifikacijama šećera.
[0133] Reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremanje određenih od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza, kao i drugih modifikovanih nukleobaza uključuju, ali nisu ograničeni na, prethodno navedene SAD patente br. 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0134] RNK iz IRNK može takođe biti modifikovana tako da uključuje jednu ili više „zaključanih” nukleinskih kiselina (LNA). „Zaključana” nukleinska kiselina je nukleotid koji ima modifikovan ribozni ostatak u kome ribozni ostatak sadrži dodatni most koji povezuje 2' i 4' ugljenike. Ova struktura efektivno „zaključava” ribozu u 3'-endo strukturnoj konformaciji. Pokazano je i da dodavanje „zaključanih” nukleinskih kiselina na siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i smanjuje efekte delovanja van ciljnog mesta (Elmen J. i saradnici (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook OR. i saradnici (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller A. i saradnici (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[0135] U pojedinim opcijama, RNK iz IRNK može biti modifikovana tako da uključuje i jedan ili više bicikličnih šećernih ostataka. „Biciklični šećer” je furanozilni prsten modifikovan premošćavanjem dva atoma. „Bicikličan nukleozid” ("BNA") je nukleozid koji ima ostatak šećera koji sadži most koji povezuje dva atoma ugljenika iz prstena šećera, čime se obrazuju bicikličan sistem prstenova. U određenim opcijama, most povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik prstena šećera. Prema tome, u pojedinim opcijama, agens opisa može uključivati jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNA). Zaključana nukleinska kiselina je nukleotid koji ima modifikovan ribozni ostatak u kome ostatak riboze sadrži dodatni most koji povezuje 2' i 4' ugljenike. Drugim rečima, LNA je nukleotid koji sadrži bicikličan ostatak sećera koji sadrži 4'-CH2-O-2' most. Ova struktura efektivno „zaključava” ribozu u 3'-endo strukturnoj konformaciji. Pokazano je i da dodavanje „zaključanih” nukleinskih kiselina na siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i smanjuje efekte delovanja van ciljnog mesta (Elmen J. i saradnici (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook OR. i saradnici (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller A. i saradnici (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Primeri bicikličnih nukleozida za upotrebu u polinukleotidima opisa, obuhvataju bez ograničenja nukleozide koji sadrže most između 4' i 2' atoma ribozilnog prstena. U određenim opcijama, antisens polinukleotidni agensi opisa uključuju jedan ili više bicikličnih nukleozida koji sadrže 4' do 2' most. Primeri takvih 4' do 2' premoštenih bicikličnih nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (označen i kao „krut etil” ili „cEt") i 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (i njihove analoge; pogledati, npr. SAD patent br. 7,399,845); 4'-C(CH3)(CH3)-0-2' (i njihove analoge; pogledati, npr. SAD patent br. 8,278,283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (i njihove analoge; pogledati, npr. SAD patent br.
8,278,425); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (pogledati, npr. Objavu SAD patenta br.2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', gde R je H, C1-C12 alkil ili zaštitna grupa (pogledati, npr. SAD patent br. 7,427,672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (pogledati, npr.Chattopadhyaya i saradnici, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4'-CH2-C(=CH2)-2' (i njihove analoge; pogledati, npr. SAD patent br.8,278,426).
[0136] Dodatni reprezentativni SAD patenti i objave SAD patenata koji opisuju pipremu zaključanih nukleotida za nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: SAD patente br.6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; i US 2009/0012281.
[0137] Bilo koji od prethodno navedenih bicikličnih nukleozida može biti pripremljen sa jednom ili više stereohemijskih konfiguracija šećera uključujući na primer α-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (pogledati WO 99/14226).
[0138] RNK iz IRNK može takođe biti modifikovana tako da uključuje jedan ili više krutih etil nukleotida. Kao što se ovde upotrebljava, „kruti etil nukleotid” ili „cEt” je zaključana nukleinska kiselina koja sadrži bicikličan ostatak šećera koji sadrži 4'-CH(CH3)-O-2' most. U jednoj opciji, krut etil nukleotid je u S konformaciji koja se ovde navodi kao „S-cEt."
[0139] IRNK opisa takođe može uključivati jedan ili više „konformaciono ograničenih nukleotida” ("CRN"). CRN su analozi nukleotida sa linkerom koji povezuje C2' i C4' ugljenike riboze ili C3 i -C5' ugljenike riboze. CRN zaključava ribozni prsten u stabilnu konformaciju i povećava afinitet hibridizacije prema iRNK. Linker je dovoljne dužine da postavi kiseonik u optimalnu poziciju za stabilnost i afinitet, što rezultuje manjim nabiranjem riboznog prstena.
[0140] Reprezentativne publikacije koje opisuju pripremu određenih od prethodno navedenih CRN uključuju, ali nisu ograničene na, objavu SAD patenta br. 2013/0190383; i PCT publikaciju WO 2013/036868.
[0141] U pojedinim opcijama, IRNK opisa sadrži jedan ili više monomera koji su UNA („otključane” nukleinske kiseline) nukleotidi. UNA je „otključana” aciklična nukleinska kiselina, pri čemu je bilo koja od veza šećera uklonjena, čime se obrazuje „otključana” ostatak „šećera”. U jednom primeru, UNA takođe obuhvata monomer sa uklonjenim vezama između C1'-C4' (tj. kovalentnom vezom ugljenikkiseonik-ugljenik između C1' i C4' ugljenika). U drugom primeru, C2'-C3' veza (tj. kovalentna veza ugljenik-ugljenik između C2' i C3' ugljenika) šećera je uklonjena (pogledati Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) i Fluiter i saradnici, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039).
[0142] Reprezentativne američke publikacije koje opisuju pripremu UNA uključuju, ali nisu ograničene na, SAD patent br. 8,314,227; i objave SAD patenata br. 2013/0096289; 2013/0011922; i 2011/0313020.
[0143] Potencijalno stabilizirajuće modifikacije krajeva RNK molekula mogu uključivati N-(acetilaminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(kaproil-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroksiprolinol (Hyp-NHAc), timidin-2'-0-dezoksitimidin (etar), N-(aminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-dokozanoil-uridin-3"-fosfat, invertovanu bazu dT( idT) i druge. Opis ove modifikacije se može naći u PCT objavi br. WO 2011/005861.
[0144] Druge modifikacije nukleotida IRNK opisa uključuju 5' fosfat ili 5' fosfatne mimetike, npr. 5'-terminalni fosfat ili fosfatni mimetik na antisens lancu IRNK. Pogodni fosfatni mimetici su opisani u, na primer, Objavi SAD patenta br.2012/0157511.
A. Modifikovane IRNK koje sadrže motive opisa
[0145] Prema određenim aspektima opisa, dvolančani RNK agensi opisa uključuju agense sa hemijskim modifikacijama koje su opisane, na primer, u WO2013/075035. WO2013/075035 obezbeđuje motive tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lancu ili antisens lancu dsRNKi agensa, posebno na ili blizu mesta cepanja. U pojedinim opcijama, sens lanac i antisens lanac dsRNKi agensa mogu inače biti potpuno modifikovani. Uvođenje ovih motiva prekida obrazac modifikacija, ukoliko je prisutan, sens ili antisens lanca. dsRNKi agens može biti opciono konjugovan sa ligandom GalNAc derivata, na primer, na sens lancu.
[0146] Preciznije, kada su sens lanac i antisens lanac dvolančanog RNK agensa potpuno modifikovan tako da imaju jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, na ili blizu mesta cepanja najmanje jednog lanca dsRNKi agensa, uočena je aktivnost utišavanja gena za taj dsRNKi agens.
[0147] U skladu sa navedenim, opis obezbeđuje dvolančane RNK agense sposobne da inhibiraju ekspresiju ciljnog gena (tj. AGT gena) in vivo. RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac. Svaki lanac RNKi agensa može biti dužine od, na primer, 17-30 nukleotida, dužine od 25-30 nukleotida, dužine od 27-30 nukleotida, dužine od 19-25 nukleotida, dužine od 19-23 nukleotida, dužine od 19-21 nukleotida, dužine od 21-25 nukleotida ili dužine od 21-23 nukleotida.
[0148] Sens lanac i antisens lanac obično obrazuju dupleks dvolančanu RNK ("dsRNK"), koja se ovde takođe označava kao „dsRNKi agens". Dupleksni region dsRNKi agensa može biti, na primer, dupleksni region dužine 27-30 nukleotidnih parova, dužine 19-25 nukleotidnih parova, dužine 19-23 nukleotidnih parova, dužine 19-21 nukleotidnih parova, dužine 21-25 nukleotidnih parova ili dužine 21-23 nukleotidnih parova. U drugom primeru, dupleksni region je izabran od regiona dužine 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 i 27 nukleotida.
[0149] U određenim opcijama, dsRNKi agens može sadržavati jedan ili više jednolančanih regiona ili grupa koje obrazuju strukturu „kape” na 3'-kraju, 5'-kraju ili na oba kraja jednog ili oba lanca. Nukleotidni jednolančani kraj može biti, nezavisno, dužine 1-6 nukleotida, dužine, na primer, 2-6 nukleotida, dužine 1-5 nukleotida, dužine 2-5 nukleotida, dužine 1-4 nukleotida, dužine 2-4 nukleotida, dužine 1-3 nukleotida, dužine 2-3 nukleotida ili dužine 1-2 nukleotida. U određenim opcijama, jednolančani regioni mogu uključivati proširene jednolančane regione kao što je prethodno navedeno. Jednolančani krajevi mogu biti rezultat toga što je jedan lanac duži od drugog, ili rezultat toga što su dva lanca iste dužine smaknutih pozicija. Jednolančani kraj može obrazovati progrešno sparen kraj sa ciljnom iRNK ili može biti komplementaran genskim sekvencama na koje se ciljano deluje ili može biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac takođe mogu biti spojeni, npr. dodatnim bazama za obrazovanje strukture ukosnice, ili drugim linkerima koji nisu sastavljeni od baza.
[0150] U određenim opcijama, svaki od nukleotida u jednolančanom regionu dsRNKi agensa može nezavisno biti modifikovan ili nemodifikovan nukleotidi uključujući, ali bez ograničavanja samo na, 2'-modifikovan šećer, kao što je 2'-F, 2'-O-metil, timidin (T), 2'-O-metoksietil-5-metiluridin (Teo), 2'-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2'-O-metoksietil 1-5-metilcitidin (m5Ceo) i sve njihove kombinacije. Na primer, TT može biti sekvenca jednolančanog kraja za bilo koji kraj na bilo kom lancu. Jednolančani kraj može biti pogršno sparen sa ciljnom iRNK ili može biti komplementaran genskim sekvencama na koje se ciljano deluje ili može biti druga sekvenca.
[0151] 5'- ili 3'-jednolančani krajevi na sens lancu, antisens lancu, ili oba lanca dsRNKi agensa, mogu biti fosforilisani. U pojedinim opcijama, jednolančani region(i) sadrži(e) dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, pri čemu dva nukleotida mogu biti ista ili različita. U pojedinim opcijama, jednolančani kraj je prisutan na 3'-kraju sens lanca, antisens lanca ili oba lanca. U pojedinim opcijama, ovaj 3'-jednolančani kraj je prisutan u antisens lancu. U pojedinim opcijama, ovaj 3'-jednolančani kraj je prisutan u sens lancu.
[0152] dsRNKi agens može sadržavati samo jedan jednolančani kraj, koji može pojačati aktivnost interferencije IRNK, bez uticaja na njegovu ukupnu stabilnost. Na primer, jednolančani kraj može biti lociran na 3'-kraju sens lanca ili, alternativno, na 3'-kraju antisens lanca. IRNK takođe može imati tup kraj, koji se nalazi na 5'-kraju antisens lanca (ili 3'-kraju sens lanca) ili obrnuto. U principu, antisens lanac dsRNKi agensa ima nukleotidni jednolančani kraj na 3'-kraju, a 5'-kraj je tup. Bez želje da bude vezano za teoriju, asimetrični tupi kraj na 5'-kraju antisens lanca i 3'-jednolančani kraj antisens lanca favorizuju uključivanje vodećeg lanca u RISC proces.
[0153] U određenim opcijama, dsRNKi agens je sa tupim krajevima na oba kraja i dužine je od 19 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 7, 8, 9 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0154] U drugim opcijama, dsRNKi agens je sa tupim krajevima na oba kraja i dužine je od 20 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 8, 9, 10 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0155] U još drugim opcijama, dsRNKi agens je sa tupim krajevima na oba kraja i dužine je od 21 nukleotid, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5' kraj. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0156] U određenim opcijama, dsRNKi agens se sastoji od 21 nukleotidnog sens lanca i antisens lanca od 23 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5 'kraj; antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja, pri čemu je jedan kraj RNKi agensa tup, dok drugi kraj sadrži jednolančani kraj od 2 nukleotida. Poželjno je da je jednolančani kraj od 2 nukleotida na 3'-kraju antisens lanca.
[0157] Kada se jednolančani kraj od 2 nukleotida nalazi na 3'-kraju antisens lanca, mogu postojati dve fosforotioatne međunukleotidne veze između tri krajnja nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi jednolančanog kraja, a treći nukleotid je sparen nukleotid koji je sledeći u nizu do nukleotida iz jednolančanog kraja U jednoj opciji, RNKi agens dodatno ima dve fosforotioatne međunukleotidne veze između terminalna tri nukleotida i na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca. U određenim opcijama, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu dsRNKi agensa, uključujući nukleotide koji su deo motiva, modifikovani su nukleotidi. U određenim opcijama, svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metilom ili 3'-fluoro, npr. u naizmeničnom motivu. Opciono, dsRNKi agens dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc ligande).
[0158] U određenim opcijama, dsRNKi agens sadrži sens i antisens lanac, pri čemu je sens lanac dužine 25-30 nukleotidnih ostataka i pri čemu, počev od 5' terminalnog nukleotida (pozicija 1) pozicije 1 do 23 prvog lanca, sadrži najmanje 8 ribonukleotida; antisens lanac je dužine od 36-66 nukleotidnih ostataka i, počevši od 3' terminalnog nukleotida, sadrži najmanje 8 ribonukleotida na pozicijama uparenim sa pozicijama 1-23 sens lanca, da bi se obrazovao dupleks; gde najmanje 3' terminalni nukleotid antisens lanca nije uparen sa sens lancem, a do 6 uzastopnih 3' terminalnih nukleotida nije upareno sa sens lancem, čime se obrazuje 3' jednolančani kraj od 1-6 nukleotida; pri čemu 5' kraj antisens lanca sadrži od 10-30 uzastopnih nukleotida koji nisu upareni sa sens lancem, čime se obrazuje 5' jednolančani kraj od 10-30 nukleotida; gde su najmanje 5' terminalni i 3' terminalni nukleotidi sens lanca spareni sa nukleotidima antisens lanca kada su sens i antisens lanci poravnati radi maksimalne komplementarnosti, čime se obrazuje suštinski dupleksni region između sens i antisens lanaca; i antisens lanac je dovoljno komplementaran ciljnoj RNK duž najmanje 19 ribonukleotida u dužini antisens lanca, da bi se smanjila ekspresiju ciljnog gena kada se dvolančana nukleinska kiselina uvede u sisarsku ćeliju; i pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se najmanje jedan od motiva javlja na ili blizu mesta cepanja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili blizu mesta cepanja.
[0159] U određenim opcijama, dsRNKi agens sadrži sens i antisens lance, pri čemu dsRNKi agens sadrži prvi lanac koji ima dužinu od najmanje 25, a najviše 29 nukleotida, dok je drugi lanac dužine od najviše 30 nukleotida sa najmanje jednim motivom od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na poziciji 11, 12, 13 od 5' kraja; pri čemu 3' kraj prvog lanca i 5' kraj drugog lanca obrazuju tup kraj i drugi lanac je duži od prvog lanca za 1-4 nukleotida na svom 3' kraju, a pri čemu je dupleksni region dužine od najmanje 25 nukleotida i drugi lanac je dovoljno komplementaran ciljnoj iRNK duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog lanca, da bi se smanjila ekspresija ciljnog gena kada se RNKi agens uvede u sisarsku ćeliju, i pri čemu je rezultat Dicer cepanja dsRNKi agensa prvenstveno siRNK koja sadrži 3'-kraj drugog lanca, čime se smanjuje ekspresija ciljnog gena kod sisara. Opciono, dsRNKi agens dalje sadrži ligand.
[0160] U određenim opcijama, sens lanac dsRNKi agensa sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u sens lancu.
[0161] U određenim opcijama, antisens lanac dsRNKi agensa takođe može sadržavati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva javlja na ili blizu mesta cepanja u antisens lancu.
[0162] Za dsRNKi agens koji ima dupleksni region dužine 19-23 nukleotida, mesto cepanja antisens lanca je obično na poziciji oko 10, 11 i 12 od 5'-kraja. Tako se motivi tri identične modifikacije mogu pojaviti na pozicijama 9, 10, 11; pozicijama 10, 11, 12; pozicijama 11, 12, 13; pozicijama 12, 13, 14; ili pozicijama 13, 14, 15 antisens lanca, pri čemu brojanje započinje od prvog nukleotida sa 5'-kraja antisens lanca, ili brojanje započinje od prvog sparenog nukleotida unutar dupleksnog regiona od 5'-kraj antisens lanca. Mesto cepanja u antisens lancu može biti takođe izmenjeno u zavisnosti od dužine dupleksnog regiona dsRNKi agensa sa 5'-kraja.
[0163] Sens lanac dsRNKi agensa može sadržavati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida kod mesta cepanja lanca; a antisens lanac može imati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili blizu mesta cepanja lanca. Kada sens lanac i antisens lanac obrazuju dsRNK dupleks, sens lanac i antisens lanac mogu biti tako poravnati tako da jedan motiv od tri nukleotida na sens lancu i jedan motiv od tri nukleotida na antisens lancu imaju najmanje jedan nukleotidno preklapanje, tj. da najmanje jedan od tri nukleotida motiva u sens lancu obrazuje bazni par sa najmanje jednim od tri nukleotida motiva u antisens lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida se mogu preklapati, ili se sva tri nukleotida mogu preklapati.
[0164] U pojedinim opcijama, sens lanac dsRNKi agensa može sadržavati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv može biti prisutna na ili blizu mesta cepanja lanca, a drugi motivi mogu biti bočne modifikacije. Termin „bočne modifikacija” ovde se odnosi na motiv koji se javlja na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na ili blizu mesta cepanja istog lanca. Bočna modifikacija je ili pored prvog motiva ili je odvojena sa najmanje jednim ili više nukleotida. Kada su motivi neposredno jedni uz druge, onda su hemije motiva različite jedna od druge, a kada su motivi razdvojeni sa jednim ili više nukleotida, onda hemije mogu biti iste ili različite. Mogu biti prisutne dve ili više bočnih modifikacija. Na primer, kada su prisutne dve bočne modifikacije, svaka bočna modifikacija se može javiti na jednom kraju u odnosu na prvi motiv koji se nalazi na ili blizu mesta cepanja ili sa obe strane vodećeg motiva.
[0165] Kao i sens lanac, antisens lanac dsRNKi agensa može sadržavati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se najmanje jedan od motiva javlja na ili blizu mesta cepanja lanca. Ovaj antisens lanac može takođe sadržavati jednu ili više bočnih modifikacija u poravnanju sličnom za bočne modifikacije koje mogu biti prisutne na sens lancu.
[0166] U pojedinim opcijama, bočna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu dsRNKi agensa obično ne uključuje jedan ili dva od prvih terminalnih nukleotida na 3'-kraju, 5'-kraju ili na oba kraja lanca.
[0167] U drugim opcijama, bočna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu dsRNKi agensa obično ne uključuje jedan ili dva od prvih sparenih nukleotida unutar dupleksnog regiona na 3'-kraju, 5'-kraju ili na oba kraja lanca.
[0168] Kada svaki od sens lanca i antisens lanca dsRNKi agensa sadrže najmanje jednu bočnu modifikaciju, bočne modifikacije mogu biti na istomm kraju dupleksnog regiona i imati preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida.
[0169] Kada svaki od sens lanca i antisens lanca dsRNKi agensa sadrže najmanje dve bočne modifikacije, sens lanac i antisens lanac mogu biti tako poravnati da su po dve modifikacije iz svakog lanca na jednom kraju dupleksnog regiona, sa preklapanjem od jednog, dva ili tri nukleotida; da su po dve modifikacije iz svakog lanca na drugim krajevima dupleksnog regiona, sa preklapanjem od jednog, dva ili tri nukleotida; da su po dve modifikacije jednog lanca na svakom kraju vodećeg motiva, sa preklapanjem jednog, dva ili tri nukleotida u dupleksom regionu.
[0170] U pojedinim opcijama, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu dsRNKi agensa, uključujući nukleotide koji su deo motiva, može biti modifikovan. Svaki nukleotid može biti modifikovan istom ili različitom modifikacijom koja može uključivati jednu ili više izmena jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika ili jednog ili više od vezujućih fosfatnih kiseonika; izmenu sastojka riboznog šećera, npr.2'-hidroksila na šećeru riboze; veliku zamenu fosfatnog ostatka sa „defosfo” linkerima; modifikaciju ili zamenu baze koja se javlja u prirodi; i zamenu ili modifikaciju ribozno-fosfatne okosnice.
[0171] Kako su nukleinske kiseline polimeri subjedinica, mnoge od modifikacija mogu biti prisutne na poziciji koja se ponavlja unutar nukleinske kiseline, npr. to može biti modifikacija baze, ili fosfatnog ostatka, ili nevezujućeg O fosfatnog ostatka. U pojedinim slučajevima, modifikacija može biti prisutna na svim od naznačenih pozicija u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima i ne. Na primer, modifikacija može biti prisutna samo na 3'- ili 5' terminalnoj poziciji, može biti prisutna samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili u poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija može biti prisutna i u dvolančanom regionu, jednolančanom regionu ili u oba. Modifikacija može biti prisutna samo u dvolančanom regionu RNK ili može biti prisutna samo u jednom lančanom regionu RNK. Na primer, fosforotioatna modifikacija na nevezujućoj O poziciji može biti prisutna samo na jednom ili na oba kraja, može biti prisutna samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji terminalnih nukleotida ili u poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca, ili može biti prisutna u dvolančanim i jednolančanim regionima, posebno na krajevima. 5'-kraj ili krajevi mogu biti fosforilovani.
[0172] Može biti moguće, npr. da se poboljša stabilnost, da se uključe određene baze u jednolančane krajeve, ili da se uključe modifikovani nukleotidi ili surogati nukleotida u jednolančane krajeve, npr. u 5'- ili 3'-jednolančane krajeve, ili u oba. Na primer, može biti poželjno da se uključe purinski nukleotidi u jednolančane krajeve. U pojedinim opcijama, sve ili poojedine od baza u 3'- ili 5'-jednolančanom kraju mogu biti modifikovane, npr. sa modifikacijom koja je ovde opisana. Modifikacije mogu uključivati, npr. upotrebu modifikacija na 2' poziciji riboznog šećera sa modifikacijama koje su poznate u oblasti tehnike, npr. upotrebu dezoksiribonukleotida, 2'-dezoksi-2'-fluoro (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovanih umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacije u fosfatnoj grupi, npr. fosforotioatne modifikacije. Jednolančani krajevi ne moraju biti homologni sa ciljnom sekvencom.
[0173] U pojedinim opcijama, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil ili 2'-fluoro. Lanci mogu sadržavati više od jedne modifikacije. U jednoj opciji, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluoro.
[0174] Najmanje dve različite modifikacije su obično prisutne na sens lancu i antisens lancu. Te dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, ili druge.
[0175] U određenim opcijama, Naili Nbsadrže modifikacije naizmeničnog obrasca. Termin „naizmeničan motiv”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, pri čemu se svaka modifikacija javlja na naizmeničnim nukleotidima jednog lanca. Naizmeničan nukleotid se može odnositi na jedan nukleotid na svaka dva nukleotida ili na jedan na svaka tri nukleotida ili na sličan obrazac. Na primer, ukoliko svaki od A, B i C predstavljaju jedan tip modifikacije nukleotida, naizmenični motiv može biti „ABABABABABAB...," „AABBAABBAABB...”, „AABAABAABAAB...”, „AAABAAABAAAB...”, „AAABBBAAABBB...” ili „ABCABCABCABC...” itd.
[0176] Tip modifikacija sadržanih u naizmeničnom motivu može biti isti ili različit. Na primer, ukoliko svaki od A, B, C, D predstavlja jednu vrstu modifikacije na nukleotidu, naizmenični obrazac, tj. modifikacije na svakom drugom nukleotidu, mogu biti iste, ali svaki od sens lanca ili antisens lanca može biti izabran od nekoliko mogućnosti modifikacija unutar naizmeničnog motiva kao što su „ABABAB...”, „ACACAC...” „BDBDBD...” ili „CDCDCD...” itd.
[0177] U pojedinim opcijama, dsRNKi agens opisa sadrži obrazac modifikacija za naizmenični motiv na sens lancu u odnosu na obrazac modifikacija za naizmenični motiv na antisens lancu koji je pomeren. Pomeranje može biti takvo da modifikovana grupa nukleotida sens lanca odgovara drugačije modifikovanoj grupi nukleotida antisens lanca i obrnuto. Na primer, kada je sens lanac uparen sa antisens lancem u dsRNK dupleksu, naizmenični motiv u sens lancu može počinjati sa „ABABAB” od 5 'do 3' lanca, a naizmenični motiv u antisens lancu može počinjati sa „BABABA” od 5' do 3' lanca u dupleks regionu. Kao još jedan primer, naizmenični motiv u sens lancu može počinjati sa „AABBAABB” od 5' do 3' lanca, a naizmenični motiv u antisens lancu može počinjati sa „BBAABBAA” od 5' do 3' lanca unutar dupleksnog regiona, tako da postoji potpuni ili delimični pomeraj obrasca modifikacija između sens lanca i antisens lanca.
[0178] U pojedinim opcijama, dsRNKi agens sadrži obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na sens lancu koji u početku ima pomeraj u odnosu na obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na antisens lancu u početku, tj.2'-O-metil modifikovan nukleotid na bazi sens lanca se uparuje sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antisens lancu i obrnuto. Pozicija 1 sens lanca može počinjati sa 2'-F modifikacijom, a pozicija 1 antisens lanca može počinjati sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0179] Uvođenje jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lancu ili antisens lancu prekida početni obrazac modifikacija prisutan u sens lancu ili antisens lancu. Ovaj prekid obrasca modifikacija sens ili antisens lanca uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens ili antisens lanac može poboljšati aktivnost utišavanja gena za ciljni gen.
[0180] U pojedinim opcijama, kada se motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uvede u bilo koji od lanaca, modifikacija nukleotida pored motiva je drugačija modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koji sadrži motiv je „..NaYYYNb..,” gde „Y” predstavlja modifikaciju motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „Na” i „Nb” predstavljaju modifikaciju nukleotida pored motiva „YYY” koja se razlikuje od modifikacije Y, a gde je Nai Nbmogu biti iste ili različite modifikacije. Alternativno, Naili Nbmože biti prisutan ili odsutan kada postoji bočna modifikacija.
[0181] IRNK može dalje sadržavati najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu međunukleotidnu vezu. Modifikacija fosforotioatne ili metilfosfonatne međunukleotidne veze može biti prisutna na bilo kom nukleotidu sens lanca, antisens lanca ili oba lanca, u bilo kojoj poziciji lanca. Na primer, modifikacija međunukleotidne veze može biti prisutna na svakom nukleotidu na sens lancu ili antisens lancu; svaka modifikacija međunukleotidne veze može biti prisutna u naizmeničnom obrascu na sens lancu ili antisens lancu; ili sens lanac ili antisens lanac mogu sadržavati obe modifikacije međunukleotidne veze u naizmeničnom obrascu. Naizmenični obrazac modifikacije međunukleotidne veze na sens lancu može biti isti ili različit od antisens lanca, a naizmeničan obrazac modifikacije međunukleotidne veze na sens lancu može imati pomeraj u odnosu na naizmenični obrazac modifikacije međunukleotidne veze na antisens lancu. U jednoj opciji, dvolančani RNKi agens sadrži 6-8 fosforotioatnih međunukleotidnih veza. U pojedinim opcijama, antisens lanac sadrži dve fosforotioatne međunukleotidne veze na 5'-kraju i dve fosforotioatne međunukleotidne veze na 3'-kraju, a sens lanac sadrži najmanje dve fosforotioatne međunukleotidne veze bilo na 5'-kraju ili 3'-kraju.
[0182] U pojedinim opcijama, dsRNKi agens sadrži fosforotioatnu ili metilfosfonatnu međunukleotidnu modifikaciju veze u jednolančanom regionu. Na primer, jednolančani region može sadržavati dva nukleotida koji imaju fosforotioatnu ili metilfosfonatnu međunukleotidnu vezu između dva nukleotida. Modifikacije međunukleotidnih veza mogu takođe biti napravljene tako da se povežu nukleotidi jednolančanih krajeva sa terminalnim sparenim nukleotidima unutar dupleksnog regiona. Na primer, najmanje 2, 3, 4 ili svi od nukleotida jednolančanih krajeva mogu biti povezani preko fosforotioatne ili metilfosfonatne međunukleotidne veze, aopciono, može postojati dodatna fosforotioatna ili metilfosfonatna međunukleotidna veza koja povezuje nukleotide jednolančanog kraja sa uparenim nukleotidom koji je sledeći do nukleotida jednolančanog kraja. Na primer, mogu postojati najmanje dve fosforotioatne međunukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, u kojima su dva od tri nukleotida nukleotidi jednolančanog kraja, a treći je spareni nukleotid pored nukleotida jednolančanog kraja. Ova tri terminalna nukleotida mogu biti na 3'-kraju antisens lanca, 3'-kraju sens lanca, 5'-kraju antisens lanca ili 5'-kraju antisens lanca.
[0183] U pojedinim opcijama, jednolančani kraj od 2 nukleotida je na 3'-kraju antisens lanca, a postoje dve fosforotioatne međunukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi jednolančanog kraja, a treći nukleotid spareni nukleotid pored nukleotida jednolančanog kraja. Opciono, dsRNKi agens može dodatno imati dve fosforotioatne međunukleotidne veze između tri terminalna nukleotida i na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca.
[0184] U jednoj opciji, dsRNKi agens sadrži pogrešno(a) sparivanje(a) sa ciljnim molekulom, unutar dupleksa, ili njihove kombinacije. Do pogrešnog sparivanja može doći u jednolančanom regionu ili dupleksnom regionu. Bazno sparivanje se može rangirati na osnovu sklonosti para da se pospeši disocijacija ili topljenje (npr. po slobodnoj energiji asocijacije ili disocijacije određenog uparivanja, najjednostavniji pristup je da se parovi ispitaju na osnovu pojedinačnog para, iako se može koristiti i sledeći susedni par ili slična analiza). U pogledu pospešivanja disocijacije: A:U je poželjniji u odnosu na G:C; G:U je poželjniji u odnosu na G:C; i I:C je poželjniji u odnosu na G:C (I=inozin). Pogrešna sparivanja, npr. nekanonska ili sparivanja drugačija od kanonskih (kao što je ovde opisano na drugom mestu) poželjnija su u odnosu na kanonska (A:T, A:U, G:C) sparivanja; a sparivanja koja uključuju univerzalnu bazu su poželjnija od kanonskih sparivanja.
[0185] U određenim opcijama, dsRNKi agens sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova unutar dupleksnog regiona sa 5'-kraja antisens lanca, nezavisno izabrana iz grupe: A:U, G:U, I:C i pogrešno sparenih parova, npr. nekanonskih ili sparivanja drugačijih od kanonskih ili sparivanja koja uključuju univerzalnu bazu, da bi se pospešila disocijaciju antisens lanca na 5'-kraju dupleksa.
[0186] U određenim opcijama, nukleotid na poziciji 1 unutar dupleksnog regiona sa 5'-kraja u antisens lancu je izabran od A, dA, dU, U i dT. Alternativno, najmanje jedan od prvih 1, 2 ili 3 baznih parova unutar dupleksnog regiona od 5'-kraja antisens lanca je AU bazni par. Na primer, prvi bazni par unutar dupleksnog regiona sa 5'-kraja antisens lanca je AU bazni par.
[0187] U drugim opcijama, nukleotid na 3'-kraju sens lanca je dezoksi-timin (dT) ili nukleotid na 3'-kraju antisens lanca je dezoksi-timin (dT). Na primer, postoji kratka sekvenca dezoksi-timinskih nukleotida, na primer, dva dT nukleotida na 3'-kraju sens, antisens lanca ili oba lanca.
[0188] U određenim opcijama, sekvenca sens lanca može biti predstavljena formulom (I):
5’ np-Na-(XXX)iNb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’ (I)
gde:
i i j su svaki nezavisno 0 ili 1;
p i q su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
svaki npi nqnezavisno predstavljaju nukleotid jednolančanog kraja;
pri čemu Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
svaki XXX, YYY i ZZZ nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Poželjno, YYY su svi 2'-F modifikovan nukleotidi.
[0189] U pojedinim opcijama, Naili Nbsadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0190] U pojedinim opcijama, YYY motiv je prisutan na ili blizu mesta cepanja sens lanca. Na primer, kada dsRNKi agens ima dupleksni region dužine 17-23 nukleotida, YYY motiv može biti prisutan na ili u blizini mesta cepanja (npr. može biti prisutan na pozicijama 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11,12; ili 11, 12, 13) sens lanca, pri čemu brojanje započinje od prvog nukleotida, od 5'-kraja; ili opciono, brojanje započinje od prvog sparenog nukleotida unutar dupleksnog regiona, od 5'-kraja.
[0191] U jednoj opciji, i je 1, a j je 0, ili i je 0 i j je 1, ili su i i i j 1. Sens lacan stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Ib);
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’ (Ic);
ili
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Id).
[0192] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ib), Nbpredstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Nanezavisno može predstavljati oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0193] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ic), Nbpredstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Namože nezavisno predstavljati oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0194] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Id), svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 Svaki Namože nezavisno predstavljati oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0195] Svaki od X, Y i Z može biti isti ili različit jedan od drugog.
[0196] U drugim opcijama, i je 0, a j je 0, tako da sens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np-Na-YYY- Na-nq3' (Ia).
[0197] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ia), svaki Nanezavisno može predstavljati oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0198] U jednoj opciji, sekvenca antisens lanca IRNK može biti predstavljena formulom (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'- Y’Y’Y’-Nb'-(X'X'X')1-N'a-np'3' (II)
gde:
k i 1 su svaki nezavisno 0 ili 1;
p' i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svaki Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
svaki np' i nq' nezavisno predstavljaju nukleotid jednolančanog kraja;
pri čemu Nb' i Y' nemaju istu modifikaciju; i
svaki od X'X'X', Y’Y’Y’ i Z'Z'Z' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0199] U pojedinim opcijama, Na' ili Nb' sadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0200] Y’Y’Y’ motiv se javlja na ili blizu mesta cepanja antisens lanca. Na primer, kada dsRNKi agens ima dupleksni region dužine 17-23 nukleotida, Y’Y’Y’ motiv može biti prisutan na pozicijama 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ili 13, 14, 15 antisens lanca, pri čemu brojanje započinje od prvog nukleotida, od 5'-kraja; ili opciono, brojanje započinje od prvog sparenog nukleotida unutar dupleksnog regiona, od 5'-kraja. Poželjno je da je motiv Y’Y’Y’ prisutan na pozicijama 11, 12, 13.
[0201] U određenim opcijama, svi u Y’Y’Y’ motivu su 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0202] U određenim opcijama, k je 1 i 1 je 0, ili k je 0, a 1 je 1, ili su i k i 11.
[0203] Antisens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y’Y’Y’-Na'-np'3' (IIb);
5' nq,-Na'-Y’Y’Y’-Nb'-X'X'X'-np'3' (IIc);
ili
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y’Y’Y’-Nb'- X'X'X'-Na'-np'3' (IId).
[0204] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIb), Nb' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0205] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IIc), Nb' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0206] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IId), svaki Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0207] U drugim opcijama, k je 0, a 1 je 0, a antisens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np'-Na'-Y’Y’Y’- Na'-nq'3' (Ia).
[0208] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IIa), svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svaki od X', Y' i Z' može biti isti ili različit jedan od drugog.
[0209] Svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-hidroksil ili 2'-fluoro. Na primer, svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metilom ili 2'-fluoro. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', posebno, može predstavljati 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluoro modifikaciju.
[0210] U pojedinim opcijama, sens lanac dsRNKi agensa može sadržavati YYY motiv koji se javlja na pozicijama lanca 9, 10 i 11, kada je dupleksni region od 21 nt, a sa brojanjem se započinje od prvog nukleotida sa 5'-kraja, ili opciono, sa brojanjem se započinje od prvog sparenog nukleotida unutar dupleksnog regiona, od 5'-kraja; i Y predstavlja 2'-F modifikaciju. Sens lanac može dodatno sadržavati XXX motiv ili ZZZ motive kao bočne modifikacije na suprotnom kraju dupleksnog regiona; a svaki od XXX i ZZZ nezavisno predstavlja 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0211] U pojedinim opcijama, antisens lanac može sadržavati Y’Y’Y’ motiv koji se javlja na pozicijama lanca 11, 12, 13, a sa brojanjem se započinje od prvog nukleotida sa 5'-kraja, ili opciono, sa brojanjem se započinje od prvog sparenog nukleotida unutar dupleksnog regiona, od 5'-kraja; i Y' predstavlja 2'-O-metil modifikaciju. Antisens lanac može dodatno sadržavati X'X'X' motiv ili Z'Z'Z' motive kao bočne modifikacije na suprotnom kraju dupleksnog regiona; a svaki od X'X'X' i Z'Z'Z' nezavisno predstavlja 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0212] Sens lanac predstavljen bilo kojom od prethodno navedenih formula (Ia), (Ib), (Ic) i (Id), obrazuje dupleks sa antisens lancem koji je predstavljen bilo kojom od formula (IIa), (IIb), ( IIc) i (IId), tim redom.
[0213] Shodno tome, dsRNKi agensi za upotrebu u postupcima opisa mogu sadržavati sens lanac i antisens lanac, pri čemu svaki lanac ima 14 do 30 nukleotida, a IRNK dupleks je predstavljen formulom (III):
sens: 5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’
antisens: 3’ np-Na-(X’X’X’)k-Nb-YYY-Nb-(Z’Z’Z’)l-Na-nq5’
(III)
gde:
i, j, k i 1 su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nai Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
pri čemu svaki np', np, nq', i nq, od kojih svaki može ili ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja nukleotid jednolančanog kraja; i
svaki od XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y’Y’Y’ i Z'Z'Z' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0214] U jednoj opciji, i je 0 i j je 0; ili i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili su i i i j 0; ili su i i i j 1. U drugoj opciji, k je 0, a 1 je 0; ili k je 1 i 1 je 0; k je 0 i 1 je 1; ili su i k i 10; ili su i k i 11.
[0215] Primeri kombinacija sens lanca i antisens lanca koji obrazuju IRNK dupleks uključuju formule u nastavku:
5'np- Na-Y Y Y -Na-nq3'
3'np-Na-Y’Y’Y’ -Na'nq' 5' (IIIa)
5'np-Na-Y Y Y -Nb-Z Z Z -Na-nq3'
3' np'-Na'-Y’Y’Y’-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5' (IIIb)
5' np-Na- X X X -Nb-Y Y Y - Na-nq3'
3'np-Na-X'X'X'-Nb-Y’Y’Y’-Na-nq5' (IIIc)
5'np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq3'
3'np-Na-X'X'X'-Nb-Y’Y’Y’-Nb-Z'Z'Z'-Na-nq5' (IIId)
[0216] Kada je dsRNKi agens predstavljen formulom (IIIa), svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0217] Kada je dsRNKi agens predstavljen formulom (IIIb), svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 1-10, 1-7, 1-5 ili 1-4 modifikovana nukleotida. Svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0218] Kada je dsRNKi agens predstavljen kao formula (IIIc), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida.
Svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0219] Kada je dsRNKi agens predstavljen kao formula (IIId), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na, Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svaki od Na, Na', Nb, a Nb' nezavisno sadrži modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0220] Svaki od X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId) može biti isti ili različit jedan od drugog.
[0221] Kada je dsRNKi agens predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId), najmanje jedan od Y nukleotida može obrazovati bazni par sa jednim od Y' nukleotida. Alternativno, najmanje dva od Y nukleotida obrazuju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima; ili sva tri Y nukleotida obrazuju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0222] Kada je dsRNKi agens predstavljen formulom (IIIb) ili (IIId), najmanje jedan od Z nukleotida može obrazovati bazni par sa jednim od Z' nukleotida. Alternativno, najmanje dva od Z nukleotida obrazuju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili sva tri Z nukleotida obrazuju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0223] Kada je dsRNKi agens predstavljen kao formula (IIIc) ili (IIId), najmanje jedan od X nukleotida može obrazovati bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, najmanje dva od X nukleotida obrazuju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima; ili sva tri X nukleotida obrazuju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0224] U određenim opcijama, modifikacija na Y nukleotidu je drugačija od modifikacije na Y’ nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je drugačija od modifikacije na Z' nukleotidu, ili je modifikacija na X nukleotidu drugačija od modifikacije na X' nukleotidu.
[0225] U određenim opcijama, kada je dsRNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije. U drugim opcijama, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, a np' je >0 i najmanje jedan np' je vezan za susedni nukleotid preko fosforotioatne veze. U još drugim opcijama, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, np' je >0 i najmanje jedan np' je vezan za susedni nukleotid preko fosforotioatne veze, dok je sens lanac konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata vezanih preko dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera (opisano u nastavku). U drugim opcijama, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, np' je >0 i najmanje jedan np' je vezan za susedni nukleotid preko fosforotioatne veze, a sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu, dok je sens lanac konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata vezanih preko dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera.
[0226] U pojedinim opcijama, kada je dsRNKi agens predstavljen formulom (IIIa), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, np' je >0 i najmanje jedan np' je vezan za susedni nukleotid preko fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu, dok je sens lanac konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata vezanih preko dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera.
[0227] U pojedinim opcijama, dsRNKi agens je multimer koji sadrži najmanje dva dupleksa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId), pri čemu su dupleksi povezani linkerom. Linker može biti onaj koji je podložan ili nije podložan cepanju. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki od dupleksa može ciljano delovati na isti gen ili na dva različita gena; ili svaki od dupleksa može ciljano delovati na isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0228] U pojedinim opcijama, dsRNKi agens je multimer koji sadrži tri, četiri, pet, šest ili više dupleksa predstavljenih formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId), pri čemu su dupleksi povezana linkerom. Linker može biti onaj koji je podložan ili nije podložan cepanju. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki od dupleksa može ciljano delovati na isti gen ili na dva različita gena; ili svaki od dupleksa može ciljano delovati na isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0229] U jednoj opciji, dva dsRNKi agensa predstavljena najmanje jednom od formula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) i (IIId) su međusobno povezana na 5' kraju, i na jednom ili oba od 3' krajeva, a opciono su konjugovani sa ligandom. Svaki od agenasa može ciljano delovati na isti gen ili na dva različita gena; ili svaki od agenasa može ciljano delovati na isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0230] U određenim opcijama, RNKi agens opisa može sadržavati mali broj nukleotida koji sadrže 2'-fluoro modifikaciju, npr. 10 ili manje nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom. Na primer, RNKi agens može sadržavati 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ili 0 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom. U specifičnoj opciji, RNKi agens opisa sadrži 10 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom, npr.4 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom u sens lancu i 6 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom u antisens lancu. U drugoj specifičnoj opciji, RNKi agens opisa sadrži 6 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom, npr.4 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom u sens lancu i 2 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom u antisens lancu.
[0231] U drugim opcijama, RNKi agens opisa može sadržavati ultra mali broj nukleotida koji sadrže 2'-fluoro modifikaciju, npr.2 ili manje nukleotida koji sadrže 2'-fluoro modifikaciju. Na primer, RNKi agens može sadržavati 2, 1 od 0 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom. U specifičnoj opciji, RNKi agens može sadržavati 2 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom, npr.0 nukleotida sa 2-fluoro modifikacijom u sens lancu i 2 nukleotida sa 2'-fluoro modifikacijom u antisens lancu.
[0232] Razne objave opisuju multimerne IRNK koje mogu biti upotrebljene u postupcima opisa. Takve objave uključuju WO2007/091269, SAD patent br. 7,858,769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0233] Kao što je detaljnije opisano u nastavku, IRNK koja sadrži konjugacije jednog ili više ostataka ugljenih hidrata u IRNK, mogu optimizovati jednu ili više osobina IRNK. U mnogim slučajevima, ostatak ugljenih hidrata će biti vezan za modifikovanu subjedinicu IRNK. Na primer, ribozni šećer jedne ili više od ribonukleotidnih subjedinica IRNK može biti zamenjen drugim ostatkom, npr. nosačem koji nije ugljeni hidrat (poželjno je cikličan) za koga je vezan ugljenohidratni ligand. Ribonukleotidna subjedinica u kojoj je ribozni šećer subjedinice tako zamenjen je ovde označena kao subjedinica za modifikaciju tipa zamene riboze (RRMS). Ciklični nosač može biti karbocikličan sistem prstenova, tj. svi atomi u prstenu su atomi ugljenika, ili heterocikliča sistem prstenova, tj. jedan ili više atoma u prstenu mogu biti heteroatom, npr. azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklična sistem prstenova, ili može sadržavati dva ili više prstenova, npr. kondenzovane prsenove. Cikličan nosač može biti potpuno zasićen sistem prstenova, ili može sadržavati jednu ili više dvostrukih veza.
[0234] Ligand može biti vezan za polinukleotid preko nosač. Nosači uključuju (i) najmanje jednu „tačku vezivanja za okosnicu”, poželjno dve „tačke vezivanja za okosnicu” i (ii) najmanje jednu „tačku vezivanja za premošćavanje". „Tačka vezivanja za okosnicu”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksilnu grupu, ili generalno, vezu dostupna za, a koja je pogodna za ugradnju nosača u okosnicu, npr. fosfat ili modifikovan fosfat, npr. okosnicu ribonukleinske kiseline koja sadrži sumpor. „Tačka vezivanja mosta” (TAP) u pojedinim opcijama odnosi se na sastavni atom prstena cikličnog nosača, npr. atom ugljenika ili heteroatom (razlikuje se od atoma koji obezbeđuje tačku vezivanja za okosnicu), koji povezuje odabrani ostatak. Ostatak može biti, npr. ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid ili polisaharid. Opciono, odabrani ostatak je povezan intervenišućom premošćujućom vezom sa cikličnim nosačem. Ciklični nosač će stoga često uključivati funkcionalnu grupu, npr. amino grupu, ili generalno, obezbeđivaće vezu koja je pogodna za ugradnju ili vezivanje drugog hemijskog entiteta, npr. liganda za sastavni prsten.
[0235] IRNK može biti konjugovana sa ligandom preko nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; poželjno, ciklična grupa je izabrana od pirolidinil, pirazolinil, pirazolidinil, imidazolinil, imidazolidinil, piperidinil, piperazinil, [1,3]dioksolan, oksazolidinil, izoksazolidinil, morfolinil, tiazolizolidinil, izotiazolidinil, hinoksalinil, piridazinonil tetrahidrofuril i dekalin grupe; poželjno, aciklična grupa je okosnica serinola ili dietanolaminska okosnica.
[0236] U drugoj opciji opisa, RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu svaki lanac ima 14 do 40 nukleotida. RNKi agens može biti predstavljen formulom (L):
U formuli (L), B1, B2, B3, B1', B2', B3' i B4' su svaki nezavisno nukleotid koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-alkil, 2'-supstituisani alkoksi, 2'-supstituisani alkil, 2'-halo, ENA i BNA/LNA. U jednoj opciji, B1, B2, B3, B1', B2', B3' i B4' sadrže 2'-OMe modifikacije. U jednoj opciji, svaki od B1, B2, B3, B1', B2', B3' i B4' sadrži 2'-OMe ili 2'-F modifikacije. U jednoj opciji, najmanje jedan od B1, B2, B3, B1', B2', B3' i B4' sadrži 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) modifikaciju.
[0237] C1 je termički destabilišući nukleotid smešten na mestu suprotnom od regiona klice antisens lanca (tj. na pozicijama 2-8 5'-kraja antisens lanca). Na primer, C1 je na poziciji sens lanca koji se uparuje sa nukleotidom na pozicijama 2-8 sa 5'-kraja antisens lanca. U jednom primeru, C1 je na poziciji 15 od 5'-kraja sens lanca. C1 nukleotid nosi termički destabilišuću modifikaciju koja može uključivati abazičnu modifikaciju; pogrešno sparivanje sa suprotnim nukleotidom u dupleksu; i modifikaciju šećera kao što je 2'-dezoksi modifikacija ili aciklični nukleotid npr. otključane nukleinske kiseline (UNA) ili glicerolne nukleinske kiseline (GNA). U jednoj opciji, C1 ima termički destabilišuću modifikaciju izabranu iz grupe koju čine: i) pogrešno sparivanje sa suprotnim nukleotidom u antisens lancu; ii) abazična modifikacija izabrana iz grupe koju čine:
i iii) modifikacija šećera izabrana iz grupe koju čine:
gde je B modifikovana ili nemodifikovana nukleobaza, R<1>i R<2>nezavisno su H, halogen, OR3ili alkil; a R3je H, alkil, cikloalkil, aril, aralkil, heteroaril ili šećer. U jednoj opciji, termički destabilišuća modifikacija u C1 je pogrešno sparivanje izabrano iz grupe koju čine G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T i U:T; i opciono, najmanje jedna nukleobaza u paru koji je pogrešno sparen je 2'-dezoksi nukleobaza. U jednom primeru, termički destabilišuća modifikacija u C1 je GNA ili
svaki od T1, T1', T2' i T3' nezavisno predstavlja nukleotid koji sadrži modifikaciju koja obezbeđuje nukleotidu steričku masu koja je manja ili jednaka steričnoj masi 2'-OMe modifikacije. Sterička masa se odnosi na zbir steričnih efekata modifikacije. Stručnjacima su poznati postupci za određivanje steričnih efekata modifikacije nukleotida. Modifikacija može biti na 2'poziciji riboznog šećera nukleotida, ili modifikacija može biti na nukleotidu koji nije ribozni, na acikličnom nukleotidu ili u okviru okosnice nukleotida koja je slična ili ekvivalentna 2' poziciji riboznog šećera, i obezbeđuje nukleotidu steričku masu koja je manja ili jednaka steričnoj masi 2'-OMe modifikacije. Na primer, svaki od T1, T1', T2' i T3' je nezavisno izabran od DNK, RNK, LNA, 2'-F i 2'-F-5'-metila. U jednoj opciji, T1 je DNK. U jednoj opciji, T1' je DNK, RNK ili LNA. U jednoj opciji, T2' je DNK ili RNK. U jednoj opciji, T3' je DNK ili RNK.
n<1>, n<3>i q<1>su nezavisno dužine od 4 do 15 nukleotida.
n<5>, q<3>i q<7>su nezavisno dužine od 1-6 nukleotida.
n<4>, q<2>i q<6>su nezavisno dužine od 1-3 nukleotida; alternativno, n<4>je 0.
q<5>je nezavisno dužine 0-10 nukleotida.
n<2>i q<4>su nezavisno dužine od 0-3 nukleotida.
[0238] Alternativno, n<4>je dužine od 0-3 nukleotida.
[0239] U jednoj opciji, n<4>može biti 0. U jednom primeru, n<4>je 0, a q<2>i q<6>su 1. U drugom primeru, n<4>je 0, a q<2>i q<6>su 1, sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca), i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0240] U jednoj opciji, svakii od n<4>, q<2>i q<6>je 1.
[0241] U jednoj opciji, svakii od n<2>, n<4>, q<2>, q<4>i q<6>je 1.
[0242] U jednoj opciji, C1 je na poziciji 14-17 od 5'-kraja sens lanca, kada je sens lancu dužine 19-22 nukleotida, a n<4>je 1. U jednoj opciji, C1 je na poziciji 15 na 5'-kraju sens lanca
[0243] U jednoj opciji, T3' počinje na poziciji 2 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T3' je na poziciji 2 od 5' kraja antisens lanca, a q<6>je jednako 1.
[0244] U jednoj opciji, T1' počinje na poziciji 14 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T1' je na poziciji 14 od 5' kraja antisens lanca, a q<2>je jednako 1.
[0245] U opciji za primer, T3' počinje od pozicije 2 sa 5' kraja antisens lanca i T1' počinje od pozicije 14 sa 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T3' počinje od pozicije 2 sa 5' kraja antisens lanca i q<6>je jednako 1, i T1' počinje sa pozicije 14 sa 5' kraja antisens lanca, a q<2>je jednako 1.
[0246] U jednoj opciji, T1' i T3' su razdvojeni sa 11 nukleotida po dužini (tj. ne računajući T1' i T3' nukleotide).
[0247] U jednoj opciji, T1' je na poziciji 14 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T1' je na poziciji 14 od 5' kraja antisens lanca, a q<2>je jednako 1, dok modifikacija na 2' poziciji ili na pozicijama van riboznog prstena, u acikličnom delu molekula ili okosnici obezbeđuje manju steričnu zapreminu od 2'-OMe riboze.
[0248] U jednoj opciji, T3' je na poziciji 2 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T3' je na poziciji 2 sa 5' kraja antisens lanca, a q<6>je jednako 1, dok modifikacija na 2' poziciji ili na pozicijama van riboznog prstena, u acikličnom delu molekula ili okosnici obezbeđuje manju steričnu zapreminu od 2'-OMe riboze.
[0249] U jednoj opciji, T1 je na mestu cepanja sens lanca. U jednom primeru, T1 se nalazi na poziciji 11 od 5' kraja sens lanca, kada je sens lanac dužine od 19-22 nukleotida, a n<2>je 1. U opciji za primer, T1 je na mestu cepanja sens lanca na poziciji 11 od 5' kraja sens lanca, kada je sens lanac dužine 19-22 nukleotida, a n<2>je 1,
[0250] U jednoj opciji, T2' počinje na poziciji 6 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T2' je na pozicijama 6-10 od 5' kraja antisens lanca, a q<4>je 1.
[0251] U jednoj opciji za primer, T1 je na mestu cepanja sens lanca, na primer, na poziciji 11 od 5' kraja sens lanca, kada je sens lanac dužine 19-22 nukleotida, a n<2>je 1; T1' je na poziciji 14 od 5' kraja antisens lanca, a q<2>je jednako 1, dok je modifikacija u T1' na 2' poziciji riboznog šećera ili na pozicijama van riboznog prstena, u acikličnom delu molekula ili okosnici koja obezbeđuje manju steričnu zapreminu od 2'-OMe riboze; T2' je na pozicijama 6-10 od 5' kraja antisens lanca, a q<4>je 1; i T3' je na poziciji 2 od 5' kraja antisens lanca i q<6>je jednako 1, a modifikacija T3' je na 2' poziciji ili na pozicijama van riboznog prstena, acikličnom delu molekula ili okosnici koje obezbeđuju manju ili jednaku steričnu zapreminu od 2'-OMe riboze.
[0252] U jednoj opciji, T2' počinje na poziciji 8 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T2' počinje na poziciji 8 od 5' kraja antisens lanca, a q<4>je 2.
[0253] U jednoj opciji, T2' počinje na poziciji 9 od 5' kraja antisens lanca. U jednom primeru, T2' je na poziciji 9 od 5' kraja antisens lanca, a q<4>je 1.
[0254] U jednoj opciji, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 1, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 6, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0255] U jednoj opciji, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 1, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 6, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe, a q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0256] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0257] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 6, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 7, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 6, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 7, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne internukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne internukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0258] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 1, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 6, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 1, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 6, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0259] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 5, T2' je 2'-F, q<4>je 1, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; opciono sa najmanje 2 dodatna TT na 3'-kraju antisens lanca.
[0260] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 5, T2' je 2'-F, q<4>je 1, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; opciono sa najmanje 2 dodatna TT na 3'-kraju antisens lanca; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0261] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1.
[0262] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0263] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1.
[0264] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0265] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1.
[0266] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca).
[0267] RNKi agens može sadržavati grupu sa fosforom na 5'-kraju sens lanca ili antisens lanca. Grupa sa fosforom na 5'-kraju može biti fosfat na 5' kraju (5'-P), fosforotioat na 5' kraju (5'-PS), fosforoditioat na 5' kraju (5'-PS2), vinilfosfonat na 5' kraju (5'-VP), metilfosfonat na 5' kraju (MePhos) ili 5'-dezoksi-5'-C-malonil
Kada je grupa koja sadrži fosfor na 5'-kraju vinilfosfonat (5'-VP), 5'-VP može biti bilo 5'-E-VP izomer (tj. trans-vinilfosfat,
5'-Z-VP izomer (tj. cis-vinilfosfat,
ili njihove smeše.
[0268] U jednoj opciji, RNKi agens sadrži grupu sa fosforom na 5'-kraju sens lanca. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži grupu sa fosforom na 5'-kraju antisens lanca.
[0269] U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-P. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-P u antisens lancu.
[0270] U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-PS. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-PS u antisens lancu.
[0271] U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-VP. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-VP u antisens lancu. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-E-VP u antisens lancu. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-Z-VP u antisens lancu.
[0272] U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-PS2. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-PS2u antisens lancu.
[0273] U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-PS2. U jednoj opciji, RNKi agens sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil u antisens lancu.
[0274] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0275] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0276] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5'-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0277] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0278] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0279] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0280] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0281] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5'-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0282] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0283] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0284] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0285] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. dsRNK agens takođe sadrži 5'-PS.
[0286] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5'-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0287] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0288] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0289] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0290] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0291] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5'-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0292] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0293] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0294] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0295] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0296] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5'-Z-VP ili njihova kombinacija. U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. dsRNKi RNK agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0297] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0298] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0299] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0300] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'- VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5'-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0301] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0302] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0303] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0304] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0305] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'- VP.5'-VP može biti 5'-E-VP, 5’-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0306] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0307] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1. RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0308] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-P.
[0309] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS.
[0310] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'- VP. 5'-VP može biti 5'-E-VP, 5’-Z-VP ili njihova kombinacija.
[0311] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2.
[0312] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil.
[0313] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-P i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-P je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0314] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0315] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-VP (npr.5’-E-VP, 5’-Z-VP ili njihovu kombinaciju) i ligand sa ciljnim delovanjem.
[0316] U jednoj opciji, 5'-VP je na 5’-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0317] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS2je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0318] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-dezoksi-5'-C-malonil je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0319] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-P i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-P je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0320] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0321] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-VP (npr. 5’-E-VP, 5’-Z-VP ili njihovu kombinaciju) i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-VP je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0322] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS2je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0323] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-OMe i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-dezoksi-5'-C-malonil je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0324] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-P i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-P je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0325] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0326] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-VP (npr.5’-E-VP, 5’-Z-VP ili njihovu kombinaciju) i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-VP je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0327] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS2je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0328] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, T2' je 2'-F, q<4>je 2, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 5, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-dezoksi-5'-C-malonil je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0329] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-P i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-P je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0330] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0331] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-VP (npr.5’-E-VP, 5’-Z-VP ili njihovu kombinaciju) i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-VP je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0332] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-PS2i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-PS2je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0333] U jednoj opciji, B1 je 2'-OMe ili 2'-F, n<1>je 8, T1 je 2'F, n<2>je 3, B2 je 2'-OMe, n<3>je 7, n<4>je 0, B3 je 2'-OMe, n<5>je 3, B1' je 2'-OMe ili 2'-F, q<1>je 9, T1' je 2'-F, q<2>je 1, B2' je 2'-OMe ili 2'-F, q<3>je 4, q<4>je 0, B3' je 2'-OMe ili 2'-F, q<5>je 7, T3' je 2'-F, q<6>je 1, B4' je 2'-F i q<7>je 1; sa dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 1-5 sens lanca (računajući od 5'-kraja sens lanca) i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze na pozicijama 1 i 2, kao i dve modifikacije fosforotioatne međunukleotidne veze unutar pozicija 18-23 antisens lanca (računajući od 5'-kraja antisens lanca). RNKi agens takođe sadrži 5'-dezoksi-5'-C-malonil i ligand sa ciljnim delovanjem. U jednoj opciji, 5'-dezoksi-5'-C-malonil je na 5'-kraju antisens lanca, a ligand sa ciljnim delovanjem je na 3'-kraju sens lanca.
[0334] U posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera; i
(iii) 2'-F modifikacije na pozicijama 1, 3, 5, 7, 9 do 11, 13, 17, 19 i 21 i 2'-OMe modifikacije na pozicijama 2, 4, 6, 8, 12, 14 do 16, 18 i 20 (računajući od 5’ kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3, 5, 9, 11 do 13, 15, 17, 19, 21 i 23, i 2'F modifikacije na pozicijama 2, 4, 6 do 8, 10, 14, 16, 18, 20 i 22 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5’ kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0335] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-F modifikacije na pozicijama 1, 3, 5, 7, 9 do 11, 13, 15, 17, 19 i 21 i 2'-OMe modifikacije na pozicijama 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18 i 20 (računajući od kraja 5'); i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5’ kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3, 5, 7, 9, 11 do 13, 15, 17, 19 i 21 do 23, i 2’F modifikacije na pozicijama 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 i 20 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0336] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1 do 6, 8, 10 i 12 do 21, 2'-F modifikacije na pozicijama 7 i 9, i dezoksi-nukleotid (npr. dT) na poziciji 11 (računajući od kraja 5'); i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5’ kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19 do 23, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2, 4 do 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 18 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0337] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1 do 6, 8, 10, 12, 14 i 16 do 21, i 2’-F modifikacije na pozicijama 7, 9, 11, 13 i 15; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 i 21 do 23, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2 do 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0338] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1 do 9, i 12 do 21, i 2’-F modifikacije na pozicijama 10 i 11; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3, 5, 7, 9, 11 do 13, 15, 17, 19 i 21 do 23, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 i 20 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0339] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-F modifikacije na pozicijama 1, 3, 5, 7, 9 do 11 i 13, i 2'-OMe modifikacije na pozicijama 2, 4, 6, 8, 12 i 14 do 21; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3, 5 do 7, 9, 11 do 13, 15, 17 do 19 i 21 do 23, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2, 4, 8, 10, 14, 16 i 20 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0340] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 15, 17 i 19 do 21, i 2’-F modifikacije na pozicijama 3, 5, 7, 9 do 11, 13, 16 i 18; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 25 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 4, 6, 7, 9, 11 do 13, 15, 17 i 19 do 23, 2'-F modifikacije na pozicijama 2, 3, 5, 8, 10, 14, 16 i 18, i dezoksi-nukleotide (npr. dT) na pozicijama 24 i 25 (računajući od 5' kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od četiri nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0341] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1 do 6, 8 i 12 do 21, i 2’-F modifikacije na pozicijama 7 i 9 do 11; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3 do 5, 7, 8, 10 do 13, 15 i 17 do 23, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2, 6, 9, 14 i 16 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0342] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1 do 6, 8 i 12 do 21, i 2’-F modifikacije na pozicijama 7 i 9 do 11; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 23 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3 do 5, 7, 10 do 13, 15 i 17 do 23, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2, 6, 8, 9, 14 i 16 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama 21 i 22, i između nukleotida na pozicijama 22 i 23 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0343] U drugoj posebnoj opciji, RNKi agens predmetnog opisa sadrži:
(a) sens lanac koji ima:
(i) dužinu od 19 nukleotida;
(ii) ASGPR ligand vezan za 3'-kraj, pri čemu navedeni ASGPR ligand sadrži tri GalNAc derivata vezana preko trovalentnog razgranatog linkera;
(iii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1 do 4, 6 i 10 do 19, i 2’-F modifikacije na pozicijama 5 i 7 do 9; i
(iv) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, i između nukleotida na pozicijama 2 i 3 (računajući od 5' kraja);
i
(b) antisens lanac koji ima:
(i) dužinu od 21 nukleotida;
(ii) 2'-OMe modifikacije na pozicijama 1, 3 do 5, 7, 10 do 13, 15 i 17 do 21, i 2’-F modifikacije na pozicijama 2, 6, 8, 9, 14 i 16 (računajući od 5’ kraja); i
(iii) fosforotioatne međunukleotidne veze između nukleotida na pozicijama 1 i 2, između nukleotida na pozicijama 2 i 3, između nukleotida na pozicijama19 i 20, i između nukleotida na pozicijama 20 i 21 (računajući od 5' kraja);
pri čemu dsRNK agensi imaju jednolančani kraj od dva nukleotida na 3’-kraju antisens lanca, i tupi kraj na 5’-kraju antisens lanca.
[0344] U određenim opcijama, IRNK za upotrebu u postupcima opisa je agens odabran od agenasa navedenih u Tabeli 3, Tabeli 5 ili Tabeli 6. Ovi agensi mogu dalje sadržavati ligand.
III. IRNK konjugovane sa ligandima
[0345] Druga modifikacija RNK unutar IRNK predmetnog opisa uključuje hemijsko povezivanje IRNK sa jednim ili više liganada, ostataka ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje IRNK npr. u ćeliju. Takvi ostaci uključuju, ali nisu ograničeni na, lipidne ostatke kao što je ostatak holesterola (Letsinger i saradnici, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556). U drugim opcijama, ligand je holna kiselina (Manoharan i saradnici, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), tioetar, npr. beril-S-tritiltiol (Manoharan i saradnici, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan i saradnici, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), tioholesterol (Oberhauser i saradnici, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), alifatičan lanac, npr. ostaci dodekandiola ili andecila (Saison-Behmoaras i saradnici, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov i saradnici, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk i saradnici, Biochimie, 1993, 75:49-54), fosfolipid, npr. di-heksadecil-racglicerol ili trietil-amonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-fosfonat (Manoharan i saradnici, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea i saradnici, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), poliaminski ili polietilen glikolni lanac (Manoharan i saradnici, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan i saradnici, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), palmitilni ostatak (Mishra i saradnici, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237) ili oktadecilaminski ili ostatak heksilamino-karboniloksiholesterola (Crooke i saradnici, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
[0346] U određenim opcijama, ligand menja distribuciju, mesto ciljanog dejstva ili životni vek RNKi agensa u koji je ugrađen. U poželjnim opcijama, ligand obezbeđuje pojačan afinitet za izabrano mesto ciljanog delovanja, npr. molekul, ćeliju ili tip ćelije, odeljak, npr. ćelijski odeljak ili deo organa, tkivo, organ ili region tela, kao, npr. u poređenju sa vrstom kod koje je takav ligand odsutan. Poželjni ligandi ne učestvuju u dupleksnom sparivanju u dupleksu nukleinske kiseline.
[0347] Ligandi mogu uključivati supstancu koja se javlja u prirodi, kao što je protein (npr. humani serumski albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin, N-acetilglukozamin, N-acetilgalaktozamin ili hijaluronsku kiselinu); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantan ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliamino kiselina. Primeri poliamino kiselina uključuju poliamino kiselinu koja je polilizin (PLL), poli L-asparaginska kiselina, poli L-glutaminska kiselina, kopolimer stirena i anhidrida maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolidni) kopolimer, kopolimer divinil etra i anhidrida maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamidni kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamidni polimeri ili polifosfazin. Primeri poliamina uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptidpoliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimerni poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarnu so poliamina ili alfa heliksni peptid.
[0348] Ligandi takođe mogu uključivati grupe sa ciljanim dejstvom, npr. agens za ciljano delovanje na ćelije ili tkiva, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo, koje se vezuje za određeni tip ćelije kao što je ćelija bubrega. Grupa sa ciljanim dejstvom može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktantni protein A, mucinski ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozaminska multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliaminokiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, vitamin A, biotin ili RGD peptid ili RGD peptidni mimetik. U određenim opcijama, ligand je multivalentna galaktoza, npr. N-acetilgalaktozamin.
[0349] Drugi primeri liganada uključuju boje, interkalirajuće agense (npr. akridine), umrežavače (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze (npr. EDTA), lipofilne molekule, npr. holesterol, holnu kiselina, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupu, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupu, palmitinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, O3-(oleoil)litoholnu kiselinu, O3-(oleoil)holensku kiselinu, dimetoksitricil ili fenoksazin)i peptidne konjugate (npr. peptid antenapedija, Tat peptid), alkilirajuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioaktivno obeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), olakšivače transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folnu kiselinu), sintetičke ribonukleaze (npr. imidazol, bisimidazol, histamin, klastere imidazola, akridin-imidazolne konjugate, Eu3+ komplekse tetraazamakrocikala), dinitrofenil, HRP ili AP.
[0350] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet za koligand, ili antitela, npr. antitelo koje se vezuje za određeni tip ćelije kao što je ćelija jetre. Ligandi takođe mogu uključivati hormone i hormonske receptore. Oni takođe mogu uključiti nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozaminska multivalentna manoza ili multivalentna fukoza. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF- κB.
[0351] Ligand može biti supstanca, npr. lek, koji može povećati preuzimanje IRNK agensa u ćeliju, na primer, remeteći ćelijski citoskelet, npr. narušavanjem mikrotubula, mikrofilamenata ili intermedijarnih filamenata ćelije. Lek može biti, na primer, taksol, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0352] U pojednim opcijama, ligand vezan za IRNK kao što je ovde opisano, deluje kao farmakokinetički modulator (PK modulator). PK modulatori uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, fosfolipidne analoge, peptide, agense koji vezuju proteine, PEG, vitamine itd. PK modulatori za primer uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilglicerid, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin. Poznato je takođe da su oligonukleotidi koji sadrže veliki broj fosforotioatnih veza vezuju za serumski protein, tako da su kratki oligonukleotidi, npr. oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže višestruke fosforotioatne veze u okosnici, takođe primeljivi kao ligandi u predmetnom opisu (npr. kao ligandi koji modulušu PK). Dodatno, aptameri koji vezuju komponente seruma (npr. serumske proteine) takođe su pogodni za upotrebu kao PK modulirajući ligandi u opcijama koje su ovde opisane.
[0353] IRNK predmetnog opisa koje su konjugovane sa ligandom, mogu biti sintetisane upotrebom oligonukleotida koji nosi pružajuće reaktivne funkcionalne grupe, kao što je onaj koji je dobijen vezivanjem povezujućeg molekula na oligonukleotid (opisano u nastavku). Ovakav reaktivni oligonukleotid može direktno reagovati sa komercijalno dostupnim ligandima, ligandima sintetisanim tako da nose bilo koju od mnogobrojnih zaštitnih grupa ili sa ligandima koji imaju za sebe vezan povezujući ostatak.
[0354] Oligonukleotidi koji se upotrebljavaju u konjugatima predmetnog opisa mogu biti konvencionalno i rutinski napravljeni putem dobro poznate tehnike sinteze na čvrstoj fazi. Opremu za takvu sintezu prodaje nekoliko kompanija uključujući, na primer, Applied Biosystems<®>(Foster City, Kalifornija). Bilo koji drugi postupci za takvu sintezu koji su poznati u oblasti tehnike, mogu se dodatno ili alternativno koristiti. Poznato je takođe da se upotrebljavaju slične tehnike za pripremu drugih oligonukleotida, kao što su fosforotioati i alkilovani derivati.
[0355] U IRNK konjugovanim sa ligandom, kao i molekulu liganda koji nosi vezane nukleozide za specifične sekvence predmetnog opisa, oligonukleotidi i oligonukleozidi mogu biti udruženi na pogodnom DNK sintetizeru koristeći standardne nukleotidne ili nukleozidne prekursore, ili prekursore konjugovane sa nukleotidima ili nukleozidima koji već nose povezujuću strukturu, prekursore konjugovane sa ligandom i nukleotidima ili nukleozidima koji već nose ligandski molekul, ili gradivne blokove koji ne sadrže nukleozide ali nose ligand.
[0356] Prilikom upotrebe prekursora konjugovanih sa nukleotidima koji već nose povezujuću strukturu, sinteza nukleozida povezanih sa specifičnim sekvencama se obično najpre u potpunosti završava, nakon čega ligandski molekul reaguje sa povezujućom strukturom, da bi se obrazovao oligonukleotid konjugovan sa ligandom. U pojednim opcijama, oligonukleotidi ili vezani nukleozidi predmetnog opisa sintetišu se automatizovanim sintetizerom upotrebom fosforamidita izvedenih iz nukleozidnih konjugata sa ligandom pored standardnih fosforamidita i nestandardnih fosforamidita koji su komercijalno dostupni i rutinski se upotrebljavaju u oligonukleotidnoj sintezi.
A. Lipidni konjugati
[0357] U određenim opcijama, ligand ili konjugat su lipid ili molekul na bazi lipida. Takav lipid ili molekul na bazi lipida poželjno vezuje serumski protein, npr. humani serumski albumin (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata u ciljno tkivo, npr. ciljno tkivo u telu koje je različito od bubrega. Na primer, ciljno tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Drugi molekuli koji mogu vezati HSA takođe mogu biti upotrebljeni kao ligandi. Na primer, mogu biti upotrebljeni naproksen ili aspirin. Lipid ili ligand na bazi lipida može (a) povećati rezistenciju na degradaciju konjugata, (b) povećati sposobnost ciljanog delovanja ili transporta u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu, ili (c) može biti upotrebljen za podešavanje vezivanja za serumski protein, npr. HSA.
[0358] Ligand na bazi lipida može biti upotrebljen za inhibiciju, npr. kontrolu vezivanja konjugata za ciljno tkivo. Na primer, manje je verovatno da će lipid ili ligand na bazi lipida koji se jače vezuje za HSA, biti usmeren na bubreg i stoga je manje verovatno da će biti izlučen iz tela. Lipid ili ligand na bazi lipida koji se slabije vezuje za HSA može biti upotrebljen za ciljno dopremanje konjugata do bubrega.
[0359] U određenim opcijama, ligand na bazi lipida vezuje HSA. Poželjno, vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će se konjugat biti poželjno distribuiran u tkivo koje je različito od tkiva bubrega. Ipak, poželjno je da afinitet ne bude toliko jak da se veza HSA i liganda ne može revertovati.
[0360] U drugim opcijama, ligand na bazi lipida slabo ili uopšte ne vezuje HSA, tako da će se konjugat poželjno distribuirati do bubrega. Drugi ostaci koji ciljano deluju na ćelije bubrega takođe mogu biti upotrebljeni umesto, ili kao dodatak, ligandu na bazi lipida.
[0361] Prema drugom aspektu, ligand je ostatak, npr. vitamin, koga preuzima ciljna ćelija, npr. ćelija koja proliferiše. Oni su posebno korisni za lečenje poremećaja koje karakteriše neželjena proliferacija ćelija, npr. malignog ili nemalignog tipa, npr. kancerskih ćelija. Vtamini za primer uključuju vitamin A, E i K. Ostali vitamini za primer su vitamin B, npr. folna kiselina, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili drugi vitamini ili hranljive materije koje preuzimaju ciljne ćelije, kao što su ćelije jetre. Uključeni su takođe HSA i lipoprotein niske gustine (LDL).
B. Agensi za permeaciju ćelija
[0362] Prema drugom aspektu, ligand je agens za ćelijsku permeaciju, poželjno heliksni agens za ćelijsku permeaciju. Poželjno, agens je amfipatski. Agens za primer je peptid kao što je tat ili antenopedija. Ukoliko je agens peptid, on može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetičkim, invertomernim, nepeptidnim ili pseudopeptidnim vezama, kao i upotrebom D-aminokiselina. Heliksni agens je poželjno alfa-heliksni agens, koji poželjno ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0363] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (ovde takođe označen kao oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se uvija u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Vezivanje peptida i peptidomimetika za IRNK agenese može uticati na farmakokinetičku distribuciju IRNK, kao što je poboljšanje ćelijskog prepoznavanja i apsorpcije. Peptidni ili peptidomimetički ostatak može biti dužine od oko 5-50 aminokiselina, npr. dužine od oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina.
[0364] Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid za ćelijsku permeaciju, katjonski peptid, amfipatski peptid ili hidrofobni peptid (npr. koji se prvenstveno sastoji od Tyr, Trp ili Phe). Peptidni ostatak može biti dendrimerni peptid, krut peptid ili umreženi peptid. Druga mogućnost je da peptidni ostatak uključuje hidrofobnu sekvencu za translokaciju na membranu (MTS). Primer hidrofobnog peptida koji sadrži MTS je RFGF koji ima aminokiselinsku sekvencu AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 15). RFGF analog (npr. aminokiselinska sekvenca AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:16) koja sadrži hidrofobni MTS, takođe može biti ostatak sa ciljnim dejstvom. Peptidni ostatak može biti peptid za „isporuku”, koji može nositi velike polarne molekule kroz ćelijske membrane, uključujući peptide, oligonukleotide i proteine. Na primer, utvrđeno je da su sekvence iz HIV Tat proteina (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:17) i proteina Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:18) u stanju da funkcioišu kao peptidi za isporuku. Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz fagne biblioteke ili kombinatorne biblioteke tipa jedno zrno-jedno jedinjenje (OBOC) (Lam i saradnici, Nature, 354:82-84, 1991). Primer peptida ili peptidomimetika u kojima je prisutno premošćavanje sa dsRNK agensom preko ugrađenih monomernih jedinica, a u svrhu ciljanog delovanja na ćelije, jeste peptid arginin-glicin-asparaginske kiseline (RGD) ili RGD mimetik. Peptidni ostatak može biti dužine od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidni ostaci mogu imati strukturnu modifikaciju, da bi se povećala stabilnosti ili direktne konformacione osobine. Bilo koja od strukturnih modifikacija opisanih u nastavku teksta, može biti upotrebljena.
[0365] RGD peptid za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisa, može biti linearan ili cikličan, i može biti modifikovan, npr. glikozilovan ili metilovan, da bi se olakšalo ciljano delovanje na specifično(a) tkivo(a). Peptidi i peptidomimemtici koji sadrže RGD mogu uključivati D-aminokiseline, kao i sintetičke RGD mimike. Pored RGD, mogu biti upotrebljeni i drugi ostaci koji ciljano deluju na integrinski ligand. Poželjni konjugati ovog liganda ciljano deluju na PECAM-1 ili VEGF.
[0366] „Peptid ćelijske permeacije” je sposoban da prodre u ćeliju, npr. mikrobnu ćeliju, kao što je bakterijska ćelija ili ćelija gljivica, ili sisarska ćelija, kao što je humana ćelija. Peptid koji permealizuje mikrobne ćelije može biti, na primer, α-heliksni linearni peptid (npr. LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidne veze (npr. α-defenzin, β-defenzin ili baktenecin), ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr. PR-39 ili indolicidin). Peptid ćelijske permeacije može takođe uključivati signal za lokalizaciju u jedro (NLS). Na primer, peptid ćelijske permeacije može biti bipartitni amfipatski peptid, kao što je MPG, koji je izveden iz fuzionog peptidnog domena HIV-1 gp41 i NLS velikog T antigena SV40 (Simeoni i saradnici, Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003).
C. Konjugati sa ugljenim hidratima
[0367] U pojednim opcijama kompozicija i postupaka opisa, IRNK dalje sadrži ugljene hidrate. IRNK konjugovana sa ugljenim hidratima ima prednost u pogledu in vivo isporuke nukleinskih kiselina, kao i kompozicija pogodnih za in vivo terapijsku upotrebu, kao što je ovde opisano. Kao što se ovde upotrebljava,"ugljeni hidrat” odnosi se na jedinjenje koje je bilo ugljeni hidrat per se, sastavljeno od jedne ili više monosaharidnih jedinica sa najmanje 6 atoma ugljenika (koji mogu biti linearni, razgranati ili ciklični) sa atomom kiseonika, azota ili sumpora koji su vezani za svaki atom ugljenika; ili jedinjenje koje kao svoj deo ima ugljenohidratni ostatak sastavljen od jedne ili više monosaharidnih jedinica od kojih svaka ima najmanje šest atoma ugljenika (koji mogu biti linearni, razgranati ili ciklični), sa atomom kiseonika, azota ili sumpora vezanim za svaki atom ugljenika. Reprezentativni ugljeni hidrati uključuju šećere (mono-, di-, tri- i oligosaharide koji sadrže od oko 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 monosaharidnih jedinica) i polisaharide kao što su skrobovi, glikogen, celuloza i polisaharidne gume. Specifični monosaharidi uključuju šećere sa C5 i više (npr. C5, C6, C7 ili C8); di- i trisaharidi uključuju šećere koji imaju dve ili tri monosaharidne jedinice (npr. C5, C6, C7 ili C8).
[0368] U određenim opcijama, konjugat sa ugljenim hidratima za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisa je monosaharid.
[0369] U jednoj opciji, konjugat sa ugljenim hidratima za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisa je izabran iz grupe koju čine:
gde Y je O ili S i n je 3-6 (Formula XXIV);
gde Y je O ili S i n je 3-6 (Formula XXV);
gde X je O ili S (Formula XXVII);
Ċ
[0370] U drugoj opciji, konjugat sa ugljenim hidratima za upotrebu u kompozicijama i postupcima opisa je monosaharid. U jednoj opciji, monosaharid je N-acetilgalaktozamin, kao što je
[0371] Drugi reprezentativni konjugat sa ugljenim hidratima za upotrebu u opcijama koje su ovde opisane uključuje, ali nije ograničen na,
kada je jedan od X ili Y oligonukleotid, a drugi je vodonik.
[0372] U određenim opcijama opisa, GalNAc ili derivat GalNAc je vezan za RNKi agens opisa preko monovalentnog linkera. U pojednim opcijama, GalNAc ili derivat GalNAc je vezan za RNKi agens opisa preko bivalentnog linkera. U još drugim opcijama opisa, GalNAc ili derivat GalNAc je vezan za RNKi agens opisa preko trovalentnog linkera.
[0373] U jednoj opciji, dvolančani RNKi agensi opisa sadrže jedan GalNAc ili derivat GalNAc vezan za RNKi agens, npr. za 5' kraj sens lanca dsRNK agensa, ili za 5' kraj jednog ili oba sens lanca RNKi agensa sa dvostrukim ciljanim dejstvom, kao što je ovde opisano. U drugoj opciji, dvolančani RNKi agensi opisa obuhvataju mnoštvo (npr.2, 3, 4, 5, ili 6) GalNAc ili derivata GalNAc, od kojih je svaki nezavisno vezan za mnoštvo nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko mnoštva monovalentnih linkera.
[0374] U pojednim opcijama, na primer, kada su dva lanca RNKi agensa opisa deo jednog većeg molekula povezanog neprekinutim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji obrazuje petlju strukture ukosnice sa mnoštvom nesparenih nukleotida, svaki nespareni nukleotid unutar petlje strukture ukosnice može nezavisno sadržavati GalNAc ili derivat GalNAc, vezan preko monovalentnog linkera.
[0375] U pojednim opcijama, konjugat sa ugljenim hidratima dalje sadrži jedan ili više dodatnih liganada kao što je prethodno opisano, kao što je, ali bez ograničenja samo na, PK modulator ili peptid ćelijske permeacije.
[0376] Dodatni konjugati sa ugljenim hidratima i linkeri pogodni za upotrebu u predmetnom opisu uključuju one opisane u PCT objavama br. WO 2014/179620 i WO 2014/179627.
D. Linkeri
[0377] U pojednim opcijama, konjugat ili ligand koji je ovde opisan, može biti vezan za IRNK oligonukleotid sa raznim linkerima koji se mogu ili ne mogu cepati.
[0378] Termin „linker” ili „povezujuća grupa” označava organski ostatak koji povezuje dva dela jedinjenja, npr. onaj koji kovalentno vezuje dva dela jedinjenja. Linkeri obično sadrže direktnu vezu ili atom kao što je kiseonik ili sumpor, grupe kao što su NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ili lanac atoma, kao što su, ali bez ograničenja samo na, supstituisan ili nesupstituisani alkil, supstituisan ili nesupstituisani alkenil, supstituisan ili nesupstituisani alkinil, arilalkil, arilalkenil, arilalkinil, heteroarilalkil, heteroarilalkenil, heteroarilalkinil, heterociklilalkil, heterociklilalkinil, aril, heteroaril, heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil, alkilarilalkil, alkilarilalkenil, alkilarilalkinil, alkenilarilalkil, alkenilarilalkenil, alkenilarilalkinil, alkinilarilalkil, alkinilarilalkenil, alkinilarilalkinil, alkilheteroarilalkil, alkilheteroarilalkenil, alkilheteroarilalkinil, alkenilheteroarilalkil, alkenilheteroarilalkenil, alkenilheteroarilalkinil, alkinilheteroarilalkil, alkinilheteroarilalkenil, alkinilheteroarilalkinil, alkilheterociklilalkil, alkilheterociklilalkenil, alkilhererociklilalkinil, alkenilheterociklilalkil, alkenilheterociklilalkenil, alkenilheterociklilalkinil, alkinilheterociklilalkil, alkinilheterociklilalkenil, alkinilheterociklilalkinil, alkilaril, alkenilaril, alkinilaril, alkilheteroaril, alkenilheteroaril, alkinilhereroaril, kod kojih jedan ili više metilena mogu biti prekinuti ili završeni sa O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), supstituisanim ili nesupstituisanim arilom, supstituisanim ili nesupstituisanim heteroarilom, ili supstituisanom ili nesupstituisanom heterocikličnom grupom; gde je R8 vodonik, acil, alifatičan ili supstituisani alifatični radikal. U jednoj opciji, linker ima oko 1-24 atoma, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18, 7-17, 8 -17, 6-16, 7-17 ili 8-16 atoma.
[0379] Povezujuća grupa koja se može cepati je ona koja je dovoljno stabilna van ćelije, ali koja se, po ulasku u ćeliju na koju se ciljano deluje, cepa da bi se oslobodila dva dela koja linker drži zajedno. U poželjnoj opciji, povezujuća grupa koja se može cepati, cepa se najmanje oko 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta ili više, ili najmanje 100 puta brže u ćeliji na koju se ciljano deluje, ili pod prvim referentnim uslovima (koji mogu biti izabrani tako da npr. imitiraju ili predstavljaju uslove unutar ćelije) nego u krvi subjekta, ili pod drugim referentnim uslovima (koji mogu biti izabrani tako da npr. imitiraju ili predstavljaju uslove koji se nalaze u krvi ili serumu).
[0380] Povezujuće grupe koje se mogu cepati su podložne agensima za cepanje, npr. dejstvu pH, redoks potencijala, ili one koje su osetljive na prisustvo degradujućih molekula. U principu, agensi za cepanje su rasprostranjeniji ili se nalaze u višim nivoima ili sa većim aktivnostima unutar ćelija, nego u serumu ili krvi. Primeri takvih degradujućih agenasa uključuju: redoks agense koji su odabrani za određene supstrate, ili koji nemaju specifičnost za supstrat, uključujući, npr. oksidujuće ili redukujuće enzime, ili redukujuće agense kao što su merkaptani, prisutni u ćelijama, koji mogu redukcijom degradovati grupe koje se mogu cepati, promenom redoks uslova; esteraze; endozome ili agense koji mogu stvoriti kiselu sredinu, npr. one koji dovode do pH od pet ili niže; enzime koji mogu hidrolizovati ili degradovati povezujuće grupe koje se mogu cepati u kiseloj sredini, a koji deluju kao opšte kiseline, peptidaze (koje mogu biti specifične za supstrat) i fosfataze.
[0381] Povezujuća grupa koja se može cepati, kao što je disulfidna veza, može biti osetljiva na pH. pH humanog seruma je 7,4, dok je prosečan pH unutar ćelije nešto niži, opsega od oko 7,1-7,3. Endozomi imaju kiseliji pH, u opsegu od 5,5-6,0, dok lizozomi imaju još kiseliji pH, oko 5,0. Pojedini linkeri će imati vezujuću grupu koja se može cepati i koja se cepa pri poželjnom pH, čime se oslobađa katjonski lipid iz liganda unutar ćelije, ili u željenom odeljku ćelije.
[0382] Linker može uključivati vezujuću grupu koja se može cepiti dejstvom određenog enzima. Tip vezujuće grupe koja se može cepati, a koja je uključena u linker, može zavisiti od ćelije na koju se ciljano deluje. Na primer, ligand koji ciljano deluje na jetru može biti vezan za katjonski lipid, preko linkera koji uključuje estarsku grupu. Ćelije jetre su bogate esterazama i linker će stoga biti podvrgnut efikasnijem cepanju u ćelijama jetre nego u vrstama ćelija koje nisu bogate esterazama. Drugi tipovi ćelija koje su bogate esterazama uključuju ćelije pluća, ćelije kore bubrega i testisa.
[0383] Linkeri koji sadrže peptidne veze mogu biti upotrebljeni kada se ciljano deluju na tipove ćelija koje su bogate peptidazama, kao što su ćelije jetre i sinoviociti.
[0384] U principu, pogodnost kandidata za povezujuću grupu koja se može cepati, može biti procenjivana ispitivanjem sposobnosti degradujućeg agensa (ili uslova) da cepa povezujuću grupu koja je kandidat. Poželjno je takođe da se ispita sposobnost povezujuće grupe koja je kandidat u pogledu rezistencije na cepanje u krvi ili kada je u kontaktu sa drugim tkivom koje je različito od tkiva na koga se ciljano deluje. Prema tome, može biti utvrđena relativna podložnost cepanju između prvih i drugih uslova, pri čemu se prvi uslovi biraju tako da ukažu na cepanje u ćeliji na koju se ciljano deluje, dok se drugi uslovi biraju tako da ukažu na cepanje u drugim tkivima ili biološkim tečnostima, npr. u krvi ili serumu. Procene mogu biti urađene u sistemima bez ćelija, u ćelijama, u ćelijskoj kulturi, u kulturi organa ili tkiva, ili u životinjama. Može biti korisno i da se urade početne procene u uslovima bez ćelija ili u ćelijskoj kulturi, kao i da se dalje procene vrše u organizmima životinja. U poželjnim opcijama, korisna jedinjenja kandidati se cepaju najmanje oko 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 puta brže u ćeliji (ili pod in vitro uslovima odabranim tako da oponašaju uslove unutar ćelije) u poređenju sa krvlju ili serumom (ili pod in vitro uslovima izabranim da oponašaju vanćelijske uslove).
i. Povezujuće grupe koje se mogu cepati promenom redoks potencijala
[0385] U određenim opcijama, povezujuća grupa koja se može cepati je grupa koja se može cepati promenom redoks potencijala, odnosno koja se cepa nakon redukcije ili oksidacije. Primer povezujuće grupe koja se cepa redukcijom je disulfidna povezujuća grupa (-S-S-). Da bi se utvrdilo da li je povezujuća grupa koja je kandidat pogodna kao „povezujuće grupa koja se cepa redukcijom”, ili je, na primer, pogodna za upotrebu sa određenim IRNK ostatkom i određenim agensom za ciljano delovanje, mogu se pogledati postupci koji su ovde opisani. Na primer, kandidat može biti procenjivan inkubacijom sa ditiotreitolom (DTT), ili drugim redukujućim agensom, upotrebom reagenasa koji su poznati u oblasti tehnike, koji oponašaju stopu cepanja koja bi se uočila u ćeliji, npr. ciljnoj ćeliji. Kandidati takođe mogu biti procenjivani pod uslovima koji su odabrani tako da oponašaju uslove u krvi ili serumu. U jednom, jedinjenja kandidati se cepaju najviše do oko 10% u krvi. U drugim opcijama, korisna jedinjenja kandidati se razgrađuju najmanje oko 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili oko 100 puta brže u ćeliji (ili pod in vitro uslovima odabranim tako da oponašaju uslove unutar ćelije) u poređenju sa krvlju (ili pod in vitro uslovima odabranim tako da oponašaju vanćelijske uslove). Brzina cepanja jedinjenja kandidata može biti utvrđena upotrebom standardnih enzimskih kinetičkih testova, pod uslovima odabranim tako da oponašaju uslove unutar ćelije, i njihovim poređenjem sa uslovima odabranim tako da oponašaju vanćelijske uslove.
ii. Povezujuće grupe koje se mogu cepati na bazi fosfata
[0386] U drugim opcijama, liker koji se može cepati sadrži povezujuću grupu koja se može cepati na bazi fosfata. Povezujuća grupa na bazi fosfata se cepa agensima koji razlažu ili hidrolizuju fosfatnu grupu. Primer agensa koji cepa fosfatne grupe u ćelijama su enzimi kao što su fosfataze u ćelijama. Primeri povezujućih grupa na bazi fosfata su -O-P(O)(ORk)-O-, -OP(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -SP(O)(ORk)-S-, -OP(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Poželjne opcije su -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -OP(S)(SH)-O-, -SP(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -SP(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S- i -O-P(S)(H)-S-. Poželjna opcija je -O-P(O)(OH)-O-. Ovi kandidati mogu biti procenjivani upotrebom postupaka analognih onima koji su prethodno opisani.
iii. Povezujuće grupe koje se mogu cepati kiselinama
[0387] U drugim opcijama, linker koji se može cepati sadrži povezujuću grupu koja se može cepati kiselinama. Povezujuća grupa koja se može cepati kiselinama je povezujuća grupa koja se cepa u kiselim uslovima. U poželjnim opcijama, povezujuće grupe koje se mogu cepati kiselinama, cepaju se u kiseloj sredini sa pH od oko 6,5 ili niže (npr. oko 6,0, 5,5, 5,0 ili niže), ili agensima kao što su enzimi koji mogu delovati kao opšta kiselina. U ćeliji, specifične organele sa niskim pH vrednostima, kao što su endozomi i lizozomi, mogu obezbediti okruženje za cepanje povezujućih grupa koje se mogu cepati kiselinom. Primeri povezujućih grupa koje se cepaju kiselinama uključuju, ali nisu ograničene na, hidrazone, estre i estre aminokiselina. Grupe koje se cepaju kiselinama mogu imati opštu formulu -C=NN-, C(O)O ili -OC(O). Poželjna opcija je kada je ugljenik vezan za kiseonik estra (alkoksi grupu) koji je aril grupa, supstituisana alkil grupa ili tercijarna alkil grupa kao što je dimetil pentil ili t-butil. Ovi kandidati mogu biti procenjivani upotrebom postupaka analognih onima koji su prethodno opisani.
iv. Povezujuće grupe na bazi estara
[0388] U drugim opcijama, linker koji se može cepati sadrži estarsku grupu koja se može cepati. Povezujuću grupu koja se može cepati na bazi estara cepaju enzimi kao što su esteraze i amidaze u ćelijama. Primeri povezujućih grupa koje se mogu cepati na bazi estara uključuju, ali nisu ograničeni na, estre alkilenskih, alkenilnih i alkinilenskih grupa. Povezujuće grupe koje se mogu cepati na bazi estara imaju opštu formulu -C(O)O- ili -OC(O)-. Ovi kandidati mogu biti procenjivani upotrebom postupaka analognih onima koji su prethodno opisani.
v. Grupe koje se mogu cepati na bazi peptida
[0389] U još drugim opcijama, linker koji se može cepati sadrži povezujuću grupu koja se može cepati na bazi peptida. Povezujuća grupa koja se može cepati na bazi peptida cepa se enzimima kao što su peptidaze i proteaze u ćelijama. Povezujuće grupe koje se mogu cepiti na bazi peptida su peptidne veze obrazovane između aminokiselina da bi se dobili oligopeptidi (npr. dipeptidi, tripeptidi itd.) i polipeptidi. Povezujuće grupe koje se mogu cepati na bazi peptida ne uključuju amidnu grupu (-C(O)NH-). Amidna grupa se može obrazovati između bilo kog alkilena, alkenilena ili alkinelena. Peptidna veza je posebna vrsta amidne veze koja se obrazuje između aminokiselina da bi se dobili peptidi i proteini. Grupa koja se može cepati na bazi peptida je generalno ograničena na peptidnu vezu (tj. amidnu vezu) koja je obrazovana između aminokiselina da bi se dobili peptidi i proteini, i ne uključuje celu amidnu funkcionalnu grupu. Povezujuće grupe koje se mogu cepiti na bazi peptida imaju opštu formulu - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, gde su RA i RB, R grupe dve susedne aminokiseline. Ovi kandidati mogu biti procenjivani upotrebom postupaka analognih onima koji su prethodno opisani.
[0390] U pojednim opcijama, IRNK opisa je konjugovana sa ugljenim hidratom preko linkera. Neograničavajući primeri konjugata IRNKi konjugata sa ugljeni hidratima i sa linkerima u kompozicijama i postupcima opisa uključuju, ali nisu ograničeni na,
kada je jedan od X ili Y oligonukleotid, a drugi je vodonik.
[0391] U određenim opcijama kompozicija i postupaka opisa, ligand je jedan ili više derivata „GalNAc” (N-acetilgalaktozamina) vezanih preko dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera.
[0392] U jednoj opciji, dsRNK opisa je konjugovana sa dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom izabranim iz grupe struktura prikazanih u bilo kojoj od formula (XLV) - (XL VI):
gde:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B i q5C nezavisno predstavljaju, pri svakom pojavljivanju, 0-20 i gde jedinica koja se ponavlja može biti ista ili različita;
svaki od P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>je nezavisno, pri svakom pojavljivanju, odsutan ili je CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
svaki od Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>je nezavisno, pri svakom pojavljivanju, odsutan ili je alkilen, supstituisani alkilen, pri čemu jedan ili više metilena mogu biti prekinuti ili završeni sa jednim ili više od O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R')=C(R"), C≡C ili C(O);
svaki od R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>je nezavisno, pri svakom pojavljivanju, odsutan ili je NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(R<a>)C(O), -C(O)-CH(R<a>)-NH-, CO, CH=N-O,
ili heterociklil;
L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand; tj. svaki je nezavisno, pri svakom pojavljivanju, odsutan ili je monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid ili polisaharid; a R<a>je H ili bočni lanac aminokiseline. Trovalentni konjugujući derivati GalNAc su posebno korisni za upotrebu sa RNKi agensima za inhibiciju ekspresije ciljnog gena, kao što su oni formule (XLIX):
gde L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je derivat GalNAc.
[0393] Primeri pogodnih dvovalentnih i trovalentnih razgranatih linkerskih grupa koje konjuguju derivate GalNAc uključuju, ali nisu ograničeni na, strukture koje su prethodno navedene kao formule II, VII, XI, X i XIII.
[0394] Reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremanj RNK konjugata uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patentne br.4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928;5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; i 8,106,022.
[0395] Nije neophodno da sve pozicije u datom jedinjenju budu uniformno modifikovane, a zapravo više od jedne od prethodno pomenutih modifikacija mogu biti uključene u svako pojedinačno jedinjenje ili čak u svaki pojedinačni nukleozid IRNK. Predmetni opis takođe uključuje IRNK jedinjenja koja su himerna jedinjenja.
[0396] „Himerna” IRNK jedinjenja ili „himere”, u kontekstu ovog opisa, jedinjenja su IRNK, poželjno dsRNKi agensi, koja sadrže dva ili više hemijski jasno različitih regiona, od kojih se svaki sastoji od najmanje jedne monomerne jedinice, tj. nukleotida u slučaju dsRNK jedinjenja. Ove IRNK obično sadrže najmanje jedan region u kome je RNK modifikovana tako da IRNK ima povećanu otpornost na degradaciju nukleazama, da se poveća preuzimanje od strane ćelija ili da se poveća afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu. Dodatni region IRNK može poslužiti kao supstrat za enzime koji su sposobni da cepaju RNK:DNK ili RNK:RNK hibride. Na primer, RNaza H je ćelijska endonukleaza koja cepa RNK lanac RNK:DNK dupleksa. Aktivacija RNaze H stoga dovodi do cepanja ciljanog RNK molekula, čime se u velikoj meri povećava efikasnost IRNK u inhibiciji ekspresije gena. Posledično, uporedivi rezultati se često mogu dobiti sa kraćim IRNK kada se upotrebljavaju himerne dsRNK, u poređenju sa fosforotioat dezoksi dsRNK koje hibridizuju sa istim ciljnim regionom. Cepanje ciljnog molekula RNK se može rutinski detektovati elektroforezom na gelu, a, ukoliko je potrebno, i pratećim tehnikama hibridizacije nukleinskih kiselina koje su poznate u oblasti tehnike.
[0397] U određenim slučajevima, RNK iz IRNK može biti modifikovana grupom koja nije ligand. Određeni broj molekula koji nisu ligandi konjugovani su sa IRNK, da bi se poboljšala aktivnost, ćelijska distribucija ili preuzimanje IRNK od strane ćelija, a procedure za pripremu takvih konjugata su dostupni u naučnoj literaturi. Takvi ostaci koji nisu ligandi uključuju lipidne ostatke, kao što je holesterol (Kubo T. i saradnici, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), holna kiselina (Manoharan i saradnici, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), tioetar, npr. heksil-S-tritiltiol (Manoharan i saradnici, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan i saradnici, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), tioholesterol (Oberhauser i saradnici, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), alifatični lanac, npr. dodekandiolni ili ostaci andecila (Saison-Behmoaras i saradnici, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov i saradnici, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk i saradnici, Biochimie, 1993, 75:49), fosfolipid, npr. di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan i saradnici, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea i saradnici, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), poliaminski ili polietilen glikolni lanac (Manoharan i saradnici, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) ili adamantan sirćetnu kiselinu (Manoharan i saradnici, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), palmitilni ostatak (Mishra i saradnici, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ili oktadecilaminski ili heksilaminokarbonil-oksiholesterolski ostatak (Crooke i saradnici, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremu takvih RNK konjugata su prethodno navedeni. Uobičajeni protokoli za konjugacije uključuju sintezu RNK koje nose aminolinker na jednoj ili više pozicija sekvence. Amino grupa zatim reaguje sa molekulom koji se konjuguje, upotrebom odgovarajućih reagenasa za kuplovanje ili aktiviranje. Reakcija konjugacije se može vršiti bilo sa RNK koja je još uvek vezana za čvrstu podlogu ili nakon cepanja RNK, u fazi rastvora. Prečišćavanje RNK konjugata HPLC postupkom obično obezbeđuje čist konjugat.
IV. Isporuka IRNK opisa
[0398] Isporuka IRNK opisa u ćeliju, npr. ćeliju unutar subjekta, kao što je humani subjekat (npr. subjekat kome je to potrebno, kao što je subjekat koji je podložan, ili kome je postavljena dijagnoza poremećaja povezanog sa AGT, npr. hipertenzije) može biti ostvarene na više različitih načina. Na primer, isporuka može biti izvršena dovođenjem ćelije u kontakt sa IRNK opisa in vitro ili in vivo. In vivo isporuka može biti takođe izvršena direktno, davanjem kompozicije koja sadrži IRNK, npr. dsRNK, subjektu. Alternativno, in vivo isporuka može biti izvršena indirektno, davanjem jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju ekspresiju IRNK. Ove alternative se razmatraju u nastavku teksta.
[0399] U principu, bilo koji postupak isporuke molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može biti prilagođen za upotrebu sa IRNK predmetnog opisa (pogledati, npr. Akhtar S. i Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 i WO94/02595). Za isporuka in vivo, faktori koje je potrebno uzeti u obzir da bi se molekul IRNK isporučio uključuju, na primer, biološku stabilnost isporučenog molekula, prevenciju nespecifičnih efekata i akumulaciju isporučenog molekula u tkivu na koga se ciljano deluje. Interferencija RNK se takođe pokazala uspešnom pri lokalnoj isporuci u CNS, direktnom injeciranjem (Dorn G. i saradnici (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan PH. i saradnici (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura H. i saradnici (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina GT. i saradnici (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker ER. i saradnici (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya Y. i saradnici (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602). Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe mogu omogućiti usmeravanje IRNK do tkiva na koje se ciljano deluje, uz izbegavanje neželjenih delovanja izvan tog tkiva. Molekuli IRNK mogu biti modifikovani hemijskom konjugacijom sa lipofilnim grupama kao što su holesterola, da bi se poboljšalo ćelijsko preuzimanje i sprečila degradacija. Na primer, IRNK usmerena na ApoB, koja konjugovana sa lipofilnim holesterolskim ostatkom sistemski je injecirana u miša i dovela je do „isključivanja” iRNK za apoB kako u jetri, tako i u jejunumu (Soutschek J. i saradnici (2004) Nature 432:173-178).
[0400] U alternativnoj opciji, IRNK može biti ispoučena upotrebom sistema za isporuku lekova kao što su nanočestice, dendrimer, polimer, lipozomi ili katjonski sistem za isporuku. Pozitivno naelektrisani katjonski sistemi za isporuku olakšavaju vezivanje molekula IRNK (negativno naelektrisanog), a poboljšavaju i interakcije na negativno naelektrisanoj ćelijskoj membrani, da bi se omogućilo efikasno preuzimanje IRNK od strane ćelija. Katjonski lipidi, dendrimeri ili polimeri mogu biti ili vezani za IRNK, ili indukovani tako da se se obrazuju vezikule ili micele (pogledati, npr. Kim SH i saradnici (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) u kojima se nalazi IRNK. Obrazovanje vezikula ili micela dalje sprečava razgradnju IRNK kada se ona sistemski daje. Postupci za pravljenje i davanje kompleksa katjonskih-IRNK su u okviru sposobnosti stručnjaka (pogledati, npr. Sorensen DR i saradnici (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma UN i saradnici (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold AS i saradnici (2007) J. Hipertens. 25:197-205). Pojedini neograničavajući primeri sistema za isporuku lekova koji su korisni za sistemsku isporuku IRNK uključuju DOTAP (Sorensen DR. i saradnici (2003), navedeno iznad; Verma UN i saradnici (2003), navedeno iznad), „čvrste lipidne čestice nukleinskih kiselina” (Zimmermann TS i saradnici (2006) Nature 441:111-114), kardiolipin (Chien PY i saradnici (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal A i saradnici (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME i saradnici (2008) Pharm. Res. 16. avgust Epub pre štampanja; Aigner A. (2006) J. Biomed. Biotechnol.71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptide (Liu S. (2006) Mol. Pharm.3:472-487) i poliamidoamine (Tomalia DA i saradnici (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo H. i saradnici (1999) Pharm. Res.16:1799-1804). U pojednim opcijama, IRNK obrazuje kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsko davanje. Postupci za davanje i farmaceutske kompozicije IRNK i ciklodekstrina mogu se naći u SAD patentu br.7,427,605.
A. Vektorsko kodirane IRNK opisa
[0401] IRNK koja ciljano deluje na AGT gen može biti eksprimirana sa transkripcionih jedinica ubačenih u DNK ili RNK vektore (pogledati, npr. Couture A, i saradnici, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern A, i saradnici, International PCT Publication No. WO 00/22113, Conrad, International PCT Publication No. WO 00/22114 i Conrad, SAD patent br.6,054,299). Ekspresija može biti prolazna (reda veličine od nekoliko sati do nekoliko nedelja) ili trajna (nekoliko nedelja do nekoliko meseci ili duže), u zavisnosti od specifičnog konstrukta koji je upotrebljen, kao i vrste ciljnog tkiva ili ćelije. Ovakvi transgeni mogu biti uvedeni kao linearan konstrukt, kružni plazmid ili virusni vektor, koji može biti vektor koji će se ugraditi ili koji se neće ugraditi. Transgen može takođe biti konstruisan tako da se omogući da se nasleđuje u vidu vanhromozomskog plazmida (Gassmann i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0402] Sistemi virusnih vektora koji se mogu koristiti sa postupcima i kompozicijama koji su ovde opisani, uključuju, ali nisu ograničeni na, (a) adenovirusne vektore; (b) retrovirusne vektore, uključujući, ali ne ograničavajući se na lentivirusne vektore, virus mišije moloni leukemije itd.; (c) adeno-asocirane virusne vektore; (d) virusne vektore dobijene od virusa herpes simpleksa; (e) SV 40 vektore; (f) polioma virusne vektore; (g) papiloma virusne vektore; (h) pikornavirusne vektore;(i) poksvirusne vektore kao što su ortopoksvirusni, npr. vektori virusa vakcinije ili avipoksvirusa, npr. kanarinskih boginje ili boginja živine; i (j) vektori adenovirusa zavisnih od pomoćnih virusa ili adenovirusni vektori visokog kapaciteta (engl. gutless). Virusi defektni u replikaciji takođe mogu biti korisni. Različiti vektori će biti ili neće biti ugrađeni u ćelijski genom. Konstrukti mogu uključivati virusne sekvence za transfekciju, ukoliko je to poželjno. Alternativno, konstrukt može biti ugrađen u vektore sposobne za epizomalnu replikaciju, npr. EPV i EBV vektore. Konstrukti za rekombinantnu ekspresiju IRNK će generalno zahtevati regulatorne elemente, npr. promotore, pojačivače itd., da bi se osigurala ekspresija IRNK u ciljnim ćelijama. Drugi aspekti koje je potrebno uzeti u obzir za vektore i konstrukte poznati su u oblasti tehnike.
V. Farmaceutske kompozicije opisa
[0403] Predmetni opis takođe uključuje farmaceutske kompozicije i formulacije koje uključuju IRNK opisa. U jednoj opciji, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže IRNK koja je kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije koje sadrže IRNK su korisne za prevenciju ili lečenje poremećaja povezanih sa AGT, npr. hipertenzije. Takve farmaceutske kompozicije se formulišu na osnovu načina isporuke. Jedan primer su kompozicije koje su formulisane za sistemsko davanje putem parenteralne isporuke, npr. za subkutanu (SC), intramuskularnu (IM) ili intravensku (IV) isporuku. Farmaceutske kompozicije opisa mogu se davati u dozama koje su dovoljen da se inhibira ekspresija AGT gena.
[0404] Farmaceutske kompozicije opisa se mogu davati u dozama dovoljnim da se inhibira ekspresija AGT gena. U principu, pogodna doza IRNK opisa će biti u opsegu od oko 0,001 do oko 200,0 miligrama po kilogramu telesne težine primaoca terapije dnevno, uglavnom u opsegu od oko 1 do 50 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Obično, pogodna doza IRNK opisa će biti u opsegu od oko 0,1 mg/kg do oko 5,0 mg/kg, poželjno oko 0,3 mg/kg i oko 3,0 mg/kg. Režim ponavljenog davanja doza može uključivati redovno davanje terapijske količine IRNK, na primer svakog meseca, jednom u 3-6 meseci ili jedanput godišnje. U određenim opcijama, IRNK se daje oko jednom mesečno do oko jednom u šest meseci.
[0405] Nakon početnog režima lečenja, tretmani mogu biti davani ređe. Trajanje lečenja se može utvrditi na osnovu ozbiljnosti bolesti.
[0406] U drugim opcijama, pojedinačna doza farmaceutskih kompozicija može biti dugotrajna, tako da se doze daju u intervalima ne dužim od 1, 2, 3 ili 4 meseca. U pojednim opcijama opisa, jedna doza farmaceutskih kompozicija opisa se daje otprilike jednom mesečno. U drugim opcijama opisa, pojedinačna doza farmaceutskih kompozicija opisa se daje kvartalno (tj. otprilike na svaka tri meseca). U drugim opcijama opisa, pojedinačna doza farmaceutskih kompozicija opisa se daje dva puta godišnje (tj. otprilike jednom u šest meseci).
[0407] Potrebno je napomenuti da određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efektivno lečenje subjekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, mutacije koje su prisutne kod subjekta, prethodne tretmane, opšte zdravstveno stanje ili starost subjekta, kao i druge postojeće bolesti. Štaviše, lečenje subjekta sa profilaktički ili terapijski efektivnom količinom kompozicije može, prema potrebi, uključivati jedan tretman ili seriju tretmana.
[0408] IRNK može biti isporučena na način koji obezbeđuje da se ciljano deluje na određeno tkivo (npr. hepatocite).
[0409] Farmaceutske kompozicije opisa uključuju, ali nisu ograničene na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ove kompozicije mogu biti generisane od raznovrsnih komponenti koje uključuju, ali nisu ograničene na, prethodno obrazovane tečnosti, samoemulgujuće čvrste supstance i samoemulgujuće polučvrste supstance. Formulacije uključuju one koje ciljano deluju na jetru.
[0410] Farmaceutske formulacije predmetnog opisa, koje konvencionalno mogu biti u vidu jediničnog doznog oblika, mogu se pripremiti u skladu sa konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju korak udruživanja aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačem(ima) ili eksipijensom(ima). U principu, formulacije se pripremaju ujednačenim dovođenjem aktivnih sastojaka u blisku vezu sa tečnim nosačima.
A. Dodatne formulacije
i. Emulzije
[0411] Kompozicije predmetnog opisa mogu biti pripremljene i formulisane kao emulzije. Emulzije su obično heterogeni sistemi jedne tečnosti raspršene u drugoj, u obliku kapljica, čiji prečnik obično prelazi 0,1 µm (pogledati, npr. Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izdanje), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str. 199; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 2, str.335; Higuchi i saradnici, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, str.301). Emulzije su često dvofazni sistemi koji sadrže dve tečne faze koje se međusobno ne mešaju, a koje su blisko izmešane i raspršene jedna u drugoj. U principu, emulzije mogu biti tipa ili voda-u-ulju (v/u) ili ulje-u-vodi (u/v). Kada se vodena faza fino raspodeli i rasprši u obliku malih kapljica u masi uljane faze, rezultujuća kompozicija se naziva emulzija tipa voda-u-ulju (v/u). Alternativno, kada se uljana faza fino raspodeli i rasprši u obliku malih kapljicau vodenoj fazi, rezultujuća kompozicija se naziva emulzija tipa ulje-u-vodi (u/v). Emulzije mogu sadržavati dodatne komponente pored dispergovanih faza, kao i aktivni lek koji može biti prisutan kao rastvor bilo u vodenoj fazi, uljanoj fazi ili sam po sebi kao zasebna faza. Farmaceutski eksipijensi kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i antioksidansi, takođe mogu biti prisutni u emulzijama, po potrebi. Farmaceutske emulzije takođe mogu biti višestruke emulzije koje se sastoje od više od dve faze kao što su, na primer, slučajevi emulzijetipa ulje-u-vodi-u-ulju (u/v/u) i voda-u-ulju-u-vodi (v/u/v). Takve složene formulacije često obezbeđuju određene prednosti koje jednostavne dvofazne emulzije nemaju. Višestruke emulzije u kojima pojedinačne kapljice ulja emulzije u/v okružuju male kapljice vode, čine emulziju v/u/v. Slično tome, sistem kapljica ulja zatvorenih u globule vode stabilizovane u uljanoj kontinuiranoj fazi, obezbeđuju emulziju u/v/u.
[0412] Emulzije karakteriše mala ili nikakva termodinamička stabilnost. Često se dispergovana ili diskontinualna faza emulzije dobro disperguje u spoljašnjoj ili kontinuiranoj fazi i održava se u ovom obliku upotrebom emulgatora ili viskoznosti formulacije. Drugi načini stabilizacije emulzija podrazumevaju upotrebu emulgatora koji mogu biti ugrađeni u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori se široko mogu podeliti u četiri kategorije: sintetičke surfaktante, prirodne emulgatore, apsorpcione baze i fino raspršene čvrste supstance (pogledati, npr. Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izdanje), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.199).
[0413] Sintetički surfaktanti, takođe poznati kao površinski aktivni agensi, našli su široku primenu u formulaciji emulzija i opisani su u literaturi (pogledati, npr. Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izdanje), New York, NY; Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str. 285; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, tom 1, str. 199). Surfaktanti su obično amfifilni i sadrže hidrofilni i hidrofobni deo. Odnos hidrofilne i hidrofobne prirode surfaktanta je nazvan hidrofilno/lipofilni balans (HLB) i predstavlja važnu alatku u kategorizaciji i odabiru surfaktanata pri pripremi formulacija. Surfaktanti mogu biti podeljeni u različite klase na osnovu prirode hidrofilne grupe: nejonske, anjonske, katjonske i amfoterne (pogledati, npr. Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izdanje), New York, NY Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.285).
[0414] Raznovrsni neemulgujući materijali takođe su uključeni u formulacije emulzija i doprinose svojstvima emulzija. Tu spadaju masti, ulja, voskovi, masne kiseline, masni alkoholi, masni estri, ovlaživači, hidrofilni koloidi, konzervansi i antioksidansi (Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.335; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.199).
[0415] Način primene formulacija tipa emulzija preko kože, oralno i parenteralno, kao i postupci za njihovu proizvodnju opisani su u literaturi (pogledati, npr. Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izdanje), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.199).
ii. Mikroemulzije
[0416] U jednoj opciji predmentog opisa, kompozicije IRNK i nukleinskih kiselina su formulisane kao mikroemulzije. Mikroemulzija može biti definisana kao sistem vode, ulja i amfifila koji je sa jednom optičkom izotropijom i termodinamički je stabilan tečni rastvor (pogledati, npr. , Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8. izdanje), New York, NY; Rosoff, i Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (ur.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., tom 1, str.245). Obično su mikroemulzije sistemi koji se pripremaju tako što se najpre rasprši ulje u vodenom rastvoru surfaktanta, nakon čega se dodaje dovoljna količina četvrte komponente, obično alkohola srednje dužine lanca, da bi se obrazovao transparentan sistem. Mikroemulzije su stoga takođe opisane kao termodinamički stabilne, izotropno bistre disperzije dve tečnosti koje se ne mešaju, a koje su stabilizovane međufaznim filmovima površinski aktivnih molekula (Leung i Shah, u: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff M., ur., 1989, VCHPublishers, New York, strane 185-215).
iii. Mikročestice
[0417] IRNK opisa može biti ugrađena u česticu, npr. mikročesticu. Mikročestice mogu biti proizvedene sušenjem raspršivanjem, ali se takođe mogu proizvesti drugim postupcima uključujući liofilizaciju, uparavanje, sušenje fluida, sušenje u vakuumu ili kombinaciju ovih tehnika.
iv. Pojačivači penetracije
[0418] U jednoj opciji, predmetni opis koristi razne pojačivače penetracije da bi se obavila efikasna isporuka nukleinskih kiselina, posebno IRNK, u kožu životinja. Većina lekova je prisutna u rastvoru i u jonizovanom i u nejonizovanom obliku. Ipak, obično samo lekovi rastvorljivi u lipidima ili lipofilni lekovi lako prolaze kroz ćelijske membrane. Otkriveno je da čak i lekovi koji nisu lipofilni mogu prolaziti kroz ćelijske membrane, ukoliko se membrana kroz koju lek treba da prođe, tretira pojačivačem penetracije. Pored toga što pomažu u difuziji lekova koji nisu lipofilni kroz ćelijske membrane, pojačivači penetracije takođe povećavaju prolazak lipofilnih lekova.
[0419] Pojačivači penetracije mogu biti klasifikovani kao oni koji pripadaju jednoj od pet širokih kategorija, tj. surfaktantima, masnim kiselinama, žučnim solima, helirajućim agensima i nehelirajućim agensima koji nisu surfaktanti (pogledati, npr. Malmsten M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i saradnici, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, str.92). Svaka od prethodno navedenih klasa pojačivača penetracije i njihova upotreba u proizvodnji farmaceutskih kompozicija i isporuci farmaceutskih agenasa su dobro poznati u oblasti tehnike.
v. Ekscipijensi
[0420] Za razliku od jedinjenja nosača, „farmaceutski nosač” ili „ekscipijens” je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, agens za resuspendovanje, ili bilo koji drugi farmakološki inertan nosač za isporčivanje jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijens može biti tečan ili čvrst, a bira se, imajući u vidu planirani način primene, tako da obezbedi željenu masu, konzistenciju itd., kada se kombinuje sa nukleinskom kiselinom i drugim komponentama date farmaceutske kompozicije. Takvi agensi su dobro poznati u oblasti tehnike.
vi. Druge komponente
[0421] Kompozicije predmentog opisa mogu dodatno sadržavati druge pomoćne komponente koje se uobičajeno nalaze u farmaceutskim kompozicijama, u nivoima upotrebe koji su dobro uspostavljeni u obasti tehnike. Tako, na primer, kompozicije mogu sadržavati dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruritici, adstringenti, lokalni anestetici ili antiinflamatorni agensi, ili mogu sadržavati dodatne materijale korisne u fizičkom formulisanju raznih doznih oblika kompozicija predmetnog opisa, kao što su boje, arome, konzervansi, antioksidansi, agensi za opacifikaciju, zgušnjivači i stabilizatori. Ipak, takvi materijali, kada se dodaju, ne bi trebalo neopravdano da ometaju biološke aktivnosti komponenti kompozicija predmetnog opisa. Formulacije mogu biti sterilisane i, po želji, pomešane sa pomoćnim sredstvima, npr. lubrikantima, konzervansima, stabilizatorima, agensima za vlaženje, emulgatorima, solima koje utiču na osmotski pritisak, puferima, bojama, aromama ili aromatičnim supstancama i slično, a koji nemaju štetnu interakciju sa nukleinskom(ima) kiselinom(ama) formulacije.
[0422] Vodene suspenzije mogu sadržavati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol ili dekstran. Suspenzija takođe može sadržavati stabilizatore.
[0423] U pojednim opcijama, farmaceutske kompozicije opisa uključuju (a) jednu ili više IRNK i (b) jedan ili više agenasa koji funkcionišu mehanizmom različitim od IRNK, a koji su korisni u lečenju poremećaja povezanih sa AGT, npr. hipertenzije.
[0424] Toksičnost i profilaktička efikasnost takvih jedinjenja može se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za određivanje LD50 (letalne doze za 50% populacije) i ED50 (doza koja je profilaktički efektivna kod 50% populacije). Odnos između doza sa toksičnim i terapijskim efekatom je terapijski indeks, a isti može biti izražen kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju visoke terapijske indekse.
[0425] Podaci dobijeni iz testova u kulturi ćelija i u studijama na životinjama mogu biti upotrebljeni u formulisanju opsega doza za humanu upotrebu. Doziranje kompozicija koje su ovde opisane generalno se nalazi u opsegu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50, poželjno ED80 ili ED90, sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje može varirati unutar ovog opsega, u zavisnosti od upotrebljenog doznog oblika i puta davanja koji se koristi. Za bilo koje jedinjenje koje se upotrebljava u postupcima okarakterisanim opisom, profilaktički efektivna doza može biti iniciajlno ustanovljena na osnovu testova iz ćelijske kulture. Doza može biti formulisana u životinjskim modelima, da bi se postigao opseg koncentracije jedinjenja u cirkulišućoj plazmi ili, kada je prikladno, polipeptidnog proizvoda sekvence na koju se ciljano deluje (npr. postizanje smanjene koncentracije polipeptida) koji uključuje IC50 (tj. koncentraciju ispitivanog jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) ili više nivoe inhibicije od onih koji su utvrđeni u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu biti upotrebljene za tačnije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi mogu biti izmereni, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0426] Pored njihovog davanja, kao što je prethodno razmotreno, IRNK okarakterisane opisom mogu biti date u kombinaciji sa drugim poznatim agensima koji su u upotrebi za prevenciju ili lečenje poremećaja povezanih sa AGT, npr. hipertenzije. U svakom slučaju, ordinirajući lekar može podesiti količinu i vreme davanja IRNK na osnovu rezultata uočenih upotrebom standardnih mera efikasnosti koji su poznati u oblasti tehnike ili ovde opisani.
VI. Postupci za inhibiranje ekspresije AGT
[0427] Predmetni opis takođe obezbeđuje postupke za inhibiranje ekspresije AGT gena u ćeliji. Postupci uključuju dovođenje ćelije u kontakt sa RNKi agensom, npr. dvolančanim RNK agensom, u količini koja je efktivna u inhibiciji ekspresije AGT u ćeliji, čime se inhibira ekspresija AGT u ćeliji.
[0428] Dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK, npr. dvolančanim RNK agensom, može se vršiti in vitro ili in vivo. Dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK in vivo uključuje dovođđenje ćelije ili grupe ćelija unutar subjekta, npr. humanog subjekta, u kontakt sa IRNK. Moguće su i kombinacije in vitro i in vivo postupaka za dovođenja ćelije u kontakt sa agensom. Dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK može biti direktno ili indirektno, kao što je prethodno razmotreno. Štaviše, dovođenje ćelije u kontakt sa IRNK se može ostvariti preko liganda sa ciljnim dejstvom, uključujući bilo koji ligand koji je ovde opisan ili poznat u oblasti tehnike. U poželjnim opcijama, ligand sa ciljnim dejstvom je ugljenohidratni ostatak, npr. GalNAc ligand, ili bilo koji drugi ligand koji usmerava RNKi agens na mesto od interesa.
[0429] Termin „inhibiranje”, kako se ovde upotrebljava, koristi se naizmenično sa „smanjivanjem”, „utišavanjem”, „negativnom regulacijom”, „supresijom” i drugim sličnim terminima, a uključuje bilo koji nivo inhibicije.
[0430] Predviđeno je da se izraz „inhibiranje ekspresije AGT” odnosi na inhibiciju ekspresije bilo kog AGT gena (kao što je, npr. mišji AGT gen, pacovski AGT gen, majmunski AGT gen ili humani AGT gen), kao i varijanti ili mutiranom obliku AGT gena. AGT gen može stoga biti AGT gen divljeg tipa, mutirani AGT gen ili transgeni AGT gen, u kontekstu genetički manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0431] „Inhibiranje ekspresije AGT gena” uključuje bilo koji nivo inhibicije AGT gena, npr. barem delimičnu supresiju ekspresije AGT gena. Ekspresija AGT gena može biti procenjena na osnovu nivoa, ili promene u nivou, bilo koje promenljive povezane sa ekspresijom AGT gena, npr. nivoa iRNK za AGT ili nivoa AGT proteina. Ovaj nivo može biti procenjen u pojedinačnoj ćeliji ili u grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak dobijen iz subjekta. Podrazumeva se da je AGT eksprimiran pretežno u jetri, ali i u mozgu, žučnoj kesi, srcu i bubrezima, kao i da je prisutan i u cirkulaciji.
[0432] Inhibicija može biti procenjena smanjenjem apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više promeljivih koje su povezane sa ekspresijom AGT, u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koji tip kontrolnog nivoa koji se koristi u oblasti tehnike, npr. bazalni nivo pre davanja doze, ili nivo određen kod sličnog subjekta, ćelije ili uzorka koji je netretiran ili je tretiran kontrolnim agensima (kao što je, npr. kontrola tretirana samo puferom ili kontrola tretirana neaktivnim agensom).
[0433] U pojednim opcijama postupaka opisa, ekspresija AGT gena je inhibirana za najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%, ili je ispod nivoa detekcije testa. U poželjnim opcijama, ekspresija AGT gena je inhibirana za najmanje 70%.. Podrazumeva se dalje da može biti poželjno da inhibicija ekspresije AGT u određenim tkivima, npr. u jetri, bude bez značajne inhibicije ekspresije u drugim tkivima, npr. mozgu. U poželjnim opcijama, nivo ekspresije se utvrđuje upotrebom postupaka za analize koji su obezbeđeni u Primeru 2, sa koncentracijom siRNK od 10 nM, u ćelijskoj liniji odgovarajuće vrste.
[0434] U određenim opcijama, inhibicija ekspresije in vivo određuje se genetičkim isključivanjem (engl. kockdown) humanog gena kod glodara koji eksprimira ljudski gen, npr. kod miša inficiranog sa AAV koji eksprimira humani ciljni gen (tj. AGT), npr. kada se daje jednokratna doza od 3 mg/kg pri nadiru ekspresije RNK. Isključivanje ekspresije endogenog gena u sistemu životinjskog modela takođe može biti određeno, npr. nakon davanja jednokratne doze od 3 mg/kg pri nadiru ekspresije RNK. Takvi sistemi su korisni kada su sekvenca nukleinske kiseline humanog gena i gena animalnog modela dovoljno bliske tako da humana IRNK obezbeđuje efektivano isključivanje gena u životinjskom modelu. Ekspresija RNK u jetri je utvređivana upotrebom PCR postupaka navedenih u Primeru 2.
[0435] Inhibicija ekspresije AGT gena može se manifestovati smanjenjem količine iRNK koja se eksprimira u prvoj ćeliji ili grupi ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku dobijenom iz subjekta) u kojima je AGT gen transkribovan i koje su bile tretirane pre dužeg ili kraćeg vremena (npr. dovođenjem ćelije ili ćelija u kontakt sa IRNK opisa, ili davanjem IRNK opisa subjektu u kome se nalaze ćelije ili u kome su bile prisutne) tako da je ekspresija AGT gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija koja je suštinski identična prvoj ćeliji ili grupi ćelija, ali koja nije tretirane ni pre dužeg niti kraćeg vremena (kontrolna(e) ćelija(e) koja(e) nije tretirana sa IRNK ili nije tretirana sa IRNK koja ima ciljano delovanje na gen od interesa). U poželjnim opcijama, inhibicija se procenjuje postupkom obezbeđenim u Primeru 2, upotrebom koncentracije siRNK od 10nM u ćelijskoj liniji iz iste vrste, a koja u tretiranim ćelijama eksprimira nivo IRNK koji predstavlja procenat nivoa iRNK u kontrolnim ćelijama, što se izračunava upotrebom sledeće formule:
<(>iRNK u kontrolnim ćelijama<)>− (iRNK u tretiranim ćelijama)
∙ 100%
<(>iRNK u kontrolnim ćelijama<)>
[0436] U drugim opcijama, inhibicija ekspresije AGT gena može biti procenjena u kontekstu smanjenja parametra koji je funkcionalno povezan sa ekspresijom AGT gena, npr. sa nivoom AGT proteina u krvi ili serumu subjekta. Utišavanje AGT gena može biti utvrđeno u bilo kojoj ćeliji koja eksprimira AGT, bilo endogeno ili heterologno sa ekspresionog konstrukta, kao i bilo kojim testom poznatim u oblasti tehnike.
[0437] Inhibicija ekspresije AGT proteina može se manifestovati smanjenjem nivoa AGT proteina koji je eksprimiran u ćeliji ili grupi ćelija ili uzorku subjekta (npr. kao nivo proteina u uzorku krvi dobijenom iz subjekta). Kao što je prethodno objašnjeno, za procenu supresije informacione RNK, inhibicija nivoa ekspresije proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija može se na sličan način izraziti kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija, ili promena u nivou proteina u uzorku subjekata, npr. u krvi ili serumu koji je iz njih dobijen.
[0438] Kontrolna ćelija, grupa ćelija ili uzorak subjekta koji može biti upotrebljen za procenu inhibicije ekspresije AGT gena, uključuje ćeliju, grupu ćelija ili uzorak subjekta koji još nije bio u kontaktu sa RNKi agensom opisa. Na primer, kontrolna ćelija, grupa ćelija ili uzorak subjekta mogu biti dobijeni iz pojedinačnog subjekta (npr. humanog ili životinjskog subjekta) pre tretmana subjekta sa RNKi agensom ili iz odgovarajuće podudarne kontrole populacije.
[0439] Nivo ekspresije AGT iRNK u ćeliji ili grupi ćelija može biti utvrđen upotrebom bilo kog postupka poznatog u oblasti tehnke za procenu ekspresije informacione RNK. U jednoj opciji, nivo ekspresije AGT u uzorku se određuje detekcijom transkribovanog polinukleotida ili njegovog dela, npr. informacione RNK AGTgena. RNK može biti ekstrahovana iz ćelija upotrebom tehnika ekstrakcije RNK uključujući, na primer, upotrebu ekstrakcije sa kislim fenolom/guanidin izotiocijanatom (RNAzolom B; Biogenesis), RNeasy™ kompletom za izolovanje RNK (Qiagen®) ili PAXgene™ reagensom (PreAnalytix™, Švajcarska). Uobičajeni formati testova koji koriste hibridizaciju ribonukleinske kiseline uključuju nuklearne „run-on” testove, RT-PCR, testove pokvirenosti mesta isecanja RNazom, RNK blotovanje, in situ hibridizaciju i mikročip analize.
[0440] U pojednim opcijama, nivo ekspresije AGT se određuje upotrebom proba za nukleinske kiseline. Termin „proba”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji molekul koji je sposoban da se selektivno vezuje za specifičan AGT. Probe mogu biti sintetisane od strane stručnjaka iz oblasti tehnike, ili mogu biti izvedene iz odgovarajućih bioloških preparata. Probe mogu biti posebno dizajnirane tako da budu obeležen. Primeri molekula koji se mogu koristiti kao probe uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteini, antitela i organske molekule.
[0441] Izolovana informaciona RNK može biti upotrebljena u testovima hibridizacije ili amplifikacije koji uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK ili RNK blotovanje, analize lančane reakcije polimeraze (PCR) i mikročip analize. Jedan od postupaka za određivanje nivoa informacione RNK uključuje dovođenje u kontakt izolovane informacione RNK sa molekulom nukleinske kiseline (probom) koja može da hibridizuje sa AGT iRNK. U jednoj opciji, iRNK se imobiliše na čvrstoj površini i dovodi se u kontakt sa probom, na primer, puštanjem izolovane informacione RNK na agarozni gel i prenošenjem iRNK sa gela na membranu, kao što je nitrocelulozna membrana. U alternativnoj opciji, proba(e) su imobilisana na čvrstoj površini i informaciona RNK se doodi u kontakt sa probom(ama), na primer, u Affymetrix<®>platformi mikročip analiza. Stručnjak može lako prilagoditi poznate postupke detekcije informacione RNK za upotrebu u određivanju nivoa AGT iRNK.
[0442] Alternativni postupak za određivanje nivoa ekspresije AGT u uzorku uključuje proces amplifikacije nukleinske kiseline ili reverzne transkriptaze (za pripremu cDNK), na primer, iRNK u uzorku, npr. RT-PCR postupkom (eksperimentalna procedura navedena u Mullis, 1987, SAD patent br.
4,683,202), lančanom reakcijom ligaze (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), samoodrživom replikacijom sekvenci (Guatelli i saradnici (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripcionim sistemom amplifikacije (Kwoh i saradnici (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), postupkom Q-Beta replikaze (Lizardi i saradnici (1988) Bio/Technology 6:1197), replikacijom u ciklusima (Lizardi i saradnici, SAD patent br.5,854,033) ili bilo kojim drugim postupkom amplifikacije nukleinskih kiselina, nakon čega sledi detekcija amplifikovanih molekula upotrebom tehnika koje su dobro poznate stručnjacima iz oblasti tehnike. Ove šeme detekcije su posebno korisne za detekciju molekula nukleinskih kielina ukoliko su takvi molekuli prisutni u veoma malim brojevima. Prema posebnim aspektima opisa, nivo ekspresije AGT se određuje kvantitativnim fluorogenim RT-PCR postupkom (tj. TaqMan<™>sistemom). U poželjnim opcijama, nivo ekspresije se određuje postupkom obezbeđenim u Primeru 2, upotrebom siRNK koncentracije od 10 nM, u ćelijskoj liniji koja odgovara vrsti.
[0443] Nivoi ekspresije AGT informacione RNK mogu biti praćeni upotrebom membranskog blota (kao što se upotrebljava u hibridizacionoj analizi poput DNK, RNK, tačkastog blotovanja i slično), ili u mikrobunarićima, epruvetama za uzorkovanje, na gelovima, smolama ili vlaknima (ili na bilo kojoj čvrstoj podloži koja sadrži vezane nukleinske kiseline). Pogledati SAD patente br.5,770,722; 5,874,219; 5,744,305; 5,677,195 i 5,445,934. Određivanje nivoa ekspresije AGT može takođe obuhvatati upotrebu proba tipa nukleinskih kiselina u rastvoru.
[0444] U poželjnim opcijama, nivo ekspresije informacione RNK se procenjuje upotrebom analiza razgranate DNK (bDNK) ili PCR postupkom u realnom vremenu (qPCR). Upotreba ovih postupaka je opisana i ilustrovana u Primerima koji su ovde predstavljeni. U poželjnim opcijama, nivo ekspresije se određuje postupkom koji je obezbeđen u Primeru 2, upotrebom siRNK koncentracije od 10 nM, u ćelijskoj liniji koja odgovara vrsti.
[0445] Nivo ekspresije AGT proteina može biti određen upotrebom bilo kog postupka koji je poznat u oblasti tehnike za merenje nivoa proteina. Takvi postupci uključuju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tankoslojnu hromatografiju (TLC), hiperdifuzionu hromatografiju, reakcije precipitina u tečnosti ili na gelu, apsorpcionu spektroskopiju, kolorimetrijske testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imodifuziju (jednostruku ili dvostruku), imunoelektroforezu, imunoblotovanje, radioimuni test (RIA), enzimski povezan imunosorbentni test (ELISA), imunofluorescentne testove, elektrohemiluminiscentne testove i slično.
[0446] U pojednim opcijama, efikasnost postupaka opisa se procenjuju smanjenjem AGT iRNK ili nivoa AGT proteina (npr. u biopsiji jetre).
[0447] U pojednim opcijama postupaka opisa, IRNK se daje subjektu tako da se IRNK isporučuje na specifično mesto unutar subjekta. Inhibicija ekspresije AGT može biti procenjena upotrebom merenja nivoa ili promene nivoa AGT iRNK ili agt proteina u uzorku dobijenom iz tečnosti ili tkiva sa specifičnog mesta unutar subjekta (npr. iz jetre ili krvi).
[0448] Kao što se ovde upotrebljava, termini detekcije ili određivanja nivoa analita podrazumevaju izvođenje koraka za određivanje da li je materijal, npr. protein, RNK, prisutan. Kao što se ovde upotrebljava, postupci detekcije ili određivanja uključuju detekciju ili određivanje nivoa analita koji je ispod nivoa detekcije za upotrebljeni postupak.
VII. Profilaktički postupci i postupci lečenja opisa
[0449] Predmetni opis takođe obezbeđuje postupke upotrebe IRNK opisa ili kompozicije koja sadrži IRNK opisa, u cilju inhibicije ekspresije AGT, čime se omogućava prevencija ili lečenje poremećaja povezanog sa AGT, npr. visokpg krvnog pritiska, npr. hipertenzije.
[0450] U postupcima opisa, ćelija može biti u dovedena u kontakt sa siRNK in vitro ili in vivo, tj. ćelija može biti unutar subjekta.
[0451] Ćelija pogodna za tretman upotrebom postupaka opisa može biti bilo koja ćelija koja eksprimira AGT gen, npr. ćelija jetre, ćelija mozga, ćelija žučne kese, ćelija srca ili ćelija bubrega, ali poželjno je ćelija jetre. Ćelija pogodna za upotrebu u postupcima opisa može biti ćelija sisara, npr. ćelija primata (kao što je humana ćelija, uključujući humanu ćeliju u himernoj životinji koja je različita od čoveka, ili ćelija primata koji je različit od čoveka, npr. kao što je ćelija majmuna ili ćelija šimpanze), ili ćelija koja nije iz primata. U određenim opcijama, ćelija je humana ćelija, npr. ćelija jetre čoveka. U postupcima opisa, ekspresija AGT je inhibirana u ćeliji za najmanje 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ili 95, ili do nivoa ispod nivoa detekcije testa.
[0452] In vivo postupci opisa mogu uključiti davanje kompozicije koja sadrži IRNK subjektu, pri čemu IRNK uključuje nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna najmanje jednom delu RNK transkripta AGT gena sisara kojem RNKi agens treba da bude dat. Kompozicija može biti davana na bilo koji način poznat u oblasti tehnike uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, intraperitonealni ili parenteralni put davanja, uključujući intrakranijalno (npr. intraventrikularno, intraparenhimsko i intratekalnu), intravensku, intramuskularnu, subkutano, transdermalno davanje, davanje preko disajnih puteva (aerosolom), nazalno, rektalno i topikano (uključujući bukalno i sublingvalno) davanje. U određenim opcijama, kompozicije se daju intravenskom infuzijom ili injekcijom. U određenim opcijama, kompozicije se daju subkutanom injekcijom. U određenim opcijama, kompozicije se daju intramuskularnom injekcijom.
[0453] Prema jednom aspektu, predmetni opis takođe obezbeđuje postupke za inhibiranje ekspresije AGT gena kod sisara. Postupci uključuju davanje sisaru kompozicije koja sadrži dsRNK koja ciljano deluje na AGT gen u ćeliji sisara, kao i održavanje kod sisara tokom vremena dovoljnog da se odigra degradacija informacione RNK transkripta AGT gena, čime se inhibira ekspresija AGT gena u ćeliji. Smanjenje ekspresije gena može biti procenjeno bilo kojim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike i postupcima koji su ovde opisani, npr. qRT-PCR-a, npr. u Primeru 2. Smanjenje proizvodnje proteina može biti procenjeno bilo kojim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike, npr. ELISA postupcima. U određenim opcijama, uzorak biopsije jetre dobijen punkcijom može poslužiti kao materijal tkiva za praćenje smanjenja ekspresije AGT gena ili proteina. U drugim opcijama, uzorak krvi služi kao uzorak za praćenje smanjenja ekspresije agt proteina.
[0454] Predmetni opis dalje obezbeđuje postupke lečenja kod subjekta kome je to potrebno, npr. kod subjekt sa dijagnozom hipertenzije.
[0455] Predmetni opis dalje obezbeđuje postupke profilakse kod subjekta kojem je to potrebno. Postupci tretmana opisa uključuju davanje IRNK opisa subjektu, npr. subjektu koji bi imao koristi od smanjenja ekspresije AGT, u profilaktički efektivnoj količini IRNK koja ciljano deluje na AGT gen, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži IRNK koja ciljano deluje na AGT gen.
[0456] IRNK opisa može biti data kao „slobodna IRNK". Slobodna IRNK se daje u odsustvu farmaceutske kompozicije. Gola IRNK može biti u odgovarajućem puferskom rastvoru. Rastvor pufera može sadržavati acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju od njihovih kombinacija. U jednoj opciji, puferski rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). pH i osmolarnost puferskog rastvora koji sadrži IRNK mogu biti podešeni tako da su pogodani za davanje subjektu.
[0457] Alternativno, IRNK opisa može biti data kao farmaceutska kompozicija, kao što je lipozomska formulacija dsRNK.
[0458] Subjekti koji bi imali koristi od inhibicije ekspresije AGT gena su subjekti koji su podložni ili kojima je postavljena dijagnoza hipertenzije.
[0459] U jednoj opciji, postupak uključuje davanje kompozicije, tako da se smanji ekspresija AGT gena na koga se ciljano deluje, na primer, tokom koja je ovde okarakterisana oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1-6, 1-3 ili 3- 6 meseci po dozi. U određenim opcijama, kompozicija se primenjuje jedan put na 3-6 meseci.
[0460] Poželjno, IRNK korisne za postupke i kompozicije koje su ovde okarakterisani, specifično ciljano deluju na RNK (primarnu ili obrađenu) AGT gena na koga se ciljano deluje. Kompozicije i postupci za inhibiranje ekspresije ovih gena upotrebom IRNK mogu biti pripremljeni i izvedeni kao što je ovde opisano.
[0461] Rezultat davanja IRNK u skladu sa postupcima opisa, može biti prevencija ili lečenje poremećaja povezanog sa AGT, npr. visokog krvnog pritiska, npr. hipertenzije. Dijagnostički kriterijumi za razne vrste visokog krvnog pritiska su obezbeđeni u nastavku teksta.
[0462] Subjektima može biti davana terapijska količina IRNK, kao što je oko 0,01 mg/kg do oko 200 mg/kg.
[0463] Poželjno je da se IRNK primenjuje subkutano, tj. subkutanim injeciranjem. Jedna ili više injekcija mogu biti upotrebljene za isporuka željene doze IRNK subjektu. Injekcije se mogu ponavljati tokom određenog vremenskog perioda.
[0464] Davanje se može redovno ponavljati. U određenim opcijama, nakon inicijalnog režima lečenja, tretmani mogu biti davani ređe. Režim ponavljanja doze može uključivati redovno davanje terapijske količine IRNK, na primer jednom mesečno do jedan put godišnje. U određenim opcijama, IRNK se primenjuje otprilike jedan put mesečno do oko jedan put na svaka tri meseca ili oko jedan put na svaka tri meseca do oko jedan put na svakih šest meseci.
VIII. Dijagnostički kriterijumi, faktori rizika i tretmani za hipertenziju
[0465] Nedavno su revidirane praktične smernice za prevenciju i lečenje hipertenzije. Obimne izveštaje su objavili Reboussin i saradnici (Systematic Review for the 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004.) i Whelton i saradnici (2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol.2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41519-1. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.006.). Pojedini istaknuti delovi novih Smernica su opisani u nastavku. Ipak, Smernice dobre kliničke prakse treba shvatiti kao pružanje znanja stručnjacima iz ove oblasti tehnike samo u pogledu dijagnostičkih kriterijuma i kriterijuma za praćenje i lečenjem hipertenzije u vreme podnošenja ove prijave.
A. Dijagnostički kriterijumi
[0466] Iako postoji stalna povezanost između visokog krvnog pritiska i povećanog rizika od kardiovaskularnih bolesti, korisno je kategorizovati nivoe krvnog pritiska zarad donošenja ispravnih odluka u kliničkom i javnom zdravstvu. Krvni pritisak se može kategorisati u 4 nivoa na osnovu prosečnog krvnog pritiska izmerenog u zdravstvenoj ustanovi (hipertenzija belih mantila): normalan, povišen i hipertenzija 1 ili 2 stadijuma kao što je prikazano u tabeli ispod (iz Whelton i saradnici, 2017).
[0467] Krvni pritisak ukazuje na krvni pritisak zasnovan na proseku ≥2 pažljiva očitavanja dobijena u ≥2 navrata. Najbolje prakse za dobijanje pažljivih očitavanja krvnog pritiska su detaljno opisane u Whelton i saradnici, 2017, i poznati su u oblasti tehnike.
[0468] Ovakva kategorizacija se razlikuje od one prethodno preporučene u JNC 7 izveštaju (Chobanian i saradnici; the National High Blood Pressure Education Program Coordinating Committee. Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension.2003;42:1206-52) sa hipertenzijom stadijuma 1 koja je sada definisana sa sistolnim krvnim pritiskom (SBP) od 130-139 ili dijastolnim krvnim pritiskom (DBP) od 80-89 mm Hg, i sa hipertenzijom stadijuma 2 definisanom u ovom dokumentu kao onom koja odgovara stadijumima 1 i 2 u izveštaju JNC 7. Obrazloženje za ovu kategorizaciju je zasnovano na opservacionim podacima, koji se odnose na povezanost između SBP/DBP i rizika od kardiovaskularnih bolesti, kao i na rezultatima randomizovanih kliničkih ispitivanja promene načina života radi snižavanja krvnog pritiska i randomizovanih kliničkih ispitivanja lečenja antihipertenzivnim lekovima za prevenciju kardiovaskularnih bolesti.
[0469] Povećan rizik od kardiovaskularnih bolesti kod odraslih sa hipertenzijom 2. stadijuma je dobro ustanoveljen. Sve veći broj pojedinačnih studija i meta-analiza opservacionih podataka prijavio je gradijent progresivno većeg rizika od kardiovaskularnih bolesti raspona od normalnog krvnog pritiska do povišenog krvnog pritiska i hipertenzije stadijuma 1. U mnogim od ovih meta-analiza, odnosi rizika za koronarnu bolest srca i moždani udar iznosili su između 1,1 i 1,5 kada se porede SBP/DBP od 120-129/80-84 mm Hg naspram <120/80 mm Hg i između 1,5 i 2.0 kada se porede SBP/DBP od 130-139/85-89 mm Hg u odnosu na <120/80 mm Hg. Ovaj gradijent rizika bio je konzistentan u svim podgrupama definisanim po polu i rasi/etničkoj pripadnosti. Relativno povećanje rizika od kardiovaskularnih bolesti povezano sa višim krvnim pritiskom je bilo manje, ali i dalje prisutno kod starijih odraslih osoba. Promena načina života i farmakološki tretman antihipertenzivnim lekovimase preporučuju se osobama sa povišenim krvnim pritiskom i hipertenzijom stadijuma 1 i 2. Klinička korist se može postići smanjenjem stadijuma povišenog krvnog pritiska, čak i ukoliko se krvni pritisak ne normalizuje tretmanom.
B. Faktori rizika
[0470] Hipertenzija je složena bolest koja je rezultat kombinacije faktora uključujući, ali ne ograničavajući se na, genetiku, način života, ishranu i sekundarne faktore rizika. Hipertenzija takođe može biti povezana sa trudnoćom. Podrazumeva se da zbog složene prirode hipertenzije, podrazumeva se da za lečenje hipertenzije mogu biti potrebne višestruke intervencije. Štaviše, nefarmakološke intervencije, uključujući promenu ishrane i načina života, mogu biti korisne za prevenciju i lečenje hipertenzije. Dalje, intervencija može obezbediti kliničku korist bez potpune normalizacije krvnog pritiska kod pojedinca.
1. Genetički faktori rizika
[0471] Identifikovano je nekoliko monogenih oblika hipertenzije, kao što su aldosteronizam koji se može otkloniti glukokortikoidima, Lidlov sindrom, Gordonov sindrom i drugi kod kojih mutacije jednog gena u potpunosti objašnjavaju patofiziologiju hipertenzije, ali ovi poremećaji su retki. U listi trenutno poznatih genetičkih varijanti koje doprinose krvnom pritisku i hipertenziji, nalazi se više od 25 retkih mutacija i 120 pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama. Međutim, iako genetički faktori mogu doprineti hipertenziji kod nekih pojedinaca, procenjuje se da genetičke varijacije čine samo oko 3,5% varijabilnosti u krvnom pritisku.
2. Ishrana i konzumiranje alkohola
[0472] Uobičajeni faktori rizika iz životne sredine i načina života koji dovode do hipertenzije uključuju lošu ishranu, nedovoljnu fizičku aktivnost i prekomernu konzumaciju alkohola. Ovi faktori mogu dovesti do toga da osoba ima višak kilograma ili postane gojazna, što dodatno povećava verovatnoću razvoja ili pogoršanja hipertenzije. Povišen krvni pritisak je još snažnije povezan sa povećanim odnosom obima struka i kukova ili drugim merama centralne distribucije masnog tkiva. Gojaznost u mladosti i gojaznost koja je u toku, u snažnoj su korelaciji sa hipertenzijom kasnije u životu. Postizanje normalne težine može smanjiti rizik od razvoja visokog krvnog pritiska na onaj nivo koji je prisutan kod osobe koja nikada nije bila gojazna.
[0473] Unos natrijuma, kalijuma, magnezijuma i kalcijuma takođe može imati značajan uticaj na krvni pritisak. Unos natrijuma je u pozitivnoj korelaciji sa krvnim pritiskom i objašnjava veći deo porasta krvnog pritiska vezanog za godine života. Određene grupe su osetljivije na povećan unos natrijuma od drugih, uključujući osobe negroidne rase i starije odrasle osobe (≥ 65 godina), kao i one sa višim nivoom krvnog pritiska ili komorbiditetima kao što su hronična bolest bubrega, dijabetes melitus ili metabolički sindrom. Sumarno, ove grupe čine više od polovine svih odraslih u SAD. Osetljivost na so može biti marker za povećanu smrtnost od kardiovaskularnih bolesti, mada i od svih drugih uzroka, nezavisno od krvnog pritiska. Trenutno su tehnike za prepoznavanje osetljivosti na so nepraktične u kliničkoj postavci. Najbolje je stoga osetljivost na so razatrati kao karakteristiku grupe.
[0474] Unos kalijuma je obrnuto povezan sa krvnim pritiskom i moždanim udarom, a deluje i da viši nivo kalijuma umanjuje efekat natrijuma na krvni pritisak. Niži odnos natrijuma i kalijuma je povezan sa nižim krvnim pritiskom od onog koji se zapaža za odgovarajuće nivoe natrijuma ili kalijuma pojedinačno. Slično tome, uočeno je rizik od kardiovaskularnih bolesti.
[0475] Konzumacija alkohola je dugo bila povezana sa visokim krvnim pritiskom. Procenjuje se da u SAD konzumacija alkohola čini oko 10% populacionog opterećenja za hipertenziju, pri čemu je opterećenje veće kod muškaraca nego kod žena.
[0476] Podrazumeva se i da promene u ishrani ili konzumiranju alkohola mogu biti aspekt prevencije ili lečenja hipertenzije.
3. Fizička aktivnost
[0477] Postoji dobro ustanovljena obrnuta korelacija između fizičke aktivnosti/fizičke kondicije i nivoa krvnog pritiska. Čak i skromni nivoi fizičke aktivnosti su se pokazali korisnim u smanjenju hipertenzije.
[0478] Podrazumeva se da povećanje fizičke aktivnosti može biti aspekt prevencije ili lečenja hipertenzije.
4. Sekundarni faktori rizika
[0479] Sekundarna hipertenzija može biti u osnovi ozbiljnog povišenja krvnog pritiska, farmakološki rezistentne hipertenzije, iznenadnog početka hipertenzije, povišenja krvnog pritiska kod pacijenata sa hipertenzijom koja je prethodno bila kontrolisana terapijom lekovima, kao i pojave dijastolne hipertenzije kod starijih osoba i oštećenja pogođenog organa koje je nesrazmerno trajanju ili težini hipertenzije. Iako na sekundarnu hipertenziju treba posumnjati kod mlađih pacijenata (starost <30 godina) sa povišenim krvnim pritiskom, nije neuobičajeno da se primarna hipertenzija manifestuje u mlađoj dobi, posebno kod osoba negroidne rase, a pojedini oblici sekundarne hipertenzije, kao što je renovaskularna bolest, češći su u starijoj dobi (≥ 65 godina). Mnogi od uzroka sekundarne hipertenzije su snažno povezani sa kliničkim nalazima ili grupama nalaza koji ukazuju na specifičan poremećaj. U takvim slučajevima, lečenje stanja u osnovi, može razrešiti nalaze povišenog krvnog pritiska bez davanj agenasa koji se obično koriste za lečenje hipertenzije.
5. Trudnoća
[0480] Trudnoća je faktor rizika za visok krvni pritisak, a visok krvni pritisak u toku trudnoće je faktor rizika za kardiovaskularne bolesti i hipertenziju kasnije u životu. Izveštaj o hipertenziji povezanoj sa trudnoćom je objavio Američki koledž za akušerstvo i ginekologiju (ACOG) 2013. godine (American College of Obstetricians and Gynecologists, Task Force on Hypertension in Pregnancy. Hypertension in pregnancy. Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists’ Task Force on Hypertension in Pregnancy. Obstet Gynecol.2013;122:1122-31). Pojedini istaknuti delovi Izveštaja su dati u nastavku. Međutim, Izveštaj treba shvatiti kao pružanje znanja stručnjacima iz ove oblasti tehnike samo u pogledu dijagnostičkih kriterijuma i kriterijuma za praćenje i lečenjem hipertenzije u trudnoći u vreme podnošenja ove prijave.
[0481] Dijagnostički kriterijumi za preeklampsiju su obezbeđeni u tabeli ispod (iz Tabele 1 ACOG izveštaja, 2013).
[0482] Kontrola krvnog pritiska tokom trudnoće je komplikovana činjenicom da su mnogi uobičajeni antihipertenzivi u upotrebi, uključujući ACE inhibitore i ARB, kontraindikovani tokom trudnoće zbog potencijalnog štetnog delovanja na fetus. Cilj antihipertenzivne terapije tokom trudnoće uključuje prevenciju teške hipertenzije i mogućnost produženja trudnoće kako bi se fetusu pre porođaja omogućilo više vremena za sazrevanje. Pregledom lečenja teške hipertenzije povezane sa trudnoćom nije nađeno dovoljno dokaza za preporuku specifičnih agenasa; radije se stoga preporučuje u ovom slučaju iskustvo kliničara (Duley L, Meher S, Jones L. Drugs for treatment of very high blood pressure during pregnancy. Cochrane Database Syst Rev.2013;7:CD001449.).
C. Tretmani
[0483] Lečenje visokog krvnog pritiska je složeno pošto su često prisutni drugi komorbiditeti, često uključujući smanjenu bubrežnu funkciju, zbog kojih subjekat takođe može biti na lečenju. Kliničari koji leče odrasle sa visokim krvnim pritiskom treba da se fokusiraju na opšte zdravstvno stanje pacijenata, sa posebnim naglaskom na smanjenje rizika od kardiovaskularnih bolesti, kao budućih štetnih ishoda. Sve faktore rizika za pacijente treba kontrolisati na integrisan način, sa sveobuhvatnim skupom nefarmakoloških i farmakoloških strategija. Kako se krvni pritisak pacijenata i rizik od budućih kardiovaskularnih bolesti povećavaju, potrebno je intenzivirati i kontrolu krvnog pritiska.
[0484] Dok se lečenje visokog krvnog pritiska lekovima za snižavanje krvnog pritiska samo na osnovu nivoa krvnog pritiska smatra isplativim, efikasnijim i isplativijim za smanjenje rizika od kardiovaskularnih bolesti se smatra usmeravanje lečenja sa upotrebom kombinacije apsolutnog rizika od kardiovaskularnih bolesti i nivoa krvnog pritiska, nego što je upotreba samo nivoa krvnog pritiska. Mnogim pacijentima koji su započeli sa uzimanjem samo jednog leka, kasnije će biti potrebno ≥2 leka iz različitih farmakoloških klasa, da bi postigli željeni nivoi krvnog pritiska. Poznavanje farmakoloških mehanizama delovanja svakog agensa je važno. Režimi lekova sa komplementarnom aktivnošću, gde se drugi antihipertenzivni agens upotrebljava da blokira kompenzatorne odgovore na početni agens ili utiče na drugačiji presorski mehanizam, može dovesti do aditivnog snižavanja krvnog pritiska. Na primer, tiazidni diuretici mogu stimulisati renin-angiotenzin-aldosteronski sistem. Dodavanjem ACE inhibitora ili ARB tiazidu, može se postići aditivni efekat snižavanja krvnog pritiska. Upotreba kombinovane terapije takođe može poboljšati pridržavanje propisanoj terapiji. Dostupno je nekoliko kombinacija lekova sa 2 i 3 fiksne doze antihipertenzivne terapije, sa komplementarnim mehanizmima delovanja među komponentama.
Tabela 18 iz publikacije Whelton i saradnici, 2017, obezbeđuje spisak oralnih antihipertenzivnih lekova. Navedene su klase terapijskih agenasa za lečenje visokog krvnog pritiska i lekovi koji spadaju u te klase. Opsezi i učestalosti doza, kao i komentari takođe su navedeni.
PRIMERI
Primer 1. Sinteza IRNK
Izvor reagenasa
[0485] Gde izvor reagensa ovde nije posebno naveden, takav reagens se može nabaviti od bilo kog dobavljača reagenasa za molekularnu biologiju po standardu kvaliteta/čistoće za primenu u molekularnoj biologiji.
Dizajn siRNK
[0486] Skup siRNK sa ciljanim dejstvom na humani AGT gen (humani: NCBI refseqID NM_000029.3; NCBI GeneID: 183) dizajniran je upotrebom prilagođenih R i Python skripti. Humana NM_000029 REFSEQ informaciona RNK, verzija 3, ima dužinu od 2587 baza.
[0487] Detaljna lista nukleotidnih sekvenci nemodifikovanog sens i antisens lanca AGT prikazana je u Tabeli 3. Detaljna lista nukleotidnih sekvenci modifikovanog sens i antisens lanca AGT prikazana je u Tabeli 5.
Sinteza siRNK
[0488] siRNK su sintetisane i anilovane upotrebom rutinskih postupaka poznatih u oblasti tehnke.
Primer 2. In vitro postupci skrininga
Ćelijska kultura i transfekcije u 384 bunarića
[0489] Hep3b ćelije (ATCC, Manassas, VA) su gajane do skoro potpune konfluentnosti na 37°C, u atmosferi sa 5% CO2, u Eagle's Minimum Essential medijumu (Gibco) sa dodatkom 10% FBS (ATCC) pre nego što se sa odlepljene sa ploče tripsinizacijom.
[0490] Transfekcija je vršena dodavanjem 4,9µl Opti-MEM sa 0,1 µl Lipofektamina RNKiMax po bunariću (Invitrogen, Carlsbad CA. kat. br.13778-150), u 5 µl svakog od siRNK dupleksa, u pojedinačni bunarić na ploči sa 384 mesta. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta. Pedeset µl kompletnog medijuma za rast koji je sadržavao 5000 Hep3b ćelija, dodat je zatim u smešu siRNK. Ćelije su inkubirane tokom 24 sata, pre prečišćavanja RNK. Eksperimenti sa jednokratnom dozom su rađeni pri konačnoj koncentraciji dupleksa od 10 nM i 0,1 nM, a eksperimenti odgovora na dozu su izvedeni upotrebom šestostrukog serijskog razblaženja u osam tačaka, u opsegu od 10 nM do 37,5 fM.
[0491] Dodatni dsRNK agensi koji ciljano deluju na AGT iRNK opisani su u PCT Publication No. WO 2015/179724.
Izolacija ukupne RNK upotrebom DYNABEADS kompleta za izolaciju iRNK (Invitrogen<™>, partija br.: 610-12)
[0492] Ćelije su lizirane u 75 μl pufera za lizu/vezivanje koji je sadržavao 3 μL zrnaca po bunariću, pa je smeša mešana 10 minuta na elektrostatičkom šejkeru. Koraci pranja su automatizovani na Biotek EL406, upotrebom nosača magnetne ploče. Smole su isprane (u 90 µL) jednom u puferu A, jednom u puferu B i dva puta u puferu E, sa koracima aspiriranja između. Nakon finalne aspiracije, 10 uL kompletne RT smeše je dodato u svaki bunar, kao što je opisano u nastavku.
Sinteza cDNK upotrebom ABI kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems, Foster Citi, CA, kat. br.4368813):
[0493] Master smeša 1ul 10X pufera, 0,4µl 25X dNTP, 1µl nasumičnih prajmera, 0,5µl reverzne transkriptaze, 0,5µl inhibitora RNaze i 6,6µl H2O po reakciji, dodata je u svaki bunarić. Ploče su zatim zatvorene, mešane agitacijom tokom 10 minuta na elektrostatičkom šejkeru, pa su inkubirane na 37 stepeni C tokom 2 sata. Nakon toga, ploče su mešane agitacijom na 80 stepeni C tokom 8 minuta.
PCR u realnom vremenu:
[0494] Dva µl cDNK su dodavana u master smešu koja je sadržavala 0,5 µl humane GAPDH TaqMan probe (4326317E), 0,5 µl humanog AGT (Hs00174854m1), 2 µl vode bez nukleaze i 5 µl master smeše probe za Lightcycler 480 (Roche, kat. br. 04887301001), u ploču sa 384 mesta (Roche kat. br.
04887301001). PCR u realnom vremenu je urađen u LightCycler480 PCR sistemu u realnom vremenu (Roche).
[0495] Da bi se izračunala relativan stepen promene, podaci su analizirani upotrebom ΔΔCt postupka i normalizacijom u odnosu na testove rađene sa ćelijama transfektovanim sa 10nM AD-1955, ili lažno transfektovanim ćelijama. IC50su izračunavane upotrebom modela krive sa 4 parametra i XLFit programa, a normalizovano u odnosu na ćelije transfektovane sa AD-1955 ili lažno transfektovane ćelije. Sense i antisens sekvence AD-1955 su: sens: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO:19) i antisens UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 20)). Rezultati skrininga su prikazani u Tabeli 4.
Tabela 2. Skraćenice nukleotidnih monomera upotrebljenih u predstavljanju sekvenci nukleinskih kiselina. Podrazumeva se da ovi monomeri, kada su prisutni u oligonukleotidu, međusobno su povezani 5'-3'-fosfodiestarskim vezama.
asa
agen A
N dsR T AG ca ananslise antsin se ncekve se e anvoik odife3.NelaTab
a<a>lij ćeB p3 Heu n,1 i0 n 10 od T AG
doze eatnkr dnojeingin
4.Skr aelTab
sa enaagA RN dsT hAG a nac sla
tisenian
sensce en sekv evan koifiod
neat od D
6. ela bTa
Primer 3. In vivo skrining dsRNK dupleksa kod miševa transdukovanih sa AAV koji ekspresuje humani AGT
[0496] Da bi se eksprimirao humani angiotenzinogen, C57/BL6 miševi su najpre transduovani AAV (adeno-asociranim virusnim) vektorom koji eksprimira humani AGT transkript. Nakon najmanje dve nedelje od uvođenja AAV, uzorkovana je krv iz miševa za osnovne vrednosti cirkulišućih nivoa humanog AGT, a životinje su zatim primile jednokratnu subkutanu dozu od 3 mg/kg jednog od dsRNK agenasa navedenih u Tabelama 5 i 6 (N =3 po grupi). Krv je ponovo uorkovana iz životinja četrnaest dana nakon poslenje doze dsRNK agensa. Nivoi humanog AGT su kvantifikovani ELISA postupkom specifičnim za humani angiotenzinogen, prema protokolu proizvođača (IBL America, kat. br.27412). Podaci su izraženi kao procenat od bazalne vrednosti i predstavljeni su kao srednja vrednost plus standardna devijacija. Određeni dsRNK dupleksi su izabrani za dalju analizu.
Tabela 7. Skrining za jednokratnu doza AGT od 3 mg/kg u miševima transdukovanim sa AAV-humanim AGT
14
Primer 4. In vivo skrining dsRNK dupleksa kod cinomolgus majmuna
[0497] Dupleksi od interesa, identifikovani iz prethodno opisanih studija na miševima, procenjeni su i kod cinomolgus majmuna. Životinje (N=3 po grupi) su prvog dana subkutano primile jednu dozu dsRNK agensa od 3 mg/kg (AD-85481, AD-126306, AD-126307, AD-126308 ili AD-133362). Krv je uzorkovana dana -6, 1, 4, 8, 15, 22, 29, 32, 35, 43, 57, 71, 85 i 99 nakon davanja doze. Nivoi AGT u cirkulaciji su kvantifikovani upotrebom ELISA postupka specifičnog za humani angiotenzinogen (i unakrsno reaktivan sa isti kod cinomolgus majmuna), u skladu sa protokolom proizvođača (IBL America, kat. br.
27412). Podaci su izraženi kao procenat bazalne vrednosti i predstavljeni su kao srednja vrednost plus/minus standardna devijacija. Rezultati su prikazani na Slici 1A. Očigledne razlike između AD-85481, AD-126306 i AD-133362 bile su unutar opsega uobičajene varijabilnosti tipa „od studije do studije“ kod primata različitih od ljudi.
[0498] Dozno zavisne studije su rađene da bi se procenila aktivnost AD-67327 i AD-85481. Iako su eksperimenti bili izvedeni odvojeno, upotrebljeni postupci su suštinski bili isti i rezultati su zajedno predstavljeni na Slici 1B. Cinomolgus majmuni su subkutano primili jednu dozu dsRNK agensa od 0,3 mg/kg, 1 mg/kg ili 3 mg/kg prvog dana. Krv je uzorkovana dana -6, 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43., 50, 57, 64, 71 i 78 nakon davanja doze za AD-67327 i dana -6, 1, 4, 8, 15, 22, 29, 32, 35, 43, 57, 71, 85 i 99 nakon davanja doze za AD-85481. Nivoi AGT u cirkulaciji su kvantifikovani upotrebom ELISA postupka specifičnog za humani angiotenzinogen (i unakrsno reaktivnog sa istim iz cinomolgus majmuna), u skladu sa protokolom proizvođača (IBL America, kat. br. 27412). Podaci su izraženi kao procenat od bazalne vrednosti i predstavljeni su kao srednja vrednost plus/minus standardna devijacija. Rezultati su prikazani na Slici 1B. Ovi podaci pokazuju približno trostruko poboljšanje u efikasnosti i trajanju za AD-85481 u odnosu na AD-67327.
[0499] Sprovedene su i studije višestrukih doza, da bi se odredila potencija i trajnost AD-67327 i AD-85481. Iako su eksperimenti izvođeni odvojeno, upotrebljeni postupci su suštinski bili isti i rezultati su zajedno predstavljeni na Slici 1C. Cinomolgus majmuni su subkutano primali dozu od 1 mg/kg AD-67327 ili AD-85481, jednom na svake četiri nedelje tokom tri nedelje (q4w doziranje) (1., 29. i 57. dana nakon prve doze). Krv je uzeta za procenu cirkulišućeg AGT, -6, 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 i 78 dana nakon prve doze AD-67327 i -8, 1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 57, 64, 71, 85, 99 dana nakon prve doze AD-85481. Ovi podaci pokazuju povećanu potenciju i trajnost utišavanja ciljanog gena sa AD-85481 u poređenju sa AD-67327.
14
Primer 5. Tretman hipertenzije sa AGT dsRNK u modelu spontano hipertenzivnih pacova
[0500] Dizajnirana je specifična dsRNK za pacove, da bi se ispitao efekat isključivanja AGT u modelu spontano hipertenzivnih pacova. Spontano hipertenzivnim pacovima (N=9 po grupi) je subkutano data doza od 10 mg/kg AGT dsRNK za pacove, jednom na svake 2 nedelje (10 mg/kg q2w), ili dneve oralne doze ARB valsartana (31 mg/kg/dan), ili dnevne oralne doze ACE inhibitora kaptoprila (100 mg/kg/dan). Odabrane kombinacije (dsRNK agens specifičan za pacova plus valsartan ili kaptopril plus valsartan) takođe su procenjivane, nakon primene doza koje su prethodno navedene. Srednji arterijski pritisak je meren telemetrijom u periodu od 4 nedelje. Nakon četiri nedelje tretmana, životinje su anestezirane i.p. injekcijom pentobarbitala i krv je uzorkovana iz portalne vene jetre radi merenja AGT u plazmi, renina u plazmi, angiotenzina II u plazmi, aldosterona u plazmi, K<+>u plazmi, kao i aktivnosti Renina u plazmi. Vrednosti težine srca i dužine tibije (za normalizaciju težine srca) takođe su dobijene.
[0501] Tretman dsRNK agensom specifičnim za pacove snizio je nivoe AGT u plazmi za preko 98%, kada je agens davan samostalno ili u kombinaciji sa valsartanom, u poređenju sa nivoima pre tretmana (Slika 2A). Pokazano je i da tretman kombinacijom valsartana i kaptoprila značajno smanjuje nivoe AGT u serumu. Svi tretmani su povećali nivo Renina, pri čemu je najveći porast zabeležen kod životinja tretiranih kombinacijom valsartana i dsRNK agensa, a sledeće je značajno povećanje je uočeno u grupi koja je tretirana samo sa dsRNK agensom. Utvrđeno je da samo kombinovana terapija sa valsartanom i dsRNK agensom snižava nivoe cirkulišućeg Angiotenzina II. Trend ka smanjenju AGT u urinu je uočen nakon tretmana dsRNK agensom, što ukazuje da nivoi AGT proteina u bubregu nisu značajno inhibirani tretmanom sa dsRNK agensom (Slika 3). Utvrđeno je i da samo kombinacija valsartana i dsRNK agensa značajno snižava AGT u urinu. Nijedan tretman nije izmenio nivo aldosterona. Trend povećanja nivoa K<+>u plazmi uočen je u svim grupama, pri čemu je značajno povećanje postignuto samo u grupi tretmanoj kombinacijom valsartana i siRNK.
[0502] Slika 2B prikazuje srednje nivoe arterijskog pritiska merenog telemetrijom tokom eksperimenta, grafički prikazane u odnosu na početne nivoe krvnog pritiska. Svaki od tretmana je prouzrokovao statistički značajno smanjenje krvnog pritiska u poređenju sa netretiranim životinjama. Statistička poređenja (p<0,05) su zabeležena u odnosu na početnu vrednost (#) ili valsartan plus kaptopril ($). U snižavanju srednjeg arterijskog pritiska, tretman valsaratanom sa dsRNK agensom specifičnim za pacove, bio je značajno bolji od tretmana kaptoprilom sa valsartanom.
[0503] Slika 2C prikazuje težine srca normalizovane na dužinu tibije, da bi se obezbedila mera srčane hipertrofije. Tretman i valsartanom sa kaptoprilom i valsartanom sa dsRNK agensom je bio efektivan u smanjenju srčane hipertrofije u odnosu na kontrolu (p<0,05), dok je valsartan sa dsRNK agensom, takođe smanjio srčanu hipertrofiju u odnosu na valsartan sa kaptoprilom (p<0,05). Slika 2E prikazuje iste podatke kao tačkasti dijagram težine srca normalizovane na dužinu tibije u odnosu na MAP. Uočen je linearni odnos između srčane hipertrofije i MAP, pri čemu tretman valsartanom sa dsRNK agensom obezbeđuju najveće smanjenje srčane hipertrofije. Veličina kardiomiocita je bila smanjena u odnosu na kontrolu u svim grupama, izutev valsartana (Slika 2F), dok je NT-proBNP bio smanjen u grupi koja je primala kaptopril sa valsartanom, a trend smanjenja je zapažen i u grupi koja je primala valsartan sa dsRNK (Slika 2G).
[0504] Slika 2D prikazuje relativnu aktivnost Renina na nivou od 4 nedelje u odnosu na početnu vrednost. Aktivnost Renina u plazmi (PRA), koja odražava smanjenu angiotenzinsku signalizaciju, ukazuje na jasno povećanje PRA nakon tretmana dsRNK agensom (p<0,05 u odnosu i na početnu vrednost i kontrolnu grupu, i za dsRNK i za valsartan sa siRNK). PRA test meri aktivnost Renina kvantifikovanjem količine Angiotenzina I koji je Renin proizveo u uzorku krvi, u prisustvu angiotenzinogena u višku. Ovi podaci pokazuju smanjenje signalizacije Angiotenzina II nakon tretmana
1
agensom AGT-dsRNK, kao i da je efekat pojačan istovremenim tretmanom sa valsartanom. Zbog pozitivne regulacije, cirkulišući angiotenzin II ostaje intaktan, čak i kada su nivoi AGT skoro potpuno isključeni. Podaci ukazuju i da AGT-dsRNK agens prouzrokuje sličan antihipertenzivni efekat kao valsartan i kaptopril. Bez vezivanja za teoriju, predlaže se da se nivoi angiotenzina II obaraju samo kada se kombinuju dsRNK agens i valsartan, što dovodi do sinergističkog smanjenja krvnog pritiska.
[0505] Efekat raznih tretmana na nivoe AngI i AngII u krvi i bubrezima ispitivan je nakon četiri nedelje tretmana. Slike 4A-4C pokazuju da je tretman sa valsartanom i kaptoprilom, bilo pojedinačno ili u kombinaciji, značajno povećao nivoe AngI u krvi u poređenju sa kontrolom koja je primala rastvarač (Slika 4A). dsRNK agens samostalno nije značajn promenio nivoe AngI u krvi, ali je kombinacija valsartana sa dsRNK agensom značajno smanjila AngI u krvi u poređenju sa kontrolom koja je primala rastvarač, kao i sa tretmanom samo sa dsRNK agensom. Utvrđeno je i da valsartan samostalno značajno povećava AngII u krvi u poređenju sa kontrolom (Slika 4B). Kombinacija valsartana sa dsRNK agensom je takođe značajno smanjila AngII u krvi, u poređenju sa kontrolom koja je primala rastvarač. Ove promene su dovele do značajnog smanjenja odnosa AngII/AngI kod životinja tretiranih kaptoprilom i kombinacijom kaptopril valsartan. Podaci za kaptopril i valsartan su u skladu sa njihovim mehanizmima delovanja, dok podaci za dsRNK ukazuju na mali pojedinačan efekat na AngII/I u krvi.
[0506] Slike 5A-5C pokazuju da dsRNK agens smanjuje renalni AngI bez očiglednog efekta na renalni AngII, što dovodi do povećanog renalnog AngII/I odnosa. Slika 5A pokazuje da svaki od valsartana i kaptoprila značajno povećava renalni AngI, dok kombinacija agenasa nije imala značajan uticaj na nivo AngI. Renalni AngI je bio značajno smanjen i nakon tretmana sa dsRNK agensom i kombinacijom dsRNK agensa sa valsartanom. Štaviše, kombinovani tretman je značajno smanjio nivo renalnog AngI u poređenju tretmanom samo sa dsRNK agensom. Slika 5B prikazuje promenu u bubrežnom AngII koja nije bila statistički znalajna nakon tretmana sa bilo kojom od monoterapije izuzev kaptorila, tj. sa valsartanom ili dsRNK agensom, pojedinačno. Međutim, pokazano je da kombinacija kaptoprila i valsartana, kao i kombinacija valsartana i dsRNK agensa značajno smanjuju bubrežni Ang II. Podaci za kaptopril i valsartan su u skladu sa njihovim mehanizmima delovanja, dok podaci za dsRNK ukazuju na mali pojedinačan efekat na AngII u bubrezima. Odnos renalnog AngII/AngI se povećao za 4 puta nakon primene AGT dsRNK agensa samostalno (Slika 5C). Nasuprot navedenom, smanjenje od preko 70% u odnosu Ang II/Ang I je uočeno nakon tretmanaa valsartanom, kaptoprilom i kombinacijom valsartan kaptopril. Nije uočena značajna promena u odnosu AngII/AngI nakon tretmana kombinacijom valsartan AGT dsRNK agens. Pokazano je takođe da povećanje renalnog AngII nije rezultat promene nivoa angiotenzinskog receptora u bubrezima ili ekspresije ACE iRNK u bubrežnoj kori ili srži. Slike 6A-6C prikazuju promene u nivou AT1a receptora, AT1b receptora ili ACE mRNK u bubrezima koje nisu bile statistički značajne pod bilo kojim uslovima tretmana izuzev u jednom. Tretman kaptoprilom prouzrokovao je značajno povećanje nivoa AT1b receptora u srži bubrega. Takođe, procenjen je efekat režima tretmana na funkciju bubrega. Nisu uočene promene u brzini glomerularne filtracije (GFR), natriurezi i albuminuriji. Ovo ukazuje da ovi tretmani nisu narušili funkciju bubrega.
[0507] Tokom eksperimenta praćeni su i zapremina urina i natrijum u urinu. Tretman valsartanom dsRNK agensom, valsartanom kaptoprilom i samo kaptoprilom, izazvao je značajno povećanje zapremine urina unutar grupa, između početne vrednosti i nakon 4 nedelje (Slika 7). Poređenje zapremine urina između grupa nakon 4 nedelje, ukazalo je na značajno povećanje izlučivanja urina kod životinja tretiranih kaptoprilom u poređenju sa svim ostalim grupama. Tretman valsartanom dsRNK agensom je doveo do značajnog povećanja izlučivanja urina nakon 4 nedelje, u poređenju sa tretmanom valsartanom pojedinačno ili sa kontrolom. Tokom eksperimenta nisu uočene značajne promene u količini natrijumu u urinu između ili unutar grupa.
1 1
[0508] Navedeni podaci pokazuju da smanjeni odnos renalnog Ang II/I tokom ACEi i ARB potvrđuje da bubrežni ACE generiše Ang II, i da tkivni Ang II predstavlja AT1R-internalizovan Ang II (van Esch i saradnici, Cardiovasc Res 201086(3):401-409). Dalje, smanjenje bubrežnog Ang I nakon tretmana sa AGT siRNK za ciljano delovanje na jetru, pokazalo je da proizvodnja bubrežnog Anga zavisi od AGT jetre. Iako je urinarni AGT bilo delimično poreklom iz bubrega, ovaj renalni AGT ne doprinosi stvaranju renalnog Ang, kao što je ranije pokazano (Matsusaka i saradnici, JASN 201223: 1181-1189). Povećani odnos bubrežnog Ang II/I nakon AGT dsRNK tretmana, a koji omogućava nivoima Ang II u bubregu da ostanu netaknuti, ukazuje na pojačanu internalizaciju Ang II, iako u odsustvu poozitivne regulacije AT1b receptora. U skladu sa ovim konceptom, aditivna izloženost ARB je praktično ukinula renalni Ang II. Tretman sa AGT dsRNK agensom specifičnim za jetru, sinergistički je snižio arterijski pritisak kada je data kombinaija sa postojećim blokatorima RAS, a bila je smanjena i proizvodnja Ang u bubrezima, bez očiglednih negativnih efekata na funkciju bubrega.
Primer 6. Lečenje hipertenzije sa AGT dsRNK u modelu pacova za ishranu sa visokom koncentracijom soli
[0509] Model pacova sa dezoksikortikosteron acetatom (DOCA) so je dobro uspostavljen model za hipertenziju u kontekstu visokih nivoa soli i smatra se modelom neurogene hipertenzije usled uticaja na centralni i periferni nervni sistem (Basting T & Lazartigues E, Cur Hypertension Rep 2017).
[0510] Po dolasku, Sprague-Dawley pacovima je dozvoljeno da se aklimatizuju tokom 7 dana. Nakon toga, pacovima su pod anestezijom izofluranom, intraabdominalno, u abdominalnu aortu, implantirani telemetrijski predajnici. Pacovima je zatim dozvoljeno da se oporave od ove procedure tkom 10 dana. Od tada pa nadalje, telemetrijski su mereni krvni pritisak, broj otkucaja srca i drugi pokazatelji hipertenzije, u vremenskom periodu od 7 nedelja. Tokom prve 4 nedelje, životinjama je subkutano implantiran i pelet sa 200 mg DOCA, dok su u vodi za piće dobijajli 0,9% soli (ad libitum), što je indukovalo hroničnu hipertenziju. Nakon ovog perioda, tokom kog započinje hipertenzija, započet je i tronedeljni tretman. Pacovi su tretirani sa
1) rastvaračem;
2) valsartanom, 31 mg/kg/dan kroz vodu za piće;
3) AGT dsRNK agensom, u dozi od 10 mg/kg jednom u dve nedelje, subkutano;
4) spironolaktonom, 50 mg/kg/dan, subkutano; kombinacijom AGT dsRNK agensa, u dozi od 10 mg/kg jednom u dve nedelje, subkutano, i valsartanom, u dozi od 31 mg/kg/dan, kroz vodu za piće;
5) AGT dsRNK agensom, u dozi od 10 mg/kg jednom u dve nedelje, subkutano, kao i spironolaktonom, 50 mg/kg/dan, subkutano;
6) valsartanom, u dozi od 31 mg/kg/dan, kroz vodu za piće, kao i spironolaktonom, 50 mg/kg/dan, subkutano; ili
7) AGT dsRNK agensom, u dozi od 30 mg/kg, jednom u dve nedelje, subkutano. Dodatno, jedna grupa pacova koji nisu primili DOCA i so u vodi za piće poslužila je kao kontrola za procenu efekta tretmana na normalizaciju krvnog pritiska.
Primer 7. Tretman gojaznosti sa AGT dsRNK agensom u mišjem modelu gojaznosti izazvane ishranom sa visokim sadržajem masti (DIO)
[0511] Šesnaest nedelja stari gojazni miševi hranjeni visokim sadržajem masti (HFF) (ishranom izazvana gojaznost (DIO)) i kontrolne životinje normalne težine nabavljene su i držane na ishrani sa visokim sadržajem masti (60% kalorija u obliku masti) ili na normalnoj ishrani briketiranom hranom. Nakon aklimatizacije, životinje su podeljene u četiri grupe: Normalna težina PBS; Normalna težina
1 2
AGT dsRNK; DIO PBS; i DIO AGT dsRNK (n=5/grupi). Životinje su dobijale 10 mg/kg dsRNK koja je bila specifična za miša ili PBS, svake druge nedelje tokom 12 nedelja, počevši od nedelje 0. Svake dve nedelje, životinje su merene i uzorkovana im je krv. Nivoi AGT u serumu su određivani ELISA testom. Test tolerancije na glukozu nakon gladovanja je urađen pre davanja doze, 6 nedelja nakon prve doze i dvanaest nedelja nakon prve doze. Težina organa je izmerena na kraju studije.
[0512] Davanje AGT dsRNK agensa je bilo efektivno u utišavanju AGT i kod životinja hranjenih sa visokim sadržajem masti i kod životinja hranjenih normalnom briketiranom hranom, sa trajnim obarenjem AGT dsRNK agensom od oko 93% u tretiranim grupama, počevši od prve vremenske tačke, dve nedelje nakon prvog davanja dsRNK agensa.
[0513] Tretman sa AGT dsRNK agensom bio je efektivan i značajno je smanjio prirast telesne težine u poređenju sa DIO miševima tretiranim PBSom, što je utvrđeno dvofaktorskim ANOVA testom sa ponovljenim merenjima kod DIO miševa, počevši od dve nedelje nakon prve doze i održavano je tokom studije (Slika 8A). U analizi kojom su upoređene početne težine, grupa DIO+AGT dsRNK nije dobila na težini u odnosu na početnu težinu sve do poslednje vremenske tačke. Pre poslednje vremenske tačke, miševi su ili izgubili na težini u odnosu na početnu težinu (2, 4, 6 nedelje), ili nije bilo razlike u težini (nedelje 8, 10). Nije uočena značajna razlika u težini između miševa tretiranih sa PBSom i AGT dsRNK agensom koji su hranjeni normalnom hranom do 10. i 12. nedelje studije.
[0514] Težine organe su određivane na kraju studije, da bi se procenio efekat tretmana sa AGT dsRNK agensom na lokaciju deponovanja masti. Težina jetre DIO miševa tretiranih sa AGT dsRNK agensom bila je značajno niža nego kod DIO miševa tretiranih da PBS-om (Slika 8B). Nije uočena značajna razlika ni u težini jetre između miševa tretiranih AGT dsRNK agensom i PBS-om koji su hranjeni normalnom hranom. Težina masnog tkiva (epididimalnog) bila je statistički veća u grupi DIO+AGT siRNK u odnosu na DIO+PBS, dok je kod životinja normalne težine zapažen suprotan efekat. Nije bilo značajne razlike ni u težini mišića lista između sve četiri grupe.
[0515] Testovi tolerancije na glukozu su vršeni u nedelji 0 (pre davanja doze), kao i 6. i 12. nedelji, upotrebom standardnog protokola. Glukoza u krvi je merena pre davanja doze, 30, 60, 90 i 120 minuta nakon bolusne intraperitonealne primene glukoze, upotrebom AlphaTRAK-a<®>2 glukometra (Abbott Animal Health). Rezultati su prikazani na Slikama 9A-9C. U nedelji 0, DIO miševi su imali smanjenu toleranciju na glukozu u poređenju sa kontrolama koje su hranjene normalnom hranom. Do šeste nedelje, uočena je značajna razlika u višestrukim poređenjima post-hoc testom, između DIO miševa tretiranih sa AGT dsRNK agensom i DIO miševa tretiranih PBS-om. U dvanaestoj nedelji, isključujući jednu DIO+PBS životinju čije su vrednosti bile iznad granice glukometra, i dalje je postojala značajna razlika između DIO miševa tretiranih AGT dsRNK agensom i DIO miševa tretiranih PBS-om. Pored toga, podaci iz DIO+AGT siRNK grupe nisu se razlikovali od bilo koje kontrolne grupe (tretirane sa AGT dsRNK agensom ili kod miševa tretiranih PBS-om koji su hranjeni normalnom hranom) nakon šest ili dvanaest nedelja.
Primer 8. Tretman NASH sa AGT dsRNK agensom u modelu miša nakon ishrane sa visokim sadržajem masti i fruktoze
[0516] Model ishrane miševa visokim sadržajem masti i visokim sadržajem fruktoze (HF HFr) predstavlja mišji model za NASH (Softic i saradnici, J Clin Invest 127 (11):4059-4074,2017) i upotrebljen je za demonstraciju efikasnosti AGT siRNK u tretmanu NASH i znakova metaboličkog poremećaja.
[0517] Šest do osam nedelja stari mužjaci C57BL/6 miševa, nabaljeni od kompanije Jackson Laboratories, hranjeni su ishranom sa visokim sadržajem masti, koja je zadržavala 60% kalorija u vidu
1
masti, uz dodatak 30% fruktoze u vodi (Hf Hfr ishrana) tokom 12 nedelja pre tretmana sa AGT dsRNK agensom ili PBS-om (kontrola), da bi se indukovao NASH, ili su hranjenji standardnom briketiranom hranom i vodom. Hrana i voda su bili obezbeđeni ad libitum. Počevši od 12. nedelje, HF HFr hranjeni miševi su svake druge nedelje, a ukupno četiri puta, subkutano primili dozu od 10 mg/kg dsRNK agensa sa ciljanim delovanjem na AGT. Dve nedelje nakon poslednje doze (u 20. nedelji), uzorkovane su jetre, RNK je izolovana i pad AGT u jetri je određivan RT-qPCR postupkom, upotrebom prethodno opisanih postupaka. U jetri Hf Hfr hranjenih miševa tretiranih sa AGT dsRNK agensom, uočeno je smanjenje AGT informacione RNK od 93%, u poređenju sa HF HFr hranjenim miševima koji su primali PBS.
[0518] Kao što se i očekivalo, telesna težina (Slika 10A), kumulativan priprast telesne težine (Slika 10B) i terminalna težina jetre bili su značajno veći kod kontrolnih miševa hranjenih HF HFr u poređenju sa miševima hranjenim standardnom hranom, u svim vremenskim tačkama. Tretman sa AGT dsRNK agensom kod HF HFr hranjenih miševa je prouzrokovao gubitak težine od 12. do 20. nedelje, što je dovelo do značajnog smanjenja terminalne telesne težine u poređenju sa kontrolnim miševima (p = 0,0023). Nije uočena značajna razlika u terminalnoj težini jetre (pri žrtvovanju).
[0519] Lipidi u serumu i jetri, kao i glukoza i insulin u serumu, procenjivani su da bi utvrdio efekat dsRNK agensa u HF HFr modelu. U 20. nedelji, nivoi triglicerida i glukoze u serumu su bili suštinski isti u sve tri grupe (normalna hrana, HF HFr dsRNK, HF HFr kontrola). Nivoi holesterola i insulina u serumu bili su približno isti u obe HF Hfr grupe, a značajno viši nego u grupi koja je hranjena normalnom briketiranom hranom, kao što se i očekivalo. Pokazano je i da tretman AGT dsRNK agensom značajno smanjuje serumske neesterifikovane masne kiseline (NEFA) (p = 0,01). U jetri, holesterol je bio povišen u obe HF HFr grupe u poređenju sa kontrolom hranjenom normalnom briketiranom hranom, ali ponovo nije uočeno značajno smanjenje nakon tretmana sa AGT dsRNK agensom. Značajno smanjenje triglicerida u jetri (p = 0,017) i slobodnih masnih kiselina (p = 0,001) uočeno je u grupi koja je bila tretirana sa AGT dsRNK agensom u poređenju sa kontrolnom grupom. Moguć trend ka smanjenju tiobarbiturne kiseline (TBA), indikatora oksidacije lipida, uočen je u grupi tretiranoj sa AGT dsRNK.
[0520] Na oštećenje jetre je ukazalo značajno povećanje nivoa alanin aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST) i glutamat dehidrogenaze (GLDH) kod kontrolnih Hf Hfr miševa u poređenju sa miševima hranjenim normalnom hranom. Tretman AGT dsRNK agensom je doveo do značajnog smanjenja ALT (p = 0,01) (Slika 11A) sa trendom ka smanjenju AST (Slika 11B) i GLDH (Slika 11C), u poređenju sa kontrolnim tretiranim HF HFr miševima.
[0521] Oštećenje jetre je procenjeno i histopatološki, kao i NAS skorovima. Kao što se očekivalo, HF HFr dijeta je izazvala značajnu steatozu, balonirajuću degeneraciju i lobularnu inflamaciju što je rezultiralo povećanjem ukupnog NAS skora u poređenju sa miševima hranjenim normalnom hranom. Tretman sa AGT dsRNK agensom je doveo do značajnog smanjenja balonirajuće degeneracije (p = 0,04) sa trendom ka smanjenju lobularne inflamacije, što je rezultiralo značajnim smanjenjem ukupnog NAS skora (p = 0,01) kod HF HFr hranjenih životinja tretiranih Asa GT dsRNK agensom, u poređenju sa HF HFr hranjenim kontrolnim životinjama.
[0522] Navedni podaci pokazuju da je tretman sa AGT dsRNK agensom efektivan u ublažavanju pojedinih znakova NASH. Važno je napomenut da je tretman sa AGT dsRNK agensom bio je efektivan u smanjenju težine i enzima oštećenja jetre, sa značajnim smanjenjem ALT i blagim smanjenjem AST i GLDH. Uočeno je i smanjenje lobularne inflamacije i skorova baloniranja, što je smanjilo ukupan NAS skor.
1 4
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi 1. Agens koji je dvolančana ribonukleinska kiselina (dsRNK), ili njegova so, za inhibiranje ekspresije angiotenzinogena (AGT), pri čemu dsRNK agens, ili njegova so, sadrži sens lanac i antisens lanac koji obrazuju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži nukleotidnu sekvencu 5’-gsuscaucCfaCfAfAfugagaguaca-3’ (SEQ ID NO:482), a antisens lanac sadrži nukleotidnu sekvencu 5’- usGfsuac(Tgn)cucauugUfgGfaugacsgsa-3’ (SEQ ID NO:666), gde a, g, c i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, G, C i U, tim redom; Af, Gf, Cf i Uf su 2'-fluoro A, G, C i U, tim redom; s je fosforotioatna veza; a (Tgn) je S-izomer timidin-glikolne nukleinske kiseline (GNA), i dalje sadrži ligand koji je derivat N-acetilgalaktozamina (GalNAc). 2. dsRNK agens, ili njegova so, prema patentnom zahtevu 1, gde je ligand: (i) konjugovan na 3' kraj sens lanca dsRNK agensa, ili njegove soli; i/ili (ii) derivat N-acetilgalaktozamina (GalNAc), koji je
    dalje opciono, pri čemu je dsRNK agens, ili njegova so, konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    a, gde X je O ili S; ili (iv) jedan ili više GalNAc derivata, vezanih preko monovalentnog, dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera. 3. Izolovana ćelija koja sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, prema patentnom zahtevu 1 ili 2. 4. Farmaceutska kompozicija za inhiranje ekspresije gena koji kodira AGT, koja sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, prema patentnom zahtevu 1 ili 2. 5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, prema patentnom zahtevu 1 ili 2, i lipidnu formulaciju. 6. In vitro postupak inhibiranja ekspresije AGT gena u ćeliji, postupak koji obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom, ili njegovom soli, prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili farmaceutskom kompozicijom prema patentnom zahtevu 4 ili 5, čime se inhibira ekspresija AGT gena u ćeliji. 7. dsRNK agens, ili njegova so, prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 ili 5, za upotrebu u lečenju subjekta koji ima poremećaj povezan sa AGT. 8. dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je subjektu postavljena dijagnoza poremećaja povezanog sa AGT, opciono, pri čemu je poremećaj povezan sa AGT izabran iz grupe koju čine visok krvni pritisak, hipertenzija, granična hipertenzija, primarna hipertenzija, sekundarna hipertenzija, izolovana sistolna ili dijastolna hipertenzija, hipertenzija povezana sa trudnoćom, dijabetska hipertenzija, rezistentna hipertenzija, refraktorna hipertenzija, paroksizmalna hipertenzija, renovaskularna hipertenzija, Goldblatova hipertenzija, hipertenzija povezana sa niskom aktivnošću renina ili koncentracijom renina u plazmi, očna hipertenzija, glaukom, plućna hipertenzija, portalna hipertenzija, sistemska venska hipertenzija, sistolna hipertenzija, labilna hipertenzija; hipertenzivna bolest srca, hipertenzivna nefropatija, ateroskleroza, arterioskleroza, vaskulopatija, dijabetska nefropatija, dijabetska retinopatija, hronična srčana insuficijencija, kardiomiopatija, dijabetska kardiomiopatija, glomeruloskleroza, koarktacija aorte, aneurizma aorte, ventrikularna fibroza, insuficijencija srca, infarkt miokarda, angina, moždani udar, bubrežna bolest, bubrežna insuficijencija, sistemska skleroza, oraničenje intrauterinog rasta (IUGR), ograničenje rasta fetusa, gojaznost, steatoza jetre/masna jetra, nealkoholni steatohepatitis (NASH), bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD); intolerancija na glukozu, dijabetes tipa 2 (dijabetes nezavisan od insulina) i metabolički sindrom. 9. dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, pri čemu dovođenje ćelije u kontakt sa dsRNK agensom, ili njegovom soli, ili farmaceutskom kompozicijom, inhibira ekspresiju AGT za najmanje 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95%. 10. dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-9, pri čemu subjekat: (i) ima sistolni krvni pritisak od najmanje 130 mm Hg ili dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg; (ii) ima sistolni krvni pritisak od najmanje 140 mm Hg i dijastolni krvni pritisak od najmanje 80 mm Hg; (iii) čovek je; i/ili (iv) deo je grupe podložne osetljivosti na so, prekomerne je težine, gojazan je ili je u trudnoći. 1 11. dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-10, pri čemu se dsRNK agens daje subjektu u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg, i/ili pri čemu se dsRNK agens, ili njegova so, ili farmaceutska kompozicija, daju subkutano; i/ili pri čemu se subjektu daje dodatni terapijski agens za lečenje hipertenzije, opciono, pri čemu je dodatni terapijski agens: (a) izabran iz grupe koju čine diuretik, inhibitor angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), antagonista receptora angiotenzina II, beta-blokator, vazodilatator, blokator kalcijumovih kanala, antagonista aldosterona, alfa2-agonista, inhibitor renina, alfa-blokator, adrenergički agens perifernog delovanja, selektivni delimičan agonista D1 receptora, neselektivni alfaadrenergički antagonista, sintetički, steroidni antimineralokortikoidni agens, inhibitori angiotenzinskog receptora-neprilizina (ARNi), Entresto<®>, sakubitril/valsartan; ili antagonista endotelinskog receptora (ERA), sitaksentan, ambrisentan, atrasentan, BQ-123, zibotentan, bosentan, macitentan i tezosentan; kombinacija bilo kojih od prethodno navedenih; i terapijski agens za hipertenziju formulisan kao kombinacija agenasa; ili (b) sadrži antagonistu receptora angiotenzina II, dodatno opciono, pri čemu je antagonista receptora angiotenzina II izabran iz grupe koju čine losartan, valsartan, olmesartan, eprosartan i azilsartan. 12. Komplet koji sadrži dsRNK agens, ili njegovu so, prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili farmaceutsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 4 ili 5. 2
RS20231051A 2018-05-14 2019-05-14 Irnk kompozicije za angiotenzinogen (agt) i postupci njihove upotrebe RS64812B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862671094P 2018-05-14 2018-05-14
US201862727141P 2018-09-05 2018-09-05
US201962816996P 2019-03-12 2019-03-12
EP19728800.4A EP3794122B1 (en) 2018-05-14 2019-05-14 Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
PCT/US2019/032150 WO2019222166A1 (en) 2018-05-14 2019-05-14 Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64812B1 true RS64812B1 (sr) 2023-12-29

Family

ID=66770566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231051A RS64812B1 (sr) 2018-05-14 2019-05-14 Irnk kompozicije za angiotenzinogen (agt) i postupci njihove upotrebe

Country Status (30)

Country Link
US (3) US11015201B2 (sr)
EP (2) EP3794122B1 (sr)
JP (3) JP7346460B2 (sr)
KR (2) KR102893711B1 (sr)
CN (4) CN118638789A (sr)
AU (2) AU2019269418B2 (sr)
BR (1) BR112020022943A2 (sr)
CA (2) CA3294778A1 (sr)
CL (3) CL2020002865A1 (sr)
CO (1) CO2020015314A2 (sr)
DK (1) DK3794122T5 (sr)
ES (1) ES2967713T3 (sr)
FI (1) FI3794122T3 (sr)
HR (1) HRP20231412T1 (sr)
HU (1) HUE064073T2 (sr)
IL (2) IL292877B2 (sr)
LT (1) LT3794122T (sr)
MX (2) MX421205B (sr)
MY (1) MY198716A (sr)
PE (1) PE20210114A1 (sr)
PH (1) PH12020551904A1 (sr)
PL (1) PL3794122T3 (sr)
PT (1) PT3794122T (sr)
RS (1) RS64812B1 (sr)
SG (1) SG11202011144QA (sr)
SI (1) SI3794122T1 (sr)
SM (1) SMT202300388T1 (sr)
TW (1) TWI851574B (sr)
WO (1) WO2019222166A1 (sr)
ZA (1) ZA202108348B (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015264038B2 (en) 2014-05-22 2021-02-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen (AGT) iRNA compositions and methods of use thereof
TWI851574B (zh) 2018-05-14 2024-08-11 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
BR112022009216A2 (pt) * 2019-11-13 2022-08-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos e composições para tratar um distúrbio associado a angiotensinogênio (agt)
EP4149618A4 (en) 2020-05-12 2024-07-03 Duke University COMPOSITIONS AND METHODS FOR CONTROLLING BLOOD PRESSURE
WO2021231552A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Duke University Compositions and methods for controlling blood pressure
EP4381071A1 (en) * 2021-08-04 2024-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing angiotensinogen (agt)
US20240401045A1 (en) * 2021-10-01 2024-12-05 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen-modulating compositions and methods of use thereof
CN120775847A (zh) * 2021-10-20 2025-10-14 厦门甘宝利生物医药有限公司 Agt抑制剂及其用途
IL312811A (en) 2021-11-16 2024-07-01 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co Ltd Composition and method for inhibiting angiotensinogen (agt) protein expression
US20250197853A1 (en) * 2021-11-19 2025-06-19 Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Sirna targeting angiotensinogen and pharmaceutical use of sirna
WO2023138650A1 (zh) * 2022-01-20 2023-07-27 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其应用及制备方法
WO2023155909A1 (zh) * 2022-02-18 2023-08-24 南京明德新药研发有限公司 三氮唑核苷类似物及其作为嵌入基团的应用
US20240041913A1 (en) * 2022-04-01 2024-02-08 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen-modulating compositions and methods of use thereof
KR20250023356A (ko) 2022-04-29 2025-02-18 베이스큐어 테라퓨틱스 뉴클레오타이드 유사체-함유 이중 가닥 RANi 유사체의 접합체
CN117264948B (zh) * 2022-06-14 2024-05-10 广州必贝特医药股份有限公司 抑制血管紧张素原基因表达的RNAi抑制剂及其应用
WO2024013334A1 (en) * 2022-07-15 2024-01-18 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acids for inhibiting expression of agt in a cell
KR20250046303A (ko) * 2022-08-05 2025-04-02 사네진 바이오 유에스에이 인크. 안지오텐시노겐 (agt)을 표적화하는 이중 가닥 rna 및 그의 사용 방법
TW202449152A (zh) 2023-02-09 2024-12-16 美商艾拉倫製藥股份有限公司 Ｒｅｖｅｒｓｉｒ分子及其使用方法
WO2024234831A1 (zh) * 2023-05-15 2024-11-21 苏州时安生物技术有限公司 一种用于调节血管紧张素原基因表达的双链rna、其缀合物、药物组合物及用途
EP4562158A1 (en) 2023-06-13 2025-06-04 Arnatar Therapeutics, Inc Advanced rna targeting (arnatar) for angiotensinogen
AU2024304372A1 (en) * 2023-06-16 2026-01-15 Synerk Inc. Nucleic acid targeting angiotensinogen and use thereof
WO2025007961A1 (zh) 2023-07-06 2025-01-09 大睿生物 调控AGT表达的dsRNA分子
CN119585433A (zh) * 2023-07-06 2025-03-07 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种抑制AGT基因表达的RNAi剂及其应用
TW202509216A (zh) * 2023-07-14 2025-03-01 大陸商北京安龍生物醫藥有限公司 靶向血管收縮素原的寡核苷酸及其用途
WO2025036511A1 (zh) 2023-08-16 2025-02-20 成都国为生物医药有限公司 一种siRNA、siRNA缀合物、药物组合物及其用途
CN119585432B (zh) * 2023-08-22 2025-08-12 成都先衍生物技术有限公司 一种靶向AGT基因表达的siRNA及其缀合物和用途
CN121006363A (zh) * 2023-09-18 2025-11-25 广州必贝特医药股份有限公司 用于同时抑制两个靶基因表达的siRNA、药物及其应用
WO2025087237A1 (zh) * 2023-10-23 2025-05-01 广东东阳光药业股份有限公司 一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途
WO2025097040A1 (en) * 2023-11-03 2025-05-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for reducing angiotensinogen
CN120005876A (zh) * 2023-11-15 2025-05-16 纳肽得(青岛)生物医药有限公司 抑制血管紧张素原表达的siRNA及其用途
TW202543655A (zh) 2023-12-12 2025-11-16 美商艾拉倫製藥股份有限公司 用於治療血管收縮素原（ａｇｔ）相關疾患的方法及組成物
WO2025130862A1 (zh) * 2023-12-18 2025-06-26 广东东阳光药业股份有限公司 一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途
CN120350001A (zh) * 2024-01-22 2025-07-22 尧唐(上海)生物科技有限公司 靶向AGT基因的gRNA及其应用
WO2026026829A1 (zh) * 2024-07-31 2026-02-05 苏州吉玛基因股份有限公司 靶向血管紧张素原的双链rna分子、其修饰物和应用
CN118685411B (zh) * 2024-08-27 2024-11-05 苏州炫景生物科技有限公司 抑制agt基因表达的双链寡核苷酸、其缀合物及用途
WO2026050125A1 (en) 2024-08-28 2026-03-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating an angiotensinogen- (agt-) associated disorder
CN119040330B (zh) * 2024-11-01 2025-03-04 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种调控AGT基因表达的siRNA及其用途

Family Cites Families (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5130300A (en) 1986-03-07 1992-07-14 Monsanto Company Method for enhancing growth of mammary parenchyma
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
FR2623508B1 (fr) 1987-11-20 1990-04-20 Commissariat Energie Atomique Proteine basique denommee phospholipase a2 isolee de venin de serpent de la famille des elapides et sa sequence en amino-acides, derives et fragments de ladite proteine, leur procede d'obtention, compositions therapeutiques et agents de diagnostic contenant ladite proteine et/ou ses derives et/ou ses fragments
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
MY107332A (en) 1990-08-03 1995-11-30 Sterling Drug Inc Compounds and methods for inhibiting gene expression.
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
CA2124087C (en) 1991-11-22 2002-10-01 James L. Winkler Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
JP3131222B2 (ja) 1991-12-24 2001-01-31 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5374525A (en) 1992-09-30 1994-12-20 University Of Utah Research Foundation Methods to determine predisposition to hypertension and association of variant angiotensinogen gene and hypertension
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
CA2176256A1 (en) 1993-11-16 1995-05-26 Lyle John Arnold, Jr. Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
WO1996027606A1 (en) 1995-03-06 1996-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US5645620A (en) 1995-05-25 1997-07-08 Foster Wheeler Development Corp. System for separating particulates and condensable species from a gas stream
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
JP2002527061A (ja) 1998-10-09 2002-08-27 インジーン・インコーポレイテッド ｓｓＤＮＡの酵素的合成
MXPA01003643A (es) 1998-10-09 2003-07-21 Ingene Inc Produccion de adnss in vivo.
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US7053207B2 (en) 1999-05-04 2006-05-30 Exiqon A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US20030113330A1 (en) 1999-11-08 2003-06-19 Uhal Bruce D. Methods for treating pulmonary fibrosis
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
JP4413493B2 (ja) 2000-10-04 2010-02-10 サンタリス ファーマ アー／エス プリンｌｎａ類似体の改善された合成方法
US7176303B2 (en) 2003-11-06 2007-02-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of STAT5 expression
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
CN1738648A (zh) 2003-01-17 2006-02-22 佛罗里达大学研究基金会有限公司 小干扰rna基因治疗
CA2519476A1 (en) 2003-03-18 2004-09-30 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with rheumatoid arthritis, methods of detection and uses thereof
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
HUE033977T2 (en) * 2004-08-23 2018-02-28 Sylentis Sau Treatment of eye disorders with siRNAs characterized by increased intraocular pressure
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
US8501703B2 (en) 2005-08-30 2013-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
WO2007090071A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1989307B1 (en) 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
KR101221589B1 (ko) 2006-04-07 2013-01-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
KR101629017B1 (ko) 2007-05-22 2016-06-10 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. 히드록시메틸 치환된 ｒｎａ 올리고뉴클레오티드 및 ｒｎａ 복합체
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
AU2008272918B2 (en) 2007-07-05 2012-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
EP2357231A2 (en) 2007-07-09 2011-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds
WO2009073809A2 (en) 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009151539A1 (en) * 2008-05-24 2009-12-17 Sirnaomics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS
WO2010042749A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Chimeros Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
SG171879A1 (en) 2008-12-03 2011-07-28 Marina Biotech Inc Usirna complexes
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
JP5894913B2 (ja) 2009-06-15 2016-03-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
US20130090371A1 (en) 2010-04-20 2013-04-11 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for inhibition of beta2-adrenergic receptor degradation
EP2563922A1 (en) 2010-04-26 2013-03-06 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
EP3388068A1 (en) 2011-06-21 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes
EP2753631A1 (en) 2011-09-07 2014-07-16 Marina Biotech, Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
EP3730618A1 (en) 2011-11-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
SI3366775T2 (sl) * 2011-11-18 2025-12-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modificirana sredstva RNAI
US9133461B2 (en) * 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
US20150141320A1 (en) 2012-05-16 2015-05-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
WO2014018930A1 (en) 2012-07-27 2014-01-30 Isis Pharmaceuticals. Inc. Modulation of renin-angiotensin system (ras) related diseases by angiotensinogen
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
EA038792B1 (ru) * 2013-05-22 2021-10-20 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ RNAi Serpina1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
KR102234623B1 (ko) * 2013-05-22 2021-04-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｔｍｐｒｓｓ6 조성물 및 이의 사용 방법
CN113057959B (zh) * 2014-02-11 2024-07-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 己酮糖激酶（KHK）iRNA组合物及其使用方法
AU2015264038B2 (en) * 2014-05-22 2021-02-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen (AGT) iRNA compositions and methods of use thereof
TW202503057A (zh) * 2014-10-10 2025-01-16 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於抑制hao1(羥酸氧化酶1(乙醇酸鹽氧化酶))基因表現的組合物及方法
JP2017535552A (ja) * 2014-11-17 2017-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP3262181B1 (en) 2015-02-23 2024-04-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase detritylation of oligomeric compounds
CN115927335A (zh) * 2015-04-13 2023-04-07 阿尔尼拉姆医药品有限公司 类血管生成素3（ANGPTL3）iRNA组合物及其使用方法
WO2016196111A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting angiotensinogen (agt) and methods of use thereof
CN113817735A (zh) 2015-10-08 2021-12-21 Ionis制药公司 用于调节血管紧张素原表达的化合物和方法
US11504391B1 (en) 2016-11-23 2022-11-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNA agents with reduced off-target effect
TWI851574B (zh) 2018-05-14 2024-08-11 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2020097044A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double stranded oligonucleotides
BR112022009216A2 (pt) 2019-11-13 2022-08-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos e composições para tratar um distúrbio associado a angiotensinogênio (agt)
AU2022303164A1 (en) 2021-06-30 2024-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating an angiotensinogen- (agt-) associated disorder
EP4381071A1 (en) 2021-08-04 2024-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing angiotensinogen (agt)

Also Published As

Publication number Publication date
CL2023002870A1 (es) 2024-06-28
EP3794122B1 (en) 2023-08-09
CA3100003A1 (en) 2019-11-21
BR112020022943A2 (pt) 2021-02-17
SMT202300388T1 (it) 2024-01-10
EP4324520A2 (en) 2024-02-21
DK3794122T3 (en) 2023-11-13
AU2025283597A1 (en) 2026-02-12
HRP20231412T1 (hr) 2024-02-16
JP2023182578A (ja) 2023-12-26
MY198716A (en) 2023-09-20
PT3794122T (pt) 2023-11-22
CL2021002326A1 (es) 2022-05-13
JP2025179045A (ja) 2025-12-09
CN112313335A (zh) 2021-02-02
LT3794122T (lt) 2023-11-27
US20240191236A1 (en) 2024-06-13
JP2021522841A (ja) 2021-09-02
US11834661B2 (en) 2023-12-05
US20210310006A1 (en) 2021-10-07
IL292877B1 (en) 2024-04-01
TWI851574B (zh) 2024-08-11
NZ770717A (en) 2025-06-27
CN112313335B (zh) 2024-07-09
WO2019222166A1 (en) 2019-11-21
ZA202108348B (en) 2023-11-29
MX2020012048A (es) 2021-01-29
ES2967713T3 (es) 2024-05-03
AU2019269418B2 (en) 2025-10-09
HUE064073T2 (hu) 2024-02-28
CN118685406A (zh) 2024-09-24
CN118638790A (zh) 2024-09-13
IL292877A (en) 2022-07-01
JP7346460B2 (ja) 2023-09-19
CO2020015314A2 (es) 2021-03-19
US12584130B2 (en) 2026-03-24
IL278539B (en) 2022-06-01
EP4324520A3 (en) 2024-08-28
PE20210114A1 (es) 2021-01-19
TW202016304A (zh) 2020-05-01
SI3794122T1 (sl) 2024-02-29
CA3294778A1 (en) 2026-03-02
CL2020002865A1 (es) 2021-04-30
KR20210010529A (ko) 2021-01-27
US20210095290A1 (en) 2021-04-01
EP3794122A1 (en) 2021-03-24
DK3794122T5 (da) 2024-08-05
IL292877B2 (en) 2024-08-01
KR20250171473A (ko) 2025-12-08
PH12020551904A1 (en) 2021-06-21
US11015201B2 (en) 2021-05-25
CN118638789A (zh) 2024-09-13
KR102893711B1 (ko) 2025-12-01
SG11202011144QA (en) 2020-12-30
MX2025001244A (es) 2025-03-07
FI3794122T3 (fi) 2023-11-07
AU2019269418A1 (en) 2021-01-07
MX421205B (es) 2025-02-10
PL3794122T3 (pl) 2024-03-11
JP7721606B2 (ja) 2025-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7721606B2 (ja) アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
JP7707164B2 (ja) アンギオテンシノーゲン（ａｇｔ）関連障害を処置するための方法および組成物
EP4381071A1 (en) Irna compositions and methods for silencing angiotensinogen (agt)
HK40107874A (en) Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
HK40116744A (zh) 血管紧张素原(agt) irna组合物及其使用方法
HK40116419A (zh) 血管紧张素原(agt)irna组合物及其使用方法
HK40116420A (zh) 血管紧张素原(agt) irna组合物及其使用方法
EA046962B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ иРНК ПРОТИВ АНГИОТЕНЗИНОГЕНА (AGT) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
HK40050733B (en) Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
HK40050733A (en) Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof