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JP7721606B2 - アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 - Google Patents
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JP7721606B2 - アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 - Google Patents

アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法

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Description

関連出願
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／６７１，０９４号、２０１８年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，１４１号、及び２０１９年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８１６，９９６号に関連している。上記の仮特許出願のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、全体が参照により本明細書に援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年５月３日に作成され、１２１３０１＿０８６２０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２７２，４８８バイトのサイズである。
レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）は、血圧の調節に重要な役割を果たす。ＲＡＡＳカスケードは、肝臓からのアンジオテンシノーゲン、及び腎臓の傍糸球体細胞によるレニンの循環系への放出から開始する。レニン分泌は、遠位尿細管におけるＮａ＋負荷、β－交感神経刺激、又は低下した腎臓灌流を含むいくつかの要因によって刺激される。血漿中の活性型レニンは、アンジオテンシノーゲン（肝臓によって産生される）を切断してアンジオテンシンＩにし、その後、それは、循環し、局所的に発現されたアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩＩに変換される。ＲＡＡＳに対するアンジオテンシンＩＩの作用のほとんどは、アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴ１Ｒ）へのその結合によって発揮され、促進されたＮａ＋再吸収又は糸球体ろ過率の調節などの、動脈血管収縮、尿細管作用及び糸球体作用をもたらす。更に、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、カテコールアミン、エンドセリン、セロトニン、並びにＭｇ２＋及びＫ＋のレベルなどの他の刺激とともに、ＡＴ１Ｒ刺激は、アルドステロン放出をもたらし、これが、ひいては、腎臓の遠位尿細管におけるＮａ＋及びＫ＋の排出を促進する。
例えば、過剰なアンジオテンシンＩＩ産生又はＡＴ１Ｒ刺激をもたらすＲＡＡＳの調節不全は、例えば、心臓、腎臓、及び動脈における酸化ストレスの増加、炎症の促進、肥大、及び線維症につながり得る高血圧をもたらし、例えば、左心室線維症、動脈リモデリング、及び糸球体硬化症をもたらす。
高血圧は、先進国において最もよく見られるコントロール可能な疾患であり、成人人口の２０～５０％が罹患している。高血圧は、平均寿命の短縮、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤（例えば大動脈瘤）、末梢動脈疾患、心臓障害（例えば、心肥大（ｈｅａｒｔ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｏｒ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）及び他の心血管関連疾患、障害、又は病態などの様々な疾病、障害及び病態の主要な危険因子である。更に、高血圧は、心血管罹病率及び死亡率の重要な危険因子であることが示されており、脳卒中の全症例の６２％及び心疾患の全症例の４９％を占めるか、又はそれに寄与する。２０１７年には、高血圧に関連する疾病及び障害の発症のリスクを更に低下させるために更に低い血圧の目標を提供するよう、高血圧の診断、予防、及び処置のためのガイドラインの変化が生じた（例えば、Ｒｅｂｏｕｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｔｈｅ ２０１７ ＡＣＣ／ＡＨＡ／ＡＡＰＡ／ＡＢＣ／ＡＣＰＭ／ＡＧＳ／ＡＰｈＡ／ＡＳＨ／ＡＳＰＣ／ＮＭＡ／ＰＣＮＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１７ Ｎｏｖ ７．ｐｉｉ：Ｓ０７３５－１０９７（１７）４１５１７－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１７．１１．００４；及びＷｈｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７ ＡＣＣ／ＡＨＡ／ＡＡＰＡ／ＡＢＣ／ＡＣＰＭ／ＡＧＳ／ＡＰｈＡ／ＡＳＨ／ＡＳＰＣ／ＮＭＡ／ＰＣＮＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１７ Ｎｏｖ ７．ｐｉｉ：Ｓ０７３５－１０９７（１７）４１５１９－１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１７．１１．００６を参照）。
高血圧を処置するのに利用可能な降圧剤の数にもかかわらず、対象の３分の２以上は、１つの降圧剤で制御されず、異なる薬剤クラスから選択される２つ以上の降圧剤を必要とする。これは更に、薬剤の数の増加とともに、アドヒアランスが低下され、副作用が増加されるため、血圧が制御された対象の数を減少させる。
本発明は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断に影響を与えるｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＧＴは、細胞、例えば、ヒト対象などの対象中の細胞中にあり得る。
一態様において、本発明は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド６３５～６５８、６３６～６５８、６４２～６６７、６４２～６６４、６４５～６６７、１２４８～１２７３、１２４８～１２７２、１２４８～１２７０、１２５０～１２７２、１２５１～１２７３、１５８０～１６０２、１５８４～１６０６、１５８７～１６０９、１６０１～１６２３、１８８１～１９０３、２０７４～２０９７、２０７４～２０９６、２０７５～２０９７、２０８０～２１０２、２２７２～２２９４、２２７６～２２９８、２２８１～２３０４、２２８１～２３０３、又は２２８２～２３０４のいずれか１つのヌクレオチド配列からの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列からの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
特定の実施形態において、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド６３５～６５８、６３６～６５８、６４２～６６７、６４２～６６４、６４５～６６７、１２４８～１２７３、１２４８～１２７２、１２４８～１２７０、１２５０～１２７２、１２５１～１２７３、１５８０～１６０２、１５８４～１６０６、１５８７～１６０９、１６０１～１６２３、１８８１～１９０３、２０７４～２０９７、２０７４～２０９６、２０７５～２０９７、２０８０～２１０２、２２７２～２２９４、２２７６～２２９８、２２８１～２３０４、２２８１～２３０３、又は２２８２～２３０４のいずれか１つの少なくとも２１連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列からの少なくとも２１連続ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つからの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つからの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖のヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－８５４８１のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（５’－ＵＧＵＡＣＵＣＵＣＡＵＵＧＵＧＧＡＵＧＡＣＧＡ－３’（配列番号９））からの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖は、ＡＤ－８５４８１のセンス鎖のヌクレオチド配列（５’－ＧＵＣＡＵＣＣＡＣＡＡＵＧＡＧＡＧＵＡＣＡ－３’（配列番号１０））からの少なくとも１９連続ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、ＡＤ－８５４８１のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（５’－ＵＧＵＡＣＵＣＵＣＡＵＵＧＵＧＧＡＵＧＡＣＧＡ－３’（配列番号９）及び５’－ＧＵＣＡＵＣＣＡＣＡＡＵＧＡＧＡＧＵＡＣＡ－３’（配列番号１０））を含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含む。特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、熱的に不安定なヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、及び２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、ＧＮＡ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾である。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、及び２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において、ヌクレオチド修飾の少なくとも１つが、熱的に不安定なヌクレオチド修飾である。特定の実施形態において、熱的に不安定なヌクレオチド修飾は、非塩基性修飾；二本鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；及び不安定な糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環状ヌクレオチド、非固定核酸（ＵＮＡ）、及びグリセロール核酸（ＧＮＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態において、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、二本鎖領域は、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、独立して、３０ヌクレオチド長以下である。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチド又は少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドを更に含む。特定の実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされている。特定の実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体であり、例えば、リガンドは、
である。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の概略図
に示されるようにリガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳであり、例えば、ＸがＯである。
特定の実施形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖が、ヒトＡＧＴをコードするｍＲＮＡに相補性の領域を含み、相補性の領域が、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖配列の１つの少なくとも１９ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、ヒトＡＧＴをコードするｍＲＮＡに相補性の領域を含み、相補性の領域は、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖配列のいずれか１つを含む。特定の実施形態において、相補性の領域は、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖配列のいずれか１つからなる。
特定の実施形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖が、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖の化学修飾ヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖が、二本鎖ＡＤ－８５４８１の化学修飾ヌクレオチド配列（５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’（配列番号１１））を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－リン酸、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－リン酸、及び２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－リン酸であり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－Ｏ－フルオロアデノシン－３’－リン酸、２’－Ｏ－フルオロシチジン－３’－リン酸、２’－Ｏ－フルオログアノシン－３’－リン酸、及び２’－Ｏ－フルオロウリジン－３’－リン酸であり；ｄＴが、デオキシ－チミンであり；ｓが、ホスホロチオエート結合であり；（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖及びセンス鎖が、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、ＡＤ－８５６５５、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、ＡＤ－１２６３１０、ＡＤ１３３３６０、ＡＤ－１３３３６１、ＡＤ－１３３３６２、ＡＤ－１３３３７４、及びＡＤ－１３３３８５からなる群から選択される二本鎖の化学修飾ヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖及びセンス鎖が、二本鎖ＡＤ－８５４８１の化学修飾ヌクレオチド配列（５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’（配列番号１１）及び５’－ｇｓｕｓｃａｕｃＣｆａＣｆＡｆＡｆｕｇａｇａｇｕａｃａ－３’（配列番号１２））を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－リン酸、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－リン酸、及び２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－リン酸であり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－Ｏ－フルオロアデノシン－３’－リン酸、２’－Ｏ－フルオロシチジン－３’－リン酸、２’－Ｏ－フルオログアノシン－３’－リン酸、及び２’－Ｏ－フルオロウリジン－３’－リン酸であり；ｄＴが、デオキシ－チミンであり；ｓが、ホスホロチオエート結合であり；（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体であり；センス鎖の３’末端が、Ｎ－［トリス（ＧａｌＮＡｃ－アルキル）－アミドデカノイル）］－４－ヒドロキシプロリノール（Ｌ９６）リガンドに任意にコンジュゲートされる、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
特定の実施形態において、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤であって、アンチセンス鎖及びセンス鎖が、二本鎖ＡＤ－８５４８１の化学修飾ヌクレオチド配列（５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’（配列番号１１）及び５’－ｇｓｕｓｃａｕｃＣｆａＣｆＡｆＡｆｕｇａｇａｇｕａｃａ－３’（配列番号１２））からなり、センス鎖の３’末端が、Ｎ－［トリス（ＧａｌＮＡｃ－アルキル）－アミドデカノイル）］－４－ヒドロキシプロリノール（Ｌ９６）リガンドにコンジュゲートされ、ここで、ａ、ｃ、ｇ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－リン酸、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－リン酸、及び２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－リン酸であり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－Ｏ－フルオロアデノシン－３’－リン酸、２’－Ｏ－フルオロシチジン－３’－リン酸、２’－Ｏ－フルオログアノシン－３’－リン酸、及び２’－Ｏ－フルオロウリジン－３’－リン酸であり；ｄＴが、デオキシ－チミンであり；ｓが、ホスホロチオエート結合であり；（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域は、約１９～３０ヌクレオチド対長、約１９～２５ヌクレオチド対長、約２３～２７ヌクレオチド対長、約１９～２３ヌクレオチド対長、約２１～２３ヌクレオチド対長である。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、独立して、１９～３０ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、リガンドは、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。特定の実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の３’末端にある。特定の実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。特定の実施形態において、鎖は、センス鎖である。特定の実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端にある。特定の実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。特定の実施形態において、鎖は、センス鎖である。特定の実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にある。特定の実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。
特定の実施形態において、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位におけるｄｓＲＮＡ剤は、ＡＵ塩基対である塩基対を含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、合計で２１のヌクレオチドを有するセンス鎖及び合計で２３のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。
一態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む細胞を提供する。
一態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む、ＡＧＴをコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤及び脂質製剤を含む。
一態様において、本発明は、細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する方法であって、
（ａ）細胞を、本発明のｄｓＲＮＡ剤又は医薬組成物と接触させる工程と；
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって、細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する工程とを含む方法を提供する。
特定の実施形態において、細胞は、対象中にある。特定の実施形態において、対象はヒトである。特定の実施形態において、対象は、ＡＧＴ関連疾患と診断されている。
特定の実施形態において、ＡＧＴ関連疾患は、高血圧、高血圧症、境界域高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、孤立性収縮期若しくは拡張期高血圧、妊娠関連高血圧、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、心不全、心筋梗塞、狭心症、脳卒中、腎疾患、腎不全、全身性硬化症、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、胎児発育不全、肥満、肝臓脂肪症／脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；耐糖能異常、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）、及びメタボリック・シンドロームから選択される。
特定の実施形態において、対象は、少なくとも１３０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧又は少なくとも８０ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧を有する。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１４０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧及び少なくとも８０ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧を有する。特定の実施形態において、対象は、食塩感受性になりやすい群の一員であるか、過体重であるか、肥満であるか、又は妊娠している。
特定の実施形態において、細胞をｄｓＲＮＡ剤と接触させる工程は、（例えば、細胞とｄｓＲＮＡ剤とを最初に接触させる前の；例えば、対象へのｄｓＲＮＡ剤の最初の用量の投与の前のＡＧＴの発現のレベルと比較して）少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％だけＡＧＴの発現を阻害する。特定の実施形態において、ＡＧＴの発現を阻害する工程は、例えば、細胞とｄｓＲＮＡ剤とを最初に接触させる前のＡＧＴの発現のレベルと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％だけ、対象血清試料中のＡＧＴタンパク質レベルを低下させる。
一態様において、本発明は、対象におけるＡＧＴ関連疾患を処置する方法であって、本発明のｄｓＲＮＡ剤又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象におけるＡＧＴ関連疾患を処置する工程を含む方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１３０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧又は少なくとも８０ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧を有する。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１４０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧及び少なくとも８０ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧を有する。特定の実施形態において、対象はヒトである。特定の実施形態において、対象は、食塩感受性になりやすい群の一員であるか、過体重であるか、肥満であるか、又は妊娠している。
本発明の特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に皮下投与される。特定の実施形態において、ＡＧＴのレベルは、対象中で測定される。特定の実施形態において、対象中のＡＧＴのレベルは、対象血液試料、血清試料、又は尿試料中のＡＧＴタンパク質レベルである。
特定の実施形態において、高血圧の処置のための更なる治療剤が、対象に投与される。特定の実施形態において、更なる治療剤は、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、β遮断薬、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、α２－アゴニスト、レニン阻害剤、α遮断薬、末梢作用型アドレナリン作動薬、選択的Ｄ１受容体部分アゴニスト、非選択的α－アドレナリン拮抗薬、合成したステロイド性の抗ミネラルコルチコイド薬；又は上記のいずれかの組合せ、及び薬剤の組合せとして製剤化された高血圧治療剤からなる群から選択される。特定の実施形態において、更なる治療剤は、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、例えば、ロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、エプロサルタン、及びアジルサルタンを含む。特定の実施形態において、更なる治療剤は、アンジオテンシン受容体－ネプリライシン阻害剤（ＡＲＮｉ）、例えば、Ｅｎｔｒｅｓｔｏ（登録商標）、サクビトリル／バルサルタン；又はエンドセリン受容体アンタゴニスト（ＥＲＡ）、例えば、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ＢＱ－１２３、ジボテンタン、ボセンタン、マシテンタン、及びテゾセンタンである。
本発明はまた、ＡＧＴ関連疾患の処置のための本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ剤及び医薬組成物の使用も提供する。特定の実施形態において、使用は、本発明によって提供される方法のいずれかを含む。
本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含むキットを提供する。特定の実施形態において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
単回の３ｍｇ／ｋｇの用量の示されるｓｉＲＮＡで処置されたカニクイザル（群当たりｎ＝３）における血清ＡＧＴタンパク質レベルを示すグラフである。ＡＧＴレベルが、処置前のＡＧＴレベルにおけるパーセントとして示される。 １日目に単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ－８５４８１又はＡＤ－６７３２７で処置されたカニクイザル（群当たりｎ＝３）における血清ＡＧＴタンパク質レベルを示すグラフである。ＡＧＴレベルが、処置前のＡＧＴレベルにおけるパーセントとして示される。 ３回の投与のために４週間に１回、１ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ－８５４８１又はＡＤ－６７３２７を投与されたカニクイザル（群当たりｎ＝３）における血清ＡＧＴタンパク質レベルを示すグラフである。ＡＧＴレベルが、処置前のＡＧＴレベルにおけるパーセントとして示される。 ［図２Ａ－２Ｇ］ビヒクル、バルサルタン（３１ｍｇ／ｋｇ／日）、ラット特異的ＡＧＴ－ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇを２週間に１回（ｑ２ｗ））、カプトプリル（１００ｍｇ／ｋｇ／日）、バルサルタン及びカプトプリル、又はバルサルタン及びＡＧＴ－ｓｉＲＮＡで処置された自然発症高血圧ラット（群当たりｎ＝９）の試験における様々なパラメータの結果を示す。 試験（４週間）の開始（黒いバー）及び終了（点描されたバー）の時点での血漿ＡＧＴレベルを示す。 ベースラインと比較した毎日の血圧読み取りを示す。 心臓重量：脛骨長さ比を示すグラフである。 試験（４週間）の開始（黒いバー）及び終了（点描されたバー）の時点での血漿レニン活性レベルを示すグラフである。 図２Ｅは、平均動脈圧（ＭＡＰ）（ｍｍ Ｈｇ）に対してグラフ化された心臓重量：脛骨長さのグラフである。図２Ｆは、心筋細胞サイズのグラフである。図２Ｇは、Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－プロＢＮＰ）レベルのグラフである。 自然発症高血圧ラット試験における尿中ＡＧＴレベルを示すグラフである。 図４Ａは、自然発症高血圧ラット試験における血液Ａｎｇ Ｉのレベルを示すグラフである。図４Ｂは、自然発症高血圧ラット試験における血液Ａｎｇ ＩＩのレベルを示すグラフである。図４Ｃは、自然発症高血圧ラット試験における血液Ａｎｇ ＩＩ対血液Ａｎｇ Ｉの比率を示すグラフである。 図５Ａは、自然発症高血圧ラット試験における腎臓Ａｎｇ Ｉのレベルを示すグラフである。図５Ｂは、自然発症高血圧ラット試験における腎臓Ａｎｇ ＩＩのレベルを示すグラフである。図５Ｃは、自然発症高血圧ラット試験における腎臓Ａｎｇ ＩＩ対腎臓Ａｎｇ Ｉの比率を示すグラフである。 図６Ａは、自然発症ラット高血圧試験における腎皮質及び髄質中のアンジオテンシン受容体１ａのレベルを示すグラフである。図６Ｂは、自然発症ラット高血圧試験における腎皮質及び髄質中のアンジオテンシン１ｂ受容体のレベルを示すグラフである。図６Ｃは、自然発症ラット高血圧試験における腎皮質及び髄質中のＡＣＥのレベルを示すグラフである。 ベースライン及び自然発症ラット高血圧試験における処置の開始から４週間後の時点における尿量を示すグラフである。 ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤又はＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス又は標準食給餌マウス（群当たりｎ＝５）の平均体重を示すグラフである。 ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤又はＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス又は標準食給餌マウスの最終的な肝臓、脂肪、及び筋肉重量（群当たりｎ＝５）を示すグラフである。 図９Ａは、最初の処置投与の前の０週の時点でＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤又はＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス又は標準食給餌マウス（群当たりｎ＝５）における血漿グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）の変化を示すグラフである。図９Ｂは、実験の６週の時点でＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤又はＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス又は標準食給餌マウス（群当たりｎ＝５）における血漿グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。図９Ｃは、実験の１２週の時点でＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪食餌性肥満（ＤＩＯ）マウス又は標準食給餌マウス（群当たりｎ＝５）における血漿グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。 図１０Ａは、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウス、又は標準食給餌（ＬＦＤ）マウスの平均体重を示すグラフである。図１０Ｂは、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウス、又は標準食給餌（ＬＦＤ）マウスの平均累積体重増加を示すグラフである。 実験の２０週の時点でＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳで処置された高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウス、又は標準食給餌（ＬＦＤ）マウスにおける血清肝臓酵素を示すグラフである。図１１Ａは、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウス、又は標準食給餌（ＬＦＤ）マウスにおけるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを示すグラフである。図１１Ｂは、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウス、又は標準食給餌（ＬＦＤ）マウスにおけるアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルを示すグラフである。図１１Ｃは、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤若しくはＰＢＳのいずれかで処置された高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウス、又は標準食給餌（ＬＦＤ）マウスにおけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）レベルを示すグラフである。
本発明は、ＡＧＴ遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。この遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞中にあり得る。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＡＧＴ遺伝子）のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。
本発明のｉＲＮＡは、他の哺乳動物種のＡＧＴオルソログにおいて保存される遺伝子の部分を含むヒトＡＧＴ遺伝子を標的とするように設計されている。理論に制約されるのを意図していないが、上記の特性及びこれらのｉＲＮＡにおける特定の標的部位又は特定の修飾の組合せ又は部分的な組合せが、本発明のｉＲＮＡに、改善された有効性、安定性、効力、耐久性、及び安全性を与えるものと考えられる。
したがって、本発明は、ＡＧＴ遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧症を処置及び予防するための方法を提供する。
本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。
特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の一方又は両方は、最大で６６ヌクレオチド長、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長であり、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的な少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を有する。ある実施形態において、より長い長さのアンチセンス鎖を有するこのようなｉＲＮＡ剤は、好ましくは、２０～６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでいてもよく、ここで、センス及びアンチセンス鎖は、１８～３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
本発明のｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＡＧＴ遺伝子）のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。インビトロ及びインビボアッセイを用いて、本発明者らは、ＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介することができ、ＡＧＴの発現のかなりの阻害をもたらすことを実証した。このような対象におけるＡＧＴの発現を阻害は、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧の発症を予防又は処置する。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法及び組成物は、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧に罹患しやすいか又はそれと診断された対象を予防及び処置するのに有用である。本明細書における方法及び組成物は、対象におけるＡＧＴのレベルを低下させるのに有用である。
以下の詳細な説明は、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡを含有する組成物を作製及び使用する方法、並びにＡＧＴ遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る対象、例えば、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧症を受けやすいか又はＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧症と診断された対象を処置するための組成物、使用、及び方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「～を含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。
「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。例えば、「センス鎖又はアンチセンス鎖」は、「センス鎖又はアンチセンス鎖又はセンス鎖及びアンチセンス鎖」であると理解される。
「約」という用語は、当該技術分野における許容差の典型的な範囲内にあることを意味するように本明細書において使用される。例えば、「約」は、平均から約２標準偏差であると理解され得る。特定の実施形態において、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態において、約は、±５％を意味する。約が、一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「約」が、一連の数値又は範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
数値又は一連の数値の前の「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接する数値、及び文脈から明らかであるような、論理的に含まれ得る全ての後続の数値又は整数を含むことが意図される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１９ヌクレオチド」は、１９、２０、又は２１ヌクレオチドが、示される特性を有することを意味する。少なくともが、一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「少なくとも」が、一連の数値又は範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用される際、「以下」又は「未満」は、この語句に隣接する値、及び文脈から論理的である際、ゼロまでの、論理的なより低い値又は整数であると理解される。例えば、「２つ以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１、又は０個のヌクレオチドオーバーハングを有する。「以下」が、一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「以下」が、一連の数値又は範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。本明細書において使用される際、範囲は、上限値及び下限値の両方を含む。
配列と転写物上のその示される部位又は他の配列との間に矛盾がある場合、本明細書中、列挙されるヌクレオチド配列が優先される。
本明細書において使用される際、「ＡＧＴ」という用語と同義的に使用される「アンジオテンシノーゲン」は、当該技術分野において、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー８；α－１アンチプロテイナーゼ；アンチトリプシン；ＳＥＲＰＩＮＡ８；アンジオテンシンＩ；セルピンＡ８；アンジオテンシンＩＩ；α－１アンチプロテイナーゼアンジオテンシノーゲン；アンチトリプシン；プレ－アンジオテンシノーゲン２；ＡＮＨＵ；セリンプロティナーゼ阻害剤；及びシステインプロティナーゼ阻害剤としても知られている周知の遺伝子及びポリペプチドを指す。
「ＡＧＴ」という用語は、ヒトＡＧＴ（そのアミノ酸及び完全コード配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１８８５９５６５８（ＮＭ＿００００２９．３；配列番号１）に見られる）；カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＡＧＴ（そのアミノ酸及び完全コード配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：９００７５３９１（ＡＢ１７０３１３．１：配列番号３）に見られる）；マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ＡＧＴ（そのアミノ酸及び完全コード配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１１３４６１９９７（ＮＭ＿００７４２８．３；配列番号５）に見られる）；及びラットＡＧＴ（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ＡＧＴ（そのアミノ酸及び完全コード配列が、例えば、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５１０３６６７２（ＮＭ＿１３４４３２；配列番号７）に見られる）を含む。
ＡＧＴ ｍＲＮＡ配列の更なる例は、公開されているデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、及びマカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイトを用いて容易に利用可能である。
本明細書において使用される際の「ＡＧＴ」という用語はまた、ＡＧＴ遺伝子における一塩基ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）などの、ＡＧＴ遺伝子の天然ＤＮＡ配列変異も指す。例示的なＳＮＰが、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｇｅｎｅＩｄ＝１８３で利用可能なｄｂＳＮＰデータベースにおいて見られる。ＡＧＴ遺伝子内の配列変異の非限定的な例としては、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第５，５８９，５８４号明細書に記載されるものが挙げられる。例えば、ＡＧＴ遺伝子内の配列変異は、位置－５３２（転写開始部位と比較して）でのＣ→Ｔ；位置－３８６でのＧ→Ａ；位置－２１８でのＧ→Ａ；位置－１８でのＣ→Ｔ；位置－６及び－１０でのＧ→Ａ及びＡ→Ｃ；位置＋１０でのＣ→Ｔ（非翻訳）；位置＋５２１Ｔ→Ｃ（Ｔ１７４Ｍ）でのＣ→Ｔ；位置＋５９７でのＴ→Ｃ（Ｐ１９９Ｐ）；位置＋７０４でのＴ→Ｃ（Ｍ２３５Ｔ；例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰで利用可能なＲｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ（ｒｅｆＳＮＰ）Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ：ｒｓ６９９も参照）；位置＋７４３でのＡ→Ｇ（Ｙ２４８Ｃ）；位置＋８１３でのＣ→Ｔ（Ｎ２７１Ｎ）；位置＋１０１７でのＧ→Ａ（Ｌ３３９Ｌ）；位置＋１０７５でのＣ→Ａ（Ｌ３５９Ｍ）；及び／又は位置＋１１６２でのＧ→Ａ（Ｖ３８８Ｍ）を含み得る。
本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＡＧＴ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。配列の標的部分は少なくとも、ＡＧＴ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分で又はその近くでｉＲＮＡ指向性切断のための基質として用いられるのに十分な長さであろう。一実施形態において、標的配列は、ＡＧＴのタンパク質コード領域内にある。
標的配列は、約１９～３６ヌクレオチド長、例えば、好ましくは、約１９～３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１９～３０ヌクレオチド、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２ヌクレオチド長であり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう（例えば、表２を参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換され得ることを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。別の例では、オリゴヌクレオチド中のどこかのアデニン及びシトシンが、それぞれグアニン及びウラシルで置換されて、標的ｍＲＮＡとのＧ－Ｕゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明に取り上げられる組成物及び方法に好適である。
本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのＡＧＴの発現を調節する（例えば阻害する）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＧＴ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられている（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、すなわち、ＡＧＴ遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のｉＲＮＡを指すために本明細書において使用される。
特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞又は生物中に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、それが、次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５～３０のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計及び試験が、米国特許第８，１０１，３４８号明細書及びＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載されており、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ｉＲＮＡ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＡＧＴ遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用される際、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ｉＲＮＡは、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用される際、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、若しくは修飾された核酸塩基、又はそれらの任意の組合せを有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、又は核酸塩基に対する、例えば、官能基又は原子の置換、付加又は除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」又は「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約１９～３６塩基対の長さ、例えば、約１９～３０塩基対の長さの範囲、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２塩基対の長さなどの、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対の長さであり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、２０個、２３個又はそれを超える不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、１０個以下のヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、８個以下の不対ヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、４～１０個の不対ヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、４～８つのヌクレオチドであり得る。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって含まれる場合、それらの分子は、共有結合され得るが、共有結合されていなくてもよい。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、各鎖が、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＧＴ遺伝子と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く１９～２３個のヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡである。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＧＴ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く２４～３０個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか、又はその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；或いはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド又はそれを超える数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端に存在し得る。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端又は５’末端に、１～１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。特定の実施形態において、センス鎖又はアンチセンス鎖、又はその両方におけるオーバーハングは、１０個のヌクレオチドより長い伸長された長さ、例えば、１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、又は１０～１５ヌクレオチド長を含み得る。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態において、伸長されたオーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。特定の実施形態において、オーバーハングが、生理的条件下で安定したヘアピン構造を形成することが可能であるように、オーバーハングは、自己相補的な部分を含む。
「平滑な」又は「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡ剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」二本鎖ＲＮＡ剤は、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しない。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有さない（すなわち、１つのオーバーハング及び１つの平滑末端を有する剤）又はいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングを有さないＲＮＡｉ剤を含む。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖であるであろう。
「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えば、ＡＧＴ ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用される際、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＡＧＴヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’末端又は３’末端の５、４、又は３ヌクレオチド以内にある。ある実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖中にヌクレオチドミスマッチを含む。ある実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖中にヌクレオチドミスマッチを含む。ある実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３ヌクレオチド以内にある。別の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド中にある。
本明細書において使用される際の「センス鎖」又は「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書において使用される際、「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」は、大部分が修飾されるが、完全に修飾されるわけではなく、５、４、３、２、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
本明細書において使用される際、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０及び１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、及び１３を含む。
本明細書で使用される用語「相補的な」は、特に示されない限り、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄を含み得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。内部で遭遇し得る、生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定できるであろう。
ｉＲＮＡ中、例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と称され得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又は、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的において、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な配列である２１ヌクレオチドの配列を含む場合でも、「完全に相補的」と称されてもよい。
本明細書で使用される「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン－クリック塩基対、又は非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含むことができ、又は該塩基対から完全に形成され得る。そのような非ワトソン－クリック塩基対には、非限定的に、Ｇ：Ｕゆらぎ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対が挙げられる。
本明細書で、用語「相補的な」「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又は二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。
本明細書において使用される際、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＡＧＴ遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＡＧＴ遺伝子をコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＡＧＴｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＧＴ配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＧＴ配列に実質的に相補的であり、配列番号１及び２のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号１及び２のいずれか１つのフラグメントの等価な領域に、その全長にわたって少なくとも８０％相補的な、例えば、少なくとも９０％、又は９５％相補的な；又は１００％相補的な、連続ヌクレオチド配列を含む。
したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＧＴ配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＧＴ配列に実質的に相補的であり、配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号１のフラグメントの等価な領域に、その全長にわたって少なくとも約９０％相補的な、例えば、約９０％、又は約９５％相補的な、連続ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、配列番号１のフラグメントは、配列番号１のヌクレオチド６３２～６５８、６３５～６５８、６３６～６５８、１２４８～１２７３、１２４８～１２７０、１２５０～１２７２、１２５１～１２７３、１５８０～１６０２、１５８４～１６０６、１５８７～１６０９、１６０１～１６２３、１８８１～１９０３、２０７４～２０９７、２０７４～２０９６、２０７５～２０９７、２０８０～２１０２、２２７２～２２９４、２２７６～２２９８、２２８１～２３０４、２２８１～２３０３、又は２２８２～２３０４の群から選択される。好ましい実施形態において、二本鎖は、ｕｓｃｓｕｃｃｃＡｆｃＣｆＵｆＵｆｕｕｃｕｕｃｕａａｕＬ９６（配列番号１３）からなるセンス鎖及びａｓＵｆｓｕａｇＡｆａｇａａａａｇＧｆｕＧｆｇｇａｇａｓｃｓｕ（配列番号１４）からなるアンチセンス鎖からならない。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＡＧＴ配列に実質的に相補的であり、且つその全長にわたって、表３、表５、若しくは表６におけるセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当する領域、又は表３、表５、若しくは表６におけるセンス鎖のいずれか１つのフラグメントに少なくとも約９０％相補的、例えば、約９０％、９５％、又は１００％相補的である連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンスポリヌクレオチドは、今度は、標的ＡＧＴ配列に相補的であり、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたって、表３、５、若しくは６におけるアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列の相当する領域、又は表３、５、若しくは６におけるアンチセンス鎖のいずれか１つのフラグメントに少なくとも約９０％相補的、例えば、約９０％、９５％、又は１００％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、表３又は表５中のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、及びＡＤ－８５６５５から選択される。
一般に、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含む。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｄｓＲＮＡ分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」によって包含される。
本発明の一態様において、本発明の方法及び組成物に使用するための剤は、アンチセンス阻害機構によって、標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照）。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含み得る。
本明細書において使用される際の、ｄｓＲＮＡなどの「ｉＲＮＡと細胞を接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。ｉＲＮＡと細胞を接触させる工程は、細胞をｉＲＮＡとインビトロで接触させる工程又は細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、ｉＲＮＡは、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、或いは、ＲＮＡｉ剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。
細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、ｉＲＮＡを用いて細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ｉＲＮＡが接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、ｉＲＮＡを、細胞が位置する組織中又は組織の近くに注入することによって、又はｉＲＮＡを、別の部位、例えば、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ｉＲＮＡは、目的の部位、例えば、肝臓にｉＲＮＡを指向するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含んでいてもよく、又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。例えば、細胞はまた、ｉＲＮＡとインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。
特定の実施形態において、細胞をｉＲＮＡと接触させる工程は、細胞中への取り込み又は吸収を促進するか又は行うことによって、「導入する」又は「ｉＲＮＡを細胞中に送達する」工程を含む。ｉＲＮＡの吸収又は取り込みは、補助されない拡散（ｕｎａｉｄｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）又は活性な細胞プロセスによって、又は補助的な薬剤又はデバイスによって行われ得る。細胞中へのｉＲＮＡの導入は、インビトロ又はインビボであってもよい。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入されるか又は全身投与され得る。細胞中へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの、当該技術分野において公知の方法を含む。更なる手法が、本明細書において後述され、又は当該技術分野において公知である。
「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子、例えば、ｉＲＮＡが転写されるｉＲＮＡ又はプラスミドなどの薬学的に有効な分子を封入する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰは、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，８５８，２２５号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書、同第８，１５８，６０１号明細書、及び同第８，０５８，０６９号明細書に記載されている。
本明細書において使用される際、「対象」は、内因的に又は異種的に標的遺伝子を発現する、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、又はマウスなど）を含む哺乳動物、又は鳥類などの動物である。一実施形態において、対象は、ＡＧＴの発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害について処置又は評価されているヒト；ＡＧＴの発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害のリスクがあるヒト；ＡＧＴの発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に罹患しているヒト；又は本明細書に記載されるＡＧＴの発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害について処置されているヒトなどのヒトである。ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧の診断基準が、以下に示される。ある実施形態において、対象は、ヒト女性である。他の実施形態において、対象は、ヒト男性である。特定の実施形態において、対象は、食塩感受性になりやすい群の一員、例えば、黒人又は高齢者（６５歳以上）である。特定の実施形態において、対象は、過体重又は肥満、例えば、中心性肥満に罹患している対象である。特定の実施形態において、対象は、運動不足である。特定の実施形態において、対象は、妊娠している。
本明細書において使用される際、「処置する」又は「処置」という用語は、対象におけるＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧の少なくとも１つの兆候又は症状を低減するなどの、有益又は所望の結果を指す。処置はまた、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、望ましくないＡＧＴ発現に関連する１つ又は複数の兆候又は症状の低減、例えば、アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体活性化（ＡＴ１Ｒ）（例えば、高血圧、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤、末梢動脈疾患、心疾患、増加した酸化ストレス、例えば、増加したスーパーオキシドの形成、炎症、血管収縮、ナトリウム及び水の貯留、カリウム及びマグネシウムの減少、レニン抑制、筋細胞及び平滑筋肥大、増加したコラーゲン合成、血管の刺激、心筋及び腎線維症、心臓の増加した収縮速度及び収縮力、変化された心拍数、例えば、増加した不整脈、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）の刺激、交感神経系の活性化、及び増加したエンドセリン分泌）、限定はされないが、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）若しくは胎児発育不全を含む、妊娠関連高血圧の症状（例えば、子癇前症、及び子癇）、悪性高血圧に関連する症状、高アルドステロン症に関連する症状；望ましくないＡＴ１Ｒ活性化の程度の低下；慢性ＡＴ１Ｒ活性化の状態の安定化（すなわち、悪化しない）；望ましくないＡＴ１Ｒ活性化の改善又は緩和（例えば、高血圧、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤、末梢動脈疾患、心疾患、増加した酸化ストレス、例えば、増加したスーパーオキシドの形成、炎症、血管収縮、ナトリウム及び水の貯留、カリウム及びマグネシウムの減少、レニン抑制、筋細胞及び平滑筋肥大、増加したコラーゲン合成、血管の刺激、心筋及び腎線維症、心臓の増加した収縮速度及び収縮力、変化された心拍数、例えば、増加した不整脈、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）の刺激、交感神経系の活性化、及び増加したエンドセリン分泌）も含む。ＡＧＴ関連疾患は、肥満、肝臓脂肪症／脂肪肝、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、耐糖能異常、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）、及びメタボリック・シンドロームも含み得る。特定の実施形態において、高血圧としては、低い血漿レニン活性若しくは血漿レニン濃度に関連する高血圧が挙げられる。「処置」はまた、未処置での予測生存と比較した生存の延長も意味し得る。
対象におけるＡＧＴ遺伝子発現又はａｇｔタンパク質産生のレベル、又は疾病マーカー若しくは症状の文脈における「低下させる」という用語は、このようなレベルの統計的に有意な低下を指す。低下は、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％、又は関連する細胞又は組織、例えば、肝細胞、又は他の対象試料、例えば、血液若しくはそれに由来する血清、尿における検出方法のための検出レベル未満であり得る。
本明細書において使用される際、「予防」又は「予防する」は、例えば、加齢、遺伝的要因、ホルモン変化、食習慣、及び座りがちな生活様式などに起因するＡＧＴ関連疾患に罹患しやすい対象における、ＡＧＴ遺伝子の発現又はａｇｔタンパク質の産生の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に関連して使用される場合。特定の実施形態において、疾病又は障害は、例えば、望ましくないＡＴ１Ｒ活性化の症状、例えば、高血圧、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤、末梢動脈疾患、心疾患、増加した酸化ストレス、例えば、増加したスーパーオキシドの形成、炎症、血管収縮、ナトリウム及び水の貯留、カリウム及びマグネシウムの減少、レニン抑制、筋細胞及び平滑筋肥大、増加したコラーゲン合成、血管の刺激、心筋及び腎線維症、心臓の増加した収縮速度及び収縮力、変化された心拍数、例えば、増加した不整脈、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）の刺激、交感神経系の活性化、及び増加したエンドセリン分泌である。ＡＧＴ関連疾患は、肥満、肝臓脂肪症／脂肪肝、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、耐糖能異常、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）、及びメタボリック・シンドロームも含み得る。特定の実施形態において、高血圧としては、低い血漿レニン活性若しくは血漿レニン濃度に関連する高血圧が挙げられる。例えば、高血圧を発症する可能性は、例えば、高血圧の１つ又は複数の危険因子を有する個体が高血圧を発症しない場合、又は同じ危険因子を有し、本明細書に記載される処置を受けない集団と比べてより軽度の高血圧を発症する場合のいずれかに低下される。ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧を発症しないこと又は数カ月若しくは数年の高血圧を発症する時期の遅延が、有効な予防とみなされる。予防は、ｉＲＮＡ剤の２回以上の用量の投与を必要とし得る。
本明細書において使用される際、「アンジオテンシノーゲン関連疾患」又は「ＡＧＴ関連疾患」という用語は、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）活性化によって引き起こされるか、又はそれに関連する疾病若しくは障害、又はその症状若しくはその進行がＲＡＡＳ不活性化に応答する疾病若しくは障害である。「アンジオテンシノーゲン関連疾患」という用語は、ＡＧＴの発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態を含む。このような疾病は、典型的に、高血圧に関連する。アンジオテンシノーゲン関連疾患の非限定的な例としては、高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても知られている）、原発性高血圧（本態性高血圧又は特発性高血圧としても知られている）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても知られている）、孤立性収縮期若しくは拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇、及び出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎臓高血圧としても知られている）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、睡眠時無呼吸、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、脳卒中、腎疾患、例えば、任意に妊娠に関連する慢性腎疾患又は糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、及び全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）が挙げられる。特定の実施形態において、ＡＧＴ関連疾患としては、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）又は胎児発育不全が挙げられる。特定の実施形態において、ＡＧＴ関連疾患は、肥満、肝臓脂肪症／脂肪肝、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、耐糖能異常、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）、及びメタボリック・シンドロームも含む。特定の実施形態において、高血圧としては、低い血漿レニン活性若しくは血漿レニン濃度に関連する高血圧が挙げられる。
高血圧に対する閾値及び高血圧の段階が、以下に詳細に説明される。
一実施形態において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、原発性高血圧である。「原発性高血圧」は、環境又は遺伝子的原因の結果（例えば、明らかな基礎疾患原因のない結果）である。
一実施形態において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、二次性高血圧である。「二次性高血圧」は、腎臓、血管、及び内分泌原因、例えば、実質性腎疾患（例えば、多嚢胞性腎、糸球体又は間質性疾患）、腎血管疾患（例えば、腎動脈狭窄、線維筋性異形成）、内分泌障害（例えば、副腎皮質ステロイド又はミネラルコルチコイド過剰、褐色細胞腫、甲状腺機能亢進症又は甲状腺機能低下症、成長ホルモン過剰、副甲状腺機能亢進症）、大動脈狭窄症、又は経口避妊薬の使用を含む、複数の病因を有し得る識別可能な基礎疾患を有する。
一実施形態において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、妊娠関連高血圧、例えば、妊娠性慢性高血圧、妊娠高血圧症、子癇前症、子癇、慢性高血圧に加えて子癇前症、ＨＥＬＬＰ症候群、及び妊娠高血圧症（妊娠の一過性高血圧、妊娠の後半で識別された慢性高血圧、及び妊娠高血圧症候群（ＰＩＨ）としても知られている）である。妊娠関連高血圧の診断基準が、以下に示される。
一実施形態において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、治療抵抗性高血圧である。「治療抵抗性高血圧」は、そのうちの１つがチアジド利尿剤である異なるクラスの３つの降圧剤の同時使用にかかわらず目標を超えたままの血圧（例えば、１３０ｍｍ Ｈｇ超の収縮期血圧又は９０超の拡張期血圧）である。血圧が４つ以上の薬剤を用いて制御される対象も、治療抵抗性高血圧を有すると考えられる。
「治療有効量」又は「予防的に有効な量」はまた、任意の処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）である所望の作用を生じる、ＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡは、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。
「薬学的に許容され得る」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット・リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、或いは他の問題又は合併症を伴わずに、ヒト対象及び動物対象の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、又は剤形を指すために本明細書において用いられる。
本明細書において使用される際の「薬学的に許容され得る担体」という語句は、身体の１つの器官、又は部分から、身体の別の器官、又は部分へと対象に化合物を運ぶ又は輸送するのに関与する、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛、又はステアリン酸）、又は溶媒封入材料などの、薬学的に許容され得る材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、処置される対象に有害でないという意味で「許容でき」なければならない。このような担体は、当該技術分野において公知である。薬学的に許容され得る担体は、注射による投与のための担体を含む。
本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、並びに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、或いはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。ある実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる尿を指す。「対象に由来する試料」は、対象からの血液、又は血液由来の血清若しくは血漿を指し得る。
Ｉ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡは、ＡＧＴ関連疾患、例えば高血圧症を発症しやすい、対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物内の細胞などの細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡｉ剤は、ＡＧＴ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約１９～３０ヌクレオチド長（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、又は１９ヌクレオチド）である。ＡＧＴ遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲ若しくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づいた方法、又は例えば、ウエスタンブロット法若しくはフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイした際に、少なくとも約５０％、ＡＧＴ遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又はＡＧＴ遺伝子）の発現を阻害する。好ましい実施形態において、発現の阻害は、本明細書に示される適切な生物細胞株中で１０ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡを用いて、実施例、特に実施例２に示されるｑＰＣＲ方法によって決定される。好ましい実施形態において、インビボでの発現の阻害は、例えば、最低量（ｎａｄｉｒ）のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与される場合、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類、例えば、ヒト標的遺伝子を発現するマウス若しくはＡＡＶ感染マウスにおけるヒト遺伝子のノックダウンによって決定される。肝臓におけるＲＮＡ発現は、実施例２に示されるＰＣＲ方法を用いて決定される。
ｄｓＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含み、この２本のＲＮＡ鎖は、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズする。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、一般に完全に相補的な、相補性の領域を含む。標的配列は、ＡＧＴ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下が組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のどこかに記載されるように、及び当該技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補的な領域として含まれることもある。
一般に、二本鎖構造は、１９～３０塩基対の長さである。同様に、標的配列に相補性の領域は、１９～３０ヌクレオチド長である。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１９～約２３ヌクレオチド長、又は約２５～約３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として働くのに十分に長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒのための基質として働き得ることが当該技術分野において周知である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性の切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約１９～約３０塩基対、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。ここで、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする例えば１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる程度まで、ＲＮＡ分子又は３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然のｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＡＧＴ遺伝子の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中に生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１～４、２～４、１～３、１、２、３、又は４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのンチセンス鎖又はセンス鎖の５’末端、３’末端又は両方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、当該技術分野において公知の標準的な方法によって合成され得る。本発明の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、２工程の手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別個に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列及びアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表３、５及び６に示される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表３、５及び６の配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、ＡＧＴ遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表５又は６のセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表３、５、又は６のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。特定の実施形態において、表３、又は５からのセンス又はアンチセンス鎖は、ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－８４７０１、ＡＤ－８４７０３、ＡＤ－８４７０４、ＡＤ－８４７０５、ＡＤ－８４７０７、ＡＤ－８４７１５、ＡＤ－８４７１６、ＡＤ－８４７３９、ＡＤ－８４７４１、ＡＤ－８４７４６、ＡＤ－８５４３２、ＡＤ－８５４３４、ＡＤ－８５４３５、ＡＤ－８５４３６、ＡＤ－８５４３７、ＡＤ－８５４３８、ＡＤ－８５４４１、ＡＤ－８５４４２、ＡＤ－８５４４３、ＡＤ－８５４４４、ＡＤ－８５４４６、ＡＤ－８５４４７、ＡＤ－８５４８２、ＡＤ－８５４８５、ＡＤ－８５４９３、ＡＤ－８５４９６、ＡＤ－８５５０４、ＡＤ－８５５１７、ＡＤ－８５５１９、ＡＤ－８５５２４、ＡＤ－８５６２２、ＡＤ－８５６２３、ＡＤ－８５６２５、ＡＤ－８５６２６、ＡＤ－８５６３４、ＡＤ－８５６３５、ＡＤ－８５６３７、及びＡＤ－８５６５５から選択される。
表３中の配列は、修飾又はコンジュゲートされた配列として記載されていないが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡが、表３に記載の配列のいずれか１つ、又は修飾された表５、若しくは６の配列、又はコンジュゲートされた表５、若しくは６の配列を含み得ることが理解されるであろう。言い換えると、本発明は、本明細書に記載されるように、非修飾、非コンジュゲート、修飾された、又はコンジュゲートされた、表３、５、及び６のいずれか１つのｄｓＲＮＡを包含する。
当業者は、約２０～２３個の塩基対、例えば、２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であることが認められたことを十分に認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．，２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、他の当業者が、より短い又はより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上記の実施形態において、表３、５、及び６に示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小限の２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一端又は両端におけるごくわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表３、５、及び６の配列のうちの１つを有するより短い二本鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが当然予測され得る。したがって、表３、５、及び６の配列のうちの１つからの、少なくとも１９、２０個、又はそれを超える連続するヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を有するｄｓＲＮＡとは約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害だけ異なるｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
更に、表３、５、及び６に示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすい、ＡＧＴ転写物における部位を特定する。したがって、本発明は、これらの部位の１つ内を標的とするｉＲＮＡを更に特徴とする。本明細書において使用される際、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするとされている。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＡＧＴ遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から取られた更なるヌクレオチド配列に連結される、表３、５、及び６に示される配列のうちの１つからの少なくとも約１９連続ヌクレオチドを含むであろう。
ＩＩ．本発明の修飾されたｉＲＮＡ
特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、非修飾であり、例えば、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される化学修飾又はコンジュゲーションを含まない。他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明の特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の他の実施形態において、ｉＲＮＡのヌクレオチドの全て又はｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾され、すなわち、５、４、３、２、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドが、ｉＲＮＡの鎖中に存在する。
本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾されたＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾されたｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、及び、隣接するヌクレオシド単位の対が、３’－５’～５’－３’又は２’－５’ ～５’－２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６，２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有するその他、が挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
好適なＲＮＡ模倣体が、本明細書で提供されるｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合された。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；５，７１４，３３１号明細書；及び５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。
本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－及び－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［式中、天然のホスホジエステル骨格は、－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾されたＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキニル；或いはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎ及びｍが、１～約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られている２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られている２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２である。更なる例示的な修飾としては、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド、（これらの３つのファミリーのＲ及びＳ異性体の両方）；２’－アルコキシアルキル；及び２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾は、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡは、核酸塩基（当技術分野にて多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、デオキシ－チミン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシ及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－ダアザアデニン（ｄａａｚａｇｕａｎｉｎ）、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン及びＮ－２、Ｎ－６及び０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６～１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
上記の修飾された核酸塩基並びに他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書、同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第６，０１５，８８６号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，２２２，０２５号明細書；同第６，２３５，８８７号明細書；同第６，３８０，３６８号明細書；同第６，５２８，６４０号明細書；同第６，６３９，０６２号明細書；同第６，６１７，４３８号明細書；同第７，０４５，６１０号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。この構造は、３’－ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
ある実施形態において、ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２個の炭素原子を結合し、それによって、二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’－炭素及び２’－炭素を結合する。したがって、ある実施形態において、本発明の剤は、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’－ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’及び２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４’－２’架橋を含む１つ又は複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４’－２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（ここで、Ｒが、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルである）、又は保護基（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照）；及び４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ロックト核酸ヌクレオチドの調製を教示する更なる代表的な米国特許及び米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，５２５，１９１号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；同第７，３９９，８４５号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；同第７，５６９，６８６号明細書；同第７，７４１，４５７号明細書；同第８，０２２，１９３号明細書；同第８，０３０，４６７号明細書；同第８，２７８，４２５号明細書；同第８，２７８，４２６号明細書；同第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；及び米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
例えば、α－Ｌ－リボフラノース及びβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つ又は複数の立体化学的糖配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書において使用される際、「拘束エチルヌクレオチド」又は「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックト核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配置にある。
本発明のｉＲＮＡは、１つ又は複数の「立体配座的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’及びＣ４’炭素又はリボースのＣ３及びＣ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定した立体配置へと固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高める。リンカーは、酸素を安定性及び親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、リボース環の歪み（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を少なくする。
上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な公報としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；及びＰＣＴ公報の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（非固定（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸）ヌクレオチドである１つ又は複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、非固定非環状核酸であり、糖の結合のいずれかが、除去されており、非固定「糖」残基を形成する。一例において、ＵＮＡは、Ｃ１’－Ｃ４’の間の結合が除去されたモノマーも包含する（すなわち、Ｃ１’及びＣ４’炭素の間の共有炭素－酸素－炭素結合）。別の例において、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’及びＣ３’炭素の間の共有炭素－炭素結合）が除去されている（参照により本明細書に援用される、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；及び米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；及び同第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾としては、５’ホスフェート又は５’ホスフェート模倣体、例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェート又はホスフェート模倣体が挙げられる。好適なホスフェート模倣体が、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書に開示され、その全内容が、参照により本明細書に援用される。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤としては、例えば、それぞれ全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに開示される化学修飾を有する剤が挙げられる。国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットは、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖中、特に、切断部位又はその近傍に提供する。ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、或いは完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入により、存在する場合、センス又はアンチセンス鎖の修飾パターンが中断される。ｄｓＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意にコンジュゲートされ得る。
より詳細には、二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、ｄｓＲＮＡｉ剤の少なくとも１本の鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを有するように完全に修飾される場合、ｄｓＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が観察された。
したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子（すなわち、ＡＧＴ遺伝子）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、例えば、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長、又は２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「ｄｓＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、例えば、二本鎖領域は、２７～３０ヌクレオチド対長、１９～２５ヌクレオチド対長、１９～２３ヌクレオチド対長、１９～２１ヌクレオチド対長、２１～２５ヌクレオチド対長、又は２１～２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例において、二本鎖領域は、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７ヌクレオチド長から選択される。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１つ又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端において１つ又は複数のオーバーハング領域又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、独立して、１～６ヌクレオチド長、例えば２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、又は１～２ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、オーバーハング領域は、上に示される伸長されたオーバーハング領域を含み得る。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第１及び第２の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組合せなどの２’－糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖における５’－又は３’－オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。ある実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。ある実施形態において、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。ある実施形態において、この３’－オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
ｄｓＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る、１つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、或いは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に作用する。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７、８、９位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８、９、１０位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
更に他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖及び２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。特定の実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’－Ｏ－メチル又は３’－フルオロで修飾される。任意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）を更に含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を起点として、第１の鎖の１～２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１～２３位と対合される位置において少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６連続の３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１～６つのヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０～３０連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０～３０個のヌクレオチド一本鎖５’オーバーハングを形成し；少なくともセンス鎖５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによって、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフのうちの少なくとも１つが、切断部位又はその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス及びアンチセンス鎖を含み、ｄｓＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１～４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２の鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ｄｓＲＮＡｉ剤のダイサー切断（Ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。
１９～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０、１１、及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端の１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又はアンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；又は１３、１４、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖の切断部位はまた、５’末端からのｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフ及びアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、すなわち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。或いは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、又は少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部に又はリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ又は複数のウイング修飾を含み得る。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端に第１の１つ又は２つの末端ヌクレオチドを含まない。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つ又は２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つ、又は３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つ、又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。
ある実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素又は結合リン酸酸素の１つ又は複数の一方又は両方の１つ又は複数の改変；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’－ヒドロキシルの改変；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース－リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’末端又は５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。
例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、５’－又は３’－オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、３’－又は５’－オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）又は２’－Ｏ－メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
ある実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、又は２’－フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾、又は他のものであり得る。
特定の実施形態において、Ｎａ又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、１つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ又は３つおきのヌクレオチドに１つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、及びＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、すなわち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」又は「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
ある実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾及び２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを最初に有し、すなわち、センス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾から開始してもよい。
センス鎖又はアンチセンス鎖への、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖又はアンチセンス鎖に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を高め得る。
ある実施形態において、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」及び「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾を表し、Ｎａ及びＮｂは、同じか又は異なる修飾であり得る。或いは、Ｎａ又はＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。
ｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端又は３’末端のいずれかにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４つ、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、又はアンチセンス鎖の５’末端にあり得る。
ある実施形態において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解を促進する傾向に基づいて評価され得る（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに基づいて評価され、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃ；Ｇより好ましく：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２、３、４、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴから選択される。或いは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２、又は３つの塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
他の実施形態において、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）であり、又はアンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端において、デオキシ－チミンヌクレオチドの短い配列、例えば、２つのｄＴヌクレオチドが存在する。
特定の実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
（式中：
ｉ及びｊがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ及びｑがそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎａが、独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂが、独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ及びＹが、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、及びＺＺＺがそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。好ましくは、ＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
ある実施形態において、Ｎａ又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
ある実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る（例えば：６、７、８；７、８、９；８、９、１０；９、１０、１１；１０、１１，１２；又は１１、１２、１３位に存在し得る）。
一実施形態において、ｉが１であり、ｊが０であり、又はｉが０であり、ｊが１であり、又はｉ及びｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）；又は
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、又は６である。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、Ｙ及びＺのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
他の実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（ＩＩ）
（式中：
ｋ及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ’及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎａ’が、独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’が、独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’及びＹ’が、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。
ある実施形態において、Ｎａ’又はＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９、１０、１１；１０、１１、１２；１１、１２、１３；１２、１３、１４；又は１３、１４、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位に存在する。
特定の実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、ｋが１であり、ｌが０であり、又はｋが０であり、ｌが１であり、又はｋ及びｌの両方が１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；又は
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、又は６である。
他の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉａ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’及びＺ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、又は２’－フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、及びＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾又は２’－フルオロ修飾を表し得る。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔである場合、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９、１０、及び１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフ又はＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸ及びＺＺＺはそれぞれ、独立して、２’－ＯＭｅ修飾又は２’－Ｆ修飾を表す。
ある実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は任意に、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１、１２、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてもよく；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフ又はＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ、独立して、２’－ＯＭｅ修飾又は２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用するためのｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ｉＲＮＡ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０～６であり；
各Ｎａ及びＮａ ’が、独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ ’が、独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
一実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり；又はｉが１であり、ｊが０であり；又はｉが０であり、ｊが１であり；又はｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり；又はｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；又はｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。
ｉＲＮＡ二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式を含む：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｄ）
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立して、１～１０、１～７、１～５、又は１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は、独立して、２～２０、２～１５、又は２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、及びＮｂ ’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ、及びＺのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）又は（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＸヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
特定の実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、又はＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾である。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる（以下に記載）。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意に、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される３、４、５、６つ、又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意に、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）の少なくとも１つによって表される２つのｄｓＲＮＡｉ剤は、５’末端、及び３’末端の一方又は両方において互いに結合され、任意に、リガンドにコンジュゲートされる。この剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又はこの剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含む少数のヌクレオチド、例えば、２’－フルオロ修飾を有する１０以下のヌクレオチドを含み得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する１０のヌクレオチド、例えば、センス鎖における２’－フルオロ修飾を有する４つのヌクレオチド及びアンチセンス鎖における２’－フルオロ修飾を有する６つのヌクレオチドを含む。別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する６つのヌクレオチド、例えば、センス鎖における２’－フルオロ修飾を有する４つのヌクレオチド及びアンチセンス鎖における２’－フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含むごく少数のヌクレオチド、例えば、２’－フルオロ修飾を含む２つ以下のヌクレオチドを含み得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する２、１又は０のヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチド、例えば、センス鎖における２－フルオロ修飾を有する０のヌクレオチド及びアンチセンス鎖における２’－フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチドを含み得る。
様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ｉＲＮＡが記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７，８５８，７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット、及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
以下により詳細に説明されるように、ｉＲＮＡに対する１つ又は複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むｉＲＮＡは、ｉＲＮＡの１つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ｉＲＮＡの修飾サブユニットに結合される。例えば、ｉＲＮＡの１つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環状の）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、すなわち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、すなわち、１つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は２つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は１つ又は複数の二重結合を含み得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、ホスフェート、又は修飾ホスフェート、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸の骨格中への担体の組み込みに利用可能であり、且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」（ＴＡＰ）は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり得る。任意に、選択された部分は、介在するテザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を提供する。
ｉＲＮＡは、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｙｌ）、テトラヒドロフリル、及びデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格である。
本発明の別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～４０のヌクレオチドを有する。ＲＮＡｉ剤は、式（Ｌ）：
（Ｌ）
によって表され得、
式（Ｌ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、独立して、２’－Ｏ－アルキル、２’－置換アルコキシ、２’－置換アルキル、２’－ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドである。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、２’－ＯＭｅ修飾を含む。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆ修飾を含む。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’の少なくとも１つが、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾を含む。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域の反対側に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位に）配置された熱的に不安定なヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位においてヌクレオチドと対合するセンス鎖の位置にある。一例において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、非塩基性修飾；二本鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；及び２’－デオキシ修飾などの糖修飾又は非環状ヌクレオチド、例えば、非固定核酸（ＵＮＡ）又はグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み得る熱的に不安定な修飾を有する。一実施形態において、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖における反対のヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）以下からなる群から選択される非塩基性修飾：
；及びｉｉｉ）以下からなる群から選択される糖修飾：
からなる群から選択される熱的に不安定な修飾を有し、式中、Ｂが、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２が、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、又はアルキルであり；Ｒ３が、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である。一実施形態において、Ｃ１における熱的に不安定な修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、及びＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；任意に、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基は、２’－デオキシ核酸塩基である。一例において、Ｃ１における熱的に不安定な修飾は、ＧＮＡ又は
である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’はそれぞれ、独立して、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さより小さいか又は等しい立体的嵩高さをヌクレオチドに与える修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さは、修飾の立体効果の総和を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定するための方法は、当業者に公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあるか、又は非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、又はリボース糖の２’位と同様若しくは同等のヌクレオチドの骨格に対する修飾であり得、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さより小さいか又は等しい立体的嵩高さをヌクレオチドに与える。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’はそれぞれ、独立して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’－Ｆ、及び２’－Ｆ－５’－メチルから選択される。一実施形態において、Ｔ１はＤＮＡである。一実施形態において、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡである。一実施形態において、Ｔ２’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。一実施形態において、Ｔ３’は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３、及びｑ１は、独立して、４～１５ヌクレオチド長である。
ｎ５、ｑ３、及びｑ７は、独立して、１～６ヌクレオチド長である。
ｎ４、ｑ２、及びｑ６は、独立して、１～３ヌクレオチド長であり；或いは、ｎ４は０である。
ｑ５は、独立して、０～１０ヌクレオチド長である。
ｎ２及びｑ４は、独立して、０～３ヌクレオチド長である。
或いは、ｎ４は、０～３ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ｎ４は０であり得る。一例において、ｎ４は０であり、ｑ２及びｑ６は１である。別の例において、ｎ４は０であり、ｑ２及びｑ６は１であり、（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、ｎ４、ｑ２、及びｑ６はそれぞれ、１である。
一実施形態において、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、及びｑ６はそれぞれ、１である。
一実施形態において、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４～１７位にあり、ｎ４は１である。一実施形態において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
一実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始する。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１に等しい。
一実施形態において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一例において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１に等しい。
例示的な実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、ｑ６は１に等しく、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始し、ｑ２は１に等しい。
一実施形態において、Ｔ１’及びＴ３’は、１１ヌクレオチド長だけ隔てられる（すなわち、Ｔ１’及びＴ３’ヌクレオチドを数えない）。
一実施形態において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一例において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１に等しく、修飾は、２’位又は２’－ＯＭｅリボースより少ない立体的嵩高さを与える非リボース、非環状若しくは骨格における位置にある。
一実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１に等しく、修飾は、２’位又は２’－ＯＭｅリボースより少ないか又は等しい立体的嵩高さを与える非リボース、非環状又は骨格における位置にある。
一実施形態において、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例において、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にあり、ｎ２は１である。例示的な実施形態において、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位の、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１である。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位から開始する。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、ｑ４は１である。
例示的な実施形態において、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、例えば、センス鎖の５’末端から１１位の、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１であり；Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１に等しく、Ｔ１’に対する修飾は、リボース糖の２’位にあるか又は２’－ＯＭｅリボースより少ない立体的嵩高さを与える非リボース、非環状若しくは骨格における位置にあり；Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、ｑ４は１であり；Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１に等しく、Ｔ３’に対する修飾は、２’位にあるか又は２’－ＯＭｅリボースより少ないか又は等しい立体的嵩高さを与える非リボース、非環状又は骨格における位置にある。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位から開始する。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位から開始し、ｑ４は２である。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位から開始する。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位にあり、ｑ４は１である。
一実施形態において、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意に、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの更なるＴＴを有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意に、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの更なるＴＴを有し；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’－Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’－ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、又は５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル
であり得る。５’末端リン含有基が、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である場合、５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわち、トランス－ビニルホスフェート、
）、５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわち、シス－ビニルホスフェート、
）、又はそれらの混合物のいずれかであり得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端にリン含有基を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－Ｐを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－ＰＳを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－Ｅ－ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－Ｚ－ＶＰを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－ＰＳ２を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖中に５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルを含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡｉ ＲＮＡ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せ）、及び標的化リガンドも含む。
一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、又はそれらの組合せ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅ又は２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の１及び２位における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及び１８～２３位以内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９～１１、１３、１７、１９、及び２１位における２’－Ｆ修飾、並びに２、４、６、８、１２、１４～１６、１８、及び２０位における２’－ＯＭｅ修飾を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、９、１１～１３、１５、１７、１９、２１、及び２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、４、６～８、１０、１４、１６、１８、２０、及び２２位における２’Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９～１１、１３、１５、１７、１９位における２’－Ｆ修飾、及び２１、並びに２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、及び２０位における２’－ＯＭｅ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９、１１～１３、１５、１７、１９、及び２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、及び２０位における２’Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１～６、８、１０、及び１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、７、及び９位における２’－Ｆ修飾、並びに１１位におけるデオキシ－ヌクレオチド（例えばｄＴ）；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、４～６、８、１０、１２、１４、１６、及び１８位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、１０、１２、１４、及び１６～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに７、９、１１、１３、及び１５位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２～４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～９、及び１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに１０、及び１１位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９、１１～１３、１５、１７、１９、及び２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、及び２０位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９～１１、及び１３位における２’－Ｆ修飾、並びに２、４、６、８、１２、及び１４～２１位における２’－ＯＭｅ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５～７、９、１１～１３、１５、１７～１９、及び２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、４、８、１０、１４、１６、及び２０位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、２、４、６、８、１２、１４、１５、１７、及び１９～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに３、５、７、９～１１、１３、１６、及び１８位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、４、６、７、９、１１～１３、１５、１７、及び１９～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、２、３、５、８、１０、１４、１６、及び１８位における２’－Ｆ修飾、並びに２４及び２５位におけるデオキシ－ヌクレオチド（例えばｄＴ）；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に４つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、及び１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに７、及び９～１１位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３～５、７、８、１０～１３、１５、及び１７～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、６、９、１４、及び１６位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、及び１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに７、及び９～１１位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３～５、７、１０～１３、１５、及び１７～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、６、８、９、１４、及び１６位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、及びヌクレオチド２２位と２３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）１９ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～４、６、及び１０～１９位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに５、及び７～９位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位との間、及びヌクレオチド２位と３位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３～５、７、１０～１３、１５、及び１７～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、並びに２、６、８、９、１４、及び１６位における２’－Ｆ修飾；並びに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド１９位と２０位との間、及びヌクレオチド２０位と２１位との間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖とを含み；
このＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
特定の実施形態において、本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡは、表３、表５、又は表６に列挙される薬剤から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドを更に含み得る。
ＩＩＩ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、例えば細胞中への、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをｉＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）。他の実施形態において、リガンドは、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）である。
特定の実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞型）、区画（例えば、細胞又は器官の区画）、身体の組織、器官又は領域に対する向上した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。
リガンドは、タンパク質などの天然の物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン又はヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの、組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態において、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンである。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン－イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ－ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、又は多価フコースなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ－κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＰＫ調節剤）として働く。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンド（例えばＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。更に、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。
本発明のリガンドコンジュゲートｉＲＮＡは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述される）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、又は結合部分が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。
本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に及び日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の方法が、それに加えて又はその代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートｉＲＮＡ及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、或いは結合部分を既に有するヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド－ヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、或いは非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。
結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が、通常、完了されてから、リガンド分子が、結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される市販の、標準的なホスホラミダイト及び非標準的なホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホラミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
特定の実施形態において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ－リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。
他の実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミン或いは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＳＡ及び低比重リポタンパク（ＬＤＬ）も含まれる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ－アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα－へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチド及びペプチド模倣薬の結合は、細胞認識及び吸収を向上させることなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を与え得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５～５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。
ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１４）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１５）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１６）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４、１９９１）。細胞標的化の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、又はＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
本発明の組成物及び方法に使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状又は環状であってもよく、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾されていてもよく、例えば、グリコシル化又はメチル化されていてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸、並びに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１又はＶＥＧＦを標的とする。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、或いはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α－へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７又はＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、ｉＲＮＡは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書で使用される「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、該単糖単位の各々が少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物には、糖（単糖、二糖、三糖、及び、約４、５、６、７、８、又は９単糖単位を含むオリゴ糖）、並びに澱粉、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖には、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二及び三糖には、２つ又は３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８）を有する糖が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。
一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、
（式中、Ｙが、Ｏ又はＳであり、ｎが３～６である）（式ＸＸＩＶ）；
（式中、Ｙが、Ｏ又はＳであり、ｎが、３～６である）（式ＸＸＶ）；
（式中、Ｘが、Ｏ又はＳである）（式ＸＸＶＩＩ）；
からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
本明細書に記載される実施形態に使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定はされないが、
が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
本発明の特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。ある実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。本発明の更に他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。
一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端、又は本明細書に記載される二重標的化ＲＮＡｉ剤の一方若しくは両方のセンス鎖の５’末端に結合された１つのＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、それぞれが独立して、複数の一価のリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合された、複数（例えば、２、３、４、５、又は６つ）のＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
ある実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された１つのより大きい分子の一部である場合、ヘアピンループ内の各不対ヌクレオチドは、独立して、一価のリンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。
ある実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、限定はされないが、ＰＫ調節剤又は細胞透過性ペプチドなどの上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを更に含む。
本発明における使用に好適な更なる炭水化物コンジュゲート及びリンカーとしては、それぞれの全内容が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は非切断可能であってもよい様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。
用語「リンカー」又は「結合基」は、化合物の２つの部分を接続し、例えば化合物の２つの部分を共有結合させる有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合、又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、又は、非限定的に置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）アリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、又は置換又は非置換のヘテロ環状により中断又は終結されてもよい）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７、又は８～１６個の原子からなる。
切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０、倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又はそれを超える、又は少なくとも１００倍速く切断される。
結合可能な結合基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解剤の例には：例えば細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素、又は、還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できる、メルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な、例えば５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは５．５～６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドから陽イオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含んでもよい。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、陽イオン性脂質に結合されてもよい。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞タイプ内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞タイプには、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などの、ペプチダーゼに富んだ細胞タイプを標的とする際に使用することができる。
一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。それ故、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００倍速く切断される。
ｉ．切断可能なレドックス結合基
特定の実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定のターゲティング剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載した方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、又は当技術分野にて既知の試薬を使用した他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価し得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で多くて約１０％切断される。別の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能な結合基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、又はそれ未満）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの、特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、非限定的にヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ－ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｉｖ．エステルベースの切断可能な結合基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、非限定的にアルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｖ．ペプチドベースの切断可能な結合基
更なる別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基の例は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとのｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、限定はされないが、
が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
本発明の組成物及び方法の特定の実施形態において、リガンドは、二価及び三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）：
のいずれかに示される構造の群から選択される二価及び三価の分枝鎖状リンカーにコンジュゲートされ、
式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、０～２０を表し、繰返し単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ又は複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終端されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
又はヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、リガンドを表し；すなわち、それぞれ、出現するごとに独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒａが、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＬＩＸ）：
のものなどの、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤とともに使用するのに特に有用であり、式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝状結合基の例には、非限定的に、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上記に引用した構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許には、非限定的に米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書，米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８；５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書；及び米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中に又は更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、ｉＲＮＡ化合物、好ましくは、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｄｓＲＮＡｉ剤である。これらのｉＲＮＡは、通常、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質として働き得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通例検出され得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡに結合されており、このような結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的な結合プロトコルは、配列の１つ又は複数に位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤又は活性化試薬を用いて、アミノ基を結合された分子と反応させる。結合反応は、固体担体に依然として結合されたＲＮＡを用いて、又は溶液相中のＲＮＡの切断の後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、ＧＴ関連疾患、例えば高血圧症を受けやすいか又はＡＧＴ関連疾患、例えば高血圧症と診断された対象などの、それを必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。或いは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達による成功も示している（Ｄｏｒｎ、Ｇ．、ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡの標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。
代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。
Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らのＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、ＣｏｎｒａｄのＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。或いは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様は、当該技術分野で知られている。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧症を予防又は処置するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口送達を介した、例えば、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、又は静脈内（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化された組成物である。本発明の医薬組成物は、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。
本発明の医薬組成物は、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、一日当たりレシピエントのキログラム体重当たり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、一日当たりキログラム体重当たり約１～５０ｍｇの範囲であろう。典型的に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ及び約３．０ｍｇ／ｋｇであろう。反復投与計画は、毎月、３～６ヶ月に１回、又は年に１回など、定期的な、治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、月に約１回から６ヶ月に約１回投与される。
最初の治療計画の後、治療は、より低い頻度で投与され得る。治療の期間は、疾病の重症度に基づいて決定され得る。
他の実施形態において、医薬組成物の単回投与は、長続きすることができるため、用量は、１、２、３、又は４ヶ月以下の間隔で投与される。本発明のある実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、月に約１回投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、四半期ごと（すなわち、約３ヶ月ごと）に投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、年に２回（すなわち、６ヶ月に約１回）投与される。
当業者は、対象に存在する突然変異、以前の治療、対象の全体的な健康又は年齢、及び存在する他の疾病を含むがこれらに限定されないいくつかの要因が、対象を有効に処置するのに必要とされる投与量及び時間に影響を与え得ることを理解するであろう。更に、必要に応じて、予防的又は治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。
ｉＲＮＡは、特定の組織（例えば、肝細胞）を標的とするように送達され得る。
本発明の医薬組成物としては、限定はされないが、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、限定はされないが、予め形成された液剤、自己乳化型固体、及び自己乳化型半固体を含む様々な成分から生成され得る。製剤としては、肝臓を標的とする製剤が挙げられる。
単位剤形において好都合に存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業において周知の従来の技術にしたがって調製され得る。このような技術は、有効成分を医薬担体又は賦形剤と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体と均一且つ密接に関連させることによって調製される。
Ａ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
多種多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。これらは、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水コロイド、保存剤、及び酸化防止剤を含む（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用、並びにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５－２１５）。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡは、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組合せを含む他の方法によって生成されてもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上記の種類のそれぞれ、並びに医薬組成物の製造及び薬剤の送達におけるそれらの使用が、当該技術分野において周知である。
ｖ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び所与の医薬組成物の他の成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。このような薬剤は、当該技術分野において周知である。
ｖｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有することができ、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料又は芳香性物質などと混合される。
水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。
ある実施形態において、本発明に取り上げられる医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｉＲＮＡ及び（ｂ）非ｉＲＮＡ機構によって機能し、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧症を処置するのに有用な１つ又は複数の薬剤を含む。
このような化合物の毒性及び予防的効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％に予防に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０、好ましくはＥＤ８０又はＥＤ９０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、予防に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）又はより高いレベルの阻害を含む、化合物の、又は、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
上述されるそれらの投与に加えて、本発明に取り上げられるｉＲＮＡは、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧症の予防又は処置に使用される他の公知の薬剤と組み合わせて投与され得る。いずれの場合でも、投与する医師は、当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を使用して、観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量及び時間を調整することができる。
ＶＩ．ＡＧＴ発現を阻害するための方法
本発明は、細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を、細胞内でのＡＧＴの発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤と接触させ、それによって、細胞内でのＡＧＴの発現を阻害する工程を含む。
細胞を、ｉＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤と接触させる工程は、インビトロで又はインビボで行われ得る。細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程は、対象、例えば、ヒト対象中の細胞又は細胞群を、ｉＲＮＡと接触させる工程を含む。細胞を接触させるインビトロ及びインビボ方法の組合せも可能である。細胞を接触させる工程は、上述されるように、直接又は間接的であり得る。更に、細胞を接触させる工程は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して行われ得る。好ましい実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、又は目的とする部位にＲＮＡｉ剤を指向する任意の他のリガンドである。
本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
「ＡＧＴの発現を阻害する」という語句は、任意のＡＧＴ遺伝子（例えば、マウスＡＧＴ遺伝子、ラットＡＧＴ遺伝子、サルＡＧＴ遺伝子、又はヒトＡＧＴ遺伝子など）並びにＡＧＴ遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。したがって、ＡＧＴ遺伝子は、野生型ＡＧＴ遺伝子、突然変異体ＡＧＴ遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、若しくは生物の文脈におけるトランスジェニックＡＧＴ遺伝子であり得る。
「ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する」は、ＡＧＴ遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＡＧＴ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＡＧＴ遺伝子の発現は、ＡＧＴ遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化、例えば、ＡＧＴ ｍＲＮＡレベル又はＡＧＴタンパク質レベルに基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む、個々の細胞又は細胞群中で評価され得る。ＡＧＴが、主に、肝臓において、更には脳、胆嚢、心臓、及び腎臓においても発現され、循環中に存在することが理解される。
阻害は、対照のレベルと比較したＡＧＴ発現に関連する１つ又は複数の変数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ－ｄｏｓｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理若しくは対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、若しくは試料から測定されるレベルであり得る。
本発明の方法のある実施形態において、ＡＧＴ遺伝子の発現は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％だけ、又はアッセイの検出のレベル未満になるまで阻害される。好ましい実施形態において、ＡＧＴ遺伝子の発現は、少なくとも７０％阻害される。他の組織、例えば、脳における発現のかなりの阻害を伴わない、特定の組織、例えば、肝臓におけるＡＧＴ発現の阻害が望ましいことがあることが更に理解される。好ましい実施形態において、発現レベルは、種を一致させた適切な細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示されるアッセイ方法を用いて決定される。
特定の実施形態において、インビボでの発現の阻害は、例えば、最低量のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与される場合、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類、例えば、ヒト標的遺伝子（すなわち、ＡＧＴ）を発現するＡＡＶ感染マウスにおけるヒト遺伝子のノックダウンによって決定される。モデル動物系における内在性遺伝子の発現のノックダウンはまた、例えば、最低量のＲＮＡ発現で３ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与の後、決定され得る。このような系は、ヒトｉＲＮＡがモデル動物遺伝子の有効なノックダウンを提供するように、ヒト遺伝子及びモデル動物遺伝子の核酸配列が十分に近い場合に有用である。肝臓におけるＲＮＡ発現は、実施例２に示されるＰＣＲ方法を用いて決定される。
ＡＧＴ遺伝子の発現の阻害は、ＡＧＴ遺伝子が転写され、ＡＧＴ遺伝子の発現が阻害されるように処理されている（例えば、１つ又は複数の細胞を本発明のｉＲＮＡと接触させることによって、又は本発明のｉＲＮＡを、細胞が存在する若しくは存在していた対象に投与することによって）第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（ｉＲＮＡで処理されていないか又は対象とする遺伝子に標的化されたｉＲＮＡで処理されていない対照細胞）と比較した際の低下によって現れ得る。好ましい実施形態において、阻害は、種を一致させた細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示される方法によって、及び以下の式を用いて、対照細胞内のｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして、処理された細胞内のｍＲＮＡのレベルを表すことによって評価される：
他の実施形態において、ＡＧＴ遺伝子の発現の阻害は、ＡＧＴ遺伝子発現に機能的に関連付けられたパラメータ、例えば、対象に由来する血液若しくは血清中のＡＧＴタンパク質レベルの低下に関して評価され得る。ＡＧＴ遺伝子サイレンシングは、発現構築物からの内在性又は異種のいずれかの、ＡＧＴを発現する任意の細胞において、及び当該技術分野において公知の任意のアッセイによって決定され得る。
ＡＧＴタンパク質の発現の阻害は、細胞若しくは細胞群によって発現されるか又は対象試料中のＡＧＴタンパク質のレベル（例えば、対象に由来する血液試料中のタンパク質のレベル）の低下によって現れ得る。上記に説明されるように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処理された細胞又は細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞若しくは細胞群におけるタンパク質のレベルにおけるパーセンテージ、又は対象試料、例えば、血液、又はそれに由来する血清におけるタンパク質のレベルの変化として同様に表され得る。
ＡＧＴ遺伝子の発現の阻害を評価するのに使用され得る対照細胞、細胞群、又は対象試料は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞、細胞群、又は対象試料を含む。例えば、対照細胞、細胞群、又は対象試料は、ＲＮＡｉ剤又は適切に一致させた集団対照による対象の処置の前に、個々の対象（例えば、ヒト又は動物対象）から得られ得る。
細胞又は細胞群によって発現されるＡＧＴ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定され得る。一実施形態において、試料におけるＡＧＴの発現のレベルは、転写されるポリヌクレオチド、又はその部分、例えば、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ（商標）、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することを含むＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ解析が挙げられる。
ある実施形態において、ＡＧＴの発現のレベルは、核酸プローブを用いて決定される。本明細書において使用される際の「プローブ」という用語は、特定のＡＧＴに選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、又は適切な生物学的製剤から得られる。プローブは、標識されるように特に設計され得る。プローブとして用いられ得る分子の例としては、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡが、ハイブリダイゼーション又は限定はされないが、サザン若しくはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含む増幅アッセイに使用され得る。ｍＲＮＡレベルの決定のための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＡＧＴ ｍＲＮＡにハイブリダイズされ得る核酸分子（プローブ）と接触させる工程を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、固体表面上で固定され、例えば、アガロースゲル上で単離されたｍＲＮＡを電気泳動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜へと移すことによって、プローブと接触される。代替的な実施形態において、プローブは、固体表面上で固定され、ｍＲＮＡは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触される。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＡＧＴ ｍＲＮＡのレベルを決定するのに使用するために容易に適合させることができる。
試料中のＡＧＴの発現のレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらの米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅方法による、例えば試料中のｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅又は逆転写酵素のプロセス、続いて、当業者に周知の技術を用いた増幅した分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子がごく少数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様において、ＡＧＴの発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって決定される。好ましい実施形態において、発現レベルは、種を一致させた細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示される方法によって決定される。
ＡＧＴ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されるような）、又はマイクロウェル、試料管、ゲル、ビーズ若しくは繊維（又は結合核酸を含む任意の固体担体）を用いて監視され得る。参照により本明細書に援用される、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＡＧＴ発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブを使用することも含み得る。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書に示される実施例に記載され、例示されている。好ましい実施形態において、発現レベルは、種を一致させた細胞株中で１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を用いて、実施例２に示される方法によって決定される。
ＡＧＴタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体又はゲル内沈降素反応、吸光分光法、比色分析法、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、（単純又は二重）免疫拡散法、免疫電気泳動、ウエスタンブロット法、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
ある実施形態において、本発明の方法の有効性は、ＡＧＴ ｍＲＮＡ又はタンパク質レベル（例えば、肝生検）の低下によって評価される。
本発明の方法のある実施形態において、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、対象中の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＡＧＴの発現の阻害は、対象中に特定の部位に由来する体液又は組織（例えば、肝臓、又は血液）に由来する試料中のＡＧＴ ｍＲＮＡ又はａｇｔタンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を用いて評価され得る。
本明細書において使用される際、被分析物のレベルを検出又は決定するという用語は、材料、例えば、タンパク質、ＲＮＡが存在するかどうかを決定する工程を行うことを意味することが理解される。本明細書において使用される際、検出又は決定する方法は、使用される方法のための検出のレベル未満の被分析物レベルの検出又は決定を含む。
ＶＩＩ．本発明の予防及び処置方法
本発明は、ＡＧＴの発現を阻害し、それによって、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧、例えば、高血圧症を予防又は処置するために、本発明のｉＲＮＡ又は本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用する方法も提供する。
本発明の方法において、細胞は、インビトロ又はインビボでｓｉＲＮＡと接触され得、すなわち、細胞は、対象中にあり得る。
本発明の方法を使用する処置に好適な細胞は、ＡＧＴ遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、肝細胞、脳細胞、胆嚢細胞、心臓細胞、又は腎臓細胞、好ましくは、肝細胞であり得る。本発明の方法に使用するのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（キメラ非ヒト動物中のヒト細胞を含むヒト細胞、又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞若しくはチンパンジー細胞など）、又は非霊長類細胞であり得る。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞である。本発明の方法において、ＡＧＴ発現は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、若しくは９５だけ、又はアッセイの検出のレベル未満のレベルまで、細胞内で阻害される。
本発明のインビボ方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与する工程を含んでいてもよく、ここで、ｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ剤が投与される哺乳動物のＡＧＴ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。組成物は、経口、腹腔内、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、及び髄腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、経鼻、直腸、及び局所（口腔及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、筋肉内注射によって投与される。
一態様において、本発明は、哺乳動物におけるＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＡＧＴ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を哺乳動物に投与する工程、及びＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって、細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する工程を含む。遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、及び例えば、本明細書、例えば実施例２に記載されるｑＲＴ－ＰＣＲといった方法によって評価され得る。タンパク質産生の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えばＥＬＩＳＡによって評価され得る。特定の実施形態において、穿刺肝生検試料は、ＡＧＴ遺伝子又はタンパク質発現の低下を監視するための組織材料として用いられる。他の実施形態において、血液試料は、ａｇｔタンパク質発現の低下を監視するための対象試料として用いられる。
本発明は、それを必要とする対象、例えば、高血圧症と診断された対象における処置の方法を更に提供する。
本発明は、それを必要とする対象における予防の方法を更に提供する。本発明の処置方法は、ＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ又はＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む医薬組成物の予防的に有効な量で、対象、例えば、ＡＧＴ発現の低下から利益を得られ得る対象に、本発明のｉＲＮＡを投与する工程を含む。
本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与され得る。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。裸のｉＲＮＡは、好適な緩衝液中にあり得る。緩衝液は、アセテート、シトレート、プロラミン、カーボネート、若しくはホスフェート、又はそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適であるように調整され得る。
或いは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
ＡＧＴ遺伝子発現の阻害から利益を得られ得る対象は、高血圧に罹患しやすいか又はそれと診断された対象である。
一実施形態において、本方法は、標的ＡＧＴ遺伝子の発現が、例えば、１回の投与当たり約１、２、３、４、５、６、１～６、１～３、又は３～６ヶ月にわたって低下されるように、本明細書に取り上げられる組成物を投与する工程を含む。特定の実施形態において、組成物は、３～６ヶ月に１回投与される。
好ましくは、本明細書に取り上げられる方法及び組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＡＧＴ遺伝子の（一次又はプロセシングされた）ＲＮＡを特異的に標的とする。ｉＲＮＡを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法が、本明細書に記載されるように、調製され、実施され得る。
本発明の方法に係るｉＲＮＡの投与は、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧、例えば、高血圧症の予防又は処置をもたらし得る。様々なタイプの高血圧の診断基準が以下に示される。
対象は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与され得る。
ｉＲＮＡは、好ましくは、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与される。１回又は複数回の注射を用いて、所望の用量のｉＲＮＡを対象に送達し得る。注射は、所定の期間にわたって繰り返され得る。
投与は、定期的に繰り返され得る。特定の実施形態において、最初の治療計画の後、治療は、より低い頻度で投与され得る。反復投与計画は、月に１回から年に１回など、定期的な、治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、月に約１回から３ヶ月に約１回、又は３ヶ月に約１回から６ヶ月に約１回投与される。
ＶＩＩＩ．高血圧の診断基準、危険因子、及び処置
最近、高血圧の予防及び処置のための実施ガイドラインが見直された。広範なレポートが、Ｒｅｂｏｕｓｓｉｎら（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｔｈｅ ２０１７ ＡＣＣ／ＡＨＡ／ＡＡＰＡ／ＡＢＣ／ＡＣＰＭ／ＡＧＳ／ＡＰｈＡ／ＡＳＨ／ＡＳＰＣ／ＮＭＡ／ＰＣＮＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１７ Ｎｏｖ ７．ｐｉｉ：Ｓ０７３５－１０９７（１７）４１５１７－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１７．１１．００４．）及びＷｈｅｌｔｏｎら（２０１７ ＡＣＣ／ＡＨＡ／ＡＡＰＡ／ＡＢＣ／ＡＣＰＭ／ＡＧＳ／ＡＰｈＡ／ＡＳＨ／ＡＳＰＣ／ＮＭＡ／ＰＣＮＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１７ Ｎｏｖ ７．ｐｉｉ：Ｓ０７３５－１０９７（１７）４１５１９－１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１７．１１．００６．）によって公表された。新たなガイドラインの一部の主要部分が以下に示される。しかしながら、ガイドラインは、本出願の時点での高血圧の診断及び監視基準並びに処置に関する当業者の知識を提供するものであると理解されるべきであり、参照により本明細書に援用される。
Ａ．診断基準
より高い血圧と増加した心血管疾患リスクとの間には持続的な関連が存在するが、臨床及び公衆衛生上の決定を行うために血圧レベルを分類することが有用である。血圧は、医療現場（オフィスの血圧測定）で測定される平均血圧に基づいて以下の表に示されるように４つのレベル：正常、上昇、及びステージ１又は２の高血圧に分類され得る（Ｗｈｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
血圧は、２回以上の機会に得られる２回以上の慎重な読み取り値の平均に基づいた血圧を示す。慎重な血圧読み取り値を得るために最良の実施が、Ｗｈｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７に詳述されており、当該技術分野において公知である。
この分類は、ＪＮＣ ７レポート（Ｃｈｏｂａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ；ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００３；４２：１２０６－５２）において以前に推奨されていたものと異なり、ステージ１高血圧は、現在、１３０～１３９の収縮期血圧（ＳＢＰ）又は８０～８９ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧（ＤＢＰ）として定義され、本明細書中のステージ２高血圧は、ＪＮＣ ７レポート中のステージ１及び２に相当する。この分類の論理的根拠は、ＳＢＰ／ＤＢＰ及び心血管疾患リスクの間の関連、血圧を低下させるための生活様式の変更のランダム化臨床試験、及び心血管疾患を予防するための降圧剤による処置のランダム化臨床試験に関する観測データに基づいている。
ステージ２高血圧を有する成人の間での心血管疾患の増加したリスクは、十分に確立されている。増加した数の個々の試験及び観測データのメタ分析が、徐々に増加した心血管疾患リスクの勾配が、正常血圧から上昇した血圧及びステージ１高血圧へと向かっていることを報告している。これらのメタ分析の多くにおいて、冠状動脈性心疾患及び脳卒中の危険率は、＜１２０／８０ｍｍ Ｈｇに対する１２０～１２９／８０～８４ｍｍ ＨｇのＳＢＰ／ＤＢＰの比較については１．１～１．５であり、＜１２０／８０ｍｍ Ｈｇに対する１３０～１３９／８５～８９ｍｍ ＨｇのＳＢＰ／ＤＢＰの比較については１．５～２．０である。このリスク勾配は、性別及び人種／民族によって定義されるサブグループにわたって一貫していた。より高い血圧に関連する心血管疾患リスクの相対的増加は、軽減されたが、他の成人の間で依然として存在していた。生活様式の変更及び薬理学的な降圧剤処置が、上昇した血圧並びにステージ１及び２高血圧を有する個体に推奨される。血圧が処置によって正常化されない場合でさえ、臨床的利点が、上昇した血圧のステージの低下によって得られる。
Ｂ．危険因子
高血圧は、限定はされないが、遺伝学、生活様式、食習慣、及び二次的な危険因子を含む要因の組合せに起因する複雑な疾患である。高血圧は、妊娠にも関連し得る。高血圧の複雑な性質のため、複数の介入が、高血圧の処置に必要とされ得ることが理解される。更に、食習慣及び生活様式の変更を含む非薬理学的な介入が、高血圧の予防及び処置に有用であり得る。更に、介入が、個体における血圧を完全に正常化しなくても臨床的利点を提供し得る。
１．遺伝的な危険因子
グルココルチコイド反応性アルドステロン症、リドル症候群、ゴードン症候群、及び単一遺伝子突然変異が高血圧の病態生理学を完全に説明するその他の高血圧などのいくつかの単遺伝子型の高血圧が特定されており、これらの疾患は稀である。血圧及び高血圧に寄与する公知の遺伝的変異の最新の一覧には、２５を超える稀な突然変異及び１２０の一塩基ヌクレオチド多型が含まれる。しかしながら、遺伝的要因は、一部の個体における高血圧に寄与し得るが、遺伝的変異は、血圧変動の約３．５％を説明するに過ぎないものと推定される。
２．食習慣及びアルコール摂取
高血圧をもたらす一般的な環境及び生活様式の危険因子としては、質の悪い食事、不足した身体活動、及び過剰なアルコール摂取が挙げられる。これらの因子は、過体重又は肥満になる人を生じさせ、高血圧を発症又は悪化させる可能性を更に高め得る。上昇した血圧は、増加したウエスト・ヒップ比又は腹部脂肪分布の他の尺度と更に強く相関している。若年での肥満及び進行中の肥満は、後年における高血圧と強く相関している。正常体重の達成は、高血圧を発症するリスクを、肥満になったことがない人のものへと低下させ得る。
ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウムの摂取も、血圧にかなりの影響を与え得る。ナトリウム摂取は、血圧と正に相関し、加齢に伴う血圧の上昇の多くを説明する。特定の群は、黒人及び高齢者（６５歳以上）を含む他の群、並びにより高いレベルの血圧又は慢性腎疾患、糖尿病、若しくはメタボリック・シンドロームなどの併存疾患を有するものよりナトリウム摂取の増加により感受性である。全体として、これらの群は、米国の全成人の半分以上を占める。食塩感受性は、血圧と無関係に、増加した心血管疾患及び総死亡率のマーカーであり得る。現在、食塩感受性の認識のための技術は、臨床環境において実用的でない。したがって、食塩感受性は、集団特性であると最も考えられる。
カリウム摂取は、血圧及び脳卒中に逆相関し、カリウムのより高いレベルが、血圧に対するナトリウムの影響を鈍らせるようである。より低いナトリウム－カリウム比は、ナトリウム又はカリウム自体の対応するレベルについて知られているものより低い血圧に関連している。同様の観察が、心血管疾患のリスクについてなされている。
アルコール摂取は、長い間、高血圧に関連付けられてきた。米国では、アルコール摂取が、高血圧の人口負荷の約１０％を占めると推定されており、この負荷は、女性より男性が高い。
食習慣又はアルコール摂取の変化が、高血圧の予防又は処置の一側面であり得ることが理解される。
３．身体活動
身体活動／体力と血圧レベルとの間に十分に確立された逆相関がある。最も少ないレベルの身体活動でさえ、高血圧を低下させるのに有益であることが実証されている。
身体活動の増加が、高血圧の予防又は処置の一側面であり得ることが理解される。
４．二次的な危険因子
二次的な高血圧が、血圧の深刻な上昇、薬理学的に治療抵抗性の高血圧、高血圧の突然発症、薬剤治療で以前は高血圧が制御されていた患者における血圧上昇、高齢者における拡張期高血圧の発症、及び高血圧の持続時間若しくは重症度に不釣り合いな標的臓器障害の根底にあり得る。二次性高血圧は、上昇した血圧を有する若年患者（３０歳未満）において疑われるべきであるが、特に黒人において、若年で原発性高血圧が発現するのは珍しくなく、腎血管性疾患などの何らかの形態の二次性高血圧が、高齢期（６５歳以上）により多く見られる。二次性高血圧の原因の多くは、臨床所見又は特定の疾患を裏付ける一連の所見に強く関連している。このような場合、基礎疾患の処置は、高血圧の処置に典型的に使用される薬剤を投与せずに上昇した血圧の所見を回復させ得る。
５．妊娠
妊娠は、高血圧の危険因子であり、妊娠中の高血圧は、後年における心血管疾患及び高血圧の危険因子である。妊娠に関連する高血圧についてのレポートが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（ＡＣＯＧ）によって２０１３年に発表された（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ’ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１３；１２２：１１２２－３１）。レポートの一部の主要部分が、以下に示される。しかしながら、レポートは、本出願の時点での妊娠中の高血圧の診断及び監視基準並びに処置に関する当業者の知識を提供するものであると理解されるべきであり、参照により本明細書に援用される。
子癇前症の診断基準が、以下の表（ＡＣＯＧレポート、２０１３の表１から）に示される。
妊娠中の血圧管理は、ＡＣＥ阻害剤及びＡＲＢを含む多くの一般的に使用される降圧剤が、胎児への潜在的な有害性のため、妊娠中は禁忌であることによって、複雑化される。妊娠中の降圧治療の目標は、重度の高血圧の防止及び胎児が出産前に成熟するより多くの時間を可能にする妊娠期間の延長の可能性を含む。妊娠に関連する重度の高血圧の処置の検討では、推奨される特定の薬剤に対する十分なエビデンスが見出されず；むしろ、臨床医の経験が、この状況において推奨された（Ｄｕｌｅｙ Ｌ，Ｍｅｈｅｒ Ｓ，Ｊｏｎｅｓ Ｌ．Ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ．２０１３；７：ＣＤ００１４４９．）。
Ｃ．処置
高血圧の処置は、対象が同様に治療を受けている他の併存疾患（しばしば腎臓機能の低下を含む）が存在することが多いため複雑である。高血圧の成人を管理する臨床医は、患者の健康全般に焦点を合わせるべきであり、将来の有害な心血管疾患転帰のリスクを低下させることに特に重点を置く。全ての患者の危険因子は、包括的な非薬理学的及び薬理学的手法と一元的に管理される必要がある。患者の血圧及び将来の心血管疾患発症のリスクが増加するにつれて、血圧管理が強化されるべきである。
血圧レベルのみに基づいた降圧剤による高血圧の処置は、コスト効率が高いと考えられているが、このような処置を誘導する絶対的な心血管疾患リスク及び血圧レベルの組合せの使用は、血圧レベルのみの使用より心血管疾患のリスクを低下させる際により効率的で且つコスト効率が高い。単剤から開始した多くの患者は、その後、自身の血圧の目標を達成するために異なる薬理学的クラスからの２種以上の薬剤を必要とすることになる。各薬剤の薬理学的作用機序の知識は重要である。第２の降圧剤が、最初の薬剤に対する代償性反応を阻止するために使用されるか又は異なる昇圧機構に作用する、補完的活性を用いた投薬計画が、血圧の相加的な低下をもたらし得る。例えば、チアジド利尿剤が、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系を刺激し得る。ＡＣＥ阻害剤又はＡＲＢをチアジドに加えることによって、相加的な血圧低下効果が得られる。併用療法の使用はまた、アドヒアランスを改善し得る。成分間の補完的な作用機序を用いた、降圧剤治療のいくつかの２つ及び３つの固定用量の薬剤の組合せが利用可能である。
経口降圧剤を列挙するＷｈｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１７からの表１８が、以下に示される。高血圧の処置のための治療剤のクラス及びそれらのクラスに含まれる薬剤が示される。用量範囲、頻度、及び注記も示される。
本発明は、以下の実施例によって更に示されるが、これらの実施例は、限定的なものであると解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献、特許及び公開特許出願の全内容、並びに配列表が、参照により本明細書に援用される。
実施例１．ｉＲＮＡ合成
試薬の供給源
本明細書に試薬の供給源が特に示されていない場合、このような試薬は、分子生物学における試薬の任意の供給業者から、分子生物学における用途のための品質／純度基準で得ることができる。
ｓｉＲＮＡ設計
ヒトＡＧＴ遺伝子を標的とする一連のｓｉＲＮＡ（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿００００２９．３；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：１８３）を、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて設計した。ヒトＮＭ＿００００２９ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、ｖｅｒｓｉｏｎ ３は、２５８７塩基の長さを有する。
非修飾ＡＧＴセンス鎖及びアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳細なリストが、表３に示される。修飾ＡＧＴセンス鎖及びアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳細なリストが、表５に示される。
ｓｉＲＮＡ合成
当該技術分野において公知の日常的な方法を用いて、ｓｉＲＮＡを合成し、アニールした。
実施例２．インビトロスクリーニング方法
細胞培養及び３８４ウェルトランスフェクション
Ｈｅｐ３ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ）を補充したイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、５％のＣＯ２の雰囲気中で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで増殖させてから、トリプシン処理によってプレートから剥離させた。
ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ及び０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ ＃ １３７７８－１５０）を、３８４ウェルプレート中の個々のウェルに５μｌの各ｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによって、トランスフェクションを行った。次に、混合物を、室温で２０分間インキュベートした。次に、５，０００個のＨｅｐ３ｂ細胞を含有する５０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。細胞を、ＲＮＡ精製の前に２４時間インキュベートした。単回投与実験を、１０ｎＭ及び０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で行い、用量反応実験を、１０ｎＭ～３７．５ｆＭの範囲にわたって８点６倍連続希釈を用いて行った。
ＡＧＴ ｍＲＮＡを標的とする更なるｄｓＲＮＡ剤が、全内容が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公報国際公開第２０１５／１７９７２４号パンフレットに記載されている。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ｐａｒｔ ＃：６１０－１２）を使用した総ＲＮＡ単離
細胞を、ウェル当たり３ｕＬのビーズを含む７５μｌの溶解／結合緩衝液に溶解させ、１０分間にわたって電磁振動機において混合した。洗浄工程を、磁気プレートの補助を用いて、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６において自動化した。ビーズを緩衝液Ａで１回、緩衝液Ｂで１回、及び緩衝液Ｅで２回洗浄し（９０μＬ中）、それらの間に吸引工程があった。最後の吸引の後、完全な１０μＬのＲＴ混合物を、後述されるように、各ウェルに加えた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり１ｕｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮアーゼ阻害剤及び６．６μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、ウェルごとに加えた。プレートを密閉し、電磁振動機において１０分間撹拌し、次に、３７℃で２時間インキュベートした。この後、プレートを８０℃で８分間撹拌した。
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＡＧＴ（Ｈｓ００１７４８５４ｍ１）、２μｌのヌクレアーゼフリー水及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で行った。
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞、又はモックトランスフェクト細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬＦｉｔを用いた４パラメータフィットモデルを用いて計算し、ＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた又はモックトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。ＡＤ－１９５５のセンス及びアンチセンス配列は、センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号１９）及びアンチセンスＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号２０）である。スクリーニングからの結果が、表４に示される。
実施例３．ヒトＡＧＴを発現するＡＡＶが遺伝子導入されたマウスにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖のインビボスクリーニング
ヒトアンジオテンシノーゲンを発現するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、まず、ヒトＡＧＴ転写物を発現するＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターを遺伝子導入した。ＡＡＶ導入から少なくとも２週間後、血液を、ベースライン循環ヒトＡＧＴレベルのためにマウスから採取し、次に、動物に、表５及び６に示されるｄｓＲＮＡ剤のサブセットの１つの単回の３ｍｇ／ｋｇの皮下投与を与えた（群当たりＮ＝３）。血液を、ｄｓＲＮＡ剤の投与の１４日後の時点で再度動物から採取した。ヒトＡＧＴレベルを、製造業者のプロトコル（ＩＢＬ Ａｍｅｒｉｃａ ＃２７４１２）にしたがって、ヒトアンジオテンシノーゲンに特異的なＥＬＩＳＡを用いて定量した。データを、ベースライン値におけるパーセントとして表し、平均＋標準偏差として示した。いくつかのｄｓＲＮＡ二本鎖を、更なる分析のために選択した。
実施例４．カニクイザルにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖のインビボスクリーニング
上記のマウス試験から特定された、目的の二本鎖を、カニクイザルにおいて評価した。動物（群当たりＮ＝３）に、１日目にｄｓＲＮＡ剤（ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－１２６３０６、ＡＤ－１２６３０７、ＡＤ－１２６３０８、又はＡＤ－１３３３６２）の単回の３ｍｇ／ｋｇの皮下投与を与えた。血液を、投与の－６、１、４、８、１５、２２、２９、３２、３５、４３、５７、７１、８５、及び９９日後に採取した。循環ＡＧＴレベルを、製造業者のプロトコル（ＩＢＬ Ａｍｅｒｉｃａ ＃２７４１２）にしたがって、ヒトアンジオテンシノーゲンに特異的な（且つカニクイザルと交差反応性である）ＥＬＩＳＡを用いて定量した。データを、ベースライン値におけるパーセントとして表し、平均±標準偏差として示した。結果が、図１Ａに示される。ＡＤ－８５４８１、ＡＤ－１２６３０６、及びＡＤ－１３３３６２の間の見掛けの差は、非ヒト霊長類における典型的な試験間の変動の範囲内である。
用量反応試験を、ＡＤ－６７３２７及びＡＤ－８５４８１の活性を評価するために行った。実験を別々に行ったが、使用される方法は、実質的に同じであり、結果が、図１Ｂに一緒に示される。カニクイザルに、１日目にｄｓＲＮＡ剤の単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇの皮下投与を与えた。血液を、ＡＤ－６７３２７の投与の－６、１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、７１及び７８日後並びにＡＤ－８５４８１の投与の－６、１、４、８、１５、２２、２９、３２、３５、４３、５７、７１、８５、及び９９日後に採取した。循環ＡＧＴレベルを、製造業者のプロトコル（ＩＢＬ Ａｍｅｒｉｃａ ＃２７４１２）にしたがって、ヒトアンジオテンシノーゲンに特異的な（且つカニクイザルと交差反応性である）ＥＬＩＳＡを用いて定量した。データを、ベースライン値におけるパーセントとして表し、平均＋標準偏差として示した。結果が、図１Ｂに示される。これらのデータは、ＡＤ－６７３２７よりＡＤ－８５４８１についての有効性及び持続時間の約３倍の改善を実証している。
複数回投与試験を、ＡＤ－６７３２７及びＡＤ－８５４８１の効力及び持続性を決定するために行った。実験を別々に行ったが、使用される方法は、実質的に同じであり、結果が、図１Ｃに一緒に示される。カニクイザルに、３週間にわたって４週間に１回（ｑ４ｗ投与）（最初の投与の１、２９、及び５７日後）、１ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ－６７３２７又はＡＤ－８５４８１を皮下投与した。血液を、ＡＤ－６７３２７の最初の投与の－６、１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、７１及び７８日後並びにＡＤ－８５４８１の最初の投与の－８、１、４、８、１５、２２、２９、３６、４３、５７、６４、７１、８５、９９日後に、循環ＡＧＴの評価のために採取した。これらのデータは、ＡＤ－６７３２７と比較したＡＤ－８５４８１による標的サイレンシングの効力及び持続性の増加を実証している。
実施例５．自然発症高血圧ラットモデルにおけるＡＧＴ ｄｓＲＮＡによる高血圧の処置
ラット特異的ｄｓＲＮＡを、自然発症高血圧ラットモデルにおけるＡＧＴノックダウンの影響を試験するために設計した。自然発症高血圧ラット（群当たりＮ＝９）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量のラット特異的ＡＧＴ ｄｓＲＮＡを２週間に１回（１０ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ）皮下投与し、又はＡＲＢバルサルタンを毎日経口投与するか（３１ｍｇ／ｋｇ／日）、又はＡＣＥ阻害剤カプトプリルを毎日経口投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／日）。選択された組合せ（ラット特異的ｄｓＲＮＡ剤及びバルサルタン又はカプトプリル及びバルサルタン）も評価し、上記のように投与した。平均動脈圧を、４週間の期間にわたって遠隔測定法によって測定した。４週間の処置の後、動物を、腹腔内（ｉ．ｐ．）ペントバルビタール注入によって麻酔をかけ、血液を、血漿ＡＧＴ、血漿レニン、血漿アンジオテンシンＩＩ、血漿アルドステロン、血漿Ｋ＋、及び血漿レニン活性の測定のために肝門静脈から採取した。心臓重量及び脛骨長さ（心臓重量の正規化のため）も得た。
ラット特異的ｄｓＲＮＡ剤による処置は、処置前のレベルと比べて、単独で又はバルサルタンと組み合わせて投与されたときに９８％超だけ血漿ＡＧＴレベルをノックダウンした（図２Ａ）。バルサルタン及びカプトプリルの組合せによる処置はまた、血清ＡＧＴレベルを有意に低下させることが実証された。全ての処置が、レニンのレベルを増加させ、最も大きい増加は、バルサルタン及びｄｓＲＮＡ剤の組合せで処置された動物において起こり、続いて、ｄｓＲＮＡ剤単独処置群における有意な増加があった。バルサルタン及びｄｓＲＮＡ剤による併用処置のみが、循環アンジオテンシンＩＩレベルを低下させることが分かった。尿中ＡＧＴの低下の傾向は、ｄｓＲＮＡ剤による処置の後に観察され、これは、腎臓中のＡＧＴタンパク質のレベルが、ｄｓＲＮＡ剤による処置によって有意に阻害されないことを示唆している（図３）。バルサルタン及びｄｓＲＮＡ剤の組合せのみが、尿中ＡＧＴを有意に低下させることが分かった。いずれの処置もアルドステロンレベルを変化させなかった。血漿Ｋ＋は、全ての群において増加する傾向にあり、組合せバルサルタン及びｓｉＲＮＡ処置群のみにおいて有意性が達成された。
図２Ｂは、実験を通して遠隔測定法によって測定された平均動脈圧レベルを示し、開始血圧レベルに対してグラフ化された。処置のそれぞれが、非処置の動物と比較して、血圧の統計的に有意な低下を引き起こした。統計比較（ｐ＜０．０５）が、ベースライン（＃）又はバルサルタン及びカプトプリル（＄）に対して示される。バルサルタン及びラット特異的ｄｓＲＮＡ剤による処置が、平均動脈圧を低下させる際に、カプトプリル及びバルサルタンによる処置より有意に良好であった。
図２Ｃは、心臓肥大の尺度を提供するために脛骨長さに対して正規化された心臓重量を示す。バルサルタン及びカプトプリル並びにバルサルタン及びｄｓＲＮＡ剤の両方による処置が、対照と比べて心臓肥大を軽減するのに有効であり（ｐ＜０．０５）、バルサルタン及びｄｓＲＮＡ剤はまた、バルサルタン及びカプトプリルと比べて心臓肥大を軽減した（ｐ＜０．０５）。図２Ｅは、ＭＡＰと比べた心臓重量対脛骨長さの散布図と同じデータを示す。心臓肥大とＭＡＰとの間の線形関係が観察され、バルサルタン及びｄｓＲＮＡ剤が、心臓肥大の最大の軽減を提供する。心筋細胞サイズは、バルサルタンを除く全ての群によってビヒクルと比べて減少された一方（図２Ｆ）、ＮＴ－プロＢＮＰは、カプトプリル及びバルサルタン群において減少され、減少の傾向が、バルサルタン及びｄｓＲＮＡ群において観察された（図２Ｇ）。
図２Ｄは、ベースラインと比べた４週間の時点でのレベルで相対レニン活性を示す。減少したアンジオテンシンシグナル伝達を反映する血漿レニン活性（ＰＲＡ）は、ｄｓＲＮＡ剤処置によるＰＲＡの明らかな増加を示す（ｄｓＲＮＡ剤単独及びバルサルタン及びｓｉＲＮＡの両方について、ベースライン及び対照群の両方と比べてｐ＜０．０５）。ＰＲＡアッセイは、過剰なアンジオテンシノーゲンの存在下で、血液試料中のレニンによって産生されるアンジオテンシンＩの量を定量することによってレニン活性を測定する。これらのデータは、ＡＧＴ－ｄｓＲＮＡ剤による該当する処置の後のアンジオテンシンＩＩシグナル伝達の低下、及び効果がバルサルタンとの併用処置によって増強されることを実証している。上方制御のため、循環アンジオテンシンＩＩは、ＡＧＴレベルが、ほぼ完全にノックダウンされるときでさえ、無傷のままである。これらのデータは、ＡＧＴ－ｄｓＲＮＡ剤が、バルサルタン及びカプトプリルと同様の降圧作用を引き起こすことを実証している。理論に制約されるものではないが、ｄｓＲＮＡ剤及びバルサルタンを組み合わせた場合のみ、アンジオテンシンＩＩレベルが急減し、血圧の相乗的な低下をもたらすことが提示される。
血液及び腎臓ＡｎｇＩ及びＡｎｇＩＩレベルに対する様々な処置の効果を、４週間の処置の後に調べた。図４Ａ～４Ｃは、単独で又は組み合わせた、バルサルタン及びカプトプリルによる処置が、ビヒクル対照と比較してＡｎｇＩの血中濃度を有意に増加させたことを示す（図４Ａ）。ｄｓＲＮＡ剤単独は、ＡｎｇＩの血中濃度を有意に変化させなかったが、バルサルタンとｄｓＲＮＡ剤との組合せが、ビヒクル対照及びｄｓＲＮＡ剤単独での処置と比較して、血液ＡｎｇＩを有意に低下させた。バルサルタン単独は、ビヒクル対照と比較して、血液ＡｎｇＩＩを有意に増加させることが分かった（図４Ｂ）。バルサルタンとｄｓＲＮＡ剤との組合せが、ビヒクル対照と比較して、血液ＡｎｇＩＩを有意に低下させることが分かった。これらの変化は、カプトプリル及びカプトプリル＋バルサルタンで処置された動物においてＡｎｇＩＩ／ＡｎｇＩの比率の有意な減少をもたらした。カプトプリル及びバルサルタンについてのデータは、それらの作用機序と一致しているが、ｄｓＲＮＡ単独についてのデータは、血液中のＡｎｇＩＩ／Ｉに対する効果がほとんどないことを示す。
図５Ａ～５Ｃは、ｄｓＲＮＡ剤が、腎臓ＡｎｇＩＩに対する明らかな効果なしで腎臓ＡｎｇＩを減少させ、上方制御された腎臓ＡｎｇＩＩ／Ｉ比をもたらしたことを示す。図５Ａは、各バルサルタン及びカプトプリルが、腎臓ＡｎｇＩを有意に増加させた一方、これらの薬剤の組合せが、ＡｎｇＩのレベルに対する有意な効果を与えなかったことを示す。腎臓ＡｎｇＩは、ｄｓＲＮＡ剤及びｄｓＲＮＡ剤とバルサルタンとの組合せによって有意に低下された。更に、併用処置は、ｄｓＲＮＡ剤単独による処置と比較して、腎臓ＡｎｇＩレベルを有意に低下させた。図５Ｂは、カプトプリルを除く単剤治療剤のいずれか、すなわち、バルサルタン又はｄｓＲＮＡ剤単独による処置の後、腎臓ＡｎｇＩＩの有意な変化を示さない。しかしながら、カプトプリルとバルサルタンとの組合せ及びバルサルタンとｄｓＲＮＡ剤との組合せは、腎臓Ａｎｇ ＩＩを有意に低下させることが実証された。カプトプリル及びバルサルタンについてのデータは、それらの作用機序と一致しているが、ｄｓＲＮＡ単独についてのデータは、腎臓中のＡｎｇＩＩに対する明らかな効果がほとんどないことを示す。腎臓ＡｎｇＩＩ／ＡｎｇＩ比は、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤単独の投与後に４倍増加した（図５Ｃ）。逆に、Ａｎｇ ＩＩ／Ａｎｇ Ｉ比の７０％超の低下が、バルサルタン、カプトプリル、及びバルサルタン＋カプトプリルの組合せによる処置の後に見られた。ＡｎｇＩＩ／ＡｎｇＩの比率の有意な変化は、バルサルタン＋ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置の後に観察されなかった。腎臓ＡｎｇＩＩの増加は、腎皮質又は髄質における腎臓アンジオテンシン受容体レベル又はＡＣＥ ｍＲＮＡ発現の変化の結果ではないことが実証された。図６Ａ～６Ｃは、１つを除く任意の処置条件下で、腎臓におけるＡＴ１ａ受容体、ＡＴ１ｂ受容体、又はＡＣＥ ｍＲＮＡレベルの有意な変化を示さない。カプトプリルによる処置は、腎髄質におけるＡＴ１ｂ受容体レベルの有意な増加をもたらした。腎臓機能に対する治療計画の影響も評価した。糸球体ろ過率（ＧＦＲ）、ナトリウム利尿、及びタンパク尿の変化は観察されなかった。これは、これらの処置が腎臓機能を損なわなかったことを示す。
尿量及び尿中ナトリウムを、実験中に監視した。バルサルタン＋ｄｓＲＮＡ剤、バルサルタン＋カプトプリル、及びカプトプリル単独による処置は、ベースラインと４週間との間で群内の尿量の有意な増加をもたらした（図７）。４週間の時点での群間の尿量の比較は、全ての他の群と比較して、カプトプリル処置動物における尿量の有意な増加を示した。バルサルタン＋ｄｓＲＮＡ剤による処置は、バルサルタン単独又はビヒクルによる処置と比較して、４週間の時点で尿量の有意な増加をもたらした。尿中ナトリウムの有意な変化が、実験中に群間又は群内で観察されなかった。
これらのデータは、ＡＣＥｉ及びＡＲＢの両方における低下した腎臓Ａｎｇ ＩＩ／Ｉ比が、腎臓ＡＣＥがＡｎｇ ＩＩを生成すること、及び組織Ａｎｇ ＩＩが、ＡＴ１Ｒが内在化したＡｎｇ ＩＩを表すことを確認していることを実証している（ｖａｎ Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８６（３）：４０１－４０９）。更に、肝臓を標的としたＡＧＴ ｓｉＲＮＡ処置の後の腎臓Ａｎｇ Ｉの低下は、腎臓Ａｎｇ生成が肝臓ＡＧＴに依存することを実証している。尿中ＡＧＴは、部分的に腎臓由来であるが、この腎臓ＡＧＴは、以前に示唆されているように、腎臓Ａｎｇ生成に寄与しない（Ｍａｔｓｕｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＳＮ ２０１２ ２３：１１８１－１１８９）。腎臓Ａｎｇ ＩＩレベルを無傷のままに保つことを可能にする、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ処置の後に増加した腎臓Ａｎｇ ＩＩ／Ｉ比は、ＡＴ１ｂ受容体の上方制御はないが、促進されたＡｎｇ ＩＩ内在化を示唆している。この考え方に一致して、相加的なＡＲＢ曝露が、腎臓Ａｎｇ ＩＩを実質的になくした。肝臓特異的ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、既存のＲＡＳ遮断薬と組み合わされたときに、動脈圧を相乗的に低下させ、腎臓機能に対する明らかな悪影響なしで腎臓Ａｎｇ産生を低下させる。
実施例６．高食塩ラットモデルにおけるＡＧＴ ｄｓＲＮＡによる高血圧の処置
酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）－食塩ラットモデルは、高食塩レベルに関する高血圧のための十分に確立したモデルであり、中枢及び末梢神経系に対する影響による神経性高血圧のモデルであると考えられる（Ｂａｓｔｉｎｇ Ｔ ＆ Ｌａｚａｒｔｉｇｕｅｓ Ｅ，Ｃｕｒ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｒｅｐ ２０１７）。
到着後すぐに、スプラーグドーリーラットを、７日間にわたって順化させる。その後、遠隔測定法送信機を、イソフルラン麻酔下で、ラットの腹部内、腹部大動脈内に埋め込む。ラットを、１０日間にわたってこの手術から回復させる。それ以降、血圧、心拍数、及び高血圧の他の指標を、７週間の期間にわたって遠隔測定法によって測定する。最初の４週間の間、動物の皮下に、２００ｍｇのＤＯＣＡペレットを埋め込み、長期的に飲料水（自由摂取）中０．９％の食塩を与えて、高血圧を誘発した。高血圧が開始するこの期間の後、３週間の治療期間が開始する。ラットを以下で処置する。
１）ビヒクル；
２）３１ｍｇ／ｋｇ／日で飲料水に加えられるバルサルタン；
３）ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤、１０ｍｇ／ｋｇを２週間に１回、皮下；
４）スピロノラクトン、５０ｍｇ／ｋｇ／日、皮下；ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤、１０ｍｇ／ｋｇを２週間に１回、皮下、及び、３１ｍｇ／ｋｇ／日で飲料水に加えられるバルサルタンの組合せ；
５）ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤、１０ｍｇ／ｋｇを２週間に１回、皮下、及びスピロノラクトン、５０ｍｇ／ｋｇ／日、皮下；
６）３１ｍｇ／ｋｇ／日で飲料水に加えられるバルサルタン、及びスピロノラクトン、５０ｍｇ／ｋｇ／日、皮下；又は
７）ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤、３０ｍｇ／ｋｇを２週間に１回、皮下。更に、ＤＯＣＡ及び飲料水中の食塩を与えられないラットの１つの群が、血圧を正常化するための処置の効果を評価するために対照として用いられる。
実施例７．食餌性肥満（ＤＩＯ）の高脂肪給餌マウスモデルにおけるＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による肥満の処置
１６週齢の高脂肪給餌（ＨＦＦ）肥満マウス（食餌性肥満（ＤＩＯ））及び正常体重対照動物を購入し、それらのそれぞれの高脂肪食（脂肪としてのカロリーの６０％）又は標準食で飼育した。順化の後、動物を４つの群に分けた：正常体重＋ＰＢＳ；正常体重＋ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ；ＤＩＯ＋ＰＢＳ；及びＤＩＯ＋ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ（ｎ＝５／群）。動物に、０週から開始して１２週間にわたって１週間置きに、１０ｍｇ／ｋｇのマウス特異的ｄｓＲＮＡ又はＰＢＳを投与した。動物を計量し、血液を隔週で採取した。血清ＡＧＴレベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。空腹時糖負荷試験を、投与前、最初の投与の６週間後の時点、及び最初の投与の１２週間後の時点で行った。臓器重量を、試験の終了時点で測定した。
ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤の投与は、最初の時点から開始して、ｄｓＲＮＡ剤の最初の投与の２週間後に、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤処置群にわたって約９３％の持続したノックダウンを伴い、高脂肪食及び標準食動物の両方においてＡＧＴをサイレンシングする際に有効であった。
ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、ＤＩＯマウスにおける二元配置反復測定ＡＮＯＶＡによって決定した際に、ＰＢＳ処置ＤＩＯマウスと比較して体重増加を有意に減少させる際に有効であり、最初の投与の２週間後から開始して、試験全体を通して維持される（図８Ａ）。開始体重を比較する分析において、ＤＩＯ＋ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ群は、最後の時点まで開始体重と比べて体重を増加させなかった。最後の時点の前に、マウスは、開始体重と比べて体重を減少させたか（２、４、６週）、又は体重の差はなかった（８、１０週）。試験の１０及び１２週まで、ＰＢＳとＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤標準食（ｃｈｏｗ）給餌マウスとの間で、体重の有意差は観察されなかった。
臓器重量を、脂肪沈着の場所に対するＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置の効果を評価するために、試験の終了の時点で測定した。ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤で処置されたＤＩＯマウスの肝臓重量は、ＰＢＳ処置ＤＩＯマウスより著しく低かった（図８Ｂ）。ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤及びＰＢＳ処置標準食給餌マウスの間に、肝臓重量の有意差は観察されなかった。脂肪組織（精巣上体）重量が、ＤＩＯ＋ＰＢＳよりＤＩＯ＋ＡＧＴ ｓｉＲＮＡ群において統計的に高かった一方、正常体重動物においてその逆が当てはまっていた。全ての４つの群にわたって、腓腹筋重量の有意差はなかった。
糖負荷試験を、標準的なプロトコルを用いて、０週（投与前）、６週、及び１２週の時点で行った。血糖を、ＡｌｐｈａＴＲＡＫ（登録商標）２血糖値測定器（Ａｂｂｏｔｔ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、投与前、ボーラス腹腔内グルコース用量投与の３０、６０、９０、及び１２０分後の時点で測定した。結果が、図９Ａ～９Ｃに示される。０週の時点で、ＤＩＯマウスは、標準食給餌対照と比較して、糖負荷を減少させた。６週までに、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤で処置されたＤＩＯマウスとＰＢＳ処置ＤＩＯマウスとの間の試験後の複数回の比較において、有意差が観察された。１２週の時点で、値が血糖値測定器の限度を超えた１匹のＤＩＯ＋ＰＢＳ動物を除いて、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤で処置されたＤＩＯマウスとＰＢＳ処置ＤＩＯマウスとの間で有意差が依然としてあった。更に、ＤＩＯ＋ＡＧＴ ｓｉＲＮＡ群からのデータは、６又は１２週の時点でいずれの対照群（ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤で処置された又はＰＢＳで処置された標準食給餌マウス）とも異なっていなかった。
実施例８．高脂肪高フルクトースマウスモデルにおけるＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤によるＮＡＳＨの処置
ＮＡＳＨの高脂肪高フルクトース（ＨＦ ＨＦｒ）給餌マウスモデル（参照により本明細書に援用される、Ｓｏｆｔｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２７（１１）：４０５９－４０７４，２０１７）を用いて、ＮＡＳＨ及び代謝障害の兆候を処置するためのＡＧＴ ｓｉＲＮＡの有効性を実証した。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに、ＮＡＳＨを誘発するためにＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤又はＰＢＳ（対照）による処置前の１２週間にわたって水中の脂肪としてのカロリーの６０％及び３０％のフルクトースを含有する高脂肪食（Ｈｆ Ｈｆｒ食）を与え、又は標準食及び水の食餌を与えた。食物及び水を自由に与えた。１２週から開始して、ＨＦ ＨＦｒ給餌マウスに、合計４回の投与のために１週間置きにＡＧＴに標的化された１０ｍｇ／ｋｇの用量のｄｓＲＮＡ剤を皮下投与した。最後の投与の２週間後（２０週の時点）、肝臓を採取し、ＲＮＡを単離し、肝臓におけるＡＧＴノックダウンを、上記の方法を用いてＲＴ－ｑＰＣＲによって決定した。肝臓ＡＧＴ ｍＲＮＡの９３％の減少が、ＰＢＳ処置ＨＦ ＨＦｒ給餌マウスと比較して、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤で処置されたＨｆ Ｈｆｒ給餌マウスにおいて観察された。
予想通りに、体重（図１０Ａ）、累積体重増加（図１０Ｂ）、及び最終的な肝臓重量は、全ての時点で標準食給餌マウスと比較してＨＦ ＨＦｒ給餌対照マウスにおいて有意に高かった。ＨＦ ＨＦｒマウスにおけるＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、１２週から２０週まで体重を減少させ、これは、対照処置マウスと比較して最終的な体重の有意な減少をもたらした（ｐ＝０．００２３）。最終的な肝臓重量の有意差は、観察されなかった。
血清及び肝臓脂質及びグルコース、及び血清インスリンを、ＨＦ ＨＦｒモデルにおけるｄｓＲＮＡ剤の効果を決定するために評価した。２０週の時点で、血清トリグリセリド及びグルコースレベルは、全ての３つの群（標準食、ＨＦ ＨＦｒ ｄｓＲＮＡ、ＨＦ ＨＦｒ対照）にわたって実質的に同じであった。血清コレステロール及びインスリンレベルは、両方のＨＦ Ｈｆｒ群においてほぼ同じであり、予想通りに、標準食給餌群において有意に高かった。ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、血清非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を有意に減少させることが実証された（ｐ＝０．０１）。肝臓において、コレステロールは、標準食対照と比較して両方のＨＦ ＨＦｒ群において上昇されたが、やはり、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置の後に、有意な減少は観察されなかった。肝臓トリグリセリド（ｐ＝０．０１７）及び遊離脂肪酸（ｐ＝０．００１）の有意な減少が、対照処置群と比較して、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤処置群において観察された。脂質酸化の指標であるチオバルビツール酸（ＴＢＡ）の減少傾向の可能性が、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ処置群において見られた。
肝障害が、標準食給餌マウスと比較して、対照処置Ｈｆ Ｈｆｒマウスにおける血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）レベルの有意な増加によって示された。ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、対照処置ＨＦ ＨＦｒマウスと比較した際に、ＡＬＴの有意な減少をもたらし（ｐ＝０．０１）（図１１Ａ）、ＡＳＴ（図１１Ｂ）及びＧＬＤＨ（図１１Ｃ）の減少傾向を有していた。
肝障害を、組織病理学及びＮＡＳスコアによっても評価した。予想通りに、ＨＦ ＨＦｒ食は、重度の脂肪症、膨化変性、及び小葉炎症を誘発し、標準食給餌マウスと比較して全体的なＮＡＳスコアの増加をもたらした。ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、膨化変性の有意な減少をもたらし（ｐ＝０．０４）、小葉炎症の減少傾向を有し、対照処置ＨＦ ＨＦｒ給餌動物と比較して、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤で処置されたＨＦ ＨＦｒ給餌動物における全体的なＮＡＳスコアの有意な減少（ｐ＝０．０１）をもたらした。
これらのデータは、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置が、ＮＡＳＨの兆候のいくつかを改善するのに有効であることを実証している。特に、ＡＧＴ ｄｓＲＮＡ剤による処置は、ＡＬＴの有意な減少並びにＡＳＴ及びＧＬＤＨのわずかな減少を伴い、体重及び肝障害酵素を減少させる際に有効であった。小葉炎症及び膨化スコアの減少も観察され、全体的なＮＡＳスコアを減少させた。
均等物
当業者は、本明細書に記載される特定の実施形態及び方法に対する多くの均等物を認識するか、又は単なる日常的な実験を用いて確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (31)

  1. アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤またはその薬学的に許容され得る塩であって、
    前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して、３０ヌクレオチド長以下であり、
    前記センス鎖が、配列番号４８２のヌクレオチド配列５’－ｇｓｕｓｃａｕｃＣｆａＣｆＡｆＡｆｕｇａｇａｇｕａｃａ－３’と３つ以下の修飾又は非修飾ヌクレオチドにより異なり、前記アンチセンス鎖が、配列番号６６６のヌクレオチド配列５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’と３つ以下の修飾又は非修飾ヌクレオチドにより異なり、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、及びｕがそれぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、及びＵｆがそれぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵであり；ｓが、ホスホロチオエート結合であり；そして（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体である、
    ｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  2. 前記センス鎖が、配列番号４８２のヌクレオチド配列５’－ｇｓｕｓｃａｕｃＣｆａＣｆＡｆＡｆｕｇａｇａｇｕａｃａ－３’と２つ以下の修飾又は非修飾ヌクレオチドにより異なり、前記アンチセンス鎖が、配列番号６６６のヌクレオチド配列５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’と２つ以下の修飾又は非修飾ヌクレオチドにより異なる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  3. 前記センス鎖が、配列番号４８２のヌクレオチド配列５’－ｇｓｕｓｃａｕｃＣｆａＣｆＡｆＡｆｕｇａｇａｇｕａｃａ－３’と１つ以下の修飾又は非修飾ヌクレオチドにより異なり、前記アンチセンス鎖が、配列番号６６６のヌクレオチド配列５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’と１つ以下の修飾又は非修飾ヌクレオチドにより異なる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  4. 前記センス鎖が、配列番号４８２のヌクレオチド配列５’－ｇｓｕｓｃａｕｃＣｆａＣｆＡｆＡｆｕｇａｇａｇｕａｃａ－３’からなり、前記アンチセンス鎖が、配列番号６６６のヌクレオチド配列５’－ｕｓＧｆｓｕａｃ（Ｔｇｎ）ｃｕｃａｕｕｇＵｆｇＧｆａｕｇａｃｓｇｓａ－３’からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  5. リガンドを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  6. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、請求項５に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  7. 前記リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項５～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  8. 前記リガンドが、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  9. 前記リガンドが、
    である、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  10. 前記ｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩が、以下の概略図
    に示されるように前記リガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである、
    請求項６～９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  11. ＸがＯである、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  12. 前記二本鎖領域が、１９～２３ヌクレオチド対長である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  13. 塩形態である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩を含む細胞。
  15. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩を含む、ＡＧＴの発現を阻害するための医薬組成物。
  16. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩および薬学的に許容され得る担体を含む、ＡＧＴの発現を阻害するための医薬組成物。
  17. 細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するインビトロでの方法であって、前記細胞を、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩又は請求項１５～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞内での前記ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する工程を含むインビトロでの方法。
  18. 前記細胞を前記ｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩と接触させる工程が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％だけＡＧＴの発現を阻害する、請求項１７に記載の方法。
  19. 対象におけるアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連疾患を処置するための医薬組成物であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩又は請求項１５～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、医薬組成物。
  20. 前記ＡＧＴ関連疾患が、高血圧、高血圧症、境界域高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、孤立性収縮期若しくは拡張期高血圧、妊娠関連高血圧、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧、ゴールドブラット高血圧、低い血漿レニン活性若しくは血漿レニン濃度に関連する高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、心不全、心筋梗塞、狭心症、脳卒中、慢性腎疾患、腎疾患、腎不全、全身性硬化症、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、胎児発育不全、肥満、肝臓脂肪症／脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；耐糖能異常、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）、及びメタボリック・シンドロームからなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記対象が、少なくとも１３０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧および少なくとも８０ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
  22. 前記対象が、少なくとも１４０ｍｍ Ｈｇの収縮期血圧及び少なくとも８０ｍｍ Ｈｇの拡張期血圧を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
  23. 前記対象がヒトである、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 前記対象が、食塩感受性になりやすい群の一員であるか、過体重であるか、肥満であるか、又は妊娠している、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 前記ｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるためのものである、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. 前記ｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩が、皮下投与されるためのものである、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 高血圧の処置のための更なる治療剤と組み合わせて投与されるためのものである、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. 前記更なる治療剤が、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、β遮断薬、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、α２－アゴニスト、レニン阻害剤、α遮断薬、末梢作用型アドレナリン作動薬、選択的Ｄ１受容体部分アゴニスト、非選択的α－アドレナリン拮抗薬、合成したステロイド性の抗ミネラルコルチコイド薬、アンジオテンシン受容体－ネプリライシン阻害剤（ＡＲＮｉ）、Ｅｎｔｒｅｓｔｏ（登録商標）、サクビトリル／バルサルタン；又はエンドセリン受容体アンタゴニスト（ＥＲＡ）、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ＢＱ－１２３、ジボテンタン、ボセンタン、マシテンタン、及びテゾセンタン；上記のいずれかの組合せ；及び薬剤の組合せとして製剤化された高血圧治療剤からなる群から選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 前記更なる治療剤が、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストを含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
  30. アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストが、ロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、エプロサルタン、及びアジルサルタンからなる群から選択される、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤またはその薬学的に許容され得る塩又は請求項１５～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
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