RS64957B1 - Očuvanje mikroorganizama - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na oblast očuvanja mikroorganizama, a posebno obezbeđuje sistem sa 2 odeljka koji se sastoji od prvog odeljka, koji se sastoji od mikrokapsula i koji sadrži vitalne mikroorganizme u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula i drugi vodeni organski odeljak koji sadrži kiselinu. Dodatno obezbeđuje metode za očuvanje mikroorganizama, na osnovu takvih sistema, kao i upotrebu takvih sistema za očuvanje mikroorganizama.

Osnova pronalaska

Upotreba korisnih mikroorganizama kao probiotika u medicini se poslednjih nekoliko decenija proširila. Da bi se obezbedila stabilnost takvih probiotika, bakterije treba da se osuše (npr. zamrzavanjem ili raspršivanjem) da bi se dobilo metabolički neaktivno stanje. Kao takvi mogu da prežive decenijama pod odgovarajućim uslovima skladištenja (npr. vlaga, temperatura...). Uvođenjem vode, bakterijski prah će se ponovo aktivirati i bakterije mogu vršiti svoju funkciju. Do sada se većina probiotičkih formulacija koristila za gastro-intestinalne primene. Najčešće formulacije su kapsule i tablete koje se lako mogu čuvati u odsustvu vode i koje se mogu zatvoriti pod inertnim gasovima kao što su azot ili ugljendioksid da bi se postavila dobra relativna vlažnost za maksimalnu stabilnost.

S druge strane, upotreba probiotika u topikalnim (ili drugim vrstama vodenih) formulacija takođe može imati ogroman potencijal. Jedna od opcija može da bude da formuliše ove supstance kao što su masti ili oleogelovi, međutim, pacijenti uopšte ne prihvataju te formulacije. Prihvaćenije formulacije su one u obliku gelova/krema/pena/losiona. Međutim, takve topikalne formulacije inherentno sadrže visok stepen vode, odnosno da bi se na odgovarajući način formulisale u gel, kremu, penu, losion, mast... Očigledno, prisustvo tako visokog stepena vode u ovim formulacijama predstavlja problem za skladištenje probiotika u njihovom metabolički neaktivnom stanju.

Drugi problem koji se javlja u takvim vodenim (npr. topikalnim) formulacijama je da oni generalno sadrže agense koji nisu kompatibilni sa preživljavanjem mikroorganizama; kao što su konzervansi, surfaktanti, emulzije,... u cilju zaštite takvih formulacija od rasta neželjenih mikroorganizama kao i formiranja stabilnih emulzija. Međutim, ovi agensi će, naravno, stvoriti veliki problem u formulisanju pozitivnih mikroorganizama.

Otuda je cilj predmetnog pronalaska bio da obezbedi sistem koji omogućava dugotrajno skladištenje mikroorganizama i koji suštinski ne šteti takvim mikroorganizmima nakon njihove upotrebe. Iznenađujuće je pronađeno da sistem sa 2 odeljka koji sadrži prvi odeljak koji sadrži mikrokapsule, koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula; i drugi odeljak koji sadrži (ili se sastoji od) vodene kompozicije koja sadrži jednu ili više organskih kiselina (sa pH-vrednošću manjom od 7,0 i bez puferskih agenasa), pruža rešenje za gore navedene probleme. Konkretno, utvrđeno je da takav sistem omogućava dugotrajno skladištenje mikroorganizama, jer su tokom skladištenja zaštićeni od izlaganja vodi i jer se nalaze u odeljku koji ne sadrži vodu. Nakon toga, i nakon kombinovanja sadržaja oba odeljka za upotrebu, iznenađujuće je otkriveno da organske kiseline, koje služe kao konzervans za skladištenje, ne oštećuju odmah oslobođene mikroorganizme koji se aktiviraju zbog vodene komponente u navedenu drugu kompoziciju. Ovo je u suprotnosti sa drugim klasama konzervansa koji imaju veoma direktan mehanizam delovanja na mikroorganizme.

Pored toga, dok su formulacije predmetnog pronalaska posebno pogodne za topikalnu primenu probiotika, koncept pronalaska bi se takođe mogao proširiti na druga polja u kojima se javlja problem očuvanja/stabilizacije mikroorganizama u vodenom okruženju. Stoga su njihovim formulisanjem u sistemu sa 2 odeljka, kako je definisano predmetnim pronalaskom, ovi problemi rešeni.

Iako je koncept formulisanja mikroorganizama u sistemu sa 2 odeljka već otkriven, stanje tehnike ne pruža rešenje za zaštitu mikroorganizama kada se kombinuje sadržaj oba odeljka. Konkretno, vodena komponenta potrebna za aktiviranje mikroorganizama je često veoma oštra za mikroorganizme i uglavnom sadrži konzervanse, surfaktante... koji nisu kompatibilni sa dugotrajnim preživljavanjem takvih mikroorganizama. Nasuprot tome, zbog izbora organskih kiselina kao konzervansa, otkrili smo da nema potrebe za uključivanjem dodatnih konzervanasa, surfaktanata ili drugih štetnih komponenti, dok je potrebna stabilnost takvih formulacija zadržana.

Antunes et al., 2013. (Nauka i tehnologija hrane 54: 125-131) opisuje proces mikrokapsulacije u kojem se imobiliše bakterijska suspenzija u celuloznom acetatu zajedno sa glicerolom, maltodekstrinom, Tween-om... Tokom sušenja raspršivanjem, bakterijska suspenzija se raspršuje pomoću jedne mlaznice u zagrejanom prostoru (100 °C – 200 °C). Kao takva, voda u suspenziji isparava i dobija se suvi bakterijski prah. Dobijeni prah podseća na matricu koja sadrži navedene mikroorganizme umesto mikrokapsula koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula.

US2012263826 opisuje oralni rastvor koji sadrži najmanje jedan vodeni rastvor i žele kapsule koje sadrže alginat, proteine surutke i probiotike. Takve žele kapsule su u stvari 1-fasic gel čestice (tj. matrica koja sadrži probiotike), a ne sistem sa 2 odeljka kao što je ovde otkriveno, pri čemu se probiotici održavaju u anhidrovanom jezgru navedene kapsule.

WO2008016214A1 otkriva kompoziciju koja sadrži probiotike formulisane kao kapsule i da je mikroorganizam pomešan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem da bi se pripremila suspenzija ili rastvor za disperziju koji puni kapsule. Ovaj dokument dalje otkriva da kapsule mogu imati enteričku prevlaku i da kompozicija može dalje da sadrži dodatne komponente, kao što je glukonska kiselina. WO2008016214A1 je, međutim, konkretno izrađen oko oralnih farmaceutskih kompozicija (npr. kapsula), sa enteričkom prevlakom protiv visoke kiselosti želudačne kiseline i ovaj dokument ne pokazuje sistem sa dva odeljka koji sadrži probiotike kako je ovde otkriveno.

Sažetak pronalaska

U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje sistem sa 2 odeljka koji se sastoji od:

- prvog odeljka koji sadrži mikrokapsule, koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i još sadrži vitalne mikroorganizme u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula; i

- drugog odeljka koji sadrži vodenu kompoziciju, koja ima pH-vrednost manju od 7,0 i koji sadrži jednu ili više organskih kiselina;

gde navedeni drugi odeljak ne sadrži puferske agense.

U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, navedena druga vodena kompozicija ima pH-vrednost manju od 5,5, poželjno manju od 5,0, poželjnije manju od 4,5.

U drugoj posebnoj realizaciji, navedena jedna ili više organskih kiselina su izabrane sa liste koja sadrži benzojevu kiselinu, sorbinsku kiselinu, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, mlečnu kiselinu, oksalnu kiselinu, mravlju kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, fumarnu kiselinu, anisovu kiselinu, glukonsku kiselinu, jabučnu kiselinu, jantarnu kiselinu, vinsku kiselinu, fosfornu kiselinu i propionsku kiselinu i njihove derivate.

U još jednoj realizaciji, navedeni održivi mikroorganizmi su probiotički mikroorganizmi, poželjnije izabrani sa liste koja sadrži Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus i Lactobacillus plantarum.

U posebnoj realizaciji, navedeni prvi odeljak je nepropusan za vodu i kiseonik.

U drugoj posebnoj realizaciji, navedena vodonerastvorljiva i vodonepropusna ljuska mikrokapsula predmetnog pronalaska sastoji se od alginata, ksantan gume, arapske gume, gelanske gume, karagena, želatina, celuloze ili njihovih derivata; ili polimeri na bazi agara, proteina, poliola, želatina, PVA (polivinil alkohola), PLGA (poli(mlečna-ko-glikolna kiselina), PLA (polimlečna kiselina) i njihovih derivata, PCL, poliizoheksilcijanoakrilata, derivata akrilata ili skroba, opciono u kombinaciji sa hitozanom ili čvrstim mastima.

U posebnoj realizaciji, sistem sa 2 odeljka predmetnog pronalaska je u obliku gela, kreme, pene, losiona ili masti koji sadrže navedene mikrokapsule.

U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, nevodena kompozicija je izabrana sa liste koja sadrži biljna ulja, mineralna ulja, silicijumska ulja ili hidrofilne polimere; posebno kaprični/kaprilični trigliceridi, tečni parafin, polietilen glikol, silikoni ili čvrste masti.

U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, navedena jedna ili više organskih kiselina služe kao konzervans, a navedena kompozicija je u suštini bez dodatnih konzervanasa.

U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod za očuvanje održivih mikroorganizama koji obuhvata:

- obezbeđivanje sistema sa 2 odeljka;

- uključujući navedene održive mikroorganizme u navedenom prvom odeljku koji sadrži mikrokapsule, koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula;

- uključujući jednu ili više organskih kiselina u navedenoj vodenoj kompoziciji u drugom odeljku navedenog sistema sa 2 odeljka u količini dovoljnoj da se dobije pH-vrednost manja od 7,0; gde navedeni drugi odeljak ne sadrži puferske agense.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu sistema sa 2 odeljka prema ovom pronalasku za očuvanje vodene kompozicije bez oštećenja navedenih vitalnih mikroorganizama.

Kratak opis crteža

Sa posebnim osvrtom na slike, naglašava se da su prikazani detalji dati samo kao primer i u svrhu ilustrativne diskusije na temu različitih realizacija predmetnog pronalaska. Oni su predstavljeni u cilju pružanja, kako se veruje, najkorisnijeg i najlakšeg opisa principa i konceptualnih aspekata pronalaska. U tom pogledu, ne pokušava se da se prikažu strukturni detalji pronalaska detaljnije nego što je neophodno za fundamentalno razumevanje pronalaska. Opis zajedno sa crtežima pokazuje stručnjacima kako se nekoliko oblika pronalaska mogu realizovati u praksi.

Sl. 1: Stabilnost mikroorganizama u silikonu; A) CF 1406, B) CF6570.

Sl. 2: Stabilnost mikroorganizama u uljima; A) suncokretovo ulje, B) Miglyol 812N.

Sl. 3: Stabilnost mikroorganizama u polarnim medijima; A) PEG400, B) Glicerin.

Sl. 4: Stabilnost mikroorganizama u čvrstim mastima; A) Whitepsol h15, B) Hydrobase 32/34.

Detaljan opis pronalaska

Kao što je već detaljno objašnjeno u ovom tekstu, u prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje sistem sa 2 odeljka koji se sastoji od:

- prvog odeljka koji sadrži mikrokapsule, koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula; i

- drugog odeljka koji sadrži vodenu kompoziciju, koja ima pH-vrednost manju od 7,0 i koji sadrži jednu ili više organskih kiselina;

gde navedeni drugi odeljak ne sadrži puferske agense.

Još preciznije, predmetni pronalazak obezbeđuje sistem sa 2 odeljka, kako je ovde definisano, koji se sastoji od:

- mikrokapsula, koje imaju vodonerastvorljivu i vodonepropusnu ljusku i održive mikroorganizme sadržane u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedene ljuske; i

- vodene kompozicije, koja ima pH-vrednost manju od 7,0 i koja sadrži jednu ili više organskih kiselina;

gde navedena vodena kompozicija ne sadrži puferske agense.

I još preciznije, predmetni pronalazak obezbeđuje sistem sa 2 odeljka, kako je ovde definisano, koji se sastoji od:

- mikrokapsule, koje mogu da imaju vodonerastvorljivu i vodonepropusnu ljusku i održive mikroorganizme sadržane u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedene ljuske; i

- vodene kompozicije, koja ima pH-vrednost manju od 7,0 i koja sadrži jednu ili više organskih kiselina;

gde navedena vodena kompozicija ne sadrži puferske agense.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termini „vodonerastvorljive” i „vodonepropusne” mikrokapsule treba da se shvate kao vodootporni. Posebno, vodootporne kapsule se mogu opisati kao da se ne degradiraju kada su suspendovane u navedenom drugom vodenom odeljku. Međutim, s obzirom na to kako se ovde koriste, mikrokapsule mogu (i obično će) degradirati, npr. izgubiti svoju nerastvorljivost pod određenim uslovima naprezanja, kao što su koncentracije soli ili mehaničko naprezanje usled smicanja, čime se oslobađa njihov aktivni sadržaj npr. mehanizam otpuštanja kapsula, kao što je ovde opisano.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „vodena kompozicija” podrazumeva formulaciju koja sadrži vodu. Konkretno, navedene formulacije sadrže značajnu količinu vode, kao što je najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% vode. Shodno tome, termin „nevodena kompozicija” podrazumeva formulaciju koja ne sadrži značajne količine vode, kao ne više od 10%, poželjno ne više od 5%, još poželjnije ne više od 2%, najpoželjnije uopšte ne sadrži vodu, odnosno 0%.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „održivi mikroorganizmi” se odnosi na mikroorganizme koji su živi i nije zamišljeno da budu fragmenti, supernatanti kulture ili njihovi ubijeni oblici. Navedeni održivi mikroorganizmi su poželjno osušeni zamrzavanjem da bi se povećalo njihovo očuvanje.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „organska kiselina” je organsko jedinjenje sa kiselim svojstvima. Očigledno, u kontekstu predmetnog pronalaska, bilo koja pogodna organska kiselina, može da se koristi u meri u kojoj može da deluje kao konzervans.

Utvrđeno je da ove organske kiseline imaju spor mehanizam delovanja na mikroorganizme i da ne oštećuju odmah (probiotske) mikroorganizme kada dođu u kontakt sa ovim organskim kiselinama. Posle dužeg izlaganja okolini, kao što je koža, organske kiseline gube svoju aktivnost i time ne oštećuju (probiotske) mikroorganizme tokom dužeg vremenskog perioda. Dok se pronalazak poželjno izvodi korišćenjem organske kiseline kao konzervansa (pošto je utvrđeno da gube svoju aktivnost nakon izlaganja okolini), može se izvesti i korišćenjem drugog konzervansa ukoliko ima spor mehanizam delovanja, npr. potrebno je najmanje 24 sata da postanu aktivne.

U odnosu na upotrebu organskih kiselina, formulacije ne sadrže puferske agense. Prisustvo puferskog agensa će zadržati kompozicije na niskoj pH-vrednosti tokom dužeg vremenskog perioda, zbog čega će biti potrebno više vremena da se inhibira konzervansno delovanje organskih kiselina, čime se povećava rizik od oštećenja mikroorganizama kada dođu u kontakt sa organskom kiselinom. Dok će većina komponenti imati mali efekat puferovanja, poželjno je da se komponente kompozicija odaberu tako da ne smanjuju ili povećavaju vreme potrebno za inaktivaciju organskih kiselina.

Posebno pogodne organske kiseline su one izabrane sa liste koja sadrži benzojevu kiselinu, sorbinsku kiselinu, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, mlečnu kiselinu, anisovu kiselinu, oksalnu kiselinu, mravlju kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, fumarnu kiselinu, glukonsku kiselinu, jabučnu kiselinu, jantarnu kiselinu, vinsku kiselinu, fosfornu kiselinu i propionsku kiselinu i njihove derivate. Tačnije navedene organske kiseline su izabrane sa liste koja sadrži benzojevu kiselinu, sorbinsku kiselinu, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, mlečnu kiselinu, oksalnu kiselinu, mravlju kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, fumarnu kiselinu, glukonsku kiselinu, jabučnu kiselinu, jantarnu kiselinu, vinsku kiselinu, fosfornu kiselinu i propionsku kiselinu i njihove derivate; kao što je sorbinska kiselina.

U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, pH-vrednost druge vodene kompozicije prema ovom pronalasku je manja od 5,5, poželjno manja od 5,0, poželjnije manja od 4,5, manji od 4,0 ili manja od 3,5. pH-vrednost formulacija je veoma relevantna u kontekstu predmetnog pronalaska. Uopšteno govoreći, što je niža pH-vrednost, veći je njen efekat očuvanja, čime se doprinosi dugoročnoj stabilnosti formulacija predmetnog pronalaska. Željena pH-vrednost se dobija koformulisanim organskim kiselinama, koje stoga imaju svrhu konzervansa u formulacijama. Zbog prisustva ovih organskih kiselina, otkrili smo da nema dalje potrebe za uključivanjem dodatnih konzervanasa, pa je stoga formulacija predmetnog pronalaska poželjna u suštini bez drugih konzervanasa, osim organskih kiselina. Pored toga, kompozicija je takođe suštinski oslobođena drugih komponenti koje su štetne za mikroorganizme, kao što su fenoksietanol, bronidoks, izotiazolinoni i natrijum lauret sulfat; koji se vrlo često koriste u topikalnim formulacijama.

U poželjnoj realizaciji, održivi mikroorganizmi predmetnog pronalaska su održivi probiotički mikroorganizmi.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „probiotik” podrazumeva da uključuje održive mikroorganizme koji pružaju zdravstvene dobrobiti kada se koriste u oblasti lečenja ljudi ili veterine. Formulacije predmetnog pronalaska su veoma pogodne za formulisanje svih poznatih bioloških mikroorganizama, kao što su, ali ne ograničavajući se na Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus i/ili Lactobacillus plantarum. Očigledno, formulacije predmetnog pronalaska mogu da sadrže samo jednu vrstu održivih probiotičkih mikroorganizama, ili njihove kombinacije, u zavisnosti od nameravane upotrebe.

Da bi se povećala stabilnost mikroorganizama u prvom odeljku, navedeni prvi odeljak je poželjno nepropustan za vodu i kiseonik.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termini „mikrokapsulirani” ili „mikrokapsule” se odnose na proizvode dobijene postupkom mikrokapsuliranja. Ovo je proces u kome su čestice ili kapljice mikroveličine (mikrometarskog opsega) okružene premazom da bi se dobile male kapsule, sa mnogim korisnim svojstvima. U kontekstu predmetnog pronalaska, on se koristi za ugradnju probiotičkih mikroorganizama. U relativno jednostavnom obliku, mikrokapsula je mala sfera sa

1

uniformnim zidom oko nje. Materijal unutar mikrokapsule se naziva jezgrom, internom fazom ili punjenjem; dok se zid naziva ljuskom, oblogom ili membranom.

Stručnjak u ovoj oblasti je prilično svestan činjenice da postoji nekoliko metoda za proizvodnju mikrokapsula i da predmetni pronalazak nije ograničen ni na jedan od ovih metoda. Metode mikrokapsuliranja pogodne u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničene na premazivanje posudom, premazivanje vazdušnom suspenzijom, centrifugalnu ekstruziju,

vibracionu mlaznicu, sušenje raspršivanjem, jonotropno geliranje, razdvajanje faza koacervacije, međufaznu polikondenzaciju, međufazno unakrsno povezivanje, in situ polimerizaciju, matričnu polimerizaciju.

Početni cilj mikrokapsulacije je izolacija jezgra od njegovog okruženja, u predmetnom pronalasku, posebno da bi se zaštitili inkapsulirani mikroorganizmi od konzerviranja od strane okolnih organskih kiselina i da bi se zaštitili od aktiviranja u vodenoj sredini. Očigledno, nakon upotrebe, zidovi mikrokapsula moraju biti ruptirani da bi se mikroorganizmi oslobodili i omogućili im da deluju kako se želi. Poželjno je da se takva ruptura dobije niskim pritiskom, trenjem ili naprezanjem na smicanje tokom upotrebe, kao što je nanošenje formulacija na kožu ili druga topikalna područja.

U svom najjednostavnijem obliku, mikrokapsule predmetnog pronalaska sadrže vodonerastvorljivu i vodonepropusnu školjku sa mikroorganizmima sadržanim u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula. Međutim, gde je prikladno, mikrokapsule mogu sadržati dodatne slojeve, kao što je na primer dodatni sloj premaza za povećanje zaštite sadržaja.

U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, navedene mikrokapsule sadrže vodonerastvorljivu i vodonepropusnu školjku; a navedeni mikroorganizmi su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula. Prisustvo vode je dovoljno da se ponovo aktiviraju bakterije osušene zamrzavanjem, pa je važno da se formulišu u odsustvu vode, čime se omogućava dugotrajno skladištenje. Navedena vodonerastvorljiva i vodonepropusna ljuska može biti sastavljena od bilo kog pogodnog materijala kao što su, ali bez ograničenja na alginat, ksantan guma, arapska guma, gelanska guma, karagen, želatin, celuloza ili njihovi derivati; ili polimeri na bazi agara, proteina, poliola, želatina, PVA (polivinil alkohola), PLGA (poli(mlečna-ko-glikolna kiselina), PLA (polimlečna kiselina) i njihovih derivata, PCL, poliizoheksilcijanoakrilata, derivata akrilata ili skroba ili čvrste masti kao što su na primer Whitepsol ili Hydrobase.

Iako se ove komponente mogu koristiti kao takve, one se takođe mogu kombinovati jedna sa drugom ili mogu biti unakrsno povezane sa polimerima ili hitozanom. Takvo dalje umrežavanje može povećati trajnost mikrokapsula. Štaviše, da bi se sadržaj mikrokapsula (tj. mikroorganizmi) još više zaštitio od vode i vazduha, kapsule mogu opciono biti obložene odgovarajućim premazom.

Kao što je ranije navedeno, mikroorganizme treba čuvati u odsustvu vode kako bi se obezbedilo dugotrajno skladištenje. Prema tome, jezgro mikrokapsula predmetnog pronalaska je poželjno bezvodni medijum, kao što su bez ograničenja na biljna ulja, mineralna ulja, silicijumska ulja ili hidrofilni polimeri; posebno kaprični/kaprilični trigliceridi, tečni parafin, polietilen glikol, silikoni ili čvrste masti, kao što su npr. Whitepsol ili Hydrobase.

Naravno, prisustvo konzervansa je veoma važno za dugotrajno skladištenje formulacija, međutim, predstavlja ozbiljan problem za formulaciju mikroorganizama kao što su probiotici. Kao rešenje za to, otkrili smo da su mikrokapsuliranje (probiotičkih) mikroorganizama i obezbeđivanje takvih mikrokapsula u formulaciji koja sadrži organske kiseline dovoljni da garantuju dugotrajno skladištenje formulacija, bez ometanja aktivnosti mikroorganizama. Čak i nakon upotrebe formulacije i oslobađanja mikroorganizama, ove druge ne ometaju ko-formulisane organske kiseline, pošto one brzo gube svoju aktivnost nakon upotrebe, na primer zbog puferskog kapaciteta kože. Prema tome, organske kiseline predmetnog pronalaska su namenjene da služe kao konzervansi, a formulacija je u suštini bez dodatnih konzervansa koji mogu ometati aktivnost mikroorganizama nakon oslobađanja iz mikrokapsula.

Stoga, u posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, navedena organska kiselina služi kao konzervans, a formulacija je u suštini bez dodatnih konzervansa.

Formulacije predmetnog pronalaska su posebno pogodne za topikalnu primenu jer takve formulacije uopšteno imaju visok sadržaj vode. Zato je, u posebnoj realizaciji, vodena formulacija prema predmetnom pronalasku u stvari vodena formulacija za topikalnu primenu.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „topikalno” podrazumeva lokalnu isporuku na određenoj lokaciji tela, posebno primenu na određeno mesto na ili u telu. Konkretno, uključuje nanošenje na sluzokožu putem vodenih, tj. nečvrstih formulacija, kao što su kreme, pene, gelovi, losioni ili masti, ili bilo koje druge vrste formulacija koje sadrže vodu. Očigledno, termin „topikalno” ne podrazumeva isporuku u obliku čvrstih preparata, kao što su kapsule, tablete...

Formulacije probiotika za topikalnu primenu predmetnog pronalaska mogu se naći u bilo kom pogodnom obliku, kao što su, bez ograničenja, gel, krema, pena, losion ili mast, koji sadrži navedene mikrokapsule.

Kao što je gore detaljno objašnjeno, otkriće predmetnog pronalaska je da je formulacija mikroorganizama, koji ne dolaze u kontakt sa vodenom komponentom u sistemu sa 2 odeljka, u kombinaciji sa upotrebom organske kiseline dovoljna da omogući dugotrajno skladištenje formulacije bez značajnih oštećenja (probiotičkih) mikroorganizama.

Kao takav, u daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod za očuvanje održivih mikroorganizama koji obuhvata:

- obezbeđivanje sistema sa 2 odeljka;

- uključujući navedene održive mikroorganizme u navedenom prvom odeljku koji sadrži mikrokapsule, koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke, i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula;

- uključujući jednu ili više organskih kiselina u navedenoj vodenoj kompoziciji u drugom odeljku navedenog sistema sa 2 odeljka u količini dovoljnoj da se dobije pH-vrednost manja od 7,0; gde navedeni drugi odeljak ne sadrži puferske agense.

1

U konačnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu sistema sa 2 odeljka prema ovom pronalasku za očuvanje vodene kompozicije bez oštećenja navedenih vitalnih mikroorganizama u navedenim mikrokapsulama.

Formulacije predmetnog pronalaska su posebno veoma pogodne za topikalnu primenu, što uključuje direktnu primenu na kožu ili na mukoznu membranu, kao što je vagina.

Pogodni oblici za davanje – koji mogu biti polučvrsti ili tečni, u zavisnosti od načina primene – kao i postupci i nosači, razblaživači i ekscipijenti za upotrebu u njihovoj pripremi, biće jasni stručnom licu; ponovo se pozivamo na, na primer, US-A-6,372,778, US-A-6,369,086, US-A-6,369,087 i US-A-6,372,733, kao i na standardne priručnike, kao što je najnovije izdanje Remingtonove Science Pharmace.

Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih preparata uključuju eliksire, suspenzije, emulzije, rastvore, sirupe, masti, kreme, losione, koji mogu biti formulisani sa nosačima, ekscipijentima i razblaživačima koji su sami po sebi pogodni za takve formulacije, kao npr. laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitol, manitol, skrob, guma bagrema, alginati, tragakant, želatin, polietilen glikol, celuloza, (sterilna) voda, metilceluloza, jestiva ulja, biljna ulja i mineralna ulja ili njihove pogodne mešavine.

Formulacije predmetnog pronalaska mogu opciono da sadrže druge komponente kao što su lekovi i/ili prebiotici, na primer za stimulisanje rasta mikroorganizama.

Formulacije mogu opciono da sadrže druge supstance koje se obično koriste u farmaceutskim formulacijama, kao što su sredstva za vlaženje, agensi za emulgovanje i suspendovanje, sredstva za dispergovanje. Međutim, veoma je važno da takve dalje supstance ne nanose značajnu štetu probiotičkim organizmima tokom skladištenja kompozicije, niti prilikom njene upotrebe.

Posebno, kompozicije mogu biti formulisane u farmaceutskoj formulaciji koja sadrži čestice koje se sastoje od čvrste disperzije mikroorganizama pronalaska i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih polimera rastvorljivih u vodi.

Termin „čvrsta disperzija” definiše sistem u čvrstom stanju (za razliku od tečnog ili gasovitog stanja) koji se sastoji od najmanje dve komponente, pri čemu je jedna komponenta više ili manje ravnomerno dispergovana u drugoj komponenti ili komponentama.

Dalje može biti pogodno formulisati mikroorganizme u obliku mikročestica koje imaju modifikator površine adsorbovan na svojoj površini u količini dovoljnoj da održi efektivnu prosečnu veličinu čestica od oko 1–5000 µm. Pogodni modifikatori površine mogu se poželjno izabrati između poznatih organskih i neorganskih farmaceutskih ekscipijenata. Takvi ekscipijenti uključuju različite polimere, oligomere male molekulske težine, prirodne proizvode i surfaktante, kao što su nejonski i anjonski surfaktanti.

Pronalazak će sada biti ilustrovan pomoću sledećih sintetičkih i bioloških primera koji ni na koji način ne ograničavaju obim pronalaska.

Primeri

Primer br.1: Izbor nevodene kompozicije za prvi odeljak

Cilj ovog primera je bio da se odabere pogodna nevodena kompozicija za uključivanje vitalnih mikroorganizama, što omogućava njihovu dugoročnu stabilnost i održivost.

Materijal i metode

Studija stabilnosti

U ovoj studiji stabilnosti upotrebljena su tri soja:

- Samokultivisan L. pentosus (tj. lac4 ili Lp)

- Samokultivisan LGG (tj. lac7 ili LGG)

- Kupljeni LGG osušen zamrzavanjem.

Osam različitih bezvodnih medijuma za suspenziju je testirano za očuvanje bakterija na sobnoj temperaturi (+/- 20 °C). Korišćeni mediji za suspenziju se mogu podeliti u 4 tipa, za koje su u svakoj grupi upoređena 2 podtipa na sledeći način:

1

� Silikoni:

∘ kozmetička tečnost 1406 (dimetikonol i dimetikon) – proizvođač Chemsil

∘ kozmetička tečnost 6570 (disiloksan, trisiloksan, ciklopentasiloksan i dimetikon) – proizvođač Chesil

� Ulja:

∘ suncokretovo ulje – proizvođač Everyday

∘ Migyol 812 N – proizvođač Hüls

� Polarni rastvarači:

∘ PEG 400 – proizvođač Roth

∘ Glycerine – proizvođač Fagron

� Čvrste masti:

∘ Witepsol H15 – proizvođač VW chemicals

∘ Hydrobase 32/34 – proizvođač Prod'hyg laboratoires

Uzorci su dobijeni u 9 prethodno definisanih vremenskih tačaka:

• T0 = pre suspenzije u medijumu za suspenziju

• T1 = 1 dan nakon suspenzije

• T2 = 1 nedelja nakon suspenzije

• T3 = 2 nedelje nakon suspenzije

• T4 = 1 mesec nakon suspenzije

• T5 = 2 meseca nakon suspenzije

• T6 = 6 meseci nakon suspenzije

• T7 = 12 meseci nakon suspenzije

• T8 = 24 meseca

1

Svi upotrebljeni materijali su pre upotrebe sterilizovani u autoklavu. Sve upotrebljene komponente, sastojci,... po mogućnosti su sterilizovani u autoklavu i na drugi način filtrirani u sterilnim uslovima.

T0 Određivanje CFU

Lac 4 i Lac 7 su kultivisani u tečnom MRS (de MAN, Rogosa & Sharpe) medijumu (37 °C) do potpunog rasta. Medijum je centrifugiran 10 minuta na 2780 G. Supernatant je odložen, a bakterijska peleta je dalje korišćena.

Izmereno je 100 mg i razblaženo fiziološkim rastvorom (0,85% NaCl) da bi se dobila ukupna zapremina od 10 ml. Od tri soja (lac 4, lac 7 i LGG), napravljene su serije razblaženja (10-struka serijska razblaženja) i određivanje broja mikroorganizama je izvršeno prema metodi razmaza (izvedeno iz metoda farmakopeje 2.6.12 i 2.6.13. Merenja su ponovljena u tri primerka. Rezultati su izraženi kao cfu/gram praha.

Suspendiranje bakterija u medijumu za suspenziju

Sa dobijenim bakterijskim masama izvršeno je homogeno

1/10 razblaživanje (m/m %) sa različitim anhidrovanim medijumima za suspenziju.

1 gram navedene suspenzije je izmeren u falcon epruveti i zatvoren u aluminijumsku kesu (RH = 20%). Svaki uzorak je sadržao 100 mg bakterija za dalje testiranje. Aluminijumske kese su otvorene u određenim vremenskim tačkama radi ispitivanja održivosti.

Testiranje nakon vremena skladištenja

Zapečaćene kese su otvorene u određenim vremenskim tačkama radi ispitivanja stabilnosti. Falcon epruveta koja sadrži 1 gram bezvodne supstance je dalje obrađena dodavanjem 1 grama mešavine emulgatora (koja se sastoji od polisorbata 80 i sorbitanseskvioleata) i 8 grama fiziološkog rastvora. Ovo je formiralo emulziju kroz koju su bakterije mogle da dođu u kontakt sa vodom i ponovo se aktiviraju. Dalja priprema uzoraka i određivanje broja mikroorganizama obavljena je kao što je gore opisano i izvedeno iz farmakopejske metode 2.6.12: Mikrobiološko ispitivanje nesterilnih proizvoda: testovi sa brojanjem mikroba i

1

2.6.13: mikrobiološko ispitivanje nesterilnih proizvoda: test na određene mikroorganizme.

Rezultati i diskusija

Stabilnost praha osušenog zamrzavanjem bila je daleko superiornija, kao što se očekivalo, u poređenju sa sojevima „kao takvim”. Nakon samo

1 meseca, u proseku dolazi do smanjenja od 3 log, dok kod soja osušenog zamrzavanjem nema smanjenja. Ovim je dokazano da je važno početi sa formulisanjem sa prahom koji je pravilno osušen zamrzavanjem (ili drugom metodom sušenja) kako bi se obezbedila stabilna formulacija održivih mikroorganizama tokom vremena.

Stoga će se dalje raspravljati samo o rezultatima soja LGG osušenog zamrzavanjem.

Rezultati stabilnosti su bili uporedivi za smeše silicijuma (sl.1), ulja (sl. 2) i čvrstih masti (sl.3). Od hidrofilnih medijuma (sl.3) samo PEG 400 se čini pogodnim kao medijum za suspenzije, za razliku od glicerola, koji negativno utiče na stabilnost FD IGG.

Postoji prosečno smanjenje od 1 log nakon stabilnosti od godinu dana za različite anhidrovane medijume. Ovo ostavlja dovoljno održivih mikroorganizama koji se mogu primeniti topikalno i imati blagotvorno dejstvo na kožu.

Ovim se dokazuje da je radom sa pravilno liofilizovanim prahom, suspendovanim u anhidrovanim medijima, zaštićenim od svetlosti, vlage i konzervansa, moguće dobiti fazu/odeljak sa stabilnim probioticima. Ovaj odeljak može biti ili u dvofaznom sistemu, gde se in situ vrši mešanje vodene i anhidrovane faze ili u obliku kapsule suspendovane u formulaciji.

Primer br.2: Izbor vodene kompozicije za drugi odeljak

Cilj je da se napravi topikalna formulacija sa održivim mikroorganizmima koji se mogu primeniti na kožu gde će imati blagotvorno dejstvo. Topikalna formulacija, kao što je krema, obično sadrži ulje, vodu, konzervanse i emulzije. Prisustvo emulgatora i konzervansa može negativno uticati na stabilnost

1

prisutnih mikroorganizama osušenih zamrzavanjem. Način da se garantuje određeni rok trajanja je suspendovanje probiotika sušenih zamrzavanjem u anhidrovanom medijumu (videti takođe primer 1). Ova bezvodna suspenzija će obezbediti dobru stabilnost za mikroorganizme osušene zamrzavanjem. Da bi se sprečio negativan uticaj drugih komponenti u topikalnoj formulaciji, navedenu anhidrovanu suspenziju je najbolje odvojiti od ostatka formulacije, bilo fizičkim odvajanjem faza ili kapsuliranjem navedene anhidrovane suspenzije. Kapsule se zatim mogu suspendovati u topikalnoj formulaciji.

Sve dok su faze razdvojene, može se dobiti dugotrajan topikalni proizvod sa održivim mikroorganizmima. Problem može nastati kada se 2 faze pomešaju pre nanošenja na kožu. Liofilizirani probiotici će se aktivirati putem uzimanja vode iz formulacije, ali će se takođe sresti sa prisutnim emulgatorima i konzervansima, ubijajući aktivirane mikroorganizme i sprečavajući ih da ostvare blagotvorno dejstvo na kožu. Ovaj eksperiment predstavlja skrining za određivanje kratkoročnog efekta (10 minuta -> 1 dan) različitih formulacija na preživljavanje liofiliziranih probiotika.

1. METOD

1.1 Eksperiment A

Ovaj eksperiment je simulacija u kojoj se održivi mikroorganizmi osušeni zamrzavanjem nalaze stabilno u anhidrovanoj suspenziji i zatim se mešaju sa formulacijom koja sadrži različite konzervanse i emulgatore. Tri standardna TMF preparata se inkubiraju sa 10% (m/m) liofiliziranim LGG. TMF formulacije su široko korišćene (Belgija) i smatraju se bezbednim i stabilnim formulacijama za topikalnu primenu lekova. Uzorak iz formulacije se uzima nakon 10 minuta i nakon 24 sata da bi se utvrdila održivost, a time i kratkoročni antibakterijski efekat navedenih formulacija. Primena topikalnih probiotika se obično dešava svaki dan. Zbog toga nisu uzeti uzorci nakon 24 sata. Priprema uzorka i određivanje CFU (određivanje broja mikroorganizama) odvijali su se prema metodi razmaza na podlozi (izvedeno iz metoda Farmakopeje 2.6.12 i 2.6.13. Merenja su ponovljena u tri primerka.

Rezultati su izraženi kao cfu/gram praha.

1

Sastav testiranih krema je sledeći:

1.2 Eksperiment B

Da bi se proširila platforma za skrining u eksperimentu A, eksperiment A je ponovljen sa komercijalno dostupnim formulacijama koje sadrže različite

2

konzervanse i emulgatore. Eksperiment je sproveden na isti način kao što je opisano u 2.1. Krema A iz eksperimenta A je uzeta kao referenca. Druge farmaceutske baze krema (1-5) su pregledane i upoređene sa komercijalno dostupnim kozmetičkim formulacijama (6-11), kao što je detaljno prikazano u sledećoj tabeli:

2. Rezultati

2.1 Eksperiment A

Izgleda da je preživljavanje liofiliziranog LGG-a samo minimalno pogođeno nakon suspenzije od 10 minuta u gornjim formulacijama. Za kremu A skoro da nije primetno smanjenje posle 24 sata. Blago smanjenje (± 0,5 log) je zabeleženo za kremu C i veliko smanjenje (± 3 log) za kremu B. Obe kreme A i C sadrže organsku kiselinu sorbinsku kiselinu kao konzervans, za razliku od kreme B koja sadrži parabene kao konzervans i natrijum lauril sulfat (anjonski emulgator sa poznatim antimikrobnim svojstvima).

Sve u svemu, može se zaključiti da organske kiseline imaju spor mehanizam delovanja (vreme potrebno za efektivnost je 1-3 dana (podaci nisu prikazani)) i stoga se mogu smatrati sigurnim konzervansom za upotrebu u topikalnim formulacijama u kombinaciji sa mikroorganizamima koji su osušeni zamrzavanjem. Formulacija A se predlaže za dalja ispitivanja u vezi sa kombinacijom liofiliziranih probiotika u topikalnoj formulaciji.

2.2 Eksperiment B

Na prvi pogled, izgleda da su farmaceutske baze krema (1-5) manje antibakterijske u kratkom roku od testiranih kozmetičkih formulacija (6-10).

Kozmetičke formulacije su izuzetno antibakterijske (> 4 log smanjenja posle 10 minuta) i njihovi sastojci (emulzije i konzervansi) se smatraju nepogodnim za formulaciju. Glavni problematični sastojci su identifikovani kao fenoksietanol, bronidoks, izotiazolinoni i natrijum lauret sulfat. Prisutni su i drugi sastojci sa antibakterijskim svojstvima, ali su manjeg značaja.

Najbolja formulacija (nakon 24 sata) je ponovo puferovana cetomakrogol krema, sa sorbinskom kiselinom kao jedinim konzervansom

(± 0,15 log smanjenja posle 24 sata). Formulacija sa drugim najboljim preživljavanjem je farmaceutska baza Nourivan, koja sadrži samo sorbinsku kiselinu kao konzervans. Treća najbolja formulacija je carbomeergel koji sadrži parabene, a četvrta najbolja formulacija je Pentravan krema koja sadrži sorbinsku kiselinu i benzojevu kiselinu kao konzervanse. Lanette krema sadrži parabene i sorbinsku kiselinu kao konzervans.

Jasno je da su organske kiseline (i parabeni) konzervansi koji sporo deluju, za razliku od onih koji se obično nalaze u kozmetičkim formulacijama i ne oštećuju značajno probiotike nakon nanošenja na kožu. Formulacije 1, 4 i 5, koje sadrže samo organske kiseline kao konzervanse, pokazuju najmanje smanjenje nakon 10 minuta. Iako parabeni mogu takođe biti pogodni za upotrebu kao konzervansi, oni su poznati alergeni i stoga se poželjno ne koriste u kozmetičkoj industriji. Stoga se zaključuje da su organske kiseline kao konzervansi pogodna opcija za ko-formulisanje sa probioticima.

Primer br.3: Testovi stabilnosti

Naše kapsule formiraju homogeni zid (ljusku) oko unutrašnjeg jezgra koje sadrži probiotičke bakterije. Ova ljuska štiti bakterije i vodi računa da se one ne ispuste odmah u vodeno okruženje kada se naše kapsule suspenduju.

Možemo da obezbedimo dobru stabilnost i na hlađenim i na sobnim temperaturama, kao što je vidljivo iz tabele u nastavku:

2

Primer br.4: Ispitivanja održivosti u kremama koje sadrže organske kiseline kao konzervans

Cilj ovog primera je bio da se utvrdi efikasnost probiotičkih kapsula, kada su suspendovane u uljnoj/vodenoj kremi u prisustvu konzervansa sorbinske kiseline u različitim koncentracijama. Drugi cilj je bio da se dokaže da su izabrani konzervansi pogodni za zaštitu kreme. Ovo je dokazano sprovođenjem testa izdržljivosti na kremi (bez probiotičkih kapsula) sa različitim koncentracijama konzervansa, prema Evropskoj farmakopeji (5.1.3).

Materijal i metode:

Upotrebljene kompozicije

Kao osnova za dalja testiranja korišćena je osnovna krema bez konzervansa/parfema. Testirani konzervans je bila sorbinska kiselina

(2,4 heksadienska kiselina), organska kiselina sa pKa 4,76 na 25 °C u različitim koncentracijama. pH-vrednost kreme za sve testirane uslove je podešena na 4,5 korišćenjem HCl/NaOH.

Testovi izdržljivosti i efikasnost koncentracija organskih kiselina kao konzervansa

Testovi izdržljivosti se koriste za određivanje efikasnosti antimikrobnog sistema konzervacije za dermatološke proizvode. Cilj je povećati bezbednost i trajnost proizvoda. Sorbinska kiselina je testirana u koncentracijama: 0,5% - 0,3% - 0,1% - 0% (kontrola).

Izazvani organizmi bili su E. coli (DSM 1576), Ps. Aeruginosa (DSM 1128), C. albicans(DSM 1386), St. aureus(DSM 799), As. Niger (DSM 1988).

Dodavanje izazvanih organizama (u 100 grama proizvoda) se dešava na 10<6>CFU/ML. Uzorkovanje je vršeno nakon 6 sati, 24 sata, 7-14 i 28 dana. Test izdržljivosti je uspešan ako je smanjenje od najmanje 3 log vidljivo nakon 7 dana za bakterije i smanjenje od 2 log za kvasce/plesni nakon 14 dana, odn. smanjenje od 3 log nakon 4 nedelje. Prikazani su rezultati nakon 4 nedelje uzorkovanja.

Sposobnost probiotičkih kapsula u bazi kreme sa različitim konzervansima

Probiotičke kapsule su suspendovane 15% (m/) u bazi kreme sa različitim koncentracijama konzervansa. Da bi se simuliralo oslobađanje probiotika in vivo, korišćen je pufer od limunske kiseline in vitro. Limunska kiselina će rastvoriti membranu kapsule i time osloboditi probiotike unutar kapsule. CA pufer je napravljen rastvaranjem 31,2 g Na2HPo4 i 1,25 g limunske kiseline u 971,54 g sterilne vode. Konačni rastvor je izotoničan sa pH-vrednošću od 7,4t 0,2.

Uzorci kreme su uzorkovani u duplikatu, nakon čega su rastvoreni u CA-puferu. Napravljena je još jedna serija razblaženja od 1/10, a 0,1 ml je razmazano na MRS agar pločicama korišćenjem „kopakabana metode razmaza” sa 5 staklenih perli prečnika 4 mm. Postavljanje se vrši u duplikatu, a rezultati (nakon 3 dana inkubacije na 37 °C) su izračunati u jedinici CFU/gram kreme. Skladištenje je vršeno na 4 °C i 25 °C. Uzimanje uzoraka je vršeno nakon 1-2-3 meseca. Prikazani rezultati predstavljaju stabilnost kapsula nakon 3 meseca skladištenja na hladnom.

Rezultati

Rezultati testiranja izdržljivosti

Rezultati testiranja izdržljivosti na osnovnoj kremi (osim probiotičkih kapsula) nakon 4 nedelje.

2

* Test izdržljivosti je uspešan ako se dobije veće smanjenje od log 3. Brojevi se moraju tumačiti na sledeći način: 3 = smanjenje manje od 1 log;

2 = smanjenje između 1 i 2 log;1 = smanjenje između 2 i 3 log; 0 = smanjenje veće od 3 log u odnosu na početno bakterijsko opterećenje.

Održivost probiotičkih kapsula u kremi sa različitim koncentracijama sorbinske kiseline

Preživljavanje probiotičkih kapsula nakon 3 meseca u osnovnoj kremi u prisustvu različitih koncentracija sorbinske kiseline kao konzervansa.

Zaključak

Organske kiseline (kao što je sorbinska kiselina) su vredni konzervansi za dermatološke formulacije. Sorbinska kiselina ima dobar efekat konzerviranja u koncentracijama do 0,1%. Nijedan dodatak sorbinske kiseline nije rezultirao neuspehom testa izdržljivosti jer se činilo da nije u stanju da ubije sve testirane mikroorganizme u predviđenom vremenskom okviru. Zato izgleda da je upotreba

2

organskih kiselina kao jedinog konzervansa u formulaciji pogodna za sprečavanje kvarenja bilo pod dejstvom bakterija, kvasca ili plesni, kada su prisutne u odgovarajućoj koncentraciji.

Suspendovanjem probiotičkih kapsula (15% m/m) u istoj osnovnoj kremi koja je korišćena za testove izdržljivosti, otkriveno je da na probiotičke kapsule ne utiče nijedna od različitih konverzacionih koncentracija. Bakterijsko opterećenje CFU kreme koja sadrži različite konzervanse nije variralo više od 32% (smanjenja manje od 0,3 log) u poređenju sa blanko uzorkom. Ovo je prilično u granicama odstupanja i nema značajne razlike.

To podrazumeva da probiotičke kapsule nude dobru zaštitu od organskih kiselina koje su testirane u ovom eksperimentu u ovoj formulaciji kreme, dok su u isto vreme konzervansi u stanju da spreče rast egzogenih organizama u kremi.

2

Claims (11)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Sistem sa 2 odeljka koji se sastoji od:

- prvog odeljka koji sadrži mikrokapsule, koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru

navedenih mikrokapsula; i

- drugog odeljka koji sadrži vodenu kompoziciju koja ima pH-vrednost manju od 7,0 i koji sadrži jednu ili više organskih kiselina;

gde navedeni drugi odeljak ne sadrži puferske agense.

2. Sistem sa 2 odeljka prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da pomenuta vodena kompozicija drugog odeljka ima pH-vrednost manju od 5,5, poželjno manju od 5,0, a poželjnije manju od 4,5.

3. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2; gde je pomenuta jedna ili više organskih kiselina izabrano sa liste koja sadrži benzojevu kiselinu, sorbinsku kiselinu, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, mlečnu kiselinu, anisovu kiselinu, oksalnu kiselinu, mravlju kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, fumarnu kiselinu, glukonsku kiselinu, jabučnu kiselinu, jantarnu kiselinu, vinsku kiselinu, fosfornu kiselinu i propionsku kiselinu i njihovu derivate.

4. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3; gdenavedeni održivi mikroorganizmi predstavljaju održive probiotičke mikroorganizme, poželjnije izabrani sa liste koja sadrži Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus i Lactobacillus plantarum.

5. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4; gde je navedeni mikroorganizam koji sadrži prvi odeljak nepropusan za vodu i kiseonik.

6. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5; gde se pomenuta vodonerastvorljiva i vodonepropusna ljuska sastoji od alginata, ksantan gume, arapske gume, 30 gelanske gume, karagena, želatina, celuloze ili njihovih derivata; ili polimera na bazi agara, proteina, poliola, želatina, PVA (polivinil

2

alkohola), PLGA (poli(mlečna-ko-glikolna kiselina), PLA (polimlečna kiselina) i njihovih derivata, PCL, poliizoheksilcijanoakrilata, derivata akrilata ili skroba, opciono u kombinaciji sa hitozanom; ili čvrstih masti.

7. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6; koji je u obliku gela, kreme, pene, losiona ili masti, koji sadrži pomenute mikrokapsule.

8. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7; gde je pomenuta nevodena kompozicija izabrana sa liste koja sadrži biljna ulja, mineralna ulja, silicijumska ulja ili hidrofilne polimere; posebno kaprični/kaprilični trigliceridi, tečni parafin, polietilen glikol, silikoni ili čvrste masti.

9. Sistem sa 2 odeljka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8; gde navedena organska kiselina služi kao konzervans i gde je kompozicija u suštini bez dodatnih konzervanasa.

10. Metod za očuvanje održivih mikroorganizama koji sadrži:

- obezbeđivanje sistema sa 2 odeljka prema patentnom zahtevu 1

- uključujući navedene održive mikroorganizme u navedenom prvom odeljku koji sadrži mikrokapsule koje se sastoje od vodonerastvorljive i vodonepropusne školjke i vitalnih mikroorganizama koji su sadržani u nevodenoj kompoziciji u jezgru navedenih mikrokapsula;

- uključujući jednu ili više organskih kiselina u navedenoj vodenoj kompoziciji u drugom odeljku navedenog sistema sa 2 odeljka u količini dovoljnoj da se dobije pH-vrednost manja od 7,0; gde navedeni drugi odeljak ne sadrži puferske agense.

11. Upotreba sistema sa 2 odeljka prema patentnom zahtevu 1 za očuvanje vodene kompozicije bez oštećenja navedenih vitalnih mikroorganizama u navedenim mikrokapsulama.